RS62359B1 - Lečenje amd upotrebom aav sflt-1 - Google Patents

Lečenje amd upotrebom aav sflt-1

Info

Publication number
RS62359B1
RS62359B1 RS20211170A RSP20211170A RS62359B1 RS 62359 B1 RS62359 B1 RS 62359B1 RS 20211170 A RS20211170 A RS 20211170A RS P20211170 A RSP20211170 A RS P20211170A RS 62359 B1 RS62359 B1 RS 62359B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sflt
raav
vegf
certain aspects
vector
Prior art date
Application number
RS20211170A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian J Constable
Elizabeth P Rakoczy
Chooi-May Lai
Thomas W Chalberg Jr
Original Assignee
Avalanche Australia Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49584435&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62359(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Avalanche Australia Pty Ltd filed Critical Avalanche Australia Pty Ltd
Publication of RS62359B1 publication Critical patent/RS62359B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B3/00—Apparatus for testing the eyes; Instruments for examining the eyes
    • A61B3/02—Subjective types, i.e. testing apparatus requiring the active assistance of the patient
    • A61B3/028—Subjective types, i.e. testing apparatus requiring the active assistance of the patient for testing visual acuity; for determination of refraction, e.g. phoropters
    • A61B3/032—Devices for presenting test symbols or characters, e.g. test chart projectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10002—Non-specific protein-tyrosine kinase (2.7.10.2), i.e. spleen tyrosine kinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14142—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Opis pronalaska
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0001] Senilna makularna degeneracija (AMD) jedan je od vodećih uzroka nepovratnog oštećenja vida kod ljudi starijih od 50 godina. AMD je klinički podeljena na dva oblika označena kao „suvi“ i „vlažni“. Vlažni oblik AMD se može razviti brzo i često dovodi do slepila. Patološke promene u oboljenju mogu prouzrokovati ozbiljna oštećenja vida. Manifestacije AMD mogu uključivati, ali nisu ograničene na, poremećenu funkciju retinalnih pigmentnih epitelnih ćelija (RPE) i horoidnu neovaskularizaciju (CNV) u regionu makule (žute mrlje). U ozbiljnim slučajevima, može doći do “curenja” tečnosti, odvajanja RPE ili nervnog epitela, kao i do krvarenja iz krvnih sudova sa rupturama. Utvrđeno je i da mnogi ćelijski faktori imaju važne uloge u regulaciji nastanka CNV, među kojima su uključeni, ali bez ograničavanja na, vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), VEGF receptor (VEGFR), faktor rasta poreklom iz trombocita (PDGF), faktor indukovan hipoksijom (HIF), angiopoetin (Ang) i drugi citokini, proteinske kinaze aktivirane mitogenima (MAPK) i drugi.
[0002] Jedna od trenutno odobrenih terapija za vlažnu AMD je Lucentis®. Lucentis® je antiangiogeno sredstvo i ciljano deluje na sve izoforme vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF). Kliničke studije su pokazale poboljšan ili stabilan vid kod približno 95% pacijenata kojima je primenjivan Lucentis®, u poređenju sa približno 60% pacijenata koji su primali “lažnu” (engl. sham) terapiju. Iako je Lucentis® prvo odobreno sredstvo za poboljšanje vida, radi prostizanja optimalnih koristi za vid potrebna je intravitrealna primena na svake 4 nedelje. Eylea® je još jedan VEGF inhibitor koji je odobren za lečenje vlažne AMD. Eylea® takođe zahteva česta intravitrealna injeciranja, na svakih 4-8 nedelja, da bi se ostvarile optimalne koristi za vid. Intravitrealni načini primene mogu povećati rizik od ozbiljnih komplikacija, kao što su infektivni endoftalmitis i odvajanje mrežnjače (retine), za koje se kumulativni rizik povećava sa ponovljenim primenama. Prijavljeni su takođe povećan intraokularni pritisak, traumatska katarakta i cepanja mrežnjače. Konačno, sa tretmanom koji sprovodi oftalmolog, učestalost lečenja određuje stepen opterećenja za pacijenta, lekara i zdravstveni sistem uopšte, do obima koji je potrebno smanjiti koliko god je to moguće. Ograničenja trenutno dostupne terapije za CNV koji nastaje sekundarno u odnosu na AMD, stvorila su u oblasti tehnike potrebu za alternativnim pristupima koji bi se bavili visokom učestalošću potrebnih tretmana, kao i invazivnošću procedure lečenja. Neovaskularizacija koja uključuje povišenje VEGF-a može takođe dovesti do drugih očnih patologija, kao što su dijabetesna retinopatija, dijabetesni makularni edem (DME) i okluzije retinalne vene (RVO). Ova oboljenja vode neovaskularizaciji mrežnjače i gubitku vida. Inhibitori VEGF-a, kao što je Lucentis®, pokazali su efikasnost u DME i RVO, mada terapija, kao i kod vlažne AMD, zahteva česte intravitrealne primene da bi se održavala korisna dejsva tretmana.
[0003] Lukason i saradnici, "Inhibition of Choroidal Neovascularization in a Nonhuman Primate Model by Intravitreal Administration of an AAV2 Vector expressing a Novel Anti-VEGF Molecule", MOLECULAR THERAPY, tom 19, br. 2, str. 260-265, 2010, opisuju eksperimente sa intravitrealnom primenom rAAV2-sFLT1 kod majmuna, pri čemu ne opisuju ili ne ukazuju na uvođenje prethodnog intraokularnog injeciranja VEGF inhibitornog proteina.
[0004] Pronalazak obezbeđuje rekombinantan adeno-asocirani virus (rAAV) za upotrebu koja je kao što definisano u priloženim patentnim zahtevima. Opis, u tekstu koji sledi, obezbeđuje tehničke informacije stanja tehnike i nije predviđeno da definiše pronalazak kao takav, već da olakša razumevanje i primenu pronalaska, stavljajući ga u tehnički kontekst.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0005] Predmetni opis obezbeđuje kompozicije i postupke za lečenje CNV-a, poput onog koji se javlja kod humanog subjekta u vlažnom obliku AMD.
[0006] Prema jednom aspektu, predmetni opis obezbeđuje kompozicije i postupke za lečenje AMD kod humanog subjekta koji obuhvataju: subretinalnu primenu farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski efektivnu količinu VEGF inhibitora, humanom subjektu kome je potrebno lečenje za AMD. Prema jednom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži rekombinantan virus. Prema drugom aspektu, VEGF inhibitor sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira solubilni tirozin kinazni protein srodan Fms tipa 1 (sFLT-1).
[0007] Prema jednom aspektu, predmetni opis obezbeđuje kompozicije i postupke za prevenciju CNV kod osoba sa AMD, koji obuhvataju: subretinalnu primenu farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski efektivnu količinu rekombinantnog virusa koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira solubilni tirozin kinazni protein srodan Fms tipa 1 (sFLT-1), humanom subjektu kome je potreban tretman za AMD.
[0008] Prema pojedinim aspektima, virus je izabran od adeno-asociranih virusa (AAV), adenovirusa zavisnog od “pomagača”, retrovirusa, herpes simpleks virusa, lentivirusa, poksvirusa, kompleksa hemaglutinirajućeg virusa iz Japana (HVJ) i lipozoma, Molonijevog virusa mišje leukemije i virusa zasnovanog na HIV-u. Prema pojedinim aspektima, AAV kapsid ili invertovani terminali ponovci (ITR) su izabrani iz grupe koja se sastoji od: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 i njihovih hibrida.
[0009] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži promotor izabran od promotora citomegalovirusa (CMV), promotora Rousovog sarkoma virusa (RSV), MMT promotora, EF-1 alfa promotora, UB6 promotora, promotora beta-aktina pileta, CAG promotora, RPE65 promotora i opsinskog promotora.
[0010] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži pojačivač.
[0011] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži intron ili himerni intron.
[0012] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži poli A sekvencu SV40.
[0013] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži humani sFlt-1 protein ili njegov funkcionalni fragment.
[0014] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus se generiše iz plazmida koji sadrži bilo marker rezistencije na ampicilin ili marker rezistencije koja nije ampicilinska.
[0015] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži bakterijske regulatorne sekvence, poput promotora T7 RNK polimeraze.
[0016] Prema pojedinim aspektima, rekombinantnom virusu nedostaju bakterijske regulatorne sekvence, poput promotora T7 RNK polimeraze.
[0017] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži regulatorni fragment nukleinske kiseline koji je u stanju da usmeri selektivnu ekspresiju sFlt-1 proteina ili njegovog funkcionalnog fragmenta u ćeliji oka.
[0018] Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija sadrži oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<15>genoma rekombinantnog virusnog vektora, oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<14>genoma rekombinantnog virusnog vektora, oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<13>genoma rekombinantnog virusnog vektora, oko 1 x 10<9>do oko 3 x 10<12>genoma rekombinantnog virusnog vektora ili oko 1 x 10<10>do oko 3 x 10<12>genoma rekombinantnog virusnog vektora.
[0019] Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje subretinalnim injeciranjem.
[0020] Prema pojedinim aspektima, postupak dalje obuhvata primenu farmaceutski efektivne količine VEGF inhibitora humanom subjektu. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor sadrži anti-VEGF antitelo ili njegov funkcionalni fragment. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor sadrži ranibizumab. Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje najmanje 5, 6, 7 ili 8 dana nakon primene VEGF inhibitora. Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje u periodu do 30, 60 ili 90 dana od primene VEGF inhibitora.
[0021] Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor se primenjuje 1 put pre primene farmaceutske kompozicije koja sadrži rekombinantan virus, kao i 1 do 2 puta nakon primene. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor se primenjuje najmanje 2 puta pre primene farmaceutske kompozicije i 1 do 2 puta nakon primene. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor se primenjuje tokom perioda od 6 do 7 nedelja.
[0022] Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor je anti-VEGF antitelo, kao što su bevacizumab ili ranibizumab. Prema drugim aspektima, VEGF inhibitor je solubilni receptor, fuzioni protein ili njegov fragment, kao što je aflibercept ili sFLT01.
[0023] Prema pojedinim aspektima, AMD je vlažna AMD.
[0024] Prema pojedinim aspektima, AMD je suva AMD.
[0025] Prema pojedinim aspektima, humani subjekat je sa rizikom da oboli od vlažne AMD.
[0026] Prema pojedinim aspektima, kod humanog subjekta su prisutni simptomi ranog stadijuma vlažne AMD.
[0027] Prema pojedinim aspektima, navedenom humanom subjektu je prethodno primenjivano najmanje 3, 5, 10, 15 ili 20 tretmana različitog VEGF inhibitora za lečenje AMD
[0028] Prema pojedinim aspektima, najbolje korigovana oštrina vida (BCVA) se nije poboljšala nakon navedenog tretmana sa ranibizumabom.
[0029] Prema pojedinim aspektima, najbolje korigovana oštrina vida (BCVA), izmerena ETDRS slovima (iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije), poboljšava se za više od 1 reda nakon navedenog tretmana sa ranibizumabom.
[0030] Prema pojedinim aspektima, kod humanog subjekta su prisutni simptomi ranog stadijuma suve AMD.
[0031] Prema pojedinim aspektima, lečenje se primenjuje sa učestalošću od najmanje dva puta godišnje.
[0032] Prema pojedinim aspektima, korak primene se izvodi kod navedenog humanog subjekta kada je subjekat starosti 20, 40, 50, 55 ili 65 godina ili je stariji.
[0033] Prema pojedinim aspektima, primena se vrši na mestu izvan fovee.
[0034] Prema pojedinim aspektima, primena se vrši na jednu ili više ćelija subretinalnog prostora centralne retine.
[0035] Prema pojedinim aspektima, primena se vrši na jednu ili više ćelija spoljašnjeg regiona makule.
[0036] Prema pojedinim aspektima, primena se vrši na jednu ili više ćelija unutrašnjeg regiona makule.
[0037] Prema pojedinim aspektima, primena se vrši na ćelije pigmentnog epitela retine.
[0038] Prema pojedinim aspektima, primena ne utiče štetno na funciju centralne retine ili na strukturu centralne retine.
[0039] Prema pojedinim aspektima, primena ne povećava sistemske nivoe VEGF inhibitora kod humanog subjekta.
[0040] Prema pojedinim aspektima, primena ne povećava sistemske nivoe sFlt-1 kod humanog subjekta.
[0041] Prema pojedinim aspektima, korak primene se vrši istovremeno ili sekvencijalno u oba oka.
[0042] Prema pojedinim aspektima, korak primene se vrši u jedno oko.
[0043] Prema pojedinim aspektima, korak primene se vrši u jedno oko kada susedno oko ispoljava simptome AMD.
[0044] Prema pojedinim aspektima, korak primene se izvodi kod humanog subjekta rezistentnog na penicilin.
[0045] Prema pojedinim aspektima, korak primene se izvodi kod humanog subjekta osetljivog na penicilin.
[0046] Prema pojedinim aspektima, korak primene se izvodi kod humanog subjekta alergičnog na penicilin.
[0047] Prema pojedinim aspektima, korak primene se izvodi kod humanog subjekta koji nije alergičan na penicilin.
[0048] Prema pojedinim aspektima, korak primene ne prouzrokuje inflamaciju staklastog tela, što se može uočiti biomikroskopijom (BE) i indirektnom oftalmoskopijom (IOE) nakon koraka primene.
[0049] Prema pojedinim aspektima, korak primene ne prouzrokuje odgovor citotoksičnih T-ćelija.
[0050] Prema pojedinim aspektima, korak primene ne prouzrokuje odgovor citotoksičnih T-ćelija kao meru u povećanju citotoksičnih T-ćelija koje je manje od vrednosti više za 10% u odnosu na bazalni opseg.
[0051] Prema pojedinim aspektima, T-ćelije ne ispoljavaju aktiviran efektorski fenotip nakon koraka primene.
[0052] Prema pojedinim aspektima, najbolje korigovana vidna oštrina (BCVA) se poboljšava za 1, 2, 3, 4 ili 5 redova ili više. što je izmereno ETDRS slovima (iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije) nakon koraka primene.
[0053] Prema pojedinim aspektima, uočava se smanjenje u neovaskularizaciji nakon koraka primene, upotrebom fluoresceinske angiografije (FA).
[0054] Prema pojedinim aspektima, učestalost primene ranibizumaba je smanjena na manje od 12 doza godišnje. Prema pojedinim aspektima, učestalost primene aflibercepta je smanjena na manje od 6 doza godišnje.
[0055] Prema pojedinim aspektima, ranibizumab ili aflibercept ili drugi VEGF inhibitor se primenjuju sa smanjenom učestalošću ili se više ne primenjuju.
[0056] Prema pojedinim aspektima, virus sadrži sFLT-1 gen ili njegov funkcionalni fragment koji je sa homologijom sekvence od ≥90% u odnosu na sekvencu humanog sFLT-1 gena.
[0057] Prema pojedinim aspektima, primenjeni virus sadrži sFLT-1 gen, varijantu gena ili fragment gena.
[0058] Prema pojedinim aspektima, 7, 14, 21 ili 30 dana nakon primene farmaceutske kompozicije, vektor se ne detektuje u uzorcima suza, krvi, pljuvačke ili urina humanog subjekta.
[0059] Prema pojedinim aspektima, prisustvo virusnog vektora se detektuje qPCR ili ELISA postupcima.
[0060] Prema pojedinim aspektima, nivoi sFLT-1 proteina u staklastom telu humanog subjekta su oko 500 – 5000 pg/ml, oko 600 - 4000 pg/ml, oko 800 - 3000 pg/ml oko 900 - 2000 pg/ml ili oko 1000 – 1800 pg/ml, a 7, 14, 21 ili 30 dana nakon primene farmaceutske kompozicije. Prema pojedinim aspektima, nivo sFlt-1 proteina, koji takođe može biti označen kao koncentracija sFlt-1 proteina, u staklastom telu humanog subjekta je povišen nakon 7, 14, 31, 30, 60, 90, 180, 270 i 365 dana od primene farmaceutske kompozicije.
[0061] Prema pojedinim aspektima, kod humanog pacijenta ne dolazi do pojave klinički značajne toksičnosti u retini, što je utvrđeno serijskim oftalmološkim pregledima u periodu od najmanje dva meseca.
[0062] Prema pojedinim aspektima, kod humanog subjekta nisu prisutni površinski ili znaci inflamacije prednjeg segmenta ili staklastog tela, tokom perioda od najmanje dva meseca.
[0063] Prema pojedinim aspektima, humanom subjektu nije potrebna terapija “spašavanja” sa VEGF inhibitorom najmanje do 120 dana nakon primene rekombinantnih virusa. Prema pojedinim aspektima, humanom subjektu nije potrebna terapija “spašavanja” sa VEGF inhibitorom najmanje 180 dana ili najmanje 210 dana nakon primene rekombinantnih virusa. Prema pojedinim aspektima, humanom subjektu nije potrebna terapija “spašavanja” sa VEGF inhibitorom najmanje 270 dana nakon primene rekombinantnih virusa. Prema pojedinim aspektima, humanom subjektu nije potrebna terapija “spašavanja” sa VEGF inhibitorom najmanje 365 dana nakon primene rekombinantnih virusa.
[0064] Prema pojedinim aspektima, nema dokaza o gubitku oštrine vida, povišenju IOP, odvajanju mrežnjače ili bilo kakvom intraokularnom ili sistemskom imunskom odgovoru kod navedenog humanog subjekta, najmanje 180 dana ili najmanje 210 dana nakon navedene primene rekombinantnih virusa. Prema pojedinim aspektima, nema dokaza o gubitku oštrine vida, povišenju IOP, odvajanju retine ili bilo kakvom intraokularnom ili sistemskom imunskom odgovoru kod navedenog humanog subjekta najmanje 365 dana nakon primene rekombinantnih virusa.
[0065] Prema sledećem aspektu, predmetni opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<15>rekombinantnih virusa, pri čemu svaki rekombinantni virus sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira solubilni tirozin kinazni protein srodan Fms tipa 1 (sFlt-1).
[0066] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje postupak za lečenje ili profilaksu očne neovaskularizacije kod humanog subjekta, koji obuhvata: primenu farmaceutski efektivne količine farmaceutske kompozicije sa nukleinskom kiselinom koja kodira sFLT-1, na jedno ili više subretinalnih mesta, humanom subjektu kome je lečenje potrebno.
[0067] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje humanog subjekta koji je oboleo ili za koga se sumnja da je oboleo od jednog ili više stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od: senilne makularne degeneracije (AMD), vlažne-AMD, suve-AMD, retinalne neovaskularizacije, horoidne neovaskularizacije i dijabetesne retinopatije. U pojedinim slučajevima, humani subjekat boluje ili se sumnja da boluje od jednog ili više stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od: proliferativne dijabetesne retinopatije, okluzije retinalne vene, okluzije centralne retinalne vene, okluzije razgranate retinalne vene, dijabetesnog makularnog edema, dijabetesne ishemija retine, ishemijske retinopatija i dijabetesnog retinalnog edema.
[0068] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koji sadrži rekombinantni virus, pri čemu je virus izabran iz grupe koja se sastoji od: adeno-asociranog virusa (AAV), adenovirusa, adenovirusa zavisnog od “pomagača”, retrovirusa, herpes simpleks virusa, lentivirusa, poksvirusa, kompleksa hemaglutinirajućeg virusa iz Japana (HVJ) i lipozoma, Molonijevog virusa mišje leukemije i virusa zasnovanog na HIV-u.
[0069] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira sFLT-1 i operativno je povezana sa promotorom izabranim iz grupe koja se sastoji od: promotora citomegalovirusa (CMV), promotora Rausovog sarkoma virusa (RSV), MMT promotora, EF-1 alfa promotora, UB6 promotora, promotor beta-aktina pileta, CAG promotora, RPE65 promotora i opsinskog promotora.
[0070] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za sFLT-1, pri čemu sFLT-1 kodira najmanje 1 dimerizacioni domen. U pojedinim slučajevima, nukleinska kiselina za sFLT-1 ne sadrži prokariotsku regulatornu sekvencu. U pojedinim slučajevima, nukleinska kiselina za sFLT-1 zapravo sadrži prokariotsku regulatornu sekvencu.
[0071] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koji sadrži virus ili plazmid.
[0072] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje primenu jednog ili više tretmana sa VEGF inhibitorom humanom subjektu. U pojedinim slučajevima, VEGF inhibitor se primenjuje u periodu do 30, 90 ili 180 dana nakon primene farmaceutske kompozicije. U pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija opisa i VEGF inhibitor se primenjuju sa razmakom od najmanje 24 sata.
[0073] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje humanom subjektu starom najmanje 55 godina.
[0074] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje primenu farmaceutske kompozicije izvan fovee.
[0075] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da se najbolje korigovana oštrina vida (BCVA) humanog subjekta poboljša za najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 redova nakon primene farmaceutske kompozicije, što se meri ETDRS slovima (iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije).
[0076] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da se najbolje korigovana oštrina vida (BCVA) smanji za manje od 15 slova nakon primene farmaceutske kompozicije, što se meri ETDRS slovima (iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije).
[0077] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje primenu farmaceutske kompozicije pod uslovima izabranim iz grupe koja se sastoji od: primene farmaceutske kompozicije u jedno oko, primene farmaceutske kompozicije sekvencijalno u dva oka i primene farmaceutske kompozicije istovremeno u dva oka.
[0078] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje smanjenje neovaskularizacije nakon primene farmaceutske kompozicije. što se uočava fluorosceinskom angiografijom (FA).
[0079] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da nisu prisutni znaci površinske ili inflamacije prednjeg segmenta ili staklastog tela kod humanog subjekta, najmanje 1 nedelju nakon injeciranja.
[0080] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da nisu prisutni znaci površinske ili inflamacije prednjeg segmenta ili staklastog tela kod humanog subjekta, 1 nedelju ili 3, 6, 9 ili 12 meseci nakon primene farmaceutske kompozicije.
[0081] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da humanom subjektu nije potreban tretman “spašavanja” tokom najmanje 30, 60, 90, 120, 180, 270 ili 365 dana nakon primene farmaceutske kompozicije.
[0082] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da humani subjekat ne iskusi gubitak oštrine vida, povišenje IOP, odvajanje mrežnjače, intraokularni ili sistemski imunski odgovor nakon primene farmaceutske kompozicije.
[0083] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da se nakon koraka primene ne može izmeriti povećan anti-AAV odgovor citotoksičnih T-ćelija.
[0084] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da virus ne bude detektovan u uzorcima krvi, pljuvačke ili urina humanog subjekta, 3, 7, 14, 21 ili 30 dana nakon primene farmaceutske kompozicije.
[0085] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da nivoi sFLT-1 proteina u staklastom telu humanog subjekta budu oko 500 - 5000 pg/ml, a 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 ili 365 dana nakon primene farmaceutske kompozicije humanom subjektu.
[0086] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da humani subjekat primi jedan ili više tretmana sa VEGF inhibitorima, pre primene farmaceutske kompozicije.
[0087] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje za humanog subjekta koji je rezistentan na lečenje VEGF inhibitorima.
[0088] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje za humanog subjekta koji prethodno, pre primene farmaceutske kompozicije, nije primao VEGF inhibitor.
[0089] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje primenu farmaceutske kompozicije humanom subjektu sa učestalošću manjom od 3 puta godišnje.
[0090] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje primenu farmaceutske kompozicije humanom subjektu tako da se smanji učestalost primene dodatnih tretmana sa VEGF inhibitorima.
[0091] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da koncentracija sFLT-1 proteina u staklastom telu humanog subjekta bude povišena kada se meri 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 ili 365 dana nakon primene farmaceutske kompozicije.
[0092] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje za humanog subjekta kome je uklonjen gel staklastog tela pre ili u periodu do jednog dana ili jedne nedelje od primene farmaceutske kompozicije.
[0093] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje upotrebom sistema za vitrektomiju promera manjeg od 20 G.
[0094] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje upotrebom sistema za vitrektomiju koji ne zahteva ušivanja.
[0095] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje upotrebom vrha kanile koji je manji od 39 G.
[0096] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju nakon koje sledi izmena gasa i tečnosti u komori staklastog tela.
[0097] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da se debljina centralne retine subjekta ne poveća za više od 50 mikrona, 100 mikrona ili 250 mikrona u periodu do 12 meseci nakon lečenja sa navedenim farmakološkim sredstvom.
[0098] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje da geografska atrofija u bolesnom oku humanog subjekta ne napreduje u poređenju sa bolesnim očima kod netretiranih humanih subjekata.
1
[0099] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koji sadrži rekombinantne viruse ili plazmide koji sadrže nukleinsku kiselinu sa najmanje 1 promotorskom sekvencom operativno povezanom sa sFLT-1 transgenom sekvencom. U pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija opisa sadrži promotorsku sekvencu i sFLT-1 transgenu sekvencu koje su razdvojene sekvencom većom od 300 baznih parova. U pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija opisa sadrži promotorsku sekvencu i sFLT-1 transgenu sekvencu koje su razdvojene UTR sekvencom. U pojedinim slučajevima, UTR sekvenca sadrži najmanje 10 baznih parova. U pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje 3 linkerske sekvence od kojih svaka sadrži najmanje 50 baznih parova.
[0100] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, gde nukleinska kiselina sFLT-1 kodira najmanje 1 dimerizacioni domen.
[0101] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži promotorsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No.17, SEQ ID No.18, SEQ ID No.
19, SEQ ID No.20, SEQ ID No.21, SEQ ID No.22, SEQ ID No.23, SEQ ID No.24, SEQ ID No.25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32, SEQ ID No.33, SEQ ID No.34, SEQ ID No.35, SEQ ID No.36, SEQ ID No.37, SEQ ID No.38, SEQ ID No.
39, SEQ ID No.340, SEQ ID No.41, SEQ ID No.42, SEQ ID No.43, SEQ ID No.44, SEQ ID No.45, SEQ ID No. 46 i SEQ ID No. 47; sekvencu koja kodira VEGF inhibitor izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No. 102, SEQ ID No. 103, SEQ ID No. 104, SEQ ID No. 105, SEQ ID No. 106, SEQ ID No. 107 i SEQ ID No.108; intronsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID No.48, SEQ ID No.115, SEQ ID No.116, SEQ ID No.117, SEQ ID No.118 i SEQ ID No.119; UTR sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No.91, SEQ ID No.2, SEQ ID No.92, SEQ ID No.93, SEQ ID No.94, SEQ ID No.95, SEQ ID No.
96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No. 100 i SEQ ID No. 101; i terminacionu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No.49, SEQ ID No.50, SEQ ID No.51, SEQ ID No.
52, SEQ ID No.53, SEQ ID No.54 i SEQ ID No.55.
[0102] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje jediničnu dozu farmaceutske kompozicije koja sadrži rekombinantne viruse sa 1x10<6>do 1x10<15>genoma vektora, pri čemu rekombinantni virusi sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira sFLT-1 operativno povezan sa promotorom. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije sadrži 1x10<10>do 3x10<12>genoma vektora.
[0103] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje postupak generisanja rekombinantnog virusa u ćeliji, pri čemu postupak obuhvata: unošenje nukleinske kiseline koja sadrži najmanje 1 promotorsku sekvencu operativno povezanu sa sFLT-1 transgenom sekvencom, ITR sekvencom i UTR sekvencom u ćeliju; i prečišćavanje rekombinantnog virusa. U pojedinim slučajevima, UTR sekvenca je humana UTR sekvenca. U pojedinim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline ne sadrži sekvencu rezistencije na beta-laktamske antibiotike. U pojedinim slučajevima, rekombinantan virus proizvodi sFLT-1 protein u opsegu od 100-10000 pg/mL, kada se merenje vrši 72 sata nakon transdukcije HEK293 ćelija pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 1x10<6>. U pojedinim slučajevima, rekombinantan virus inhibira proliferaciju humanih endotelnih ćelija pupčane vene (HUVEC).
[0104] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje ćeliju za generisanje rekombinantnog virusnog vektora, ćeliju koja sadrži najmanje 1 promotorsku polinukleotidnu sekvencu operativno povezanu sa sFLT-1 transgenom sekvencom, ITR polinukleotidnom sekvencom i UTR polinukleotidnom sekvencom.
[0105] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira sFLT-1, za upotrebu u lečenju ili profilaksi očne neovaskularizacije kod ljudi; pri čemu navedena upotreba obuhvata primenu efektivne količine farmaceutske kompozicije direktno humanom subjektu kome je to potrebno, na jednom ili na više sub retinalnih mesta u navedenom humanom subjektu; pri čemu navedena farmaceutska kompozicija sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
[0106] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu je navedeni sFLT-1 inhibitor VEGF-a i pri čemu se navedeno lečenje ili smanjenje verovatnoće očne neovaskularizacije javlja kao rezultat inhibicije VEGF-a.
[0107] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu je farmaceutska kompozicija sposobna da podigne nivoe sFLT-1 proteina u staklastom telu humanog subjekta nakon najmanje 72 sata od primene navedene farmaceutske kompozicije navedenom humanom subjektu, u poređenju sa nivoima sFLT-1 proteina u staklastom telu navedenog humanog subjekta pre navedene primene.
[0108] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu nukleinska kiselina, koja sadrži navedeni sFLT-1, sadrži i rekombinantni virus, virus izabran iz grupe koja se sastoji od: adeno-asociranog virusa (AAV), adenovirusa, adenovirusa zavisanog od “pomagača”, retrovirusa, herpes simpleks virusa, lentivirusa, poksvirusa, kompleksa hemaglutinirajućeg virusa iz Japana (HVJ) i lipozoma, Molonijevog virusa mišje leukemije i virusa zasnovanog na HIV-u.
[0109] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu je nukleinska kiselina koja kodira sFLT-1 operativno povezana sa promotorom izabranim iz grupe koja se sastoji od: promotora citomegalovirusa (CMV), promotora Rausovog sarkoma virusa (RSV), MMT promotora, EF-1 alfa promotora, UB6 promotora, promotora beta-aktivna pileta, CAG promotora, RPE65 promotora i opsinskog promotora.
[0110] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu je nukleinska kiselina upakovana u virus ili je plazmidna DNK.
[0111] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu navedena upotreba dalje obuhvata primenu jednog ili više dodatnih VEGF inhibitora humanom subjektu kome je lečenje ili smanjenje potrebno, po izboru pri čemu je navedeni dodatni VEGF inhibitor ranibizumab ili bevacizumab.
[0112] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu navedena upotreba obuhvata primenu navedene farmaceutske kompozicije humanom subjektu starosti najmanje 50, 55 ili 65 godina.
[0113] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu navedena upotreba obuhvata primenu navedene farmaceutske kompozicije izvan fovee.
[0114] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu se najbolje korigovana oštrina vida (BCVA), kod humanog subjekta kome je lečenje potrebno, poboljšava za najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 redova, što se meri ETDRS slovima (iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije) nakon primene efektivne količine farmaceutske kompozicije.
[0115] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu se primena farmaceutske kompozicije vrši kod humanog subjekta kome je potrebno lečenje, sa učestalošću od najmanje jednom u 3, 6, 9, 12, 18 ili 24 meseca.
[0116] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje nukleinsku kiselinu za upotrebu, pri čemu se primena farmaceutske kompozicije vrši humanom subjektu sa učestalošću koja je manja od 3 puta godišnje ili se vrši sa učestalošću koja smanjuje učestalost primene dodatnih tretmana sa VEGF inhibitorima humanom subjektu.
[0117] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje jediničnu dozu farmaceutske kompozicije koja sadrži oko 1x10<6>do 1x10<15>ili 1x10<10>do 3x10<12>genoma vektora. Prema pojedinim aspektima, rekombinantni virusi sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira sFLT-1 ili njen funkcionalni fragment, operativno povezan sa promotorom.
[0118] Prema pojedinim aspektima, opis obezbeđuje postupak za lečenje ili profilaksu očne neovaskularizacije oka kod humanog subjekta, koji obuhvata: primenu farmaceutski efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira VEGF inhibitor, humanom subjektu kome je lečenje potrebno, na jednom ili na više subretinalnih mesta. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor je anti-VEGF antitelo ili njegov funkcionalni fragment. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor je solubilni receptor, fuzioni protein ili njihov funkcionalni fragment.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
1
[0119] Nove karakteristike opisa su preciznije navedene u priloženim patentnim zahtevima. Bolje razumevanje karakteristika i prednosti predmetnog opisa će se steći pozivanjem na detaljan opis koji sledi i u kome su navedeni ilustrativni aspekti kao primer upotrebe principa opisa, ali i pozivanjem na pridružene slike:
SL.1 je šematski prikaz plazmida za primer.
SL. 2 prikazuje ekspresiju, izlučivanje i biološku aktivnost sFLT-1 iz ćelija transdukovanih sa rAAV.sflt-1. (a) Imunoblot analiza kondicioniranih medijuma iz 293 ćelija transdukovanih sa Ad.sFlt-1 (traka 1), D407 ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1 (traka 2), 293 ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1 (traka 3) i D407 ćelija transdukovanih sa AAV.gfp (traka 4). (b) Inhibicija proliferacije HUVEC indukovane sa VEGF-om, posredstvom kondicioniranih medijuma iz ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1. HUVEC su kultivisane u medijumu za izgladnjivanje (kolona 1), u medijumu koji je sadržavao rekombinantan VEGF (kolona 2), u medijumu koji je sadržavao VEGF i 40 µL kondicioniranog medijuma iz 293 ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1 (kolona 3), u medijumu koji je sadržavao VEGF i 80 µL kondicioniranog medijuma iz 293 ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1 (kolona 4) i u medijumu koji je sadržavao VEGF i 80 µL kondicioniranog medijuma iz 293 ćelija transdukovanih sa rAAV.gfp (kolona 5). (*P < 0,02, ** P <0,005, za razlike između rAAV.sFlt-1 sa VEGF-om i samo VEGF.
SL. 3A prikazuje grafik koji pokazuje ekspresiju humanog sFlt-1 (hsFLT-1) u staklastom telu majmuna kojima je u levo oko injeciran rAAV.sFlt-1 (Majmun 8514, 8530, 8523, 8524 i 999), rAAV.gfp (Majmun 8297 i 8532 ), u oba oka injeciran rekombinantan sFLT-1 protein (Majmun 8294) i kod kontrolnog majmuna koji je bio bez injeciranja (kontrola). Kontrola i majmuni 8294 i 999 su eutanazirani 3 meseca nakon injeciranja, dok je Majmun 8524 eutanaziran 9 meseci nakon injeciranja, a majmuni 8297, 8532, 8514, 8530 i 8523 su eutanazirani 12 meseci nakon injeciranja. * označava nivoe sFLT-1 proteina koji su značajno veći u očima majmuna kojima je injeciran AAV.sFlt-1 (p <0,05). SL. 3B prikazuje grafike koji pokazuju nivoe hsFLT-1 u majmunima kojima je injeciran rAAV.sFlt-1 (999, 8524, 8523, 8530 i 8514), rAAV.gfp (8297 i 8532), rekombinantan sFlt-1 protein (8294), kao i kod neinjeciranih (kontrolnih) majmuna, u različitim vremenima nakon injeciranja.
SL.4: Populacija podgrupa imunskih ćelija u očima miševa. Grafici prikazuju populaciju podgrupa imunih ćelija u različitim vremenima nakon injeciranja.
SL. 5: Populacija podgrupa imunskih ćelija u slezinama miševa. Grafici prikazuju populaciju podgrupa imunskih ćelija u različitim vremenima nakon injeciranja.
SL.6 prikazuje dijagrame koji upoređuju Ki67 odgovore u CD4+ T-ćelijama kod različitih miševa u različitim vremenima nakon injeciranja.
SL.7A do 7D prikazuju razne sekvence mesta početka replikacije za primer.
SL.8A do 8F prikazuju sekvence raznih promotora za primer.
SL.9A do 9C prikazuju sekvence raznih introna, poli A sekvenci i ITR regiona za primer.
SL.9D do 9F prikazuju sekvence raznih linkerskih sekvenci za primer.
SL.9G do 9H prikazuju sekvence raznih UTR sekvenci za primer.
SL.10A do 10C prikazuju sekvencu koja kodira razne anti-VEGF proteine za primer.
SL.11A prikazuje aminokiselinsku sekvencu sFLT-1. SLIKA 11B prikazuje aminokiselinsku sekvencu domena 2 sFLT-1, funkcionalnog fragmenta sFLT-1. SLIKA 11C prikazuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira domen 2 sFLT-1.
SL.12A do 12B prikazuju sekvence raznih gena rezistencije na antibiotike za primer.
SL. 13 prikazuje PK jedne kompozicije za primer (rAAV.sFlt-1), pri čemu ona dostiže optimalnu anti-VEGF ekspresiju u 6.-8 nedelji. RBZ je standardna nega za anti-VEGF, kao što je ranibizumab. „RBZ spašavanje“ označava terapiju “spašavanja”.
SL. 14 prikazuje oftalmološku procenu pacijenata. Inflamacija je procenjivana biomikroskopijom (BE) i indirektnom oftalmoskopijom (IOE). Neupad.: neupadljivo.
SL.15A i 15B prikazuju rezultate za oštrinu vida.
SL. 16 prikazuje merenje debljine retine kod pacijenta kome je prethodno davano 24 injekcije Lucentis-a.
SL.17 prikazuje biodistribuciju: qPCR za sFLT-1 sekvencu (detektovanje broja kopija).
SL.18 prikazuje biodistribuciju: AAV kapsid meren ELISA testom, AAV titar u kapsidima/mL.
SL. 19 prikazuje biodistribuciju sFLT-1 izmerenu ELISA testom. Prikazane su koncentracije humanog sFLT-1 (pg/mL).
SL.20A i 20B prikazuju OCT procene pacijenata koji su primali bilo niske doze rAAV.sFlt-1 (R1, R2, R4) ili visoke doze rAAV.sFlt-1 (R5, R6 i R8).
SL. 21A i 21B prikazuju rezultate oštrine vida kod humanih subjekata lečenih sa rAAV.sFlt-1 u odnosu na netretirane kontrolne pacijente, 180 dana nakon tretmana.
SL. 22A i 22B prikazuju rezultate oštrine vida kod humanih subjekata lečenih sa rAAV.sFlt-1 u odnosu na netretirane kontrolne pacijente, godinu dana nakon tretmana.
SL.23 prikazuje tabelu humanih subjekata koji su nedeljno primili injekcije Lucentis-a kao terapiju “spašavanja” (ponovna primena VEGF inhibitora) u kliničkoj studiji za rAAV.sFlt-1.
SL.24 prikazuje oštrinu vida i SD-OCT snimke po nedeljama, za humanog subjekta koji je tretiran sa rAAV.sFlt-1 u kliničkoj studiji za rAAV.sFlt-1.
SL.25A i 25B prikazuju podatke o proizvodnji humanog sFlt-1 proteina u humanim embrionalnim HEK-293 ćelijama bubrega (HEK293), što je detektovano ELISA testom. rAAV.sFlt-1 je proizveden
1
transfekcijom sa plazmidom, u HEK293 ćelijama. Drugi konstrukt, rAAV(bv).sFlt-1, proizveden je upotrebom rekombinantnog bakulovirusa u Sf9 ćelijama insekata. Koncentracija sFlt-1 proteina je merena upotrebom ELISA testa, nakon 72, pri ranim MOI.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0120] Predmetni opis obezbeđuje kompozicije i postupke za prevenciju ili lečenje očne neovaskularizacije kod humanog subjekta poput AMD, subretinalnom primenom farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski efektivnu količinu vektora koji uključuje nukleinsku kiselinu koja dalje kodira protein solubilne tirozin kinaze srodne Fms, tipa 1 (sFlt-1) humanom subjektu.
[0121] U nastavku teksta je opisano nekoliko aspekata opisa uz pozivanje na primere primene, radi ilustracije. Podrazumeva se da su brojni specifični detalji, odnosi i postupci navedeni da bi se obezbedilo potpuno razumevanje opisa. Prosečno iskusan stručanjak iz relevantne oblasti tehnike će, međutim, lako uvideti da opis može biti primenjen bez jednog ili više specifičnih detalja ili upotrebom drugih postupaka. Predmetni opis nije ograničen ilustrovanim redosledom radnji ili događaja, pošto se određene radnje mogu odvijati različitim redosledima i/ili istovremeno sa drugim radnjama ili događajima. Štaviše, nisu sve ilustrovane radnje ili događaji potrebni za sprovođenje metodologije koja je u skladu sa primenom predmetnog opisa u praksi.
[0122] Svrha terminologije predmetnog opisa je da se opišu samo određeni slučajevi i nije predviđeno da ista bude ograničavajuća za kompozicije, posupke i kompozicije ovog opisa.
[0123] Kompozicije i postupci predmetnog opisa koji su ovde opisani, mogu koristiti, ukoliko nije naznačeno drugačije, konvencionalne tehnike i opise molekularne biologije (uključujući rekombinantnih tehnika), ćelijske biologije, biohemije, imunohemije i oftalmoloških tehnika koji se i podrazumevaju kao deo stručnosti onih koji praksu primenjuju unutar oblasti tehnike. Takve konvencionalne tehnike obuhvataju postupke za posmatranje i analizu retine ili vida kod subjekta, kloniranje i razmnožavanje rekombinantnog virusa, formulisanje farmaceutske kompozicije, kao i biohemijska prečišćavanja i imunohemiju. Specifične ilustracije pogodnih tehnika se mogu dobiti kroz primere koji su ovde navedeni. Ipak, podrazumeva se i da se mogu upotrebljavati ekvivalentne konvencionalne procedure. Takve konvencionalne tehnike i opisi se mogu pronaći u standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što su to Green i saradnici, izd., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (tomovi I-IV) (1999); Weiner i saradnici, izd., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, izd., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell i Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook i Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A
1
Laboratory Manual (2006); i Sambrook i Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (svi od Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4. izd.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson i Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3. izd., W.H. Freeman Pub., New York (2000); i Berg i saradnici, Biochemistry, 5. izd., W.H. Freeman Pub., New York (2002). Pre opisa predmetnih kompozicija, opisani su alati i postupci istraživanja, da bi se naglasilo da ovaj opis nije ograničen na specifične postupke, kompozicije, ciljne molekule i upotrebe koji su opisani, pošto je naravno da isti mogu biti varijabilni. Podrazumeva se takođe da je terminologija koja je ovde upotrebljavana samo sa svrhom opisa određenih aspekata i da nije predviđeno da ograniči obim predmetnog opisa koji će biti ograničen samo na priložene patentne zahteve.
[0124] Kao što se ovde upotrebljava, predviđeno je da oblici jednine takođe obuhvataju oblike množine pojmova, osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Štaviše, previđeno je da obim u kome se termini "uključujući", "uključuje", "imati", "ima", "sa" ili njihove varijante, upotrebljavaju u detaljnom opisu i/ili patentnim zahtevima uključuju druge termine na način koji je sličan terminu "obuhvata".
[0125] Opsezi mogu ovde biti prikazani kao od "oko" jedne određene vrednosti i/ili do “oko” druge određene vrednosti. Kada je takav raspon prikazan, drugi slučaj uključuje sve od jedne konkretne vrednosti i/ili do druge konkretne vrednosti. Slično navedenom, kada se vrednosti izraze kao aproksimacije, upotrebom termina "oko" koji mu prethodi, podrazumeva se da konkretna vrednost predstavlja drugi slučaj. Podrazumeva se dalje da su krajnje vrednosti svakog opsega značajne kako u odnosu na drugu krajnju vretnost, tako i nezavisno od druge krajnje vrednosti. Termin "oko", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na opseg koji je za 15% plus ili minus u odnosu na numeričku vrednost koja je navedene u kontekstu određene upotrebe. Na primer, oko 10 bi uključivalo opseg od 8,5 do 11,5. Termin "oko" takođe uračunava uobičajenu grešku ili nepreciznost u merenju vrednosti.
I. AMD
[0126] AMD je vodeći uzrok slepila kod pacijenata starijih od 50 godina i karakteriše ga progresivna degeneracija fotoreceptora, spoljne retine i retinalnog pigmentnog epitela u makuli. Uznapredovali "vlažni" oblik (neovaskularni ili eksudativni) AMD je ređi, ali često može prouzrokovati brz i obično značajan gubitak centralnog vida kod pacijenata. U vlažnom obliku AMD-a, horoidna neovaskularizacija nastaje i razvija se u mrežu krvnih sudova koja može dalje rasti ispod i kroz retinalni pigmentni epitel. Pošto je ovakva promena praćena curenjem plazme i/ili krvarenjem u subretinalni prostor, time moće doci do ozbiljnog iznenadnog gubitka centralnog vida, ukoliko se to dogodi u makuli.
1
[0127] Termin "AMD", ukoliko nije drugačije naznačeno, može biti bilo suva AMD ili vlažna AMD. Predmetni opis razmatra lečenje ili prevenciju AMD, vlažne AMD i/ili suve AMD.
[0128] Kao što je i poznato u oblasti tehnike, za AMD je pokazano da nije prouzrokovana jedinstvenim uzrokom. Ovo izuzetno složeno oboljenje može biti rezultat raznovrsnih doprinosa uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, starost, genetičku predispoziciju i uticaj sredine, ili na njihovu kombinaciju. Kod ljudi, na primer, utvrđeni epidemiološki faktori rizika mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, pušenje cigareta, ishranu, ženski pol, belu rasu i porodičnu istoriju AMD-a. Pošto je AMD redak kod osoba mlađih od 50 godina, jedini neophodan faktor rizika je starost, što ukazuje da je mnoštvo ćelijskih promena koje prate normalno starenje bitan faktor u patogenezi AMD.
[0129] Etiološka kompleksnost AMD se ogleda u relativnom nedostatku efektivnih terapija, preventivnih strategija, kao i dobrih životinjskih modela na kojima se oboljenje može proučavati. Usled složenosti i nepotpune karakterizacije oboljenja, ne postoji dobar životinjski model AMD. Navedeno je delom posledica anatomskih razlika u mrežnjačama životinja i primata, kao i dužeg vremena potrebnog za razvoj oboljenja. Dokazi iz molekularno-genetičkih studija na ljudima i studija na životinjama potvrđuju zapažanje da izmenjena homeostaza mnoštva mehanizama odgovornih za normalnu fiziologiju fotoreceptora-RPE može dovesti do pojave oboljenja. Barem na molekulskom nivou, oboljenje može biti istraživano u životinjskim modelima, a u pojedinim slučajevima čak i u slučajevima gde genski defekti gena nisu primarni uzroci AMD kod ljudi.
[0130] Prethodne genetičke studije, kao i detaljne patološke analize, ukazale su da ne postoji jednostavni obrazac nasleđivanja za AMD, kao i da nijedna patologija nije zajednička za razne životinjske modele AMD. Iako je u oblasti tehnike poznato da modeli na primatima različitim od čoveka bolje aproksimiraju CNV kod ljudi, nego što je to slučaj sa mišjim ili modelima na pacovima, fundamentalne razlike u anatomiji, histologiji mrežnjače, pa čak i genetici primata različitih od čoveka, dovode do različitih vrsta specifičnih patologija.
[0131] Dodatno, a kao što je ovde opisano, za indukovanje CNV u životinjskim modelima, kao jednog od simptoma sličnog AMD, može biti upotrebljavana laserska fotokoagulacija. U pojedinim slučajevima, laserski tretman stvara rupture u Bruhovoj membrani i izaziva fibrovaskularni proliferativni odgovor koji započinje u horiodu. Ovakav odgovor je osnova za modeliranje horoidne neovaskularizacije u kasnoj fazi AMD i razvijen je kod rezus i cinomolgus makakija.
[0132] Upotrebom argonskog lasera, obrazovane mrlje se održavaju malima i indukuju se dovoljnom snagom da dovedu do rupture Bruhove membrane. Navedeno je vidljivo fundoskopijom, u vidu mehura u vreme fotokoagulacije. Fotokoagulacija indukuje trombozu horoidnih sudova, nakon čega sledi ponovna endotelizacija tokom perioda do 48 sati, kao i rast novih sudova u subretinalnom
1
prostoru tokom nedelju dana. Pošto su novonastali sudovi propusniji, neovaskularni razvoj može biti praćen upotrebom fluoresceinske angiografije u cilju procene stepena “curenja” iz krvnih sudova.
[0133] Spontana neovaskularna involucija (na koju ukazuje smanjeno isticanje fluoresceina) počinje nakon približno 3 do 7 sedmica, a zatim postepeno napreduje (tokom preioda od približno 2 do 13 meseci) sve dok se curenje na datom mestu ne prestane da bude primetno.
[0134] Obim rasta novih sudova u poređenju sa slabo vaskularizovanim ožiljcima može biti promenljiv u svim modelima, i na njega utiču vrste, mesta povrede u mrežnjači i intenzitet laserskog snopa. Inherentna varijabilnost koja doprinosi razlikama u tretmanu od vrste do vrste, dodatno podržava ideju da nijedan životinjski model ne može u potpunosti rekapitulirati AMD kod ljudi.
[0135] Terapije za AMD su se promenile u poslednjih nekoliko godina, sa dostupnošću aptamera, antitela i solubilnih “mamaca” receptora koji vezuju VEGF protein. Pokazano je takođe da VEGF protein ili VEGF ligand stimulišu obrazovanje novih krvnih sudova (tj. angiogenezu) vezivanjem za ćelijske receptore, uključujući i VEGF receptor. Kao što je poznato u oblasti tehnike, anti-VEGF agensi mogu u određenom stepenu sprečiti neovaskularizaciju i angiogenezu koja se javlja u vlažnoj AMD. Intraokularno injeciranje Macugen®-a ili Lucentis®-a ili Eylea® (anti-VEGF agenasa) je skupo, a u većini slučajeva, lečenje mora biti ponovljeno na svakih četiri do šest nedelja ili na svakih osam nedelja u slučaju Eylea®. Na primer, Lucentis je fragment anti-VEGF antitela koji košta oko 1950 USD/inj. mesečno. Avastin (VEGF antitelo) se obično uporebljava mimo preporuka, dok Eylea (VEGF “zamka”) košta oko 1850 USD/inj i primenjuje se svakog drugog meseca. Sve ove lekove karakterišu zajednički problemi smanjenja farmakokinetičkog profila, tako da oni stoga zahtevaju ponovljena očna injeciranja.
[0136] U oblasti tehnike postoji potreba za praktičnom, ekonomski održivom, dugotrajnom strategijom lečenja. Opis stoga obezbeđuje nove terapeutike kojima bi se mogle rešiti neke od ovih potreba.
[0137] Predmetni opis obezbeđuje anti-VEGF molekul, kao što je sFLT-1, isporučen bilo kojim pogodnim vektorom (npr. rekombinantnim virusnim sistemom) u retinu humanog subjekta koji boluje ili za koga se sumnja da boluje od AMD ili srodnog neovaskularnog oboljenja mrežnjače. U pojedinim slučajevima, sFLT-1 može biti potentan protein direktnog vezivanja VEGF-a. U pojedinim slučajevima, sFLT-1 može takođe blokirati ili inhibirati aktivnost VEGF-a.
[0138] Na primer, kao što je poznato u oblasti tehnike, uočeno je da se sFLT-1 (koji je kao što je ovde dalje opisano) vezuje za dimer VEGF proteina sa Kd=10 pM.
[0139] Predmetni opis takođe opisuje kompozicije i postupke koji se odnose na isporuku gena u oko posredovanu sa rAAV. Sa sistemom zasnovanim na AAV uočena je dugotrajna genska ekspresija u očima pasa (>8 godina). Ekspresija iRNK za sFLT-1 u mrežnjači se održava tokom najmanje 18 meseci.
1
Sprovedena su i tri klinička ispitivanja na ljudima za Leberovu kongenitalnu amarozu koja su pokazala da je sistem za isporuku na bazi AAV bezbedan u kontekstu degenerativnog oboljenja mrežnjače, kao što je LCA.
II. VEGF i tirozin kinazni protein srodan Fms tipa 1 (sFLT-1)
A. VEGF
[0140] Vaskularni endotelni faktor rasta (ovde označen kao "VEGF" ili "VEGF ligand") je snažan mitogen specifičan za endotelne ćelije, koji je sa ključnom ulogom u fiziološkom nastanku krvnih sudova. U pojedinim slučajevima, aktivnost VEGF je rezultat vezivanja VEGF liganda za jedan ili više VEGF receptora u ćeliji. Vezivanje VEGF liganda za VEGF receptor može imati brojne nishodne ćelijske i biohemijske efekte, uključujući, ali ne ograničavajući se na, angiogenezu u tkivima. Za VEGF je takođe pokazano da je verovatno uključen u gotovo sve vrste angiogenih ili neovaskularnih poremećaja, uključujući one povezane sa kancerom, ishemijom i inflamacijom. Dodatno, pokazano da je VEGF verovatno uključen i u oboljenja oka, uključujući, ali ne ograničavajuće se samo na, ishemijsku retinopatiju, intraokularnu neovaskularizaciju, senilnu makularnu degeneraciju (AMD), vlažnu-AMD, suvu-AMD, retinalnu neovaskularizaciju, dijabetesni makularni edem, dijabetesnu ishemiju retine, dijabetesni retinalni edem, proliferativnu dijabetesnu retinopatiju, okluziju retinalne vene, okluziju centralne retinalne vene, okluziju razgranate retinalne vene. Pored toga, anti-VEGF tretmani, uključujući kompozicije i postupke ovog opisa koji su ovde opisani, mogu biti upotrebljeni u lečenju jednog ili više od ovih oboljenja koja su ovde opisana.
[0141] Skorašnji podaci ukazuju takođe da je VEGF glavni angiogeni faktor rasta u patogenezi vlažnog oblika AMD.
[0142] VEGF, homodimerni glikopeptid od 46-kDa, eksprimira se od strane nekoliko različitih vrsta očnih ćelija uključujući, ali ne ograničavajući se na, pigmentisane epitelne ćelije, pericite, vaskularne endotelne ćelije, neurogliju i ganglijske ćelije. U pojedinim slučajevima, VEGF se tokom razvoja mrežnjače eksprimira po specifičnim prostornim i vremenskim obrascima. U pojedinim slučajevima, humane izoforme VEGF-a mogu uključivati proteine od 206, 189, 183, 165, 148, 145 i 121 aminokiselina po monomeru, međutim, preovlađujuće humane VEGF izoforme obuhvataju, ali nisu ograničene na, VEGF121, VEGF165, VEGF189 i VEGF206. Ovi proteini se proizvode alternativnom obradom iRNK za VEGF i razlikuju se po sposobnosti vezivanja za heparin i za specifične VEGF receptore ili koreceptore (neuropiline). Domen kodiran egzonima 1-5 gena za VEGF, sadrži informacije potrebne za prepoznavanje poznatih VEGF receptora KDR/FLK-1 i FLT-1. Ovaj domen je prisutan u svim izoformama VEGF-a. VEGF deluje putem ovih receptora, a koji su receptori sa tirozin
2
kinaznom aktivnošću visokog afiniteta, što dovodi do proliferacije endotelnih ćelija, migracije i povećane vazopermeabilnosti.
[0143] VEGF je jedan od nekoliko faktora uključenih u složen proces angiogeneze i sa veoma je visokom specifičnošću za vaskularne endotelne ćelije. VEGF je regulator fiziološke angiogeneze tokom procesa kao što su embriogeneza, rast skeleta i reproduktivna funkcija, ali je takođe ukazano da je verovatno uključen u patološku angiogenezu koja je povezana sa oboljenjima poput kancera, poremećaja placente i drugih stanja. Potencijalni biološki efekti VEGF-a mogu biti posredovani specifičnim receptorima koji prolaze kroz membranu i slični su fms, FLT-1 i FLK-1/KDR. U pojedinim slučajevima, ovi vezivni partneri VEGF-a koji se javljaju u prirodi mogu uticati na vezivanje VEGF-a za VEGF receptore, modulirajući time aktivaciju VEGF receptora i nishodnih puteva koje on aktivira.
[0144] U kontekstu kancera, nekoliko VEGF inhibitora, uključujući humanizovano monoklonsko antitelo na VEGF (rhuMab VEGF), anti-VEGFR-2 antitelo, male molekule koji inhibiraju transdukciju signala VEGFR-2 i solubilni VEGF receptor, pokazali su pojedine terapijske osobine.
[0145] U kontekstu intraokularnih neovaskularnih oboljenja, kao što su dijabetesna retinopatija, okluzije retinalne vene ili senilna degeneracije makule, pojedini VEGF antagonisti su pokazali terapijske efekte, uprkos potrebi za čestom primenom.
B. Anti-VEGF
[0146] Rekombinantan virus predmetnog pronalaska sadrži sekvencu koja kodira anti-VEGF protein, uključujući, ali ne ograničavajući se na, proteine koji se vezuju za VEGF ili njihove funkcionalne fragmente opisane u U.S. Pat. No 5,712,380; 5,861,484 i 7,071,159 i fuzione proteine koji se vezuju za VEGF koji su opisani U.S. Pat. No. 7,635,474. Anti-VEGF protein može takođe uključivati sFLT-1 protein koji je kao što je to ovde opisano.
[0147] Rekombinantni virusi ili plazmidi predmetnog opisa mogu sadržavati sekvencu koja kodira anti-VEGF protein, uključujući sFLT-1 protein koji se javlja u prirodi, kao što je opisano u US Patent 5,861,484, pri čemu je ova sekvenca opisana i kao SEQ ID NO: 109. Ista takođe uključuje, ali ne ograničavajući se na, njene funkcionalne fragmente, uključujući sekvence domena 2 sFlt-1 ili one navedene u SEQ ID NO: 121, kao i srodne konstrukte, kao što su VEGF-vezujući fuzioni proteini opisani u U.S. Pat. No. 7,635,474. Anti-VEGF protein može takođe uključivati sFLT-1 protein koji je kao što je to ovde opisano. Ovakve sekvence mogu biti eksprimirane sa DNK koja kodira takve sekvence upotrebom genetičkog koda, standarnim tehnikama koje se podrazumevaju od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Potrebno je ipak napomenuti da usled degeneracije genetičkog koda, sekvence anti-VEGF proteina lako mogu biti eksprimirane sa brojnih različitih DNK sekvenci.
[0148] "sFLT-1 protein" se ovde odnosi na polipeptidnu sekvencu, ili njen funkcionalan fragment, koji su najmanje 90% ili više homologni sekvenci humanog sFLT-1 koja se javlja u prirodi, tako da se sFlt-1 protein ili polipeptid vezuju za VEGF i/ili VEGF receptor. Homologija se odnosi na % očuvanosti ostataka prilikom poravnavanja između dve sekvence (npr. humani sFLT-1 protein koji se javlja u prirodi može uključivati bilo koju pogodnu varijantu sFLT-1, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, funkcionalne fragmente, sekvence koje sadrže insercije, delecije, supstitucije, kao i na pseudofragmente, pseudogene, varijante obrade ili veštački optimizovane sekvence. U pojedinim slučajevima, "sFLT-1 protein" može biti najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99% ili 100% homolog sekvenci humanogi sFLT-1 proteina koji se javlja u prirodi. U pojedinim slučajevima, "sFLT-1 protein" može biti najviše oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99% ili 100% homolog sekvenci humanogi sFLT-1 proteina koji se javlja u prirodi. U pojedinim slučajevima, "sFLT-1 protein" može biti sa prostornim rasporedom koji je najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99% ili 100% homologna konformaciji humanog sFLT-1 proteina koji se javlja u prirodi. U pojedinim slučajevima, „sFLT-1 protein" može biti sa prostornim rasporedom koji je najviše oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99% ili 100% homolog konformaciji humanogi sFLT-1 proteina koji se javlja u prirodi.
[0149] Dalje, solubilan skraćeni oblik VEGF receptora FLT-1, sFLT-1, jedini je poznati endogeni specifičan inhibitor VEGF-a. U prirodi, generiše se alternativnom obradom iRNK i nedostaju mu domen sličan imunoglobulinskom koji se nalazi proksimalno u odnosu na membranu, transmembranski region koji prolazi kroz membranu i unutarćelijski domen sa tirozin kinaznom aktivnošću. Strukturno, oba od FLT-1 i sFLT-1 proteina mogu sadržavati više funkcionalnih domena. U pojedinim varijantama, FLT i sFLT proteini obično dele 6 međusobno povezanih domena; 3 domena su uključena u dimerizaciju proteina, dok su 3 domena uključena u vezivanje liganda kao što je VEGF.
[0150] sFLT-1 je solubilni skraćeni oblik FLT-1 i eksprimira se endogeno. Kao što je ovde opisano, "solubilni" FLT-1 ili sFLT-1 se odnose na FLT-1 koji nije ograničen na ćelijsku membranu. Nevezan sFLT-1 može slobodno difundovati u vanćelijski prostor ili rastvor.
[0151] sFLT-1 je jedini poznat endogeni specifičan inhibitor VEGF-a. Ova interakcija je specifična i može biti ostvarena sa neobeleženim VEGF-om u višku od 100 puta. U pojedinim slučajevima, angiostatska aktivnost sFLT-1 može biti rezultat inhibicije VEGF-a putem dva mehanizma: i) sekvestracije VEGF-a, za koji se vezuje sa visokim afinitetom, i ii) obrazovanjem neaktivnih heterodimera sa izoformama VEGF receptora FLTt-1 i FLK-1/KDR koje prolaze kroz membranu. Kao što je poznato u oblasti tehnike, in vitro testovi vezivanja su ukazali da se sFLT-1 vezuje za VEGF sa visokim afinitetom i da takođe može inhibirati proliferaciju humanih endotelnih ćelija pupčane vene indukovanu sa VEGF-om. U životinjskim modelima kancera, sFLT-1 inhibira rast tumora. U pojedinim slučajevima, sFLT-1 može funkcionisati na substehiometrijski ili dominantno negativan način, pošto vezivanje VEGF-a u višku, u vanćelijskom prostoru, kao i naknadno aktiviranje VEGF receptora mogu biti sprečeni. Ove karakteristike sFLT-1 su opisane u Kendall i Thomas, 1993; Proc Natl Acad Sci. 90: 10705-10709. Kao što je poznato u oblasti tehnike, funkcionalni fragmenti sFLT-1 mogu biti upotrebljeni umesto proteina pune dužine. Preciznije, domen vezivanja VEGF-a (domen 2) ili alternativni domen 2 iz sFLT-1, zajedno sa domenom 3 iz sFLT1, KDR ili drugog člana familije, može biti upotrebljen za vezivanje i inaktivaciju VEGF-a. Takvi funkcionalni fragmenti su opisani u Wiesmann i saradnici, 1997; Cell, 91: 695-704. Termini "sFLT-1" i "funkcionalan fragment sFLT-1" su ekvivalentni i ovde se upotrebljavaju naizmenično.
III. Vektori i rekombinantni virusi
[0152] Kompozicije i postupci opisa obezbeđuju isporuku nukleinske kiseline koja kodira anti-VEGF (npr. sFLT-1 proteine) u ćelije humanog subjekta ili pacijenta kome je to potrebno. U pojedinim slučajevima, isporuka nukleinske kiseline može biti označena kao genska terapija.
[0153] Kompozicija i postupci opisa obezbeđuju bilo koji pogodan postupak za isporuku anti-VEGF nukleinske kiseline (npr. sFLT-1). U pojedinim slučajevima, isporuka nukleinske kiseline može biti izvršena upotrebom bilo kog pogodnog "vektora" (ponekada označenog i kao nosač za "isporuku gena" ili "prenos gena"). Vektor, nosač za isporuku, nosač za gensku isporuku ili nosač za prenos gena se mogu odnositi na bilo koji odgovarajući makromolekul ili kompleks molekula koji sadrže polinukleotid koji se isporučuje ciljnoj ćeliji. U pojedinim slučajevima, ciljna ćelija može biti bilo koja ćelija u koju se isporučuje nukleinska kiselina ili gen. Polinukleotid koji se isporučuje može sadržavati kodirajuću sekvencu od interesa za gensku terapiju, kao što je sFLT-1 gen.
[0154] Na primer, pogodni vektori mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, virusne vektore kao što su adenovirusi, adeno-asocirani virusi (AAV) i retrovirusi, lipozomi, drugi kompleksi koji sadrže lipide, kao i drugi makromolekulski kompleksi sposobni da posreduju u isporuci polinukleotida do ciljne ćelije.
[0155] U pojedinim slučajevima, vektor može biti organski ili neorganski molekul. U pojedinim slučajevima, vektor može biti mali molekul (tj. <5 kD) ili makromolekul (tj. > 5 kD). Na primer, vektor može uključivati, ali nije ograničen na inertne, biološki neaktivne molekule kao što su metalne čestice. U pojedinim slučajevima, vektor mogu biti čestice zlata.
[0156] U pojedinim slučajevima, vektor može sadržavati biološki aktivan molekul. Na primer, vektori mogu sadržavati polimerizovane makromolekule kao što su dendrimeri.
2
[0157] U pojedinim slučajevima, vektor može sadržavati rekombinantan virusni vektor u koji je ugrađena jedna ili više nukleinskih kiselina. Kao što je ovde opisano, nukleinske kiseline se mogu odnositi na polinukleotide. Nukleinska kiselina i polinukleotid se mogu upotrebljavati naizmenično. U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline mogu sadržavati DNK ili RNK. U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline mogu uključivati DNK ili RNK za ekspresiju sFLT-1. U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline tipa RNK mogu uključivati, ali nisu ograničene na, transkript gena od interesa (npr. sFLT-1), introne, netranslatirane regione, terminacione sekvence i slično. U drugim slučajevima, nukleinske kiseline tipa DNK mogu uključivati, ali nisu ograničene na, sekvence kao što su hibridne promotorske genske sekvence, jake konstitutivne promotorske sekvence, gen od interesa (npr. sFLT-1), netranslatirani regioni, terminacione sekvence i slično. U pojedinim slučajevima, može biti upotrebljena kombinacija DNK i RNK.
[0158] Kao što je ovde opisano u tekstu, podrazumeva se da termin "ekspresioni konstrukt" uključuje bilo koju vrstu genetičkog konstrukta koji sadrži nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji kodira genske proizvode u kojima se deo ili celokupna kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline može transkribovati. Transkript može zatim biti preveden u protein. U pojedinim slučajevima, isti može biti delimično preveden ili se ne prevodi translacijom. Prema određenim aspektima, ekspresija uključuje i transkripciju gena i translaciju iRNK u genski proizvod. Prema drugim aspektima, ekspresija uključuje samo transkripciju nukleinske kiseline koja kodria gen od interesa.
[0159] Prema jednom aspektu, predmetni opis obezbeđuje rekombinantan virus, poput adenoasociranog virusa (rAAV), kao vektor koji posreduje u ekspresiji sFLT-1.
[0160] U pojedinim slučajevima, virusni vektor opisa može biti izmeren u vidu pfu (jedinice obrazovanja plakova). U pojedinim slučajevima, pfu rekombinantnog virusa ili virusnog vektora iz kompozicija i postupaka opisa može iznositi oko 10<8>do oko 5 x 10<10>pfu. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini koja iznosi najmanje oko 1x10<8>, 2x10<8>, 3x10<8>, 4x10<8>, 5x10<8>, 6x10<8>, 7x10<8>, 8x10<8>, 9x10<8>, 1x10<9>, 2x10<9>, 3x10<9>, 4x10<9>, 5x10<9>, 6x10<9>, 7x10<9>, 8x10<9>, 9x10<9>, 1x10<10>, 2x10<10>, 3x10<10>, 4x10<10>i 5x10<10>pfu. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini koja iznosi najviše oko 1x10<8>, 2x10<8>, 3x10<8>, 4x10<8>, 5x10<8>, 6x10<8>, 7x10<8>, 8x10<8>, 9x10<8>, 1x10<9>, 2x10<9>, 3x10<9>, 4x10<9>, 5x10<9>, 6x10<9>, 7x10<9>, 8x10<9>, 9x10<9>, 1x10<10>, 2x10<10>, 3x10<10>, 4x10<10>i 5x10<10>pfu.
[0161] U pojedinim slučajevima, virusni vektor opisa može biti izmeren u vidu genoma vektora. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini od 1x10<10>do 3x10<12>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini od 1x10<9>do 3x10<13>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini od 1x10<8>do 3x10<14>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini od najmanje oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini od 1x10<8>do 3x10<14>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini od najviše oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>genoma vektora.
[0162] U pojedinim slučajevima, virusni vektor opisa može biti izmeren upotrebom multipliciteta infekcije (MOI). U pojedinim slučajevima, MOI se može odnositi na odnos ili na višestruke vektorske ili virusne genome u odnosu na ćelije kojima nukleinski materijal može biti isporučen. U pojedinim slučajevima, MOI može iznositi 1x10<6>. U pojedinim slučajevima, MOI može iznositi 1x10<5>-1x10<7>. U pojedinim slučajevima, MOI može iznositi 1x10<4>-1x10<8>. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini koja iznosi najmanje oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>MOI. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini koja iznosi 1x10<8>do 3x10<14>MOI. U pojedinim slučajevima, rekombinantni virusi opisa su u količini koja iznosi najviše oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>MOI.
[0163] Prema pojedinim aspektima, nukleinska kiselina može biti isporučena bez upotrebe virusa (tj. sa vektorom koji nije virusni) i može biti izmerena u vidu količine nukleinske kiseline. U principu, bilo koja pogodna količina nukleinske kiseline može biti upotrebljena sa kompozicijama i postupcima ovog opisa. U pojedinim slučajevima, nukleinska kiselina može biti u količini koja iznosi najmanje oko 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 µg, 10 µg, 100 µg, 200 µg, 300 µg, 400 µg, 500 µg, 600 µg, 700 µg, 800 µg, 900 µg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ili 5 g. U pojedinim slučajevima, nukleinska kiselina može biti u količini koja iznosi najviše oko 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 µg, 10 µg, 100 µg, 200 µg, 300 µg, 400 µg, 500 µg, 600 µg, 700 µg, 800 µg, 900 µg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ili 5 g.
[0164] Prema pojedinim aspektima, može biti upotrebljen vektor koji je komplementaran sam sebi (sc). Upotreba AAV vektora koji je komplementaran sam sebi može zaobići zahtev za sintezom drugog lanca virusne DNK i može dovesti do veće stope ekspresije transgenog proteina, kao što je to opisano od strane Wu, Hum Gene Ther.2007, 18(2): 171-82.
[0165] Prema pojedinim aspektima, nekoliko AAV vektora može biti generisano tako da se omogući izbor najoptimalnijeg serotipa, promotora i transgena.
2
[0166] U pojedinim slučajevima, vektor može biti vector sa ciljanim delovanjem, posebno vektor sa ciljanim delovanjem koji se selektivno vezuje za specifičnu ćeliju, kao što su to kancerske ćelije ili tumorske ćelije ili ćelije oka. Virusni vektori za upotrebu u opisu mogu uključivati one koji ispoljavaju nisku toksičnost za ciljnu ćeliju i indukuju proizvodnju terapijski korisnih količina anti-VEGF proteina na način koji je specifičan za ćeliju.
[0167] Kompozicije i postupci opisa obezbeđuju bilo koje pogodne virusne sisteme za isporuku nukleinskih kiselina, uključujući, ali se ne ograničavajući samo na, upotrebu najmanje jednog od adeno-asociranih virusa (AAV), adenovirusa, adenovirusa zavisnog od “pomagača”, retrovirusa, virusa herpes simpleksa, lentivirusa, poksvirusa, kompleksa hemaglutinirajućeg virusa iz Japana (HVJ) i lipozoma, Molonijevog virusa mišje leukemije i virusa zasnovanog na HIV-u. Poželjno je da virusni vektor sadrži jak eukariotski promotor operativno povezan sa polinukleotidom, npr. promotor citomegalovirusa (CMV).
[0168] U principu, bilo koji pogodni virusni vektori mogu biti kontruisani tako da budu optimizovani za upotrebu sa kompozicijama i postupcima opisa. Na primer, mogu biti upotrebljeni virusni vektori izvedeni iz adenovirusa (Ad) ili adeno-asociranog virusa (AAV). Mogu biti upotrebljeni i humani i virusni vektori koji nisu humani, a rekombinantni virusni vektor može biti izmenjen tako da kod ljudi može biti sa defektom u replikaciji. Kada je vektor adenovirus, vektor može sadržavati polinukleotid sa promotorom koji je operativno povezan sa genom koji kodira anti-VEGF protein i sa defektom je u replikaciji kod ljudi.
[0169] Za kombinovanje povoljnih osobina dva virusna vektorska sistema, mogu biti upotrebljeni hibridni virusni vektori za isporuku nukleinske kiseline koja kodira sFLT-1 protein u ciljnu ćeliju ili tkivo. Standardne tehnike za konstrukciju hibridnih vektora su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike. Takve tehnike se mogu pronaći, na primer, u Sambrook i saradnici, u Molecular Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. ili u bilo kom od brojnih laboratorijskih priručnika koji razmatra tehnologiju rekombinantne DNK. Za transdukciju ćelija mogu biti upotrebljavani dvolančani AAV genomi u adenovirusnim kapsidima koji sadrže kombinaciju AAV i adenovirusnih ITR. U drugom primeru primene, AAV vektor može biti smešten u "nepotpuni", "zavisan od pomagača" ili adenovirusni vektor "velikog kapaciteta". Adenovirusni/AAV hibridni vektori su opisani u Lieber i saradnici, J. Virol. 73:9314-9324, 1999. Retrovirusni/adenovirusni hibridni vektori su opisani u Zheng i saradnici, Nature Biotechnol.18:176-186, 2000.
[0170] Retrovirusni genomi sadržani unutar adenovirusa mogu biti integrisani unutar genoma ciljne ćelije i ostvariti stabilnu gensku ekspresiju.
[0171] Rekombinantni adenovirusni vektori sa defektom replikacije mogu biti proizvedeni u skladu sa poznatim tehnikama. Pogledati Quantin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584
2
(1992); Stratford-Perricadet i saradnici, J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); i Rosenfeld i saradnici, Cell, 68:143-155 (1992).
[0172] Dodatni poželjni vektori mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, fuzione proteine i hemijske konjugate. Retrovirusni vektori uključuju Molonijeve viruse mišje leukemije i viruse zasnovane na HIV-u. U pojedinim slučajevima, može biti upotrebljen virusni vektor zasnovan na HIV-u, pri čemu virusni vektor na bazi HIV-a sadrži najmanje dva vektora, gde su gag i pol geni iz HIV genoma, dok je env gen iz drugog virusa. Mogu biti upotrebljeni i DNK virusni vektori. Ovakvi vektori uključuju poksvirusne vektore kao što su ortopoksni ili avipoksni vektori, herpesvirusni vektori, poput vektora iz virusa herpes simpleksa I (HSV) [Geller A.I. i saradnici, J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim F. i saradnici, u DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, ur. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller A.I. i saradnici, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:907603 (1993); Geller A.I. i saradnici, Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)], Adenovirus Vectors [LeGal LaSalle i saradnici, Science, 259:988 (1993); Davidson i saradnici, Nat. Genet.3: 219 (1993); Yang i saradnici, J. Virol.69: 2004 (1995)] i Adeno-associated Virus Vectors [Kaplitt M.G. i saradnici, Nat. Genet.8:148 (1994)].
[0173] Drugi virusni vektori koji mogu biti upotrebljeni u skladu sa premetnim opisom obuhvataju vektore zasnovane na herpes simpleks virusu (HSV). Prednost HSV vektora kojima je delecijom ukonjen jedan ili više ranih gena (IE) je što uglavnom nisu citotoksični, opstaju u ciljnoj ćeliji u stanju sličnom latenciji i omogućavaju efikasnu transdukciju ciljnih ćelija. U rekombinantne HSV vektore može biti ugrađeno približno 30 kb heterologne nukleinske kiseline.
[0174] Retrovirusi, kao što su retrovirusi tipa C i lentivirusi, takođe mogu biti upotrebljeni u opisu. Na primer, retrovirusni vektori mogu biti zasnovani na virusu mišje leukemije (MLV), kao što je opisano u Hu i Pathak, Pharmacol. Rev.52:493511, 2000 i Fong i saradnici, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.
17:1-60, 2000. Vektori zasnovani na MLV mogu sadržavati do 8 kb heterologne (terapijske) DNK umesto virusnih gena. Heterologna DNK može uključivati promotor koji je specifičan za tkivo i nukleinsku kiselinu za anti-VEGF protein. U postupcima isporuke neoplastičnim ćelijama, isti može kodirati i ligand za receptor koji je specifičan za tkivo.
[0175] Mogu biti upotrebljeni i dodatni retrovirusni vektori, uključujući, ali ne ograničavajući se na, vektore na bazi lentivirusa sa defektom u replikaciji, a uključujući vektore zasnovane na virusu humane imunodeficijencije (HIV), kao što je to opisano u Vigna i Naldini, J. Gene Med. 5:308-316, 2000 i Miyoshi i saradnici, J. Virol. 72:8150-8157, 1998. Prednost lentivirusnih vektora može biti što su sposobni da inficiraju i ćelije koje se aktivno dele i ćelije koje se ne dele. Oni takođe mogu biti visoko efikasni u transdukciji humanih epitelnih ćelija.
[0176] Lentivirusni vektori za upotrebu u opisu mogu biti izvedeni iz humanih i lentivirusa koji nisu humani (uključujući SIV). Primeri lentivirusnih vektora obuhvataju sekvence nukleinskih kiselina koje
2
su potrebne za propagaciju vektora, kao i promotor koji je specifičan za tkivo i operativno povezan sa genom anti-VEGF proteina. Sekvence nukleinskih kiselina mogu uključivati virusne LTR, mesto vezivanja prajmera, polipurinski trakt, att mesta i mesto inkapsidacije.
[0177] Lentivirusni vektor može biti upakovan u bilo koji pogodan lentivirusni kapsid. Zamena jednog proteina čestice sa drugim, iz različitog virusa, označava se kao "pseudotipizacija". Vektorski kapsid može sadržavati proteine virusne ovojnice iz drugih virusa, uključujući virus mišje leukemije (MLV) ili virus vezikularnog stomatitisa (VSV). Prinos pri upotrebi VSV G-proteina je visok vektorski titar, tako da je rezultat veća stabilnost vektorskih virusnih čestica.
[0178] Vektori zasnovani na alfavirusima, kao što su oni napravljeni od virusa semliki šume (SFV) i sindbis virusa (SIN), takođe mogu biti upotrebljavani u opisu. Upotreba alfavirusa je opisana u Lundstrom K., Intervirology 43:247-257, 2000 i Perri i saradnici, Journal of Virology 74:9802-9807, 2000.
[0179] Prednost rekombinantnih alfavirusnih vektora sa defektom u replikaciji može biti što su sposobni za ekspresiju heterolognih (terapijskih) gena u visokim nivoima i što mogu inficirati širok dijapazon ciljnih ćelija. Alfavirusni replikoni mogu ciljano delovati na specifične vrste ćelija, prikazivanjem na površini njihovog viriona funkcionalnog heterolognog liganda ili domena vezivanja koji bi omogućio selektivno vezivanje za ciljne ćelije koje eksprimiraju srodnog vezujućeg partnera. Alfavirusni replikoni mogu uspostaviti latenciju, a time i dugoročnu heterolognu ekspresiju nukleinske kiseline u ciljnoj ćeliji. Replikoni mogu takođe dovesti do tranzijentne ekspresije heterolognih nukleinskih kiselina u ciljnoj ćeliji.
[0180] Poksvirusni vektori mogu uvoditi gen u ćelijsku citoplazmu. Avipoksni virusni vektori mogu dovesti samo do kratkotrajne ekspresije gena ili nukleinske kiseline. Adenovirusni vektori, adenoasocirani virusni vektori i vektori herpes simpleks virusa (HSV) mogu biti upotrebljeni sa kompozicijama i postupcima opisa. Prema pojedinim aspektima, adenovirusni vektor može dovesti do kratkotrajnije ekspresije (npr. kraće od mesec dana) u odnosu na adeno-asocirane virus, a može ga karakterisati i mnogo duža ekspresija. Konkretan iazbrani vektor može biti zavisan od vrste ciljne ćelije i stanja koje se leči.
[0181] Adeno-asocirani virusi (AAV) su mali virusi bez omotača sa jednolančanom DNK. Oni su nepatogeni humani parvovirusi i njihova replikacija može zavisiti od pomoćnih virusa, uključujući adenovirus, virus herpes simpleksa, virus vakcinije i CMV. Izloženost AAV divljeg tipa (wt) nije povezana sa ili za nju nije poznato da prouzrokuje bilo kakve humane patologije, odnosno izloženost je uobičajeno prisutna u opštoj populaciji pošto do adenovirusne infekcije obično dolazi već u prvoj deceniji života.
2
[0182] Kao što je ovde opisano, "AAV" se odnosi na adeno-asocirani virus, dok se "rAAV" odnosi na rekombinantan adeno-asocirani virus.
[0183] U pojedinim slučajevima, AAV divljeg tipa kodira rep i cap gene. Gen rep je potreban za replikaciju virusa, dok je cap gen neophodan za sintezu kapsidnih proteina. Kombinacijom alternativnih mesta za početak translacije i mesta obrade, mali genom može biti u stanju da eksprimira četiri rep i tri cap genska proizvoda. Proizvodi rep gena i sekvence u invretovanim terminalnim ponovcima (ITR od 145 bp, koji okružuju genom) mogu biti od ključnog značaja u ovom procesu. Do danas, izolovano je 11 serotipova AAV. AAV2 može biti upotrebljen sa kompozicijom i postupcima opisa. Kompozicije i postupci opisa obezbeđuju upotrebu bilo kog pogodnog AAV serotipa. Prema pojedinim aspektima, AAV je izabran iz grupe koja se sastoji od: AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10 i njihovih hibrida.
[0184] Prema pojedinim aspektima, predmetni opis obezbeđuje rekombinantan virus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja dalje sadrži humani oblik skraćenog, solubilnog VEGF receptora 1 (sFLT-1), a koji je nazvan rAAV.sFlt-1. Vektor je rekombinantan adeno-asocirani virusni (rAAV) vektor sa deficijencijom u replikaciji, serotipa 2. Prema drugom aspektu, vektor je rekombinantan adenoasocirani virusni (rAAV) vektor sa deficijencijom u replikaciji serotipa 2, označen kao rAAV.sFlt-1.
[0185] AAV2 je najviše okarakterisan. Pokazano je tako da rAAV2 može biti u stanju da posreduje u dugotrajnoj ekspresiji transgena u očima mnogih vrsta životinja. Kod pacova, reporterski gen unet posredstvom rAAV (zeleni fluorescentni protein) bio je još uvek prisutan 18 meseci nakon injeciranja. Kod majmuna, isti reporterski gen je bio prisutan 17 meseci nakon injeciranja. Slično navedenom, visoki nivoi sFLT-1 proteina su bili prisutni u staklastom telu očiju majmuna kojima je injeciran rAAV.sFlt-1 nakon 15 meseci od injeciranja.
[0186] rAAV.sFlt-1 je ispitivan u životinjskim modelima za intraokularne neovaskularne poremećaje. Deluje da je rAAV.sFlt-1 usporio progresiju neovaskularizacije u životinjskim modelima neovaskularizacije rožnjače i neovaskularizacije mrežnjače. Zanimljivo je da je sFlt-1 eksprimiran sa rAAV ukazao na određenu inhibiciju neovaskularizacije u majmunskom modelu horoidne neovaskularizacije (modelu za vlažni oblik senilne makularne degeneracije ili AMD). U ovoj studiji, prisustvo rAAV.sFlt-1 konstrukta je ukazalo na niske nivoe ekspresije sFLT-1 u očima majmuna i nije uticalo na dobrobit niti na funkciju mrežnjače majmuna. Nije bilo ni dokaza koji bi ukazali na bilo kakve probleme sa bezbednošću koji bi bili povezani sa sistemskom izloženošću rAAV.sFlt-1. Sveukupni pozitivni nalazi i nedostatak toksičnosti rAAV vektora u ovim studijama, kao i nalazi za rAAV.sFlt-1 u sisarskim modelima horoidne neovaskularizacije sisara/AMD, obezbedili su opsežne
2
potkrepljujuće podatke o tome da je vektor sa povoljnim bezbedonosnim profilom kada se primenjuje u oko.
[0187] Uprkos sposobnosti rAAV.sFlt-1 da umanji određene simptome AMD-a u modelu na majmunima, nivo sFLT-1 proteina je bio neočekivano nizak u retini. Za nivoe ekspresije sFLT-1 koji su bili indukovani sa konstitutivno aktivnim sisarskim promotorom je u oblasti tehnike već pokazano da obezbeđuju visoke nivoe proteinske ekspresije u brojnim vrstama ćelija. Iako nije sa teorijskom osnovom, može postojati više mogućnosti za ovakav niži nivo ekspresije od očekivanog. Kao veliki multidomenski protein, sFLT-1 može biti podložan prevremenoj proteolitičkoj degradaciji, lošoj kinetici ekspresije ili sortiranju koje nije optimalno. S obzirom na poslednje navedeno, pošto je protein koji se izlučuje, kada se sFLT-1 eksprimira rekombinantno u ćeliji, on ulazi u sekretorni put. U ćelijama mrežnjače, uključujući ćelije RPE, sFLT-1 može biti izlučen bilo apikalno ili bazolateralno, u zavisnosti od toga da li se sortiranje proteina odvija putem ER ili Goldži aparata. U pojedinim slučajevima, sortiranje koje nije optimalno može dovesti do sekrecije molekula na bazolateralnoj membrane što nije poželjno, čime se smanjuje koncentracija sFLT-1 molekula koji su dostupni za inhibiranje VEGF signalizacije i neovaskularne angiogeneze na apikalnoj površini ćelijskog sloja RPE.
[0188] Pored navedenog, u oblasti tehnike nije bilo poznato da ovaj neočekivano niži nivo sFLT-1 može uticati na efikasnost leka prilikom lečenja aktuelnog AMD oboljenja kod ljudi. Iako su jedva povišeni nivoi u modelu na majmunu ukazali na obećavajuće znake ublažavanja simptoma AMD, životinjski model na majmunima za AMD može poslužiti samo kao surogat za AMD bolest. Kao što je ovde opisano, simptomi AMD se veštački indukuju (putem lasera) u mrežnjači. Iako je ovaj model pogodan za razne analize, stvarnu efikasnost leka u lečenju simptoma u modelu na majmunima je zaptavo teško ekstrapolisati na lečenje oboljenja kod ljudi. Neočekivano niži proteinski nivoi generisani sa rAAV.sFlt-1 dodatno povećavaju poteškoće u ovoj proceni bez eksperimenata na ljudima.
[0189] Dodatno, tri klinička ispitivanja na Lebersovoj kongenitalnoj amaurozi (LCA) bila su sprovedena u Velikoj Britaniji i SAD, upotrebom osnove rAAV2. LCA je retko nasledno očno oboljenje koja se javlja pri rođenju ili u prvih nekoliko meseci života, a karakterišu ga nistagmus, usporeno ili odsustvo reakcije zenica, kao i ozbiljan gubitak vida ili slepilo. Do danas, nisu prijavljeni nikakvi problemi u kontekstu bezbednosti nakon injeciranja rAAV2 konstrukta u subretinalni prostor 6 učesnika u ova dva ispitivanja. Oba tima uključena u klinička ispitivanja su zaključila da su njihovi nalazi podržali dalje studije genske terapije kod pacijenata sa LCA.
[0190] S obzirom na očigledne tehničke poteškoće u generisanju značajno ili održivo povišenih nivoa sFLT-1 kod majmuna, mogu biti preuzete različite strategije optimizacije da bi se rešilo jedno ili više tehničkih pitanja koja su u osnovi nižih proteinskih nivoa sFlt-1 u mrežnjači nakon uvođenja rAAV.sFlt-1. U pojedinim slučajevima, strategije optimizacije, uključujući one koje su obezbeđene kompozicijom i postupcima ovog opisa, mogu uključivati povećanje optimizacije sFlt-1 proteinske sekvence, ili domena, uvođenjem kontrolnih elemenata za usmeravanje pravilnog sortiranja nakon ekspresije u ćelijama retine ili povećanjem nivoa sFlt-1 proteina, da bi se kompenzovali bilo koji od ovih mogućih faktora. U pojedinim slučajevima, kompozicija i postupci opisa obezbeđuju posebne strategije usmerene na poslednje navedeno, uključujući ugradnju specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina koje su usmerene na poboljšanje u povišavanju proteinskih nivoa u retinama ljudi preko sFlt-1 nivoa koji su prethodno zapaženi u studijama na majmunima. Kao što je ovde opisano, za povećanje nivoa sFlt-1 proteina u retini nakon izlaganja rAAV.sFlt-1, mogu biti upotrebljavane razne sekvence, linkeri, UTR sekvence, introni, varijante sFLT-1 ili njihove kombinacije.
[0191] Vektori mogu sadržavati komponente ili funkcionalne karakteristike koje dodatno modulišu isporuku gena i/ili gensku ekspresiju, ili koje na drugi način obezbeđuju korisne osobine ciljnim ćelijama. Takve druge komponente obuhvataju, na primer, komponente koje utiču na vezivanje ili ciljano dejstvo na ćelije (uključujući komponente koje posreduju u vezivanju specifičnom za određenu vrstu ćelija ili tkiva); komponente koje utiču na preuzimanje vektorske nukleinske kiseline od strane ćelije; komponente koje utiču na lokalizaciju polinukleotida unutar ćelije nakon preuzimanja (kao što su agensi koji posreduju u lokalizaciji u jedro); i komponente koje utiču na ekspresiju polinukleotida. Takve komponente takođe mogu uključivati markere, kao što su markeri koji se mogu detektovati i/ili selektovati, a koji mogu biti upotrebljeni da bi se detektovale ili selektovale ćelije koje su preuzele i eksprimiraju nukelinsku kiselinu koja je isporučena vektorom. Takve komponente mogu biti obezbeđene kao prirodna karakteristika vektora (kao što je upotreba određenih virusnih vektora koji imaju komponente ili funkcije koje posreduju u vezivanju i preuzimanju) ili vektori mogu biti modifikovani tako da se obezbede takve funkcije.
[0192] Selektivni markeri mogu biti pozitivni, negativni ili bifunkcionalni. Pozitivni selektivni markeri omogućavaju selekciju ćelija koje nose marker, dok negativni selektivni markeri omogućavaju selektivno uklanjanje ćelija koje nose marker. Opisani su različiti takvi geni markeri, uključujući bifunkcionalne (tj. pozitivne/negativne) markere (pogledati npr. Lupton S., WO 92/08796, objavljen 29. maja 1992. godine; i Lupton S., WO 94/28143, objavljen 8. decembra 1994. godine). Primeri negativnih selektivnih markera mogu obuhvatati uključivanje gena rezistencije na antibiotike, poput ampicilina ili kanamicina. Takvi geni markeri mogu obezbediti dodatnu meru u kontroli koja može predstavljati prednost u kontekstu genske terapije. Veliki broj takvih vektora je poznat u oblasti tehnike i uglavnom je dostupan.
1
[0193] U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline koje kodiraju markere rezistencije na antibiotike mogu uključivati, ali nisu ograničene na, sekvence kao što su SEQ ID No.110, SEQ ID No.111, SEQ ID No.112, SEQ ID No.113 ili SEQ ID No.114.
[0194] U mnogim virusnim vektorima koji su kompatibilni sa postupcima opisa, u vektor može biti uključen jedan ili više promotora, da bi se omogućilo da se vektorom eksprimira više od jednog heterolognog gena. Nadalje, vektor može sadržavati sekvencu koja kodira signalni peptid ili drugu strukturu koja olakšava ekspresiju anti-VEGF proteina iz ciljne ćelije.
[0195] Nukleinska kiselina koja kodira genski proizvod može biti pod transkripcionom kontrolom od strane promotora. "Promotor", koji je kao što je ovde obezbeđeno, odnosi se na odgovarajuću DNK sekvencu koja je potrebna za iniciranje transkripcije gena. Izraz "pod transkripcionom kontrolom" označava da je promotor na ispravnoj lokaciji i u pravilnoj orjentaciji u odnosu na nukleinsku kiselinu za uspostavljanje kontrole nad inicijacijom i ekspresijom gena sa RNK polimerazom. U pojedinim slučajevima, promotor može uključivati "jak" ili konstitutivno aktivan promotor. Na primer, CMV promotor može biti upotrebljen kao konstitutivno aktivan promotor, što je to poznato u oblasti tehnike. U pojedinim slučajevima, CMV promotor može sadržavati dodatne regulatorne elemente za pospešivanje ekspresije. U pojedinim slučajevima, CMV promotor može sadržavati inicijalni-rani CMV promotor.
[0196] U pojedinim slučajevima, promotor se može odnositi na "slab" promotor ili sekvencu čiji se prinos ogleda u nižim nivoima sFLT-1 proteina u odnosu na jaki promotor. U pojedinim slučajevima, može biti upotrebljen promotor koji je takav da pokreće selektivnu ekspresiju sFLT-1. U pojedinim slučajevima, promotor ili drugi regulatorni elementi upotrebljeni u kombinaciji sa drugim sekvencama koje su ovde opisane, može biti upotrebljen za pokretanje selektivne ekspresije sFLT-1 u ćeliji oka ili tkivu oka.
[0197] Dodatno, "promotor", 104 može ovde takođe biti korišćen naizmenično, za označavanje bilo kojih dodatnih modula koji su pogodni za transkripcionu kontrolu, a koji mogu biti prisutni oko mesta inicijacije za RNK polimerazu. Kompozicije i postupci ovog opisa mogu upotrebljavati bilo koji od pogodnih promotora i modula transkripcione kontrole za ekspresiju transgena, 106. Dodatni moduli transkripcione kontrole mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, elemente kao što su HSV timidin kinaza (tk) i jedinice rane transkripcije iz SV40. U principu, promotori mogu biti sastavljeni od diskretnih funkcionalnih modula, pri čemu se svaki sastoji od približno 7-20 bp DNK ili 20-5000 bp DNK, a dalje sadrži i jedno ili više mesta prepoznavanja za transkripcione aktivacione ili represorske proteine. Kompozicija i postupci opisa obezbeđuju bilo koje pogodne regulatorne sekvence ili njihovu kombinaciju. U pojedinim slučajevima, ovakve sekvence modula transkripcione kontrole se mogu odnositi na ili identifikovati kao sekvence pojačivača ili represora.
2
[0198] Najmanje jedan modul u svakom promotoru funkcioniše tako da pozicionira mesto početka sinteze RNK. Jedan primer je TATA sekvenca (engl. TATA box). Drugi primer može uključivati pojedine promotore kojima nedostaje TATA sekvenca, kao što su promotor gena za teminalnu dezoksinukleotidil transferazu sisara i promotor kasnih gena SV40, diskretan element koji se nalazi preko samog mesta početka transkripcije čime potpomaže u fiksiranju mesta inicijacije.
[0199] Dodatni promotorski elementi regulišu učestalost inicijacije transkripcije. U principu, oni se nalaze u regionu koji je 30-110 bp uzvodno od mesta započinjanja traskripcije, iako određeni broj promotora može sadržavati i funkcionalne elemente koji su nizvodno od mesta započinjanja traskripcije. Razmak između promotorskih elemenata često može biti fleksibilan, tako da je funkcija promotora očuvana i kada se elementi invertuju ili pomere jedan u odnosu na drugog. U tk promotoru, na primer, razmak između promotorskih elemenata može biti povećan do 50 bp pre nego što aktivnost počne da opada. U zavisnosti od promotora, pojedinačni elementi mogu biti pozicionirani tako da funkcionišu u aktivaciji transkripcije bilo u saradnji ili nezavisno.
[0200] Kompozicije i postupci opisa obezbeđuju bilo koje pogodne sekvence za kontrolu ekspresije sekvence nukleinske kiseline od interesa u ciljnoj ćeliji. Prema tome, kada se ciljano deluje na humanu ćeliju, sekvenca može biti konstruisana tako da kodirajući region nukleinske kiseline bude susedan sa i pod kontrolom promotora koji je u stanju da je eksprimira u humanoj ćeliji. U principu, takav promotor može uključivati bilo humani ili virusni promotor.
[0201] Prema raznim aspektima opisa, promotor neposrednog ranog gena humanog citomegalovirusa (CMV) (ie-CMV), promotor ranih gena SV40, promotor Rausovog sarkoma virusa sa dugim terminalnim ponovcima, promotor β-aktina, promotor insulina pacova i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze mogu biti upotrebljavani za postizanje visokog nivoa ekspresije kodirajuće sekvence od interesa (npr. sFLT-1). Razmatra se i upotreba ostalih virusnih i sisarskih ćelijskih ili promotora bakteriofaga koji su dobro poznati u oblasti tehnike, za postizanje ekspresije kodirajuće sekvence od interesa, pod uslovom da su nivoi ekspresije dovoljni za datu namenu. Prema pojedinim aspektima, prokariotske regulatorne sekvence mogu biti prisutne u vektoru, kao što je to promotorska sekvenca T7 RNK polimeraze. Prema drugim aspektima, vektor je oslobođen od takvih regulatornih sekvenci. Korišćenjem promotora poznatih osobina, nivo i obrazac ekspresije proteina od interesa nakon transfekcije ili transformacije može biti optimizovan.
[0202] Izbor promotora koji se reguliše u odgovoru na specifične fiziološke ili sintetičke signale može dozvoliti inducibilnu ekspresiju genskog proizvoda. Na primer, u slučaju kada je ekspresija jednog transgena, ili više transgena kada se koristi multicistronski vektor, toksična za ćelije u kojima se vektor proizvodi, može biti poželjno da se zabrani ili smanji ekspresija jednog ili više transgena. Primeri transgena koji mogu biti toksični za ćelijsku liniju proizvođača su pro-apoptotski i citokinski geni. Nekoliko inducibilnih promoterskih sistema je dostupno za proizvodnju virusnih vektora kada transgeni proizvod može biti toksičan. Kompozicija i postupci opisa obezbeđuju bilo koju pogodnu kombinaciju promotorske sekvence, regulatornih sekvenci i transgena. U pojedinim slučajevima, rezultat kombinacije sekvenci može biti odsustvo toksičnosti za ćeliju. U pojedinim slučajevima, rezultat kombinacije sekvenci može biti visoka toksičnost za ćeliju. U pojedinim slučajevima, kombinacija sekvenci može dovesti do umerenih nivoa toksičnosti u ćeliji.
[0203] Ekdizonski sistem (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija) je jedan takav sistem za ekspresiju transgena. Ovaj sistem je dizajniran tako da dozvoli regulisanu ekspresiju gena od interesa u sisarskim ćelijama. Sastoji se od strogo regulisanih ekspresionih mehanizama koji omogućavaju nizak bazalni nivo ekspresije transgena, ali je i sa inducibilnošću reda veličine od preko 200 puta. Sistem se zasniva na heterodimernom ekdizonskom receptoru Drozofile i kada se ekdizon ili analog, poput muristerona A, veže za receptor, receptor aktivira promotor tako da se uključi ekspresija nizvodnog transgena do postizanja visokih nivoa iRNK transkripata. U ovom sistemu, oba monomera heterodimernog receptora se eksprimiraju konstitutivno sa jednog vektora, dok je promotor koji reaguje na ekdizon, koji pokreće ekspresiju gena od interesa, na drugom plazmidu. Konstruisanje ovakve vrste sistema, u vektor za transfer gena od interesa, može biti upotrebljeno u kompozicijama i postupcima ovog opisa. Istovremena transfekcija plazmida koji sadrže gen od interesa i receptorske monomere, u ćelijsku liniju proizvođača, omogućila bi tada proizvodnju vektora za transfer gena bez ekspresije potencijalno toksičnog transgena. U odgovarajuće vreme, ekspresija transgena može biti aktivirana sa ekdizonom ili muristeronom A.
[0204] U pojedinim okolnostima, može biti poželjno da se ekspresija transgena reguliše u vektoru za gensku terapiju. Na primer, mogu biti upotrebljeni različiti virusni promotori sa različitim jačinama aktivnosti, u zavisnosti od nivoa ekspresije koji je poželjan. U sisarskim ćelijama, CMV promotor neposrednog ranog gena može biti upotrebljen da bi se obezbedila jaka transkripciona aktivacija. Modifikovane verzije CMV promotora koje su manje potentne, takođe su upotrebljavane kada je bilo poželjno smanjenje nivoa ekspresije transgena. Kad je poželjna ekspresija transgena u hematopoetskim ćelijama, često se upotrebljavaju retrovirusni promotori, kao što su LTR sekvence (od engl. Long Terminal Repeat) iz MLV ili MMTV. Ostali virusni promotori koji mogu biti upotrebljavani u zavisnosti od željenog efekta obuhvataju SV40, RSV LTR, HIV-1 i HIV-2 LTR, adenovirusne promotore kao što su oni iz E1A, E2A ili MLP regiona, AAV LTR, virusa mozaika karfiola, HSV-TK i virusa sarkoma ptica.
[0205] Prema pojedinim aspektima, promotori koji su specifični za tkiva upotrebljavaju se za ostvarenje transkripcije u specifičnim tkivima ili ćelijama i tako da se smanje moguća toksičnost ili neželjni efekti na tkivima na koja se ciljano ne deluje. Na primer, promotori kao što su iz PSA,
4
probazina, fosfataze prostatične kiseline ili žlezdanog kalikreina specifičanog za prostatu (hK2), mogu biti upotrebljeni za ciljanu gensku ekspresiju u prostati.
[0206] U pojedinim slučajevima, promotori ili elementi regulatornih sekveci mogu biti upotrebljeni za usmeravanje selektivne ekspresije u ćelijama oka ili tkivu oka. Na primer, promotor, elementi sekvence ili regulatorne sekvence koji se nalaze u specifičnim tipovima očnih ćelija, kao što su retinalne pigmentne epitelne ćelije, mogu biti upotrebljeni u odgovarajućim ekspresionim konstruktima (npr. RPE65 ili VMD2 promotori).
[0207] Odabir odgovarajućih promotora se može lako postići. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni promotor za visoku ekspresiju ili snažan promotor. Primer pogodnog promotora je promotor citomegalovirusa (CMV) od 763 baznih parova. Promotori Rausovog sarkoma virusa (RSV) (Davis i saradnici, Hum Gene Ther 4:151 (1993)) i MMT takođe mogu biti upotrebljavani. Određeni proteini mogu biti eksprimirani upotrebom njihovog nativnog promotora. Mogu biti uključeni i drugi elementi koji mogu pojačati ekspresiju, kao što su to pojačivač ili sistem koji dovodi do visokog nivoa ekspresije, poput tat gena i tar elementa. Ova kaseta može zatim biti insetovana u vektor, npr. plazmidni vektor kao što su pUC19, pUC118, pBR322 ili druge poznate plazmidne vektore, koji uključuju, na primer, mesto početka replikacije iz E. coli. Pogledati Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989). U ovoj publikaciji su promotori detaljno opisani. Plazmidni vektor može takođe uključivati selektivni marker kao što je βlaktamazni gen za rezistenciju na ampicilin, pod uslovom da polipeptid markera ne utiče štetno na metabolizam organizma koji se leči. Kaseta takođe može biti vezana za strukturu vezivanja nukleinske kiseline u sintetičkom sistemu isporuke, kao što je sistem opisan u WO 95/22618. U principu, promotorske sekvence i/ili bilo koje srodne regulatorne sekvence mogu sadržavati oko 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp ili 10000 bp. Promotorske sekvence i bilo koje srodne regulatorne sekvence mogu sadržavati najviše 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp ili 10000 bp.
[0208] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus ili plazmid sadrži promotor izabran od promotora citomegalovirusa (CMV), promotora Rousovog sarkoma virusa (RSV) i MMT promotora, EF-1 alfa promotora, UB6 promotora, promotora beta-aktina pileta, CAG promotora, RPE65 promotora i opsinskog promotora. U principu, promotorske sekvence i sekvence promotora/pojačivača koje su obezbeđene predmetnim opisom mogu uključivati, ali nisu ograničene na, bilo koju sekvencu izabranu od SEQ ID No.17, SEQ ID No.18, SEQ ID No.19, SEQ ID No.20, SEQ ID No.21, SEQ ID No.22, SEQ ID No.23, SEQ ID No.24, SEQ ID No.25, SEQ ID No.26, SEQ ID No.27, SEQ ID No.28, SEQ ID No.29, SEQ ID No.30, SEQ ID No.31, SEQ ID No.32, SEQ ID No.33, SEQ ID No.
34, SEQ ID No.35, SEQ ID No.36, SEQ ID No.37, SEQ ID No.38, SEQ ID No.39, SEQ ID No.340, SEQ ID No.41, SEQ ID No.42, SEQ ID No.43, SEQ ID No.44, SEQ ID No.45, SEQ ID No.46 i SEQ ID No.47.
[0209] Prema pojedinim aspektima, antibiotski marker se upotrebljava u procesu za proizvodnju rekombinantnog virusa. Markeri rezistencije na antibiotike mogu biti upotrebljeni za identifikaciju ćelija pozitivnih na transgene prilikom generisanja rekombinantnog virusa. Prema pojedinim aspektima, antibiotski marker sadrži sekvencu koja kodira gen za rezistenciju na antibiotike, poput onih koji su ovde obzbeđeni, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, sekvence prikazane na Sl.
8A i 8B. Na primer, markeri koji obezbeđuju rezistenciju mogu obuhvatati one za kanamicin, gentamicin, ampicilin, hloramfenikol, tetraciklin, doksiciklin ili higromicin, ali nisu ograničeni samo na njih. Prema pojedinim aspektima, gen rezistencije na antibiotike je gen rezistencije na betalaktamske antibiotike poput kanamicina.
[0210] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, sadrži sekvencu koja kodira sekvencu početka replikacije, kao što su one koje su ovde obezbeđene. Sekvence početka replikacije uglavnom obezbeđuju sekvence koje su korisne za propagaciju plazmida. U principu, sekvence početka replikacije koje su obezbeđene predmetnim opisom mogu uključivati, ali nisu ograničene na, bilo koju od sekvenci izabranih od sekvenci koje su obezbeđene na Sl.7A, Sl.7B, Sl.7C i Sl.7D.
[0211] Prema pojedinim aspektima, početak replikacije ili sekvenca početka replikacije može uključivati, ali nije ograničena samo na, sekvence kao što su SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No.7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No.11, SEQ ID No.12, SEQ ID No.13, SEQ ID No.14, SEQ ID No.15, SEQ ID No.16 ili SEQ ID No.17.
[0212] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, sadrži pojačivač, kao što su oni koji su ovde obezbeđeni.
[0213] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, sadrži himerni intron ili intron, 105, kao što su oni koji su ovde obezbeđeni i opisani u U.S. Pat. No. 7635474. Intron ili himerni intron se ovde mogu upotrebljavati naizmenično. U pojedinim slučajevima, intron se može odnositi na bilo koju sekvencu koja može biti transkribovana, ali se ne prevodi translacijom. U pojedinim slučajevima, intron se može odnositi na bilo koju sekvencu koja može biti transkribovana i uklanja se iz zrelog RNK transkripta u ćeliji. U pojedinim slučajevima, intron može sadržavati najmanje 1 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp ili 5000 bp. U pojedinim slučajevima, intron može sadržavati oko najmanje 1 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp ili 5000 bp. U pojedinim slučajevima, intron može biti oko 300 bp. U pojedinim slučajevima, intron može biti oko 200-400 bp. U pojedinim slučajevima, himerni intron može biti oko 100 - 500 bp. U pojedinim slučajevima, intron može biti oko 50 - 200 bp. U pojedinim slučajevima, intron može biti bilo intaktan intron koji se javlja u prirodi ili himerni intron.
[0214] Prema pojedinim aspektima, intron može uključivati, ali nije ograničen na, sekvence kao što je SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 116, SEQ ID No. 117, SEQ ID No. 118, SEQ ID No. 119 ili SEQ ID No.120.
[0215] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, sadrži poli A (poliadenilacionu) sekvencu, 107, poput onih koji su ovde obezbeđene (npr. poli A sekvencu SV40). U principu, bilo koja pogodna poliA sekvenca može biti upotrebljena za željenu ekspresiju transgena (tj. sFLT-1). Na primer, u pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje sekvencu koja sadrži poliA sekvencu SV40 ili deo poliA sekvence SV40. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljene nativne poliA sekvence poput onih koje se nalaze nizvodno (3'UTR) od humanog sFLT-1 gena, kao što je i pronađeno u humanoj genomskoj sekvenci. U drugim slučajevima, mogu biti upotrebljene poliA sekvence koje se nalaze nizvodno od gena drugačijih od sFLT-1. U sledećim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje poliA sekvence koje sadrže kombinaciju jedne ili više poliA sekvenci ili elemenata sekvenci. U pojedinim slučajevima, ne upotrebljava se poliA sekvenca. U pojedinim slučajevima, jedna ili više poliA sekvenci mogu biti označene kao netranslatirajući regioni (UTR), 3’ UTR ili terminacione sekvence.
[0216] Prema određenim aspektima opisa, upotreba internih mesta vezivanja za ribozome (IRES) ili elemenata virusa slinavke i šapa (FMDV), mogu biti upotrebljeni za stvaranje multigenih ili policistronskih informacionih RNK. IRES elementi mogu zaobići model skeniranja ribozoma pri translaciji koja je zavisna od 5' metilisane kape RNK i započeti translaciju na mestu unutar iRNK. Opisani su IRES elementi iz dva člana familije pikornavirusa (poliovirusa i encefalomiokarditisa), kao i IRES iz sisarskih iRNK. IRES elementi mogu biti povezani sa heterolognim sekvencama u otvoren okvir čitanja. Višestruki otvoreni okviri čitanja mogu biti transkribovani zajedno, pri čemu je svaki razdvojen sa IRES, čime nastaju policistronske iRNK. Zahvaljujući IRES elementu, svaki otvoreni okvir čitanja može biti dostupan ribozomima radi efikasne translacije. Višestruki geni mogu biti efikasno eksprimirani upotrebom jednog promotora/pojačivača za transkripciju jedne iRNK. Alternativan sistem za koekspresiju dva proteina u vektorima za isporuku genske terapije je FMDV 2A sistem. FMDV 2A sistem koristi retrovirusni plazmidni vektor u kome dva gena mogu biti povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira 2A sekvencu iz pikornavirusa virusa slinavke i šapa. Transkripcijom i translacijom nastaje bicistronska iRNK, a dalje nastaju i dva nezavisna proteinska proizvoda.
[0217] Bilo koji heterologni otvoreni okvir čitanja može biti povezan sa IRES elementima. Navedeno može uključivati gene za proteine koji se izlučuju, proteine sa više subjedinica, kodirane nezavisnim genima, unutarćelijske ili proteine koji su svezani za membranu i selektivne markere. Na ovaj način, ekspresija nekoliko proteina može biti regulisana jednim konstruktom i jednim selektivnim markerom koji su konstruisani tako da budu istovremeno uneti u ćeliju.
[0218] PoliA sekvenca može biti dužine od 1 - 10 bp, 10 - 20 bp, 20 - 50 bp, 50 - 100 bp, 100 - 500 bp, 500 bp - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb i 9Kb - 10 Kb. PoliA sekvenca može biti dužine od najmanje 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb i 10 Kb. PoliA sekvenca može biti dužine od najviše 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb i 10 Kb.
[0219] U pojedinim slučajevima, poliA ili terminaciona sekvenca mogu uključivati, ali nisu ograničene na, sekvence kao što su SEQ ID No.49, SEQ ID No.50, SEQ ID No.51, SEQ ID No.52, SEQ ID No.53, SEQ ID No.54 i SEQ ID No.55.
[0220] U principu, poliA sekvence, koje su kao što je to ovde obezbeđeno, mogu uključivati, ali nisu ograničene na, bilo koje sekvence izabrane od PoliA regiona 1-10 koji su obezbeđeni na Sl.9A i Sl.9B.
[0221] U pojedinim slučajevima, poliA sekvence mogu biti optimizovane u kontekstu raznih parametara koji utiču na ekspresiju proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polu-život iRNK transgena u ćeliji, stabilnost iRNK transgena ili regulaciju transkripcije. Na primer, poliA sekvence mogu biti izmenjene tako da se poveća iRNK transkript transgena, što može dovesti do povećane proteinske ekspresije. U pojedinim slučajevima, poliA sekvence mogu biti izmenjene tako da se smanjii polu-život iRNK transkripta transgena, što može dovesti do smanjene proteinske ekspresije.
[0222] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljeni za stvaranje rekombinantnog virusa sadrže polinukleotid koji kodira humani sFLT-1 protein ili njegov funkcionalni fragment. U pojedinim slučajevima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljeni za stvaranje rekombinantnog virusa, sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira drugi anti-VEGF protein ili VEGF inhibitor.
[0223] U pojedinim slučajevima, VEGF inhibitor može uključivati, ali bez ograničenja, sekvence kao što su SEQ ID No.102, SEQ ID No.103, SEQ ID No.104, SEQ ID No.105, SEQ ID No.106, SEQ ID No.
107, SEQ ID No.108 ili SEQ ID No.122
[0224] U pojedinim slučajevima, nukleinske kiseline VEGF inhibitora mogu kodirati polipeptidne sekvence koje mogu uključivati, ali bez ograničenja, polipeptidne sekvence kao što su SEQ ID No.109 ili SEQ ID No.121.
[0225] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, sadrži regulatorni fragment nukleinske kiseline koji je sposoban da usmeri selektivnu ekspresiju sFLT-1 proteina u ćeliju oka. U pojedinim slučajevima, ćelije oka mogu podrazumevati pigmentne epitelne ćelije retine (RPE).
[0226] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, može sadržavati jedan ili više netranslatirajućih regiona (UTR) ili sekvenci. U principu, bilo koja pogodna UTR sekvenca može biti upotrebljena za željenu optimalnu ekspresiju transgena (tj. sFLT-1). Na primer, u pojedinim slučajevima, UTR regioni ili sekvence mogu sadržavati nativne sekvence. U pojedinim slučajevima, UTR sekvence mogu biti sekvence koje se nalaze uzvodno (5’ UTR) ili nizvodno (3'UTR) od humanog sFLT-1 gena, kao što je pronađeno u humanoj genomskoj sekvenci ili njenim delovima. U drugim slučajevima, UTR sekvence mogu sadržavati sekvence koje nisu nativne, kao što su one koje se mogu pronaći uzvodno ili nizvodno od gena koji nisu sFLT-1, ili sadrže sekvence koje dodatno sadrže kombinaciju jednog ili više elemenata UTR sekvenc,i koji su kao što je ovde dodatno opisano. U pojedinim slučajevima, upotrebljava se samo 5’ UTR sekvenca. U pojedinim slučajevima, upotrebljava se samo 3’ UTR sekvenca. U pojedinim slučajevima, ne upotrebljavaju se UTR sekvence.
[0227] UTR sekvenca može biti dužine od 1 - 10 bp, 10 - 20 bp, 20 - 50 bp, 50 - 100 bp, 100 - 500 bp, 500 bp - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb i 9Kb - 10 Kb. UTR sekvenca može biti dužine od od najmanje 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb i 10 Kb. UTR sekvenca biti dužine od najviše 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb i 10 Kb.
[0228] U principu, UTR sekvence koje su obezbeđene predmetnim opisom mogu uključivati, ali bez ograničavanja samo na, bilo koju sekvencu uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, SEQ ID No.
91, SEQ ID No.2, SEQ ID No.92, SEQ ID No.93, SEQ ID No.94, SEQ ID No.95, SEQ ID No.96, SEQ ID No.97, SEQ ID No.98, SEQ ID No.99, SEQ ID No.100 i SEQ ID No.101.
[0229] U pojedinim slučajevima, varijacije bilo 5'UTR i/ili 3'UTR mogu biti optimizovane da bi se ostvri željeni nivo ekspresije proteina. U pojedinim slučajevima, 3'UTR sekvence mogu biti optimizovane u kontekstu raznih parametara koji utiču na ekspresiju proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, polu-život iRNK transgena u ćeliji, stabilnost ili sekundarnu strukturu iRNK transgena ili kondicionalnu regulaciju (npr. vezivanjem raznih faktora za modulisanje translacije). Na primer, 3'UTR sekvenca može biti izmenjena tako da se poveća polu-život iRNK transkripta transgena, što može dovesti do povećane ekspresije proteina. U pojedinim slučajevima, 3'UTR sekvenca može biti izmenjena tako da se smanji polu-život iRNK transkripta transgena, što može dovesti do smanjene ekspresije proteina.
[0230] U principu, 3’ UTR sekvence mogu sadržavati razne elemente sekvenci. Predmetni opis obezbeđuje 3’ UTR sekvence koje mogu uključivati, ali nisu ograničene na, elemente sekvenci kao što su jedan ili više signala poliadenilacije, linkerske sekvence, spejserske sekvence, SECIS elementi, AU bogate ili ARE sekvence ili sekvence vezivanja miRNK ili RNKi, terminacione sekvence transkripcije, 3’ terminacione sekvence ili njihove varijante i/ili kombinacije.
[0231] U pojedinim slučajevima, 5'UTR sekvence mogu biti optimizovane u kontekstu raznih parametara koji utiču na ekspresiju proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, polu-život iRNK transgena u ćeliji, stabilnost ili sekundarnu strukturu iRNK transgena ili regulaciju transkripcije. Na primer, 5'UTR sekvence mogu biti izmenjene tako da se poveća efikasnost translacije iRNK transkripta transgena, što može dovesti do povećane ekspresije proteina. U pojedinim slučajevima, 5'UTR sekvence mogu biti izmenjene tako da se smanji efikasnost prevođenja iRNK transkripta transgena, što može dovesti do smanjene ekspresije proteina.
[0232] U principu, 5’ UTR sekvence mogu sadržavati razne elemente sekvenci. Predmetni opis obezbeđuje 5’ UTR sekvence koje mogu uključivati, ali nisu ograničene na, elemente sekvenci kao što su mesta vezivanja za ribozom (RBS), linkerske sekvence, spejserske sekvence, regulatorne sekvence, regulatorni elementi odgovora, ribo-“prekidači”, sekvence koje pospešuju ili inhibiraju inicijaciju translacije, regulatorne sekvence za transport iRNK ili njihove varijante i/ili kombinacije.
[0233] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa, može sadržavati jednu ili više linkerskih ili spejserskih sekvenci. Kao što je ovde opisano, termini linkerska sekvenca ili spejserska sekvenca mogu biti upotrebljavani naizmenično. U principu, linkerska sekvenca ili spejserska sekvenca mogu biti bilo koje pogodne sekvence koje se koriste za stvaranje nesusednih sekvenci između najmanje dva elementa sekvence. Na primer, prema jednom aspektu opisa, linkerska sekvenca se može naći insertovanom između ITR-1, 108 sekvence, ili ITR-2, 103, i sekvence gena rezistencije na antibiotike, 106, kao što je prikazano na Sl. 1A. U drugom primeru, linkerske sekvence mogu biti insertovane pored bilo kog elementa sekvence rekombinantnog virusa ili plazmida koji kodira rekombinantan virus, uključujući ITR sekvence, promotorske ili promotorske/pojačivačke sekvence, intronsku sekvencu, transgenu sekvencu i sekvencu poli A regiona. U principu, bilo koja pogodna linkerska ili spejserska sekvenca
4
može biti upotrebljena za stvaranje sekvenci koje nisu u kontinuitetu. Na primer, u pojedinim slučajevima, linkerske sekvence mogu biti nasumično generisane sekvence. U pojedinim slučajevima, linkerska sekvenca može biti nespecifična sekvenca optimizovana tako da se spreči obrazovanje sekundarne strukture ili unutarmolekulskih interakcije koje mogu štetno uticati na ekspresiju proteina. U pojedinim slučajevima, linkerske sekvence mogu sadržavati bilo koje dodatne elemente funkcionalne sekvence, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, introne, regulatorne sekvence, pojačivače ili slično. Funkcionalni elementi u linkerskim sekvencama mogu biti upotrebljeni za željenu optimalnu proizvodnju virusa i/ili ekspresiju transgene ekspresije. U pojedinim slučajevima, linkerske sekvence su mesta kloniranja, ostaci prethodnih mesta kloniranja ili druge sekvence koje nisu od posebnog značaja, pri čemu je insercija takvih linkerskih sekvenci između bilo koja dva elementa sekvenci opciona.
[0234] U principu, linkerska sekvenca, koja je kao što je to obezbeđeno predmetnim opisom, može uključivati, ali nije ograničeno na, bilo koju sekvencu izabranu od sekvenci koje su obezbeđene na Sl.
9D, Sl.9E i Sl.9F.
[0235] U pojedinim slučajevima, dužina linkerske sekvence može biti optimizovana za željenu optimalnu proizvodnju virusa i/ili ekspresiju transgene ekspresije. U pojedinim slučajevima, dužina jedne ili više linkerskih sekvenci koje se nalaze na jednom ili na više mesta u virusnom genomu ili plazmidu može biti promenjena tako da se proizvodi željena optimalna ekspresija proteina. Na primer, linkerska sekvenca se može pronaći između introna, kao što je ovde opisano, i transgena (tj. sFLT-1). Dužina linkerske sekvence može biti promenjena tako da proizvodi raznovrsna dejstva na transkripciju i naknadnu translaciju transgena u ćeliji.
[0236] Linkerska sekvenca može biti dužine od 1 - 10 bp, 10 - 20 bp, 20 - 50 bp, 50 - 100 bp, 100 - 500 bp, 500 bp - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb -9 Kb i 9Kb - 10 Kb. Linkerska sekvenca može biti dužine od najmanje 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb i 10 Kb. Linkerska sekvenca može biti dužine od najviše 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb i 10 Kb.
[0237] U pojedinim slučajevima, linkerska ili spejserska sekvenca može uključivati, ali nije ograničena na, SEQ ID No.60, SEQ ID No.61, SEQ ID No.62, SEQ ID No.63, SEQ ID No.64, SEQ ID No.65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID No.73, SEQ ID No.74, SEQ ID No.75, SEQ ID No.76, SEQ ID No.77, SEQ ID No.78, SEQ ID No.
79, SEQ ID No.80, SEQ ID No.81, SEQ ID No.82, SEQ ID No.83, SEQ ID No.84, SEQ ID No.85, SEQ ID No.86, SEQ ID No.87, SEQ ID No.88, SEQ ID No.89 i SEQ ID No.90.
[0238] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus sadrži sekvence sa invertovanim terminalnim ponovcima (ITR) koje se upotrebljavaju za pakovanje kasete za ekspresiju rekombinantnog gena u virion virusnog vektora. U pojedinim slučajevima, ITR je iz adeno-asociranog virusa (AAV). U pojedinim slučajevima, ITR je iz AAV serotipa 2. U pojedinim slučajevima, ITR može uključivati, ali nije ograničen na, SEQ ID No.56, SEQ ID No.57, SEQ ID No.58 ili SEQ ID No.59.
[0239] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za stvaranje rekombinantnog virusa sadrži elemente nukleinske kiseline po sledećem redosledu: a) prva ITR sekvenca; b) promotorska sekvenca; c) intronska sekvenca; d) prva UTR sekvenca; e) sekvenca koja kodira VEGF inhibitor; f) druga UTR sekvenca; g) poli A sekvenca; i h) druga ITR sekvenca. Prema pojedinim aspektima rekombinantnog virusa i/ili plazmida upotrebljenog za generisanje rekombinantnog virusa, promotorska sekvenca sadrži sekvencu promotora/pojačivača. Prema pojedinim aspektima, sekvenca koja kodira VEGF inhibitor sadrži sekvencu koja kodira humani sFLT-1 protein ili njegov funkcionalni fragment. Prema drugim aspektima, plazmid upotrebljen generisanje rekombinantnog virusa dalje sadrži sekvencu mesta početka replikacije, 102. Prema pojedinim aspektima, plazmid dalje sadrži sekvencu gena za rezistenciju na antibiotike, kao što je ovde obezbeđeno.
[0240] Prema pojedinim aspektima, rekombinantan virus i/ili plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa sadrži elemente nukleinske kiseline po sledećem redosledu: a) prva ITR sekvenca; b) prva linkerska sekvenca; c) promotorska sekvenca; d) druga linkerska sekvenca; e) intronska sekvenca; f) treća linkerska sekvenca; g) prva UTR sekvenca; h) sekvenca koja kodira VEGF inhibitor; i) druga UTR sekvenca; j) četvrta linkerska sekvenca; k) poli A sekvenca; 1) peta linkerska sekvenca; i m) druga ITR sekvenca. Prema pojedinim aspektima rekombinantnog virusa i/ili plazmida upotrebljenog za stvaranje rekombinantnog virusa, promotorska sekvenca sadrži sekvencu promotora/pojačivača. Prema pojedinim aspektima, sekvenca koja kodira VEGF inhibitor sadrži sekvencu koja kodira humani sFLT-1 protein ili njegov funkcionalni fragment. Prema drugim aspektima, plazmid upotrebljen za generisanje rekombinantnog virusa dalje sadrži sekvencu mesta početka replikacije. Prema pojedinim aspektima, plazmid dalje sadrži sekvencu gena za rezistenciju na antibiotike, kao što je ovde obezbeđeno.
IV. Farmaceutske kompozicije
[0241] Farmaceutska kompozicija je formulacija koja sadrži jedan ili više aktivnih sastojaka, kao i jedan ili više eksipijenasa, nosača, stabilizatora ili sredstava za povećanje mase, koji su pogodni za primenu humanom pacijentu da bi se postigao željeni dijagnostički rezultat ili terapijski ili profilakstički efekat. Za stabilnost tokom skladištenja i za pogodnost rukovanja, farmaceutska kompozicija može biti formulisana tako da bude liofilizovana (tj. sušena zamrzavanjem), ili u vidu praha osušenog pod vakuumom, a koji zatim može biti rekonstituisan pre primene pacijentu, sa fiziološkim rastvorom ili vodom. Alternativno, farmaceutska kompozicija može biti formulisana kao vodeni rastvor. Farmaceutska kompozicija može sadržavati proteinski aktivni sastojak. Nažalost, za proteine je moguće da ih je veoma teško stabilizovati, što dovodi do gubitka proteina i/ili gubitka proteinske aktivnosti tokom formulisanja, rekonstitucije (ukoliko je potrebna), kao i tokom skladištenja pre upotrebe farmaceutske kompozicije koja sadrži proteine. Problemi sa stabilnošću mogu nastati zbog denaturacije proteina, njihove razgradnje, dimerizacije i/ili polimerizacije. Razni eksipijensi, poput albumina i želatina, upotrebljavani su sa različitim stepenom uspeha u pokušaju da se stabilizuje proteinski aktivan sastojak koji je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji. Pored toga, upotrebljavani su i krioprotektanti, kao što su alkoholi, radi smanjenja denaturacije proteina u uslovima zamrzavanja tokom liofilizacije.
[0242] Farmaceutske kompozicije pogodne za unutrašnju upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove, za privremenu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija koji se mogu injecirati. Za intravensku primenu, pogodni nosači obuhvataju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu ili fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i potrebno je da bude tečna do obima koji omogućava laku primenu putem šprica. Kompozicija mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti u stanju da se može lako očuvati u kontekstu kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), kao i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost može biti održavana, na primer, upotrebom premaza kao što su oni sa lecitinom, kao i održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata kao što su polisorbati (Tween™), natrijum dodecil sulfat (natrijum lauril sulfat), lauril dimetil amin oksid, cetiltrimetilamonijum bromid (CTAB), polietoksilisani alkoholi, polioksietilen sorbitan, oktoksinol (Triton X100™), N,N-dimetildodecilamin-N-oksid, heksadeciltrimetilamonijum bromid (HTAB), polioksil 10 lauril etar, Brij 721™, žučne soli (natrijum deoksiholat, natrijum holat), pluronske kiseline (F-68, F-127), polioksil ricinusovo ulje (Cremophor™), nonilfenol etoksilat (Tergitol™), ciklodekstrini i etilbenzetonijum hlorid (Hyamine™). Prevencija dejstva mikroorganizama može biti
4
postignutom raznim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i sličnima. U mnogim slučajevima, poželjno je da u kompoziciju budu uključeni izotonični agensi, na primer, šećeri i polialkoholi, poput manitola, sorbitola, natrijum hlorida. Produžena apsorpcija unetih kompozicija može biti postignuta uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0243] Sterilni rastvori mogu biti pripremani ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnu količinu odgovarajućeg rastvarača, sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka koji su prethodno nabrojani, ukoliko je to potrebno, nakon čega sledi sterilizacija filtriranjem. U principu, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži bazni medijum za disperziju i potrebne druge sastojke od onih koji su prethondo nabrojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injeciranje, postupci pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem kojima se dobija prah aktivnog sastojka sa dodatnim željenim sastojkom iz njihovog rastvora koji je prethodno sterilisan filtriranjem.
[0244] Prema jednom aspektu, aktivna jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog uklanjanja iz organizma, kao što je to u formulaciji sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i sisteme za isporuku sa mikroinkapsulacijom. Mogu biti upotrebljeni biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polanhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoesteri i polimlečna kiselina. Postupci pripreme takvih formulacija biće očigledni stručnjacima iz oblasti tehnike. Materijali mogu takođe biti nabavljeni komercijalno. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome sa ciljanim dejstvom na inficirane ćelije sa monoklonskim antitelima na virusne antigene) mogu takođe biti upotrebljavani kao farmaceutski prihvatljivi nosači. One mogu biti pripremane prema postupcima poznatim stručnjacima iz oblasti tehnike, na primer, kao što je opisano u U.S. Pat. No.4,522,811.
[0245] Posebnom prednošću se smatra formulisanje oralnih ili parenteralnih kompozicija u jedinične dozne oblike radi lake primene i ujednačenosti doza. Jedinični dozni oblik koji se ovde upotrebljava, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su prilagođene tako da predstavljaju jedinične doze za humanog subjekta koji će biti lečen; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja koja je izračunata tako da se proizvede željeni terapijski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne oblike opisa je diktirana ili je direktno zavisna od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i konkretnog terapijskog efekta koji je potrebno postići, a ograničena je inherentnim karakteristikama jedinjenja poput aktivnog jedinjenja za lečenje pojedinaca.
[0246] Farmaceutske kompozicije mogu biti sadržane unutar kontejnera, pakovanja ili dozatora zajedno sa uputstvima za primenu.
[0247] Farmaceutske kompozicije opisa obuhvataju bilo koje od farmaceutski prihvatljivih soli, estara ili soli takvih estara, ili bilo koje drugo jedinjenje koje je, nakon primene životinji, uključujući i čoveka, sposobno da obezbedi (direktno ili indirektno) biološki aktivan metabolit ili njegov ostatak. Shodno navedenom, opis se, na primer, takođe odnosi na prolekove i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja opisa, farmaceutski prihvatljive soli takvih prolekova i druge bio-ekvivalente.
[0248] Termin "prolek" ukazuje na terapijsko sredstvo koje je pripremljeno u neaktivnom obliku, a koje se zatim prevodi u aktivan oblik (tj. lek) unutar tela ili njegovih ćelija, delovanjem endogenih enzima ili hemikalija i/ili uslova.
[0249] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja opisa: tj. soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne dodeljuju mu neželjena toksikološka dejstva.
[0250] Farmaceutski prihvatljive adicione soli sa bazom obrazuju se sa metalima ili aminima, kao što su alkalni i zemnoalkalni metali ili organski amini. Metali upotrebljeni kao katjoni uključuju natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slične. Amini podrazumevaju N-N'-dibenziletilendiamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, dicikloheksilamin, etilendiamin, N-metilglukamin i prokain (pogledati, na primer, Berge i saradnici, "Pharmaceutical Salts", J. Pharma Sci., 1977, 66, 119). Bazne adicione soli navedenih kiselih jedinjenja se pripremaju kontaktom oblika slobodne kiseline sa dovoljnom količinom željene baze, da bi se proizvela so na uobičajeni način. Oblik slobodne kiseline može biti povratno dobijen kontaktom oblika soli sa kiselinom i izolovanjem slobodne kiseline na uobičajen način. Oblik slobodne kiseline se donekle razlikuju od njihovih odgovarajućih oblika soli po određenim fizičkim svojstvima, kao što je to rastvorljivost u polarnim rastvaračima, ali su inače, za potrebe ovog opisa, soli ekvivalentne njihovoj slobodnoj kiselini.
[0251] Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutska adiciona so" sadrži farmaceutski prihvatljivu so kiselog oblika jedne od komponenti kompozicija opisa. One obuhvataju organske ili neorganske kisele soli amina. Poželjne kisele soli su hidrohloridi, acetati, salicilati, nitrati i fosfati. Druge pogodne farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike i sadrže bazne soli raznih neorganskih i organskih kiselina, kao što su, na primer, sa neorganskim kiselinama poput, na primer, hlorovodonične kiseline, bromovodične kiseline, sumporne kiseline ili fosforne kiseline; sa organskim karboksilnim, sulfonskim, sulfo ili fosfo kiselinama ili N-supstituisanim sulfaminskim kiselinama, na primer, sa sirćetnom kiselinom, propionskom kiselinom, glikolnom kiselinom, ćilibarnom kiselinom, maleinskom kiselinom, hidroksimaleinskom kiselinom, metilmaleinskom kiselinom, fumarnom kiselinom, jabučnom kiselinom, vinskom kiselinom, mlečnom kiselinom,
4
oksalnom kiselinom, glukonskom kiselinom, glukarinskom kiselinom, glukuronskom kiselinom, limunskom kiselinom, benzoevom kiselinom, cimetnom kiselinom, bademovom kiselinom, salicilnom kiselinom, 4-aminosalicilnom kiselinom, 2-fenoksibenzoevom kiselinom, 2-acetoksibenzoevom kiselinom, embonskom kiselinom, nikotinskom kiselinom ili izonikotinskom kiselinom; i sa aminokiselinama, kao što je to 20 alfa-aminokiselina uključenih u sintezu proteina u prirodi, na primer, sa glutaminskom kiselinom ili asparaginskom kiselinom, kao i sa fenilacetatnom kiselinom, metansulfonskom kiselinom, etansulfonskom kiselinom, 2-hidroksietansulfonskom kiselinom, etan-1,2-disulfonskom kiselinom, benzensulfonskom kiselinom, 4-metilbenzensulfonskom kiselinom, naftalen-2-sulfonskom kiselinom, naftalen-1,5-disulfonskom kiselinom, 2- ili 3-fosfogliceratom, glukoza-6-fosfatom, N-cikloheksilsulfaminskom kiselinom (uz obrazovanje ciklamata) ili sa drugim kiselim organskim jedinjenjima, kao što je askorbinska kiselina. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja mogu takođe biti pripremljene sa farmaceutski prihvatljivim katjonom. Pogodni farmaceutski prihvatljivi katjoni su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike i obuhvataju alkalne, zemnoalkalne, amonijumske i kvarternarne amonijumske katjone. Mogući su i karbonati ili hidrogenkarbonati. Za oligonukleotide, poželjni primeri farmaceutski prihvatljivih soli obuhvataju, ali nisu ograničeni na: (I) soli obrazovane sa katjonima kao što su natrijuma, kalijuma, amonijuma, magnezijuma, kalcijuma, poliamida poput spermina i spermidina i sličnih; (II) kisele adicione soli obrazovane sa neorganskim kiselinama, na primer, sa hlorovodoničnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, fosfornom kiselinom, azotnom kiselinom i sličnima; (III) soli obrazovane sa organskim kiselinama kao što su, na primer, sirćetna kiselina, oksalna kiselina, vinska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, glukonska kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, askorbinska kiselina, benzoeva kiselina, taninska kiselina, palmitinska kiselina, alginska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, naftalendisulfonska kiselina, poligalakturonska kiselina i slične; i (IV) soli obrazovane od elementarnih anjona kao što su hlor, brom i jod.
[0252] Farmaceutske kompozicije predmetnog opisa obuhvataju, ali bez ograničavanja samo na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ovakve kompozicije mogu biti generisane od raznih komponenti koje sadrže, ali bez ograničavanja samo na, prethodno obrazovane tečnosti, samoemulgujuće čvrste supstance i samoemulgujuće polučvrste supstance.
[0253] Određene kompozicije predmetnog opisa takođe uključuju jedinjenja nosača u formulaciji. Kao što se ovde upotrebljava, "jedinjenje nosača" ili "nosač" se može odnositi na nukleinsku kiselinu, ili njen analog, koji je inertan (tj. sam po sebi nema biološku aktivnost), ali je prepoznat kao nukleinska kiselina sa in vivo procesima koji smanjuju bioraspoloživost nukleinske kiseline sa biološkom aktivnošću, na primer, razgradnjom biološki aktivne nukleinske kiseline ili pospešivanjem
4
njenog uklanjanja iz cirkulacije. Istovremena primena nukleinske kiseline i jedinjenja nosača, uglavnom sa supstancom koja je druonavedena u višku, može dovesti do značajnog smanjenja količine nukleinske kiseline, a koja se izdvaja u jetri, bubrezima ili drugim rezervoarima van cirkulacije, verovatno usled kompeticije između jedinjenja nosača i nukleinske kiseline za zajednički receptor. Na primer, izdvajanje delimično fosforotioatnog oligonukleotida u tkivu jetre može biti smanjeno kada se isti primeni istovremeno sa poliinozininskom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidnom kiselinom ili 4-acetamido-4'izotiocijano-stilben-2,2-disulfonskom kiselinom (Miyao i saradnici, Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura i saradnici, Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
[0254] Vektorski ili rekombinantni virusi (virioni) mogu biti ugrađeni u faceutske kompozicije za primenu sisarskim pacijentima, posebno ljudima. Vektor ili virioni mogu biti formulisani u netoksičnim, inertnim, farmaceutski prihvatljivim vodenim nosačima, poželjno sa pH opsega od 3 do 8, poželjnije opsega od 6 do 8. Takve sterilne kompozicije će sadržavati vektor ili virion koji sadrži nukleinsku kiselinu, koja kodira terapijski molekul, rastvoren u vodenom puferu koji ima prihvatljiv pH nakon rekonstitucije.
[0255] Prema pojedinim aspektima, farmaceutske kompozicije koji su ovde obezbeđene, sadrže terapijski efektivnu količinu vektora ili viriona, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i/ili ekscipijensom, na primer fiziološkim rastvorom, fiziološki rastvorom puferisanim fosfatom, fosfatom i aminokiselinama, polimerima, poliolima, šećerom, puferima, konzervansima i drugim proteinima. Aminokiseline, polimeri i šećeri i slično za primer su: jedinjenja oktilfenoksi polietoksi etanola, jedinjenja polietilen glikol monostearata, estri polioksietilen sorbitan masnih kiselina, saharoza, fruktoza, dekstroza, maltoza, glukoza, manitol, dekstran, sorbitol, inozitol galaktitol, ksilitol, laktoza, trehaloza, goveđi ili humani serumski albumin, citrat, acetat, Ringerov i Hankov rastvor, cistein, arginin, karnitin, alanin, glicin, lizin, valin, leucin, polivinilpirolidon, polietilen i glikol. Poželjno je da je ovakva formulacija stabilna najmanje šest meseci na 4°C.
[0256] Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija koja je ovde obezbeđena, sadrži pufer, kao što su fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS) ili natrijum fosfat/natrijum sulfat, tris pufer, glicinski pufer, sterilna voda i drugi puferi koji su poznati prosečno iskusnim stručnjacima, poput onih opisanih u Good i saradnici (1966) Biochemistry 5:467. pH pufera u kome se nalazi farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-VEGF u sistemu za isporuku adenovirusnih vektora, može biti opsega od 6,5 do 7,75; 7 do 7,5 ili 7,2 do 7,4. pH formulacije može biti opsega od oko 3,0 do oko 12,0. pH imunogene kompozicije može biti najmanje oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 pH jedinica. pH imunogene kompozicije može biti najviše oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 pH jedinica.
4
[0257] Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija koja je ovde obezbeđena sadrži supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, poput natrijum karboksimetil celuloze, sorbitola ili dekstrana, u količini od oko 1-10 procenata, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 procenata.
[0258] Određeni aspekti opisa obezbeđuju farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više rekombinantnih virusa i jedan ili više drugih hemoterapijskih agenasa.
[0259] Primeri takvih hemoterapijskih sredstava obuhvataju, ali nisu ograničeni na, lekove protiv kancera, kao što su daunorubicin, daktinomicin, doksorubicin, bleomicin, mitomicin, azotni iperit, hlorambucil, melfalan, ciklofosfamid, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin (CA), 5-fluorouracil (5-FU), floksuridin (5-FUdR), metotreksat (MIX), kolhicin, vinkristin, vinblastin, etopozid, tenipozid, cisplatin i dietilstilbestrol (DES). Radi opšteg pregleda, pogledati The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15.izd., Berkow i saradnici, ur., 1987, Rahway, N.J., strane 1206-1228).
[0260] Anti-inflamatorni lekovi, koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, nesteroidne antiinflamatorne lekove i kortikosteroide, kao i antivirusni lekovi, koji obuhvataju, ali nije ograničeni na, ribivirin, vidarabin, aciklovir i ganciklovir, mogu se takođe kombinovati sa kompozicijama opisa (The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15.izd., Berkow i saradnici, ur., 1987, Rahway, N.J., strane 1206-1228 i 46-49, tim redom). Drugi hemoterapijski agensi koji nisu tipa antisens terapeutika mogu takođe biti obuhvaćeni obimom ovog opisa. Dva ili više kombinovanih jedinjenja mogu biti upotrebljavani zajedno ili sekvencijalno.
[0261] Prema drugom srodnom aspektu, kompozicije opisa mogu sadržavati jedan ili više rekombinantnih virusa sa sFLT-1, prevashodno sa različitim sekvencama. Dva ili više kombinovanih virusa mogu biti upotrebljavani zajedno ili sekvencijalno.
[0262] Prema drugom aspektu, predmetni opis obezbeđuje jediničnu dozu farmaceutske kompozicije koja sadrži oko 1 x 10<6>oko 1 x 10<15>virusnih genoma, pri čemu virusi sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira sFLT-1.
[0263] U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa može biti izmerena u vidu pfu (jedinica obrazovanja plakova). U pojedinim slučajevima, pfu jedinične doze farmaceutske kompozicije opisa je najmanje oko 1x10<8>do oko 5x10<10>pfu. U pojedinim slučajevima, pfu jedinične doze farmaceutske kompozicije opisa je najmanje oko 1x10<8>, 2x10<8>, 3x10<8>, 4x10<8>, 5x10<8>, 6x10<8>, 7x10<8>, 8x10<8>, 9x10<8>, 1x10<9>, 2x10<9>, 3x10<9>, 4x10<9>, 5x10<9>, 6x10<9>, 7x10<9>, 8x10<9>, 9x10<9>, 1x10<10>, 2x10<10>, 3x10<10>, 4x10<10>i 5x10<10>pfu. U pojedinim slučajevima, pfu jedinične doze farmaceutske kompozicije opisa je najviše oko 1x10<8>, 2x10<8>, 3x10<8>, 4x10<8>, 5x10<8>, 6x10<8>, 7x10<8>, 8x10<8>, 9x10<8>, 1x10<9>, 2x10<9>, 3x10<9>, 4x10<9>, 5x10<9>, 6x10<9>, 7x10<9>, 8x10<9>, 9x10<9>, 1x10<10>, 2x10<10>, 3x10<10>, 4x10<10>i 5x10<10>pfu.
[0264] U pojedinim slučajevima, virusni vektor opisa može biti izmeren u vidu genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je sa 1x10<10>do 3x10<12>
4
genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je sa 1x10<9>do 3x10<13>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je sa 1x10<10>do 1x10<11>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je sa 1x10<8>do 3x10<14>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je sa najmanje oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je sa 1x10<8>do 3x10<14>genoma vektora. U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa je najviše sa oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>genoma vektora.
[0265] U pojedinim slučajevima, jedinična doza farmaceutske kompozicije opisa može biti izmerena upotrebom multipliciteta infekcije (MOI). U pojedinim slučajevima, MOI se može odnositi na odnos, ili na višestrukost prisustva genoma vektora ili virusa u ćelijama u koje nukleinski materijal može biti isporučen. U pojedinim slučajevima, MOI može biti 1x10<6>. U pojedinim slučajevima, MOI može biti 1x10<5>-1x10<7>. U pojedinim slučajevima, MOI može biti 1x10<4>-1x10<8>. U pojedinim slučajevima, rekombinantnih virusa opisa je najmanje oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>MOI. U pojedinim slučajevima, rekombinantnih virusa opisa je 1x10<8>do 3x10<14>MOI. U pojedinim slučajevima, rekombinantnih virusa opisa je najviše oko 1x10<1>, 1x10<2>, 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, 1x10<10>, 1x10<11>, 1x10<12>, 1x10<13>, 1x10<14>, 1x10<15>, 1x10<16>, 1x10<17>i 1x10<18>MOI.
[0266] Prema pojedinim aspektima, nukleinska kiselina može biti isporučiti bez upotrebe virusa (tj. vektorima koji nisu virusni) i može biti izmerena kao količina nukleinske kiseline. U principu, bilo koja pogodna količina nukleinske kiseline može biti upotrebljena sa kompozicijama i postupcima ovog opisa. U pojedinim slučajevima, količina nukleinske kiseline može iznositi najmanje oko 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 µg, 10 µg, 100 µg, 200 µg, 300 µg, 400 µg, 500 µg, 600 µg, 700 µg, 800 µg, 900 µg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ili 5 g. U pojedinim slučajevima, nukleinska kiselina može iznositi najviše oko 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 µg, 10 µg, 100 µg, 200 µg, 300 µg, 400 µg, 500 µg, 600 µg, 700 µg, 800 µg, 900 µg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ili 5 g.
4
[0267] Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija sadrži oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<15>rekombinantnih virusa, oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<14>rekombinantnih virusa, oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<13>rekombinantnih virusa, oko 1 x 10<9>do oko 3 x 10<12>rekombinantnih virusa ili oko 1 x 10<10>do oko 3 x 10<12>rekombinantnih virusa.
Kompleti
[0268] Kompozicije i reagensi korisni za predmetni opis, mogu biti upakovani u komplete, da bi se olakšala primena premetnog opisa. Prema pojedinim aspektima, predmetni postupak obezbeđuje komplet koji sadrži rekombinantnu nukleinsku kiselinu opisa. Prema pojedinim aspektima, predmetni postupak obezbeđuje komplet koji sadrži rekombinantan virus opisa. Uputstva mogu biti u bilo kom željenom obliku, uključujući, ali ne ograničavajući se na, štampani materijal u vidu umetka u kompletu, štampani materijal na jednom ili na više kontejnera, kao i elektronski uskladištena uputstva koja se obezbeđuju na elektronskom medijumu za skladištenje poput medijuma za skladištenje koji se može očitati na računaru. Na medijumu za skladištenje koji se može očitati na računaru, po izvoru, može biti uključen i softverski paket koji omogućava korisniku da integriše informacije i izračuna kontrolnu dozu.
[0269] Prema sledećem aspektu, predmetni opis obezbeđuje komplet koji sadrži farmaceutske kompozicije koje su ovde obezbeđene. Prema još jednom aspektu, opis obezbeđuje komplete za lečenje oboljenja kao što su, na primer: AMD, DME, RVO, bolesti srodne sa angiogenezom, kancer, autoimuna oboljenja, oboljenja prouzrokovana infektivnim organizmima i slična.
[0270] Prema jednom aspektu, komplet sadrži: (a) rekombinantan virus koji je ovde obezbeđen i (b) uputstva za primenu, ćelijama ili osobama, terapijski efektivne količine rekombinantnog virusa. Prema pojedinim aspektima, komplet može sadržavati farmaceutski prihvatljive soli ili rastvore za primenu rekombinantnog virusa. Po izboru, komplet može dalje sadržavati uputstva za odgovarajuće radne parametre u vidu nalepnice ili odvojenog umetka. Na primer, komplet može imati standardna uputstva koja obaveštavaju lekara ili laboratorijskog tehničara kako da pripremi dozu rekombinantnog virusa.
[0271] Po izboru, komplet može dalje sadržavati standardne ili kontrolne informacije, tako da se uzorak pacijenta može uporediti sa standardom kontrolnih informacija da bi se utvrdilo da li je ispitivana količina rekombinantnog virusa terapijska količina koja je u skladu sa, na primer, smanjenjem tumora. Po izboru, komplet može dalje sadržavati uređaje za primenu, kao što su špric, igla sa filterom, duga cevčica, kanila i subretinalni injektor.
[0272] Rekombinantni virusi mogu biti generisani na bilo koji pogodan način. Postupci i kompozicije, kao i opis, obezbeđuju stvaranje rekombinantnog virusa raznim načinima, uključujući upotrebu transgenih ćelija, koje mogu uključivati sisarske ćelije, ćelije insekata, životinjske ćelije ili ćelije gljivica.
[0273] Na primer, prema pojedinim aspektima, rekombinantni virusi mogu biti generisani transfekcijom ćelija insekata putem rekombinantnog bakulovirusa. U pojedinim slučajevima, rekombinantni bakulovirus može biti generisan kao posrednik, pri čemu bakulovirus može sadržavati sekvence koje su neophodne za stvaranje drugih virusa, poput AAV ili rAAV2 virusa. U pojedinim slučajevima, jedan ili više bakulovirusa mogu biti upotrebljeni u generisanju rekombinantnih virusa koji se upotrebljavaju za kompoziciju i postupke lečenja ovog opisa. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni ćelije insekata kao što su Sf9, High-Five ili Sf21 ćelijske linije. U pojedinim slučajevima, ćelijske linije mogu biti generisane tranzijentnim postupcima (tj. infekcijom sa nestabilno integrisanim transgenima.) U drugim slučajevima, ćelijske linije mogu biti generisane stvaranjem stabilnih ćelijskih linija (tj. infekcijom sa transgenima koji su stabilno integrisani u genom ćelije domaćina).) Prema drugim aspektima, farmaceutska kompozicija koji je ovde obezbeđena se proizvodi upotrebom adherentnih humanih embrionalnih HEK-293 ćelija bubrega (HEK293). Prema alternativnom aspektu, ovde obezbeđena farmaceutska kompozicija se proizvodi upotrebom HEK293 ćelija prilagođenih za rast u suspenzijama. Prema sledećem aspektu, ovde obezbeđena farmaceutska kompozicija se proizvodi upotrebom bakulovirusnog ekspresionog sistema (BVES) u ćelijama insekata. Prema pojedinim aspektima, vektor se proizvodi upotrebom herpes-pomoćnog virusa. Prema pojedinim aspektima, vektor se proizvodi postupcima kloniranja u proizvođaču. Prema pojedinim aspektima, vektor se proizvodi upotrebom Ad-AAV.
[0274] U principu, bilo koji pogodan postupak može biti upotrebljen u biohemijskom prečišćavanju rekombinantnih virusa za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji koja je kao što je ovde opisano. Rekombinantni virusi mogu biti prikupljani direktno iz ćelija ili iz medijuma za kulturu koji okružuje ćelije domaćine. Virus može biti prečišćen upotrebom raznih biohemijskih sredstava, kao što su to gel filtracija, filtracija, hromatografija, afinitetno prečišćavanje, gradijentno ultracentrifugiranje ili postupci izdvajanja prema veličini. Rekombinantan virus može biti ispitan u kontekstu sadržaja (tj. identiteta), čistoće ili potencije (tj. aktivnost), upotrebom bilo kog pogodnog načina, a pre formulisanja u farmaceutsku kompoziciju. Postupak može uključivati, ali nije ograničen na, imunotestove, ELISA, SDS-PAGE, imunoblot, “Northern”-blot, “Southern”- blot ili PCR postupke, HUVEC testove i slično.
V. Postupak lečenja
[0275] Prema sledećem aspektu, predmetni opis je obezbedio postupak za lečenje oboljenja srodnog patološkoj angiogenezi, koji obuhvata primenu farmaceutski efektivne količine farmaceutske
1
kompozicije koja je ovde obezbeđena, humanom subjektu kome je takvo lečenje potrebno. Prema pojedinim aspektima, oboljenje je izabrano iz grupe očnih neovaskularnih oboljenja koja se sastoje od: senilne makularne degeneracije (AMD), vlažne-AMD, suve-AMD, retinalne neovaskularizacije, horoidne neovaskularizacije dijabetesne retinopatije, proliferativne dijabetesne retinopatije, okluzije retinalne vene, okluzija centralne retinalne vene, okluzije razgranate retinalne vene, dijabetesnog makularnog edema, dijabetesne ishemije retine, ishemijske retinopatije i dijabetesnog retinalnog edema.
[0276] U pojedinim slučajevima, može biti lečena suva AMD. U pojedinim slučajevima, suva AMD može biti označena kao centralna geografska atrofija, koju karakteriše atrofija retinalnog pigmentnog epitela koji se nalazi ispod retine, kao i potonji gubitak fotoreceptora u centralnom delu oka. Kompozicija i postupci ovog opisa obezbeđuju lečenje bilo kod od i svih oblika AMD.
[0277] Prema drugom aspektu, predmetni opis obezbeđuje postupak za profilaktičko lečenje AMD ili očnih neovaskularnih oboljenja, koja su kao što je ovde opisano, koji obuhvata primenu farmaceutski efektivne količine farmaceutskih kompozicija koje su ovde obezbeđene, humanom subjektu kome je takvo lečenje potrebno. Predmetni opis može biti upotrebljen za lečenje pacijenata kod kojih postoji rizik razvoja AMD ili koji ispoljavaju rane simptome oboljenja. Navedno može uključivati tretman očiju bilo istovremeno ili sekvencijalno. Istovremeni tretman može označavati tretman koji se primenjuje na svako oko u isto vreme ili kada se oba oka tretiraju tokom iste posete ordinirajućem lekaru ili drugom zdravstvenom radniku. Dokumentovano je i da su pacijenti sa većim rizikom razvoja AMD u zdravom oku ukoliko susedno oko ispoljava simptome AMD, ili kod pacijenata koji su sa genetičkom predispozicijom za razvoj AMD. Predmetni opis može biti upotrebljen kao profilaktički tretman u prevenciji AMD u susednom oku.
[0278] Iako mehanizam u osnovi povećanog rizika za progresiju očne neovaskularne bolesti u susednom oku nije poznat, postoji više studija u oblasti tehnike koje detaljno opisuju ovakav povišeni rizik. Na primer, u jednoj takvoj studiji velikog obima, uočena je progresija do uznapredovale AMD u prethodno zdravim susednim očima kod 110 slučajeva, dok se horoidna neovaskularizacija (CNV) razvila u prethodno zdravim susednim očima kod 98 slučajevima i fovealna geografska atrofija (GA) u 15 sluajeva. Ophthalmologica. 2011;226(3):110-8. doi: 10.1159/000329473. Curr Opin Ophthalmol. jun 1998.;9(3):38-46. Nijedna karakteristika koja nije bila povezana sa očnim statusom (starost, pol, istorija hipertenzije ili pušenja) ili očna karakteristika ispitivanog oka na početku (sastav lezije, veličina lezije ili oštrina vida) nisu bile osnov da se predvidi progresiju do uznapredovale AMD u ovoj kohorti. Ipak, statistička analiza ukazuje da su simptomi AMD prvog oka, uključujući veličinu drusena, fokalnu hiperpigmentaciju i nefovealnu geografsku atrofiju, bili sa značajnim nezavisnim odnosima u proceni rizika za razvoja AMD u drugom oku. Skorašnje studije su takođe ukazale da karakteristike
2
očiju, genetički faktori i određeni faktori sredine mogu imati ulogu u povećanom riziku razvoja AMD u susednom oku. JAMA Ophthalmol. april 2013;131(4):448-55.doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578. S obziorm na dobro okarakterisan povišen rizik od razvoja AMD kod netretiranih susednih očiju, postoji potreba u oblasti tehnike za postupcima prevencije početka i naknadnog gubitka vida usled oboljenja.
[0279] Termini "subjekat", "pojedinac" ili "pacijent", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na pojedince koji boluju od oboljenja ili poremećaja ili za koje se sumnja da boluju od oboljenja ili poremećaja i slično. Termini subjekat, pojedinac ili patent mogu biti upotrebljavani naizmenično u prikazu opisa i obuhvatati sisare i životinje koje nisu sisari. Primeri sisara obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bilo kog člana klase sisara: ljude, primate koji nisu ljudi, poput šimpanzi i drugih vrsta čovekolikih majmuna i majmuna; domaće životinje kao što su goveda, konji, ovce, koze, svinje; kućne ljubimce kao što su zečevi, psi i mačke; laboratorijske životinje uključujući glodare, kao što su pacovi, miševi i zamorci, i slično. Primeri životinja koje nisu sisari obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ptice, ribe i slično. Prema pojedinim aspektima postupaka i kompozicija koje su ovde obezbeđeni, sisar je čovek.
[0280] Termini "subjekat" ili "pojedinac" takođe obuhvataju ljude koji pate od poremećaja ili oboljenja, starosti od 20 i više godina. Neočekivano, predmetni opis može biti upotrebljen u različitim uzrastima pacijenata. Navedeno obuhvata mlađe pacijente koji uglavnom nisu povezani sa AMD oboljenjem, koje se češće javlja kod pacijenata starijih od 65 godina. Humani subjekti ili pacijenti opisa mogu uključivati uzraste od najmanje oko 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 godina. Humani subjekti ili pacijenti opisa mogu uključivati starost od najviše 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 godina.
[0281] Prema pojedinim aspektima, termini "subjekat" ili "pojedinac" uključuju pacijente sa različitim odgovorima na penicilin, poput rezistencije ili osetljivosti na njegove efekte ili pacijente koji pokazuju ili im nedostaju simptomi alergijskog odgovora na lek.
A. Postupak isporuke
[0282] Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje na subretinalna mesta, upotrebom bilo koje postupka usmerene primene. U pojedinim slučajevima, postupak isporuke može biti injeciranjem, kao što su oni opisani u US Pat Pub. No. 2010008170. U pojedinim slučajevima, direktna primena na subretinalna mesta obuhvata injeciranje tečne farmaceutske kompozicije putem šprica. U drugom primeru, direktna primena može uključivati injeciranje putem kanile ili drugog pogodnog instrumenta za isporuku vektora ili rekombinantnog virusa. U ostalim primerima, direktna primena može podrazumevati implant koji dalje sadrži odgovarajući vektor za isporuku transgena, kao što je sFLT-1. U pojedinim slučajevima, implant može biti ugrađen bilo direktno u mrežnjaču ili blizu nje.
[0283] Centralna retina, makula i regioni fovee u retini su jedinstveni među sisarima do primata. Štaviše, postoje jasne razlike u anatomiji i naknadnoj patogenezi AMD između primata i ljudi. Centralna retina je oblast mrežnjače koja okružuje zadnji pol između vaskularnih arkada oka primata, a koja obuhvata foveu, makulu i okolno područje. Makula je blizu centra mrežnjače i prečnika je od približno 1,5 mm. Ovo područje sadrži najveću koncentraciju fotoreceptora kako tipa štapića tako i tipa čepića. U središtu makule je fovea, mala jama koja sadrži najveću koncentraciju fotoreceptora tipa čepića. Regioni makule i fovee mrežnjače takođe sadrže RPE ćelije koje su u osnovi. Ovi regioni retine su odgovorna za percepciju finih detalja (oštrinu) i boje. Kako je ovo područje odgovorno za najvažniji deo humanog vida (fini vid), poželjno je bezbedno i efektivno ciljano delovanje vektora na subretinalni prostor makule i fovee. U pojedinim slučajevima, farmaceutska kompozicija opisa se primenjuje u centralnu retinu. U pojedinim slučajevima, primenja se vrši u središnji region retine izvan fovee.
[0284] Ukratko, opšti postupak za isporuku vektora u subretinalni prostor makule i fovee može biti ilustrovan putem kratkog pregleda koji sledi. Navedeni primer služi samo za ilustraciju određenih karakteristika postupka i nije predviđeno da bude ograničavajući na bilo koji način.
[0285] U principu, vektor može biti isporučen u obliku suspenzije koja se injecira intraokularno (subretinalno) uz direktno praćenje postupka upotrebom operativnog mikroskopa. Navedena procedura može uključivati vitrektomiju praćenu injeciranjem suspenzije vektora u subretinalni prostor, upotrebom fine kanile, a putem jedne ili više manjih retinotomija.
[0286] Ukratko, infuziona kanila može biti prišvršćena na mesto ušiovanjem/šavom, da bi se održala normalna globalna zapremina, infuzijom (na primer, fiziološkog rastvora) tokom celokupne operacije. Vitrektomija se izvodi upotrebom kanile odgovarajuće veličine otvora (na primer, promera od 20 do 27 G), pri čemu se zapremina gela staklastog tela koji se uklanja zamenjuje infuzijom fiziološkog rastvora ili drugog izotoničnog rastvora iz infuzione kanile. Prednost izvođenja vitrektomija je što (1) uklanja koru staklastog tela (zadnju hijaloidnu membranu) i olakšava prodiranje kanile kroz retinu; (2) uklanja staklasto telo i zamenjuje ga tečnošću (npr. fiziološkim rastvorom), što stvara prostor za prilagođavanje intraokularnom injeciranju vektora i (3) kontrolisano uklanjanje staklastog gela smanjuje mogućnost cepanja retine i neplanirano odvajanja mrežnjače.
[0287] Prema pojedinim aspektima, vektor se direktno injecira u subretinalni prostor unutar centralne retine, korišćenjem kanile odgovarajuće veličine otvora (npr. 27-45 G), čime se stvara mehur u subretinalnom prostoru. Prema drugim aspektima, subretinalnom injeciranju suspenzije vektora prethodi subretinalno injeciranje male zapremine (npr. oko 0,1 do oko 0,5 ml) odgovarajuće
4
tečnosti (kao što je fiziološki rastvor ili Ringerov rastvor) u subretinalni prostor unutar centralne retine. Ovo početno injeciranje u subretinalni prostor uspostavlja inicijalni mehur tečnosti unutar subretinalnog prostora, što prouzrokuje lokalizovano odvajanje mrežnjače na mestu početnog mehura. Ovakav početni mehur tečnosti može olakšati ciljanu isporuku suspenzije vektora u subretinalni prostor (definisanjem ravni injeciranja pre isporuke vektora) i time do minimuma smanjiti moguću primenu vektora u horoid i mogučnost injeciranja vektora ili njegov refluks u šupljinu staklastog tela. Prema pojedinim aspektima, u ovaj početni mehur tečnosti može dalje biti inecirana tečnost koja sadrži jednu ili više suspenzija i/ili jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava, primenom ovih tečnosti direktno u početni mehur tečnosti bilo sa istim ili sa dodatnim finim kanilama.
[0288] Intraokularna primena vektorske suspenzije i/ili početne male zapremine tečnosti može biti izvršena upotrebom kanile sa finim otvorom (npr. 27-45 G) koja je pričvršćena na špric. Prema pojedinim aspektima, klip ovog šprica se može pokretati mehanizovanim uređajem, kao što je pritiskom na nožnu pedalu. Kanila sa finim otvorom napreduje putem sklerotomije, duž šupljine staklastog tela i u retinu do mesta koje se unapred određuje kod svakog subjekta shodno površini retine na koju je potrebno ciljano delovati (unutar centralne retine). Prema jednom aspektu, primena se vrši na mesto izvan fovee. Uz direktnu vizualizaciju, vektorska suspenzija se mehanički injecira pod neurosenzornu retinu, čime se prouzrokuje lokalizovano odvajanje mrežnjače sa retinotomijom koja će se sama povući i neće se proširiti. Kao što je prethodno navedeno, vektor može biti injeciran bilo direktno u subretinalni prostor, čime nastaje mehur unutar centralne retine, ili se vektor može injecirati u početni mehur unutar centralne retine, čime se prouzrokuje njegovo širenje (i širenje površine na kojoj je mrežnjača odvojena). Prema pojedinim aspektima, nakon injeciranja vektorske suspenzije sledi injeciranje druge tečnosti u mehur.
[0289] Bez želje da bude vezano za teoriju, stopa i lokacija subretinalnog injeciranja mogu dovesti do lokalizovanih sila cepanja koje mogu oštetiti makulu, foveu i/ili RPE ćelije koje su u osnovi. Subretinalna injeciranja mogu biti izvršena sa stopom koja svodi na minimum ili izbegava sile cepanja. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira tokom oko 15-17 minuta. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira tokom oko 17-20 minuta. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira tokom oko 20-22 minuta. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira tokom oko 1 minuta ili tokom oko 1-3 minuta ili za manje od jednog minuta. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 35 do oko 65µl/min ili 65 µl/min do oko 150 µl/min. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 35μl/min. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 40 µl/min. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 45 µl/min. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 50 µl/ml. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 55 µl/min. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 60 µl/ml. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 65 µl/min. Prema pojedinim aspektima, vektor se injecira stopom od oko 100 µl/min. Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike će lako uvideti da stopa i vreme injeciranja u mehur može zavisiti od, na primer, zapremine vektora ili veličine mehura potrebne za stvaranje dovoljno velikog odvajanja mrežnjače da bi se pristupilo ćelijama centralne retine, kao i od veličine kanile koja se upotrebljava za isporuku vektora, a dalje i od mogućnosti da se bezbedno održi pozicija kanile opisa.
[0290] Može se kreirati jedan ili više (npr. 2, 3 ili više) mehurova. U principu, ukupna zapremina mehura ili mehurova koji su stvoreni postupcima i sistemima opisa, ne može premašivati zapreminu tečnosti u oku, na primer od oko 4 ml što je prisutno kod uobičajenog humanog subjekta. Ukupna zapremina svakog pojedinačnog mehura poželjno iznosi oko 0,1 - 0,2 ml. Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike će uvideti da se, pri kreiranju mehura prema postupcima i sistemima opisa, mora održavati odgovarajući očni pritisak da bi se izbeglo oštećenje očnih struktura. Veličina svakog pojedinačnog mehura može biti, na primer, oko 50 µl do oko 100 µl, oko 50 µl do oko 200 µl, oko 0,1 do oko 0,2 ml, oko 0,1 do oko 0,3 ml ili > 0,3 ml.
[0291] Da bi se bezbedno i efikasno transdukovala područja ciljne retine (npr. centralna retina) izvan ivice originalne lokacije mehura, u pojedinim slučajevima može biti poželjno da se manipuliše mehurom tako da se promeni pozicija mehura do ciljnog područja za transdukciju. Manipulisanje mehurom se može odvijati putem zavisnosti mehura koji je stvoren od zapremine mehura, kao i promenom pozicije oka koje sadrži mehur, promenom pozicije glave čoveka čije oko ili tako što oči sadrže jedan ili više mehurova i/ili putem izmene tipa tečnost-vazduh. Ovo je posebno važno za centralnu retinu pošto se ovo područje uglavnom opire odvajanju putem subretinalnog injeciranja.
[0292] Prema pojedinim aspektima, izmena tečnosti i vazduha se koristi nakon subretinalnog injeciranja; tečnost iz kanile za infuziju se privremeno zamenjuje vazduhom, npr. uduvavanjem vazduha u površinu mrežnjače. Kako zapremina vazduha istiskuje slanu tečnost iz šupljine staklastog tela, mehur se zadržava na mestu, bez isticanja u šupljinu staklastog tela. Postavljanjem očne jabučice na odgovarajući način, sa mehurom subretinalnog vektora se, u pojedinim slučajevima, može manipulisati tako da on zahvata susedna područja (npr. makulu i/ili foveu). U pojedinim slučajevima, masa mehura je dovoljna da prouzrokuje da se on nagne, čak i bez upotrebe izmene tipa tečnost-vazduh. Kretanje mehura se može dodatno olakšati izmenom položaja glave humanog subjekta, tako da bi se omogućilo da mehur sklizne do željene lokacije u oku. Jednom kada se postigne željena konfiguracija mehura, tečnost se vraća u šupljinu staklastog tela. Tečnost je odgovarajuća tečnost, na primer, svež fiziološki rastvor. U principu, subretinalni vektor može biti ostavljen in situ bez retinopeksije do retinotomije, kao i bez intraokularne tamponade, a retina će se spontano ponovo pripojiti u periodu do oko 48 sati.
[0293] Subretinalna primena AAV-2 za lečenje očnog oboljenja je pokazana prilikom lečenja retkog genetičkog oboljenja, Leberove urođene amauroze ("LCA"). Patologija LCA i populacija pacijenata sa LCA se razlikuju od onih sa patologijom vlažne AMD, pa se stoga pre rAAV.sFLT kliničke stuidje nije očekivalo da bi tretman vlažnog AMD-a sa genskom terapijom, a posebno sa AAV-2, bio bezbedan i efektivan. Preciznije, LCA je degenerativno genetičko oboljenje prouzrokovano nedovoljnom ekspresijom retinalnog proteina RPE-65. Ovaj protein prouzrokuje sporo pogoršanje vida kod beba i male dece, koje dalje dovodi do potpunog slepila kod mladog adulta, uglavnom pre starosti od 25 do 30 godina. Nasuprot tome, kao što je ovde ranije opisano, vlažnu AMD prouzrokuje rast novih krvnih sudova u retini kasnije u životu, a uglavnom je sa početkom kod osoba starih između 65 i 75 godina. Prisustvo novih sudova izaziva zabrinutost da će se AAV čestice, transgen ili proizvod transgena, transportovati izvan oka u većim količinama nego što je pokazano u LCA studiji. Dodatno, imunski sistem i imunski odgovor na strane supstance se menja kako pacijenti stare, ukazujući da nije sigurno da bi lečenje vlažne AMD sa virusnim vektorom kao što je rAAV.sFLT-1 bilo bezbedno i efektivno.
B. Efekat lečenja
[0294] Prema pojedinim aspektima, jednokranto injeciranje farmaceutske kompozicije predmetnog opisa u oko koje je zavaćeno, ne samo da je sa koristima od lečenja sa Lucentis®-om, već takođe može zahtevati samo jedno jednokranto injeciranje.
[0295] Farmaceutske kompozicije predmetnog opisa mogu zaustaviti curenje u postojećim krvnim sudovima i može inhibirati dalje obrazovanje novih sudova u subretinalnom prostoru pacijenata koji boluju od CNV-a, a koji nastaje sekundarno u odnosu na AMD tokom najmanje 18 meseci, a prema pojedinim aspektima, aktivnost se nastavlja tokom 3-5 godina. Inhibicija curenja i obrazovanja novih sudova sprečava razvoj slepila kod obolelih pacijenata.
[0296] Prema pojedinim aspektima, nivo sFLT-1 proteina u staklastom telu navedenog humanog subjekta je oko 500 - 5000 pg/ml, oko 600 - 4000 pg/ml, oko 800 - 3000 pg/ml oko 900 - 2000 pg/ml ili oko 1000 – 1800 pg/ml, 500 - 700 pg/ml, 700 - 1000 pg/ml, 1000 - 1200 pg/ml, 1200 – 1500 pg/ml, 1 800 – 2000 pg/ml. U pojedinim slučajevima, nivoi proteina u staklastom telu humanog subjekta su najmanje oko 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700.800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 ili 2400 pg/ml. U pojedinim slučajevima, nivoi proteina u staklastom telu humanog subjekta su najviše oko 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 ili 2400 pg/ml.
[0297] U pojedinim slučajevima, "nivoi" proteina se mogu odnositi na bilo koju količinu ili relativnu količinu proteina. U pojedinim slučajevima, nivo može biti izmeren kao koncentracija (npr. pM, nM, uM itd.), molalnost (npr. m), masa (npr. pg, ug, ng itd.) ili sa bilo kojim pogodnim merenjem. U pojedinim slučajevima, merenje bez jedinica može ukazivati na nivo.
[0298] U pojedinim slučajevima, nivoi proteina mogu biti mereni nakon primene navedene farmaceutske kompozicije, odnosno nakon najmanje oko 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 ili 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 ili 365 dana. U pojedinim slučajevima, nivoi proteina mogu biti mereni nakon primene navedene farmaceutske kompozicije, odnosno nakon najviše oko 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 ili 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 ili 365 dana. U pojedinim slučajevima, nivoi proteina se mere najmanje 72 sata nakon primene navedene farmaceutske kompozicije.
[0299] Primena farmaceutske kompozicije predmetnog opisa uglavnom ne dovodi do sporednih efekata ili štetnih događaja.
[0300] Prema pojedinim aspektima, u uzorcima suza, krvi, pljuvačke ili urina humanog subjekta se ne može detektovati vektor, 7, 14, 21 ili 30 dana nakon primene navedene farmaceutske kompozicije. Prema pojedinim aspektima, prisustvo virusnog vektora se detektuje upotrebom qPCR ili ELISA postupka, kao što je poznato u oblasti tehnike.
[0301] U pojedinim slučajevima, vektor nije detektovan u uzorcima suza, krvi, pljuvačke ili urina humanog subjekta nakon primene navedene farmaceutske kompozicije, odnosno nakon najmanje 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 ili 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 ili 365 dana. U pojedinim slučajevima, vektor nije detektovan u uzorcima suza, krvi, pljuvačke ili urina humanog subjekta nakon primene navedene farmaceutske kompozicije, odnosno nakon najviše oko 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 ili 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 ili 365 dana. U pojedinim slučajevima, vektor nije detektovan u uzorcima suza, krvi, pljuvačke ili urina humanog subjekta, što je izmereno nakon najmanje 72 sata od primene navedene farmaceutske kompozicije.
[0302] Prema pojedinim aspektima, humani subjekat ne pokazuje klinički značajnu toksičnost u retini, što se procenjuje serijskim oftalmološkim pregledima tokom perioda od najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci. Prema pojedinim aspektima, humani subjekat ne ispoljava klinički značajnu toksičnost u retini, što se procenjuje serijskim oftalmološkim pregledima tokom perioda od najviše oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci.
[0303] Prema pojedinim aspektima, kod humanog subjekta nisu prisutni znaci inflamacije na površini, prednjem segmentu ili staklastom telu, tokom perioda od najmanje dva meseca. U pojedinim slučajevima, kod humanog subjekta nisu prisutni znaci inflamacije na površini, prednjem segmentu ili staklastom telu tokom perioda od 1 nedelje ili 3, 6, 9 ili 12 meseci nakon primene farmaceutske kompozicije.
[0304] Prema pojedinim aspektima, ne mogu se uočiti znaci inflamacije uključujući odgovor citotoksičnih T-ćelija unutar oko 10% od normalnog opsega, nakon koraka primene. Prema pojedinim aspektima, nema povećanja T-ćelijskog odgovora, što je izmereno upotrebom ELISpot postupka. Prema pojedinim aspektima, T ćelije ne eksprimiraju HLA-DR ili Ki67 i ne razvijaju aktivirani efektorski fenotip, kao što je opisano u Lai i saradnici 2011; Gene Therapy. Prema pojedinim aspektima, nakon koraka primene se, biomikroskopijom (BE) i indirektnom oftalmoskopijom (IOE), ne može uočiti inflamacija staklastog tela. Prema pojedinim aspektima, nakon koraka primene se, biomikroskopijom (BE) i indirektnom oftalmoskopijom (IOE), uočava inflamacija staklastog tela u tragovima, koja se povlači u periodu do 10 dana. Prema pojedinim aspektima, humanom subjektu nije potrebna terapija “spašavanja” najmanje 120 dana nakon primene. Prema pojedinim aspektima, humanom subjektu nije potrebna terapija “spašavanja” najmanje 30 dana, najmanje 60 dana, najmanje 90 dana, najmanje 120 dana najmanje 180 dana, najmanje 270 dana ili najmanje 365 dana nakon primene.
[0305] Kao što se ovde upotrebljava, terapija “spašavanja” se odnosi na primenu doze VEGF inhibitora nakon početne primene farmaceutske kompozicije opisane u predmetnom opisu. Terapija “spasavanja” se primenjuje da bi se intenzivno povećala količina inhibicije VEGF-a u oku pacijenta, odnosno da bi se zaustavili ili poništili znaci i simptomi progresije oboljenja. Odluka o primenu terapije “spašavanja” može biti zasnovana na unapred utvrđenim dijagnostičkim kriterijumima, kao u kliničkoj studiji opisanoj u Primeru 12, ili na kliničkoj proceni ordinirajućeg lekara da su znaci aktivnog oboljenja prisutni kod pacijenta.
[0306] Prema pojedinim aspektima, nema dokaza o gubitku oštrine vida, povišenju IOP, odvajanju mrežnjače ili bilo kakvom intraokularnom ili sistemskom imunskom odgovoru kod navedenog humanog subjekta, najmanje 120 dana nakon primene. Prema pojedinim aspektima, nema dokaza o gubitku oštrine vida, povećanju IOP, odvajanju mrežnjače ili bilo kakvom intraokularnom ili sistemskom imunskom odgovoru kod navedenog humanog subjekta, najmanje 30 dana, najmanje 60 dana, najmanje 90 dana, najmanje 120 dana najmanje 180 dana, najmanje 270 dana ili najmanje 365 dana nakon primene. Prema pojedinim aspektima, nema dokaza o gubitku oštrine vida, povišenju IOP, odvajanju mrežnjače ili bilo kakvom intraokularnom ili sistemskom imunskom odgovoru kod navedenog humanog subjekta, najviše 30 dana, najmanje 60 dana, najmanje 90 dana, najmanje 120 dana najmanje 180 dana, najmanje 270 dana ili najmanje 365 dana nakon primene.
[0307] Prema pojedinim aspektima, najbolje korigovana oštrina vida (BCVA) se kod pacijenta poboljšava za 1, 23, 4, 5 ili više redova.
[0308] Prema pojedinim aspektima, smanjenje neovaskularizacije se procenjuje Fluoresceinskom angiografijom (FA) nakon korak primene.
[0309] U pojedinim slučajevima, da bi se ispitali efekti tretmana, može biti merena debljina retine. U pojedinim slučajevima, debljina centralne retine humanog subjekta se ne povećava za više od 50 mikrona, 100 mikrona ili 250 mikrona u periodu do 12 meseci nakon tretmana sa farmaceutskom kompozicijom opisa. U pojedinim slučajevima, debljina centralne retine humanog subjekta se smanjuje za najmanje 50 mikrona, 100 mikrona, 200 mikrona, 250 mikrona, 300 mikrona, 400 mikrona, 500 mikrona, 600 mikrona u periodu do 3 meseca, 6 meseci ili 9 meseci 12 meseci nakon tretmana sa farmaceutskom kompozicijom opisa. Smanjenje debljine centralne retine kod humanog subjekta može biti izmereno upoređivanjem debljine centralne retine u vremenskim tačkama sa osnovnim merenjem obavljenim u ili unutar perioda od 1, 3, 7 ili 10 dana nakon primene farmaceutske kompozicije opisa.
C. Kombinovano lečenje sa VEGF inhibitorima
[0310] Prema pojedinim aspektima, postupak dalje obuhvata primenu farmaceutski efektivne količine VEGF inhibitora humanom subjektu.
[0311] Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor sadrži anti-VEGF antitelo ili njegov funkcionalni fragment. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor sadrži ranibizumab. Prema drugim aspektima, VEGF inhibitor je solubilni receptor, fuzioni protein ili njegov fragment, kao što je aflibercept ili sFLT01. Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 dana nakon primene navedenog VEGF inhibitora. Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 dana nakon primene navedenog VEGF inhibitora. Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija se primenjuje u periodu do 90 dana nakon primene navedenog VEGF inhibitora.
[0312] Prema pojedinim aspektima, pacijent se leči prema protokolu koji je u kratkim crtama opisan na SL. 13. Nakon što se protein eksprimirao od strane rekombinantnog virusa u odgovarajućem nivou (ili "uključen je"), pacijenti se prate sa ponovljenim tretmanom zasnovanim na kriterijumima: a. ukoliko se oboljenje ponovo pojavi, dozvoljeno je ponovno lečenje ranibizumabom
b. Očekuje se potreba za 5-8 ponovljenih tretmana godišnje sa kontrolnom grupom
c. U terapijskoj grupi se očekujte ekvivalentan vid sa značajnim smanjenjem u broju ponovljenih tretmana.
[0313] Pacijent ima pravo na ponovno lečenje ukoliko su prisutni znaci aktivnog CNV:
a. Na osnovu objektivnih kriterijuma, što se postiže “prikrivanjem” podataka o tremanu osoblju (tehničaru i oftalmologu)
b. Kriterijumi ponovnog lečenja se zasnivaju na značajnom iskustvu sa tretmanom „po potrebi“ (PRN) u prethodnim ispitivanjima sa anti-VEGF sredstvima.
[0314] Ponovni tretman je opravdan na osnovu znakova aktivne oboljenja; kao što su:
a. gubitak slova iz Studije ranog lečenja dijabetesne retinopatije (ETDRS) >10, tokom prethodne posete humanog subjekta (ukoliko se može pripisati uzrocima povezanim sa mrežnjačom), ILI smanjenje >5 ETDRS slova iz prethodne posete, zajedno sa percepcijom pacijenta o funkcionalnom gubitku;
b. Bilo kakvo povećanje, pojava nove ili postojane subsenzorne ili tečnosti ispod retinalnog pigmentnog epitela (RPE) ili unutar retine, na OCT-u;
c. Znaci povećanog CNV curenja, dobijeni sa FA.
[0315] Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor se primenjuje najmanje 1 put pre primene navedene farmaceutske kompozicije i još 1 ili 2 puta u intervalima od oko 30 dana nakon navedene primene, da bi se sprečila progresija oboljenja, dok ekspresija proteina raste do odgovarajućih nivoa. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor se primenjuje najmanje 2 puta pre primene navedene farmaceutske kompozicije. Prema pojedinim aspektima, VEGF inhibitor se primenjuje tokom perioda od 6 do 7 nedelja nakon primene navedene farmaceutske kompozicije.
[0316] Prema pojedinim aspektima, učestalost primene VEGF inhibitora se smanjuje za manje od godinu dana ili se potpuno prekida.
[0317] Prema pojedinim aspektima, predmetni opis se upotrebljava nakon 3 ili više tretmana sa VEGF inhibitorima. Prema pojedinim aspektima, predmetni opis se upotrebljava nakon zapažanja da pacijenti sa AMD ne pokazuju poboljšanje u BCVA nakon upotrebe drugih VEGF inhibitora.
D. Drugi kombinovani tretmani
[0318] Prema drugom poželjnom aspektu, lečenje pacijenta obuhvata primenu jedne ili više od farmaceutskih kompozicija koje su ovde obezbeđene, zajedno sa drugim terapijama, na primer, hemoterapijom, zračenjem, hirurgijom, antiinflamatornim agensima, odabranim vitaminima i sličnim. Ostali agensi mogu biti primenjivani pre, nakon ili se primenjuju zajedno sa farmaceutskim kompozicijama.
[0319] Aspekti opisa mogu biti primenjeni u praksi bez iznetih teorijskih aspekata. Štaviše, teorijski aspekti su predstavljeni tako da se porazumeva da Podnosioci zahteva ne nastoje da budu vezani predstavljenom teorijskom osnovom.
1
[0320] Iako su poželjni aspekti predmetnog opisa ovde prikazani i opisani, stručnjacima iz oblasti tehnike će biti očigledno da su takvi aspekti navedeni samo kao primer. Stručnjaci će dalje uvideti mogućnost brojnih varijacija, promena i zamena bez odstupanja od obima opisa. Podrazumeva se stoga da razni alternativni aspekti opisa koji su ovde opisani, mogu biti iskorišćeni u primeni opisa. Predviđeno je i da patentni zahtevi koji slede, definišu obim opisa i da se time obuhvate postupci i strukture u okviru obima ovih zahteva i njihovi ekvivalenti.
[0321] Efektivna doza nukleinske kiseline će biti u funkciji određenog eksprimiranog proteina, određenog oboljenja na koje se ciljano deluje, pacijenta i njegovog ili njenog kliničkog stanja, težine, starosti, pola itd.
PRIMERI
[0322] Stručnjaci iz oblasti tehnike će uvideti da mogu biti uvedene brojne i različite modifikacije i da se time mogu dobiti suštinski slični rezultati bez odstupanja od duha predmetnog opisa. Primeri koji slede su navedeni isključivo u ilustrativne svrhe i nije predviđeno da ograničavaju obim opisa.
[0323] Potrebno je ipak objasniti da su, ukoliko nije preciznije navedeno, svi procenti u okviru primera koji slede, zapravo težinski procentualni sadržaj, tež %.
Primer 1
rAAV.sFlt-1
[0324] Jedan primer rekombinantnog virusa je rAAV.sFlt-1. Ovaj virus kodira vektor i humani oblik skraćenog, solubilnog VEGF receptora 1 (sFLT-1). Vektor je rekombinantan adeno-asocirani virusni (rAAV) vektor sa deficijencijom u replikaciji, serotipa 2.
[0325] rAAV.sFlt-1 je proizveden u skladu sa Dobrom proizvodnom praksom (cGMP). Na mestu proizvodnje, konačni proizvod se alikvotira u sterilne epruvete za mikrocentrifugiranje niskog stepena vezivanja virusa (pojedinačno umotanih sterilnih vajli sa ravnim poklopcem, koje karakteriše nisko zadržavanja), prema zahtevima protokola (tj.200 □ 1 od 1 X 10<10>ili 1 X 10<11>genoma virusa), a koje se dalje čuvaju na -80°C do konačnog otpremanja proizvoda. Svaka vajlica sadrži dovoljno vektora za upotrebu kod jednog pacijenta (100 □ 1 za primenu).
[0326] Rekombinantan virus, rAAV.sFlt-1, je rekombinantan adeno-asocirani virusni 2 (rAAV2) vektor koji nosi solubilni VEGFR receptor 1 (VEGFR1), ili sFLT-1, a čija se transkripija pokreće promotorom humanog citomegalovirusa (CMV). Vektor rAAV.sFlt-1 i intaktni AAV2 genom, koji se upotrebljava kao okosnica, pripremani su kao što je opisano u Lai i saradnici, Gene Therapy 2002, tom 9 (12) 804-813). Vektor rAAV2 je lišen virusnih kodirajućih sekvenci, tj. rep i cap su zamenjeni ekspresionom
2
kasetom za terapijski gen. Aktivan deo rAAV.sFlt-1 je sFlt-1. sFLT-1 je solubilni skraćeni oblik receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta tipa 1 (VEGFR1 ili Flt-1) koji se javlja u prirodi. sFLT-1 je jedini poznati endogeni inhibitor VEGF-a koji je specifičan. sFLT-1 se generiše alternativnom obradom i nedostaje mu membranski proksimalni domen sličan imunoglobulinskom, transmemranski region koji se proteže kroz membranu i unutarćelijski domen sa tirozin kinaznom aktivnošću. Dakle, sFLT-1 sadrži samo prvih šest vanćelijskih petlji sličnih imunoglobulinskim, nakon čega sledi lanac sastavljen od 31 jedinstvenog aminokiselinskog ostatka. sFLT-1 je prvi put identifikovan u humanim ćelijama endotela pupčane vene (HUVEC), ali je od tada pronađeno da se prirodno javlja u placenti i da sistematski cirkuliše kod trudnica. sFLT-1 koji se koristi u generisanju rAAV.sFlt-1, sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira samo prvih šest vanćelijskih domena nalik imunoglobulinskim iz FLT-1 pune dužine koji prožima membranu, nakon kojih sledi C-terminalni ispust određene dužine koga čini niz od 31 jedinstvene aminokiseline, a koji predstavlja varijante alternativne obrade, odnosno solubilnu izoformu FLT-1 koja se može izlučivati i koja je ranije opisana.
[0327] Iako je pokazano da ITR poseduje blagu promotorsku aktivnost, za maksimalne nivoe ekspresije transgena, u kaseti uglavnom moraju biti prisutni i kombinacija promotora/pojačivača, male intronske sekvence, cDNK terapijskog gena i poliadenilacioni signal. U rAAV.sFlt-1, pojačivač/promotor glavnog neposredno ranog gena humanog CMV i himerni intron su postavljeni uzvodno od cDNK za sFLT-1. Signal poliadenilacije iz simijan virusa 40 (SV40 poli A) postavljen je nizvodno u odnosu na cDNK za sFLT-1.
[0328] Vezivanje sFLT-1 za VEGF je uveliko pokazano in vitro. Sposobnost sFLT-1 da inhibira angiogenezu pokrenutu sa VEGF-om, privukla je značajnu pažnju zbog svoje potencijalne kliničke primene, ali nisu dobijeni dokazi efikasnosti ili stabilnosti kod ljudi pre kliničke studije za rAAV.sFlt-1 koja je opisana u Primeru 12. Angiostatska aktivnost sFLT-1 je rezultat inhibicije VEGF-a putem dva mehanizma: i) sekvestracije VEGF-a, za koji se on vezuje sa visokim afinitetom i ii) putem obrazovanja neaktivnih heterodimera sa izoformama VEGF receptora Flt-1 i KDR/Flk-1 koji se protežu kroz membranu.
Nukleotidna sekvenca i dijagram plazmidnog vektora upotrebljenog za generisanje rAAV.sFlt-1
[0329] rAAV.sFlt-1 je generisan trostrukom transfekcijom humanih embrionalnih ćelija 293 bubrega sa DNK iz pSSV.CI.hsFlt-1 plazmidnog vektora i pomoćnih plazmida, kao što je poznato u oblasti tehnike (Xiao i saradnici, 1998. J Virololgy, 72(3): 2224-2232). rAAV.sFlt-1 se prečišćava upotrebom sekvencijalnog procesa izolacije jedara, centrifugiranja u gradijentu gustine i hromatografije na afinitetnoj koloni sa heparin sulfatom. Dijagram sFLT-1 plazmidnog vektora je prikazan na SL.1.
Formulacija
[0330] rAAV.sFlt-1 je bio formulisan u sterilnom fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (pH 7), u 2 koncentracije: 1 X 1010 genoma vektora/100 uL (niska doza) i 1 X 1011 genoma vektora/100 uL (visoka doza), u sterilnim epruvetama za mikrocentrifugiranje sa niskim kapacitetom vezivanja virusa. Formulacija je takođe bila bez konzervansa i predviđeno je da se koristi jednokratno, nakon jednog otapanja, isključivo za subretinalno injeciranje.
rAAV(bv).sFlt-1
[0331] Drugi primer rekombinantnog virusa je rAAV(bv).SFlt-1. rAAV(bv).sFlt-1 je rekombinantan, adeno-asocirani virusni (rAAV) vektor sa deficijencijom replikacije serotipa 2, koji se proizvodi upotrebom bakulovirusnog ekspresionog sistema (BEVS) u Sf9 ćelijama insekata, a koji kodira humani oblik skraćenog, solubilnog VEGF receptora 1 (sFLT-1). Vektor je proizveden infekcijom Sf9 ćelija sa dva rekombinantna bakulovirsua, Bac-inRep-inCap i Bac-sFlt-1. Bac-sFlt-1 je izveden iz bakmidne DNK koja se generiše transformacijom elektrokompetentnih ćelija sa plazmidom AVA01-pFB-CMV-sFlt od 8,7 kb, kloniranim iz Frag001m-BHKan i okosnice plazmida V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan, upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije, kao što je opisano u Maniatis i saradnici, a dodatno i u tekstu koji sledi. Frag001m je obrazovan od sekvencijalnih elemenata nukleinskih kiselina koji slede i koji su hemijski sintetisani od strane kompnije Blue Heron Biotech, LLC (Bothell, WA), nakon čega su klonirani u BHKan okosnicu: ITR (AAV serotipa 2), CMV-IE promotor, himerni intron, 5’ netranslatirani region (UTR), kodirajuća sekvenca za sFlt-1, poliA region SV40, ITR (AAV serotipa 2). Plazmid V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan je dobijen od kompanije Virovek, Inc. (Hayward, CA). Plazmid je sadržavao gen antibiotske rezistencije na kanamicin, ColE1 mesto početka replikacije i rekombinantnu AAV kasetu, sa CMV-IE promotorom, intronom, višestrukom sekvencom kloniranja i SV40 poliA regionom, okruženima invertnim terminalnim ponavcima (ITR) iz AAV serotipa 2. U okruženju ovakve rAAV kasete su se nalazili i genom za rezistenciju na gentamicin i mesta vezivanja Tn7L. AVA01-pFB-CMV-sFlt nije sadržavao promotor T7 RNK polimeraze ili drugu prokariotsku regulatornu sekvencu. Bac-inRep-inCap je rekombinantan bakulovirus koji sadrži ekspresione kasete za rep i cap gene iz AAV serotipa 2.
Proizvodnja rAAV(bv).sFlt-1 u bakulovirusu
[0332] rAAV(bv).sFlt-1 je proizveden u bakulovirusu prema postupcima opisanim u US Patentnoj prijavi br. 12/297,958, a još preciznije, na sledeći način: Sf9 ćelije su gajene na 28°C do gustine od oko 107 ćelija/ml, u SF900 II SFM medijumu koji je sadržavao 100 jedinica/ml penicilina i 100 µg/ml
4
streptomicina, nakon čega su ćelije razblažene do oko 5 × 106 ćelija/ml, pre infekcije. Bac-inRepinCap i Bac-sFlt-1, svaki sa m.o.i. od jedan, upotrebljeni su za inficiranje ćelija na 28°C tokom 3 dana, da bi se proizveo AAV vektor tipa 2. Nakon 3 dana infekcije, prikupljen je talog ćelija, centrifugiranjem na 2000 o/min tokom 15 minuta u stolnoj centrifugi. Ćelijski talog je liziran u puferu za liziranje kao što je opisano u Urabe i saradnici, Hum Gene Ther.1; 13(16): 1935-43 (2002), nakon čega su ćelijske nukleinske kiseline (DNK i RNK) razgrađene digestijom sa benzonazom (Sigma, St. Louis, MO). Ćelijski lizati su izbistreni centrifugiranjem na 8000 o/min tokom 30 minuta, u centrifugi tipa Avanti J-25 (Beckman, Fullerton, Kalifornija), pa su prebačeni u SW28 epruvetu za centrifugiranje koja je sadržavala 5 ml 1,55 g/cc i 10 ml 1,32 g/cc rastvora CsCl. Nakon centrifugiranja na 28000 o/min tokom oko 16 sati na 15°C, frakcija koja je sadržavala rAAV je prikupljena probijanjem epruvete za centrifugiranje, upotrebom igle za špric, i podvrgavanjem drugoj rundi ultracentrifugiranja u CsCl. Frakcija koja je sadržavala rAAV je ponovo prikupljena probijanjem epruvete za centrifugiranje upotrebom igle za špric, nakon čega je podvrgnuta dijalizi u PBS puferu da bu se uklonile soli i deterdženti. Titri vektora su određeni kvantitativnim PCR postupkom u realnom vremenu prema protokolu proizvođača (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija).
Primer 2
In vitro inhibicija proliferacije endotelnih ćelija indukovane sa VEGF-om
[0333] Studije su sprovedene da bi se procenila proliferacija humanih endotelnih ćelija pupčane vene (HUVEC) koja je indukovana sa VEGF-om i da bi se utvrdilo da li će proliferacija HUVEC indukovana VEGF-om biti inhibirana sa sFLT-1 koji je dobijen posredstvom rAAV. Prisustvo sFLT-1 u transdukovanim ćelijama je najpre potvrđeno imunoblot analizom kondicioniranog medijuma (SL.2, panel a). Kondicionirani medijum iz 293 ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1 i rAAV.gfp, dodat je u HUVEC tretirane sa VEGF-om u rastućim razblaženjima. Bio je uključen i kontrolni medijum za gladovanje (normalni medijum rasta za HUVEC, ali bez goveđeg endotelnog faktora rasta). Zatim je u svaki bunarić dodat heparin koncentracije 100 µg/mL. Relativna proliferacija HUVEC indukovana sa VEGF-om, isptivana je nakon tretmana sa VEGF-om i različitim kondicioniranim medijumima, dodavanjem 25 µL 3-(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrozolijum bromida (MTT, 5 mg/mL, Sigma) u svaki bunarić, i potom inkubacijom tokom 4 sata na 37°C. Potvrđeno je da sFLT-1, kodiran sa rAAV vektorom i izlučen u 40 µL kondicioniranog medijuma 293 ćelija transdukovanih sa rAAV.sFlt-1, inhibira proliferaciju HUVEC indukovanu sa VEGF-om za 32%. Udvostručavanje zapremine kondicioniranog medijuma je dovelo do potpune inhibicije ćelijskog rasta koja je bila ekvivalentna bazalnim nivoima sličnim onima prisutnim u kulturi koja je rasla u medijumu za gladovanje (SL. 2, panel b).
In vitro analiza potencije rAAV.sFt-1 vektora
[0334] Studije su sprovedene da bi se procenila potencija AAV vektora koji kodiraju rekombinantan humani sFlt-1 gen, kvantifikovanjem ekspresije humanog sFlt-1 proteina iz transdukovanih humanih embrionalnih HEK-293 ćelija bubrega (HEK293), upotrebom ELISA postupka. Humane embrionalne HEK-293 ćelije bubrega su nabavljene od Američke kolekcije ćelijskih kultura (Rockville, MD, SAD) i gajene su u Eagle-ovom medijumu modifikovanom po Dulbecco-u (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, SAD) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, GIBCO) i IX penicilin-streptomicin-glutaminom. Sve kulture su držane na 37°C i u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.
[0335] HEK293 ćelije su zasejane u gustini od 8E4 ili 1,5E5 ćelija/24 bunarića, nakon čega su transdukovane pri konfluentnosti od 60-90%, sa rekombinantnim AAV vektorima, uz multiplicitet infekcije (MOI) opsega od 1x10<3>-1x10<6>i u DMEM medijumu u koji je bio dodat 2% FBS. Nakon 72 sata, post-transdukcioni kondicionirani medijum je prikupljen. Alikvoti kondicioniranih medijuma su pripremani za ELISA postupak upotrebom reagenasa i prema standardnim uputstvima iz kompleta SVR100B Quantikine ELISA Human sVEGF R1/ sFlt-1 kompanije R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN). Uzorci, standardi i kontrole su pripremani prema uputstvima iz kompleta za ELISA postupak, sa ELISA reagensima kompanije R&D Systems, nakon čega su prebačeni na ELISA ploču prethodno obloženu sa antitelom za sVEGF R1/sFlt-1 i inkubirani dva sata na sobnoj temperaturi uz mešanje na horizontalnom orbitalnom šejkeru za mikroploče. Nakon inkubacije, anti-sVEGF R1 konjugat (dva sata), rastvor supstrata (30 minuta) i rastvor za zaustavljenje reakcije sekvencijalno su nanošeni u svaki bunarić, uz korake aspiriranja i pranja između svakog koraka u skladu sa standardnim procedurama za ELISA postupak. Optička gustina (OD) uzoraka, standarda i kontrola je merena u periodu do 30 minuta nakon zaustavljanja reakcije supstrata, upotrebom ELISA čitača ploča. Koncentracija sFlt-1 u pg/mL je izračunavana upotrebom kompjuterskog programa SoftmaxPro i OD merenja dobijenih sa ELISA čitača za mikrotitar ploče.
[0336] Rezultati studija za rAAV.sFlt-1 i rAAV(bv).SFlt-1 su prikazani na SL. 25A i SL. 25B. Koncentracija sFlt-1 proteina koji je bio eksprimiran od strane HEK293 ćelija, 72 sata nakon transdukcije sa rAAV.sFlt-1 i rAAV(bv).SFlt-1 bila je opsega od 100-1000 pg/mL pri MOI od 1x10<4>, 100-10,000 pg/mL pri MOI od 1x10<5>i 1000-10000 pg/mL pri MOI od 1x10<6>.
Primer 3
Studija sa rAAV.sFlt-1 na miševima
[0337] Kao model za retinalnu neovaskularizaciju upotrebljavani su transgeni miševi (trVEGF029) sa sporom, ali stabilnom retinalnom neovaskularizacijom koja se indukuje transgenom ekspresijom humanog VEGF-a u okviru fotoreceptorskih ćelija. Sa ovim miševima su dprovedene dve odvojene studije.
[0338] U prvoj studiji na miševima, kod 13 transgenih miševa su procenjivane okularne neovaskularne promene pre i nakon primene rAAV.sFlt-1 vektora (1 X 10<11>vektorskih čestica) u jedno oko, kao i kontrolnog vektora u kontralateralno oko. U očima su ispitivane neovaskularne promene upotrebom fluoresceinske angiografije, jedan, tri i osam meseci nakon injeciranja. Obim, intenzitet i stadijum neovaskularizacije su ocenjivani (0 - 4) od strana tri posmatrača, koji nisu imali informacije o tretmanu koji je bio primenjen u oči koje su ispitivne. Došlo je do statistički značajnog sveukupnog smanjenja neovaskularnog gradusa, sa medijanom gradusa koji se promenio sa '3' (pre injeciranja) do medijana gradusa '1' mesec dana nakon injeciranja (P = 0,012). Ovo smanjenje se održalo i nakon tri meseca (medijana = 1; P = 0,001) i nakon osam meseci (medijana = 1; P = 0,001) od injeciranja sa rAAV.sFlt-1. Injeciranje rAAV.sFlt-1 vektora je dovelo do dugotrajne (od najmanje osam meseci) regresije neovaskularnih sudova u 85% (11 od 13) tretiranih očiju u poređenju sa 8% (1 od 13) očiju koje su tretirane kontrolnim vektorom.
[0339] Histološki pregled očiju u ovoj pretkliničkoj studiji je ukazao da je remećenje ili gubitak fotoreceptora značajno (P <0,01) izraženiji u očima injeciranim sa kontrolnim vektorom u odnosu na oči kojima je injeciran rAAV.sFlt-1. Ekspresija sFLT-1 je takođe potvrđena analizom reverzne transkripcije/lančane reakcije polimeraze za uzorke tkiva; iRNK za sFLT-1 je detektovana u sva četiri ispitivana oka. U oku u koje je injeciran rAAV.sFlt-1, nisu zabeleženi nikakvi neželjeni efekti specifični za rAAV.sFlt-1 vektor u poređenju sa okom u koje je bio injeciran kontrolni (rAAV.gfp) vektor.
[0340] U drugoj studiji, sprovedenoj na trVEGF02 transgenim miševima, cilj studije je bio da se utvrdi da li je rezultat subretinalnog injeciranja rAAV.sFlt-1 bio bilo koji od imunskih odgovora posredovan ćelijama koji bi mogao negativno uticati na dugoročnu ekspresiju sFLT-1 ili prouzrokovati oštećenje mrežnjače povezano sa imunskim odgovorom. U ovoj studiji, u po jedno oko kod 50 trVEGF02 transgenih miševa, subretinalno je injeciran rAAV.sFlt-1 (8 X 109 virusnih čestica) ili fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS). Retine 30 miševa bilo iz grupe tretirane sa rAAV.sFlt-1 ili kontrolne grupe, procenjivane su zatim, nakon jedne sedmice i nakon jednog meseca od injeciranje, na prisustvo imunskih ćelija (leukocita, makrofaga i B- i T-limfocita). Analiza zadnjeg dela očne čašice protočnom citometrijom, ukazala je da je nedelju dana nakon injeciranja došlo do statistički značajnog povećanja CD45+ leukocita (povećanje od 6,6 puta u odnosu na kontrolu; P <0,05) i CD11b+ makrofaga (povećanje od 5,7 puta u poređenju sa kontrolom; P <0,036). Ipak, u ovom trenutku nije bilo razlika u CD19+, CD8+ i CD4+ (B- i T-limfocita). Mesec dana nakon injeciranja, nije bilo razlika u brojevima ćelija u okviru podtipova leukocita (tj. CD45+, CD19+, CD11b+, CD8+ili CD4+ćelija) u očima miševa tretiranih sa rAAV.sFlt-1 ili PBS kontrolom, što je ukazalo da je infiltracija leukocita i makrofaga bila prolazna. Analiza tipova limfocita slezine iz ovih miševa, protočnom citometrijom, nije pokazala značajne razlike u broju limfocita. Navedeni nalaz ukazuje da nije uočen sistemski imunski odgovor, iako je u retini bio prisutan prolazan, lokalizovan imunski odgovor.
[0341] U ovoj drugoj studiji, histološki pregled očiju iz pet od miševa injeciranih bilo sa rAAV.sFlt-1 ili PBS-om, ukazao je da se u retinama bilo kog od ispitivanih miševa nisu mogli uočiti razlaganje ili posledice povezane sa imunskim odgovorom.
[0342] Da bi se procenio uticaj rAAV.sFlt-1 na nivo neovaskularizacije u ovom transgenom mišjem modelu (trVEGF02) retinalne neovaskularizacije, retine miševa kojima je bio injeciran bilo rAAV.sFlt-1 ili PBS, takođe su nezavisno ocenjivani od strane dva različita procenjivača, nakon dva meseca od tretmana. Sveukupno, došlo je do značajnog smanjenja srednjih stepena neovaskularizacije (pre injeciranja: 1,46 ± 0,58; nakon injeciranja: 0,81 ± 0,57; P < 0,00015) u očima u koje je injeciran rAAV.sFlt-1, dok je do značajnog povećanja srednjih stepena neovaskularizacije (pre injeciranja: 1,08 ± 0,56; nakon injeciranja: 1,63 ± 0,96; P < 0,018) došlo u očima u koje je injeciran PBS kao kontrola.
[0343] Nalazi iz ove druge studije na miševima jasno ukazuju da izgleda da je lečenje sa rAAV.sFlt-1 poništilo progresivno povećanje neovaskularizacije koje je uočeno u ovom mišjem modelu retinalne neovaskularizacije i AMD. Štaviše, uočen je samo ograničen, lokalizovan inflamatorni odgovor, nedelju dana nakon subretinalnog injeciranja rAAV.sFlt-1, koji se i povukao nakon mesec dana. Deluje i da ovaj imunski odgovor nije ugrozio dugoročnu terapijsku efikasnost rAAV.sFlt-1 u retini.
[0344] Modeli transgenih miševa opisani u ovom Primeru 3, pokazuju da ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu biti upotrebljene za lečenje i/ili profilaksu drugih retinalnih vaskularnih oboljenja kod kojih je pokazano da je u patologiju verovatno uključena inhibicija VEGF-a. Navedena oboljenja obuhvataju dijabetesni makularni edem, dijabetesnu ishemiju retine, dijabetesni retinalni edem, proliferativnu dijabetesnu retinopatiju, okluziju retinalne vene, okluziju centralne retinalne vene i okluziju razgranate retinalne vene. U kliničkim studijama je pokazano da pojedini VEGF inhibitori, poput Lucentis-a, efikasno leče određene od ovih oboljenja, uključujući dijabetesni makularni edem i okluziju retinalne vene. Efikasnost rAAV.sFlt-1 koja je pokazana u ovim mišjim modelima ukazuje da je rAAV.sFlt-1 takođe efektivan u lečenju ovih oboljenja posredovanih sa VEGF-om.
Primer 4
Studija sa rAAV.sFlt-1 na pacovima
[0345] U studiji rAAV.sFlt-1 na pacovima, upotrebljena su dva modela neovaskularizacije u oku: neovaskularizacija rožnjače indukovana kauterizacijom i horoidna neovaskularizacija (CNV) indukovana laserskom fotokoagulacijom. U modelu neovaskularizacije rožnjače, u prednju komoru jednog oka, kod 22 pacova je injeciran rAAV.sFlt-1 vektor (8 X 10<8>virusnih čestica), dok je kontrolni vektor (rAAV.gfp) injeciran u kontralateralno oko, nakon čega je sledila kauterizacija rožnjače. Oči su zatim pregledane u kontekstu neovaskularizacije, četiri dana nakon kauterizacije, upotrebom fotografisanja i lampi sa prorezima. Uočena je značajno niža stopa vaskularizacije rožnjače u očima tretiranim sa rAAV.sFlt-1 u poređenju sa očima tretiranim sa kontrolnim vektorom (27% i 63%, tim redom; P = 0,009). Histološka analiza očiju je pokazala da se u većini kauterizovanih očiju tretiranih sa rAAV.sFlt-1, nisu mogli uočiti krvni sudovi rožnjače. Histološka analiza je takođe ukazala da je ćelijska infiltracija u stromalni sloj rožnjače bila izraženija u očima u koje je injeciran kontrolni vektor u odnosu na oči tretirane sa rAAV.sFlt-1. Pored toga, u očima tretiranim kontrolnim vektorom je bio je prisutan očigledan edem, kao i oticanje strome rožnjače, dok nije bilo dokaza o značajnom oticanju tkiva u očima tretiranim sa rAAV.sFlt-1.
[0346] U CNV modelu indukovanom laserskom fotokoagulacijom, kod 10 pacova je subretinalno injeciran rAAV.sFlt-1 vektor (8 X 108 virusnih čestica) u jedno oko, dok je kontrolni vektor (rAAV.gfp) ineciran u kontralateralno oko. Laserska fotokoagulacija je korišćena za indukovanje CNV-a mesec dana nakon injeciranja. Pet nedelja nakon laserske fotokoagulacije, oči su analizirane u kontekstu CNV, upotrebom fluoresceinske angiografije. Samo je u 41% područja koja su bila tretirana laserom došlo do pojave curenje u očima koje su bile tretirane sa rAAV.sFlt-1, u poređenju sa 60% u očima tretiranim kontrolnim vektorom (P = 0,002). Šesnaest nedelja nakon laserski indukovanog CNV-a, u očima tretiranim sa rAAV.sFlt-1 je i dalje bila prisutna značajno niža neovaskularizacija nego u kontrolnim očima. Histološka analiza očiju u regionima neposredno uz mesta injeciranja, ukazala je na normalan pigmentni epitel retine, kao i na normalne spoljne segmente i spoljni nuklearni sloj. Ovi nalazi ukazuju da nije došlo do očigledne toksičnosti koja bi bila povezana sa ekspresijom sFLT-1. Elektroretinogrami su takođe ukazali na normalno funkcionisanje očiju tretiranih sa rAAV.sFlt-1. Većina laserskih lezija tretiranih sa rAAV.sFlt-1 i kontrolnim vektorom razvila je subretinalne ćelijske membrane. Ipak, lezije u očima tretiranim sa rAAV.sFlt-1 su uglavnom imale manje proliferišućih endotelnih ćelija, što je odraz i nalaza fluoresceinske angiografije i što ukazuje da je stopa angiogeneze (tj. neovaskularizacije) bila smanjena u očima tretiranim sa rAAV.sFlt-1.
Studija sa rAAV.sFlt-1 i rAAV(bv).sFlt-1 u pacovskom modelu dijabetesa
[0347] Da bi se dodatno ispitala bezbednost i efikasnost rAAV.sFlt-1 i rAAV(bv).sFlt-1 u lečenju dijabetesne retinopatije (DR) i dijabetesnog makularnog edema (DME), sproveden je eksperiment u kome je upotrebljen pacovski model dijabetesa.
[0348] Gubitak vida kod pacijenata sa dijabetesom posredovan je inflamacijom, što dovodi do konačnog oštećivanja krvno-retinalne barijere i potonjeg vaskularnog “curenja”, a time dalje i do edema makule. Model dijabetesa na pacovu sa streptozotocinom (STZ) ispoljava dobro okarakterisan obrazac vaskularnog “curenja”, u kome je VEGF snažno regulisan već nakon 2 nedelje. (Miyamoto K. i saradnici, Proc Natl Acad Sci USA 96, 10836-10841 (1999). Sadašnji pristupi u lečenju kod životinjskih modela DR, pokazuju samo delimično rešavanje problema vaskularnog “curenja”.
[0349] Dijabetes je indukovan u pacovima soja Brown Norway, intraperitonealnom injekcijom streptozotocina (50 mg/kg). Dijabetes je potvrđen i praćen merenjima glukoze u krvi. Pacovi sa glukozom u krvi > 350 mg/dl smatrali su se dijabetičarima. Osam dana nakon početka dijabetesa, pacovi su tretirani subretinalnim injeciranjem (n=12 očiju po grupi) po 5 µL rastvora koji je sadržavao bilo 1x10<10>ili 5x10<10>vg rAAV.sFlt-1 ili rAAV(bv).sFlt-1, upotrebom uspostavljene tehnike koja je opisana u Chalberg T.W. i saradnici, Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 2140-2146 (2005). AAV2.GFP (5x10<10>vg) i nosač su injecirani kao kontrole. Grupe bez dijabetesa i grupe sa dijabetesom bez tretmana takođe su upotrebljavane kao kontrolne.
[0350] Dejstvo rAAV(bv).sFlt-1, koji eksprimira sFLT-1, na vaskularno curenje mereno je 60. dana. Vaskularno curenje u retini je mereno postupkom za analizu curenja sa FITC-albuminom, a nakon injeciranja albumina konjugovanog sa FITC kao molekulom za praćenje. Postupak curenja FITC-albumina direktno meri curenje FITC-albumina koji iz cirkulacije ističe u mrežnjaču i često se koristi za merenje vaskularne permeabilnosti mrežnjače. Vaskularno curenje mrežnjače u injeciranim očima je upoređivano sa očima iz kontrola bez dijabetesa, iz netretiranih i sa očima životinja sa dijabetesom koje su tretirana sa nosačem i AAV serotipovima 2 i 8 divljeg tipa.
[0351] Rezultati: rAAV(bv).SFlt-1 koji eksprimira sFLT-1 smanjuje vaskularno curenje kod STZ-dijabetesnog pacova, dok injekcija AAV2.GFP i druge kontrole ne dovode do smanjenja.
Primer 5
Studija sa rAAV.sFlt-1 na majmunima
[0352] Efikasnost i bezbednost rAAV.sFlt-1 je takođe ispitivana u modelu AMD-a kod primata različitih od čoveka (makaki majmuna), upotrebom laserske fotokoagulacije za indukovanje CNV-a. Jedan od izazova u razvoju tretmana za AMD kod ljudi je to što primati različiti od čoveka ne razvijaju AMD. CNV indukovan laserskom fotokoagulacijom oponaša pojedine simptome AMD-a, ali osnovni biološki proces je pre zarastanje akutne povrede, a ne progresija hroničnog oboljenja, tako da model ne može biti od pomoći u predviđanju performansi bilo kog određenog tretmana za CNV kod ljudi sa AMD ili drugim oboljenjem koje se zasniva na CNV. Bez obzira na navedeno, pošto su oči čoveka anatomski sličnije očima primata različitim od čoveka nego očima životinja koje nisu primati, primati različiti od čoveka se često proučavaju da bi se procenili toksičnost i histološki odgovor na potencijalni tretman ili drugu intervenciju.
[0353] U prvoj studiji na primatima različitim od čoveka, u po jedno oko pet makaki majmuna je subretinalno injeciran rAAV.sFlt-1 (4 X 10<12>virusne čestice), dok je kontrolni vektor (rAAV.gfp) injeciran u kontralateralno oko. Zdravstveni status očiju majmuna je procenjivan periodično, nakon subretinalnog injeciranja. Očigledne komplikacije koje bi bilo direktno povezane sa subretinalnim injeciranjem bilo kontrolnog, bilo rAAVsFlt-1 vektora nisu uočene. U nedelji nakon injeciranja, primećeni su prolazna iritacija konjunktive i zamućenje staklastog tela koje su se i povukle do druge nedelje. Subretinalno injeciranje je bilo bez uspeha u desnom oku jednog od majmuna; ova životinja stoga nije bila podvrgavana daljoj analizi.
[0354] Subretinalno injeciranje 40-100 uL rAAV suspenzije je izdiglo mrežnjaču, stvarajući mehur u kome je vektor bio smešten između pigmentnog epitela i fotoreceptorskog sloja, na lokalizovani način. Ovaj mehur se sam korigovao u periodu do 24 do 48 sati. Osim manjeg poremećaja pigmentnog epitela retine na mestu uboda iglom, nisu uočene druge abnormalnosti mrežnjače tokom perioda praćenja (3 do 17 meseci nakon injeciranja). Nisu uočene ni druge abnormalnosti ili neželjeni događaji; ni u jednom trenutku nije došlo do odvajanje mrežnjače koje bi bilo povezano sa operacijom.
[0355] Da bi se procenila dugotrajna terapijska efikasnost rAAVsFlt-1, četiri injecirana majmuna su zatim podvrgnuta intenzivnoj laserskoj fotokoagulaciji, 16 meseci nakon tretmana sa vektorima. U svakom oku je upotrebom lasera indukovano osam lezija, nakon čega je u očima praćeno prisustvo CNV, dve i četiri nedelje nakon laserskog tretmana. Nakon laserske fotokoagulacije, samo su tri od četiri majmuna bila pogodna za analizu, tako da su podaci o efikasnosti prikupljeni za tri životinje. Nijedno od tri oka majmuna tretiranih sa rAAVsFlt-1 nije razvilo lezije koje bi se mogle povezati sa CNV, a uočeno je samo slabo bojenje fluoresceinom, što ukazuje na minimalno curenje/neovaskularizaciju. Sve kontralateralne oči tretirane kontrolnim vektorom su razvile lezije koje su se mogle povezati sa CNV.
[0356] U naknadnoj studiji koja je imala za cilj procenu bezbednosti i toksičnosti rAAV.sFlt-1 injeciranog u subretinalni prostor, upotrebljeno je osam majmuna: kod pet je u levo oko injeciran rAAV.sFlt-1, kod dva je u levo oko injeciran rAAV.gfp, dok je kod jednog u oba oka injeciran
1
rekombinantan Flt-1 protein, a jedan je uzet kao kontrola bez injeciranja. Majmuni su pregledani pre i nakon injeciranja, upotrebom fotografisanja fundusa u boji, fluoresceinske angiografije i elektroretinografije. Krv je rutinski prikupljana da bi se odredili nivoi sFLT-1, a limfociti periferne krvi su izolovani radi analize protočnom citometrijom i analize odgovora subpopulacija imunskih ćelija. U vreme žrtvovanja (3, 9 i 12 meseci nakon injeciranja), prikupljena su i tkiva za i) studije biodistribucije rAAV.sFlt-1 vektora, upotrebom lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu sa ekstrahovanom genomskom DNK; ii) kvantifikaciju nivoa hsFlt-1 proteina i AAV2 kapsidnog proteina ELISA postupkom; i iii) histologiju očiju.
[0357] Fotografija fundusa u boji, fluoresceinska angiografija i elektroretinografija nisu ukazali na štetne efekte na oko nakon injeciranja. Nivo sFLT-1 u plazmi nije pokazao bilo kakvo povećanje nivoa rAAV.sFlt-1 povezanog sa injeciranjem kod bilo kog od ispitivanih mužjaka ili kod ispitivanih ženki majmuna. Osim u uzorku optičkog nerva, sekvenca rAAV.sFlt-1 nije detektovana u genomskoj DNK kod nijednog drugog uzorkovanog tkiva (limfnih čvorova, slezine, jetri, mozga, mozga, srca, slezine, rožnjače). Parafinski preseci očiju obojeni hematoksilinom i eozinom su izgledali normalno.
[0358] Iako je anatomija primata različitih od čoveka sličnija anatomiji čoveka nego anatomija manjih sisara, poput miševa, postoje ograničenja koja čine studije kod primata koji nisu ljudi intrigantnima, ali i takvima da se ne mogu predvideti klinički rezultati kod ljudi. Kao što je prethodno navedeno, studija u ovom primeru koristi model povrede laserom u kome životinja ima inače zdravo tkivo mrežnjače. Tkivo mrežnjače nije podleglo propadanju tokom vremena kao što se to dešava u obolelom tkivu mrežnjače, niti su bili prisutni patogeni faktori specifični za bolest. Primati različiti od čoveka se često razlikuju od ljudi u pogledu biodistribucije, farmakokinetike i zavisnosti od doze, titra antitela, imunskog odgovora i inflamacionog odgovora na načine koji se ne mogu predvideti. Dodatne razlike uključuju karakteristike ILM (unutrašnje granične membrane) i zapreminu komore staklastog tela, koja je približno četiri puta veća kod ljudi nego kod primata različitih od čoveka koji su upotrebljeni u ovoj studiji. Humana unutrašnja granična membrana, barijera koja deluje tako da ograničava transport između retine i staklastog tela, dublja je i efikasnija barijera od ILM-a majmuna.
Primer 6
Studije bezbednosti
[0359] U ovim studijama, sFLT-1 protein je meren u staklastom telu i plazmi životinja, upotrebom kompleta za imunosorbentni test povezan sa enzimom radi detekcije sFLT-1proteina. Nivo sFLT-1 proteina je bio pozitivno regulisan u staklastom telu i očima životinja kojima je injeciran rAAV.sFlt-1. SL.3A prikazuje nivo sFLT-1 proteina u staklastom telu očiju majmuna kojima je injeciran rAAV.sFlt-1
2
(levo oko), kao i u kontrolnom oku u koje je injeciran rAAV.gfp, a dalje i u očima u koja nije vršeno injeciranje (desno oko). Nivo sFLT-1 proteina je bio značajno veći u četiri od pet očiju u koja je bio injeciran rAAV.sFlt-1. Tabela 5.3.1 prikazuje nivo sFLT-1 proteina u očima miša bez injeciranja i onima koja su injecirana sa rAAV.sFlt-1, a koja su zatim anukleizovana, meseca dana nakon injeciranja. Prekomerna ekspresija sFLT-1 u očima miševa i staklastom telu majmuna nije imala negativan uticaj na njihovo celokupno dobro stanje. Kod majmuna, prekomerna ekspresija sFLT-1 u staklastom telu je bila bez bilo kakvog efekta na funkciju njihove mrežnjače, a bili su odsutni i bilo kakvi očigledni klinički ili histološki toksični efekti na oči. Značajno veći nivoi sFLT-1 proteina u očima kojima je bio injeciran rAAV.sFlt-1 ukazuju na dugotrajnu ekspresiju hsFLT-1 posredovanu sa rAAV i podržavaju prethodne podatke o detekciji virusne iRNK sekvence i prisustvu gfp ekspresije posredovane sa rAAV u mrežnjači majmuna 17 meseci nakon injeciranja.
Tabela 1 Pregled nivoa hsFLT-1 protein u očima miševa kojima je injeciran rAAV.sFlt-1 i očima koja nisu injecirana, uoči 1 meseca nakon injeciranja
[0360] Nivoi hsFLT-1 u plazmi kod majmuna nisu pokazali nikakav trend u različitim vremenima uzorkovanja (SL. 3B). Navedeno ukazuje da injeciranje rAAV.sFlt-1 nije imalo jasan efekat na nivo hsFLT-1 u plazmi. Promenljivi nivoi nisu imali nikakvog uticaja na dobro zdravstveno stanje majmuna.
Tabela 2 Studije imunogenosti
[0361] Tabela 2: Pregled soja životinja, načina injeciranja, trajanja i doze rAAV.sFlt-1 upotrebljenog u studijama imunogenosti.
Primer 7
Studije imunogenosti na miševima
[0362] Ćelijski imunski odgovor na rAAV.sFlt-1 terapiju procenjivan je u oku miša, jednu, dve i četiri nedelje nakon injeciranja, upotrebom protočne citometrije. Infiltracioni leukociti su identifikovani na osnovu ekspresije CD45 i klasifikovani su kao monociti/granulociti, B ćelije, CD4<+>T-ćelije i CD8<+>T-ćelije na osnovu ekspresije CD11b, CD19, CD4 i CD8, tim redom. Posteriorni region očne čašice je prikupljen iz pet miševa svake grupe (injeciranih sa rAAV.sFlt-1, injeciranih sa PBS-om i iz neinjecirane kontrole) i tikvo je objedinjeno za analizu. Kao što je prikazano na SL.4A, nije bilo razlike u broju ćelija izdvojenih iz svake grupe miševa tokom trajanja ovog eksperimenta. Ipak, došlo je do značajnog povećanja broja CD45<+>ćelije, jednu i dve nedelje nakon injeciranja, koji se zatim smanjio do četvrte nedelje (SL. 4B). Skoro sva od povećanja koja su zapažena se mogu pripisati porastu u broju CD11b<+>ćelija (SL.4C), pošto nije bilo razlike u broju CD4<+>, CD8<+>i CD19<+>ćelija (SL.4D-F). Nakon dve nedelje, međutim, više nije bilo značajne razlike u broju CD11b<+>koje su bile prisutne u očima miševa injeciranih sa AAV.sFlt-1; umesto toga, došlo je do značajnog povećanja u broju CD4<+>i CD8<+>T-ćelija i do izglednog trenda povećanja B ćelija. Brojevi CD4<+>i CD8<+>ćelije su naglo opali nakon četiri nedelje, ali su ostali značajno povećani u poređenju sa miševima kojima je injeciran PBS i onima koji nisu injecirani. Nasuprot navedenom, tokom ovog eksperimenta nije došlo do promene u broju CD11b<+>, CD4<+>, CD8<+>i CD19<+>ćelija u slezini (SL.5A-E).
[0363] Funkcija T-ćelija koje se infiltriraju u retinu, bliže je ispitana njihovom stimulacijom sa PMA/jonomicinom ili anti-CD3 i merenjem unutarćelijske proizvodnje IFN-gama protočnom citometrijom. SL. 6 prikazuje da u poređenju sa neinjeciranim kontrolama, mali udeo obe od populacija CD4<+>i CD8<+>T-ćelija je prajmovan, tako da proizvodi IFN-gama nakon injeciranja rAAV.sFlt-1. Učestalost ćelija koje proizvode IFN-gama se nije značajno razlikovala tokom eksperimenta uprkos očiglednom porastu u okviru CD8<+>T-ćelija 3. dana (SL.6B). Niži nivoi IFN-gama su izmereni kada su T-ćelije bile ponovno sitmulisane sa epitopima ograničenim na klasu I MHC molukula iz rAAV kapsidnog proteina, dok je određena količina IFN-gama takođe detektovana u odsustvu bilo kakve stimulacije (podaci nisu prikazani). Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju da je mali deo T-ćelija infiltriranih u oči miševa kojima je injeciran rAAV.sFlt-1 nedavno aktiviran, tako da proizvodi IFN-gama, ali se navedeno nije suštinski razlikovalo među populacijama T-ćelija tokom trajanja ovog eksperimenta.
4
[0364] Podaci predstavljeni za ove eksperimente, koji se odnose na infiltraciju imunskih ćelija u oči miševa kojima je injeciran AAV-sFLT-1, jasno pokazuju dva talasa ćelijske infiltracije. Postojao je rani talas CD11b<+>ćelija nakon 1 nedelje, nakon čega je sledio talas CD4<+>i CD8<+>T-ćelije nakon 2 nedelje. Važno je da nijedan talas infiltracije još uvek nije bio prisutan nakon 4 nedelje, što ukazuje da se infiltracija povukla sama od sebe. Važno je i da proizvodnja sFLT-1 proteina u ovom trenutku nije oslabila, odnosno da se ekspresija nastavila u veoma visokim nivoima.
[0365] Podaci o proizvodnji IFN-gama su ukazali da je oko 5% CD4<+>i CD8<+>T bilo nedavno prajmovano, kao i da se ova učestalost nije menjala tokom trajanja eksperimenta. Hu i saradnici su prvi opisali propadanje krvno-retinalne barijere usled dejstva aktiviranih T-ćelija, a ovde prikazani podaci su u skladu sa infiltracijom aktiviranih CD4<+>i CD8<+>ćelija. Ipak, nije bilo dokaza o povećanju broja T-ćelija specifičnih za kapsid u ovoj populaciji, pošto je ponovna stimulacija sa specifičnim peptidom ukazala samo na niske nivoe proizvodnje IFN-gama koji se nisu menjali tokom trajanja eksperimenta. Uzeta zajedno, ova zapažanja ukazuju da je početna povreda, koja se dogodila injeciranjem rAAV.sFlt-1, proizvela kratkotrajni talas infiltracije imunskih ćelija koji se povukao sam po sebi tokom perioda do četiri nedelje i nije uspeo da izazove stalni imunski odgovor koji bi mogao da naškodi tkivima oka ili da utiče na ekspresiju sFLT-1.
Primer 8
Studije imunogenosti na majmunima
[0366] Imunski odgovor nakon subretinalnog injeciranja rAAV.sFlt-1 ili rAAV.gfp analiziran je upotrebom panela antitela za identifikovanje promene u populacijama imunskih ćelija. Rezultati su sumirani na SL. 4. Kod nekih majmuna su uočene vrlo male promene u populaciji različitih imunskih ćelija, ali ove promene nisu bile statistički značajne. Uprkos tome, fenomen je praćen i detaljnijom analizom cirkulišućih ćelija. Preciznije, procenjivali smo mogućnost da bilo vektor (rAAV) ili insertovani genski proizvod (sFLT-1) mogu prouzrokovati imunsku aktivaciju. Ispitivana je aktivacija B-ćelija i T-ćelija (SL.5 i SL.6). Druge populacije limfocita su takođe analizirane, da bi se utvrdilo da li je terapija prouzrokovala bilo kakve uočljive razlike koje mogu ukazati na direktnu aktivaciju ili odgovor na aktivaciju. Analiza je sprovedena upotrebom kombinacije klasičnih markera (Pitcher, 2002 #129), kao i nove fenotipske analize opisane u nedavno objavljenoj publikaciji (Miller, 2008 #126). Upotrebom male grupe fenotipskih markera (HLA-DR, Ki-67 i Bcl-2) istražili smo da li su nakon primene rAAV-sFLT-1 CD4+ ili CD8+ T-ćelije i/ili B-ćelije pokazale znake aktivacije. U studijama koje su objavili Miller i kolege, aktivirane T-ćelije pokazuju aktivirani efektorski fenotip koga karakteriše ekspresija markera diferencijacije HLA-DR i nuklearnog antigena Ki-67 koji je povezan sa ćelijskim ciklusom, a koji se upotrebljava kao marker za proliferaciju. T-ćelije u mirovanju ne eksprimiraju Ki-67, dok ciklirajuće ili nedavno podeljene T-ćelije povećavaju ekspresiju Ki-67. Nivo ekspresije Ki-67 se obično detektuje kao deo homeostaze ćelijskog ciklusa.
Primer 9
Biodistribucija rAAV.sFlt-1
[0367] Genomska DNK je ekstrahovana iz prikupljenih tkiva (optičkog nerva, limfnih čvorova, mozga, srca, pluća, slezine, jetre, rožnjače) odmah nakon eutanazije majmuna. Lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu izvedena je na genomskoj DNK, da bi se utvrdilo da li će rAAV.sFlt-1 vektorski konstrukt injeciran u subretinalni prostor, biti prisutan i na drugom mestu. Na osnovu poređenja Ct vrednosti između poznatih količina DNK kontrolnog plazmida pssv.C1.sflt-1, utvrđeno je da je konstrukt rAAV.sFlt-1 prisutan sa niskim brojem kopija u optičkom nervu jednog injeciranog oka, ali ne i u bilo kom drugom uzorku tkiva. Navedeno ukazuje da rAAV.sFlt-1 injeciran u subretinalni prostor ostaje uglavnom unutar oka. Tabela 4 predstavlja rezime Ct vrednosti dobijenih iz genomske DNK ekstrahovane iz majmuna koji nisu injecirani ili im je injeciran rAAV.sFlt-1- i rAAV.gfp.
Tabela 3: Ct vrednosti i vrednosti standardne devijacije Ct za različite analizirane uzorke genomske DNK i za DNK kontrolnog plazmida.
Primer 10
Studije efikasnosti u mišjem modelu retinalne neovaskularizacije
[0368] U studiji su upotrebljavani transgeni miševi generisani putem pozitivne regulacije VEGF-a u ćelijama fotoreceptora. U jedno oko je injeciran rAAV.sFlt-1, dok je u kontralateralno oko injeciran rAAV.gfp. Opseg, intenzitet i stadijum neovaskularizacije su ocenjivali objektivni posmatrači na osnovu unapred dogovorene skale. Rezultati su pokazali da je došlo do statistički značajnog sveukupnog smanjenja stepena neovaskularizacije sa vrednostima medijane od 3 (teške) do medijane 1 (blage), mesec dana nakon injeciranja (P = 0,012). Ovako nizak nivo curenja fluoresceina je održavan do tri (medijana = 1; P = 0,001) i osam meseci (medijana 1; P = 0,001) nakon injeciranja rAAV.sFlt-1, što ukazuje na dugotrajan, održiv terapijski efekat rAAV.sFlt-1.
Tabela 4: Sistem za procenu statusa očiju pre i nakon injeciranja AAV.sFlt-1 i AAV.gfp i broj/redovi fotoreceptora 8 meseci nakon injeciranja
Primer 11
Studije efikasnosti u modelu laserski indukovane horoidne neovaskularizacije kod majmuna
[0369] U po jedno oko je kod pet majmuna injeciran rAAV.sFlt-1, dok je u drugo injeciran rAAV.gfp. Subretinalno injeciranje je bilo bez uspeha u desnom oku jednog od majmuna; ova životinja stoga nije bila podvrgnuta daljoj analizi. Subretinalno injeciranje 40-100 uL rAAV suspenzije je izdiglo mrežnjaču, stvarajući mehur u kome je vektor bio smešten između pigmentnog epitela i fotoreceptorskog sloja, na lokalizovani način. Ovaj mehur se sam korigovao u periodu do 24 do 48 sati. Osim manjeg poremećaja pigmentnog epitela retine na mestu uboda iglom, nisu uočene druge abnormalnosti mrežnjače tokom perioda praćenja (3 do 17 meseci nakon injeciranja). Nisu uočene ni druge abnormalnosti ili neželjeni događaji; ni u jednom trenutku nije došlo do odvajanje mrežnjače koje bi bilo povezano sa operacijom.
[0370] Da bi se procenila dugotrajna terapijska efikasnost rAAVsFlt-1, četiri injecirana majmuna su zatim bila podvrgnuta intenzivnoj laserskoj fotokoagulaciji, 16 meseci nakon tretmana sa vektorima. U svakom oku je upotrebom lasera indukovano osam lezija, nakon čega je u očima praćeno prisustvo CNV, nakon dve i četiri nedelje od laserskog tretmana. Nakon laserske fotokoagulacije, samo su tri od četiri majmuna bila pogodna za analizu, tako da su podaci o efikasnosti prikupljeni za tri životinje. Nijedno od tri oka majmuna tretiranih sa rAAVsFlt-1 nije razvilo lezije koje bi se mogle povezati sa CNV, a uočeno je samo slabo bojenje fluoresceinom, koje je ukazalo na minimalno curenje/neovaskularizaciju. Sve kontralateralne oči tretirane kontrolnim vektorom razvile su lezije povezane sa horoidnom neovaskularizacijom. Podaci o efikasnosti za tri životinje su prikazani u Tabeli 5.
Funkcija retine majmuna je analizirana elektroretinografijom. Amplitude i implicitna vremena u okviru odgovora injeciranog oka i neinjeciranog kontralateralnog oka su izračunavani i upoređivani pre injeciranja i u različitim vremenima nakon injeciranja. Rezultati su pokazali da injeciranje rAAV.sFlt-1, rekombinantnog sFLT-1 proteina ili rAAV.gfp nije imalo negativan uticaj na funkciju retine kod majmuna.
Primer 12
[0371] Standard nege u lečenju vlažne AMD podrazumeva česta intraokularna injeciranja rekombinantnih anti-VEGF proteina, na svakih 4-8 nedelja. Konstrukt rAAV je razvijen za potentan (Kd ∼10 pM) anti-VEGF protein koji se javlja u prirodi, solubilnu tirozin kinazu srodnu Fms tipa 1 (sFlt-1), u cilju lečenja vlažne AMD. rAAV.sFlt-1 je proizveden u skladu sa FDA i ICH smernicama u UNC Vector Core Laboratoriji za primenu ljudima. Sprovedeno je osam kontrolisanih studija bezbednosti i efikasnosti rAAV.sFlt-1 sa pacijentima. Kriterijumi podobnosti, uključivanja i isključivanja za studiju su bili sledeći:
1
Kriterijumi podobnosti
[0372]
Starost podobna za studiju: 65 godine i više
Pol podoban za studiju: Oba
Prihvataju se zdravi volonteri: Ne
Kriterijumi uključivanja:
[0373]
● Starost veća ili jednaka 65 godina;
● Subfovealni CNV koji nastaje sekundarno u odnosu na AMD, praćen najbolje korigovanom oštrinom vida u drugom oku od 20/80 - 20/400 ili bolje;
● Fluoresceinski angiogram ispitivanog oka mora pokazivati dokaze o “curenju” subfovealne horoidne neovaskularne lezije;
● Mora biti kandidat za anti-VEGF intravitrealna injeciranja;
● Čitava dimenzija lezije ne sme prelaziti 12 površina diska za istraživanje makularnom fotokoagulacijom;
● Bez prethodnog tretmana retine sa fotodinamičkom terapijom ili laserom;
● U stanju da obezbedi informisani pristanak;
● Učesnik ima klinički prihvatljive laboratorijske rezultate i EKG u vreme uključivanja u studiju; i ● U stanju je da ispuni zahteve protokola, uključujući i posete praćenja.
Kriterijumi isključivanja:
[0374]
● Enzimi jetre > 2 X od gornje granica normalnih vrednost;
● Klinički dokazi o aktivnoj infekciji bilo koje vrste, uključujući adenovirusnu, hepatitisom A, B ili C ili HIV virusom;
● Bilo koji prethodni tretman za AMD u ispitivanom/kontrolnom oku, isključujući anti-VEGF injeciranja;
● Rupture u retinalnom pigmentnom epitelu;
● Obimno submakularno ožiljno tkivo;
● Značajna retinalna oboljenje drugačija od subfovealnog CNV u AMD, kao što su dijabetesna retinopatija ili retinalna vaskularna okluzija;
● Bitna oboljenja koja nisu u vezi sa retinom, kao što je očna atrofija ili katarakta;
● Poznata alergija na fluorescein;
2
● Trenutna upotreba prednizolona, drugih antiinflamatornih steroida ili imunosupresivnih lekova. Dozvoljeni su nesteroidni lekovi kao što je aspirin;
● Bilo koje drugo bitno oboljenje ili poremećaj koji, po mišljenju istraživača, može dovesti učesnike u rizik zbog učešća u studiji, ili može uticati na rezultat studije ili na sposobnost učesnika da učestvuje u studiji;
● Učesnici koji su učestvovali u drugoj istraživačkoj studiji koja je uključivala uporebu ispitivanog proizvoda u proteklih 12 nedelja; i
● Osetljivost na penicilin.
[0375] Postupak primene: Farmaceutska kompozicija koja sadrži rAAV.sFlt-1 primenjivana je subjektima studije u okruženju pogodnom za subretinalno injeciranje prema sledećoj proceduri: 1. Periokularna koža i ivice kapaka i trepavice subjekta se čiste sa 5% povidon jodom pre postavljanja sterilne prostirke;
2. Postavlja se sterilna prostirka preko celog tela, nakon čega se postavlja i dodatna prostirka za pokrivanje oka.
3. Umeće se spekulum za očne kapake i osigurava se da je dobro postavljen ispod kapaka i tako da trepavice usmerava dalje od polja rada, nakon čega se zaštićuje prostirkom za pokrivanje oka.
4. Ubacuje se priključak za vitrektomiju sa otvorom promera 3 x 23G ili 25G;
5. Infuzija fiziološkog rastvora se povezuje sa prvim priključkom;
6. U drugi priključak sa otvorom se ubacuju optička vlakna;
7. Subretinalna kanila promera 36G-41G se povezuje sa špricem za lekove preko mikrokonektora u trećem priključku;
8. Pod mikroskopskom kontrolom, ispod retine se injecira 100 mikrolitara;
9. Nakon injeciranja, instrumenti i priključci se povlače;
10. Primenjuje se mast sa hloramfenikolom;
11. Ukapava se kap 1% atropina iz sterilnog kontejnera za jednokratnu upotrebu; i
12. Nanosi se tampon i štitnik za oči.
[0376] Rezultati studije sa rAAV.sFlt-1 su ukratko prikazani u tekstu koji sledi.
Od osam uključenih subjekata (prosečne starosti 77 godina), svi su imali aktivnu subfovealnu horoidnu neovaskularizaciju, sa oštrinom vida od 20/40 do 20/400, a prethodno su primali između 1 i 25 intravitrealnih injekcija ranibizumaba. Pacijenti su nasumično raspoređeni u tri grupe, kontrolnu i dve eksperimentalne grupe. Svi pacijenti su primili intravitrealne injeciranja ranibizumaba 1. i 30. dana studije. Prvoj eksperimentalnoj grupi je 7. dana subretinalnim injeciranjem primenjeno 1 x 10<10>genoma vektora rAAV.sFlt-1 u zapremini od 100ul, dok je drugoj eksperimentalnoj grupi subretinalnim injeciranjem primenjeno 1 x 10<11>genoma vektora rAAV.sFlt-1 u zapremini od 100ul. U svih šest slučajeva pacijenata iz eksperimentalnih grupa, mehur subretinalne tečnosti je nestao u vremenskom periodu do 4 sata. Nakon 24 sata, većina vazduha u staklastom telu se apsorbovala i samo je mesto injeciranja u retini ostalo vidljivo. Jedan pacijent je razvio manje krvarenje povezano sa procedurom koje nije uticalo na vid. Kao što se očekivalo nakon vitrektomije, došlo je do prolaznog povećanja broja neutrofila koji se vratio u normalu 14 dana nakon injeciranja. Vektorska sekvenca je pronađena u suzama jednog subjekta jedan dan nakon injeciranja, ali se dalje nije moglo detektovati prisustvo do 30. dana. Osim ovog jednog događaja, AAV2 do danas nije detektovan upotrebom qPCR ili ELISA postupka u uzorcima krvi, pljuvačke ili urina nijednog subjekta. Nivoi prirodno prisutnog sFLT-1 proteina koji bi predstavljao šum pozadine, pokazali su velike početne varijacije u urinu, serumu i pljuvački, ali su bili i bez povećanja nakon tretmana. Kod subjekata su takođe varirali nivoi sFLT-1 u staklastom telu (975-2085pg/ml). Biohemija krvi, kompletna krvna slika i odgovor T-ćelija su ostali bez značajnih promena u odnosu na osnovne vrednosti. Subretinalno injeciranje rAAV.sFlt-1 nije dovelo do klinički značajne toksičnosti u mrežnjači, što je utvrđeno serijskim oftalmološkim pregledima tokom perioda od dva meseca. Ni kod jednog subjekata nisu bili prisutni površinski ili znaci inflamacije prednjeg segmenta ili staklastog tela. Nije bilo dokaza ni o gubitku oštrine vida, povećanju IOP, odvajanju mrežnjače ili bilo kakvom intraokularnom ili sistemskom imunskom odgovoru kod bilo kog od pacijenata. Kratak pregled anti-VEGF tretmana, kako početnih tako i “spasavanja”, sažet je za svakog pacijenta u Tabeli 6.
4
ai ij<e>nt pac
abapo
zubini jaranirainjecled Preg6: laTabe
[0377] Značajno je da kod nijednog od pacijenata u eksperimentalnim grupama nije došlo do neophodnosti tretmana “spašavanja” do 60. dana, a većini pacijenata u eksperimentalnoj grupi sa manjom dozom je bilo potrebno 0 tretmana spašavanja nakon 90, 120, 150, 180 ili 210 ili 270 ili 365 dana (nakon 1 godine). Kontrolnom pacijentu je bilo potrebno više tretmana “spašavanja”. Ovi rezultati su neočekivani i proširuju obećavajuću perspektivu za gensku terapiji u većoj kohorti starijih pacijenata koji boluju od vlažne AMD. U principu, pacijentima koji su lečeni sadašnjom anti-VEGF terapijom, kao što su intravitrealna injeciranja inhibitornih proteina VEGF-a ili drugog anti-VEGF sredstva, biće potrebna dodatna injeciranja za 30, 60 ili 90 dana.
[0378] Maksimalni nivoi ekspresije sFLT-1 kod subjekata ili pacijenta studije su dostignuti šest do osam nedelja nakon subretinalne primene rAAV.sFLT-1. Tokom ovog takozvanog perioda „postepenog povećavanja“, najmanje jedno, dva ili tri intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva su primenjivana u intervalima od 15 do 45 dana, a poželjno u intervalima od 30 dana, da bi se sprečila progresija oboljenja. Poželjno je takođe da se prvo intravitrealno injeciranje anti-VEGF sredstva primeni između 1. do 30. dana, a poželjno od 5. do 10. dana, pre primene rAAV.sFlt-1, da bi se omogućila apsorpcija intravitrealno injeciranog anti-VEGF sredstva (Lucentis-a ili Avastin-a ili Eylea ili drugog sredstva koji nije sFLT). Ukoliko se ova prva intravitrealna injekcija primenjuje u periodu manjem od 24 sata pre subretinalne primene rAAV.sFLT, ista može biti isprana iz staklastog tela tokom procedure subretinalnog injeciranja. što dovodi do svođenja na supterapijsku koncentraciju anti-VEGF sredstva i do progresije oboljenja.
[0379] Po završetku perioda “postepenog povećavanja”, pacijentima koji eksprimiraju dovoljno sFLT-1 za lečenje ili prevenciju progresije AMD, možda neće biti potrebna dodatna intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva, iako se očekuje da će ostati pod nadzorom lekara. Pacijenti se prate i leče po potrebi i na osnovu objektivnih kriterijuma, kao što je povećano merenje debljine retine u centralnoj tački sa optičkom koherentnom tomografijom.
[0380] U ovoj studiji, kod pacijenata u kontrolnoj i obe eksperimentalne grupe su procenjivani znaci aktivne horoidne neovaskularizacije, približno na mesečnom nivou, a ponovo su tretirani intravitrealnim ranibizumabom ukoliko je bio ispunjen bilo koji od sledećih kriterijuma:
- Gubitak slova iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS) za > 10 u odnosu na prethodnu posetu subjekta (može se pripisati problemima sa retinom), ILI smanjenje 5 ETDRS slova za > 5 u odnosu na prethodnu posetu subjekta, zajedno sa percepcijom pacijenta o funkcionalnom gubitku;
- Bilo koje povećano, novo ili postojano subsenzorno ili prisustvo tečnosti ispod retinalnog pigmentnog epitela (RPE) ili intraretinalna tečnost na OCT-u;
- Znaci povećanog curenja iz CNV, putem FA.
Primer 13
Optička koherentna tomografija (OCT)
[0381] Optička koherentna tomografija spektralnog domena (SD-OCT) vršena je upotrebom odobrene opreme (Heidelberg Spectralis® SD-OCT) i standardnim tehnikama za praćenje debljine retine u centralnoj tački, kao i za curenja tečnosti u retini pacijenata.
[0382] Optička koherentna tomografija (OCT) je beskontaktna medicinska tehnologija snimanja slična ultrazvuku i MRI. Pri OCT, odbijena svetlost se koristi za izradu detaljnih poprečnih preseka i 3D slika oka. SPECTRALIS® SD-OCT istovremeno meri više talasnih dužina reflektovane svetlosti u čitavom spektru, odakle i potiče deo naziva - “spektralnog domena”. Povećana brzina i broj skeniranja prevodi se u veću rezoluciju i veće šanse za praćenje oboljenja. Kod pacijenata sa vlažnom AMD, sa SD-OCT se može detektovati nova retinalna tečnost ili klinički značajno povećanje debljine retine. (Adhi i saradnici, Curr Opin Ophthalmol. 2013. maj; 24(3):213-21; Malamos i saradnici, _ Invest Ophthalmol Vis Sci.2009 Oct; 50(10):4926-33). Detektovanje ovih simptoma kod pacijenata sa AMD ukazuje na progresiju oboljenja koje zahteva lečenje sa anti-VEGF terapijom kao što su Lucentis ili Eylea.
[0383] Zdravlje mrežnjače i simptomi progresije AMD-a kod svakog subjekata studije, praćeni su putem SD-OCT. Snimano je najmanje 6 radijalnih snimaka kroz makulu, pri čemu je svaki bio dužine od približno 6 mm; OCT slike/ skenovi su prikupljani i pri svakoj navedenoj poseti. SD-OCT slike su analizirane i utvrđivano je prisustvo intraretinalne tečnosti upotrebom objektivnog čitača, dok je središnja debljina retine merena upotrebom Heidelberg Heyex SD-OCT programa. Rezultati centralne debljine retine prilikom svake posete, za 8 pacijenata, prikazani su ispod, u Tabeli 7.
Tabela 7: Srednja promena debljine centralne mrežnjače u odnosu na početnu vrednost na dan 0, u mikronima po doznoj grupi
[0384] Kao što je prikazano u tabeli 7, srednja debljina centralne retine subjekta u svim doznim kohortama je opadala nakon primene intravitrealnih injeciranja anti-VEGF proteina (Lucentis) na početku studije, kao što to protokol i zahteva. Kao što se očekivalo, debljina centralne retine pacijenata u kontrolnoj grupi počiela je da se povećava i na SD-OCT snimcima u periodu do 30-90 dana od primene anti-VEGF proteina se mogla videti tečnost. Neočekivano, debljina centralne retine subjekata u grupama sa niskim i visokim dozama je uglavnom bila dobro kontrolisana upotrebom rAAV.sFlt-1 i nije se povećavala tokom vremena. Nova intraretinalna tečnost se nije pojavila u retinama subjekata iz grupe sa niskim dozama ili retinama subjekata iz grupe sa visokim dozama. Navedeno je pokazano putem OCT snimaka, na primer, na Slici 24. Sa 12 meseci, debljina centralne retine subjekata tretiranih sa rAAV.sFlt-1 se nije povećala za više od 50 mikrona ili za više od 100 mikrona ili za više od 250 mikrona u periodu do 12 meseci od primene farmaceutske kompozicije koja je sadržavala rAAV.sFlt-1. U poređenju sa osnovnim vrednostima, debljina centralne retine kod ljudi koji su bili tretirani sa rAAV.sFlt-1 se smanjila za 50 mikrona ili, u pojedinim slučajevima, za 100 mikrona ili, u pojedinim slučajevima, za 200 mikrona. Ovo smanjenje se moglo uočiti tokom 8 nedelja nakon primene sFlt-1 i zadržalo se nakon 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci i 12 meseci. Ovaj rezultat je iznenađujuć i nepoznat je u kliničkom lečenju AMD-a i očne neovaskularizacije kod ljudi. Generalno, bez dodatnih primena anti-VEGF proteina ili drugog VEGF inhibitora, intraretinalna tečnost i povećanje centralne debljine retine će se primećivati tek nakon 30, 60, 90 ili 180 dana od početnog anti-VEGF tretmana.
Fluoresceinska angiografija (FA)
[0385] FA je vršena upotrebom standarne tehnike. Tranzitne slike su snimane za ispitivano oko. Snimci srednje ili kasne faze su uzimani za ispitivano i oko koje nije ispitivano; a FA je obično obavljana pri svakoj do navedenih poseta.
Studije biodistribucije
[0386] Rasejavanje vektora je ispitivano umnožavanjem vektorskih genoma izolovanih iz uzoraka suza, plazme, urina i pljuvačke, upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR postupka). Biodistribucija vektora i sFLT-1 je ispitivana i ELISA postupkom za sFLT-1 i AAV2 kapside u plazmi, suzama i pljuvački.
Ekstrakcija DNK
[0387] Uzorci (100-300 ul) su pipetom odmereni na kartice za prikupljanje uzoraka (Qiagen, Valencia, CA) ili na aplikatore sa vrhom od sterilne pene. DNK je ekstrahovana iz svakog uzorka prema protokolu proizvođača. Prečišćena DNK je rastvorena u 50 ul elucionog pufera. Količina prisutne DNK je određena spektrofotometrijom.
Detekcija rAAV.sFlt-1 upotrebom PCR-a u realnom vremenu
[0388] U uzorcima genomske DNK (0,5-1 µg) je urađen skrining na prisustvo AAV.sFlt-1 vektora, upotrebom TaqMan® tehnologije za analizu genske ekspresije (Applied Biosystems, U.S.A.). Analiza podrazumeva prisusvo para neobeleženih prajmera za PCR koji umnožavaju fragment između AAV2 i sFLT-1 sekvenci, kao i TaqMan® probe obeležene sa FAM™ ili VIC® bojom i strukturom koja se vezuje za mali žljeb na 5’ kraju, kao i bojom prigušivača fluorescencije na 3’ kraju. Uslovi u ciklusima su bili: 1 inkubiranje od 2 minuta na 50°C i drugo inkubiranje na 95°C tokom 20 sekundi, nakon čega je sledilo 45 ciklusa od 95°C tokom 3 sekunde i 60°C tokom 30 sekundi.
[0389] Uzorci pozitivni na rAAV.sFlt-1 fragment su dalje ispitivani i kvantifikovan je broj genskih kopija prisutnog rAAV.sFlt-1, lančanom reakcijom polimeraze u realnom vremenu (PCR). Između 0,5-1,0 ug ekstrahovane DNK je amplifikovano u reakcionim smešama od 20-ul koje su sadržavale Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) i po 0,5 uM svakog prajmera, upotrebom IQ5 sistema za PCR u realnom vremenu kompanije Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Sličan skup uzoraka obogaćen plazmidnom DNK koji je sadržavao ciljnu sekvencu postavljen je paralelno sa spajkovanim uzorcima. Upotrebljeni par prajmera (uzvodni: CACTAGTCCAGTGTGGTGGA; nizvodni: AGCCAGGAGACAACCACTTC) dizajniran je uz pomoć kompjuterskog programa Primer3 Output (Whitehead Institute, MA, SAD) za amplifikaciju regiona iz vektorske cDNA u sFLT-1 gen upotrebom Rotorgene programa (Corbett). Upotrebljavani su sledeći uslovi amplifikacije u ciklusima: 2 min na 50,0°C, 2 min na 95,0°C i 60 ciklusa u tri koraka: 95,0°C tokom 20 s, 60,0°C tokom 20 s i 72,0°C tokom 20 s. Standardna kriva je generisana u svakom ciklusu na osnovu razblaženja od 10-puta plazmidne DNK (pSSV.sFlt-1), koja je bila sa istom sekvencom kao i ciljni vektor. Svaki uzorak je analiziran u triplikatu.
Kvantifikacija koncentracije sFlt-1 proteina upotrebom ELISA postupka
[0390] Koncentracija sFLT-1 prisutnog u plazmi, suzama i pljuvački je kvantitativno merena ELISA postupkom, upotrebom Quantikine ELISA kompleta (R&D Systems, Minneapolis, MN) koji je zasnovan na tehnici “sendvič” imunoeseja. Uzorci (100 ul) su dodavani u ploču sa 96 bunarića koja je bila obložena monoklonskim antitelom specifičnim za VEGF R1/sFLT-1, nakon čega je ploča ostavljena da se inkubira tokom 2 sata. Sav nevezan sFLT-1 je uklonjen pranjem sa puferom. Nakon inkubacije sa poliklonskim antitelom specifičnim za VEGF R1/sFLT-1 koje je bilo konjugovano sa enzimom, višak konjugata antitela i enzima je uklonjen pranjem i uzorci su dalje inkubirani sa rastvorom supstrata. Obrazovanje hromogena katalizovano enzimom je kvantifikovano merenjem apsorbancije u vidljivom delu spektra na 450 nm. Koncentracije sFLT-1 (u pg/ml) u uzorcima izračunate su iz vrednosti apsorbancije, upotrebom kalibracione krive koja je bila grafički predstavljena na osnovu izmerenih vrednosti za poznate koncentracije rekombinantnog humanog sFLT-1.
Detekcija AAV2 upotrebom ELISA postupka
[0391] Prisustvo AAV2 kapsida u plazmi, suzama, urinu i pljuvački je analizirano upotrebom AAV2 Titration ELISA kompleta (American Research Products, Inc., Belmont, Massachusetts, SAD). Ovaj komplet se zasniva takođe na tehnici “sendvič” ELISA postupka i upotrebljava mišje monoklonsko antitelo specifično za konformacioni epitop na “skopljenim” AAV česticama. Ovo monoklonsko antitelo je bilo naneto na površinu traka za mikotitarske ploče i upotrebljavano je za “hvatanje” AAV čestica iz uzorka. “Uhvaćene” AAV čestice su detekotvane u dva koraka. Najpre je monoklonsko antitelo na AAV, koje je bilo konjugovano sa biotinom, vezano za imunski kompleks. U drugom koraku, konjugat streptavidin peroksidaze je reagovao sa molekulima biotina. Dodavanjem rastvora supstrata došlo je do razvijanja bojene reakcije koja je bila proporcionalna specifično vezanim česticama virusa. Apsorbancija je merena fotometrijski na 450 nm. Priložena kontrola kompleta je sadržavala preparat praznih kapsida AAV čestica i omogućila je kvantitativno određivanje nepoznatog titra čestica u uzorcima. U ploče su konačno dodavani uzorci (100 ul) i ispitivanje je bilo potrebno vršiti prema protokolu proizvođača.
Detekcija neutrališućeg AAV-2 antitela
[0392] Ispitivana je i sposobnost plazme da blokira transdukciju HEK293 ćelija sa AAV2.gfp. Plazma pacijenata je serijski razblaživana u normalnom mišjem serumu, u mikrotitarskim pločama. U svaki bunarić je dodavan AAV2.gfp i ploče su inkubirane na 37°C tokom 1 sata, a pre dodavanja u HEK293 ćelije u triplikatu. Titar neutrališućeg antitela je izražen kao razblaženje plazme koje dovodi do inhibicije transdukcije sa AAV2-gfp od 50%. Maksimalna gfp aktivnost predstavljala je vrednost dobijenu za vektor razblažen u normalnom mišjem serumu; maksimalnu inhibiciju je predstavljala vrednost dobijena samo za medijum u normalnom mišjem serumu. Bazalna vrednost za plazmu svakog subjetka je ispitivana uporedo za svaki postoperativni uzorak. Zeleno obojene ćelije, nastale transdukcijom 293T-ćelija sa AAV2.gfp, prebrojane su u ispitivanim bunarićama nakon 48 sati i upoređene su sa brojem zeleno obojenih ćelija u uzorku seruma sa bazalnim vrednostima.
Detekcija anti-AAV2 antitela
[0393] Da bi se detektovala antitela na AAV2 kapsid u plazmi, ELISA ploče za pojačano vezivanje proteina su bile obložene sa 10<9>vg/ml AAV2 (Vector Core Facility, North Carolina), inkubiranjem na 4°C preko noći. Ploče su zatim blokirane na 37°C tokom 2 sata, pa su inkubirane preko noći na 4°C sa serijski razblaženim anti-AAV2 monoklonskim antitelom (Industries International, Concord, MA) ili sa razblaženjima plazme pacijenta od 1:50, 1:100, 1:200 ili 1:400. Ploče su inkubirane sa anti-humanim Ig-om konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) na 37°C tokom 2 sata, a zatim i sa tetrametil benzidinskim (TMP) supstratom i vodonik-peroksidom (H2O2). Reakcija je zaustavljena fosfornom kiselinom (H3PO4) i očitana je obojenost na 450 nm upotrebom čitača za ploče. Titar anti-AAV2 antitela je izračunat na osnovu standardne krive dobijene sa komercijalnim antitelom koja je istovremeno očitavana. Svaka vrednost je određivana u triplikatu.
Geografska atrofija
[0394] Kod ljudi uključenih u studiju su ispitivani znaci geografske atrofije u njihovim tretiranim i netretiranim očima u skladu sa standardnim tehnikama. Povećanje geografske atrofije nije uočeno kod pacijenata lečenih sa rAAV.sFlt-1, nakon 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci ili 12 meseci. Pretpostavlja se da bi lečenje moglo zaustaviti progresiju geografske atrofije u tretiranom oku do 15 meseci, 18 meseci, 24 meseca, 36 meseci, 5 godina i 10 godina.
Primer 14
[0395] Da bi se dalje ispitali bezbednost i efikasnost rAAV.sFlt-1 za lečenje vlažne AMD i horoidne neovaskularizacije, u kontrolisanu kliničku studiju je uključeno četrdeset (40) dodatnih subjekata. Kao u primeru 12, rAAV.sFlt-1 je proizveden u skladu sa FDA i ICH smernicama u UNC Vector Core Laboratoriji za humanu primenu. Kriterijumi podobnosti, uključivanja i isključivanja iz studije su bili sledeći:
Podobnost:
[0396]
Starost podobna za studiju: 55 godine i više
Pol podoban za studiju: Oba
Prihvataju se zdravi volonteri: Ne
1
Kriterijumi uključivanja:
[0397]
● Starost veća ili jednaka 55 godina;
● Subfovealni CNV koji nastaje sekundarno u odnosu na AMD, praćen najbolje korigovanom oštrinom vida u drugom oku od 20/30 - 20/400 i 20/200 ili bolje;
● Fluoresceinski angiogram ispitivanog oka mora pokazivati dokaze o “curenju” subfovealne horoidne neovaskularne lezije; ili horoidnoj neovaskularizaciji koja je trenutno pod aktivnim održavanjam sa anti-VEGF terapijom
● Mora biti kandidat za anti-VEGF intravitrealna injeciranja;
● Čitava dimenzija lezije ne sme prelaziti 12 površina diska za istraživanje makularnom fotokoagulacijom;
● Bez prethodnog tretmana retine sa fotodinamičkom terapijom ili laserom;
● U stanju da obezbedi informisani pristanak;
● Učesnik ima klinički prihvatljive laboratorijske rezultate i EKG u vreme uključivanja u studiju; i ● U stanju je da ispuni zahteve protokola, uključujući i posete praćenja.
Kriterijumi isključivanja:
[0398]
● Enzimi jetre > 2 X od gornje granice normalnih vrednost;
● Klinički dokazi o aktivnoj infekciji bilo koje vrste, uključujući adenovirusnu, hepatitisom A, B ili C ili HIV virusom; ili dokumentovana istorija hepatitisa B ili hepatitisa C;
● Bilo koji prethodni tretman za AMD u ispitivanom/kontrolnom oku, isključujući anti-VEGF injeciranja;
● Rupture u retinalnom pigmentnom epitelu;
● Obimno subfovealno ožiljačno tkivo; obimna geografska atrofija ili debeli sloj krvi ispod retine u istpivanom oku koje je utvrdio istraživač;
● Bitna retinalna oboljenje drugačija od subfovealnog CNV AMD, kao što su dijabetesna retinopatija ili retinalna vaskularna okluzija;
● Bitna oboljenja koja nisu u vezi sa retinom kao što je očna atrofija ili katarakta u ispitivanom oku, uključujući ožiljačno tkivo rožnjače koje utiče na oštrinu vida, glaukom sa defektom polja ili bilo koji merljivi uveitis;
● Poznata alergija na fluorescein;
● Trenutna upotreba prednizolona, drugih antiinflamatornih steroida ili imunosupresivnih lekova. Dozvoljeni su steroidi za inhalaciju i nesterodini lekovi kao što je aspirin;
2
● Bilo koje drugo bitno oboljenje ili poremećaj koji, po mišljenju istraživača, može dovesti učesnike u rizik zbog učešća u studiji, ili može uticati na rezultat studije ili na sposobnost učesnika da učestvuje u studiji;
● Učesnici koji su učestvovali u drugoj istraživačkoj studiji koja je podrazumevala upotrebu ispitivanog proizvoda u proteklih 12 nedelja; i
● Osetljivost na penicilin koja je potvrđena medicinskom dokumentacijom učesnika.
[0399] Inicijalno uključeni subjekti su bili sa aktivnom subfovealnom horoidnom neovaskularizacijom, sa oštrinom vida u ispitivanom oku od 20/30 do 20/400 i prethodno su primali od 0 i 25 intravitrealnih injekcija ranibizumaba. Pacijenti su nasumično raspoređeni u kontrolnu grupu ili eksperimentalnu grupu sve dok nije bilo uključeno 14 pacijenata u kontrolnu grupu i 26 pacijenata u eksperimentalnu grupu. Svi pacijenti su primili intravitrealne injeciranja ranibizumaba 1. i 30. dana studije. Eksperimentalnoj grupi je 7. dana subretinalnim injeciranjem primenjeno 1 x 10<11>genoma rAAV.sFlt-1 vektora u zapremini od 100 ul.
[0400] Kao i u studiji iz Primera 12, maksimalni nivoi ekspresije sFLT-1 kod subjekata ili pacijenta studije su dostignuti šest do osam nedelja nakon subretinalne primene rAAV.sFLT-1. Tokom ovog takozvanog perioda „postepenog povećavanja“, najmanje jedno, dva ili tri intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva su primenjivana u intervalima od 15 do 45 dana, a poželjno u intervalima od 30 dana, da bi se sprečila progresija oboljenja. Poželjno je takođe da se najpre primeni intravitrealno injeciranje anti-VEGF sredstva između 1. do 30 dana, a poželjno od 5. do 10. dana, pre primene rAAV.sFLT-1, da bi se omogućila apsorpcija intravitrealno injeciranog anti-VEGF sredstva (Lucentis-a ili Avastin-a ili Eylea ili drugog sredstva koji nije sFLT). Ukoliko se ova prva intravitrealna injekcija primenjuje u periodu manjem od 24 sata pre subretinalne primene rAAV.sFLT, ista može biti isprana iz staklastog tela tokom procedure subretinalnog injeciranja, što dovodi do supterapijske koncentracije anti-VEGF sredstva i progresije oboljenja.
[0401] Po završetku perioda “postepenog povećavanja”, pacijentima koji eksprimiraju dovoljno sFLT-1 za lečenje ili prevenciju progresije AMD-a, ili drugih simptoram horoidne neovaskularizacije, možda neće biti potrebna dodatna intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva, iako se očekuje da će ostati pod nadzorom lekara.
[0402] U ovoj studiji navedenoj u ovom primeru, kod pacijenata u kontrolnoj i eksperimentalnoj grupi su procenjivani znaci aktivne horoidne neovaskularizacije, na približno mesečnom nivou, a ponovo su tretirani intravitrealnim ranibizumabom ukoliko je bio ispunjen bilo koji od sledećih kriterijuma:
- Gubitak slova iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS) za > 10 u odnosu na prethodnu posetu subjekta (može se pripisati problemima sa retinom), ILI smanjenje 5 ETDRS slova za > 5 u odnosu na prethodnu posetu subjekta, zajedno sa percepcijom pacijenta o funkcionalnom gubitku;
- Bilo koje povećano, novo ili postojano subsenzorno ili prisustvo tečnosti ispod retinalnog pigmentnog epitela (RPE) ili intraretinalna tečnost na OCT-u;
- Znaci povećanog curenja iz CNV, upotrebom FA.
Primer 15
[0403] Da bi se ispitala bezbednost i efikasnost rAAV.sFlt-1 za prevenciju ili profilaksu očnog neovaskularnog oboljenja tipa senilne makularne degeneracije (AMD), sprovedena je dodatna kontrolisana klinička studija sa četrdeset (150) pacijenata. rAAV(bv).sFlt-1 je proizveden u skladu sa FDA i ICH smernicama u kompaniji Lonza Houston, Inc. (Houston, Teksas). Kriterijumi podobnosti, uključivanja i isključivanja za studiju bili su sledeći:
Podobnost:
[0404]
Starost podobna za studiju: 50 godine i više
Pol podoban za studiju: Oba
Prihvataju se zdravi volonteri: Da
Kriterijumi uključivanja:
[0405]
● Pacijenti sa neeksudativnim AMD (bilo kategorija 2, 3 i 4 prema AREDS kriterijumima: u grupi 4 će biti uključene oči sa AMD koji nije uznapredovao); Uključeni su pacijenti sa AMD koja je klasifikovana bilo kao “vlažna” ili “suva”;
● Starost između 50 i 90 godina;
● U stanju je da razume i ispuni zahteve kliničkog ispitivanja
● Oština vida > 0,4;
Kriterijumi isključivanja:
[0406]
● Trenutno uključen u kliničko ispitivanje iz oblasti oftamologije;
● Oči sa istovremenim makularnim ili horoidnim poremećajima drugačijim od AMD i sa mnoštvom znaka AMD;
4
● Oči sa dijagnozom eksudativne AMD sa aktivnom subretinalnom neovaskularizacijom (SRNV) ili CNV lezijama koje zahtevaju lasersku fotokoagulaciju u ispitivanom oku;
● Subjekti sa značajnim zamućenjem očnog sočiva koje je uzrok slabljenja vida;
● Subjekti sa ambliopijom;
● Subjekti sa oboljenjem optičkog nerva (neuropatijom, atrofijom, papilarnim edemom), nestabilnim glaukomom definisanim intraokularnim pritiskom većim od 25 mm Hg, 3 ili više lekova za glaukom, C/D od 0,8 ili više i vidna polja konzistentna sa glaukomom; istorija hirurgije retine i staklastog tela, degenerativna kratkovidost, aktivno posteriorno intraokularno inflamatorno oboljenje, hronična upotreba topikalnih očnih steroidnih lekova, vazoproliferativne retinopatije (osim AMD), regmatogeno odvajanje mrežnjače i nasledne makularne distrofije;
● Subjekti sa zahtevom za nekon vrstom pejsmejkera ili sa epilepsijom;
● Subjekti sa nekontrolisanom hipertenzijom (definisanom kao dijastolna od 90 ili više i sistolna od 150 ili više);
● Subjekti sa skorašnjom istorijom cerebralne vaskularne bolesti (u prethodnoj godini);
● koja se manifestuje prolaznim ishemijskim napadima (TIA) ili cerebralnim vaskularnim događajima (CVA);
● Subjekti sa istorijom side;
● Subjekti koji su imali intraokularnu operaciju na ispitivanom oku u periodu od 3 meseca pre uključivanja u ispitivanje;
● Pacijenti koji nisu voljni da se pridržavaju rasporeda pregleda;
Mere primarnih ishoda:
[0407] MPOD i multifokalni elektroretinogrami [Vremenski okvir: 1 godina] [Određeno kao bezbednosno pitanje: Da]
Mere sekundarnih ishoda:
[0408] Bezbednost i efikasnost rAAV(bv).sFlt-1 u smanjenju rizika za razvoj uznapredovale AMD.
[Vremenski okvir: 1 godina] [Određeno kao bezbednosno pitanje: Da]
Tabela 9: Pravac ekspreimentalnog dizajna
Primer 16
[0409] Da bi se ispitala bezbednost i efikasnost rAAV.sFlt-1 za lečenje očnog neovaskularnog oboljenja tipa dijabetesnog makularnog edema (DME), sprovedena je dodatna kontrolisana klinička studija sa četrdeset (40) pacijenata. rAAV(bv).sFlt-1 je proizveden u skladu sa FDA i ICH smernicama u kompaniji Lonza Houston, Inc. (Houston, Teksas). Kriterijumi podobnosti, uključivanja i isključivanja iz studije su bili sledeći:
Podobnost:
[0410]
Starost podobna za studiju: 18 godine i više
Pol podoban za studiju: Oba
Prihvataju se zdravi volonteri: Ne
Opšti kriterijumi uključivanja:
[0411]
● Subjekti su podobni ukoliko su ispunjeni sledeći kriterijumi:
● Spremnost da se pruži pisani informisani pristanak i, na američkim internet stranicama, ovlašćenje u skladu sa Zakonu o prenosivosti i odgovornosti zdravstvenog osiguranja (HIPAA), a u drugim zemljama, shodno nacionalnim zakonima.
● Dijabetes melitus (tipa 1 ili 2).
● Zadebljanje mrežnjače koje nastaje sekundarno u odnosu na dijabetes melitus (DME), a koje zahvata središte fovee sa centralnom debljinom makule ≥ 275 µm u središnjem podregionu, što se procenjuje optičkom koherentnom tomografijom (OCT).
● Vrednost najbolje korigovane oštrine vida (BCVA) u ispitivanom oku od 20/40 do 20/320, što je približan ekvivalent Snellen kriterijumima uz upotrebu protokola iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS), na početnoj udaljenosti za ispitivanje od 4 metra.
● Slabljenje vida za koje je utvrđeno da je prvenstveno rezultat DME, a ne drugih uzroka.
● Sposobnost (po mišljenju istraživača) i spremnost da se vrati na sve zakazane posete i procene.
Kriterijumi za isključenje:
[0412]
● Istorija vitreoretinalne hirurgije u ispitivanom oku.
● Panretinalna fotokoagulacija (PRP) ili laserska fotokoagulacija makule u ispitivanom oku unutar perioda od 3 meseca od skrininga.
● Proliferativna dijabetesna retinopatija (PDR) u ispitivanom oku, sa izuzetkom neaktivnog, regresiranog PDR.
● Neovaskularizacija irisa, krvarenje u staklastom telu, trakciono odvajanje mrežnjače ili preretinalna fibroza koja obuhvata makulu u ispitivanom oku.
● Vitreomakularna traktacija ili epiretinalna membrana u ispitivanom oku.
● Očna inflamacija (uključujući onu u tragu ili obimniju) u ispitivanom oku.
● Istorija idiopatskog ili autoimunskog uveitisa u oba oka.
● Strukturno oštećenje centra makule u ispitivanom oku koje će verovatno sprečiti poboljšanje VA nakon povlačenja makularnog edema, uključujući atrofiju retinalnog pigmentnog epitela (RPE), subretinalnu fibrozu ili organizovani plak tvrdog eksudata.
● Očni poremećaji u ispitivanom oku koji mogu uticati na tumačenje rezultata studije, uključujući vaskularnu okluziju retine, odvajanje mrežnjače, makularnu rupu ili horoidnu neovaskularizaciju (CNV) bilo kog uzroka (npr. usled senilne makularne degeneracije (AMD), očne histoplazmoze ili patološke kratkovidosti).
● Operacija katarakte u ispitivanom oku u periodu od 3 meseca, laserska kapslotomija sa itrijumaluminijum-garnetskim (IAG) laserom u poslednja 2 meseca, ili bilo koja druga operacija unutar oka u periodu do 90 dana pre dana 0.
● Nekontrolisan glaukom ili prethodna filtraciona operacija u ispitivanom oku.
● Nekontrolisan krvni pritisak.
● Istorija cerebralnog vaskularnog događaja ili infarkta miokarda u poslednja 3 meseca pre dana 0.
● Nekontrolisan dijabetes melitus.
● Bubrežna insuficijencija koja zahteva dijalizu ili transplantaciju bubrega.
● Istorija drugih oboljenja, metaboličke disfunkcije, nalaz fizičkog pregleda ili klinički laboratorijski nalaz koji daje osnovanu sumnju za oboljenje ili stanje koje je kontraidikovano sa upotrebom leka koji se ispituje i može uticanti na tumačenje rezultata studije ili dovesti subjekta u visok rizik od komplikacija u lečenju.
Mere primarnih ishoda:
[0413]
● Procenat pacijenata koji su postili rezultat od ≥ 15 slova u svojoj proceni najbolje korigoavne oštrine vida (BCVA) u odnosu na početnu vrednosti, a nakon 12 meseci [Vremenski okvir: Polazna tačka do 12. meseca] [Označeno kao bezbednosno pitanje: Ne]
Mere sekundarnih ishoda:
[0414]
● Srednja promena u odnosu na početnu vrednost u najboljoj korigovanoj oštrini vida (BCVA) nakon 12, 24 i 36 meseci
● Procenat pacijenata sa Snellen-ovim ekvivalentom oštrine vida (VA) od 20/40 ili boljim, nakon 12, 24 i 36 meseci.
● Srednja promena u odnosu na osnovnu debljinu centralne fovee merena sa SD-OCT nakon 12, 24 i 36 meseci.
● Smanjenje učestalosti istovremenog anti-VEGF lečenja (npr. sa Lucentis, Avastin, Macugen ili Eyelea) [Označeno kao bezbednosno pitanje: Ne]
Tabela 10: Pravac eksperimentalnog dizajna za DME studiju
[0415] Inicijalno uključeni subjekti boluju od DME i sa oštrinom su vida u ispitivanom oku od 20/40 do 20/320, a prethodno su primali od 0 i 25 intravitrealnih injekcija ranibizumaba ili aflibercepta. Pacijenti su nasumično raspoređeni u kontrolnu grupu ili dve eksperimentalne grupe dok nije bilo uključeno ukupno 14 pacijenata kao kontrolnih pacijenata i 13 eksperimentalnih pacijenata za nisku dozu i 13 eksperimentalnih pacijenata za visoku dozu. Svi pacijenti su primali intravitrealna injeciranja ranibizumaba 1. i 30. dana studije. Eksperimentalnim grupama je 7. dana subretinalnim injeciranjem primenjeno 1 x 10<10>ili 1 x 10<11>genoma rAAV(bv).sFlt-1 vektora u zapremini od 100 ul.
[0416] Kao i u studiji iz Primera 12, maksimalni nivoi ekspresije sFLT-1 kod subjekata ili pacijenta studije su dostignuti šest do osam nedelja nakon subretinalne primene rAAV(bv).sFLT-1. Tokom ovog takozvanog perioda „postepenog povećavanja“, najmanje jedno, dva ili tri intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva su primenjivana u intervalima od 15 do 45 dana, a poželjno u intervalima od 30 dana, da bi se sprečila progresija oboljenja. Poželjno je takođe da se najpre primeni intravitrealno injeciranje anti-VEGF sredstva između 1. do 30 dana, a poželjno od 5. do 10. dana, pre primene rAAV(bv).sFLT-1, da bi se omogućila apsorpcija intravitrealno injeciranog anti-VEGF sredstva (Lucentis-a ili Avastin-a ili Eylea ili drugog sredstva koji nije sFLT). Ukoliko se ova prva intravitrealna injekcija primenjuje u periodu manjem od 24 sata pre subretinalne primene rAAV(bv).sFLT-1, ista može biti isprana iz staklastog tela tokom procedure subretinalnog injeciranja, što dovodi do supterapijske koncentracije anti-VEGF sredstva i progresije oboljenja.
[0417] Po završetku perioda “postepenog povećavanja”, pacijentima koji eksprimiraju dovoljno sFLT-1 za lečenje ili prevenciju njihovog DME, možda neće biti potrebna dodatna intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva, iako se očekuje da će ostati pod nadzorom lekara.
[0418] U ovoj studiji navedenoj u ovom primeru, kod pacijenata u kontrolnoj i eksperimentalnoj grupi su procenjivani znaci aktivnog ili novonastalog DME i neovaskularizacije, na približno mesečnom nivou, a ponovo su tretirani intravitrealnim ranibizumabom ukoliko je bio ispunjen bilo koji od sledećih kriterijuma:
- Gubitak slova iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS) za > 10 u odnosu na prethodnu posetu subjekta (može se pripisati problemima sa retinom), ILI smanjenje 5 ETDRS slova za > 5 u odnosu na prethodnu posetu subjekta, zajedno sa percepcijom pacijenta o funkcionalnom gubitku;
- Bilo koje povećano, novo ili postojano subsenzorno ili prisustvo tečnosti ispod retinalnog pigmentnog epitela (RPE) ili intraretinalna tečnost na OCT-u;
- Znaci povećanog curenja iz CNV, upotrebom FA.
Primer 17
[0419] Da bi se ispitala bezbednost i efikasnost rAAV.sFlt-1 za lečenje očnog neovaskularnog oboljenja tipa okluzije retinalne vena (RVO), sprovedena je dodatna kontrolisana klinička studija sa četrdeset (40) pacijenata. Klinička studija je sprovedena sa pacijentima 2 kohorte, pri čemu je 1 kohorta uključivala pacijente sa okluzijom centralne retinalne vene (CRVO), dok je 1 kohorta uključivala okluziju razgranate retinalne vene (BRVO). Kao u Primeru 15, rAAV(bv).SFlt-1 je proizveden u skladu sa FDA i ICH smernicama u kompaniji Lonza Houston, Inc. (Houston, Teksas). Kriterijumi podobnosti, uključivanja i isključivanja iz studije su bili sledeći:
Kriterijumi uključivanja:
[0420]
● Makularni edem koji zahvata središnji deo i javlja se sekundarno u odnosu na okluziju centralne retinalne vene (CRVO) ili makularni edem koji zahvata razgranato područje i nastaje sekundarno u odnosu na BRVO tokom ne duže od 9 meseci, i sa srednjom je vrednošću debljine centralnog ≥ 250 µm koja je izmerena optičkom koherentnom tomografijom (OCT);
● Odrasli ≥ 18 godina;
● Najbolje je korigovalo oštrinu vida (BCVA) shodno paramterima iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS), odnosno iznosi u ispitivanom oku od 20/40 do 20/320 (73 do 24 slova);
1
Kriterijumi isključivanja:
[0421]
● Bilo koji prethodni tretman sa anti-VEGF agensima u ispitivanom oku (sa pegaptanib natrijumom, anekortav acetatom, bevacizumabom, ranibizumabom itd.) ili prethodna primena sistemskih antiangiogenih lekova;
● Prethodna panretinalna laserska fotokoagulacija ili makularna laserska fotokoagulacija u ispitivanom oku
● Trajanje CRVO oboljenja > 9 meseci od datuma dijagnoze; trajanje BRVO oboljenja > 9 meseci od datuma dijagnoze;
● Prethodna upotreba intraokularnih kortikosteroida u ispitivanom oku ili upotreba periokularnih kortikosteroida u ispitivanom oku u periodu do 3 meseca pre 1. dana;
● Neovaskularizacija irisa, krvarenje u staklastom telu, trakciono odvajanje retine ili preretinalna fibroza koja uključuje makulu bilo u ispitivanom oku ili u susednom oku;
Mere primarnih ishoda:
[0422]
● Srednja promena u odnosu na početan skor najbolje korigovane oštrine vida (BCVA) nakon 6 meseci. [Vremenski okvir: bazalna vrednost i 6 meseci] [Određeno kao bezbednosno pitanje: Ne]. ● Definisani početni opseg studije iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS) sa najboljom korigovanom oštrinom vida (BCVA) od 73 do 24 (= Oštrina od 20/40 do 20/320) u ispitivanom oku; viši skor predstavlja bolje funkcionisanje. Nominator=(Broj učesnika kojima je održavan vid*100); Imenilac=Broj analiziranih učesnika.
Mere sekundarnih ishoda:
[0423]
● Procenat učesnika koji su u BCVA skoru povećali ≥ 15 slova nakon 6 meseci u poređenju sa početnom vrednošću.
● Srednja promena u odnosu na osnovnu debljinu centralne retine (CRT) nakon 6 meseci [vremenski okvir: bazalna vrednost i 6 meseci] [Označeno kao bezbednosno pitanje: Ne]
● Smanjenje učestalosti istovremenog anti-VEGF lečenja ((npr. sa Lucentis, Avastin, Macugen ili Eyelea) [Označeno kao bezbednosno pitanje: Ne]
1 1
Tabela 11: Pravci eksperimentalnog dizajna za BRVO/CRVO studiju
[0424] Inicijalno uključeni subjekti koji boluju od CRVO ili BRVO, sa oštrinom vida u ispitivanom oku od 20/40 do 20/320, a koji su prethodno primali od 0 i 25 intravitrealnih injekcija ranibizumaba ili aflibercepta. Pacijenti su nasumično raspoređeni u kontrolnu grupu ili dve eksperimentalne grupe dok nije bilo uključeno ukupno 14 pacijenata kao kontrolnih pacijenata i 13 eksperimentalnih pacijenata za nisku dozu i 13 eksperimentalnih pacijenata za visoku dozu. Svi pacijenti su primali intravitrealna injeciranja ranibizumaba 1. i 30. dana studije. Eksperimentalnim grupama je 7. dana subretinalnim injeciranjem primenjeno 1 x 10<10>ili 1 x 10<11>genoma rAAV(bv).sFlt-1 vetora u zapremini od 100 ul.
[0425] Kao i u studiji iz Primera 14, maksimalni nivoi ekspresije sFLT-1 kod subjekta ili pacijenta studije dostignuti su šest do osam nedelja nakon subretinalne primene rAAV(bv).sFLT-1. Po završetku perioda “postepenog povećavanja”, a kao što je opisano u Primeru 14, pacijentima koji eksprimiraju dovoljno sFLT-1 za lečenje ili prevenciju progresije njihovog BRVO ili CRVO, možda neće biti potrebna dodatna intravitrealna injeciranja anti-VEGF sredstva, iako se očekuje da će ostati pod nadzorom lekara.
[0426] U ovoj studiji navedenoj u ovom primeru, kod pacijenata u kontrolnoj i eksperimentalnoj grupi su procenjivani znaci aktivne ili novonastaleokluzije retinalne vene i neovaskularizacije, na
1 2
približno mesečnom nivou, a ponovo su tretirani intravitrealnim ranibizumabom ukoliko je bio ispunjen bilo koji od sledećih kriterijuma:
- Gubitak slova iz Studije rane terapije dijabetesne retinopatije (ETDRS) za > 10 u odnosu na prethodnu posetu subjekta (može se pripisati problemima sa retinom), ILI smanjenje 5 ETDRS slova za > 5 u odnosu na prethodnu posetu subjekta, zajedno sa percepcijom pacijenta o funkcionalnom gubitku;
- Bilo koje povećano, novo ili postojano subsenzorno ili prisustvo tečnosti ispod retinalnog pigmentnog epitela (RPE) ili intraretinalna tečnost na OCT-u;
- Znaci povećanog curenja iz CNV, upotrebom FA.
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantan adeno-asocirani virus (rAAV) za upotrebu u postupku za lečenje vlažne senilne makularne degeneracije (vlažne AMD) kod humanog subjekta koji boluje od vlažne AMD, pri čemu postupak obuhvata:
i) primenu najmanje jedne doze inhibitora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) izabranog od anti-VEGF antitela i solubilnog VEGF receptora, ili njihovog fuzionog proteina ili fragmenta, intravitrealnim injeciranjem, između 1 i 30 dana pre primene rAAV humanom subjektu;
ii) injeciranje, u oko humanog subjekta, jedinične doze koja sadrži najmanje 1 x 10<6>, a najviše 1 x 10<15>genoma rAAV vektora, i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu rAAV sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira anti-VEGF protein i pri čemu anti-VEGF protein sadrži humani sFLT1 ili njegov funkcionalni fragment; i po izboru
iii) primenu jedne ili dve doze VEGF inhibitora i) intraokularnim injeciranjem u intervalu od 30 dana nakon primene rAAV.
2. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se injeciranje vrši samo jednom u najmanje 18 meseci.
3. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu jedinična doza sadrži najmanje 1 x 10<8>, a najviše 1 x 10<13>genoma vektora.
4. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu jedinična doza sadrži najmanje 1 x 10<9>, a najviše 3 x 10<13>genoma vektora.
5. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu upotreba dalje obuhvata merenje oštrine vida upotrebom slova Studije rane terapije u dijabetičnoj retinopatiji (ETDRS), nakon primene farmaceutske kompozicije, pri čemu se smanjenje neovaskularizacije zapaža fluoresceinskom angiografijom (FA) nakon primene farmaceutske kompozicije, ili pri čemu se najbolje korigovana oštrina vida (BCVA) kod humanog subjekta smanjuje za manje od 15 slova, što se meri upotrebom ETDRS slova nakon primene farmaceutske kompozicije, ili pri čemu se BCVA kod humanog subjekta poboljšava za najmanje 1 red, što se meri upotrebom ETDRS slova nakon primene jedinične doze.
6. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu injeciranje obuhvata subretinalno injeciranje.
7. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema patentnom zahtevu 6, koji dalje obuhvata uklanjanje staklastog gela pre injeciranja jedinične doze.
8. rAAV za upotrebu u postupku za lečenje vlažne AMD prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7, pri čemu je VEGF-inhibitor i) izabran iz grupe koju čine bevacizumab, ranibizumab i aflibercept.
1
RS20211170A 2012-05-15 2013-05-07 Lečenje amd upotrebom aav sflt-1 RS62359B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261647461P 2012-05-15 2012-05-15
US201261670535P 2012-07-11 2012-07-11
US201261678555P 2012-08-01 2012-08-01
US201261691660P 2012-08-21 2012-08-21
US201361775440P 2013-03-08 2013-03-08
EP18198081.4A EP3501549B1 (en) 2012-05-15 2013-05-07 Treatment of amd using aav sflt-1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62359B1 true RS62359B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=49584435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211170A RS62359B1 (sr) 2012-05-15 2013-05-07 Lečenje amd upotrebom aav sflt-1

Country Status (27)

Country Link
US (7) US20130323302A1 (sr)
EP (3) EP4371615A3 (sr)
JP (5) JP6466322B2 (sr)
KR (3) KR20210021111A (sr)
CN (2) CN104994882A (sr)
AU (3) AU2013263159B2 (sr)
BR (1) BR112014028633A8 (sr)
CA (1) CA2873628C (sr)
CY (1) CY1124495T1 (sr)
DK (1) DK3501549T3 (sr)
ES (2) ES2890813T3 (sr)
HR (1) HRP20211453T1 (sr)
HU (1) HUE056327T2 (sr)
IL (2) IL235679B (sr)
LT (1) LT3501549T (sr)
MX (2) MX362452B (sr)
NZ (2) NZ702637A (sr)
PL (1) PL3501549T3 (sr)
PT (1) PT3501549T (sr)
RS (1) RS62359B1 (sr)
RU (1) RU2014150340A (sr)
SG (2) SG11201407548UA (sr)
SI (1) SI3501549T1 (sr)
SM (1) SMT202100549T1 (sr)
TW (3) TWI775096B (sr)
WO (1) WO2013173129A2 (sr)
ZA (1) ZA201409025B (sr)

Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9730790B2 (en) 2009-09-29 2017-08-15 Edwards Lifesciences Cardiaq Llc Replacement valve and method
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
RU2611202C2 (ru) 2011-04-22 2017-02-21 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Вирионы аденоассоциированного вируса с вариантным капсидом и способы их использования
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
US9681951B2 (en) 2013-03-14 2017-06-20 Edwards Lifesciences Cardiaq Llc Prosthesis with outer skirt and anchors
EP3003391B1 (en) 2013-05-31 2021-09-22 The Regents of The University of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
KR101591823B1 (ko) * 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
TWI687225B (zh) * 2014-02-06 2020-03-11 美商健臻公司 用於治療及預防黃斑部病變的組成物及方法
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
KR102537394B1 (ko) * 2014-03-17 2023-05-30 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
RS58337B1 (sr) * 2014-03-24 2019-03-29 Translate Bio Inc Irnk terapija za lečenje očnih oboljenja
US10507232B2 (en) 2014-04-02 2019-12-17 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
KR102863726B1 (ko) * 2014-05-02 2025-09-25 젠자임 코포레이션 망막 및 cns 유전자 요법을 위한 aav 벡터
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
SG10202001102XA (en) 2014-11-14 2020-03-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
CN107109407A (zh) 2014-11-14 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
GB201502137D0 (en) * 2015-02-09 2015-03-25 Ucl Business Plc Treatment
MY187898A (en) 2015-03-02 2021-10-27 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
US20180043034A1 (en) * 2015-03-06 2018-02-15 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Gene augmentation therapies for inherited retinal degeneration caused by mutations in the prpf31 gene
CN107532177A (zh) 2015-03-24 2018-01-02 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒变体及其使用方法
US11104917B2 (en) * 2015-05-08 2021-08-31 Children's Medical Research Institute Promoters for expression of heterologous genes
EP3294309A4 (en) * 2015-05-14 2019-01-16 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. NUCLEIC ACID MOLECULES WITH SPACERS AND METHOD FOR USE THEREOF
US10016514B2 (en) * 2015-05-15 2018-07-10 New Hope Research Foundation Polynucleotides, vectors and methods for insertion and expression of transgenes
WO2017066579A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
GB201519086D0 (en) * 2015-10-28 2015-12-09 Syncona Partners Llp Gene Therapy
CA3006952A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
SG11201805420SA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Kodiak Sciences Inc Antibodies and conjugates thereof
IL262207B2 (en) * 2016-04-15 2026-01-01 Univ Pennsylvania Preparations for the treatment of wet age-related macular degeneration
SG10202008378UA (en) * 2016-04-15 2020-10-29 Regenxbio Inc Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
KR20190065191A (ko) * 2016-05-03 2019-06-11 웨인 스테이트 유니버시티 프로테오좀 억제제를 사용하여 눈에서 바이러스 매개 유전자 전달을 향상시키는 방법
EP3458589A4 (en) 2016-05-18 2020-01-01 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING MORBUS HUNTINGTON
EP3458588B1 (en) 2016-05-18 2025-10-29 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
SMT202200251T1 (it) * 2016-06-16 2022-07-21 Adverum Biotechnologies Inc Composizioni e metodi per ridurre la neovascolarizzazione oculare
DK3471780T3 (da) * 2016-06-16 2020-11-23 Adverum Biotechnologies Inc Behandling af amd med aav2-variant med aflibercept
JP7071332B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
EP3528785A4 (en) 2016-10-19 2020-12-02 Adverum Biotechnologies, Inc. MODIFIED AVA CAPSIDES AND THEIR USES
CN107058315B (zh) * 2016-12-08 2019-11-08 上海优卡迪生物医药科技有限公司 敲减人PD-1的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
JP7229161B2 (ja) * 2016-12-30 2023-02-27 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア フェニルケトン尿症を処置するための遺伝子療法
WO2018170494A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Bio Time, Inc. Methods for measuring therapeutic effects of retinal disease therapies
JP7343903B2 (ja) * 2017-03-17 2023-09-13 アドヴェラム バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド 遺伝子発現増強のための組成物および方法
US11752181B2 (en) 2017-05-05 2023-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's disease
AU2018261790B2 (en) 2017-05-05 2024-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CN110461368A (zh) 2017-06-30 2019-11-15 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
EP3654860A1 (en) 2017-07-17 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
CN110709511A (zh) 2017-08-28 2020-01-17 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒衣壳变体及其使用方法
CA3076905A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 The Johns Hopkins University Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
US20200263199A1 (en) 2017-09-29 2020-08-20 Voyager Therapeutics, Inc. Rescue of central and peripheral neurological phenotype of friedreich's ataxia by intravenous delivery
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
KR102205830B1 (ko) * 2017-10-26 2021-01-21 주식회사 큐로진생명과학 솔루블 VEGFR-1 변이체 cDNA를 함유하는 rAAV를 포함하는 황반변성 치료용 조성물
MY207644A (en) * 2017-12-19 2025-03-07 Akouos Inc Aav-mediated delivery of therapeutic antibodies to the inner ear
US10610606B2 (en) * 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US12558434B2 (en) 2018-02-20 2026-02-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
CA3092588A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Kodiak Sciences Inc. Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
WO2019173434A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
SG11202009914SA (en) * 2018-05-08 2020-11-27 Rutgers The State University Of New Jersey Aav-compatible laminin-linker polymerization proteins
SG11202010684YA (en) 2018-05-10 2020-11-27 Regeneron Pharma High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations
CN112424359A (zh) 2018-05-15 2021-02-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森氏病的组合物和方法
US20210207167A1 (en) 2018-05-16 2021-07-08 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
JP7470057B2 (ja) * 2018-06-11 2024-04-17 セルジュ フィトゥシ 組み換えａａｖベクター及びその使用方法
CA3103963A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
CA3107462A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
CN113383010B (zh) 2018-09-28 2025-09-09 沃雅戈治疗公司 具有经工程化改造的启动子的共济蛋白表达构建体及其使用方法
WO2020072849A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2020112853A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Genascence Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
WO2020136384A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 Constable Ian Jeffery Methods of retinal administration
CA3125770A1 (en) 2019-01-18 2020-07-23 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
KR20210135267A (ko) 2019-03-04 2021-11-12 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 반대측 눈에 대한 aav 유전자 요법의 순차적 유리체내 투여
TWI862583B (zh) 2019-04-26 2024-11-21 美商愛德維仁生物科技公司 用於玻璃體內遞送之變異體aav蛋白殼
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
CN118767255A (zh) 2019-06-05 2024-10-15 里珍纳龙药品有限公司 用于精确剂量递送的装置及方法
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
EP4022070A1 (en) 2019-08-26 2022-07-06 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
JP2022547305A (ja) * 2019-09-13 2022-11-11 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー Ａａｖ適合性ラミニン－リンカー重合タンパク質
EP4031214B1 (en) * 2019-09-20 2026-02-18 MeiraGTx Ocular UK Limited Injection systems
CN112552410A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
KR102505262B1 (ko) * 2019-12-04 2023-03-03 (주) 씨드모젠 솔루블 VEGFR-1 변이체 cDNA를 함유하는 rAAV를 포함하는 당뇨망막병증 치료용 조성물
WO2021240488A1 (en) * 2020-05-27 2021-12-02 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for treating neovascularization and ischemic retinopathies by targeting angiogenesis and cholesterol transport
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
CN113952473A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 英斯培瑞有限公司 用于治疗眼部疾病的组合物和方法
EP4192514A1 (en) 2020-08-06 2023-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
KR102775781B1 (ko) * 2020-10-13 2025-03-06 재단법인 아산사회복지재단 Acta2 억제제를 유효성분으로 포함하는 망막 또는 맥락막 질환 치료용 조성물
PH12023551518A1 (en) 2020-12-01 2024-05-13 Akouos Inc Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
US20220267795A1 (en) * 2021-02-24 2022-08-25 Kinase Pharma Inc. Compositions and methods for regulating production of an angiogensis inhibitor
WO2022187473A2 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
KR20240014477A (ko) 2021-05-28 2024-02-01 상하이 레제네리드 테라피즈 컴퍼니 리미티드 변이체 캡시드를 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 이의 응용
WO2023206134A1 (en) * 2022-04-27 2023-11-02 Beijing Sightnovo Medical Technology Co., Ltd Compositions and methods for eye diseases
US20260085328A1 (en) 2022-09-08 2026-03-26 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
USD1120314S1 (en) 2022-11-30 2026-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dose delivery device
WO2025019458A2 (en) * 2023-07-14 2025-01-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Specific blood retinal barrier defect in glaucoma directs new treatments and clinical tests
CN117925664B (zh) 2023-11-29 2025-01-21 上海科锐克医药科技有限公司 用于递送人vegf受体融合蛋白的基因递送载体及其应用
US20250276095A1 (en) * 2024-03-04 2025-09-04 Kate Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus compositions for the treatment of duchenne muscular dystrophy
CN119082112A (zh) * 2024-06-05 2024-12-06 上海凌医生物科技有限公司 一种诱导型启动子

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4874237A (en) 1987-05-07 1989-10-17 Lions Eye Inst. Of Western Australia Electroretinogram apparatus
IL92298A (en) 1988-11-14 2001-04-30 Us Secretary U S Dept Of Comme Method for producing isolated empty b19 parvovirus capsids, introducing genes into cells utilizing the same, diagnostic assays for detecting parvovirus infection and an anti-parvovirus vaccine containing said capsids
FR2643252B1 (fr) 1989-02-21 1991-06-07 Technomed Int Sa Appareil de destruction selective de cellules incluant les tissus mous et les os a l'interieur du corps d'un etre vivant par implosion de bulles de gaz
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6287815B1 (en) 1989-09-14 2001-09-11 Rijksuniversiteit Te Leiden Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines
AU650085B2 (en) 1990-11-13 1994-06-09 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
US5383917A (en) 1991-07-05 1995-01-24 Jawahar M. Desai Device and method for multi-phase radio-frequency ablation
DE69434115T2 (de) 1993-03-25 2005-10-27 Merck & Co., Inc. Inhibitor des wachstumsfaktors für gefässendothelzellen
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
WO1995022618A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
FR2718150B1 (fr) 1994-03-29 1996-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5527533A (en) * 1994-10-27 1996-06-18 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method of retarding and ameliorating central nervous system and eye damage
US20020168342A1 (en) 1994-11-03 2002-11-14 Cell Genesys, Inc. Novel adenoviral vectors, packaging cell lines, recombinant adenoviruses and methods
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6040183A (en) 1995-06-07 2000-03-21 University Of North Carloina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5641749A (en) 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
CA2260992C (en) * 1996-08-20 2004-03-09 The Regents Of The University Of California Eye treatments using synthetic thyroid hormone compositions
AU738806B2 (en) 1996-09-24 2001-09-27 Merck & Co., Inc. Gene therapy for inhibition of angiogenesis
FR2756297B1 (fr) 1996-11-22 1999-01-08 Centre Nat Rech Scient Procede de production de virus recombinants
US6153436A (en) 1997-01-10 2000-11-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method of gene delivery using wildtype adeno associated viral (AAV) vectors with insertions
WO1998046728A1 (en) 1997-04-14 1998-10-22 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant aav product
EP1173191A4 (en) 1997-05-13 2004-12-01 Univ California NEW ANTIANGIOGENIC PEPTIDAGENTS AND THEIR THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC USE
US6458157B1 (en) * 1997-08-04 2002-10-01 Suaning Gregg Joergen Retinal stimulator
AU9319198A (en) * 1997-09-19 1999-04-05 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
JPH11100327A (ja) 1997-09-26 1999-04-13 Toray Ind Inc 網膜変性症治療剤
WO1999016889A1 (en) 1997-10-01 1999-04-08 G.D. Searle & Co. Fusion proteins comprising an angiostatin moiety and their use in anti-tumor treatment
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
WO1999036511A2 (en) 1998-01-16 1999-07-22 Chiron Corporation Feline immunodeficiency virus gene therapy vectors
WO1999045952A2 (en) 1998-03-12 1999-09-16 Genentech, Inc. Method of preventing the death of retinal neurons and treating ocular diseases
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
US6328958B1 (en) * 1998-08-28 2001-12-11 Duke University Deleted adenovirus vectors and methods of making and administering the same
WO2000015822A1 (en) 1998-09-17 2000-03-23 University Of Florida Methods for treatment of degenerative retinal diseases
US20040234505A1 (en) 1998-09-23 2004-11-25 Stuart Naylor Polynucleotide constructs and uses thereof
CA2367375A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US6943153B1 (en) * 1999-03-15 2005-09-13 The Regents Of The University Of California Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7306799B2 (en) * 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
WO2001034018A2 (en) 1999-10-25 2001-05-17 Therus Corporation Use of focused ultrasound for vascular sealing
ATE511784T1 (de) 2000-04-17 2011-06-15 Univ Sydney Verfahren zur objektiven elektrophysiologischen bewertung der visuellen funktion
US6329181B1 (en) 2000-08-07 2001-12-11 Neurologix, Inc. Helper functions for recombinant vector production
EP1357912B9 (en) * 2001-02-06 2012-06-13 QLT Inc. Photodynamic therapy of occult choroidal neovascularization linked to age-related macular degeneration
EP1372552B1 (de) 2001-03-27 2017-03-01 WaveLight GmbH Vorrichtung zur bearbeitung und diagnose von augengewebe
WO2002082904A2 (en) 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
JP2002363107A (ja) 2001-06-04 2002-12-18 Noriyuki Azuma 色覚不全動物の色覚復元方法
US7629153B2 (en) 2001-08-02 2009-12-08 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
NZ535100A (en) 2002-03-20 2008-04-30 Univ Florida RAAV vector compositions and methods for the treatment of choroidal neovascularization
AU2003223775A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
US8304233B2 (en) 2002-06-04 2012-11-06 Poetic Genetics, Llc Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same
WO2004020600A2 (en) 2002-08-28 2004-03-11 University Of Florida Modified aav
GB0220467D0 (en) 2002-09-03 2002-10-09 Oxford Biomedica Ltd Composition
JP2006519026A (ja) * 2003-03-04 2006-08-24 独立行政法人産業技術総合研究所 標的物質の細胞導入効率を上昇させるための組成物および方法
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
WO2005072364A2 (en) 2004-01-27 2005-08-11 University Of Florida A modified baculovirus expression system for production of pseudotyped raav vector
DK2229956T3 (da) 2004-09-13 2013-07-29 Genzyme Corp Multimere konstruktioner
PL1802334T3 (pl) * 2004-10-21 2013-01-31 Genentech Inc Sposób leczenia wewnątrzgałkowych chorób neowaskularnych
SI1809750T1 (sl) 2004-11-08 2012-08-31 Chromagenics Bv Izbira gostiteljskih celic, ki imajo visok nivo izraĹľanja proteina
US7922670B2 (en) 2005-02-24 2011-04-12 Warren Jones System and method for quantifying and mapping visual salience
US8999678B2 (en) 2005-04-07 2015-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
US20060234347A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Harding Thomas C Targeting multiple angiogenic pathways for cancer therapy using soluble tyrosine kinase receptors
SI1945779T1 (sl) 2005-10-20 2013-07-31 Uniqure Ip B.V. Izboljĺ ani aav vektorji proizvedeni v celicah insekta
EP1981548A4 (en) 2006-01-20 2010-03-24 Univ North Carolina REINFORCED PRODUCTION OF INFECTIOUS PARVOVIRUS VECTORS IN INSECT CELLS
US20070190028A1 (en) 2006-02-13 2007-08-16 Jihong Qu Method and apparatus for heat or electromagnetic control of gene expression
US8118752B2 (en) 2006-02-16 2012-02-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Apparatus and methods for mapping retinal function
US7384145B2 (en) 2006-02-16 2008-06-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mapping retinal function using corneal electrode array
US8216575B2 (en) * 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
AU2007247426B2 (en) * 2006-05-04 2012-03-08 Fondation Ophthalmologique Adolf De Rothschild Combination comprising a VEGF inhibitor and a serine protease for treating neovascular diseases
JP2009540011A (ja) * 2006-06-12 2009-11-19 エクセジェニックス、インク．ディー／ビー／エー オプコ ヘルス、インク． 血管新生のｓｉＲＮＡ阻害のための組成物及び方法
GB0612096D0 (en) 2006-06-19 2006-07-26 Greater Glasgow Nhs Board Functional imaging of the retina
CA2921594A1 (en) 2006-06-21 2007-12-27 Uniqure Ip B.V. Aav vectors with improved rep coding sequences for production in insect cells
CN101313366A (zh) 2006-06-27 2008-11-26 株式会社爱德万测试 半导体试验装置以及半导体存储器的试验方法
ES2385679T3 (es) 2006-08-24 2012-07-30 Virovek, Inc. Expresión de células de insecto de genes con marcos de lectura abiertos superpuestos, métodos y composiciones de éstos
WO2008098310A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Objectivision Limited Stimulus method for multifocal visual evoked potential
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
WO2008150459A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A method for transducing cells with primary cilia
WO2009023805A1 (en) 2007-08-16 2009-02-19 The Research Foundation Of State University Of New York Led variable light source
US8518037B2 (en) 2007-10-30 2013-08-27 Boston Scientific Scimed, Inc. Radiofrequency ablation device
EP2227553A4 (en) * 2007-11-30 2011-01-19 Scarab Genomics Llc Lac expression system
EP3257937B1 (en) 2008-02-19 2022-08-03 uniQure IP B.V. Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells
JP2011512417A (ja) 2008-02-20 2011-04-21 ジェンザイム・コーポレーション 血管形成の阻害
WO2009105690A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Targeted Genetics Corporation Devices and methods for delivering polynucleotides into retinal cells of the macula and fovea
ITFI20080081A1 (it) 2008-04-18 2009-10-19 Strumenti Oftalmici C S O S R Procedimento e sistema per la registrazione di risposte elettrofunzionali erg, perg e vep multifocali in tempo reale
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
ES2330826B1 (es) 2008-06-04 2010-07-26 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad.
DK2403867T3 (da) 2009-03-04 2019-08-12 Deutsches Krebsforsch Assembly activating protein (aap) og dets anvendelse til fremstilling af parvoviruspartikler hovedsageligt bestående af vp3
WO2010114948A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (raav) vectors
TWI466158B (zh) 2009-07-03 2014-12-21 Univ Lunghwa Sci & Technology 電漿測量裝置、電漿系統及測量電漿特性之方法
EP2287323A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
US20120172419A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Medical College Of Wisconsin Research Foundation Inc. Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity
WO2011088081A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
EP2545165B1 (en) 2010-03-11 2020-07-29 uniQure IP B.V. Mutated rep encoding sequences for use in aav production
JP5922095B2 (ja) * 2010-03-29 2016-05-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 薬理学的に誘導される導入遺伝子アブレーション系
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
CN201704771U (zh) 2010-04-30 2011-01-12 陈福环 无水箱节水型抽水马桶
WO2011137344A2 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Lpath, Inc. Anti-s1p antibody treatment of patients with ocular disease
WO2011140450A1 (en) 2010-05-07 2011-11-10 Medicinelodge, Inc Dba Imds Co-Innovation Surgical rasp with radiofrequency ablation
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US20110052678A1 (en) * 2010-11-05 2011-03-03 Shantha Totada R Method for treating age related macular degeneration
DK2640743T3 (en) 2010-11-16 2017-01-23 Excelimmune Inc PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT PROTEINS
CA2823890C (en) 2011-01-07 2020-10-06 Applied Genetic Technologies Corporation Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases
RU2611202C2 (ru) 2011-04-22 2017-02-21 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Вирионы аденоассоциированного вируса с вариантным капсидом и способы их использования
WO2013063601A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric promoter for cone photoreceptor targeted gene therapy
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2013188316A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Avalanche Biotechnologies, Inc. Optical regulation of gene expression in the retina
EP3013946B8 (en) 2013-06-28 2019-04-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for expressing a polynucleotide of interest in the retina of a subject
US20150025939A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Somnath Chatterjee Company Centric Social Media Platfonn for Content Sharing aud Tracking
US9585971B2 (en) 2013-09-13 2017-03-07 California Institute Of Technology Recombinant AAV capsid protein
EP3049527A4 (en) 2013-09-26 2017-08-16 University of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
WO2015134643A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells
KR102537394B1 (ko) 2014-03-17 2023-05-30 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
MY187898A (en) 2015-03-02 2021-10-27 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018211212B2 (en) 2020-10-15
ZA201409025B (en) 2019-04-24
AU2018211212A1 (en) 2018-08-16
TW201408307A (zh) 2014-03-01
EP2849802B1 (en) 2023-12-20
US20220111015A1 (en) 2022-04-14
EP3501549B1 (en) 2021-06-23
EP4371615A3 (en) 2024-06-26
CA2873628C (en) 2020-11-24
PL3501549T3 (pl) 2022-01-17
TW201828951A (zh) 2018-08-16
SI3501549T1 (sl) 2021-11-30
CN104994882A (zh) 2015-10-21
JP2018015008A (ja) 2018-02-01
EP3501549A1 (en) 2019-06-26
RU2014150340A (ru) 2016-07-10
JP6466322B2 (ja) 2019-02-06
DK3501549T3 (da) 2021-09-13
SMT202100549T1 (it) 2021-11-12
US20150004101A1 (en) 2015-01-01
JP6667486B2 (ja) 2020-03-18
KR20150014965A (ko) 2015-02-09
LT3501549T (lt) 2021-10-11
TWI698240B (zh) 2020-07-11
MX2014013933A (es) 2015-06-03
EP2849802A4 (en) 2016-01-20
SG11201407548UA (en) 2014-12-30
HRP20211453T1 (hr) 2021-12-24
JP2015523060A (ja) 2015-08-13
US20140371438A1 (en) 2014-12-18
US10004788B2 (en) 2018-06-26
JP2022106929A (ja) 2022-07-20
EP2849802A2 (en) 2015-03-25
KR20200119276A (ko) 2020-10-19
TWI775096B (zh) 2022-08-21
NZ702637A (en) 2017-05-26
IL235679B (en) 2021-04-29
HUE056327T2 (hu) 2022-02-28
KR102154225B1 (ko) 2020-09-11
CY1124495T1 (el) 2022-07-22
PT3501549T (pt) 2021-09-30
KR102218067B1 (ko) 2021-02-22
EP2849802C0 (en) 2023-12-20
AU2013263159A1 (en) 2015-01-15
AU2013263159B2 (en) 2018-05-31
SG10201609412QA (en) 2017-01-27
IL281833A (en) 2021-05-31
EP4371615A2 (en) 2024-05-22
WO2013173129A2 (en) 2013-11-21
NZ727516A (en) 2018-05-25
IL235679A0 (en) 2015-02-26
CA2873628A1 (en) 2013-11-21
WO2013173129A3 (en) 2014-01-30
US20180125948A1 (en) 2018-05-10
AU2021200253A1 (en) 2021-03-18
KR20210021111A (ko) 2021-02-24
US20180311319A1 (en) 2018-11-01
BR112014028633A2 (pt) 2017-08-01
MX362452B (es) 2019-01-18
US9943573B2 (en) 2018-04-17
ES2967616T3 (es) 2024-05-03
TW202103711A (zh) 2021-02-01
JP2019071908A (ja) 2019-05-16
TWI702955B (zh) 2020-09-01
MX2019000586A (es) 2021-06-15
BR112014028633A8 (pt) 2020-01-21
ES2890813T3 (es) 2022-01-24
JP2021045170A (ja) 2021-03-25
US20140341977A1 (en) 2014-11-20
CN115337407A (zh) 2022-11-15
HK1207568A1 (en) 2016-02-05
US20130323302A1 (en) 2013-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6667486B2 (ja) Ａａｖ ｓｆｌｔ−１を用いたａｍｄの処置
EP3472317B1 (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40104787A (en) Treatment of amd using aav sflt-1
HK40010151B (en) Treatment of amd using aav sflt-1
HK40010151A (en) Treatment of amd using aav sflt-1
HK1207568B (en) Treatment of amd using aav sflt-1
HK40082757B (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40008120B (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40008120A (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization