RS62387B1 - Anti-dll3 antitelo - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetna prijava zahteva priznanje prava prvenstva od Japanske prijave patenta br.2010-019391 (podnete 29. januara 2010).

[0002] Predmetni pronalazak odnosi se na farmaceutsku kompoziciju za primenu u postupku lečenja sitnoćelijskog kancera pluća.

Stanje tehnike

[0003] Sitnoćelijski kancer pluća obuhvata približno 20% registrovanih kancera pluća. Sitnoćelijski kancer pluća brzo napreduje i teško ga je hirurški ukloniti jer, u velikom broju slučajeva, u vreme dijagnoze već postoje metastaze u limfnim čvorovima i udaljene metastaze. Ovaj kancer u svojoj ranoj fazi ispoljava visoke stope odgovora na antikancersko sredstvo. Hemioterapija se, dakle, smatra za prvi izbor u lečenju kancera. Kancer, međutim, veoma brzo postaje otporan na hemioterapiju i vraća se, što rezultuje trogodišnjom stopom preživljavanja od 5% ili manje. Stoga postoji potreba za novom terapijom.

[0004] Delta-sličan 3 (delta-like, DLL3) je membranski protein tipa I, koji pripada članovima porodice Notch liganda. DLL3 je neophodan za normalan nastanak i strukturiranje somita. Mutacije u DLL3 izazivaju defekte rebara ili spondilozu kod obolelih od autozomno recesivne spondilokostalne disostoze [Nepatentna literatura 1 i 2]. DLL1 se nalazi na površini ćelije i vezuje se sa Notch, dok se DLL3 prevashodno nalazi u Goldžijevom aparatu i ne vezuje se za Notch [Nepatentna literatura 3 i 4].

[0005] Postoje ranije studije u kojima se izveštava o amplifikaciji DLL3 gena na hromozomu i povećanoj ekspresiji ovog gena u ćelijskim linijama kancera pankreasa [Nepatentna literatura 5] i povećanoj ekspresiji DLL3 u nekim slučajevima glioma [Nepatentna literatura 6]. Međutim, još uvek nema izveštaja o broju DLL3 proteina na površini ćelije. Ekspresija od 10<5>ili više antigenskih molekula, za nemodifikovana antitela, ili reda veličine 10<4>antigenskih molekula čak i za defukozilovana antitela koja imaju povećanu sposobnost indukovanja ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), potrebna je za ciljanje antigenskih molekula na površini ćelije takvim antitelima ili za ubijanje kancerksih ćelija antitumorskim mehanizmom ADCC aktivnosti [Nepatentna literatura 7]. Prema tome, neizvesno je da li je DLL3 podoban kao cilj terapije na bazi antitela.

[0006] Mišja anti-DLL3 monoklonska antitela (MAB4315, R&D Systems, Inc.) već su komercijalno dostupna kao reagens za istraživanja.

Lista navoda

Nepatentna literatura

[0007]

Nepatentna literatura 1: Bulman, M. P. i sarad. (2000) Nat Genet 24, 438-441.

Nepatentna literatura 2: Turnpenny, P. D. i sarad. (2003) J Med Genet 40, 333-339.

Nepatentna literatura 3: Geffers, I. i sarad. (2007) J Cell Biol 178, 465-476.

Nepatentna literatura 4: Ladi, E. i sarad. (2005) J Cell Biol 170, 983-992.

Nepatentna literatura 5: Phillips, H. S. (2006) Cancer Cell 9, 157-173.

Nepatentna literatura 6: Mulledndore, M. E. (2009) Clin Cancer Res 15, 2291-2301.

Nepatentna literatura 7: Kenya Shitara (2009) YAKUGAKU ZASSHI 129, 3-9.

[0008] Pozivanje se vrši i na sledeće dodatne dokumente:

● WO 2007/080597 koji se odnosi na nove sekvence nukleotida i amino-kiselina, i postupke njihove primene u dijagnostici.

● Dunwoodie (2009) Current Opinion in Genetics & Development, 19: 329-337 koji se odnosi na ulogu Notch u strukturiranju kičmenog stuba kod ljudi.

● D'Souza i sarad. (2008) Oncogene, 27: 5148-5167 koji se odnosi na mnoge aspekte Notch liganda.

Kratak opis pronalaska

Tehnički problem

[0009] Predmet ovog pronalaska je obezbediti farmaceutsku kompoziciju za primenu u postupku lečenja sitnoćelijskog kancera pluća.

Rešenje problema

[0010] Predmetni pronalazači su utvrdili da je u sitnoćelijskom kanceru pluća povećana ekspresija DLL3 mRNK (informacione RNK). Njena ekspresija je niska u svim normalnim tkivima osim u fetalnom mozgu. Predmetni pronalazači su pripremili monoklonska antitela protiv DLL3 proteina. Nivo antigena na površini ćelije, meren na osnovu sposobnosti vezivanja za antitelo, iznosio je manje od 10<4>po ćeliji koja ga eksprimira. Neočekivano, predmetni pronalazači su utvrdili da se antitelo koje se vezuje za DLL3 preko karakterističnog epitopa u blizini C-terminusa vanćelijskog domena, stabilno održava na ćelijskoj membrani i da ima ADCC-indukujuću aktivnost. Tačnije, predmetni pronalazači su sukcesivno izvršili skrining u potrazi za antitelima koja imaju antitumorsku aktivnost. Pored toga, predmetni pronalazači su utvrdili da antitelo konjugovano sa toksinom ima citotoksičnu aktivnost prema ćelijama koje eksprimiraju DLL3. Na osnovu tih nalaza, predmetni pronalazači utvrdili su da je anti-DLL3 antitelo korisno u dijagnostici, prevenciji i lečenju primarnog ili metastatskog kancera koji eksprimira DLL3.

[0011] U skladu sa tim, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u postupku lečenja sitnoćelijskog kancera pluća koji eksprimira DLL3 protein, pri čemu farmaceutska kompozicija uključuje antitelo koje se vezuje za DLL3 protein, pri čemu antitelo ima citotoksičnu aktivnost; i prepoznaje region od amino-kiseline 216 do 492 u humanom DLL3 koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO (SEK ID BR): 1.

[0012] Antitelo se vezuje za DLL3 protein i ima citotoksičnu aktivnost. Posebno poželjno, citotoksična aktivnost je ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC aktivnost). Isto tako poželjno, antitelo ima internalizacionu aktivnost. Isto tako poželjno, antitelo je konjugovano sa citotoksičnom supstancom. Antitelo prepoznaje region od amino-kiseline 216 do 492 u humanom DLL3 koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1.

[0013] U drugom aspektu, farmaceutska kompozicija za upotrebu prema pronalasku uključuje antitelo koje se vezuje za DLL3 protein opisan bilo kojim od sledećeg:

(1) antitelo koje uključuje varijabilni region teškog lanca, koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 12, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 13, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 14, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 18, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 19, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 20; (2) antitelo koje uključuje varijabilni region teškog lanca, koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 24, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 25, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 26, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 30, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 31, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 32; (3) antitelo koje uključuje varijabilni region teškog lanca, koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 36, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 37, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 38, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 42, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 43, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 44; (4) antitelo koje uključuje varijabilni region teškog lanca, koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 49, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 50, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 54, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 55, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 56.

[0014] Pronalazak je definisan u patentnom zahtevu 1. Dodatni aspekti i poželjna tehnička rešenja definisani su u zavisnim patentnim zahtevima. Aspekti, tehnička rešenja i primeri predmetne objave, koji ne potpadaju pod obim priloženih patentnih zahteva, ne čine deo pronalaska i dati su samo radi ilustrovanja.

Kratak opis crteža

[0015]

[Slika 1] Slika 1 prikazuje povećanu ekspresiju DLL3 u sitnoćelijskom kanceru pluća i fetalnom mozgu.

[Slika 2] Slika 2 prikazuje vezivanje anti-DLL3 monoklonskog antitela za solubilni DLL3 protein.

[Slika 3] Slika 3 prikazuje vezivanje antitela za DLL3 protein na ćelijskoj membrani i promet antitela vezanog za membranu.

[Slika 4] Slika 4 prikazuje indukovanje ADCC anti-DLL3 antitelom (koncentracija: 2.5 µg/ml).

[Slika 5] Slika 5 prikazuje zavisnost ADCC aktivnosti prema ciljnim ćelijama DLL3/BaF3 (a) i NCI-H1184 (b) od koncentracije antitela.

[Slika 6] Slika 6 prikazuje inhibiciju rasta ćelija preuzimanjem anti-DLL3 antitela i antimišjeg sekundarnog antitela Mab-ZAP obeleženog toksinom.

[Slika 7] Slika 7 prikazuje vezivanje rekombinantnog anti-DLL3 antitela za DLL3 protein na površini ćelije.

[Slika 8] Slika 8 prikazuje vezivanje rekombinantnog anti-DLL3 humanog himernog antitela za solubilni DLL3 protein i kompeticiju u vezivanju anti-DLL3 himernog antitela sa mišjim antitelom protiv solubilnog DLL3 proteina.

[Slika 9] Slika 9 prikazuje shemu strukture DLL3 proteina pune dužine i solubilnog DLL3 proteina i mesto prepoznavanja anti-DLL3 antitelom.

[Slika 10] Slika 10 prikazuje vezivanje rekombinantnog anti-DLL3 humanog himernog antitela DL306 za DLL3 protein na površini ćelije.

[Slika 11] Slika 11 prikazuje zavisnost ADCC aktivnosti anti-DLL3 humanog himernog antitela protiv ciljnih ćelija DLL3/BaF3 i NCI-H1184, od koncentracije antitela.

[Slika 12] Slika 12 prikazuje zavisnost ADCC aktivnosti anti-DLL3 mišjeg antitela sa niskim sadržajem fukoze protiv ciljnih ćelija DLL3/BaF3 i NCI-H1184, od koncentracije antitela.

Detaljan opis

DLL3

[0016] Aminokiselinska sekvenca od DLL3 (delta-sličan 3) poznata je u struci. Na primer, aminokiselinska sekvenca humanog DLL3 je navedena u SEQ ID NO: 1 (NM_016941), a aminokiselinska sekvenca mišjeg DLL3 je navedena u SEQ ID NO: 2 (NM_007866).

[0017] DLL3 protein može biti DLL3 protein koji ima sekvencu opisanu gore ili može biti modifikovani protein koji ima sekvencu izvedenu iz sekvence opisane gore, modifikacijom jedne ili više amino-kiselina. Primeri modifikovanog proteina koji ima sekvencu izvedenu iz sekvence opisane gore modifikacijom jedne ili više amino-kiselina, mogu uključivati polipeptide koji imaju 70% ili više, poželjno 80% ili više, poželjnije 90% ili više, još poželjnije 95% ili više homologije sa aminokiselinskom sekvencom. Alternativno, mogu se koristiti peptidi koji su delovi ovih DLL3 proteina.

[0018] DLL3 protein nije ograničen svojim poreklom i poželjno je humani DLL3 protein.

Anti-DLL3 antitelo

[0019] Anti-DLL3 antitelo treba samo da se vezuje za DLL3 protein, da ima citotoksičnu aktivnost i da prepoznaje region od amino-kiseline 216 do 492 u humanom DLL3 sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1, i nije posebno ograničeno svojim poreklom, tipom, oblikom, itd. Konkretno, može se korisiti antitelo kao što je nehumano antitelo poreklom iz životinje (npr., antitelo miša, pacova ili kamile), antitelo poreklom iz čoveka, himerno antitelo, ili humanizovano antitelo. Anti-DLL3 antitelo može biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo, a poželjno je monoklonsko antitelo.

[0020] Anti-DLL3 antitelo je poželjno antihumano DLL3 antitelo. Antihumano DLL3 antitelo može biti antitelo koje se specifično vezuje za humani DLL3 ili može biti antitelo koje se vezuje za humani DLL3 kao i za nehumani, iz životinje izvedeni DLL3 (npr., DLL3 miša).

[0021] Anti-DLL3 antitelo može se dobiti kao poliklonsko ili monoklonsko antitelo, korišćenjem sredstava poznatih u struci. Anti-DLL3 antitelo je posebno poželjno, monoklonsko antitelo poreklom iz sisara. Monoklonsko antitelo poreklom iz sisara obuhvata, na primer, antitela koja proizvode hibridomi i antitela koja proizvode domaćini transformisani ekspresionim vektorima koji sadrže gen za antitelo, pristupom genetičkog inženjerstva.

[0022] Anti-DLL3 antitelo može biti modifikovano različitim molekulima, na primer polietilen glikolom (polyethylene glycol, PEG). Kako će biti opisano kasnije, anti-DLL3 antitelo može biti modifikovano i hemioterapijskim sredstvom, radioaktivnim hemijskim sredstvom, ili slično, koji imaju citotoksičnu aktivnost.

[0023] Primeri antitela koje prepoznaje DLL3 i vezuje se za njega, mogu uključiti sledeća antitela:

(1) antitelo (DL301) koje uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 12, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 13, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 14, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 18, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 19, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 20; (2) antitelo (DL306) koje uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 24, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 25, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 26, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 30, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 31, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 32; (3) antitelo (DL309) koje uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 36, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 37, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 38, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 42, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 43, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 44; i (4) antitelo (DL312) koje uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 49, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 50, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 54, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 55, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 56.

[0024] Antitela (1) do (4) mogu sadržati konstantne regione. Upotrebljeni konstantni regioni nisu posebno ograničeni, i može se koristiti bilo koji konstantni region. Poželjni primeri konstantnih regiona mogu uključivati konstantne regione izvedene iz ljudi. Na primer, kao konstantni region teškog lanca može se upotrebiti konstantni region izveden iz humanog IgG1, izveden iz humanog IgG2, izveden iz humanog IgG3 ili izveden iz humanog IgG4. Isto tako, na primer, kao konstantni region lakog lanca može se koristiti konstantni region izveden iz humanog κ lanca ili izveden iz humanog λ lanca. Konstantni regioni mogu biti konstantni regioni koji imaju nativnu sekvencu ili mogu biti modifikovani konstantni regioni koji imaju sekvencu izvedenu iz nativne sekvence, modifikovanjem jedne ili više amino-kiselina.

[0025] Antitela (1) do (4) mogu sadržati FR. Upotrebljeni FR nisu posebno ograničeni, i može se koristiti bilo koji FR dokle god dobijeno antitelo zadržava svoju aktivnost vezivanja sa humanim DLL3. Poželjni primeri FR mogu uključivati FR izvedene iz humanog antitela. Pošto je tehnika zamene FR uz zadržavanje aktivnosti vezivanja sa antigenom poznata u struci, stručnjak u oblasti može na odgovarajući način odabrati FR. FR mogu biti FR koji imaju nativnu sekvencu ili mogu biti FR koji imaju sekvencu izvedenu iz nativne sekvence, modifikovanjem jedne ili više aminokiselina.

[0026] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 12, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 13, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 14 mogu uključiti varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 9. Isto tako, primeri teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca mogu uključiti teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10 ili 11.

[0027] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 24, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 25, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 26 mogu uključiti varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 21. Isto tako, primeri teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca mogu uključiti teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 22 ili 23.

[0028] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 36, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 37, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 38 mogu uključiti varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 33. Isto tako, primeri teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca mogu uključiti teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 34 ili 35.

[0029] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 49, i CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 50 mogu uključiti varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 45. Isto tako, primeri teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca mogu uključiti teški lanac sa aminokiselnskom sekvencom SEQ ID NO: 46 ili 47.

[0030] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 18, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 19, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 20 mogu uključiti varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 15. Isto tako, primeri lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca mogu uključiti laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 16 ili 17.

[0031] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 30, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 31, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 32 mogu uključivati varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 27. Isto tako, primeri lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca mogu uključiti laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28 ili 29.

[0032] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 42, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 43, i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 44 mogu uključiti varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 39. Isto tako, primeri lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca mogu uključiti laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 40 ili 41.

[0033] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 54, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 55, , i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 56 mogu uključiti varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 51. Isto tako, primeri lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca mogu uključiti laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 52 ili 53.

[0034] Izraz "koji ima aktivnost ekvivalentnu aktivnosti antitela" označava posedovanje aktivnosti vezivanja za DLL3, aktivnosti internalizacije, i/ili citotoksične aktivnosti (ADCC aktivnost, itd.) prema DLL3-eksprimirajućim ćelijama, ekvivalentne toj aktivnosti. Ekvivalentna aktivnost ne mora obavezno biti identična aktivnost i može iznositi, na primer, 50% ili više, poželjno 70% ili više, poželjnije 90% ili više aktivnosti, u poređenju sa aktivnošću bilo kojeg od antitela (1) do (12). Primeri gornje granice aktivnosti mogu uključivati, ali se posebno ne ograničavaju na 1000% ili manje, 500% ili manje, 300% ili manje, 150% ili manje, i 100% ili manje.

[0035] Antitelo izvedeno supstitucijom, delecijom, adicijom, i/ili insercijom jedne ili više aminokiselina takođe je ovde opisano i može biti veštački pripremljeno ili se pojavljivati prirodno. Primeri postupaka za uvođenje mutacije u polipeptid uključuju mutagenezu usmerenu na mesto (Hashimoto-Gotoh, T. i sarad. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. i sarad. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol.85, 2763-2766). To je jedan od postupaka dobro poznat stručnjacima u oblasti, za pripremanje polipeptida funkcionalno ekvivalentnog određenom polipeptidu. Korišćenjem tog postupka, stručnjaci u oblasti mogu na odgovarajući način uvesti mutaciju u antitelo i tako pripremiti antitelo koje je funkcionalno ekvivalentno antitelu. Pored toga, aminokiselinske mutacije mogu se sresti u prirodnom svetu. Ono antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz aminokiselinske sekvence antitela mutacijom jedne ili više amino-kiselina i koje je funkcionalno ekvivalentno antitelu, takođe je opisano u ovom tekstu.

[0036] Broj amino-kiselina mutiranih u takvoj varijanti obično iznosi do 50 amino-kiselina, poželjno do 30 amino-kiselina, poželjnije do 10 amino-kiselina (npr., do 5 amino-kiselina).

[0037] U vezi sa aminokiselinskim reziduama koje će biti mutirane, poželjno je da se ta mutacija obavi konzervativno, između amino-kiselina koje imaju bočni lanac sa istim svojstvom. Na primer, na osnovu svojstava bočnih lanaca amino-kiselina, uspostavljena je sledeća klasifikacija:

hidrofobne amino-kiseline (A, I, L, M, F, P, W, Y, i V),

hidrofilne amino-kiseline (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, i T),

amino-kiseline koje imaju alifatični bočni lanac (G, A, V, L, I, i P),

amino-kiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži hidroksi grupu (S, T, i Y),

amino-kiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži atom sumpora (C i M),

amino-kiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži karboksilnu kiselinu i amid (D, N, E, i Q),

amino-kiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži bazu (R, K, i H), i

amino-kiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži aromatičnu grupu (H, F, Y, i W) (svi simboli unutar zagrada predstavljaju jednoslovne šifre amino-kiselina).

[0038] Već je poznato da polipeptid čija je aminokiselinska sekvenca delecijom i/ili adicijom jedne ili više aminokiselinskih rezidua i/ili njihovom supstitucijom drugim amino-kiselinama, modifikovana u odnosu na određenu aminokiselinsku sekvencu, zadržava biološku aktivnost originalnog polipeptida (Mark, D. F. i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. i sarad., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413). Konkretno, kada se amino-kiseline u aminokiselinskoj sekvenci koja sačinjava određeni polipeptid, supstituišu amino-kiselinama svrstanim u istu grupu, uopšteno se kaže da će polipeptid verovatno zadržati svoju aktivnost. Supstitucija između amino-kiselina koje su u istoj grupi amino-kiselina, kako je opisano gore, označava se kao konzervativna supstitucija.

[0039] Da li analitsko antitelo ima isti epitop kao određeno anitelo ili nema, može se utvrditi na osnovu njihove kompeticije za isti epitop. Kompeticija između antitela detektuje se testom unakrsnog blokiranja, ili sličnim. Test unakrsnog blokiranja je poželjno, na primer, kompetitivni ELISA test.

[0040] Konkretno, test unakrsnog blokiranja uključuje preinkubiranje DLL3 proteina kojim su obloženi bunarčići mikrotitarske ploče, u prisustvu ili odsustvu kandidatskog kompetirajućeg antitela, i zatim dodavanje anti-DLL3 antitela. Količina anti-DLL3 antitela vezanog za DLL3 protein u svakom bunarčiću u indirektnoj je korelaciji sa sposobnošću vezivanja kandidatskog kompetirajućeg antitela (analitsko antitelo) koje se sa njim takmiči u vezivanju za isti epitop. Tačnije, veći afinitet analitskog antitela za isti epitop rezultuje manjom količinom anti-DLL3 antitela vezanog za bunarčić obložen DLL3 proteinom i umesto njega, većom količinom analitskog antitela vezanog za bunarčić obložen DLL3 proteinom.

[0041] Količina svakog antitela vezanog za bunarčić može se lako odrediti ako se antitelo obeleži unapred. Na primer, biotinizovano antitelo može da se testira korišćenjem konjugata avidinperoksidaza i odgovarajućeg supstrata. Test unakrsnog blokiranja u kojem se koristi obeležavanje enzimom (npr., peroksidazom) posebno se naziva kompetitivni ELISA test. Antitelo može biti obeleženo bilo kojim drugim detektabilnim ili merljivim obeležavajućim materijalima. Konkretno, na primer, radioobeležavanje ili fluorescentno obeležavanje, poznato je u struci.

[0042] Pored toga, kada analitsko antitelo ima konstantne regione izvedene iz vrste različite od one iz koje je anti-DLL3 antitelo, količina jednog od antitela vezanog za bunarčić može se meriti i korišćenjem obeleženog antitela koje prepoznaje jedan od konstantnih regiona. Alternativno, čak i antitela različitih klasa, iako poreklom iz iste vrste, mogu se meriti u pogledu svojih respektivnih količina vezanih za bunarčić, korišćenjem antitela koja razlikuju svaku od klasa.

[0043] Sve dok kandidatsko antitelo može da blokira vezivanje anti-DLL3 antitela za najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 80%, u poređenju sa aktivnošću vezivanja koja se dobija u kontrolnom testu izvedenom u odsustvu kompetirajućeg antitela, ovo kandidatsko antitelo se određuje kao antitelo koje se suštinski vezuje za isti epitop kao što je epitop za koji se vezuje anti-DLL3 antitelo ili antitelo koje sa njim kompetira u vezivanju za isti epitop.

[0044] Antitelo farmaceutske kompozicije prepoznaje region od amino-kiselina 216 do 492 u humanom DLL3. Isto tako, ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani DLL3, kao i za polipeptid (DLL3delta1-Fc) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 6 i polipeptid (DLL3delta2-Fc) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 7.

[0045] Antitelo može imati aktivnosti kao što su ADCC aktivnost i aktivnost internalizacije i kao takvo, korisno je kao farmaceutski lek, posebno kao antitkancersko sredstvo.

Genetički rekombinantno anti-DLL3 antitelo

[0046] Antitelo koje treba da se primeni kod ljudi može se konvertovati u genetički rekombinantno antitelo koje je veštački inženjerisano, na primer, u svrhu smanjenja heteroantigenosti u ljudima. Genetički rekombinantno antitelo obuhvata, na primer, himerna antitela i humanizovana antitela. Ova inženjerisana antitela mogu se proizvesti korišćenjem postupka poznatog u struci.

(1) Himerno antitelo

[0047] Himerna antitela odnose se na antitela koja sadrže međusobno povezane varijabilne i konstantne regione različitog porekla. Na primer, heterogena himerna antitela miš-čovek su ona antitela koja sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela miša i konstantne regione teškog i lakog lanca antitela čoveka. DNK koje kodiraju varijabilne regione mišjeg antitela povezane su sa DNK koje kodiraju konstantne regione antitela čoveka, i proizvodi povezivanja mogu se inkorporisati u ekspresione vektore da bi se pripremili rekombinantni vektori koji eksprimiraju himerno antitelo. Ćelije transformisane ovim vektorima (rekombinantne ćelije) mogu se kultivisati da bi eksprimirale insertovanu DNK i da bi se dobila himerna antitela proizvedena tokom kultivacije.

[0048] Konstantni regioni antitela čoveka koriste se kao konstantni regioni himernih antitela. Na primer, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cµ, Cδ, Cα1, Cα2, i Cε mogu se upotrebiti kao konstantni regioni teškog lanca. Pored toga, Cκ i Cλ mogu se upotrebiti kao konstantni regioni lakog lanca. Aminokiselinske sekvence ovih konstantnih regiona i nukleotidne sekvence koje ih kodiraju poznate su u struci. Pored toga, jedna ili više amino-kiselina u konstantnim regionima humanih antitela mogu biti supstituisane, deletirane, adirane, i/ili insertovane da bi se poboljšala stabilnost samog antitela ili njegova proizvodnja.

(2) Humanizovano antitelo

[0049] Uopšteno, himerna antitela uključuju varijabilne regione nehumanog antitela, poreklom iz životinja i konstantne regione humanog antitela. Nasuprot tome, humanizovana antitela sadrže regione koji određuju komplementarnost (complementarity-determining region, CDR) nehumanog antitela, poreklom iz životinja, regione okvira (framework region, FR) poreklom iz humanog antitela, i konstantne regione poreklom iz humanog antitela. Humanizovana antitela se nazivaju i preoblikovana humana antitela. Konkretno, na primer, humanizovana antitela koja uključuju nehumane CDR iz antitela životinje (npr., miša) kalemljene u humana antitela poznata su u struci. Zahvaljujući svojoj smanjenoj antigenosti u čovečjem telu, humanizovana antitela korisna su kao aktivni sastojci terapijskog sredstva.

[0050] Svaki varijabilni region antitela obično sadrži 3 CDR na čijim bokovima se nalaze 4 FR. CDR regioni suštinski određuju specifičnost vezivanja antitela. CDR imaju raznovrsne aminokiselinske sekvence. Sa druge strane, aminokiselinske sekvence koje sačinjavaju FR često ispoljavaju visoku homologiju među antitelima sa različitom specifičnošću vezivanja. Prema tome, uglavnom, veruje se da se specifičnost vezivanja određenog antitela može transplantirati u druga antitela putem kalemljenja CDR.

[0051] Za dobijanje humanizovanih antitela poznati su i opšti pristupi rekombinacije gena. Konkretno, na primer, PCR sa produženjem preklopa poznata je u struci kao postupak za kalemljenje CDR iz antitela miša u čovečje FR. U PCR sa produženjem preklopa koriste se prajmeri za sintezu FR humanog antitela, koji sadrže dodatnu nukleotidnu sekvencu kodirajuću za svaki CDR antitela miša koji će se kalemiti. Prajmeri se pripremaju za svaki od 4 FR. Pri kalemljenju CDR miša u humane FR, uopšteno, veruje se da je povoljno odabrati humane FR visoko homologne sa mišjim FR kako bi se zadržale funkcije CDR. Konkretno, obično je poželjno upotrebiti humane FR koji sadrže aminokiselinske sekvence visoko homologne sa sekvencama FR koji se nalaze uz mišje CDR koji će se kalemiti.

[0052] Pored toga, nukleotidne sekvence koje treba da se povežu, dizajniraju se tako da se spajaju u okviru. Nukleotidne sekvence koje kodiraju humane FR sintetišu se pojedinačno korišćenjem za njih odgovarajućih prajmera. Kao rezultat, dobijaju se proizvodi koji sadrže DNK kodirajuću za CDR miša, dodatu svakoj sekvenci koja kodira FR. Nukleotidna sekvenca koja kodira CDR miša u svakom proizvodu dizajnirana je tako da se nukleotidna sekvenca preklapa sa sledećom. Posledično, preklapajući delovi CDR se međusobno komplementarno sparuju zbog reakcije sinteze komplementarnog lanca. Ovom reakcijom, sekvence humanih FR povezuju se preko mišjih CDR sekvenci.

[0053] Na kraju, gen varijabilnog regiona pune dužine, koji sadrži povezane 3 CDR i 4 FR, amplifikuje se u prisustvu prajmera koji se respektivno komplementarno sparuju sa njegovim 5' i 3' krajem i sadrže dodatnu sekvencu prepoznavanja za odgovarajući restrikcioni enzim. Tako dobijena DNK i DNK koja kodira konstantni region humanog antitela, mogu se insertovati u ekspresione vektore tako da se fuzionišu u okviru da bi se pripremili vektori za eksprimiranje humanizovanog antitela. Domaćini se transformišu ovim vektorima da bi se uspostavile rekombinantne ćelije koje se zatim kultivišu da bi eksprimirale DNK koja kodira humanizovano antitelo, za proizvodnju humanizovanih antitela u kulturama ćelija (vidi Evropsku patentnu objavu br. EP 239400 i Međunarodnu objavu br. WO 96/02576).

[0054] Tako pripremljena humanizovana antitela mogu se kvalitativnim ili kvantitativnim testom evaluirati u pogledu svojih aktivnosti vezivanja za antigen,. Kao rezultat, FR humanog antitela mogu se odabrati poželjno tako da, kada se povežu preko CDR, omogućavaju da CDR formiraju povoljno antigen-vezujuće mesto. Ako je potrebno, aminokiselinska rezidua(rezidue) može se supstituisati tako da CDR humanizovanog antitela formiraju odgovarajuće mesto za vezivanje antigena. Na primer, mutacija se može uvesti u aminokiselinsku sekvencu FR korišćenjem PCR postupka upotrebljenog u kalemljenju CDR miša u čovečje FR. Tačnije, mutacija delimične nukleotidne sekvence može se uvesti u prajmere koji se komplementarno sparuju sa nukleotidnom sekvencom FR. Nukleotidna sekvenca FR sintetisana korišćenjem takvih prajmera sadrži na taj način uvedenu mutaciju. Varijantna antitela koja imaju supstituisanu amino-kiselinu(-e) mogu se evaluirati u pogledu svojih aktivnosti vezivanja za antigen, istim testom kao gore da bi se odabrale varijantne FR sekvence koje imaju željeno svojstvo (Sato, K. i sarad., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).

(3) Polivalentno antitelo

[0055] Antitelo prisutno u farmaceutskoj kompoziciji obuhvata ne samo bivalentna antitela sa tipskim predstavnikom IgG (IgG1, IgG2, IgG4, itd.) nego i monovalentna antitela ili polivalentna antitela sa tipskim predstavnikom IgM, sve dok se ova antitela vezuju za DLL3 protein. Polivalentno antitelo koje može biti prisutno u farmaceutskoj kompoziciji obuhvata polivalentna antitela koja imaju antigen-vezujuća mesta koja su sva međusobno ista ili se neka, ili sva međusobno razlikuju.

(4) Niskomolekularno antitelo

[0056] Antitelo prisutno u farmaceutskoj kompoziciji nije ograničeno na cele molekule antitela i može biti niskomolekularno antitelo ili njegova modifikovana forma, sve dok se antitelo vezuje za DLL3 protein.

[0057] Niskomolekularno antitelo obuhvata fragment antitela kojem nedostaje deo celog antitela (npr., celog IgG). Takav nedostatak dela molekula antitela prihvatljiv je sve dok je dobijeni fragment antitela sposoban da se vezuje za DLL3 antigen. Poželjno je da fragment antitela upotrebljen u farmaceutskoj kompoziciji sadrži jedan ili oba od varijabilnog regiona teškog lanca (heavy chain variable, VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (light chain variable, VL). Isto tako, poželjno je da fragment antitela upotrebljen u farmaceutskoj kompoziciji sadrži CDR. Broj CDR sadržanih u fragmentu antitela upotrebljenog u farmaceutskoj kompoziciji nije posebno ograničen i poželjno iznosi najmanje 6 CDR: CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca.

[0058] Aminokiselinska sekvenca VH ili VL može sadržati supstituciju, deleciju, adiciju, i/ili inserciju. Pored toga, fragmentu antitela koji se može upotrebiti u farmaceutskoj kompoziciji može nedostajati deo jednog ili oba od VH i VL, sve dok dobijeni fragment antitela može da se vezuje za DLL3 antigen. Pored toga, njegov varijabilni region može biti himerizovan ili humanizovan.

Specifični primeri fragmenata antitela mogu uključiti Fab, Fab', F(ab')2, i Fv. Pored toga, specifični primeri niskomolekularnog antitela mogu uključiti Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (jednolančani Fv), dijatelo, sc(Fv)2 (jednolančani (Fv)2), i scFv-Fc. Niskomolekularno antitelo je poželjno dijatelo ili sc(Fv)2. Multimeri antitela (npr., dimeri, trimeri, tetrameri, i polimeri) takođe spadaju u niskomolekularna antitela koja se mogu upotrebiti u farmaceutskoj kompoziciji.

[0059] Takvi fragmenti antitela mogu se dobiti enzimskom obradom antitela da bi se formirali fragmenti antitela. Digestivni enzimi odsecaju fragment antitela na određenoj poziciji da bi se dobio fragment antitela sa određenom strukturom. Na primer, papain, pepsin, ili plazmin poznati su u struci kao enzimi za formiranje fragmenata antitela. Digestija papainom daje F(ab)2 ili Fab, dok digestija pepsinom daje F(ab')2 ili Fab'. Alternativno, konstruisani su geni koji kodiraju ove fragmente antitela i ti geni se mogu uvesti u ekspresione vektore i zatim eksprimirati u odgovarajućim ćelijama-domaćinima (vidi npr., Co, M. S. i sarad., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663, Rousseaux, J. i sarad., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669, Bird, R. E. i sarad., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

[0060] Korišćenjem genetičkog inženjerstva za enzimski dobijene fragmente antitela, može se deletirati arbitrarni deo antitela. Niskomolekularnom antitelu može nedostajati arbitrarni region sve dok dobijeni fragment antitela ima afinitet vezivanja za DLL3.

i) Dijatelo

[0061] Dijatelo odnosi se na bivalentni fragment antitela konstruisan genskom fuzijom (npr., Holliger P i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404,097, i WO 93/11161). Dijatelo je dimer koji sadrži dva polipeptidna lanca. Obično, svaki od polipeptidnih lanaca koji čine dimer sadrži varijabilne regione lakog i teškog lanca spojene linkerom, na istom lancu. Linker u dijatelu je obično suviše kratak da bi sparivanje varijabilnih regiona teškog i lakog lanca na istom lancu bilo moguće. Tačnije, broj aminokiselinskih rezidua koje sačinjavaju linker iznosi, na primer, približno 5 rezidua. Prema tome, varijabilni regioni lakog i teškog lanca kodirani na istom polipeptidnom lancu ne mogu zajedno formirati jednolančani fragment varijabilnog regiona. Umesto toga, oni formiraju dimer sparivanjem sa drugim jednolančanim fragmentom varijabilnog regiona. Kao rezultat, dijatelo ima dva antigen-vezujuća mesta.

ii) scFv

[0062] scFv se dobija povezivanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela. U scFv, varijabilni regioni teškog i lakog lanca povezani linkerom, poželjno, peptidnim linkerom (Huston, J. S. i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883). Varijabilni regioni teškog i lakog lanca u scFv mogu se izvesti iz bilo kojeg od antitela opisanih u predmetnoj specifikaciji. Peptidni linker koji povezuje varijabilne regione nije posebno ograničen. Na primer, kao linker se može upotrebiti arbitrarni jednolančani peptid od približno 3 do 25 rezidua. Konkretno, na primer, može se upotrebiti peptidni linker opisan kasnije.

[0063] Varijabilni regioni oba lanca mogu se povezati, na primer, korišćenjem PCR. Prvo, od DNK sekvenci koje kodiraju teški lanac ili varijabilni region teškog lanca antitela i DNK sekvenci koje kodiraju laki lanac ili varijabilni region lakog lanca antitela, DNK koje kodiraju celu ili željenu delimičnu aminokiselinsku sekvencu koriste se kao templati za povezivanje varijabilnih regiona putem PCR.

[0064] DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca i DNK koja kodira varijabilni region lakog lanca amplifikuju se zasebno pomoću PCR, uz korišćenje para parajmera čije sekvence odgovaraju obema terminalnim sekvencama svake DNK koja će se amplifikovati. Posle toga, priprema se DNK koja kodira peptidni linkerski deo. DNK koja kodira peptidni linker može se sintetisati i korišćenjem PCR. Nukleotidne sekvence koje se mogu vezati za zasebno sintetisan proizvod amplifikacije svakog varijabilnog regiona, respektivno se dodaju na 5' sekvence prajmera upotrebljenih u ovoj PCR. Zatim se izvodi PCR reakcija korišćenjem svake od sledećih DNK [DNK varijabilnog regiona teškog lanca]-[DNK peptidnog linkera]-[DNK varijabilnog regiona lakog lanca] i prajmera za asambliranje PCR.

[0065] Prajmeri za asambliranje PCR uključuju kombinaciju prajmera koji se komplementarno sparuje sa 5' sekvencom [DNK varijabilnog regiona teškog lanca] i prajmera koji se komplementarno sparuje sa 3' sekvencom [DNK varijabilnog regiona lakog lanca]. Tačnije, prajmeri za asambliranje PCR predstavljaju set prajmera sposobnih da amplifikuju DNK kodirajuću za sekvencu pune dužine scFv koju treba sintetisati. Nasuprot tome, [DNK peptidnog linkera] sadrži dodatnu nukleotidnu sekvencu koja se može povezati sa DNK svakog od varijabilnih regiona. Kao rezultat, ove DNK se povezuju i, potom, finalno pripremaju kao scFvamplifikacioni proizvod pune dužine, korišćenje prajmera za asambliranje PCR. Posle pripremanja scFv-kodirajuće DNK, ekspresioni vektori koji sadrže ovu DNK i ćelije transformisane ekspresionim vektorima (rekombinantne ćelije) mogu se dobiti rutinskim postupcima. Pored toga, dobijene rekombinantne ćelije mogu se kultivisati da eksprimiraju scFv-kodirajuću DNK da bi se dobio scFv.

iii) scFv-Fc

[0066] scFv-Fc je niskomolekularno antitelo koje sadrži Fc region fuzionisan sa scFv (Cellular & Molecular Immunology 2006; 3: 439-443). Poreklo scFv upotrebljenog u scFv-Fc nije posebno ograničeno, i, na primer, može se koristiti scFv izveden iz IgM. Pored toga, poreklo Fc nije posebno ograničeno, i, na primer, može se koristiti Fc izveden iz humanog IgG (humani IgG1, itd.). Prema tome, poželjan aspekt scFv-Fc može uključivati scFv-Fc koji uključuje scFv fragment IgM antitela, povezan sa CH2 (npr., Cy2) i CH3 (npr., Cy3) humanog IgG1, preko regiona šarke (Hy) humanog IgG1.

iv) sc(Fv)2

[0067] sc(Fv)2 je niskomolekularno antitelo koje ima jedan lanac koji sadrži dva varijabilna regiona teškog lanca (VH) i dva varijabilna regiona lakog lanca (VL), povezana linkerima ili slično (Hudson i sarad., J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). sc(Fv)2 se može pripremiti, na primer, povezivanjem scFv pomoću linkera. Tri linkera se obično potrebna za povezivanje četiri varijabilna regiona antitela.

[0068] Pored toga, sc(Fv)2 je poželjno antitelo u kojem su dva VH i dva VL postavljena u nizu VH, VL, VH, i VL (tj., [VH]-linker-[VL]-linker-[VH]-linker-[VL]), tim redom, počevši od N-terminusa jednolančanog polipeptida.

[0069] Redosled dvaVH i dva VL nije posebno ograničen na aranžman opisan gore i može podrazumevati aranžman bilo kojim redom. Primeri ovoga uključuju i sledeće aranžmane:

[VL]-linker-[VH]-linker-[VH]-linker-[VL]

[VH]-linker-[VL]-linker-[VL]-linker-[VH]

[VH]-linker-[VH]-linker-[VL]-linker-[VL]

[VL]-linker-[VL]-linker-[VH]-linker-[VH]

[VL]-linker-[VH]-linker-[VL]-linker-[VH]

[0070] Na primer, arbitrarni peptidni linker ili sintetski složeni linker (npr., linkeri objavljeni u referenci Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996) koji se može uvesti genetičkim inženjerstvom, može se upotrebiti kao linker koji povezuje varijabilne regione antitela. Može se upotrebiti veliki broj istih ili različitih linkera. Poželjan je peptidni linker. Dužina peptidnog linkera nije posebno ograničena i može je na odgovarajući način odabrati stručnjak u oblasti, u skladu sa namenom. Broj aminokiselinskih rezidua koje sačinjavaju peptidni linker obično iznosi 1 do 100 amino-kiselina, poželjno 3 do 50 amino-kiselina, poželjnije 5 do 30 amino-kiselina, posbno poželjno 12 do 18 amino-kiselina (npr., 15 amino-kiselina).

[0071] Aminokiselinska sekvenca koja sačinjava peptidni linker može biti arbitrarna sekvenca sve dok ova sekvenca ne inhibira vezujući efekat scFv. Na primer, kao peptidni linker mogu se upotrebiti sledeće aminokiselinske sekvence:

Ser

Gly · Ser

Gly · Gly · Ser

Ser · Gly · Gly

Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 61)

Ser · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 62)

Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 63)

Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 64)

Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 65)

Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 66)

Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO: 67)

Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO: 68)

(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser)n

(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly)n

[n predstavlja ceo broj od 1 ili više].

[0072] Aminokiselinsku sekvencu peptidnog linkera može na odgovarajući način odabrati stručnjak u oblasti, u skladu sa namenom. Na primer, ceo broj n koji određuje dužinu peptidnog linkera obično je 1 do 5, poželjno 1 do 3, poželjnije 1 ili 2.

[0073] Prema tome, primeri posebno poželjnog aspekta sc(Fv)2 koji može da se koristi u farmaceutskoj kompoziciji mogu uključivati sledeće sc(Fv)2:

[VH]-peptidni linker (15 amino-kiselina)-[VL]-peptidni linker (15 amino-kiselina)-[VH]-peptidni linker (15 amino-kiselina)-[VL] .

[0074] Alternativno, varijabilni regioni mogu se povezati i korišćenjem hemijski sintetisanog linkera (hemijsko unakrsno povezujuće sredstvo). Mogu se koristiti unakrsno povezujuća sredstva koja se obično koriste u unakrsnom povezivanju peptidnih jedinjenja ili slično. Na primer, hemijska unakrsno povezujuća sredstva pokazana u nastavku ovog teksta poznata su u struci. Komercijalno su dostupna ova unakrsno povezujuća sredstva:

N-hidroksisukcinimid (NHS),

disukcinimidil suberat (DSS),

bis(sulfosukcinimidil) suberat (BS3),

ditiobis(sukcinimidil propionat) (DSP),

ditiobis(sulfosukcinimidil propionat) (DTSSP),

etilen glikol bis(sukcinimidil sukcinat) (EGS),

etilen glikol bis(sulfosukcinimidil sukcinat) (sulfo-EGS),

disukcinimidil tartrat (DST), disulfosukcinimidil tartrat (sulfo-DST),

bis[2-(sukcinimidoksikarboniloksi)etil]sulfon (BSOCOES), i

bis[2-(sulfosukcinimidoksikarboniloksi)etil]sulfon (sulfo-BSOCOES), itd.

Aktivnost anti-DLL3 antitela

(1) Citotoksična aktivnost

[0075] Za lečenje ćelijskih proliferativnih oboljenja kao što je kancer, poželjno je da antitelo zadrži svoju efektorsku aktivnost. Konkretno, poželjno antitelo ima i vezujući afinitet za DLL3 i efektorske funkcije. Upotrebljeno antitelo ima citotoksičnu aktivnost. Efektorske funkcije antitela obuhvataju ćelijama posredovanu citotoksičnu aktivnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnu aktivnost zavisnu od komplementa (complement-dependent cytotoxic activity, CDC). Kao efektorsku funkciju, terapijsko antitelo posebno poželjno poseduje ADCC aktivnost.

[0076] Antitelo upotrebljeno u terapijske svrhe je antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost.

[0077] Primeri citotoksične aktivnosti mogu uključivati ADCC aktivnost i CDC aktivnost. ADCC aktivnost označava aktivnost oštećivanja ciljnih ćelija vezivanjem ćelija koje nose Fcγ receptor (imunociti, itd.) preko Fcγ receptora za Fc domene antitela specifično prikačenih za ćelijske površinske antigene ciljnih ćelija. Sa druge strane, CDC aktivnost označava citotoksičnu aktivnost posredovanu sistemom komplementa.

[0078] Da li anti-DLL3 antitelo ima ili nema ADCC aktivnost, ili CDC aktivnost, može se odrediti postupkom poznatim u struci (npr., Current protocols in Immunology, poglavlje 7. Immunologic studies in humans, izdavač, John E, Coligan i sarad., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). Preciznije, prvo se pripreme efektorske ćelije, rastvor komplementa, i ciljne ćelije.

i) Pripremanje efektorskih ćelija

[0079] Iz CBA/N miševa ili slično izoluje se slezina, i ćelije slezine se iz nje izdvoje u RPMI1640 medijumu (proizvođač Invitrogen Corp.). Ćelije se mogu isprati ovim medijumom koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (fetal bovine serum, FBS, proizvođač HyClone Laboratories, Inc.) i zatim se koncentracija ćelija podesi na 5×10<6>ćelija/ml da bi se pripremile efektorske ćelije.

ii) Pripremanje rastvora komplementa

[0080] Komplement beba-zečeva (Baby Rabbit Complement, proizvođač CEDARLANE Laboratories Ltd.) može se desetostruko razblažiti medijumom (proizvođač Invitrogen Corp.) koji sadrži 10% FBS da bi se pripremio rastvor komplementa.

iii) Pripremanje ciljne ćelije

[0081] Ćelije koje eksprimiraju DLL3 proteine mogu se kultivisati na 37°C, 1 sat, zajedno sa 0.2 mCi<51>Cr-natrijum hromatom (proizvođač GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), u DMEM medijumu koji sadrži 10% FBS da bi se ciljne ćelije radioaktivno obeležile. Ćelije transformisane genima koji kodiraju DLL3 protein, ćelijske linije sitnoćelijskog kancera pluća, ili slično, mogu se koristiti kao ćelijske linije koje eksprimiraju DLL3 proteine. Takve radioaktivno obeležene ćelije mogu se isprati u tri promene RPMI1640 medijuma koji sadrži 10% FBS i koncentracija ćelija se podesi na 2×10<5>ćelija/ml da bi se pripremile ciljne ćelije.

[0082] ADCC ili CDC aktivnost može se testirati postupkom opisanim u nastavku ovog teksta. Za testiranje ADCC aktivnosti, ciljne ćelije i anti-DLL3 antitelo (po 50 µl svakog) dodaju se u ploču sa 96 bunarčića sa U-dnom (proizvođač Becton, Dickinson and Company) i reaguju 15 minuta na ledu. Zatim se ploči doda 100 µl efektorskih ćelija, i ćelije se kultivišu 4 sata u inkubatoru sa CO2. Finalna koncentracija antitela podesi se na 0 ili 10 µg/ml. Posle kultivacije, sakupi se 100 µl supernatanta i radioaktivnost se meri korišćenjem gama brojača (COBRA II AUTO-GAMMA, MODEL D5005, proizvođač Packard Instrument Company). Citotoksična aktivnost (%) može se izračunati na osnovu formule (A - C) / (B - C) x 100 uz korišćenje dobijene vrednosti. U formuli, A predstavlja radioaktivnost (cpm) svakog uzorka; B predstavlja radioaktivnost (cpm) uzorka dopunjenog 1% NP-40 (proizvođač Nacalai Tesque, Inc.); i C predstavlja radioaktivnost (cpm) uzorka koji sadrži samo ciljne ćelije.

[0083] Sa druge strane, za testiranje CDC aktivnosti, ciljne ćelije i anti-DLL3 antitelo (po 50 µl od svakog) dodaju se u ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (proizvođač Becton, Dickinson and Company) i reaguju 15 minuta na ledu. Zatim se ploči doda 100 µl rastvora komplementa i ćelije se kultivišu 4 sata u inkubatoru sa CO2. Finalna koncentracija antitela podesi se na 0 ili 3 µg/ml. Posle kultivacije, sakupi se 100 µl supernatanta i radioaktivnost se meri korišćenjem gama brojača. Citotoksična aktivnost se može izračunati na isti način kao u testu ADCC aktivnosti.

[0084] Nasuprot tome, u testu citotoksične aktivnosti u kojem se koriste konjugati antitela, ciljne ćelije i konjugati anti-DLL3 antitela (po 50 µl od svakog) dodaju se u ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (proizvođač Becton, Dickinson and Company) i reaguju 15 minuta na ledu. Ćelije se kultivišu 1 do 4 sata u inkubatoru sa CO2. Finalna koncentracija antitela podesi se na 0 ili 3 µg/ml. Posle kultivacije, sakupi se 100 µl supernatanta i radioaktivnost se meri korišćenjem gama brojača. Citotoksična aktivnost se može izračunati na isti način kao u testu ADCC aktivnosti.

(2) Konjugovano antitelo

[0085] Antitelo može biti konjugovano sa citotoksičnom supstancom kao što je hemioterapijsko sredstvo, toksični peptid, ili radioaktivno hemijsko sredstvo. Tako modifikovano antitelo (kasnije ovde označeno kao konjugat antitela) može se dobiti hemijskim modifikovanjem dobijenog antitela. Postupak za modifikovanje antitela već je uspostavljen u struci.

[0086] Primeri hemioterapijskog sredstva čija se citotoksična aktivnost ispoljava preko konjugovanja sa anti-DLL3 antitelom, mogu uključivati sledeća hemioterapijska sredstva: azaribin, anastrozol, azacitidin, bleomicin, bortezomib, briostatin-1, busulfan, kamptotecin, 10-hidroksikamptotecin, karmustin, celebreks, hlorambucil, cisplatin, irinotekan, karboplatin, kladribin, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin, docetaksel, daktinomicin, daunomicin glukuronid, daunorubicin, deksametazon, dietilstilbestrol, doksorubicin, doksorubicin glukuronid, epirubicin, etinil estradiol, estramustin, etopozid, etopozid glukuronid, floksuridin, fludarabin, flutamid, fluorouracil, fluoksimesteron, gemcitabin, hidroksiprogesteron kaproat, hidroksiurea, idarubicin, ifosfamid, leukovorin, lomustin, mehloretamin, medroksiprogesteron acetat, megestrol acetat, melfalan, merkaptopurin, metotreksat, mitoksantron, mitramicin, mitomicin, mitotan, fenilbutirat, prednizon, prokarbazin, paklitaksel, pentostatin, semustin, streptozocin, tamoksifen, taksani, taksol, testosteron propionat, talidomid, tioguanin, tiotepa, tenipozid, topotekan, uramustin, vinblastin, vinorelbin, vinkristin.

[0087] Hemioterapijsko sredstvo je poželjno niskomolekularno hemioterapijsko sredstvo. Nije verovatno da niskomolekularno hemioterapijsko sredstvo interferira sa funkcijama antitela čak ni pošto se konjuguje sa antitelom. Niskomolekularno hemioterapijsko sredstvo obično ima molekulsku težinu od 100 do 2000, poželjno 200 do 1000. Sva hemioterapijska sredstva navedena gore kao primeri su niskomolekularna hemioterapijska sredstva. Ova hemioterapijska sredstva obuhvataju prolekove koji se konvertuju in vivo u aktivna hemioterapijska sredstva. Aktivacija proleka može biti enzimska konverzija ili neenzimska konverzija.

[0088] Pored toga, antitelo se može modifikovati toksičnim peptidom. Primeri toksičnog peptida mogu uključiti sledeće: A lanac toksina difterije (Langone J. J., i sarad., Methods in Enzymology, 93, 307-308, 1983), egzotoksin pseudomonasa (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996), A lanac ricina (Fulton R. J., i sarad., J. Biol. Chem., 261, 5314-5319, 1986; Sivam G., i sarad., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. i sarad., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., i sarad., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Gheeite V., i sarad., J. Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991); deglikozilovani lanac A ricina (Thorpe P. E., i sarad., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); A lanac abrina (Wawrzynczak E. J., i sarad., Br. J. Cancer, 66, 361-366, 1992; Wawrzynczak E. J., i sarad., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Sivam G., i sarad., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Thorpe P. E., i sarad., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); gelonin (Sivam G., i sarad., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. i sarad., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., i sarad., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); PAP; antivirusni protein iz semena vinobojke (Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); briodin (Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); saporin (Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); momordin (Cumber A. J., i sarad., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., i sarad., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); momorkohin (Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); diantin 32 (Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); diantin 30 (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); modecin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); viskumin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); volkesin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); dodekandrin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); tritin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); lufin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); trihokirin (Casellas P., i sarad., Eur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; Bolognesi A., i sarad., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992).

[0089] Radioaktivna hemijska sredstva odnosi se na hemijska sredstva koja sadrže radioizotop. Radioizotop nije posebno ograničen, i može se upotrebiti bilo koji radioizotop. Na primer, može se koristiti<32>P,<14>C,<125>I,<3>H,<131>I,<186>Re, ili<188>Re.

[0090] U sledećem aspektu, jedno ili dva ili više niskomolekularnih hemioterapijskih sredstava i jedan ili dva ili više toksičnih peptida može se koristiti u kombinaciji, za modifikovanje antitela. Anti-DLL3 antitelo može da se konjuguje sa niskomolekularnim hemioterapijskim sredstvom preko kovalentne ili nekovalentne veze. Postupak za pripremanje takvog antitela konjugovanog sa hemioterapijskim sredstvom poznat je u struci.

[0091] Proteinsko sredstvo ili toksin može se konjugovati sa antitelom pristupom genetičkog inženjerstva. Konkretno, na primer, DNK koja kodira toksični peptid i DNK koja kodira anti-DLL3 antitelo fuzionišu se jedan sa drugim u okviru, i ova fuzionisana DNK može da se inkorporiše u ekspresione vektore da bi se konstruisali rekombinantni vektori. Vektori se uvode u odgovarajuće ćelije-domaćine, i dobijene transformisane ćelije se kultivišu. Ćelije mogu eksprimirati insertovanu DNK da bi se kao fuzioni proteini dobila anti-DLL3 antitela konjugovana sa toksičnim peptidom. Za dobijanje fuzionih proteina antitela, proteinsko sredstvo ili toksin obično se nalazi na C-terminalnoj strani antitela. Može se dopustiti da se između antitela i proteinskog sredstva ili toksina nalazi peptidni linker.

(3) Bispecifično antitelo

[0092] Pored toga, antitelo prisutno u farmaceutskoj kompoziciji može biti bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo odnosi se na antitelo koje ima, u istom molekulu antitela, varijabilne regione koji prepoznaju različite epitope. Bispecifično antitelo može imati antigen-vezujuća mesta koja prepoznaju različite epitope na DLL3 molekulu. Prema tome, dva takva molekula bispecifičnog antitela mogu da se vežu za jedan DLL3 molekul. Kao rezultat, može se očekivati jači citotoksični efekat.

[0093] Alternativno, bispecifično antitelo prisutno u farmaceutskoj kompoziciji može imati antigen-vezujuća mesta, od kojih jedno prepoznaje DLL3 i drugo koje prepoznaje citotoksičnu supstancu. Citotoksična supstanca specifično obuhvata, na primer, hemioterapijsko sredstvo, toksični peptid, i radioaktivno hemijsko sredstvo. Takvo bispecifično antitelo vezuje se za ćelije koje eksprimiraju DLL3, dok istovremeno vezuje i citotoksičnu supstancu. Kao rezultat, omogućeno je da citotoksična supstanca direktno deluje na ćelije koje eksprimiraju DLL3. Konkretno, bispecifično antitelo koje prepoznaje citotoksičnu supstancu može specifično oštetiti tumorske ćelije i inhibirati rast tumorskih ćelija.

[0094] Pored toga, može se upotrebiti bispecifično antitelo koje sadrži DLL3-vezujuće mesto u kombinaciji sa antigen-vezujućim mestom koje prepoznaje antigen različit od DLL3. Antigenvezujuće mesto koje se može kombinovati u ovakvom bispecifičnom antitelu prepoznaje, na primer, antigen koji se specifično eksprimira na površini ciljnih kancerskih ćelija, kao DLL3, ali je različit od DLL3.

[0095] Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela poznat je u struci. Na primer, da bi se pripremilo bispecifično antitelo, mogu se povezati dva antitela koja se razlikuju po antigenu koji prepoznaju. Svako od povezanih antitela može biti 1/2 molekula koji ima teške i lake lance ili može biti 1/4 molekula koji se sastoji od teških lanaca. Alternativno, različiti hibridomi koji proizvode monoklonsko antitelo mogu se fuzionisati da bi se pripremile fuzione ćelije koje proizvode bispecifična antitela. Pored toga, bispecifično antitelo može se pripremiti genetičkim inženjerstvom.

[0096] Antigen-vezujuća aktivnost antitela može se odrediti korišćenjem sredstava poznatih u struci (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Na primer, mogu se koristiti ELISA (enzimski vezani imunoapsorbujući test, enzymelinked immunosorbent assay), EIA (enzimski imunotest, enzyme immunoassay), RIA (radioimunoesej, radioimmunoassay), ili fluoroimunotest.

(4) Modifikacija šećernog lanca

[0097] Antitelo može biti antitelo sa modifikovanim šećernim lancem. Poznato je da citotoksične aktivnosti antitela mogu da se pojačaju modifikovanjem njihovih šećernih lanaca. Na primer, glikozilovana antitela (WO 99/54342, itd.), antitela deficijentna u fukozi dodatoj njihovim šećernim lancima (WO 00/61739, WO 02/31140, itd.), i antitela koja imaju šećerni lanac sa bisektnim GlcNAc (WO 02/79255, itd.) poznata su u struci kao antitela sa modifikovanim šećernim lancem.

(5) Aktivnost internalizacije

[0098] Pored toga, antitelo prisutno u farmaceutskoj kompoziciji može imati aktivnost internalizacije. "Antitelo koje ima aktivnost internalizacije" označava antitelo koje se transportuje u ćeliju (citoplazmu, vezikule, druge organele, itd.) kada se veže za DLL3.

[0099] Da li antitelo ima aktivnost internalizacije ili ne, može se utvrditi postupkom opšte poznatim stručnjacima u oblasti i može se utvrditi, na primer, postupkom koji uključuje dovođenje u kontakt anti-DLL3 antitela povezanih sa obeležavajućim materijalom, sa DLL3-eksprimirajućim ćelijama i utvrđivanjem da li se obeležavajući materijal inkorporiše u ćelije ili ne, ili postupkom koji uključuje dovođenje u kontakt anti-DLL3 antitela konjugovanih sa citotoksičnom supstancom, sa DLL3-eksprimirajućim ćelijama i utvrđivanjem da li dolazi do indukovanja ćelijske smrti ili ne.

[0100] Konkretnije, aktivnost internalizacije anti-DLL3 antitela može se testirati, na primer, postupkom opisanim u Primerima.

[0101] Antitelo koje ima aktivnost internalizacije može se konjugovati sa, na primer, citotoksičnom supstancom i upotrebiti kao farmaceutska kompozicija kao što je antikancersko sredstvo opisano kasnije.

Pripremanje anti-DLL3 antitela

1. Pripremanje anti-DLL3 antitela korišćenjem hibridoma koji proizvodi monoklonsko antitelo

[0102] Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela mogu se pripremiti u skladu sa tehnikom koja je poznata u struci na sledeći način: prvo, životinje se imunizuju DLL3 proteinima ili njihovim parcijalnim peptidima (koji će biti opisani kasnije) upotrebljenim u vidu senzitizujućih sredstava, uobičajenim postupkom imunizacije. Dobijeni imunociti fuzionišu se sa roditeljskim ćelijama poznatim u struci, uobičajenim postupkom fuzije ćelija da se dobiju hibridomi. Ovi hibridomi se zatim dodatno pretražuju na ćelije koje proizvode antitelo od interesa, uobičajenim postupkom pretraživanja, kako bi se odabrali hibridomi koji proizvode anti-DLL3 antitelo. Željeno anti-DLL3 monoklonsko antitelo dobija se iz odabranih hibridoma. Konkretno, anti-DLL3 monoklonsko antitelo priprema se na sledeći način:

(1) Pripremanje DLL3 proteina

[0103] Prvo, DLL3 geni mogu da se eksprimiraju da bi se dobili DLL3 proteini koji se koriste kao senzitizujući antigeni za dobijanje antitela. Konkretno, DLL3-kodirajuća genska sekvenca insertuje se u ekspresione vektore poznate u struci, kojima se zatim transformišu odgovarajuće ćelije-domaćini. Zatim se humani DLL3 proteini od interesa prečišćavaju iz ćelija-domaćina ili supernatanta njihove kulture, postupkom poznatim u struci. Prečišćeni prirodni DLL3 proteini ili fuzioni proteini koji sadrže željeni parcijalni polipeptid DLL3 proteina fuzionisan sa drugim polipeptidom, mogu se upotrebiti kao imunogeni. Na primer, Fc fragmenti antitela, peptidne oznake, i tako dalje, mogu se upotrebiti za proizvodnju fuzionih proteina koji se upotrebljavaju kao imunogeni. Ekspresioni vektori za fuzione proteine mogu se pripremiti fuzionisanjem, u okviru, dva ili više gena koji respektivno kodiraju željene polipeptidne fragmente i insertovanjem ovog fuzionog gena u ekspresione vektore. Postupak za pripremanje fuzionih proteina opisan je u Molecular Cloning 2, izd. (Sambrook, J. i sarad., Molecular Cloning 2. izd., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).

[0104] Tako prečišćeni DLL3 proteini mogu se upotrebiti kao senzitizujući antigeni za imunizaciju sisara. Parcijalni peptidi DLL3 mogu se takođe koristiti kao senzitizujući antigeni. Na primer, sledeći peptidi se mogu upotrebiti kao senzitizujući antigeni:

[0105] Region i veličina upotrebljenog parcijalnog peptida DLL3 nisu ograničeni. Broj aminokiselina koje čine peptid koji služi kao senzitizujući antigen poželjno iznosi najmanje 3 ili više, na primer, 5 ili više ili 6 ili više. Konkretnije, kao senzitizujući antigeni mogu se upotrebiti peptidi od 8 do 50 rezidua, poželjno od 10 do 30 rezidua.

(2) Imunizacija DLL3 proteinom

[0106] Nehumani sisari imunizuju se DLL3 proteinima ili njihovim parcijalnim peptidima kao senzitizujućim antigenima. Imunizovani nehumani sisari nisu posebno ograničeni. Za dobijanje monoklonskog antitela postupkom fuzije ćelija, poželjno je da se imunizovane nehumane životinje odaberu uz razmatranje kompatibilnosti sa roditeljskim ćelijama koje se upotrebljavaju u fuziji ćelija. Uopšteno, glodari su poželjni kao imunizovane nehumane životinje. Konkretno, kao imunizovane nehumane životinje mogu se koristiti miševi, pacovi, hrčci, ili zečevi.

[0107] Ove nehumane životinje mogu se imunizovati senzitizujućim antigenima u skladu sa postupkom poznatim u struci. Na primer, opšti postupak može uključivati imunizovanje nehumanih sisara senzitizujućim antigenima intraperitonealnom ili supkutanom injekcijom. Konkretno, senzitizujući antigeni se daju nehumanim sisarima nekoliko puta u četvorodnevnim do dvadesetjednodnevnim intervalima. Senzitizujući antigeni se razblaže pomoću PBS (slani rastvor puferisan fosfatom), slanog rastvora, ili slično u odgovarajućem razblaženju i koriste u imunizaciji. Pored toga, senzitizujući antigeni mogu se davati zajedno sa adjuvansom. Na primer, antigeni se mogu pomešati sa Freund-ovim kompletnim adjuvansom za emulgovanje, da bi se pripremili senzitizujući antigeni. Pored toga, u imunizaciji senzitizujućim antigenima može se upotrebiti odgovarajući nosač. Posebno, kada se parcijalni peptidi male molekulske mase koriste kao senzitizujući antigeni, poželjno je da se senzitizujući antigenski peptidi vežu za nosačke proteine kao što su albumin ili hemocijanin puža "ključaonice" i upotrebe u imunizaciji.

(3) DNK imunizacija

[0108] Monoklonsko antitelo može se dobiti i DNK imunizacijom. DNK imunizacija je postupak imunostimulacije koji uključuje: imunizovanje životinja davanjem vektorske DNK konstruisane u obliku u kojem može da eksprimira gene koji kodiraju antigenski protein u imunizovanim životinjama; i dopuštanje imunizovanim životinjama da eksprimiraju imunizujuće antigene in vivo. Može se očekivati da DNK imunizacija bude superiorna u odnosu na opšte postupke imunizacije u kojima se koristi davanje proteinskih antigena, kako sledi:

● ona može obezbediti imunostimulaciju uz održavanje strukture membranskog proteina (npr., DLL3); i

● ona eliminiše potrebu za prečišćavanjem imunizujućih antigena.

[0109] Za dobijanje monoklonskog antitela DNK imunizacijom, životinje se prvo imunizuju davanjem ekspresione vektorske DNK za DLL3 protein. DLL3-kodirajuća DNK može se sintetisati postupkom poznatim u struci kao što je PCR. Dobijena DNK iinsertuje se u odgovarajuće ekspresione vektore, čijim davanjem se životinje imunizuju. Na primer, komercijalno dostupni ekspresioni vektor kao što je pcDNA3.1 može se upotrebiti kao ekspresioni vektor. Slično tome, opšte korišćeni postupak može se upotrebiti za davanje vektora životinjama. Na primer, čestice zlata na koje se adsorbuju ekspresioni vektori, mogu se insertovati u ćelije korišćenjem genskog pištolja kako bi bi se izvela DNK imunizcija.

(4) Pripremanje hibridoma

[0110] Porast količine željenog antitela potvrđuje se u serumu tako imunizovanih sisara. Zatim se imunociti sakupe iz sisara i podvrgnu ćelijskoj fuziji. Posebno, ćelije slezine mogu se koristiti kao poželjni imunociti.

[0111] Ćelije mijeloma sisara koriste se za ćelijsku fuziju sa imunocitima. Poželjno je da ćelije mijeloma imaju odgovarajući selekcioni marker za pretraživanje. Selekcioni marker odnosi se na karakter koji može opstati (ili ne može opstati) pod određenim uslovima kulture. Na primer, nedostatak hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (kasnije u ovom tekstu skraćeno u nedostatak HGPRT) ili nedostatak timidin kinaze (kasnije u ovom tekstu skraćeno u nedostatak TK) poznati je u struci kao selekcioni marker. Ćelije koje imaju nedostatak HGPRT ili TK osetljive su na hipoksantin-aminopterin-timidin (kasnije u ovom tekstu skraćeno u HAT-senzitivne). HAT-senzitivne ćelije umiru u HAT selektivnom medijumu zbog toga što ne mogu da sintetišu DNK. Nasuprot tome, ove ćelije, kada se fuzionišu sa normalnim ćelijama, mogu rasti čak i u HAT selektivnom medijumu jer mogu da nastave sa sintezom DNK koristeći put "spasa" normalnih ćelija.

[0112] Ćelije sa nedostatkom HGPRT ili TK mogu se odabirati u medijumu koji sadrži 6-tioguanin ili 8-azaguanin (kasnije u ovom tekstu skraćeno u 8AG) u vezi sa nedostatkom HGPRT ili 5'-bromodeoksiuridin u vezi sa nedostatkom TK. Normalne ćelije u takvom medijumu umiru jer u svoju DNK inkorporišu ove pirimidinske analoge. Nasuprot tome, ćelije sa nedostatkom ovog enzima mogu opstati u selektivnom medijumu jer ne mogu da inkorporišu pirimidinske analoge u sebe. Pored toga, selekcioni marker nazvan G418 rezistencija, daje, ćelijama, otpornost na 2-deoksistreptaminski antibiotik (analog gentamicina) preko gena za rezistenciju na neomicin. Različite ćelije mijeloma pogodne za ćelijsku fuziju poznate su u struci. Na primer, sledeće ćelije mijeloma mogu se koristiti u proizvodnji monoklonskog antitela za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama:

P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550),

P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519),

MPC-11 (Margulies. D. H. i sarad., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. i sarad., Nature (1978) 276, 269-270),

FO (de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21),

S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. i sarad., Nature (1979) 277, 131-133)

ili slično.

[0113] U osnovi, ćelijska fuzija imunocita sa ćelijama mijeloma izvodi se prema postupku poznatom u struci, na primer, prema postupku Kohler and Milstein i sarad. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

[0114] Konkretnije, fuzija ćelija može se izvesti, na primer, u uobičajenom hranljivom medijumu za kulturu, u prisustvu promotora fuzije ćelija. Na primer, kao promotor fuzije može se upotrebiti polietilen glikol (PEG) ili hemaglutinišući virus Japana (hemagglutinating virus of Japan, HVJ). Pored toga, mogu se dodati i pomoćne supstance kao što je dimetil sulfoksid, po želji, za povećanje efikasnosti fuzije.

[0115] Odnos između upotrebljenih imunocita i ćelija mijeloma može se postaviti arbitrarno. Na primer, poželjno je da se količina imunocita podesi na 1- do 10-struku količinu ćelija mijeloma. Na primer, RPMI1640 ili MEM medijum za kulturu podoban za rast ćelijske linije mijeloma kao i uobičajeni medijum za kulturu za ovu vrstu ćelijske kulture, mogu se koristiti u ćelijskoj fuziji kao medijumi za kulturu. Pored toga, rastvor dopunjen serumom (npr., fetalni serum teleta, fetal calf serum, FCS) može se dodati medijumu za kulturu.

[0116] Za ćelijsku fuziju, imunociti i ćelije mijeloma dobro se pomešaju u unapred određenim količinama u medijumu za kulturu, a zatim se pomešaju sa rastvorom PEG, prethodno zagrejanim na približno 37°C, da se formiraju fuzione ćelije (hibridomi) od interesa. U postupku fuzije ćelija, na primer, PEG prosečne molekulske mase reda 1000 do 6000 može se obično dodati u koncentraciji od 30 do 60% (tež./zapr.). Posle toga, odgovarajući medijum za kulturu čiji je primer naveden gore, redom se dodaje hibridomima, i mešavina se centrifugira, posle čega se uklanja supernatant. Ova procedura se ponavlja da bi se uklonila sredstva za fuziju ćelija ili slično što bi bilo nepovoljno za rast hibridoma.

[0117] Odabir tako dobijenih hibridoma može se vršiti upotrebom selektivnog medijuma za kulturu pogodnog za selekcioni marker ćelija mijeloma upotrebljenih u ćelijskoj fuziji. Na primer, ćelije koje imaju deficijenciju HGPRT ili TK mogu se odabrati kultivisanjem hibridoma u HAT medijumu za kulturu (medijum za kulturu koji sadrži hipoksantin, aminopterin, i timidin). Konkretno, kada se HAT-senzitivne ćelije mijeloma koriste u fiziji ćelija, samo ćelije koje su se uspešno fuzionisale sa normalnim ćelijama mogu rasti selektivno u HAT medijumu za kulturu. Kultura u kojoj se koristi HAT medijum za kulturu održava se dovoljno dugo da se ubiju ćelije (nefuzionisane ćelije) različite od hibridoma od interesa. Tačnije, da bi se izvršio odabir hibridoma od interesa, kultivacija će se obično izvoditi nekoliko dana do nekoliko nedelja. Posle toga, hibridomi koji proizvode antitelo od interesa mogu se pretražiti i klonirati kao pojedinačni klonovi uobičajenim postupkom kloniranja razblaživanjem.

[0118] Pretraživanje na antitela od interesa i kloniranje pojedinačnih klonova može se izvesti poželjni postupkom pretraživanja zasnovanim na reakciji antigen-antitelo, poznatoj u struci. Na primer, antigeni se vežu za nosač kao što su perlice napravljene od polistirena ili slično, ili komercijalno dostupna mikrotitarska ploča sa 96 bunarčića, i reaguju sa supernatantom kulture hibridoma. Posle toga, nosač se ispere i zatim reaguje sa sekundarnim antitelima obeleženim enzimom, ili slično. Kada supernatant kulture sadrži antitelo od interesa koje je reaktivno sa sensitizujućim antigenima, sekundarna antitela vezuju se za nosač preko tog antitela. Na kraju, sekundarna antitela vezana sa nosačem mogu da se detektuju kako bi se odredilo prisustvo antitela od interesa u supernatantu kulture. Hibridomi koji proizvode željeno antitelo sposobno da se vezuje za antigen mogu se klonirati postupkom kloniranja razblaživanjem ili slično. U ovoj pretrazi, DLL3 proteini upotrebljeni za imunizaciju ili DLL3 proteini suštinski identični sa njima mogu se upotrebiti poželjno kao antigeni. Na primer, ćelijske linije koje eksprimirjau DLL3, solubilni DLL3, ili slično mogu se upotrebiti kao antigeni.

[0119] Postupak opisan u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 03/104453 može se upotrebiti za proizvodnju antitela protiv humanog DLL3.

[0120] Pored toga, u dodatku postupku za dobijanje hibridoma imunizovanjem nehumanih životinja antigenima, humani limfociti mogu se senzitizovati antigenima da bi se dobilo antitelo od interesa. Konkretno, humani limfociti se prvo senzitizuju DLL3 proteinima in vitro. Posle toga se senzitizovani limfociti fuzionišu sa odgovarajućim fuzionim partnerima. Na primer, ćelije mijeloma poreklom iz ljudi, sposobne za deobu tokom čitavog svog života, mogu se upotrebiti kao fuzioni partneri (vidi Japansku patentnu objavu br.1-59878).

[0121] Pored toga, anti-DLL3 humano antitelo može se dobiti i primenom DLL3 proteina kao antigena kod transgenih nehumanih životinja koje imaju sve repertoare gena za humana antitela ili imunizovanjem nehumanih životinja korišćenjem DNK koja je konstruisana tako da eksprimira DLL3 u nehumanim životinjama. Ćelije koje proizvode antitelo, iz imunizovanih nehumanih životinja, mogu se imortalizovati tretmanom kao što je fuzija ćelija sa odgovarajućim fuzionim partnerom ili infekcija Epstein-Barr-ovim virusom. Iz tako dobijenih imortalizovanih ćelija mogu se izolovati humana antitela protiv DLL3 proteina (vidi Međunarodne objave br. WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918, i WO 94/02602). Pored toga, imortalizovane ćelije se takođe mogu klonirati kao ćelije koje proizvode antitela koja imaju reakcionu specifičnost od interesa. Kada se transgene nehumane životinje koriste kao imunizovane nehumane životinje, imunski sistemi nehumanih životinja prepoznaju humani DLL3 kao stran. Na taj način, lako se mogu dobiti humana antitela protiv humanog DLL3.

(5) Dobijanje monoklonskog antitela iz hibridoma

[0122] Hibridomi koji proizvode tako pripremljeno monoklonsko antitelo mogu se i subkultivisati u uobičajenom medijumu za kulturu. Pored toga, hibridomi se tokom dugog vremenskog perioda mogu držati uskladišteni u tečnom azotu.

[0123] Hibridomi se kultivišu prema uobičajenom postupku, i monoklonsko antitelo od interesa može se dobiti iz supernatanta njihove kulture. Alternativno, hibridomi se uvode u nehumane sisare koji su sa njima kompatibilni i rastu, a monoklonska antitela se mogu dobiti u vidu ascitne tečnosti. Prvi postupak je pogodan za dobijanje antitela visoke čistoće.

2. Prepremanje anti-DLL3 antitela pristupom genetičkog inženjerstva

(1) Kloniranje gena za antitelo

[0124] Antitelo se može pripremiti pristupom genetičkog inženjerstva, korišćenjem gena za antitelo kloniranih iz ćelija koje proizvode antitela. Klonirani geni antitela mogu se inkorporisati u odgovarajuće vektore i transformisanjem domaćina eksprimirati kao antitela. Postupci za izolovanje gena antitela, uvođenje u vektore, i transformisanje ćelija-domaćina već su uspostavljeni (vidi npr., Vandamme, A. M. i sarad., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775).

[0125] Na primer, cDNK koje kodiraju varijabilne regione anti-DLL3 antitela mogu se dobiti iz hibridoma ćelija koje proizvode anti-DLL3 antitelo. Za tu namenu, obično se prvo ukupne RNK ekstrahuju iz hibridoma. Na primer, za ekstrahovanje mRNK iz ćelija mogu se koristiti sledeći postupci:

● postupak ultracentrifugiranja posle izlaganja guanidinu (Chirgwin, J. M. i sarad., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), i

● AGPC postupak (Chomczynski, P. i sarad., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).

[0126] Ekstrahovane mRNK mogu se prečistiti korišćenjem kita za prečišćavanje mRNK – mRNA Purification kit (proizvođač GE Healthcare BioSciences Corp.) ili slično. Alternativno, kit za direktno ekstrahovanje ukupnih mRNK iz ćelija takođe je komercijalno dostupan, na primer QuickPrep mRNA Purification kit (proizvođač GE Healthcare BioSciences Corp.). Korišćenjem takvog kita, iz hibridoma se mogu dobiti ukupne mRNK. Iz dobijenih mRNK, korišćenjem reverzne transkriptaze mogu se sintetisati cDNK koje kodiraju varijabilne regione antitela. U ovoj proceduri, kao prajmeri mogu se uzeti arbitrarne sekvence duge 15 do 30 baza, odabrane između sekvenci zajedničkih za gene antitela. cDNK mogu se sintetisati korišćenjem kita za sintezu prvolančane cDNK sa AMV reverznom transkriptazom - AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (proizvođač Seikagaku Corp.) ili slično. Pored toga, 5'-Ampli FINDER RACE kit (proizvođač Clontech Laboratories, Inc.) i 5'-RACE PCR (Frohman, M. A. i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; i Belyavsky, A. i sarad., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) mogu se upotrebiti za sintezu i amplifikaciju cDNK. Pored toga, u toku takve sinteze cDNK, na oba kraja cDNK mogu se uvesti odgovarajuća mesta za delovanje restrikcionih enzima, opisana kasnije.

[0127] Iz dobijenih PCR proizvoda, fragmenti cDNK od interesa prečišćavaju se i zatim povezuju sa vektorskim DNK. Tako propremljeni rekombinantni vektori uvode se u E. coli ili slično. Posle odabira kolonija, željeni rekombinantni vektori mogu se pripremiti od E. coli koja je formirala koloniju. cDNK tada može da se sekvencira postupkom poznatim u struci, na primer, postupkom terminacije lanca dideoksinukleotidom.

[0128] Pored toga, za dobijanje gena koji kodiraju varijabilne regione antitela mogu se koristiti biblioteke cDNK. Prvo, cDNK se sintetišu uz korišćenje mRNK ekstrahovanih iz ćelija koje proizvode antitelo, kao templata, za dobijanje biblioteka cDNK. Komercijalno dostupni kit se pogodno koristi u sintezi biblioteka cDNK. Zapravo, mRNK se dobijaju iz samo malog broja ćelija, u veoma malim količinama. Prema tome, njihovo direktno prečišćavanje rezultuje malim prinosima. Zbog toga, obično im se dodaju nosačke RNK za koje je pokazano da ne sadrže gene antitela, posle čega sledi prečišćavanje mRNK. Alternativno, kada RNK mogu da se ekstrahuju u datim količinama iz ćelija koje proizvode antitelo, efikasna ekstrakcija se može postići bez korišćenja nosačkih RNK. Dodavanje nosačkih RNK ne mora biti potrebno za ekstrahovanje RNK iz, na primer, 10 ili više, ili 30 ili više, poželjno 50 ili više ćelija koje proizvode antitelo.

[0129] Geni za antitela amplifikuju se korišćenjem PCR sa dobijenim bibliotekama cDNK kao templatima. Prajmeri za PCR amplifikaciju gena za antitela poznati su u struci. Na primer, prajmeri za amplifikaciju gena za humana antitela mogu se dizajnirati na osnovu objave članka (J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597) ili slično. Ovi prajmeri imaju nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje na bazi potklase imunoglobulina. Tako, kada se biblioteke cDNK čija je potklasa nepoznata koriste kao templati, PCR se izvodi odabirom prajmera uz uzimanje u obzir svake mogućnosti.

[0130] Konkretno, na primer, u svrhu dobijanja gena koji kodiraju IgG čoveka, mogu se koristiti prajmeri sposobni da amplifikuju svaki od gena koji kodiraju γ1 do γ4 teške lance i κ i λ lake lance. Prajmeri koji se komplementarno sparuju sa delom koji odgovara regionu šarke obično se koriste kao 3' prajmeri za amplifikovanje gena za varijabilni region IgG. Sa druge strane, kao 5' prajmeri mogu se koristiti prajmeri pogodni za svaku potklasu.

[0131] PCR proizvodi dobijeni od prajmera za amplifikaciju gena za ove potklase teškog i lakog lanca pripremaju se kao odgovarajuće nezavisne biblioteke. Tako sintetisane biblioteke mogu se koristiti za preoblikovanje imunoglobulina koji uključuju teške i lake lance u kombinaciji. Pretraživanje za antitelo od interesa može se vršiti prema vezujućim aktivnostima preoblikovanih imunoglobulina za DLL3, kao indeksom.

(2) Introdukovanje gena antitela u ćeliju-domaćina

[0132] Za proizvodnju anti-DLL3 antitela, klonirani geni antitela mogu se inkorporisati u ekspresione vektore tako da se ti geni eksprimiraju pod kontrolom kontrolnih regiona ekspresije. Kontrolni regioni ekspresije za ekspresiju antitela obuhvataju, na primer, enhensere i promotore. Posle toga, pogodne ćelije-domaćini mogu se transformisati ovim ekspresionim vektorima da bi se dobile rekombinantne ćelije koje eksprimiraju DNK koja kodira anti-DLL3 antitelo.

[0133] Za ekspresiju gena antitela, DNK koje kodiraju teške lance i lake lance mogu se odvojeno inkorporisati u različite ekspresione vektore. Ista ćelija-domaćin može se kotransfektovati vektorima u koje su inkorporisani teški lanac i laki lanac, čime se omogućava ekspresija molekula antitela koje sadrži teške i lake lance. Alternativno, DNK koje kodiraju teške lance i lake lance mogu se inkorporisati u jedan ekspresioni vektor kojim se transformišu ćelije-domaćini (vidi Međunarodnu objavu br. WO 94/11523).

[0134] Mnoge kombinacije domaćina i ekspresionih vektora poznate su u struci za uvođenje gena za antitela u odgovarajuće domaćine i pripremanje antitela. Mogu se primeniti svi ti ekspresioni sistemi. Kada se eukariotske ćelije koriste kao domaćini, mogu se koristiti ćelije životinje, biljke, ili gljive. Konkretno, primeri životinjskih ćelija koje se mogu koristiti mogu uključivati sledeće ćelije:

i) ćelije sisara kao što su CHO, COS, mijeloma, BHK (bubreg novorođenog hrčka), Hela, Vero, HEK293, Ba/F3, HL-60, Jurkat, i SK-HEP1 ćelije;

ii) ćelije vodozemaca kao što su oocite Xenopus; i

iii) ćelije insekta kao što su: sf9, sf21, i Tn5 ćelije.

[0135] Za ćelije biljaka, sistemi za ekspresiju gena antitela poznati su u struci, i uključuju ćelije izvedene iz roda Nicotiana (npr., Nicotiana tabacum). Ćelije kalusa u kulturi mogu se koristiti u transformisanju biljnih ćelija.

[0136] Pored toga, sledeće ćelije mogu se koristiti kao ćelije gljiva: ćelije poreklom iz kvasaca kao što je rod Saccharomyces (npr., Saccharomyces cerevisiae) i filamentoznih gljiva roda Pichia (npr., Pichia pastoris), i ćelije izvedene iz roda Aspergillus (npr., Aspergillus niger).

[0137] Alternativno, sistemi za ekspresiju gena antitela u kojima se koriste prokariotske ćelije takođe su poznati u struci. Na primer, kada se koriste bakterijske ćelije, mogu se koristiti bakterijske ćelije izvedene iz E. coli, Bacillus subtilis, ili slično.

[0138] Za ekspresiju gena uz korišćenje sisarskih ćelija, korisni rutinski upotrebljavani promotor, gen za antitelo, koji će se eksprimirati i poli-A signal lociran na 3'-nizvodno od njega mogu se funkcionalno povezati. Primeri promotora/pojačivača mogu uključiti neposredni rani promotor/ pojačivač humanog citomegalovirusa.

[0139] Pored toga, na primer, u ekspresiji antitela mogu se koristiti virusni promotori/pojačivači ili promotori/pojačivači poreklom iz ćelija sisara (npr., humani faktor elongacije 1α (human elongation factor 1α, HEF1α)). Primeri virusa čiji se promotori/pojačivači mogu koristiti, konkretno mogu uključiti retrovirus, poliomavirus, adenovirus, i simijan virus 40 (SV40).

[0140] Promotor/enhenser SV40 može se koristiti u skladu sa postupkom Mulligan i sarad. (Nature (1979) 277, 108). Pored toga, HEF1α promotor/enhenser može se lako upotrebiti u ekspresiji gena od interesa prema postupku Mizushima i sarad. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

[0141] Kada se antitela proizvode korišćenjem životinjskih ćelija, signalna sekvenca gena za teški ili laki lanac antitela se poželjno koristi kao signalna sekvenca potrebna za sekreciju iz ćelije. Pored toga, može se upotrebiti signalna sekvenca sekretornog proteina, na primer IL-3 ili IL-6.

[0142] Za ekspresiju gena korišćenjem E. coli, korisni rutinski upotrebljavani promotor, signalna sekvenca za sekreciju antitela, i gen antitela koji će se eksprimirati mogu da se povežu funkcionalno. Primeri promotora mogu uključiti lacZ i araB promotore. lacZ promotor može da se koristi u skladu sa postupkom Ward i sarad. (Nature (1989) 341, 544-546; i FASEBJ. (1992) 6, 2422-2427). Alternativno, araB promotor može da se koristi za eksprimiranje gena od interesa prema postupku Better i sarad. (Science (1988) 240, 1041-1043).

[0143] Kada se antitela proizvedu u periplazmi E. coli, pelB signalna sekvenca (Lei, S. P. i sarad., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) može da se upotrebi za sekreciju antitela. Zatim se antitela proizvedena u periplazmi izdvajaju i zatim ponovo nabiraju uz korišćenje sredstava za denaturaciju proteina kao što su urea i guanidin hidrohlorid, tako da dobijena antitela imaju željenu aktivnost vezivanja.

[0144] Mesto početka replikacije izvedeno iz SV40, poliomavirusa, adenovirusa, goveđeg papilomavirusa (bovine papillomavirus, BPV), ili slično, mogu se insertovati u ekspresione vektore. Pored toga, selekcioni marker može se insertovati u ekspresione vektore da bi se povećao broj kopija gena u sistemima ćelija-domaćina. Konkretno, mogu se upotrebiti selekcioni markeri kao što su aminoglikozid fosfotransferazni (aminoglycoside phosphotransferase APH) gen, timidin kinazni (thymidine kinase, TK) gen, E. coli ksantin-guanin fosforiboziltransferazni (E. coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, Ecogpt) gen, i dihidrofolat reduktazni (dihydrofolate reductase, dhfr) gen.

(3) Dobijanje antitela iz ćelije-domaćina

[0145] Ćelije-domaćini se transformišu ovim ekspresionim vektorima, i transformisane ćelijedomaćini se zatim kultivišu in vitro ili in vivo da bi proizvele antitelo od interesa. Kultivacija ćelija-domaćina izvodi se u skladu sa postupkom poznatim u struci. Na primer, može se koristiti DMEM, MEM, RPMI1640, ili IMDM medijum za kulturu i može se koristiti u kombinaciji sa rastvoro koji je dopunjen serumom kao što je fetalni serum teleta (FCS).

[0146] Tako eksprimirana i proizvedena antitela mogu se prečistiti korišćenjem uobičajenih postupaka prečišćavanja proteina poznatih u struci, pojedinačnih ili u odgovarajućoj kombinaciji. Na primer, afinitetna ili hromatografija na kolonama (npr., protein A-kolone), filteri, ultrafiltracija, isoljavanje i dijaliza mogu se odabrati i kombinovati na odgovarajući način kako bi se antitela izdvojila i prečistila (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

3. Proizvodnja antitela uz korišćenje transgene nehumane životinje

[0147] Pored ćelija-domaćina, transgene nehumane životinje takođe mogu da se koriste u proizvodnji rekombinantnog antitela. Konkretno, antitelo od interesa može da se dobije iz nehumanih životinja transfektovanih genima koji kodiraju to antitelo od interesa. Na primer, može se izvršiti insertovanje gena antitela u okviru ("in frame") u gene koji kodiraju proteine specifično proizvedene u mleku da bi se konstruisali fuzioni geni. Na primer, kao protein koji se sekretuje u mleku može da se upotrebi kozji β kazein. DNK fragmenti koji sadrže fuzione gene koji imaju insertovan gen antitela injektiraju se u kozje embrione, koji se zatim unesu u koze. Iz mleka koje proizvode transgene koze (ili njihovo potomstvo), dobijenog od koza koje su bile primaoci embriona, može se dobiti željeno antitelo u vidu fuzionog proteina sa proteinom mleka. Pored toga, kod transgenih koza, hormon može da se upotrebi na odgovarajući način da bi se povećala količina mleka koje sadrži željeno antitelo koje proizvode transgene koze (Ebert, K. M. i sarad., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Farmaceutska kompozicija

[0148] S obzirom na to da se DLL3 visoko eksprimira u tkivima sitnoćelijskog kancera pluća, anti-DLL3 antitelo ima citotoksičnu aktivnost specifičnu za kancerske ćelije. Anti-DLL3 antitelo je dakle korisno za lečenje kancera pluća koji eksprimira DLL3.

[0149] Izraz "kao aktivni sastojak sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3" znači da sadrži anti-DLL3 antitelo kao glavni aktivni sastojak i ne ograničava sadržaj anti-DLL3 antitela.

[0150] Farmaceutska kompozicija kao aktivni sastojak može sadržati anti-DLL3 antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom. Ova farmaceutska kompozicija može da se koristi, na primer, kao inhibitor ćelijskog rasta, posebno, kao antikancersko sredstvo. Poželjno, inhibitor ćelijskog rasta i antikancersko sredstvo primenjuju se kod subjekta koji ima kancer ili je moguće da ima kancer.

[0151] Izraz "kao aktivni sastojak sadrži anti-DLL3 antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom", kako se ovde koristi, znači da kao glavni aktivni sastojak sadrži anti-DLL3 antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom i ne ograničava sadržaj anti-DLL3 antitela konjugovanog sa citotoksičnom supstancom.

[0152] Farmaceutska kompozicija je za upotrebu u lečenju sitnoćelijskog kancera pluća. Kancer može biti bilo koji od primarnih fokusa ili metastatskih fokusa.

[0153] Farmaceutska kompozicija se kod pacijenta može primeniti oralno ili parenteralno. Poželjna je parenteralna primena. Specifični primeri postupaka takve primene uključuju injekcionu, transnazalnu, pulmonalnu, i transdermalnu primenu. Primeri primene injekcijom uključuju intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, i supkutanu injekciju, kojima se farmaceutska kompozicija može primenjivati sistemski ili lokalno. Pored toga, postupak primene može se pogodno odabrati u skladu sa pacijentovom starošću ili simptomima. Doza farmaceutske kompozicije može se odabrati u okviru doznog opsega od, na primer, 0.0001 mg do 1000 mg po kg telesne mase, po doziranju. Alternativno, doza se može odabrati u okviru opsega od, na primer, 0.001 do 100000 mg po površini tela. Međutim, farmaceutska kompozicija nije ograničena na ove doze.

[0154] Farmaceutska kompozicija može da se formuliše prema standardnom postupku (npr., Remington's Pharmaceutical Science, poslednje izdanje, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A) i može dodatno sadržati farmaceutski prihvatljive nosače ili aditive. Njihovi primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na surfaktante, ekscipijense, sredstva za bojenje, sredstva za davanje ukusa, konzervanse, stabilizatore, pufere, suspendujuća sredstva, tonična sredstva, vezujuća sredstva, dezintegrante, lubrikanse, promotore protočnosti, i korigense. Drugi rutinski upotrebljavani nosači mogu se koristiti na odgovarajući način. Specifični primeri nosača mogu uključiti laku anhidrovanu silicijumovu kiselinu, laktozu, kristalnu celulozu, manitol, skrob, karmelozu kalcijum, karmelozu natrijum, hidroksipropilcelulozu, hidroksipropilmetilcelulozu, polivinil acetal dietilaminoacetat, polivinil pirolidon, želatin, triglicerid masnih kiselina srednje dužine lanca, polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje 60, beli šećer, karboksimetilcelulozu, kukuruzni skrob, i neorganske soli.

[0155] Posle kontakta sa DLL3-eksprimirajućim ćelijama, anti-DLL3 antitelo može oštetiti DLL3-eksprimirajuće ćelije ili inhibirati njihov rast. Upotrebljeno antitelo nije posebno ograničeno, i, na primer, može se upotrebiti bilo koje od antitela opisanih ranije u ovom tekstu. Ćelije za koje se vezuje anti-DLL3 antitelo nisu posebno ograničene sve dok ćelije eksprimiraju DLL3. DLL3-eksprimirajuće ćelije su poželjno kancerske ćelije, poželjnije ćelije kancera pluća, posebno poželjno ćelije sitnoćelijskog kancera pluća.

[0156] "Kontakt" se izvodi, na primer, dodavanjem antitela u medijum za kulturu DLL3-eksprimirajućih ćelija kultivisanih in vitro. "Kontakt" se izvodi i davanjem anti-DLL3 antitela nehumanim životinjama kojima su u njihovo telo implantirane DLL3-eksprimirajuće ćelije ili životinjama koje endogeno imaju kancerske ćelije koje eksprimiraju DLL3.

[0157] Postupci prikazani u nastavku ovog teksta se poželjno koriste za evaluaciju ili određivanje citotoksičnosti izazvane u DLL3-eksprimirajućim ćelijama kontaktom sa anti-DLL3 antitelom. Primeri postupaka za evaluiranje ili određivanje citotoksične aktivnosti in vitro mogu uključivati testove ADCC ili CDC aktivnosti opisane ranije u ovom tekstu. Da li anti-DLL3 antitelo ima ili nema ADCC aktivnost ili CDC aktivnost može se odrediti postupkom poznatim u struci (npr., Current protocols in Immunology, poglavlje 7. Immunologic studies in humans, urednik, John E, Coligan i sarad., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). U testu aktivnosti, antitela koja imaju izotip identičan sa izotipom anti-DLL3 antitela, a ne vezuju se za ćelije, koriste se kao kontrolna antitela na isti način kao anti-DLL3 antitelo. Kada anti-DLL3 antitelo ispoljava jaču citotoksičnu aktivnost od one kontrolnih antitela, može se odrediti da anti-DLL3 antitelo ima aktivnost.

[0158] Izotip antitela definiše se na osnovu sekvence konstantnog regiona teškog lanca u aminokiselinskoj sekvenci tog antitela. Izotip antitela konačno se određuje u zavisnosti od zamene klase izazvane genetičkom rekombinacijom na hromozomu tokom maturacije B ćelija koje proizvode antitelo, in vivo. Razlika u izotipu odražava razliku između fizioloških/patoloških funkcija antitela. Konkretno, poznato je, na primer, da na snagu citotoksične aktivnosti utiču ne samo nivoi ekspresije antigena nego i izotip antitela. Prilikom testiranja citotoksične aktivnosti, opisanog ranije u ovom tekstu, dakle, poželjno je da antitela upotrebljena kao kontrole budu istog izotipa kao analitsko antitelo.

[0159] Pored toga, za evaluiranje ili određivanje citotoksične aktivnosti in vivo, na primer, DLL3-eksprimirajuće kancerske ćelije se intradermalno ili supkutano transplantiraju u nehumane životinje za ispitivanje. Zatim im se analitsko antitelo daje intravenski ili intraperitonealno, na dnevnoj bazi ili u intervalima od nekoliko dana, od dana davanja ili sledećeg dana. Citotoksična aktivnost može se odrediti merenjem veličine tumora tokom vremena. Kontrolna antitela sa identičnim izotipom kao analitsko antitelo, daju se na isti način u evaluaciji in vitro. Kada grupa kod koje je primenjeno anti-DLL3 antitelo ima značajno manju veličinu tumora od grupe kod koje je administrirano kontrolno antitelo, može se odrediti da anti-DLL3 antitelo ima citotoksičnu aktivnost. Kada se kao nehumane životinje za ispitivanje koriste miševi, poželjno mogu da se koriste "nude" (nu/nu) miševi kojima genetički nedostaje grudna žlezda, tako da im nedostaju funkcije T limfocita. Upotreba ovih miševa može isključiti učešće endogenih T limfocita nehumanih životinja za ispitivanje u evaluaciji/određivanju citotoksične aktivnosti primenjenih antitela.

Dijagnostički lek (dijagnostički postupak) - nije deo pronalaska za koji se traži zaštita

[0160] Ovde se pominje i postupak za dijagnostikovanje kancera, koji uključuje detektovanje DLL3 proteina ili gena koji kodira DLL3 protein. Bilo je potvrđeno da je ekspresija DLL3 upadljivo povećana u kancerskim tkivima ili kancerskim ćelijskim linijama. Prema tome, DLL3 je koristan kao marker za specifičnu detekciju kancera.

[0161] Jedan specifičan primer dijagnostičkog postupka može uključiti postupak za dijagnozu kancera, koji uključuje sledeće korake:

(a) obezbeđivanje uzorka izolovanog iz subjekta za ispitivanje; i

(b) detektovanje nivoa ekspresije DLL3 proteina ili DLL3 gena u uzorku.

[0162] Postupak može uključivati još i korak (c) evaluiranja mogućnosti da subjekat za ispitivanje ima kancer, na bazi nivoa ekspresije DLL3 proteina ili DLL3 gena.

Detekcija DLL3 proteina ili gena koji kodira DLL3 protein

[0163] Isto tako, objavljen je, ali ne formira deo pronalaska za koji se traži zaštita, postupak u kojem se kancerske ćelije dijagnostikuju detektovanjem DLL3 proteina u uzorku. Poželjno je da se detekcija DLL3 proteina izvodi korišćenjem antitela koje prepoznaje DLL3 protein.

[0164] Detekcija obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. Primeri kvalitativne detekcije mogu uključivati sledeće testove:

● test za jednostavno određivanje prisustva ili odsustva DLL3 proteina,

● test za određivanje prisustva ili odsustva veće od unapred određene količine DLL3 proteina, i

● test za upoređivanje količine sadržanog DLL3 proteina sa onom u drugom uzorku (npr., kontrolnom uzorku).

[0165] Sa druge strane, primeri kvantitativne detekcije mogu uključiti merenje koncentracije DLL3 proteina i merenje količine DLL3 proteina.

[0166] Uzorak za ispitivanje nije posebno ograničen sve dok je verovatno da uzorak sadrži DLL3 protein. Konkretno, poželjni su uzorci sakupljeni iz živih tela kao što su sisari. Poželjniji su uzorci sakupljeni iz ljudi. Specifični primeri uzorka za ispitivanje mogu uključiti krv, intersicijalnu tečnost, plazmu, ekstravaskularnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, sinovijalnu tečnost, pleuralnu tečnost, serum, limfu, salivu, urin, i tkiva. Uzorak je poželjno uzorak dobijen iz uzorka za ispitivanje, kao što je preparat u kojem su tkiva ili ćelije sakupljene iz živog tela fiksirani, ili je to medijum ćelijske kulture.

[0167] Dijagnostikovani kancer može biti bilo koji kancer bez posebnih ograničavanja. Specifični primeri kancera mogu uključiti kancer pluća, posebno sitnoćelijski kancer pluća. Može se dijagnostikovati bilo koji od primarnih fokusa i metastatskih fokusa ovih kancera.

[0168] Kada se u uzorku za ispitivanje detektuje protein, kancer se dijagnostikuje sa svojim nivoom kao indeksom. Konkretno, kada je količina DLL3 proteina detektovana u uzorku za ispitivanje veća od količine u negativnoj kontroli ili zdravoj individui, pokazano je da subjekt za ispitivanje ima kancer ili ima veliku verovatnoću da će imati kancer u budućnosti. Konkretno, takođe je objavljen, ali ne čini deo pronalaska za koji se traži zaštita, postupak za dijagnostikovanje kancera, koji uključuje sledeće korake:

(1) detektovanje nivoa ekspresije DLL3 u biološkom uzorku sakupljenom iz subjekta za ispitivanje, i

(2) upoređivanje nivoa ekspresije DLL3 detektovanog u koraku (1) sa onim u kontroli, pri čemu, kada je nivo ekspresije DLL3 viši od onog u kontroli, određeno je da subjekt za ispitivanje ima kancer.

[0169] Kontrola se odnosi na referentni uzorak za upoređivanje i obuhvata negativne kontrole i biološke uzorke zdravih individua. Negativne kontrole mogu da se dobiju sakupljanjem bioloških uzoraka zdravih individua i njihovim mešanjem, ako je potrebno. Nivo ekspresije DLL3 u kontroli može se detektovati paralelno sa detekcijom nivoa ekspresije DLL3 u biološkom uzorku subjekta za ispitivanje. Alternativno, nivo ekspresije DLL3 u velikom broju bioloških uzoraka zdravih individua može se detektovati unapred da bi se statistički odredio standardni nivo ekspresije kod zdravih individua. Konkretno, na primer, kao standardna vrednost može se upotrebiti srednja vrednost ± 2 × standardna devijacija (S.D.) ili srednja vrednost ± 3 × standardna devijacija (S.D.). Statistički, srednja vrednost ± 2 × standardna devijacija (S.D.) i srednja vrednost ± 3 × standardna devijacija (S.D.) uključuju vrednosti kod 80%, odnosno 90% zdravih individua.

[0170] Alternativno, nivo ekspresije DLL3 u kontroli može se postaviti korišćenjem ROC krive. ROC kriva, ili karakteristična kriva primaoca (receiver operating characteristic curve), je grafikon koji na ordinati prikazuje senzitivnost detekcije, a na apscisi stope lažne pozitivnosti (tj., "1-specifičnost"). ROC kriva se može dobiti grafičkim unošenjem promena senzitivnosti i stope lažne pozitivnosti u nizu različitih referentnih vrednosti za odeđivanje nivoa ekspresije DLL3 u biološkim uzorcima.

[0171] "Referentna vrednost" za dobijanje ROC krive je numerička vrednost koja se privremeno koristi za statističku analizu. Uopšteno govoreći, "referentna vrednost" za dobijanje ROC krive serijski varira u opsegu koji može pokriti sve selektabilne referentne vrednosti. Na primer, referentna vrednost može varirati između minimalne i maksimalne izmerene vrednosti DLL3 u populaciji koju treba analizirati.

[0172] Standardna vrednost za koju se može očekivati da ponudi željenu senzitivnost detekcije i preciznost, može se odabrati na osnovu dobijene ROC krive. Statistički postavljena standardna vrednost bazirana na ROC krivoj ili slično naziva se i granična vrednost. U postupku za detektovanje kancera na bazi granične vrednosti, korak (2) opisan ranije u ovom tekstu uključuje upoređivanje nivoa ekspresije DLL3 detektovanog u koraku (1), sa graničnom vrednošću. U tom slučju, kada je nivo ekspresije DLL3 detektovan u koraku (1) viši od granične vrednosti, kod subjekta za ispitivanje je detektovan kancer.

[0173] Nivo ekspresije DLL3 može se odrediti arbitrarnim postupkom. Konkretno, nivo ekspresije DLL3 može se odrediti evaluacijom količine DLL3 mRNK, količine DLL3 proteina, ili biološkom aktivnošću DLL3 proteina. Količina DLL3 mRNK ili proteina može se odrediti postupkom opisanim u ovoj specifikaciji.

[0174] Kada se nehumana životinja koristi kao subjekt za ispitivanje, DLL3 protein koji će se detektovati poreklom je iz te životinjske vrste.

[0175] Postupak za detektovanje DLL3 proteina sadržanog u uzorku za ispitivanje nije posebno ograničen i poželjno je postupak imunološke detekcije uz korišćenje anti-DLL3 antitela, kako je kao primer prikazano u nastavku:

enzimski vezani imunoapsorbujući test (ELISA),

radioimunoesej (RIA),

enzimski imunotest (EIA),

fluoroimunotest (FIA),

luminescentni imunotest (luminescent immunoassay, LIA),

imunoprecipitacija (immunoprecipitation, IP),

turbidimetrijski imunotest (turbidimetric immunoassay, TIA),

Western blotting (WB),

imunohistohemijski metod (immunohistochemical (IHC) method),

pojedinačna radijalna imunodifuzija (single radial immunodiffusion, SRID),

dot blot, i

slot blot.

[0176] Među ovim pristupima, poželjan imunološki postupak za ispitivanje za dijagnostikovanje kancera je imunohistohemijski (IHC) metod, koji uključuje korak detektovanja DLL3 proteina na presecima na kojima su fiksirani tkiva ili ćelije dobijeni od pacijenta koji ima kancer. Imunološki postupci opisani ranije u ovom tekstu, kao što je imunohistohemijski (IHC) metod, opšte su poznati stručnjacima u oblasti.

[0177] Pošto je DLL3 membranski protein čija je ekspresija pojačana na način specifičan za kancer, kancerske ćelije ili kancerska tkiva mogu se detektovati korišćenjem anti-DLL3 antitela. Kancerske ćelije koje se nalaze među ćelijama ili tkivima sakupljenim iz živih tela detektuju se imunohistološkom analizom.

[0178] Kancerska tkiva mogu se detektovati i in vivo korišćenjem anti-DLL3 antitela. Ovaj postupak specifično uključuje korake: (1) davanje, subjektu za ispitivanje, obeležavajućeg materijala (npr., radioizotopski)-obeleženog antitela koje se vezuje za DLL3 protein; i (2) detektovanje akumulacije obeležavajućeg materijala. Antitelo se može detektabilno obeležiti da bi se pratilo antitelo uneto u živo telo. Na primer, antitelo se može obeležiti fluorescentnim ili luminescentnim materijalom ili radioizotopom, i može se pratiti njegovo in vivo ponašanje. Antitelo obeleženo fluorescentnim ili luminescentnim materijalom može se uočiti korišćenjem endoskopa ili peritoneoskopa. Slika lokalizacije antitela može se dobiti praćenjem radioaktivnosti radioizotopa. In vivo localizacija anti-DLL3 antitela reprezentuje prisustvo kancerskih ćelija.

[0179] Pozitron-emitujući nuklid može se upotrebiti kao radioizotop za obeležavanje antitela za in vivo detekciju kancera. Na primer, antitelo se može obeležiti pozitron-emitujućim nuklidom, na primer 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr, i 1241. Za obeležavanje anti-DLL3 antitela ovim pozitron-emitujućim nuklidima može se koristiti postupak poznat u struci (Acta Oncol.32, 825-830, 1993).

[0180] Anti-DLL3 antitelo obeleženo pozitron-emitujućim nuklidom primeni se kod ljudi ili životinja. Posle toga radionuklid emituje radijaciju koja se neinvazivno meri korišćenjem PET (positron emission tomograph, pozitron-emisioni tomograf) i konvertuje u sliku pristupom kompjuterizovane tomografije. PET aparat namenjen je neinvazivnom dobijanju podataka o in vivo ponašanju leka ili slično. PET može kvantitativno prikazati intenzitet radijacije kao intenzitet signala. Takvom upotrebom PET, molekuli antigena visoko eksprimiranog u određenom kanceru mogu se detektovati bez uzimanja uzorka od pacijenata. Pored gore opisanih nuklida, anti-DLL3 antitelo može se radioaktivno obeležiti kratkoživećim nuklidom, korišćenjem pozitron-emitujućeg nuklida kao 11C, 13N, 15O, 18F, i 45Ti.

[0181] Istraživanja i razvoj bave se, na primer, tehnikama proizvodnje kratkoživećih nuklida korišćenjem medicinskog ciklotrona i nuklida opisanih gore ili proizvodnje kratkoživećih radioobeležavajućih jedinjenja. Ove tehnike omogućavaju obeležavanje anti-DLL3 antitela različitim radioizotopima. Anti-DLL3 antitelo dato pacijentima akumulira se u primarnim fokusima i metastatskim fokusima, u skladu sa specifičnošću anti-DLL3 antitela za patološko tkivo na svakom od mesta. Kada je anti-DLL3 antitelo obeleženo pozitron-emitujućim nuklidom, može se detektovati njegova radioaktivnost, da bi se zatim na osnovu lokalizacije radioaktivnosti detektovalo prisustvo primarnih fokusa i metastatskih fokusa. Aktivna vrednost gama radijacije ili emisije pozitrona od 25 do 4000 keV može se na odgovarajući način koristiti u dijagnostici. Pored toga, terapijski efekat može se očekivati odabirom odgovarajućeg nuklida i primenom odabranog nuklida u većim količinama. Nuklid koji obezbeđuje vrednost gama radijacije ili emisije pozitrona od 70 do 700 keV može se koristiti za dobijanje antikancerskog efekta pripisanog radijaciji.

Detekcija polinukleotida koji kodiraju DLL3 protein

[0182] Moguće je detektovati ekspresiju polinukleotida za DLL3. Detektovani polinukleotid nije posebno ograničen i poželjno to je mRNK. Detekcija obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. Primeri kvalitativne detekcije mogu uključivati sledeće procedure za ispitivanje:

● test za jednostavno određivanje prisustva ili odsustva DLL3 mRNK,

● test za određivanje prisustva ili odsustva veće od unapred određene količine DLL3 mRNK, i

● test za upoređivanje količine DLL3 mRNK sa onom u drugom uzorku (npr., kontrolnom uzorku).

[0183] Sa druge strane, primeri kvantitativne detekcije mogu uključiti merenje koncentracije DLL3 mRNK i merenje količine DLL3 mRNK.

[0184] Kao uzorak za ispitivanje može se upotrebiti arbitrarni uzorak za koji je verovatno da sadrži DLL3 mRNK. Poželjni su uzorci sakupljeni iz živih tela kao što su tela sisara. Uzorci sakupljeni iz ljudi su poželjniji. Specifični primeri uzorka za ispitivanje mogu uključiti krv, intersicijalnu tečnost, plazmu, ekstravaskularnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, sinovijalnu tečnost, pleuralnu tečnost, serum, limfu, salivu, urin, i tkiva. Uzorak je poželjno uzorak dobijen iz uzorka za ispitivanje, kao što je preparat u kojem su tkiva ili ćelije sakupljeni iz živog tela fiksirani, ili je to medijum kulture ćelija. Ovi uzorci obuhvaćeni su pojmom uzorak za ispitivanje.

[0185] In situ hibridizacija se poželjno koristi za uzorak dobijen iz uzorka za ispitivanje, kao što je preparat u kojem su tkiva ili ćelije sakupljene iz živog tela fiksirani, ili medijum kulture ćelija. In situ hibridizacija razvijena je kao pristup za utvrđivanje prisustva ili odsustva ili distribucije određene DNK ili RNK u ćelijama ili tkivima, i jačine njihove ekspresije. U postupku se koriste principi prema kojima nukleinskokiselinska proba koja ima nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa određenom unutarćelijskom sekvencom nukleinske kiseline, ima svojstvo da specifično formira kompleks. Proba se unapred obeleži radioizotopom (RI), antigenskom supstancom (hapten), ili slično. Kao rezultat, mesto hibridizacije može se razlikovati preko detektovanja obeleživača. Na taj način, in situ hibridizacija se koristi, na primer, u detekciji unutarćelijske DNK ili RNK, ili slično. Poželjno, RI može se upotrebiti za obeležavanje probe. Na primer, poželjnije može se koristiti fluorescentno obeležavanje neradioaktivnom supstancom kao što je biotin ili hapten (npr., digoksigenin). Na primer, posebno je poželjno koristiti postupak detekcije fluorescentnom in situ hibridizacijom, nazvanom FISH.

[0186] Dijagnostikovani kancer može uključiti kancer pluća, posebno, sitnoćelijski kancer pluća. Mogu se dijagnostikovati svi primarni fokusi i metastatski fokusi ovih kancera.

[0187] Kao subjekt za ispitivanje može se upotrebiti arbitrarna nehumana životinjska vrsta koja eksprimira DLL3 gen. Subjekat za ispitivanje je posebno poželjno čovek. Kada se nehumana životinjska vrsta koristi kao subjekt za ispitivanje, DLL3 gen koji treba da se detektuje poreklom je iz te životinjske vrste.

[0188] U nastavku teksta biće opisan specifičan aspekt postupka detekcije. Najpre se iz subjekta za ispitivanje pripremi uzorak. Posle toga, detektuje se DLL3 mRNK sadržana u uzorku. U postupku, može se detektovati i cDNK sintetisana na osnovu mRNK. Kada se DLL3 mRNK ili DLL3-kodirajuća cDNK detektuje u uzorku za ispitivanje, dijagnostikuje se da je moguće da subjekt za ispitivanje ima kancer. Na primer, kada je količina DLL3 mRNK ili DLL3-kodirajuće cDNK detektovana u uzorku za ispitivanje, veća od one kod negativne kontrole ili zdravih individua, znači da subjekt za ispitivanje ima kancer ili da postoji visoka mogućnost da će u budućnosti imati kancer.

[0189] Postupak za detektovanje mRNK poznat je u struci. Specifični primeri postupaka koji se mogu koristiti uključuju: hibridizaciju nukleinskih kiselina korišćenjem uzoraka imobilisanih na čvrstoj fazi koja se bira između genskih čipova, cDNK nizova, i membranskih filtera; RT-PCR; PCR u realnom vremenu; postupak oduzimanja; postupak diferencijalnog prikazivanja; diferencijalna hibridizacija; i ukrštena hibridizacija.

[0190] Postupak za detektovanje može se automatizovati korišćenjem različitih automatskih detektora. Takvom automatizacijom postiže se detekcija velikog broja uzoraka za kratko vreme.

Kit za dijagnostikovanje kancera - nije deo pronalaska

[0191] Opisan je i dijagnostički lek ili kit za dijagostikovanje kancera, koji sadrži reagens za detektovanje DLL3 proteina u uzorku za ispitivanje. Dijagnostički lek sadrži bar anti-DLL3 antitelo.

[0192] Za pripremanje kita za dijagnostikovanje kancera, reagens za dijagnostikovanje kancera može se kombinovati sa drugim faktorima upotrebljenim u detekciji DLL3. Konkretno, opisan je i kit za dijagnostikovanje kancera, koji sadrži: antitelo koje se vezuje za DLL3; i reagens za detektovanje vezivanja antitela za DLL3, a može sadržati još i kontrolni uzorak sa DLL3. U kit može biti uključen i priručnik sa uputstvima za obavljanje procedura testa.

Primeri

[0193] U nastavku ovog teksta, predmetni pronalazak biće opisan konkretnije uz pozivanje na Primere.

[Primer 1] Povišena transkripcija DLL3 (delta-sličan 3) u sitnoćelijskom kanceru pluća

[0194] Distribucija genske ekspresije mRNK za humani DLL3 u kliničkim kancerima, kancerskim ćelijskim linijama, i različitim normalnim organima analizirana je korišćenjem Human Exon 1.0 ST čipa (Affymetrix, Inc.). U analizi ekspresije, ukupne korišćene RNK bile su iz tumorskih mesta izolovanih iz 13 slučajeva izolovanog tkiva sitnoćelijskog kancera pluća, 3 tipa ćelijskih linija sitnoćelijskog kancera, i 49 tipova normalnih tkiva (kupljeno od Clontech Laboratories, Inc., Ambion, Inc., Stratagene Corp., Cell Applications, Inc., Panomics, Inc., CHEMICON, i BioChain Institute, Inc.). Sva tumorska mesta u izolovanim tkivima kliničkog kancera i kancerske ćelijske linije (kupljene od ATCC) podvrgavaju se ekstrahovanju ukupne RNK, uz korišćenje reagensa Trizol (Invitrogen Corp.) prema protokolu koji je priložen uz proizvod. Eksperiment analize genske ekspresije izveden je korišćenjem 1 µg svake od tako dobijenih ukupnih RNK, u skladu sa uputstvom za GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling test (Affymetrix, Inc.). Human Exon 1.0 ST podaci sa čipa se digitalizuju korišćenjem ExACT (Exon Array Computational Tool) softvera koji obezbeđuje Affymetrix, Inc.

[0195] Na Human Exon 1.0 ST čipu bilo je prisutno 13 setova sržnih ("core") proba za DLL3. Prosečne vrednosti ekspresije određene su na osnovu ovih setova proba, i nivo ekspresije gena upoređivan je među ovim tkivima. Podaci o ekspresiji dobijeni iz normalnih tkiva, tumorskih mesta u izolovanim tkivima kliničkog sitnoćelijskog kancera pluća i kancerskih ćelijskih linija, prikazani su na Slici 1.

[0196] Utvrđeno je da je ekspresija humanog DLL3 gena upadljivo povećana u tumorskim mestima u izolovanim tkivima sitnoćelijskog kancera pluća i ćelijskim linijama sitnoćelijskog kancera pluća, u poređenju sa normalnim tkivima, osim fetalnog mozga. Ovi rezultati obećavaju efikasnost terapije u kojoj se koristi antitumorsko sredstvo koje molekularno cilja humani DLL3, tj., mogućnost smanjenja veličine tumora bez oštećenja normalnih tkiva.

[Primer 2] kloniranje cDNK i pripremanje rekombinantne ćelije

[0197] Humana DLL3 cDNK (NM_016941) kako je navedeno u SEQ ID NO: 1 i 57 amplifikuje se pomoću PCR, iz biblioteke cDNK mozga humanog fetusa i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. pMCN vektor ostvaruje ekspresiju stranog gena pod kontrolom promotora mišjeg CMV (GenBank: U68299). pMCN vektor ima gen za rezistenciju na geneticin. CHO ćelijska linija DG44 (Invitrogen Corp.) transformiše se humanim DLL3 ekspresionim vektorom. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir kloniranih ćelija koje stabilno eksprimiraju humani DLL3 protein vrši se koriščenjem komercijalno dostupnih anti-DLL3 antitela (R&D Systems, Inc., MAB4315) da bi se uspostavile ćelije humani DLL3/DG. Slično tome, mišja IL-3-zavisna pro B ćelijska linija Ba/F3 transformiše se humanim DLL3 ekspresionim vektorom da se uspostave ćelije humani DLL3/BaF3.

[0198] Mišja DLL3 cDNK (NM_007866) kako je navedeno u SEQ ID NO: 2 i 58 amplifikuje se pomoću PCR iz biblioteke cDNK fetusa miša i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija Ba/F3 transformiše se mišjim DLL3 ekspresionim vektorom. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir ćelija koje eksprimiraju mišji DLL3 protein vrši se korišćenjem komercijalno dostupnih antitela (R&D Systems, Inc., MAB4315) da bi se uspostavile ćelije mišji DLL3/BaF3.

[0199] Humana DLL1 cDNK (NM_005618) kako je navedeno u SEQ ID NO: 3 i 59 amplifikuje se pomoću PCR iz biblioteke cDNK slezine čoveka i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija Ba/F3 transformiše se humanim DLL1 ekspresionim vektorom. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir ćelija koje eksprimiraju humani DLL1 protein vrši se korišćenjem komercijalno dostupnih antitela (R&D Systems, Inc., MAB1818) da bi se uspostavile ćelije humani DLL1/BaF3.

[0200] Humana Notch1 cDNK (NM_017617) kako je navedeno u SEQ ID NO: 4 i 60 amplifikuje se pomoću PCR iz biblioteke cDNK ćelijske linije DU4475 kancera dojke i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 transformiše se humanim Notch1 ekspresionim vektorom. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir ćelija koje eksprimiraju humani Notch1 protein vrši se korišćenjem komercijalno dostupnih antitela (GeneTex Inc., GTX23294) da bi se uspostavile ćelije humani Notch1/DG44.

[0201] Ćelijske linije koje proizvode solubilni DLL3 protein ili njegov varijantni protein sa N-terminalnom delecijom pripremaju se u svrhu dobijanja imunogena za dobijanje anti-DLL3 antitela i određivanje epitopa za dobijena antitela. Vanćelijska sekvenca humanog DLL3 sastavljena je od motiva DSL domena koji se vezuje za Notch receptor (br. 176-215 u aminokiselinskoj sekvenci) i šest EGF-sličnih domena (1: 216-249, 2: 274-310, 3: 312-351, 4: 353-389, 5: 391-427, i 6: 429-465).

[0202] cDNK koja kodira himerni molekul humani DLL3-Fc (SEQ ID NO: 5), koji se sastoji od sekvenci vanćelijskog regiona humanog DLL3 (27-492 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1) i konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela priprema se i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 transformiše se ekspresionim vektorom humani DLL3-Fc. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir klonova koji visoko eksprimiraju protein humani DLL3-Fc vrši se pomoću ELISA, uz korišćenje antimišjih antitela da bi se uspostavile DG44 ćelije koje proizvode humani DLL3-Fc.

[0203] cDNK koja kodira himerni molekul humani DLL3delta1-Fc (SEQ ID NO: 6), koji se sastoji od delimične sekvence vanćelijskog regiona humanog DLL3 (176-492 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1) i konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela priprema se i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 transformiše se ekspresionim vektorom humani DLL3delta1-Fc. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir klonova koji visoko eksprimiraju protein humani DLL3delta1delta1-Fc vrši se pomoću ELISA, uz korišćenje antimišjih antitela da bi se uspostavile DG44 ćelije koje proizvode humani DLL3delta1-Fc.

[0204] cDNK koja kodira himerni molekul humani DLL3delta2-Fc (SEQ ID NO: 7), koji se sastoji od delimične sekvence vanćelijskog regiona humanog DLL3 (216-492 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1) i konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela priprema se i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 transformiše se ekspresionim vektorom humani DLL3delta2-Fc. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir klonova koji visoko eksprimiraju protein humani DLL3deltaldelta2-Fc vrši se pomoću ELISA uz korišćenje antimišjih antitela da bi se uspostavile DG44 ćelije koje proizvode humani DLL3delta2-Fc.

[0205] cDNK koja kodira himerni molekul DLL3-Fc sekvence SEQ ID NO: 8, koji se sastoji od vanćelijskog regiona mišjeg DLL3 (33-490 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2) i konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela priprema se i klonira u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 transformiše se ekspresionim vektorom mišji DLL3-Fc. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir klonova koji visoko eksprimiraju protein mišji DLL3-Fc vrši se pomoću ELISA, uz korišćenje antimišjeg antitela da se uspostave DG44 ćelije koje proizvode mišji DLL3-Fc.

[0206] Svaki protein od interesa prečišćava se iz supernatanta kulture ćelijske linije koja proizvodi Fc fuzioni protein, pomoću afinitetne hromatografije na Protein G-koloni i gel-filtracione hromatografije. Koncentracija prečišćenog proteina određuje se DC proteinskim testom (Bio-Rad Laboratories, Inc.), sa poznatom koncentracijom IgG kao standardom.

[Primer 3] Dobijanje anti-DLL3 antitela i analiza epitopa i internalizacije antitela

[0207] Šest do sedam nedelja stari Balb/c (Charles River Laboratories Japan, Inc.) i MRL/MpJJmsSlc-lpr/lpr (Japan SLC, Inc.) miševi se imunizuju. Kao inicijalni izazov, supkutano im se daju antigenski proteini pripremljeni u vidu emulzije uz korišćenje Freund-ovog kompletnog ađuvansa (Becton, Dickinson and Company), u dozi od 0.1 mg humani DLL3-Fc/glavi. Dve nedelje kasnije, supkutano im se daje emulzija antigena pripremljena korišćenjem Freund-ovog nekompletnog ađuvansa u dozi od 0.05 mg/glavi, ukupno 3 do 6 puta na bazi jednom nedeljno.

0.05 mg antigenskih proteina intravenski se daje svakom pojedinačnom mišu kod kojeg je potvrđen porast titra antitela u serumu. Tri dana kasnije, njihove ćelije slezine se ekstrahuju i pomešaju sa ćelijama mišjeg mijeloma P3-X63Ag8U1 (ATCC) u odnosu broja ćelija od približno 3:1. Ove ćelije se fuzionišu postupkom sa polietilen glikolom (PEG). Posle uklanjanja PEG centrifugiranjem, ćelije se suspenduju u RPMI1640 medijumu koji sadrži 1 x HAT suplement za medijum (Sigma-Aldrich Corp.), 0.5 x BM-Condimed H1 suplement za kloniranje hibridoma (Roche Diagnostics GmbH), i 10% fetalni goveđi serum za podešavanje koncentracije ćelija. Zatim se ćelije zaseju u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića. Potvrdi se formiranje kolonije hibridoma, a prisustvo ili odsustvo anti-DLL3 antitela u supernatantu kulture se tada analizira pomoću ELISA uz korišćenje ploče obložene humanim DLL3-Fc. Hibridoma ćelije sadržane u pozitivnim bunarčićima kloniraju se postupkom razblaživanja da bi se uspostavile linije hibridoma koje proizvode anti-DLL3 antitela. Monoklonska antitela se izotipiziraju korišćenjem IsoStrip (Roche Diagnostics GmbH).

[0208] Svako od IgG monoklonskih antitela prečisti se iz supernatanta kultura uspostavljenih hibridoma, afinitetnom hromatografijom na Protein G-koloni i tretmanom desalinizacije. Koncentracija prečišćenog antitela određuje se DC proteinskim testom.

[0209] Humani DLL3-Fc, mišji DLL3-Fc, humani DLL3delta1-Fc, i humani DLL3delta2-Fc zasebno se imobilišu na Nunc imunoploči (439454). Posle toga, neodreagovala površina ploče se blokira rastvorom koji sadrži goveđi serumski albumin. Posle ispiranja, svaki razblaženi rastvor antitela doteran do odgovarajuće koncentracije se dodaje u to i vrši se inkubiranje na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 sata. Reakcioni rastvor se ukloni sa ploče. Posle ispiranja sa TBS koji sadrži Tween 20, u ploču se dodaju antimišja IgK antitela obeležena alkalnom fosfatazom i inkubiraju 1 sat. Posle ispiranja ploče, tome se doda supstrat alkalne fosfataze, Sigma 104 i inkubira na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, meri se apsorbanca na talasnoj dužini od 405 nm i referentnoj talasnoj dužini od 655 nm. Rezultati su prikazani na Slici 2. Sva prečišćena antitela vezala su se za humani DLL3-Fc na dozno-zavisan način. Monoklonska antitela DL301, DL302, DL306, i DL312 i komercijalno dostupno antitelo MAB4315 vezala su se za mišji DLL3-Fc. Komercijalno dostupno antitelo MAB4315 vezalo se za humani DLL3delta1-Fc, ali se nije vezalo za humani DLL3delta2-Fc, što pokazuje da je njegov epitop lociran u DSL domenu. DL303, DL304, DL307, i DL311 antitela nisu se vezala ni za humani DLL3delta1-Fc ni za humani DLL3delta2-Fc. Prema tome, predviđeni epitopi za ova antitela locirani su između rezidua 27 i 175 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1. DL301, DL302, DL305, DL306, DL308, DL309, i DL312 vezala su se i za humani DLL3delta1-Fc i za humani DLL3delta2-Fc, što pokazuje da su epitopi za ova antitela locirana između rezidua 216-492 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1. Shematska struktura DLL3 proteina pune dužine i solubilnog DLL3-Fc fuzionog proteina, i mesto prepoznavanja svakim anti-DLL3 antitelom, prikazani su na Slici 9.

[0210] Vezivanje svakog monoklonskog antitela za humani DLL3 eksprimiran na ćelijskoj membrani, i ponašanje kompleksa humani DLL3-monoklonsko antitelo na ćelijskoj membrani analizirani su protočnom citometrijom. Ćelije humani DLL3/BaF3 suspenduju se u FACS puferu (PBS koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma i 0.05% natrijum azida). Ćelijska suspenzija 1 x 10<6>ćelija/ml reaguje sa monoklonskim antitelom (finalna koncentracija: 5 µg/ml) na 4°C, 30 minuta. Posle centrifugiranja i uklanjanja supernatanta, ćelije se isperu u jednoj promeni FACS pufera. Tome se dodaju FITC-obeležena antimišja IgG (H+L) antitela (Beckman Coulter, Inc.) i vrši se inkubacija na 4°C u trajanju od 30 minuta. Neodreagovala FITC antitela se uklone centrifugiranjem. Zatim se ćelije resuspenduju i analiziraju korišćenjem protočnog citometra FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). U svrhu analiziranja kretanja ili nestajanja kompleksa DLL3-antitelo sa ćelijske membrane, ćelije humani DLL3/BaF3 se suspenduju u RPMI1640 medijumu za kulturu, koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i mišji IL3. Suspenzija ćelija u koncentraciji od 1 x 10<6>ćelija/ml pomeša se sa monoklonskim antitelom (finalna koncentracija: 5 µg/ml) i reaguje na 37°C u trajanju od 1 sata ili 4 sata, u inkubatoru sa CO2. Posle reakcije, količina antitela vezanog na ćelijskoj membrani analizira se protočnom citometrijom na isti način kao gore. Histogram geometrijskih srednjih vrednosti intenziteta fluorescencije (X Geo Mean) u ćeliji konstruiše se korišćenjem analitičkog softvera CELLQuest Pro uključenog u FACSCalibur. Sva izolovana anti-DLL3 monoklonska antitela vezala su se za DLL3 na ćelijama (Slika 3(a)). Reakcija antitela sa ćelijama na 4°C inhibira fluidnost membrane, na primer preuzimanje u ćeliju kompleksa DLL3-antitelo sa ćelijske membrane. Reakcija antitela sa ćelijama na 37°C može dovesti do ćelijskog preuzimanja kompleksa DLL3-antitelo i "zasenčenja" (oslobađanja sa ćelijske membrane) kao rezultata digestije proteazom ili slično. Količina svakog od monoklonskih antitela vezanih za ćelijsku membranu posle inkubacije na 37°C u trajanju od 1 sata ili 4 sata, prikazana je na Slici 3(b) kao relativna vrednost u poređenju sa količinom na 4°C. Kao rezultat inkubacije na 37°C, količina antitela DL303, DL304, DL305, DL308, DL309, ili MAB4315 na površini ćelijske membrane je smanjena. Ovi rezultati sugerišu internalizaciju ili "zasenčenje" kompleksa DLL3-antitelo. Nasuprot tome, kao rezultat inkubacije na 37°C, količina antitela DL301, DL306, DL307, DL311, ili DL312 na površini ćelijske membrane jedva da je promenjena ili je, naprotiv, povećana. Drugi rezultat pokazuje da su ova antitela sposobna da stabilno borave na ćelijskoj membrani, u formi DLL3 kompleksa.

[0211] Broj DLL3 proteina na površini ćelije određuje se korišćenjem QIFIKIT (DAKO, F0479) za kvantitativno određivanje ćelijskog površinskog antigena protočnom citometrijom. Analiza je izvedena sa anti-DLL3 antitelom DL303 (finalna koncentracija: 5 µg/ml) kao primarnim antitelom, prema datom protokolu. Brojevi antigena na površinama ćelija humani DLL3/BaF3, NCI-H1184 (ATCC), NCI-H1436 (ATCC), i Y79 (Riken Cell Bank) bili su približno 9000, 7000, 6000, odnosno 3000.

[Primer 4] Indukovanje ADCC aktivnosti anti-DLL3 antitelom i inhibicija rasta posredovana kompleksom antitelo-toksin

[0212] Svako anti-DLL3 antitelo ispitivano je u pogledu svoje aktivnosti indukovanja ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) prema DLL3-eksprimirajućim ćelijama obeleženim kalceinom. DLL3-eksprimirajuće ćelijske linije humani DLL3/BaF3 i NCI-H1184 (ATCC) sitnoćelijskog kancera pluća zasebno se kultivišu 90 minuta u prisustvu 20 µg/ml Calcein-AM (Dojindo, 349-07201), zatim centrifugiraju, i isperu da bi se pripremile ciljne ćelije obeležene kalceinom. Ciljne ćelije se zaseju pri gustini od 1 x 10<4>ćelija/bunarčiću u ploču sa 96 bunarčića (Coster 3799). Posle toga, doda im se antitelo podešeno na odgovarajuću finalnu koncentraciju i vrši se inkubacija na sobnoj temperaturi, u trajanju od 15 minuta. Efektorske ćelije im se dodaju pri gustini od 5 x 10<4>ćelija/bunarčiću. Reakciona ploča se inkubira na 37°C u inkubatoru sa CO2. Upotrebljene efektorske ćelije bile su NK92 ćelije koje eksprimiraju himerni molekul mišji FcyR3-humani FcyR3 (WO 2008/093688). Posle 4 sata inkubacije, ploča se centrifugira, i iz svakog bunarčića se uzme 100 µl supernatanta kulture. Intenzitet fluorescencije meri se korišćenjem ARVO SX (Wallac).

[0213] ADCC-indukujuća aktivnost izračunava se prema sledećoj formuli:

gde

A predstavlja intenzitet fluorescencije u svakom bunarčiću; B predstavlja srednji intenzitet fluorescencije u supernatantu ćelija liziranih korišćenjem Nonidet P-40 finalne koncentracije 1%; i C predstavlja srednji intenzitet fluorescencije u bunarčiću koji je dopunjen samo medijumom. Srednja vrednost i standardna devijacija izračunavaju se iz tri merenja pri svakom od eksperimentalnih uslova. Slika 4 prikazuje ADCC-indukujuću aktivnost antitela dodatog u finalnoj koncentraciji od 2.5 µg/ml prema DLL3/BaF3 ćelijama. ADCC aktivnost nije potvrđena za kontrolna antitela IgG1 i IgG2b, dok je ADCC-indukujuća aktivnost potvrđena za DL301, DL306, i DL312. Nije potvrđena jasna ADCC-indukujuća aktivnost za komercijalno dostupno monoklonsko antitelo MAB4315. Na Slici 5 prikazano je da antitela DL301, DL306, i D312 indukuju ADCC protiv DLL3/BaF3 i NCI-H1184 na dozno-zavisan način.

[0214] Svako anti-DLL3 monoklonsko atitelo evaluirano je u pogledu ćelijskog preuzimanja korišćenjem antimišjeg sekundarnog antitela Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems) obeleženog toksinom. DLL3/BaF3 ćelije se zaseju pri gustini od 5 x 10<3>ćelija/bunarčiću u ploču sa 96 bunarčića. Posle toga, dodaju im se anti-DLL3 mišje monoklonsko antitelo i Mab-ZAP (finalna koncentracija: 1 µg/ml) i vrši se inkubacija na 37°C u inkubatoru sa CO2. Četiri dana kasnije, tome se doda Reagens za brojanje ćelija SF - Cell Count Reagent SF (Nacalai Tesque, Inc.). Apsorbanca se meri na 450 nm i na kontrolnoj talasnoj dužini od 620 nm, uz korišćenje čitača mikroploča, da bi se odredio ćelijski rast (Slika 6). Dodavanje anti-DLL3 monoklonskog antitela i Mab-ZAP ćelija inhibira ćelijski rast. Posle mešanja sa ćelijama i kultivisanja na 37°C, DL301, DL306, i DL312 antitela za koja je potvrđeno da imaju ADCC-indukujuću aktivnost ostala su u velikim količinama na DLL3-eksprimirajućim ćelijama i ispoljila su nizak efekat inhibicije rasta izazvan ćelijskim preuzimanjem Mab-ZAP kompleksa.

[Primer 5] Kloniranje varijabilnog regiona antitela i pripremanje rekombinantnog antitela

[0215] cDNK biblioteka Smart 5'-RACE (Clontech Laboratories, Inc.) pripremljena je od ukupnih RNK hibridoma koji proizvode svako od anti-DLL3 antitela. Pripremanje ukupne RNK izvedeno je korišćenjem RNeasy Mini kolone (Qiagen). Pripremanje cDNK biblioteke obavljeno je po uputstvu proizvođača. Sekvence koje kodiraju varijabilne regione antitela (VH i VL) amplifikovane su pomoću PCR uz korišćenje prajmera komplementarnih sa sekvencama koje kodiraju konstantne regione antitela. Fragments tako amplifikovani pomoću PCR, kloniraju se u pCR2.1TOPO i sekvenciraju. Konstruišu se ekspresioni vektori himernog antitela, koji sadrže dobijene VH- i VL-kodirajuće sekvence i sekvence koje kodiraju konstantne regione humanog IgG. Sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac se obe inkorporišu u jedan ekspresioni vektor za sisarske ćelije i prepisuju pod kontrolom promotora mišjeg CMV. Tabela 1 prikazuje SEQ ID NO identifikovanih sekvenci varijabilnog regiona antitela i njihovih CDR sekvenci, sekvenci mišjeg antitela pune dužine i sekvenci himernih antitela.

[0216] COS-7 ćelije transfektuju se ekspresionim vektorom svakog himernog antitela i ostave se da prolazno eksprimiraju himerno antitelo. Protočnom citometrijom i ELISA potvrđeno je da se himerno antitelo u supernatantu kulture COS-7 vezuje za humani DLL3 protein. Koncentracija himernog antitela u supernatantu kulture COS-7 izračunata je korišćenjem "sendvič" ELISA. U ovom izračunavanju koncentracije, humano himerno antitelo poznate koncentracije upotrebljeno je kao standard. Himerno antitelo (finalna koncentracija: 1 µg/ml) doda se ćelijama humani DLL3/BaF3 suspendovanim u FACS puferu (PBS koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma). Posle inkubacije na 4°C u trajanju od 30 minuta i ispiranja, ćelije su reagovale sa FITC-obeleženim antihumanim antitelima (Beckman Coulter, Inc.), i vezivanje himernog antitela analizirano je korišćenjem protočnog citometra FACSCalibur. Kako je prikazano na Slici 7, himerna antitela DL301, DL309, i DL312 vezala su se za ćelije humani DLL3/BaF3. Nijedno od himernih antitela nije se vezalo za Ba/F3 ćelije koje su roditeljska linija forsirano eksprimirajućih ćelija. Humani DLL3-Fc imobiliše se na Nunc imunoploču, i analizira se vezivanje svakog himernog antitela za imobilisani protein. Za detektovanje himernih antitela vezanih za antigen, doda mu se himerno antitelo, a zatim se dodaju antihumana antitela obeležena alkalnom fosfatazom (Biosource, AHI0305) i supstrat za alkalnu fosfatazu Sigma 104, tim redom. Određuje se apsorbanca. Himerna antitela DL301, DL309, i DL312 vezala su se za humani DLL3-Fc na dozno-zavisan način (Slika 8(a)).

[Primer 6] Grupisanje epitopa kompetitivnim ELISA

[0217] Kompeticija himernog antitela i mišjeg antitela u vezivanju za molekul antigena analizira se korišćenjem ELISA (Slika 8(b)). Humani DLL3-Fc doda se u koncentraciji od 10 ng/bunarčiću u Nunc imunoploču i imobiliše se na njoj. Mešavina (finalna koncentracija: 50 ng/ml) himernog antitela i odgovarajuće razblaženog mišjeg antitela doda se u ploče na kojima je imobilisan DLL3-Fc protein. Ploča se inkubira na sobnoj temperaturi 1 sat i zatim ispere. Tome se zatim dodaju antihumana antitela obeležena alkalnom fosfatazom i inkubiraju. Posle inkubiranja, tome se doda Sigma 104, i meri se apsorbanca. Vezivanje himernog antitela za molekul antigena kompetira sa onim originalnog mišjeg antitela za isti. Antitela različita od mišjeg antitela DL301 nisu inhibirala vezivanje himernog antitela DL301 za antigen. Antitela različita od mišjeg antitela DL312 nisu inhibirala vezivanje himernog antitela DL312 za antigen. Ovi rezultati pokazuju da se DL301 i DL312 vezuju za svoje odgovarajuće jedinstvene epitope. Antitela miša DL305, DL308, i DL309 inhibiraju vezivanje himernog antitela DL309 za antigen u skoro istom nivou, što sugeriše da je epitop za ova 3 antitela isti. Mišje antitelo DL306 za koje je potvrđeno da ima ADCC-indukujuću aktivnost, nije inhibiralo vezivanje DL301, DL309, ili DL312 himernog antitela za antigen. Ovi rezultati pokazuju da DL306 prepoznaje epitop nezavisan od epitopa za DL301, DL309, ili DL312.

[Primer 7] Uspostavljanje ćelijske linije koja eksprimira rekombinantno anti-DLL3 antitelo i prečišćavanje rekombinantnog antitela

[0218] COS-7 ćelije se transfektuju ekspresionim vektorom himernog antitela DL306 i ostave se da prolazno eksprimiraju himerno antitelo. Protočnom citometrijom potvrđeno je da se himerno antitelo u supernatantu kulture COS-7 vezuje za humani DLL3 protein. Koncentracija himernog antitela u supernatantu kulture COS-7 izračunata je korišćenjem "sendvič" ELISA. U ovom izračunavanju koncentracije, humano himerno antitelo poznate koncentracije upotrebljeno je kao standard. Himerno antitelo (finalna koncentracija: 1 µg/ml) doda se ćelijama humani DLL3/BaF3 suspendovanim u FACS puferu (PBS koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma). Posle inkubacije na 4°C u trajanju od 30 minuta i ispiranja, ćelije su reagovale sa FITC-obeleženim antihumanim antitelima (Beckman Coulter, Inc.), i vezivanje himernog antitela analizirano je korišćenjem protočnog citometra FACSCalibur. Kako je pokazano na Slici 10, himerno antitelo DL306 vezuje se za humani DLL3/BaF3 i ne vezuje se za ćelije Ba/F3 koje su roditeljska linija.

[0219] Ćelijska linija DG44 transformiše se ekspresionim vektorom humanih himernih antitela DL301, DL306, DL309, ili DL312. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir klonova koji visoko eksprimiraju humano himerno antitelo vrši se pomoću ELISA, uz korišćenje anti-humanih antitela, da bi se uspostavile DG44 ćelije koje proizvode humano himerno antitelo.

[0220] Svaki protein od interesa prečisti se iz supernatanta kulture ćelijske linije koja proizvodi humano himerno antitelo, afinitetnom hromatografijom na Protein A-koloni i gel-filtracionom hromatografijom. Koncentracija prečišćenog proteina određuje se DC proteinskim testom (Bio-Rad Laboratories, Inc.), sa IgG poznate koncentracije kao standardom.

[0221] Konstruiše se ekspresioni vektor mišjeg IgG2a antitela, koji sadrži VH- i VL-kodirajuće sekvence za DL301, DL306, ili DL312 i sekvence koje kodiraju konstantni region mišjeg IgG2a.

Sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac se obe inkorporišu u jedan ekspresioni vektor za sisarske ćelije i transkribuju pod kontrolom promotora mišjeg CMV. CHO ćelijska linija kojoj nedostaje transporter fukoze (WO2005/017155) transformiše se ekspresionim vektorom mišjeg IgG2a antitela. Odabir ćelija rezistentnih na lek vrši se u prisustvu geneticina. Odabir klonova koji visoko eksprimiraju mišje IgG2a antitelo vrši se pomoću ELISA, uz korišćenje antimišjih IgG2a antitela, da bi se uspostavile CHO ćelije koje proizvode mišje IgG2a antitelo sa niskim sadržajem fukoze. Svaki protein od interesa prečišćava se iz supernatanta kulture ćelijske linije koja proizvodi mišje IgG2a antitelo sa niskim sadržajem fukoze, afinitetnom hromatografijom na Proteinom G-koloni. Koncentracija prečišćenog proteina određuje se DC proteinskim testom, sa IgG poznate koncentracije kao standardom.

[Tabela 2]

[Primer 8] Indukovanje ADCC aktivnosti rekombinantnim anti-DLL3 antitelom

[0222] Humana himerna i mišja IgG2a rekombinantna anti-DLL3 antitela ispituju se u pogledu svoje aktivnosti indukovanja ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) prema DLL3-eksprimirajućim ćelijama obeleženim kalceinom. Ćelijske linije DLL3-eksprimirajućih ćelija humani DLL3/BaF3 i sitnoćelijskog kancera pluća NCI-H1184 (ATCC) zasebno se kultivišu 90 minuta, u prisustvu 20 µg/ml Calcein-AM (Dojindo, 349-07201), zatim centrifugiraju i isperu da bi se pripremile ciljne ćelije obeležene kalceinom. Ciljne ćelije se zaseju pri gustini od 1 x 10<4>ćelija/bunarčiću, u ploču sa 96 bunarčića (Coster 3799). Posle toga, doda im se antitelo podešeno na odgovarajuću finalnu koncentraciju i vrši se inkubacija na sobnoj temperaturi u trajanju od 15 minuta. Efektorske ćelije im se dodaju pri gustini od 5 x 10<4>ćelija/bunarčiću. Reakciona ploča se inkubira na 37°C u inkubatoru sa CO2. Efektorske ćelije upotrebljene za rekombinantno mišje IgG2a antitelo sa niskim sadržajem fukoze bile su NK92 ćelije koje eksprimiraju himerni molekul mišji FcyR4-humani FcyR3 (WO 2008/093688). Efektorske ćelije upotrebljene za humano himerno rekombinantno antitelo bile su NK92 ćelije koje eksprimiraju humani FcyR3 molekul. Posle 4 sata inkubacije, ploča se centrifugira, i 100 µl supernatanta kulture se sakupi iz svakog bunarčića. Intenzitet fluorescencije se meri korišćenjem ARVO SX. ADCC-indukujuća aktivnost izračunava se prema postupku opisanom u Primeru 4.

[0223] Slika 11 prikazuje da rekombinantna humana himerna antitela DL301, DL306, DL309, i D312 indukuju ADCC protiv DLL3/BaF3 i NCI-H1184 na dozno-zavisan način.

[0224] Slika 12 pokazuje da rekombinantna mišja antitela IgG2a sa niskim sadržajem fukoze DL301, DL306, i D312 indukuju ADCC protiv DLL3/BaF3 i NCI-H1184 na dozno-zavisan način.

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija za primenu u metodi lečenja sitnoćelijskog kancera pluća koji eksprimira DLL3 protein, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 protein, pri čemu antitelo ima citotoksičnu aktivnost i prepoznaje region iz amino kiselina 216 do 492 u humanom DLL3 koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 1.

2. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je citotoksična aktivnost ćelijski-posredovana citotoksična aktivnost zavisna od antitela (ADCC aktivnost).

3. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je citotoksična aktivnost citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC aktivnost).

4. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu antitelo ima aktivnost internalizacije.

5. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu je antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom.

6. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 protein opisano u bilo kojem od sledećeg:

(1) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što što je naznačeno u SEQ ID NO: 12, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što što je naznačeno u SEQ ID NO: 13, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što što je naznačeno u SEQ ID NO: 14, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što što je naznačeno u SEQ ID NO: 18, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što što je naznačeno u SEQ ID NO: 19, CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što što je naznačeno u SEQ ID NO: 20;

(2) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 24, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 25, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 26, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 30, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 31, i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 32;

(3) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 36, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 37, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 38, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 42, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 43, i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 44; i

(4) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 49, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 50, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 54, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 55, i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 56.

7. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je antitelo bispecifično antitelo.

8. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu antitelo sadrži antigen-vezujuće mesto koje prepoznaje antigen drugačiji od DLL3.