RS62390B1 - Izbor neoepitopa kao ciljeva specifičnih za bolest za terapiju sa povećanom efikasnošću - Google Patents

Izbor neoepitopa kao ciljeva specifičnih za bolest za terapiju sa povećanom efikasnošću

Info

Publication number
RS62390B1
RS62390B1 RS20211138A RSP20211138A RS62390B1 RS 62390 B1 RS62390 B1 RS 62390B1 RS 20211138 A RS20211138 A RS 20211138A RS P20211138 A RSP20211138 A RS P20211138A RS 62390 B1 RS62390 B1 RS 62390B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
disease
antigen
gene
Prior art date
Application number
RS20211138A
Other languages
English (en)
Inventor
Arbel D Tadmor
Ugur Sahin
Original Assignee
BioNTech SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioNTech SE filed Critical BioNTech SE
Publication of RS62390B1 publication Critical patent/RS62390B1/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Predmetno učenje odnosi se na postupke za određivanje podobnosti neoepitopa specifičnog za bolest kao cilja specifičnog za bolest i na upotrebu tako identifikovanih podobnih neoepitopa u imunoterapiji specifično usmerenoj prema pacijentovom obolelom tkivu, kao što je tumorsko tkivo koje eksprimira jedan ili više identifikovanih podobnih neoepitopa.
OSNOV
[0002] Kancer je osnovni uzrok smrtnosti, odgovoran za 1 od 4 smrtna slučaja. Lečenje kancera se tradicionalno zasniva na zakonu uprosečivanja - onome što najviše pomaže najvećem broju pacijenata. Međutim, zbog molekularne heterogenosti kancera, često se dešava da manje od 25% lečenih osoba ima koristi od odobrenih terapija. Individualizovana medicina zasnovana na lečenju prilagođenom svakom pojedinačnom pacijentu smatra se potencijalnim rešenjem za nisku efikasnost i visoke troškove inovacije u razvoju lekova.
[0003] Personalizovana imunoterapija kancera pojavlje se kao mogući veliki napredak u lečenju kancera sa potencijalom transformisanja standardne nege za milione obolelih širom sveta kojima se na godišnjem nivou postavi dijagnoza kancera. Aspekt koji objedinjuje personalizovane imunoterapije kancera je omogućavanje imunskom sistemu da cilja genetičke abnormalnosti (mutacije) jedinstvene za kancer svakog određenog pacijenta. Takve mutacije specifične za bolest mogu kodirati neoepitope koji predstavljaju ciljeve specifične za bolest. Najčešće genetičke abnormalnosti koje opterećuju kancerske genome, a koje se u personalizovanoj imunoterapiji mogu koristiti kao ciljevi specifični za bolest su nesinonimne pojedinačne nukleotidne varijacije (single nucleotide variations, SNV). Prema tome, precizna i iscrpna identifikacija pacijentovih SNV u kodirajućim regionima genoma kritičan je korak u procesu proizvodnje personalizovanih kancerskih imunoterapija.
[0004] Međutim, kako je opisano u ovom tekstu, poznavanje identiteta mutacije specifične za bolest samo je deo slike. Celovito genetičko profilisanje mutacije zahteva poznavanje tačnog broja kopija gena koji sadrži mutaciju u oboleloj ćeliji, npr., u tumorskoj ćeliji (uključujući divlji tip alela i mutirane alele), broja kopija mutiranog alela u tumorskoj ćeliji (ovde označeno kao zigotnost mutacije), i stepena subklonalnosti mutacije u uzorku obolelih ćelija, kao što je uzorak tumora. Uistinu, varijacije broja kopija koje se sreću u obolelim ćelijama važna su komponenta genetičke varijacije u obolelim ćelijama u većini indikovanih oboljenja. Štaviše, opseg varijacija broja kopija, identitet gena obuhvaćenih varijacijama broja kopija i precizni genetički sklop varijacija broja kopija jedinstveni su za svakog pojedinca i od osobe do osobe mogu široko varirati. Vidi, uopšteno, Shlien and Malkin, 2009, Genome Med. 1:62; Yang et al., 2013, Cell 153:919-929. Precizno poznavanje ovih genetičkih svojstava može biti kritično pri izboru mutacija koje bi, kada se ciljaju, bile imune na "izbavljenje" tumora, i stoga imale potencijal za potpunu kontrolu tumora.
[0005] U cilju dovođenja na najviši mogući nivo efikasnosti personalizovanih kancerskih imunoterapija i trajne kontrole tumora za većinu lečenih pacijenata, terapije treba da na neki način prevaziđu sposobnost tumora da izbegne imunski nadzor, na primer utišavanjem ekspresije mutiranog cilja, npr., delecijom gena. Bez rešavanja ovog problema, imunoterapije nose rizik od recidiva jer imunoterapija ne može ciljati mutacije ako nisu eksprimirane, npr., ako su deletovane iz genoma. Izbor podobnih neoepitopa koji povećavaju kontrolu tumora bio bi od koristi za sve personalizovane imunoterapijske pristupe koji ciljaju neoepitope, bez obzira na to kako se izvode.
[0006] Stanje tehnike sugeriše da verovatno nema načina da se relevantni epitopi predvide sa apsolutnom sigurnošću. Türeci et al. 2016 (Clinic. Cancer Res. 22:1885-1896) sugerišu upotrebu poliepitopa u cilju povećanja verovatnoće uključivanja pogodnog epitopa (vidi stranu 1890, 2. kol., 1. paragraf u Türeci et al. 2016). Pored toga, dokument stanja tehnike Castle et al. 2014 (Scientific Reports 4: 1-6) bavi se opštim pitanjima utvrđivanja da li postoji ili ne postoji korelacija između frekvencije DNK mutiranog alela i frekvencije RNK mutiranog alela. Konačno, dokument stanja tehnike WO2012/159754 opisuje analizu varijacije broja kopija, upotrebljenu za identifikovanje mogućih neoepitopa. Nijedan od ovih dokumenata stanja tehnike, međutim, ne obezbeđuje učenje za određivanje podobnosti neoepitopa za ciljanje obolele ćelije na osnovu broja kopija alela koji kodiraju neoepitop.
[0007] U struci postoji potreba za načinima biranja neoepitopa koji su rezultat mutacija specifičnih za bolest, koji bi doveli do poboljšanje kontrole tumora.
OPIS
SAŽETAK
[0008] Predmetno učenje obezbeđuje načine načine prevazilaženja nedostataka u stanju tehnike, obezbeđivanjem postupaka za određivanje podobnosti neoepitopa koji je rezultat za bolest specifične mutacije u genu, kao cilja specifičnog za bolest, pri čemu obolelo tkivo ne može lako izbeći imunski nadzor, što bi u slučaju kancera za rezultat imalo povećanu kontrolu tumora. Posle identifikovanja podobnih neoepitopa, ti podobni epitopi mogu se koristiti kao ciljevi specifični za bolest, kako bi se kod obolelog pacijenta indukovao specifičan imunski odgovor. Na primer, bolest može biti kancer i, potencijalno, primarni tumor kao i tumorske metastaze, koji eksprimiraju podobni neoepitop, mogu se ciljati kako bi se postiglo efikasnije lečenje.
[0009] Predmetno učenje odnosi se na postupak za određivanje podobnosti neoepitopa koji je rezultat za bolest specifične mutacije alela u genu (mutirani alel) kao cilja specifičnog za bolest, koji uključuje određivanje, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, broja kopija mutiranog alela koji kodira neoepitop. Kako se koristi u ovom tekstu, broj kopija može da se označi i kao zigotnost tako da, na primer, kada broj kopija mutiranog alela iznosi 4, mutirani alel ima zigotnost 4. Kako se koristi u ovom tekstu, alel je mesto u genomu koje ima specifičan nukleotidni identitet, taj identitet može biti isti na majčinoj i na očevoj kopiji genoma (homozigotni genotip) ili identitet može biti različit na majčinoj i očevoj kopiji genoma (heterozigotni genotip). Mutirani alel je alel koji, zbog mutacije specifične za bolest, ima različit identitet od tog mesta u odgovarajućem normalnom genomu, npr., genomu neobolele ćelije iste osobe (upareni genom), poželjno neobolele ćelije istog tipa tkiva kao što je obolela ćelija. Neoepitop podoban kao cilj specifičan za bolest (podoban neoepitop) kako se ovde koristi, predstavlja neoepitop za koji je, kada se cilja imunskim sistemom, manje verovatno da će negativno regulisati ili utišati svoju ekspresiju (npr., zbog delecije) u obolelom tkivu, tako da će biti manje verovatno da obolelo tkivo izbegne odgovor, poželjno imunski odgovor proizveden protiv neoepitopa, na primer, vakcinacijom protiv neoepitopa ili primenom imunskih ćelija koje mogu da ciljaju (da se vežu za) neoepitop. U primeru izvođenja, broj kopija mutiranog alela može biti isti kao broj kopija gena koji sadrži mutirani alel tako da se predmetno učenje odnosi i na postupak određivanja podobnosti neoepitopa nastalog kao rezultat za bolest specifične mutacije u genu kao cilja specifičnog za bolest, koji uključuje određivanje, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, broja kopija gena sa mutacijom specifičnom za bolest.
[0010] U jednom primeru izvođenja, veliki broj kopija mutiranog alela ili gena sa mutacijom specifičnom za bolest ukazuje na podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest, tako da što je veći broj kopija mutiranog alela ili gena sa mutacijom specifičnom za bolest, veća je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. U jednom primeru izvođenja, kada je broj kopija mutiranog alela ili gena sa mutacijom specifičnom za bolest u oboleloj ćeliji veći od 2, to ukazuje na podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. U jednom primeru izvođenja, kada je broj kopija gena sa mutacijom specifičnom za bolest veći od 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili je veći od 100, to ukazuje na podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest.
[0011] U slučajevima kada mutaciju nemaju sve kopije gena, pri čemu bar jedna kopija ima mutirani alel, poželjno je da mnogo kopije gena ima mutirani alel, tj., poželjno je da veća, a ne manja frakcija kopija gena ima mutirani alel (viša, a ne niža frakciona zigotnost). Prema tome, u određenim primerima izvođenja, mutirani alel se nalazi u visokoj frakciji kopija gena od kojih najmanje jedna kopija ima mutirani alel (frakciona zigotnost), pri čemu frakciona zigotnost predstavlja odnos broja kopija mutiranog alela (zigotnost mutiranog alela) prema ukupnom broju kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutirani alel mapira, posebno u referentnom genomu ili odgovarajućem divljem tipu genoma ili uparenom genomu, tj., divljem tipu genoma iz iste individue. Što je viša frakciona zigotnost kopija mutiranog alela, veća je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. Poželjno, frakciona zigotnost može biti veća od 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, i najpoželjnije frakciona zigotnost je 1, tj., sve kopije gena u oboleloj ćeliji imaju mutirani alel. U slučajevima kada frakciona zigotnost iznosi 1, nema kopija divljeg tipa gena tako da obolela ćelija ne može da se vrati na eksprimiranje odgovarajućeg epitopa divljeg tipa. Kako se ovde koristi, frakcija iznosi 1 kada se hipoteza da je genetička konfiguracija mutiranog alela/gena, npr., broj kopija, zigotnost, ista, ne može pobiti podacima, tj., statistički je konzistentna.
[0012] Poznato je da obolelo tkivo, kao što je tumorsko, može biti heterogeno u pogledu svog genetičkog sklopa i genske ekspresije, tako da je moguće da sve obolele ćelije u obolelom tkivu ne sadrže isti broj kopija gena i/ili gena čija najmanje jedna kopija ima mutirani alel (ukupan broj kopija gena) i/ili kopija gena sa mutiranim alelom, a još manje samu mutaciju specifičnu za bolest. Stoga, poželjno je utvrditi da je broj kopija, npr., mutiranog alela i/ili frakciona zigotnost i/ili ukupan broj kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutirani alel mapira, isti ili sličan u visokoj frakciji obolelih ćelija, a ne u niskoj frakciji obolelih ćelija u obolelom tkivu (visoka, pre nego niska klonska frakcija). Što je viša frakcija obolelih ćelija sa istim ili sličnim brojem kopija, npr., mutiranog alela i/ili frakcionom zigotnošću i/ili ukupnim brojem kopija nukleotidnog mesta na kojem se mapira mutirani alel, veća je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. Na primer, klonska frakcija može iznositi najmanje 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, ili najmanje 0.9. U poželjnom primeru izvođenja, sve obolele ćelije u obolelom tkivu imaju isti ili sličan broj kopija, tj., klonska frakcija iznosi 1, tj., statistički je konzistentna. Kako se koristi u ovom tekstu, isti ili sličan broj kopija obuhvata isti broj kopija ili broj kopija koji ne odstupa za više od 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%; 3%, 2% ili manje od broja kopija, npr., broja kopija ili apsolutnog broja kopija sa ili bez korekcije greške.
[0013] Poželjno, klonska frakcija mutacije može biti predstavljena frakcijom obolelih ćelija koje imaju istu ili sličnu genetičku konfiguraciju mutacije, pri čemu genetička konfiguracija mutacije uključuje ukupan broj kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutacija mapira i broj kopija mutiranog alela. Kaže se da je karakteristika fiksirana u populaciji obolelih ćelija ako je prisutna u svim obolelim ćelijama do stepena da se statistički ne može pobiti raspoloživim podacima. Poželjno, klonska frakcija 1 znači da je genetička konfiguracija mutacije fiksirana u populaciji obolelih ćelija. Poželjno, genetička konfiguracija mutacije je fiksirana u populaciji obolelih ćelija ako je mutacija fiksirana u populaciji obolelih ćelija i CNV koja zahvata mesto kodirajuće za mutaciju je fiksirana u populaciji obolelih ćelija. Poželjno, ako je određeno da je mutacija za koju ukupan broj kopija nukleotidnog mesta na kojem se mapira mutacija iznosi 2 i koja je u balansiranom regionu obolelog (tumorskog) genoma, fiksirana u populaciji obolelih ćelija, onda je genetička konfiguracija mutacije fiksirana.
[0014] Gen u kojem je nađena mutacija specifična za bolest potencijalno može biti bilo koji gen u genomu. Poželjan tip gena u kojem je nađena mutacija koja rezultuje podobnim neoepitopom je gen čija ekspresija rezultuje transformacijom ćelije u kancerozni fenotip ili čiji izostanak ekspresije rezultuje kanceroznom ćelijom koja gubi svoj kancerozni fenotip, tj., gen čija ekspresija doprinosi progresiji tumora. Takvi geni poznati su kao vodeći geni. Primeri vodećih gena za mnoge tipove tumora dobro su poznati. Na primer, spisak sa 291 kancerskim vodećim genom visokog poverenja, koji deluju na 3,205 tumora iz 12 različitih tipova kancera objavljen je u Tamborero et al., 2013, Comprehensive identification of mutational cancer driver genes across 12 tumor types, Scientific Reports 3:2650. Dodatni vodeći geni identifikovani su korišćenjem postupaka objavljenih u Youn et al., 2011, Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies, Bioinformatics 27(2): 175-181, u Sakoparnig et al., 2015, Identification of constrained cancer driver genes based on mutation timing, PLoS Comput. Biol.
11(1):e1004027, i u Forbes et al., 2008, Current protocols in human genetics 10-11. Mutacija specifična za bolest u vodećem genu može, ali ne mora doprineti kanceroznom fenotipu. Poželjno, svaka kopija vodećeg gena nađena u oboleloj ćeliji ima mutaciju specifičnu za bolest. Isto tako poželjno, sve ćelije u obolelom tkivu su obolele ćelije u kojima svaka kopija vodećeg gena ima mutaciju specifičnu za bolest.
[0015] Još jedan poželjna tip gena je esencijalni gen. U primeru izvođenja, esencijalni gen je gen koji, kada je utišan ili je njegova ekspresija smanjena (npr., tako što je deletovan), za rezultat ima bar ometeni rast ili smanjeni fitnes ćelije, poželjno obolele ćelije. Takvi geni se ovde označavaju kao esencijalni geni. U jednom primeru izvođenja, esencijalni gen je gen kod kojeg postoji najmanje 10% smanjenja rasta ili smanjenja fitnesa obolele ćelije kada je gen utišan ili mu je smanjena ekspesija, u poređenju sa ćelijom u kojoj gen nije utišan niti mu je smanjena ekspresija. U jednom primeru izvođenja, smanjenje rasta ili smanjenje fitnesa iznosi najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, ili najmanje 95%, najpoželjnije utišavanje ili smanjenje ekspresije esencijalnog gena rezultuju smrću obolele ćelije. Poželjno, svaka kopija esencijalnog gena nađena u oboleloj ćeliji ima mutaciju specifičnu za bolest.
[0016] Esencijalni geni dobro su poznati u struci, na primer, spisak esencijalnih gena kod ljudi (npr., u humanim ćelijskim linijama ili poreklom iz drugih organizama) objavljen je u Liao et al., 2008, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 105: 6987-6992 i u Georgi et al., 2013, PLoS Genetics 9 (5):e1003484, kao i odgovarajući ortolozi u drugim eukariotskim organizmima kao što su miš (Liao et al., 2007, Trends Genet.23:378-381), voćna mušica (Spradling et al., 1999, Genetics 153:135-177), C. elegans (Kamath et al., 2003, Nature 421:231-237), zebrica (Amsterdam et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:12792-12797), Arabidopsis thaliana (Tzafrir et al., 2004, Plant Physiol.135:1206-1220), kvasac (Kim et al., 2010, Nat. Biotechnol.28:617-623) i tako dalje. Spisak esencijalnih gena izvedenih iz humanih kancerskih ćelijskih linija objavljen je u Wang et al., 2015, Science 350:1096-1101, a spisak esencijalnih gena može se naći u bazi podataka esencijalnih gena, DEG5.0 (Zhang et al., 2009, Nucleic Acids Res.37:D455-D458).
[0017] Pored toga, spisak esencijalnih gena čija delecija/utišavanje značajno smanjuju fitnes kohorta ćelijskih linija može se generisati empirijski na osnovu velikog broja ćelijskih linija zdravih tkiva i/ili ćelijskih linija kancera, pri čemu se ćelijske linije mogu biti poreklom iz donora ili iz pacijenta. Delecija/utišavanje gena mogu se izvršiti eksperimentalno, korišćenjem različitih tehnika molekularne biologije kao što su CRISPR tehnologija, RNK interferencija, i tako dalje, pri čemu se preživljavanje ili fitnes ćelije određuju u prisustvu ili bez ekspresije pretpostavljenog esencijalnog gena. Spisak esencijalnih gena može se eksperimentalno odrediti iz ćelija ili iz ćelijske linije ili se spisak esencijalnih gena može dobiti bioinformatičkim pristupima. Ćelije ili ćelijske linije mogu biti obolele ćelije ili ćelijske linije (tumorske ćelije ili ćelijske linije) ili neobolele (zdrave/normalne) ćelije ili ćelijske linije, i mogu se dobiti od donora ili obolelog pacijenta. Poželjno, neobolelel ćelije ili ćelijske linije su iz istog tipa tkiva kao obolele ćelije, i poželjnije iz istog su pacijenta. U primeru izvođenja kada je bolest kancer, ćelije ili ćelijske linije mogu se dobiti iz primarnog tumora ili iz bilo koje od metastaza, ako ih ima. Pored toga, spisak esencijalnih gena može biti suštinski isti kao minimalni set gena eksprimiranih u velikom broju različitih tkiva u telu. Na primer, esencijalni gen je gen koji se eksprimira u velikom broju različitih tkiva i eksprimira se sa RPKM (minimum reads per kilobase of transcript per million mapped reads, minimum očitavanja po kilobazi transkripta na milion mapiranih očitavanja) pragom većim od 0, poželjno većim od 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25. Takav spisak esencijalnih gena može se dobiti analiziranjem podataka ekspresije RNK (npr., RNKsekv) dobijenih sa panela ćelijskih uzoraka iz najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više različitih tkiva. Pored toga, ako je dostupna tumorska ćelijska linija iz pacijenta, geni u kojima sve kopije sadrže mutaciju koja kodira neoepitop mogu se deletovati jedan po jedan i zatim meriti stope rasta svake modifikovane ćelijske linije. Takvo merenje/analiza mogu se izvesti visokopropusnim postupcima poznatim u struci, koji dopuštaju skrining najmanje jednog gena u jednom trenutku, poželjno mnogo gena u jednom trenutku, u cilju procene njihovog efekta na fitnes obolele ili neobolele ćelije. Takvi postupci omogućavaju i detekciju sintetički bolesne ili letalne kombinacije gena, o čemu će biti reči u nastavku. Ukratko, biblioteka ćelijskih linija, svakoj ćelijskoj liniji nedostaje jedan gen, može se upotrebiti za testiranje delecije jednog ili više kandidatskih gena tako da se može odrediti efekat delecije gena na ćeliju.
[0018] Predmetno učenje odnosi se i na postupak određivanja podobnosti neoepitopa koji je rezultat za bolest specifične mutacije u genu, kao cilja specifičnog za bolest, koji uključuje određivanje, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, broja kopija gena, tj., određivanje broja kopija gena pri čemu najmanje jedna kopija gena ima mutaciju specifičnu za bolest. U slučajevima u kojima gen ima visok broj kopija u oboleloj ćeliji kao što je tumorska ćelija, npr., zbog fokalne amplifikacije, veoma su dobre šanse da gen može biti vodeći gen. Prema tome, visok broj kopija gena ukazuje na podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest, i što je viši broj kopija gena, veća je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. Na primer, visok broj kopija može biti broj kopija veći od 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili veći od 100. Visok broj kopija može biti i broj kopija koji je najmanje 50% veći od broja kopija gena u odgovarajućoj neoboleloj ćeliji. Visok broj kopija može biti i kada je broj kopija gena čija najmanje jedna kopija ima mutaciju specifičnu za bolest najmanje 2x, 3x, 5x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, ili najmanje 100x viši od broja kopija gena u odgovarajućoj neoboleloj ćeliji. Zbog varijacija u broju kopija, koje mogu biti prisutne i u normalnom genomu, broj kopija gena u normalnom genomu nije obavezno dva. Pored toga, poznato je da se fokalne amplifikacije u nekim bolestima češće zapažaju nego u drugim, na primer u glioblastomu gde je gen za receptor za faktor rasta epiderma često fokalno amplifikovan, tako da je ovaj primer izvođenja dobro prilagođen za upotrebu u tim bolestima.
[0019] Pored toga, poželjno je nađeno da je broj kopija gena isti ili sličan u visokoj frakciji obolelih ćelija, a ne u niskoj frakciji obolelih ćelija, tako da što je viša frakcija obolelih ćelija koje imaju isti ili sličan broj kopija, veća je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. U poželjnom primeru izvođenja, sve obolele ćelije u obolelom tkivu iamju isti ili sličan broj kopija gena, pri čemu najmanje jedna kopija ima mutaciju specifičnu za bolest, tj., klonska frakcija je 1. Kako se koristi u ovom tekstu, isti ili sličan broj kopija obuhvata isti broj kopija ili broj kopija koji je u okviru 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%; 3%, 2% ili manje od broja kopija, npr., broja kopija ili apsolutnog broja kopija sa ili bez korekcije greške.
[0020] Pored toga, gen sa visokim brojem kopija, čija najmanje jedna kopija ima mutaciju specifičnu za bolest, koja rezultuje neoepitopom, poželjno može biti gen čija ekspresija rezultuje transformacijom ćelije u kancerozni fenotip ili čije odsustvo ekspresije rezultuje time da kancerozna ćelija gubi svoj kancerozni fenotip, tj., vodeći gen, kao što su vodeći geni poznati u struci, ili može biti esencijalni gen, npr., gen koji, kada se utiša ili se njegova ekspresija smanji, rezultuje bar ometenim rastom ili smanjenim fitnesom obolele ćelije.
[0021] Predmetno učenje se takođe odnosi na postupak za određivanje podobnosti neoepitopa koji je rezultat za bolest specifične mutacije u genu, kao cilja specifičnog za bolest, koji uključuje određivanje, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, da li je gen koji ima mutaciju specifičnu za bolest esencijalni gen. U jednom primeru izvođenja, esencijalni gen je gen koji, kada se utiša ili se njegova ekspresija smanji (npr., brisanjem gena), rezultuje bar ometenim rastom ili smanjenim fitnesom obolele ćelije. U ovom primeru izvođenja, kada je gen esencijalni gen i sve kopije esencijalnog gena imaju mutaciju specifičnu za bolest (frakciona zigotnost 1), to ukazuje na podobnost neoepitopa kao poželjnog cilja specifičnog za bolest. U primeru izvođenja, esencijalni gen je gen koji se eksprimira u velikom broju različitih tkiva i eksprimira se sa RPKM (minimum očitavanja po kilobazi transkripta na milion mapiranih očitavanja) pragom većim od 0, poželjno većim od 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25. Poželjno, sve kopije esencijalnog gena sadrže mutaciju. Pored toga, poželjno je da visoka frakcija obolelih ćelija sadrži kopije esencijalnog gena pri čemu sve kopije esencijalnog gena imaju mutaciju specifičnu za bolest (visoka, a ne niska klonska frakcija), tako da što je viša frakcija obolelih ćelija koje sadrže kopije esencijalnog gena, pri čemu sve kopije esencijalnog gena imaju mutaciju specifičnu za bolest, veća je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. U poželjnijem primeru izvođenja, sve obolele ćelije u obolelom tkivu imaju esencijalni gen, pri čemu sve kopije esencijalnog gena imaju mutaciju specifičnu za bolest, tj., klonska frakcija iznosi 1.
[0022] Poznato je da određeni geni, kada su pojedinačno utišani ili kada je njihova ekspresija pojedinačno smanjena, mogu imati samo mali efekat, ukoliko ga uopšte imaju, na fitnes ili sposobnost rasta obolele ćelije. Međutim, zapaženo je da dva ovakva gena, kada su oba utišana ili je ekspresija svakog od njih smanjena, mogu mogu za rezultat imati veću ometenost rasta, pa i smrtni ishod. Takve genetičke kombinacije označene su kao sintetički letalne ili sintetički bolesne/ometene. Videti Nijman, 2011, Synthetic lethality: General principles, utility and detection using genetic screens in human cells, FEBS Lett. 585:1-6 za diskusiju o sintetički letalnim i sintetički bolesnim genima i postupcima za identifikovanje takvih gena. Pošto su ćeliji potrebna oba gena da bi preživela, nije verovatno da će ćelija utišati ili smanjiti ekspresiju oba gena. Dakle, podobna kombinacija neoepitopa kao ciljeva specifičnih za bolest može nastati kao rezultat ovih mutacija specifičnih za bolest u najmanje dva gena koji su zajedno sintetički letalni ili sintetički bolesni. Imajući to u vidu, predmetno učenje se odnosi i na postupak za određivanje podobnosti kombinacije najmanje dva neoepitopa koja su rezultat mutacija specifičnih za bolest u najmanje dva gena, kao kombinacije ciljeva specifičnih za bolest, koji uključuje određivanje da li su najmanje dva gena u kombinaciji, od kojih svaki ima mutaciju specifičnu za bolest, sintetički letalni ili sintetički bolesni geni. Kada kombinacija najmanje dva gena rezultuje sintetički letalnim ili sintetički bolesnim fenotipom, to ukazuje da su rezultujući neoepitopi podobna kombinacija ciljeva specifičnih za bolest. U poželjnom primeru izvođenja, sintetički bolestan gen rezultuje najmanje povećanim efektom na ćelijski rast/fitnes u odnosu na onaj koji bi se očekivao na osnovu aditivnog efekta delecije/smanjene ekspresije svakog pojedinačnog gena. Ovaj pristup se favorizuje tamo gde postoji veliki broj pogodnih neoepitopa jer što je veći broj neoepitopa, veći je broj kombinacija koje bi mogle biti sintetički bolesne ili letalne. Na primer, 10 mutacija korespondira sa 45 mogućih kombinacija, 100 mutacija korespondira sa 4950 kombinacija, i 1000 mutacija korespondira sa do oko 500,000 kombinacija. U određenim primerima izvođenja, najmnaje dva gena, od kojih svaki ima višu, a ne nižu frakcionu zigotnost, poželjno frakcionu zigotnost 1, i/ili svaki ima višu, a ne nižu klonsku frakciju, poželjno klonsku frakciju 1, nalaze se oba u obolelim ćelijama i obolele ćelije nalaze se u obolelom tkivu. Kako se koristi u ovom tekstu, svaki neoepitop nađen u kombinaciji podobnih neoepitopa razmatra se, za potrebe predmetnog učenja, kao podoban neoepitop.
[0023] Kako je navedeno u ovom tekstu, broj kopija gena u oboleloj ili neoboleloj ćeliji može biti relativan broj kopija, ali je poželjno apsolutan broj kopija, i poželjnije, apsolutan broj kopija normalizovan u odnosu na ploidiju, npr., ploidiju genoma obolele ćelije, tj., broj kopija genoma. Još poželjnije, relativni, apsolutni i normalizovani broj kopija korigovani su za grešku.
[0024] Kada se procenjuje apsolutni broj kopija, na primer mutiranog alela ili gena ili njegova zigotnost, procena može biti neprecizna i poželjna je korekcija apsolutnog broja kopija, koja će uzeti u obzir izvore greške. U primerima izvođenja u kojima se sekvenciranje sledeće generacije koristi za dobijanje informacija o genomima i egzomima, izvori greške mogu uključiti:
1
pristrasnost u procenjenoj čistoći uzorka obolelog tkiva, na primer uzorku tumora, pristrasnost u bilo kojem procenjenom parametru potrebnih zaizvođenje čistoće i/ili apsolutnih brojeva kopija, stohastičke greške zbog ograničene pokrivenosti uzorka koji se sekvencira, ograničene sposobnosti detekcije zbog niske čistoće, niske klonske frakcije, i tako dalje.
[0025] U primeru izvođenja u kojem se apsolutni broj kopija određuje korišćenjem balansiranih heterozigotnih segmenata koji sadrže heterozigotni SNP, kao što je objavljeno u Međunarodnoj PCT patentnoj prijavi pod naslovom "Tumor Modeling Based on Primary Balanced Heterozygous Segments", podnetoj istog datuma kao ova, greška u apsolutnom broju kopija segmenta može se proširiti na druge procenjivane parametre, kao što su apsolutan broj kopija mutiranog alela, npr., SNV, koji kodira neoepitop, zigotnost mutiranog alela, klonska frakcija, i tako dalje. Pošto takvi nizvodni procenjivani parametri imaju kliničke implikacije na određivanje podobnosti neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest, kod pacijenta, kako je opisano u ovom tekstu, poželjno je korigovati greške u apsolutnom broju kopija kako bi se dobila najtačnija vrednost apsolutnog broja kopija. Pored toga, pošto mutacije koje kodiraju neoepitope mogu dobiti prioritet zbog svoje podobnosti, da budu uključene u vakcinu koja će se dati pacijentu, korišćenjem kriterijuma o kojima se ovde govori, i zbog toga što je frakciona zigotnost 1 kvalitativno bolja nego frakciona zigotnost manja od 1, posebno kada je gen koji sadrži mutaciju esencijalni gen, korisno je imati najpreciznije procene apsolutnog broja kopija i svakog parametra izvedenog iz toga.
[0026] U poželjnom primeru izvođenja, apsolutni broj kopija mutiranog alela, npr., SNV, i/ili zigotnost SNV mogu se korigovati za grešku. U primeru izvođenja, apsolutni broj kopija SNV se najpre koriguje za grešku, a zatim se koriguje zigotnost SNV da bi odražavala apsolutni broj kopija SNV korigovan za grešku. Kada se apsolutni broj kopija SNV i/ili zigotnost SNV koriguju za grešku, može da se koriguje i procena klonske frakcije da bi odražavala apsolutni broj kopija korigovan za grešku, uključujući određivanje toga da li je klonska frakcija statistički konzistentna sa vrednošću 1.
[0027] Apsolutni broj kopija SNV poželjno je dat apsolutnim brojem kopija segmenta na kojem je SNV mapirana. Apsolutni broj kopija svih segmenata u obolelom, npr., tumorskom genomu može biti korigovan za grešku, uključujući apsolutni broj kopija SNV. Kada se apsolutni brojevi kopija svih segmenata u genomu koriguju za grešku, može se izračunati ploidija korigovana za grešku, na osnovu apsolutnih brojeva kopija segmenata u obolelom, npr., tumorskom genomu, korigovanih za grešku.
[0028] U specifičnom primeru izvođenja, ako je apsolutni broj kopija SNV korigovan za grešku takav da se novi apsolutni broj kopija razlikuje od originalnog apsolutnog broja kopija, to se može uzeti kao pokazatelj da procenjeni apsolutni broj kopija SNV nije pouzdan.
[0029] Jedan primer korekcije greške apsolutnih brojeva kopija segmenata je korekcija greške parnosti, koja uključuje korekciju neparnog apsolutnog broja kopija segmenta u paran apsolutni broj kopija ako je segment u balansiranom regionu. Balansirani region je region obolelog, npr., tumorskog genoma, u kojem su majčini i očevi aleli u regionu prošli jednaku (balansiranu) amplifikaciju, ili ni majčini ni očevi aleli nisu uopšte prošli amplifikaciju.
[0030] Odluka o korigovanju neparnog apsolutnog broja kopija segmenta u najbliži viši paran apsolutni broj kopija ili najbliži niži paran apsolutni broj kopija može zavisiti od očitavanja bolesti i normalnih očitavanja mapiranih na segmentu, i upoređivanja sa predviđenim granicama koje definišu apsolutni broj kopija segmenta. Pri tome, normalno očitavanje je očitavanje koje se odnosi na sekvencirani normalni uzorak, a očitavanje bolesti je očitavanje koje se odnosi na sekvencirani oboleli uzorak. Posebno, kada je bolest kancer, očitavanje tumora je očitavanje koje se odnosi na sekvencirani tumorski uzorak.
[0031] Na primer, u korekciji greške parnosti prve vrste, ako je CNmutapsolutni broj kopija u obolelom genomu, segmenta u kojem se mapira mutacija, apsolutni broj kopija segmenta za koji se predviđa da ima vrednost CNmut, može se korigovati u CNmut+ 1 ako je r > ρ<th>, i u CNmut- 1 ako je r < ρ<th>, gde je r odnos broja očitavanja bolesnog u odnosu na normalni segment (odnos broja bolesnih, npr., tumorskih očitavanja mapiranih na segmentu u odnosu na broj normalnih očitavanja na segmentu), pri čemu je ρ<th>predviđena granica odlučivanja, čija vrednost zavisi i od čistoće uzorka obolelog tkiva, npr., tumorskog uzorka.
[0032] Za alel specifičan broj kopija segmenta je broj kopija u obolelom genomu, majčinog ili očevog alela segmenta. Kada segment sadrži heterozigotni SNP (heterozigotni segment), heterozigotni SNP može se upotrebiti za određivanje za alel specifičnog broja kopija segmenta. Heterozigotni segment se može dodeliti poželjnom čvoru, pri čemu se čvor može definisati kao jedinstvena kombinacija apsolutnog broja kopija heterozigotnog segmenta i za alel specifičnog broja kopija heterozigotnog segmenta. Parni čvorovi su podgrupa čvorova za koje je apsolutni broj kopija segmenta paran. Ako heterozigotni segment sadrži više od jednog heterozigotnog SNP, grupa od dva ili više heterozigotnih SNP može biti predstavljena jednim članom grupe, ili se frekvencije alela svih članova grupe mogu uprosečiti, ili se može uzeti medijana, uz uslov da se učestalost alela svakog heterozigotnog SNP izračunava dosledno bilo za alel koji ima viši ili niži broj kopija u obolelom genomu.
[0033] Korekcija greške parnosti prve vrste heterozigotnog segmenta može uključiti nalaženje najverovatnijeg parnog čvora koji će odgovarati heterozigotnom segmentu, na primer, na bazi okvira najveće verovatnoće, s obzirom na izmerena očitavanja bolesti (npr., tumor) i normalna očitavanja mapirana na segmentu.
[0034] U korekciji greške parnosti druge vrste, identifikuju se najbliži uzvodni i nizvodni segmenti koji ne zahtevaju korekciju greške parnosti, poželjno unutar 10 Mb, 5 Mb, 1 Mb segmenta koji sadrži SNV. Ako su apsolutni brojevi kopija najbližeg uzvodnog i nizvodnog segmenta identični, onda se apsolutni broj kopija segmenta koji sadrži SNV menja u apsolutni broj kopija najbližeg segmenta. Uopšteno, korekcija greške parnosti druge vrste poželjna je u odnosu na korekciju greške parnosti prve vrste, osim ako se ne može upotrebiti zbog toga što podobni susedni segmenti ne mogu da se identifikuju, u kom slučaju se može primeniti korekcija greške parnosti prve vrste.
[0035] Mogu se uvesti i drugi oblici korekcije greške apsolutnog broja kopija segmenta umesto ili kao dodatak korekciji greške parnosti. Na primer, to su postupci koji uzimaju u obzir apsolutni broj kopija segmenata u neposrednoj blizini gena koji sadrži mutaciju u obolelom genomu, pri čemu je apsolutni broj kopija segmenta koji sadrži SNV promenjen u modalitet apsolutnih brojeva kopija susednih segmenata, poželjno ako promena apsolutnog broja kopija nije veća od 3, 2 i poželjno 1, i poželjno ako većina susednih segmenata (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) ima apsolutni broj kopija jednak modalitetu.
[0036] Mogu se kombinovati različite sheme korekcije greške apsolutnog broja kopija. U poželjnom primeru izvođenja, prva korekcija greške parnosti primenjuje se kao prvi sloj korekcije greške, preko kojeg se mogu primeniti dodatni postupci korekcije greške.
[0037] Kako se koristi u ovom tekstu, segment može biti unapred određeni region genoma, npr., unapred određen na osnovu referentnog genoma. Segment može obuhvatiti gen, npr., kako je definisano u referentnom genomu sa kojim su očitavanja poravnata. Segment može biti i fragment gena, egzon, unija egzona, ili unija egzona udruženih sa datim genom. Segment može biti i drugi set unapred određenih regiona u referentnom genomu (sa ili bez introna), ili drugi set unapred određenih regiona u referentnom genomu na bazi normalnog genoma. U specifičnim primerima izvođenja, segment može biti region referentnog genoma sa datim konstantnim brojem kopija i/ili datim za alel specifičnim brojem kopija u obolelom, npr., tumorskom, genomu ili alternativno fragment gena sa datim konstantnim brojem kopija i/ili za alel specifičnim brojem kopija u obolelom, npr., tumorskom, genomu. Segment može biti definisan tako da uključuje ili isključuje introne.
1
[0038] Broj kopija segmenta u datom genomu (npr., u normalnom genomu, ili u tumorskom genomu) može se definisati kao to koliko se često, ukupno, nukleotidna sekvenca segmenta sreće u genomu, ignorišući varijacije izazvane SNP i/ili SNV i/ili drugim kancer-asociranim promenama kao što su, bez ograničavanja, mutacije, insercije, delecije i/ili druge genetičke varijante povezane sa kancerom. Poželjno različite kopije segmenta u datom genomu imaju istu dužinu ili skoroo istu dužinu.
[0039] Broj kopija segmenta u genomu može značiti broj fizičkih kopija segmenta u ćeliji koja sadrži genom. Apsolutni broj kopija segmenta u normalnom genomu može se definisati kao broj fizičkih kopija datog segmenta u zdravoj ćeliji. Apsolutni broj kopija segmenta u obolelom, npr., tumorskom, genomu može se definisati kao broj fizičkih kopija datog segmenta u oboleloj, npr., tumorskoj, ćeliji. Broj kopija segmenta u genomu može se označiti kao apsolutni broj kopija segmenta u pomenutom genomu. Broj kopija može značiti apsolutni broj kopija.
[0040] U specifičnom primeru izvođenja, ako se samo deo segmenta u genomu amplifikuje ili deletuje, onda se takva parcijalna kopija segmenta može da se broji kao kopija segmenta ili da se ne broji kao kopija segmenta. U poželjnom primeru izvođenja, kopije segmenta koje obuhvataju manje od 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ili 5% dužine segmenta mogu se ignorisati.
[0041] Referentni genom se koristi za mapirajuća očitavanja i obezbeđivanje koordinatnog sistema za normalni genom i oboleli, npr., tumorski, genom, pri čemu koordinatni sistem može uključivati obezbeđivanje broja hromozoma, pozicije nukleotida u hromozomu, kao i smera očitavanja, pri čemu je pozicija u hromozomu naznačena linijom.
[0042] Referentni genom se može bazirati na genomu jednog ili više članova iz iste vrste kao što je subjekt koji obezbeđuje uzorak obolelog tkiva, ili se može bazirati na normalnom genomu subjekta.
[0043] Uzorak obolelog tkiva, kao što je uzorak tumora, može sadržati i kontaminaciju iz normalnog genoma, posebno normalnog genoma iz istog pacijenta iz kojeg je uzorak uzet, i/ili u slučaju intratumorske heterogenosti, sadrži i više od jednog tumorskog genoma. Izrazi čistoća, čistoća tumorskog uzorka, tumorska čistoća i čistoća uzorka se uzimaju kao ekvivalentni izrazi koji poželjno označavaju frakciju tumorskih ćelija prisutnih u tumorskom uzorku. Normalna kontaminacija poželjno označava frakciju normalnih ćelija prisutnih u tumorskom uzorku, i može biti data kao "jedan minus čistoća".
[0044] Normalizacija u odnosu na ploidiju ćelije kontroliše prisustvo kopija gena usled događaja dupliciranja genoma. U primeru izvođenja, apsolutni broj kopija može se normalizovati u odnosu na ploidiju genoma, pri čemu je ploidija prosek apsolutnog broja kopija svih segmenata u datom genomu u datoj ćeliji, ponderisan dužinom svakog segmenta. U primeru izvođenja, apsolutni broj kopija može se normalizovati u odnosu na ploidnost hromozoma koji sadrži mutirani gen od interesa (sadrži mutaciju), ploidnost je prosek apsolutnog broja kopija svih segmenata na datom hromozomu u datoj ćeliji, ponderisan dužinom svakog segmenta na hromozomu. U primeru izvođenja, apsolutni broj kopija može se normalizovati u odnosu na ploidnost susednog regiona hromozoma koji sadrži mutirani gen od interesa, ploidnost je prosek svakog segmenta u datom regionu u datoj ćeliji, ponderisan dužinom svakog segmenta u regionu. Susedni region može biti unutar unapred određene udaljenosti od gena koji ima mutaciju specifičnu za bolest, npr., unutar 100 megabaza (Mb), 75 Mb, 50 Mb, 25 Mb, 10 Mb, 5 Mb, 4 Mb, 3 Mb, 2 Mb, ili 1 Mb od gena sa mutacijom specifičnom za bolest. Broj kopija segmenta može se rutinski izračunati postupcima poznatim u struci, i eksperimentalno i kompjuterski. Na primer, EP patenti br.2 198 292 B1 i EP 2002 016 B1 objavljuju postupke za određivanje relativnog broja kopija, odnosno frekvencije broja kopija sekvenci nukleinske kiseline. Pored toga, EP objavljena patentna prijava br.2 835 752 A i Međunarodne objavljene patentne prijave br. WO 2014/014497 i WO 2014/138153 takođe objavljuju posupke za određivanje varijacija broja kopija. Vidi i Machado et al., 2013, Copy Number Variation of Fc Gamma Receptor Genes in HIV-Infected and HIV-Tuberculosis Co-Infected Individuals in Sub-Saharan Africa, PLoS, 8(11):e78165. Drugi postupci uključuju upotrebu FACS, FISH ili drugih postupaka zasnovanih na fluorescenciji, spektralnoj kariotipizaciji (spectral karyotyping, SKY), i digitalnoj PCR. Segment može biti i gen.
[0045] Mutacija specifična za bolest može biti bilo koja mutacija koja za rezultat ima ekspresiju neoepitopa, poželjno na površini obolele ćelije. Posebno, mutacija može biti indel događaj ili genski fuzioni događaj ili može biti varijacija jednog nukleotida (tačkasta mutacija). Poželjno, mutacije specifične za bolest su nesinonimne mutacije, poželjno nesinonimne mutacije proteina eksprimiranih u tumorskoj ili kancerskoj ćeliji. Za određivanje mutacija specifičnih za bolest može se koristiti bilo koji postupak poznat u struci, a posebno su poželjni postupci u kojima se podaci sekvenciranja sledeće generacije koriste za određivanje bilo koje promene genoma/egzoma obolele ćelije u poređenju sa genomom/egzomom odgovarajuće neobolele ćelije divljeg tipa. Na primer, Carter et al., 2012, Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer, Nature Biotechnology 30:413-421; Cibulskis et al., 2013, Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples, Nature
1
Biotechnology 31:213-219; i Li and Li, 2014, A general framework for analyzing tumor subclonality using SNP array and DNA sequencing data, Genome Biology 15:473-495 objavljuju postupke ne samo za identifikovanje mutacija specifičnih za bolest, nego objavlju i postupke za određivanje broja kopija gena, frakcione zigotnosti i frakcione subklonalnosti zigotnosti i frakcione zigotnosti. U drugom postupku za određivanje broja kopija, kao što je apsolutni broj kopija, razmatra se upotreba segmenata genoma, svaki segment sadrži najmanje jedan heterozigotni polimorfizam pojedinačnog nukleotidni (single nucleotide polymorphism, SNP), i segmenti su balansirani (jednak broj svake verzije heterozigotnog SNP) i imaju isti broj kopija (primarni broj kopija) koji je poželjno najčešće zapaženi apsolutni broj kopija od svih balansiranih segmenata genoma, kako je objavljeno u Međunarodnoj PCT prijavi patenta pod nazivom "Tumor Modeling Based on Primary Balanced Heterozygous Segments", podnetoj istog datuma kao ova. Štaviše, pored određivanja apsolutnog broja kopija, ova patentna prijava može odrediti i zigotnost, frakcionu zigotnost, i subklonalnost mutiranog alela ili gena čija bar jedna kopija sadrži mutirani alel. Pored toga, tamošnja metodologija vrši i korekciju greške apsolutnih brojeva kopija, što poboljšava tačnost apsolutnih brojeva kopija i zigotnosti i iz toga izvedenih parametara, kao što su subklonalnost, ploidnost i tako dalje.
[0046] Uopšteno, ukupan broj kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutirani alel mapira može značiti apsolutan broj kopija mutacija, što može značiti apsolutan broj kopija SNV, posebno kada je mutacija SNV. Uopšteno, apsolutni broj kopija mutacija može poželjno biti dat apsolutnim brojem kopija segmenta na kojem se mutacija mapira (pri čemu je apsolutni broj kopija u obolelom, npr., tumorskom genomu).
[0047] Uopšteno, broj kopija mutiranog alela koji kodira neoepitop može značiti apsolutni broj kopija mutiranog alela mutacije, što može značiti apsolutni broj kopija alternativnog alela SNV (zigotnost SNV), pri čemu je alternativni alel SNV mutirani alel, posebno kada je mutacija SNV.
[0048] Poželjno, kada mutacija nije SNV, apsolutni broj kopija mutiranog alela mutacije može se proceniti na način koji je sličan postupku primenjenom za SNV.
[0049] Uopšteno, broj kopija gena može označavati apsolutni broj kopija segmenta, pri čemu segment može biti gen, ili može obuhvatati gen. Broj kopija gena može značiti apsolutni broj kopija gena.
[0050] Poželjno, bolest može biti bilo koja bolest u kojoj je poželjan imunski odgovor protiv obolele ćelije/tkiva, kao što je virusom inficirana ćelija. Poželjno, bolest je kancer.
[0051] Postupci učenja mogu uključivati dodatni korak određivanja upotrebljivosti/pogodnosti podobnih neoepitopa koji su postupcima učenja identifikovani kao podobni ciljevi specifični za
1
bolest, za upotrebu u postupku za obezbeđivanje imunskog odgovora protiv podobnog neoepitopa, kao što je uključivanje podobnog neoepitopa u kancersku vakcinu. Prema tome, dodatni koraci mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: određivanje antigenosti i/ili imunogenosti podobnog neoepitopa; procena da li se podobni neoepitop eksprimira na površini obolele ćelije; sposobnost peptida koji sadrži podobni neoepitop da se prezentuje kao MHC-prezentovani epitop; određivanje efikasnosti ekspresije podobnog neoepitopa iz kodirajuće nukleinske kiseline; određivanje da li su predviđeni podobni neoepitopi, posebno kada su prisutni u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr. kada su bočno ograničeni aminokiselinskim sekvencama koje bočno ograničavaju pomenute neoepitope i u prirodnom proteinu, i kada se eksprimiraju u antigen-prezentujućim ćelijama, sposobni da stimulišu T ćelije kao što su T ćelije pacijenta sa željenom specifičnošću.
[0052] Kada se odredi da je neoepitop podoban/pogodan da se koristi kao cilj u svetlu njegove antigenosti/imunogenosti, sposobnosti da se eksprimira, sposobnosti da se prezentuje kao MHC-prezentovani epitop, itd., identifikovani podobni neoepitopi mogu da se rangiraju, tj., da im se dodeli prioritet, prema njihovom potencijalu da ne podležu nishodnoj regulaciji ili da se ne deletuju iz obolele ćelije, to jest manjoj verovatnoći da obolelo tkivo može izbeći ciljanje neoepitopa. Na primer, jedna prioritizacija počinje sa "najboljim" neoepitopom, onim koji je kodiran esencijalnim genom, u kojem sve kopije esencijalnog gena imaju mutaciju koja kodira neoepitop, što je praćeno parom sintetički bolesnih ili letalnih gena, gde svaka kopija svakog gena ima mutaciju koja kodira neoepitop, što je praćeno neoepitopom kodiranim poznatim vodećim genom sa veoma velikim apsolutnim brojem kopija, gde sve kopije gena imaju mutaciju, što je praćeno neoepitopom kodiranim genom za koji nije poznato da je vodeći gen sa veoma velikim apsolutnim brojem kopija i visokom zigotnošću, što je praćeno neoepitopom kodiranim genom sa visokim brojem kopija (zigotnost), i tako dalje.
[0053] U primeru izvođenja, neoepitop kodiran esencijalnim genom sa frakcionom zigotnošću 1 poželjan je u odnosu na druge neoepitope koji nisu kodirani esencijalnim genom. U primeru izvođenja, između dva esencijalna gena koja kodiraju neoepitope, sa frakcionom zigotnošću 1, poželjan je neoepitop kodiran genom koji ima veći apsolutni broj kopija. U primeru izvođenja, između dva esencijalna gena koja kodiraju neoepitope, poželjan je neoepitop kodiran genom koji, kada se deletuje, vodi ka nižem fitnesu. U primeru izvođenja, između gena koji kodiraju neoepitope, gde svi geni imaju frakcionu zigotnost 1, poželjni su neoepitopi kodirani genima koji imaju veći apsolutni broj kopija. U primeru izvođenja gde je frakciona zigotnost manja od 1, neoepitopi kodirani genima koji imaju visoku zigotnost poželjni su u odnosu na gene koji imaju visoku frakcionu zigotnost, a ako je zigotnost ista ili slična, geni koji imaju visok
1
apsolutni broj kopija poželjni su u odnosu na one sa visokom frakcionom zigotnošću (10 kopija mutiranog alela/20 ukupnih kopija nukleotidnog mesta bolje je nego 3/4 zbog više zigotnosti; 10/100 bolje je nego 10/20 jer prvi može biti vodeći gen; 9/100 bolje je nego 10/20 jer je zigotnost slična, ali prvi može biti vodeći gen). U primeru izvođenja, neoepitop kodiran vodećim genom, u kojem je mutacija specifična za bolest odgovorna za transformaciju ćelije u u kancerozni fenotip poželjan je u odnosu na onaj u kojem mutacija nema ulogu u transformaciji ćelije u kancerozni fenotip. Pored toga, poželjno je da neoepitopi imaju višu, a ne nižu klonsku frakciju.
[0054] Dodatni primeri izvođenja predmetnog učenja odnose se na upotrebu postupaka određivanja podobnosti neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest, za izradu leka kao što je vakcina, npr., personalizovana kancerska vakcina. Vakcina može biti izvedena iz jednog ili više podobnih neoepitopa ili iz kombinacije podobnih neoepitopa identifikovanih postupcima učenja. U poželjnom primeru izvođenja, vakcina uključuje peptid ili polipeptid koji sadrži jedan ili više podobnih neoepitopa ili kombinaciju podobnih neoepitopa identifikovanih postupcima učenja, ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti peptid ili polipeptid.
[0055] Posebno, može se obezbediti rekombinantna vakcina koja, kada se primeni kod pacijenta, poželjno obezbeđuje kolekciju MHC-prezentovanih epitopa od kojih je najmanje jedan podoban neoepitop ili od kojih najmanje dva predstavljaju podobnu kombinaciju neoepitopa identifikovanih postupcima ovog učenja, na primer 2 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više i poželjno do 60, do 55, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 MHC-prezentovanih epitopa. Prezentovanje ovih epitopa od strane pacijentovih ćelija, tačnije antigen-prezentujućih ćelija, poželjno rezultuje T ćelijama koje ciljaju epitope vezane za MHC, a prema tome i pacijentov tumor, poželjno primarni tumor kao i tumorske metastaze, koji eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni MHC-prezentovani epitopi i koji su isti epitopi koji se prezentuju na površini tumorskih ćelija.
[0056] Postupci predmetnog učenja korisni su i u proizvodnji rekombinantnih imunskih ćelija koje eksprimiraju receptor za antigen, usmeren ka pogodnom neoepitopu ili jednom neoepitopu u kombinaciji podobnih neoepitopa. Poželjno, imunske ćelije su T ćelije i receptor za antigen je T-ćelijski receptor.
[0057] Ovo učenje se takođe odnosi na postupak obezbeđivanja rekombinantne imunske ćelije koja cilja podobni neoepitop ili jedan epitop u kombinaciji podobnih neoepitopa, pomenuti postupak uključuje transfektovanje imunske ćelije rekombinantnim receptorom za antigen, usmerenim ka podobnom neoepitopu ili jednom epitopu u kombinaciji podobnih epitopa
1
identifikovanih postupcima predmetnog učenja za određivanje podobnosti neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest, kao i na rekombinantne imunske ćelije proizvedene takvim postupcima.
[0058] Predmetno učenje obezbeđuje i postupke za ciljanje ćelijske populacije ili tkiva, koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa. Na primer, antitelo usmereno prema jednom ili više neoepitopa može se upotrebiti za ciljanje ćelija ili tkiva koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa identifikovanih postupcima opisanim u ovom tekstu. U jednom primeru izvođenja, predmetno učenje obezbeđuje postupke za obezbeđivanje imunskog odgovora na ciljnu ćelijsku populaciju ili ciljno tkivo, koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa u sisaru, pomenuti postupak uključuje primenu kod sisara (a) jedne ili više imunskih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više receptora za antigene, koji ciljaju jedan ili više neoepitopa; (b) primenu nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više neoepitopa; ili (c) primenu peptida ili polipeptida koji uključuje jedan ili više neoepitopa, gde su neoepitopi identifikovani prema postupcima učenja za određivanje podobnosti neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest. U jednom primeru izvođenja, postupak za obezbeđivanje imunskog odgovora prema ciljnoj ćelijskoj populaciji ili ciljnom tkivu, koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa u sisaru uključuje korake (i) određivanja, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, broja kopija mutiranog alela u genu koji kodira neoepitop (mutacija specifična za bolest); i (ii) primenu (a) imunske ćelije koja eksprimira receptor za antigen, koji cilja neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest; (b) primenu nukleinske kiseline koja kodira neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest; ili (c) primenu peptida ili polipeptida koji sadržie neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest.
[0059] U jednom primeru izvođenja, postupak za obezbeđivanje imunskog odgovora na ciljnu ćelijsku populaciju ili ciljno tkivo, koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa u sisaru uključuje korake (i) određivanja, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, broja kopija gena, gde najmanje jedna kopija gena ima mutaciju specifičnu za bolest koja rezultuje neoepitopom; i (ii) primenu (a) imunske ćelije koja eksprimira receptor za antigen, koji cilja neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest; (b) primenu nukleinske kiseline koja kodira neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest; ili (c) primenu peptida ili polipeptida koji sadrži neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest. U jednom primeru izvođenja, postupak za obezbeđivanje imunskog odgovora na ciljnu ćelijsku populaciju ili ciljno tkivo, koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa u sisaru uključuje korake (i) određivanja, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, da li je gen koji ima mutaciju specifičnu za bolest koja rezultuje neoepitopom, esencijalni gen; i (ii) primenu (a) imunske ćelije koja eksprimira receptor za antigen, koji cilja neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest; (b) primenu
1
nukleinske kiseline koja kodira neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest; ili (c) primenu peptida ili polipeptida koji sadrži neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za bolest. Poželjno, sve kopije esencijalnog gena imaju mutaciju specifičnu za bolest, tj., frakciona zigotnost je 1.
[0060] U jednom primeru izvođenja, postupak za obezbeđivanje imunskog odgovora na ciljnu ćelijsku populaciju ili ciljno tkivo, koji eksprimiraju jedan ili više neoepitopa u sisaru uključuje korake (i) određivanja, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, da li su najmanje dva gena u kombinaciji, od kojih svaki ima mutaciju specifičnu za bolest koja rezultuje neoepitopom, sintetički letalni ili sintetički bolesni geni; i (ii) primenu (a) jedne ili više imunskih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više antigenskih receptora usmerenih prema jednom ili više neoepitopa koji su rezultat mutacija specifičnih za bolest u najmanje dva gena; (b) primenu nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više neoepitopa koji su rezultat mutacija specifičnih za bolest u najmanje dva gena; ili (c) primenu peptida ili polipeptida koji uključuje jedan ili više neoepitopa koji su rezultat mutacija specifičnih za bolest u najmanje dva gena. Poželjno, svi neoepitopi koji su rezultat mutacija specifičnih za bolest u najmanje dva gena ciljaju se primenom imunskih ćelija, kodira ih primenjena nukleinska kiselina, ili su sadržani u primenjenom peptidu ili polipeptidu.
[0061] Pored toga, imunski odgovor može biti obezbeđen kod sisara koji ima bolest, poremećaj ili stanje udruženo sa ekspresijom neoepitopa koji je rezultat mutacije specifične za bolest, tako da se bolest, poremećaj ili stanje leče ili preveniraju. Poželjno, bolest, poremećaj ili stanje je kancer.
[0062] Poželjno, imunske ćelije su T ćelije i receptori za antigen su T-ćelijski receptori, i imunski odgovor je imunski odgovor posredovan T ćelijama. Poželjnije, imunski odgovor je antitumorski imunski odgovor i ciljna ćelijska populacija ili ciljno tkivo, koji eksprimiraju jedan ili više pogodnih neoepitopa su tumorske ćelije ili tumorsko tkivo.
[0063] Druge osobine i prednosti sadašnjeg učenja biće očigledni iz detaljnog opisa i patentnih zahteva koji slede.
[0064] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0065] Iako je predmetno učenje detaljno opisano u nastavku ovog teksta, treba razumeti da ovo učenje nije ograničeno na određene postupke, protokole i reagense opisane u ovom tekstu jer oni mogu varirati. Isto tako, treba razumeti da je terminologija upotrebljena u ovom tekstu namenjena samo opisivanju određenih primera izvođenja, i nije namenjena ograničavanju
2
obima predmetnog učenja koje će biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju ista značenja koja uobičajeno razume prosečno obučeni stručnjak u oblasti.
[0066] U nastavku, biće opisani elementi ovog učenja. Ovi elementi navedeni su sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da se oni mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kojem broju da bi formirali dodatne primere izvođenja. Različito opisane poželjne primere izvođenja ne treba shvatiti kao da ograničavaju predmetno učenje samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Treba razumeti da ovaj opis podržava i obuhvata primere izvođenja u kojima se eksplicitno opisani primeri izvođenja kombinuju sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Pored toga, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati kao objavljene na osnovu opisa predmetne prijave, ukoliko kontekstom nije naznačeno drugačije. Na primer, ako u poželjnom primeru izvođenja neoepitop ima visoku zigotnost, a ne visoku frakcionu zigotnost, i u jednom poželjnom primeru izvođenja neoepitop je rezultat mutacije u esencijalnom genu, onda u poželjnom primeru izvođenja, podobni neoepitop ima visoku frakcionu zigotnost i rezultat je mutacije u esencijalnom genu, i u poželjnijem primeru izvođenja frakciona zigotnost jednaka je 1.
[0067] Poželjno, izrazi upotrebljeni u ovom tekstu definisani su kako je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.
[0068] U primeni predmetnog učenja koristiće se, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalni postupci biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNK, koje su objašnjene u literaturi u oblasti (uporediti sa npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0069] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, izraz "uključivati", i varijacije kao što su "uključuje" i "koji uključuje", treba razumeti da podrazumeva uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključenje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takav drugi član, ceo broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključena, tj., predmet se sastoji od uključivanja navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Treba razumeti da izrazi upotrebljeni u kontekstu opisivanja učenja (posebno u kontekstu patentnih zahteva) obuhvataju i jedninu i množinu, ukoliko nije drugačije navedeno u ovom tekstu ili nije u očiglednoj suprotnosti sa kontekstom. Navođenje opsega vrednosti u ovom tekstu treba da služi samo kao skraćeni postupak pojedinačnog navođenja svake zasebne vrednosti koja je unutar tog opsega. Ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu, svaka pojedinačna vrednost uključena je u specifikaciju kao da je pojedinačno navedena u ovom tekstu.
[0070] Svi postupci opisani u ovom tekstu mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redom, ukoliko nije drugačije navedeno u ovom tekstu ili nije u očiglednoj suprotnosti sa kontekstom. Na primer, određivanje da li je neoepitop pogodan cilj specifičan za bolest određivanjem broja kopija kodirajućeg gena može se vršiti pre, posle ili istovremeno sa određivanjem toga da li je gen vodeći gen ili esencijalni gen, ili može biti određeno pre, posle ili istovremeno sa određivanjem toga da li se neoepitop eksprimira na površini ćelije ili indukuje zadovoljavajući imunski odgovor tako da bi bio podoban za vakcinu.
[0071] Upotreba bilo kojeg i svih primera, ili jezika primera (npr., "kao što je"), datih u ovom tekstu treba da služi zamo za bolje ilustrovanje učenja i ne predstavlja ograničenje učenja koje se inače zahteva. Nijedan izraz u specifikaciji ne treba tumačiti kao da ukazuje na neki nezahtevani element bitan za praksu učenja.
[0072] Sadašnje učenje predviđa lečenje bolesti, koje uključuje imunoterapiju i radioterapiju, posebno kancera, ciljanjem neoepitopa ("pogodni neoepitopi") koji se eksprimiraju samo u ili na obolelim ćelijama i koji imaju karakteristiku da se eksprimiraju na osnovu gena za koje je manje verovatno da će biti utišani u oboleloj ćeliji, tako da će biti manje verovatno da obolela ćelija izbegne imunski nadzor preko ciljanog neoepitopa. Imunoterapija se može sprovesti aktivnim i/ili pasivnim imunoterapijskim postupcima. Na primer, u jednom primeru izvođenja, antitelo ili drugi molekul koji specifično cilja neoepitop i koji je konjugovan sa toksičnim sredstvom sposobnim da ubije ćeliju koja eksprimira neoepitop, može se koristiti u skladu sa predmetnim učenjem za ciljanje i ubijanje te ćelije.
[0073] Učenje se specifično odnosi na identifikaciju takvih pogodnih neoepitopa kao ciljeva specifičnih za bolest u imunoterapiji. Posle identifikacije podobnih neoepitopa, oni se mogu koristiti u vakcinama u cilju indukovanja imunskog odgovora protiv neoepitopa, posebno, indukovanjem i/ili aktiviranjem pogodnih efektorskih ćelija kao što su T ćelije koje prepoznaju identifikovani podobni neoepitop, naročito kada se prezentuje u kontekstu MHC, preko odgovarajućeg receptora za antigen, kao što je T-ćelijski receptor ili veštački T-ćelijski receptor, što za rezultat ima smrt obolele ćelije koja eksprimira podobni neoepitop. Alternativno, ili dodatno, mogu se primeniti imunske ćelije koje prepoznaju identifikovani podobni neoepitop preko odgovarajućeg antigenskog receptora, što će takođe rezultovati smrću ćelija koje eksprimiraju podobni neoepitop.
[0074] Imunoterapijski pristupi u skladu sa učenjem uključuju imunizaciju peptidom ili polipeptidom koji sadrži podobni neoepitop, ii) nukleinskom kiselinom koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži podobni neoepitop, iii) rekombinantnim ćelijama koje kodiraju peptid ili polipeptid koji sadrži podobni neoepitop, iv) rekombinantnim virusima koji kodiraju peptid ili polipeptid koji sadrži neoepitop i v) antigen-prezentujućim ćelijama koje su stimulisane peptidom ili polipeptidom koji sadrži neoepitop ili transfektovane nukleinskim kiselinama koje kodiraju peptid ili polipeptid. Drugi imunoterapijski pristupi u skladu sa učenjem uključuju transfer vi) T-ćelijskih receptora koji prepoznaju neoepitop, i vii) efektorskih ćelija koje kodiraju receptore (kao što su T ćelije) koji prepoznaju neoepitop, posebno kada je prezentovan u kontekstu MHC.
[0075] Izraz "mutacija specifična za bolest" u kontekstu predmetnog učenja odnosi se na somatsku mutaciju prisutnu u nukleinskoj kiselini obolele ćelije, ali ne i u nukleinskoj kiselini odgovarajuće normalne, neobolele ćelije. Bolest može biti kancer, dakle, izraz "mutacija specifična za tumor" ili "mutacija specifična za kancer" odnosi se na somatsku mutaciju prisutnu u nukleinskoj kiselini tumorske ili kancerske ćelije, ali ne i u nukleinskoj kiselini odgovarajuće normalne, tj. netumorozne ili nekancerozne ćelije. Izrazi "mutacija specifična za tumor" i "tumorska mutacija" i izrazi "mutacija specifična za kancer" i "kancerska mutacija" koriste se u ovom tekstu naizmenično.
[0076] Kako se koristi u ovom tekstu, polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) je mesto u normalnom genomu na kojem najmanje jedan od dva alela (majčin ili očev) ima različiti identitet od onog u normalnom genomu, ili u odnosu na, na primer, referentni genom.
[0077] Kako se koristi u ovom tekstu, heterozigotni polimorfizam pojedinačnog nukleotida (heterozigotni SNP) definiše se kao mesto u normalnom genomu na kojem dva alela (majčin i očev alel) imaju različit identitet.
[0078] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "frakciona zigotnost" odnosi se na frakciju broja kopija gena sa mutacijom specifičnom za bolest u svetlu ukupnog broja kopija gena, bilo da gen ima mutaciju ili je nema. Na primer, ako postoji ukupno 20 kopija gena i 10 kopija ima mutaciju specifičnu za bolest, onda frakciona zigotnost iznosi 0.5. Ako sve kopije gena imaju mutaciju specifičnu za bolest, onda frakciona zigotnost iznosi 1. Frakciona zigotnost može iznositi najmanje 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, ili najmanje 0.95. U kontekstu predmetnog učenja, veća frakciona zigotnost poželjna je u odnosu na manju frakcionu zigotnost. U primeru izvođenja, frakciona zigotnost mutiranog alela koji kodira epitop, poželjno
2
neoepitop, predstavlja odnos broja kopija mutiranog alela prema ukupnom broju kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutirani alel mapira, npr., u referentnom genomu.
[0079] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "klonska frakcija" odnosi se na frakciju broja obolelih ćelija koje sadrže istu mutaciju specifičnu za bolest u istom genu i njene genetičke karakteristike kao što su broj kopija i frakciona zigotnost u svetlu ukupnog broja obolelih ćelija, bilo da obolele ćelije imaju istu mutaciju u istom genu ili ne. Ovaj izraz se takođe može primeniti na tumorsko tkivo u kojem klonska frakcija predstavlja frakciju obolelih ćelija u tumorskom tkivu, koje sadrže istu mutaciju specifičnu za bolest u istom genu i njene genetičke karakteristike kao što je broj kopija u svetlu ukupnog broja ćelija u tumorskom tkivu. Na primer, u uzorku dobijenom iz tumora, u kojem samo polovina ukupnog broja tumorskih ćelija ima istu mutaciju u istom genu, klonska frakcija iznosi 0.5. Klonska frakcija može bit najmanje 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, ili najmnaje 0.95. U kontekstu predmetnog učenja, viša klonska frakcija poželjna je u odnosu na nižu klonsku frakciju. Najpoželjnija je klonska frakcija 1, u kojoj sve obolele ćelije imaju istu mutaciju specifičnu za bolest, u istom genu. "Klonska frakcija", "frakciona klonalnost" i "frakciona subklonalnost" koriste se u ovom tekstu naizmenično.
[0080] Izraz "fokalna amplifikacija" odnosi se na amplifikaciju, ili povećanje broja kopija, dela genoma, npr., amplifikaciju jednog ili više gena lociranih zajedno na istom hromozomu, što rezultuje brojem kopija većim od 2, poželjno većim od 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 za ovaj deo genoma, uz uslov da nije bilo delecionih događaja za isti deo genoma. Prema tome, u svrhu predmetnog učenja, geni koji su fokalno amplifikovani u obolelim ćelijama su oni geni koji mogu imati povećani broj kopija u poređenju sa brojem kopija divljeg tipa, koji iznosi 2 ili brojem kopija divljeg tipa, koji iznosi 1 za one gene na X i Y hromozomima kod mužjaka. Fokalna amplifikacija je različita od duplikacionih i/ili amplifikacionih događaja za celi genom.
[0081] Izraz "imunski odgovor" odnosi se na integrisani odgovor tela na antigen i poželjno odnosi se na ćelijski imunski odgovor ili ćelijski kao i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti zaštitni/preventivni//profilaktički i/ili terapijski.
[0082] "Koji indukuje imunski odgovor" može značiti da pre indukovanja ne postoji imunski odgovor protiv određenog antigena, ali može značiti i da pre indukovanja postoji određeni nivo imunskog odgovora protiv određenog antigena, a posle indukovanja pomenuti imunski odgovor se pojačava. Prema tome, "koji indukuje imunski odgovor" takođe uključuje "koji pojačava imunski odgovor". Poželjno, posle indukovanja imunskog odgovora kod subjekta, pomenuti subjekt je zaštićen od razvijanja bolesti kao što je kancerska bolest ili je bolesno stanje ublaženo indukovanjem imunskog odgovora. Na primer, imunski odgovor protiv tumor-eksprimirajućeg antigena može biti indukovan kod pacijenta koji ima kancersku bolest ili kod subjekta koji je pod rizikom da razvije kancersku bolest. Indukovanje imunskog odgovora u ovom slučaju može značiti da je bolesno stanje subjekta ublaženo, da subjekt ne razvija metastaze, ili da subjekt koji je pod rizikom da razvije kancersku bolest ne razvija kancersku bolest.
[0083] "Ćelijski imunski odgovor", "ćelijski odgovor", "odgovor ćelije na antigen" ili sličan izraz treba da uključi ćelijski odgovor usmeren ka ćelijama koje se karakterišu prezentovanjem antigena sa MHC klase I ili klase II. Ćelijski odgovor odnosi se na ćelije nazvane T ćelije ili T-limfociti koji dejstvuju kao "pomagači" ili "ubice". Pomažuće T ćelije (označene i kao CD4<+>T ćelije) imaju centralnu ulogu time što regulišu imunski odgovor, a ćelije-ubice (označene i kao citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8<+>T ćelije ili CTL) ubijaju obolele ćelije kao što su kancerske ćelije, prevenirajući proizvodnju još većeg broja obolelih ćelija. Poželjno, antitumorski odgovor posredstvom CTL stimulisan je protiv ćelija koje eksprimiraju jedan ili više tumor-eksprimirajućih antigena i poželjno prezentuju takve tumor-eksprimirajuće antigene sa MHC klase I.
[0084] "Antigen", u skladu sa učenjem, obuhvata svaku supstancu, poželjno peptid ili protein, koja je ciljna i/ili indukuje imunski odgovor kao što je specifična reakcija sa antitelima ili T-limfocitima (T ćelijama). Poželjno, antigen sadrži najmanje jedan epitop kao što je epitop za T ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog učenja, antigen je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen (uključujući ćelije koje eksprimiraju antigen). Antigen ili epitop za T ćelije poželjno prezentuje ćelija, poželjno antigenprezentujuća ćelija koja uključuje obolelu ćeliju, posebno kancersku ćeliju, u kontekstu MHC molekula, što rezultuje imunskim odgovorom protiv antigena (uključujući ćelije koje eksprimiraju antigen).
[0085] Poželjno, u kontekstu predmetnog učenja, antigen je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen. Prema predmetnom učenju, može se koristiti svaki pogodni antigen koji je kandidat za imunsku reakciju, pri čemu imunska reakcija može biti humoralna, kao i ćelijska imunska reakcija. U kontekstu predmetnog učenja, antigen poželjno prezentuje ćelija, poželjno antigen-prezentujuća ćelija u kontekstu MHC molekula, što rezultuje imunskom reakcijom protiv antigena. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je izveden iz prirodnog antigena. Takvi prirodni antigeni mogu uključivati ili mogu biti izvedeni iz alergena, virusa, bakterija, gljiva, parazita i drugih infektivnih sredstava i patogena ili antigen može biti i tumorski antigen. Prema predmetnom učenju, antigen može odgovarati prirodnom proizvodu, na primer, virusnom proteinu, ili njegovom delu. U poželjnim primerima izvođenja, antigen je površinski polipeptid, tj., polipeptid koji se prirodno prikazuje
2
na površini ćelije, patogena, bakterije, virusa, gljive, parazita, alergena, ili tumora. Antigen može ispoljiti imunski odgovor protiv ćelije, patogena, bakterije, virusa, gljive, parazita, alergena, ili tumora.
[0086] Izraz "antigen udružen sa bolešću" ili "antigen specifičan za bolest" koristi se u najširem smislu da označi svaki antigen koji je udružen ili specifičan za bolest. Takav antigen je molekul koji sadrži epitope koji će stimulisati domaćinov imunski sistem da bi se proizveo ćelijski antigen-specifični imunski odgovor i/ili humoralni odgovor antitela protiv bolesti. Antigen udružen sa bolešću može, prema tome, da se koristi u terapijske svrhe. Antigeni udruženi sa bolešću su poželjno udruženi sa infekcijom mikrobima, tipično mikrobnim antigenima, ili su udruženi sa kancerom, tipično tumorima.
[0087] Izraz "patogen" označava patogeni biološki materijal sposoban da izazove bolest u organizmu, poželjno organizmu vertebrata. Patogeni uključuju mikroorganizme kao što su bakterije, jednoćelijski eukariotski organizmi (protozoe), gljive, kao i virusi.
[0088] U kontekstu predmetnog učenja, izraz "tumorski antigen" ili "antigen udružen sa tumorom" odnosi se na proteine koji se pod normalnim uslovima specifino eksprimiraju u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili na specifičnim stupnjevima razvića, na primer, tumorski antigen može se pod normalnim uslovima specifično eksprimirati u želudačnom tkivu, poželjno u želudačnoj mukozi, u reproduktivnim organima, npr., u testisu, u tkivu trofoblasta, npr., u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimira se ili se aberantno eksprimira u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U tom kontekstu, "ograničeni broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnog učenja uključuju, na primer, diferencijacione antigene, poželjno diferencijacione antigene specifične za tip ćelije, tj., proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenom ćelijskom tipu na određenom stupnju diferencijacije, kancerske/testisne antigene, tj., proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u testisu i ponekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu predmetnog učenja, tumorski antigen je poželjno udružen sa površinom kancerske ćelije i poželjno se ne eksprimira ili se samo retko eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuje ćelije kancera. U kontekstu predmetnog učenja, tumorski antigen koji eksprimira kancerska ćelija subjekta, npr., pacijenta obolelog od kancerske bolesti, poželjno je sopstveni protein pomenutog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen, u kontekstu predmetnog učenja, eksprimira se pod normalnim uslovima specifičbo u tkivu ili organu koji nisu esencijalni, tj., tkivima ili organima koji, ako se oštete imunskim sistemom, neće dovesti do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koji nisu dostupni ili su teško dostupni
2
imunskom sistemu. Poželjno, aminokiselinska sekvenca tumorskog antigena identična je kod tumorskog antigena koji se eksprimira u normalnim tkivima i tumorskog antigena koji se eksprimira u kancerskim tkivima.
[0089] Prema učenju, izrazi "tumorski antigen", "tumor-eksprimirajući antigen", "kancerski antigen" i "kancer-eksprimirajući antigen" su ekvivalentni i koriste se u ovom tekstu naizmenično.
[0090] Izrazi "epitop", "antigenski peptid", "antigenski epitop", "imunogeni peptid" i "MHC-vezujući peptid" koriste se u ovom tekstu naizmenično i označavaju antigensku determinantu u molekulu kao što je antigen, tj., deo ili fragment imunološki aktivnog jedinjenja koji biva prepoznat imunskim sistemom, na primer, koji biva prepoznat T ćelijom, posebno kada se prezentuje u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina poželjno uključuje kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno dug je između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 amino-kiselina, na primer, epitop može biti poželjno dug 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina. Prema učenju, epitop može da se veže za MHC molekule kao što su MHC molekuli na površini ćelije i, dakle, može biti "MHC-vezujući peptid" ili "antigenski peptid". Izraz "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II i odnose se na kompleks gena prisutnih kod svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli važni su za signalizaciju između limfocita i antigen-prezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu se MHC proteini ili molekuli vezuju za peptide i prezentuju ih da biih prepoznali T-ćelijski receptori. Proteini kodirani MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i T ćelijama prikazuju sopstvene antigene (peptidni fragmenti iz same ćelije) i strane antigene (npr., fragmente invadirajućih mikroorganizama). Poželjno, takvi imunogeni delovi vezuju se za MHC molekul klase I ili klase II. Kako se koristi u ovom tekstu, za imunogeni deo se kaže da se "vezuje za" MHC molekul klase I ili klase II akodr takvo vezivanje može detektovati korišćenjem bilo kojeg testa poznatog u struci. Izraz "MHC-vezujući peptid" odnosi se na peptid koji se vezuje za MHC molekul klase I i/ili MHC molekul klase II. U slučaju kompleksa MHC klase I/peptid, vezujući peptidi su tipično dugi 8-10 amino-kiselina mada i duži ili kraći peptidi mogu biti efikasni. U slučaju kompleksa MHC klase II/peptid, the vezujući peptidi su tipično dugi 10-25 amino-kiselina i posebno dugi su 13-18 amino-kiselina, iako efikasni mogu biti duži i kraći peptidi.
[0091] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "neoepitop" odnosi se na epitop koji nije prisutan u referenci kao što je normalna nekancerozna ćelija ili ćelija germinativne linije, ali se nalazi u obolelim ćelijama kao što su kancerske ćelije. Ovo uključuje, posebno, situacije u kojima se u
2
normalnoj nekanceroznoj ili ćeliji germinativne linije nalazi odgovarajući epitop, međutim, zbog jedne ili više mutacija u kancerskoj ćeliji, sekvenca epitopa je promenjena tako da rezultuje neoepitopom. Pored toga, neoepitop može ne samo biti specifičan za obolele ćelije nego može biti specifičan i za pacijenta koji ima bolest. Pošto neoepitopi i podobni neoepitopi identifikovani postupcima učenja predstavljaju podgrupe epitopa, objava u ovom tekstu koja se odnosi na epitope uopšteno kao imunološke ciljeve, važi jednako za neoepitope i podobne neoepitope.
[0092] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja učenja, epitop ili neoepitop je epitop za T ćeliju. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "epitop za T ćeliju" odnosi se na peptid koji se vezujje za MHC molekul u konfiguraciji koju prepoznaje T-ćelijski receptor. Tipično, epitopi za T-ćelije prezentuju se na površini antigen-prezentujuće ćelije.
[0093] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "predviđanje imunogenih aminokiselinskih modifikacija" odnosi se na predviđanje da li će peptid koji sadrži takvu aminokiselinsku modifikaciju biti imunogen i, prema tome, koristan kao epitop, posebno kao epitop za T ćeliju, u vakcinaciji.
[0094] Prema učenju, epitop za T ćeliju može biti prisutan u vakcini kao deo većeg entiteta kao što je vakcinska sekvenca i/ili polipeptid koji sadrži više od jednog epitopa za T ćeliju. Prezentovani peptid ili epitop za T ćeliju proizvodi se posle odgovarajuće obrade.
[0095] Epitopi za T ćelije mogu se modifikovati na jednoj ili više rezidua koje nisu esencijalne za prepoznavanje putem TCR ili za vezivanje za MHC. Tako modifikovani epitopi za T ćelije mogu se smatrati imunološki ekvivalentnim.
[0096] Poželjno, epitop za T ćeliju, kada se prezentuje pomoću MHC i kada ga prepoznaje T-ćelijski receptor, sposoban je da u prisustvu odgovarajućih kostimulatornih signala indukuje klonsku ekspanziju T ćelija koje nose T-ćelijski receptor koji specifično prepoznaje kompleks peptid/MHC.
[0097] Poželjno, epitop za T ćeliju sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno, pomenuti fragment antigena je peptid koji se prezentuje u kontekstu MHC klase I i/ili klase II.
[0098] Epitop za T ćeliju prema učenju, poželjno se odnosi na deo ili fragment antigena sposoban da stimuliše imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena ili ćelija koje se karakterišu ekspresijom antigena i, poželjno, prezentovanjem antigena, kao što su obolele ćelije, posebno kancerske ćelije. Poželjno, epitop za T ćeliju sposoban je da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja se karakteriše prezentovanjem antigena u kontekstu MHC klase I i poželjno sposoban je da stimuliše citotoksične T limfocite (CTL) koji odgovaraju na antigen.
2
[0099] U nekim primerima izvođenja, antigen je sopstveni antigen, posebno tumorski antigen. Tumorski antigeni i njihovo određivanje poznati su stručnjaku.
[0100] Izraz "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost u indukovanju imunskog odgovora koji je poželjno udružen sa terapijskim tretmanima, kao što su tretmani protiv kancera. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "imunogen" odnosi se na svojstvo posedovanja imunogenosti. Na primer, izraz "imunogena modifikacija", kada se koristi u kontekstu peptida, polipeptida ili proteina. odnosi se na efikasnost pomenutog peptida, polipeptida ili proteina u indukovanju imunskog odgovora izazvanog i/ili usmerenog protiv pomenute modifikacije. Poželjno, nemodifikovani peptid, polipeptid ili protein ne indukuje imunski odgovor, indukuje različiti imunski odgovor ili indukuje različiti nivo, poželjno niži nivo, imunskog odgovora.
[0101] Prema učenju, izraz "imunogenost" ili "imunogen" se poželjno odnosi na relativnu efikasnost u indukovanju biološki relevantnog imunskog odgovora, posebno imunskog odgovora korisnog u vakcinaciji. Prema tome, u jednom poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska modifikacija ili modifikovani peptid imunogeni su ako indukuju imunski odgovor protiv ciljne modifikacije kod subjekta, pri čemu imunski odgovor može biti koristan u terapijske ili profilaktičke svrhe.
[0102] "Obrada antigena" ili "obrada", odnosi se na degradaciju polipeptida ili antigena u proizvode obrade, koji predstavljaju fragmente pomenutog polippetida ili antigena (npr., degradacija polipeptida u peptide), i udruživanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., vezivanjem) sa MHC molekulima za prezentaciju ćelijama, poželjno antigen-prezentujućim ćelijama, specifičnim T ćelijama.
[0103] "Antigen-prezentujuće ćelije" (antigen presenting cells, APC) su ćelije koje na svojoj površini prezentuju peptidne fragmente proteinskih antigena udružene sa MHC molekulima. Neke APC mogu aktivirati antigen-specifične T ćelije.
[0104] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije veoma su efikasne u internalizaciji antigena, bilo fagocitozom bilo endocitozom posredovanom receptorima, i zatim prikazivanju na svojoj membrani fragmenta antigena vezanog za MHC molekul klase II. T ćelija prepoznaje i interaguje sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II na membrani antigen-prezentujuće ćelije. Antigen-prezentujuća ćelija zatim proizvodi dodatni kostimulatorni signal koji dovodi do aktivacije T ćelije. Ekspresija kostimulatornih molekula je osobina koja definiše profesionalne antigen-prezentujuće ćelije.
[0105] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije koje imaju najširi opseg prezentacije antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, makrofagi, B ćelije i određene aktivirane epitelne ćelije.
2
[0106] Dendritske ćelije (dendritic cells, DC) su populacije leukocita koje T ćelijama prezentuju antigene zarobljene u perifernim tkivima, putevima prezentacije antigena posredstvom MHC klase II i I. Dobro je poznato da su densritske ćelije snažni induktori imunskih odgovora i aktivacija ovih ćelija je kritičan korak za indukovanje antitumorske imunosti. Dendritske ćelije se pogodno kategorizuju kao "nezrele" i "zrele" ćelije, što se može koristiti kao jednostavan način razlikovanja dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ovu nomenklaturu ne treba tumačiti kao da isključuje sve moguće prelazne stupnjeve diferencijacije. Nezrele dendritske ćelije su okarakterisane kao antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obrađivanje antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fey receptora i manoznog receptora. Zreli fenotip se tipično karakteriše nižom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom ćelijskih površinskih molekula odgovornih za aktivaciju T ćelija, kao što su MHC klase I i klase II, adhezioni molekuli (npr., CD54 i CD11) i kostimulatorni molekuli (npr., CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).
[0107] Maturacija dendritske ćelije označava se kao stanje aktivacije dendritske ćelije, na kojem takve antigen-prezentujuće dendritske ćelije dovode do pobuđivanja T ćelija, dok prezentacija nezrelim dendritskim ćelijama dovodi do tolerancije. Maturacija dendritskih ćelija je uglavnom prouzrokovana biomolekulima sa mikrobnim osobinama koje se detektuju urođenim receptorima (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), proinflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFN), ligacijom CD40 na površini dendritske ćelije pomoću CD40L, i supstancama oslobođenim iz ćelija koje su podlegle smrti usled stresa. Dendritske ćelije mogu biti izvedene kultivisanjem ćelija kostne srži in vitro u prisustvu citokina, kao što su faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.
[0108] Neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno proteine MHC klase II potrebne za interakciju sa naivnim T ćelijama; oni se eksprimiraju samo posle stimulacije neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija određenim citokinima kao što je IFNγ.
[0109] "Antigen-prezentujuće ćelije" mogu se "natovariti" peptidima koji se prezentuju MHC molekulima klase I tako što se ćelije transdukuju nukleinskom kiselinom, poželjno RNK, koja kodira peptid ili polipeptid, uključujući peptid koji će se prezentovati, npr. nukleinskom kiselinom koja kodira antigen.
[0110] U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se može primeniti farmaceutska kompozicija učenja koja uključuje prenosnik za dostavu gena, koji cilja dendritsku ili drugu antigen-prezentujuću ćeliju, što za rezultat ima transfekciju koja se dešava in vivo. In vivo transfekcija dendritskih ćelija, na primer, može uopšteno da se izvrši korišćenjem bilo kojeg postupka poznatog u struci, kao što su oni opisani u WO 97/24447, ili pristupom genskog pištolja koji je opisan u Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997.
[0111] Izraz "antigen-prezentujuća ćelija" uključuje i ciljne ćelije.
[0112] "Ciljna ćelija" označiće ćeliju koja predstavlja cilj za imunski odgovor kao što je ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije obuhvataju ćelije koje prezentuju antigen ili antigenski epitop, tj. peptidni fragment izveden iz antigena, i uključuju svaku neželjenu ćeliju kao što je kancerska ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen kako je opisano u ovom tekstu i poželjno koja prezentuje pomenuti antigen sa MHC klase I.
[0113] Izraz "deo" odnosi se na frakciju. U odnosu na određenu strukturu kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, izraz "deo" istog može označiti kontinuiranu ili diskontinuiranu frakciju pomenute strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence uključuje najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 90% amino-kiselina pomenute aminokiselinske sekvence. Poželjno, ako je deo diskontinuirana frakcija, pomenuta diskontinuirana frakcija sastoji se od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, svaki deo je kontinuirani element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija aminokiselinske sekvence može biti sačinjena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela pomenute aminokiselinske sekvence, pri čemu svaki deo poželjno uključuje najmanje 5 kontinuiranih amino-kiselina, najmanje 10 kontinuiranih amino-kiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih amino-kiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih amino-kiselina aminokiselinske sekvence.
[0114] Izrazi "deo" i "fragment" koriste se naizmenično u ovom tekstu i odnose se na kontinuirani element. Na primer, deo strukture kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein odnosi se na kontinuirani element pomenute strukture. Porcija, deo ili fragment strukture poželjno uključuje jednu ili više funkcionalnih osobina pomenute strukture. Na primer, porcija, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina je poželjno imunološki ekvivalent epitopa, peptida ili proteina iz kojeg je izveden. U kontekstu predmetnog učenja, "deo" strukture kao što je aminokiselinska sekvenca poželjno uključuje, poželjno sastoji se od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% čitave strukture ili aminokiselinske sekvence.
[0115] Izraz "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu predmetnog učenja odnosi se na ćeliju koja ispoljava efektorske funkcije tokom imunske reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" poželjno je
1
sposobna za vezivanje antigena ili ćelije koja se karakteriše prezentacijom antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena i posredovanjem u imunskom odgovoru. Na primer, takve ćelije sekretuju citokine i/ili hemokine, sekretuju antitela, prepoznaju kancerozne ćelije, i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije uključuju T ćelije (citotoksične T ćelije, pomažuće T ćelije, tumor-infiltrirajuće T ćelije), B ćelije, ćelije-prirodne ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog učenja, "imunoreaktivne ćelije" su T ćelije, poželjno CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije.
[0116] Poželjno, "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena, sa određenim stepenom specifičnosti, posebno ako je prezentovan u kontekstu MHC molekula na primer na površini antigen-prezentujućih ćelija, ili obolelih ćelija, na primer kancerskih ćelija. Poželjno, pomenuto prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena da se odazove ili bude reaktivna. Ako je ćelija pomažuća T ćelija (CD4<+>T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena u kontekstu molekula MHC klase II, takav odziv ili reaktivnost mogu uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ako je ćelija CTL, takav odziv ili reaktivnost mogu uključivati eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu molekula MHC klase I, tj., ćelija koje se karakterišu prezentacijom antigena u kontekstu MHC klase I, na primer, apoptozom ili lizom ćelija posredovanom perforinom. Odziv CTL može obuhvatiti održivi tokkalcijuma, ćelijsku deobu, proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, pozitivnu regulaciju markera aktivacije kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje antigen-eksprimirajućih ciljnih ćelija. Odziv CTL može se odrediti i korišćenjem veštačkog reportera koji precizno ukazuje na odziv CTL. Takvi CTL koji prepoznaju antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena i koji se odazivaju ili su reaktivni, označavaju se u ovom tekstu i kao "CTL koji se odazivaju na antigen". Ako je ćelija B ćelija, takav odziv može uključivati oslobađanje imunoglobulina.
[0117] Izrazi "T ćelija" i "T limfocit" koriste se naizmenično u ovom tekstu i uključuju T pomažuće ćelije (CD4<+>T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8<+>T ćelije) koje uključuju citolitičke T ćelije.
[0118] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija poznatih kao limfociti, i igraju centralnu ulogu u imunosti posredovanoj ćelijama. Mogu se razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i ćelije-prirodne ubice po prisustvu specijalnog receptora na površini ćelije nazvanog T-ćelijski receptor (T cell receptor, TCR). Glavni organ odgovoran za maturaciju T ćelija je timus. Otkriveno je nekoliko različitih podgrupa T ćelija, svaka sa različitom funkcijom.
2
[0119] T pomažuće ćelije, pored ostalih funkcija, pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunskim procesima koji uključuju maturaciju B ćelija u plazmocite i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga,. Ove ćelije su poznate i kao CD4<+>T ćelije zato što eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. Pomažuće T ćelije postaju aktivirane kada im se peptidni antigeni prezentuju MHC molekulima klase II, koji se eksprimiraju na površini antigen-prezentujućih ćelija (APC). Kada se aktiviraju, brzo se dele i sekretuju male proteine koji se nazivaju citokini, koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunskom odgovoru.
[0120] Citotoksične T ćelije uništavaju virusom inficiran ećelije i tumorske ćelije, a uključene su i u odbacivanje transplanta. Ove ćelije su poznate i kao CD8<+>T ćelije, jer eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljeve vezivanjem za antigen udružen sa MHC molekulima klase I, prisutnim na površini skoro svake ćelije u telu.
[0121] Većina T ćelija ima T-ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Aktuelni T-ćelijski receptor sastoji se od dva odvojena peptidna lanca koji se proizvode na osnovu nezavisnih T-ćelijskih receptorskih alfa i beta (TCRα i TCRβ) gena i nazivaju se α- i β-TCR lanci. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju malu podgrupu T ćelija koje poseduju poseban T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. U γδ T ćelijama, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo manje česta (2% svih T ćelija) nego αβ T ćelije.
[0122] U skladu sa učenjem, izraz "receptor za antigen" uključuje prirodne receptore kao što je T-ćelijski receptor, kao i inženjerisane receptore, koji daju arbitrarnu specifičnost kao što je specifičnost monoklonskog antitela na imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija. Na ovaj način, veliki broj antigen-specifičnih T ćelija može se generisati za adoptivni ćelijski transfer. Prema tome, receptor za antigen prema učenju može biti prisutan na T ćelijama, npr. umesto ili pored T-ćelijskog receptora T ćelije. Takve T ćelije ne moraju obavezno zahtevati obradu i prezentaciju antigena za prepoznavanje ciljne ćelije već umesto toga mogu prepoznati, poželjno specifično, bilo koji antigen prisutan na ciljnoj ćeliji. Poželjno, pomenuti receptor za antigen eksprimira se na površini ćelija. U svrhu predmetnog učenja, T ćelije koje sadrže receptor za antigen obuhvaćene su izrazom "T ćelija" kako se ovde koristi. Specifično, u skladu sa učenjem, izraz "receptor za antigen" uključuje veštačke receptore koji sadrže jedan molekul ili kompleks molekula koji prepoznaju, tj. vezuju se za ciljnu struktutu (npr. antigen) na ciljnoj ćeliji kao što je kancerska ćelija (npr. vezivanjem antigen-vezujućeg mesta ili antigen-vezujućeg domena za antigen eksprimiran na površini ciljne ćelije) i mogu dati specifičnost imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija koja eksprimira pomenuti receptor za antigen na površini ćelije. Poželjno, prepoznavanje ciljne strukture receptorom za antigen rezultuje aktivacijom imunske efektorske ćelije koja eksprimira pomenuti receptor za antigen. Receptor za antigen može uključivati jednu ili više proteinskih jedinica, pomenute proteinske jedinice uključuju jedan ili više domena, kako je opisano u ovom tekstu. U skladu sa učenjem "receptor za antigen" može biti i "himerni receptor za antigen" (chimeric antigen receptor, CAR), "himerni T-ćelijski receptor" ili "veštački T-ćelijski receptor".
[0123] Antigen se može prepoznati receptorom za antigen preko bilo kojeg od domena za prepoznavanje antigena (ovde označeni jednostavno kao "domeni") sposobnog da formira antigen-vezujuće mesto, na primer preko antigen-vezujućih delova antitela i T-ćelijskih receptora koji se mogu nalaziti na istom ili različitim peptidnim lancima. U jednom primeru izvođenja, dva domena koja formiraju antigen-vezujuće mesto izvedana su iz imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, dva domena koja formiraju antigen-vezujuće mesto izvedana su iz T-ćelijskog receptora. Posebno su poželjni varijabilni domeni antitela, kao što su jednolančani varijabilni fragmenti (single-chain variable fragments, scFv) izvedeni iz monoklonskih antitela i varijabilni domeni T-ćelijskog receptora, posebno TCR alfa i beta pojedinačni lanci. U stvari, gotovo sve što se sa visokim afinitetom vezuje za dati cilj, može se upotrebiti kao domen za prepoznavanje antigena.
[0124] Prvi signal u aktivaciji T ćelija obezbeđuje se vezivanjem T-ćelijskog receptora za kratki peptid prezentovan glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC), na drugoj ćeliji. To osigurava da se aktivira samo T ćelija sa TCR specifičnim za taj peptid. Partnerska ćelija je obično profesionalna antigen-prezentujuća ćelija (APC), obično dendritska ćelija u slučaju naivnih odgovora, iako B ćelije i makrofagi mogu biti važne APC. Peptidi koji se prezentuju CD8<+>T ćelijama posredstvom MHC molekula klase I dugi su tipično 8-10 amino-kiselina; peptidi koji se prezentuju CD4<+>T ćelijama posredstvom MHC molekula klase II tipično su duži, jer su krajevi vezujućeg žleba molekula MHC klase II otvoreni.
[0125] U skladu sa predmetnim učenjem, molekul je sposoban da se vezuje za cilj ako u standardnim testovima ima značajan afinitet za pomenuti unapred određeni cilj. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" često se meri ravnotežnom konstantom disocijacije (equilibrium dissociation constant, KD). Molekul nije (suštinski) sposoban da se veže za cilj ako nema značajan afinitet za pomenuti cilj i ne vezuje se značajno za pomenuti cilj u standardnim testovima.
[0126] Citotoksični T limfociti mogu se generisati in vivo inkorporisanjem antigena ili antigenog peptida u antigen-prezentujuće ćelije in vivo. Antigen ili antigeni peptid mogu biti predstavljeni u vidu proteina, DNK (npr. u vektoru) ili RNK. Antigen se može obraditi da bi se proizveo peptidni partner za MHC molekul, dok se njegov fragment može prezentovati bez potrebe za dodatnim obrađivanjem. Ovo drugo je posebno slučaj ako se može vezivati za MHC
4
molekule. Uopšteno, kod pacijenta je moguća primena intradermalnom injekcijom. Međutim, injekcija se može izvesti i intranodalno, u limfni čvor (Maloy et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). Rezultujuće ćelije prezentuju kompleks od interesa i bivaju prepoznate autolognim citotoksičnim T limfocitima koji se onda propagiraju.
[0127] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija može se detektovati na različite načine. Postupci detektovanja specifične aktivacije T ćelija uključuju detektovanje proliferacije T ćelija, proizvodnju citokina (npr., limfokina), ili generisanje citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjan postupak detektovanja specifične aktivacije T ćelija je detekcija proliferacije T ćelija. ZA CD8+ T ćelije, poželjan postupak detektovanja specifične aktivacije T ćelija je detekcija generisanja citolitičke aktivnosti.
[0128] Pod "ćelija koja se karakteriše prezentacijom antigena" ili "ćelija koja prezentuje antigen" ili sličnim izrazima misli se na ćeliju kao što je obolela ćelija, npr. kancerska ćelija, ili antigen-prezentujuća ćelija koja prezentuje antigen koji eksprimira ili fragment izveden iz pomenutog antigena, npr.obrađivanjem antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično, izrazi "bolest koja se karakteriše prezentacijom antigena" označava bolest koja uključuje ćelije koje se karakterišu prezentacijom antigena, posebno sa MHC molekulima klase I. Ćelija može prezentovati antigen posle transfektovanja ćelije nukleinskom kiselinom kao što je RNK koja kodira antigen.
[0129] Pod "fragment antigena koji se prezentuje" ili sličnim izrazima misli se na to da fragment može da se prezentuje posredstvom MHC molekula klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, npr. kada se doda direktno antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji prirodno prezentuju ćelije koje eksprimiraju antigen.
[0130] Izraz "imunološki ekvivalentan" znači da imunološki ekvivalentan molekul kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca, ispoljava iste ili suštinski iste imunološke osobine i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr., u odnosu na tip imunološkog efekta kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, snaga i/ili dužina trajanja indukovane imunske reakcije, ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnog učenja, izraz "imunološki ekvivalentan" se poželjno koristi u vezi sa imunološkim efektima ili osobinama peptida upotrebljenog za imunizaciju. Na primer, aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna sa referentnom aminokiselinskom sekvencom ako pomenuta aminokiselinska sekvenca, kada se izloži imunskom sistemu subjekta, indukuje imunsku reakciju sa specifičnošću reagovanja sa referentnom aminokiselinskom sekvencom.
[0131] Izraz "imunske efektorske funkcije", u kontekstu predmetnog učenja, uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje rezultuju, na primer, ubijanjem tumorskih ćelija, ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i metastaza. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu predmetnog učenja su efektorske funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije uključuju u slučaju pomažuće T ćelije (CD4+ T ćelija) prepoznavanje, T-ćelijskim receptorima, antigena ili antigenog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II, oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, i u slučaju CTL, prepoznavanje T-ćelijskim receptorima, antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase I, eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, tj., ćelija koje se karakterišu prezentacijom antigena sa MHC molekulima klase I, na primer, apoptozom ili lizom ćelije posredovanom perforinom, proizvodnjom citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifičnim citolitičkim ubijanjem antigen-eksprimirajućih ciljnih ćelija.
[0132] Izrazi "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenia "MHC" uključuju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II i odnose se na kompleks gena koji se sreću kod svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli važni su za signalizaciju između limfocita i antigenprezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih za prepoznavanje T-ćelijskim receptorima. Proteini kodirani MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i T ćelijama prikazuju sopstvene antigene (peptidne fragmente iz same ćelije) i nesopstvene antigene (npr., fragmente invadirajućih mikroorganizama).
[0133] MHC region je podeljen u tri podgrupe, klasu I, klasu II, i klasu III. MHC proteini klase I sadrže α-lanac i p2-mikroglobulin (nije deo MHC kodiranog hromozomom 15). Oni prezentuju antigenske fragmente citotoksičnim T ćelijama. Na većini ćelija imunskog sistema, specifično na antigen-prezentujućim ćelijama, MHC proteini klase II sadrže α- i β-lance i oni prezentuju antigenske fragmente T-pomažućim ćelijama. MHC region klase III kodira druge imunske komponente, kao što su komponente komplementa i neke citokine.
[0134] MHC je poligenski (postoji nekoliko gena MHC klase I i gena MHC klase II) i polimorfan (za svaki gen postoji više alela).
[0135] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "haplotip" odnosi se na HLA alele koji se nalaze na jednom hromozomu i proteine koji se njima kodiraju. Haplotip može da se odnosi i na alel prisutan na bilo kojem lokusu unutar MHC. Svaka klasa MHC predstavljena je sa nekoliko lokusa: npr., HLA-A (humani leukocitni antigen-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P i HLA-V za klasu I i HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, i HLA-DOB za klasu II. Izrazi "HLA alel" i "MHC alel" koriste se u ovom tekstu naizmenično.
[0136] MHC ispoljavaju ekstremni polimorfizam. U humanoj populaciji postoji, na svakom genskom lokusu, veliki broj haplotipova koji uključuju posebne alele. Različiti polimorfni MHC aleli, i klase I i klase II, imaju različite peptidne specifičnosti po tome što svaki alel kodira proteine koji se vezuju sa peptidima koji ispoljavaju određene sekvencione obrasce.
[0137] U kontekstu predmetnog učenja, MHC molekul je poželjno HLA molekul.
[0138] U kontekstu predmetnog učenja, izraz "MHC-vezujući peptid" uključuje peptide koji se vezuju za MHC klase I i/ili klase II ili peptide koji se mogu obraditi da bi se proizveli peptidi koji se vezuju za MHC klase I i/ili klase II. U slučaju kompleksa MHC klase I/peptid, vezujući peptidi su dugi tipično 8-12, poželjno 8-10 amino-kiselina, mada efikasni mogu biti i duži i kraći peptidi. U slučaju kompleksa MHC klase II/peptid, vezujući peptidi su dugi tipično 9-30, poželjno 10-25 amino-kiselina i posebno dugi su 13-18 amino-kiselina, iako efikasni mogu biti i duži i kraći peptidi.
[0139] "Antigenski peptid" se poželjno odnosi na deo ili fragment antigena koji je sposoban da stimuliše imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena ili ćelija koje se karakterišu ekspresijom antigena i poželjno prezentovanjem antigena, kao što su obolele ćelije, posebno kancerske ćelije. Poželjno, antigenski peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja se karakterišu ekspresijom antigena sa MHC klase I i poželjno, sposoban je da stimuliše citotoksični T-limfocit koji odgovara na antigen (CTL). Poželjno, antigenski peptidi su peptidi koji se prezentuju sa MHC klase I i/ili klase II ili koji se mogu obraditi da bi proizveli peptide koji se prezentuju sa MHC klase I i/ili klase II. Poželjno, antigenski peptidi uključuju aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno, pomenuti fragment antigena je peptid koji se prezentuje sa MHC klase I i/ili klase II. Poželjno, antigenski peptid uključuje aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci takvog fragmenta i obrađena je da bi se proizveo takav fragment, tj., peptid koji se prezentuje sa MHC klase I i/ili klase II izveden iz antigena.
[0140] Ako se peptid prezentuje direktno, tj., bez obrade, posebno bez sečenja, ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, posebno molekulom MHC klase I, i poželjno dug je 7-20 amino-kiselina, poželjnije dug je 7-12 amino-kiselina, poželjnije dug je 8-11 aminokiselina, posebno dug je 9 ili 10 amino-kiselina.
[0141] Ako je peptid deo većeg entiteta koji sadrži dodatne sekvence, npr. vakcinsku sekvencu ili polipeptid, i treba da se prezentuje posle obrade, tačnije posle sečenja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, posebno molekulom MHC klase I, i poželjno dug je 7-20 amino-kiselina, poželjnije dug je 7-12 amino-kiselina, poželjnije dug je 8-11 amino-kiselina, posebno dug je 9 ili 10 amino-kiselina. Poželjno, sekvenca peptida koja se prezentuje posle obrade izvedena je iz aminokiselinske sekvence antigena, tj., njena sekvenca suštinski odgovara i poželjno potpuno je identična sa fragmentom antigena. Prema tome, MHC-vezujući peptid uključuje sekvencu koja suštinski odgovara i poželjno potpuno je identična sa fragmentom antigena.
[0142] Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje suštinski odgovaraju sekvenci peptida koji se prezentuje posredstvom MHC klase I mogu se razlikovati na jednoj ili više rezidua koje nisu esencijalne za prepoznavanje peptida prezentovanog posredstvom MHC klase I, od strane TCR, ili za vezivanje peptida za MHC. Takvi suštinski odgovarajući peptidi sposobni su i da stimulišu CTL koji odgovaraju na antigen i mogu se smatrati imunološki ekvivalentnim. Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje se razlikuju od prezentovanog peptida na reziduama koje ne utiču na prepoznavanje od strane TCR, ali poboljšavaju stabilnost vezivanja za MHC, mogu poboljšati imunogenost antigenskog peptida, i mogu se označiti u ovom tekstu kao "optimizovani peptid". Korišćenjem postojećeg znanja o tome za koju je od ovih rezidua verovatnije da utiče na vezivanje za MHC ili za TCR, može se upotrebiti racionalni pristup za dizajniranje odgovarajućih peptida. Rezultujući peptidi koji su funkcionalni razmatraju se kao antigenski peptidi.
[0143] Antigenski peptid, kada se prezentuje sa MHC, trebalo bi da može da bude prepoznat T-ćelijskim receptorom. Poželjno, antigenski peptid, ako bude prepoznat T-ćelijskim receptorom, sposoban je da indukuje, u prisustvu pogodnih kostimulatornih signala, klonsku ekspanziju T ćelije koja nosi T-ćelijski receptor koji specifično prepoznaje antigenski peptid. Poželjno, antigenski peptidi, posebno ako se prezentuju u kontekstu MHC molekula, sposobni su da stimulišu imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena iz kojeg su izvedeni ili ćelija koje se karakterišu ekspresijom antigena i poželjno koje se karakterišu prezentacijom antigena. Poželjno, antigenski peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja se karakteriše prezentacijom antigena sa MHC klase I i poželjno sposoban je da stimuliše CTL koji odgovaraju na antigen. Ta ćelija je poželjno ciljna ćelija.
[0144] Izraz "genom" odnosi se na ukupnu količinu genetičke informacije u hromozomima organizma ili ćelije.
[0145] Izraz "egzom" odnosi se na deo genoma organizma, formiran egzonima koji su kodirajući delovi eksprimiranih gena. Egzom obezbeđuje genetički obrazac koji se koristi u sintezi proteina i drugih funkcionalnih genskih proizvoda. To je funkcionalno najrelevantniji deo genoma i, dakle, najverovatnije je da doprinosi fenotipu organizma. Procenjuje se da egzom humanog genoma obuhvata 1.5% ukupnog genoma (Ng et al., 2008, PLoS Gen., 4(8):1-15).
[0146] Izraz "transkriptom" odnosi se na set svih RNK molekula, uključujući mRNK, rRNK, tRNK, i druge nekodirajuće RNK koji se proizvedu u jednoj ćeliji ili populaciji ćelija. U kontekstu predmetnog učenja, transkriptom ili RNKsek označava set svih RNK molekula proizvedenih u jednoj ćeliji, populaciji ćelija, poželjno populaciji kancerskih ćelija, ili svim ćelijama date individue u određenoj vremenskoj tački.
[0147] "Nukleinska kiselina" je poželjno deoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetička RNK. Nukleinske kiseline uključuju genomsku DNK, cDNK, mRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetisane molekule. Nukleinska kiselina može biti prisutna u vidu jednolančanog ili dvolančanog i linearnog ili kružnog kovalentno zatvorenog molekula. Nukleinska kiselina može biti izolovana. Izraz "izolovana nukleinska kiselina" znači da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (polymerase chain reaction, PCR), (ii) proizvedena rekombinantno kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, sečenjem i razdvajanjem gel-elektroforezom, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinska kiselina se može koristiti za uvođenje u ćelije, tj. transfekciju ćelija, posebno u vidu RNK koja se može pripremiti in vitro, transkripcijom sa DNK templata. Pored toga, RNK se pre primene može modifikovati stabilisanjem sekvence, dodavanjem "kape", i poliadenilacijom.
[0148] Izraz "genetički materijal" odnosi se na izolovanu nukleinsku kiselinu, DNK ili RNK, isečak dvostruke zavojnice, isečak hromozoma, ili ceo genom organizma ili ćelije, posebno njihov egzom ili transkriptom.
[0149] Izraz "mutacija" odnosi se na promenu ili razliku u sekvenci nukleinske kiseline (nukleotidna supstitucija, adicija ili delecija) u obolelom genomu u poređenju sa referentnim, i poželjno odgovarajućim normalnim genomom. "Somatska mutacija" može se sresti u bilo kojoj od ćelija tela, osim germinativnih ćelija (spermatozoid i jajna ćelija) i prema tome, ne prenosi se na decu. Ove promene mogu (ali ne uvek) izazvati kancer ili druge bolesti. Poželjno, mutacija je nesinonimna mutacija. Izraz "nesinonimna mutacija" odnosi se na mutaciju, poželjno nukleotidnu supstituciju, koja rezultuje aminokiselinskom promenom kao što je aminokiselinska supstitucija u translacionom proizvodu, koja poželjno rezultuje formiranjem neoepitopa.
[0150] Izraz "varijanta/varijacija pojedinačnog nukleotida" (SNV) odnosi se na razliku u sekvenci nukleinske kiseline na određenom mestu (alel) kada se upoređuju genom iz obolele ćelije kao što je tumorska ćelija, i genom poželjno odgovarajuće (korespondirajuće) normalne, neobolele ćelije ili referentni genom. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz mutacija poželjno obuhvata SNV.
[0151] Događaj varijacije broja kopija (copy number variation, CNV) u obolelom (tumorskom) genomu je događaj varijacije somatskog broja kopija koji se sreće samo u obolelim ćelijama, i definiše se kao promena broja kopija majčinih i/ili očevih alela regiona obolelog (tumorskog) genoma u odnosu na upareni normalni genom, pri čemu alternacija poželjno zahvata region genoma koji obuhvata približno 1 kb ili duži region.
[0152] Izraz "mutacija" uključuje tačkaste mutacije, indele, fuzije, hromotripsis i editovanja RNK.
[0153] Izraz "indel" opisuje specijalnu klasu mutacija koje e definišu kao mutacije koje rezultuju kolokalizovanom insercijom i delecijom i ukupnim dobitkom ili gubitkom nukleotida. U kodirajućim regionima genoma, osim ako dužina indela nije umnožak broja 3, one proizvode "frameshift" mutaciju (mutacija promene okvira čitanja). Indeli se mogu uporediti sa tačkastom mutacijom; dok indel insertuje i briše nukleotide iz sekvence, tačkasta mutacija je vid supstitucije kojom se zamenjuje jedan od nukleotida.
[0154] Fuzijama mogu nastati hibridni geni formirani od dva prethodno razdvojena gena. Može se sresti kao rezultat translokacije, intersticijalne delecije, ili hromozomske inverzije. Često, fuzioni geni su onkogeni. Onkogeni fuzioni geni mogu dati proizvod gena sa novom ili drugačijom funkcijom od funkcija dva fuziona partnera. Alternativno, protoonkogen se fuzioniše sa jačim promotorom, i time se onkogena funkcija postavlja u funkciju pod pozitivnom regulacijom jakim promotorom uzvodnog fuzionog partnera. Onkogeni fuzioni transkripti mogu biti izazvani i transsplajsujućim događajima ili "readthrough" događajima.
[0155] Izraz "hromotripsis" odnosi se na genetički fenomen kojim se jednim kritičnim događajem, specifični regioni genoma "razbijaju" i zatim povezuju.
[0156] Izraz "RNK editovanje" ili "editovanje RNK" označava molekularne procese u kojima se informacioni sadržaj u RNK molekulu menja hemijskim promenama u sklopu baza. RNK editovanje uključuje modifikacije nukleozida kao što su deaminacije citidin (C) u uridin (U) i adenozin (A) u inozin (I), kao i netemplatne nukleotidne adicije i insercije. RNK editovanje u mRNK efikasno menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina tako da se ona razlikuje od one koja je predviđena sekvencom genomske DNK.
[0157] Izraz "kancerska mutaciona signatura" označava set mutacija koje su prisutne u kancerskim ćelijama u poređenju sa nekanceroznim referentnim ćelijama.
4
[0158] "Referenca" u kontekstu predmetnog učenja može se upotrebiti za korelisanje i upoređivanje rezultata dobijenih iz tumorskih uzoraka. Tipično, "referenca" se može dobiti na osnovu jednog ili više normalnh uzoraka, tačnije uzoraka koji nisu zahvaćeni kancerskom bolešću, dobijenih od pacijenta ili jedne ili više različitih osoba, poželjno zdravih osoba, posebno osoba iste vrste. "Referenca" se može odrediti empirijski, testiranjem dovoljno velikog broja normalnih uzoraka.
[0159] Izraz "referentni genom" označava genom koji obezbeđuje koordinatni sistem za normalni genom i oboleli genom. Referentni genom se koristi za mapirajuća očitavanja i obezbeđivanje koordinatnog sistema za normalni genom i tumorski genom, pri čemu koordinatni sistem omogućava obezbeđivanje broja hromozoma, pozicije nukleotida u hromozomu, kao i smer očitavanja. Referentni genom može se bazirati na genomu jednog ili više članova iz iste vrste kao što je subjekt koji daje oboleli uzorak, ili se može bazirati na normalnom genomu subjekta (upareni genom).
[0160] U kontekstu predmetnog učenja, za identifikovanje mutacija specifičnih za bolest nože se koristiti bilo koji pogodni postupak sekvenciranja, poželjne su tehnologije sekvenciranja sledeće generacije (next generation sequencing, NGS), i opciono u kombinaciji sa SNP nizovima za dobijanje informacija o apsolutnom broju kopija. Postupci sekvenciranja treće generacije mogu zameniti tehnologiju NGS u budućnosti da bi se ubrzao korak sekvenciranja, postupka. U svrhu razjašnjenja: izrazi "sekvenciranje sledeće generacije" ili "NGS" u kontekstu predmetnog učenja označavaju sve nove visokopropusne tehnologije sekvenciranja koje, nasuprot postupcima "konvencionalnog" sekvenciranja poznatim kao Sanger-ova hemija, očitavaju template nukleinske kiseline nasumično, paralelno, duž čitavog genoma, razlaganjem čitavog genoma u manje delove. Takve tehnologije NGS (poznate i kao tehnologije masivnog paralelnog sekvenciranja) sposobne su da dostave informacije o sekvenci nukleinske kiseline za celi genom, egzom, transkriptom (sve transkribovane sekvence genoma) ili metilom (sve metilisane sekvence genoma) u veoma kratkim vremenskim periodima, npr. u roku od 1-2 nedelje, poželjno u roku od 1-7 dana ili najpoželjnije u roku od manje od 24 sata i omogućavaju, u principu, pristup sekvenciranja pojedinačnih ćelija. Veliki broj NGS platformi koje su komercijalno dostupne ili koje se pominju u literaturi mogu se upotrebiti u kontekstu predmetnog učenja npr. one koje su detaljno opisane u Zhang et al., 2011, The impact of nextgeneration sequencing on genomics, J. Genet Genomics 38(3):95-109; ili u Voelkerding et al., 2009, Next generation sequencing: From basic research to diagnostics, Clinical chemistry 55:641-658. Neograničavajući primeri takvih NGS tehnologija/platformi su
1) Tehnologija sekvenciranja sintezom, poznata kao pirosekvenciranje, implementirana npr. u GS-FLX 454 Genome Sequencer ™ kompanije pridružene Roche-u, 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), prvi put opisana u Ronaghi et al., 1998, A sequencing method based on real-time pyrophosphate, Science 281:363-365. U ovoj tehnologiji koristi se emulziona PCR u kojoj se perlice za koje se vezuje jednolančana DNK inkapsuliraju snažnim vorteksovanjem u vodene micele koje sadrže PCR reaktante okružene uljem za emulzionu PCR amplifikaciju. Tokom procesa pirosekvenciranja, svetlo emitovano sa molekula fosfata tokom inkorporisanja nukleotida beleži se kako se DNK lanac sintetiše polimerazom.
2) Pristupi sekvenciranja sintezom, koje su razvili Solexa (sada deo Illumina Inc., San Diego, California) zasnovani na reverzibilnim terminatorima markiranim bojom, koriste se npr. u Illumina/Solexa Genome Analyzer ™ i u Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™. U ovoj tehnologiji, sva četiri nukleotida se dodaju istovremeno u oligoprajmovane klaster-fragmente, u kanalima protočne ćelije, zajedno sa DNK polimerazom. Amplifikacijom postupkom mosta produžavaju se klaster-lanci sa sva četiri fluorescentno obeležena nukleotida za sekvenciranje.
3) Pristup sekvenciranja ligacijom, npr. koristi se u SOLid™ platformi Applied Biosystems (sada Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). U ovoj tehnologiji, pul svih mogućih oligonukleotida fiksirane dužine obeleži se prema sekvenciranoj poziciji. Oligonukleotidi se sparuju i povezuju; preferencijalna ligacija DNK-ligazom za uparivanje sekvenci rezultuje signalom koji daje informaciju o nukleotidu na toj poziciji. Pre sekvenciranja, DNK se amplifikuje emulzionom PCR. Rezultujuće perlice, svaka sadrži samo kopije istog DNK molekula, deponuju se na staklenoj pločici. Kao drugi primer, Polonator™ G.007 platforma, Dover Systems (Salem, New Hampshire) takođe upotrebljava pristup sekvenciranja ligacijom korišćenjem na perlicama zasnovane emulzione PCR sa nasumičnim nizovima za amplifikovanje DNK fragmenata za paralelno sekvenciranje.
4) Tehnologije sekvenciranja jednog molekula kao što su npr. korišćene u PacBio RS system, Pacific Biosciences (Menlo Park, California) ili u HeliScope™ platformi Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). Posebna karakteristika ove tehnologije je njena sposobnost da sekvencira pojedinačne DNK ili RNK molekule bez amplifikacije, što se definiše kao sekvenciranje jednog molekula DNK u realnom vremenu (single-molecule real time, SMRT). Na primer, HeliScope koristi visoko senzitivni sistem za detekciju fluorescencije, za direktno detektovanje svakog nukleotida, kako se sintetiše. Sličan pristup zasnovan na fluorescentno-rezonantnom energetskom transferu (fluorescence resonance energy transfer, FRET) razvili su Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Druge tehnike jednog molekula, zasnovane na fluorescenciji su iz U.S. Genomics (GeneEngine™) i Genovoxx (AnyGene ™). 5) Nano-tehnologije za sekvenciranje jednog molekula, u kojima se koriste različite nanostrukture koje su npr. aranžirane na čipu za praćenje kretanja molekula polimeraze na jednom lancu tokom replikacije. Neograničavajući primeri pristupa zasnovanih na nanotehnologijama su GridON™ platforma Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), platforme za hibridizacijom potpomognuto sekvenciranje tehnologijom nanopora (hybridization-assisted nano-pore sequencing, HANS™) koje su razvili Nabsys (Providence, Rhode Island), i vlasnička na ligazi bazirana platforma za sekvenciranje DNK sa tehnologijom DNK nanolopti (DNA nanoball, DNB), nazvana kombinovana ligacija proba-sidro (combinatorial probe-anchor ligation, cPAL™).
6) Tehnologije zasnovane na elektronskoj mikroskopiji, za sekvenciranje pojedinačnih molekula, npr. one koje su razvili LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) i Halcyon Molecular (Redwood City, California)
7) Jonsko poluprovodničko sekvenciranje koje je zasnovano na detektovanju vodonikovih jona koji se oslobađaju tokom polimerizacije DNK. Na primer, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) koristi niz mikromašinskih bunarčića velike gustine za izvođenje ovog biohemijskog procesa na masivno uporedan način. Svaki bunarčić nosi različiti DNK templat. Ispod bunarčića je jonsko-senzitivni sloj i ispod toga je vlasnički jonski senzor.
[0161] U jednom primeru izvođenja, da li je došlo do mutacije specifične za bolest može se odrediti postupkom povezanim sa utvrđivanjem da je mesto u normalnom genomu konzistentno sa homozigornim genotipom, što se reflektuje normalnim alelom i trima alelima šuma, i idealnom distribucijom šuma i proglašavanjem mutacije kada korespondirajuće mesto u genomu tumora nije konzistentno sa homozigotnim genotipom i idealnom distribucijom šuma, pri čemu su očitavanja konzistentna sa idealnom distribucijom šuma ako očitavanja mapiraju svaki od alela šuma sa verovatnoćom od jedne trećine stope greške po bazi, kao što je objavljeno u Međunarodnoj PCT patentnoj prijavi pod naslovom "Highly Accurate Mutation Detection, In Particular for Personalized Therapeutics" podnetoj istog datuma kao ova, čija objava je inkorporisana u ovaj tekst kao referenca, u celini.
4
[0162] Poželjno, DNK i RNK preparati služe kao polazni materijal za NGS. Takve nukleinske kiseline se mogu lako dobiti iz uzoraka kao što je biološki materijal, npr. iz svežeg, brzo zamrznutog ili u formalinu fiksiranog i u parafinu ukalupljenog tumorskih tkiva (formalin-fixed paraffin embedded tumor tissues, FFPE) ili iz sveže izolovanih ćelija ili iz CTC prisutnih u pacijentovoj perifernoj krvi. Normalna nemutirana genomska DNK ili RNK mogu se ekstrahovati iz normalnog, somatskog tkiva, međutim u kontekstu predmetnog učenja poželjne su ćelije germinativne linije. DNK ili RNK germinativne linije ekstrahju se iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pacijenata sa nehematološkim malignitetima. Iako su nukleinske kiseline ekstrahovane iz FFPE tkiva ili sveže izolovanih pojedinačnih ćelija visoko fragmentisane, one su pogodne za primenu u NGS.
[0163] U literaturi je opisano nekoliko ciljanih postupaka NGS za sekvenciranje egzoma (za pregled vidi, npr., Teer and Mullikin, 2010, Human Mol Genet 19(2):R145-51), koji se svi mogu koristiti sa predmetnim učenjem. Mnogi od ovih postupaka (opisani npr. kao "hvatanje" genoma, podela genoma, obogaćivanje genoma itd.) koriste tehnike hibridizacije i uključuju hibridizacione pristupe zasnovane na nizovima (npr., Hodges et al., 2007, Nat. Genet.39:1522-1527) i zasnovane na tečnosti (npr., Choi et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci USA 106:19096-19101). Komercijalni kitovi za pripremanje uzorka DNK i potom "hvatanje" egzoma, takođe su dostupni: na primer, Illumina Inc. (San Diego, California) nude TruSeq™ Kit za pripremanje uzorka DNK i Exome Enrichment Kit TruSeq™ kit za obogaćivanje egzoma.
[0164] Kako bi se smanjio broj lažno pozitivnih nalaza u detektovanju kancer-specifičnih somatskih mutacija ili razlika sekvenci, pri upoređivanju npr. sekvence tumorskog uzorka sa sekvencom referentnog uzorka kao što je sekvenca uzorka germinativne linije, poželjno je odrediti sekvencu u replikatima jednog ili oba ova tipa uzoraka. Prema tome, poželjno je da se sekvenca referentnog uzorka, na primer sekvenca uzorka germinativne linije, određuje dva puta, tri puta ili više. Alternativno ili dodatno, sekvenca tumorskog uzorka određuje se dva puta, tri puta ili više. Sekvencu referentnog uzorka, kao što je sekvenca uzorka germinativne linije i/ili sekvenca tumorskog uzorka moguće je odrediti više nego jednom i određivanjem, najmanje jednom, sekvence u genomskoj DNK i određivanjem, najmanje jednom, sekvence u RNK pomenutog referentnog uzorka i/ili pomenutog tumorskog uzorka. Na primer, određivanjem varijacija između replikata referentnog uzorka kao što je uzorak germinativne linije, može se proceniti očekivana stopa lažno pozitivnih (FDR) somatskih mutacija kao statistička veličina. Tehnički replikati uzorka trebalo bi da daju identične rezultate i svaka detektovana mutacija u ovom "poređenju istog sa istim" je lažno pozitivna. Posebno, da bi se odredila stopa lažnog otkrivanja u detekciji somatskih mutacija u tumorskom uzorku, u odnosu na referentni uzorak, tehnička replika referentnog uzorka može se koristiti kao referentna za procenu broja lažno pozitivnih nalaza. Pored toga, različite metrike vezane za kvalitet (npr. pokrivenost ili SNP kvalitet) mogu se kombinovati u jednom skoru kvaliteta, korišćenjem pristupa mašinskog učenja. Opciono, za datu somatsku varijaciju, mogu se računati sve druge varijacije sa višom ocenom kvaliteta, što omogućava rangiranje svih varijacija u skupu podataka.
[0165] U kontekstu predmetnog učenja, izraz "RNK" odnosi se na molekul koji sadrži najmanje jednu ribonukleotidnu reziduu i poželjno u celini je ili je suštinski sastavljen od ribonukleotidnih rezidua. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2’-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Izraz "RNK" uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetsku RNK, i rekombinantno generisanu RNK kao što je modifikovana RNK koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili alteraciji jednog ili više nukleotida. Takve alteracije mogu obuhvatati adiciju nenukleotidnog materijala, na primer na kraju(-evima) RNK ili u unutrašnjosti, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulu mogu uključivati i nestandardne nukleotide, kao što su neprirodni nukleotidi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili deoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu se označiti kao analozi ili analozi pririodnih RNK.
[0166] Izraz "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "mRNK". Izraz "mRNK" označava "mesendžer-RNK" i odnosi se na "transkript" koji se stvara korišćenjem DNK templata i koji kodira peptid ili polipeptid. Tipično, mRNK uključuje 5’-UTR, protein-kodirajući region, i 3’-UTR. mRNK ima samo ograničen poluživot u ćelijama i in vitro. U kontekstu predmetnog učenja, mRNK može se generisati in vitro transkripcijom sa DNK templata. Metodologija in vitro transkripcije poznata je stručnjaku. Na primer, postoje različiti komercijalno dostupni in vitro transkripcioni kitovi.
[0167] Stabilnost i translaciona efikasnost RNK mogu se po potrebi modifikovati. Na primer, RNK se može stabilisati i njena translacija povećati putem jedne ili više modifikacija koje imaju stabilišuće efekte i/ili koje povećavaju translacionu efikasnost RNK. Takve modifikacije opisane su, na primer, u PCT/EP2006/009448. U cilju povećanja ekspresije RNK upotrebljene u primerima izvođenja predmetnog učenja, ona se može modifikovati unutar kodirajućeg regiona, tj. sekvence koja kodira eksprimirani peptid ili protein, poželjno bez izmene sekvence eksprimiranog peptida ili proteina, tako što se poveća GC-sadržaj da bi se povećala stabilnost mRNK i izvela optimizacija kodona i povećala translacija u ćelijama.
[0168] Izraz "modifikacija" u kontekstu RNK, upotrebljen u predmetnom učenju, uključuje svaku modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.
4
[0169] U jednom primeru izvođenja učenja, RNK upotrebljena u skladu sa učenjem nema 5’-trifosfate bez "kape". Uklanjanje takvih 5’-trifosfata koji nemaju "kapu" može se postići tretiranjem RNK fosfatazom.
[0170] RNK u skladu sa učenjem može imati modifikovane ribonukleotide u cilju povećavanja stabilnosti i/ili smanjenja citotoksičnosti. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK upotrebljenoj prema učenju, citidin je delimično ili potpuno, poželjno potpuno, supstituisan 5-metilcitidinom. Alternativno ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u RNK upotrebljenoj prema učenju, uridin je supstituisan delimično ili potpuno, poželjno potpuno, pseudouridinom.
[0171] U jednom primeru izvođenja, izraz "modifikacija" odnosi se na obezbeđivanje RNK sa 5’-"kapom" ili 5’-"kapa" analogom. Izraz "5’-kapa" označava "kapa" strukturu koja se nalazi na 5’-kraju mRNK molekula i uopšteno, sastoji se od guanozinskog nukleotida spojenog sa mRNK preko neobične 5’ ka 5’ trifosfatnom vezom. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilisan na poziciji 7. Izraz "konvencionalna 5’-kapa" označava prirodnu RNK 5’-"kapu", poželjno 7-metilguanozin "kapu" (m<7>G). U kontekstu predmetnog učenja, izraz "5’-kapa" uključuje 5’-"kapa" analog koji liči na RNK "kapa" strukturu i modifikovan je da ima spsoobnost da stabiliše RNK i/ili pojača translaciju RNK ako je zakačen za nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.
[0172] Obezbeđivanje RNK sa 5’-"kapom" ili 5’-"kapa" analogom može se postići transkripcijom DNK templata in vitro u prisustvu pomenutih 5’-"kape" ili 5’-"kapa" analoga, pri čemu se pomenuti 5’-"kapa" kotranskripciono inkorporiše u generisani RNK lanac, ili se RNK može generisati, na primer, in vitro transkripcijom, i 5’-"kapa" se može prikačiti za RNK posttranskripciono korišćenjem enzima za dodavanje "kape", na primer, enzima za dodavanje "kape" vakcinija virusa.
[0173] RNK može sadržati dodatne modifikacije. Na primer, dodatna modifikacija RNK upotrebljene u ovom učenju može biti produženje ili skraćenje prirodnog poli(A) repa ili izmena 5’- ili 3’-netranslatujućih regiona (untranslated regions, UTR) na primer uvođenje UTR koji nije u vezi sa kodirajućim regionom pomenute RNK, na primer, zamena postojećeg 3’-UTR ili insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3’-UTR poreklom iz globinskog gena, kao što je alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani beta-globin.
[0174] RNK koja ima demaskiranu poli-A sekvencu translatuje se efikasnije nego RNK koja ima maskiranu poli-A sekvencu. Izraz "poli(A) rep" ili "poli-A sekvenca" odnosi se na sekvencu adenil (A) rezidua koje se tipično nalaze na 3’-kraju RNK molekula, a "nemaskirana poli-A sekvenca" znači da se poli-A sekvenca na 3’ kraju RNK molekula završava sa A iz poli-A sekvence i nije praćena nukleotidima različitim od A koji bi se nalazili na 3’ kraju, tj.
4
nizvodno od poli-A sekvence. Pored toga, duga poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova rezultuje optimalnom stabilnošću transkripta i translacionom efikasnošću RNK.
[0175] Prema tome, u cilju povećanja stabilnosti i/ili ekspresije RNK upotrebljene u skladu sa predmetnim učenjem, ona se može modifikovati tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, poželjno male dužine od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i posebno 100 do 150 adenozinskih rezidua. U posebno poželjnom primeru izvođenja poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 adenozinskih rezidua. Da bi se dodatno povećale stabilnost i/ili ekspresija RNK upotrebljene u skladu sa učenjem, poli-A sekvenca može biti nemaskirana.
[0176] Pored toga, inkorporisanje 3’-netranslatujućeg regiona (UTR) u 3’-netranslatujući region RNK molekula može rezultovati pojačanjem efikasnosti translacije. Sinergistički efekat može se postići inkorporisanjem dva ili više takvih 3’-netranslatujućih regiona. 3’-netranslatujući regioni mogu biti autologni ili heterologni sa RNK u koju se uvode. U jednom posebnom primeru izvođenja 3’-netranslatujući region je poreklom iz humanog β-globinskog gena.
[0177] Kombinacije gore opisanih modifikacija, tj. inkorporacija poli-A sekvenve, demaskiranje poli-A sekvence i inkorporisanje jednog ili više 3’-netranslatujućih regiona, imaju sinergistički uticaj na stabilnost RNK i povećavaju efikasnost translacije.
[0178] Izraz "stabilnost RNK" odnosi se na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na period vremena koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu predmetnog učenja, poluživot RNK ukazuje na stabilnost pomenute RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će se RNK koja ima dug poluživot eksprimirati tokom produženog vremenskog perioda.
[0179] Naravno, ako je poželjno smanjiti stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK, moguće je modifikovati RNK tako da interferira sa funkcijom elemenata opisanih gore koji povećavaju stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK.
[0180] Izraz "ekspresija" koristi se u svom najopštijem značenju i uključuje proizvodnju RNK i/ili peptida ili polipeptida, npr. transkripcijom i/ili translacijom. U vezi sa RNK, izraz "ekspresija" ili "translacija" odnosi se posebno na proizvodnju peptida ili polipeptida. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može biti prolazna ili stabilna.
[0181] Izraz ekspresija uključuje i "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju". "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" znači da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referentnom, npr. stanjem kod subjekta koji nema bolest udruženu sa
4
aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., tumorskog antigena. Porast ekspresije odnosi se na porast za najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se sreće samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom.
[0182] Izraz "specifično eksprimiran" znači da se protein suštinski eksprimira samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen se specifično eksprimira u želudačnoj mukozi što znači da se pomenuti protein primarno eksprimira u želudačnoj mukozi i da se ne eksprimira u drugim tkivima ili se ne eksprimira u značajnoj meri u drugim tipovima tkiva ili organa. Prema tome, protein koji se isključivo eksprimira u ćelijama želudačne mukoze i u značajno manjoj meri u bilo kojem drugom tkivu, kao što je testis, specifično se eksprimira u ćelijama želudačne mukoze. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen može se takođe specifično eksprimirati pod normlanim uslovima u više nego jednom tipu tkiva ili organu, na primer u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U tom slučaju, tumorski antigen se specifično eksprimira u ovim organima. Na primer, ako se tumorski antigen eksprimira pod normalnim uslovima poželjno u približno jednakoj meri u plućima i želucu, pomenuti tumorski antigen se specifično eksprimira u plućima i želucu.
[0183] U kontekstu predmetnog učenja, izraz "transkripcija" odnosi se na proces u kojem se genetički kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Posle toga, RNK može da se translatuje u protein. U skladu sa predmetnim učenjem, izraz "transkripcija" uključuje "in vitro transkripciju", pri čemu se izraz "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kojem se RNK, posebno mRNK, in vitro sintetiše u sistemu koji ne sadrži ćelije, poželjno uz korišćenje odgovarajućih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, klonirajući vektori se primenjuju za generisanje transkripata. Ovi klonirajući vektori se uopšteno dizajniraju kao transkripcioni vektori i obuhvaćeni su izrazom "vektor". RNK upotrebljena u predmetnom učenju poželjno je in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK templata. Promotor za kontrolisanje transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Posebni primeri RNK polimeraze su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. Poželjno, in vitro transkripcija se kontroliše T7 ili SP6 promotorom. DNK templat za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i njenim uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK može se dobiti reverznom transkripcijom RNK.
[0184] Izraz "translacija" odnosi se na proces u ribozomima ćelije, kojim lanac mesendžer RNK usmerava asambliranje sekvence amino-kiselina da bi se proizveo peptid ili polipeptid.
4
[0185] Ekspresione kontrolne sekvence ili regulatorne sekvence, koje u kontekstu predmetnog učenja mogu biti funkcionalno povezane sa nukleinskom kiselinom, mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna skevenca povezane su međusobno "funkcionalno" ako su međusobno kovalentno povezane, tako da je transkripcija ili translacija kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem regulatorne sekvence. Ako kodirajuća sekvenca treba da se translatuje u funkcionalni protein, uz funkcionalnu vezu regulatorne sekvence sa kodirajućom sekvencom, uvođenje regulatorne sekvence dovodi do transkripcije kodirajuće sekvence, bez izazivanja pomaka u ramu čitanja u kodirajućoj sekvenci koja treba da se translatuje u željeni protein ili peptid.
[0186] Izraz "ekspresiona kontrolna sekvenca" ili "regulatorna sekvenca" uključuje, u kontekstu učenja, promotore, ribozom-vezujuće sekvence i druge kontrolne elemente, koji kontrolišu transkripciju nukleinske kiseline ili translaciju izvedene RNK. U određenim primerima izvođenja, regulatorne sekvence se mogu kontrolisati. Precizna struktura regulatornih sekvenci može varirati u zavisnosti od vrste ili u zavisnosti od tipa ćelije, ali uopšteno uključuje 5’-netranskribujuće i 5’- i 3’-netranslatujuće sekvence, koje su uključene u inicijaciju transkripcije ili translacije, kao što su TATA-boks, "kapa"-sekvenca, CAAT-sekvenca i slično. Posebno, 5’-netranskribujuće regulatorne sekvence uključuju promotorski region koji sadrži promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezanog gena. Regulatorne sekvence takođe mogu uključivati enhenserske sekvence ili uzvodne aktivatorske sekvence.
[0187] Poželjno, RNK koja treba da se eksprimira u ćeliji uvodi se u pomenutu ćeliju. U jednom primeru izvođenja postupaka u skladu sa učenjem, RNK koja treba da se uvede u ćeliju dobija se in vitro, transkripcijom odgovarajućeg DNK templata.
[0188] Izrazi kao što su "RNK sposobna za ekspresiju" i "RNK koja kodira" koriste se naizmenično u ovom tekstu i, u odnosu na određeni peptid ili polipeptid, znače da RNK, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može da se eksprimira da bi se proizveo pomenuti peptid ili polipeptid. Poželjno, RNK je sposobna da interaguje sa ćelijskom translacionom mašinerijom da bi se proizveo peptid ili polipeptid koji može da eksprimira.
[0189] Izrazi kao što su "transfer", "uvođenje" ili "transfektovanje" koriste se naizmenično u ovom tekstu i odnose se na uvođenje nukleinskih kiselina, posebno egzogenih ili heterolognih nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju. U skladu sa predmetnim učenjem, ćelija može činiti deo organa, tkiva i/ili organizma. U skladu sa predmetnim učenjem, nukleinska kiselina se primenjuje ili kao ogoljena nukleinska kiselina ili u kombinaciji sa reagensom za primenu. Poželjno, nukleinske kiseline se primenjuju kao ogoljene nukleinske kiseline. Poželjno, RNK
4
se primenjuje u kombinaciji sa stabilišućim supstancama kao što su inhibitori RNaze. Predmetno učenje predviđa i ponavljano uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, da bi se omogućila trajna ekspresija tokom dužih vremenskih perioda.
[0190] Ćelije se mogu transfektovati bilo kojim nosačima sa kojima se RNK može udružiti, npr. formiranjem kompleksa sa RNK ili formiranjem vezikula u kojima je RNK zatvorena ili inkapsulirana, što rezultuje povećanom stabilnošću RNK u poređenju sa ogoljenom RNK. Korisni nosači uključuju, na primer, nosače koji sadrže lipide kao što su katjonski lipidi, lipozomi, posebno katjonski lipozomi, i micele, i nanočestice. Katjonski lipidi mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Može se upotrebiti bilo koji katjonski lipid.
[0191] Poželjno, uvođenje RNK koja kodira peptid ili polipeptid u ćeliji, posebno u ćeliji prisutnoj in vivo, rezultuje ekspresijom pomenutog peptida ili polipeptida u ćeliji. U posebnim primerima izvođenja, poželjno je usmeravanje nukleinskih kiselina ka određenim ćelijama. U takvim primerima izvođenja, nosač koji se koristi za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju (na primer, retrovirus ili lipozom), izlaže ciljajući molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo specifično za membranski protein na površini ciljne ćelije ili ligand za receptor na ciljnoj ćeliji, može se inkorporisati u nosač nukleinske kiseline ili se može za nju vezati. U slučaju da se nukleinska kiselina uvodi pomoću lipozoma, proteini koji se vezuju za površinski protein membrane povezan sa endocitozom, mogu se inkorporisati u lipozomsku formulaciju u cilju omogućavanja ciljanja i/ili preuzimanja. Takvi proteini obuhvataju kapsidne proteine ili njihove fragmente specifične za određeni tip ćelije, antitela protiv proteina koji se internalizuju, proteine koji ciljaju mesto unutar ćelije, itd.
[0192] Izraz "ćelija" ili "ćelija-domaćin" poželjno znači intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom, koja nije oslobodila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj. živa ćelija koja može da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno, pomenuti izraz se odnosi na svaku ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati egzogenom nukleinskom kiselinom. Izraz "ćelija" uključuje prokariotske ćelije (npr., E. coli) ili eukariotske ćelije (npr., dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca, i insekatske ćelije). Egzogena nukleinska kiselina može se naći unutar ćelije (i) slobodno dispergovana kao takva, (ii) inkorporisana u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ćelije-domaćina ili u mitohondrijalnu DNK. Posebno su poželjne sisarske ćelije kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza i primata. Ćelije se mogu izvesti iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži, i embrionalne matične ćelije. U drugim primerima izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit, ili makrofag.
[0193] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom.
[0194] Izraz "klonska ekspanzija" označava proces u kojem se specifični entitet umnožava. U vezi sa predmetnim učenjem, izraz se poželjno koristi u kontekstu imunskog odgovora u kojem se limfociti stimulišu antigenom, proliferišu i specifični limfocit koji prepoznaje pomenuti antigen se amplifikuje. Poželjno, klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.
[0195] Izrazi kao što su "smanjivanje" ili "inhibiranje" odnose se na sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili veće, 10% ili veće, 20% ili veće, poželjnije od 50% ili veće i najpoželjnije od 75% ili veće, nivoa. Izraz "inhibirati" ili slične fraze, uključuje potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. smanjenje na nulu ili suštinski na nulu.
[0196] Izrazi kao što su "povećanje", "pojačanje", "promovisanje" ili "produžavanje" poželjno se odnose na povećanje, pojačanje, promociju ili produženje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 100%, poželjno najmanje 200% i posebno najmanje 300%. Ovi izrazi mogu se odnositi i na povećanje, pojačanje, promociju ili produženje od nule ili nemerljivog ili nedetektabilnog nivoa do nivoa većeg od nule ili nivoa koji je merljiv ili detektabilan.
[0197] U skladu sa predmetnim učenjem, izraz "peptid" označava supstancu koja sadrži dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 aminokiselina, kovalentno povezanih peptidnim vezama. Izraz "polipeptid" ili "protein" označava velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 aminokiselinskih rezidua, ali uopšteno izrazi "peptid", "polipeptid" i "protein" su sinonimi i koriste se naizmenično u ovom tekstu. U skladu sa učenjem, izraz "modifikacija" ili "promena sekvence" u vezi sa peptidima, polipeptidima ili proteinima, odnosi se na promenu sekvence peptida, polipeptida ili proteina u poređenju sa roditeljskom sekvencom kao što je sekvenca divljeg tipa peptida, polipeptida ili proteina. Izraz uključuje aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i aminokiselinske supstitucione varijante, poželjno aminokiselinske supstitucione varijante. Sve ove promene sekvence u skladu sa učenjem mogu potencijalno stvoriti nove epitope.
1
[0198] Aminokiselinske insercione varijante uključuju insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu.
[0199] Aminokiselinske adicione varijante uključuju amino i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više amino-kiselina, na primer 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više amino-kiselina.
[0200] Aminokiselinske delecione varijante karakterišu se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, na primer uklanjanjem 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više amino-kiselina.
[0201] Aminokiselinske supstitucione varijante karakterišu se najmanje jednom reziduom uklonjenom iz sekvence i drugom reziduom insertovanom na njeno mesto.
[0202] U skladu sa učenjem, modifikacija ili modifikovani peptid upotrebljen za testiranje u postupcima učenja može se izvesti iz proteina koji sadrži modifikaciju.
[0203] Izraz "izveden" znači, u skladu sa učenjem, da je taj određeni entitet, posebno određena peptidna sekvenca, prisutna u objektu iz kojeg je izvedena. U slučaju aminokiselinskih sekvenci, posebno određenih sekvencionih regiona, "izveden" posebno znači da je relevantna aminokiselinska sekvenca izvedena iz aminokiselinske sekvence u kojoj je prisutna.
[0204] Sredstva, kompozicije i postupci opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje subjekta koji ima bolest, npr., bolest koja se karakteriše prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju antigen i prezentuju antigenski peptid. Posebno poželjna oboljenja su kancerska oboljenja. Sredstva, kompozicije i postupci opisani u ovom tekstu mogu se koristiti i za imunizaciju ili vakcinaciju, kako bi se prevenirala bolest opisana u ovom tekstu.
[0205] Jedno takvo sredstvo je vakcina kao što je kancerska vakcina dizajnirana na osnovu podobnih neoepitopa koji ne podležu imunskom "bekstvu", identifikovanih postupcima predmetnog učenja.
[0206] U skladu sa učenjem, izraz "vakcina" odnosi se na farmaceutski preparat (farmaceutsku kompoziciju) ili proizvod koji posle primene indukuje imunski odgovor, posebno ćelijski imunski odgovor, koji prepoznaje i napada patogen ili obolelu ćeliju kao što je kancerska ćelija. Vakcina može da se koristi za prevenciju ili lečenje oboljenja. Izraz "personalizovana kancerska vakcina" ili "individualizovana kancerska vakcina" tiče se određenog pacijenta sa kancerom i znači da je kancerska vakcina prilagođena potrebama ili posebnim uslovima pojedinačnog pacijenta sa kancerom.
[0207] Kada se kancerska vakcina data prema učenju primeni kod pacijenta, obezbeđuje jedan ili više epitopa za T ćelije, za stimulisanje, podsticanje i/ili ekspandiranje T ćelija specifičnih za pacijentov tumor. T ćelije su poželjno usmerene protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih je izveden epitop za T ćelije. Prema tome, vakcine opisane u ovom tekstu su poželjno sposobne da indukuju ili promovišu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost T citotoksičnih ćelija,
2
protiv kancerskog oboljenja, koji se karakteriše prezentacijom jednog ili više tumor-asociranih neoantigena u kontekstu MHC klase I. Pošto će vakcina obezbeđena u ovom tekstu ciljati mutacije specifične za kancer, ona će biti specifična za pacijentov tumor.
[0208] U kontekstu predmetnog učenja, vakcina se odnosi na vakcinu koja, kada se primeni kod pacijenta, poželjno obezbeđuje jedan ili više epitopa za T ćelije (neoepitopi, podobni neoepitopi, kombinacija podobnih neoepitopa identifikovanih u ovom tekstu), na primer 2 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više i poželjno do 60, do 55, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 T-ćelijskih epitopa, koji inkorporišu aminokiselinske modifikacije ili modifikovane peptide za koje je pretpostavljeno da su podobni epitopi. Prezentacija ovih epitopa od strane pacijentovih ćelija, posebno antigen-prezentujućih ćelija, poželjno rezultuje T ćelijama koje ciljaju epitope kada su vezani za MHC i, dakle, pacijentov tumor, poželjno primarni tumor, kao i tumorske metastaze, koji eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi za T ćelije i prezentuju iste epitope na površini tumorskih ćelija.
[0209] Postupci ovog učenja mogu uključivati dodatni korak utvrđivanja upotrebljivosti identifikovane aminokiselinske modifikacije ili modifikovanih peptida koji sadrže podoban neoepitop identifikovan u ovom tekstu za vakcinaciju protiv kancera. Prema tome, dodatni koraci mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: (i) procenu da li su modifikacije locirane u poznatim ili predviđenim MHC-prezentovanim epitopima, (ii) in vitro i/ili in silico testiranje da li su modifikacije locirane u MHC-prezentovanim epitopima, npr. testiranje da li su modifikacije deo peptidnih sekvenci koje se obrađuju i/ili prezentuju kao MHC-prezentovani epitopi, i (iii) in vitro testiranje da li su predviđeni modifikovani epitopi, posebno kada su prisutni u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr. kada su bočno ograničeni aminokiselinskim sekvencama koje bočno ograničavaju pomenute epitope i u prirodnom proteinu, i kada se eksprimiraju u antigen-prezentujućim ćelijama, sposobni da stimulišu T ćelije kao što su T ćelije pacijenta željene specifičnosti. Takve bočne sekvence mogu sadržati 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina i mogu biti na bokovima epitopske sekvence N-terminalno i/ili C-terminalno.
[0210] Modifikovani peptidi određeni u skladu sa učenjem mogu se rangirati u pogledu svoje upotrebljivosti kao epitopa za kancersku vakcinaciju. Prema tome, u jednom aspektu, postupak učenja uključuje ručni ili kompjuterski bazirani analitički proces u kojem se identifikovani modifikovani peptidi analiziraju i biraju u pogledu svoje upotrebljivosti u odgovarajućoj vakcini koju treba obezbediti. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti analitički proces je proces baziran na kompjuterskim algoritmima. Poželjno, pomenuti analitički proces uključuje određivanje i/ili rangiranje epitopa prema predviđanju njihovog kapaciteta da budu imunogeni.
[0211] Epitopi identifikovani u skladu sa učenjem i obezbeđeni u vakcini, poželjno su prisutni u vidu polipeptida koji sadrži pomenute epitope (neoepitope, podobne neoepitope, neoepitope koji se nalaze u kombinaciji podobnih neoepitopa identifikovanih u ovom tekstu) kao što su poliepitopski polipeptid ili nukleinska kiselina, posebno RNK, koja kodira pomenuti polipeptid. Pored toga, epitopi mogu biti prisutni u polipeptidu u vidu vakcinske sekvence, tj. prisutni u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr. bočno ograničeni aminokiselinskim sekvencama koje bočno ograničavaju pomenute epitope i u prirodnom proteinu. Svaka od tih bočnih sekvenci može sadržati 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina i mogu ograničavati epitopsku sekvencu N-terminalno i/ili C-terminalno. Prema tome, vakcinska sekvenca može sadržati 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 35 ili više, 40 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina. U jednom primeru izvođenja, epitopi i/ili vakcinske sekvence nalaze se u polipeptidu u orijentaciji glava prema repu.
[0212] U jednom primeru izvođenja, epitopi/podobni neoepitopi identifikovani u ovom tekstu i/ili vakcinske sekvence, razdvojeni su linkerima, posebno neutralnim linkerima. Izraz "linker" upotrebljen u kontekstu predmetnog učenja odnosi se na peptid dodat između dva peptidna domena kao što su epitopi ili vakcinske sekvence da bi se pomenuti peptidni domeni povezali. Ne postoje posebna ograničenja u vezi sa linkerskom sekvencom. Međutim, poželjno je da linkerska sekvenca smanji sterično ometanje između dva peptidna domena, da se dobro translatuje, i podržava ili omogućava obradu epitopa. Pored toga, linker bi trebalo da ne sadrži ili da sadrži samo malo imunogenih sekvencionih elemenata. Linkeri poželjno ne bi trebalo da stvaraju neendogene epitope kao što su oni nastali od spojnog šava između susednih epitopa, koji bi mogli stvoriti neželjene imunske reakacije. Prema tome, poliepitopska vakcina bi trebalo poželjno da sadrži linkerske sekvence koje mogu da smanje broj neželjenih MHC-vezujućih spojnih epitopa. Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) i Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) pokazali su da sekvence bogate glicinom ometaju obradu proteazomima, tako da korišćenje linkerskih sekvenci bogatih glicinom na najmanju moguću meru svodi broj linker-sadržavajućih peptida koji se mogu obrađivati proteazomom. Pored toga, zapaženo je da glicin inhibira snažno vezivanje na mestima MHC-vezujućeg žleba (Abastado et al., 1993, J. Immunol. 151(7):3569-75). Schlessinger et al., 2005, Proteins 61(1): 115-26 našli su da amino-kiseline glicin i serin uključene u aminokiselinsku sekvencu rezultuju fleksibilnijim proteinom koji se efikasnije translatuje i obrađuje proteazomom, što omogućava bolji pristup kodiranim epitopima. Svaki linker može sadržati 3 ili više, 6 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina.
4
Poželjno, linker je obogaćen amino-kiselinama glicinom i/ili serinom. Poželjno, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% amino-kiselina linkera su glicin i/ili serin. U jednom poželjnom primeru izvođenja, linker je suštinski sastavljen od amino-kiselina glicina i serina. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e gde su a, b, c, d i e nezavisno brojevi koji se biraju između 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 i gde je a b c d e različito od 0 i poželjno je 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više ili 5 ili više. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u ovom tekstu koja uključuje linkerske sekvence opisane u primerima kao što je sekvenca GGSGGGGSG.
[0213] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, polipeptid koji uključuje jedan ili više pogodnih neoepitopa identifikovanih postupcima u ovom tekstu, kao što je poliepitopski polipeptid, primenjuje se kod pacijenta u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja se može eksprimirati u ćelijama pacijenta kao što su antigen-prezentujuće ćelije, da bi se proizveo polipeptid. Predmetno učenje takođe predviđa primenu jednog ili više multiepitopskih polipeptida koji su u svrhu predmetnog učenja obuhvaćeni izrazom "poliepitopski polipeptid", poželjno u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja se može eksprimirati u ćelijama pacijenta kao što su antigen-prezentujuće ćelije da bi se proizveo jedan ili više polipeptida. U slučaju primene više od jednog multiepitopskog polipeptida pogodni neoepitopi obezbeđeni različitim multiepitopskim polipeptidima mogu biti različiti ili delimično preklapajući. Kada se nađe u pacijentovim ćelijama kao što su antigen-prezentujuće ćelije, polipeptid u skladu sa učenjem obrađuje se da bi se proizveli podobni neoepitopi identifikovani u skladu sa učenjem. Primena vakcine obezbeđene u skladu sa učenjem može dati epitope koji se prezentuju u kontekstu MHC klase II, sposobne da pobude odgovor CD4+ pomažućih T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su izvedeni epitopi prezentovani u kontekstu MHC. Alternativno ili dodatno, primena vakcine obezbeđene u skladu sa učenjem može obezbediti neoepitope koji se prezentuju u kontekstu MHC klase I, sposobne da pobude odgovor CD8+ T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su izvedeni neoepitopi prezentovani u kontekstu MHC. Pored toga, primena vakcine obezbeđene u skladu sa učenjem može obezbediti jedan ili više neoepitopa (uključujući poznate neoepitope i podobne neoepitope identifikovane u skladu sa učenjem) kao i jedan ili više epitopa koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije, ali se eksprimiraju od strane kancerskih ćelija i poželjno indukuju imunski odgovor protiv kancerskih ćelija, poželjno imunski odgovor specifičan za kancer. U jednom primeru izvođenja, primena vakcine obezbeđene u skladu sa učenjem obezbeđuje neoepitope koji su epitopi koji se prezentuju u kontekstu MHC klase II i/ili koji su sposobni da pobude odgovor CD4+ pomažućih T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su izvedeni epitopi prezentovani u kontekstu MHC kao i epitope koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije, koji su epitopi koji se prezentuju u kontekstu MHC klase I i/ili su sposobni da pobude odgovor CD8+ T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su izvedeni epitopi koji se prezentuju u kontekstu MHC. U jednom primeru izvođenja, epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije izvedeni su iz tumorskog antigena. U jednom primeru izvođenja, neoepitopi i epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije imaju sinergistički efekat u lečenju kancera. Poželjno, vakcina obezbeđena u skladu sa učenjem korisna je za poliepitopsku stimulaciju odgovora citotoksičnih i/ili pomažućih T ćelija.
[0214] Vakcina obezbeđena u skladu sa učenjem može biti rekombinantna vakcina.
[0215] Drugi tip sredstva je imunska ćelija, kao što je T ćelija koja eksprimira T-ćelijski receptor, ili T ćelija koja rekombinantno eksprimira T-ćelijski receptor, ili koja eksprimira veštački ili himerni T-ćelijski receptor (CAR), koji cilja antigen, npr., podobni neoepitop identifikovan postupcima predmetnog učenja kao podoban cilj specifičan za bolest, poželjno pri čemu se takav neoepitop eksprimira na površini ćelije u kompleksu sa MHC molekulima. Poželjno, kada imunske ćelije prepoznaju antigen putem vezivanja receptor-antigen, imunska ćelija (imunoreaktivna ćelija) se stimuliše, podstiče i/ili ekspandira ili ispoljava efektorske funkcije imunoreaktivnih ćelija, kako je opisano ranije u ovom tekstu.
[0216] Izraz "antigen-specifična T ćelija" ili slični izrazi odnose se na T ćeliju koja prepoznaje antigen, npr., podobni neoepitop kompleksovan sa MHC molekulima klase I i, posle vezivanja sa pomenutim antigenom, poželjno ispoljava efektorske funkcije T ćelija, kako je opisano ranije u ovom tekstu. Smatra se da su T ćelije i druge limfoidne ćelije specifične za antigen ako ćelije ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju antigen. Specifičnost T ćelije može se evaluirati korišćenjem različitih standardnih tehnika, na primer, testa oslobađanja hroma ili testa proliferacije. Alternativno, može se meriti sinteza limfokina (kao što je interferon-γ).
[0217] T-ćelijski receptori i drugi receptori za antigene opisani su gore. Izraz "CAR" (ili "himerni receptor za antigen") odnosi se na veštački receptor koji sadrži jedan molekul ili kompleks molekula koji prepoznaju, tj., vezuju se za ciljnu strukturu (npr. antigen) na ciljnoj ćeliji kao što je kancerska ćelija (npr., vezivanjem antigen-vezujućeg domena za antigen eksprimiran na površini ciljne ćelije) i koji može dati specifičnost imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija koja eksprimira pomenuti CAR na svojoj površini. Poželjno, prepoznavanje ciljne strukture pomoću CAR rezultuje aktivacijom imunske efektorske ćelije koja eksprimira pomenuti CAR. CAR može sadržati jednu ili više proteinskih jedinica, pomenute proteinske jedinice sadrže jedan ili više domena, kako je opisano u ovom tekstu. Izraz "CAR" ne uključuje T-ćelijske receptore.
[0218] U jednom primeru izvođenja, jednolančani varijabilni fragment (single-chain variable fragment, scFv) izveden iz monoklonskog antitela fuzionisan je sa transmembranskim i endodomenom CD3-zeta. Takvi molekuli rezultuju transmisijom zeta signala u odgovoru na prepoznavanje, putem scFv, svog antigenskog cilja na ciljnoj ćeliji, i ubijanjem ciljne ćelije koja eksprimira ciljni antigen. Domeni za prepoznavanje antigena koji se takođe mogu koristiti uključuju, između ostalih, pojedinačne alfa i beta lance T-ćelijskog receptora (TCR). U stvari, gotovo sve što se sa visokim afinitetom vezuje za dati cilj, može se upotrebiti kao domen za prepoznavanje antigena.
[0219] Posle prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se transmituje u ćeliju. U vezi sa tim, "T-ćelijski signalizirajući domen" je domen, poželjno endodomen koji, posle vezivanja antigena, prenosi aktivacioni signal u T ćeliju. Najčešće korišćena endodomenska komponenta je CD3-zeta.
[0220] Terapija adoptivnim ćelijskim transferom sa CAR-inženjerisanim T ćelijama koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajući model terapije jer se CAR-modifikovane T ćelije mogu inženjerisati da ciljaju praktično bilo koji antigen koji se eksprimira na obolelim ćelijama, na primer tumorski antigen. Poželjno, tumorski antigen je neoepitop koji je rezultat mutacije specifične za tumor, postupcima predmetnog učenja identifikovan kao podoban tumor-specifični cilj. Na primer, pacijentove T ćelije mogu se genetički inženjerisati (genetički modifikovane) da eksprimiraju CAR specifično usmeren prema tumor-specifičnom neoepitopu kompleksovanom sa MHC molekulima na površini pacijentovih tumorskih ćelija, i zatim infuzijom vratiti u pacijenta.
[0221] CAR može zameniti funkciju T-ćelijskog receptora i, posebno, ćeliji kao što je T ćelija može dodeliti reaktivnost kao što je citolitička aktivnost. Međutim, nasuprot vezivanju T-ćelijskog receptora za kompleks antigenski peptid-MHC, kako je opisano gore, CAR može da se veže i za antigen, posebno kada se eksprimira na površini ćelije.
[0222] U skladu sa učenjem, CAR mogu generalno sadržati tri domena. Prvi domen je vezujući domen koji prepoznaje i vezuje se sa antigenom. Drugi domen je kostimulacioni domen. Kostimulacioni domen služi da poveća proliferaciju i preživljavanje citotoksičnih limfocita posle vezivanja CAR za ciljnu komponentu. Identitet kostimulacionog domena ograničen je samo sposobnošću da pojača ćelijsku proliferaciju i preživljavanje posle vezivanja ciljne komponente i CAR. Pogodni kostimulacioni domeni uključuju CD28, CD137 (4-1BB), člana familije receptora za faktor nekroze tumora (tumor necrosis factor, TNF), CD134 (OX40), člana superfamilije TNFR receptora, i CD278 (ICOS), kostimulatorni molekul superfamilije CD28 koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama. Treći domen je aktivacioni signalni domen (ili T-ćelijski signalni domen). Aktivacija signalnog domena služi za aktivaciju citotoksičnih limfocita posle vezivanja CAR sa antigenom. Identitet aktivacionog signalnog domena ograničen je samo sposobnošću da indukuje aktivaciju odabranog citotoksičnog limfocita posle vezivanja antigena sa CAR. Pogodni aktivacioni signalni domeni uključuju T-ćelijski CD3 [zeta] lanac i Fc receptor [gama].
[0223] CAR mogu sadržati tri domena, spojena u formi fuzionog proteina. Takvi fuzioni proteini će generalno uključivati vezujući domen, jedan ili više kostimulacionih domena, i aktivacioni signalni domen, povezane u smeru N-terminus ka C-terminusu. Međutim, CAR nisu ograničeni na ovaj aranžman i drugi aranžmani su prihvatljivi i uključuju vezujući domen, aktivacioni signalni domen, i jedan ili više kostimulacionih domena. Zbog toga što vezujući domen mora biti slobodan za vezivanje sa antigenom, razume se da će postavljanje vezujućeg domena u fuzionom proteinu generalno biti takvo da se postigne prikazivanje regiona na spoljašnjosti ćelije. Na isti način, zbog toga što kostimulacioni i aktivirajući signalni domeni služe za indukovanje aktivnosti i proliferacije citotoksičnih limfocita, fuzioni protein će obično prikazivati ova dva domena u unutrašnjosti ćelije. CAR mogu sadržati dodatne elemente, kao što su signalni peptid za obezbeđivanje ispravnog eksporta fuzionog proteina na površinu ćelije, transmembranski domen za obezbeđivanje da se fuzioni protein održava kao integrisani membranski protein, i domen šarke (ili spejserski region) koji daje fleksibilnost vezujućem domenu i omogućava snažno vezivanje sa antigenom.
[0224] Ćelije koje se koriste u vezi sa CAR i drugim veštačkim receptorima za antigene, poželjno su T ćelije, posebno citotoksični limfociti, poželjno odabrani između citotoksičnih T ćelija, ćelija-prirodnih ubica (natural killer, NK cells), i limfokinom aktiviranih ćelija-ubica (lymphokine-activated killer, LAK, cells). Posle aktivacije, svaki od ovih citotoksičnih limfocita pokreće destrukciju ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T ćelije pokreću destrukciju ciljnih ćelija na jedan ili oba od sledećih načina. Prvo, posle aktivacije, T ćelije oslobađaju citokine kao što su perforin, granzimi, i granulizin. Perforin i granulizin stvaraju pore u ciljnoj ćeliji i granzimi ulaze u ćeliju i u citoplazmi pokreću kaspaznu kaskadu koja indukuje apoptozu (programiranu ćelijsku smrt) ćelije. Drugo, apoptoza može biti indukovana interakcijom Fas-Fas ligand između T ćelija i ciljnih ćelija. Citotoksični limfociti će poželjno biti autologne ćelije, mada se mogu koristiti i heterologne ćelije ili alogene ćelije.
[0225] Domen za vezivanje sa antigenom, koji može biti prisutan unutar CAR, ima sposobnost da se veže za (ciljni) antigen, tj. sposobnost da se veže za (ciljni) epitop prisutan u antigenu, poželjno sposobnost da se veže za (ciljni) neoepitop identifikovan postupcima predmetnog učenja kao podoban cilj specifičan za bolest, pri čemu se neoepitop prezentuje u kontekstu MHC na površini ćelije. Poželjno, domen za vezivanje sa antigenom specifičan je za antigen.
[0226] Drugi tip sredstva je imunska ćelija, na primer limfoidna ćelija, koja nosi peptid koji sadrži podobni neoepitop identifikovan postupcima predmetnog učenja. U poželjnom primeru izvođenja, limfoidna ćelija je dendritska ćelija. U kontekstu predmetnog učenja, limfoidne ćelije poželjno izolovane iz pacijenta koji treba da se leči, inkubiraju se sa antigenom koji treba da se cilja i inkubirane ćelije se zatim daju pacijentu u kojem se indukuje imunski odgovor na ćelije koje eksprimiraju antigen. Prema tome, peptid koji sadrži podobni epitop može se inkubirati sa dendritskim ćelijama i inkubirane ćelije se mogu primeniti u cilju indukovanja imunskog odgovora protiv ćelija koje eksprimiraju podobni neoepitop.
[0227] Izraz "rekombinantni" u kontekstu predmetnog učenja znači "napravljen genetičkim inženjerstvom". Poželjno, "rekombinantni entitet" kao što je rekombinantni polipeptid u kontekstu predmetnog učenja ne sreće se prirodno, i poželjno rezultat je kombinacije entiteta kao što su sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina, koje se ne kombinuju u prirodi. Na primer, rekombinantni polipeptid u kontekstu predmetnog učenja može sadržati nekoliko aminokiselinskih sekvenci kao što su neoepitopi ili vakcinske sekvence izvedene iz različitih proteina ili različitih delova istog proteina fuzionisanih međusobno, npr., peptidnim vezama ili odgovarajućim linkerima.
[0228] Izraz "prirodni" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na činjenicu da se objekt može naći u prirodi. Na primer, prirodni su peptid ili nukleinska kiselina, koji su prisutni u organizmu (uključujući viruse) i koji se mogu izolovati iz prirodnog izvora, i koje čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji.
[0229] U skladu sa učenjem, izraz "bolest" označava svako patološko stanje, uključujući kancersko oboljenje, posebno one forme kancerskog oboljenja opisane u ovom tekstu.
[0230] Izraz "normalno" označava zdravo stanje ili uslove u zdravom subjektu ili tkivu, tj., nepatološke uslove, pri čemu "zdravo" poželjno znači nekancerozno.
[0231] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen" znači da je detektovana ekspresija antigena u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama obolelog tkiva ili organa može biti povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. Povećanje označava povećanje od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak i više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se sreće samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom. U skladu sa učenjem, bolest koja uključuje ili je udružena sa ćelijama koje eksprimiraju antigen uključuje kancerske bolesti.
[0232] Kancer (medicinski izraz: maligna neoplazma) je klasa oboljenja u kojima grupa ćelija pokazuje nekontrolisani rast (deoba prevazilazi normalne okvire), invaziju (osvajanje i destrukcija susednih tkiva), i ponekad metastaze (širenje na druga mesta u telu limfom ili krvlju). Ove tri maligne osobine kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su samoograničeni, i ne šire se ili metastaziraju. Većina kancera formira tumor, ali neki kao leukemija, ne.
[0233] Maligni tumor je suštinski sinonim za kancer. Malignitet, maligna neoplazma, i maligni tumor su suštinski sinonimi za kancer.
[0234] U skladu sa učenjem, izraz "tumor" ili "tumorska bolest" označava nenormalan rast ćelija (nazvanih neoplastične ćelije, tumorigene ćelije ili tumorske ćelije) koje poželjno formiraju otok ili leziju. Pod "tumorska ćelija" misli se na abnormalnu ćeliju koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste i kada nestanu stimulusi koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimično ili potpuno odsustvo strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično formiraju zasebni masu tkiva koja može biti benigna, premaligna ili maligna.
[0235] Benigni tumor je tumor koji nema ove tri maligne osobine kancera. Prema tome, po definiciji, benigni tumor ne raste na neograničen, agresivan način, ne širi se u okolna tkiva i ne širi se u nesusedna tkiva (ne metastazira).
[0236] Neoplazma je nenormalna masa tkiva koja je rezultat neoplazije. Neoplazija (novi rast, na grčkom) je neormalna proliferacija ćelija. Rast ćelija prevazilazi, i nije koordinisan sa rastom normalnih okolnih tkiva. Rast se održava na isti preterani način čak i posle prestanka stimulusa. To obično izaziva grudvicu ili tumor. Neoplazme mogu biti benigne, premaligne ili maligne.
[0237] "Rast tumora" ili "tumorski rast" u kontekstu predmetnog učenja, odnosi se na tendenciju tumora da poveća svoju veličinu i/ili na tendenciju tumorskih ćelija da proliferišu.
[0238] Za potrebe ovog učenja, izrazi "kancer" i "kancerska bolest" koriste se naizmenično sa izrazima "tumor" i "tumorska bolest".
[0239] Kanceri se klasifikuju prema tipu ćelije koja podseća na tumor i, prema tome, tkivu od kojeg se pretpostavlja da tumor vodi poreklo. Ovo su histologija, odnosno lokacija.
[0240] Izraz "kancer" u skladu sa učenjem obuhvata leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, kancer rektuma, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer nadbubrega, tiroidni kancer, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, kancer cerviksa, kancer creva, kancer jetre, kancer kolona, kancer želuca, kancer creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnog čvora, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uva, nosa i grla (ear, nose and throat, ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer uterusa, kancer ovarijuma i kancer pluća i njihove metastaze. Njihovi primeri su karcinomi pluća, karcinomi mlečne žlezde, karcinomi prostate, karcinomi kolona, karcinomi bubrežnih ćelija, karcinomi cerviksa, ili metastaze tipova kancera ili tumora opisanih gore. Izraz kancer u skladu sa učenjem obuhvata i kancerske metastaze i relaps kancera.
[0241] Pod "metastazom" misli se na rasejavanje kancerskih ćelija sa njihovog originalnog mesta u druge delove tela. Formiranje metastaza je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, prolaska kroz bazalnu membranu endotela da se uđe u telesnu šupljinu ili sudove, i zatim, posle transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Na kraju, rast novog tumora, tj. sekundarnog tumora ili metastatskog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Tumorska metastaza često se dešava čak i posle uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" u skladu sa učenjem odnosi se na "udaljenu metastazu" i označava metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i sistema regionalnih limfnih čvorova.
[0242] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su kao one u originalnom tumoru. Ovo znači, na primer da, ako kancer ovarijuma metastazira u jetru, sekundarni tumor sačinjavaju abnormalne ćelije ovarijuma, a ne abnormalne ćelije jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski kancer ovarijuma, a ne kancer jetre.
[0243] Izraz "cirkulišuće tumorske ćelije" ili "CTC" (circulating tumor cells) odnosi se na ćelije koje su se odvojile od primarnog tumora ili tumorske metastaze i cirkulišu u krvnom toku. CTC mogu predstavljati zametke kasnijeg rasta dodatnih tumora (metastaza) u različitim tkivima. Kod pacijenata sa metastatskom bolešću, cirkulišuće tumorske ćelije nalaze se sa učestalošću reda 1-10 CTC po mL cele krvi. Istraživački postupci razvijeni su za izolovanje CTC. U struci je opisano nekoliko istraživačkih postupaka za izolovanje CTC, npr. tehnike u kojima se koristi činjenica da epitelne ćelije obično eksprimiraju ćelijski adhezioni protein EpCAM, koji je odsutan u normalnim ćelijama krvi. Imunomagnetno zadržavanje bazirano na perlicama obuhvata tretiranje uzoraka krvi antitelom na EpCAM, koje je konjugovano sa magnetnim česticama, praćeno izdvajanjem obeleženih ćelija u magnetnom polju. Izolovane ćelije se zatim boje antitelom za drugi epitelni marker, citokeratin, kao i antitelom za opšti marker leukocita, CD45, tako da se razlikuju retke CTC od kontaminirajućih belih krvnih ćelija. Ovaj robustni i poluautomatizovani pristup identifikuje CTC sa prosečnim prinosom od približno 1 CTC/mL i čistoćom 0.1% (Allard et al., 2004, Clin Cancer Res 10:6897-6904). U drugom postupku za
1
izolovanje CTC koristi se uređaj za zadržavanje CTC na bazi mikrofluida, koji uključuje proticanje cele krvi kroz komoru u kojoj je fiksirano 80,000 mikrostubića funkcionalizovanih oblaganjem antitelom na EpCAM. CTC se zatim boje sekundarnim antitelima na citokeratin ili tkivno-specifične markere, kao što su PSA za kancer prostate ili HER2 za kancer dojke i vizuelizuju automatizovanim skeniranjem mikrostubića u velikom broju ravni duž koordinata u tri dimenzije. CTC-čipovi mogu da identifikuju citokeratin-pozitivne cirkulišuće tumorske ćelije kod pacijenata sa medijanom prinosa od 50 ćelija/ml i čistoćom u rasponu 1-80% (Nagrath et al., 2007, Nature 450:1235-1239). Još jedna mogućnost za izolovanje CTC je korišćenje CellSearch™ Circulating Tumor Cell (CTC) testa, Veridex, LLC (Raritan, NJ) koji zadržava, identifikuje i broji CTC u tubi krvi. The CellSearch™ sistem je postupak koji je odobrila Uprava za hranu i lekove SAD (U.S. Food and Drug Administration, FDA) za određivanje broja CTC u celoj krvi na bazi kombinacije imunomagnetnog obeležavanja i automatizovane digitalne mikroskopije. Postoje i drugi postupci za izolovanje CTC opisani u literaturi koji se svi mogu koristiti u sprezi sa predmetnim učenjem.
[0244] Relaps ili recidiv dešava se kada osoba ponovo bude pogođena stanjem kojim je bila pogođena u prošlosti. Na primer, ako je pacijent bolovao od tumorskog oboljenja, bio uspešno lečen od pomenute bolesti i ponovo razvio pomenutu bolest, pomenuta novorazvijena bolest može se smatrati relapsom ili recidivom. Međutim, u skladu sa učenjem, relaps ili recidiv tumorske bolesti može, ali se ne mora obavezno desiti na mestu originalne tumorske bolesti. Prema tome, na primer, ako je pacijent bolovao od tumora ovarijuma i bio uspešno lečen, relaps ili recidiv može biti pojava ovarijalnog tumora ili pojava tumora na mestu koje nije ovarijum. Relaps ili recidiv tumora uključuje i situacije kada se tumor pojavi na mestu različitom od originalnog tumora kao i na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor od kojeg je pacijent bio lečen je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.
[0245] Izraz "imunski odgovor" odnosi se na reakciju imunskog sistema na primer na imunogene organizme kao što su bakterije ili virusi, ćelije ili supstance. Izraz "imunski odgovor" uključuje urođeni imunski odgovor i stečeni imunski odgovor. Poželjno, imunski odgovor je povezan sa aktivacijom imunskih ćelija, indukcijom biosinteze citokina i/ili proizvodnjom antitela.
[0246] Poželjno je da imunski odgovor indukovan kompozicijama predmetnog učenja uključuje korake aktivacije antigen-prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije i/ili makrofagi, prezentaciju antigena ili njegovog fragmenta pomenutim antigen-prezentujućim ćelijama i aktivaciju citotoksičnih T ćelija usled ove prezentacije.
2
[0247] Izraz "imunske ćelije" označava ćelije imunskig sistema uključene u odbranu tela osobe. Izraz "imunske ćelije" obuhvata specifične tipove imunskih ćelija i njihove prekursore, uključujući leukocite koji obuhvataju makrofage, monocite (prekursore makrofaga), granulocite kao što su neutrofili, eozinofili i bazofili, dendritske ćelije, mastocite i limfocite kao što su B ćelije, T ćelije i ćelije-prirodne ubice (NK ćelije). Makrofagi, monociti (prekursori makrofaga), neutrofili, dendritske ćelije, mastociti su fagocitne ćelije.
[0248] Izraz "imunoterapija" odnosi se na lečenje bolesti ili stanja indukovanjem, pojačavanjem ili suprimiranjem imunskog odgovora. Imunoterapije dizajnirane da pobude ili pojačaju imunski odogovor klasifikuju se kao aktivacione imunoterapjie, dok se imunoterapije koje smanjuju ili suprimiraju imunski odgovor klasifikuju kao supresivne imunoterapije. Izraz "imunoterapija" uključuje imunizaciju antigenom ili vakcinaciju antigenom, imunizaciju tumorom ili vakcinaciju tumorom. Izraz "imunoterapija" odnosi se i na manipulaciju imunskih odgovora tako da se neodgovarajući imunski odgovori modulišu u pogodnije, u kontekstu autoimunskih oboljenja kao što su reumatični artritis, alergije, dijabetes ili multipla skleroza.
[0249] Izrazi "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuju proces primene antigena kod pojedinca u svrhu indukovanja imunskog odgovora, na primer, iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.
[0250] Pod "lečiti/tretirati" misli se na primenu jedinjenja ili kompozicije, kako je opisano u ovom tesktu, kod subjekta u cilju prevencije ili eliminisanja bolesti, uključujući smanjenje veličine tumora ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanja ili usporavanja bolesti kod subjekta; inhibiranja ili usporavanja razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenja učestalosti ili težine simptoma i/ili recidiva kod subjekta koji trenutno ima ili je ranije imao bolest; i/ili produžavanja, tj. porasta životnog veka subjekta. Posebno, izraz "lečenje bolesti" uključuje lečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, preveniranje, usporavanje ili zaustavljanje napredovanja ili pogoršanja, ili preveniranje ili odlaganje pojave bolesti ili njenih simptoma.
[0251] Pod "biti pod rizikom" misli se na subjekta, tj. pacijenta za kojeg je utvrđeno da ima šansu veću od normalne da razvije bolest, posebno kancer, u poređenju sa opštom populacijom. Pored toga, subjekt koji je imao ili koji trenutno ima bolest, posebno kancer, je subjekt koji je pod povećanim rizikom da razvije bolest, jer taj subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju ili su imali kancer imaju povećan rizik i za kancerske metastaze.
[0252] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena kompozicije učenja, poželjno štiti primaoca od razvijanja bolesti. Terapijska primena imunoterapije, na primer, terapijska primena kompozicije učenja može dovesti do inhibicije napredovanja/rasta bolesti. Ovo uključuje usporavanje napredovanja/rasta bolesti, posebno prekid napredovanja bolesti, što poželjno dovodi do eliminisanja bolesti.
[0253] Imunoterapija se može izvesti korišćenjem neke od različitih tehnika, u kojima sredstva obezbeđena u ovom tekstu funkcionišu da uklone obolele ćelije iz pacijenta. Takvo uklanjanje može se desiti kao rezultat pojačavanja ili indukovanja pacijentovog imunskog odgovora, specifičnog za antigen ili ćeliju koja eksprimira antigen.
[0254] U okviru određenih primera izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, u kojoj tretmani počivaju na in vivo stimulaciji endogenog imunskog sistema domaćina da reaguje protiv obolelih ćelija uz primenu sredstava koja modifikuju imunski odgovor (kao što su polipeptidi i nukleinske kiseline, obezbeđeni u ovom tekstu).
[0255] Sredstva i kompozicije obezbeđeni u ovom tekstu mogu se upotrebiti sami ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim režimima kao što su operacija, zračenje, hemioterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologna, singena, alogena i nesrodna).
[0256] Izraz "in vivo" odnosi se na situaciju u subjektu.
[0257] Izrazi "subjekt", "individua", "organizam" ili "pacijent" odnose se na vertebrate, posebno sisare. Na primer, sisari u kontekstu predmetnog učenja su ljudi, nehumani primati, domestifikovani sisari kao psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji, itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd. kao i sisari u zarobljeništvu kao što su životinje u zoološkim vrtovima. Izrazi se takođe odnose na nesisarske vertebrate kao što su ptice (posebno domestifikovane ptice kao što su pilići, patke, guske, ćurke) i na ribe (posebno ribe na farmama, npr. losos ili som). Izraz "životinja", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje i ljude.
[0258] Izraz "autologno" koristi se za opisivanje svega što je poreklom iz istog subjekta. Na primer, "autologni transplant" odnosi se na transplant tkiva ili organa poreklom iz istog subjekta. Takve procedure su pogodne jer se njima prevazilazi imunološka barijera koja bi inače rezultovala odbacivanjem.
[0259] Izraz "heterologno" koristi se za opisivanje nečega što se sastoji od više različitih elemenata. Kao primer, transfer kostne srži jedne individue u drugu individuu predstavlja heterologni transplant. Heterologni gen je gen poreklom iz izvora različitog od subjekta.
[0260] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinaciju, poželjno jedno ili više sredstava opisanih u ovom tekstu primenjuje se zajedno sa jednim ili više adjuvanasa za indukovanje imunskog odgovora ili za pojačavanje imunskog odgovora. Izraz "adjuvans" odnosi se na jedinjenja koja produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. Kompozicija predmetnog učenja poželjno ispoljava svoj efekat bez dodavanja adjuvansa. Ipak, kompozicija predmetne patentne prijave može sadržati svaki poznati adjuvans. Adjuvansi obuhvataju heterogenu grupu jedinjenja kao što su uljane emulzije (npr., Freund-ov adjuvans), mineralna
4
jedinjenja (kao stipsa), bakterijski proizvodi (kao što je toksin Bordetella pertussis), lipozomi, i imunostimulišući kompleksi. Primeri adjuvanasa su monofosforil-lipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponini kao QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (Smith-Kline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, i QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), nekompletni Freund-ov adjuvans, kompletni Freund-ov adjuvans, vitamin E, montanid, stipsa, CpG oligonukleotidi (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), i različite emulzije vode u ulju koje se pripremaju od biološki razgradljivih ulja kao što su skvalen i/ili tokoferol.
[0261] Mogu se upotrebiti i druge supstance koje stimulišu pacijentov imunski odgovor. U vakcinaciji je moguća na primer upotreba citokina, zbog njihovih regulatornih svojstava prema limfocitima. Ti citokini obuhvataju, na primer, interleukin-12 (IL-12) za koji je pokazano da povećava protektivna dejstva vakcina (vidi, Hall, 1995, IL-12 at the crossroads, Science 268:1432-1434), GM-CSF i IL-18.
[0262] Postoje brojna jedinjenja koja pojačavaju imunski odgovor i koja se zbog toga mogu koristiti u vakcinaciji. Pomenuta jedinjenja uključuju kostimulišuće molekule date u obliku proteina ili nukleinskih kiselina kao što su B7-1 i B7-2 (CD80, odnosno CD86).
[0263] U skladu sa učenjem, "tumorski uzorak" je uzorak kao što je telesni uzorak koji sadrži tumorske ili kancerske ćelije kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC), posebno tkivni uzorak, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak. U skladu sa učenjem, "netumorozni uzorak" je uzorak kao što je telesni uzorak koji ne sadrži tumorske ili kancerske ćelije kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC), posebno tkivni uzorak, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak. Takvi telesni uzorci mogu se dobiti na uobičajeni način na primer biopsijom tkiva, uključujući biopsiju kleštima ("punch"), i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fecesa ili druge telesne tečnosti. U skladu sa učenjem, izraz "uzorak" uključuje i obrađene uzorke kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. nukleinske kiseline ili ćelijski izolati.
[0264] Terapijski aktivna sredstva, vakcine i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se primeniti bilo kojim pogodnim putem, uključujući injekciju ili infuziju. Primena se može izvesti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, supkutano ili transdermalno. U jednom primeru izvođenja, primena se izvodi intranodalno, na primer injekcijom u limfni čvor. Drugi oblici primene predviđaju in vitro transfekciju antigenprezentujućih ćelija kao što su dendritske ćelije, nukleinskim kiselinama opisanim u ovom tekstu, posle čega sledi primena antigen-prezentujućih ćelija.
[0265] Sredstva opisana u ovom tekstu primenjuju se u efikasnim količinama. "Efikasna količina" odnosi se na količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat, samu ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. To uključuje usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekidanje ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može biti i odlaganje pojave ili prevencija pojave pomenute bolesti ili pomenutog stanja.
[0266] Efikasna količina sredstva opisanog u ovom tekstu zavisiće od stanja koje treba lečiti, težine bolesti, individualnih pacijentovih parametara, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanja lečenja, tipa pridružene terapije (ako je prisutna), specifičnog puta primene i sličnih faktora. Prema tome, primenjene doze sredstava opisanih u ovom tekstu mogu različito zavisiti od takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna posle početne doze, mogu se koristiti više doze (ili efektivno više doze postignute različitim, lokalizovanijim putem primene).
[0267] Izraz "farmaceutski prihvtljiv" označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0268] Farmaceutske kompozicije predmetnog učenja mogu sadržati soli, pufere, prezervirajuća sredstva, nosače i opciono druga terapijska sredstva. Poželjno, farmaceutske kompozicije predmetnog učenja uključuju jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenata.
[0269] Izraz "ekscipijent" treba da označi sve supstance u farmaceutskoj kompoziciji koje nisu aktivni sastojci, kao što su povezivači, lubrikansi, zgušnjivači, površinski aktivna sredstva, prezervansi, emulgatori, puferi, sredstva za poboljšanje ukusa, ili sredstva za davanje boje.
[0270] Izraz "razblaživač" odnosi se na sredstvo za razblaživanje i/ili razređivanje. Pored toga, izraz "razblaživač" obuhvata bilo koji ili sve od fluida, tečne ili čvrste suspenzije i/ili mešovitih medijuma.
[0271] Izraz "nosač" odnosi se na jednu ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih potpornih supstanci ili razblaživača pogodnih za primenu kod ljudi. Izraz "nosač" odnosi se na prirodnu ili sintetsku organsku ili neorgansku komponentu koja se kombinuje sa aktivnom komponentom da bi se olakšala primena aktivne komponente. Poželjno, nosačke komponente su sterilne tečnosti kao što su voda ili ulja, uključujući one koje su izvedene iz mineralnog ulja, životinja ili biljaka, kao što su ulje kikirikija, ulje semena soje, susamovo ulje, suncokretovo ulje, itd. Rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerina mogu se takođe koristiti kao vodena nosačka jedinjenja.
[0272] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku primenu dobro su poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Primeri pogodnih nosača uključuju, na primer, magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktozu, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragant, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, vosak sa niskom tačkom topljenja, kakao buter, i slično. Primeri pogodnih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu.
[0273] Farmaceutski nosači, ekscipijenti ili razblaživači mogu se birati u odnosu na nameravani put primene i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske kompozicije predmetnog učenja mogu uključivati kao ili u dodatku, nosač(-e), ekscipijen(-e) ili razblaživač(-e) svaki pogodan povezivač(-e), lubrikans(-e), suspendujuće sredstvo(-a), oblažuće sredstvo(-a), i/ili solubilizujuće sredstvo(-a). Primeri pogodnih povezivača uključuju skrob, želatin, prirodne šećere kao što su glukoza, anhidrovana laktoza, slobodnosipljiva laktoza, beta-laktoza, kukurzni zaslađivači, prirodne i sintetske gume, kao što su akacija, tragant ili natrijum alginat, karboksimetilcelulozu i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanasa uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. Prezervansi, stabilizeri, boje, čak i sredstva za poboljšanje ukusa mogu se obezbediti u farmaceutskoj kompoziciji. Primeri prezervanasa uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Antioksidansi i suspendujuća sredstva takođe se mogu koristiti.
[0274] U jednom primeru izvođenja, kompozicija je vodena kompozicija. Vodena kompozicija može opciono uključivati rastvore, npr. soli. U jednom primeru izvođenja, kompozicija je u obliku kompozicije osušene zamrzavanjem. Kompozicija osušena zamrzavanjem može se dobiti sušenjem zamrzavanjem odgovarajuće vodene kompozicije.
[0275] Sredstva i kompozicije obezbeđeni u ovom tekstu mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim terapijskim režimima kao što su operacija, zračenje, hemioterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).
[0276] Predmetno učenje je detaljno opisano i ilustrovano slikama i primerima, koji služe samo kao ilustracija i nisu namenjeni ograničavanju. Zahvaljujući opisu i primerima, dodatni primeri izvođenja koji su isto tako uključeni u učenje, dostupni su iskusnom stručnjaku.
SLIKE
[0277]
Slike 1a i 1b Uzorak glioblastoma sa visokom fokalnom amplifikacijom gena za receptor za faktor rasta epiderma (EGFR). Sl. 1a: Grafički prikaz lokalnih gena koji okružuju EGFR na hromozomu 7. Sl.1b: Spisak 12 pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa najvišim apsolutnim brojem kopija.
Slika 2 Spisak brojnih gena koji imaju mutaciju specifičnu za bolest, iz uzorka melanoma sortiranih po zigotnosti (Cx).
Slika 3 Spisak brojnih gena iz uzorka melanoma u kojem sve kopije imaju mutaciju specifičnu za bolest (frakciona zigotnost je jednaka 1), od kojih su tri gena esencijalni geni kod ljudi ili se zaključuje da su esencijalni geni kod ljudi.
[0278] Skraćenice za slike: chr_pos hromozomska pozicija; CN apsolutni broj kopija; Cx zigotnost; EC korekcija greške apsolutnog broja kopija; VAF frekvencija varijantnog alela; rho procenjeni procenat tumorskih ćelija koje sadrže mutirani alel (SNV); FLRT+u ocena pouzdanosti u mutaciji; Mesto klasifikacije je klasa pouzdanosti mutacije; esencijalni gen, Y ako je nađeno da je gen esencijalan.
PRIMER 1 Ciljanje mutacija specifičnih za bolest u genima sa visokim brojem kopija
[0279] Genomska informacija za uzorak glioblastoma (Chin et al., 2008, Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways, Nature 455:1061-1068) analizirana je traženjem gena koji imaju veliki broj kopija i kod kojih najmanje jedna kopija gena sadrži mutaciju specifičnu za bolest. Kvalitativna analiza pokazala je da postoji velika vernost u dodeljivanju broja kopija za 11,574 pojedinačnih analiziranih gena, i određeno je da ploidnost genoma uzorka iznosi 1.95. Slika 1a predstavlja grafički prikaz lokalnih gena koji okružuju receptor za faktor rasta epiderma (EGFR) na hromozomu 7, koji je poznati vodeći gen i bio je cilj tretmana. Pokazano je da EGFR u ovom genomu ima za grešku korigovan apsolutni broj kopija 76, od čega je 13 kopija sadržalo varijaciju pojedinačnog nukleotida specifičnu za bolest. Slika 1b daje spisak gena u genomskom uzorku sa najvećim apsolutnim brojem kopija. Postoje četiri dodatna gena koja imaju apsolutni broj kopija veći od 2. Zaista, EGFR amplifikacija je poznati genetički marker primarnih glioblastoma (Benito et al., 2009, Neuropathology 30 (4):392-400) i smatra se da je ovaj gen cilj tretmana (Taylor, 2012, Curr Cancer Drug Targets. Mar; 12(3):197-209).
PRIMER 2 Ciljanje mutacija specifičnih za bolest sa visokom zigotnošću
[0280] Egzom dobijen iz uzorka ćelija melanoma iz tumora kod ljudi analiziran je traženjem gena u kojima najmanje jedna kopija gena ima mutaciju specifičnu za bolest i traženjem broja kopija gena sa mutacijom specifičnom za bolest, kao i ukupnog broja kopija gena, bilo da gen ima mutaciju ili ne. Slika 2 prikazuje spisak gena sortiranih prema zigotnosti, u kojima se mutacija specifična za bolest nalazi u velikom broju kopija gena. Na primer, mutacija specifična za bolest u OXGR1 genu ima najvišu zigotnost (4), i posebno ima i najvišu frakcionu zigotnost od 4/5 ili 0.8 pošto postoji ukupno 5 kopija OXGR1 gena od kojih 4 kopije sadrže mutaciju specifičnu za bolest. Spisak prikazuje 10 dodatnih gena kod kojih 3 kopije gena od ukupno 4 kopije imaju mutaciju, što ukazuje da mutacija specifična za bolest u ovim genima ima frakcionu zigotnost 3/4 ili 0.75. Preostali navedeni geni imaju mutacije sa frakcionom zigotnošću 2/3 ili 0.66 jer 2 kopije od ukupno 3 kopije imaju mutaciju.
PRIMER 3 Ciljanje mutacija specifičnih za bolest prisutnih u svim kopijama esencijalnog gena
[0281] Egzom dobijen iz uzorka ćelija melanoma iz tumora kod ljudi analiziran je traženjem gena u kojima sve kopije gena imaju istu mutaciju specifičnu za bolest i određivanjem koji je od ovih gena esencijalni gen. Geni su određivani kao esencijalni izvođenjem zaključka o njihovoj esencijalnosti kod ljudi na osnovu znanja da su esencijalni kod miševa (Georgi et al., 2013, From mouse to human: evolutionary genomics analysis of human orthologs of essential genes, PLoS Genetics 9 (5):e1003484; Liao et al., 2007, Mouse duplicate genes are as essential as singletons, Trends Genet.23:378-381). Slika 3 navodi brojne gene u kojima sve kopije gena imaju istu mutaciju specifičnu za bolest. Pored toga, određeno je da su tri istaknuta gena esencijalna, zaključivanjem na osnovu njihove esencijalnosti iz podataka za miša.

Claims (11)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak za određivanje podobnosti neoepitopa koji je rezultat mutacije specifične za bolest na alelu u genu (mutirani alel) kao cilja specifičnog za bolest, naznačen time, što uključuje određivanje, u oboleloj ćeliji ili populaciji obolelih ćelija, broja kopija mutiranog alela koji kodira neoepitop, pri čemu broj kopija mutiranog alela koji je veći od 2 ukazuje na podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest, pri čemu je bolest kancer i pri čemu što je viši broj kopija mutiranog alela, viša je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što broj kopija mutiranog alela koji je veći od 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili veći od 100 ukazuje na podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest.
3. Postupak prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačen time, što je odnos broja kopija mutiranog alela prema ukupnom broju kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutacija mapira veći od 0.5, pri čemu, poželjno, odnos iznosi 1.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, da što je viši odnos broja kopija mutiranog alela prema ukupnom broju kopija nukleotidnog mesta na kojem se mutacija mapira, viša je podobnost neoepitopa kao cilja specifičnog za bolest.
5. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time, što je gen vodeći gen čija ekspresija rezultuje transformacijom ćelije u kancerozni fenotip ili čiji izostanak ekspresije rezultuje time da kancerozna ćelija izgubi svoj kancerozni fenotip.
6. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time, što je gen esencijalni gen, pri čemu, poželjno,
esencijalni gen je gen koji, kada je utišan ili je njegova ekspresija smanjena, rezultuje bar ometenim rastom ili smanjenim fitnesom ćelije u kojoj se esencijalni gen eksprimira, poželjno oboleloj ćeliji; ili
se esencijalni gen eksprimira u velikom broju različitih tkiva i eksprimira se sa minimalnim RPKM pragom većim od 0.
7. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time, što je mutacija specifična za bolest varijacija pojedinačnog nukleotida.
8. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time, što je neoepitop identifikovan postupkom koji uključuje sekvenciranje genoma obolele ćelije ili njegovog dela.
9. Postupak za obezbeđivanje vakcine, naznačen time, što uključuje identifikovanje podobnog neoepitopa ili kombinacije podobnih neoepitopa u skladu sa postupkom iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 8.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, što vakcina uključuje peptid ili polipeptid koji sadrže jedan ili više podobnih neoepitopa ili kombinaciju podobnih neoepitopa, ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti peptid ili polipeptid.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time, što je nukleinska kiselina RNK.
1
RS20211138A 2016-07-20 2017-07-19 Izbor neoepitopa kao ciljeva specifičnih za bolest za terapiju sa povećanom efikasnošću RS62390B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP2016067348 2016-07-20
EP17743311.7A EP3488443B8 (en) 2016-07-20 2017-07-19 Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
PCT/EP2017/068226 WO2018015433A2 (en) 2016-07-20 2017-07-19 Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62390B1 true RS62390B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=59399416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211138A RS62390B1 (sr) 2016-07-20 2017-07-19 Izbor neoepitopa kao ciljeva specifičnih za bolest za terapiju sa povećanom efikasnošću

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20190189241A1 (sr)
EP (2) EP3488443B8 (sr)
JP (3) JP7171543B2 (sr)
KR (3) KR102516166B1 (sr)
CN (2) CN117757931A (sr)
AU (2) AU2017299162B2 (sr)
CA (1) CA3031003A1 (sr)
CY (1) CY1124551T1 (sr)
DK (1) DK3488443T3 (sr)
ES (1) ES2890424T3 (sr)
HR (1) HRP20211443T1 (sr)
HU (1) HUE056660T2 (sr)
IL (2) IL311369A (sr)
LT (1) LT3488443T (sr)
MX (4) MX2019000733A (sr)
PL (1) PL3488443T3 (sr)
PT (1) PT3488443T (sr)
RS (1) RS62390B1 (sr)
SG (2) SG10201912678QA (sr)
SI (1) SI3488443T1 (sr)
SM (1) SMT202100544T1 (sr)
WO (1) WO2018015433A2 (sr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017205270B2 (en) 2016-01-08 2024-01-18 Nykode Therapeutics ASA Therapeutic anticancer neoepitope vaccine
AU2017299162B2 (en) * 2016-07-20 2024-09-26 BioNTech SE Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
WO2018144775A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
EP3666888A4 (en) * 2017-08-10 2021-09-01 Good T Cells, Inc. T-CELL ACTIVATION METHOD FOR CANCER TREATMENT
AU2018348249A1 (en) * 2017-10-12 2020-04-16 Nantomics, Llc Cancer score for assessment and response prediction from biological fluids
WO2020020444A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Individualized vaccines for cancer
EP3826669A2 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Frame Pharmaceuticals B.V. Off-the-shelf cancer vaccines
IL280112B2 (en) 2018-07-26 2025-11-01 Curevac Netherlands B V Cancer vaccines for breast cancer
CN109294983A (zh) * 2018-09-30 2019-02-01 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种lff2细胞
CN111402954B (zh) * 2019-01-02 2023-07-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种辨识与预测空间辐射损伤防护药靶相关人类基因的方法
CN117457069A (zh) * 2023-10-30 2024-01-26 南方医科大学南方医院 一种基于m7G相关基因突变对肝癌进行分型的方法和生存预测模型构建
US20250335785A1 (en) 2024-03-11 2025-10-30 Instadeep Ltd Systems and methods for machine learning-based genome annotation
WO2025202937A1 (en) 2024-03-26 2025-10-02 BioNTech SE Cancer vaccines

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
JP2002515734A (ja) 1996-01-02 2002-05-28 カイロン コーポレイション 遺伝子改変された樹状細胞により媒介される免疫刺激
DK2002016T3 (da) 2006-04-12 2010-03-29 Medical Res Council Fremgangsmåde til bestemmelse af kopital
CA2697045C (en) 2007-08-21 2019-12-31 Washington University Improved alzheimer's diagnosis
BRPI0816393A2 (pt) 2007-09-07 2015-03-03 Fluidigm Corp Método para determinar o número de cópias relativo de uma sequência de polinucleotídeo alvo em um genoma de um indivíduo
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
EP2569633B1 (en) * 2010-05-14 2016-02-10 The General Hospital Corporation Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens
HRP20250981T1 (hr) * 2011-05-24 2025-10-24 BioNTech SE Individualizirana cjepiva protiv raka
JP6368243B2 (ja) * 2011-11-11 2018-08-08 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター がんのためのサイクリンａ１に標的化されたｔ細胞免疫療法
US9569586B2 (en) * 2012-02-13 2017-02-14 Albert Rubben Algorithm for modification of somatic cancer evolution
RU2014144349A (ru) 2012-04-05 2016-05-27 БГИ Диагносис Ко., Лтд. Способ и система детекции вариации числа копий
EP3511425A1 (en) * 2012-07-12 2019-07-17 Persimmune, Inc. Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies
AU2013204615A1 (en) 2012-07-20 2014-02-06 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation in a fetal genome
EP2984598B1 (en) 2013-03-06 2024-12-04 Life Technologies Corporation Systems and methods for determining copy number variation
AU2014251207B2 (en) * 2013-04-07 2019-06-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
US20150331992A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Cancer prognosis and therapy based on syntheic lethality
JP2018535202A (ja) 2015-10-12 2018-11-29 ナントミクス，エルエルシー ネオエピトープの反復発見と適応可能な免疫療法およびその方法
US20170199961A1 (en) * 2015-12-16 2017-07-13 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen Identification, Manufacture, and Use
US20190247435A1 (en) * 2016-06-29 2019-08-15 The Johns Hopkins University Neoantigens as targets for immunotherapy
AU2017299162B2 (en) * 2016-07-20 2024-09-26 BioNTech SE Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023009371A (es) 2023-08-16
IL264203A (en) 2019-02-28
JP7171543B2 (ja) 2022-11-15
CA3031003A1 (en) 2018-01-25
CY1124551T1 (el) 2022-07-22
PT3488443T (pt) 2021-09-24
MX2019000733A (es) 2019-05-02
SG11201900132QA (en) 2019-02-27
KR20230019223A (ko) 2023-02-07
EP3488443B1 (en) 2021-08-18
US20190189241A1 (en) 2019-06-20
BR112018077122A2 (pt) 2019-04-30
CN117757931A (zh) 2024-03-26
IL311369A (en) 2024-05-01
SI3488443T1 (sl) 2021-11-30
KR20190027832A (ko) 2019-03-15
EP3488443B8 (en) 2021-09-29
AU2017299162A1 (en) 2019-02-07
MX2023009370A (es) 2023-08-16
CN109477149A (zh) 2019-03-15
DK3488443T3 (da) 2021-09-27
EP3488443A2 (en) 2019-05-29
AU2017299162B2 (en) 2024-09-26
WO2018015433A2 (en) 2018-01-25
EP3967324A1 (en) 2022-03-16
LT3488443T (lt) 2021-10-25
ES2890424T3 (es) 2022-01-19
BR112018077122A8 (pt) 2023-01-31
KR102516166B1 (ko) 2023-03-31
IL264203B2 (en) 2024-08-01
MX2023009369A (es) 2023-08-16
PL3488443T3 (pl) 2021-12-20
JP2019524106A (ja) 2019-09-05
WO2018015433A3 (en) 2018-03-01
JP2023009120A (ja) 2023-01-19
KR20250160514A (ko) 2025-11-13
AU2024219496A1 (en) 2024-10-03
SMT202100544T1 (it) 2021-11-12
HRP20211443T1 (hr) 2021-12-24
JP7711038B2 (ja) 2025-07-22
IL264203B1 (en) 2024-04-01
SG10201912678QA (en) 2020-02-27
JP2024163123A (ja) 2024-11-21
HUE056660T2 (hu) 2022-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7711038B2 (ja) 有効性が増強された治療法のための疾患特異的標的としてのネオエピトープの選択
US20220074948A1 (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
HK40071503A (en) Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
HK40109445A (zh) 选择新表位作为具有增强效力的用於治疗的疾病特异性靶标
HK40009417B (en) Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
HK40068529A (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
NZ790046A (en) Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
BR122025011643A2 (pt) Método in vitro para a determinação da adequação de um neo-epítopo, método, para fornecer uma vacina, vacina, método para proporcionar uma célula imune recombinante, célula imune recombinante, método para fornecer uma resposta imune a uma população de células alvo ou tecido alvo, usos de uma ou mais células imunes, usos de um ácido nucleico e usos de um peptídeo ou polipeptídeo
HK40006811A (en) Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
BR122025011646A2 (pt) Método in vitro para a determinação da adequação de uma combinação de pelo menos dois neo-epítopos, método para fornecer uma vacina, vacina, método para proporcionar uma célula imune recombinante, célula imune recombinante, método para fornecer uma resposta imune a uma população de células alvo ou tecido alvo, usos de uma ou mais células imunes, usos de um ácido nucleico e usos de um peptídeo ou polipeptídeo
BR122025011641A2 (pt) Método para a determinação da adequação de um neo-epítopo, método para fornecer uma vacina, vacina, método para proporcionar uma célula imune recombinante, célula imune recombinante, método para fornecer uma resposta imune a uma população de células alvo ou tecido alvo, usos de uma ou mais células imunes, usos de um ácido nucleico e usos de um peptídeo ou polipeptídeo
BR112018077122B1 (pt) Método para a determinação da adequação de um neo-epítopo
HK1247989B (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
HK1246852B (zh) 预测可用於疫苗接种的t细胞表位