RS62441B1 - N-supstituisani derivati indola - Google Patents

Description

Opis

Prikazani pronalazak se odnosi na nove N-supstituisane derivate indola (I) i njihovu upotrebu kao farmaceutika. Pronalazak se takođe odnosi na srodne aspekte koji obuhvataju postupke dobijanja jedinjenja, farmaceutske kompozicije koje sadrže jedno ili više jedinjenja formule (I), i njihovu upotrebu kao modulatora PGE2 receptora EP2 (takođe poznatih kao PTGER2, poznatih kao PGE2 receptor EP2 podtipa). Jedinjenja formule (I) mogu naročito biti korišćena kao pojedinačna sredstva ili naročito u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava koji su posebno modulatori PGE2 receptora EP4 (takođe poznatih kao PTGER4, poznatih kao EP4R, zvani PGE2 receptor EP4 podtipa); i/ili hemoterapijom i/ili radioterapijom i/ili imunoterapijom u sprečavanju/profilaksi ili lečenju kancera; posebno u sprečavanju /profilaksi ili lečenju melanoma; kancera pluća; kancera bešike; karcinoma bubrega; gastrointestinalnih kancera; kancera endometrijuma; kancera jajnika; kancera grlića materice; i neuroblastoma.

Prostaglandin E2 (PGE2) je bioaktivni lipid koji može izazvati široki opseg bioloških efekata u vezi sa inflamacijom i kancerom. PGE2 pripada familiji lipida prostanoida. Cikooksigenaza (COX) je enzim koji ograničava brzinu u sintezi bioloških medijatora koji se zovu prostanoidi, koji se sastoje od prostaglandina PGD2, PGE2, PGF2α, prostaciklina PGI2, i tromboksana TXA2. Prostanoidi funkcionišu preko aktivacije sedam transmembranskih receptora kuplovanih sa G proteinom (GPCRs), naročito EP1, EP2, EP3, i EP4 koji su receptori za PGE2. Aktivacija oba EP2 i EP4 sa PGE2 stimuliše adenilat ciklazu, dovodeći do podizanja nivoa cAMP u citoplazmi da bi se inicirali višetruki nishodni slučajevi preko njenog prototipskog efektora protein kinaze A. Pored toga, PGE2 je takođe u stanju da signalizira pomoću PI3K/AKT i Ras-MAPK/ERK signalizacije

Kancer je jedan od vodećih uzroka smrti u svetu. Tumori se sastoje od abnormalno proliferirajućih malignih ćelija kancera ali takođe i od mikrookoline koja to funkcionalno podržava. Mikrookolina ovog tumora se sastoji od složenog niza ćelija, komponenti vanćelijskog matriksa i signalih molekula i uspostavila je izmenjenu komunikaciju između stromalnih i tumorskih ćelija. Kako tumor povećava veličinu, one izazvivaju proizvodnju različitih faktora koji mogu pomoći tumoru da raste kao što su angiogeni faktori (pospešuju unutrašnjii rast krvnih sudova) ili koje mogu pomoći da se izbegne napad imunološkog odgovora domaćina. PGE2 je tako imuno-modulatorni faktor koji se proizvodi u tumorima.

Ustanovljeno je da COX2, uglavnom preko PGE2, pospešuje celokupni rast tumora i nadregulisan je i u korelaciji sa kliničkim ishodom u velikom procentu uobičajenih kancera, naročito kolorektalnog, želudca, ezofagusa, pankresa, grudi kancera jajnika. Visoki nivoi ekspresije COX-2 i PGE2 su u vezi sa neoplastičnom transformacijom, ćelijskim rastvom, angiogenezom, invazivnošću, metastazama i zatajivanjem imunog sistema.

Nalaz da je COX2 prekomerno eksprimovan i igra važnu ulogu u karcinogenezi kod gastrointestinalnih (GI) kancera uključujući između ostalih ezofagusne, želudačne i kolorektalne kancere je doveo do činjenice da inhibitori COX (Coxibs), uključujući celekoksib, i ostale nesteroidne antiinflamatorne lekove (NSAID), uključujući aspirin, su među najistraživanijim hemopreventivnim sredstvima protiv kancera u današnjem razvoju (za pregled videti na primer Wang R et al, Curr Pharm Des. 2013;19(1):115-25; Garcia Rodriguez LA et al, Recent Results Cancer Res.

2013;191:67-93, Sahin IH et al, Cancer Lett.2014 Apr 10;345(2):249-57; Drew DA et al, Nat Rev Cancer 2016, 16:173; Brotons C et al, Am J Cardiovasc Drugs.2015 Apr; 15(2):113)

Dodatno COX2 i PGE2, takođe EP receptori, naročito EP2 i EP4, su abnormalno prekomerno eksprimovani u višestrukim tipovima kancera, naročito u gastro-intestinalnim (GI) kancerima i kanceru pankreasa. Pored toga, prekomerna ekspresija PGE2 i/ili EP2 i/ili EP4 je u korelaciji sa napredovanjem kod nekih tipova kacera kao što su ezofagusni karcionom skvamoznih ćelija (Kuo KT et al, Ann Surg Onc 2009; 16(2), 352-60); karcinom skvamoznih ćelija pluća (Alaa M et al, Int J Oncol 2009, 34(3); 805-12); kancer prostate (Miyata Y et al, Urology 2013, 81(1):136-42); Badawi AF and Badr MZ Int J Cancer.2003, 103(1):84-90); karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (Gallo O et al, Hum Pathol.2002, 33(7):708-14).

Prema ispitivanjima izvedenim sa koksibima, kod miševa, utišavanje ili COX1, COX2, mikrozomalne prostaglandin E sitnetaze 1 (mPTGES1), EP2 ili EP4 dovela je do smanjenog javljanja tumora i napredovanja na različitim modelima tumora. Suprotno, prekomerna ekspresija COX2 ili mPTGES1 u transgenim miševima dovodi do povećanog javljanja tumora i opterećenja tumorom (za pregled pogledati Nakanishi M. and Rosenberg D.W., Seminars in Immunopathology 2013, 35: 123–137; Fischer SM et al Cancer Prev Res (Phila) 2011 Nov;4(11):1728-35; Fulton AM et al Cancer Res 2006; 66(20); 9794-97).

Nekoliko farmakoloških ispitivanja inhibiranja rasta tumora i napredovanja korišćenjem antagonista EP receptora ili inhibitora COX2 na različitim modelima tumora je izvedeno kod miševa. Između ostalih, EP antagonisti i/ili COX2 inhibitori smanjuju rast tumora i metastaze na eksperimentalnim modelima kolorektalnog kancera (npr. Yang L et al Cancer Res 2006, 66(19), 9665-9672; Pozzi A.et al JBC 279(28); 29797-29804), karcinoma pluća (Sharma S et al Cancer Res 200565(12), 5211-5220), gastro-intestinalnog kancera (Oshima H et al Gastroenterology 2011, 140(2); 596-607; Fu SL et al world J Gastroenterol 2004, 10(13); 1971-1974), kancera grudi (Kundu N et al, Breast Cancer Res Treat 117, 2009; 235-242; Ma X et al, OncoImmunology 2013; Xin X et al Lab Investigation 2012, 1-14; Markosyan N et al; Breast Cancer Res 2013, 15:R75), kancera prostate (Xu S et al, Cell Biochem Biophys 2014, Terada et al Cancer Res 70(4) 2010; 1606-1615), kancera pankreasa (Al-Wadei HA et al, PLOS One 2012, 7(8):e43376; Funahashi H et al, Cancer Res 2007, 67(15):7068-71). Inhibitori COX2 su odobreni za lečenje familijarne adenomatozne polipoze (FAP) koji je nasleđen sindrom predispozicije za kolorektalni kancer, ali kasnije povučen znog kardiovaskularnih neželjenih dejstava.

Mehanički, PGE2 signalizacija je uglavnom uključena u ukrštanje izmeću tumora i stromalnih ćelija, tako stvarajući mikrookolinu koja je pogodna za rast tumora. Posebno, PGE2 signalizacija preko EP2 i EP4 može na primer (i) potisnuti citotoksičnost i proizvodnju ćelija prirodnih ubica od strane citokina, (ii) iskriviti polarizaciju makrofaga u vezi sa tumorom naspram M2 makrofaga koji pospešuju tumor (videti na primer Nakanishi Y et al Carcinogenesis 2011, 32:1333-39), (iii) regulisati aktivaciju, ekspanziju i efektorsku funkciju obe Tregs (regulatorne T ćelije) i MDSC (supresorske ćelije izvedene iz mijeloida), koje su potentne imunosupresivne ćelije koje se akumuliraju u tumorima i kod pacijenata i na eksperimentalnim životinjskim modelima (videti na primer Sharma S et al, Cancer Res 2005, 5(12):5211-20; Sinha P et al Cancer Res 2007, 67(9), 4507-4513; Obermajer N et al, Blood 2011, 118(20):5498-5505); (iv) smanjeno regulisati ekspresiju IFN-γ, TNF-α IL-12 i IL-2 u imunim ćelijama kao što su ćelije prirodne ubice, T-ćelije, dendritske ćelije i makrofagi, umanjujući sposobnost ovih imunih ćelija da izazovu apoptozu ćelija tumora i suzbiju tumorigenezu (videti na primer Bao YS et al, Int Immunopharmacol.2011;11(10):1599-605; Kim JG and Hahn YS, Immunol Invest.2000;29(3):257-69; Demeuere CE et al, Eur J Immunol.1997;27(12):3526-31; Mitsuhashi M et al, J Leukoc Biol.2004;76(2):322-32; Pockaj BA et al , Ann Surg Oncol.2004;11(3):328-39; (v) suzbiti aktivaciju, odgovaranje na IL-2, ekspanziju i citotoksičnost T-ćelija tako doprinoseći lokalnoj imunosupresiji (videti na primer Specht C et al, Int J Cancer 200191:705-712); (vi) inhibirati zrenje dendritnih ćelija, njihove sposobnosti da prezentuju antigene i proizvode IL-12, što dovodi do abortivne aktivacije citotoksičnih T-ćelija (videti na primer Ahmadi M et al, Cancer Res 2008, 68(18):7250-9; Stolina M et al, J Immunol 2000, 164:361-70); (vii) regulisati angiogenezu tumora (obrazovanje novih krvnih sudova za snabdevanje nutrijentima i kiseonikom) pospešivanjem pokretljivosti endotelijalnih ćelija i preživljavanja kao i povećanje ekspresije VEGF (vaskularni endotelijalni faktor rasta) (videti na primer Zhang Y and Daaka Y, Blood 2011;118(19):5355-64; Jain S et al, Cancer Res. 2008; 68(19):7750-9; Wang and Klein, Molecular Carcinogenesis 2007, 46:912-923; (viii) pospešiti preživljavanja ćelija tumora (pomoću signalizacije PI3K/AKT i MAPK). Za pregled videti na primer Kalinski P, J Immunol 2012, 188(1), 21-28; Obermajer N et al, Oncoimmunology 1(5), 762-4; Greenhough A et al, carcinogenesis 2009, 30(3), 377-86; Wang D and Dubois RN, Gut 2006, 55, 115-122; Harris SG e al Trends Immunol 2002, 22, 144-150).

Koksibi su pokazali da čine ćelije tumora osetljivim na zračenje i hemoterapiju i nekoliko kliničkih ispitivanja je izvedeno ili je u toku koja kombinuju koksibe sa radio- i/ili hemoterapijom (za pregled videti npr. Ghosh N et al, Pharmacol Rep.2010 Mar-Apr;62(2):233-44; Davis TW et al, Am J Clin Oncol.2003, 26(4):S58-61; videti takođe Higgins JP et al, Cancer Biol Ther 2009, 8:1440-49).

Pored toga, postoje neki dokazi za aditivne efekte i/ili sinergiju između koksiba i inhibitora receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) (videti na primer Zhang X et al, Clin Cancer Res.2005, 11(17):6261-9; Yamaguchi NH et al, J Gastrointest Oncol.2014, 5(1):57-66); i sa inhbitorima aromataze (videti na primer Generali D et al, Br J Cancer.

2014;111(1):46-54; Lustberg MB et all, Clin Breast Cancer.2011 Aug;11(4):221-7; Falandry C et al, Breast Cancer Res Treat.2009 Aug;116(3):501-8); Chow LW et al, J Steroid Biochem Mol Biol.2008, 111(1-2):13-7).

Pored toga, aditivni/sinergijski efekti su viđeni kod različitih modela tumora na mišu kada je asprin (inhibitor COX1/2) bio kombinovan sa anti-VEGF antitelom (Motz GT et al; Nat Med 201420(6):607) i ova kombinacija se trenutno ispituje u kliničkim ispitivanjima (NCT02659384).

Nedavno, pokazano je da, različiti imunoterapeutski prilazi ukoliko se kombinuju pospešuju antitumornu efkasnost. Usled imunomodulatornih osobina PGE2, koksibi su takođe bili korišćeni u kombinaciji sa različitim imunoterapeutskim prilazima. Posebno, aditivni ili čak sinergijski efekti se mogu primetiti kada se koksibi kombinuju sa vakcinacijom dendritnih ćelija na modelu glioma kod pacova i na modelu mišjeg mezotelioma ili melanoma (Zhang H et al, Oncol Res.2013;20(10):447-55; Veltman JD et al, BMC Cancer.2010;10:464; Toomey D et all, Vaccine.2008 Jun 25;26(27-28):3540-9); sa granulocitno makrofagnim faktorom stimulacije kolonija (GM-CSF) na tumorima na mozgu miša (Eberstål S et al, Int J Cancer.2014 Jun 1;134(11):2748-53); sa gama interferonom (IFN-γ) na tumorima mozga (Eberstål S et al, Cancer Immunol Immunother. 2012, 61(8):1191-9); sa vakcinacijom dendritnih ćelija ili sa GM-CSF na modelu kancera grudi kod miša (Hahn T et al, Int J Cancer.2006,118(9):2220-31); i sa terapijom adenovirusnog beta interferona (IFN- β) na modelu mezotelioma miša (DeLong P et al, Cancer Res. 2003 Nov 15;63(22):7845-52). U tom smislu, aditivni ili čak sinergijski efekti koksiba i/ili EP2 i/ili EP4 antagonista mogu biti predviđeni sa sredstvima koja deluju na citotoksični protein 4 povezan sa T-limfocitima (CTLA-4) kao što su anti-CTLA-4 antitela; anti-TIM-3 antitela, anti-Lag-3 antitela; anti-TIGIT antitela; ili, posebno, sa sredstvima koja deluju na protein 1 programirane ćelijske smrti (PD1), kao što su anti-PD1 ili anti-PDL1 (ligand 1 programirane ćelijske smrti) antitela (Yongkui Li et al Oncoimmunology 2016, 5(2):e1074374; Zelenay S et al, Cell 2015, 162; 1-14; WO2013/090552, koja ukazuju na sinergijski efekat dvojne blokade EP2 i EP4 u kombinaciji sa sredstvima koja deluju na PD1).

Adenozin je još jedan endogeni faktor sa anti-inflamatornim osobinama koje su stvorene preko aktivnosti ektonukleotidaza, CD39 i CD73, eksprimovanim na različitim ćelijskim tipovima, uključujući regulatorne T ćelije (Treg) (Mandapathil M et al, J Biol Chem.2010; 285(10):7176-86). Imune ćelije takođe odgovaraju na adenozin, zato jer nose receptor za ADO, koji je uglavnom A2a/A2b tipa (Hoskin DW, et al, Int J Oncol 2008, 32:527–535). Signalizacija preko receptora adenozina i recptora EP2/EP4 konvergira citoplazmatičnoj adenilil ciklazi, vodeći do povećane regulacije cAMP. Pokazano je da adenozin i PGE2 sarađuju u supresiji imunih odgovora posredovanih regulatornim T ćelijama (Mandapathil M et al, J Biol Chem.2010; 285(36):27571-80; Caiazzo E et al, Biochem Pharmacol.2016; 112:72-81).

Prema tome, prikazani antagonisti EP2 i/ili EP4 antagonisti mogu biti korisni, sami, ili u kombinaciji sa sa jednim ili više terapeutskih sredstava i/ili hemoterapija i/ili radioterapija i/ili imunoterapija; posebno u kombinaciji sa hemorerapijom, radioterapijom, EGFR inhibitorima, inhibitorima aromataze, anti-angiogenim lekovima, inhibitorima adenozina, imunoterapijom kao što je naročito blokada PD1 i/ili PDL1, ili druge ciljane terapije; za prevenciju / profilaksu ili lečenje kancera, posebno za prevenciju / profilaksu ili lečenje kancera kože uključujući melanom koji obuhvata i metastatički melanom; kancer pluća koji uključuje kancer nemalih ćelija pluća; kancer bešike koji uključuje kancer mokraćne bešike, karcinom urotelijalnih ćelija; karcinome bubrega uključujući karcinom bubrežnih ćelija, metastatski karcinom bubrežnih ćelija, metastatski bubrežni svetloćeliski karcinom; gastro-intestinalni kanceri koji uključju kolorektalni kancer, metastatski kolorektalni kancer, familijarnu adenomatznu polipozu (FAP), ezofagusni kancer, kancer želudca, kancer žučne kese, holangiokarcinom, hepatocelularni karcinom, i kancer pankreasa kao što je adenokarcinom pankreasa ili duktalni karcinom pankreasa; kancer endometrijuma; kancer jajnika; kancer grlića materice; neuroblastom; kancer prostate koji uključuje kancer prostate rezistentan na kastraciju; tumore mozga koji uključuju metastaze mozga, maligne gliome, multiformni glioblastom, meduloblastom, meningiome; kancer grudi uključujući trostruko negativni karcinom grudi; oralni tumori; nazofaringealni tumori; rak grudnog koša; kancer glave i vrata; leukemije koje uključuju akutnu mijeloidnu leukemiju, leukemiju odraslih T-ćelija; karcinome; adenokarcinome; karcinom tiroidee uključujući papilarni tiroidni karcinom; horiokarcinom; Ewingov sarkom; osteosarkom; rhabdomiosarkom; Kapošijev sarkom; limfom uključujući Burkitov limfom, Hodgkinov limfom, MALT limfom; multipli mijelomi; i virusom izazvani tumori.

Pored toga, selektivni ili dvojni EP2 i/ili EP4 antagonisti mogu biti korisni u nekoliko drugih bolesti ili poremećaja koji reguju na lečenje sa inhibitorima COX2, sa predošću da antagonisti EP2 i/ili EP4 ne treba da poseduju potencijalna kardiovaskularna neželjena dejstva koja se javljaju kod inhibitora COX2, koji su uglavnom usled smetnje sinteze PGI2 i TXA2 (videti na primer Boyd MJ et al, bioorganic and medicinal chemistry letters 21, 484, 2011). Na primer, blokada proizvodnje prostaglandina inhibitorima COX je lečenje prema izboru za bol, uključujući naročito zapaljenski bol i bolne menstruacije. Prema tome EP2 i/ili EP4 i/ili dvojni EP2/EP4 antagonisti mogu biti korisni u lečenju bola, naročito zapaljenskog bola. Dokazi iz miša sa utišanim EP2 sugeriše da antagonisti EP2 mogu biti korisni u lečenju zapaljenske hiperalgezije (Reinold H et al, J Clin Invest 2005, 115(3):673-9). Pored toga, antagonisti EP4 imaju korisne efekte in vivo na modelima zapaljenskog bola (eg Murase A, Eur J Pharmacol 2008; Clark P, J Pharmacol Exp Ther.2008; Maubach KA Br J Pharmacol.2009; Colucci J Bioorg Med Chem Lett.2010, Boyd MJ et al, Bioorg Med Chem Lett 2011, Chn Q et al Br J Phramacol 2010, Nakao K et al, J Pharmacol Exp Ther.2007 Aug;322(2):686-94). Davanje EP2 u kominaciji sa antagonistom EP4 pokazalo je značajnu, ali parcijalnu inhibiciju zajedničkog zapaljena na mišjem modelu artritisa izazvanog kolagenom (Honda T et al J Exp Med 2006, 203(2):325-35).

EP2 i/ili dvojni EP2/EP4 antagonisti mogu biti korišćeni da smanje žensku plodnost, tj. pokazano je da sprečavaju trudnoću ukoliko se koriste kao kontraceptivi kod makakija (Peluffo MC et al Hum Reprod 2014). Miševi sa utišanim EP2 imaju smanjenu plodnost, manju veličinu legla i smanjeno širenje kumulusa (Matsumoto et al, Biology of reproduction 2001, 64; 1557-65; Hitzaki et al, PNAS 1999, 96(18), 10501-10506; Tilley SL J Clin Inves 1999, 103(11):1539-45; Kennedy CR et al, Nat Med 19995(2):217-20).

Postoji i obrazloženje da antagonisti EP2 i/ ili EP4 mogu biti korišćeni za sprečavanje ili lečenje endometrioze: na primer EP2, EP3 i EP4 i COX2 su prekomerno eksprimovani u endometrioznim ćelijskim linijama i tkivima (npr. Santulli P et al J Clin Endocrinol Metab 2014, 99(3):881-90); lečenje antagonistima je takođe pokazano da inhibira adheziju ćelija endometrijuma in vitro (Lee J et al Biol Reprod 2013, 88(3):77; Lee J et al Fertil Steril 201, 93(8):2498-506); inhibitori COX2 je pokazano da smanjuju lezije endometrijuma kod miševa pomoću EP2 (Chuang PC et al, Am J Pathol 2010, 176(2):850-60); i lečenje antagonistima je pokazalo da izaziva apoptozu ćelija endometrijuma in vitro (Banu SK et al, MOl endocrinol 2009, 23(8) 1291-305).

Dvojni antagonisti EP2/EP4, ili kombinacija selektivnih EP2 antagonista sa selektivnim EP4 antagonistom, može biti za potencijalnu upotrebu za autoimune bolesti; npr. dokazano je da je efikasna na modelu multiple skleroze kod miša (MS) (Esaki Yet al PNAS 2010, 107(27):12233-8; Schiffmann S et al, Biochem Pharmacol.2014, 87(4): 625-35; videti takođe Kofler DM et al J Clin Invest 2014, 124(6):2513-22). Aktivacija EP2 / EP 4 signalizacije u ćelijama in vitro (Kojima F et al Prostaglandins Other Lipid Mediat 2009, 89:26-33) povezala je dvojne ili selektivne antagoniste EP2 i/ili EP4 antagoniste za lečenje reumatoidnog artritisa. Takođe, povećani nivoi PGE(2) su zabeleženi u sinovijalnoj tečnosti i hrskavici pacijenata sa osteoartritisom (OA) i pokazano je da PGE2 stimuliše degaradaciju matriksa u hondrociatma osteoartritisa preko EP4 receptora (Attur M et al, J Immunol.

2008;181(7):5082-8).

Prekomerna ekspresija EP4 je u vezi sa zapaljenskom reakcijom u aterosklerotskom plaku pacijenta (Cipollone F et al, Artherioscler Thromb Vasc Biol 2005, 25(9); 1925-31), prema tome upotreba antagonista EP4 i/ili dvojnog antagonista EP2/EP4 može biti indikovana za stabilizaciju plaka i prevenciju / profilaksu akutnih ishemijskih sindroma. Pored toga, deficijencija EP4 suzbija ranu aterosklerozu, ugrožavanjem preživljavanja makrofaga (Babaev VR et al, Cell Metab.2008 Dec;8(6):492-501)

Antagonisti EP2 i/ili dvojni antagonisti EP2/EP4 mogu takođe biti korisni u lečenju upale pluća: intrapulmonarno davanje apoptotičkih ćelija pokazuje da PGE(2) preko EP2 objašnjavaju nakanadno umanjanje plućno regrutovanje leukocita i klirans Streptococcus pneumoniae, kao i povećano stvaranje IL-10 in vivo (Medeiros AI et al J Exp Med 2009206(1):61-8).

Antagonisti EP2 i/ili dvojni antagonisti EP2/EP4 mogu dodato biti korisni u lečenju neurodegenerativnih bolesti (za pregled videti Cimino PJ et al, Curr Med Chem. 2008;15(19):1863-9). EP2 receptor ubrzava napredovanje zapaljenja na modelu amiotrofne lateralne skleroze kod miša (ALS) (Liang X et al, Ann Neurol 2008, 64(3):304-14); pokazano je da su inhibitori COX2 neuroprotektivni kod glodara na modelima moždanog udara, Parkinsonove bolesti i ALS (za pregled videti Liang X et al J Mol Neurosci 2007, 33(1):94-9), smanjena neurotoksičnost je primećena kod miševa sa utišanim EP2 lečenim sa parkinsonskim otrovom (Jin J et al, J Neuroinflammation 2007, 4:2), PGE2 preko EP2 pogoršava neurodegeneraciju kod kultivisanih ćelija pacova (Takadera T et al, Life Sci 2006, 78(16): 1878-83); smanjeno amiloidno opterećenje je primećeno na mišijem modelu Alchajmerove bolesti ukoliko je ukrštena sa miševima sa utišanim EP2 (Liang X et al J Neurosci 2005, 25(44):10180-7; Keene CD etal, Am J Pathol.2010, 177(1):346-54). EP2 null miševi su zaštićeni od neuronskih oštećenja posredovanih CD14-zavisnim/ urođenim imunitetom kod neurodegenerativnih bolesti (Shie FS et al Glia 2005, 52(1):70-7); PGE2 preko EP2 povećava ekspresiju proteina amiloidnog prekursora (APP) u kultivisanim mikroglijanim ćelijama pacova (Pooler AM et al Neurosci. Lett. 2004, 362(2):127-30). Antagonist EP2 ograničava oksidativno oštećenje od aktivacije urođenog imuniteta (intrakranijalna injekcija LPS) u mozgu i može biti korišćen za demenciju u vezi sa Alchajmerom ili HIV (Montine TJ et al, J Neurochem 2002, 83(2):463-70). Na mišjem modelu Alchajmerove bolesti kognitivna funkcija može biti poboljšana genetski i farmakološki inhibicijom EP4 (Hoshino T et al, J Neurochem 2012, 120(5):795-805).

Antagonisti EP2 i/ili dvojni antagonisti EP2/EP4 mogu takođe biti korisni u lečenju autozomalno dominantne bolesti policističnih bubrega (ADPKD): PGE2 preko EP2 indukovane cistogeneze humanih renalnih epitelijalnih ćelija; i EP2 je nađeno da je prekomerno eksprimovan u uzorcima pacijenta (Elberg G et al, Am J Physiol Renal Physiol 2007, 293(5):F1622-32).

Antagonisti EP4 i/ili dvojni antagonisti EP2/EP4 mogu takođe biti korisni za lečenje osteoporoze: PGE2 stimuliše resorpciju kosti uglavnom preko EP4 i parcijalno preko EP2 (Suzawa T et all, Endocrinology.2000 Apr;141(4):1554-9), miševi sa utišanim EP4 pokazuju pogoršanu resorpciju kosti (Miyaura C et al, J Biol Chem 2000, 275(26): 19819-23) i antagonisti EP4 pokazuju parcijalnu inhibiciju PGE(2)-stimulisane osteoklastogeneze i osteklasne resporpcije kostiju (Tomita M et al, Bone.2002 Jan;30(1):159-63).

WO2008/152093 opisuje selektivne modulatore EP2 receptora koji sadrže indolni prsten povezan sa ostatkom molekula u položaju 3, i pirimidinski deo koji međutim nije supstituisan sa direktno veznim aromatičnim supstituentom. WO2006/044732 opisuje jedinjenja pirimidina koja su modulatori PGD2 za koje je tražena zaštita kao korisnih npr. u lečenju alergijskih bolesti. WO2008/006583 opisuje derivate pirimidina koji su inhibitori ALK-5. WO2006/044732 i WO2008/039882 opisuju izvesne derivate pirimidina kao antagoniste receptora D2 prostaglandina. Pirimidin-2-il derivati su opisani u WO2013/020945, WO2012/127032, WO2011/144742, Bioorg. Med. Chem 2011, 21(13) 4108-4114 i Bioorg. Med. Chem 2011, 21(1) 66-75. Izvesna jedinjenja indol-1-acetamidnih jedinjenja su pozanata kao bibliotetska jedinjenja, npr. CAS 1448123-30-5 i CAS 1448075-88-4. Druga jedinjenja za koja je tražena zaštita kao sredstava protiv kancera su opisani u WO2006/128129, WO2008/008059 i Bioorg. Med. Chem 2013, 21(2), 540-546. WO2013/163190 i WO2015/058031 opisuju izvesne inhibitore DNK-PK koji su u interakciji sa postupcima popravke DNK. Opisana jedinjenja se smatra da su korisna za sezibiliziranje ćelija kancera, i da se pospeši efikasnost i hemoterapije i radioterapije kancera. EP1661896 opisuje pirolopirimidintionske derivate koji nose 2-amino-etil vezane supstituente na pirolnom azotu, pokazujući GSK-3 inhibitornu aktivnost umesto što su modulatori receptora EP2 za prostaglandin 2.

Prikazani pronalazak obezbeđuje nove N-supstituisane derivate indola formule (I) koji su modulatori receptora EP2 prostaglandina 2. Prikazana jedinjenja mogu, prema tome, kao pojedinačna sredstva ili naročito u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava kao što su naročito modulatori receptora PGE2 EP4, biti korisni za prevenciju / profilaksu ili lečenje bolesti koje reaguju na blokadu receptora EP2 (ili, ukoliko su korišćeni u kombinacji sa modulatorom receptora PGE2 EP4, do blokade oba receptora EP2 i EP4) kao što su naročito kanceri; kao i bol uključujući naročito zapaljenski bol i bolne menstruacije; endometrioza; akutne ishemijske sindrome kod aterosklerotskih pacijenata; upalu pluća; neurodegenerativne bolesti uključujući amiotrofnu lateralnu sklerozu, moždani udar; Parkinsonovu bolest, Alchajmerovu boelst i demenciju u vezi sa HIV-om; autozomalnu dominantu bolest policističnih bubrega i; i kontrolu ženske plodnosti.

1) Prvi aspekt pronalaska se odnosi na jedinjenja formule (I)

Formula (I)

gde

R<1>predstavlja vodonik ili metil;

R<2>predstavlja metil, bromo, hloro, ili cijano.

Prikazani pronalazak takođe obuhvata izotoposki obeležen, naročito<2>H (deuterijumom) obeležena jedinjenja formule (I) prema izvođenjima 1) do 7), čija jedinjenja su identična jedinjenjima formule (I) osim što je jedan ili više atoma bilo zamenjeno sa atomom koji ima isti atomski broj ali različitu atomsku masu od atomske mase koja se uobičajeno nalazi u prirodi. Izotopski obeleženi, naročito<2>H (deuterijumski) obeležena jedinjenja formule (I) i njene soli su u okviru obima prikazanog pronalaska. Supstitucija vodonika sa težim izotopom<2>H (deuterijumom) može voditi do veće metaboličke stabilnosti, dovodeći do npr. povećanog in-vivo poluživota ili smanjenih zahteva za doziranje, ili može voditi do smanjene inhibicije enzima citohroma P450, dovodeći npr. do povećanog profila sigurnosti. U jednom izvođenju pronalaska, jedinjenja formule (I) nisu izotoposki obeležena, ili oni su obležena samo sa jednim ili više deuterijumskih atoma. U podizvođenju, jedinjenja formule (I) nisu uopšte izotopski obelžena. Izotopski obležena jedinjenja formule (I) mogu biti dobijena analogno dole opisanim postupcima, ali korišćenjem odgovarajućih izotopskih varijacija pogodnih reagenasa ili polaznih materijala.

U ovoj patentnoj prijavi, veza koja je prikazana crticama prikazuje tačku vezivanja nacrtanog radikala. Na primer, radikal dole nacrtan

je 2-metil-1H-indol-1-il grupa.

Kada je korišćen oblik u množini za jedinjenja, soli, farmaceutske kompozicije, bolesti i slično namera je da se takođe označava pojedinačno jedinjenje, so ili slično.

Bilo koje pozivanje na jedinjenja formule (I) prema izvođenjima 1) do 7) treba razumeti da se takođe pozivaju na soli (i naročito farmaceutski prihvatljive soli) takvih jedinjenja, kao odgovarajuće i celishodne.

Izraz "farmaceutski prihvatljive soli" odnosi se na soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost predmetnog jedinjenja i pokazuju minimalne neželjene toksikološke efekte. Takve soli uključuju neogranske ili organske i-ili bazne adicione soli u zavisnosti od prisustva baznih i/ili kiselih grupa u predmetnom jedinjenju. Radi reference pogledati na primer “Handbook of Phramaceutical Salts. Properties, Selection and Use.”, P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.), Wiley-VCH, 2008; i “Pharmaceutical Salts and Co-crystals”, Johan Wouters and Luc Quéré (Eds.), RSC Publishing, 2012.

Ovde obezbeđene definicije imaju nameru da se primenjuju jednoobrazno na jedinjenja formule (I), kako je definisano u bilo kom od izvođenja 1) do 6), i, mutatis mutandis, kroz opis i patentne zahteve osim ako nije drugačije izričito navedeno u definiciji koja obezbeđuje širu ili užu definiciju. Razume se da definicija ili poželjna definicija izraza definiše i može zameniti odgovarajući izraz nezavisno (ili u kombinaciji sa) bilo kojom definicijom ili poželjnom definicijom bilo kog ili svih drugih izraza kako je ovde definisano.

Kad god je supstitent označen kao opcioni, razume se da takav susptituent ne mora biti prisutan, u tom slučaju svi položaji koji imaju slobodnu valencu (za koji takav opcioni supstituent bi mogao biti vezan; kao što su na primer u aromatičnom prstenu ugljenikovi atomi i / ili azotovi atomi u prstenu koji imaju slobodnu valencu ) kada je pogodno su supstituisani sa vodonikom. Slično, u slučaju da je izraz “opciono” korišćen u kontekstu heteroatom(a) (u prstenu), izraz označava da ili odgovarajući opcioni heteroatom(i) ili slično, nisu prisutni (tj. izvesni deo ne sadrži heteroatom(e) / je karbocikl / ili slično), ili odgovarajući opcioni heteroatom(i), ili slično, su prisutni kao eksplicitno definisani.

Izraz “halogen” označava fluor, hlor, brom, ili jod; naročito fluor, hlor, ili brom; poželjno fluor ili hlor.

Izraz “alkil”, korišćen sam ili u kombinaciji, odnosi se na zasićenu pravu ili razgranatu ugljovodoničnu grupu koja sadrži jedan do šest ugljenikovih atoma. Izraz “(Cx-y)alkil” (x i y su oba celi broj), odnosi se na alkil grupu kao što je ranije definisano, koja sadrži x do y ugljenikovih atoma. Na primer (C1-6)alkil grupa sadrži od jedan do šest ugljenikovih atoma. Primeri alkil grupa su metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, terc.-butil, 3-metil-butil, 2,2-dimetil-propil i 3,3-dimetil-butil. Da bi se izbegla svaka sumnja, u slučaju da se grupa odnosi na npr. propil ili butil, smatra se da je n-propil, odnosno n-butil. Poželjni su metil i etil. Najpoželjniji je metil.

Izraz “alkoksi”, korišćen sam ili u kombinaciji, odnosi se na alkil-O- grupu u kojoj alkil grupa je kao što je gore definisano. Izraz “(Cx-y)alkoksi” (x i y svaki je ceo broj) odnosi se na alkoksi grupu kako je ranije definisano koja sadrži x do y ugljenikovih atoma. Na primer (C1-4)alkoksi grupa označava grupu formule (C1-4)alkil-O- u kojoj izraz “(C1-4)alkil” ima prethodno dato značanje. Primeri alkoksi grupa su metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, nbutoksi, izobutoksi, sek.-butoksi i terc.-butoksi. Poželjni su etoksi i naročito metoksi.

Izraz "fluoroalkil”, korišćen sam ili u kombinaciji, odnosi se na alkil grupu kako je gore definisano koja sadrži jedan do tri ugljenikova atoma u kojima jedan ili više (i moguće svi) atomi vodonika su bili zamenjeni sa fluorom. Izraz

1

“(Cx-y)fluoroalkil” (x i y svaki je celi broj) odnosi se na fluoroalkil grupu kako je gore definisano koja sadrži x do y ugljenikovih atoma. Na primer (C1-3)fluoroalkil grupa sadrži od jedan do tri ugljenikova atoma u kojima jedan do sedam vodonikovih atoma je zamenjeno sa fluorom. Reprezentativni primeri fluoroalkil grupa uključuju trifluorometil, 2-fluoroetil, 2,2-difluoroetil i 2,2,2-trifluoroetil. Poželjne su (C1)fluoroalkil grupe kao što je trifluorometil.

Izraz "fluoroalkoksi”, korišćen sam ili u kombinaciji, odnosi se na alkoksi grupu kako je gore definisano koja sadrži jedan do tri ugljenikovih atoma u kojima jedan ili više (i moguće svi) atoma vodonika je zamenjeno sa fluorom. Izraz “(Cx-y)fluoroalkoksi” (x i y svaki je seo broj) odnosi se na fluoroalkoksi grupu kako je gore definisano koja sadrži x do y ugljenikovih atoma. Na primer (C1-3)fluoroalkoksi grupa sadrži od jedan do tri ugljenikovih atoma u kojima jedan do sedam atoma vodonika je zamenjeno sa fluorom. Reperezentativni primeri fluoroalkoksi grupa uključuju trifluorometoksi, difluorometoksi, 2-fluoroetoksi, 2,2-difluoroetoksi i 2,2,2-trifluoroetoksi. Poželjni su (C1)fluoroalkoksi grupe kao što su trifluorometoksi i difluorometoksi, kao i 2,2,2-trifluoroetoksi.

Izraz "cikloalkil", korišćen sam ili u kombinaciji, odnosi se na zasićeni monociklični ugljovodonični prsten koji sadrži tri do šest ugljenikovih atoma. Izraz "(Cx-y)cikloalkil" (x i y su svaki ceo broj), odnosi se na cikloalkil grupu kao što je gore definisano koja sadrži x do y ugljenikovih atoma. Na primer (C3-6)cikloalkil grupu koja sadrži od tri do šest ugljenikovih atoma. Primeri cikloalkil grupa su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, i cikloheptil. Poželjni su ciklopropil, ciklobutil, i ciklopentil; naročito ciklopropil.

Izraz "cijano" odnosi se na grupu -CN.

Jedinjenja formule (I) su supstituisana sa karboksilnom kiselinskom grupom -COOH; razume se da takva karboksilna kiselinska grupa može biti prisutna u obliku grupe proleka. Takvi prolekovi su obuhvaćeni obimom prikazanog pronalaska. U izvesnim slučajevima karboksilno kiselinske grupe proleka mogu kao takve pokazivati biološku aktivnost na receptor EP2, gde u drugim slučajevima, takva jedinjenja koja sadrže takve karboksilno kiselinske grupe proleka zahtevaju (npr. enzimsko) cepanje proleka da bi pokazali biološku aktivnost na receptoru EP2. Prolekovi karboksilno kiselinske funkcionalne grupe su dobro poznati u stanju tehnike (videti na primer J. Rautio (Ed.) Prodrugs and Targeted Delivery: Towards Better ADME Properties, Volume 47, Wiley 2010,ISBN: 978-3-527-32603-7; H. Maag in Stella, V., Borchardt, R., Hageman, M., Oliyai, R., Maag, H.,Tilley, J. (Eds.) Prodrugs: Challenges and Rewards, Springer 2007, ISBN 978-0-387-49785-3).

Posebni primeri prolekova, na primer pogodni za takve -COOH grupe su:

● estarske grupe -CO-O-P<1>u kojima P<1>je na primer (C1-4)alkil; (C3-6)cikloalkil gde (C3-6)cikloalkil opciono sadrži kiseonikov atom u prstenu; (C3-6)cikloalkil-(C1-3)alkil gde (C3-6)cikloalkil opciono sadrži kiseonikov atom u prstenu; (C1-3)fluoroalkil; hidroksi-(C2-4)alkil; ili (C1-4)alkoksi-(C2-4)alkil (naročito P<1>je (C1-4)alkil, naročito metil ili etil);

● grupe -CO-NH-SO2-R<S3>u kojima R<S3>predstavlja (C1-4)alkil, (C3-6)cikloalkil gde (C3-6)cikloalkil opciono sadrži kiseonikov atom u prstenu; (C3-6)cikloalkil-(C1-3)alkil u kome (C3-6)cikloalkil opciono sadrži kiseonikov atom u prstenu; (C1-3)fluoroalkil, fenil, -NH2; (naročito R<S3>je (C1-4)alkil, (C3-6)cikloalkil, ili fenil; naročito metil);

● grupe - -CO-R<O1>u kojima R<O1>predstavlja -O-CH2-CO-R<O4>, gde R<O4>predstavlja hidroksi, ili (C1-4)alkoksi, ili -N[(C1-4)alkil]2(naročito -CO-O-CH2-COOH, -CO-O-CH2-CO-N(CH3)2);

● grupe -CO-R<O1>gde R<O1>predstavlja -O-CH2-O-CO-R<O5>, gde R<O5>predstavlja (C1-4)alkil ili (C1-4)alkoksi (naročito -CO-O-CH2-O-CO-O-etil, -CO-O-CH2-O-CO-propil);

● grupe -CO-R<O1>gde R<O1>predstavlja -O-CH2-CH2-N[(C1-4)alkil]2(naročito -CO-O-CH2-CH2-N(CH3)2); i ● grupe -CO-R<O1>gde R<O1>predstavlja 5-metil-2-okso-[1,3]dioksol-4-il)-metiloksi-.

Gde god je korišćena reč “između” da opiše brojčani opseg, razume se da su krajnje tačke navedenog opsega eksplicitno uključene u ovaj opseg. Na primer: ukoliko je opisan temperaturni opseg između 40 ºC i 80 ºC, ovo znači da su krajnje tačke 40 ºC i 80 ºC uključene u opseg; ili ukoliko je promenjiva definisana kao ceo broj između 1 i 4, ovo znači da je promenjeiva ceo broj 1, 2, 3, ili 4.

Osim ako se ne koristi u pogledu temperatura, izraz “oko” smešten ispred numeričke vrednosti “X” odnosi se u ovoj prijavi na interval koji je proteže od X minus 10% od X do X plus 10% od X, i poželjno na interval koji se proteže od X minus 5% od X do X plus 5% od X. U posebnom slučaju sa temperaturama, izraz “oko” smešten ispred temperature “Y” odnosi se u ovoj prijavi na interval koji se proteže od temperature Y minus 10ºC do Y plus 10ºC, i poželjno na interval koji se proteže od Y minus 5ºC do Y plus 5ºC. Pored toga, izraz “sobna temperatura” kako je korišćen odnosi se na temperaturu od oko 25°C.

Druga izvođenja pronalaska su dole prikazana:

2) Drugo izvođenje odnosi se na jedinjenja prema izvođenju 1), gde R<1>predstavlja vodonik.

3) Još jedno izvođenje se odnosi na jedinjenja prema izvođenju 1), gde R<1>predstavlja metil.

4) Još jedno izvođenje se odnosi na jedinjenja prema bilo kom od izvođenja 1) do 3), gde R<2>predstavlja metil.

5) Još jedno izvođenje se odnosi na jedinjenja prema bilo kom od izvođenja 1) do 3), gde R<2>predstavlja hloro ili bromo (naročito hloro).

6) Još jedno izvođenje se odnosi na jedinjenja prema bilo kom od izvođenja 1) do 3), gde R<2>predstavlja cijano.

7) Još jedno izvođenje se odnosi na najpoželjnija jedinjenja prema izvođenju 1) koja su izabrana između sledećih jedinjenja:

4-{6-[2-(2-Metil-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeve kiseline;

4-{6-[2-(2-Cijano-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeve kiseline;

4-{6-[2-(2,7-Dimetil-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeve kiseline;

4-{6-[2-(2-Hloro-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeve kiseline; i

4-{6-[2-(2-Bromo-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeve kiseline.

Jedinjenja formule (I) prema izvođenjima 1) do 7) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu biti korišćene kao lekovi, npr. u obliku farmaceutskih kompozicija za unutrašnje (kao što je oralno npr. u obliku tablete ili kapsule) ili parenteralno davanje (uključujući lokalnu primenu ili inhalaciju).

Proizvodnja farmaceuteskih kompozicija može biti postignuta na način koji je poznat osobi iz struke (videti na primer Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (2005), Part 5, “Pharmaceutical Manufacturing” [objavljeno od strane Lippincott Williams & Wilkins]) dovođenjem opisanih jedinjenja formule (I) ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, opciono u kombinaciji sa drugim terapeutski značajnim supstancama u oblik za galensko davanje zajedno sa pogodnim, netoksičnim, inertnim, terapeutski kompatibilnim čvrsti ili tečnim materijalima nosača i, ukoliko je poželjno, uobičajenim farmaceutskim adjuvantima.

Prikazani pronalazak se takođe odnosi na postupak prevencije / profilakse ili lečenja bolesti ili poremećaja ovde pomenutih koji obuhvata davanje subjektu farmaceutski aktivne količine jedinjenja formule (I) prema izvođenjima 1) do 7).

U poželjnom izvođenju pronalaska, davana količina se nalazu između 1 mg i 2000 mg po danu, naročito između 5 mg i 1000 mg po danu, određenije između 25 mg i 500 mg po danu, naročito između 50 mg i 200 mg po danu.

Gde god je korišćena reč “između” da opiše numerički opseg, treba znati da su krajnje tačke navedenog opsega eksplicitno uključene u ovaj opseg. Na primer: ukoliko je opisano da je temperaturni opseg između 40 ºC i 80 ºC, ovo znači da su krajnje tačke 40 ºC i 80 ºC uključene u opseg; ili ukoliko je promenjiva definisana da je ceo broj između 1 i 4, ovo znači da je promenjiva ceo broj 1, 2, 3, ili 4.

Osim ako se ne koristi u pogledu temperatura, izraz “oko” smešten ispred numeričke vrednosti “X” odnosi se u ovoj prijavi na interval koji je proteže od X minus 10% od X do X plus 10% od X, i poželjno na interval koji se proteže od X minus 5% od X do X plus 5% od X. U posebnom slučaju sa temperaturama, izraz “oko” smešten ispred temperature “Y” odnosi se u ovoj prijavi na interval koji se proteže od temperature Y minus 10ºC do Y plus 10ºC, i poželjno na interval koji se proteže od Y minus 5ºC do Y plus 5ºC.

Da bi se izbegla svaka sumnja, ukoliko su jedinjenja opisana kao korisna u prevenciji / profilaksi ili lečenju izvesnih bolesti, takva jedinjenja su takođe pogodna za upotrebu u dobijanju lekova za prevenciju/ profilaksu ili lenjenje pomenutih bolesti. Slično, takva jedinjanja su takođe pogodna u postupku za prevenciju / profilkaksu ili lečenje takvih bolesti, koji obuhvata davanje subjektu (sisaru, naročito čoveku) kome je potrebno, efikasne količine takvnog jedinjenja.

Jedinjenja formule (I) prema izvođenjima 1) do 7) su korisna za prevenciju /profilaksu ili lečenje bolesti u vezi sa EP2 i/ili, ukoliko su korišćene u kombinaciji sa PGE2 receptora EP4, za oba receptora EP2 i EP4.

Jedinjenja koja inhibiraju receptor EP4 su naročito jedinjenja 4-[[4-(5-metoksi-2-piridinil)fenoksi]metil]-5-metil-N-[(2-metilfenil)sulfonil]-2-furankarboksamid (BGC-20-1531, BGC20-1531; WO2004/067524); N-[[2,4-(2-etil-4,6-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-1-il)feniletilamino]karbonil]-4-metil-benzensulfonamid (Grapiprant, AAT-007, CJ-023423, MR-10A7, RQ-00000007, RQ-07, RQ-7-; WO2002/032900); 4-[(1S)-1-[[[3-(difluorometil)-1-metil-5-[3-

1

(trifluorometil)fenoksi]-1H-pirazol-4-il]karbonil]amino]etil]-benzojeva kiselina (E-7046, ER-886046-00; WO2012/039972); CR-6086 (WO2012/076063); ONO-4578 (WO2016/111347); i 4-[1(S)-[5-Hloro-2-(3-fluorofenoksi)piridin-3-ilkarboksamido]etil]benzojeva kiselina (AAT-008, RQ-08, RQ-00000008; WO2005/021508); kao i jedinjenja opisana u WO2017/066633; WO2017/014323; WO2016/111347; WO2016/021742; WO2015/179615; WO2015/147020; WO2015/091475; WO2015/094912; WO2015/094902; WO2014/200075; WO2014/186218; WO2014/126746; WO2014/122267; WO2014/086739; WO2014/004230; WO2014/004229; WO2013/004290; WO2012/103071; WO2012/076063; WO2012/043634; WO2012/039972; WO2010/034110; WO2010/032123; WO2010/019796; WO2009/139373; WO2009/005076; WO2008/123207; WO2008/116304; WO2008/104055; WO2008/017164; WO2007/143825; WO2007/121578; WO2006/122403; WO2005/105733; WO2005/105732; WO2005/037812; WO2005/021508; WO2004/067524; WO2003/099857; WO2003/086390; WO2003/087061; WO2002/064564; WO2002/050032; WO2002/050033; WO2002/032422; WO2001/072302.

Izvesna jedinjenja formule (I) prema izvođenjima 1) do 7) pokazuju njihovu biološku aktivnost kao modulatori prostaglandin 2 receptora EP2 u biološkoj okolini, (tj. u prisustvu jednog ili više enzima koji su u stanju da cepaju kovalentnu vezanu za karbonilnu grupu kao što su amidaza, esteraza ili bilo koji njen pogodan ekvivalent sposoban da ukloni grupu proleka iz karboksilne kiselinske grupe.

Bolesti ili poremećaji koji se odnose na EP2 i/ili, ukoliko su takva jedinjenje korišćena u kombinaciji sa modulatorom PGE2 receptora EP4, za oba receptora EP2 i EP4, naročito su

● kancer (naročito melanom uključujući metastatski melanom; kancer pluća koji uključuje kancer nemalih ćelija pluća; kancer bešike uključujući kancer mokraćne bešike, karcionom urotelijalnih ćelija; karcinome bubrega uključujući karcinom bubrežnih ćelija, metastatski karcinom bubrežnih ćelija, metastatski bubrežni svetloćelijski karcinom; gastro-intestinalni kanceri koji uključuju kolorektalni kancer, metastatski kolorektalni kancer, familijarnu adenomatznu polipozu (FAP), ezofagusni kancer, kancer želudca, kancer žučne kese, holangiokarcinom, hepatocelularni karcinom, i kancer pankreasa kao što je adenokarcinom pankreasa ili duktalni karcinom pankreasa; kancer endometrijuma; kancer jajnika; kancer grlića materice; neuroblastom; kancer prostate koji uključuje kancer prostate rezistentan na kastraciju; tumore mozga koji uključuju metastaze mozga, maligne gliome, multiformni glioblastom, meduloblastom, meningiome; kancer grudi uključujući trostruko negativni karcinom grudi; oralni tumori; nazofaringealni tumori; rak grudnog koša; kancer glave i vrata; leukemije koje uključuju akutnu mijeloidnu leukemiju, leukemiju odraslih T- ćelija; karcinome; adenokarcinome; karcinom tiroidee uključujući papilarni tiroidni karcinom; horiokarcinom; Ewingov sarkom; osteosarkom; rhabdomiosarkom; Kapošijev sarkom; limfom uključujući Burkitov limfom, Hodgkinov limfom, MALT limfom; multipli mijelomi; i virusom izazvani tumori; naročito melanom; kancer pluća; kancer bešike; karcinomi bubrega; gastro-intestinalni kanceri; kancer endometrijuma; kancer jajnika; kancer grlića materice; i neuroblastom);

kao i druge bolesti ili poremećaji koji se odnose na receptore EP2 i/ili EP4 kao što su:

● bol (naročito zapaljenksi bol i bolne menstruacije);

● endometrioza;

● autozomalno dominantna bolest policističnih bubrega;

● akutne ishemijske sindrome kod pacijentata sa aterosklerozom;

● pneumonija; i

● neurodegenerativne bolesti uključujuči amiotrofnu lateralnu sklerozu , moždani udar; Parkinsonovu bolest, Alzhajmerovu bolest i demenciju u vezi sa HIV-om;

● i antagoniste EP2 i/ili EP4 koji mogu dalje biti korišćeni za kontrolu ženske plodnosti.

Druge bolesti ili poremećaji u vezi sa receptorima EP2 i/ili EP4 su autoimune bolesti kao što su naročito multiple skleroza, reumatoidni artritis i oesteoartritis; i osteoporoza.

Jedinjenja formule (I) prema bilo kom od izvođenja 1) do 7) su naročito korisna kao terapetuska sredstva za prevenciju / profilaksu ili lečenje kancera. Ona mogu biti korišćena kao pojedinačna terapeutska sredstva, gde prevencija / profilaska ili lečenje kancera pomenutih jedinjenja su korišćena poželjno u kombinaciji sa modulatorom PGE2 receptora EP4; i, pored toga, opciono u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapeutskih sredstava i/ili radioterapiji i/ili ciljanoj terapiji. Takvo kombinovano lečenje može se postići simultano, odvojeno, ili u toku vremenskog perioda.

Pronalazak, prema tome, takođe se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv materijal nosača, i:

● jedinjenje prema formuli (I) prema bilo kom od izvođenja 1) do 7); i/ili

● modulator PGE2 receptora EP4; i/ili

● jedan ili više citotoksičnih hemoterapeutskih sredstava.

Pronalazak, prema tome, dalje se odnosi na komplet koji sadrži

● farmaceutsku kompoziciju, pomenuta kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv materijal nosača, i:

� jedinjenje formule (I) prema bilo kom od izvođenja 1) do 7);

● i uputstva kako se koristi pomenuta farmaceutska kompozicija za prevenciju profilaksu ili lečenje kancera, u kombinaciji sa hemoterapijom i/ili radioterapijom i/ili ciljanom terapijom .

Izrazi "radioterapija" ili "terapija zračenjem" ili "radiaciona onkologija ", odnose se na medicinsku upotrebu jonizujućeg zračenja u prevenciji / profilaksi (pomoćnoj terapiji) i / ili lečenju kancera; uključujući spoljnu ili unutrašnju radioterapiju.

Izraz "ciljana terapija" odnosi se na prevenciju / profilaksu (pomoćnu terapiju) i / ili lečenje kancera sa jednim ili više anti-neoplastičnih sredstava kao što su mali molekuli ili antitela koja deluju na specifične tipove ćelija kancera ili stromalnih ćelija. Neke ciljane terapije blokiraju dejstvo izvesnih enzima, proteina ili drugih molekula koji su uključeni u rast i raznošenje ćelija kancera. Drugi tipovi ciljanih terapija pomažu imunom sistemu da ubije ćelije kancera (imunoterapije); ili inhibiraju angiogenezu, rast i obrazovanje novih krvnih sudova u tumoru; ili dostavljanje

1

toksičnih supstanci direktno u čelije kancera i njihovo ubijanje. Primer ciljane terapije koja je naročito pogodna da se kombinuje sa jedinjenjima prema prikazanom pronalasku je imunoterapija, naročito imunoterapija koja cilja receptor 1 programirane ćelijske smrti (PD-1 receptor) ili njegov ligand PD-L1 (Zelenay et al., 2015, Cell 162, 1-14; Yongkui Li et al., Oncoimmunology 2016, 5(2):e1074374).

Kada je korišćen u kombinaciji sa jedinjenjima formule (I), izraz "ciljana terpaija" se naročito odnosi na sredstva kao što su:

a) inhibitori receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) ili blokirajuća antitela (na primer Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Ikotinib, Lapatinib, Panitumumab, Zalutumumab, Nimotuzumab, Matuzumab i Cetuksimab); b) Inhibitori RAS/RAF/MEK puta (na primer Vemurafenib, Sorafenib, Dabrafenib,GDC-0879, PLX-4720, LGX818, RG7304, Trametinib (GSK1120212), Kobimetinib (GDC-0973/XL518), Binimetinib (MEK162, ARRY-162), Selumetinib (AZD6244));

c) Inhibitori aromataze (na primer Eksemestan, Letrozol, Anastrozol, Vorozol, u tokumestan, Fadrozol); d) Inhibitori angiogeneze, posebno inhibitori signalizacije VEGF kao što su Bevakuzimab (Avastin), Ramucirumab , Sorafenib ili Aksitinib;

e) Inhibitori imunoloških kontrolnih tačaka (na primer: anti-PD1 antitela kao što je Pembrolizumab (Lambrolizumab, MK-3475), Nivolumab, Pidilizumab (CT-011), AMP-514/MED10680, PDR001, SHR-1210; REGN2810, BGBA317; spojeni proteini koji ciljaju PD-1 kao što je AMP-224; mali molekuli anti-PD1 sredstva kao što su na primer jedinjenja opisana u WO 2015/033299, WO 2015/044900 i WO 2015/034820; anti-PD1L antitela, kao što je BMS-936559, atezolizumab (MPDL3280A, RG7446), MEDI4736, avelumab (MSB0010718C), durvalumab (MEDI4736); anti-PDL2 antitela, kao što je AMP224; anti-CTLA-4 antitela, kao što je ipilimumab, tremilmumab; antitela anti-Limfocitne-aktivacije gena 3 (LAG-3), kao što su BMS-986016, IMP701, MK-4280, ImmuFact IMP321; antitela anti T ćelijskog imunoglobulinskog mucina-3 (TIM-3), kao što su MBG453; anti-CD137/4-1BB antitela, kao što su BMS-663513 / urelumab, PF-05082566; anti T ćelijski imunoreceptor sa Ig i ITIM domenima (TIGIT) antitela, kao što je RG6058 (anti-TIGIT, MTIG7192A);

f) Pristupi vakcinaciji (na primer vakcinacija dendritskim ćelijama, vakcinacija peptidima ili proteinima (na primer sa gp100 peptida ili MAGE-A3 peptida);

g) Ponovno unošenje ćelija karcinoma koje potiču iz pacijenata ili alogenih (ne-sopstvenih) genetski modifikovanih da luče faktore imunomodulacije vakcine transfektovanih ćelija tumora (GVAX) genom stimulišućeg faktora granulocitno monocitnih kolonija (GMCSF) ili vakcine transfektovanih ćelija tumora (FVAX) genom liganda tirozin kinaze 3 u vezi sa Fms (Flt-3), ili vakcine na bazi tumora (TEGVAX) poboljšanih receptorom sličnim tolu;

h) adoptivne imunoterapije na bazi T-ćelija, uključujući T-ćelije genetski izmenjene receptorom himernog antigena (CAR) (na primer CTL019);

i) Terapija zasnovana na citokinu ili imunocitokinu (na primer Interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interleukin 2, interleukin 15);

1

j) Antagonisti receptora sličnog tolu (TLR) (na primer resikvimod, imikvimod, glukopiranozil lipid A, CpG oligodezoksinukleotidi);

k) Analozi talidomida (na primer lenalidomid, pomalidomid);

l) Inhibitori indoleamin-2,3-dioksigenaze (IDO) i/ili triptofan-2,3-dioksigenaze (TDO) (na primer RG6078 / NLG919 / GDC-0919; Indoksimod / 1MT (1-metiltriptofan), INCB024360 / Epakadostat, PF-06840003 (EOS200271), F001287);

m) Aktivatori receptora zajedno stimulisanih T-ćelijama (na primer anti-OX40/CD134 (član 4, superfamilije receptora faktora nekroze tumora, , kao što su RG7888 (MOXR0916), 9B12; MEDI6469, GSK3174998, MEDI0562), anti OX40-ligand/CD252; gen u vezi sa familijom TNFR indukovanom anti-glukokortikoidima (GITR) (kao što su TRX518, MEDI1873, MK-4166, BMS-986156), anti-CD40 (član 5 superfamilije TNF receptora) antitela (kao što je dacetuzumab (SGN-40), HCD122, CP-870,893, RG7876, ADC-1013, APX005M, SEA-CD40); anti-CD40-ligand antitela (kao što je BG9588); anti-CD27 antitela kao što je varlilumab);

n) Molekuli koji se vezuju za antigen specifičan za tumor kao i površinski marker T-ćelija kao što su bispecifična antitela (na primer RG7802 ciljajući CEA i CD3) ili fragmenti antitela, proteini koji podražavaju antiela kao što je konstruisani proteini sa ankirinskim ponavljanjima (DARPINS), bispecifični aktivatori T-ćelija (BITE, na primer AMG103, AMG330);

o) Antitela ili inhibitori male molekulske težine koji ciljaju receptor faktora -1 stimulacije kolonija (CSF-1R) (na primer emaktuzumab (RG7155), kabiralizumab (FPA-008), PLX3397);

p) Sredstva koja ciljaju kontrolne tačke imunih ćelija na prirodnim ćelijama ubicama kao što su antitela protiv receptora sličnih imunoglobulinima ćelija ubica (KIR) na primer lirilumab (IPH2102/BMS-986015); q) Sredstva koja ciljaju adenozinske receptore ili ektonukleaze CD39 i CD73 koje pretvaraju ATP u adenozin, kao što je MEDI9447 (anti-CD73 antitelo), PBF-509; CPI-444 (antagonist denozinskog A2a receptora).

Kada su korišćeni u kombinaciji sa jedinjenjenjima formule (I), poželjni su inhibitori imune kontrole tačke kao što su oni izlistani pod d), i naročiti oni koji ciljaju receptor 1 programirane smrti ćelija (PD-1 receptor) ili njegov ligand PD-L1, .

Izraz "hemoterapija" odnosi se na lečenje kancera sa jednim ili više citotoksičnih antineoplastičnih sredstava ("citotoksična sredstva za hemoterapiju"). Hemoterapija se često koristi zajedno sa drugim tretmanima za karcinom, kao što je radioterapija ili hirurgija. Izraz se posebno odnosi na konvencionalna citotoksična sredstva za hemoterapiju koja deluju ubijanjem ćelija koje se ubrzano dele, jednog od glavnih svojstava većine ćelija karcinoma. Hemoterapija može da koristi jedan lek u vremskom periodu (hemoterapija sa pojedinačnim sredstvom) ili nekoliko lekova odjednom (kombinovana hemoterapija ili polihemoterapija). Hemoterapija koja koristi lekove koji prelaze u citotoksičnu aktivnost samo pri izlaganju svetlosti se naziva fotohemoterapija ili fotodinamička terapija.

1

Izraz “citotoksično sredstvo za hemoterapiju” ili “hemoterapijsko sredstvo” kako se ovde koristi, odnosi se na aktivno antineoplastično sredstvo koje izaziva apoptozu ili nekrotičnu ćelijsku smrt. Kada se koristi u kombinaciji sa jedinjenjima formule (I), izraz se posebno odnosi na konvencionalna citotoksična sredstva za hemoterapiju kao što su:

a) sredstva za alkilovanje (na primer mehloretamin, hlorambucil, ciklofosfamid, ifosfamid, streptozocin, karmustin, lomustin, melfalan, dakarbazin, temozolomid, fotemustin, tiotepa ili altretamin; posebno ciklofosfamid, karmustin, melfalan, dakarbazin, ili temozolomid);

b) lekovi sa platinom (posebno cisplatin, karboplatin ili oksaliplatin);

c) antimetabolitski lekovi (na primer 5-fluorouracil, folna kiselina/leukovorin, kapecitabin, 6-merkaptopurin, metotreksat, gemcitabin, citarabin, fludarabin il pemetreksed; posebno 5-fluorouracil, folna kiselina/leukovorin, kapecitabin, metotreksat, gemcitabin ili pemetreksed);

d) antitumorski antibiotici (na primer daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, actinomicin-D, bleomicin, mitomicin-C ili mitokantrone; posebno doksorubicin);

e) mitotički inhibitori (na primer paklitaksel, docetaksel, iksabepilon, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, vindesin ili estramustin; posebno paklitaksel, docetaksel, iksabepilon ili, vincristin); ili

f) inhibitori topomeraze (na primer etopozid, tenipozid, topotekan, irinotekan, diflomotekan ili elomotekan;

posebno etopozid ili irinotekan).

Kada se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima formule (I), poželjna citotoksična sredstva za hemoterapiju su gore pomenuta sredstva za alkilovanje (naročito fotemustin,ciklofosfamid, ifosfamid, karmustin, dakarbazin i njihovi prolekovi kao što su posebno temozolomid ili farmaceutski prihvatljive soli ovih jedinjenja; posebno temozolomid); mitotički inhibitori (naročito paklitaksel, docetaksel, iksabepilon,; ili farmaceutski prihvatljive soli ovih jedinjenja; posebno paklitaksel); lekovi sa platinom (naročito cisplatin, oksaliplatin i karboplatin); kao i etopozid i gemcitabin.

Hemoterapija se može davati u svrhu lečenja ili može imati za cilj produžavanje života ili ublažavanje simptoma.

● Hemoterapija kombinovanog modaliteta je upotreba lekova sa drugim tretmanima karcinoma, kao što je terapija zračenjem ili hirurgija.

● Indukciona hemoterapija je prva linija lečenja karcinoma sa hemoterapijskim lekom. Ovaj tip hemoterapije se koristi u svrhu lečenja.

● Konsolidaciona hemoterapija se daje nakon remisije kako bi se produžilo ukupno vreme bez bolesti i poboljšalo ukupno preživljavanje. Lek koji se daje je isti kao i lek koji je postigao remisiju.

● Intenzivirajuća hemoterapija je identična sa konsolidacionom hemoterapijom ali se koristi drugačiji lek od onog koji se koristio za početak hemoterapije.

● Kombinovana hemoterapija obuhvata lečenje pacijenta sa više različitih lekova istovremeno. Lekovi se razlikuju u njihovom mehanizmu i neželjenim efektima. Najveća prednost je minimiziranje šansi za razvoj rezistentnosti prema bilo kom sredstvu. Takođe, lekovi se često mogu koristiti u nižim dozama, smanjujući toksičnost.

1

● Neoađuvantna hemoterapija se daje pre lokalnog lečenja kao što je hirurgija, i osmišljena je da smanji primarni tumor. Takođe se daje kod karcinoma sa visokim rizikom od mikrometastatske bolesti.

● Ađuvantna hemoterapija se daje nakon lokalnog lečenja (radioterapija ili hirurgija). Može se koristiti kada postoje mali dokazi o prisustvu kancera, ali postoji rizik od recidiva. Takođe je korisno u ubijanju svih ćelija kancera koje se šire na druge delove tela. Ove mikrometastaze se mogu lečiti sa ađuvantnom hemoterapijom i mogu smanjiti stopu recidiva uzrokovanu ovim rasejanim ćelijama.

● Hemoterapija za održavanje je ponovljeno lečenje malim dozama za produženje remisije

● Hemoterapija za spašavanje ili palijativna hemoterapija se daje bez kurativne namere, već samo za smanjenje tumorskog opterećenja i povećanja očekivanog životnog veka. Za ove režime, generalno se očekuje bolji profil toksičnosti.

“Istovremeno”, kada se misli na tip davanja, u ovoj prijavi znači da se dotični tip davanja sastoji u davanju dva ili više aktivnih sastojaka i/ili tretmana u približno isto vreme; pri čemu se podrazumeva da će istovremeno davanje dovesti do izlaganja subjekta na dva ili više aktivnih sastojaka i/ili tretmana u isto vreme. Kada se daju istovremeno, pomenuta dva ili više aktivnih sastojaka se mogu davati u kombinaciji sa fiksnom dozom, ili u kombinaciji sa ekvivalentnom nefiksnom dozom (npr. korišćenjem dve ili više različitih farmaceutskih kompozicija koje se daju istim putem davanja u približno isto vreme), ili kombinacijom nefiksne doze koristeći dva ili više različitih puteva davanja; pri čemu pomenuto davanje dovodi do suštinski istovremenog izlaganja subjekta na dva ili više aktivnih sastojaka i/ili tretmana. Na primer, kada se koriste u kombinaciji sa hemoterapijom i/ili pogodnom ciljanom terapijom, prisutni antagonistit EP2/EP4 bi se verovatno mogli koristiti "istovremeno".

“Fiksna kombinovana doza”, kada se misli na vrstu primene, u ovoj prijavi znači da se dotični tip davanja sastoji u davanju jedne pojedinačne farmaceutske kompozicije koja sadrži dva ili više aktivnih sastojaka.

“Odvojeno”, kada se misli na vrstu primene, u ovoj prijavi znači da se dotični tip davanja sastoji u davanju dva ili više aktivnih sastojaka i/ili tretmana u različitim vremenskim tačkama; pri čemu se podrazumeva da će zasebno davanje dovesti do faze lečenja (npr. najmanje 1 sat, naročito najmanje 6 sati, posebno najmanje 12 sati) gde je subjekt izložen na dva ili više aktivna sastojka i/ili tretmana u isto vreme; ali zasebno davanje takođe može dovesti do faze lečenja gde će tokom određenog vremenskog perioda (npr. najmanje 12 sati, posebno najmanje jedan dan) subjekt biti izložen jednom od dva ili više aktivna sastojka i/ili tretmana. Odvojeno davanje posebno se odnosi na situacije u kojima se barem jedan od aktivnih sastojaka i/ili tretmana daje periodično suštinski različito od dnevnog (kao što je jednom ili dva puta dnevno) davanja (npr. gde se jedan aktivni sastojakt i/ili tretman daje npr. jednom ili dva puta dnevno, a drugi se daje npr. svaki drugi dan, ili jednom nedeljno ili čak sa većim razmacima). Na primer, kada se koriste u kombinaciji sa radioterapijom, prikazani antagonisti EP2/EP4 bi se verovatno mogli koristiti "odvojeno".

Pod davanjem “tokom vremenskog perioda” u ovoj prijavi znači da se naknadno daju dva ili više aktivna sastojka i/ili tretmana u različito vreme. Izraz se posebno odnosi na postupak davanja prema kome se kompletno davanje jednog od aktivnih sastojaka i/ili tretmana završi pre nego što započne davanje drugog / ostalih. Na ovaj način je

1

moguće davati jedan od aktivnih sastojaka i/ili tretmana tokom nekoliko meseci pre davanja drugog aktivnog sastoj(a)ka) i/ili tretmana.

Davanje “tokom vremenskog perioda” takođe obuhvata situacije gde bi se jedinjenje formule (I) koristilo u lečenju koje počinje nakon završetka početnog hemoterapeutika (na primer indukciona hemoterapija) i/ili radioterapeutskog lečenja i/ili lečenja ciljanom terapijom, pri čemu bi opciono pomenuto lečenje bilo u kombinaciji sa daljim / tekućim hemoterapijskim i/ili radioterapijskim lečenjem i/ili lečenjem ciljanom terapijom (na primer u kombinaciji sa konsolidacionom hemoterapijom, intenzivirajućom hemoterapijom, ađuvantskom hemoterapijom, ili hemoterapijom za održavanje; ili njihovim radioterapijskim ekvivalentima); pri čemu bi takvo dalje /tekuće lečenje hemoterapijom i/ili radioterapijom i/ili lečenje ciljanom terapijom bilo istovremeno, odvojeno, ili tokom vremenskog perioda u smislu "nije dato sa istom periodičnošću".

Jedinjenja formule (I) kao što je definisano u izvođenjima 1) do 7), naročito u kombinaciji sa modulatorom PGE2 receptora EP4, su takođe korisna u postupku modulacije imunog odgovora subjekta koji ima tumor, koji obuhvata davanje efikasne količine jedinjenja formule (I); gde pomenuta efikasna količina reaktivira imuni sistem u tumoru pomenutog subjekta; gde je naročito pomenuta efikasna količina :

● suzbija polarizaciju makrofaga povezanih sa tumorom prema makrofagima M2 koji promovišu tumor; i/ili ● smanjuje regulaciju aktivacije, ekspanzije i/ili efektorske funkcije imunosupresivnih ćelija koje su se nakupile u tumoru (posebno regulatornih T ćelija (Tregs) i/ili supresorskih ćelija izvedenih iz mijeloida (MDSC)); i/ili ● pospešuje ekspresiju IFN-γ i/ili TNF-α i/ili IL-12 i/ili IL-2 u imunološkim ćelijama kao što su ćelije prirodne ubice, T-ćelije, dendrične ćelije i makrofagi (što dovodi do indukcije apoptoze ćelija tumora i/ili suzdržane tumorogeneze); i/ili

● direktno ili indirektno suzbija potisnutu aktivaciju, IL-2 odgovaranje i širenje citotoksičnih T-ćelija (čime se smanjuje lokalna imunosupresija).

Jedinjenja formule (I) kako je definisano u izvođenjima 1) do 7) , naročito u kombinaciji sa modulatorima PGE2 receptora EP4, su takođe korisna u postupku smanjenja rasta tumora i/ili smanjenja veličine tumora kod subjekta koji ima tumor, koji obuhvata davanje efiksane doze jedinjenja formule (I); gde pomenuta efikasna količina smanjuje regulaciju angiogeneze tumora (naročito smanjenjem pokretljivosti endotelijalnih ćelija i/ili preživljavanja, i/ili smanjenjem ekspresije VEGF(vaskularnog endotelijalnog faktora rasta)); i/ili gde pomenuta efikasna količina smanjuje preživljavanje ćelija tumora i/ili izaziva apoptozu ćelija tumora (naročito preko inhibicije PI3K/AKT i MAPK signalizacije).

Jedinjenja formule (I) kao što je definisano u izvođenjima 1) do 7) , naročito u kombinaciji sa modulatorom PGE2 receptora EP4, su takođe korisna u postupku modulacije imunog odgovora subjekta koji ima tumor, koji obuhvata davanje efikasne količine jedinjenja formule (I); gde pomenuta efikasna količina reaktivira imuni sistem u tumoru pomenutog subjekta; gde pomenuta efikasna količina aktivira citotoksičnost i proizvodnju citokina prirodnih ćelija ubica i / ili citotoksičnih T-ćelija.

2

Eksperimentalni deo

I. Hemija

Sve temperature su izražene u °C. Komercijalno dostupni polazni materijali su korišćeni kao što su dobijeni bez daljeg prečišćavanja. Osim ako nije drugačije navedeno, sve reakcije su izvedene u posuđu koje je osušeno u sušnici u atmosferi azota. Jedinjenja su prečišćena fleš hromatografijom na silikagelu ili preparativnom HPLC. Opisana jedinjenja u pronalasku su karakterisana podacima LC-MS (retenciono vreme tRje dato u min; molekulska masa dobijena iz masenog spektra je data u g/mol) pomoću dole navedenih uslova. U slučajevima kada su se jedinjenja prema prikazanom pronalasku javila kao smeša konformacionih izomera, naročito vidljivih na njihovom LC-MS spektru, dato je retenciono vreme najzastupljenijeg konformera.

Analitička LC-MS oprema:

HPLC pumpa: pumpa sa binarnim gradijentom, Agilent G4220A ili ekvivalent

Autosempler: Gilson LH215 (sa Gilson 845z injectorom) ili ekvivalent

Odeljak za kolonu: Dionex TCC-3000RS ili ekvivalent

Degaser: Dionex SRD-3200 ili ekvivalenat

Make-up pumpa: Dionex HPG-3200SD ili ekvivalent

DAD detektor: Agilent G4212A ili ekvivalent

MS detektor: Jednostruki kvadripoli maseni analizator, Thermo Finnigan MSQPlus ili ekvivalent

ELS detektor: Sedere SEDEX 90 ili ekvivalent

LC-MS postupak A

Kolona: Zorbax SB-aq (3.5 μm, 4.6 x 50 mm). Uslovi: MeCN [eluent A]; voda 0.04% TFA [eluent B].

Gradijent: 95% B → 5% B u toku 1.5 min (protok: 4.5 mL/min). Detekcija: UV/Vis MS, tRje dato u min.

Preparativna HPLC oprema:

Gilson 333/334 HPLC pumpa snabdevena sa Gilson LH215, Dionex SRD-3200 degaserom,

Dionex ISO-3100A make-up pumpa, Dionex DAD-3000 DAD detektor, jednostruki kvadripoli maseni analizator MS detektor, Thermo Finnigan MSQ Plus, MRA100-000 razdelnik protoka, Polymer Laboratories PL-ELS1000 ELS detektor

Preparativna HPLC sa baznim uslovima

Kolona: Waters XBridge (10 μm, 75 x 30 mm). Uslovi: MeCN [eluent A]; voda 0.5% NH4OH (25% vod.) [eluent B]; Gradijent videti Tabelu 1 (protok: 75 mL/min), polazni procenat Eluenta A (x) je određen u zavisnosti od polarnosti jedinjenja za prečišćavanje. Detekcija: UV/Vis MS

Tabela 1

Preparativna HPLC sa kiselim uslovima

Kolona: Waters Atlantis T3 (10 μm, 75 x 30 mm). Uslovi: MeCN [eluent A]; voda 0.5% HCO2H [eluent B]; Gradijent videti Tabelu 2 (protok: 75 mL/min), polazni procenat eluenta A (x) je određen u zavisnosti od polarnosti jedinjenja za prečišćavanje. Detekcija: UV/Vis MS

Tabela 2

Skraćenice (kako su korišćene i gore i dole):

vod. vodeni

atm atmosfera

boc terc-butiloksikarbonil

d dani

DCM dihlorometan

DIPEA diizopropil-etilamin, Hünig-ova baza

DMF dimetilformamid

DMSO dimetilsulfoksid

Et2O dietiletar

EtOAc etil acetat

EtOH etanol

Pr. primer

FC fleš hromatografija na silikagelu

h sat(i)

hept heptan (i)

HPLC visokoefikasna tečna hromatografija

LC-MS tečna hromatografija – masena spektrometrija

Lit. Literatura

MeCN acetonitrila

MeOH metanol

mL millilitar

min minut (i)

MT mikro talasi

Ph fenil

PPh3trifenil fosfin

prep. preparativna

RS reakciona smeša

ST sobna temperatura

s sekund(i)

zas. zasićeni (ako nije navedeno drugačije: zas. vod.)

tBu terc-butil = tercijarni butil

TEA trietilamin

TFA trifluorosirćetna kiselina

THF tetrahidrofuran

TLC tankoslojna hromatorgafija

tRretenciono vreme

triflat trifluorometansulfonat

A- Dobijanje derivata pirimidin halogenida formule (III)

A.1. 6-Hloro-N-(2-(2-metil-1H-indol-1-il)etil)pirimidin-4-amin

U rastvor 4,6-dihloropirimidina (3.00 g, 20.1 mmol) u 2-propanolu (50 mL) na ST je dodat 2-(2-metil-1H-indol-1-il)etan-1-amin (3.68 g, 21.1 mmol) i TEA (3.08 mL, 22.2 mmol). Dobijena smeša je refluktovana u toku 2h, zatim je omogućeno da se ohladi na ST i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak je razdeljen između zas. vod. rastvora NaHCO3i EtOAc. Slojevi su odvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan još jednom sa EtOAc. Spojeni organski slojevi su isprani sa vodom, rastvorom soli, osušeni preko MgSO4, proceđeni i rastvarač je uklonjen in vacuo dajući željeni proizvod kao žuti prah (5.45 g, 94%). LC-MS A: tR= 0.87 min; [M+H]<+>= 287.13.

A.1.1. 2-(2-Metil-1H-indol-1-il)etan-1-amin

U rastvor 2-metilindola (10.04 g, 75 mmol) u toluenu (200 mL) dodati su 2-hloroetilamin hidrohlorid (17.4 g, 150 mmol), sveže sprašen NaOH (21.00 g, 525 mmol) i tetrabutil amonijum hidrogen sulfat (2.037 g, 6 mmol). Dobijena smeša je zagrejana do refluksa i mešana u toku 17h. Zatim je ohlađena na ST, i

2

proceđena kroz filter papir. Ostatak je dva puta staložen sa toluenom, i proceđen. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen sa FC, pomoću gradijenta DCM/MeOH od 100:0 do 95:5. Posle koncentrovanja proizvoda koji je sadržao frakcije, dobijeno je naslovno jedinjenje (13.2 g, 99%) kao žuta smola: LC-MS A: tR= 0.54 min; [M+H]<+>= 175.31.

A.2. 1-(2-((6-Hloropirimidin-4-il)amino)etil)-1H-indol-2-karbonitril

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanoj sintezi A.1. pomoću 2-(2-cijano-1H-indol-1-il)etan-1-aminijum 2,2,2-trifluoroacetata; LC-MS A: tR= 0.85 min; [M+H]<+>= 298.05.

A.2.1. 2-(2-Cijano-1H-indol-1-il)ethan-1-aminijum 2,2,2-trifluoroacetat

Rastvor terc-butil (2-(2-cijano-1H-indol-1-il)etil)karbamata (2.08 g, 6.56 mmol) u DCM (20 mL) je tretiran sa TFA (20 mL) i RS je mešana u toku 1h na ST. Rastvarači su uklonjeni pod vakuumom. Ostatak je triturisan tri puta u Et2O, dajući naslovno jedinjenje kao bež prah (1.56 g, 81%). LC-MS A: tR= 0.82 min;

[M+H]<+>= 186.25.

A.2.2. Terc-butil (2-(2-cijano-1H-indol-1-il)etil)karbamat

NaH (0.27 g, 6.75 mmol) je dodat u porcijama u rastvor 1H-indol-2-karbonitrila (0.80 g, 5.63 mmol) u DMF (25 mL) i RS je mešana na ST u toku 15 min. Rastvor N-Boc-2-bromoetil-amina (1.30 g, 5.63 mmol) u DMF (10 mL) je dodat u kapima, i RS je zagrejana do 85°C i mešana na ovoj temperaturi u toku 17 h, zatim ohlađena na ST i razdeljena između Et2O i H2O. Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa Et2O (x3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko MgSO4, proceđeni i koncentrovani pod sniženim pritiskom, dajući naslovno jedinjenje kao braon ulje. LC-MS A: tR= 0.90 min; [M+H-Boc]<+>= 186.27.

A.3. 6-Hloro-N-(2-(2,7-dimetil-1H-indol-1-il)etil)pirimidin-4-amin

Naslovno jedinjenje je prirpemljeno prema gore opisanoj sintezi A.1. pomoću 2-(2-metil-1H-indol-1-il)etan-1-amina; LC-MS A: tR= 0.91 min; [M+H]<+>= 301.19.

A.3.1. 2-(2-Metil-1H-indol-1-il)etan-1-amin

Naslovno jedinjenje je dobijeno u gore opisanoj sintezi f A.1.1. pomoću 2,7-dimetilindola; LC-MS A: tR= 0.58 min; [M+H]<+>= 189.26.

B- Primeri dobijanja

Opšti postupak A: Suzukijevo kuplovanje sa Pd(PPh3)4

Smeša odgovarajućih derivata pirimidin halogenida (II) (0.15 mmol), 4-karboksifenilboronske kiseline (0.18 mmol), i K2CO32M (0.3 mL, 0.6 mmol) u entanolu (3 mL) je prečišćena argonom, dodat je tetrakis-(trifenilfosfin)-paladijum (0.0075 mmol), i RS je zagrevana na 90°C u toku noći. Alternativno, reakcija može biti izvedena u mikrotalasnom aparatu , na 120°C u toku 10 - 30 min. RS je proceđen kroz skaleni filter od mikrofibrera od 0.45 um isprana sa EtOH/MeCN i DMF. Filtrat je prečišćen ili preparativnom HPLC ili FC. Alternativno, razblažen je vodom, ukoliko je potrebno podešen je pH, i ekstrahovan sa EtOAc (3x). Spojeni organski ekstrakti su osušeni (MgSO4) i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC ili FC.

Primer 1: 4-{6-[2-(2-Metil-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanom opštem postupku A pomoću 6-hloro-N-(2-(2-metil-1H-indol-1-il)etil)pirimidin-4-amina (A.1.) i dobijeno je kao beličasta čvrsta supstanca; LC-MS A: tR= 0.67 min; [M+H]<+>= 373.09.

Primer 2: 4-{6-[2-(2-Cijano-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanom opštem postupku A pomoću 1-(2-((6-hloropirimidin-4-il)amino)etil)-1H-indol-2-karbonitrila (A.2.) i dobijeno je kao bela čvrsta supstanca; LC-MS A: tR= 0.56 min; [M+H]<+>= 384.16.

Primer 3: 4-{6-[2-(2,7-Dimetil-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanom opštem postupku A pomoću 6-hloro-N-(2-(2,7-dimetil-1H-indol-1-il)etil)pirimidin-4-amina (A.3.) i dobijeno je kao bledo žuta čvrsta supstanca; LC-MS A: tR= 0.69 min; [M+H]<+>= 386.92.

Primer 4: 4-{6-[2-(2-Hloro-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina

MT-fiola je napunjena sa terc-butil 4-(6-((2-(2-oksoindolin-1-il)etil)amino)pirimidin-4-il)benzoatom (200 mg, 0.465 mmol), DCM (3 mL) i POCl3 (0.0848 mL, 0.929 mmol), zatvorena je i mešana pod refluksom u toku 6h. RS je ohlađena na 0°C i pažljivo zaustavljena sa NaOH 32% do baznog pH i zatim je pažljivo dodato još vode. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (x 3). Organnski slojevi su isprani sa rastvorom soli, osušeni preko MgSO4. Proceđeni i koncentrovani pod sniženim pritiskom. MeOH je dodat i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u etanolu (2 mL) i H2O (1 mL), dodat je litijum hidroksid monohidrat (101 mg, 2.38 mmol) i smeša je zagrejana na 105°C u toku 1h. Reakciona smeša je proceđena preko stakleonog filtera od mikrofibrea od 0.45 um i prečišćena baznom prep HPLC da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenja kao bela čvrsta supstanca (16 mg, 9%). LC-MS A: tR= 0.69 min; [M+H]+ = 393.13.

a) Terc-butil 4-(6-((2-(2-oksoindolin-1-il)etil)amino)pirimidin-4-il)benzoat

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanom opštem postupku A pomoću 1-(2-((6-hloropirimidin-4-il)amino)etil)indolin-2-ona i 4-terc-butoksikarbonilfenilboronske kiseline; LC-MS A: tR= 0.75 min; [M+H]<+>= 431.07.

b) 1-(2-((6-Hloropirimidin-4-il)amino)etil)indolin-2-on

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanoj sintezi A.1. pomoću 1-(2-aminoetil)indolin-2-ona; LC-MS A: tR= 0.70 min; [M+H]<+>= 289.13.

Primer 5: 4-{6-[2-(2-Bromo-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina

2

MT-fiola je napunjena sa etil 4-(6-((2-(2-oksoindolin-1-il)etil)amino)pirimidin-4-il)benzoatom (60 mg, 0.149 mmol), DCM (2 mL) i POBr3 (64 mg, 0.224 mmol), zatvorena je i mešana pod refluksom u toku 1h. RS je ohlađena na ST, dodat je imidazol (12.3 mg, 0.179 mmol), i RS je refluktovana u toku 48h. RS je ohlađena i pažljivo zaustavljena sa zas. vod. NaHCO3 i ekstrahovana sa DCM (x 3). Organski slojevi su isprani sa rastvorom soli, osušeni preko MgSO4,proceđeni i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u etanolu (2 mL) i H2O (1 mL), dodat je litijum hidroksid monohidrat (35 mg, 0.83 mmol) i smeša je refluktovana u toku noći. Reakciona smeša je proceđena preko staklenog filtra od mikrofibera od 0.45 um i prečišćena baznom prep HPLC da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (1mg, 1%). LC-MS A: tR= 0.69 min; [M+H]+ = 438.85.

a) Etil 4-(6-((2-(2-oksoindolin-1-il)etil)amino)pirimidin-4-il)benzoat

Naslovno jedinjenje je dobijeno prema gore opisanom opštem postupku A pomoću 1-(2-((6-hloropirimidin-4-il)amino)etil)indolin-2-ona (primer 4-b) i 4-etoksikarbonilfenilboronske kiseline; LC-MS A: tR= 0.69 min;

[M+H]<+>= 402.94.

Biološki in vitro testovi

Antagonističke aktivnosti jedinjenja formule (I) na receptorima EP2 i EP4 su određene prema sledećim eksperimentalnim postupcima.

U testu su korišćene PathHunterTM HEK 293 PTGER2 i PTGER4 b-arestin ćelijske linije od DiscoverX. Sistem je zasnovan na tehnologiji komplementacionih enzimskih fragmenata (eng. Enzyme Fragment Complementation Technology). Dva komplementna fragmenta enzima b-galaktozidaze su eksprimovana u stabilno transfektovanim ćelijama. Veći deo b-gal, nazvan EA za Enzimski Akceptor, je spojen sa C-krajem b-arestina 2. Manji fragment, nazvan ProLinkTM tag, je spojen sa PTGER2 (EP2) ili PTRGER4 (EP4) na C-kraju. Posle aktivacije, b-arestin je regrutovan što prisiljava na interakciju ProLink i EA, dozvoljavajući komplementiranje dva fragmenta b-gal i obrazovanje funkcionalnog enzima koji je u stanju da hidrolizuje supstrat i stvori hemiluminiscentni signal .

Test hEP2 b-arestina:

HEK 293 PTGER2 b-arestin ćelije (DiscoverX 93-021-4C1) su odvojene od Petrijevih šolja sa kulturama sa puferom za disocijaciju ćelija (Invitrogen, 13151-014), i sakupljene u medijumu za rast (GM: DMEM Glutamax-I (Invitrogen 32430) /10% FCS, 1 % Penicilin/streptomicin).5000 ćelija po bunarčiću na ploči sa 384 bunarčića (bela sa belim dnom Greiner 781080 ) su zasejane u 20ul po bunarčiću GM. Ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2 u toku 24 sata.

Štok rastvori testiranih jedinjenja su napravljenu koncentraciji od 10 mM u DMSO, i serijski razblaženi u DMSO do potrebnih koncentracija za inhibicione krive zavisnosti odgovora od doze (testirani koncentracioni opseg 10 μM-2nM ili 1 μM-0.2nM).

2

PGE2 (Cayman 14010, štok rastvor: 10mM u DMSO) je korišćen kao agonist u krajnjoj koncentraciji od 5 μM, koja odgovara EC80.

Pet mikrolitara razblaženih jedinjenja je premešteno na ploču za testiranje. Ploča je prethodno inkubirana 15 minuta na 37°C. Zatim je premešteno pet mikrolitara PGE2 (krajnja konc.5 μM) na ploču za testiranje. Ploča je inkubirana u toku 120 minuta na 37°C.

Komponente PathHunter Glo detekcionog kompleta su otopljene i pomešane prema uputstvima proizvođača : 1 deo Galacton Star supstrata sa 5 delova Emerald IITM rastvora, i 19 delova PathHunter ćelijskog pufera za testiranje, respektivno. Dvanaest μL reagensa je preneto na ploče za testiranje i inkubirano u toku 1 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Intenzitet luminiscencije je očitavan na BMG Fluostar Optima čitaču prema uputstvima proizvođača.

Za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je procentat aktivnosti u poređenju sa kontrolnom vrednošću DMSO kao prosečne vrednosti ± STDEV. (svaka koncentracija je merena u duplikatu)

IC50 vrednosti i krive su dobijene sa XLfit softverom(IDBS) pomoću doza-odgovor One Site modela 203. Kada su jedinjenja merena više puta, data je srednja vrednost.

Test hEP4 b-arestina:

HEK 293 PTGER4 b-arestin ćelije (DiscoverX 93-030-4C1) su odvojene od Petrijeve šolja za sa ćelijskim puferom za disocijaciju (Invitrogen, 13151-014), i sakupljene u medijumu za rast (GM: DMEM Glutamax-I (Invitrogen 32430) /10% FCS, 1 % Penicilin/streptomicin).5000 ćelija po bunarčiću na ploči sa 384 bunarčića (bela sa belim dnom Greiner 781080 ) je zasejano u 20 μl po bunarčiću GM. Ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2 u toku 24 sata.

Štok rastvori testiranih jedinjenja su napravljeni u koncentraciji od 10 mM DMSO, i serijski razblaženi u DMSO do potrebnih koncentracija za inhibicione krive zavisnosti odgovora od doze (testirani koncentracioni opsezi 10 μM-2nM ili 1 μM-0.2nM).

PGE2 (Cayman 14010, štok rastvor: 100uM in DMSO) je korišćen kao agonist u krajnjoj koncentraciji od 20nM, što odgovara EC80.

Pet mikrolitara razblaženih jedinjenja je premešteno na ploču za testiranje. Ploče su prethodno inkubirane 15 minuta na 37°C. Zatim pet mikrolitara PGE2 (krajnja konc.20nM) je premešteno na ploče za testiranje. Ploča je inkubirana 120 minuta na 37°C.

Komponente PathHunter Glo detekcionog kompleta su odmrznute i pomešane prema uputstvima proizvođača: 1 deo Galacton Star supstrata sa 5 delova Emerald IITM rastvora, i 19 delova PathHunter ćelijskog pufera za testiranje, respektivno. Dvanaest l reagensa je premešteno na ploču za testiranje i inkubirano u toku 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku. Intenzitet luminiscencije je očitavan na BMG Fluostar Optima čitaču prema uputstvu proizvođača.

2

Za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je procentat aktivnosti u odnosu na kontrolnu vrednost DMSO kao srednja vrednost ± STDEV. (svaka koncentracija je merena u duplikatu)

IC50 vrednosti i krive su dobijene XLfit softverom (IDBS) pomoću doza-odgovor One Site modela 203. Kada su jedinjenja merena više puta, data je srednja vrednost.

Antagonističke aktivnosti jedinjenja formule (I) na receptore EP2 i EP4 su takođe određivane prema sledećem eksperimentalnom postupku.

Humane ćelijske linije tumora koje eksprimuju endogeno ili EP4 ili EP2 su korišćene i praćena je akumulacija cAMP u ćelija posle stimulacije PGE2. Ćelije SF295 glioblastoma eksprimuju visoke endogene EP2, ali ne i EP4,dok BT549 ćelije kancera grudi, eksprimuju visoke endogene nivoe EP4 i veoma niske nivoe EP2.

Kao detekcioni postupak za cAMP korišćen je HTRF (eng. homogeneous time resolved fluorescence) Cisbio komplet (HTRF cAMP dinamic 2 kit 20'000 tests Cisbio Cat. #62AM4PEC), koji je zasnovan na kompetitivnom imunotestu sa anti-cAMP antitelom obeleženim kriptatom i cAMP obeleženim d2. Prirodno dobijeni cAMP od ćelija ili neobeleženi cAMP (za standardnu krivu) se takmiči sa egzogeno dodatim cAMP obeleženim d2 (akceptorom) za vezivanje za monoklonalni anti-cAMP-Eu3+ Criptat (donor). FRET signal (eng.Fluorescence Resonance Energy Transfer) je dobijen samo ukoliko beleženo anti-cAMP antitelo se veže za cAMP obeležen d2, prema tome specifični signal (tj. transfer energije) je inverzno proporcionalan koncentraciji cAMP u standardu ili uslovu.

hEP2 cAMP test:

SF295 ćelije (NCI/No.0503170) su odvojene od Petrijevih šolja sa kulturama pomoću pufera za ćelijsku disocijaciju (Invitrogen, 13151-014), i sakupljene u medijumu za rast (GM: RPMI1640 (Invitrogen 21875) /10% FCS, 1 % Penicilin/streptomicin). Ćelije su izbrojane isprane i resuspendovane u puferu za testiranje (AB; HBSS, 20mM HEPES, 0.2% BSA; 2mM IBMX ).4’000 ćelija u 5 μL AB je zasejano po bunarčiću ploče sa 384 bunarčića male zapremine (crna sa crnim dnom, Greiner 784076).

Štok rastvori testiranih jedinjenja su napravljeni u koncentraciji od 10 mM u DMSO, i serijski razblaženi u DMSO do potrebnih koncentracija za inhibicione krive zavisnosti odgovora od doze (testirani koncentracioni opseg 30 μM - 0.4nM; 30 M - 0.015nM ili 1 μM - 0.01nM).

PGE2 (Cayman 14010, štok rastvor: 75 μM u DMSO) je korišćen kao agonist u krajnjoj koncentraciji od 75nM, što odgovara EC80.

2.5 μL razblaženih jedinjenja je premešteno na ploče za testiranje. Ploča je preinkubirana u toku 45 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, 2.5 μL PGE2 (krajnja konc.75nM) je preneto na ploču za testiranje. Ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Pet l svakog donora (anti-cAMP kriptat) i akceptor (cAMP-d2) je dodato i ploča je inkubirana još jedan sat na sobnoj temperaturi u mraku i zatim očitavana pomoću BMG LABTECH PHERAstar čitača (Ekscitacija : 337nm, emisija : 620 i 665nm).

2

Dobijene Delta F (fluorescencija) vrednosti (665nm/620nM) su pretvorene u % cAMP vrednosti pomoću merenja cAMP kalibratora obezbeđenog u kompletu. Za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je procenat cAMP poređen sa DMSO kontrolnom vrednošću koja je srednja vrednost ± STDEV (svaka koncentracija je merena u duplikatu).

IC50 vrednosti i krive su dobijena sa XLfit softverom (IDBS) pomoću doza-odgovor One Site modela 203. Kada su jedinjenja merena više puta, data je srednja vrednost.

hEP4 cAMP test:

BT549 ćelije (NCI/No.0507282) su odvojene od Petrijeve šolje sa kulturom pomoću pufera za disocijaciju ćelija (Invitrogen, 13151-014), i sakupljene u medijumu za rast (GM: RPMI1640 (Invitrogen 21875) /10% FCS, 1 % Penicilin/streptomicin). Ćelije su izbrojane, isprane i ponovo suspendovane u testu za pufer (AB; HBSS, 20mM HEPES, 0.2% BSA; 2mM IBMX ).4’000 ćelija u 5 μL AB je zasejano po bunarčiću ploče sa 384 malih bunarčića (crna sa crnim dnom, Greiner 784076).

Štok rastvori testiranih jedinjenja su napravljeni u koncentraciji 10 mM u DMSO, i serijski razblaženi u DMSO do potrebnih koncentracija za inhibiciju kriva doza-odgovor (testirani koncentracioni opseg 30 μM - 0.4nM; 30 μM -0.015nM ili 1 μM - 0.01nM).

PGE2 (Cayman 14010, štok rastvor: 6 μM u DMSO) je korišćen kao agonist u krajnjoj koncentraciji od 6nM, koja odgovara EC80.

2.5 μL razblaženih jedinjenja je premešteno na ploču za testiranje. Ploča je prethodno inkubirana 45 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, 2.5 μL PGE2 (krajnja konc. 6nM) je premešteno na ploču za testiranje. Ploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Pet μL svakog, donora (anti-cAMP criptat) i akceptora (cAMP-d2) je dodato i ploča je inkubirana u toku još jednog sata na sobnoj temperaturi u mraku i zatim očitana pomoću BMG LABTECH PHERAstar čitača (Ekscitacija : 337nm, Emission : 620 i 665nm).

Dobijene Delta F (fluorescencije) vrednosti (665nm/620nM) su pretvorene u % cAMP vrednosti pomoću merenja cAMP kalibratorom obezbeđenim u kompletu. Za svaku koncentraciju jedinjenja izračunat je procenat cAMP u odnosu na kontrolnu vrednost DMSO kao srednja vrednost ± STDEV (svaka koncentracija je merena u duplikatu).

IC50 vrednosti i krive su dobijene XLfit softverom (IDBS) pomoću doza-odgovor One Site modela 203. Kada su jedinjenja merena više puta, date su srednje vrednosti.

Antagonističke aktivnosti jedinjenja datih kao primeru su prikazane u Tabeli 3:

2

Tabela 3:

Claims (14)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule (I)

   Formula (I) u kojoj R<1>predstavlja vodonik ili metil; R<2>predstavlja metil, brom, hlor ili cijano; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, u kome R<1>predstavlja vodonik; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, u kome R<1>predstavlja metil; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u kome R<2>predstavlja metil; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u kome R<2>predstavlja hlor; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u kome R<2>predstavlja cijano; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. 7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje se bira iz grupe koju čine: 4-{6-[2-(2-Metil-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina; 4-{6-[2-(2-Cijano-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina; 4-{6-[2-(2,7-Dimetil-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina; 4-{6-[2-(2-Hloro-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina; i 4-{6-[2-(2-Bromo-indol-1-il)-etilamino]-pirimidin-4-il}-benzojeva kiselina; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži, kao aktivni sastojak jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje jedno terapeutski inertno pomoćno sredstvo.
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu kao lek.
10. 10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti odabranih iz grupe koja se sastoji od karcinoma; bola; endometrioze; autozomalne dominantne bolesti policističnih bubrega; akutnih ishemijskih sindroma kod ateroskleroznih pacijenata; pneumonije; i neurodegenerativnih bolesti; ili za upotrebu u kontroli ženske plodnosti.
11. 11. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prevenciji ili lečenju karcinoma odabranog od melanoma; karcinoma pluća; karcinoma bešike; karcinoma bubrega; karcinoma gastrointestinalnog trakta; karcinoma endometrija; karcinoma jajnika; karcinoma grlića materice; i neuroblastoma.
12. 12. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u proizvodnji leka za prevenciju ili lečenje bolesti odabranih iz grupe koja se sastoji od karcinoma; bola; endometrioze; autozomalne dominantne bolesti policističnih bubrega; akutnih ishemijskih sindroma kod ateroskleroznih pacijenata; pneumonije; i neurodegenerativnih bolesti; ili za kontrolu ženske plodnosti.
13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u postupku modulacije imunog odgovora kod pojedinca koji ima tumor; pri čemu navedeni postupak reaktivira imuni sistem u tumoru spomenutog pojedinca.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u prevenciji ili lečenju raka; pri čemu se navedeno jedinjenje upotrebljava u kombinaciji s modulatorom PGE2 receptora EP4; i dodatno, opcionalno u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapeutskih sredstava i / ili sa radioterapijom i / ili sa ciljanom terapijom. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5