RS62446B1

RS62446B1 - Neutrališući vezujući molekuli protiv gripa i njihova primena

Info

Publication number: RS62446B1
Application number: RS20211271A
Authority: RS
Inventors: Nicole Kallewaard-Lelay; Qing Zhu; Godfrey Jonah Rainey; Cuihua Gao; Srinath Kasturirangan; Changshou Gao
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2021-11-30
Also published as: EP3303384A1; AU2016271323A1; WO2016196470A1; CY1125793T1; MX2017015189A; MX2022001220A; US20200109187A1; LT3303384T; US10442854B2; HK1250725A1; HUE056407T2; CA2987816A1; HK1253092A1; BR112017025496A2; JP2018518475A; EP3960761A1; JP2023078352A; PT3303384T; CN113480640A; US11926657B2

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na bispecifična antitela koja imaju široku neutrališuću aktivnost na virus gripa A i B, i na primenu takvih antitela.

Pozadina pronalaska

[0002] Virusi gripa uzrokuju godišnje epidemije gripa i povremene pandemije, što predstavlja značajnu pretnju po javno zdravlje širom sveta. Sezonske infekcije gripa su povezane sa 200.000-500.000 smrti svake godine, naročito kod male dece, pacijenata sa kompromitovanim imunskim sistemom i starijih osoba. Stopa smrtnosti se obično dalje povećava tokom sezone sa izbijanjem pandemije gripa. I dalje postoji značajna nezadovoljena medicinska potreba za potentnim antivirusnim terapeutskim sredstvima za prevenciju i lečenje infekcija gripom, naročito u nedovoljno zaštićenim populacijama.

[0003] Postoje tri vrste virusa gripa: tipovi A, B i C. Većinu bolesti gripa uzrokuje virus gripa A i B (Thompson et al. (2004) JAMA.292:1333-1340; i Zhou et al. (2012) Clin Infect. Dis.

54:1427-1436). Sveukupna struktura virusa gripa A, B i C je slična, i obuhvata virusni omotač koji okružuje centralno jezgro. Virusni omotač sadrži dva površinska glikoproteina, hemaglutinin (HA) i neuraminidazu (NA). HA posreduje u vezivanju virusa za ciljne ćelije i ulasku u ciljne ćelije, dok NA učestvuje u otpuštanju virusnog potomstva iz inficiranih ćelija.

[0004] Protein HA je odgovoran za vezivanje za receptor ćelije domaćina, kao i za fuziju membrana virusa i ćelije domaćina, i primarna je meta zaštitnih humoralnih imunskih odgovora. Protein HA ima trimernu strukturu i sadrži tri identične kopije jednog polipeptidnog prekursora, HA0, koji se nakon proteolitičkog sazrevanja cepa na metastabilni intermedijer koji sadrži globularnu glavu (HA1) i region stabljike (HA2) (Wilson et al.

(1981) Nature.289:366-373). Membranska distalna „globularna glava“ čini veći deo strukture HA1 i sadrži vezujući džep sijalinske kiseline za ulaz virusa i veće antigene domene. Membranska proksimalna struktura „stabljike“, sastavljena od ostataka HA2 i HA1, uključuje fuzioni mehanizam, koji trpi promenu konformacije u okruženju kasnih endozoma sa niskim pH radi aktiviranja fuzije membrane i prodiranja u ćelije. Stepen homolognosti sekvence između podtipova gripa tip A je manji u HA1 (34%-59% homolognosti između podtipova) nego u regionu HA2 (51%-80% homolognosti).

[0005] Virusi gripa A mogu da se klasifikuju na podtipove na osnovu genetskih varijacija u genima hemaglutinina (HA) i neuraminidaze (NA). Serološki, grip A može da se podeli na 18 podtipova HA koji se dalje dele na dve različite filogenetske grupe: grupu 1 (podtipovi H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 i H18) i grupu 2 (podtipovi H3, H4, H7, H10, H14 i H15). Kod sezonskih epidemija, H1 i H3 HA podtipovi gripa A trenutno su primarno povezani sa ljudskom bolešću, dok virusi koji kodiraju H5, H7, H9 i H10 uzrokuju sporadične epidemije među ljudima usled direktnog prenosa sa životinja. Nasuprot virusima gripa A, virusi gripa B su ograničeni na zaražavanje ljudi, i virusi gripa B nisu podeljeni na podtipove na osnovu dva površinska glikoproteina. Zapravo, sve do 1970-ih, virusi gripa B bili su klasifikovani kao jedna homogena grupa. Međutim, tokom 1970-ih, virusi gripa B počeli su da se dele u dve antigenski prepoznatljive loze, nazvane loza Viktorija i loza Jamagata po njihovim prvim predstavnicima, B/Viktorija/2/87, odnosno B/Jamagata/16/88. (Biere et al. (2010) J Clin Microbiol.48(4):1425-7; doi: 10.1128/JCM.02116-09. Epub 2010 Jan 27). Obe loze, Jamagata i Viktorija, doprinose godišnjim epidemijama. Mada je morbiditet uzrokovan virusima gripa B manji nego morbiditet povezan sa gripom A H3N2, veći je nego morbiditet povezan sa gripom A H1N1 (Zhou et al. (2012) Clin Infect. Dis. 54:1427-1436).

[0006] Neutrališuća antitela izazvana infekcijom virusom gripa su obično usmerena na varijabilnu globularnu glavu HA1 kako bi se sprečilo vezivanje virusnih receptora, i obično su specifična za soj. Retka su široko unakrsno reaktivna antitela koja neutrališu jedan ili više podtipova ili linija. Nedavno je otkriveno nekoliko antitela koja mogu da neutrališu više podtipova virusa gripa A u grupi 1 i 2 (Corti et al. (2011) Science 333(6044):850-856, Li et al. (2012) PNAS 109(46):18897-18902, Dreyfus et al. (2012) Science 337(6100):1343-1348, i Nakamura et al. (2013) Cell Host and Microbe 14:93-103), ili viruse gripa B obe loze (Dreyfus et al. (2012) Science 337(6100):1343-1348 i Yasugi et al. (2013) PLoS Path 9(2): e1003150. doi: 10.1371/journal.ppat.1003150), mada većina ima ograničenja vezana za opseg pokrivanja, profil otpornosti ili potentnost. Za samo jedno antitelo je opisano da se vezuje za HA proteine gripa A i gripa B, mada to antitelo funkcionalno ne neutrališe viruse gripa B niti ublažava bolest kada se terapeutski primenjuje (Dreyfus et al. (2012) Science 337(6100):1343-1348). WO2013086052 opisuje antitela koja su korisna za pasivnu imunizaciju gripa. WO2015051010 opisuje neutrališuća antitela na grip A i njihovu primenu. WO2013132007 opisuje humane vezujuće molekule koji mogu da se vezuju za viruse gripa B i da ih neutrališu, kao i njihovu primenu. Wagner et. al. (PNAS, 111:47, 2014, str.16820-16825) opisuju da bispecifično antitelo stvoreno pomoću sortaze i klik hemije ima široku neutrališuću aktivnost na virus gripa. Friesen et. al. (PNAS, 111:1, 2014, str.445-450) opisuju neutralizaciju virusa gripa grupe 2. Za sada nema dostupnih antitela koja sveobuhvatno neutrališu ili inhibiraju širok spektar virusne infekcije gripom tip A i B ili ublažavaju bolesti uzrokovane virusom gripa tip A i B. Stoga postoji potreba za identifikovanjem novih antitela koja štite od više virusa gripa.

Sažetak pronalaska

[0007] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Obezbeđen je izolovani vezujući molekul prema zahtevu 1. Ovde je opisan izolovani vezujući molekul koji se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B. U jednom otkriću, izolovani vezujući molekul obuhvata prvi vezujući domen koji može da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje 1 podtip grupe 2 virusa gripa tip A; i drugi vezujući domen koji može da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i neutrališe virus gripa tip B u najmanje dve filogenetski različite loze. U jednom otkriću, prvi vezujući domen može da neutrališe jedan ili više podtipova grupe 1 virusa gripa tip A izabranih od: H1. H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 i njihove varijante, i jedan ili više podtipova grupe 2 virusa gripa tip A izabranih od: H3, H4, H7, H10, H14 i H15 i njihove varijante. U jednom otkriću, drugi vezujući domen može da neutrališe virus gripa tip B u lozama Jamagata i Viktorija.

[0008] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula obuhvata antitelo na virus gripa tip A ili njegov antigen vezujući fragment. U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula obuhvata antitelo na virus gripa tip B ili njegov antigen vezujući fragment. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela. U jednom otkriću, prvi vezujući domen sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela. U jednom otkriću, drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela.

[0009] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu skup od šest CDR-a ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od:

(a) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.:

8, HCDR2 SEQ ID NO.: 9, HCDR3 SEQ ID NO.: 10, LCDR1 SEQ ID NO.: 3,

LCDR2 SEQ ID NO.: 4 i LCDR3 SEQ ID NO.: 5;

(b) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 8, HCDR2 SEQ ID NO.: 9, HCDR3 SEQ ID NO.: 10, LCDR1 SEQ ID NO.: 3, LCDR2 SEQ ID NO.: 4 i LCDR3 SEQ ID NO.: 5;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.:

18, HCDR2 SEQ ID NO.: 19, HCDR3 SEQ ID NO.: 20, LCDR1 SEQ ID NO.: 13,

LCDR2 SEQ ID NO.: 14, LCDR3 SEQ ID NO.: 15; i

(d) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 18, HCDR2 SEQ ID NO.: 19,

HCDR3 SEQ ID NO.: 20, LCDR1 SEQ ID NO.: 13, LCDR2 SEQ ID NO.: 14,

LCDR3 SEQ ID NO.: 15.

[0010] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NO.: 7, i SEQ ID NO.: 17. U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VL koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NO.: 2, i VL SEQ ID NO.: 12. U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH i VL koji je najmanje 75% identičan aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, izabranoj od VH SEQ ID NO.: 7 i VL SEQ ID NO.: 2, i VH SEQ ID NO.: 17 i VL SEQ ID NO.: 12. U jednom otkriću, prvi vezujući domen sadrži VH i VL izabrane od: VH SEQ ID NO.: 7 i VL SEQ ID NO.: 2, i VH SEQ ID NO.: 17 i VL SEQ ID NO.: 12.

[0011] U jednom otkriću, drugi vezujući domen sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu skup od šest CDR-a ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od:

28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30, LCDR1 SEQ ID NO.: 23,

LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(b) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30, LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci:

HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46,

LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(d) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46, LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(e) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.:

60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62, LCDR1 SEQ ID NO.: 55,

LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57; i

(f) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61,

HCDR3 SEQ ID NO.: 62, LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56,

LCDR3 SEQ ID NO.: 57.

[0012] U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VH izabranoj od:

(a) VH SEQ ID NO.: 27;

(b) VH SEQ ID NO.: 33;

(c) VH SEQ ID NO.: 36;

(d) VH SEQ ID NO.: 43;

(e) VH SEQ ID NO.: 49;

(f) VH SEQ ID NO.: 52;

(g) VH SEQ ID NO.: 59; i

(h) VH SEQ ID NO.: 65.

[0013] U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VL koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VL izabranoj od:

(a) VL SEQ ID NO.: 22;

(b) VL SEQ ID NO.: 32;

(c) VL SEQ ID NO.: 35;

(d) VL SEQ ID NO.: 38;

(e) VL SEQ ID NO.: 48;

(f) VL SEQ ID NO.: 51;

(g) VL SEQ ID NO.: 54; i

(h) VL SEQ ID NO.: 64.

[0014] U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH i VL koji je najmanje 75% identičan aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, izabranoj od:

(a) VH SEQ ID NO.: 27 i VL SEQ ID NO.: 22;

(b) VH SEQ ID NO.: 33 i VL SEQ ID NO.: 32;

(c) VH SEQ ID NO.: 36 i VL SEQ ID NO.: 35;

(d) VH SEQ ID NO.: 43 i VL SEQ ID NO.: 38;

(e) VH SEQ ID NO.: 49 i VL SEQ ID NO.: 48;

(f) VH SEQ ID NO.: 52 i VL SEQ ID NO.: 51;

(g) VH SEQ ID NO.: 59 i VL SEQ ID NO.: 54; i

(h) VH SEQ ID NO.: 65 i VL SEQ ID NO.: 64.

[0015] U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH i VL izabrane od:

(a) VH SEQ ID NO.: 27 i VL SEQ ID NO.: 22;

(b) VH SEQ ID NO.: 33 i VL SEQ ID NO.: 32;

(c) VH SEQ ID NO.: 36 i VL SEQ ID NO.: 35;

(d) VH SEQ ID NO.: 43 i VL SEQ ID NO.: 38;

(e) VH SEQ ID NO.: 49 i VL SEQ ID NO.: 48;

(f) VH SEQ ID NO.: 52 i VL SEQ ID NO.: 51;

(g) VH SEQ ID NO.: 59 i VL SEQ ID NO.: 54; i

(h) VH SEQ ID NO.: 65 i VL SEQ ID NO.: 64.

[0016] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje dva teška lanca antitela i najmanje dva laka lanca antitela. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje bispecifično antitelo. U jednom otkriću, jedan ili više vezujućih domena vezujućeg molekula sadrži domen varijabilnog fragmenta (Fv). U jednom otkriću, jedan ili više vezujućih domena vezujućeg molekula sadrži molekul scFv. U jednom otkriću, jedan ili više vezujućih domena vezujućeg molekula sadrži domen Fv i jedan ili više vezujućih domena sadrži molekul scFv. U jednom otkriću,

prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži domen Fv antitela na virus gripa tip A. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži domen Fv koji uključuje varijabilni domen teškog lanca antitela i varijabilni domen lakog lanca antitela, i specifično vezuje antitelo na virus gripa tip A. U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula obuhvata molekul scFv za virus gripa tip B.

[0017] U jednom otkriću, prvi vezujući domen obuhvata domen Fv antitela na virus gripa tip A, a drugi vezujući domen obuhvata molekul scFv virusa gripa tip B. U jednom otkriću, domen Fv prvog vezujućeg domena ima teški lanac (HC) sa polipeptidnim lancem koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC) sa polipeptidnim lancem koji ima amino terminus i karboksi terminus, i

(a) drugi vezujući domen je kovalentno vezan za karboksi terminus HC prvog vezujućeg domena;

(b) drugi vezujući domen je kovalentno vezan za amino terminus HC prvog vezujućeg domena;

(c) drugi vezujući domen je kovalentno vezan za amino terminus LC prvog vezujućeg domena; ili

(d) drugi vezujući domen je kovalentno umetnut u polipeptidni lanac HC prvog vezujućeg domena.

[0018] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment sa jednim ili više N-terminalnih domena, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za jedan ili više N-terminalnih domena antitela ili njegovog fragmenta. U jednom otkriću, N-terminalni domen antitela ili njegovog fragmenta sadrži jedan ili više domena Fv i jedan ili više molekula scFv koji su kovalentno vezani za jedan ili više domena Fv antitela ili njegovog fragmenta. U jednom otkriću, N-terminalni domen sadrži domen Fv koji sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL). U jednom otkriću, jedan ili više molekula scFv je kovalentno vezano za jedan ili više varijabilnih domena lakog lanca (VL) antitela ili njegovog fragmenta. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment koji sadrži laki lanac antitela formule scFv-L1-VL-CL, pri čemu, scFv je molekul scFv, L1 je linker, VL je varijabilni domen lakog lanca, CL je konstantni domen lakog lanca, i VL je varijabilni domen lakog lanca. U jednom otkriću, jedan ili više molekula scFv je kovalentno vezano za jedan ili više varijabilnih domena teškog lanca (VH) antitela ili njegovog fragmenta. U jednom otkriću, teški lanac obuhvata formulu scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, scFv je molekul scFv, L1 je linker, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je konstantni domen teškog lanca domen-1, CH2 je konstantni domen teškog lanca domen-2, a CH3 je konstantni domen teškog lanca domen-3.

[0019] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VH domena izabranoj od SEQ ID NO: 7 odnosno SEQ ID NO: 17. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VL domena izabranoj od SEQ ID NO: 2 odnosno SEQ ID NO: 12.

[0020] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment sa C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za Cterminalni domen antitela ili njegovog fragmenta. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi i drugi teški lanac sa prvim, odnosno drugim C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za C-terminalni domen prvog teškog lanca, drugog teškog lanca, ili njihove kombinacije. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje antitelo ili njegov fragment sa jednim ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu je jedan ili više molekula scFv umetnuto u teški lanac između jednog ili više konstantnih domena teškog lanca jednog ili više teških lanaca. U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca uključuje formulu VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je konstantni domen teškog lanca domen-1, CH2 je konstantni domen teškog lanca domen-2, a CH3 je konstantni domen teškog lanca domen-3. U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca uključuje formulu VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linker, a scFv je molekul scFv. U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca uključuje formulu VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linker, a scFv je molekul scFv. U jednom otkriću, L1 i L2 nezavisno uključuju (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (SEQ ID NO:93) (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO:106), ili kombinaciju (a) i (b).

[0021] U jednom otkriću, scFv uključuje formulu: VH-LS-VL, i, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, LS je linker, a VL je varijabilni domen lakog lanca. U jednom otkriću, LS uključuje (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO:93), (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO:106), ili kombinaciju (a) i (b).

[0022] U jednom otkriću, teški lanac i laki lanac prvog vezujućeg domena su povezani sa jednom ili više disulfidnih veza. U jednom otkriću, scFv drugog vezujućeg domena uključuje varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL), i VH scFv uključuje cisteinski ostatak na poziciji izabranoj od pozicije 43, 44, 100, 101, 105, i njihovih kombinacija, i VL scFv uključuje cisteinski ostatak na poziciji izabranoj od pozicije 43, 44, 46, 49, 50, 100, i njihovih kombinacija. U jednom otkriću, VL i VH scFv su vezani disulfidnom vezom izabranom od: VL100-VH44, VL43-VH105, VL46-VH101, VL49-VH100, VL50-VH100 i njihovih kombinacija. U jednom otkriću, VH i VL scFv su vezani disulfidnom vezom izabranom od: VH44-VL100, VH100-VL49, VH100-VL50, VH101-VL46, VH105-VL43 i njihovih kombinacija.

1

[0023] U jednom otkriću, VH sadrži skup od tri CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, gde je skup od tri CDR-a izabran od:

28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30;

(b) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29,

HCDR3 SEQ ID NO.: 30;

44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46;

(d) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45,

HCDR3 SEQ ID NO.: 46;

60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62; i

(f) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61,

HCDR3 SEQ ID NO.: 62.

[0024] U jednom otkriću, VL sadrži skup od tri CDR-a: LCDR1, LCDR2, LCDR3, gde je skup od tri CDR-a izabran od:

(a) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: LCDR1 SEQ ID NO.:

23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(b) aminokiselinske sekvence: LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i

LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: LCDR1 SEQ ID NO.:

39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(d) aminokiselinske sekvence: LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i

LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(e) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: LCDR1 SEQ ID NO.:

55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57; i

(f) aminokiselinske sekvence: LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56,

LCDR3 SEQ ID NO.: 57.

[0025] U jednom otkriću, scFv ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od: SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:63.

[0026] U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68. U jednom otkriću, bispecifično antitelo sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, i sadrži teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69. U jednom otkriću, teški lanac ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, i sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68, i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69.

[0027] U jednom otkriću, bispecifično antitelo sadrži:

(a) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja uključuje SEQ ID NO:66 i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja uključuje SEQ ID NO:67; ili

(b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja uključuje SEQ ID NO:68 i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja uključuje SEQ ID NO:69

[0028] Takođe je obezbeđena ćelija koja sadrži ili proizvodi vezujući molekul ili bispecifično antitelo ili ovde opisani fragment.

[0029] Takođe je obezbeđen izolovani polinukleotid koji kodira vezujući molekul ili bispecifično antitelo koje je ovde opisano. U jednom otkriću, obezbeđen je vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira vezujući molekul ili bispecifično antitelo koje je ovde opisano.

[0030] U drugom otkriću, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid koji kodira vezujući molekul ili bispecifično antitelo koje je ovde opisano.

[0031] Ovde je takođe obezbeđena kompozicija koja sadrži vezujući molekul ili bispecifično antitelo ili njegov fragment, kako je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži takvu kompoziciju. U drugom otkriću, obezbeđena je takva kompozicija za upotrebu u postupku za prevenciju ili lečenje infekcije virusom gripa tip A ili virusom gripa tip B kod ispitanika, pri čemu postupak obuhvata primenu na ispitaniku delotvorne količine takve kompozicije.

[0032] Ovde je takođe obezbeđen postupak za proizvodnju vezujućeg molekula ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta kako je ovde opisan. U jednom otkriću, postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina u uslovima koji su pogodni za ekspresiju vezujućeg molekula ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta. U jednom otkriću, postupak dalje obuhvata izolovanje vezujućeg molekula iz kulture ćelije domaćina.

[0033] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za primenu vezujućeg molekula ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta kako je ovde opisan. U jednom otkriću, vezujući molekul ili bispecifično antitelo ili njegov fragment su za upotrebu u profilaksi ili lečenju infekcije virusom gripa tip A, infekcije virusom gripa tip B, ili njihove kombinacije kod ispitanika.

[0034] U drugom otkriću, ovde opisani vezujući molekul ili bispecifično antitelo ili njegov fragment su pogodni za upotrebu u proizvodnji leka za profilaksu ili lečenje infekcije virusom gripa tip A, infekcije virusom gripa tip B, ili njihove kombinacije kod ispitanika. U jednom otkriću, vezujući molekul ili bispecifično antitelo ili njegov ovde opisani fragment se koriste u proizvodnji leka za profilaksu ili lečenje infekcije virusom gripa tip A i virusom gripa tip B kod ispitanika. U jednom otkriću, obezbeđen je vezujući molekul ili bispecifično antitelo za primenu u postupku za profilaksu ili lečenje infekcije virusom gripa tip A, infekcije virusom gripa tip B, ili njihove kombinacije kod ispitanika, što obuhvata primenu delotvorne količine vezujućeg molekula ili bispecifičnog antitela ili njegovog ovde opisanog fragmenta na ispitaniku. U jednom otkriću, obezbeđen je vezujući molekul ili bispecifično antitelo za primenu u postupku za profilaksu ili lečenje infekcije virusom gripa tip A i infekcije virusom gripa tip B, što obuhvata primenu delotvorne količine vezujućeg molekula ili bispecifičnog antitela ili njegovog ovde opisanog fragmenta na ispitaniku.

1

[0035] U jednom otkriću, vezujući molekul ili bispecifično antitelo ili njegov ovde opisani fragment su pogodni za in vitro dijagnozu infekcije virusom gripa tip A, infekcije virusom gripa tip B, ili njihove kombinacije kod ispitanika.

Kratak opis slika

[0036]

Slika 1 prikazuje opšti strukturni format skeleta pet različitih bispecifičnih antitela (BiS), BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 i BiS5. ScFv je prikazan tamnosivom bojom, a Fv IgG je prikazan svetlosivom bojom.

Slike 2A-D pokazuju aktivnost ADCC primarnih humanih ćelija prirodnih ubica (NK) inkubiranih u prisustvu rastućih količina GL20/39 BiS443/105 (Flu BiS), GL20 ili FBC39. Ubijanje inficirane ćelije (A) A/California/07/2009 H1N1 (B) A/Hong Kong/8/68 H3N2 (C) B/Malaysia/2506/2004 loze Viktorija i (D) B/Sichuan/379/99 loze Jamagata inficiranih A549 ćelija izmereno je otpuštanjem laktat dehidrogenaze (LDH).

Slike 3A-C prikazuju aktivnost ADCP i CDC GL20/39 BiS443/105 (Flu BiS), GL20 ili FBC39 anti-HA antitela. Aktivnost ADCP je predstavljena procentom humanih makrofaga koji su fagocitovali MDCK ciljne ćelije koje eksprimiraju protein HA (A) A/South Dakota/6/2007 H1N1 i (B) A/Hong Kong/8/68 H3N2. (C) Ćelijsko ubijanje posredovano sa CDC je izmereno pomoću otpuštanja LDH iz MDCK ćelija inficiranih sa A/Puerto Rico/8/34 u prisustvu komplementa bebe zeca.

Slike 4A-D prikazuju stopu preživljavanja (A i C) i virusni titar pluća 5. dana posle infekcije (B i D) u svakoj studijskoj grupi, kada su različite koncentracije GL20/39 BiS4 43/105 (Flu BiS), GL20 i nerelevantnog kontrolnog antitela (Ctl. mAb) primenjene na miševima 4 sata pre infekcije smrtonosnom dozom virusa gripa A/Wilson Smith N/33 H1N1 (A i B), rA/HK/68 H3N2 (C i D).

Slike 5A-D prikazuju stopu preživljavanja (A i C) i virusni titar pluća 5. dana posle infekcije (B i D) u svakoj studijskoj grupi, kada su različite koncentracije GL20/39 BiS4 43/105 (Flu BiS), FBC39 i nerelevantnog kontrolnog antitela (Ctl. mAb) primenjene na miševima 4 sata pre infekcije smrtonosnom dozom virusa gripa (A i B) B/Florida/4/2006 loze Jamagata i (C i D) B/Malaysia/2506/2004 loze Viktorija.

Slike 6A-F prikazuju stopu preživljavanja (A i B), virusni titar pluća 5. dana posle infekcije (C i D) i funkciju pluća izmerenu pulsnom oksimetrijom 6. dana posle infekcije (E i F) u svakoj studijskoj grupi, gde su miševi inficirani smrtonosnom dozom A/Wilson Smith N/33 H1N1 virusa gripa (A, C, E) ili B/Florida/4/2006 virusom loze Jamagata (B, D, F). Lečenje sa 25 mg/kg oseltamivira dva puta dnevno (BID) tokom 5 dana, 10 mg/kg GL20/39 BiS443/105 (Flu BiS) ili 10 mg/kg nerelevantnog kontrolnog antitela (Ctl. mAb) započeto je u različitim terminima (1. dan, 2. dan, 3. dan, 4. dan nakon infekcije).

Detaljan opis

Uvod

[0037] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Ovde su opisani vezujući molekuli, na primer, antitela, uključujući, bez ograničenja, bispecifična antitela, humana antitela, njihove antigen vezujuće fragmente, derivate ili konjugate koji sadrže najmanje dva vezujuća domena protiv gripa. Obezbeđen je izolovan vezujući molekul prema zahtevu 1. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji specifično vezuje virus gripa tip A i drugi vezujući domen koji specifično vezuje virus gripa tip B. Antitela koja specifično vezuju virus gripa tip A opisana su u U.S. privremenoj prijavi br.61/885,808, koja je podneta 2. oktobra 2013. godine, i 62/002,414, koja je podneta 23. maja 2014. godine, a antitela koja specifično vezuju virus gripa tip B opisana su u U.S. privremenoj prijavi br. 62/024,804, koja je podneta 15. jula 2014. godine.

[0038] U jednom otkriću, prvi vezujući domen specifično vezuje hemaglutininsku (HA) stabljiku virusa gripa tip A. U jednom otkriću, prvi vezujući domen specifično vezuje hemaglutininsku (HA) stabljiku virusa gripa tip A i neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje jedan podtip grupe 2 virusa gripa tip A.

[0039] U jednom otkriću, drugi vezujući domen specifično vezuje hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B. U jednom otkriću, drugi vezujući domen specifično vezuje hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i neutrališe virus gripa tip B u dve filogenetski različite loze. U jednom

1

otkriću, drugi vezujući domen specifično vezuje hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i neutrališe virus gripa tip B u lozama Jamagata i Viktorija. U drugom otkriću, drugi vezujući domen specifično vezuje hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i neutrališe najmanje jedan virus gripa tip B loze Jamagata; najmanje jedan virus gripa tip B loze Viktorija; najmanje jedan podtip virusa gripa tip A, i njihove kombinacije.

[0040] U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na jedan ili više sojeva virusa gripa tip A i/ili virusa gripa tip B u poređenju sa bilo kojim matičnim antitelom. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na jedan ili više sojeva virusa gripa tip A grupe 1 ili grupe 2. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na soj virusa gripa tip A grupe 1 izabran od podtipova H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 i H18. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na soj virusa gripa tip A grupe 2 izabran od podtipova H3, H4, H7, H10, H14 i H15. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na H9 podtip virusa gripa tip A.

[0041] Kako se ovde koristi, termin „neutralisati“ se odnosi na sposobnost vezujućeg molekula, kao što je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, da se vezuje za infektivni agens, na primer, virus gripa tip A i/ili B, i da smanji biološku aktivnost infektivnog agensa, na primer, virulenciju. U jednom otkriću, vezujući molekul se imunospecifično vezuje za najmanje jedan naznačeni epitop ili antigensku determinantu virusa gripa tip A, virusa gripa tip B, ili njihove kombinacije. Vezujući molekul može da neutrališe aktivnost infektivnog agensa, kao što je virus gripa tip A i/ili B, u različitim tačkama tokom životnog ciklusa virusa. Na primer, antitelo može da ometa vezivanje virusa za ciljnu ćeliju tako što ometa interakciju virusa i jednog ili više receptora ćelijske površine. Alternativno, antitelo može da ometa jednu ili više interakcija nakon vezivanja virusa sa njegovim receptorima, na primer, tako što ometa virusnu internalizaciju putem endocitoze posredovane receptorom.

Terminologija

[0042] Pre detaljnog opisivanja predmetnog pronalaska, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na specifične kompozicije ili korake procesa, te može da varira. Mora se imati u vidu da, kako se koriste u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju ukazivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

1

[0043] Termin „oko“ se odnosi na varijaciju numeričke količine koja može da se javi, na primer, u uobičajenim postupcima za merenje i rukovanje koji se koriste za dobijanje jedinjenja, kompozicija, koncentrata ili formulacija; usled nenamerne greške u ovim postupcima; usled razlike u proizvodnji, izvoru ili čistoći polaznih supstanci ili sastojaka koji se koriste za obavljanje postupaka, i sličnih faktora. Termin „oko“ takođe obuhvata količine koje se razlikuju usled starenja jedinjenja, kompozicija, koncentrata ili formulacija sa određenom prvobitnom koncentracijom ili smešom, i količine koje se razlikuju usled mešanja ili obrade jedinjenja, kompozicija, koncentrata ili formulacija sa određenom prvobitnom koncentracijom ili smešom. Kada su modifikovani terminom „oko“, ovde priloženi zahtevi obuhvataju ekvivalente tih količina.

[0044] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je poznato osobi sa uobičajenim znanjima u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show (2002) 2. izd. CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3. izd. (1999) Academic Press; i Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revidiran (2000) Oxford University Press, stručnjaku pružaju sveobuhvatni rečnih mnogih pojmova koji se koriste u ovom pronalasku.

[0045] Aminokiseline se ovde mogu označavati uobičajeno poznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. Slično tome, nukleotidi se mogu označavati opšteprihvaćenim jednoslovnim šiframa.

Definicije

[0046] Termin „nukleinska kiselina“ ili „polinukleotid“ obuhvata bilo koji fizički niz monomernih jedinica koji odgovara nizu nukleotida, uključujući, bez ograničenja, polimer nukleotida, uključujući DNK i RNK polimere, i modifikovane oligonukleotide, na primer, oligonukleotide koji imaju baze koje nisu uobičajene za biološku RNK ili DNK u rastvoru, kao što su 2'-O-metilovani oligonukleotidi. Polinukleotid može da sadrži konvencionalne fosfodiestarske veze ili nekonvencionalne veze, na primer, amidnu vezu, kao što se može naći u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Nukleinska kiselina može biti jednolančana ili

1

dvolančana. Ako nije drugačije naznačeno, sekvenca nukleinske kiseline obuhvata komplementarne sekvence, pored sekvence koja je eksplicitno naznačena.

[0047] Termin „gen“ se široko koristi da se označi nukleinska kiselina povezana sa biološkom funkcijom. Tako, geni uključuju kodirajuće sekvence i/ili regulatorne sekvence potrebne za njihovu ekspresiju. Termin „gen“ se odnosi na specifičnu genomsku sekvencu, kao i na kDNK ili iRNK kodiranu tom genomskom sekvencom. Geni takođe uključuju neeksprimirane sekvence nukleinske kiseline koje, na primer, grade sekvence prepoznavanja za druge proteine. Neeksprimirane regulatorne sekvence uključuju „promotere“ i „pojačivače“ za koje se vezuju regulatorni proteini, kao što su faktori transkripcije, što dovodi do transkripcije susednih ili obližnjih sekvenci. Na primer, polinukleotid koji kodira polipeptid može da obuhvata promoter i/ili druge kontrolne elemente transkripcije ili translacije koji su operativno povezani sa jednim ili više kodirajućih regiona. „Operativno povezano“ se odnosi na kodirajući region za genski proizvod povezan sa jednom ili više regulatornih sekvenci na takav način da stavlja ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatornih sekvenci. „Ekspresija gena“ ili „ekspresija nukleinske kiseline“ odnosi se na transkripciju DNK u RNK, translaciju RNK u polipeptid, ili i na transkripciju i na translaciju, kako nalaže kontekst.

[0048] Kako se ovde koristi, termin „kodirajući region“ odnosi se na deo nukleinske kiseline koji sadrži kodone koji mogu da se prevedu u aminokiseline. Mada se „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) ne prevodi u aminokiselinu, on se uobičajeno smatra delom kodirajućeg regiona. Međutim, bočne sekvence, na primer promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije i introni, ne smatraju se delom kodirajućeg regiona. Vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da uključuje dva ili više kodirajućih regiona. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da kodiraju heterologne kodirajuće regione, koji su fuzionisani ili nefuzionisani sa nukleinskom kiselinom koja kodira genski proizvod od interesa, na primer, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, varijanta ili derivat. Heterologni kodirajući regioni uključuju, ali nisu ograničeni na, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen.

[0049] Termin „vektor“ se odnosi na sredstvo pomoću koga nukleinska kiselina može da se propagira i/ili prebacuje između organizama, ćelija ili ćelijskih komponenata. Vektori

1

uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, viruse, bakteriofage, pro-viruse, fagemide, transpozone i veštačke hromozome, koji mogu autonomno da se replikuju ili integrišu u hromozom ćelije domaćina. Vektori takođe uključuju, ali nisu ograničeni na: goli RNK polinukleotid, goli DNK polinukleotid, polinukleotid koji sadrži DNK i RNK u istom lancu, DNK ili RNK konjugovanu polilizinom, DNK ili RNK konjugovanu peptidom, DNK konjugovanu lipozomom, koji se ne replikuju autonomno. „Ekspresioni vektor“ je vektor, kao što je plazmid, koji je sposoban da promoviše ekspresiju, kao i replikaciju nukleinske kiseline koja je u njega ugrađena. Nukleinska kiselina koja treba da se eksprimira je obično „operativno povezana“ sa promoterom i/ili pojačivačem, i podložna je regulatornoj kontroli transkripcije od strane promotera i/ili pojačivača.

[0050] Termin „ćelija domaćin“ se odnosi na ćeliju koja sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu, kao što je vektor, i podržava replikaciju i/ili ekspresiju nukleinske kiseline. Ćelije domaćini mogu biti prokariotske ćelije poput E. coli, ili eukariotske ćelije poput ćelija kvasca, insekata, vodozemaca, ptica ili sisara, uključujući humane ćelije, na primer, HEp-2 ćelije i Vero ćelije.

[0051] Termin „uvedena“, kada se odnosi na heterolognu ili izolovanu nukleinsku kiselinu, odnosi se na prenos nukleinske kiseline u eukariotsku ili prokariotsku ćeliju kada je nukleinska kiselina inkorporisana u genom ćelije, konvertovana u autonomni replikon, ili tranzijentno eksprimirana. Termin obuhvata postupke poput „infekcije“, „transfekcije“, „transformacije“ i „transdukcije“. Za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije domaćine mogu da se koriste različiti postupci, uključujući, bez ograničenja, elektroporaciju, taloženje kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu lipidom i lipofekciju.

[0052] Termin „ekspresija“ se odnosi na proces kojim se informacija iz gena koristi u sintezi funkcionalnog genskog proizvoda. Genski proizvodi su često proteini, ali mogu biti i funkcionalna RNK. Ekspresija gena može da se detektuje utvrđivanjem prisustva odgovarajuće rRNK, tRNK, iRNK, snRNK i/ili genskih proizvoda na proteinskom nivou.

[0053] „Polipeptid“ se odnosi na molekul koji sadrži dva ili više aminokiselinskih ostataka koji su linearno povezani amidnim vezama (poznate i kao peptidne veze), kao što je peptid ili protein. Termin „polipeptid“ se odnosi na bilo koji lanac ili lance dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Tako, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi,

1

„protein“, „lanac aminokiselina“ ili bilo koji drugi termin koji se koristi da se ukaže na lanac ili lance dve ili više aminokiselina, obuhvaćeni su definicijom „polipeptida“, i termin „polipeptid“ može da se koristi umesto bilo kog od ovih termina ili naizmenično sa njima. Termin „polipeptid“ takođe treba da označava proizvode postekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući, bez ograničenja, glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju pomoću poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko cepanje, ili modifikacije pomoću aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. Polipeptid može da se dobije iz prirodnog biološkog izvora ili se proizvodi putem rekombinantne tehnologije, i nije nužno preveden iz naznačene sekvence nukleinske kiseline. Može se stvoriti bilo kojim putem, uključujući hemijsku sintezu. Aminokiselinski ostaci polipeptida mogu biti prirodni ili neprirodni, i mogu biti nesupstituisani, nemodifikovani, supstituisani ili modifikovani.

„Aminokiselinska sekvenca“ je polimer aminokiselinskih ostataka, na primer, protein ili polipeptid, ili niz karaktera koji predstavlja polimer aminokiseline, u zavisnosti od konteksta.

[0054] Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ se odnosi na polipeptid ili grupu polipeptida koji sadrže najmanje jedan vezujući domen načinjen presavijanjem polipeptidnih lanaca koji imaju trodimenzionalne vezujuće prostore sa oblicima unutrašnje površine i distribucijom naelektrisanja komplementarnim sa osobinama antigenske determinante antigena. Antitelo obično ima tetramerni oblik, sa dva para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan „laki“ i jedan „teški lanac“, pri čemu varijabilni region svakog para laki/teški lanac gradi mesto vezivanja antitela. Svaki laki lanac je uobičajeno povezan sa teškim lancem putem jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza varira kod teških lanaca različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima uobičajeno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac uobičajeno ima varijabilni domen (VH) na jednom kraju nakon koga sledi određeni broj konstantnih domena (CH) i svaki laki lanac ima varijabilni domen (VL) na jednom kraju i konstantni domen (CL) na svom drugom kraju u kome je konstantni domen lakog lanca poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, i varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca.

[0055] Termini „antitelo“, „antitela“ i „imunoglobulini“, kako se ovde koriste, obuhvataju monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela kompletne dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela nastala od najmanje dva epitop vezujuća fragmenta (npr. bispecifična antitela), CDR-graftovana, humana antitela, humanizovana antitela, kamelizovana antitela, himerna antitela, jednolančane fv (scFv), jednolančana antitela,

2

antitela sa jednim domenom, fragmente Fab, fragmente Fab', fragmente F(ab')2, fragmente antitela koji ispoljavaju željenu biološku aktivnost (npr. antigen vezujući deo) disulfidno vezane Fv (dsFv) i antiidiotipska (anti-Id) antitela, intratela i epitop vezujuće fragmente ili derivate bilo čega od prethodno navedenog. Naročito, antitela uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne fragmente molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže najmanje jedno antigen-vezujuće mesto. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog izotipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), podizotipa (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili alotipa (npr. Gm, npr. G1m(f, z, a ili x), G2m(n), G3m(g, b, ili c), Am, Em, i Km(1, 2 ili 3)). Antitela mogu biti dobijena od bilo koje vrste sisara, uključujući, bez ograničenja, ljude, majmune, svinje, konje, zečeve, pse, mačke, miševe, itd., ili od drugih životinja, kao što su ptice (npr. kokoške). Antitela mogu biti fuzionisana sa heterolognom polipeptidnom sekvencom, na primer, oznakom za lakše prečišćavanje.

[0056] Termin „specifično vezuje“ odnosi se na vezivanje vezujućeg molekula, kao što je antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat, sa epitopom preko njegovog antigen vezujućeg domena lakše nego što bi se vezao za nasumični, nepovezani epitop. Termin „specifičnost“ se ovde koristi da se odredi relativni afinitet sa kojim se određeni vezujući molekul vezuje za određeni epitop.

[0057] Kako se ovde koristi, termin „afinitet“ se odnosi na jačinu vezivanja pojedinačnog epitopa za vezujući domen molekula imunoglobulina.

[0058] Termin „epitop“, kako se ovde koristi, označava proteinsku determinantu koja može da se veže za vezujući domen antitela. Epitopi obično sadrže hemijski aktivne površinske grupe molekula, kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0059] Termin „izolovana“ se odnosi na biološku supstancu, kao što je nukleinska kiselina ili protein, koja je suštinski bez komponenata koje je obično prate ili interaguju sa njom u njenom prirodnom okruženju. S druge strane, izolovana supstanca može da uključuje supstancu koja se ne susreće sa supstancom u njenom prirodnom okruženju. Na primer, ako je supstanca u svom prirodnom okruženju, kao što je ćelija, supstanca može biti postavljena na lokaciju u ćeliji koja nije nativna za supstancu koja se sreće u tom okruženju. Na primer, nukleinska kiselina koja se javlja u prirodi može da se smatra izolovanom ako je uvedena sredstvom koje se ne javlja u prirodi u lokus genoma koji nije nativan za nukleinsku kiselinu. Takve nukleinske kiseline se takođe nazivaju „heterologne“ nukleinske kiseline.

[0060] Termin „rekombinantna“ se odnosi na supstancu koja je veštački ili sintetički izmenjena delovanjem čoveka. Izmena može da se vrši na supstanci koja se nalazi u svom prirodnom okruženju ili stanju, ili je iz njega uklonjena. Na primer, „rekombinantna nukleinska kiselina“ može da se odnosi na nukleinsku kiselinu koja je napravljena rekombinacijom nukleinskih kiselina, na primer, tokom kloniranja, mešanja DNK ili drugih postupaka, ili putem hemijske ili druge mutageneze; a „rekombinantni polipeptid“ ili „rekombinantni protein“ može da se odnosi na polipeptid ili protein koji je proizveden ekspresijom rekombinantne nukleinske kiseline.

[0061] Kako se ovde koristi, termin „konstruisano“ obuhvata obradu molekula nukleinske kiseline ili polipeptida sintetičkim putem, uključujući, na primer, rekombinantne tehnike, in vitro sintezu peptida, enzimsko ili hemijsko kuplovanja peptida ili njihove kombinacije.

[0062] Kako se ovde koristi, termin „delotvorna količina“ ili „terapeutski delotvorna količina“ odnosi se na količinu terapeutske kompozicije koja je neophodna ili dovoljna za postizanje željenog kliničkog ishoda za dato stanje i režim primene, na primer, količinu koja je dovoljna za postizanje koncentracije jedinjenja koja je dovoljna za prevenciju ili lečenje infekcije gripom kod ispitanika. Stručnjaci mogu da odrede takve količine i koncentracije. Količinu terapeutske kompozicije koja se stvarno primenjuje obično će odrediti lekar, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući, ali se ne ograničavajući na, stanje koje se leči, izabrani put primene, samo jedinjenje koje se primenjuje, starost, težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta, i težinu pacijentovih simptoma.

[0063] Kako se ovde koristi, termin „terapeutska kompozicija“ se odnosi na jedinjenje ili kompoziciju sa terapeutskom primenom i uključuje, ali nije ograničen na, biološka jedinjenja, kao što su antitela, proteini i nukleinske kiseline, kao i jedinjenja malih organskih molekula koja su hemijski sintetisana.

[0064] Kako se ovde koristi, termin „farmaceutska kompozicija“ se odnosi na kompoziciju koja sadrži terapeutski delotvornu količinu terapeutskog agensa zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i, po želji, jednim ili više razblaživača ili ekscipijenasa. Kako se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljiv“ znači odobren od strane regulatorne agencije federalne ili državne uprave ili naveden u Farmakopeji Sjedinjenih Američkih Država, Evropskoj farmakopeji, ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji, za upotrebu kod sisara, a konkretnije kod ljudi.

[0065] Termin „sinergijsko dejstvo“, kako se ovde koristi, odnosi se na terapeutsko dejstvo veće od zbirnog, nastalo pomoću kombinacije jedinjenja, pri čemu terapeutsko dejstvo dobijeno kombinacijom premašuje zbirno dejstvo koje bi inače nastalo usled pojedinačne primene jedinjenja. Određena otkrića uključuju postupke za proizvodnju sinergijskog efekta u lečenju infekcije virusom gripa tip A i/ili virusom gripa tip B, pri čemu je navedeno dejstvo najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500% ili najmanje 1000% veće nego odgovarajuće zbirno dejstvo.

[0066] Kako se ovde koriste, termini „lečenje“ ili „lečiti“ odnose se na terapeutsko lečenje i profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je cilj da se stabilizuje, spreči, ublaži ili smanji jedan ili više simptoma infekcije gripom, ili da se odloži, spreči ili inhibira progresija infekcije gripom. Lečenje takođe može da se odnosi na klirens ili smanjenje infektivnog agensa kao što je grip tipa A i/ili grip tipa B kod pojedinca. „Lečenje“ takođe znači produžetak preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem kada se ne dobija lečenje. Lečenje ne mora da znači da je infekcija u potpunosti izlečena.

[0067] Kako se ovde koristi, termin „ispitanik“ ili „pacijent“ odnosi se na bilo kog člana podroda hordata, uključujući, bez ograničenja, ljude i druge primate, uključujući nehumane primate kao što su šimpanze i drugi čovekoliki majmuni i vrste majmuna. Poljoprivredne životinje, kao što je stoka, ovce, svinje, koze i konji; domaće životinje kao što su psi i mačke; laboratorijske životinje, uključujući glodare kao što su miševi, pacovi i zamorci; ptice, uključujući domaće, divlje i ptice koje se love kao što su kokoške, ćurke i druge kokoši, patke, guske i slično, takođe su neograničavajući primeri. Termini „sisari“ i „životinje“ su obuhvaćeni ovom definicijom. Predviđeno je da budu obuhvaćeni i odrasli i novorođeni sisari.

2

Vezujući molekuli

[0068] Izolovani vezujući molekuli su definisani zahtevima. Ovde su opisani vezujući molekuli koji se specifično vezuju za virus gripa tip A i/ili virus gripa tip B. Kako se ovde koristi, termin „vezujući molekul“ se odnosi na molekul koji je sposoban da se vezuje za ciljni molekul ili antigen na način sličan antitelu koje se vezuje za antigen. Primeri za vezujuće molekule uključuju netaknuta antitela, kao i antigen vezujuće fragmente, varijante, analoge ili derivate takvih antitela, na primer, antitelo ili molekuli imunoglobulina koji se javljaju u prirodi ili konstruisani molekuli ili fragmenti antitela, uključujući bispecifična antitela. Vezujući molekul može da sadrži jedan ili više vezujućih domena. Dok vezujući molekul može da sadrži kanonsku strukturu antitela, vezujući molekuli mogu imati druge strukture koje sadrže jedan ili više vezujućih domena. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje dva vezujuća domena i najmanje dve vezujuće specifičnosti.

[0069] Kako se ovde koristi, „vezujući domen“ se odnosi na deo, region ili mesto vezujućeg molekula koji je odgovoran za specifično vezivanje za ciljni molekul ili antigen. U jednom otkriću, vezujući domen sadrži varijabilni fragment (Fv) antitela. U jednom otkriću, vezujući domen sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca (VH) i varijabilnu sekvencu lakog lanca (VL) antitela. U jednom otkriću, vezujući domen uključuje jedan ili više, dva, tri, četiri, pet ili šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) antitela koji su pozicionirani u odgovarajućim regionima okvira (FR). Vezujući domen može biti dobijen od jedne vrste ili vezujući domen može da sadrži CDR jedne vrste i sekvence okvira druge vrste, na primer, kao kod humanizovanog antitela.

[0070] Vezujući molekuli mogu biti bilo kog životinjskog porekla, uključujući, bez ograničenja, ptice i sisare. Antitela vezujućeg molekula ili njihovi fragmenti mogu biti ljudska, mišja, magareća, zečja, kozja, zamorčeva, kamilja, lamina, konjska ili kokošja antitela. Kako se ovde koriste, „humana“ antitela uključuju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz bibilioteka humanog imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina, koja ne eksprimiraju endogene imunoglobuline.

[0071] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za virus gripa tip A i/ili da ga neutrališe. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za virus gripa tip B i/ili da ga neutrališe. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za virus gripa tip A i/ili da ga neutrališe, i drugi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za virus gripa tip B i/ili da ga neutrališe. U jednom otkriću, vezujući molekul obuhvata prvi vezujući domen koji može da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje jedan podtip grupe 2 virusa gripa tip A, i drugi vezujući domen koji može da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i neutrališe virus gripa tip B u najmanje dve filogenetski različite loze. U jednom otkriću, prvi vezujući domen može da neutrališe jedan ili više podtipova grupe 1 virusa gripa tip A izabranih od: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 i njihove varijante, i jedan ili više podtipova grupe 2 virusa gripa tip A izabranih od: H3, H4, H7, H10, H14 i H15 i njihove varijante. U jednom otkriću, drugi vezujući domen može da neutrališe virus gripa tip B u lozama Jamagata i Viktorija.

Antitela

[0072] Vezujući molekul može da sadrži antitelo koje je kompletne dužine ili netaknuto, fragment antitela, uključujući antigen vezujući fragment, humano, humanizovano, posttranslaciono modifikovano, himerno ili fuziono antitelo, imunokonjugat ili njegov funkcionalni fragment. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji sadrže antitelo koje je kompletne dužine ili netaknuto, ili jedan ili više fragmenata antitela, uključujući antigen vezujuće fragmente.

[0073] Primeri za „antigen vezujuće fragmente“ antitela uključuju (i) Fab fragment, jednovalentni fragment koji sadrži VL, VH, CL i CH1 domen antitela; (ii) F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana putem disulfidnog mosta u regionu šarke; (iii) Fd fragment koji sadrži VH i CH1 domen; (iv) Fv fragment koji sadrži VL i VH domen jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji sadrži VH domen; i (vi) izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR). Antigen vezujući fragmenti mogu da se proizvedu tehnikama rekombinantne DNK, ili putem enzimskog ili hemijskog cepanja netaknutih imunoglobulina.

[0074] U jednom otkriću, antigen vezujući fragment sadrži jednolančano antitelo, uključujući, na primer, „jednolančani varijabilni fragment“ ili „scFv“. Termin „jednolančani varijabilni fragment“ ili „scFv“ odnosi se na fuzioni protein koji sadrži najmanje jedan

2

varijabilni region teškog lanca (VH) i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca (VL) imunoglobulina. Ovi jednolančani fragmenti antitela mogu da se dobiju koristeći uobičajene tehnike koje su poznate stručnjacima. Na primer, VH i VL domeni Fv fragmenta, koji su kodirani različitim genima, mogu biti spojeni, koristeći rekombinantne postupke, putem sintetičkog linkera koji omogućava da budu načinjeni kao jedan lanac polipeptida u kome se VL i VH regioni sparuju da grade jednovalentni molekul (vidite, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). U jednom otkriću, VH i VL regioni scFv su povezani kratkim linkerskim peptidom od najmanje oko 5, 10, 15 ili 20, i do oko 10, 15, 20, 25 ili 30 aminokiselina. ScFv linkeri su poznati, i uključuju linkere koji su bogati glicinom (za fleksibilnost), kao i linkere koji sadrže serin ili treonin (za rastvorljivost). U jednom otkriću, linker povezuje N-terminus VH sa C-terminusom VL. U drugim otkrićima, linker povezuje C-terminus VH sa N-terminusom VL. U jednom otkriću, scFv zadržava specifičnost izvornog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera. Postupci za proizvodnju jednolančanih Fv uključuju one koji su opisani u U.S. pat. br.4,946,778 i 5,258,498; Huston et al., (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., (1993) PNAS 90:7995-7999; i Skerra et al., (1988) Science 240:1038-1040.

[0075] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan vezujući domen koji sadrži antitelo na virus gripa tip A ili njegov antigen vezujući fragment. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan vezujući domen koji sadrži antitelo na virus gripa tip B ili njegov antigen vezujući fragment. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan vezujući domen koji sadrži antitelo na virus gripa tip A ili njegov antigen vezujući fragment i najmanje jedan vezujući domen koji sadrži antitelo na virus gripa tip B ili njegov antigen vezujući fragment.

[0076] Kako se ovde koriste, termini „antitelo“ i „antitela“, poznata i kao imunoglobulini, obuhvataju monoklonska antitela, uključujući monoklonska antitela kompletne dužine, humana antitela, humanizovana antitela, kamelidna antitela, himerna antitela, jednolančana antitela, jednolančane Fv (scFv), antitela sa jednim domenom, domenska antitela, Fab fragmente, F(ab')2 fragmente, fragmente antitela koji ispoljavaju željenu biološku aktivnost, na primer, antigen vezujući fragmenti, disulfidno vezani Fv (dsFv), antiidiotipska (anti-Id) antitela i njihove antigen vezujuće fragmente.

2

[0077] Odgovarajući molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog izotipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), podizotipa (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili alotipa (npr. Gm, npr. G1m(f, z, a ili x), G2m(n), G3m(g, b, ili c), Am, Em, i Km(1, 2 ili 3)). Molekuli imunoglobulina mogu da sadrže lake lance koji su klasifikovani kao lambda lanci ili kapa lanci na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog regiona lakog lanca.

[0078] Uobičajena strukturna jedinica imunoglobulina (antitela) je tetramer od oko 150 kD, koji sadrži dva para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan „laki“ lanac (oko 25 kD) i jedan „teški“ lanac (oko 50-70 kD). Svaki laki lanac je uobičajeno povezan sa teškim lancem putem jedne kovalentne disulfidne veze, mada broj disulfidnih veza kod teških lanaca različitih izotipova imunoglobulina može da varira. Svaki teški i laki lanac takođe ima uobičajeno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Kod većine antitela koja se javljaju u prirodi, dva para polipeptidnih lanaca su identična. Međutim, kod konstruisanih antitela, dva para polipeptidnih lanaca nisu nužno identična, na primer, kao kod trifunkcionalnih antitela.

[0079] Laki i teški lanci antitela mogu da se podele na „konstantne“ i „varijabilne“ domene. C-terminalni deo teškog i lakog lanca se naziva konstantni domen. „CH1 domen“ se odnosi na konstantni domen teškog lanca imunoglobulina između varijabilnog teškog domena (VH) i regiona šarke. „CH2 domen“ se odnosi na konstantni domen teškog lanca imunoglobulina koji se nalazi između regiona šarke i CH3 domena. „CH3 domen“ se odnosi na konstantni domen teškog lanca imunoglobulina koji se nalazi C-terminalno od CH2 domena. „CH4 domen“ se odnosi na konstantni domen teškog lanca imunoglobulina koji se nalazi C-terminalno od CH3 domena kod IgM i IgE antitela. Termin „region šarke“ se odnosi na deo molekula teškog lanca koji spaja CH1 domen sa CH2 domenom. „CL domen“ se odnosi na konstantni domen lakog lanca imunoglobulina koji se nalazi C-terminalno od varijabilnog lakog domena (VL).

[0080] N-terminus svakog teškog i lakog lanca definiše varijabilni region trodimenzionalnog antigen vezujućeg mesta koji se naziva varijabilni domen. Varijabilni domeni lakog (VL) i teškog (VH) lanca sadrže oko 100 do 110 ili više aminokiselina, i prvenstveno su odgovorni za prepoznavanje antigena i specifičnost. Konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) daju biološka svojstva, kao što je sekrecija, transplacentalna mobilnost, vezivanje Fc receptora i komplementno vezivanje. Po konvenciji, numeracija domena

2

konstantnog regiona raste sa domenima koji su udaljeniji od antigen vezujućeg mesta ili N-terminusa antitela.

[0081] Kako se ovde koristi, termin „deo teškog lanca“ odnosi se na aminokiselinske sekvence dobijene od teškog lanca imunoglobulina koje sadrže najmanje jedno od: VH, CH1 domena, regiona šarke, CH2 domena, CH3 domena, ili njihove varijante ili fragmenta. Kako se ovde koristi, termin „deo lakog lanca“ odnosi se na aminokiselinske sekvence dobijene od lakog lanca imunoglobulina koje sadrže najmanje jedan od VL ili CL domena.

Varijabilni regioni antitela

[0082] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan antigen vezujući domen koji sadrži domen varijabilnog fragmenta (Fv). U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži najmanje jedan vezujući domen koji sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela. U jednom otkriću,

vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela, i drugi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji se vezuje za virus gripa tip A i sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela, i drugi vezujući domen koji se vezuje za virus gripa tip B i sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela. VH i VL domeni antitela koji se vezuju za virus gripa tip A i virus gripa tip B koji su ovde opisani prikazani su u Tabeli 1, odnosno 2.

Tabela 1: Antitelo na virus gripa tip A

2

Tabela 2: Antitelo na virus gripa tip B

[0083] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više VH i/ili VL domena koji imaju najmanje naznačeni procenat identičnosti sa jednom ili više sekvenci VH i/ili VL prikazanih u Tabeli 1 i 2. Kako se ovde koristi, termin „procenat (%) identičnosti sekvence“ ili „homologija“ odnosi se na procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima ili nukleotidima u referentnoj sekvenci, kao što je sekvenca matičnog antitela, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja razmaka, ako je to neophodno, za postizanje maksimalnog procenta identičnosti sekvence, i ne smatrajući bilo koje konzervativne supstitucije delom identičnosti sekvence. Poravnavanje sekvenci može da se postigne ručno ili koristeći algoritam homologije autora Smith i Waterman, (1981) Ads App. Math.2, 482 ili Neddleman i Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48, 443, koristeći postupak pretraživanja sličnosti autora Pearson i Lipman, (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili koristeći kompjuterske programe koji su zasnovani na jednom ili više od ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0084] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH koja je ovde opisana, uključujući, na primer, one prikazane u Tabeli 1 ili 2. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH koja je ovde opisana, uključujući, na primer, one prikazane u Tabeli 1 ili 2.

2

[0085] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VL koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili najmanje 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VL koja je ovde opisana, uključujući, na primer, one prikazane u Tabeli 1 ili 2. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VL koja je ovde opisana, uključujući, na primer, one prikazane u Tabeli 1 ili 2.

[0086] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL koja je ovde opisana, uključujući, na primer, one prikazane u Tabeli 1 ili 2. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL koja je ovde opisana, uključujući, na primer, one prikazane u Tabeli 1 ili 2.

[0087] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 1. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 1.

[0088] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 2. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 2.

[0089] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 1, i drugi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 2. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 1, i drugi vezujući domen koji ima aminokiselinsku sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, prikazanoj u Tabeli 2.

[0090] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NO.: 7, i SEQ ID NO.: 17. U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VL koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NO.: 2, i VL SEQ ID NO.: 12. U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH i VL koji je najmanje 75% identičan aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, izabranoj od VH SEQ ID NO.: 7 i VL SEQ ID NO.: 2, i VH SEQ ID NO.: 17 i VL SEQ ID NO.: 12. U jednom otkriću, prvi vezujući domen sadrži VH i VL izabrane od: VH SEQ ID NO.: 7 i VL SEQ ID NO.: 2, i VH SEQ ID NO.: 17 i VL SEQ ID NO.: 12.

Regioni za određivanje komplementarnosti (CDR)

[0091] Kod antitela koja se javljaju u prirodi, šest kratkih, neuzastopnih sekvenci aminokiselina, koje se nazivaju „regioni za određivanje komplementarnosti“ ili „CDR“, prisutno je u svakom antigen vezujućem domenu. Preostale aminokiseline u antigen vezujućim domenima se nazivaju regionima „okvira“. Regioni okvira funkcionišu kao konstrukcija koja pozicionira CDR u pravilnom smeru putem međulančanih, nekovalentnih interakcija. Tri CDR-a teškog lanca se označavaju sa CDRH1, CDRH2 i CDRH3, a tri CDR-a lakog lanca se označavaju sa CDRL1, CDRL2 i CDRL3.

[0092] Osoba sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci lako može da identifikuje aminokiseline koje čine CDR i regione okvira, koje su opisali Kabat et al., (1983) U.S. Dept.

1

of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" i Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol.196:901-917. Definicije koje su dali Kabat i sar. i Čotija i sar. obuhvataju preklapajuće aminokiselinske ostatke. Aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR prema definiciji Kabat i sar. i Čotija i sar. dati su u nastavku u Tabeli 3. Tačan broj ostataka koje obuhvata specifičan CDR može da se razlikuje zavisno od sekvence i veličine CDR-a. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci su u specifičnom CDR-u na osnovu aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona antitela.

TABELA 3: Primeri za definicije<1>CDR

[0093] Primena bilo koje definicije je predviđena da bude u opsegu pojma „CDR“, kako se ovde definiše i koristi. Međutim, ako nije drugačije naznačeno, reference na numeraciju specifičnih pozicija aminokiselinskih ostataka u vezujućem molekulu, antitelu, njegovom antigen vezujućem fragmentu, varijanti ili derivatu su prema sistemu numeracije autora Kabat et al.

[0094] U jednom otelotvorenju, aminokiseline u varijabilnom domenu, regionu za određivanje komplementarnosti (CDR) i regionima okvira (FR) antitela identifikuju se prema Kabat et al. Kabatova numeracija ostataka može da se odredi za dato antitelo poravnavanjem regiona homologije sekvence antitela sa „standardnom“ sekvencom numerisanom prema Kabatu. Za maksimalno poravnavanje ostataka okvira često može biti potrebno umetanje ostataka „spejsera“ u sistemu numercije. Pored toga, identičnost određenih pojedinačnih ostataka na bilo kom datom Kabatovom broju mesta može da varira od jednog do drugog lanca antitela do lanca antitela usled međuvrsnih ili alelnih razlika.

2

[0095] Prema sistemu numeracije autora Kabat et al, HCDR1 počinje približno od aminokiseline 31 (tj. približno 9 ostataka nakon prvog cisteinskog ostatka), uključuje približno 5-7 aminokiselina, i završava se kod sledećeg tirozinskog ostatka. HCDR2 počinje od petnaestog ostatka nakon kraja CDRH1, uključuje približno 16-19 aminokiselina i završava se kod sledećeg argininskog ili lizinskog ostatka. HCDR3 počinje od približno trideset trećeg aminokiselinskog ostatka nakon kraja HCDR2; uključuje 3-25 aminokiselina; i završava se kod sekvence W-G-X-G, gde je X bilo koja aminokiselina. LCDR1 počinje približno od ostatka 24 (tj. nakon cisteinskog ostatka), uključuje približno 10-17 ostataka i završava se kod sledećeg tirozinskog ostatka. LCDR2 počinje približno od šesnaestog ostatka nakon kraja LCDR1 i uključuje približno 7 ostataka. LCDR3 počinje približno od trideset trećeg ostatka nakon kraja LCDR2; uključuje približno 7-11 ostataka; i završava se kod sekvence F-G-X-G, gde je X bilo koja aminokiselina. CDR-ovi mogu znatno da variraju od jednog do drugog antitela (i po definiciji neće pokazivati homologiju sa Kabatovim sekvencama konsenzusa). Sekvence teškog lanca i lakog lanca CDR antitela iz pronalaska numerisane koristeći Kabatov sistem prikazane su u Tabelama 4 i 5, ispod.

[0096] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a teškog lanca (HCDR) prikazanih u Tabeli 4 i 5. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a lakog lanca (LCDR) prikazanih u Tabeli 4 i 5. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HCDR prikazanih u Tabeli 4 i 5 i najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest LCDR prikazanih u Tabeli 4 i 5.

Tabela 4: CDR-i antitela na grip tip A identifikovani prema Kabat et al.

Tabela 5: CDR-i antitela na grip tip B identifikovani prema Kabat et al.

[0097] U drugom otkriću, aminokiseline u varijabilnom domenu, regionima za određivanje komplementarnosti (CDR) i regionima okvira (FR) antitela mogu da se identifikuju koristeći bazu podataka Immunogenetics (IMGT) (http://imgt.cines.fr). Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol. 27(1):55-77. Baza podataka IMGT je razvijena koristeći informacije o sekvenci za imunoglobuline (IgG), T-ćelijske receptore (TcR) i molekule glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC) i objedinjuje numeraciju za lambda i kapa lake lance antitela, teške lance i lance receptora Tćelije, i izbegava korišćenje kodova umetanja za sva umetanja osim izrazito dugačkih. IMGT takođe uzima u obzir i kombinuje definiciju okvira (FR) i regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) Kabata i saradnika, karakterizaciju hipervarijabilnih petlji Čotije i saradnika, kao i strukturne podatke iz studija rendgenske difrakcije. Sekvence teškog lanca i lakog lanca CDR numerisane koristeći IMGT sistem prikazane su u Tabeli 6, ispod.

Tabela 6. CDR-i antitela na grip tip B identifikovani prema IMGT

[0098] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji uključuju jedan ili više, uključujući jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a izabranih od HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu su CDR-i izabrani od HCDR i LCDR

4

prikazanih u Tabelama 4 do 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 4 do 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 4 do 6.

[0099] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu su CDR-i izabrani od HCDR i LCDR prikazanih u Tabeli 4. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabeli 4. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabeli 4.

[0100] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu su CDR-i izabrani od HCDR i LCDR prikazanih u Tabelama 5 i 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6.

[0101] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji uključuje skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 prikazanih u Tabeli 4 i drugi vezujući domen koji uključuje skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, izabranih od HCDR i LCDR prikazanih u Tabelama 5 i 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji uključuje skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabeli 4 i drugi vezujući domen koji uključuje skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi vezujući domen koji uključuje skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabeli 4 i drugi vezujući domen koji uključuje skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6.

[0102] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i pojedinačno imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci:

(a) HCDR1 SEQ ID NO.: 8, HCDR2 SEQ ID NO.: 9, HCDR3 SEQ ID NO.: 10, LCDR1 SEQ ID NO.: 3, LCDR2 SEQ ID NO.: 4 i LCDR3 SEQ ID NO.: 5; ili

(b) HCDR1 SEQ ID NO.: 18, HCDR2 SEQ ID NO.: 19, HCDR3 SEQ ID NO.: 20,

LCDR1 SEQ ID NO.: 13, LCDR2 SEQ ID NO.: 14, LCDR3 SEQ ID NO.: 15.

[0103] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i pojedinačno imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci:

(b) HCDR1 SEQ ID NO.: 18, HCDR2 SEQ ID NO.: 19, HCDR3 SEQ ID NO.: 20,

LCDR1 SEQ ID NO.: 13, LCDR2 SEQ ID NO.: 14, LCDR3 SEQ ID NO.: 15.

[0104] U jednom otkriću, drugi vezujući domen sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i pojedinačno imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci:

(a) HCDR1 SEQ ID NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30, LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25; (b) HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46, LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41; ili (c) HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62,

LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57.

[0105] U jednom otkriću, drugi vezujući domen sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i pojedinačno imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci:

LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57.

Regioni okvira

[0106] Varijabilni domen teškog i lakog lanca sadrži četiri regiona okvira (FR1, FR2, FR3, FR4) koji su očuvaniji delovi varijabilnih domena. Četiri FR teškog lanca se označavaju FRH1, FRH2, FRH3 i FRH4, a četiri FR lakog lanca se označavaju FRL1, FRL2, FRL3 i FRL4. Koristeći Kabatov sistem numeracije, FRH1 počinje na poziciji 1, i završava se približno na aminokiselini 30; FRH2 je približno od aminokiseline 36 do 49; FRH3 je približno od aminokiseline 66 do 94; i FRH4 je približno od aminokiseline 103 do 113. U jednom otkriću, može da se uvede jedna ili više modifikacija, kao što su supstitucije, delecije ili insercije jednog ili više ostataka FR, na primer, kako bi se poboljšao ili optimizovao afinitet vezivanja jednog ili više vezujućih domena vezujućeg molekula prema virusu gripa tip A i/ili virusu gripa tip B. Primeri za ostatke regiona okvira koji mogu da se modifikuju uključuju one koji nekovalentno direktno vezuju antigen (Amit et al. Science, 233:747-753 (1986)); interaguju sa konformacijom CDR/utiču na nju (Chothia et al. J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); i/ili učestvuju u međupovršini VL-VH (US patent br.5,225,539).

[0107] U jednom otkriću, FR jednog ili više vezujućih domena vezujućeg molekula uključuje jednu ili više aminokiselinskih izmena u svrhe „dobijanja germinativnih mutacija“. Kod dobijanja germinativnih mutacija, aminokiselinske sekvence teškog i/ili lakog lanca antitela se porede sa aminokiselinskim sekvencama teškog i lakog lanca germinativne linije. Kada se neki ostaci okvira teškog lanca i/ili lakog lanca razlikuju od konfiguracije germinativne linije, na primer, kao rezultat somatske mutacije gena imunoglobulina korišćene za pripremu biblioteke faga, može biti poželjno da izmenjeni ostaci okvira „povratno mutiraju“ u konfiguraciju germinativne linije (tj. da se promene aminokiselinske sekvence okvira tako da budu iste kao aminokiselinske sekvence okvira germinativne linije). Takva „povratna mutacija“ (ili „dobijanje germinativnih mutacija“) ostataka okvira može da se postigne uobičajenim metodama molekularne biologije za uvođenje specifičnih mutacija (npr. mutageneza usmerena na mesto, PCR-posredovana mutageneza, i slično).

Disulfidne veze

[0108] Kako se ovde koristi, termin „disulfidna veza“ se odnosi na kovalentnu vezu nastalu između dva atoma sumpora. Aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da gradi disulfidnu vezu ili most sa drugom tiolnom grupom. Kod većine molekula IgG koji se javljaju u prirodi, regioni CH1 i CL su povezani putem disulfidne veze, i dva teška lanca su povezana putem dve disulfidne veze u fleksibilnom regionu teškog lanca koji je poznat kao region šarke (obično na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 koristeći Kabatov sistem numeracije).

[0109] U jednom otkriću, može biti načinjena jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u regionu okvira, na primer, da bi se poboljšalo vezivanje antitela za njegov antigen. U jednom otkriću, aminokiselinska sekvenca regiona okvira može da se modifikuje da se načini aminokiselinska supstitucija ili delecija jednog ili više cisteinskih ostataka koji učestvuju u međulančanoj disulfidnoj vezi, na primer, kako bi se stvorio vezujući molekul koji nema jednu ili više međulančanih disulfidnih veza; kako bi se stvorio vezujući molekul koji ima jednu ili više dodatnih međulančanih disulfidnih veza; ili kako bi se promenila lokacija jedne ili više međulančanih disulfidnih veza.

[0110] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više scFv. U jednom otkriću, scFv uključuje VH i VL, gde je C-terminus domena prvog varijabilnog regiona povezan sa N-terminusom domena drugog varijabilnog regiona preko fleksibilnog peptidnog linkera. U jednom otkriću, C-terminus varijabilnog teškog domena (VH) povezan je sa N-terminusom varijabilnog lakog domena (VL). To može da se naziva „VH-VL“ ili „HL“ orijentacija. U drugim otkrićima, C-terminus varijabilnog lakog domena (VL) povezan je sa N-terminusom varijabilnog teškog domena (VH). To može da se naziva „VL-VH“ ili „LH“ orijentacija. Dužina linkera (LS) koji spaja VH i VL scFv može da se razlikuje. U jednom otkriću, linker (LS) ima aminokiselinsku sekvencu [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 93). U drugom otkriću, linker (LS) ima aminokiselinsku sekvencu [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 106). U drugim otkrićima, linker uključuje kombinaciju ove dve sekvence. U konkretnijem otkriću, linker uključuje aminokiselinsku sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92).

[0111] U drugim otkrićima, pozicija disulfidne veze između VH i VL scFv može da se menja dodavanjem, uklanjanjem ili menjanjem lokacije jednog ili više cisteinskih ostataka u scFv. U jednom otkriću, VH scFv uključuje cisteinski ostatak na poziciji 43, 44, 100, 101, 105, i njihove kombinacije (numeracija prema Kabatu). U jednom otkriću, VL scFv uključuje cisteinski ostatak na poziciji 43, 44, 46, 49, 50, 100, i njihove kombinacije (numeracija prema Kabatu). U jednom otkriću, scFv ima orijentaciju VL-VH gde su VL i VH povezani disulfidnom vezom na VL100-VH44, VL43-VH105, VL46-VH101, VL49-VH100, VL50-VH100, ili njihova kombinacija. U drugom otkriću, scFv ima orijentaciju VH-VL gde su VH i VL povezani disulfidnom vezom na VH44-VL100, VH100-VL49, VH100-VL50, VH101-VL46, VH105-VL43, ili njihova kombinacija.

Bispecifična antitela

[0112] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje „bispecifično antitelo“. Kako se ovde koristi, termin „bispecifično antitelo“ se odnosi na antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koje ima dva ili više vezujućih domena koji mogu specifično da vezuju dva različita ciljna molekula ili antigena. Bispecifična antitela obično u jednom molekulu spajaju specifičnosti i svojstva jednog ili više, često najmanje dva, a uobičajeno dva različita monoklonska antitela, koja se nazivaju „matična antitela“. Neka bispecifična antitela pokazuju sinergijsko delovanje. U jednom otkriću, bispecifično antitelo pokazuje pojačanu aktivnost neutralizacije za jedan ili više sojeva gripa tip A i/ili B u poređenju sa matičnim antitelom.

[0113] U jednom otkriću, ovde opisana bispecifična antitela imaju sveobuhvatniji opseg u poređenju sa pojedinačnim mAb, i takođe mogu da pokazuju pojačanu neutralizaciju jednog ili više sojeva virusa gripa tip A. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na jedan ili više sojeva virusa gripa tip A grupe 1 ili grupe 2. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije za soj grupe 1 virusa gripa tip A izabran od podtipova H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 i H18). U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije za soj grupe 2 virusa gripa tip A izabran od podtipova H3, H4, H7, H10, H14 i H15. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo sa pojačanom aktivnošću neutralizacije na H9 podtip virusa gripa tip A.

[0114] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje bispecifično antitelo sa više od dve valence. Na primer, u jednom otkriću, vezujući molekul uključuje trispecifično antitelo. Trispecifična antitela su poznata, i mogu da se pripreme koristeći postupke koji su poznati stručnjaku (Tutt et al., (1991) J. Immunol., 147:60).

[0115] Bispecifična antitela mogu da se eksprimiraju od strane ćelijskih linija kao što su triomi i hibridni hibridomi, ili mogu biti konstruisana rekombinantnim putem. (Ströhlein i Heiss, Future Oncol.6:1387-94 (2010); Mabry i Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)).

[0116] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje bispecifično antitelo koje sadrži najmanje dva para teškog i lakog lanca, ili njegove vezujuće fragmente, pri čemu je prvi par dobijen od prvog „matičnog“ antitela i ima prvu specifičnost vezivanja, a drugi par je dobijen od drugog „matičnog“ antitela i ima drugu specifičnost vezivanja. U jednom otkriću, vezujući

4

molekul sadrži prvi par teškog i lakog lanca, ili njegove fragmente, koji se specifično vezuje za virus gripa tip A, i drugi par teškog i lakog lanca, ili njegove fragmente, koji se specifično vezuje za virus gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje bispecifično antitelo koje uključuje dva ili više hemijski povezanih regiona Fab koji su usmereni na dva različita ciljna molekula ili antigena. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više regiona Fab koji specifično vezuju virus gripa tip A. U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više regiona Fab koji specifično vezuju virus gripa tip B. U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje bispecifično antitelo koje uključuje jedan ili više jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv). U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje najmanje jedan scFv koji specifično vezuje virus gripa tip A. U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje najmanje jedan scFv koji specifično vezuje virus gripa tip B.

[0117] U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo nastalo fuzionisanjem IgG antitela i jednog ili više jednolančanih vezujućih domena. U jednom otkriću, vezujući molekul zadržava strukturu jezgra antitela (IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM). U drugim otkrićima, struktura jezgra antitela (IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM) nije zadržana, na primer, u dija-, trija- ili tetratelima, minitelima i jednolančanim formatima (scFv, Bis-scFv). U drugom otkriću, bispecifično antitelo može da uključuje F(ab)2fuziju kada je dva ili više Fab fragmenata fuzionisano sa hemijskim kroslinkerom. Brojni formati bispecifičnih antitela koriste jedan ili više linkera, na primer, kako bi se jezgro antitela (IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM) fuzionisalo sa vezujućim domenom (npr. scFv) ili radi fuzionisanja dva ili više Fab fragmenata ili scFv. U nekim otkrićima, zadržan je Fc domen, te stoga i efektorske funkcije Fc. U drugim otkrićima, Fc domen nije zadržan.

[0118] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje asimetričnu strukturu nalik IgG sa dva teška i dva laka lanca koji grade molekul u obliku slova „Y“, pri čemu prvi „krak“ antitela specifično vezuje prvi antigen, a drugi „krak“ antitela vezuje drugi antigen.

[0119] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više fragmenata antitela, kao što su jednolančana antitela, koji sadrže jedan ili više varijabilnih regiona teškog lanca (VH), samostalno ili u kombinaciji sa nijednim, nekim ili svakim od sledećih: region šarke (H), CH1, CH2 i CH3 domeni, i/ili jedan ili više varijabilnih regiona lakog lanca (VL), samostalno ili u kombinaciji sa CL domenom.

[0120] U jednom otkriću, bispecifično antitelo uključuje jedan ili više jednolančanih Fv (scFv). U jednom otkriću, bispecifično antitelo uključuje dva ili više scFv. U drugom otkriću, bispecifično antitelo uključuje deo ili celinu „bazne“ strukture imunoglobulina, na primer, strukturu IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM koja uključuje jedan ili više Fv domena, na primer, jedan ili više teških lanaca i jedan ili više lakih lanaca, pri čemu je jedan ili više scFv fuzionisano sa „baznom“ strukturom imunoglobulina. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje strukturu IgG koja uključuje dva teška lanca i dva laka lanca, pri čemu su za nju fuzionisani jedan ili više scFv.

[0121] U jednom otkriću, format antitela može biti bilo koji format koji je ovde razmotren. U drugom otkriću, format je bilo koji od Bis1, Bis2, Bis3, Bis4 ili Bis5. U jednom otkriću, Fv domen prvog vezujućeg domena uključuje teški lanac (HC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i drugi vezujući domen je kovalentno vezan za karboksi terminus HC prvog vezujućeg domena koristeći jedan ili dva linkera. U jednom otkriću, Fv domen prvog vezujućeg domena uključuje teški lanac (HC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i drugi vezujući domen je kovalentno vezan za karboksi terminus HC prvog vezujućeg domena koristeći jedan linker. U jednom otkriću, Fv domen prvog vezujućeg domena uključuje teški lanac (HC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i drugi vezujući domen je kovalentno vezan za karboksi terminus HC prvog vezujućeg domena koristeći dva linkera. U jednom otkriću, Fv domen prvog vezujućeg domena uključuje teški lanac (HC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i drugi vezujući domen je kovalentno vezan za amino terminus HC prvog vezujućeg domena. U jednom otkriću, Fv domen prvog vezujućeg domena uključuje teški lanac (HC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i drugi vezujući domen je kovalentno vezan za amino terminus LC prvog vezujućeg domena. U drugom otkriću, Fv domen prvog vezujućeg domena uključuje teški lanac (HC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i laki lanac (LC), koji ima amino terminus i karboksi terminus, i drugi vezujući domen je kovalentno interkaliran duž polipeptidnog lanca HC prvog vezujućeg domena.

[0122] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje bispecifično antitelo koje uključuje teški lanac antitela sa formulom VH-CH1-H-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen 1 konstantnog regiona teškog lanca, H je region šarke, CH2 je domen 2 konstantnog regiona teškog lanca, i CH3 je domen 3 konstantnog regiona teškog lanca. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje uključuje laki lanac antitela sa formulom VL-CL, pri čemu je VL varijabilni domen lakog lanca, a CL je konstantni domen lakog lanca.

[0123] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje teški lanac antitela sa N-terminalnim domenom, pri čemu teški lanac antitela ima formulu VH-CH1-H-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen 1 konstantnog regiona teškog lanca, H je region šarke, CH2 je domen 2 konstantnog regiona teškog lanca, a CH3 je domen 3 konstantnog regiona teškog lanca, i laki lanac antitela sa N-terminalnim domenom, pri čemu laki lanac antitela ima formulu VL-CL, pri čemu je VL varijabilni domen lakog lanca, a CL je konstantni domen lakog lanca, i pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za jedan ili više N-terminalnih domena teškog lanca antitela ili lakog lanca antitela (Slika 1).

[0124] U jednom otkriću, N-terminalni domen antitela ili njegov fragment sadrži jedan ili više domena Fv, i jedan ili više molekula scFv su kovalentno vezani za jedan ili više domena Fv antitela ili njegovog fragmenta (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više molekula scFv je kovalentno vezano za N-terminalni domen jednog ili više varijabilnih domena lakog lanca (VL) antitela ili njegovog fragmenta. (Slika 1) U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži laki lanac antitela sa formulom scFv-L1-VL-CL, pri čemu, scFv je molekul scFv, L1 je linker, VL je varijabilni domen lakog lanca, VL je varijabilni domen lakog lanca i CL je konstantni domen lakog lanca (Slika 1).

[0125] U jednom otkriću, jedan ili više molekula scFv je kovalentno vezano za N-terminalni domen jednog ili više varijabilnih domena teškog lanca (VH) antitela ili njegovog fragmenta (Slika 1). U jednom otkriću, teški lanac ima formulu scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, scFv je molekul scFv, L1 je linker, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen 1 konstantnog domena teškog lanca, CH2 je domen 2 konstantnog domena teškog lanca, a CH3 je domen 3 konstantnog domena teškog lanca (Slika 1).

[0126] U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment sa C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za C-

4

terminalni domen antitela ili njegovog fragmenta (Slika 1). U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi i drugi teški lanac sa prvim, odnosno drugim C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za C-terminalni domen prvog teškog lanca, drugog teškog lanca, ili njihove kombinacije (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen 1 konstantnog domena teškog lanca, CH2 je domen 2 konstantnog domena teškog lanca, a CH3 je domen 3 konstantnog domena teškog lanca (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv, pri čemu je L1 linker, a scFv je molekul scFv (Slika 1).

[0127] U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment sa C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za C-terminalni domen antitela ili njegovog fragmenta (Slika 1). U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži prvi i drugi teški lanac sa prvim, odnosno drugim C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za C-terminalni domen prvog teškog lanca, drugog teškog lanca, ili njihove kombinacije (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen 1 konstantnog domena teškog lanca, CH2 je domen 2 konstantnog domena teškog lanca, a CH3 je domen 3 konstantnog domena teškog lanca (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFvL2, pri čemu su L1 i L2 nezavisno linkeri, a scFv je molekul scFv (Slika 1).

[0128] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment sa jednim ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu je jedan ili više molekula scFv umetnuto između jednog ili više konstantnih domena teškog lanca jednog ili više teških lanaca (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen 1 konstantnog domena teškog lanca, CH2 je domen 2 konstantnog domena teškog lanca, a CH3 je domen 3 konstantnog domena teškog lanca (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3, pri čemu su L1 i L2 nezavisno linker, a scFv je molekul scFv (Slika 1). U jednom otkriću, jedan ili više teških lanaca ima formulu VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linkeri, a scFv je molekul scFv.

[0129] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje strukturu imunoglobulina, na primer, strukturu IgG koja ima jedan ili više Fv domena. U jednom otkriću, Fv domen uključuje sekvencu VH i VL koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 1. U drugom otkriću, Fv domen uključuje sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 1. U jednom otkriću, Fv domen uključuje sekvencu VH i VL koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 2. U drugom otkriću, Fv domen uključuje sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 2.

[0130] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje strukturu imunoglobulina sa jednim ili više vezujućih domena koji uključuju jedan ili više, uključujući jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a izabranih od HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži strukturu imunoglobulina sa jednim ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu su CDR-i izabrani od HCDR i LCDR prikazanih u Tabelama 4 do 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži strukturu imunoglobulina sa jednim ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 4 do 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži strukturu imunoglobulina sa jednim ili više vezujućih domena koji uključuju skup od šest CDR:

HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 4 do 6.

[0131] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više scFv sa formulom VH-LS-VL ili, alternativno, VL-LS-VH, gde je LS sekvenca linkera. U jednom otkriću, scFv uključuje sekvencu VH i VL koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu sekvenci VH ili VL prikazanoj u tabeli 1. U drugom otkriću, scFv uključuje sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u tabeli 1. U

4

jednom otkriću, scFv uključuje sekvencu VH i VL koja ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu sekvenci VH ili VL prikazanoj u tabeli 2. U drugom otkriću, scFv uključuje sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 2.

[0132] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više scFv sa jednim ili više, uključujući jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR izabranih od HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više scFv sa skupom od šest CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu su CDR-i izabrani od HCDR i LCDR prikazanih u Tabelama 4 do 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više scFv sa skupom od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 4 do 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži jedan ili više scFv sa skupom od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu CDR-i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR i LCDR prikazanoj u Tabelama 4 do 6.

[0133] U jednom otkriću, linker LS ima aminokiselinsku sekvencu: (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (SEQ ID NO: 106) ili kombinaciju (a) i (b). Na primer, ovde opisani linker uključuje:

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92). U jednom otkriću, scFv je fuzionisan sa strukturom imunoglobulina, na primer, strukturom IgG preko linkera (L1 ili L2) koji ima aminokiselinsku sekvencu: (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (SEQ ID NO: 106) ili kombinaciju (a) i (b), uključujući, na primer, aminokiselinsku sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92).

[0134] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje strukturu imunoglobulina, na primer, strukturu IgG sa jednim ili više Fv domena koji uključuju sekvencu VH i VL sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 1, ili sekvencu VH i VL koja je

4

najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 1. U jednom otkriću, jedan ili više scFv sa formulom VH-LS-VL ili, alternativno, VL-LS-VH, gde je LS sekvenca linkera, fuzionisano je sa strukturom imunoglobulina, i scFv uključuje sekvence VH i VL koje imaju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnosti sa sekvencom VH ili VL prikazanom u Tabeli 2. U drugom otkriću, scFv uključuje sekvencu VH i VL koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci VH ili VL prikazanoj u Tabeli 2. U jednom otkriću, linker LS ima aminokiselinsku sekvencu: (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (SEQ ID NO: 106) ili kombinaciju (a) i (b). Na primer, ovde opisani linker uključuje: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92). U jednom otkriću, scFv je fuzionisan sa strukturom imunoglobulina, na primer, strukturom IgG preko linkera (L1 ili L2) koji ima aminokiselinsku sekvencu: (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (SEQ ID NO: 106) ili kombinaciju (a) i (b), uključujući, na primer, aminokiselinsku sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92).

[0135] U jednom otkriću, prvi vezujući domen vezujućeg molekula obuhvata antitelo na virus gripa tip A ili njegov antigen vezujući fragment. U jednom otkriću, drugi vezujući domen vezujućeg molekula obuhvata antitelo na virus gripa tip B ili njegov antigen vezujući fragment. U jednom otkriću, prvi vezujući domen uključuje Fv domen antitela na virus gripa tip A. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje domen varijabilnog fragmenta (Fv) koji ima varijabilni domen teškog lanca antitela i varijabilni domen lakog lanca antitela, pri čemu Fv specifično vezuje antitelo na virus gripa tip A. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji uključuju scFv molekul antitela na virus gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje prvi vezujući domen koji obuhvata Fv domen na virus gripa tip A i drugi vezujući domen koji obuhvata molekul scFv na virus gripa tip B.

[0136] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68.

4

[0137] U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje ima teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje ima teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69.

[0138] U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68. U jednom otkriću, vezujući molekul sadrži teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68, i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69.

[0139] U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68, i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje ima laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:66 i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:67. U jednom otkriću, vezujući molekul je bispecifično antitelo koje ima laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:68 i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:69

[0140] U jednom otkriću, molekul scFv uključuje domen VH koji ima skup od tri CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, pri čemu skup od tri CDR-a sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži domen VH koji ima skup od tri CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, pri čemu skup od tri CDR-a sadrži

4

aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci HCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6.

[0141] U jednom otkriću, molekul scFv uključuje domen VL koji ima skup od tri CDR-a: LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu skup od tri CDR-a sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci LCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6. U drugom otkriću, vezujući molekul sadrži domen VL koji ima skup od tri CDR-a: LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu skup od tri CDR-a sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci LCDR prikazanoj u Tabelama 5 i 6.

[0142] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više scFv sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, i SEQ ID NO:63. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više scFv sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, i SEQ ID NO:63.

Vezujući domen za grip tip A

[0143] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji imunospecifično vezuju najmanje jedan naznačeni epitop virusa gripa tip A. Kako se ovde koriste, termini „vezujući domen“ ili „antigen vezujući domen“ uključuju mesto koje specifično vezuje epitop na antigenu. Antigen vezujući domen antitela obično obuhvata barem deo varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina i barem deo varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina, pri čemu mesto vezivanja koje grade ovi varijabilni regioni određuje specifičnost antitela.

[0144] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji imunospecifično vezuju najmanje jedan naznačeni epitop HA proteina virusa gripa tip A. Termin „epitop“, kako se ovde koristi, označava proteinsku determinantu koja može da se veže za antitelo. Epitopi obično sadrže hemijski aktivne površinske grupe molekula, kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i

4

nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0145] U jednom otkriću, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje se za epitop koji je očuvan najmanje kod 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili svih podtipova gripa tip A. U drugom otkriću, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje se za epitop koji je očuvan kod jednog ili više, ili najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 podtipova grupe 1 virusa gripa tip A izabranih od H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, i H18 i jednog ili više, ili najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 podtipova grupe 2 izabranih od H3, H4, H7, H10, H14 i H15.

[0146] U jednom otkriću, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 ili sve podtipove gripa tip A sa EC50od oko 0,01 ug/ml do oko 5 ug/ml, ili od oko 0,01 ug/ml do oko 0,5 ug/ml, ili od oko 0,01 ug/ml do oko 0,1 ug/ml, ili manje od oko 5 ug/ml, 1 ug/ml, 0,5 ug/ml, 0,1 ug/ml ili 0,05 ug/ml. U drugom otkriću, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje jedan ili više, ili najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 podtipova grupe 1 virusa gripa tip A izabranih od H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, i H18 i jedan ili više, ili najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 podtipova grupe 2 izabranih od H3, H4, H7, H10, H14 i H15 sa EC50od oko 0,01 ug/ml do oko 5 ug/ml, ili od oko 0,01 ug/ml do oko 0,5 ug/ml, ili od oko 0,01 ug/ml do oko 0,1 ug/ml, ili manje od oko 5 ug/ml, 1 ug/ml, 0,5 ug/ml, 0,1 ug/ml, ili 0,05 ug/ml.

[0147] U jednom otkriću, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prepoznaje epitop koji je linearni epitop ili kontinualni epitop. U drugom otkriću, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prepoznaje nelinearni ili konformacioni epitop. U jednom otkriću, epitop se nalazi u veoma očuvanom regionu stabljike HA2. U jednom otkriću, antitelo ili antigen vezujući fragment se vezuje za konformacioni epitop u veoma očuvanom regionu stabljike HA2. (Wilson et al. (1981) Nature.289:366-373). U jednom otkriću, epitop uključuje jednu ili više aminokiselina izabranih od: 18, 19, 42, 45, 156, i 196 u regionu stabljike HA2 kao kontaktne ostatke. U jednom otkriću, epitop uključuje jednu ili više aminokiselina izabranih od 18, 19, 42 i 45 u regionu stabljike HA2 kao kontaktne ostatke. U daljem otkriću, epitop uključuje aminokiseline 18, 19, 42 i 45 u regionu stabljike HA2 kao kontaktne ostatke. U još daljem otkriću, epitop uključuje aminokiseline 18, 19 i 42 u regionu stabljike HA2 kao kontaktne ostatke.

Vezujući domen za grip tip B

[0148] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji imunospecifično vezuju najmanje jedan naznačeni epitop virusa gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji imunospecifično vezuju najmanje jedan naznačeni epitop HA proteina virusa gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se specifično vezuju za epitop prisutan na najmanje dve filogenetski različite loze gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za epitop prisutan u najmanje jednom Jamagata soju gripa tip B i najmanje jednom Viktorija soju gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za epitop koji je prisutan kod virusa gripa tip B obe loze, Jamagata i Viktorija. U jednom otkriću, vezujući član uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za epitop koji je očuvan kod gripa tip B obe loze, Jamagata i Viktorija.

[0149] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za najmanje jedan Jamagata soj gripa tip B i najmanje jedan Viktorija soj gripa tip B sa polovinom maksimalne efektivne koncentracije (EC50) od oko 1 ng/ml do oko 500 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 250 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 50 ng/ml, ili manje od oko 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml ili 15 µg/ml. U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za virus gripa tip B loze Jamagata i Viktorija sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 500 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 250 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 50 ng/ml, ili manje od oko 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml ili 15 µg/ml. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za epitop prisutan kod virusa gripa tip B obe loze, Jamagata i Viktorija. sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 500 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 250 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 50 ng/ml, ili manje od oko 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml ili 15 µg/ml.

[0150] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za: epitop prisutan na lozi Jamagata gripa tip B sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 100 ng/ml, 1 ng/ml i oko 50 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 25 ng/ml, ili manje od oko 50 ng/ml ili 25 ng/ml; i epitop prisutan na lozi Viktorija gripa tip B sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 500

1

ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 250 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 50 ng/ml, ili manje od oko 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml ili 50 ng/ml.

[0151] U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za: epitop prisutan na lozi Jamagata gripa tip B sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 100 ng/ml, 1 ng/ml i oko 50 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 25 ng/ml, ili manje od oko 50 ng/ml ili 25 ng/ml; epitop prisutan na lozi Viktorija gripa tip B sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 500 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 250 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 50 ng/ml, ili manje od oko 500 ng/ml, 250 ng/ml ili 100 ng/ml; i epitop na HA gripa tip A sa EC50od oko 1 µg/ml do oko 50 µg/ml, ili manje od oko 50 µg/ml, 25 µg/ml, 15 µg/ml ili 10 µg/ml. U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji se vezuju za: epitop prisutan na lozi Jamagata gripa tip B sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 100 ng/ml, 1 ng/ml i oko 50 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 25 ng/ml, ili manje od oko 50 ng/ml ili 25 ng/ml; epitop prisutan na lozi Viktorija gripa tip B sa EC50od oko 1 ng/ml do oko 500 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 250 ng/ml, ili od oko 1 ng/ml do oko 50 ng/ml, ili manje od oko 500 ng/ml, 250 ng/ml ili 100 ng/ml; i epitop na H9 HA gripa tip A sa EC50od oko 1 µg/ml do oko 50 µg/ml, ili manje od oko 50 µg/ml, 25 µg/ml, 15 µg/ml ili 10 µg/ml.

[0152] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji prepoznaju epitop koji je linearni epitop ili kontinualni epitop. U drugom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji prepoznaju nelinearni ili konformacioni epitop. U jednom otkriću, epitop se nalazi na glikoproteinu hemaglutininu (HA) gripa tip B. U jednom otkriću, epitop se nalazi na regionu glave HA glikoproteina gripa tip B. U jednom otkriću, epitop uključuje jednu ili više aminokiselina na pozicijama 128, 141, 150 ili 235 u regionu glave HA gripa tip B kao kontaktne ostatke, koji su numerisani prema H3 sistemu numeracije, kako je opisano u Wang et al. (2008) J. Virol.82(6):3011-20. U jednom otkriću, epitop uključuje aminokiselinu 128 sekvence regiona glave HA gripa tip B kao kontaktni ostatak. U drugom otkriću, epitop uključuje aminokiseline 141, 150 i 235 sekvence regiona glave HA gripa tip B kao kontaktne ostatke.

Unakrsna reaktivnost

[0153] U jednom otkriću, vezujući molekul može da se opiše ili precizira pomoću epitopa ili delova antigena koje vezujući molekul prepoznaje ili specifično vezuje. Deo ciljnog molekula koji specifično interaguje sa antigen vezujućim domenom antitela naziva se „epitop“ ili

2

„antigenska determinanta“. Ciljni antigen može da uključuje bilo koji broj epitopa, u zavisnosti od veličine, konformacije i vrste antigena. U jednom otkriću, vezujući molekul se specifično vezuje za isti epitop kao jedno ili više ovde opisanih antitela, i/ili konkurentski inhibira ovde opisano antitelo u vezivanju za epitop.

[0154] U jednom otkriću, jedan ili više vezujućih domena vezujućeg molekula pokazuje unakrsnu reaktivnost sa virusom gripa tip A i virusom gripa tip B. Kako se ovde koristi, termin „unakrsna reaktivnost“ odnosi se na sposobnost vezujućeg domena vezujućeg molekula, koji je specifičan za jedan antigen, da reaguje sa drugim antigenom. Tako, vezujući molekul je unakrsno reaktivan ako se vezuje za epitop koji nije onaj koji je indukovao njegov nastanak.

Fc region

[0155] U jednom otkriću, vezujući molekul je antitelo koje je modifikovano u Fc regionu da bi se dobile željene efektorske funkcije ili poluživot u serumu. U jednom otkriću, Fc region može da indukuje citotoksičnost, na primer, putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) ili regrutacijom komplementa u komplementno zavisnoj citotoksičnosti (CDC), ili regrutacijom nespecifičnih citotoksičnih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više efektorskih liganda koji prepoznaju vezano antitelo na virusu gripa tip A i/ili gripa tip B, te zatim prouzrokuju fagocitozu ćelije u ćelijski posredovanoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP), ili drugim mehanizmom. U drugim otkrićima, može biti poželjno da se eliminiše ili smanji efektorska funkcija, kako bi se minimizovala neželjena dejstva ili terapeutske komplikacije. Poznati su postupci za pojačavanje i smanjivanje, ili eliminaciju efektorske funkcije Fc. U drugim otkrićima, Fc region može biti modifikovan radi povećanja afiniteta vezivanja za FcRn i tako produžiti poluživot u serumu. U još nekim otkrićima, Fc region može biti konjugovan sa PEG ili albuminom kako bi se produžio poluživot u serumu. Varijante Fc su detaljnije opisane u U.S. privremenoj prijavi br.61/885,808, koja je podneta 2. oktobra 2013. godine, 62/002,414, koja je podneta 23. maja 2014. godine i 62/024,804, koja je podneta 15. jula 2014. godine.

Karakteristike vezivanja

[0156] Kao što je prethodno opisano, ovde opisani vezujući molekuli imunospecifično vezuju najmanje jedan naznačeni epitop ili antigensku determinantu proteina virusa gripa tip A i/ili virusa gripa tip B, peptid, podjedinicu, fragment, deo ili bilo koju njihovu kombinaciju, isključivo ili preferencijalno u odnosu na druge polipeptide. Termin „epitop“ ili „antigenska determinanta“, kako se ovde koristi, označava proteinsku determinantu koja može da se veže za antitelo. U jednom otkriću, termin „vezivanje“ se ovde odnosi na specifično vezivanje. Ove proteinske determinante ili epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Termin „diskontinualni epitop“, kako se ovde koristi, odnosi se na konformacioni epitop na antigenu proteina koji nastaje od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci proteina.

[0157] Interakcije između antigena i antitela su iste kao za ostale nekovalentne interakcije protein-protein. Uopšteno, postoje četiri tipa vezujućih interakcija između antigena i antitela: (i) vodonične veze, (ii) disperzione sile, (iii) elektrostatičke sile između Luisovih kiselina i Luisovih baza i (iv) hidrofobne interakcije. Hidrofobne interakcije su značajan pokretač interakcija antitelo-antigen, i zasnivaju se na odbijanju vode od strane nepolarnih grupa, a ne na privlačnosti molekula (Tanford, (1978) Science.200:1012-8). Međutim, određene fizičke sile takođe doprinose vezivanju antigen-antitelo, na primer, slaganje ili komplementarnost oblika epitopa sa različitim mestima vezivanja antitela. Štaviše, druge supstance i antigeni mogu unakrsno da reaguju sa antitelom, te se tako takmiče za dostupno slobodno antitelo.

[0158] Merenje konstante afiniteta i specifičnosti vezivanja između antigena i antitela može da pomogne u određivanju delotvornosti profilaktičkih, terapeutskih, dijagnostičkih i istraživačkih metoda koristeći ovde opisane vezujuće molekule. „Afinitet vezivanja“ se uopšteno odnosi na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može uopšteno da se predstavi ravnotežnom konstantom disocijacije (Kd), koja se izračunava kao odnos koff/kon. Vidite, npr. Chen et al. (1999) J. Mol Biol.293:865-881. Antitela malog afiniteta obično polako vezuju antigen i lako se otpuštaju, dok antitela velikog afiniteta obično brže vezuju antigen i duže ostaju vezana. U struci su poznati različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja.

4

[0159] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jednu ili više aminokiselinskih izmena, na primer, jednu ili više supstitucija, delecija i/ili adicija, uvedenih u jedan ili više varijabilnih regiona antitela. U drugom otkriću, aminokiselinske izmene su uvedene u regione okvira. Jedna ili više izmena ostataka regiona okvira može dovesti do poboljšanja afiniteta vezivanja vezujućeg molekula za antigen. U jednom otkriću, može se izmeniti od oko jednog do oko pet ostataka okvira.

[0160] Jedan postupak za određivanje afiniteta vezivanja uključuje merenje konstante disocijacije „Kd“ pomoću testa vezivanja radiološki obeleženog antigena (RIA) koji se obavlja sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena, kako opisuju Chen et al. (1999) J. Mol Biol.293:865-881. Alternativno, vrednost Kd može da se izmeri koristeći test površinske plazmonske rezonance koristeći BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). Ako brzina asocijacije premašuje 10<6>M<-1>S<-1>po testu površinske plazmonske rezonance, brzina asocijacije onda može da se odredi koristeći tehniku fluorescentnog deaktiviranja koja meri porast ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije u prisustvu rastućih koncentracija antigena. „Brzina direktne reakcije“ ili „brzina asocijacije“ ili „kon“ takođe može da se odredi istom tehnikom površinske plazmonske rezonance koja je prethodno opisana.

[0161] Postupci i reagensi pogodni za određivanje vezujućih karakteristika vezujućeg molekula su poznati u struci i/ili su komercijalno dostupni (US patenti br.6,849,425;

6,632,926; 6,294,391; 6,143,574). Štaviše, oprema i softver dizajnirani za takve kinetičke analize su komercijalno dostupni (npr. instrumenti Biacore® A100 i Biacore® 2000; Biacore International AB, Uppsala, Švedska).

[0162] U jednom otkriću, vezujući molekuli, uključujući njihove antigen vezujuće fragmente ili varijante, mogu da se opišu ili preciziraju pomoću njihovog afiniteta vezivanja za virus gripa tip A, virusu gripa tip B ili njihovu kombinaciju. Antitela sa velikim afinitetom obično imaju Kd manji od 10<-7>M. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegovi antigen vezujući fragmenti vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B, njihove fragmente ili varijante, ili njihovu kombinaciju, sa konstantom disocijacije ili Kd koja je manja ili jednaka 5×10<-7>M, 10<-7>M, 5×10<-8>M, 10<-8>M, 5×10<-9>M, 10<-9>M, 5×10<-10>M, 10<-10>M, 5×10<-11>M, 10<-11>M, 5×10<-12>M, 10<-12>M, 5×10<-13>M, 10<-13>M, 5×10<-14>M, 10<-14>M, 5×10<-15>M ili 10<-15>M. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegovi antigen vezujući fragmenti vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B, njihove fragmente ili varijante, ili njihovu kombinaciju, sa konstantom disocijacije ili Kd koja je manja ili jednaka 5×10<-10>M, 10<-10>M, 5×10<-11>M, 10<-11>M, 5×10<-12>M ili 10<-12>M. Otkriće obuhvata vezujuće molekule ili njihove antigen vezujuće fragmente koji vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B ili njihovu kombinaciju, sa konstantom disocijacije ili Kd koja je u rasponu između bilo koje od navedenih pojedinačnih vrednosti.

[0163] U drugom otkriću, vezujući molekul ili njegovi antigen vezujući fragmenti vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B ili njihove fragmente ili varijante ili njihovu kombinaciju, brzinom disocijacije (koff) koja je manja ili jednaka 5×10<-2>s<-1>, 10<-2>s<-1>, 5×10<-3>s<-1>ili 10<-3>s<-1>, 5×10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5×10<-5>s<-1>, ili 10<-5>s<-1>, 5×10<-6>s<-1>, 10<-6>s<-1>, 5×10<-7>s<-1>ili 10<-7>s<-1>. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegovi antigen vezujući fragmenti vezuju polipeptide gripa tip A ili njegove fragmente ili varijante, brzinom disocijacije (koff) koja je manja ili jednaka 5×10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5×10<-5>s<-1>, ili 10<-5>s<-1>, 5×10<-6>s<-1>, 10<-6>s<-1>, 5×10<-7>s<-1>ili 10<-7>s<-1>. Otkriće takođe obuhvata vezujuće molekule ili njihove antigen vezujuće fragmente koji vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B ili njihovu kombinaciju, brzinom disocijacije (koff) koja je u rasponu između bilo koje od navedenih pojedinačnih vrednosti.

[0164] U drugom otkriću, vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B, njegove fragmente ili varijante, ili njihovu kombinaciju, brzinom asocijacije (kon) koja je veća ili jednaka 10<3>M<-1>s<-1>, 5×10<3>M<-1>s<-1>, 10<4>M<-1>s<-1>, 5×10<4>M<-1>s<-1>, 10<5>M<-1>s<-1>, 5×10<5>M<-1>s<-1>, 10<6>M<-1>s-1, 5×10<6>M<-1>s<-1>, 10<7>M<-1>s-1, ili 5×10<7>M<-1>s<-1>. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegovi antigen vezujući fragmenti vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B, njegove fragmente ili varijante, ili njihovu kombinaciju, brzinom asocijacije (kon) koja je veća ili jednaka 10<5>M<-1>s<-1>, 5×10<5>M<-1>s<-1>, 10<6>M<-1>s-1, 5×10<6>M<-1>s<-1>, 10<7>M<-1>s<-1>ili 5×10<7>M<-1>s<-1>. Otkriće obuhvata antitela koja vezuju virus gripa tip A, virus gripa tip B ili njihovu kombinaciju, brzinom asocijacije (kon) koja je u rasponu između bilo kojih pojedinačno navedenih vrednosti.

[0165] U jednom otkriću, test vezivanja može da se obavi kao test direktnog vezivanja ili test konkurentskog vezivanja. Vezivanje može da se detektuje koristeći standardni ELISA test ili standardne testove protočne citometrije. U testu direktnog vezivanja, kandidat za vezujući molekul ili antitelo se testira na vezivanje za svoj srodni antigen. Test konkurentskog vezivanja, sa druge strane, procenjuje sposobnost kandidata za vezujući molekul ili antitelo da se takmiči sa poznatim antitelom ili drugim jedinjenjem koje se vezuje za određeni antigen, na primer, HA virusa gripa tip A ili HA virusa gripa tip B. Uopšteno, svaki postupak koji omogućava vezivanje vezujućeg molekula sa HA virusa gripa tip A i/ili HA virusa gripa tip B koje može da se detektuje može da se koristi za detekciju i merenje vezujućih karakteristika ovde otkrivenih vezujućih molekula.

[0166] U jednom otkriću, vezujući molekul je sposoban da se imunospecifično vezuje za HA virusa gripa tip A i/ili HA virusa gripa tip B i sposoban je da neutrališe infekciju virusom gripa tip A i/ili virusom gripa tip B.

[0167] U jednom otkriću, najmanje jedan vezujući domen vezujućeg molekula je sposoban da se imunospecifično vezuje za HA virusa gripa tip A i sposoban je da neutrališe infekciju virusom gripa tip A. Hemaglutininski podtipovi virusa gripa tip A spadaju u dve velike filogenetske grupacije, označene kao grupa 1, koja sadrži podtipove H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 H17, i H18 i grupa 2, koja sadrži podtipove H3, H4, H7, H10, H14 i H15. U jednom otkriću, najmanje jedan vezujući domen vezujućeg molekula ili njegovog vezujućeg fragmenta je sposoban da se vezuje za jedan ili više podtipova virusa gripa tip A grupe 1 izabranih od H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, i H18 i njihovih varijanti i/ili da ih neutrališe. U drugom otkriću, najmanje jedan vezujući domen vezujućeg molekula ili njegovog vezujućeg fragmenta je sposoban da se vezuje za jedan ili više podtipova virusa gripa tip A grupe 2 izabranih od H3, H4, H7, H10, H14 i H15 i njihovih varijanti i/ili da ih neutrališe. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji su sposobni da se imunospecifično vežu za podtip H9 virusa gripa tip A grupe 1. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji su sposobni da se imunospecifično vezuju za podtip H9 virusa gripa tip A grupe 1 i da ga neutrališu.

[0168] U jednom otkriću, najmanje jedan vezujući domen vezujućeg molekula je sposoban da se imunospecifično veže za najmanje jedan virus gripa tip B loze Jamagata i najmanje jedan virus gripa tip B loze Viktorija i da ih neutrališe. U drugom otkriću, najmanje jedan vezujući domen vezujućeg molekula imunospecifično vezuje i neutrališe virus gripa tip B obe loze, Jamagata i Viktorija.

[0169] U jednom otkriću, najmanje jedan vezujući domen vezujućeg molekula ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta je sposoban da se imunospecifično veže za HA virusa gripa tip A i HA virusa gripa tip B i da neutrališe infekciju virusom gripa tip A i infekciju virusom gripa tip B. Testovi neutralizacije mogu da se obave koristeći postupke koji su poznati u struci. Termin „50% inhibitorne koncentracije“ (skraćeno kao predstavlja koncentraciju inhibitora (npr. ovde opisanog vezujućeg molekula) koja je potrebna za 50% neutralizacije virusa gripa tip A i/ili virusa gripa tip B. Osobi sa uobičajenim znanjem u struci biće jasno da niža vrednost IC50ukazuje na snažniji inhibitor.

[0170] U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment imaju IC50za neutralizaciju virusa gripa tip A i/ili virusa gripa tip B u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 5 µg/ml, ili u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 1 µg/ml antitela, ili manje od 5 µg/ml, manje od 2 µg/ml, manje od 1 µg/ml, manje od 0,5 µg/ml, manje od 0,1 µg/ml, manje od 0,05 µg/ml ili manje od 0,01 µg/ml u testu mikroneutralizacije.

[0171] U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment imaju prvi vezujući domen sa IC50za neutralizaciju virusa gripa tip A u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 5 µg/ml, ili u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 1 µg/ml antitela, ili manje od 5 µg/ml, manje od 2 µg/ml, manje od 1 µg/ml, manje od 0,5 µg/ml, manje od 0,1 µg/ml, manje od 0,05 µg/ml ili manje od 0,01 µg/ml u testu mikroneutralizacije. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment imaju drugi vezujući domen sa IC50za neutralizaciju virusa gripa tip B u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 50 µg/ml, ili u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 5 µg/ml antitela, ili u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 1 µg/ml antitela, ili manje od 10 µg/ml, manje od 5 µg/ml, manje od 1 µg/ml, manje od 0,5 µg/ml, manje od 0,1 µg/ml, manje od 0,05 µg/ml ili manje od 0,01 µg/ml u testu mikroneutralizacije.

[0172] U jednom otkriću, vezujući molekul ima vezujući domen ili njegov vezujući fragment sa IC50za neutralizaciju virusa gripa tip B u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 5 µg/ml, ili u rasponu od oko 0,001 µg/ml do oko 1 µg/ml antitela, ili manje od 5 µg/ml, manje od 2 µg/ml, manje od 1 µg/ml, manje od 0,5 µg/ml, manje od 0,1 µg/ml, manje od 0,05 µg/ml ili manje od 0,01 µg/ml u testu mikroneutralizacije; i IC50za neutralizaciju virusa gripa tip A u rasponu od oko 0,1 µg/ml do oko 5 µg/ml, ili u rasponu od oko 0,1 µg/ml do oko 2 µg/ml antitela, ili manje od 5 µg/ml, manje od 2 µg/ml, manje od 1 µg/ml, ili manje od 0,5 µg/ml za neutralizaciju gripa tip A u testu mikroneutralizacije.

[0173] U nekim otkrićima, ovde opisani vezujući molekuli mogu da indukuju ćelijsku smrt. Antitelo koje „indukuje ćelijsku smrt“ je ono koje čini da vijabilna ćelija postane nevijabilna. Ćelijska smrt in vitro može da se odredi u odsustvu komplementa i imunskih efektorskih ćelija kako bi se razlikovala ćelijska smrt indukovana putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) ili komplementno zavisne citotoksičnosti (CDC). Tako, test za ćelijsku smrt može da se obavi koristeći toplotno inaktivirani serum (tj. u odsustvu komplementa) i u odsustvu imunskih efektorskih ćelija. Kako bi se utvrdilo da li je antitelo sposobno da indukuje ćelijsku smrt, gubitak integriteta membrane procenjen pomoću preuzimanja propidijum jodida (PI), tripan plavog (vidite Moore et al. (1995) Cytotechnology 17:1-11), 7AAD ili druge metode dobro poznate u struci, može da se proceni u odnosu na netretirane ćelije.

[0174] U jednom otkriću, vezujući molekul može da indukuje ćelijsku smrt putem apoptoze. Vezujući molekul koji „indukuje apoptozu“ je onaj koje indukuje programiranu ćelijsku smrt kako je određeno vezivanjem aneksina V, fragmentacijom DNK, skupljanjem ćelije, širenjem endoplazmatičnog retikuluma, ćelijskom fragmentacijom i/ili stvaranjem membranskih vezikula (koje se nazivaju apoptotična tela). Različite metode su dostupne za procenu ćelijskih događaja povezanih sa apoptozom. Na primer, translokacija fosfatidil serina (PS) može da se meri vezivanjem aneksina; fragmentacija DNK može da se proceni fragmentacijom molekula DNK na gelu; i kondenzacija nukleusa/hromatina zajedno sa fragmentacijom DNK može da se proceni preko eventualnog porasta broja hipodiploidnih ćelija. U jednom otkriću, antitelo koje indukuje apoptozu je ono koje dovodi do oko 2 do 50 puta, u jednom otelotvorenju oko 5 do 50 puta, a u jednom otkriću oko 10 do 50 puta većeg indukovanja vezivanja aneksina u odnosu na netretiranu ćeliju u testu vezivanja aneksina.

[0175] U drugom otkriću, ovde opisani vezujući molekuli mogu da indukuju ćelijsku smrt putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i/ili komplementno zavisne ćelijski posredovane citotoksičnosti (CDC) i/ili ćelijski posredovane fagocitoze zavisne od antitela (ADCP). Ekspresija aktivnosti ADCC i aktivnosti CDC antitela potklase humanog IgG1 generalno uključuje vezivanje Fc regiona antitela za receptor za antitelo (nadalje se naziva „FcγR“) koji postoji na površini efektorskih ćelija kao što su ćelije ubice, ćelije prirodne ubice ili aktivirani makrofagi. Mogu da se vežu različite komponente komplementa. U pogledu vezivanja, ukazano je na to da je nekoliko aminokiselinskih ostataka u regionu šarke i drugom domenu C regiona antitela (nadalje se naziva „Cγ2 domen“) značajno (Greenwood et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23(5):1098-104; Morgan et al. (1995) Immunology. 86(2):319-324; Clark, M. (1997) Chemical Immunology. 65:88-110) i da je lanac šećera u Cγ2 domenu (Clark, M. (1997) Chemical Immunology. 65:88-110) takođe značajan.

[0176] Da bi se procenila aktivnost ADCC, može se koristiti in vitro test ADCC, kao što je opisano u US patentu br.5,500,362. Test se takođe može obaviti koristeći komercijalno dostupan komplet, npr. CytoTox 96 ® (Promega). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju, ali nisu ograničene na, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK) i NK ćelijske linije. NK ćelijske linije koje eksprimiraju transgeni Fc receptor (npr. CD16) i povezani signalni polipeptid (npr. FCεRI-γ) mogu takođe da služe kao efektorske ćelije (WO 2006/023148). U jednom otkriću, NK ćelijska linija uključuje CD16 i ima luciferazu pod promoterom NFAT i može da se koristi za merenje NK ćelijske aktivacije, pre nego ćelijske lize ili ćelijske smrti. Sličnu tehnologiju prodaje kompanija Promega, koja koristi Jurkatove ćelije umesto NK ćelija (Promega ADCC reporterski biotest br. G7010). Na primer, može da se testira sposobnost bilo kog konkretnog antitela da posreduje u lizi putem aktivacije komplementa i/ili ADCC. Željene ćelije se uzgajaju i obeležavaju in vitro; vezujući molekul se dodaje ćelijskoj kulturi u kombinaciji sa imunskim ćelijama koje mogu biti aktivirane putem kompleksa antigen antitelo; tj. efektorskim ćelijama koje učestvuju u odgovoru ADCC. Vezujući molekul takođe može da se testira na aktivaciju komplementa. U svakom slučaju, citoliza se detektuje putem otpuštanja oznake sa liziranih ćelija. Obim ćelijske lize može takođe da se odredi putem detekcije otpuštanja citoplazmatskih proteina (npr. LDH) u supernatant. Zapravo, antitela mogu da se ispitaju koristeći pacijentov sopstveni serum kao izvor komplementa i/ili imunskih ćelija. Vezujući molekuli koji mogu da posreduju u humanoj ADCC u in vitro testu mogu zatim da se koriste terapeutski za tog konkretnog pacijenta. Aktivnost ADCC vezujućeg molekula može takođe da se proceni in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je onaj otkriven u Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656. Štaviše, tehnike za modulaciju (tj. povećanje ili smanjenje) nivoa ADCC, i opciono aktivnosti CDC, antitela su dobro poznate u struci (npr. US patenti br. 5,624,821; 6,194,551; 7,317,091). Vezujući molekuli koji su ovde opisani mogu biti sposobni ili mogu biti modifikovani da imaju sposobnost da indukuju ADCC i/ili CDC.

Testovi za utvrđivanje funkcije ADCC mogu da se obavljaju koristeći ljudske efektorske ćelije za procenu ljudske funkcije ADCC. Takvi testovi mogu takođe da uključuju one koji su namenjeni za skrining antitela koja indukuju, posreduju, pojačavaju, blokiraju ćelijsku smrt putem nekrotskih i/ili apoptotskih mehanizama. Takve metode, uključujući testove koji koriste vijabilne boje, metode za detekciju i analiziranje kaspaza i testove koji mere oštećenje DNK, mogu da se koriste za procenu apoptotske aktivnosti ćelija uzgajanih in vitro sa željenim antitelom.

Polinukleotidi

[0177] Ovde su takođe obezbeđene nukleotidne sekvence koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama i kodiraju ovde opisane vezujuće molekule. U jednom otkriću, pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisani vezujući molekul ili njegove fragmente, uključujući, na primer, polinukleotidne sekvence koje kodiraju regione VH i VL uključujući CDR i FR, kao i ekspresione vektore za delotvornu ekspresiju u ćelijama (npr. ćelijama sisara). Postupci za proizvodnju vezujućih molekula koristeći nukleotide su poznati, i opisani su ukratko u nastavku.

[0178] Takođe su uključeni polinukleotidi koji se hibridizuju pod strogim ili manje strogim uslovima hibridizacije, npr. kako je ovde definisano, u polinukleotide koji kodiraju ovde opisani vezujući molekul ili njegove fragmente. Termin „strog“, kako se ovde koristi, odnosi se na eksperimentalne uslove (npr. temperatura i koncentracija soli) eksperimenta hibridizacije da se označi stepen homolognosti između probe i nukleinske kiseline vezane za filter; što je veći stepen strogosti, veći je procenat homolognosti između probe i nukleinske kiseline vezane za filter.

[0179] Strogi uslovi hibridizacije uključuju, ali nisu ograničeni na, hibridizaciju sa DNK vezanom za filter u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45°C, nakon čega sledi jedno ili više ispiranja u 0,2X SSC/0,1% SDS na oko 50-65°C, veoma stroge uslove kao što je hibridizacija sa DNK vezanom za filter u 6X SSC na oko 45°C nakon čega sledi jedno ili više ispiranja u 0,1 X SSC/0,2% SDS na oko 65°C, ili bilo koje druge stroge uslove hibridizacije poznate osobama sa znanjem u struci (vidite, na primer, Ausubel et al. izd. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, vol.1, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley and Sons, Inc., NY na stranama 6.3.1 do 6.3.6 i 2.10.3).

[0180] Suštinski identične sekvence mogu da uključuju polimorfne sekvence, tj. alternativne sekvence ili alele u populaciji. Alelna razlika može biti veličine samo jednog baznog para. Suštinski identične sekvence takođe mogu da uključuju mutagenizovane sekvence,

1

uključujući sekvence koje imaju tihe mutacije. Mutacija može da uključuje jednu ili više izmena ostataka, deleciju jednog ili više ostataka, ili inserciju jednog ili više dodatnih ostataka.

[0181] Polinukleotidi se mogu dobiti, a nukleotidna sekvenca polinukleotida utvrditi, putem bilo koje metode koja je poznata u struci. Na primer, ako je nukleotidna sekvenca vezujućeg molekula poznata, polinukleotid koji kodira vezujući molekul može da se sastavi od hemijski sintetisanih oligonukleotida (npr. kako je opisano u Kutmeier et al. (1994) BioTechniques.

17:242), što, ukratko, obuhvata sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koji kodiraju vezujući molekul, komplementarno vezivanje prajmera i ligaciju tih oligonukleotida, a zatim amplifikaciju ligiranog nukleotida putem PCR.

[0182] Polinukleotid koji kodira vezujući molekul može se takođe dobiti iz nukleinske kiseline iz pogodnog izvora. Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira konkretan vezujući molekul nije dostupan, ali je sekvenca vezujućeg molekula poznata, nukleinska kiselina koja kodira imunoglobulin može biti hemijski sintetisana ili dobijena iz pogodnog izvora (npr. biblioteke kDNK antitela ili biblioteke kDNK dobijene od, ili nukleinske kiseline, u jednom otelotvorenju, poli A RNK, izolovane iz, bilo kog tkiva ili ćelija koje eksprimiraju antitelo, kao što su ćelije hibridoma izabrane za ekspresiju antitela) putem PCR amplifikacije koristeći sintetičke prajmere koji mogu da se hibridizuju sa 3' i 5' krajevima sekvence ili putem kloniranja koristeći oligonukleotidnu sondu specifičnu za konkretnu sekvencu gena da se identifikuje, npr., klon kDNK iz biblioteke kDNK koji kodira antitelo. Amplifikovane nukleinske kiseline stvorene pomoću PCR zatim mogu da se kloniraju u replikabilne klonirajuće vektore koristeći bilo koju metodu koja je dobro poznata u struci.

[0183] Kada se utvrdi nukleotidna sekvenca i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca vezujućeg molekula, nukleotidna sekvenca vezujućeg molekula može da se obradi koristeći postupke dobro poznate u struci za obradu nukleotidnih sekvenci, npr., tehnike rekombinacije DNK, mutageneza usmerena na mesto, PCR, itd. (vidite, na primer, tehnike opisane u Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. izd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. i Ausubel et al. izd. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), radi stvaranja vezujućih molekula koji imaju različitu aminokiselinsku sekvencu, na primer, radi stvaranja aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercija.

2

Proizvodnja vezujućih molekula

[0184] Postupci rekombinacije DNK za proizvodnju i skrining polipeptida, kao što su ovde opisani vezujući molekuli, rutinski su i dobro su poznati u struci (npr. US patent br.

4,816,567). DNK koja kodira vezujuće molekule ili njihove fragmente, na primer, DNK koja kodira VH domen, VL domen, scFv ili njihove kombinacije, može da se umetne u odgovarajući ekspresioni vektor, koji se zatim transficira u odgovarajuću ćeliju domaćina, kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein antitela, kako bi se dobio vezujući molekul.

[0185] U jednom otkriću, ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira vezujući molekul, teški ili laki lanac vezujućeg molekula ili njegov vezujući domen, varijabilni domen teškog ili lakog lanca vezujućeg domena, ili CDR teškog ili lakog lanca, operativno povezan sa promoterom. Takvi vektori mogu da obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (vidite, npr. US. patente br.5,981,216; 5,591,639;

5,658,759 and 5,122,464) i varijabilni domen antitela može biti kloniran u takav vektor za ekspresiju celog teškog lanca, celog lakog lanca ili celih teških i lakih lanaca.

[0186] Ekspresioni vektor može da se prebaci u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama, i transficirane ćelije mogu da se uzgajaju konvencionalnim tehnikama kako bi se proizveo vezujući molekul. U jednom otkriću, obezbeđene su ćelije domaćini koje sadrže polinukleotid koji kodira vezujući molekul ili njegove fragmente, ili njegov teški ili laki lanac, ili njegov deo, ili jednolančano antitelo, operativno povezane za heterologni promoter.

[0187] Ćelijske linije sisara pogodne kao domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela su poznate u struci, i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), ćelije epitela ljudskog bubrega 293, i brojne druge ćelijske linije. Različite ćelije domaćini imaju karakteristike i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda.

Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se izabrati kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada antitela ili njegovog dela koji je eksprimiran. U tu svrhu, mogu da se koriste eukariotske ćelije domaćini koje poseduju ćelijski mehanizam za odgovarajuću obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda. Takve ćelije domaćini sisara uključuju, ali nisu ograničene na, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, NS0 (ćelijska linija mišjeg mijeloma koja ne proizvodi endogeno funkcionalne lance imunoglobulina), SP20, CRL7O3O i HsS78Bst ćelije. Humane ćelijske linije dobijene putem imortalizacije ljudskih limfocita mogu se koristiti da se rekombinantno proizvedu monoklonska antitela. Humana ćelijska linija PER.C6®. (Crucell, Netherlands) može da se koristi za rekombinantnu proizvodnju monoklonskih antitela.

[0188] Dodatne ćelijske linije koje mogu da se koriste kao domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije insekata (npr. Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) ili ćelije kvasca (npr. S. cerevisiae, Pichia, US7326681; itd.), ćelije biljaka (US20080066200); i ćelije kokoške (WO2008142124).

[0189] U jednom otkriću, vezujući molekul je stabilno eksprimiran u ćelijskoj liniji. Stabilna ekspresija može da se koristi za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa velikim prinosom. Kod stabilne ekspresije, ćelije domaćini mogu da se transformišu sa odgovarajuće konstruisanim vektorom koji sadrži elemente kontrole ekspresije (npr. promoter, pojačivač, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.) i selektabilni marker gen. Nakon uvođenja strane DNK, ćelije su ostavljene da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim prebačene u selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpornost na selekciju, i omogućava ćelijama koje su stabilno integrisale plazmid u svoje hromozome da rastu i grade fokuse koji se zauzvrat mogu klonirati i ekspandovati u ćelijske linije. Metode za proizvodnju stabilnih ćelijskih linija sa visokim prinosom su poznate u struci i reagensi su generalno komercijalno dostupni.

[0190] U drugim otkriću, vezujući molekuli su prolazno eksprimirani u ćelijskoj liniji.

Tranzijentna transfekcija je proces u kome se nukleinska kiselina uvedena u ćeliju ne integriše u genom niti hromozomsku DNK te ćelije, već se održava u vanhromozomskom elementu, npr. kao epizom, u ćeliji.

[0191] Ćelijska linija, stabilno ili tranzijentno transficirana, održava se u medijumu za ćelijsku kulturu i uslovima koji su poznati u struci, što dovodi do ekspresije i proizvodnje vezujućeg molekula. U određenim otkrićima, medijumi za ćelijsku kulturu sisara zasnivaju se

4

na komercijalno dostupnim formulacijama medijuma, uključujući, na primer, DMEM ili Hamov F12. U drugim otkrićima, medijumi za ćelijsku kulturu su modifikovani da podržavaju povećanje ćelijskog rasta i biološku ekspresiju proteina. Kako se ovde koriste, termini „medijum za ćelijsku kulturu“, „medijum za kulturu“ i „formulacija

medijuma“ odnose se na hranljivi rastvor za održavanje, rast, propagaciju ili ekspanziju ćelija u veštačkom in vitro okruženju van višećelijskog organizma ili tkiva. Medijum za ćelijsku kulturu može da se optimizuje za specifičnu upotrebu ćelijske kulture, uključujući, na primer, medijum ćelijske kulture za rast koji je formulisan da promoviše ćelijski rast ili medijum ćelijske kulture za proizvodnju koji je formulisan da promoviše proizvodnju rekombinantnog proteina. Termini nutrijent, sastojak i komponenta ovde se koriste naizmenično da označe konstituente koji sačinjavaju medijum za ćelijsku kulturu.

[0192] U jednom otkriću, ćelijske linije se održavaju koristeći postupak sa dolivanjem. Kako se ovde koristi, „postupak sa dolivanjem“, odnosi se na postupak kojim se ćelijska kultura snabdeva dodatnim nutrijentima nakon što se prvobitno inkubira sa osnovnim medijumom. Na primer, postupak sa dolivanjem može da uključuje dodavanje medijuma za suplementaciju u skladu sa utvrđenim rasporedom dolivanja u datom vremenskom periodu. Tako, „ćelijska kultura sa dolivanjem“ odnosi se na ćelijsku kulturu naznačenu time što su ćelije, tipično ćelije sisara, i medijum za kulturu inicijalno ubacuju u posudu za kulturu i dolivaju se dodatni nutrijenti za kulturu, neprekidno ili u odvojenim koracima, u kulturu tokom uzgajanja, sa periodičnim sakupljanjem ćelija i/ili proizvoda pre kraja uzgajanja ili bez toga.

[0193] Medijum za ćelijsku kulturu i nutrijenti sadržani u njemu su poznati osobi sa znanjem u struci. U jednom otkriću, medijum za ćelijsku kulturu sadrži osnovni medijum i najmanje jedan hidrolizat, npr. hidrolizat na bazi soje, hidrolizat na bazi kvasca ili kombinaciju dve vrste hidrolizata, što dovodi do modifikovanog osnovnog medijuma. U drugom otkriću, dodatni nutrijenti mogu da uključuju samo osnovni medijum, kao što je koncentrovani osnovni medijum, ili mogu da uključuju samo hidrolizate ili koncentrovane hidrolizate.

Pogodni osnovni medijumi uključuju, ali nisu ograničeni na, Dulbekov modifikovani Iglov medijum (DMEM), DME/F12, minimalni esencijalni medijum (MEM), Iglov bazni medijum (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α-minimalni esencijalni medijum (a-MEM), Glazgovljev minimalni esencijalni medijum (G-MEM), PF CHO (vidite, npr. CHO medijum bez proteina (Sigma) ili EX-CELL™ 325 PF CHO medijum bez seruma za CHO ćelije bez proteina (SAFC Bioscience), i Iskovljev modifikovani Dulbekov medijum. Drugi primeri osnovnih medijuma koji mogu da se koriste u pronalasku uključuju BME bazalni medijum (Gibco-Invitrogen; vidite takođe Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med.89, 36); Dulbekov modifikovani Iglov medijum (DMEM, prah) (Gibco-Invitrogen (br.31600); vidite takođe Dulbecco i Freeman (1959) Virology.8:396; Smith et al. (1960) Virology.12:185. Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6:2, 93); CMRL 1066 medijum (Gibco-Invitrogen (br.

11530); vidite takođe Parker et al..(1957) Special Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5:303).

[0194] Osnovni medijum može biti bez seruma, što znači da medijum ne sadrži serum (npr. fetalni goveđi serum (FBS), konjski serum, kozji serum, ili bilo koji drugi serum dobijen od životinje koji je poznat osobi sa znanjem u struci) ili je medijum bez životinjskog proteina ili hemijski definisan medijum.

[0195] Osnovni medijum može biti modifikovan kako bi se uklonile određene nehranljive komponente koje se mogu naći u standardnom osnovnom medijumu, poput različitih neorganskih i organskih pufera, surfaktanata i natrijum hlorida. Uklanjanje takvih komponenti iz osnovnog ćelijskog medijuma omogućava povećane koncentracije preostalih nutricionih komponenti, i može poboljšati ukupan ćelijski rast i ekspresiju proteina. Pored toga, izbačene komponente mogu se dodati nazad u medijum za ćelijsku kulturu koji sadrži modifikovani osnovni ćelijski medijum u skladu sa zahtevima za uslove ćelijskog uzgajanja. U određenim otkrićima, medijum za ćelijsku kulturu sadrži modifikovan osnovni ćelijski medijum i najmanje jedan od sledećih nutrijenata, izvor gvožđa, rekombinantni faktor rasta; pufer; surfaktant; regulator osmolarnosti; izvor energije; i neživotinjske hidrolizate. Pored toga, modifikovani osnovni ćelijski medijum može opciono da sadrži aminokiseline, vitamine ili kombinaciju aminokiselina i vitamina. U drugom otkriću, modifikovani osnovni medijum dalje sadrži glutamin, npr. L-glutamin i/ili metotreksat.

Prečišćavanje i izolovanje

[0196] Nakon što je vezujući molekul proizveden, on može da se prečisti bilo kojim postupkom koji je u struci poznat za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer, hromatografijom (vidite, jonoizmenjivačku, afinitetnu, naročito pomoću afiniteta prema specifičnim antigenima proteinu A ili proteinu G, hromatografija na molekulskim sitima), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Nadalje, antitela iz predmetnog pronalaska ili njihovi fragmenti mogu se fuzionisati sa heterolognim sekvencama polipeptida (ovde se nazivaju „oznake“) kako bi se olakšalo prečišćavanje.

[0197] U jednom otkriću, obezbeđen je suštinski prečišćen/izolovan vezujući molekul. U drugom otkriću, ti izolovani/prečišćeni rekombinantno eksprimirani vezujući molekuli se mogu primenjivati na pacijentu kako bi se izazvalo profilaktičko ili terapeutsko dejstvo. Profilaksa je lek ili lečenje dizajnirano i korišćeno za prevenciju pojave bolesti, poremećaja ili infekcije. Terapeutsko sredstvo se specifično bavi lečenjem konkretne bolesti, poremećaja ili infekcije. Terapeutska doza je količina potrebna za lečenje konkretne bolesti, poremećaja ili infekcije. U drugom otkriću, ta izolovana/prečišćena antitela mogu da se koriste za dijagnostikovanje infekcije virusom gripa, na primer, infekcije virusom gripa tip A, infekcije virusom gripa tip B, ili njihovom kombinacijom.

Glikozilacija

[0198] Osim sposobnosti glikozilacije da izmeni efektorsku funkciju antitela, modifikovana glikozilacija u varijabilnom regionu može da izmeni afinitet antitela prema antigenu. U jednom otkriću, modifikovan je obrazac glikozilacije u varijabilnom regionu predmetnih antitela. Na primer, može da se napravi aglikozilovano antitelo (tj. antitelo bez glikozilacije). Glikozilacija može da se izmeni da, na primer, poveća afinitet antitela prema antigenu. Takve ugljovodonične modifikacije mogu da se postignu putem, na primer, izmene jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, može da se napravi jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje dovode do eliminacije jednog ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona okvira kako bi se tim putem eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može da poveća afinitet antitela prema antigenu. Takav pristup je detaljnije opisan u US patentima br.5,714,350 i 6,350,861. Može takođe da se napravi jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje dovode do eliminacije mesta glikozilacije prisutnog u Fc regionu (npr. asparagin 297 u IgG). Nadalje, aglikozilovana antitela mogu da se proizvedu u bakterijskim ćelijama kojima nedostaje neophodni mehanizam za glikozilaciju.

Varijante i konjugati

[0199] U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jedan ili više vezujućih domena koji uključuju jednu ili više supstitucija, adicija i/ili delecija aminokiselinskih ostataka i/ili polipeptida u varijabilnom lakom domenu (VL) i/ili varijabilnom teškom domenu (VH) i/ili Fc regionu, i posttranslacione modifikacije. U jednom otkriću, vezujući molekul uključuje jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu biti načinjene na osnovu sličnosti u polarnosti, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatičnoj prirodi uključenih ostataka. Na primer, nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin; polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju arginin, lizin i histidin; a negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Pored toga, glicin i prolin su ostaci koji mogu da utiču na orijentaciju lanca. Nekonzervativne supstitucije će obuhvatati zamenu člana jedne od ovih klasa članom druge klase. Nadalje, ako je poželjno, neklasične aminokiseline ili hemijski analozi aminokiselina mogu da se uvode kao supstitucije ili adicije u sekvencu antitela. Neklasične aminokiseline uključuju, ali nisu ograničene na, D-izomere uobičajenih aminokiselina, α-amino izobuternu kiselinu, 4-aminobuternu kiselinu, Abu, 2-amino buternu kiselinu, γ-Abu, ε-Ahx, 6-amino heksansku kiselinu, Aib, 2-amino izobuternu kiselinu, 3-amino propionsku kiselinu, ornitin, norleucin, norvalin, hidroksiprolin, sarkozin, citrulin, cisteinsku kiselinu, t-butilglicin, t-butilalanin, fenilglicin, cikloheksilalanin, β-alanin, fluor-aminokiseline, konstruisane aminokiseline poput β-metil aminokiselina, Cα-metil aminokiselina, Nα-metil aminokiselina, i analoge aminokiselina uopšteno.

[0200] U jednom otkriću, jedan ili više cisteinskih ostataka može biti supstituisan, generalno serinom, kako bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo aberantno umrežavanje. Nasuprot tome, cisteinske veze se mogu dodati antitelu da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito kada je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0201] U jednom otkriću, jedna ili više mutacija može da se uvede u jedan ili više regiona okvira molekula antitela. U drugom otkriću, jedna ili više mutacija može da se uvede u jedan ili više regiona CDR molekula antitela.

[0202] U jednom otkriću, vezujući molekul je konjugovan ili kovalentno vezan za heterolognu aminokiselinsku sekvencu ili drugi ostatak ili supstancu koristeći postupke koji su poznati u struci. U jednom otkriću, vezana supstanca je terapeutski agens, oznaka koja može da se detektuje (ovde se naziva i reporterski molekul) ili čvrsta podloga. Pogodne supstance za vezivanje za antitela uključuju, ali nisu ograničene na, aminokiselinu, peptid, protein, polisaharid, nukleozid, nukleotid, oligonukleotid, nukleinsku kiselinu, hapten, lek, hormon, lipid, sklop lipida, sintetički polimer, polimernu mikročesticu, biološku ćeliju, virus, fluorofor, hromofor, boju, toksin, enzim, antitelo, fragment antitela, radioizotop, čvrste matrice, polučvrste matrice, i njihove kombinacije. Poznati su postupci za konjugaciju ili kovalentno vezivanje druge supstance za antitelo.

[0203] U jednom otkriću, vezujući molekul je konjugovan sa čvrstom podlogom. Vezujući molekuli mogu biti konjugovani sa čvrstom podlogom kao deo procesa skrininga i/ili prečišćavanja i/ili proizvodnje. Alternativno, vezujući molekuli mogu biti konjugovani sa čvrstom podlogom kao deo dijagnostičkog postupka ili kompozicije. Čvrsta podloga je obično suštinski nerastvorna u tečnoj fazi. Veliki broj podloga je dostupan i poznat osobi sa uobičajenim znanjem u struci.

[0204] U jednom otkriću, vezujući molekul je konjugovan sa oznakom radi dijagnostikovanja i drugih testova, pri čemu se mogu detektovati vezujući molekuli i/ili njihov povezani ligand. Oznaka uključuje bilo koji hemijski ostatak, organski ili neorganski, koji ispoljava maksimum apsorpcije na talasnoj dužini većoj od 280 nm, i zadržava svoja spektralna svojstva kada se kovalentno veže za vezujući molekul. Oznake uključuju, bez ograničenja, hromofor, fluorofor, fluorescentni protein, fosforescentnu boju, tandemsku boju, česticu, hapten, enzim i radioizotop.

[0205] U određenim otkrićima, oznaka je enzim. Enzimi mogu biti poželjne oznake, pošto se može ostvariti amplifikacija signala koji može da se detektuje, što dovodi do veće osetljivosti testa. Sam enzim ne proizvodi odgovor koji može da se detektuje, već deluje tako što razgrađuje supstrat kada dođe u kontakt sa odgovarajućim supstratom, tako da konvertovani supstrat proizvodi fluorescentni, kolorimetrijski ili luminescentni signal. Enzimi pojačavaju signal koji može da se detektuje, pošto jedan enzim na reagensu za obeležavanje može dovesti do konverzije više supstrata u signal koji može da se detektuje. Enzimski supstrat je izabran tako da daje željeni merljivi proizvod, npr. kolorimetrijski, fluorescentni ili hemiluminescentni. Takvi supstrati se obimno koriste u struci i dobro su poznati osobi sa znanjem u struci.

[0206] U drugom otkriću, oznaka je hapten, kao što je biotin. Biotin je koristan jer može da deluje u sistemu enzima kako bi se dalje pojačao signal koji može da se detektuje, i može da deluje kao oznaka koja se koristi u afinitetnoj hromatografiji za izolovanje. Za detekciju se koristi enzimski konjugat koji ima afinitet prema biotinu, kao što je avidin-HRP. Nakon toga, dodaje se supstrat peroksidaze kako bi se dobio signal koji može da se detektuje. Hapteni takođe uključuju hormone, prirodne i sintetičke lekove, zagađivače, alergene, afektorske molekule, faktore rasta, hemokine, citokine, limfokine, aminokiseline, peptide, hemijske intermedijere, nukleotide, i slično.

[0207] U određenim otelotvorenjima, fluorescentni proteini mogu da se koriste kao oznaka. Primeri fluorescentnih proteina uključuju zeleni fluorescentni protein (GFP) i fikobiliproteine i njihove derivate.

[0208] U određenim otkrićima, oznaka je radioaktivni izotop. Primeri pogodnih radioaktivnih supstanci uključuju, ali nisu ograničeni na, jod (<121>I,<123>I,<125>I,<131>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<111>In,<112>In,<113m>In,<115m>In), tehnecijum (<99>Tc,<99m>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<135>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh i<97>Ru.

Medicinsko lečenje i primene

[0209] Ovde opisani vezujući molekuli i njihovi antigen vezujući fragmenti mogu biti za upotrebu u lečenju infekcije virusom gripa tip A i/ili infekcije virusom gripa tip B, za upotrebu u prevenciji infekcije virusom gripa tip A i/ili virusom gripa tip B; za detekciju, dijagnostikovanje i/ili prognoziranje infekcije virusom gripa tip A i/ili infekcije virusom gripa tip B; ili za kombinaciju prethodnog.

[0210] Postupci za dijagnozu mogu da uključuju dovođenje u kontakt vezujućeg molekula ili njegovog fragmenta sa uzorkom. Takvi uzorci mogu biti tkiva uzeta, na primer, iz nosne duplje, sinusnih šupljina, pljuvačnih žlezda, pluća, jetre, pankreasa, bubrega, uha, oka, posteljice, probavnog trakta, srca, jajnika, hipofize, nadbubrežnih žlezda, štitaste žlezde, mozga ili kože. Metode za detekciju, dijagnozu i/ili prognoziranje mogu takođe da uključuju detekciju kompleksa antigen/antitelo.

[0211] U jednom otkriću, obezbeđen je izolovani vezujući molekul iz zahteva ili farmaceutska kompozicija koja ga sadrži za upotrebu u postupku lečenja ispitanika.

[0212] U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment su suštinski prečišćeni (tj. suštinski bez supstanci koje ograničavaju njegovo dejstvo ili proizvode neželjena dejstva). U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuju nakon izlaganja, ili pošto je ispitanik izložen virusu gripa tip A i/ili virusu gripa tip B, ili je inficiran virusom gripa tip A i/ili virusom gripa tip B. U drugom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuju pre izlaganja, ili na ispitaniku koji još nije izložen virusu gripa tip A i/ili virusu gripa tip B, ili još nije inficiran virusom gripa tip A i/ili virusom gripa tip B.

[0213] U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuju na ispitaniku koji je seronegativan na jedan ili više podtipova virusa gripa tip A i/ili sojeva virusa gripa tip B. U drugom otkriću, vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment se primenjuju na ispitaniku koji je seropozitivan na jedan ili više podtipova virusa gripa tip A i/ili sojeva virusa gripa tip B. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuju na ispitaniku u roku od 1, 2, 3, 4, 5 dana od infekcije ili pojave simptoma. U drugom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuju na ispitaniku nakon 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, i u roku od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 dana nakon infekcije ili pojave simptoma.

[0214] U jednom otkriću, postupak smanjuje infekciju virusom gripa tip A i/ili virusom gripa tip B kod ispitanika. U drugom otkriću, postupak sprečava, smanjuje rizik ili odlaže virusnu infekciju gripom tip A i/ili gripom tip B kod ispitanika. U jednom otkriću, ispitanik je životinja. U jednom otkriću, ispitanik je član podroda hordata, uključujući, na primer, ljude i druge primate, uključujući nehumane primate, kao što su šimpanze i drugi čovekoliki majmuni i vrste majmuna. U drugom otkriću, ispitanik je poljoprivredna životinja, kao što su stoka, ovce, svinje, koze i konji; domaća životinja, kao što su psi i mačke; laboratorijska životinja, uključujući glodare, kao što su miševi, pacovi i zamorci; ptica, uključujući domaće, divlje i ptice koje se love, kao što su kokoške, ćurke i druge kokoši, patke, guske. U jednom otkriću, ispitanik uključuje, ali nije ograničen na, osobu koja je naročito izložena riziku ili je podložna virusnoj infekciji gripom tip A i/ili gripom tip B, uključujući, na primer, imunokompromitovanog ispitanika.

1

[0215] Lečenje može biti po rasporedu sa jednom dozom ili rasporedu sa više doza, i vezujući molekul ili njegov vezujući fragment mogu da se koriste u pasivnoj imunizaciji ili aktivnoj vakcinaciji.

[0216] U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuje na ispitaniku u kombinaciji sa jednim ili više antivirusnih lekova. U jednom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment se primenjuju na ispitaniku u kombinaciji sa jednim ili više antivirusnih lekova malog molekula, uključujući, bez ograničenja, inhibitore neuraminidaze, kao što su oseltamivir (TAMIFLU®), zanamivir (RELENZA®), i adamantane kao što su amantadin i rimantadin.

U drugom otkriću, obezbeđena je kompozicija koja sadrži izolovani vezujući molekul iz zahteva za upotrebu kao lek za prevenciju ili lečenje virusne infekcije gripom tip A i/ili gripom tip B. U drugom otkriću, vezujući molekul ili njegov vezujući fragment i/ili protein koji ima epitop za koji se vezuje vezujući molekul ili njegov antigen vezujući fragment, koristi se u proizvodnji leka za lečenje ispitanika i/ili dijagnozu kod ispitanika.

[0217] Vezujući molekuli i njihovi fragmenti, kako su ovde opisani, mogu takođe da se koriste u kompletu za dijagnozu virusne infekcije gripom tip A, virusne infekcije gripom tip B; ili kombinaciju prethodnog. Vezujući molekuli, fragment antitela ili njihove varijante i derivati, kako su ovde opisani, mogu takođe da se koriste u kompletu za praćenje imunogenosti vakcine.

[0218] U jednom otkriću, obezbeđen je postupak za pripremu farmaceutske kompozicije, koji obuhvata korak mešanja ovde opisanog vezujućeg molekula sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0219] Različiti sistemi za isporuku su poznati i mogu se koristiti za primenu ovde opisanog vezujućeg molekula ili njegovog vezujućeg fragmenta, uključujući, ali se ne ograničavajući na, inkapsulaciju u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju vezujući molekul ili fragment, endocitozu posredovanu receptorom, elektroporaciju, konstruisanje nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Postupci za uvođenje uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, intramuskularne,

2

intraperitonealne, intravenske, supkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve primene. U jednom otkriću, vezujući molekul može da se primeni kao plazmid sa DNK ili RNK koja kodira vezujući molekul, na primer, elektroporacijom. Kompozicije mogu da se primenjuju zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima, uključujući, bez ograničenja, mikromolekulske antivirusne kompozicije. Primena može biti sistemska ili lokalna. Može se koristiti i plućna primena, npr. koristeći inhalator ili raspršivač i formulaciju sa aerosolnim agensom. U još jednom otkriću, kompozicija se može isporučiti u sistemu sa kontrolisanim otpuštanjem.

[0220] Ovde su takođe obezbeđene farmaceutske kompozicije koje uključuju terapeutski delotvornu količinu vezujućeg molekula iz zahteva, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Termin „farmaceutski prihvatljiv“, kako se ovde koristi, znači odobren od strane regulatorne agencije federalne ili državne uprave ili naveden u Farmakopeji Sjedinjenih Američkih Država ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a konkretnije kod ljudi. Termin „nosač“ odnosi se na razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili sredstvo za dostavljanje sa kojim se terapeutsko sredstvo primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ulja iz nafte, kao i ulja životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su kikirikijevo ulje, sojino ulje, susamovo ulje, i slično. Voda je poželjni nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvor dekstroze i rastvori glicerola takođe mogu da se koriste kao tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Pogodni farmaceutski ekscipijensi uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol, i slično. Kompozicija, po želji, takođe može da sadrži male količine agenasa za kvašenje ili emulgovanje ili pH puferujućih agenasa. Ove kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim otpuštanjem, i slično. Kompozicija može da se formuliše kao supozitorija, sa tradicionalnim vezivima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može da uključuje standardne nosače, kao što je manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd., farmaceutske čistoće. U jednom otkriću, farmaceutska kompozicija sadrži terapeutski delotvornu količinu antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa odgovarajućom količinom nosača kako bi se dobio oblik za odgovarajuću primenu na pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu primene. Obično, doza koja se primenjuje na pacijentu za terapeutska antitela je od oko 0,1 mg/kg do 100 mg/kg pacijentove telesne težine.

Kompleti

[0221] U jednom otkriću, obezbeđeni su proizvodi koji uključuju najmanje vezujući molekul kao što je ovde opisan, kao što su sterilni dozni oblici i kompleti. Mogu biti obezbeđeni kompleti koji sadrže vezujuće molekule za detekciju i kvantifikaciju virusa gripa in vitro, npr. u ELISA ili vestern blot testu. Vezujući molekuli korisni za detekciju mogu da se obezbede sa oznakom, kao što je fluorescentna ili radioaktivna oznaka.

Primeri otkrića

[0222]

1. Ovde je opisan izolovani vezujući molekul koji se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koji sadrži:

(a) prvi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje 1 podtip grupe 2 virusa gripa tip A; i

(b) drugi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i neutrališe virus gripa tip B u najmanje dve filogenetski različite loze.

2. Izolovani vezujući molekul prema otkriću 1, pri čemu je prvi vezujući domen sposoban da neutrališe jedan ili više podtipova grupe 1 virusa gripa tip A izabranih od: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 i njihove varijante, i jedan ili više podtipova grupe 2 virusa gripa tip A izabranih od: H3, H4, H7, H10, H14 i H15 i njihove varijante.

3. Izolovani vezujući molekul prema otkriću 1, pri čemu je drugi vezujući domen sposoban da neutrališe virus gripa tip B u lozama Jamagata i Viktorija.

4. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži virusno antitelo na grip tip A ili njegov antigen vezujući fragment.

4

ezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži virusno antitelo na grip tip B ili njegov antigen vezujući fragment.

ezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića koji sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela.

ezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela.

ezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži najmanje jedan VH teškog lanca antitela i najmanje jedan VL lakog lanca antitela.

olovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu skup od šest CDR-a ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od:

(a) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.: 8, HCDR2 SEQ ID NO.: 9, HCDR3 SEQ ID NO.: 10, LCDR1 SEQ ID NO.: 3, LCDR2 SEQ ID NO.: 4 i LCDR3 SEQ ID NO.: 5;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.: 18, HCDR2 SEQ ID NO.: 19, HCDR3 SEQ ID NO.: 20, LCDR1 SEQ ID NO.: 13, LCDR2 SEQ ID NO.: 14, LCDR3 SEQ ID NO.: 15; i

(d) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 18, HCDR2 SEQ ID NO.:

19, HCDR3 SEQ ID NO.: 20, LCDR1 SEQ ID NO.: 13, LCDR2 SEQ ID NO.: 14, LCDR3 SEQ ID NO.: 15.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VH izabranoj od:

(a) VH SEQ ID NO.: 7; i

(b) VH SEQ ID NO.: 17.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VL koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VL izabranoj od:

(a) VL SEQ ID NO.: 2; i

(b) VL SEQ ID NO.: 12.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH i VL koji je najmanje 75% identičan aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, izabranoj od:

(a) VH SEQ ID NO.: 7 i VL SEQ ID NO.: 2; i

(b) VH SEQ ID NO.: 17 i VL SEQ ID NO.: 12.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH i VL izabrane od:

(a) VH SEQ ID NO.: 7 i VL SEQ ID NO.: 2; i

(b) VH SEQ ID NO.: 17 i VL SEQ ID NO.: 12.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži skup od šest CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, pri čemu skup od šest CDR-a ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od:

(a) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30, LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(b) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.:

29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30, LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci: HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46, LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(d) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.:

45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46, LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(e) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62, LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57; i

(f) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.:

61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62, LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži VH koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VH izabranoj od:

(a) VH SEQ ID NO.: 27;

(b) VH SEQ ID NO.: 33;

(c) VH SEQ ID NO.: 36;

(d) VH SEQ ID NO.: 43;

(e) VH SEQ ID NO.: 49;

(f) VH SEQ ID NO.: 52;

(g) VH SEQ ID NO.: 59; i

(h) VH SEQ ID NO.: 65.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži VL koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VL izabranoj od:

(a) VL SEQ ID NO.: 22;

(b) VL SEQ ID NO.: 32;

(c) VL SEQ ID NO.: 35;

(d) VL SEQ ID NO.: 38;

(e) VL SEQ ID NO.: 48;

(f) VL SEQ ID NO.: 51;

(g) VL SEQ ID NO.: 54; i

(h) VL SEQ ID NO.: 64.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži VH i VL koji je najmanje 75% identičan aminokiselinskoj sekvenci VH, odnosno VL, izabranoj od:

(a) VH SEQ ID NO.: 27 i VL SEQ ID NO.: 22;

(b) VH SEQ ID NO.: 33 i VL SEQ ID NO.: 32;

(c) VH SEQ ID NO.: 36 i VL SEQ ID NO.: 35;

(d) VH SEQ ID NO.: 43 i VL SEQ ID NO.: 38;

(e) VH SEQ ID NO.: 49 i VL SEQ ID NO.: 48;

(f) VH SEQ ID NO.: 52 i VL SEQ ID NO.: 51;

(g) VH SEQ ID NO.: 59 i VL SEQ ID NO.: 54; i

(h) VH SEQ ID NO.: 65 i VL SEQ ID NO.: 64.

Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži VH i VL izabrane od:

(a) VH SEQ ID NO.: 27 i VL SEQ ID NO.: 22;

(b) VH SEQ ID NO.: 33 i VL SEQ ID NO.: 32;

(c) VH SEQ ID NO.: 36 i VL SEQ ID NO.: 35;

(d) VH SEQ ID NO.: 43 i VL SEQ ID NO.: 38;

(e) VH SEQ ID NO.: 49 i VL SEQ ID NO.: 48;

(f) VH SEQ ID NO.: 52 i VL SEQ ID NO.: 51;

(g) VH SEQ ID NO.: 59 i VL SEQ ID NO.: 54; i

(h) VH SEQ ID NO.: 65 i VL SEQ ID NO.: 64.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, koji sadrži bispecifično antitelo.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu jedan ili više vezujućih domena sadrži domen varijabilnog fragmenta (Fv).

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu jedan ili više vezujućih domena sadrži molekul scFv.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu jedan ili više vezujućih domena sadrži domen Fv, i jedan ili više vezujućih domena sadrži molekul scFv.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži Fv domen antitela na grip virusa tip A.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, koji sadrži dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića koji sadrži domen Fv koji sadrži varijabilni domen teškog lanca antitela i varijabilni domen lakog lanca antitela, pri čemu Fv specifično vezuje anti-influenca A virus.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu drugi vezujući domen sadrži scFv molekul anti-influenca B virusa.

Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih otkrića, pri čemu prvi vezujući domen sadrži Fv domen anti-influenca A virusa, a drugi vezujući domen sadrži molekul scFv anti-influenca B virusa.

Vezujući molekul prema otkriću 27, pri čemu Fv domen prvog vezujućeg domena sadrži teški lanac (HC) koji sadrži polipeptidni lanac sa amino terminusom i karboksi terminusom i laki lanac (LC) koji sadrži lanac polipeptida sa amino terminusom i karboksi terminusom, i

Vezujući molekul prema otkriću 28, pri čemu vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment koje sadrži laki lanac antitela sa formulom scFv-L1-VL-CL, pri čemu, scFv je molekul scFv, L1 je linker, VL je varijabilni domen lakog lanca, CL je konstantni domen lakog lanca, i VL je varijabilni domen lakog lanca.

Vezujući molekul prema otkriću 28, pri čemu teški lanac sadrži formulu scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, scFv je molekul scFv, L1 je linker, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen-1 konstantnog domena teškog lanca, CH2 je domen-2 konstantnog domena teškog lanca, i CH3 je domen-3 konstantnog domena teškog lanca.

Vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 28-30 koji sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VH domena izabranoj od SEQ ID NO: 7 odnosno SEQ ID NO: 17.

Vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 28-31 koji sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci VL domena izabranoj od SEQ ID NO: 2 odnosno SEQ ID NO: 12.

Vezujući molekul prema otkriću 28, pri čemu vezujući molekul sadrži prvi i drugi teški lanac sa prvim, odnosno drugim C-terminalnim domenom, pri čemu je jedan ili više molekula scFv kovalentno vezano za C-terminalni domen prvog teškog lanca, drugog teškog lanca, ili njihove kombinacije.

Vezujući molekul prema otkriću 28, pri čemu jedan ili više teških lanaca sadrži formulu VH-CH1-CH2-CH3, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, CH1 je domen-1 konstantnog domena teškog lanca, CH2 je domen-2 konstantnog domena teškog lanca, i CH3 je domen-3 konstantnog domena teškog lanca.

Vezujući molekul prema otkriću 34, pri čemu jedan ili više teških lanaca sadrži formulu VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linker, a scFv je molekul scFv.

Vezujući molekul prema otkriću 34, pri čemu jedan ili više teških lanaca sadrži formulu VH-CH1-CH2-L1-scFV-L2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linker, a scFv je molekul scFv.

Vezujući molekul prema otkriću 34, pri čemu jedan ili više teških lanaca sadrži formulu VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFV-L2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linker, a scFv je molekul scFv.

Vezujući molekul prema otkrićima 35, 36 ili 37, pri čemu L1 i L2 nezavisno sadrže (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4, ili 5, ili kombinaciju (a) i (b).

Vezujući molekul prema otkrićima 21-38, pri čemu scFv sadrži formulu: VH-LS-VL, i, pri čemu, VH je varijabilni domen teškog lanca, LS je linker, a VL je varijabilni domen lakog lanca.

Vezujući molekul prema otkriću 39, pri čemu LS sadrži (a) [GGGGS]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, (b) [GGGG]n, pri čemu, n je 0, 1, 2, 3, 4, ili 5, ili kombinaciju (a) i (b).

1

Vezujući molekul prema otkriću 28, pri čemu su teški lanac i laki lanac drugog vezujućeg domena povezani sa jednom ili više disulfidnih veza.

Vezujući molekul prema otkriću 41, pri čemu scFv drugog vezujućeg domena sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL), i VH iz scFv uključuje cisteinski ostatak na poziciji izabranoj od pozicije 43, 44, 100, 101, 105, i njihovih kombinacija, i VL iz scFv uključuje cisteinski ostatak na poziciji izabranoj od pozicije 43, 44, 46, 49, 50, 100, i njihovih kombinacija.

Vezujući molekul prema otkriću 42, pri čemu su VL i VH scFv vezani disulfidnom vezom izabranom od: VL100-VH44, VL43-VH105, VL46-VH101, VL49-VH100, VL50-VH100 i njihovih kombinacija.

Vezujući molekul prema otkriću 42, pri čemu su VH i VL scFv vezani disulfidnom vezom izabranom od: VH44-VL100, VH100-VL49, VH100-VL50, VH101-VL46, VH105-VL43 i njihovih kombinacija.

Vezujući molekul prema otkriću 39, pri čemu VH sadrži skup od tri CDR-a: HCDR1, HCDR2, HCDR3, gde je skup od tri CDR-a izabran od:

(a) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID

NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.: 29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30;

(b) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 28, HCDR2 SEQ ID NO.:

29, HCDR3 SEQ ID NO.: 30;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID

NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.: 45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46;

(d) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 44, HCDR2 SEQ ID NO.:

45, HCDR3 SEQ ID NO.: 46;

(e) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.: 61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62; i

(f) aminokiselinske sekvence: HCDR1 SEQ ID NO.: 60, HCDR2 SEQ ID NO.:

61, HCDR3 SEQ ID NO.: 62.

2

Vezujući molekul prema otkriću 39, pri čemu VL sadrži skup od tri CDR-a: LCDR1, LCDR2, LCDR3, gde je skup od tri CDR-a izabran od:

(a) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(b) aminokiselinske sekvence: LCDR1 SEQ ID NO.: 23, LCDR2 SEQ ID NO.: 24 i LCDR3 SEQ ID NO.: 25;

(c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(d) aminokiselinske sekvence: LCDR1 SEQ ID NO.: 39, LCDR2 SEQ ID NO.: 40 i LCDR3 SEQ ID NO.: 41;

(e) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 75% identična sa: LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57; i

(f) aminokiselinske sekvence: LCDR1 SEQ ID NO.: 55, LCDR2 SEQ ID NO.: 56, LCDR3 SEQ ID NO.: 57.

Vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 21-46, pri čemu scFv ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:63.

Ovde je opisano bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje sadrži najmanje jedan laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68.

Bispecifično antitelo prema otkriću 48, koje sadrži najmanje jedan laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68.

Ovde je opisano bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje sadrži najmanje jedan teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69

Bispecifično antitelo prema otkriću 50, koje sadrži najmanje jedan teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69.

Ovde je opisano bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, koje sadrži najmanje jedan laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:66 ili SEQ ID NO:68, i najmanje jedan teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:67 ili SEQ ID NO:69.

Bispecifično antitelo prema otkriću 52, koje sadrži:

(a) najmanje jedan laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:66, i najmanje jedan teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:67; ili

(b) najmanje jedan laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:68 i najmanje jedan teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEQ ID NO:69

Ovde je opisana ćelija koja sadrži ili proizvodi vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 1-47, bispecifično antitelo ili njegov fragment iz otkrića 48-53, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

Ovde je opisan izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifično antitelo ili njegov fragment iz otkrića 48-53.

Vektor koji sadrži polinukleotid iz otkrića 55.

Ovde je opisana ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid iz otkrića 55 ili vektor iz otkrića 56.

4

Ovde je opisana kompozicija koja sadrži vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 1-47, bispecifično antitelo ili njegov fragment iz otkrića 48-53, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Ovde je opisan komplet koji sadrži kompoziciju iz otkrića 58.

Ovde je opisana kompozicija iz otkrića 58 za upotrebu u postupku za prevenciju ili lečenje virusne infekcije gripom tip A ili gripom tip B kod ispitanika kome je to potrebno, što obuhvata primenu na ispitaniku delotvorne količine kompozicije iz otkrića 58.

Ovde je opisan postupak za proizvodnju vezujućeg molekula prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta iz otkrića 48-53, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina prema otkriću 57 u uslovima koji su pogodni za ekspresiju vezujućeg molekula ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta.

Postupak prema otkriću 61 koji dalje obuhvata izolovanje vezujućeg molekula iz kulture ćelije domaćina.

Ovde je opisan vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifično antitelo ili njegov fragment iz otkrića 48-53 za upotrebu u profilaksi ili lečenju infekcije gripom tip A, infekcije gripom tip B ili kombinacije prethodnog kod ispitanika.

Ovde je opisana upotreba vezujućeg molekula prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta iz otkrića 48-53 u proizvodnji leka za profilaksu ili lečenje infekcije gripom tip A, infekcije gripom tip B ili kombinacije prethodnog kod ispitanika.

Ovde je opisana upotreba vezujućeg molekula prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta iz otkrića 48-53 u proizvodnji leka za profilaksu ili lečenje infekcije gripom tip A i gripom tip B kod ispitanika.

66. Ovde je opisan vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifično antitelo ili njegov fragment iz otkrića 48-53 za upotrebu u postupku za profilaksu ili lečenje infekcije gripom tip A, infekcije gripom tip B ili kombinacije prethodnog kod ispitanika.

67. Ovde je opisan vezujući molekul prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifično antitelo ili njegov fragment iz otkrića 48-53 za upotrebu u postupku za profilaksu ili lečenje infekcije gripom tip A i gripom tip B kod ispitanika.

68. Ovde je opisana upotreba vezujućeg molekula prema bilo kom od otkrića 1-47 ili bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta iz otkrića 48-53 za in vitro dijagnozu infekcije gripom tip A, infekcije gripom tip B ili njihove kombinacije kod ispitanika.

Primeri

Primer 1. Priprema konstrukta bispecifičnog antitela

[0223] Anti-HA IgG antitela koja specifično vezuju virus gripa tip A opisana su u U.S. privremenoj prijavi br.61/885,808, koja je podneta 2. oktobra 2013. godine, i 62/002,414, koja je podneta 23. maja 2014. godine, a anti-HA IgG antitela koja specifično vezuju virus gripa tip B opisana su u U.S. privremenoj prijavi br.62/024,804, koja je podneta 15. jula 2014. godine. Ukratko, ova antitela su široko unakrsno reaktivna antitela koja prepoznaju virus gripa tip A (FY1 i GL20) i virus gripa tip B (FBD94, FBC39, i FBC39 FTL).

Konstruisan je niz bispecifičnih (BiS) antitela koristeći IgG VH i VL genske sekvence tih antitela. Nastala bispecifična antitela kombinuju komplementarne aktivnosti različitih mAb na HA gripa tip A ili B kako bi nastali pojedinačni molekuli nalik antitelu koji su sposobni da neutrališu sve sojeve gripa tip A i B.

[0224] Slika 1 daje šematski prikaz orijentacije pet različitih skeleta BiS. Na primer, kod stvorenih Bis-Flu A+B antitela, anti-Flu A antitelo (FY1 ili njegov optimizovani oblik GL20) korišćeno je kao IgG, a anti-Flu B antitelo (FBD94, FBC39 ili njegov optimizovani oblik FBC39FTL) korišćeno je kao scFv, pri čemu je scFv insertovan na različitim pozicijama duž strukture IgG u različitim BiS formatima. BiS konstrukti su imenovani koristeći skraćenicu dva IgG od kojih je BiS antitelo dobijeno, nakon čega sledi korišćeni BiS format, a zatim aminokiselinska pozicija dva cisteinska ostatka koji se koriste da grade stabilizujuću disulfidnu vezu u scFv.

A. FY1/39 BiS2100/44

[0225] Sledeći postupak je korišćen za stvaranje FY1/39 BiS2100/44 konstrukta koji obuhvata laki lanac FY1/39 Bis2100/44 (SEQ ID NO:107) i teški lanac FY1/39 Bis2100/44 (SEQ ID NO:108). Ukratko, vektor koji sadrži VH i VL sekvence FY1 (pOE-FY1 vektor) digestovan je sa BssHII/BsiWI radi dobijanja DNK VL FY1 (SEQ ID NO:1). DNK VL FY1 (SEQ ID NO:1) je zatim prečišćena na gelu i klonirana u vektor koji sadrži sekvence lakog lanca, scFv i teškog lanca (BiS2 vektor), koji je digestovan sa BssHII/BsiWI, radi dobijanja vektora FY1 LC-BiS2.

[0226] DNK VH FBC39 scFv-FY1 (SEQ ID NO:111) sintetisana je pomoću Geneart i PCR amplifikovana koristeći sledeće prajmere, koji sadrže sekvence za prepoznavanje BsrGI/SaII na 5' i 3' kraju.

Direktni prajmer:

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID

NO: 70)

Reversni prajmer:

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC (SEQ ID

NO: 71)

[0227] Potvrđena je amplifikacija DNK VH FBC39 scFv-FY1 (SEQ ID NO:111) i DNK je prečišćena na gelu.

[0228] Vektor FY1-LC-BiS2 je zatim digestovan sa BsrGI/SaII, i traka vektora je prečišćena na gelu. U prečišćeni vektor FY1-LC-BiS2 je ubačen VH FBC39 scFv-FY1 (SEQ ID NO:111) proizvod PCR koristeći In-Fusion sistem (Clontech®) radi stvaranja konstrukta FY1/39 BiS2100/44. Stelarne kompetentne ćelije su transformisane FY1/39 BiS2100/44 konstruktom i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBC39 scFv.

B. FY1/39 BiS4100/44

[0229] Sličan postupak je korišćen za stvaranje konstrukta FY1/39 BiS4100/44 koji obuhvata laki lanac FY1/39 Bis4100/44 (SEQ ID NO: 109) i teški lanac FY1/39 Bis4100/44 (SEQ ID NO: 110). Ukratko, vektor pOE-FY1-VL je digestovan sa BssHII/BsiWI radi dobijanja DNK VL FY1 (SEQ ID NO:1). DNK VL FY1 (SEQ ID NO:1) je zatim prečišćena na gelu i klonirana u vektor koji sadrži sekvence lakog lanca, VH, CH1, scFv, CH2 i CH3 (BiS4 vektor), koji je digestovan sa BssHII/BsiWI, radi stvaranja vektora FY1-LC BiS4.

[0230] DNK scFv FBC39 (SEQ ID NO:112) amplifikovana je iz DNK VH scFv-FY1 FBC39 (SEQ ID NO:111), koja je sintetisana pomoću Geneart, koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO:

72)

Reversni prajmer:

[0231] Vektor FY1-LC-BiS4 je zatim digestovan sa BsrGI/SaII, i traka vektora je prečišćena na gelu. Vektor koji sadrži VL i VH sekvence FY1 (pOE-FY1) digestovan je sa BsrGI/SaII radi dobijanja VH FY1 (SEQ ID NO:6).

[0232] Vektor (FY1-LC-Bis4 digestovan sa BsrGI/SaII, opisan u redu 5 i 6) zatim je ligiran sa VH FY1 (SEQ ID NO:6) radi dobijanja vektora BiS4-FY1, koji je digestovan sa BamHI i prečišćen na gelu. Prečišćeni BiS4-FY1 je zatim napunjen prethodno dobijenim FBC39 scFv PCR proizvodom koristeći sistem In-Fusion (Clontech®) radi dobijanja konstrukta FY1/39 BiS4 100/44. Stelarne kompetentne ćelije su transformisane FY1/39 BiS4100/44 konstruktom i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBC39 scFv.

C. FY1/39 BiS1 100/44

[0233] Sličan postupak je korišćen za stvaranje konstrukta FY1/39 BiS1100/44 koji obuhvata laki lanac FY1/39 Bis1100/44 (SEQ ID NO:113) i teški lanac FY1/39 Bis1100/44 (SEQ ID NO:114).

[0234] VL FY1 je amplifikovan iz prethodno opisanog FY1/FBC39 BiS4100/44 (SEQ ID NO:109) koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer BiS1 FY1-VL:

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGATATTCAGATGACCCAGAGCCC

(SEQ ID NO: 76)

Reversni prajmer BiS1 FY1-VL:

TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCACCTTAGTGCCC (SEQ ID NO: 77)

[0235] ScFv FBC39 je amplifikovan iz DNK VH scFv-FY1 FBC39 (SEQ ID NO:111), koja je sintetisana pomoću Geneart, koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer BiS1 FBC39:

CTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 74)

Reversni prajmer BiS1 FBC39:

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID NO: 75)

[0236] ScFv FBC39 i FY1-VL PCR trake su prečišćeni na gelu.

[0237] FY1/FBC39 BiS4100/44 je digestovan sa BsrGI/SaII radi dobijanja VH FY1; traka VH FY1 je prečišćena na gelu. VH FY1 (SEQ ID NO:6) ligiran je sa vektorom koji sadrži sekvence scFv, LC i HC (BiS1 vektor), koji je takođe digestovan sa BsrGI/SaII.

[0238] Nastali vektor FY1 HC BiS1 je zatim digestovan sa BssHII/BsiWI, traka vektora je prečišćena na gelu i napunjena sa FBC39 scFv i FY1 VL PCR proizvodima koristeći sistem In-Fusion (Clontech®) radi nastanka konstrukta FY1/39 BiS1100/44. Stelarne kompetentne ćelije su transformisane FY1/39 BiS1100/44 konstruktom i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBC39 scFv.

D. FY1/39 BiS3100/44

[0239] Na sličan način je konstruisan FY1/39 BiS3100/44 konstrukt koji sadrži laki lanac FY1/39 Bis3100/44 (SEQ ID NO:115) i teški lanac FY1/39 Bis3 100/44 (SEQ ID NO:116).

[0240] Sledeći prajmeri su korišćeni za amplifikaciju FBC39 scFv (SEQ ID NO:112) iz DNK VH FBC39 scFv-FY1 (SEQ ID NO:111) koja je sintetisana pomoću Geneart.

Direktni prajmer:

AAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGACATCCAGATGACCC

AGTCT C (SEQ ID NO: 78)

Reversni prajmer:

TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID

NO: 79)

[0241] Amplifikacija DNK scFv FBC je potvrđena i prečišćena na gelu.

[0242] FY1/FBC39 BiS4100/44 je digestovan sa BssHII/SaII radi dobijanja FY1 LC/VH. Traka LC/VH FY1 je prečišćena na gelu i ligirana sa vektorom koji sadrži sekvence LC, HC i scFv (BiS3 vektor), koji je takođe digestovan sa BssHII/SaII, dajući vektor FY1 BiS3.

[0243] Vektor FY1 BiS3 je zatim digestovan sa BamHI i prečišćen na gelu. U prečišćeni vektor FY1 BiS3 uliven je FBC39 scFv (SEQ ID NO:112) PCR proizvod koristeći sistem In-Fusion (Clontech®) radi stvaranja konstrukta FY1/39 BiS3100/44. Stelarne kompetentne ćelije su transformisane FY1/39 BiS3100/44 konstruktom i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBC39 scFv.

E. FY1/94 BiS2100/44

[0244] FY1/94 BiS2100/44, koji sadrži laki lanac FY1/94 Bis2100/44 (SEQ ID NO: 117) i teški lanac FY1/94 Bis2 100/44 (SEQ ID NO: 118) konstruisan je na sledeći način.

[0245] DNK scFv FBD94 (SEQ ID NO: 119) sintetisana je putem Eurofin i amplifikovana za inserciju u vektor BiS2 koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC (SEQ ID

NO: 80)

Reversni prajmer:

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID NO: 81)

[0246] VH FY1 (SEQ ID NO:6) je amplifikovan pomoću PCR iz FY1/39 BiS4100/44 (SEQ ID NO:110) koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTCAGGTCCAGCTGCAGGAGAGC (SEQ ID NO: 82)

Reversni prajmer:

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC (SEQ ID

NO: 83)

1

[0247] Potvrđena je amplifikacija PCR proizvoda, DNK scFv FBD94 (SEQ ID NO:119) i VH FY1 (SEQ ID NO:6), i PCR proizvodi su prečišćeni na gelu. BiS2-FY1-LC vektor je linearizovan putem digestije sa BsrGI/SaII i napunjen sa DNK scFv FBD94 (SEQ ID NO:119) i VH FY1 (SEQ ID NO:6) koristeći sistem In-Fusion (Clontech®). Orijentacija PCR proizvoda u vektoru je kontrolisana koristeći prajmere koji sadrže preklapajuće sekvence sa vektorom. Stelarne kompetentne ćelije su transformisane FY1/94 BiS2100/44 konstruktom i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBD94 scFv.

F. FY1/94 BiS4100/44

[0248] FY1/94 BiS4100/44 je konstruisan na sledeći način:

ScFv FBD94 (SEQ ID NO:119) sintetisan je putem Eurofin i amplifikovan za inserciju u vektor koji sadrži sekvence lakog lanca, VH, CH1, scFv, CH2 i CH3 (BiS4 vektor) koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC (SEQ ID NO:

84)

Reversni prajmer:

[0249] Amplifikacija PCR proizvoda je potvrđena i FBD94 je prečišćen na gelu.

[0250] BiS4-FY1 vektor (prethodno opisan) je linearizovan koristeći BamHI i napunjen je sa FBD94 koristeći sistem In-Fusion (Clontech®). Stelarne kompetentne ćelije su transformisane FY1/94 BiS4100/44 konstruktom i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBD94 scFv.

G. FY1/39 BiS443/105

2

[0251] FY1/39 BiS443/105, koji sadrži laki lanac FY1/39 Bis443/105 (SEQ ID NO:120) i teški lanac FY1/39 Bis4 43/105 (SEQ ID NO: 121) konstruisan je na sledeći način:

DNK scFv FBC39-43/105 sintetisana je putem Eurofin i amplifikovana za inserciju u vektor BiS4 koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO:

86)

Reversni prajmer:

[0252] Amplifikacija PCR proizvoda je potvrđena i prečišćen je na gelu.

[0253] BiS4-FY1 vektor je linearizovan sa BamHI i napunjen sa DNK scFv FBC39-43/105 (SEQ ID NO:124) koja je prethodno dobijena koristeći sistem In-Fusion (Clontech®).

Stelarne kompetentne ćelije su transformisane konstruktom FY1/39 BiS443/105 i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci FY1 VL, VH i FBC39-43/105 scFv.

H. GL20/39 BiS4100/44

[0254] GL20/39 BiS4100/44, koji obuhvata teški lanac GL20/39 BiS4100/44 (SEQ ID NO: 66) i laki lanac GL20/39 BiS4100/44 (SEQ ID NO:67) konstruisan je na sličan način.

[0255] Vektor koji sadrži FY-GL20 LC i HC (pOE-FY1-GL20) digestovan je sa BssHII/SaII radi dobijanja GL20 LC(VL-CL) i VH (SEQ ID NO:123), koji su prečišćeni na gelu. FY1/39 BiS4 100/44 vektor je digestovan sa BssHII/SaII i ligiran sa GL20 LC/VH (SEQ ID NO:123). Kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci GL20 VL, VH i FBC39 scFv.

I. GL20/39 BiS443/105

[0256] Na sličan način je konstruisan GL20/39 BiS443/105, koji obuhvata teški lanac GL20/39 BiS443/105 (SEQ ID NO:68) i laki lanac GL20/39 BiS443/105 (SEQ ID NO:69). pOE-FY1-GL20 je digestovan sa BssHII/SaII radi dobijanja GL20 LC/VH (SEQ ID NO: 123), koji je prečišćen na gelu. Laki lanac FY1/39 BiS443/105 (SEQ ID NO:120) digestovan je sa BssHII/SaII i ligiran sa GL20 LC/VH (SEQ ID NO:123). Kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci GL20 VL, VH i FBC39-43/105 scFv.

J. GL20/39FTL BiS4 100/44

[0257] GL20/39FTL BiS4100/44 je konstruisan na sličan način.

[0258] DNK scFv FBC39FTL (SEQ ID NO: 124) sintetisana je putem Eurofin i amplifikovana za inserciju u vektor BiS4 koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO:

88)

Reversni prajmer:

[0259] Amplifikacija PCR proizvoda je potvrđena i DNK scFv FBC39FTL (SEQ ID NO:124) je prečišćena. Vektor GL20/39 BiS443/105 je linearizovan sa BamHI i napunjen sa DNK scFv FBC39FTL (SEQ ID NO:124) koristeći sistem In-Fusion (Clontech®). Kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci GL20 VL, VH i FBC39FTL scFv.

K. GL20/39FTL BiS4 43/105

[0260] GL20/39FTL BiS443/105, koji sadrži laki lanac GL20/39FTL Bis443/105 (SEQ ID NO:125) i teški lanac GL20/39FTL Bis4 43/105 (SEQ ID NO: 126) konstruisan je na sličan način.

4

[0261] DNK scFv FBC39FTL43/105 (SEQ ID NO:127) sintetisana je putem Eurofin i amplifikovana za inserciju u vektor BiS4 koristeći sledeće prajmere:

Direktni prajmer:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO:

90)

Reversni prajmer:

[0262] Amplifikovani PCR proizvod je prečišćen i napunjen linearizovanim vektorom GL20/39 BiS443/105 (digestovan sa BamHI) i kolonije su sekvencirane radi ispravnih sekvenci GL20 VL, VH i FBC39FTL-43/105 scFv.

L. BiS5 GL20-FBC39

[0263]

FY1GL20VL-Ckapa

M. BiS5 GL20-FBC39-43-105

[0264]

FY1GL20VL-Ckapa

Primer 2: Ekspresija BiS konstrukta

[0265] Rekombinantna antitela su proizvedena tranzijentnom transfekcijom ćelijskih linija sisara koje su dobijene od 293F ili CHO ćelija. Supernatanti iz transficiranih ćelija su sakupljeni nakon 7-10 dana uzgajanja. Prečišćavanje je obavljeno koristeći kolonu sa proteinom A (HiTrap Protein A HP kompanije GE Healthcare). Sadržaj monomera je određen pomoću HPLC-SEC analize, i agregati su uklonjeni hromatografijom na molekulskim sitima.

Primer 3: Optimizacija BiS4 konstrukta

[0266] Konstrukt FY1/39 BiS4 je korišćen kao skelet koji će se optimizovati za scFv radi stvaranja konstrukta koji eksprimira visok sadržaj monomera, koji je još aktivan. U ovim studijama, orijentacija scFv je promenjena iz VL/VH u VH/VL, dužina scFv linkera je promenjena sa 20 aminokiselina na 10, 15 ili 25 aminokiselina, stabilizujuće disulfidne veze su uklonjene ili premeštene sa 100/44 na četiri različite lokacije, a regioni okvira FBC39 su u potpunosti germinatizovani. Tabela 7 daje specifične informacije o konstruktima.

Tabela 7.

[0267] Ekspresija i aktivnost ovih optimizovanih konstrukta BiS4 nije pod velikim uticajem dužine linkera. Međutim, pozicija disulfidne veze je važna i za ekspresiju i za aktivnost. Najbolji profil ekspresije je uočen kod konstrukta koji ne sadrže disulfidne veze, lokacija disulfidne veze je promenjena na 43/105, 46/101 ili 49/100, ili kod germinatizovanog konstrukta FBC39 disulfidnom vezom 100/44. Međutim, iako je ekspresija poboljšana, mnogi od ovih klonova su izgubili antivirusnu aktivnost izmerenu putem vezivanja HA i neutralizacije, kako je opisano u primerima 4 i 5 u nastavku. Jedan konstrukt (FY1/39 BiS4 43/105) pokazao je bolji profil ekspresije nego FY1/39 BiS4100/44 i zadržao je funkcionalnu antivirusnu aktivnost. Pošto su ova dva konstrukta (FY1/FBC39 BiS4100/44 i BiS 43/105) pokazala dobru ekspresiju, kao i dobru funkcionalnu aktivnost, optimizovani klonovi BiS (GL20/FBC39 Bis) konstruisani su sa orijentacijom BiS4100/44, odnosno BiS 43/105.

Primer 4. Flu A B BiS konstrukti se vezuju za HA proteine virusa gripa tip A i B [0268] Flu A B BiS konstrukti su testirani kako bi se utvrdilo da li zadržavaju specifičnost matičnih IgG konstrukata koristeći ELISA test vezivanja unakrsne reaktivnosti HA. Maxisorb ELISA ploče sa 384 bunarčića (Nunc) premazane su preko noći na 4°C sa 1 ug/ml rekombinantnog HA dobijenog od sojeva gripa tip A, A/California/07/2009 H1N1 (A/CA/09) i A/Perth/2009 H3N2 (A/PTH/09), i sojeva gripa tip B B/Florida/4/2006 loze Jamagata (B/FLA/06) i B/Brisbane/60/2008 loze Viktorija (B/BNE/08) u PBS-u. Ploča je isprana PBS-om koji sadrži 0,1% V/V Tween-20 da bi se uklonio nepremazani protein, i dodat je rastvor za blokiranje koji sadrži 1% (m/V) kazeina (Thermo Scientific) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Rastvor za blokiranje je odbačen i dodato je 3-struko serijsko razblaženje svakog anti-HA IgG i BiS antitela u PBS-u, i inkubirano je tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana tri puta, i vezani IgG i BiS antitela su detektovani koristeći kozje antihumano IgG antitelo (H+L) (KPL) konjugovano sa peroksidazom. Vezujuća aktivnost je izračunata merenjem promene boje na 450 nm nakon inkubacije sa tetrametilbenzidinskim (TMB) jednokomponentnim supstratom (KPL), a zatim je dodata 2 N sumporna kiselina kako bi se prekinula reakcija.

[0269] Tabela 8 pokazuje vrednosti EC50koje su izračunate iz krive vezivanja. Kao što je očekivano, Flu A IgG mAb (FY1 i GL20) vezivala su se za oba HA proteina gripa tip A, a tri Flu IgG mAb (FBD94, FBC39 i FBC39FTL) vezivala su se za HA proteine gripa tip B. Svi BiS konstrukti su se vezivali za sva četiri HA proteina gripa koji pripadaju tipu A i tipu B. BiS4 konstrukti za FBC39 i FBD94 su pokazali najbolje sveukupno vezivanje. Kada su optimizovani IgG stavljeni u BiS4 konstrukte sa disulfidnim vezama na 100/44 ili 43/105, GL20/39 BiS443/105 je pokazao najbolje sveukupno vezivanje sa vrednostima EC50 <1 nM za A/CA/09, A/PTH/09, i B/FL/06, i manjim od 10 nM za B/BNE/08 koji se teže vezuje.

Tabela 8.

[0270] Da bi se dalje okarakterisala kinetika interakcije vezivanja, obavljeno je merenje afiniteta koristeći kinetički analizator ForteBio Octet QK 384 (Menlo Park, CA) na ploči sa 384 bunarčića kosih ivica. Svi reagensi su razblaženi u kinetičkom puferu Octet (ForteBio). His-označeni HA različitih virusa gripa: H1 podtip gripa A (A/California/7/04 (H1 N1)), H3 podtip gripa A (A/Perth/16/09 (H3N2)), Viktorija loza gripa B (B/Brisbane/60/2008 (Viktorija)), i Jamagata loza gripa B (B/Florida/4/2006 (Jamagata)) imobilisani su na anti-His Ni-NTA senzorima sa 8 µg/ml. Asocijacija/disocijacija anti-HA mAt je zatim praćena u 2-strukim razblaženjima od 100 nM, uz nultu kontrolu mAt. Neobrađeni podaci za asocijaciju i disocijaciju su korigovani za odstupanja nulte kontrole mAt, i zatim su izvezeni na GraphPad Prism (San Diego, CA) radi podešavanja krive afiniteta. Podaci su postavljeni koristeći globalnu jednačinu asocijacije/disocijacije sa nametnutim limitom od > 5x10<-6>s<-1>. Kao što je prikazano u Tabeli 9, oba BiS konstrukta su pokazala vezivanje sa velikim afinitetom za sva četiri HA proteina koji pripadaju sojevima gripa A i B.

Tabela 9.

Primer 5. In vitro neutrališuća aktivnost Flu A B BiS konstrukta

[0271] Modifikovani test mikroneutralizacije je zasnovan na prethodno opisanom testu ubrzane virusne inhibicije koristeći aktivnost neuraminidaze (NA) kao očitavanje

1

(Hassantoufighi, A. et al.2010, Vaccine 28:790). Ukratko, testovi su obavljeni na MDCK ćelijama koje su uzgajane u MEM medijumu (Invitrogen) sa dodatkom antibiotika, glutamina (kompletni MEM medijum) i 10% (V/V) fetalnog goveđeg seruma.60 TCID50(doze za infekciju 50% kulture tkiva) virusa je dodato u trostruka razblaženja antitela na ploču sa 384 bunarčića u MEM medijumu sa 0,75 ug/ml TPCK tripsina (Worthington) u dvostruke bunarčiće. Nakon 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, 2x10<4>ćelija/bunarčiću je dodato na ploču. Nakon inkubacije na 33°C u inkubatoru sa 5% CO2tokom oko 40 h, aktivnost NA je izmerena dodavanjem fluorescentno obeleženog supstrata, metilumbeliferil-N-acetil neuraminske kiseline (MU-NANA) (Sigma) u svaki bunarčić i inkubiranjem na 37°C tokom 1 h. Replikacija virusa predstavljena aktivnošću NA je kvantifikovana očitavanjem fluorescencije koristeći fluorimetar Envision (PerkinElmer) koristeći sledeće postavke: ekscitacija 355 nm, emisija 460 nm, 10 bliceva po bunarčiću. Titar neutralizacije (50% inhibitorne koncentracije [IC50]) eksprimiran je kao konačna koncentracija antitela koja smanjuje signal fluorescencije za 50% u poređenju sa bunarčićima sa ćelijskom kontrolom.

[0272] Sojevi virusa gripa tip A i B koji su korišćeni u Tabeli 10 i 11 navedeni su u nastavku.

[0273] U Tabeli 10: A/WSN/33 (A/Wilson Smith N/33 (H1N1)); A/BJ/95 (A/Beijing/262/95 (H1N1)); A/SI/06 (A/Solomon Island/3/2006 (H1N1)); A/CA/09 (A/California/07/2009 (H1N1)); A/HK/68 (A/Hong Kong/8/68 (H3N2)); A/VIC/75 (A/Victoria/3/75 (H3N2)); A/SD/93 (A/Shangdong/9/93 (H3N3)); A/Pan/99 (prilagođen na hladnoću (ca) A/Panama//2007/99 (H3N2)); B/BJ/97 (ca B/ Beijing/243/97 (Vic)); B/HK/01 (B/Hong Kong/330/2001 (Vic)); B/MY/04 (B/Malaysia/2506/2004 (Vic)); B/OH/05 (B/Ohio/1/2005 (Vic)); B/YI/98 (B/Yamanashi/166/98 (Yam)); B/SIC/99 (B/Sichuan/379/99 (Yam)); i B/FLA/06 (B/Florida/4/2006 (Yam)).

[0274] U Tabeli 11: A/WSN/33 H1 (A/Wilson Smith N/33 (H1N1)); A/PR/34 H1 (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)); A/FM/47 H1 (A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)); A/BJ/95 H1 (ca A/Beijing/262/95 (H1N1)); A/SZ/95 H1 (A/Shenzhen/227/95 (H1N1)); A/NC/99 H1 (ca A/New Caledonia/20/99 (H1N1)); A/SI/06 H1 (A/Solomon Island/3/2006 (H1N1)); A/SD/07 H1 (ca A/South Dakota/6/2007 (H1N1)); A/CA/09 H1 (ca A/California/7/2009 (H1N1)); A/BS/10 H1 (A/Brisbane/10/2010 (H1N1)); A/HK/10 H1 (A/Hong Kong/2212/2010 (H1N1)); A/NH/10 H1 (A/New Hampshire/04/2010 (H1N1)); A/WS/12 H1 (A/Washington/24/2012 (H1N1)); A/NY/12 H1 (A/New York/36/2012 (H1N1)); A/BO/13

1 1

H1 (A/Bolivia/559/2013 (H1N1)); A/Jap/57 H2 (ca A/Japan/57 (H2N2)); A/VN/04 H5 (ca A/Vietnam/1203/04 (H5N1)); A/Alb/85 H6 (ca A/mallard/Alberta/89/85 (H6N2)); A/HK/97 H9 (ca A/chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2)); A/HK/68 H3 (A/Hong Kong/8/68 (H3N2)); A/Vic/75 H3 (A/Victoria/3/75 (H3N2)); A/SD/93 H3 (A/Shan dong/9/93 (H3N2)); A/WH/95 H3 (ca A/Wuhan/359/95 (H3N2)); A/SY/97 H3 (ca A/Sydney/5/97 (H3N2)); APA/99 H3 (ca A/Panama/2007/99 (H3N2)); A/CA/04 H3 (A/California/7/2004 (H3N2)); A/WS/05 H3 (A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)); A/Perth/09 H3 (ca A/Perth/16/2009 (H3N2)), A/VC/11 H3 (A/Victoria/361/2011 (H3N2)); A/BR/11 H3 (A/Berlin/93/2011 (H3N2)); A/NY/12 H3 A/New York/39/2012 (H3N2)); A/X/12 H3 (A/Texas/50/2012 (H3N2)); A/AS/13 H3 (A/AmericanSomoa/4786/2013 (H3N2)); A/SW/13 H3 (A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)); A/PU/14 H3 (A/Palau/6759/2014 (H3N2)); A/NC/14 H3 (A/New Caledonia/71/2014 (H3N2)); A/IN/11 H3v (A/Indiana/10/2011 (H3N2v)); A/MN/10 H3v (A/Minnesota/11/2010 (H3N2v)); A/BC/04 H7 (ca A/Brit. Columbia/CN-6/04 (H7N3-LP); B/Lee/40 (B/Lee/40); B/AA/66 (ca B/Ann Arbor/1/66); B/HK/72 (B/Hong Kong/5/72); B/BJ/97 (ca B/Beijing/243/97 (Viktorija)), B/HK/01 (B/Hong Kong/330/2001 (Viktorija)); B/MY/04 (B/Malaysia/2506/2004 (Viktorija)); B/OH/05 (B/Ohio/1/2005 (Viktorija));

B/BNE/08 (ca B/Brisbane/60/2008 (Viktorija)); B/NV/11 (B/Nevada/3/2011 (Viktorija)); B/NJ/12 (B/New Jersey/01/2012 (Viktorija)); B/TX/13 (B/Texas/2/2013 (Viktorija));

B/Wis/13 (B/Wisconsin/5/2013 (Viktorija)); B/Yam/88 (B/Yamagata/16/88 (Jamagata)); B/AA/94 (ca B/Ann Arbor/2/94 (Jamagata)); B/geo/98 (ca B/Georgia/02/98 (Jamagata)); B/YSI/98 (ca B/Yamanashi/166/98 (Jamagata)); B/Joh/99 (ca B/Johannesburg/5/99 (Jamagata)); B/Sic/99 (B/Sichuan/379/99 (Jamagata)); B/Vic/00 (ca B/Victoria/504/2000 (Jamagata)); B/Shg/02 (B/Shanghai/361/02 (Jamagata)); i B/FL/06 (B/Florida/4/2006 (Jamagata)); B/WS/10 (B/Wisconsin/1/2010 (Jamagata)); B/Mass/12 (B/Massachusetts/2/2012 (Jamagata)); B/AZ/13 (B/Arizona/8/2013 (Jamagata)); B/PH/13 (B/Phuket/3073/2013 (Jamagata)).

1 2

10. ael ab T

[0275] Tabela 10 pokazuje prosečnu vrednost IC50iz dva nezavisna eksperimenta. Matični IgG FY1 i GL20 su neutralisali sve sojeve gripa tip A i nisu pokazali unakrsnu reaktivnost sa testiranim sojevima gripa tip B. U skladu sa očekivanim, FBD94, FBC39 i FBC39 LTL IgG neutralisali su sve sojeve gripa tip B bez aktivnosti na testirane sojeve gripa tip A. Međutim, slično eksperimentima vezivanja, konstrukti BiS4 su pokazali najbolji sveukupni profil neutralizacije sa neutrališućom aktivnošću za sve testirane sojeve gripa tip A i B. Konstrukti BiS4 stvoreni sa optimizovanim klonovima antitela, GL20/39 BiS4100/44 i GL20/39 BiS4 43/105, pokazali su poboljšanu sveukupnu neutralizaciju za sve testirane sojeve u odnosu na matični BiS4. GL20/39 BiS443/105 dovodi do vrednosti IC50< 50 nM za svih 15 testiranih virusa gripa A i B.

[0276] Kako bi se potvrdilo da se raspon pokrivenosti održava za optimizovane konstrukte BiS4, testirana je neutralizacija većeg panela od 39 virusa gripa tip A i 25 virusa gripa tip B. Tabela 11 pokazuje prosečne vrednosti IC50iz dva nezavisna eksperimenta. GL20/39 BiS4 100/44 i GL20/39 BiS443/105 pokazuju neutrališuću aktivnost za sve testirane viruse.

Srednja vrednost IC50(nM) za viruse gripa tip A bila je 8,2, 8,0 i 7,5 za GL20 IgG, GL20/39 BiS4100/44, odnosno GL20/39 BiS443/105, što pokazuje da BiS konstrukti zadržavaju sveukupnu neutrališuću aktivnost matičnog IgG. Srednja vrednost IC50za viruse gripa tip B bila je 0,4, 13,9 i 9,0 za FBC39 IgG, GL20/39 BiS4100/44, odnosno GL20/39 BiS443/105. BiS konstrukti su pokazali >10-struko smanjenu aktivnost na viruse B u poređenju sa matičnim mAb IgG. Međutim, ukupna neutrališuća aktivnost je održana na nivoima koji su slični onima na viruse gripa tip A. Mada oba BiS konstrukta, GL20/39 BiS4100/44 i GL20/39 BiS4 43/105, pokazuju slične profile, GL20/39 BiS443/105 pokazuje bolji profil ukupne neutralizacije sa vrednostima IC50< 50 nM za sve viruse. Kao što je prethodno opisano, kao mAb GL20 za grip tipa A, mAb FBC39 može da neutrališe A/HK/97 H9 soj gripa pored sojeva gripa tip B. Kada su konstruisana u BiS4 formatu, BiS4 antitela pokazuju pojačanu aktivnost neutralizacije za A/HK/97 H9 u poređenju sa bilo kojim od matičnih mAb, sa vrednostima IC50(nM) od 1,6 i 1,1 za GL20/39 BiS4100/44 i GL/20/39 BiS443/105 i 3,0 i 13,3 za GL20, odnosno FBC39.

1

Tabela 11.

1

Primer 6. Aktivnost inhibicije hemaglutinacije

[0277] Deo mAb na grip B BiS konstrukta vezuje se za globularnu glavu HA proteina i inhibira ulazak virusa u ćeliju domaćina. Da bi se utvrdilo da li je ovaj isti mehanizam delovanja važan za funkciju BiS konstrukta za grip tip B, obavili smo testove inhibicije hemaglutinacije (HAI) koristeći raznoliku grupu sojeva virusa gripa tip B. HAI test detektuje antitela koja blokiraju angažovanje virusnih receptora sijalinske kiseline koju eksprimira ćelijska površina putem merenja inhibicije aglutinacije eritrocita posredovane virusom. Virusi gripa tip B (skraćenice kako je opisano u Primeru 5) prilagođeni su na 4 HA jedinice utvrđene inkubacijom sa 0,05% eritrocita ćurke (Lampire Biological Laboratories) u odsustvu antitela. GL20/39 BiS4100/44, GL20/39 BiS443/105 i FBC39 IgG su serijski razblaženi u dvostrukim inkrementima na ploči sa dnom u obliku slova U sa 96 bunarčića, i razblaženi virus je dodat u bunarčiće. Nakon inkubacije od 30 do 60 minuta, dodato je 50 ul 0,05% eritrocita ćurke. Ploče su inkubirane još 30 do 60 minuta, i posmatrana je aglutinacija. Titar HAI je određen kao minimalna delotvorna koncentracija (nM) antitela koja u potpunosti inhibira aglutinaciju. Tabela 12 pokazuje da oba GL20/39 BiS4 konstrukta imaju aktivnost HAI na sve testirane sojeve gripa tip B, što obezbeđuje dokaze da se BiS konstrukti vezuju za globularnu glavu HA gripa tip B. Ukupna potentnost aktivnosti HAI je varirala između dva konstrukta, pri čemu GL20/39 BiS443/105 dovodi do snažnije inhibicije nego GL20/39 BiS4 100/44, sa sličnom aktivnošću kao FBC39 matično mAb na mnoge od testiranih virusa.

Tabela 12.

1

Primer 7. In vitro Fc efektorska funkcija Flu A+B BiS konstrukta

[0278] HA monoklonska antitela gripa mogu da očiste virusom inficirane ćelije putem Fcefektorske funkcije, kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), i komplementno zavisno ubijanje (CDC). Da bi se potvrdilo da BiS konstrukti pokazuju slične nivoe ovih efektorskih funkcija kao matični IgG mAb, testirali smo ih u tri različita in vitro testa kako bi se utvrdila aktivnost ADCC, ADCP i CDC. Test ADCC meri sposobnost primarnih humanih NK ćelija da ubijaju ćelije inficirane gripom kada se aktiviraju antitelom. A549 ćelije su inficirane pomoću A/California/07/2009 H1N1 sa multiplicitetom infekcije (MOI) 10, A/Hong Kong/8/68 H3N2 sa MOI 10, B/Malaysia/2506/2004 lozom Viktorija sa MOI 20 i B/Sichuan/379/99 lozom Jamagata sa MOI 10, i inkubirane su na 37°C tokom 15 sati. Inficirane ćelije su inkubirane sa serijom razblaženja GL20, FBC39 ili GL20/39 BiS443/105, a zatim su inkubirane sa prečišćenim NK ćelijama koje su pozitivno odabrane od ljudskih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) (Miltenyi), uz odnos efektora prema cilju od 6:1. Inficirane ćelije, antitelo i NK ćelije su inkubirani tokom 4 sata, i ćelijsko ubijanje je izmereno pomoću otpuštanja LDH (Roche). Slika 2 pokazuje da GL20/39 BiS443/105 ispoljava približno 3-struko smanjeno ubijanje zavisno od doze A549 ćelija inficiranih gripom tip A u poređenju sa GL20 sa vrednostima IC50(nM) od 0,024 i 0,086 za A/California/07/2009 H1N1 i 0,018 i 0,052 za

1

A/Hong Kong/8/68 H3N2 za GL20, odnosno GL20/39 BiS4 43/105 (A i B). GL20/39 BiS4 43/105 ispoljava isti odgovor zavisan od doze kao FBC39 IgG uz izračunatu vrednost IC50(nM) od 1,45 i 1,50 za B/Malaysia/2506/2004 Viktorija i 0,85 i 0,42 za B/Sichuan/379/99 Jamagata za FBC39, odnosno GL20/39 BiS443/105 (C i D).

[0279] Da bi se izmerila sposobnost anti-HA BiS antitela da posreduju fagocitozu u testu ADCP, kao ciljne ćelije smo koristili MDCK ćelije stabilno transficirane HA proteinima dobijenim od A/South Dakota/6/2007 H1N1, odnosno A/Hong Kong/8/68 H3N2. Ljudski monociti su izolovani iz PBMC i uzgajani tokom 7 dana u prisustvu M-CSF radi diferencijacije u makrofage. Ljudski makrofagi i ciljne ćelije koje eksprimiraju HA su fluorescentno obeleženi ljubičasto, odnosno zeleno (CellTrace Violet ili CSFE, Invitrogen). Obeležene efektorske i ciljne ćelije su inkubirane u odnosu 6:1 u prisustvu serija razblaženja IgG ili BiS antitela tokom 2 sata, a zatim analizirane pomoću protočne citometrije. Procenat fagocitoze je meren kao procenat ljubičasto obojenih makrofaga koji su takođe pozitivni na zelene ciljne ćelije (dvostruko pozitivni). Slika 3 pokazuje da GL20/39 BiS443/105 ima sličnu aktivnost ADCP kao GL20 IgG na ćelije koje eksprimiraju H1 i ćelije koje eksprimiraju H3, dok FBC39 IgG u skladu sa očekivanim ne pokazuje fagocitozu ćelija koje eksprimiraju grip tip A.

[0280] Da bi se izmerilo ćelijsko ubijanje zavisno od komplementa posredovano anti-HA BiS antitelom, koristili smo MDCK ćelije inficirane gripom kao ciljne ćelije. U ovom testu CDC, MDCK ćelije su inficirane putem A/Portoriko/8/34 sa MOI 2, inkubirane sa serijama razblaženja GL20 IgG, GL20/39 BiS4 43/105, ili nerelevantnog kontrolnog mAb, u prisustvu komplementa dobijenog od zeca (Cedarlane) uz odnos efektora prema cilju od 1:18. Ćelijsko ubijanje je mereno otpuštanjem LDH (Roche). Slika 3 C pokazuje da GL20/39 BiS 43/105 ispoljava sličan nivo kapaciteta za ćelijsko ubijanje kao GL20 IgG.

Primer 8. In vivo profilaktička zaštita Flu A+B BiS konstrukta na letalnim mišjim modelima infekcije gripom tip A i gripom tip B

[0281] Da bi se testirala profilaktička efikasnost, šest do osam nedelja starim BALB/c (Harlan Laboratories) miševima je data jedna intraperitonealna injekcija (IP) GL20 IgG sa 3, 0,3 ili 0,03 mg/kg, ili jednaki molski ekvivalent GL20/39 BiS443/105 u zapremini od 100 µl. Četiri sata nakon doziranja, miševi su intranazalno inokulirani sa 2,5 puta pedeset posto smrtnosne doze za miša (2,5 MLD50) A/Wilson Smith N/33 H1N1 (A/WSN/33) ili 7 MLD50

11

7:1 A/Puerto Rico/8/34:A/Hong Kong/8/68 HA kombinacije (rA/HK/68) u zapremini od 50 µl za proučavanje modela infekcije gripom tip A; ili 7 MLD50B/Florida/4/2006 loze Jamagata (B/FLA/06) ili 10 MLD50B/Malaysia//2506/2004 loze Viktorija (B/MAL/04) u zapremini od 50 µl za studiju koristeći model infekcije gripom tip B. Grupama od 8-10 miševa je izmerena težina na dan virusnog izazova, i svakodnevno je praćen gubitak težine i preživljavanje tokom 14 dana (miševi sa gubitkom telesne težine ≥ 25% su eutanazirani). Pored toga, pluća su sakupljena od 4 dodatne životinje 5. dana posle infekcije radi virusne titracije. Pluća su homogenizovana koristeći Teen Lysing Matrix A u 10% m/V rastvoru i homogenizator Fastprep24. TCID50 kvantifikacija je obavljena na serijski razblaženom homogenatu pluća na ploči za uzgajanje tkiva sa 384 bunarčića sa crnim zidovima u četiri primerka. Tripsinizovane MDCK ćelije su zatim dodate u homogenat sa 2,0 × 10<4>ćelija/bunarčiću, i ploče su inkubirane na 33°C sa 5% CO2tokom približno 40 sati. Virusna replikacija je izmerena dodatkom 40 µM MU-NANA, kako je prethodno opisano. Infektivni virusni titri su izračunati koristeći Karberov metod (Karber et al, 1931 Arch. Exp. Pathol. Pharmak. 162:480-3), i pozitivni uzorci su definisani kao oni koji pokazuju više od 10 standardnih devijacija iznad srednje vrednosti samo ćelija.

Profilaktička aktivnost na infekciju gripom tip A

[0282] I GL20/39 BiS443/105 i matični IgG GL20 pružaju miševima zaštitu od smrtonosnog izazova gripom tip A na sličan način zavisan od doze. Poput GL20, IP injekcija od 3 mg/kg ekvivalenta BiS molekula zaštitila je 100% životinja izazvanih A/WSN/33 H1 virusom, a IP injekcija od 3 i 0,3 mg/kg ekvivalenta sprečila je letalnost kod 100% životinja izazvanih rA/HK/68 H3 virusom (Slika 4 A i C). Kada je virusni titar procenjen u plućima sakupljenim 5. dana posle infekcije, molekuli oba antitela su smanjili virusni titar pluća, pri čemu je smanjenje izraženije sa ekvivalentnom dozom od 3 mg/kg. Kada poredimo BiS sa IgG, vidimo slična smanjenja virusnog titra u dve grupe, pri čemu životinje lečene sa GL20 imaju malo manji virusni titar na modelu H1, dok BiS pokazuje manji virusni titar na modelu H3 (Slika 4 B i D). Zajedno, ovi podaci pokazuju da GL20/39 BiS443/105 može da spreči letalnost i smanji virusnu replikaciji u plućima u sličnoj meri kao GL20 IgG.

Profilaktička aktivnost na infekciju gripom tip B

[0283] I GL20/39 BiS443/105 i matični FBC39 IgG pružaju zaštitu od letalne infekcije gripom tip B na način zavisan od doze. IP injekcija od 3 mg/kg ekvivalenta BiS molekula zaštitila je 100% životinja izazvanih virusima B/FLA/06 loze Jamagata i B/MAL/04 loze Viktorija (Slika 5 A i C, pune linije). Mada BiS i FBC39 sa dozom od 3 mg/kg pružaju potpunu zaštitu sa stopom preživljavanja od 100%, FBC39 pokazuje bolju zaštitu od FBC39 pri doznom nivou od 0,3 mg/kg kod oba modela infekcije gripom tip B. Kada je virusni titar u plućima procenjen 5. dana posle infekcije, molekuli oba antitela su smanjili virusni titar pluća, što je bilo najuočljivije sa dozom od 3 mg/kg ekvivalenta. Kada poredimo BiS sa IgG, vidimo slična smanjenja virusnog titra na modelu B/FLA/06 Jamagata infekcije, međutim, BiS je bio manje delotvoran od FBC39 u smanjenju virusnog titra u plućima miševa inficiranih B/Mal/04 Viktorija sojem (slika 5 B i D). Ovi podaci zajedno, na Slici 4 i 5 pokazuju da GL20/39 BiS443/105 može delotvorno da spreči letalnost i smanji virusnu replikaciju u plućima na modelu smrtonosne infekcije gripom tip A i B.

Primer 9. In vivo terapeutska zaštita Flu A+B BiS konstrukta u poređenju sa oseltamivirom na letalnom mišjem modelu infekcije gripom tip A i gripom tip B [0284] Kako bismo neposredno uporedili terapeutsku delotvornost BiS molekula sa mikromolekulskim inhibitorom NA, oseltamivirom, koristili smo mišji model infekcije gripom tip A i B.

Terapeutsko poređenje GL20/39 BiS443/105 i oseltamivira (Slika 5)

[0285] Miševi su inokulirani sa 2,5 MLD50A/WSN/33 H1 virusa ili 7 MLD50B/FLA/06 virusa loze Jamagata, a zatim lečeni jednom i.v. dozom sa 10 mg/kg ekvivalenta (14,1 mg/kg) GL20/39 BiS443/105 ili 25 mg/kg oseltamivira BID, oralno tokom 5 dana 1 dan, 2 dana, 3 dana ili 4 dana posle infekcije. Gubitak telesne težine i preživljavanje su praćeni kod 10 životinja po grupi, i 4 životinje su žrtvovane da bi se izmerio virusni titar u plućima, kako je prethodno opisano. Pored toga, neinvazivno očitavanje funkcije pluća, nivoa zasićenosti krvi kiseonikom izmereno je koristeći pulsnu oksimetriju (mišja oksimetrija) 6. dana posle infekcije za 4 životinje po grupi.

[0286] Lečenje BiS molekulom zaštitilo je 100% miševa od letalne infekcije sa A/WSN/33 ili B/FLA/06 kada se primenjuje 2. dana posle infekcije (Slika 6 A i B). Čak i kada je lečenje odloženo do 3. dana posle infekcije, BiS molekul i dalje sprečava letalnost kod 50% životinja inficiranih virusom gripa tip A ili B. Oseltamivir nije pokazao zaštitu na modelu infekcije gripom tip A kada je lečenje primenjeno 1. dana ili kasnije, međutim, pružao je dobru zaštitu sa stopom preživljavanja 90-100% kada je primena započeta 1. dana ili 2. dana posle infekcije gripom tip B. Mada je oseltamivir dobro štitio na modelu gripa tip B, BiS pokazuje trend za bolju zaštitu sa većom stopom preživljavanja od oseltamivira kada se primenjuje 2. dana, 3. dana i 4. dana posle infekcije (Slika 6 A i B).

[0287] Slika 6 (C i D) pokazuje virusni titar u plućima miševa lečenih BiS ili oseltamivirom 5 dana posle infekcije. Lečenje molekulom BiS u različitim terminima posle infekcije A/WSN/33 H1N1 virusom inhibiralo je virusnu replikaciju u plućima na način zavisan od vremena, počevši smanjenja virusa za više od 3 reda veličine kada je lečenje započeto 1. dana posle infekcije, do smanjenja virusnog titra za više od 1 reda veličine kada je lečenje započeto 4. dana posle infekcije (Slika 6 C). U poređenju sa oseltamivirom, molekul BiS pokazuje za 1-2 reda veličine veće smanjenje kada je lečenje započeto 2. dana, 3. dana ili 4. dana posle infekcije.

[0288] Kako bi se procenilo dejstvo različitog lečenja na funkciju pluća, nivo zasićenosti kiseonikom je meren pulsnom oksimetrijom (Slika 6 E i F). Inficirane životinje lečene samo nerelevantnim kontrolnim mAb pokazale su smanjenje procenta zasićenosti kiseonikom na 80%, za A/WSN/33 i 78% 6. dana posle infekcije u poređenju sa 98% za životinje koje prethodno nisu lečene. Lečenje sa GL20/39 BiS443/105 je sprečilo da nivoi zasićenosti kiseonikom padnu ispod 90% čak i kada je lečenje odloženo od 4. dana posle infekcije, dok životinje lečene oseltamivirom pokazuju smanjenu zasićenost kiseonikom sa sličnim nivoima kao kod životinja koje su lečene nerelevantnim kontrolnim mAb (Slika 6 E). Kada su miševi inficirani sa B/FLA/06, a zatim lečeni sa BiS ili oseltamivirom, oba agensa su zaštitila funkciju pluća, pri čemu životinje lečene sa BiS imaju malo veći nivo zasićenosti kiseonikom kada je lečenje započeto 1. dana posle infekcije (Slika 6 F). Kada je lečenje započeto 2. dana posle infekcije, životinje lečene sa BiS su pokazale značajno poboljšanu funkciju pluća kod 3 od 4 lečene životinje u odnosu na životinje lečene oseltamivirom (pros.92% prema 86%). Zajedno, ove dve studije pokazuju da GL20/39 BiS443/105 može da spreči letalnost, smanji virusni titar i zaštiti funkciju pluća kod životinja inficiranih letalnom dozom gripa tip A i B kada je lečenje započeto do 3. dana posle infekcije.

11

12

SEQ ID NO: 121 (FY1/39 Bis443/105 teški lanac)

12

Ċ

SEQ ID NO: 126 (GL20/39FTL Bis4 43/105 teški lanac)

12

SEQ ID NO:129 (GL20-FBC39 BiS5 - GL20VH - Fc (CH3-) - linker - FBC39 scFvlinker - Fc -CH3

SEQ ID NO: 131 (GL20VH BiS5 - Fc (CH3-) - linker - FBC39 (43-105) scFv - linker - Fc

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

�

��

�

1

�

1

11

12

1

14

1

�

11

��

�

��

1

�

1

�

1

11

��

�

14

1

�

1

11

��

1

14

1

�

2

21

22

�

��

2

�

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovani vezujući molekul koji se specifično vezuje za virus gripa tip A i virus gripa tip B, pri čemu je izolovani vezujući molekul izabran od:

(a) izolovanog vezujućeg molekula koji sadrži prvi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i da neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje 1 podtip grupe 2 virusa gripa tip A, pri čemu prvi vezujući domen sadrži domen Fv, i pri čemu prvi vezujući domen sadrži:

(i) VH teškog lanca antitela SEQ ID NO: 7 i VL lakog lanca antitela SEQ ID NO: 2; ili

(ii) VH teškog lanca antitela SEQ ID NO.: 17 i VL lakog lanca antitela SEQ ID NO.: 12; i

drugi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i da neutrališe virus gripa tip B u najmanje dve filogenetski različite loze, pri čemu drugi vezujući domen sadrži scFv, i pri čemu drugi vezujući domen sadrži:

(i) VH teškog lanca antitela SEQ ID NO: 59 i VL lakog lanca antitela SEQ ID NO: 54; ili

(b) izolovanog vezujućeg molekula koji sadrži prvi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i da neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje 1 podtip grupe 2 virusa gripa tip A, pri čemu prvi vezujući domen sadrži domen Fv, i pri čemu prvi vezujući domen sadrži:

drugi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip B i neutrališe virus gripa tip B u najmanje dve filogenetski različite loze, pri čemu drugi vezujući domen sadrži scFv, i pri čemu drugi vezujući domen sadrži:

(i) VH teškog lanca antitela SEQ ID NO: 27 i VL lakog lanca antitela SEQ ID NO: 22; ili

(c) izolovanog vezujućeg molekula koji sadrži prvi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za hemaglutinin (HA) virusa gripa tip A i da neutrališe najmanje jedan podtip grupe 1 i najmanje 1 podtip grupe 2 virusa gripa tip A, pri čemu prvi vezujući domen sadrži domen Fv, i pri čemu prvi vezujući domen sadrži:

(ii) VH teškog lanca antitela SEQ ID NO: 17 i VL lakog lanca antitela SEQ ID NO: 12; i

(i) VH teškog lanca antitela SEQ ID NO: 43 i VL lakog lanca antitela SEQ ID NO: 38; pri čemu prvi vezujući domen sadrži formulu VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, pri čemu, L1 i L2 su nezavisno linker, i scFv je drugi vezujući domen; i pri čemu VL scFv, drugog vezujućeg domena, sadrži cisteinski ostatak na poziciji izabranoj od 43, 44, 46, 49, 50 ili 100, i VH scFv drugog vezujućeg domena sadrži cisteinski ostatak na poziciji izabranoj od pozicije 43, 44, 100, 101 ili 105 (numeracija prema Kabatu).

2. Izolovani vezujući molekul prema zahtevu 1, izabran od izolovanog vezujućeg molekula koji sadrži:

(a) sekvencu lakog lanca SEQ ID NO.: 109 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO.:110; (b) sekvencu lakog lanca SEQ ID NO.: 120 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO.:121; (c) sekvencu lakog lanca SEQ ID NO.: 68 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO.:69; i (d) sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 125 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO.:126.

3. Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je prvi vezujući domen sposoban da neutrališe jedan ili više podtipova grupe 1 virusa gripa tip A izabranih od: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 i njihove varijante, i jedan ili više podtipova grupe 2 virusa gripa tip A izabranih od: H3, H4, H7, H10, H14 i H15 i njihovih varijanti, opciono, pri čemu je drugi vezujući domen sposoban da neutrališe virus gripa tip B u lozama Jamagata i Viktorija.

4. Izolovani polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira izolovani vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih zahteva.

5. Vektor koji sadrži polinukleotid iz zahteva 4.

6. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid iz zahteva 4.

7. Kompozicija koja sadrži izolovani vezujući molekul prema bilo kom od zahteva 1 do 3 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

8. Postupak za proizvodnju izolovanog molekula prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 6 u uslovima koji su pogodni za ekspresiju navedenog vezujućeg molekula.

9. Izolovani vezujući molekul prema bilo kom od zahteva 1 do 3 za upotrebu u profilaksi ili lečenju infekcije gripom tip A, gripom tip B ili njihove kombinacije.