BRPI0707290A2 - composições e métodos para humanização e otimização de n-glicanas em plantas - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSIçõES E MéTODOS PARA HUMANIZAçãO E OTIMIZAçãO DE N-GLICANAS EM PLANTAS<D>. A presente invenção refere-se a métodos para alterar o padrão de N-glicosilação de proteínas em plantas superiores. Os métodos compreendem introduzir na planta uma construção recombinante que proporciona a inibição da expressão da <244>1,3-fucosiltransferase (FucT) e <225>1,2-xiiosiltransferase (XylT) em uma planta. Também é descrito o uso destas construções para inibir ou suprimir a expressão de ambas as enzimas, e isoformas destas, proporcionando vantajosamente a produção de proteínas endógenas e heterólogas que tenham um padrão de N-glicosilação "humanizado" sem maiores conseqüências para o crescimento e desenvolvimento da planta. A presente invenção refere-se ainda a plantas superiores transformadas de maneira estável que tenham este padrão de N-glicosilação de proteínas. Composições de glicoproteinas, incluindo composições de anticorpos monoclonais, que tenham perfis de glicosilação consideravelmente homogêneos, e os quais são consideravelmente homogêneos para a glico-forma GO, são também fornecidos de acordo com a invenção.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA HUMANIZAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE N-GLI CANAS EM PLANTAS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção é relacionada ao campo da biologiamolecular vegetal, mais particularmente ao campo deprodução recombinante de proteínas de mamíferos em plantas. ;

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Um número de espécies vegetais foi visado para uso em"cultivo molecular" de proteínas de mamíferos de interessefarmacêutico. Esses sistemas de expressão vegetais provêmprodução de proteínas de mamíferos biologicamente ativas abaixo custo e são prontamente viáveis para implementaçãorápida e econômica (Ma et al. (2003) Nat. Rev. Genet.4:794-805; Raskin et al. (2002) Trends Biotechnol. 20:522-531) . Grandes números de proteínas vegetais e de mamíferosrequerem processamento pós-tradução para dobramento,agrupamento, e função corretos. Dessas modificações, asdiferenças em padrões de glicosilação entre plantas emamíferos oferecem um desafio à exeqüibilidade de sistemasde expressão vegetais para produzir proteínas de mamíferosrecombinantes de alta qualidade para uso farmacêutico.

À medida que peptídeos se movem através do retículoendoplasmático (ER) e compartimentos subcelulares de Golgi,cadeias de resíduos de açúcar, ou glicanas, são anexadas,levando, em última instância, à formação de glicoproteínas.A ligação entre as cadeias de açúcar e o peptideo ocorrepela formação de uma ligação química a apenas um dos quatroaminoácidos da proteína: asparagina, serina, treonina, ehidroxilisina. Baseado nesse padrão de ligação, dois tipos básicos de cadeias de resíduos de açúcar em glicoproteínasforam reconhecidos: a cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo (também referida como glicana N-Iigada ou N-glicana), que se liga a resíduos de asparagina no peptideo;e a cadeia de açúcar ligada a O-glicosídeo, que se liga a resíduos de serina, treonina, e hidroxilisina no peptideo.

As cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo, ou N-glicanas, possuem várias estruturas (ver, por exemplo,Takahashi, ed. (1989) Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (GakujutsuShuppan Center), mas compartilham um núcleo monossacarídicocomum (ver Figura 2 9A) . As etapas iniciais na via deglicosilação levando à formação de N-glicanas sãoconservadas em plantas e animais. Contudo, as etapas finais envolvidas na formação de N-glicanas complexas diferem(Lerouge et al. (1998) Plant Mo. Biol. 38:31-48;Steinkellner and Strasser (2003) Ann. Plant Rev. 9: 181-192) . Plantas produzem glicoproteínas com N-glicanascomplexas tendo um núcleo abrigando dois resíduos de N- acetilglucosamina (GlcNAc) que são similares àquelesobservados em mamíferos. Contudo, em glicoproteínasvegetais, esse núcleo é substituído por um resíduo dexilose βl,2-ligado (xilose núcleo), cujo resíduo não ocorreem humanos, Lewisa epitopos, e uma fucose al,3-ligada (α[1,3]-fucose núcleo) ao invés de uma fucose núcelo ai, 6-ligada como em mamíferos (ver, por exemplo, Lerouge et al.(1998) Plant Mol. Biol. 38:31-48 para uma revisão) (vertambém a Figura 29B) . Ambos resíduos de α (1,3)-fucose eβ(1,2)-xilose são reportadamente, pelo menos parcialmente,responsáveis pela imunogenicidade de glicoproteínasvegetais em mamíferos (ver, por exemplo, Ree et al. (2000)J. Biol. Chem. 15: 11451-11458; Bardor et al. (2003)Glycobiol. 13:427-434; Garcia-Casado et al. (1996)Glycobiol. 6:471-477). Portanto a remoção desses resíduosde açúcar potencialmente alergênicos de glicoproteínas demamíferos produzidas de forma recombinante em plantassuperaria preocupações sobre o uso dessas proteínas comofarmacêuticos para tratamento de humanos.

Um número de glicoproteínas produzidas de formarecombinante atualmente servem como terapêuticos ou estãosob investigação clínica. Exemplos incluem os interferons(IFNs), eritropoietina (EPO), ativado de tecidoplasminogênico (tPA), antitrombina, fator estimulador degranulócito de colônia de macrófagos (GM-CSF), e anticorposterapêuticos monoclonais (mABs). 0 componente

oligossacarídeo das estruturas N-glicanas de glicoproteínaspode influenciar sua eficácia terapêutica, assim como suaestabilidade física, resistência a ataque de protease,farmacocinética, interação com o sistema imune, e atividadebiológica específica. Ver, por exemplo, Jenkins et . al.(1996) Nature Biotechnol. 14:975-981.

Métodos são necessários para alterar o padrão deglicosilação em sistemas de expressão vegetais,especificamente para inibir glicosilação especifica deplanta da estrutura núcleo eucarionte, para produzirvantajosamente proteínas de mamíferos recombinantes com umpadrão de glicosilação humanizado.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Métodos para alterar o padrão de N-glicosilação deproteínas em vegetais superiores são providos. Os métodoscompreendem transformar estavelmente a planta com pelomenos um constructo de nucleotídeo recombinante queprovenha inibição de expressão de al,3-fucosiltransferase(FucT) e β1,2-xilosiltransferase (XylT) em uma planta. Ouso desses constructos para inibir ou suprimir a expressãode um ou ambas essas enzimas, e isoformas dessas,vantajosamente provê a produção de proteínas endógenas eheterólogas tendo um padrão de N-glicosilação "humanizado"sem causar impacto no crescimento e desenvolvimentovegetal. Plantas superiores estavelmente transformadastendo esse padrão de N-glicosilação de proteína sãoprovidas. Em alguns avanços, a planta é uma planta decultivo que é um membro das dicotiledôneas, tal comoervilha, alfafa, e tabaco; em outros avanços, a planta éuma planta de cultivo que é uma monocotiledônea, tal comoarroz ou milho. Ainda em outros avanços, a planta é ummembro da família Lemnaceae, por exemplo, Lemna sp.

As plantas transgênicas da invenção possuem ahabilidade de produzir proteínas de mamíferos recombinantestendo um padrão de N-glicosilação que é mais similar àqueledo mamífero hospedeiro. Assim, em alguns avanços, asproteínas de mamíferos produzidas de forma recombinante sãoglicoproteínas compreendendo N-glicanas complexas tendo umaredução na anexação de resíduos de α(1,3)-fucose e β(1,2)-xilose específicos de plantas. Em outros avanços, essasglicoproteínas produzidas de forma recombinante compreendemN-glicanas complexas que são desprovidas desses resíduosespecíficos de plantas. Ainda em outros avanços, essasglicoproteínas produzidas de forma recombinante possuemGlcNAc2Man3GlcNAc2 como a única espécie de glicana anexadaao(s) sítio(s) de glicosilação de asparagina naglicoproteína.

Em alguns avanços, a glicoproteína produzida de formarecombinante é um anticorpo monoclonal. Dessa maneira, apresente invenção provê plantas transgênicas que sãocapazes de produzir anticorpos monoclonais glicanaotimizados que se ligam especificamente a uma proteína alvode interesse, incluindo anticorpos monoclonais tendo funçãoefetora aumentada. Assim, em alguns avanços, os anticorposmonoclonais glicana otimizados produzidos de formarecombinante compreendem N-glicanas complexas que possuemuma redução na anexação de resíduos de fucose α (1,3)-ligados, aumentando, dessa forma, a atividade de ADCCdesses anticorpos. Em outros avanços, os anticorposmonoclonais produzidos de forma recombinante compreendemglicanas N-Iigadas complexas que são desprovidas dessesresíduos de fucose específicos de plantas. Dessa maneira, apresente invenção provê a produção de uma composição deanticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que pelomenos 90% ou mais do anticorpo intacto é representado poruma única glicoforma, mais particularmente, a glicoformaGO. Assim, em alguns avanços da invenção, os anticorposmonoclonais produzidos de forma recombinante possuem funçãoefetora aumentada, caracterizado pelo fato de que aatividade de ADCC é aumentada e/ou a razão de atividade deADCC/CDC é aumentada. Em alguns desses avanços, osanticorpos monoclonais produzidos de forma recombinantepossuem atividade de CDC diminuída, o que pode reduzirvantajosamente o potencial para efeitos colaterais adversosrelacionados à ativação de CDC com a administração. Essesanticorpos monoclonais glicana otimizados pode ser usadosvantajosamente para alterar rotas correntes deadministração e regimes terapêuticos atuais, já que suafunção efetora aumentada significa que podem ser dosados emconcentrações mais baixas e menos freqüentemente,reduzindo, dessa forma, o potencial para toxicidade deanticorpo e/ou desenvolvimento de tolerância a anticorpo.Adicionalmente, sua função efetora melhora permite novasabordagens para tratar indicações clínicas que forampreviamente resistentes ou refratárias a tratamento com oanticorpo monoclonal correspondente produzido em outrossistemas hospedeiros recombinantes.

Composições para praticar os métodos da invenção sãoprovidas. As composições compreendem novos polinucleotídeose polipeptídeos isolados codificando uma al,3-fucosiltransferase e βΐ,2-xilosiltransferase de Lemnaminor, e variantes e fragmentos dessas. Constructos denucleotídeos recombinantes que direcionam a expressãodessas duas proteínas, ou expressão de variantes dessas,são também providos, assim como células vegetais, tecidosvegetais, plantas, e sementes compreendendo essesconstructos recombinantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FORMAIS

A Figura 1 apresenta as seqüências de DNA (SEQ ID NO:1; seqüência codificadora relatada em SEQ ID N0:2) e deaminoácidos (SEQ ID NO:3) para a αϊ,3-fucosiltransferase(FucT) de Lemna minor. A seqüência codificadora estáapresentada em negrito. Nucleotideos indicados pelosublinhado simples ( - ) correspondem ao fragmento diretoFucT no cassete de expressão de RNAi projetado para inibira expressão de FucT (ver figura 5); nucleotídeos indicadospelo sublinhado duplo (=) correspondem à seqüênciaespaçadora nesse cassete de expressão de RNAi. 0 fragmentoreverso FucT do cassete de expressão de RNAi é anti-sensodo FucT fragmento direto FucT apresentado aqui.

A Figura 2 apresenta um alinhamento de FucT de Lemnaminor de SEQ ID NO: 3 com αϊ, 3-f ucosiltransf erases deoutras plantas superiores, com alinhamento positivo totalde 89,2% e alinhamento de identidade total de 41,1%.

A Figura 3 apresenta a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 4;seqüência codificadora apresentada em SEQ ID NO:5) para aisoforma #1 de βΐ,2-xilosiltransferase (XylT) de Lemnaminor e a seqüência de aminoácidos codificada (SEQ IDNO:6). Nucleotídeos indicados pelo sublinhado simples ( - )correspondem ao fragmento direto XylT no cassete deexpressão de RNAi projetado para inibir a expressão de XylT(ver figura 6); nucleotideos indicados pelo sublinhadoduplo (=) correspondem à seqüência espaçadora neste cassetede expressão de RNAi. 0 fragmento reverso XylT do cassetede expressão de RNAi é o anti-senso do fragmento diretoXylT apresentado aqui.

A Figura 4 apresenta um alinhamento do XylT de Lemnaminor de SEQ ID NO: 6 com β1, 2-xilosiltransferases deoutras plantas superiores, com alinhamento positivo totalde 76,6% e alinhamento de identidade total de 33,7%.

A Figura 5 apresenta uma estratégia para projetar umknockout de RNAi de gene simples de FucT de Leiuna Kiinor. Ocassete de expressão de RNAi de fucosiltransferase (FucT)foi projetado para expressar um RNA hairpin com 730 pb deseqüência de RNA de dupla-fita e uma seqüência deespaçamento de 458 pb. O cassete de expressão de RNAicompreende um fragmento de sentido direto de FucT (nt 255-985 de SEQ ID NO: 1), a seqüência de espaçamento (nt 986-1444 de SEQ ID NO: l)e o fragmento de sentido reverso deFucT (versão anti-senso de nt 255-985 de SEQ ID NO: 1)

A Figura 6 apresenta uma estratégia para projetar umknockout de RNAi de gene simples de XylT de Lemna minorbaseado na seqüência de DNA para a isoforma #1 de XylT. Ocassete de expressão de RNAi de xilosiltransferase (XylT)foi projetado para expressar um RNA hairpin com 734 pb deseqüência de RNA de dupla-fita e uma seqüência deespaçamento de 547 pb. O cassete de expressão de RNAicompreende um fragmento de sentido direto de XylT (nt 318-1052 de SEQ ID NO: 4), a seqüência de espaçamento (nt 1053-1599 de SEQ ID NO: 4)e o fragmento de sentido reverso deXylT (versão anti-senso de nt 318-1052 de SEQ ID NO: 4)

A Figura 7 apresenta uma estratégia para projetar umknockout de RNAi de gene duplo de FucT e XylT de Lemnaminor onde a porção XylT do knockout de RNAi é baseada naseqüência de DNA para a isoforma $1 de XylT. O cassete deexpressão de RNAi quimérico de FucT + XylT foi projetadopara expressar um RNA hairpin com 602 pb de seqüência deFucT de dupla-fita, 626 pb de seqüência de XylT de dupla-fita, e uma seqüência de espaçamento de 500 pb. O cassetede expressão de RNAi compreende na direção 5' - 3' eoperacionalmente ligados: o fragmento de sentido direto deFucT (nt 254-855 de SEQ ID NO: 1), o fragmento de sentidodireto de XylT (nt 318-934 de SEQ ID NO: 4), a seqüênciade espaçamento (nt 944-1443 de SEQ ID NO: 4), o fragmentode sentido reverso de XylT (versão anti-senso de nt 318-943de SEQ ID NO: 4) e o fragmento de sentido reverso de FucT(versão anti-senso de nt 254-855 de SEQ ID NO: 1) .

A Figura 8 mostra o constructo Fuc02 compreendendo umcassete de expressão de RNAi projetado para knockout deRNAi de gene simples de FucT de Lemna minor. A expressão daseqüência inibidora de FucT (indicada pelas setas de FucTdireto e FucT reverso; ver figura 5) é dirigida por umelemento controle de expressão operacionalmente ligado(indicado como AocsAocsAocsAmasPmas) compreendendo trêsseqüências de ativação acima (Aocs) derivadas do gene deoctopina sintase de Agrobacterium tumefaciensoperacionalmente ligado a um promotor derivado de um genede manopina sintase de Agrobacterium tumefaciens (AmasPmas) . Lider de RbcS, seqüência líder de subunidadepequena de rubisco; ADHl, intron de gene de álcooldesidrogenase 1 de milho; nos-ter, seqüência terminadora denopalina sintetase de Agrobacterium tumefacians (nos).

A Figura 9 mostra o constructo Xyl02 compreendendo umcassete de expressão de RNAi projetado para knockout deRNAi de gene simples de XylT de Lemna minor. A expressão daseqüência inibidora de XylT (indicada pelas setas XylTdireto e XylT reverso; ver figura 6) é dirigida pelo elemento controle de expressão AocsAocsAocsAmasPmasoperacionalmente ligado. Lider de RbcS, seqüência líder desubunidade pequena de rubisco; ADHl, intron de gene deálcool desidrogenase de milho; nos-ter, seqüênciaterminadora de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefacians (nos).

A Figura 10 mostra o constructo XF02 compreendendo umcassete de expressão quimérico de RNAi projetado paraknockout de RNAi de gene duplo de FucT/XylT de Lemna minor.

O RNA hairpin é expresso como uma seqüência quimérica (umRNA hairpin quimérico), onde fragmentos dos dois genes sãofusionados juntos e expressos como um transcrito. Aexpressão da seqüência inibidora de FucT/XylT (indicada porsetas para frente FucT e XylT e setas reversas XylT e FucT; ver figura 7) é dirigido pelo elemento controle deexpressão AocsAocsAocsAmasPmas operacionalmente ligado.Líder de RbcS, seqüência líder de subunidade pequena derubisco; ADH1, íntron de gene de álcool desidrogenase demilho; nos-ter, seqüência terminadora de nopalina sintetasede Agrobacterium tumefacians (nos).

A Figura 11 mostra o constructo XF03 compreendendo umcassete de expressão de RNAi projetado para knockout deRNAi de gene duplo de FucT/XylT de Lemna minor. O casseteexpressa dois.RNAi hairpins, um direcionando a expressão deFucT, o outros direcionando a expressão de XylT. Aexpressão da seqüência inibidora de FucT (indicado pelassetas FucT direto e FucT reversa; ver figura 5) é dirigidopor um elemento controle de expressão operacionalmenteligado compreendendo o promotor de ubiquitina de Lemnaminor mais 5' UTR (promotor de LmUbq) e íntron (íntronLmUbq) (ver SEQ ID NO: 7) . A expressão da seqüênciainibidora de XylT (indicada pelas setas XylT direto e XylTreversa; ver figura 6) é dirigida pelo elemento controle deexpressão AocsAocsAocsAmasPmas operacionalmente ligado.Líder de RbcS, seqüência líder de subunidade pequena derubisco; ADH1, íntron de gene de álcool desidrogenase demilho; nos-ter, seqüência terminadora de nopalina sintetasede Agrobacterium tumefacians (nos).

A Figura 12 mostra o constructo mAbI04 que provê a co-expressão de um anticorpo monoclonal IgGl (aqui referidocomo mAbl) e o knockout de gene duplo de FucT e XylT deLemna minor, caracterizado pelo fato de que um RNA hairpinquimérico direcionando a expressão do FucT e XylT éexpresso. A expressão da seqüência inibidora de FucT/XylT(indicada pelas setas FucT e XylT direto e XylT e FucTreversas; ver figura 7) é dirigida por um elemento controlede expressão operacionalmente ligado compreendendo opromotor de ubiquitina de Spirodella polyrrhiza mais 5' UTR(promotor de SpUbq) e intron (intron SpUbq) (ver SEQ IDN0:8). A expressão da cadeia leve de IgGl é dirigida por umelemento controle de expressão operacionalmente ligadocompreendendo o promotor de ubiquitina de L.minor mais 5'UTR (promotor de LmUbq) e intron (intron LmUbq) . Aexpressão da cadeia pesada de IgGl é dirigida pelo elementocontrole de expressão AocsAocsAocsAmasPmas operacionalmenteligado. Lider de RbcS, seqüência lider de subunidadepequena de rubisco; ADHl, intron de gene de álcool desidrogenase de milho; nos- ter, seqüência terminadora denopalina sintetase (nos) de Agrobacterium tumefacians.

A Figura 13 mostra o constructo mAbl05 que provê a co-expressão de mAbl e o knockout duplo de FucT e XylT deLemna minor, caracterizado pelo fato de que dois RNAshairpin são expressos, um direcionando a expressão de FucT,o outro direcionando a expressão do XylT. A expressão daseqüência inibidora de FucT (indicada pelas setas FucTdireto e FucT reversa; ver figura 5) é dirigida por umelemento controle de expressão operacionalmente ligadocompreendendo o promotor de ubiquitina de S.polyrrhiza mais5' UTR (promotor de SpUbq) e intron (intron SpUbq) . Aexpressão da seqüência inibidora de XylT (indicada pelassetas XylT direto e XylT reversa; ver figura 6) é dirigidapor um elemento controle de expressão operacionalmenteligado compreendendo o promotor de ubiquitina de Lemnaaequinoctialis mais 5' UTR (promotor de Laübq) e intron(intron Laübq) (ver SEQ ID NO:9). A expressão da cadeialeve de IgGl é dirigida por um elemento controle deexpressão operacionalmente ligado compreendendo o promotorde ubiquitina de L.minor mais 5' UTR (promotor de LmUbq) eintron (intron LmUbq). A expressão da cadeia pesada de IgGlé dirigida pelo elemento controle de expressãoAocsAocsAocsAmasPmas operacionalmente ligado. Lider deRbcS, seqüência líder de subunidade pequena de rubisco;ADH1, intron de gene de álcool desidrogenase de milho; nos-ter, seqüência terminadora de nopalina sintetase (nos) deAgrobacterium tumefacians.

A Figura 14 mostra o constructo mAblOl que provê aexpressão de mAbl, onde a expressão de FucT e XylT não ésuprimida. A expressão da cadeia leve de IgGl e cadeiapesada de IgGl é independentemente dirigida pelo elementocontrole de expressão AocsAocsAocsAmasPmas operacionalmenteligado. Líder de RbcS, seqüência líder de subunidadepequena de rubisco; ADHl, intron de gene de álcooldesidrogenase de milho; nos-ter, seqüência terminadora denopalina sintetase (nos) de Agrobacterium tumefacians.mAblOl é referido como o constructo mAblOl "de tiposelvagem" já que o mAbl expresso exibe o perfil deglicosilação de L.minor de tipo selvagem.

As Figuras 15 e 16 mostram os dados primários derastreamento para linhagens de plantas de L.minor de RNAitransgênico compreendendo o constructo XF02 da Figura 10.A Figura 17 mostra dados primários de rastreamentopara linhagens de plantas de L.minor de RNAi transgênicocompreendendo o constructo mAbl04 da Figura 12 e oconstructo mAbl05 da Figura 13.

A Figura 18 mostra a estrutura e peso molecular das N-glicanas mAb derivadas de L.minor de tipo selvagem. "GnGn"representa a espécie de N-glicana GlcNAc2Man3GlcNAc2, tambémreferida como uma espécie N-glicana GO. "GnGnX" representa a espécie N-glicana GlcNAc2Man3GlcNAc2 com o resíduo β (1,2)-xilose específico de planta anexado. "GnGnXF" representa aespécie N-glicana GlcNAc2Man3GlcNAc2 com o resíduo β (1,2)-xilose específico de planta e o resíduo α(1,3)-fucoseespecífico de planta anexados.

A Figura 19 mostra que o constructo mAblOl de tiposelvagem (mostrado na Figura 15) provendo a expressão doanticorpo monoclonal IgGl mAbl em L.minor, sem a supressãode RNAi de FucT e XylT de L.minor, produz um perfil de N- glicosilação com três principais espécies N-glicanas,incluindo uma espécie tendo xilose βl,2-ligada e umaespécie tendo ambos resíduos de xilose βl,2-ligada e fucosenúcleo ai,3-ligada; este perfil é confirmado comespectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) de N-glicanas. 2AA de mAblOl (Figura 20) e análise MALDI(Figura 21) de N-glicanas mAblOl (WT) confirma osresultados de LC-MS.

A Figura 22 mostra uma sobreposição das quantidadesrelativas das várias espécies N-glicanas de mAbl produzidasna linhagem de L.minor de tipo selvagem compreendendo oconstructo mAblOl (sem supressão de FucT ou XylT) e nasduas linhagens de L.minor transgênicas compreendendo oconstructo mAbl04 da Figura 12 (provendo a co-expressão demAbl e o constructo de RNAi quimérico direcionando tantoFucT e XlT de L.minor) . Note o enriquecimento das espéciesglicanas GnGn (i.e., GO), sem resíduos de xilose β1,2-ligada ou fucose núcleo al,3-ligada anexados, e a ausênciadas espécies tendo a xilose pi,2-ligada ou ambos resíduosde xilose pi,2-ligada ou fucose núcleo al,3-ligada. "MGn"representa um N-glicana precursora, caracterizado pelo fatode que a estrutura núcleo de trimanose, MansGlcNAc2, possuiuma N-acetilglucosamina anexada à ramificação 1,3 manose."GnM" representa uma N-glicana precursora, caracterizadopelo fato de que a estrutura núcleo de trimanose,MansGlcNAc2, possui uma N-acetilglucosamina anexada àramificação 1,6 manose. Esses precursores de N-glicanarepresentam uma quantidade traço das N-glicanas totaispresentes na amostra. Esse perfil é confirmado comespectrometria de massa (LC-MS) de N-glicanas 2 AA delinhagens mAbI04 (Figura 23) e análise MALDI (Figura 24) deN-glicanas mAblOl e mAbI04. A Figura 25 mostra análise de massa intacta decomposições mAbl produzidas em L.minor de tipo selvagem(linhagem 20) compreendendo o constructo mAblOl. Quando aexpressão de XylT e FucT não é suprimida em L.minor, acomposição mAbl produzida de forma recombinante éheterogênea, compreendendo pelo menos 9 diferentesglicoformas, com a glicoforma GOXF3 sendo a espéciepredominante presente. Note o pico muito pequenorepresentando a glicoforma GO.

A Figura 26 mostra análise de massa intacta decomposições mAbl produzidas em L.minor transgênicas(linhagem 15) compreendendo o constructo mAbI04 da Figura12. Quando a expressão de XylT e FucT é suprimida emL.minor usando esse constructo de RNAi quimérico, acomposição mAbl intacta é substancialmente homogênea paraN-glicanas GO, com apenas quantidades traço de N-glicanasprecursoras presentes (representadas pelas espéciesglicanas precursoras GnM e MGn) . Além disso, a composiçãomAbl é substancialmente homogênea para a glicoforma GO,caracterizado pelo fato de que ambos sítios de glicosilaçãosão ocupados pela espécie JV-glicana GO, com três picospequenos refletindo quantidades traço de glicoformasprecursoras (um pico mostrando mAbl tendo uma região Fc,caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 de uma cadeiapesada possui uma espécie glicana GO anexada a Asn 297, e odomínio CH2 da outra cadeia pesada é não glicosilada; outropico mostrando mAbl tendo uma região Fc, caracterizado pelofato de que o domínio CH2 de uma cadeia pesada possui umaespécie glicana GO anexada a Asn 297, e o domínio CH2 daoutra cadeia pesada possui a glicana precursora GnM ou MGnanexada a Asn 2 97; e outro pico mostrando mAbl tendo umaregião Fc, caracterizado pelo fato de que o sítio deglicosilação de Asn 297 em cada dos domínios CH2 possui umaespécie glicana GO anexada, com uma terceira espécieglicana GO anexada a um sítio de glicosilação adicional naestrutura mAbl).A Figura 27 mostra a análise de massa intacta dascomposições mAbl produzidas em L.minor transgênica(linhagem 72) compreendendo o constructo mAbI05 da Figura13. Quando a expressão de XylT e FucT é suprimida emL.minor usando este constructo, a composição mAbl intacta ésubstancialmente homogênea para N-glicanas GO, com apenasquantidades traço de espécies N-glicanas precursoraspresentes (representadas pelas espécies glicanasprecursoras GnM e MGn) . Além disso, a composição mAbl ésubstancialmente homogênea (pelo menos 90%) para aglicoforma GO, com os mesmos três picos refletindoglicoformas precursoras como obtido com o constructomAbI04.

A Figura 28 resume dois projetos possíveis paradirecionar a expressão de genes de FucT e XylT individuais.

Possível desenho 1 (Para direcionar genes individuais;aplicável para ambas seqüências): primeiro clonar aseqüência de comprimento total na orientação anti-senso,então clonar a metade 3' da seqüência a jusante daseqüência de comprimento total, mas na orientação senso.Desse jeito, a metade 3' da seqüência (e.g. nt 950-1860)irá formar a ramificação dsRNA no hpRNA, e a metade 5' daseqüência irá atuar como uma seqüência de espaçamento. Aregião 3' é escolhida, já que essa região é relativamenteconservada entre diferentes espécies vegetais(especialmente para FucT) comparada com a região 5'.Possível desenho 2 (Para direcionar ambos os genes):fusionar uma seqüência de 500 pb de FucT com uma seqüênciade 500 pb de XylT, e, então, usar a seqüência de fusão parapreparar as construções de hpRNA mostrados. A seqüênciaentre nt 700 e nt 1400 representa uma região (especialmentepara FucT) que é relativamente conservada entre diferentesespécies vegetais e é, assim, representativa de um alvopotencialmente bom. Ambas versões mostradas abaixo podemser preparadas para usò juntas para maximizarpotencialmente o silenciamento, já que os resultadospreliminares mostram que a seqüência adjacente à seqüênciade espaçamento aparenta dar melhor silenciamento do que aseqüência distai na construção de hpRNA.

A Figura 29A mostra a estrutura núcleo oligomanosídicacomum de N-glicanas complexas de glicoproteinas produzidasem plantas e animais. Em mamíferos, a estrutura núcleo podeincluir um resido de fucose no qual a posição 1 da fucose éligada à posição 6 da N-acetilgucosamina na extremidaderedutora através de uma ligação α (i.e., fucose α (1,6)-ligada). A figura 29B mostra as modificações específicas deplantas pata essas N-glicanas. Os grupos R de mamíferospodem ser um dos seguintes: (a) R=GlcNAcβ (1,2) ; (b)R=Galp(1,4)-GlcNAcP(1,2); (c) R=NeuAca(2,3)-Gaip(1,4)-GlcNAcp(1,2); (d) R=NeuGca(2,3)-Gaip(1,4)-GlcNAcP(1,2); e(e) R=Gala(l,3)-Galp(1,4)-GlcNAcp(1,2). Os grupos Rvegetais podem ser um dos seguintes: (a) R=null; (b)R=GlcNAcp(1,2);<formula>formula see original document page 20</formula>

Abreviações: Man, manose; GlcNAc, N-acetilglucosamina; Xyl,xilose; Fuc, fucose; Gal, galactose; NeuAc (ácidoneuraminico (ácido siálico); *, extremidade redutora dacadeia de açúcar que se liga a asparagina.

A Figura 30 mostra as espécies GO, GOX, e GOXF3 deglicanas W-Iigadas de glicoproteinas referidas como nadescrição e reivindicações da presente invenção, junto coma nomenclatura alternada aqui usada.

A Figura 31 apresenta a seqüência de cDNA parcial (SEQID NO: 19; seqüência codificadora apresentada em SEQ IDN0:20) para a isoforma #2 de βΐ,2-xilosiltransferase (XylT)de Lemna minor, e seqüência de aminoácidos parcial (SEQ IDNO:21) codificada dessa forma. Nucleotideos indicados pelosublinhado simples ( - ) correspondem ao fragmento XylTdireto no cassete de expressão de RNAi projetado parainibir a expressão de XylT (ver figura 33); nucleotideosindicados pelo sublinhado duplo (=) correspondem àseqüência espaçadora nesse cassete de expressão de RNAi. 0fragmento reverso XylT do cassete de expressão de RNAi é oanti-senso do fragmento direto XylT mostrado aqui.

A Figura 32 apresenta um alinhamento da isoforma #1 deXylT de Lemna minor de SEQ ID NO: 6 com a isoforma #2 deXylT de comprimento parcial de Lemna minor de SEQ ID NO: 21.A Figura 33 apresenta uma estratégia para projetar umknockout de RNAi de gene simples de XylT de Lemna minorbaseado na seqüência parcial de DNA para a isoforma #1 deXylT.

O cassete de expressão de RNAi de xilosiltransferase(XylT) foi desenhado para expressar um RNA hairpin com 734pb de seqüência de RNA de dupla-fita e uma seqüência deespaçamento de 547 pb, baseadas na seqüência de DNA parcialda isoforma #2 de XylT. O cassete de expressão de RNAicompreende o fragmento de sentido direto de XylT (nt 1-734de SEQ ID NO: 19) , a seqüência de espaçamento (nt 735-1282de SEQ ID NO: 19) e o fragmento de sentido reverso de XylT(versão anti-senso de nt 1-734 de SEQ ID NO: 19)

A Figura 34 apresenta uma estratégia para projetar umknockout de RNAi de gene duplo de FucT e XylT de Lemnaminor, onde a porção XylT do knockout de RNAi é baseada naseqüência parcial de de DNA para a isoforma #2 de XylT.

O cassete de expressão de RNAi quimérico de FucT +XylT foi desenhado para expressar um RNA hairpin com 602 pbde seqüência de FucT de dupla-fita, 626 pb de seqüência deXylT de dupla-fita, e uma seqüência de espaçamento de 500pb. O cassete de expressão de RNAi engloba na direção 5' -3' e operacionalmente ligados: o fragmento de sentidodireto de FucT (nt 254-855 de SEQ ID NO: 1), o fragmentode sentido direto de XylT da isoforma #2 (nt 1-626 de SEQID NO: 19), uma seqüência de espaçamento (nt 627-1126 deSEQ ID NO: 19) , o fragmento de sentido reverso de XylT(versão anti-senso de nt 1-626 de SEQ ID NO: 19) e ofragmento de sentido reverso de FucT (versão anti-senso dent 254-855 de SEQ ID NO: 1).

A Figura 35 mostra atividade de ligação de receptor doproduto mAbl derivado de CHO e SP2/0 para FcYRIIIa emcélulas NK humanas frescas isoladas.

A Figura.36 mostra atividade de ligação de receptor doproduto mAbl de tipo selvagem derivado de Lemna e o produtomAbl transgênico derivado de Lemna para FcYRIIIa em célulasNK humanas frescas isoladas coletadas do Doador 1.

A Figura 37 mostra atividade de ligação de receptor doproduto mAbl de tipo selvagem derivado de Lemna e o produtomAbl transgênico derivado de Lemna para FcYRIIIa em célulasNK humanas frescas isoladas coletadas dos doadores 2 e 3.

A Figura 38 mostra atividade de ligação de receptor doproduto mAbl derivado de Sp2/0, o produto mAbl de tiposelvagem derivado de Lemnaf e o o produto mAbl transgênicoderivado de Lemna para FcyRIV de camundongo.

A Figura 39 mostra um diagrama do vetor de expressãobinário MDXA04 para silenciamento de RNAi de atividade deFucT e XylT em Lemna. Regiões eclodidas mostram a posiçãodas seqüências gênicas de região variável de cadeia pesada(H) e leve (L) de anticorpo MDX-060 capa de mAblcompletamente humano e o RNA hairpin quimérico (RNAi)projetados para direcionar o silenciamento de genesendógenos de Lemna codificando FucT e XylT. Promotores: PI,P2, e P3; terminador: T; marcador selecionável: SM; limiteda esquerda: LB; limite da direita, RB. O vetor deexpressão MDXAOl usado para expressar o mAb MDX-060 emLemna de tipo selvagem não contém a região RNA hairpin.

A Figura 40 mostra atividade de glicosiltransferase emlinhagens de Lemna de tipo selvagem e RNAi de MDX-060LEXopt. Membranas microssomais de plantas (WT) de tiposelvagem e RNAi de MDX-060 LEX0pt (os números das linhagensestão indicados) foram incubadas na presença de um tampãode reação contendo GDP-Fuc, UDP-Xyl e GnGn-dabsil-peptídeoaceptor. Picos de massa correspondendo a produtosfucosilados (barras brancas) ou xilosilados (barras pretas)sintetisados por microssomas de cada linhagem foram medidospelo modo de positive reflectron mode MALDI-TOF MS enormalizados, em porcentagem, ao controle positivo WT.Membranas fervidas de tipo selvgem (BWT) indicam contagensde ions da base.

A Figura 41 mostra SDS-PAGE de extratos vegetais eamostras purificadas de proteína A ou hidroxiapatita deMDX-060 LEX0pt sob condições não redutoras (Figura 41A) econdições redutoras (Figura 41B), respectivamente. MAbpurificado de uma linhagem de células CHO (MDX-060 CHO) foiusado como controle positivo. Marcadores de peso molecularMarkl2 foram incluídos nos géis. Os géis foram coloridoscom Colloidal Blue.A Figura 42 mostra os espectros obtidos a partir daanálise espectrométrica de massa de modo negativo dereflectron mode MALDI- TOF de N-glicanas rotuladas com 2-AAliberadas a partir de mAbs MDX-060 expressos em CHO (MDX-060 CHO), Lemna de tipo selvagem (MDX-060 LEX), ou Lemnatransformada com o constructo de RNAi de XylT/FucT (MDX-060LEXopt) . Picos significativos são identificados pela massacorrespondente ([M-H]"). 0 * indica a localização dosartefatos da matriz.

A Figura 43 mostra os espectros obtidos a partir daanálise MS de NP-HPLC-QTOF de N-glicanas rotuladas com 2-AAliberadas a partir de mAbs MDX-060 expressos em CHO (MDX-060 CHO) , Lemna de tipo selvagem (MDX-060 LEX), ou Lemnatransformada com o constructo de RNAi de XylT/FucT (MDX-060LEX0pt) . N-glicanas rotuladas com 2-AA foram separadas porcromatografia de fase normal e detectadas porfluorescência. Os picos mais abundantes de cada amostra (a-i rotuladas) foram caracterizados por MS on-line negativode modo QTOF e seus espectros de massa QTOF correspondentes([M-2H]2") estão apresentados.

A Figura 44 mostra atividade in vitro de mAbs MDX-060medida por análise de citométrica de fluxo de MDX-060 CHO,LEX, ou mAb LEXopt glico-otimizados se ligando a CD30expresso em células L540. As células L540 foram incubadascom concentrações crescentes do anticorpo indicado comodestacado no Exemplo 6 aqui abaixo. Intensidade deFluorescência Média de Geo (GMFI) está plotada contra asvárias concentrações de mAb usadas.■: MDX-060 CHO; ▲: MDX-060 LEX; ▼: MDX-060 LEXopt.

A Figura 45 mostra ligação de equilíbrio de mAb glico-otimizados e de tipo selvagem para dois alótipos FcRYlIIahumanos diferentes (Vai158 ou Phe158) . O sinal de ligaçãocomo uma função de FcRYlIIa foi ajustado para um modelo deligação de um sítio. ■: MDX-060 CHO; ▲: MDX-060 LEX; ▼:MDX-060 LEXopt.

A Figura 46 mostra atividade ADCC de mAb MDX-060derivado de CHO, LEX (glicosilação de Lemna de tiposelvagem) , ou LEX0pt (Lemna de RNAi transgênico) . Célulasefetoras humanas de um doador homozigoto de FcYRIIIaPhel58e um doador heterozigoto de FcYRIIIaPhe/Vall58 foramincubadas com células L540 rotuladas com BATDA em uma razãoefetorraivo de 50:1 na presença de concentrações aumentadasdos anticorpos indicados. A Iise percentual específica emcada concentração de mAb é plotada. mAbl humano nãoreconhecendo antígeno em células L540 foi usado como umisotipo controle em todos os experimentos. Valores de EC50(yg/mL), constantes de ligação e Iise percentual máximaforam calculados usando o software GraphPad Prism 3.0. ■:MDX-060 CHO; ▲: MDX- 060 LEX; ▼: MDX-060 LEXopt.

A Figura 47 mostra análise de massa intacta dascomposições mAb MDX-060 LEX produzidas em L.minor de tiposelvagem compreendendo o constructo MDXA01. Quando aexpressão de XylT e FucT não são suprimidas em L.minor, acomposição mAb MDX-060 LEX produzida de forma recombinantecompreende pelo menos 7 glicoformas diferentes, com aglicoforma GOXF3 sendo a espécie predominante presente.Note a ausência de um pico representando a glicoforma GO.

A Figura 48 mostra a análise de massa de glicana dacadeia pesada de mAb MDX-060 LEX produzida em L.minor detipo selvagem compreendendo o constructo MDXA01. Quando aexpressão de XylT e FucT não é suprimida em L.minor, aespécie N-glicana predominante presente é GOXF3 , com picosprincipais adicionais refletindo a espécie GOX. Note apresença menor das espécies glicanas GO.

A Figura 49 mostra a análise de massa intacta dascomposições mAb MDX-060 LEX0pt produzidas em L.minortransgênica compreendendo o constructo MDXA04. Quando aexpressão de XylT e FucT é suprimida em L.minor, acomposição mAb intacta contém apenas N-glicanas GO. Alémdisso, a composição é substancialmente homogênea para aglicoforma GO (pico 2), caracterizado pelo fato de gueambos os sítios de glicosilação estão ocupados pela espécieN-glicana GO, com dois picos menores refletindo quantidadestraço de glicoformas precursoras (pico 1, mostrando mAbtendo uma região Fc, caracterizado pelo fato de que odomínio CH2 de uma cadeia pesada possui uma espécie deglicana GO anexada a Asn 297, e o domínio CH2 da outracadeia pesada não é glicosilada; e pico 3, mostrando mAbtendo uma região Fc, caracterizado pelo fato de que o sítiode glicosilação de Asn 297 em cada dos domínios CH2 possuiuma espécie de glicana GO anexada, com uma terceira espéciede glicana GO anexada a um sitio de glicosilação adicionalna estrutura de mAb).

A Figura 50 mostra uma análise de massa de glicana dacadeia pesada de mAb MDX-060 LEXOpt produzido em L.minortransgênica compreendendo o constructo MDXAO4. Quando aexpressão de XylT e FucT é suprimida em L.minor, a únicaespécie de N-glicana prontamente detectável anexada aossítios de glicosilação de Asn 297 dos domínios CH2 dascadeias pesadas é GO.

As Figuras 51A (análise MALDI) e 51B (análise HPLC)mostram que o perfil de glicosilação homogêneo exibido pormAbl produzido em L.minor transgênica (linhagem 24)compreendendo o constructo de RNAi mAbI04 foiconsistentemente observado com produção em escala. Esseperfil de glicosilação foi consistente por período de 8meses de manutenção contínua da linhagem transgênica viaexpansão clonal.

A Figura 52 mostra, através da análise MALDI de N-glicanas glicoproteínas endógenas de Lemna em linhagens detipo selvagem e RNAi, a supressão de expressão de FucT eXylT usando o constructo mAbI04 de RNAi quimérico da Figura12 resulta em glicoproteínas endógenas tendo um padrão deglicosilação homogêneo consistente com aquele observadopara glicoproteínas recombinantes. Para esta figura, oresíduo de xilose 31,2-ligada anexado à estrutura núcleotrimanose é designado pelo símbolo estrela.A Figura 53 mostra a estrutura de N-glicanas complexasdescritas no Exemplo 6 abaixo. M = manose; Gn = N-acetilglucosamina; A = galactose; X = xilose; F = fucose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será agora descrita maiscompletamente daqui por diante com referência às figurasacompanhantes, nas quais algüns, mas não todos os avançosda invenção são mostrados. De fato, essas invenções podemser incorporadas em várias formas diferentes e não deveriamser construidas como limitadas aos avanços aquiapresentados; ao invés, esses avanços estão providos deforma que essa revelação satisfaça requerimentos legaisaplicáveis. Números relativos referem-se a elementosrelativos e assim por diante.

Várias modificações e outros avanços da invenção aquiapresentados virão à mente de um especialista na técnica aqual essas invenções pertencem, tendo o beneficio dosensinamentos apresentados nas descrições precedentes e osdesenhos associados. Portanto, deve ser entendido que asinvenções não devem ser limitadas aos avanços específicosdescritos e que modificações e outros avanços devem estarincluídos no escopo das reivindicações em anexo. Apesar determos específicos serem aqui empregados, eles são usadosem um senso genérico e descritivo e não por propósitos delimitação.A presente invenção provê composições e métodos paraalterar o padrão de N-glicosilação de polipeptideoshomólogos e heterólogos produzidos em uma planta,particularmente uma planta que serve como um sistema deexpressão para proteínas recombinantes de interesse. Osmétodos compreendem o uso de constructos de nucleotídeoscompreendendo uma ou mais seqüências que são capazes deinibir a expressão de al,3-fucosiltransferase (FucT) eβ1,2-xilosiltransferase (XylT) em uma planta. São tambémprovidas composições para uso em praticar os métodos dainvenção, e composições compreendendo glicoproteínas tendoum perfil de glicosilação substancialmente homólogo,incluindo anticorpos monoclonais glicana otimizados comfunção efetora melhorada.

Definições:

"Polipeptídeo" refere-se a qualquer proteína oupeptídeo monomérico ou multimérico.

"Polipeptídeo biologicamente ativo" refere-se a umpolipeptídeo que possui a capacidade de efetuar uma ou maisfunções biológicas ou um grupo de atividades normalmenteatribuídas ao polipeptídeo em um contexto biológico.Aqueles especialistas na técnica irão ponderar que o termo"biologicamente ativo" inclui polipeptideos nos quais aatividade biológica é alterada, se comparada com a proteínanativa (e.g., suprimida ou intensificada), contanto que aproteína possua atividade suficiente para ser de interessepara uso em processos industriais ou químicos como umterapêutico, vacina, ou reagente diagnóstico. A atividadebiológica pode ser determinada por qualquer métododisponível na técnica. Por exemplo, a atividade biológicade membros da família interferon de proteínas pode serdeterminada por qualquer de um número de métodos incluindosua interação com anticorpos específicos de interferon, suahabilidade para aumentar a resistência à infecção viral, ousua habilidade para modular a transcrição de alvos gênicosregulados por interferon. De maneira similar, a atividadebiológica de anticorpos monoclonais pode ser determinadapor qualquer de um número de métodos incluindo, mas nãolimitado a, testes para medir a especificidade de ligação efunção efetora, por exemplo, usando testes paracitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) eatividade de citotoxicidade dependente de complemento(CDC).

Por "célula hospedeira" pretende-se uma célula quecompreenda uma seqüência de ácidos nucléicos heteróloga dainvenção. Assim, as seqüências de ácidos nucléicos dainvenção, e fragmentos e variantes dessas, podem serintroduzidas em quaisquer células de interesse, departicular interesse são células hospedeiras vegetais. Emalguns avanços, as células hospedeiras vegetais são célulasde uma planta que serve como hospedeiro para expressão deproteínas recombinantes, por exemplo, um sistema deexpressão vegetal para a produção de proteínas de mamíferosrecombinantes de interesse como aqui notado abaixo.Por "polipeptídeo heterólogo de interesse" pretende-seum polipeptídeo que não seja expresso pelas célulashospedeiras na natureza. Conseqüentemente, por"polipeptídeo homólogo" pretende-se um polipeptídeo queseja naturalmente produzido nas células do hospedeiro.Polipeptideos homólogos e heterólogos que passam por N-glicosilação pós-tradução são aqui referidos comoglicoproteínas homólogas ou heterólogas. De acordo com osmétodos da presente invenção, o padrão de N-glicosilação deambas glicoproteínas homólogas ou heterólogas é alteradonas células de uma planta hospedeira de forma que essasglicoproteínas possuam um padrão de A/-glicosilação que émais similar àquele observado com mamíferos hospedeiros.

Polipeptídeos heterólogos e seqüências de nucleotídeosheterólogas exemplares de interesse incluem, mas não sãolimitados a, seqüências que codificam polipeptídeos demamíferos, tais como insulina, hormônio de crescimento, a-interferon, β-interferon, β-glucocerebrosidase, β-glucoronidase, proteína retinoblastoma, proteína p53,angiostatina, leptina, eritropoietina (EPO), fatorestimulador de granulócito de coloônia de macrófago,plasminogen, ativador de tecido plasminogênico, fatores decoagulação de sangue, por exemplo, Fator VII, Fator VIII,Fator IX, e proteína C ativada, alfa 1-antitripsina,anticorpos monoclonais (mAbs), fragmentos Fab, anticorposde cadeia simples, citoquinas, receptores, hormônios,vacinas humanas, vacinas animais, peptídeos, e albumina desoro.Para propósitos da presente invenção, os termos "N-glicana", "glicana N-ligada", e "glicana" são usadosintercaladamente e referem-se a um oligosacarideo N-ligado,e.g., um que está ou foi anexado por um resíduo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) ligado ao nitrogênio amida de umresíduo de asparagina em uma proteína. Os açúcarespredominantes encontrados em glicoproteínas são glicose,galactose, manose, fucose, N-acetilgalactosamina (GalNAc),N-acetilglucosamina (GlcNAc), é ácido siálico (e.g., ácidoN-acetil-neuramínico (NeuAc)). 0 processamento dos gruposde açúcar ocorrem de forma co-traducional no lúmen do RE econtinua no aparelho de Golgi para glicoproteínas N-ligadas.

Por "estrutura núcleo oligomanosídica" ou "estruturanúcleo trimanose" de uma N-glicana complexa pretende-se aestrutura núcleo apresentada na Figura 29A, caracterizadopelo fato de que o núcleo compreende três resíduosmonossacarídeos de manose (Man) e dois de N-acetilglucosamina (GlcNAc) que são anexados ao resíduo deasparagina da glicoproteína. 0 resíduo de asparagina estágeralmente na seqüência peptídica conservada Asn-Xxx-Thr ouAsn-Xxx-Ser, onde Xxx é qualquer resíduo exceto prolina,aspartato, ou glutamato. Etapas de glicosilaçãosubseqüentes produzem a estrutura N-glicana complexa final.A estrutura núcleo de trimanose é aqui indicada como"Man3GlcNAc2. "

As N-glicanas ligadas a glicoproteínas diferem-se comrespeito ao número de ramificações (antenas) compreendendoaçúcares periféricos (e.g., GlcNAc, galactose, fucose, eácido siálico) que são adicionados à estrutura núcleo detrimanose. N-glicanas são comumente classificadas de acordocom suas constituições de ramificação (e.g., complexa, dealta manose, ou híbrida). Uma N-glicana tipo "complexa"tipicamente possui pelo menos um GlcNAc anexado àramificação 1,3 manose e pelo menos um GlcNAc anexado àramificação 1,6 manose de um núcleo "trimanose". Onde umGlcNAc é anexado a cada ramificação de manose, a espécie deglicana N-Iigada é aqui indicada como "GlcNAc2Man3GlcNAc2"ou "GnGn".

Onde apenas um GlcNac é anexado, a espécie N-glicana éaqui indicada como "GlcNAciMan3GlcNAc2" , caracterizado pelofato de que o GlcNac é anexado tanto à ramificação 1,3manose (indicada aqui como "MGn") ou à ramificação 1,6manose (indicada aqui como "GnM") (ver figura 30). N-glicanas complexas podem ter também galactose ("Gal") ouresíduos de açúcar N-acetilgalactosamina ("GalNAc") que sãoopcionalmente modificados com ácido siálico ou derivados(e.g., "NeuAc," onde "Neu" refere-se a ácido neuramínicon e"Ac" refere-se a acetil) . Onde um resíduo de açúcargalactose é anexado a cada GlcNAc em cada ramificação demanose, a espécie de glicana N-Iigada é indicada aqui como"Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2". N-glicanas complexas podem tertambém substituições intra-cadeias compreendendo "bi-seccionar" GlcNAc e fucose núcleo ("Fuc"). N-glicanascomplexas podem ter também múltiplas antenas no "núcleotrimanose", freqüentemente referido como "glicanas deantenas múltiplas". Uma N-glicana tipo "alta manose" possuicinco ou mais resíduos de manose. Um N-glicana "híbrida"possui pelo menos um GlcNAc no terminal da ramificação 1,3manose do núcleo de trimanose e zero ou mais manoses naramificação 1,6 manose do núcleo trimanose.

Os termos "glicana GO" e "estrutura glicana GO" e"espécie glicana GO" são usadas intercaladamente e devemsignificar a glicana N-ligada complexa tendo a estruturaGlcNAc2Man3GlcNAc2, caracterizado pelo fato de que nenhumresíduo de açúcar ácido siálico terminal (NeuAcs) ougalactose terminal (Gal) estão presentes. Se uma glicana GOcompreende um resíduo de fucose ("Fuc") anexado à estruturanúcleo trimanose, esta é referida aqui como uma "glicanaGOF3" (tendo o resíduo de fucose al,3-ligada específico deplanta) ou "glicana GOF6" (tendo o resíduo de al,6-ligadade mamífero). Em plantas, uma glicana GO compreendendo oresíduo de xilose pi,2-ligada específico de planta anexadoà estrutura núcleo trimanose é aqui referida como uma"glicana GOX," e uma glicana GO compreendendo ambosresíduos de xilose pi,2-ligada específico de planta efucose al,3-ligada específico de planta anexados àestrutura núcleo trimanose, é aqui referida como uma"glicana GOXF3".

Os termos "glicana Gl" e "estrutura glicana Gl" e"espécie glicana Gl" são usados intercambiavelmente e devemsignificar a glicana N-ligada complexa tendo a estruturaGlcNAc2Man3GlcNAc2, caracterizado pelo fato de que umresíduo de galactose (Gal) terminal é anexado tanto àramificação 1,3 manose ou 1,6 manose, e nenhum ácidosiálico terminal está presente. Os termos "glicana G2" e"estrutura glicana G2" e "espécie glicana G2" são usadosintercambiavelmente e devem significar a glicana N-Iigadacomplexa tendo a estrutura GlcNAc2Man3GlcNAc2, caracterizadopelo fato de que um residuo de galactose (Gal) terminal éanexado à ramificação 1,3 manose e à ramificação 1,6manose, e nenhum ácido siálico terminal está presente.

O termo "glicoforma" como aqui usado refere-se a umaglicoproteína contendo uma estrutura de carboidratoparticular ou estruturas. Assim, por exemplo, uma"glicoforma GO" refere-se a uma glicoproteína quecompreende apenas espécies glicanas GO anexadas a seussítios de glicosilação. É reconhecido que uma glicoproteínatendo mais de um sítio de glicosilação possa ter a mesmaespécie glicana anexada em cada sítio de glicosilação, oupode ter espécies glicanas diferentes anexadas a diferentessítios de glicosilação. Dessa maneira, diferentes padrõesde anexação de glicanas rendem glicoformas diferentes deuma glicoproteína.

O termo "perfil de glicosilação" deve significar acaracterística "impressão digital" das espécies N-glicanasrepresentativas que foram liberadas a partir de umacomposição de glicoproteína ou produto de glicoproteína,tanto enzimaticamente como quimicamente, e, então,analisados para sua estrutura de carboidratos, por exemplo,usando LC-HPLC, ou MALDI-TOF MS, e similares. Ver, porexemplo, a revisão em Current Analytical Chemistry, Vol. 1,No. 1 (2005), pp. 28-57; aqui incorporada por referência emsua integra.

Os termos "substancialmente homogêneo",

"substancialmente uniforme" e "homogeneidade substancial"no contexto de um perfil de glicosilação, para umacomposição de glicoproteina ou produto de glicoproteina,são usados intercambiavelmente e devem significar um perfilde glicosilação caracterizado pelo fato de que pelo menos80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% das espécies N-glicana totais no perfil sejam representadas por umaespécie N-glicana desejada, com uma quantidade traço deespécies N-glicanas precursoras aparecendo no perfil. Por"quantidade traço" pretende-se que qualquer dada espécie N-glicana precursora que esteja presente no perfil deglicosilação esteja presente em menos de 5%,preferencialmente em menos de 4%, em menos de 3%, em menosde 2%, em menos de 1%, e mesmo em menos de 0,5% ou mesmo emmenos de 0, 1% da quantidade total de espécies N-glicanasaparecendo no perfil. Por espécie N-glicana "precursora",pretende-se uma espécie N-glicana que é incompletamenteprocessada. Exemplos de espécies N-glicana precursoraspresentes em quantidades traço nas composições deglicoproteina ou produtos, de glicoproteina da invenção, eassim aparecendo nos perfis de glicosilação dessas, sãoMan3GlcNAc2, MGn (GlcNaclMan3GlcNAc2 caracterizado pelo fatode que GlcNacl é anexado à ramificação 1,3 manose) , e GnM(GlcNaclMan3GlcNAc2 caracterizado pelo fato de que GlcNaclé anexado à ramificação 1,6 manose) espécies N-glicanasprecursoras descritas acima.

Assim, por exemplo, onde a espécie 2\7-glicana desejadaem um produto de glicoproteina ou composição é GO, umperfil de glicosilação substancialmente homogêneo paraaquele produto ou composição seria um caracterizado pelofato de que pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%da quantidade total de espécies N-glicanas aparecendo noperfil de glicosilação para o produto ou composição sejarepresentado pela espécie glicana GO, com uma quantidadetraço de espécies A/-glicanas precursoras aparecendo noperfil de glicosilação. Para tal composição, uma espécie N-glicana precursora representativa aparecendo em seu perfilde glicosilação seria Man3GlcNAc2, MGn (GlcNacl Man3GlcNAc2caracterizado pelo fato de que GlcNacl é anexado àramificação 1,3 manose), e GnM (GlcNaclMan3GlcNAc2caracterizado pelo fato de que GlcNacl é anexado àramificação 1,6 manose) espécies N-glicanas precursorasdescritas acima.

Os termos"substancialmente homogêneo",

"substancialmente uniforme", e "homogeneidade substancial" no contexto de uma composição de glicoproteina ou produtode glicoproteina são usados intercambiavelmente e devemsignificar o produto de glicoproteina ou composição deglicoproteina, caracterizado pelo fato de que pelo menos80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% da glicoproteinapresente no produto ou composição seja representado por umaglicoforma desejada, com uma quantidade traço deglicoformas precursoras ou indesejadas estando presentes nacomposição. Por "quantidade traço" pretende-se que qualquerdada glicoforma precursora ou indesejada que estejapresente no produto de glicoproteina ou composição estápresente em menos de 5%, preferencialmente em menos de 4%,em menos de 3%, em menos de 2%, em menos de 1%, e mesmo emmenos de 0,5% ou até em menos de 0,1% da glicoproteinatotal. Por glicoforma "precursora" pretende-se umaglicoforma, caracterizado pelo fato de que pelo menos umsitio de glicosilação é tanto não glicosilado, ou estáocupado por uma espécie N-glicana que representa umprecursor da espécie N-glicana desejada, ou uma glicoforma,caracterizado pelo fato de que um ou mais sítios deglicosilação adicionais estejam presentes, em relação àglicoforma desejada, e estejam ocupados por (i.e., possuianexado a esse) a espécie N-glicana desejada ou uma espécieN-glicana desejada.

Assim, por exemplo, uma composição de glicoproteinasubstancialmente homogênea ou produto compreendendo aglicoforma GO é uma composição ou produto, caracterizadopelo fato de que pelo menos 80%, 80%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelomenos 99% da glicoproteina presente no produto oucomposição esteja representada pela glicoforma GO,caracterizado pelo fato de que todos os sítios deglicosilação antecipados estão ocupados pelas espéciesglicanas GO, com uma quantidade traço de glicoformasprecursoras ou indesejadas estando presentes na composição.Em tal composição, uma glicoforma precursora representativaseria uma na qual sitios de glicosilação estivessedesocupados, e uma glicoforma indesejada exemplar seria umaglicoforma tendo uma mistura de glicana GO e GOX ou espécieglicana G0XF3 anexada a seus sitios de glicosilação.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo ecobre completamente anticorpos associados, fragmentos deanticorpos que se ligam a antigeno (e.g., Fab', F1 (ab)2,Fv, anticorpos de cadeias simples, diacorpos), e peptideosrecombinantes compreendendo os precedentes. Anticorposrepresentam uma das várias glicoproteinas contempladaspelos métodos e composições da presente invenção. Derivadosde anticorpos são também contemplados pela presenteinvenção. Derivados incluem proteínas de fusãocompreendendo uma imunoglobulina ou porção dessa, tal comouma região Fc tendo um domínio CH2.

O termo "anticorpo monoclonal", como aqui usado,refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma populaçãode anticorpos substancialmente homogêneos, i.e., osanticorpos individuais compreendendo a população sãoidênticos, exceto por possíveis mutações naturalmenteocorrentes que podem estar presentes em quantidadespequenas.

"Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" sãousualmente glicoproteinas heterotetraméricas de cerca de150.000 dáltons, compostas de duas cadeias leves (L)idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeialeve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação covalentedissulfeto, enquanto o número de ligações dissulfeto variadentre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia leve e pesada também possuipontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cadacadeia pesada possui em uma extremidade, um domíniovariável (Vh) seguido por um número de domínios constantes.Cada cadeia leve possui em uma extremidade, um domínio variável (Vl) e um domínio constante em sua outraextremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhadocom o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e odomínio variável de cadeia pesada é alinhado com o domíniovariável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos em particular formem uma interface entre osdomínios variáveis de cadeia leve e pesada.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certasporções dos domínios variáveis diferem extensivamente em seqüência entre anticorpos e são usados na ligação eespecificidade de cada anticorpo em particular para seuantígeno em particular. Contudo, a variabilidade não édistribuída igualmente através dos domínios variáveis deanticorpos. Ela é concentrada em três segmento? chamados deregiões de determinação de complementaridade (CDRs) ouregiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis decadeia pesada e cadeia leve. As porções mais altamenteconservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões'framework' (FR). Os domínios variáveis das cadeias nativas pesada e leve compreendem, cada, quatro regiões FR,adotando amplamente uma configuração de folha β, conectadospor três CDRs, que formam loops conectando e, em algunscasos, formando parte da estrutura de folha β. As CDRs emcada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidadepelas regiões FR e, com as CDRs de outra cadeia, contribuempara a formação do sitio de ligação a antigeno deanticorpos (ver Kabat et al (1991) NIHPubl No. 91-3242,Vol. I, pages 647-669).

Os domínios constantes não são envolvidos diretamentena ligação de um anticorpo a um antigeno, mas exibem váriasfunções efetoras, tais como ligação de receptor de Fc(FcR), participação do anticorpo em citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC), opsonização, iniciação decitotoxicidade dependente de complemento (atividade deCDC) , e degranulação de mastócitos.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção deum anticorpo intacto, preferencialmente a região de ligaçãoa antigeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos defragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab1,F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata etal. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas deanticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficosformados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestãode papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligaçãoa antígenos idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada qualcom um único sítio de ligação de antigeno, e um fragmento"Fc" residual, cujo nome reflete sua habilidade de secristalizar prontamente. 0 tratamento com pepsina produzum fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinaçãode antigeno e é ainda capaz de ligação cruzada de antígeno.

"Fv" é o menor fragmento de anticorpo que contém umsítio completo de reconhecimento e ligação de antígeno. Emuma espécie com duas cadeias Fv, essa região consiste de umdímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e umacadeia leve em associação estreita não covalente. Em umaespécie Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeiapesada e cadeia leve pode ser covalentemente ligado porligante peptídico flexível, de forma que as cadeias leve epesada possam se associar em uma estrutura "dimérica"análoga àquela em uma espécie de duas Fv. É nestaconfiguração que as três CDRs de cada domínio variávelinteragem para definir um sítio de ligação de antígeno nasuperfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRsconferem ao anticorpo especificidade de ligação a antígeno.Contudo, mesmo um único domínio variável domínio variável(ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRsespecíficas para um antígeno) possui a habilidade dereconhecer e ligar um antígeno, apesar de quem em umaafinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (CH 1) da cadeiapesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab1 pelaadição de poucos resíduos no terminal carboxi do domínioCHI de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas daregião de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designaçãoaqui para Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dosdomínios constantes abrigam um grupo tiol livre. Fragmentosde anticorpos F(ab')2 originalmente foram produzidos comopares de fragmentos Fab1 que possuem cisteínas dearticulação entre eles. Outros pareamentos químicos defragmentos de anticorpos são também conhecidos.

As "cadeia leves" de anticorpos (imunoglobulinas) dequalquer espécie de vertebrado pode ser designado para umde dois tipos claramente distintos, chamados capa (κ) elambda (λ) , baseado nas seqüências de aminoácidos de seusdomínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínioconstante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podemser designadas para diferentes classes. Existem cincoclasses principais de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD,IgE, IgG, e IgM, e diversas dessas podem ser ainda dividasem subclasses (isotipos), e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4,IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada quecorrespondem às diferentes classes de imunoglobulinas sãochamados alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respectivamente.As estruturas subunidades e configurações tridimensionaisde classes diferentes de imunoglobulinas são bemconhecidas. Diferentes isotipos possuem diferentes funçõesefetoras. Por exemplo, isotipos IgGl e IgG3 humanos mediamatividade de citotoxicidade mediada por célula dependentede anticorpo (ADCC).

Imunoglobulinas possuem glicosilação N-Iigadaconservada da região Fc de cada das duas cadeias pesadas.Assim, por exemplo, imunoglobulinas do tipo IgG possuemdomínio CH2 glicosilados abrigando oligossacarídeos N-ligados na asparagina 297 (Asn-297). Glicoformas diferentesde imunoglobulinas existem dependendo da espécie N-glicanaem particular anexada a cada desses dois sítios deglicosilação, e dependendo do grau ao qual ambos sítios sãoglicosilados em uma composição de imunoglobulina.

"Seqüência de nucleotídeos de interesse" como aquiusado com referência a expressão de polipeptídeosheterólogos refere-se a qualquer seqüência depolinucleotídeos codificando um polipeptídeo heterólogopretendido para expressão em um hospedeiro, particularmenteum hospedeiro vegetal, por exemplo, em uma planta superior,incluindo membros das dicotiledôneas e monocotiledôneas.Por exemplo, seqüências de polinucleotídeos codificandopolipeptídeos terapêuticos (e.g. para usos veterinários oumédicos) ou imunogênicos (e.g., para vacinação) podem serexpressas usando plantas hospedeiras transformadas, porexemplo, lentilha d'água, de acordo com a presenteinvenção.

0 uso do termo "polinucleotídeo" não deve limitar apresente invenção a polinucleotídeos compreendendo DNA.Aqueles de conhecimento ordinário na técnica reconhecerãoque polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos ecombinações de ribonucleotídeos de desoxirribonucleotídeos.Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluemambas moléculas naturalmente ocorrentes e análogossintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também englobamtodas as formas de seqüências incluindo, mas não limitadosa, formas de fita simples, formas de dupla fita,'hairpins', estruturas 'stem-and-loop' , e similares.

Os termos "inibir", "inibição" e "inibindo" como aquiusado referem-se a qualquer decréscimo na expressão oufunção do produto gênico alvo, incluindo qualquerdecréscimo relativo em expressão ou função até e incluindoabrogação completa de expressão ou função do produto gênicoalvo. 0 termo "expressão", como aqui usado no contexto deum produto gênico, refere-se.à biossintese daquele produtogênico, incluindo a transcrição e/ou tradução e/ou reuniãodo produto gênico. A inibição de expressão ou função de umproduto gênico alvo (i.e., um produto gênico de interesse)pode estar no contexto de uma comparação entre quaisquerduas plantas, por exemplo, expressão ou função de umproduto gênico alvo em uma planta alterada geneticamenteversus a expressão ou função daquele produto gênico alvo emuma planta correspondente de tipo selvagem.Alternativamente, a inibição de expressão ou função doproduto gênico alvo pode estar no contexto de umacomparação entre células vegetais, organelas, órgãos,tecidos, ou partes de plantas na mesma planta ou entreplantas, e inclui comparações entre estágios dedesenvolvimento ou temporais na mesma planta ou entreplantas. Qualquer método ou composição que regulenegativamente a expressão de um produto gênico alvo, tantono nivel de transcrição ou tradução, ou regulenegativamente a atividade funcional do produto gênico alvopode ser usado para alcançar a inibição da expressão oufunção do produto gênico alvo.

0 termo "seqüência inibidora" engloba qualquerseqüência de polinucleotideos ou seqüência de polipeptideosque seja capaz de inibir a expressão de um produto gênicoalvo, por exemplo, no nível de transcrição ou tradução, ouque seja capaz de inibir a função de um produto gênicoalvo. Exemplos de seqüências inibidoras incluem, mas nãosão limitados a, seqüências de polinucleotideos oupolipeptideos de comprimento total, seqüências depolinucleotideos ou polipeptideos truncadas, fragmentos deseqüências de polinucleotideos ou polipeptideos, variantesde seqüências de polinucleotideos ou polipeptideos,seqüências de nucleotídeos senso-orientadas, seqüências denucleotideos orientadas anti-senso, o complemento deseqüência de nucleotídeos senso-orientadas ou orientadasanti-senso, regiões invertidas de seqüências denucleotídeos, hairpins de seqüências de nucleotídeos,seqüências de nucleotídeos de dupla-fita, seqüências denucleotídeos de fita simples, combinações dessas, esimilares. 0 termo "seqüência de polinucleotideos" incluiseqüências de RNA, DNA, ácidos nucléicos quimicamentemodificados, ácidos nucléicos análogos, combinações desses,e similares..

É reconhecido que polinucleotideos inibidores incluemseqüências de nucleotídeos que inibem diretamente (i.e.,não requerem transcrição) ou indiretamente (i.e., requeremtranscrição ou transcrição e tradução) a expressão de umproduto gênico alvo. Por exemplo, um polinucleotídeoinibidor pode compreender uma seqüência de nucleotideos queé quimicamente sintetizada ou RNA pequeno de interferência(siRNA) produzido in vitro ou micro RNA (miRNA) que, quandointroduzido em uma célula vegetal, tecido, ou órgão, iriadiretamente, apesar de transientemente, silenciar aexpressão do produto gênico alvo de interesse.Alternativamente, um polinucleotídeo inibidor podecompreender uma seqüência de nucleotideos que codifica umuma molécula nucleotídica inibidora que é projetada parasilenciar a expressão do produto gênico de interesse, talcomo RNA de orientação senso, RNA anti-senso, RNA de dupla-fita (dsRNA), RNA hairpin (hpRNA) , hpRNA contendo íntron,RNA catalítico, miRNA, e similares. Ainda em outrosavanços, o polinucleotídeo inibidor pode compreender umaseqüência de nucleotideos que codifica um mRNA, a traduçãodo qual produz um polipeptídeo que inibe expressão oufunção do produto gênico alvo de interesse. Dessa maneira,onde o polinucleotídeo inibidor compreende uma seqüência denucleotideos que codifica uma molécula nucleotídicainibidora ou um mRNA para um polipeptídeo, a seqüênciacodificadora é operacionalmente ligada a um promotor quedirige a expressão em uma célula vegetal, de forma que amolécula nucleotídica inibidora codificada ou mRNA possaser expressa.

Seqüências inibidoras são aqui projetadas com o nomedo produto gênico alvo. Assim, por exemplo, uma "seqüênciainibidora de al,3-fucosiltransferase (FucT)" refere-se a umseqüência inibidora que é capaz de inibir a expressão deuma FucT, por exemplo, no nivel da transcrição e/outradução, ou que é capaz de inibir a função de uma FucT.Similarmente, uma "seqüência inibidora de β1,2-xilosiltransferase (XylT)" referir-se-ia a uma seqüênciainibidora que é capaz de inibir a expressão de uma XylT, nonivel da transcrição e/ou tradução, ou que é capaz deinibir a função de uma XylT. Quando a expressão "capaz deinibir" é usada no contexto de uma seqüência depolinucleotideos inibidora, ela deve significar que aseqüência inibidora propriamente exerce o efeito inibidor;ou, onde a seqüência inibidora codifica uma moléculanucleotidica inibidora (por exemplo, polinucleotideos deRNA hairpin, miRNA, ou RNA de dupla-fita), ou codifica umpolipeptideo inibidor (i.e., um polipeptideo que inibe aexpressão ou função do produto gênico alvo), após suatranscrição (por exemplo, no caso de uma seqüênciainibidora codificando polinucleotideos de RNA hairpin,miRNA, ou RNA de dupla-fita) ou sua transcrição e tradução(no caso de uma seqüência inibidora codificando umpolipeptideo inibidor), o produto transcrito ou traduzido,respectivamente, exerce o efeito inibidor no produto gênicoalvo (i.e., inibe a expressão ou função do produto gênicoalvo).

termo "introduzir" no contexto de umpolinucleotideo, por exemplo, um constructo de nucleotideosde interesse, deve significar apresentar à planta opolinucleotideo, de forma que o polinucleotideo ganheacesso ao interior de uma célula da planta. Onde mais de umpolinucleotideo devem ser introduzidos, essespolinucleotídeos podem ser reunidos como parte de um únicoconstructo de nucleotideos, ou como constructos denucleotídeos separados, e podem estar localizados no mesmoou diferentes vetores de transformação. Dessa forma, essespolinucleotídeos podem ser introduzidos na célulahospedeira de interesse em um único evento detransformação, em eventos de transformação separados, ou,por exemplo, em plantas, como parte de um protocolo demelhoramento. Os métodos da invenção não dependem de ummétodo em particular para introduzir um ou maispolinucleotídeos em uma planta, apenas que o(s)polinucleotídeo(s) ganhe(m) acesso ao interior de pelomenos uma célula da planta. Métodos para introduzirpolinucleotídeos em plantas são conhecidos na técnicaincluindo, mas não limitados a, métodos de transformaçãotransiente, métodos de transformação estável, e métodosmediados por vírus.

"Transformação transiente" no contexto de umpolinucleotídeo deve significar que um polinucleotídeo éintroduzido na planta e não se integra ao genoma da planta.

Por "introduzir estavelmente" ou "introduzidoestavelmente" no contexto de um polinucleotídeo introduzidoem uma planta, pretende-se que o polinucleotídeointroduzido seja estavelmente incorporado no genoma daplanta, e, assim, a planta está estavelmente transformadacom o polinucleotídeo."Transformação estável" ou "estavelmente transformado"deve significar que um polinucleotídeo, por exemplo, umconstructo de nucleotideo aqui descrito, introduzido em umaplanta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie dessa, mais particularmente, pelaprogênie de múltiplas sucessivas gerações. Em algunsavanços, sucessivas gerações incluem progênie produzida deforma vegetativa (i.e., reprodução assexuada), por exemplo,com propagação clonal. Em outros avanços, sucessivas gerações incluem progênie produzida via reprodução sexuada.Uma planta superior hospedeira que é "estavelmentetransformada" com pelo menos um constructo de nucleotideosque é capaz de inibir a expressão de uma FucT e/ou XylTcomo aqui descrito refere-se a uma planta superior hospedeira que possui o constructo(s) de nucleotideosintegrado em seu genoma, e é capaz de produzirdescendentes, tanto por reprodução assexuada ou sexuada,que também compreendem o(s) constructo(s) de nucleotideosinibidor(es) estavelmente integrado(s) em seu genoma, e assim a progênie também exibirá o fenótipo desejado de terum padrão de N-glicosilação alterado caracterizado pelaredução na anexação de al,3-fucose e/ou pi,2-xiloseresíduos das N-glicanas de glicoproteínas homólogas eheterólogas aqui produzidas.

Como aqui usado, O termo "planta" inclui referência aplantas inteiras, órgãos vegetais (e.g., folhas, caules,raízes, etc.), sementes, células vegetais, e progênie dasmesmas. Partes de plantas transgênicas devem ser entendidasno escopo da invenção para compreender, por exemplo,células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões,assim como flores, óvulos, caules, frutos, folhas, raízes,pontas de raízes, e similares se originando em plantastransgênicas ou sua progênie previamente transformada comuma molécula de DNA da invenção e, portanto, consistindo,pelo menos em parte, de células transgênicas. Como aquiusado, o termo "célula vegetal" inclui, sem limintação,células de sementes, embriões, regiões meristemáticas,calos, tecido, folhas, raízes, brotos, gametófitos,esporófitos, pólen e microesporos.

A classe de plantas que pode ser usada nos métodos dainvenção é geralmente tão ampla como a classe de vegetaissuperiores propensas a técnicas de transformação, incluindotanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas.Exemplos de dicotiledôneas incluem, mas não são limitadosa, leguminosas incluindo soja e alfafa, tabaco, batatas,tomates e similares. Exemplos de monocotiledôneas incluem,mas não são limitados a, milho, arroz, aveia, cevada,trigo, membros da família das lentilhas d'água, gramíneas,e similares. "Vegetais inferiores" refere-se a plantas semflores, incluindo samambaia, cavalinha, musgos, briófitas,Ceratophyllum, algas, por exemplo, algas rodófitas,pirrófitas e clorófitas, gametófitos, esporófitos depteridófitas, e similares. Em alguns avanços, a planta deinteresse é um membro da famíla das plantas lentilhasd'água.

O termo "lentilha d'água" refere-se a membros dafamília Lemnaceae. Essa família é atualmente divida emcinco gêneros e 38 espécies de lentilhas d1água, como aseguir: gênero Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L.ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L.minor, L.miniscula, L. obscura,· L. perpusitta, L. tenera, L.trisulca, L. turionifera, L. valdiviana) ; gênero Spirodela(S. intermedia, S. polyrrhiza, S. punctata) ; gênero Wolffia(Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis,Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongataf Wa.globosa, Wa. microscópica, Wa. neglecta) ; gênero Wolfiella(Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina,Wl. Iingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda, e Wl. neotropica)e gênero Landoltia (L. punctata). Quaisquer outros gênerose espécies, se existem, são também aspectos da presenteinvenção. Espécies de Lemna podem ser classificadas usandoo esquema taxonômico descrito por Landolt (1986)Biosystematic Investigation on the Family of Lentilhad'águas: The family of Lemnaceae - A Monograph Study(Geobatanischen Institut ΕΤΗ, Stiftung Rubel, Zurich).

O termo "nódulo de lentilha d'água" como aqui usadorefere-se ao tecido de lentilha d'água compreendendocélulas de lentilha d'água onde pelo menos cerca de 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% dascélulas sejam células diferenciadas. Uma "céluladiferenciada", como aqui usado, é uma célula com pelo menosuma característica fenotípica (e.g., morfologia celulardistintiva ou a expressão de um ácido nucléico ou proteínamarcadora) que a distingue de células não diferenciadas oude células encontradas em outros tipos de tecidos. Ascélulas diferenciadas de cultura de nódulo de lentilhad'água aqui descritas formam uma superfície suave oucélulas interconectadas fusionadas em suas paredescelulares adjacentes, com nódulos que começaram a seorganizar em primórdio de folhas espalhadas através dotecido. A superfície do tecido da cultura de nódulo possuicélulas epidérmicas conectadas uma a outra viaplasmadesmata. Membros da família das lentilhas d'água sereproduzem por propagação clonal, e, assim, sãorepresentativos de plantas que se propagam clonalmente.

"Códons preferenciais de lentilha d'água" como aquiusado refere-se a códons que possuem uma freqüência de usode códons em lentilha d'água maior do que 17%.

"Códons preferenciais de Lemna" como aqui usadorefere-se a códons que possuem uma freqüência de uso decódons no gênero Lemna maior do que 17%.

"Códons preferenciais de Lemna gibba" como aqui usadorefere-se a códons que possuem uma freqüência de uso decódons em Lemna gibba maior do que 17%, onde a freqüênciade uso de códons em Lemna gibba foi obtida a partir da basede dados Codon Usage Database (GenBank Release 113,0; emhttp://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=Lemna+gibba+[gbpln]).

"Códon de iniciação de tradução" refere-se ao códonque inicia a tradução do mRNA transcrito a partir daseqüência de nucleotídeos de interesse."Seqüência de nucleotideos contexto de iniciação detradução" como aqui usado refere-se à identidade dos trêsnucleotideos diretamente 5' do códon de iniciação detradução.

"Secreção" como aqui usado refere-se à translocação deum polipeptideo através tanto da membrana plasmática e daparede celular de uma célula vegetal hospedeira.

"Operacionalmente ligado" como aqui usado emreferência a seqüências de nucleotideos refere-se amúltiplas seqüências de nucleotideos que são colocadas emuma relação funcional uma com a outra. Geralmente,seqüências de DNA operacionalmente ligadas são contíguas e,onde necessário para juntar duas regiões codificadoras deproteínas, no quadro de leitura.

Polinucleotídeos e Polipeptídeos Isolados

A presente invenção prove polinucleotídeos epolipeptídeos isolados que estão envolvidos em modificaçãoadicional de glicanas vegetais N-Iigadas (também referidascomo "N-glicanas"), particularmente αl,3-fucosiltransferase(FucT) e βl,2-xilosiltransferase (XylT) identificadas emLemna minor, a membro da família das lentilhas d'água, evariantes e fragmentos desses polinucleotídeos epolipeptídeos. A inibição da expressão de uma ou ambasdessas proteínas, ou variantes biologicamente ativosdessas, em uma planta que expressa essas proteínasbeneficamente resulta em um padrão de N-glicosilação quepossui uma redução na anexação de resíduos de al,3-fucose e31,2-xilose para N-glicanas glicoproteinas. Em algunsavanços da invenção, os métodos aqui descritos provêm ainibição completa de expressão de FucT e XylT, resultandoem um padrão de N-glicosilação de glicoproteinas produzidasem uma planta, caracterizado pelo fato de que as glicanasN-Iigadas são desprovidas de resíduos de al,3-fucose andβΐ,2-xilose.

A seqüência de cDNA de comprimento total, incluindo5'- e 31 -UTR, para alfa 1-3 fucosiltransferase (FucT) deL.minor é apresentada na Figura 1; ver também SEQ ID NO: 1(quadro de abertura de leitura apresentado em SEQ ID N0:2).A seqüência de aminoácidos prevista codificada dessa formaé apresentada em SEQ ID NO: 3. Pelo menos duas isoformas dogene FucT de L.minor foram identificadas; a homologia entreas isoformas é de cerca de 90%. A proteína codificadacompartilha alguma similaridade com outras FucTs de outrasplantas superiores. Ver figura 2. Por exemplo, a seqüênciaFucT de L.minor compartilha aproximadamente 50,1% deidentidade de seqüência com FucT de Arabidopsis thalianamostrada na Figura 2.

A seqüência de cDNA de comprimento total, incluindo5'- e 3'-UTR, para β1-2 xilosiltransf erase (XylT) deL.minor (isoforma #1) é apresentada na Figura 3; ver tambémSEQ ID NO: 4 (ORF apresentado em SEQ ID N0:5). A seqüênciade aminoácidos prevista codificada dessa forma éapresentada em SEQ ID NO: 6. Pelo menos duas isoformas dogene XylT de L.minor foram identificadas; a homologia entreas isoformas é de cerca de 90%. A proteína codificadacompartilha alguma similaridade com outras XylTs de outrasplantas superiores. Ver figura 4. Por exemplo, XylT deL.minor compartilha aproximadamente 56,4% de identidade deseqüência com XylT de Arabidopsis thaliana mostrada naFigura 4. Uma seqüência de cDNA de comprimento parcial,incluindo 3'-UTR, para β1-2 xilosiltransferase (XylT) deL.minor (isoforma #2) é apresentada na Figura 31; vertambém SEQ ID NO: 19 (ORF apresentado em SEQ ID NO: 20) . Aseqüência de aminoácidos prevista codificada dessa forma éapresentada em SEQ ID NO: 21. Isoforma #2 de XylT decomprimento parcial compartilha alta identidade deseqüência com a região correspondente da isoforma #1 deXylT, como pode ser visto a partir do alinhamento mostradona Figura 32.

A invenção engloba composições de polinucleotídeos ouproteínas isoladas ou substancialmente purificadas. Umpolinucleotídeo, ou proteína, "isolado" ou "purificado", ouporção biologicamente ativa desse, é substancialmente ouessencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteínacomo encontrado em seu ambiente naturalmente ocorrente.Assim, um polinucleotídeo, ou proteína, isolado oupurificado é substancialmente livre de outro materialcelular, ou meio de cultura quando produzido por técnicasrecombinantes, ou substancialmente livre de precursoresquímicos ou outros químicos quando sintetizadoquimicamente. Otimamente, um polinucleotídeo "isolado" élivre de seqüências (otimamente seqüências codificadoras deproteínas) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo(i.e., seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' dopolinucleotídeo) no DNA genômico do organismo do qual opolinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em vários avanços,o polinucleotídeo isolado pode conter menos de cerca de 5kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüênciade nucleotídeos que naturalmente flanqueia opolinucleotídeo no DNA genômico da célula da qual opolinucleotídeo é derivado. A proteína que ésubstancialmente livre de material celular incluipreparações de proteínas tendo menos de cerca de 30%, 20%,10%, 5%, ou 1% (por peso seco) de proteína contaminante.Quando a proteína da invenção ou porção biologicamenteativa dessa é produzida de forma recombinante, otimamentemeio de cultura representa menos de cerca de 30%, 20%, 10%,5%, ou 1% (por peso seco) de precursores químicos ouquímicos que não a proteína de interesse.

A seqüência codificadora para o gene FucT de L.minor éapresentada como os nucleotídeos (nt) 243-1715 de SEQ IDNO: 1 e como SEQ ID NO: 2, e a seqüência de aminoácidos parao polipeptídeo FucT codificado é apresentada em SEQ IDNO: 3. A seqüência codificadora para o gene de isoforma #1de XylT de L.minor é apresentada como os nucleotídeos 63-1592 de SEQ ID NO: 4 e como SEQ ID NO: 5, e a seqüência deaminoácidos para o polipeptídeo XylT codificado éapresentada em SEQ ID NO:6. A seqüência codificadora para ogene de isoforma #2 de XylT de L.minor de comprimentoparcial é apresentada como os nucleotídeos 1-1276 de SEQ IDNO: 19 e como SEQ ID NO: 20, e a seqüência de aminoácidospara o polipeptideo XylT de comprimento parcial codificadoé apresentada em SEQ ID NO:21.

Em particular, a presente invenção provêpolinucleotideos isolados compreendendo seqüências denucleotideos codificando as seqüências de aminoácidosapresentadas em SEQ ID NOS: 3, 6, e 21. Ainda providos sãopolipeptideos tendo uma seqüência de aminoácidos codificadapor um polinucleotideo aqui descrito, por exemplo, aquelesapresentados em SEQ ID NOS: 1, 2, 4, 5, 19, e 20, efragmentos e variantes desses. Moléculas de ácidosnucléicos compreendendo os complementos dessas seqüênciasde nucleotideos são também providas. É reconhecido que aseqüência codificadora para o gene de FucT e/ou XylT podeser expressa em uma planta para super expressão de FucTe/ou XylT codificados. Contudo, para propósitos de suprimirou inibir a expressão dessas proteínas, as respectivasseqüências de nucleotideos de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 19, e20 serão usadas para projetar constructos para supressão deexpressão da respectiva proteína FucT e/ou XylT. Assim,polinucleotideos, no contexto de suprimir a proteína FucT,referem-se às seqüências codificadoras de FucT e apolinucleotideos que, quando expressos, suprimem ou inibema expressão do gene de FucT, por exemplo, via supressãodireta ou indireta, como aqui notado abaixo. Similarmente,polinucleotideos, no contexto de suprimir ou inibir aproteína XylT refere-se às seqüências codificadoras de XylTe a polinucleotideos que, quando expressos, suprimem ouinibem a expressão do gene de XylT, por exemplo, viasupressão direta ou indireta como aqui notado abaixo.Fragmentos e variantes dos polinucleotídeos eproteínas descritos codificados dessa forma são tambémenglobados pela presente invenção. Por "fragmento"pretende-se uma porção do polinucleotídeo FucT ou XylT ouuma porção da seqüência de aminoácidos FucT ou XylTcodificada dessa forma. Fragmentos de um polinucleotídeopodem codificar fragmentos de proteína que retém aatividade biológica da proteína nativa e, assim, possuematividade FucT ou atividade XylT, como aqui notado em outraparte. Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeoque são úteis como sondas de hibridização geralmente nãocodificam proteínas fragmento retendo atividade biológica.Fragmentos de um polinucleotídeo FucT ou XylT podem sertambém usados para projetar seqüências inibidoras parasupressão de expressão do polipeptídeo FucT e/ou XylT.Assim, por exemplo, fragmentos de uma seqüência denucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 15nucleotídeos, 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos,cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cercade 200 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de300 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 400nucleotídeos, cerca de 450 nucleotídeos, cerca de 500nucleotídeos, cerca de 550 nucleotídeos, cerca de 600nucleotídeos, cerca de 650 nucleotídeos, cerca de 700nucleotídeos, cerca de 750 nucleotídeos, cerca de 800nucleotídeos, e até o polinucleotídeo de comprimento totalcodificando as proteínas da invenção.Um fragmento de um polinucleotideo FucT que codificauma porção biologicamente ativa de uma proteína FucT dainvenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500 aminoácidoscontíguos, ou até o número total de aminoácidos presentesem uma proteína FucT de comprimento total da invenção (porexemplo, 509 aminoácidos para SEQ ID NO:3). Um fragmento deum polinucleotideo XylT que codifica uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína XylT de comprimentototal da invenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475 aminoácidoscontíguos, ou até o número total de aminoácidos presentesem uma proteína XylT de comprimento total da invenção (porexemplo, 490 aminoácidos para SEQ ID NO:3). Um fragmento deum polinucleotideo XylT que codifica uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína XylT de comprimentoparcial da invenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contíguos, ouaté o número total de aminoácidos presentes em uma proteínaXylT de comprimento parcial da invenção (por exemplo, 490aminoácidos para SEQ ID NO:21).

Assim, a fragmento de um polinucleotideo FucT ou XylTpode codificar uma porção biologicamente ativa de umaproteína FucT ou XylT, respectivamente, ou pode ser umfragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridizaçãoou primer de PCR, ou usado para projetar seqüênciasinibidoras para supressão, usando métodos descritos abaixo.Uma porção biologicamente ativa de uma proteína FucT ouXylT pode ser preparada isolando-se uma porção de um dospolinucleotídeos FucT ou XylT da invenção, respectivamente,expressando a porção codificada da proteína FucT ou XylT(e.g., por expressão recombinante in vitro) , e testando aatividade da porção codificada do polipeptídeo FucT ouXylT. Polinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüênciade nucleotídeos de FucT ou XylT compreendem pelo menos 15,20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300,1.400, ou 1.450 nucleotídeos contíguos, ou até o número denucleotídeos presentes em um polinucleotídeo de FucT ouXylT aqui descrito (por exemplo, 1865, 1473, 1860, 1530,1282, ou 1275 nucleotídeos para SEQ ID NOS: 1, 2, 4, 5, 19,e 20, respectivamente).

"Variantes" devem significar substancialmenteseqüências similares. Para polinucleotídeos, um variantecompreende uma deleção e/ou adição de um ou maisnucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativoe/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um oumais sítios no polinucleotídeo nativo. Como aqui usado, umpolinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende umaseqüência de nucleotídeos ou seqüência de aminoácidosnaturalmente ocorrente, respectivamente. Para

polinucleotídeos, variantes conservativos incluem aquelasseqüências que, por causa da degeneração do códigogenético, codificam a seqüência de aminoácidos de um dospolipeptídeos FucT ou XylT da invenção. Variantes alélicosnaturalmente ocorrentes, tais como esses podem seridentificados com o uso de técnicas de biologia molecularbem conhecidas, como, por exemplo, com reação de cadeia depolimerase (PCR) e técnicas de hibridização, como destacadoabaixo. Polinucleotideos variantes também incluempolinucleotideos derivados sinteticamente, tais comoaqueles gerados, por exemplo, usando mutagênese sítio-direcionada, mas que ainda codificam uma proteína FucT ouXylT da invenção. Geralmente, variantes de umpolinucleotídeo da invenção em particular (por exemplo, SEQID NO: 1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:19, ou SEQ ID NO:20, fragmentos desses, e complementosdessas seqüências) terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüênciaàquele polinucleotídeo em particular, como determinado porprogramas de alinhamento de seqüências e parâmetros aquidescritos em outra parte.

Variantes de um polinucleotídeo da invenção emparticular (i.e., o polinucleotídeo referência) podem sertambém avaliados por comparação da identidade de seqüênciapercentual entre o polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelopolinucleotídeo referência. Assim, por exemplo, umpolinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo comuma dada identidade de seqüência percentual ao polipeptídeoFucT ou XylT de SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID N0:21,respectivamente, é descrito. A identidade de seqüênciapercentual entre quaisquer dois polipeptídeos pode sercalculada usando programas de alinhamento de seqüências eparâmetros aqui descritos em outra parte. Onde qualquerdado par de polinucleotideos da invenção é avaliado porcomparação da identidade de seqüência percentualcompartilhada pelos dois polipeptideos que codificam, aidentidade de seqüência percentual entre os doispolipeptideos codificados é pelo menos cerca de 40%, 45%,50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência.

Proteína "variante" deve significar uma proteínaderivada da proteína nativa por deleção ou adição de um oumais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativae/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou maissítios na proteína nativa. Proteínas variantes englobadaspela presente invenção são biologicamente ativas, isto é,elas continuam a possuir a atividade biológica desejada daproteína nativa, isto é, a atividade enzimática de anexaçãode resíduo de fucose al,3-ligada (atividade de FucT) ouresíduo de xilose pi,2-ligada (atividade de XylT) para N-glicanas glicoproteínas em plantas como aqui descrito. Taisvariantes podem resultar de, por exemplo, polimorfismogenético ou de manipulação humana. Variantes biologicamenteativos de uma proteína FucT ou XylT nativa da invençãoterão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99% ou mais de identidade de seqüência à seqüência deaminoácidos para a proteína nativa como determinado porprogramas de alinhamento de seqüências e parâmetros aquidescritos em outra parte. Um variante biologicamente ativode uma proteína da invenção pode diferir daquela proteínapor tão pouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tãopouco quanto 1-10, tais como 6-10, tão pouco quanto 5, tãopouco quanto 4, 3, 2, ou até 1 resíduo de aminoácido.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de váriosjeitos, incluindo substituições, deleções, truncações einserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulaçõessão geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo,variantes e fragmentos de seqüências de aminoácidos dasproteínas FucT e XylT podem ser preparados por mutações noDNA. Métodos para mutagênese e alterações empolinucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al (1987) Methods in Enzymol 154:367-382;U.S. Patent No. 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983)Techniques in Molecular Biology (MacMillan PublishingCompany, New York) e as referências aí citadas. Diretrizespara substituições apropriadas de aminoácidos que nãoafetem a atividade biológica da proteína de interesse podemser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas ofProtein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D. C) , aqui incorporado por referência.Substituições conservativas, tais como troca de umaminoácido por outro tendo propriedades similares, pode serótimo.

Assim, os polinucleotídeos da invenção incluem ambasseqüências FucT e XylT naturalmente ocorrentes assim comoformas mutantes. Igualmente, as proteínas da invençãoenglobam ambas proteínas FucT e XylT naturalmenteocorrentes, assim como variações e formas modificadasdessas. Tais variantes continuaram a possuir a atividadedesejada. Assim, onde a expressão de uma proteína funcionalé desejada, a proteína expressa possuirá a atividade deFucT ou XylT desejada, i.e., a atividade enzimática deanexar o resíduo de fucose al,3-ligada (atividade de FucT)ou resíduo de xilose 31,2-ligada (atividade de XylT) paraN-glicanas glicoproteínas em plantas como aqui descrito.Onde o objetivo é a inibição de expressão ou função dopolipeptídeo FucT e/ou XylT, uma atividade desejada dopolinucleotídeo ou polipeptídeo variante é uma de inibir aexpressão ou função do respectivo polipeptídeo FucT e/ouXylT. Obviamente, onde a expressão de um variante funcionalFucT ou XylT é desejada, as mutações que serão feitas noDNA codificando o variante pode colocar a seqüência fora doquadro de leitura e otimamente não criará regiões decomplementaridade que poderiam produzir estruturas de mRNAsecundárias. Ver, EP Patent Application Publication No.75.444.

Onde uma proteína funcional é desejada, as deleções,inserções, e substituições das seqüências de proteínas aquienglobadas não são esperadas por produzir mudanças radicaisnas características da proteína. Contudo, quando é difícilprever o efeito exato da substituição, deleção, ou inserçãoantes de fazê-la, um especialista na técnica irá ponderarque o efeito será avaliado por testes de rastreamento derotina, incluindo os testes para monitorar a atividade deFucT e XylT aqui descritos abaixo na seção Experimental.Polinucleotideos e proteínas variantes também englobamseqüências e proteínas derivadas de um procedimentomutagênico e recombinogênico, tal como embaralhamento deDNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüênciascodificadoras de FucT ou XylT diferentes podem sermanipuladas para criar uma nova proteína FucT ou XylTpossuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira,bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas apartir de uma população de polinucleotídeos de seqüênciarelacionados compreendendo regiões de seqüência que possuemidentidade de seqüência substancial e podem serhomologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Porexemplo, usando esta abordagem, motivos de seqüênciacodificando um domínio de interesse podem ser embaralhadosentre o gene de FucT ou XylT da invenção e outros genes deFucT ou XylT conhecidos, respectivamente, para obter umnovo gene codificando uma proteína com uma propriedade deinteresse melhorada. Estratégias para tal embaralhamento deDNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) NatureBiotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol.272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; eU.S. Patent Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

A comparação de seqüências e determinação deidentidade percentual e similaridade percentual entre duasseqüências pode ser conseguida usando um algoritmomatemático. Em um avanço preferido, a identidade percentualentre duas seqüências de aminoácidos é determinado usando oalgoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.45:444-453, que é incorporado no programa GAP no pacote desoftware GCG (disponibilizado em www.accelrys.com), usandotanto uma matriz BLOSSUM62 ou uma matriz PAM250, e um pesogap de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimentode 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Ainda em outro avanço preferido, aidentidade percentual entre duas seqüências de nucleotideosé determinada usando o programa GAP no pacote de softwareGCG, usando uma matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoffet al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) e umpeso gap de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimentode 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um grupo de parâmetrosparticularmente preferidos (e aquele que deveria ser usadose o praticante está incerto sobre que parâmetros deveriamser aplicados para determinar se uma molécula está nalimitação de identidade de seqüência da invenção) é usaruma matriz de pontuação BLOSUM62 com um peso gap de 60 e umpeso de comprimento de 3).

A identidade percentual entre duas seqüências deaminoácidos ou nucleotideos pode ser também determinadausando o algoritmo de Meyers and Miller (1989) CABIOS 4:11-11 que foi incorporado no programa ALIGN (version 2.0),usando uma tabela PAM120 de peso de resíduo, uma penalidadepor comprimento de espaço de 12 e uma penalidade por espaçode 4 .

Uma indicação alternativa de que duas moléculas deácidos nucléicos são proximamente relacionadas é que asduas moléculas hibridizam uma à outra sob condiçõesestringentes. Condições estringentes são dependentes deseqüência e são diferentes sob diferentes parâmetrosambientais. Geralmente, condições estringentes sãoselecionadas para serem cerca de 5°C a 20°C menores do queo ponto térmico de derretimento (Tm) para a seqüênciaespecifica em uma determinada força iônica e pH. A Tm é atemperatura (sob determinada força iônica e pH) na qual 50%da seqüência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamentecorrespondente.

Condições para hibridização de ácidos nucléicos ecálculo de estringências podem ser encontradas, porexemplo, em Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY) e Tijssen (1993) Hybridization WithNucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic AcidPreparation (Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY).

Para propósitos da presente invenção, "condiçõesestringentes" englobam condições sob as quais ahibridização irá ocorrer apenas se existir menos de 25% defalta de correspondência entre a molécula de hibridização ea seqüência alvo. "Condições estringentes" podem serquebradas em níveis particulares de estringência paradefinição mais precisa. Assim, como aqui usado, condiçõesde "estringência moderada" são aquelas sob as quaismoléculas com mais de 25% de falta de correspondência deseqüência não hibridizam; condições de "estringência demeio" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 15% defalta de correspondência não hibridizam, e condições de"alta estringência" são aquelas sob as quais seqüências commais de 10% de falta de correspondência não hibridizam.

Condições de "estringência muito alta" são aquelas sob asquais seqüências com mais de 6% de falta de correspondêncianão hibridizam.

Os polinucleotideos de FucT e XylT da invenção podemser usados como sondas para o isolamento de seqüênciashomólogas correspondentes em outros organismos, maisparticularmente em outras espécies vegetais. Dessa maneira,métodos, tais como PCR, hibridização, e similares podem serusados para identificar tais seqüências baseado em suahomologia de seqüência para as seqüências da invenção. Ver,por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Plainview, New York) e Innis et al. (1990), PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, New York). Seqüências de polinucleotideos isoladasbaseadas em sua identidade de seqüência aos FucT ou XylTpolinucleotideos completos da invenção (i.e., SEQ ID NOS: 1e 2 para FucT; SEQ ID NOS:4 e 5 para isoforma #1 de XylT deSEQ ID NO:6; e SEQ ID NOS: 19 e 20 para isoforma #2 de XylTde SEQ ID NO: 21) ou a fragmentos e variantes dessas, sãoenglobadas pela presente invenção.

Em um método de PCR, primers de oligonucleotideospodem ser projetados para uso em reações de PCR paraamplificação de seqüências de DNA correspondentes a partirde cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo deinteresse. Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não sãolimitados a, métodos usando primers pareados, primers derefúgio, primers simples específicos, primers degenerados, primers gene-específicos, primers específicos de vetor,primers parcialmente sem correspondência, e similares.Métodos para projetar primers de PCR e clonagem de PCR sãogeralmente conhecidos na técnica e são descritos emSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, New York). Ver também Innis et al., eds. (1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995)PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press,New York).

Em um método de hibridização, toda ou parte de umaseqüência de nucleotídeos conhecida pode ser usada como umasona que hibridiza seletivamente a outros polinucleotídeoscorrespondentes presentes em uma população de fragmentosclonados de DNA genômico ou fragmentos de cDNA (i.e.,bibliotecas de cDNA ou genômicas) a partir de outroorganismo de interesse. As chamadas sondas de hibridizaçãopodem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA,fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem serrotuladas com um grupo detectável, tal como 32P, ouqualquer outro marcador detectável. Sondas parahibridização podem ser feitas rotulando-se oligonucleotídeos sintéticos baseados na seqüência denucleotídeos de interesse, por exemplo, os polinucleotídeosFucT ou XylT da invenção. Primers degenerados projetados nabase de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos conservadosno nucleotídeo ou seqüência de aminoácidos codificadosconhecidos podem ser adicionalmente usados. Métodos para aconstrução de bibliotecas de cDNA e genômico, e parapreparar sondas de hibridização, são geralmente conhecidasna técnica e estão descritos em Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), aquiincorporado por referência.

Por exemplo, toda ou parte da seqüência depolinucleotídeos de FucT ou XylT específica conhecida podeser usado como sonda que hibridiza seletivamente a outronucleotídeo de FucT ou XylT e RNAs mensageiros. Paraalcançar hibridização específica sob uma variedade decondições, tais sondas incluem seqüências que são únicas esão preferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeosem comprimento, e mais otimamente pelo menos cerca de 20nucleotídeos em comprimento. Esta técnica pode ser usadapara isolar outras seqüências de nucleotídeos de FucT ouXylT a partir de um organismo desejado ou como um testediagnóstico para determinar a presença de seqüênciascodificadoras de FucT ou XylT em um organismo. Técnicas dehibridização incluem rastreamento de hibridização debibliotecas de DNA plaqueado (tanto placas como colônias;ver, por exemplo, Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NewYork)).Assim, além dos polinucleotídeos de FucT e XylTnativos e fragmentos e variantes desses, ospolinucleotídeos isolados da invenção também englobamseqüências de DNA homólogas identificas e isoladas deoutros organismos por hibridização com seqüências inteirasou parciais obtidas a partir de polinucleotídeos de FucT ouXylT da invenção ou variantes desses. Condições quepermitirão que outras seqüências de DNA hibridizem àsseqüências de DNA aqui descritas podem ser determinadas deacordo com técnicas geralmente conhecidas na técnica. Porexemplo, a hibridização de tais seqüências pode serconduzida sob várias condições de estringência moderada,média, alta, ou muito alta, como aqui notado acima.

Métodos da invenção

A presente invenção é direcionada a métodos paraalterar padrões de glicosilação de proteínas em vegetaissuperiores, particularmente em plantas superiores queservem como hospedeiros para a produção de proteínasrecombinantes, particularmente proteínas recombinantes demamíferos de interesse farmacêutico. Os métodos são úteispara produzir plantas superiores que são capazes deproduzir proteínas recombinantes tendo um padrão de N-glicosilação que lembre mais proximamente aquele encontradoem mamíferos. Composições da invenção incluem plantassuperiores que são estavelmente transformadas paracompreender um padrão de N-glicosilação alterado de suasproteínas heterólogas endógenas (i.e., homólogas) eproduzidas de forma recombinante. Em alguns avanços, asplantas superiores são plantas transgênicas que produzemanticorpos monoclonais (mAbs) para proteinas de mamíferosque possuem atividade ADCC intensificada relativa a mAbsproduzidos em uma planta controle que não possui omaquinário de glicosilação alterado para reduzir a anexaçãoespecífica de planta de resíduos de al,3-fucose para as N-glicanas de glicoproteínas homólogas e heterólogas aíproduzidas.

Os métodos da invenção visam a supressão (i.e.,inibição) da expressão de uma ou ambas enzimas envolvidasna produção de glicoproteínas complexas em plantassuperiores. De particular interesse é a supressão de umafucosiltransferase ou uma ou mais isoformas dessa,supressão de uma xilosiltransf erase ou uma ou maisisoformas dessa, ou supressão da expressão de ambasproteínas e uma ou mais isoformas dessas. É reconhecido quea supressão de fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase euma ou mais isoformas dessas pode ser conseguidatransientemente. Alternativamente, suprimindo-se

estavelmente a expressão de fucosiltransferase e/ouxilosiltransferase, é possível produzir plantas superiorestransgênicas que carregam de geração para geração, tantoassexuadamente ou sexuadamente, a habilidade de produzirglicoproteínas tendo um padrão de W-glicosilação que lembremais aquele encontrado em mamíferos, mais particularmente,em humanos. Isso vantajosamente provê a produção deglicoproteínas de mamíferos recombinantes que reduziram aanexação do resíduo de xilose vegetal ß1,2-ligada e/ouresíduo de fucose al,3-ligada para N-glicanasglicoproteínas.

A inibição da expressão de um ou vantajosamente ambasproteínas em uma planta, por exemplo, uma plantadicotiledônea ou monocotiledônea, por exemplo, uma plantalentilha d'água, pode ser conduzida usando qualquer métodoconhecido na técnica. Dessa maneira, um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência inibidora para FucT, XylT, ouuma combinação dessa é introduzido na célula hospedeira deinteresse. Para supressão transiente, a seqüência inibidorade FucT ou XylT pode ser um RNA quimicamente sintetizado ouRNA pequeno de interferência produzido in vitro (siRNA) oumicro RNA (miRNA) que, quando introduzido na célulahospedeira, inibiria diretamente, apesar detransientemente, FucT, XylT, ou uma combinação dessas,silenciando a expressão desse(s) produto(s) gênico(s)alvo(s).

Alternativamente, a supressão estável da expressão deFucT, XylT, ou uma combinação dessas é desejada como aquinotado acima. Assim, em alguns avanços, a atividade dopolipeptídeo FucT ou XylT da invenção é reduzida oueliminada transformando uma célula vegetal com um cassetede expressão que expressa um polinucleotídeo que inibe aexpressão de FucT ou XylT, ou ambas. O polinucleotídeo podeinibir a expressão de FucT ou XylT, ou ambas, diretamente,prevenindo a transcrição ou tradução de RNA mensageiro deFucT ou XylT, ou indiretamente, codificando um polipeptídeoque inibe a transcrição ou tradução de um gene codificandoFucT ou XylT, ou ambas. Métodos para inibir ou eliminar aexpressão de um gene em uma planta são bem conhecidos natécnica, e qualquer tal método pode ser usado na presenteinvenção para inibir a expressão de FucT ou XylT, ou ambas.

Assim, em alguns avanços, a expressão da proteína FucTe/ou XylT pode ser inibida introduzindo-se na planta umconstructo de nucleotídeo, tal como um cassete deexpressão, compreendendo uma seqüência que codifica umamolécula nucleotídica inibidora que é projetada parasilenciar a expressão do produto gênico FucT e/ou XylT deinteresse, tal como RNA de orientação senso, RNA anti-senso, RNA de dupla-fita (dsRNA), RNA hairpin (hpRNA),hpRNA contendo íntron, RNA catalítico, miRNA, e similares.Em outros avanços, o constructo de nucleotídeo, porexemplo, um cassete de expressão, pode compreender umaseqüência que codifica um mRNA, a tradução do qual produzum polipeptídeo de interesse que inibe a expressão oufunção do produto gênico FucT e/ou XylT de interesse. Ondeo constructo de nucleotídeo compreende uma seqüência quecodifica uma molécula nucleotídica inibidora ou um mRNApara um polipeptídeo de interesse, a seqüência éoperacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão em uma célula vegetal do forma que a moléculanucleotídica inibidora codificada ou mRNA possa serexpressa.

De acordo com a presente invenção, a expressão de umgene de FucT ou XylT é inibida se o nível de proteína deFucT ou XylT é estatisticamente menor do que o nível deproteína da mesma FucT ou XylT em uma planta que não foigeneticamente modificada ou mutagenizada para inibir aexpressão daquela FucT ou XylT. Em avanços da invenção emparticular, o nível de proteína de FucT ou XylT, ou ambas,em uma planta modificada de acordo com a invenção é demenos de 95%, menos de 90%, menos de 80%, menos de 70%,menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%,menos de 20%, menos de 10%, ou menos de 5% do nível deproteína da mesma FucT ou XylT em uma planta que não émutante ou que não foi geneticamente modificada para inibira expressão daquela FucT ou XylT, ou ambas FucT ou XylT. Onível de expressão de FucT ou XylT, ou ambas, pode sermedido diretamente, por exemplo, testando-se o nível deFucT ou XylT, ou ambas, expresso na célula vegetal ouplanta, ou indiretamente, por exemplo, observando o efeitoem uma planta transgênica no nível fenotípico, i.e., poranálise de planta transgênica, observado como uma redução,ou até eliminação, da anexação de resíduos de pi,2-xilosee/ou de al,3-fucose para N-glicanas glicoproteínas naplanta.

Em outros avanços da invenção, a atividade de FucT ouXylT, ou ambas, é reduzida ou eliminada transformando umacélula vegetal com um cassete de expressão compreendendo umpolinucleotídeo codificando um polipeptídeo que inibe aatividade de FucT ou XylT, ou ambas. A atividade de umaFucT ou XylT é inibida de acordo com a presente invenção sea atividade de FucT ou XylT é estatisticamente menor que aatividade da mesma FucT ou XylT em uma planta que não foigeneticamente modificada para inibir a atividade daquelaFucT ou XylT. Em avanços da invenção em particular, aatividade da FucT ou XylT em uma planta modificada deacordo com a invenção é de menos de 95%, menos de 90%,menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%,menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, oumenos de 5% da atividade da mesma FucT ou XylT em umaplanta que não foi geneticamente modificada para inibir aexpressão daquela FucT ou XylT. A atividade de uma FucT ouXylT é "eliminada" de acordo com a invenção quando não édetectável pelos métodos de teste aqui descritos em outraparte.

Em outros avanços, a atividade de uma FucT ou XylT, ouambas, pode ser reduzida ou eliminada rompendo-se o genecodificando FucT ou XylT, ou ambas desses genes. A invençãoengloba plantas mutagenizadas, particularmente plantas quesão membros da família das lentilhas d'água, que carregammutações em um gene de FucT ou XylT, ou mutações em ambosgenes, onde as mutações reduzem a expressão do gene de FucTe/ou XylT ou inibe a atividade de FucT e/ou XylTcodificada.

Os métodos da invenção podem envolver qualquer métodoou mecanismo conhecido na técnica para reduzir ou eliminara atividade ou nível de FucT e/ou XylT nas células de umaplanta superior, incluindo, mas não limitados a, supressãoanti-senso, supressão senso, interferência de RNA, mutaçãoou deleção direcionada, estratégias negativas dominantes, esimilares. Assim, os métodos e composições aqui descritosnão são limitados a qualquer mecanismo ou teoria de ação, eincluem qualquer método onde a expressão ou função de FucTe/ou XylT é inibida nas células das planta superior deinteresse, alterando, dessa forma, o padrão de N-glicosilação de glicoproteinas endógenas e heterólogasproduzidas na planta.

Por exemplo, em alguns avanços, a seqüência inibidorade FucT ou a seqüência inibidora de XylT (ou ambas) éexpressa na orientação senso, caracterizado pelo fato deque os transcritos senso-orientados causam co-supressão daexpressão de um ou ambas enzimas. Alternativamente, aseqüência inibidora de FucT e/ou XylT (e.g., seqüência decomprimento total, seqüência truncada, fragmentos daseqüência, combinações dessas, e similares) pode serexpressa na orientação anti-senso e, assim, inibir aexpressão endógena de FucT e/ou XIyT ou função pormecanismos anti-senso.

Ainda em outros avanços, a seqüência inibidora de FueTe/ou XylT ou seqüências são expressas como um RNA hairpin,que compreende ambas seqüência senso e seqüência anti-senso. Em avanços compreendendo uma estrutura hairpin, aestrutura Ioop pode compreender qualquer seqüência denucleotideos adequada incluindo, por exemplo, regiões 5'não traduzidas e/ou traduzidas do gene a ser suprimido, talcomo a região 5' UTR e/ou traduzida do polinucleotideo FucTde SEQ ID NO: 1 ou 2, ou a região 5' UTR e/ou traduzida dopolinucleotideo XylT de SEQ ID NO: 4, 5, 19, ou 20, esimilares. Em alguns avanços, a seqüência inibidora de FueTou XylT expressa como um hairpin é codificada por umaregião invertida da seqüência de nucleotideos de FucT ouXylT. Ainda em outros avanços, as seqüências inibidoras deFucT e/ou XylT são expressas como RNA de dupla-fita, ondeuma seqüência inibidora de FucT e/ou XylT é expressa naorientação senso e outra seqüência complementar é expressana orientação anti-senso. RNA de dupla-fita, estruturashairpin, e combinações dessas compreendendo seqüências denucleotideos de FucT, seqüências de nucleotideos de XylT,ou combinações dessas podem operar por interferência deRNA, co-supressão, mecanismo anti-senso, qualquercombinação dessa, ou por meios de qualquer outro mecanismoque causa a inibição da expressão ou função de FucT e/ouXylT.

Assim, vários métodos podem ser usados para reduzir oueliminar a atividade de uma FucT ou XylT, ou ambasproteínas, e quaisquer isoformas dessas. Por "isoforma"pretende-se uma proteína variante naturalmente ocorrente deuma proteína FucT ou XylT de interesse, onde o variante écodificado por um gene diferente. Geralmente, isoformas deuma proteína FucT ou XylT de interesse em particular sãocodificadas por uma seqüência de nucleotideos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência à seqüência denucleotideos codificando a proteína FucT ou XylT deinteresse. Mais de um método pode ser usado para reduzir oueliminar a atividade de uma única FucT ou XylT vegetal, eisoformas dessa. Exemplos não limitantes de métodos dereduzir ou eliminar a atividade de uma FucT ou XylT vegetalsão dados abaixo.Métodos baseados em polinucleotideos:

Em alguns avanços da presente invenção, uma célulavegetal é transformada com um cassete de expressão que écapaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressãode FucT ou XylT, ou ambas. O termo "expressão", como aquiusado, refere-se à biossintese de um produto gênico,incluindo a transcrição e/ou tradução do produto gênico.Por exemplo, para os propósitos da presente invenção, umcassete de expressão capaz de expressar um polinucleotídeoque inibe a expressão de pelo menos uma FucT ou XylT, ouambas, é um cassete de expressão capaz de produzir umamolécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução depelo menos uma FucT ou XylT, ou ambas. A "expressão" ou"produção" de uma proteína ou polipeptídeo a partir de umamolécula de DNA refere-se à transcrição e tradução daseqüência codificadora para produzir a proteína oupolipeptídeo, enquanto a "expressão" ou "produção" de umaproteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de RNArefere-se à tradução da seqüência de RNA codificadora paraproduzir a proteína ou polipeptídeo.

Exemplos de polinucleotideos que inibem a expressão deuma FucT ou XylT, ou ambas, são dados abaixo.

Supressão/Co-Supressão Senso

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode FucT ou XylT, ou ambas, pode ser obtida por supressão ouco-supressão senso. Para co-supressão, um cassete deexpressão é projetado para expressar uma molécula de RNAcorrespondendo a todo ou parte de um RNA mensageirocodificando uma FucT ou XylT, ou ambas, na orientação"senso". A super expressão da molécula de RNA pode resultarem expressão reduzida do gene nativo. Dessa forma,múltiplas linhagens de plantas transformadas com o cassetede expressão de co-supressão são rastreadas paraidentificar aquelas que apresentam a maior inibição daexpressão de FucT ou XylT.

O polinucleotideo usado para co-supressão podecorresponder a toda ou parte da seqüência codificando FucTou XylT, toda ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3'de um transcrito FucT ou XylT, ou toda ou parte de ambas seqüência codificadora e regiões não traduzidas de umtranscrito codificando FucT ou XylT. Em alguns avanços ondeo polinucleotideo compreende toda ou parte da regiãocodificadora para a proteína FucT ou XylT, o cassete deexpressão é projetado para eliminar o códon de iniciação do polinucleotideo de forma que nenhum produto de proteínaseja transcrito.

A co-supressão pode ser usada para inibir a expressãode genes vegetais para produzir plantas tendo níveis de proteína indetectáveis para as proteínas codificadas poresses genes. Ver, por exemplo, Broin et al. (2002) PlantCell 14: 1417-1432. Co-supressão pode ser também usada parainibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta.Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5.942.657. Métodos para usar co-supressão para inibir a expressão de genesendógenos em plantas são descritos em Flavell et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:34 90-34 96; Jorgensen et al.(1996) Plant Mol. Biol. 31:957- 973; Johansen andCarrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin et al.(2002) Plant Cell 14: 1417-1432; Stoutjesdijk et al. (2002)Plant Physiol. 129: 1723-1731; Yu et al. (2003)Phytochemistry 63:753-763; e U.S. Patent Nos. 5.034.323,5.283.184, e 5.942.657; cada qual é aqui incorporado porreferência. A eficiência de co-supressão pode ser aumentadaincluindo-se uma região poli-dT no cassete de expressão naposição 3' em relação à seqüência senso e 5' do sinal depoliadenilação. Ver, U.S. Patent Publication No.20020048814, aqui incorporada por referência. Tipicamente,tal seqüência de nucleotideos possui identidade deseqüência substancial em relação à seqüência do transcritodo gene endógeno, otimamente maior do que cerca de 65% deidentidade de seqüência, mais otimamente maior do que cercade 85% de identidade de seqüência, mais otimamente maior doque cerca de 95% de identidade de seqüência. Ver, U.S.Patent Nos. 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas porreferência.

Supressão anti-senso

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode FucT ou XylT, ou ambas, pode ser obtida por supressãoanti-senso. Para supressão anti-senso, o cassete deexpressão é projetado para expressar uma molécula de RNAcomplementar a todo ou parte de um RNA mensageirocodificando a FucT ou XylT. A super expressão da moléculade RNA anti-senso pode resultam em expressão reduzida dogene nativo. Dessa forma, múltiplas linhagens de plantastransformadas com o cassete de expressão de supressão anti-senso são rastreadas para se identificar aquelas queapresentam a maior inibição de expressão de FucT ou XylT.

0 polinucleotideo para uso na supressão anti-sensopode corresponder a todo ou parte do complemento daseqüência codificando a FucT ou XylT, todo ou parte docomplemento da região 5' e/ou 3' não traduzida dotranscrito FucT ou XylT, ou todo ou parte do complemento deambas seqüência codificadora e regiões não traduzidas de utranscrito codificando FucT ou XylT. Além disso, opolinucleotideo anti-senso pode ser completamentecomplementar (i.e., 100% idêntico ao complemento daseqüência alvo) ou parcialmente complementar (i.e., menosde 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) emrelação à seqüência alvo. A supressão anti-senso pode serusada para inibir a expressão de múltiplas proteínas namesma planta. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5.942.657.Adicionalmente, porções dos nucleotídeos anti-senso podemser usadas para romper a expressão do gene alvo.Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 400, 450, 500, 550, oumaiores podem ser usadas. Métodos para usar supressão anti-senso para inibir a expressão de genes endógenos em plantassão descritos, por exemplo, em Liu et al. (2002) PlantPhysiol. 129: 1732-1743 e U.S. Patent Nos. 5.759.829 e5.942.657, cada qual é aqui incorporado por referência. Aeficiência de supressão anti-senso pode ser aumentadaincluindo-se uma região poli-dT no cassete de expressão naposição 3' em relação à seqüência anti-senso e 51 do sinalde poliadenilação. Ver, U.S. Patent Publication No.20020048814, aqui incorporada por referência.

Interferência de RNA de Dupla-Fita

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode uma FucT ou XylT, ou ambas, pode ser obtida porinterferência de RNA de dupla-fita (dsRNA) . Parainterferência de dsRNA, uma molécula de RNA senso comoaquela descrita acima para co-supressão e uma molécula deRNA anti-senso, que é completamente ou parcialmentecomplementar à molécula de RNA senso, são expressas namesma célula, resultando na inibição da expressão do RNAmensageiro endógeno correspondente.

A expressão das moléculas senso e anti-senso pode serconseguida projetando-se o cassete de expressão paracompreender tanto uma seqüência senso e uma seqüência anti-senso. Alternativamente, cassetes de expressão separadospodem ser usados para as seqüências senso e anti-senso.Múltiplas linhagens de plantas transformadas com o cassetede expressão ou de interferência de dsRNA ou cassetes deexpressão são, então, rastreadas para se identificarlinhagens de plantas que apresentam a maior inibição deexpressão de FucT ou XylT. Métodos para usar interferênciade dsRNA para inibir a expressão de genes vegetaisendógenos são descritos em Waterhouse et al (1998) Proc.Natl Acad. Sci USA 95: 13959-13964, Liu et al (2002) PlantPhysiol 129: 1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO99/61631, e WO 00/49035; cada qual é aqui incorporado porreferência.

Interferência de RNA Hairpin e Interferência de RNA HairpinContendo íntron

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode FucT ou XylT, ou ambas, pode ser obtida porinterferência de RNA hairpin (hpRNA) ou interferência deRNA hairpin contendo intron (ihpRNA). Esses métodos sãoaltamente eficientes em inibir a expressão de genesendógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38 e as referências ai citadas.

Para interferência de hpRNA, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA que hibridizacom si mesma para formar uma estrutura hairpin quecompreende uma região Ioop de fita simples e umaramificação base-pareada. A região de ramificação base-pareada compreende uma seqüência senso correspondendo atodo ou parte do RNA mensageiro endógeno codificando o genecuja expressão deve ser inibida, e uma seqüência anti-sensoque é completamente ou parcialmente complementar àseqüência senso. Assim, a região de ramificação base-pareada da molécula geralmente determina a especificidadeda interferência de RNA. Moléculas de hpRNA são altamenteeficientes em inibir a expressão de genes endógenos, e ainterferência de RNA que induzem é herdada por subseqüentesgerações de plantas. Ver, por exemplo, Chuang andMeyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4 985-4 990;Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731;and Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para usar interferência de hpRNA para inibir ousilenciar a expressão de genes são descritos, por exemplo,em Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol.129: 1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7, eU.S. Patent Publication No. 20030175965; cada qual é aquiincorporado por referência. Um teste transiente para aeficiência de constructos de hpRNA em silenciar a expressãode genes in vivo foi descrito por Panstruga et al. (2003)Mol. Biol. Rep. 30: 135-140, aqui incorporado porreferência.

Para ihpRNA, as moléculas de interferência possuem amesma estrutura geral como para hpRNA, mas a molécula deRNA compreende adicionalmente um intron que é capaz desofrer splice na célula na qual o ihpRNA é expresso. 0 usode um intron minimiza o tamanho do Ioop na molécula de RNAhairpin após splicing, e esse aumento na eficência deinterferência. Ver, por exemplo, Smith et al. (2000) Nature407:319-320. De fato, Smith et al. mostram 100% desupressão de expressão de gene endógeno. usandointerferência mediada por ihpRNA. Métodos para usarinterferência de ihpRNA para inibir a expressão de genesvegetais endógenos são descritos, por exemplo, em Smith etal. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001) PlantJ. 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin. PlantBiol. 5: 146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003) Methods30:289-295, e U.S. Patent Publication No. 20030180945, cadaqual é aqui incorporado por referência.

0 cassete de expressão para interferência de hpRNApode ser também projetado de forma que a seqüência senso ea seqüência anti-senso não correspondam a um RNA endógeno.Neste avanço, as seqüências senso e anti-senso flanqueiamuma seqüência Ioop que compreende uma seqüência denucleotideos correspondendo a todo ou parte do RNAmensageiro endógeno do gene alvo. Assim, é a região Ioopque determina a especificidade da interferência de RNA.Ver, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporado porreferência.

Silenciamento transcricional de gene (TGS) pode serconseguido através do uso de constructos de hpRNAcaracterizado pelo fato de que a repetição invertida dohairpin compartilha identidade de seqüência com a regiãopromotora de um gene a ser silenciado. 0 processamento dohpRNA em RNAs curtos que podem interagir com a regiãopromotora homóloga podem iniciar a degradação ou metilaçãopara resultar no silenciamento (Aufsatz et al. (2002) PNAS99 (Suppl. 4): 16499-16506; MQUQ et al. (2000) EMBO J19(19) : 5194-5201) .

Cassetes de expressão que são projetados paraexpressar uma molécula de RNA que forma uma estruturahairpin são aqui referidos como cassetes de expressão deRNAi. Em alguns avanços, o cassete de expressão de RNAi éprojetado de acordo com uma estratégia destacada na Figura28. Em tais avanços, um cassete de expressão de RNAi podeser projetado para suprimir a expressão dos genes FucT eXylT individuais (i.e., cada cassete provê um knockout degene único), ou pode ser projetado para suprimir aexpressão de ambos genes de FucT e XylT (i.e., um únicocassete de expressão de RNAi expressa uma moléculainibidora que provê a supressão de expressão de ambosgenes). Onde o cassete de expressão de RNAi suprime aexpressão de ambos genes de FucT e XylT, ele é aquiereferido como um cassete de expressão de RNAi "quimérico".Os cassetes de expressão de RNAi de gene único e quiméridopodem ser projetados para expressar estruturas de hpRNAmaiores ou, alternativamente, estruturas pequenas de hpRNA,como aqui notado abaixo.

Assim, em alguns avanços, o cassete de expressão deRNAi é projetado para expressar estruturas maiores de hpRNAtendo homologia suficiente em relação ao transcrito de mRNAalvo para prover silenciamento de gene pós-transcricionalde um ou ambos genes de FucT e XylT. Para estruturasmaiores de hpRNA, a banda fita do cassete de expressão deRNAi é projetada para compreender na direção 5' a 3' osseguintes elementos operacionalmente ligados: um promotorde interesse, um fragmento direto da seqüência gênica deFucT ou XylT compreendendo cerca de 500 a cerca de 800nucleotídeos (nt) de uma fita senso para FucT ou XylT,respectivamente, uma seqüência espaçadora compreendendocerca de 100 a cerca de 700 nt de qualquer seqüência comoaqui notado abaixo, e um fragmento reverso da seqüênciagênica de XylT ou FucT, caracterizado pelo fato de que ofragmento reverso compreende a seqüência anti-sensocomplementar ao respectivo (i.e., FucT ou XylT) fragmentodireto. Assim, por exemplo, se um fragmento direto érepresentado por nucleotideos " . ..acttg...", o fragmentoreverso correspondente é representado pelos nucleotideos"...caagt...", e a fita senso para tal cassete de expressãode RNAi compreenderia a seguinte seqüência: "5'-...acttg...nnnn.... caagt...-3', onde "nnnn" representa aseqüência espaçadora.

É reconhecido que o fragmento direto pode compreenderuma seqüência de nucleotideos que é 100% idêntica à porçãocorrespondente à fita senso para a seqüência gênica de FucTou XylT alvo, ou na alternativa, pode compreender umaseqüência que compartilha pelo menos 90%, pelo menos 95%,ou pelo menos 98% de identidade de seqüência à porçãocorrespondente da fita senso para o gene de FucT ou XylTalvo a ser silenciado. Da mesma maneira, é reconhecido queo fragmento reverso não tem que compartilhar 100% deidentidade de seqüência em relação ao complemento dofragmento direto; ao invés, deve ser de comprimento ecomplementaridade suficiente em relação à seqüênciafragmento direto de forma que, quando a molécula de RNAinibidora for expressa, as regiões transcritascorrespondentes ao fragmento direto e fragmento reversohibridizem para formar a ramificação base-pareada (i.e.,porção de dupla-fita) da estrutura hp RNA. Por "comprimentosuficiente" pretende-se um comprimento que seja pelo menos10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelomenos 40% do comprimento do fragmento direto, maisfreqüentemente pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos90%, ou pelo menos 95% do comprimento do fragmento direto.

Por "complementaridade suficiente" pretende-se que aseqüência do fragmento reverso compartilhe pelo menos 90%,pelo menos 95%, pelo menos 98% de identidade de seqüênciacom o complemento daquela porção do fragmento direto queirá hibridizar com o fragmento reverso para formar aramificação base-pareada da estrutura hp RNA. Assim, emalguns avanços, o fragmento reverso é o complemento (i.e.,versão anti-senso) do fragmento direto.

Ao projetar tal cassete de expressão de RNAi, oscomprimentos do fragmento direto, seqüência espaçadora, efragmentos reversos são escolhidos de forma que ocomprimento combinado do polinucleotideo que codifica oconstructo hpRNA seja de cerca de 650 até cerca de 2500 nt,cerca de 750 até cerca de 2500 nt, cerca de 750 até cercade 2400 nt, cerca de 1000 até cerca de 2400 nt, cerca de1200 até cerca de 2300 nt, cerca de 1250 até cerca de 2100nt, ou cerca de 1500 até cerca de 1800. Em alguns avanços,o comprimento combinado do constructo hairpin expresso é decerca de 650 nt, cerca de 700 nt, cerca de 750 nt, cerca de800 nt, cerca de 850 nt, cerca de 900 nt, cerca de 950 nt,cerca de 1000 nt, cerca de 1050 nt, cerca de 1100 nt, cercade 1150 nt, cerca de 1200 nt, cerca de 1250 nt, cerca de1300 nt, cerca de 1350 nt, cerca de 1400 nt, cerca de 1450nt, cerca de 1500 nt, cerca de 1550 nt, cerca de 1600 nt,cerca de 1650 nt, cerca de 1700 nt, cerca de 1750 nt, cercade 1800 nt, cerca de 1850 nt, cerca de 1900 nt, cerca de1950 nt, cerca de 2000 nt, cerca de 2050 nt, cerca de 2100nt, cerca de 2150 nt, cerca de 2200 nt, cerca de 2250 nt,cerca de 2300 nt, ou qualquer comprimento entre cerca de650 nt até cerca de 2300 nt.

Em alguns avanços, o fragmento direto compreende cercade 500 até cerca de 800 nt, por exemplo, 500, 525, 550,575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, ou 800 nt deuma fita senso para FucT ou XylT, por exemplo, da fitasenso apresentada em SEQ ID NO: 1 ou 2 (FucT) ou SEQ ID NO:4, 5, 19, ou 20 (XylT) ; a seqüência espaçadora compreendecerca de 100 até cerca de 700 nt, por exemplo, 100, 125,150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425,450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, ou 700 ntde qualquer seqüência, como notado abaixo, e o fragmentoreverso compreende a fita anti-senso para a seqüênciafragmento direto, ou uma seqüência tendo comprimentosuficiente e complementaridade suficiente em relação àseqüência fragmento direto.

A seqüência espaçadora pode ser qualquer seqüência quepossui homologia insuficiente em relação ao gene alvo,i.e., FucT ou XylT, e homologia insuficiente à si mesma deforma que a porção da molécula de RNA inibidora expressacorrespondente à região espaçadora não consiga se auto-hibridizar, e, assim, forme o Ioop da estrutura de RNAhairpin. Em alguns avanços, a seqüência espaçadoracompreende um intron, e, assim, a molécula de RNA inibidoraexpressa forma um ihpRNA, como aqui notado acima. Em outrosavanços, a seqüência espaçadora compreende uma porção dafita senso para o gene de FucT ou XylT a ser silenciado,por exemplo, uma porção da fita senso apresentada em SEQ IDNO: 1 ou 2 (FucT) ou SEQ ID N0:4, 5, 19, ou 20 (XylT) ,particularmente uma porção da fita senso imediatamenteabaixo da seqüência fragmento direto.

O promotor operacionalmente ligado pode ser qualquerpromotor de interesse que provê a expressão dopolinucleotideo inibidor operacionalmente ligado na plantade interesse, incluindo um dos promotores aqui descritosabaixo. A região reguladora pode compreender elementosreguladores adicionais que intensificam a expressão dopolinucleotideo inibidor, incluindo, mas não limitado a, asseqüências lider 5' e seqüências líder 5' mais íntronsvegetais como aqui discutidos abaixo.

Em um avanço, o cassete de expressão de RNAi éprojetado para suprimir a expressão do polipeptídeo FucT deSEQ ID NO:3, um variante biologicamente ativo dopolipeptídeo FucT de SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo FucTcodificado por uma seqüência tendo pelo menos 75% deidentidade de seqüência em relação à seqüência de SEQ IDNO: 1 ou SEQ ID NO: 2, por exemplo, pelo menos 75%, pelomenos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos95% de identidade de seqüência em relação à seqüência deSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2. Dessa maneira, a fita senso docassete de expressão de RNAi é projetada para compreenderna direção 5' a 3' os seguintes elementos operacionalmenteligados: um promotor de interesse; um fragmento direto daseqüência gênica de FucT, caracterizado pelo fato de que ofragmento direto compreende os nt 255-985 de SEQ ID NO: 1;uma seqüência espaçadora compreendendo cerca de 100 atécerca de 700 nt de qualquer seqüência como notado acima; eum fragmento reverso da seqüência gênica de FucT,caracterizado pelo fato de que o fragmento reversocompreende o complemento (i.e., versão anti-senso) de nt255-985 de SEQ ID NO: 1. Em um avanço como tal, a seqüênciaespaçadora é representada pelos nt 986-1444 de SEQ ID NO:1, e o comprimento total daquela porção da fita sem o.cassete de expressão de RNAi correspondente à seqüênciacodificadora para a estrutura hpRNA é 1918 nt. Transformarestavelmente uma planta com um constructo de nucleotideocompreendendo esse cassete de expressão de RNAi, porexemplo, o vetor mostrado na Figura 8, efetivamente inibe aexpressão de FucT nas células vegetais da planta na qual aestrutura hpRNA é expressa. Em um avanço, a planta deinteresse é um membro da família das lentilhas d'água, porexemplo, um membro das Lemnaceae, e a planta foiestavelmente transformada com o vetor mostrado na Figura 8.

Em outros avanços da invenção, o cassete de expressãode RNAi é projetado para suprimir a expressão dopolipeptídeo XylT de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO:21, umvariante biologicamente ativo do polipeptídeo XylT de SEQID NO: 6 ou SEQ ID NO:21, ou ura polipeptídeo XylT codificadopor uma seqüência tendo pelo menos 75% de identidade deseqüência em relação à seqüência de SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID N0:20, por exemplo, pelomenos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,ou pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação àseqüência de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 19, ouSEQ ID NO:20. Dessa maneira, a fita senso do cassete deexpressão de RNAi é projetada para compreender na direção5' a 3' os seguintes elementos operacionalmente ligados: umpromotor de interesse; um fragmento direto da seqüênciagênica de XylT, caracterizado pelo fato de que o fragmentodireto compreende nt 318-1052 de SEQ ID NO:4; uma seqüênciaespaçadora compreendendo cerca de 100 até cerca de 700 nt de qualquer seqüência, como notado acima; e um fragmentoreverso da seqüência gênica de XylT, caracterizado pelofato de que o fragmento reverso compreende o complemento(i.e., versão anti-senso) de nt 318-1052 de SEQ ID NO:4. Emum avanço como tal, a seqüência espaçadora é representada por nt 1053- 1599 de SEQ ID NO: 4, e o comprimento totaldaquela porção da fita senso do cassete de expressão deRNAi correspondendo à seqüência codificadora para aestrutura hpRNA é 2015 nt. Transformar estavelmente umaplanta com um constructo de nucleotideo compreendendo esse cassete de expressão de RNAi, por exemplo, o vetor mostradona Figura 9, inibe efetivamente a expressão de FucT nascélulas vegetais da planta na qual a estrutura hpRNA éexpressa. Em um avanço, a planta de interesse é um membroda família das lentilhas d'água, por exemplo, um membro de Lemnaceaer e a planta foi estavelmente transformada com ovetor mostrado na Figura 9.

Em outros avanços, a fita senso do cassete deexpressão de RNAi é projetada para compreender na direção 51 a 31 os seguintes elementos operacionalmente ligados: umpromotor de interesse; um fragmento direto da seqüênciagênica de XylT, caracterizado pelo fato de que o fragmentodireto compreende nt 1-734 de SEQ ID NO: 19; uma seqüênciaespaçadora compreendendo cerca de 100 a cerca de 700 nt dequalquer seqüência, como notado acima; e um fragmentoreverso da seqüência gênica de XylT, caracterizado pelofato de que o fragmento reverso compreende o complemento(i.e., versão anti-senso) de nt 1-734 de SEQ ID NO: 19. Emum avanço como tal, a seqüência espaçadora é representadapor nt 735-1282 de SEQ ID NO: 19, e o comprimento totaldaquela porção da fita senso do cassete de expressão deRNAi correspondendo à seqüência codificadora para aestrutura hpRNA é 2015 nt. Transformar estavelmente umaplanta com um constructo de nucleotideo compreendendo essecassete de expressão de RNAi, por exemplo, o vetor mostradona Figura 9, efetivamente inibe expressão de FucT nascélulas vegetais da planta na qual a estrutura hpRNA éexpressa. Em um avanço, a planta de interesse é um membroda família das lentilhas d'água, por exemplo, um membro dasLemnaceaer e a planta foi estavelmente transformada com ovetor mostrado na Figura 9.

Ainda em outros avanços, estruturas hpRNA maiorespodem ser projetadas de forma que as seqüências anti-sensoe senso estejam em orientação oposta. Dessa maneira, a fitasenso do cassete de expressão de RNAi é projetada paracompreender na direção 5' a 3' os seguintes elementosoperacionalmente ligados: um promotor de interesse, aseqüência gênica de FucT ou de XylT de comprimento total naorientação anti-senso, e um fragmento direto da seqüênciagênica de FucT ou XylT compreendendo a metade 3' daseqüência na orientação senso (ver figura 28, projeto 1).Nesse tipo de constructo, a metade 3' da seqüência forma aramificação base-pareada (i.e., fita dupla) do hpRNA, e ametade 5' da seqüência age como uma seqüência espaçadora.Sem ser limitado pior qualquer teoria ou mecanismo, a região3' da seqüência FucT ou XylT é escolhida para formar aregião de dupla-fita do hpRNA para este constructo, poisesta região é relativamente conservada entre diferentesespécies vegetais comparada à região 5'.

Em um avanço como tal, o cassete de expressão de RNAié projetado para suprimir a expressão do polipeptideo FucTde SEQ ID NO:3, um variante biologicamente ativo dopolipeptideo FucT de SEQ ID NO: 3, ou um polipeptideo FucTcodificado por uma seqüência tendo pelo menos 75% deidentidade de seqüência em relação à seqüência de SEQ IDNO: 1 ou SEQ ID NO:2, por exemplo, pelo menos 75%, pelomenos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos95% de identidade de seqüência em relação à seqüência deSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2. Dessa maneira, a fita senso docassete de expressão de RNAi é projetada para compreenderna direção 5' a 3* os seguintes elementos operacionalmenteligados: um promotor de interesse; nucleotideos 1-1865 deSEQ ID NO: 1 na orientação anti-senso, e nucleotideos 950-1865 de SEQ ID NO: 1 na orientação senso. Transformarestavelmente uma planta com um constructo de nucleotideocompreendendo esse cassete de expressão de RNAi inibeefetivamente a expressão de FucT nas células vegetais daplanta na qual a estrutura hpRNA é expressa. Em um avanço,a planta de interesse é um membro da família das lentilhasd'água, por exemplo, um membro de Lemnaceae.

Em outro avanço como tal, o cassete de expressão deRNAi é projetado para suprimir a expressão do polipeptídeoXylT de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID N0:21, um variantebiologicamente ativo do polipeptídeo XylT of SEQ ID NO: 6ou SEQ ID N0:21, ou um polipeptídeo XylT codificado por umaseqüência tendo pelo menos 75% de identidade de seqüênciaem relação à seqüência de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO: 19, ou SEQ ID N0:20, por exemplo, pelo menos 75%, pelomenos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos95% de identidade de seqüência em relação à seqüência deSEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID N0:20. Dessa maneira,a fita senso do cassete de expressão de RNAi é projetadapara compreender na direção 51 a 3' os seguintes elementosoperacionalmente ligados: um promotor de interesse,nucleotídeos 1-1860 de SEQ ID NO: 4 na orientação anti-senso, e nucleotídeos 950-1860 de SEQ ID NO:4 na orientaçãosenso. Transformar estavelmente uma planta com umconstructo de nucleotídeo compreendendo esse cassete deexpressão de RNAi inibe efetivamente a expressão de XylTnas células vegetais da planta na qual a estrutura hpRNA éexpressa. Em um avanço, a planta de interesse é um membroda família das lentilhas d1água, por exemplo, um membro deLemnaceae.

Em outro avanço como tal, a fita senso do cassete deexpressão de RNAi é projetada para compreender na direção5' a 3' os seguintes elementos operacionalmente ligados: umpromotor de interesse, nucleotideos 1-1282 de SEQ ID NO: 19na orientação anti-senso, e nucleotideos 652-1282 de SEQ IDNO: 19 na orientação senso. Transformar estavelmente umaplanta com um constructo de nucleotideo compreendendo essecassete de expressão de RNAi inibe efetivamente a expressãode XylT nas células vegetais da planta na qual a estruturahpRNA é expressa. Em um avanço, a planta de interesse é ummembro da família das lentilhas d'água, por exemplo, ummembro de Lemnaceae.

Onde a supressão de ambas proteínas FucT e XylT édesejada, ela pode ser alcançada introduzindo-se essescassetes de expressão' de RNAi de gene simples na planta emum único evento de transformação, por exemplo, reunindoesses cassetes de expressão de RNAi de gene simples em umúnico vetor de transformação, por exemplo, um vetor similaràquele mostrado na Figura 11, ou como eventos de co-transformação separados, por exemplo, reunindo essescassetes de expressão de RNAi de gene simples em doisvetores de transformação, por exemplo, vetores similaresàqueles mostrados nas Figuras 8 e 9, usando qualquer métodode transformação adequando conhecido na técnica, incluindomas não limitados a métodos de transformação aqui descritosem outra parte.

Alternativamente, a supressão de ambas proteínas FucTe XylT pode ser alcançada introduzindo-se na plantasuperior de interesse um cassete de expressão de RNAiquimérico, como aqui notado acima. Assim, em alguns avançosda invenção, a fita senso de um cassete de expressão deRNAi quimérico é projetada para compreender na direção 51 a3' os seguintes elementos operacionalmente ligados: umpromotor de interesse; um fragmento direto quimérico,compreendendo cerca de 500 até cerca de 650 nucleotideos(nt) de uma fita senso para FucT e cerca de 500 até cercade 650 nt de uma fita senso para XylT, caracterizado pelofato de que a seqüência FucT e seqüência XylT podem ser emqualquer ordem; uma seqüência espaçadora compreendendocerca de 100 até cerca de 700 nt de qualquer seqüência; eum fragmento reverso do fragmento direto quimérico,caracterizado pelo fato de que o fragmento reversocompreende a seqüência anti-senso complementar aorespectivo fragmento direto quimérico.

Como notado previamente para os cassetes de expressãode RNAi individuais, é reconhecido que a seqüência de FucTou XylT individual no fragmento direto quimérico podecompreender uma seqüência de nucleotideos que é 100%idêntica à porção correspondente da fita senso para aseqüência gênica alvo de FucT e XylT, respectivamente, oucomo alternativa, pode compreender uma seqüência quecompartilhe pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos98% de identidade de seqüência em relação à porçãocorrespondente da fita senso para o gene alvo de FucT ouXylT a ser silenciado. Da mesma maneira, é reconhecido queo fragmento reverso não tem que compartilhar 100% deidentidade de seqüência em relação ao complemento dofragmento direto quimérico; ao invés, ele deve ser decomprimento suficiente e complementaridade suficiente paraa seqüência fragmento direto quimérico, como aqui definidoacima, de forma que quando a molécula de RNA inibidora éexpressa, as regiões transcritas correspondentes aofragmento direto quimérico e fragmento reverso irãohibridizar para formar a ramificação base-pareada (i.e.,porção de dupla-fita) da estrutura hpRNA. Em projetando talcassete de expressão de RNAi quimérico, os comprimentos dosfragmentos direto, seqüências espaçadoras, e fragmentosreversos são escolhidos de forma que o comprimentocombinado do polinucleotideo que codifica a estrutura hpRNAé de cerca de- 1200 até cerca de 3300 nt, cerca de 1250 atécerca de 3300 nt, cerca de 1300 até cerca de 3300 nt, cercade 1350 até cerca de 3300 nt, cerca de 1400 até cerca de3300 nt, cerca de 1450 nt até cerca de 3300 nt, cerca de1500 até cerca de 3300 nt, cerca de 2200 até cerca de 3100nt, cerca de 2250 até cerca de 2800 nt, ou cerca de 2500até cerca de 2700 nt. Em alguns avanços, o comprimentocombinado do constructo hairpin expresso é de cerca de 1200nt, cerca de 1250 nt, cerca de 1300 nt, cerca de 1350 nt,cerca de 1400 nt, cerca de 1450 nt, cerca de 1500 nt, cercade 1800 nt, cerca de 2200 nt, cerca de 2250 nt, cerca de2300 nt, cerca de 2350 nt, cerca de 2400 nt, cerca de 2450nt, cerca de 2500 nt, cerca de 2550 nt, cerca de 2600 nt,cerca de 2650 nt, cerca de 2700 nt, cerca de 2750 nt, cercade 2800 nt, cerca de 2850 nt, cerca de 2900 nt, cerca de2950 nt, cerca de 3000 nt, cerca de 3050 nt, cerca de 3100nt, cerca de 3150 nt, cerca de 3200 nt, cerca de 3250 nt,cerca de 3300 nt, ou qualquer comprimento entre cerca de1200 nt até cerca de 3300 nt.Em alguns avanços, o fragmento direto quiméricocompreende cerca de 500 até cerca de 650 nt, por exemplo,500, 525, 550, 575, 600, 625, ou 650 nt, de uma fita sensopara FucT, por exemplo, da fita senso apresentada em SEQ IDNO: 1 ou 2, e cerca de 500 até cerca de 650 nt, porexemplo, 500, 525, 550, 575, 600, 625, ou 650 nt, de umafita senso para XylT, por exemplo, da fita sensoapresentada em SEQ ID NO: 4, 5, 19, ou 20, onde a seqüênciade FucT e XylT pode ser fusionada em qualquer ordem; aseqüência espaçadora compreende cerca de 100 até cerca de700 nt, por exemplo, 100, 200, 225, 250, 275, 300, 325,350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625,650, 675, ou 700 nt dè qualquer seqüência de interesse; e ofragmento reverso compreende a fita anti-senso para ofragmento direto quimérico seqüência, ou uma seqüênciatendo comprimento suficiente e complementaridade suficientepara a seqüência fragmento direto quimérico.

Como notado acima para os cassetes de expressão deRNAi de gene simples, a seqüência espaçadora pode serqualquer seqüência que possua homologia insuficiente emrelação ao gene alvo, i.e., FucT ou XylT, e homologiainsuficiente a si mesma de forma que a porção da moléculade RNA inibidora expressa correspondente à regiãoespaçadora não consiga auto-hibridizar, e, assim forme oloop da estrutura hpRNA. Em alguns avanços, a seqüênciaespaçadora compreende um intron, e, assim, a molécula deRNA inibidora expressa forma um ihpRNA, como aqui notadoacima. Em outros avanços, a seqüência espaçadora compreendeuma porção da fita senso para o gene de FucT ou XylT a sersilenciado, por exemplo, uma porção da fita sensoapresentada em SEQ ID NO: 1 ou 2 (FucT) ou SEQ ID NO: 4, 5,19, ou 20 (XylT) . Em um avanço, o fragmento diretoquimérico compreende a seqüência FucT e XylT fusionadanaquela ordem, e a seqüência espaçadora compreende umaporção da fita senso XylT imediatamente abaixo da seqüênciaXylT contida no fragmento direto quimérico. Em outroavanço, o fragmento direto quimérico compreende a seqüênciade XylT and FucT fusionada naquela ordem, e a seqüênciaespaçadora compreende uma porção da fita senso FucTimediatamente abaixo da seqüência de FucT contida nofragmento direto quimérico.

Em alguns avanços, o cassete de expressão de RNAiquimérico é projetado para suprimir a expressão dopolipeptideo FucT de SEQ ID NO: 3, um variantebiologicamente ativo do polipeptideo FucT de SEQ ID NO: 3,ou um polipeptideo FucT codificado por uma seqüência tendopelo menos 7 5% de identidade de seqüência em relação àseqüência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID N0:2, por exemplo, pelomenos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,ou pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação àseqüência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID N0:2, e para suprimiraexpressão do polipeptideo XylT de SEQ ID NO: 6 ou SEQ IDN0:21, um variante biologicamente ativo do polipeptideoXylT de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 21, ou um polipeptideoXylT codificado por uma seqüência tendo pelo menos 75% deidentidade de seqüência em relação à seqüência de SEQ IDNO: 4, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID N0:20, porexemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%,pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade deseqüência em relação à seqüência de SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 20 . Para alguns dessesavanços, a seqüência FucT no fragmento direto quimérico éescolhida de forma que corresponda ao nt 700 até nt 1400 deSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, e/ou a seqüência de XylT nofragmento direto quimérico é escolhida de forma quecorresponda ao nt 700 até nt 1400 de SEQ ID NO:4 ou SEQ IDNO: 5, ou nt 383 até 1083 de SEQ ID NO: 19 ou 20. Sem estarligado por qualquer teoria, acredita-se que essa região(particularmente para FucT) seja relativamente conservadaentre diferentes espécies vegetais e, portanto, seja umaalvo potencialmente bom.

Em outros avanços, a fita senso do cassete deexpressão.de RNAi quimérico é projetada para compreender nadireção 5' a 3' os seguintes elementos operacionalmenteligados: um promotor de interesse; um fragmento diretoquimérico compreendendo nt 254-855 de SEQ ID NO: 1(seqüência de FucT) e nt 318-943 de SEQ ID NO: 4 (seqüênciade XIyT); uma seqüência espaçadora compreendendo cerca de100 até cerca de 700 nt de qualquer seqüência, como notadoacima; e um fragmento reverso compreendendo o complemento(i.e., versão anti-senso) do fragmento direto quimérico,i.e., compreendendo o complemento de nt 318-94 3 de SEQ IDNO: 4 e o complemento de nt 254-855 de SEQ ID NO: 1. Em umavanço em particular, a seqüência espaçadora nesse cassetede expressão de RNAi quimérico é representada por nt 944-14 43 de SEQ ID NO:4, e o comprimento total daquela porçãoda fita senso do cassete de expressão de RNAicorrespondendo à seqüência codificadora para a estruturahpRNA é de 2 956 nt.

Em outro avanço como tal, a fita senso do cassete deexpressão de RNAi quimérico é projetada para compreender nadireção 5' a 3' os seguintes elementos operacionalmenteligados: um promotor de interesse; um fragmento diretoquimérico compreendendo nt 318-943 of SEQ ID NO: 4(seqüência de XIyT) and nt 254-855 of SEQ ID NO: 1(seqüência de FucT); uma seqüência espaçadora compreendendocerca de 100 até cerca de 700 nt de qualquer seqüência,como notado acima; e um fragmento reverso compreendendo ocomplemento (i.e., versão anti-senso) do fragmento diretoquimérico, i.e., compreendendo o complemento de nt 254-855de SEQ ID NO: 1 e o complemento de nt 318-943 de SEQ IDNO: 4. Em um avanço em particular, a seqüência espaçadoranesse cassete de expressão de RNAi quimérico é representadapor nt 856-1355 de SEQ ID NO: 1, e o comprimento totaldaquela porção da fita senso do cassete de expressão deRNAi correspondendo à seqüência codificadora para aestrutura hpRNA é de 2956 nt.

Ainda em outros avanços, a fita senso do cassete deexpressão de RNAi quimérico é projetada para compreender nadireção 5' a 3' os seguintes elementos operacionalmenteligados: um promotor de interesse; um fragmento diretoquimérico compreendendo nt 254-855 of SEQ ID NO: 1(seqüência de FucT) e nt 1-626 de SEQ ID NO: 19 (seqüênciade XIyT); uma seqüência espaçadora compreendendo cerca de100 até cerca de 700 nt de qualquer seqüência como notadoacima; e um fragmento reverso compreendendo o complemento(i.e., versão anti-senso) do fragmento direto quimérico,i.e., compreendendo o complemento de nt 1-626 de SEQ ID NO:19 e o complemento de nt 254-855 de SEQ ID NO: 1. Em umavanço em particular, a seqüência espaçadora nesse cassetede expressão de RNAi quimérico é representada por nt 627-1126 de SEQ ID NO: 19, e o comprimento total daquela porçãoda fita senso do cassete de expressão de RNAicorrespondendo à seqüência codificadora para a estruturahpRNA é de 2956 nt.

Em outro avanço como tal, a fita senso do cassete deexpressão de RNAi quimérico é projetada para compreender nadireção 5' a 3' os seguintes elementos operacionalmenteligados: um promotor de interesse; um fragmento diretoquimérico compreendendo nt 1-626 de SEQ ID NO: 19(seqüência de XIyT) e nt 254-855 de SEQ ID NO: 1 (seqüênciade FucT); uma seqüência espaçadora compreendendo cerca de100 até cerca de 700 nt de qualquer seqüência, como notadoacima; e um fragmento reverso compreendendo o complemento(i.e., versão anti-senso) do fragmento direto quimérico,i.e., compreendendo o complemento de nt 254-855 de SEQ IDNO: 1 e o complemento de nt 1-626 of SEQ ID NO: 19. Em umavanço em particular, a seqüência espaçadora nesse cassetede expressão de RNAi quimérico é representada por nt 856-1355 de SEQ ID NO: 1, e o comprimento total daquela porçãoda fita senso do cassete de expressão de RNAicorrespondendo à seqüência codificadora para a estruturahpRNA é de 2956 nt.Transformar estavelmente uma planta com um constructode nucleotideos compreendendo um cassete de expressão deRNAi quimérico aqui descrito, por exemplo, transformaçãoestável com o vetor mostrado na Figura 10, inibeefetivamente a expressão de ambas FucT e XylT nas célulasvegetais da planta na qual a estrutura hpRNA é expressa. Emum avanço, a planta de interesse é um membro da família daslentilhas d'água, por exemplo, um membro de Lemnaceae, e aplanta foi estavelmente transformada com o vetor mostradona Figura 10.

É reconhecido que a planta pode ser estavelmentetransformada com pelo menos dois desses cassetes deexpressão de RNAi quiméricos para prover o silenciamento degenes muito eficiente das proteínas FucT e XylT, incluindosilenciamento de quaisquer isoformas dessas duas proteínas.Ver, por exemplo, as duas orientações providas no "possívelprojeto 2" da Figura 28. Dessa maneira, a planta pode serestavelmente transformada com um primeiro cassete deexpressão de RNAi quimérico, caracterizado pelo fato de queo fragmento direto quimérico compreende a seqüência de FucTe XylT fusionada naquela ordem, e a seqüência espaçadoracompreende uma porção da fita senso XylT imediatamenteabaixo da seqüência de XylT contida no fragmento diretoquimérico; e com um segundo cassete de expressão de RNAiquimérico, caracterizado pelo fato de que o fragmentodireto quimérico compreende a seqüência de XylT e FucTfusionada naquela ordem, e a seqüência espaçadoracompreende uma porção da fita senso FucT imediatamenteabaixo da seqüência de FucT contida no fragmento diretoquimérico.

O promotor operacionalmente ligado em qualquer doscassetes de expressão de RNAi codificando estruturas hpRNAgrandes, ou estruturas ihpRNA grandes, pode ser qualquerpromotor de interesse que provenha a expressão dopolinucleotideo inibidor operacionalmente ligado na plantade interesse, incluindo um dos promotores aqui descritosabaixo. A região reguladora pode compreender elementosreguladores adicionais que intensificam a expressão dopolinucleotideo inibidor, incluindo, mas não limitado a, asseqüências líder 5' e seqüências líder 5' mais íntronsvegetais aqui discutidos abaixo.

Ainda em outros avanços, o cassete de expressão deRNAi pode ser projetado para prover a expressão deestruturas hpRNA pequenas tendo uma região de ramificaçãobase-pareada compreendendo cerca de 200 pares de base oumenos. A expressão da estrutura hpRNA pequena épreferencialmente dirigida por um promotor reconhecido porRNA polimerase III dependente de DNA. Ver, por exemplo,U.S. Patent Application No. 20040231016, aqui incorporadapor referência em sua íntegra.

25

Dessa maneira, o cassete de expressão de RNAi éprojetado de forma que a região do DNA transcrita codifiqueuma molécula de RNA compreendendo uma região nucleotídicasenso e anti-senso, onde a seqüência senso de nucleotídeos30 compreende cerca de 19 nucleotídeos contíguos tendo cercade 90% até cerca de 100% de identidade de seqüência emrelação a uma seqüência de nucleotideos de cerca de 19nucleotideos contíguos do RNA transcrito a partir do genede interesse, e onde a seqüência de nucleotideos anti-sensocompreende cerca de 19 nucleotideos contíguos tendo cercade 90% até cerca de 100% de identidade de seqüência emrelação ao complemento de uma seqüência de nucleotideos decerca de 19 nucleotideos contíguos da seqüência senso. Asseqüências de nucleotideos senso e anti-senso da moléculade RNA deveria ser capaz de formar uma região deramificação base-pareada (i.e., dupla-fita) de RNA de cercade 19 até cerca de 200 nucleotideos, alternativamente cercade 21 até cerca de 90 ou 100 nucleotideos, oualternativamente cerca de 40 até cerca de 50 nucleotideosem comprimento. Contudo, o comprimento da região deramificação base-pareada da molécula de RNA pode ser tambémde cerca de 30, cerca de 60, cerca de 70 ou cerca de 80nucleotideos em comprimento. Onde a região de ramificaçãobase-pareada da molécula de RNA é maior do que 19nucleotideos, há apenas um requisito de que exista pelomenos uma região de dupla-fita de cerca de 19 nucleotideos(caracterizado pelo fato de que pode existir cerca de umafalta de correspondência entre as regiões senso e anti-senso) a fita senso que é "idêntica" (permitindo uma faltade correspondência) com 19 nucleotideos consecutivos dopolinucleotídeo FucT ou XylT de interesse. A regiãotranscrita de DNA desse tipo de cassete de expressão deRNAi pode compreender uma seqüência espaçadora posicionadaentre a região nucleotídica senso e anti-sensocodificadora. A seqüência espaçadora não é relacionada como polinucleotídeo FucT ou XylT visado, e pode variar emcomrpimento de 3 até cerca de 100 nucleotideos oualternativamente de cerca de 6 até cerca de 40nucleotideos. Esse tipo de cassete de expressão de RNAitambém compreende uma seqüência terminadora reconhecidapela RNA polimerase III, a seqüência sendo um trecho oligodT, posicionada abaixo da região nucleotidica codificadoraanti-senso do cassete. Por "trecho oligo dT" pretende-se umtrecho de resíduos T consecutivos. Isso deveria compreenderpelo menos 4 resíduos T, mas obviamente pode conter maisresíduos T.

É reconhecido que em projetando o hpRNA curto, osfragmentos da seqüência gênica visada (i.e., fragmentos deseqüência gênica de FucT ou XylT), e qualquer seqüênciaespaçadora a ser incluída na porção do cassete de expressãode RNAi codificando hpRNA, sejam escolhidos para evitarseqüências em GC, particularmente aquelas com três G/Cs(Guaninas/Citosinas) consecutivas, e para evitar aocorrência de quatro ou mais Ts (Timinas) ou As(Adeninas)consecutivas, como a cauda "TTTT..serve como umaseqüência terminadora reconhecida pela RNA polimerase III.

Assim, onde o silenciamento de genes com um hpRNAcurto é desejado, o cassete de expressão de RNAi pode serprojetado para compreender na direção 5' a 3' os seguinteselementos operacionalmente ligados: um promotor reconhecidopor uma RNA polimerase III dependente de DNA da célulavegetal, como aqui definido abaixo; um fragmento de DNAcompreendendo uma seqüência de nucleotideos senso e anti-senso, caracterizado pelo fato de que a seqüência senso denucleotideos compreende pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo cerca de 90% até cerca de 100% deidentidade de seqüência em relação a uma seqüência denucleotideos de pelo menos 19 nucleotideos contíguos apartir da fita senso do gene de FucT ou XylT de interesse,e caracterizado pelo fato de que a seqüência denucleotideos anti-senso compreende pelo menos 19nucleotideos contíguos tendo cerca de 90% até cerca de 100%de identidade de seqüência em relação ao complemento de umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19 nucleotideoscontíguos da seqüência senso, caracterizado pelo fato deque as seqüências de nucleotideos senso e anti-senso sãocapazes de formar um RNA de dupla-fita de cerca de 19 atécerca de 200 nucleotideos em comprimento; e um trecho oligodT compreendendo pelo menos 4 resíduos T consecutivos.

Em alguns avanços da invenção, o cassete de expressãode RNAi é projetado para expressar um hpRNA pequeno quesuprime a expressão do polipeptídeo FucT de SEQ ID NO:3, umvariante biologicamente ativo do polipeptídeo FucT de SEQID NO: 3, ou um polipeptídeo FucT codificado por umaseqüência tendo pelo menos 90% de identidade de seqüênciaem relação à seqüência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.Dessa maneira, o cassete de expressão de RNAi pode serprojetado para compreender na direção 5' a 3' os seguinteselementos operacionalmente ligados: um promotor reconhecidopor uma RNA polimerase III dependente de DNA da célulavegetal, como aqui definido abaixo; um fragmento de DNAcompreendendo uma seqüência de nucleotideos senso e anti-senso, caracterizado pelo fato de que a seqüência denucleotideos senso compreende pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo cerca de 90% até cerca de 100% deidentidade de seqüência em relação a uma seqüência denucleotideos de pelo menos 19 nucleotideos contíguos de SEQID NO: 1, e caracterizado pelo fato de que a seqüência denucleotideos anti-senso compreende pelo menos 19nucleotideos contíguos tendo cerca de 90% até cerca de 100%de identidade de seqüência em relação ao complemento de umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19 nucleotideoscontíguos da seqüência senso, caracterizado pelo fato deque as seqüências de nucleotideos senso e anti-senso sãocapazes de formar um RNA de dupla-fita de cerca de 19 atécerca de 200 nucleotideos em comprimento; e um trecho oligodT compreendendo pelo menos 4 resíduos T consecutivos.

Em outros avanços da invenção, o cassete de expressãode RNAi é projetado para expressar um hpRNA pequeno quesuprime a expressão do polipeptídeo XylT de SEQ ID NO:6 ouSEQ ID NO:21, um variante biologicamente ativo dopolipeptídeo XylT de SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:21, ou umpolipeptídeo XylT codificado por uma seqüência tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência em relação à seqüênciade SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 19, ou SEQ IDNO: 20. Dessa maneira, o cassete de expressão de RNAi podeser projetado para compreender na direção 5' a 3' osseguintes elementos operacionalmente ligados: um promotorreconhecido por uma RNA polimerase III dependente de DNA dacélula vegetal, como aqui definido abaixo; um fragmento deDNA compreendendo uma seqüência de nucleotideos senso eanti-senso, caracterizado pelo fato de que a seqüência denucleotideos senso compreende pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo cerca de 90% até cerca de 100% deidentidade de seqüência em relação a uma seqüência denucleotideos de pelo menos 19 nucleotideos contíguos de SEQID NO: 4, e caracterizado pelo fato de que a seqüência denucleotideos anti-senso compreende pelo menos 19nucleotideos contíguos tendo cerca de 90% até cerca de 100%de identidade de seqüência em relação ao complemento de umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19 nucleotideoscontíguos da seqüência senso, caracterizado pelo fato deque as seqüências de nucleotideos senso e anti-senso sãocapazes de formar um RNA de dupla-fita de cerca de 19 atécerca de 200 nucleotideos em comprimento; e um trecho oligodT compreendendo pelo menos 4 resíduos T consecutivos.

Interferência mediada por Amplicon

Cassetes de expressão amplicon compreender umaseqüência vegetal derivada de vírus que contém todo ouparte do gene alvo, mas geralmente não todos os genes dovírus nativo. As seqüências virais presentes no produto detranscrição do cassete de expressão permitem que o produtode transcrição direcione sua própria replicação. Ostranscritos produzidos pelo amplicon podem ser tanto sensoou anti-senso relativos à seqüência alvo (i.e., o RNAmensageiro para FucT ou XylT, ou ambas) . Métodos de usaramplicons para inibir a expressão de genes vegetaisendógenos são descritos em, por exemplo, Angell andBaulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell and Baulcombe(1999) Plant J. 20:357-362, e U.S. Patent No. 6.646.805,cada qual é aqui incorporado por referência.

Ribozimas

Em alguns avanços, o polinucleotideo expresso pelocassete de expressão da invenção é RNA catalitico ou possuiatividade de ribozima especifica para o RNA mensageiro deFucT ou XylT, ou ambas. Assim, o polinucleotideo causa adegradação do RNA mensageiro endógeno, resultando emexpressão reduzida de FucT ou XylT, ou ambas. Esse método édescrito, por exemplo, em U.S. Patent No. 4.987.071, aquiincorporada por referência.

RNA de interferência pequeno ou Micro RNA

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode FucT ou XylT, ou ambas, pode ser obtida porinterferência de RNA por expressão de um gene codificandoum micro RNA (miRNA). miRNAs são agentes reguladoresconsistindo de cerca de 22 ribonucleotideos. miRNA sãoaltamente eficientes em inibir a expressão de genesendógenos. Ver, por exemplo Javier et al. (2003) Nature425: 257-263, aqui incorporado por referência.

Para interferência de miRNA, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA que é modeladaem um gene de miRNA endógeno. 0 gene de miRNA codifica umRNA que forma uma estrutura hairpin contendo uma seqüênciade 22 nucleotideos que é complementar a outro gene endógeno(seqüência alvo) . Para a supressão da expressão de FucT ouXylT, a seqüência de 22 nucleotideos é selecionada a partirde uma seqüência transcrita de FucT ou XylT e contém 22nucleotideos de dita seqüência de FucT ou XylT naorientação senso e 21 nucleotideos de uma seqüência anti-senso correspondente que é complementar à seqüência senso.Moléculas de miRNA são altamente eficientes em inibir aexpressão de genes endógenos, e a interferência de RNA queinduzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas.

Inibição de Expressão Gênica baseada em Polipeptideo

Em um avanço, o polinucleotideo codifica uma proteínadedo de zinco que se liga a um gene codificando uma FucT ouXylT, ou ambas, resultando em expressão reduzida do gene.Em avanços em particular, a proteína dedo de zinco se ligaa uma região reguladora de um gene de FucT ou XylT. Emoutros avanços, a proteína dedo de zinco se liga a um RNAmensageiro codificando FucT ou XylT e previne sua tradução.Métodos de selecionar sítios para direcionamento porproteínas dedo de zinco foram descritos, por exemplo, emU.S. Patent No. 6.453.242, e métodos para usar proteínasdedo de zinco para inibir a expressão de genes em plantassão descritos em, por exemplo, U.S. Patent Publication No.20030037355; cada qual é aqui incorporada por referência.

Inibição de Atividade de Proteína Baseada em Polipeptídeo

Em alguns avanços da invenção, o polinucleotideocodifica um anticorpo que se liga a pelo menos uma FucT ouXylT, e reduz a atividade da FucT ou XylT. Em outro avanço,a ligação do anticorpo resulta em conversão crescente docomplexo anticorpo-FucT ou XylT por mecanismos celulares decontrole de qualidade. A expressão de anticorpos em célulasvegetais e a inibição das vias moleculares por expressão eligação de anticorpos a. proteínas em células vegetais sãobem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Conrad andSonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporado aquipor referência.

Rompimento de Genes

Em alguns avanços da presente invenção, a atividade ofFucT ou XylT, ou ambas, é reduzida ou eliminada porrompimento do gene codificando a FucT ou XylT, ou ambas. 0gene codificando FucT ou XylT, ou ambas, pode ser rompidopor qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, emum avanço, o gene é rompido por marcação de transposon. Emoutro avanço, o gene é rompido mutagenizando-se plantasusando mutagênese aleatória ou direcionada, e selecionadoplantas que reduziram a atividade de FucT e/ou XylT.

Marcação de Transposon

Em um avanço da invenção, marcação de transposon éusada para reduzir ou eliminar a atividade de FucT ou XylT,ou ambas. Marcação de transposon compreende inserir umtransposon em um gene de FucT ou XylT endógeno para reduzirou eliminar expressão de FucT ou XylT. Gene de "FucT" ou"XylT" deve significar o gene que codifica uma FucT ouXylT, respectivamente, de acordo com a invenção.

Neste avanço, a expressão de FucT ou XylT é reduzidaou eliminada inserindo-se um transposon em uma regiãoreguladora ou região codificadora do gene codificando FucTou XylT. Um transposon que está em um éxon, intron,seqüência 5' ou 3' não traduzida, um promotor, ou qualqueroutra seqüência reguladora de uma FucT ou XylT, ou ambas,gene pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressãoe/ou atividade da FucT ou XylT codificada.

Métodos para a marcação de transposon de genesespecíficos em plantas são bem conhecidos na técnica. Ver,por exemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sci 4:90-96;Dharmapuri and Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat etal. (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin.Plant Biol. 2: 103-107; Gai et al. (2000) Nucleic AcidsRes. 28:94-96; Fitzmaurice et al. (1999) Genetics 153:1919-1928). Além disso, o processo de TUSC para selecionarinserções Mu em genes selecionados foi descrito em Bensenet al. (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena et al. (1996)Science 274: 1537-1540; cada qual é aqui incorporado porreferência.

A invenção engloba métodos adicionais para reduzir oueliminar a atividade de FucT ou XylT. Exemplos de outrosmétodos para alterar ou mutar uma seqüência de nucleotídeosgenômica em uma planta são conhecidos na técnica e incluem,mas não são limitados a, o uso de vetores RNA:DNA, vetoresmutacionais RNA:DNA, vetores de reparo RNA:DNA,oligonucleotideos duplos misturados, oligonucleotideosRNA:DNA de auto-complementaridade, e oligonucleobasesrecombinogênicas. Tais vetores e métodos de uso sãoconhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos.5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; and5.871.984; cada qual é aqui incorporada por referência. Vertambém, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham etal (1999) Proc. Natl Acad. Sci USA 96:8774-8778; cada qualé aqui incorporado por referência.

Assim, a inibição da expressão de FucT e/ou XylT emuma planta superior de interesse pode ser conseguida porqualquer dos métodos precedentes para alterar o padrão deN-glicosilação de glicoproteinas endógenas e heterólogasproduzidas naquela planta, de forma que essasglicoproteinas compreendam N-glicanas complexas que possuemuma redução na quantidade de resíduos de xilose pi,2-ligadae/ou resíduos fucose al,3-ligada. A extensão em que aanexação do resíduo de Lemnaceae e/ou resíduo de Lemnaceaea N-glicanas glicoproteinas é reduzida é governada pelograu de inibição de expressão das respectivas enzimas XylTe FucT.

Em alguns avanços da invenção, glicoproteinasrecombinantes produzidas em um hospedeiro vegetal que éestavelmente transformado usando os métodos aqui descritospara direcionar a expressão de XylT possuem glicanas N-ligadas compreendendo menos de 50%, menos de 40%, menos de30% dos resíduos de xilose pl,2-ligada ocorrendo nasrespectivas glicanas N-ligadas de glicoproteínas produzidasem um hospedeiro vegetal que não foi geneticamentemodificado para inibir a expressão da enzima XylT eisoformas dessa. Em outros avanços, essas glicoproteínasrecombinantes possuem glicanas N-ligadas compreendendomenos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%,menos de 5%, ou menos de 1% dos resíduos de xilose β1,2-ligada ocorrendo nas respectivas glicanas N-ligadas deglicoproteínas produzidas em um hospedeiro vegetal que nãofoi geneticamente modificado para inibir a expressão daenzima XylT e isoformas dessa. Ainda em outros avanços, osmétodos da invenção provêm silenciamento completo do genede XylT e quaisquer isoformas dessa na planta estavelmentetransformada, de forma que as glicoproteínas recombinantesproduzidas na planta possuam glicanas N-ligadas que sejadesprovidas de resíduos de xilose βl,2-ligada.

Da mesma maneira, onde um hospedeiro vegetal foiestavelmente transformado usando os métodos aqui descritospara direcionar a expressão de FucT, glicoproteínasrecombinantes produzidas na planta possuem glicanas N-ligadas compreendendo menos de 50%, menos de 40%, menos de30% dos resíduos de fucose al,3-ligada ocorrendo nasrespectivas glicanas N-ligadas de glicoproteínas produzidasem um hospedeiro vegetal que não foi geneticamentemodificado para inibir a expressão da enzima FucT eisoformas dessas. Em outros avanços, essas glicoproteínasrecombinantes possuem glicanas N-ligadas compreendendomenos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%,menos de 5%, ou menos de 1% dos resíduos de fucose al,3-ligada ocorrendo nas respectivas glicanas N-Iigadas deglicoproteinas produzidas em um hospedeiro vegetal que nãofoi geneticamente modificado para inibir a expressão daenzima FucT e isoformas dessa. Ainda em outros avanços, osmétodos da .invenção provêm silenciamento completo do genede FucT e quaisquer isoformas dessas na planta estavelmentetransformada, de forma que as glicoproteinas recombinantesproduzidas na planta possuam glicanas N-Iigadas que sejamdesprovidas de resíduos de fucose al,3-ligada.

Onde um hospedeiro vegetal foi estavelmentetransformado usando os métodos aqui descritos paradirecionar a expressão de ambas enzimas XylT e FucT, equaisquer isoformas dessas, glicoproteinas recombinantesproduzidas na planta possuem glicanas N-Iigadascompreendendo menos de 50%, menos de 4 0%, menos de 30% dosresíduos de xilose 31,2-ligada e menos de 50%, menos de40%, menos de 30% dos resíduos de fucose al,3-ligadaocorrendo nas respectivas glicanas N-ligadas deglicoproteinas produzidas em um hospedeiro vegetal que nãofoi geneticamente modificado para inibir a expressão dasenzimas XylT e FucT e isoformas dessas. Em outros avanços,essas glicoproteinas recombinantes possuem glicanas N-ligadas compreendendo menos de 25%, menos de 20%, menos de15%, menos de 10%, menos de 5%, ou menos de 1% dos resíduosde xilose βl,2-ligada e menos de 25%, menos de 20%, menosde 15%, menos de 10%, menos de 5%, ou menos de 1% dosresíduos de fucose al,3-ligada ocorrendo nas respectivasglicanas N-Iigadas de glicoproteinas produzidas em umhospedeiro vegetal que não foi geneticamente modificadopara inibir a expressão das enzimas XylT e FucT e isoformasdessas. Ainda em outros avanços, os métodos da invençãoprovêm silenciamento completo do gene de XylT e FucT equaisquer isoformas dessas na planta estavelmentetransformada, de forma que as glicoproteinas recombinantesproduzidas na planta possuam glicanas N-Iigadas que sejadesprovidas de resíduos de xilose 31,2-ligada e resíduos defucose al,3-ligada.

Em alguns avanços da presente invenção, um hospedeirovegetal que foi estavelmente transformado usando os métodosaqui descritos para direcionar a expressão de ambas enzimasXylT e FucT, e quaisquer isoformas dessas, é capaz deproduzir glicoproteinas recombinantes, caracterizado pelofato de que as glicanas N-Iigadas são substancialmentehomogêneas. Por "substancialmente homogêneas" pretende-seque o perfil de glicosilação reflita a presença de um únicopico principal correspondendo a uma espécie N-glicanadesejada, mais particularmente, as espécies glicanas GO,caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% dasestruturas N-glicanas presentes em ditas glicoproteinassejam das espécies glicanas GO.

Métodos para monitorar mudanças no padrão de N-glicosilação de glicoproteinas, também referidos comoperfis de glicosilação, são bem conhecidos na técnica eincluem, mas não são limitados a, espectrometria de massa"tempo de vôo" (MALDI-TOF) assistida por matriz deionização de desabsorção a laser, por exemplo, usando oteste MALDI-TOF modificado descrito no Exemplo 3 aquiabaixo, espectrometria de massa de cromatografia liquida(LC-MS), cromatografia de gás, cromatografia de troca deânions, cromatografia de exclusão por tamanho, eletroforesede gel de poliacrilamida de alta concentração,espectroscopia de ressonância magnética nuclear, eeletroforese capilar e eletroforese capilar em gel,rotulação por fluorescência e detecção por cromatografia deliquido de alta performance (HPLC) e QTOF, e similares.Dess.a maneira, mudanças no padrão de N-glicosilação devidoà inibição da expressão ou função de XylT e/ou FucT em umaplanta estavelmente transformada da invenção podem sermonitoradas sujeitando uma amostra (por exemplo, umaamostra de tecido foliar) obtida da planta estavelmentetransformada para análise total de N-glicana porespectrometria de massa MALDI-TOF, e comparando osresultados com aqueles obtidos para uma amosrta comparávelde uma planta controle, caracterizado pelo fato de que aplanta controle não foi geneticamente modificad para inibira expressão ou função de XylT e/ou FucT. Uma redução naquantidade de resíduos de xilose e/ou fucose nas N-glicanaspode ser monitorada por uma redução da massa dosrespectivos picos. Ver, por exemplo, Strasser et al. (2004)FEBS Letters 561 : 132-136.

Similarmente, o perfil de glicosilação de qualquerdada glicoproteina produzida de forma recombinante éprontamente determinado usando técnicas padrão bemconhecidas daqueles especialistas na técnica. Ver, porexemplo, a revisão provida em Morelle and Michalski (2005)Curr. Anal. Chem. 1:29-57; aqui incorporada por referênciaem sua integra. Assim, glicoproteinas que foram produzidasde forma recombinante em um organismo hospedeiro, incluindoum hospedeiro vegetal, podem ser analisadas para a razãodas estruturas glicanas N-Iigadas em particular anexadas aesse. Dessa maneira, uma amostra compreendendoglicoproteinas isoladas produzidas de forma recombinantepode ser sujeita a reação enzimática para liberarestruturas glicanas individuais da glicoproteina. Seguindoessa etapa de desglicosilação, a análise... do perfil deglicosilação pode ser conduzida usando qualquer dos testesanalíticos aqui descritos acima.

Produtos de glicoproteina produzidos de formarecombinante tipicamente existem como uma população diversade glicoformas carregando entre uma e diversas dúzias deglicanas diferente em quantidades molares variáveis emsitios de glicosilação com graus variados de ocupação desítios. Dependendo da glicoproteina, glicoformas diferentespodem produzir diferentes perfis funcionais. Assim, emalguns avanços da invenção, é desejável determinar o perfilde glicosilação da glicoproteina tendo as N-glicanasintactas. Qualquer técnica conhecida na técnica paradeterminar o perfil de glicosilação de uma glicoproteinaintacta pode ser usada, incluindo os métodos deespectrometria de massa notados aqui acima e nos exemplesabaixo.

Reduzindo-se ou eliminando-se a expressão ou função defucosiltransferase e/ou xilosiltransferase da maneira aquiapresentada, tanto transientemente ou estavelmente, épossível produzir uma planta transgênica superior tendo ahabilidade de produzir glicoproteinas tendo um perfil de N-glicosilação com heterogeneidade reduzida relativa àquelanormalmente observada para glicoproteinas produzidas poresta planta quando a expressão ou função dessas enzimas nãofoi alterada (i.e., a planta possui o maquinário deglicosilação nativo ou de tipo selvagem). Onde a expressãoou função de uma ou ambas enzimas é estavelmente reduzidaou eliminada usando um ou mais dos métodos aqui descritosacima, a redução na heterogeneidade do perfil de N-glicosilação de glicoproteinas produzidas pela plantatransgênica pode ser mantido de geração de planta parageração de planta, incluindo com reprodução assexuada ousexuada, e pode ser mantido através de condições culturaise com magnificação em produção.

Dessa maneira, a presente invenção provê um métodopara reduzir a heterogeneidade do perfil de N-glicosilaçãode uma glicoproteína produzida em uma planta superior, porexemplo, uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea, porexemplo, uma planta lentilha d'água. O método compreendeintroduzir na planta um constructo de nucleotídeo aquidescrito, de forma que a expressão ou função defucosiltransferase e/ou xilosiltransferase seja reduzida oueliminada na planta. Em alguns avanços da invenção, ométodo para reduzir a heterogeneidade do perfil de N-glicosilação de uma glicoproteína produzida em uma plantasuperior compreende introduzir na planta superior deinteresse pelo menos um constructo de nucleotídeo aquidescrito acima, onde o(s) constructo(s) de nucleotideo(s)provê a supressão da expressão de fucosiltransferase e/ouxilosiltransferase na planta, por exemplo, usando um oumais dos métodos aqui descritos acima.

Por "reduzir, a heterogeneidade do perfil de N-glicosilação" pretende-se que o perfil de N-glicosilaçãoseja caracterizado por uma redução no número total deespécies N-glicanas distintas que aparecem no perfil.Assim, por exemplo, onde uma glicoproteina produzida poruma planta superior tendo o maquinário de glicosilaçãonativo ou de tipo selvagem (e, assim, que não foigeneticamente modificada para reduzir ou eliminar aexpressão de fucosiltransferase e xilosiltransferase)produz uma glicoproteina com um perfil de N-glicosilaçãocaracterizado pela presença de uma mistura de 5 espécies N-glicanas, os métodos da invenção podem ser usados parareduzir o número de espécies N-glicanas aparecendo noperfil de N-glicosilação. Dessa maneira, quando aquelaplanta superior é geneticamente modificada da maneira aquiapresentada para reduzir ou eliminar a expressão ou funçãode fucosiltransferase e/ou xilosiltransferase, o perfil deN-glicosilação dessa glicoproteina seria caracterizado poruma redução no número de espécies N-glicanas aparecendo noperfil, por exemplo, uma mistura de menos do que 5 espéciesN-glicanas, por exemplo, 4, 3, ou 2 espécies N-glicanas, oumesmo uma espécie N-glicana. Onde a heterogeneidade doperfil de N-glicosilação é reduzida de forma que o perfil écaracterizado pela presença de uma única espécie N-glicanapredominante, o perfil de N-glicosilação seriasubstancialmente homogêneo para aquela espécie N-glicana.

Em alguns avanços, os métodos para reduzir aheterogeneidade do perfil de N-glicosilação de umaglicoproteina produzida em uma planta superior resultam naglicoproteina produzida tendo um perfil de N-glicosilaçãoque é substancialmente homogêneo para as espécies glicanasGO. Em tais avanços, os métodos para reduzir aheterogeneidade do perfil de N-glicosilação de umaglicoproteina produzida em uma planta superior resultam naglicoproteina produzida tendo um perfil de N-glicosilaçãosubstancialmente homogêneo, caracterizado pelo fato de quepelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% daquantidade total de espécies N-glicanas aparecendo noperfil de N-glicosilação para a glicoproteina érepresentado pelas espécies glicanas GO. Nestes avanços,uma quantidade traço de espécies N-glicanas precursoraspode aparecer no perfil de N-glicosilação como aqui notadoem outra parte, onde qualquer dada espécie N-glicanaprecursora que está presente no perfil de N-glicosilaçãoestá em presente em menos de 5%, preferencialmente menos de4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, e até menos de0,5% ou mesmo menos de 0,1% da quantidade total de espéciesN-glicanas aparecendo no perfil.

A glicoproteina pode ser uma glicoproteina endógena deinteresse, ou pode ser uma glicoproteina heteróloga que éproduzida pela planta superior de interesse, por exemplo,uma glicoproteína de mamífero, incluindo, por exemplo, asglicoproteinas aqui descritas em outra parte. Em algunsavanços, a glicoproteína é um anticorpo monoclonal. Emoutros avanços, a glicoproteína é selecionada do grupoconsistindo de um interferon, eritropoietina (EPO), tecidoplasminogênico ativador (tPA), plasminogen, fatorestimulador de granulócito de colônia de macrófago (GM-CSF) , e imunoglobulinas terapêuticas.

Usando os métodos da presente invenção, é possívelmanter a heterogeneidade reduzida no perfil de N-glicosilaçâo para uma glicoproteína produzida na plantatransgênica com maximização em produção e, assim, a plantacontinua a produzir a glicoproteína de forma que seu perfilde N-glicosilação seja caracterizado por uma redução nonúmero de espécies N-glicanas aparecendo no perfil. Por"maximização em produção" ou "aumento em escala deprodução" pretende-se um aumento na quantidade de biomassavegetal que está presente no sistema de cultura (i.e., umveio de cultura ou recipiente de cultura no qual a planta écultivada) que está sendo usado para produzir uma proteínade interesse, nesse caso, uma glicoproteína de interesse.Assim, maximização em produção ocorre, por exemplo, quandoaumentando a escala da produção a partir de uma escala queé adequada para propósitos de pesquisa para um que éadequado para produção piloto, e aumentando mais para umaescala que é adequada para produção comercial daglicoproteína de interesse.Em alguns avanços, a planta superior transgênica é umaplanta monocotiledônea, por exemplo, uma planta lentilhad'água, que serve como hospedeiro para produçãorecombinante de uma glicoproteina, e a heterogeneidadereduzida do perfil de N-glicosilação de uma glicoproteinaproduzida de forma recombinante é mantida com um aumento naescala de produção, onde a escala de produção é aumentadaem pelo menos 300 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos700 vezes, pelo menos 1.000 vezes, pelo menos 1.500 vezesou mais pela biomassa inicial. Em alguns desses avanços, aplanta superior transgênica é uma planta lentilha d'águaque produz, de forma recombinante, uma glicoproteina deinteresse, e a heterogeneidade reduzida do perfil de N-glicosilação é mantida com um aumento na escala deprodução, onde a escala de produção é aumentada em pelomenos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes, pelo menos 4.000vezes, pelo menos 5.000 vezes, pelo menos 6.000 vezes, pelomenos 6.500 vezes, ou mais pela biomassa inicial. Em umavanço como tal, a planta superior é uma planta lentilhad'água que produz, de forma recombinante, uma glicoproteinade interesse, e a heterogeneidade reduzida do perfil de N-glicosilação para aquela glicoproteina é mantida com umaumento na escala de produção, onde a escala de produção éaumentada em pelo menos 7.000 vezes, 8.000 vezes, 9.000vezes, 10.000 vezes, 12.500 vezes, 15.000 vezes, 17.500vezes, 20.000 vezes, 23.000 vezes, 26.000 vezes, ou maispela biomassa inicial.

Adicionalmente, quando a planta transgênica deinteresse é para ser mantida por cultura clonal continua, alinhagem transgênica resultante continua a produzirglicoproteinas que exibem a heterogeneidade reduzida em seuperfil de N-glicosilação. Cultura clonal continua pode seralcançada usando qualquer método adequado conhecido natécnica. Em alguns avanços, a cultura clonal continua é: conseguida tirando-se periodicamente uma ou maissubamostras da cultura vegetal e transferindo a(s)subamostra (s) para meio de cultura fresco para cultivoadicional. Assim, por exemplo, em alguns avanços, alinhagem de planta transgênica que é mantida por culturaclonal continua é uma linhagem de planta lentilha d'águatransgênica que foi geneticamente modificada para reduzirou eliminar a expressão ou função de fucosiltransferasee/ou xilosiltransferase. Dessa maneira, a heterogeneidadereduzida do perfil de N-glicosilação de glicoproteinasproduzidas na linhagem de planta transgênica é mantida comcultura clonal continua da linhagem de planta transgênicapor menos 8 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 1 ano,pelo menos 1,5 anos, pelo menos 2 anos, pelo menos 2,5anos, pelo menos 3 anos, pelo menos 3,5 anos, pelo menos 4anos, pelo menos 4,5 anos, pelo menos 5 anos, ou mais, epode ser mantida por tanto quanto a linhagem plantatransgênica for mantida.

Polipeptideos Heterólogos e Glicoproteinas

Vegetais superiores, particularmente plantassuperiores que servem como sistemas de expressão paraproteínas recombinantes para uso farmacêutico, que foramestavelmente transformadas para produzir glicoproteinas comum padrão de N-glicosilação alterado usando os métodos aquidescritos podem ser geneticamente modificadas para produzirqualquer proteína recombinante de interesse. Onde aproteína recombinante é uma na qual glicosilação pós-tradução é aplicável, os métodos da invenção vantajosamenteprovêm meios para produzir essas glicoproteínas com umpadrão de N-glicosilação que reflita mais aquele dehospedeiros mamíferos, particularmente um padrão deglicosilação que é "humanizado." Exemplos de proteínasrecombinantes de interesse incluem, mas não estão limitadosa, insulina, hormônio de crescimento, plasminogen, a-interferon, β-interferon, β-glucocerebrosidase, β-glucoronidase, proteína retinoblastoma, proteína p53,angiostatina, leptina, anticorpos monoclonais e fragmentosdesses, citoquinas, por exemplo, eritropoietina (EPO),fator estimulador de granulócito de colônia de macrófago,ativador de tecido plasminogênico, fatores de coagulação desangue, por exemplo, Fator VII, Fator VIII, Fator IX, eproteína C ativada, alfa 1-antitripsina, receptores,hormônios, vacinas humanas, vacinas animal, peptídeos, ealbumina de soro. Adicionalmente, as plantas superiorestransgênicas da invenção são capazes de produzir um produtode glicoproteína que possui um perfil de glicosilaçãosubstancialmente homogêneo para a espécie glicana GO, e queé caracterizado por sua homogeneidade substancial para aglicoforma G0. Isso vantajosamente resulta em sistemas deexpressão de hospedeiro vegetal que possuem consistência deprodução aumentada, assim como riscos químicos, defabricação, e de controle (CMC) reduzidos associados com aprodução dessas composições de glicoproteína.As composições de glicoproteina produzidas de acordocom os métodos da presente invenção podem estar contidas emuma composição compreendendo um carregadorfarmaceuticamente aceitável. Tais composições são úteis emum método de tratar um sujeito para uma doença ou desordempara a qual o tratamento com a glicoproteina proverá umbeneficio terapêutico. Dessa maneira, glicoproteinas queforam produzidas em uma planta, por exemplo, uma plantalentilha d'água, estavelmente transformada de acordo com osmétodos da presente invenção podem ser administradas a umsujeito em necessidade do mesmo.

As composições de glicoproteina da invençãocompreendem glicanas N-Iigadas que são predominantemente daestrutura glicana GO. Dessa maneira, a presente invençãoprovê composições de glicoproteina que possuem perfis deglicosilação que são "substancialmente homogêneos" ou"substancialmente uniformes" ou possuem "homogeneidadesubstancial" como aqui definido acima. Assim, em algunsavanços, as composições de glicoproteina sãosubstancialmente homogêneas para as espécies glicanas GO,e, assim, possuem um perfil de glicosilaçãosubstancialmente homogêneo, caracterizado pelo fato de quepelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% daquantidade total de espécies N-glicanas aparecendo noperfil de glicosilação para a composição é representadopela espécie glicana GO, com uma quantidade traço deespécies N-glicanas precursoras aparecendo no perfil deglicosilação, i.e., qualquer dada espécie N-glicanaprecursora que esteja presente no perfil de glicosilaçãoestá presente em menos de 5%, preferencialmente menos de4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, e mesmo menos de0,5% ou até menos de 0,1% da quantidade total de espéciesN-glicanas aparecendo no perfil. Para tal composição, umaespécie N-glicana precursora representativa aparecendo emseu perfil de glicosilação seria a espécie N-glicanaprecursora Man3GlcNAc2, MGn(GlcNaclMan3GlcNAc2caracterizado pelo fato de que GlcNacl está anexado ãramificação 1,3 manose), e GnM (GlcNaclMan3GlcNAc2caracterizado pelo fato de que GlcNacl está anexado àramificação 1,6 manose) descrita acima, onde qualquer umaou qualquer combinação dessas espécies N-glicanasprecursoras pode estar presente.

Dessa maneira, a invenção provê composições deglicoproteina "substancialmente homogêneas" ou"substancialmente uniformes" ou composições deglicoproteina tendo "homogeneidade substancial", como aquidefinido acima. Em alguns avanços, a invenção provêcomposições de glicoproteina substancialmente homogêneas,caracterizado pelo fato de que pelo menos 80%, pelo menos85%, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, ou pelo menos 99% da glicoproteina presente nacomposição é representado pela glicoforma GO, caracterizadopelo fato de que todos sítios de glicosilação antecipadossão ocupados pelas espécies glicanas GO, com uma quantidadetraço de glicoformas precursoras ou indesejadas estandopresentes na composição, i.e., as glicoformas precursorasrepresentam menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de2%, menos de 1%, ou mesmo menos de 0,5%, ou menos de 0,1%do total de glicoformas presentes na composição. Em talcomposição, uma glicoforma precursora representativa seriauma na qual sítios de glicosilação estão desocupados, e umaglicoforma.indesejada exemplar seria uma glicoforma tendouma mistura de glicana GO e espécies glicanas GOX e G0XF3anexadas a seus sítios de glicosilação.

Em alguns avanços da invenção, o hospedeiro vegetalcompreende um ou mais polinucleotídeos que provêm aexpressão de um anticorpo que se liga especificamente a umaproteína de mamíferô de interesse, particularmente umaproteína humana de interesse. Assim, em um aspecto, ainvenção provê métodos para produzir anticorpos monoclonaisem plantas superiores, caracterizado pelo fato de que osanticorpos monoclonais possuem um padrão de N-glicosilaçãoque reflete uma redução na quantidade de resíduos de xilosepi,2-ligada e resíduos de al,3-ligada nas glicanas N-ligadas, e composições compreendendo anticorpos monoclonaisrecombinantes produzidos usando hospedeiros vegetaisgeneticamente modificados da maneira aqui apresentada. Emalguns avanços, a planta hospedeira de interesse é ummembro da família das lentilhas d'água.

Anticorpos monoclonais são crescentemente usados comoagentes terapêuticos para tratar doenças humanas,incluindo, mas não limitadas a, câncer e doenças tendo umcomponente auto-imune ou inflamatório. Ver, por exemplo,King (1999) Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2: 110-17;Vaswani and Hamilton (1998) Ann. Allergy Asthma Immunol.81: 105-19; e Holliger and Hoogenboom, Nat. Biotechnology16: 1015-16; cada qual é aqui incorporado por referência.Apesar de alguns desses anticorpos terem efeitosterapêuticos que resultem somente de ligação de antigeno,por exemplo, anticorpos que se ligam a um receptor ouligante para prevenir interações ligante-receptor, outrosanticorpos necessitam funções efetoras tais como orecrutamento do sistema imune para matar células alvo paraserem terapeuticamente ativos. Ver, por exemplo,- Clynes etal. (2000) Nat. Med. 6:443-46; Clynes et al. (1998) Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95:652-56, e Anderson et al. (1997)Biochem. Soe. Trans. 25:705-8; cada qual é aqui incorporadopor referência.

As atividades de reconhecimento de antigeno e funçõesefetoras de anticorpos residem em diferentes porções damolécula de anticorpo. A porção Fab1 do anticorpo provêatividade de reconhecimento de antigeno, enquanto que aporção Fc provê funções efetoras, tais como a ativação decélulas efetoras acessórias incluindo células fagociticas(macrófagos e neutrofilos), células matadoras naturais, emastócitos. Anticorpos se liga a células via a região Fc,com um sitio receptor de Fc na região Fc do anticorpo seligando a um receptor de Fc (FcR) em uma célula. Existe umnúmero de receptores Fc que são específicos para diferentesclasses de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE(receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptoresmu) . A ligação de anticorpo a receptores de Fc nasuperfície celular inicia um número de respostas biológicasimportantes e diversas, incluindo engolfamento e destruiçãode partículas cobertas por anticorpo, liberação decomplexos imune, lise de células alvo cobertas poranticorpo por células matadoras (chamado de citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo, ou ADCC),iniciação de citotoxicidade dependente de complemento(CDC), liberação de mediadores inflamatórios e controle deprodução de imunoglobulina. Métodos para testar a funçãoefetora de anticorpos são bem conhecidos na técnica eincluem aqueles testando para CDC, ADCC, e apoptose. Ver,por exemplo, Subbramanian et al. (2002) J. Clin. Microbiol.40:2141- 2146; Ahman et al. (1994) J. Immunol. Methods36:243-254; Brezickâ et al. (2000) Câncer Irranunol.Immunother. 49:235-242; Gazzano-Santoro et al. (1997) J.Immunol. Methods 202: 163-171; Prang et al. (2005) BritishJ. Câncer 92:342-349; Shan et al. (1998) Blood 92:3756-3771; Ghetie et al. (2001) Blood 97: 1392-1398; e, Mathaset al. (2000) Câncer Research 60:7170-7176; todos os quaissão aqui incorporados por referência.

É conhecido na técnica que o status de glicosilação daporção Fc de uma molécula de anticorpo desempenha um papelchave na determinação de se um anticorpo terá funçãoefetora. Ver, por exemplo, Tao and Morrison (1987) J.Immunol. 143:2595- 601; Wright and Morrison (1997) Trendsin Biotech. 15:26-32; Wright and Morrison (1998) J.Immunol. 160:3393-402; Mimura et al. (2000) Mol. Immunol.37: 697-706; Jefferis and Lund (2002) Immunol. Lett. 82:57-65; Krapp et al. (2003) J. Mol. Biol. 325:979-89; eJefferis (2005) Biotechnol. Prog. 21 : 11-16; cada qual éaqui incorporado por referência. A glicosilação deanticorpos produzidos de forma recombinante variadependendo do sistema de expressão usado. Ver, por exemplo,Raju et al. (2000) Glycobiology 10:477-86; Wright andMorrison (1997) Trends in Biotech. 15:26-32. Ainda, onde opadrão de N-glicosilação de um anticorpo monoclonalproduzido em mamifero é alterado para reduzir ou diminuir oresíduo de fucose núcleo α(1,6)-ligada, o anticorpomonoclonal exibe função efetora aumentada, particularmenteatividade ADCC aumentada. Ver, por exemplo, U.S. Patent No.6.946.292. Para alguns anticorpos monoclonais produzidos emmamíferos, onde o padrão de N-glicosilação é alterado parareduzir ou diminuir os resíduos de β (1,4)-galactoseanexados às ramificações 1,3 e/ou 1,6 manose, a ativação decitotoxicidade dependente de complemento (CDC) contracélulas alvo abrigando antígeno pode ser reduzida semalterar outras atividades funcionais do anticorpo,incluindo atividade ADCC. Ver, por exemplo, Boyd et al.(1995) Mol. Immunol. 32: 1311-1318.

Anticorpos tendo atividade de reconhecimento deantígeno, e em alguns avanços função efetora melhorada,podem ser produzidos por uma planta superior hospedeira,tal como lentilha d1água, que foi estavelmente transformadada maneira aqui apresentada para alterar seu maquinário deglicosilação. Dessa forma, a presente invenção provêmétodos para produzir um anticorpo monoclonal recombinante,incluindo um anticorpo monoclonal tendo função efetoramelhorada, caracterizado pelo fato de que o anticorpo éproduzido de forma recombinante em uma planta tendo umpadrão de N-glicosilação alterado de glicoproteinasendógenas e heterólogas ai produzidas, de forma que essasglicoproteinas exibam uma redução na quantidade de resíduosde xilose βl,2-ligada e/ou resíduos de fucose al,3-ligada específicos de planta anexados às N-glicanas dessas. Ondeos anticorpos possuem quantidade reduzidas de resíduos defucose al/3-ligada anexados às N-glicanas dessas, osanticorpos podem ter atividade ADCC aumentada relativa aanticorpos produzidos em uma planta controle que não foi geneticamente modificada para inibir a expressão ou função

Também englobádos são anticorpos monoclonaisrecombinantes tendo função efetora, e em alguns avanços,função efetora melhorada, onde os anticorpos são produzidosem um sistema de expressão de lentilha d'água que foigeneticamente modificado para inibir a expressão ou funçãoda FucT de SEQ ID NO:3 e/ou XylT de SEQ ID NO:6, equaisquer isoformas dessas, por exemplo, a isoforma #2 de XylT compreendendo a seqüência apresentada em SEQ ID NO:21(codificada por SEQ ID NO:20). Assim, era alguns avanços, aplanta servindo como hospedeiro para produção recombinantedo anticorpo monoclonal é um membro de Lemnaceae, como aquinotado em outra parte, por exemplo, uma planta Lemnar compreendendo, por exemplo, um cassete de expressão de RNAide XylT e/ou um cassete de expressão de RNAi de FucT,descrito acima, estavelmente integrado em seu genome. Dessamaneira, a presente invenção provê iam método para produzirum anticorpo monoclonal recombinante tendo um padrão de N-glicosilação que lembre mais aquele encontrado em umsistema de expressão hospedeiro de mamífero, e com funçãoefetora melhorada, onde o método compreende expressar umaou mais cadeias do anticorpo em uma planta lentilha d'água,ou célula de lentilha d'água ou nódulo de lentilha d'água,que foi geneticamente modificado para alterar o maquináriode glicosilação, de forma que o anticorpo monoclonalproduzido de forma recombinante exiba uma redução naanexação do resíduo de xilose 31,2-ligada e/ou resíduo defucose al,3-ligada vegetais para as N-glicanas desses, ecultivar a planta lentilha d'água, ou célula de lentilhad'água ou nódulo de lentilha d'água, sob condiçõesadequadas para a expressão do anticorpo monoclonal.

Assim, a presente invenção provê novas composições deanticorpos, caracterizadas pelo fato de que o anticorpocompreende glicanas N-Iigadas que são predominantemente daestrutura glicana GO. Dessa maneira, a presente invençãoprovê composições de anticorpos, por exemplo, composiçõesde anticorpos monoclonais, que têm perfis de glicosilaçãoque são "substancialmente homogêneos" ou "substancialmenteuniformes" ou têm "homogeneidade substancial", como aquidefinido acima. Assim, em alguns avanços, as composições deanticorpos são substancialmente homogêneas para as espéciesglicanas GO e, assim, possuem um perfil de glicosilaçãosubstancialmente homogêneo, caracterizado pelo fato de quepelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% daquantidade total de espécies N-glicanas aparecendo noperfil de glicosilação para a composição é representadopela espécie glicana GO, com uma quantidade traço deespécies N-glicanas precursoras aparecendo no perfil deglicosilação, i.e., qualquer dada espécie N-glicanaprecursora que esteja presente no perfil de glicosilaçãoestá presente em menos de 5%, preferencialmente menos de4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, e até menos de0,5%, ou mesmo menos de 0,1% da quantidade total deespécies N-glicanas aparecendo no perfil. Para talcomposição, uma espécie N-glicana precursora representativaaparecendo em seu perfil de glicosilação seria, porexemplo, a espécie N-glicana precursora Man3GlcNAc2, MGn(GlcNaclMan3GlcNAc2 caracterizado pelo fato de que GlcNaclé anexado à ramificação 1,3 manose) , e GnM(GlcNaclMan3GlcNAc2 caracterizado pelo fato de que GlcNaclé anexado à ramificação 1,6 manose) descrita acima, ondequalquer uma ou qualquer combinação dessas espécies N-glicanas precursoras pode estar presente.

Em um avanço como tal, a composição de anticorpomonoclonal possui um perfil de glicosilaçãosubstancialmente homogêneo, caracterizado pelo fato de que95,8% da quantidade total de espécies N-glicanas aparecendono perfil de glicosilação para a composição é representadopelas espécies glicanas GO (GlcNAc2Man3GlcNAc2) , com asseguintes espécies N-glicanas precursoras aparecendo noperfil de glicosilação: Man3GlcNAc2 (0,67%),GlcNAcMan3GlcNAc2 (1,6%), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 (1,2%),Man6GlcNAc2 (0,21%), Man7GlcNAc2 (0,30%), e Man8GlcNAc2(0,28%). Isso pode ser comparado com a composição deanticorpo monoclonal obtida a partir do sistema deexpressão de "tipo selvagem" de planta lentilha d'água,caracterizado pelo fato de que o mesmo anticorpo monoclonalé expresso, mas onde o maquinário de glicosilação da plantalentilha d'água não foi geneticamente modificado parainibir a expressão de XylT e FucT. Tal composição deanticorpo monoclonal derivada de "tipo selvagem" possui umperfil de glicosilação mais heterogêneo que é caracterizadopor duas espécies N-glicanas predominantes, i.e., G0XF3 eGOX, com diversas espécies N-glicana precursorasrepresentadas em quantidades traço. Em um avanço como tal,a composição de anticorpo monoclonal derivada de "tiposelvagem" possui um perfil de glicosilação com as seguintesespécies N-glicanas ai representadas: GO

(GlcNAc2Man3GlcNAc2) (8,4%); GOX (GIcNAc2 [Xyl] Man3GIcNAc2) (17,2%); G0XF3 (GlcNAc2[Xyl]Man3[Fuc]GlcNAc2)(67,4%); Man3GlcNAc2 (0,26%); GlcNAcMan3GlcNAc2 (0,40%);(Xyl)Man3(Fuc)GlcNAc2 (0,76%); GlcNAc2Man3(Fuc)GlcNAc2(2,1%); GlcNAc(Xyl)Man3(Fuc)GlcNAc2 (1,4%);Man6GlcNAc2 (0,21%); Man7GlcNAc2 (0,63%);

Gal(Fuc)GlcNAc2(Xyl)Man3(Fuc)GlcNAc2 (0,26%); Man8GlcNAc2(0,61%); and Man9GlcNAc2 (0,40%).

Dessa maneira, a invenção provê composições deanticorpos "substancialmente homogêneas" ou

"substancialmente uniformes" ou composições de anticorpostendo "homogeneidade substancial", como aqui definidoacima. Em alguns avanços, a invenção provê composições deanticorpos substancialmente homogêneas, por exemplo,composições de anticorpo monoclonal, caracterizado pelofato de que pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%do anticorpo presente na composição é representado pelaglicoforma GO, caracterizado pelo fato de que todos ossítios de glicosilação antecipados (por exemplo, cada umdos resíduos Asn-297 dos domínios CH2 das cadeias pesadasde um anticorpo tipo IgG) são ocupados pelas espéciesglicanas GO, corri uma quantidade traço de glicoformasprecursoras estando presentes na composição. Em talcomposição, as glicoformas precursoras são selecionadas dogrupo consistindo de um anticorpo tendo uma região Fc,caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 de uma cadeiapesada possui uma espécie glicana GO anexada a Asn 297, e odomínio CH2 da outra cadeia pesada não glicosilado; umanticorpo tendo uma região Fc, caracterizado pelo fato deque o domínio CH2 de uma cadeia pesada possui uma espécieglicana GO anexada a Asn 2 97, e o domínio CH2 da outracadeia pesada possui a glicana precursora GnM ou MGnanexada a Asn 2 97; e um anticorpo tendo uma região Fc,caracterizado pelo fato de que o sítio de glicosilação deAsn 297 em cada um dos domínios CH2 possui uma espécieglicana GO anexada, com uma terceira espécie glicana GOanexada a um sítio de glicosilação adicional na estruturamAb; caracterizado pelo fato de que uma quantidade traçodessas glicoformas precursoras esteja presente, i.e., asglicoformas precursoras representam menos de 5%, menos de4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, ou até menos de0,5%, ou menos de 0,1% das glicoformas totais presentes nacomposição de anticorpos.

As composições de anticorpos substancialmentehomogêneas da invenção, caracterizadas pelo fato de quepelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% doanticorpo presente na composição é representado pelaglicoforma GO representam "anticorpos glicana otimizados".Por "anticorpos glicana otimizados" pretende-se que osanticorpos da invenção tenham sido geneticamenteconstruídos em seu padrão de glicosilação, de forma quesejam substancialmente homogêneos para a glicoforma GO, queproduz um anticorpo tendo função efetora de Fc melhorada.Por "função efetora de Fc melhorada" pretende-se que essesanticorpos tenham atividade ADCC aumentada relativa à mesmaseqüência anticorpos (i.e., anticorpos que possuem a mesmaseqüência de aminoácidos) que, como resultado do processode produção, possuem um perfil de glicosilação maisheterogêneo. Assim, por exemplo, anticorpos produzidos emsistemas de expressão de mamíferos hospedeiros, por exemplocélulas CHO, em célula hospedeiras de inseto, em células deleveduras, ou em outros sistemas de expressão vegetaishospedeiros que não foram geneticamente alterados parainibir a expressão de XylT e FucT tendo que ter perfis deglicosilação mais heterogêneos e, assim, uma mistura deglicoformas, que pode efetuar a função efetora geral doproduto de anticorpo. A glicoforma GO das composições deanticorpos da presente invenção provê vantajosamente umacomposição de anticorpos que possui atividade ADCCaumentada em associação com a ausência de resíduos defucose. Em alguns avanços, atividade ADCC é aumentada em 25vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes,250 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, ou até 1000vezes relativa à mesma seqüência anticorpos tendo um perfilde glicosilação heterogêneo (i.e., com múltiplasglicoformas presentes como glicoformas principais nacomposição de anticorpos). Adicionalmente, a glicoforma GOnão possui os resíduos terminais Gal presentes emanticorpos tendo a glicoforma G2. Sendo assim, essascomposições de anticorpos substancialmente homogêneas dainvenção tendo predominantemente a glicoforma GO possuemrazões ADCC/CDC aumentadas. Além disso, as composições deanticorpos substancialmente homogêneas da invenção tendopredominantemente a glicoforma GO possuem ligação aumentadaa FcyRIII, por exemplo, FcYRIIIa, caracterizado pelo fatode que a afinidade de ligação é aumentada em cerca de 20vezes, 30 vezes, 40' vezes, 50 vezes, 75 vezes, até 100vezes acima daquela observada para composições deanticorpos com a mesma seqüência tendo um perfil deglicosilação heterogêneo, e, assim, uma mistura deglicoformas. Para oncologia e doenças autoimunes,anticorpos terapêuticos tendo afinidade de ligaçãoaumentada para receptores de Fc, por exemplo, FcyRIII, têmsido fortemente correlacionados com eficácia aumentada eresposta melhorada a tratamento.

Em alguns avanços da invenção, as composições deanticorpos substancialmente homogêneas da invenção tendopredominantemente a glicoforma GO possuem atividade CDCalterada quando comparada àquela observada para composiçõesde anticorpos com mesmas seqüências tendo um perfil deglicosilação heterogêneo, e, assim, uma mistura deglicoformas. Por exemplo, em um avanço como tal, ascomposições de anticorpos substancialmente homogêneas dainvenção possuem predominantemente a glicoforma GO epossuem atividade CDC diminuída, quando comparado àquelaobservada para composições de anticorpos com mesmasseqüências tendo um perfil de glicosilação heterogêneo, e,assim, uma mistura de glicoformas. Assim, em algunsavanços, a presente invenção provê composições deanticorpos substancialmente homogêneas tendo

predominantemente a glicoforma GO e atividade CDC que édiminuída em tanto quanto 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%,40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,ou até 100% quando comparada a composições de anticorposcom mesmas seqüências tendo um perfil de glicosilaçãoheterogêneo. Em alguns desses avanços, as composições deanticorpos substancialmente homogêneas tendo

predominantemente a glicoforma GO e atividade CDC diminuídasão ainda caracterizadas em tendo atividade ADCC aumentada,quando comparado a composições de anticorpos com mesmasseqüências tendo um perfil de glicosilação heterogêneo.

Sem ser limitado por qualquer teoria ou mecanismo deação, uma composição de anticorpos de glicoformas GOsubstancialmente homogênea da presente invenção tendoatividade CDC diminuída, e similar ou atividade ADCCaumentada da maneira descrita acima, pode vantajosamenteprover citotoxicidade aumentada contra células alvoenquanto reduzindo efeitos colaterais potenciais adversosque podem estar associados com ativação de complemento apóssua administração. Reduzindo-se o potencial para essesefeitos colaterais adversos, as composições de anticorpossubstancialmente homogêneas tendo predominantemente aglicoforma GO podem vantajosamente ser administradas emtaxas de infusão mais rápidas, reduzindo, dessa forma, otempo de dosagem em qualquer dada administração, e/ou podemser dosadas em concentrações iniciais maiores se comgarantia, com preocupação reduzida para iniciar efeitoscolaterais adversos associados com ativação de complemento.

Por exemplo, ativação de complemento desempenha umpapel central na patogênese de efeitos colaterais deprimeira dose moderados a severos do tratamento com oanticorpo monoclonal IDEC-C2B8 anti-CD20 quimérico (IDECPharmaceuticals Corp., San Diego, Califórnia;comercialmente. disponível sob o nome de marca Rituxan®,também referido como rituximab) . Ver, por exemplo, van derKolk et al. (2001) British J. Haematol. 115: 807-811. Oanticorpo rituximab no produto Rituxan® é expresso emcélulas de ovário de hamster chinês (CHO) , e, assim, acomposição de anticorpos compreende um perfil deglicosilação heterogêneo (i.e., uma mistura deglicoformas) . A atividade CDC de rituximab foi mostrada porser correlacionada com conteúdo de galactose. Dessamaneira, à medida que o número de resíduos de galactoseaumenta de 0-2 moles/mol de cadeia pesada, o nível deatividade CDC aumenta de 80% (β-galactosidase tratada pararemover todos os resíduos de β (1,4)-galactose dasramificações 1,3 e 1,6 manose das N-glicanas anexadas a Asn297 dos domínios Ch 2 das cadeias pesadas) até 150% (UDPgalactosil transferase tratada para assegurar que resíduosde β(1,4)-galactose sejam anexado a ambas ramificações 1,3e 1,6 manose das N-glicanas anexadas a sítios Asn 297) domáximo observado para o anticorpo tendo 1 mol degalactose/mol de cadeia pesada (ver, IDEC BLA 97-0260 nositio eletrônico fda.gov/Cder/biologics/review/ritugenl12697, disponível na internet). Uma composição deanticorpos anti-CD20 substancialmente homogênea

compreendendo anticorpo anti-CD20 tendo a mesma seqüênciacomo rituximab e tendo predominantemente a glicoforma GOteria vantajosamente diminuído a atividade CDC, reduzindo,dessa forma, o potencial para efeitos colaterais adversosnormalmente associados com ativação de complemento com aadministração de anticorpo quando a composição deanticorpos compreende um perfil de glicosilação heterogêneo(i.e., uma mistura de glicoformas).

Assim, uma composição de anticorpos de glicoforma GOsubstancialmente homogênea da presente invenção tendoatividade CDC diminuída, e a mesma ou atividade ADCCaumentada, pode ser usada vantajosamente em aplicaçõesterapêuticas que foram até agora inadequadas,desaconselháveis, ou ineficazes para um ou mais populaçõesde pacientes como resultados de complicações devido aefeitos colaterais adversos normalmente associados comativação de complemento com a administração da composiçãode anticorpos com mesmas seqüências que compreende umperfil de glicosilação heterogêneo (i.e., uma mistura deglicoformas). Tais efeitos colaterais incluem, mas não sãolimitados a, efeitos colaterais moderados a severo quepodem estar associados com primeira administração e/ouadministração rápida de um anticorpo, incluindo, porexemplo, febre e/ou calafrios, náusea, dispnéia, acessosfebris, e similares. Ver, por exemplo, van der Kolk et al.(2001) British J. Haematol. 115:807-811 e as referências aicitadas; Winkler et al. (1999) Blood 94:2217-2224). Dessamaneira, a presente invenção provê um método para reduzirum ou mais efeitos colaterais adversos relacionados comativação de complemento com a administração de umanticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal, o métodocompreendendo administrar o anticorpo como uma composiçãode anticorpos substancialmente homogênea, como aquidefinido acima, -e, assim, pelo menos 80%, pelo menos 85%,pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oupelo menos 99% do anticorpo presente na composição érepresentado pela glicoforma GO, com uma quantidade traçode glicoformas precursoras estando presentes na composição.Em alguns avanços, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelomenos 99% do anticorpo presente na composição érepresentado pela glicoforma GO, com uma quantidade traçode glicoformas precursoras estando presentes na composição.

Como resultado de sua função efetora de Fc aumentada,as composições de anticorpos substancialmente homogêneas dainvenção tendo predominantemente a glicoforma GO provêmoportunidades para novas e melhoradas rotas deadministração, por exemplo, estendendo as possíveis rotasde administração para anticorpos terapêuticos conhecidospara outras rotas de administração além de infusão eadministração intravenosa, por exemplo, para administraçãosubcutânea. Adicionalmente, como resultado de seu potencialaumentado, as composições de anticorpos da invenção podemser dosadas em menores concentrações, ou dosadas em menoresvolumes, e dosadas com menos freqüência. Uma redução novolume da composição de anticorpos administrada éparticularmente vantajosa naquelas instâncias onde eventosadversos resultando de reações a infusão com um anticorpomonoclonal são relacionadas a volume. 0 potencial aumentadodás composições de anticorpos da invenção também abre novasindicações clinicas para alvos mAb existentes que podem nãoser responsivos a terapia com anticorpos com composições deanticorpos de glicoformas mais heterogêneas, e provê ahabilidade de revisitar alvos mAb previamente nãodesenvolvidos.

Os anticorpos mònoclonais produzidos de acordo com osmétodos da presente invenção podem estar contidos em umacomposição compreendendo um carregador farmaceuticamenteaceitável. Tais composições são úteis em um método detratar um sujeito em necessidade de um anticorpo tendofunção efetora, e em alguns avanços, função efetoramelhorada, onde a expressão de FucT foi direcionada parainibição. Dessa maneira, anticorpos monoclonais produzidosem uma planta, por exemplo, uma planta lentilha d'água,estavelmente transformada de acordo com os métodos dapresente invenção podem ser administrados a um sujeito emnecessidade do mesmo.

Qualquer anticorpo pode ser produzido em um hospedeirovegetal geneticamente modificado de acordo com os métodosda invenção. Em um avanço, o anticorpo é um anticorpoterapêutico. Anticorpos foram aprovados para o tratamentode um número de desordens, e vários anticorpos terapêuticosadicionais estão em desenvolvimento. Ver, Brekke andSandlie (2003) Nat. Rev. Drug. Discov. 2(3):240, aquiincorporado por referência. Exemplos de anticorposterapêuticos que podem ser expressos pelos métodos dainvenção incluem, mas não são limitados a, anticorpos anti-CD3 visando o antigeno CD3 (e.g., 0KT®3); anticorposgpIIb/IIIa anti-placas (e.g. abciximab (previamenteconhecido como c7E3 Fab), distribuído como ReoPro®);anticorpos anti-EpCAM (e.g., Panorex®); anticorpos anti-CD20 visando o antigeno CD20 (e.g. rituximab, distribuídocomo Rituxan®; ver U.S. Patent No. 5.736.137, aquiincorporada por referência); receptor anti IL-2 (e.g.Zenapax®, Simulect®); anti-ERBB2 (e.g. trastuzumab,distribuído como Herceptin®; ver U.S. Patent No. 6.165.4 64,aqui incorporada por referência); anti-TNF-α (e.g.,infliximab, distribuído como Remicade®) , anti proteína F(e.g. Synagis®); anticorpos anti-CD30 visando o antigenoCD30 (ver, por exemplo, o anticorpo 5F1 1 descrito emBorchmann et al. (2003) Blood 102:3737-3742 e no Exemplo 6aqui abaixo, ver também WO 03/059282 e U.S. PatentApplication Publication No. 2004/0006215, aqui incorporadaspor referência; o anticorpo SGN-30 descrito em Wahl et al.(2002) Câncer Res. 61:2,12,6-2,1 A2, uma versão quiméricado anticorpo AClO anti-CD30, ver também U.S. PatentApplication Publication No. 20040018194 e U.S. Patent No.7.090.843, aqui incorporadas por referência); anticorposanti-CD33 visando o antigeno CD33 (e.g. Mylotarg®; ver U.S.Patent No. 5.733.001, aqui incorporada por referência);anticorpos anti-CD52 visando o antigeno CD52 (e.g.,alemtuzumab, distribuído como Campath®; ver U.S. Patent No.5.846.534, aqui incorporada por referência); anti-CD20(e.g., Zevalin®); Fc anti-IgE (e.g., omalizumab,comercializado sob Xolair®); anti-VEGF (e.g., bevacizumab,distribuído como Avastin®; ver, Presta et al. (1997) CâncerRes. 57:4593- 9; aqui incorporado por referência); anti-EGF-R (e.g., cetuximab, distribuído como Erbitux®)); anti-CDl Ia (e.g., efalizumab, distribuído sob Raptiva®) , anti-IL-8; anti-C5; anti-TNF-α (e.g., adalimumab, distribuídocom Humira®); anti-TGF-p2; receptor anti-IL2 (e.g.,daclizumab (Zenapax) e basiliximab (Simulect) ) ; anti-a-4-integrina; anti-CD4; anti-CD2; anti-CD19 (e.g., MT103, umanticorpo biespecífico); anticorpo anti- CD22 visando oantígeno CD22 (e.g:, o anticorpo monoclonal BL-22);anticorpo anti-CD23 visando o antígeno CD23 em células Bmalignas (e.g., IDEC- 152); anticorpo anti-CD80 visando oantígeno CD80 (e.g., IDEC-114); anticorpo anti-CD38 visandoo antígeno CD38 em células B malignas; anticorpo a-M-CSFvisando fator estimulador de colônia de macrófagos;anticorpos visando ativador do receptor de factor-capaBnuclear (RANK) e seu ligante (RANKL) , que são super-expressos em mieloma múltiplo; anticorpos anti-CD40 (e.g.,SGN-40) visando o antígeno CD40 em células B malignas;anticorpos visando receptor 1 relacionado a fator denecrose tumoral de ligante indutor de apoptose (TRAIL-Rl)(e.g., o anticorpo monoclonal humano agonístico HGS-ETRl) eTRAIL-R2 expresso em um número de tumores sólidos e tumoresde origem hematopoiética) anticorpos anti-HBV; ouanticorpos anti-MHC de classe II. Vários desses anticorpossão conhecidos por necessitarem de atividade efetora parafuncionar, tanto CDC e/ou ADCC, por exemplo, Herceptin®,Rituxan®, Mylotarg®, e Campath®.

Em alguns avanços, o hospedeiro vegetal que foigeneticamente modificado para alterar seu maquinário deglicosilação da maneira aqui apresentada, por exemplo,lentilha d1água, pode expressar a-2b-interferonbiologicamente ativo, por exemplo a-2b- interferon humanoprecursor (NCBI Protein Accession No. AAB59402) ou a-2b-interferon humano maduro (aminoácidos 24-188 de NCBIProtein Accession No. AAB9402) ou variantes biologicamenteativos desses. Exemplos de variantes biologicamente ativosde a-2b-interferon humano são conhecidos na técnica. Ver,por exemplo, WO 2005/035767, descrevendo versões truncadasde a-2b-interferon; European patent EP211148B1; e U.S.Patent Nos. 4.748.233, 4.801.685, 4.816.566, 4.973.479,4.975.276, 5.089.400, 5.098.703, 5.231.176, e 5.869.293;aqui incorporadas por referência. Em outros avanços, ohospedeiro vegetal, por exemplo, lentilha d'água, podeexpressar hormônio de crescimento humano madurobiologicamente ativo com ou sem seu peptideo sinalacompanhante. 0 hospedeiro vegetal pode expressar tambémvariantes biologicamente ..ativos de hormônio do crescimentohumano. Ver, por exemplo, WO 02/10414, direcionada paraexpressão de polipeptideos biologicamente ativos usando umsistema de expressão de lentilha d'água.

Ainda em outros avanços, o hospedeiro vegetal, porexemplo, lentilha d1água, pode expressar plasminogen,microplasminogen, ou variantes biologicamente ativosdesses. O plasminogen ou microplasminogen a ser expresso nohospedeiro vegetal pode ser de qualquer mamífero fonte. Emalguns avanços, o plasminogen ou microplasminogen é humanoou suino. Ver, por exemplo, WO 2005/078109, direcionada para expressão dessas proteínas usando um sistema deexpressão de lentilha d'água.

Por "variante biologicamente ativo" dessespolipeptídeos heterólogos pretende-se um polipeptídeo derivado do polipeptídeo nativo pp.r deleção (chamadatruncação) ou adição de um ou mais aminoácidos àextremidade N terminal e/ou C terminal da proteína nativa;deleção ou adição de' um ou mais aminoácidos em um ou maissítios na proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa.Variantes de um polipeptídeo heterólogo de interesseenglobados pela presente invenção retêm a atividadebiológica dos polipeptídeos nativos. Por exemplo, variantesbiologicamente ativos de a-2b-interferon continuam a possuir a atividade biológica desejada do a-2b-interferonnativo incluindo a habilidade de aumentar a resistência ainfecção viral, ou a habilidade de modular a transcrição dealvos gênicos regulados por a-2b-interferon. Tais variantesbiologicamente ativos podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético ou de manipulação humana. Variantesbiologicamente ativos de uma proteína heteróloga deinteresse terão pelo menos cerca de 50%, 60%, 65%, 70%,geralmente pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%,preferencialmente pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, e mais preferencialmente pelo menoscerca de 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência emrelação à seqüência de aminoácidos para a proteínaheteróloga de interesse. Assim, por exemplo, um variantebiologicamente ativo de a-2b-interferon nativo terá pelomenos cerca de 50%, 60%, 65%, 70%, geralmente pelo menoscerca de 75%, 80%, 85%, preferencialmente pelo menos cercade 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, e maispreferencialmente pelo menos cerca de 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência em relação à seqüência deaminoácidos para a-2b-interferon humano precursor (NCBIProtein Accession No. AAB59402) ou oí-2b-interferon humanomaduro (aminoácidos 24-188 de NCBI Protein Accession No.AAB94 02), onde a identidade de seqüência é determinadausando os parâmetros aqui identificados acima. Assim, umvariante biologicamente ativo de uma proteína heteróloganativa de interesse pode diferir daquela proteína por tãopouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tão pouco quanto1-10, tal como 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto4, 3, 2, ou até 1 resíduo de aminoácido.

Em um avanço, o hospedeiro vegetal que foigeneticamente modificado para alterar seu maquinário deglicosilação da maneira aqui apresentada é uma plantalentilha d'água estavelmente transformada ou célula delentilha d'água ou nódulo de lentilha d'água que expressapolipeptídeos biologicamente ativos que não podem sereficientemente comercialmente produzidos por sistemas deexpressão de genes existentes, por causa de restrições decusto ou logísticas, ou ambas. Por exemplo, algumasproteínas não podem ser expressas em sistemas de mamíferos,pois a proteína interfere com a viabilidade celular,proliferação celular, diferenciação celular, ou reunião deproteína em células de mamíferos. Tais proteínas incluem,mas não são limitadas a, proteína retinoblastoma, p53,angiostatina, e leptina. A presente invenção pode servantajosamente empregada para produzir proteínasreguladoras de mamíferos; é improvável dada a grandedistância evolucionária entre plantas superiores emamíferos que essas proteínas interfiram com processosreguladores em lentilha d'água. Lentilha d'água transgênicapode ser também usada para produzir grandes quantidades deproteínas, tais como albumina de soro (em particular,albumina de soro humana), hemoglobina, e colágeno, quedesafiam as capacidades de produção de sistemas deexpressão existentes.

Finalmente, sistemas de plantas superiores podem serconstruídos para produzir proteínas multiméricasbiologicamente ativas (e.g., anticorpos monoclonais,hemoglobina, oxidase P450, e colágeno, e similares) muitomais facilmente do que sistemas de mamíferos. Uma abordagemexemplar para produzir proteínas multiméricasbiologicamente ativas em lentilha d'água usa um vetor deexpressão contendo os genes codificando todas assubunidades do polipeptídeo. Ver, e.g., During et al.(1990) Plant Mol Biol. 15:281 e van Engelen et al. (1994)Plant Mol. Biol. 26: 1701. 0 cassete de expressãocompreendendo o polinucleotídeo inibidor de XylT e/ou FucTpode ser introduzido em tal vetor. Esse vetor é, então,introduzido em células de lentilha d'água usando qualquermétodo de transformação conhecido, tal como bombardeamentobalístico ou transformação mediada por Agrobacterium. Essemétodo resulta em linhagens de células clonais queexpressam todos os polipeptídeos necessários para reunir aproteína multimérica, assim como as seqüências inibidorasde XylT e/ou FucT que alteram o padrão de glicosilação dasN-glicanas de glicoproteínas. Dessa forma, em algunsavanços, a lentilha d'água transformada contém um ou maisvetores de expressão codificando uma cadeia pesada e levede um anticorpo monoclonal ou fragmento Fáb' de anticorpo,e um cassete de expressão compreendendo o polinucleotídeoinibidor de XylT e/ou FucT, e o anticorpo monoclonal oufragmento de anticorpo é reunido na planta lentilha d'águaa partir da cadeia pesada e leve expressa.

Uma variação dessa abordagem é fazer constructos degene simples, DNA misturado a partir desses constructosjuntos, então liberar essa mistura de DNAs em célulasvegetais usando bombardeamento balístico ou transformaçãomediada por Agrobacterium. Como uma variação adicional,alguns ou todos os vetores podem codificar mais de umasubunidade da proteína multimérica (i.e., de forma que hajamenos clones de lentilha d'água para serem cruzados do queo número de subunidades na proteína multimérica) . Em umavanço alternativo, cada clone de lentilha d1água foigeneticamente modificado para alterar seu maquinário deglicosilação e expressa pelo menos uma das subunidades daproteína multimérica, e os clones de lentilha d'águasecretando cada subunidade são cultivados juntos e aproteína multimérica é reunida no meio de váriassubunidades secretadas. Em algumas instâncias, pode serdesejável produzir menos do que todas as subunidades de umaproteína multimérica, ou mesmo uma única subunidade daproteína, em uma planta lentilha d'água transformada oucultura de nódulo de lentilha d'água, e.g., para propósitosindustriais ou processos químicos ou para propósitosdiagnósticos, terapêuticos, ou de vacinação.

Em alguns avanços da invenção, a planta transgênicahospedeira de interesse é um "alto expressor" de umaglicoproteína aqui descrita, incluindo, por exemplo, asglicoproteínas compreendendo glicanas N-Iigadas que sãopredominantemente dá estrutura glicana GO. Por "altoexpressor" pretende-se que a planta transgênica hospedeiroque foi construída para produzir as glicoproteínas aquidescritas seja capaz de produzir a glicoproteína deinteresse em um nível de forma que a glicoproteína deinteresse represente pelo menos 5% ou mais da proteínasolúvel total produzida na planta transgênica hospedeira.Em alguns avanços, um "alto expressor" é uma plantatransgênica hospedeira que foi construída para produzir asglicoproteínas aqui descritas, de forma que a glicoproteínade interesse represente pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%,11%, 12%, 13%, 14%, 15%, ou mais da proteína solúvel totalproduzida na planta transgênica hospedeira. Assim, porexemplo, em um avanço, a planta transgênica hospedeira éuma lentilha d'água que foi modificada para inibir aexpressão de XylT e FucT, e a lentilha d'água transgênica éum alto expressor de uma glicoproteína aqui descrita. Emalguns desses avanços, a lentilha d'água transgênica é umalto expressor de um anticorpo monoclonal glicana otimizadotendo a glicoforma GO predominante aqui descrita acima.Ainda em outros avanços, a lentilha d'água transgênicaexpressa o anticorpo monoclonal glicana otimizado de formaque essa glicoproteina represente cerca de 5%, 6%, 7%, 8%,9%, 10%, 11%, 12%, 13%,. 14%, 15%, ou mais, da proteínasolúvel total.

Humanização Adicional de Glicoproteinas

Em alguns avanços, pode ser desejável para asglicoproteínas da presente invenção compreender N-glicanascomplexas tendo os rfesíduos de β (1,4)-galactose terminaisanexados às ramificações 1,3 e/ou 1,6 manose. Sem estarligado a uma teoria, esses resíduos de galactose terminaispodem contribuir para a função terapêutica e/ou atividadefarmacocinética de uma glicoproteina. É reconhecido que osmétodos da presente invenção podem ser combinados comoutros métodos conhecidos na técnica para modificar mais asglicoproteínas da invenção, de forma que uma ou mais das N-glicanas anexadas a essas compreendam um ou mais resíduosde galactose terminais, i.e., caracterizado pelo fato deque uma ou mais das N-glicanas é representada pela espécieglicana Gl ou G2. Dessa maneira, as composições deglicoproteina da presente invenção, incluindo os anticorposmonoclonais aqui descritos, podem ser modificadas, porexemplo, enzimaticamente com o uso de uma enzimaglicosiltransferase para obter glicoproteínas tendo umperfil de glicosilação substancialmente homogêneo para Gl,preferencialmente para a espécie glicana G2. Ver, porexemplo, U.S. Patent Application Publication No.2004/0191256, aqui incorporada por referência em suaintegra, ensinando modificação de galactosiltransferase deuma glicoproteina substrato para obter uma glicoproteina,caracterizado pelo fato de que substancialmente todas dasespécies glicanas N-Iigadas são da forma G2. Dessa maneira,a glicoproteina de interesse pode ser reagida com umagalactose ativada na presença de uma galactosiltransferasee um sal metal. A galactosiltransferase pode ser uma β1,4galactosiltransferase (GalT) de mamífero, por exemplo, GalThumana, e a glactose ativada pode ser, por exemplo, UDP-galactose.

Alternativamente, as plantas transgênicas da invençãotendo expressão de FucT e XylT silenciada da maneira aquiapresentada podem ser adicionalmente modificadas em seumaquinário de glicosilação de forma que expressem umagalactosiltransferase e eficientemente anexem o resíduo degalactose terminal às N-glicanas de glicoproteínasendógenas e heterólogas aí produzidas. Dessa maneira, asplantas transgênicas da invenção podem ser modificadasadicionalmente introduzindo-se um constructo denucleotídeos, por exemplo, um cassete de expressão, queprovê a expressão de uma galactosiltransferase. Agalactosiltransferase pode ser uma β1,4galactosiltransferase (GalT) de mamífero, por exemplo, GalThumana (ver, por exemplo, U.S. Patent No. 6.998.267, aquiincorporada por referência em sua íntegra) ou uma GalThíbrida (ver, por exemplo, WO 03/078637, aqui incorporadapor referência em sua íntegra) compreendendo pelo menos umaporção de uma região citoplasmática transmembrana de umaprimeira glicosiltransferase (e.g., uma glicosiltransferasevegetal, tal como xilosiltransferase, N-acetilglicosaminlitransferase ou fucosiltransferase) e pelo menos uma porção de uma região catalitica de uma segundaglicosiltransferase (e.g., glicosiltransferase de mamífero,por exemplo, GalT humana). Silenciando a expressão de XylTe FucT em uma planta, por exemplo, uma lentilha d'água, eprovendo a expressão de GalT, por exemplo, GalT humana, ou uma enzima híbrida compreendendo uma porção .do domíniocatalítico de GalT, por exemplo, GalT humana, nessa planta,por exemplo, lentilha d'água, é possível obter plantastransgênicas produzindo glicoproteínas, tanto endógenas e heterólogas, que possuem um padrão de glicosilação alterado, caracterizado pelo fato de que as glicanas N-ligadas anexadas a essas possuem uma redução na anexação deresíduos de xilose específicos de planta e de fucoseespecíficos de planta e que compreendem os resíduos degalactose terminais (i.e., espécie glicana G2). Dessa maneira, glicoproteínas que possuem um perfilsubstancialmente homogêneo para a espécie glicana G2, e/ouque são substancialmente homogêneas para a glicoforma G2podem ser obtidas a partir de plantas transgênicas dainvenção.

Em outros avanços, pode ser desejável modificar mais opadrão de glicosilação das glicoproteínas da invenção,caracterizado pelo fato de que as glicanas N-Iigadasanexadas a essas compreendem, ainda, um resíduo de ácido siálico terminal anexado a um ou ambos resíduos degalactose anexados às ramificações 1,3 e 1,6 manose. Aadição do(s) resíduo(s) de ácido siálico terminal(is) podeser necessária para a estabilidade sustentada, e, em algunscasos, função de algumas proteínas terapêuticas.

Dependendo do sistema de planta transgênica,sialilação natural de glicoproteínas pode ocorrer. Assim,existiram relatos na literatura que Arabidopsis cultivada,tabaco, e células cultivadas de Medicago sintetisamglicoproteínas sialiladas (Shah et al. (2003) Nat. Biotech.21(12): 1470-1471; Joshi and Lopez (2005) Curr. Opin. PlantBiol. 8 (2) : 223-226) . Mais recentemente, foi relatado que oarroz japonês expressa proteínas ativas tiposialiltransferase (Takashima et al. (2006) J. Biochem.(Tokyo) 139 (2) :279-287). Portanto, existem, agora, relatosortogonais de que plantas possuem o maquinário necessáriopara sialilar glicoproteínas.

Aonde modificação adicional do padrão de glicosilaçãodas glicoproteínas da invenção é desejada, caracterizadopelo fato de que as glicanas N-Iigadas anexadas a essascompreendem, ainda, um resíduo de ácido siálico terminalanexado a um ou ambos resíduos de galactose anexados àsramificações 1,3 e 1,6 manose, as plantas transgênicas dainvenção podem ser modificadas para expressar uma β-1,4galactosiltransferase, por exemplo, β-1/4

galactosiltransferase humana, e para expressar ou super-expressar uma sialiltransferase. Assim, por exemplo, asplantas transgênicas podem ser modificadas ainda paraexpressar uma sialiltransferase, tal como a-2,3- e/ou a-2,6-sialiltransferase. Ver, por exemplo WO 2004/071177; eWee et al. (1998) Plant Cell 10: 1759-1768; aquiincorporados por referência em sua integra.Alternativamente, as plantas transgênicas da invenção podemser modificadas para expressar uma β-1,4galactosiltransferase, por exemplo, β-1,4galactosiltransferase humana, e para expressar quaisqueroutras enzimas que são deficientes na via de ácido siálicodo hospedeiro vegetal. A(s) estratégia(s) empregada(s) podeser determinada após uma investigação inicial de. se ohospedeiro vegetal em particular, por exemplo, uma lentilhad'água, naturalmente expressa N-glicanas contendo ácidosiálico em glicoprotèinas nativas ou produzidas de fotmarecombinante. Por exemplo, se não há evidência para apresença dos resíduos de ácido siálico terminais em N-glicanas de glicoprotèinas produzidas na planta transgênicahospedeira, particularmente uma planta transgênicahospedeira construída para expressar uma β-1,4galactosiltransferase, então uma ou ambas dessasestratégias poderiam ser empregadas para alcançarsialilação terminal das N-glicanas de glicoprotèinasproduzidas na planta transgênica hospedeira de interesse.

Alternativamente, as composições de glicoproteína dainvenção que são substancialmente homólogas para espéciesglicanas G2, ou a glicoforma G2, podem ser modificadas porprocessamento enzimático in vitro; ver, por exemplo, U.S.Patent Application Publication No. 20030040037; aquiincorporada por referência em sua íntegra.É também reconhecido que para algumas glicoproteinasproduzidas nas plantas transgênicas da invenção, pode serdesejável ter o resíduo de al-6 fucose de mamífero anexadoà estrutura núcleo trimanose (Man3GlcNAc2) das espécies N-glicanas aí anexadas. Em tais avanços, as plantastransgênicas da invenção podem ser geneticamentemodificadas adicionalmente para expressar uma al-6fucosiltransferase, por exemplo, al-6 fucosiltransferasehumana, usando métodos de glicoengenharia conhecidos natécnica.

É reconhecido que as composições de glicoproteína dainvenção podem ser ' produzidas construindo-se qualquercélula hospedeira de interesse, incluindo as célulashospedeiras vegetais aqui exemplificas e descritas. Dessamaneira, outros sistemas hospedeiros de expressão deproteínas, além de hospedeiros vegetais, incluindo célulasde animais, insetos, bacterianas e similares podem serusados para produzir composições de glicoproteína de acordocom a presente invenção. Tais sistemas hospedeiros deexpressão de proteínas podem ser construídos ouselecionados para expressar uma glicoforma predominante oualternativamente pode naturalmente produzir glicoproteinastendo estruturas glicanas predominantes. Exemplos desistemas hospedeiros de expressão de proteínas construídosproduzindo uma glicoproteína tendo uma glicoformapredominante incluem knockouts/mutações de genes (Shieldset al. (2002) JBC 277:26733-26740); engenharia genética('Umana et al. (1999) Nature Biotech. 17: 176-180); ou umacombinação de ambas. Alternativamente, certas célulasexpressam naturalmente uma glicoforma predominante, porexemplo, galinhas, humanos, e vacas (Raju et al. (2000)Glycobiology 10:477-486). Assim, a expressão de umaglicoproteina, incluindo uma imunoglobulina tal como umanticorpo monoclonal, ou composição tendo predominantementeuma estrutura glicana especifica de acordo com a presenteinvenção pode ser obtida por um especialista na técnica,selecionado pelo menos um de vários sistemas hospedeiros deexpressão. Sistemas hospedeiros de expressão adicionais sãoencontrados na técnica para a produção de glicoproteinas eincluem: células CHO (ver, por exemplo, WO 9922764A1 e WO03/035835A1); células de hibridroma (Trebak et al (1999) J.Immunol. Methods 230:59-70); células de insetos (Hsu et al.(1997) JBC 272:9062-970). Ver também, WO 04/074499A2relacionado a sistemas hospedeiros vegetais adicionais.

As glicoproteinas produzidas de acordo com os métodosda presente invenção podem ser colhidas de célulashospedeiras nas quais são produzidas de forma recombinantepara obtê-las em sua forma isolada ou purificas. Dessamaneira, as glicoproteinas produzidas de forma recombinanteda invenção são isoladas das células hospedeiras usandoqualquer meio convencional conhecido na técnica epurificadas, por exemplo, por cromatografia, eletroforese,diálise, extração solvente-solvente, e similares. Assim, apresente invenção também provê glicoproteinas purificadas,incluindo composições de anticorpo monoclonal, onde asglicoproteinas possuem perfis de glicosilaçãosubstancialmente homogêneos, e são substancialmentehomogêneas para a glicoforma GO. Essas glicoproteinaspurificadas são substancialmente livres de material celularde hospedeiro, e incluem preparações de glicoproteinastendo menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (por pesoseco) de proteína contaminante, como aqui notado acima. Emalguns avanços, essas glicoproteinas purificadas podemincluir pelo menos 0,001%, 0,005%, 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%,2 *6 ^ 2,5-s, 3-6, 3,b-ô, 4%/ 4/5*6/ 5%, 5,5 , Ss, 6/5*6/ Hs, 7/5%/8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ou até cerca de 30%(por peso seco) de proteína contaminante. Adicionalmente,para as glicoproteinas produzidas de forma recombinantepurificadas da invenção, meio de cultura ótimo representamenos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco)de precursores químióos ou químicos que não a proteína deinteresse na preparação de glicoproteína purificada, comoaqui notado acima. Assim, em alguns avanços, componentes demeio de cultura nessas glicoproteinas purificadas poderepresentar pelo menos 0,001%, 0,005%, 0,1%, 0,5%, 1%,1.5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%,7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ou até cercade 30% (por peso seco) de precursores químicos ou que não aproteína de interesse na preparação de glicoproteínapurificada. Em alguns avanços, isolamento e purificaçãoresulta em recuperação de glicoproteína purificada que estálivre de proteína contaminante de hospedeiro, livre decomponentes de meio de cultura, e/ou livre de ambosproteína contaminante de hospedeiro e componentes de meiode cultura.

Assim, em alguns avanços, o sistema hospedeiro deexpressão de proteína é uma planta, por exemplo, umalentilha d'água, e a glicoproteina purificada obtida apartir do hospedeiro vegetal é substancialmente livre dematerial celular vegetal, incluindo avanços onde aspreparações de glicoproteina têm menos de cerca de 30%,20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco) de proteína vegetalcontaminante. Em outros avanços, o meio de cultura vegetalrepresenta menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (porpeso seco) de precursores químicos ou químicos que não aproteína de interesse na glicoproteina purificada.

Em alguns avanços, essas glicoproteínas purificadasobtidas a partir do hospedeiro vegetal podem incluir pelomenos 0,001%, .0,005%,' 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%,3,5%, 4 %, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, "7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9 %,9,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ou até cerca de 30% (por pesoseco) de proteína vegetal contaminante. Em outros avanços,componentes de meio de cultura vegetal nessasglicoproteínas purificadas podem representar pelo menos0,001%, 0,005%, 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%,4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7 %, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%,10%, 15%, 20%, 25%, ou até cerca de 30% (por. peso seco) deprecursores químicos ou químicos que não a proteína deinteresse na glicoproteina purificada. Em alguns avanços,isolamento e purificação do hospedeiro vegetal resultam emrecuperação de glicoproteina purificada que está livre deproteína vegetal contaminante, livre de componentes de meiode cultura vegetal, e/ou livre de ambas proteína vegetalcontaminante e componentes de meio de cultura vegetal.

Cassetes de expressãoDe acordo com a presente invenção, plantas superioresestavelmente transformadas, por exemplo, lentilha d'águaestavelmente transformada, são obtidas por transformaçãocom um polinucleotideo de interesse contido em um cassetede expressão. Dependendo do objetivo, o polinucleotideo deinteresse pode ser um codificando um polipeptideo FucT ouXylT de interesse, por exemplo, codificando o polipeptideoapresentado em SEQ ID NO: 3 (FucT) ou SEQ ID NO: 6 ou 21(XylT), ou um variante desses, provendo, assim, a expressãodesses polipeptideos em uma célula, por exemplo, uma célulavegetal, ou pode ser um polinucleotideo inibidor de FucT ouXylT que é capaz de inibir a expressão ou função dopolipeptideo FucT ou XylT quando estavelmente introduzidoem uma célula, por exemplo, uma célula vegetal deinteresse.

Assim, em alguns avanços, os polinucleotideos FucTe/ou XylT da invenção, incluindo aqueles apresentados emSEQ ID NOS: 1 e 2 (FucT) e SEQ ID NOS:4, 5, 19, e 20 (XylT)e fragmentos e variantes desses, são usados para construircassetes de expressão que compreendem um polinucleotideoinibidor de FucT e/ou XylT, como aqui definido acima.Introduzir estavelmente tal cassete de expressão em umaplanta ou célula vegetal de interesse pode prover ainibição de expressão ou função dos polipeptideos FucT e/ouXylT da invenção, incluindo aqueles apresentados em SEQ IDNO: 3 (FucT) e SEQ ID NO: 6 ou 21 (XylT) e variantes desses,alterando, dessa forma, o padrão de glicosilação de N-glicana de glicoproteinas endógenas e heterólogas em umaplanta ou célula vegetal estavelmente transformada com ocassete de expressão.

Em alguns avanços, a planta ou célula vegetal que éestavelmente transformada com um cassete de expressãocompreendendo um polinucleotídeo inibidor de FucT e/ou XylTtambém foi estavelmente transformado com um cassete deexpressão que provê a expressão de um polipeptideoheterólogo de interesse, por exemplo, uma proteína demamífero de interesse, incluindo as proteínas de mamíferode interesse farmacêutico, como aqui notado acima. 0cassete de expressão provendo a expressão de umpolipeptideo heteróltígo de interesse pode ser provido nomesmo polinucleotídeo (por exemplo, no mesmo vetor detransformação) para introdução em uma planta, ou em umpolinucleotídeo diferente (por exemplo, em vetores detransformação diferentes) para introdução na planta oucélula vegetal de interesse ao mesmo tempo, ou em momentosdiferentes, pelos mesmos ou por métodos de introduçãodiferentes, por exemplo, pelos mesmos ou por métodos detransformação diferentes.

Os cassetes de expressão da presente invençãocompreendem elementos controle de expressão que compreendempelo menos uma região de iniciação transcricional (e.g., umpromotor) ligado ao polinucleotídeo de interesse, i.e., umpolinucleotídeo codificando um polipeptideo FucT ou XylT dainvenção, um polinucleotídeo inibidor de FucT e/ou XylT, ouum polinucleotídeo codificando um polipeptideo heterólogode interesse, por exemplo, uma proteína de mamífero. Talcassete de expressão é provido com uma pluralidade desítios de restrição para inserção do polinucleotídeo oupolinucleotídeos de interesse (e.g., um polinucleotídeo deinteresse, dois polinucleotídeos de interesse, etc.) paraestarem sob regulação transcricional do promotor e outroselementos controle de expressão. Em avanços da invenção emparticular, o polinucleotídeo a ser transferido contém doisou mais cassetes de expressão, cada qual codifica pelomenos um polinucleotídeo de interesse.

Por "elemento controle de expressão" compreende-se umaregião reguladora de DNA, usualmente compreendendo um TATAbox, capaz de direcionar RNA polimerase II, ou em algunsavanços, RNA polimerase III, para iniciar a síntese de RNAno sítio de iniciação de transcrição apropriado para umaseqüência codificadora em particular. LJm elemento controlede expressão pode compreender adicionalmente outrasseqüências de reconhecimento geralmente posicionadas acimaou 5' do TATA box, o que influencia (e.g., intensifica) ataxa de iniciação de transcrição. Adicionalmente, umelemento controle de expressão pode compreenderadicionalmente seqüências geralmente posicionadas abaixo ou3' do TATA box, o que influencia (e.g., intensifica) a taxade iniciação de transcrição.

A região de iniciação transcricional (e.g., umpromotor) pode ser nativa ou homóloga ou estrangeira aohospedeiro, ou poderia ser a seqüência natural ou umaseqüência sintética. Por estrangeiro, pretende-se que aregião de iniciação transcricional não seja encontrada nohospedeiro de tipo selvagem no qual a região de iniciaçãotranscricional é introduzida. Por "promotor funcional"pretende-se que o promotor, quando operacionalmente ligadoa uma seqüência codificando uma proteína de interesse, sejacapaz de dirigir a expressão (i.e., transcrição e tradução)da proteína codificada, ou, quando operacionalmente ligadaa uma seqüência inibidora codificando uma moléculanucleotídica inibidora (por exemplo, um RNA hairpin, RNA dedupla-fita, polinucleotídeo de miRNA, e similares), opromotor seja capaz de iniciar a transcrição da seqüênciainibidora operacionalmente ligada, de forma que a moléculanucleotídica inibidora seja expressa. Os promotores podemser selecionados baseados no resultado desejado. Assim, oscassetes de expressão da invenção podem compreenderpromotores constitutivos, preferenciais de tecido, ououtros promotores para expressão em plantas.

Como aqui usado um gene quimérico compreende umaseqüência codificadora operacionalmente ligada a uma regiãode iniciação de transcrição que é heteróloga em relação àseqüência codificadora.

Qualquer promotor adequado conhecido na técnica podeser empregado de acordo com a presente invenção, incluindopromotores bacterianos, de leveduras, fúngicos, de insetos,de mamíferos, e promotores vegetais. Por exemplo,promotores vegetais, incluindo promotores de lentilhad'água, podem ser usados. Promotores exemplares incluem,mas não são limitados a, o promotor 35S de vírus de mosaicode couve-flor, os promotores de opina sintetase (e.g., nos,mas, ocs, etc.), o promotor de ubiquitina, o promotor deactina, o promotor de subunidade pequena de ribulosebisfosfato (RubP) carboxilase, e o promotor de álcooldesidrogenase. 0 promotor de subunidade pequena RubP decarboxilase de lentilha d'água é conhecido na técnica(Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). Outrospromotores de vírus que infectam plantas, preferencialmentelentilhas d'água, são também adequados incluindo, mas nãolimitando-se a, promotores isolados de vírus de mosaicoDasheen, vírus Chlorella (e.g., o promotor demethyltransferase de adenina de vírus Chlorella; Mitra etal. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), vírus manchado dotomate, vírus rattle de tabaco, vírus de necrose de tabaco,vírus ring spot de tabaco, vírus ring spot de tomate, vírusde mosaico de pepino, vírus stump de amendoim, vírus demosaico de alfafa, badnavírus baciliforme da cana-de-açúcare similares.

Outros elementos controle de expressão adequados sãodescritos na aplicação comumente apropriada e pendenteprovisória intitulada "Expression Control Elements from theLemnaceae Family", designada U.S. Patent Application No.60/759.308, Attorney Docket No. 040989/243656, preenchidaem 17 de janeiro de 2006, aqui incorporada por referênciaem sua íntegra. Os elementos controle de expressãodescritos nessa aplicação pendente foram isolados a partirde genes de ubiquitina para diversos membros da famíliaLemnaceae, e são, assim, referidos como "elementos controlede expressão de ubiquitina de Lemnaceae". A SEQ ID N0:7 dapresente aplicação apresenta o elemento controle deexpressão de ubiquitina de Lemna minor de comprimentototal, incluindo tanto o promotor mais 5' UTR (nucleotideos1-1625) e intron (nucleotideos 1626-2160). A SEQ ID N0:8apresenta o elemento controle de expressão de ubiquitina deSpirodella polyrrhiza de comprimento total, incluindo tantoo: promotor- mais 5' UTR (nucleotideos 1-1041) e intron(nucleotideos 1042-2021). SEQ ID NO: 9 apresenta o elementocontrole de expressão de ubiquitina de Lemna aequinoctialisde comprimento total, incluindo tanto o promotor mais 5'UTR (nucleotideos 1-964) e intron (nucleotideos 965-2068).SEQ ID NO: 10 apresenta o promotor mais a porção 5' UTR doelemento controle de expressão de ubiquitina de Lemna minor(projetado aqui "promotor LmUbq") . A SEQ ID NO: 11apresenta o promotor mais a porção 5' UTR do elementocontrole de expressão de ubiquitina de S.polyrrhiza(projetado "promotor SpUbq" aqui). A SEQ ID NO: 12apresenta o promotor mais a porção 5' UTR do elementocontrole de expressão de ubiquitina de L. aequinoctialis(projetado "promotor LaUbq" aqui). A SEQ ID NO: 13apresenta a porção intron do elemento controle de expressão -de ubiquitina de L.minor (projetado "intron LmUbq" aqui). ASEQ ID NO: 14 apresenta a porção intron do elementocontrole de expressão de ubiquitin de S.polyrrhiza(projetado "intron SpUbq" aqui). A SEQ ID NO: 15 apresentaa porção intron do elemento controle de expressão deubiquitina de L. aequinoctialis (projetado "intron LaUbq"aqui) . É reconhecido que o promotor individual mais asseqüências 5' UTR apresentadas em SEQ ID NOs: 10-12, evariantes biologicamente ativos e fragmentos dessas, podemser usadas para regular a transcrição de seqüências denucleotideos operacionalmente ligadas de interesse emplantas. Similarmente, uma ou mais das seqüências introapresentadas em SEQ ID NOs: 13- 15, e fragmentos ouvariantes biologicamente ativos dessas, podem seroperacionalmente ligadas a um promotor de interesse,incluindo um promotor apresentado em SEQ ID NO : 10, 11 ,ou 12 para intensificar a expressão de uma seqüência denucleotideos que é operacionalmente ligada àquele promotor.

Fragmentos e variantes dos elementos controle deexpressão descritos podem ser também usados em cassetes deexpressão para dirigir a expressão do polinucleotideooperacionalmente ligado de interesse. Por "fragmento de umelemento controle de expressão" pretende-se uma porção doelemento controle de expressão de comprimento total, talcom uma porção de qualquer dos elementos controle deexpressão apresentados em SEQ ID NOs:7-9. Os fragmentos deum elemento controle de expressão retêm atividade biológicae, assim, englobam fragmentos capazes de iniciar ouintensificar a expressão de um polinucleotideooperacionalmente ligado de interesse. Assim, por exemplo,menos do que todos os elementos controle de expressão aquidescritos podem ser utilizados para dirigir a expressão deum polinucleotideo operacionalmente ligado de interesse.Exemplos específicos não limitantes de tais fragmentos deum elemento controle de expressão incluem as seqüências denucleotideos apresentadas em qualquer uma de SEQ ID NOs:10-12 (como aqui descrito acima), assim como truncações 5'do elemento controle de expressão de ubiquitina de L.minor(SEQ ID NO: 7), tal como nucleotideos 1288-2160 de SEQ IDNO: 7 (promotor LmUbq No. 1 truncado) e nucleotideos 1132-2160 de SEQ ID NO: 1 (promotor LmUbq No. 2 truncado). Ver aaplicação provisória pendente designada U.S. PatentApplication No. 60/759.308, aqui incorporada por referência em sua integra.

Os nucleotideos de tais fragmentos compreenderãousualmente a seqüência TATA de reconhecimento do elementocontrole de expressão em particular. Tais fragmentos podem ser obtidos por uso de enzimas de restrição para clivar os,elementos controle de expressão naturalmente ocorrentesaqui descritos; sintetizando-se uma seqüência denucleotideos a partir das seqüências naturalmente,. ocorrentes da seqüência de DNA do elemento controle de expressão; ou podem ser obtidos através do uso detecnologia de reação de cadeia de polimerase (PCR). Verparticularmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol.155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (StocktonPress, New York).

Variantes de elementos controle de expressão, taiscomo aqueles resultando de mutagênese sitio-direcionada,podem ser usados, também, nos cassetes de expressão dapresente invenção para prover expressão do polinucleotideo operacionalmente ligado de interesse. Por "variante de umelemento controle de expressão" pretende-se seqüênciastendo similaridade substancial com um elemento controle deexpressão aqui descrito (por exemplo, o elemento controlede expressão apresentado em SEQ ID NO: 7, 9, ou 9), ou comum fragmento desses (por exemplo, as respectivas seqüênciasapresentadas em SEQ ID NOs: 10-15). Variantes naturalmenteocorrentes de elementos controle de expressão podem seridentificados com o uso de técnicas bem conhecidas debiologia molecular, as, por exemplo, com técnicas de PCR ehibridização como destacado acima. Elementos controle deexpressão variantes também incluem seqüências denucleotideos sinteticamente derivadas, tais como aquelasgeradas, por exemplo, usando mutagênese sitio-direcionada.Geralmente, variantes de um elemento controle de expressãoem particular aqui descrito, incluindo variantes de SEQ IDNOs: 7-15, terão pelo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%,geralmente pelo menos 75%, 80%, 85%, preferencialmentecerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, a 95%, 96%, 97%, e maispreferencialmente cerca de 98%, 99% ou mais de identidadede seqüência em relação àquela seqüência de nucleotideos emparticular, como determinado por programas de alinhamentode seqüências aqui descritos acima usando parâmetrospadrão.

Elementos controle de expressão, incluindo promotores,podem ser escolhidos para dar um nível desejado deregulação. Por exemplo, em algumas instâncias, pode servantajoso usar um promotor que confira expressãoconstitutiva (e.g, o promotor de manopina sintase deAgrobacterium tumefaciens). Alternativamente, em outrassituações, por exemplo, onde a expressão de um polipeptídeoheterólogo é relacionada, pode ser vantajoso usarpromotores que são ativados em resposta a estímulosambientais específicos (e.g., promotores gênicos de choquede calor, promotores gênicos induzidos por seca, promotoresgênicos induzidos por patógenos, promotores gênicosinduzidos por ferimento, e promotores gênicos induzidos porluz /escuro) ou reguladores de crescimento vegetal (e.g.,promotores de genes induzidos por ácido absisico, auxinas,citoquinas, e ácido giberélico). Como uma alternativaadicional, . promotores que dão expressão especifica detecido (e.g., promotores específicos de raiz, folha, eflorais) podem ser escolhidos.

A força total de um dado promotor pode serinfluenciada pela combinação e organização espacial deseqüências de nucleotideos cis-atuantes, tais comoseqüências ativadoras acima. Por exemplo, seqüências denucleotideos ativadoras derivadas do gene de octopinasintase de Agrobacterium tumefaciens pode intensificar atranscrição a partir do promotor de manopina sintase deAgrobacterium tumefaciens (ver U.S. Patent 5.955.64 6 paraGelvin et al). Na presente invenção, o cassete de expressãopode conter seqüências de nucleotideos ativadoras inseridasacima da seqüência promotora para intensificar a expressãoda seqüência de nucleotideos de interesse. Em um avanço, ocassete de expressão inclui três seqüências ativadorasacima derivadas do gene de octopina sintase deAgrobacterium tumefaciens operacionalmente ligado a umpromotor derivado de um gene de manopina sintaseAgrobacterium tumefaciens (ver U. S Patent 5.955.646, aquiincorporada por referência).

Onde o elemento controle de expressão será usado paradirigir a expressão de uma seqüência de DNAoperacionalmente ligada codificando uma molécula pequena dehpRNA, por exemplo, em um cassete de expressão de RNAi aquidescrito acima, é vantajoso usar um elemento controle deexpressão compreendendo um promotor reconhecido pela RNApolimerase III dependente de DNA. Como aqui usado, "umpromotor reconhecido pela RNA polimerase III dependente deDNA" é um promotor que dirige a transcrição da região deDNA associada através da ação de polimerase de RNApolimerase III. Esses incluem genes codificando 5S RNA,tRNA, 7SL RNA, U6 snRNA,, e uns poucos outros RNAs pequenosestáveis, vários envolvidos no processamento de RNA. Amaioria dos promotores usados por Pol III requeremelementos de seqüência abaixo de +1, na região transcrita.Uma minoria de modelos pol III, contudo, não possuiqualquer requisito para elementos promotores intragênicos.Esses são referidos como promotores do tipo 3. Por"promotores de Pol III do tipo 3" pretende-se aquelespromotores que são reconhecidos por RNA polimerase III econtém todos elementos cis-atuantes, interagindo com a RNApolimerase III acima da região normalmente transcrita pelaRNA polimerase III. Tais promotores de Pol III do tipo 3podem ser reunidos nos cassetes de expressão de RNAi dainvenção para dirigir a expressão da seqüência de DNAoperacionalmente ligada codificando a molécula pequena dehpRNA.

Tipicamente, promotores de Pol III do tipo 3 contêm umTATA box (localizado entre -25 e -30 no gene U6 snRNAHumano) e um elemento de seqüência proximal (PSE;localizado entre -47 e -66 em U6 snRNA Humano) . Eles podemtambém conter um Elemento de Seqüência Distai (DSE;localizado entre -214 e -244 em U6 snRNA Humano).Promotores de Pol III do tipo 3 podem ser encontrados,e.g., associados com os genes codificando 7SL RNA, U3 snRNAe U6 snRNA. Tais seqüências foram isoladas de Arabidopsis,arroz e tomate. Ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 1-8 de U.S.Patent Application Publication No. 20040231016.

Outras seqüências de nucleotideos para promotores dePol III do,,, tipo 3 podem ser encontradas em bases de dadosde seqüências de nucleotideos sob as estradas para o geneAT7SL-1 de A. thaliana para 7SL RNA (X72228), gene AT7SL-2de A. thaliana para 7SL RNA (X72229) , gene AT7SL-3 de A.thaliana para 7SL RNA (AJ290403), gene H17SL-1 de Humuluslupulus (AJ236706), gene H17SL-2 de Humulus lupulus(AJ236704), gene H17SL-3 de Humulus lupulus (AJ236705) ,gene H17SL-4 de Humulus lupulus (AJ236703) , gene U6-1 snRNAde A. thaliana (X52527), gene U6-26 snRNA de A. thaliana(X52528), gene U6-29 snRNA de A. thaliana (X52529), geneU6-1 snRNA de A. thaliana (X52527), gene U3 snRNA de Zeamays (Z29641), gene U6 snRNA de Solanum tuberosum (Z17301;X 60506; S83742), gene U6 de RNA nuclear pequeno de tomate(X51447) , gene U3C snRNA de A. thaliana (X52630), gene U3BsnRNA de A. thaliana (X52629) , promotor de U3 snRNA deOryza sativa (X79685) , gene U3 de RNA nuclear pequeno detomate (X 14411), gene U3 snRNA de Triticum aestivum(X63065), e gene U6 snRNA de Triticum aestivum (X63066).

Outros promotores de Pol III do tipo 3 podem serisolados de outras variedades de tomate, arroz ouArabidopsis, ou de outras espécies vegetais usando métodosbem conhecidos na técnica. Por exemplo, bibliotecas declones genômicos de tais plantas podem ser isoladas usandoseqüências codificadoras de U6 snRNA, U3 snRNA, ou 7SL RNA(tais como as seqüências codificadoras de qualquer dasseqüências acima mencionadas identificadas pelo seu númerode acesso e adicionalmente a seqüência codificadora deU 6 snRNA de Vicia faba (X04788), o DNA de milho para U6snRNA (X52315) , ou DNA de milho para 7SL RNA (X14661) ) comosonda, e as seqüências acima, preferencialmente as cerca de300 a 400 pb acima das regiões transcritas podem serisoladas e usadas como promotores de Pol IIX do tipo 3.Alternativamente, técnicas baseadas em PCR, tais como PCRinverso ou TAILtm-PCR podem ser usadas para isolar asseqüências genômicas incluindo as seqüências promotorasadjacentes àquelas regiões transcritas conhecidas. Além domais, qualquer das seqüências promotoras de Pol III do tipo3 aqui descritas, identificadas por seus números de aceossoe SEQ ID NOS, podem ser usadas como sondas sob condições dehibridização estringentes, ou como fonte de informação paragerar primers de PCR para isolar as seqüências promotorascorrespondentes de outras variedades ou espécies vegetais.

Apesar dos promotores de Pol III do tipo 3 não teremrequisitos para elementos cis-atuantes localizados com aregião transcrita, está claro que as seqüências normalmentelocalizadas abaixo do sitio de iniciação de transcriçãopodem, contudo, ser incluídas nos cassetes de expressão deRNAi da invenção. Ainda, enquanto promotores de Pol III dotipo 3 originalmente isolados de plantas monocotiledôneaspodem efetivamente ser usados em cassetes de expressão deRNAi para suprimir a expressão de um gene alvo em ambascélulas vegetais e plantas de dicotiledôneas emonocotiledôneas, promotores de Pol III do tipo 3originalmente isolados de plantas dicotiledôneasreportadamente podem apenas ser eficientemente usadas emcélulas vegetais e plantas de dicotiledôneas. Além do mais,o mais eficiente silenciamento gênico reportadamente éobtido quando o cassete de expressão de RNAi é projetadopara compreender um promotor de Pol III de tipo 3 derivadoda mesma espécie ou espécie proximamente relacionada. Ver,por exemplo, U.S. Patent Application Publication No.20040231016. Assim, onde a planta de interesse é uma plantamonocotiledônea, uma interferência de hpRNA pequeno é ométodo de escolha para inibir a expressão de FucT e/ouXylT, o promotor de Pol III de tipo 3 preferencialmente éde outra planta monocotiledônea, incluindo a espécievegetal para a qual o padrão de glicosilação de glicanas Nde uma glicoproteína de interesse deve ser alterado.

O cassete de expressão da invenção inclui, assim, nadireção 5'-3' de transcrição, um elemento controle deexpressão compreendendo uma região de iniciaçãotranscricional e de tradução, um polinucleotideo deinteresse, por exemplo, uma seqüência codificando umaproteína heteróloga de interesse ou uma seqüênciacodificando uma seqüência inibidora de FucT ou XylT que,quando expressa, é capaz de inibir a expressão ou função deFucT e/ou XylT, e uma região de terminação transcricional ede tradução funcional em plantas. Qualquer seqüência determinação adequada conhecida na técnica pode ser usada deacordo com a presente invenção. A região de terminação podeser nativa com a região de iniciação transcricional, podeser nativa com a seqüência de nucleotideos de interesse, oupode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminaçãoconvenientes estão disponíveis a partir do plasmídio Ti deA. tumefaciens, tal como as regiões de terminação deoctopina sintetase e nopalina sintetase. Ver tambémGuerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141;Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) GenesDev. 5: 141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261; Munroeet al. (1990) Gene 91: 151; Bailas et al. (1989) NucleicAcids Res. 17 :7891; e Joshi et al. (1987) Nucleic AcidsRes. 15:9627. Seqüências de terminação exemplaresadicionais são a seqüência de terminação de subunidadepequena de RubP carboxilase de ervilha e a seqüência determinação 35S de vírus de mosaico de couve-flor. Outrasseqüências de terminação adequadas serão aparentes daquelesespecialistas na técnica, incluindo o trecho oligo dT aquidescrito acima para uso com promotores de Pol III do tipo 3dirigindo a expressão de um polinucleotídeo inibidor deFucT e/ou XIyT que forma uma estrutura de hpRNA pequeno.

Alternativamente, o(s) polinucleotídeo(s) de interessepode(m) ser provido(s) em qualquer outro cassete deexpressão adequado conhecido na técnica.

Geralmente, o cassete de expressão compreenderá umgene marcador selecionável para a seleção de células outecidos transformados. Genes marcadores de seleção incluemgenes codificando resistência a antibiótico, tais comoaqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) ehigromicina fosfotransferase (HPT), assim como genesconferindo resistência a compostos herbicidas. Genes deresistência a herbicidas geralmente codificam uma proteínaalvo modificada insensível ao herbicida ou uma enzima quedegrade ou desintoxifique o herbicida na planta antes quepossa agir. Ver DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513;DeBlock et al.(l 989) Plant Physiol. 91 :691; Fromm et al.(1990) BioTechnology 8:833; Gordon-Kamm et al. (1990) PlantCell 2:603. Por exemplo, resistência a herbicidas deglifosato ou sulfoniluréia foi obtida usando genescodificando enzimas alvo mutantes, 5

enolpiruvilchiquimato-3 -fosfato sintase (EPSPS) eacetolactato sintase (ALS). Resistência a amônioglufosinato, boromoxinil, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida usando genes bacterianos codificandofosfinotricina acetiltransferase, uma nitrilase, ou uma2,4- diclorofenoxiacetato monooxigenase, que desitoxificaos respectivos herbicidas.

Para propósitos da presente invenção, genes marcadoresde seleção incluem, mas não são limitados a, genescodificando neomicina fosfotransferase II (Fraley et al.(1986) CRC Criticai Reviews in Plant Science 4:1);cianamida hidratase (Maier-Greiner et al. (1991) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 88 :4250); aspartato qu-inase;dihidrodipicolinato sintase (Perl et al. (1993)BioTechnology 11 :715); gene bar (Toki et al. (1992) PlantPhysiol. 100: 1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci 36:1367); triptofano descarboxilase (Goddijn et al. (1993)Plant Mol. Biol. 22:907); neomicina fosfotransferase (NE0;Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1 :327);higromicina fosfotransferase (HPT or HYG; Shimizu et al.(1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074); dihidrofolato redutase(DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA83:4552); fosfinotricina acetiltransferase (DeBlock et al.(1987) EMBO J. 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiônicodehalogenase (Buchanan-Wollatron et al. (19&.9) J. Cell.Biochem. 13D:330); acetohidroxiácido sintase (U.S. Pat. No.4.761.373 para Anderson et al; Haughn et al. (1988) Mol.Gen. Genet. 221:266); 5-enolpiruvil-chiquimato-fosfatosintase (aroA; Comai et al. (1985) Nature 317:741);haloarilnitrilase (WO 87/04181 para Stalker et al); acetil-coenzima A carboxilase (Parker et al. (1990) Plant Physiol.92: 1220); dihidropteroato sintase (sull; Guerineau et al.(1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); e polipeptideo de 32 kDade fotosistema II (psbA; Hirschberg et al. (1983) Science222: 1346 (1983).

Também incluídos estão genes codificando resistênciaa: gentamicina (e.g., aacCl, Wohlleben et al. (1989) Mol.Gen. Genet. 217:202-208); cloramfenicol (Herrera-Estrellaet al. (1983) EMBO J. 2:987); metotrexato (Herrera-Estrellaet al. (1983) Nature 303:209; Meijer et al. (1991) PlantMol. Biol. 16:807); higromicina (Waldron et al. (1985)Plant Mol. Biol. 5: 103; Zhijian et al. (1995) PlantScience 108:219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio.16:807); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen.Genet. 210:86); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al.(1996) Transgenic Res. 5: 131); bleomicina (Hille et al.(1986) Plant Mol. Biol. 7: 171); sulfonamida (Guerineau etal. (1990) Plant Mol. Bio. 15: 127); bromoxinil (Stalker etal. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Streber et al. (1989)BioTechnology 7:811); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987)EMBO J. 6:2513); espectinomicina (Bretagne-Sagnard andChupeau, Transgenic Research 5: 131).

O gene bar confere resistência a herbicida paraherbicidas tipo glufosinato, tais como fosfinotricina (PPT)ou bialaphos, e similares. Como notado acima, outrosmarcadores selecionáveis que poderiam ser usados nosconstructos de vetores incluem, mas não são limitados a, ogene pat, também para resistência a fosf inotricina oubialaphos, o gene ALS para resistência a imidazolinona, ogene HPH ou HYG para resistência a higromicina, o gene EPSPsintase para resistência a glifosato, o gene HmI pararesistência à toxina He, e outros agentes seletivos usadosrotineiramente e conhecidos daqueles · de conhecimentoordinário na técnica. Ver Yarranton (1992) Curr. Opin.Biotech. 3:506; Chistopherson et al . (1992) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63;Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al.(1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555;Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow etal. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952; Bairn et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072; Wyborski et al.(1991) Nue. Aeids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989)Topies in Mol. And Strue. Biol. 10: 143; Degenkolb et al.(1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591; Kleinsehnidtet al. (1988) Bioehemistry 27: 1094; Gatz et al. (1992)Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. AgentsChemother. 36:913; Hlavka et al. (1985) Handbook ofExperimental Pharmacology 78; e Gill et al. (1988) ,,Nature334:721. Tais descrições são aqui incorporadas porreferência.

A lista de genes marcadores de seleção acima não éfeita para ser limitante. Qualquer gene marcador de seleçãopode ser usado na presente invenção.

Modificação de Seqüências de nucleotideos para ExpressãoIntensificada em um Hospedeiro Vegetal

Onde a planta de interesse é também geneticamentemodificada para expressar uma proteína heteróloga deinteresse, por exemplo, uma planta transgênica hospedeiraservindo como sistema de expressão para produçãorecombinante de uma proteína heteróloga, a presenteinvenção provê a modificação da seqüência depolinucleotídeos expressa codificando a proteína heterólogade interesse para intensificar sua expressão na plantahospedeira. Assim, onde apropriado, os polinucleotídeospodem ser otimizados para expressão aumentada na plantatransformada. Ou seja, os polinucleotideos podem sersintetizados usando códons preferidos de planta paraexpressão melhorada. Ver, por exemplo, Campbell and Gowri(1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para uma discussão de uso decódon preferido de hospedeiro. Métodos estão disponíveis natécnica· para sintetizar seqüências de nucleotídeos comcódons preferidos de plantas. Ver, e.g., U.S. Patent Nos.5.380.831 e 5.436.391; Perlak et al. (1991) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 15:3324; Iannacome et al. (1991) Plant Mol.Biol. 34:485; e Murray et al., (1989).Nucleic Acids. Res.17:477, aqui incorporados por referência.

Em alguns.avanços da invenção, o hospedeiro vegetal éum membro da família das lentilhas d'água, e opolinucleotídeo codificando o polipeptídeo heterólogo deinteresse, por exemplo, um polipeptídeo de mamífero, émodificado para expressão intensificada do polipeptídeoheterólogo codificado. Dessa maneira, uma modificação comotal é a síntese do polinucleotídeo codificando opolipeptídeo heterólogo de interesse usando códonspreferidos de lentilha d'água, onde a síntese pode serconseguida usando qualquer método conhecido para umespecialista na técnica. Os códons preferidos podem serdeterminados a partir dos códons de freqüência mais altanas proteínas expressas em lentilha d'água. Por exemplo, afreqüência de uso de códon para Lemna gibba é encontrada napágina da internet:

http: //www. kazusa. or. jp/codon/cgibin/showcodon. cgi?species=Lemna+qibba+[gbpln], e a freqüência de uso de códon paraLemna minor é encontrada na página da internethttp: //www. kazusa . or. jp/codon/cgibin/showcodon. cgi?species=Lemna+rainor+ [gbpln] e na Tabela 1. É reconhecido que genesheterólogos que foram otimizados para expressão em lentilhad'água e outras monocotiledôneas, assim como outrasdicotiledôneas, podem ser usados nos métodos da invenção.Ver, e.g., EP 0 359 472, EP 0 385 962, WO 91/16432; Ferlaket al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324; Iannacomeet al. (1997) Plant Mol Biol. 34:485; e Murray et al.(1989) Nuc. Acids Res. 17:477, e similares, aquiincorporados por referência. É ainda reconhecido que todoou qualquer parte do polinucleotideo codificando opolipeptideo heterólogo de interesse pode ser otimizado ousintético. Em outraá palavras, seqüências completamenteotimizadas ou parcialmente otimizadas podem ser tambémusadas. Por exemplo, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%, ou 100% dos códons podem ser códons preferidos delentilha d'água. Em um avanço, entre 90 e 96 % dos códonssão códons preferidos de lentilha d'água. A seqüênciacodificadora de uma seqüência de polinucleotideoscodificando um polipeptideo heterólogo de interesse podecompreender códons usados com uma freqüência de pelo menos17% em Lemna gibba. Em um avanço, a seqüência denucleotideos modificada é a seqüência de nucleotideoscodificando a-2B-interferon humano mostrada em SEQ ID NO:16, que contém 93% códons preferidos de lentilha d'água.

Tabela 1: Códons preferidos de Lemna gibba a partir daliberação do GenBank (Release 113)UUU 2,2 (4) UCU 0,5 (1) UAU 2,2 (4) UGU 0,0 (0)UUC 50, 5 (92) UCC 31, 9 (58) UAC 40, 1 (73) UGC 17,6 (32)UUA 0,0 (0) UCA 0,5 (1) UAA 3,8 (7) UGA 1,6 (3)UUG 2,7 (5) UCG 15, 4 (28) UAG 0, 0 (0) UGG 24,2 (44)CUU 0,5 (1) CCU 6, 6 (12) CAU 0, 5 (1) CGU 1,1 (2)CUC 39, 0 (71) CCC 43,4 (79) CAC 6, 6 (12) CGC 26,9 (49)CUA Irl (2) CCA 2,2 (4) CAA 4,4 (8) CGA 1,1 (2)CUG 22, 5 (41) CCG 20, 9 (38) CAG 26, 9 (49) CGG 7,7 (14)AUU 0,0 (0) ACU 3,3 (6) AAU 1,1 (2) AGU 0,0 (0)AUC 33,5 (61) ACC 26,4 (48) AAC 37, 9 (69) AGC 22, 0 (40)AUA 0,0 (0) ACA 0,5 (1) AAA 0,0 (0) AGA 4,9 (9)AUG 33, 5 (61) ACG 9,3 (17) AAG 57,1 (104) AGG 6,0 (H)GUU 9,3 (17) GCU 7,1 (13) GAU 1,6 (3) GGU 1,1 (2)GUC 28, 0 (51) GCC 73, 6 (134) GAC 38,4 (70) GGC 46,7 (85)GUA 0,0 (0) GCA 5,5 (10) GAA 2,2 (4) GGA 1,1 (2)GUG 34, 0 (62) GCG 20, 9 (38) GAG 62, 6 (114) GGG 27,5 (50)

Outras modificações também podem ser feitas aopolinucleotideo codificando o polipeptideo heterólogo deinteresse para intensificar sua expressão em um hospedeirovegetal de interesse, incluindo lentilha d'água. Essasmodificações incluem, mas não são limitadas a, eliminaçãode seqüências codificando sinais de poliadenilaçãoespuriosos, sinais de sitio de splice éxon-intron,repetições tipo transposon, e outras seqüências bemcaracterizadas que podem ser deletérias para expressãogênica. O conteúdo G-C da seqüência pode ser ajustado aníveis médios para um dado hospedeiro celular, comocalculado por referência para genes conhecidos expressos nacélula hospedeira. Quando possível, o polinucleotídeocodificando o polipeptídeo heterólogo de interesse pode ser modificado para evitar estruturas secundárias de mRNAhairpin previstas.

Existem diferenças conhecidas entre as seqüências denucleotídeos de contexto de iniciação de tradução ótimapara códons de iniciação de tradução em animais e plantas ea composição dessas seqüências de nucleotídeos de contextode iniciação de tradução pode influenciar a eficiência deiniciação de tradução: Ver, por exemplo, Lukaszewicz et al.(2000) Plant Science 154:89-98; e Joshi et al. (1997);Plant Mol. Biol. 35:993-1001. Na presente invenção, aseqüência de nucleotídeos de contexto de iniciação detradução para o códon de iniciação de tradução dopolinucleotídeo nucleotídeo de interesse, por exemplo, opolinucleotídeo codificando um polipeptídeo heterólogo deinteresse, pode ser modificada para intensificar aexpressão em lentilha d'água. Em um avanço, a seqüência denucleotídeos é modificada de forma que os três nucleotídeosdiretamente acima do códon de iniciação de tradução daseqüência de nucleotídeos de interesse são "ACC". Em umsegundo avanço, esses nucleotídeos são "ACA".

A expressão de um transgene em um hospedeiro vegetal,incluindo lentilha d'água, pode ser também intensificadapelo uso de seqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem agir para intensificar a tradução. Líderes detradução são conhecidos na técnica e incluem, mas não sãolimitados a, lideres de picornavírus, e.g., Iider de EMCV(região 5' não codificadora de Encefalomiocardite; Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126);lideres de potivirus, e.g., Iider de TEV (Virus Etch deTabaco; Allison et al. (1986) Virology 154:9); proteína deligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP;Macajak and Sarnow (1991) Nature 353:90); líder nãotraduzido de proteína de cobertura de mRNA de vírus demosaico de alfafa (AMV RNA 4; Jobling and Gehrke (1987)Nature 325:622); líder de vírus de mosaico de tabaco (TMV;Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56); líder devírus etch de batata' (Tomashevskaya et al. (1993) J. Gen.Virol. 74:2717-2724); região Fed-I 5' não traduzida (Dickey(1992) EMBO J. 11:2311-2317); região RbcS 5' não traduzida(Silverthorne et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58);e líder de vírus mottle clorótico de milho (MCMV; Lommel etal. (1991) Virology 81 :382). Ver também, Della-Cioppa etal. (1987) Plant Physiology 84:965. Seqüência lídercompreendendo seqüência íntron vegetal, incluindo seqüênciaíntron de gene de álcool desidrogenase 1 de milho (ADHl), ogene de catalase de rícino, ou o gene PATl de via detriptofano de Arabidopsis foi também mostrado por aumentara eficiência de tradução em plantas (Callis et al. (1987)Genes Dev. 1 :1183-1200; Mascarenhas et al. (1990) PlantMol. Biol. 15:913-920). Ver também aplicação provisóriapendente U.S. Patent Application No. 60/759.308,caracterizado pelo fato de que a seqüência lídercompreendendo uma seqüência íntron de lentilha d'águaselecionada do grupo consistindo dos íntrons apresentadosem SEQ ID NOs: 13-15 provê eficiência de tradução aumentadaem lentilha d'água.

Em alguns avanços da presente invenção, a seqüência denucleotideos correspondendo aos nucleotideos 1222-1775 degene de álcool desidrogenase 1 de milho (ADH1; GenBankAccession Number X04049), ou a seqüência de nucleotideoscorrespondendo ao intron apresentado em SEQ ID NO: 13, 14,ou 15, é inserida acima do polinucleotideo codificando opolipeptídeo heterólogo de interesse ou o polinucleotideoinibidor de FucT e/ou XylT para intensificar a eficiênciade sua tradução. Em outro avanço, o cassete de expressãocontém o líder do 'gene de subunidade 5B pequena deribulose-bisfosfato carboxilase de Lemna gibba (líder deRbcS; ver Buzby et al. (1990) Plant Cell 2:805-814; vertambém SEQ ID NO: 16, 17, ou 18 da presente invenção) .

Ver também, por meio de exemplo apenas, os vetores deexpressão descritos nas figuras daqui, caracterizados pelofato de que o líder de RbcS e o intron ADHl estão incluídoscomo seqüências reguladoras acima em um cassete deexpressão compreendendo o polinucleotideo inibidor de FucT(Figura 8), o polinucleotideo inibidor de XylT (Figuras 9 e11), um cassete de expressão compreendendo a moléculaquimérica inibidora de FucT/XylT (Figura 10), ou um cassetede expressão compreendendo a seqüência codificadora para opolipeptídeo heterólogo, a cadeia pesada de IgGl de umanticorpo monoclonal (Figuras 12, 13, e 14) ou a cadeialeve de um anticorpo monoclonal (Figura 14); caracterizadopelo fato de que o promotor de LmUbq e o intron LmUbq estãoincluídos como seqüências reguladoras acima em um cassetede expressão compreendendo o polinucleotideo inibidor deFucT (Figura 11), ou um cassete de expressão compreendendoa seqüência codificadora para o polipeptídeo heterólogo, a cadeia leve de IgFl de um anticorpo monoclonal (Figura 13);caracterizado pelo. fato . de que o promotor de SpUbq eíntrons SpUbq estão incluídos como seqüências reguladorasacima em um cassete de expressão compreendendo opolinucleotideo inibidor de FucT (Figura 13), ou um cassete de expressão compreendendo o polinucleotideo inibidorquimérico de FucT/XylT (Figura 12) ; e caracterizado pelofato de que o promotor LaUbq e íntron LaUbq estão incluídoscomo seqüências reguladoras acima em um cassete deexpressão compreendendo o polinucleotideo inibidor de XylT (Figura 13).

É reconhecido que qualquer das modificações deseqüências de nucleotídeos para intensificação de expressãodescrita acima pode ser usada na presente invenção, incluindo qualquer modificação simples ou qualquercombinação possível de modificações. A expressão"modificado para expressão intensificada" em uma planta,por exemplo, uma planta lentilha d'água, como aqui usadorefere-se a uma seqüência de polinucleotídeos que contém qualquer uma ou qualquer combinação dessas modificações.

Peptídeos Sinal

É reconhecido que o polipeptídeo heterólogo de interesse pode ser um que é normalmente ou vantajosamenteexpresso como uma proteína secretada. Proteínas secretadassão usualmente traduzidas a partir de polipeptídeosprecursores que incluem um "peptídeo sinal" que interagecom uma proteína receptora na membrana do retículoendoplasmático (ER) para direcionar a translocação dacadeia de polipeptídeo crescendo através da membrana e noretículo endoplasmático para secreção a partir da célula.Esse peptídeo sinal é freqüentemente clivado a partir dopolipeptídeo precursor para produzir um polipeptídeo"maduro" sem o peptídeo sinal. Em um avanço da presenteinvenção, um polipeptídeo biologicamente ativo é expressono hospedeiro vegetal de interesse, por exemplo, lentilhad'água ou outra planta superior, a partir de uma seqüênciade polinucleotídeos que é operacionalmente ligada com umaseqüência de nucleotídeos codificando um peptídeo sinal quedirige a secreção do polipeptídeo no meio de cultura.Peptídeos sinais vegetais que direcionam a translocação deproteínas para o retículo endoplasmático (para secreçãofora da célula) são conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, U.S. Patent No. 6.020.169 para Lee et al. Napresente invenção, qualquer peptídeo sinal vegetal pode serusado para direcionar o polipeptídeo expresso para o ER.Em alguns avanços, o peptídeo sinal é o peptídeo sinal deendoquitinase básica de Arabidopsis thaliana (aminoácidos14-34 de NCBI Protein Accession No. BAA82823) , o peptídeosinal de extensin (Stiefel et al. (1990) Plant Cell 2:785-793) , o peptídeo sinal de α-amilase de arroz (aminoácidos1-31 de NCBI Protein Accession No. AAA33885) , ou umaseqüência sinal modificada de α-amilase de arroz (SEQ IDNO: 17) . Em outro avanço, o peptídeo sinal corresponde aopeptideo sinal de uma proteína secretada de lentilhad'água.

Alternativamente, um peptideo sinal de mamífero podeser usado para direcionar polipeptídeos recombinantesexpressos em uma. planta geneticamente construída dainvenção, por exemplo, lentilha d'água ou outra plantasuperior de interesse, para secreção. Foi demonstrado quecélulas vegetais reconhecem peptídeos sinal de mamíferosque visam o retículo endoplasmático, e que esses peptídeossinal podem direcionar a secreção de polipeptídeos nãoapenas através da membrana plasmática, mas também atravésda parede da célula vègetal. Ver U.S. Patent Nos. 5.202.422e 5.639.947 para Hiatt et al. Em um avanço da presenteinvenção, o peptideo sinal de mamífero que direciona asecreção do polipeptídeo é o peptideo sinal de a-2b-interferon humano (aminoácidos 1-23 de NCBI ProteinAccession No. AAB59402).

Em um avanço, a seqüência de nucleotídeos codificandoo peptideo sinal é modificada para expressão intensificadano hospedeiro vegetal de interesse, por exemplo, lentilhad'água ou outra planta superior, utilizando qualquermodificação ou combinação de modificações descritas acimapara a seqüência de polinucleotídeos de interesse.

0 polipeptídeo biologicamente ativo secretado pode sercolhido do meio de cultura por qualquer meio convencionalconhecido na técnica, e purificado por cromatografia,eletroforese, diálise, extração solvente-solvente, esimilares. Dessa maneira, polipeptideos purificados, comodefinidos acima, podem ser obtidos do meio de cultura.

Assim, em alguns avanços, a o sistema hospedeiro deexpressão de proteína é uma planta, por exemplo, umalentilha d'água ou outra planta superior, e o polipeptídeobiologicamente ativo secretado é uma glicoproteína dainvenção, onde a glicoproteína possui um perfil deglicosilação substancialmente homogêneo, e ésubstancialmente homogêneo, para a glicoforma GO. Em taisavanços, qualquer tal glicoproteína que pode permanecer nomaterial vegetal pode ser opcionalmente isolada epurificada como descrito acima. A glicoproteína secretadapode ser obtida do meio de cultura vegetal e purificadausando qualquer meio convencional na técnica, como notadoacima. Dessa maneira, a glicoproteína purificada obtida domaterial vegetal é substancialmente livre de materialcelular vegetal, e inclui avanços onde as preparações deglicoproteína têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou1% (por peso seco) de proteína vegetal contaminante. Onde aglicoproteína purificada é obtida do meio de culturavegetal, o meio de cultura vegetal representa menos decerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco) deprecursores químicos ou químicos que não a proteína deinteresse na preparação de glicoproteína purificada.

Em alguns avanços, essas glicoproteínas purificadasobtidas a partir do hospedeiro vegetal podem incluir pelomenos 0,001%, 0,005%, 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%,3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%,9,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ou até cerca de 30% (por pesoseco) de proteína vegetal contaminante. Em outros avanços,onde a glicoproteina é coletada do meio de cultura vegetal,o meio de cultura vegetal nessas glicoproteinas purificadaspode incluir pelo menos 0,001%, 0,005%, 0,1%, 0,5%, 1%,1,5%, 2%, 2,5%, 3%,· 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%,7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ou até cercade 30% (por peso seco) de precursores químicos ou químicosque não a proteína de interesse na preparação deglicoproteina purificada. Em alguns avanços, o isolamento ea purificação do hospedeiro vegetal, e onde secretado, apartir do meio de cultura, resulta em recuperação deglicoproteina purificada que é livre de proteína vegetalcontaminante, livre de componentes de meio de culturavegetal, e/ou livre de ambos, proteína vegetal contaminantee componentes de meio de cultura vegetal.

Plantas Transformadas e Plantas de Lentilha d'águaTransformadas e Culturas de Nódulos de Lentilha d'água

Protocolos de transformação, assim como protocolospara introduzir seqüências de nucleotídeos em plantas,podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetalou nódulo, que é, monocotiledônea ou dicotiledônea, visadopara transformação. Métodos adequados de introduzirseqüências de nucleotídeos em plantas ou células vegetaisou nódulos incluem microinjeção (Crossway et al. (1986)Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606),transformação mediada por Agrobacterium (U.S. Patent Nos.5.563.055 e 5.981.840, ambas as quais são aqui incorporadaspor referência), transferência direta de genes (Paszkowskiet al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), aceleração balística departículas (ver, e.g., U.S. Patent Nos. 4.945.050;5.879.918; 5.886.244; e 5.932.782 (cada qual é aquiincorporada por referência); e Tomes et al. (1995) "DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) ; McCabe et al. (.1988) Biotechnology 6:923-926). As células que foram transformadas podem sercultivadas em plantas de acordo com meios convencionais.Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant CellReports 5:81-84.

A lentilha d'água estavelmente transformada utilizadanesta invenção pode ser obtida por qualquer métodoconhecido na técnica. Em um avanço, a lentilha d'águaestavelmente transformada é obtida por um dos métodos detransferência de genes descritos em U.S. Patent No.6.040.4 98 para Stomp et al., aqui incorporada porreferência. Esses métodos incluem transferência de genespor bombardeamento balístico com microprojéteis cobertoscom um ácido nucléico compreendendo a seqüência denucleotídeos de interesse, transferência de genes poreletroporação, e transferência de genes mediada porAgrobacterium compreendendo um vetor compreendendo aseqüência de nucleotídeos de interesse. Em um avanço, alentilha d'água estavelmente transformada é obtida viaqualquer um dos métodos mediados por Agrobacteriumdescritos em U.S. Patent No. 6.040.498 para Stomp et al. AAgrobacterium usada é Agrobacterium tumefaciens ouAgrobacterium rhizogenes.

É preferido que as plantas de lentilha d1águaestavelmente transformadas utilizadas nesses métodos exibammorfologia normal e sejam férteis por reprodução sexuada.Preferencialmente, plantas transformadas da presenteinvenção contêm uma única cópia do ácido nucléicotransferido, e o ácido nucléico transferido não possuirearranjos notáveis ai. Também preferidas são plantaslentilha d'água nas quais o ácido nucléico transferido estápresente em baixos números de cópias (i.e., não mais do quecinco cópias, alternativamente, não mais do que trêscópias, como uma alternativa adicional, menos do que trêscópias do ácido nucléico por célula transformada) .

Os exemplos a seguir são oferecidos por meio deilustração e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL

Lemnar uma planta aquática pequena, é uma plataformade expressão de escala e economicamente atraente para afabricação de proteínas terapêuticas livres de patógenoshumanos e com um caminho claro para aprovação regulatória.O sistema de expressão de Lemna (LEX Systemsi4) permiterápida expansão clonal de plantas transgênicas, secreção deproteínas transgênicas, alto rendimento de proteína,facilidade de refreamento que é comparável a sistemas decultura de células de mamíferos, tais como células CHO, epossui a vantagem adicional de baixos custos de operação ecapital (Gasdaska et al. (2003) Bioprocessing J. 50-56).Além disso, esse sistema de expressão vegetal oferece avantagem de altos rendimentos de proteína (na faixa de 6-8%da proteína solúvel total (TSP)). Esses níveis deexpressão, em combinação com alto conteúdo de proteína erápida taxa de crescimento de Lemna (tempo de duplicação de36 hr) , permite a produção de >lg de mAb por kg de biomassae um formato robusto e bem controlado.

Os exemplos a seguir demonstram como a humanização doperfil de glicosilação de uma mAb foi conseguida por co-expressão do mAb com um constructo de RNA (RNAi) de* interferência direcionando a expressão endógena de genes deal, 3-fucosiltransferase e βΐ, 2-xilosiltransferase. 0 mAbresultante conteve uma única espécie N-glicana principal(>95%) desprovida dos açúcares fucose a-l,3-ligada e xiloseβ-l,2-ligada específicos de planta. Em testes de ligação dereceptor, esse mAb glicana otimizado exibiu atividade deligação de receptor de célula efetora intensificada quandocomparado com mAb produzido em Lemna de tipo selvagem tendoo maquinário de glicosilação nativo e mAb produzido emcélulas CHO.

Exemplo 1: Isolamento de Proteínas de Lemna minorEnvolvidas na N-Glicosilação de Proteínas

De modo a gerar proteínas recombinantes com N-glicanaremodelada, alfa 1-3 fucosiltransferase e β1-2xilosiltransferase foram selecionadas como alvos parasilenciamento gênico por RNAi em L.minor. Os resultadosiniciais de esforços em seqüenciamento de cDNA indicaramque duas ou mais isoformas estavam presentes para cada umdos genes alvo. Homologia de seqüência entre as isoformasfoi determinada em sendo entre 90 e. 95%. Seqüências de cDNAde comprimento total para ambos os genes alvo foramcoletadas e caracterizadas. A seqüência de cDNA decomprimento total, incluindo 5'- e 3'-UTR, para α1-3fucosiltransferase (FucT) de L.minor é mostrada na Figura1; ver também SEQ ID NO: 1 (ORF apresentado em SEQ IDNO:2). A seqüência de aminoácidos prevista codificada dessemodo é apresentada em SEQ ID NO: 3. A proteína codificadacompartilha alguma similaridade com outras FucTs de outras"plantas superiores. Ver Figura 2. Por exemplo, a seqüênciade FucT de L.minor compartilha aproximadamente 50,1% deidentidade de seqüência com a FucT de Arabidopsis thalianamostrada na Figura 2.

A seqüência de cDNA de comprimento total, incluindo55'- e L.minor é apresentada na figura 3; ver também SEQ IDNO: 4 (ORF apresentado na SEQ ID NO: 5). A seqüência deaminoácidos prevista codificada desse modo é apresentada naSEQ ID NO: 6. A proteína codificada compartilha algumasimilaridade com outras XylTs de outras plantas superiores.Ver figura 4. Por exemplo, a XylT de L.minor compartilhaaproximadamente 56,4% de identidade de seqüência com a XylTde Arabidopsis thaliana mostrada na Figura 4. Uma seqüênciade cDNA de comprimento parcial, incluindo 3'-UTR, para β1-2xilosiltransferase (XylT) (isoforma #2) de L.minor éapresentada na Figura 31; ver também SEQ ID NO: 19 (ORFapresentado na SEQ ID NO:20). A seqüência de aminoácidosprevista codificada dessa forma é apresentada na SEQ ID NO:21. A isoforma #2 de XylT de comprimento parcialcompartilha alta identidade de seqüência com a regiãocorrespondente da isoforma #1 de Xy 1T de comprimento total,como pode ser visto a partir do alinhamento mostrado naFigura 32.

Exemplo 2: Inibição da Expressão de FucT e XylT de L.minorpor RNAi

Várias estratégias de RNAi foram realizadas parainibir a expressão de isoformas de FucT e XylT de L.minor.Figuras 5-7, 33, e 34 esboçam estas estratégias. Figuras 8-13 mostram mapas de vários constructos que foram feitospara alcançar o knockout desejado da expressão destes doisgenes. Um número de linhagens transgênicas compreendendo osvários constructos de RNAi para knockout foi gerado usandoprotocolos padrão de transformação aqui descritos acima.

O anticorpo de teste, designado aqui como mAbl, foiexpresso em Lemna de tipo selvagem tendo o maquinárionativo de glicosilação, e linhagens transgênicas de Lemnaexpressando constructos de RNAi desenhados para inibir aexpressão de isoformas de XylT e FucT de L.minor.Geralmente, três vetores binários foram construídos paraexpressão de mAbl no sistema Lemna. Vetor de expressãomAbI01 continham genes com códons otimizados codificandocadeias pesadas (H) e leves (L) de mAbl; vetor mAbI04

ιcontinha genes com códons otimizados codificando cadeias He L de mAbl e um constructo quimérico de RNAi alvejando aexpressão de ambas as isoformas de XylT e FucT; e vetormAb05 contendo genes com códons otimizados codificando ascadeias H e L de mAbl, um constructo de RNAi de gene" simples alvejando a -expressão gênica de FucT, e umconstructo de RNAi de gene simples alvejando a expressãogênica de XylT. Linhagens transgênicas independentes foramgeradas para os vetores de expressão mAblOl, mAbl04, e10 mAbl05.

Genes otimizados para cadeias H e L de mAbl foramprojetados para ter ò uso de códons preferidos por Lemna(635 - 67% de conteúdo GC) e conter a seqüência sinal de α-amilase de arroz (GenBank M24286) fusionada à terminação51 de suas seqüências codificadoras. Sitios de restrição deendonucleases foram adicionados para clonagem em vetoresbinários Agrobacterium (EcoRI (5') / SacI (3')/ cadeia H) e(SalI (5') / HindIII (3'), cadeia L).

Para os dados de XF02 apresentados nas Figuras 15-17 eos dados de mAbl04 apresentados nas Figuras 22-24 e 26,aqui descritos acima, a estratégia de RNAi para inibir aexpressão de isoformas de FucT e XylT de L.minor empregou oprojeto de RNAi quimérico mostrado na Figura 34. Para osdados de mAbI05 apresentados na Figura 27, aqui descritoacima, a estratégia de RNAi para inibir a expressão deisoformas de FucT e XylT de L.minor empregou um knockoutduplo destes genes usando uma combinação dos projetos deRNAi para um gene mostrados na Figura 5 (projeto de RNAipara FucT) e Figura 33 (projeto de RNAi para XylT) .

Cassetes de expressão independentes contendo promotor, gene de interesse, e terminador Nos foram criados para ascadeias otimizadas de H e L de mAbl e o RNAi para um geneou quimérico. Cassetes de expressão foram clonados em umamodificação do vetor binário de Agrobacterium pBMSP3(obtido do Dr. Stan Gelvin, Purdue University) com os sítios de restrição apropriados. Dependendo do cassete deexpressão, a cadeia leve (L) foi fusionada ou com opromotor quimérico modificado de octopina e manopinasintase com líder 5*RbcS de Lemna gibba (mAblOl, Figura 14)ou com o polipromotor de ubiquitina constitutivo de Lemna minor (Lmübq) de alta expressão (mAbI04, Figura 12; mAbI05;Figura 13) . A cadeia pesada (H) foi fusionada ao promotorquimérico modificado de octopina e manopina sintase comlíder 51RbcS de Lemna gibba (mAbI04, mAbI05, e mAblOl). Ocassete de RNAi quimérico, retirado do plasmídeo XK02 em Tl-A,. foi fusionado ao polipromotor de ubiquitina deSpirodela polyrhiza (SpUbq) de alta expressão. O cassete deRNAi para um gene para expressão da seqüência inibidora deFucT foi dirigido pelo promotor SpUbq; e o cassete de RNAipara um gene para expressão da seqüência inibidora de XylT foi dirigido por um elemento controle de expressãooperacionalmente ligado compreendendo o promotor deubiquitina plus 51UTR de Lemna aequinoctialis (promotorLaUbq) . Os cassetes de expressão H, L, e RNAi quiméricoforam clonados em um vetor binário pBMSP3 modificado em orientação seqüencial criando o plasmídeo mAbI04. Oscassetes de expressão H, L, e RNAi para um gene alvejando aexpressão de FucT e XylT foram clonados em um vetor bináriopBMSP3 modificado criando o plasmideo mAbl05. Os cassetesde expressão HeL foram clonados em um vetor bináriopBMSP3 modificado criando o plasmideo mAblOl.

Apesar de qualquer protocolo de transformação poderser usado, como aqui notado acima, em alguns avanços, oprotocolo de transformação foi da seguinte forma. UsandoAgrobacterium tumefaciens C58Z707, uma linhagem c58desarmada e de larga escala de hospedeiros (Hepburn et al.(1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969), plantastransgênicas represeiítando linhagens clonais individuaisforam geradas a partir de nódulos de Lemna minor crescendorapidamente de acordo com o procedimento de Yamamoto et al.(2001) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37:349-353. Paravarredura transgênica, linhagens clonais individuais foramprecondicionadas por 1 semana a 150 até 200 μπιοί m-2s-2 emvasilhames ventilados para crescimento de plantas contendomeio SH (Schenk e Hildebrandt (1972) Can. J. Botany 50:199-204) sem sacarose. Quinze a vinte frondes foram entãocolocadas em contêineres ventilados contendo meio SHfresco, e permitidos que crescessem por duas semanas.Amostras de tecido e meio de cada linhagem foram congeladase estocadas a -70° C.

Um teste de MALDI-T0F foi desenvolvido para medir asatividades de β-l,2-xilosiltransferase (XylT) e a-1,3-fucosiltransferase (FucT) de L.minor (Exemplo 3 abaixo).As figuras 15-17 representam dados de varreduraprimária para as linhagens de plantas XF02, mAbII04, emAbI05 usando o teste acima mencionado. Neste teste, WT(tipo selvagem) representa a atividade de FucT e XylT emplantas de tipo selvagem enquanto Bwt (tipo selvagem: fervido) :representa: as .suas atividades em extratos fervidosde planta. Extratos fervidos de planta de tipo selvagem(BWT) são representativos de material de planta na qual aatividade de FucT e XylT foram desativadas. Este conjuntode dados mostra que várias linhagens de plantas de cadaconstructo têm níveis reduzidos de atividade de FucT e XylTquando comparados a linhagens de plantas de tipo selvagem(WT) e um nível comparável de atividade com amostras detipos selvagens fervidos (BWT).

Especificamente, dados primários de varredura paralinhagens de plantas L.minor com RNAi transgênicoscompreendendo o constructo XF02 da Figura 10 são mostradosnas Figuras 15 e 16. O constructo XF02 expressa a moléculade RNAi quimérico que alveja a expressão de ambas asproteínas FucT e XylT de L.minor, incluindo as váriasisoformas das respectivas proteínas.

A Figura 17 mostra dados de varredura primária paralinhagens de plantas L.minor com RNAi transgênicoscompreendendo o constructo mAbI04 da Figura 12 e constructomAbI05 da Figura 13.Exemplo 3: Teste de MALDI-TOF para Atividade de N-glicanaα-1, 2-xilosiltransferase (XylT) e a-1,3-fucosiltransferase(FucT)

O seguinte teste de MALDI-TOF modificado foi usadopara determinar a atividade de XylT e FucT nas plantastransgênicas descritas no Exemplo 2 acima.

Materiais

TAMPÃO DE HOMOGENEIZAÇÃO: HEPES a 50 mM, pH 7,5, sacarose a0,25 M, EDTA a 2 mM, DTT a ImM.

TAMPÃO DE REAÇÃO: Mes a 0,1 Mf pH 7,0, MnC12 a 10 mM,Triton X-100 a 0,1% (v/v).

URIDINA-5'-DIFOSFO-D-XILOSE (UDP-Xyl)

GUANOSINA-5'-DIFOSFO-L-FUCOSE (GDP-Fuc)

N-ACETILGLUCOSAMINA

POLIETILENOGLICOL (PEG) MISTURA 1000-3000 (10 mg/Ml de PEG1000, 2000, e 3000 (razão 4:5:6) misturado 4: 1 com 2 mg/mLde iodeto de sódio) .

[Glu^1] -FIBRINOPEPTÍDEO B (GFP), HUMANO (1 pmol/uL em água)ACEPTOR N-GLICANO, DABSILADO, TETRAPEPTÍDEO (EMDBiosciences)MATRIZ CHCA (ÁCIDO a-CIANO-4-HIDROXICINÂMICO) (10 mg emacetonitrila a 50% [v/v], ácido trifluoroacético a 0,05%[v/v]).

Preparação microssomal

Tecido de L.minor (100 mg) foi moido em 1 mL de tampãode homogeneização gelado em ura moedor de contas emvelocidade 5x por 4 0 s. O homogenato foi centrifugado a1.000g por 5 min, 4 o C. O sobrenadante foi removido ecentrifugado a 18. OOOg por 2 h, 4 o C. 0 sobrenadante foientão descartado. O precipitado foi ressuspendido em 20 μΐ,de tampão de ração gelado e mantido em gelo ou estocado a -80° C até uso.

Condições de reação

A mistura de reação contém N-acetilglucosamina a 125mM, UDP-Xyl a 1,25 mM, GDP-Fuc a 6,25 mM, MnCl2 a 12,5 mM,e 1,5 nmol de aceptor N-glicano, dabsilado, tetrapeptideo.Microssomas (4pL) foram adicionados à mistura de reaçãopara iniciar a reação. A reação foi incubada por 30 minutosa temperatura ambiente, e 90 min a 37o C. A reação foiterminada por centrifugação a 18.OOOg por 1 min e incubaçãoa 4°C.

Análise por MALDI-TOF

Uma porção do sobrenadante de cada reação (0,5 pL) foimisturada com 0,5 μΣ de matriz CHCA em uma placa alvo MALDIe permitida a secar. O instrumento MALDI foi configuradopara modo ion positivo reflectron e calibrado com PEG 1000-3000. Espectros MS combinados (~200 tiros) foram coletadosa partir de 1500-2500 Da usando GFP a 0,5 pmol como massafechada. Contagem de ions do pico de referência (m/z =2222, 865) deve ser acima de 400. Contagem de ions dosprodutos XylT e FucT (m/z = 2192, 854 e 2206, 870,respectivamente) foram normalizadas para o pico dereferência e a concentração de proteínas da fraçãomicrossomal.

Exemplo 4: Efeito da Inibição da Expressão de FucT e XylTde L.minor por RNAi sobre o Perfil de Glicosilação de

Anticorpos Monoclonais

Anticorpos monoclonais produzidos por L.minor de tiposelvagem (isto é, expressão de FucT e XylT não silenciadas)compreendendo o constructo mAblOl (ver Figura 14) elinhagens transgênicas de L.minor para o constructo mAbI04(ver Figura 12) ou constructo mAbI05 (ver Figura 13) foramanalisadas para os seus perfis de N-glicosilação. Osseguintes procedimentos foram usados.

Purificação de mAb de Lemna.

Tecido de planta foi homogeneizado com 50 mM defosfato de sódio, cloreto de sódio a 0,3 M, e EDTA a 10 mMa pH 7,2 usando um Misturador de Alto CisalhamentoSilverson em uma razão tecido:tampão de 1:8. 0 homogenatofoi acidificado a pH 4,5 com ácido cítrico IM, ecentrifugado a 7.500 χ g por 30 minutos a 4o C. 0sobrenadante foi filtrado através de filtro 0,22 μιη ecarregado diretamente em resina mAbSelect SuRe (GEHealthcare) equilibrado com uma solução contendo fosfato desódio a 50 mM, cloreto de sódio a 0,3 M, e EDTA a 10 mM, pH7,2. Após carregamento, a coluna foi lavada até linhagem debase com o tampão de equilíbrio seguido por uma lavagemintermediária com 5 volumes de coluna de acetato de sódio a0,1 M, pH 5,0, e finalmente, anticorpo ligado foi eluídocom 10 volumes de anticorpo de acetato de sódio 0,1 M, pH3,0. 0 eluato foi imediatamente neutralizado com Tris basea 2 M.

Purificação de glicanas N-Iigadas.

Anticorpos monoclonais purificados por proteína A (1mg) de linhagens de plantas tipo selvagem e RNAi foramdialisadas extensivamente contra água e liofilizadas atésecagem. Amostras foram ressuspendidas em 100 pL de ácidofórmico a 5% (v/v), trazidos a pepsina a 0,05 mg/mL, eincubados a 37° C de um dia para o outro. As amostras foraminativadas por calor a 95o C por 10 min e secas. Digestõesde pepsina foram ressuspendidas em 100 μΐ; de acetato desódio a 100 mM, pH 5,0 e incubadas com I mU de N-glicosidase A a 37° C de um dia para o outro. As N-glicanasliberadas foram isoladas usando colunas de 4 cc CarbographSPE de acordo com Packer et al. (1998) Glycoconj. J. 15:737-747, e secas.N-glicanas secas foram adicionalmente purificadasusando cartuchos de 1 cc Waters Oasis MCX. Colunas forampreparadas por lavagem com 3 volumes de coluna de metanolseguidas por 3 volumes de coluna de ácido fórmico a 5%(v/v). N-glicanas, ressuspensas em 1 mL de ácido fórmico a5% (v/v), foram carregadas em colunas preparadas. A fraçãodesligada assim como 2 lavagens adicionais de volume decoluna de ácido fórmico a 5% (v/v) foram coletadas,conjugadas e secas.

Derivação de oligossacarideos com ácido 2-aminobenzóico (2-AA).

N-glicanas purificadas ou malto-oligossacarideos forammarcados com 2-AA e purificados usando cartuchos de 1 ccWaters Oasis HLB de acordo com Anumula e Dhume (1998)Glycobiology 8: 685-694. N-glicanas e malto-oligossacarideos marcados foram ressuspendidos em 50 pL deágua e analisados por MALDI-TOF MS e (NP) HPLC-QTOF MS defase normal.

Espectrometria de Massa MALDI-TOF.

MALDI-TOF MS foi conduzido usando um Waters MALDIMicro MX (Millford, MA). N-glicanas marcadas com 2-AA (0,5pL) foram diluidas apropriadamente com água, misturadas com0,5 pL de matriz DHB a 10 mg/mL em acetonitrila a 70%(v/v), colocadas sobre uma placa alvo e analisadas em modoreflectron negativo.Análise por NP-HPLC-Q-TOF MS de N-glicanas marcadas com 2-AA.

N-glicanas ou malto-oligossacarideos marcados com 2-AAforam trazidos a acetonitrila 80% (v/v) e separados em umsistema de HPLC Waters 2695 adaptado, .com. uma. coluna TSK-GelAmide-80 (2 mm χ 25 cm, 5 μπι) (Tosoh Biosciences,Montgomeryville, PA). Carboidratos marcados com 2-AA foramdetectados e analisados por fluorescência (excitação a 230nm, emissão a 425 nm) usando um detector de fluorescênciaWaters 2475 e um espectrômetro de massa de tempo de vôo-quádruplo (Q-TOF) Waters Q-TOF API US (Millford, MA)adaptado em linha com' o sistema de HPLC.

Separações foram conduzidas a 0,2 mL/min, 40o C,usando acetato de amônia a 10 mM, pH 7,3 (solvente A) eacetato de amônia a 10 mM, pH 7,3, acetonitrila a 80% (v/v)(solvente B) . Eluição da amostra foi realizada com A a 0%isocrático por 5 min, seguido por um aumento linear até A a10% em 8 min, e um aumento linear até A a 30% em 48 min. Acoluna foi íàvada com A á 100% por 15 min e equilibrada comA a 0% por 15 min antes da próxima injeção.

Análise de Q-TOF foi conduzida em modo ion negativocom temperaturas de fonte e dessolvatação de 100° C e 300°C, respectivamente, e voltagens capilar e de cone de 2.100e 30 V, respectivamente. Espectros de massa mostrados são oresultado da combinação de >50 varreduras individuais porN-glicana marcada.Análise por RP-HPLC-Q-TOF MS de IgG Intacto.

IgGs purificadas por proteína A (50 μg) foramdessalgadas usando o sistema de HPLC Waters 2695 adaptadocom uma coluna Poros Rl-IO (2 mm χ 30 mm; AppliedBiosystems). IgGs foram detectadas e analisadas usando umdetector UV de dois comprimentos de onda Waters 2487 (280nm) e um Waters Q-TOF API US. Separações foram conduzidas a0,15 mL/min, 600C, usando ácido trifluoroacético a 0,05%(v/v) (TFA; solvente A) e TFA a 0,05% (v/v), acetonitrila a80% (v/v) (solvente B) . Eluição da amostra foi realizadausando um aumento linear de 30 a 50% por 50 min, um aumentoaté B a 80% por 5 min. A razão de solvente permaneceu em Ba 80% por 4 min adicionais, seguido por uma lavagem com B a100% por 1 min e equilíbrio da coluna com B a 30% por 15min antes da próxima corrida.

Análise de Q-TOF foi conduzida em modo de íon positivocom temperaturas de fonte e dessolvatação de 100°C e 300°C, respectivamente, e voltagens de capilar e de cone de 3,0e 60 V, respectivamente. Dados são o resultado de combinar>100 varreduras individuais e deconvolução ao espectro demassa parental usando MaxEnt 1.

Ver também Triguero et al. (2005) Plant Biotechnol. J.3: 449-457; Takahashi et al. (1998) Anal. Biochem. 255:183-187; Dillon et al. (2004) J. Chromatogr. A. 1053: 299-305.

ResultadosA figura 18 mostra a estrutura e peso molecular deanticorpo monoclonal derivado para N-glicanas de L.minor detipo selvagem.

A figura 19 mostra que o constructo mAblOl de tiposelvagem (mostrado ria Figura 15) . provendo para. a expressãodo anticorpo IgGl monoclonal mAbl em L.minor, sem asupressão por RNAi de FucT e XylT de L.minor, produz umperfil de N-glicosilação com três espécies N-glicanasmajoritárias, incluindo uma espécie tendo resíduo de xiloseligada por β1,2 e outra espécie tendo tanto resíduo dexilose ligada por β1,2 quanto resíduo núcleo de fucoseligada por ai,3; este perfil é confirmado comespectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS)'(Figura 20) e análise de MALDI (Figura 21).

A Figura 22 mostra uma sobreposição das quantidadesrelativas das várias mAbl para espécies de N-glicanasproduzidos no L.minor de linhagem de tipo selvagemcompreendendo o constructo mAbl01 (sem supressão de FucT ouXylT) e nas duas linhagens transgênicas de L.minorcompreendendo o constructo mAbl04 da Figura 12. Note oenriquecimento das espécies de glicana GnGn (isto é, GO) ,sem resíduos de xilose ligada por β1,2 ou núcleo com fucoseligada por al,3, e a ausência das espécies tendo resíduosde xilose ligada por β1,2 ou ambos a xilose ligada por β1,2e núcleo com fucose ligada por al,3. Este perfil éconfirmado com espectrometria de massa (LC-MS) (Figura 23)e análise de MALDI (Figura 24).A Figura 25 mostra análise de massa intacta dascomposições de mAbl produzidas em L.minor de tipo selvagem(linhagem 20) compreendendo o constructo mAblOl. Quando aexpressão de XylT e FucT não são suprimidas em L.minor, acomposição mAbl produzida de forma recombinante éheterogênea, compreendendo pelo menos 9 glicoformasdiferentes, com a glicoforma GOXF sendo a espéciepredominante presente. Note o pico altamente minoritáriorepresentando a glicoforma GO.

A Figura 26 mostra análise de massa intacta dascomposições de mAbl produzidas em L.minor transgênica(linhagem 15) compreendendo o constructo mAbI04 da Figura12. Quando as expressões de XylT e FucT são suprimidas emL.minor usando esta construção quimérica de RNAi, acomposição intacta de mAbl é substancialmente homogêneapara N-glicanas GO, com apenas quantidades traço deprecursores de N-glicanas presentes (representados pelasespécies precursoras de glicanas GnM e MGn). Além disso, acomposição mAbl é substancialmente homogênea para aglicoforma GO, caracterizada pelo fato de que ambos ossítios de glicosilação são ocupados pelas espécies GO de N-glicana, com três picos minoritários refletindo quantidadestraço de glicoformas precursoras (um pico mostrando mAbltendo uma região Fc caracterizada pelo fato de que odomínio CH2 de uma cadeia pesada tem uma espécie glicana GOassociada a Asn 297, e o domínio CH2 da outra cadeia pesadanão é glicosilada; outro pico mostrando mAbl tendo umaregião Fc caracterizada pelo fato de que o domínio CH2 deuma cadeia pesada tem uma espécie glicana associada a Asn297, e o domínio CH2 da outra cadeia pesada tem osprecursores de glicana GnM ou MGn associados a Asn 297; eoutro pico mostrando mAbl tendo uma região Fc caracterizadapelo fato de que o sítio de glicosilação Asn 297 em cada umdos domínios CH2 tem uma espécie glicana GO associada, comuma terceira espécie glicana GO associada a . um sítio deglicosilação adicional dentro da estrutura do mAbl).

A Figura 27 mostra análise de massa intacta dascomposições de mAbl produzidas em L.minor transgênicas(linhagem 72) compreendendo o constructo mAbI05 da Figura13. Quando as expressões de XylT e FucT são suprimidas emL.minor usando este 'constructo, a composição intacta demAbl é substancialmente homogênea para N-glicanas GO, comapenas quantidades traço de espécies precursoras de N-glicanas presentes (representadas pelas espécies glicanasprecursoras GnM e MGn) . Além disso, a composição mAbl ésubstancialmente homogênea (pelo menos 90%) para aglicoforma GO, com os mesmos três picos minoritáriosrefletindo glicoformas precursoras como obtido com oconstructo mAbl04.

A atividade de ligação a receptor dos mAbl produzidosnas linhagens de tipo selvagem de Lemna compreendendo oconstructo mAblOl (isto é, sem a inibição da expressão deXylT e FucT) e linhagens transgênicas de Lemnacompreendendo os constructos mAbl04 ou mAbI05 (isto é, coma expressão de XylT e FucT inibidas) foi comparada àatividade de ligação a receptor dos mAbl produzidos emlinhagens de células de mamíferos (CHO e SP2/0).Ligação a FcFcYRIIIa em células NK humanasrecentemente isoladas foram avaliadas para os váriosprodutos mAbl. Dado controle coletado para mAbl derivado deCHO e mAbl derivado de SP2/0 é mostrado na Figura 35. Dadosde testes coletados para mAbl produzidas por Lemna de tiposelvagem tendo o perfil de N-glicana normal para planta sãodesignados como mAbI01-15 e mAblOl-20, caracterizado pelofato de que o produto mAbl tem glicanas N-associadas queinclui resíduos de α(1,3)-fucose (ver figuras 36 e 37).Dados de testes coletados para mAbl derivados de Lemnatransgênicas tendo um perfil de N-glicanas otimizado (OPT)obtidos com constructos de RNAi silenciadores de genes quealvejam a -expressão de al,3-fucosiltransferase sãodesignados como mAbI05-72, mAbI05-74, mAbI04-24, e mAbI04-15 (ver Figuras 36 e 37), caracterizados pelo fato de queos produtos mAbl têm glicanas N-Iigadas que são desprovidosde resíduos α(1,3)-fucose. Dados comparando a eficácia deligação de mAblOl-15, mAbl01-20, mAbl SP2/0, mAbI04-15,mAbI04-24, mAbI05-72, e mAbI05-74 a FcyRIV recombinante decamundongos, um receptor sensível a níveis de IgG parafucose e o qual serviu como um substituto para FcYRIIIahumano, é mostrado na Figura 38.

Estes dados demonstram que o produto mAbl derivado deLemna transgênica tendo o perfil otimizado de glicana (OPT)mostra ligação aumentada a FcYRIIIa em células NK humanasrecentemente isoladas (aumento de cerca de 20 a 50 vezes)assim como ligação aumentada a FcyRIV recombinante decamundongo (aumento de cerca de 10 vezes) quando comparadoscom o produto mAbl derivado de Lemna de tipo selvagem.

Exemplo 6: Produção de um anticorpo Monoclonal Anti-CD30Tendo Ligação a Receptor aumentada e Atividade ADCC Elevada

Este exemplo delineia a expressão de anticorposmonoclonais humanos anti-CD30 em Lemna. Otimização daglicosilação de mAb anti-CD30 foi realizada pela co-expressão com uma constructo de RNAi alvejando a expressãoendógena dos genes de a-1,3-fucosiltransferase (FucT) e β-1,2-xilosiltransferase (XylT) de uma maneira similar àquelaobservada nos exemplos acima para mAbl. 0 mAb anti-CD30resultante produzido em Lemna tendo o seu maquinário nativo*de glicosilação construído para suprimir a expressão deFucT e XylT continha uma única espécie majoritária de N-glicana sem nenhum traço de N-glicanas específicas deplanta. Em adição à homogeneidade de N-glicana, mAbs anti-CD30 glico-otimizados foram também mostrados como tendoci.totoxicidade dependente de anticorpo mediada por células(ADCC) e atividadè de ligação a receptores de célulasefetoras elevadas quando comparadas a mAbs anti-CD30expressos em CHO.

MÉTODOS

Cepas e Reagentes.

Células competentes de Escherichia coli Novablue foramusadas para todos os trabalhos de DNA recombinante (EMDBiosciences, San Diego, CA). Endonucleases de restrição eenzimas de modificação de DNA foram obtidas de New EnglandBiolabs (Ipswich, MA). Oligonucleotideos foram obtidos deIntegrated DNA technologies (Coralville, IA). ColunasWaters Oasis HLB e MCX (1 cc), ácido 2,5-dihidroxibenzóico(DHB), e ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) foramobtidos de Waters Corporation (Milford, MA). Aceptorespurificados N-glicana GnGn, dabsilados, tetrapeptideo(GnGn-dabsyl- peptideo) e N-glicosidase A foram obtidos deEMD Biosciences. Colunas - Carbograph SPE (4 cc) foramobtidas de Grace Davidson Discovery Sciences (Deerfield,IL). Uridina-5'-difosfo-D-xilose (UDP-Xyl) foi comprada deCarbosource Services (Athens, GA). Acetonitrila (grauOptima) foi obtida de Fisher Scientific (Summerville, NY).Acetato de amônia foi obtido de MP Biochemicals (Irvine,CA). Malto-oligossacarideos (MD6-1) foram obtidos de V-LabsInc. (Covington, CA). Padrões de monossacarideos foramobtidos de Dionex (Sunnyvale, CA). BATDA(bis(acetoximetil)2,2':6',2"-terpiridina-6, 6"-dicarboxilato) e solução Europium foram obtidas de Perkin-Elmer (Wellesley, MA). Guanosina-5'-difosfo-L-fucose (GDP-Fuc) , N-acetilglucosamina (GlcNAc) , ácido 2-aminobenzóico(2-AA) e todos os outros materiais foram da Sigma (St.Louis, MO).

Construção de vetores de expressão de mAb e RNAi.

As seqüências de cDNA das regiões variáveis de cadeiapesada (H) e leve (L) de anticorpo kappa mAbl MDX-060completamente humano derivado de um camundongo transgênicoMedarex HuMAb-Mouse® (Borchmann et al. (2003) Blood102:3737-3742) foram determinadas e o anticorpo kappa mAblMDX-060 humano de comprimento total foi produzido de formarecombinante por uma linhagem de células de ovário dehamster chinês, CHO DG44 (Urlaub et al. (1986) Cell Mol.Genet. 12:555-566)· usando técnicas padrão. Genes otimizadospara cadeias HeL foram projetadas para ter uso de códonspreferidos por Lemna (63%-67% de conteúdo GC) e contêm aseqüência sinal de α-amilase de arroz (GenBank M24286)fusionada à terminação 5' de suas seqüências codificadoras.Sitios de endonucleases de restrição foram adicionados paraclonagem em vetores binários de Agrobacterium (EcoRI (5') /SacI (3' ) , cadeia H) ' e (SalI (5') / HindIII (3'), cadeiaL). Genes sintéticos foram construídos e fornecidos porPicoscript (Houston, TX).

Um RNA hairpin quimérico (ver figura 34) foi projetadopara silenciar alvos de genes endógenos de Lemnacodificando a-1,3-fucosiltransferase (baseado na seqüênciacodificadora para a isoforma #1 de FucT de L.minor,descrita na SEQ ID NÕ; 2; ver também GenBank DQ789145) β'β-1,2-xilosiltransferase (baseado na seqüência codificadorapara a isoforma #2 de XylT de L.minor, nt 1-1275 de SEQ IDNO: 19; descrita em SEQ ID N0:20; ver também GenBankDQ7 8 914 6) . 0 RNA hairpin quimérico FucT + XylT foiprojetado para ter 602 pb da seqüência FucT de dupla fita,626 pb da seqüência de XylT de dupla fita, e 500 pb deseqüência espaçadora. A porção de fita senso do cassete deRNA hairpin engloba o fragmento direto de FucT (nt 12-613de SEQ ID NO:2; equivalente a nt 254-855 de SEQ ID NO: 1) efragmento direto de XylT (nt 1-626 de SEQ ID NO: 19) , aseqüência espaçadora (nt 627-1126 de SEQ ID NO: 19) . Aporção de fita anti-senso do RNA hairpin engloba ofragmento reverso de XylT (versão anti-senso de nt 1-626SEQ ID NO: 19) e fragmento reverso de FucT (versão anti-senso de nt 12-613 de SEQ ID NO: 2 ou nt 254-855 de SEQ IDNO: 1) . 0 RNA hairpin quimérico foi construído poramplificação em PCR dos fragmentos gênicos direto e reversode FucT e XylT de cDNA de Lemna minor (8627) eseqüencialmente clonando-os em pT7blue (EMD Biosciences)criando plasmídio XF02 em T7-4. 0 fragmento gênico diretode FucT foi amplificado com primers de DNA BLX 686 (5' —ATGGTCGACTGCTGCTGGTGCTC TCAAC-3') (SEQ ID NO:22) e BLX690(5'- ATGTCTAGAATG CAGCAGC AAGTGCACC-31) (SEQ ID NO:23)produzindo um produto de 620 pb com sítios de clonagem SalI(5') e XbaI (3') terminais. O fragmento gênico direto deXylT foi amplificado com primers de DNA BLX 700 (5'-ATGACTAGTTGC GAAGCCTACTTCGGCAACAGC3') (SEQ ID NO:24) eBLX694 (5'-ATGGGATCCGAATCTCAAGA ACAACTGTCG-3') (SEQ IDNO: 25) produzindo um produto de 1144 pb com sítios declonagem SpeI (5') e BamHI (3') terminais. O fragmentogênico reverso de XylT foi amplificado com primers de DNABLX 695 (5'- ATGGGTACCTGCGAAGCCTACTTCGGCAA CAGC-3') (SEQ IDNO:2 6) e BLX696 (5'- ATGGGA TCCACTGGCTGGGAGAAGTTCTT-3')(SEQ ID NO: 27) produzindo um produto de 644 pb com sítiosde clonagem BamHI (5') e Kpnl (3') terminais. O fragmentogênico reverso de FucT foi amplificado com primers de DNABLX 691 (5'- ATGGAGCTCTGCTGCTGGTGCT CTCAAC-3' ) (SEQ IDNO:28) e BLX692 (5'- ATGGGTACCATGCAGCAGCAAGTGCACC-31) (SEQID NO: 29) produzindo um produto de 620 pb com sítios declonagem Kpnl (51) e SacI (3') terminais.

Cassetes de expressão independentes contendo promotor,gene de interesse, e terminador Nos foram criados para ascadeias H e L otimizadas de MDX-060 e o RNAi quimérico.Cassetes de expressão foram clonados em um vetor bináriomodificado de Agrobacterium pBMSP3 (obtido do Dr. StanGelvin, Purdue University) com os sítios de restriçãoapropriados. A cadeia H foi fusionada ao promotor líderquimérico modificado 5' RbcS de octopina e manopina sintasede Lemna gibba (Gasdaska et al. (2003) Bioprocessing J. 50-56). A cadeia L foi fusionada ao polipromotor constitutivode ubiquitina de Lemna minor (LmUbq) de alta expressão. Ocassete de RNAi quimérico, pego do plasmídeo XF02 em T7-4,foi fusionado ao polipromotor constitutivo de ubiquitina deSpirodela polyrhiza (SpUbq) de alta expressão. Os trêscassetes de expressão foram clonados em um vetor bináriopBMSP3 modificado em orientação seqüencial criando oplasmídio MDXAO4.

Transformação e varredura de linhagens de plantas.

Usando Agrobacterium tumefaciens C58Z707 (Hepburn etal. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969), plantastransgênicas representando linhagens de clones individuaisforam geradas a partir de nódulos de Lemna minor com altataxa de crescimento de acordo com o procedimento deYamamoto et al. (Yamamoto et al. (2001) In vitro Cell. Dev.Biol. 37). Para varredura transgênica, linhagens clonaisindividuais foram pré-condicionadas por 1 semana a 150 até200 μmοl m-2s-2 em vasilhames ventilados de crescimento deplantas contendo meio SH (Schenk e Hildenbrandt (1972) Can.J. Botany 50: 199-204) sem sacarose. Quinze a vinte frondespré-condicionadas foram então colocadas em contêineresventilados contendo meio SH fresco, e permitidos a crescerpor duas semanas. Amostras de tecidos e meio de cadalinhagem foram congelados e estocados a -70° C.

Análise por ELISA de mAb produzido em Lemna.

Tecido de Lemna (100 mg) foi homogeneizado usando ummoedor de contas FastPrep FP120 (Thermo ElectronCorporation). Sobrenadantes foram diluídos a 1 pg/mL eensaiados usando o conjunto de ELIAS de quantificação deIgG (Bethyl Laboratories). Para o teste, placas demicrotitulação foram recobertas com anti-IgG de humanosfeito em cabra a uma concentração de 10 μg/mL, e mAb foidetectado por anti-IgG humana feita em cabra conjugada aperoxidase de raiz forte (HRP) diluída 1:100.000. Curvaspadrão foram criadas com Referência de IgG Humana fornecidacom o conjunto de ELISA. A sensibilidade do ELISA FOI DE7,8 NG/M1. Todas as amostras foram analisadas em duplicata.

Preparação de membranas microssomais de Lemna é teste paraatividades de β-1,2-xilosiltransferase de núcleo e a-1,3-fucosiltransferase.

Tecido de Lemna (100 mg) de cada linhagem foihomogeneizado em 1 mL de tampão de homogeneização gelado(ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperazinaetanosulfônico [HEPES]a 50 mM, pH 7,5, sacarose a 0,25 M, ácidoetilenodiaminotetracético [EDTA] a 2 mM, 1,4-ditiotreitol[DTT] a 1 mM) por 40 s em um moedor de contas FastPrep FP120 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) . Ohomogenato foi centrifugado a 1.000 g por 5 min a 4o C. 0sobrenadante foi removido e centrifugado a 18.OOOg por 90min a 4°C. O precipitado resultante foi ressuspendido em20 µL de tampão de reação gelado (ácido 2-[4-morfolino]etanossulfônico [Mes] a 0,1 M, pH 7,0, Triton X-100 a 0,1%[v/v], MnCl2 a 10 mM) e mantido em gelo ou estocado a -80°C até o uso.

Atividades de β-1,2-xilosiltransferase de núcleo ou a-1, 3-fucosiltransferase foram medidas simultaneamente em 4membranas microssomais preparadas de cada linhagem de, RNAipor incubação com GlcNAc a 125 mM, UDP-Xyl a 6,25 mM, GDP-Fuc a 6,25 mM, MnCl2 a 12,5 mM, e 1,5 nmol de aceptor GnGn-dabsil-peptideo por 2 h a 37° C como descrito previamente(Leiter et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:21830-21839). Areação foi terminada por uma breve centrifugação eincubação a 4o C e os produtos foram analisados por modoreflectron positivo em MALDI-TOF MS.

Purificação de mAbs MDX-060 LEX e LEX0pt.

Tecido de planta foi homogeneizado com fosfato desódio a 50 mM, cloreto de sódio a 0.3 M, e EDTA alO mM, pH7,2 usando um misturador de alto cisalhamento Silverson. 0homogenato foi acidifiçado a pH 4,5 com ácido citrico a 1Μ, e centrifugado a 7.500 g por 30 min a 4º C. O pH dosobrenadante foi ajustado a pH 7,2 com Tris a 2 M, antes defiltrar usando filtros de 0,22 μπ\. O material foi carregadodiretamente em resina de proteína A mAbSelect SuRe (GEHealthcare) equilibrada com uma solução contendo fosfato desódio a 50 mM, cloreto de sódio a 0,3 M, e EDTA a 10 mMEDTA, pH 7,2. Após carregamento, a coluna foi lavada atélinha de base com o tampão de equilíbrio seguido por umalavagem intermediária com 5 volumes de coluna de acetato desódio a 0,1 M, pH 5,0. Anticorpo ligado foi eluído com 10volumes de coluna de acetato de sódio a 0,1 M, pH 3,0. Oeluato de proteína de A foi imediatamente de neutralizadocom 2-amino-2-[hidroximetil]-1,3-propanodiol (Tris) a 2 M.Para remoção de agregado, o eluato de proteína A foiajustado para pH 5,5 e aplicado a uma coluna de cerâmica dehidroxiapatita do tipo I (Bio-Rad) equilibrada com fosfatode sódio a 25 mM, pH 5,5. Após lavar a coluna com 5 volumesde coluna de tampão de equilíbrio, o anticorpo foi eluídoem uma eluição de etapa única usando fosfato de sódio a0,25 M, pH 5,5. Frações contendo anticorpo por A280 foramagrupados e estocados a -80° C.

Amostras de extrato de tecido e de fluxo através deproteína A foram preparados para SDS-PAGE sob condiçõesredutoras e não redutoras pela adição de tampão de amostrade SDS 2x ± 2-mercaptoetanol a 5% [v/v] . Amostras de eluatode proteína A e eluato de hidroxiapatita foram diluídas auma concentração de proteínas de 0,5 mg/mL pela adição detampão de amostra de SDS 2x ± 2-mercaptoetanol a 5% [v/v] .Amostras foram incubadas a 95° C por 2 minutos antes daeletroforese usando géis com gradiente de Tris-glicina 4-20% (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Marcadores de pesomolecular Markl2 (Invitrogen) e um padrão de referênciaMDX-060 foram incluídos nos géis. Géis foram corados comcoloração Azul Coloidal.

Purificação de glicanas N-Iigadas.

Anticorpos monoclonais purificados com proteína A (1mg) de linhagens de plantas Lemna tipo selvagem ou RNAiforam dialisadas extensivamente contra água e liofilizadasaté secagem. Amostras foram ressuspendidas em 100 pL deácido fórmico a 5% (V/v), trazidas a pepsina a 0,05 mg/mL,e incubadas a 37° C de um dia para o outro. As amostras* foram inativadas por fervura a 95° C por 15 min a secas.Digestões de pepsina foram ressuspendidas em 100 pL deacetato de sódio 100 mM, pH 5,0 e incubadas com 1 mU de N-glicosidase Aa 37° C de um dia para o outro. As N-glicanasliberadas foram isoladas usando colunas Carbograph SPE de4cc (Packer et al. (1998) Glycoconj. J. 19:737-747) esacas.

N-glicanas secas foram adicionalmente purificadasusando cartuchos Waters Oasis MCX de Icc. Colunas forampreparadas por lavagem com 3 volumes de coluna seguida por3 volumes de coluna de ácido fórmico a 5% (v/v) . N-glicanas, ressuspendidas em 1 mL de ácido fórmico a 5%(v/v), foram carregadas em colunas preparadas. A fraçãodesligada assim como 2 lavagens adicionais de volume decoluna de ácido fórmico a 5% (v/v) foram coletadas,agrupadas, e secas.

Derivação de oligossacarideos com ácido 2-aminobenzóico.

N-glicanas ou malto-oligossacarideos purificados forammarcados com 2-AA e purificados usando cartuchos WatersOasis HLB de 1 cc de acordo com Anumula e Dhume, 1998(AnumuIa e Dhume (1998) Glycobiology 8:685-694). N-glicanase malto-oligossacarideos marcados foram ressuspendidos em50 pL de água e analisados por MALDI-TOF MS e modo negativoe NP-HPLC-QTOF MS.

Espectrometria de Massa MALDI-TOF.

MALDI-TOF MS foi conduzido usando um Waters MALDIMicro MX (Millford, MA) . Análise dos produtos de reação β-1, 2-xilosiltransferase/a-l,3-fucosiltransferase foiconduzida ao se misturar 0,5 μL de cada sobrenadante dereação com 0,5 pL de CHCA a 10 mg/mL em TFA a 0,05% (v/v),acetonitrila a 50% (v/v) e uma placa alvo. Produtos deGnGn-dabsil-peptídeo xilosilados ([M+H]+ = 2192,85 Da) oufucosilados ([M+H]+ = 2206,87 Da) foram detectados em modoreflectron positivo. Contagem de ions de 200 espectroscombinados de cada amostra foram normalizados contra aquelede GnGn-dabsil-peptídeo β-1,4-galactosilado, ([M+H]+ =2222,87 Da) presente como um contaminante (<5%) na misturaoriginal de GnGn-dabsil-peptídeo da EMD Biosçiences.N-glicanas ou malto-oligossacarideos marcados.com 2-AA(0,5 pL) foram diluídos com água, misturados com 0,5 pL dematriz DHB a 10 mg/mL em acetonitrila a 70% (v/v),assentada em placa alvo e analisada em modo reflectronnegativo.

Análise por NP-HPLC-Q-TOF MS de N-glicanas marcadas com 2-AA.

N-glicanas ou malto-oligossacarídeos marcados com 2-AAforam trazidos para acetonitrila a 80% (v/v) e separados emum sistema de HPLC Waters 2695 adaptado com uma coluna TSK-Gel Amide-80 (2 mm 'x 25 cm, 5 μτα) (Tosoh Biosciences,Montgomeryville, PA). Carboidratos marcados com 2-AA foramdetectados e analisados usando um detector de fluorescênciaWaters 2475 (excitação 230 nm, emissão 425 nm) e umespectrômetro de massa de tempo de vôo quádruplo (QTOF)Waters Q-TOF API US adaptado em linha com o sistema deHPLC.

Separações fòrám conduzidas a 0,2 mL/min, 40° C,usando acetato de amônia a 10 mM, pH 7,3 (solvente A) eacetato de amônia a 10 mM, pH 7,3, acetonitrila a 80% (v/v)(solvente B). Eluição da amostra foi realizada em A a 0%isocrático por 5 min, seguido por um aumento linear até A a10% em 8 min, e um aumento linear até A a 30% em 48 min. Acoluna foi lavada com A a 100% por 15 min e equilibrada emA a 0% por 15 min antes da próxima injeção. Análise de QTOFfoi conduzida em modo íon negativo com temperaturas defonte e dessolvatação de 100° C e 300° C, respectivamente,e voltagens de capilar e de cone de 2.100 e 30 V,respectivamente. Espectros de massa mostrados são osresultados de combinar >40 varreduras individuais por N-glicana marcadas.

Análise de monossacarídeos por HPAEC-PAD.

Amostras de mAb (200 μς) foram sujeitas a hidróliseácida usando 2 N TFA a 100° C por 3 h. Amostras foram secaspor centrifugação a vácuo em temperatura ambiente ereconstituídas em 150 μί de água antes da análise por HPAE-PAD (Dionex). Uma alíquota (25 μΙΟ da amostra reconstituídafoi aplicada a uma coluna CarboPac PAIO (4 χ 250 mm) comuma pré-coluna Amino Trap (Dionex). Separação dosmonossacarídeos foi realizada com uma fase móvel de KOH a3,5 mM, usando um gerador eluente EG40. Identidade de picode monossacarídeos e abundância relativa foram determinadasusando padrões de monossacarídeos.

Estabilidade Termal de mAb.

Um instrumento de calorimetria por varreduradiferencial (DSC) VP-capilar MicroCal (Northampton, MA) foiusado para determinar a estabilidade termal de mAbs tiposelvagem e glico-otimizadas. Amostras de mAb purificadasforam dialisadas em NaH2PO4 a 20 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM(PBS) de um dia para o outro. Dado de desnaturação termalfoi coletado pelo aquecimento de amostras em umaconcentração de 300 μg/mL de 35 até 95° C em uma taxa devarredura de Io C/min usando PBS como o tampão dereferência. A retroalimentação e ganho foram ajustados parabaixo. 0 dado corrigido por linha de base e normalizado foiajustado a um modelo *non-2-state' usando programa decomputador Origin v7.0.

Atividade de ligação a .FcR de mAb.

O experimento foi conduzido usando um instrumentoBIACORE (Biacore AB, Uppsala, Sweden) usando tecnologia deressonância de plasmon de superfície. mAbs, 2 pg/mL, foramcapturados na superfície recoberta com antígeno (CD30humano recombinante). Várias concentrações de ambos osalótipos de FcRYlIIa' VaI158 e Phe158, iniciando de 6 μΜ,foram corridos sobre os anticorpos capturados por 3 min. 0sinal de ligação como função de FcRYlIIa foi ajustado paraum modelo de um sítio usando programa de computadorGraphPad Prism (v4.01) para obter os valores de KD. TampãoHBS-EP (HEPES a 10 mM, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM e P20 a0,005% (v/v) a pH 7,4) foi usado ao longo do experimento.Ligação dos mAbs a tampão ou FcRY-IIIa a superfícies vaziasforam usadas como controles negativos.

Teste para afinidade de ligação, a antígeno.

Células L540 expressando CD30 (DSMZ Cell CultureCollection # ACC 72) foram usadas como células positivaspara antígeno para ensaiar a ligação. Alíquotas de 2 χ 105células/poço foram incubadas por 30 min a 4o C com 100 pLde anticorpo primário nas concentrações indicadas. Célulasforam lavadas duas vezes em PBS com soro fetal bovina (FBS)a 2% (v/v) antes da adição de anticorpo secundário anti-mAbhumana feito em cabra marcado com FITC (JacksonImmunoResearch, West Grove, PA) em diluição 1:500 em 100pL/poço por 30 min a 4o C. Células foram lavadas duas vezesem PBS com FBS a 2% (v/v) e ensaiadas por citometria defluxo usando um instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson,Franklin Lakes, NJ) . Valores de EC50 de mAb MDX-060 CHO,LEX e LEX0pt ligando-se a CD30 em células L540 foramdeterminados a partir de curvas de ligação utilizandoprograma de computador GraphPad Prism 3.0.

Teste ADCC.

Células efetoras mononucleares de sangue periféricohumano foram purificadas a partir de sangue completoheparinizado por separação padrão em Ficoll-Paque. Células(2χ 10"6) foram lavadas em PBS e enviadas para genotipagem.As células efetoras remanescentes foram entãoressuspendidas a 1χ10"6 células/mL em meio RPMI 1640contendo FBS a 10% (v/v) e 50 U/mL de IL-2 humana (ResearchDiagnostics, Concord, MA) e incubadas de um dia para ooutro e 37° C. As células efetoras foram lavadas uma vez emmeio de cultura e ressuspendidas a 1 χ 10"7 células/mL antesdo uso. Células alvo L540 a 1 χ 10"6 células/poço em meioRPMI 1640 contendo 10% de FBS (v/v) e probenecid a 5 mMforam marcadas com BATDA (bis(acetoximetil)2, 2':61 , 2"-terpiridina-6,6"-dicarboxilato) a 20 μΜ por 20 min a 37° C.Células alvo foram lavadas três vezes em PBS suplementadocom HEES a 20 mM e probenecid a 5 mM, ressuspendidas a 1 χ10"5 células/mL e adicionadas a células efetoras em placasde 96 poços (1 χ IO4 células alvo e 5 χ IO5 célulasefetora/poço) a uma razão final alvo para efetora de 1:50.Liberação máxima foi obtida por incubação de células alvoem Lysol a 3% (v/v) e liberação espontânea obtida pelaincubação somente em meio de cultura de células. Após 1hora de incubação a 37° C, 20 pL. do sobrenadante foicoletado de cada poço e adicionado a poços contendo 180 μLde solução Europium. A reação foi lida com um leitor PerkinElmer Fusion Alpha TRF usando atraso de 400 pseg e filtrosde excitação e emissão 330/80 e 620/10 respectivamente. Ascontagens por segundo foram plotadas como uma função daconcentração de anticorpo e o dado foi analisado porregressão não-linear,' resposta dose sigmoidal (inclinaçãovariável) usando um programa de computador GraphPad Prism3.0. A porcentagem de Iise especifica foi calculada daseguinte forma: (liberação experimental - liberaçãoespontânea)/(liberação máxima - liberação espontânea) χ100. Em todos os estudos, mAbl controle isotipo foiincluído e comparado a mAbs MDX-O 60 CHO, LEX, e LEX0pt.Outros controles incluíam células alvo e efetoras semnenhum mAb, célulás alvo sem células efetoras e célulasalvo e efetoras na presença de Lisol a 3% (v/v).

RESULTADOS

Expressão de mAb MDX-060 no sistema LEX.

MDX-060 é um anticorpo anti-CD30 (anteriormenteconhecido como 5F11) sendo desenvolvido para o tratamentode linfoma de Hodgkins e linfoma anaplástico celular grande(Borchmann et al. (2003) Blood 102:3737-3742). Dois vetoresbinários foram construídos para a expressão de MDX-060 nosistema LEX. Vetor de expressão MDXAOl continha genes comcódons otimizados codificando cadeias pesada (H) e leve (L)de MDX-060 enquanto o vetor MDXA04 continha genescodificando cadeias H e L em adição a um gene de RNAiFucT/XylT quimérico (Figura 39). Linhagens transgênicasindependentes foram geradas para ambos os vetores deexpressão MDXAOl (165 linhagens) e MDXAO4 (195 linhagens).

Para simplicidade, rrAbs derivados de MDXAOl (N-glicosilaçãode tipo selvagem), e mAbs derivados de MDXA04 (contendo oconstructo de RNAi para FucT/XylT) serão referidos comoMDX-060 LEX e MDX-060 LEX0pt, respectivamente, na discussãoabaixo.

Linhagens de plantas transgênicas foram primeiramenterastreadas para expressão de mAb com um ELISA de IgG.Linhagens LEX0pt com altos níveis de expressão de mAb foramadicionalmente ensaiadas para atividade de FucT e XylT.

Atividades de transferase na maioria das linhagens MDX-060LEX^0pt de alta expressão foram reduzidas a níveis docontrole negativo indicando silenciamento efetivo namaioria das linhagens ensaiadas (Figura 40). Linhagens MDX-060 LEX0pt não exibiram nenhuma diferença morfológica ou decrescimento quando comparadas com plantas Lemna de tiposelvagem (dados não mostrados).

Estabilidades termais dos mAbs MDX-060 CHO, LEX, eLEX0pt foram determinadas usando rastreamento diferencial decalorimetria (DSC). Todos os três mAbs exibiram cinéticasde curvas de fusão similares (dados não mostrados) etemperaturas de ponto de transição de fusão (Tabela 2abaixo), demonstrando adicionalmente a integridadeestrutural dos mAbs de Lemna MDX-O60 LEX e LEX0pt comparadosao mAb de MDX-060 CHO. Análise de SDS-PAGE sob condiçõesnão-redutoras (Figura 41A) e redutoras (Figura 41B)mostraram que mAbs a partir de linhagens MDX-060 LEX0pt eMDX-060 CHO tinham perfis de proteínas similares com o mAbaparecendo como o componente majoritário no extrato deproteínas.

Tabela 2. Comparação das estabilidades termais dos mAbs deMDX-060 CHO, MDX-060 LEX, e MDX-060 LEX0pt glico-otimizadopor calorimetria por varredura diferencial (DSC).

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Estruturas N-glicana dos mAbs de MDX-060 CHO, LEX, e LEX0pt.

Os perfis de N-glicana de mAbs derivados de MDX-060CHO, MDX-060 LEX, e MDX-060 LEX0pt recombinantes foramdeterminados por MALDI-TOF MS em modo reflectron negativo eHPLC-QTOF MS de fase normal (NP) . As estruturas de N-glicanas referidas na discussão a seguir são mostradas naFigura 53.Análises de MALDI-TOF MS das N-glicanas de linhagensde MDX-060 CHO indicaram a presença de quatro N-glicanasmajoritárias com valores de m/z correspondendo a GnGnF6(nomenclatura derivada de http://www.proglycan.com), Man5,GnAisoF6f e AAF6 (Figura 42) marcadas com 2-AA. NP-HPLC• separou a N-glicana GnAisoF6 em. suas duas. isoformas (Galassociada às ramificações cx-l,6-Man ou a-l,3-Man) trazendoo número total de N-glicanas majoritárias achadas em MDX-060 CHO para cinco (Figura 43) . Fragmentação dos picos porMS/MS não foi realizada para confirmar a identidade de cadaisoforma; contudo, a maior abundância do pico anteriorsugeriu que Gal estava associada à remificação a-l,6-Mandesta N-glicana (Shi'nkawa et al. (2003) J. Biol. Chem.278:3466- 3473; Zhu et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1159-1169). Análise por TOF MS em modo negativo em linhadeu valores de m/z correspondendo a GnGnF6, Man5, GnAisoF6(ambas as isoformas), e AAF6 duplamente carregados,confirmando os resultados de MALDI-TOF MS (Tabela 3abaixo). Integração do pico do traço fluorescente revelouque GnGnF6, Man5, AGnF6, GnAF6, e AAF6 constituíam 50,8,2,5, 26,1, 10,7 e 6,8%, respectivamente, do total deestruturas N-glicanas de MDX-060 CH0. As 3,1% N-glicanasremanescentes foram achadas como sendo uma mistura de GnGn,GnMiS0F6, GnMiso e MM com nenhuma estrutura maior do que 1,2%do total (dados não mostrados).

Tabela 3. Sumário das massas observadas por MALDI-TOF eQTOF MS das N-glicanas marcadas com 2-AA majoritárias demAbs DE MDXA-O60 produzidos por células CHO (CHO), Lemnade tipo selvagem (LEX), ou linhagens de Lemna glico-otimizadas expressando o constructo de RNAi (LEX0pt) .

<table>table see original document page 233</column></row><table>

aNomes de N-glicanas são baseados em nomenclatura Proglycan(http://www.proglycan.com).

2AA, ácido 2-aminobenzóico.

bOs símbolos das estruturas de N-glicana propostas são daseguinte forma: , N-acetilglucosamina; manose;galactose; Φ, xilose; α-1,3-fucose; α-1,6-

fucose, ácido 2-aminobenzóico.

cOs valores de m/z e as áreas de pico (%) de cada estruturaN-glicana foram obtidos da Figura 2.

Análise de MALDI-TOF MS de mAb de MDX-060 LEX de tiposelvagem revelaram a presença de três espécies majoritáriascom valores de m/z correspondentes a GnGnXF3, GnGnX e GnGn(Figura 42). Análise por NP-HPLC-QTOF MS mostrou três picosfluorescentes majoritários . com valores de m/zcorrespondentes GnGnXF3, GnGnX e GnGn duplamentecarregados, novamente confirmando os resultados de MALDI-TOF MS (Figura 43;' Tabela 3) . Integração dos picosfluorescentes indicaram que GnGnXF3, GnGnX e GnGnconstituíram 67,4, 17,2 e 8,4%, respectivamente, do totalde N-glicanas derivados dos mAb de MDX-060 LEX. Os 7%remanescentes de N-glicanas foram determinados como sendouma mistura de MM, GnMis0/ MMXF3, GnGnF3, GnMisoXF3, Man6,Man7, Gn(FA)isoXF3, Man8 e Man9 sem nenhuma N-glicana maiordo que 2% do total. Resultados similares foram observadoscom mAbs isoladas de duas linhagens MDX-060 transformadasindependentemente (dados não mostrados). 0 arranjo simplesde N-glicanas em mAbs de LEX demonstrados aqui provê umponto de início receptivo para glico-otimização.

Em contraste aos mAbs de MDX-060 LEX, as N-glicanas demAbs de MDX-060 LEX0pt possuíam GnGn com a espécie de N-glicana majoritária por ambas as análises de MALDI-TOF MS eNP-HPLC-QTOF MS (Figuras 42 e 43; Tabela 3). GnGncompreendia 95,8% do total de N-glicanas com os 4,2% de N-glicanas remanescentes determinadas como sendo MM, GnMis0/GnAiso, Man6, Man7 e Man8 com nenhuma das estruturas maiordo que 1,2% do total de N-glicanas. Nenhuma das N-glicanasde LEX0pt continham fucose (Fuc) ou xilose (Xyl). Estesresultados demonstram que a co-expressão de um constructode RNAi alvejando FucT e XylT de Lemna resultou na completaeliminação de N-glicanas contendo Fuc e Xyl de mAbs de MDX-060 LEX0pt e produziram glicoformas de mAb altamentehomogêneas. Os mesmos resultados foram obtidos para mAb deMDX-O 60 LEX0pt coletados a partir de uma linhagemtransgênica independente (linhagem 225) compreendendo ovetor de expressão MDXA04, em uma escala de crescimentodiferente (300 g de tecido para a linhagem transgênica 225versus 1 g de tecido para a linhagem transgênica 52, a qualproduziu o mAb de MDX-060 LEX0pt tendo o perfil de N-glicanamostrado nas Figuras 42 e 43. Diferentemente de sistemas decultivo de células de mamíferos onde a heterogeneidade deN-glicanas pode mudar com as condições de cultivo, escalade crescimento, e período de crescimento (Kanda et al.(2006) Biotechnol. Bioeng. 94:680-688), a uniformidade deglicanas observada com mAbs de LEX0pt foi mostrada comosendo consistente sob uma variedade de condições decrescimento e escalas.

A ausência de Fuc ou Xyl em mAb de MDX-060 LEX0pt foiainda confirmada por análise de monossacarídeos (Tabela 4abaixo). Monossacarídeos foram liberados de mAbs de MDX-060CHO, LEX e LEX0pt por hidrólise ácida e analisados porcromatografia de troca de ânions de alta performance(HPAEC) acoplada a detecção amperométrica pulsada (PAD). Asrazões de monossacarídeos para resíduos Man e GlcNAc foramsimilares para mAbs de CHO e LEX de tipo selvagem ecorrelacionaram bem com valores esperados. mAbs de LEXtiveram conteúdo de Gal e Fuc significativamente diminuídose tiveram um aumento significativo em Xyl quando comparadoscom mAbs derivados de CHO. Análise, de monossacarídeos demAbs derivados de Lemna revelaram que enquanto Fuc e Xyleram presentes em N-glicanas de LEX de tipo selvagem, elesnão eram detectados em mAbs de LEX"opt. Coletivamente, estesresultados demonstram que a co-expressão de um constructode RNAi alvejando XylT e FucT de Lemna resulta naeliminação de N-glicanas contendo Fuc e Xyl de mAbs de MDX-060 LEX"opt e produzem glicoformas de mAb altamentehomogêneas. A robustez desta estratégia de glico-otimizaçãofoi confirmada com múltiplas linhagens de plantasindependentes expressando o mAb de MDX-060 LEX:opt assim comocom outros mAbs expressos no sistema LEX, por exemplo, oanticorpo monoclonal mAbl discutido nos exemplos aquiacima. Nestas transformações subseqüentes, níveis deexpressão dos mAb glico-otimizados de até 6% do total deproteínas solúveis (TSP) foram obtidos.Tabela 4. Liberação de monossacarídeos de mAbs de MDX-060CHO, LEX e LEX0pt por hidrólise ácida e analisados porHPAEC-PAD. O conteúdo de monossacarídeos de cada mAb foideterminado por normalização contra carboidratos controle.

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Atividade funcional de mAbs de MDX-060 CHO, MDX-060 LEX eMDX-060 LEXOpt.

Propriedades de ligação a antígenos dos mAbs de MDX-060 CHO, MDX-060 LEX, e MDX-060 LEX0pt foram determinadosusando células L540 expressando CD30. Todos os três mAbstinham curvas de ligação quase idênticas (Figura 43).Concentrações EC50 foram determinadas como sendo 0,180 pg/mL, 0,227 pg/mL, e 0,196 pg/mL para MDX-060 CHO, LEX, eLEXOpt, respectivamente (Figura 44), indicando que aligação a antígeno para todos os três mAbs eram similares.

Função das células efetoras medida por receptor Fc foi mostrada como sendo importante para a atividade in vivo demuitos mAbs terapêuticos. Uma vez que o FcR expresso emcélulas NK e macrófagos responsáveis por atividade ADCC éFcYRIIIa, a ligação de vários mAbs a este receptor foicomparada. Ligação ao FcR pelos mAbs de CHO, LEX, e LEX0ptfoi determinada por ligação de equilíbrio dos mAbs comcélulas efetoras expressando dois alotipos humanosdiferentes de FcRYlIIa (Phe158 ou Val158) . MDX-060 LEXapresentou . um aumento : de 1,7 vez na. ligação emFcRylIIaPhe158 e uma diminuição de 0,4 vez em FcRYlIIaVal158comparados com o mAb derivado de CHO, demonstrando que aligação a receptor dos mAbs de CHO e LEX eram similares. Emcontraste, mAbs de LEX0pt tinham uma afinidade aumentada em27 e 15 vezes para FcRYlIIaPhe158 e FcRYlIIaVal158,respectivamente, em relação a mAbs de CHO (Figura 45) .Estes resultados sug'erem que silenciamento por RNAi dasatividades de FucT e XylT de Lemna em linhagens LEX0pt"produziram mAbs os quais aumentaram a ligação a FcR.

Atividades ADCC para os mAbs de CHO, LEX e LEX0pt foramdeterminados pela incubação dos mAbs seja com célulashumanas efetoras homozigotas FcRYlIIaPhe158) ouheterozigotas (FcRYlIIaPhe/Val158) e células alvo- L540marcadas com BATDA (bis(acetoximetil)2,2':6',2"-

terpiridina-6,6"-dicarboxilato) (Figura 45). mAbs de MDX-060 LEX (31%) tinham o mesmo percentual máximo de Iisecelular que os mAbs de CHO (31%) usando células efetorashumanas heterozigotas FcRYlIIaPhe/Val158 (Figura 46) comvalores de EC50 similares. 0 percentual máximo de Iisecelular de mAbs de LEX (27%) foi ligeiramente aumentadoquando comparado a mAbs de CHO (15%) usando célulasefetoras homozigotas FcyRIIIa Phe/Phe158. Importantemente,mAbs de ADCC quando comparados com mAbs de MDX-060 CHO eLEX, não respectivamente do genótipo do doador. Isto foiavaliado por aumento em ambas a potência e a eficácia.Percentual máximo de Iise para MDX-060 LEX0pt foi 45% paraambos os experimentos, enquanto o valor de EC50 foi 3 a 5vezes inferior aos mAbs de MDX-060 LEX e MDX-060 CHO,respectivamente, para células efetoras FcYRIIIa Val/Phe158 e2 a 3 vezes inferior para as células efetoras FcYRIIIaPhe/Phe158. Estes resultados demonstram que a remoção de N-glicanas contendo Fuc e Xyl de mAbs de MDX-060 LEX0pt causouum aumento na atividade ADCC e portanto pode aumentar seuspotenciais terapêuticos.

Análise por RP-HPLC-Q-TOF MS de IgG intacta para MDX-060LEX e MDX-060 LEX0pt.

IgGs purificadas com proteína A (50 pg) foramdessalgadas usando o sistema de HPLC Waters 2695 adaptado auma coluna Poros Rl-10 (2 mm χ 30 mm; Applied Biosystems).As IgGs foram detectadas e analisadas usando um detector UVde duplo comprimento de onda Waters 2487 (280 nm) e oWaters Q-TOF API US. Separações foram conduzidas a 0,15mL/min, 60° C, usando ácido trifluoroacético 0,05% (v/v)(TFA; solvente A) e (v/v)TFA a 0,05% (v/v), acetonitrila a80% (v/v) (solvente B) . Eluição da amostra foi realizadausando um aumento linear de B a 30_ para 50% por 5 min, umaumento para B a 80% por 5min. A razão de solventepermaneceu em B a 80% por 4 min adicionais, seguidos poruma lavagem com B a 100% por 1 min e equilíbrio da colunacom B a 30% por 15 min antes da próxima corrida.Análise por Q-TOF foi conduzida em modo de ionpositivo com temperaturas de fonte de dessolvatação de 100°C e 300° C, respectivamente, e voltagens de capilar e decone de 3,0 e 60 V, respectivamente. Dados são o resultadoda combinação de >100 varreduras individuais e deconvoluçãoao espectro de massa parental usando. MaxEnt 1.

Ver também Triguero et al. (2005) Plant Biotechnol J.3: 449-457; Takahashi et al. (1998) Anal. Biochem. 255:183-187; Dillon et al. (2004) J. Chromatogr. A. 1053: 299-® 305.

A figura. 47 móstra análise de massa intacta dascomposições de mAb de MDX-060 LEX produzidas em L.minor detipo selvagem compreendendo o constructo MDXAOl. Quando aexpressão de XylT e FucT não é suprimida em L.minor, acomposição de mAb produzida de foram recombinante em MDX-060 LEX compreende pelo menos 7 glicoformas diferentes, coma glicoforma GOXF3 sendo a espécie predominante presente.Note a ausência de um pico representando a glicoforma GO.

A Figura 48 mostra a análise de massas de glicanas dacadeia pesada do mAb de MDX-060 LEX produzido em L.minor detipo selvagem compreendendo o constructo MDXAOl. Quando aexpressão de XylT e FucT não é suprimida em L.minor, aespécie de N-glicana predominante é GOXF3, com picosmajoritários adicionais refletindo as espécies GOX, Note apresença minoritária das espécies glicanas GO.A Figura 49 mostra análise de massa intacta dascomposições de mAb de MDX-O60 LEX0pt produzidas em L.minortransgênica compreendendo o constructo MDXAO4. Quando aexpressão de XylT e FucT é suprimida em L.minor, acomposição de mAb intacta contém apenas N-glicanas GO. Alémdisso, a composição é substancialmente homogênea para aglicoforma GO (pico 2), caracterizado pelo fato de queambos os sítios de glicosilação são ocupados por espéciesN-glicana GO, com dois picos minoritários refletindoquantidades traço, de glicoformas precursoras (pico 1,mostrando mAb tendo uma região Fc caracterizada pelo fatode que o domínio CH2 de uma cadeia pesada tem uma espécieglicana associada a Asn 297, e o domínio CH2 da outracadeia pesada não é glicosilada; e o pico 3, mostrando mAbtendo uma região Fc caracterizada pelo fato de que o sítiode glicosilação Asn 297 em cada um dos domínios CH2 tem umaespécie glicana GO associada , com uma terceira espécieglicana GO associada a um sítio de glicosilação adicionaldentro da estrutura do mAb).

A Figura 50 mostra análise de massa glicana da cadeiapesada do mAb de MDX-060 LEXopt produzido em L.minortransgênica compreendendo o constructo MDXAO4. Quando aexpressão de XylT e FucT é suprimida em L.minor, a únicaespécie N-glicana prontamente detectável associada aossítios de glicosilação Asn 297 dos domínios CH2 das cadeiaspesadas é GO.Glico-otimização de MDX-060 foi realizada pela co-expressão com um cassete de RNAi que almejava osilenciamento dos genes endógenos de Lemna FucT e XylT.Este silenciamento simultâneo de ambos os genes FucT e XylTfoi alcançado usando uma única transcrição de RNAi. Aausência de Fuce Xyl no mAb de LEX0pt foi confirmada porMALDI-TOF, NP-HPLC-QTOF MS, e análise de monossacarideos deN-glicanas purificadas a partir de mAb de MDX-060 LEX0pt.Estas análises corroboram com a falta de atividade detransferase observada em membranas microssomais. De maneiraimportante, >95% das N-glicanas liberadas de mAbs de LEX0pteram de uma estrutura única, GnGn, indicando que estaestratégia tinha o beneficio adicional de produzir mAbs comum perfil homogêneo de N-glicana. mAbs de MDX-060 LEX e*MDX-060 LEX0pt foram observados como sendo indistinguiveisno que tange sua estabilidade termal e ligação a antigenoquando comparados a MDX-060 CHO. Análise por eletroforesefoi também observada como sendo similar a todos os trêsmAbs. De fato, a única diferença estrutural detectada foramnos perfis de N-glicana dos mAbs.

Sem ser limitado por teoria, a habilidade daslinhagens de MDX-060 LEX0pt em produzir mAbs com uma únicaespécie de N-glicana majoritária pode ser baseada nadistribuição de glicoformas mais uniforme em mAb observadaem Lemna de tipo selvagem. N-glicanas liberadas de mAbspurificados de tabaco (Fujiyama et al. (2006) J. Biosci.Bioeng. 101:212-218; Elbers et al. (2001) Plant Physiol.126: 1314-1322; Bakker et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci98:2899-2904), alfafa (Bardor et al. (2003) PlantBiotechnol. J. 1:451-462), e musgo (Koprivova et al.(2003) Plant Bio. 5:582-591) de tipos selvagens mostram quea heterogeneidade de glicoformas de mAb em plantas com N-glicosilação de tipo selvagem pode variar de cinco (alfafa)(Bardor et al. (2003) Plant Biotechnol. J. 1 :451-462) aoito (tabaco) (Fujiyama et al. (2006) J. Biosci. Bioeng.101:212-218) estruturas majoritárias diferentes. MDX-060LEX possui apenas três estruturas de N-glicana majoritárias(GnGn, GnGnX e GnGnXF3 ). Este conjunto simples de N-glicanas em mAbs produzidos por Lemna de tipo selvagem podefornecer um ponto de partida mais receptivo para glico-otimização levando a maior homogeneidade do que aquelaobservada em outros sistemas.

A função de células efetoras mediada por receptores Fctem sido mostrada como sendo importante para a atividade invivo de muito mAbs terapêuticos. Neste estudo, a atividadeADCC de mAbs de MDX-060 CHO, MDX-060 LEX, e MDX-060 LEX0ptfoi comparada. Uma vez que o FcR expresso em células NK emacrófagos responsáveis pela atividade ADCC é FcYRIIIa, aligação de vários mAbs a este receptor foi tambémcomparada. Os resultados discutidos acima mostram que mAbde MDX-060 LEX0pt tem uma afinidade de ligação (15-25 vezes)e ligação máxima (4 a 5 vezes) a FcYRIIIa aumentadas assimcomo atividade ADCC aumentada quando comparados a mAbs deMDX-060 CHO e MDX-060 LEX. A remoção de Fuc ligada por α-ϊ, 6 de vários mAbs produzidos em outros sistemas deexpressão tem sido previamente mostrada como capaz deaumentar a ligação a FcR e aumentar a função ADCC (Shinkawaet al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466-3473; Shields et al.(2002) J. Biol. Chemi 277:26733-26740; Niwa et al. (2004)Clin. Câncer Res. 10:6248-6255). Os resultados apresentadosaqui sugerem que a remoção de Fuc ligada por a-1,3 de mAbsde MDX-O60 LEX0pt têm o mesmo efeito na função de mAb que aremoção de Fuc ligada por α-1,6.

Neste estudo, duas isoformas polimórficas de FcYRIIIaque ocorrem naturalmente nos resíduos 15841, Val158 e Phe158,foram avaliadas. MDX-060 LEX0pt mostra uma maior afinidadede ligação a FcYRIIIa-Val158 quando comparados a FcYRIIIa-Phe158 como foi observado com outras mAbs IgGl (Shields etal. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). 0 fato de umaumento na ligação com MDX-060 LEX0pt ser observado comambas as isoformas é importante uma vez que ligação* diferencial a Val158 sobre Phe158 foi vista com sendoprevisível da resposta clínica e imunológica de certosgrupos de pacientes recebendo tratamento anti-CD20 (Cartronet al. (2002) Blood 99:754-758; Weng et al. (2003) J. Clin.Oncol. 21:3940-3947; Weng et al. (2004) J. Clin. Oncol.22:4717- 4724) . Este aumento em ligação foi hipotetizado emresultar em uma porcentagem maior de pacientes respondendoa tratamento que requer funcionalidade de Fc.

Um aumento similar em atividade ADCC também foiobservada. Neste estudo, o mAb de MDX-060 LEX0pt mostrou umaumento na Iise celular e um diminuição no valor de EC50,resultando em um aumento na eficácia e potência quandocomparado a MDX-060 CHO. Isto corresponde a um aumento de20 vezes na atividade, determinado ao se pegar o percentualmáximo de Iise de MDX-060 CHO e calculando a concentraçãode mAb de MDX-060 LEX0pt dando origem ao mesmo percentual deIise celular. Assim como no estudo de ligação a FcYRIIIa, oaumento em atividade de ADCC foi observado com ambos osdoadores de células efetoras homozigoto FcYRIIIaPhe/Phe158 eheterozigoto FcYRIIIaPhe/Val158. Os resultados apresentadosaqui sugerem que a remoção de Fuc ligada por a-1,3 de mAbsde MDX-060 LEX0pt tem o mesmo efeito na função mAb do que aremoção de Fuc ligada por a-1,6.

A robustez desta estratégia de glico-otimização foidemonstrada com múltiplas linhagens de plantasindependentes expressando o mAb de MDX-060 LEX0pt assim comocom outros mAbs expressos no sistema de expressão Lemna(ver, por exemplo, Exemplos 2-4 acima). Adicionalmente, nãohá aparentemente diferença no fenótipo ou taxa decrescimento da planta quando comparadas com plantas Lemnade tipo selvagem. Diferentemente de sistemas de cultivo decélulas de mamiferos onde a heterogeneidade de N-glicanaspode mudar com as condições de cultivo, escala decrescimento e período de crescimento-8, a uniformidade deglicanas observada com mAbs de MDX-060 LEX0pt têm sidomostradas como sendo consistente sob uma variedade decondições e escalas de crescimento (dados não mostrados).

Em conclusão, uma estratégia de RNAi foi usada paraproduzir um anticorpo anti-CD30 glico-otimizado no sistemade expressão em Lemna. 0 mAb resultante consiste de umaestrutura majoritária única de N-glicana, sem qualquerevidência dos resíduos Fuc e Xyl específicos de planta.Além disso, o mAb otimizado resultante tem atividade ADCC eatividade de ligação a FcYRIIIa aumentadas quando comparadoa mAb derivado de CHO. O perfil de glicosilação homogêneoobtido em mAbs produzidos em um sistema de expressão emLemna tendo esta estratégia de knockout dos genes FucT+XylTtorna possível a expressão destas mAbs com consistência deprodução elevada.

Exemplo 7: Produção em Larga Escala de mAbl glicana-otimizado em Lemna minor

A linhagem transgênica 24 de L.minor compreendendo oconstructo mAbI04 da Figura 12 (apresentando a supressão deFucT e XylT) foi geírada de uma maneira similar a aqueladescrita acima. Seguindo a sua geração, a linhagemtransgênica 24 foi continuamente mantida por cultivoclonal, caracterizado pelo fato de que periodicamente umasubamostra do cultivo da planta era transferida para meiode cultura fresco para cultivo adicional. Esta linhagemtransgênica foi analisada para o padrão de N-glicosilaçãodo anticorpo mAbl produzido de forma recombinante seguidapela produção em larga escala de 1 g de tecido até 300 g(0,3 kg) de tecido, e produção adicional em escala até 6,5kg de tecido ocorreu em aproximadamente 8 meses após alinhagem transgênica ter sido gerada. Resultados sãomostrados nas Figuras 51A (análise de N-glicanas por MALDI-TOF) e 51B (análise de N-glicanas por HPLC defluorescência)

O perfil de glicosilação para o anticorpo mAblproduzido pela linhagem transgênica 24 compreendendo oconstructo mAbl04 permaneceu homogêneo com a produção emlarga escala de 1 g de tecido para 0,3 kg de tecido, eprodução em larga escala adicional até 6,5 kg de tecido, eportanto foi caracterizada pela presença de um pico únicopredominante correspondendo a espécie de glicana GnGn (istoé, G0). Assim, a homogeneidade do perfil de glicosilação emL.minor transgênica compreendendo o constructo mAbI04 foiconsistentemente mantido com um aumento de aproximadamente6.500 vezes na escala de produção (isto é, de 1 g até 6,5kg). Adicionalmente, a homogeneidade do perfil deglicosilação foi consistentemente mantida nesta linhagemtransgênica em 8 meses seguidos de sua geração.

Este dado demonstra que a homogeneidade do perfil deglicosilação em L.minor transgênica compreendendo oconstructo mAbl04 permanece consistente com pelo menos umaumento de 6.500 vezes na escala de produção.Adicionalmente, a homogeneidade do perfil de glicosilaçãoem L.minor transgênica compreendendo o constructo mAbl04 émantido por pelo menos 8 meses após a linhagem transg6enicaser gerada. A homogeneidade do perfil de glicosilaçãopoderia ser esperada em ser mantida com aumento ainda maiorda escala de produção, e assim, por exemplo, seria esperadoque se mantivesse caso a escala de produção fosse aumentadapor um outro fato de 4 vezes além de 6,5 kg (por exemplo,aumento da escala de 6,5 kg para 26 kg). Também é esperadoque a homogeneidade do perfil de glicosilação se mantenhacom o cultivo clonal continuo da linhagem transgênica bemsuperior a 8 meses após a geração da linhagem transgênica.Exemplo 8: Padrão de glicosilação para GlicoproteinasEndógenas em Linhagens Transgênicas de Lemna minor para oConstructo de RNAi de mAbl04

A protease L40 é uma glicoproteina endógenarepresentativa produzida em L.minor,.. De modo, a avaliar oimpacto do constructo de RNAi mAbl04 (Figura 12) naglicosilação de proteínas endógenas, a proteína L40 foiisolada de uma linhagem transgênica de L.minor para oconstructo de RNAi mAbI04 usando cromatografia de afinidadea benzamidina. O padrão de N-glicosilação para a proteínaL40 isolada foi analisada usando análise por MAALDI-TOF deuma maneira descrita acima. Os resultados são mostrados nafigura 52.

Como pode ser visto a partir desta análise, asupressão da expressão de FucT e XylT usando o constructoquimérico de RNAi mAbI04 resulta em glicoproteínasendógenas tendo um padrão homogêneo de glicosilaçãoconsistente com aquele observado para glicoproteínasrecombinantés. Assim, o perfil heterogêneo de N-glicanaspara a glicoproteina L40 isolada de L.minor tendo omaquinário de glicosilação de tipo selvagem é representadopor uma mistura de espécies de N-glicanas tendo o resíduode xilose ligado por β1,2, ou ambos os resíduos de xiloseligado por β1,2 e fucose de núcleo ligada por al,3associados. Em contraste, o perfil homogêneo de N-glicanapara L40 isolada de L.minor transgênica para o constructode RNAi mAbI04 é representado por um único picopredominante correspondendo às espécies glicanas GO, e écaracterizada pela ausência de espécies de N^-glicana tendoos resíduos xilose ligados por β1,2, ou ambos os resíduosde xilose ligados por β1,2 e fucose de núcleo ligados poral,3 associados.

Exemplo 9: Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-CD20 eAnti-HER2 Tendo Atividade ADCC Aumentada

IDEC-C2B8 (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego,Califórnia; comercialmente disponível sob o nome comercialRituxan®, também referido como rituximab; ver U.S. PatentNo. 5,736,137, aqui incorporada por referência) é umanticorpo monoclonal quimérico anti-CD20 contendo regiõesconstantes de IgGl e capa humanas com regiões variáveismurinas isoladas de um anticorpo monoclonal murino anti-CD20, IDEC-2B8 (Reff et al. (1994) Blood 83:435-445).Rituximab é licenciado para o tratamento de células Brelapsas de baixo grau ou linfoma folicular não-Hodgkin(NHL). O anticorpo anti-CD20 vendido como rituximab(Rituxan®) é produzido de forma recombinante em * célulasCHO. O padrão de glicosilação deste anticorpo anti-CD20expresso em CHO revela uma mistura heterogênea deglicoformas.

Um anticorpo humanizado anti-ERBB2 é comercialmentedisponível sob o nome comercial Herceptin® (Genentech,Inc., San Francisco, Califórnia) (ver U.S. Patent No.6,165,464, aqui incorporada por referência). Este anticorpomonoclonal recombinante humanizado tem alta afinidade porpl85HER2. Testes clínicos iniciais com pacientes tendocarcinomas de mama metas/táticos extensos demonstram ahabilidade deste anticorpo monoclonal de inibir ocrescimento de células de câncer de mama que superexpressam HER2 (Baselga et al. (1996) J. Clin. Oncol14 (3) :737-744) .

Anticorpo com seqüência do rituximab e anticorpo comseqüência de Herceptin® anti-ERBB2 são produzidos de formarecombinante em Lemna tendo o padrão de glicosilação detipo selvagem, usando o constructo mAblOl descrito acima, eem Lemna que é geneticamente modificada para suprimir aexpressão de ambos FucT e XylT, usando o constructoquimérico de RNAi mAbI04, com as seqüências codificadorasda cadeia pesada e leve de rituximab ou anti-ERBB2substituindo aquelas para o mAbl em cada um destesconstructos. As seqüências codificando as cadeias pesadas eleves são opcionalmente ambas códon-otimizadas com códonspreferidos por Lemna. 0 mAb com seqüência de rituximab(isto é, tendo a seqüência de aminoácidos do anticorporituximab) e o mAb com a seqüência do anti-ERBB2 (isto é,tendo a seqüência dé aminoácidos do mAb de Herceptin® anti-ERBB2) secretados foram analisados para o padrão deglicosilação como descrito acima no Exemplo 1.

0 perfil de glicosilação para mAb com seqüência derituximab e mAb com a seqüência do anti-ERBB2 intactosproduzidos em Lemna de tipo selvagem compreendendo oconstructo tipo mAblOl mostra um perfil heterogêneo comnumerosos picos correspondendo a múltiplas glicoformas. Emcontraste, o perfil de glicosilação para mAb intacto comseqüência de rituximab ou mAb intacto com a seqüência doanti-ERBB2 produzidos em Lemna transgênica compreendendo oconstructo tipo mAbI04 mostra uma composição deglicoproteinas substancialmente homogênea, com três picosde glicoformas majoritárias, o maior dos quais correspondeà glicoforma GO, e dois picos bem menores correspondendo aquantidades traço de glicoformas precursoras,caracterizadas pelo fato de que resíduos de xilose e fucosenão estão associados.

As composições de anticorpos monoclonais com seqüênciade rituximab e seqüência de anti-ERBB2 tendo o perfil deglicosilação que é substancialmente homogêneo para aglicoforma GO são testadas para atividade ADCC e ligação areceptor Fcy IIIa (Fcy RIIIa) em células humanas NKrecentemente isoladas. Os mAbs com seqüência de rituximab eseqüência de anti-ERBB2 produzidos a partir de linhagensconstruídas de L.minor com o constructo tipo mAbI04 exibe oaumento de ligação esperado em vista da falta de qualquerresíduo de fucose, relativo à ligação observada para os'mAbs com seqüência de rituximab e seqüência de anti-ERBB2produzidos em linhagens de L.minor tendo o maquinário deglicosilação de tipo selvagem (isto é, não há silenciamentode FucT ou XylT). Adicionalmente, a afinidade de ligação épelo menos tão forte quanto aquela correspondendo ao mAbproduzido em linhagens de células CHO.

A Atividade ADCC da glicoforma substancialmentehomogênea GO do mAb com seqüência de rituximab e do mAb coma seqüência do anti-ERBB2 produzidos na linhagem de L.minorconstruída com o constructo tipo mAbl04 é ensaiada usandocélulas mononucleares de sangue periférico humano comocélulas efetoras (ver, por exemplo, Shinkawa et al. (2003)J. Biol. Chem. 278(5):3466-3473; aqui incorporado porreferência em sua íntegra). A atividade da glicoforma GOdas composições dé mAb com seqüência de rituximab e do mAbcom a seqüência do anti-ERBB2 é aumentada 50-1000 vezessobre aquela exibida pelas respectivas mAb com seqüência derituximab e do mAb com a seqüência do anti-ERBB2 produzidasna linhagem de L.minor tendo o maquinário de glicosilaçãode tipo selvagem ou produzidos em células CHO.

A atividade CDC da glicoforma GO substancialmentehomogênea do mAb com seqüência de rituximab produzido emL.minor construída com o constructo de RNAi tipo mAbI04 éensaiada usando testes padrão conhecidos na técnica (ver,por exemplo, os testes de ativação de complemento descritosem U.S. Patent Application Publication No. 2004/0167319,aqui incorporada por referência em sua íntegra), ecomparada a aquela observada para rituximab. Anticorpo nãorelevante serve comó o controle negativo. Em tal tipo deteste, atividade CDC dos vários anticorpos contra célulasalvo Daudi é medida pela avaliação da elevação dapermeabilidade de membrana usando teste de exclusão comiodeto de propídeo (PI), com soro de voluntários saudáveisservindo como uma fonte de complemento. Soro para Iise porcomplemento é preparado pela retirada de sangue devoluntários saudáveis em gel autosep e tubos vacutainerativadores de coágulo (BD Biosciences, Rutherford, NewJersey), os quais são mantidos em temperatura ambiente por30-60 minutos e então centrifugados a 3000 rpm por 5minutos. O soro é coletado e estocado a -80o C.

Brevemente, para este teste de atividade CDC, célulasDaudi são lavadas e ressuspendidas em RPMI-BSA a 1% a 1 χ1 OfVmL. Várias concentrações da glicoforma GOsubstancialmente homogênea do mAb com seqüência derituximab, rituximab, e mAb controle negativo foramadicionados às células Daudi e permitidas a se ligar por10-15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, sorocomo uma fonte de complemento é adicionado a umaconcentração final de 20% (v/v) e as misturas são incubadaspor 45 min a 37° C. A cada amostra (150 μΐ) são entãoadicionados 10 μΐ da solução PI (10 pg/ml em PBS) em umtubo FACS. A mistura é avaliada imediatamente para Iisecelular (número de células positivas para PI) por umcitômetro de fluxo FACScalibur e analisada usando programade computador CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain View,Califórnia). Pelo menos 5000 eventos são coletados paraanálise com restos celulares sendo excluídos pelo ajuste dolimiar do espalhamento lateral frontal (FCS).

A atividade CDC da glicoforma GO substancialmentehomogênea em mAb com seqüência de rituximab é diminuída emrelação a aquela exibida por rituximab.

Todas as publicações e aplicações de patentesmencionadas na especificação são indicativas do níveldaqueles especialistas na técnica a qual esta invençãopertence. Todas as publicações e aplicações de patentes sãoaqui incorporadas por referência na mesma extensão de comose cada publicação individual ou aplicação de patentetivesse sido especificamente e individualmente indicadacomo sendo incorporada por referência.

Claims (165)

1. Composição de glicoproteínas, caracterizada pelo fatode que compreende um perfil de N-glicosilaçãoconsideravelmente homogêneo, em que pelo menos 90% dasespécies N-glicanas presentes no perfil citado sãoGlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO), o perfil citado compreendendo umaquantidade traço da espécie N-glicana precursora, em que aespécie N-glicana precursora citada é selecionada do grupoque consiste em Man3GlcNAc2, GlcNaclMan3GlcNAc2 em queGlcNac1 é ligada ao braço 1,3 manose (MGn),GlcNac1Man3GlcNAc2 em que GlcNacl é ligada ao braço 1,6manose (GnM), e qualquer combinação destas.

2. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que aglicoproteína citada é uma imunoglobulina.

3. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que aimunoglobulina citada compreende uma região Fc selecionadado qrupo que consiste em uma região IgGl, IgG2, IgG3, eIgG4 .

4. Composição de glicoproteínas de acordoreivindicação 2, caracterizada pelo fato deimunoglobulina citada é um anticorpo monoclonal.

5. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpomonoclonal citado se liga a um antigeno selecionado dogrupo que consiste em CD20 e ERBB2 (HER2).

6. Composição de glicoproteínas de acordo com qualqueruma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato deque a imunoglobulina citada mostra afinidade de ligação poruma FcyRIII aumentada.

7. Composição de glicoproteínas de acordo com qualqueruma das reivindicações 2 a 6, caracterizada pelo fato deque a imunoglobulina citada mostra atividade decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)aumentada.

8. Composição de glicoproteínas de acordo com qualqueruma das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato deque a imunoglobulina citada mostra atividade decitotoxicidade dependente de complemento (CDC) diminuída.

9. Composição de glicoproteínas consideravelmentehomogênea, caracterizada pelo fato de que pelo menos 90%das glicoproteínas presentes na composição sãorepresentadas pela forma glicosilada GO, a composiçãocitada compreendendo uma quantidade traço de formaglicosilada precursora.

10. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que aglicoproteina citada é uma imunoglobulina.

11. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 10, caracterizada pelo fato de que aimunoglobulina citada compreende uma região Fc selecionadado grupo que consiste em uma região IgGl, IgG2, IgG3, eIgG4 .

12. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 10, caracterizada pelo fato de que aimunoglobulina citada é um anticorpo monoclonal.

13. Composição de glicoproteínas de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que oanticorpo monoclonal citado se liga a um antígenoselecionado do grupo que consiste em CD20 e ERBB2 (HER2).

14. Composição de glicoproteínas de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato deque a imunoglobulina citada mostra uma afinidade de ligaçãopor uma FcyRIII aumentada.

15. Composição de glicoproteínas de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato deque a imunoglobulina citada mostra atividade decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)aumentada.

16. Composição de glicoproteínas de acordo com qualqueruma das reivindicações 10 a 15, caracterizada pelo fato deque a imunoglobulina citada mostra atividade decitotoxicidade dependente de complemento (CDC) diminuída.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato deque compreende a composição de glicoproteínas como definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

18. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de quecompreende a composição de glicoproteínas como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 16.

19. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira citada éuma célula hospedeira de planta.

20. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de que a planta citada é uma plantaaquática.

21. Método para alterar o padrão de N-glicosilação de umpolipeptídeo heterólogo produzido em uma planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática, caracterizado pelofato de que compreende:(a) introduzir na planta aquática ou célula ou nódulode planta aquática citados uma construção denucleotídeos compreendendo uma primeira seqüênciade nucleotídeos que é capaz da inibir a expressãoou função de uma α,3-fucosiltranferase (FucT) naplanta aquática ou célula ou nódulo de plantaaquática citados, e em que a primeira seqüênciade nucleotídeos citada está operacionalmenteligada a um promotor que é funcional em umacélula de planta, a primeira seqüência denucleotídeos citada compreendendo na orientação-5' para 3' e operacionalmente ligados:i) fragmento de sentido direto de FucT, ofragmento de sentido direto de FucT citadocompreendendo cerca de 500 a cerca de 800nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90%de identidade de seqüência com uma seqüênciade nucleotídeos de cerca de 500 a cerca de-800 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1ou SEQ ID NO: 2;(ii) seqüência de espaçamento compreendendo cercade 200 a cerca de 700 nucleotídeosimediatamente a jusante do fragmento desentido direto de FucT citado; e(iii) fragmento de sentido reverso de FucT, ofragmento de sentido reverso de FucT citadotendo comprimento suficiente ecomplementaridade suficiente com o fragmentode sentido direto de FucT citado tal que aprimeira seqüência de nucleotideos citada étranscrita como uma molécula de RNA capaz deformar uma estrutura hairpin de RNA; e(b) cultivar a planta aquática ou célula ou nódulo deplanta aquática citados sob condições favoráveisà expressão do polipeptideo heterólogo citado.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o fragmento de sentido reverso de FucTcitado compreende o complemento do fragmento de sentidodireto de FucT citado ou uma seqüência que tenha pelo menos90% de identidade de seqüência com o complemento dofragmento de sentido direto de FucT citado.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que o fragmento de sentidodireto de FucT citado compreende nucleotideos (nt) 255-985da SEQ ID NO: Iea seqüência de espaçamento citadacompreende nt 986-1444 da SEQ ID NO: 1.

24. Método para alterar o padrão de N-glicosilação de umpolipeptideo heterólogo produzido em uma planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática caracterizado pelo fatode que o método citado compreende:(a) introduzir na planta aquática ou célula ou nódulode planta aquática citados uma construção denucleotideos compreendendo uma primeira seqüênciade nucleotideos que é capaz da inibir a expressãoou função de uma αϊ,3-fucosiltranferase (FucT) naplanta aquática ou célula ou nódulo de plantaaquática citados, e em que a primeira seqüênciade nucleotideos citada está operacionalmenteligada a um promotor que é funcional em umacélula de planta, a primeira seqüência denucleotideos citada compreendendo na orientação5' para 3' e operacionalmente ligados:) seqüência de nucleotideos sensecompreendendo pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com uma seqüência denucleotideos de pelo menos 19 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 1; ei) seqüência de nucleotideos antisensecompreendendo pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com o complemento de umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19nucleotideos contíguos da seqüência denucleotideos sense citada; em que a primeiraseqüencia de nucleotideos citada étranscrita como uma hairpin pequena de RNAtendo um comprimento de haste de basespareadas menor que cerca de 200 pares debases; e(b) cultivar a planta aquática ou célula ou nódulo deplanta aquática citados sob condições favoráveisà expressão do polipeptideo heterólogo citado.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o promotor citado operacionalmente ligadoà primeira seqüência de nucleotideos citada é um promotordo tipo 3 da RNA polimerase III.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que compreendeadicionalmente inibir a expressão ou função de uma β1,2-xilosiltransferase (XylT) na planta aquática ou célula ounódulo de planta citados.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que a expressão ou a função da XylT citada éinibida pelo método selecionado do grupo consistindo de:(a) introduzir um polinucleotideo ou polipeptideo naplanta aquática ou célula ou nódulo de plantaaquática citados, em que o polinucleotideo ou opolipeptideo citado inibe a expressão ou a funçãoda XylT citada na planta aquática ou na célula ouno nódulo de planta aquática citados;(b) eliminar um gene na planta aquática ou na célulaou no nódulo de planta aquática citados, em que ogene citado codifica a XylT citada; e(c) causar mutação em um gene na planta aquática ouna célula ou no nódulo de planta aquáticacitados, em que o gene citado codifica a XylTcitada.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que compreende introduzir na planta aquáticaou célula ou nódulo de planta aquática citados umaconstrução de nucleotideos compreendendo uma seqüência denucleotideos que é capaz de inibir a expressão ou função daXylT citada na planta aquática ou célula ou nódulo daplanta aquática citados, em que a seqüência de nucleotideoscitada que é capaz de inibir a expressão ou função da XylTcitada é operacionalmente ligada a um promotor que éfuncional em uma célula de planta.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a seqüência de nucleotideos citada que écapaz de inibir a expressão ou função da XylT citadacompreende na orientação 5' para 3' e operacionalmenteligados:(a) fragmento de sentido direto de XylT, o fragmentode sentido direto de XylT citado compreendendocerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotídeos decerca de 500 a cerca de 800 nucleotídeoscontíguos da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 19, ou SEQ ID NO: 20;(b) seqüência de espaçamento compreendendo cerca de-200 a cerca de 700 nucleotídeos imediatamente ajusante do fragmento de sentido direto de XylTcitado; e(c) fragmento de sentido reverso de XylT, o fragmentode sentido reverso de XylT citado tendocomprimento suficiente e complementaridadesuficiente com o fragmento de sentido direto deXylT citado tal que a seqüência de nucleotídeoscitada que é capaz de inibir a expressão oufunção da XylT citada é transcrita como umamolécula de RNA capaz de formar uma estruturahairpin de RNA.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o fragmento de sentido reverso de XylTcitado compreende o complemento do fragmento de sentidodireto de XylT citado ou uma seqüência que tenha pelo menos-90% de identidade de seqüência com o complemento dofragmento de sentido direto de XylT citado.

31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30,caracterizado pelo fato de que:(a) fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nucleotideos (nt) 318-1052 da SEQ IDNO: 4 e em que a seqüência de espaçamento citadacompreende nt 1053-1599 da SEQ ID NO: 4; ou(b) fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nt 1-734 da SEQ ID NO: 19 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt-735-1282 da SEQ ID NO: 19.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a seqüência de nucleotideos citada que écapaz de inibir a expressão ou função da XylT citadacompreende na orientação 5' para 3' e operacionalmenteligados:(a) seqüência de nucleotideos sense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ IDNO: 19, e(b) seqüência de nucleotideos antisense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com ocomplemento de uma seqüência de nucleotideos depelo menos 19 nucleotideos contíguos da seqüênciade nucleotideos sense do item anterior (a) ;em que a seqüência de nucleotideos citada que é capazde inibir a expressão ou função da XylT citada étranscrita como uma hairpin pequena de RNA tendo umcomprimento de haste de bases pareadas menor que cercade 200 pares de bases.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que o promotor citado operacionalmente ligadoà seqüência de nucleotideos citada que é capaz de inibir aexpressão ou função da XylT citada é um promotor do tipo 3da RNA polimerase III.

34. Método para alterar o padrão de N-glicosilação de umpolipeptídeo heterólogo produzido em uma planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática, caracterizado pelofato de que compreende:(a) introduzir na planta aquática ou célula ou nódulode planta aquática citados uma construção denucleotideos compreendendo uma primeira seqüênciade nucleotideos que é capaz da inibir a expressãoou função de uma βΐ,2-xilosiltranferase (XylT) naplanta aquática ou célula ou nódulo de plantaaquática citados, e em que a primeira seqüênciade nucleotideos citada está operacionalmenteligada a um promotor que é funcional em umacélula de planta, a primeira seqüência denucleotideos citada compreendendo na orientação-5' para 3' e operacionalmente ligados:(i) fragmento de sentido direto de XylT, ofragmento de sentido direto de XylT citadocompreendendo cerca de 500 a cerca de 800nucleotideos contíguos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüênciade nucleotideos de cerca de 500 a cerca de-800 nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 6ou SEQ ID NO: 21; (ii) seqüência de espaçamento compreendendo cercade 200 a cerca de 700 nucleotideosimediatamente a jusante do fragmento desentido direto de XylT citado; e(iii) fragmento de sentido reverso de XylT, ofragmento de sentido reverso de XylT citadotendo comprimento suficiente ecomplementaridade suficiente com o fragmentode sentido direto de XylT citado tal que aprimeira seqüência de nucleotideos citada étranscrita como uma molécula de RNA capaz deformar uma estrutura hairpin de RNA; e(b) cultivar a planta aquática ou célula ou nódulo deplanta aquática citados sob condições favoráveisà expressão do polipeptideo heterólogo citado.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o fragmento de sentido reverso de XylTcitado compreende o complemento do fragmento de sentidodireto de XylT citado ou uma seqüência tendo pelo menos 90%de identidade de seqüência com o complemento do fragmentode sentido direto de XylT citado.

36. Método de acordo com a reivindicação 34 ou 35,caracterizado pelo fato de que:(a) o fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nucleotideos (nt) 318-1052 da SEQ IDNO: 4 e em que a seqüência de espaçamento citadacompreende nt 1053-1599 da SEQ ID NO: 4; ou(b) o fragmento de sentido direto XylT citadocompreende nt 1-734 da SEQ ID NO: 19 e em que aseqüência de espaçamento citada compreende nt-735-1282 da SEQ ID NO: 19.

37. Método para alterar o padrão de N-glicosilação de umpolipeptideo heterólogo produzido em uma planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática, caracterizado pelofato de que compreende:introduzir na planta aquática ou célula ou nódulode planta aquática citados uma construção denucleotideos compreendendo uma primeira seqüênciade nucleotideos que é capaz da inibir a expressãoou função de uma βΐ,2-xilosiltranferase (XylT) naplanta aquática ou célula ou nódulo de plantaaquática citados, e em que a primeira seqüênciade nucleotideos citada está operacionalmenteligada a um promotor que é funcional em umacélula de planta, a primeira seqüência denucleotideos citada compreendendo na orientação5' para 3' e operacionalmente ligados:(i) seqüência de nucleotideos sensecompreendendo pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com uma seqüência denucleotideos de pelo menos 19 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19;e(ii) seqüência de nucleotideos antisensecompreendendo pelo menos 19 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com o complemento de umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19nucleotideos contíguos da seqüência denucleotideos sense citada do item anterior(a) ; em que a primeira seqüencia denucleotídeos citada que é capaz de inibir aexpressão ou a função da XylT citada étranscrita como uma hairpin pequena de RNAtendo um comprimento de haste de basespareadas menor que cerca de 200 pares debases; e(b) cultivar a planta aquática ou célula ou nódulo deplanta aquática citados sob condições favoráveisà expressão do polipeptideo heterólogo citado.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que o promotor citado operacionalmente ligadoà primeira seqüência de nucleotídeos citada é um promotordo tipo 3 da RNA polimerase III.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizado pelo fato de que compreendeadicionalmente inibir a expressão ou função de uma al,3-fucosiltransferase (FucT) na planta aquática ou célula ounódulo de planta aquática citados.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a expressão ou função da FucT citada éinibida por um método selecionado do grupo que consiste em:(a) introduzir um polinucleotídeo ou polipeptideo naplanta aquática ou célula ou nódulo de plantaaquática citados, em que o polinucleotídeo oupolipeptideo citados inibe a expressão ou funçãoda FucT citada na planta aquática ou célula ounódulo de planta aquática citados;(b) eliminar um gene na planta aquática ou célula ounódulo de planta aquática citados, em que o genecitado codifica a FucT citada; e(c) causar mutação em um gene na planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática citados, emque o gene citado codifica a FucT citada.

41. Método para alterar o padrão de N-glicosilação de umpolipeptideo heterólogo produzido em uma planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática, caracterizado pelofato de que compreende:(a) introduzir na planta aquática ou célula ou nódulode planta aquática citados uma construção denucleotideos compreendendo um polinucleotideo defusão que é capaz da inibir a expressão ou funçãode uma αϊ, 3-fucosiltranferase (FucT) e uma β1,2-xilosiltranferase (XylT) na planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática citados, e emque o polinucleotideo de fusão citado estáoperacionalmente ligado a um promotor que éfuncional em uma célula de planta, opolinucleotideo de fusão citado compreendendo naorientação 5' para 3' e operacionalmente ligados:fragmento de sentido direto quimérico, ofragmento de sentido direto quiméricocitado compreendendo:a) primeiro fragmento compreendendo cerca de-500 a cerca de 650 nucleotideos contíguostendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência denucleotideos de cerca de 500 a cerca de-650 nucleotideos contíguos de umpolinucleotídeo que codifique a FucTcitada; eb) segundo fragmento compreendendo cerca de-500 a cerca de 650 nucleotideos contíguostendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência denucleotideos de cerca de 500 a cerca de-650 nucleotideos contíguos de umpolinucleotídeo que codifique a XylTcitada;seqüência de espaçamento compreendendo cercade 200 a cerca de 700 nucleotideosimediatamente a jusante do fragmento desentido direto quimérico citado; e(iii) fragmento de sentido reverso, o fragmento desentido reverso citado tendo comprimentosuficiente e complementaridade suficientecom o fragmento de sentido direto quiméricocitado tal que o polinucleotideo de fusãocitado é transcrito como uma molécula de RNAcapaz de formar uma estrutura hairpin deRNA; e(b) cultivar a planta aquática ou célula ou nódulo deplanta aquática citados sob condições favoráveisà expressão do polipeptideo heterólogo citado.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que o primeiro fragmento citado compreendecerca de 500 a cerca de 650 nucleotideos contíguos tendopelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüênciade nucleotideos de cerca de 500 a cerca de 650 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 1; e o segundo fragmento citadocompreende cerca de 500 a cerca de 650 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüênciacom uma seqüência de nucleotideos de cerca de 500 a cercade 650 nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que o fragmento de sentido reverso citadocompreende o complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado ou uma seqüência que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com o complemento do fragmentode sentido direto quimérico citado.

44. Método de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que:(a) o fragmento de sentido direto quiméricocompreende nucleotideos (nt) 254-855 da SEQ IDNO: 1 e nt 318-943 da SEQ ID NO: 4, e em que a seqüência de espaçamento citada compreende nt-944-1443 da SEQ ID NO: 4; ou(b) o fragmento de sentido direto quiméricocompreende nucleotideos (nt) 254-855 da SEQ ID NO: 1 e nt 1-626 da SEQ ID NO: 19, e em que aseqüência de espaçamento citada compreende nt-627-1126 da SEQ ID NO: 19.

45. Método para alterar o padrão de N-glicosilação de um polipeptideo heterólogo produzido em uma planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática, caracterizado pelofato de que compreende:(a) introduzir na planta aquática ou célula ou nódulo de planta aquática citados uma construção denucleotideos compreendendo um polinucleotideo defusão que é capaz da inibir a expressão ou funçãode uma αϊ, 3-fucosiltranferase (FucT) e uma β1,2-xilosiltranferase (XylT) na planta aquática oucélula ou nódulo de planta aquática citados, e emque o polinucleotideo de fusão citado estáoperacionalmente ligado a um promotor que éfuncional em uma célula de planta, opolinucleotideo de fusão citado compreendendo naorientação 5' para 3' e operacionalmente ligados:fragmento de sentido direto quimérico, ofragmento de sentido direto quimérico citadocompreendendo:(a) primeiro fragmento compreendendo cerca de-500 a cerca de 650 nucleotideos contíguostendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência denucleotideos de cerca de 500 a cerca de-650 nucleotideos contíguos de umpolinucleotideo que codifique a XylTcitada; e(b) segundo fragmento compreendendo cerca de-500 a cerca de 650 nucleotideos contíguostendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência denucleotideos de cerca de 500 a cerca de-650 nucleotideos contíguos de umpolinucleotideo que codifique a FucTcitada;(ii) seqüência de espaçamento compreendendo cercade 200 a cerca de 700 nucleotideosimediatamente a jusante do fragmento desentido direto quimérico citado; e(iii) fragmento de sentido reverso, o fragmento desentido reverso citado tendo comprimentosuficiente e complementaridade suficientecom o fragmento de sentido direto quiméricocitado tal que o polinucleotideo de fusãocitado é transcrito como uma molécula de RNAcapaz de formar uma estrutura hairpin deRNA; e(b) cultivar a planta aquática ou célula ou nódulo deplanta aquática citados sob condições favoráveisà expressão do polipeptideo heterólogo citado.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que o fragmento de sentido reverso citadocompreende o complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado ou uma seqüência que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com o complemento do fragmentode sentido direto quimérico citado.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que o primeiro fragmento citado compreendecerca de 500 a cerca de 650 nucleotideos contíguos tendopelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüênciade nucleotideos de cerca de 500 a cerca de 650 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19; e o segundofragmento citado compreende cerca de 500 a cerca de 650nucleotideos contíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com uma seqüência de nucleotideos de cerca de-500 a cerca de 650 nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 1.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que o fragmento de sentido reverso citadocompreende o complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado ou uma seqüência que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com o complemento do fragmentode sentido direto quimérico citado.

49. Construção de nucleotideos, caracterizada pelo fato deque compreende uma primeira seqüência de nucleotideos que écapaz de inibir a expressão ou função de uma ai, 3-fucosiltransferase (FucT) em uma planta, e uma segundaseqüência de nucleotideos que é capaz de inibir a expressãoou função de uma β1,2-xilosiltransferase (XylT) em umaplanta, em que a primeira seqüência de nucleotideos citadaestá operacionalmente ligada a um primeiro promotor que éfuncional em uma célula de planta, e em que a segundaseqüência de nucleotideos citada está operacionalmenteligada a um segundo promotor que é funcional em uma célulade planta, em que a primeira seqüência de nucleotideoscitada compreende na orientação 5' para 3' e ligadosoperacionalmente:(a) fragmento de sentido direto de FucT, o fragmentode sentido direto de FucT citado compreendendocerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotideos decerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2;(b) seqüência de espaçamento compreendendo umfragmento de nucleotideos da seqüênciaapresentada na SEQ ID NO: 1;(c) fragmento de sentido reverso de FucT, o fragmentode sentido reverso de FucT citado tendocomprimento suficiente e complementaridadesuficiente com o fragmento de sentido direto deFucT citado tal que a primeira seqüência denucleotideos citada é transcrita como umamolécula de RNA capaz de formar uma estruturahairpin de RNA.

50. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 49, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de FucT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de FucT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento de sentido direto de FucTcitado.

51. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 49 ou 50, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de FucT citado compreendenucleotideos (nt) 255-985 da SEQ ID NO: 1.

52. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações de 49 até 51, caracterizada pelo fato deque o fragmento de nucleotideos citado da seqüênciaapresentada na SEQ ID NO: 1 compreende cerca de 200 a cercade 700 nucleotideos imediatamente a jusante do fragmento desentido direto de FucT citado.

53. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 52, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada compreende (nt) 986-1444 daSEQ ID NO: 1.

54. Construção de nucleotideos, caracterizada pelo fato deque compreende uma primeira seqüência de nucleotideos que écapaz de inibir a expressão ou função de uma al,3-fucosiltransferase (FucT) em uma planta, e uma segundaseqüência de nucleotideos que é capaz de inibir a expressãoou função de uma βΐ,2-xilosiltransferase (XylT) em umaplanta, em que a primeira seqüência de nucleotideos citadaestá operacionalmente ligada a um primeiro promotor que éfuncional em uma célula de planta, e em que a segundaseqüência de nucleotideos citada está operacionalmenteligada a um segundo promotor que é funcional em uma célulade planta, em que a primeira seqüência de nucleotideoscitada compreende na orientação 5' para 3' e ligadosoperacionalmente:(a) seqüência de nucleotideos sense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contiguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19nucleotideos contiguos da SEQ ID NO: 1; e(b) seqüência de nucleotideos antisense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contiguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com ocomplemento de uma seqüência de nucleotideos depelo menos 19 nucleotideos contiguos da seqüênciade nucleotideos sense citada;em que a primeira seqüência de nucleotideos citada étranscrita como uma hairpin pequena de RNA tendo umcomprimento de haste de bases pareadas menor que cercade 200 pares de bases.

55. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o promotorcitado operacionalmente ligado à primeira seqüência denucleotideos citada é um promotor do tipo 3 da RNApolimerase III.

56. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 49 a 55, caracterizada pelo fato de quea XylT citada é um polipeptideo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 6 ou SEQ ID NO: 21; e(b) seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ IDNO: 21, em que o polipeptideo citado tematividade de XylT.

57. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a segundaseqüência de nucleotideos citada compreende uma seqüênciaselecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de nucleotideos apresentada na SEQ IDNO: 4 ou SEQ ID NO: 19, ou um complemento destas;(b) seqüência de nucleotideos apresentada na SEQ IDNO: 5 ou SEQ ID NO: 20, ou um complemento destas;(c) seqüência de nucleotideos que tenha pelo menos-90% de identidade de seqüência com a seqüência doitem anterior (a) ou (b); e(d) fragmento da seqüência de nucleotideos dequalquer um dos itens anteriores (a) a (c) , emque o fragmento citado compreende pelo menos 7 5nucleotideos contíguos da seqüência denucleotideos citada.

58. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a segundaseqüência de nucleotideos citada compreende na orientação5' para 3' e operacionalmente ligados:(a) fragmento de sentido direto de XylT, o fragmentode sentido direto de XylT citado compreendendocerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotideos decerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 19, ou SEQ ID NO: 20;(b) seqüência de espaçamento compreendendo cerca de-200 a cerca de 700 nucleotideos; e(c) fragmento de sentido reverso de XylT, o fragmentode sentido reverso de XylT citado tendocomprimento suficiente e complementaridadesuficiente com o fragmento de sentido direto deXylT citado tal que a segunda seqüência denucleotideos citada é transcrita como umamolécula de RNA capaz de formar uma estruturahairpin de RNA.

59. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 58, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de XylT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de XylT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretode XylT citado.

60. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 58 ou 59, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de XylT citado compreendenucleotídeos (nt) 318-1052 da SEQ ID NO: 4 ou nt 1-734 daSEQ ID NO: 19.

61. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer umadas reivindicações 58 a 60, caracterizada pelo fato de quea seqüência de espaçamento citada dentro da segundaseqüência de nucleotídeos citada compreende um fragmento denucleotídeos da seqüência apresentada na SEQ ID NO: 4 ouSEQ ID NO: 19.

62. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 61, caracterizada pelo fato de que ofragmento de nucleotídeos citado da seqüência apresentadana SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19 compreende cerca de 200 acerca de 700 nucleotídeos imediatamente a jusante dofragmento de sentido direto de XylT citado.

63. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 62, caracterizada pelo fato de que:(a) o fragmento de sentido direto de XylT citado compreende nt 318-1052 da SEQ ID NO: 4 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt-1053-1599 da SEQ ID NO: 4; ou(b) o fragmento de sentido direto de XylT citado compreende nt 1-734 da SEQ ID NO: 19 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt-735-1282 da SEQ ID NO: 19.

64. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 60, caracterizada pelo fato de quea seqüência de espaçamento citada dentro da segundaseqüência de nucleotídeos citada compreende um íntron.

65. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a segundaseqüência de nucleotídeos citada compreende na direção 5'para 3' e operacionalmente ligados:(a) seqüência de nucleotídeos sense compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com umaseqüência de nucleotídeos de pelo menos 19nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ IDNO: 19; e(b) seqüência de nucleotideos antisense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com ocomplemento de uma seqüência de nucleotideos depelo menos 19 nucleotideos contíguos da seqüênciade nucleotideos sense citada do item anterior(a) ;em que a segunda seqüência de nucleotideos citada étranscrita como uma pequena hairpin de RNA tendo umcomprimento de haste de bases pareadas menor que cercade 200 pares de bases.

66. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o promotorcitado operacionalmente ligado à segunda seqüência denucleotideos citada é um promotor do tipo 3 da RNApolimerase III.

67. Construção de nucleotideos, caracterizada pelo fato deque compreende uma primeira seqüência de nucleotideos que écapaz de inibir a expressão ou função de uma al,3-fucosiltransferase (FucT) em uma planta, e uma segundaseqüência de nucleotideos que é capaz de inibir a expressãoou função de uma βΐ,2-xilosiltransferase (XylT) em umaplanta, em que a primeira seqüência de nucleotideos citadaestá operacionalmente ligada a um primeiro promotor que éfuncional em uma célula de planta, e em que a segundaseqüência de nucleotideos citada está operacionalmenteligada a um segundo promotor que é funcional em uma célulade planta, em que a segunda seqüência de nucleotideoscitada compreende na orientação 5' para 3' e ligadosoperacionalmente:(a) fragmento de sentido direto de XylT, o fragmentode sentido direto de XylT citado compreendendocerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotideos decerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 19, ou SEQ ID NO: 20;(b) seqüência de espaçamento compreendendo umfragmento de nucleotideos da seqüênciaapresentada na SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19;(c) fragmento de sentido reverso de XylT, o fragmentode sentido reverso de XylT citado tendocomprimento suficiente e complementaridadesuficiente com o fragmento de sentido direto deXylT citado tal que a segunda seqüência denucleotideos citada é transcrita como umamolécula de RNA capaz de formar uma estruturahairpin de RNA.

68. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 67, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de XylT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de XylT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretode XylT citado.

69. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 67 ou 68, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de XylT citado compreendenucleotideos (nt) 318-1052 da SEQ ID NO: 4 ou nt 1-734 daSEQ ID NO: 19.

70. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 67 a 69, caracterizada pelo fato de queo fragmento de nucleotideos citado da seqüência apresentadana SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19 compreende cerca de 200 a-700 nucleotideos imediatamente a jusante do fragmento desentido direto de XylT citado.

71. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 70, caracterizada pelo fato de que:(a) o fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nt 318-1052 da SEQ ID NO: 4 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt1053-1599 da SEQ ID NO: 4; ou(b) o fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nt 1-734 da SEQ ID NO: 19 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt-735-1282 da SEQ ID NO: 19.

72. Construção de nucleotideos, caracterizada pelo fato deque compreende uma primeira seqüência de nucleotideos que écapaz de inibir a expressão ou função de uma al,3-fucosiltransferase (FucT) em uma planta, e uma segundaseqüência de nucleotideos que é capaz de inibir a expressãoou função de uma βΐ,2-xilosiltransferase (XylT) em umaplanta, em que a primeira seqüência de nucleotideos citadaestá operacionalmente ligada a um primeiro promotor que éfuncional em uma célula de planta, e em que a segundaseqüência de nucleotideos citada compreende na direção 5'para 3' e operacionalmente ligados:(a) seqüência de nucleotideos sense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com umaseqüência de nucleotideos de pelo menos 19nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ IDNO: 19; e(b) seqüência de nucleotideos antisense compreendendopelo menos 19 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com ocomplemento de uma seqüência de nucleotideos depelo menos 19 nucleotideos contíguos da seqüênciade nucleotídeos sense citada do item anterior(a) ;em que a segunda seqüência de nucleotídeos citada étranscrita como uma pequena hairpin de RNA tendo umcomprimento de haste de bases pareadas menor que cercade 200 pares de bases.

73. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 72, caracterizada pelo fato de que o promotorcitado operacionalmente ligado à segunda seqüência denucleotídeos citada é um promotor do tipo 3 da RNApolimerase III.

74. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer umadas reivindicações 67 a 73, caracterizada pelo fato de quea FucT citada é um polipeptídeo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo de consiste em:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 3; e(b) seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, em que opolipeptídeo citado tem atividade de FucT.

75. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 74, caracterizada pelo fato de que a primeiraseqüência de nucleotídeos citada compreende uma seqüênciaselecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ IDNO: 1 ou um complemento desta;(b) seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ IDNO: 2 ou um complemento desta;(c) seqüência de nucleotídeos que tenha pelo menos90% de identidade de seqüência com a seqüência doitem anterior (a) ou (b); e(d) fragmento da seqüência de nucleotídeos dequalquer um dos itens anteriores de (a) até (c) ,em que o fragmento citado compreende pelo menos-75 nucleotídeos contíguos da seqüência denucleotídeos citada.

76. Construção de nucleotídeos caracterizada pelo fato deque compreende um polinucleotídeo de fusão que é capaz deinibir a expressão ou função de uma ai,3-fucosiltransferase(FucT) e uma βΐ,2-xilosiltransferase (XylT) na plantaaquática ou célula ou nódulo de planta aquática citados, emque o polinucleotídeo de fusão citado está operacionalmenteligado a um promotor que é funcional em uma célula deplanta, o polinucleotídeo de fusão citado compreendendo naorientação 5' para 3' e ligados operacionalmente:(a) fragmento de sentido direto quimérico, ofragmento de sentido direto quimérico citadocompreendendo.: (i) primeiro fragmento compreendendo cerca de-500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguostendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotídeosde cerca de 500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo quecodifique a FucT citada; e(ii) segundo fragmento compreendendo cerca de 500a cerca de 650 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüênciacom uma seqüência de nucleotídeos de cercade 500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguosde um polinucleotídeos que codifique a XylTcitada;(b) seqüência de espaçamento compreendendo umfragmento do polinucleotídeo citado que codifiquea XylT citada, o fragmento citado tendo cerca de-200 a cerca de 700 nucleotídeos de comprimento;(c) e um fragmento de sentido reverso, o fragmento desentido reverso citado tendo comprimentosuficiente e complementaridade suficiente aofragmento de sentido direto quimérico citado talque o polinucleotideo de fusão citado étranscrito como uma molécula de RNA capaz deformar uma estrutura hairpin de RNA.

77. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 76, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto quimérico citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência ao complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado.

78. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 76 ou 77, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada compreende cerca de 200 a-700 nucleotideos imediatamente a jusante do segundofragmento do fragmento de sentido direto quimérico citado.

79. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 76 a 78, caracterizada pelo fato de quea FucT citada é um polipeptideo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 3; e(b) seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, em que opolipeptideo citado tem atividade de FucT.

80. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 76 a 79, caracterizada pelo fato de quea XylT citada é um polipeptideo que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consisteem:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 6 ou SEQ ID NO: 21; e(b) seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ IDNO: 21, em que o polipeptideo citado tematividade de XylT.

81. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 76, caracterizada pelo fato de que o primeirofragmento citado compreende cerca de 500 a cerca de 650nucleotideos contíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com uma seqüência de nucleotideos de cerca de-500 a cerca de 650 nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 1;e o segundo fragmento citado compreende cerca de 500 acerca de 650 nucleotideos contíguos tendo pelo menos 90% deidentidade de seqüência com uma seqüência de nucleotideosde cerca de 500 a cerca de 650 nucleotideos contíguos daSEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19.

82. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 81, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto quimérico citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado.

83. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 81 ou 82, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto quimérico citado compreende:(a) nucleotideos (nt) 254-855 da SEQ ID NO: 1 e nt-318-943 da SEQ ID NO: 4; ou(b) nucleotideos (nt) 254-855 da SEQ ID NO: lentl--626 da SEQ ID NO: 19.

84. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 81 a 83, caracterizada pelo fato de quea seqüência de espaçamento citada compreende um fragmentode nucleotideos da seqüência apresentada na SEQ ID NO: 4 ouSEQ ID NO: 19.

85. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 84, caracterizada pelo fato de que ofragmento de nucleotideos citado compreende cerca de 200 a-700 nucleotideos imediatamente a jusante do segundofragmento do fragmento de sentido direto quimérico citado.

86. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 85, caracterizada pelo fato de que:(a) o fragmento de sentido direto quimérico citadocompreende nt 254-855 da SEQ ID NO: 1 e nt 318-943 da SEQ ID NO: 4 e a seqüência de espaçamentocitada compreende nt 944-1443 da SEQ ID NO: 4; ou(b) o fragmento de sentido direto quimérico citadocompreende nt 254-855 da SEQ ID NO: 1 e nt 1-626da SEQ ID NO: 19 e a seqüência de espaçamentocitada compreende nt 627-1126 da SEQ ID NO: 19.

87. Construção de nucleotideos, caracterizada pelo fato deque compreende um polinucleotideo de fusão que é capaz deinibir a expressão ou função de uma αϊ,3-fucosiltransferase(FucT) e uma βΐ,2-xilosiltransferase (XylT) na plantaaquática ou célula ou nódulo de planta aquática citados, emque o polinucleotideo de fusão citado está operacionalmenteligado a um promotor que é funcional em uma célula deplanta, o polinucleotideo de fusão citado compreendendo naorientação 5' para 3' e ligados operacionalmente:(a) fragmento de sentido direto quimérico, ofragmento de sentido direto quimérico citadocompreendendo:) primeiro fragmento compreendendo cerca de-500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguostendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotídeosde cerca de 500 a cerca de 650 nucleotídeoscontíguos de um polinucleotídeo quecodifique a XylT citada; ei) segundo fragmento compreendendo cerca de 500a cerca de 650 nucleotídeos contíguos tendopelo menos 90% de identidade de seqüênciacom uma seqüência de nucleotídeos de cercade 500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguosde um polinucleotídeos que codifique a FucTcitada;seqüência de espaçamento compreendendo umfragmento do polinucleotídeo citado que codifiquea FucT citada, o fragmento citado tendo cerca de-200 a cerca de 700 nucleotídeos de comprimento; efragmento de sentido reverso, o fragmento desentido reverso citado tendo comprimentosuficiente e complementaridade suficiente aofragmento de sentido direto quimérico citado talque o polinucleotídeo de fusão citado étranscrito como uma molécula de RNA capaz deformar uma estrutura hairpin de RNA.

88. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 87, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto quimérico citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado.

89. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 87 ou 88, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada compreende cerca de 200 a700 nucleotídeos imediatamente a jusante do segundofragmento do fragmento de sentido direto quimérico citado.

90. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer umadas reivindicações 87 a 89, caracterizada pelo fato de quea FucT citada é um polipeptídeo que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consisteem:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 3; e(b) seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, em que opolipeptídeo citado tem atividade de FucT.

91. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer umadas reivindicações 87 a 90, caracterizada pelo fato de quea XylT citada é um polipeptideo que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consisteem:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 6 ou SEQ ID NO: 21; e(b) seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%de identidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ IDNO: 21, em que o polipeptideo citado tematividade de XylT.

92. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 87, caracterizada pelo fato de que o primeirofragmento citado compreende cerca de 500 a cerca de 650nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de identidadede seqüência com uma seqüência de nucleotídeos de cerca de-500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 4ou SEQ ID NO: 19; e o segundo fragmento citado compreendecerca de 500 a cerca de 650 nucleotídeos contíguos tendopelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüênciade nucleotídeos de cerca de 500 a cerca de 650 nucleotídeoscontíguos da SEQ ID NO: 1.

93. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 92, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto quimérico citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretoquimérico citado.

94. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 92 ou 93, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada compreende um fragmento denucleotideos da seqüência apresentada na SEQ ID NO: 1.

95. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 94, caracterizada pelo fato de que ofragmento de nucleotideos citado compreende cerca de 200 a 700 nucleotideos imediatamente a jusante do segundofragmento de sentido direto quimérico citado.

96. Construção de nucleotideos, caracterizada pelo fato deque compreende uma primeira seqüência de polinucleotideosque é capaz de inibir a expressão ou função de uma al,3-fucosiltransferase (FucT) em uma planta, em que a primeiraseqüência de polinucleotideos citada compreende naorientação 5' para 3' e operacionalmente ligados:(a) fragmento de sentido direto de FucT, o fragmentode sentido direto de FucT citado compreendendocerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotideos decerca de 500 a cerca de 800 nucleotídeoscontíguos de um polinucleotídeo que codifique aFucT citada;(b) seqüência de espaçamento compreendendo umfragmento do polinucleotídeo citado codificando aFucT citada, o fragmento citado tendo cerca de-200 a cerca de 700 nucleotídeos de comprimento;e; e(c) fragmento de sentido reverso de FucT, o fragmentode sentido reverso de FucT citado tendocomprimento suficiente e complementaridadesuficiente ao fragmento de sentido direto de FucTcitado tal que a primeira seqüência depolinucleotídeos citada é transcrita como umamolécula de RNA capaz de formar uma estruturahairpin de RNA;em que a primeira seqüência de polinucleotídeos citadaestá operacionalmente ligada a um promotor que éfuncional em uma célula de planta.

97. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 96, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de FucT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de FucT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretode FucT citado.

98. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 96 ou 97, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada dentro da primeiraseqüência de polinucleotideos citada compreende cerca de200 a 700 nucleotideos imediatamente a jusante do fragmentode sentido direto de FucT citado.

99. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 96, caracterizada pelo fato de que a FucTcitada é um polipeptideo que compreende uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 3; e(b) seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, em que opolipeptideo citado tem atividade de FucT.

100. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 99, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de FucT citado compreende cercade 500 a cerca de 800 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência denucleotideos de cerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO: 2.

101. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 100, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de FucT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de FucT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretode FucT citado.

102. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 100 ou 101, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de FucT citado compreendenucleotideos (nt) 255-985 da SEQ ID NO: 1.

103. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato deque a seqüência de espaçamento da primeira seqüência depolinucleotídeos citada compreende um fragmento denucleotideos da seqüência apresentada na SEQ ID NO: 1.

104. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 103, caracterizada pelo fato de que ofragmento de nucleotideos citado da seqüência apresentadana SEQ ID NO: 1 compreende cerca de 200 a 700 nucleotideosimediatamente a jusante do fragmento de sentido direto deFucT citado.

105. Construção de nucleotídeos de acordo com areivindicação 104, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada compreende nt 986-1444 daSEQ ID NO: 1.

106. Construção de nucleotídeos, caracterizada pelo fato deque compreende uma primeira seqüência de polinucleotídeosque é capaz de inibir a expressão ou função de uma β1,2-xilosiltransferase (XylT) em uma planta, em que a primeiraseqüência de polinucleotídeos citada compreende naorientação 5' para 3' e operacionalmente ligados:(a) fragmento de sentido direto de XylT, o fragmentode sentido direto de XylT citado compreendendocerca de 500 a cerca de 800 nucleotídeoscontíguos tendo pelo menos 90% de identidade deseqüência com uma seqüência de nucleotídeos decerca de 500 a cerca de 800 nucleotídeoscontíguos de um polinucleotídeo que codifique aXylT citada;(b) seqüência de espaçamento compreendendo umfragmento do polinucleotídeo citado codificando aXylT citada, o fragmento citado tendo cerca de-200 a cerca de 700 nucleotídeos de comprimento; e(c)fragmento de sentido reverso de XylT, o fragmentode sentido reverso de XylT citado tendocomprimento suficiente e complementaridadesuficiente ao fragmento de sentido direto de XylTcitado tal que a primeira seqüência depolinucleotideos citada é transcrita como umamolécula de RNA capaz de formar uma estruturahairpin de RNA;em que a primeira seqüência de polinucleotideos citadaestá operacionalmente ligada a um promotor que éfuncional em uma célula de planta.

107. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 106, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de XylT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de XylT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretode XylT citado.

108. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 106 ou 107, caracterizada pelo fato de que aseqüência de espaçamento citada dentro da primeiraseqüência de polinucleotideos citada compreende cerca de 200 a 700 nucleotideos imediatamente a jusante do fragmentode sentido direto de XylT citado.

109. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 106, caracterizada pelo fato de que a XylTcitada é um polipeptideo que compreende uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ IDNO: 6 ou SEQ ID NO: 21; e(b) seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüência deaminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ IDNO: 21, em que o polipeptideo citado tematividade de XylT.

110. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 109, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de XylT citado compreende cercade 500 a cerca de 800 nucleotideos contíguos tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência denucleotideos de cerca de 500 a cerca de 800 nucleotideoscontíguos da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19 ouSEQ ID NO: 20.

111. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 110, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido reverso de XylT citado compreende ocomplemento do fragmento de sentido direto de XylT citadoou uma seqüência que tenha pelo menos 90% de identidade deseqüência com o complemento do fragmento de sentido diretode XylT citado.

112. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 110 ou 111, caracterizada pelo fato de que ofragmento de sentido direto de XylT citado compreendenucleotideos nt 318-1052 da SEQ ID NO: 4 ou nt 1-734 da SEQID NO: 19.

113. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 110 a 112, caracterizada pelo fato deque a seqüência de espaçamento da primeira seqüência depolinucleotideos citada compreende um fragmento denucleotideos da seqüência apresentada na SEQ ID NO: 4 ouSEQ ID NO: 19.

114. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 113, caracterizada pelo fato de que ofragmento de nucleotideos citado da seqüência apresentadana SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 19 compreende cerca de 200 a-700 nucleotideos imediatamente a jusante do fragmento desentido direto de XylT citado.

115. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 114, caracterizada pelo fato de:(a) o fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nt 318-1052 da SEQ ID NO: 4 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt1053-1599 da SEQ ID NO: 4; ou(b) o fragmento de sentido direto de XylT citadocompreende nt 1-734 da SEQ ID NO: 19 e aseqüência de espaçamento citada compreende nt-735-1282 da SEQ ID NO: 19.

116. Construção de nucleotideos de acordo com qualquer umadas reivindicações 49 a 115, caracterizada pelo fato de quecompreende adicionalmente pelo menos um polinucleotideo quecodifique um polipeptideo de interesse, em que opolinucleotideo citado que codifica o polipeptideo deinteresse citado está operacionalmente ligado a um promotorque é funcional em uma célula de planta.

117. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 116, caracterizada pelo fato de que opolipeptideo de interesse citado é um polipeptideo demamíferos.

118. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 117, caracterizada pelo fato de que opolipeptideo de mamíferos citado é um anticorpo monoclonal.

119. Construção de nucleotideos de acordo com areivindicação 117, caracterizada pelo fato de que opolipeptideo de mamíferos citado é selecionado do grupo queconsiste em interferon, eritropoetina (EPO), ativador deplasminogênio tecidual (tPA), plasminogênio, fatores decoagulação sangüínea, fator estimulante de colônia degranulócito-macrófago (GM-CSF), e imunoglobulinasterapêuticas.

120. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende aconstrução de nucleotideos como definida em qualquer umadas reivindicações 49 a 119.

121. Planta ou célula de planta, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de nucleotideos como definidaem qualquer uma das reivindicações 49 a 119, integrada aoseu genoma de maneira estável.

122. Planta ou célula de planta de acordo com areivindicação 121, caracterizada pelo fato de que a plantacitada é uma monocotiledônea ou a célula de planta citada éde uma monocotiledônea.

123. Planta ou célula de planta de acordo com areivindicação 122, caracterizada pelo fato de que amonocotiledônea citada é um membro da família Lemnaceae.

124. Planta ou célula de planta de acordo com areivindicação 123, caracterizada pelo fato de que amonocotiledônea citada é um membro de um gênero selecionadodo grupo que consiste no gênero Spirodela, gênero Nolffia,gênero Wolfiella, gênero Landoltia, e gênero Lemna.

125. Planta ou célula de planta de acordo com areivindicação 124, caracterizada pelo fato de que amonocotiledônea citada é um membro de uma espécieselecionada do grupo que consiste em Lemna minor, Lemnaminiscula, Lemna aequinoctialis, e Lemna gibba.

126. Planta ou célula de planta de acordo com areivindicação 121, caracterizada pelo fato de que a plantacitada é uma dicotiledônea ou a célula de planta citada éde uma dicotiledônea.

127. Método para transformar de maneira estável uma plantasuperior para expressar glicoproteinas que tenham um padrãode ΛΓ-glicosilação alterado, caracterizado pelo fato de quecompreende introduzir na planta superior citada aconstrução de nucleotideos como definida em qualquer umadas reivindicações 50 a 95.

128. Método de acordo com a reivindicação 127,caracterizado pelo fato de que a planta superior citada éuma planta hospedeira que expressa pelo menos umpolipeptideo heterólogo de interesse.

129. Método de acordo com a reivindicação 128,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo heterólogo deinteresse citado é um polipeptideo de mamíferos ou umavariante biologicamente ativa deste.

130. Método de acordo com a reivindicação 129,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo de mamíferoscitado é um anticorpo monoclonal.

131. Método de acordo com a reivindicação 129,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo de mamíferoscitado é selecionado do grupo que consiste em interferon,eritropoetina (EPO), ativador de plasminogênio tecidual(tPA), plasminogênio, fatores de coagulação sangüínea,fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago(GM-CSF), e imunoglobulinas terapêuticas.

132. Método para transformar de maneira estável uma plantasuperior para expressar um polipeptídeo heterólogo deinteresse que tenha um padrão de W-glicosilação alterado,caracterizado pelo fato de que compreende introduzir naplanta superior citada a construção de nucleotídeos comodefinida em qualquer uma das reivindicações 116 a 119.

133. Método de acordo com a reivindicação 132,caracterizado pelo fato de que o padrão de N-glicosilação édefinido por uma redução na ligação de resíduos deal,3-fucose às W-glicanas ligadas ao polipeptídeoheterólogo citado.

134. Método de acordo com a reivindicação 132,caracterizado pelo fato de que o padrão de W-glicosilação édefinido por uma redução na ligação de resíduos de β1,2-xilose às N-glicanas ligadas ao polipeptídeo heterólogocitado.

135. Método de acordo com a reivindicação 132,caracterizado pelo fato de que o padrão de N-glicosilação édefinido por uma redução na ligação de resíduos de ai, 3-fucose e resíduos de ß1,2-xilose às N-glicanas ligadas aopolipeptideo heterólogo citado.

136. Método para produzir glicoproteína heteróloga demamíferos em uma planta superior, em que a glicoproteínaheteróloga de mamíferos citada têm uma redução na ligaçãode resíduos de a1,3-fucose e ß1,2-xilose às N-glicanas daglicoproteína citada quando produzida na planta superiorcitada, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introduzir na planta citada um cassete deexpressão compreendendo uma seqüência quecodifique um polipeptideo de mamíferos que éprocessado pós-traducionalmente como aglicoproteína citada, e um polinucleotídeo quecompreenda a construção de nucleotídeos comodefinida em qualquer uma das reivindicações 50 a79; e(b) cultivar a planta citada sob condições favoráveisà expressão da glicoproteína citada.

137. Método de acordo com a reivindicação 136,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo de mamíferoscitado é um anticorpo monoclonal.

138. Método de acordo com a reivindicação 136,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo de mamíferoscitado é selecionado do grupo que consiste em interferon,eritropoetina. (EPO), ativador de plasminogênio tecidual(tPA), plasminogênio, fatores de coagulação sangüínea,fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago(GM-CSF), e imunoglobulinas terapêuticas.

139. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-127 a 138, caracterizado pelo fato de que a planta superiorcitada é uma monocotiledônea.

140. Método de acordo com a reivindicação 139,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éum membro da família Lemnaceae.

141. Método de acordo com a reivindicação 140,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éde um gênero selecionado do grupo que consiste no gêneroSpirodela, gênero Wolffiar gênero Wolfiellar gêneroLandoltiar e gênero Lemna.

142. Método de acordo com a reivindicação 141,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éum membro de uma espécie selecionada do grupo que consisteem Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, eLemna gibba.

143. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-127 a 138, caracterizado pelo fato de que a planta superiorcitada é uma dicotiledônea.

144. Método para reduzir a heterogeneidade do padrão de N-glicosilação de uma glicoproteina produzida em uma plantasuperior, caracterizado pelo fato de que compreendeintroduzir na planta citada a construção de nucleotideoscomo definida em qualquer uma das reivindicações 50 a 99, ecultivar a planta citada sob condições favoráveis àexpressão da glicoproteina citada.

145. Método de acordo com a reivindicação 144,caracterizado pelo fato de que a glicoproteina citada é umaglicoproteina endógena.

146. Método de acordo com a reivindicação 144,caracterizado pelo fato de que a glicoproteina citada é umaglicoproteina heteróloga.

147. Método de acordo com a reivindicação 146,caracterizado pelo fato de que a glicoproteina heterólogacitada é uma glicoproteina de mamíferos.

148. Método de acordo com a reivindicação 147,caracterizado pelo fato de que a glicoproteina de mamíferoscitada é um anticorpo monoclonal.

149. Método de acordo com a reivindicação 147,caracterizado pelo fato de que a glicoproteina de mamíferoscitada é selecionada do grupo que consiste em interferon,eritropoetina (EPO), ativador de plasminogênio tecidual(tPA), plasminogênio, fatores de coagulação sangüínea,fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago(GM-CSF), e imunoglobulinas terapêuticas.

150. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-144 a 149, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90%das N-glicanas no perfil citado são GlcNAc2Man3GlcNAc2(GO) , e em que o perfil citado é desprovido de espécies N-glicanas que tenham fucose, xilose, ou ambos fucose exilose ligados a este.

151. Método de acordo com a reivindicação 150,caracterizado pelo fato de que pelo menos 95% das N-glicanas no perfil citado são GO.

152. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-144 a 151, caracterizado pelo fato de que a planta superiorcitada é uma monocotiledônea.

153. Método de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éum membro da família Lemnaceae.

154. Método de acordo com a reivindicação 153,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éde um gênero selecionado do grupo que consiste no gêneroSpirodela, gênero Wolffiar gênero Wolfiella, gêneroLandoltia, e gênero Lemna.

155. Método de acordo com a reivindicação 154,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éum membro de uma espécie selecionada do grupo que consisteem Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, eLemna gibba.

156. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações153 a 155, caracterizado pelo fato de que a heterogeneidadereduzida do perfil de N-glicosilação citado é mantida comaumento de escala na produção da planta citada, em que aescala de produção é aumentada em pelo menos 6500 vezes.

157. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-153 a 156, caracterizado pelo fato de que a heterogeneidadereduzida do perfil de N-glicosilação citado é mantida com ocultivo clonal continuo da planta citada.

158. Método de acordo com a reivindicação 157,caracterizado pelo fato de que a heterogeneidade reduzidado perfil de N-glicosilação citado é mantida com o cultivoclonal continuo da planta citada por pelo menos 8 meses.

159. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-144 a 151, caracterizado pelo fato de que a planta superiorcitada é uma dicotiledônea.

160. Método para reduzir um ou mais efeitos adversosrelacionados a ativação de complemento com administração deum anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar o anticorpo citado na forma de uma composiçãode anticorpos consideravelmente homogênea, em que pelomenos 90% dos anticorpos citados presentes na composiçãosão representados pela forma glicosilada GO, a composiçãocitada compreendendo uma quantidade traço do anticorposcitados representados por uma forma glicosilada precursora,em que os anticorpos citados na composição citada têmatividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC)diminuída.

161. Método de acordo com a reivindicação 160,caracterizado pelo fato de que o anticorpo citado é umanticorpo monoclonal.

162. Método de acordo com a reivindicação 161,caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonalcitado se liga a antígeno CD20.

163. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 162, caracterizado pelo fato de que o anticorpocitado mostra uma afinidade de ligação por FcyRIIIaumentada.

164. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpocitado mostra uma atividade de citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC) aumentada.

165. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma glicoproteína produzida pelo o método como definido emqualquer uma das reivindicações 136 a 159.