RS62463B1 - Postupci za unapređivanje odgovora t ćelija - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA:

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antagoniste humanog CLEC-1 za upotrebu u lečenju kancera, putem unapređivanja odgovora T ćelija.

OSNOV PRONALASKA:

[0002] Kancer predstavlja veliki problem jer je vodeći uzrok smrti širom sveta, sa 8.2 miliona smrtnih slučajeva u 2012 (world cancer report, 2014, World Health Organization). Na primer, kancer je drugi najčešći uzrok smrtnosti u SAD, koji nadmašuju samo srčane bolesti, i ogovoran je za 1 od svaka 4 smrtna ishoda (cancer facts and figures 2015, American Cancer Society). Uprkos brojnim načinima lečenja koji trenutno postoje, i dalje postoji potreba za poboljšanim postupkom za lečenje kancera.

[0003] Odgovori T ćelija predstavljaju ključni element antitumorskih imunskih odgovora. Antitumorski T-ćelijski odgovor i dalje je slabo poznat, ali je nekoliko studija pokazalo da odgovori citotoksičnih ćelije CD8 tipa i pomoćnićkih ćelija CD4 tipa igra ključnu ulogu (Motz, GT i Coukos, G (2013). Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity 39: 61-73) (Bos, R i Sherman, LA (2010). CD4<+>T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+ T lymphocytes. Cancer Res 70: 8368-8377) (Tosolini, M, et al. (2011). Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells (Th1, Th2, Treg, Th17) in patients with colorectal cancer. Cancer Res 71: 1263-1271). Šta više, Th17 ćelije pokreću antitumorske imunske odgovore na taj način što regrutuju imunske ćelije u tumore, aktiviraju efektorske CD8+ T ćelije, ili čak direktno, tako što se preobražavaju ka Th1 fenotipu i proizvode IFN-y (Th17 Cell Plasticity and Functions in Cancer Immunity, Leslie Guéry i Stéphanie Hugues, BioMed Research International, Volume 2015 (2015)).

[0004] Među naperspektivnijim pristupima za aktivaciju terapeutske antitumorske imunosti je blokada imunoloških kontorolnih tačaka. Imunološke kontrolne tačke odnose se na mnoštvo inhibitornih signalnih puteva povezanih sa imunim sistemom koji su od suštinskog značaja za održavanje autotolerancije i za maksimalno smanjenje kolateralnog oštećenja tkiva. Sada je već jasno da tumori usvajaju neke signalne puteve imunoloških kontrolnih tačaka posebno preko mijeloidnih ćelija kao glavnog mehanizma imunološke rezistencije (Couzin-Frankel 2013; De Henau, Rausch et al. 2016). Nekoliko poslednjih godina, dokazi koji se nakupljaju pokazuju da tumori koriste fiziološke procese inhibitornih lektinskih receptora C tipa (CLR receptori) naročito one uključene u zarastanje rana, kako bi suprimirali aktivaciju mijeloidnih ćelija i pospešili izbegavanje imunog sistema. CLR receptori imaju jedinstvenu sposobnost da prepoznaju poremećenu glikozilaciju od strane tumorskih ćelija ali i raznovrsnije ligande kao što su lipidi, proteini ili DAMP markeri koje oslobađaju umiruće ćelije (Geijtenbeek i Gringhuis 2009; Yan, Kamiya et al. 2015). Nekoliko eksperimentalnih studija pokazuje da CLR receptori doprinose progresiji kancera i metastatskom širenju tumora putem svog funkcionisanja u ćelijskoj adheziji ili u oblikovanju T-ćelijskog odgovora (Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). Na primer, pokazano je da imunomodulatorni receptori DC-SIGN, MINCLE, DCIR i BDCA-2 inhibiraju aktivaciju mijeloidnih ćelija, inflamaciju i da su neizostavni za pokretanje ekspanzije Foxp3+ CD4<+>CD25+ Treg ćelija (Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). DC-SIGN prepoznaje karcinoembrionski antigen koji je prekomerno eksprimiran na skoro svim ljudskim karcinomima (Nonaka, Ma et al.2008) i pospešuje sekreciju imunosupresivnih citokina IL-10 i IL-6 od strane mijeloidnih ćelija. Osim toga, utvrđeno je da su polimorfizmi u promotoru gena DC-SIGN u vezi sa povećanim rizikom kod pacijenata sa kolorektalnim kancerom (Lu, Bevier et al. 2013). Pokazano je da se ekspresija MINCLE pojačava kod leukocita koji se infiltriraju u tumore, kod pankreasnog duktalnog adenokarcinoma i naročito od strane supresivnih mijeloidnih ćelija (MSC ćelije). Ligacija MINCLE sa SAP130 (subjedinica kompleksa histonske deacetilaze) koji se oslobađa iz umirućih ćelija, indukuje snažnu peritumorsku supresiju (Seifert, Werba et al. 2016). Slično tome, pokazano je da je CLR LOX-1 pojačano prisutan specifično na površini neutrofila u krvi i neutrofila koji se infiltriraju u tumore (15 do 50%) kod pacijenata sa kancerom, dok ga je skoro nemoguće detektovati u krvi zdravih davalaca (Condamine, Dominguez et al. 2016). U ovoj studiji, oni su pokazali da stres endoplazmatičnog retikuluma indukuje ekspresiju LOX-1 i prevodi neutrofile u MSC ćelije sa snažnom supresivnom funkcijom.

Nasuprot tome, pokazano je da pokretanje signalizacije aktivacionih CLR receptora, kao što je DECTIN-1, jača antitumorski imunitet i smanjuje Treg i MSC ćelije (Tian, Ma et al. 2013). Primena beta-glukana, koji su ligandi za DECTIN-1 inhibira rast tumora u mišjim modelima karcinoma (Li, Cai et al. 2010; Masuda, Inoue et al. 2013; Tian, Ma et al. 2013), u ksenograft modelima melanoma, neuroblastoma i limfoma (Modak, Koehne et al. 2005) kod ljudi, kao u kanceru jajnika i želuca kod ljudi (Inoue, Tanaka et al.1993; Oba, Kobayashi et al.2009).

Dakle, ciljano delovanje na inhibitorne CLR receptore koji se naročito indukuju u ovom mikrookruženju, predstavlja perspektivnu terapeutsku strategiju za pojačavanje aktivacije mijeloidnih ćelija i antitumorske imunosti.

[0005] U prošlosti su pronalazači utvrdili da lektinski receptor-1 C tipa (CLEC-1) ima povišenu ekspresiju u modelu tolerancije na alograft kod glodara (Thebault, Lhermite et al.2009). CLEC-1 pripada DECTIN-1 klasteru lektinskih receptora C tipa (Plato, Willment et al. 2013), a premda su odavno identifikovani, njihovi ligandi i signalni putevi i dalje nisu okarakterisani. CLEC-1 pripada DECTIN-1 klasteru CTLR receptora, uključujući CLEC-2, DECTIN-1, CLEC-9A, MICL, MAH i LOX-1, i iako su odavno identifikovani (Colonna M, Samaridis J, Angman L. Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors, one of which is selectively expressed in human dendritic cells. Eur J Immunol. 2000;30(2):697-704), njihovi ligandi, nizvodni signalni putevi i biološko delovanje i dalje nisu okarakterisani. CLEC- 1 ne sadrži imunoreceptorski tirozinski aktivacioni (ITAM) ili inhibitorni (ITIM) motiv u citoplazmatskom repu, nego tirozinski ostatak u neokarakterisanoj signalnoj sekvenci (Flornes LM, Nylenna O, Saether PC, Daws MR, Dissen E, Fossum S. The complete inventory of receptors encoded by the rat natural killer cell gene complex. Immunogenetics. 2010;62(8):521 530). Međutim, nepoznato je da li ovaj motiv podleže fosforilaciji ili da li CLEC-1 za stabilnu ekspresiju i signalizaciju zahteva, kao i drugi CTLR receptori, adapterski lanac. CLEC-1 sadrži takođe kao i Dectin-1, DC-SIGN ili CLEC-2 trokiselinski motiv [DDD]. Interesantno, za Dectin-1 je pokazano da ovaj trokiselinski motiv modulira aktivnost Raf-1 i da suprimira NF-κB signalni put zavisan od proteina 9 koji sadrži domen za regrutovanje kaspaze (Card9) indukovan od strane najvećeg broja CTLR receptora, tako da reprogramira set sekretovanih citokina i balansira nizvodnu diferencijaciju Th1 i Th17 ćelija (Gringhuis SI, den Dunnen J, Litjens M, et al. Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk. Nat Immunol. 2009;10(2):203-213). Ekspresija, regulacija, i funkcionisanje proteina CLEC-1 kod ljudi je veoma slabo opisano do sada. Postoji samo jedna publikacija o ekspresiji CLEC-1 koja prikazuje da CLEC-1 može da se detektuje samo unutar endotelnih ćelija, pri čemu obrazac bojenja liči na proteine endoplazmatičnog retikuluma, kao i da ni TGF-β ni inflamatorni stimulusi ne mogu da promovišu značajnu translokaciju na ćelijsku površinu (The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment. Sattler et al., ScandJImmunol. 2012 Mar;75(3):282-92). Dakle, jedina informacija koja postoji u stanju tehnike u vezi sa hCLEC-1 (tj. unutarćelijska lokalizacija u endotelskim ćelijama) u suprotnosti je sa onim što se zna o pacovima (tj.; rCLEC-1 lokalizovan na površini endotelnih i mijeloidnih ćelija).

[0006] Ovi pronalazači su po prvi put pokazali da je CLEC-1 eksprimiran na površini konvencionalnih DC ćelija (cDC) kao i male podgrupe monicita i DC ćelija u ljudskoj krvi i da se ekspresija pojačava pomoću imunosupresivnog citokina TGFβ. Oni su pokazali, i kod glodara, i kod ljudi, da CLEC-1 deluje kao inhibitorni receptor u mijeloidnim ćelijama i da sprečava ekspresiju IL12p40 i nizvodne Th1 i Th17 odgovore in vivo.

[0007] Takođe su pokazali da se proliferacija T ćelija i IFN-gama kod ljudi povećavaju kada se anti-hCLEC-1 antitela koriste kao antagonisti CLEC-1. Pokazali su i da su miševi deficijentni za CLEC-1 otporniji na rast tumora i da pokazuju povećanu stopu preživljavanja u mišjem modelu hepatokarcinoma. Pronalazači su pokazali da CLEC-1 kod ljudi eksprimiraju pro-tumorski makrofagi M2 tipa, mijeloidne ćelije iz pleuralnog izliva mezotelioma i iz ascita tumora jajnika. Dakle, CLEC-1 kao receptor na površini ćelija može da predstavlja korisni terapeutski alat za poboljšavanje anti-tumorske imunosti u kliničkom okruženju.

KRATAK OPIS PRONALASKA:

[0008] Predmetni pronalazak se odnosi na antagoniste ljudskog CLEC-1 za upotrebu u lečenju kancera, time što unapređuju odgovor T ćelija. Konkretno, pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

DETALJAN OPIS PRONALASKA:

[0009] Iznenađujuće, pronalazači su ispitivali ekspresiju i funkcionisanje CLEC-1 u ljudskim DC ćelijama i pokazali su, po prvi put, ekspresiju na površini ćelija. Pronalazači su takođe pokazali kod ljudi, da h-CLEC-1 eksprimiraju pro-tumorski makrofagi M2 tipa, mijeloidne ćelije iz pleuralnog izliva mezotelioma i iz ascita tumora jajnika. Istraživali su njegovu funkcionalnu ulogu, nakon pokretanja, u orkestraciji odgovora T-ćelija.

[0010] Osim toga, istraživali su in vitro i in vivo, na pacovima deficijentnim za CLEC-1 i fuzionim proteinom CLEC-1 Fc pacova, posledice poremećene signalizacije CLEC-1 na funkcionisanje DC ćelija i nizvodnu T-ćelijsku imunost. Poremećaj signalizacije CLEC-1 pojačava in vitro aktivaciju Th17, a in vivo pojačava prajming T ćelija i aktivaciju Th17 i Th1. Njihovi rezultati jasno ukazuju na to da CLEC-1 u DC ćelijama inhibira stepen i kvalitet nizvodne aktivacije Th17 i Th1 ćelija i da kao receptor na površini ćelija može da obezbedi terapeutski alat za manipulaciju odgovorom T ćelija.

Pronalazači su takođe pokazali da se proliferacija humanih T ćelija i humani IFN gama povećavaju kada se anti-hCLEC-1 antitela koriste kao antagonisti CLEC-1. Takođe su pokazali da su miševi deficijentni za CLEC-1 otporniji na rast tumora i da pokazuju povećanu stopu preživljavanja u mišjem modelu hepatokarcinoma. Rezultati pokazuju da CLEC-1 igra ulogu inhibitornog receptora u mijeloidnim ćelijama tako što povećava prag aktivacije. Inaktivacija CLEC-1 povećava proliferaciju T ćelija i polarizaciju kako Th1, tako i Th17.

[0011] Shodno tome, prvi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na antagoniste ljudskog CLEC-1 za upotrebu u lečenju kancera, na taj način što unapređuju odgovor T ćelija kod subjekta kome je to potrebno, uključujući primenu kod subjekta, terapeutski efikasne količine antagonista CLEC-1.

[0012] Upotreba prema pronalasku je upotreba za lečenje subjekta koji pati od kancera.

[0013] Drugi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na kompoziciju, naročito farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži CLEC-1 antagonist prema pronalasku.

[0014] Kako se ovde koristi, izraz "T ćelije" ima svoje opšte značenje u tehnici i odnosi se na T limfocit koji je vrsta limfocita sa T-ćelijskim receptorom na površini ćelije i igra centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu. Kako se ovde koristi, izraz "odgovor T ćelija" odnosi se na bilo koji biološki proces koji uključuje proliferaciju T ćelija i/ili sintezu citokina. Odgovor T ćelija može da se odredi različitim metodama koje su dobro poznate stručnjaku u ovoj oblasti, procenom proliferacije T ćelija i/ili sinteze citokina. U jednom primeru izvođenja, odgovor T ćelija se određuje izvođenjem reakcije mešanih leukocita (MLR) koja se sastoji od prečišćenih T ćelija izolovanih iz periferne krvi i pomešanih sa dendritskim ćelijama, dobijenim od alogenih monocita, koje eksprimiraju CLEC-1. Proliferacija T ćelija može da se proceni razblaživanjem karboksifluorescein sukcinimidil estarom, a ekspresija IFNγ može da se proceni protočnom citometrijom u T ćelijama i ELISA tehnikom u supernatantima.

[0015] Kako se ovde koristi, izraz "subjekt" označava sisara, kao što je glodar, mačka, pas i primat. Poželjno, subjekt prema pronalasku je čovek.

[0016] Izraz "kancer" ima svoje opšte značenje u tehnici i odnosi se na grupu bolesti koje uključuju abnormalni rast ćelija sa potencijalom da napadnu ili se prošire na druge delove tela. Izraz "kancer" dalje obuhvata i primarne i metastatske kancere. Primeri kancera koji mogu da se leče postupcima i kompozicijama prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, ćelije kancera iz bešike, krvi, kostiju, koštane srži, mozga, dojke, debelog creva, jednjaka, gastrointestinalnog trakta, desni, glave, bubrega, jetre, pluća, nazofarinksa, vrata, jajnika, prostate, kože, želuca, testisa, jezika ili materice. Osim toga, kancer specifično može da bude sledećeg histološkog tipa, mada nije ograničen samo na ove tipove: neoplazija, malignitet; karcinom; karcinom, nediferencirani; karcinom džinovskih i vretenastih ćelija; karcinom sitnih ćelija; papilarni karcinom; karcinom skvamoznih ćelija; limfoepitelni karcinom; bazocelularni karcinom; karcinom pilomatriksa; karcinom prelaznih ćelija; papilarni karcinom prelaznih ćelija; adenokarcinom; gastrinom, maligni; holangiokarcinom; hepatocelularni karcinom; kombinovani hepatocelularni karcinom i holangiokarcinom; trabekularni adenokarcinom; adenoidni cistični karcinom; adenokarcinom u adenomatoznom polipu; adenokarcinom, familijalna polipoza koli; čvrsti karcinom; karcinoidni tumor, maligni; bronhiolo-alveolarni adenokarcinom; papilarni adenokarcinom; hromofobni karcinom; acidofilni karcinom; oksifilni adenokarcinom; karcinom bazofila; adenokarcinom jasnih ćelija; karcinom granularnih ćelija; folikularni adenokarcinom; papilarni i folikularni adenokarcinom; neinkapsulirajući skleroti ni karcinom; nadbubrežni kortikalni karcinom; endometroidni karcinom; karcinom pomoćnih organa kože; apokrini adenokarcinom; adenokarcinom lojne žlezde; cerumenski; adenokarcinom; mukoepidermoidni karcinom; cistadenokarcinom; papilarni cistadenokarcinom; papilarni serozni cistadenokarcinom; mukozni cistadenokarcinom; mukozni adenokarcinom; karcinom ćelija pe atnog prstena; infiltracijski karcinom duktusa; medularni karcinom; lobularni karcinom; inflamatorni karcinom; Padžetova bolest, dojke; karcinom acinusnih ćelija; adenoskvamozni karcinom; adenokarcinom sa plo astim metaplazijama; timom, maligni; stromalni tumor jajnika, maligni; tecoma, maligna; tumor granuloza ćelija, maligni; i roblastom, maligni; karcinom Sertolijevih ćelija; tumor Lejdigovih ćelija, maligni; tumor lipidnih ćelija, maligni; paragangliom, maligni; ekstra-mamarni paragangliom, maligni; feohromocitom; glomangiosarkom; maligni melanom; amelaninski melanom; melanom sa površinskim širenjem; maligni melanom u džinovskom pigmentnom nevusu; melanom epitelioidnih ćelija; plavi nevus, maligni; sarkom; fibrosarkom; fibrozni histiocitom, maligni; miksosarkom; liposarkom; lejomiosarkom; rabdomiosarkom; embrionalni rabdomiosarkom; alveolarni rabdomiosarkom; stromalni sarkom; mešoviti tumor, maligni; Milerov mešoviti tumor; nefroblastom; hepatoblastom; karcinosarkom; mezenhimom, maligni; Brenerov tumor, maligni; filodes tumor, maligni; sinovijalni sarkom; mezoteliom, maligni; disgerminoma; embrionalni karcinom; teratom, maligni; struma jajnika, maligna; horiokarcinom; mezonefrom, maligni; hemangiosarkom; hemangioendoteliom, maligni; Kapošijev sarkom; hemangiopericitom, maligni; limfangiosarkom; osteosarkom; jukstakortikalni osteosarkom; hondrosarkom; hondroblastom, maligni; mezenhimalni hondrosarkom; tumor gigantskih ćelija kostiju; Juingov sarkom; odontogeni tumor, maligni; ameloblastni odontosarkom; ameloblastom, maligni; ameloblastni fibrosarkom; pinealom, maligni; hordom; gliom, maligni; ependimom; astrocitom; protoplazmatski astrocitom; fibrilarni astrocitom; astroblastom; glioblastom; oligodendrogliom; oligodendroblastom; primitivni neuroektodermalni; sarkom malog mozga; ganglioneuroblastom; neuroblastom; retinoblastom; olfaktorni neurogeni tumor; meningiom, maligni; neurofibrosarkom; neurilemom, maligni; granularni ćelijski tumor, maligni; maligni limfom; Ho kinova bolest; Ho kinov limfom; paragranuloma; maligni limfom, mali limfocitni; maligni limfom, velikih ćelija, difuzni; maligni limfom, folikularni; mikoza fungoides; drugi navedeni ne-Ho kinovi limfomi; maligna histiocitoza; multipli mijelom; sarkom mastocita; imunoproliferativna bolest tankog creva; leukemija; limfoidna leukemija; leukemija plazma ćelija; eritroleukemija; leukemija ćelija limfosarkoma; mijeloidna leukemija; bazofilna leukemija; eozinofilna leukemija; monocitna leukemija; leukemija mast ćelija; megakarioblastna leukemija; mijeloidni sarkom; i leukemija dlakastih ćelija.

[0017] U nekim primerima izvo enja, subjekt pati od kancera odabranog iz grupe koja se sastoji od kancera žu nih kanala, kancera bešike, kancera kostiju, kancera mozga i centralnog nervnog sistema, kancera dojke, Kaselmanove bolesti, kancera grlića materice, kolorektalnog kancera, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, kancera žu ne kese, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, Ho kinove bolesti, ne-Ho kinovog limfoma, Kapošijevog sarkoma, kancera bubrega, kancera larinksa i hipofarinksa, kancera jetre, kancera pluća, mezotelioma, plazmacitoma, kancera nosne šupljine i paranazalnih sinusa, kancera nazofarinksa, neuroblastoma, kancera usne šupljine i orofarinksa, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera penisa, kancera hipofize, kancera prostate, retinoblastoma, rabdomiosarkoma, kancera pljuva nih žlezda, kancera kože, kancera želuca, kancera testisa, kancer timusa, kancera štitne žlezde, kancera vagine, kancera vulve i kancera materice.

U jednom primeru izvo enja, kancer je kancer jetre.

U jednom primeru izvo enja, kancer je hepatokarcinom.

U jednom primeru izvo enja, kancer je kancer jajnika.

U jednom primeru izvo enja, kancer je gliom.

Kako se ovde koristi, "tretman" ili "le enje" je pristup kojim se dobijaju povoljni ili željeni rezultati uklju ujući klini ke rezultate. Za potrebe ovog pronalaska, povoljni ili željeni klini ki rezultati uklju uju, ali nisu ograni eni na, jedno ili više od sledećeg: ublažavanje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, smanjenje obima bolesti, stabilizacija bolesti (npr. spre avanje ili odlaganje pogoršanja bolesti), spre avanje ili odlaganje širenja bolesti, spre avanje ili odlaganje ponovnog pojavljivanja bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje stanja bolesti, obezbe ivanje remisije (delimi ne ili potpune) bolesti, smanjenje doze jednog ili više drugih lekova potrebnih za le enje bolesti, odlaganje progresije bolesti, povećanje kvaliteta života i/ili produžavanje preživljavanja. Izraz "tretman" obuhvata profilakti ki tretman. Kako se ovde koristi, izraz "spre ava" se odnosi na smanjenje rizika od sticanja ili razvijanja datog stanja. Kako se ovde koristi, izraz "CLEC-1" ima svoje opšte zna enje u oblasti i odnosi se na lektinski receptor C tipa-1, posebno iz sisarskih vrsta, konkretnije, na ljudski CLEC-1. CLEC-1 pripada DECTIN-1 klasteru lektinskih receptora C tipa (CTLR receptora) koji uklju uju CLEC-2, DECTIN-1, CLEC-9A, MICL, MAH i LOX-1.

Poželjno, izraz "ljudski CLEC-1" odnosi se na protein amino kiselinske sekvence ija je referenca Uniprot pristupni broj Q8NC01 i koju kodira CLEC1A gen ija je referenca NCBI pristupni broj 51267. Konkretno, CLEC-1 antagonist je antagonist humanog CLEC-1.

Kako se ovde koristi, izraz "CLEC-1 antagonist" ima svoje opšte značenje u oblasti i odnosi se na bilo koje jedinjenje, prirodno ili sintetičko, koje blokira, suprimira ili smanjuje biološku aktivnost CLEC-1. Konkretno, CLEC-1 antagonist inhibira interakcije između receptora CLEC-1 i najmanje jednog od njegovih liganada, konkretnije i svih njegovih liganada. Konkretnije, CLEC-1 antagonist može da se veže za receptor CLEC-1 ili za bilo koji od njegovih liganada. CLEC-1 antagonist pojačava odgovor T ćelija, naročito povećava proliferaciju T ćelija i/ili sintezu citokina kao što je IFNgama.

Na primer, CLEC-1 antagonist može da se identifikuje sledećim postupkom koji uključuje korake koji se sastoje od:

a) obezbeđivanja većeg broja ćelija koje eksprimiraju CLEC-1 na svojoj površini;

b) inkubacije navedenih ćelija sa jedinjenjem koje je kandidat;

c) utvrđivanja da li se navedeno jedinjenje koje je kandidat vezuje za, i blokira, suprimira ili smanjuje biološku aktivnost CLEC-1 i naročito da li navedeni kandidat unapređuje odgovor T ćelija;

i d) selektovanja jedinjenja koje je kandidat, a koje se vezuje za, i blokira, suprimira ili smanjuje biološku aktivnost CLEC-1 i naročito, unapređuje odgovor T ćelija.

Izraz "mali organski molekul" se odnosi na molekul čija je veličina uporediva sa organskim molekulima koji se u principu koriste u farmaceutskim proizvodima. Izraz isključuje biološke makromolekule (npr., proteine, nukleinske kiseline, itd.). Poželjni mali organski molekuli se kreću u opsegu veličina do oko 5000 Da, konkretnije do oko 2000 Da, i najkonkretnije najviše do oko 1000 Da.

[0018] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist je antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za CLEC-1.

[0019] Kako se ovde koristi, izraz "specifično vezuje za" ili "vezuje specifično" odnosi se na sposobnost antigenskog receptora da se veže za antigen sa afinitetom od najmanje oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M,1 x 10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, 1 x 10<-12>, ili više, i/ili da se veže za ciljni molekul sa afinitetom koji je najmanje dva puta veći od njegovog afiniteta za nespecifični antigen.

Afinitet može da se utvrdi različitim postupcima koje stručnjak u oblasti dobro poznaje. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, Biacore analizu, Blitz analizu i Scatchard plot.

U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku ima KD vrednost koja je manja ili jednaka 10<-8>M, poželjno manja ili jednaka 10<-9>M za CLEC-1, naročito za humani CLEC-1, poželjnije manja od ili jednaka 1. 10<-10>M, kao što može da se odredi biosenzornom analizom, naročito Biacore analizom.

U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist, naročito antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku specifično se vezuje za ekstracelularni domen CLEC-1, naročito humanog CLEC-1.

U jednom primeru izvođenja, amino kiselinska sekvenca ekstracelularnog domena humanog CLEC-1 je YYQLSNTGQDTISQMEERLGNTSQELQSLQVQNIKLAGSLQHVAEKLCRELYNKAGAR CSPCTEQWKWHGDNCYQFYKDSKSWEDCKYFCLSENSTMLKINKQEDLEFAASQSYEF FYSYWTGLLRPDSGKAWLWMDGTPFTSELFHIIIDVTSPRSRDCVAILNGMIFSKDCELK RCVCERRAGMVKPESLHVPPETLGEGD(SEQ ID NO: 1).

U jednom primeru izvođenja, amino kiselinska sekvenca koju prepoznaje antagonist CLEC-1 receptora, naročito anittelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku je CERRAGMVKPESLHVPPETLGEGD(SEQ ID NO:2).

[0020] Kako se ovde koristi, "antitelo" uključuje i antitela koja se javljaju u prirodi, i antitela koja se ne javljaju u prirodi. Konkretno, "antitelo" uključuje poliklonska, monoklonska, rekombinantna (uključujući himerna i humanizovana), bispecifična, multispecifična i modifikovana antitela, kao i njihove monovalentne i dvovalentne antigen-vezujuće fragmente. Dalje, "antitelo" uključuje himerna antitela, potpuno sintetička antitela, jednolančana antitela i njihove fragmente. Antitelo može biti ljudsko ili ne-ljudsko antitelo. Ne-ljudsko antitelo može da bude humanizovano rekombinantnim metodama da bi se smanjila njegova imunogenost kod čoveka.

Kako se ovde koristi, "modifikovano antitelo" odgovara molekulu koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu je pomenuto antitelo ili njegov fragment povezan sa funkcionalno različitim molekulom.

U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, antitelo je potpuno ljudsko monoklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, antitelo je poliklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, antitelo je humanizovano antitelo. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, antitelo je himerno antitelo. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži laki lanac antitela. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži teški lanac antitela. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži Fab deo antitela. U jednom primeru izvođenja

1

antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži F(ab’)2 deo antitela. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži Fc deo antitela. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži Fv deo antitela. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži varijabilni domen antitela. U jednom primeru izvođenja antitela i njihovih delova koji su ovde opisani, deo antitela sadrži jedan ili više CDR domena antitela.

[0021] Antitela se pripremaju u skladu sa konvencionalnom metodologijom. Monoklonska antitela mogu da se generišu postupkom prema autorima Kohler i Milstein (Nature, 256:495, 1975). Da bi se pripremila monoklonska antitela korisna u pronalasku, miš ili druga životinjadomaćin se imunizuje u pogodnim intervalima (npr., dva puta nedeljno, jednom nedeljno, dva puta mesečno ili jednom mesečno) antigenim oblicima CLEC-1. Kod životinje može da se primeni i finalna „udarna“ doza antigena u roku od nedelju dana pre žrtvovanja. Često je poželjno da se tokom imunizacije koristi neki imunološki adjuvans. Pogodni imunološki adjuvansi uključuju Frojndov kompletni adjuvans, Frojndov nekompletni adjuvans incomplete adjuvant, alum, Ribi adjuvans, Hunterov Titermax, saponinski adjuvansi kao što su QS21 ili Quil A, ili imunostimulatorni oligonukleotidi koji sadrže CpG. Drugi pogodni adjuvansi su dobro poznati u oblasti. Životinje mogu da se imunizuju potkožnim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intravenskim, intranazalnim ili drugim putevima. Data životinja može da se imunizuje sa više oblika antigena, višestrukim putevima. Ukratko, rekombinantni CLEC-1 može da bude obezbeđen putem ekspresije u rekombinantnim ćelijskim linijama. Konkretno, CLEC-1 može da bude obezbeđen u obliku ljudskih ćelija koje eksprimiraju CLEC-1 na svojoj površini. Nakon režima imunizacije, limfociti se izoluju iz slezine, limfnog čvora ili drugog organa životinje i fuzionišu sa odgovarajućom ćelijskom linijom mijeloma koristeći sredstvo kao što je polietilen glikol da formiraju hibridom. Nakon fuzije, ćelije se stavljaju u medijum koji dozvoljava rast hibridoma, ali ne i fuzionog partnera, standardnim metodama, kao što je opisano (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996). Nakon gajenja hibridoma, prisustvo antitela željene specifičnosti, tj. onih koja selektivno vezuju antigen, analizira se u ćelijskim supernatantima. Pogodne analitičke tehnike uključuju ELISA test, protočnu citometriju, imunoprecipitaciju i Western blot. Druge tehnike skrininga su dobro poznate u ovoj oblasti. Poželjne tehnike su one koje potvrđuju vezivanje antitela za konformaciono intaktan, izvorno savijen antigen, kao što su nedenaturišući ELISA test, protočna citometrija i imunoprecipitacija.

U jednom primeru izvođenja, antagonist za CLEC-1 je odabran iz grupe koja se sastoji od himernih antitela, humanizovanih antitela i potpuno humanih antitela.

U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku je himerno antitelo, konkretno, himerno mišje/humano antitelo.

Prema pronalasku, izraz " himerno antitelo " odnosi se na antitelo koje sadrži VH domen i VL domen ne-humanog antitela, i CH domen i CL domen humanog antitela.

[0022] U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano antitelo, naročito humanizovano monoklonsko antitelo. Kako se ovde koristi, "humanizovano" opisuje antitela proizvedena u nehumanoj vrsti čije su proteinske sekvence modifikovane tako da se poveća njihova identičnost sa varijantama antitela koje se priprodno proizvode kod ljudi. Budući da su, u skladu s tim, originalno dobijena iz životinja, naročito iz glodara, i konkretno iz pacova, nakon imunizacije životinja i proizvodnje antitela, naročito monoklonskih antitela iz hibridoma, antitela se zatim modifikuju u svojim VH i/ili VL sekvencama, tako što se supstituišu amino kiselinski ostaci u okviru čitanja, i, izborno, dodaju CDR sekvence, kako bi se dobila humanizovana antitela. Konkretno, navedeno humanizovano antitelo ima manje od 10% mutiranih amino kiselinskih ostataka, poželjno jedan ili nijedan amino kiselinski ostatak, kada se CDR regioni pojedinačno razmatraju u odnosu na originalne CDR regione. Postupci za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke opisane u SAD patentima br. 4,816,567, 5,225,539, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 i 5,859,205.

[0023] U nekim primerima izvođenja, antitelo je potpuno humano antitelo, konkretno, potpuno humano monoklonsko antitelo. Potpuno humana monoklonska antitela mogu takođe da se pripremaju i imunizacijom miševa koji su transgeni za velike delove lokusa humanih imunoglobulinskih teških i lakih lanaca. Videti, npr. SAD patente br. 5,591,669, 5,598,369, 5,545,806, 5,545,807, 6,150,584, i reference koje su u njima citirane.

[0024] Ove životinje su genetski modifikovane tako da postoji funkcionalna delecija u proizvodnji endogenih (npr., mišjih) antitela. Životinje su dodatno modifikovane tako da sadrže sve ili deo ljudskog imunoglobulinskog genskog lokusa klicine linije tako da imunuizacija ovih životinja dovodi do proizvodnje potpunih ljudskih antitela na antigen od interesa. Nakon imunizacije ovih miševa (npr., XenoMouse(Abgenix), HuMAb miševi (Medarex/GenPharm)), monoklonska antitela mogu da se pripreme u skladu sa standardnom hibridoma tehnologijom. Ova monoklonska antitela će imati amino kiselinske sekvence humanog imunoglobulina i stoga neće izazvati reakcije humanih anti-mišjih antitela (KAMA) kada se primenjuju kod ljudi. Takođe postoje i in vitro postupci za proizvodnju humanih antitela. Oni uključuju tehnologiju prikaza na fagima (SAD patenti br.5,565,332 i 5,573,905), kao i in vitro stimulaciju humanih B ćelija (SAD patenti br.5,229,275 i 5,567,610).

[0025] Različiti molekuli i fragmenti antitela mogu da se dobiju iz bilo koje od uobičajeno poznatih klasa imunoglobulina, uključujući, ali ne i ograničeno na, IgA, sekretorne IgA, IgE, IgG i IgM. Podklase IgG su takođe dobro poznate stručnjacima u oblasti i uključuju, ali nisu ograničene na humane IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

[0026] U drugom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku je antitelo sa jednim domenom. Izraz "antitelo sa jednim domenom" (sdAb) ili "VHH" odnosi se na jedan varijabilni domen teškog lanca antitela koja pripadaju tipu koji se može naći kod sisara kamelida kojima prirodno nedostaju laki lanci. Takvi VHH se takođe nazivaju "nanobody®".

[0027] U nekim primerima izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku ne posreduje u ćelijskoj citotoksičnost zavisnoj od antitela i stoga ne sadrži Fc deo koji indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku ne dovodi, direktno ili indirektno, do smanjenja broja ćelija koje eksprimiraju CLEC 1 (npr. ne dovode do eliminacije od 10%, 20%, 50%, 60%, ili do veće eliminacije ili smanjenja broja ćelija koje eksprimiraju CLEC-1). U nekim primerima izvođenja, antitelu prema predmetnom pronalasku nedostaje Fc domen (npr. nedostaje domen CH2 i/ili CH3) ili sadrži Fc domen IgG2 ili IgG4 izotipa.

[0028] Kako se ovde koristi, izraz "ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" ili "ADCC" odnosi se na ćelijski posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji, a zatim izazivaju liziranje ciljne ćelije. Iako bez želje za ograničenjem na bilo koji određeni mehanizam delovanja, ove citotoksične ćelije koje posreduju u ADCC generalno eksprimiraju Fc receptore (FcR receptore).

[0029] Kako se ovde koristi, izraz "smanjenje broja", kad su u pitanju ćelije koje eksprimiraju CLEC-1, označava proces, metodu ili jedinjenje koje može da ubije, eliminiše, lizira ili da dovede do takvog ubijanja, eliminacije ili liziranja, tako da negativno utiče na broj ćelija koje eksprimiraju CLEC-1, a koje su prisutne u uzorku ili subjektu.

[0030] U jednom primeru izvođenja, antagonist CLEC-1 je anitgen-vezujući mimetik antitela. Kako se ovde koristi, izraz " antigen-vezujući mimetik antitela" odnosi se na veštačke proteine, peptide i bilo koja hemijska jedinjenja sa sposobnošću da se vežu za antigene koji imitiraju antigene antitela.

Ovi mimetici sadrže afitine i antikaline, kao i aptamere (peptidne aptamere i oligonukleotidne aptamere).

U jednom primeru izvođenja, antagonist CLEC-1 je aptamer. Aptameri su klasa molekula koja predstavlja alternativu antitelima u smislu molekulskog prepoznavanja. Aptameri su oligonukleotidne ili oligopeptidne sekvence sa sposobnošću da prepoznaju praktično bilo koju klasu ciljnih molekula sa visokim afinitetom i specifičnošću. Takvi ligandi se mogu izolovati sistematskom evolucijom liganda eksponencijalnim obogaćivanjem (engl. Systematic Evolution

1

of Ligands by EXponential enrichment, skr. SELEX) biblioteke slučajnih sekvenci. Biblioteka slučajnih sekvenci se može dobiti kombinatornom hemijskom sintezom DNK. U ovoj biblioteci, svaki član je linearni oligomer, konačno hemijski modifikovan, sa jedinstvenom sekvencom. Peptidni aptameri se sastoje od konformaciono ograničenog varijabilnog regiona antitela prikazanog na proteinu platforme, kao što je E. coli tioredoksin A, koji se biraju iz kombinatornih biblioteka pomoću metode dva hibrida.

[0031] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist je polipeptid.

Izraz "polipeptid" označava ovde polimer amino kiselina koji nema definisanu dužinu. Dakle, peptidi, oligopeptidi i proteini su uključeni u definiciju "polipeptid" i ovi izrazi se koriste naizmenično kroz specifikaciju, kao i patentnim zahtevima. Izraz "polipeptid" ne isklučuje posttranslacione modifikacije koje uključuju, ali nisu ograničene na, fosforilaciju, acetilaciju, glikozilaciju, i slično.

U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku ima dužinu sadržanu između 2 i 200 amino kiselina. U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku ima dužinu sadržanu između 2 i 190, konkretno između 10 i 180, između 10 i 170, između 10 i 160, između 10 i 150, između 10 i 140, između 10 i 130, između 10 i 120, između 10 i 110 amino kiselina.U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku ima dužinu sadržanu između 10 i 100 amino kiselina. U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku ima dužinu sadržanu između 50 i 100 amino kiselina. U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku ima dužinu od 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 amino kiselina.

[0032] U konkretnom izvođenju, polipeptid je funkcionalni ekvivalent CLEC-1. Kako se ovde koristi, "funkcionalni ekvivalent" molekula CLEC-1 je jedinjenje koje je u stanju da se veže za najmanje jedan CLEC-1 ligand, čime sprečava njegovu interakciju sa CLEC-1. Izraz "funkcionalni ekvivalent" uključuje fragmente, mutante i muteine molekula CLEC-1. Izraz "funkcionalno ekvivalentan" uključuje, dakle, bilo kog ekvivalenta CLEC-1 koji je dobijen menjanjem amino kiselinske sekvence, na primer putem jedne ili više amino kiselinskih delecija, supstitucija ili adicija tako da proteinski analog zadržava sposobnost da se veže za svoj ligand. Amino kiselinske supstitucije mogu da se dobiju, na primer, tačkastom mutacijom DNK koja kodira amino kiselinsku sekvencu.

Funkcionalni ekvivalenti uključuju ali nisu ograničeni na molekule koji se vezuju za ligand molekula CLEC-1 i sadrže sve ekstracelularne domene ili delove ekstracelularnih domena CLEC-1 tako da mogu da formiraju solubilni receptor koji može da uhvati ligand molekula CLEC-1. Dakle, funkcionalni ekvivalenti uključuju solubilne oblike molekula CLEC-1. Pogodan solubilni oblik ovih proteina, ili njihovih funkcionalnih ekvivalenata može da obuhvata, na primer, skraćeni oblik proteina iz koga je transmembranski domen uklonjen hemijski, proteolitičkim ili rekombinantnim postupcima. Naročito, funkcionalni ekvivalent se sastoji od sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti, konkretnije, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% i još konkretnije, najmanje 99% identičnosti sa odgovarajućim proteinom, celom dužinom odgovarajućeg protein. Kako se ovde koristi, izraz " odgovarajući protein" se odnosi na protein za koji funkcionalni ekvivalenti prema pronalasku ima sličnu funkciju. Procenati identičnosti koji se navode u predstavljanju predmetnog pronalaska određeni su na osnovu uopštenog poravnavanja sekvenci koje se pored, odnosno, poravnavanja sekvenci celom njihovom dužinom, koristeći, na primer, algoritam autora Needleman i Wunsch 1970. Ovo poređenje sekvenci može da se obavi, na primer, softverom needle koji upotrebljava parametar "Gap open" jednak 10.0, parametar "Gap Extend" jednak 0.5, i matricu "BLOSUM 62". Softver kao što je needle dostupan je na internet stranici ebi.ac.uk worldwide, pod imenom "needle". Izraz "funkcionalno ekvivalentan fragment", kako se ovde koristi, takođe može da označava bilo koji fragment ili aranžman fragmenata molekula CLEC-1 koji se vezuje za ligand molekula CLEC-1. U skladu sa tim, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid, konkretno, funkcionalni ekvivalent, koji je u stanju da inhibira vezivanje CLEC-1 za najmanje jedan ligand molekula CLEC-1, pri čemu ovaj polipeptid sadrži uzastopne amino kiseline čija sekvenca odgovara sekvenci najmanje dela ekstracelularnog domena molekula CLEC-1, pri čemu se taj deo vezuje za ligand molekula CLEC-1. U nekim primerima izvođenja, polpeptid, konkretno, funkcionalni ekvivalent, odgovara ekstracelularnom domenu molekula CLEC-1.

[0033] U nekim primerima izvođenja, funkcionalni ekvivalent molekula CLEC-1 je fuzionisan sa heterologim polipeptidom kako bi se obrazovao fuzioni protein. Kako se ovde koristi, "fuzioni protein" sadrži ceo ili deo (tipično, biološki aktivan) funkcionalnog ekvivalenta prema predmetnom pronalasku operabilno povezan sa heterologim polipeptidom (tj., drugim polipeptidom u odnosu na sam taj polipeptid). U okviru fuzionog proteina, predviđeno je da izraz "operabilno povezan" označava da su funkcionalni ekvivalent prema predmetnom pronalasku i heterologi polipeptid fuzionisani u istom okviru čitanja jedan u odnosu na drugi. Heterologi polipeptid može da bude fuzionisan sa N-terminusom ili sa C-terminusom funkcionalnog ekvivalenta prema predmetnom pronalasku.

[0034] U nekim primerima izvođenja, funkcionalni ekvivalent molekula CLEC-1 je fuzionisan sa konstantnim domenom imunoglobulina (Fc region) kako bi formirao imunoadhezin. Imunoadhezini mogu da imaju brojne vredne hemijske i biološke osobine humanih antitela.

1

Pošto imunoadhezini mogu da se konstruišu od humane proteinske sekvence željene specifičnosti, koja se vezuje sa odgovarajućim humanim imunoglobulinskim sekvencama zglobnog i konstantnog domena (Fc), specifičnost vezivanja od interesa može da se postigne upotrebom u potpunosti humanih komponenti. Ovakvi imunoadhezini si imunogeni za pacijenta, i bezbedni su za hroničnu ili ponovljenu upotrebu. U nekim primerima izvođenja, Fc region je Fc region nativne sekvence. U nekim primerima izvođenja, , Fc region je varijantni Fc region. U dodatnom primeru izvođenja, Fc region je funkcionalni Fc region. Kako se ovde koristi, izraz "Fc region" koristi se da bi se definisao C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca, uključujući Fc regione nativne sekvence i varijantne Fc regione. Iako granice Fc regiona imunoglobulinskog teškog lanca mogu da variraju, obično je definisano da Fc region humanog IgG teškog lanca proteže od amino kiselinskog ostatka na poziciji Cys226, ili od Pro230, pa do svog karboksi- terminusa. Adhzioni deo i deo imunoglobulinske sekvence imunoadhezina mogu da budu povezani minimalnim linkerom. Imunoglobulinska sekvenca uobičajeno, ali ne i nužno, predstavlja imunoglobulinski konstantni domen. Imunoglobulinska komponenta u himerama prema predmetnom pronalasku može da se dobije od IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 podtipova, IgA, IgE, IgD ili IgM, ali se tipično dobija od IgG1 ili IgG4. U nekim primerima izvođenja, funkcionalni ekvivalent molekula CLEC-1 i deo imunoglobulinske sekvence imunoadhesina, povezani su minimalnim linkerom. Kako se ovde koristi, izraz "linker" odnosi se na sekvencu od najmanje jedne amino kiseline koja povezuje polipeptid prema pronalasku i deo sa imunoglobulinskom sekvencom. Ovakav linker može da bude koristan za prevenciju sternog ometanja. U nekim primerima izvođenja,linker ima 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30 amino kiselinskih ostataka. Pri tome, gornja granica nije od suštinskog značaja, već se bira na osnovu pogodnosti u smislu, npr. biofarmaceutske proizvodnje ovih polipeptida. Linkerska sekvenca može da bude sekvenca koja se javlja u prirodi i sekvenca koja se ne javlja u prirodi. Ukoliko se koristi u terapeutske svrhe, linker je tipično neimunogen za subjekta kod koga se imunoadhezin primenjuje. Jedna korisna grupa linkerskih sekvenci su linkeri dobijeni od zglobnog regiona antitela sa teškim lancem, kao što je opisano u WO 96/34103 i WO 94/04678. Drugi primeri su polialaninske linkerske sekvence.

[0035] Polipeptidi prema pronalasku mogu da se proizvedu na bilo koji pogodan način, što će biti očigledno stručnjacima u oblasi. Da bi se proizvele dovoljne količine polipeptida za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, ekspresija se može pogodno da se postigne gajnjem pod odgovarajućim uslovima rekombinantnih ćelija domaćina koje sadrže polipeptid prema pronalasku. Konkretno, polipeptid se proizvodi rekombinantnim putem, ekspresijom iz kodirajućeg molekula nukleinske kiseline. Sistemi za kloniranje i ekspresiju polipeptida u

1

velikom broju različitih ćelija domaćina su dobro poznati. Kada se eksprimira u rekombinantnom obliku, polipeptid se posebno generiše ekspresijom iz kodirajuće nukleinske kiseline u ćeliji domaćina. Može da se koristi bilo koja ćelija domaćin, u zavisnosti od individualnih zahteva određenog sistema. Odgovarajuće ćelije domaćini uključuju bakterijske ćelije sisara, biljne ćelije, sisteme kvasca i bakulovirusa. Ćelijske linije sisara dostupne u tehnici za ekspresiju heterolognog polipeptida uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka, HeLa ćelije, ćelije bubrega beba hrčka i mnoge druge. Bakterije su takođe poželjni domaćini za proizvodnju rekombinantnog proteina, zbog lakoće kojom bakterije mogu da se manipulišu i uzgajaju. Uobičajeni, poželjni bakterijski domaćin je E coli.

[0036] Polipeptidi prema pronalasku, njihovi fragmenti i fuzioni proteini prema pronalasku mogu da pokazuju post-translacione modifikacije, uključujući, ali ne i ograničeno na, glikozilacije (npr. N-vezane ili O-vezane glikozilacije), miristilacije, palimitilacije, acetilacije i fosforilacije (npr. serin/treonin ili tirozin).

[0037] U nekim primerima izvođenja, smatra se da polipeptidi koji se koriste u terapeutskim postupcima prema ovom pronalasku mogu da se modifikuju kako bi se poboljšala njihova terapeutska efikasnost. Takva modifikacija terapeutskih jedinjenja može da se koristi za smanjenje toksičnosti, produženje vremena cirkulacije ili modifikovanje biološke distribucije. Na primer, toksičnost potencijalno važnih terapeutskih jedinjenja može značajno da se smanji kombinovanjem sa različitim nosačima lekova koji modifikuju biološku distribuciju.

[0038] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na postupak za lečenja kancera, naročito unapređivanjem odgovora T ćelija, kod subjekta kome je to potrebno, koji uključuje primenu kod subjekta terapeutski efikasne količine CLEC-1 antagonista.

[0039] Predmetni pronalazak se tako odnosi na CLEC-1 antagonista za upotrebu u tretmanu kancera, naročito unapređivanjem odgovora T ćelija.

[0040] Predmetni pronalazak se tako odnosi na CLEC-1 antagonist za proizvodnju medikamenta za tretman kancera, naročito unapređivanjem odgovora T ćelija.

[0041] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema pronalasku se primenjuje kod subjekta sa terapeutski efikasnom količinom.

[0042] Izrazi "primenjuje" ili "primena" odnose se na postupak injeciranja ili druge fizičke isporuke supstance kakva ona postoji izvan tela (npr., CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku) u subjekta, kao što je, intradermalna, intravenska, potkožna, intramuskularna, intraartikularna isporuka i/ili bilo koji drugi postupak fizičke isporuke koji je ovde opisan ili koji je poznat u tehnici. Kada se bolest, ili njen simptom, leče, primena supstance se tipično odvija nakon pojave bolesti ili njenih simptoma. Kada se bolest ili njeni simptomi sprečavaju, primena supstance se tipično odvija pre pojave bolesti ili njenih simptoma.

1

[0043] Pod "terapeutski efikasnom količinom" podrazumeva se dovoljna količina CLEC-1 antagonista za upotrebu u postupku lečenja kancera sa razumnim odnosom koristi i rizika koji je primenjiv na bilo koji medicinski tretman. Podrazumeva se da će o ukupnoj dnevnoj upotrebi jedinjenja i kompozicija prema predmetnom pronalasku odlučivati ordinirajući lekar i to u okvirima razumne medicinske procene. Specifičan terapeutski efikasan nivo doze za bilo kog konkretnog subjekta zavisiće od niza različitih faktora, uključujući težinu kancera, životnu dob, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol i ishranu subjekta; vreme primene, način primene i brzinu izlučivanja specifičnog jedinjenja koje se koristi; trajanje lečenja; i slične faktore koji su dobro poznati u oblasti medicine. Na primer, u tehnici u okviru ove oblasti, dobro je poznato da se počinje sa dozama jedinjenja koje su niže od doza potrebnih da se postigne željeni terapetuski efekat i da se doze postepeno povećavaju dok se ne postigne željeni efekat. Međutim, dnevne doze proizvoda mogu da variraju od 0.01 do 1,000 mg po odrasloj jedinki, na dan. Tipično, kompozicije sadrže 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 i 500 mg aktivnog sastojka za simptomatsko prilagođavanje doze subjektu koji se leči. Medikament tipično sadrži od oko 0.01 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka, tipično od 1 mg do oko 100 mg aktivnog sastojka. Efikasna količina leka obično se obezbeđuje na nivou doze od 0.0002 mg/kg do oko 20 mg/kg telesne težine na dan, naročito od oko 0.001 mg/kg do 7 mg/kg telesne težine na dan.

[0044] Kompozicije prema pronalasku su formulisane za parenteralnu, transdermalnu, oralnu, rektalnu, potkožnu, sublingvalnu, lokalnu ili intranazalnu primenu.

[0045] Pogodni jedinični oblici primene obuhvataju oblike za oralnu primenu, kao što su tablete, gel kapsule, praškovi, granule i oralne suspenzije ili rastvori, sublingvalni i bukalni oblici primene, aerosoli, implantati, potkožni, transdermalni, topikalni, intraperitonealni, intramuskularni, intravenski, potkožni, transdermalni, intratekalni i intranazalni oblici primene i oblici rektalne primene.

[0046] U jednom primeru izvođenja, kompozicije, posebno farmaceutske kompozicije, prema pronalasku su formulisane za parenteralnu primenu. Farmaceutske kompozicije sadrže vehikulume koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja može da se injecira. To naročito mogu da budu izotonični, sterilni, fiziološki rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično ili smeše takvih soli), ili suve, posebno smrzavanjem osušene kompozicije koji, nakon dodavanja, u zavisnosti od slučaja, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora, omogućavaju konstituisanje rastvora za injekcije.

[0047] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicije prema pronalasku su formulisane za intravensku primenu. U drugom primeru izvođenja, kompozicije prema pronalasku su formulisane za oralnu primenu.

1

[0048] Tipično, aktivni sastojak prema predmetnom pronalasku (tj., CLEC-1 antagonist) kombinuje se sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, i opciono, sa nosačima za produženo oslobađanje, kao što su biorazgradivi polimeri, kako bi se obrazovale farmaceutske kompozicije.

[0049] Izraz "farmaceutski" ili "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekulske entitete i kompozicije koje ne proizvode štetne, alergijske ili druge neželjene reakcije kada se primene kod sisara, posebno čoveka, po potrebi.

[0050] Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens odnosi se na netoksično čvrsto, polučvrsto ili tečno sredstvo za punjenje, razređivač, materijal za inkapsulaciju ili pomoćno sredstvo za formulaciju bilo koje vrste. Nosač takođe može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), njihove pogodne smeše, i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom obloga, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju kad se radi o dispergovanju, kao i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama mogu da obavljaju različiti antibakterijski i antifungalni agensi, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerosal i slično. U mnogim slučajevima poželjno je uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injeciranje može da se postigne ako se u kompozicijama koriste sredstva koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.

[0051] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom.

[0052] Navedeni drugi aktivni sastojak uključuje, ali nije ograničen na, probiotike i terapeutske sredstva koja su opisana u nastavku teksta.

[0053] Predmetni pronalazak se dakle odnosi na kombinaciju CLEC-1 agonista sa drugim aktivnim sastojkom za upotrebu u lečenju kancera.

[0054] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa standardnim (konvencionalnim) tretmanom. Predmetni pronalazak se, dakle, odnosi na kombinaciju CLEC-1 agonista sa konvencionalnim tretmanom za upotrebu u lečenju kancera.

[0055] Kako se ovde koristi, izraz "standardni ili konvencionalni tretman" odnosi se na bilo koje lečenje kancera (lekovi, radioterapija, itd.) koje se primenjuje kod subjekta koji pati od kancera.

[0056] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom, npr. za lečenje kancera. Takva primena može biti istovremena, odvojena ili sekvencijalna. Za istovremenu primenu, sredstva mogu da se primenjuju kao jedna kompozicija ili kao zasebne kompozicije, prema potrebi. Dodatno terapeutsko sredstvo je tipično relevantno za poremećaj

1

koji se leči. Primeri terapeutskih sredstava uključuju druga anti-kancerska antitela, citotoksična sredstva, hemioterapijska sredstva, antiangiogena sredstva, anti-kancerske imunogene, sredstva za regulaciju kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoze, sredstva za regulaciju hormona i druga sredstva koja su opisana u nastavku teksta.

[0057] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se koristi u kombinaciji sa hemioterapeutskim sredstvom, ciljanom terapijom kancera, imunoterapeutskim sredstvom ili radioterapijom.

[0058] Predmetni pronalazak se dakle odnosi na kombinaciju CLEC-1 antagonista sa hemioterapeutskim sredstvom za upotrebu u lečenju kancera.

[0059] Izraz "hemioterapeutsko sredstvo" odnosi se na hemijska jedinjenja koja su efikasna u inhibiciji rasta tumora. Primeri hemioterapijskih sredstava uključuju sredstva za alkilaciju kao što su tiotepa i ciklofosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaorarnid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekana); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estrarnustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotice kao što su enedinski antibiotici (npr. kalihemicin, posebno kalihemicin (11 i kalihemicin 211, videti, npr., Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatinske hromofore i srodni hromoproteinske endieninske anobiotske hromofore), aklacinomisini, aktinomicin, autramicin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaninomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolinodoksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, eszorubicin, idanrbicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptomgrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin,

2

enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalna jedinjenja kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopunjavač folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bizantrene; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; majtanzinoidi kao što su majtanzin i anzamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pento statin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2 etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogenanijum; tenuazonska kiselina; triazikuon; 2,2',2" -trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridinA i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobromtol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francuska); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-1 1 ; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoinska kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kojeg od navedenih jedinjenja. U ovu definiciju su takođe uključena antihormonska sredstva koja deluju tako što regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore kao što su anti-estrogeni uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, 4(5)-imidazole inhibitorne za aromatazu, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston); i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kojeg od navedenih jedinjenja.

[0060] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se koristi u kombinaciji sa ciljanom terapijom za kancer. Predmetni pronalazak se, dakle, odnosi na kombinovanje CLEC-1 antagonista sa ciljnom terapijom za upotrebu u lečenju kancera.

[0061] Ciljane terapije za kancer su lekovi ili druge supstance koje blokiraju rast i širenje kancera tako što interferiraju sa specifičnim molekulima ("ciljnim molekulima") koji su uključeni u rast, progresiju i širenje kancera. Ciljane terapije za kancer se ponekad označavaju kao "molekulski ciljani lekovi", "molekulski ciljane terapije", "precizni lekovi" ili sličnim nazivima. U nekim primerima izvođenja, ciljana terapija se sastoji od primene kod subjekta tirozin kinaznog inhibitora. Izraz "tirozin kinazni inhibitor" odnosi se na bilo koje od niza različitih terapeutskih sredstava ili lekova koji deluju kao selektivni ili neselktivni inhibitori receptorskih i/ili nereceptorskih tirozin kinaza. Tirozin kinazni inhibitor i srodna jedninjenja su dobro poznati u tehnici i opisani u SAD objavi patenta 2007/0254295. Stručnjak u oblasti će znati da jedinjenje srodno tirozin kinaznom inhibitoru rekapitulira efekat tirozin kinaznog inhibitora npr., srodno jedinjenje deluje na različitog člana tirozin kinaznog signalnog puta, kako bi proizveo isti efekat kao i tirozin kinazni inhibitor te tirozin kinaze. Primeri tirozin kinaznih inhibitora i srodnih jedinjenja koja su pogodna za upotrebu u postupcima iz primera izvođenja prema predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, dasatinib (BMS-354825), PP2, BEZ235, sarakatinib, gefitinib (Iressa), sunitinib (Sutent; SU11248), erlotinib (Tarceva; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaksinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec; STI571), leflunomid (SU101), vandetanib (Zactima; ZD6474), MK-2206 (8-[4 aminociklobutil)fenil]-9-fenil-1,2,4-triazolo[3,4-f][1,6]naftiridin-3(2H)-on hidrohlorid), njihove derivate, njihove analoge i njihove kombinacije. Dodatni tirozin kinazni inhibitori i srodna jedinjenja pogodna za upotrebu prema predmetnom pronalasku opisani su u, na primer, SAD objavi patenta 2007/0254295, SAD patentima br. 5,618,829, 5,639,757, 5,728,868, 5,804,396, 6,100,254, 6,127,374, 6,245,759, 6,306,874, 6,313,138, 6,316,444, 6,329,380, 6,344,459, 6,420,382, 6,479,512, 6,498,165, 6,544,988, 6,562,818, 6,586,423, 6,586,424, 6,740,665, 6,794,393, 6,875,767, 6,927,293 i 6,958,340. U nekim primerima izvođenja, inhibitor tirozin kinaze je kinazni inhibitor malog molekula koji se primenjuje oralno i koji je subjekt najmanje jednog kliničkog ispitivanja Faze I, poželjnije najmanje jednog ispitivanja Faze II, i, još poželjnije, najmanje jednog kliničkog ispitivanja Faze III, i najpoželjnije, koji je odobrila FDA za najmanje jednu hematološku ili onkološku indikaciju. Primeri takvih inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na, Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Canertinib, BMS-599626 (AC-480), Neratinib, KRN-633, CEP-11981, Imatinib, Nilotinib, Dasatinib, AZM-475271, CP-724714, TAK-165, Sunitinib, Vatalanib, CP-547632, Vandetanib, Bosutinib, Lestaurtinib, Tandutinib, Midostaurin, Enzastaurin, AEE-788, Pazopanib, Axitinib, Motasenib, OSI-930, Cediranib, KRN-951, Dovitinib, Seliciclib, SNS-032, PD-0332991, MKC-I (Ro-317453; R-440), Sorafenib, ABT-869, Brivanib (BMS-582664), SU 14813, Telatinib, SU-6668, (TSU-68), L-21649, MLN-8054, AEW-541 i PD-0325901.

[0062] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se koristi u kombinaciji sa imunoterapeutskim sredstvom. Predmetni pronalazak se, dakle, odnosi na kombinaciju CLEC-1 antagonista sa imunoterapeutskim sredstvom za upotrebu u lečenju kancera.

[0063] Izraz "imunoterapeutsko sredstvo", kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje, kompoziciju ili tretman koji indirektno ili direktno pojačava, stimuliše ili povećava imunski odgovor tela na ćelije kancera i/ili smanjuje nuspojave drugih terapija protiv kancera. Imunoterapija je stoga terapija koja direktno ili indirektno stimuliše ili pojačava reakcije imunskog sistema na ćelije kancera i/ili smanjuje nuspojave koje su možda izazvali druga sredstva protiv kancera. Imunoterapija se u tehnici tako e naziva imunološka terapija, biološka terapija, terapija koja modifikuje biološki odgovor i bioterapija. Primeri uobi ajenih imunoterapeutskih sredstava poznatih u tehnici uklju uju, ali nisu ograni eni na, citokine, vakcine protiv kancera, monoklonska antitela i necitokinske adjuvanse. Alternativno, imunoterapeutski tretman može da se sastoji od primene kod subjekta odre ene koli ine imunskih ćelija (T ćelije, NK ćelije, dendritske ćelije, B ćelije ...). Imunoterapeutska sredstva mogu da budu nespecifi na, tj. da generalno ja aju imuni sistem tako da ljudsko telo postaje efikasnije u borbi protiv rasta i/ili širenja ćelija kancera, ili mogu da budu specifi ni, tj. usmereni na same ćelije kancera. Režimi imunoterapije mogu kombinuju upotrebu nespecifi nih i specifi nih imunoterapeutskih sredstava. Nespecifi na imunoterapeutska sredstva su supstance koje stimulišu ili indirektno poboljšavaju imuni sistem. Nespecifi na imunoterapeutska sredstva koriste se sama kao glavna terapija za le enje kancera, i kao dodatak glavnoj terapiji, u kom slu aju nespecifi no imunoterapeutsko sredstvo deluje kao pomoćno sredstvo za povećanje efikasnosti drugih terapija (npr. vakcine protiv kancera). Nespecifi na imunoterapeutska sredstva tako e mogu da deluju i u ovom poslednjem kontekstu kako bi smanjili neželjene efekte drugih terapija, na primer, supresiju koštane srži do koje dovode neka hemioterapeutska sredstva. Nespecifi na imunoterapeutska sredstva mogu da deluju na klju ne ćelije imunog sistema i da dovedu do sekundarne reakcije, kao što je povećana proizvodnja citokina i imunoglobulina. Alternativno, sredstva mogu sama da sadrže citokine. Nespecifi na imunoterapeutska sredstva se generalno klasifikuju kao citokini ili ne-citokinski adjuvansi. Odre eni broj citokina je našao primenu u le enju kancera ili kao opšte nespecifi ne imunoterapije osmišljene za ja anje imunog sistema, ili kao adjuvansi koji su obezbe eni uz druge terapije. Pogodni citokini uklju uju, ali nisu ograni eni na, interferone, interleukine i faktore za stimulaciju kolonija. Interferoni (IFN) koji se razmatraju u predmetnom pronalasku uklju uju uobi ajene IFN tipove, IFN-alfa (IFN- ), IFN-beta (IFN- ) i IFN-gama (IFN- ). IFN mogu da deluju direktno na ćelije kancera tako što, na primer, usporavaju njihov rast, pospešuju njihov razvoj u ćelije sa normalnijim ponašanjem i/ili povećavaju njihovu proizvodnju antigena, ime olakšavaju imunom sistemu da prepozna i uništi ćelije kancera. IFN tako e mogu indirektno da deluju na ćelije kancera, tako što, na primer, usporavaju angiogenezu, ja aju imuni sistem i/ili stimulišu ćelije prirodne ubice (NK), T ćelije i makrofage. Rekombinantni IFN-alfa je komercijalno dostupan kao Roferon (Roche Pharmaceuticals) i Intron A (Schering Corporation). Interleukini koji se razmatraju u predmetnom pronalasku uklju uju IL-2, IL-4, IL-11 i IL-12. Primeri komercijalno dostupnih rekombinantnih interleukina uklju uju Proleukin® (IL-2; Chiron Corporation) i Neumega® (IL-12; Wyeth Pharmaceuticals). Kompanija Zymogenetics, Inc. (Seattle, Wash.) trenutno testira

2

rekombinantni oblik IL-21, koji je takođe predviđen za upotrebu u kombinacijama prema predmetnom pronalasku. Faktori za stimulaciju kolonija (CSF faktori), a koji se razmatraju u predmetnom pronalasku, uključuju granulocitni faktor za stimulaciju kolonija (G-CSF ili filgrastim), granulocitno-makrofagni faktor za stimulaciju kolonija (GM-CSF ili sargramostim) i eritropoetin (epoetin alfa, darbepoetin). Tretman sa jednim ili više faktora rasta može da pomogne stimulaciju generisanja novih krvnih ćelija kod subjekata koji su izloženi tradicionalnoj hemioterapiji. Shodno tome, tretman CSF faktorima može da bude od pomoći u smanjivanju nuspojava u vezi sa hemioterapijom i može da omogući upotrebu viših doza hemioterapeutskih sredstva. Različiti rekombinantni faktori za stimulaciju kolonija dostupni su komercijalno, na primer, Neupogen® (G-CSF; Amgen), Neulasta (pelfilgrastim; Amgen), Leukine (GM-CSF; Berlex), Procrit (eritropoetin; Ortho Biotech), Epogen (eritropoetin; Amgen), Arnesp (eritropoetin). Kombinovane kompozicije i kombinovani postupci primene prema predmetnom pronalasku mogu da uključuju i imunoterapijske postupke "celih ćelija" i "adoptivne" imunoterapijske postupke. Na primer, ovi postupci mogu da uključuju infuziju ili ponovljenu infuziju ćelija imunog sistema (na primerlimfocita koji se infiltriraju u tumore (TIL), kao što su CC2+ i/ili CD8+ T ćelije (na primer T ćelije umnožene tumor-specifičnim antigenima i/ili genetičkim poboljšanjima), B ćelije koje eksprimiraju antitela ili druge ćelije koje proizvode i prezentuju antigene, dendritske ćelije (npr., dendritske ćelije gajene sa DC-propagirajućim sredstvom kao što je GM-CSF i/ili Flt3-L, i/ili dendritske ćelije kojima je dodat tumorski antigen), anti-tumorske NK ćelije, takozvane hibridne ćelije, ili njihove kombinacije. Ćelijski lizati mogu takođe da budu korisni u ovim postupcima i kompozicijama. Ćelijske "vakcine" u kljiničkim ispitivanjima, koje mogu da budu korisne u ovim aspektima, uključuju ćelijske lizate Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics) i Melacine®. Antigeni koje odbacuju ćelije kancera, i njihove smeše (videti, na primer, Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001), opciono pomešane sa adjuvansima kao što je alum, takođe mogu da budu komponente u postupcima i kombinovanim kompozicijama.

[0064] U nekim primerima izvođenja, CLEC-1 antagonist prema predmetnom pronalasku se koristi u kombinaciji sa radioterapijom. Predmetni pronalazak se, dakle, odnosi na kombinaciju CLEC-1 antagonista sa radioterapijom za upotrebu u lečenju kancera.

[0065] Radioterapija može da obuhvata zračenje ili povezanu primenu radiofamaceutika kod pacijenta. Izvor zračenja može da bude ili spoljašnji ili unutrašnji u odnosu na pacijenta koji se tretira (tretman zračenjem može, na primer, da bude u obliku terapije zračenjem spoljašnjim zracima (EBRT) ili brahiterapije (BT)). Radioaktivni elementi koji mogu da se koriste u praktikovanju ovih postupaka uključuju, npr. radijum, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, zlato 198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jod-123, jod-131 i indijum-111.

[0066] U jednom primeru izvođenja, predmetni prikaz se odnosi na postupak za skrining CLEC-1 antagonista koji uključuje korake koji se sastoje od:

a) obezbeđivanja većeg broja ćelija koje eksprimiraju CLEC-1 na svojoj površini;

b) inkubacije navedenih ćelija sa jedinjenjem koje je kandidat;

c) utvrđivanja da li se navedeno jedinjenje koje je kandidat vezuje za, i blokira, suprimira ili smanjuje biološku aktivnost CLEC-1 i da li navedeni kandidat unapređuje odgovor T ćelija;

i d) selektovanja jedinjenja koje je kandidat, a koje se vezuje za, i blokira, suprimira ili smanjuje biološku aktivnost CLEC-1 i unapređuje odgovor T ćelija.

[0067] U konkretnom primeru izvođenja, postupak skrininga prema pronalasku može dodatno da uključuje korak koji se sastoji od primene jedinjenja koje je kandidat, i koje je odabrano u koraku d), u životinjskom modelu, kako bi se potvrdili zaštitni efekti navedenog kandidata.

[0068] U principu, ovi postupci skrininga uključuju obezbeđivanje pogodnih ćelija koje eksprimiraju CLEC-1 na svojoj površini. Konkretno, nukleinska kiselina koja kodira CLEC-1 može da se upotreebi za transfekciju ćelija koje na taj način eksprimiraju receptor prema pronalasku. Ovakva transfekcija može da se postigne postupcima koji su dobro poznati u tehnici.

[0069] Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupak za pripremu jedinjenja koje se koristi za lečenje kancera, pri čemu navedeni postupak sadrži korak u kome se identifikuje CLEC-1 antagonist koji je u stanju da unapređuje odgovor T ćelije.

[0070] Pronalazak će dalje biti ilustrovan sledećim slikama i primerima.

SLIKE:

[0071]

Slika 1: Ekspresija i regulacija CLEC-1 mRNK i proteina u ljudskim organima i ćelijama.

A) Ekspresija CLEC-1 mRNK je ocenjena kvantitativnom RT-PCR u leukocitima iz periferne krvi (PBL), neutrofilima (neutro), monocitima (mono), dendritskim ćelijama izvedenim iz monocita (moDC), humanim endotelskim ćelijama aorte (HAEC ćelijama), T i B ćelijama.

B) Reprezentativni tačkasti grafikoni i histogrami za IgG1 izotip ili CLEC-1 bojenje ocenjeno protočnom citometrijom na humanoj krvi i) CD45+ CD14- CD111c+ HLA-DR<visoko>DC ćelije, ii) CD45+CD14+ monociti iii) SSC<visoko>CD16+ neutrofili i na i u iiii) HAEC ćelijama (ekstracelularno i intracelularno), sa mAb anti-hCLEC-1.

2

Histogram gde su superponirane slika za CLEC-1 i histogram ćelija obojenih kontrolnim izotipom IgG1.

C) Ekspresija CLEC-1 na humanim moDC ćelijama. i) Reprezentativni tačkasti grafikoni za % moDC ćelija koje eksprimiraju CLEC-1 (APC) na površini i HLA-DR (FITC), procenjeno protočnom citometrijom u nestimulisanim (NS) ćelijama i u ćelijama stimulisanim pomoću LPS (TLR4-L), Poly I:C (TLR3-L), R848 (TLR7-L) i TGF-β kao što je opisano u odeljku Materijal i metode, sa mAb anti-hCLEC-1. IgG1 izotip je urađen kao kontrola. ii) Histogram predstavlja srednji intenzitet fluorescencije (MFI) ± SEM za CLEC-1 bojenje iz 6 nezavisnih eksperimenata. Statistička analiza CLEC-1 MFI bojenja je izvedena za NS ćelije u odnosu na stimulisane ćelije.

Slika 2: Efekat pokretanja CLEC-1 na sazrevanje ljudskih moDC ćelija i nizvodnu aktivaciju T ćelija.

A) Humane moDC inkubirane bez ičega ili sa anti-CLEC-1 mAb vezanim za ploču ili sa IgG1 kontrolom izotipa su alternativno stimulisane istovremeno sa LPS (1µg/ml) tokom 24 sata, sakupljene, i CD80, CD86, CD83 i HLA-DR su ocenjene protočnom citometrijom i B), TNF-α, IL-12p70, IL-6, IL-23 and IL-10 su ocenjeni u supernatantima ELISA tehnikom.

C) Ćelije su zatim isprane i urađena je MLR sa alogenim T ćelijama tokom 5 dana. Proliferacija je ocenjena protočnom citometrijom razblaživanjem CFSE u alogenim T ćelijama, i IL-17 i IFN-y su ocenjeni u supernatantu ELISA tehnikom.

Slika 3: Efekat deficijencije CLEC-1 (CLEC-1 KO pacovi) na osobine sazrevanja BMDC, sekrecije citokina i aktivacije T ćelija kod pacova.

BMDC su generisane iz WT ili KO pacova tokom 8 dana, kao što je opisano u odeljku Materijal i metode, i inkubirane tokom 4 dana u MLR sa alogenim prečišćenim CD4<+>T ćelijama iz neizloženih pacova. i) Histogram i reprezentativno bojenje proliferacije ocenjeno u CD4<+>T ćelijama CFSE razblaživanjem i protočnom citometrijom i ii) Histogram i reprezentativni tačkasti grafikoni procenta IL 17<+>i IFN-y+ ćelija među izdvojenim CD4<+>T ćelijama procenjeno protočnom citometrijom. Podaci su izraženi u histogramima kao srednja vrednost ± SEM iz 4 nezavisna eksperimenta.

Slika 4: Efekat blokiranja CLEC-1 signalizacije CLEC-1 Fc fuzionim proteinom na BMDC-posredovanu T-ćelijsku aktivaciju kod pacova.

2

BMDC ćelije iz WT pacova su inkubirane tokom 4 dana u MLR sa alogenim prečišćenim CD4<+>T ćelijama iz neizloženih pacova zajedno sa CLEC-1-Fc ili irelevantnim hSEAP-Fc fuzionim proteinima (proizvedeni i prečišćeni pod istim uslovima conditions) (10µg/ml). i) Proliferacija Foxp3+ i Foxp3- ćelija je ocenjena u CD4<+>T ćelijama CFSE razblaživanjem i protočnom citometrijom i

ii) Proizvodnja citokina IL-17 i IFN-y ocenjena je u supernatantima MLR pomoću ELISA tehnike. Podaci su izraženi u histogramima kao srednja vrednost ± SEM iz 4 nezavisna eksperimenta.

Slika 5: Efekat deficijencije CLEC-1 (CLEC-1 KO pacovi) na in vivo DC-posredovan prajming CD4<+>T ćelija i sudbinu Th polarizacije.

A) Ekspresija CLEC-1 mRNK je ocenjena kvantitativnom RT-PCR u različitim podtipovima pacovskih CD103+ CD4- (unakrsno prezentujuće) i CD4<+>(ne-unakrsno prezentujuće) konvencionalnih DC ćelija iz sekundarnih limfoidnih oragana (SLO) (n=5, *p<0.05).

B) WT i CLEC-1 KO pacovi su imunizovani potkožno u jastučiće na stopalima pomoću CFA sa KLH proteinom (100 µg/ml). 10. dana nakon imunizacije, poplitealni limfni čvorovi su sakupljeni i gajeni u prisustvu KLH ili kontrolnog OVA (25 µg/ml) tokom 3 dana. Histogrami i reprezentativni grafikoni i) Proliferacija u CD4<+>T ocenjena CFSE razblaživanjem i ii) udeo IL-17<+>, IL-17<+>IFN-γ<+>i IFN-γ+ ćelija u izdvojenim CD4<+>T ćelijama, ocenjeno protočnom citometrijom. Podaci su izraženi u histogramima kao srednja vrednost ± SEM iz 4 nezavisna eksperimenta.

Slika 6: Efekat potencijalnog CLEC-1 antagonista na aktivaciju MLR (moDC ćelije+ Alo T).

MLR se sastojala od prečišćenih T ćelija izolovanih iz periferne krvi (5X10<4>), pomešanih sa alogenim dendritskim ćelijama dobijenim od monocita (12.5X103) koje eksprimiraju visok nivo CLEC-1. Antitela za kontrolu izotipa (IgG1) ili anti-humana CLEC-1 antitela su dodata u dozama od 0.5 do 10 µg/ml tokom 5 dana. Proliferacija T ćelija je zatim ocenjena razblaživanjem karboksifluorescein sukcinimidil estrom, a ekspresija IFN-y je ocenjena protočnom citometrijom u T ćelijama i ELISA tehnikom u supernatantima (Slike 6A, B i C, histogrami i reprezentativni grafikoni).

Slika 7: Inhibitorna kontrolna tačka CLEC-1 u kanceru (dokaz koncepta kod glodara).

2

a) Brza i dugotrajna ekspresija CLEC-1 u čvrstim tumorima kod glodara (tumorske ćelije hepatokarcinoma hepa 1.6 su intraportalno injecirane u jetru b6 miševa, ekspresija Clec1a je ocenjena Q-PCR tehnikom).

b) CLEC-1 deficijentni glodari bolje se bore sa tumorima od miševa divljeg tipa: hepa 1.6 tumorske ćelije hepatokarcinoma intraportalno su injecirane u b6 WT ili Clec1a deficijentne miševe, podaci su iskazani kao % preživljavanja miševa sa Wilcoxson testom***p<0.001

c) pacovi: C6 glioma ćelije (1 milion) injecirane su potkožno u bok sprague dawley (spd) WT ili Clec1a deficijentnih pacova i zapremina tumora je praćena do d35. d) C6 glioma ćelije (1 milion) injecirane su potkožno u bok sprague dawley (spd) WT ili Clec1a deficijentnih pacova pa su tumori i limfni čvorovi sakupljeni 18. dana i izvedena je Q-PCR za inos, ifng i tnfa. Podaci predstavljaju histograme ekspresije inos, ifng i tnfa u odnosu na hprt i izraženi su u arbitrarnim jedinicama (promena izražena kao broj puta u odnosu na ekspresiju kod WT pacovi iz istog legla, vrednost 1) za tumore (n=3) ili u vidu udela transkripta za limfne čvorove (n=6,* p<0.05)

Slika 8: CLEC-1 eksprimiraju pro-tumorski makrofagi tipa M2 tipa i mijeloidne ćelije iz pleuralnog izliva mezotelioma i iz ascita tumora jajnika.

Humani monociti su gajeni sa M-CSF kako bi se generisali M0 makrofagi, a zatim sa IFNγ, LPS ili IL-4 kako bi se generisali M1 ili M2 makrofagi, kao što je opisano u Zajac, Blood, 2013). Ekspresija CLEC-1 je ocenjena QPCR tehnikom (a) i protočnom citometrijom (b), n=4 *p<0.05. Pleuralni izlivi iz mezotelioma su sakupljeni i podvrgnuti protočnoj citometriji kako bi bila ocenjena ekspresija CLEC-1 na CD45+ HLA DR+ CD16+ mijeloidnim ćelijama nakon blokiranja Fc receptora FcBlock serumom i humanim AB pozitivnim serumom (kontrola izotipa) (c). Asciti su sakupljeni tokom rutinske nege pacijenata sa karcinomom jajnika, a mononuklearne ćelije su izolovane nakon gradijenta na Ficoll reagensu. Humane CD14<+>ćelije su izolovane pomoću CD14 mikrozrnaca i pozitivne selekcije sa AutoMACS. Nakon blokiranja Fc receptora pomoću FcBlock seruma i humanog AB pozitivnog seruma, CD14<+>ćelije su obojene ili monoklonskim antitelom za kontrolu izotipa ili anti-humanim CLEC-1 (d).

2

PRIMER 1:

Materijal i metode

Životinje

[0072] Pacovi su kupljeni od firme "Centre d’ElevageJanvier" (Genest, Saint-Isle, France) i eksperimentalne procedure su izvođene strogo prateći protokole odobrene od strane Komiteta za etiku eksperimenata na životinjama oblasti Pays de la Loire i odobreni od strane Ministarstva za visoko obrazovanje i nauku francuske vlade. Clec-1 nokauti (KO) su generisani u laboratorijama Platforma za transgene pacove i imunofenomiku (engl. Transgenic Rats and Immunophenomics Platform facility) (SFR-Santé-Nantes), tehnologijom nukleaza sa cinkanim prstićima (ZFN) na osnovi inbred RT1a Lewis pacova. Odsustvo CLEC-1 proteina očekivane veličine od 32 kDa potvrđeno je Western blotom.

Antitela

[0073] Anti-humana CLEC-1 monoklonska Abs (mAb) antitela su generisana somatskom hibridizacijom limfocita (Biotem, Apprieu, Francuska) tako što su Balb/c miševi imunizovani peptidom koji kodira ekstracelularni domen hCLEC-1 i selektovana skriningom na rekombinantni humani CLEC-1 protein (RD system) ELISA tehnikom, a zatim prečišćavanjem pomoću hromatografije na proteinu A. Anti-humano CLEC1 mAb (IgG-D6) dobijeno je od Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, CA). Prečišćeni anti-pacovski-β-aktin, CD3 (G4.18); antipacovski TCRαβ-A647 ili -A488 (R73), CD4-PECy7 (OX35), CD8-A488 (Ox8), IL-17-APC (ebio17B7), Foxp3-APC, IFNγ-FITC, CD11b-PerCP-Cy5.5 (WT.5), CD103(αE Integrin)-FITC i anti-humani fosfotirozini (p-Tyr) (4G10), CD4-PE, CD3-APC, CD45-PercP, CD3-FITC, CD19-PE, CD16-PE, CD14-FITC HLA-DR-APC/Cy7, HLADR-FITC, CD11c-PECy7, CD11b-FITC CD80-FITC, CD86-FITC, CD83-FITC i IgG1 kontrola izotipa, nabavljeni su od firme BD Biosciences (Franklin Lakes).

Generisanje clec-1 -/- nokaut (KO) pacova tehnologijom nukleaza sa cinkanim prstićima (ZFN).

[0074] In vitro transkribovane mRNK koje kodiraju ZFN-ciljane sekvence specifične za pacovski clec-1 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), mikroinjecirane su u oplođene embrione u jednoćelijskom stadijumu, kako je prethodno opisano. PCR tehnikom su detektovane mutacije kod novorođenih životinja. Jednom od začetnika loze koji je imao deleciju od 7 bp koja dovodi do prevremenog stop-kodona na 114. aminokiselini CLEC-1, nedostajao je veći deo

2

ekstracelularnog domena. Heterozigoti su su ukrštani kako bi u istom leglu bile generisane životinje KO i divljeg tipa (WT).

Generisanje CLEC-1 Fc fuzionog proteina pacova.

[0075] cDNK koja kodira ekstracelularni domen CLEC-1 (ADK94891 amino kiseline 74261), amplifikovana je pomoću PCR tehnike i 5’ i 3’ krajevi su obeleženi ECORI Bg1II restrikcionim mestima, respektivno. Nakon digestije, proizvodi cDNK su klonirani i inserirani u okvir čitanja u pFUSE mIgG2Ae1-Fc2 v10 [Fab] (Invivogen, San Diego, CA) vektor koji sadrži IgG2a Fc fragment mutiran na 3 amino kiseline kako bi se sprečilo FcγRI vezivanje. Plazmidi su transfektovani u eukariotske ćelije pomoću lipofektamina u skladu sa uputstvima proizvođača (ThermoFisher). CLEC-1 Fc je prečišćen iz supernatanta pomoću HiTrap g afinitetne kolone (GE Healthcare Bio-sciences, Pittsburgh, PA), dijaliziran pomoću kasete za dijalizu Slide-A-Lyzer (ThermoFisher) i kvantifikovan pomoću kita BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce). Čistoća i struktura proteina su potvrđeni SDS-PAGE tehnikom i, nakon toga, Coomassie bojenjem i western blot analizom sa anti-mišjim IgG ili anti-pacovskim CLEC-1 antitelom kao što je opisano u odeljku o Western blotu u dodatku Materijala i metoda. Kontrolna rekombinantna humana embrionska alkalna fosfataza (hSEAP Fc) koja se sekretuje u skraćenom obliku, generisana je (pFUSE-SEAP-hFc, Invivogen) i prečišćena pod istim uslovima kao i CLEC-1 Fc.

KLH imunizacija

[0076] Pacovi su imunizovani sc., u jastuče na šapi, hemocijaninskim proteinom prilepka (KLH) (Sigma) (100 µg) koji je emulgovan (zap.:zap.) u 100 µl kompletnog Frojndovog adjuvansa (CFA) (Difco) i poplitealni limfni čvorovi su sakupljeni 10 dana nakon imunizacije. Sve ćelije (1X10<5>) ili prečišćene CD4<+>T ćelije (1X10<5>) obeležene karboksifluoresceinsukcinimidil estrom (CFSE) (Molecular Probes/Invitrogen) (5 µM) plus splenociti siromašni T ćelijama (1X10<5>) iz neizloženih WT pacova podvrgnute su in vitro sekundarnom izlaganju KLH ili irelevantnom proteinu OVA (25 µg/ml) tokom 3 dana.

Protočna citometrija i razdvajanje ćelija

[0077] Pre bojenja, ćelije su podvrgnute Fc blokiranju (BD Biosciences) kako je opisano u uputstvima proizvođača. Za intracelularno bojenje citokina, ćelije su stimulisane 4 sata sa PMA i jonomicinom (50 ng/ml i 1 µg/ml, respektivno) u prisustvu inhibitora transporta proteina GolgiStop (2 µl/bunarčiću) i podvrgnute fiksiranju i permeabilizaciji (rastvor Facspermeabilizing) (svi reagensi iz BD Biosciences). Fluorescentno obeležavanje obojenih ćelija (2.5 µg/ml) mereno je pomoću FACS LSR II (BD Biosciences) i analizirano pomoću softvera FlowJo® (Tree Star, Inc., Ashland).

[0078] Za razdvajanje ćelija, pacovske CD4<+>T ćelije i CD11b+CD103+CD4- i CD11b+CD103+CD4<+>DC ćelije su izolovane iz slezine neizloženih pacova pozitivnom selekcijom pomoću FACSAria proto nog citometra (BD Biosciences) putem TCR+ i CD4<+>i putem CD11b, CD103 i CD4 bojenja, respektivno, a za humane ćelije putem SSC<nisko>CD45+CD3+ ili CD19+ za T i B ćelije, respektivno, SSC<visoko>CD45+CD16+ za neutrofile, SSC<nisko>CD45+CD14+ za monocite iSSC<nisko>CD45+HLA-DR+CD1 1c+, za cDC ćelije. istoća je bila >99%.

[0079] Mrtve ćelije su isklju ene izdvajanjem 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)-negativnih ćelija.

Generisanje ćelija, in vitro stimulacija i reakcija mešanih leukocita (MLR)

[0080]

- Humane DC ćelije dobijene od monocita (moDC ćelije) generisane su od elutrizovanih monocita koji su gajeni 7 dana u kompletnom RPMI 1640 medijumu (10% FCS bez endotoksina (Perbio Sciences), 2 mM L-glutamina (Sigma), 1 mM natrijum piruvata (Sigma), 1 mM Hepes (Sigma), i 5x10<-5>M 2-merkaptoetanola (Sigma)), u koji su dodati IL-4 (40 ng/ml; AbCys, Paris, Francuska) i GM CSF (1000IU/ml; AbCys). Zatim su ćelije stimulisane tokom 24h (1X10<6>/ml) sa LPS (0.5 µg/ml) (Sigma), Poly I:C (2 µg/ml) (Invivogen, San Diego, CA), R848 (2.5 µg/ml) (Invivogen), rekombinantnim humanim TGF 1(20 ng/ml) (R&D systems) alternativno u prisustvu 10 µg/ml anti-CLEC-1 mAb ili IgG1 kontrole za izotip, kojima su prethodno obložene plo e) i podvrgnute proto noj citometriji ili gajene (12.5X10<3>) sa 5X10<4>alogenih humanih T ćelija (Pan T Cell Isolation kit (Mylteni)) tokom 5 dana (MLR). Rekombinantni CLEC-1-His tag (R&D system) ili irelevantni rekombinantni svinjski alfal,3GT-6-His protein dodati su pri 10 µg/ml u MLR. Proliferacija je merena proto nom citometrijom pomoću CFSE profila u CD3+CD4<+>ćelijama, a IL-17 i IFN-y citokini su ocenjeni u supernatantima ELISA tehnikom.

- Humane endotelne ćelije (EC ćelije) iz aorte (HAEC) ili iz umbilikalne vene (HUVEC) izolovane su i gajene ili su alternativno stimulisane sa 1000 jedinica/ml rekombinantnog humanog TNF (eBiosciences) tokom 12 sati.

- Humani monociti su gajeni sa M-CSF kako bi se generisali M0 makrofagi, a zatim sa IFN , LPS ili IL-4 kako bi se generisali M1 ili M2 makrofagi, kao što je opisano u Zajac, Blood, 2013).

1

- Pleuralni izlivi od pacijenata sa mezoteliomom su sakupljeni i podvrgnuti protočnoj citometriji

- Asciti su sakupljani tokom rutinske nege pacijenata sa karcinomom jajnika i mononuklearne ćelije su izolovane nakon gradijenta na Ficoll reagensu. Humane CD14+ ćelije su izolovane pomoću CD14 mikro zrnaca i pozitivne selekcije pomoću AutoMACS.

- Pacovske CD4<+>T ćelije su stimulisane pomoću anti-CD3 (Clone G4.18) (5 µg/ml) vezanog za ploču. DC ćelije dobijene iz koštane srži (BMDC ćelije) od neizloženih, CLEC-1 WT i KO LEW.1A (RT1a) pacova iz istog legla, dobijene su gajenjem ćelija tokom 8 dana u kompletnom RPMI medijumu suplementiranim sa pacovskim IL-4 (4 ng/ml) i mišjim GM-CSF (1.5 ng/ml). Zatim su BMDC ćelije stimulisane sa LPS (1 mg/ml) (Sigma) ili zimozanom (20 mg/ml) (Invivogen) tokom 6 sati u cilju analize transkripta i tokom 24 sata za ekpresiju markera sazrevanja i za MLR (zajedničko gajenje tokom 5 dana sa prečišćenim alogenim CD4<+>T ćelijama iz mezenteričnih limfnih čvorova LEW.1W (RT1u) neizloženih pacova sa 5 µM CFSE). Alternativno, pacovski CLEC-1 Fc fuzioni protein i kontrolni hSEAP Fc(10µg/ml) dodati su u MLR u prisustvu inhibitora endotoksina, polimiksina B (10µg/ml)(Invivogen).

Ekstrakcija RNK i kvantitativna RT-PCR reakcija u realnom vremenu

[0081] Ukupna RNK iz tkiva, tumora ili ćelija je pripremljena pomoću reagensa Trizol (Invitrogen) u skladu sa uputstvima proizvođača. Nabavljena je cDNK ljudskih organa, od Human Immune System, kao i MTC Panel I za muškarce i žene bele rase (Clontech Mountain View). Kvantitativna PCR u realnom vremenu je izvedena pomoću sistema ViiA 7 Real-Time PCR System i master smeše SYBR® Green PCR Master mix (Applied Biosystems). Hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza (HPRT) je korišćena kao gen za endogenu kontrolu kako bi se normalizovale varijacije u polaznoj količini RNK. Relativna ekspresija je izračunavana pomoću 2-ΔΔCt metode i izražena u arbitrarnim jedinicama.

Imunoprecipitacija i Western blot

[0082] Ljudske moDC ćelije su zasejane na ploče obložene anti-CLEC-1 ili kontrolnim mAb IgG1 izotipa (Invitrogen) (10 µg/ml) tokom 5 ili 20 minuta, u medijumu sa zimozanom (20 µg/ml) ili bez njega. Humane moDC ćelije, HAEC, HUVEC i HEK, lizirane su u Nonidet P-40 1% puferu za liziranje sa koktelom proteaznih inhibitora (Sigma Aldrich). Imunoprecipitacija CLEC-1 je izvedena sa 4µg anti-humanog CLEC-1 mAb (D6) nakon čega je sledila inkubacija

2

sa kuglicama protein G-sefaroze. Proteini su preko noći tretirani PNGazom F (Sigma Aldrich), eluirani i rastvoreni kuvanjem od 5 min u Lemlijevom puferu za uzorke. Koncentracija proteina je određena pomoću kita sa BC testovima, sa BSA kao standardom (Interchim, San Pedro). Nitrocelulozne membrane su blokirane fiziološkim rastvorom puferovanim sa Tween-20-Tris i 5% mleka i inkubirane sa 0.5µg/ml antifosfotirozina (4G10) ili sa 2µg/ml anti CLEC1 mAbs, a nakon toga sa sekundarnim Abs koja su konjugovana sa peroksidazom rena (Jackson immunoresearch, West Grove, PA.). Kit Proteome Profiler Human NF-κB Pathway Array Kit je upotrebljen kao što je opisano u uputstvima proizvođača (R&D System). Detekcija hemiluminiscencijom je izvedena pomoću West Pico hemiluminiscentnog supstrata (Thermofisher scientific, Waltham, MA) i proteinska ekspresija je ocenjena pomoću Las 4000 (Fuji).

Imunohistohemija

[0083] Neutrofili, moDC ćelije, adherentne transfektovane HEK293T ćelije i HUVEC ćelije (gajene preko noći na pokrovnim pločicama) fiksirane su u 4% paraformaldehidu (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, SAD) i permeabilizovane, osim moDC ćelija, reagensom Triton X100 (0.1%). Ćelije su obojene anti-CLEC1 mAb (D6) ili IgG1 kontrolom za izotip (Invitrogen) (4 µg/ml) tokom 1h na sobnoj temperaturi u PBS 1% FCS, 1% BSA i Fc Block za moDC ćelije, a zatim sa sekundarnim Alexa Fluor 488 ili Alexa Fluor 568 anti-mišjim IgG1 atitelima, 1h. NAkon 10 min inkubacije u PBS rastvoru sa 1% DAPI, mikroskopske pločice su adaptirane pomoću reagensa Prolong Antifade Reagent (Invitrogen) i posmatrane fluorescentnom mikroskopijom (Nikon A1 R Si konfokalni mikroskop). Slike su dobijene (X60 Plan Apo N.A: 1.4, zum 2) u sekvencijalnom modu i analizirane pomoću programa ImageJ.

In vivo tumorski modeli

[0084] hepa 1.6, tumorske ćelije hepatokarcinoma injecirane su intraportalno u jetru b6 WT ili Clec1a deficijentnih miševa. C6 ćelije glioma (1 milion) su potkožno injecirane u bok sprague dawley (spd) WT ili Clec1a deficijentnih pacova.

Statistička analiza

[0085] Sve statističke analize su izvedene pomoću softvera Graphpad Prism (La Jolla) sa dvostranim neuparenim neparametarskim Studentovim testom (Mann-Whitney). Rezultati su smatrani značajnim ukoliko su p vrednosti bile <0.05.

Rezultati

Humane mijeloidne DC ćelije eksprimiraju CLEC-1 na ćelijskoj površini.

[0086] Do sada je objavljena samo ograničena količina informacija o ekspresiji CLEC-1 kod ljudi. Vrlo malo je do sada opisano kad je u pitanju ekspresija, regulacija i funkcija humanog CLEC-1 proteina. Postoji samo jedna publikacija o ekspresiji CLEC-1 koja prikazuje da humani CLEC-1 može da se detektuje samo intracelularno u endotelnim ćelijama pri čemu obrazac bojenja podseća na proteine endoplazmatičnog retikuluma i da ni TGF-β ni inflamatorni stimulusi ne mogu da pospeše značajnu translokaciju na ćelijsku površinu (The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment. Sattler et al., ScandJImmunol. 2012 Mar;75(3):282-92 ). Tako su jedine informacije dostupne u stanju tehnike o hCLEC-1 (tj. intracelularna lokalizacija u endotelnim ćelijama) suprotne onome što je poznato kod pacova (tj. da je rCLEC-1 lokalizovan na površini endotelnih i mijeloidnih ćelija).

[0087] Pronalazači su pomoću kvantitativne RT-PCR uočili snažnu ekspresiju CLEC-1 transkripata u plućima i placenti i umereniju ekspresiju u limfoidnim organima kao što su timus, limfni čvorovi, slezina i krajnici (podaci nisu prikazani). Što se tiče podtipova humanih ćelija, brojni transkripti CLEC-1 su pronađeni u neutrofilima, monocitima, moDC ćelijama i HAEC ćelijama (slika 1A), a u T i B ćelijama nije otkriven nikakav transkript. Prisustvo proteina CLEC-1 u moDC i EC ćelijama potvrđeno je imunoprecipitacijom CLEC-1, i nakon toga, Western blotom (podaci nisu prikazani), i u suprotnosti je sa malom količinom uočenom u epitelnim HEK ćelijama. Pronalazači su generisali mišje anti-humano CLEC-1 mAb usmereno protiv ekstracelularnog domena i primetili nisku ektopičnu ekspresiju CLEC-1 na ćelijskoj površini transfektovanih HEK ćelija, što potvrđuju prethodne nalaze opisane u literaturi (podaci nisu prikazani). Što se tiče drugih CLR receptora, da bi se CLEC-1 efikasno eksprimirao, transportovao i bio stabilan na ćelijskoj površini, mogu da mu budu neophodni drugi adapterski lanci, drugi PRR receptori ili dovoljna glikozilacija. Ekspresija CLEC-1 proteina na ćelijskoj površini potvrđena je imunohistohemijom u transfektovanim ćelijama (podaci nisu prikazani).

[0088] Pomoću generisanog mAb, oni su, po prvi put prema našim saznanjima, protočnom citometrijom pokazali ekspresiju CLEC-1 na površini ćelija u subpopulaciji mijeloidnih CD16-DC ćelija iz humane krvi (CD45+CD14-HLADR<visoko>CD11c+) i na CD14+CD16+ monocitima (CD45+CD14+CD16+). Ekspresija na površini ćelija nije uočena ni na BDCA3+ subpopulaciji mijeloidnih DC ćelija (BDCA3+CD45+HLA-DR<visoko>CD11c<nisko>), ni na CD123+ plazmacitoidnim DC ćelijama (CD123+CD11c-HLA-DR<visoko>) (podaci nisu prikazani). Niska ekspresija CLEC-1 uočena je na ćelijskoj površini neutrofila ili HAEC ćelija za koje je ekspresija, kako je prethodno objavljeno, uglavnom intacelularna (Slika 1B). Ista lokalizacija

4

CLEC-1 proteina uočena je i pomoću imunhistohemije, sa intracelularnim bojenjem CLEC-1 u humanim neutrofilima i EC ćelijama i u vidu površinske ekspresije na DC ćelijama (podaci nisu prikazani). Važno je da su, slično onome što smo prethodno opisali kod pacova, pronalazači uočili da je ekspresija CLEC-1 kod ljudi smanjena na DC ćelijama usled inflamatornih stimulusa kao što su TLR ligandi i pojačana delovanjem TGFβ (reprezentativni tačkasti grafikoni i MFI histogram, Slika 1C respektivno).

Pokretanje CLEC-1 na humanim moDC ćelijama suprimira in vitro nizvodnu alogenu aktivaciju Th17.

[0089] Pošto prirodni ligandi za CLEC-1 još nisu identifikovani, pronalazači su koristili antihumano CLEC-1 mAb da imitiraju ligand i unakrsno vežu CLEC-1 na ćelijskoj površini moDC ćelija. Nakon imunoprecipitacije CLEC-1 u blagim uslovima, Western blotom je uočeno da nema fosforilacije tirozina pri očekivanoj veličini CLEC-1 (32 kDa) nakon što je CLEC-1 pokrenut, što ukazuje na to da tirozinski motiv u citoplazmatskom repu nije direktno fosforilisan (podaci nisu pokazani). Ipak, primetili smo nekoliko promena u obrascima fosforilacije tirozina sa pojačanom ili smanjenom fosforilacijom nekoliko traka veličine oko 40-50 kDa, što je ubedljiv pokazatelj da je CLEC-1 funkcionalni receptor čija se signalizacija odvija preko partnera za vezivanje koje tek treba identifikovati.

[0090] Pronalazači su zatim ispitivali da li pokretanje CLEC-1 modulira TLR-indukovano sazrevanje moDC ćelija, kao što je opisano za druge aktivacione ili inhibitorne CLR receptore. Uočili su da pokretanje CLEC-1 niti samo po sebi indukuje, niti potencira ili suprimira LPS-indukovano stanje sazrevanja moDC ćelija prema ekspresiji aktivacionih markera CD80, CD86, CD83 i HLA-DR (slika 2A) i proizvodnji TNFa , IL-12, IL-6, IL-23 ili IL-10 (slika 2B). Slični rezultati su primećeni i kod drugih TLR liganada (podaci nisu prikazani).

[0091] Zatim su pronalazači procenili uticaj pokretanja CLEC-1 na sposobnost moDC ćelija da polarizuju nizvodni alogeni odgovor T ćelija. Nije primećena razlika u naknadnoj alogenoj proliferaciji T ćelija nakon samog aktiviranja CLEC-1 (Slika 2C), niti u kombinaciji sa TLR receptorima (podaci nisu prikazani). Međutim, oni beleže značajno manje IL-17, a više IFNy koga sekretuju alogene T ćelije, što sugeriše da je aktiviranje CLEC-1 na moDC ćelijama smanjilo naknadnu alogenu aktivaciju Thl7 i usmerilo odgovor prema Th1 odgovoru (Slika 2C).

[0092] S obzirom na to da je CLR signalizacija dovela do aktivacije NF-κB, istraživali su nivo i aktivaciju proteina povezanih sa NF-κB signalnim putem, pomoću sredstva Proteome Profiler nakon pokretanja CLEC-1 samog ili zajedno sa zimozanom, agonistom i DECTIN-1 i TLR signalnih puteva. Pronalazači su primetili da za razliku od zimozana, pokretanje CLEC-1 samo po sebi ne izaziva aktivaciju NF-κB puta, što se vidi po procenjenu degradaciji inhibitora NF-κB, IκBα, i po fosforilaciji subjedinice RelA p65 (Ser529) (podaci nisu prikazani). Međutim, naglasili su da je povezanost sa pokretanjem CLEC-1 smanjila degradaciju IκBα indukovanu zimozanom. Međutim, nije primećeno značajno smanjenje fosforilacije subjedinice p65. Pošto je fosforilacija na Ser529 nezavisna od IKKβ, ovi podaci ukazuju na to da CLEC-1 možda naročito inhibira put aktivacije IKKβ. Ako se posmatraju zbirno, ovi podaci ukazuju na to da je pokretanje CLEC-1 na humanim moDC ćelijama funkcionalno aktivno i da, iako nismo primetili značajan uticaj na proizvodnju citokina, ono može reguliše signalne puteve NF-κB koje indukuju PRR receptori kako bi fino modulirali njihovo stanje aktivacije i suprimirali nizvodni odgovor Th17.

Poremećena CLEC-1 signalizacija kod pacovskih BMDC ćelija pojačava in vitro odgovore T ćelija.

[0093] Da bi stekli uvid u funkcionisanje CLEC-1, pronalazači su generisali pacove deficijentne za CLEC-1. Pacovi deficijentni za CLEC-1 bili su vijabilni, zdravi i rođeni su uzgojem heterozigota sa očekivanom učestalošću po Mendelu. Kod stabilnog stanja, pacovi deficijentni za CLEC-1 pokazali su regularne kompartmane mijeloidnih i limfoidnih imunskih ćelija u krvi i perifernim limfoidnim organima (podaci nisu prikazani).

[0094] Pronalazači su generisali BMDC ćelije od pacova deficijentnih za CLEC-1 i primetili da se ove ćelije normalno diferenciraju i sazrevaju kao odgovor na stimulaciju pomoću LPS (CD80, CD86, MHC klase I i II) (podaci nisu prikazani). Zanimljivo je da su primetili da su nakon aktivacije sa LPS ili zimozanom, BMDC ćelije deficijentne za CLEC-1 eksprimirale viši nivo transkripata IL-12p40 od BMDC ćelija kod pacova divljeg tipa (podaci nisu prikazani). Nisu primećene značajne razlike za ekspresiju IL-6, IL-23, TGFβ i IL-10. Međutim, impresivno, BMDC ćelije deficijentne za CLEC-1 indukovale su pojačanu proliferaciju alogenih CD4<+>T ćelija koja je bila povezana sa povećanom aktivacijom Th17 T ćelija (Slika 3).

[0095] Da bi dodatno potvrdili ove podatke, pronalazači su generisali pacovski fuzioni protein CLEC-1 Fc (podaci nisu prikazani). Ovaj fuzioni protein koji se sastojao od ekstracelularnog domena pacovskog CLEC-1 koji je fuzionisan sa IgG Fc fragmentom koji je mutiran na 3 aminokiseline da bi se sprečilo vezivanje FcγRI, trebalo bi da blokira CLEC-1 interakcije na BMDC ćelijama sa svojim putativnim ligandima i da na taj način podražava deficijenciju CLEC-1. Slično tome, primetili su, u prisustvu fuzionog proteina CLEC-1 Fc u in vitro MLR, izraženiju proliferaciju ne-Foxp3 alogenih efektorskih T ćelija i veću aktivaciju Th17 (Slika 4). Važno je da nije primećena indukcija Th-17 sa CLEC-1 Fc na prečišćenim T ćelijama nakon anti-CD3 poliklonske aktivacije (podaci nisu prikazani), što pokazuje da je ovaj efekat specifičan za poremećenu signalizaciju CLEC-1 u BMDC ćelijama, i da nije posledica ligacije CLEC-1 Fc i delovanja agonista na putativni ligand na T ćelijama.

[0096] Kada se zbirno razmatraju, ovi podaci ukazuju na to da odsustvo signalizacije CLEC-1 u mijeloidnim ćelijama, posebno u DC ćelijama, poja ava njihovo stanje aktivacije potrebno za efikasnu in vitro proliferaciju i aktivaciju T ćelija.

Nedostatak CLEC-1 pojačava in vivo T-ćelijski odgovor posredovan DC ćelijama.

[0097] Pronalaza i su zatim istraživali potencijalnu funkciju CLEC-1 in vivo u diferencijaciji Th posredovanoj DC ćelijama, nakon imunizacije potkožnom injekcijom sa stranim antigenom, hemocijaninom prilepka (KLH) i kompletnim Frojndovim adjuvansom. Prvo su procenili ekspresiju transkripata CLEC-1 u razli itim podtipovima cDC ćelija, CD103+ CD11b+ u limfnim vorovima. Zanimljivo je da su primetili da je ekspresija CLEC-1 ograni ena na CD4-DC ćelije koje odgovaraju CD8 DC ćelijama kod miševa, koje su specijalizovane za fagocitozu mrtvih ćelija i koje pokazuju citotoksi nu aktivnost (Slika 5A).

[0098] Nakon imunizacije, primetili su, posle in vitro sekundarnog izlaganja drenaži limfnih vorova, povećanu proliferaciju CD4<+>T ćelija specifi nih za KLH iz imunizovanih pacova deficijentnih za CLEC-1, koja je povezana sa povećanim brojem IL-17<+>, IL-17<+>IFN i IFN CD4<+>T ćelija (histogram i reprezentativne ta kasti grafikoni, slika 5B). Važno je tako e da je uo en poja an memorijski odgovor na KLH sa pre išćenim CD4<+>T ćelijama koje su dobijene od imunizovanih pacova deficijentnih za CLEC-1 u prisustvu DC ćelija dobijenih od pacova divljeg tipa, koji pokazuje specifi no povećanje in vivo prajminga T ćelija u odsustvu CLEC-1 (podaci nisu prikazani).

[0099] Ovi podaci pokazuju in vivo da nedostatak CLEC-1 signalizacije kod cDC ćelija pogoršava nizvodni imunski odgovor T ćelija.

Diskusija

[0100] U ovoj studiji, pronalaza i su pokazali, prema našim saznanjima po prvi put, da ljudski CLEC-1 predstavlja funkcionalni regulatorni receptor na površini DC ćelija, koji suprimira nizvodni odgovor Th17 efektora. Štaviše, kod pacova deficijentnih za CLEC-1 pokazana je in vivo uloga CLEC-1 u prevenciji prekomernog prajminga CD4<+>T ćelija posredovanog DC ćelijama. Kao i kod pacova, uo ili su da se ekspresija CLEC-1 u ljudskim moDC ćelijama smanjuje inflamatornim stimulusima i poja ava pomoću TGF . Ovaj profil ekspresije u DC ćelijama, gde nakon inflamatorne stimulacije dolazi do smanjenja, predstavlja klasi an odgovor koji se uo ava za druge inhibitorne receptore kao što su MICL ili DCIR za koje je tako e pokazano da suprimiraju in vivo T-ćelijske odgovore i inflamaciju (Uto T. et al. Clec4A4 is a regulatory receptor for dendritic cells that impairs inflammation and T-cell immunity. Nat Commun. 2016;7:11273) (Redelinghuys P, et al. MICL controls inflammation in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis.2015). Zanimljivo je da su pronalazači utvrdili da kod pacova CLEC-1 eksprimira CD4<+>podgrupa cDC ćelija u limfoidnim organima. Ova subpopulacija DC ćelija odgovara CD8α+ DC ćelijama koje su mišji pandan uključen u citotoksičnu aktivnost i fagocitozu mrtvih ćelija i za koji je opisano da predstavljaju glavno mesto proizvodnje IL-12 i da su uključene u unakrsnu prezentaciju tumorskih antigena. Ovaj obrazac ekspresije je suprotan inhibitornom receptoru DCIR-2 za koji je pokazano da je ograničen na CD8α-cDC ćelije. Bez obzira na to, u ljudskoj krvi je uočeno da je CLEC-1 eksprimiran na ćelijskoj površini subpopulacije CD16-CD14 mijeloidnih DC ćelija, a ne na BDCA3+ DC ćelijama, koje su ljudski pandan CD8α+ DC ćelija. Ova razlika između ljudi i glodara nalaže dodatna ispitivanja. Pronalazači su uočili da poremećena signalizacija CLEC-1 pojačava naročito aktivaciju Th17 posredovanu DC ćelijama in vitro ali su i Th1 i Th17 odgovori pojačani nakon imunizacije in vivo. Ovo ukazuje na to da CLEC-1 možda različito suprimira Th1 i Th17 odgovore u skladu sa istovremenim angažmanom PRR receptora. Nasuprot tome, DECTIN-1 koji deluje kao aktivirajući receptor u DC ćelijama, različito promoviše Thl7/Thl balans u skladu sa ligandima i istovremenim angažmanom PRR receptora, na taj način što fino reguliše sekreciju polarizujućih citokina IL-12 i IL-23 (Gringhuis SI, et al. Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk. Nat Immunol.

2009;10(2):203-213) (LeibundGut-Landmann S, et al. Syk- and CARD9 dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin 17. Nat Immunol.

2007;8(6):630-638) (Lee EJ, et al. Mincle Activation and the Syk/Card9 Signaling Axis Are Central to the Development of Autoimmune Disease of the Eye. J Immunol. 2016;196(7):3148-3158). Na primer, kada je izložen organizmu Aspergillus Fumigatus, DECTIN-1, kako je pokazano kod miševa, stimuliše Th17 diferencijaciju posebno smanjivanjem ekspresije IFN-y and IL12p40 čime se smanjuje Th1 polarizacija. Začuđujuće, pronalazači nisu uočili da signalizacija CLEC-1 u DC ćelijama suprimira ekspresiju Th17 polarizujućih citokina indukovanu PRR receptorom, a zabeležili su samo efekat na proizvodnju IL- 12p40 na pacovskim KO BMDC ćelijama. Ovi rezultati ukazuju na to da CLEC-1 u DC ćelijama može da oblikuje Th17/Th1 balans i drugim mehanizmima osim ekspresijom polarizujućih citokina. Na primer, pokazano je da DECTIN-1 utiče na polarizacionu sudbinu T ćelija takođe i modulacijom ekspresije kostimulatornih molekula za Ox40 ligand na DC ćelijama (Joo H, et al. Opposing Roles of Dectin-1 Expressed on Human Plasmacytoid Dendritic Cells and Myeloid Dendritic Cells in Th2 Polarization. J Immunol. 2015;195(4):1723-1731). Zanimljivo je da su pronalazači uočili da pokretanjeCLEC-1 na ljudskim DC ćelijama sprečava IκBα degradaciju koju indukuje DECTIN-1 signalizacija. Dakle, CLEC-1 može takođe da spreči Card9 signalni put koji je posredovan aktivacionim CLR receptorima i za koji se zna da specifično održava Th17 odgovor.

[0101] Oni nisu bili u stanju da pomoću CLEC-1 Fc fuzionog proteina detektuju ćelije koje eksprimiraju endogene ligande. Bez obzira na to, njihovi podaci pokazuju da CLEC-1 ligandi mogu da budu eksprimirani od strane hematopoetskih ćelija ili da se oslobađaju "prirodno" ili u nekom određenom kontekstu oštećenja tkiva ili ćelija. Ligande mogu da eksprimiraju same ćelije sa ekspresijom CLEC-1 kao što je to slučaj za DCIR 2 ili alternativno, T ćelije. Objavljeno je da je endogeni ligand za DECTIN-1 ligand eksprimiraju T ćelije i da on, za razliku od CLEC-1, deluje kao kostimulatorni molekul koji pojačava proliferaciju T ćelija (Ariizumi K, et al. Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, dectin-1, by subtractive cDNA cloning. J Biol Chem. 2000;275(26):20157-20167).

[0102] Ovi nalazi su ustanovili da je CLEC-1 značajan u DC ćelijama za kontrolu stepena i kvaliteta nizvodne aktivacije T-ćelija u uskim granicama i da kao receptor na površini ćelija može da obezbedi terapeutsko oruđe za manipulaciju T-ćelijskog odgovora.

[0103] Dakle, CLEC-1 kao inhibitorni receptor na površini mijeloidnih ćelija, ističe se kao potencijalni ciljni molekul za terapeutsku intervenciju i kao nova paradigma za lečenje kancera.

[0104] Nekoliko eksperimentalnih studija pokazuje da CLR receptori doprinose progresiji kancera i metastatskom širenju, preko svog funkcionisanja u ćelijskoj adheziji ili u oblikovanju T-ćelijskog odgovora (Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al.2017). Na primer, pokazano je da imunomodulatorni receptori DC-SIGN, MINCLE, DCIR i BDCA-2 inhibiraju aktivaciju mijeloidnih ćelija, inflamaciju i da su kritični za sprovođenje ekspanzije Foxp3+ CD4<+>CD25+ Tregova (Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). DC-SIGN prepoznaje karcinoembrionski antigen koji je prekomerno eksprimiran na skoro svim humanim karcinomima (Nonaka, Ma et al. 2008) i pospešuje sekreciju imunosupresivnih citokina IL-10 i IL-6 od strane mijeloidnih ćelija. Osim toga, utvrđeno je da su polimorfizmi u promotoru DC SIGN gena u vezi sa povećanim rizikom kod pacijenata sa kolorektalnim kancerom ( Lu, Bevier et al. 2013). Za MINCLE je pokazano da je pojačan u leukocitima koji se infiltriraju u tumore duktalnog adenokarcinoma pankreasa i naročito od strane mijeloid-supresivnih ćelija (MSC ćelije). Ligacija MINCLE sa SAP130 (subjedinica kompleksa histonske deacetilaze) koji se oslobađa iz umirućih ćelija, indukuje snažnu peri-tumorsku supresiju (Seifert, Werba et al.

2016). Slično tome, za CLR LOX-1 je pokazano da je specifično pojačan na ćelijskoj površini neutrofila iz krvi i neutrofila koji se infiltriraju u tumore (15 do 50%) kod pacijenata sa kancerom, dok ga je skoro nemoguće detektovati u krvi zdravih davalaca (Condamine, Dominguez et al. 2016). U ovoj studiji su pokazali da stres endoplazmatičnog retikuluma indukuje ekspresiju LOX-1 i pretvara neutrofile u MSC ćelije sa snažnom supresivnom funkcijom.

[0105] ZA razliku od toga, pokazano je da pokretanje signala za aktivaciju CLR receptora, kao što je DECTIN-1, povećava anti-tumorsku imunost i da smanjuje Treg i MSC celije (Tian, Ma et al. 2013). Primena beta-glukana, liganda za DECTIN-1, inhibira rast tumora u mišjim modelima karcinoma (Li, Cai et al. 2010; Masuda, Inoue et al. 2013; Tian, Ma et al. 2013), u humanim ksenograft-modelima melanoma, neuroblastoma, limfoma (Modak, Koehne et al. 2005), kao i u humanom kanceru jajnika i želuca (Inoue, Tanaka et al.1993; Oba, Kobayashi et al.2009).

[0106] Stoga, pojačavanje DC ćelija ili, šire gledano, aktivacija mijeloidnih ćelija pomoću CLEC-1 antagonista može da predstavlja ciljni događaj imunološke kontrolne tačke koji modulira nizvodnu efektorsku T-ćelijsku imunost, što bi moglo da ima važne kliničke implikacije kod kancera.

PRIMER 2

[0107] Pronalazači su prethodno pokazali da blokada CLEC-1 fuzionim proteinom CLEC-1 Fc pojačava proliferaciju T ćelija u reakciji mešanih leukocita (MLR) kod pacova (videti PRIMER 1). Oni su generisali nekoliko mAbs usmerenih protiv vanćelijskog dela humanog CLEC-1 i pokazali da je jedno mAbs, po svemu sudeći, antagonist signalizacije CLEC-1 i da, dakle, pojačava proliferaciju T ćelija i proizvodnju IFN-y u reakciji mešanih leukocita (MLR). MLR se sastojala od prečišćenih T ćelija izolovanih iz periferne krvi (5X10<4>) koje su pomešane sa dendritskim ćelijama dobijenim iz alogenih monocita (12.5X10<3>) koje eksprimiraju visok nivo CLEC-1. Kontrola izotipa (IgG1) ili anti humano CLEC-1 antitelo su dodavani u dozama od 0.5 do 10 µg/ml tokom 5 dana. Proliferacija T ćelija je zatim procenjena razblaživanjem karboksifluorescein sukcinimidil estrom i procenom ekspresije IFNγ pomoću protočne citometrije u T ćelijama i pomoću ELISA testa u supernatantima (Slike 6A i 6B, histogrami i reprezentativni grafikoni na 6C).

PRIMER 3

CLEC-1 je intenzivno eksprimiran u tumorima i igra funkcionalnu ulogu u tumorskoj imunosti

[0108] U mišjem modelu hepatokarcinoma (intraportalna injekcija hepa 1.6 tumorskih ćelija), pronalazači su uočili povećanu i dugotrajnu ekspresiju CLEC-1 u tumorima (Slika 7a). Važno je i to da su u ovom modelu miševi deficijentni za CLEC-1 (koje je ljubazno poklonio Derrick J. Rossi, Harvard Stem Cell Institute, Kembridž) otporniji na rast tumora i pokazuju povećanu

4

stopu preživljavanja (medijana preživljavanja 28d u KO, u odnosu na 21d u WT) (Slika 7b). Slično tome, u pacovskom modelu pokožnog (sc.) glioma (C6), pronalazači su uočili potpunu regresiju tumora u 3 od 5 pacova deficijentnih za CLEC-1 (koji su dobijeni ZFN tehnologijom u našoj laboratoriji) (Slika 7c). Takođe važno, Q-PCR tehnikom je u tumorima koji su izolovani 18. dana nakon inokulacije tumorskim ćelijama, utvrđena viša ekspresija mRNK za inos, tnfa i ifng za tumore iz pacova deficijentnih za CLEC-1 (Slika 7d). Osim toga, viša ekspresija mRNK za ifng detektovana je u limfnim čvorovima (Slika 7d). Ovi podaci pokazuju bolji anti-tumorski odgovor kod pacova deficijentnih za CLEC-1 i ukazuje na to da je odsustvo CLEC-1 dovelo do indukcije većeg broja anti-tumorskih M1 makrofaga, kao i citotoksičnih i Th1 T ćelija.

CLEC-1 ekspresija je ograničena na cDC ćelije specijalizovane za unakrsnu prezentaciju

[0109] Zanimljivo je da su pronalazači i kod pacova i kod miševa uočili da je ekspresija CLEC-1 na cDC ćelijama iz sekundarnih limfoidnih organa ograničena na specifičan podskup DC ćelija koje su specijalizovane za unakrsnu prezentaciju antigena (CD4<+>kod pacova, CD8α+ kod miševa) (Slika 5A). Pokazalo se da ove ćelije luče visok nivo IL-12 i da su odgovorne za aktivaciju antitumorskog odgovora citotoksičnih CD8+ T limfocita (CTL). Stoga, delujući kao inhibitorni receptor u ovim specijalizovanim podgrupama DC ćelija, inicijacija CLEC-1 može da spreči proizvodnju IL-12, efikasnu unakrsnu prezentaciju i CTL odgovor na tumorske antigene.

CLEC-1 eksprimiraju pro-tumorski makrofagi M2 tipa i mijeloidne ćelije iz pleuralnog izliva mezotelioma i iz ascita tumora jajnika.

[0110] Pronalazači su primetili intenzivniju ekspresiju CLEC-1 i u transkriptima (a) i na nivou proteina (b) na ljudskim pro-tumorskim makrofagima tipa M2 u poređenju sa antitumorskim makrofagima tipa M1 ili u poređenju sa makrofagima M0 (Slika 8). Osim toga, posmatrali su ekspresiju proteina CLEC-1 na površini ljudskih mijeloidnih CD45+ HLADR+ CD16+ ćelija iz pleuralnog izliva mezotelioma (c) i na CD14+ mijeloidnim ćelijama iz ascita karcinoma jajnika (d) u poređenju sa kontrolnim izotipom (Slika 8). Ovi podaci pokazuju da je ekspresija CLEC-1 pojačana na mijeloidnim ćelijama u tumorskom mikrookruženju i da bi mogla da igra kritičnu ulogu u izbegavanju imunskog sitema od strane tumora.

[0111] U zaključku, s obzirom na prethodno navedene rezultate (naročito rezultate koji pokazuju da fuzioni protein CLEC-1 Fc i antitela usmerena protiv vanćelijskog dela ljudskog CLEC-1 pospešuju proliferaciju T ćelija), čini se verodostojnim da antagonisti CLEC-1 mogu da se koriste se za lečenje kancera.

4

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Antagonist humanog CLEC-1 za upotrebu u lečenju ljudskog subjekta koji pati od kancera.

2. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što ljudski subjekt pati od kancera koji je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera žučnih kanala, kancera bešike, kancera kostiju, kancera mozga i centralnog nervnog sistema, kancera dojke, Kaselmanove bolesti, kancera grlića materice, kolorektalnog kancera, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, kancera žučne kese, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, Hočkinove bolesti, ne-Hočkinovog limfoma, Kapošijevog sarkoma, kancera bubrega, kancera larinksa i hipofarinksa, kancera jetre, kancera pluća, mezotelioma, plazmacitoma, kancera nosne šupljine i paranazalnih sinusa, kancera nazofarinksa, neuroblastoma, kancera usne šupljine i orofarinksa, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera penisa, kancera hipofize, kancera prostate, retinoblastoma, rabdomiosarkoma, kancera pljuvačnih žlezda, kancera kože, kancera želuca, kancera testisa, kancer timusa, kancera štitne žlezde, kancera vagine, kancera vulve i kancera materice.

3. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je antagonist ljudskog CLEC-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

4. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je antagonist ljudskog CLEC-1 odabran iz grupe koja se sastoji od himernih antitela, humanizovanih ili potpuno humanih monoklonskih antitela, ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata.

5. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačen time što se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično vezuje za ekstracelularni domen humanog CLEC-1.

6. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je antagonist humanog CLEC-1 polipeptid.

7. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što je polipeptid funkcionalni ekvivalent humanog CLEC-1.

8. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što je polipeptid funkcionalni ekvivalent humanog CLEC-1 fuzionisan sa konstantnim domenom imunoglobulina.

9. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je antagonist humanog CLEC-1 aptamer.

10. Antagonist za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što se kancer leči tako što se unapređuje odgovor T ćelija.

4

11. Antagonist za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, u kombinaciji sa konvencionalnim tretmanom za kancer.

12. Antagonist za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, u kombinaciji sa sredstvom izabranim od hemioterapeutskog sredstva, ciljane terapije za kancer, imunoterapeutskog sredstva ili radioterapije, naročito za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu.

13. Antagonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što je sredstvo odabrano iz grupe koja se sastoji od citotoksičnog sredstva, antiangiogenog sredstva, anti-kancerskog imunogenog sredstva, sredstva za regulaciju kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoze, antikancerskog antitela i sredstva za regulaciju hormona.

4