RS62523B1 - Kompozicije i postupci za inhibiciju genske ekspresije lpa - Google Patents

Kompozicije i postupci za inhibiciju genske ekspresije lpa

Info

Publication number
RS62523B1
RS62523B1 RS20211351A RSP20211351A RS62523B1 RS 62523 B1 RS62523 B1 RS 62523B1 RS 20211351 A RS20211351 A RS 20211351A RS P20211351 A RSP20211351 A RS P20211351A RS 62523 B1 RS62523 B1 RS 62523B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rnai agent
seq
lpa
lpa rnai
sequence
Prior art date
Application number
RS20211351A
Other languages
English (en)
Inventor
Stacey Melquist
Steven Kanner
David B Rozema
David L Lewis
Lauren J Almeida
Darren H Wakefield
Vladimir S Trubetskoy
Tao Pei
Zhen Li
Aaron Almeida
Original Assignee
Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arrowhead Pharmaceuticals Inc filed Critical Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Publication of RS62523B1 publication Critical patent/RS62523B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
[0001] Lipoprotein(a) [Lp(a)] je heterogena čestica male gustine (low density lipoprotein, LDL) nalik lipoproteinu koja sadrži lipidno jezgro i apolipoprotein B (apoB-100) sa jedinstvenim sastojkom, apolipoproteinom (a) (apo(a)), koji je vezan za apoB-100 preko disulfidne veze.
[0002] Gen apo(a) (LPA) eksprimira se prvenstveno u jetri, i ekspresija je ograničena na ljude i primate koji nisu ljudi. Nivoi Lp(a) kod ljudi su definisani genetski, i ne menjaju se znatno pod uticajem ishrane, fizičke aktivnosti i drugih promena načina života. Dužina LPA varira u zavisnosti od broja prisutnih Kringl KIV2 domena, i njegova ekspresija je obrnuto srazmerna broju prisutnih domena. Normalni nivoi Lp(a) su u rasponu od 0,1–25 mg/dl, pri čemu oko 25% populacije u Sjedinjenim Američkim Državama ima nivo Lp(a) od 30 mg/dl ili više.
[0003] Analiza nivoa Lp(a) u različitim studijama ukazuje na visok nivo Lp(a) kao nezavisan faktor rizika za kardiovaskularnu bolest, moždani udar i druge srodne poremećaje, uključujući aterosklerotičnu stenozu. Pored toga, analize povezivanja na nivou genoma takođe ukazuju na LPA kao genetski faktor rizika za bolesti kao što je aterosklerotična stenoza.
[0004] Publikacija Tadin-Strapps et al., 2015, J. Cardiovasc. Transl. Res. 8, 44-53 opisuje siRNK formulisane nanočesticama lipida, koje ciljaju gen LPA radi proučavanja uloge lipoprotein (a) ateroskleroze kod primata koji nisu ljudi.
[0005] Kada je afereza terapeutskog lipoproteina korišćena za sniženje nivoa Lp(a) i LDL kod hiperlipidemičnih pacijenata, uočeno je značajno smanjenje kardiovaskularnih događaja.
[0006] Zato postoji potreba za terapeutskim agensima i lečenjem povezanim sa ovim i drugim bolestima povezanim sa LPA.
SAŽETAK PRONALASKA
[0007] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0008] Predmetni pronalazak je usmeren na agens LPA interferirajuće RNK (RNKi) koji sadrži sens lanac i antisens lanac, naznačeno time što antisens lanac sadrži sekvencu bilo kog od SEQ ID NO:1280, SEQ ID NO:1282, SEQ ID NO:1246, SEQ ID NO:1242, SEQ ID NO:1244 ili SEQ ID NO:1254, i naznačeno time što sens lanac sadrži sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom antisens lanca.
[0009] Nadalje, predmetni pronalazak je usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens LPA RNKi iz predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0010] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na agens LPA RNKi iz predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za inhibiciju genske ekspresije LPA kod ispitanika.
[0011] Predmetni pronalazak takođe obuhvata agens LPA RNKi iz predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju kardiovaskularne bolesti kod ispitanika kome je to potrebno.
[0012] Predmetni pronalazak dalje obuhvata agens LPA RNKi iz pronalaska za upotrebu u lečenju Bergerove bolesti, bolesti perifernih arterija, koronarne arterijske bolesti, metaboličkog sindroma, akutnog koronarnog sindroma, stenoze aortnog zaliska, regurgitacije aortnog zaliska, aortne disekcije, okluzije retinalne arterije, cerebrovaskularne bolesti, mezenterične ishemije, okluzije gornje mezenterične arterije, stenoze renalnih arterija, stabilne/nestabilne angine, akutnog koronarnog sindroma, heterozigotne ili homozigotne familijarne hiperholesterolemije, hiperapobetalipoproteinemije, cerebrovaskularne ateroskleroze, cerebrovaskularne bolesti ili tromboze vena kod ispitanika kome je to potrebno.
[0013] Ovde su opisani agensi LPA (naziva se i apo(a)) interferirajuće RNK (RNKi) (naziva se i RNKi okidač, ili okidač) i kompozicije koje sadrže agense LPA RNKi za selektivnu i efikasnu inhibiciju ekspresije gena LPA. LPA je naziv gena koji kodira apolipoprotein (a) (apo(a)), ključnu komponentu čestice lipoproteina (a) (Lp(a)). Agensi LPA RNKi koji su ovde opisani mogu da se koriste u prevenciji ili lečenju ili pripremi leka za prevenciju ili lečenje bolesti, uključujući, bez ograničenja: Bergerovu bolest, bolest perifernih arterija, koronarnu arterijsku bolest, metabolički sindrom, akutni koronarni sindrom, stenozu aortnog zaliska, regurgitaciju aortnog zaliska, aortnu disekciju, okluziju retinalne arterije, cerebrovaskularnu bolest, mezenteričnu ishemiju, okluziju gornje mezenterične arterije, stenozu renalnih arterija, stabilnu/nestabilnu anginu, akutni koronarni sindrom, heterozigotnu ili homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju, hiperapobetalipoproteinemiju, cerebrovaskularnu aterosklerozu, cerebrovaskularnu bolest ili trombozu vena.
[0014] Svaki agens LPA RNKi obuhvata najmanje sens lanac i antisens lanac. Sens lanac i antisens lanac mogu biti delimično, u velikoj meri, ili u potpunosti međusobno komplementarni. Dužina sens i antisens lanaca ovde opisanog agensa RNKi za svaki može biti 17 do 30 nukleotida. U nekim slučajevima, sens i antisens lanci su nezavisno dužine 17 do 26 nukleotida. Sens i antisens lanci mogu biti iste ili različite dužine. Ovde opisani agensi RNKi, nakon isporuke u ćeliju koja eksprimira gen LPA, inhibiraju ekspresiju gena LPA in vitro ili in vivo.
[0015] Sens lanac agensa LPA RNKi sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90% identična u nizu jezgra od najmanje 17 uzastopnih nukleotida sa sekvencom u LPA iRNK. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca sens lanca koja je najmanje 90% identična sa sekvencom u LPA iRNK ima dužinu od 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 nukleotida. Antisens lanac agensa LPA RNKi sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90% komplementarna u nizu jezgra od najmanje 16 uzastopnih nukleotida sa sekvencom u LPA iRNK i odgovarajućim sens lancem. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca antisens lanca koja je najmanje 90% komplementarna sa sekvencom u LPA iRNK ili odgovarajućim sens lancem ima dužinu od 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 nukleotida.
[0016] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više agenasa LPA RNKi se isporučuje u ciljne ćelije ili tkiva koristeći bilo koju oligonukleotidnu tehnologiju za isporuku koja je poznata u struci. Postupci za isporuku nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, isporuku putem enkapsulacije u lipozomima, putem jontoforeze ili putem inkorporacije u druge nosače, kao što su hidrogelovi, ciklodekstrini, biorazgradive nanokapsule i bioadhezivne mikrosfere, proteinski vektori ili Dynamic Polyconjugates™ (DPC (vidite, na primer WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 i WO 2012/083185. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi je konjugovan sa ciljajućom grupom. U nekim otelotvorenjima, ciljajuća grupa može da uključuje ligand ćelijskog receptora, kao što je klaster galaktoze, uključujući klaster galaktoze koji sadrži trimer N-acetil-galaktozamina.
[0017] U nekim otelotvorenjima su opisane farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više agenasa LPA RNKi. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi je opciono kombinovan sa jednim ili više dodatnih (tj. drugim, trećim, itd.) terapeutskih agenasa. Dodatni terapeutski agens može biti još jedan agens LPA RNKi (npr. agens LPA RNKi koji cilja različitu sekvencu u ciljnom LPA). Dodatni terapeutski agens takođe može biti lek malog molekula, antitelo, fragment antitela i/ili vakcina. Agensi LPA RNKi, sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili bez njih, mogu da se kombinuju sa jednim ili više ekscipijenasa kako bi nastale farmaceutske kompozicije.
[0018] U nekim otelotvorenjima, opisane su kompozicije za in vivo isporuku agensa LPA RNKi u ćelije jetre, naročito hepatocite, koje sadrže: agens LPA RNKi konjugovan sa ciljajućom grupom. U nekim otelotvorenjima, ciljajuća grupa je asijaloglikoproteinski ligand.
[0019] Takođe su opisani postupci za lečenje ljudskog ispitanika koji ima patološko stanje ili rizik od razvoja patološkog stanja koje je barem delimično posredovano ekspresijom LPA, pri čemu postupci obuhvataju korake primene na ispitaniku terapeutski delotvorne količine agensa LPA RNKi ili kompozicije koja sadrži agens LPA RNKi. Postupak za lečenje ispitanika agensom LPA RNKi ili kompozicijom koja sadrži agens LPA RNKi može opciono da se kombinuje sa jednim ili više koraka primene jednog ili više dodatnih (npr. drugih) terapeutskih agenasa ili lečenja. Agens LPA RNKi i dodatni terapeutski agensi mogu da se primene u jednoj kompoziciji ili mogu da se primene zasebno. Primeri za dodatne terapeutske agense uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore HMg Co-A reduktaze (statine), ezetimib, inhibitore PCSK-9, inhibitore CTEP, terapije koje ciljaju ANGPTL3, terapije koje ciljaju APOC3, i niacin.
[0020] Primena opisanih agenasa LPA RNKi može da se koristi u postupcima za terapeutsku prevenciju ili lečenje bolesti, uključujući, bez ograničenja: Bergerovu bolest, bolest perifernih arterija, koronarnu arterijsku bolest, metabolički sindrom, akutni koronarni sindrom, stenozu aortnog zaliska, regurgitaciju aortnog zaliska, aortnu disekciju, okluziju retinalne arterije, cerebrovaskularnu bolest, mezenteričnu ishemiju, okluziju gornje mezenterične arterije, stenozu renalnih arterija, stabilnu/nestabilnu anginu, akutni koronarni sindrom, heterozigotnu ili homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju, hiperapobetalipoproteinemiju, cerebrovaskularnu aterosklerozu, cerebrovaskularnu bolest ili trombozu vena. Takvi postupci obuhvataju primenu agensa LPA RNKi, kao što je ovde opisan, na ispitaniku, npr. ispitaniku koji je čovek ili životinja.
[0021] Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju na brojne načine u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje, i od oblasti koja će se lečiti. Primena može da se izvrši na bilo koji način koji je uobičajeno poznat u struci, kao što je, bez ograničenja, topikalno (npr. putem transdermalnog flastera), pulmonarno (npr. putem inhalacije ili insuflacije praškova ili aerosola, uključujući primenu pomoću raspršivača, intratrahealno, intranazalno), epidermalno, transdermalno, oralno ili parenteralno. Parenteralna primena uključuje, ali nije ograničena na, intravensku, intraarterijsku, supkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; subdermalnu (npr. putem implantiranog sredstva), intrakranijalnu, intraparenhimsku, intratekalnu i intraventrikularnu primenu. U nekim otelotvorenjima, ovde opisane farmaceutske kompozicije se primenjuju supkutanom injekcijom.
[0022] Opisani agensi i/ili kompozicije LPA RNKi mogu da se koriste u postupcima za terapeutsko lečenje bolesti, uključujući, bez ograničenja: Bergerovu bolest, bolest perifernih arterija, koronarnu arterijsku bolest, metabolički sindrom, akutni koronarni sindrom, stenozu aortnog zaliska, regurgitaciju aortnog zaliska, aortnu disekciju, okluziju retinalne arterije, cerebrovaskularnu bolest, mezenteričnu ishemiju, okluziju gornje mezenterične arterije, stenozu renalnih arterija, stabilnu/nestabilnu anginu, akutni koronarni sindrom, heterozigotnu ili homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju, hiperapobetalipoproteinemiju, cerebrovaskularnu aterosklerozu, cerebrovaskularnu bolest ili trombozu vena. Takvi postupci obuhvataju primenu agensa LPA RNKi, kao što je ovde opisan, na ispitaniku, npr. ispitaniku koji je čovek ili životinja.
[0023] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje je uobičajeno poznato osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako postupci i supstance slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu da se koriste u praktikovanju ili testiranju predmetnog pronalaska, odgovarajući postupci i supstance su opisani u nastavku. U slučaju neslaganja, prednost ima predmetna specifikacija, uključujući definicije. Pored toga, supstance, postupci i primeri su isključivo u svrhu primera, i nisu ograničavajući.
[0024] Druge karakteristike i prednosti pronalaska biće jasne iz sledećeg detaljnog opisa i iz patentnih zahteva.
KRATAK OPIS SLIKA
[0025]
SL. 1. Grafik koji ilustruje nivoe Lp(a) proteina u serumu kod Lp(a) transgenih (Tg) miševa nakon jedne supkutane primene 0,5 mg/kg (isprekidana linija) ili 2 mg/kg (puna linija) naznačenog agensa LPA RNKi. Nivoi Lp(a) su normalizovani na 1. dan i kontrolni uzorak koji je fiziološki rastvor.
SL. 2. Grafik koji ilustruje nivoe Lp(a) proteina u serumu kod Lp(a) Tg miševa nakon primene tri supkutane doze od 1 mg/kg (isprekidana linija) ili 3 mg/kg (puna linija) naznačenog agensa LPA RNKi, koji se primenjuje jednom nedeljno tokom tri nedelje (doza 1, 8. i 15. dana). Nivoi Lp(a) su normalizovani na 1. dan i kontrolni uzorak koji je fiziološki rastvor.
SL. 3. Grafik koji ilustruje nivoe Lp(a) čestica u serumu majmuna Cynomolgus (makaki) nakon primene jedne doze od 2 mg/kg AD01196 agensa LPA RNKi koji je doziran 1:1 (mas./mas.) sa polimerom za isporučivanje 1. dana. Nivoi Lp(a) su normalizovani na dve vrednosti pre doze (prikazano kao 0. dan).
SL. 4. Grafik koji ilustruje nivoe Lp(a) čestica u serumu majmuna Cynomolgus (makaki) nakon primene 4 mg/kg ili 6 mg/kg agensa LPA RNKi koji je doziran 1:1 (mas./mas.) sa polimerom za isporučivanje 1. i 71. dana. Nivoi Lp(a) su normalizovani na dve vrednosti pre doze (prikazano kao 0. dan). Doza od 4 mg/kg = crni krugovi; doza od 6 mg/kg = sivi kvadrati.
SL. 5. Grafik koji ilustruje nivoe Lp(a) čestica u serumu majmuna Cynomolgus (makaki) nakon tri nedeljne supkutane doze od 3 mg/kg AD02819 agensa LPA RNKi 1, 8. i 15. dana. Nivoi Lp(a) su normalizovani na tri vrednosti pre doze (što je prikazano kao 0. dan).
SL. 6. Grafik koji ilustruje nivoe Lp(a) čestica u serumu majmuna Cynomolgus (makaki) nakon jedne supkutane primene 3 mg/kg LPA RNKi 1. dana. Grupe sa AD03460 i AD03536 primile su dodatnu dozu od 1 mg/kg agensa LPA RNKi 48. dana. Nivoi Lp(a) su normalizovani na tri vrednosti pre doze (što je prikazano kao 0. dan).
DETALJAN OPIS
[0026] Ovde su opisani agensi RNKi za inhibiciju ekspresije gena LPA (ovde se nazivaju agensi LPA RNKi). Ovde opisani agensi RNKi, nakon isporuke u ćeliju koja eksprimira gen LPA, inhibiraju ili obaraju ekspresiju LPA in vitro i/ili in vivo putem biološkog procesa interferencije RNK (RNKi). Kako se ovde koristi, osim ako specifično nije naznačeno drugačije, LPA može da se odnosi na gen LPA, LPA iRNK ili LP(a) protein, po potrebi.
[0027] Agens LPA RNKi sadrži sens lanac i antisens lanac. Sens lanac i antisens lanac sadrže sekvencu jezgra dužine 17–23 nukleobaza. Sekvenca jezgra antisens lanca je 100% (savršeno) komplementarna, ili najmanje 90% (u velikoj meri) komplementarna sa nukleotidnom sekvencom (ponekad se naziva, npr., ciljna sekvenca) prisutnom u LPA iRNK. Sekvenca jezgra sens lanca je 100% (savršeno) komplementarna, ili najmanje 90% (u velikoj meri) komplementarna sa antisens lancem, te je tako sekvenca jezgra sens lanca savršeno identična ili najmanje 90% identična sa nukleotidnom sekvencom (ciljnom sekvencom) prisutnom u LPA iRNK. Sekvenca jezgra sens lanca može biti iste dužine kao odgovarajuća antisens sekvenca jezgra, ili može biti različite dužine. U nekim otelotvorenjima, sekvenca jezgra antisens lanca je dužine 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sekvenca jezgra sens lanca je dužine 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 nukleotida.
[0028] Sens i antisens lanac agensa LPA RNKi se komplementarno vezuju gradeći dupleks. Sens lanac i antisens lanac agensa LPA RNKi su delimično, u velikoj meri ili u potpunosti međusobno komplementarni. U komplementarnom regionu dupleksa, sekvenca jezgra sens lanca je najmanje 90% komplementarna ili 100% komplementarna sa antisens sekvencom jezgra. U nekim otelotvorenjima, sekvenca jezgra sens lanca sadrži sekvencu od najmanje 17, najmanje 18, najmanje 19, najmanje 20 ili najmanje 21 nukleotida koja je najmanje 90% ili 100% komplementarna odgovarajućoj sekvenci od 17, 18, 19, 20 ili 21 nukleotida sekvence jezgra antisens lanca (tj. sekvence jezgra sens lanca i antisens lanca agensa LPA RNKi imaju region od najmanje 17, najmanje 18, najmanje 19, najmanje 20 ili najmanje 21 nukleotida koji su najmanje 90% bazno upareni ili 100% bazno upareni).
[0029] Kako se ovde koristi, i ako nije drugačije naznačeno, termin „komplementarna“, kada se koristi da opiše prvu nukleotidnu sekvencu (npr. sens lanac agensa RNKi ili LPA iRNK) u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu (npr. antisens lanac agensa RNKi), odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu da se hibridizuje (gradi vodonične veze baznog para) i gradi dupleks ili strukturu dvojne spirale pod određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu nukleotidnu sekvencu. Komplementarne sekvence uključuju Votson-Krikove bazne parove ili bazne parove koji nisu po Votsonu i Kriku, i uključuju prirodne ili modifikovane nukleotide ili imitaciju nukleotida sve dok su ispunjeni prethodni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti hibridizacije. „Savršeno komplementarna“ ili „u potpunosti komplementarna“ znači da će se sve baze (100%) u uzastopnoj sekvenci prvog polinukleotida hibridizovati sa istim brojem baza u uzastopnoj sekvenci drugog polinukleotida. Uzastopna sekvenca može da sadrži celu prvu ili drugu nukleotidnu sekvencu ili njen deo. Kako se ovde koristi, „delimično komplementarna“ znači da će se u hibridizovanom paru nukleobaznih sekvenci, najmanje 70% baza u uzastopnoj sekvenci prvog polinukleotida hibridizovati sa istim brojem baza u uzastopnoj sekvenci drugog polinukleotida. Kako se ovde koristi, „u velikoj meri komplementarna“ znači da će se u hibridizovanom paru nukleobaznih sekvenci, najmanje 85% baza u uzastopnoj sekvenci prvog polinukleotida hibridizovati sa istim brojem baza u uzastopnoj sekvenci drugog polinukleotida. Termini „komplementarna“ „potpuno komplementarna“ i „u velikoj meri komplementarna“, kako se ovde koriste, mogu da se koriste u odnosu na sparivanje baza između sens lanca i antisens lanca agensa RNKi, ili između antisens lanca agensa RNK i sekvence LPA iRNK. Identičnost ili komplementarnost sekvence ne zavisi od modifikacija. Za svrhe određivanja identičnosti ili komplementarnosti, na primer, a i Af su komplementarni sa U (ili T) i identični sa A. Dužina sens i antisens lanaca agensa LPA RNKi koji su ovde opisani je nezavisno 17 do 30 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens i antisens lanci su nezavisno dužine 19 do 26 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens i antisens lanci su dužine 19–26 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens i antisens lanci agensa RNKi su nezavisno dužine 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili 26 nukleotida. Sens i antisens lanci mogu biti iste dužine ili mogu biti različitih dužina. U nekim otelotvorenjima, i sens lanac i antisens lanac su dužine 26 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens lanac je dužine 23 nukleotida, a antisens lanac je dužine 21 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens lanac je dužine 22 nukleotida, a antisens lanac je dužine 21 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens lanac je dužine 21 nukleotida, a antisens lanac je dužine 21 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens lanac je dužine 19 nukleotida, a antisens lanac je dužine 21 nukleotida.
[0030] Sens lanac i/ili antisens lanac mogu opciono i nezavisno da sadrže dodatnih 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleotida (ekstenzija) na 3' kraju, 5' kraju, ili i na 3' i na 5' kraju sekvenci jezgra. Dodatni nukleotidi antisens lanca, ako su prisutni, mogu i ne moraju biti komplementarni odgovarajućoj sekvenci u LPA iRNK. Dodatni nukleotidi sens lanca, ako su prisutni, mogu i ne moraju biti identični odgovarajućoj sekvenci u LPA iRNK. Dodatni nukleotidi antisens lanca, ako su prisutni, mogu i ne moraju biti komplementarni odgovarajućim dodatnim nukleotidima sens lanca, ako su prisutni.
[0031] Kako se ovde koristi, ekstenzija sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleotida na 5' i/ili 3' kraju sekvence jezgra sens lanca i/ili sekvence jezgra antisens lanca. Nukleotidi ekstenzije na sens lancu mogu i ne moraju biti komplementarni nukleotidima, bilo nukleotidima sekvence jezgra ili nukleotidima ekstenzije, u odgovarajućem antisens lancu. Obrnuto, nukleotidi ekstenzije na antisens lancu mogu i ne moraju biti komplementarni nukleotidima, bilo nukleotidima sekvence jezgra ili nukleotidima ekstenzije, u odgovarajućem sens lancu. U nekim otelotvorenjima, i sens lanac i antisens lanac agensa RNKi sadrže ekstenzije na 3' i 5'. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida 3' ekstenzije jednog lanca bazno se sparuje sa jednim ili više nukleotida 5' ekstenzije drugog lanca. U drugim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida 3' ekstenzije jednog lanca se ne sparuje bazno sa jednim ili više nukleotida 5' ekstenzije drugog lanca. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi ima antisens lanac sa 3' ekstenzijom i sens lanac sa 5' ekstenzijom.
[0032] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac sa 3' ekstenzijom dužine 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleotida. U drugim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac sa 3' ekstenzijom dužine 1, 2 ili 3 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida ekstenzije antisens lanca sadrži nukleotide uracil ili timidin ili nukleotide koji su komplementarni odgovarajućoj sekvenci LPA iRNK. U nekim otelotvorenjima, 3' ekstenzija antisens lanca uključuje ili se sastoji od sledećeg, bez ograničenja: Ab, AbAb, AUA, UGCUU, CUG, UG, UGCC, CUGCC, CGU, CUU, UGCCUA, CUGCCU, UGCCU, UGAUU, GCCUAU, T, TT (svaki naveden od 5' do 3').
[0033] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac sa 5' ekstenzijom dužine 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida. U drugim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac sa 5' ekstenzijom dužine 1 ili 2 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više
1
nukleotida ekstenzije antisens lanca sadrži nukleotide uracil ili timidin, ili nukleotide koji su komplementarni odgovarajućoj sekvenci LPA iRNK. U nekim otelotvorenjima, 5' ekstenzija antisens lanca, bez ograničenja, uključuje ili se sastoji od UA, TU, U, T, CUC (svaki naveden od 5' do 3'). Antisens lanac može imati bilo koju od prethodno opisanih 3' ekstenzija u kombinaciji sa bilo kojom od opisanih 5'' antisens ekstenzija, ako su prisutne.
[0034] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac sa 3' ekstenzijom dužine 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida ekstenzije sens lanca sadrži nukleotide adenozin, uracil ili timidin, AT dinukleotid, ili nukleotide koji odgovaraju nukleotidima u sekvenci LPA iRNK. U nekim otelotvorenjima, 3' ekstenzija sens lanca, bez ograničenja, uključuje ili se sastoji od: T, UUAb, UAb, Ab, UT, TT, UUT, TTT ili TTTT (svaki naveden od 5' do 3').
[0035] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac sa 5' ekstenzijom dužine 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida ekstenzije sens lanca sadrži nukleotide uracil ili adenozin ili nukleotide koji odgovaraju nukleotidima u sekvenci LPA iRNK. U nekim otelotvorenjima, 5' ekstenzija sens lanca, bez ograničenja, može biti: CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, Ab, UCA, UAU (svaki naveden od 5' do 3'). Sens lanac može imati 3' ekstenziju i/ili 5' ekstenziju.
[0036] Primeri za nukleotidne sekvence korišćene u formiranju agenasa LPA RNKi su dati u tabelama 1, 2A, 2B, 3A i 3B. Kako se ovde koristi, termin „sekvenca“ ili „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na redosled ili red nukleobaza, nukleotida i/ili nukleozida, bilo modifikovanih ili nemodifikovanih, opisan nizom slova koristeći standardnu nomenklaturu za nukleotide i legendu za ovde opisane modifikovane nukleotide.
[0037] Agensi RNKi uključuju, ali nisu ograničeni na: kratke interferirajuće RNK (siRNK), dvolančane RNK (dsRNK), mikro RNK (miRNK), kratke ukosnice RNK (shRNK) i dajser supstrate (npr. američki U.S. patenti br.8084599, 8349809 i 8513207).
[0038] Sekvence sens lanca i antisens lanca nemodifikovanog agensa LPA RNKi su obezbeđene u tabeli 1. Prilikom nastanka agenasa LPA RNKi, svaki nukleotid u svakoj od sekvenci navedenih u tabeli 1 može biti modifikovani nukleotid.
Tabela 1. Sekvence antisens lanca i sens lanca nemodifikovanog agensa LPA RNKi.
1
1
1
1
1
[0039] Ovde opisani agensi LPA RNKi nastaju komplementarnim vezivanjem antisens lanca sa sens lancem. Sens lanac koji sadrži sekvencu navedenu u tabeli 1 ili tabeli 2B može biti hibridizovan u bilo koji antisens lanac koji sadrži sekvencu navedenu u tabeli 1 ili tabeli 2A, pod uslovom da dve sekvence imaju region sa najmanje 90% komplementarnosti u sekvenci od 16, 17, 18, 19, 20 ili 21 uzastopnih nukleotida.
[0040] U nekim otelotvorenjima, sens i antisens lanac agenasa RNKi koji su ovde opisani sadrže isti broj nukleotida. U nekim otelotvorenjima, sens i antisens lanac agenasa RNKi koji su ovde opisani sadrže različiti broj nukleotida. U nekim otelotvorenjima, 5' kraj sens lanca i 3' kraj antisens lanca agensa RNKi grade tupi kraj. U nekim otelotvorenjima, 3' kraj sens lanca i 5' kraj antisens lanca agensa RNKi grade tupi kraj. U nekim otelotvorenjima, oba kraja agensa
1
RNKi grade tupi kraj. U nekim otelotvorenjima, nijedan kraj agensa RNKi nije tup. Kako se ovde koristi, tupi kraj se odnosi na kraj agensa dvolančane RNKi u kome su terminalni nukleotidi dva komplementarno vezana kraja komplementarni (grade komplementarni bazni par). U nekim otelotvorenjima, 5' kraj sens lanca i 3' kraj antisens lanca agensa RNKi grade iskrzani kraj. U nekim otelotvorenjima, 3' kraj sens lanca i 5' kraj antisens lanca agensa RNKi grade iskrzani kraj. U nekim otelotvorenjima, oba kraja agensa RNKi grade iskrzani kraj. U nekim otelotvorenjima, nijedan kraj agensa RNKi nije iskrzani kraj. Kako se ovde koristi, iskrzani kraj se odnosi na kraj agensa dvolančane RNKi u kome terminalni nukleotidi dva komplementarno vezana lanca grade par (tj. ne grade prepust) ali nisu komplementarni (tj. grade nekomplementarni par). Kako se ovde koristi, prepust je niz od jednog ili više nesparenih nukleotida na kraju jednog lanca agensa dvolančane RNKi. Nespareni nukleotidi mogu biti na sens lancu ili antisens lancu, što stvara 3' ili 5' prepuste. U nekim otelotvorenjima, agens RNKi sadrži: tup kraj i iskrzani kraj, tup kraj i prepust na 5' kraju, tup kraj i prepust na 3' kraju, iskrzani kraj i prepust na 5' kraju, iskrzani kraj i prepust na 3' kraju, dva 5' kraja sa prepustom, dva 3' kraja sa prepustom, prepust na 5' kraju i prepust na 3' kraju, dva iskrzana kraja, ili dva tupa kraja.
[0041] Nukleotidna baza (ili nukleobaza) je jedinjenje heterocikličnog pirimidina ili purina koja je sastavni deo svih nukleinskih kiselina, i uključuje adenin (A), guanin (G), citozin (C), timin (T) i uracil (U). Kako se ovde koristi, termin „nukleotid“ može da obuhvata modifikovani nukleotid ili imitaciju nukleotida, abazno mesto (Ab ili X) ili surogat ostatka za zamenu.
[0042] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi se priprema ili obezbeđuje kao so, mešovita so, ili slobodna kiselina.
Modifikovani nukleotidi
[0043] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži jedan ili više modifikovanih nukleotida. Kako se ovde koristi, „modifikovani nukleotid“ je nukleotid koji nije ribonukleotid (2'-hidroksil nukleotid). U nekim otelotvorenjima, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% nukleotida je modifikovano. Modifikovani nukleotidi uključuju, ali nisu ograničeni na, dezoksinukleotide, imitaciju nukleotida, abazne nukleotide (ovde predstavljeni sa X, Ab), 2'-modifikovane nukleotide, 3' sa 3' povezane (invertovane) nukleotide (ovde predstavljeni sa invdN, invN, invn, invX, invAb, nukleotide koji ne sadrže prirodnu bazu, premošćene nukleotide, peptidne nukleinske kiseline
2
(PNK), 2',3'-seko imitaciju nukleotida (neotključani analozi nukleobaza, ovde predstavljeni sa NUNA iliNUNA), zaključane nukleotide (ovde predstavljeni sa NLNAili NLNA), 3'-O-metoksi (2' internukleozidno vezane) nukleotide (ovde predstavljeni sa 3'-OMen), 2'-F-arabino nukleotide (ovde predstavljeni sa NfANA ili NfANA), 5'-Me,2'-fluor nukleotide (ovde predstavljene sa 5Me-Nf), morfolino nukleotide, vinil fosfonat dezoksiribonukleotide (ovde predstavljeni sa vpdN), nukleotide koji sadrže vinil fosfonat i nukleotide koji sadrže ciklopropil fosfonat (cPrpN). 2'-modifikovani nukleotidi (tj. nukleotid sa grupom koja nije hidroksilna grupa na 2' poziciji petočlanog prstena šećera) uključuju, ali nisu ograničeni na, 2'-O-metil nukleotide (ovde predstavljeni malim slovom „n“ u nukleotidnoj sekvenci), 2'-dezoksi-2'-fluor nukleotide (ovde predstavljeni sa Nf, takođe ovde predstavljeni sa 2'-fluor nukleotid), 2'-dezoksi nukleotide (ovde predstavljeni sa dN), 2'-metoksietil (2'-O-2-metoksiletil) nukleotide (ovde predstavljeni sa NM ili 2'-MOE), 2'-amino nukleotide i 2'-alkil nukleotide. Nije neophodno da sve pozicije u datom jedinjenju budu jednoobrazno modifikovane. Naprotiv, više od jedne modifikacije može biti uključeno u jedan agens LPA RNKi ili čak u jedan njegov nukleotid. Sens lanac i antisens lanac agensa LPA RNKi može biti sintetisan i/ili modifikovan postupcima koji su poznati u struci. Modifikacija na jednom nukleotidu je nezavisna od modifikacije na drugom nukleotidu.
[0044] Modifikovani nukleotidi takođe uključuju nukleotide koji imaju modifikovane nukleobaze. Modifikovane nukleobaze uključuju, ali nisu ograničene na, sintetičke i prirodne nukleobaze, 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin, 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo, naročito 5-brom, 5- trifluormetil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin.
Modifikovane internukleozidne veze
[0045] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida agensa LPA RNKi je povezano nestandardnim vezama ili skeletima (tj. modifikovanim internukleozidnim vezama ili modifikovanim skeletima). U nekim otelotvorenjima, modifikovana internukleozidna veza je kovalentna internukleozidna veza koja ne sadrži fosfat. Modifikovane internukleozidne veze ili skeleti uključuju, ali nisu ograničene na, 5'-fosforotioatnu grupu (ovde predstavljena malim slovom „s“ ispred nukleotida, recimo sN, sn, sNf ili sdN), hiralne fosforotioate, tiofosfat, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkil-fosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate, uključujući 3'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate, uključujući 3'-amino fosforamidat i aminoalkil fosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkil fosfonate, tionoalkil fosfotriestre, morfolino veze i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, njihove 2'-5' vezane analoge i one koji imaju invertovanu polarnost, naznačeno time što su susedni parovi nukleozidnih jedinica povezani 3'-5' sa 5'-3' ili 2'-5' sa 5'-2'. U drugom otelotvorenju, modifikovana internukleozidna veza ili skelet nema atom fosfora. Modifikovane internukleozidne veze koje nemaju atom fosfora uključuju, ali nisu ograničene na, kratkolančane alkil ili cikloalkil međušećerne veze, međušećerne veze sa mešovitim heteroatomom i alkil ili cikloalkil međušećerne veze, ili jednu ili više kratkolančanih heteroatomskih ili heterocikličnih međušećernih veza. U nekim otelotvorenjima, modifikovani internukleozidni skeleti uključuju, ali nisu ograničeni na, siloksanske skelete, sulfidne, sulfoksidne i sulfonske skelete; formacetilne i tioformacetilne skelete, metilen formacetilne i tioformacetilne skelete, skelete koji sadrže alken, sulfamatne skelete, metilenimino i metilenhidrazino skelete, sulfonatne i sulfonamidne skelete, amidne skelete; i druge koji imaju mešovite N, O, S i CH2delove komponenata.
[0046] U nekim otelotvorenjima, sens lanac agensa LPA RNKi može da sadrži 1, 2, 3, 4 fosforotioatne veze, antisens lanac agensa LPA RNKi može da sadrži 1, 2, 3 ili 4 fosforotioatne veze, ili sens lanac i antisens lanac nezavisno mogu da sadrže 1, 2, 3 ili 4 fosforotioatne veze.
[0047] U nekim otelotvorenjima, sens lanac agensa LPA RNKi sadrži dve fosforotioatne internukleozidne veze. U nekim otelotvorenjima, dve fosforotioatne internukleozidne veze su između nukleozida na pozicijama 1-3 od 3' kraja sens lanca. U nekim otelotvorenjima, dve fosforotioatne internukleozidne veze su između nukleozida na pozicijama 1–3, 2–4, 3–5, 4–6, 4–5 ili 6–8 od 5' kraja sens lanca. U nekim otelotvorenjima, antisens lanac agensa LPA RNKi sadrži četiri fosforotioatne internukleozidne veze. U nekim otelotvorenjima, četiri fosforotioatne internukleozidne veze su između nukleozida na pozicijama 1-3 od 5' kraja sens lanca i između nukleotida na pozicijama 19–21, 20–22, 21–23, 22–24, 23–25 ili 24–26 od 5' kraja. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži dve fosforotioatne internukleozidne veze u sens lancu i četiri fosforotioatne internukleozidne veze u antisens lancu.
[0048] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži jedan ili više modifikovanih nukleotida i jednu ili više modifikovanih internukleozidnih veza. U nekim otelotvorenjima, 2'-modifikovani nukleotid je kombinovan sa modifikovanom internukleozidnom vezom.
Agensi LPA RNKi koji imaju modifikovane nukleotide
[0049] Primeri za antisens lance koji sadrže modifikovane nukleotide dati su u tabeli 2A. Primeri za sens lance koji sadrže modifikovane nukleotide dati su u tabeli 2B. U tabelama 2A i 2B, sledeće oznake se koriste da se naznače modifikovane nukleotide:
N= 2'-OH (nemodifikovani) ribonukleotid (veliko slovo bez oznake f ili d)
n= 2'-OMe modifikovani nukleotid
Nf= 2'-fluor modifikovani nukleotid
dN= 2'-dezoksi nukleotidi
NUNA= 2',3'-seko imitacija nukleotida (neotključani analozi nukleobaze)
NLNA= zaključani nukleotid
NfANA= 2'-F-arabino nukleotid
NM= 2'-metoksietil nukleotid
Ab= abazna riboza
(invdN)= invertni dezoksiribonukleotid (3'-3' vezani nukleotid)
(invAb)= invertni abazni nukleotid
(invn)= invertni 2'-OMe nukleotid
s= fosforotioatno vezani nukleotid
p= fosfat
vpdN= vinil fosfonat dezoksiribonukleotid
(3'OMen)= 3'-OMe nukleotid
(5Me-Nf)= 5'-Me, 2'-fluor nukleotid
cPrp= ciklopropil fosfonat
epTcPr= vidite tabelu 4
epTM = vidite tabelu 4
[0050] Pored toga, sledeće ciljajuće grupe i vezujuće grupe su navedene u tabelama 2A i 2B: (Alk-PEG5-C6), (C11-PEG3-NAG3), (C12), (C6-PEG4-NAG3), (C6-SS-Alk-Me), (Chol-TEG), (Dy540), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG26), (NAG27), (NAG28),
2
(NAG29), (NAG30), (NAG31), (NAG32), (NAG33), (NAG34). (NAG35). (NAG36), (NAG37), (NAG4), (PAZ), (Sp18), (Steryl), (Alk-SMPT-C6). Svaki sens lanac i/ili antisens lanac može imati bilo koju od prethodno naznačenih ciljajućih grupa ili vezujućih grupa, kao i druge ciljajuće ili vezujuće grupe, konjugovane na 5' i/ili 3' kraju sekvence. Hemijske strukture ovih grupa su obezbeđene u tabeli 4.
Tabela 2A. Antisens lanci agensa LPA RNKi koji imaju modifikovane nukleotide.
2
2
2
2
2
1
2
4
Tabela 2B. Sens lanci agensa LPA RNKi koji imaju modifikovane nukleotide.
4
4
4
4
4
4
4
1
[0051] Sens lanac koji sadrži sekvencu navedenu u tabeli 2B može biti hibridizovan u bilo koji antisens lanac koji sadrži sekvencu navedenu u tabeli 2A, pod uslovom da dve sekvence imaju region sa najmanje 90% komplementarnosti u sekvenci od 16, 17, 18, 19, 20 ili 21 uzastopnih nukleotida. Reprezentativni agensi LPA RNKi su predstavljeni pomoću ID br. dupleksa koji su prikazani u tabelama 3A i 3B.
2
[0052] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži jedinjenje sa bilo kojim ovde predstavljenim ID br. dupleksa, naznačeno time što antisens lanac sadrži sekvencu bilo kog od SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1282, SEQ ID NO: 1246, SEQ ID NO:1242, SEQ ID NO: 1244, ili SEQ ID NO: 1254.
Tabela 3A. Dupleksi agensa LPA RNKi sa ID brojevima dupleksa.
4
1
2
4
1
2
Tabela 3B. Dupleksi agensa LPA RNKi sa ID brojevima dupleksa.
4
1
2
4
[0053] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1242 (TCGUAUAACAAUAAGGGGC). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1244 (UCGUAUAACAAUAAGGGG). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1246 (UCGUAUAACAAUAAGGG).
[0054] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1254 (UGUAUAACAAUAAGGGG). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1280 (CGUAUAACAAUAAGGGGC).
[0055] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1282 (UCGUAUAACAAUAAGGGGC).
[0056] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1243 (GCCCCUUAUUGUUAUACGA). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1245 (CCCCUUAUUGUUAUACGA). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1247 (CCCUUAUUGUUAUACGA). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1255 (CCCCUUAUUGUUAUACA). U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1284 (GCCCCUUAUUGUUAUACG).
[0057] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1242 i sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1243. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1244 i sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1245. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1246 i sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1247.
[0058] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1254 i sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1255. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1280 i sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1284. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1282 i sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1259.
[0059] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO. 156, 164 ili 188. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO.310, 357, 384 ili 376. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac koji sadrže nukleotidne sekvence SEQ ID NO:156/310, SEQ ID NO:164/357, SEQ ID NO:188/384, SEQ ID NO:164/376 ili SEQ ID NO:164/384. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotida je modifikovano.
[0060] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO.637, 709, 790, 787 ili 788. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1132, 1135, 1189 ili 1191. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac koji sadrže nukleotidne sekvence SEQ ID NO:637/1132, SEQ ID NO:709/1135, SEQ ID NO:790/1189, SEQ ID NO:787/1191 ili SEQ ID NO:788/1189.
[0061] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži SEQ ID NO.637, 709, 790, 787 ili 788. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži SEQ ID NO:1132, 1135, 1189, 1191 ili 1186. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži SEQ ID NO:637/1132, SEQ ID NO:709/1135, SEQ ID NO:790/1189, SEQ ID NO:787/1191 ili SEQ ID NO:788/1189.
[0062] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi se sastoji od SEQ ID NO.637, 709, 790, 787 ili 788. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi se sastoji od SEQ ID NO:1132, 1135, 1189 ili 1191. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi se sastoji od SEQ ID NO:637/1132, SEQ ID NO:709/1135, SEQ ID NO:790/1189, SEQ ID NO:787/1191 ili SEQ ID NO:788/1189.
[0063] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac sa nukleotidnim sekvencama AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110.
[0064] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac sa nukleotidnim sekvencama AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110, i dalje sadrži ciljajuću grupu liganda receptora asialoglikoproteina.
[0065] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac sa nukleotidnim sekvencama AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110, i dalje sadrži ciljajuću grupu izabranu iz grupe koja se sastoji od (C11-PEG3-NAG3), (C6-PEG4-NAG3), (NAG 3), (NAG4), (NAG3-AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36) i (NAG37).
[0066] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac sa modifikovanim nukleotidnim sekvencama AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110.
[0067] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac sa modifikovanim nukleotidnim sekvencama AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110, i dalje sadrži ciljajuću grupu liganda receptora asialoglikoproteina.
[0068] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži antisens lanac i sens lanac sa modifikovanim nukleotidnim sekvencama AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110, i dalje sadrži ciljajuću grupu izabranu iz grupe koja se sastoji od (C11-PEG3-NAG3), (C6-PEG4-NAG3), (NAG3), (NAG4), (NAG3-AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36) i (NAG37).
[0069] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110.
[0070] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi se sastoji od AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847 ili AD04110.
Nenukleotidna grupa
[0071] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži jednu ili više nenukleotidnih grupa ili je konjugovan sa njima, uključujući, bez ograničenja, ciljajuću grupu, vezujuću grupu, polimer za isporuku ili vehikulum za isporuku. Nenukleotidna grupa može da poboljša ciljanje, isporučivanje ili vezivanje agensa RNKi. Primeri za ciljajuće grupe i vezujuće grupe su dati u tabeli 4. Nenukleotidna grupa može da bude kovalentno vezana sa 3' i/ili 5' krajem sens lanca i/ili antisens lanca. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi sadrži nenukleotidnu grupu vezanu za 3' i/ili 5' kraj sens lanca. U nekim otelotvorenjima, nenukleotidna grupa je vezana za 5' kraj sens lanca agensa LPA RNKi. Nenukleotidna grupa može biti vezana za agens RNKi neposredno ili posredno putem linkera/vezujuće grupe. U nekim otelotvorenjima, nenukleotidna grupa je vezana za agens RNKi putem labilne, raskidive ili reverzibilne veze ili linkera.
[0072] U nekim otelotvorenjima, nenukleotidna grupa poboljšava farmakokinetička svojstva ili svojstva bioraspodele agensa RNKi ili konjugata za koji je vezana, kako bi se poboljšala raspodela specifična za ćeliju ili tkivo i unos konjugata specifičan za ćeliju. U nekim otelotvorenjima, nenukleotidna grupa poboljšava endocitozu agensa RNKi.
Ciljajuća grupa
[0073] Ciljajuća grupa može biti jednovalentna, dvovalentna, trovalentna, četvorovalentna, ili polivalentna. Reprezentativne ciljajuće grupe uključuju, bez ograničenja, jedinjenja sa afinitetom prema molekulu ćelijske površine, ligande ćelijskih receptora, hapten, antitela, monoklonska antitela, fragmente antitela i imitaciju antitela sa afinitetom prema molekulima ćelijske površine. U nekim otelotvorenjima, ciljajuća grupa je povezana sa agensom RNKi koristeći linker, kao što je PEG linker ili jedna, dve ili tri abazne i/ili ribitolske grupe. U nekim otelotvorenjima, ciljajuća grupa sadrži klaster galaktoze.
[0074] Ovde opisani agensi LPA RNKi mogu da se sintetišu tako da imaju reaktivnu grupu, kao što je amino grupa, na 5'-terminusu. Reaktivna grupa se može koristiti da kasnije veže ciljajući ostatak koristeći postupke koji su uobičajeni u struci.
[0075] U nekim otelotvorenjima, ciljajuća grupa sadrži ligand receptora asialoglikoproteina. U nekim otelotvorenjima, ligand receptora asialoglikoproteina sadrži jedan ili više derivata galaktoze ili klastera galaktoze ili se sastoji od njih. Kako se ovde koristi, termin derivat galaktoze obuhvata galaktozu i derivate galaktoze sa afinitetom prema receptoru asialoglikoproteina koji je jednak ili veći od afiniteta same galaktoze. Derivati galaktoze uključuju, ali nisu ograničeni na: galaktozu, galaktozamin, N-formilgalaktozamin, N-acetilgalaktozamin, N-propionil-galaktozamin, N-n-butanoil-galaktozamin i N-izobutanoilgalaktozamin (vidite, na primer: Iobst, S.T. i Drickamer, K. J.B.C.1996, 271, 6686). U struci su poznati derivati i klasteri galaktoze koji su korisni za in vivo ciljanje oligonukleotida i drugih molekula ka jetri (vidite, na primer, Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Derivati galaktoze su korišćeni za ciljanje molekula na hepatocite in vivo putem njihovog vezivanja za receptor asialoglikoproteina (ASGPr) koji je eksprimiran na površini hepatocita. Vezivanje liganda ASGPr za ASGPr olakšava ćelijski specifično ciljanje na hepatocite i endocitozu molekula u hepatocite. Klaster galaktoze može biti povezan sa 3' ili 5' krajem polinukleotida RNKi koristeći postupke koji su poznati u struci.
1
[0076] Kako se ovde koristi, klaster galaktoze sadrži molekul sa dva do četiri terminalna derivata galaktoze. Terminalni derivat galaktoze je vezan za molekul preko svog C-1 ugljenika. U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze je trimer derivata galaktoze, triantenarni derivat galaktoze ili trovalentni derivat galaktoze. U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze sadrži N-acetil galaktozamine (GalNAc). U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze sadrži trovalentni N-acetil-galaktozamin. U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze je tetramer derivata galaktoze, tetraantenarni derivat galaktoze ili četvorovalentni derivat galaktoze. U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze sadrži četvorovalentni N-acetil-galaktozamin.
[0077] Kako se ovde koristi, trimer galaktoze sadrži tri derivata galaktoze, pri čemu je svaki povezan sa centralnom tačkom grananja. Kako se ovde koristi, tetramer galaktoze sadrži četiri derivata galaktoze, pri čemu je svaki povezan sa centralnom tačkom grananja. Derivati galaktoze mogu biti povezani sa centralnom tačkom grananja preko C-1 ugljenika saharida. U nekim otelotvorenjima, derivati galaktoze su povezani sa tačkom grananja preko linkera ili spejsera. U nekim otelotvorenjima, linker ili spejser je fleksibilni hidrofilni spejser, kao što je PEG grupa (vidite, na primer, američki U.S. patent br.5885968; Biessen et al. J. Med. Chem.
1995 Vol. 39 p. 1538-1546). U nekim otelotvorenjima, PEG spejser je PEG3spejser. Tačka grananja može biti bilo koji mali molekul koji omogućava vezivanje tri derivata galaktoze i dalje omogućava vezivanje tačke grananja za agens RNKi. Primer za grupu tačke grananja je dilizin ili diglutamat. Vezivanje tačke grananja za agens RNKi može da bude preko linkera ili spejsera. U nekim otelotvorenjima, linker ili spejser sadrži fleksibilni hidrofilni spejser, kao što je, bez ograničenja: PEG spejser. U nekim otelotvorenjima, PEG spejser je PEG3spejser (tri jedinice etilena). U drugim otelotvorenjima, PEG spejser ima 1 do 20 jedinica etilena (PEG1do PEG20). U nekim otelotvorenjima, derivat galaktoze sadrži N-acetil galaktozamin (GalNAc ili NAG). U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze se sastoji od tetramera derivata galaktoze koji može biti, na primer, tetramer N-acetil-galaktozamina.
[0078] U nekim otelotvorenjima, opisane su farmaceutske kompozicije za isporuku agensa LPA RNKi u ćelije jetre in vivo. Takve farmaceutske kompozicije mogu da sadrže, na primer, agens LPA RNKi konjugovan sa klasterom galaktoze. U nekim otelotvorenjima, klaster galaktoze se sastoji od trimera derivata galaktoze koji može biti, na primer, trimer N-acetilgalaktozamina, ili tetramera derivata galaktoze koji može biti, na primer, tetramer N-acetilgalaktozamina.
2
[0079] Ciljajuće grupe uključuju, ali nisu ograničene na, (Chol-TEG), (TEG-Chol), (C11-PEG3-NAG3), (Cm-PEGn-NAG3), (Cx-PEGz-NAG3), (NAG 3), (NAG4), (NAG3-AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG13), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36) i (NAG37).
Vezujuća grupa
[0080] U nekim otelotvorenjima, vezujuća grupa je konjugovana sa agensom RNKi. Vezujuća grupa olakšava kovalentno vezivanje agensa sa ciljajućom grupom ili polimerom za isporuku ili vehikulumom za isporuku. Vezujuća grupa može biti vezana za 3' ili 5' kraj sens lanca ili antisens lanca agensa RNKi. U nekim otelotvorenjima, vezujuća grupa je povezana sa sens lancem agensa RNKi. U nekim otelotvorenjima, vezujuća grupa je konjugovana sa 5' ili 3' krajem sens lanca agensa RNKi. U nekim otelotvorenjima, vezujuća grupa je konjugovana sa 5' krajem sens lanca agensa RNKi. Primeri za vezujuće grupe uključuju, ali nisu ograničeni na: Alk-SMPT-C6, Alk-SS-C6, DBCO-TEG, Me-Alk-SS-C6 i C6-SS-Alk-Me, reaktivne grupe kao što su primarni amini i alkini, alkil grupe, abaznu ribozu, ribitol i/ili PEG grupe.
[0081] Linker ili vezujuća grupa je veza između dva atoma koja povezuje jednu hemijsku grupu (kao što je agens RNKi) ili segment od interesa sa drugom hemijskom grupom (kao što je ciljajuća grupa ili polimer za isporuku) ili segmentom od interesa putem jedne ili više kovalentnih veza. Labilno povezivanje obuhvata labilnu vezu. Veza opciono može da uključuje spejser koji povećava rastojanje između dva spojena atoma. Spejser može dalje da povećava fleksibilnost i/ili dužinu veze. Spejseri mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, alkil grupe, alkenil grupe, alkinil grupe, aril grupe, aralkil grupe, aralkenil grupe i aralkinil grupe; pri čemu svaka može da sadrži jedan ili više heteroatoma, heterocikala, aminokiselina, nukleotida i saharida. Spejserske grupe su dobro poznate u struci, i prethodna lista ne treba da ograniči obim opisa.
[0082] Vezujuće grupe uključuju, ali nisu ograničene na, alkil, PEG, (C6-PEGn-Alk), (Cn-SMPT-Alk) i (Cn-SS-Alk-Me).
[0083] Bilo koji od agenasa LPA RNKi navedenih u tabelama 2A i 2B koji sadrži 3' ili 5' ciljajuću grupu ili vezujuću grupu alternativno može da ne sadrži 3' ili 5' ciljajuću grupu ili vezujuću grupu, ili može da sadrži različitu 3' ili 5' ciljajuću grupu ili vezujuću grupu, uključujući, bez ograničenja, one prikazane u tabeli 4. Bilo koja od nukleotidnih sekvenci agensa LPA RNKi koje su navedene u tabelama 1, 2A i 2B, bilo da je modifikovana ili nemodifikovana, može da sadrži 3' ili 5' ciljajuću grupu ili vezujuću grupu, uključujući, bez ograničenja, one prikazane u tabeli 4. Bilo koji dupleks agensa LPA RNKi naveden u tabelama 3A i 3B, bilo da je modifikovan ili nemodifikovan, može dalje da sadrži ciljajuću grupu ili vezujuću grupu, uključujući, bez ograničenja, one prikazane u tabeli 4, i ciljajuća grupa ili vezujuća grupa može biti vezana za 3' ili 5' terminus sens lanca ili antisens lanca dupleksa agensa LPA RNKi.
Tabela 4. Strukture koje predstavljaju različite modifikovane nukleotide, ciljajuće grupe i vezujuće grupe.
4
(Alk-PEGn-C6) ili (C6-PEGn-Alk), naznačeno time što je n = 1=12 U nekim otelotvorenjima, n = 5 (npr. (Alk-PEG5-C6)).
(Cn-SMPT-Alk) ili (Alk-SMPT-Cn), naznačeno time što je n=1–10, U nekim otelotvorenjima, n = 4 (npr. (C6-SMPT-Alk)).
(Cn-SS-Alk-Me) ili ((Me-Alk-SS-Cn); naznačeno time što je n = 1–10 U nekim otelotvorenjima, n = 4 (npr. (C6-SS-Alk-Me)).
(Chol-TEG), naznačeno time što je n = 1–10 U nekim otelotvorenjima, n = 2.
(TEG-Chol), naznačeno time što je n = 1–10 U nekim otelotvorenjima, n = 3.
(Cx-PEGz-NAG3), naznačeno time što je x = 1–10, y - 1–10, i z = 1–10 U nekim otelotvorenjima, x = 3, y = 3, i z = 4 (C6-PEG4-NAG3)
�
11
��
�
��
[0084]U svakoj od prethodnih struktura, NAG sadrži N-acetil-galaktozamin ili drugi ligand ASGPR. Svaki (NAGx) može biti vezan za agens LPA RNKi putem fosfatne grupe (kao u (NAG25), (NAG30), i (NAG31)), ili fosforotioatne grupe (kao u (NAG25)s, (NAG30)s, i (NAG31)s), ili druge vezujuće grupe. Alternativno, mogu da se koriste druge vezujuće grupe poznate u struci.
<fosfatna grupa>fosforotioatna grupaN-acetil-galaktozamin
Vehikulumi za isporuku
1
[0085] U nekim otelotvorenjima, za isporuku agensa RNKi u ćeliju ili tkivo može da se koristi vehikulum za isporuku. Vehikulum za isporuku je jedinjenje koje poboljšava isporuku agensa RNKi u ćeliju ili tkivo. Vehikulum za isporuku može, bez ograničenja, da uključuje: polimer, kao što je amfipatični polimer, membranski aktivan polimer, peptid, peptid melitin, peptid nalik melitinu (MLP), lipid, reverzibilno modifikovani polimer ili peptid, ili reverzibilno modifikovan membranski aktivni poliamin, ili da se sastoji od njih.
[0086] U nekim otelotvorenjima, agensi RNKi mogu da se kombinuju sa lipidima, nanočesticama, polimerima, lipozomima, micelama, DPC ili drugim sistemima za isporuku koji su poznati u struci. Agensi RNKi takođe mogu biti hemijski konjugovani sa ciljajućim grupama, lipidima (uključujući, bez ograničenja, holesterol i derivate holesterola), nanočesticama, polimerima, lipozomima, micelama, DPC (vidite, na primer, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169, i WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141), ili drugim sistemima za isporuku koji su dostupni u struci.
Farmaceutske kompozicije
[0087] Ovde su opisani postupci za isporuku agenasa LPA RNKi u ćelije jetre sisara in vivo. U nekim otelotvorenjima, može da se koristi vehikulum za isporuku. Vehikulum za isporuku je jedinjenje koje poboljšava isporuku agensa RNKi u ćeliju. Vehikulum za isporuku može da bude, bez ograničenja: polimer, kao što je amfipatični polimer, membranski aktivan polimer, peptid, kao što je melitin ili peptid nalik melitinu, reverzibilno modifikovani polimer, ili peptid ili lipid. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi je povezan sa ciljajućim ligandom koji sadrži ligand asialoglikoproteina. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi je povezan sa ciljajućim ligandom koji sadrži klaster galaktoze ili se sastoji od njega.
[0088] Agens LPA RNKi može da se koristi za inhibiciju ekspresije LPA u ćeliji, grupi ćelija ili tkivu, npr. kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi se koristi za formulisanje kompozicije, tj. farmaceutske kompozicije ili leka, za primenu na ispitaniku. Kako se ovde koristi, farmaceutska kompozicija ili lek sadrži farmakološki delotvornu količinu najmanje jednog od opisanih agenasa LPA RNKi i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi (ekscipijensi) su supstance, osim aktivnog farmaceutskog sastojka (API, terapeutski proizvod, npr. agens LPA RNKi), čija bezbednost je prikladno ispitana, i namerno su uključene u sistem za isporuku leka. Ekscipijensi ne vrše, ili se ne očekuje da vrše, terapeutsko dejstvo pri nameravanoj dozi. Ekscipijensi mogu da deluju
1
u cilju a) pomoći u obradi sistema za isporuku leka tokom proizvodnje, b) zaštite, podrške ili poboljšanja stabilnosti, bioraspoloživosti ili pacijentovog prihvatanja API, c) pomoći u identifikaciji proizvoda i/ili d) poboljšanja bilo kog svojstva ukupne bezbednosti, delotvornosti, isporuke API tokom skladištenja ili upotrebe. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijens može, ali ne mora biti, inertna supstanca.
[0089] Ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na: pojačivače apsorpcije, agense protiv prianjanja, antipenušavce, antioksidanse, veziva, puferujuće agense, nosače, premaze, boje, pojačivače isporuke, polimere za isporuku, dekstran, dekstrozu, razblaživače, dezintegranse, emulgatore, ekstenzore, punioce, arome, glidanse, humektanse, lubrikanse, ulja, polimere, konzervanse, fiziološki rastvor, soli, rastvarače, šećere, suspendujuće agense, matrice sa produženim otpuštanjem, zaslađivače, agense za zgušnjavanje, agense za toničnost, vehikulume, agense koji odbijaju vodu i kvašljivce.
[0090] Farmaceutska kompozicija može da sadrži druge dodatne komponente koje se uobičajeno mogu naći u farmaceutskim kompozicijama. Takve dodatne komponente uključuju, ali nisu ograničene na: antipruritike, adstringente, lokalne anestetike ili antiinflamatorne agense (npr. antihistamin, difenilhidramin, itd.). Takođe je predviđeno da ćelije, tkiva ili izolovani organi koji eksprimiraju ili sadrže ovde definisane agense RNKi mogu da se koriste kao „farmaceutske kompozicije“. Kako se ovde koristi, „farmakološki delotvorna količina“, „terapeutski delotvorna količina“ ili jednostavno „delotvorna količina“ odnosi se na količinu agensa RNKi za dobijanje nameravanog farmakološkog, terapeutskog ili preventivnog rezultata.
[0091] U nekim otelotvorenjima, opisani agens LPA RNKi se kombinuje sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili lečenja, uključujući, bez ograničenja: drugi agens LPA RNKi ili drugi agens RNKi, lek malog molekula, antitelo, fragment antitela i/ili vakcinu. Primeri za dodatne terapeutske agense uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore HMg Co-A reduktaze (statine), ezetimib, inhibitore PCSK-9, inhibitore CTEP, terapije koje ciljaju ANGPTL3, terapije koje ciljaju APOC3, i niacin.
[0092] Opisani agensi RNKi i farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde otkrivene agense LPA RNKi mogu da se pakuju ili uključe u komplet, ambalažu, pakovanje ili dozator. Agensi
1
LPA RNKi i farmaceutske kompozicije koje sadrže navedene agense LPA RNKi mogu da se pakuju u prethodno napunjene špriceve ili bočice.
[0093] U nekim otelotvorenjima, razmatraju se farmaceutske kompozicije koje sadrže najmanje jedan od opisanih agenasa LPA RNKi. Ove farmaceutske kompozicije su korisne u inhibiciji ekspresije gena LPA u ćeliji, tkivu ili organizmu. U nekim otelotvorenjima, opisane farmaceutske kompozicije se koriste za lečenje ispitanika koji ima bolest, stanje ili poremećaj kome bi koristilo smanjenje ili inhibicija ekspresije LPA. U nekim otelotvorenjima, opisane farmaceutske kompozicije se koriste za lečenje ispitanika koji je pod rizikom od nastanka bolesti, stanja ili poremećaja kome bi koristilo smanjenje ili inhibicija ekspresije LPA. Bolesti, stanja ili poremećaji koji bi imali koristi od smanjenja ili inhibicije ekspresije LPA uključuju, bez ograničenja: Bergerovu bolest, bolest perifernih arterija, koronarnu arterijsku bolest, metabolički sindrom, akutni koronarni sindrom, stenozu aortnog zaliska, regurgitaciju aortnog zaliska, aortnu disekciju, okluziju retinalne arterije, cerebrovaskularnu bolest, mezenteričnu ishemiju, okluziju gornje mezenterične arterije, stenozu renalnih arterija, stabilnu/nestabilnu anginu, akutni koronarni sindrom, heterozigotnu ili homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju, hiperapobetalipoproteinemiju, cerebrovaskularnu aterosklerozu, cerebrovaskularnu bolest ili trombozu vena. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je sisar, uključujući, bez ograničenja, ljudskog pacijenta.
[0094] Razmatrane su ćelije, tkiva i nehumani organizmi koji sadrže najmanje jedan od ovde opisanih agenasa LPA RNKi. Ćelija, tkivo ili nehumani organizam se dobijaju isporukom agensa RNKi u ćeliju, tkivo ili nehumani organizam bilo kojim putem koji je dostupan u struci. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija sisara, uključujući, bez ograničenja, ćeliju čoveka. Ćelija, tkivo ili nehumani organizmi su korisni za istraživanje ili kao istraživački alati (npr. testiranje leka ili dijagnoza).
Agensi LPA RNKi za upotrebu u postupku lečenja
[0095] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani agensi LPA RNKi su za upotrebu u lečenju ispitanika koji ima bolest, stanje ili poremećaj, ili ima rizik da dobije bolest, stanje ili poremećaj kome bi koristilo smanjenje ili inhibicija ekspresije LPA u skladu sa zahtevima. Lečenje ispitanika kome bi koristilo smanjenje i/ili inhibicija ekspresije gena LPA uključuje terapeutsko i/ili profilaktičko lečenje. Primeri za bolesti, stanja ili poremećaje uključuju, bez ograničenja: Bergerovu bolest, bolest perifernih arterija, koronarnu arterijsku bolest,
1
metabolički sindrom, akutni koronarni sindrom, stenozu aortnog zaliska, regurgitaciju aortnog zaliska, aortnu disekciju, okluziju retinalne arterije, cerebrovaskularnu bolest, mezenteričnu ishemiju, okluziju gornje mezenterične arterije, stenozu renalnih arterija, stabilnu/nestabilnu anginu, akutni koronarni sindrom, heterozigotnu ili homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju, hiperapobetalipoproteinemiju, cerebrovaskularnu aterosklerozu, cerebrovaskularnu bolest ili trombozu vena. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu kompozicije, kao što je farmaceutska kompozicija, koja sadrži ovde opisani agens LPA RNKi na sisaru koji se leči.
[0096] U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje terapeutski delotvorna količina jednog ili više opisanih agenasa LPA RNKi, čime se inhibira ekspresija LPA kod ispitanika (npr. količina koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije LPA kod ispitanika). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ovde opisanih agenasa LPA RNKi je za upotrebu u lečenju ispitanika koji ima bolest ili poremećaj kome bi koristilo smanjenje ili inhibicija ekspresije LPA. U nekim otelotvorenjima, opisani agensi LPA RNKi su za upotrebu u lečenju ili prevenciji najmanje jednog simptoma kod ispitanika koji ima bolest ili poremećaj kome bi koristilo smanjenje ili inhibicija ekspresije LPA u skladu sa zahtevima. Na ispitaniku se primenjuje terapeutski delotvorna količina bilo kog pojedinačnog, ili više opisanih agenasa RNKi, čime se simptom leči. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje profilaktički delotvorna količina bilo kog pojedinačnog, ili više opisanih agenasa RNKi, čime se sprečava najmanje jedan simptom.
[0097] U nekim otelotvorenjima, agens LPA RNKi je za upotrebu u lečenju ili kontrolisanju kliničke prezentacije, naznačeno time što se na ispitaniku kome je potrebno takvo lečenje, prevencija ili kontrolisanje, primenjuje terapeutski ili profilaktički delotvorna količina jednog ili više agenasa LPA RNKi ili ovde opisanih kompozicija koje sadrže agense LPA RNKi. U nekim otelotvorenjima, upotreba u lečenju obuhvata primenu ovde opisane kompozicije koja sadrži agens LPA RNKi na ispitaniku koji se leči.
[0098] U nekim otelotvorenjima, upotreba u lečenju dalje obuhvata korak primene drugog terapeutskog agensa ili lečenja. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je još jedan agens LPA RNKi (npr. agens LPA RNKi koji cilja različitu sekvencu u ciljnom LPA). U drugim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens može da se izabere iz grupe koja sadrži: lek malog molekula, antitelo, fragment antitela i vakcinu.
1
[0099] Način primene je put kojim se agens RNKi dovodi u kontakt sa organizmom. Uopšteno, postupci za primenu lekova i nukleinskih kiselina za lečenje ispitanika su dobro poznati u struci i mogu da se koriste za primenu ovde opisanih kompozicija. Ovde opisana jedinjenja mogu da se primenjuju na bilo koji odgovarajući način u preparatu koji je odgovarajuće prilagođen konkretnom načinu. Tako, ovde opisana jedinjenja mogu da se primene injekcijom, na primer, intravenski, intramuskularno, intrakutano, supkutano ili intraperitonealno.
[0100] U nekim otelotvorenjima, agensi LPA RNKi ili kompozicije koje su ovde opisane mogu da se isporuče u ćeliju, grupu ćelija, tkivo ili ispitanika koristeći tehnologije oligonukleotidne isporuke koje su poznate u struci. Uopšteno, bilo koji odgovarajući postupak koji je u struci priznat za isporuku molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može da se prilagodi za upotrebu sa ovde opisanim agensom LPA RNKi. Na primer, isporuka može biti putem lokalne primene (npr. direktna injekcija, implantacija ili topikalna primena), sistemske primene ili supkutanim, intravenskim, oralnim, intraperitonealnim ili parenteralnim putem, uključujući intrakranijalni (npr. intraventrikularni, intraparenhimski i intratekalni), intramuskularna, transdermalna, disajnim putevima (aerosol), nazalna, rektalna ili topikalna primena (uključujući bukalnu i sublingvalnu). U određenim otelotvorenjima, kompozicije se primenjuju supkutanom ili intravenskom infuzijom ili injekcijom.
[0101] U nekim otelotvorenjima, agensi RNKi mogu da se kombinuju sa lipidima, nanočesticama, polimerima, lipozomima, micelama, DPC ili drugim sistemima za isporuku koji su poznati u struci. Agensi RNKi takođe mogu biti hemijski konjugovani sa ciljajućim grupama, lipidima (uključujući, bez ograničenja, holesterol i holesteril derivate), nanočesticama, polimerima, lipozomima, micelama, DPC (vidite, npr. WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 i WO 2012/083185), ili drugim sistemima za isporuku koji su dostupni u struci. Agens LPA RNKi može biti konjugovan sa polimerom za isporuku. U nekim otelotvorenjima, polimer za isporuku je reverzibilno maskirani/modifikovani aktivni poliamin amfipatične membrane.
Inhibicija ekspresije
[0102] Kako se ovde koriste, termini „utišati“, „smanjiti“, „inhibirati“, „nishodno regulisati“ ili „oboriti ekspresiju gena“, kada se odnose na gen LPA, znače da je ekspresija gena, izmerena pomoću nivoa RNK transkribovane iz gena ili nivoa polipeptida, proteina ili proteinske
11
podjedinice translatovane iz iRNK u ćeliju, grupu ćelija ili tkivo, u koje je gen LPA transkribovan, smanjena kada se ćelija, grupa ćelija ili tkivo tretiraju opisanim agensima LPA RNKi, u poređenju sa drugom ćelijom, grupom ćelija ili tkivom koje je bilo ili nije bilo tretirano na taj način ili u poređenju sa istom ćelijom, grupom ćelija ili tkivom pre primene agensa LPA RNKi.
[0103] U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije gena i/ili nivo iRNK LPA kod ispitanika na kome je primenjen opisani agens LPA RNKi smanjen je za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% u odnosu na ispitanika pre primene agensa LPA RNKi ili na ispitanika koji nije dobio agens LPA RNKi. Nivo ekspresije gena i/ili nivo iRNK kod ispitanika može biti smanjen u ćeliji, grupi ćelija i/ili tkivu ispitanika. U nekim otelotvorenjima, proteinski nivo LPA kod ispitanika na kome je primenjen opisani agens LPA RNKi smanjen je za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% u odnosu na ispitanika pre primene agensa LPA RNKi ili na ispitanika koji nije dobio agens LPA RNKi. Proteinski nivo kod ispitanika može biti smanjen u ćeliji, grupi ćelija, tkivu, krvi i/ili drugoj tečnosti ispitanika. Smanjenje ekspresije gena, iRNK ili proteinskih nivoa može da se proceni bilo kojim postupcima koji su poznati u struci. Smanjenje ili opadanje nivoa LPA iRNK i/ili proteinskog nivoa zbirno se ovde nazivaju smanjenje ili opadanje LPA, ili inhibicija ili smanjenje ekspresije LPA.
[0104] Uvođenje u ćeliju, kada se odnosi na agens RNKi, znači funkcionalnu isporuku agensa RNKi u ćeliju. Pod funkcionalnom isporukom misli se da je agens RNKi isporučen u ćeliju i ima očekivanu biološku aktivnost (npr. inhibicija ekspresije gena specifična za sekvencu).
Ćelije i tkiva i nehumani organizmi
[0105] Razmatrane su ćelije, tkiva i nehumani organizmi koji sadrže najmanje jedan od ovde opisanih agenasa LPA RNKi. Ćelija, tkivo ili nehumani organizam se dobijaju isporukom agensa RNKi u ćeliju, tkivo ili nehumani organizam.
[0106] Prethodno data otelotvorenja i stavke sada će biti ilustrovani sledećim, neograničavajućim primerima.
PRIMERI
Primer 1. Sinteza agensa RNKi.
[0107]
A) Sinteza. Agensi LPA RNKi su sintetisani u skladu sa fosforoamiditnom tehnologijom na čvrstoj fazi koja se koristi u sintezi oligonukleotida. U zavisnosti od razmere, korišćen je MerMade96E (Bioautomation) ili MerMade12 (Bioautomation). Sinteza je obavljena na čvrstoj podlozi načinjenoj od stakla sa kontrolisanim porama (CPG, 500 Å ili 600Å, nabavljeno od Prime Synthesis, Aston, PA, SAD). Sva DNK, 2'-modifikovana RNK i UNA fosforamiditi su kupljeni od kompanije Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, SAD). Specifično, korišćeni su sledeći 2'-O-metil fosforamiditi: (5'-O-dimetoksitritil-N<6>-(benzoil)-2'-O-metil-adenozin-3'-O-(2-cijanoetil-N,N-diizopropi-lamino) fosforamidit, 5'-O-dimetoksi-tritil-N<4>-(acetil)-2'-O-metil-citidin-3'-O-(2-cijanoetil-N,N-diizopropil-amino) fosforamidit, (5'-O-dimetoksitritil-N<2>-(izobutiril)-2'-O-metil-guanozin-3'-O-(2-cijano-etil-N,N-diizopropilamino)fosforamidit i 5'-O-dimetoksi-tritil-2'-O-metil-uridin-3'-O-(2-cijanoetil-N,N-diizopropilamino)fosforamidit. 2'-deoksi-2'-fluor-fosfor-amiditi su imali iste zaštitne grupe kao 2'-O-metil RNK amiditi. Korišćeni su sledeći UNA fosforamiditi: 5'-(4,4'-dimetoksitritil)-N-benzoil-2',3'-seko-adenozin, 2'-benzoil-3'-[(2-cijanoetil)-(N,N-diizopropil)]-fosfor-amidit, 5'-(4,4'-dimetoksitritil)-N-acetil-2',3'-seko-citozin, 2'-benzoil-3'-[(2-cijanoetil)-(N,N-diizo-propil)]-fosforamidit, 5'-(4,4'-dimetoksitritil)-N-izobutiril-2',3'-seko-guanozin, 2'-benzoil-3'-[(2-cijanoetil)-(N,N-diizopropil)]-fosforamidit i 5'-(4,4'-dimetoksitritil)-2',3'-seko-uridin, 2'-benzoil-3'-[(2-cijanoetil)-(N,N-diizo-propil)]-fosforamidit. Svi amiditi su rastvoreni u anhidrovanom acetonitrilu (50 mM) i dodata su molekulska sita (3 Å). Kako bi se TEG-holesterol uveo na 5'-kraj oligomera, korišćen je 1-dimetoksitritiloksi-3-O-(N-holesteril-3-aminopropil)-trietileneglikol-gliceril-2-O-(2-cijanoetil)-(N,N,-diizopropil)-fosforamidit kompanije Glen Research (Sterling, VA, SAD). 5'-modifikacije su uvedene bez bilo kakve modifikacije ciklusa sinteze.5-benziltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM u acetonitrilu) korišćen je kao rastvor za aktivaciju. Vreme kuplovanja je bilo 10 min (RNK), 180 s (holesterol), 90 s (2'OMe i UNA) i 60 s (2'F i DNK). Kako bi se uvele fosforotioatne veze, korišćen je 100 mM rastvor 3-fenil 1,2,4-ditiazolin-5-ona (POS, nabavljen od kompanije PolyOrg, Inc., Leominster, MA, SAD) u anhidrovanom acetonitrilu. Za specifične sekvence vidite tabele 1, 2A i 2B.
B. Cepanje i deprotekcija oligomera vezanog za podlogu. Po završetku sinteze čvrste faze, osušena čvrsta podloga je tretirana 1:1 zapreminom rastvora 40 mas.% metilamina u vodi i 28% rastvora amonijum hidroksida (Aldrich) tokom dva sata na 30 °C. Rastvor je uparen, i čvrsti ostatak je rekonstituisan u vodi (vidite u nastavku).
C. Prečišćavanje. Sirovi oligomeri koji sadrže holesterol su prečišćeni reverzno faznom HPLC koristeći kolonu Waters XBridge BEH300 C45u Prep i sistem Shimadzu LC-8. Pufer A je bio 100 mM TEAA, pH 7,5 i sadržao je 5% acetonitrila, a pufer B je bio 100 mM TEAA i sadržao je 95% acetonitrila. Zabeležene su UV trake na 260 nm. Odgovarajuće frakcije su zatim puštene na HPLC sa molekulskim sitima koristeći kolonu GE Healthcare XK 16/40 napunjenu medijumom Sephadex G-25 sa radnim puferom 100 mM amonijum bikarbonata, pH 6,7 i 20% acetonitrila. Ostali sirovi oligomeri su prečišćeni anjonsko izmenjivačkom HPLC koristeći kolonu TKSgel SuperQ-5PW 13u i sistem Shimadzu LC-8. Pufer A je bio 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 9,0 i sadržao je 20% acetonitrila, a pufer B je bio isti kao pufer A uz dodatak 1,5 M natrijum hlorida. Zabeležene su UV trake na 260 nm. Odgovarajuće frakcije su sakupljene a zatim puštene na HPLC sa molekulskim sitima kao što je opisano za oligomere koji sadrže holesterol.
D. Komplementarno vezivanje. Komplementarni lanci su pomešani kombinovanjem ekvimolarnih rastvora (sens i antisens) u 0,2×PBS (fiziološki rastvor puferovan fosfatom, 1×, Corning, Cellgro) radi nastanka agenasa RNKi. Ovaj rastvor je stavljen u termomikser na 70 °C, zagrejan na 95 °C, držan na 95 °C tokom 5 minuta i polako ohlađen na sobnu temperaturu. Neki agensi RNKi su liofilizovani i skladišteni na -15 °C do -25 °C. Koncentracija dupleksa je određena merenjem apsorbance rastvora na UV-Vis spektrometru u 0,2×PBS. Apsorbanca rastvora na 260 nm je zatim pomnožena faktorom konverzije i faktorom razblaženja da bi se odredila koncentracija dupleksa. Ako nije drugačije navedeno, ukupni faktor konverzije je 0,037 mg/(ml cm). Za neke eksperimente, faktor konverzije je izračunat iz koeficijenta ekstinkcije koji je eksperimentalno određen.
[0108] Primer 2. Primarna in vitro analiza agenasa LPA RNKi. Ispitani su kandidati za sekvence koji su kompjuterskom simulacijom identifikovani kao unakrsno reaktivni za ljude i primate koji nisu ljudi. Sintetisano je 108 potencijalnih agenasa LPA RNKi koji su
11
identifikovani kompjuterskom simulacijom i ispitana je njihova efikasnost in vitro u tri grupe. Za svrhe skrininga, sekvenca humane LPA kDNK (pristupni br. NM_005577.1) subklonirana je iz komercijalno dostupnog ekspresionog vektora sisara (Origene, Rockville, MD) u komercijalno dostupni plazmid za skrining na bazi reportera, psiCHECK2 (Promega, Madison, WI), što je stvorilo fuzionu iRNk renila luciferaze/LPA. Za ispitivanje efikasnosti agensa LPA RNKi u humanom okruženju, Hep3B ćelije, linija humanog hepatocelularnog karcinoma, zasejane su sa ∼10.000 ćelija po bunarčiću u formatu sa 96 bunarčića. Svaki od 108 agenasa LPA RNKi je kotransficiran u dve ili tri koncentracije (1 nM i 0,1 nM, ili 0,02, 0,2 i 2 nM) sa 50–100 ng LPA-psiCHECK2 plazmidne DNK po bunarčiću i 0,2 µl lipofektamina 2000 po bunarčiću. Nokdaun gena je utvrđen merenjem nivoa renila luciferaze normalizovanih na nivoe konstitutivno eksprimirane luciferaze svica, takođe prisutne na psiCHECK2 plazmidu, koristeći reporterski test dvojne luciferaze (Promega, Madison, WI) (tabele 5A i 5B).
Tabela 5A. In vitro analiza agenasa LPA RNKi, inhibicija ekspresije LPA.
Tabela 5B. In vitro analiza agenasa LPA RNKi, inhibicija ekspresije LPA.
11
11 Tabela 5C. In vitro analiza 10 mM agenasa LPA RNKi, inhibicija ekspresije LPA.
Tabela 5D. In vitro analiza 1 mM agenasa LPA RNKi, inhibicija ekspresije LPA.
11
11
11
12
[0109] Primer 3. Određivanje EC50agensa LPA RNKi. Krive EC50sa deset tačaka su konstruisane koristeći iste ćelije i uslove transfekcije, sa rasponom koncentracija agensa LPA RNKi od 150 fM–3 nM. Vrednosti EC50su utvrđene koristeći softver GraphPad Prism (tabela 6).
Tabela 6. Vrednosti EC50(nM) određene in vitro za naznačene agense LPA RNKi.
[0110] Primer 4. In vitro analiza agenasa LPA RNKi dizajniranih odnosom struktura-aktivnost (SAR). Skupovi SAR agensa LPA RNKi (364 sekvence na bazi AD01532 i 351 sekvenca na bazi AD01533) sintetisani su i ispitani na delotvornost in vitro. Za svrhe skrininga, sekvence od 2756 bp humane LPA kDNK iz KIV-3 do KIV-9 (pistupni br. NM_005577.1) sintetisane su i klonirane (GeneWiz, South Plainfield, NJ) u komercijalno dostupni plazmid za skrining na bazi reportera, psiCHECK2 (Promega, Madison, WI), dajući fuzionu iRNK renila luciferaze/LPA. Za ispitivanje efikasnosti agensa LPA RNKi u humanom okruženju, HuH7 ćelije, linija humanog hepatocelularnog karcinoma, zasejane su sa ∼7500 ćelija po bunarčiću u formatu sa 96 bunarčića. Svaki od agenasa LPA RNKi je kotransficiran u dve koncentracije (1 nM i 0,1 nM, ili 10 nM i 1 nM) sa 25 ng LPA-psiCHECK2 plazmidne DNK po bunarčiću i 0,2 µl lipofektamina 2000 po bunarčiću. Nokdaun gena je utvrđen merenjem nivoa renila luciferaze normalizovanih na nivoe konstitutivno eksprimirane luciferaze svica, takođe prisutne na psiCHECK2 plazmidu, koristeći reporterski test dvojne luciferaze (Promega, Madison, WI) (tabele 7A i 7B).
Tabela 7A. Rezultati ispitivanja delotvornosti agenasa LPA RNKi in vitro, kako je određeno reporterskim testom dvojne luciferaze.
12
12
12 Tabela 7B. Rezultati ispitivanja delotvornosti agenasa LPA RNKi in vitro, određeno reporterskim testom dvojne luciferaze.
12
12
12
1
11
12
1
Primer 5. In vitro analiza delotvornosti agensa RNKi kod tranzijentno transgenih i transgenih miševa.
[0111] A) Primena i sakupljanje uzorka. Tranzijentno transgeni miševi su korišćeni da se proceni delotvornost agenasa LPA RNKi in vivo. Najmanje 30 dana pre primene agensa LPA RNKi konjugovanog sa holesterolom, miševima divljeg tipa je u repnu venu data hidrodinamična injekcija plazmida koji sadrži SEAP gen pod kontrolom promotera mišjeg albumina. Ciljne sekvence gena LPA su klonirane u 3' UTR plazmida. Ovi miševi su označeni kao SEAP-LPA HTV miševi. Agensi LPA RNKi konjugovani sa holesterolom su primenjeni
1 4
na miševima koristeći MLP polimer za isporuku 1. dana (WO 2012/083185; melitin je sintetisan i modifikovan sa CDM-NAG radi dobijanja MLP polimera za isporuku kako je tamo opisan). Svaki miš je u repnu venu primio intravensku (i.v.) injekciju od 200–250 µl rastvora koji sadrži dozu agensa LPA RNKi MLP polimer za isporuku (u većini slučajeva, 1:1 m/m agens RNKi: MLP polimer za isporuku). U nekim eksperimentima, agensi LPA RNKi su bili direktno konjugovani sa polimerom za isporuku. Agensi LPA RNKi konjugovani sa polimerom na sličan način su injektovani u repnu venu. Naznačeni agens LPA RNKi (tabela 8B) konjugovan je sa poliakrilatnim polimerom, ARF1164-106A-5, koji ima 54,4% amino monomera etoksi etil amino akrilata (EEAA) i 45,6% propil monomera propil akrilata (Mm 41.962 g/mol, polimer sintetisan kao što je opisano u WO 2013/158141) i maskiran sa 3× ACit-NAG, 6× ACit-PEG (polimer maskiran kao što je opisano u WO 2012/092373 i PCT/US16/34512). Kontrolni uzorci seruma (pre lečenja) uzeti su od miševa pre injekcije -4. ili -1. dana. Uzorci seruma nakon injekcije su uzeti od miševa 4, 8, 15, 22, 29, 36. i 43. dana. Za neke miševe, uzorci su sakupljeni 3. dana ili 5. dana umesto 4. dana.
[0112] U dodatnim eksperimentima, agensi LPA RNKi su procenjeni in vivo koristeći tranzijentno transgene miševe koji eksprimiraju LPA kompletne dužine. Najmanje 30 dana pre primene agensa LPA RNKi usmerenog na holesterol, imuno kompromitovanim (Nod.scid) miševima je u repnu venu data hidrodinamična injekcija minikruga koji sadrži LPA kDNK pod kontrolom promotera mišjeg albumina. Ovi miševi su označeni kao LPA mc HTV miševi. Na miševima su 1. dana primenjeni agensi LPA RNKi usmereni na holesterol ili konjugovani sa NAG (nazivaju se i GalNAc). Kod agenasa RNKi usmerenih na holesterol, svaki miš je u repnu venu primio intravensku (i.v.) injekciju sa 200–250 µl rastvora koji sadrži dozu agensa LPA RNKi MLP polimer za isporuku (u većini slučajeva, agens RNKi:MLP polimer za isporuku m/m 1:1). Za agense LPA RNKi konjugovane sa NAG, miševi su u labavu kožu na leđima između lopatica primili supkutanu (s.c.) injekciju sa 300 µl rastvora koji sadrži dozu agensa RNKi puferovanog u fiziološkom rastvoru. Za neke uzorke, agens LPA RNKi je primenjen sa MLP peptidom za isporuku ili bez njega. Agensi RNKi isporučeni sa MLP peptidom za isporuku primenjeni su u repnu venu intravenskom (i.v.) injekcijom sa 200–250 µl rastvora koji sadrži dozu agensa RNKi MLP polimer za isporuku (u većini slučajeva, 1:2 m/m agens RNKi: MLP polimer za isporuku). Kontrolni uzorci seruma (pre lečenja) uzeti su od miševa pre injekcije -4. ili -1. dana. Uzorci seruma nakon injekcije su uzeti od miševa 4, 8, 15, 22, 29, 36. i 43. dana. Za neke miševe, uzorci su sakupljeni 3. dana ili 5. dana umesto 4. dana.
1
[0113] U daljim eksperimentima, agensi LPA RNKi su primenjeni na apo(a) i Lp(a) transgene miševe (Frazer KA et al 1995, Nature Genetics 9:424-431). Takav miš eksprimira humani apo(a) iz YAC sa kompletnim genom LPA (kodira protein apo(a)) sa dodatnim sekvencama 5' i 3'. Lp(a) miševi su uzgajani ukrštanjem miševa koji sadrže apo(a) YAC sa miševima koji eksprimiraju humani apoB-100 (Callow MJ et al 1994, PNAS 91:2130-2134). Agensi RNKi usmereni na holesterol i agensi RNKi konjugovani sa NAG primenjeni su kao što je prethodno opisano. Kontrolni uzorci seruma (pre lečenja) uzeti su od miševa pre injekcije -1. dana. Uzorci seruma nakon injekcije su uzeti od miševa 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57. i 64. dana.
[0114] B) Analize opadanja ekspresije LPA. Kod SEAP-LPA HTV miševa, nivoi SEAP proteina u serumu su praćeni ispitivanjem seruma miševa koristeći Phospha-Light™, sistem testova sa hemiluminescentnim reporterskim genom (Life Technologies). Radi normalizacije, nivo SEAP za svaku životinju u datom terminu podeljen je nivoom ekspresije kod te životinje pre lečenja da bi se odredio odnos ekspresije „normalizovane na nivo pre lečenja“. Ekspresija u specifičnom terminu je zatim uprosečena među pojedincima u grupi.
[0115] Kod LPA mc HTV i transgenih miševa, nivoi proteina humanog apo(a) u serumu su praćeni ispitivanjem seruma miševa koristeći ELISA test za apo(a) (Abcam). Radi normalizacije, nivo apo(a) za svaku životinju u nekom terminu podeljen je nivoom ekspresije kod te životinje pre lečenja (u ovom slučaju 1. dana) kako bi se odredio odnos ekspresije „normalizovane na 1. dan“. Ekspresija u specifičnom terminu je zatim normalizovana na kontrolnu grupu sa fiziološkim rastvorom deljenjem odnosa „normalizovane na 1. dan“ za pojedinačnu životinju srednjom vrednošću odnosa „normalizovane na 1. dan“ svih miševa u kontrolnoj grupi sa fiziološkim rastvorom. To je dalo ekspresiju za svaki termin normalizovanu na ekspresiju u kontrolnoj grupi.
[0116] Nivoi Lp(a) su određeni na uređaju Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics) prema preporukama proizvođača. Radi normalizacije, nivo apo(a) za svaku životinju u nekom terminu podeljen je nivoom ekspresije kod te životinje pre lečenja (u ovom slučaju 1. dana) kako bi se odredio odnos ekspresije „normalizovane na 1. dan“. Ekspresija u specifičnom terminu je zatim normalizovana na kontrolnu grupu sa fiziološkim rastvorom deljenjem odnosa „normalizovane na 1. dan“ za pojedinačnu životinju srednjom vrednošću odnosa „normalizovane na 1. dan“ svih miševa u kontrolnoj grupi sa fiziološkim rastvorom. To je dalo ekspresiju za svaki termin normalizovanu na ekspresiju u kontrolnoj grupi.
1
Tabela 8A. Relativni nivoi LPA kod miševa nakon intravenske primene agenasa LPA RNKi konjugovanih sa holesterolom MLP polimera za isporuku.
1
Tabela 8B. Relativni nivoi LPA kod miševa nakon intravenske primene agenasa LPA RNKi konjugovanih sa polimerom za isporuku.
Tabela 8C. Relativni nivoi LPA kod miševa nakon supkutane primene agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG.
1
1
14
[0117] Primer 6. In vivo skrining agensa LPA RNKi i vremenski tok opadanja SEAP. Agensi LPA RNKi konjugovani sa holesterolom su primenjeni na tranzijentno transgenim miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu intravensku (i.v.) dozu od 8 mg/kg agensa LPA RNKi sa 8 mg/kg MLP polimera za isporuku. Nivoi SEAP proteina u serumu praćeni su do 36 dana. Nivoi opadanja i trajanje odgovora su prikazani u tabeli 9. Smanjenje nivoa SEAP proteina u serumu veće od 85% ostvareno je nakon primene svih testiranih agenasa LPA RNKi; pri čemu svi osim dva testirana agensa LPA RNKi pokazuju opadanje veće od 99,4%. AD01196 i AD01199 su pokazali opadanje > 95% 36. dana.
[0118] Primer 7. In vivo skrining agenasa LPA RNKi i vremenski tok opadanja LPA pri nižim dozama agensa LPA RNKi. Agensi LPA RNKi konjugovani sa holesterolom su primenjeni na tranzijentno transgenim miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu intravensku (i.v.) dozu od 2 mg/kg agensa LPA RNKi sa 2 mg/kg MLP polimera za isporuku. Nivoi SEAP proteina u serumu praćeni su do 43 dana (tabela 10).
[0119] Primer 8. In vivo testiranje agenasa LPA RNKi kod apo(a) transgenih (Tg) miševa. AD01196 je primenjen na miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu intravensku (i.v.) dozu od 2 mg/kg agensa LPA RNKi sa 2 mg/kg MLP polimera za isporuku ili fiziološki rastvor. Nivoi humanog apo(a) (apo(a)) u serumu praćeni su do 64 dana (tabela 11). 15. dana, životinje u grupi sa fiziološkim rastvorom primile su jednu i.v. dozu od 2 mg/kg agensa RNKi kontrolnog mišjeg faktora VII (F7) sa 2 mg/kg MLP polimera za isporuku. Nivoi F7 su 22. dana izmereni kod svih životinja. Aktivnost F7 je smanjena za 99% 7 dana nakon doziranja, bez uticaja na nivoe apo(a) u serumu. AD01196 je pokazao opadanje > 3 reda veličine nivoa apo(a) na najnižoj tački, uz opadanje > 80% uočeno nakon 3 nedelje (tabela 11).
Tabela 9. Nivoi SEAP proteina u serumu SEAP-LPAHTV miševa nakon primene 8 mg/kg agenasa chol-RNKi sa 8 mg/kg MLP peptida za isporuku. Nivoi SEAP su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
14
Tabela 10. Nivoi SEAP proteina u serumu SEAP-LPAHTV miševa nakon primene 2 mg/kg agenasa chol-RNKi sa 2 mg/kg MLP peptida za isporuku. Nivoi SEAP su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
Tabela 11. Nivoi apo(a) proteina u serumu kod apo(a) transgenih miševa nakon primene 2 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa holesterolom sa 2 mg/kg MLP polimera za isporuku. Nivoi apo(a) su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
[0120] Primer 9. Opadanje apolipoproteina (a) (apo(a)) kod nehumanih primata nakon isporuke agensa LPA RNKi putem MLP polimera za isporuku. MLP polimer za isporuku i agens LPA RNKi su napravljeni i kombinovani u farmaceutski prihvatljivom puferu kao što je prethodno opisano. 1. dana, dva cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primata (dva mužjaka, 5,0 kg, odnosno 8,15 kg) injektovani su sa 2 mg/kg AD01196 2 mg/kg MLP polimera za isporuku. Za svaku injekciju, agens LPA RNKi MLP polimer za isporuku (2 ml/kg) injektovan je u safenoznu venu koristeći intravenski kateter veličine 22 do 25. Uzorci krvi su prikupljeni u naznačenim terminima (navedeni u tabeli 12), i analizirani su nivoi apo(a), nivoi lipida i markeri toksičnosti. Krv je prikupljena iz femoralne vene, i primati su preko noći izgladnjivani pre svakog prikupljanja krvi. Testovi krvi za određivanje azota uree u krvi (BUN), alanin transaminaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST), kreatinina, ukupnog holesterola (TC) i triglicerida (TG) obavljeni su na automatizovanom hemijskom analizatoru u laboratorijama Meriter. Testovi krvi za određivanje lipoproteina (a) (Lp(a)) i lipoproteina male gustine (LDL) izmereni su na automatizovanom hemijskom analizatoru. Nivoi apo(a) u serumu su izmereni putem ELISA testa. Uočeno je značajno opadanje apo(a) sa prosečnim maksimalnim opadanjem od 94,5% koje je uočeno 22. dana. Prosečno maksimalno opadanje Lp(a) bilo je 91,5% uočeno 15. dana (SL. 3). Kod lečenih životinja nije uočena toksičnost povezana sa dozom.
Tabela 12. Nivoi apo(a) proteina, lipoproteina(a) (mg/dl), lipoproteina male gustine (LDL), ukupnog holesterola i triglicerida u serumu cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primata nakon primene 2 mg/kg AD01196 sa 2 mg/kg MLP polimera za isporuku. Nivoi apo(a) su normalizovani na nivo pre doze.
14
Tabela 13. Nivoi azota u urei, kreatinina, alanin transaminaze i aspartat aminotransferaze kod cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primata nakon primene 2 mg/kg AD01196 sa 2 mg/kg MLP polimera za isporuku.
14
[0121] Primer 10. In vivo skrining agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG i vremenski tok opadanja. Agensi LPA RNKi konjugovani sa NAG su primenjeni na tranzijentno transgenim miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu intravensku (i.v.) dozu od 2 mg/kg agensa LPA RNKi sa 1 mg/kg MLP polimera za isporuku, ili jednu supkutanu (s.c.) dozu od 10 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG. Nivoi SEAP proteina u serumu praćeni su do 22 dana. Nivoi opadanja i trajanje odgovora su prikazani u tabelama 14–15. AD01529, AD01532 i AD01533 su pokazali opadanje nivoa SEAP ≥ 85% nakon i.v. primene sa MLP polimerom za isporuku, i maksimalno opadanje nivoa SEAP ≥ 60% nakon s.c. primene samo agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG.
Tabela 14. Nivoi SEAP proteina u serumu SEAP-LPA HTV miševa nakon s.c. primene 10 mg/kg agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG. Nivoi SEAP su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
Tabela 15. Nivoi SEAP proteina u serumu SEAP-LPA HTV miševa nakon i.v. primene 1 mg/kg agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG 2 mg/kg MLP polimera za isporuku. Nivoi SEAP su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
14
[0122] Primer 11. In vivo skrining modifikovanih agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG i vremenski tok opadanja. Naznačeni agensi LPA RNKi konjugovani sa NAG su primenjeni na SEAP-LPA HTV miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu supkutanu (s.c.) dozu od 10 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG. Nivoi SEAP proteina u serumu praćeni su do 22 dana. Nivoi opadanja i trajanje odgovora su prikazani u tabelama 16– 17. AD01765 i AD01768 su pokazali opadanje aktivnosti > 89%.
Tabela 16. Nivoi SEAP proteina u serumu SEAP-LPA HTV miševa nakon s.c. primene 10 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG. Nivoi SEAP su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
Tabela 17. Nivoi SEAP proteina u serumu SEAP-LPA HTV miševa nakon s.c. primene 10 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG. Nivoi SEAP su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
14
[0123] Primer 12. In vivo testiranje agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG kod apo(a) Tg miševa. Agensi LPA RNKi konjugovani sa NAG su primenjeni na apo(a) Tg miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu supkutanu dozu (s.c.) 10 mg/kg agensa LPA RNKi ili fiziološkog rastvora. Nivoi humanog apo(a) (apo(a)) u serumu praćeni su do 22 dana (tabela 18). AD01765 je pokazao najveće opadanje nivoa apo(a) 8. dana sa 96% opadanja, a opadanje > 74% je uočeno 3 nedelje nakon doziranja.
Tabela 18. Nivoi apo(a) proteina u serumu apo(a) Tg miševa nakon s.c. primene 10 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG. Nivoi apo(a) su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
[0124] Primer 13. In vivo testiranje agenasa LPA RNKi konjugovanih sa NAG kod LPA mc HTV miševa. Naznačeni agensi LPA RNKi konjugovani sa NAG su primenjeni na LPA mc HTV miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu supkutanu dozu (s.c.) 10 mg/kg agensa LPA RNKi ili fiziološkog rastvora. Nivoi humanog apo(a) (apo(a)) u serumu
14
analizirani su 4. dana (tabela 19). AD02001, AD01765 i AD01768 su pokazali opadanje > 90% 4. dana.
Tabela 19. Nivoi apo(a) proteina u serumu LPA mc HTV miševa nakon s.c. primene 10 mg/kg agensa LPA RNKi konjugovanog sa NAG. Nivoi apo(a) su normalizovani na -1. dan i kontrolni uzorak sa fiziološkim rastvorom.
[0125] Primer 14. Opadanje apolipoproteina (a) (apo(a)) kod nehumanih primata nakon isporuke agensa LPA RNKi putem MLP polimera za isporuku. MLP polimer za isporuku i agens LPA RNKi su napravljeni i kombinovani u farmaceutski prihvatljivom puferu. 1. dana i 71. dana, dva cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primata injektovana su sa 4 mg/kg AD01196 4 mg/kg MLP polimera za isporuku ili sa 6 mg/kg AD01196 6 mg/kg MLP polimera za isporuku. Za svaku injekciju, agens LPA RNKi MLP polimer za isporuku injektovan je u safenoznu venu koristeći intravenski kateter veličine 22 do 25. Uzorci krvi su prikupljeni u naznačenim terminima (SL. 4) i analizirani na nivoe apo(a), nivoe lipida i markere toksičnosti, kao što je prethodno opisano.. Značajno opadanje apo(a) uočeno je nakon prve doze sa prosečnim maksimalnim opadanjem od 96% za dozu od 4 mg/kg 15. dana i 96% za dozu od 6 mg/kg, uočeno 15. dana. Prosečno maksimalno opadanje Lp(a) nakon prve doze bilo je 98,5% za dozu od 4 mg/kg 29. dana i 98,5% za dozu od 6 mg/kg 22. dana. Kod lečenih životinja nije uočena toksičnost povezana sa dozom.
[0126] Primer 15. In vivo testiranje doznog odgovora na agense LPA RNKi konjugovane sa NAG kod Lp(a) Tg miševa. Agensi LPA RNKi konjugovani sa NAG su primenjeni na Lp(a) Tg miševima kao što je prethodno opisano. Svaki miš je primio jednu supkutanu (s.c.) dozu agensa LPA RNKi sa doznim nivoom od 0,5 mg/kg ili 2 mg/kg ili fiziološki rastvor. Nivoi Lp(a) u serumu su praćeni do 43. dana (SL 1, FIG.2). Svi agensi LPA RNKi su pokazali dozni
1
odgovor, pri čemu veće doze pokazuju veće opadanje sa najnižom tačkom između 15. i 22. dana.
[0127] Primer 16. Opadanje apolipoproteina (a) (apo(a)) kod nehumanih primata nakon molekulske isporuke agensa LPA RNKi specifičnog za apo(a). Agens LPA RNKi je pripremljen u farmaceutski prihvatljivom puferu kao što je ovde opisano za supkutanu (s.c.) injekciju.1, 7. i 15. dana, dva cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primata injektovana su supkutano sa 3 mg/kg AD02713, AD02819, AD02820 ili AD02821. Pored toga, majmuni lečeni sa AD02819 su ponovo dozirani sa 3 mg/kg AD0281957. i 85. dana. Uzorci krvi su prikupljeni i analizirani na nivoe apo(a), nivoe lipida i markere toksičnosti, kao što je prethodno opisano. Uočeno je značajno opadanje Lp(a) sa prosečnim maksimalnim opadanjem od 89% koje je uočeno 43. dana za AD02713, 87% koje je uočeno 36. dana za AD02819, 79% koje je uočeno 36. dana za AD02820 i 95% koje je uočeno 29. dana za AD02821 (SL 5). Tokom trajanja eksperimenta, kod lečenih životinja nije uočena toksičnost povezana sa dozom.
[0128] Primer 17. Opadanje apolipoproteina (a) (apo(a)) kod nehumanih primata nakon isporuke agensa LPA RNKi. Agens LPA RNKi je pripremljen u farmaceutski prihvatljivom puferu kao što je ovde opisano za supkutanu (s.c.) injekciju.1. dana, dva cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primata injektovana su supkutano sa 3 mg/kg AD03272, AD03462, AD03549, AD03547, AD03668, AD03460 ili AD03536. Pored toga, majmuni lečeni sa AD03460 i AD03536 su ponovo dozirani sa 1 mg/kg odgovarajućeg agensa LPA RNKi 48. dana. Uzorci krvi su prikupljeni i analizirani na nivoe apo(a), nivoe lipida i markere toksičnosti, kao što je prethodno opisano. Uočeno je značajno opadanje Lp(a) sa prosečnim maksimalnim opadanjem od 62% za AD0327215. dana, 28% za AD0346215. dana, 47% za AD0354929. dana, 44% za AD0354715. dana, 53% za AD0366822. dana, 79% za AD0346029. dana i 71% za AD0353622. dana (SL.6). Tokom trajanja eksperimenta, kod lečenih životinja nije uočena toksičnost povezana sa dozom.
[0129] Primer 18. Opadanje apolipoproteina (a) (apo(a)) kod primata nakon molekulske isporuke agensa LPA RNKi specifičnog za apo(a). Agens LPA RNKi je napravljen i kombinovan u farmaceutski prihvatljivom puferu kao što je prethodno opisano za supkutanu (s.c.) injekciju. 1. dana, cinomolgus makaki (Macaca fascicularis) primati injektovani su supkutano fiziološkim rastvorom ili sa 2 mg/kg AD03460, AD03536, AD03851, AD03853 ili AD04110. Uzorci krvi su prikupljeni i analizirani na nivoe apo(a), nivoe lipida i markere
1 1
toksičnosti 8. i 15. dana, kao što je prethodno opisano. Nivoi Lp(a) su normalizovani na prosek tri vrednosti pre doze.
Tabela 20. Nivoi lipoproteina(a) kod cinomolgus makaki primata nakon primene fiziološkog rastvora ili 2 mg/kg AD03460, AD03536, AD03851, AD03853 ili AD04110.
1 2
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Agens LPA (lipoprotein(a)) interferirajuće RNK (RNKi) koji sadrži sens lanac i antisens lanac, naznačeno time što antisens lanac sadrži sekvencu bilo kog od SEQ ID NO:1280, SEQ ID NO:1282, SEQ ID NO:1246, SEQ ID NO:1242, SEQ ID NO:1244 ili SEQ ID NO:1254, i naznačeno time što sens lanac sadrži sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom antisens lanca.
2. Agens LPA RNKi iz zahteva 1, naznačeno time što su i sens lanac i antisens lanac dužine 19 do 26 nukleotida.
3. Agens LPA RNKi iz zahteva 2, naznačeno time što su i sens lanac i antisens lanac dužine 21 nukleotid.
4. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 3, naznačeno time što agens LPA RNKi sadrži jedan ili dva prepusta.
5. Agens LPA RNKi iz zahteva 4, naznačeno time što agens LPA RNKi sadrži prepust na 3' kraju antisens lanca i prepust na 3' kraju sens lanca.
6. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 3, naznačeno time što agens LPA RNKi sadrži jedan ili dva tupa kraja.
7. Agens LPA RNKi iz zahteva 6, naznačeno time što agens LPA RNKi sadrži dva tupa kraja.
8. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 7, naznačeno time što sens lanac, antisens lanac, ili i sens i antisens lanac sadrže jedan ili više modifikovanih nukleotida.
9. Agens LPA RNKi iz zahteva 8, naznačeno time što je jedan ili više modifikovanih nukleotida nezavisno izabrano od 2'-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abaznog nukleotida, invertnog dezoksinukleotida, morfolino nukleotida, 2',3'-seko imitacije nukleotida ili nukleotida koji sadrži neprirodnu bazu.
10. Agens LPA RNKi iz zahteva 9, naznačeno time što 2'-modifikovani nukleotid je 2'-O-metil nukleotid, 2'-dezoksi-2'-fluor nukleotid, 2'-dezoksinukleotid, 2'-metoksietil nukleotid, 2'-amino nukleotid ili 2'-alkil nukleotid.
11. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 10, naznačeno time što agens LPA RNKi sadrži jednu ili više fosforotioatnih internukleozidnih veza.
12. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 11, naznačeno time što agens LPA RNKi dalje sadrži ciljajuću grupu, naznačeno time što ciljajuća grupa sadrži ligand receptora asialoglikoproteina.
13. Agens LPA RNKi iz zahteva 12, naznačeno time što ligand receptora asialoglikoproteina sadrži klaster galaktoze izabran od (C11-PEG3-NAG3), (C6-PEG4-NAG3), (NAG3), (NAG4), (NAG3-AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36) i (NAG37).
14. Agens LPA RNKi iz zahteva 12 ili 13, naznačeno time što je ciljajuća grupa konjugovana sa 5' krajem sens lanca ili 3' krajem sens lanca.
15. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 14, naznačeno time što:
a) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1280, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1284;
b) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1246, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1247;
c) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1242, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1243;
d) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1244, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1245;
e) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1254, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1255;
f) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1280, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1260; ili
g) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1282, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:1259.
16. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 15, naznačeno time što:
a) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:188, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:384;
b) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:156, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:310;
c) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:164, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:357;
d) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:164, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:376; ili
e) antisens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:164, i sens lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:384.
17. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 16, naznačeno time što:
a) antisens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 790, i sens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 1189; b) antisens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 637, i sens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 1132; c) antisens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 709, i sens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 1135; d) antisens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 787, i sens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 1191; ili e) antisens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 788, i sens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 1189.
18. Agens LPA RNKi iz zahteva 17, naznačeno time što antisens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 790, i sens lanac sadrži sekvencu modifikovanih nukleotida prema SEQ ID NO: 1189.
2
19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 18 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
20. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 18 za upotrebu u lečenju kardiovaskularnog poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno.
21. Agens LPA RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 18 za upotrebu u lečenju Bergerove bolesti, bolesti perifernih arterija, koronarne arterijske bolesti, metaboličkog sindroma, akutnog koronarnog sindroma, stenoze aortnog zaliska, regurgitacije aortnog zaliska, aortne disekcije, okluzije retinalne arterije, cerebrovaskularne bolesti, mezenterične ishemije, okluzije gornje mezenterične arterije, stenoze renalnih arterija, stabilne/nestabilne angine, akutnog koronarnog sindroma, heterozigotne ili homozigotne familijarne hiperholesterolemije, hiperapobetalipoproteinemije, cerebrovaskularne ateroskleroze, cerebrovaskularne bolesti ili tromboze vena kod ispitanika kome je to potrebno.
RS20211351A 2015-10-01 2016-09-30 Kompozicije i postupci za inhibiciju genske ekspresije lpa RS62523B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562235816P 2015-10-01 2015-10-01
US201662346304P 2016-06-06 2016-06-06
US201662383221P 2016-09-02 2016-09-02
PCT/US2016/054729 WO2017059223A2 (en) 2015-10-01 2016-09-30 Compositions and methods for inhibiting gene expression of lpa
EP16852695.2A EP3356529B1 (en) 2015-10-01 2016-09-30 Compositions and methods for inhibiting gene expression of lpa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62523B1 true RS62523B1 (sr) 2021-11-30

Family

ID=58424351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211351A RS62523B1 (sr) 2015-10-01 2016-09-30 Kompozicije i postupci za inhibiciju genske ekspresije lpa

Country Status (36)

Country Link
US (4) US9932586B2 (sr)
EP (2) EP3356529B1 (sr)
JP (5) JP6991966B2 (sr)
KR (3) KR20260046241A (sr)
CN (1) CN108368506A (sr)
AU (3) AU2016331084B2 (sr)
CA (1) CA3000397A1 (sr)
CL (1) CL2018000803A1 (sr)
CO (1) CO2018003678A2 (sr)
CR (1) CR20180231A (sr)
CY (1) CY1125263T1 (sr)
DK (1) DK3356529T3 (sr)
EA (1) EA038478B1 (sr)
ES (1) ES2896298T3 (sr)
HR (1) HRP20211410T1 (sr)
HU (1) HUE055942T2 (sr)
IL (3) IL258333B (sr)
JO (2) JOP20160211B1 (sr)
LT (1) LT3356529T (sr)
MA (1) MA43347B1 (sr)
MX (2) MX2018003833A (sr)
MY (1) MY195796A (sr)
PE (1) PE20181139A1 (sr)
PH (1) PH12018500713A1 (sr)
PL (1) PL3356529T3 (sr)
PT (1) PT3356529T (sr)
RS (1) RS62523B1 (sr)
SG (1) SG10202008530TA (sr)
SI (1) SI3356529T1 (sr)
SM (1) SMT202100622T1 (sr)
TN (1) TN2018000094A1 (sr)
TW (4) TWI836693B (sr)
UA (1) UA121998C2 (sr)
UY (1) UY36926A (sr)
WO (1) WO2017059223A2 (sr)
ZA (1) ZA202106265B (sr)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7718133B2 (en) 2003-10-09 2010-05-18 3M Innovative Properties Company Multilayer processing devices and methods
KR102515329B1 (ko) * 2016-03-07 2023-03-29 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 치료용 화합물을 위한 표적화 리간드
MX2018009853A (es) 2016-09-02 2018-11-09 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Ligandos de direccion.
JP7155239B2 (ja) 2017-04-05 2022-10-18 サイレンス・セラピューティクス・ゲーエムベーハー 産物及び組成物
TN2019000308A1 (en) * 2017-07-06 2021-05-07 Arrowhead Pharmaceuticals Inc RNAi AGENTS FOR INHIBITING EXPRESSION OF ALPHA-ENaC AND METHODS OF USE
US10597657B2 (en) * 2017-09-11 2020-03-24 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents and compositions for inhibiting expression of apolipoprotein C-III (APOC3)
MX2020001912A (es) * 2017-09-14 2020-03-24 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de iarn y composiciones para inhibir la expresion de la angiopoyetina tipo 3 (angptl3) y metodos de uso.
WO2019071028A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Avidity Biosciences Llc NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US11492624B2 (en) * 2017-10-17 2022-11-08 Arrowheads Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents and compositions for inhibiting expression of Asialoglycoprotein receptor 1
EP3483270A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-15 Silence Therapeutics GmbH Products and compositions
MX2020004897A (es) 2017-11-13 2020-10-05 Silence Therapeutics Gmbh Acidos nucleicos para inhibir la expresion de lpa en una celula.
MX2021003077A (es) * 2018-09-19 2021-05-27 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de arni para inhibir la expresion de 17beta-hsd tipo 13 (hsd17b13), composiciones de dichos agentes, y metodos de uso.
BR112021009213A2 (pt) * 2018-11-13 2021-08-10 Silence Therapeutics Gmbh ácidos nucleicos para inibição da expressão de lpa em uma célula
JP7592034B2 (ja) * 2019-06-06 2024-11-29 アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． 核酸ポリペプチド組成物およびその使用
US20220307024A1 (en) * 2019-06-17 2022-09-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Delivery of oligonucleotides to the striatum
CN112442499B (zh) * 2019-08-30 2026-03-10 恩康药业科技（广州）有限公司 一种抑制MCM7的siRNA、组合物及其应用
US20230078200A1 (en) * 2019-12-09 2023-03-16 Amgen Inc. RNAi CONSTRUCTS AND METHODS FOR INHIBITING LPA EXPRESSION
EP4126967A1 (en) * 2020-03-23 2023-02-08 Amgen Inc. Monoclonal antibodies to chemically-modified nucleic acids and uses thereof
KR102812602B1 (ko) 2020-08-05 2025-05-28 다이서나 파마수이티컬, 인크. Lpa 발현을 저해하기 위한 조성물 및 방법
US20240035029A1 (en) * 2020-10-16 2024-02-01 Sanofi Rna compositions and methods for inhibiting lipoprotein(a)
WO2022098841A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 Amgen Inc. METHODS FOR TREATING ATHEROSCLEROTIC CARDIOVASCULAR DISEASE WITH LPA-TARGETED RNAi CONSTRUCTS
WO2022121959A1 (zh) * 2020-12-09 2022-06-16 纳肽得有限公司 siRNA分子及其在治疗冠状动脉疾病中的应用
US20250304966A1 (en) 2020-12-23 2025-10-02 Argonaute RNA Limited Treatment of cardiovascular disease
EP4294449A1 (en) * 2021-02-18 2023-12-27 Oneglobe Holdings Limited Compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates
JP2024523237A (ja) 2021-06-18 2024-06-28 ホンジーン バイオテック コーポレイション 官能化されたｎ－アセチルガラクトサミンヌクレオシド
JP2024532271A (ja) 2021-08-30 2024-09-05 ホンジーン バイオテック コーポレイション 官能化ｎ－アセチルガラクトサミンアナログ
WO2023041508A2 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Argonaute RNA Limited Treatment of cardiovascular disease
JP2024534508A (ja) * 2021-09-18 2024-09-20 成都心正合医▲葯▼科技有限公司 Ｌｐａ阻害剤及びその使用
IL312811A (en) 2021-11-16 2024-07-01 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co Ltd Composition and method for inhibiting angiotensinogen (agt) protein expression
WO2023114746A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Hongene Biotech Corporation Functionalized n-acetylgalactosamine analogs
WO2023109940A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海拓界生物医药科技有限公司 靶向lpa的sirna及缀合物
CN114703184B (zh) * 2022-03-11 2024-06-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
WO2024032681A1 (zh) * 2022-08-11 2024-02-15 益杰立科(上海)生物科技有限公司 一种表观编辑靶点的方法及用途
CN115851723B (zh) * 2022-10-24 2023-10-03 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制lpa基因表达的rna抑制剂及其应用
WO2024118503A1 (en) 2022-11-28 2024-06-06 Hongene Biotech Corporation Functionalized n-acetylgalactosamine analogs
IL321855A (en) * 2023-01-13 2025-08-01 Lilly Co Eli Pharmaceutical preparations containing therapeutic oligonucleotides and dosage regimens using the same
CN118773191A (zh) * 2023-04-03 2024-10-15 翰森（上海）健康科技有限公司 靶向LPA基因的RNAi剂及其用途
WO2024222686A1 (zh) * 2023-04-24 2024-10-31 上海京新生物医药有限公司 用于抑制LPA表达的RNAi剂及其应用
WO2024240056A1 (zh) 2023-05-19 2024-11-28 深圳信立泰药业股份有限公司 一种磺酰胺类化合物及其制备方法和医药用途
WO2024240212A1 (zh) * 2023-05-24 2024-11-28 云合智药（苏州）生物科技有限公司 用于抑制angptl3表达的rnai剂及其应用
CN121079106A (zh) 2023-05-31 2025-12-05 上海拓界生物医药科技有限公司 一种靶向LPA的dsRNA及其应用
KR20260034076A (ko) * 2023-05-31 2026-03-10 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 다량체성 RNAi 작용제 접합체를 위한 간 전달 플랫폼 및 그의 사용 방법
DE102023115075A1 (de) * 2023-06-07 2024-12-12 B.Braun Avitum Ag Schlauchrollenpumpe
WO2025064821A2 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for inhibiting lpa
WO2025082058A1 (zh) * 2023-10-16 2025-04-24 润佳(上海)医药技术有限公司 一种抑制LPA基因表达的dsRNA及其用途
WO2025087442A1 (zh) * 2023-10-27 2025-05-01 北京安龙生物医药有限公司 靶向脂蛋白a的寡核苷酸及其用途
WO2025103391A1 (zh) * 2023-11-15 2025-05-22 北京加科瑞康医药科技有限公司 用于抑制lpa的基因表达的sirna，含其的组合物及其用途
CN120020252A (zh) * 2023-11-17 2025-05-20 纳肽得(青岛)生物医药有限公司 抑制LPA表达的siRNA及其用途
CN120098993A (zh) * 2023-12-05 2025-06-06 广东东阳光药业股份有限公司 一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途
CN120485189B (zh) * 2025-07-16 2025-10-17 北京悦康科创医药科技股份有限公司 靶向调控LPA基因表达的siRNA及其用途

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US5599706A (en) 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
DE60040274D1 (de) 1999-03-10 2008-10-30 Phogen Ltd Verabreichung von nukleinsäuren und proteinen an zellen
US8137695B2 (en) * 2006-08-18 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US20040259247A1 (en) * 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
US7259150B2 (en) * 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
EP1613348B1 (en) 2003-03-12 2010-06-23 The Arizona Board of Regents on Behalf of the University of Arizona Methods for modulating angiogenesis with apelin compositions
AU2005222965B8 (en) 2004-03-15 2010-07-01 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US20100249214A1 (en) 2009-02-11 2010-09-30 Dicerna Pharmaceuticals Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
AU2009336191B2 (en) 2008-12-18 2017-08-24 Novo Nordisk A/S Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
DK2539451T3 (da) 2010-02-24 2016-04-04 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til målrettet tilførsel af siRNA
WO2011141703A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
EP2652134B1 (en) 2010-12-17 2017-03-01 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for sirna
NZ611656A (en) 2010-12-29 2014-10-31 Arrowhead Res Corp In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages
WO2013032829A1 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Arrowhead Research Corporation Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery
HUE048622T2 (hu) * 2011-11-18 2020-08-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc RNSi szerek, készítmények és alkalmazási eljárások transztiretin (TTR) asszociált betegségek kezelésére
JP2015515530A (ja) 2012-04-18 2015-05-28 アローヘッド リサーチ コーポレイション インビボ核酸送達のためのポリ（アクリラート）ポリマー
RU2748495C2 (ru) 2012-05-24 2021-05-26 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для модулирования экспрессии аполипопротеина (а)
JP6494533B2 (ja) * 2013-02-28 2019-04-03 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤及び細胞毒性剤としてのマイタンシノイドを含む複合体
DK2991656T3 (da) 2013-05-01 2020-03-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af apolipoprotein c-iii-ekspression
WO2015021092A1 (en) 2013-08-07 2015-02-12 Arrowhead Research Corporation Polyconjugates for delivery of rnai triggers to tumor cells in vivo
US20160272970A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Arrowhead Madison Inc. RNA Interference Agents
HK1252852A1 (zh) 2015-05-29 2019-06-06 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. 阻止HIF2α基因表达的组合物及方法
CN108138182B (zh) * 2015-07-31 2022-08-19 阿尔尼拉姆医药品有限公司 甲状腺素运载蛋白(TTR)iRNA组合物及其治疗或预防TTR相关疾病的使用方法
KR102515329B1 (ko) 2016-03-07 2023-03-29 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 치료용 화합물을 위한 표적화 리간드

Also Published As

Publication number Publication date
JOP20210043A1 (ar) 2021-03-08
EA201890864A1 (ru) 2018-09-28
IL300438B1 (en) 2026-03-01
CL2018000803A1 (es) 2018-08-31
PH12018500713A1 (en) 2018-10-15
EA038478B1 (ru) 2021-09-03
TN2018000094A1 (en) 2019-07-08
IL258333A (en) 2018-05-31
JOP20160211B1 (ar) 2021-08-17
HRP20211410T1 (hr) 2021-12-24
JP7442574B2 (ja) 2024-03-04
AU2022283623A1 (en) 2023-02-02
IL290566B2 (en) 2023-07-01
JP2021087459A (ja) 2021-06-10
SMT202100622T1 (it) 2022-01-10
JP2024009262A (ja) 2024-01-19
PL3356529T3 (pl) 2021-12-20
TW202600825A (zh) 2026-01-01
CR20180231A (es) 2018-05-31
IL290566A (en) 2022-04-01
IL258333B (en) 2022-03-01
MX2018003833A (es) 2018-06-18
ZA202106265B (en) 2023-08-30
AU2022283623B2 (en) 2025-07-10
CO2018003678A2 (es) 2018-11-30
WO2017059223A2 (en) 2017-04-06
TW202332769A (zh) 2023-08-16
KR20240162596A (ko) 2024-11-15
KR20260046241A (ko) 2026-04-06
UA121998C2 (uk) 2020-08-25
PT3356529T (pt) 2021-11-04
CA3000397A1 (en) 2017-04-06
NZ741086A (en) 2023-11-24
BR112018006489A2 (pt) 2018-10-09
US9932586B2 (en) 2018-04-03
DK3356529T3 (da) 2021-11-08
KR102728481B1 (ko) 2024-11-12
JP2026040461A (ja) 2026-03-09
EP3356529A2 (en) 2018-08-08
NZ780687A (en) 2025-06-27
HK1259063A1 (en) 2019-11-22
US20200263179A1 (en) 2020-08-20
CY1125263T1 (el) 2023-03-24
JP2018529732A (ja) 2018-10-11
WO2017059223A3 (en) 2017-05-11
US20250115907A1 (en) 2025-04-10
MA43347B1 (fr) 2021-11-30
US20180195070A1 (en) 2018-07-12
CN108368506A (zh) 2018-08-03
US20170096665A1 (en) 2017-04-06
UY36926A (es) 2017-04-28
HUE055942T2 (hu) 2022-01-28
JP6991966B2 (ja) 2022-02-03
KR20180052703A (ko) 2018-05-18
PE20181139A1 (es) 2018-07-17
AU2016331084B2 (en) 2022-09-08
EP4029941A1 (en) 2022-07-20
IL290566B1 (en) 2023-03-01
LT3356529T (lt) 2021-12-27
TWI880645B (zh) 2025-04-11
SG10202008530TA (en) 2020-10-29
ES2896298T3 (es) 2022-02-24
JP2022113835A (ja) 2022-08-04
EP3356529B1 (en) 2021-08-25
TW201726918A (zh) 2017-08-01
AU2016331084A1 (en) 2018-04-19
TWI784934B (zh) 2022-12-01
SI3356529T1 (sl) 2022-01-31
MA43347A (fr) 2018-08-08
US10662427B2 (en) 2020-05-26
EP3356529A4 (en) 2019-09-04
MX2022013010A (es) 2022-11-09
TW202449154A (zh) 2024-12-16
WO2017059223A9 (en) 2017-08-17
KR102942707B1 (ko) 2026-03-23
AU2025242219A1 (en) 2025-10-23
IL300438A (en) 2023-04-01
JP7116212B2 (ja) 2022-08-09
MY195796A (en) 2023-02-21
TWI836693B (zh) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250115907A1 (en) Compositions and methods for inhibiting gene expression of lpa
US20160272970A1 (en) RNA Interference Agents
CN108064313A (zh) 用于抑制因子xii的基因表达的组合物和方法
JP2024086876A (ja) アシアロ糖タンパク質受容体１の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤および組成物
HK1259063B (en) Compositions and methods for inhibiting gene expression of lpa
BR112018006489B1 (pt) Agente de interferência de rna (rnai) da lipoproteína a (lpa), seus usos e composição farmacêutica
EA048832B1 (ru) Композиции и способы для ингибирования генной экспрессии лпа