RS62619B1 - Genska terapija - Google Patents

Genska terapija

Info

Publication number
RS62619B1
RS62619B1 RS20211471A RSP20211471A RS62619B1 RS 62619 B1 RS62619 B1 RS 62619B1 RS 20211471 A RS20211471 A RS 20211471A RS P20211471 A RSP20211471 A RS P20211471A RS 62619 B1 RS62619 B1 RS 62619B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
vector
csh
transduction
cell
Prior art date
Application number
RS20211471A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna Christina Kajaste-Rudnitski
Carolina Petrillo
Bernhard Rudolf Gentner
Luigi Naldini
Pietro Genovese
Giulia Schiroli
Original Assignee
Ospedale San Raffaele Srl
Fond Telethon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ospedale San Raffaele Srl, Fond Telethon filed Critical Ospedale San Raffaele Srl
Publication of RS62619B1 publication Critical patent/RS62619B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
    • C12N2810/6054—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na genetsku modifikaciju ćelija. Tačnije, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja za poboljšanje transdukcije ćelija pomoću virusnih vektora i za poboljšanje genskog uređivanja ćelija.
STANJE TEHNIKE
[0002] Hematopoetski sistem je složena hijerarhija ćelija različitih linija zrelih ćelija. To uključuje ćelije imunog sistema koje nude zaštitu od patogena, ćelije koje prenose kiseonik kroz telo i ćelije uključene u zarastanje rana. Sve ove zrele ćelije su izvedene iz skupa matičnih ćelija hematopoeze (HSC) koje su sposobne da se samoobnavljaju i diferenciraju u bilo koju liniju ćelija krvi. HSC imaju sposobnost da obnove ceo hematopoetski sistem.
[0003] Transplantacija ćelija hematopoeze (HCT) je kurativna terapija za nekoliko naslednih i stečenih poremećaja. Međutim, alogena HCT je ograničena slabom dostupnošću podudarnih donora, mortalitetom povezanim sa alogenom procedurom koja je uglavnom povezana sa graft-protiv-domaćina bolešću (GvHD) i infektivnim komplikacijama izazvanim dubokim i dugotrajnim stanjem disfunkcije imunog sistema.
[0004] Pristupi genskoj terapiji zasnovani na transplantaciji genetski modifikovanih autolognih HSC nude potencijalno poboljšanu bezbednost i efikasnost u odnosu na alogene HCT. Oni su posebno relevantni za pacijente kojima nedostaje odgovarajući donor.
[0005] Koncept genske terapije matičnim ćelijama zasniva se na genetskoj modifikaciji relativno malog broja matičnih ćelija. One dugotrajno opstaju u telu podvrgavajući se samoobnavljanju i stvaraju veliki broj genetski „ispravljenih“ potomaka. Ovo pruža kontinuirano snabdevanje ispravljenim ćelijama do kraja života pacijenta. HSC su posebno atraktivne mete za gensku terapiju jer će se njihova genetska modifikacija preneti na sve linije ćelija krvi dok se diferenciraju. Štaviše, HSC se mogu lako i bezbedno dobiti, na primer iz koštane srži, mobilisane periferne krvi i krvi pupčane vrpce.
[0006] Efikasna dugoročna genska modifikacija HSC i njihovog potomstva zahteva tehnologiju koja dozvoljava stabilnu integraciju korektivne DNK u genom, bez uticaja na funkciju HSC. Shodno tome, upotreba integrisanih rekombinantnih virusnih sistema kao što su γ-retrovirusi, lentivirusi i spumavirusi dominirala je u ovoj oblasti (Chang, A.H. et al. (2007) Mol. Ther.15: 445-456). Terapeutske koristi su već postignute u kliničkim ispitivanjima zasnovanim na γ-retrovirusu za tešku kombinovanu imunodeficijenciju adenozin deaminaze (ADA-SCID; Aiuti, A. et al. (2009) N. Engl. J. Med.360: 447-458), X-vezanu tešku kombinovanu imunodeficijenciju (SCID-X1; Hacein-Bey-Abina, S. et al. (2010) N. Engl. J. Med.363: 355-364) i Wiskott-Aldrich sindrom (WAS; Boztug, K. et al. (2010) N. Engl. J. Med.363: 1918-1927). Pored toga, lentivirusi su korišćeni kao nosači za isporuku u tretmanu X-vezane adrenoleukodistrofije (ALD; Cartier, N. et al. (2009) Science 326: 818-823), a vrlo nedavno i za metahromatsku leukodistrofiju (MLD; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158) i WAS (Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151). Ipak, iako su lentivirusi među najboljim dostupnim platformama za ćelijsku transdukciju, ostaju poteškoće sa postupcima koje se koriste za genetsku modifikaciju ćelija, posebno matičnih i progenitornih ćelija hematopoeze. Na primer, da bi genska terapija bila efikasna, mora se postići efikasan transfer gena u ciljane ćelije bez izazivanja štetnih efekata na njihova biološka svojstva.
[0007] Mnogi postojeći postupci pokazuju suboptimalnu permisivnost ciljane ćelije jer mogu biti potrebne visoke doze vektora, produženo vreme transdukcije i ex vivo kultura da bi se dostigli klinički relevantni nivoi transdukcije. Ovo ostaje prepreka za ovu oblast jer može dovesti do glomaznih, skupih i ne uvek održivih velikih vektorskih produkcija i kompromitovanog kvaliteta ćelija usled produženih protokola ex vivo transdukcije.
[0008] Među neželjenim efektima prijavljenim u ispitivanjima genske terapije, produžena neutropenija zbog odloženog usađivanja ex vivo modifikovanih ćelija je glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta u vezi sa tretmanom. Odloženi oporavak može biti uzrokovan ex vivo kulturom proizvoda za ćelijsku terapiju, koja obično traje više od 60 sati (Aiuti, A. et al.
(2013) Science 341: 1233151; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158). Akumulirani eksperimentalni dokazi sugerišu da kultivisane matične i progenitorne ćelije hematopoeze progresivno gube potencijal ugrađivanja regrutacijom u ćelijski ciklus i gubitkom adhezionih molekula, čime se ometa njihovo vraćanje u nišu i podstiče posvećenost i diferencijaciju linije. Povećanje efikasnosti transdukcije bi na kraju omogućilo smanjenje količine vektora potrebnog za klinički relevantan transfer gena, kao i skraćivanje vremena ex vivo kulture. Iako je postignut napredak u poboljšanju protokola transdukcije, na primer, pronalazači su ranije pokazali da se poboljšanje efikasnosti transdukcije matičnih i progenitornih ćelija hematopoeze može postići korišćenjem ciklosporina A (WO2015162594), ostaje potreba za daljim pristupima za poboljšanje genetske modifikacije ćelija sa virusnim vektorima.
SAŽETAK PRONALASKA
[0009] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da je ciklosporin H (CsH) bio mnogo bolji od ciklosporina A u poboljšanju transdukcije ćelija, uključujući matične i progenitorne ćelije hematopoeze. CsH je pružio skoro 100% efikasnost transdukcije i do 3 vektorske kopije po genomu nakon jedne primene lentivirusnog vektora („hit“) pri umerenom broju infekcija od 10. Ovi nalazi su napravljeni u klinički relevantnim mobilisanim matičnim i progenitorniim ćelijama hematopoeze izvedenim iz periferne krvi, i primećeno je da CsH nije imao štetni efekat na biološka svojstva ćelija.
[0010] Pronalazači su takođe otkrili da su visoki nivoi transdukcije održani in vivo u dugoročnom repopulisanju matičnih i progenitornih ćelija hematopoeze i dodatno je utvrđeno da CsH prevazilazi bazalnu i IFN-indukovanu lentivirusnu restrikciju u ovim ćelijama.
Takođe je utvrđeno da su efekti CsH dodatno poboljšani kada se kombinuju sa drugim jedinjenjima ranog dejstva kao što su rapamicin i prostaglandin E2.
[0011] Štaviše, pronalazači su otkrili da CsH povećava efikasnost transdukcije u nestimulisanim matičnim i progenitornim ćelijama hematopoeze, u aktiviranim T ćelijama i kada se koristi lentivirusni vektor sa defektom integraze (IDLV). CsH je takođe poboljšao efikasnost ciljanja gena u mišjim i ljudskim matičnim i progenitornim ćelijama hematopoeze, posebno u primitivnijem CD34+CD133+CD90+ fragmentu. Pored toga, CsH bi se mogao koristiti za smanjenje IDLV doze tokom transdukcije bez ugrožavanja efikasnosti ciljanja u primarnim ljudskim T ćelijama.
[0012] Pronalazak je kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.
[0013] U jednom otelotvorenju, upotreba je za povećanje efikasnosti transdukcije izolovane populacije ćelija virusnim vektorom, i opciono povećanje efikasnosti uređivanja gena izolovane populacije ćelija transdukovanih virusnim vektorom, gde je virusni vektor pseudotipizovan kako bi ušao u ćelije preko mehanizma koji zavisi od endocitoze i/ili gde je virusni vektor VSV-g pseudotipizovani vektor. Poželjno, virusni vektor je neintegrišući vektor (npr. lentivirusni vektor sa defektom integracije, IDLV).
[0014] U jednom otelotvorenju, uređivanje gena koristi jednu ili više cinkov prst nukleaza, efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) i/ili CRISPR/Cas sisteme.
[0015] U jednom otelotvorenju, ćelije su matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze. U drugom otelotvorenju, ćelije su T ćelije. U jednom otelotvorenju, T ćelije su CD4+ T ćelije. U jednom otelotvorenju, T ćelije su CD3+ T ćelije.
[0016] U jednom otelotvorenju, izolovana populacija ćelija obuhvata CD34+CD38- ćelije.
[0017] U poželjnom otelotvorenju, ćelije su ljudske ćelije.
[0018] U jednom otelotvorenju, ćelije su stimulisane ćelije. U drugom otelotvorenju, ćelije su nestimulisane ćelije.
[0019] U jednom otelotvorenju, virusni vektor je retrovirusni vektor. U poželjnom otelotvorenju, virusni vektor je lentivirusni vektor.
[0020] U jednom otelotvorenju, lentivirusni vektor je izveden iz HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV ili visna lentivirusa. U poželjnom otelotvorenju, lentivirusni vektor je izveden iz HIV-1. Vektor izveden iz HIV-1 može biti, na primer, izveden iz bilo kog od HIV-1 sojeva NL4-3, IIIB_LAI ili HXB2_LAI (X4-tropni), ili BAL (R5-tropni), ili iz njihovih himera.
[0021] U jednom otelotvorenju, virusni vektor je neintegrišući vektor. U jednom otelotvorenju, virusni vektor je lentivirusni vektor sa defektom integracije (IDLV), na primer vektor sa defektom integracije izveden iz HIV-1.
[0022] U jednom otelotvorenju, virusni vektor je gama-retrovirusni vektor.
[0023] U jednom otelotvorenju, vektor se „podudara“ sa ćelijom domaćinom. Pod „podudaranjem“ treba razumeti da je vektorski kapsid izveden iz virusa koji prirodno inficira određeni tip domaćina (na primer, HIV kapsidi se „podudaraju“ sa ljudima). Prema tome, u jednom otelotvorenju, vektor za upotrebu u ljudskim matičnim i/ili progenitornim ćelijama hematopoeze ne sadrži kapsidne proteine osim onih koji su izvedeni iz virusa humane imunodeficijencije.
[0024] U poželjnom otelotvorenju, virusni vektor je VSV-g pseudotipizovan vektor. Virusni vektor je pseudotipizovan da uđe u ćelije putem mehanizma koji zavisi od endocitoze.
[0025] U jednom otelotvorenju, procenat ćelija transdukovanih vektorom je povećan. U drugom otelotvorenju, broj kopija vektora po ćeliji je povećan. I procenat ćelija transdukovanih vektorom i broj kopija vektora po ćeliji mogu se povećati u isto vreme.
[0026] U jednom otelotvorenju, efikasnost uređivanja gena je povećana u primitivnim matičnim ćelijama hematopoeze. U jednom otelotvorenju, efikasnost uređivanja gena je povećana u CD34+CD133+CD90+ ćelijama.
[0027] U jednom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 1-50 µM. U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 5-50 µM. U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 10-50 µM.
[0028] U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 1-40, 5-40 ili 10-40 µM. U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 1-30, 5-30 ili 10-30 µM. U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 1-20, 5-20 ili 10-20 µM. U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 1-15, 5-15 ili 10-15 µM.
[0029] U drugom otelotvorenju, CsH je u koncentraciji od oko 1-15, 2-14, 3-13, 4-12, 5-11, 6-10 ili 7-9 µM).
[0030] Na primer, koncentracija CsH može biti oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 µM. U poželjnom otelotvorenju, koncentracija CsH je oko 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 µM. U posebno poželjnom otelotvorenju, koncentracija CsH je oko 10 µM.
[0031] U jednom otelotvorenju, populacija ćelija je u dodiru sa CsH u kombinaciji sa drugim agensom koji može da poveća efikasnost transdukcije.
[0032] U jednom otelotvorenju, populacija ćelija je u dodiru sa CsH u kombinaciji sa rapamicinom ili njegovim derivatom.
[0033] U jednom otelotvorenju, populacija ćelija je u dodiru sa CsH u kombinaciji sa prostaglandinom E2 ili njegovim derivatom. U poželjnom otelotvorenju, derivat prostaglandina E2 je 16-16 dimetil prostaglandin E2.
[0034] U jednom otelotvorenju, populacija ćelija je u dodiru sa CsH u kombinaciji sa staurosporinom ili njegovim derivatom.
[0035] U jednom otelotvorenju, populacija ćelija je u dodiru sa CsH u kombinaciji sa rapamicinom ili njegovim derivatom, i prostaglandinom E2 ili njegovim derivatom.
[0036] U jednom otelotvorenju, postupak uključuje dalji korak obogaćivanja populacije za matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze. Korak obogaćivanja populacije za matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze može se izvesti pre nego što se populacija ćelija dovede u dodir sa CsH. Alternativno, ili dodatno, korak obogaćivanja populacije za matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze može se izvesti nakon transdukcije populacije ćelija vektorom.
[0037] Postupak takođe može uključivati korake pranja. Korak pranja se može koristiti za suštinsko uklanjanje CsH iz medijuma. Korak pranja se može izvesti nakon transdukcije populacije ćelija vektorom. Alternativno, ili dodatno, korak pranja se može izvesti pre transdukcije ćelija.
[0038] U jednom otelotvorenju, populacija matičnih i/ili progenitornih ćelija hematopoeze se dobija iz mobilisane periferne krvi, koštane srži ili krvi pupčane vrpce.
[0039] U jednom otelotvorenju, transdukovane ćelije se primenjuju pacijentu kao deo postupka transplantacije autolognih matičnih ćelija. U drugom otelotvorenju, transdukovane ćelije se primenjuju pacijentu kao deo postupka transplantacije alogenih matičnih ćelija.
OPIS SLIKA
[0040]
Slika 1 Kraći transdukcioni protokoli zasnovani na ciklosporinu A (CsA) i rapamicinu (Rapa) u poređenju sa trenutnim kliničkim standardom. (A) Šema eksperimentalnog pristupa koji upoređuje različite protokole transdukcije koristeći dva LV kliničkog kvaliteta i CD34+ ćelije izvedene iz koštane srži (BM). (BC) Procenat transdukcije (TD) i broj kopija vektora (VCN) po ćeliji, kao i (D) broj jedinica koje formiraju kolonije (CFU-GM, BFU) izbrojane 14 dana nakon postavljanja, prikazani su za ćelije transdukovane sa IDUA ili ARSA-kodirajući LV. Podaci su srednja vrednost ± SEM tri nezavisna eksperimenta u tri primerka svakog, p vrednosti su za jednosmernu ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem u odnosu na DMSO, * za p<0,05, ** za p<0,01.
Slika 2 Kraći transdukcioni protokoli, posebno u prisustvu CsA, poboljšavaju HSPC presađivanje in vivo. (AB) Analize periferne krvi kod NSG miševa u različito vreme nakon transplantacije: (A) nivoi presađivanja procenjeni kao procenat ljudskih CD45+ ćelija u odnosu na ukupnu krv mononuklearnih ćelija (y-osa) kod miševa iz različitih tretman grupa (označeno na x-osi), (B) procenti ljudskih B, T i mijeloidnih ćelijskih linija (hCD19+, hCD3+ i hCD13+, respektivno) unutar ljudskih CD45+ ćelija su prikazani tokom vremena. (C) VCN i (D) nivoi presađivanja ljudskih CD45+ ćelija u koštanoj srži (BM) i slezini prikazani su 20 nedelja nakon transplantacije. Sve vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM. p vrednosti su za jednosmernu ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem.
Slika 3
CsA čuva primitivne HSC ex vivo nezavisno od transdukcije. Sastav subpopulacije CD34+ HSPC izvedenih iz BM je meren korišćenjem strategije ulaza prikazane na (A) 16 sati i (B) 72 sata nakon transdukcije u prisustvu ili odsustvu CsA. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM tri nezavisna eksperimenta. p vrednosti su za jednosmernu ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem.
Slika 4
CsA smanjuje proliferaciju HSPC i čuva mirovanje u kulturi. CD34+ ćelije izvedene iz BM obojene su crvenom fluorescentnom bojom koja se može koristiti za praćenje pojedinačnih ćelijskih deoba, kao što je prikazano na (A). Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) boje je praćen tokom vremena pomoću FACS u ukupnoj populaciji CD34+ (B) i unutar različitih subpopulacija na (C) 16 sati i (D) 72 sata kulture. (E) Status ćelijskog ciklusa i (F) ROS nivoi HSPC izvedenih iz BM procenjeni su u prisustvu ili odsustvu CsA 48 sati nakon transdukcije. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM tri nezavisna eksperimenta. p vrednosti su za jednosmernu ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem.
Slika 5 CsH je moćan i netoksičan pojačivač lentivirusne (LV) vektorske transdukcije u matičnim ćelijama hematopoeze.
(A, B) Ljudske CD34<+>ćelije izvedene iz CB su transdukovane sa LV koji eksprimira shRNK protiv CypA ili kontrolom koja ne utišava pri MOI od 100, i obaranje (KD) CypA je verifikovano koristeći Western blot (A) i eksprimiranjem mRNK (B). Nivoi CypB su praćeni kao kontrola RNKi specifičnosti (A, B). (C) Uticaj iscrpljivanja je zatim procenjen transdukcijom ćelija sa drugim LV pri MOI od 10 i procenom efikasnosti transdukcije pomoću FACS u smislu GFP<+>ćelija i pomoću VCN. (D) Ljudska krv pupčane vrpce (CB) (srednja vrednost ± SEM; n=20; jednosmerna ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem, *p≤0,05, **p≤0,01, ****p≤0,0001), (E) mobilisana periferna krv (mPB)-CD34<+>ćelije (srednja vrednost ± SEM, n=4, Mann Whitney test, *p≤0,05) ili (F) mišji HSPC (mHSPC) (srednja vrednost ± SEM, n=8, Wilcoxon Signed Rank Test, *p=0,0078) su transdukovane sa VSV-g PGK-GFP/BFP WT LV sa višestrukom infekcijom (MOI) od 1 transdukcione jedinice (TU)/293T ćelija u prisustvu ili odsustvu 8 µM CsA ili CsH. Procenti transdukovanih ćelija i broj kopija vektora/ljudski genom (VCN/genom) procenjeni su 5 ili 14 dana nakon transdukcije, respektivno. Uticaj CsA i CsH na (G) apoptozu (srednja vrednost ± SEM; n=6; Dunnov prilagođen Kruskal-Wallis test, ns=nije značajno) i (H) proliferaciju ćelija (srednja vrednost ± SEM; n=4; Dunnov prilagođen Kruskal-Wallisov test, *p≤0,05) je procenjen u hCB-CD34<+>ćelijama 48 sati nakon transdukcije. (K) Efikasnost transdukcije u različitim subpopulacijama merena je u ljudskim CB- ili mPB-CD34<+>ćelijama transdukovanim sa LV pri MOI od 1 (srednja vrednost ± SEM, n=4, Mann Whitney test naspram svakog DMSO, *p≤0,05). (N) Sastav i status ćelijskog ciklusa hCB- ili mPB-CD34+ ćelije transdukovane u prisustvu CsH procenjene su 48 sati nakon transdukcije. (I,J) HSPC izvedene iz hCB i mPB transdukovane su u prisustvu različitih kombinacija lekova sa LV pri MOI od 1 ili 10. (O) hCB-CD34<+>ćelije su transdukovane sa VSV-g pseudotipizovanim yRV na MOI=10 sa ili bez 8µM CsH (srednja vrednost ± SEM, n=4, Mann Whitney test, *p≤0,05). (L) VCN izveden iz mPB-CD34+ ćelija transdukovanih sa IDUA-LV kliničkog stepena pri MOI od 5014 dana nakon transdukcije in vitro. (M) VCN izveden iz periferne krvi NSG miševa 8 nedelja nakon transplantacije sa ljudskim mPB-CD34+ ćelijama transdukovanim sa IDUA-LV kliničkog stepena pri MOI od 50, predstavljeno kao višestruko povećanje u odnosu na grupu sa 2 pogotka.
Slika 6 Karakterizacija kapaciteta CsH za poboljšanje LV transdukcije. (A) Makrofagi izvedeni iz ljudskih monocita (MDM) prethodno jesu ili nisu izloženi Vpk (srednja vrednost ± SEM, n=3) i (B) primarne CD3<+>ili CD4<+>T ćelije su transdukovane pri MOI od 1 u prisustvu ili odsustvu 8 µM CsA/H (srednja vrednost ± SEM, n=8, Wilcoxon Signed Rank Test vs. DMSO=1, **p=0,0078). (C-H i J-L) ljudske CD34+ ćelije iz različitih izvora transdukovane su različitim vektorima kako je naznačeno, u prisustvu ili odsustvu CsA ili CsH, i efikasnost transdukcije je procenjena 5 dana nakon transdukcije. Na primer, hCB-CD34+ ćelije su transdukovane pri MOI od 50 sa integrazom defektnim LV (IDLV) vektorom sa ili bez CsH (H). (I) Late-RT i 2LTR intermedijeri kružne replikacije su izmereni za CB-CD34<+>ćelije transdukovane sa LV MOI 100 na 6 ili 24 sata nakon transdukcije (srednja vrednost ± SEM, n≥3). Efikasnost transdukcije je procenjena 5 dana nakon transdukcije. (M,N) Efikasnost transdukcije (M) i apoptoza (N) u ljudskim CB-CD34+ ćelijama u prisustvu različitih koncentracija CsH (srednja vrednost ± SEM, n=2). Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM tri nezavisna eksperimenta. p vrednosti su za jednosmernu ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem.
Slika 7 Ciklosporini se suprotstavljaju IFN-inducibilnom bloku za VSV-g posredovani ulazak vektora. (A) THP-1 (srednja vrednost ± SEM; n=10; Jednosmerni ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem, *p≤0,05, ***p≤0,001; Mann Whitney test, $$$p=0,0007), (B) K562 (srednja vrednost ± SEM, n=8) i (C) Ljudske CD34<+>ćelije izvedene iz CB (srednja vrednost ± SEM; n=6; jednosmerna ANOVA sa Bonferonijevim višestrukim poređenjem, **p=0,0051; Mann Whitney test, $p=0,02) prethodno jesu ili nisu stimulisane sa 1000 IU/mL ljudskog IFNα tokom 24 sata, nakon čega je usledila transdukcija sa LV pri MOI od 1 u prisustvu ili odsustvu 8 µM CsA/H. (D) THP-1 ćelije prethodno stimulisane ljudskim IFNα i transdukovane sa Amfo-pseudotipizovanim RV sa ili bez CsH (srednja vrednost ± SEM, n=4). (E) THP-1 (srednja vrednost ± SEM, n=4); i (F) Ljudske CD34<+>ćelije izvedene iz CB (srednja vrednost ± SEM, n≥4) prethodno jesu ili nisu stimulisane sa sa IFNα tokom 24 sata nakon čega je usledila transdukcija sa BaEV-TR LV pri MOI od 0,5-1 u prisustvu ili odsustvu CsA/H. Efikasnost transdukcije je procenjena pomoću FACS 5 dana nakon transdukcije.
Figura 8 CsH povećava uređivanje gena u ljudskim i mišjim HSPC. (A) Procenat genski
1
uređenih GFP+ ljudskih CB-izvedenih CD34+ subpopulacija ili mišjih Lin-HSPC procenjen je 3 dana nakon nukleofekcije. (B) Sastav subpopulacije CB-CD34+ je procenjen pomoću FACS 3 dana nakon nukleofekcije. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM dva nezavisna eksperimenta.
Slika 9 CsA ne menja profile integracije LV u ljudskom HSPC. Lokacije integracije lentivirusa su izvučene iz genomske DNK ekstrahovane iz CD34+ HSPC izvedenih iz CB transdukovanih pri MOI od 100 u prisustvu ili odsustvu CsA. Distribucija genoma identifikovanih integracionih mesta (IS) prikazana je u cirko dijagramu. Ljudski genom je predstavljen hromozomima od 1 do 22, x i y u smeru kazaljke na satu od vrha (spoljni krug). Srednji krug predstavlja sav IS sa svojim izobiljem koji se odražava u visini vrha sa zelenim vrhovima koji odgovaraju IS od kontrolnih transdukovanih ćelija i crvenim do onih iz ćelija transdukovanih u prisustvu CsA. Plavi histogrami unutar unutrašnjeg kruga predstavljaju značajnost razlike između dve grupe (DMSO u odnosu na CsA), što je histogram veći, razlika je značajnija. Crvena traka je postavljena na pragu od p<0,1 i histogrami koji ga prelaze mogu se smatrati značajnim.
Slika 10 CsH povećava transfer i uređivanje gena u ljudskim HSPC koji dugoročno repopulišu SCID. (A) Eksperimentalna šema različitih transdukcionih protokola koristeći LV klinički stepen i ljudske CD34<+>ćelije izvedene iz mPB. (B) Procenjen je broj mijeloidnih i eritroidnih jedinica koje formiraju kolonije (CFU) in vitro (srednja vrednost ± SEM; n=8; Dunnov prilagođeni Kruskal-Wallisov test naspram 2-hit ukupne CFU, *p≤0,05). (C) VCN/genom je izmeren u koštanoj srži (BM) nakom 18 nedelja (srednja vrednost ± SEM; n=8; Dunnov prilagođen Kruskal-Wallis, *p≤0,05, ***p≤0,001). (D, E) Nivoi presađivanja su procenjeni kao procenat ljudskih CD45<+>ćelija preko ukupnog broja mononuklearnih ćelija krvi (y-osa) u perifernoj krvi miševa iz različitih grupa tretmana (označeno na x-osi) (srednja vrednost ± SEM; n≥11; Dunnov prilagođen Kruskal-Wallis, ns=nije značajno). (F) Nivoi presađivanja ljudskih CD45+ ćelija u BM su prikazani 18 nedelja nakon transplantacije (srednja vrednost ± SEM; n≥11; Dunnov prilagođen Kruskal-Wallis, **p≤0,01). (G) Šema protokola za uređivanje gena za ljudske CD34+ ćelije izvedene iz CB. (H) Procenat uređivanih ćelija izmeren unutar naznačenih subpopulacija 3 dana nakon uređivanja (srednja vrednost ± SEM; n= 7, Mann-Whitney test, *p≤0,05, *p≤0,05). (I) Presađivanje ljudskih CD45<+>ćelija u perifernoj krvi (PB) u naznačeno vreme nakon transplantacije uređenih CB-CD34<+>ćelija (n= 5). (J) Procenat uređivanja gena popravkom vođenom homologijom (HDR) izmeren u ljudskim ćelijama kod miševa iz (I). (K) Procenat ljudskih genski uređenih ćelija i efikasnost uređivanja kod BM miševa iz (J).
Slika 11 CsH povećava efikasnost LV transdukcije i uređivanja gena kod HSPC koji repopulišu SCID. Ljudske CD34<+>ćelije izvedene iz mPB su transdukovane sa LV kliničkog kvaliteta upoređujući različite protokole transdukcije. VCN/genom je izmeren u (A) tečnoj kulturi (LC) i (B) u masi CFU 14 dana nakon transdukcije (srednja vrednost ± SEM, n=2). (C) VCN/genom je izmeren u perifernoj krvi (PB) NSG miševa 8 nedelja nakon transplantacije (srednja vrednost ± SEM, n≥4, Dunnov prilagođen Kruskal-Wallisov test, *p≤0,05, ***p ≤0,001). (D) VCN i (E) nivoi presađivanja ljudskog CD45+ ćelije u slezini (SPL) su prikazani 18 nedelja nakon transplantacije (srednja vrednost ± SEM, n≥6; Dunnov prilagođen Kruskal-Wallisov test, **p ≤0,01, ***p ≤0,001). (F) Procenti ljudskih B i mijeloidnih ćelijskih linija (hCD19+ i hCD33+ odnosno) unutar ljudskih CD45+ ćelije su prikazane u koštanoj srži (BM) miševa sa 18 nedelja. (G) Sastav subpopulacije tretiranih ljudskih CB-CD34+ ćelije sa slike 10J mereno protočnom citometrijom 3 dana nakon elektroporacije (n=7). (H) Efikasnost uređivanja merena pomoću ddPCR u sortiranim CD34<+>HSPCs, CD19<+>B ćelijama i CD33+ mijeloidnim ćelije miševa na slici 10K 19 nedelja nakon transplantacije (Mann-Whitney test). (I) Procenat naznačenih subpopulacija izmeren unutar presađenih ljudskih ćelija u BM od miševa sa Slike 10K.
Slika 12 Ciklosporini se suprotstavljaju IFN-inducibilnom lentivirusnom restrikcijskom bloku takođe kod HSPC. (A) THP-1 ćelije kojima je izbrisan FPR1 su transdukovane sa LV na MOI 1 /- 8 µM CsH. Efikasnost transdukcije je procenjena pomoću FACS 5 dana nakon druge transdukcije (srednja vrednost ± SEM, n=4, Mann Whitney test naspram svake DMSO kontrole, *p≤0,05). (B) THP-1, (C) K562 i (D) CD34<+>ćelije izvedene iz CBsu prethodno stimulisane sa 1000 IU/mL ljudskog IFNα tokom 24 sata, nakon čega je usledila transdukcija samo za ljudski HSPC sa LV pri MOI od 1 u prisustvu ili odsustvu 8 µM CsA/H. Regulacija na gore odabranih IFN-stimulisanih gena (ISG) je procenjena pomoću RT-qPCR (srednja vrednost ± SEM, n=2-3).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0041] Pronalazak je kao što je definisano u patentnih zahtevima.
[0042] Izrazi „sadrži“ i „sastoji se od“ kako se ovde koriste su sinonimi za „uključujući“ ili „uključuje"; ili „obuhvata“, i obuhvataju ili su otvorenog tipa i ne isključuju dodatne, nenavedene članove, elemente ili korake. Izrazi „sastoji se“, „sadrži“ i „obuhvata“ takođe uključuju izraz „uključuje“.
[0043] U jednom aspektu, pronalazak pruža upotrebu ciklosporina H (CsH) za povećanje efikasnosti transdukcije izolovane populacije ćelija virusnim vektorom, i opciono povećanje efikasnosti uređivanja gena izolovane populacije ćelija transdukovanih virusnim vektorom, gde je virusni vektor pseudotipizovan da uđe u ćelije preko mehanizma koji zavisi od endocitoze i/ili gde je virusni vektor VSV-g pseudotipizovani vektor.
[0044] Povećanje efikasnosti transdukcije se odnosi na povećanje transdukcije ćelija (npr. matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze; ili T ćelije) u prisustvu agensa (npr. CsH ili njegovog derivata), u poređenju sa transdukcijom postignutom u odsustvu agensa ali pod inače suštinski identičnim uslovima. Povećana efikasnost transdukcije stoga može omogućiti smanjenje brojnosti infekcije (MOI) i/ili vremena transdukcije potrebnog za postizanje efikasne transdukcije.
[0045] U jednom otelotvorenju, procenat ćelija transdukovanih vektorom je povećan. U drugom otelotvorenju, broj kopija vektora po ćeliji je povećan. Poželjno je da se oba postižu u isto vreme.
[0046] Postupci za određivanje procenta ćelija transdukovanih vektorom su poznate u struci. Pogodni postupci uključuju protočnu citometriju, fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS) i fluorescentnu mikroskopiju. Korišćena tehnika je poželjno ona koja je podložna automatizaciji i/ili skriningu velike propusnosti.
[0047] Na primer, populacija ćelija može biti transdukovana vektorom koji sadrži reporterski gen. Vektor se može konstruisati tako da se reporterski gen eksprimira kada vektor transdukuje ćeliju. Pogodni reporterski geni uključuju gene koji kodiraju fluorescentne proteine, na primer zelene, žute, crvene, tirkizne ili narandžaste fluorescentne proteine. Kada se populacija ćelija transdukuje vektorom, i broj ćelija koje eksprimiraju i ne eksprimiraju reporterski gen može se kvantifikovati korišćenjem odgovarajuće tehnike, kao što je FACS. Tada se može izračunati procenat ćelija transdukovanih vektorom.
[0048] Alternativno, kvantitativni PCR (qPCR) se može koristiti za određivanje procenta ćelija transdukovanih vektorom koji ne sadrži reporterski gen. Na primer, pojedinačne kolonije ćelija (npr. CD34+ ćelije) mogu biti odabrane iz polučvrste kulture i qPCR se može izvesti na svakoj koloniji posebno kako bi se odredio procenat kolonija pozitivnih na vektor
1
među analiziranim.
[0049] Postupci za određivanje broja kopija vektora su takođe poznati u struci. Korišćena tehnika je poželjno ona koja je podložna automatizaciji i/ili skriningu velike propusnosti. Pogodne tehnike uključuju kvantitativni PCR (qPCR) i pristupe zasnovane na Southern blotu.
[0050] Povećanje efikasnosti uređivanja gena može se odnositi na povećanje broja ćelija (npr. matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze; ili T ćelije) u kojima je uređivan ciljani gen ili mesto (npr. poremećen, zamenjen, izbrisan ili ima sekvencu nukleinske kiseline umetnutu unutar ili na sebe) na predviđeni način nakon transdukcije populacije ćelija virusnim vektorom u prisustvu agensa (npr. CsH ili njegovog derivata), u poređenju sa onim postignutim u odsustvu agensa ali pod inače suštinski identičnim uslovima. Povećana efikasnost uređivanja gena stoga može omogućiti smanjenje brojnosti infekcije (MOI) i/ili vremena transdukcije potrebnog za postizanje efektivnog uređivanja gena. Postupci za određivanje da li su ciljani gen ili mesto uređeni poznati su u struci.
[0051] U kontekstu uređivanja gena, na primer korišćenjem CRISPR/Cas sistema, poželjno je da vektor koji se koristi za transdukciju populacije ćelija je neintegrišući vektor (npr. lentivirusni vektor sa defektom integracije, IDLV).
Ciklosporin H
[0052] Ciklosporin H (CsH, CAS br.83602-39-5) je ciklični undekapeptid koji ima narednu strukturu:
[0053] Poznato je da CsH selektivno antagonizuje receptor formil peptida, međutim, za razliku od ciklosporina A (CsA), CsH se ne vezuje za ciklofilin da bi izazvao imunosupresiju. CsA posreduje u imunosupresiji kao kompleksu sa peptidil-prolil izomeraza ciklofilinom A (CypA) domaćina. Ovo inhibira Ca<2+>-zavisan fosfataza kalcineurin i posledičnu aktivaciju proupalnih citokina kao što je IL-2 (Sokolskaja, E. et al. (2006) Curr. Opin. Microbiol.9: 404-8).
[0054] Rastvori CsH za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu se pripremiti korišćenjem rutinskih postupaka poznatih u struci.
[0055] Koncentracija pri kojoj se CsH ili njegov derivat primenjuju na populaciju ćelija može se prilagoditi za različite vektorske sisteme kako bi se optimizovala efikasnost transdukcije i/ili uređivanje gena. Postupci za određivanje efikasnosti transdukcije i uređivanja gena su opisani iznad. Stručnjak može stoga da izabere odgovarajuću koncentraciju CsH ili njegovog derivata da maksimizuje povećanje efikasnosti transdukcije i/ili uređivanja gena uz minimizovanje bilo kakve toksičnosti koristeći ovde opisane pristupe.
[0056] Derivati CsH se mogu identifikovati korišćenjem postupaka poznatih u struci za određivanje efikasnosti transdukcije i/ili uređivanja gena. Na primer, mogu se koristiti postupci za određivanje procenta ćelija koje su transdukovane vektorom, ili postupci za određivanje broja kopija vektora po ćeliji. Takve postupci su opisani iznad. Korišćeni postupak je poželjno onaj koji je podložan automatizaciji i/ili visokom propusnom skriningu kandidata za CsH derivate. Kandidati za derivate CsH mogu činiti deo biblioteke CsH derivata.
Rapamicin
[0057] Rapamicin (CAS br.53123-88-9, takođe poznat kao Sirolimus) je makrolid koji proizvodi Streptomyces hygroscopicus. Rapamicin ima narednu strukturu:
1
[0058] Rapamicin je odobreni imunosupresiv za upotrebu u prevenciji odbacivanja alografta. Rapamicin ispoljava svoj imunosupresivni efekat kroz vezivanje i inhibiciju peptidil-prolil izomeraze FKBP12 domaćina (Harding, M.W. et al. (1989) Nature 341: 758-60; Siekierka, J.J. et al. (1989) Nature 341: 755-7).
[0059] Pod derivatom rapamicina, podrazumeva se da je rapamicin modifikovan bilo kojom od brojnih tehnika poznatih u struci, poželjno da poboljša svojstva kao što su stabilnost i aktivnost, dok i dalje zadržava svoju funkciju povećanja efikasnosti transdukcije i/ili efikasnosti uređivanja gena izolovane populacije ćelija.
Prostaglandin E2
[0060] Prostaglandin E2, koji je takođe poznat kao dinoproston, je prirodni prostaglandin koji ima strukturu:
[0061] Prostaglandin E2 ili derivat prostaglandina E2 se može koristiti prema pronalasku u kombinaciji sa CsH za povećanje efikasnosti transdukcije i/ili efikasnosti uređivanja gena izolovane populacije ćelija.
[0062] U jednom otelotvorenju, derivat prostaglandina E2 je 16,16-dimetil prostaglandin E2.
[0063] Pod derivatom prostaglandina E2, podrazumeva se da se prostaglandin E2 modifikuje bilo kojom od brojnih tehnika poznatih u struci, poželjno da poboljša svojstva kao što su stabilnost i aktivnost, dok i dalje zadržava svoju funkciju povećanja efikasnosti transdukcije i/ili efikasnosti uređivanja gena izolovane populacije ćelija.
Stavrosporin
[0064] Stavrosporin je prirodni proizvod prvobitno izolovan iz Streptomyces staurosporeus. Pokazuje aktivnost kao inhibitor protein kinaza kroz prevenciju vezivanja ATP za kinazu.
1
Matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze
[0065] Matična ćelija je u stanju da se diferencira na mnoge tipove ćelija. Ćelija koja je u stanju da se diferencira na sve tipove ćelija poznata je kao totipotentna. Kod sisara su samo zigoti i rane embrionalne ćelije totipotentne. Matične ćelije se nalaze u većini, ako ne i u svim, višećelijskim organizmima. Odlikuje ih sposobnost da se obnavljaju kroz mitotičku ćelijsku deobu i diferenciraju se u raznolik spektar specijalizovanih tipova ćelija. Dva široka tipa matičnih ćelija sisara su embrionalne matične ćelije koje su izolovane iz unutrašnje ćelijske mase blastocista i odrasle matične ćelije koje se nalaze u tkivima odraslih. U embrionu u razvoju, matične ćelije se mogu diferencirati u sva specijalizovana embrionalna tkiva. U odraslim organizmima, matične ćelije i progenitorne ćelije deluju kao sistem za popravku za telo, obnavljajući specijalizovane ćelije, ali i održavajući normalan promet regenerativnih organa, kao što su krv, koža ili crevna tkiva.
[0066] Matične ćelije hematopoeze (HSC) su multipotentne matične ćelije koje se mogu naći, na primer, u perifernoj krvi, koštanoj srži i krvi pupčane vrpce. HSC su sposobne za samoobnavljanje i diferencijaciju u bilo koju liniju krvnih ćelija. Oni su sposobne da rekolonizuju ceo imuni sistem, eritroidne i mijeloidne linije u svim hematopoetskim tkivima (kao što su koštana srž, slezina i timus). One pružaju doživotnu proizvodnju svih linija ćelija hematopoeze.
[0067] Progenitorne ćelije hematopoeze imaju kapacitet da se diferenciraju u specifičnu vrstu ćelije. Međutim, za razliku od matičnih ćelija, one su već daleko specifičnije: guraju se da se diferenciraju u svoju „ciljanu“ ćeliju. Razlika između matičnih ćelija i progenitornih ćelija je u tome što se matične ćelije mogu replicirati neograničeno, dok se progenitorne ćelije mogu deliti samo ograničen broj puta. Progenitorne ćelije hematopoeze mogu se rigorozno razlikovati od HSC samo funkcionalnim in vivo testom (tj. transplantacijom i demonstracijom da li mogu da dovedu do svih linija krvi tokom dužih vremenskih perioda).
[0068] Matične i progenitorne ćelije hematopoeze pronalaska sadrže CD34 ćelijski površinski marker (označen kao CD34+).
Izvor matičnih i progenitornih ćelija hematopoeze (HSPC).
[0069] Populacija matičnih i/ili progenitornih ćelija hematopoeze može se dobiti iz uzorka tkiva.
1
[0070] Na primer, populacija matičnih i/ili progenitornih ćelija hematopoeze može se dobiti iz periferne krvi (npr. periferne krvi odraslih i fetusa), krvi pupčane vrpce, koštane srži, jetre ili slezine. Poželjno, ove ćelije se dobijaju iz periferne krvi ili koštane srži. Mogu se dobiti nakon mobilizacije ćelija in vivo uz pomoć tretmana faktorom rasta.
[0071] Mobilizacija se može izvesti korišćenjem, na primer, G-CSF, pleriksafora ili njihovih kombinacija. Drugi agensi, kao što su NSAID i inhibitori dipeptidil peptidaze, takođe mogu biti korisni kao agensi za mobilizaciju.
[0072] Sa dostupnošću faktora rasta matičnih ćelija GM-CSF i G-CSF, većina procedura transplantacije matičnih ćelija hematopoeze se sada izvodi korišćenjem matičnih ćelija prikupljenih iz periferne krvi, i ne iz koštane srži. Sakupljanje matičnih ćelija periferne krvi pruža veći transplantat, ne zahteva da davalac bude podvrgnut opštoj anesteziji da bi prihvatio transplantat, rezultuje kraćim vremenom do transplantacije i može pružiti nižu dugoročnu stopu relapsa.
[0073] Koštana srž se može sakupljati standardnim postupcima aspiracije (bilo u stabilnom stanju ili nakon mobilizacije), ili korišćenjem alata za sakupljanje naredne generacije (npr. Marrow Miner).
[0074] Pored toga, matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze takođe mogu biti izvedene iz indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija.
Karakteristike HSC
[0075] HSC su tipično sa niskim profilom prednjeg rasipanja i bočnog rasipanja prema procedurama protočne citometrije. Neke su metabolički mirne, kao što je pokazano obeležavanjem rodaminom koji omogućava određivanje mitohondrijalne aktivnosti. HSC mogu da sadrže određene markere ćelijske površine kao što su CD34, CD45, CD133, CD90 i CD49f. One se takođe mogu definisati kao ćelije kojima nedostaje eksprimiranje CD38 i CD45RA markera ćelijske površine. Međutim, eksprimiranje nekih od ovih markera zavisi od razvojne faze i tkivno specifičnog konteksta HSC. Neki HSC koji se nazivaju „bočne populacione ćelije“ isključuju Hoechst 33342 boju kao što je otkriveno protočnom citometrijom. Dakle, HSC imaju deskriptivne karakteristike koje omogućavaju njihovu identifikaciju i izolaciju.
1
Negativni markeri
[0076] CD38 je najutvrđeniji i najkorisniji pojedinačni negativni marker za ljudske HSC.
[0077] Ljudski HSC takođe mogu biti negativni na markere linija kao što su CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271 i CD45RA. Međutim, ovi markeri će možda morati da se koriste u kombinaciji za HSC obogaćivanje.
[0078] Pod „negativnim markerom“ treba razumeti da ljudskim HSC nedostaje eksprimiranje ovih markera.
Pozitivni markeri
[0079] CD34 i CD133 su najkorisniji pozitivni markeri za HSC.
[0080] Neki HSC su takođe pozitivni na markere linija kao što su CD90, CD49f i CD93. Međutim, ovi markeri će možda morati da se koriste u kombinaciji za HSC obogaćivanje.
[0081] Pod „pozitivnim markerom“ treba razumeti da ljudski HSC eksprimiraju ove markere.
[0082] U jednom otelotvorenju, matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze su CD34+CD38- ćelije.
Diferencirane ćelije
[0083] Diferencirana ćelija je ćelija koja je postala specijalizovanija u poređenju sa matičnom ili progenitornom ćelijom. Diferencijacija se dešava tokom razvoja višećelijskog organizma kako se organizam menja iz jednog zigota u složen sistem tkiva i tipova ćelija. Diferencijacija je takođe uobičajen proces kod odraslih: odrasle matične ćelije se dele i stvaraju potpuno diferencirane ćerke ćelije tokom popravke tkiva i normalnog obnavljanja ćelija.
Diferencijacija dramatično menja veličinu ćelije, oblik, membranski potencijal, metaboličku aktivnost i odziv na signale. Ove promene su uglavnom posledica visoko kontrolisanih modifikacija u eksprimiranju gena. Drugim rečima, diferencirana ćelija je ćelija koja ima specifične strukture i obavlja određene funkcije usled razvojnog procesa koji uključuje aktivaciju i deaktivaciju specifičnih gena. Ovde diferencirana ćelija uključuje diferencirane ćelije hematopoetske linije kao što su monociti, makrofagi, neutrofili, bazofili, eozinofili, eritrociti, megakariociti/trombociti, dendritske ćelije, T ćelije, B-ćelije i NK-ćelije. Na primer,
1
diferencirane ćelije hematopoetske linije mogu se razlikovati od matičnih ćelija i progenitornih ćelija detekcijom površinskih molekula ćelije koji nisu eksprimirani ili su eksprimirani u manjem stepenu na nediferenciranim ćelijama. Primeri odgovarajućih markera ljudske linije uključuju CD33, CD13, CD14, CD15 (mijeloid), CD19, CD20, CD22, CD79a (B), CD36, CD71, CD235a (eritroid), CD2, CD3, CD4, CD8 (T) i CD56 (NK).
T ćelije
[0084] T ćelije (ili T limfociti) su tip limfocita koji igraju centralnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama. Mogu se razlikovati od drugih limfocita, kao što su B ćelije i prirodne ćelije ubice (NK ćelije), po prisustvu T-ćelijskog receptora (TCR) na površini ćelije.
[0085] U jednom otelotvorenju, T ćelije su CD4+ T ćelije. U drugom otelotvorenju, T ćelije su CD3+ T ćelije.
Izolacija i obogaćivanje populacija ćelija
[0086] Izraz „izolovana populacija“ ćelija kako se ovde koristi može se odnositi na populaciju ćelija koje su prethodno uklonjene iz tela. Izolovana populacija ćelija može se kultivisati i manipulisati ex vivo ili in vitro korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci. Izolovana populacija ćelija može se kasnije ponovo uvesti u pacijenta. Navedeni pacijent može biti isti pacijent od kog su ćelije prvobitno izolovane ili drugi pacijent.
[0087] Populacija ćelija može biti prečišćena selektivno za ćelije koje pokazuju specifičan fenotip ili karakteristiku, i od drugih ćelija koje ne pokazuju taj fenotip ili karakteristike, ili ga pokazuju u manjem stepenu. Na primer, populacija ćelija koja eksprimira specifičan marker (kao što je CD34) može biti prečišćena od početne populacije ćelija. Alternativno, ili kao dodatak, populacija ćelija koja ne eksprimira drugi marker (kao što je CD38) može biti prečišćena.
[0088] Pod „obogaćivanjem“ populacije ćelija za određenu vrstu ćelija treba razumeti da se koncentracija te vrste ćelija povećava unutar populacije. Koncentracija drugih tipova ćelija može biti istovremeno smanjena.
[0089] Prečišćavanje ili obogaćivanje može dovesti do toga da populacija ćelija bude suštinski čista od drugih tipova ćelija.
2
[0090] Prečišćavanje ili obogaćivanje populacije ćelija koje eksprimiraju specifični marker (npr. CD34 ili CD38) može se postići korišćenjem agensa koji se vezuje za taj marker, poželjno suštinski specifično za taj marker.
[0091] Agens koji se vezuje za ćelijski marker može biti antitelo, na primer anti-CD34 ili anti-CD38 antitelo.
[0092] Izraz „antitelo“ se odnosi na kompletna antitela ili fragmente antitela koji su sposobni da se vežu za odabranu metu, uključujući Fv, ScFv, F(ab') i F(ab')2, monoklonska i poliklonska antitela, sintetička antitela uključujući himerna, CDR-transplantirana i humanizovana antitela, i veštački odabrana antitela proizvedena korišćenjem prikaza faga ili alternativnih tehnika.
[0093] Pored toga, u pronalasku se mogu koristiti i alternative klasičnim antitelima, na primer „avitela“, „avimeri“, „antikalini“, „nanotela“ i „DARPini".
[0094] Agensi koji se vezuju za specifične markere mogu biti označeni tako da se mogu identifikovati korišćenjem bilo koje od brojnih tehnika poznatih u struci. Agens može biti inherentno označen, ili može biti modifikovan konjugovanjem oznake na njega. Pod „konjugacijom“ treba razumeti da su agens i oznaka operativno povezani. To znači da su agens i oznaka međusobno povezani na način koji omogućava da oba obavljaju svoju funkciju (npr. vezivanje za marker, omogućavanje fluorescentne identifikacije ili omogućavanje razdvajanja kada se stavi u magnetno polje) u suštini nesmetano. Pogodni postupci konjugacije su dobro poznati u struci i stručnjak će ih lako identifikovati.
[0095] Oznaka može da omogući, na primer, da se označeni agens i bilo koja ćelija za koju je vezan prečiste iz svog okruženja (npr. agens može biti označen magnetnom perlicom ili afinitetnom oznakom, kao što je avidin), detektuju ili oba. Detektabilni markeri pogodan za upotrebu kao oznaka uključuju fluorofore (npr. zelene, crvene, tirkizne i narandžaste fluorescentne proteine) i peptidne oznake (npr. His oznake, Myc oznake, FLAG oznake i HA oznake).
[0096] Brojne tehnike za odvajanje populacije ćelija koje eksprimiraju specifični marker su poznate u struci. To uključuje tehnologije odvajanja zasnovane na magnetnim perlama (npr.
magnetno odvajanje na bazi zatvorenog kruga), protočnu citometriju, sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS), prečišćavanje afinitetnih oznaka (npr. korišćenje afinitetnih kolona ili perli, kao što su kolone sa biotinom za odvajanje avidin-označenih agenasa) i tehnike zasnovane na mikroskopiji.
[0097] Takođe može biti moguće izvršiti razdvajanje korišćenjem kombinacije različitih tehnika, kao što je korak odvajanja na bazi magnetnih perli nakon čega sledi sortiranje rezultujuće populacije ćelija za jedan ili više dodatnih (pozitivnih ili negativnih) markera pomoću protočne citometrije.
[0098] Odvajanje kliničkog stepena može se izvršiti, na primer, korišćenjem CliniMACS® sistema (Miltenyi). Ovo je primer tehnologije odvajanja zasnovane na magnetnim perlama zatvorenog kruga.
[0099] Takođe je predviđeno da se svojstva isključivanja boje (npr. bočna populacija ili obeležavanje rodaminom) ili enzimska aktivnost (npr. aktivnost ALDH) mogu koristiti za obogaćivanje matičnih ćelija hematopoeze.
Uređivanje gena
[0100] Izraz „uređivanje gena“ se odnosi na vrstu genetskog inženjeringa u kojoj se nukleinska kiselina umeće, briše ili zamenjuje u ćeliji. Uređivanje gena se može postići korišćenjem sintetičkih nukleaza, koje mogu biti usmerene na željeno mesto u polinukleotidu (npr. genom). Takve nukleaze mogu stvoriti specifične prekide dvostrukih lanaca na željenim mestima, koji se zatim mogu popraviti kroz nehomologno spajanje krajeva (NHEJ) ili homolognu rekombinaciju (HR), što rezultuje ciljanim mutacijama.
[0101] Takve nukleaze mogu biti isporučene u ciljanu ćeliju korišćenjem virusnih vektora. Predmetni pronalazak pruža postupke za povećanje efikasnosti procesa uređivanja gena.
[0102] Primeri pogodnih nukleaza poznatih u struci uključuju nukleaze cinkovog prsta (CPN), aktivatore transkripcije poput efektorskih nukleaza (TALEN) i klasterisana regularno razmaknuta kratka palindromska ponavljanja (CRISPR)/Cas sistem (Gaj, T. et al. (2013) Trends Biotechnol. 31: 397-405; Sander, J.D. et al. (2014) Nat. Biotechnol.32: 347-55).
[0103] MEganukleaze (Silve, G. et al. (2011) Cur. Gene Ther.11: 11-27) se takođe mogu koristiti kao pogodne nukleaze za uređivanje gena.
[0104] CRISPR/Cas sistem je RNK-vođen sistem za vezivanje DNK (van der Oost et al. (2014) Nat. Rev. Microbiol.12: 479-92), gde se vodič RNK (gRNK) može izabrati da omogući da Cas9 domen bude ciljan na specifičnu sekvencu. Postupci za dizajn gRNK su poznati u struci. Štaviše, potpuno ortogonalni Cas9 proteini, kao i Cas9/gRNK ribonukleoproteinski kompleksi i modifikacije gRNK strukture/sastava za vezivanje različitih proteina, nedavno su razvijeni da istovremeno i usmereno ciljaju različite efektorske domene na željena genomska mesta ćelija (Esvelt et al. (2013) Nat. Methods 10: 1116-21; Zetsche, B. et al. (2015) Cell pii: S0092-8674(15)01200-3; Dahlman, J.E. et al. (2015) Nat. Biotechnol.
2015 Oct 5. doi: 10.1038/nbt.3390. [Epub ispred štampe]; Zalatan, J.G. et al. (2015) Cell 160: 339-50; Paix, A. et al. (2015) Genetics 201: 47-54), i pogodni su za upotrebu u pronalasku.
Vektori
[0105] Vektor je alat koji dozvoljava ili olakšava prenos entiteta iz jednog okruženja u drugo. Vektori koji se koriste za transdukciju ćelija u predmetnom pronalasku su virusni vektori.
[0106] U jednom otelotvorenju, virusni vektori su retrovirusni vektori. U poželjnom otelotvorenju, virusni vektori su lentivirusni vektori.
[0107] U jednom otelotvorenju, lentivirusni vektori su izvedeni iz HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV ili visna lentivirusa.
[0108] U jednom otelotvorenju, virusni vektor je gama-retrovirusni vektor.
[0109] Pod „vektorom izvedenom iz“ određenog tipa virusa, treba razumeti da vektor sadrži najmanje jednu komponentu koja se može izvesti iz te vrste virusa.
Retrovirusni i lentivirusni vektori
[0110] Retrovirusni vektor može biti izveden iz bilo kog pogodnog retrovirusa ili se može izvesti iz njega. Identifikovan je veliki broj različitih retrovirusa. Primeri uključuju virus leukemije miša (MLV), virus leukemije ljudskih T ćelija (HTLV), virus tumora dojke miša (MMTV), Rous virus sarkoma (RSV), Fujinami virus sarkoma (FuSV), Moloney virus mišje leukemije (Mo-MLV), FBR virus mišjeg osteosarkoma (FBR MSV), Moloney virus mišjeg
2
sarkoma (Mo-MSV), Abelson virus mišje leukemije (A-MLV), ptičji virus mijelocitomatoze-29 (MC29) i ptičji virus eritroblastoze (AEV). Detaljan spisak retrovirusa može se naći kod Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63.
[0111] Retrovirusi se mogu široko podeliti u dve kategorije, „jednostavne“ i „složene".
Retrovirusi se mogu još dalje podeliti u sedam grupa. Pet od ovih grupa predstavljaju retroviruse sa onkogenim potencijalom. Preostale dve grupe su lentivirusi i spumavirusi. Pregled ovih retrovirusa je predstavljen u Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63.
[0112] Osnovna struktura genoma retrovirusa i lentivirusa deli mnoge zajedničke karakteristike kao što su 5' LTR i 3' LTR. Između ili unutar njih nalaze se signal za pakovanje koji omogućava pakovanje genoma, mesto vezivanja prajmera, mesta integracije koja omogućavaju integraciju u genom ćelije domaćina i gag, pol i env gene koji kodiraju komponente pakovanja - ovo su polipeptidi potrebni za sklapanje virusnih čestica. Lentivirusi imaju dodatne karakteristike, kao što su rev i RRE sekvence u HIV, koje omogućavaju efikasan izvoz RNK transkripata integrisanog provirusa iz jezgra u citoplazmu inficirane ciljane ćelije.
[0113] U provirusu, ovi geni su na oba kraja okruženi regionima koji se nazivaju dugačkim terminalnim ponavljanjima (LTR). LTR su odgovorni za provirusnu integraciju i transkripciju. LTR takođe služe kao pojačivač-promoter sekvence i mogu da kontrolišu eksprimiranje virusnih gena.
[0114] Sami LTR su identične sekvence koje se mogu podeliti na tri elementa: U3, R i U5. U3 je izveden iz sekvence jedinstvene za 3' kraj RNK. R je izveden iz sekvence koja se ponavlja na oba kraja RNK. U5 je izveden iz sekvence jedinstvene za 5' kraj RNK. Veličine tri elementa mogu značajno da variraju među različitim retrovirusima.
[0115] U defektnom retrovirusnom vektorskom genomu gag, pol i env mogu biti odsutni ili nefunkcionalni.
[0116] U tipičnom retrovirusnom vektoru, najmanje deo jednog ili više regiona koji kodiraju proteine bitne za replikaciju mogu biti uklonjeni iz virusa. Ovo čini replikaciju virusnog vektora defektnom. Delovi virusnog genoma takođe mogu biti zamenjeni bibliotekom koja kodira kandidate za modulirajuće delove koji su operativno povezani sa regulatornim kontrolnim regionom i reporterskim delom u vektorskom genomu kako bi se stvorio vektor koji sadrži kandidata za modulirajuće delove koji je sposoban da transdukuje ciljanu ćeliju domaćina i/ili da integriše njen genoma u genom domaćina.
[0117] Lentivirusni vektori su deo veće grupe retrovirusnih vektora. Detaljan spisak lentivirusa može se pronaći kod Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 758-63. Ukratko, lentivirusi se mogu podeliti na grupu primatskih i neprimatskih. Primeri primatskih lentivirusa uključuju, ali nisu ograničeni na virus humane imunodeficijencije (HIV), uzročnik sindroma stečene imunodeficijencije kod ljudi (AIDS); i virus majmunske imunodeficijencije (SIV). Primeri neprimatskih lentivirusa uključuju prototip „spor virusa“ visna/maedi virus (VMV), kao i srodni virus artritisa i encefalitisa koza (CAEV), virus infektivne anemije konja (EIAV) i nedavno opisani virus mačje imunodeficijencije (FIV) i virus goveđe imunodeficijencije (BIV).
[0118] Porodica lentivirusa se razlikuje od retrovirusa po tome što lentivirusi imaju sposobnost da inficiraju i ćelije koje se dele i ćelije koje se ne dele (Lewis, P et al. (1992) EMBO J.11: 3053-8; Lewis, P.F. et al. (1994) J. Virol.68: 510-6). Nasuprot tome, drugi retrovirusi, kao što je MLV, nisu u stanju da inficiraju ćelije koje se ne dele ili se sporo dele, kao što su one koje čine, na primer, tkivo mišića, mozga, pluća i jetre.
[0119] Lentivirusni vektor, kako se ovde koristi, je vektor koji sadrži najmanje jednu komponentu koja se može izvesti iz lentivirusa. Poželjno, taj sastavni deo je uključen u biološke mehanizme pomoću kojih vektor inficira ćelije, eksprimira gene ili se replicira.
[0120] Lentivirusni vektor može biti „primatski“ vektor. Lentivirusni vektor može biti „neprimatski“ vektor (tj. izveden iz virusa koji primarno ne inficira primate, posebno ljude). Primeri neprimatskih lentivirusa mogu biti bilo koji član porodice lentiviridae koji prirodno ne inficira primate.
[0121] Kao primeri vektora zasnovanih na lentivirusu, vektori zasnovani na HIV-1 i HIV-2 su opisani u nastavku.
2
[0122] HIV-1 vektor sadrži cis delujuće elemente koji se takođe nalaze u jednostavnim retrovirusima. Pokazalo se da su sekvence koje se protežu u gag otvoreni okvir za čitanje važne za pakovanje HIV-1. Stoga, HIV-1 vektori često sadrže relevantni gag deo u kom je mutiran translacioni inicijacioni kodon. Pored toga, većina HIV-1 vektora takođe sadrži deo env gena koji uključuje RRE. Rev se vezuje za RRE, što dozvoljava transport mRNK pune dužine ili pojedinačno spojenih mRNK iz jezgra u citoplazmu. U odsustvu Rev i/ili RRE, HIV-1 RNK pune dužine se akumuliraju u jezgru. Alternativno, konstitutivni transportni element iz određenih jednostavnih retrovirusa, kao što je Mason-Pfizer majmunski virus, može se koristiti za ublažavanje zahteva za Rev i RRE. Efikasna transkripcija od HIV-1 LTR promotera zahteva virusni protein Tat.
[0123] Većina vektora zasnovanih na HIV-2 je strukturno veoma slična HIV-1 vektorima. Slično vektorima zasnovanim na HIV-1, HIV-2 vektori takođe zahtevaju RRE za efikasan transport virusne RNK pune dužine ili pojedinačno splajsovane virusne RNK.
[0124] U jednom sistemu, vektorski i pomoćni konstrukti su iz dva različita virusa, i smanjena homologija nukleotida može smanjiti verovatnoću rekombinacije. Pored vektora zasnovanih na lentivirusima primata, vektori zasnovani na FIV su takođe razvijeni kao alternativa vektorima izvedenim iz patogenog HIV-1 genoma. Strukture ovih vektora su takođe slične vektorima zasnovanim na HIV-1.
[0125] Poželjno, virusni vektor koji se koristi u predmetnom pronalasku ima minimalan virusni genom.
[0126] Pod „minimalnim virusnim genomom“ treba razumeti da je virusni vektor manipulisan tako da se uklone neesencijalni elementi i da se zadrže esencijalni elementi kako bi se pružila potrebna funkcionalnost za inficiranje, transdukciju i isporuku nukleotidne sekvence od interesa interes do ciljane ćelije domaćina. Više detalja o ovoj strategiji možete pronaći u WO 1998/017815.
[0127] Poželjno je da će plazmidni vektor koji se koristi za proizvodnju virusnog genoma unutar ćelije domaćina/ćelije za pakovanje imati dovoljno lentivirusnih genetičkih informacija da omogući pakovanje RNK genoma, u prisustvu komponenti pakovanja, u virusnu česticu koja je sposobna da inficira ciljanu ćeliju, ali nije sposoban za nezavisnu replikaciju da
2
proizvede infektivne virusne čestice unutar krajnje ciljane ćelije. Poželjno, vektoru nedostaje funkcionalni gag-pol i/ili env gen i/ili drugi geni esencijalni za replikaciju.
[0128] Međutim, plazmidni vektor koji se koristi za proizvodnju virusnog genoma u ćeliji domaćinu/ćeliji za pakovanje će takođe uključivati transkripcione regulatorne kontrolne sekvence koje su operativno povezane sa lentivirusnim genomom za direktnu transkripciju genoma u ćeliji domaćinu/ćeliji za pakovanje. Ove regulatorne sekvence mogu biti prirodne sekvence povezane sa transkribovanom virusnom sekvencom (tj.5' U3 region), ili mogu biti heterologni promoter, kao što je drugi virusni promoter (npr. CMV promoter).
[0129] Vektori mogu biti samoinaktivirajući (SIN) vektori u kojima su sekvence pojačivača virusa i promotera izbrisane. SIN vektori se mogu generisati i transdukovati ćelije koje se ne dele in vivo sa efikasnošću sličnom onoj kod vektora divljeg tipa. Inaktivacija transkripcije dugog terminalnog ponavljanja (LTR) u SIN provirusu bi trebalo da spreči mobilizaciju virusa kompetentnog za replikaciju. Ovo bi takođe trebalo da omogući regulisano eksprimiranje gena iz unutrašnjih promotera eliminisanjem bilo kakvih cis efekata od LTR.
[0130] Vektori mogu biti integraciono defektni. Integracioni defektni lentivirusni vektori (IDLV) mogu se proizvesti, na primer, bilo pakovanjem vektora sa katalitički neaktivnom integrazom (kao što je HIV integraza koja nosi D64V mutaciju na katalitičkom mestu;
Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-7; Naldini, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-8; Leavitt, A.D. et al. (1996) J. Virol.70: 721-8) ili modifikovanjem ili brisanjem esencijalnih att sekvenci iz vektora LTR (Nightingale, S.J. et al. (2006) Mol. Ther.
13: 1121-32), ili kombinacijom gore navedenog.
Vektori izvedeni iz HIV
[0131] Vektori izvedeni iz HIV za upotrebu u predmetnom pronalasku nisu posebno ograničeni u pogledu HIV soja. Brojni primeri sekvenci sojeva HIV mogu se naći u bazi podataka o HIV sekvencama (http://www.hiv.lanl.gov/content/index).
[0132] Na primer, vektor izveden iz HIV-1 može biti izveden iz bilo kog od HIV-1 sojeva NL4-3, IIIB_LAI ili HXB2_LAI (X4-tropic), ili BAL (R5-tropic), ili njihovih himera.
Poželjno, vektori izvedeni iz HIV-1 su izvedeni iz pMDLg/pRRE Gag-Pol-eksprimirajućeg konstrukta pakovanja (US 7629153; US 8652837; Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-
2
7; Follenzi, A. et al. (2002) Methods Enzymol.346: 454-65).
[0133] Vektor izveden iz HIV-2 može biti izveden, na primer, iz HIV-2 soja ROD.
Nukleotid od interesa
[0134] Vektor koji se koristi u predmetnom pronalasku poželjno sadrži nukleotid od interesa.
[0135] Poželjno, nukleotid od interesa izaziva terapeutski efekat.
[0136] Pogodni NOI uključuju, ali nisu ograničeni na sekvence koje kodiraju enzime, citokine, hemokine, hormone, antitela, antioksidans molekule, sintetičke molekule slične imunoglobulinu, jednolančana antitela, fuzione proteine, imuno ko-stimulativne molekule, imunomodulatorne anti-molekule, anti-sens RNK, mikroRNK, shRNK, siRNK, vodiča RNK (gRNK, npr. korišćen u vezi sa CRISPR/Cas sistemom), ribozime, ciljane sekvence miRNK, transdomenski negativni mutant ciljanog proteina, toksine, uslovne toksine, antigene, proteine supresore tumora, faktore raste, faktori transkripcije, membranske proteine, površinske receptore, molekule protiv raka, vazoaktivne proteine i peptide, antivirusne proteine i ribozime, i njihove derivate (kao što su derivati sa povezanom reporterskom grupom). NOI takođe mogu kodirati enzime koji aktiviraju prolekove.
[0137] Primer NOI je beta-globinski lanac koji se može koristiti za gensku terapiju talasemije/bolesti srpastih ćelija.
[0138] NOI takođe uključuju one korisne za tretman drugih bolesti koje zahtevaju nehitnu/elektivnu korekciju gena u mijeloidnoj liniji, kao što su: hronična granulomatozna bolest (CGD, npr. gp91phok transgen), defekti adhezije leukocita, drugi poremećaji fagocita kod pacijenata bez teških infekcije i nasledni sindromi otkazivanja koštane srži (npr.
Fankonijeva anemija), kao i primarne imunodeficijencije (SCID).
[0139] NOI takođe uključuju one korisne u tretmanu lizozomalnih poremećaja skladištenja i imunodeficijencije.
[0140] Primenjivost pronalaska na T ćelije takođe olakšava njegovu primenu u ćelijskim terapijama koje se zasnivaju na infuziji modifikovanih T ćelija u pacijente, uključujući strategije protiv raka (kao što je korišćenje sintetičhih CAR-T ćelija) i pristupe zasnovane na
2
infuziji T ćelija univerzalnog donora. NOI stoga mogu takođe uključiti, na primer, himerne antigen receptore (CAR).
Farmaceutski sastav
[0141] Ćelije se mogu formulisati za primenu pacijentima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom. Pogodni nosači i razblaživači uključuju izotonične fiziološke rastvore, na primer fiziološki rastvor puferisan fosfatom, i potencijalno sadrže ljudski serumski albumin.
[0142] Rukovanje proizvodom za ćelijsku terapiju je poželjno obavljati u skladu sa FACT-JACIE International Standards za ćelijsku terapiju.
Transplantacija matičnih i/ili progenitornih ćelija hematopoeze
[0143] Predmetni pronalazak pruža ciklosporin H (CsH) za upotrebu u genskoj terapiji, gde je genska terapija posredovana virusnim vektorom, gde je virusni vektor pseudotipizovan da uđe u ćelije putem mehanizma koji zavisi od endocitoze i/ili gde je virusni vektor VSV-g pseudotipizovani vektor
[0144] Upotreba može biti kao deo procedure transplantacije ćelija, na primer postupka transplantacije matičnih ćelija hematopoeze i/ili progenitornih ćelija.
[0145] Transplantacija matičnih ćelija hematopoeze (HSCT) je transplantacija krvnih matičnih ćelija izveden iz koštane srži (u ovom slučaju poznata kao transplantacija koštane srži) ili krvi. Transplantacija matičnih ćelija je medicinski postupak iz oblasti hematologije i onkologije, koji se najčešće izvodi kod osoba sa oboljenjima krvi ili koštane srži, ili određenim vrstama raka.
[0146] Mnogi primaoci HSCT su pacijenti sa multiplim mijelomom ili leukemijom koji ne bi imali koristi od produženog tretmana ili su već otporni na hemoterapiju. Kandidati za HSCT uključuju pedijatrijske slučajeve gde pacijent ima urođeni defekt kao što je teška kombinovana imunodeficijencija ili kongenitalna neutropenija sa defektnim matičnim ćelijama, kao i deca ili odrasli sa aplastičnom anemijom koji su izgubili svoje matične ćelije nakon rođenja. Ostala stanja koja se tretiraju transplantacijom matičnih ćelija uključuju bolest srpastih ćelija, mijelodisplastični sindrom, neuroblastom, limfom, Evingov sarkom,
2
dezmoplastični tumor malih okruglih ćelija i Hodžkinovu bolest. Nedavno su razvijene nemijeloablativne, ili takozvane „mini transplantacije“, procedure koje zahtevaju manje doze preparativne hemoterapije i zračenja. Ovo je omogućilo da se HSCT sprovede kod starijih i drugih pacijenata koji bi se inače smatrali suviše slabim da izdrže konvencionalni režim tretmana.
[0147] Populacija matičnih i/ili progenitornih ćelija hematopoeze može biti primenjena kao deo postupka transplantacije autolognih matičnih ćelija.
[0148] Populacija matičnih i/ili progenitornih ćelija hematopoeze može biti primenjena kao deo postupka transplantacije alogenih matičnih ćelija.
[0149] Izraz „autologna procedura transplantacije matičnih ćelija“ kako se ovde koristi odnosi se na proceduru u kojoj se početna populacija ćelija (koje se zatim transdukuju u skladu sa postupakom pronalaska) dobija od istog pacijenta kom se transdukovana ćelijska populacija primenjuje. Procedure autologne transplantacije su korisne jer izbegavaju probleme povezane sa imunološkom nekompatibilnošću i dostupne su pacijentima bez obzira na dostupnost genetski podudarnog donora.
[0150] Izraz „procedura alogenske transplantacije matičnih ćelija“ kako se ovde koristi odnosi se na proceduru u kojoj se početna populacija ćelija (koje se zatim transdukuju prema postupku pronalaska) dobija od drugog pacijenta od onoga kom se transdukovana ćelijska populacija primenjuje. Poželjno, donor će biti genetski uparen sa pacijentom kome se ćelije primenjuju kako bi se smanjio rizik od imunološke nekompatibilnosti.
[0151] Pogodne doze transdukovanih populacija ćelija su takve da budu terapeutski i/ili profilaktički efikasne. Doza koja se primenjuje može zavisiti od pacijenta i stanja koje se tretira, i može je lako odrediti stručnjak.
[0152] Progenitorne ćelije hematopoeze pružaju kratkotrajno presađivanje. Shodno tome, genska terapija primenom transdukovanih progenitornih ćelija hematopoeze bi pružila nepostojan efekat kod pacijenta. Na primer, efekat može biti ograničen na 1-6 meseci nakon primene transdukovanih progenitornih ćelija hematopoeze. Prednost ovog pristupa bila bi bolja bezbednost i podnošljivost, zbog samoograničene prirode terapijske intervencije.
[0153] Takva genska terapija progenitornim ćelijama hematopoeze može biti prikladna za tretman stečenih poremećaja, na primer raka, gde vremenski ograničeno eksprimiranje (potencijalno toksičnog) nukleotida protiv raka od interesa može biti dovoljno za iskorenjivanje bolesti.
[0154] Pronalazak može biti koristan u tretmanu poremećaja navedenih u WO 1998/005635. Radi lakšeg snalaženja, deo tog spiska je ovde pružen: rak, upala ili upalna bolest, dermatološki poremećaji, groznica, kardiovaskularni efekti, krvarenje, koagulacija i odgovor akutne faze, kaheksija, anoreksija, akutna infekcija, HIV infekcija, stanja šoka, transplantatprotiv-domaćina reakcije, autoimuna bolest, reperfuziona povreda, meningitis, migrena i antitromboza zavisna od aspirina; rast tumora, invazija i širenje, angiogeneza, metastaze, maligni, ascites i maligni pleuralni izliv; cerebralna ishemija, ishemijska bolest srca, osteoartritis, reumatoidni artritis, osteoporoza, astma, multipla skleroza, neurodegeneracija, Alchajmerova bolest, ateroskleroza, moždani udar, vaskulitis, Kronova bolest i ulcerozni kolitis; parodontitis, gingivitis; psorijaza, atopijski dermatitis, hronični ulkusi, buloza epidermolize; ulceracije rožnjače, retinopatija i hirurško zarastanje rana; rinitis, alergijski konjunktivitis, ekcem, anafilaksa; restenoza, kongestivna srčana insuficijencija, endometrioza, ateroskleroza ili endoskleroza.
[0155] Pored toga, ili alternativno, pronalazak može biti koristan u tretmanu poremećaja navedenih u WO 1998/007859. Radi lakšeg snalaženja, deo tog spiska je ovde pružen: aktivnost proliferacije/diferencijacije citokina i ćelija; imunosupresivna ili imunostimulativna aktivnost (npr. za tretman imunodeficijencije, uključujući infekciju virusom humane imunodeficijencije; regulaciju rasta limfocita; tretman raka i mnogih autoimunih bolesti, kao i za sprečavanje odbacivanja transplantata ili izazivanje imuniteta tumora); regulisanje hematopoeze, npr. tretman mijeloidnih ili limfoidnih bolesti; podsticanje rasta kostiju, hrskavice, tetiva, ligamenata i nervnog tkiva, npr. za zarastanje rana, tretman opekotina, čireva i parodontalne bolesti i neurodegeneracije; inhibicija ili aktivacija folikulo-stimulišućeg hormona (modulacija plodnosti); hemotaktička/hemokinetička aktivnost (npr. za mobilizaciju specifičnih tipova ćelija na mesta povrede ili infekcije); hemostatska i trombolitička aktivnost (npr. za tretman hemofilije i moždanog udara); protiv-upalna aktivnost (za tretman npr. septičkog šoka ili Kronove bolesti); kao antimikrobni agensi; modulatori npr. metabolizma ili ponašanja; kao analgetici; tretman specifičnih poremećaja nedostatka; u tretmanu npr. psorijaze, u ljudskoj ili veterinarskoj medicini.
1
[0156] Pored toga, ili alternativno, pronalazak može biti koristan u tretmanu poremećaja navedenih u WO 1998/009985. Radi lakšeg snalaženja, deo tog spiska je ovde pružen: inhibitorna aktivnost makrofaga i/ili inhibitorna aktivnost T ćelija, i time i protiv-upalna aktivnost; anti-imunska aktivnost, tj. inhibitorni efekti protiv ćelijskog i/ili humoralnog imunološkog odgovora, uključujući odgovor koji nije povezan sa upalom; inhibiranje sposobnosti makrofaga i T ćelija da se lepe za komponente ekstracelularnog matriksa i fibronektin, kao i eksprimiranje receptora za fas u T ćelijama; inhibiranje neželjene imunološke reakcije i upale uključujući artritis, uključujući naredno: reumatoidni artritis, upala povezana sa preosetljivošću, alergijske reakcije, astma, sistemski eritematozni lupus, bolesti kolagena i druge autoimune bolesti, upala povezana sa aterosklerozom, ateroskleroza, regeneracija srčane arterioskleroze, infarkt miokarda, vaskularni upalni poremećaji, sindrom respiratornog distresa ili druge kardiopulmonalne bolesti, upala povezana sa peptičkim ulkusom, ulceroznim kolitisom i drugim oboljenjima gastrointestinalnog trakta, fibroza jetre, ciroza jetre ili druga oboljenja jetre, tiroiditis ili druga oboljenja žlezda, glomerulonefritis ili druga bubrežna i urološka oboljenja, otitis ili druga oto-rino-laringološka oboljenja, dermatitis ili druga kožna oboljenja, parodontalna oboljenja ili druga zubna oboljenja, orhitis ili epididimo-orhitis, neplodnost, orhidalna trauma ili druge bolesti testisa povezane sa imunitetom, disfunkcija placente, insuficijencija placente, uobičajeni abortus, eklampsija, preeklampsija i druga imunološka i/ili upalna ginekološka oboljenja, zadnji uveitis, intermedijarni uveitis, prednji uveitis, konjuktivitis, horioretinitis, upalnski horioretinitis na primer retinitis ili cistoidni makularni edem, simpatička oftalmija, skleritis, retinitis pigmentosa, imunološke i upalne komponente degenerativne bolesti fondusa, upalne komponente očne traume, upala oka uzrokovana infekcijom, proliferativna vitreo-retinopatija, akutntna ishemihsja očna neuropatija, prekomerni ožiljci npr. nakon operacije filtriranja glaukoma, imunološke i/ili upalne reakcije na očne implantate i druge imune i upalne oftalmološke bolesti, upale povezane sa autoimunim bolestima ili stanjima ili poremećajima gde bi, kako u centralnom nervnom sistemu (CNS), tako i u bilo kom drugom organu, supresija imuniteta i/ili upale bila korisna, Parkinsonova bolest, komplikacija i/ili neželjeni efekti tretmana Parkinsonove bolesti, kompleksa demencije povezanog sa AIDS, encefalopatija povezana sa HIV, Devičova bolest, Sidenhamova horeja, Alchajmerova bolest i druga degenerativna oboljenja, stanja ili poremećaji CNS, upalne komponente Stokesa, postpolio sindrom, imunološke i upalne komponente psihijatrijskih poremećaja, mijelitis, encefalitis, subakutni sklerozirajući panencefalitis, encefalomijelitis, akutna neuropatija,
2
subakutna neuropatija, hronična neuropatija, Guillaim-Barre sindrom, Sydenham hora, mijastenija gravis, pseudo-tumor mozga, Daunov sindrom, Hantingtonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, upalne komponente CNS kompresije ili CNS traume ili CNS infekcije, upalne komponente mišićnih atrofija i distrofija, i imunološke i upalne bolesti, stanja ili poremećaji centralnog i perifernog nervnog sistema, post-traumatske upale, septički šok, zarazne bolesti, upalne komplikacije ili neželjeni efekti operacije, transplantacije koštane srži ili druge komplikacije transplantacije i/ili neželjeni efekti, upalne i/ili imunološke komplikacije i neželjeni efekti genske terapije, npr. zbog infekcije virusnim nosačem, ili upale povezane sa AIDS, za suzbijanje ili inhibiciju humoralnog i/ili ćelijskog imunog odgovora, za tretman ili poboljšanje proliferativnih bolesti monocita ili leukocita, npr. leukemija, smanjenjem količine monocita ili limfocita, za prevenciju i/ili tretman odbacivanja grafta u slučajevima transplantacije prirodnih ili veštačkih ćelija, tkiva i organa kao što su rožnjača, koštana srž, organi, sočiva, pejsmejkeri, prirodno ili veštačko tkivo kože.
[0157] Pored toga, ili alternativno, pronalazak može biti koristan u tretmanu β-talasemije, hronične granulomatozne bolesti, metahromatske leukodistrofije, poremećaja mukopolisaharidoze i drugih poremećaja lizozomskog skladištenja.
[0158] Kao što je gore navedeno, primenljivost pronalaska na T ćelije takođe olakšava njegovu primenu u ćelijskim terapijama koje se zasnivaju na infuziji modifikovanih T ćelija u pacijente, uključujući strategije protiv raka (kao što je korišćenje sintetičkih CAR-T ćelija) i pristupe zasnovane na infuziji univerzalnih donora T ćelija. Stoga, kao dodatak, ili kao alternativa, pronalazak može biti koristan u prevenciji bolesti transplantata protiv domaćina.
Komplet
[0159] CsH ili njegov derivat, i/ili populacije ćelija mogu se pružiti u odgovarajućim kontejnerima.
[0160] Komplet takođe može sadržati uputstva za upotrebu.
Način tretmana
[0161] Treba razumeti da sve reference ovde na tretman uključuju kurativni, palijativni i profilaktički tretman; iako su u kontekstu pronalaska reference na prevenciju češće povezane sa profilaktičkim tretmanom. Poželjan je tretman sisara, posebno ljudi. I ljudski i veterinarski tretmani su unutar obima obelodanjenja.
[0162] Poželjne karakteristike i otelotvorenja pronalaska će sada biti opisani putem neograničavajućih primera.
[0163] Praksa predmetnog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike hemije, biohemije, molekularne biologije, mikrobiologije i imunologije, koje su u okviru mogućnosti stručnjaka. Takve tehnike su objašnjene u literaturi. Poledati, na primer, Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 i periodični dodaci) Current Protocols in Molecular Biology, Ch.9, 13 i 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. i Kahn, A. (1996) DNA Isolation i Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. i McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; i Lilley, D.M. i Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press.
PRIMERI
Primer 1
Materijali i postupci
Vektori
[0164] Zalihe lentivirusa treće generacije (LV) su pripremljene, koncentrisane i titrirane kao što je prethodno opisano (Dull, T. et al. (1998) J Virol 72: 8463-8471; Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet 25: 217-222). Ukratko, samoinaktivirajući (SIN) LV vektori su proizvedeni korišćenjem vektora prenosa pCCLsin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre, plazmida za pakovanje pMDLg/pRRE, pCMV-Rev koji eksprimira Rev i VSV-g omotač-kodirajućih pMD2.VSV-G plazmida. Lentivirusni vektor sa defektom integraze (IDLV) proizveden je kako je prethodno opisano (Lombardo, A. et al. (2007) Nat Biotechnol 25: 1298-1306) supstitucijom plazmida za pakovanje pMDLg/pRRE sa pMD.Lg/pRRE.D64VInt. Ćelavi vektor, normalan LV proizveden izostavljajući Env-kodirajući plazmid tokom proizvodnje vektora, proizveden je kao negativna kontrola. Tokom proizvodnje vektora, Env konstrukt je zamenjen sa pcDNA3.1
4
(Invitrogen Inc.). Za SINLV kapsid mutante, vektori su proizvedeni kao što je gore opisano, osim što je divlji tip pMDLg/pRRE zamenjen plazmidom za pakovanje koji sadrži specifičnu tačkastu mutaciju u p24 kodirajućem regionu, kao što sledi: pMDLg/pRRE-N74D; pMDLg/pRRE-P90A. Svi modifikovani plazmidi za pakovanje su kupljeni od GenScript Inc. Za pseudotipizaciju LV sa omotačem mutantnog retrovirusa babuna, pMD2.VSV-G je zamenjen sa BaEV-TR tokom proizvodnje vektora kao što je prethodno opisano (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221-1231). SIN-retrovirusni vektor (SIN-RV) je proizveden kao što je prethodno opisano (Montini, E. et al. (2006) Nat Biotechnol 24: 687-696) koristeći kao vektor za prenos RVrkat43.2MLV GFP, plazmid za pakovanje pCM-gagpol i VSV-g omotač-kodirajući pMD2.VSV-G plazmidili pseudotipizovan sa amfotropnim glikoproteinom omotača (AmphoRV). Majmunski vektor imunodeficijencije (SIV) je proizveden kao što je prethodno opisano (Mangeot, P.E. et al. (2002) Mol Ther 5: 283-290) korišćenjem vektora za prenos SIV-GFP, SIV3+plazmida za pakovanje i pseudotipizovanog VSV-G. AAV6 donorski šabloni za HDR su generisani iz konstrukta koji sadrži AAV2 invertovana terminalna ponavljanja, proizvedeni postupkom trostruke transfekcije i prečišćeni ultracentrifugiranjem na gradijentu cezijum hlorida kao što je prethodno opisano (Wang, L. et al. (2015) Mol Ther 23: 1877-1887). ARSA i IDUA LV kliničkog kvaliteta proizvedeni su od strane MolMed (Milano, Italija) koristeći validirani proces velikog obima kao što je ranije objavljeno (Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158).
Ćelije
Ćelijske linije
[0165] Ćelije ljudskog embrionalnog bubrega 293T (HEK293T) kao i ćelijske linije ljudske K562 mijelogene leukemije održavane su u Iskovovom modifikovanom Dulbekovom medijumu (IMDM; Sigma). Ljudske THP-1 ćelije su održavane u Roswell Park Memorial Institute medijumu (RPMI; Lonza). Oba medijuma su dopunjena sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS; Gibco), penicilinom (100 IU/ml), streptomicinom (100 µg/ml) i 2% glutaminom.
Primarne ćelije
[0166] Ljudske CD34+ HSPC, CD4+ ili CD3+ T ćelije i CD14+ monociti su izolovani putem pozitivne selekcije magnetnih kuglica u skladu sa uputstvima proizvođača (Miltenyi) iz krvi pupčane vrpce (CB) ili iz mononuklearnih ćelija prikupljenih na osnovu informisanog pristanka od zdravih dobrovoljaca prema Institutional Ethical Committee odobrenom protokolu (TIGET01). Inače, CB, koštane srži (BM) ili G-CSF mobilisane CD34+ ćelije periferne krvi (mPB) su direktno kupljene od Lonza ili Hemacare. CD4+ T ćelije su aktivirane u RPMI, dopunjene sa 10% FBS, penicilinom (100 IU/ml), streptomicinom (100 µg/ml), 2% glutaminom, fitohemaglutaninom (PHA) (2 µg/ml, Roche) i IL-2 (300 IU/ml, Novartis) tri dana i održavane u RPMI, dopunjene sa 10% FBS, penicilinom (100 IU/ml), streptomicinom (100 µg/ml), 2% glutaminom i IL-2 (300 Ul/ml).). Inače, CD3+ T ćelije su stimulisane korišćenjem magnetnih perli konjugovanih sa anti-ljudskim CD3 i CD28 antitelima (Dynabeads ljudski T-aktivator CD3/CD28; Invitrogen), prateći uputstva proizvođača, i uzgajane u Iskovovom modifikovanom Dulbekovom mediju (IMDM) (GIBCO-BRL) sa dodatkom penicilina, streptomicina, 10% FBS i 5 ng/ml svakog od IL-7 i IL-15 (PeproTech). Makrofagi izvedeni iz monocita (MDM) su diferencirani od izolovanih CD14+ monocita u DMEM sa dodatkom 10% FBS, penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100 µg/ml), 2% glutamina i 5% ljudskog seruma AB (Lonza) tokom sedam dana.
[0167] Sve ćelije su održavane u 5% CO2vlažnoj atmosferi na 37°C.
Transdukcija
[0168] Ljudske matične/progenitorne ćelije hematopoeze (HSPC) izvedene iz CB su uzgajane u StemSpan medijumu bez seruma (StemCell Technologies) sa dodatkom penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100 µg/ml), 100 ng/ml rekombinantnog faktora ljudskih matičnih ćelija (rhSCF), 20 ng/ml rekombinantnog ljudskog trombopoetina (rhTPO), 100 ng/ml rekombinantnog ljudskog Flt3 liganda (rhFlt3) i 20 ng/ml rekombinantnog ljudskog IL6 (rhIL6) (sve od Peprotech), 16 do 24 sata pre transdukcije. HSPC su zatim transdukovani u koncentraciji od 1 × 10<6>ćelija po mililitru sa glikoproteinom virusa vezikularnog stomatitisa (VSV-G)- pseudotipizovanim SINLV tokom 16 sati pri naznačenoj brojnosti infekcije (MOI) u istom medijumu. Koštana srž i G-CSF mobilisane CD34+ ćelije periferne krvi stavljene su u kulturu na retronektinom obložene komorice koje nisu tretirani kulturom tkiva (T100A Takara) u CellGro medijumu(Cell Genix) koji sadrži koktel citokina: 60 ng/ml IL-3, 100 ng/ml TPO, 300 ng/ml SCF i 300 ng/ml FLT-3L (sve od Cell Peprotech). Ćelije su zatim transdukovane sa naznačenom dozom vektora tokom 14-15 sati u istom medijumu koji sadrži citokine. Nakon transdukcije sa jednim pogođenim reporterom LV, ćelije su isprane i održavane u medijumu bez seruma dopunjenom citokinima kao što je gore navedeno do očitavanja procenta pozitivnih ćelija pomoću FACS, nakon čega su održavane u IMDM dopunjenom sa 10% FBS, 25 ng/ ml rhSCF, 5 ng/ml rhIL6-3, 25 ng/ml rhFlt3 i 5 ng/ml rhTPO još sedam dana pre analize broja kopija vektora. U protokolu koji predviđa dva kruga transdukcije, odabrane za kliničku primenu, ćelije su isprane 10 sati u CellGro SCGM medijumu sa dodatkom citokinima i podvrgnute su drugoj transdukciji pod istim uslovima kao i za prvu, kao što je ranije objavljeno (Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158). Na kraju transdukcije, ćelije su prebrojane i sakupljene za klonogene testove, protočnu citometriju i in vivo studije. Preostale ćelije su postavljene u IMDM 10% fetalni goveđi serum (FBS) sa citokinima (IL-3, 60 ng/ml; IL-6, 60 ng/ml; SCF, 300 ng/ml) i kultivisane ukupno 14 dana. Nakon toga, ćelije su sakupljene za molekularne i biohemijske studije. Nestimulisani HSPC su transdukovani sveže izolovani u StemSpan medijumu sa dodatkom penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100 µg/ml) tokom 16-24 sata, i zatim održavani u prisustvu ljudskih citokina i 10 µM inhibitora reverzne transkriptaze 3TC (SIGMA) kako bi se izbegla naknadna transdukcija usled stimulacije citokina.
[0169] MDM su transdukovani 7 dana nakon diferencijacije. T limfociti su transdukovani u koncentraciji od 10<6>ćelija/ml, nakon 2-3 dana stimulacije. Ćelije su izložene vektoru 16-20 sati.
Jedinjenja
[0170] Ciklosporin A (CsA), ciklosporin H (CsH) i rapamicin (svi iz Sigma-Aldrich) su resuspendovani i uskladišteni prema uputstvima proizvođača. Oni su dodati u medijum za transdukciju u naznačenoj koncentraciji i isprani vektorom 16-20 sati kasnije. Gde je opisano, prostaglandin E2 (dinoproston od Yonsung) je dodat u konačnoj koncentraciji od 10 µM) dva sata pre LV transdukcije.
Linearnom amplifikacijom posredovan PCR i sekvenciranje
[0171] Linearnom amplifikacijom posredovan (LAM)-PCR je izvedena na ∼300 ng DNK ekstrahovane iz kultivisanih ćelija. Ukratko, napravljeno je 100 ciklusa linearne PCR preamplifikacije vektor-genom spojeva, nakon čega je usledilo magnetno hvatanje biotinilovane ciljane DNK pomoću magnetnih perli spojenih sa streptavidinom, prajming heksanukleotida, restrikciona digestija korišćenjem MluCl, HpyCHIV4 i Acil enzima, i ligacija za kasetu veznika komplementarnog mestu ograničenja. Proizvod ligacije je zatim amplifikovan pomoću dva ugnežđena PCR sa prajmerima specifičnim za vektorsko dugačko terminalno ponavljanje (LTR) i sekvence kasete veznika. LAM-PCR amplikoni su razdvojeni na Shimadzu MultiNA Microchip Electrophoresis System kako bi se procenila efikasnost PCR i obrazac trake za svaki uzorak. Korišćeni prajmeri i PCR termalni protokoli su prethodno opisani (Schmidt, M. et al. (2007) Nat Methods 4: 1051-1057). LAM-PCR proizvodi su zatim prečišćeni AmpureXP perlama i kvantifikovani pomoću Qubit™ fluorometra (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).40 ng PCR proizvoda je reamplikovano sa Fusion-LTR (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGA TCT NNNNNNNNNNNNXXXXXXXXACCCTTTTAGTCAGTGTGGA) i Fusion-LC (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT NNNNNNNNNNNNXXXXXXXXgatctgaattcagtggcacag) prajmerima, koji sadrže osam nukleotida (X) oznake omogućavaju da uzorci budu obeleženi barkodom kako na LTR tako i na Linker strani kasete amplikona, specifične sekvence koje omogućavaju upareno sekvenciranje krajeva sa Illumina MiSeq System, i nasumične sekvence od 12 nukleotida (N) za povećanje razdvajanja klastera. PCR je izveden korišćenjem Qiagen TAQ DNK polimeraze pod narednim uslovima: 95°C tokom 2 min, i 95°C tokom 45s, 58°C tokom 45s i 72°C tokom 1 min, tokom 12 ciklusa, nakon čega je usledila inkubacija od 5 min na 72°C. Barkodirani LAM-PCR proizvodi su kvantifikovani fluorometrijskom kvantifikacijom i sastavljeni u biblioteke u ekvimolarnim odnosima, izbegavajući ponavljanje identičnih parova.
Uobičajena analiza mesta umetanja
[0172] Značajna uobičajena mesta umetanja (CIS) su identifikovana korišćenjem pristupa kliznog prozora (Abel, U. et al. (2007) PLoS One 2: e570) i Grubsovog test za izlazne vrednosti za analizu mesta umetanja (IS) (Biffi, A. et al. (2011) Blood 117: 5332-5339). Za postupak kliznog prozora, R paket (poslednje ažuriranje avgusta 2012.) je iskorišćen korišćenjem funkcije „Cluster“ koja je vratila originalnu ulaznu listu IS sa dodatnim poljima za napomene kao što je „CIS max order“ koji predstavlja maksimalan broj integracije sadržane u svakom CISi „Cluster ID“ koji predstavlja genomski prozor u kom su grupisani jedan ili više CIS intervala. Za gen-centričan postupaku korišćena je anotacija RefSeq gena (General Feature Format datoteka preuzeta sa UCSC Genome Browser, release hg19, NCBI Build 37), i izračunata je prosečna dužina transkripta za svaki simbol gena. Zatim je izvršen Grubsov test za vanredne vrednosti kako bi se uporedila učestalost integracije za svaki ciljani gen u odnosu na prosečnu frekvenciju za sve ciljane gene skupa podataka. Kako bismo uporedili IS distribucije dobijene iz ćelija transdukovanih u prisustvu DMSO u odnosu na one transdukovane u prisustvu CsA, izdvojili smo pokrivenost IS preko 5 Mb prozora koji klize 1 Mb preko celog genoma. Zatim smo izračunali promenu log2 preklopa za svaki prozor, upoređujući CsA sa DMSO.
Uređivanje gena ljudskih i mišjih ćelija
[0173] Šabloni LV donora za HDR generisani su korišćenjem konstrukata za samoinaktiviranje transfera treće generacije izvedenih od HIV. IDLV zalihe su pripremljene i titrirane kao što je prethodno opisano (Lombardo, A. et al. (2007) Nat Biotechnol 25: 1298-1306).Za eksperimente za uređivanje gena kod mišjeg HSPC , Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J miševi su ukršteni sa humanizovanim SCID-X1 C57B6 miševima, koji imaju umetak mutiranog ljudskog IL2RG na mestu mišjeg Il2rg gena (Schiroli, G. et al.
(2017) Sci Transl Med 9: 411). HSPC su prečišćeni od miševa-donora starih 8 nedelja Linselekcijom korišćenjem mišjeg Lineage Cell Depletion Kit (Miltenyi Biotec) prema uputstvima proizvođača. Lin-ćelije su kultivisane u koncentraciji od 10<6>ćelija/ml u StemSpan medijumu bez seruma (StemCell Technologies) koji sadrži penicilin, streptomicin, glutamin, 200 ng/ml B18R rekombinantnog proteina (eBiovision) i kombinaciju mišjih citokina (20 ng/ml IL-3, 10 mlF 100 ng/ml Flt-3L, 50 ng/ml TPO, sve od Peprotech). Lin-ćelije su prethodno stimulisane 2 sata, i zatim transdukovane sa IDLV koji sadrži šablon donora za korekciju IL2RG (plus kaseta za izveštavanje za praćenje uređenih ćelija) i izražavanje srodne gRNK za uređivanje IL2RG pod kontrolom konstitutivnog PollII promotera U6 (prepoznata genomska sekvenca: TTCCACAGAGTGGGTTAAAGcgg) (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). Posle 24 sata transdukcije na MOI 100 u prisustvu ili bez CsH, ćelije su isprane sa PBS, i zatim kultivisane in vitro dodatna 3 dana kako bi se kvantifikovao fragment uređenih ćelija pomoću protočne citometrije. Za eksperimente za uređivanje gena u ljudskom HSPC, 10<6>CD34<+>ćelija/ml su stimulisane u StemSpan medijumu bez seruma (StemCell Technologies) sa dodatkom penicilina, streptomicina, glutamina, 1 µM SR-1 (Biovision), 50 µM UM171 (STEMCell Technologies), 10 µM PGE2 dodatog samo na početku kultura (Cayman) i ljudskog citokina ranog delovanja (SCF 100 ng/ml, Flt3-L 100 ng/ml, TPO 20 ng/ml i IL-620 ng/ml; svi kupljeni od Peprotech) (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). Transdukcija sa IDLV je izvedena na MOI 100, u prisustvu ili bez CsH, nakon 2 dana prestimulacije. Šabloni IDLV donora sa homologijama za AAVS1 lokus (kodiranje za PGK.GFP reporter kasetu; (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240) ili ciljanje na intron 1 od IL2RG (kodiranje za IL2RG korektivnu cDNK; (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411) su korišćeni kako je naznačeno. Posle 24 sata od transdukcije, ćelije su isprane sa PBS i podvrgnute elektroporaciji (P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit, program EO-100; Lonza) sa 1,25 µM ribonukleoproteina (RNP). RNP su sastavljeni inkubacijom u 1:1,5 molarnom odnosu s.p.Cas9 proteina (Integrated DNK Technologies) sa sintetičkom cr:tracrRNK (Integrated DNK Technologies) tokom 10' na 25°C. Pojačivač elektroporacije (Integrated DNK Technologies) je dodat pre elektroporacije prema uputstvima proizvođača. Genomske sekvence koje prepoznaju gRNK su naredne:
TCACCAATCCTGTCCCTAGtgg za AAVS1 lokus i ACTGGCCATTACAATCATGTggg za intron 1 IL2RG. Efikasnost uređivanja gena je merena iz kultivisanih ćelija in vitro 3 dana nakon elektroporacije. Za AAVS1 uređene ćelije, uređivanje popravkom usmerenom na homologiju (HDR) je kvantifikovano protočnom citometrijom merenjem procenta ćelija koje eksprimiraju GFP marker. Za IL2RG uređene ćelije, HDR je kvantifikovan digitalnom PCR analizom u obliku kapljica, dizajniranjem prajmera i sonde na spoju između vektorske sekvence i ciljanog lokusa i na kontrolnim sekvencama korišćenim kao normalizator (ljudski TTC5 geni) kao što je prethodno opisano (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411).
Transplantacija ljudskog HSPC kod NSG miševa
[0174] NOD-SCID-IL2Rg-/- (NSG) miševi su kupljeni od Jackson laboratorije. Sve procedure na životinjama su sprovedene u skladu sa protokolima odobrenim od strane Animal Care and Use Committee of the Ospedale San Raffaele (IACUC 784) i saopšteni Ministarstvu zdravlja i lokalnim vlastima u skladu sa italijanskim zakonima. CD34+ ćelije izvedene iz ljudske koštane srži su prethodno stimulisane i transdukovane kao što je ranije opisano sa IDUA-LV pri MOI od 100 u prisustvu ili bez DMSO, CsA i/ili rapamicina kao što je naznačeno. Ljudske mPB CD34+ ćelije su prethodno stimulisane i transdukovane kao što je ranije opisano sa IDUA-LV pri MOI od 50 u prisustvu ili bez DMSO, CsH i/ili 16-16 dimetil prostaglandina E2 ili njihove kombinacije kako je naznačeno. Posle transdukcije 2-5 x 10<5>ćelije su infundirane u repnu venu subletalno ozračenih NSG miševa starih 8-10 nedelja (doza zračenja: 200 cGi za miševe težine 18-25 g i 220 cGi za miševe težine iznad 25 g).
Transdukovane i netransdukovane ćelije su takođe kultivisane in vitro tokom 14 dana za dalju analizu. In vitro kultivisane ćelije i BM ćelije izolovane od transplantiranih miševa u vreme žrtvovanja su zatim korišćene za kvantifikaciju VCN pomoću qPCR.
Test ćelija koje formiraju kolonije
[0175] Testovi ćelija koje formiraju kolonije su izvedene nanošenjem na ploče 8 x 10<2>ljudskih HSPC transdukovanih u prisustvu različitih jedinjenja u medijumu na bazi metilceluloze (Methocult GF4434; Stem Cell Technologies). Petnaest dana kasnije kolonije su ocenjene svetlosnom mikroskopijom za broj kolonija i morfologiju. CFU-E i BFU-E su ocenjeni kao eritroidne kolonije, dok su CFU-G, CFU-M i CFU-GM i CFU-GEMM ocenjene kao mijeloidne kolonije. Štaviše, pojedinačne kolonije su izvađene za molekularnu analizu.
4
Protočna citometrija
[0176] Sve citometrijske analize su obavljene korišćenjem FACSCanto III instrumenta i LSRFortessa instrumenata (BD Biosciences) i analizirane pomoćuFACS Express softvera (De Novo Software).
Transdukovane ćelije
[0177] Eksprimiranje GFP ili BFP u transdukovanim ćelijama mereno je 5-7 dana nakon transdukcije. Adherentni MDM je odvojen struganjem u 5 mM PBS-EDTA, ispran i resuspendovan u PBS koji sadrži 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Ćelije uzgajane u suspenziji su isprane i resuspendovane u PBS koji sadrži 2% FBS. Za merenje HSPC subpopulacijske sastavi ćelija su sakupljeni 16 ili 72 sata nakon transdukcije, inkubirane sa antitelima koja blokiraju anti-ljudske receptore 15 minuta na 4°C, i zatim obojene 20 minuta na 4°C sa anti-ljudskim CD34, CD38, CD45RA, CD90 ili sa anti-ljudskim CD34, CD133, CD90 antitelima (za antitela, pogledati Tabelu 3). Kako bi se isključile mrtve ćelije iz analize, dodato je 10 ng/ml 7-aminoaktinomicina D (7-AAD).
Ljudske kolonije
[0178] Ljudske diferencirane ćelije iz CFC su sakupljene sa jedne ploče (skup kolonija) i pomešane u jednu ćelijsku suspenziju. Ćelije su zatim isprane i resuspendovane u PBS koji sadrži 2% FBS. Za imunološko bojenje, ćelije su inkubirane sa antitelima koja blokiraju antiljudske receptore tokom 15 minuta na 4°C, i zatim su obojene 20 minuta na 4°C sa antiljudskim CD235a i CD33 antitelima (za antitela, pogledati Tabelu 3). Kako bi se isključile mrtve ćelije iz analize, ćelije su isprane i resuspendovane u PBS koji sadrži 10 ng/ml 7-aminoaktinomicina D (7-AAD).
Periferna krv od miševa
[0179] Za svakog miša, 250 µl periferne krvi je dodato u 15 µL PBS koji sadrži 45 mg/mL EDTA. Za imunobojenje poznata zapremina pune krvi (100 µl) je prvo inkubirana sa antitelima koja blokiraju FcγIII/II receptor (Cd16/Cd32) tokom 15 minuta na 4°C, a zatim inkubirana u prisustvu monoklonskih antitela (za antitela, pogledati Tabelu 3) tokom 20 min na 4°C. Eritrociti su uklonjeni lizom pomoću TQ-Prep radne stanice (Beckman-Coulter) u prisustvu jednake zapremine FBS (100 µl) kako bi se zaštitila bela krvna zrnca.
Koštana srž
[0180] BM ćelije su dobijene ispiranjem butne kosti u PBS 2% rastvoru FBS. Ćelije (1 x 10<6>ćelija) su isprane, resuspendovane u 100 µl PBS koji sadrži 2% FBS, i inkubirane sa antitelima koja blokiraju anti-ljudski receptor (Cd16/Cd32) tokom 15 minuta na 4°C. Zatim je izvršeno bojenje monoklonskim antitelima (za antitela, pogledati Tabelu 3) tokom 20 minuta na 4°C. Ćelije su isprane i konačno resuspendovane u PBS koji sadrži 2% FBS.
Slezina
[0181] Slezine su prvo razbijene i dobijena ćelijska suspenzija je propuštena kroz 40 µm najlonski filter i isprana u hladnom fosfatnom puferu (PBS) koji sadrži 2 mM EDTA i 0,5% goveđeg serumskog albumina (BSA). Ćelije su inkubirane sa antitelima koja blokiraju antiljudski receptor (Cd16/Cd32) tokom 15 minuta na 4°C, i zatim obojene anti-ljudskim monoklonskim antitelima (za antitela, pogledati Tabelu 3) tokom 20 minuta na 4°C. Ćelije su na kraju isprane i resuspendovane u PBS koji sadrži 2% FBS.
Ki67 i Hoechst protočna citometrija
[0182] Ćelije su isprane i fiksirane korišćenjem BD Cytofix pufera (kat. #554655), isprane i permeabilizovane sa BD Perm 2 (kat. br.347692), isprane i obojene PE-konjugovanim Ki67 antitelom (BD) i na kraju resuspendovane u BD Cytofix puferu sa Hoechst na 1 µg/mL. Ćelije su zatim analizirane na BD LSRII mašini sa UV laserom.
Test proliferacije ćelija
[0183] Ćelije su obojene sa Cell Proliferation Dye eFluor® 670 (Affimetrix, eBioscience) posle 24 sata pre-stimulacije citokinom i pre ćelijske transdukcije. Ova fluorescentna boja se vezuje za bilo koji ćelijski protein koji sadrži primarne amine, i kako se ćelije dele, boja se ravnomerno raspoređuje između ćerki ćelija što se može meriti kao uzastopno prepolovljenje intenziteta fluorescencije boje. U različitim vremenskim tačkama nakon transdukcije, ćelije su sakupljene i analizirane protočnom citometrijom. Boja za proliferaciju ćelija eFluor® 670 ima maksimalnu ekscitaciju od 647 nm i može biti pobuđena crvenom (633 nm) laserskom linijom. Ima vršnu emisiju od 670 nm i može se detektovati pomoću filtera raspona 660/20 (ekvivalentno APC, Alexa Fluor® 647 ili eFluor® 660).
ROS kvantifikacija
[0184] Ćelije su obojene sa CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific) koji se pasivno raspršuje u ćelije gde njegove acetatne grupe cepaju intracelularne esteraze, i njegova tiolreaktivna hlorometil grupa reaguje sa intracelularnim glutationom i drugim tiolima. Naknadna oksidacija daje fluorescentni adukt koji je zarobljen unutar ćelije i nadgledan pomoću protočnog citometra. N-acetil-L-cistein (NAC, iz SIGMA) i vodonik peroksid (H2O2, SIGMA) sa fluorescentnom sondom u koncentraciji od 1 mM i 10 mM, respektivno.
Ekstrahovanje RNK, qPCR i analiza eskprmiranja gena
[0185] Ekstrahovanje RNK iz ćelija izvedeno je korišćenjem RNeasy Plus mini kompleta (Qiagen). Ukratko, ćelije su lizirane u puferu RLT plus, dopunjenom beta-merkaptoetanolom. RNK je zatim ekstrahovana prema uputstvima proizvođača. Ekstrahovane mRNK su retrotranskribovane korišćenjem SuperScript Vilo kompleta(11754250; Invitrogen). Q-PCR analize su urađene korišćenjem TaqMan sondi iz Applied Biosystems (pogledati u nastavku). Q-PCR je vođen tokom 40 ciklusa koristeći Viia 7 instrument, dok je Viia 7 softver zatim korišćen za ekstrakciju neobrađenih podataka (Ct). Kako bi se odredilo eksprimiranje gena, razlika (ΔCt) između ciklusa praga (Ct) svakog gena i referentnog gena izračunata je primenom jednakog praga. Relativne kvantifikacione vrednosti su izračunate kao eksprimiranje stepena promene gena od interesa u odnosu na njegovo eksprimiranje u referentnom uzorku, po formuli 2-ΔΔCt. Eksprimiranje je normalizovano korišćenjem gena za održavanje HPRT1. Korišćene su naredne TaqMan sonde od Applied Biosystems: PPIA (Hs99999904_m1), PPIB (Hs00168719_m1), OAS1 (Hs00973637_m1), IRF7 (Hs01014809_g1), MX2 (Hs01550808_m1) i HPRT1 (Hs01003267_m1).
Replikacioni intermedijari
[0186] CD34+ ćelije izvedene iz CB transdukovane su pri MOI od 100, u prisustvu ili odsustvu CsA ili CsH. Za analizu intermedijara virusne replikacije, transdukovane ćelije su isprane i resuspendovane u Monini puferu za lizu (0,1% polioksietilen 10 lauril etar (Sigma), 0,1 mg/mL proteinaza K (Promega)) (25 µl/ 1 k 10<5>ćelija), inkubirane na 65°C tokom 2 sata i toplotom inaktivirane na 94°C tokom 15 minuta (Monini, P. et al. (1999) Blood 93: 4044-4058). Liza ćelija kako bi se dobili Late-RT i 2-LTR intermedijeri je izvedena 6 ili 24 sata nakon transdukcije, respektivno. Late-RT i 2LTR krugovi su mereni kvantitativnim digitalnim PCR testom (dd-PCR) sa prajmerima opisanim u nastavku i normalizovani korišćenjem ljudskog TERT gena.
[0187] Prajmeri za detektovanje Late-RT proizvoda su:
4
LATE RT fw (DU3 sens): 5'-TCACTCCCAACGAAGACAAGATC-3' (Matrai, J. et al.
(2011) Hepatology 53: 1696-1707)
LATE RT rv (5NC2 rev): 5'-GAGTCCTGCGTCGAGAGAG-3' (Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-267)
[0188] Prajmeri za detektovanje 2LTR proizvoda su:
2LTR fw (2junct): 5'-CAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAC-3'
2LTR rv (J2 rev): 5'-GCCGTGCGCGCTTCAGCAAGC-3'
[0189] Prajmeri za detektovanje TELO su:
hTelo fw: 5'-GGCACACGTGGCTTTTCG-3' (Follenzi, A. et al. (2002) Methods Enzymol 346: 454-465)
hTelo rev: 5'-GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3'
Ekstrakcija genomske DNK i qPCR
[0190] DNK iz ćelijskih kultura i krvi ekstrahovana je korišćenjem Maxwell 16 instrumenta (Promega) ili DNK mikro kompleta za krv i ćelijske kulture (Qiagen). Kopije vektora po diploidnom genomu (broj kopije vektora, VCN) integrisanih lentivirusnih vektora su kvantifikovane kvantitativnim digitalnim PCR (dd-PCR) korišćenjem narednih prajmera (HIV sens: 5'-TACTGACGCTCTCGCACC-3'; HIV antisens: 5'-TCTCGACGCAGGACTCG-3') i sonda (FAM 5'-ATCTCTCTCCTTCTAGCCTC-3') protiv regiona mesta vezivanja prajmera od LV. VCN kvantifikacija ukupne lentivirusne DNK (integrisane i neintegrisane) je izvedena kao što je prethodno opisano (Matrai, J. et al. (2011) Hepatology 53: 1696-1707) tri dana nakon transdukcije. Broj kopija reverzno transkribovanog retrovirusnog vektorskog genoma (i integrisanog i neintegrisanog) izveden je kvantitativnim digitalnim PCR(dd-PCR) koji ga je razlikovao od plazmida prenetog iz prolazne transfekcije korišćenjem narednih prajmera: RT-RV; ΔU3 sens: 5'-CGAGCTCAATAAAAGAGCCCAC-3', PBS antisens: 5'-GAGTCCTGCGTCGGAGAGAG-3'. Broj kopija vektora i intermedijeri replikacije su normalizovani na sadržaj genomske DNK, koji je procenjen korišćenjem ljudskog TERT gena. VCN analiza pomoću dd-PCR uključivala je kvantifikaciju ciljanih i referentnih lokusa korišćenjem dupleksnih ciljanih i referentnih testova. UQuantaSoft™ softveru , broj kopija je određen izračunavanjem odnosa koncentracije ciljanog molekula i referentne koncentracije molekula, pomnoženog sa brojem kopija referentnih vrsta u genomu (obično 2).
Tabela 1. PCR reakcije za dd-PCR.
Western Blot
[0191] Ekstrakti celih ćelija pripremljeni su od HSPC kao što je prethodno opisano (Kajaste-Rudnitski, A. et al. (2011) J Virol 85: 5183-5196; Kajaste-Rudnitski, A. et al. (2006) J Biol Chem 281: 4624-4637). Uzorci su podvrgnuti SDS-PAGE, preneti na PVDF membranu elektroblotiranjem i blotirani mišjim poliklonskim antitelom (Ab) podignutim protiv CypA (Santa-Cruz Biotechnology). Anti-aktin Ab (Sigma-Aldrich) je korišćen kao normalizator.
Statistička analiza
[0192] U svim studijama, vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM). Statističke analize su obavljene neupaernim Studentovim t testom ili pomoću ANOVA za višestruka poređenja, kao što je naznačeno. Procenti su konvertovani u Log ODD za statističku analizu. Razlike su smatrane statistički značajnim na p<0,05.
Tabela 2. Fenotipovi prijavljeni za CA mutante testirane u ovoj studiji.
Tabela 2. Fenotipovi prijavljeni za CA mutante testirane u ovoj studiji.
4
Tabela 3. Spisak anti-ljudskih antitela korišćenih za protočnu citometriju.
4
Rezultati
Skraćeni protokoli zasnovani na CsA i rapamicinu bezbedno postižu sličnu efikasnost transfera gena kao trenutni klinički standard i poboljšavaju HSPC presađivanje [0193] Ljudske CD34+ ćelije izvedene iz BM transdukovane su jednim pogotkom LV kliničkog kvaliteta koji eksprimira IDUA ili ARSA sa ili bez ovih jedinjenja. Kao kontrola, ćelije su transdukovane trenutnim standardnim protokolom kliničke transdukcije, koji se sastoji od dva pogotka transdukcije (TD) pri MOI od 100 vektora (Slika 1A). CsA i rapamicin su bili u stanju da povećaju efikasnost transdukcije i IDUA kliničkog stepena i ARSA-LV u poređenju sa kontrolom sa jednim pogotkom bez lekova, dostižući VCN uporediv sa zlatnim standardom sa dva pogotka in vitro (Slika 1B-C). Štaviše, nisu primećene nikakve promene u kapacitetu za formiranje kolonija (Slika 1D).
[0194] FACS analiza periferne krvi (PB) NSG miševa transplantiranih sa HSPC transdukovanim jednim pogotkom pokazala je bolje presađivanje ljudskih CD45+ ćelija u poređenju sa kliničkim protokolom, posebno sa CsA, do 16 nedelja nakon transplantacije (Slika 2A). Štaviše, nisu primećene nikakve promene u različitim izlaznim linijama (Slika 2B). Oba protokola su omogućila poboljšanu transdukciju dugotrajnih repopulacijskih HSPC in vivo pošto je VCN/ljudski genom uporediv sa zlatnim standardom od dva pogotka postignut u BM i u slezini miševa 22 nedelje nakon transplantacije (Slika 2C). Kraći period ex vivo kulture sam po sebi je poboljšao HSPC presađivanje takođe u BM i u slezini miševa za sve kraće protokole (Slika 2D).
[0195] Za rapamicin je ranije pokazano da ne utiče na profil mesta integracije LV u ljudskim HSPC (Wang, C.X. et al. (2014). Rapamycin relieves lentiviral vector transduction resistance in human and mouse hematopoietic stem cells. Blood). Ovde smo procenili bezbednosni profil protokola za prenos gena zasnovanog na CsA u smislu profilisanja mesta integracije LV. Iako je više integracionih mesta sistematski pronađeno u prisustvu CsA, u skladu sa njegovom sposobnošću da poveća vektorske kopije po ćeliji, nismo otkrili nikakve značajne razlike između distribucije integracionih mesta preuzetih iz HSPC transdukovanih u odsustvu prisustva CsA i u poređenju sa brojnim studijama IS dobijenim iz nedavnih ispitivanja genske terapije (Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158) (Slika 9).
4
CsA čuva primitivne HSC ex vivo nezavisno od transdukcije
[0196] Kako bismo istražili razloge većeg presađivanja ljudskih ćelija uočenih za stanje CsA, procenili smo uticaj CsA na sastav matičnih ćelija in vitro. Ljudske CD34+ ćelije izvedene iz BM transdukovane su sa SINLV-GFP pri MOI od 10, u prisustvu ili odsustvu CsA. Procenat primitivnih matičnih i progenitornih ćelija je procenjen pomoću FACS 16 sati nakon TD (Slika 3A). Izloženost CsA in vitro povećava procenat primitivnijeg stabla i multipotentnih progenitora dok smanjuje onih koji su više posvećeni. Treba napomenuti da tokom vremena nisu primećene promene u mijeloidnoj diferencijaciji u kulturi. Procenat primitivnih matičnih i progenitornih ćelija je procenjen pomoću FACS 72 sata nakon TD (Slika 3B). Izlaganje CsA in vitro i dalje je povećalo procenat primitivnijeg stabla i multipotentnih progenitora 3 dana nakon TD.
[0197] Kako bi se istražilo da li sporije stope proliferacije mogu da objasne očuvanje primitivnijih ćelija u prisustvu CsA, ljudske CD34+ ćelije izvedene iz BM obojene su crvenom fluorescentnom bojom koja se može koristiti za praćenje pojedinačnih ćelijskih deoba. Nakon ovog bojenja, ćelije su transdukovane sa ili bez CsA i analizirane pomoću FACS u različito vreme nakon TD kako bi se pratile stope proliferacije ćelija (Slika 4A). CsA značajno smanjuje proliferaciju ćelija in vitro (Slika 4B). Nivoi boje za proliferaciju ćelija unutar različitih HSPC subpopulacija su procenjeni pomoću FACS 16 i 72 sata nakon transdukcije (Slika 4C-D). CsA je doveo do jednakog smanjenja proliferacije ćelija u svim HSPC subpopulacijama u rasponu od predanijih progenitora do najprimitivnijih ćelija.
[0198] Primitivne HSC karakteriše mirniji status ćelijskog ciklusa. Istražili smo da li je CsA-posredovano povećanje HSC povezano sa većim fragmentom ćelija u G0fazi ćelijskog ciklusa. Koristili smo kombinatornu strategiju bojenja zasnovanu na FACS koja nam omogućava da razlikujemo ćelije u G0, G1, S i G2-M fazama ćelijskog ciklusa. Tretman CsA značajno je povećao udeo ćelija uhvaćenih u mirnoj G0fazi ciklusa (Slika 4D). Kako oksidativni stres igra kritičnu ulogu u biologiji HSPC, i predloženo je da CsA utiče na redoks ravnotežu u HSPC (Mantel, C.R. et al. (2015) Cell 161: 1553-1565), takođe smo procenili efekte CsA na nivoe ROS u ljudskim HSPC izvedenim iz BM. U našem eksperimentalnom okruženju CsA nije doveo do bilo kakvih promena u nivoima ROS merenih in vitro (Slika 4E). Uzeto zajedno, smanjenje proliferacije HSPC posredovano CsA i održavanje mirovanja bi potencijalno moglo da doprinese očuvanju njihovih svojstava matičnih ćelija i da dovede
4
do većeg presađivanja in vivo.
CypA-nezavisni ciklosporin otkriva rani blok LV transdukcije u HSPC
[0199] Kako bismo se direktno pozabavili ulogom CypA tokom LV transdukcije i efekata posredovanih CsA u ljudskim HSPC, oborili (KD) smo ovaj kofaktor domaćina u CD34+ ćelijama izvedenim iz CB koristeći shRNK (Slika 5A-B) i procenili njegov uticaj na transdukciju. U saglasnosti sa pozitivnom ulogom CypA tokom LV transdukcije (Towers, G.J. et al. (2014) Cell Host Microbe 16: 10-18), KD CypA doveo je do niže transdukcije u ljudskom HSPC (Slika 5C). Ovi rezultati impliciraju da je kapacitet CsA da poveća LV transdukciju u HSPC verovatno suboptimalan s obzirom na to da će takođe ometati ovu pozitivnu vektorsku interakciju sa CypA.
[0200] Zatim smo testirali prirodnu izoformu CsA, ciklosporin H (CsH), koja se ne vezuje za CypA i nije imunosupresivna (Jeffery, J.R. (1991) Clin Biochem 24: 15-21). Zanimljivo je da je CsH povećao LV transdukciju u ljudskim i mišjim HSPC, uključujući klinički relevantne HSPC izvedene iz mPB, značajno efikasnije od CsA (Slika 5D-F; Slika 6M, N). Važno je da se ovo povećanje transdukcije dogodilo u odsustvu bilo kakvih znakova toksičnosti in vitro (Slika 5G). Za razliku od CsA, i u skladu sa neimunosupresivnom karakteristikom CsH, u ovom slučaju nije primećeno kašnjenje u proliferaciji (Slika 5H). Zanimljivo je da je CsH bio aditiv sa druga dva jedinjenja rapamicina sa ranim dejstvom (Rapa) (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362; Wang, C.X. et al. (2014). Rapamycin relieves lentiviral vector transduction resistance in human and mouse hematopoietic stem cells. Blood) i prostaglandinom E2 (PGE2; Zonari, E. et al. (2017). Efficient Ex Vivo Engineering and Expansion of Highly Purified Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Populations for Gene Therapy. Stem Cell Reports), ali ne i sa CsA (Slika 5I -J), što sugeriše da oba ciklosporina deluju na isti lentivirusni restrikcioni blok koji se međutim razlikuje od ranih događaja na koje ciljaju Rapa i PGE2, respektivno. Važno je da je CsH značajno povećao efikasnost transdukcije u svim CD34+ subpopulacijama, uključujući i primitivniji CD34+CD133+CD90+ fragment (Slika 5K), i u SCID repopulišućim CD34+ ćelijama izvedenim iz mPB koje su transdukovane sa LV kliničkog kvaliteta (Slike 5L-M, 10 i 11) bez promene sastava subpopulacije i statusa ćelijskog ciklusa (Slika 5N). Važno je napomenuti da je CsH efikasno poboljšao i gamaretrovirusnu transdukciju u HSPC (Slika 5O), što sugeriše da bi to moglo biti korisno i za strategije genske terapije zasnovane na yRV (Ferrua, F. et al. (2017) Hum Gene Ther 28: 972-981).
4
[0201] Takođe smo testirali uticaj CsH na LV transdukciju u drugim tipovima ćelija. CsH nije promenio transdukciju u primarnim ljudskim makrofagima izvedenim iz monocita (MDM) (Slika 6A), nezavisno od ograničenja SAMHD1-posredovanog LV koje se može ublažiti prethodnim izlaganjem ćelija SIV dodatnom proteinu Vpk (Berger, G. et al. (2011) Nat Protoc 6: 806-816). Nasuprot tome, videli smo blagi porast procenta GFP+ ćelija u kontekstu aktiviranih CD4+ T ćelija (Slika 6B). Ovi podaci su u oštroj suprotnosti sa onim što smo mi i drugi primetili za CsA u ovim ćelijskim odeljcima, dodatno naglašavajući kako efekti CsA povezani sa CypA verovatno maskiraju druge potencijalne prednosti pre integracije, koje može imati na LV transdukciju. Zaista, CypA nezavisan P90A LV kapsid mutant je imao koristi od CsA u sličnoj ili čak većoj meri u poređenju sa CsH (Slika 6C). Nivoi transdukcije CPSF6 nezavisnog N74D kapsidnog mutanta LV su se povećali u prisustvu CsH (Slika 6D) isključujući ovu interakciju kapsid-domaćin iz mehanizma delovanja CsH. Treba napomenuti da vektori virusa majmunske imunodeficijencije (SIV) i vektori izvedeni iz yRV, koji nemaju interakciju sa CypA (Fujita, M. et al. (2001) J Virol 75: 10527-10531; Sokolskaja, E. et al. (2006) Curr Opin Microbiol 9: 404-408), imaju korist od CsH, ali i CsA (Slika 6E), dodatno potvrđujući CypA-nezavisno olakšanje restrikcije LV od strane oba ciklosporina. U saglasnosti, i za razliku od CsA, CsH je bio u mogućnosti da poveća LV transdukciju i kod nestimulisanih HSPC (Slika 6G), kao i korišćenjem LV sa defektnom integrazom (IDLV) (Slika 6H), verovatno zbog održavanja korisne interakcije vektora sa CypA u ovim eksperimentalnim postavkama. U skladu sa ranijim efektom pre integracije, CsH je doveo do značajnog povećanja i late-RT i 2LTR intermedijara replikacije kruga na koje CsA nije uticao (Slika 6I), kao što smo takođe ranije izvestili (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362).
[0202] Svi vektori korišćeni u ovom radu do sada su pseudotipizovani sa VSV-g glikoproteinom omotača, koji se najčešće koristi u kontekstu genske terapije LV (Cronin, J. et al. (2005) Curr Gene Ther 5: 387-398). Pokazalo se da rapamicin olakšava VSV-g posredovanu pH-zavisnu endocitozu LV (Wang, C.X. et al. (2014). Rapamycin relieves lentiviral vector transduction resistance in human and mouse hematopoietic stem cells.
Blood). Kako bismo procenili da li bi VSV-g posredovan ulazak LV čestice mogao biti uključen u povećanje CsH-izazvano transdukcije, generisali smo LV pseudotipizovan sa modifikovanim babunskim endogenim retrovirusnim glikoproteinom omotača (BaEV-TR) koji ulazi direktno fuzijom posredovanom receptorom. na plazma membrani i ranije je opisano da efikasno transdukuje nekoliko primarnih ljudskih ćelija hematopoeze, uključujući HSPC (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221-1231). Zanimljivo je da se nije mogla otkriti jasna korist za BaEV-TR pseudotipovanu LV transdukciju u HSPC izvedenom iz CB i mPB u prisustvu CsH, dok je CsA zapravo narušio transdukciju u ovom okruženju (Slika 6J-K). Oba ciklosporina nisu uspela da poboljšaju transdukciju adeno-povezanog vektora povez (AAV) (Slika 6L) bez obzira na njegov ulazak u ciljane ćelije posredovan endocitozom (Nonnenmacher, M. et al. (2012) Gene Ther 19: 649-658).
CsH povećava LV transdukciju i efikasnost uređivanja gena u SCID-repopulišućim HSPC [0203] Kako bismo procenili transdukciju pojačanu CsH u klinički relevantnijem okruženju, transdukovali smo ljudske mPB-CD34<+>ćelije sa LV kliničkog kvaliteta koje eksprimiraju alfa-L-iduronidaza (IDUA) transgen (IDUA-LV), dizajnirane za tretman pacijenata pogođenih mukopolisaharidozama tipa I (MPS-I) (Visigalli, I. et al. (2016) Hum Gene Ther 27: 813-829; Visigalli, I. et al. (2010) Blood 116: 5130-5139). Transplantirali smo ćelije transdukovane u prisustvu/odsustvu CsH, PGE-2 ili njihove kombinacije u ksenograft NSG mišji model ljudske hematopoeze kako bismo pratili efikasnost presađivanja i transdukcije in vivo (Slika 10A). Za poređenje, ćelije su transdukovane dva puta, kako je diktirao trenutni standardni protokol. Nisu uočene razlike u kapacitetu za formiranje kolonija između kontrolnih i ćelija tretiranih sa CsH/PGE-2 (Slika 10B). Zanimljivo je da je jedna pojedinačna doza LV u prisustvu CsH bila dovoljna da se dobije značajno veće obeležavanje gena in vitro (Slika 11A, B), kao i za dugotrajnu repopulaciju HSC i dobijanje potomstva in vivo (Slika 10C; Slika 11C, D). Ovo je nadmašilo trenutni standard koji se sastoji od dva kruga transdukcije i postiglo skoro 10 puta povećanje dugotrajnog obeležavanja gena in vivo u poređenju sa kontrolnom grupom sa jednom transdukcijom. Iako su CsH i PGE-2 bili aditivi in vitro takođe u ovom okruženju (Slika 11A, B), kao i tokom rane faze presađivanja in vivo (Slika 11C), iznenađujuće je kombinatorna korist izgubljena u dugotrajnoj repopulaciji HSC u koštanu srž i potomstvo u slezini miševa (Slika 10C; Slika 11D). Izloženost CsH nije promenila kratkoročni kapacitet presađivanja HSPC u poređenju sa protokolom sa dva pogotka, dok su miševi transplantirani sa kontrolnim transdukovanim ćelijama sa jednim pogotkom pokazali veće presađivanje ljudskog CD45<+>ćelije u poređenju sa protokolom sa dva pogotka rano nakon 8 nedelja od transplantacije (Slika 10D), u skladu sa idejom da kraća ex vivo kultura čuva kapacitet repopulacije HSPC (Zonari, E. et al. (2017) Stem Cell Reports 8: 977-990). Nedostatak takve koristi u kontekstu ćelija tretiranih sa CsH mogao bi biti povezan sa poboljšanom transdukcijom, jer smo nedavno pokazali da prenos lentivirusnih gena utiče na ex vivo oporavak HSPC i njihovo kratkoročno in vivo usađivanje na način koji zavisi od doze
1
zbog vektorom posredovanog pokretanja p53 signalne kaskade (Piras, F. et al. (2017) EMBO Mol Med 9: 1198-1211). U skladu sa tim, izlaganje mPB-CD34<+>ćelija samo na CsH nije uticalo na rano presađivanje HSPC u poređenju sa kontrolnim ćelijama (Slika 10E). Važno je da je veće presađivanje povezano sa kraćom ex vivo kulturom otkriveno dugoročno u BM i u slezini miševa takođe za ćelije transdukovane u prisustvu CsH (Slika 10F; Slika 11E, F).
[0204] Suboptimalna dostupnost šablona DNK donora može doprineti slaboj efikasnosti uređivanja gena homolognom rekombinacijom u ljudskim HSPC (Naldini, L. (2011) Nat Rev Genet 12: 301-315). IDLV i AAV su trenutno najčešće korišćene vektorske platforme za isporuku DNK donora u protokolima za uređivanje gena (Naldini, L. (2015) Nature 526: 351-360). Kako je CsH poboljšao IDLV transdukciju u ljudskim HSPC, testirali smo njegov efekat na efikasnost IDLV posredovanog uređivanja HSPC gena (Slika 10G). Zanimljivo je da je isporuka IDLV donora u prisustvu CsH povećala efikasnost uređivanja gena u ljudskom HSPC za dva puta (Slika 10H) bez promene relativnog sastava hematopoetskih subpopulacija tri dana nakon tretmana (Slika 11G). Ovo povećanje se takođe dogodilo kod primitivnog CD34<+>CD133<+>CD90<+>fragmenta (Slika 10H), što sugeriše da CsH favorizuje uređivanje u dugoročno repopulišućem fragmentu HSPC. Zaista, ćelije uređene u prisustvu CsH efikasno su repopulisale NSG miševe i značajno veća efikasnost ciljanja održavana je dugoročno u perifernoj krvi, kao i u koštanoj srži miševa (Slika 10I-K). Važno je da je povećanje efikasnosti ciljanja gena potvrđeno kod svih potomaka dobijenih od HSPC u koštanoj srži (Slika 11H, I). Uzeti zajedno, ovi rezultati identifikuju CsH kao najbolji pojačivač HSPC prenosa i uređivanja gena opisanog do sada i snažno podržavaju njegovu upotrebu u terapijskom HSPC genskom inženjeringu.
Ciklosporini se suprotstavljaju IFN-inducibilnom bloku za ulazak lentivirusnog vektora zavisnog od VSV-g
[0205] Kako bismo stekli mehanistički uvid u to kako CsH poboljšava transfer i uređivanje gena u HSPC, iskoristili smo zapažanje da je za CsA prijavljeno da poboljšava transdukciju u ljudskim IFNα-stimulisanim monocitnim THP-1 ćelijama (Bulli, L. et al. (2016) J Virol 90: 7469-7480). Prvo smo potvrdili da CsA delimično spasava IFNα-indukovanu inhibiciju VSV-g pseudotipizovane LV transdukcije u THP-1 ćelijama (Slika 7A). Za poređenje, CsH je potpuno spasio inhibiciju IFNα (Slika 7A), što sugeriše da je CsH snažniji u ublažavanju antivirusnog bloka posredovanog sa tipom I IFN. Dalje, spasavanje infekcije je nezavisno od imunosupresivnog efekta CsA posredovanog inhibicijom kalcineurina (Petrillo, C. et al.
2
(2015) Mol Ther 23: 352-362). Najbolje okarakterisana meta domaćina CsH je receptor formil peptida 1 (FPR1) uključen u migraciju neutrofila i antimikrobnu odbranu (de Paulis, A. et al. (1996) J Allergy Clin Immunol 98: 152-164; Prevete, N. et al. (2015) Pharmacol Res 102: 184-191). Međutim, FPR1 nije uključen u IFNα-posredovanu restrikciju koju inhibiraju ciklosporini, pošto je IFN nastavio da potiskuje transdukciju u THP-1 ćelijama osiromašenim za FPR1 (Slika 12A). Zanimljivo je da je ovo ponašanje bilo specifično za ćelijsku liniju THP-1, pošto ni tretman IFNα ni ciklosporinom nisu uticali na LV transdukciju u ćelijskoj liniji hronične mijelone leukemije K562 (Slika 7B), uprkos tome što obe ćelije reaguju na IFNα slično, što je dokazano povećanjem regulacije na gore gena stimulisanih tipom I IFN (ISG) (Slika 12B, C). Ovo sugeriše da su ISG i/ili kofaktori specifični za ćelijski tip uključeni u transdukciju osetljivu na ciklosporin u THP-1 i HSPC. Oba ciklosporina su takođe spasila LV transdukciju kod ljudskog HSPC prethodno tretiranog IFNα, gde je CsH ponovo imao snažniji efekat u poređenju sa CsA (Slika 7C; Slika 12D).
[0206] Vektori pseudotipizovani sa glikoproteinom amfotropnog omotača dobijenog od MLV ostali su neosetljivi na inhibiciju posredovanu sa tipom I IFN (Slika 7D), pokazujući da na restrikcionu osetljivost utiče virusni omotač. U skladu sa mehanizmom delovanja koji zavisi od omotača, LV je pseudotipizovan sa modifikovanim babunskim endogenim retrovirusnim glikoproteinom omotača (BaEV-TR), koji ulazi putem fuzije posredovane receptorima direktno na plazma membranu (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221-1231), ostao je neosetljiv i na tip I IFN i na ciklosporine u THP-1 ćelijama (Slika 7E). Važno je da transdukcija BaEV-TR pseudotipovanog LV nije poboljšana tretmanom ciklosporinom u HSPC i bila je manje osetljiva na IFNα (Slika 7F). Uzeti zajedno, ovi rezultati su u skladu sa IFN-indukovanim blokom tipa I za VSV-g-posredovani ulazak LV u ćelije THP-1 koji je takođe aktivan i osetljiv na ciklosporine u netretiranim HSPC.
CsH povećava efikasnost uređivanja gena u ljudskim i mišjim HSPC, kao i u primarnim ljudskim T ćelijama
[0207] Jedna od prepreka efikasnom uređivanju gena u ljudskim HSPC može biti neoptimalna dostupnost šablona DNK donora (Naldini, L. (2011) Nat Rev Genet 12: 301-315). IDLV i Adeno-povezani vektori (AAV) su trenutno najčešće korišćene vektorske platforme za donorske DNK transportere u protokolima za uređivanje gena (Naldini, L. (2015) Nature 526: 351-360). S obzirom na kapacitet CsH da poveća i efikasnost IDLV transdukcije u ljudskim i mišjim HSPC, testirali smo njegove efekte u kontekstu pristupa uređivanju HSPC gena.
Zanimljivo je da je isporuka IDLV donora u prisustvu CsH povećala efikasnost ciljanja gena za dva puta i kod mišjih i kod ljudi HSPC (Slika 8A-B). Ovo povećanje se dogodilo u svim subpopulacijama, uključujući i primitivniji CD34+CD133+CD90+ fragment, što sugeriše da bi CsH mogao favorizovati uređivanje takođe u dugoročno repopulišućem HSPC fragmentu, za koji se navodi da je najotporniji na homolognom rekombinacijom (HR) posredovano ciljanje gena (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240). Nisu primećene značajne promene u relativnom sastavu hematopoetskih subpopulacija 3 dana nakon tretmana, što sugeriše da uključivanje CsH tokom postupka uređivanja gena nije negativno uticalo na preživljavanje i rast primitivnijih ćelija (Slika 8B, desni panel). Štaviše, upotreba CsH tokom HSPC uređivanja gena može omogućiti postizanje nivoa uređivanja gena uporedivih sa trenutnim standardnim protokolom sa manje IDLV. Treba napomenuti da bi CsH mogao poboljšati efikasnost ciljanja gena u ljudskim primarnim CD3+ T ćelijama, čak i kada je količina donora IDLV smanjena.
Diskusija
[0208] Poboljšanje permisivnosti HSPC za LV transdukciju ostaje kritično za široku primenu genske terapije kao opcije tretmana za nekoliko naslednih bolesti. Naši napori da poboljšamo efikasnost LV transdukcije kod ljudskih HSPC doveli su do identifikacije ciklosporina A (CsA) kao snažnog pojačivača transdukcije u ovom okruženju (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362). Ovde smo pokazali njegovu efikasnost i bezbednost u uslovima kliničke kulture korišćenjem HSPC izvedenih iz koštane srži (BM) i LV kliničkog kvaliteta i identifikovali smo ciklosporin H (CsH) kao još snažniji pojačivač LV transdukcije, na osnovu molekularne karakterizacije mehanizma kojim ova jedinjenja poboljšavaju LV transdukciju u ljudskim HSPC.
[0209] Ovde pokazujemo da CsA ne samo da bezbedno poboljšava LV transdukciju, već takođe omogućava bolje usađivanje ljudskih HSPC izvedenih iz BM u modelu NSG ksenografta rekonstitucije ljudske hematopoeze. Ova korist je verovatno povezana sa njegovom sposobnošću da smanji proliferaciju HSPC i bolje sačuva primitivnije ćelije u kulturi, pošto se pokazalo da i mirovanje i kraća ex vivo kultura poboljšavaju usađivanje HSPC u drugim okruženjima (Glimm, H. et al. (2000) Blood 96: 4185-4193; Kallinikou, K. et al. (2012) Br J Haematol 158: 778-787; Larochelle, A. et al. (2012) Blood 119: 1848-1855). Takođe se pokazalo da CsA poboljšava presađivanje CD34+ ćelija izvedenih iz Lin i ljudskog CB kroz svoj kapacitet da ublaži oksidativni stres zavisan od ciklofilina D (Mantel, C.R. et al.
4
(2015) Cell 161: 1553-1565). Nismo primetili slične prednosti u našim prethodnim studijama koje su koristile HSPC izvedene iz CB (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362), potencijalno zbog činjenice da nismo izolovali i kultivisali ćelije u strogom prisustvu CsA kao što su to izveli Mantel et al. Mirnije CD34+ ćelije izvedene iz BM mogu biti manje osetljive na oksidativni stres okoline, što odražava prednosti CsA i nakon kraćeg izlaganja samo tokom ex vivo procesa transdukcije. Ipak, dodatni mehanizmi bi takođe mogli biti uključeni u ovu kraću postavku izloženosti jer nismo mogli da otkrijemo bilo kakav jasan uticaj CsA na nivoe ROS u HSPC izvedenim iz BM.
[0210] Zbog zabrinutosti za toksičnost u vezi sa imunosupresivnom funkcijom CsA, razvijeni su i testirani brojni neimunosupresivni derivati ciklosporina za nekoliko primena (Peel, M. et al. (2013) Bioorg Med Chem Lett 23: 4485-4492). Ipak, većina njih još uvek vezuje i faktor domaćina CypA, za koji smo ovde pokazali da je važan za efikasnu transdukciju i u HSPC. U skladu sa idejom da bi neimunosupresivni i CypA nezavisan ciklosporin bio optimalan, identifikovali smo CsH, prirodnu izoformu CsA (Jeffery, J.R. (1991) Clin Biochem 24: 15-21), kao još snažniji i manje toksični pojačivač LV transdukcije u poređenju sa CsA. CsH je, prema našem saznanju, najefikasniji pojačivač transfera HSPC gena koji je do sada opisan, o čemu svedoči naše zapažanje da jedan krug transdukcije u prisustvu CsH nadmašuje čak i standardni protokol sa dvostrukim udarcem u smislu efikasnosti transdukcije bez promene usađivanja dugoročnog repopulisanja HSPC. Dalja optimizacija za smanjenje vektorske doze kada se koristi CsH bi trebalo da omogući visoko obeležavanje gena, kao i poboljšano HSPC presađivanje. Ovo će biti posebno relevantno u okruženjima genske terapije u kojima su potrebni visoki nivoi obeležavanja gena, ali ih je teško postići, kao što su hemoglobinopatije, gde velika i složena kaseta za eksprimiranje gena za ljudski β-globin ograničava proizvodnju LV na kliničkom nivou. Karakterizacija efekata posredovanih CsH pružila nam je mnogo bolje razumevanje LV restrikcijskih blokova koji se javljaju u ljudskim HSPC, ali potencijalno i šire u drugim ljudskim ćelijama hematopoeze nakon pokretanja antivirusnog odgovora. CsH je delio nekoliko karakteristika sa CsA, uključujući nezavisnost od kapsida, ali je takođe predstavio neke značajne razlike. Konkretno, LV defektni integrazom (IDLV) imao je koristi od CsH u CD34+ HSPC, i CsH je bio u stanju da poveća transdukciju LV takođe u mirnim HSPC, kao i u primarnim ljudskim T ćelijama, u oštroj suprotnosti sa onim što smo ranije primetili za CsA (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362). Ove razlike su vrlo verovatno povezane sa negativnim uticajem CsA na vektor-CypA interakciju koja je očuvana kada se koristi CsH. CypA je faktor domaćina koji koristi HIV-1 tokom koraka uklanjanja omotača virusa, jezgarnog uvoza i možda čak integracije kroz interakciju sa virusnim kapsidom (CA) (Towers, G.J. et al. (2014) Cell Host Microbe 16: 10-18). U kontekstu HIV-1 istraživanja, poznato je da CsA negativno utiče na lentivirusnu infekciju jer remeti interakciju između CypA i virusnog kapsida (Sokolskaja, E. et al. (2006) Curr Opin Microbiol 9: 404-408; Towers, G.J. et al. (2014) Cell Host Microbe 16: 10-18). Na ovim pretpostavkama, pozitivan efekat koji CsA ima na LV transdukciju u ljudskim HSPC je verovatno uravnotežen njegovim negativnim smetnjama na CypA-CA osi. U skladu sa ovom hipotezom, CypA nezavisni LV su takođe pokazali ranu korist u prisustvu CsA u HSPC (Petrillo, C. et al.
(2015) Mol Ther 23: 352-362).
[0211] Nedavno je objavljen kapacitet CsA da prevaziđe IFN-indukovano antivirusno stanje u THP-1 (Bulli, L. et al. (2016) J Virol 90: 7469-7480), ali molekularni mehanizam je ostao neuhvatljiv. Ovde pokazujemo da CsA, i tačnije CsH, prevazilaze restrikciju LV izazvanu tipom I IFN takođe u kontekstu ljudskih HSPC. Kapacitet ciklosporina da prevaziđu restrikciju LV i u stabilnom stanju kao i nakon stimulacije tipom I IFN izgleda zavisi od tipa glikoproteina omotača koji se koristi za pseudotipizaciju vektora. Dok je VSV-g pseudotipni LV imao koristi od ciklosporina, pseudotipizacija LV sa modifikovanim glikoproteinom omotača iz babunskog endogenog retrovirusa (BaEVTR) učinila je vektor neosetljivim na korisne efekte i CsA i CsH. Zanimljivo je da je sugerisano da pseudotipizacija LV sa glikoproteinom omotača BaEVTR značajno poboljšava efikasnost LV transdukcije u ljudskim CD34+ ćelijama u poređenju sa VSV-g pseudotipizovanim vektorima, uključujući i nestimulisane HSPC (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221-1231). Na osnovu ovde predstavljenih rezultata i imajući u vidu pozitivan uticaj CsH na LV transdukciju takođe kod nestimulisanih HSPC, ova razlika se takođe može objasniti, barem delimično, osetljivošću VSV-g pseudotipa LV na restrikcioni blok osetljiv na ciklosporin u ljudskim HSPC.
[0212] Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da ciklosporini deluju i u ranoj fazi životnog ciklusa LV kao i na nivou integracije vektora i da su rani efekti CsA verovatno maskirani njegovim kapacitetom da poremeti korisnu interakciju LV kapsid-CypA koja je sačuvana kada se umesto toga koristi CsH. Učešće endocitnog puta ostaje nejasno pošto su oba ciklosporina aditivna sa još dva jedinjenja sa ranim dejstvom, rapamicinom i PGE2, za koje se sugeriše da deluju na nivou ulaska posredovanog sa VSV-g ((Wang, C.X. et al. (2014).
Rapamycin relieves lentiviral vector transduction resistance in human and mouse hematopoietic stem cells. Blood; Zonari, E. et al. (2017). Efficient Ex Vivo Engineering and Expansion of Highly Purified Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Populations for Gene Therapy. Stem Cell Reports). Štaviše, sam ulazak endocita ne dozvoljava vektorima da imaju koristi od ciklosporina u HSPC, pošto ova jedinjenja nisu poboljšala transdukciju AAV6 vektora. CsA i CsH nisu bili aditivni jedni sa drugima, što sugeriše da obe izoforme deluju na iste puteve ograničavajući LV transdukciju u HSPC. Štaviše, činilo se da je negativan uticaj CsA na kapsid-CypA interakciju preovladavao pošto su nivoi transdukcije slični samom CsA dobijeni kombinovanjem dva ciklosporina, dodatno naglašavajući važnost ove domaćin-vektor interakcije tokom LV transdukcije u HSPC.
[0213] Najkarakterističniji cilj domaćina CsH je receptor formil peptida 1 (FPR1) (de Paulis, A. et al. (1996) J Allergy Clin Immunol 98: 152-164). FPR1 pripada N-formil peptidni receptori (FPR) porodici receptora za prepoznavanje obrazaca (PRR) koji regulišu urođene imune odgovore (Prevete, N. et al. (2015) Pharmacol Res 102: 184-191). Eksprimiranje FPR je prvobitno opisano u imunim ćelijama, i zatim u ćelijama koje nisu ćelije hematopoeze i određenim tkivima, i nedavno se pokazalo da su uključeni u diferencijaciju neuralnih matičnih ćelija (Zhang, L. et al. (2017) Sci Rep 7: 206). Iako do sada nema izveštaja o učešću FPR1 u HSPC biologiji, neke od kaskada signala koje on može pokrenuti, kao što je PI3K-AKT signalizacija, igraju kritičnu ulogu u HSPC (Lechman, E.R. et al. (2012) Cell Stem Cell 11: 799-811). Međutim, FPR1 nije uključen u ciklosporin posredovano ublažavanje LV restrikcije kod HSPC.
[0214] U skladu sa svojim širim rasponom ćelija i kapacitetom da poveća i efikasnost IDLV transdukcije, CsH će verovatno omogućiti poboljšano ciljanje gena u HSPC i primarnim ljudskim CD4+ T ćelijama, kao i smanjenje doze IDLV bez ugrožavanja efikasnosti. Ovi rezultati čine platforme za uređivanje zasnovane na IDLV konkurentnom alternativom drugim postupcima zasnovanim na AAV ili oligonukleotid-posredovanoj isporuci DNK donora (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). Konkretno, postoji zabrinutost u vezi sa imunogenošću AAV-izloženog HSPC zbog pacijenata koji često imaju već postojeći adaptivni imunitet protiv ovog vektora genske terapije. CsH u kombinaciji sa platformama za uređivanje zasnovanim na IDLV mogao bi da pruži rešenje za ovu deo pacijenata koji se mogu identifikovati i imati značajne koristi od širokog spektra najnovijih terapijskih pristupa, uključujući imunoterapije i korekciju gena monogenih hematopoetskih bolesti (Naldini, L. (2015) Nature 526: 351-360). Zanimljivo je da se činilo da CsH povećava efikasnost ciljanja, posebno kod primitivnijih HSC, za koje se ranije pokazalo da su osetljiviji od predanih progenitora na citotoksičnost postupka ciljanja gena i manje vični izvođenju HDR, verovatno zbog svog mirovanja ili sporog ciklusa (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240) Povećana permisivnost za isporuku gena omogućava upotrebu mnogo nižih doza vektora donora, smanjujući time i zaustavljanje rasta i apoptozu kao odgovor na proceduru ciljanja gena. Naš poboljšani protokol za uređivanje gena zasnovan na CsH bi omogućio povećanje potencijalno ograničavajuće količine ciljanih HSPC kako bi se omogućila efikasna i sigurna korekcija specifičnih genskih defekata kod ljudi. Štaviše, kako poboljšane procedure za eks vivo ekspanziju HSC postanu dostupne, kombinatorni pristupi uključujući i poboljšanje isporuke donora mogu povećati ukupan prinos ćelija ciljanih na gen. Zaista, PGE2 je već korišćen u podešavanjima za uređivanje HSPC gena za očuvanje HSPC ex vivo (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240). Dodavanje CsH ima potencijal da dodatno poboljša ukupan prinos ćelija koje uređuju gen. Štaviše, kombinovanje CsH sa PGE2 takođe u kontekstu više kanonskih protokola genske terapije ima potencijal da značajno poboljša kliničke ishode u okruženjima u kojima je terapeutski vektor posebno neefikasan ili je potreban veliki broj kopija za terapijsku efikasnost.
[0215] Sve u svemu, identifikovali smo novi ciklosporin koji je sposoban da efikasnije i bezbednije suprotstavi bazalnu, kao i IFN-inducibilnu LV restrikciju tipa I u primarnim ljudskim HSPC i T ćelijama. Detektovanje mehanizma kojim ciklosporini poboljšavaju LV transdukciju i isporuku donora imaće velike implikacije na gensku terapiju i aplikacije za uređivanje. Štaviše, naš nalaz da se čini da se ciklosporini suprotstavljaju antivirusnim efektima izazvanim tipom I IFN u širem spektru tipova ćelija može doprineti boljem razumevanju urođenih imunoloških mehanizama koji mogu da smanje HIV-1 infekciju.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Upotreba ciklosporina H (CsH) za povećanje efikasnosti transdukcije izolovane populacije ćelija virusnim vektorom, i opciono povećanje efikasnosti uređivanja gena izolovane populacije ćelija transdukovanih virusnim vektorom, gde je virusni vektor pseudotipizovan da uđe u ćelije preko mehanizma koji zavisi od endocitoze i/ili gde je virusni vektor VSV-g pseudotipizovani vektor.
2. Upotreba prema patentnom zahtevu 1, gde su ćelije:
(a) matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze; ili
(b) T ćelije, opciono CD4<+>i/ili CD3<+>T ćelije.
3. Upotreba prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je virusni vektor retrovirusni vektor, poželjno lentivirusni vektor.
4. Upotreba prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde su ćelije stimulisane ćelije.
5. Upotreba prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se povećava procenat ćelija transdukovanih vektorom i/ili se povećava broj kopija vektora po ćeliji.
6. Upotreba prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je CsH u koncentraciji od oko 1-50 µM.
7. Upotreba prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se populacija ćelija dovodi u dodir sa:
(a) CsH u kombinaciji sa rapamicinom ili njegovim derivatom; i/ili
(b) CsH u kombinaciji sa prostaglandinom E2 ili njegovim derivatom, poželjno gde je populacija ćelija u dodiru sa CsH u kombinaciji sa 16-16 dimetil prostaglandinom E2.
8. In vitro postupak transdukcije populacije ćelija koji se sastoji od koraka:
(a) dovođenje u dodir populacije ćelija sa ciklosporinom H (CsH); i
(b) transdukcija populacije ćelija virusnim vektorom, gde je virusni vektor pseudotipizovan da uđe u ćelije preko mehanizma koji zavisi od endocitoze i/ili gde je virusni vektor VSV-g pseudotipizovani vektor,
tako da je povećana efikasnost transdukcije populacije ćelija virusnim vektorom, i opciono povećana je efikasnost uređivanja gena izolovane populacije ćelija transdukovanih virusnim vektorom.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, gde su ćelije:
(a) matične i/ili progenitorne ćelije hematopoeze; ili
(b) T ćelije, opciono CD4<+>i/ili CD3<+>T ćelije.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde je virusni vektor retrovirusni vektor, poželjno lentivirusni vektor.
11. Postupak prema bilo kom patentnom zahtevu 8-10, gde su ćelije stimulisane ćelije.
12. Postupak prema bilo kom patentnom zahtevu 8-11, gde se povećava procenat ćelija transdukovanih vektorom i/ili se povećava broj kopija vektora po ćeliji.
13. Postupak prema bilo kom patentnom zahtevu 8-12, gde je CsH u koncentraciji od oko 1-50 µM.
14 Postupak prema bilo kom patentnom zahtevu 8-13, gde se populacija ćelija dovodi u dodir sa:
(a) CsH u kombinaciji sa rapamicinom ili njegovim derivatom; i/ili
(b) CsH u kombinaciji sa prostaglandinom E2 ili njegovim derivatom, poželjno gde je populacija ćelija u dodiru sa CsH u kombinaciji sa 16-16 dimetil prostaglandinom E2.
15. Postupak prema bilo kom patentnom zahtevu 8-14, koji uključuje dalji korak obogaćivanja populacije sa matičnim i/ili progenitornim ćelijama hematopoeze.
16. Ciklosporin H (CsH) za upotrebu u genskoj terapiji, gde je genska terapija posredovana virusnim vektorom, gde je virusni vektor pseudotipizovan da uđe u ćelije putem mehanizma koji zavisi od endocitoze i/ili gde je virusni vektor pseudotipizovan VSV-g vektor.
RS20211471A 2017-04-21 2018-04-20 Genska terapija RS62619B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1706394.2A GB201706394D0 (en) 2017-04-21 2017-04-21 Gene Therapy
EP18719544.1A EP3612237B1 (en) 2017-04-21 2018-04-20 Gene therapy
PCT/EP2018/060237 WO2018193118A1 (en) 2017-04-21 2018-04-20 Gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62619B1 true RS62619B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=58795636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211471A RS62619B1 (sr) 2017-04-21 2018-04-20 Genska terapija

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11964027B2 (sr)
EP (2) EP3612237B1 (sr)
JP (2) JP7443063B2 (sr)
CN (1) CN110769860B (sr)
AU (1) AU2018253958B2 (sr)
CA (1) CA3060128A1 (sr)
DK (1) DK3612237T3 (sr)
ES (1) ES2900560T3 (sr)
GB (1) GB201706394D0 (sr)
HR (1) HRP20211803T1 (sr)
HU (1) HUE056570T2 (sr)
IL (1) IL270032B2 (sr)
LT (1) LT3612237T (sr)
PL (1) PL3612237T3 (sr)
PT (1) PT3612237T (sr)
RS (1) RS62619B1 (sr)
SI (1) SI3612237T1 (sr)
WO (1) WO2018193118A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2760994T (pt) * 2011-09-30 2017-08-24 Bluebird Bio Inc Compostos para melhor transdução viral
US20250230511A1 (en) * 2021-10-29 2025-07-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods and reagents for amplifying viral vector nucleic acid products
GB202208550D0 (en) * 2022-06-10 2022-07-27 Ospedale San Raffaele Srl Cyclosporin h and uses thereof
GB202209098D0 (en) * 2022-06-21 2022-08-10 Ucl Business Ltd Cyclosporine analogues
WO2024033802A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Fondazione Telethon Ets Gene therapy
EP4602153A1 (en) 2022-10-11 2025-08-20 Fondazione Telethon ETS 3d cell culture methods
IT202300011790A1 (it) 2023-06-08 2024-12-08 Fond Telethon Ets Protocolli di manipolazione genica in cellule immunitarie
IT202300022191A1 (it) 2023-10-24 2025-04-24 Fond Telethon Ets Mezzi e metodi per la modifica genetica di uba1
EP4640830A1 (en) 2024-04-23 2025-10-29 Fondazione Telethon ETS Means and methods for safe and efficient gene editing in cells

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723315A (en) 1996-08-23 1998-03-03 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
DE69729007T2 (de) 1996-08-07 2005-04-07 Darwin Discovery Ltd., Slough Hydroxamsäure- und carbonsäure-derivate mit mmp und tnf hemmender wirkung
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
PL332875A1 (en) 1996-10-17 1999-10-25 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
EP1849873B1 (en) 1999-04-29 2011-10-12 Gbp Ip, Llc Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
EP1412493B1 (en) 2001-08-02 2011-10-05 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
WO2004032969A1 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Lorantis Limited Modulation of immune function
ATE488252T1 (de) * 2003-05-05 2010-12-15 Virxsys Corp Erhöhte transduktion mit abc- transportersubstratenhemmern
WO2012058673A2 (en) 2010-10-31 2012-05-03 Tocagen Inc. Enhanced cancer treatment and monitoring using recombinant vectors
US20150352228A1 (en) 2013-01-11 2015-12-10 Bruce TORBET Methods and compositions for enhancing transduction efficiency of retroviral vectors
ES2747951T3 (es) 2013-10-24 2020-03-12 Ospedale San Raffaele Srl Método
GB201407322D0 (en) * 2014-04-25 2014-06-11 Ospedale San Raffaele Gene therapy
AU2016261358B2 (en) 2015-05-11 2021-09-16 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
DK3612237T3 (da) 2021-12-06
JP2020517253A (ja) 2020-06-18
IL270032A (sr) 2019-12-31
CN110769860A (zh) 2020-02-07
US20210121579A1 (en) 2021-04-29
JP7443063B2 (ja) 2024-03-05
CA3060128A1 (en) 2018-10-25
US12485187B2 (en) 2025-12-02
EP3612237A1 (en) 2020-02-26
EP3612237B1 (en) 2021-09-01
AU2018253958B2 (en) 2024-03-07
US20240350661A1 (en) 2024-10-24
PT3612237T (pt) 2021-12-02
IL270032B2 (en) 2025-03-01
ES2900560T3 (es) 2022-03-17
WO2018193118A1 (en) 2018-10-25
PL3612237T3 (pl) 2022-02-14
AU2018253958A1 (en) 2019-11-21
JP2024045128A (ja) 2024-04-02
US11964027B2 (en) 2024-04-23
LT3612237T (lt) 2022-01-25
SI3612237T1 (sl) 2022-02-28
IL270032B1 (en) 2024-11-01
HRP20211803T1 (hr) 2022-03-04
HUE056570T2 (hu) 2022-02-28
CN110769860B (zh) 2024-03-08
EP3973996A1 (en) 2022-03-30
GB201706394D0 (en) 2017-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12485187B2 (en) Method for improving retroviral transduction and gene editing in hematopoietic stem cells using clyclosporin H and UM171
JP6691048B2 (ja) 方法
US20200237962A1 (en) Gene Therapy
US12558435B2 (en) Transient inhibition of p53 in gene therapy
CA3235572A1 (en) Gene therapy
US20240218330A1 (en) Compositions for improving the transduction of cells by viral vectors
JP7320950B2 (ja) 遺伝子治療
Li et al. Enhanced genetic modification of adult growth factor mobilized peripheral blood hematopoietic stem and progenitor cells with rapamycin
Gori Methotrexate resistance gene transfer in stem cells