RS62700B1 - Anti-cd277 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na anti-CD277 antitela i njihove upotrebe.

POZADINA OVOG PRONALASKA

[0002] Bela krvna zrnca su ćelije imunog sistema uključene u odbrani tela protiv patogena. Među ovim ćelijama, mogu se navesti, limfociti, monociti, i dendritske ćelije. Monociti mogu da migriraju iz krvotoka u druga tkiva i diferenciraju u makrofage ili dendritske ćelije koji su nastanjeni u tkivima. Dendritske ćelije igraju ulogu ćelija koje predstavljaju antigen (APC) koje aktiviraju limfocite. Među limfocitima, T ćelije se mogu podeliti u γδ T ćelije i αβ T ćelije.

[0003] Vγ9/Vδ2 T ćelije su važni efektori imune odbrane. One direktno liziraju patogenom zaražene ili abnormalne ćelije. Pored toga, one regulišu imune odgovore indukovanjem sazrevanja dendritskih ćelija (DC) kao i izotipskog prebacivanja i proizvodnjom imunoglobulina. Ova izuzetno značajna ćelijska platforma imunog sistema isključivo se reguliše površinskim receptorima, hemokinima i citokinima.

[0004] Prajmovanje T ćelija modulisano je uključivanjem specijalizovanih ćelija i lučenjem hemotaktičnih citokina. U današnje vreme, poznato je da je aktivacija T-ćelija rezultat dva sinergijska događaja. Prvi je inretakcija između receptora T ćelije (TCR) i glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) konjugovan sa obrađenim antigenom na površini ćelija koje predstavljaju antigen (APC). Drugi događaj je kostimulatorni antigen-nezavisni signal koji uključuje B7 molekule. Nedostatak kostimulatornog signala indukuje anergiju, tj. inhibiciju proliferacije T ćelija, lučenje citokina i citotoksičnih aktivnosti. Ispitivanje ovih putanja može da obezbedi uvid u vezi izazivanja patoloških događaja, kao što su autoimuni ili limfoproliferativni poremećaji.

[0005] B7 familija pre proširena grupa kostimulatornih molekula (Coyle et al., 2001). B7 familiji pripradaju ligandi B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86): njihovi receptori su CD28, što vodi ka T ćelijskoj aktivaciji (Linsley and Ledbetter, 1993, June, et al., 1994, Lenschow et al., 1996), i CTLA-4 (CD152), što ulazi u kompeticiju sa CD28 i transdukuje inhibitorni signal (Waterhouse et al., 1996). Kritička uloga CD152 kao negativnog regulatora T ćelijske aktivacije pokazana je pojavom limfoproliferativnih poremećaja kod miševa koji su u deficitu sa CTLA-4 (Waterhouse et al., 1995). Većina podataka o inhibitornoj funkciji koju ispoljava CD152, sakupljena je iz ispitivanja proliferacije ili proizvodnje citokina od strane naivnih T limfocita tokom T ćelijskog prajmovanja (Linsley et al., 1992, Walunas et al., 1995, Walunas and Bluestone, 1998). Određenije, CD152 je eksprimiran praćeno aktivacijom T-limfocita i inhibira citolitičke funkcije CTL klonova dobijenih praćeno PHA stimulacijom ili Ag selekcijom (Saverino et al., 1998).

[0006] B7-H1 (PD-L1, CD274) i B7-DC (PD-L2, CD273), čiji je receptor PD-1 (CD279), dokazano inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju i lučenje citokina (Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001). Drugačije, različita ispitivanja su pokazala da angažovanje PD-L1 i PD-L2 povećavaju T ćelijsku proliferaciju i proizvodnju IL-10 ili IFN-γ (Dong et al., 1999, Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001, Chapoval et al., 2001, Tseng et al., 2001). Drugi molekuli povezani sa familijom B7 eksprimiranom na površini T ćelija su B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4 čije uloge nisu u potpunosti shvaćene (Hutloff et al., 1999, Sun et al., 2002).

[0007] Henry et al. (1999) otkrivaju da je region koji kodira butirofilin (BT) smešten na telomernom položaju od MHC klase I regiona na ljudskom hromozomu 6. Određenije, oni opisuju dva gena Bt2 i Bt3, koji kodiraju novu grupu kostimulatornih molekula (BT2.1, BT2.2, BT2.3, BT3.1, BT3.2 i BT3.3) koji pripadaju Ig superfamiliji (IgSF) (Williams and Barclay, 1988) i povezani su sa B7 familijom analizom sličnosti sekvenci: određenije, ona pokazuje sličnost sa Ig-V sličnim ekstracelularnim domenom od CD80 i CD86 (Linsley et al., 1992).

Članovi BT3 familije pojavljuju se u literaturi sa različitim imenima: BT3.1 se takođe naziva BTF5 (Rhodes et al., 2001), ili BTN3A1 (Ruddy et al., 1997), ili skorije CD277 (Bensussan and Olive, 2005); BT3.2 se takođe naziva BTF4 (Rhodes et al., 2001), ili BTN3A2 (Ruddy et al., 1997); i, konačno, BT3.3 takođe se javlja kao BTF3 (Rhodes et al., 2001) ili BTN3A3 (Ruddy et al., 1997). BT3 ima dva Ig-slična ekstracelularna domena koji karakterišu IgSF.

[0008] Predloženo je da b7 geni i MHC klasa I i II geni mogu da imaju zajednički nasleđeni gen i mogu da kodiraju proteine uključene u sličnoj funckiji, kao što je T ćelijska aktivacija (Rhodes et al., 2001). BT3 molekuli su pronađeni na imunim ćelijama, kao što su T, B i NK ćelije, monociti i dendritske ćelije kao i hematopoietični prekursori i neke neoplastične ćelijske linije (Compte et al., 2004). Što se tiče drugih kostimulatornih molekula, njihova struktura je okarakterisana pomoću tri domena: ekstracelularni domen za vezivanje liganda, transmembranski domen i intracelularni domen nazvan B30.2 koji je verovatno uključen u regulaciju intracelularnih superoksidnih koncentracija (Henry et al., 1998). Do sada, ligand(i) od CD277 još uvek je nepoznat.

[0009] Do danas, ni jedan zadovoljavajući pristup nije dokazan za indukovanje potentnih imunih odgovora protiv vakcina, naročito kod pacijenata obolelih od karcinoma. Postupci tek treba da se osmisle kojima bi se savladali imunosupresivni mehanizmi zapaženi kod pacijenata obolelih od karcinoma, i tokom hroničnih infekcija.

KRATAK PREGLED

[0010] Ovaj pronalazak definisan je u patentnim zahtevima.

Ovo otkrivanje odnosi se na anti-CD277 antitelo, koje aktivira citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i proliferaciju Vγ9/Vδ2 T ćelija. Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo, koje kostimuliše T ćelije zajedno sa CD3-TCR, i/ili koje kostimuliše T ćelije pored CD28-B7 kostimulacije. Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo, koje povećava aktivnost i/ili preživljavanje monocita i dendritskih ćelija.

[0011] Poželjno, antitelo prema ovom otkrivanju je anti-CD277 antitelo, koje:

- aktivira citolitičku funkciju Vγ9/Vδ2 T ćelija, i

- kostimuliše T ćelije zajedno sa CD3-TCR, i

- kostimuliše T ćelije pored CD28-B7 kostimulacije, i

- povećava aktivnost i/ili preživljavanje monocita i dendritskih ćelija.

[0012] Određenije, ovo otkrivanje odnosi se na anti-CD277 antitelo (odabrano od mAb 20.1, 7.2) koje se može dobiti od jednog od hibridoma dostupnih pod CNCM brojem depozita I-4401 i I-4402.

[0013] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo koje obuhvata CDR od mAb 20.1. Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo koje obuhvata CDR od mAb 7.2. Ovo otkrivanje takođe se odnosi na jedno od mAb 20.1, 7.2, ili njihov derivat, za upotrebu u terapiji.

Ovo otkrivanje odnosi se na jedno od mAb 20.1 i 7.2, ili njihov derivat, za upotrebu za tretiranje kancera ili hronične infekcije.

[0014] Ovo otkrivanje odnosi se na vakcinu za tretiranje kancera ili hronične infekcije koja obuhvata jedno od mAb 20.1 i 7.2, ili njihov derivat. Ovo otkrivanje odnosi se na komplet za tretiranje kancera ili hronične infekcije koji obuhvata:

a) mAb 20.1 ili 7.2 ili njihov derivat; i

b) vakcinu za tretiranje kancera ili hronične infekcije.

[0015] Ovo otkrivanje odnosi se na anti-CD277 antitelo kakvo je prethodno definisano za upotrebu u terapiji.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0016] Prema ovom otkrivanju, "antitelo" ili "imunoglobulin" imaju isto značenje, i biće upotrebljivani jednako kroz ovo otkrivanje. Pojam "antitelo" kako se koristi ovde odnosi se na imunoglobulinske molekule i imunološki aktivne delove imunoglobulinskih molekula, tj., molekuli koji sadrže antigen vezujuće mesto koje imunospecifično vezuje antigen. Kao takvo, pojam antitelo obuhvata ne samo molekule celog antitela, već i fragmente ili derivate antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, Sc(Fv)2i dijatela.

Kod prirodnih antitela, dva teška lanca međusobno su povezana disulfidnim vezama i svaki teški lanac je povezan sa lakim lancem by disulfidnom vezom. Postoji dve vrste lakog lanca, lambda (λ) i kapa (K). Postoji pet glavnih klasa teških lanaca (ili izotipovi) koji određuju funkcionalnu aktivnost moekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Svaki lanac sadrži distinktne domene sekvenci.

Laki lanac uključuje dva domena, varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL). Teški lanac uključuje četiri domena, varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3, zajedno označeni kao CH). Varijabilni regioni oba lakih (VL) i teških (VH) lanaca određuju vezujuće prepoznavanje i specifičnost za antigen. Domeni konstantnih regiona lakih (CL) i teških (CH) lanaca deljuju značajne biološke osobine kao što je asocijacija lanaca antitela, lučenje, trans-placentalna mobilnost, vezivanje komplementa, i vezivanje za Fc receptore (FcR). Fv fragment je N-terminalni deo Fab fragmenta imunoglobulina i sastoji se od varijabilnih delova jednog lakog lanca i jednog teškog lanca. Specifičnost antitela leži u strukturalnoj komplementarnosti između mesta kombinovanja antitelo i antigenske determinante. Mesta kombinovanja antitela sačinjena su od ostataka koji su primarno od hipervarijabilnih ili komplementarnost određujućih regiona (CDR). Povremeno, ostaci od nehipervarijabilnih ili okvirnih regiona (FR) utiču na ukupnu domensku strukturu i samim tim mesto kombinovanja. Komplementarnost određujući regioni ili CDR odnose se na aminokiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodnog Fv regiona nativnog imunoglobulin vezujućeg mesta. Laki i teški lanci imunoglobulina svaki imaju tri CDR, označene kao L-CDRI, L-CDR2, L-CDR3 i H-CDRI, H-CDR2, H-CDR3, tim redom. Antigen-vezujuće mesto, prema tome, uključuje šest CDR, koji obuhvataju CDR skup od svakog V regiona teškog i lakog lanca. Okvirni regioni (FR) odnose se na aminokiselinske sekvence umetnute između CDR. Pojmovi "himerno antitelo" odnose se na genetski konstruisanu fuziju delova životinjskog antitela, tipično mišje antitelo, sa delovima humanog antitela. Generalno, himerna antitela sadrže približno 33% mišjeg proteina i 67% humanog proteina. Razvijena da redukuju humani odgovor na antiživotinjska antitela pobuđen životinjskim antitelom, ona kombinuju specifičnost životinjskog antitela sa efikasnom interakcijom ljudskog imunog sistema humanog antitela.

[0017] Prema ovom otkrivanju, pojam "humanizovano antitelo" odnosi se na antitelo koje ima varijabilni region okvira i konstantni regioni od humanog antitela ali zadržava CDR životinjskog antitela.

[0018] Pojam "Fab" označava fragment antitela koji ima molekulsku masu od oko 50,000 i antigen vezujuću aktivnost, kod kojeg oko polovina N-terminalne strane H lanca i ceo L lanac, među fragmentima dobijenim tretiranjem sa IgG sa proteazom, papainom, međusobno su povezana disulfidnom vezom.

Pojam "F(ab')2" odnosi se na fragment antitela koje ima molekulsku masu od oko 100,000 i antigen vezujuću aktivnost, koji je nešto veći od Fab vezanog disulfidnom vezom regiona zgloba, među fragmentima dobijenim tretiranjem sa IgG sa proteazom, pepsinom.

Pojam "Fab' " odnosi se na fragment antitela koje ima molekulsku masu od oko 50,000 i antigen vezujuću aktivnost, koji je dobijen prekidanjem disulfidne veze regiona zgloba od F(ab')2.

Jednolančani Fv ("scFv") polipeptid je kovalentno vezan sa VH::VL heterodimerom koji je obično eksprimiran iz genske fuzije koja uključuje VH i VL kodirajuće gene vezane peptid-kodirajućim veznikom.

"dsFv" je VH:: VL heterodimer stabilisan disulfidnom vezom. Dvovalentni i multivalentni fragmenti antitela mogu da se obrazuju ili spontano asocijacijom monovalentnih scFv, ili se mogu genrisati kuplovanjem monovalentnih scFv peptidnim veznikom, kao što je dvovalentni sc(Fv)2.

Pojam "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, pri čemu ti fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Primenom veznika koji je previše kratak da omogući uparivanje između dva domena na istom lancu, ti domeni su prisiljeni da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva antigen-vezujuća mesta.

[0019] Pod "prečišćen" i "izolovan" podrazumeva se, kada e poziva na polipeptid (tj. antitelo prema ovom otkrivanju) ili na nukleotidnu sekvencu, da je indikovani molekul prisutan u suštinskom odsustvu drugih bioloških makromolekula iste vrste.

Pojam "prečišćen" kako se koristi ovde poželjno označava da je prisutno najmanje 75mas.%, poželjnije najmanje 85mas.%, još poželjnije najmanje 95mas.%, i najpoželjnije najmanje 98mas.% bioloških makromolekula iste vrste.

"Izolovani" molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je suštinski oslobođen od drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju taj polipeptid; međutim, taj molekul može da uključuje neke dodatne baze ili grupe koje ne utiču štetno na osnovne karakteristike kompozicije.

[0020] U kontekstu ovog otkrivanja, pojam "tretiranje" ili "tretman", kako se koristi ovde, označava preokretanje, ublažavanje, inhibiranje napredovanja, ili sprečavanje poremećaja ili sanja na koja se ovaj pojam primenjuje, ili jedan ili više simptomi takvog poremećaja ili stanja.

[0021] "Terapeutski efektivna količina" namenjena je za minimalnu količinu aktivnog agens koja je potrebna da obezbedi terapeutski benefit subjektu. Na primer, "terapeutski efektivna količina" ta sisara je takva količina koja indukuje, poboljšava ili na drugi način izaziva poboljšanje upatološkim simptomima, napredovanja bolesti ili fizioloških stanja povezanih sa ili otpornost od obolevanja od tog poremećaja.

[0022] Kako se koristi ovde, pojam "prevencija" odnosi se na sprečavanje da se bolest ili stanje javi kod subjekta kod kog još uvek nisu isti dijagnostikovani. Kako se koristi ovde, pojam "subjekt" označava sisara, kao što je glodar, mačka, pas, i primat. Poželjno, subjekt prema ovom otkrivanju je čovek.

[0023] Kako se koristi ovde, pojmovi "kancer", "hiperproliferativni" i "neoplastični" odnose se na ćelije sa kapacitetom za autonomni rast, tj., abnormalni stadijum ili stanje okarakterisano rapidnim proliferativnim ćelijskim rastom. Hiperproliferativna i neoplastična stanja bolesti mogu se katergorizovati kao patološki, tj., okarakterisani ili koji čine stanje bolesti, ili mogu biti kategorizovani kao ne-patološki, tj., odstupanje od normalnom ali koji nij povezan sa stanjem bolesti. Pojam je namenjen da uključi sve vrste kancerogenih izraslina ili onkogenih procesa, metastatičkih tkiva ili maligno transformisanih ćelija, tkiva, ili organa, nevezano od histopatološke vrste ili stanja invazivnosti. Pojmovi "kancer" ili "neoplazme" uključuju malignitete različitih sistema organa, kao što je uticanje na pluća, dojku, štitnu žlezdu, limfoid, gastrointestinalni, i genito-urinarni trakt, kao i adenokarcinomi koji uključuju malignitete kao što je većina kancera kolona, karcinom ćelija bubrega, kancer prostate i/ili tumori testisa, karcinom ne-malih ćelija pluća, kancer tankog creva i kancer jednjaka.

[0024] Pronalazači su deponovali mišje anti-CD277 antitelo (mAb 20.1) koje proizvodi hibridom, na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), u skladu sa uslovima Budimpeštanskog ugovora, 24. novembra 2010. Deponovani hibridom za mAb 20.1 ima CNCM broj deponovanja I-4402.

[0025] "mAb 20.1" odnosi se na izolovano anti-CD277 antitelo koje se može dobiti od hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita I-4402. Izraz “derivat mAb 20.1" odnosi se na anti-CD277 antitelo koje obuhvata 6 CDR od mAb 20.1.

[0026] Pronalazači su deponovali mišje anti-CD277 antitelo (mAb 7.2) koje proizvodi hibridom u Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), u skladu sa uslovima Budimpeštanskog ugovora, 24 novembra 2010. Deponovani hibridom za mAb 7.2 ima CNCM broj deponovanja I-4401.

[0027] "mAb 7.2" odnosi se na izolovano anti-CD277 antitelo koje se može dobiti od hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita I-4401. Izraz “derivat mAb 7.2" odnosi se na anti-CD277 antitelo koje obuhvata 6 CDR od mAb 7.2.

Antitela prema ovom otkrivanju i nukleinske kiseline koje ih kodiraju

[0028] Ovo otkrivanje odnosi se na izolovano anti-CD277 antitelo, koje aktivira citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i proliferaciju Vγ9/Vδ2 T ćelija.

Aktiviranjem citolitičke funkcije Vγ9/Vδ2 T ćelija, podrazumeva se da je zapaženo značajno povećavanje citotoksičnost Vγ9/Vδ2 T ćelija, tj. značajno povećavanje specifične lizije ciljanih ćelija putem Vγ9/Vδ2 T ćelija.

Povećavanjem proizvodnje citokina putem Vγ9/Vδ2 T ćelija, podrazumeva se da je zapaženo značajno povećanje proizvodnje citokina putem Vγ9/Vδ2 T ćelija, u poređenju sa kontrolnim Vγ9/Vδ2 T ćelijama (tj. nestimulisane i netretirane).

Povećavanjem proliferacije Vγ9/Vδ2 T ćelija, podrazumeva se da je zapaženo značajno povećavanje proliferacije Vγ9/Vδ2 T ćelija, u poređenju sa kontrolnim Vγ9/Vδ2 T ćelijama (tj. nestimulisane i netretirane).

Tipično, aktivacija citolitičke funkcije Vγ9/Vδ2 T ćelija može se izmeriti u skladu sa postupkom opisanim u primeru 3 (tj. "Analiza Vγ9Vδ2 T ćelijski odgovora ogledom direktne citotoksičnosti", i na primer rezultatima "CD277 potencira antitumorsku citolizu posredovanu Vγ9Vδ2 T ćelijama"). Primeri izolovanih anti-CD277 antitela, koja aktiviraju citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i proliferaciju Vγ9/Vδ2 T ćelija, su mAb 20.1 ili 7.2, ili njihovi derivati.

[0029] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo, koje kostimuliše T ćelije zajedno sa CD3-TCR. Kostimulisanjem T ćelija zajedno sa CD3-TCR, podrazumeva se da se aktivira kaskada reakcija posle vezivanja CD3 sa TCR. Tipično kostimulacija T ćelija zajedno sa CD3-TCR može se izmeriti u skladu sa postupkom opisanim u primeru 2 (određenije "CD277 kostimuliše CD3 signale"). Primeri izolovanih anti-CD277 antitela, koja kostimulišu T ćelije zajedno sa CD3-TCR, su mAb 20.1 ili 7.2, ili njihovi derivati.

[0030] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo, koje kostimuliše T ćelije pored CD28-B7 kostimulacije. Kostimulisanjem T ćelija zajedno sa CD28-B7, podrazumeva se da se aktivira kaskada reakcija posle vezivanja CD28 sa B7. Tipično kostimulacija T ćelija zajedno sa CD28-B7 može se izmeriti u skladu sa postupkom opisanim u primeru 2 (određenije "CD277 kostimuliše CD3 signale"). Primeri izolovanih anti-CD277 antitela, koja kostimulišu T ćelije zajedno sa CD28-B7, su mAb 20.1 ili 7.2, ili njihovi derivati.

[0031] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na anti-CD277 antitelo, koje povećava aktivnost i/ili preživljavanje monocita i dendritskih ćelija. Povećavanjem aktivnost monocita i dendritskih ćelija, podrazumeva se da pomenuto anti-CD277 antitelo povećava ekspresiju kostimulatornih molekula (poput CD86, CD80 i HLA-DR) na površini monocita i dendritskih ćelija, i povećava prozapaljenske odgovore indukovane TLR ligandima u ovim ćelijama. Tipično povećavanje aktivnosti i/ili preživljavanje monocita i dendritskih ćelija može se izmeriti u skladu sa postupkom opisanim u primeru 1 (određenije "Detekcija apoptoze" i "Proizvodnja citokina"). Primeri izolovanih anti-CD277 antitela, koja povećavaju aktivnost i/ili preživljavanje monocita i dendritskih ćelija, su mAb 20.1, ili njihovi derivati.

[0032] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na izolovano anti-CD277 antitelo (mAb 20.1) koje se može dobiti od hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita I-4402.

Ovo otkrivanje odnosi se na hibridom dostupan pod CNCM brojem depozita I-4402.

Ovo otkrivanje odnosi se na antitelo koje obuhvata 6 CDR od mAb 20.1.

U još jednom načinu izvođenja, ovo otkrivanje odnosi se na derivat mAb 20.1 koji obuhvata VL lance i VH lance od mAb 20.1.

U još jednom načinu izvođenja, ovo otkrivanje odnosi se na derivat mAb 20.1 koji je himerno antitelo, koje obuhvata varijabilni domeni od mAb 20.1.

[0033] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na izolovano anti-CD277 antitelo (mAb 7.2) koje se može dobiti od hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita I-4401.

[0034] Ovo otkrivanje odnosi se na hibridom dostupan pod CNCM brojem depozita I-4401.

Ovo otkrivanje odnosi se na antitelo koje obuhvata 6 CDR od mAb 7.2.

U još jednom načinu izvođenja, ovo otkrivanje odnosi se na derivat mAb 7.2 koji obuhvata VL lance i VH lance od mAb 7.2.

U još jednom načinu izvođenja, ovo otkrivanje odnosi se na derivat mAb 7.2 koji je himerno antitelo, koje obuhvata varijabilni domeni od mAb 7.2.

[0035] U jednom načinu izvođenja, antitelo prema ovom otkrivanju je monoklonalno antitelo.

U jednom načinu izvođenja, antitelo prema ovom otkrivanju je himerno antitelo.

U jednom načinu izvođenja, antitelo prema ovom otkrivanju je humanizovano antitelo.

[0036] Dalji način izvođenja prema ovom otkrivanju odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema ovom otkrivanju.

[0037] U određenom načinu izvođenja, ovo otkrivanje odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VH domen ili VL domen antitela prema ovom otkrivanju. Tipično, pomenuta nukleinska kiselina je DNK ili RNK molekul, koja može biti uključena u bilo koji pogodan vektor, kao što je plazmid, kozmid, epizom, veštački hromozom, faga ili virusni vektor.

[0038] Pojmovi "vektor", "klonirajući vektor" i "ekspresioni vektor" označavaju nosač kojim se DNK ili RNK sekvenca (npr. strani gen) mogu uvesti u ćeliju domaćin, kako bi transformisao domaćina i promovisala ekspresiju (npr. transkripciju i translaciju) uvedene sekvence. Dakle, dalji predmet prema ovom otkrivanju odnosi se na vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema ovom otkrivanju.

[0039] Takvi vektori mogu da obuhvataju regulatorne elemente, kao što je promoter, pojačivač, terminator i slično, radi izazivanja ili usmeravanja ekspresije pomenutog antitela posle davanja subjektu. Primeri promotera i pojačivači koji se koriste u ekspresionom vektoru za životinjsku ćeliju uključuju rani promoter i pojačivač od SV40, LTR promoter i pojačivač od Moloney virusa mišje leukemje, promoter i pojačivač imunoglobulinskog H lanca i slično.

[0040] Bilo koji ekspresioni vektor za životinjsku ćeliju može se primeniti, dokle god gen koji kodira C region humanog antitela može da se umetne i da bude eksprimiran. Primeri pogodnih vektora uključuju pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSGI beta d2-4- i slično.

Drugi primeri plazmida uključuju replicirajuće plazmide koji obuhvataju poreklo replikacije, ili integrativne plazmide, kao što je primera radi pUC, pcDNK, pBR, i slično. Drugi primeri virusnog vektora uključuju adenovirusni, retrovirusni, herpes virusni i AAV vektore. Takvi rekombinantni virusi mogu biti proizvedeni tehnikama poznatim u struci, kao što je transfektovanjem pakujućih ćelije ili tranzijentnom transfekcijom sa plazmidima pomoćnicima ili virusima. Tipični primeri virus pakujućih ćelija uključuju PA317 ćelije, PsiCRIP ćelije, GPenv+ ćelije, 293 ćelije, itd. Detaljni protokoli za proizvodnju takvih replikacija-defektivnih rekombinantnih virusa mogu biti pronađeni primera radi u WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 i WO 94/19478.

[0041] Dalji predmet prema ovom otkrivanju odnosi se na ćeliju koja je transfektovana, inficirana ili transformisana nukleinskom kiselinom i/ili vektorom prema ovom otkrivanju. Pojam "transformacija" označava uvođenje "stranog" (tj. spoljnog ili ekstracelularnog) gena, DNK ili RNK sekvence u ćeliju domaćin, tako da ćelija domaćin eksprimira uvedeni gen ili sekvencu radi proizvodnje poželjne supstance, tipično proteina ili enzima kodiranog uvedenim genom ili sekvencom. Ćelija domaćin koja prima i eksprimira uvedenu DNK ili RNK smatra se "transformisanom". Nukleinske kiseline prema ovom otkrivanju mogu biti upotrebljene za proizvodnju antitela prema ovom otkrivanju u pogodnom ekspresionom sistemu. Pojam "ekspresioni sistem" označava ćeliju domaćina i kompatibilan vektor pod pogodnim uslovima, npr. za ekspresiju proteina kodiranog putem strane DNK nošene vektorom i uvedene u ćeliju domaćin.

Uobičajeni ekspresioni sistemi uključuju E. coli ćelije domaćine i plazmidne vektore, ćelije domaćine insekata i Bakulovirusne vektore, i ćelije domaćine i vektore sisara. Drugi primeri ćelija domaćina uključuju, bez ograničavanja, prokariotske ćelije (kao što je bakterija) i eukariotske ćelije (kao što su ćelije kvasca, sisarske ćelije, ćelije insekta, biljne ćelije, itd.). Specifični primeri uključuju E. coli, Kluyveromyces ili Saccharomyces kvasce, sisarske ćelijske linije (npr., Vero ćelije, CHO ćelije, 3T3 ćelije, COS ćelije, itd.) kao i primarne ili utvrđene sisarske ćelijske kulture (npr., proizvedene iz limfoblasta, fibroblasta, embrionskih ćelija, epitelijalnih ćelija, nervnih ćelija, adipocita, itd.). Primeri takođe uključuju mišje SP2/0-Agl4 ćelije (ATCC CRL1581), mišje P3X63-Ag8.653 ćelije (ATCC CRL1580), CHO ćelije u kojima je dihidrofolatni reduktaza gen (takođe označen i kao "DHFR gen") defektivan, pacovske YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O ćelije (ATCC CRL1662, takođe označene i kao "YB2/0 ćelije"), i slično.

[0042] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na postupak za proizvodnju rekombinantne ćelije domaćina koja eksprimira antitelo prema ovom otkrivanju, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze:

(i) uvođenja in vitro ili ex vivo rekombinantne nukleinske kiseline ili vektora kako je opisano gore u kompetentnu ćeliju domaćina,

(ii) uzgajanja in vitro ili ex vivo dobijene rekombinantne ćelije domaćina, i

(iii) opciono, biranja ćelija koje eksprimiraju i/ili luče pomenuto antitelo. Takve rekombinantne ćelije domaćini mogu se primeniti za proizvodnju antitela prema ovom otkrivanju.

Postupci za proizvodnju antitela prema ovom otkrivanju

[0043] Antitela prema ovom otkrivanju mogu biti proizvedena bilo kojom tehnikom poznatoj u struci, kao što je, bez ograničavanja, bilo koja hemijska, biološka, genetska ili enzimatska tehnika, bilo sama ili u kombinaciji.

[0044] Poznavajući aminokiselinsku sekvencu poželjne sekvence, stručnjak iz ove oblasti može lako da proizvede pomenuta antitela, standardnim tehnikama za proizvodnju polipeptida. Primera radi, ona se mogu sintetizovati primenom dobro poznatog postupka čvrste faze, poželjno primenom komercijalno dostupnog uređaja za sintezu peptida (kao što je onaj proizveden od Applied Biosystems, Foster City, California) i prateći instrukcije proizvođača. Alternativno, antitela prema ovom otkrivanju mi se sintetizovati rekombinantnim DNK tehnikama dobro-poznatim u struci. Na primer, antitela mogu biti dobijena kao DNK ekspresioni proizvodi nakon inkorporacije DNK sekvenci koje kodiraju antitela u

1

ekspresione vektori i uvođenja takvih vektora u pogodne eukariotske ili prokariotske domaćine koji će eksprimirati poželjna antitela, za koja se kasnije mogu izolovati primenom dobro poznatih tehnika.

[0045] Određenije, ovo otkrivanje dalje se odnosi na postupak za proizvodnju antitela prema ovom otkrivanju, koji postupak obuhvata faze koje se sastoje od:

(i) uzgajanja transformisane ćelija domaćin prema ovom otkrivanju pod uslovima pogodnim da omoguće ekspresiju pomenutog antitela; i

(ii) izdvajanje eksprimiranog antitela.

[0046] U još jednom određenom načinu izvođenja, postupak obuhvata faze:

(i) uzgajanje hibridoma deponovanog kao CNCM I-4401, CNCM I-4402 pod uslovima pogodnim da omoguće ekspresiju antitela; i

(ii) izdvajanje eksprimiranog antitela.

[0047] Antitela prema ovom otkrivanju pogodno se odvajaju iz podloge za uzgajanje pogodnim procedurama za imunoglobulinsko prečišćavanje kao što je, na primer, protein A-Sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza, ili afinitetna hromatografija.

U određenom načinu izvođenja, humano himerno antitelo prema ovom otkrivanju može se proizvesti obezbeđivanjem nukleinskih sekvenci koje kodiraju VL i VH domene kako je prethodno opisano, konstruišući ekspresioni vektor humanog himernog antitela njihovim umetanjem u ekspresioni vektor za životinjsku ćeliju sa genima koji kodiraju humano antitelo CH i humano antitelo CL, i koji eksprimira kodirajuću sekvencu uvođenjem ekspresionog vektora u životinjsku ćeliju. Kao CH domen humanog himernog antitela, to može biti bilo koji region koji pripada humanom imunoglobulinu, ali oni koji pripadaju IgG klasi su pogodni, a bilo koja od podklasa kojima pripadaju IgG klasa, kao što je IgGI, IgG2, IgG3 i IgG4, takođe se može primeniti. Takođe, kao CL humanog himernog antitela, to može biti bilo koji region koji pripada Ig, a i one koje pripadaju kapa klasi ili lambda klasi mogu se primeniti. Postupci za proizvodnju himernog antitela koji uključuju uobičajenu rekombinantne DNK i genske transfekcione tehnike dobro su poznati u struci (Videti patentne dokumente US5,202,238; i US5,204,244).

[0048] Humanizovano antitelo prema ovom otkrivanju može biti proizvedeno obezbeđivanjem sekvence nukleinske kiseline koja kodira CDR domene, kako je prethodno opisano, konstruisanjem ekspresionog vektora humanizovanog antitela njihovim umetanjem u ekspresioni vektor za životinjsku ćeliju sa genima koji kodiraju (i) konstantni region teškog lanca identičan onom koje ima humano antitelo i (ii) konstantni region lakog lanca identičan onom koje ima humano antitelo, i koje eksprimiraju te gene uvođenjem ekspresionog vektora u životinjsku ćeliju.

[0049] Ekspresioni vektor humanizovanog antitela može biti ili vrsta u kojoj gen koji kodira teški lanac antitela i gen koji kodira laki lanac antitela postoji na odvojenim vektorima ili vrsti u kojima oba gena postoje na istom vektoru (tandemska vrsta). U pogledu lakoće konstruisanja ekspresionog vektora humanizovanog antitela, lakoća uvođenja u životinja ćelije, i balansa između ekspresionih nivoa H i L lanaca antitela u životinjskim ćelijama, ekspresioni vektor humanizovanog antitela tandemske vrste je poželjan. Primeri tandemske vrste ekspresionog vektora humanizovanog antitela uključuju pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 i slično.

[0050] Postupci za proizvodnju humanizovanog antitela na bazi uobičajenih rekombinantnih DNK i genskih transfekcionih tehnika, dobro su poznati u struci. Antitela mogu biti humanizovana primenom raznih tehnika poznatih u struci, uključujući, na primer, CDR-kalemljenje (EP 239,400; PCT objava WO91/09967; U.S. Pat. Br.5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), fasetiranje ili obnavljanje površine (EP 592,106; EP 519,596), i mešanje lanaca (U.S. Pat. Br.5,565, 332). Uobičajena rekombinantna DNK tehnologija za pripremu takvih antitela takođe je poznata (videti Evropsku patentnu prijavu EP 125023 i Međunarodnu patentnu prijavu WO 96/02576).

[0051] Fab prema ovom otkrivanju može biti dobijen tretiranjem sa antitelom koje specifično reaguje sa CD277 sa proteazom, papainom. Takođe, Fab se može proizvesti umetanjem DNK koja kodira Fab antitela u vektor za prokariotski ekspresioni sistem, ili za eukariotski ekspresioni sistem, i uvođenjem tog vektora u prokariot ili eukariot (po potrebi) radi eksprimiranja Fab.

[0052] F(ab’)2 prema ovom otkrivanju može se dobiti tretiranjem antitela koje specifično reaguje sa CD277 sa proteazom, pepsinom.

Takođe, F(ab’)2 se može proizvesti vezivanjem Fab' opisanim u nastavku putemn tioetarske veze ili disulfidne veze.

[0053] Fab' prema ovom otkrivanju može se dobiti tretiranjem sa F(ab')2 koji specifično reaguje sa humanim CD277 sa redukujućim agensom, ditiotreitolom. Takođe, Fab' se može proizvesti umetanjem DNK koja kodira Fab' fragment antitela u ekspresioni vektor za prokariot, ili ekspresioni vektor za eukariot, i uvođenjem tog vektora u prokariot ili eukariot (po potrebi) radi izvođenja njegove ekspresije.

[0054] scFv prema ovom otkrivanju se može proizvesti obezbeđivanjem cDNK koja kodira VH i VL domene kako je prethodno opisano, konstruisanjem DNK koja kodira scFv, umetanjem te DNK u ekspresioni vektor za prokariot, ili ekspresioni vektor za eukariot, a zatim uvođenjem ekspresionog vektora u prokariot ili eukariot (po potrebi) radi eksprimiranja scFv. Da bi se generisao humanizovani scFv fragment, dobro poznata tehnologija koja se naziva CDR kalemljenje može se primeniti, koja uključuje biranje komplementarno određujućih regiona (CDR) od donorskog scFv fragment, i njihovo kalemljenje na okvir humanog scFv fragmenta poznate tro-dimenzionalne strukture (videti,

npr., WO98/45322; WO 87/02671; US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494).

[0055] Ovde su opisane modifikacija(e) aminokiselinske sekvence antitela koja su ovde opisana. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antitela. Poznato je da je humanizovano antitelo proizvedeno jednostavnim kalemljenjem samo CDR u VH i VL antitelima izvedenim iz ne-humanih životinja u FR od VH i VL humanog antitela, antigen vezujuća aktivnost je redukovana u poređenju sa onom koje ima originalno antitelo izvedeno iz ne-humane životinje. Smatra se da je nekoliko aminokiselinskih ostataka VH i VL ne-humanog antitela, ne samo u CDR već i u FR, direktno ili indirektno povezano sa antigen vezujućom aktivnošću. Samim tim, supstitucija ovih aminokiselinskih ostataka sa različitim aminokiselinskim ostatacima izvedenim iz FR od VH i VL humanog antitela redukovala bi vezujuću aktivnost.

[0056] Kako bi se rešio ovaj problem, kod antitela graftovanih sa humanim CDR, izvedeni su pokušaji da se identifikuju, među aminokiselinskim sekvencama od FR od VH i VL humanih antitela, aminokiselinski ostatak koji je direktno povezan sa vezivanjem za antitelo, ili koji ulazi u međusobnu reakciju sa aminokiselinskim ostatkom od CDR, ili koji održava tro-dimenzionalnu strukturu antitela i koji je direktno povezan sa vezivanjem za antigen. Redukovana antigen vezujuća aktivnost može se povećati zamenom identifikovanih aminokiselina aminokiselinskim ostacima originalnog antitela izvedenog od ne-humane životinje.

[0057] Modifikacije i promene mogu se izvesti u strukturi antitela prema ovom otkrivanju, i u DNK sekvencama koje ih kodiraju, i dalje dobijajući funkcionalni molekul koji kodira antitelo sa poželjnim karakteristikama. Izvođenjem promena u amino sekvencama, hidropatski indeks aminokiselina može biti uzet u obzor. Značaj hidropatskog aminokiselinskog indeksa u dodeljivanju interaktivne biološke funkcije na proteinu generalno je shvaćeno u struci. Prihvaćeno je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi dobijenog proteina, koji sa druge strane definiše interakciju tog proteina sa drugim molekulima, na primer, enzimima, supstratima, receptorima, DNK, antitelima, antigenima, i slično.

Svakoj aminokiselini dodeljen je hidropatski indeks na bazi karakteristika njihove hidrofobnosti i naelektrisanja, a oni su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8) ; fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).

[0058] Dalji način izvođenja prema ovom otkrivanju takođe obuhvata varijante koje čuvaju funkcije antitela prema ovom otkrivanju.

"Varijante koje čuvaju funkcije" su one kod kojih je dati aminokiselinski ostatak u proteinu ili enzimu has promenjen bez menjanja ukupne konformacije i funkcije polipeptida, uključujući, bez ograničavanja, zamenu aminokiseline sa jednom koja ima slične osobine (kao što je, na primer, polarnost, potencijal vezivanja vodonika, kiselost, baznost, hidrofobnost, aromatičnost, i slično).

[0059] Aminokiseline koje se razlikuju od onih indikovanih kao sačuvane mogu se razlikovati u proteinu tako da procentualna proteinska ili aminokiselinska sekvenciona sličnost između bilo koja dva proteina

1

sličnih funkcija može da varira i može biti, na primer, od 70 % do 99 % kako je određeno u skladu sa šemom poravnavanja kao što je Klaster Postupkom, pri čemu je sličnost na bazi MEGALIGN algoritma.

[0060] "Varijanta koja čuva funkcije" takođe uključuje polipeptid koji ima najmanje 60 % aminokiselinskog identiteta kako je određeno BLAST ili FASTA algoritmima, poželjno najmanje 75 %, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90 %, i još poželjnije najmanje 95%, i koji ima iste ili suštinski slične osobine ili funkcije kao nativni ili roditeljski protein sa kojim se poredi. Dve aminokiselinske sekvence su "suštinski homologne" ili "suštinski slične" kada je više od 80 %, poželjno više od 85 %, poželjno više od 90 % aminokiselina identično, ili više od oko 90 %, poželjno više od 95 %, slično (funkcionalno identično) duž cele dužine kraće sekvence. Poželjno, slične ili homologne sekvence identifikovane su poravnavanjem koje primenjuje, na primer, GCG (Genetics Computer Group, Uputsvo za upotrebu za GCG Pasket, Verzija 7, Madison, Wisconsin) program za slaganje, ili bilo koji od algoritama za poređenje sekvenci kao što je BLAST, FASTA, itd.

[0061] Na primer, određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama u strukturi proteina bez značajnog gubitka aktivnosti. Kako interaktivni kapacitet i priroda proteina definišu biološku funkcionalnu aktivnost proteina, određene aminokiselinske supstitucije mogu se izvesti u sekvenci proteina, i, naravno, u njegovoj DNK koja kodira sekvencu, nedobijajući protein sa sličnim osobinama. Tako je zamišljeno da se različite promene mogu izvesti u sekvencama antitela prema ovom otkrivanju, ili odgovarajućim DNK sekvencama koje kodiraju pomenuta antitela, bez značajnog gubitka njihove biološke aktivnosti.

[0062] struci je poznato da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju slični hidropatski indeks ili ocenu, a i dalje rezultuju u proteinu sa sličnom biološkom aktivnošću, tj. i dalje daju biološki funkcionalno ekvivalentan protein. Kao što je gore navedeno, aminokiselinske supstitucije su prema tome generalno na bazi relativne sličnosti supstituenata bočnog lanca aminokiselina, na primer, njihove hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanja, veličine, i slično. Primerne supstitucije koje u obzir uzimaju razne gorenavedene karakteristike su dobro poznate stručnjaku iz ove oblasti i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin. Još jedna vrsta aminokiselinske modifikacije antitela prema ovom otkrivanju može biti korisna za menjanje originalnog glikozilacionog obrasca antitela. Pod "menjanjem" podrazumeva se brisanje jedne ili više ugljenohidratnih grupa pronađenih u antitelu, i/ili dodavanjem jednog ili više mesta glikolizacije koja nisu prisutna u antitelu.

[0063] Glikozilacija antitela tipično je N-linkovana. "N-linkovana" odnosi se na pričvršćivanje ugljenohidratne grupe na bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagini-X-treonin, gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu osim prolina, su prepoznavajuće sekvence za enzimatsko pričvršćivanje ugljenohidratne grupe za asparaginski bočni lanac. Na taj način, prisustvo bilo kog od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikolizacije.

Dodavanje mesta glikolizacije antitelu pogodno se izvodi menjanjem aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-linkovana mesta glikolizacije). Još jedna vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimatsko kuplovanje glikozida za antitelo. Ove procedure su poželjne zbog toga što ne zahtevaju proizvodnju antitela u ćeliji domaćinu koja ima glikozilacione sposobnosti za N- ili O-linkovanu glikozilaciju. Zavisno od primenjenog načina kuplovanja, šećer(i) mogu biti vezani za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidril grupe kao što su one od cisteina, (d) slobodne hidroksil grupe kao što su one od serina, treonina, orhidroksiprolina, (e) aromatični ostaci kao što su oni od fenilalanina, tirozina, ili triptofana, ili (f) amidna grupa glutamina. Na primer, takvi postupci opisani su u WO87/05330.

Uklanjanje bilo koje ugljenohidratne grupe prisutne na antitelu može se postići hemijski ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje antitela jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline, ili jednakom jedinjenju. Ovaj tretman rezultuje u cepanju većine ili svih šećera osim vezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), ostavljajući antitelo netaknuto. Enzimatsko cepanje ugljenohidratnih grupa na antitelima može se postići primenom raznih endo-i egzo-glikozidaza.

[0064] Još jedna vrsta kovalentne modifikacije antitela obuhvata vezivanje antitela za jedan od raznih neproteinskih polimera, npr., polietilen glikol, polipropilen glikol, ili polioksialkyleni, na način naveden u US Patent Br.4,640, 835; 4,496, 689; 4,301, 144; 4,670, 417; 4,791, 192 ili 4,179,337. Takođe može biti poželjno da se modifikuje antitelo ovog pronalaska u odnosu na efektoriku funkciju, npr. tako da se ojača antigen-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost (ADCC) i/ili komplement-zavisna citotoksičnost (CDC) antitela. To se može postići uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu antitela. Alternativno ili dodatno, cisteinski ostatak(ci) mogu se uvesti u Fc region, čime se omogućava obrazovanje među-lančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može da ima poboljšan kapacitet internalizacije i/ili povećano komplement-posredovano ubijanje ćelija i/ili antitelo-zavisnu celularnu citotoksičnost (ADCC) (Caron PC. et al. J Exp Med.1992 Oct 1;176(4):1191-5 i Shopes B. J Imunol.1992 May I;148(9):2918-22).

Terapeutske primene antitela ovog pronalaska

[0065] Pronalazači su pokazali da neka antitela, poput mAb 20.1 i 7.2, aktiviraju citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i proliferaciju Vγ9/Vδ2 T ćelija, i time mogu biti upotrebljene za prevazilaženje imunosupresivnih mehanizama zapaženih kod pacijenata obolelih od karcinoma i tokom hroničnih infekcija. Neka antitela kostimulišu T ćelije zajedno sa CD3-TCR, ili kostimulišu T ćelije pored CD28-B7 kostimulacije; pomenuta antitela mogu biti upotrebljena u istim terapeutskim primenama. Neka antitela povećavaju preživljavanje monocita i dendritskih ćelija; pomenuta antitela mogu biti upotrebljena u istim terapeutskim primenama.

1

[0066] Ovo otkrivanje odnosi se na mAb 20.1 ili 7.2 ili njihov derivat za upotrebu u terapiji. Ovo otkrivanje odnosi se na mAb 20.1 ili 7.2 ili njihov derivat za upotrebu za tretiranje kancera ili hronične infekcije.

[0067] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na postupak za tretiranje kancera ili hronične infekcije, pri čemu pomenut postupak obuhvata fazu davanja subjektu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine od mAb 20.1 ili 7.2 ili njihovog derivata.

[0068] Primeri kancera uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine hematološki maligniteti kao što je B-ćelijska limfoidna neoplazma, T-ćelijska limfoidna neoplazma, ne-Hodžkinov limfom (NHL), B-NHL, T-NHL, hronična limfocitna leukemija (CLL), mali limfocitni limfom (SLL), limfom ćelija omotača (MCL), NK-ćelijska limfoidna neoplazma i neoplazma ćelija mijeloidne loze.

Primeri ne-hematoloških kancera uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine kancer kolona, kancer dojke, kancer pluća, kancer mozga, kancer prostate, kancer glave i vrata, kancer pankreasa, kancer bešike, kolorektalni kancer, kancer kostiju, kancer grlića materice, kancer jetre, oralni kancer, kancer jednjaka, kancer štitne žlezde, kancer bubrega, kancer želuca, kancer testisa i kancer kože.

[0069] Primeri hroničnih infekcija uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine virusne, bakterijske, parazitske ili glivične infekcije kao što je hronični hepatitis, plućne infekcije, infekcije donjeg respiratornog trakta, bronhitis, grip, upala pluća i polno prenosive bolesti. Primeri virusnih infekcija uključuju uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine hepatitis (HAV, HBV, HCV), herpes simpleks (HSV), herpes zoster, HPV, grip (Flu), SIDA i SIDA povezan kompleks, male boginje (varičele), uobičajena prehlada, citomegalovirusna (CMV) infekcija, velike boginje (variola), Kolorado krpeljska groznica, denga groznica, ebola hemoragična groznica, bolest nogu i usta, lasa groznica, morbile, marburg hemoragična groznica, infektivna mononukleoza, zauške, norovirus, poliomijelitis, progresivna multifokalna leukencefalopatija (PML), besnilo, rubeola, SARS, virusni encefalitis, virusni gastroenteritis, virusni meningitis, virusna upala pluća, bolest zapadnog nila i žuta groznica. Primeri bakterijskih infekcija uključuju uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine upala pluća, bakterijski meningitis, kolera, difterija, tuberkuloza,antraks, botulizam, bruceloza, kampilobakterioza, tifus, gonoreja, listerioza, lajmska bolest, reumatična groznica, pertusis (veliki kašalj), kuga, salmoneloza, skarlet groznica, šigeloza, sifilis, tetanus, trahoma, tularemija, tifuidna groznica, i infekcije urinarnog trakta.

Primeri parazitskih infekcija uključuju uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine malarija, lajšmanijaza, tripanosomoza, šagasova bolest, kriptosporidioza, fascioliaza, filariaza, amebične infekcije, giardiaza, infekcija glistama, šistosomiaza, taeniaza, toksoplazmoza, trihineloza, i tripanozomiaza.

Primeri glivičnih infekcija uključuju uključuju, ali se ne ograničavaju na, grupu koju čine kandidijaza, aspergiloza, kokcidioidomikoza, kriptokokoza, histoplazmoza i tinea pedis.

[0070] mAb 20.1 ili 7.2 ili njihov derivat mogu biti upotrebljene kao vakcinacioni adjuvans za tretiranje kancera ili hronične infekcije.

1

[0071] Ovo otkrivanje odnosi se na vakcinu za tretiranje kancera ili hronične infekcije koja obuhvata mAb 20.1 ili 7.2 ili njihov derivat.

Ovo otkrivanje odnosi se na komplet za tretiranje kancera ili hronične infekcije koja obuhvata:

a) mAb 20.1 ili 7.2 ili njihov derivat; i

b) vakcinu za tretiranje kancera ili hronične infekcije.

[0072] Dva elementa kompleta mogu se davati vremenski konkominantno ili sekvencijalno.

[0073] Primeri vakcine za tretiranje kancera ili hronične infekcije uključuju, ali se ne ograničavaju na vakcine protiv virusnih, bakterijskih, parazitskih ili glivičnih infekcija kao što je HIV i HBV i vakcine protiv sa virusom povezanih kancera (primera radi HPV ili HBV) ili anti kancer vakcine primera radi upotrebljene za tretiranje pacijenata obolelih od melanoma, leukemije, kancera dojke, kancera pluća.

[0074] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata antitelo ovog pronalaska.

[0075] Prema tome, antitelo prema ovom otkrivanju može biti kombinovano sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, i opciono matricama za produženo oslobađanje, kao što su biorazgradivi polimeri, radi formiranja terapeutske kompozicije.

"Farmaceutski" ili "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekulske entitete i kompozicije koje ne proizvode štetne, alergijske ili druge neželjene reakcije kada se daju sisaru, naročito čoveku, po potrebi. Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens odnosi se na ne-toksični čvrst, polu-čvrst ili tečni punilac, razblaživač, koji enkapsulira materijal ili pomoćnu formulaciju bilo koje vrste.

[0076] Oblik farmaceutskih kompozicija, način davanja, doza i režim prirodno zavise od stanja koje se tretira, težine bolesti, starosti, mase, i pola pacijenta, itd.

[0077] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju mogu se formulisati za topikalno, oralno, parenteralno, intranazalno, intravenozno, intramuskularno, subkutano ili intraokulrno davanje i slično.

[0078] Poželjno, farmaceutske kompozicije sadrže nosače koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju sposobnu da se injektuje. One određenije mogu biti izotonični, sterilni, slani rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično ili mešavine takvih soli), ili suve, naročito zamrzavanjem osušene kompozicije koje nakon dodavanja, zavisno od slučaja, sterilne vode ili fiziološkog slanog rastvora, omogućavaju konstituisanje injektabilnih rastvora.

[0079] Doze upotrebljene za davanje mogu se prilagoditi kao funkcija raznih parametara, a određenije kao funkcija upotrebljenog načina davanja, relevantne patologije, ili alternativno poželjnog trajanja tretmana. Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije, efektivna količina antitela može se rastvoriti ili dispergovati u farmaceutski prihvatljiv nosač ili vodenu podlogu. Farmaceutski oblici pogodni za injektabilnu primenu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, kikiriki ulje ili vodeni propilen glikol; i sterilni praškovi za ekstemporalni pripravak

1

sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do određene mere da bi se omogućila tečljivost kroz špric. Mora biti stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti konzervirana protiv kontaminacije mikroorganizmima, kao što su bakterija i gljivice.

[0080] Rastvori aktivnog jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi pogodnoj umešanoj sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima, i njihovim mešavinama i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i primene, ovi preparati sadrže konzervanse koji sprečavaju rast mikroorganizama.

Antitelo prema ovom otkrivanju može se formulisati u kompoziciju u neutralnom ili slanom obliku. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju adicione soli sa kiselinama (obrazovane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje su obrazovane sa neorganskim kiselinama kao što je, na primer, hlorovodnična ili fosforna kiselina, ili takvim organskim kiselinama kao što je sirćetna, oksalna, vinska, bademova, i slično. Soli obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu biti izvedene od neorganskih baza kao što je, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum, ili feri hidroksidi, i takvih organskih baza kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.

[0081] Nosač takođe može biti rastvarač ili disperziona podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne mešavine, i biljna ulja.

[0082] Odgovarajuća tečljivost se može održavati, na primer, primenom obloga, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i primenom surfaktanata.

[0083] Prevencija od uticaja mikroorganizama može se izvesti raznim antibakterijskim i antiglivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima, poželjno će biti da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri ili natrijum hlorid.

[0084] Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se izvesti primenom u kompozicijama agenasa za odlaganje apsorpcije, na primer, aluminijum monostearat i želatin.

[0085] Sterilni injektabilni rastvori pripremaju se inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u pogodni rastvarač sa raznim drugim sastojcima koji su prethodno navedeni, po potrebi, praćeno sterilizacijom filtriranjem.

Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem raznih stelisanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži bazni disperziona podloga i potrebne sastojke odabrane od gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pipremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su tehnike sušenja u vakuumu, sušenja zamrzavanjem koje daju prah aktivnog sastojka dodavanjem bilo kog njihovog poželjnog sastojka od prethodno sterilisanih-filtriranih rastvora.

1

[0086] Pripema više, bolje koncetrovanijih rastvora za direktno injektovanje takođe je zamišljeno, gde je predviđena primena DMSO kao rastvarača da bi se postigla izuzetno rapidna penetracija, što daje visoke koncentracije aktivnih agenasa u malom delu tumora.

[0087] Nakon formulisanja, rastvori se daju na način kompatibilan sa doznom formulacijom i u onoj količini koja je terapeutski efektivna. Formulacije se lako daju u različitim doznim oblicima, kao što je vrsta prethodno opisanih injektabilnih rastvora, ali se takođe mogu primeniti i kapsule koje oslobađaju lek i slični oblici.

[0088] Za parenteralno davanje u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba da je pogodno puferovan ako je potrebno, a tečni razblaživač prvo preveden u izotonično stanje sa dovoljno slanog rastvora ili glukoze.

[0089] Ovi određeni vodeni rastvori, naročito su pogodni za intravenozno, intramuskularno, subkutano i intraperitonealno davanje. U vezi sa tim, sterilna vodena podloga koja se može primeniti biće poznat stručnjaku iz ove oblasti u skladu sa ovim otkrivanjem. Na primer, jedna doza mogla bi da se rastvori u 1 ml izotoničnog NaCl rastvora i, ili da se doda u 1000 ml hipodermoklizne tečnosti ili injektuje na predloženo mesto za infuziju, (videti na primer, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. izdanje, strane 1035-1038 i 1570-1580). Može doći do nekih varijacija u dozama zavisno od stanja subjekta koji se tretira. Osoba odgovorna za davanje će, od slučaja do slučaja, odrediti pogodnu dozu za pojedinačnog subjekta.

[0090] Antitela prema ovom otkrivanju mogu se formulisati u terapeutsku mešavinu da obuhvataju oko 0.0001 do 1.0 miligrama, ili oko 0.001 do 0.1 miligrama, ili oko 0.1 do 1.0 ili čak oko 10 miligrama po dozi ili slično. Takođe se može dati više doza. Pored jedinjenja formulisanog za parenteralno davanje, kao što je intravenozna ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr. tablete ili druge čvrste oblike za oralno davanje; kapsule sa vremenski odloženim oslobađanjem; i bilo koji drugi oblik koji se trenutno upotrebljava.

[0091] U određenim načinima izvođenja, primena lipozoma i/ili nanočestica predviđena je za uvođenje antitela u ćelije domaćine. Formulisanje i upotreba lipozoma i/ili nanočestica poznati su stručnjacima iz ove oblasti.

[0092] Nanokapsule generalno mogu da zarobe jedinjenja na stabilan i reproducibilan način. Da bi se izbegli štetni efekti usled intracelularnog polimernog prekomernog uvođenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0.1 µm) generalno su konstruisane primenom polimera koji se može razgraditi in vivo. Biorazgradive polialkil-cijanoakrilatne nanočestice koje ispunjavaju ove zahteve predviđene su za upotrebu u ovom otkrivanju, a takve čestice mogu se lako pripremiti.

[0093] Lipozomi su obrazovani od fosfolipida koji su dispergovani u vodenoj podlozi i spontano obrazuju višeslojne koncentrične dvoslojne vezikule (takođe nazvane višeslojne vezikule (MLV)). MLV generalno imaju prečnik od 25 nm do 4 µm. Sonikacija MLV rezultuje u formulisanju malih jednoslojnih vezikula

1

(SUV) sa prečnikom u opsegu od 200 do 500 A, koje sadrže vodeni rastvor i jezgru. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske snage i prisustva dvovalentnih katjona.

[0094] Ovo otkrivanje dalje će biti ilustrovano u pogledu pratećih crteža i primera.

CRTEŽI

[0095]

Fig.1:

A: BT3 receptori konstitutivno su eksprimirani na površini monocita i iDC. Ekspresija na sveže izolovanim monocitima i iDC primenom oba klonska 20.1 anti-BT3 mAb su prikazane. Pokazani eksperiment je prikaz pet ispitivanih donora (intenzitet varijacije fluorescencije između pet eksperimenata bio je <2%).

B: BT3 ligacija obezbeđuje signal preživljavanja za monocite i iDC. Sveže izolovani monociti (gornji red) i iDC (donji red) stimulisani su sa plastikom-obloženim mAb (anti-CD19, i anti-BT3) ili 20 ng/ml GM-CSF kako je indikovano. Posle stimulacije tokom 72 sata, ćelije su sakupljene i analizirane na Aneksin V vezivanje, kao marker apoptotičkih ćelija. Brojevi u uglovima odgovaraju procentu pozitivnih ćelija za Aneksin V. Prikazani podaci su prikaz pet nezavisnih eksperimenata.

C: BT3 angažovanje povećava ekspresiju kostimulatornih molekula na površini monocita.

D: BT3 angažovanje povećava ekspresiju kostimulatornih molekula na površini od iDC.

Fig.2: Regulacija AKT fosforilacije i ERK fosforilacije na CD277 aktiviranim CD4+ T ćelijama.

Prečišćene CD4+ T ćelije od odmrznutih PBMC od 4 zdrava donora stimulisan ili ne antitelomobloženim epoksidnim dinaperlama (1µg/ml anti-CD3 plus različite koncentracije anti-CD277.20.1klona ili IgG1 (izotipna kontrola). Svaka 2, 5, 10 i 30 minuta, intracelularna fosforilacija AKT i B, ERK na CD4+ T ćelijama merena je protočnom citometrijom. Ovi podaci su prikaz čeiri nezavisna ispitivanja.

Rezultati su prikazani kao MFI (ekspresija srednjeg intenziteta fluorescencije) na CD4+ T ćelijama u različitim vremenskim tačkama posle tretmana tokom 2-30 minuta.

Fig.3: CD277 je kostimulatorni molekul CD4+ T ćelija

CD4+ T ćelije prečišćene su od PBMC od 4 zdrava donora. Prečišćene CD4+ T ćelije stimulisane su antitelom-obloženim epoksidnim dinaperlama (1µg/ml anti-CD3 i 2µg/ml anti-CD28 plus različite koncentracije anti-CD277 (20.1) ili IgG1 (izotipna kontrola) Supernatanti su sakupljeni na dan 2 uzgajanja za citokinski ogled pomoću ELISA. INFg, IL-2 i IL-10 proizvodni ogled.

Fig.4: Ekspresija CD277 u limfnim čvorovima

Ekspresioni profili za CD277 i PD1 u limfoidnim organima. Žive T ćelije iz limfoidnog tkiva razlikuju se bojenjem anti-CD14 (CD14 negativne ćelije), a vivid. T folikularne Pomoćne ćelije dalje su

2

sprovedene primenom bojenja sa mAb CD4, ICOS i CXCR5. Rezultati su prikazani pomoću MFI (srednji intenzitet fluorescencije). Ovi podaci su prikaz 7 nezavisnih ispitivanja. p vrednosti izračunate su primenom Mann-Witney upareni test da bi se uporedile razlike između CD277 ili PD1 ekspresija na podskupovima T ćelija.

* p < 0.05; ** 0.001 < p <0.01; *** p < 0.001. p >0.05 nije prikazano.

Fig.5: Anti-CD277 mAb 20.1 stimuliše širenje Vγ9Vδ2 T ćelija

A: ex vivo širenje (15 dana+IL-2): PBMC stimulisane su pomoću 20.1 mAb abd IL-2, a Vγ9Vδ2 T ćelije praćene su bojenjem pomoću Vγ9Vδ2 T ćelijski specifičnim mAb.

B: CFSE ogled (4 dana+IL-2): PBMC stimulisane su pomoću 20.1 mAb abd IL-2, a Vγ9Vδ2 Proliferacija T ćelija praćena je CFSE analizom.

Fig.6: Aktivirajuće (20.1) i inhibitorno (103.2) CD277 mAb regulacione Vγ9Vδ2 T ćelije praćene su bojenjem pomoću Vγ9Vδ2 ćelijski specifičnim mAb.

A: Antagonist CD77 mAb 103.2 inhibira fosfoantigenom posredovanom aktivacijom Vγ9Vδ2 B: Antagonist CD77 mAb 103.2 ne inhbira CD3 posredovane aktivacijom Vγ9Vδ2 C: 103.2 BTN3 mAb inhibira fosfoantigenom-indukovanu aktivaciju Jurkat TCR Vγ9/Vδ2 T ćelija kako je određeno pomoću CD69 ekspresije.

Fig.7: CD277 potencira antitumorsku citolizu posredovanu Vγ9Vδ2 T ćelijama Tumorske ćelijske linije inkubirane su sa Vγ9Vδ2 sa ili bez 20.1 agonist mAb. Aktivacija Vγ9Vδ2 procenjena je pomoću CD107a/b degranulacije.

PRIMER 1

Materijali i postupci

Ćelijske kulture

[0096] Uzorci krvi dobijeni su od 5 zdravih dobrovoljaca odabranih od članova osoblja, posle nakon informisanog pristanka. Monociti odvojeni su od mononuklearnih ćelija iz periferne krvi, i izolovani primenom MACS CD14 izolacionog kompleta (Miltenyi Biotech, Auburn, CA USA). Monociti su uzgajani tokom 5 dana sa 200 ng/ml rekombinantnog humanog GM-CSF i 10 ng/ml rekombinantnog humanog IL-4 (Schering-Plough Research Institute). Ove ćelije nazvane su nezrele dendritske ćelije (iDC). Da bi se postigla stimulacija, monociti i iDC uzgajani su sa 10 ng/ml LPS, ligandom za TLR4, 30 µg/ml R848 (Sigma-Aldrich, Milano, Italy), ligandom za TLR7/8 i sa 2.5 mg/ml poli (I:C) (Sigma-Aldrich), ligandom za TLR3, i sakupljene su posle 48h. Ćelije su uzgajane u RPMI 1640 dopunjena sa 10% toplotom-inaktiviranim FCS, 5mM L-glutaminom i 50 IU/ml penicilin-streptomicin (u daljem tekstu označena kao kompletna podloga).

Protočna citometrija i Antitela

[0097] Monociti i iDC pre i posle stimulacije analizirani su imunofluorescencionom protočnom citometrijom (FACScalibur Becton Dickinson, Milano, Italy) da bi se verifikovala njihovo aktivacioni stanje. U tom smslu, mAb specifična za CD80, CD86, HLA-DR, CD1a, CD14 (BD Becton Dickinson), BT3 (klon 20.1, IgG1) i BT3 Fab2prethodno su odabrana, prečišćena i okarakterisana (Bensussan and Olive, 2005, Compte et al., 2004) ili su upotrebljeni irelevantni molekuli (anti-CD19, Becton Dickinson, i anti-CD31, klon Moon-1, obezbeđeni od strane F. Malavasi, oba IgG1). Sva dostupna anti-BT3 mAb nemoguće je razlikovati među ta tri člana ove familije (BT3.1, BT3.2, ili BT3.3), verovatno zbog njihove visoke homologije sekvenci (Compte et al., 2004, Bensussan and Olive, 2005). Kao dalja kontrola, da bi se blokirao moguć efekat količine u tragovima endotoksina, polimiksin B (10 µg/ml, Sigma-Aldrich) dodat je anti-BT3 mAb 20.1 pre dodavana ćelija.

Kao kontrola uvođenja za Western blot analize, upotrebljeno je anti-tubulin mAb (klon: 6-11B-1, IgG1, Invitrogen, Milano, Italy).

Detekcija apoptoze

[0098] Monociti i iDC uzgajani su na plastici obloženoj sa anti-BT3 mAb (klon 20.1) ili sa izotip-uparenim irelevantnim mAb. Kao kontrola, ćelije su stimulisane sa 20 ng/ml rekombinantnog humanog GM-CSF (Schering-Plough Research Institute). Posle tri dana, ćelije su sakupljene, obojene sa Aneksin V-FITC (Bender MedSystems, Wien, Austria) i analizirane protočnom citometrijom.

Kvantitativna RT-PCR

[0099] qRT-PCR analiza je izvedena sa Applied Biosystems 7900HT PCR brzim sistemom koji radi u realnom vremenu primenom Taqman detekcija. Ukratko, ukupna RNK izolovana je iz THP-1 ćelija primenom standardnog TRIzol reagens protokola (Invitrogen Life Technologies).2 µg dobijene RNK reverzno je transkriptovano primenom oligo(dT). svaki PCR ogled je izveden u 25 µl reakciji koja sadrži 2x TaqMan univerzalni miks (Applied Biosystems) reagens, 20X prajmeri i 2 µl cDNK (jednako 40 ng ukupne RNK). Uslovi toplotnog ciklusa bili su 95 °C tokom 15 s i 60 °C tokom 60 s (40 ciklusa). Hvatanje fluorescencije zabeleženo je na ABI Prism 7900HT skeneru, a Ct (granični ciklus) izračunat je za svaki ogled (Softver za sistem za detekciju sekvenci 2.3, Applied Biosystems). Podaci su normalizovani primenom GAPDH kao endogena kontrola (ΔCt = Ctciljani gen- CtGAPDH). Više ΔCt odgovaraju nižoj ekspresiji analiziranog gena. BT3.1, BT3.2, BT3.3 i GAPDH TaqMan ogledi genske ekspresije kupljeni su od Applied Biosystems.

Statističke analize

[0100] Statistička analiza je izvedena pomoću GraphPad Prism4 softvera 4.0 (GraphPad Software Inc., CA, USA) primenom Student-ovog t testa. Za procenu proizvodnje citokina, podaci su analizirani sa jednosmernom analizom varijance (ANOVA). Za procenu idukcije apoptoze, podaci su analizirani sa neparametarskim testom. Nivo značaja podešen je na P<0.05.

Rezultati

BT3 receptori konstitutivno su eksprimirani na površini monocita i iDC.

[0101] kako bi se ispitala ekspresija BT3, odabran je panel zdravih donora da bi se dobili monociti i iDC. BT3 ekspresija procenjena je na sveže izolovanim monocitima i iDC primenom klon 20.1 anti-BT3 mAb (Fig.1A). Fig.1A prikazuje BT3 ekspresiju na sveže izolovanim monocitima i iDC primenom klon 20.1 anti-BT3 mAb. Diferencijacija monocita u DC verifikovana je putem ekspresionih ćelijskih površinskih markera: CD14 je nizvodno regulisan i ostao je nizak i kod nezrelih i zrelih DC, dok je CD1a i HLA-DR uzvodno regulisan (podaci nisu prikazani). Pokazani eksperiment je prikaz pet različitih donora. Nivo ekspresije BT3 blago je viši na monocitima. Pored toga, analizirana je ekspresija BT3 praćena stimulacijom ovih ćelija sa LPS, poli (I:C) i R848, ligandima za TLR4, TLR3 i TLR7/8, tim redom. Aktivacija putem TLR (Toll slični receptori) nije značajno menjala ćelijsku površinsku ekspresiju od BT3 (podaci nisu prikazani). Može se izvesti da su BT3 receptori konstitutivno eksprimirani na površini monocita i iDC, nezavisno od njihovog aktivacionog stanja.

[0102] Konačno, qRT-PCR analiza potvrdila je imunofenotipske rezultate koji pokazuju da su sva tri receptora BT3 familije eksprimirana od strane THP-1 ćelija. Detaljnije, pronađeno je da je BT3.2 bilo najreprezentativnije (deset puta više BT3.2 od BT3.1 i BT3.3) (podaci nisu prikazani).

BT3 ligacija obezbeđuje signal preživljavanja za monocite i iDC u kulturi.

[0103] Kako je BT3 stabilno eksprimirana receptorska familija, ispitana je sposobnost BT3 angažovanja u modifikovanju životnog veka ex vivo monocita i iDC uzgajanih bez faktora preživljavanja (tj. kompletna podloga sa serumom) tokom 72 sata. Stimulacija ćelija pomoću plastikom-obloženog mAb upotrebljena radi angažovanja BT3 na površini monocita i iDC. Približno 77.98% monocita tretiranih sa mAb specifičnim za BT3 preživelo je bez endogenih faktora preživljavanja tokom 3 dana (opseg 51.13-77.98%, p=0.0040) (Fig.1B, gornji red, prikazuje reprezentativni eksperiment od pet). Ovaj efekat nešto je manji od onog dobijenog putem GM-CSF tretmana (81.22%, opseg 60.41-83%, p=0.0278). U kontrolnim kulturama, tj. u prisustvu plastikom-obloženog irelevantnog mAb (anti-CD19 mAb), efekat preživljavanja bio je minimalan, a veoma visoka proporcija apoptotičkih monocita (Annexin-V-pozitivne ćelije) je zapažena (oko 95.48% apoptotičkih ćelija izmereno je u samoj podlozi i oko 88.79% u uslovima sa plastikom-obloženim irelevantnim mAb, sa opsegom preživljavanja 0.8-11.74% i 1.08-11.21% tim redom, gde je p N.S.). Slični rezultati dobijeni su analiziranjem efekta na iDC preživljavanju (Fig.1B, donji red, prikazuje reprezentativni eksperiment od pet). Aktivacija iDC putem BT3 uspela je delimično da inhibira apoptozu iDC tokom 72-h perioda uzgajanja (56.75% zdravih-vitalnih ćelija naspram 85.97% za

2

preživljavanje GM-CSF tretmanom, opseg 53.13-60.71%, p=0.00044, i 71.01-85.97%, p=0.0040 tim redom). Irelevantni izotip-upareno mAb nije menjalo prirodnu apoptozu DC (u poređenju sa samom podlogom i anti-CD19 mAb uslovima reprezentativnog eksperimenta od pet, opsega 0.8-24.12% i 0.9-26.97% preživljavajućih ćelija tim redom, p=0.3452). Sve zajedno, ovi rezultati sugerišu da su BT3 receptori sposobni da promovišu monocite i iDC preživljavanje i da produže trajanje ćelijskih odgovora atenuiranjem apoptoze. Za oba ćelijska tipa, razlike u preživljavanju praćene anti-BT3 naspram kontrolnim izotip-uparenim mAb statistički je značajna (kao i za GM-CSF tretman). Pored toga, efekat doznog odgovora anti-BT3 mAb na preživljavanje oba i monocita i iDC je očigledan (podaci nisu prikazani). Najniže anti-BT3 mAb razblaženje koje je moglo da promoviše dobar kapacitet preživljavanja iznosilo je 10µg/ml.

BT3 angažovanje povećava ekspresiju kostimulatornih molekula na površini monocita i iDC.

[0104] Da bi se ispitala uloga BT3 na primarne zapaljenske odgovore, sveže izolovani krvni monociti i iz monocita izvedene dendritske ćelije stimulisane su putem mAb, obložene na ploče za uzgajanje tkiva, ili TLR ligandima poznatim da stimulišu monocite i dendritske ćelije (LPS). Posle 24h stimulacije, obloženo anti-BT3 mAb bilo je sposobno da izazove aktivaciju monocita, kako je pokazano ushodnom regulacijom ćelisjkog površinskog kostimulatornog molekula CD86 (Fig.1C). Izotip-upareno kontrolno mAb (čiji se antigen ne eksprimira na ovim ćelijama), nije imalo značajan efekat. Prema tome, aktivacija zapažena primenom anti-BT3.1 mAb bila je specifična, a ne zbog angažovanja FcR. Unakrsno povezivanje bilo je potrebno za celularnu aktivaciju, budući da nikakav efekat nije zapažen sa ne-obloženim (rastvorljivim) anti-BT3 mAb (podaci nisu prikazani). Pored toga, aktivirajući efekat anti-BT3 mAb održavan je u prisustvu polimiksina B, čime se isključuje uloga nivoa endotoksina u tragovima.

[0105] Zanimljivo, CD86 ushodna regulacija nakon BT3 stimulacije slična je onoj zapaženoj sa TLR ligandom LPS. BT3 stimulacija takođe izaziva ushodnu regulaciju na monocitnoj površini CD80 i HLA-DR molekula (Fig.1C). Konzistentno, pronađena je povećana ekspresija CD80, CD86 i HLA-DR na iDC (Fig. 1D). Pored toga, slični rezultati dobijeni su primenom anti-BT3 Fab mAb (kao što je prikazano na Fig.1C i 1D na monocitima i DC tim redom). Ovi rezultati omogućavaju odbacivanje toga da signal kroz FcRs ne može biti odgovoran za ćeliju aktivaciju. Irelevantno mAb (anti-CD19) je negativna kontrola, dok je stimulacija putem TLR4 liganda za LPS bila pozitivna kontrola.

PRIMER 2

Materijali i postupci

Ćelijski preparat

[0106] Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) dobijene su od ydravih dobrovoljaca donera obezbeđeni od strane "Etablissement Français du Sang" (EFS-Marseille-France) i izolovane frakcionisanjem preko gradijenta gustine Lymphoprep© (Abcys). Humane CD4<+>T ćelije negativno su odabrane od izolovanih PBMC trošenjem ne-CD4<+>T ćelija magnetnim perlicama primenom T ćelije izolacionog kompleta II od Miltenyi Biotec®. Izolovane CD4 ćelije upotrebljene su za dalje eksperimente kada je čistoća bila veća od 90%.

Generisanje monoklonalnog antitela (mAb)

[0107] Mišje anti-humano sa programiranom smrću-1 (PD-1) mAB i tri različita klona mišjeg antihumanog CD277 prečišćena su od ascitesa u laboratoriji pronalazača: Anti-PD-1 (klon PD13.1 sa IgG1 izotipom) (ghiotto et al. Int Imunol., 2010), Anti-CD277 (klon 103.2 sa IgG2a izotipom, klonovi 20.1 i 7.2 oba sa IgG1 izotipom) (compte et al.). Anti-CD277 (klon 20.1) mAb obeležen je sa Alexa Fluor 647 primenom komercijalno dostupnog kompleta (Invitrogen, Eugene, OR).

Profil CD277 ekspresije na podpopulacijiama T ćelija

[0108] Odmrznute humane PBMC od četiri zdrava donora obojene su sa 5µl sledećeg mišjeg antihumanog monoklonalnog antitela na milion ćelija: ECD-konjugovano anti-CD3, PC5-konjugovano anti-CD14, PC5-konjugovano anti-CD19 (radi biranja CD3<+>CD14<->CD19<->ćelija) (sva od Beckman Coulter, Marseilles, France), Pacific Blue-konjugovano anti-CD4, Alexa700-konjugovano anti-CD8 (sva od BD Pharmingen (San Diego, USA)), APC-Alexa750-konjugovano anti-CD27 (od Caltag, Invitrogen, USA), PC7-konjugovano anti-CD45RA (od BD Biosciences), Alexa647-konjugovano anti-CD277 (klon 20.1, pripremljen u laboratoriji pronalazača). APC-konjugovano IgG1 (Beckman Coulter) upotrebljeno je kao kontrola, a LIVE/DEAD Komplet za bojenje mrtvih ćelija koje se mogu popraviti upotrebljen je za vijabilnost. Ćelije su inkubirane 20 minuta na 4°C zatim oprane dva puta u fosfatno-puferovanom slanom rastvoru (PBS, Lonza) fiksirane sa 2% paraformaldehidom, i analizirane na FACSAria protočnom citometru (BD Biosciences). Podaci su analizirani primenom FlowJo Softvera (TreeStar, Ashland, OR).

Kinetika CD277 ekspresionog profila na naivne CD4<+>T ćelije

[0109] Prečišćene CD4+ T ćelije (200 X 10<3>ćelije/bazenčić) od odmrznutih humanih PBMC uzgajane su tokom 96h u RPMI 164010% FBS u pločama sa ravnim dnom sa 96 bazenčića (Microtest™ 96, Becton Dickinson) sa prethodno na ploči imobilisanim mišjim anti-humanim CD3/CD28 ili ne (nestimulisane). Anti-CD3 (klon OKT3) i anti-CD28 (klon CD28.2, pripremljen u laboratoriji pronalazača) upotrebljena su pri 0.3µg/ml i 10µg/ml tim redom. Ćelije su smeštene u atmosferu 5% CO2na 37°C u vlažnom inkubatoru. Svaka 24h ćelije su transferovane in a ploča sa kupastim dnom sa 96 bazenčića (Nunc™, Denmark) i obojene sa sledećim mAb 30 minuta na 4°C: 3µl prečišćenog anti-PD-1 (klon PD-13.1, pripremljen u laboratoriji pronalazača) (giotto et al, int imunol.2010), oprane 3 puta u PBS- FBS 0.2%-azid 0.02%, zatim obojene sa PE-konjugovanim kozijim anti-mišjim (1/80, Beckman Coulter), oprane i

2

obojene sa 3µl svakog od sledećih mAb 30 minuta na 4°C: PC7-konjugovano anti-CD4, FITC-konjugovano anti-CD3 (sva od BD Biosciences) Alexa647-konjugovano anti-CD277 i 6µl od 7-AAD (BD Biosciences) za vijabilnost. Prečišćeno IgG1 ili APC-konjugovano IgG1 upotrebljeno je kao kontrola. Imunoobojeni ćelijski uzorci fiksirani sa 2% paraformaldehidom analiziranisu na BD FACS Canto (BD Bioscience). Podaci su analizirani primenom FlowJo Softvera (TreeStar, Ashland, OR).

Ekspresija CD277 u limfnim čvorovima

[0110] Ćelije izvučene iz limfnih čvorova su sakupljene od 7 pacijenata koji su pristali na to nakon informisanog pristanka. Mononuklearne ćelije dobijene su usitnjavanjem uzoraka svežeg tkiva u RPMI 164010% FBS. Detekcija ćelija folikularnih T pomoćnih ćelija (TFH) izvedena je inkubisanjem tokom 20 minuta na 4°C sa PE-konjugovanim anti-ICOS, biotinilovanim anti-CXCR5 (sva od BD Biosciences), PC5-konjugovanim anti-CD14, Pacific blue-konjugovanim anti-CD4 (sva od Beckman Coulter) i Kompleta za bojenje mrtvih ćelija koje se mogu popraviti LIVE/DEAD ©. Ćelije su zatim oprane u PBS i inkubirane sa anti-biotin-alofikocijanin-Alexa Fluorom 750 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tokom 20 minuta na 4°C. Posle bojenja, svaki ćelijski preparat opran je dva puta u PBS, fiksiran sa 2% paraformaldehidom, i analiziran na FACSAria protočnom citometru (BD Biosciences). Podaci su analizirani primenom FlowJo Softvera (TreeStar, Ashland, OR).

Profil CD277 ekspresije na NK ćelijama

[0111] Odmrznute žive NK ćelije (Live dead© negativne ćelije) odabrane su na bazi ekspresije CD56+CD3- od zdravih humanih PBMC posle 20 minuta inkubisanja na 4°C sa anti-CD277-Alexa647 (klon 20.1). Ćelije su dalje oprane dva puta u PBS (PBS, Lonza), zatim fiksirane sa 2% formaldehidom i analizirane na FACSAria© protočnom citometru (BD Biosciences). Podaci su analizirani primenom FlowJo Softvera (TreeStar, Ashland).

Funkcionalni ogledi na CD4+ T ćelijama primenom na ploči imobilisanih mAb

[0112] Prečišćene CD4+ T ćelije (200 X 10<3>ćelije/bazenčić) od odmrznutih humanih PBMC uzgajane su u RPMI 164010% FBS u pločama sa ravnim dnom sa 96 bazenčića (Microtest™ 96, BD) sa prethodno na ploči imobilisanim mišjim anti-humanim CD3 (klon OKT3)/CD28 (klon CD28.2) ili anti-CD3/anti-CD277 (klon 20.1) ili anti-CD3/izotipskom kontrolom (IgG1). Prečišćeno anti-CD3 upotrebljeno je pri 0, 3µg/ml. Anti-CD28, anti-CD277 i izotipska kontrola upotrebljeni su pri 10µg/ml. Ćelije su smeštene u atmosferu 5% CO2na 37°C u vlažnom inkubatoru. Posle 2 dana uzgajanja, proizvodnja citokina (Interleukin-2, IL-2 i Interferon gama, IFN-γ) izmerena je pomoću ELISA ogleda u skladu sa protokolom proizvođača (OptEIA, humano IFN-γ ili IL-2 Set, BD Pharmingen). Posle 5 dana, ćelije su obojene sa 3µl PE-konjugovanog anti-CD25 (BD Biosciences), i 5µl 7-AAD tokom 30 minuta na 4°C zatim oprane dva puta u PBS, fiksirane sa 2%

2

paraformaldehida i analizirane na BD FACS Canto (BD Bioscience). Podaci su analizirani primenom FlowJo Softvera (TreeStar, Ashland, OR).

Funkcionalni ogled on CD4+ T ćelijama sa aAPC i karboksifluorescein diacetat sukcinimidil diestarskim (CFSE) obeležavanjem

[0113] Humane CD4<+>T ćelije prečišćene su negativnom selekcijom od PBMC primenom magnetnih perlica (Miltenyi Biotec) u skladu sa protokolom proizvođača. CD4+ T ćelije su rutinski bile više od 97% čiste.

[0114] CD4<+>T ćelije obeležene su sa 0.5µM CFSE (Invitrogen) tokom 10 min na 37°C, oprane i stimulisane (1.5x10<5>ćelije/bazenčić) sa aAPC pri odnosu od 1:1 (ćelije prema perlicama) koji se sastoji od magnetnih perlica u triplikatu u pločama okruglog dna sa 96 bazenčića (Falcon; BD Biosciences). Kulture sui inkubirane na 37°C, 5% CO2 tokom 5 dana, a zatim je proliferacija CFSE obeleženih CD4<+>T ćelija izmerena protočnom citometrijom (FACS Canto, Beckman Coulter).

Funkcionalni ogled na NK ćelijama, citolitička aktivnost.

[0115] Fresh NK ćelije su sortirane sa Easy Sep® komplet za sertiranje negativnom selekcijom i inkubirane preko noći u podlozi dopunjenoj sa pod-optimalnim koncentracijama IL-2 (100 U/ml) i IL-15 (10ng/ml). NK ćelijski receptorske funkcije ispitane su u ponovo usmerenim citolitičkim eksperimentima protiv FcyR pozitivne P815 mastocitne mišje ćelijske linije. Ukratko, efektor ćelije inkubirane su sa P815 ćelijama prethodno obloženim tokom 30 minuta sa mAb od interesa (irelevantno mišje IgG1: 11 µg/ml, anti-NKp46: 1µg/ml, anti-DNAM: 5 µg/ml, anti-CD27720.1: 10 µg/ml) u skladu sa a 1:1 Efektor:Cilj (E/T) odnosom. Citotoksična ispitivanja izvedena su u 4-satnim ogledima u prisustvu GolgiStop® i rastvorljivog CD107 (a&b)-FITC (oba od BD Biosciences), posle čega su ćelije obojene za površinske markere (CD56-PeCy7 (Beckman Coulter, Imunotech), fiksirane i permeabilizovane (Citofix/Citoperm®) zatim obojene sa intracelularnim mAb (IFN-γ (Beckman Coulter, Imunotech)). Ćelije su konačno re-suspendovane u PBS 2% paraformaldehidu i ekstemporalno analizirane na BD FACS Canto® (BD Biosciences, San Jose, CA). Stepen aktivacije NK ćelija izmeren je na bazi procenta ćelija pozitivnih na CD107a i CD107b (degranulaciju) i/ili proizvodnju zapaljenskog citokina (IFN-γ).

Veštačke APC (aAPC)

[0116] Magnetne perlice (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal Biotech) obložen su sa sledećim mAb kako je opisano u Serriari et al. (serriari, ji 2010) : anti-CD3 (OKT3), anti-human CD28 (CD28.2), i/ili različite koncentracije anti-humanog CD277 (CD277, 20.1) ili IgG1 ili anti-MHC klasa I (MHC I) (YJ4) ili IgG1. Ove aAPC obložene su sa podoptimalnim anti-CD3 Ab (5%), podoptimalnim nivoima anti-CD28 Ab (10%), i bilo IgG1 Ab (CD3/CD28/IgG1), anti-CD277 Ab (CD3/CD28/CD277 IgG1) ili anti-MHC klasa I (CD3/28/

2

anti-MHC klasa I IgG1), konstituišući preostalih 85% proteina koji je dodat perlicama. Količina proteina održavana je konstantnom na 20 mg/ml dodavanjem kontrolnog IgG1.

ELISA za analizu citokina

[0117] Da bi se odredila proizvodnja citokina, supernatanti bez ćelija sakupljeni su na 48 h i ispitani na IL-2, IL-10 i IFN-γ pomoću ELISA primenom OptEIA kompleta (BD Pharmingen) u skladu sa instrukcijama proizvođača.

Imunohistohemija

[0118] CD277 imunobojenja izvedena su na ukupno zamrznutim sekcijama reaktivnih limfnih čvorova kako je prethodno opisano (25). Konačno razblaženje za CD277.20.1 mAb iznosilo je 1/800. Uzorci negativne kontrole pripremljeni su izostavljanjem primarnog mAb.

Skrining različitih transkripta bnt3a izoformi u PBMC od zdravih subjekata

[0119] Javni i lični Affymetrix U133+2 skupovi podataka prečišćenog CD8, CD4, GD i NK ćelija su sakupljeni. CD8 i CD4 podaci us dobijeni iz javnig GEO skupova podataka (Sharp et al.) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds), dok su NK i gama delta skupovi bili lični. Pronalazači su upotrebili Robustno višečipno uprosečavanje (RMA) sa ne-parametričkim kvantilnim algoritmom kao parametar normalizacije. RMA je primenjeno na sirove podatke sakupljene iz različitih serija. Kvantilna normalizacija i Loess-ova korekcija izvedeni su u R primenom Bioconductor-a i pridruženih paketa.

Probni set koji odgovara trima izoformama BTN3A dobijen je od normalizovanih skupova podataka, a odgovarajuće log vrednosti su linearizovane za grafičku reprezentaciju. Upotrebljeni su respektivni Affymetrix probni setovi koji odgovaraju BTN3A1, BTN3A2 i BTN3A3 izoformama : 201623_s_at, 213282_at, 204171_at

Stimulacija, protok fosfora i FACS bojenje

[0120] Humane CD4<+>T ćelije prečišćene su negativnom selekcijom od PBMC primenom magnetnih perlica (Miltenyi Biotec) u skladu sa protokolom proizvođača. CD4 T ćelije su rutinski bile više od 97% čiste. Ćelije su inkubirane 24 sata u RPMI 164010% FBS na 37°C.

CD4<+>T ćelije su oprane i stimulisane u različitim vremenima (2, 5, 10 i 30 minuta) sa aAPC pri odnosu od 1:3 (ćelije prema perlicama) koje se sastoje od magnetnih perlica (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal Biotech) obložene su sa sledećim mAb: anti-CD3 (OKT3), anti-humano CD28 (CD28.2), i/ili različite koncentracije anti-humanog CD277 (CD277.20.1 klon) ili izotipnog kontrolnog IgG1. Ove aAPC obložene su sa podoptimalnim anti-CD3 Ab (5%), podoptimalnim nivoima anti-CD28 Ab (10%), i bilo IgG1 Ab (CD3/CD28/IgG1), anti-CD277.20.1 Ab (CD3/CD28/CD277.20.1 IgG1), konstituišući preostalih 85%

2

proteina koji je dodat perlicama. Količina proteina održavana je konstantnom na 20 mg/ml dodavanjem kontrolnog IgG1.

Ispitan je efekat angažovanja mAb CD277 klonova na AKT i ERK fosforilaciju u CD4+ T ćelijama postupkom proteomskog protoka fosfora [27], koji koristi za stanje specifična antitela za detektovanje ciljnih fosfoproteina sortiranjem fluorescencijom aktiviranih ćelija (FACS). Određena je aktivnost signalnih puteva posle izlaganja ćelija na stimulacije perlicama. Primenjen je postupak sendvič obeležavanja, koji uključuje primenu biotin-konjugovanog sekundarnog antitela praćeno detekcijom sa fluorescentno konjugovanim streptavidinom. Pokazana je aktivnost PI3K-puta merenjem fosforilacije AKT na SER 473 i ERK na p44/42 MAPK T (202/y204) posle stimulacije sa perlicama sa različitim dozama CD277 mAb i na četiri različita vremena (2, 5, 10 i 30 minuta). Ćelije su permeabilizovane, fiksirane i analizirane posle intracelularnog bojenja ciljnih fosfoproteina (AKT i ERK) primenom citofix/citoperm KOMPLETA i pufera za permeabilizovanje/pranje (BD Biosciences).

FACS podaci su dobijeni na FACSCanto protočnom citometru (BD Biosciences) primenom Diva softvera. FACS podaci su analizirani primenom Flowjo softvera (TreeStar, Ashland, OR).

Statistička analiza

[0121] Svi podaci su analizirani primenom GraphPad Prism verzije 5.00 za (GraphPad, San Diego, CA) i microsoft excel-a (microsoft office). Mann-Whitney test uparen sa neparametarskim testom upotrebljen za ispitivanje : varijacije CD277 i PD-1 ekspresije iz limfoidnog tkiva na podskupovima živih T limfocita (na Fig.3), varijacija AKT i ERK fosforilacije na CD277 stimulisanim T limfocitnim ćelijama (na Fig.4-5), i razlika lučenja citokina na T ćelijama (na Fig.6). Poređenja su izvedena između različitih uslova stimulacije. Wilcoxon upareni test upotrebljen je da bi se izvela poređenja između različitih uslova stimulacije na NK ćelijama (na Fig.7). Razlike se smatraju statistički značajne kada je p < 0.05.

Rezultati

Profil CD277 ekspresije na podpopulacijama T ćelija i NK ćelija

[0122] Prethodno je prijavljeno da je CD277 eksprimirano na T i NK ćelijama (compte et al). Zbog toga se ispitala njegova ekspresija na poznatim podpopulacijama perifernih limfocita od zdravih donora (n = 4). Primenom multi-parametričke protočne citometrije, tako su analizirane CD3<+>CD4<+>i CD3<+>CD8<+>podpopulacije (podaci nisu prikazani). Bojenja sa monoklonalnim anti-CD277 (podaci nisu prikazani) otkrilo je snažnu ekspresiju CD277 i na CD4<+>pomoćnim T ćelijama i citotoksičnim CD8<+>T ćelijama (podaci nisu prikazani). Takođe je ispitana ekspresija CD277 na memorijske i naivne populacije T limfocita na bazi različitih ekspresija CD27 i CD45RA ekspresija (podaci nisu prikazani). Ponovo, nije zapažena bilo kakva značajna razlika između podskupova (podaci nisu prikazani).

Istovremeno, praćena je CD277 ekspresija na još jednoj populaciji limfocita koji pripadaju inatnom

2

imunom sistemu, NK (podaci nisu prikazani). Pronađeno je da je 100% NK ćelija takođe eksprimirano pri visokom nivou CD277, nezavisno od njihovog CD56<Bright>(pomoćni) ili CD56<Dim>(citotoksični) fenotipa, što pokazuje da su molekuli povezani sa B7/CD28 familijom slično pronađeni na dva glavna podkupa NK ćelija.

Modulacija CD277 na aktiviranim T ćelijama i NK ćelijama

[0123] Kako ekspresija nekih T ćelijskih kosignalizirajućih molekula može biti regulisana posle aktivacije T ćelijskog receptora (TCR), poput indukcije PD1, ko-regulatorni molekul, postavljeno je pitanje da bi i CD277 takođe moglo biti modulisano pod aktivacijom. Da bi se ispitala ova hipoteza, uporedili smo ekspresioni profil CD277 i PD1 pod CD3/CD28 aktivacijom CD4+ T ćelija.

Prečišćene CD4+ T ćelije od četiri zdrava donora tako su inkubirane od 24 do 96 sati sa monoklonalnim antitelima usmerenim protiv CD3 i CD28 ili sa respektivnim kontrolnim izotipovima. Kako je očekivano, CD3/CD28 tretman rezultuje u sedmostrukom povećanju PD1 ekspresije posle 72 sata uzgajanja, dok CD277 ekspresija nije modifikovana u bilo kojoj vremenskoj tački (podaci nisu prikazani). Slični rezultati dobijeni su sa CD8 T ćelijama (podaci nisu prikazani).

Istovremeno se postavlja pitanje da li se CD277 ekspresije može modulisati na NK ćelijama. Zbog toga, NK ćelije su stimulisane uobičajenim NK ćelijskim stimulišućim citokinima (IL-2 i IL-15). Izvedena su poređenja ekspresionog profila CD277 i HVEM. HVEM je veoma eksprimiran na NK ćelijama, a snižen nakon stimulacije NK ćelijama. Rezultat pokazuje da CD277 ekspresija nije modulisana posle aktivacije NK ćelijama, nasuprot pozitivnom kontrolom HVEM (podaci nisu prikazani).

Sve zajedno, ovi rezultati pokazuju da T ćelije i NK ćelije konstitutivno eksprimiraju CD277, ali da njegova ekspresija nije modulisana in vitro posle T ili NK ćelijske kostimulacije.

Profil CD277 ekspresije na CD4 TFH ćelijama u limfnim čvorovima

[0124] Višestruko imune T ćelijske populacije pronađene su u limfoidnim organima gde imaju specijalizovane funkcije. Među njima, folikularne T pomoćne ćelije (TFH) prisitne u germinativnim centrima imaju značajnu ulogu u diferencijaciji B ćelija. Ove ćelije eksprimiraju hemokinski receptor CXCR5 i visoke nivoe kosignalizirajućih molekula ICSO, ali i PD-1 i BTLA. CD277 ekspresija mogla bi biti diferencijalno regulisana u limfnim čvorovima. (Fig.4)

Potpuno zamrznute sekcije reaktivnih limfnih čvorova takođe su imuno obojene na CD277. Rezultati imunohistohemijske analize pokazuju snažnu pozitivnost i na oblastima inter-folikularnih T-ćelija i na zoni omotača B-ćelija što ukazuje da su pozitivne na T ćelije kao i B ćelije. Začuđujuće, obrazac bojenja bio je potpuno različit u germinativnom centru. Većina GC bila je negativna štp okazuje da su B ćelije izgubile ekspresiju CD277 tokom procesa diferencijacije. Međutim, nekoliko raštrkanih ćelija obojene su tako da podsećaju na TFH bojenje. Ovo je potvrđeno nakon izvođenja analize protočne citometrije. TFH ćelije (CXCR5+ICOS+ PD-1+) bile su pozitivne na CD277. Pored toga CD277 je podjednako prisitno na CXCR5- uobičajenim T ćelijama, dok nije bilo značajnog bojenja na (GC) B-ćelijama ili ćelijama germinativnog centra (podaci nisu prikazani).

[0125] Zaključak ovog prvog dela ispitivanja je da je CD277 eksprimirano na svim podtipovima T limfocita u perifernoj krvi kao i u limfnim čvorovima i NK ćelijama, ali njegova ekspresija nije modulisana pod stimulacijom kao što je često slučaj za molekule B7/CD28 familije, ili bilo kog drugog od molekula uključenih u regulaciju limfocita.

AKT i ERK fosforilacija je uvećana posle CD277 angažovanja na CD4<+>T ćelijama

[0126] Da bi se ispitala kostimulatorna uloga CD277 na funkciju limfocita, ispitano je da li je CD277 izazivanje sposobno da indukuje fosforilaciju na dve najznačajnije kinaze puta signaliziranja limfocita: ERK iz mitogenom-aktivirane protein kinaze i AKT serin treonin kinaza. Poznato je da Akt i ERK signaliziranje ima centralnu ulogu u T ćelijskim funkcijama uključujući proliferaciju, sintezu proteina i regulaciju apoptoze.

[0127] Prvo, pokazano je da izazivanje CD27720.1 indukuje fosforilaciju AKT i ERK (Fig.2), što pokazuje da je CD277 stimulacija uključena u regulaciju T ćelijske aktivacije (prečišćene CD4+ T ćelije stimulisane su antitelom-obloženim epoksidnim dinaperlama sa mAb anti-CD3 plus mAb anti-CD277.20.1)

[0128] Drugo, kako bi se razjasnila implikacija CD277 kao komodulatora TCR signalizirajućeg puta, stimulisane su prečišćene CD4+ T ćelije sa različitim koncentracijama mAb do CD277.20.1 klona ili izotipnog kontrolnog IgG1, zajedno sa anti-CD3 plus anti-CD28 na različiti vremenskim tačkama (2, 5, 10 i 30 minuta). Zapaženo je da je unakrsno povezivanje CD277 sa mAb CD277.20.1 klonom snažno ushodno regulisalo fosforilaciju AKT i ERK indukovane CD3 CD28 stimulacijom. Ovaj efekat bio je zavisan i od doze i od vremena (podaci nisu prikazani).

[0129] U ovomdelu rada, pokazano je da CD277 izazivanje potencijalizuje TCR signal. Zatim je odlučeno da se ispitaju funkcionalne posledice aktivacije ovog signalizirajućeg puta.

CD277 kostimuliše CD3 signale

[0130] Sledeći je ispitan efekat CD277 angažovanja na regulaciju proizvodnje citokina i aktivacije markera posredovana CD3 posredovanim signalima. Prečišćene CD4+ T ćelije od najmanje 4 zdrava donora uzgajane su tokom 24 do 72 sata sa anti-CD3/anti-CD28 ili anti-CD3/anti-CD277 (klon 20.1) ili anti-CD3/IgG1 (kontrolni uslovi). Posle 24 sati uzgajanja, IL-2 i IFN-γ proizvodnja od strane CD4+ T ćelija izmerena je pomoću ELISA. Kako je očekivano, ova dva citokina su proizvedena u velikim količinama posle CD3/CD28 stimulacije u porešenju sa kontrolim uslovima (p= 0.0079, p=0.0317, podaci nisu prikazani). Iako je IL-2 nivo proizveden od strane CD3/CD277 koaktiviranih CD4<+>T ćelija bio niži od onog dobijenog sa CD3/CD28 kostimulacijom, količina IL-2 indukovanih CD3/CD277 koaktivacijom bila je ipak

1

značajno najviša u odnosu na onu sa IgG kontrolom (p= 0.0159, podaci nisu prikazani). Štaviše, IFN-γ lučenje jako je pojačano CD3/CD277 koaktivacijom u poređenju sa kontrolnom situacijom, i začuđujuće, proizvodnja je bila još viša od one dobijene posle CD3/CD28 koaktivacije (podaci nisu prikazani). Dalje, posle 3 dana uzgajanja, sličan efekat je dobijen u pogledu ekspresionog profila aktivacije markera CD25 posle CD3/CD277 kostimulacije. Ova kostimulacija CD4<+>T ćelija indukovala je značajno povećanje do 45% aktiviranih CD25 pozitivnih ćelija, dok je CD3/CD28 koaktivacija indukovala samo povećanje do 25% aktiviranih CD25 pozitivnih ćelija u poređenju sa kontrolnim uslovima (podaci nisu prikazani).

[0131] Sve zajedno, ovi rezultati snažno sugerišu da je CD277 kostimulatorni molekul T limfocitnog aktivacionog signala.

CD277 dalje pojačava CD3-CD28 kostimulaciju i može da dejstvuje kao treći signal da pojača T ćelijsku proliferaciju i proizvodnju citokina

[0132] Zatim, ispitane su posledice CD277 zajedničkog signala na T ćelijsku proliferaciju i proizvodnju citokina indukovanu CD3+CD28 signalima. Stimulisane su prečišćene CD4+ T ćelije sa različitim koncentracijama mAb do CD277, zajedno sa anti-CD3 plus anti-CD28. Određena količina antitela na perlicama održavana je konstantnim dodavanjem izotipnog kontrolnog IgG1 i anti-MHC klase I (MHC I). Pokazano je da unakrsno povezivanje CD277 na CD4<+>T ćelijama snažno aktivira CD4<+>T ćelijsku proliferaciju posredovanu anti-CD3 plus anti-CD28 na dozno zavisan način. Zaista, izmerena je proliferacija CD4 ćelija merenjem razblaženja citozolne boje CFSE (podaci nisu prikazani). Pronađen je da je 60% ćelija stimulisano sa anti-CD3 plus anti-CD28 i IgG1 ušlo u deljenje do dana 5. Unakrsno povezivanje CD277 (na 17µg/ml) snažno je pojačalo CD4<+>T ćelijsko deljenje koje je već indukovano anti-CD3 plus anti-CD28 na dozno zavisan način, kao što je 90% ćelija koje su ušle u podelu (podaci nisu prikazani).

Istovremeno, rezultati takođe pokazuju da angažovanje CD277 povećava proliferaciju (podaci nisu prikazani) i lučenje citokina indukovano anti-CD3 i anti-CD28 stimulacijom na dozno zavisan način (Fig. 3).

[0133] Sve zajedno, ovi podaci podržavaju ulogu kostimulatornog molekula za CD277 čak i posle optimalne kostimulacije obezbeđene od strane CD28.

Da li je CD277 takođe kostimulatorni molekul NK ćelija?

[0134] Istovremeno, ispitano je da je sličan kostimulatorni efekat dobijen u NK ćelijama. Zbog toga, stimulisana su dva najznačajnija receptora NK ćelija (anti-NKp46 ili anti-CD16), u prisustvu izotipske kontrole ili CD277 monoklonalnog antitela (20.1) ili anti-DNAM (pozitivna kontrola kostimulacije aktivacionih receptora) ili anti-NKG2A (pozitivna kontrola koinhibicije aktivacionih receptora). Prvo, CD277 sam nije imalo nikakav efekat na NK ćelijsku stimulaciju. Drugo, monoklonalno mAb 20.1

2

usmereno protiv CD277 molekula nije uspelo da potencijalizuje bilo koji od efekata na NK ćelijsku aktivaciju kao što su to činili DNAM ili NKG2A. Ni citotoksičnost (podaci nisu prikazani), niti IFN-γ lučenje (podaci nisu prikazani) nisu poremećeni, bilo da je primo-stimulacija je izvedena sa NKp46 ili CD16. Ovaj rezultat bio je značajno iznenađujuć, ali očigledno CD277 nije uključen u regulaciju NK ćelijske aktivacije, nasuprot onome što je zapaženo sa T ćelijama.

Btna izoforme eksprimirane od strane limfocita

[0135] Uzimajući u obzir da CD277 ima tri izoforme btn3a1, btn3a2 i btn3a3, sa (btn3a1 i btn3a3), ili bez (btn3a2) B30.2 domena, ispitana je mRNK ekspresija svake izoforme na T limfocite da bi se odredilo da li svaka izoforma ima ekvimolarni ekspresioni obrazac. Primenom dostupnih podataka iz GEO omnibusa koji je dalje potvrđen putem Q-PCR, pronađeno je da je btn3a1 glavni oblik eksprimiran od strane T limfocita dok je oblik mamca (btn3a2) uglavnom eksprimiran na NK ćelijama (podaci nisu prikazani). Ovaj rezultat potvrđen je kvantitativnom PCR na 4 zdrava donora. Zbog toga se može reći da hipoteza da odsustvo kostimulacije u odgovoru na CD277 stimulaciju NK ćelija može biti pripisano ovom obliku BTN3A.

PRIMER 3

Materijali i postupci

Antitela i Fab fragmentacija

[0136] Anti-CD277: anti-BT3-20.1 i 103.2 mAb su generisana i validirana kako je prethodno opisano [10]. Fab fragmenti anti-BT3-20.1 su generisani i prečišćeni sa the Imunopure Fab Kompletom za pripremanje prateći preporuke proizvođača (Pierce). Čistoća proteina određena je neredukujućom SDS-PAGE.

Konstrukcija filogenetskih stabala

[0137] Filogenetske analize izvedene su primenom automatizovane platforme za genomske anotacije FIGENIX (FIGENIX Annotation Platform: [http://figenix2.up.univmrs.fr/Figenix/indeks.jsp]) da bi se dobil sekvence i poravnanja i izvela filogenetska rekonstrukcija. Upotrebljeni cevovod primenjuje tri različita postupka rekonstrukcijae filogenetskog stabla, tj. Maksimalna štedljivost [38], Maksimalna verovatnoća [39] i Susedno spajanje [40], gradi koncenczus stablo ukorenjeno srednjom tačkom. Butstraping je izveden sa 1000 replikacija. Butstrap vrednosti prijavljene su za svaki postupak (za detaljniji opis upotrebljenih cevovoda i modela, pogledati [41].

Ćelijske linije i širenje γδ T ćelija

[0138] P815 (ćelijska linija mišjeg mastocitoma), K562 (ćelijska linija hronične mijeloidne leukemije), Raji i Daudi (ćelijske linije Burkitt limfoma) uzgajane su RPMI 1640 podlozi (Invitrogen) i 10% fetalnom goveđem serumu (FCS) (Eurobio). PBMC od zdravih donora raspoređene su pri 106/ml u ploče za uzgajanje sa 24 bazenčića na 37°C u 5% CO2 u RPMI 1640 podlozi i 10% FCS. Poliklonalne Vγ9Vδ2 T ćelije specifično su proširene sa 3µmol/l Fosfostima (BrHPP molekul, Innate Pharma, Marseille, France) i 100 U/ml IL-2 (Chiron, Basel, Switzerland) tokom 12 dana. Fosfostim je dodat jednom na početku uzgajanja. Svaka 2 dana, polovina zapremine podloge za uzgajanje zamenjena je svežom podlogom koja sadrži 100 U/ml IL-2.

Poslednji dan, procenjen je procenat γδ T ćelija primenom anti Vd2 FITC i anti-CD3-Cy7. Samo ćelijske kulture koje dostižu više od 90% γδ T Ćelija, odabrane su da su upotrebljene u funkcionalnim ispitivanjima.

Protočna citometrija

[0139] Za obeleživanje γδ T ćelija u ispitivanju čistoće posle širenja, upotrebljne su anti-CD3 PE-Cy7 i anti-Vδ2 FITC mAb (BD Pharmingen). Za CD277 karakterizaciju u različitim podskupovima PBMC su inkubirane sledećim antitelima i molekulima: anti-CD3 PE-Cy5 (BD Pharmingen), anti-CD4 PB (BD Pharmingen), anti-CD8 PB (BD Pharmingen), anti-Vδ2 FITC (BD Pharmingen), anti-CD27 APC-Alexa Fluor 750 (CALTAG Laboratory), anti-CCR7 PECy7 (BD Pharmingen), anti-CD28 PE (Beckman Coulter), anti-CD45RA ECD (Beckman Coulter), LIVE/DEAD® Komplet za bojenje mrtvih ćelija koje se mogu popraviti (L34957, Invitrogen) i anti-CD277 obeležene sa Alexa Fluor 647 (Komplet za obeležavanje proteina Alexa Fluor 647, Molecular Probes, Invitrogen). Za analizu CD107a i CD107b ekspresije, γδ T ćelije i ciljne ćelije su koinkubirane na 37°C sa anti-CD107a FITC i anti-CD107b FITC u prisustvu monensina (10µM, GoligiStop, BD Bioscience). Ćelije su sakupljene i oprane sa PBS, 4 sata posle inkubisanja. γδ T ćelije su obeležene sa anti-pan γδ TCR PE i anti-CD3 PECy7 mAb (BD Pharmingen). Svi uzorci su izmereni na FACSCanto ili FACSAria protočnim citometrima (BD Biosciences) primenom FACSDiva softvera. Analize su izveden sa FlowJo softverom (Tree Star).

Dopunski materijal:

[0140] Intracelularne bojenje je izvedeno u skladu sa preporukom BD Pharmingen Fiks i Perm Kompletom (BD Biosciences).100 µl γδ T ćelija na 2.106 ćelije/ml zasađene su u ploče sa 96 bazenčića. Inkubirane su u prisustvu ili ne BrHPP pri 3µM i sa anti-CD277 ili kontrolnim izotipovima pri 10µg/ml, tokom 30 min na 4°C. Ćelije su stimulisane u različitim vremenina na 37°C. Stimulacija je zaustavljena dodavanjem 100µl Citofix/Citoper rastvora na 37°C tokom 10min. Intracelularni fosforisani proteini su obojeni prečišćenim monoklonalnim zečijim antitelima: anti-pZap 70, anti-pAKT i anti-pErk od Cell Signaling Technology (Danvers, USA) ; obeležene sa Biotin-SP-konjugovanim F(ab')2 magareće anti-zečije (Jackson) ; i otkriveni putem streptavindin-PE (Beckman Coulter).

4

Ogled stimulacije i širenja

[0141] PBMC su zasađene i stimulisane kako je opisano u paragrafu: ćelijske linije i širenje γδ T ćelija, osim ćelija stimulisanie su sa anti-CD277 mAb (10µg/ml); ili kontrolim izotipovima (10µg/ml); i sa ili bez BrHPP pri različitim koncentracijama. Uzgajanja su zastavljena 9 dana posle. Procenti Vγ9Vδ2 izmereni su prvog dana i poslednjeg dana uzgajanja kako je prethodno opisano. Proširene γδ T ćelije efektori stimulisane su sa ili bez različitih doza BrHPP dodae u anti-CD277 mAb pri 10µg/ml; ili sa OKT3 (4ng/ml) povezano sa anti-BT319.5 mAb u različitim koncentracijama. Aktivacija degranulacije izmerena je ogledom CD107 obeležavanja kako je prethodno opisano.

Ogled preusmerene aktivacije

[0142] 2.10<5>P815 ćelije mišje mastocitoma inkubirane su 30 min, sa mišjim kontrolim izotipovima ili anti-CD277 mAb (10µg/ml) ili/i sa anti-CD3 (OKT3, 4ng/ml). Posle pranja, P815 su inkubirane 4h na 37°C, sa proširenim Vγ9Vδ2 T efektorskim ćelijama pri istoj koncentraciji. Na protoku baziran ogled CD107a degranulacije je izveden kako je prethodno opisano.

ELISA

[0143] Supernatanti iz ogleda preusmerene aktivacije su sakupljeni posle 4h kouzgajanja. IFNγ, TNFα i IL-17 oslobađanje ipsitiano je pomoću ELISA Kompleta (OptEIA kompleta od BD Pharmingen za IFNγ i TNFα. Citokini su detektovani čitačem ploča Multiskan RC (Labsystems). Koncentracije citokina su određeni iz standardnih kriva utvrđenih sa rekombinantnim standardima.

Analiza Vγ9 Vδ2 T ćelijskih odgovora primenom ogleda direktne citotoksičnosti:

[0144] Ciljne ćelije obeležene su sa 20µCi of 51Cr (PerkinElmer) tokom 1h na 37°C. Posle pranja, ciljne ćelije inkubirane su sa efektorskim Vγ9Vδ2 T ćelijama tokom 4h na 37°C pri različitom odnosu.

Inkubisanja su izvedena u prisustvu specifičnih ili izotipnih kontrolnih mAb ili Fab fragmenata.

Radioaktivnost odlobođena od strane ciljnih ćelija izmereno je, 4h kasnije, na beta čitaču ploča. Procenat specifične 51Cr lize izračunat je primenom sledeće jednačine:

Procenat specifične lize = 100 x [(test oslobađanje) – (spontano oslobađanje)]/[(maksimalno oslobađanje) – (spontano oslobađanje)].

Statistička analiza:

[0145] StatXact softver (version 8 PC) proizveden od strane Cytel, upotrebljen je za sve statističke analize. Vrednosti od značaja za poređenja između grupa određene su neparametričkom Mann i Whitney analizom. Pod pretpostavkom nejednake varijanse sa 95% nivoima pouzdanosti, i p vrednosti <0.05 se smatraju značajnim.

Skint-1 i CD277 pripadaju istoj super familiji kao i B7

[0146] Primenom Skint-1 IgV proteinske domen sekvence u NCBI pBlast, ispitane su sličnost između Skint-1 i drugih humanih proteina u bazama podataka. Dobijena sekvenca poravnanja pokazuje da je Skint-1 relativno sličan CD277 sa 38% identiteta (podaci nisu prikazani). Da bi se razjasnili odnosi između ovih Skint i Btn familija, izvedena je filogenetska analiza na bazi njihovih IgV sekvenci, primenom Figenix automatizovane platforme za genomske anotacije.

Filogenija prikazuje da Skint-1 i CD277 formiraju monofilogenetsku grupu sa genima ili genskom familijom obuhvaćena u regulaciji imunog odgovora: BTN 1 do 3, BTNL2 ERMAP; B-G i MOG (podaci nisu prikazani). Ova grupa takođe uključuje CD80 i CD86 od do B7 familije, jednako poznatim po svom uticaju na regulaciju imunog odgovora. Svaka grupa odbrazuje podfamiliju.

Fokusiranjem na Skint podfamiliju (podaci nisu prikazani), filogenetska analiza na bazi Skint-1 pune sekvence svedoči najmanje osam paralog gena kod glodara uključujući pet kod miševa u oštroj suprotnosti sa primatima kod kojih je samo jedna kopija. Ovaj rezultat sugeriše značajnu ulogu skint familije kod glodara. Izvedena je ista analiza primenom CD277 sekvence (podaci nisu prikazani).

Pokazano je da CD277 i njegova druga izoforma: BTN3-A3, imaju uobičajenog pretka u grananju između konja i primata. Zanimljivo, ove dve izoforme su prisutne kod primata, ali ih nema kod glodara.

Humani Skint-1 gen je verovatno pseudogen budući da su dva zasutavna kodona prisutna unutar njegove sekvence. Prvi zaustavni kodon smeštene je neposredno nishodno od signalnog peptida, na početku IgV sekvence i drugog nishodnog toka prvog transmembranskog domena [7]. To je verovatno zbog grešaka u sekvenciranju budući da su iste mutacije pronađene i u Pongo abelii DNK sekvenci. Ovi podaci ukazuju da Skint geni nisu neophodni za primatne vrste i sugeriše da njihovu funkciju mogu da izvedu drugi geni.

Recipročno, CD277 gen je odsutan u Ratus norvegicus i u Mus musculus DNK sekvenci primenom NCBI ntBlast. Zaista, unutar BTN familija samo je BTN2 sekvenca prisutna kod ove dve vrste. Ovi rezultati pokazuju da su CD277 zaista iščezli kod glodara i samim tim nisu neophodni za preživljavanje ovih vrsta. To sugeriše da je CD277 funkcija pretpostavljena nekim drugim genom(ima).

Obe funkcionalne suvišnosti kod uobičajenih predataka glodara i primata mogle bi sa jedne strane biti u poreklu isčezavanja CD277 kod glodara, a sa druge strane Skint-1 kod primata.

[0147] Kao sumiranje, oba molekula imaju sličnosti u svom ekstracelularnom regionu unutar oba i IgV i IgC domena, ali se razlikuju brojem transmembranskih domena i iznad svega svojim intracitoplasmatskim regionom (podaci nisu prikazani). Indeed, CD277 ima samo jedan transmembranski domen umesto tri za Skint-1. Dalje, u svom intracitoplasmatskom regionu, CD277 ima B30.2 domen. Ovaj domen je odsutan kod Skint-1.

CD277 je eksprimiran u Vγ9Vδ2 T ćelijama i nije modulisan njihovom diferencijacijom

[0148] Prethodno je pokazano da je CD277 eksprimiran na uobičajenim T limfocitima što sugeriše ulogu CD277 u regulaciji T ćelijskog odgovora.

Ispitana je CD277 ekspresija na γδ T ćelijama kao i njhovim opisanim podpopulacijama koje odgovaraju njihovim različitim stadijumima diferencijacije koja počinje od naivnog odeljka. Samim tim, primenom 8 bojne protočne citometrije, utvrđene su 4 glavne podpopulacije: Naivne ćelije (CD45RA+/CD27+);

Centralno Memorijske ćelije (CD45RA-/CD27+); Efektorske Memorijske (CD45RA-/CD27-/CCR7-) i Efektorske Memorijske RA+ (CD45RA+/CD27-/CCR7-).

Takođe je procenjeno da CD28 diskriminiše dva podskupa među N, CM, EM kao i EMRA+ gd T ćelijama. Njegova funkcija nije jasna iako je u αβ T ćelijama povezana sa CTL funkcijama.

[0149] 95% Vγ9Vδ2 T ćelija eksprimira CD277 sa višim srednjim intenzitetom fluorescencije od αβ T ćelija što sugeriše značajnu ulogu u homeostazi γδ T ćelija. Zanimljivo usvim Vγ9Vδ2 podpopulacijama, svaka od ćelija eksprimira CD277. Njihov nivo ekspresije je približno isti u analiziranim γδ T ćelijskim podpopulacijama. Jedino blago povećanje pronađeno je kod naivnih CD45RA+/CD27+/CD28+/CCR7+, ali ova varijacija nije značajna u serijama kada su testirani zdravi dobrovoljci.

[0150] Ovi rezultati ukazuju da CD277 nije modulisan u Vγ9Vδ2 T ćelijskoj diferencijaciji i sugeriše putativnu ulogu pro različitim stadijumima Vγ9Vδ2 T ćelijske aktivacije.

Anti-CD277mAb 20.1 indukuje proliferaciju Vγ9Vδ2 T ćelija dok 103.2 inhibira stimulaciju posredovanu optimalnom TCR stimulacijom fosfoantigena.

[0151] Da bi se ispitala funkcija CD277 kod γδ T ćelija, upotrebljeno je mAb usmereno protiv CD277. U prvom setovanju, ispitano je da li CD277 izazivanje može da utiče na stimulaciju γδ T ćelija optimalnim dozama fosfoantigena BrHPP. Uzgajane su PBMC sa IL-2 (100U/ml) i BrHPP (3000nM).

Posle 15 dana uzgajanja Vγ9Vδ2 T ćelije su proširene (Fig.5A) posle dodavanja anti-CD277 mAb 20.1. Ovaj efekat je povezan sa proliferacijom Vγ9Vδ2 ćelija kako je pokazano analizom CFSE obeleženih ćelija (Fig.5B).

Ovi rezultati sugerišu stimulatornu funkciju CD27720.1 na aktivaciji Vγ9Vδ2 T ćelija.

[0152] Zatim je ispitana funkcija CD277 mAb 103.2 na fosfoantigenom posredovanu aktivaciju Vγ9Vδ2 ćelija.103. mAb potpuno je inhibiralo aktivaciju Vγ9Vδ2 T ćelija posredovanu fofoantigenima, ali CD3mAb (Fig.6A i 6B). Slični efekti su pokazani kod Jurkat ćelija koje eksprimiraju Vγ9Vδ2TcR

CD277 moduliše degranulaciju kod Vγ9Vδ2 T ćelija posredovanu TcR kompleksom

[0153] Ovi podaci podstakli su ispitivanje da li funkcija CD277 može biti detektovana u drugim funkcijama γδ T ćelija kao što je proizvodnja citokina, citotoksičnost i degranulacija.

[0154] Stimilisane su γδ T ćelije fosfoantigenima i ispitane proširene ćelije na njihove efektorske funkcije. Prvo su upotrebljene modulacija CD107 ekspresije kao indikator degranulacije. Ovaj test odgovara delom sposobnošću ćelija da izazovu svoju citolitičku funkciju. U ovom eksperimentu, izmeren je efekat CD277 angažovanja bilo sa podoptimalnim (0.06 nM) ili optimalnim (4000 nM) dozama fosfoantigena BrHPP. Povećavanje doza BrHPP indukuje povećavanje CD107 ekspresije čak do 40%. Primenom niske doze BrHPP kojom nije moguće indukovanje CD107 ekspresije, dodavanje anti-CD277 povećalo je CD107 ekspresiju čak do (20%). Međutim, sa višom dozom BrHPP, anti-CD277 inhibirana je CD107 ekspresija indukovana BrHPP koji je snižen sa 40% no 20%. Ispitan je još jedan sistem za stimulaciju γδ T ćelija primenom anti-CD3 i anti-CD277 imobilisanog mAb. Samom CD277 stimulacijom indukovana je CD107 ekspresija (30%). CD3 mAb indukovalo je dozno zavisnu CD107 ekspresiju koja je dostigla zaravan pri 50 ng/ml u ovoj postavci.

Zatim je ispitana CD107 ekspresija primenom stabilne doze CD277 mAb sa povećavanjem koncentracije CD3 mAb. CD107 ekspresija je povećana kada se kombinuje CD277 sa povećavanjem doza anti-CD3 čak do 10ng/ml. Međutim, pri višim dozama CD3 mAb CD107 ekspresija snižavala se na dozno zavisan način.

[0155] Sve zajedno ovi podaci pokazuju da CD277 moduliše sposobnost γδ T ćelija da eksprimiraju CD107 i samim tim da degranulišu prateći fosfoantigen ili anti-CD3 stimulaciju. CD277 efekat je dvofazan: pojačavanje pri niskim nivoima stimulacije i snižavanje pri višim nivoima TCR koji unakrsno vezuje γδ T ćelijsku degranulacionu aktivnost.

[0156] Unakrsno vezivanje CD277 izaziva degranulaciju zajedno sa INFγ i TNFα oslobađanjem.

[0157] Zatim je izvedena preusmerena aktivacija proširenih Vγ9Vδ2 T ćelija primenom CD277 mAb. Anti-CD277 samo indukuje CD107 ekspresijom posle 4 sata stimulacije na dozno zavisni način (10%< 30%). Optimalna aktivacija je dobijena sa 10µg/ml doze anti-CD277 dok ID50 od mAb za njegovu metu iznosi 3ug/ml (podaci nisu prikazani).

Štaviše, CD227 angažovanje indukuje robustno oslobađanje IFNγ i TNFα koje je usmereno rano odmah nakon 4 sata stimulacije. Tako da degranulacija indukovana putem CD277 dolazi zajedno sa Th1 citokinima. Ova indukcija degranulacija i oslobađanja citokina rezultuje u CD277 stimulaciji anti-CD277 unakrsnim vezivanjem bez potrebe za TCR angažovanjem.

CD277 potencira antitumorsku citolizu posredovanu Vγ9Vδ2 T ćelijama.

[0158] Konačno, ispitano je da CD277 može biti uključen u anti-tumor funkciju Vγ9Vδ2 T ćelijske aktivacije. Da bi se verifikovala ova hipoteza, upotrebljeni su anti-CD277 mAb i anti-CD277 Fab fragmenti u ogledu citotoksičnosti protiv različitih tumorskih ćelijskih linija uključujući Daudi, K562 ili Raji ćelijske linije.

20.1 Mab potenciraju i otkrivaju funkciju Vγ9Vδ2 T ćelija protiv ciljeva kakvi su određeni putem ogleda CD107a/b degranulacije (Fig.7). Nasuprot tome 103.2 mAb sprečava aktivaciju Vγ9Vδ2 T ćelija u istoj eksperimentalnoj postavci (podaci nisu prikazani).

[0159] Ovi rezultati pokazuju da CD277 mAb potencira ili inhibira anti-tumor citolizu posredovanu odgovaranjem Vγ9Vδ2 T ćelija.

REFERENCE

[0160]

Arnett, H. A., Escobar, S. S., Gonzalez-Suarez, E., Budelsky, A. L., Steffen, L. A., Boiani, N., Zhang, M., Siu, G., Brewer, A. W., and Viney, J. L.2007. BTNL2, a butyrophilin/B7-like molecule, is a negative costimulatory molecule modulated in intestinal inflammation. J. Immunol.178: 1523-1533.

Bensussan, A., Olive, D.2005. T-cell: section report. Cellular Immunol.236: 3-5.

Carreno, B. M., and Collins, M.2002. The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulation and inhibition of immune responses. Annu. Rev. Immunol.20:29-53.

Chambers, C.A., Kuhns, M. S., Egen, J. G., and Allison, J.P.2001. CTLA-4-mediated inhibition in regulation of T cells responses: mechanisms and manipulation in tumor immunotherapy. Annu. Rev. Immunol.19:565-594.

Chapoval, A. I., Ni, J., Lau, J. S., Wilcox, R. A., Flies, D. B., Liu, D., Dong, H., Sica, G. L., Zhu, G., Tamada, K., and Chen, L.2001. B7-H3: a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production. Nat. Immunol.2:269-274.

Compte, E., Pontarotti, P., Collette, Y., Lopez, M., and Olive, D.2004. Characterization of BT3 molecules belong to the B7 family espressed on immune cells. Eur. J. Immunol.34:2089-2099. Coyle, A. J., and Gutierrez-Ramos, J. C.2001. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell function. Nat. Immunol.2:203-209.

Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., and Chen, L.1999. B7-H1, a third member of B7 family, costimulates T cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med.5:1365-1369.

Durum, S.K., Schmidt, J. A., and Oppenheim, J. J.1985. Inteleukin 1: an immunological Perspective. Annu. Rev. Immunol.3:263-287.

Eisenberg, S.P., Evans, R. J., Arend, W. P., Verderber, E., Brewer, M. T., Hannun, C. H., Thompson, R.C.1990. Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist. Nature.343:341-346.

Freeman, G. J., Long, A. J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L. J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne M. C., Horton, H.F., Fouser, L., Carter, L., Ling, V., Bowman, M.R., Carreno, B.M., Collins, M., Wood, C.R., and Honjo, T..2000. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med.192:1027-1034.

Fulton, S. A., Johnsen, J. M., Wolf, S. F., Sieburth, D. S., and Boom, W. H.1996. Interleukin-12 production by human monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis: role of phagocytosis. Infect. Immun.64:2523-2531.

Grob, P. M., David, E., Warren, T. C., De Leon, R. P., Farina, P. R., and Homon, C. A.1990.

Characterization of a receptor for human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor/interleukin-8. J.Biol. Chem.265:8311-8316.

Henry, J., Mather, I. H., McDermott, M. F., and Pontarotti, P.1998. B30.2-like domain proteins: update and new insights into a rapidly expanding family of proteins. Mol. Biol. Evol.15:1696-1705.

Henry, J., Miller, M., and Pontarotti, P.1999. Structure and evolution of the extended B7 family. Immunol. Today.20:285-288.

Hutloff, A., Dittrich, A. M., Beier, K. C., Eljaschewitsch, B., Kraft, R., Anagnostopoulos, I., and Kroczek, R. A.1999. ICOS is an inducible T cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature.397: 263-266.

June, C. H., Bluestone, J. A., Nadler, L. M., and Thompson, C. B.1994. The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today.15:321-331.

Kaufman, J., and Salomonsen, J.1992. B-G: we know what it is, but what does it do? Immunol. Today.13: 1-3.

Latchman, Y., Wood, C. R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A. J., Brown, J. A., Nunes R., Greenfield, E.A., Bourque, K., Boussiotis, V.A., Carter, L.L., Carreno, B.M., Malenkovich, N., Nishimura, H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, A.H., and Freeman, G.J. 2001. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat. Immunol.2:261-274. Ledbetter, J.A., Imboden, J. B., Schieven, G. L., Grosmaire, L. S., Rabinovitch, P. S., Lindsten, T., Thompson, C. B., and June, C. H.1990. CD28 ligation in T-cell activation: evidence for two signal transduction pathways. Blood.75:1531-1539.

Lenschow, D. J., Walunas, T. L., and Bluestone, J. A.1996. CD28/B7 of T cell costimulation. Annu. Rev. Immnuol.14:233-258.

Linsley, P. S., Greene, J. L., Tane, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J. A., Anasetti, C., and Damle, N. K.

1992. Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes. J. Exp. Med.176:1595-15604.

Linsley, P. S., and Ledbetter, J. A.1993. The role of the CD 28 receptor during T cell responses to antigen. Annu. Rev. Immunol.11:191-212.

Liu, Y., and Linsley, P.S.1992. Costimulation of T-cell growth. Curr.Opin. Immunol.4:265-270.

4

Ma, X., Chow, J. M., Gri, G., Carra, G., Gerosa, F., Wolf, S. F., Dzialo, R., and Trinchieri, G.1996. The interleukin-12 p40 gene promoter is primed by interferon gamma in monocytic cells. J. Exp. Med.183:147-157.

Medzhitov, R.2001. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol.1:135-145. Nurieva, R., Thomas, S., Nguyen, T., Martin-Orozco, N., Wang, Y., Kaja, M. K., Yu, X. Z., and Dong, C.2006. T-cell tolerance or function is determined by combinatorial costimulatory signals. Embo J.25:2623-2633.

Price, P., Santoso, F., Mastaglia, M., Garlepp, C., Kok, C., Allcock, R., and Laing, N.2004. Two major histocompatibility complex haplotypes influence susceptibility to sporadic inclusion body myositis: critical evaluation of an association with HLA-DR3. Tissue Antigens.64: 575-580.

Rhodes, D. A., Stammers, M., Malcherek, G., Beck, S., and Trowsdale, J.2001. The cluster of BTN genes in the extended major histocompatibility complex. Genomics.71: 351-362.

Ruddy, D. A., Kronmal, G. S., Lee, V. K., Mintier, G. A., Quintana, L., Domingo, R. Jr., Meyer, N. C., Irrinki, A., McClelland, E. E., Fullan, A., Mapa, F.A., Moore, T., Thomas, W., Loeb, D.B., Harmon, C., Tsuchihashi, Z., Wolff, R.K., Schatzman, R.C., Feder, J.N.1997. A 1.1-Mb transcript map of the hereditary hemochromatosis locus. Genome Res.7: 441-456.

Rybicki, B. A., Walewski, J. L., Maliarik, M. J., Kian, H., and lannuzzi, M. C.2005. The BTNL2 gene and sarcoidosis susceptibility in African Americans and Whites. Am. J. Hum. Genet.77: 491-499. Salmaso, C., Olive, D., Pesce, G., and Bagnasco, M.2002. Costimulatory molecules and auoimmune thyroid diseases. Autoimmunity.35:159-167.

Saverino, D., Tenca, C., Zarcone, D., Merlo, A., Megiovanni, A. M., Valle, M. T., Manca, F., Grossi, C. E., and Ciccone, E.1998. CTLA-4 (CD152) inhibits the specific lysis mediated by human cytolytic T lymphocytes in a clonally distributed fashion. J. Immunol.162:651-658.

Sun, M., Richards, S., Prasad, D. V., Mai, X. M., Rudensky, A., and Dong, C.2002. Characterization of mouse and human B7-H3 genes. J. Immunol.168:6294-6297.

Takeda, K., and Akira, S.2003. Toll receptors and pathogen resistance. Cell Microbiol.5:143-153. Tseng, S. Y., Otsuji, M., Gorski, K., Huang, X., Slansky, J. E., Pai, S. I., Shalabi, A., Shin, T., Pardoll, D. M., and Tsuchiya, H.2001. B7-DC, a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T cells. J. Exp. Med.193:839-846.

Valentonyte, R., Hampe, J., Huse, K., Rosenstiel, P., Albrecht, M., Stenzel, A., Nagy, M., Gaede, K. I., Franke, A., Haesler, R., Koch, A,, Lengauer, T., Seegert, D., Reiling, N., Ehlers, S., Schwinger, E., Platzer, M., Krawczak, M., Müller-Quernheim, J., Schürmann, M., Schreiber, S.2005. Sarcoidosis is associated with a truncating splice site mutation in BTNL2. Nat. Genet.37: 357-364-364.

Walunas, T. L., Lenschow, D. J., Bakker, C. Y., Linsley, P. S., Freeman, G. J., Green, J. M., Thompson, C. B., and Bluestone, J. A.1994. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity.1:405-413.

Walunas, T. L., and Bluestone, J. A.1998. CTLA-4 regulates tolerance induction and T cell differentiation in vivo. J. Immunol.160:3855-3860.

Waterhouse, P., Penninger, J. M., Timms, E., Wakeham, A., Shahinian, A., Lee, K. P., Thompson, C. B., Griesser, H., and Mak, T. W.1995. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science.270: 985-988.

Waterhouse, P., Marengere, L. E. M., Mittrucker, H.-W., and Mak, T. W.1996. CTLA-4, a negative regulator of T-lymphocyte activation. Immnunol. Rev.153:183-207.

Williams, A. F., and Barclay, A. N.1988. The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Annu. Rev.Immunol.6: 381-405.

Wolf, S. F., Sieburth, D., and Sypek, J.1994. Interleukin-12: a key modulator of immune function. Stem Cells Dayt.12:154-168.

Yi-qun, Z., Lorrè, K., de Boer, M., and Ceuppens, J. L.1997. B7-blocking agents, alone or in combination with cyclosporin A, induce antigen-specific anergy of human memory T cells. J. Immunol.158:4734-4740.

1. Sharpe, A.H. and G.J. Freeman, The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol, 2002.2(2): p.

116-26.

2. Greenwald, R.J., G.J. Freeman, and A.H. Sharpe, The B7 family revisited. Annu Rev Immunol,

2005.23: p.515-48.

3. Croft, M., Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat

Rev Immunol, 2003.3(8): p.609-20.

4. Watts, T.H., TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses. Annu Rev

Immunol, 2005.23: p.23-68.

5. Ishida, Y., et al., Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene

superfamily, upon programmed cell death. Embo J, 1992.11(11): p.3887-95.

6. Chambers, C.A. and J.P. Allison, Co-stimulation in T cell responses. Curr Opin Immunol, 1997.

9(3): p.396-404.

7. Lenschow, D.J., T.L. Walunas, and J.A. Bluestone, CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol, 1996.14: p.233-58.

8. June, C.H., et al., The B7 and CD28 receptor families. Immunol Today, 1994.15(7): p.321-31.

9. Boise, L.H., et al., CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-XL. Immunity, 1995.3(1): p.87-98.

10. Linsley, P.S., et al., CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J Exp Med, 1991.174(3): p.561-9.

11. Tazi-Ahnini, R., et al., Cloning, localization, and structure of new members of the butyrophilin gene family in the juxta-telomeric region of the major histocompatibility complex. Immunogenetics, 1997.47(1): p.55-63.

12. Rhodes, D.A., et al., The cluster of BTN genes in the extended major histocompatibility complex. Genomics, 2001.71(3): p.351-62.

13. Henry, J., et al., Cloning, structural analysis, and mapping of the B30 and B7 multigenic families to the major histocompatibility complex (MHC) and other chromosomal regions.

Immunogenetics, 1997.46(5): p.383-95.

14. Henry, J., et al., B30.2-like domain proteins: a growing family. Biochem Biophys Res Commun, 1997.235(1): p.162-5.

15. Ogg, S.L., et al., Expression of butyrophilin (Btn1a1) in lactating mammary gland is essential for the regulated secretion of milk-lipid droplets. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004.101(27): p. 10084-9.

16. Robenek, H., et al., Butyrophilin controls milk fat globule secretion. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006.103(27): p.10385-90.

17. Ishii, T., et al., Carboxy-terminal cytoplasmic domain of mouse butyrophilin specifically associates with a 150-kDa protein of mammary epithelial cells and milk fat globule membrane. Biochim Biophys Acta, 1995.1245(3): p.285-92.

4

18. Henry, J., et al., B30.2-like domain proteins: update and new insights into a rapidly

expanding family of proteins. Mol Biol Evol, 1998.15(12): p.1696-705.

19. Ruddy, D.A., et al., A 1.1-Mb transcript map of the hereditary hemochromatosis locus.

Genome Res, 1997.7(5): p.441-56.

20. Henry, J., M.M. Miller, and P. Pontarotti, Structure and evolution of the extended B7 family.

Immunol Today, 1999.20(6): p.285-8.

21. Compte, E., et al., Frontline: Characterization of BT3 molecules belonging to the B7 family

expressed on immune cells. Eur J Immunol, 2004.34(8): p.2089-99.

22. Malcherek, G., L. Mayr, P. Roda-Navarro, D. Rhodes, N. Miller, and J. Trowsdale.2007. The

B7 homolog butyrophilin BTN2A1 is a novel ligand for DC-SIGN. J. Immunol.179: 3804-3811.

23. Nguyen, T., X. K. Liu, Y. Zhang, and C. Dong.2006. BTNL2, a butyrophilin-like molecule that

functions to inhibit T cell activation. J. Immunol.176: 7354-736

24. Arnett, H. A., S. S. Escobar, E. Gonzalez-Suarez, A. L. Budelsky, L. A. Steffen, N. Boiani, M.

Zhang, G. Siu, A. W. Brewer, and J. L. Viney.2007. BTNL2, a butyrophilin/B7-like molecule, is a

negative costimulatory molecule modulated in intestinal inflammation. J. Immunol.178: 1523-

1533.

25. Xerri L, Devilard E, Hassoun J, et al. In vivo expression of theCTLA4 inhibitory receptor in

malignant and reactive cellsfrom human lymphomas. J Pathol.1997;183:182-187.

26. Yamashiro H, Yoshizaki S, Tadaki T, Egawa K and Seo N.2010. Stimulation of human

butyrophilin 3 molecules results in negative regulation of cellular immunity.

27. Firaguay G and Nunès JA.2009. Analysis of signaling events by dynamic phosphoflow

cytometry. Sience Signaling.

Reference navedene u Primeru 3 su sledeće:

[0161]

1. Tanaka, Y. et coll. Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells. Nature 375, 155-8(1995).

2. Halary, F. et coll. Control of self-reactive cytotoxic T lymphocytes expressing gamma delta T cell receptors by natural killer inhibitory receptors. Eur J Immunol 27, 2812-21(1997).

3. Das, H. et coll. MICA engagement by human Vgamma2Vdelta2 T cells enhances their antigendependent effector function. Immunity 15, 83-93(2001).

4. Deetz, C.O. et coll. Gamma interferon secretion by human Vgamma2Vdelta2 T cells after stimulation with antibody against the T-cell receptor plus the Toll-Like receptor 2 agonist Pam3Cys. Infect Immun 74, 4505-11(2006).

5. Wesch, D. et coll. Direct costimulatory effect of TLR3 ligand poly(I:C) on human gamma delta T lymphocytes. J Immunol 176, 1348-54(2006).

6. Rincon-Orozco, B. et coll. Activation of V gamma 9V delta 2 T cells by NKG2D. J Immunol 175, 2144-51(2005).

7. Boyden, L.M. et coll. Skint1, the prototype of a newly identified immunoglobulin superfamily gene cluster, positively selects epidermal gammadelta T cells. Nat Genet 40, 656-62(2008). 8. Stammers, M. et coll. BTL-II: a polymorphic locus with homology to the butyrophilin gene family, located at the border of the major histocompatibility complex class II and class III regions in human and mouse. Immunogenetics 51, 373-82(2000).

9. Arnett, H.A. et coll. BTNL2, a butyrophilin/B7-like molecule, is a negative costimulatory molecule modulated in intestinal inflammation. J Immunol 178, 1523-33(2007).

10. Compte, E. et coll. Frontline: Characterization of BT3 molecules belonging to the B7 family expressed on immune cells. Eur J Immunol 34, 2089-99(2004).

11. Mann, M. et coll. Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the phosphoproteome. Trends Biotechnol 20, 261-8(2002).

12. Cantin, G.T. et coll. Combining protein-based IMAC, peptide-based IMAC, and MudPIT for efficient phosphoproteomic analysis. J Proteome Res 7, 1346-51(2008).

13. Villén, J. et coll. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1488-93(2007).

14. Park, H. et coll. A point mutation in the murine Hem1 gene reveals an essential role for Hematopoietic protein 1 in lymphopoiesis and innate immunity. J Exp Med 205, 2899-913(2008).

15. Wang, Y. et coll. Profiling signaling polarity in chemotactic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 8328-33(2007).

16. Tzivion, G., Luo, Z. & Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature 394, 88-92(1998).

17. Di Bartolo, V. et coll. A novel pathway down-modulating T cell activation involves HPK-1-dependent recruitment of 14-3-3 proteins on SLP-76. J Exp Med 204, 681-91(2007).

4

18. Zhang, H. et coll. RIP1-mediated AIP1 phosphorylation at a 14-3-3-binding site is critical for tumor necrosis factor-induced ASK1-JNK/p38 activation. J Biol Chem 282, 14788-96(2007). 19. Parker, F. et coll. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Mol Cell Biol 16, 2561-9(1996).

20. Tourrière, H. et coll. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. J Cell Biol 160, 823-31(2003).

21. Rahmouni, S. et coll. Removal of C-terminal SRC kinase from the immune synapse by a new binding protein. Mol Cell Biol 25, 2227-41(2005).

22. Grewal, T. et coll. Annexin A6 stimulates the membrane recruitment of p120GAP to modulate Ras and Raf-1 activity. Oncogene 24, 5809-20(2005).

23. Li, M., Makkinje, A. & Damuni, Z. The myeloid leukemia-associated protein SET is a potent inhibitor of protein phosphatase 2A. J Biol Chem 271, 11059-62(1996).

24. Grantham, J. et coll. Eukaryotic chaperonin containing T-complex polypeptide 1 interacts with filamentous actin and reduces the initial rate of actin polymerization in vitro. Cell Stress Chaperones 7, 235-42(2002).

25. Williams, J.C., Xie, H. & Hendrickson, W.A. Crystal structure of dynein light chain TcTex-1. J Biol Chem 280, 21981-6(2005).

26. Sachdev, P. et coll. G protein beta gamma subunit interaction with the dynein lightchain component Tctex-1 regulates neurite outgrowth. EMBO J 26, 2621-32(2007).

27. Schnapp, B.J. & Reese, T.S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1548-52(1989).

28. Wang, Y. et coll. Rim is a putative Rab3 effector in regulating synaptic-vesicle fusion. Nature 388, 593-8(1997).

29. Martín-Cófreces, N.B. et coll. MTOC translocation modulates IS formation and controls sustained T cell signaling. J Cell Biol 182, 951-62(2008).

30. Stremlau, M. et coll. The cytoplasmic body component TRIM5alpha restricts HIV-1 infection in Old World monkeys. Nature 427, 848-53(2004).

31. Jéru, I. et coll. Interaction of pyrin with 14.3.3 in an isoform-specific and phosphorylationdependent manner regulates its translocation to the nucleus. Arthritis Rheum 52, 1848-57(2005).

32. Mansfield, E. et coll. The familial Mediterranean fever protein, pyrin, associates with microtubules and colocalizes with actin filaments. Blood 98, 851-9(2001).

33. Yu, J. et coll. Pyrin activates the ASC pyroptosome in response to engagement by autoinflammatory PSTPIP1 mutants. Mol Cell 28, 214-27(2007).

4

Claims (8)

1. 34. Badour, K. et coll. The Wiskott-Aldrich syndrome protein acts downstream of CD2 and the CD2AP and PSTPIP1 adaptors to promote formation of the immunological synapse. Immunity 18, 141-54(2003).

   35. Côté, J. et coll. PSTPIP is a substrate of PTP-PEST and serves as a scaffold guiding PTP-PEST toward a specific dephosphorylation of WASP. J Biol Chem 277, 2973-86(2002).

   36. Maeda, Y. et coll. Critical role of host gammadelta T cells in experimental acute graftversushost disease. Blood 106, 749-55(2005).

   37. Pabst, C. et coll. The graft content of donor T cells expressing gamma delta TCR+ and CD4+foxp3+ predicts the risk of acute graft versus host disease after transplantation of allogeneic peripheral blood stem cells from unrelated donors. Clin Cancer Res 13, 2916-22(2007).

   38. Fitch, W. Toward defining the courfe of evolution: minimum change for a specific tree topology. Systematic Zoology 406-416(1971).

   39. Felsenstein, J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J Mol Evol 17, 368-76(1981).

   40. Saitou, N. & Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4, 406-25(1987).

   41. Gouret, P. et coll. FIGENIX: Intelligent automation of genomic annotation: expertise integration in a new software platform. BMC Bioinformatics 6, 198(2005).

   Patentni zahtevi

   1. Anti-CD277 antitelo za upotrebu u terapiji, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata 6 CDR-a antitela mAb20.1 ili mAb7.2 koje se može dobiti od hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita 1-4401 ili 1-4402, tim redom, i

   pri čemu pomenuto anti-CD277 antitelo aktivira citolitičku funkciju, proizvodnju citokina i proliferaciju Vγ9/Vδ2 T ćelija.
2. 2. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto anti-CD277 antitelo

   - kostimuliše T ćelije zajedno sa CD3-TCR, a kostimuliše T ćelije dodatno CD28-B7 kostimulaciji, i - povećava aktivnost i/ili preživljavanje monocita i dendritskih ćelija.
3. 3. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu pomenuto antitelo predstavlja monoklonalno, himerno ili humanizovano antitelo.

   4
4. 4. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu se pomenuto anti-CD277 antitelo može dobiti od hibridoma dostupnog pod CNCM brojem depozita 1-4401 ili 1-4402.
5. 5. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuta terapija kancer.
6. 6. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu pomenuti kancer predstavlja hematološki malignitet.
7. 7. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu hematološki malignitet predstavlja neoplazmu ćelija mijeloidne loze.
8. 8. Anti-CD277 antitelo za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu je pomenuti kancer neki nehematološki kancer odabran iz grupe koju čine kancer kolona, kancer dojke, kancer pluća, kancer mozga, kancer prostate, kancer glave i vrata, kancer pankreasa, kancer bešike, kolorektalni kancer, kancer kostiju, kancer grlića materice, kancer jetre, oralni kancer, kancer jednjaka, kancer štitne žlezde, kancer bubrega, kancer želuca, kancer testisa i kancer kože.

   4