RS62726B1 - Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS62726B1
RS62726B1 RS20211552A RSP20211552A RS62726B1 RS 62726 B1 RS62726 B1 RS 62726B1 RS 20211552 A RS20211552 A RS 20211552A RS P20211552 A RSP20211552 A RS P20211552A RS 62726 B1 RS62726 B1 RS 62726B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
seq
human
cells
Prior art date
Application number
RS20211552A
Other languages
English (en)
Inventor
Diane Hollenbaugh
Shiming Ye
Diane Sau Mun COHEN
Original Assignee
Abbvie Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Biotherapeutics Inc filed Critical Abbvie Biotherapeutics Inc
Publication of RS62726B1 publication Critical patent/RS62726B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis pronalaska
3. OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetna prijava se odnosi na, između ostalog, nova anti-CD40 antitela, kompozicije koje uključuju nova antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju antitela i postupke pravljenja i upotrebe istih.
4. POZNATO STANJE TEHNIKE
[0002] Terapije kancera obuhvataju širok spektar terapijskih pristupa, uključujući hirurgiju, zračenje i hemoterapiju. Iako razni pristupi omogućavaju da širok izbor tretmana bude dostupan ordinirajućem lekaru za lečenje kancera, postojeće terapeutike karakterišu brojne mane, kao što su nedostatak selektivnosti u ciljanom delovanju na kancerske ćelije u odnosu na normalne, zdrave ćelije, kao i razvoj rezistencije kancera na lečenje.
[0003] Skorašnji pristupi zasnovani na terapeuticima sa ciljanim dejstvom, koji preferencijalno ometaju ćelijske procese u kancerskim ćelijama u odnosu na normalne ćelije, doveli su do hemoterapijskih režima sa manje sporednih efekata u poređenju sa terapijama bez ciljanog dejstva poput lečenja zračenjem.
[0004] Imunoterapija kancera, posebno razvoj sredstava koja aktiviraju T-ćelije imunog sistema domaćina, da bi se sprečila proliferacija ili se ubile kancerske ćelije, pojavila se kao obećavajući terapijski pristup koji bi predstavljao dopunu postojećih standarda nege. Pogledati, npr. Miller i saradnici, Cancer Cell, 27, 439-449 (2015). Takvi imunoterapijski pristupi uključuju razvoj antitela koja se upotrebljavaju za modulisanje imunog sistema tako da ubija kancerske ćelije. Na primer, anti-PD-1 blokirajuća antitela pembrolizumab (Keytruda®) i nivolumab (Opdivo®) odobrena su u SAD i Evropskoj uniji za lečenje bolesti kao što je melanom koji se ne može resektovati ili metastatski melanom i metastatski nesitnoćelijski kancer pluća. Napori da se inhibiraju imunosupresivni proteini kao što je CTLA-4, doveli su do razvoja i kliničke procene anti-CTLA-4 antitela, poput tremelimumaba i ipilimumaba (Yervoy®).
[0005] Ostaje potreba za alternativnim pristupima i dodatnim tretmanima kancera koji bi predstavljali dopunu postojećih terapijskih standarda nege.
US2014120103A1 opisuje anti-CD40 antitela i postupke njihove upotrebe.
US2009074711A1 opisuje humane terapije sa upotrebom himernog agonističkog anti-humanog CD40 antitela.
WO2015091853A2 opisuje antitela koja se specifično vezuju za CD40.
EP1707627A1 opisuje mutanta antagonističkog anti-CD40 antitela.
WO2014144960A2 opisuje Fc varijante.
EP2889377A1 opisuje varijantu Fc regiona sa pojačanom aktivnošću vezivanja Fc<3>RIIb i/ili sa pojačanom selektivnošću vezivanja.
5. IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0006] Humani CD40 (SEQ ID NO:40) je član superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNF) (član 5 TNF superfamilije) koji je eksprimiran na ćelijama koje prezentuju antigen, kao što su B-ćelije, dendritične ćelije (DC) i monociti i neimunske ćelije, uključujući određene vrste tumorskih ćelija. Kada se aktivira humanim CD40 ligandom (SEQ ID NO:41), humani CD40 aktivira ćelije koje prezentuju antigen i indukuje odgovore i urođenog i adaptivnog imunskog sistema. Agonistička CD40 sredstva mogu biti upotrebljena da se indukuje imunski sistem tako da se spreči proliferacija i/ili da se ubiju tumorske ćelije i da se na taj način obezbedi efektivan terapijski tretman solidnih tumora.
[0007] Anti-CD40 antitela i njihovi vezujući fragmenti opisa su oni koji se specifično vezuju za humani CD40 (SEQ ID NO:40). Aminokiselinske sekvence CDR regiona za primer, kao i aminokiselinska sekvenca VHi VLregiona teških i lakih lanaca anti-CD40 antitela za primer, obezbeđene su ispod, u Detaljnom opisu pronalaska.
[0008] Preciznije, pronalazak obezbeđuje anti-CD40 antitelo sa sekvencom teškog lanca u skladu sa SEQ ID NO: 132 ili 133 i sa sekvencom lakog lanca u skladu sa SEQ ID NO: 141.
[0009] Takođe su obezbeđeni:
molekul ili molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-CD40 antitelo pronalaska;
vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska;
ćelija domaćin, pri čemu je navedena ćelija domaćin eukariotska ćelija i sadrži vektor pronalaska; ćelija domaćin, pri čemu je navedena ćelija domaćin eukariotska ćelija i konstruisana je tako da eksprimira molekul ili molekule nukleinskih kiselina pronalaska; i
postupak za proizvodnju anti-CD40 antitela, koji obuhvata kultivisanje eukariotske ćelije domaćina koja je transformisana vektorom pronalaska i izdvajanje antitela.
[0010] Ovde opisani VHi VLlanci anti-CD40 antitela omogućavaju alosterični agonistički receptorski odgovor koji može aktivirati humani CD40 u prisustvu ili odsustvu liganda za CD40 (CD40L), bez kompeticije u interakciji vezivanja CD40L-CD40. Štaviše, predmetna anti-CD40 antitela, interakcijom sa CD40, mogu poboljšati vezivanje CD40L za CD40.
[0011] Anti-CD40 antitela mogu uključivati modifikacije i/ili mutacije koje menjaju osobine antitela, kao što su povećanje poluživota, povećanje ili smanjenje ADCC-a ili povećanje agonističke aktivnosti, kao što je poznato u oblasti tehnike.
[0012] Ovde su obezbeđene i nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju anti-CD40 antitela opisa, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Opisane su takođe prokariotske i eukariotske ćelije domaćini transformisane vektorom koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira opisano anti-CD40 antitelo koje je ovde obezbeđeno, kao i eukariotske ćelije domaćini (poput sisarskih) konstruisane tako da eksprimiraju nukleotidne sekvence. Obezbeđeni su i postupci proizvodnje antitela, kultivisanjem ćelija domaćina i izdvajanjem antitela, a isti se dodatno razmatraju u nastavku teksta, u Detaljnom opisu pronalaska.
[0013] Opisane su i kompozicije koje uključuju ovde opisana anti-CD40 antitela. Kompozicije generalno sadrže jedno ili više anti-CD40 antitela koja su kao što je ovde opisano, i/ili njihove soli, i jedan ili više ekscipijenasa, nosača ili razblaživača.
[0014] Ovde su opisani postupci lečenja subjekata, kao što su humani subjekti kojima je postavljena dijagnoza solidnog tumora, sa anti-CD40 antitelom. Postupak u principu uključuje primenu subjektu količine ovde opisanog anti-CD40 antitela koja je efektivna u obezbeđivanju terapijske koristi. Subjektu može biti postavljena dijagnoza bilo kog od brojnih solidnih tumora koji mogu biti novodijagnostikovani, u relapsu ili u relapsu i refraktorni. Anti-CD40 antitelo se uobičajeno primenjuje kao intravenska infuzija ili intratumorska injekcija, u dozama opsega od oko 0,001 mg/kg do oko 4 mg/kg. Anti-CD40 antitelo se obično primenjuje kao intravenska infuzija ili intratumorska injekcija dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom na svake tri nedelje, jednom na svake četiri nedelje, jednom na svakih pet nedelja, jednom na svakih šest nedelja, jednom na svakih sedam nedelja ili jednom na svakih osam nedelja.
[0015] Anti-CD40 antitela mogu biti primenjivana kao samostalna terapijska sredstva (monoterapija) ili kao dopunska terapija, ili sa drugim terapijskim sredstvima koja su obično, ali ne i obavezno, ona koja se upotrebljavaju za lečenje solidnog tumora. Terapijska sredstva će obično biti upotrebljena u njihovoj odobrenoj dozi, odobrenim putem primene i sa odobrenom učestalošću primene, ali mogu biti upotrebljena u nižim dozama.
[0016] Anti-CD40 antitela mogu biti primenjena raznovrsnim putevima ili načinima primene, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravensku infuziju i/ili injeciranje, subkutano injeciranje i intratumorsko injeciranje. Primenjena količina će zavisiti od puta primene, šeme doziranja, vrste kancera koji se leči, stadijuma kancera koji se leči i drugih parametara kao što su starost i težina pacijenta, kao što je dobro poznato u oblasti tehnike. Specifični primeri doznih režima za koje se očekuje da će obezbediti terapijsku korist obezbeđeni su u Detaljnom opisu pronalaska.
[0017] Na osnovu podataka koji su ovde prikazani, očekuje se da će anti-CD40 antitela koja su ovde opisana obezbediti terapijsku korist subjektima sa dijagnozom solidnog tumora.
6. KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0018]
SL. 1 prikazuje aminokiselinske sekvence humanog CD40 receptora (SEQ ID NO:40) i humanog liganda za CD40 (SEQ ID NO:41).
SL.2A-2G obezbeđuju aminokiselinske sekvence VHi VLza mišja i humanizovana anti-CD40 antitela za primer. SL.2A prikazuje VHi VLaminokiselinske sekvence za muAb1 do muAb3; SL.2B prikazuje aminokiselinske sekvence VHi VLza muAb4 do muAb7; SL. 2C prikazuje VHi VLaminokiselinske sekvence za muAb8 do muAb10; SL.2D prikazuje VHi VLaminokiselinske sekvence za humanizovana antitela muAb6 i muAb8; SL. 2E prikazuje VHi VLaminokiselinske sekvence za humanizovana antitela muAb8 i muAb9; SL. 2F prikazuje VHi VLaminokiselinske sekvence za dodatna humanizovana antitela muAb9; i SL. 2G prikazuje VHi VLaminokiselinske sekvence za dodatna humanizovana antitela muAb9.
SL.3 obezbeđuje rezultate eksperimenata kompeticije za humani CD40 između CD40L i anti-CD40 antitela za primer. U gornjem levom delu su prikazana anti-CD40 antitela za primer koja su u kompeticiji sa CD40L; gornji desni deo slike prikazuje antitela koja nisu u značajnoj kompeticiji sa CD40L; dole levo su prikazana antitela koja pojačavaju interakciju CD40-CD40L; dole desno su prikazani efekti anti-CD40 antitela huAb9 A2I i CP-870,893. Y-osa prikazuje optičku gustinu (OD) na 650 nm; x-osa prikazuje dozu antitela („Uzorak“) u µg/mL.
SL.4 prikazuje vezivanje humanog CD40 konjugovanog sa fluorohromom, u fiksnoj koncentraciji od 1 µg/mL, na Jurkat ćelije koje eksprimiraju humani CD40L u prisustvu rastućih količina antitela huAb9 A2I, CP-870,893, humanog IgG1("huIgG1") izotipa ili humanog IgG2("huIgG2") izotipa. Y-osa prikazuje srednji intenzitet fluorescencije ("MFI") koji predstavlja vezivanje; x-osa prikazuje dozu antitela („Uzorak“) u µg/mL.
SL.5A-5B pokazuju efekte doze antitela („Uzorka“) od 3 µg/mL ili samog medijuma na NFκB signal iz HEK293 plavih CD40 NFκB reporterskih ćelija koje su bile pomešane sa Jurkat D1.1 ćelijama (u odnosu 1:1). Antitelo huAb9 A2I, CP-870,893, humani IgG1("huIgG1") izotip ili humani IgG2("huIgG2") izotip, ili sam medijum, dodavani su pojedinačnom uzorku. SL.5A prikazuje NFkB signal u kulturama koje su sadržavale CD40L negativne ("CD40L-") Jurkat D1.1 ćelije. SL.5B prikazuje NFkB signal u kulturama koje su sadržavale CD40L pozitivne ("CD40L+") Jurkat D1.1 ćelije. Y-osa prikazuje OD na 625 nm; x-osa prikazuje tretman sa antitelom ili samo sa medijumom („Uzorak“).
SL.6A-6B pokazuju vezivanje doza antitela („Uzorak“) u µg/mL za huAb9-5 sa huIgG1divljeg tipa, ili sa V273Y ili V273E varijantom, ili za CP-870,893, u CHO ćelijama koje eksprimiraju CD16F, CD16V, CD32a, CD32b ili CD64. SL.6A prikazuje vezivanje anti-CD40 antitela za CHO ćelije koje eksprimiraju CD16F (gore levo), CD16V (gore desno), CD32a (dole levo) ili CD32b (dole desno). SL.6B prikazuje vezivanje anti-CD40 antitela za CHO ćelije koje eksprimiraju CD64. Y-osa prikazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) koji predstavlja vezivanje; x-osa prikazuje dozu antitela („Uzorak“) u µg/mL. SL.7 prikazuje citotoksičnost posredovanu ćelijama i zavisnu od antitela (ADCC) za V273E ili V273Y varijatne konstantnog regiona huAb9-5 antitela u poređenju sa huAb9-5 sa humanim IgG1divljeg tipa, u RL ćelijama. Y-osa prikazuje procenat citotoksičnosti u RL ćelijama; x-osa prikazuje dozu antitela („Uzorak“) u µg/mL.
SL.8 pokazuje efekat antitela huAb6-1 (gore levo), huAb9-5 (dole levo), huAb8-1 (gore desno) sa humanim IgG1divljeg tipa, ili V273E ili V273Y varijante konstantnog regiona, na proliferaciju B-ćelija. Donji desni grafik prikazuje efekte na proliferaciju B-ćelija za huAb9 A2I sa V273E varijantom humanog IgG1ili za CP-870,893. Y-osa prikazuje proliferaciju B-ćelija u broju otkucaja po minuti (CPM); x-osa prikazuje dozu antitela („Uzorak“) u µg/mL.
SL.9 pokazuje efekat antitela huAb6-1 (gore levo), huAb9-5 (dole levo) i huAb8-1 (gore desno) sa humanim IgG1divljeg tipa, ili sa V273E ili V273Y varijantom konstantnog regiona, na aktivaciju dendritičnih ćelija (DC), što je izmereno proizvodnjom IL-12p70 u pg/mL. Donji desni grafik prikazuje aktivaciju DC za huAb9 A2I sa V273E varijantom humanog IgG1ili za CP-870,893. Y-osa prikazuje IL-12p70 u pg/mL; x-osa prikazuje dozu antitela („Uzorak“) u µg/mL.
SL. 10 prikazuje efekat V273Y varijante huAb6-1, huAb8-1 ili huAb9-5 na ko-kulture DC i T-ćelija, izmeren proizvodnjom interferona-gama (IFN-y) u pg/mL.
SL.11 pokazuje efekat antitela huAb6-1 (gornji panel), huAb9-5 (srednji) ili huAb9 A2I (donji panel) na zapreminu tumora (mm<3>) u profilaktičkom PC3 mišjem modelu.
SL.12 prikazuje in vivo efekte nakon intratumorske (IT) ili intraperitonealne (IP) isporuke anti-CD40 antitela 1C10, ili mIgG1 izotipa, u mišjem modelu koji nosi bilateralno uspostavljene CT26 singene tumore. IT doziranje je primenjivano u jedan tumor na jednom boku, bez injeciranja u tumor na drugom boku.
SL.13 pokazuje efekte na zapreminu tumora (mm<3>) nakon primene doze dva puta nedeljno za anti-CD40 antitela 1C10 u koncentraciji od 0,6 mg/kg, anti-PD-1 antitela u koncentraciji od 10 mg/kg, ili kombinovanog tretmana i sa 1C10 i anti-PD-1 antitelom, u CT26 mišjem singenom modelu.
SL.14 prikazuje nivoe ALT (gore levo), TNFα ("TNFa", dole levo) ili IL-6 (dole desno), 24 sata nakon primene doze anti-CD40 antitela 1C10 ("anti-CD40"), anti-PD-1 antitela ("anti-PD-1") ili kombinovanog tretmana ("anti-CD40 anti-PD-1") u CT26 mišjem singenom modelu. Gornji desni grafik prikazuje težinu slezine 4 dana nakon primene doze.
7. DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0019] Predmetni opis se odnosi na antitela i fragmente koji specifično vezuju humani CD40 (SEQ ID NO:40), kompozicije koje sadrže antitela, polinukleotide koji kodiraju anti-CD40 antitela, ćelije domaćine koje su u stanju da proizvode antitela, postupke i kompozicije korisne za stvaranje antitela i vezujućih fragmenata i razne postupke upotrebe istih.
[0020] Iskusnom stručnjaku je od značaja napomena da su antitela "modularna" po svojoj prirodi. Kroz opis, opisani su razni "moduli". Kao specifični neograničavajući primeri, opisane su razne specifične VHCDR sekvence, VHlanci, VLCDR sekvence i VLlanci.
7.1. Skraćenice
[0021] Antitela, vezujući fragmenti, ADC i polinukleotidi koji su ovde opisani su, u mnogim slučajevima, opisani putem njihovih odgovarajućih polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci. Ukoliko nije drugačije naznačeno, polipepRdne sekvence su obezbeđene u N→C orijentaciji; polinukleotidne sekvence u 5'→3' orijentaciji. Za polipeptidne sekvence mogu biti upotrebljavane konvencionalne skraćenice od tri ili jednog slova za genetički kodirane aminokiseline, kao što je navedeno ispod, u TABELI 1.
[0022] Određene sekvence su definisane strukturnim formulama koje specifično određuju aminokiselinske ostatke koji pripadaju određenim klasam (npr. alifatični, hidrofobni su itd.). Razne klase kojima pripadaju genetički kodirane aminokiseline, kako što se ovde upotrebljava, navedene su ispod, u TABELI 2. Pojedine aminokiseline mogu pripadati u više od jedne klase. Cistein, koji sadrži sulfhidrilnu grupu, i prolin, koji je sa konformacionim ograničenjima, nisu sa dodeljenim klasama.
[0023] Skraćenice upotrebljene za razna antitela za primer koja su ovde opisana, obezbeđene su ispod, u TABELI 3:
7.2. Definicije
[0024] Ukoliko nije ovde drugačije definisano, naučni i tehnički termini upotrebljeni u vezi sa predmetnim opisom bi trebali da budu sa značenjima koja se uobičajeno podrazumevaju od strane prosečno iskusnih stručanjka iz oblasti tehnike.
7.3. Anti-CD40 antitela i vezujući fragmenti
[0025] Prema jednom aspektu, opis se odnosi na antitela i/ili njihove vezujuće fragmente koji specifično vezuju humani CD40 receptor (takođe poznat kao član 5 superfamilije faktora nekroze tumora, TNFRSF5, Bp50 i CD40L receptor).
[0026] Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" (Ab) se odnosi na imunoglobulinski molekul koji se specifično vezuje za određeni antigen - ovde, CD40. Anti-CD40 antitela opisa se vezuju za humani CD40 i na taj način modulišu, npr. aktiviraju imunski sistem. Rezultujući odgovor imunskog sistema inhibira proliferaciju ćelija kao što su tumorske ćelije, a u pojedinim slučajevima su citotoksični za tumorske ćelije. Anti-CD40 antitela opisa obuhvataju regione koji određuju komplementarnost (CDR), takođe poznate kao hipervarijabilni regioni, kako u varijabilnim domenima lakih lanaca tako i teških lanaca. Više evolutivno očuvani delovi varijabilnih domena se nazivaju uokvirujući region (FR). Kao što je poznato u oblasti tehnike, aminokiselinska pozicija/granica koja ocrtava hipervarijabilni region antitela može varirati, u zavisnosti od konteksta i raznih definicija koje su poznate u oblasti tehnike. Pojedine pozicije unutar varijabilnog domena se mogu posmatrati kao hibridne hipervarijabilne pozicije po tome što se ove pozicije mogu smatrati onima unutar hipervarijabilnog regiona prema jednom skupu kriterijuma, dok se smatraju kao one koje su izvan hipervarijabilnog regiona prema drugom skupu kriterijuma. Jedna ili više od ovih pozicija se takođe mogu pronaći u proširenim hipervarijabilnim regionima. Opis obezbeđuje antitela koja sadrže modifikacije u ovim hibridnim hipervarijabilnim pozicijama. Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FR regiona, uglavnom usvajanjem konfiguracije β-pločica, povezanih sa tri CDR sekvence, koje obrazuju petlje koje povezuju, a u pojedinim slučajevima i čine deo, strukture β-pločica. CDR sekvence u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona i, sa CDR sekvencama iz drugog lanca, doprinose obrazovanju mesta ciljnog vezivanja antitela. Pogledati, Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Kao što se ovde upotrebljava, numerisanje imunoglobulinskih aminokiselinskih ostataka se vrši prema sistemu numerisanja imunoglobulinskih aminokiselinskih ostataka Kabat-a i saradnika, ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0027] Antitela opisa mogu biti poliklonska, monoklonska, genetički konstruisana i/ili drugačije modifikovana po svojoj prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, primatizovana antitela, jednolančana antitela itd. Antitela mogu sadržavati ceo ili deo konstantnog regiona antitela. Prema pojedinim aspektima, konstantni region je izotipa izabranog od: IgA (npr. IgA1ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3ili IgG4) i IgM. U specifičnim primerima izvođenja, anti-CD40 antitela koja su ovde opisana sadrže IgG1. Prema drugim aspektima, anti-CD40 antitela sadrže IgG2. Prema još drugim aspektima, anti-CD40 antitela sadrže IgG4. Kao što se ovde upotrebljava, "konstantni region" antitela uključuje prirodni konstantni region, alotipove ili prirodne varijante, kao što su D356E i L358M, ili A431G u humanom IgG1. Pogledati, npr. Jefferis i Lefranc, MAbs, 1(4):332-338 (jul-avg 2009).
[0028] Konstantni region lakog lanca anti-CD40 antitela može biti kapa (κ) region ili lambda (λ) region lakog lanca. λ region lakog lanca može biti bilo koji od poznatih podtipova, npr. λ1, λ2, λ3, ili λ4. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo sadrži kapa (κ) region lakog lanca.
[0029] Termin "monoklonsko antitelo", kako se ovde upotrebljava, nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Monoklonsko antitelo je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili klon faga, na bilo koji način dostupan ili poznat u oblasti tehnike. Monoklonska antitela od koristi za predmetni opis, mogu biti pripremljena upotrebom širokog spektra tehnika koje su poznate u oblasti tehnike, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i tehnologija prikaza u fagima, ili njihove kombinacije. U mnogim upotrebama predmetnog opisa, uključujući in vivo upotrebu anti-CD40 antitela kod ljudi, himerna, mogu biti prikladno upotrebljena primatizovana, humanizovana ili humana antitela.
[0030] Termin "himerno" antitelo, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo koje ima varijabilne sekvence izvedene iz imunoglobulina koji nije humani, kao što su pacovsko ili mišje antitelo, kao i konstantne regione humanog imunoglobulina, obično izabrane iz matrice humanih imunoglobulina. Postupci za proizvodnju himernih antitela su poznati u oblasti tehnike. Pogledati, npr. Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi i saradnici, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies i saradnici, 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. No.5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397.
[0031] „Humanizovani“ oblici antitela koja nisu humana (npr. mišjih) su himerni imunoglobulini koji sadrže minimalne sekvence izvedene iz imunoglobulina koji nije humani. U principu, humanizovana antitela će sadržavati suštinski sve od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz imunoglobulina koji nije humani, dok su svi ili suštinski svi FR regioni oni iz sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo može takođe sadržavati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično onaj iz konsenzusne sekvence humanog imunoglobulina. Postupci humanizacije antitela su poznate u oblasti tehnike. Pogledati, npr. Riechmann i saradnici, 1988, Nature 332:323-7; U.S. Patent No: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370 autora Queen i saradnici; EP239400; PCT publicaciju WO 91/09967; U.S. Patent No.5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka i saradnici, 1994, Prot. Eng.7:805-814; Roguska i saradnici, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.91:969-973; i U.S. Patent No.5,565,332.
[0032] "Humana antitela" obuhvataju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina, a koje ne eksprimiraju endogene imunoglobuline. Humana antitela mogu biti napravljena raznovrsnim postupcima poznatim u oblasti tehnike, uključujući postupke prikazivanja u fagima sa upotrebom biblioteka antitela izvedenih iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Pogledati, U.S. Patent No. 4,444,887 i 4,716,111; i PCT publikacije WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; i WO 91/10741. Humana antitela mogu takođe biti proizvedena upotrebom transgenih miševa koji nisu u stanju da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju humane imunoglobulinske gene. Pogledati, npr. PCT publikacije WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; U.S. Patent No. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; i 5,939,598. Dodatno, kompanije kao što su LakePharma, Inc. (Belmont, CA) ili Creative BioLabs (Shirley, NY) mogu biti angažovane da obezbede humana antitela usmerena na odabrani antigen, upotrebom tehnologija sličnih onima koje su prethodno opisane. U potpunosti humana antitela koja prepoznaju odabrani epitop mogu biti generisana upotrebom tehnika označenih kao „vođena selekcija“. U ovom pristupu, odabrano monoklonsko antitelo koje nije humano, npr. mišje antitelo, upotrebljava se za vođenje selekcije potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (pogledati, Jespers i saradnici, 1988, Biotechnology 12:899-903).
[0033] "Primatizovana antitela" sadrže varijabilne regione majmuna i humane konstantne regione. Postupci za proizvodnju primatizovanih antitela su poznati u oblasti tehnike. Pogledati, npr. U.S. Patent No.5,658,570; 5,681,722; i 5,693,780.
[0034] Anti-CD40 antitela opisa uključuju molekule antitela pune dužine (intaktne) koji su u stanju da specifično vezuju CD40, npr. humani CD40 (SEQ ID NO:40).
[0035] Opisani su i anti-CD40 vezujući fragmenti koji su u stanju da specifično vezuju humani CD40. Primeri vezujućih fragmenata antitela uključuju, u vidu primera i bez ograničenja, Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmente, jednolančane Fv fragmente i jednodomenske fragmente.
[0036] Fab fragment sadrži konstantne i varijabilne domene lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) i varijabilni domen teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodatku nekoliko ostataka na karboksilnom kraju CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. F(ab') fragmenti se proizvode cepanjem disulfidne veze između cisteina regiona zgloba kod proizvoda nastalog digestijom F(ab')2fragmenta. Dodatno hemijsko kuplovanje fragmenata antitela je poznato onima sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike. Fab i F(ab')2fragmentima nedostaje Fc fragment intaktnog antitela, brže se čiste iz cirkulacije životinja i mogu se manje nespecifično vezivati za tkivo u odnosu na intaktno antitelo (pogledati, npr. Wahl i saradnici, 1983, J. Nucl. Med.24:316).
[0037] "Fv" fragment je minimalni fragment antitela koji sadrži potpuno mesto za ciljno prepoznavanje i vezivanje. Ovaj region se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca koji su u čvrstoj, nekovalentnoj vezi (VH-VLdimer). U ovoj konfiguraciji, tri CDR-a svakog varijabilnog domena interaguju tako da definišu mesto ciljnog vezivanja na površini VH-VLdimera. Često, šest CDR sekvenci obezbeđuje antitelu specifičnost ciljanog vezivanja. Ipak, u pojedinim slučajevima, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri CDR sekvence specifične za ciljni molekul) može imati sposobnost da prepozna i veže ciljni molekul, iako sa nižim afinitetom od celokupnog vezujućeg mesta.
[0038] Vezujući fragmenti "jednolančanog Fv" ili "scFv" antitela sadrže VHi VLdomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. U principu, Fv polipeptid dodatno sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena, koji omogućava da scFv obrazuje željenu strukturu za ciljano vezivanje.
[0039] „Jednodomenski fragmenti“ se sastoje od jednog VHili VLdomene koga karakteriše dovoljan afinitet za humani CD40. Jednodomenski fragment može biti kamelizovani fragment (Pogledati, npr. Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25―38).
[0040] Anti-CD40 antitela opisa uključuju derivatizovana antitela. Na primer, ali ne na način koji predstavlja ograničenje, derivatizovana antitela su obično modifikovana glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom sa poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može biti izvedena sa poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina itd. Pored navedenog, derivat može sadržavati jednu ili više neprirodnih aminokiselina, npr. upotrebom Ambryx tehnologije (Pogledati, npr. Wolfson, 2006, Chem. Biol.13(10):1011-2).
[0041] Anti-CD40 antitela ili vezujući fragmenti mogu biti antitela ili fragmenti čije su sekvence modifikovane tako da se izmeni najmanje jedna biološka efektorska funkcija posredovana konstantnim regionom. Anti-CD40 antitelo opisa može biti modifikovano tako da se smanji najmanje jedna biološka efektorska funkcija posredovana konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr. tako da se smanji vezivanje za jedan ili više Fc receptora (FcyR) kao što su FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA i/ili FcyRIIIB. Vezivanje FcyR može biti smanjeno mutiranjem segmenta imunoglobulinskog konstantnog regiona antitela u određenim regionima koji su neophodni za interakcije sa FcyR (Pogledati, npr. Canfield i Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; i Lund i saradnici, 1991, J. Immunol.147:2657-2662). Smanjenje sposobnosti antitela da vezuje FcyR takođe može smanjiti ostale efektorske funkcije koje se oslanjaju na interakcije sa FcyR, a kao što su opsonizacija, fagocitoza i ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena
[0042] Anti-CD40 antitelo ili vezujući fragment koji su ovde opisani obuhvataju antitela koja su modifikovana tako da steknu ili da im se poboljša najmanje jedna biološka efektorska funkcija posredovana konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr. da se poboljšaju interakcije sa FcyR (Pogledati, npr. US Patent Appl. No.2006/0134709). Na primer, anti-CD40 antitelo opisa može imati konstantni region koji vezuje FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA i/ili FcyRIIIB sa većim afinitetom od odgovarajućeg konstantnog regiona divljeg tipa.
[0043] Prema tome, antitela opisa mogu imati izmene u biološkoj aktivnosti čiji je rezultat povećanje ili smanjenje opsonizacije, fagocitoze ili ADCC. Takve izmene su poznate u oblasti tehnike. Na primer, modifikacije u antitelima koje smanjuju aktivnost ADCC su opisane u U.S. Patent No. 5,834,597. Varijanta snižavanja ADCC za primer odgovara "mutantu 3" (takođe poznatom kao "M3", prikazanom na SL. 4 u U.S. Patent No. 5,834,597) u kome su ostaci 234 i 237 (upotrebom EU numeracije) supstituisani alaninima. Varijacija mutanta 3 (takođe poznatog kao "M3") može biti upotrebljena u brojnim izotipovima antitela, npr. IgG2.
[0044] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitela opisa su sa niskim nivoima, ili sa nedostatkom, fukoze. Za antitela kojima nedostaje fukoza je pokazano da su u korelaciji sa pojačanom ADCC aktivnošću, posebno u malim dozama antitela. Pogledati, Shields i saradnici, 2002, J. Biol. Chem.
277:26733-26740; Shinkawa i saradnici, 2003, J. Biol. Chem.278:3466-73. Postupci pripreme antitela bez fukoze uključuju rast u YB2/0 ćelijama mijeloma pacova (ATCC CRL 1662). YB2/0 ćelije eksprimiraju niske nivoe iRNK za FUT8, koja kodira α-1,6-fukoziltransferazu, enzim koji je neophodan za fukozilaciju polipeptida.
[0045] Anti-CD40 antitela opisa mogu sadržavati modifikovane (ili varijante) CH2 domene ili cele Fc domene koji uključuju aminokiselinske supstitucije koje povećavaju vezivanje za FcγRIIB i/ili smanjeno vezivanje za FcyRIIIA u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg CH2 ili Fc regiona divljeg tipa. Varijanta CH2 ili varijanta Fc domena su opisane u U.S. Patent Appl. No. 2014/0377253. Varijanta CH2 ili varijanta Fc domena obično uključuje jednu ili više supstitucija na poziciji 263, poziciji 266, poziciji 273 i poziciji 305, pri čemu je numerisanje ostataka u Fc domenu u skladu sa EU indeksom opisanom u publikaciji Kabata. Ovde opisana anti-CD40 antitela sadrže jednu ili više supstitucija izabranih od V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K i V305W u odnosu na CH2 domen divljeg tipa. Na primer, jedna ili više supstitucija CH2 domena je izbrana od V263L, V273E, V273F, V273M, V273S i V273Y, u odnosu na CH2 domen humanog IgG1. Na primer, jedna ili više supstitucija CH2 domena IgG1može biti V273EAlternativno, anti-CD40 antitelo opisa sadrži varijantu CH2 regiona IgG1koji sadrži aminokiselinsku supstituciju V263L.
[0046] Drugi primeri varijante CH2 ili varijante Fc domena koji mogu omogućiti povećano vezivanje za FcyRIIB i/ili smanjeno vezivanje za FcyRIIIA u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg CH2 ili Fc regiona divljeg tipa uključuju one koji se mogu naći u publikaciji Vonderheide-a i saradnika, Clin. Cancer Res., 19(5), 1035-1043 (2013), kao što je S267E ili S267E/L328F u humanom IgG1.
[0047] Ovde opisana anti-CD40 antitela ili vezujući fragmenti uključuju modifikacije koje povećavaju ili smanjuju njihov afinitet vezivanja za fetalni Fc receptor, FcRn, na primer, mutacijom segmenta imunoglobulinskog konstantnog regiona u određenim regionima uključenim u interakcije sa FcRn (pogledati, npr. WO 2005/123780). Na primer, anti-CD40 antitelo IgG klase može biti mutirano tako da je najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka 250, 314 i 428 konstantnog regiona teškog lanca supstituisan samostalno, ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji, kao što je na pozicijama 250 i 428, ili na pozicijama 250 i 314, ili na pozicijama 314 i 428, ili na pozicijama 250, 314 i 428, pri čemu su pozicije 250 i 428 specifična kombinacija. Za poziciju 250, supstituišući aminokiselinski ostatak može biti bilo koji aminokiselinski ostatak drugačiji od treonina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 314, supstituišući aminokiselinski ostatak može biti bilo koji aminokiselinski ostatak drugačiji od leucina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 428, supstituišući aminokiselinski ostatak može biti bilo koji aminokiselinski ostatak drugačiji od metionina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Primer supstitucije za koju je poznato da modifikuje Fc efektorsku funkciju je supstitucija M428L u Fc, koja se može javiti u kombinaciji sa supstitucijom T250Q u Fc. Dodatne specifične kombinacije pogodnih aminokiselinskih supstitucija su identifikovane u Tabeli 1 iz U.S. Patent No. 7,217,797. Takve mutacije povećavaju vezivanje za FcRn, što štiti antitelo od razgradnje i produžava njegov poluživot.
[0048] Anti-CD40 antitelo može imati jednu ili više aminokiselina insertovanih u jednu ili više od njegovih CDR sekvenci, na primer kao što je opisano u Jung i Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966; Yazaki i saradnici, 2004, Protein Eng. Des Sel.17(5):481-9. Epub 2004, 17. avgust; i U.S. Pat. Appl. No.2007/0280931.
[0049] Anti-CD40 antitela sa afinitetom za humani CD40 mogu biti poželjna za terapijsku i dijagnostičku upotrebu. Shodno tome, predmetni opis razmatra antitela sa afinitetom vezivanja za humani CD40. U specifičnim primerima izvođenja, anti-CD40 antitela koja vezuju humani CD40 su sa afinitetom od najmanje oko 1000 nM, ali mogu pokazati veći afinitet, na primer, od najmanje oko 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM ili čak i više. U pojedinim primerima izvođenja, antitela vezuju humani CD40 sa afinitetom opsega od oko 1 pM do oko 1000 nM ili sa afinitetom opsega između bilo kojih od prethodno navedenih vrednosti.
[0050] Afinitet anti-CD40 antitela za humani CD40 može biti utvrđen upotrebom tehnika koje su dobro poznate u oblasti tehnike ili su ovde opisane, kao što su, na primer, ali ne na način koji je ograničenje, upotrebom ELISA postupka, izotermičke titracione kalorimetrije (ITC), površinske plazmonske rezonancije ili fluorescentne polarizacione analize.
[0051] Anti-CD40 antitela generalno sadrže teški lanac koji sadrži varijabilni region (VH) sa tri regiona koji određuju komplementarnost ("CDR"), koji se ovde označeni (po N→C redosledu) kao VHCDR#1, VHCDR#2 i VHCDR#3, dok je laki lanac koji sadrži varijabilni region (VL) sa tri regiona koji određuju komplementarnost koji su ovde označeni (po N→C redosledu) kao VLCDR#1, VLCDR#2 i VLCDR#3. Ovde su obezbeđene i aminokiselinske sekvence CDR sekvenci za primer, kao i aminokiselinska sekvenca VHi VLregiona teških i lakih lanaca anti-CD40 za primer. Anti-CD40 antitela opisa uključuju ove CDR i/ili VHi/ili VLsekvence za primer, kao i antitela koja stupaju u kompeticiju za vezivanje humanog CD40 sa takvim antitelima.
[0052] Aminokiselinske sekvence CDR-ova anti-CD40 antitela opisa su izabrane od sledećih sekvenci:
[0053] Svaki CDR anti-CD40 antitela, nezavisno od ostalih, može biti izabran tako da odgovara po sekvenci odgovarajućem CDR antitela koji je obezbeđen u TABELI 3. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je IgG i ima VHi VLkoji po sekvenci odgovaraju VHi VLiz antitela obezbeđenog u TABELI 3.
[0054] Ovde opisano, anti-CD40 antitelo opisa sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara bilo kojoj SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ili 109; i VLlanac koji po sekvenci odgovara bilo kojoj od SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ili 160. Na primer, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 101 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 151. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 102 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 152. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 103 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 153. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 104 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 154. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 105 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 155. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 106 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 156. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 106 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:157. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 107 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:158. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 108 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:159. Alternativno, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 109 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:160.
[0055] Ovde su opisana specifična anti-CD40 antitela opisa sa prethodno navedenim CDR sekvencama. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 1, 11, 31, 51, 61 i 81. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 2, 12, 32, 52, 62 i 82. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 3, 13, 33, 53, 63 i 83. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 4, 14, 34, 54, 64 i 84. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 5, 15, 35, 55, 65 i 85. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 6, 16, 36, 56, 66 i 86. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 6, 19, 36, 56, 66 i 86. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 7, 17, 37, 57, 67 i 87. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 7, 20, 37, 57, 67 i 87. Anti-CD40 antitelo pronalaska ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 8, 18, 35, 58, 68 i 88. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 9, 21, 35, 58, 68 i 88. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima CDR sekvence iz SEQ ID NO: 10, 22, 35, 58, 68 i 88.
[0056] Anti-CD40 antitelo opisa može biti pogodno za primenu ljudima. Prema specifičnom primeru izvođenja, anti-CD40 antitelo je humanizovano. Aminokiselinske sekvence CDR-ova opisanog anti-CD40 antitela mogu biti izabrane od:
[0057] Anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati VHlanac koji po sekvenci odgovara bilo kojoj od SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 ili 123; i VLlanac koji po sekvenci odgovara bilo kojoj od SEQ ID NO: 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170 ili 171. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 110 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:161. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 111 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:161.
Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 112 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:161. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:113 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:162. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 114 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:162. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 115 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:162. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:116 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:163. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:163. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:118 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:163. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:116 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:164. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:164. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 119 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:165. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 120 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:165. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO: 121 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:166. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:167. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:168. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:169. Anti-CD40 antitelo pronalaska sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:170. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:117 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:171. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:118 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:164. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:122 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:167. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:122 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:168. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo sadrži VHlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:123 i VLlanac koji po sekvenci odgovara SEQ ID NO:169.
[0058] Anti-CD40 antitela opisa mogu biti u kompeticiji za vezivanje humanog CD40 u in vitro testovima sa referentnim antitelom. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitela su u kompeticiji za vezivanje humanog CD40 na ćelijama koje eksprimiraju humani CD40. Referentno antitelo može biti bilo koje od anti-CD40 antitela koja su ovde opisana. Prema pojedinim aspektima, referentno antitelo je antitelo obezbeđeno u TABELI 3. Prema specifičnim aspektima, referentno antitelo je izabrano od antitela AD163.9.3 ("muAb1”); antitela AD166.4.4 ("muAb2”); antitela AD175.14.11 ("muAb3”); antitela AD163.10.7 ("muAb4”); antitela AD165.1.2 ("muAb5”); antitela AD163.162.1 ("muAb6”); antitela AD163.27.12 ("muAb7”); antitela AD163.7.2 ("muAb8”); antitela AD164.14.6 ("muAb9"); i antitela AD164.76.2 ("muAb10"). Prema pojedinim aspektima, referentno antitelo je humanizovana verzija antitela obezbeđenog u TABELI 3. Prema pojedinim aspektima, referentno antitelo je humanizovana verzija muAb6, muAb8 ili muAb9. Prema specifičnom aspektu, referentno antitelo je huAb9-2. Prema drugom aspektu, referentno antitelo je huAb9-5. Prema sledećem specifičnom aspektu, referentno antitelo je huAb9 A2I.
[0059] Može doći i do post-translacionih modifikacija sekvenci anti-CD40 antitela, kao što je cepanje jednog ili više (npr. 1, 2, 3 ili više) aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju teškog lanca antitela.
[0060] Anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati teški lanac prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 130-135, i laki lanac prema SEQ ID NO: 140-142. Na primer, anti-CD40 antitelo opisa može sadržavati teški lanac prema SEQ ID NO: 130 ili 131, i laki lanac prema SEQ ID NO: 140. Takođe je opisano anti-CD40 antitelo koje sadrži teški lanac prema SEQ ID NO: 132 ili 133, i laki lanac prema SEQ ID NO: 140. Takođe je opisano anti-CD40 antitelo koje sadrži teški lanac prema SEQ ID NO: 134 ili 135, i laki lanac prema SEQ ID NO: 140. Anti-CD40 antitelo pronalaska obuhvata teški lanac prema SEQ ID NO: 132 ili 133, i laki lanac prema SEQ ID NO: 141. Takođe je opisano anti-CD40 antitelo koji sadrži teški lanac prema SEQ ID NO: 132 ili 133, i laki lanac prema SEQ ID NO: 142.
[0061] Ovde opisana anti-CD40 antitela se generalno specifično vezuju za humani CD40. Unakrsna reaktivnost antitela u vezivanju za CD40 iz drugih vrsta, na primer, iz majmuna, npr. cinomolgus majmuna, može ponuditi prednosti, kao što je mogućnost testiranja biološke aktivnosti u majmunskim životinjskim modelima. Takvo testiranje na životinjskom modelu može biti upotrebljeno za skrining anti-CD40 antitela da bi se izabrale osobine, npr. povoljne farmakokinetike. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitela se vezuju za CD40 cinomolgus majmuna.
[0062] Testovi kompeticije obuhvataju, ali nisu ograničeni na, imunoesej sa materijalima obeleženim radioaktivitetom (RIA), enzimski-povezan imunosorbentni test (ELISA), sendvič ELISA postupak, analize sortiranja ćelija aktivirane fluorescencijom (FACS) i testove površinske plazmonske rezonancije.
[0063] Prilikom sprovođenja testa kompeticije antitela između referentnog antitela i ispitivanog antitela (bez obzira na vrstu ili izotip), može se najpre obeležiti referentno antitelo sa obeleživačem koji se može detektovati, kao što je to fluorofora, biotin ili enzimski (ili čak radioaktivni) obeleživač, da bi se omogućila naknadna identifikacija. U ovom slučaju, ćelije koje eksprimiraju humani CD40 se inkubiraju sa neobeleženim antitelom koje se ispituje, nakon čega se dodaje obeleženo referentno antitelo i meri se intenzitet vezanog obeleživača. Ukoliko je ispitivano antitelo u kompeticiji sa obeleženim referentnim antitelom tako što se vezuje za preklapajući epitop, intenzitet će biti smanjen u odnosu na kontrolnu reakciju koja je sprovedena bez ispitivanog antitela.
[0064] Prema specifičnom primeru ovog testa, najpre se utvrđuje koncentracija obeleženog referentnog antitela koja obebzeđuje 80% od maksimalnog vezivanja („konc80%") pod uslovima analize (npr. sa određenom gustinom ćelija), nakon čega se sprovodi ispitivanje kompeticije sa 10X konc80%neobeleženog ispitivanog antitela i konc80%obeleženog referentnog antitela.
[0065] Inhibicija se može izraziti kao konstanta inhibicije, ili Ki, koja se izračunava prema sledećoj formuli:
koncentracija referentnog At
gde je IC50koncentracija ispitivanog antitela koja obezbeđuje smanjenje od 50% u vezivanju referentnog antitela, a Kdje konstanta disocijacije referentnog antitela, što je mera njegovog afiniteta za humani CD40. Antitela koja su u kompeticiji sa anti-CD40 antitelima koja su ovde opisana, može karakterisati Kiod 10 pM do 1000 nM u uslovima ispitivanja koji su ovde opisani.
[0066] Prema raznim aspektima, smatra se da je ispitivano antitelo u kompeticiji sa referentnim antitelom ukoliko ono smanjuje vezivanje referentnog antitela za najmanje oko 20% ili više, na primer, za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak više, ili u procentu koji je opsega između bilo kojih od prethodno navedenih vrednosti, pri koncentraciji referentnog antitela koja iznosti 80% od maksimalnog vezivanja pod specifičnim korišćenim uslovima analize i pri koncentraciji ispitivanog antitela koja je 10 puta veća od koncentracije referentnog antitela.
[0067] Ovde opisana anti-CD40 antitela su sposobna da agonizuju humani CD40 (SEQ ID NO:40) aktiviranjem humanog CD40, putem najmanje dva mehanizma delovanja. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo vezuje humani CD40 u odsustvu CD40L (SEQ ID NO:41) i pojačava signalizaciju humanog CD40. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo vezuje humani vezani CD40L-CD40 kompleks i pojačava signalizaciju humanog CD40. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo je u kompeticiji vezivanja za humani CD40 (SEQ ID NO:40) sa kontrolnim antitelom izabranim od humanizovanog antitela navedenog u TABELI 3, i aktivira humani CD40 nezavisno od liganda humanog CD40 (SEQ ID NO:41 ), tj. u odsustvu ili prisustvu CD40L.
[0068] Efekat anti-CD40 antitela na interakciju humanog CD40-CD40L može biti određen testovima poznatim u oblasti tehnike, kao što je kompetitivni test sa CD40L opisan u Primeru 2. Odnos OD450izmerenog u uzorcima koji sadrže anti-CD40 antitela u odnosu na OD450uzet iz uzoraka sa izotipskim kontrolnim antitelom ("OD450odnos") može biti upotrebljen za utvrđivanje efekta anti-CD40 antitela na vezivanje humanog CD40L za humani CD40. Odnos OD450od 1 ukazuje da nema efekta; manji od 1 ukazuje na kompeticiju sa CD40L; veći od 1 ukazuje na pojačano vezivanja CD40L sa CD40. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo povećava (tj. pojačava) vezivanje humanog CD40L (SEQ ID NO:41) za humani CD40 (SEQ ID NO:40), što je utvrđuje odnosom OD450. Poboljšanje vezivanja CD40L za CD40 koje se ogleda u odnosu OD450je najmanje oko 1,2, kao što je oko 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,2; 2,4; 2,5, 2,6; 2,8; 3,0 ili više.
[0069] Specifičan test i uslovi analize korisni za procenu da li je antitelo u kompeticiji vezivanja za humani CD40 sa referentnim antitelom koje je kao što je ovde opisano, obezbeđeno je u Primeru 2. Kompeticija antitela može biti utvrđena testom površinske plazmonske rezonancije kao što je opisano u Primeru 2, ili u kompetitivnom protokolu vezivanja opisanom u Odeljku 8.4.3.
[0070] Dok agonističko anti-CD40 antitelo aktivira imunski sistem tako da ispoljava antitumorski efekat, široka sistemska imunska aktivacija svih vrsta ćelija može dovesti do neželjenih sporednih efekata. Shodno navedenom, prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo aktivira imunski odgovor posredovan dendritičnim ćelijama, selektivno u odnosu na B-ćelijski imunski odgovor, u poređenju sa referentnim anti-CD40 antitelom. Prema pojedinim aspektima, referentno anti-CD40 antitelo je CP-870,893. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je sa sličnom aktivnošću, npr. proizvodnja IL-12p70 u datoj dozi je unutar oko 200%, kao što je unutar oko 180%, 150%, 130%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50 %, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ili oko 5%, u aktiviranju dendritične ćelije u poređenju sa proizvodnjom IL-12p70 u istoj dozi referentnog anti-CD40 antitela u testu opisanom u Odeljku 8.1.3. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je sa nižom potencijom u aktivaciji B-ćelije u poređenju sa referentnim anti-CD40 antitelom. B-ćelijski EC50odnos anti-CD40 antitela sa referentnim anti-CD40 antitelom može biti veći od oko 1,5, kao što je oko 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ili više, u testu opisanom u Odeljku 8.5.3. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo ima sličnu aktivnost u aktiviranju dendritične ćelije i nižu potenciju u aktiviranju B-ćelije u poređenju sa referentnim anti-CD40 antitelom.
7.4. Polinukleotidi koji kodiraju anti-CD40 antitela, ekspresioni sistemi i postupci pravljenja antitela
[0071] Predmetni opis obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju gene imunoglobulinskog lakog i teškog lanca za anti-CD40 antitela, vektore koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije domaćine sposobne da proizvode anti-CD40 antitela opisa.
[0072] Anti-CD40 antitelo opisa može biti pripremljeno rekombinantnom ekspresijom gena imunoglobulinskog lakog i teškog lanca u ćeliji domaćinu. Za rekombinantnu ekspresiju antitela, ćelija domaćin se transfektuje sa jednim ili sa više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose DNK fragmente koji kodiraju imunoglobulinske lake i teške lance antitela, tako da se laki i teški lanci eksprimiraju u ćeliji domaćinu i, po izboru, izlučuju u medijum u kome se ćelije domaćini gaje, pri čemu se antitela iz ovog medijum mogu i izdvojiti. Za dobijanje gena teškog i lakog lanca antitela, ugradnju ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore i uvođenje vektora u ćelije domaćina se upotrebljavaju standardne metodologije rekombinantne DNK, kao što su one opisane u Molecular Cloning; A Laboratory Manual, drugo izdanje (Sambrook, Fritsch and Maniatis (ur.), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel F.M. i saradnici, izd. Greene Publishing Associates, 1989) i u U.S. Patent No.4,816,397.
[0073] Da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju takva anti-CD40 antitela, najpre se dobijaju DNK fragmenti koji kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca. Ovakve DNK se mogu dobiti umnožavanjem i modifikacijom germinativne DNK ili cDNK koja kodira varijabilne sekvence lakog i teškog lanca, na primer, upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR-a). Germinativne DNK sekvence za gene varijabilnog regiona humanog teškog i lakog lanca su poznate u oblasti tehnike (Pogledati, npr. "VBASE" bazu podataka humanih germinativnih sekvenci; pogledati takođe Kabat E. A. i saradnici, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson i saradnici, 1992, J. Mol. Biol.22T: 116-198; i Cox i saradnici, 1994, Eur. J. Immunol.24:827-836).
[0074] Jednom kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLsegmente povezane sa anti-CD40 antitelom, ovakvim fragmentima DNK se može dalje manipulisati sa standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer, da bi se geni varijabilnog regiona konvertovali u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u gen scFv. Pri ovakvim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VLili VHse operativno povezuje sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region ili fleksibilni linker antitela. Predviđeno je da termin "operativno povezan", kako se upotrebljava u ovom kontekstu, označava da su dva fragmenta DNK spojena tako da aminokiselinske sekvence kodirane sa dva fragmenta DNK ostanu sa očuvanim okvirom čitanja.
[0075] Izolovana DNK koja kodira VHregion može biti konvertovana u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira VHsa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2, CH3 i, po izboru, CH4). Sekvence gena konstantnog regiona humanog teškog lanca su poznate u oblasti tehnike (Pogledati, npr. Kabat E.A. i saradnici, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu biti dobijeni standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region iz IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VHmože biti operativno povezana sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0076] Izolovana DNK koja kodira VLregion može biti prevedena u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen lakog lanca Fab), operativnim povezivanjem DNK koja kodira VLsa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca su poznate u oblasti tehnike (Pogledati, npr. Kabat i saradnici, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu biti dobijeni standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region. U antitelu pronalaska, konstantni region lakog lanca je kapa konstantni region. Da bi se stvorio scFv gen, fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLoperativno se povezuju sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr. koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4~Ser)3(SEQ ID NO:200), tako da VHi VLsekvence mogu biti eksprimirane kao kontinuirani jednolančani protein, sa VLi VHregionima koji su spojeni sa fleksibilnim linkerom (Pogledati, npr. Bird i saradnici, 1988, Science 242:423-426; Huston i saradnici, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty i saradnici, 1990, Nature 348:552-554).
[0077] Da bi se eksprimirala anti-CD40 antitela opisa, DNK koje kodiraju delimične ili lake i teške lance pune dužine, dobijene kao što je prethodno opisano, insertuju se u ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U ovom kontekstu, predviđeno je da termin "operativno povezan" označava da je gen antitela ligacijom insertovan u vektor tako da kontrolne sekvence transkripcije i translacije unutar vektora posluže svojoj predviđenoj funkciji regulacije transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije se biraju tako da budu kompatibilne sa ćelijom domaćinom koja se upotrebljava za ekspresiju. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti insertovani u odvojene vektore ili, uobičajenije, oba gena se insertuju u isti ekspresioni vektor.
[0078] Geni antitela se insertuju u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr. ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektoru, ili ligacijom tipa tupih krajeva ukoliko nisu prisutna restrikciona mesta). Pre insercije sekvenci lakog ili teškog lanca povezanog sa anti-CD40 antitelom, ekspresioni vektor već može nositi sekvence konstantnog regiona antitela. Na primer, jedan pristup konvertovanja VHi VLsekvenci povezanih sa anti-CD40 monoklonskim antitelom u gene antitela pune dužine je njihovo insertovanje u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i konstantne regione lakog lanca, tim redom, tako da je VHsegment operativno povezan sa CH segmentom(segmentima) unutar vektora, a VLsegment je unutar vektora operativno povezan sa CL segmentom. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava izlučivanje lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može biti kloniran u vektor tako da je signalni peptid povezan sa amino krajem gena za lanac antitela tako da se zadrži okvir čitanja. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz proteina koji nije imunoglobulin).
[0079] Pored gena lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori opisa nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Predviđeno je da termin "regulatorna sekvenca" uključi promotore, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr. signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Stručnjacima iz oblasti tehnike je ipak potrebno napomenuti da dizajn vektora ekspresije, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja će biti transformisana, nivo željene ekspresije proteina itd. Pogodne regulatorne sekvence za ekspresiju u sisarskim ćelijama domaćinima uključuju virusne elemente koji usmeravaju ka visokim nivoima ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promotor/pojačivač), Simijan virusa 40 (SV40) (kao što je SV40 promotor/pojačivač), adenovirusa (npr. glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci, pogledati, npr. U.S. Patent No.5,168,062 autora Stinski, U.S. Patent No.4,510,245 autora Bell i saradnici i U.S. Patent No.4,968,615 autora Schaffner i saradnici.
[0080] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori opisa može nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinim (npr. sa mestom su početka replikacije) i selektivni markerski geni. Selektivni markerski gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (Pogledati, npr. U.S. Patents No.
4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi autora Axel i saradnici). Na primer, selektivni markerski gen obično obezbeđuje ćelijama domaćinima u koje je vektor uveden rezistenciju na lekove, kao što su to rezistencije na G418, higromicin ili metotreksat. Pogodni selektivni markerski geni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u DHFR<->ćelijama domaćinima radi selekcije/umnožavanja sa metotreksatom) i neo genom (za selekciju sa G418). Radi ekspresije lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira(ju) teške i lake lance transfektuje(u) se u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Predviđeno je da razni oblici termina "transfekcija" obuhvate širok spektar tehnika koje se obično upotrebljavaju za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporaciju, lipofekciju, precipitaciju kalcijum-fosfatom, transfekciju sa DEAE-dekstranom i slično.
[0081] Moguća je ekspresija antitela opisa bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima. U određenim primerima izvođenja, ekspresija antitela se vrši u eukariotskim ćelijama, npr. sisarskim ćelijama domaćinima, radi optimalnog izlučivanja pravilno uvijenog i imunološki aktivnog antitela. Sisarske ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela opisa za primer su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR<->CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje se koriste sa DHFR selektivnim markerom, npr. kao što je opisano u Kaufman i Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u sisarske ćelije domaćine, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da se omogući ekspresija antitela u ćelijama domaćinima ili izlučivanje antitela u medijum kulture u kome se gaje ćelije domaćini. Antitela mogu biti izdvojena iz medijuma kulture upotrebom standardnih postupaka prečišćavanja proteina. Ćelije domaćini takođe mogu biti upotrebljene za proizvodnju delova intaktnih antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumeva se da su varijacije prethodno navedene procedure unutar obima predmetnog opisa. Na primer, može biti poželjno da se ćelija domaćin transfektuje sa DNK koja kodira bilo laki ili teški lanac (ali ne oba) anti-CD40 antitela ovog opisa.
[0082] Tehnologija rekombinantne DNK može takođe biti upotrebljena za uklanjanje pojedinih ili svih DNK koje kodiraju bilo koji ili oba od lakih i teških lanaca, a koji nisu neophodni za vezivanje za humani CD40. Molekuli eksprimirani sa takvih skraćenih molekula DNK takođe su obuhvaćeni antitelima opisa.
[0083] Radi rekombinantne ekspresije anti-CD40 antitela opisa, ćelija domaćin može biti kotransfektovana sa dva ekspresiona vektora opisa, prvim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržavati identične selektivne markere ili svaki od njih može sadržavati poseban selektivni marker. Alternativno, može biti upotrebljen jedan vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca.
[0084] Jednom kada nukleinska kiselina kodira jedan ili više delova anti-CD40 antitela, mogu biti uvedene dodatne izmene ili mutacije u kodirajućoj sekvenci, na primer da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju antitela sa različitim CDR sekvencama, antitela sa smanjenim afinitetom prema Fc receptoru ili antitela različitih potklasa.
[0085] Anti-CD40 antitela opisa mogu takođe biti proizvedena hemijskom sintezom (npr. postupcima opisanim u Solid Phase Peptide Synthesis, 2. izdanje, 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Varijanta antitela može takođe biti generisana upotrebom platforme bez ćelija (Pogledati, npr. Chu i saradnici, Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) i Murray i saradnici, 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420―426).
[0086] Jednom kada je anti-CD40 antitelo opisa proizvedeno rekombinantnom ekspresijom, ono može biti prečišćeno bilo kojim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike prečišćavanja imunoglobulinskih molekula, na primer, hromatografijom (npr. jonskom izmenom, afinitetnom i hromatografijom na koloni za razdvajanje po veličini), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću ili bilo kojom drugom standarnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Dodatno, anti-CD40 antitela opisa mogu biti fuzionisana sa heterolognim polipeptidnim sekvencama koje su ovde opisane, ili na drugi način poznate u oblasti tehnike, da bi se olakšalo prečišćavanje.
[0087] Jednom izolovano, anti-CD40 antitelo može, ukoliko je to poželjno, biti dalje prečišćeno, npr. tečnom hromatografijom visokih performansi (pogledati, npr. Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, ur., Elsevier, 1980) ili gel filtracionom hromatografijom na Superdex™ 75 koloni (Pharmacia Biotech AB, Upsala, Švedska).
7.5. Farmaceutske kompozicije
[0088] Ovde opisana anti-CD40 antitela mogu biti u obliku kompozicija koje sadrže antitelo i jedan ili više nosača, ekscipijenasa i/ili razblaživača. Kompozicije mogu biti formulisane za specifične upotrebe, kao što su za veterinarsku upotrebu ili farmaceutsku upotrebu kod ljudi. Oblik kompozicije (npr. suvi prah, tečna formulacija itd.) i upotrebljeni ekscipijensi, razblaživači i/ili nosači zavisiće od predviđene upotrebe antitela i, za terapijske upotrebe, načina primene.
[0089] Za terapijske upotrebe, kompozicije mogu biti obezbeđene kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovakva kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka njegove primene subjektu, npr. humanom subjektu, tj. pacijentu). Farmaceutska kompozicija može biti primenjena subjektu raznim putevima kao što su oralna, transdermalna, subkutana, intranazalna, intravenska, intramuskularna, intratumorska, intratekalna, topikalna ili lokalna primena. Najpogodniji put za primenu u bilo kom datom slučaju zavisiće od određenog antitela, subjekta, prirode i ozbiljnosti oboljenja, kao i od fizičkog stanja subjekta. Uobičajeno je da farmaceutska kompozicija bude primenjena intravenski ili subkutano.
[0090] Farmaceutske kompozicije mogu biti konvencionalno predstavljene u jediničnim doznim oblicima koji po dozi sadrže unapred određenu količinu anti-CD40 antitela koje je ovde opisano. Količina anti-CD40 antitela uključena u jediničnu dozu će zavisti od bolesti koja se leči, kao i od drugih faktora koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Takve jedinične doze mogu biti u obliku liofilizovanog suvog praha koji sadrži količinu antitela koja je pogodna za jednokratnu primenu, ili u obliku tečnosti. Jedinični dozni oblici suvog praha mogu biti upakovani u komplet sa špricem, sa odgovarajućom količinom razblaživača i/ili sa drugim komponentama koje su korisne za primenu. Jedinične doze u tečnom obliku mogu biti prikladno isporučene u obliku prethodno napunjenog šprica sa količinom anti-CD40 antitela koja je pogodna za jednokratnu primenu.
[0091] Farmaceutske kompozicije mogu takođe biti obezbeđene u rinfuznom obliku koji sadrži količine anti-CD40 antitela pogodne za višestruke primene.
[0092] Farmaceutske kompozicije mogu biti pripremljene za skladištenje kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori, mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa izbornim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima koji se uobičajeno koriste u oblasti tehnike (svi se ovde označavaju kao "nosači"), tj. puferima, stabilizatorima, konzervansima, izotonifikatorima, nejonskim deterdžentima, antioksidansima i drugim raznovrsnim aditivima. Pogledati, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje (Osol, ur. 1980). Takvi aditivi bi trebali da budu netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama.
[0093] Puferski agensi pomažu u održavanju pH u opsegu koji je približan fiziološkim uslovima. Oni mogu biti prisutni u širokom spektru koncentracija, ali će obično biti prisutni u koncentracijama opsega od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna puferska sredstva za upotrebu u predmetnom opisu uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr. smeša mononatrijum citrata i dinatrijum citrata, smeša limunske kiseline i trinatrijum citrata, smeša limunske kiseline i mononatrijum citrata itd.), sukcinatni puferi (npr. smeša ćilibarne kiseline i mononatrijum sukcinata, smeša ćilibarne kiseline i natrijum hidroksida, smeša ćilibarne kiseline i dinatrijum sukcinata itd.), tartratni puferi (npr. smeša vinske kiseline i natrijum tartarata, smeša vinske kiseline i kalijum tartarata, smeša vinske kiseline i natrijum hidroksida itd.), fosfatni puferi (npr. smeša fosforne kiseline i mononatrijum fosfata, smeša fosforne kiseline i dinatrijum fosfata, smeša mononatrijum fosfata i dinatrijum fosfata itd.), glukonatni puferi (npr. smeša glukonske kiseline i natrijum glukonata, smeša glukonske kiseline i natrijum hidroksida, smeša glukonske kiseline i kalijum glukonata itd.), oksalatni pufer (npr. smeša oksalne kiseline i natrijum oksalata, smeša oksalne kiseline i natrijum hidroksida, smeša oksalne kiseline i kalijum oksalata itd.), laktatni puferi (npr. smeša mlečne kiseline i natrijum laktata, smeša mlečne kiseline i natrijum hidroksida, smeša mlečne kiseline i kalijum laktata itd.) i acetatni puferi (npr. smeša sirćetne kiseline i natrijum acetata, smeša sirćetne kiseline i natrijum hidroksida itd.). Dodatno, mogu biti upotrebljeni fumaratni puferi, histidinski puferi i trimetilaminske soli kao što je to 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol (tj. Tris, THAM ili tris(hidroksimetil)aminometan).
[0094] Izotonifikatori, koji su ponekad poznati kao "stabilizatori", mogu biti dodati da bi se osigurala izotoničnost tečnih kompozicija predmetnog pronalaska, a uključuju polihidrične šećerne alkohole, na primer trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenasa koji mogu biti opsega funkcija od sredstva za povećanje zapremine do aditiva koji rastvara terapijsko sredstvo ili pomaže da se spreči denaturacija ili adheriranje na zid posude. Uobičajeni stabilizatori mogu biti polihidrični šećerni alkoholi (nabrojani prethodno); aminokiseline kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što su laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinozitol, galaktitol, glicerol i slično, uključujući ciklitole kao što je inozitol; polietilen glikol; polimeri aminokiselina; redukujuća sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; polipeptidi male molekulske težine (npr. peptidi od 10 ostataka ili manje); hidrofilni polimeri, poput monosaharidnih polivinilpirolidona, kao što su ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi kao što su laktoza, maltoza, saharoza i trehaloza; i trisaharidi kao što je rafinoza; i polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u količinama opsega od 0,5 do 10 težinskih % po težini anti-CD40 antitela.
[0095] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao "sredstva za vlaženje") mogu biti dodati da bi se potpomogla solubilizacija glikoproteina, kao i da bi se glikoprotein zaštitio od agregacije izazvane agitacijom, što takođe omogućava da formulacija bude izložena silama površinskog napona bez prozrokovanja denaturacija proteina. Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 80 itd.), poloksamere (184, 188 itd.) i pluronske poliole. Nejonski surfaktanti mogu biti prisutni u opsegu od oko 0,05 mg/mL do oko 1,0 mg/mL.
[0096] Specifičan primer vodene kompozicije pogodne za primenu putem intravenske infuzije sadrži 10 mg/mL anti-CD40 antitela, 15 mM histidinskog pufera, pH 6,0, 8,0% (w/v) saharoze i 0,05% (w/v) polisorbata 80. Prema određenim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela opisanih u TABELI 3. Kompozicija može biti u obliku liofilizovanog praha koji, nakon rekonstitucije sa 2,0 mL sterilne vode ili drugog rastvora pogodnog za injeciranje ili infuziju (na primer, 0,9% fiziološkog rastvora, Ringerovog rastvora, Ringerovog rastvora sa laktatom itd.), obezbeđuje prethodno navedenu vodenu kompoziciju. Kompozicija, ili druge kompozicije, mogu takođe biti u obliku šprica ili drugog uređaja pogodnog za injeciranje i/ili infuziju, a koji je prethodno napunjen sa količinom kompozicije koja je pogodna za jednokratnu primenu anti-CD40 antitela.
7.6. Postupci upotrebe
7.6.1. Terapijska korist
[0097] Podaci koji su ovde obezbeđeni pokazuju da ovde opisana anti-CD40 antitela koja agonizuju CD40 u prisustvu tumorskih ćelija, ispoljavaju potentnu antitumorsku aktivnost u odnosu na ove solidne tumore in vivo. Prema tome, anti-CD40 antitela, vezujući fragmenti i/ili farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CD40 antitela mogu biti upotrebljeni terapijski, za lečenje solidnih tumora.
[0098] U principu, postupci uključuju primenu, humanom pacijentu sa solidnim tumorom, efektivne količine anti-CD40 antitela koje agonizuje CD40 i ubija i/ili smanjuje proliferaciju tumorskih ćelija, da bi se obezbedila terapijska korist. Solidni tumori koji mogu biti lečeni sa anti-CD40 antitelom uključuju, ali nisu ograničeni na, kancere nadbubrežne žlezde, kancere kostiju, kancere mozga, kancere dojke, kolorektalne kancere, kancere jednjaka, kancere oka, kancere želuca, kancere glave i vrata, kancere bubrega, kancere jetre, kancere pluća (npr. nesitnoćelijski kancer pluća, mezoteliom), kancere glave i vrata (npr. karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), limfome (npr. B-ćelijske limfome), melanome (npr. uznapredovali maligni melanom, kutani melanom), oralne kancere, kancere jajnika, kancere penisa, kancere prostate, kancere pankreasa, kancere kože, kancere testisa, kancere štitne žlezde, kancere materice i vaginalne kancere. Prema pojedinim aspektima, solidni tumor je kancer glave i vrata, kancer pluća, melanom ili kancer pankreasa.
[0099] Kancer može biti novodijagnostikovan i naivan za lečenje, ili može biti u relapsu, refraktoran, ili u relapsu i refraktoran, ili metastatski oblik solidnog tumora. Zaista, in vivo podaci u mišjim PC3 profilaktičkim modelima (SL. 12) pokazuju da su anti-CD40 antitela efektivna u smanjenju veličine tumora u poređenju sa primenjenim dozama koje sadrže izotipska antitela.
[0100] Bez želje da bude ograničeno teorijom, veruje se da anti-CD40 antitelo aktivira imunski sistem agonizovanjem CD40. Imunski odgovor koji sledi ispoljava time antitumorski efekat na susedne tumorske ćelije, bez obzira na nivoe ekspresije CD40. Shodno navedenom, očekuje se da će anti-CD40 antitelo opisa efektivno delovati na CD40-pozitivne ili CD40-negativne solidne tumore.
[0101] Anti-CD40 antitelo opisa može biti primenjivano samostalno (monoterapija) ili kao dopunska terapija, ili sa drugim terapijama protiv kancera i/ili sa anti-kancerskim agensima koji su sa ciljanim ili dejstvom koje nije ciljano. Bilo da se primenjuje kao monoterapija ili kao dopunska terapija, ili sa drugim terapijama ili agensima, količina anti-CD40 antitela se primenjuje tako da celokupan režim lečenja obezbedi terapijsku korist.
[0102] Pod terapijskom koristi se podrazumeva da je rezultat upotrebe anti-CD40 antitela za lečenje kancera kod pacijenata bilo kakva pokazana klinička korist u poređenju sa slučajem bez terapije (kada je to prikladno) ili sa poznatim standardom nege. Klinička korist može biti procenjena bilo kojim postupkom koji je poznat prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike. Prema jednom aspektu, klinička korist se procenjuje na osnovu objektivne stope odgovora (ORR) (određena upotrebom RECIST verzije 1.1), trajanja odgovora (DOR), preživljavanja bez napredovanja bolesti (PFS) i/ili na osnovu ukupnog preživljavanja (OS). Prema pojedinim aspektima, potpun odgovor ukazuje na terapijsku korist. Prema pojedinim aspektima, delimičan odgovor ukazuje na terapijsku korist. Prema pojedinim aspektima, stabilna bolest ukazuje na terapijsku korist. Prema pojedinim aspektima, povećanje ukupnog preživljavanja ukazuje na terapijsku korist. Prema pojedinim aspektima, terapijska korist može predstavljati poboljšanje u vremenu do progresije bolesti i/ili poboljšanje simptoma ili kvaliteta života. Prema drugim aspektima, terapijska korist ne mora biti translatirana na povećan period održavanja bolesti pod kontrolom, već na izraženo smanjenje opterećenja simptomima, što dovodi do poboljšanja kvaliteta života. Kao što će stručnjaci iz oblasti tehnike lako uočiti, terapijska korist može biti primećena upotrebom anti-CD40 antitela samostalno (u vidu monoterapije) ili u vidu dodatne terapije, ili uz druge anti-kancerske terapije i/ili anti-kancerske agense koji deluju ciljano ili koji ne deljuju ciljano.
[0103] Uobičajeno je da se terapijska korist procenjuje upotrebom standardnih kliničkih testova dizajniranih tako da se izmeri odgovor na novi tretman za kancer. Da bi se procenile terapijske prednosti anti-CD40 antitela koja su ovde opisane, može biti upotrebljen jedan ili kombinacija sledećih testova: (1) Kriterijuma za procenu odgovora kod solidnih tumora (RECIST), verzije 1.1, (2) Statusa učinka Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG), (3) Kriterijuma imunološkog odgovora (irRC), (4) testovima procene tumorskih antigena u bolest koja se može proceniti, (5) validirane skale prijavljenih ishoda pacijenata i/ili (6) Kaplan-Mejerove procene ukupnog preživljavanja i preživljavanje bez progresije.
[0104] Procena promene u opterećenju tumorom je važna karakteristika kliničke evaluacije terapeutika za kancer. I smanjenje tumora (objektivni odgovor) i vreme do razvoja progresije bolesti su važne krajnje tačke u kliničkim ispitivanjima za kancer. Standardizovani kriterijumi odgovora, poznati kao RECIST (Kriterijumi procene odgovora u solidnim tumorima, engl. Response Evaluation Criteria in Solid Tumors), objavljeni su 2000. godine. Ažuriranje (RECIST 1.1) je objavljeno 2009. RECIST kriterijumi se obično koriste u kliničkim ispitivanjima gde je objektivni odgovor primarna krajnja tačka studije, kao i u ispitivanjima u kojima se vrši procena stabilne bolesti, progresije tumora ili analize vremena do progresije, pošto se ove mere ishoda zasnivaju na proceni anatomskog opterećenja tumorom i njegove promene tokom perioda ispitivanja. TABELA 4 obezbeđuje definicije kriterijuma odgovora koji se upotrebljavaju za određivanje objektivnog odgovora tumora na ispitivani lek, kao što su ovde opisana anti-CD40 antitela.
[0105] Sekundarne mere ishoda koje mogu biti upotrebljene za određivanje terapijske koristi anti-CD40 antitela koja su ovde opisana uključuju, objektivnu stopu odgovora (ORR), preživljavanje bez progresije (PFS), ukupno preživljavanje (OS), trajanje ukupnog odgovora (DOR) i raspon odgovora (DpR). ORR se definiše kao udeo učesnika koji postižu potpuni odgovor (CR) ili delimičan odgovor (PR). PFS se definiše kao vreme od datuma primene prve doze anti-CD40 antitela bilo do progresije bolesti ili smrti, šta god da se dogodi prvo. OS se definiše kao dužina vremena od bilo datuma dijagnoze ili od početka lečenja bolesti, u kojoj su pacijenti sa dijagnozom bolesti još uvek živi. DOR se definiše kao vreme od početnog CR ili PR učesnika do vremena progresije bolesti. DpR se definiše kao procenat smanjenja tumora koje se uočava u tački maksimalnom odgovora, u odnosu na početno opterećenje tumorom. Kliničke krajnje tačke i za ORR i za PFS mogu biti utvrđene na osnovu RECIST 1.1 kriterijuma koji su prethodno opisani.
[0106] ECOG skala statusa performansi je prikazana u TABELI 5 i upotrebljava se za opisivanje nivoa pacijentovog funkcionisanja u kontekstu njegovih sposobnosti da brine o sebi, dnevnih aktivnosti i fizičke sposobnosti. Skala je razvijena od strane Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG), koja je sada deo ECOG-ACRIN grupe za istraživanje raka, a objavljena je 1982. godine.
[0107] Drugi skup kriterijuma koji može biti upotrebljen za potpunu karakterizaciju i određivanje odgovora na imunoterapijske agense, kao što su terapije kancera zasnovane na antitelima, su kriterijumi imunog odgovora (irRC) koji su razvijeni za merenje solidnih tumora u 2009. godini i koji su ažurirani 2013. godine (Wolchok i saradnici, Clin. Cancer Res. 2009; 15(23):7412-7420 i Nishino i saradnici, Clin. Cancer Res. 2013; 19(14): 3936-3943). Ažurirani irRC kriterijumi se obično koriste za procenu efekta imunoterapijskog agensa, kao što je anti-CD40 antitelo koje je ovde opisano, na opterećenje tumorom, a odgovor je definisan u skaldu sa TABELOM 6.
[0108] Jedna terapijska korist za primer koja je rezultat upotrebe anti-CD40 antitela koja su ovde opisana za lečenje solidnih tumora, bilo da su ista primenjivana kao monoterapija ili kao dopunska terapija ili sa drugim terapijama ili agensima, je potpuni odgovor. Još jedna terapijska korist koja je rezultat upotrebe anti-CD40 antitela koja su ovde opisana za lečenje solidnih tumora, bilo da su ista primenjivana kao monoterapija ili kao dopunska terapija ili sa drugim terapijama ili agensima, je delimičan odgovor.
[0109] Validirane skale prijavljenih ishoda kod pacijenata takođe mogu biti upotrebljene za označavanje odgovora obezbeđenog za svakog pacijenta, putem specifičnog sistema izveštavanja. Umesto da se fokusiraju na bolest, takve skale ishoda razmatraju zadržavanje funkcije tokom kontrole hroničnog stanja. Jedan neograničavajući primer validirane skale prijavljenih ishoda kod pacijenata je PROMIS® (Informacioni sistem merenja prijavljenih ishoda kod pacijenata, engl. Patient Reported Outcomes Measurement Information System) iz Nacionalnog instituta za zdravlje Sjedinjenih Država. Na primer, PROMIS® kao instrument fizičke funkcije kod odraslih pacijenta sa kancerom može procentiti sposobnosti funkcionisanja gornjih ekstremiteta (npr. spretnost), donjih ekstremiteta (npr.
hodanje ili mobilnost) i centralnih regiona (npr. pokretljivost vrata, leđa) koje pacijenti sami prijavljuju, pri čemu isti uključuju i rutinske svakodnevne aktivnosti, kao što je obavljanje poslova.
[0110] Kaplan-Majerove krive (Kaplan i Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53(282): 457-481) mogu takođe biti upotrebljene za procenu sveukupnog preživljavanja i preživljavanja bez progresije kod pacijenata sa kancerom koji se podvrgavaju terapiji anti-CD40 antitelima, u poređenju sa standardnom negom.
7.6.2. Dopunske terapije
[0111] Anti-CD40 antitela mogu biti upotrebljena kao dopunska terapija ili sa drugim sredstvima ili tretmanima koji su sa anti-kancerskim karakteristikama. Kada se upotrebljavaju kao dopunska sredstva, anti-CD40 antitelo i drugi agens(i) mogu biti formulisani zajedno u jednoj, kombinovanoj farmaceutskoj formulaciji, ili mogu biti formulisani i primenjivani odvojeno, bilo po jednom koordinisanom režimu doziranja ili u vidu različitih doznih režima. Sredstva koja se primenjuju kao dopunska, ili sa anti-CD40 antitelima, obično će karakterisati komplementarne aktivnosti sa anti-CD40 antitelima, tako da antitela i drugi agensi ne utiču štetno jedni na druge.
[0112] Sredstva koja mogu biti primenjivani kao dopunska terapija ili sa anti-CD40 antitelom uključuju, ali nisu ograničena na, alkilujuća sredstva, inhibitore angiogeneze, antitela, antimetabolite, antimitotike, antiproliferativne agense, antivirusne lekove, inhibitore aurora kinaze, promotore apoptoze (na primer, inhibitore Bcl-2 familije), aktivatore puta receptora smrti, inhibitore Bcr-Abl kinaze, BiTE antitela (Bi-specifične agense koja angažuju T-ćelije), konjugate antitela sa lekovima, modifikatore biološkog odgovora, inhibitore kinaza zavisnih od ciklina, inhibitore ćelijskog ciklusa, inhibitore ciklooksigenaze-2, DVD-ove, inhibitore receptora za homolog virusnog onkogena (ErbB2), inhibitore faktora rasta, inhibitore proteina toplotnog šoka (HSP)-90, inhibitore histon deacetilaze (HDAC), hormonske terapije, imunološke agense, inhibitore inhibitora proteina apoptoze (IAP), interkalirajuće antibiotike, kinazne inhibitore, inhibitore kinezina, inhibitore Jak2, inhibitore sisarskog ciljnog molekula za rapamicin (mTor), mikroRNK, inhibitore kinaza regulisanih vanćelijskim signalom posredovanim mitogenima, nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID), inhibitore poli ADP (adenozin difosfat)-riboza polimeraze (PARP), hemoterapeutike na bazi platine, inhibitore Brutonove tirozin kinaze (BTK) (npr. ibrutinib, akalabrutinib), inhibitore kinaze slične polo kinazi (Plk), inhibitore fosfoinozitid-3 kinaze (PI3K), inhibitore proteazoma, purinske analoge, pirirmidinske analoge, inhibitore receptorskih tirozin kinaza, retinoidne/deltoidne biljne alkaloide, male inhibitorne ribonukleinske kiseline (siRNK), inhibitore topoizomeraza, inhibitore ubikvitin ligaze i slično, kao i kombinacije jednog ili više od ovih sredstava.
[0113] Primeri imunoloških lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, interferone, inhibitore imunskih kontrolnih tačaka i druga sredstva za poboljšanje imuniteta. Interferoni uključuju interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gama-la, ACTIMMUNE® (interferon gama-lb) ili interferon gama-nl, njihove kombinacije i slično. Inhibitori imunskih kontrolnih tačaka obuhvataju antitela koja ciljano deluju na PD-1 (npr. pembrolizumab i nivolumab), PD-L1 (npr. durvalumab, atezolizumab, avelumab, MEDI4736, MSB0010718C i MPDL3280A) i CTLA4 (citotoksični limfocitni antigen 4; npr. ipilimumab, tremelimumab). Sredstva za jačanje imuniteta uključuju anti-OX40 agonistička antitela koja aktiviraju T-ćelije. Prema određenim aspektima, humanizovano anti-CD40 antitelo koje je prikazano u TABELI 3 primenjuje se kao dopunska terapija pembrolizumabu. Prema drugim aspektima, humanizovano anti-CD40 antitelo prikazano u TABELI 3 primenjuje se kao dopunska terapija nivolumabu.
[0114] Anti-CD40 antitelo može takođe biti upotrebljeno da se pojača efikasnost terapije zračenjem. Primeri terapije zračenjem uključuju terapiju spoljnim zračenjem, internu terapiju zračenjem (tj. brahiterapija) i sistemsku terapiju zračenjem.
7.7. Doze i režimi primene
[0115] Količina primenjenih anti-CD40 antitela zavisiće od raznovrsnih faktora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, određenu vrstu solidnog tumora koji se leči, stadijum solidnog tumora koji se leči, način primene, učestalost primene, željenu terapijsku korist i druge parametre kao što su starost, težina i druge karakteristike pacijenta itd. Utvrđivanje doza koje su efektivne u obezbeđivanju terapijske koristi za specifične načine i učestalost primene unutar je sposobnosti stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0116] Inicijalno mogu biti procenjene doze koje su efektivne u obezbeđivanju terapijske koristi u in vivo životinjskim modelima ili klinički. Pogodni životinjski modeli za širok spektar bolesti su poznati u oblasti tehnike.
[0117] Anti-CD40 antitela koja su ovde opisana mogu biti primenjivana bilo kojim putem koji odgovara stanju koje će biti lečeno. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo će obično biti primenjeno parenteralno, tj. infuzijom, subkutanim, intramuskularnim, intravenskim (IV), intradermalnim, intratekalnim, bolusnim, intratumorskim (IT) injeciranjem ili epiduralno ((Shire i saradnici, 2004, J. Pharm. Sciences 93(6): 1390-1402)). Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo je obezbeđeno kao liofilizovani prah u bočici. Bočice mogu sadržavati 21 mg anti-CD40 antitela. Pre primene, liofilizovani prah se rekonstituiše sa sterilnom vodom za injekcije (SWFI) ili sa drugim pogodnim medijumom da bi se obezbedio rastvor koji sadrži 10 mg/mL anti-CD40 antitela. Prema pojedinim aspektima, dobijeni rekonstituisani rastvor se dalje razblažuje sa fiziološkim rastvorom ili drugim pogodnim medijumom i primenjuje se putem IV infuzije, dva puta na svakih 7 dana, jednom na svakih 7 dana, jednom na svakih 14 dana, jednom na svaki 21 dan, jednom na svakih 28 dana, jednom na svakih 35 dana, jednom na svaka 42 dana, jednom na svakih 49 dana ili jednom na svakih 56 dana. Prema pojedinim aspektima, tokom prvog ciklusa, infuzija se odvija tokom 90 minuta. Prema pojedinim aspektima, naredne infuzije traju preko 60 minuta. Prema drugim aspektima, dobijeni rekonstituisani rastvor se dalje razblažuje sa fiziološkim rastvorom ili drugim pogodnim medijumom i primenjuje se putem IT injekcije dva puta na svakih 7 dana, jednom na svakih 7 dana, jednom na svakih 14 dana, jednom na svaki 21 dan, jednom na svakih 28 dana, jednom na svakih 35 dana, jednom na svaka 42 dana, jednom na svakih 49 dana ili jednom na svakih 56 dana.
[0118] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IV infuzija, jednom na svakih 7 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg.
[0119] Prema drugom aspektu, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IV infuzija, jednom na svakih 14 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg.
[0120] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IV infuzija, jednom na svakih 28 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg.
[0121] Prema drugom aspektu, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 7 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg.
[0122] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 14 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg.
[0123] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 28 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg.
[0124] Kada se primenjuje kao dopunska terapija ili sa drugim agensima, kao što su drugi hemoterapijski agensi, anti-CD40 antitela mogu biti primenjivana po istom rasporedu kao i drugi agens(i), ili po drugačijem rasporedu. Kada se primenjuje po istom rasporedu, anti-CD40 antitelo može biti primenjeno pre, nakon ili istovremeno sa drugim sredstvom. Prema pojedinim aspektima kada se anti-CD40 antitelo primenjuje kao dopunska terapija ili uz standarde nege, sa anti-CD40 antitelom se može započeti pre početka standardne terapije, na primer, dan, nekoliko dana, nedelju dana, nekoliko nedelja, mesec dana ili čak nekoliko meseci pre početka standardne terapije nege.
[0125] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija za nivolumab (OPDIVO®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje putem IV infuzije, jednom na svakih 7 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg. Nivolumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 3 mg/kg tokom 60 minuta, jednom na svake dve nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / nivolumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0126] Prema drugom aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija nivolumabu (OPDIVO®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje putem IV infuzije, jednom na svakih 14 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg. Nivolumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 3 mg/kg tokom 60 minuta, jednom na svake dve nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / nivolumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0127] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija nivolumabu (OPDIVO®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje putem IV infuzije, jednom na svakih 28 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg. Nivolumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 3 mg/kg tokom 60 minuta, jednom na svake dve nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / nivolumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0128] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija nivolumabu (OPDIVO®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 7 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg. Nivolumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 3 mg/kg tokom 60 minuta, jednom na svake dve nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / nivolumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0129] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija nivolumabu (OPDIVO®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 14 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg. Nivolumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 3 mg/kg tokom 60 minuta, jednom na svake dve nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / nivolumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0130] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija nivolumabu (OPDIVO®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 28 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg. Nivolumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 3 mg/kg tokom 60 minuta, jednom na svake dve nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / nivolumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0131] Prema drugom aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija pembrolizumabu (Keytruda®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje putem IV infuzije, jednom na svakih 7 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg. Pembrolizumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 2 mg/kg tokom 30 minuta, jednom na svake tri nedelje.
Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / pembrolizumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0132] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija pembrolizumabu (Keytruda®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje putem IV infuzije, jednom na svakih 14 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg. Pembrolizumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 2 mg/kg tokom 30 minuta, jednom na svake tri nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / pembrolizumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0133] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija pembrolizumabu (Keytruda®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje putem IV infuzije, jednom na svakih 28 dana, u dozi od 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,6 mg/kg, 2,8 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,2 mg/kg, 3,4 mg/kg, 3,6 mg/kg, 3,8 mg/kg ili 4,0 mg/kg. Pembrolizumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 2 mg/kg tokom 30 minuta, jednom na svake tri nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / pembrolizumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0134] Prema drugom aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija pembrolizumabu (Keytruda®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija, jednom na svakih 7 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg. Pembrolizumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 2 mg/kg tokom 30 minuta, jednom na svake tri nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / pembrolizumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0135] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija pembrolizumabu (Keytruda®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija jednom na svakih 14 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg. Pembrolizumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 2 mg/kg tokom 30 minuta, jednom na svake tri nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / pembrolizumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0136] Prema sledećem aspektu, anti-CD40 antitelo se upotrebljava kao dopunska terapija pembrolizumabu (Keytruda®) za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. Prema pojedinim aspektima, anti-CD40 antitelo je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. Anti-CD40 antitelo se primenjuje kao IT injekcija jednom na svakih 28 dana, u dozi od 0,001 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg ili 2,0 mg/kg. Pembrolizumab se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od 2 mg/kg tokom 30 minuta, jednom na svake tri nedelje. Dopunska terapija anti-CD40 antitelom / pembrolizumabom se nastavlja sve dok bolest napreduje ili je pacijent više ne toleriše.
[0137] Kao što će proceniti stručnjaci iz oblasti tehnike, moguće je da će biti potrebno podesiti preporučene doze za razne agense koji su prethodno opisani, da bi se optimizovao odgovor pacijenta i terapijska korist povećala do maksimuma.
8. PRIMERI
[0138] Primeri koji slede, koji naglašavaju određene karakteristike i osobine primera izvođenja anti-CD40 antitela koja su ovde opisana za primer, navedeni su u svrhu ilustracije, a ne kao ograničenja.
Primer 1: Generisanje mišjih anti-humanih CD40 antitela
[0139] Monoklonska antitela su generisana imunizacijom Balb/C miševa ili SJL miševa i intraperitonealnom primenom mišjih 3T12 ćelija koje prekomerno eksprimiraju humani CD40. Sakupljene su zatim slezine i splenociti su fuzionisani sa NS0 ćelijskom linijom multiplog mijeloma. Hibridomi su selektovani upotrebom aminopterina. Selektovani hibridomi koji eksprimiraju anti-CD40 antitela sa agonističkim aktivnostima su pregledani i subklonirani da bi se izolovali pojedinačni klonovi.
[0140] Za skrining antitela sa agonističkom aktivnošću, razvijen je panel funkcionalnih testova, uključujući stimulaciju NFκB puta, aktivaciju monocita, aktivaciju dendritičnih ćelija (DC) i test kompeticije sa CD40 ligandom (CD40L). U ovim testovima, anti-humani CD40 G28-5 (mišji IgG1) (Biolegend) je bio uključen kao pozitivna kontrola, a mišje antitelo podudatnog izotipa (mIgG1) kao negativna kontrola.
8.1.1. NFκB reporterska analiza sa HEK293 plavim CD40 ćelijama
[0141] HEK293 ćelijska linija sa CD40 koja je bila obeležena plavim (InVivogen) i koja stabilno eksprimira humani CD40 i NFκB reporterski gen, gajena je u DMEM-u, sa 10% fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplotom (FBS), u koji je bilo dodato 30 µg/mL Blasticidina i 100 µg/mL Zeocina. Aktivacija CD40 na površini HEK293 plavih CD40 ćelija pokreće signalnu kaskadu koja vodi aktivaciji NFκB i naknadnom izlučivanju embrionske alkalne fosfataze (SEAP). Inkubacija supernatanata hibridoma koji sadrže agonistički anti-CD40 sa 2,5×10<5>/mL HEK293 plavih CD40 ćelija stimulisala je proizvodnju SEAP, što je mereno kolorimetrijskim enzimskim testom. Nivo SEAP je tako odgovarao aktivnosti anti-CD40 u supernatantima hibridoma.
8.1.2. Test aktivacije monocita
[0142] Test aktivnosti monocita je izvođen upotrebom monocitne ćelijske linije THP1-XBlue ćelija (InVivogen). Ova ćelijska linija stabilno eksprimira NFkB i SEAP reporterski gen koji se indukuje sa AP-1, a gajena je u RPMI 1640 medijumu sa 10% FBS-a koji je bio inativiran toplotom i sa 200 µg/mL Zeocina. U testu, 5×10<5>/mL THP1-XBlue ćelije je najpre prajmovano sa 40 ng/mL IFNγ tokom 24 sata, nakon čega su ćelije inkubirane sa uzorcima koji su ispitivani tokom dodatna 24 sata. Agonistička aktivnost SEAP indukovana sa anti-CD40 praćena je enzimskim testom.
8.1.3. Test proizvodnje IL-12p70 u primarnim dendritičnim ćelijama
[0143] Anti-CD40 klonovi su takođe podvrgnuti skriningu, da bi se utvrdila njihova sposobnost da aktiviraju dendritične ćelije izvedene iz monocita (moDC). Aktivacija je praćena proizvodnjom IL12p70. Mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMC) su najpre izolovane upotrebom Ficoll-nog gradijenta. Ukratko, puna krv iz zdravih humanih donora je razblaživana sa jednakom zapreminom PBS-a, nakon čega je dodata u Leucosep (Greiner Bio One) epruvetu koja je ispod frita sadržavala Ficoll-Paque Plus reagens (15 mL). Krv je zatim centrifugirana na 1000 g tokom 15 minuta bez upotrebe kočnice. PBMC su prikupljene i isprane jednom sa PBS-om, nakon čega su centrifugirane na 1300 rpm tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi i isprane jednom sa RPMI 1640. Ćelije su resuspendovane u medijumu za kulturu (RPMI1640+10% FBS inaktiviran toplotom). Monociti su naknadno izolovani iz PBMC, upotrebom kompleta za obogaćivanje, kompanije StemCell, pa su gajeni u medijumu StemSep bez seruma u koji su bili dodati 10 ng/mL GM-CSF i 20 ng/mL IL-4, na 37 °C i pri 5% CO2, tokom 6 dana. Sveži GM-CSF i IL-4 su dodati u kulturu 3. dana, da bi se potmoglo u održavanju diferencijacije DC. Nakon 6 dana u kulturi, nezreli DC izvedeni iz monocita su podvrgnuti FACS analizi da bi se potvrdio nezreli DC fenotip sa: Lin-, CD80/CD86+, HLA-DR+ ili CD11c+. Nezreli moDC su dalje prajmovani sa IFNγ, nakon čega su stimulisani sa uzorcima koji su sadržavali anti-CD40 antitelo, tokom 48 sati u medijumu bez seruma StemSep, u koji su bili dodati GM-CSF i IL-4. Supernatant kulture je prikupljen i ispitana je proizvodnja IL-12p70, upotrebom komercijalno dostupnog ELISA kompleta. Rezultati skrininga i reprezentativna aktivnost su sumirani u Tabeli 1-1.
[0144] Tabela 1-1 prikazuje opseg agonističke anti-CD40 aktivnosti duž izolovanih hibridoma. Sve od novih klonova je karakterisala aktivacija monocita koja je bila uporediva sa literaturnim CD40 antitelom G28-5 (pogledati, npr. Bishop G.A., Journal of Immunology 188, 4127-4129 (2012)). Klonovi AD166.4.4 i AD175.14.11 su doveli do aktivacije monocita, ali nisu pokazali aktivaciju dendritičnih ćelija. Ostatak klonova je ispoljio aktivaciju monocita koja je bila uporediva sa G28-5, kao i poboljšanu aktivaciju dendritičnih ćelija u poređenju sa G28-5.
[0145] Sekvence cDNK koje kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca za deset monoklonskih antitela klonirane su iz hibridoma AD163.9.3, AD166.4.4, AD175.14.11, AD163.10.7, AD165.1.2, AD163.162.1, AD163.27.12, AD163.7.2, AD164.14.6 i AD164.76.3, tim redom, upotrebom standardnih PCR tehnika, nakon čega su sekvencirane upotrebom standardnih tehnika sekvenciranja DNK. U potpunosti odgovarajuće sekvence aminokiselina antitela, koje su kodirane sa DNK, prikazane su na SL.2A-2C.
Primer 2: Klasifikacija epitopa mišjih anti-humanih CD40 antitela
[0146] BIAcore analiza i ELISA postupak su upotrebljavani za klasifikaciju mišjih anti-humanih CD40 agonističkih antitela na osnovu njihove sposobnosti da stupe u kompeticiju u vezivanju za CD40, jedna sa drugima ili sa ligandom CD40 (CD40L).
[0147] BIAcore analiza je izvođena upotrebom BIAcore T100 instrumenta na 12 °C. Na CM5 senzorski čip je najpre imobilisano kozje anti-mišje Fc antitelo (Pierce, kat. br. 31170), nakon čega je sledilo “hvatanje” prvog ispitivanog antitela za površinu. Nakon blokiranja sa 50 µg/mL koktela mišjih izotipskih antitela, u protočne ćelije je injeciran solubilni oblik vanćelijskog domena humanog CD40 (Creative BioMart, kat.br. CD402221H). Injecirani su zatim drugo ispitivano antitelo ili CD40L (PeproTech, kat. br.0308145), da bi se izmerilo njihovo vezivanje za kompleks CD40 i prvo ispitivano antitelo. Kao što je prikazano u Tabeli 2-1, anti-CD40 antitela opisa su klasifikovana u tri grupe epitopa. Primer epitopske grupe 1 su bili AD163.7.2 ("muAb8") i AD175.14.11 ("muAb3"), koji su blokirali vezivanje CD40L za CD40. Epitopska grupa 2 je određena za klonove AD163.162.1 ("muAb6") i AD163.27.12 ("muAb7"), pri čemu epitopi nisu stupali u kompeticiju sa CD40L ili sa antitelima iz epitopske grupe 1. Primer treće grupe epitopa su klonovi AD163.9.3 ("muAb1"), AD166.4.4 ("muAb2") i AD165.1.2 ("muAb5"), koji nisu stupali u kompeticiju vezivanja CD40L za CD40, ali su bila u kompeticiji sa antitelima iz epitopskih grupa 1 i 2.
[0148] Razvijen je i ELISA test za merenje efekata anti-CD40 antitela na interakciju humanih CD40-CD40L. Ukratko, fuzioni protein CD40-humani Fc (huFc) (Creative BioMart) je pomešan sa anti-CD40 antitelom ili izotipskim kontrolnim antitelom, pa je rastvor prebačen u ploče sa 96 bunarića koje su bile obložene sa CD40L koji je bio obeležen sa HA (R&D Systems). Vezivanje CD40-huFc kompleksa za CD40L koji je bio vezan za ploču, detektovano je sa anti-humanim Fc antitelom konjugovanim sa HRP-om (Jackson ImmunoResearch). Nakon razvijanja signala sa TMB (3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidinskim) supstratom, ploče su očitane na OD450.
[0149] Efekat anti-CD40 antitela na interakciju CD40-CD40L je određivan izračunavanjem odnosa OD450u uzorcima koji su sadržavali anti-CD40 antitela u odnosu na OD450u uzorku koji je sadržavao izotipsko kontrolno antitelo („odnos OD450"). Odnosi OD450od ≤ 0,1 su ukazali na inhibiciju vezivanja humanog CD40L za humani CD40. Odnosi OD450između 0,1 i 1 su ukazali na delimičnu inhibiciju vezivanja CD40L za CD40. Odnosi OD450> 1 su ukazali na pojačano vezivanje humanog CD40L za humani CD40, čime se pojačala signalizacija CD40.
[0150] Podaci su sumirani u Tabeli 2-2. Antitela muAb8 i muAb3 koja su blokirala vezivanje CD40 za CD40L, karakterisao je odanos manji od 0,1. Antitela muAb6 i muAb7 je karakterisao odnos od oko 0,5, što ukazuje na skroman efekat na interakciju CD40-CD40L. Antitela muAb1, muAb2, muAb4, muAb5, muAb9 i muAb10 je karakterisao odnos OD450od oko 1 ili veći od 1, što ukazuje bilo na odsustvo efekta ili na efekat koji je pospešio vezivanje CD40 za CD40L.
Primer 3: Humanizacija mišjih anti-humanih CD40 antitela
[0151] Humanizacija V regiona antitela je izvršena kao što je navedeno od Queen C. i saradnici (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86:10029-10033). Kanonske strukture CDR sekvenci su utvrđene prema publikaciji Huang-a i saradnika (Methods, 2005; 36:35-42). Identifikovane su i humane varijabilne germinativne sekvence sa istim ili najsličnijim CDR kanonskim strukturama, a sekvence odgovarajućih humanih VH, VLi J segmenta su odabrane tako da se obezbede uokvirujući regioni za anti-CD40 varijabilni region. Na pozicijama u uokvirujućem regionu za koje je kompjuterski model ukazao da su od značaja za kontakt sa CDR sekvencama, aminokiseline iz mišjih anti-CD40 V regiona su supstituisane sa originalnim aminokiselinama humanog uokvirujućeg regiona (povratne mutacije). Upotrebljavani su konstantni regioni humanog IgG1sa prirodnim varijantama D356E i L358M u teškom lancu i kapa laki lanac, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Pune aminokiselinske sekvence VHi VLregiona humanizovanih antitela su prikazane na SL.2D-2G.
[0152] Anti-CD40 klon AD163.162.1 ("muAb6") je humanizovan prema postupku koji je prethodno opisan. Humanizovane verzije muAb6 su bile huAb6-1, huAb6-2 i huAb6-3. Antitelo huAb6-1 je nosilo VH(SEQ ID NO: 110) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: M48I, V67A, I69L i A71V. Antitelo huAb6-2 je nosilo VH(SEQ ID NO: 111) uokvirujući region sa povratnim mutacijama M48I i A71V. Antitelo huAb6-3 je nosilo VH(SEQ ID NO: 112) uokvirujući region sa povratnim mutacijama M48I i A71V, kao i VHCDR germinativne promene N60A, K64Q i D65G da bi se povećao identitet sa humanom germinativnom sekvencom. Antitela huAb6-1, huAb6-2 i huAb6-3 su nosila VL(SEQ ID NO: 161) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: A43S, L46R, L47W i F71Y.
[0153] Humanizovane verzije anti-CD40 klona AD163.7.2 ("muAb8") su bile huAb8-1, huAb8-2 i huAb8-3 (Slike 2D-2E). Antitelo huAb8-1 je nosilo VH(SEQ ID NO: 113) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, Y91F i R94S. Antitelo huAb8-2 je nosilo VH(SEQ ID NO: 114) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, Y91F i R94S; kao i VH CDR C59S mutaciju. Antitelo huAb8-3 je nosilo VH(SEQ ID NO: 115) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: M48I, A71V i R94S. Sva od antitela huAb8-1, huAb8-2 i huAb8-3 su nosila VL(SEQ ID NO: 162) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: A43S i Y87F.
[0154] Anti-CD40 klon AD164.14.6 ("muAb9") je humanizovan da bi se obezbedili huAb9-1, huAb9-2, huAb9-3, huAb9-4, huAb9-5 i huAb9-6. Antitela huAb9-1 i huAb9-4 su imala VH(SEQ ID NO: 116) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: I48M, V67I i V71R. Antitela huAb9-2 i huAb9-5 su nosila VH(SEQ ID NO: 117) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: I48M i V71R. Antitela huAb9-3 i huAb9-6 su nosila VH(SEQ ID NO: 118) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: I48M i V71R, kao i dodatne dve germininativne promene T30S i N65S u CDR sekvenci, da bi se poboljšao identitet humane germinativne sekvence. Antitela huAb9-1, huAb9-2 i huAb9-3 su nosila VL(SEQ ID NO: 163) uokvirujući region sa povratnim mutacijama: I2A, Y36F i Y87F. Antitela huAb9-4, huAb9-5 i huAb9-6 su nosila VL(SEQ ID NO: 164) uokvirujući region sa povratnom mutacijom I2A. Klon AD164.14.6 je dalje modifikovan tako da se ukloni mesto cepanja signalnog peptida koje se nalazi na drugoj pozicij lakog lanca, vraćanjem uokvirujućeg regiona sa povratnom mutacijom I2A iz VL. Antitela huAb9 A2I i huAb9 A2V su nosila VH(SEQ ID NO:117) i VLkoji su sadržavali revertne mutacije A2I (SEQ ID NO:170) i A2V (SEQ ID NO:171) u uokvirujućem regionu, tim redom, da bi se sprečilo obrazovanje neželjenog proizvoda cepanja.
[0155] Humanizovana antitela iz ovog Primeru su generisana sa konstantnim regionom teškog lanca humanog IgG1 i konstantnim regionom kapa lakog lanca. C-terminalni lizin može biti podvrgnut delimičnom cepanju, post-translacionom obradom nakon ekspresije proteina teškog lanca humanog IgG1. Shodno navedenom, huAb9-5 je imao teški lanac prema SEQ ID NO:130 ili 131 i laki lanac prema SEQ ID NO:140. Antitelo huAb9-5 je takođe proizvedeno sa aminokiselinskim mutacijama V273E i V273Y u konstantnom regionu teškog lanca, što odgovara teškom lancu prema SEQ ID NO: 132 ili 133 i SEQ ID NO: 134 ili 135, tim redom, i lakom lancu prema SEQ ID NO:140. Antitela huAb9 A2I i huAb9 A2V su generisana sa V273E konstantnim regionom teškog lanca humanog IgG1. Shodno tome, huAb9 A2I je imao teški lanac prema SEQ ID NO: 132 ili 133 i laki lanac prema SEQ ID NO: 141. Analogno, huAb9 A2V je imao teški lanac prema SEQ ID NO: 132 ili 133 i laki lanac prema SEQ ID NO: 142.
Primer 4: Karakterizacija humanizovanog anti-humanog CD40
Antitela
[0156] Da bi se osiguralo da su humanizovana anti-CD40 antitela zadržala agonistička i druga željena svojstva matičnih mišjih antitela, sproveden je panel testova karakterizacije, da bi se utvrdili: aktivacija NFkB, kinetika vezivanja CD40, unakrsna reaktivnost među vrstama, kao i epitopske klase humanizovanih antitela opisa.
8.4.1. Aktivacija NFKB
[0157] Aktivacija NFkB sa humanizovanim anti-CD40 antitelom pronalaska je procenjivana u HEK293 plavim CD40 NFkB reporterskim ćelijama. Aktivacija je predstavljena kao aktivnost reporterskog gena SEAP (sekretovane embrionske alkalne fosfataze) koja je merena na OD655. Maksimalna izmerena OD655, i koncentracija za aktivaciju koja je iznosila polovinu od maksimalne (EC50), sumirani su u Tabeli 4-1.
8.4.2. Kinetika vezivanja CD40 i unakrsna reaktivnost među vrstama
[0158] Afiniteti vezivanja opisanih humanizovanih anti-CD40 antitela su analizirani i BIAcore analizom i protočnom citometrijom.
[0159] Kinetika vezivanja CD40 je analizirana BIAcore analizom na BIAcore T200 instrumentu. Ukratko, na CM5 senzorski čip je imobilisano kozje anti-mišje Fc antitelo (Pierce, kat.br.31170) ili kozje antihumano Fc (Pierce, kat.br.31125), nakon čega je usledilo “hvatanje” anti-CD40 antitela na ispitivanoj površini. Injeciran je zatim solubilni oblik vanćelijskog domena humanog CD40 (Creative BioMart, kat.br. CD402221H) ili cinomolgusni (cino) CD40 (Creative BioMart, kat.br. CD40-8824C) i mereni su vezivanje i disocijacija.
[0160] Podaci površinske plazmonske rezonancije su ukazali da su humanizovana antitela huAb8-1, huAb9-5, huAb9 A2I i huAb9 A2V zadržala slične afinitete vezivanja (KD) kao njihovi matični klonovi AD163.7.2 ("muAb8") ili klon AD164.14.6 ("muAb9"), a ispoljili su i slično vezivanje za CD40 čoveka ili cinomolgus majmuna (Tabela 4-2).
[0161] Za humanizovana anti-CD40 antitela je takođe procenjeno vezivanje za CD40 na površini ćelija, upotrebom HEK293 ćelija koje su bile stabilno transfektovane sa humanim ili cinomolgusnim CD40, kao i upotrebom B-ćelija izvedenih iz cinomolgusnih ili humanih PBMC. Humanizovana anti-CD40 antitela su bila inkubirana sa HEK293 transfektantima tokom 15 minuta na ledu, a vezivanje je detektovano sa fluorescentno konjugovanim anti-humanim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch). FACS analiza ćelija je potvrdila da su humanizovana antitela bila vezana za humane i cinomolgusne CD40 stabilne ćelijske linije. Nasuprot tome, nije utvrđeno vezivanje u sličnim eksperimentima koji su sprovedeni sa mišjim, pacovskim ili sa CD40 iz pasa.
[0162] Za anti-CD40 antitela je takođe procenjena njihova sposobnosti da vezuju primarne humane ćelije i ćelije cinomolgusa koje eksprimiraju CD40. PBMC izolovane iz krvi ljudi ili cinomolgus majmuna su inkubirane sa anti-CD40 antitelima koja su bila konjugovana sa fluorescentnom bojom CF640R. Nakon FACS analize, podaci su analizirani upotrebom FlowJo (FlowJo, LLC) kompjuterskog programa. Ovi rezultati su pokazali da su se humanizovana antitela vezala za primarne CD40-pozitivne ćelije izvedene iz humanih i cinomolgusnih PBMC.
8.4.3. Klasifikacija epitopa
[0163] Analiza protočne citometrije i ELISA postupak su upotrebljeni za klasifikaciju agonističkih anti-CD40 antitela, na osnovu njihove sposobnosti da stupe u kompeticiju u vezivanju za CD40, jedna sa drugima ili sa ligandom CD40 (CD40L).
[0164] Razvijena je i analiza protočne citometrije, da bi se ispitalo da li antitela stupaju u kompeticiju vezivanja humanog CD40 sa drugim antitelom. U ovoj analizi, kao referentno antitelo je korišćeno CP-870,893, pripremljen iz klona potpuno humanog IgG2anti-humanog CD40 antitela 21.4.1 (pogledati, Gladue RP. i saradnici, Cancer Immunol. Immunother.2011; 60:1009-17 i US Patent No.7,618,633). Teški i laki lanci, tim redom, iz CP-870,893 su bili:
[0165] Sva anti-CD40 humana ili humanizovana antitela, uključujući huAb6-1, huAb8-1, huAb9 A2I i CP-870,893, obeležavana su potom sa Alexa Fluor (AF)-488 bojom. Svako fluorescentno obeleženo antitelo sa fiksnom koncentracijom od 1 µg/mL, odvojeno je pomešano sa rastućom količinom drugih neobeleženih anti-CD40 antitela opsega od 0,5 ng/mL do 50 µg/mL, nakon čega su ista inkubirana sa HEK293 ćelijama koje su stabilno eksprimirale humani CD40. Vezivanje fluorescentno obeleženog antitela je zatim ispraćeno protočnom citometrijom.
[0166] Kompetitivna antitela identifikovana dozno-zavisnim smanjenjem srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI), kao i nekompetitivna antitela identifikovana konstantnim MFI, sumirana su u Tabeli 4-3. Dok huAb6-1 nije stupalo u kompeticiju vezivanja humanog CD40 sa huAb8-1, i huAb9 A2I i CP-870,893 su bila u kompeticiji sa huAb6-1 i huAb8-1. Dodatno, huAb9 A2I i CP-870,893 antitela su bila u kompeticiji jedno sa drugim.
[0167] Epitopska klasifikacija humanizovanih antitela pronalaska je takođe potvrđena ELISA testom kojim je mereno vezivanje anti-CD40 antitela i CD40 kompleksa za CD40L koji je vezan za ploču, kao što je opisano u Primeru 2. U ovom testu, kao referentno anti-CD40 antitelo je upotrebljen CP-870,893 koji je pripremljen kao što je to prethodno opisano. Rastuće količine anti-CD40 antitela ili humanog IgG1(huIgG1) kontrolnog antitela su inkubirane sa 1 µg/mL fuzionog proteina CD40-huFc i smeša je zatim naneta na ploču obloženu sa CD40L. Kao što je prikazano na SL.3, humanizovana antitela huAb8-1 i huAb8-3 su blokirala interakciju CD40 i CD40L (gore levo); huAb6-1 i huAb6-2 su pokazali minimalan efekat na interakciju CD40-CD40L (gore desno); a huAb9-5 i huAb9-6 su pospešila vezivanje CD40 za CD40L (dole levo). Humanizovano antitelo huAb9 A2I je takođe pospešilo vezivanje CD40 za CD40L u poređenju sa CP-870,893, što je pokazalo minimalan efekat na interakciju CD40-CD40L (dole desno).
[0168] Rezultati su bili u skladu sa onima dobijenim u testu zasnovanom na protočnoj citometriji sa ćelijama koje eksprimiraju CD40L (SL.4). CD40L+ Jurkat ćelije su bile inkubirane sa solubilnim humanim CD40 proteinom konjugovanim sa fluorohromom Alexa Fluor 488 u konstantnoj koncentraciji od 1 µg/mL. Vezivanje CD40 konjugovanog sa fluorohromom za CD40L, za površinu Jurkat ćelija, mereno je analizom protočne citometrije u prisustvu humanizovanog antitela huAb9 A2I i referentnog anti-CD40 antitela CP-870,893. Pojačani intenzitet fluorescencije je detektovan nakon povećane količine huAb9 A2I u uzorku, ali ne i sa referentnim antitelom CP-870,893. Ovi rezultati ukazuju da je huAb9 A2I pospešio vezivanje CD40 za CD40L+ Jurkat ćelije, dok referentni CP-870,893 to nije učinio.
[0169] Funkcionalni uticaj huAb9 A2I na CD40 signalizaciju koju pokreće CD40L takođe je određen u testu koji je uključivao ćelije koje eksprimiraju i CD40 i CD40L. Ćelije koje eksprimiraju CD40 (HEK293 plave CD40 NFκB reporterske ćelije opisane u odeljku 8.1.1) su pomešane sa CD40L- ili CD40L+ Jurkat ćelijama u odnosu 1:1 i inkubirane sa bilo sa huAb9 A2I, CP-870,893 ili kontrolnim antitelom u koncentraciji od 3 µg/mL. Signalizacija CD40 je merena kroz aktivnost SEAP reportera, kolorimetrijskim testom koji je opisan u Odeljku 8.4.1. Kada su CD40 reporterske ćelije bile kultivisane istovremeno sa CD40L- Jurkat ćelijama (SL.5A), CD40 signalizacija je bila značajno poboljšana samo nakon dodavanja bilo huAb9 A2I ili CP-870,893, ali ne i nakon tretmana sa kontrolnim antitelom ili bez dodavanja. Iako su oba antitela aktivirala CD40, huAb9 A2I nije bio značajno potentniji od CP-870,893 u stimulaciji CD40 pod ovim uslovima. Kada su CD40 reporterske ćelije bile istovremeno kultivisane sa CD40L+ Jurkat ćelijama (SL.5B), CD40L sa površine ćelija je aktivirao CD40 kao što je naznačeno aktivnostima SEAP reportera. Tretman sa CP-870,893 nije dodatno poboljšao aktivnosti CD40 signalizaciju sa SEAP reporterskom aktivnošću koja je bila slična sa onom za kontrolne huIgG1 ili huIgG2 izotipove, ili pri tretmanu u odsustvu antitela (samo sa medijumom). Nasuprot tome, tretman sa huAb9 A2I je dodatno povećao signalizaciju CD40 sa reporterskom aktivnošću koja je bila značajno većom u odnosu na CP-870,893 i kontrolne tretmane (p<0,001).
[0170] Ovi podaci su ukazali da kada dolazi do aktivacije CD40 na površini ćelija sa zasićenom količinom CD40L na ćelijskoj površini, huAb9 A2I je dodatno pojačao aktivaciju CD40 tako što je izvršio veću nishodnu NFkB signalizaciju u poređenju sa ekvivalentnom količinom poznatog anti-CD40 antitela CP-870,893.
Primer 5: Varijante Fc regiona anti-CD40 antitela
[0171] Veća agonistička aktivnost CD40 može biti postignuta modifikovanjem Fc regiona da bi se pojačalo vezivanje FcyRIIB (Li i Ravetch, Science, 2011; 333:1030-1034; i White i saradnici, J. Immunol, 2011; 187:1754-1763). Dve mutacije, V273E i V273Y, na poziciji 273 u konstantnom regionu humanog IgG1 uvedene su u humanizovana anti-CD40 antitela huAb6-1, huAb8-1, huAb9-5 i huAb9 A2I. Uticaj Fc mutacija na vezivanje za Fcγ receptore je praćen FACS analizom i citotoksičnošću posredovanom ćelijama koja je zavisnom od antitela (ADCC). Agonističke aktivnosti humanizovanog anti-CD40 sa Fc modifikacijom su praćene putem aktivaciju NF-kB reportera, B-ćelija, DC izvedenih iz monocita i T-ćelija.
8.5.1. Vezivanje Fcγ receptora i ADCC funkcija
[0172] Rastuće količine anti-CD40 humanih IgG1antitela i njihovih Fc varijanti su inkubirane sa CHO ćelijama koje stabilno eksprimiraju različite humane Fcγ receptore, uključujući FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32a), FcyRIIB (CD32b) i FcyRIIIA (CD16), bilo sa F ili V polimorfizmom. Vezivanje je detektovano upotrebom anti-humanog sekundarnog antitela specifičnog za F(ab')2koje je bilo fluorescentno konjugovano (Jackson ImmunoResearch). Mutacije V273E ili V273Y su smanjile vezivanje za FcyRIIIA (CD16F ili V), dok je vezivanje FcyRI (CD64) bilo zadržano, uz pojačavanje vezivanja FcyRIIA (CD32a) ili FcγRIIB (CD32b) (SL.6A-6B).
[0173] ADCC za Fc varijante humanizovanih anti-CD40 antitela je meren standardnim protokolom (Law i saradnici, 2005, Cancer Res.65:8331-8). U ilustrativnom primeru, ADCC je bio smanjen sa varijantama konstantnog regiona V273E ili V273Y u poređenju sa IgG1divljeg tipa za antitelo huAb9-5 u RL ćelijama (SL.7).
8.5.2. Povećana agonistička aktivnost nakon vezivanja FcyR
[0174] Da bi se procenio uticaj vezivanja Fcγ receptora na agonističku aktivnost anti-CD40, za tretman HEK293 plavih CD40 NFκB reporterskih ćelija koje su kultivisane zajedno sa CHO ćelijama koje su stabilno eksprimirale različite humane Fcγ receptore je upotrebljeno huAb9 A2I sa huIgG1V273E mutacijom, nakon čega je praćena aktivnost NFkB. Kao što je prikazano u Tabeli 5-1, agonistička aktivnost CP-870,893 u stimulaciji aktivacije NFκB je bila nezavisna od vezivanja Fcγ receptora, dok je utvrđeno da je agonistička aktivnost huAb9 A2I bila zavisna od vezivanja Fcγ receptora. Potencija huAb9 A2I je bila deset puta veća u stimulisanju aktivnosti NFkB kada su reporterske ćelije bile kultivisane zajedno sa CHO ćelijama koje su eksprimirale CD32a, CD32b ili CD64 u odnosu na slučaj kada su bile kultivisane zajedno sa CHO ćelijama bez ekspresije Fcγ receptora, ili sa onima koje eksprimiraju CD16V ili CD16F.
8.5.3. Dejstvo Fc varijanti na proliferaciju B-ćelija
[0175] Uticaj Fc V273E ili V273Y mutacije na agonističku aktivnost anti-CD40 takođe je procenjen testom proliferacije B-ćelija. U ovom testu, humane B-ćelije su bile obogaćene upotrebom kompleta za obogaćivanje B-ćelija (StemCell Technologies) negativnom selekcijom. Prečišćene B-ćelije su zasejane u ploče sa 96 bunarića pri gustini od 5 X 10<5>/ml, u po 200 µL po bunariću, u AIM-V medijum bez seruma (GIBCO). Dodata su zatim serijski razblažena anti-CD40 antitela i B-ćelije su kultivisane tokom 6 dana. U poslednjih 16 sati kulture, u svaki bunarić kulture je dodat 1 µCi H<3>TdR, pa je proliferacija B-ćelija određivana putem ugradnje H<3>TdR. Radioaktivnost povezana sa ugradnjom H<3>TdR je snimana upotrebom scintilacionog brojača u vidu broja otkucaja u minuti (CPM). U poređenju sa odgovarajućim humanim IgG1 antitelima divljeg tipa, anti-CD40 (huAb6-1, huAb8-1 i huAb9-5) humani IgG1 sa Fc varijantama V273E i V273Y su pokazali pojačanu aktivaciju B-ćelija (SL.8). Ipak, u poređenju sa CP-870,893, huAb9 A2I (humani IgG1V273E) je ispoljio oko deset puta manju potenciju u stimulisanju proliferacije B-ćelija (donji desni grafik).
8.5.4. Dejstvo Fc varijanti na proizvodnju IL-12p70 u DC
[0176] Uticaj Fc V273E ili V273Y mutacije na agonističku aktivnost anti-CD40 dodatno je procenjivan upotrebom testa aktivacije DC i IL-12p70 kao očitavanja. U ovom testu, nezrele DC su najpre izvođene iz monocita prečišćenih od humanih PBMC, nakon čega su iste tretirane sa IL4 i GM-CSF. Sazrevanje DC i proizvodnja IL-12p70 su indukovani sa anti-CD40, nakon prajmovanja sa IFNγ. V273E ili V273Y mutirane verzije Fc su pojačale potenciju aktivacije DC, pojačavanjem proizvodnje IL-12p70. Kao što je ilustrovano na SL. 9, huAb6-1 (gore levo), huAb8-1 (gore desno) i huAb9-5 (dole levo) sa huIgG1Fc varijantama V273E ili V273Y pokazale su povećanu proizvodnju IL-12p70 u poređenju sa njihovim odgovarajućim antitelima koja su bila sa huIgG1divljeg tipa. Za huAb6-1 i huAb8-1, varijanta sa mutacijom V273Y u huIgG1je bila efektivnija u pojačavanju in vitro proizvodnje IL-12p70 od one sa mutacijom V273E. Za huAb9-5, V273E ili V273Y varijante huIgG1su pokazale sličnu potenciju. U slučaju huAb9 A2I (donji desni grafik), varijanta sa huIgG1V273E mutacijom je pokazala sličnu potenciju kao CP-870,893 u stimulisanju DC da proizvode IL-12p70.
8.5.5. Dejstvo Fc varijanti na aktivaciji T-ćelija u alogenoj ko-kulturi DC i T-ćelija
[0177] Da bi se pokazalo da anti-CD40 može pokrenuti aktivaciju T-ćelija putem stimulacije ćelija koje prezentuju antigen, kao što su DC, Fc varijante anti-CD40 su ispitivane u alogenoj ko-kulturi DC i T-ćelija. U ovom testu, dendritične ćelije (5 X 10<3>) su najpre izvedene iz monocita upotrebom postupka koji je prehtodno opisan, nakon čega su ćelije pomešane sa 1 X 10<5>T ćelije prečišćenih iz različitog donora. Različite količine anti-CD40 antitela huAb6-1, huAb8-1 ili huAb9-5 sa konstantnim regionom humanog IgG1bilo divljeg tipa ili njegove V273Y varijante Fc, dodati su u ko-kulturu DC i T-ćelija. Nakon inkubacije od 4 dana, supernatanti su prikupljeni i izmeren je IFN-γ upotrebom ELISA postupka.
[0178] SL.10 ilustruje antitela za primer, koja su pokazala pojačanu proizvodnju IFN-γ u ko-kulturi sa ćelijama iz dva različita para donora. U svakom slučaju, V273Y varijante huAb6-1, huAb8-1 i huAb9-5 su dovele do aktivacije T-ćelija, što je dokazano značajnim povećanjem IFN-γ u poređenju sa izotipskim kontrolnom huIgG1antitelom.
Primer 6: In vivo antitumorska aktivnost anti-CD40 antitela
[0179] Za humanizovana anti-CD40 antitela huAb6-1, huAb9-5 i huAb9 A2I sa humanim IgG divljeg tipa1, ili Fc varijantama, procenjivana je i njihova sposobnost da inhibiraju rast tumora kod NSG miševa koji nose PC3 tumore prostate u prisustvu humanih imunskih ćelija.
[0180] NSG miševi su subkutano inokulisani smešom PC3 ćelija (1 X 10<6>), prečišćenih T-ćelija (5 X 10<5>), i autolognih DC (1 X 10<5>). Jednokratna doza anti-CD40 antitela ili kontrolnih antitela u koncentraciji od 1 mg/kg intraperitonealno je injecirana odmah nakon inokulacije. Zapremine tumora su merene svakog drugog dana upotrebom kalipera. Anti-CD40 antitela, uključujući huAb6-1, huAb9-5, huAb9 A2I i njihove Fc varijante V273E ili V273Y, smanjile su rast tumora u poređenju sa izotipskim kontrolnim antitelom u PC3 modelu, kao što je prikazano na SL.11.
Primer 7: Studije dokaza koncepta u mišjem modelu singenog tumora
[0181] Usled nedostatka vezivanja mišjeg CD40 za anti-CD40 antitela opisa za primer, procena farmakoloških efekata kod miša je vršena upotrebom mišjeg CD40 agonističkog antitela 1C10 muIgG1. Po analogiji sa huIgG1Fc V273E mutacijom koja je prethodno razmatrana, 1C10 sa Fc mišjeg IgG1(muIgG1) je pokazalo snažno vezivanje za muFcyRIIB i minimalno vezivanje za muFcyRI i muFcγRIV, funkcionalni ekvivalent humanog FcyRIII. Slično anti-CD40 antitelima opisa, 1C10 muIgG1je karakterisala potencija u stimulisanju aktivacije mišjih B-ćelija slezine in vitro i in vivo. Prema tome, anti-mišje CD40 antitelo 1C10 sa mišjim konstantnim regionom IgG1je upotrebljeno kao dokaz koncepta da je molekul pogodan za istraživanje potencijalnih puteva kliničkog razvoja, što je uključivalo upotrebu intratumorske isporuke ili kombinovane terapije sa istovremenom primenom anti-PD-1 antitela.
8.7.1. Intratumorska primena
[0182] Za ispitivanje intratumorske primene, upotrebljen je CT26 singeni model u kome su miševi bili sa bilateralnim subkutanim tumorima. Vijabilne ćelije (1 X 10<5>po mišu) su subkutano inokulisane u desni i levi zadnji bok ženki Balb/c miševa 0. dana. Životinje su zatim, 12. dana, nasumično raspodeljene u grupe sa deset miševa po grupi. Srednja zapremina tumora na desnom boku na početku doziranja je bila oko 85 mm<3>. Tri životinje iz svake grupe su žrtvovane 24 sata nakon primene prve doze radi procene serumskog ALT. Kod preostalih životinja je praćen rast oba tumora. Zapremine tumora su određivane dva puta nedeljno. Merenja dužine (L), širine (V) i visine (H) tumora su vršena elektronskim kaliperom i zapremina je izračunavana prema sledećoj jednačini: L X W X H / 2. Primena doza antitela je započeta odmah nakon nasumične raspodele po grupama.
[0183] Kada je anti-CD40 antitelo 1C10 direktno injecirano u jedan tumor (3 mg/kg, 2 do 3 puta nedeljno), rast tumora i na mestu injeciranja („IT doziranje“), kao i na udaljenom mestu („nije IT doziranje") je bio smanjen, što ukazuje na uspostavljanje sistemskog antitumorskog imuniteta (SL.12). Toksičnost u jetri je praćena putem ALT enzima jetre, merenjem sa VetScan uređajem (Abaxis Inc., Union City, CA). Intratumorska (IT) primena doza anti-CD40 antitela 1C10 izazvala je niže povišenje ALT nego sistemska intraperitonealna (IP) primena doza.
8.7.2. Kombinovana terapija sa istovremenom primenom anti-PD-1 antitela
[0184] CT26 tumor je uspostavljan subkutanom inokulacijom 1 X 10<5>vijabilnih ćelija po mišu, u desni bok ženki BALB/c miševa, 0. dana. Životinje su 15. dana nasumično raspodeljene u grupe. Anti-CD40 antitelo 1C10 (0,6 mg/kg), u kombinaciji sa anti-PDl muIgG2aantitelom (10 mg/kg) u vlasništvu, primenjivano je IP, dva puta nedeljno, singenom CT26 mišjem modelu model. Kombinovani režim primene je ispoljio značajnu antitumorsku aktivnost (7 od 10 miševa je pokazalo regresiju tumora u odnosu na 0 miševa u kontrolnoj grupi i 1 od 10 u svakoj grupi tretiranoj sa anti-PD1 ili anti-CD40), što podržava dalji razvoj ove kombinacije (SL.13).
[0185] Tretman sa anti-CD40 antitelom 1C10 je vršen u koncentraciji od 0,6 mg/kg, što je bila subterapijska doza za monoterapiju u ovom modelu. U pojedinim slučajevima, održavanje nivoa antitumorske efikasnosti u ovakvim dozama svakog monoklonskog antitela može omogućiti smanjenu toksičnost, što je dokazano, na primer, nivoima enzima jetre. U ovom eksperimentu, kombinovani tretman nije povećao nivoe enzima jetre, težinu slezine ili nivoe citokina, kao što su TNFα ili IL-6 (SL.
14). Nivoi enzima jetre su mereni VetScan uređajem, a nivoi citokina su mereni upotrebom MILLIPLEX Map kompleta za mišje citokine (EMD Millipore).

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Anti-CD40 antitelo sa sekvencom teškog lanca prema SEQ ID NO: 132 ili 133 i sekvencom lakog lanca prema SEQ ID NO: 141.
2. Molekul ili molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-CD40 antitelo prema patentnom zahtevu 1.
3. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 2.
4. Ćelija domaćin, pri čemu:
(i) navedena ćelija domaćin je eukariotska i sadrži vektor prema patentnom zahtevu 3; ili (ii) navedena ćelija domaćin je eukariotska i konstruisana je tako da eksprimira molekul ili molekule nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 2.
5. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je navedena eukariotska ćelija domaćin sisarska ćelija domaćin.
6. Postupak proizvodnje anti-CD40 antitela, koji obuhvata:
(i) kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 4(i); i
(ii) izdvajanje antitela.
RS20211552A 2016-05-27 2017-05-26 Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe RS62726B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662342417P 2016-05-27 2016-05-27
PCT/US2017/034681 WO2017205742A1 (en) 2016-05-27 2017-05-26 Anti-cd40 antibodies and their uses
EP17728411.4A EP3464361B1 (en) 2016-05-27 2017-05-26 Anti-cd40 antibodies and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62726B1 true RS62726B1 (sr) 2022-01-31

Family

ID=59014833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211552A RS62726B1 (sr) 2016-05-27 2017-05-26 Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe

Country Status (35)

Country Link
US (8) US10519243B2 (sr)
EP (2) EP3995511A1 (sr)
JP (2) JP2019523221A (sr)
KR (2) KR20220028143A (sr)
CN (1) CN109476750B (sr)
AR (2) AR108611A1 (sr)
AU (1) AU2017271602A1 (sr)
BR (1) BR112018074468A2 (sr)
CA (1) CA3025347A1 (sr)
CL (1) CL2018003366A1 (sr)
CO (1) CO2018012699A2 (sr)
CR (1) CR20180605A (sr)
CY (1) CY1124806T1 (sr)
DO (1) DOP2018000258A (sr)
EC (1) ECSP18094829A (sr)
ES (1) ES2901722T3 (sr)
HR (1) HRP20211882T1 (sr)
HU (1) HUE056670T2 (sr)
IL (1) IL263223B2 (sr)
LT (1) LT3464361T (sr)
MX (1) MX393455B (sr)
MY (1) MY195442A (sr)
NZ (1) NZ748644A (sr)
PE (1) PE20190970A1 (sr)
PH (1) PH12018502456A1 (sr)
PL (1) PL3464361T3 (sr)
PT (1) PT3464361T (sr)
RS (1) RS62726B1 (sr)
RU (1) RU2752049C2 (sr)
SG (2) SG11201810522UA (sr)
SI (1) SI3464361T1 (sr)
SM (1) SMT202100721T1 (sr)
TW (2) TWI814279B (sr)
UA (1) UA123111C2 (sr)
WO (1) WO2017205742A1 (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009059298A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions and methods of enhancinc immune responses to eimeria
SMT202100721T1 (it) 2016-05-27 2022-01-10 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticorpi anti-cd40 e loro usi
CN112512572B (zh) * 2018-04-20 2024-12-10 礼进生物医药科技（上海）有限公司 抗cd40抗体及其用途
CA3119865A1 (en) 2018-11-23 2020-05-28 Strike Pharma Ab Bi-specific conjugates
MX2021005823A (es) * 2018-11-30 2021-07-15 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo anti-cd40, fragmento de union a antigeno y uso farmaceutico del mismo.
CN109912717B (zh) * 2019-03-04 2020-05-26 北京天广实生物技术股份有限公司 结合cd40的抗体及其用途
US10570210B1 (en) * 2019-03-04 2020-02-25 Beijing Mabworks Biotech Co.Ltd Antibodies binding CD40 and uses thereof
WO2020193718A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Recombinant proteins with cd40 activating properties
AU2020256828A1 (en) * 2019-04-10 2021-11-18 Nankai University Anti-CD40 antibody and use thereof
GB201910900D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Modified fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof
EP4027998A1 (en) 2019-09-09 2022-07-20 Basilea Pharmaceutica International AG Pharmaceutical combinations comprising a furazanobenzimidazoles and a cd40 agonist for use in the treatment of neoplastic diseases
MX2022003009A (es) * 2019-09-11 2022-06-14 Novartis Ag Metodo para prevenir trastornos asociados a virus humanos en pacientes.
EP4048701A4 (en) * 2019-10-23 2024-05-29 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Anti-cd40 binding molecules and bi-specific antibodies comprising such
CN115038718B (zh) * 2019-11-08 2024-07-02 山东先声生物制药有限公司 抗人程序性死亡配体-1（pd-l1）的抗体及其用途
CA3163358A1 (en) 2019-12-03 2021-06-10 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins and uses thereof
GB202008003D0 (en) 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
EP4185320A4 (en) * 2020-07-23 2025-10-08 Dyne Therapeutics Inc MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND THEIR USES IN THE TREATMENT OF MUSCLE ATROPHY
CN115403670B (zh) * 2021-05-26 2026-03-10 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 抗cd40抗体及其用途
JP7881232B2 (ja) * 2022-05-31 2026-06-29 明済生物製薬（北京）有限公司 抗ｃｄ４０抗体と抗ｐｄ－ｌ１×ｃｄ４０二重特異性抗体及びその使用
CA3262796A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Currus Biologics Pty Ltd Bispecific Polypeptides and Their Uses
TW202500587A (zh) * 2023-02-16 2025-01-01 法商賽諾菲公司 Cd40結合蛋白

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP1972194A1 (en) 1996-12-03 2008-09-24 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
JP3876002B2 (ja) 1997-04-14 2007-01-31 ミクロメート・アクチエンゲゼルシャフト 抗ヒト抗原受容体を産生するための斬新な方法およびそれらの使用
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU1728800A (en) 1998-11-18 2000-06-05 Genentech Inc. Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
MXPA02007473A (es) 2000-02-01 2003-09-22 Tanox Inc Moleculas activadoras de celulas presentadoras de antigenos (apc) que se unen a cd40.
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1707627B1 (en) * 2003-12-25 2012-11-14 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antagonistic anti-CD40 antibody mutant
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2008505645A (ja) * 2004-07-10 2008-02-28 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ガン細胞に特異的な抗体を見出すための方法およびそれによって見出される抗体
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
US8323653B2 (en) * 2006-09-08 2012-12-04 Medimmune, Llc Humanized anti-CD19 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
CA2701788C (en) * 2007-10-05 2017-06-13 Genentech, Inc. Humanized beta-amyloid antibody for treating ocular diseases
EP2796467B1 (en) * 2010-03-31 2018-03-28 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-CD40 antibodies
KR102037432B1 (ko) 2011-04-29 2019-11-27 아펙시젠, 인코포레이티드 항-cd40 항체 및 사용 방법
GB201115280D0 (en) * 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
TWI855488B (zh) * 2012-08-24 2024-09-11 日商中外製藥股份有限公司 FcγRIIb特異性Fc區域變異體
CA2888763A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
ES2699599T3 (es) * 2013-03-15 2019-02-11 Abbvie Biotherapeutics Inc Variantes de Fc
GB201322583D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Alligator Bioscience Ab Antibodies
BR112017008959A2 (pt) 2014-10-29 2018-01-16 Seattle Genetics, Inc. método para tratamento de uma doença.
JP6518917B2 (ja) * 2015-05-29 2019-05-29 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ４０抗体およびその使用
SMT202100721T1 (it) * 2016-05-27 2022-01-10 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticorpi anti-cd40 e loro usi
KR20190014525A (ko) * 2016-05-27 2019-02-12 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. 면역 조절 단백질과 종양 항원을 결합하는 이중특이적 결합 단백질

Also Published As

Publication number Publication date
PE20190970A1 (es) 2019-07-09
PL3464361T3 (pl) 2022-01-31
SG11201810522UA (en) 2018-12-28
AR108611A1 (es) 2018-09-05
US20210024642A1 (en) 2021-01-28
US20210277137A1 (en) 2021-09-09
CO2018012699A2 (es) 2019-08-20
IL263223B2 (en) 2023-03-01
US20200010558A1 (en) 2020-01-09
US10400041B2 (en) 2019-09-03
KR20190014524A (ko) 2019-02-12
JP2022068294A (ja) 2022-05-09
CA3025347A1 (en) 2017-11-30
TWI761348B (zh) 2022-04-21
US20170342159A1 (en) 2017-11-30
HUE056670T2 (hu) 2022-02-28
EP3464361A1 (en) 2019-04-10
EP3464361B1 (en) 2021-11-10
WO2017205742A1 (en) 2017-11-30
IL263223B (en) 2022-11-01
TWI814279B (zh) 2023-09-01
MX393455B (es) 2025-03-24
US20220119542A1 (en) 2022-04-21
CN109476750B (zh) 2022-02-01
US20180186889A1 (en) 2018-07-05
KR102366355B1 (ko) 2022-02-24
RU2018146533A3 (sr) 2020-06-29
RU2018146533A (ru) 2020-06-29
SG10201914132RA (en) 2020-03-30
PH12018502456A1 (en) 2019-10-21
SI3464361T1 (sl) 2022-01-31
MY195442A (en) 2023-01-21
AR124692A2 (es) 2023-04-26
KR20220028143A (ko) 2022-03-08
JP7331179B2 (ja) 2023-08-22
SMT202100721T1 (it) 2022-01-10
RU2752049C2 (ru) 2021-07-22
CL2018003366A1 (es) 2019-03-15
LT3464361T (lt) 2022-01-10
US10597460B2 (en) 2020-03-24
EP3995511A1 (en) 2022-05-11
CN109476750A (zh) 2019-03-15
TW202229356A (zh) 2022-08-01
BR112018074468A2 (pt) 2019-03-06
PT3464361T (pt) 2021-12-27
ECSP18094829A (es) 2019-03-29
US20200040090A1 (en) 2020-02-06
DOP2018000258A (es) 2019-02-15
UA123111C2 (uk) 2021-02-17
HRP20211882T1 (hr) 2022-03-04
CY1124806T1 (el) 2022-11-25
AU2017271602A1 (en) 2018-12-13
NZ748644A (en) 2023-05-26
US10844131B2 (en) 2020-11-24
CR20180605A (es) 2020-01-13
US10023645B1 (en) 2018-07-17
US10519243B2 (en) 2019-12-31
ES2901722T3 (es) 2022-03-23
US20190071509A1 (en) 2019-03-07
TW201806971A (zh) 2018-03-01
IL263223A (en) 2018-12-31
JP2019523221A (ja) 2019-08-22
MX2018014630A (es) 2019-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7331179B2 (ja) 抗ｃｄ４０抗体とその使用
EP3464362B1 (en) Anti-4-1bb antibodies and their uses
US11459395B2 (en) Binding agents binding to PD-L1 and CD137 and use thereof
KR102601298B1 (ko) 신호-조절 단백질 알파에 대한 항체 및 사용 방법
US20230272056A1 (en) Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
HK40006958B (en) Anti-cd40 antibodies and their uses
EA050284B1 (ru) Биспецифичные антитела анти-cd28 x анти-cd22 и их применение