RS62859B1

RS62859B1 - Optimizovana anti-cd3 bispecifična antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS62859B1
Application number: RS20220089A
Authority: RS
Inventors: Eric Smith; Lauric Haber; Robert Babb; Gang Chen; Douglas Macdonald
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2022-02-28
Also published as: HK1258304A1; IL258036A; PT3353212T; MX2018003403A; TWI784917B; JP7023231B2; ES2901133T3; SMT202200050T1; TW202241514A; MY195059A; AU2016325630A1; EP3353212B1; HUE057683T2; ZA201801673B; CA2999385A1; US12577304B2; JP2022064886A; CY1124944T1; HRP20220133T8; MA42935A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na bispecifična antitela, ciljanje antigena koji je u vezi sa tumorom, i postupke za ubijanje tumora. Prikaz se odnosi na postupke kojima se smanjuje ili eliminiše opterećenje tumorom i kontrolisanje toksičnih neželjenih efekata koji mogu biti povezani sa imunoterapijom tumora. Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela koja se sastoje iz efektorskog kraka koji se vezuje za efektorski antigen sa slabim afinitetom ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja, na primer, anti-CD3 antigen-vezujući krak koji se vezuje za CD3 sa KDvećom od 500 nM, u in vitro testu afiniteta vezivanja.

STANJE TEHNIKE

[0002] Obećanje terapeutskih bispecifičnih antitela (bsAbs), posebno u imunoterapijama kancera, ima za cilj da premosti višestruke antigenske mete da bi se pokrenuo snažniji urođeni imunski odgovor koji je usmeren prema ćelijama koje nose metu ili organizmu.

[0003] Sada je dobro utvrđeno da bi se posredovala preusmerena liza, bsAb mora grupisati ciljnu ćeliju direktno na molekul okidač na efektorskoj ćeliji, kao što je T ćelija. Postoje mnogi faktori koje treba uzeti u razmatranje u pravljenju bsAb, na primer, veličina i sastav će imati uticaj na biodistribuciju i stabilnost in vivo (Segal, DM, Weiner, GJ, i Weiner, LM. Current Opinion in Immunol 1999, 11: 558-562; Chames, P. i Baty, D. MAbs.2009, 1(6): 539-547). Teško je predvideti različite ishode u zavisnosti od podseta T ćelija koji se aktivira za odgovor, kao i stanja T ćelija koje su stimulisane. Dobro je poznato da bsAbs ne daju dosledne rezultate (Manzke O, et al. Cancer Immunol Immunother.1997, 45:198-202). Na primer, bez odgovarajuće proizvodnje citokina, unakrsno vezivanje CD3 može indukovati apoptotski odgovor kod T ćelija (Noel PJ, Boise LH, Thompson CB: Regulation of T cell activation by CD28 and CTLA4. Adv Exp Med Biol 1996, 406:209-217). Podset T ćelija i stanje diferencijacije takvih regrutovanih T ćelija, npr. naivnih T ćelija, su važni za efikasnost, s obzirom da naivne T ćelije ne mogu lizirati ciljne ćelije bez prethodne aktivacije (kao što je unakrsno vezivanje TCR u prisustvu IL-2).

[0004] Određene bispecifične terapije su bile uspešne, ali, kao sa mnogim terapijama za kancer, što dolazi sa određenom cenom. Toksičnost je vodeći uzrok neuspeha kod terapeutika protiv kancera. Dobro je poznato da toksičnost takozvanih hemoterapeutskih lekova je vodeći uzrok neželjenih efekata kod pacijenata i sekundarnih bolesti. Događaj "ćelijskog ubijanja" sam po sebi nosi posledice za pacijenta. Razni i brojni citokinski odgovori mogu se indukovati aktivacijom efektorskih ćelija npr. T ćelija, i ciljnih ćelija kancera, ali koji tip odgovora je najpoželjniji u imunoterapiji tumora ostaje da se vidi. Postupak za identifikovanje anti-CD3 antitela za upotrebu u bispecifičnoj terapiji ima smanjene neželjene efekte dok se održava efikasnost i poželjna farmakokinetička (PK) svojstva što bi bilo od koristi.

[0005] Opisani su postupci kao što je sazrevanje afiniteta koji, zasnovano na osnovu strukturi/aktivnosti (SAR), koriste mutagenezu da bi se optimizovala antitela da imaju povećanu i unapređenu specifičnost vezivanja ili afinitet za ciljni antigen u poređenju sa polaznim antitelom (videti, npr. WO2011056997, objavljeno 12 maja, 2011). Modifikovana OKT3 antitela koja su sposobna da se vežu za i interaguju sa CD3 sa različitim stepenima afiniteta dok još ispoljavaju umerenu do visoku aktivaciju T ćelija su opisana (US7820166). Međutim, postupci za smanjenje afiniteta vezivanja molekula antitela do blizu ili iznad detektabilnog nivoa vezivanja nisu opisani, niti je pokazano da imaju potrebnu efikasnost za smanjenje ili supresiju tumora.

[0006] Prema tome, postoji potreba za alternativnim bispecifičnim antigen-vezujućim molekulima sa kontrolisanom citotoksičnosti i boljim PK svojstvima. Takve terapije za kancer bile bi veoma korisne u terapeutskim uslovima.

KRATKA SUŠTINA PRONALASKA

[0007] Pronalazak obezbeđuje citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta, pri čemu bispecifično antitelo sadrži prvi krak koji se vezuje za antigen ispoljava slabo do ne detektabilno vezivanje za humani CD3 i CD3 cinomolgusa, i drugi krak koji se vezuje za antigen koji veže antigen u vezi sa tumorom, pri čemu svaki od prvog kraka koji se vezuje za antigen i drugog kraka koji se vezuje za antigen sastoji se iz teškog lanca i lakog lanca, pri čemu je laki lanac zajednički i za prvi krak koji se vezuje za antigen i drugi krak koji se vezuje za antigen, i pri čemu težak lanac prvog kraka koji se vezuje za antigen se sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji se sastoji iz regiona za određivanje komplementarnosti HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji se sastoji iz aminokiselinskih sekvenci, redom, SEQ ID NOs: 36, 38, i 40 ili SEQ ID NOs: 140, 142 i 144.

[0008] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji iz (i) bispecifičnog antitela iz pronalaska, i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača.

[0009] Takođe su prikazana antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen koji vezuju CD3 koji imaju slabi ili ne detektabilni afinitet za humani i/ili CD3 cinomolgusa. Antitela prema ovom aspektu su korisna, između ostalog, za ciljanje T ćelija koje eksprimuju CD3, i za stimulisanje aktivacije T ćelija, npr., pod okolnostima u kojima je korisno ili poželjno ubijanje posredovano sa T ćelijama. Anti-CD3 antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, mogu biti uključeni kao deo bispecifičnog antitela koje usmerava CD3-posredovanu aktivaciju T ćelija na specifične tipove ćelije kao što su tumorske ćelije ili infektivne čestice.

[0010] Primeri anti-CD3 antitela ovde su navedeni u Tabelama 2 i 3. Tabela 2 predstavlja identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca (HCVRs), kao i regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3). Tabela 3 predstavlja identifikatore sekvenci molekula nukleinske kiseline koji kodiraju HCVRs, HCDR1, HCDR2 i HCDR3 regione primere anti-CD3 antitela. Tabele 4 i 5 predstavljaju varijabilne regione lakog lanca (LCVRs), kao i regione koji određuju komplementarnost (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz primera anti-CD3 antitela.

[0011] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je izabrana iz bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% prema tome identična u sekvenci.

[0012] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz HCVR i LCVR aminokiselinskog para sekvenci (HCVR/LCVR) koji se sastoji iz bilo kojih HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 2 koja je uparena sa bilo kojom od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 4, ili uobičajeni laki lanac koji je izveden iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz poznatog ili javnog domena varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost da uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili zajednički laki lanac. Prema određenim slučajevima, prikazana su antitela, ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, sastoje se iz HCVR/LCVR aminokiselinskog para sekvenci koji su sadržani u bilo kom od primera anti-CD3 antitela navedenih u Tabeli 2 koji su upareni sa primerima varijabinih regiona lakih lanaca navedenih u Tabeli 4. U određenim slučajevima, HCVR/LCVR aminokiselinski par sekvenci je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 10/162 (npr., CD3-VH-G2); 18/162 (npr., CD3-VH-G3); 26/162 (npr., CD3-VH-G4); 34/162 (npr., CD3-VH-G5); 42/162 (npr., CD3-VH-G8); 50/162 (npr., CD3-VHG9); 58/162 (npr., CD3-VH-G10); 66/162 (npr., CD3-VH-G11); 74/162 (npr., CD3-VH-G12); 82/162 (npr., CD3-VH-G13); 90/162 (npr., CD3-VH-G14); 98/162 (npr., CD3-VH-G15); 106/162 (npr., CD3-VH-G16); 114/162 (npr., CD3-VH-G17); 122/162 (npr., CD3-VH-G18); 130/162 (npr., CD3-VH-G19); 138/162 (npr., CD3-VH- G20); i 146/162 (npr., CD3-VHG21).

[0013] Predmetni prikaz se odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz teškog lanca CDR1 (HCDR1) koji se sastoje iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2 ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci. Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz teškog lanca CDR1 (HCDR1) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 178.

[0014] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz teškog lanca CDR2 (HCDR2) koji se sastoje iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2 ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci. Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz teškog lanca CDR2 (HCDR2) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 179.

[0015] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz teškog lanca CDR3 (HCDR3) koji se sastoje iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2 ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci. Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz teškog lanca CDR3 (HCDR3) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 180.

[0016] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz lakog lanca CDR1 (LCDR1) koji se sastoje iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4 ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci. Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz lakog lanca CDR1 (LCDR1) koja je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili zajednički laki lanac.

[0017] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz lakog lanca CDR2 (LCDR2) koji se sastoje iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4 ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci. Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz lakog lanca CDR2 (LCDR2) koji je izveden iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni zajednički laki lanac.

[0018] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz lakog lanca CDR3 (LCDR3) koji se sastoje iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4 ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci. Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz lakog lanca CDR3 (LCDR3) koja je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac.

[0019] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoji iz HCDR3 i LCDR3 aminokiselinskog para sekvence (HCDR3/LCDR3) koja se sastoji iz bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2 uparenih sa bilo kojom od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4. Prema određenim slučajevima, ovde su prikazana antitela, ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz HCDR3/LCDR3 aminokiselinskog para sekvence koji se nalaze u bilo kojim od primerima anti-CD3 antitela navedenih u Tabeli 2. U određenim slučajevima, HCDR3/LCDR3 aminokiselinski par sekvenci je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 16/168 (npr., CD3-VH-G2); 24/168 (npr., CD3-VHG3); 32/168 (npr., CD3-VH-G4); 40/168 (npr., CD3-VH-G5); 48/168 (npr., CD3-VH-G8); 56/168 (npr., CD3-VH-G9); 64/168 (npr., CD3-VH-G10); 72/168 (npr., CD3-VH-G11); 80/168 (npr., CD3-VH-G12); 88/168 (npr., CD3-VH-G13); 96/168 (npr., CD3-VH-G14); 104/168 (npr., CD3-VH-G15); 112/168 (npr., CD3-VH-G16); 120/168 (npr., CD3-VH-G17); 128/168 (npr., CD3-VH-G18); 136/168 (npr., CD3-VH-G19); 144/168 (npr., CD3-VH-G20); i 152/168 (npr., CD3-VHG21).

[0020] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz seta od šest CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji su sadržani u bilo kom od primera anti-CD3 antitela koja su navedena u Tabelama 2 i 4. U određenim slučajevima, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinski set sekvenci je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 12-14-16-164-166-168 (npr., CD3-VH-G2); 20-22-24-164-166-168 (npr., CD3-VH-G3); 28-30-32-164-166-168 (npr., CD3-VH- G4); 36-38-40-164-166-168 (npr., CD3-VH- G5); 44-46-48-164-166-168 (npr., CD3-VH-G8); 52-54-56-164-166-168 (npr., CD3-VH- G9); 60-62-64-164-166-168 (npr., CD3-VH-G10); 68-70-72-164-166-168 (npr., CD3-VH-G11); 76-78-80-164-166-168 (npr., CD3-VH-G12); 84-86-88-164-166-168 (npr., CD3-VH-G13); 92-94-96-164-166-168 (npr., CD3-VH-G14); 100-102-104-164-166-168 (npr., CD3-VH-G15); 108-110-112-164-166-168 (npr., CD3-VH-G16); 116-118-120-164-166-168 (npr., CD3-VH-G17); 124-126-128-164-166-168 (npr., CD3-VH-G18); 132-134-136-164-166-168 (npr., CD3-VH- G19); 140-142-144-164-166-168 (npr., CD3-VH- G20); i 148-150-152-164-166-168 (npr., CD3-VH-G21).

[0021] U povezanom slučaju, predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz seta od šest CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji su sadržani u HCVR/LCVR aminokiselinskom paru sekvenci kao što je definisano bilo kojim od primera anti-CD3 antitela navedenih u Tabelama 2 i 4. Na primer, predmetni prikaz uključuje antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji se sastoje iz HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinskog seta sekvenci koje su sadržane u HCVR/LCVR aminokiselinskom paru sekvenci koje su izabrane iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 10/162 (npr., CD3-VH-G2); 18/162 (npr., CD3-VH-G3); 26/162 (npr., CD3-VH-G4); 34/162 (npr., CD3-VH-G5); 42/162 (npr., CD3-VH-G8); 50/162 (npr., CD3-VH-G9); 58/162 (npr., CD3-VH-G10); 66/162 (npr., CD3-VH-G11); 74/162 (npr., CD3-VH-G12); 82/162 (npr., CD3-VH-G13); 90/162 (npr., CD3-VH-G14); 98/162 (npr., CD3-VH-G15); 106/162 (npr., CD3-VH-G16); 114/162 (npr., CD3-VH-G17); 122/162 (npr., CD3-VH-G18); 130/162 (npr., CD3-VH-G19); 138/162 (npr., CD3-VH- G20); i 146/162 (npr., CD3-VH-G21).

[0022] Postupci i tehnike za identifikovanje CDRs unutar aminokiselinskih sekvenci HCVR i LCVR su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu se koristiti za identifikovanje CDRs u okviru navedenih HCVR i/ili LCVR ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci. Primeri konvencija koje se mogu koristiti da bi se identifikovale granice CDRs uključuju, npr., definisanje po Kabatu, definisanje po Chothia, i AbM definisanje. U opštim terminima, Kabat definisanje je zasnovano na varijabilnosti sekvence, Chothia definisanje je zasnovano na položaju regiona strukturne petlje, i AbM definisanje je kompromis između Kabat i Chothia pristupa. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); i Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje CDR sekvenci unutar antitela.

[0023] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-CD3 antitela ili njihove delove. Na primer, premetni prikaz se odnosi na molekule nukleinske kiseline prema bilo kojoj od HCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 3; U određenim slučajevima molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 3, ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci prema tome.

[0024] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4; ili LCVR koja je izvedena iz srodnog lakog lanca izanti-TAA teškog lanca, ili je izvedena iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac. U određenim aspektima, molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 5, ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci prema tome.

[0025] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2; U određenim slučajevima molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od HCDR1 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 3, ili njihove suštinski slične sekvence koja je prema tome bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0026] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2; U određenim slučajevima molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od HCDR2 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 3, ili njihove suštinski slične sekvence koja je prema tome bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0027] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od HCDR3 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 3, ili njihove suštinski slične sekvence koja je prema tome bar 90%, bar95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0028] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4; ili LCDR1 koja je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od LCDR1 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 5, ili njihove suštinski slične sekvence koja je prema tome, bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0029] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4; ili LCDR2 koja je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od LCDR2 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 5, ili njihove suštinski slične sekvence koja je prema tome, bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0030] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4; ili LCDR3 koja je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od LCDR3 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 5, ili njihove suštinski slične sekvence koja je prema tome, bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0031] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, pri čemu HCVR sadrži set od tri CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3), pri čemu HCDR1-HCDR2-HCDR3 aminokiselinski set sekvence je kao što je definisano bilo kojim od primera anti-CD3 antitela navedenih u Tabeli 2.

[0032] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju LCVR, pri čemu LCVR sadrži set od tri CDRs (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3), pri čemu LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinski set sekvence je kao što je definisano bilo kojim od primera univerzalnog lakog lanca antitela navedenih u Tabeli 4; ili LCDR1-LCDR2-LCDR3 je je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izvedena iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom nesrodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac.

[0033] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju oba, i HCVR i LCVR, pri čemu HCVR sastoji se iz aminokiselinske sekvence bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2, i pri čemu LCVR se sastoji iz aminokiselinske sekvence bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 4; ili LCVR is koja je izvedena iz srodnog lakog lanca iz anti-TAA teškog lanca, ili je izvedena iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost uparivanja sa širokim spektrom ne-srodnih teških lanaca, tj. univerzalni ili uobičajeni laki lanac. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sastoji se iz polinukleotidne sekvence koja je izabrana iz bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci prema tome, i polinukleotidne sekvence izabrane iz bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 5, ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci prema tome. U nekim slučajevima, molekuli nukleinskih kiselina koje kodiraju oba i HCVR i LCVR su potpune humane sekvence ili su izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci.

[0034] Predmetni prikaz se takođe odnosi na rekombinantne ekspresione vektore koji su sposobni da eksprimuju polipeptid koji se sastoji iz varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela. Na primer, predmetni prikaz uključuje rekombinantne ekspresione vektore koji se sastoje iz bilo koje od gore pomenutih molekula nukleinskih kiselina, tj., molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci kao što su predstavljene u Tabeli 2 ili 4. Takođe su prikazane ćelije domaćina unutar kojih su takvi vektori uvedeni, kao i postupci za proizvodnju antitela ili njihovih delova kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i obnavljanje tako proizvedenih antitela i fragmenata antitela.

[0035] Predmetni prikaz uključuje anti-CD3 antitela i/ili anti-TAA antitela, kao i bispecifična anti-CD3/anti-TAA antitela koja imaju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim slučajevima, modifikacija da bi se uklonila neželjena mesta glikozilacije mogu biti korisna, ili antitelo kome nedostaje ostatak fukoze koji se nalazi na oligosaharidnom lancu, Na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, modifikacija tipa galaktozilacije se može napraviti da bi se modifikovala citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC).

[0036] U jednom aspektu, prikaz se takođe odnosi na citotoksičnu kompoziciju koja se sastoji iz bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula koji i) nije sposoban da se specifično veže za efektorsku ćeliju, i ii) specifično veže za ciljanu tumorsku ćeliju, pri čemu je specifično vezivanje mereno u in vitro FACS testu vezivanja ili in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom. U određenim slučajevima, prikaz se odnosi na citotoksičnu kompoziciju koja se sastoji iz bispecifičnog antigenvezujućeg molekula koji ne ispoljava detektabilno vezivanje za efektorsku ćeliju, i koji se specifično veže za ciljnu tumorsku ćeliju sa merljivim afinitetom vezivanja, pri čemu je vrednost merena u in vitro FACS testu vezivanja ili in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom.

[0037] U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje citotoksičnu kompoziciju koja se sastoji iz bispecifičnog antitela iz pronalaska. Bispecifično antitelo se može sastojati iz i) prvog fragmenta koji se vezuje za antigen (Fab1) koji ne ispoljava detektabilno vezivanje sa CD3, i ii) drugog fragmenta koji se vezuje za antigen (Fab2) koji se specifično veže za ciljnu tumorsku ćeliju sa merljivim afinitetom vezivanja, pri čemu je vrednost afiniteta vezivanja kao što je izmerena u in vitro FACS testu vezivanja ili na in vitro testu vezivanja površinske plazmonske rezonancije. U nekim slučajevima, afinitet vezivanja je monovalentni afinitet vezivanja (npr., u konstruktu bispecifičnog antitela).

[0038] U drugom slučaju, prikaz se odnosi na citotoksičnu kompoziciju koja se sastoji iz bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji se specifično vezuje efektorsku ćeliju sa slabim afinitetom vezivanja, na primer ispoljava EC50vrednost od oko ili veću od oko 100 nM, i koje se specifično vezuje za ciljnu tumorsku ćeliju sa merljivom EC50vrednosti, ili visoko afinitetnom EC50vrednosti kao što je manje od 50 nM, pri čemu EC50vrednost afiniteta vezivanja je izmerena u in vitro FACS testu vezivanja. U određenim slučajevima, prikaz se odnosi na citotoksičnu kompoziciju koja se sastoji iz bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula koji se specifično vezuje za efektorsku ćeliju sa EC50vrednosti koja je veća od oko 500 nM, i koje se specifično veže za ciljnu tumorsku ćeliju sa merljivom EC50vrednosti, ili visoko afinitetnom EC50vrednosti kao što je manja od 50 nM, pri čemu je EC50vrednost afiniteta vezivanja izmerena u in vitro FACS testu vezivanja.

[0039] U nekim primerima, bispecifičan antigen-vezujući molekul uključuje Fab1 koji se specifično vezuje za humani CD3 sa EC50vrednosti većom od oko 40 nM, ili većom od oko 100 nM, većom od oko 200 nM, većom od oko 300 nM, većom od oko 400 nM, većom od oko 500 nM, ili većom od oko 1 µM (npr. u kontekstu monovalentnog vezivanja). U nekim slučajevima, bispecifični antigen-vezujući molekul uključuje Fab2 koji je izveden iz drugog antitela koje se specifično vezuje za ciljnu ćeliju tumora sa visokim afinitetom, npr. EC50vrednost manja od manja od oko 50 nM, manja od oko 40 nM, manja od oko 20 nM, manja od oko 10 nM ili manja od oko 6 nM (npr., u kontekstu monovalentnog vezivanaj). U nekim slučajevima, Fab1 specifično se vezuje za svaki od humanog CD3 i CD3 cinomolgusa sa EC50vrednosti većom od oko 40 nM, ili većom od oko 100 nM, većom od oko 200 nM, ili većom od oko 1 µM. U nekim slučajevima, Fab1 specifično se vezuje za svaki od humanog CD3 i CD3 cinomolgusa sa slabim ili bez merljivog afiniteta.

[0040] U nekim slučajevima, ciljna ćelija tumora je humana ćelija tumora. U nekim slučajevima, Fab1 (ili antigen-vezujući molekul) indukuje ubijanje ćelija tumora koje je posredovano sa T ćelijom sa EC50vrednosti manjom od oko 1.3 nM, kao što je izmereno u in vitro testu ubijanja ćelija tumora posredovano sa T ćelijama.

[0041] U nekim primenama, Fab1 ili bispecifični antigen-vezujući molekul specifično vezuje humani sa KDvrednosti većom od oko 11 nM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom. U drugim slučajevima, Fab1 ili bispecifični antigen-vezujući molekul specifično vezuje svaki od humanog CD3 i CD3 cinomolgusa sa KDvrednosti većom od oko 15 nM, ili većom od oko 30 nM, većom od oko 60 nM, većom od oko 120 nM, ili većom od oko 300 nM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom. U još nekim drugim primenama, Fab1 ili bispecifični antigen-vezujući molekul i) ne ispoljava detektabilno vezivanje za human CD3 kao što je mereno u svakom od in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom i FACS testu vezivanja, i ii) indukuje ubijanje tumora posredovano sa T ćelijama, kao što je mereno u in vitro testuubijanja ćelije tumora posredovanom sa T ćelijama.

[0042] U nekim primenama, bispecifični antigen-vezujući molekul sastoji se iz prvog teškog lanca koji se sastoji iz HCDR1 regiona koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 12 ili 20. U nekim slučajevima, prvi teški lanac sastoji se iz HCDR2 regiona koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 14 ili 54. U drugim slučajevima, prvi teški lanac sastoji se iz HCDR3 regiona koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 144, ili SEQ ID NO: 152. U drugim primenama, prvi teški lanac sastoji se iz HCVR koji se sastoji iz HCDR1-HCDR2-HCDR3 koji ima aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NOs: 178-179-180. U drugim slučajevima, prvi teški lanac sastoji se iz CDR1 koji se sastoji iz aminokiselinskih ostataka 1-7 prema SEQ ID NO:178, CDR2 koji se sastoji iz aminokiselinskih ostataka 1-7 prema SEQ ID NO:179, CDR3 koji se sastoji iz aminokiselinskih ostataka 4-11 prema SEQ ID NO:180.

[0043] U više slučaja, prvi teški lanaca sastoji se iz regiona okvira varijabilnog regiona koji imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od FR1 (SEQ ID NO: 174), FR2 (SEQ ID NO: 175), FR3 (SEQ ID NO: 176), i FR4 (SEQ ID NO: 177).

[0044] Predmetni prikaz se takođe odnosi na bispecifične antigen-vezujuće molekule koji se sastoje iz Fab1 HCVR i LCVR aminokiselinskog para sekvence (HCVR/LCVR) izbranog iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NOs: 10/162; 18/162; 26/162; 34/162; 42/162; 50/162; 58/162; 66/162; 74/162; 82/162; 90/162; 98/162; 106/162; 114/162; 122/162; 130/162; 138/162; 146/162.

[0045] Antitela, i fragmenti koji vezuju antigen i njihova bispecifična antitela su postupno dobijena zamenom, supstitucijom aminokiselinskih ostataka u parentalnom zasnovano na razlikama između germinativne sekvence i sekvence parentalnog antitela. Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupak za dobijanje citotoksične kompozicije koja se sastoji iz (a) identifikovanja aminokiselinske sekvence prvog teškog lanca koja je izvedena iz prvog antitela koje specifično veže CD3 sa visokim afinitetom, na primer ispoljava vrednost EC50afiniteta vezivanja koja je manja od oko 40 nM, (b) modifikovanja izabranih aminokiselinskih ostataka varijabilnog regiona teškog lanca prvog antitela da bi se proizvelo modifikovano antitelo, (c) uparivanja modifikovanog antitela sa drugim teškim lancem dobijenim iz drugog antitela koje specifično veže ciljni tumorski antigen da bi se proizvelo bispecifično antitelo, (d) ispitivanja u afinitetnom testu vezivanja, i ukoliko afinitet vezivanja za CD3 ima EC50vrednost veću od oko 40 nM, ili vežu od 100 nM ili veću od 300 nM ili veću od 500 nM, ili nema detektabilnog vezivanja onda (e) dobijanje kompozicije koja se sastoji iz bispecifičnog antitela i farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača. Pored modifikovanja varijabilnog regiona teškog lanca izabranih antitela da bi se konstruisali antigen-vezujući kraci sa slabim ili bez afiniteta za, ipak specifično ciljanje efektorske ćelije, prikaz se ovde takođe odnosi na postupke za modifikovanje konstantnog regiona teškog lanca (npr. CH3 domen) svakog od kraka za vezivanje da bi se dobila i izolovala bispecifična antitela.

[0046] Primer postupka obezbeđuje postupak za dobijanje citotoksičnog bispecifičnog antitela, koji se sastoji iz: (a) identifikovanja prvog humanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen koji interaguje sa antigenom efektorske ćelije iz raznih vrsta; (b) identifikovanja germinativnih aminokiselinskih ostataka varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) humanog antitela; (c) upoređivanja aminokiselinske sekvence HCVR prvog humanog antitela sa aminokiselinskom sekvencom odgovarajuće germinativne HCVR; (d) identifikovanja aminokiselina unutar modifikovanog regiona HCVR prvog antitela, pri čemu modifikovani region u prvom antitelu ima bar jednu modifikaciju aminokiselina sa supstitucijom, delecijom ili dodavanjem jednog aminokiselinskog ostatka u poređenju sa istim regionom u germinativnoj HCVR; (e) proizvodnje mnoštva modifikovanih antitela pri čemu se svako sastoji iz bar jednog modifikovanog regiona HCVR; (f) skrininga svakog od mnoštva modifikovanih antitela za monovalentni afinitet prema antigenu efektorske ćelije; (g) selekcije tako modifikovanih antitela koja ispoljavaju slabiji afinitet vezivanja ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja za antigen efektorske ćelije u poređenju sa prvim antitelom; i (h) uparivanje odabranog prvog antitela sa drugim antitelom koje interaguje sa antigenom koji je u vezi sa tumorom da bi se proizvelo citotoksično bispecifično antitelo.

[0047] Prikaz se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji iz rekombinantnog humanog bispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koje specifično vezuje CD3 i farmaceutski prihvatljivog nosača. U povezanom slučaju, prikaz otkriva kompoziciju koja je kombinacija anti-CD3 antitela i drugog terapeutskog sredstva. U jednom slučaju, drugo terapeutsko sredstvo je bilo koje sredstvo koje je povoljno kombinovano sa anti-CD3 antitelom. Primeri sredstava koja se mogu povoljno kombinovati sa anti-CD3 antitelom uključuju, bez ograničenja, druga sredstva koja vezuju i/ili aktiviraju signalizaciju CD3 (uključujući druga antitela ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, itd.) i/ili sredstva koja se ne vezuju direktno za CD3 ali pored toga aktiviraju ili stimulišu aktivaciju imunih ćelija. Dodatne kombinovane terapije i ko-formulacije koje uključuju anti-CD3 antitela ovde su na drugom mestu otkrivena.

[0048] U još drugom aspektu, prikaz se odnosi na terapeutske postupke kojima se stimuliše aktivacija T ćelija korišćenjem anti-CD3 antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen antitela iz prikaza, pri čemu terapeutski postupci obuhvataju davanje terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja se sastoji iz bispecifičnog antitela iz prikaza, ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen, subjektu kome je to potrebno. Poremećaj koji se leči je bilo koja bolest ili stanje, koja je unapređena, ublažena, inhibirana ili sprečena pomoću citotoksične terapije koja je usmerena na antigen u vezi sa tumorom, kao što je kancer.

1

[0049] Prema drugom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na bispecifične antigen-vezujuće molekule koji vezuju CD3 i ciljni antigen, naročito antigen koji je povezan sa tumorom (TAA).

[0050] Predmetni prikaz takođe uključuje upotrebu anti-CD3/anti-TAA bispecifičnog antigenvezujućeg molekula iz prikaza u dobijanju leka za lečenje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ekspresijom TAA. Predmetni prikaz se takođe odnosi na upotrebu anti-CD3/anti-TAA bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula, koje ispoljava slab afinitet prema efektorskim ćelijama koje eksprimuju CD3 i smanjeni klirens, u dobijanju leka za lečenje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ili uzrokovan eksprimovanjem TAA, u poređenju sa anti-CD3/anti-TAA bispecifičnim antigen-vezujućim molekulom koji ispoljava visok afinitet prema efektorskim ćelijama koje eksprimuju CD3.

KRATAK OPIS NACRTA

[0051] Slika 1 prikazuje poravnanje sekvenci aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca antitela (HCVR) prema sledećem:

germinativna hlgHV (SEQ ID NO:181); CD3-VH-P (SEQ ID NO:154); CD3-VH-G (SEQ ID NO:2); CD3-VH-G2

(SEQ ID NO:10); CD3-VH-G3 (SEQ ID NO:18); CD3-VH-G4 (SEQ ID NO:26); CD3-VH-G5 (SEQ ID NO: 34); CD3-VHG8

(SEQ ID NO:42); CD3-VH-G9 (SEQ ID NO:50); CD3-VH-G10 (SEQ ID NO:58); CD3-VH-G11 (SEQ ID NO:66); CD3-VH-G12(SEQ ID NO:74); CD3-VH-G13 (SEQ ID NO:82); CD3-VH-G14(SEQ ID NO:90); CD3-VH-G15(SEQ ID NO:98);

CD3-VH-G16 (SEQ ID NO:106); CD3-VH-G17 (SEQ ID NO:114); CD3-VH-G18 (SEQ ID NO:122); CD3-VH-G19 (SEQ

ID NO:130); CD3-VH- G20 (SEQ ID NO:138); i CD3-VH-G21(SEQ ID NO:146). Svaka izvedena HCVR je upoređena sa parentalnim antitelom i germinativnim aminokiselinskim ostacima, sa pravougaonim okvirima koji označavaju mutacije u CDRs.

[0052] Slike 2A, 2B i 2C ilustruju srednje vrednosti koncentracija ukupnog IgG u serumu nakon pojedinačne 0.4 mg/kg intraperitonealne injekcije BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrole antitela izotipa u miševima divljeg tipa (WT) (Sl. 2A), humanizovanim CD3 miševima (Sl. 2B) u humanizovanim MUC16 x CD3 miševima (Sl.2C).

DETALJAN OPIS

[0053] Pre nego što se opiše predmetni prikaz, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke i opisane eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe treba razumeti da ovde korišćena terminologija je za svrhu opisivanja samo određenih izvođenja, i nije namenjena da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim zahtevima.

[0054] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kako obično razume prosečan stručnjak iz oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Kao što je ovde korišćen, izraz "oko," kada se koristi u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, označava da ta vrednost može varirati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kao što je ovde korišćen, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr., 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, itd.).

[0055] Iako bilo koji postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni sa onima koji su ovde opisani mogu se koristiti u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska, poželjni postupci i materijali su sada opisani.

Definicije

[0056] Izraz "CD3" odnosi se na antigen koji je eksprimovan na T ćelijama kao deo multicelularnog T ćelijskog receptora (TCR) i koji se sastoji iz homodimera ili heterodimera koji je obrazovan iz udruživanja dva od četiri lanca receptora: CD3-epsilon, CD3- delta, CD3-zeta, i CD3-gama. Humani CD3-epsilon (hCD3ε) sastoji je iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO:169 (UniProtKB/Swiss-Prot: P07766.2). Humani CD3-delta (hCD3δ) sastoji je iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO:170 (UniProtKB/Swiss-Prot: P04234.1). Sve ovde navedene reference na proteine, polipeptide i fragmente proteina su namenjene da se odnose na humanu verziju respektivnog proteina, polipeptid ili fragment proteina osim ukoliko nije eksplicitno definisano da je iz ne-humanih vrsta. Prema tome, izraz "CD3" označava humani CD3 osim ukoliko nije naznačeno da je iz ne-humanih vrsta, npr., "mišji CD3," "majmunski CD3," itd.

[0057] Fraza "antitelo koje se vezuje za CD3" ili "anti-CD3 antitelo" uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji specifično prepoznaju i udružuju se sa pojedinačnom CD3 podjedinicom (npr., epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji specifično prepoznaju i udružuju se sa dimernim kompleksom iz dve CD3 podjedinice (npr., epsilon/delta, epsilon/gama, i zeta/zeta CD3 dimeri). Antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu vezati u rastvoru CD3, vezani CD3 i/ili CD3 koji je eksprimiran na ćelijskoj površini. Rastvorljivi CD3 uključuje prirodne CD3 proteine kao i rekombinantne CD3 proteinske varijante kao što su, npr., monomer i dimeri CD3 konstrukata, kojima nedostaje transmembranski domen ili su na drugi način nepovezani sa ćelijskom membranom. Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja vezuju i aktiviraju humani i cinomolgus CD3 sa slabim ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja. "Vezivanje za CD3 bez detektabilnog afiniteta vezivanja" znači da interakcija antitela i ili njegovog fragmenta koji se veže za antigen sa CD3 metom možda neće biti merljiva ili detektabilna sa poznatim testom za detekciju, kao što je FACS (zasnovan na ćelijama) testu vezivanja kao što je ovde opisano ili testom vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom kao što je ovde opisano i dobro poznato u oblasti tehnike. Drugi testovi vezivanja su dobro poznati u oblasti tehnike. Antitelo i ili fragment koji veže antigen-može prepoznati CD3 metu veoma slabom protein-protein biohemijskom interakcijom, međutim određivanje specifične KDili EC50vrednosti ne može biti izmereno s obzirom na to da je interakcija iznad granice detekcije testa, npr. merenje se ne može odrediti. U drugom slučaju, "afinitet vezivanja koji se ne može detektovati" je određen ukoliko afinitet antitela koje odgovara vrednosti KDje jednak sa ili je manji od deset puta niže od onog za ne-specifični antigen kao što je, BSA, kazein, ili slično. "Vezivanje za CD3 sa slabim afinitetom vezivanja" uključuje interakcije u kojima merenje afiniteta vezivanja je na ili blago iznad granice detekcije testa, ili je ekvivalentan sa afinitetom vezivanja za ne-specifični antigen.

[0058] Izraz "CD3 eksprimovan na ćelijskoj površini" označava jedan ili više CD3 protein(a) koji je/su eksprimovani na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je bar deo CD3 proteina izložen vanćelijskoj strani ćelijske membrane I pristupačan je antigen-vezujućem delu antitela. " CD3 eksprimovan na ćelijskoj površini" uključuje proteine CD3 koji su obuhvaćeni kontekstom funkcionalnog T ćelijskog receptora u membrane ćelije. Ekpresija "CD3 eksprimovanog na ćelijskog površini" uključuje CD3 protein koji je eksprimovan kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije (npr., delta/epsilon, gama/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimeri). Izraz, "CD3 eksprimovan na površini ćelije" takođe uključuje CD3 lanac (npr., CD3-delta, CD3-epsilon ili CD3-gama) koji je sam eksprimiran, bez drugih tipova CD3 lanca, na površini ćelije. "CD3 eksprimovan na površini ćelije" može sadržati ili se sastojati iz CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno eksprimuje CD3 protein. Alternativno, "CD3 eksprimovan na površini ćelije" može sadržati ili se sastojati iz CD3 proteina koji je eksprimovan na površini ćelije koja normalno ne eksprimuje humani CD3 na njegovoj površini ali je veštački modifikovan da eksprimuje CD3 na svojoj površini.

[0059] Efektorske ćelije uključuju efektorske T ćelije (T limfocite), na primer CD4+ T ćelije, CD8+ T ćelije, Th1, Th2 i regulatorne T ćelije (Tregs). Efektorske ćelije mogu takođe uključiti prirodne ćelije ubice (NK), makrofage, granulocite, plazma ćelije ili B ćelije (limfocite). Razume se da terapije mogu posredovati brojnim ćelijski posredovanim imunim odgovorima, ili efektorskom funkcijama, kroz Ig interakciju sa receptorima površine efektorskih ćelija, kao što je CD3 (receptor na površini T ćelije), CD28 (T ćelije), Fcγ receptori (FcyRs) (NK ćelije, aktivirani makrofagi i slično). Efektorske funkcije kao što je ubijanje ćelija, aktivacija komplementa, fagocitoza i opsonizacija su naknadno pokrenuti preko ovih interakcija. Vezivanje za efektorsku ćeliju i ciljnu ćeliju tumora omogućava značajan i efikasan dizajn imunoterapije za promovisanje ubijanje tumorske ćelije i indukuje endogene imunogene funkcije za borbu protiv tumora ili kancera.

[0060] Izraz "anti-CD3 antitelo" uključuje i monovalentna antitela sa jednom specifičnosti, kao I bispecifična antitela koja se sastoje iz prvog kraka koji veže CD3 i drugog kraka koji veže drugi (ciljni) antigen, pri čemu se anti-CD3 krak sastoji iz bilo koje od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci kao što su predstavljene u Tabelama 2, 3, 4 i/ili 5 ovde. Primeri anti-CD3 bispecifični antitela ovde su na drugom mestu opisani. Izraz "antigen-vezujući molekul" uključuje antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen, uključujući, npr., bispecifična antitela.

[0061] Izraz "antitelo" uključuje bilo koji molekul koji se vezuj za antigen ili molekulski kompleks koji se sastoji iz bar jednog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji se specifično veže za ili interaguje sa određenim antigenom (npr., CD3). Izraz "antitelo" uključuje imunoglobulinske molekule koji se sastoje iz četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno vezana disulfidnim vezama, kao i njiovi multimeri (npr., IgM). Svaki teški lanac sastoji se iz varijabilnog regiona teškog (ovde skraćeno HCVR ili VH) I konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se iz tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se iz varijabilog regiona lakog lanca (ovde skraćeno LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji iz jednog domena (CL1). VH i VL regioni mogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, koji su nazvani regioni za određivanje komplementarnosti (CDRs), koji su rasuti između regiona koji su više sačuvani, poznati kao regioni okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji iz tri CDRs i četiri FRs, koji su uređeni od amino-kraja prema karboksi kraju u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim izvođenjima iz pronalaska, FRs iz anti-CD3 antitela (ili njegov deo koji vezuje antigen) može biti identičan sa humanim germinativnim sekvencama, ili može biti prirodno ili veštački modifikovan. Aminokiselinska konsenzusna sekvence može biti definisana na osnovu uporedne (eng. side by side) analize dva ili više CDRs.

[0062] Izraz "antitelo" takođe uključuje fragmente koji vezuju antigen punih molekula antitela. Izrazi "deo koji vezuje antigen" antitela, "antigen-vezujući fragment" antitela, i slično, kao što je ovde korišćen, uključuje bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se nalazi u prirodi, može se dobiti enzimski, sintetički, ili genetički modifikovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično vezuje za antigen da se obrazuje kompleks. Fragmenti koji vezuju antigen antitela mogu biti izvedeni, npr., iz punih molekula antitela korišćenjem bilo kojih standardnih postupaka kao što je proteolitička digestija ili postupci rekombinantnog genetičkog inženjeringa uključujući manipulaciju i ekspresiju DNK kodiranih varijabilnih i po potrebi konstantnih domena antitela. Takva DNK je poznata i/ili brzo je dostupna od npr., komercijalnih izvora, DNK bibliotetka (uključujući, npr., biblioteke faga-antitela), ili se može sintetisati. DNK se može sekvencirati i hemijski manipulisati ili korišćenjem molekularno bioloških

1

postupaka, na primer, da bi se preuredili jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u pogodnoj konfiguraciji, iil da bi se uveli kodoni, kreirali ostaci cisteina, modifikovale, dodale ili uklonile aminokiseline, itd.

[0063] Ne-ograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jedno-lančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje iz aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi modifikovani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela jednog domena, antitela sa uklonjenim domenom, himerna antitela, antitela sa prenetim CDR, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), smali modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i “shark” varijabilno IgNAR domeni, takođe su obuhvaćeni izrazom "antigen-vezujući fragment," kao što je ovde korišćen.

[0064] Antigen-vezujući fragment antitela obično će sadržati bar jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno će sadržati bar jedan CDR koji je susedni ili je u okviru sa jednom ili više sekvenci okvira. U fragmentima koji vezuju antigen koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti locirani jedan u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom preuređenju. Na primer, varijabilni region može biti dimerni i sadržati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji veže antigen može sadržati monomerni VHili VLdomen.

[0065] U određenim izvođenjima, fragment antitela koji veže antigen može sadržati bar jedan varijabilni domen kovalentno vezan sa bar jednim konstantnim domenom. Ne-ograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu naći unutar fragmenta antitela koji veže antigen iz predmetnog pronalaska. uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koji od primera gore navedenih konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno vezani jedan sa drugim ili mogu biti vezani sa punim ili delom regiona zgloba ili linkera. Region zgloba može se sastojati iz bar 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiseline koje dovode do fleksibilne ili polu-fleksibilne veze između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u pojedinačnom polipeptidnom molekulu. Osim toga, fragment antitela koji veže antigen iz predmetnog prikaza može sadržati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija variabilnih i konstantnih domena gore navedenih u nekovalentnoj vezi jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernim VHili VLdomenom (npr., disulfidnom vezom(ama)).

[0066] Kao sa punim molekulima antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični antigen-vezujući fragment antitela će obično sadržati bar dva različita varijabilna domena, gde je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni različiti antigen ili za različiti epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uključujući ovde prikazan primer formata bispecifičnih antitela, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji veže antigen iz predmetnog pronalaska korišćenjem rutinskih postupaka koji su dostupni iz oblasti tehnike.

[0067] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu funkcionisati preko citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC) ili ćelijski posredovane citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC). "Citotoksičnost koja zavisi od komplementa" (CDC) odnosi se na lizu ćelija koje eksprimuju antigen sa antitelom iz pronalaska u prisustvu komplementa. "Ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela" (ADCC) odnosi se na reakciju koja je posredovana ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimuju Fc receptore (FcRs) (npr., prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i time dovode do lize ciljne ćelije. CDC i ADCC mogu biti izmereni korišćenjem testova koji su dobro poznati i dostupni u oblasti tehnike. (Videti, npr., U.S. Patent br 5,500,362 i 5,821,337, i Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i da posreduje u citotoksičnosti koja zavisi od ćelije. Prema tome, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje citotoksičnosti.

[0068] U određenim slučajevima iz prikaza, anti-CD3 antitela (monospecifična ili bispecifična) su humana antitela. Izraz "humano antitelo", kao što je ovde korišćen, namenjen je da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela iz pronalaska mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije koje su uvedene slučajnom ili mutagenezom koja je specifična za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDRs i naročito CDR3. Međutim, Izraz "humano antitelo", kao što je ovde korišćen, nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih drugih sisarskih vrsta, kao što je miš, koje su prenete u sekvence humanog regiona okvira.

[0069] Izraz "rekombinantno humano antitelo" je namenjen da uključi sva humana antitela koja su dobijena, eksprimovana, kreirana ili izolovana rekombinantnim postupcima, kao što su antitela koja su eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora koji je transfektovan u ćeliju domaćina (ovde opisano dalje u tekstu), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (ovde opisano dalje u tekstu), antitela koja su izolovana iz životinje (npr., miša) koji je transgeni za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res.

20:6287-6295) ili antitela koja su dobijena, eksprimovana, kreirana ili izolovana pomoću drugih sredstava koja uključuju spajanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim sekvencama DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstante regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. U određenim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada je korišćena životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i prema tome, aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, kada su izvede iz ili povezane sa humanim germinativnim VHi VLsekvencama, ne postoje nužno prirodno u humanom germinativnom (zametnom) repertoaru antitela in vivo.

[0070] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koja su vezana sa heterogenosti zglobnog regiona. U jednom obliku, imunoglobulinski molekul sadrži stabilni konstrukt od četiri lanca od približno 150-160 kDa u kome se dimeri drže zajedno sa međulančanom disulfidnom vezom teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani sa međulančanim disulfidnim vezama i molekul oko 75-80 kDa je obrazovan koji se sastoji iz kovalentno spojenog lakog i teškog lanca (poluantitelo). Ove oblike je bilo jako teško razdvojiti, čak i posle afinitetnog prečišćavanja.

[0071] Učestalost pojavljivanja drugog oblika u raznim intaktnim IgG izotipovima je zbog, ali nije ograničeno na, strukturalne razlike koje su povezane sa zglobnim regionom izotipa antitela. Pojedinačna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu humanog IgG4 zgloba može značajno smanjiti prisustvo drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji su obično zapaženi korišćenjem humanog IgG1 zgloba. Ovaj pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu koji može biti poželjan, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

1

[0072] Antitela iz pronalaska mogu biti izolovana antitela. "Izolovano antitelo," kao što je ovde korišćeno, označava antitelo koje je identifikovano i razdvojeno i/ili dobijeno iz bar jedne komponente njegovog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je razdvojeno ili uklonjeno iz bar jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojima antitelo prirodno postoji ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo" za svrhe predmetnog pronalaska. Izolovano antitelo takođe uključuje antitelo in situ u rekombinantnoj ćeliji. Izolovana antitela su antitela koja su podvrgnuta bar jednom koraku prečišćavanja ili izolovanja. Prema određenim izvođenjima, izolovano antitelo može biti u suštini slobodno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0073] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela sa jednim krakom (eng. “one-arm”) koja vezuju CD3. Fraza "antitelo sa jednim krakom" označava molekul koji vezuje antigen koji sadrži jedan težak lanac antitela i jedan laki lanac antitela. Antitela sa jednim krakom iz predmetnog prikaza mogu sadržati koju od+ HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 2.

[0074] Izraz "epitop" odnosi se na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom koje vezuje antigen u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezati za različite površine na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop je dobijen prostornim bliskim pozicioniranjem aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji je proizveden susednim aminokiselinkim ostacima u polipeptidnom lancu. U određenom slučaju, epitop može uključiti ostatke saharida, fosforil grupa, ili sulfonil grupa antigena.

[0075] Izraz "u suštini identičan" ili "suštinski identičan," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnan sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nuklelinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost u nukleotidnoj sekvenci u bar oko 95%, i poželjnije bar oko 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, kao što je mereno sa bilo kojim poznatim algoritmom za identitet sekvenci, kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kao što je razmotreno dole u tekstu. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski identičan sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u određenim slučajevima, kodirati polipeptid sa istom ili suštinski sličnom aminokiselinskom sekvencom kao polipeptid koji je kodiran sa referentnim molekulom nukleinske kiseline.

[0076] Kao što je primenjeno na polipeptide, izraz "u suštini sličan" ili "sušinski sličan" označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnane, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane “gap weights”, dele bar 95% identičnost u sekvenci, još poželjnije bar 98% ili 99% identičnost u sekvenci. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim karakteristikama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima u kojima dve ili više aminokiselinskih sekvenci se razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti u sekvenci ili stepen sličnosti može se podesiti naviše da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo prilagođavanje su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim karakteristikama uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; (6) kisele bočne lance:

1

aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alaninvalin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena sa pozitivnom vrednosti u PAM250 log-matriksu verovatnoće prikazanom u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log-matriksu verovatnoće.

[0077] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je takođe naznačena sa identičnost u sekvenci, je obično merena korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence upotrebom merenja sličnosti koja je dodeljena različitim supstiucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima da bi se odredila homologija sekvenci ili identičnost sekvenci između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti korišćenjem FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG Verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti u sekvenci regiona sa najboljim poklapanjem između sekvenci upita i sekvenci pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se porede sekvence iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Germinativne (zametne) mutacije

[0078] Ovde prikazana anti-CD3 antitela sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u regionu okvira i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz antitela od kojih su dobijeni.

[0079] Predmetni prikaz se takođe odnosi na antitela, i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji su izvedeni iz bilo kojh od ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih sekvenci unutar jednog ili više regiona okvira i/ili CDR regiona su mutirane u odgovarajući ostatak(ke) germinativne sekvence iz koje je antitelo dobijeno, ili do odgovarajućeg ostatka (a) druge humane germinativne sekvence, ili do konzervativne aminokiselinske supstitucije odgovarajućih germinativnih ostat(a)ka (takve promene sekvence ovde su kolektivno naznačene sa "germinativne mutacije"), i imaju slabo ili bez detektabilnog vezivanja za CD3 antigen. Nekoliko primera takvih antitela koja prepoznaju CD3 ovde su opisana u Tabeli 2.

[0080] Osim toga, antitela iz predmetnog prikaza mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar regiona okvira i/ili CDR regiona, npr., pri čemu su određeni individualni ostaci mutirani do odgovarajućeg ostatka određene germinativne sekvence dok određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence su održavani ili mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom kada se dobiju, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen koji sadrži jednu ili više germinativnih mutacija mogu biti ispitani za jedno ili više željenih svojstava kao što su, unapređena specifičnost vezivanja, slab ili smanjen afinitet vezivanja, unapređena ili poboljšana farmakokinetička svojstva, smanjena imunogenost, itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen, mogu se dobiti na ovaj opšti način s obzirom na smernice iz ovog predmetnog pronalaska.

[0081] Predmetni prikaz se takođe odnosi na anti-CD3 antitela koja sadrže varijante bilo kojih od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prikazane sa jednom ili više konzervativnih

1

supstitucija. Na primer, predmetni prikaz uključuje anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde predstavljene u Tabeli 2. Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz predmetnog prikaza sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u regionu okvira i/ili CDR regionima varijabilim domenima teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su dobijeni individualni domeni koji vezuju antigen, dok se održavaju ili unapređuju željeno slabo-do-bez detektabilno vezivanje za CD3 antigen. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona gde je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa istim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanjem ili hidrofobnosti). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva proteina, tj. supstitucija aminokiselina održava ili unapređuje željeni slab do bez detektabilnog afiniteta vezivanja u slučaju molekula koji se vezuju za anti-CD3. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alaninvalin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena sa pozitivnom vrednosti u PAM250 log-matriksu verovatnoće prikazanom u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log-matriksu verovatnoće.

[0082] Predmetni prikaz se takođe odnosi na molekuli koji vezuju antigenkoji se sastoji iz domena koji vezuje antigen sa HCVR i/ili CDR aminokiselinskom sekvencom koja je u suštini identična sa bilo kojom od HCVR i/ili CDR aminokiselinkih sekvenci koje su ovde prikazane, dok se održava ili unapređuje željeni slab afinitet prema CD3 antigenu. Izraz "u suštini identičan" ili "suštinski identičan," kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu znači da dve aminokiselinske sekvence, kada su optimalno poravnate, na primer programima GAP ili BESTFIT korišćenjem podrazumevanih “gap weights”, dele bar 95% identičnost u sekvenci, još poželjnije bar 98% ili 99% identičnost u sekvenci. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. U slučajevima u kojima se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge sa konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti u sekvenci ili stepen sličnosti može biti prilagođen naviše da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo prilagođavanje su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.

[0083] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je takođe naznačena sa identičnost u sekvenci, je obično merena korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence upotrebom merenja sličnosti koja je dodeljena različitim supstiucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima da bi se odredila homologija sekvenci ili identičnost sekvenci između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti korišćenjem FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG Verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti u sekvenci regiona sa najboljim poklapanjem između sekvenci upita i sekvenci pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni

1

algoritam kada se porede sekvence iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

[0084] Jednom kada se dobiju, domeni koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija ispitani su za smanjeni afinitet vezivanja korišćenjem jednog ili više in vitro testova. Iako antitela koja prepoznaju određeni antigen su obično pretražena za njihovu svrhu ispitivanjem za visok (tj. jak) afinitet vezivanja prema antigenu, antitela iz predmetnog pronalaska ispoljavaju slabo vezivanje ili nema detektabilnog vezivanja. Pronađeno je da su bispecifične molekuli koji vezuju antigen sadrže jedan ili više domena za vezivanje antigena koji su dobijeni na ovaj opšti način u prednosti kao terapije tumora vođene aviditetom.

[0085] Neočekivani benefiti, na primer, unapređena farmakokinetička svojstva i niska toksičnost prema pacijentu mogu se realizovati iz ovde prikazanih postupaka.

Svojstva vezivanja antitela

[0086] Kao što je ovde korišćen, izraz "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela, imunoglobulina, fragmenta antitela za vezivanje, ili protein koji sadrži Fc na bilo koji, npr., prethodno određeni antigen, kao što je ćelijski površinski protein ili njegov fragment, obično se odnosi na interakciju ili vezu između minimum dva entiteta ili molekularnih stuktura, kao što je interakcija antitelo-antigen.

[0087] Na primer, afinitet vezivanja obično odgovara KDvrednosti oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje kada je određeno sa, na primer, tehnologija površinske plazmon rezonancije (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu korišćenjem antigena kao liganda i antitela, Ig, fragmenta koji vezuje antigen, ili proteina koji sadrži Fc protein kao analit (ili antiligand). Strategije vezivanja zasnovan na ćelijama, kao što su testovi vezivanja zasnovani na sortiranju fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS), koji su rutinski korišćeni, i FACS podaci su u korelaciji sa drugim postupcima kao što je kompetitivno vezivanje radioliganda i SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods.2005, 302(1-2):68-77).

[0088] Prema tome, antitelo ili protein koji vezuje antigen iz prikaza može se vezati za prethodno određeni antigen ili molekul na ćelijskoj površini (receptor kao što je CD3) koji ima afinitet koji odgovara KDvredosti koja je bar deset puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje sa ne-specifičnim antigenom (npr., BSA, kazeinom). Prema predmetnom prikazu, ukoliko afinitet antitela koji odgovara KDvrednosti je jednak sa ili manji od dest puta niži od ne-specifičnog antigena, ovo se može smatrati ne-detektabilnim vezivanjem, međutim takvo antitelo može biti upareno sa drugim krakom koji vezuje antigen za proizvodnju bispecifičnog antitela iz prikaza.

[0089] Izraz "KD" (M) odnosi se na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antiteloantigen, ili konstantu ravnoteže disocijacije vezivanja antitela ili fragmenta antitela koji vezuje sa antigenom. Postoji inverzna veza između KDi afiniteta vezivanja, prema tome što je manja vrednost KD, veći je, tj. jači, afinitet. Prema tome, termini "veći afinitet" ili "jači afinitet" odnose se na veću sposobnost obrazovanja interakcije i prema tome manju KDvrednost, i obrnuto termini "niži afinitet" ili "slabiji afinitet" odnose se na manju sposobnost da se obrazuje interakcija i prema tome veću KDvrednost. U nekim slučajevima, veći afinitet vezivanja (ili KD) određenog molekula (npr. antitela) prema njegovom inaktivnom molekulu partneru (npr. antigenu X) u poređenju sa afinitetom vezivanja za molekul (npr. antitelo) sa drugim inaktivnim partner molekulom (npr. antigenom Y) može biti eksprimiran kao odnos vezivanja određen sa deljenjem veće KDvrednosti (niži, ili slabiji, afinitet) sa manjom KD(veći, ili jači, afinitet), na primer eksprimiran kao 5-puta ili 10-puta veći afinitet vezivanja,

1

kao što može biti slučaj. Na primer, "nizak afinitet" odnosi se na manje snažnu interakciju vezivanja. U nekim izvođenjima, niži afinitet vezivanja odgovara većem od oko 1nM KD, većem od oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, ili većem od oko 40 nM KD, pri čemu svaka KDvrednost afiniteta vezivanja merena je u in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom, ili ekvivalentnim “sensing” testom za biomolekulske interakcije. U nekim izvođenjima, nizak afinitet vezivanja odgovara većem od oko 10nM EC50, većem od oko 15 nM EC50, 20nM EC50, većem od oko 25 nM EC50, 30nM EC50, većem od oko 35 nM EC50, ili većem od oko 40 nM EC50, pri čemu takva vrednost EC50afiniteta vezivanja je merena u in vitro FACS testu vezivanja, ili ekvivalentnom ćelijski zasnovanom testu vezivanja. "Slab afinitet" odnosi se na slabu interakciju vezivanja. U nekim izvođenjima, slab afinitet vezivanja odgovara većem od oko 100 nM KDili EC50, većem od oko 200, 300, ili većem od oko 500 nM KDili EC50, pri čemu takva KDvrednost afiniteta vezivanja je merena u in vitro testu vezivanja površinskom plazmon rezonancom, ili ekvivalentnim “sensing” testom biomolekulske interakcije, i takva EC50vrednost afiniteta vezivanja je izmerena u in vitro FACS testu vezivanja, ili ekvivalentnom testu za detekciju interacije zasnovane na ćeliji da se detektuje monovalentno vezivanje. Bez detektabilnog vezivanja označava da afinitet između dva biomolekula, na primer, posebno između monovalentnog kraka antitela za vezivanje i njegovog ciljnog antigena, je izvan granice detekcije testa koji se koristi.

[0090] Izraz "kd" (sec -1 ili 1/s) odnosi se na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antiteloantigen, ili konstantu brzine disocijacije antitela ili fragmenta antitela koji vezuje antigen. Pomenuta vrednost je takođe naznačena kao koffvrednost.

[0091] Izraz "ka" (M-1 x sec-1 ili 1/M) odnosi se na brzinu konstante vezivanja određene interakcije antitelo-antigen, ili konstantu brzine vezivanja antitela ili fragmenta antitela za vezivanje.

[0092] Izraz "KA" (M-1 ili 1/M) odnosi se na ravnotežnu konstantu vezivanja određene interakcije antitelo-antigen, ili ravnotežnu konstantu vezivanja antitela ili fragmenta antitela za vezivanje. Ravnotežna konstanta vezivanja je dobijena deljenjem kasa kd.

[0093] Izraz "EC50" ili "EC50" odnosi se na polovinu maksimalne efektivne koncentracije, koja uključuje koncentraciju antitela koja obuhvata odgovor antitela na polovini između osnovnog nivoa i maksimuma nakon određenog vremena izlaganja. EC50u sušini predstavlja koncentraciju antitela u kojoj je uočeno 50% od njenog maksimalnog efekta. U određenim izvođenjima, EC50vrednost jednaka je koncentraciji antitela iz pronalaska koja daje polovinu maksimalnog vezivanja za ćelije koje eksprimuju CD3 ili antigen koji je povezan sa tumorom, kao što je određeno npr. FACS testom vezivanja. Prema tome, smanjeno ili slabije vezivanje je uočeno sa povećanjem EC50vrednosti, ili polovinom maksimalne vrednosti efektivne koncentracije tako da 500 nM EC50je indicator slabijeg afiniteta vezivanja u odnosu na 50 nM EC50.

[0094] U jednom izvođenju, smanjeno vezivanje se može definisati kao povećana EC50koncentracija antitela koja omogućava vezivanje sa polovinom maksimalne količine ciljnih ćelija.

[0095] U drugim eksperimentalnim merenjima, EC50vrednost predstavlja koncentraciju antitela iz pronalaska koja pokreće polovinu-maksimalne deplecije (iscrpljivanja) ciljanih ćelija sa T ćelijskom citotoksičnom aktivnosti. Prema tome, povećana citotoksična aktivnost (npr. T ćelijski posredovano ubijanje tumorske ćelije) je uočeno sa smanjenom EC50, ili polovinom maksimalne efektivne vrednosti koncentracije.

2

Bispecifični molekuli koji vezuju antigen

[0096] Antitela iz predmetnog pronalaska su bi-specifična. Multispecifična antitela mogu biti specifiča za jedan efektorski molekul, kao što CD3, u kombinaciji sa različitim epitopima jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati domene koji vezuju antigen koji su specifični za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt et al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.

22:238-244. Anti-CD3 antitela iz predmetnog prikaza mogu biti spojena sa ili istovremeno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr., hemijskim spajanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili drugačije) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bi-specifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnosti vezivanja.

[0097] Upotreba izraza "anti-CD3 antitela" ovde je namenjena da uključi i monospecifična anti-CD3 antitela kao i bispecifična antitela koja se sastoje iz CD3-vezujućeg kraka i drugog kraka koji vezuje ciljni antigen. Prema tome, predmetni prikaz uključuje bispecifična antitela pri čemu jedan kraj imunoglobulina veže humani CD3, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za ciljni antigen. Ciljni antigen kojeg vezuje drugi krak CD3 bispecifičnog antitela može biti bilo koji antigen koji je eksprimiran na ili u blizini ćelije, tkiva, organa, mikroorganizma ili virusa, protiv kojeg je poželjan ciljni imuni odgovor. Krak za vezivanje CD3 može sadržati bilo koju od HCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci kao što je ovde predstavljeno u Tabeli 2. U određenim izvođenjima, krak koji vezuje CD3 slabo se vezuje za humani CD3 i indukuje aktivaciju humanih T ćelija. U drugim izvođenjima, krak koji vezuje CD3 vezuje se slabo za humani CD3 i indukuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen u kontekstu bispecifičnog ili multispecifičnog antitela. U drugim izvođenjima, krak koji vezuje CD3 vezuje se za ili slabo asocira sa humanim i cinomolgus (majmunskim) CD3, ali interakcija vezivanja nije detektabilna sa in vitro testovima koji su poznati u oblasti tehnike. U nekim izvođenjima iz pronalaska, krak koji vezuje CD3 ne vezuje ili ne asocira sa with humanim i cinomolgus (majmunskim) CD3, ali bispecifični molekul i dalje pokreće ubijanje ćelija koje su povezane sa tumorom.

[0098] U kontekstu bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska gde jedan krak antitela vezuje CD3 i drugi krak vezuje ciljni antigen, ciljni antigen može biti antigen povezan sa tumorom (TAA). Neograničavajući primeri specifičnih antigena koji su povezani sa tumorom uključuju, npr., AFP, ALK, BAGE proteine, BIRC5 (survivin), BIRC7, β-katenin, brcabl, BRCA1, BORIS, CA9, karbonsku anhidrazu IX, kaspazu-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, cyclin-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE proteine (npr., GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipikan-3, GM3, gp100, Her2, HLA/Braf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE proteine (npr., MAGE-1, -2, -3, -4, -6, i -12), MART-1, mezotelin, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NYESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteine, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Thompsonnouvelle antigen (Tn), TRP- 1, TRP-2, tirozinazu, i uroplakin-3.

[0099] Pronalazači predviđaju da predmetni pronalazak obuhvata brojne primere bispecifičnih antitela koji imaju slab anti-CD3 vezujući kraj koji je dobijen u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0100] Prema određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje bispecifične antigenvezujuće molekule koji specifično vezuju CD3 i PSMA. Takvi molekuli ovde mogu biti naznačeni kao, npr., "anti-CD3/anti-PSMA," ili "anti-CD3xPSMA" ili "CD3xPSMA" bispecifični molekuli, i tako dalje.

Izraz "PSMA," kao što je ovde korišćen, odnosi se na humani PSMA protein osim ukoliko nije naznačeno da je iz ne-humanih vrsta (npr., "mišji PSMA," "majmunski PSMA," itd.).

[0101] Izraz "PSMA" odnosi se na membranski antigen specifičan za prostatu, takođe poznat pod imenom folatna hidrolaza 1 (FOLH1) (UniProtKB/Swiss-Prot. No. Q04609; SEQ ID NO: 171). PSMA je integralni, “non-shed” membranski glikoprotein koji je visoko eksprimiran u epitelnim ćelijama prostate i ćelijski površinski marker je za kancer prostate.

[0102] Prema drugim primerima iz izvođenja, predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji specifično vezuju CD3 i EGFRvIII. Takvi molekuli ovde mogu biti naznačeni sa, npr., "anti-CD3/anti-EGFRvlll" ili "anti-CD3x EGFRvlll" ili "CD3x EGFRvlll" bispecifični molekuli, i tome slično. Izraz "EGFRvlll" odnosi se na humani EGFRvIII protein osim ukoliko nije naznačeno da je iz nehumanih vrsta (npr., "mišji EGFRvlll," "majmunski EGFRvlll," itd.).

[0103] Izraz "EGFRvlll" odnosi se na klasu III varijante receptora epidermalnog faktora rasta (EGFRvlll; SEQ ID NO: 172) koja je najčešće zastupljena varijanta EGFR u glioblastomu (Bigner et al., 1990, Cancer Res 50:8017-8022; Humphrey et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:4207-4211; Yamazaki et al., 1990, Jap J Cancer Res 81:773-779; Ekstrand et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4309-4313; Wikstrand et al., 1995, Cancer Res 55:3140-3148; i Frederick et al., 2000, Cancer Res 60:1383-1387). EGFRvIII se karakteriše delecijom egzona 2-7 gena koji kodira za EGFR, dovodeći do delecije “u okviru” 801 baznih parova kodirajućeg regina, tj., delecije 6-273 aminokiselinskih ostataka (zasnovano na brojevima ostataka zrelog EGFR; videti UniProtKB/Swiss-Prot. No. P00533), kao i generisanja novog glicina na vezi spajanja (Humphrey et al., 1988, Cancer Res 48:2231-2238; Yamazaki et al., 1990, supra). Pokazano je da EGFRvIII ima nezavisnu od liganda, slabu ali konstitutivno aktivnu aktivnost kinaze kao i pojačanu tumorigenost (Nishikawa et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:7727-7731; I Batra et al., 1995, Cell Growth and Differentiation 6:1251-1259). Pored glioma, EGFRvIII je detektovan kod duktalnog i intraduktalnog karcinoma dojke (Wikstrand et al., 1995, Cancer Res 55:3140-3148), karcinoma nemalih ćelija pluća (Garcia de Palazzo et al., 1993, Cancer Res 53:3217-3220), karcinoma jajnika (Moscatello et al., 1995, Cancer Res 55:5536-5539), kancera prostate (Olapade-Olaopa et al., 2000, British J Cancer 82:186-194), i karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (Tinhofer et al., 2011, Clin Cancer Res 17(15):5197-5204).

[0104] U još drugim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji specifično vežu CD3 i MUC16. Takvi molekuli mogu ovde biti naznačeni sa, npr., "anti-CD3/anti-MUC16" ili "anti-CD3x MUC16" ili "CD3xMUC16" bispecifični molekuli, i tako dalje. Izraz "MUC16" odnosi se na humani MUC16 protein osim ukoliko nije naznačeno da je iz ne-humanih vrsta (npr., "mišji MUC16," "majmunski MUC16," itd.).

[0105] Mucin 16 (MUC16; NCBI Referentna Sekvenca: NP_078966.2, SEQ ID NO: 173), drugačije poznat kao antigen 125 kancera (CA-125), je mucin kodiran od strane MUC16 gena kod humanih bića. Poznato je da familija proteina mucina pruža zaštitu telu od patogenih infekcija vezivanjem za oligosaharide u vanćelijskom domenu, time sprečavajući da patogen dostigne ćelijsku površinu. Tokom mnogih godina, prekomerna ekpresija MUC16/CA125 je korišćena kao prognostički i dijagnostički marker za kancer jajnika (Yin and Lloyd, 2001, J. Biol. Chem. 276 (29), 27371-27375; O’Brien, TJ, et al, 2001, Tumour Biol. 22 (6), 348-366; Leggieri, C. et al., 2014, Eur. J. Gynaecol. Oncol. 35 (4), 438-441). Pokazano je da MUC16 šiti ćelije tumora od imunog sistema sa njegovim teško glikozilovanim tandemski ponovljenim domenom koji se može vezati za galektin-1 (imunosupresivni protein) (Seelenmeyer, C., et al., 2003, J. Cell. Sci.116 (Pt 7): 1305-18; O’Brien, TJ, et al., 2002, Tumour Biol.23 (3), 154-169). Prirodne ćelije ubice i monociti nisu sposobne da napadnu ćelije tumora koje eksprimuju visoke nivoe MUC16. U svojoj normalnoj fiziološkoj ulozi, interakcija MUC16-galaktin služi kao barijera za bakterijsku i virusnu infekciju, međutim, veruje se da je MUC16 imunoprotektivan u kontekstu ćelija tumora, na taj način sprečavajući citolizu ćelija kancera (Felder, M. et al., 2014, Molecular Cancer, 13:129). Prema tome, MUC16 je poželjna meta za imunoterapeutske bispecifične molekule antitela koji se primenjuju za lečenje kancera jajnika aktiviranjem imunih efektorskih ćelija.

[0106] U još drugim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje bispecifične antigenvezujuće molekule koji specifično vezuju CD3 i STEAP2. Takvi molekuli ovde mogu biti naznačeni kao, npr., "anti-CD3/anti-STEAP2" ili "anti-CD3xSTEAP2" ili "CD3xSTEAP2" bispecifični molekuli, i tako dalje. Izraz "STEAP2" odnosi se na humani STEAP2 protein osim ukoliko nije naznačeno da je iz ne-humanih vrsta (npr., "mišji STEAP2," STEAP2 majmuna," itd.). Šest transmembranski epitelni antigen prostate 2 (STEAP2; UniProtKB/Swiss-Prot: Q8NFT2.3) je protein dužine 490-aminokiselina kodiran STEAP2 genom koji je lociran na hromozomalnom regionu 7q21 kod humanih bića.

[0107] Prethodno pomenuti bispecifični antigen-vezujući molekuli koji specifično vezuju tumorpovezani antigen sadrži anti-CD3 antigen-vezujući molekul koji se vezuje za CD3 sa slabim ili bez detektabilnim afinitetom vezivanja ispoljavajući KDveću od oko 100 nM, 300 nM ili 500 nM, kao što je mereno sa in vitro afinitetnim testom vezivanja.

[0108] Kao što je ovde korišćen, izraz "antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži ili se sastoji iz bar jednog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDRs i/ili regiona okvira (FRs), specifično se vezuje za određeni antigen. U određenim slučajevima, antigen-vezujući molekul je antitelo ili fragment antitela, kao što su ti termini ovde na drugom mestu definisani.

[0109] Kao što je ovde korišćen, izraz "bispecifični antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji se sastoji iz bar prvog domena koji vezuje antigen i drugog domena koji vezuje antigen. Svaki domen koji vezuje antigen unutar bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula sadrži bar jedan CDR koji se zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDRs i/ili FRs, specifično vezuje za određeni antigen. U kontekstu iz predmetnog prikaza, prvi domen koji vezuje antigen specifično veže prvi antigen (npr., CD3), i drugi domen koji vezuje antigen specifično vezuje drugi, različiti antigen (npr., PSMA, MUC16, EGFRvIII ili STEAP2).

[0110] Bispecifični antigen-vezujući molekul iz pronalaska je bispecifično antitelo. Svaki domen koji vezuje antigen bispecifičnog antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula koji se sastoji iz prvog i drugog domena koji vezuje antigen (npr., bispecifično antitelo), CDRs prvog domena koji vezuje antigen može biti označen sa "A1" i CDRs drugog domena koji vezuje antigen može biti naznačen sa prefiksom "A2". Prema tome, CDRs prvog domena koji vezuje antigen može ovde biti naznačen sa A1-HCDR1, A1-HCDR2, i A1-HCDR3; i CDRs iz drugog domena koji vezuje antigen može ovde biti naznačen sa A2-HCDR1, A2-HCDR2, i A2-HCDR3.

[0111] Prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu biti direktno ili indirektno spojeni jedan sa drugim da bi se obrazovao bispecifični antigen-vezujući molekul iz predmetnog pronalaska. Alternativno, prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu svaki biti spojeni sa odvojenim domenom koji multimerizuje. Povezivanje jednog domena koji multimerizuje sa drugim domenom koji multimerizuje olakšava povezivanje između dva domena koji vezuju antigen, time obrazujući bispecifični antigen-vezujući molekul. Kao što je ovde korišćen, "domen koji multimerizuje" je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid, ili aminokiselina koji ima sposobnost da se poveže sa drugim domenom koji multimerizuje iste ili slične strukture ili sastava. Na primer, domen koji multimerizuju može biti polipeptid koji se sastoji iz

2

imunoglobulinskog CH3 domena. Ne-ograničavajući primer komponente domena koji multimerizuje je Fc deo imunoglobulina (sadrži CH2-CH3 domen), npr., Fc domen IgG izabranog iz izotipova IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, kao i bilo koji alotio u svakoj grupi izotipa.

[0112] Bispecifični antigen-vezujući molekuli iz predmetnog pronalaska će obično sadržati dva domena koji multimerizuju, npr., dva Fc domena su svaki individualno deo odvojenog teškog lanca antitela. Prvi i drugi domeni koji multimerizuju mogu biti od istog IgG izotipa kao što su, npr., IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi domeni koji multimerizuju mogu biti od različitih IgG izotipa kao što su, npr., IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, itd.

[0113] U određenim izvođenjima, domen koji multimerizuje je Fc fragment ili aminokiselinska sekvenca od 1 do oko 200 aminokiselina u dužini koja sadrži bar jedan cisteinski ostatak. U drugim izvođenjima, domen koji multimerizuje je cisteinski ostatak, ili kratak peptid koji sadrži cistein. Drugi domen koji multimerizuje uključuje peptide ili polipeptide koji sadrže ili se sastoje iz leucinskog zatvarača, zavojnica-petlja motiva, ili motiva namotana spirala.

[0114] Bilo koji bispecifični format antitela ili tehnologije mogu se koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji imaju prvu specifičnost vezivanja antigena mogu biti funkcionalno spojeni (npr., hemijskim spajanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entitet, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela koji ima drugu specifičnost vezivanja antigena da se proizvede bispecifični antigen-vezujući molekul. Specifični primeri bispecifičnih formata koji se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, npr., formate zasnovane na scFv- ili bispecifičnom diatelu, IgG-scFv fuzije, dualni varijabilni domen (DVD)-Ig, Quadroma, “knobs-into-holes”, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa “knobs-intoholes”, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)telo, leucinski zatvarač, Duobody, IgG1/IgG2, Fab sa dvostrukim dejstvom (DAF)-IgG, i Mab<2>bispecifični formati (videti, npr., Klein et al.

2012, mAbs 4:6, 1-11, i ovde navedene referenca, za pregled prethodno navedenih formata).

[0115] U kontekstu bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska, domeni koji multimerizuju, npr., Fc domaini, mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih promena (npr., insercije, delecije ili supstitucije) u poređenju sa divljim tipom, prirodnom verzijom koja postoji za Fc domen. Na primer, pronalazak uključuje bispecifične antigenske vezujuće molekule koji se sastoje iz jedne ili više modifikacija u Fc domena koji dovode do modifikovanog Fc domena sa modifikovanom interakcijum vezivanja (npr., pojačan ili umanjen) između Fc i FcRn. U jednom izvođenju, bispecifični antigenvezujući molekul sadrži modifikaciju u CH2 ili CH3 regionu, pri čemu modifikacija povećava afinitet Fc domena sa FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde pH je u opsegu oko 5.5 do oko 6.0). Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na položaju 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na položaju 428 i/ili 433 (npr., L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na položaju 250 i/ili 428; ili modifikaciju na položaju 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom izvođenju, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).

[0116] Predmetni pronalazak takođe uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji se sastoje iz prvog CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog u bar jednoj aminokiselini, i gde je bar DNK razlika u aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bi-specifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselini. U jednom izvođenju, prvi Ig CH3 domen veže Protein A i drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A kao što je H95R modifikacija (IMGT numerisanjem egzona; H435R sa EU numerisanjem). Drugi CH3 može dalje sadržati Y96F modifikaciju (sa IMGT; Y436F sa EU). Ostale modifikacije koje se mogu naći u drugom CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (sa IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I sa EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I sa EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (sa IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I sa EU) u slučaju IgG4 antitela.

[0117] U određenim izvođenjima, Fc domen može biti himerni, kombinujući Fc sekvence koje su izvedene iz više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, himerni Fc domen može sadržati deo ili celu CH2 sekvencu koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 CH2 regiona, i deo ili celu CH3 sekvencu koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni Fc domen može takođe sadržati himerni region zgloba. Na primer, himerni zglob može sadržati "gornji zglob" sekvencu, izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba, kombinovanu sa "donjom zglob" sekvencom, koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba. Poseban primer himernog Fc domena koji može biti uključen u bilo koji od antigen-vezujućih molekula koji su ovde prikazani sadrži, od N- ka C-kraju: [IgG4 CH1] - [IgG4 gornji zglob] - [IgG2 donji zglob] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Drugi primer himernog Fc domena koji može biti uključen u bilo koji od antigen-vezujućih molekula koji su ovde prikazani sadrži, od N- ka C-kraju: [IgG1 CH1] - [IgG1 gornji zglob] - [IgG2 donji zglob] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Ovi i drugi primeri himernih Fc domena koji mogu biti uključeni u bilo koji od antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska su opisani u PCT br. Međunarodne objave WO2014/121087 A1, objavljen 7 avgusta, 2014. Himerni Fc domaeni koji imaju ova generalna strukturalna preuređenja, i njihove varijante, mogu imati izmenjeno vezivanje Fc receptora, koje sa druge strane utiče na efektorsku funkciju Fc.

[0118] U određenim slučajevima, prikaz se odnosi na težak lanac antitela pri čemu konstantni region teškog lanca (CH) region sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% identičnu sa bilo kojom od SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ili SEQ ID NO: 191. U nekim slučajevima, konstantni region teškog lanca (CH) region sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 i SEQ ID NO: 191.

[0119] U drugim slučajevima, prikaz se odnosi na težak lanac antitela pri čemu Fc domen sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% identičnu sa bilo kojom od SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 ili SEQ ID NO: 201. U nekim slučajevima, Fc domen sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 i SEQ ID NO: 201.

Druge Fc Varijante

[0120] Prema određenim slučajevima iz predmetnog prikaza, obezbeđena su anti-CD3 antitela, i anti-CD3/anti-TAA bispecifični antigen-vezujući molekuli, koji se sastoje iz Fc domena koji sadrže jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, predmetni prikaz uključuje antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(e) povećavaju afinitet Fc domena prema FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde je pH opsega od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu

2

dovesti do povećanja polu-života antitela u serumu kada se daje životinji. Ne-ograničavajući primeri takvih modifikacija Fc uključuju, npr., modifikaciju na položaju 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na položaju 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na položaju 250 i/ili 428; ili modifikaciju na položaju 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom slučaju, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).

[0121] Na primer, predmetni prikaz uključuje anti-CD3 antitela, i anti-CD3/anti-TAA bispecifične molekule koji vezuju antigen, koji se sastoje iz Fc domena koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji iz: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). Sve moguće kombinacije gore navedenih mutacija Fc domena, i drugih ovde prikazanih mutacija u varijabilnim domenima antitela, sagledane su u obimu prema predmetnom prikazu.

Biološke karakteristike antitela i bispecifičnih molekula koji vezuju antigen

[0122] Predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen (npr., bispecifična antitela) koji su sposobni da se istovremeno vežu za humani CD3 i humani TAA. Prema određenim izvođenjima, bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz pronalaska specifično interaguju sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 i/ili TAA, kao što su PSMA, EGFRvIII ili MUC16. Vezujući krak koji interaguje sa ćelijama koje eksprimuju CD3 može imati slab ili bez detektabilnog vezivanja kao što je mereno u pogodnom in vitro testu vezivanja. Obim do kojeg se bispecifični molekul koji veže antigen veže za ćelije koje eksprimuju CD3 i/ili TAA može se proceniti sa sortiranjem fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS), kao što je ovde ilustrovano u primeru 4.

[0123] Na primer, predmetni prikaz uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, i njihova bispecifična antitela koja specifično vežu humane linije T-ćelja koje eksprimuju CD3 ali ne TAA (npr., Jurkat), T-ćelije primata (npr., cinomolgus mononuklearne ćelije periferne krvi [PBMCs]), i/ili ćelije koje eksprimuju TAA. Predmetni pronalazak uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji vezuju bilo koju od prethodno pomenutih T ćelija i linija T ćelija sa EC50vrednosti od oko 1.8x10<-8>(18 nM) do oko 2.1x10<-7>(210 nM), ili više (tj. slabiji afinitet), i uključuje bispecifična antitela za koje je EC50nedetektabilan, kao što je određeno korišćenjem FACS testa vezivanja koji je prikazan u Primeru 4 ili suštinski sličnom testu. U određenim slučajevima, antitela, fragmenti koji vezuju antigen, i bispecifična antitela iz predmetnog prikaza vezuju CD3 sa EC50većom od oko 30 nM, većom od oko 40 nM, većom od oko 45 nM, većom od oko 50 nM, većom od oko 55 nM, većom od oko 60 nM, većom od oko 65 nM, većom od oko 70 nM, većom od oko 75 nM, bar80 nM, većom od oko 90 nM, većom od oko 100 nM, većom od oko 110 nM, bar 120 nM, većom od oko 130 nM, većom od oko 140 nM, većom od oko 150 nM, najmanje 160 nM, većom od oko 170 nM, većom od oko 180 nM, većom od oko 190 nM, većom od oko 200 nM, većom od oko 250 nM, većom od oko 300 nM, većom od oko 500 nM, većom od oko 1 µM, većom od oko 2 µM, ili većom od oko 3 µM, ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja, kao što je mereno sa FACS vezivanjem, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisan u Primeru 4, ili suštinski sličnom testu.

[0124] Predmetni prikaz takođe uključuje antitela, fragmente koji vežu antigen, i njihova bispecifična antitela koja se vežu za ćelije i ćelijske koje eksprimuju TAA, kao što su ćelije koje eksprimuju PSMA-, EGFRvIII-, STEAP2- i MUC16, sa EC50vrednosti koja je manja od oko 100 nM, ili još manjom koncentracijom koja je potrebna za vezivanje (tj. jači afinitet) kao što je manje od 5.6 nM (5.6x10<-9>),

2

kao što je određeno FACS testom vezivanja koji je predstavljen u primeru 4 ili u suštini sličnom testu zasnovanom na ćelijama. Predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji vezuju bilo koju od gore pomenutih linija ćelija tumora sa EC50vrednosti koja je manja od oko 50 nM, manja od oko 45 nM, manja od oko 40 nM, manja od oko 35 nM, manja od oko 30 nM, manja od oko 25 nM, manja od oko 20 nM, manja od oko 15 nM, manja od oko 10 nM, manja od oko 6 nM, manja od oko 5 nM, ili manja od oko 1 nM, npr. korišćenjem prethodno pomenutog testa.

[0125] Predmetni prikaz uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 sa niskim, slabim ili čak bez detektabilnog afiniteta. Prema određenim slučajevima, predmetni prikaz se odnosi na antitela i fragmente koji vezuju antigen antitela koji vezuju humani CD3 (npr., na 37°C) sa KDvećom od oko 11 nM, uključuje antitela koja vezuju CD3 sa KDvećom od oko 100 nM ili 500 nM, i takođe uključuje antitela koja nemaju detektabilni afinitet vezivanja, kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 5. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog prikaza vezuju CD3 sa KDvećom od oko 15 nM, većom od oko 20 nM, većom od oko 25 nM, većom od oko 30 nM, većom od oko 35 nM, većom od oko 40 nM, većom od oko 45 nM, većom od oko 50 nM, većom od oko 55 nM, većom od oko 60 nM, većom od oko 65 nM, većom od oko 70 nM, većom od oko 75 nM, bar 80 nM, većom od oko 90 nM, većom od oko 100 nM, većom od oko 110 nM, najmanje 120 nM, većom od oko 130 nM, većom od oko 140 nM, većom od oko 150 nM, bar 160 nM, većom od oko 170 nM, većom od oko 180 nM, većom od oko 190 nM, većom od oko 200 nM, većom od oko 250 nM, većom od oko 300 nM, većom od oko 1 µM, većom od oko 2 µM, ili većom od oko 3 µM, ili bez detektabilnog afiniteta, kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 5 (npr., format mAthvatanja ili antigen-hvatanja), ili suštinski sličnim testom.

[0126] Predmetni prikaz uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, i njihova bispecifična antitela koja vezuju majmunski (tj. cinomolgus) CD3 sa niskim, slabim ili čak bez detektabilnog afiniteta. Prema određenim slučajevima, predmetni prikaz uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 (npr., na 37°C) sa KDvećom od oko 10 nM, uključuje antitela koja vezuju CD3 sa KDvećom od oko 100 nM ili 500 nM, i takođe uključuje antitela koja nemaju detektabilni afinitet vezivanja, kao što je mereno sa površinskom plazmon rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 5. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog prikaza vezuju CD3 sa KDvećom od oko 15 nM, većom od oko 20 nM, većom od oko 25 nM, većom od oko 30 nM, većom od oko 35 nM, većom od oko 40 nM, većom od oko 45 nM, većom od oko 50 nM, većom od oko 55 nM, većom od oko 60 nM, većom od oko 65 nM, većom od oko 70 nM, većom od oko 75 nM, bar80 nM, većom od oko 90 nM, većom od oko 100 nM, većom od oko 110 nM, bar 120 nM, većom od oko 130 nM, većom od oko 140 nM, većom od oko 150 nM, bar160 nM, većom od oko 170 nM, većom od oko 180 nM, većom od oko 190 nM, većom od oko 200 nM, većom od oko 250 nM, većom od oko 300 nM, većom od oko 1 µM, većom od oko 2 µM, ili većom od oko 3 µM, ili bez detektabilnog afiniteta, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 5 (npr., format mAt-hvatanja ili antigen-hvatanja), ili suštinski sličnim testom.

[0127] Predmetni prikaz uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 I indukuju aktivaciju T ćelija. Na primer, predmetni prikaz uključuje anti-CD3 antitela koja indukuju aktivaciju humanih T ćelija sa EC50vrednosti koja je manja od oko 113 pM, kao što je mereno sa in vitro testom aktivacije T ćelija, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 6 [npr., procenom procenta akivisanih (CD69+) ćelija od ukupnih T ćelija (CD2+)

2

u prisustvu anti-CD3 antitela], ili u suštini sličnim testom koji procenjuje T ćelije u njihovom aktivisanom stanju. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog prikaza indukuju aktivaciju humanih T ćelija [npr., procenat aktivisanih (CD69+) T ćelija] sa EC50vrednosti koja je manja od oko 100 pM, manja od oko 50 pM, manja od oko 20 pM, manja od oko 19 pM, manja od oko 18 pM, manja od oko 17 pM, manje od oko 16 pM, manja od oko 15 pM, manja od oko 14 pM, manja od oko 13 pM, manja od oko 12 pM, manja od oko 11 pM, manja od oko 10 pM, manja od oko 9 pM, manja od oko 8 pM, manja od oko 7 pM, manja od oko 6 pM, manja od oko 5 pM, manja od oko 4 pM, manja od oko 3 pM, manja od oko 2 pM, ili manja od oko 1 pM, kao što je mereno sa in vitro testom aktivacije T ćelija, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 6, ili suštinski sličnim testom. Anti-CD3 antitela koja imaju slabo ili bez detektabilnog vezivanja za CD3 imaju sposobnost indukovanja aktivacije T ćelija sa visokom potencijom (tj. pM opsegom), bez obzira na slab ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja za CD3, kao što je ovde predstavljeno u Primeru 6.

[0128] Predmetni prikaz takođe uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, i bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 i indukuju T ćelijski posredovano ubijanje ćelija koje prezentuju antigene tumora. Na primer, predmetni prikaz uključuje anti-CD3 antitela koja uključuju ubijanje posredovano T ćelijama tumorskih ćelija sa EC50manjom od oko 1.3 nM, kao što je mereno u in vitro testu ubijanja ćelija tumora posredovano sa T ćelijama, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u primeru 6 (npr., procenom obima ćelija koje eksprimiraju antigen tumora kao što su ćelije koje eksprimiraju PSMA, eksprimiraju EGFRvIII ili ubijanje ćelija koje eksprimiraju MUC16 od strane PBMCs u prisustvu anti-CD3 antitela), ili u sušini sličnim testom. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog prikaza indukuju ubijanje tumorskih ćelija posredovano sa T ćelijama (npr., PBMC-posredovano ubijanje OVCAR3 ćelija) sa EC50vrednosti koja je manja od oko 1 nM, manja od oko 400 pM, manja od oko 250 pM, manja od oko 100 pM, manja od oko 50 pM, manja od oko 40 pM, manja od oko 30 pM, manja od oko 20 pM, manja od oko 10 pM, manja od oko 9 pM, manja od oko 8 pM, manje od oko 7 pM, manja od oko 6 pM, manja od oko 5 pM, manja od oko 4 pM, manja od oko 3 pM, manja od oko 2 pM, ili manja od oko 1 pM, kao što je mereno sa in vitro testom ubijanja tumorskih ćelija posredovano sa T ćelijama, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 6, ili u suštini sličnim testom.

[0129] Predmetni prikaz takođe uključuje antitela, fragmente koji vezuju antigen, i bispecifična antitela koja vezuju CD3 sa disocijativnim poluživotom (t<1>/2) manjim od od oko 10 minuta kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 5, ili u suštini sličnom testu. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog prikaza vezuju CD3 sa t<1>/2manjim od oko 9 minuta, manjim od oko 8 minuta, manjim od oko 7 minuta, manjim od oko 6 minuta, manjim od oko 5 minuta, manjim od oko 4 minuta, manjim od oko 3 minuta, manjim od oko 2 minuta, manjim od oko 1.9 minuta, manjim od oko 1.8 minuta, ili ispoljavaju veoma slabim ili bez detektabilnog vezivanja kao što je mereno sa površinskom plazmon rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisan u Primeru 5 (npr., format hvatanja-mAt ili antigen-hvatanja), ili suštinski sličnim testom.

[0130] Anti-CD3/anti-TAA bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu dodatno ispoljiti jednu ili više karakteristika koje su izabrane iz grupe koja se sastoji iz: (a) indukovanja PBMC in vitro; (b) aktivacije T-ćelija preko indukovanja oslobađanja IFN-gama i pojačanu regulaciju CD25 u punoj humanoj krvi; i (c) indukovanja citotoksičnosti posredovane sa T-ćelijama na anti-TAA-rezistentnim ćelijskim linijama.

2

[0131] Predmetni pronalazak uključuje anti-CD3/anti-TAA bispecifične molekule koji vezuju antigen koji su sposobni za depleciju (iscrpljivanje) ćelija koje eksprimuju tumorski antigen kod subjekta (videti, npr., Primer 7). Na primer, prema određenim izvođenjima, obezbeđeni su anti-CD3/anti-PSMA, anti-CD3/anti-MUC16, ili anti-CD3/anti-STEAP2 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, pri čemu pojedinačno davanje 1 µg, ili 10 µg, ili 100 µg bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu (npr., u dozi od oko 0.1 mg/kg, oko 0.08 mg/kg, oko 0.06 mg/kg oko 0.04 mg/kg, oko 0.04 mg/kg, oko 0.02 mg/kg, oko 0.01 mg/kg, ili manje) uzrokuje smanjenje u broju ćelija koje eksprimuju tumorski antigen kod subjekta (npr., tumorski rast kod subjekta je suprimiran ili inhibiran) ispod nivoa detekcije. U određenim izvođenjima, pojedinačno davanje anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnog molekula koji vezuje antigen u dozi oko 0.4 mg/kg uzrokuje smanjenje u rastu tumora kod subjekta ispod nivoa detekcije približno u danu 7, približno u danu 6, približno u danu 5, približno u danu 4, približno u danu 3, približno u danu 2, ili približno u danu 1 nakon davanja bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu. Prema određenim izvođenjima, pojedinačno davanje anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnog molekula koji vezuje antigen iz pronalaska, u dozi od bar oko 0.01 mg/kg, uzrokuje da brojne ćelije tumora koje eksprimuju PSMA ostaju ispod nivoa detekcije do ba roko 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana ili više, nakon davanja. Kao što je ovde korišćen, izraz "ispod nivoa detekcije" označava da se nijedna ćelija tumora ne može direktno ili indirektno detektovati za subkutanozni rast kod subjekta korišćenjem standardnih postupaka merenja kaliperom, npr., kao što je ovde predstavljeno u Primeru 7. U određenim izvođenjima, pojedinačno davanje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen u dozi od oko 10 µg dovodi do supresije tumorskog rasta kod subjekta približno u danu 6, i održava supresiju tumora sve do bar dana 26 nakon davanja subjektu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen. Subjektima koji su primili pojedinačnu aplikaciju anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen u dozi od 10 µg bar 7 dana nakon implantacije tumora, bispecifični molekul koji vezuje antigen ispoljava efikasnost u supresiji uspostavljenih tumora od daljeg rasta u subjektu približno u danu 26 nakon implantiranja tumora u subjektu. Prema određenim izvođenjima, pojedinačno davanje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnog molekula iz pronalaska koji vezuje antigen, u dozi od bar oko 0.1 mg/kg, inhibira rast ćelija tumora koje eksprimuju MUC16 približno za bar oko 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana, 18 dana, 19 dana, 20 dana ili više, nakon davanja bispecifičnog molekula. Videti, npr. Primer 8.

[0132] U određenim izvođenjima, pojedinačno davanje anti-CD3/anti-STEAP2 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen u dozi oko 0.1 mg/kg ili 0.01 mg/kg održava supresiju tumorskog rasta bar do dana 46 nakon davanja bispecifičnog molekula koji vezuje antigen i tumor subjektu. Prema određenim izvođenjima, pojedinačno davanje anti-CD3/anti-STEAP2 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen iz pronalaska, u dozi od bar oko 0.1 mg/kg, oko 0.08 mg/kg, oko 0.06 mg/kg, oko 0.05 mg/kg, oko 0.04 mg/kg, oko 0.03 mg/kg, oko 0.02 mg/kg, oko 0.01 mg/kg, ili manjoj inhibira rast ćelija tumora koje eksprimuju STEAP2 za bar oko 20 dana, 30 dana, 35 dana, 40 dana, 45 dana ili više, nakon davanja bispecifičnog molekula. Videti, npr. Primer 10.

[0133] U drugim izvođenjima, anti-CD3/anti-TAA bispecifični antigen-vezujući molekuli koji imaju krak za ciljanje CD3 imaju slab afinitet vezivanja sa efektorskim ćelijama koje ispoljavaju smanjene stope eliminacije leka u poređenju sa bisprecifičnim antitelima koja sadrži isti anti-TAA vezujući krak i jači CD3 vezujući krak koji su davani u in vivo farmakokinetičkom ispitivanju. Rezutati sugerišu da bispecifični molekuli koji imaju slabije vezivanje kraka za ciljanje CD3 mogu ispoljiti korisne nivoe izlaganja leku (AUClast) i profile eliminacije leka (klirens antitela). Videti, npr. Primer 9.

[0134] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA, anti-CD3/anti-MUC16 i anti-CD3/anti-STEAP2 bispecifične molekule koji vezuju antigen (tj. anti-CD3/anti-TAA bispecifične molekule koji

2

vezuju antigen) koji ispoljavaju jednu ili više od karakteristika izabranih iz grupe koja se sastoji iz: (a) inhibicije tumorskog rasta kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte humanog kancera prostate; (b) inhibicije tumorskog rasta kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenografte humanog kancera prostate; (c) supresije tumorskog rasta uspostavljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte humanog kancera prostate; i (d) smanjenje tumorskog rasta uspostavljenih tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenografte humanog kancera prostate (videti, npr., Primere 7, 8 i 10). Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA, anti-CD3/anti-MUC16 i anti-CD3/anti-STEAP2 bispecifična antitela (tj. anti-CD3/anti-TAA bispecifična antitela) koja se sastoje iz prvog teškog lanca usmerenog prema efektorskoj T ćeliji (tj. CD3), i ii) drugog teškog lanca usmerenog prema ciljnoj ćeliji tumora, pri čemu bispecifična antitela ispoljavaju slabo vezivanje ili nema detektabilnog vezivanja sa efektorskim ćelijama, i ispoljavaju supresiju tumorskog rasta i smanjeni klirens antitela (tj. eliminaciju) iz tela u poređenju sa bispecifičnim antitelima koja ispoljavaju snažno vezivanje sa efektorskim ćelijama.

Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

[0135] Epitop na CD3 za koji se molekuli koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska vežu, može se sastojati iz jednog neprekidnog niza 3 ili više (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina CD3 proteina. Alternativno, epitop se može sastojati iz mnoštva nesusednih aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) CD3. Antitela iz pronalaska mogu interagovati sa aminokiselinama koje se nalaze u jednom CD3 lancu (npr., CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama), ili mogu interagovati sa aminokiselinama na dva ili više različitih CD3 lanaca. Izraz "epitop," kao što je ovde korišćen, odnosi se na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela mogu se vezati za različite površine antigena i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop je dobijen prostornim bliskim pozicioniranjem aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji je proizveden susednim aminokiselinkim ostacima u polipeptidnom lancu. U određenim slučajima, epitop može uključiti ostatke saharida, fosforil grupa, ili sulfonil grupa na antigenu.

[0136] Različiti postupci su poznati stručnjacima koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike, i mogu se koristiti za određivanje da li domen za vezivanje antigena u antitelu "interaguje sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primeri postupaka uključuju, npr., rutinski test unakrsnog vezivanja poput onog koji su opisali Antibodies, Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), mutaciona analiza skeniranja alanina, analiza peptidnih blotova (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), i analiza cepanja peptida. Dodatno, postupci kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena mogu se takođe koristiti (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Drugi postupak koji se može koristiti da bi se identifikovale aminokiseline u polipeptidu da kojim interaguje domen za vezivanje antigena u antitelu je izmena vodonik/deuterijum koja se detektuje masenom spektrometrijom. U opštim terminima, postupak izmene vodonik/deuterijum uključuje obeležavanje deuterijumom proteina od interesa, zatim sledi vezivanje antitela za protein koji je obeležen deuterijumom. Sledeće, komleks proteina/antitela je prenet u vodu da bi se omogućila izmena vodonik-deuterijum na svim ostacima osim ostataka koji su zaštićeni antitelom (koji ostaju obeleženi deuterijuom). Nakon disocijacije antitela, ciljni protein je izložen proteaznom cepanju i analizi masenim spektrometrom, time otkrivajući ostatke koji su obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo interaguje. videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem.

73:256A-265A. Rendgenska kristalografija (X-zračenje) kompleksa antigen/antitelo takođe se može koristiti za svrhe mapiranja epitopa.

[0137] Predmetni prikaz dalje uključuije anti-PSMA antitela koja se vezuju za isti epitop kao bilo koje od ovde opisanih primera antitela (npr. antitela koja se sastoje iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci kao što je ovde predstvljeno u Tabeli 6). Slično tome, predmetni prikaz takođe uključuje anti-PSMA antitela koja su u kompeticiji za vezivanje sa PSMA sa bilo kojim od ovde opisanih specifičnih primera antitela (npr. antitela koja se sastoje iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci kao što je ovde predstvljeno ovde u Tabeli 6). Anti-PSMA antitela su prikazana u U.S. Publication No. US 2017-0051074 A1.

[0138] Predmetni prikaz takođe uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji se sastoje iz prvog domena koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za humani CD3 i/ili cinomolgus CD3 sa niskim ili detektabilnim afinitetom vezivanja, i drugim domenom za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani antigen povezan sa tumorom (TAA), pri čemu se prvi domen za vezivanje antigena veže za isti epitop na CD3 kao bilo koji od specifičnih primera CD3-specifičnih antigenvezujućih domena koji su ovde opisani.

[0139] Slično tome, predmetni prikaz takođe uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji se sastoje iz prvog domena za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 i/ili cinomolgus CD3 niskim ili detektabilnim afinitetom vezivanja, i drugim domenom za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani antigen povezan sa tumorom (TAA), pri čemu je prvi domen za vezivanje antigena u kompeticiji za vezivanje sa CD3 sa bilo kojim od specifični primera CD3-specifičnih antigen-vezujućih domena koji su ovde opisani.

[0140] Lako se može odrediti da li određeni molekul koji vezuje antigen (npr., antitelo) ili njegov domen za vezivanje antigena se vezuje za isti epitop kao, ili je u kompeticiji za vezivanje sa, referentnim molekulom koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska korišćenjem rutinskih postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike. Na primer, da bi se odredilo da li se antitelo koje se ispituje veže za isti epitope na CD3 (ili TAA) kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska, referentnom bispecifičnom molekulu je prvo dozvoljeno da se veže za CD3 protein (ili TAA protein). Sledeće, procenjuje se sposobnost antitela koje se ispituje da se veže za CD3 molekul. Ukoliko je antitelo koje se ispituje sposobno da se veže za CD3 (ili TAA) posle zasićenja vezivanja sa referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, može se zaključiti da se antitelo koje se ispituje vezuje za različiti epitop na CD3 (ili TAA) u odnosu na referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen. Sa druge strane, ukoliko antitelo koje se ispituje nije sposobno da se veže za CD3 (ili TAA) molekul posle zasićenja vezivanja sa referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, onda se antitelo koje se ispituje može vezati za isti epitop CD3 (ili TAA) kao što je epitop koji je vezan od strane referentnog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen iz pronalaska. Dodatni rutinski eksperimenti (npr., mutiranje peptida i analize vezivanja) mogu se zatim izvesti da bi se potvrdilo da li uočeno odsustvo vezivanja antitela je zapravo zbog vezivanja sa istim epitopom kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen ili ukoliko je sterno blokiranje (ili drugi fenomen) odgovoran za odsustvo uočenog vezivanja. Ukoliko je referentno antitelo ono koje nema merljivo vezivanje kao što je ovde predstavljeno primerom, onda referentno antitelo može biti mutirano nazad do germinativne sekvence da bi se odredilo vezivanje sa CD3 za svrhu poređenja interakcije epitopa, ili poređenja njegovih svojstava vezivanja sa ispitivanim antitelom kao što je ovde opisano. Eksperimenti ove vrste mogu se izvesti korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kojim drugim kvalitativnim ili kvantitativnim testom vezivanja antitela koji je dostupan u oblasti tehnike. U skladu sa određenim izvođenjima iz predmetnog pronalaska, dva proteina za vezivanje antigena mogu biti ista vezati se za isti (ili preklapajući) epitop ukoliko, npr., 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-puta višak jednog proteina koji vezuje

1

antigen inhibira vezivanje drugog za bar 50% ali poželjno 75%, 90% ili čak 99% kao što je mereno u testu kompetitivnog vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativno, dva proteina koji vezuju antigen osuđena su da se vežu za isti epitope ukoliko su suštinski sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog proteina koji vezuje antigen smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog. Dva proteina koja vezuju antigen su osuđeni da imaju "preklapajuće epitope" ukoliko je samo podset aminokiselinskih mutacija koji smanjuje ili eliminiše vezivanje jednog proteina koji vezuje antigen smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog.

[0141] Da bi se odredilo da li antitelo ili njegov domen koji vezuje antigen je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen, gore opisana metodologija vezivanja je sprovedena u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom molekulu koji vezuje antigen je dozvoljeno da se veže za CD3 protein (ili TAA protein) pod uslovima zasićenja praćeno sa procenom vezivanja antitela koje se ispituje prema CD3 (ili TAA) molekulu. U drugoj orijentaciji, antitelu koje se ispituje je dozvoljeno da se veže za CD3 (ili TAA) molekulu pod uslovima zasićena praćeno sa procenom vezivanja referentnog molekula koji vezuje antigen prema CD3 (ili TAA) molekulu. Ukoliko, u obe orijentacije, samo prvi (zasićeni) molekul koji vezuje antigen je sposoban da se veže za CD3 (ili TAA) molekul, onda je zaključeno da antitelo koje se ispituje i referentni molekul koji vezuje antigen su u kompeticiji za vezivanje za CD3 (ili TAA). Kao što će proceniti osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen ne mora nužno da se veže za isti epitop kao i referentno antitelo, ali može sterno blokirati referentno antitelo vezivanjem preklapajućeg ili susednog epitopa. Ukoliko je referentno antitelo ono koje nema merljivo vezivanje kao što je ovde prikazano, onda se referentno antitelo može nazad mutirati do germinativne sekvence da bi se odredilo vezivanje sa CD3 za svrhu poređenja interakcije epitopa, ili poređenja njegovih svojstava vezivanja ili blokiranja interakcije sa ispitivanim antitelom kao što je ovde opisano.

Dobijanje domena za vezivanje antigena i konstruisanje bispecifičnih molekula

[0142] Domeni koji vezuju antigen koji su specifični za određene antigene mogu se dobiti korišćenjem bilo koje tehnologije za dobijanje antitela koja je poznata u oblasti tehnike. Jednom kada su dobijena, dva različita domena za vezivanje antigena, specifična za dva različita antigena (npr., CD3 i TAA), mogu na odgovarajući način biti uređena jedan u odnosu na drugi da bi se proizveo bispecifični molekul koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska upotrebom rutinskih postupaka. (Diskusija o primerima bispecifilnih formata antitela koji se mogu koristiti za konstruisanje bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska, ovde je obezbeđena na drugom mestu). U određenim izvođenjima, jedna ili više od individualnih komponenti (npr., teški i laki lanci) multispecifičnih molekula koji vezuju antigen iz pronalaska izvedeni su iz himernih, humanizovanih ili potpuno humanih antitela. U oblasti tehnike su dobro poznati postupci za dobijanje takvih antitela. Na primer, jedan ili više od teški i/ili lakih lanaca bispecifičnih molekulia koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu se dobiti korišćenjem VELOCIMMUNE™ tehnologije. Korišćenjem VELOCIMMUNE ™ tehnologije (ili bilo koje druge tehnologije za generisanje humanog antitela), visokoafinitetna himerna antitela prema određenom antigenu (npr., CD3 ili TAA) su inicijalno izolovana tako da imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Antitela su karakterisana i selektovana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisali potpuno humani teški i/ili laki lanci koji mogu biti uključeni u bispecifične molekule koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska.

[0143] Genetski modifikovane životinje mogu se koristiti za dobijanje humanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen. Na primer, može se koristiti genetski modifikovani miš koji nije sposoban za preuređivanje i eksprimovanje endogene varijabilne sekvence lakog lanca mišjeg imunoglobulina, pri čemu miš eksprimira samo jedan ili dva varijabilna domena humanog lakog lanca koji su kodirani sa

2

humanim imunoglobulinskim sekvencama operativno vezanim sa mišjim kapa (κ) konstantnim genom na endogenom mišjem kapa (κ) lokusu. Takvi genetski modifikovani miševi mogu se koristiti za proizvodnju potpuno humanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen koji se sastoje iz dva različita teška lanca koja se povezuju sa identičnim lakim lancem koji čine varijabilni domen izveden iz jednog od dva različita genska segmenta varijabilnog regiona humanog lakog lanca. (Videti, npr., US 2011/0195454 za detaljnu diskusiju takvih modifikovanih miševa i njihovu upotrebu da bi se proizveli bispecifični molekuli koji vezuju antigen). Antitela iz pronalaska sadrže teške lance imunoglobulina povezane sa zajedničkim lakim lancem. Zajednički laki lanac može biti izveden iz srodnog lakog lanca anti-TAA teškog lanca, ili izveden iz poznatog ili javnog domena varijabilnog regiona lakog lanca koji je izveden iz lakog lanca koji ispoljava promiskuitet ili sposobnost da se upari sa širokim opsegom nesrodnih teških lanaca, tj. univerzalnim lakim lancem. Antitela iz pronalaska mogu sadržati teške lance imunoglobulina povezane sa jednim preuređenim lakim lancem. U nekim izvođenjima, varijabilni domen lakog lanca je izveden iz humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili Vκ3-20 genskog segmenta. U drugim izvođenjima, laki lanac se sastoji iz varijabilnog domena koji je izveden iz humanog Vκ1-39 genskog segmenta koji je preuređen sa humanim Jκ5 ili humanim Jκ1 genskim segmentom, ili Vκ3-20 genskim segmentom koji je preuređen sa humanim Jκ1 genskim segmentom, ili Vκ1-39 genskim segmentom koji je preuređen sa humanim Jκ1 genskim segmentom.

Bioekvivalenti

[0144] Predmetni pronalazak obuhvata antigen-vezujuće molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od onih iz primera molekula koji su ovde prikazani ali koji zadržavaju sposobnost vezivanja za ili interakcije sa CD3 i/ili TAA. Takve varijante molekula mogu sadržati jednu ili više adicija, delecija, ili supstitucija aminokiselina kada su upoređene sa parentalnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna sa onom koja je opisana za bispecifične antigen vezujuće molekule.

[0145] Predmetni pronalazak uključuje antigen-vezujuće molekule koji su bioekvivalentni sa bilo kojim od primera antigen-vezujućih molekula koji su ovde predstavljeni. Dva proteina koji vežu antigen, ili antitela, su smatrani bioekvivalentom ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i obim apsorpcije ne pokazuje značajnu razliku kada su davane u istoj molarnoj dozi u sličnim eksperimentalnim uslovima, kao pojedinačne doze ili višestruke doze. Neki proteini koji vezuju antigen smatraće se ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalentni u obimu njihove apsorpcije ali ne u svojoj brzini apsorpcije a ipak se mogu smatrati bioekvivalentima zbog toga što takve razlike u brzini apsorpcije su namerne i odražavaju se u obeležavanju, nisu od suštinskog značaja za postizanje efektivne koncentracije leka u telu, npr., hroničnom upotrebom, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni proučavani proizvod leka.

[0146] U jednom izvođenju, dva antigen vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći, i potenciji.

[0147] U jednom izvođenju, dva antigen vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko pacijent može da se prebaci jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja u riziku od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu u imunogenosti, ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takvog prelaza.

[0148] U jednom izvođenju, dva antigen vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko oba deluju pomoću zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili uslove upotrebe, do obima u kome su takvi mehanizmi poznati.

[0149] Bioekvivalencija se može pokazati u in vivo i in vitro postupcima. Mere bioekvivalencije uključuju, npr.,

(a) in vivo test kod ljudi ili drugim sisarima, u kojima koncentracija antitela ili njihovih metabolita je merena u krvi, plazmi, serumu, ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa i razumno predviđa humane podatke in vivo biodostupnosti; (c) in vivo test kod humanih bića ili drugih sisara u kojima odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) je izmeren kao funkcija vremena; i

(d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili biodostupnost ili bioekvivalenciju antigen vezujućeg proteina.

[0150] Bioekvivalentne varijante primera bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde predstavljeni mogu se konstruisati, na primer, dobijanjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili delecijom terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu neophodne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu neophodni za biološku aktivnost mogu biti izbrisani ili zamenjeni sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo obrazovanje neželjenih ili nepravilnih intramolekularnih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentni antigen-vezujući proteini mogu uključiti varijante iz primera bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde predstavljeni koji se sastoje iz aminokiselinskih promena koje modifikuju karakteristike glikozilacije molekula, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.

Selektivnost prema vrsti i ukrštena reaktivnost prema vrsti

[0151] Prema određenim izvođenjima iz primera, obezbeđeni su molekuli koji vezuju antigen koji ispoljavaju slabu ili bez interakcije sa humanim CD3 i slabu ili bez interakcije sa CD3 iz drugih vrsta, kao što je CD3 cinomolgus majmuna. Takođe su obezbeđeni molekuli koji vezuju antigen koji se vezuju za humani TAA ali ne za TAA iz drugih vrsta. Predmetni pronalazak takođe uključuje molekule koji vezuju antigen koji se vezuje za humani CD3 i za CD3 iz jedne ili više nehumanih vrsta; i/ili molekule koji vezuju antigen koji se vezuju za humani TAA i za TAA iz jedne ili više ne-humanih vrsta.

[0152] Prema određenim primerima izvođenja, obezbeđeni su molekuli koji vezuju antigen koji se slabo vezuju za humani CD3 i/ili humani TAA i mogu ili ne moraju vezati, kao što slučaj može biti, za jedan ili više od miša, pacov, zamorac, hrčak, gerbil, svinja, mačke, psa, zec, koza, ovca, krava, konj, kamila, cinomolgus, marmozet, rezus ili šimpanza CD3 i/ili TAA. Na primer, u određenim primerima izvođenja iz predmetnog pronalaska obezbeđeni su bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji se sastoje iz prvog domena koji vezuje antigen koji se slabo veže za humani CD3 i CD3 cinomolgusa, i drugi domen koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za humani PSMA, MUC16, EGFRvIII ili STEAP2.

Imunokonjugati

[0153] Predmetni pronalazak obuhvata molekule koji vezuju antigen konjugovane sa terapeutskom grupom ("imunokonjugat"), kao što je citoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresant ili radioizotop. Citotoksična sredstva uključuju bilo koje sredstvo koje je oštećujuće u odnosu na ćeliju. U oblasti tehnike su poznati primeri pogodnih citotoksičnih sredstava i hemoterapeutskih sredstava za obrazovanje imunokonjugata (videti na primer, WO 05/103081).

Terapeutska formulacija i davanje

[0154] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje se sastoje iz molekula koji vezuju antigen (tj. bispecifična antitela) iz predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije iz

4

pronalaska su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima, i drugim sredstvima koja obezbeđuju unapređen transfer, isporuku, podnošljivost, i slično. Brojne odgovarajuće formulacije mogu da se pronađu u formularu koji je poznat svim farmaceutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule (katjonske ili anjonske) koje sadrže lipide (kao što je LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulja u vodi i vode u ulju, emulzije “karbowaks” (polietilen glikoli različitih molekularnih masa), polu-čvrsti gelovi, i polu-čvrste mešavine koje sadrže karbowax. Videti takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0155] Doza molekula koji vezuje antigen koja se daje pacijentu može se razlikovati od starosti i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, načina davanja, i slično. Poželjna doza je obično izračunata na osnovu telesne mase ili oblasti površine na telu. Kada je bispecifičan molekul koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska korišćen za terapeutske svrhe kod odraslog pacijenta, može se poželjno intravenozno davati bispecifični molekul koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska normalno u pojedinačnoj dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne mase, poželjnije oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do oko 5, ili oko 0.05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od težine stanja, učestalost i trajanje tretmana može biti prilagođeno. Efikasne doze i rasporedi za davanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen mogu se odrediti empirijski; Na primer, napredovanje pacijenta može se pratiti periodičnom procenom, i doza se prema tome može prilagoditi. Osim toga, podeševanje doza među vrstama može se izvesti korišćenjem dobro poznatih postupaka iz oblasti tehnike (npr., Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).

[0156] Poznati su različiti sistemi za isporuku i mogu se koristiti za davanje farmaceutske kompozicije iz pronalaska, npr., inkapsuliranjem u lipozomima, mikročesticama, mikrokapsulama, rekombinantnim ćelijama koje su sposobne za eksprimuju mutirane viruse, receptorom posredovanom endocitozom (videti, npr., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.262:4429-4432). Postupci za uvođenje uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno, subkutanozno, intranazalno, epiduralno, i oralne načine davanja. Kompozicija se može davati bilo kojim pogodnim načinom davanja, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutanozne ovojnice (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.) i mogu se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno.

[0157] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može biti isporučena subkutanozno ili intravenozno sa standardnom iglom ili špricem. Dodatno, u odnosu na subkutanoznu isporuku, sprava za isporuku u obliku olovke odmah ima primene u isporuci farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska. Takva sprava za isporuku u obliku olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Višekratna sprava za isporuku u obliku olovke generalno koristi zamenjivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Jednom kada je sva farmaceutska kompozicija u kertridžu iskorišćena i kertridž je ispražnjen, prazan kertridž može jednostavno da se odbaci i zameni sa novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Nakon toga, olovka za isporuku se može koristiti ponovo. U višekratnoj spravi za isporuku u obliku olovke, ne postoji zamenjivi kertridž. Radije, jednokratni uređaj za isporuku u obliku olovke dolazi prethodno napunjen sa farmaceutskom kompozicijom koja je držana u rezervoaru sa spravom. Jednom kada je rezervoar ispražnjen od farmaceutske kompozicije, cela sprava se odbacuje.

[0158] Brojne višekratne olovke (eng. pen) i autoinjektorske sprave za ubrizgavanje imaju primenu u subkutanoznoj isporuci farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, i OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), samo nekoliko navedenih. Primeri jednokratnih sprava za isporuku u obliku olovke koja ima primenu u subkutanoznoj isporuci farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na SOLOSTAR™ pen (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), samo nekoliko navedenih.

[0159] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena u sistemu kontrolisanog oslobađanja. U jednom izvođenju, može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). U drugom izvođenju, mogu se koristiti polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još drugom izvođenju, sistem kontrolisanog oslobađanja može biti postavljen u blizini mete kompozicije, time zahtevajući samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja su razmatrani u pregledu od strane Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0160] Injektabilni preparati mogu uključiti dozne oblike za intravenozne, subkutanozne, intrakutanozne i intramuskularne injekcije, infuzije ukapavanjem, itd. Ovi injektabilni preparati mogu se dobiti postupcima poznatim javnosti. Na primer, injektabilni preparati se mogu dobiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njihovih gore opisanih soli u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji je uobičajeno korišćen za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki rastvor soli, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druga dodatna sredstva, itd., koja se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za solubilizaciju kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonsko površinski aktivno sredstvo [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, koriste se, npr., susamovo ulje, ulje sojinog zrna, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Na taj način dobijena injekcija je poželjno napunjena u odgovarajuću ampulu.

[0161] Kao prednost, ovde opisane farmaceutske kompozicije za oralnu i parentalnu upotrebu pripremljene su u doznim oblicima u jediničnoj dozi koja je pogodna da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina sadržanog prethodno pomenutog antitela je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, poželjno je da se prethodno pomenuto antitelo nalazi u oko 5 to oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike.

Terapeutske upotrebe molekula koji vezuju antigen

[0162] Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupke koji sadrže davanje subjektu kome je potrebno terapeutske kompozicije koja se sastoji iz antitela protiv tumora ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen koje specifično slabo vezuje ili nema detektabilno vezivanje za CD i vezuje tumor koji je povezan sa antigenom. Terapeutska kompozicija može sadržati bilo koje od antitela ili bispecifičnih molekula koji vezuju antigen kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača. Kao što je ovde korišćen, izraz "subjekt kome je potrebno" označava humanu ili ne humanu životinju koja ispoljava jedan ili više simptoma ili indikacije kancera (npr., subjekt koji eksprimuje tumor ili pati od bilo kojih kancera ovde pomenutih u nastavku), ili koji bi na bilo koji drugi način ima koristi od inhibicije ili smanjenja u tumorskoj aktivnosti ili depleciji tumorskih ćelija (npr., PSMA++ ćelije kancera prostate).

[0163] Antitela i bispecifični antigen-vezujući molekuli iz pronalaska (i terapeutske kompozicije koje sadrže iste) korisni su, između ostalog, za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja u kome bi stimulacija, aktivacija i/ili ciljane imunog odgovora bilo od koristi. Posebno, bispecifični antigen-vezujući molekuli iz predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ili je posredovan sa ćelijom koja eksprimuje TAA, npr. ekspresija PSMA ili aktivnost ili proliferacija PSMA+ ćelija. Mehanizam delovanja kojim su postignuti terapeutski postupci iz pronalaska uključuju ubijanje ćelija koje eksprimuju antigene povezane sa tumorom, u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, sa CDC, apoptozom, ADCC, fagocitozom, ili kombinovanjem dva ili više navedenih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju antigene povezane sa tumorom, kao što su PSMA, MUC16, STEAP2 ili EGFRvIII, koje mogu biti inhibirane ili ubijene korišćenjem bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iz pronalaska uključuju, na primer, ćelije tumora prostate.

[0164] Molekuli koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje, npr., primarnih i/ili tumora koji su metastazirali koji nastaju u mozgu i moždanim ovojnicama, glavi i vratu, orofarinksu, plućima i bronhijalnom stablu, gastrointestinalnom traktu, muškom i ženskom reproduktivnom traktu, mišićima, kostima, koži i dodacima, vezivnom tkivu, slezini, imunskom sistemu, ćelijama koje obrazuju krv i kostnoj srži, jetri i urinarnom traktu, bubregu, bešici i/ili posebnim senzornim organima poput oka. U određenim izvođenjima, bispecifični antigen-vezujući molekuli iz pronalaska korišćeni su za lečenje jednog ili više od, ali bez ograničenja na, sledeće kancere: kancer pankreasa, kancer glave i vrata, kancer prostate, maligne gliome, osteosarkom, kolorektalni kancer, kancer želudca (npr., kancer želudca sa MET umnožavanjem), maligni mezoteliom, multipli mijelom, kancer jajnika, kancer malih ćelija pluća, kancer nemalih ćelija pluća, sinovijalni sarkom, kancer tireoidee, kancer dojke, melanomagliom, kancer dojke (npr. duktalni ili intraduktalni karcinom dojke, karcinom skvamoznih ćelija, kancer jednjaka, karcinom bubrežnih ćelija bistrih ćelija, hromofobni karcinom bubrežnih ćelija, (renalni) onkocitom, (renalni) karcinom prelaznih ćelija, urotelni karcinom, (bešika) adenokarcinom, ili (bešika) karcinom malih ćelija. Prema određenim izvođenjima iz predmetnog pronalaska, bispecifična antitela su korisna za lečenje pacijenta koji su oboleli od refraktornog ili kancera koji je rezistentan na lečenje, npr. karcinom prostate otporan na kastraciju. Prema primerima slučaja iz prikaza, obezbeđeni su postupci koji se sastoje iz davanja anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnog molekula koji vezuje antigen kao što je ovde prikazano pacijentu koji je pogođen sa kancerom prostate rezistentnim na kastraciju. Analitički/dijagnostički postupci koji su poznati u oblasti tehnike, kao što je skeniranje tumora, itd., mogu se koristiti da se utvrdi da li pacijent ima tumor koji je otporan na kastraciju.

[0165] Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupke za lečenje rezidualnog kancera kod subjketa. Kao što je ovde korišćen, termin "rezidualni kancer" označava postojanje ili postojanost jedne ili više kanceroznih ćelija u subjektu nakon tretmana sa terapijom protiv kancera, kao što je prvolinijska (osnovna) ili standardna terapija.

[0166] U skladu sa određenim aspektima, predmetni prikaz se odnosi na postupke za lečenje kancera koji je povezan sa ekspresijom TAA (npr., kancer prostate povezan sa ekspresijom PSMA ili ekspresijom STEAP2, glioblastom povezan sa ekspresijom EGFRvIII, ili kancer jajnika povezan sa ekspresijom MUC16) koji obuhvata davanje jednog ili više bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde na drugom mestu opisani subjektu nakon što je utvrđeno da subjekt ima kancer. Na primer, predmetni prikaz uključuje postupke za lečenje kancera prostate koji obuhvataju davanje anti-CD3/anti-TAA bispecifičnog molekula koji vezuje antigen pacijentu 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje ili 4 nedelje, 2 meseca, 4 meseca, 6 meseci, 8 meseci, 1 godinu, ili više nakon što je subjekt primio prethodnu terapiju.

Kombinovane terapije i formulacije

[0167] Predmetni prikaz se takođe odnosi na postupke koji obuhvataju davanje farmaceutske kompozicije koja se sastoji iz bilo kojih od primera antitela i bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde opisani u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava. Primeri dodatnih terapeutskih sredstava koja se mogu kombinovati sa ili davati u kombinaciji sa molekulom koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska uključuju, npr., anti-programirana ćelijska smrt 1 antitelo (npr. anti-PD1 antitelo kao što je opisano u U.S. Pat. Appln. Pub. No. US2015/0203579A1), anti-programirana ćelijska smrt Ligand-1 (npr. anti-PD-L1 antitelo kao što je opisano u U.S. Pat. Appln. Pub. No. US2015/0203580A1), EGFR antagonist (npr., anti-EGFR antitelo [npr., cetuksimab ili panitumumab] ili mali molekul inhibitor EGFR [npr., gefitinib ili erlotinib]), antagonist drugog člana familije EGFR kao što je Her2/ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 (npr., anti-ErbB2, anti-ErbB3 ili anti-ErbB4 antitelo ili mali molekul inhibitor ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 aktivnosti), antagonist EGFRvIII (npr., antitelo koje specifično veže EGFRvIII), cMET anagonist (npr., anti-cMET antitelo), IGF1R antagonist (npr., anti-IGF1R antitelo), B-raf inhibitor (npr., vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α inhibitor (npr., anti-PDGFR-a antitelo), PDGFR-β inhibitor (npr., anti-PDGFR-β antitelo), VEGF antagonist (npr., VEGF-Trap, videti, npr., US 7,087,411 (takođe ovde naznačen sa "VEGF-inhibitorni fuzioni protein"), anti-VEGF antitelo (npr., bevacizumab), mali molekul kinazni inhibitor VEGF receptora (npr., sunitinib, sorafenib ili pazopanib)), DLL4 antagonist (npr., anti-DLL4 antitelo koje je prikazano u US 2009/0142354 kao što je REGN421), Ang2 antagonist (npr., anti-Ang2 antitelo koje je prikazano u US 2011/0027286 kao što je H1H685P), FOLH1 (PSMA) antagonist, PRLR antagonist (npr., anti-PRLR antitelo), STEAP1 ili STEAP2 antagonist (npr., anti-STEAP1 antitelo ili anti-STEAP2 antitelo), TMPRSS2 antagonist (npr., anti-TMPRSS2 antitelo), MSLN antagonist (npr., anti-MSLN antitelo), CA9 antagonist (npr., anti-CA9 antitelo), antagonist uroplakina (npr., anti-uroplakin antitelo), itd. Druga sredstva koja se mogu pogodno davati u kombinaciji sa molekulima koji vezuju antigen iz pronalaska uključuju inhibitor citokina, uključujući male molekule inhibitore citokina i antitela koja vezuju citokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, ili za njihove odgovarajuće receptore. Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska (npr., farmaceutske kompozicije koje se sastoje iz anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnog molekula koji vezuje antigen kao što je ovde opisan) može se takođe davati kao deo terapeutskog režima koji se sastoji iz jedne ili više terapeutske kombinacije izabrane od "ICE": ifosfamida (npr., Ifex®), karboplatina (npr., Paraplatin®), etoposida (npr., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": deksametazona (npr., Decadron®), citarabina (npr., Cytosar-U®, citozin arabinosida, ara-C), cisplatina (npr., Platinol®-AQ); i "ESHAP": etoposida (npr., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolona (npr., Medrol®), visoke doze citarabina, cisplatina (npr., Platinol®-AQ).

[0168] Predmetni prikaz se takođe odnosi na terapeutske kompozicije koje se sastoje iz bilo kojih od molekula koji vezuju antigen koji su ovde pomenuti i inhibitora jednog ili više od VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakina, ili bilo kog od prethodno pomenutih citokina, pri čemu je inhibitor aptamer, antisens molekul, ribozim, siRNK, peptitelo, nanotelo ili fragment antitela (npr., Fab fragment; F(ab’)2 fragment; Fd fragment; Fv fragment; scFv; dAb fragment; ili drugi modifikovani molekuli, kao što su diatela, triatela, tetratela, minitela i minimalne jedinice za prepoznavanje). Molekuli koji vezuju antigen iz pronalaska mogu se takođe davati i/ili zajedno formulisati u kombinaciji sa antivirusnim sredstvima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima i/ili NSAIDs. Molekuli koji vezuju antigen iz pronalaska mogu se takođe davati kao deo režima tretmana koji takođe uključuje terapiju zračenjem i/ili konvencionalnu hemoterapiju.

[0169] Dodatne terapeutski aktivne komponent(e) mogu se davati neposredno pre, istovremeno sa, ili odmah nakon davanja molekula koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska; (za svrhe iz predmetnog prikaza, takvi režimi davanja se smatraju kao davanje molekula koji vezuje antigen "u kombinaciji sa" dodatnom terapeutski aktivnom komponentom).

[0170] Predmetni pronalazak uključuje farmaceutske kompozicije u kojima molekul koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska je istovremeno formulisan sa jednom ili više od dodatnih terapeutski aktivnih komponenti(ata) kao što je ovde na drugom mestu opisano.

Režimi davanja

[0171] Prema određenim slučajevima iz predmetnog prikaza, višestruke doze bispecifičnog molekula koji vezuje antigen (npr., anti-TAA bispecifični molekul koji vezuje antigen) mogu se davati subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci u skladu sa ovim aspektom iz prikaza sadrže sekvencijalno davanje subjektu višestruke doze molekula iz pronalaska koji vezuje antigen. Kao što je ovde korišćeno, "sekvencijalno davanje" označava da je svaka doza molekula koji vezuje antigen davana subjektu u različitom trenutku u vremenu, npr., u različitim danima razdvojenim sa prethodno definisanim intervalom (npr., satima, danima, nedeljama ili mesecima). Predmetni prikaz uključuje postupke koji obuhvataju sekvencijalno davanje pacijentu jedne početne doze molekula koji vezuje antigen, praćeno sa jednom ili više sekundarnih doza molekula koji vezuje antigen, i po potrebi praćeno sa jednom ili više tercijernih doza molekula koji vezuje antigen.

[0172] Termini "početna doza," "sekundarne doze," i "tercijerne doze," odnose se na vremenski redosled davanja molekula iz pronalaska koji vezuje antigen. Prema tome, "početna doza" je doza koja je davana na početku režima tretmana (takođe se naziva "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje su davane nakon početne doze; i "tercijerne doze" su doze koje su davane nakon sekundarnih doza. Početne, sekundarne, i tercijerne doze mogu svaka sadržati istu količinu molekula koji vezuje antigen, ali se generalno mogu razlikovati jedna od druge u pogledu učestalosti davanja. U određenim slučajevima, međutim, količina molekula koji vezuje antigen koja se nalazi u početnim, sekundarnim i/ili tercijernim dozama razlikuje se jedna od druge (npr., podesiti gore ili dole prema potrebi) tokom trajanja tretmana. U određenim slučajevima, dve ili više (npr., 2, 3, 4, ili 5) doze su davane na početku režima tretmana kao "doze opterećenja" a zatim slede sledeće doze koje su davane na manje učestaloj osnovi (npr., "doze za održavanje").

[0173] U jednom primeru slučaja iz predmetnog prikaza, svaka sekundarna i/ili tercijerna doza je davana 1 do 26 (npr., 1, 1<1>/2, 2, 2<1>/2, 3, 3<1>/2, 4, 4<1>/2, 5, 5<1>/2, 6, 6<1>/2, 7, 7<1>/2, 8, 8<1>/2, 9, 9<1>/2, 10, 10<1>/2, 11, 11<1>/2, 12, 12<1>/2, 13, 13<1>/2, 14, 14<1>/2, 15, 15<1>/2, 16, 16<1>/2, 17, 17<1>/2, 18, 18<1>/2, 19, 19<1>/2, 20, 20<1>/2, 21, 21<1>/2, 22, 22<1>/2, 23, 23<1>/2, 24, 24<1>/2, 25, 25<1>/2, 26, 26<1>/2, ili više) nedelja neposredno nakon prethodne doze. Fraza "neposredno nakon prethodne doze," kao što je ovde korišćena, označava, u nizu višestrukih davanja, dozu molekula koji vezuje antigen koja je davana pacijentu pre davanja sledeće doze u nizu bez međudoza.

[0174] Postupci prema ovom aspektu iz prikaza mogu sadržati davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijernih doza molekula koji vezuje antigen (npr., anti-TAA bispecifičan molekul koji vezuje antigen). Na primer, u određenim slučajevima, samo jedna pojedinačna doza je davana pacijentu. U drugim slučajevima, dva ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza su davane pacijentu. Slično tome, u određenim slučajevima, samo jedna tercijerna doza je davana pacijentu. U drugim slučajevima, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijernih doza su davane pacijentu.

[0175] U slučajevima koji uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može se davati sa istom učestalosti kao druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza se može davati pacijentu 1 do 2 nedelje neposredno nakon prethodne doze. Slično tome, u slučajima koji uključuju višestruke tercijarne doze, svaka tercijerna doza može se davati u istoj učestalosti kao druge tercijerne doze. Na primer, svaka tercijerna doza može se davati pacijentu 2 do 4 nedelje neposredno nakon prethodne doze. Alternativno, učestalost u kojoj su sekundarne i/ili tercijarne doze koje su davane pacijentu mogu se razlikovati tokom trajanja režima tretmana. Učestalost davanja se može prilagoditi tokom trajanja tretmana od strane lekara u zavisnosti od potreba individualnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

PRIMERI

[0176] Primeri koji slede su izloženi da bi predstavili običnom stručnjaku iz oblasti tehnike potpuni prikaz i opis kako napraviti i koristiti kompozicije iz pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da bi se osigurala tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperatura, itd.) ali treba računati na određene eksperimentalne greške i devijacije. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi u odnosu na masu, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperature je u stepenima celzijusa, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1: Dobijanje Anti-CD3 Antitela

[0177] Sledeći postupci imaju za cilj identifikovanje antitela koja specifično prepoznaju CD3 (T ćelijski koreceptor) kao antigen.

[0178] Grupa anti-CD3 antitela je izvedena imunizovanjem genetički modifikovanih miševa. Ukratko, miševi su genetički modifikovani da eksprimuju reverzno himerno (humani varijabilni, mišji konstantni) i teški lanci imunoglobulina su povezani sa jednim preuređenim lakim lancem (npr., Vκ1-39/J ili Vκ3-20/J), su imunizovani sa CD3 antigenom i generisane B ćelije koje su obuhvatile raznovrsnost humanih VH rearanžmana da bi se eksprimirao različit repertora visoko afinitetnih antigen-specifičnih anitela. Određeni primeri antitela koja su opisnana u predmetnoj prijavi dobijena su rekombinantim načinom i eksprimiraju istu sekvencu lakog lanca Vκ1-39JK5 (LCVR koja je predstavljena u SEQ ID NO: 162), dok druga antitela koja su dobijena rekombinantno eksprimiraju srodni laki lanac jednog od kraka teškog lanca (npr. kraka koji cilja tumor).

[0179] Dobijena antitela su ispitana za afinitet prema humanom i CD3 antigenu cinomolgus majmuna u in vitro testu vezivanja, i npr. jedno CD3 antitelo: naznačen CD3-VH-P (HCVR predstavljen u SEQ ID NO: 154) je identifikovan, među nekoliko drugih, za koje je pronađeno da se vezuju za human i cino CD3 koji ima EC50između 1 i 40 nM afiniteta (+++), kao što je određeno FACS titracijom Jurkat ćelija i cinomolgus T ćelija, redom. Videti, npr. FACS eksperimente vezivanja koji su prikazani u Primeru 4 ovde u nastavku.

[0180] Germinativni aminokiselinski ostaci CD3-VH-P su nakon toga identifikovani i antitelo naznačeno sa "CD3-VH-G" je modifikovano da sadrži samo germinativne regione okvira. Drugi derivati antitela su modifikovani sa dobro poznatim postupcima molekularnog kloniranja da bi se aminokiselinski ostaci zamenili na postepen način zasnovano na razlikama između germinativne sekvence i CD3-VH-P sekvende. Svaki derivate antitela je dat kao "CD3-VH-G" numerička naznaka. Videti Tabelu 1 i Sliku 1.

[0181] Bispecifična antitela, koja se sastoje iz prvog kraka za vezivanja koji je izveden iz modifikovanih anti-CD3 antitela sa naznačenjima i opisima prikazanim u Tabeli 1, i drugi krak za vezivanje koji je izveden iz anti-TAA antitela, dobijeni su i testirani za monovalentni afinitet prema ćelijama koje nose

4

CD3 u FACS testu (kao što je opisano u Primeru 4). Rezultati monovalentnog afiniteta vezivanja ovih bispecifičnih antitela prikazani su u dve desne kolone u Tabeli 1. U specifičnim primerima, bispecifična antitela koja imaju TAA-vezujući krak i CD3-vezujući kraj sa naznakama "CD3-VH-G," "CD3- VH-G5," i "CD3-VH-G20," redom, veže Jurkat ćelije sa EC502.7E-08, bez detektabilnog vezivanja, i 5.5E-07, redom.

Tabela 1: Mutacije u CDRs zasnovane na germinativnoj sekvenci i odgovarajućem FACS afinitetu vezivanja za svako modifikovano antitelo

[0182] Dok su CD3-VH-G i neka druga modifikovana antitela zadržala njihov afinitet vezivanja kao što se može videti u FACS testovima, nekoliko anti-CD3 antitela koja su vezana za humani ili cino CD3 in vitro sa slabom (+/-) ili bez (-) merljivog afiniteta. Afiniteti vezivanja, kinetike vezivanja, i druga biološka svojstva da bi se razjasnila toksičnost i farmakokinetički profili (pK) naknadno su ispitani za bispecifična antitela koja sadrže primer anti-CD3 antitela koja su dobijena u skladu sa postupcima iz ovog primera, i detaljno su opisana u primerima koji su predstavljeni u tekstu ispod.

Primer 2: Varijabilni regioni teškog i lakog lanca (sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina CDRs)

[0183] Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina određene su za svaku sekvencu teškog lanca antitela. Svakom teškom lancu antitela, kao derivatu germinativne sekvence IGHV3-9*01/D5-12*01/J6*02 (SEQ ID NO: 181) dodeljena je "G" naznaka broja za konzistentnu nomenklaturu. Tabela 2 predstavlja identifikatore varijabilnih regiona aminokiselinskih sekvenci teškog lanca i CDRs modifikovanih anti-CD3 antitela iz prikaza. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline su predstavljeni u Tabeli 3. Identifikatori aminokiselinske i nukleinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca i CDRs da bi se konstruisalo svako rekombinantno antitelo takođe su identifikovane ispod u tabelama 4 i 5, redom.

Tabela 2: Identifikatori aminokiselinske sekvence teškog lanca

Tabela 3: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline teškog lanca

(nastavak)

4

Tabela 4: Identifikatori aminokiselinske sekvence lakog lanca

Tabela 5: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline lakog lanca

[0184] Kontrolno 1 antitelo naznačeno sa "CD3-L2K" je konstruisano na osnovu poznatog anti-CD3 antitela (tj., anti-CD3 antitela "L2K" kao što je predstavljeno u WO2004/106380).

[0185] Antitelo za kontrolu izotipa, naznačeno ovde ispod u Primerima, je antitelo usklađeno sa izotipom (modifikovano IgG4) koje interaguje sa irelevantnim antigenom, tj. FelD1 antigenom.

Primer 3: Dobijanje ULC Bispecifičnih antitela koja se vezuju za CD3 i antigene koji su povezani sa tumorom (TAA)

[0186] Bispecifična antitela koja se sastoje iz anti-CD3-specifičnog domena za vezivanje i anti-TAA-specifičnog domena za vezivanje, kao što su PSMA, EGFRvIII, MUC16, ili STEAP2, konstruisana su upotrebom standardnih metodologija molekularne biologije korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela koje je ovde opisano, teškog lanca iz anti-TAA antitela i zajedničkog lakog lanca ili univerzalnog lakog lanca (ULC). Anti-TAA antitela koja su korišćena za konstrukciju bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska dobijena su imunizovanjem genetički modifikovanih miševa.

[0187] Pregled sastavnih delova domena koji vezuju antigen iz različitih bispecifičnih antitela dobijenih u skladu sa ovim Primerom predstavljen je u tekstu ispod u Tabelama 6, 7 i 8. Sva bispecifična antitela su dobijena da imaju modifikovani (himerni) IgG4 Fc domen kao što je predstavljen u US Prijavi patenta Objavi br. US20140243504A1, koja je publikovana 28 avgusta, 2014. Primer EGFRvlllxCD3 bispecifičnih antitela može se dobiti korišćenjem bilo kog od varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca (ili CDRs) bilo kojih od EGFRvIII antitela koja su razmotrena u US rijavi patenta Objavi br. US20150259423, u kombinaciji sa varijabilnim regionima CDRs bilo kojih od anti-CD3 antitela koja se ovde razmatraju.

Tabela 6: Konstrukcija PSMAxCD3 Bispecifičnih antitela

4

Tabela 7: Konstrukcija EGFRvIII xCD3 bispecifičnih antitela

Tabela 8: Konstrukcija MUC16xCD3 bispecifičnih antitela

Tabela 9: Konstrukcija STEAP2xCD3 Bispecifičnih antitela

4

[0188] Svaki od primera bispecifičnih antitela su ispitani u različitim biotestovima kao što je ovde dole u tekstu opisano.

Primer 4: Afiniteti vezivanja primera bispecifičnih antitela kao što je mereno sa FACS analizom

[0189] U ovom primeru, sposobnost CD3xTAA bispecifičnih antitela da se vežu za humane i cinomolgus CD3-eksprimirajuće ćelijske linije određivana je korišćenjem FACS analize. Dodatno, takođe je potvrđena sposobnost ovih bispecifičnih antitela da se vežu za ciljane specifične (TAAspecifične) ćelijske linije. Kao što je gore opisano, različita bispecifična antitela iz ovog primera koristila su pojedinačni TAA-specifični vezujući krak (PSMA, EGFRvIII, MUC16, ili STEAP2; videti Primer 3, Tabele 6, 7 i 8) uparene sa jednim od panela anti-CD3 vezujućih krakova (videti Primere 1 i 2 ovde gore navedene) i zajednički laki lanac. Kao što je takođe prikazano u Primeru 5, CD3xTAA bispecifična antitela ispoljila su opseg afiniteta prema humanom rastvorljivom heterodimernom hCD3ε/δ. mFc proteinu preko površinske plazmonske rezonance.

[0190] Ukratko, 2x10<5>ćelija/bunariću humanih Jurkat ćelija koje eksprimuju CD3, cinomolgus T ili TAA-specifičnih eksprimirajućih ćelija su inkubirane sa serijskim razblaženim bispecifičnim antitelima u trajanju od 30 min na 4°C. Nakon inkubacije, ćelije su isprane i kozje F(ab’)2anti-humano Feγ PE obeleženo sekundarno (Jackson Immunolabs) je dodato u ćelije u trajanju od dodatnih 30 min. Sledeće, ćelije su isprane, re-suspendovane u hladnom PBS 1% BSA i analizirane su protočnom citomerijom na BD FACS Canto II.

[0191] Za FACS analizu, ćelije su zatvorene “gejtovane” visinom rasipanja napred vs. na područje rasipanja napred za selekciju pojedinačnih događaja, praćeno sa bočnim i rasipanjem napred. EC50za titraciju vezivanja ćelija je određeno korišćenjem PRISM™ sofvera (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Vrednosti su izračunate korišćenjem ne-linearne regresione analize sa 4 parametra.

Tabela 10A: FACS Vezivanje na CD3 i PSMA-Specifičnim linijama ćelija

(nastavak)

4

Tabela 10B: FACS vezivanje na CD3 i EGFRvIII-Specifičnim linijama ćelija

Tabela 10C: FACS vezivanje na CD3 i MUC16-Specifičnim linijama ćelija

[0192] Kao što je prikazano u Тabeli 10A, CD3 vezujući kraci svakog od CD3xPSMA bispecifičnog antitela ispoljili su opseg afiniteta ćelijskog vezivanja za humane Jurkat ćelije koje eksprimuju CD3 (15 do 300 nM EC50opseg). Važno, CD3 kraci koji su pokazali slabo do odsustvo vezivanja za humani CD3 heterodimerni protein pomoću površinske plazmonske rezonance (videti Tabela 11 ovde ispod) takođe su u korelaciji sa slabom do bez uočljivog vezivanja za Jurkat ćelije (tj. CD3-VH-G2, CD3-VH-G3, CD3-VHG5). Ne-detektabilno vezivanje, ili bez detektabilnog vezivanja, u FACS testu ili ekvivalentnom testu označava da je afinitet između antitela i njegovog ciljnog antigena izvan granice detekcije testa (npr. > 1 µM). Nekoliko CD3-vezujućih kraka takođe je ispoljilo unakrsnu reaktivnost sa cinomolgus T-ćelijama. Sva ispitana bispecifična antitela pokazala su slično vezivanje ćelija na respektivnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju PSMA, EGFRvIII i MUC16, potvrđujući da bispecifično uparivanje sa individualnim CD3 kracima nije imalo uticaja ili umanjilo TAA-specifično vezivanje (TAA-specifično vezivanje je manje od ili jednako sa 5.6 nM (visok afinitet) u svim ispitanim primerima).

[0193] Antitela koja ispoljavaju slabo do bez detektabilnog vezivanja za humani CD3, i takođe ispoljavaju slabo do bez vezivanja za CD3 cinomolgusa, su smatrana korisnim za bispecifično uparivanje vođeno aviditetom u skladu sa predmetnim pronalaskom, i dalje su ispitana za citotoksičnost u in vitro i in vivo testovima.

Primer 5: Afiniteti vezivanja antitela iz primera kao što je mereno testom vezivanja površinske plazmon rezonance

4

[0194] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante anti-TAA x anti-CD3 bispecifičnih antitela prema rastvorljivom heterodimernom hCD3ε/δ.mFc proteinu (hCD3ε =UniProtKB/Swiss-Prot: P07766.2; SEQ_ID NO: 169; hCD3δ = UniProtKB/Swiss-Prot: P04234.1, SEQ ID NO: 170) određene su površinskom plazmon rezonancom na 37°C korišćenjem ili formata za vezivanje antigena (Tabela 11) ili formata za vezivanje antigena (podaci nisu prikazani). U ovom primeru, BSPSMA/CD3 bispecifična antitela su korišćena kao kao što ova uparivanja predstavljaju upotrebu šireg panela antitela za CD3 vezujući krak. Merenja su sprovedena na Sierra Sensors MASS-1 instrumentu.

[0195] U format za hvatanje antigena, MASS-1 površina senzora amina visoke gustine je derivatizovana sa kozjim antimišjim IgG2a poliklonskim antitelom (Southern Biotech). Rastvorljivi heterodimerni CD3 protein je uhvaćen i odgovarajuća antitela su ubrizgana preko uhvaćenog antigena.

[0196] Konstante brzine kinetičkog vezivanja (ka) i disocijacije (kd) određene su obradom i uklapanjem podataka u 1:1 model vezivanja korišćenjem MASS-1 AnalyserR2 softvera za podešavanje krive. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i polu-život disocijacie (t1/2) izračunati su iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ ka; i t1/2(min) = (In2/(60*kd).

Tabela 11: Afiniteti anti-CD3 bispecifičnih Antitela prema rastvorljivom CD3

4

[0197] Kao što je prikazano u Tabeli 11, svaki od izvedenih anti-CD3xanti-PSMA bispecifičnih antitela održali su veoma slabo vezivanje za rastvorljivi CD3 u testu vezivanja površinske plazmonske rezonancije, npr. imajući KDvrednost veću od 11 nM do 334 nM koja je slabija od one za bispecifični anti-CD3 krak koji je izveden iz germinativnih (zametne linije) regiona okvira, CD3-VH-G.

[0198] Nekoliko bispecifičnih antitela ispoljilo je vrednosti koje su veće od 50 nM KD, i neke su veće od 100 nM (>1x10<-7>) KDvrednosti (tj. BSPSMA/CD3-900, BSPSMA/CD3-1000, BSPSMA/CD3-1900), veće od 300 nM (>3x10<-7>) KDvrednosti (tj. BSPSMA/CD3-005) i čak izvan granice detekcije testa (> 500 nM; >5x10<-7>), tj. ne pokazuju detektabilno vezivanje za rastvorljivi humani CD3 (tj. BSPSMA/CD3-200, BSPSMA/CD3-300, BSPSMA/CD3-400, BSPSMA/ CD3-004 i BSPSMA/CD3-1800).

Primer 6: Aktivacija T ćelija i tumor-specifična citotoksičnost ispoljena od strane bispecifičnih antitela iz primera kao što je mereno In Vitro

[0199] U ovom primeru, specifično ubijanje PSMA, EGFRvIII ili MUC16-eksprimujućih TAA ciljnih ćelija u prisustvu CD3-zasnovanih bispecifičnih antitela praćena je preko protočne citometrije. Kao što je prethodno prijavljeno, bispecifična antitela su ispoljila opseg antitela prema CD3 proteinu i CD3-eksprimujućim ćelijskim linijama (tj. slabo, umereno i slabo vezivanje). Ovaj isti panel bispecifičnih antitela je ispitan za sposobnost indukovanja naivnih humanih T-ćelija da preusmere ubijanje prema ciljnim eksprimujućim ćelijama.

[0200] Ukratko, linije ćelija koje eksprimuju PSMA (C4-2, 22Rv1 i TRAMPC2_PSMA), eksprimuju EGFRvIII (U87/EGFRvIII) ili eksprimuju MUC16 (OVCAR3) su obeležene sa 1 µM fluorescentnom bojom Violet Cell Tracker za praćenje. Nakon obeležavanja, ćelije su zasejane preko noći na 37°C. Odvojeno, humane PBMCs su zasejane u dopunjenom RPMI medijumu na 1x10<6>ćelija/mL i inkubirane preko noći na 37°C da bi se obogatilo sa limfocitima preko deplecije adherentnih makrofaga, dendritičnih ćelija, i nešto monocita. Sledećeg dana, ciljne ćelije su istovremeno inkubirane sa adherentnim ćelijski depletiranim naivnim PBMC (efektor/ciljna ćelija 4:1 odnos) i serijski razblaženim relevantnim bispecifičnim antitelima ili kontrolom izotipa (koncentracioni opseg: 66.7nM prema 0.25pM) tokom 48 h na 37°C. Ćelije su uklonjene sa ploča za kulture ćelija korišćenje pufera za disocijaciju ćelija bez enzima, i analizirane su sa FACS.

[0201] Za FACS analizu, ćelije su obojene sa daleko crvenim tragačem mrtvih/živih ćelija (Invitrogen).

5x10<5>zrnaca za brojanje je dodato u svaki bunarić neposredno pre FACS analize. 1x10<4>zrnaca je sakupljeno za svaki uzorak. Za procenu specifičnosti ubijanja, ćelije su “gejtovane” na živim Violet obeleženim populacijama. Zabeležen je procenat žive populacije i korišćen je za izračunavanje normalizovanog preživljavanja.

[0202] Aktivacija T ćelija je procenjena inkubiranjem ćelija sa direktno konjugovanim antitelima sa CD2 i CD69, i prijavljivanjem procenta aktivisanih (CD69+) T ćelija od ukupnih T ćelija (CD2+).

[0203] Kao što rezultati u Tabelama 12A-12C pokazuju, (iscrpljivanje) deplecija TAA-eksprimujućih ćelija je uočena sa anti-PSMA, EGFRvIII ili MUC16xCD3 bispecificima. Većina od ispitanih bispecifičnih antitela aktivirala je i usmerila humane T ćelije za depleciju ciljnih ćelija sa EC50s u pikomolarnom opsegu. Dodatno, uočena liza ciljnih ćelija (deplecija) bila je povezana sa pojačanom regulacijom CD69 ćelija na CD2+ T ćelijama, sa pikomolarnim (pM) EC50s.

[0204] Važno, rezultati iz ovog primera pokazuju da nekoliko bispecifika koji su koristili CD3 vezujući krak koji je ispoljio slabo-do-ne uočljivo vezivanje sa CD3 proteinom ili CD3-eksprimujućim ćelijama (tj. CD3-VH-G5) i dalje je zadražao sposobnost da aktivira T-ćelija i ispoljio je snažnu citotoksičnost tumorskih ćelija koje prezentuju antigen.

Tabela 12A: Citotoksičnost i svojstva aktivacije T-ćelija izabranih PSMAxCD3 Bispecifičnih Antitela

(nastavak)

1

Tabela 12B: Citotoksičnost i svojstva aktivacije T-ćelija izabranih EGFRvlllxCD3 Bispecifičnih

Antitela

Tabela 12C: Citotoksičnost i svojstva T-ćelijske aktivacije izabranih MUC16xCD3 Bispecifičnih antitela

Primer 7: Anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela ispoljavaju potentnu efikasnost protiv tumora in vivo

[0205] Da bi se odredila in vivo efikasnost primera anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih antitela koja su identifikovana da imaju slabe ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja za humane i cinomolgus CD3, sprovedena su ispitivanja kod imunokompromitovanih miševa koji nose humane ksenografte kancera prostate. Takođe su izvedene dodatne studije kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenografte mišjeg kancera prostate modifikovane da eksprimuju humani PSMA.

Efikasnost anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih antitela u modelima ksenografta humanih tumora

[0206] Da bi se ispitala in vivo efikasnost anti-PSMA/anti-CD3 bispecifika u studijama ksenografta humanog tumora, NOD scid gama (NSG) miševi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) su istovremeno primili transplant sa humanim mononuklearnim ćelijama iz periferne krvi (PBMCs) zajedno sa 22Rv1 C4-2 ćelija humanog tumora prostate koje endogeno eksprimuju PSMA.

[0207] Ukratko, 4x10<6>22Rv1 ili 5x10<6>C4-2 ćelije (MD Anderson, TX) ćelije su zajedno implantirane s.c. sa 1x10<6>humanim PBMCs (ReachBio, LLC., Seattle, WA) u 50:50 mešavini matrigel matriksa (BD Biosciences) u desni bok mužjaka NSG miševa. U C4-2 studiji, miševi su tretirani i.p. u danu 0, 4, i 7 posle implantacije tumora sa 0.1 mg/kg BSPSMA/CD3-003 ili BSPSMA/CD3-005.

[0208] U dodatnom ksenogenom modelu, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifici ispitani su kod miševa kojima su presađene humane hematopoetske CD34+ matične (eng. stem) ćelije. Ukratko, novorođenim SIRPα BALB/c-Rag2- IL2rγ- (BRG) mladucima su presađene hCD34+fetalne ćelije jetre.3-6 meseci kasnije hCD34-presađeni SIRPα BRG miševima su nakon toga implantirane C4-2 ćelije (5x10<6>s.c. u matrigelu). 8 dana kasnije, miševi su tretirani sa 10 µg BSPSMA/CD3-004 ili kontrolom izotipa antitela, praćeno sa 2x/nedeljnim dozama tokom ispitivanja.

[0209] U svim ispitivanjima, veličina tumora je merena 2x/nedeljno upotrebom kalipera i zapremina tumora je izračunata kao Zapremina = (dužina x širina<2>)/2.

[0210] Kao što rezultati u Tabeli 13 pokazuju, sva bispecifična antitela koja su ispitana u gore opisanim ksenogenim modelima bila su efikasna u supresiji tumorskog rasta u poređenju sa tretmanom sa kontrolom izotipa.

2

Tabela 13: Supresija tumorskog rasta davanjem Anti-PSMA/Anti-CD3 Bispecifičnih antitela ksenogenskim mišjim modelima

[0211] Dodatno, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifici su procenjeni za aktivnost protiv tumora u imunokompetentnom modelu. Miševi koji su humanozovani za tri lanca (δγε) CD3 takođe su humanizovani za PSMA i implantirani su sa varijantom mišje ćelijske linije kancera prostate TRAMP-C2 transfektovane sa humanim PSMA.

[0212] Pre početka studije, dobijena je varijanta tumorigene ćelijske linije TRAMP-C2_hPSMAv#1. Ukratko, 7.5x10<6>TRAMP-C2_hPSMA ćelija je implantirano s.c. u desni bok mužjaka miševa koji su humanizovani za CD3 i PSMA. Tumor je izrezan i isečen u fragmente od 3 mm i nakon toga je implantiran u desni bok novih mužjaka humanizovanih miševa. Tumor koji je nastao iz implantiranih fragmenata tumora je zatim sakupljen i razdvojen u jednu ćelijsku suspenziju. Ove ćelije (TRAMP-C2_hPSMAv#1) su nakon toga kultivisane in vitro pod G418 selekcijom. 4x10<6>ćelija ove varijante ćelijske linije su nakon toga implantirane u desni bok mužjaka PSMA/CD3 humanizovanih miševa za ispitivanja efikasnosti bispecifičnih antitela.

[0213] Humanizovani PSMA/CD3 miševi koji su implantirani sa TRAMPC2_hPSMAv#1 su tretirani sa 100 µg ili 10 µg anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnim antitelom BSPSMA/CD3-004 ili kontrolom izotipa 2x/nedeljno počevši od dana implantacije tumora. Nivoi citokina u serumu 4h posle injekcije takođe su ispitani, kao i nivoi T-ćelija u slezini. Ispitivanje je završeno u Danu 27.

[0214] Kao što rezultati u Tabeli 14 pokazuju, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifični molekul koji je ispitan, BSPSMA/CD3-004, pokazuje efikasnost u značajnom odlaganju tumorskog rasta kroz grupe koje su primile tretman. Minimalno oslobađanje citokina je uočeno nakon davanja BSPSMA/CD3-004, moguće usled slabog vezivanja anti-CD3. Oba ispitana antitela pokazala su efikasnost protiv tumora bez iscrpljivanja (deplecije) T ćelija u slezini.

u

odel

m

nom

nge

si

m

tno

en

pet

kom

ski-un

im

u

tela

anti

ih

nič

cif

spe

Bi

3

-CD

nti

A/a

PSM

ti-n

t a

nos

kas

Efi

4:

1

ela

b

Ta

[0215] Ukratko, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela iz ovog primera ispoljavaju potentnu efikasnost protiv tumora i kod imuno-kompromitovanih i imuno-kompetentnih modela tumora, uprkos tome što se malo ili se uopšte ne vezuje za CD3 antigen.

Primer 8: Anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela ispoljavaju potentnu in vivo efikasnost protiv tumora

[0216] Da bi se odredila in vivo efikasnost primera anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnih antitela identifikovanih da imaju slab ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja za humani i cinomolgus CD3, ispitivanja su sprovedena u imunokompromitovanim miševima koji nose ksenografte kancera prostate kod ljudi. Efikasnost odabranih bispecifičnih antitela je testirana i u modelima doziranja trenutnog neposrednog lečenja i terapijskom tretmanu.

Efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnih antitela u modelima ksenografta tumora kod ljudi

[0217] Da bi se ispitala in vivo efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnih u studijama ksenografta tumora kod ljudi, NOD scid gama (NSG) miševi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) su preimplantirani sa humani mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMCs; ReachBio LLC., Seattle, WA) i zatim su davane ćelije ascita iz ćelijske linije humanog kancera jajnika OVCAR-3 (American Type Tissue Culture, Manassas, VA) transdukovane sa luciferazom (OVCAR-3/Luc). OVCAR-3 ćelije endogeno eksprimuju MUC-16.

[0218] Ukratko, NSG miševima je intraperitonealno ubrizgano (i.p.) 5.0 x 10<6>humanih PBMCs. 8d kasnije, 1.5 x 10<6>ćelija ascita iz OVCAR-3/Luc ćelijske linije, koja je prethodno pasažirana in vivo, davane su i.p. NSG miševima kojima su transplantirane PBMCs. U neposrednog grupi koja prima tretman, miševi su tretirani i.p. u danu OVCAR-3/Luc implantacijom ćelija sa MUC16/CD3 Bispecifičnim antitelima BSMUC16/CD3-001 ili BSMUC16/CD3-005, ili kontrolom izotipa, u dozi od 10ug/mišu (N=5 miševa/grupi koja prima tretman). U terapeutskom doznom modelu, miševi su tretirani i.p.7d nakon implantacije tumora sa MUC16/CD3 Bispecifičnim ili kontrolnim antitelima kao što je gore opisano, u dozi od 10ug/mišu (N=5/grupi koja prima tretman).

[0219] U svim ispitivanjima, rast tumora je praćen pomoć bioluminescentnog snimanja (BLI). Miševima je i.p. ubrizgan luciferazni supstrat D-luciferin suspendovan u PBS (150 mg/kg) i sniman je pod anestezijom izofluranom nakon 10 min. BLI je sproveden korišenjem Xenogen IVIS sistema (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) i BLI signali su ekstrahovani upotrebom Living Image softvera (Xenogen/Perkin Elmer). Regioni od interesa su nacrtani oko svake ćelijske mase i intenziteti fotona su zabeleženi kao fotoni(p)/sec(s)/cm<2>/steradian(sr). Za grupu sa neposrednim tretmanom, podaci su prikazani kao BLI nivoi 26d nakon implantacije tumora (Tabela 15). Za terapeutsku grupu koja prima tretman, podaci su prikazani kao opseg promene u BLI između dana 6 (1 d pre tretmana) i na kraju studije (26d nakon implantacije tumora; Tabela 16).

[0220] Kako rezulati pokazuju, oba BSMUC16/CD3-001 i BSMUC16/CD3-005 pokazala su sličnu efikasnost u suprimiranju rasta tumora u poređenju sa kontrolom izotipa kada je BLI meren u Danu 26 u neposrednom modelu doziranja. Oba anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela su takođe suprimirala rast uspostavljenih tumora kada su davani 7d posle implantacije tumora, u poređenju sa kontrolom. Ukratko, bispecifična anti-MUC16/anti-CD3 antitela iz ovog primera ispoljavaju potentnu efikasnost protiv tumora u nekoliko modela.

Tabela 15: Efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 Bispecifičnih antitela u Imuno-kompromitovanom modelu ksenografta: Trenutno doziranje

Tabela 16: Efikasnost anti-Muc16/anti-CD3 Bispecifičnih Antitela u Imuno-kompromitovanom modelu ksenografta: Terapeutski tretman

Primer 9: Farmakokinetička procena anti-MUC16 x CD3 bispecifičnih antitela

[0221] Procena farmakokinetika anti-MUC16 x CD3 bispecifičnih antitela BSMUC16/CD3-001 i BSMUC16/CD3-005 i kontrole izotipa su sprovedene u MUC16 x CD3 miševima (miševi homozigotni za humani MUC16 i CD3 ekspresiju, MUC16hu/hu x CD3hu/hu), CD3 humanizovani miševi (miševi homozigotni za humanu CD3 ekspresiju, CD3hu/hu) i miševi divljeg tipa (WT) koji odgovaraju soju (75% C57BL, 25%129Sv). Kohorte su sadržale 4-5 miševa po testiranom antitelu i po mišjem soju. Svi miševi su primili jednu intraperitonealnu (i.p.) 0.4 mg/kg doze. Uzorci krvi su sakupljeni na 3 i 6 h, 1, 3, 7, 14 i 28 dana nakon doziranja. Krv je prerađena u serum i zamrznuta je na -80 °C do analize.

[0222] Koncentracije cirkulišućih antitela su određene analizom ukupnih humanih IgG antitela korišćenjem GyroLab xPlore™ (Gyros, Uppsala, Sweden). Ukratko, biotinilovano kozje anti-humano IgG poliklonsko antitelo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) uhvaćeno je na zrnca koja su obeležena streptavidinim na Gyrolab Bioaffy 200 CD (Gyros) da bi se uhvatio humani IgG koji je prisutan u serumu. Nakon hvatanja afinitetnom kolonom, vezano humano IgG antitelo u uzorcima je detektovano sa Alexa-647 obeleženim kozjem anti-humanom IgG (Jackson ImmunoResearch). Fluorescentni signal na koloni je omogućio detekciju vezanog IgG i jedinice odgovora (RU) su očitane od strane intrumenta. Koncentracije uzorka su određene interpolacijom sa standardne krive koja je bila prilagođena korišćenjem 5-parametarske logističke krive korišćenjem Gyrolab Evaluator Softvera.

[0223] PK parametri su određeni pomoću ne-kompartmentalne analize (NCA) upotrebom Phoenix®WinNonlin® softver Verzije 6.3 (Certara, L.P., Princeton, NJ) i modela ekstravaskularnog doziranja. Korišćenjem odgovarajuće srednje vrednosti koncentracije za svako antitelo, svi PK parametri uključujući uočeni maksimum koncentracije u serumu (Cmax), uočeni procenjeni polu-život (t1/2), i površinu ispod krive koncentracija u odnosu na vreme do poslednje merljive koncentracije (AUClast) određeni su upotrebom linearnog trapeznog pravila sa linearnom interpolacijom i uniformnim ponderisanjem.

[0224] Nakon i.p. davanja antitela WT (divlji tip) miševima, ukupnil IgG koncentracijsko-vremenski profili BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrole izotipa bili su slični, a prvo ih je karakterisala kratka distribucija leka a zatim jedna faza eliminacije leka tokom ostatka studije. Maksimum koncentracija u serumu (Cmax) i izračunato izlaganje leku (AUClast) tri antitela su uporedive (unutar 1.3-puta jedna od druge). Nakon i.p. davanja antitela u CD3<hu/hu>miševima, BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa imala je uporedive Cmaxkoncentracije (4.6, 3.6 i 4.1 µg/mL, redom). BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa ispoljili su slične krive eliminacije leka, dok BSMUC16/CD3-001 ispoljio strmiju eliminaciju leka u odnosu na oba, što sugeriše da humano CD3 vezivanje cilja dovodi do čišćenja. Terminalna koncentracija antitela BSMUC16/CD3-001 je bila 0.03 µg/mL, koja je oko 28-puta manja od terminalnih koncentracija antitela koje su određene za kontrolu izotipa (0.85 µg/mL) i 22-puta manje od BSMUC16/CD3-005 (0.66 µg/mL) koncentracija u serumu.

[0225] U MUC16<hu/hu>x CD3 h<u/hu>dvostruko-humanizovanim miševima, Muc16xCD3 bispecifični i kontrolna antitela izotipa imala su uporedive Cmaxkoncentracije (Cmaxopseg: 4.5-6.9 µg/mL). Oba bispecifična antitela ispoljila su strmiju eliminaciju leka u odnosu na kontrolu izotipa ukazujući na ciljani usmereni efekat. Terminalne koncentracije antitela za BSMUC16/CD3-001 i BSMUC16/CD3-005 bile su oko 29-puta i 2.9-puta manje, redom, od terminalnih koncentracija antitela koje su određene za kontrolu izotipa (0.86 µg/mL).

[0226] Pregled podataka za ukupna anti-MUC16 x CD3 bispecifična antitela i koncentracije antitela kontrole izotipa su predstavljene u Tabeli 17. Srednje vrednosti PK parametara su opisane u Tabelama 18A i 18B. Srednje vrednosti ukupnih koncentracija antitela u odnosu na vreme prikazane su na Slikama 2A, 2B i 2C. Kao zaključak, MUC16xCD3 bispecifična antitela ispoljila su slične Cmaxi krive eliminacije leka u divljem tipu (WT) miševa, ali BSMUC16/CD3-001 su ispoljile strmije brzine eliminacije u odnosu na BSMUC16/CD3-005 i kontrolu izotipa u CD3 pojedinačno-humanizovanim miševima i MUC16/CD3 dvostruko humanizovanim miševima. S obzirom na to da bispecifična antitela koja su davana u ovoj PK studiji se sastoje iz istog anti-MUC16 vezujućeg kraka, rezultati ukazuju na to da jačina vezivanja CD3 ciljanog kraka može imati ulogu u nivoima izlaganja leku (AUClast) i brzinama eliminacije leka. Niti BSMUC16/CD3-001 ili BSMUC16/CD3-005 vezuju mišji MUC16 ili mišji CD3.

Tabela 17: Srednje vrednosti koncentracija ukupnog IgG u serumu nakon jedne 0.4 mg/kg intraperitonealne injekcije BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa antitela u WT miševima, humanizovanim CD3 miševima i humanizovanim MUC16 x CD3 miševima

Tabela 18A: pregled farmakokinetičkih parametara: CD3 hu/hu humanizovani miševi

Tabela 18B: pregled farmakokinetičkih parametara: MUC16 hu/hu x CD3 hu/hu dvostrukohumanizovani miševi

Primer 10: Anti-STEAP2/anti-CD3 bispecifična antitela ispoljavaju potentnu aktivnost protiv tumora in vivo

[0227] Da bi se odredila in vivo efikasnost primera anti-STEAP2/anti-CD3 bispecifičnih antitela koja su identifikovana da imaju slab ili bez uočljivog afiniteta vezivanja za humani i cinomolgus CD3, sprovedena su ispitivanja kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte humanog kancera prostate.

[0228] Da bi se ispitala in vivo efikasnost anti-STEAP2/anti-CD3 bispecifičnih u studijama humanog ksenografta, NOD scid gama (NSG) miševi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) su istovremeno primili implant humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMCs; ReachBio LLC., Seattle, WA) zajedno sa C4-2 ćelijama humanog kancera prostate (MD Anderson Cancer Center, Houston TX) koji endogeno eksprimuju STEAP2.

[0229] Ukratko, 5.0x10<6>C4-2 ćelija je istovremeno subkutanozno implantirano (s.c.) sa 1.25x10<6>humanih PBMCs u 50:50 mešavini matrigel matriksa (BD Biosciences, San Jose, CA) u desni bok mužjaka NSG miševa. Miševi su tretirani intraperitonealni (i.p.) u danu implantacije (neposredni model tretmana) sa anti-STEAP2/anti-CD3 bispecificima BSSTEAP2/CD3-001, BSSTEAP2/CD3-002 ili BSSTEAP2/CD3-003, ili kontrolom izotipa (koja ne vezuje C4-2 ćelije tumora), u dozi od 0.1 ili 0.01 mg/kg (N=5 miševa/grupi).

[0230] Veličina tumora je izmerena 2x/nedeljno korišćenjem kalipera i zapremina tumora je izračunata kao Zapremina = (dužina x širina<2>)/2. Podaci su prikazani kao veličina tumora (mm<3>) na kraju studije, 46d nakon implantacije tumora (Tabela 19).

[0231] Kao što rezultati u Tabeli 19 pokazuju, BSSTEAP2/CD3-001, BSSTEAP2/CD3-002 i BSSTEAP2/CD3-003 značajno su suprimirali rast tumora u poređenju sa kontrolom izotipa gde su veličine tumora merene na kraju studije. Važno, anti-STEAP2/anti-CD3 bispecifična antitela bila su efikasna u inhibiranju C4-2 tumorskog rasta čak i na najnižoj dozi od 0.1 mg/kg.

Tabela 19: Efikasnost anti-STEAP2/anti-CD3 Bispecifičnih Antitela u Imuno-kompromitovanom modelu ksenografta: Neposredno doziranje

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

��

12

��

�

11

��

1

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

1

�

21

22

�

24

�

2

�

2

�

21

22

�

21

22

�

24

�

2

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta, gde se bispecifično antitelo sastoji iz prvog kraka koji vezuje antigen koji ispoljava slabo do ne detektabilno vezivanje za humani CD3 i CD3 cinomolgusa, i drugog kraka koji vezuje antigen koji se veže za antigen koji je povezan sa tumorom, pri čemu se svaki od prvog kraka koji vezuje antigen i drugog kraka koji vezuje antigen sastoji iz teškog lanca i lakog lanca, pri čemu je laki lanac zajednički za oba, prvi krak koji vezuje antigen i drugi krak koji vezuje antigen, i pri čemu težak lanac prvog kraka koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji se sastoji iz regiona koji određuju komplementarnost HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji se sastoje iz aminokiselinskih sekvenci, redom, SEQ ID NOs: 36, 38, i 40 SEQ ID NOs: 140, 142 i 144.

2. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu bispecifično antitelo ispoljava aktivaciju T ćelija in vitro.

3. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je antigen povezan sa tumorom eksprimiran na humanoj tumorskoj ćeliji.

4. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom zahteva 1-3, gde bispecifično antitelo indukuje ubijanje tumorskih ćelija posredovano sa T ćelijama sa vrednošću EC50manjom od oko 1.3 nM, kao što je mereno u in vitro testu ubijanja tumorskih ćelija posredovanom sa T ćelijama.

5. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom zahteva 1-4, pri čemu ciljna ćelija tumora eksprimira antigen povezan sa tumorom izabran iz grupe koja se sastoji iz AFP, ALK, BAGE proteina, BIRC5 (survivin), BIRC7, β-katenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, karbonatne dehidrataze IX, kaspaza-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciklin-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE proteina (npr., GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipikan-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE proteina (npr., MAGE-1, -2, -3, -4, -6, i -12), MART-1, mezotelina, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteina, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Thompsonnouvelle antigena (Tn), TRP-1, TRP-2, tirozinaze, i uroplakina-3.

6. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom zahteva 1-5, pri čemu se laki lanac sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji se sastoji iz regiona koji određuju komplementarnost LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji se sastoje iz aminokiselinskih sekvenci, redom, SEQ ID NOs: 164, 166 i 168.

7. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, gde LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162.

8. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom zahteva 1-5, pri čemu je laki lanac srodni laki lanac teškog lanca drugog kraka koji se vezuje za antigen koji vezuje antigen povezan sa tumorom.

2

9. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, gde prvi krak koji vezuje antigen sadrži regione koji određuju komplementarnost HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji se sastoje iz aminokiselinskih sekvenci, redom, SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 164, 166 i 168.

10. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, gde prvi krak koji vezuje antigen sadrži regione koji određuju komplementarnost HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji se sastoje iz aminokiselinskih sekvenci, redom, SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 164, 166 i 168.

11. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 7, gde bispecifično antitelo sadrži par HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci (HCVR/LCVR) koje se sastoje iz aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 34/162.

12. Citotoksično bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 7, gde bispecifično antitelo sadrži par HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci (HCVR/LCVR) koje se sastoje iz aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 138/162.

13. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz (i) bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 1-12, i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača.

14. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13 za upotrebu u postupku lečenja kancera kod subjekta, postupak obuhvata davanje subjektu farmaceutske kompozicije.

15. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji iz: kancera pankreasa, melanoma, glioblastoma, kancera glave i vrata, kancera prostate, malignih glioma, osteosarkoma, kolorektalnog kancera, kancera želudca, malignog mezotelioma, multiplog mijeloma, kancera jajnika, kancera malih ćelija pluća, kancera ne-malih ćelija pluća, sinovijalnog sarkoma, kancera tireoidee, kancera dojke, melanomglioma, kancera dojke, karcinoma skvamoznih ćelija, kancera jednjaka, karcinoma bubrežnih bistrih ćelija, hromofobnog karcinoma ćelija bubrega, onkocitoma bubrega, prelaznog karcinoma ćelija bubrega, urotelnog karcinoma, adenokarcinoma, ili karcinoma malih ćelija, opciono kada je subjekt pogođen sa tumorom koji je otporan na, ili nepotpuno reaguje samo na monspecifičnu terapiju.