RS62864B1

RS62864B1 - Rnk replikon za univerzalnu i efikasnu ekspresiju gena

Info

Publication number: RS62864B1
Application number: RS20220067A
Authority: RS
Inventors: Tim Beissert; Ugur Sahin; Mario Perkovic
Original assignee: BioNTech SE; Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2022-02-28
Also published as: HUE050350T2; ZA201805519B; ES2906807T3; RU2748892C2; HK1259449A1; HRP20220044T1; CY1125086T1; AU2017236239B2; KR20180127356A; US20200299725A1; HUE059139T2; SMT202200047T1; PL3433369T3; PT3701959T; IL291100B2; SG11201807374WA; JP7465310B2; EP3433369B1; AU2017236239A1; LT3701959T

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni navodi obuhvataju RNK replikon koji može da se replikuje replikazom koja potiče iz alfavirusa. RNK replikon sadrži elemente sekvence potrebne za replikaciju replikazom, ali ovi elementi sekvence ne kodiraju nikakav protein ili njegov fragment, kao što je alfavirusni nestrukturni protein ili njegov fragment. Prema tome, u RNK replikonu prema navodima, elementi sekvence potrebni za replikaciju replikazom i regioni koji kodiraju proteine su razdvojeni. Prema predmetnim navodima razdvajanje se postiže uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona u odnosu na nativnu genomsku RNK alfavirusa. RNK replikon može da sadrži gen koji kodira protein od interesa, kao što je farmaceutski aktivan protein. Replikaza može da bude kodirana RNK replikonom ili posebnim molekulom nukleinske kiseline.

Osnov

[0002] Molekuli nukleinske kiseline koji sadrže stranu genetsku informaciju koja kodira jedan ili više polipeptida u profilaktičke i terapijske svrhe ispitivani su u biomedicinskim istraživanjima godinama. Raznim pristupima prethodnog stanja tehnike zajednička je isporuka molekula nukleinske kiseline do ciljne ćelije ili organizma, ali se oni međusobno razlikuju po vrsti molekula nukleinske kiseline i/ili sistema za isporuku: pod uticajem zabrinutosti za bezbednost u vezi sa upotrebom molekula dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), molekulima ribonukleinske kiseline (RNK) posvećena je rastuća pažnja poslednjih godina. Predlagani su razni pristupi, uključujući primenu jednolančane ili dvolančane RNK, u obliku "gole" RNK, ili u kompleksnom ili pakovanom obliku, npr. u nevirusnim ili virusnim vehikulumima za isporuku. U virusima i u virusnim vehikulumima za isporuku, genetska informacija je obično inkapsulirana proteinima i/ili lipidima (virusna čestica). Na primer, konstruisane RNK virusne čestice poreklom od RNK virusa predložene su kao vehikulum za isporuku za lečenje biljaka (WO 2000/053780 A2) ili za vakcinaciju sisara (Tubulekas et al., 1997, Gene, vol.190, pp.191-195). Uopšteno, RNK virusi su raznorodna grupa infektivnih čestica sa RNK genomom. RNK virusi mogu da se svrstaju u jednolančane RNK (ssRNA) i dvolančane RNK (dsRNA) viruse, a ssRNA virusi mogu dalje uopšteno da se podele na viruse sa pozitivnim lancem [(+) lančane] i/ili viruse sa negativnim lancem [(-) lančane]. RNK virusi sa pozitivnim lancem su na prvi pogled privlačni kao sistem za isporuku u biomedicini jer njihova RNK može direktno da služi kao matrica za translaciju u ćelijidomaćinu.

[0003] Alfavirusi su tipični predstavnici RNK virusa sa pozitivnim lancem. Domaćini alfavirusa uključuju širok opseg organizama, uključujući insekte, ribe i sisare, kao što su domaće životinje i ljudi. Alfavirusi se replikuju u citoplazmi inficiranih ćelija (za pregled životnog ciklusa alfavirusa pogledati Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol.4, pp.837-856). Ukupna dužina genoma mnogih alfavirusa obično varira između 11000 i 12000 nukleotida, i genomska RNK obično ima 5'-kapu, i 3' poli(A) rep. Genom alfavirusa kodira nestrukturne proteine (uključene u transkripciju, modifikaciju i replikaciju virusne RNK i u modifikaciju proteina) i strukturne proteine (koji obrazuju virusnu česticu). Obično postoje dva otvorena okvira čitanja (ORF) u genomu. Četiri nestrukturna proteina (nsP1-nsP4) su obično kodirana zajedno prvim ORF koji počinje blizu 5' kraja genoma, dok su alfavirusni strukturni proteini kodirani zajedno drugim ORF koji se nalazi nishodno od prvog ORF i pruža se blizu 3' kraja genoma. Tipično, prvi ORF je veći od drugog ORF, u odnosu od približno 2:1.

[0004] U ćelijama inficiranim alfavirusom, samo se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira nestrukturne proteine translatira sa genomske RNK, dok je genetska informacija koja kodira strukturne proteine translatabilna sa subgenomskog transkripta, koji predstavlja RNK molekul sličan eukariotskoj informacionoj RNK (iRNK; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol.87 pp.111-124). Nakon infekcije, tj. u ranim stadijumima životnog ciklusa virusa, (+) lančana genomska RNK direktno deluje kao informaciona RNK za translaciju otvorenog okvira čitanja koji kodira nestrukturni poliprotein (nsP1234). Kod nekih alfavirusa, postoji stop kodon opal između kodirajućih sekvenci nsP3 i nsP4: poliprotein P123, koji sadrži nsP1, nsP2, i nsP3, se proizvodi kada se translacija zaustavi na stop kodonu opal, i poliprotein P1234, koji dodatno sadrži nsP4, nastaje nakon čitanja ovog opal kodona (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.

491-562; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol.96, pp.2483-2500). nsP1234 se autoproteolitički iseca na fragmente nsP123 i nsP4. Polipeptidi nsP123 i nsP4 se udružuju da formiraju (-) lanac repikaznog kompleksa koji transkribuje (-) lančanu RNK, upotrebom (+) lančane genomske RNK kao matrice. Obično se u kasnijim stadijumima fragment nsP123 kompletno iseca na pojedinačne proteine nsP1, nsP2 i nsP3 (Shirako & Strauss, 1994, J. Virol., vol.68, pp.1874-1885). Sva četiri proteina formiraju (+) lanac replikaznog kompleksa koji sintetiše nove (+) lančane genome, upotrebom (-) lančanog komplementa genomske RNK kao matrice (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp.153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol.278, pp.41636-41645).

[0005] U inficiranim ćelijama, subgenomska RNK kao i nova genomska RNK dobija 5’-kapu pomoću nsP1 (Pettersson et al.1980, Eur. J. Biochem.105, 435-443; Rozanov et al., 1992, J. Gen. Virology, vol.73, pp.2129-2134), i dobija poli-adenilatni [poli(A)] rep pomoću nsP4 (Rubach et al., Virology, 2009, vol.384, pp.201-208). Prema tome, i subgenomska RNK i genomska RNK liče na informacionu RNK (iRNK).

[0006] Alfavirusni strukturni proteini (protein C jezgra nukleokapsida, protein omotača E2 i protein omotača E1, svi konstituenti virusne čestice) su tipično kodirani jednim otvorenim okvirom čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.491-562). Subgenomski promotor prepoznaju alfavirusni nestrukturni proteini koji deluju u cis konfiguraciji. Konkretno, alfavirusna replikaza sintetiše (+) lančani subgenomski transkript upotrebom (-) lančanog komplementa genomske RNK kao matrice. (+) lančani subgenomski transkript kodira alfavirusne strukturne proteine (Kim et al., 2004, Virology, vol.

323, pp.153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol.278, pp.41636-41645). Subgenomski RNK transkript služi kao matrica za translaciju otvorenog okvira čitanja koji kodira strukturne proteine kao jedan poliprotein, i poliprotein se iseca da bi nastali strukturni proteini. U kasnom stadijumu alfavirusne infekcije u ćeliji-domaćinu, signal za pakovanje koji se nalazi u okviru kodirajuće sekvence nsP2 osigurava selektivno pakovanje genomske RNK u virione koji pupe, pakovane pomoću strukturnih proteina (White et al., 1998, J. Virol., vol.72, pp.4320-4326).

[0007] U inficiranim ćelijama, sinteza (-) lanca RNK se obično zapaža samo u prvih 3-4 h nakon infekcije, i nije detektabilna u kasnijim stadijumima, kada se zapaža samo sinteza (+) lanca RNK (i genomske i subgenomske). Prema Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651, preovlađujući model regulisanja sinteze RNK sugeriše zavisnost od obrade nestrukturnog poliproteina: inicijalno isecanje nestrukturnog poliproteina nsP1234 daje nsP123 i nsP4; nsP4 deluje kao RNK-zavisna RNK polimeraza (RdRp) koja je aktivna u sintezi (-) lanca, ali je neefikasna u generisanju (+) lanca RNK. Dalja obrada poliproteina nsP123, koja uključuje isecanje na spoju nsP2/nsP3, menja specifičnost replikaze za matricu kako bi se povećala sinteza (+) lanca RNK i smanjila ili zaustavila sinteza (-) lanca RNK.

[0008] Sinteza alfavirusne RNK je takođe regulisana RNK elementima koji deluju u cis konfiguraciji, uključujući četiri konzervisana elementa sekvence (CSEs; Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562; i Frolov, 2001, RNA, vol.7, pp.1638-1651).

[0009] Uopšteno, 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusnog genoma se odlikuje niskom ukupnom homologijom između različitih alfavirusa, ali ima očuvanu predviđenu sekundarnu strukturu. 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusnog genoma nije uključena samo u inicijaciju translacije, već sadrži i 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije koja sadrži dva konzervisana elementa sekvence uključena u sintezu virusne RNK, CSE 1 i CSE 2. Smatra se da je za funkcionisanje CSE 1 i 2, sekundarna struktura značajnija od linearne sekvence (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562).

[0010] Nasuprot tome, 3’ terminalna sekvenca alfavirusnog genoma, tj. sekvenca neposredno ushodno od poli(A) sekvence, odlikuje se konzervisanom primarnom strukturom, posebno konzervisanim elementom sekvence 4 (CSE 4), označenim i kao "19-nt konzervisana sekvenca", koja je važna za inicijaciju sinteze (-) lanca.

[0011] CSE 3, označena i kao "spojna sekvenca" je konzervisani element sekvence na (+) lancu alfavirusne genomske RNK, i komplement CSE 3 na (-) lancu deluje kao promotor za transkripciju subgenomske RNK (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562; Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 3 se obično preklapa sa regionom koja kodira C-terminalni fragment nsP4.

[0012] Pored proteina alfavirusa, i faktori ćelija-domaćina, verovatno proteini, mogu da se vežu za konzervisane elemente sekvence (Strauss & Strauss, iznad).

[0013] Vektori poreklom iz alfavirusa su predloženi za isporuku strane genetske informacije u ciljne ćelije ili ciljne organizme. U jednostavnim pristupima, otvoreni okvir čitanja koji kodira alfavirusne strukturne proteine zamenjuje se otvorenim okvirom čitanja koji kodira protein od interesa. Trans-replikacioni sistemi na bazi alfavirusa zasnivaju se na elementima nukleotidne sekvence alfavirusa na dva odvojena molekula nukleinske kiseline: jedan molekul nukleinske kiseline kodira virusnu replikazu (obično kao poliprotein nsP1234), a drugi molekul nukleinske kiseline može da se replikuje navedenom replikazom in trans (otuda oznaka trans-replikacioni sistem). Trans-replikacija zahteva prisustvo oba ova molekula nukleinske kiseline u datoj ćelijidomaćinu. Molekul nukleinske kiseline koji može da se replikuje replikazom in trans mora da sadrži određene elemente sekvence alfavirusa da omogući prepoznavanje i sintezu RNK alfavirusnom replikazom. Odgovarajući replikon je ilustrovan kao "RNK matrica WT-RRS" na sl.

1. Takav replikon poseduje prednost da omogućava amplifikacije gena od interesa pod kontrolom subgenomskog promotora; međutim, univerzalnije vektore je teško razviti jer se otvoreni okvir čitanja koji kodira nsP1234 preklapa sa 5’ sekvencom prepoznavanja replikacije alfavirusnog genoma (sekvenca koja kodira nsP1) i tipično i sa subgenomskim promotorom koji sadrži CSE 3 (sekvenca koja kodira nsP4).

[0014] Na primer, Michel et al. (2007, Virology, vol.362, pp. 475-487) opisuju da uvođenje 95 tihih mutacija (tj. mutacija koje ne utiču na sekvencu kodiranog proteina) u kodirajućem regionu nsP1 alfavirusa virusa venecuelanskog encefalitisa (VEEV) potpuno ukida sposobnost VEEV da se replikuje u ćelijama, verovatno zato što tihe mutacije remete sekundarnu strukturu RNK. WO 2008/156829 A2 i Kamrud et al. (2010, J. Gen. Virol., vol.91, pp.1723-1727) opisuju pomoćničku RNK (tj. trans-replikativnu RNK koja eksprimira kapsid i omotač VEEV) koja je modifikovana tako da specifični bazni triplet AUG koji služi kao start kodon za nsP1 u VEEV koji postoji u prirodi može da se ukloni (pretvaranjem u stop kodon) kako bi se stvorili modifikovani konstrukti. Prema Kamrud et al., pretvaranje start kodona nsP1 u stop kodon očuvalo je replikativni potencijal RNK i ove modifikovane pomoćničke RNK su dale čestice VEEV sa neznatno sniženim titrom. Međutim, autori su zapazili da pretvaranje svih AUG kodona koji se nalaze u CSE1/2 regionu u stop kodone rezultuje nastankom pomoćničke RNK koja se slabo replikuje u prisustvu alfavirusne replikaze. Autori su slabu replikaciju pripisali mogućem poremećaju sekundarne strukture RNK u njenoj osnovi. Poremećena sekundarna struktura predstavlja verovatno objašnjenje, budući da autori ne pominju da su kontrolisali ispravnost savijanja RNK kod svojih modifikovanih pomoćničkih RNK.

[0015] Činjenica da 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije potrebna za replikaciju RNK sadrži start kodon AUG za nsP1 i time se preklapa sa kodirajućom sekvencom za N-terminalni fragment alfavirusog nestrukturnog proteina predstavlja ozbiljan problem za konstruisanje vektora na bazi alfavirusa jer će replikon koji sadrži 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije tipično kodirati (bar) deo alfavirusnog nestrukturnog proteina, tipično N-terminalni fragment nsP1. Ovo je nepovoljno u nekoliko aspekata:

U slučaju cis-replikona ovo preklapanje ograničava, na primer, prilagođavanje upotrebe kodona ORF replikaze različitim sisarskim ciljnim ćelijama (čoveka, miša, gajenih životinja). Može se zamisliti da sekundarna struktura 5’ sekvence prepoznavanja replikacije koja se javlja kod virusa nije optimalna u svakoj ciljnoj ćeliji. Međutim, sekundarna struktura ne može slobodno da se menja, jer mora de se razmotri moguće nastajanje izmena u aminokiselinama u ORF replikaze i ispita njihovo dejstvo na funkciju replikaze. Takođe nije moguće zameniti kompletan ORF replikaze za replikaze heterolognog porekla, budući da to može da dovede do poremećaja strukture 5’ sekvence prepoznavanja replikacije.

[0016] U slučaju trans-replikona ovo preklapanje rezultuje sintezom fragmenta proteina nsP1 budući da 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije treba zadržati u trans replikonima. Fragment nsP1 tipično nije potreban i nije poželjan: nepoželjna translacija nameće nepotrebno opterećenje ćeliji-domaćinu, i kod primene RNK replikona predviđenih za terapijske primene koji, pored farmaceutski aktivnog proteina, kodiraju fragment nsP1, mogu da se jave regulatorni problemi. Na primer, biće neophodno pokazati da skraćeni nsP1 ne dovodi do neželjenih sporednih dejstava. Pored toga, prisustvo start kodona AUG za nsP1 unutar 5’ sekvence prepoznavanja replikacije sprečilo je konstruisanje trans-replikona koji kodiraju heterologni gen od interesa na takav način da se start kodon za translaciju gena od interesa nalazi na poziciji koja je najbliža 5’, koja je dostupna za inicijaciju ribozomske translacije. Zauzvrat, 5’-kapa-zavisna translacija transgena sa trans-replikona RNK prethodnog stanja tehnike je složena, osim ako se ne klonira kao fuzioni protein u okviru čitanja sa start kodonom nsP1 (takvi fuzioni konstrukti opisani su npr. kod Michel et al., 2007, Virology, vol. 362, pp. 475-487). Takvi fuzioni konstrukti vode istoj nepotrebnoj translaciji fragmenta nsP1 kao što je gore pomenuto, stvarajući iste probleme. Osim toga, fuzioni proteini stvaraju dodatne probleme, budući da mogu da izmene funkciju ili aktivnost fuzionisanog transgena od interesa, ili, kada se koriste kao vektorske vakcine, peptidi koji obuhvataju fuzioni region mogu da izmene imunogenost fuzionisanog antigena.

[0017] Postoji potreba za prevazilaženjem ovih nedostataka. Na primer, postoji potreba da se obezbede poboljšani replikoni za eksprimiranje nukleinske kiseline koja kodira protein od interesa, kao što je farmaceutski aktivan protein, na bezbedan i efikasan način. Kako je ovde opisano, aspekti i primeri izvođenja predmetnih navoda odgovaraju na ovu potrebu.

Sažetak

[0018] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Imunoterapijske strategije predstavljaju obećavajuće opcije za prevenciju i terapiju npr. infektivnih bolesti i kancera. Identifikacija sve većeg broja antigena povezanih sa patogenima i tumorima dovela je do širokog spektra pogodnih ciljeva za imunoterapiju. Predmetni navodi obuhvataju poboljšane agense i postupke pogodne za efikasnu ekspresiju antigena, pogodne za imunoterapijski tretman za prevenciju i terapiju bolesti.

[0019] U prvom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju RNK replikon koji sadrži 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije, gde se 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije odlikuje time što obuhvata uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa nativnom 5’ sekvencom prepoznavanja replikacije alfavirusa.

[0020] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon navoda sadrži (modifikovanu) 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije i prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, npr. funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ili transgen koji poželjno ne potiče iz alfavirusa, konkretno alfavirusni nestrukturni protein, koji se nalazi nishodno od 5’ sekvence prepoznavanja replikacije, pri čemu se 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije i prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa ne preklapaju i poželjno se 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije ne preklapa ni sa jednim otvorenim okvirom čitanja RNK replikona, npr.5’ sekvenca prepoznavanja replikacije ne sadrži funkcionalni inicijacioni kodon i poželjno ne sadrži ni jedan inicijacioni kodon. Najpoželjnije, inicijacioni kodon prvog otvorenog okvira čitanja koji kodira protein od interesa je u 5’ → 3’ pravcu RNK replikona prvi funkcionalni inicijacioni kodon, poželjno prvi inicijacioni kodon. U jednom primeru izvođenja, prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. U jednom primeru izvođenja, prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa i poželjno ceo RNK replikon ne eksprimira nefunkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, kao što je fragment alfavirusnog nestrukturnog proteina, naročito fragment nsP1 i/ili nsP4. U jednom primeru izvođenja, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je heterolog u odnosu na 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije. U jednom primeru izvođenja, prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa nije pod kontrolom subgenomskog promotora. U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži najmanje jedan dodatni otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa koji je pod kontrolom subgenomskog promotora. U jednom primeru izvođenja, subgenomski promotor i prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa se ne preklapaju.

[0021] U jednom primeru izvođenja, 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije RNK replikona koja se odlikuje uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona sadrži sekvencu homolognu sa oko 250 nukleotida na 5’ kraju alfavirusa. U poželjnom primeru izvođenja, ona sadrži sekvencu homolognu sa oko 300 do 500 nukleotida na 5’ kraju alfavirusa. U poželjnom primeru izvođenja ona sadrži 5’-terminalnu sekvencu potrebnu za efikasnu replikaciju specifične vrste alfavirusa iz koje potiče vektorski sistem.

[0022] U jednom primeru izvođenja, 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije RNK replikona sadrži sekvence homologne konzervisanom elementu sekvence 1 (CSE 1) i konzervisanom elementu sekvence 2 (CSE 2) alfavirusa.

[0023] U poželjnom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži CSE 2 i dodatno se odlikuje time što sadrži fragment otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina iz alfavirusa. U poželjnijem primeru izvođenja, navedeni fragment otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina ne sadrži nikakav inicijacioni kodon.

[0024] U jednom primeru izvođenja, 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije sadrži sekvencu homolognu otvorenom okviru čitanja alfavirusnog nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu, pri čemu se sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja alfavirusnog nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu odlikuje time što obuhvata uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa nativnom sekvencom alfavirusa.

[0025] U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja alfavirusnog nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu se odlikuje time što sadrži uklanjanje najmanje nativnog start kodona otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina.

[0026] U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja alfavirusnog nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu odlikuje se time što obuhvata uklanjanje jednog ili više inicijacionih kodona različitih od nativnog start kodona otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina. U poželjnijem primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline se dodatno odlikuje uklanjanjem nativnog start kodona otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina, poželjno nsP1.

[0027] U poželjnom primeru izvođenja, 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije sadrži jednu ili više struktura drška-petlja koje obezbeđuju funkcionalnost 5’ sekvence prepoznavanja replikacije u pogledu replikacije RNK. U poželjnom primeru izvođenja, jedna ili više struktura drška-petlja 5’ sekvence prepoznavanja replikacije nisu deletirane ili poremećene. Poželjnije, jedna ili više struktura drška-petlja 1, 3 i 5, poželjno sve strukture drška-petlja 1, 3 i 4, ili struktura drška-petlja 3 i 4 nisu deletirane ili poremećene. Poželjnije, nijedna od struktura drška-petlja 5’ sekvence prepoznavanja replikacije nije deletirana ili poremećena.

[0028] U poželjnom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži jednu ili više izmena nukleotida koje kompenzuju poremećaje sparivanja nukleotida unutar jedne ili više struktura drška-petlja uvedene uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona.

[0029] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira skraćeni alfavirusni nestrukturni protein.

[0030] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži 3’ sekvencu prepoznavanja replikacije.

[0031] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa.

[0032] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon se odlikuje time što protein od interesa kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja može da bude eksprimiran sa RNK replikona kao matrice.

[0033] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon se odlikuje time što sadrži subgenomski promotor. Tipično, subgenomski promotor kontroliše proizvodnju subgenomske RNK koja sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa.

[0034] U poželjnom primeru izvođenja, protein od interesa kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja može da bude eksprimiran sa RNK replikona kao matrice. U poželjnijem primeru izvođenja, protein od interesa kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja može dodatno da bude eksprimiran sa subgenomske RNK.

[0035] U poželjnom primeru izvođenja, RNK replikon se dodatno odlikuje time što sadrži subgenomski promotor koji kontroliše proizvodnju subgenomske RNK koja sadrži drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa. Protein od interesa može da bude drugi protein koji je identičan sa ili drugačiji od proteina od interesa kodiranog prvim otvorenim okvirom čitanja.

[0036] U poželjnijem primeru izvođenja, subgenomski promotor i drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa smešteni su nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja koji kodira protein od interesa.

[0037] U jednom primeru izvođenja, protein od interesa kodiran prvim i/ili drugim otvorenim okvirom čitanja je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0038] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0039] U jednom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein se ne preklapa sa 5’ sekvencom prepoznavanja replikacije.

[0040] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

[0041] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. U ovom primeru izvođenja, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein za replikaciju replikona može da bude obezbeđen in trans, kako je ovde opisano.

[0042] U drugom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju sistem koji sadrži:

RNK konstrukt za eksprimiranje funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina, RNK replikon prema prvom aspektu navoda, koji može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina in trans. Poželjno, RNK replikon se dalje odlikuje time što ne kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0043] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon prema prvom aspektu ili sistem prema drugom aspektu odlikuje se time što je alfavirus virus Semliki šume.

[0044] U trećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju DNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira RNK replikon prema prvom aspektu predmetnih navoda.

[0045] U četvrtom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u ćeliji koji obuhvata sledeće korake:

(a) dobijanje RNK replikona prema prvom aspektu navoda, koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, koji može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i koji dodatno sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i

(b) inokulaciju RNK replikona u ćeliju.

[0046] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK replikon je kao što je gore definisano za replikon prema navodima.

[0047] U petom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u ćeliji koji obuhvata sledeće korake:

1

(a) dobijanje RNK konstrukta za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina,

(b) dobijanje RNK replikona prema prvom aspektu navoda, koji može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina prema (a) in trans i koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i

(c) ko-inokulaciju RNK konstrukta za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i RNK replikona u ćeliju.

[0048] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i/ili RNK replikon su kao što je gore definisano za sistem prema navodima. Prema petom aspektu, RNK replikon obično sam po sebi ne kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0049] U šestom aspektu, navodi obezbeđuju ćeliju koja sadrži replikon prema prvom aspektu ili sistem prema drugom aspektu. U jednom primeru izvođenja, ćelija se inokuliše prema postupku četvrtog aspekta, ili prema postupku petog aspekta navoda. U jednom primeru izvođenja, ćelija može da se dobije postupkom četvrtog aspekta ili postupkom petog aspekta navoda. U jednom primeru izvođenja, ćelija je deo organizma.

[0050] U sedmom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u subjektu koji obuhvata sledeće korake:

(b) primenu RNK replikona kod subjekta.

[0051] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK replikon je kao što je gore definisano za replikon prema navodima.

[0052] U osmom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u subjektu koji obuhvata sledeće korake:

(c) primenu RNK konstrukta za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i RNK replikona kod subjekta.

[0053] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i/ili RNK replikon su kao što je gore definisano za sistem prema navodima. Prema osmom aspektu, RNK replikon obično sam po sebi ne kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

Kratak opis crteža

[0054]

Sl. 1: Šematski prikaz RNK replikona koji sadrže nemodifikovanu ili modifikovanu 5’ sekvencu prepoznavanja replikacije

Skraćenice: AAAA = Poli(A) rep; ATG = start kodon/inicijacioni kodon (ATG na nivou DNK; AUG na nivou RNK); 5x ATG = sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži sve start kodone u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira nsP1* (u slučaju sekvence nukleinske kiseline koja kodira nsP1* virusa Semliki šume 5x ATG odgovara pet specifičnih start kodona, videti primer 1); Δ5ATG = sekvenca nukleinske kiseline koja odgovara sekvenci nukleinske kiseline koja kodira nsP1*; ali ne sadrži ni jedan start kodon sekvence nukleinske kiseline koja kodira nsP1* kod prirodnih alfavirusa (u slučaju nsP1* poreklom od virusa Semliki šume, "Δ5ATG" odgovara uklanjanju pet specifičnih start kodona u poređenju sa prirodnim virusom Semliki šume, videti primer 1); EcoRV = restrikciono mesto EcoRV; nsP = sekvenca nukleinske kiseline koja kodira alfavirusni nestrukturni protein (npr. nsP1, nsP2, nsP3, nsP4); nsP1* = sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fragment nsP1, pri čemu fragment ne sadrži C-terminalni fragment nsP1; *nsP4 = sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fragment nsP4, pri čemu fragment ne sadrži N-terminalni fragment nsP4; RRS = 5’ sekvenca prepoznavanja replikacije; SalI = restrikciono mesto SalI; SGP = subgenomski promotor; SL = struktura drška-petlja (npr. SL1, SL2, SL3, SL4); pozicije SL1-4 su ilustrovane grafički; UTR = netranslatirani region (npr.5’-UTR, 3’-UTR); WT = divlji tip.

cisReplikon WT-RRS: RNK replikon koji suštinski odgovara genomu alfavirusa, osim što je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira strukturne proteine alfavirusa zamenjena otvorenim okvirom čitanja koji kodira gen od interesa ("transgen"). Kada se "replikon WT-RRS" uvede u ćeliju, proizvod translacije otvorenog okvira čitanja koji kodira replikazu (nsP1234 ili njegov(e) fragment(e)) može da pokrene replikaciju RNK replikona in cis i da pokrene sintezu sekvence nukleinske kiseline (subgenomski transkript) nishodno od subgenomskog promotora (SGP).

Trans-replikon ili RNK matrica WT-RRS: RNK replikon suštinski odgovara "replikonu WT-RRS", osim što je veći deo sekvence nukleinske kiseline koja kodira alfavirusne nestrukturne proteine nsP1-4 uklonjen. Konkretnije, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira nsP2 i nsP3 je potpuno uklonjena; sekvenca nukleinske kiseline koja kodira nsP1 je skraćena tako da "RNK matrica WT-RRS" kodira fragment nsP1 koji ne sadrži C-terminalni fragment nsP1 (ali sadrži N-terminalni fragment nsP1; nsP1*); sekvenca nukleinske kiseline koja kodira nsP4 je skraćena tako da "RNK matrica WT-RRS" kodira fragment nsP4 koji ne sadrži N-terminalni fragment nsP4 (ali sadrži C-terminalni fragment nsP4; *nsP4). Ova skraćena sekvenca nsP4 se delimično preklapa sa potpuno aktivnim subgenomskim promotorom. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira nsP1* sadrži sve inicijacione kodone sekvence nukleinske kiseline koja kodira nsP1* u prirodnom alfavirusu (u slučaju nsP1* virusa Semliki šume, pet specifičnih inicijacionih kodona). Δ5ATG-RRS: RNK replikon suštinski odgovara "RNK matrici WT-RRS", osim što ne sadrži nikakve inicijacione kodone sekvence nukleinske kiseline koja kodira nsP1* u prirodnom alfavirusu (u slučaju virusa Semliki šume, "Δ5ATG-RRS" odgovara uklanjanju pet specifičnih inicijacionih kodona u poređenju sa prirodnim virusom Semliki šume). Sve izmene nukleotida koje su uvedene da bi se uklonili start kodoni kompenzovane su dodatnim izmenama nukleotida kako bi se očuvala predviđena sekundarna struktura RNK. Δ5ATG-RRSΔSGP: RNK replikon suštinski odgovara "Δ5ATG-RRS", osim što ne sadrži subgenomski promotor (SGP) i ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira *nsP4. "transgen 1" = gen od interesa.

Δ5ATG-RRS - bicistronski: RNK replikon suštinski odgovara "Δ5ATG-RRS", osim što sadrži prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira prvi gen od interesa ("transgen 1") ushodno od subgenomskog promotora, i drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira drugi gen od interesa ("transgen 2") nishodno od subgenomskog promotora. Lokalizacija drugog otvorenog okvira čitanja odgovara lokalizaciji gena od interesa ("transgen") u RNK replikonu "Δ5ATG-RRS".

cisReplikon Δ5ATG-RRS: RNK replikon suštinski odgovara "Δ5ATG-RRS -bicistronski", osim što otvoreni okvir čitanja koji kodira prvi gen od interesa kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein (tipično jedan otvoreni okvir čitanja koji kodira poliprotein nsP1-nsP2-nsP3-nsP4, tj. nsP1234). "Transgen" u "cis-replikonu Δ5ATG-RRS" odgovara "transgenu 2" u "Δ5ATG-RRS - bicistronski". Funkcionalni

1

alfavirusni nestrukturni protein može da prepozna subgenomski promotor i da sintetiše subgenomske transkripte koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira gen od interesa ("transgen"). "Cis-replikon Δ5ATG-RRS" kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein in cis kao i "cis-replikon WT-RRS"; međutim, nije neophodno da kodirajuća sekvenca za nsP1 kodirana "cis-replikonom Δ5ATG-RRS" sadrži tačnu sekvencu nukleinske kiseline "cis-replikona WT-RRS" uključujući sve strukture drškapetlja.

Sl. 2: Uklanjanje start kodona u 5’ sekvenci prepoznavanja replikacije ne utiče na replikaciju RNK trans-replikona. A: ilustracija molekula nukleinske kiseline upotrebljenih u primeru 2. B: Izmerena ekspresija luciferaze ćelija BHK21 podvrgnutih elektroporaciji. Za detalje, videti primer 2. Prikazana je srednja vrednost ± SD iz 2 nezavisna eksperimenta sa 2 nezavisno proizvedene serije RNK replikona ("matrica"); (N=4).

Sl. 3: Uklanjanje start kodona u 5’ sekvenci prepoznavanja replikacije omogućava kapazavisnu translaciju. Levo: ilustracija molekula nukleinske kiseline (RNK replikoni) upotrebljenih u primeru 3. Desno: Izmerena ekspresija luciferaze humanih fibroblasta prepucijuma podvrgnutih elektroporaciji. Za detalje, videti primer 3. Prikazana je srednja vrednost ± SD jednog eksperimenta izvedenog u triplikatu.

Sl. 4: Odmah nakon transfekcije, kapa-zavisna translacija sa trans-replikona koji se odlikuje uklanjanjem start kodona u 5’ sekvenci prepoznavanja replikacije je jača od translacije sa subgenomskog transkripta. Levo: ilustracija molekula nukleinske kiseline. RNK replikoni upotrebljeni u primeru 4 su ilustrovani kao "Δ5ATGRRS" i "Δ5ATG-RRSΔSGP". Desno: Izmerena ekspresija luciferaze ćelija BHK21 podvrgnutih elektroporaciji. Za detalje, videti primer 4. Prikazana je srednja vrednost jednog eksperimenta izvedenog u triplikatu.

Sl. 5: Trans-replikon sa dodatom kapom koji se odlikuje uklanjanjem start kodona u 5’ sekvenci prepoznavanja replikacije omogućava ekspresiju transgena u ranim stadijumima.

Levo: ilustracija "Δ5ATG-RRSΔSGP" molekula nukleinske kiseline upotrebljenog u primeru 5. Desno: Izmerena ekspresija luciferaze ćelija BHK21 podvrgnutih elektroporaciji. Za detalje, videti primer 5. Prikazana je srednja vrednost ± SD jednog eksperimenta izvedenog u triplikatu.

Sl. 6. Struktura dinukleotida kape. Gore: prirodni dinukleotid kape, m<7>GpppG. Dole: Fosforotioatni analog kape dinukleotid beta-S-ARCA: Postoje dva dijastereomera beta-S-ARCA zbog stereogenog P centra, koji su označeni D1 i D2 prema karakteristikama njihovog eluiranja u reverzno-faznoj HPLC.

Sl. 7. Rekonstruisani cis-replikoni sa RRS u kojoj su ATG deletirani su funkcionalni. ORF replikaze SFV ubačen je u "Δ5ATG-RRS" koji kodira luciferazu svica nishodno od subgenomskog promotora (SGP). Unutar ubačene replikaze regioni koji odgovaraju CSE2 i centralnom SGP su poremećeni izmenama nukleotida (isprekidani okviri) kako bi se izbeglo dupliranje ovih regulatornih regiona. Ovo je rezultovalo rekonstruisanim cis-replikonom. Ćelije BHK21 su podvrgnute ko-elektroporaciji ili sa 2,5 µg "cis-replikona WT-RRS" ili "cis-replikona Δ5ATG-RRS". 24h nakon elektroporacije merena je ekspresija luciferaze. Srednja vrednost ± SD jednog eksperimenta izvedenog u triplikatu.

Sl. 8. Bicistronski trans-replikoni eksprimiraju oba transgena. Nano-luciferaza koja se izlučuje (SNL) klonirana je nishodno od subgenomskog promotora (SGP) trans-replikona WT-RSS. Pozicija ushodno od SGP ne kodira transgen (-)SGP(SNL). U donjem konstruktu, SNL je klonirana nishodno od ΔATG-RSS, a luciferaza svica (Luc) je ubačena nishodno od SGP (SNL)SGP(Luc). Ćelije BHK21 su podvrgnute ko-elektroporaciji sa 0.9 µg trans-replikativne RNK i 5 µg iRNK koja kodira SFV-replikazu, 48h nakon elektroporacije merena je ekspresija SNL i Luc. Podaci iz jednog eksperimenta.

Sl. 9. Trans-replikoni virusa Sindbis kojima nedostaju start kodoni u sekvenci prepoznavanja replikacije replikuju se efikasno. Trans-replikoni su konstruisani iz genoma virusa Sindbis sintezom gena i GFP je ubačen nishodno od subgenomskog promotora (SGP). Pored ovog trans-replikona sa nemodifikovanom sekvencom prepoznavanja replikacije (WT-RSS), generisane su dve njegove varijante. U ΔATG-RRS originalni start kodon i još 4 dodatna ATG su deletirana iz WT-RRS. Po potrebi su uvedene kompenzatorne izmene nukleotida za očuvanje sekundarne strukture RNK. Za generisanje ΔATG-RRSΔSGP, region koji odgovara subgenomskom promotoru je deletiran iz ΔATG-RRS, što je rezultovalo vektorom sa GFP neposredno nishodno od 5’RRS sa deletiranim ATG. Ćelije BHK21 su podvrgnute koelektroporaciji sa 0.1 µg trans-replikativne RNK i 2.4 µg iRNK koja kodira SFV-replikazu.24h nakon elektroporacije procenjena je ekspresija GFP (stopa transfekcije [%] i srednji intenzitet fluorescencije (MFI)). Podaci iz jednog eksperimenta.

Detaljan opis

[0055] Iako su predmetni navodi ispod detaljno opisani, podrazumeva se da ovi navodi nisu ograničeni na ovde opisane konkretne metodologije, protokole i reagense, budući da oni mogu da variraju. Takođe se podrazumeva da je ovde upotrebljena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograniči obim predmetnih navoda koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Osim ako nije definisano drugačije, svi tehnički

1

i naučni termini koji su ovde upotrebljeni imaju ista značenja koja obično podrazumeva stručnjak u ovoj oblasti.

[0056] Poželjno, ovde upotrebljeni termini su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

[0057] Pri praktikovanju predmetnih navoda koristiće se, osim ako nije naznačeno drugačije, uobičajene metode hemije, biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u stručnoj literaturi (uporediti., npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0058] U nastavku će biti opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, podrazumeva se da oni mogu da se kombinuju na bilo koji način i u bilo kom broju kako bi nastali dodatni primeri izvođenja. Ne treba smatrati da opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ograničavaju predmetne navode samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Treba razumeti opis tako da otkriva i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem otkrivenih i/ili poželjnih elemenata. Dalje, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim ovim opisom osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.

[0059] Termin "oko" označava približno ili gotovo, i u kontekstu numeričke vrednosti ili opsega koji su ovde prikazani poželjno znači /- 10% od numeričke vrednosti ili opsega koji je naveden ili za koji se traži zaštita.

[0060] Termine u jednini upotrebljene u kontekstu opisivanja navoda (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba posmatrati tako da obuhvataju i jedninu i množinu, osim ako ovde nije drugačije naznačeno ili jasno protivrečno kontekstu. Navođenje opsega vrednosti ovde je namenjeno samo da služi kao skraćeni način pojedinačnog navođenja svake zasebne vrednosti koja spada u opseg. Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju, kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu da se izvedu bilo kojim prikladnim redosledom, osim ako ovde nije drugačije naznačeno ili jasno protivrečno kontekstu. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr., "kao što"), koji je ovde dat, ima za cilj samo da bolje ilustruje navode i ne predstavlja ograničenje obima navoda za koji se inače traži zaštita.

[0061] Ništa navedeno u specifikaciji ne treba tumačiti kao da ukazuje na bilo koji element neophodan za praktikovanje navoda, a za koji se ne traži zaštita.

1

[0062] Osim ako nije izričito navedeno drugačije, termin "koji sadrži" u kontekstu ovog dokumenta upotrebljava se da označi da dodatni članovi mogu opciono da budu prisutni pored članova navedenih iza "koji sadrži". Međutim, predviđeno je da, kao specifičan primer izvođenja predmetnih navoda, termin "koji sadrži" uključuje mogućnost da nema dodatnih članova, tj. u svrhu ovog primera izvođenja, "koji sadrži" treba razumeti u značenju "koji se sastoji od".

[0063] Oznake relativnih količina komponente koju karakteriše generički termin namenjene su da se odnose na ukupnu količinu svih specifičnih varijanti ili članova obuhvaćenih navedenim generičkim terminom. Ako je navedeno da je određena komponenta definisana generičkim terminom prisutna u određenoj relativnoj količini, i ako je ova komponenta dalje okarakterisana kao posebna varijanta ili član obuhvaćen generičkim terminom, znači da nijedna druga varijanta ili član obuhvaćen generičkim terminom nije dodatno prisutan tako da ukupna relativna količina komponenata obuhvaćenih generičkim terminom prevazilazi navedenu relativnu količinu; poželjnije nikakve druge varijante ili članovi obuhvaćeni generičkim terminom nisu uopšte prisutni.

[0064] Termini kao što su "smanjuje" ili "inhibira", kako se ovde koriste, označavaju sposobnost izazivanja ukupnog snižavanja, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije 75% ili više, nivoa. Termin "inhibira" ili slični izrazi uključuju potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. snižavanje na nulu ili suštinski na nulu.

[0065] Termini kao što su "povećava" ili "pojačava" poželjno se odnose na povećanje ili pojačavanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, čak poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%.

[0066] Termin "neto naelektrisanje" odnosi se na naelektrisanje na celom objektu, kao što je jedinjenje ili čestica.

[0067] Jon koji ima ukupno neto pozitivno naelektrisanje je katjon, dok je jon koji ima ukupno neto negativno naelektrisanje anjon. Tako, prema navodima, anjon je jon sa više elektrona nego protona, što mu daje neto negativno naelektrisanje; a katjon je jon sa manje elektrona nego protona, što mu daje pozitivno naelektrisanje.

[0068] Termini kao "naelektrisan", "neto naelektrisanje", "negativno naelektrisan" ili "pozitivno naelektrisan", u vezi sa datim jedinjenjem ili česticom, odnose se na električno neto naelektrisanje datog jedinjenja ili čestice kada je rastvoreno ili suspendovano u vodi na pH 7.0.

[0069] Termin "nukleinska kiselina" prema navodima takođe obuhvata hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu, i nukleinske kiseline koje sadrže neprirodne nukleotide i analoge nukleotida. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je

1

dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Uopšteno, molekul nukleinske kiseline ili sekvenca nukleinske kiseline se odnosi na nukleinsku kiselinu koja je poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Prema navodima, nukleinske kiseline obuhvataju genomsku DNK, cDNK, iRNK, virusnu RNK, rekombinantno pripremljene i hemijski sintetizovane molekule. Prema navodima, nukleinska kiselina može da bude u obliku jednolančanog ili dvolančanog i linearnog ili kovalentno zatvorenog kružnog molekula.

[0070] Prema navodima, "sekvenca nukleinske kiseline" se odnosi na sekvencu nukleotida u nukleinskoj kiselini, npr. ribonukleinska kiselina (RNK) ili dezoksiribonukleinska kiselina (DNK). Termin može da se odnosi na ceo molekul nukleinske kiseline (kao što je pojedinačni lanac celog molekula nukleinske kiseline) ili na njegov deo (npr. fragment).

[0071] Prema ovim navodima, termin "RNK" ili "molekul RNK" se odnosi na molekul koji sadrži ribonukleotidne ostatke i koji je poželjno u potpunosti ili suštinski sačinjen od ribonukleotidnih ostataka. Termin "ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2'-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin "RNK" obuhvata dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čista RNK, sintetička RNK i rekombinantno generisana RNK kao što je modifikovana RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu uključivati dodavanje ne-nukleotidnog materijala, kao na kraj(eve) RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne pojavljuju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu da se nazovu analozima, posebno analozima RNK koje se javljaju u prirodi.

[0072] Prema navodima, RNK može da bude jednolančana ili dvolančana. U nekim primerima izvođenja ovih navoda, poželjna je jednolančana RNK. Termin "jednolančana RNK" se generalno odnosi na molekul RNK za koji nije vezan nijedan komplementarni molekul nukleinske kiseline (obično nikakav komplementarni RNK molekul). Jednolančana RNK može da sadrži samokomplementarne sekvence koje omogućavaju delovima RNK da se savijaju i formiraju motive sekundarne strukture uključujući bez ograničenja parove baza, strukture drške, drške-petlje i izbočine. Jednolančana RNK može da postoji kao minus lanac [(-) lanac] ili kao plus lanac [(+) lanac]. (+) lanac je lanac koji sadrži ili kodira genetsku informaciju. Genetska informacija može da bude na primer polinukleotidna sekvenca koja kodira protein. Kada (+) lanac RNK kodira protein, (+) lanac može poslužiti direktno kao matrica za translaciju (sintezu proteina). (-) lanac je komplement (+) lanca. U slučaju dvolančane RNK, (+) lanac i (-) lanac su dva odvojena molekula

1

RNK, i ova dva molekula RNK se povezuju jedan sa drugim da bi formirali dvolančanu RNK ("dupleks RNK").

[0073] Termin "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. „Poluživot“ se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu predmetnih navoda, poluživot RNK je indikativan za stabilnost navedene RNK. Poluživot RNK može da utiče na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će se RNK sa dugim poluživotom eksprimirati tokom dužeg vremenskog perioda.

[0074] Termin "efikasnost translacije" odnosi se na količinu proizvoda translacije koju obezbeđuje molekul RNK u određenom vremenskom periodu.

[0075] "Fragment", koji se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline, odnosi se na deo sekvence nukleinske kiseline, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu nukleinske kiseline skraćenu na 5'- i/ili 3'-kraju. Poželjno, fragment sekvence nukleinske kiseline sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih ostataka iz navedene sekvence nukleinske kiseline. U ovim navodima poželjni su oni fragmenti molekula RNK koji zadržavaju stabilnost RNK i/ili translacionu efikasnost.

[0076] "Fragment", koji se odnosi na aminokiselinsku sekvencu (peptid ili protein), odnosi se na deo aminokiselinske sekvence, odnosno na sekvencu koja predstavlja aminokiselinsku sekvencu skraćenu na N-kraju i/ili C-kraju. Fragment skraćen na C-kraju (N-terminalni fragment) može da se dobije npr. translacijom skraćenog otvorenog okvira čitanja kome nedostaje 3'-kraj otvorenog okvira čitanja. Fragment skraćen na N-kraju (C-terminalni fragment) može da se dobije npr. translacijom skraćenog otvorenog okvira čitanja kome nedostaje 5'-kraj otvorenog okvira čitanja, sve dok skraćeni otvoreni okvir čitanja sadrži start kodon koji služi za inicijaciju translacije. Fragment aminokiselinske sekvence obuhvata npr. najmanje 1 %, najmanje 2 %, najmanje 3 %, najmanje 4 %, najmanje 5 %, najmanje 10 %, najmanje 20 %, najmanje 30 %, najmanje 40 %, najmanje 50 %, najmanje 60 %, najmanje 70 %, najmanje 80 %, najmanje 90 % aminokiselinskih ostataka aminokiselinske sekvence.

[0077] Termin "varijanta" koji se odnosi na, na primer, sekvencu nukleinske kiseline i aminokiselinsku sekvencu, prema navodima obuhvata sve varijante, posebno mutante, varijante soja virusa, varijante splajsovanja, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrste i homologe vrsta, posebno one koji su prirodno prisutni. Alelna varijanta se odnosi na promenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Što se tiče molekula nukleinske kiseline, termin "varijanta" uključuje degenerisane sekvence nukleinske kiseline, pri čemu je degenerisana nukleinska kiselina prema navodima nukleinska kiselina koja se razlikuje od referentne nukleinske

1

kiseline u sekvenci kodona zbog degeneracije genetskog koda. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od različite vrste u odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline ili aminokiselinsku sekvencu. Homolog virusa je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od različitog virusa u odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline ili aminokiselinsku sekvencu.

[0078] Prema navodima, varijante nukleinske kiseline obuhvataju pojedinačne ili višestruke delecije, adicije, mutacije, supstitucije i/ili insercije nukleotida, u poređenju sa referentnom nukleinskom kiselinom. Delecije uključuju uklanjanje jednog ili više nukleotida iz referentne nukleinske kiseline. Adicione varijante obuhvataju 5'- i/ili 3'-terminalne fuzije jednog ili više nukleotida, kao što je 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više nukleotida. U slučaju supstitucija, najmanje jedan nukleotid u sekvenci se uklanja i na njegovo mesto se ubacuje najmanje jedan drugačiji nukleotid (kao što su transverzije i tranzicije). Mutacije uključuju abazična mesta, umrežena mesta i hemijski izmenjene ili modifikovane baze. Insercije uključuju dodavanje najmanje jednog nukleotida u referentnu nukleinsku kiselinu.

[0079] Prema navodima, "izmena nukleotida" može da se odnosi na pojedinačne ili višestruke delecije, adicije, mutacije, supstitucije i/ili insercije nukleotida, u poređenju sa referentnom nukleinskom kiselinom. U nekim primerima izvođenja, "izmena nukleotida" se bira iz grupe koja se sastoji od delecije jednog nukleotida, adicije jednog nukleotida, mutacije jednog nukleotida, supstitucije jednog nukleotida i/ili insercije pojedinačnog nukleotida, u poređenju sa referentnom nukleinskom kiselinom. Prema navodima, varijanta nukleinske kiseline može da sadrži jednu ili više nukleotidnih izmena u poređenju sa referentnom nukleinskom kiselinom.

[0080] Varijante specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina poželjno imaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo navedenih specifičnih sekvenci i poželjno su funkcionalno ekvivalentne navedenim specifičnim sekvencama, npr. sekvence nukleinskih kiselina koje pokazuju svojstva identična ili slična onima kod specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina.

[0081] Kao što je dole opisano, neki primeri izvođenja predmetnih navoda su, između ostalog, okarakterisani sekvencama nukleinske kiseline koje su homologne sekvencama nukleinske kiseline alfavirusa, kao što je alfavirus koji se nalazi u prirodi. Ove homologne sekvence su varijante sekvenci nukleinske kiseline alfavirusa, kao što je alfavirus koji se nalazi u prirodi.

[0082] Poželjno je da stepen identičnosti između date sekvence nukleinske kiseline i sekvence nukleinske kiseline koja je varijanta navedene date sekvence nukleinske kiseline bude najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85 %, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen identičnosti je poželjno dat za region od najmanje oko 30, najmanje oko 50, najmanje oko 70, najmanje oko 90,

2

najmanje oko 100, najmanje oko 150, najmanje oko 200, najmanje oko 250, najmanje oko 300, ili najmanje oko 400 nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, stepen identičnosti je dat za celu dužinu sekvence referentne nukleinske kiseline.

[0083] "Sličnost sekvence" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervisane aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve sekvence polipeptida ili nukleinske kiseline ukazuje na procenat aminokiselina ili nukleotida koji su identični između sekvenci.

[0084] Termin "% identičnosti" namenjen je da se odnosi, konkretno, na procenat nukleotida koji su identični u optimalnom poravnanju dve sekvence koje treba uporediti, pri čemu je navedeni procenat čisto statistički, a razlike između dve sekvence mogu da bude nasumično raspoređeni celom dužinom sekvence i sekvenca koja se poredi može da sadrži adicije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, da bi se postiglo optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenja dve sekvence se obično vrše upoređivanjem navedenih sekvenci, nakon optimalnog poravnanja, u odnosu na segment ili "prozor poređenja", da bi se identifikovali lokalni regioni odgovarajućih sekvenci. Optimalno poravnanje za poređenje može da se obavi ručno ili uz pomoć algoritma lokalne homologije autora Smith i Waterman, 1981, Ads App. Math.2, 482, uz pomoć algoritma lokalne homologije autora Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48, 443, i uz pomoć algoritma za traženje sličnosti autora Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 ili uz pomoć kompjuterskih programa koji koriste navedene algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0085] Procenat identičnosti se dobija određivanjem broja identičnih pozicija na kojima sekvence koje treba uporediti odgovaraju, deljenjem ovog broja brojem upoređenih pozicija i množenjem ovog rezultata sa 100.

[0086] Na primer, može da se upotrebi BLAST program "BLAST 2 sekvence" koji je dostupan na internet stranici http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi.

[0087] Nukleinska kiselina je "sposobna da hibridizuje" ili "hibridizuje" sa drugom nukleinskom kiselinom ako su dve sekvence komplementarne jedna drugoj. Nukleinska kiselina je "komplementarna" drugoj nukleinskoj kiselini ako su dve sekvence sposobne da međusobno formiraju stabilan dupleks. Prema navodima, hibridizacija se poželjno izvodi pod uslovima koji dozvoljavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (strogi uslovi). Strogi uslovi su opisani, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65°C u puferu za hibridizaciju (3.5 x SSC, 0.02% fikola, 0.02% polivinilpirolidona, 0.02% goveđeg serumskog albumina, 2.5 mM NaH2PO4(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0.15 M natrijum hlorid/0.15 M natrijum citrat, pH 7. Nakon hibridizacije, membrana na koju je DNK prebačena se pere, na primer, u 2 x SSC na sobnoj temperaturi, a zatim u 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS na temperaturama do 68°C.

[0088] Procenat komplementarnosti ukazuje na procenat susednih ostataka u molekulu nukleinske kiseline koji mogu da formiraju vodonične veze (npr. Votson-Krikovo uparivanje baza) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr.5, 6, 7, 8, 9, 10 od 10 je 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 100% komplementarno). "Savršeno komplementarno" ili "potpuno komplementarno" znači da će se svi susedni ostaci sekvence nukleinske kiseline vezati vodoničnim vezama sa istim brojem susednih ostataka u drugoj sekvenci nukleinske kiseline. Poželjno, stepen komplementarnosti prema navodima je najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Najpoželjnije, stepen komplementarnosti prema navodima je 100%.

[0089] Termin "derivat" obuhvata bilo koju hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu. Termin "derivat" takođe obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide i analoge nukleotida koji se ne javljaju u prirodi. Poželjno, derivatizacija nukleinske kiseline povećava njenu stabilnost.

[0090] Prema navodima, "sekvenca nukleinske kiseline koja potiče od sekvence nukleinske kiseline" se odnosi na nukleinsku kiselinu koja je varijanta nukleinske kiseline od koje potiče. Poželjno, sekvenca koja je varijanta u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zameni specifičnu sekvencu u molekulu RNK, zadržava stabilnost RNK i/ili translacionu efikasnost.

[0091] "nt" je skraćenica za nukleotid; ili za nukleotide, poželjno uzastopne nukleotide u molekulu nukleinske kiseline.

[0092] Prema navodima, termin "kodon" se odnosi na triplet baza u kodirajućoj nukleinskoj kiselini koja određuje koja će amino kiselina da bude sledeća tokom sinteze proteina na ribozomu.

[0093] Termini "transkripcija" i "transkribovanje" odnose se na proces tokom kojeg se molekul nukleinske kiseline sa određenom sekvencom nukleinske kiseline ("matrica nukleinske kiseline") očitava pomoću RNK polimeraze, tako da RNK polimeraza proizvodi jednolančani molekul RNK. Tokom transkripcije, genetske informacije u matrici nukleinske kiseline se transkribuju. Matrica nukleinske kiseline može da bude DNK; međutim, npr. u slučaju transkripcije sa matrice alfavirusne nukleinske kiseline, matrica je tipično RNK. Nakon toga, transkribovana RNK može da bude prevedena u protein. Prema ovim navodima, termin "transkripcija" obuhvata "in vitro transkripciju", pri čemu se izraz "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kome se RNK, konkretno iRNK, in vitro sintetiše u sistemu bez ćelija. Poželjno, za generisanje transkripata se primenjuju vektori za kloniranje. Ovi vektori za kloniranje su uopšteno označeni kao vektori transkripcije i prema predmetnim navodima su obuhvaćeni terminom "vektor". Vektori za kloniranje su poželjno plazmidi. Prema predmetnim navodima, RNK je poželjno in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može da se dobije in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice. Promotor za kontrolu transkripcije može da bude bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. DNK matrica za in vitro transkripciju može da se dobije kloniranjem nukleinske kiseline, konkretno cDNK, i uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK može da se dobije reverznom transkripcijom RNK.

[0094] Jednolančani molekul nukleinske kiseline proizveden tokom transkripcije obično ima sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sekvenca matrice.

[0095] Prema navodima, termini "matrica" ili "matrica nukleinske kiseline" ili "matrična nukleinska kiselina" uopšteno se odnose na sekvencu nukleinske kiseline koja može da se replikuje ili transkribuje.

[0096] "Sekvenca nukleinske kiseline transkribovana sa sekvence nukleinske kiseline" i slični termini se odnose na sekvencu nukleinske kiseline, gde je prikladno, kao deo kompletnog RNK molekula, koji je proizvod transkripcije sekvence matrične nukleinske kiseline. Tipično, transkribovana sekvenca nukleinske kiseline je jednolančani molekul RNK.

[0097] "3' kraj nukleinske kiseline" se prema navodima odnosi na onaj kraj koji ima slobodnu hidroksilnu grupu. Na dijagramskom prikazu dvolančanih nukleinskih kiselina, posebno DNK, 3' kraj je uvek na desnoj strani. "5' kraj nukleinske kiseline" se prema navodima odnosi na onaj kraj koji ima slobodnu fosfatnu grupu. Na dijagramskom prikazu dvolančanih nukleinskih kiselina, posebno DNK, 5' kraj je uvek na levoj strani.

[0098] "Ushodno" opisuje relativni položaj prvog elementa molekula nukleinske kiseline u odnosu na drugi element tog molekula nukleinske kiseline, pri čemu su oba elementa sadržana u istom molekulu nukleinske kiseline, i gde se prvi element nalazi bliže 5' kraju molekula nukleinske kiseline od drugog elementa tog molekula nukleinske kiseline. Za drugi element se tada kaže da je "nishodno" od prvog elementa tog molekula nukleinske kiseline. Za element koji se nalazi "ushodno" od drugog elementa može sinonimno da se kaže da se nalazi "5'" od tog drugog elementa. Za dvolančani molekul nukleinske kiseline, indikacije poput "ushodno" i "nishodno" su date u odnosu na (+) lanac.

2

[0099] Prema navodima, "funkcionalna veza" ili "funkcionalno povezan" se odnosi na vezu unutar funkcionalnog odnosa. Nukleinska kiselina je "funkcionalno povezana" ako je funkcionalno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promotor je funkcionalno vezan za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju navedene kodirajuće sekvence. Funkcionalno povezane nukleinske kiseline su tipično susedne jedna drugoj, gde je to prikladno, razdvojene dodatnim sekvencama nukleinskih kiselina, a, u određenim primerima izvođenja transkribuju se pomoću RNK polimeraze tako da se dobije jedan molekul RNK (zajednički transkript).

[0100] U određenim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana u skladu sa navodima sa sekvencama za kontrolu ekspresije koje mogu da budu homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu.

[0101] Termin "sekvenca za kontrolu ekspresije" obuhvata u skladu sa promotorima prema navodima, sekvence koje se vezuju za ribozom i druge kontrolne elemente koji kontrolišu transkripciju gena ili translaciju izvedene RNK. U posebnim primerima izvođenja navoda, sekvence za kontrolu ekspresije mogu da se regulišu. Precizna struktura sekvenci za kontrolu ekspresije može da varira u zavisnosti od vrste ili tipa ćelije, ali obično uključuje 5'-netranskribovane, odnosno 5'- i 3'-netranslate sekvence uključene u inicijaciju transkripcije, odnosno translacije. Tačnije, 5'-netranskribovane sekvence za kontrolu ekspresije uključuju promotorski region koji obuhvata promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezanog gena. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu takođe da uključuju sekvence pojačivača ili ushodne aktivatorske sekvence. Sekvenca za kontrolu ekspresije molekula DNK obično uključuje 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-netranslate sekvence kao što su TATA boks, sekvenca za dodavanje kape ili CAAT sekvenca. Sekvenca za kontrolu ekspresije alfavirusne RNK može da uključuje subgenomski promotor i/ili jedan ili više konzervisanih elemenata sekvence. Specifična sekvenca za kontrolu ekspresije prema ovim navodima je subgenomski promotor alfavirusa, kao što je ovde opisano.

[0102] Ovde navedene sekvence nukleinske kiseline, posebno sekvence nukleinske kiseline koje mogu da se transkribuju i kodirajuće sekvence nukleinske kiseline, mogu da se kombinuju sa bilo kojim sekvencama za kontrolu ekspresije, posebno promotorima, koji mogu da budu homologni ili heterologni navedenim sekvencama nukleinske kiseline, sa terminom "homologni" koji se odnosi na činjenicu da je sekvenca nukleinske kiseline takođe prirodno funkcionalno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije, a izraz "heterologni" se odnosi na činjenicu da sekvenca nukleinske kiseline nije prirodno funkcionalno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije.

[0103] Sekvenca nukleinske kiseline koja može da se transkribuje, posebno sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein, i sekvenca za kontrolu ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom, ako su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je transkripcija ili ekspresija sekvence koja može da se transkribuje i posebno kodirajuće sekvence nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem sekvence za kontrolu ekspresije. Ako sekvencu nukleinske kiseline treba translatirati u funkcionalni peptid ili protein, indukcija sekvence za kontrolu ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom rezultira transkripcijom navedene kodirajuće sekvence, bez izazivanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili nemogućnosti kodirajuće sekvence. da se translatira u željeni peptid ili protein.

[0104] Termin "promotor" ili "promotorski region" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kontroliše sintezu transkripta, npr. transkripta koji sadrži kodirajuću sekvencu, obezbeđujući mesto za prepoznavanje i vezivanje za RNK polimerazu. Region promotora može da uključuje dodatna mesta za prepoznavanje ili vezivanje za dodatne faktore uključene u regulaciju transkripcije navedenog gena. Promotor može da kontroliše transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Promotor može da bude "inducibilan" i da dovede do inicijacije transkripcije kao odgovor na induktor, ili može da bude "konstitutivan" ako transkripciju ne kontroliše induktor. Inducibilni promotor se eksprimira samo u veoma maloj meri ili uopšte ne eksprimira ako je induktor odsutan. U prisustvu induktora, gen se "uključuje" ili se povećava nivo transkripcije. Ovo je obično posredovano vezivanjem specifičnog faktora transkripcije. Specifični promotor prema ovim navodima je subgenomski promotor alfavirusa, kao što je ovde opisano. Drugi specifični promotori su genomski promotori alfavirusa pozitivnog lanca ili negativnog lanca.

[0105] Termin "jezgro promotora" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koju sadrži promotor. Jezgro promotora je tipično minimalni deo promotora koji je potreban za pravilnu inicijaciju transkripcije. Jezgro promotora obično uključuje mesto početka transkripcije i mesto vezivanja za RNK polimerazu.

[0106] "Polimeraza" se uopšteno odnosi na molekularni entitet sposoban da katalizuje sintezu polimernog molekula iz monomernih gradivnih blokova. "RNK polimeraza" je molekularni entitet sposoban da katalizuje sintezu RNK molekula iz ribonukleotidnih gradivnih blokova. "DNK polimeraza" je molekularni entitet sposoban da katalizuje sintezu molekula DNK iz dezoksiribonukleotidnih gradivnih blokova. U slučaju DNK polimeraza i RNK polimeraza, molekularni entitet je tipično protein ili sklop ili kompleks više proteina. Tipično, DNK polimeraza sintetiše molekul DNK na osnovu matrične nukleinske kiseline, koja je tipično DNK molekul. Tipično, RNK polimeraza sintetiše RNK molekul na osnovu matrične nukleinske kiseline, koja je ili molekul DNK (u tom slučaju RNK polimeraza je DNK-zavisna RNK polimeraza, DdRP), ili je RNK molekul (u tom slučaju RNK polimeraza je RNK-zavisna RNK polimeraza, RdRP).

2

[0107] "RNK-zavisna RNK polimeraza" ili "RdRP" je enzim koji katalizuje transkripciju RNK sa RNK matrice. U slučaju alfavirusne RNK-zavisne RNK polimeraze, sekvencijalna sinteza (-) lanca komplementa genomske RNK i (+) lanca genomske RNK dovodi do replikacije RNK. Alfavirusna RNK-zavisna RNK polimeraza se stoga sinonimno naziva "RNK replikaza". U prirodi, RNK-zavisne RNK polimeraze tipično kodiraju svi RNK virusi osim retrovirusa. Tipični predstavnici virusa koji kodiraju RNK-zavisnu RNK polimerazu su alfavirusi.

[0108] Prema predmetnim navodima, "replikacija RNK" se generalno odnosi na molekul RNK sintetizovan na osnovu nukleotidne sekvence datog RNK molekula (matrični RNK molekul). Molekul RNK koji se sintetiše može da bude npr. identičan ili komplementaran matričnom RNK molekulu. Uopšteno, replikacija RNK se može desiti putem sinteze DNK intermedijera, ili se može desiti direktno RNK-zavisnom replikacijom RNK posredovanom RNK-zavisnom RNK polimerazom (RdRP). U slučaju alfavirusa, replikacija RNK se ne dešava preko DNK intermedijera, već je posredovana RNK-zavisnom RNK polimerazom (RdRP): matrični RNK lanac (prvi lanac RNK) - ili njegov deo - služi kao matrica za sintezu drugog lanca RNK koji je komplementaran prvom lancu RNK ili njegovom delu. Drugi lanac RNK - ili njegov deo - može zauzvrat opciono da služi kao matrica za sintezu trećeg lanca RNK koji je komplementaran drugom lancu RNK ili njegovom delu. Prema tome, treći lanac RNK je identičan prvom lancu RNK ili njegovom delu. Dakle, RNK-zavisna RNK polimeraza je sposobna da direktno sintetiše komplementarni matrični RNK lanac, i da indirektno sintetiše identičan lanac RNK (preko komplementarnog intermedijarnog lanca).

[0109] Prema navodima, termin "matrična RNK" se odnosi na RNK koja može da se transkribuje ili replikuje pomoću RNK-zavisne RNK polimeraze.

[0110] Prema navodima, termin "gen" se odnosi na određenu sekvencu nukleinske kiseline koja je odgovorna za proizvodnju jednog ili više ćelijskih proizvoda i/ili za postizanje jedne ili više međućelijskih ili unutarćelijskih funkcija. Tačnije, pomenuti termin se odnosi na deo nukleinske kiseline (obično DNK; ali RNK u slučaju RNK virusa) koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira specifični protein ili funkcionalni ili strukturni molekul RNK.

[0111] "Izolovani molekul" kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na molekul koji je suštinski bez drugih molekula kao što je drugi ćelijski materijal. Termin "izolovana nukleinska kiselina" znači prema navodima da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, npr. cepanjem i gel-elektroforetskim frakcionisanjem, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina dostupna za manipulaciju rekombinantnim tehnikama.

2

[0112] Termin "vektor" se ovde koristi u svom najopštijem značenju i obuhvata bilo koji intermedijarni vehikulum za nukleinsku kiselinu koji, na primer, omogućava da se navedena nukleinska kiselina uvede u prokariotske i/ili eukariotske ćelije-domaćine i, gde je prikladno, da se integriše u genom. Takvi vektori se poželjno replikuju i/ili eksprimiraju u ćeliji. Vektori obuhvataju plazmide, fagmide, virusne genome i njihove frakcije.

[0113] Termin "rekombinantni" u kontekstu predmetnih navoda znači "napravljen genetskim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu predmetnih navoda se ne javlja u prirodi.

[0114] Termin "prirodni" kako se ovde koristi odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može da bude izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, je prirodna. Termin "pronađen u prirodi" znači "prisutan u prirodi" i uključuje poznate objekte, kao i objekte koji još nisu otkriveni i/ili izolovani iz prirode, ali koji mogu da bude otkriveni i/ili izolovani u budućnosti iz prirodnog izvora.

[0115] Prema navodima, termin "ekspresija" se koristi u svom najopštijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK, ili RNK i proteina. Takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Osim toga, ekspresija može da bude prolazna ili stabilna. Što se tiče RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" odnosi se na proces u ribozomima ćelije pomoću kojeg lanac kodirajuće RNK (npr. informaciona RNK) usmerava sklapanje niza aminokiselina kako bi se napravio peptid ili protein.

[0116] Prema navodima, izraz "iRNK" znači "informaciona RNK" i odnosi se na transkript koji se tipično generiše korišćenjem DNK matrice i kodira peptid ili protein. Tipično, iRNK sadrži 5'-UTR, region koji kodira protein, 3'-UTR i poli(A) sekvencu. iRNK može da se generiše in vitro transkripcijom sa DNK matrice. Metodologija in vitro transkripcije je poznata stručnjaku. Na primer, postoji niz kompleta za in vitro transkripciju koji su komercijalno dostupni. Prema navodima, iRNK može da bude modifikovana stabilizujućim modifikacijama i dodavanjem kape.

[0117] Prema navodima, izrazi "poli(A) sekvenca" ili "poli(A) rep" odnose se na neprekinutu ili prekinutu sekvencu adenilatnih ostataka koja se tipično nalazi na 3' kraju molekula RNK. Neprekinutu sekvencu karakterišu uzastopni ostaci adenilata. U prirodi je tipična neprekidna poli(A) sekvenca. Dok poli(A) sekvenca obično nije kodirana u eukariotskoj DNK, već se dodaje tokom eukariotske transkripcije u jedru ćelije na slobodni 3' kraj RNK pomoću RNK polimeraze nezavisne od matrice nakon transkripcije, predmetni navodi obuhvataju poli(A) sekvence koje kodira DNK.

[0118] Prema navodima, termin "primarna struktura", u vezi sa molekulom nukleinske kiseline, odnosi se na linearnu sekvencu nukleotidnih monomera.

2

[0119] Prema navodima, termin "sekundarna struktura", u vezi sa molekulom nukleinske kiseline, odnosi se na dvodimenzionalni prikaz molekula nukleinske kiseline koji odražava uparivanje baza; npr. u slučaju jednolančanog molekula RNK, praktično na intramolekularno uparivanje baza. Iako svaki molekul RNK ima samo jedan polinukleotidni lanac, molekul se obično karakteriše regionima (intramolekularnih) baznih parova. Prema navodima, termin "sekundarna struktura" obuhvata strukturne motive uključujući bez ograničenja bazne parove, strukture drške, drškepetlje, izbočine, petlje kao što su unutrašnje petlje i razgranate petlje. Sekundarna struktura molekula nukleinske kiseline može da bude predstavljena dvodimenzionalnim crtežom (planarni grafikon), koji prikazuje uparivanje baza (za dalje detalje o sekundarnoj strukturi molekula RNK, videti Auber et al., J. Graph Algorithms Appl., 2006., vol. 10, pp. 329-351). Kao što je ovde opisano, sekundarna struktura određenih molekula RNK je relevantna u kontekstu ovih navoda.

[0120] Prema navodima, sekundarna struktura molekula nukleinske kiseline, posebno jednolančanog molekula RNK, određena je predviđanjem upotrebom veb servera za predviđanje sekundarne strukture RNK http://rna.urmc.rochester. edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html). Poželjno, prema navodima, "sekundarna struktura", u odnosu na molekul nukleinske kiseline, posebno se odnosi na sekundarnu strukturu utvrđenu navedenim predviđanjem. Predviđanje se takođe može izvršiti ili potvrditi korišćenjem predviđanja strukture MFOLD (http://unafold.rna.albany. edu/?q=mfold).

[0121] Prema navodima, "bazni par" je strukturni motiv sekundarne strukture u kojoj se dve nukleotidne baze povezuju jedna sa drugom kroz vodonične veze između donorskih i akceptorskih mesta na bazama. Komplementarne baze, A:U i G:C, formiraju stabilne parove baza kroz vodonične veze između donorskih i akceptorskih mesta na bazama; parovi baza A:U i G:C se nazivaju Votson-Krikovi bazni parovi. Slabiji par baza (koji se zove kolebljivi (eng. wobble) bazni par) formiraju baze G i U (G:U). Parovi baza A:U i G:C nazivaju se kanonski bazni parovi. Drugi parovi baza poput G:U (koji se prilično često javlja u RNK) i drugi retki parovi baza (npr. A:C; U:U) nazivaju se nekanonski parovi baza.

[0122] Prema navodima, "uparivanje nukleotida" se odnosi na dva nukleotida koji se povezuju jedan sa drugim tako da njihove baze formiraju bazni par (kanonski ili nekanonski bazni par, poželjno kanonski bazni par, najpoželjnije Votson-Krikov bazni par).

[0123] Prema navodima, termini "drška-petlja" ili "ukosnica" ili "petlja u vidu ukosnice", u vezi sa molekulom nukleinske kiseline, sinonimno se odnose na određenu sekundarnu strukturu molekula nukleinske kiseline, obično jednolančanog molekula nukleinske kiseline, kao što je jednolančana RNK. Konkretna sekundarna struktura predstavljena strukturom drške-petlje sastoji se od uzastopne sekvence nukleinske kiseline koja sadrži dršku i (terminalnu) petlju, koja se takođe

2

naziva petlja u vidu ukosnice, pri čemu je drška formirana od dva susedna, potpuno ili delimično komplementarna elementa sekvence; koji su razdvojeni kratkim nizom (npr.3-10 nukleotida), koji formira petlju strukture drška-petlja. Dve susedne, potpuno ili delimično komplementarne sekvence mogu se definisati kao npr. elementi strukture drška-petlja, drška 1 i drška 2. Drškapetlja se formira kada ove dve susedne potpuno ili delimično reverzne komplementarne sekvence, npr. elementi strukture drška-petlja, drška 1 i drška 2, formiraju parove baza jedan s drugim, što dovodi do dvolančane sekvence nukleinske kiseline koja sadrži neuparenu petlju na svom terminalnom kraju koju formira kratka sekvenca koja se nalazi između elemenata strukture drškapetlja drške 1 i drške 2. Stoga, matična petlja sadrži dve drške (dršku 1 i dršku 2), koje - na nivou sekundarne strukture molekula nukleinske kiseline - međusobno formiraju parove baza, a koje su - na nivou primarne strukture molekula nukleinske kiseline - razdvojene kratkim nizom koji nije deo drške 1 ili drške 2. Za ilustraciju, dvodimenzionalni prikaz drške-petlje podseća na strukturu u obliku lizalice. Formiranje strukture drške-petlje zahteva prisustvo sekvence koja može da se savije da bi formirala upareni dvostruki lanac; upareni dvostruki lanac formiraju drška 1 i drška 2. Stabilnost uparenih elemenata drške-petlje je tipično određena dužinom, brojem nukleotida drške 1 koji su sposobni da formiraju bazne parove (poželjno kanonske parove baza, poželjno Votson-Krik bazne parove) sa nukleotidima drške 2, u odnosu na broj nukleotida drške 1 koji nisu sposobni da formiraju takve bazne parove sa nukleotidima drške 2 (nepodudaranja ili ispupčenja). Prema predmetnim navodima, optimalna dužina petlje je 3-10 nukleotida, poželjnije 4 do 7 nukleotida, kao što je 4 nukleotida, 5 nukleotida, 6 nukleotida ili 7 nukleotida. Ako je data sekvenca nukleinske kiseline okarakterisana drškom-petljom, odgovarajuća komplementarna sekvenca nukleinske kiseline je tipično takođe okarakterisana drškom-petljom. Drška-petlja se obično formira od jednolančanih molekula RNK. Na primer, nekoliko struktura drška-petlja je prisutno u 5' sekvenci prepoznavanja replikacije alfavirusne genomske RNK (ilustrovano na sl.1).

[0124] Prema navodima, "poremećaj" ili "poremetiti", u vezi sa specifičnom sekundarnom strukturom molekula nukleinske kiseline (npr. drška-petlja) znači da je specifična sekundarna struktura odsutna ili izmenjena. Tipično, sekundarna struktura može da bude poremećena kao posledica promene najmanje jednog nukleotida koji je deo sekundarne strukture. Na primer, drškapetlja može da bude poremećena izmenom jednog ili više nukleotida koji formiraju dršku, tako da uparivanje nukleotida nije moguće.

[0125] Prema navodima, "kompenzuje poremećaj sekundarne strukture" ili "kompenzacija poremećaja sekundarne strukture" odnosi se na jednu ili više nukleotidnih izmena u sekvenci nukleinske kiseline; tipičnije se odnosi na jednu ili više drugih nukleotidnih promena u sekvenci nukleinske kiseline, gde sekvenca nukleinske kiseline takođe sadrži jednu ili više izmena prvih

2

nukleotida, okarakterisanih na sledeći način: dok jedna ili više izmena prvih nukleotida, u odsustvu jedne ili više izmena drugih nukleotida, izazivaju poremećaj sekundarne strukture sekvence nukleinske kiseline, istovremena pojava jedne ili više izmena prvih nukleotida i jedne ili više izmena drugih nukleotida ne izaziva poremećaj sekundarne strukture nukleinske kiseline. Istovremena pojava znači prisustvo i jedne ili više izmena prvih nukleotida i jedne ili više izmena drugih nukleotida. Tipično, jedna ili više izmena prvih nukleotida i jedna ili više izmena drugih nukleotida su prisutne zajedno u istom molekulu nukleinske kiseline. U specifičnom primeru izvođenja, jedna ili više izmena nukleotida koje kompenzuju poremećaj sekundarne strukture je/su jedna ili više nukleotidnih izmena koje kompenzuju jedan ili više poremećaja uparivanja nukleotida. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, "kompenzacija poremećaja sekundarne strukture" znači "kompenzacija poremećaja uparivanja nukleotida", tj. jedan ili više poremećaja uparivanja nukleotida, na primer jedan ili više poremećaja uparivanja nukleotida unutar jedne ili više struktura drška-petlja. Jedan ili više poremećaja uparivanja jednog ili više nukleotida mogu da budu uvedeni uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona. Svaka od jedne ili više nukleotidnih izmena koje kompenzuju poremećaj sekundarne strukture je izmena nukleotida, od kojih svaka može da bude nezavisno izabrana od delecije, adicije, supstitucije i/ili insercije jednog ili više nukleotida. U ilustrativnom primeru, kada je nukleotidno uparivanje A:U prekinuto supstitucijom A u C (C i U nisu tipično pogodni da formiraju nukleotidni par); onda izmena nukleotida koja kompenzuje poremećaj uparivanja nukleotida može da bude supstitucija U sa G, čime se omogućava formiranje para C:G nukleotida. Supstitucija U sa G na taj način kompenzuje poremećaj uparivanja nukleotida. U alternativnom primeru, kada je uparivanje nukleotida A:U poremećeno supstitucijom A u C; onda izmena nukleotida koja kompenzuje poremećaj uparivanja nukleotida može da bude supstitucija C sa A, čime se obnavlja formiranje originalnog A:U nukleotidnog para. Uopšteno, u predmetnim navodima, poželjne su one promene nukleotida koje kompenzuju poremećaj sekundarne strukture koje niti obnavljaju originalnu sekvencu nukleinske kiseline niti stvaraju nove AUG triplete. U gornjem skupu primera, supstitucija U u G je poželjnija od supstitucije C u A.

[0126] Prema navodima, termin "tercijarna struktura", u vezi sa molekulom nukleinske kiseline, odnosi se na trodimenzionalnu strukturu molekula nukleinske kiseline, kako je definisana atomskim koordinatama.

[0127] Prema navodima, nukleinska kiselina kao što je RNK, npr. iRNK, može da kodira peptid ili protein. Shodno tome, sekvenca nukleinske kiseline koja se može transkribovati ili njen transkript mogu da sadrže otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira peptid ili protein.

[0128] Prema navodima, izraz "nukleinska kiselina koja kodira peptid ili protein" znači da nukleinska kiselina, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može da usmerava sklapanje aminokiselina da bi se tokom procesa translacije proizveo peptid ili protein. Poželjno, kodirajuća RNK prema navodima može da stupi u interakciju sa ćelijskom translacionom mašinerijom omogućavajući translaciju kodirajuće RNK kako bi se dobio peptid ili protein.

[0129] Prema navodima, termin "peptid" obuhvata oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 20 ili više, i do poželjno 50, poželjno 100 ili poželjno 150, uzastopnih aminokiselina povezanih jedna sa drugom preko peptidnih veza. Termin "protein" se odnosi na velike peptide, poželjno peptide koji imaju najmanje 151 aminokiselinu, ali termini "peptid" i "protein" se ovde obično koriste kao sinonimi.

[0130] Termini "peptid" i "protein" obuhvataju, prema navodima, supstance koje sadrže ne samo komponente aminokiselina već i komponente koje nisu aminokiseline, kao što su šećeri i fosfatne strukture, a takođe sadrže supstance koje sadrže veze kao što su estarske, tioetarske ili disulfidne veze.

[0131] Prema navodima, termini "inicijacioni kodon" i "start kodon" sinonimno se odnose na kodon (bazni triplet) molekula RNK koji je potencijalno prvi kodon koji se translatira ribozomom. Takav kodon tipično kodira aminokiselinu metionin kod eukariota i modifikovani metionin kod prokariota. Najčešći inicijacioni kodon kod eukariota i prokariota je AUG. Osim ako je ovde izričito navedeno da se misli na inicijacioni kodon koji nije AUG, izrazi "inicijacioni kodon" i "start kodon", u vezi sa RNK molekulom, odnose se na kodon AUG. Prema navodima, termini "inicijacioni kodon" i "start kodon" se takođe koriste za označavanje odgovarajućeg baznog tripleta dezoksiribonukleinske kiseline, odnosno baznog tripleta koji kodira inicijacioni kodon RNK. Ako je inicijacioni kodon informacione RNK AUG, bazni triplet koji kodira AUG je ATG. Prema navodima, termini "inicijacioni kodon" i "start kodon" poželjno se odnose na funkcionalni inicijacioni kodon ili start kodon, odnosno na inicijacioni kodon ili start kodon koji ribozom koristi ili bi koristio kao kodon za započinjanje translacije. U molekulu RNK mogu postojati AUG kodoni koje ribozom ne koristi kao kodone za započinjanje translacije, npr. zbog male udaljenosti kodona do kape. Ovi kodoni nisu obuhvaćeni terminom funkcionalni inicijacioni kodon ili start kodon.

[0132] Prema navodima, izrazi "start kodon otvorenog okvira čitanja" ili "inicijacioni kodon otvorenog okvira čitanja" odnose se na bazni triplet koji služi kao inicijacioni kodon za sintezu proteina u kodirajućoj sekvenci, npr. u kodirajućoj sekvenci molekula nukleinske kiseline koji se

1

nalazi u prirodi. U molekulu RNK, start kodonu otvorenog okvira čitanja često prethodi 5' netranslatirani region (5'-UTR), iako to nije striktno potrebno.

[0133] Prema navodima, izrazi "nativni start kodon otvorenog okvira čitanja" ili "nativni inicijacioni kodon otvorenog okvira čitanja" odnose se na bazni triplet koji služi kao inicijacioni kodon za sintezu proteina u nativnoj kodirajućoj sekvenci. Nativna kodirajuća sekvenca može da bude npr. kodirajuća sekvenca molekula nukleinske kiseline koja se nalazi u prirodi. U nekim primerima izvođenja, predmetni navodi obezbeđuju varijante molekula nukleinske kiseline pronađene u prirodi, koje se karakterišu po tome što je prirodni start kodon (koji je prisutan u prirodnoj kodirajućoj sekvenci) uklonjen (tako da nije prisutan u varijantnom molekulu nukleinske kiseline).

[0134] Prema navodima, "prvi AUG" označava najushodniji AUG bazni triplet molekula informacione RNK, poželjno najushodniji AUG bazni triplet molekula informacione RNK koji ribozom koristi ili bi koristio kao kodon za započinjanje translacije. Shodno tome, "prvi ATG" se odnosi na bazni triplet ATG kodirajuće DNK sekvence koja kodira prvi AUG. U nekim slučajevima, prvi AUG molekula iRNK je start kodon otvorenog okvira čitanja, odnosno kodon koji se koristi kao start kodon tokom ribozomalne sinteze proteina.

[0135] Prema navodima, termini "obuhvata uklanjanje" ili "okarakterisan uklanjanjem" i slični termini, koji se odnose na određeni element varijante nukleinske kiseline, znače da navedeni određeni element nije funkcionalan ili nije prisutan u varijanta nukleinske kiseline, u poređenju sa referentnim molekulom nukleinske kiseline. Bez ograničenja, uklanjanje može da se sastoji od delecije celog ili dela određenog elementa, supstitucije celog ili dela određenog elementa ili promene funkcionalnih ili strukturnih svojstava određenog elementa. Uklanjanje funkcionalnog elementa sekvence nukleinske kiseline zahteva da se funkcija ne ispoljava na poziciji varijante nukleinske kiseline koja obuhvata uklanjanje. Na primer, varijanta RNK koju karakteriše uklanjanje određenog inicijacionog kodona zahteva da se ribozomalna sinteza proteina ne pokrene na poziciji RNK varijante koju karakteriše uklanjanje. Uklanjanje strukturnog elementa sekvence nukleinske kiseline zahteva da strukturni element nije prisutan na poziciji varijante nukleinske kiseline koja obuhvata uklanjanje. Na primer, varijanta RNK koju karakteriše uklanjanje određenog baznog tripleta AUG, tj. baznog tripleta AUG na određenoj poziciji, može da bude okarakterisana, npr. delecijom dela ili celog određenog baznog tripleta AUG (npr. ΔAUG), ili supstitucijom jednog ili više nukleotida (A, U, G) određenog baznog tripleta AUG bilo kojim jednim ili većim brojem različitih nukleotida, tako da dobijena nukleotidna sekvenca varijante ne sadrži pomenuti bazni triplet AUG. Pogodne supstitucije jednog nukleotida su one koje pretvaraju bazni triplet AUG u bazni triplet GUG, CUG ili UUG, ili u bazni triplet AAG, ACG ili AGG, ili

2

u bazni triplet AUA, AUC ili AUU. Odgovarajuće supstitucije više nukleotida se mogu odabrati u skladu sa tim.

[0136] Prema navodima, termin "alfavirus" treba razumeti u širokom smislu i on uključuje bilo koju virusnu česticu koja ima karakteristike alfavirusa. Karakteristike alfavirusa uključuju prisustvo (+) lančane RNK koja kodira genetske informacije pogodne za replikaciju u ćeliji domaćinu, uključujući aktivnost RNK polimeraze. Dalje karakteristike mnogih alfavirusa su opisane npr. u Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562. Termin "alfavirus" uključuje alfavirus koji se nalazi u prirodi, kao i bilo koju njegovu varijantu ili derivat. U nekim primerima izvođenja, varijanta ili derivat se ne nalazi u prirodi.

[0137] U jednom aspektu, alfavirus je alfavirus koji se nalazi u prirodi. Tipično, alfavirus koji se nalazi u prirodi je infektivan za bilo koji ili više eukariotskih organizama, kao što je životinja (uključujući kičmenjaka kao što je čovek, i artropodu kao što je insekt).

[0138] Alfavirus koji se nalazi u prirodi je poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od sledećeg: kompleks virusa šume Barma (koji sadrži virus šume Barma); kompleks istočnog konjskog encefalitisa (koji sadrži sedam antigenskih tipova virusa istočnog konjskog encefalitisa); kompleks virusa Middelburg (koji sadrži virus Middelburg); kompleks virusa Ndumu (koji sadrži virus Ndumu); kompleks virusa Semliki šume (koji se sastoji od virusa Bebaru, virusa Chikungunya, virusa Mayaro i njegov podtip virus Una, virus O'Nyong Nyong i njegov podtip virus Igbo-Ora, virusa reke Ross i njegove podtipove virus Bebaru, virus Getah, virus Sagiyama, virus Semliki šume i njegov podtip virus Me Tri); kompleks venecuelanskog encefalitisa konja (koji sadrži virus Cabassou, virus Everglades, virus Mosso das Pedras, virus Mucambo, virus Paramana, virus Pixuna, virus Rio Negro, virus Trocara i njegov podtip virus Bijou Bridge, virus venecuelanskog konjskog encefalitisa); kompleks zapadnog konjskog encefalitisa (koji sadrži virus Aura, virus Babanki, virus Kyzilagach, virus Sindbis, virus Ockelbo, virus Whataroa, virus Buggy Creek, virus Fort Morgan, virus Highlands J, virus zapadnog konjskog encefalitisa); i nekih neklasifikovanih virusa uključujući virus bolesti pankreasa lososa; virus bolesti spavanja; virus južnomorskog slona; virus Tonate. Poželjnije, alfavirus se bira iz grupe koja se sastoji od kompleksa virusa Semliki šume (koji sadrži tipove virusa kao što je gore navedeno, uključujući virus Semliki šume), kompleksa zapadnog konjskog encefalitisa (koji sadrži tipove virusa kao što je gore navedeno, uključujući virus Sindbis), istočnog virusa konjskog encefalitisa (koji sadrži tipove virusa kao što je gore navedeno), kompleksa venecuelanskog encefalitisa konja (koji sadrži tipove virusa kao što je gore navedeno, uključujući virus venecuelanskog konjskog encefalitisa).

[0139] U daljem poželjnom primeru izvođenja, alfavirus je virus Semliki šume. U alternativnom daljem poželjnom primeru izvođenja, alfavirus je virus Sindbis. U alternativnom daljem poželjnom primeru izvođenja, alfavirus je virus venecuelanskog konjskog encefalitisa.

[0140] U nekim primerima izvođenja ovih navoda, alfavirus nije alfavirus koji se nalazi u prirodi. Tipično, alfavirus koji se ne nalazi u prirodi je varijanta ili derivat alfavirusa koji se nalazi u prirodi, koji se razlikuje od alfavirusa koji se nalazi u prirodi po najmanje jednoj mutaciji u nukleotidnoj sekvenci, tj. genomskoj RNK. Mutacija u nukleotidnoj sekvenci može da bude odabrana između insercije, supstitucije ili delecije jednog ili više nukleotida, u poređenju sa alfavirusom koji se nalazi u prirodi.

[0141] Mutacija u nukleotidnoj sekvenci može, ali ne mora da bude povezana sa mutacijom u polipeptidu ili proteinu koji je kodiran nukleotidnom sekvencom. Na primer, alfavirus koji se ne nalazi u prirodi može da bude atenuirani alfavirus. Atenuirani alfavirus koji se ne nalazi u prirodi je alfavirus koji obično ima najmanje jednu mutaciju u svojoj nukleotidnoj sekvenci po kojoj se razlikuje od alfavirusa koji se nalazi u prirodi, i koji ili nije uopšte zarazan, ili koji je zarazan, ali ima nižu sposobnost izazivanja bolesti ili uopšte nema sposobnost izazivanja bolesti. Kao ilustrativan primer, TC83 je atenuirani alfavirus koji se razlikuje od venecuelanskog virusa konjskog encefalitisa (VEEV) koji se nalazi u prirodi (McKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol.12; pp.597-603).

[0142] Članovi roda alfavirusa se takođe mogu klasifikovati na osnovu njihovih odgovarajućih kliničkih karakteristika kod ljudi: alfavirusi povezani prvenstveno sa encefalitisom, i alfavirusi povezani prvenstveno sa groznicom, osipom i poliartritisom.

[0143] Termin "alfavirusni" znači koji se nalazi u alfavirusu, ili potiče od alfavirusa ili je dobijen iz alfavirusa, npr. genetskim inženjeringom.

[0144] Prema navodima, "SFV" označava virus Semliki šume. Prema navodima, "SIN" ili "SINV" označava virus Sindbis. Prema navodima, "VEE" ili "VEEV" označava virus venecuelanskog konjskog encefalitisa.

[0145] Prema navodima, izraz "alfavirus" se odnosi na entitet poreklom iz alfavirusa. Kao ilustracija, protein alfavirusa može da se odnosi na protein koji se nalazi u alfavirusu i/ili na protein koji je kodiran alfavirusom; i sekvenca nukleinske kiseline alfavirusa može da se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja se nalazi u alfavirusu i/ili na sekvencu nukleinske kiseline koja je kodirana alfavirusom. Poželjno, sekvenca nukleinske kiseline "alfavirusa" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline "genoma alfavirusa" i/ili "genomske RNK alfavirusa".

4

[0146] Prema navodima, termin "alfavirusna RNK" se odnosi na bilo koju ili više alfavirusnih genomskih RNK (tj. (+) lanac), komplement alfavirusne genomske RNK (tj. (-) lanac) i subgenomski transkript (tj. (+) lanac), ili fragment bilo kog od njih.

[0147] Prema navodima, "genom alfavirusa" se odnosi na genomsku (+) lančanu RNK alfavirusa.

[0148] Prema navodima, termin "nativna sekvenca alfavirusa" i slični termini se obično odnose na sekvencu (npr. nukleinske kiseline) prirodnog alfavirusa (alfavirus koji se nalazi u prirodi). U nekim primerima izvođenja, termin "nativna sekvenca alfavirusa" takođe uključuje sekvencu atenuiranog alfavirusa.

[0149] Prema navodima, termin "5' sekvenca prepoznavanja replikacije" poželjno se odnosi na kontinuiranu sekvencu nukleinske kiseline, poželjno na sekvencu ribonukleinske kiseline, koja je identična ili homologna sa 5' fragmentom genoma alfavirusa. "5' Sekvenca prepoznavanja replikacije" je sekvenca nukleinske kiseline koju alfavirusna replikaza može da prepozna. Termin 5' sekvenca prepoznavanja replikacije uključuje prirodne 5' sekvence prepoznavanja replikacije, kao i njihove funkcionalne ekvivalente, kao što su, npr., funkcionalne varijante 5' sekvence prepoznavanja replikacije alfavirusa koji se nalazi u prirodi. Prema navodima, funkcionalni ekvivalenti uključuju derivate 5' sekvenci prepoznavanja replikacije koje karakteriše uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona kako je ovde opisano. 5' Sekvenca prepoznavanja replikacije je potrebna za sintezu (-) lančanog komplementa alfavirusne genomske RNK i potrebna je za sintezu (+) lanca virusne genomske RNK na osnovu matričnog (-) lanca. Nativna 5' sekvenca prepoznavanja replikacije tipično kodira najmanje N-terminalni fragment nsP1; ali ne obuhvata ceo otvoreni okvir čitanja koji kodira nsP1234. S obzirom na činjenicu da nativna 5' sekvenca prepoznavanja replikacije tipično kodira najmanje N-terminalni fragment nsP1, nativna 5' sekvenca prepoznavanja replikacije tipično sadrži najmanje jedan inicijacioni kodon, tipično AUG. U jednom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije obuhvata konzervisani element sekvence 1 genoma alfavirusa (CSE 1) ili njegovu varijantu i konzervisani element sekvence 2 genoma alfavirusa (CSE 2) ili njegovu varijantu.5' Sekvenca prepoznavanja replikacije je tipično sposobna da formira četiri strukture drška-petlja (SL), odnosno SL1, SL2, SL3, SL4. Numerisanje ovih struktura drška-petlja počinje na 5' kraju 5' sekvence prepoznavanja replikacije.

[0150] Prema navodima, izraz "na 5' kraju alfavirusa" odnosi se na 5' kraj genoma alfavirusa. Sekvenca nukleinske kiseline na 5' kraju alfavirusa obuhvata nukleotid koji se nalazi na 5' kraju genomske RNK alfavirusa, i opciono uzastopnu sekvencu daljih nukleotida. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline na 5' kraju alfavirusa je identična 5' sekvenci prepoznavanja replikacije genoma alfavirusa.

[0151] Termin "konzervisani element sekvence" ili "CSE" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se nalazi u RNK alfavirusa. Ovi elementi sekvence se nazivaju "konzervisani" jer su ortolozi prisutni u genomu različitih alfavirusa, a ortologni CSE različitih alfavirusa poželjno dele visok procenat identičnosti sekvence i/ili sličnu sekundarnu ili tercijarnu strukturu. Termin CSE uključuje CSE 1, CSE 2, CSE 3 i CSE 4.

[0152] Prema navodima, termini "CSE 1" ili "44-nt CSE" sinonimno se odnose na nukleotidnu sekvencu koja je potrebna za sintezu (+) lanca sa matrice (-) lanca. Termin "CSE 1" se odnosi na sekvencu na (+) lancu; a komplementarna sekvenca CSE 1 (na (-) lancu) funkcioniše kao promotor za sintezu (+) lanca. Poželjno, termin CSE 1 uključuje nukleotid na samom 5' kraju genoma alfavirusa. CSE 1 tipično formira konzervisanu strukturu drška-petlja. Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, veruje se da je za CSE 1 sekundarna struktura važnija od primarne strukture, odnosno linearne sekvence. U genomskoj RNK modela alfavirusa - virusa Sindbis, CSE 1 se sastoji od uzastopne sekvence od 44 nukleotida, koja se formira od 44 nukleotida genomske RNK na samom 5' kraju (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562).

[0153] Prema navodima, termini "CSE 2" ili "51-nt CSE" sinonimno se odnose na nukleotidnu sekvencu koja je potrebna za sintezu (-) lanca sa matrice (+) lanca. Matrični (+) lanac je tipično alfavirusna genomska RNK ili RNK replikon (treba napomenuti da subgenomski RNK transkript, koji ne sadrži CSE 2, ne funkcioniše kao matrica za sintezu (-) lanca). U genomskoj RNK alfavirusa, CSE 2 je tipično lokalizovan unutar kodirajuće sekvence za nsP1. U genomskoj RNK modela alfavirusa - virusa Sindbis, 51-nt CSE se nalazi na nukleotidnim pozicijama 155-205 genomske RNK (Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 2 tipično formira dve konzervisane strukture drška-petlja. Ove strukture drška-petlja su označene kao drška-petlja 3 (SL3) i drška-petlja 4 (SL4) jer predstavljaju treću i četvrtu konzervisanu strukturu drška-petlja genomske RNK alfavirusa, računajući od 5' kraja genomske RNK alfavirusa. Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, veruje se da je za CSE 2 sekundarna struktura važnija od primarne strukture, odnosno linearne sekvence.

[0154] Prema navodima, termini "CSE 3" ili "spojna sekvenca" sinonimno se odnose na nukleotidnu sekvencu koja potiče iz alfavirusne genomske RNK i koja obuhvata početno mesto subgenomske RNK. Komplement ove sekvence u (-) lancu deluje tako što podstiče subgenomsku transkripciju RNK. U genomskoj RNK alfavirusa, CSE 3 se obično preklapa sa regionom koji kodira C-terminalni fragment nsP4 i proteže se do kratkog nekodirajućeg regiona koji se nalazi ushodno od otvorenog okvira čitanja koji kodira strukturne proteine. Prema Strauss & Strauss (Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562), CSE 3 karakteriše konsenzus sekvenca ACCUCUACGGCGGUCCUAAAUAGG (SEQ ID NO: 1; konsenzus spojna sekvenca (konsenzus CSE 3); podvučeni nukleotidi predstavljaju prvih pet nukleotida subgenomskog transkripta).

[0155] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, CSE 3 se sastoji od ili sadrži SEQ ID NO: 1 ili njenu varijantu, pri čemu je varijanta poželjno okarakterisana stepenom identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1 od 80% ili više, 85% ili više, 90 % ili više, 95 % ili više, 96 % ili više, 97 % ili više, 98 % ili više, ili 99 % ili više.

[0156] Prema navodima, termini "CSE 4" ili "19-nt konzervisana sekvenca" ili "19-nt CSE" sinonimno se odnose na nukleotidnu sekvencu alfavirusne genomske RNK, neposredno ushodno od poli(A) sekvence u 3' netranslatiranom regionu genoma alfavirusa. CSE 4 se obično sastoji od 19 uzastopnih nukleotida. Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, smatra se da CSE 4 funkcioniše kao jezgro promotora za inicijaciju sinteze (-) lanca (Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856); i/ili se smatra da CSE 4 i poli(A) rep genomske RNK alfavirusa funkcionišu zajedno u smislu efikasne sinteze (-) lanca (Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol.79, pp.

4630-4639).

[0157] Prema Strauss & Strauss, CSE 4 karakteriše konzervisana sekvenca AUUUUGUUUUUAAUAUUUC (SEQ ID NO: 2; konzervisana sekvenca od 19 nt).

[0158] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, CSE 4 se sastoji od ili sadrži SEQ ID NO: 2 ili njenu varijantu, pri čemu je varijanta poželjno okarakterisana stepenom identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 2 od 80% ili više, 85 % ili više, 90 % ili više, 95 % ili više, 96 % ili više, 97 % ili više, 98 % ili više, ili 99 % ili više.

[0159] Prema navodima, izraz "subgenomski promotor" ili "SGP" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline ushodno (5') od sekvence nukleinske kiseline (npr. kodirajuće sekvence), koja kontroliše transkripciju navedene sekvence nukleinske kiseline obezbeđivanjem mesta za prepoznavanje i vezivanje za RNK polimerazu, tipično RNK-zavisnu RNK polimerazu, konkretno funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. SGP može da uključuje dodatna mesta za prepoznavanje ili vezivanje za dodatne faktore. Subgenomski promotor je tipično genetski element pozitivnog lanca RNK virusa, kao što je alfavirus. Subgenomski promotor alfavirusa je sekvenca nukleinske kiseline sadržana u virusnoj genomskoj RNK. Subgenomski promotor se uopšteno karakteriše time što omogućava inicijaciju transkripcije (sinteze RNK) u prisustvu RNK-zavisne RNK polimeraze, npr. funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. (-) Lanac RNK, tj. komplement alfavirusne genomske RNK, služi kao matrica za sintezu (+) lanca subgenomskog transkripta, a sinteza (+) lanca subgenomskog transkripta obično je inicirana na, ili blizu subgenomskog promotora. Termin "subgenomski promotor" kako se ovde koristi, nije ograničen ni na jednu posebnu lokalizaciju u nukleinskoj kiselini koja sadrži takav subgenomski promotor. U nekim primerima izvođenja, SGP je identičan CSE 3, ili se preklapa sa CSE 3, ili sadrži CSE 3.

[0160] Termini "subgenomski transkript" ili "subgenomska RNK" sinonimno se odnose na molekul RNK koji može da se dobije kao rezultat transkripcije korišćenjem molekula RNK kao matrice ("matrična RNK"), pri čemu matrična RNK sadrži subgenomski promotor koji kontroliše transkripciju subgenomskog transkripta. Subgenomski transkript može da se dobije u prisustvu RNK-zavisne RNK polimeraze, konkretno funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. Na primer, izraz "subgenomski transkript" može da se odnosi na RNK transkript koji je pripremljen u ćeliji inficiranoj alfavirusom, upotrebom (-) lančanog komplementa alfavirusne genomske RNK kao matrice. Međutim, termin "subgenomski transkript", kako se ovde koristi, nije ograničen na njega i takođe uključuje transkripte koji mogu da se dobiju korišćenjem heterologne RNK kao matrice. Na primer, subgenomski transkripti takođe mogu da se dobiju korišćenjem (-) lančanog komplementa replikona koji sadrže SGP prema predmetnim navodima kao matrice. Prema tome, termin "subgenomski transkript" može da se odnosi na molekul RNK koji može da se dobije transkripcijom fragmenta genomske RNK alfavirusa, kao i na molekul RNK koji može da se dobije transkripcijom fragmenta replikona prema ovim navodima.

[0161] Termin "autologno" se koristi da opiše bilo šta što potiče od istog subjekta. Na primer, "autologna ćelija" se odnosi na ćeliju poreklom od istog subjekta. Uvođenje autolognih ćelija u subjekt je korisno jer ove ćelije prevazilaze imunološku barijeru koja inače dovodi do odbacivanja.

[0162] Termin "alogeno" se koristi da opiše bilo šta što potiče od različitih individua iste vrste. Za dve ili više individua se kaže da su alogene jedna drugoj kada geni na jednom ili više lokusa nisu identični.

[0163] Termin "singeno" se koristi da opiše bilo šta što potiče od pojedinaca ili tkiva koji imaju identične genotipove, tj. identičnih blizanaca ili životinja istog inbridovanog soja, ili njihova tkiva ili ćelije.

[0164] Termin "heterologno" se koristi da opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Na primer, uvođenje ćelije jedne individue u drugu individuu predstavlja heterolognu transplantaciju. Heterologni gen je gen koji potiče iz izvora koji nije subjekt.

[0165] U nastavku su date specifične i/ili poželjne varijante pojedinačnih elemenata navoda. Predmetni navodi takođe razmatraju kao posebno poželjne primere izvođenja, one primere izvođenja koji su generisani kombinovanjem dve ili više specifičnih i/ili poželjnih varijanti opisanih za dva ili više elementa predmetnih navoda.

RNK replikon

[0166] U prvom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju replikon koji sadrži 5' sekvencu prepoznavanja replikacije, pri čemu je 5' sekvenca prepoznavanja replikacije okarakterisana time što obuhvata uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa nativnim 5' sekvencom prepoznavanja replikacije alfavirusa. Replikon je poželjno RNK replikon.

[0167] 5' Sekvenca prepoznavanja replikacije koja se karakteriše time što obuhvata uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa, prema predmetnim navodima, može se ovde nazvati "modifikovanom 5' sekvencom prepoznavanja replikacije" ili "5' sekvencom prepoznavanja replikacije prema navodima". Kao što je dole opisano, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije prema navodima može opciono da bude okarakterisana prisustvom jedne ili više dodatnih izmena nukleotida.

[0168] Konstrukt nukleinske kiseline koji je sposoban da se replikuje replikazom, poželjno alfavirusnom replikazom, naziva se replikon. Prema navodima, termin "replikon" definiše molekul RNK koji može da se replikuje pomoću RNK-zavisne RNK polimeraze, dajući - bez DNK intermedijera - jednu ili više identičnih ili suštinski identičnih kopija RNK replikona. "Bez DNK intermedijera" znači da se nikakva kopija dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili komplement replikona ne formira u procesu formiranja kopija RNK replikona, i/ili da se nikakav molekul dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ne koristi kao matrica u procesu formiranja kopija RNK replikona, ili njegovog komplementa. Funkciju replikaze obično obezbeđuje funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0169] Prema navodima, termini "može da se replikuje" i "sposobna da se replikuje" uopšteno opisuju mogućnost da se pripremi jedna ili više identičnih ili suštinski identičnih kopija nukleinske kiseline. Kada se koriste zajedno sa terminom "replikaza", kao što je "sposobna da se replikuje replikazom", izrazi "može da se replikuje" i "sposobna da se replikuje" opisuju funkcionalne karakteristike molekula nukleinske kiseline, npr. RNK replikona, u odnosu na replikazu. Ove funkcionalne karakteristike obuhvataju najmanje jednu od: (i) replikaza je sposobna da prepozna replikon i (ii) replikaza je sposobna da deluje kao RNK-zavisna RNK polimeraza (RdRP). Poželjno, replikaza je sposobna i da (i) prepozna replikon i (ii) da deluje kao RNK-zavisna RNK polimeraza.

[0170] Izraz "sposobna za prepoznavanje" opisuje da je replikaza sposobna da se fizički poveže sa replikonom, i poželjno, da je replikaza sposobna da se veže za replikon, tipično nekovalentno. Termin "vezivanje" može značiti da replikaza ima sposobnost vezivanja za bilo koje ili više od konzervisanog elementa sekvence 1 (CSE 1) ili njegove komplementarne sekvence (ako je sadržana u replikonu), konzervisanog elementa sekvence 2 (CSE 2) ili njegove komplementarne sekvence (ako je sadržana u replikonu), konzervisanog elementa sekvence 3 (CSE 3) ili njegove komplementarne sekvence (ako je sadržana u replikonu), konzervisanog elementa sekvence 4 (CSE 4) ili njegove komplementarne sekvence (ako je sadržana u replikonu). Poželjno, replikaza je sposobna da se veže za CSE 2 [tj. za (+) lanac] i/ili za CSE 4 [tj. za (+) lanac], ili da se veže za komplement CSE 1 [tj. za (-) lanac] i/ili za komplement CSE 3 [tj. za (-) lanac].

[0171] Izraz "sposobna da deluje kao RdRP" znači da je replikaza sposobna da katalizuje sintezu (-) lančanog komplementa alfavirusne genomske (+) lančane RNK, pri čemu (+) lančana RNK ima funkciju matrice, i/ili da je replikaza sposobna da katalizuje sintezu (+) lančane alfavirusne genomske RNK, pri čemu (-) lančana RNK ima funkciju matrice. Uopšteno, izraz "sposobna da deluje kao RdRP" takođe može da obuhvata to, da je replikaza sposobna da katalizuje sintezu (+) lančanog subgenomskog transkripta pri čemu (-) lančana RNK ima funkciju matrice, i pri čemu se sinteza (+) lančanog subgenomskog transkripta tipično pokreće na subgenomskom promotoru alfavirusa.

[0172] Izrazi "sposobna za vezivanje" i "sposobna da deluje kao RdRP" odnose se na sposobnost u normalnim fiziološkim uslovima. Konkretno, odnose se na uslove unutar ćelije, koja eksprimira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ili koja je transfektovana nukleinskom kiselinom koja kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. Ćelija je poželjno eukariotska ćelija. Sposobnost vezivanja i/ili sposobnost delovanja kao RdRP može eksperimentalno da se testira, npr. u in vitro sistemu bez ćelija ili u eukariotskoj ćeliji. Opciono, navedena eukariotska ćelija je ćelija vrste za koju je određeni alfavirus iz koga potiče replikaza infektivan. Na primer, kada se koristi replikaza alfavirusa iz određenog alfavirusa koji je infektivan za ljude, normalni fiziološki uslovi su uslovi u ljudskoj ćeliji. Još poželjnije, eukariotska ćelija (u jednom primeru ljudska ćelija) je iz istog tkiva ili organa za koji je infektivan određeni alfavirus iz koga potiče replikaza.

[0173] Prema navodima, "u poređenju sa nativnom sekvencom alfavirusa" i slični termini se odnose na sekvencu koja je varijanta nativne sekvence alfavirusa. Varijanta obično nije sama po sebi nativna sekvenca alfavirusa.

[0174] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži 3' sekvencu prepoznavanja replikacije.

3' Sekvenca prepoznavanja replikacije je sekvenca nukleinske kiseline koju može da prepozna funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. Drugim rečima, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je sposoban da prepozna 3' sekvencu prepoznavanja replikacije. Poželjno je da se 3' sekvenca prepoznavanja replikacije nalazi na 3' kraju replikona (ako replikon ne sadrži poli(A) rep), ili neposredno ushodno od poli(A) repa (ako replikon sadrži poli(A) rep). U jednom primeru izvođenja, 3' sekvenca prepoznavanja replikacije se sastoji od ili sadrži CSE 4.

[0175] U jednom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije i 3' sekvenca prepoznavanja replikacije su sposobne da usmeravaju replikaciju RNK replikona prema

4

predmetnim navodima u prisustvu funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. Stoga, kada su prisutne same ili poželjno zajedno, ove sekvence prepoznavanja usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

[0176] Poželjno je da funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, koji je sposoban da prepozna i modifikovanu 5' sekvencu prepoznavanja replikacije i 3' sekvencu prepoznavanja replikacije replikona, bude obezbeđen u cis konfiguraciji (kodiran kao protein od interesa otvorenim okvirom čitanja na replikonu) ili u trans konfiguraciji (kodiran kao protein od interesa otvorenim okvirom čitanja na zasebnom replikaznom konstruktu kako je opisano u drugom aspektu). U jednom primeru izvođenja, ovo se postiže kada je 3' sekvenca prepoznavanja replikacije nativna za alfavirus iz koga potiče funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, i kada je modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije varijanta 5' sekvence prepoznavanja replikacije koji je nativna za alfavirus iz koga potiče funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. Nativna znači da je prirodno poreklo ovih sekvenci isti alfavirus. U alternativnom primeru izvođenja, modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije i/ili 3' sekvenca prepoznavanja replikacije nisu nativne za alfavirus iz koga potiče funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, pod uslovom da je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein sposoban da prepozna i modifikovanu 5' sekvencu prepoznavanja replikacije i 3' sekvencu prepoznavanja replikacije replikona. Drugim rečima, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je kompatibilan sa modifikovanom 5' sekvencom prepoznavanja replikacije i sa 3' sekvencom prepoznavanja replikacije Kada je ne-nativni funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein sposoban da prepozna odgovarajuću sekvencu ili element sekvence, za funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein se kaže da je kompatibilan (intervirusna kompatibilnost). Bilo koja kombinacija (3'/5') sekvenci prepoznavanja replikacije, odnosno CSE sa funkcionalnim nestrukturnim proteinom alfavirusa je moguća sve dok postoji intervirusna kompatibilnost. Intervirusnu kompatibilnost može lako da ispita stručnjak koji praktikuje ove navode inkubacijom funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina koji treba da se ispita zajedno sa RNK, pri čemu RNK ima 3'- i (opciono modifikovane) 5' sekvence prepoznavanja replikacije koje treba da se ispitaju, u uslovima pogodnim za replikaciju RNK, npr., u odgovarajućoj ćeliji-domaćinu. Ako dođe do replikacije, to potvrđuje da su (3'/5') sekvence prepoznavanja replikacije i funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein kompatibilni.

[0177] Uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona pruža nekoliko prednosti u odnosu na trans-replikone prethodnog stanja tehnike (kao što su, na primer, oni predstavljeni kao "RNK matrica WT-RRS" na sl. 1). Odsustvo inicijacionog kodona u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira nsP1* će tipično dovesti do toga da se nsP1* (N-terminalni fragment nsP1) ne translatira. Dalje, pošto se nsP1* ne translatira, otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa ("transgen") je najushodniji otvoreni okvir čitanja dostupan ribozomu; dakle, kada je replikon prisutan u ćeliji, translacija se inicira na prvom AUG otvorenog okvira čitanja (RNK) koji kodira gen od interesa. Ovo predstavlja prednost u odnosu na trans-replikone prethodnog stanja tehnike, kao što su oni koje su opisali Spuul et al. (J. Virol., 2011, vol.85, pp.4739-4751): replikoni prema Spuul et al. upravljaju ekspresijom N-terminalnog dela nsP1, peptida od 74 aminokiseline. Takođe je poznato iz prethodnog stanja tehnike da konstrukcija RNK replikona iz genoma virusa pune dužine nije trivijalna stvar, jer određene mutacije mogu učiniti RNK nesposobnom za replikaciju (WO 2000/053780 A2), a uklanjanje nekih delova 5' strukture koja je važna za replikaciju alfavirusa utiče na efikasnost replikacije (Kamrud et al., 2010, J. Gen. Virol., vol. 91, pp. 1723-1727).

[0178] Prednost u odnosu na cis-replikone prethodnog stanja tehnike je u tome što uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona razdvaja region koji kodira alfavirusni nestrukturni protein od 5' sekvence prepoznavanja replikacije. Ovo omogućava dalji inženjering cis-replikona, npr. izmenom nativne 5' sekvence prepoznavanja replikacije veštačkom sekvencom, mutiranom sekvencom ili heterolognom sekvencom uzetom iz drugog RNK virusa. Takva manipulacija sekvencom u cis-replikonima prethodnog stanja tehnike je ograničena sekvencom aminokiselina nsP1. Bilo koja tačkasta mutacija, ili klasteri tačkastih mutacija, zahtevala bi eksperimentalnu procenu u smislu uticaja na replikaciju, a male insercije ili delecije koje dovode do mutacija pomeranja okvira čitanja su nemoguće zbog njihovog štetnog dejstva na protein.

[0179] Uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona prema ovim navodima može da se postigne bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, pogodan molekul DNK koji kodira replikon prema navodima, tj. karakteriše ga uklanjanje inicijacionog kodona, može da bude dizajniran in silico, a zatim sintetizovan in vitro (sinteza gena); alternativno, odgovarajući molekul DNK može da se dobije usmerenom mutagenezom DNK sekvence koja kodira replikon. U svakom slučaju, odgovarajući molekul DNK može da posluži kao matrica za in vitro transkripciju, čime se dobija replikon prema navodima.

[0180] Uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa nije posebno ograničeno i može da se izabere od bilo koje modifikacije nukleotida, uključujući supstituciju jednog ili više nukleotida (uključujući, na nivou DNK, supstituciju A i/ili T i/ili G u inicijacionom kodonu); deleciju jednog ili više nukleotida (uključujući, na nivou DNK, deleciju A i/ili T i/ili G u inicijacionom kodonu), i inserciju jednog ili više nukleotida (uključujući, na nivou DNK, inserciju jednog ili više nukleotida između A i T i/ili između T i G u inicijacionom kodonu). Bez obzira na to da li je modifikacija nukleotida supstitucija, insercija ili delecija, modifikacija nukleotida ne sme da dovede do formiranja novog inicijacionog kodona (kao ilustrativan primer: insercija, na nivou DNK, ne sme biti umetanje ATG).

[0181] 5' Sekvenca prepoznavanja replikacije RNK replikona koju karakteriše uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona (tj. modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije prema ovim navodima) je poželjno varijanta 5' sekvence prepoznavanja replikacije genoma alfavirusa koji se nalazi u prirodi. U jednom primeru izvođenja, modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije prema ovim navodima se poželjno odlikuje stepenom identičnosti sekvence od 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, još poželjnije 95% ili više, sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije genoma najmanje jednog alfavirusa koji se nalazi u prirodi.

[0182] U jednom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije RNK replikona koju karakteriše uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona sadrži sekvencu homolognu sa oko 250 nukleotida na 5' kraju alfavirusa, tj. na 5' kraju alfavirusnog genoma. U poželjnom izvođenju, ona sadrži sekvencu homolognu sa oko 250 do 500, poželjno oko 300 do 500 nukleotida na 5' kraju alfavirusa, tj. na 5' kraju alfavirusnog genoma. "Na 5’ kraju alfavirusnog genoma" označava sekvencu nukleinske kiseline koja počinje na, i uključuje najushodniji nukleotid alfavirusnog genoma. Drugim rečima, najushodniji nukleotid alfavirusnog genoma je označen kao nukleotid br.

1, i npr. "250 nukleotida na 5' kraju alfavirusnog genoma" označava nukleotide od 1 do 250 u alfavirusnom genomu. U jednom primeru izvođenja, 5' sekvencu prepoznavanja replikacije RNK replikona koju karakteriše uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona odlikuje stepen identičnosti sekvence od 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, čak još poželjnije 95% ili više, sa najmanje 250 nukleotida na 5' kraju genoma najmanje jednog alfavirusa koji se nalazi u prirodi. Najmanje 250 nukleotida uključuje npr.250 nukleotida, 300 nukleotida, 400 nukleotida, 500 nukleotida.

[0183] 5' Sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa koja se nalazi u prirodi tipično je okarakterisana najmanje jednim inicijacionim kodonom i/ili konzervisanim sekundarnim strukturnim motivima. Na primer, nativna 5' sekvenca prepoznavanja replikacije virusa Semliki šume (SFV) sadrži pet specifičnih baznih tripleta AUG, što odgovara baznim tripletima ATG u DNK SEQ ID NO: 4 (videti primer 1). Prema autoru Frolov et al. (2001, RNA, vol.7, pp.1638-1651) analiza pomoću MFOLD otkrila je da je predviđeno da nativna 5' sekvenca prepoznavanja replikacije virusa Semliki šume formira četiri strukture drška-petlja (SL), nazvane drška-petlja 1 do 4 (SL1, SL2, SL3, SL4). Prema autoru Frolov et al., analiza pomoću MFOLD je otkrila da se takođe predviđa da će nativna 5' sekvenca prepoznavanja replikacije različitog alfavirusa, virusa Sindbis, formirati četiri strukture drška-petlja: SL1, SL2, SL3, SL4. U primeru 1 ovih navoda,

4

predviđeno prisustvo četiri strukture drška-petlja u nativnoj 5’ sekvenci prepoznavanja replikacije virusa Semliki šume je potvrđeno pomoću dva veb servera za predviđanje sekundarne strukture RNK (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html) (http://unafold.rna.albany. edu/?q=mfold).

[0184] Poznato je da 5' kraj alfavirusnog genoma sadrži elemente sekvence koji omogućavaju replikaciju alfavirusnog genoma pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije RNK replikona sadrži sekvencu homolognu konzervisanom elementu sekvence 1 (CSE 1) i/ili sekvencu homolognu konzervisanom elementu sekvence 2 (CSE 2) alfavirusa.

[0185] Konzervisani element sekvence 2 (CSE 2) genomske RNK alfavirusa tipično predstavljaju SL3 i SL4 kojima prethodi SL2 koji sadrži najmanje nativni inicijacioni kodon koji kodira prvi aminokiselinski ostatak alfavirusnog nestrukturnog proteina nsP1. U ovom opisu, međutim, u nekim primerima izvođenja, konzervisani element sekvence 2 (CSE 2) genomske RNK alfavirusa odnosi se na region koji se proteže od SL2 do SL4 i koji sadrži nativni inicijacioni kodon koji kodira prvi aminokiselinski ostatak alfavirusnog nestrukturnog proteina nsP1. U poželjnom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži CSE 2 ili sekvencu homolognu CSE 2. U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži sekvencu homolognu CSE 2 koja se poželjno odlikuje stepenom identičnosti sekvence od 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, još poželjnije 95% ili više, sa sekvencom CSE 2 najmanje jednog alfavirusa koji se nalazi u prirodi.

[0186] U poželjnoj varijanti, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije sadrži sekvencu koja je homologna sa CSE 2 alfavirusa. CSE 2 alfavirusa može da sadrži fragment otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina iz alfavirusa.

[0187] Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, RNK replikon se karakteriše time što sadrži sekvencu homolognu otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu iz alfavirusa. Sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu je tipično varijanta otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina ili njegovog fragmenta alfavirusa koji se nalazi u prirodi. U jednom primeru izvođenja, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu je poželjno okarakterisana stepenom identičnosti sekvence od 80% ili više, poželjno 85% ili više, poželjnije 90% ili više, još poželjnije 95% ili više, sa otvorenim okvirom čitanja nestrukturnog proteina ili njegovim fragmentom najmanje jednog alfavirusa koji se nalazi u prirodi.

[0188] U poželjnijem primeru izvođenja, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina koja je sadržana u replikonu prema ovim navodima ne sadrži nativni inicijacioni kodon nestrukturnog proteina, i poželjnije ne sadrži bilo koji inicijacioni kodon nestrukturnog proteina. U poželjnom primeru izvođenja, sekvencu homolognu CSE 2 karakteriše uklanjanje svih inicijacionih kodona u poređenju sa nativnom alfavirusnom sekvencom CSE 2. Prema tome, sekvenca homologna CSE 2 poželjno ne sadrži nijedan inicijacioni kodon.

[0189] Kada sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja ne sadrži nijedan inicijacioni kodon, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nije sama po sebi otvoreni okvir čitanja pošto ne služi kao matrica za translaciju.

[0190] U jednom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije sadrži sekvencu homolognu otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu iz alfavirusa, pri čemu se sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu iz alfavirusa karakteriše time što uključuje uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa nativnom sekvencom alfavirusa.

[0191] U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu iz alfavirusa karakteriše se time što obuhvata uklanjanje najmanje nativnog start kodona otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina. Poželjno, odlikuje se time što obuhvata uklanjanje najmanje nativnog start kodona otvorenog okvira čitanja koji kodira nsP1.

[0192] Nativni start kodon je bazni triplet AUG na kojem translacija na ribozomima u ćelijidomaćinu počinje kada je RNK prisutna u ćeliji-domaćinu. Drugim rečima, nativni start kodon je prvi bazni triplet koji se translatira tokom ribozomalne sinteze proteina, npr. u ćeliji-domaćinu koja je inokulisana sa RNK koja sadrži nativni start kodon. U jednom primeru izvođenja, ćelijadomaćin je ćelija eukariotske vrste koja je prirodni domaćin specifičnog alfavirusa koji sadrži 5' sekvencu prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa. U poželjnom primeru izvođenja, ćelijadomaćin je ćelija BHK21 iz ćelijske linije "BHK21 [C13] (ATCC<®>CCL10™)", dostupna u Američkoj kolekciji tipova kultura, Manassas, Virdžinija, SAD.

[0193] Genomi mnogih alfavirusa su u potpunosti sekvencirani i javno dostupni, a sekvence nestrukturnih proteina kodiranih ovim genomima su takođe javno dostupne. Takve informacije o sekvenci omogućavaju određivanje nativnog start kodona in silico.

[0194] Za ilustraciju, u primeru 1, opisan je bazni triplet DNK koji odgovara nativnom start kodonu SFV nsP1.

[0195] U jednom primeru izvođenja, nativni start kodon je sadržan u Kozak sekvenci ili funkcionalno ekvivalentnoj sekvenci. Kozak sekvenca je sekvenca koju je prvobitno opisao Kozak (1987, Nucleic Acids Res., vol. 15, pp. 8125-8148). Kozakovu sekvencu na molekulu iRNK ribozom prepoznaje kao početno mesto translacije. Prema ovoj referenci, Kozak sekvenca sadrži start kodon AUG, neposredno praćen visoko konzerviranim G nukleotidom: AUGG (videti i

4

inicijacioni kodon u DNK sekvenci prema SEQ ID NO: 4 (primer 1)). Konkretno, u ovoj referenci je opisano da se Kozakova sekvenca može identifikovati pomoću (gcc)gccRccAUGG (SEQ ID NO: 6), na sledeći način: (i) mala slova označavaju najčešću bazu na poziciji gde baza može ipak da varira; (ii) velika slova označavaju visoko konzervisane baze (npr. "AUGG"); (iii) "R" označava purin (adenin ili guanin); (iv) redosled u zagradama ((gcc)) je neodređenog značenja; (v) podvučeni bazni triplet AUG predstavlja start kodon. U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovog fragmenta iz alfavirusa karakteriše se time što obuhvata uklanjanje inicijacionog kodona koji je deo Kozak sekvence.

[0196] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, 5' sekvencu prepoznavanja replikacije replikona karakteriše uklanjanje najmanje svih onih inicijacionih kodona, koji su, na nivou RNK, deo AUGG sekvence.

[0197] U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja nestrukturnog proteina ili njegovom fragmentu iz alfavirusa karakteriše se time što obuhvata uklanjanje jednog ili više inicijacionih kodona različitih od nativnog start kodona otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina. U poželjnijem primeru izvođenja, navedena sekvenca nukleinske kiseline se dodatno karakteriše uklanjanjem nativnog start kodona. Na primer, pored uklanjanja nativnog start kodona, može da se ukloni bilo koji jedan, ili dva, ili tri, ili četiri, ili više od četiri (npr. pet) inicijacionih kodona.

[0198] Ako se replikon karakteriše uklanjanjem nativnog start kodona, i opciono uklanjanjem jednog ili više inicijacionih kodona različitih od nativnog start kodona, iz otvorenog okvira čitanja nestrukturnog proteina, sekvenca homologna otvorenom okviru čitanja sama po sebi nije otvoreni okvir čitanja jer ne služi kao matrica za translaciju.

[0199] Jedan ili više inicijacionih kodona različitih od nativnog start kodona koji je uklonjen, poželjno pored uklanjanja nativnog start kodona, poželjno je izabran od baznog tripleta AUG koji ima potencijal da inicira translaciju. Bazni triplet AUG koji ima potencijal da inicira translaciju može da bude označen kao "potencijalni inicijacioni kodon". To, da li dati bazni triplet AUG ima potencijal da inicira translaciju može da se utvrdi in silico ili u in vitro testu na ćelijama.

[0200] U jednom primeru izvođenja, utvrđuje se in silico da li dati bazni triplet AUG ima potencijal da inicira translaciju: u tom primeru izvođenja, ispituje se nukleotidna sekvenca, a za bazni triplet AUG se utvrđuje da ima potencijal da inicira translaciju ako je deo AUGG sekvence, poželjno deo Kozakove sekvence (SEQ ID NO: 6).

[0201] U jednom primeru izvođenja, u ćelijskom in vitro testu se utvrđuje da li dati bazni triplet AUG ima potencijal da inicira translaciju: RNK replikon koji se karakteriše uklanjanjem nativnog

4

start kodona i koji sadrži dati bazni triplet AUG nishodno od pozicija uklanjanja nativnog start kodona se uvodi u ćeliju-domaćina. U jednom primeru izvođenja, ćelija-domaćin je ćelija eukariotske vrste koja je prirodni domaćin specifičnog alfavirusa koji sadrži 5' sekvencu prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin je ćelija BHK21 iz ćelijske linije "BHK21 [C13] (ATCC<®>CCL10™)", dostupna u Američkoj kolekciji tipova kultura, Manassas, Virdžinija, SAD. Poželjno je da nijedan dodatni bazni triplet AUG ne bude prisutan između pozicije uklanjanja nativnog start kodona i datog baznog tripleta AUG. Ako se, nakon transfera RNK replikona – koji se karakteriše uklanjanjem nativnog start kodona i koji sadrži dati bazni triplet AUG – u ćeliju-domaćina, translacija inicira na datom baznom tripletu AUG, utvrđuje se da dati bazni triplet AUG ima potencijal za inicijaciju translacije. Bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici može da se utvrdi da li je translacija inicirana. Na primer, replikon može da kodira, nishodno od datog baznog tripleta AUG i u okviru čitanja sa datim baznim tripletom AUG, oznaku koja olakšava detekciju proizvoda translacije (ako postoji), npr. myc-oznaka ili HA-oznaka; to, da li je proizvod ekspresije koji ima kodiranu oznaku prisutan ili ne, može da se odredi npr., metodom Western Blot. U ovom primeru izvođenja, poželjno je da nema dodatnih baznih tripleta AUG između datog baznog tripleta AUG i sekvence nukleinske kiseline koja kodira oznaku. In vitro test na ćelijama može da se izvede pojedinačno za više od jednog datog baznog tripleta AUG: u svakom slučaju, poželjno je da nijedan dodatni bazni triplet AUG nije prisutan između pozicije uklanjanja nativnog start kodona i datog baznog tripleta AUG. Ovo se može postići uklanjanjem svih baznih tripleta AUG (ako ih ima) između pozicije uklanjanja nativnog start kodona i datog baznog tripleta AUG. Prema tome, dati bazni triplet AUG je prvi bazni triplet AUG nishodno od pozicije uklanjanja nativnog start kodona.

[0202] Poželjno, replikon prema ovim navodima se karakteriše uklanjanjem svih potencijalnih inicijacionih kodona koji se nalaze nishodno od pozicije uklanjanja nativnog start kodona i koji se nalaze unutar otvorenog okvira čitanja alfavirusnog nestrukturnog proteina ili njegovog fragmenta. Prema tome, prema navodima, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije poželjno ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji može da se translatira u protein.

[0203] U poželjnom primeru izvođenja, 5' sekvencu prepoznavanja replikacije replikona RNK prema navodima karakteriše sekundarna struktura koja je ekvivalentna sekundarnoj strukturi 5' sekvence prepoznavanja replikacije alfavirusne genomske RNK. U poželjnom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije replikona RNK prema navodima karakteriše se predviđenom sekundarnom strukturom koja je ekvivalentna predviđenoj sekundarnoj strukturi 5' sekvence prepoznavanja replikacije alfavirusne genomske RNK. Prema navodima, sekundarnu

4

strukturu molekula RNK poželjno je predvideti pomoću veb servera za predviđanje sekundarne strukture RNK http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html.

[0204] Upoređivanjem sekundarne strukture ili predviđene sekundarne strukture 5' sekvence prepoznavanja replikacije replikona RNK koju karakteriše uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona u poređenju sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa, može da se identifikuje prisustvo ili odsustvo poremećaja uparivanja nukleotida. Na primer, najmanje jedan bazni par može da bude odsutan na datoj poziciji, u poređenju sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa, npr. bazni par unutar strukture drška-petlja, konkretno drške strukture drška-petlja.

[0205] U poželjnom primeru izvođenja, jedna ili više struktura drška-petlja 5' sekvence prepoznavanja replikacije nisu deletirane ili poremećene. Još poželjnije, struktura drška-petlja 3 i 4 nisu deletirane ili poremećene. Još poželjnije, nijedna od struktura drška-petlja 5' sekvence prepoznavanja replikacije nije deletirana ili poremećena.

[0206] U jednom primeru izvođenja, uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona ne remeti sekundarnu strukturu 5' sekvence prepoznavanja replikacije. U alternativnom primeru izvođenja, uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona remeti sekundarnu strukturu 5' sekvence prepoznavanja replikacije. U ovom primeru izvođenja, uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona može da bude uzrok odsustva najmanje jednog baznog para na datoj poziciji, npr. baznog para unutar strukture drška-petlja, u poređenju sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa. Ako je u strukturi drška-petlja odsutan bazni par, u poređenju sa nativnom 5' sekvencom prepoznavanja replikacije alfavirusa, utvrđuje se da je uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona uvelo poremećaj uparivanja nukleotida unutar strukture drška-petlja. Bazni par unutar strukture drška-petlja je tipično bazni par u dršci strukture drška-petlja.

[0207] U poželjnom primeru izvođenja, replikon RNK sadrži jednu ili više izmena nukleotida koje kompenzuju poremećaje uparivanja nukleotida unutar jedne ili više struktura drška-petlja uvedene uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona.

[0208] Ako uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona dovodi do poremećaja uparivanja nukleotida unutar strukture drška-petlja, u poređenju sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa, može se uvesti jedna ili više nukleotidnih izmena za koje se očekuje da kompenzuju poremećaj uparivanja nukleotida, a sekundarna struktura ili predviđena sekundarna struktura dobijena na taj način može da se uporedi sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije nativnog alfavirusa.

[0209] Na osnovu uobičajenog opšteg znanja i ovde datog otkrića, stručnjak može da očekuje da određene izmene nukleotida kompenzuju poremećaje uparivanja nukleotida. Na primer, ako je

4

bazni par narušen na datoj poziciji sekundarne strukture ili predviđene sekundarne strukture date 5' sekvence prepoznavanja replikacije RNK replikona koju karakteriše uklanjanje najmanje jednog inicijacionog kodona, u poređenju sa nativnom 5' sekvencom prepoznavanja replikacije alfavirusa, očekuje se da će izmena nukleotida koja obnavlja bazni par na toj poziciji, poželjno bez ponovnog uvođenja inicijacionog kodona, kompenzovati poremećaj uparivanja nukleotida. U jednom primeru, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije replikona koja sadrži jednu ili više nukleotidnih izmena koje kompenzuju poremećaje uparivanja nukleotida unutar jedne ili više struktura drškapetlja uvedene uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona je kodirana DNK sekvencom koju predstavlja SEQ ID NO: 5 (primer 1).

[0210] U poželjnom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije replikona se ne preklapa sa, ili ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja može da se translatira, tj. koja može da se translatira u peptid ili protein, posebno nsP, posebno nsP1, ili fragment bilo kog od njih. Da bi nukleotidna sekvenca bila "translatabilna", potrebno je prisustvo inicijacionog kodona; inicijacioni kodon kodira krajnji N-terminalni aminokiselinski ostatak peptida ili proteina. U jednom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije replikona se ne preklapa sa, ili ne sadrži, translatabilnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira N-terminalni fragment nsP1.

[0211] U nekim scenarijima, koji su detaljno opisani u nastavku, RNK replikon sadrži najmanje jedan subgenomski promotor. U poželjnom primeru izvođenja, subgenomski promotor replikona se ne preklapa sa, ili ne sadrži translatabilnu sekvencu nukleinske kiseline, tj. koja može da se translatira u peptid ili protein, posebno nsP, posebno nsP4, ili fragment bilo kog od njih. U jednom primeru izvođenja, subgenomski promotor replikona se ne preklapa sa, ili ne sadrži, translatabilnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira C-terminalni fragment nsP4. RNK replikon koji ima subgenomski promotor koji se ne preklapa sa, ili ne sadrži translatabilnu sekvencu nukleinske kiseline, npr. koja može da se translatira u C-terminalni fragment nsP4, može se generisati delecijom dela kodirajuće sekvence za nsP4 (obično dela koji kodira N-terminalni deo nsP4), i/ili uklanjanjem baznog tripleta AUG u delu kodirajuće sekvence za nsP4 koji nije deletiran. Ako se uklone bazni tripleti AUG u kodirajućoj sekvenci za nsP4 ili njenom delu, uklonjeni bazni tripleti AUG su poželjno potencijalni inicijacioni kodoni. Alternativno, ako se subgenomski promotor ne preklapa sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira nsP4, cela sekvenca nukleinske kiseline koja kodira nsP4 može da bude deletirana.

[0212] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira skraćeni alfavirusni nestrukturni protein. U kontekstu ovog primera izvođenja, posebno je poželjno da RNK replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira N-terminalni fragment nsP1, i opciono ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira C-terminalni fragment nsP4. N-terminalni

4

fragment nsP1 je skraćeni protein alfavirusa; C-terminalni fragment nsP4 je takođe skraćeni protein alfavirusa.

[0213] U nekim primerima izvođenja replikon prema predmetnim navodima ne sadrži strukturu drška-petlja 2 (SL2) na 5' kraju genoma alfavirusa. Prema Frolov et al., gore, struktura drška-petlja 2 je konzervisana sekundarna struktura koja se nalazi na 5' kraju genoma alfavirusa, ushodno od CSE 2, ali nije neophodna za replikaciju.

[0214] U jednom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije replikona se ne preklapa sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira alfavirusni nestrukturni protein ili njenim fragmentom. Dakle, predmetni navodi obuhvataju replikone koji se karakterišu, u poređenju sa genomskom alfavirusnom RNK, uklanjanjem najmanje jednog inicijacionog kodona, kao što je ovde opisano, opciono kombinovano sa delecijom kodirajućeg regiona za jedan ili više alfavirusnih nestrukturnih proteina, ili njihovih delova. Na primer, može da bude deletiran kodirajući region za nsP2 i nsP3, ili može da bude deletiran kodirajući region za nsP2 i nsP3 zajedno sa delecijom kodirajućeg regiona za C-terminalni fragment nsP1 i/ili kodirajućeg regiona za N-terminalni fragment nsP4, i jedan ili više preostalih inicijacionih kodona, tj. preostalih nakon pomenutog uklanjanja, može da bude uklonjen, kao što je ovde opisano.

[0215] Delecija kodirajućeg regiona za jedan ili više alfavirusnih nestrukturnih proteina može da se postigne standardnim postupcima, npr. na nivou DNK, isecanjem pomoću restrikcionih enzima, poželjno restrikcionih enzima koji prepoznaju jedinstvena restrikciona mesta u otvorenom čitanju okvir (za ilustraciju: videti primer 1). Opciono, jedinstvena restrikciona mesta mogu da budu uvedena u otvoreni okvir čitanja mutagenezom, npr. usmerenom mutagenezom. Odgovarajuća DNK može da se koristi kao matrica za in vitro transkripciju.

[0216] Restrikciono mesto je sekvenca nukleinske kiseline, npr. DNK sekvenca, koja je neophodna i dovoljna za usmeravanje restrikcije (isecanja) molekula nukleinske kiseline, npr., molekula DNK, u kome se nalazi restrikciono mesto, pomoću specifičnog restrikcionog enzima. Restrikciono mesto je jedinstveno za dati molekul nukleinske kiseline ako je jedna kopija restrikcionog mesta prisutna u molekulu nukleinske kiseline.

[0217] Restrikcioni enzim je endonukleaza koja seče molekul nukleinske kiseline, npr., molekul DNK, na, ili blizu mesta restrikcije.

[0218] Alternativno, sekvenca nukleinske kiseline koju karakteriše delecija dela ili celog otvorenog okvira čitanja može da se dobije sintetičkim metodama.

[0219] RNK replikon prema ovim navodima je poželjno jednolančani RNK molekul. RNK replikon prema ovim navodima je tipično (+) lančani molekul RNK. U jednom primeru izvođenja, RNK replikon prema ovim navodima je izolovani molekul nukleinske kiseline.

Najmanje jedan otvoreni okvir čitanja sadržan u replikonu

[0220] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon prema predmetnim navodima sadrži najmanje jedan otvoreni okvir čitanja koji kodira peptid od interesa ili protein od interesa. Poželjno, protein od interesa je kodiran heterolognom sekvencom nukleinske kiseline. Gen koji kodira peptid ili protein od interesa se sinonimno naziva "gen od interesa" ili "transgen". U različitim primerima izvođenja, peptid ili protein od interesa je kodiran heterolognom sekvencom nukleinske kiseline. Prema predmetnim navodima, termin "heterologna" se odnosi na činjenicu da sekvenca nukleinske kiseline nije prirodno funkcionalno ili strukturno vezana za sekvencu nukleinske kiseline alfavirusa.

[0221] Replikon prema predmetnim navodima može da kodira pojedinačni polipeptid ili nekoliko polipeptida. Nekoliko polipeptida može da bude kodirano u vidu jednog polipeptida (fuzioni polipeptid) ili kao posebni polipeptidi. U nekim primerima izvođenja, replikon prema predmetnim navodima može da sadrži više od jednog otvorenog okvira čitanja, od kojih svaki može nezavisno da bude odabran da bude pod kontrolom subgenomskog promotora ili ne. Alternativno, poliprotein ili fuzioni polipeptid sadrži pojedinačne polipeptide razdvojene opcionim mestom isecanja autokatalitičkom proteazom (npr. protein 2A virusa slinavke i šapa), ili inteina.

[0222] Proteini od interesa mogu npr. da budu odabrani iz grupe koja se sastoji od reporterskih proteina, farmaceutski aktivnih peptida ili proteina, inhibitora intracelularne interferonske (IFN) signalizacije i funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

Reporterski protein

[0223] U jednom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja kodira reporterski protein. U tom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja sadrži reporterski gen. Određeni geni mogu da budu odabrani kao reporteri jer karakteristike koje daju ćelijama ili organizmima koji ih eksprimiraju mogu lako da se identifikuju i izmere, ili zato što su selektabilni markeri. Reporterski geni se često koriste kao indikacija da li je određeni gen unet ili eksprimiran u populaciji ćelija ili organizama. Poželjno, proizvod ekspresije reporterskog gena je vizuelno detektabilan. Uobičajeni vizuelno detektabilni reporterski proteini obično poseduju fluorescentne ili luminiscentne proteine. Primeri specifičnih reporterskih gena uključuju gen koji kodira zeleni fluorescentni protein meduze (GFP), koji uzrokuje da ćelije koje ga eksprimiraju svetle zeleno pod plavim svetlom, enzim luciferazu, koji katalizuje reakciju sa luciferinom proizvodeći svetlost, i crveni fluorescentni protein (RFP). Moguće su varijante bilo kog od ovih specifičnih reporterskih gena, sve dok varijante poseduju vizuelno detektabilna svojstva. Na primer, eGFP je varijanta GFP sa tačkastom mutacijom. Primer

1

izvođenja reporterskog proteina je posebno pogodan za ispitivanje ekspresije, videti npr. primere 2 do 5.

Farmaceutski aktivan peptid ili protein

[0224] Prema navodima, u jednom primeru izvođenja, RNK replikona sadrži ili se sastoji od farmaceutski aktivne RNK. "Farmaceutski aktivna RNK" može da bude RNK koja kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Poželjno, RNK replikon prema predmetnim navodima kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Poželjno, otvoreni okvir čitanja kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Poželjno, RNK replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein, opciono pod kontrolom subgenomskog promotora.

[0225] "Farmaceutski aktivan peptid ili protein" ima pozitivno ili povoljno dejstvo na stanje ili bolest kod subjekta kada se primeni kod subjekta u terapijski efikasnoj količini. Poželjno, farmaceutski aktivan peptid ili protein ima kurativna ili palijativna svojstva i može da se primeni da poboljša, oslabi, olakša, preinači, odloži početak ili smanji ozbiljnost jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja. Farmaceutski aktivan peptid ili protein može da ima profilaktička svojstva i može da se koristi da odloži početak bolesti ili smanji ozbiljnost takve bolesti ili patološkog stanja. Termin "farmaceutski aktivan peptid ili protein" uključuje cele proteine ili polipeptide, i može takođe da se odnosi na njihove farmaceutski aktivne fragmente. Može da uključuje i farmaceutski aktivne analoge peptida ili proteina. Termin "farmaceutski aktivan peptid ili protein" uključuje peptide i proteine koji su antigeni, tj., peptid ili protein koji izaziva imunološki odgovor kod subjekta koji može da bude terapijski, ili delimično ili potpuno protektivan.

[0226] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivan peptid ili protein je, ili sadrži imunološki aktivno jedinjenje ili antigen ili epitop.

[0227] Prema navodima, termin "imunološki aktivno jedinjenje" se odnosi na bilo koje jedinjenje koje menja imuni odgovor, poželjno indukcijom i/ili supresijom sazrevanja imunih ćelija, indukcijom i/ili supresijom biosinteze citokina, i/ili menjanjem humoralnog imuniteta stimulisanjem proizvodnje antitela od strane B ćelija. U jednom primeru izvođenja, imuni odgovor uključuje stimulaciju odgovora antitela (koji obično uključuje imunoglobulin G (IgG)). Imunološki aktivna jedinjenja poseduju moćnu imunostimulatornu aktivnost uključujući, ali ne ograničavajući se na, antivirusnu i antitumorsku aktivnost, a takođe mogu nishodno da regulišu druge aspekte imunog odgovora, na primer pomeranje imunološkog odgovora sa TH2imunog odgovora, što je korisno za lečenje širokog spektara bolesti posredovanih sa TH2.

[0228] Prema navodima, termin "antigen" ili "imunogen" obuhvata svaku supstancu koja će izazvati imuni odgovor. Konkretno, "antigen" se odnosi na bilo koju supstancu koja specifično

2

reaguje sa antitelima ili T-limfocitima (T-ćelijama). Prema ovim navodima, termin "antigen" obuhvata bilo koji molekul koji sadrži najmanje jedan epitop. Poželjno, antigen u kontekstu ovih navoda je molekul koji, opciono nakon obrade, indukuje imunološku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen. Prema ovim navodima, može se koristiti bilo koji pogodan antigen, koji je kandidat za imunološku reakciju, pri čemu imunološka reakcija može da bude i humoralna i ćelijska imunološka reakcija. U kontekstu primera izvođenja ovih navoda, antigen je poželjno prezentovan pomoću ćelije, poželjno antigen-prezentujuće ćelije, u kontekstu MHC molekula, što rezultira imunološkom reakcijom protiv antigena. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili potiče od prirodnog antigena. Takvi prirodni antigeni mogu da uključuju ili mogu da potiču od alergena, virusa, bakterija, gljivica, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena ili antigen takođe može da bude tumorski antigen. Prema ovim navodima, antigen može da odgovara prirodnom proizvodu, na primer, virusnom proteinu ili njegovom delu. U poželjnim primerima izvođenja, antigen je površinski polipeptid, tj. polipeptid koji je prirodno prezentovan na površini ćelije, patogen, bakterija, virus, gljivica, parazit, alergen ili tumor. Antigen može da izazove imuni odgovor protiv ćelije, patogena, bakterije, virusa, gljivice, parazita, alergena ili tumora.

[0229] Termin "patogen" se odnosi na patogeni biološki materijal sposoban da izazove bolest u organizmu, poželjno u organizmu kičmenjaka. Patogeni uključuju mikroorganizme kao što su bakterije, jednoćelijski eukariotski organizmi (protozoe), gljivice, kao i virusi.

[0230] Termini "epitop", "antigeni peptid", "antigeni epitop", "imunogeni peptid" i "MHC vezujući peptid" se ovde koriste kao sinonimi i odnose se na antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj. na deo u ili fragment imunološki aktivnog jedinjenja koji prepoznaje imuni sistem, na primer, koji prepoznaje T ćelija, posebno kada je predstavljen u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinualni deo pomenutog proteina i poželjno je dug između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 amino kiselina, na primer, epitop može poželjno da ima 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina u dužinu. Prema navodima, epitop može da se veže za molekule MHC kao što su MHC molekuli na površini ćelije i tako može da bude "MHC vezujući peptid" ili "antigeni peptid". Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" obuhvataju molekule MHC klase I i MHC klase II i odnose se na kompleks gena koji je prisutan kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i antigen-prezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunološkim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju tako da ih T-ćelijski receptori prepoznaju. Proteini koje kodira MHC eksprimiraju se na površini ćelija i prikazuju i sopstvene antigene (peptidne fragmente iz same ćelije) i antigene koji nisu sopstveni (npr. fragmente invazivnih mikroorganizama) T ćeliji. Poželjni takvi imunogeni delovi se vezuju za molekul MHC klase I ili klase II. Kako se ovde koristi, kaže se da se imunogeni deo "vezuje za" molekul MHC klase I ili klase II ako se takvo vezivanje može detektovati korišćenjem bilo kog testa poznatog u tehnici. Termin "MHC vezujući peptid" se odnosi na peptid koji se vezuje za molekul MHC klase I i/ili MHC klase II. U slučaju kompleksa MHC klase I/peptida, vezujući peptidi su tipično dugi 8-10 aminokiselina, iako duži ili kraći peptidi mogu da budu efikasni. U slučaju kompleksa MHC klase II/peptida, vezujući peptidi su tipično dugi 10-25 aminokiselina i posebno su dugački 13-18 aminokiselina, dok duži i kraći peptidi mogu takođe da budu efikasni.

[0231] U jednom primeru izvođenja, protein od interesa prema predmetnim navodima sadrži epitop pogodan za vakcinaciju ciljnog organizma. Stručnjak u ovoj oblasti zna da se jedan od principa imunobiologije i vakcinacije zasniva na činjenici da se imunoprotektivna reakcija na bolest proizvodi imunizacijom organizma antigenom, koji je imunološki relevantan u odnosu na bolest koju treba lečiti. Prema ovim navodima, antigen se bira iz grupe koja sadrži sopstveni antigen i antigen koji nije sopstveni. Antigen koji nije sopstveni je poželjno bakterijski antigen, virusni antigen, antigen gljivice, alergen ili antigen parazita. Poželjno je da antigen sadrži epitop koji je sposoban da izazove imuni odgovor u ciljnom organizmu. Na primer, epitop može da izazove imuni odgovor protiv bakterije, virusa, gljivice, parazita, alergena ili tumora.

[0232] U nekim primerima izvođenja, antigen koji nije sopstveni je bakterijski antigen. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imuni odgovor protiv bakterije koja inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući domaće životinje. Poželjno, bakterija protiv koje se izaziva imuni odgovor je patogena bakterija.

[0233] U nekim primerima izvođenja, antigen koji nije sopstveni je virusni antigen. Virusni antigen može na primer da bude peptid proteina površine virusa, npr. polipeptid kapsida ili polipeptid šiljka. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imuni odgovor protiv virusa koji inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući pripitomljene životinje. Poželjno, virus protiv koga se izaziva imuni odgovor je patogeni virus.

[0234] U nekim primerima izvođenja, antigen koji nije sopstveni je polipeptid ili protein gljivice. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imuni odgovor protiv gljivice koja inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući domaće životinje. Poželjno, gljivica protiv koje se izaziva imuni odgovor je patogena gljivica.

[0235] U nekim primerima izvođenja, antigen koji nije sopstveni je polipeptid ili protein jednoćelijskog eukariotskog parazita. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imuni odgovor protiv jednoćelijskog eukariotskog parazita, poželjno patogenog jednoćelijskog eukariotskog parazita. Patogeni jednoćelijski eukariotski paraziti mogu da budu npr., iz roda

4

Plasmodium, npr. P. falciparum, P. vivax, P. malariae ili P. ovale, iz roda Leishmania, ili iz roda Trypanosoma, npr. T. cruzi ili T. brucei.

[0236] U nekim primerima izvođenja, antigen koji nije sopstveni je alergeni polipeptid ili alergeni protein. Alergeni protein ili alergeni polipeptid je pogodan za imunoterapiju alergenom, takođe poznatu kao hiposenzibilizacija.

[0237] U nekim primerima izvođenja antigen je sopstveni antigen, konkretno tumorski antigen. Tumorski antigeni i njihovo određivanje su poznati stručnjaku u ovoj oblasti.

[0238] U kontekstu predmetnih navoda, termin "tumorski antigen" ili "antigen povezan sa tumorom" odnosi se na proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim fazama, na primer, tumorski antigen može da bude u normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu želuca, poželjno u sluznici želuca, u reproduktivnim organima, na primer, u testisima, u trofoblastnom tkivu, npr., u placenti, ili u ćelijama klicine linije, i eksprimiraju se ili aberantno eksprimiraju u jednom ili više tumorskih ili kanceroznih tkiva. U ovom kontekstu, "ograničeni broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumorski antigeni u kontekstu ovih navoda uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za ćelijski tip, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom tipu ćelije u određenoj fazi diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima, a ponekad i u placenti, i antigene specifične za klicinu liniju. U kontekstu ovih navoda, tumorski antigen je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno se ne eksprimira, ili se samo retko eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuje kancerske ćelije. U kontekstu predmetnih navoda, tumorski antigen koji eksprimira kancerska ćelija subjekta, npr., pacijenta koji boluje od kancera, poželjno je sopstveni protein navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnih navoda je eksprimiran pod normalnim uslovima, specifično u tkivu ili organu koji nije esencijalan, tj. tkivima ili organima koji kada su oštećeni imunološkim sistemom ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koji nisu, ili su teško dostupni imunom sistemu. Poželjno, aminokiselinska sekvenca tumorskog antigena je identična između tumorskog antigena koji je eksprimiran u normalnim tkivima i tumorskog antigena koji je eksprimiran u kancerskim tkivima.

[0239] Primeri tumorskih antigena koji mogu da budu korisni u predmetnim navodima su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, proteini ćelijske površine familije klaudina, kao što CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 i CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ili hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miozin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT. Posebno poželjni tumorski antigeni uključuju CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) i CLAUDIN-6 (CLDN6).

[0240] U nekim primerima izvođenja, nije neophodno da farmaceutski aktivan peptid ili protein bude antigen koji izaziva imuni odgovor. Pogodni farmaceutski aktivni proteini ili peptidi mogu da budu izabrani iz grupe koja se sastoji od citokina i proteina imunog sistema kao što su imunološki aktivna jedinjenja (npr. interleukini, faktor stimulacije kolonija (CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), eritropoetin, faktor nekroze tumora (TNF), interferoni, integrini, adresini, seletini, "homing" receptori, T-ćelijski receptori, imunoglobulini), hormoni (kao što su insulin, tiroidni hormon, kateholamini, gonadotrofini, trofični hormoni, prolaktin, oksitocin, dopamin, goveđi somatotropin ili leptini), hormoni rasta (npr. humani hormon rasta), faktori rasta (npr. epidermalni faktor rasta, faktor rasta nerava ili faktor rasta sličan insulinu), receptori faktora rasta, enzimi (npr. aktivator tkivnog plazminogena, streptokinaza, biosintetički ili degradativni holesterol, steriodogeni enzimi, kinaze, fosfodiesteraze, metilaze, demetilaze, dehidrogenaze, celulaze, proteaze, lipaze, fosfolipaze, aromataze, citohromi, adenilat ili guanilat ciklaze, ili neuramidaze), receptori (receptori steroidnih hormona, receptori peptida), vezujući proteini (npr. proteini koji vezuju hormon rasta ili faktor rasta), faktori transkripcije i translacije, proteini koji suzbijaju rast tumora (npr. proteini koji inhibiraju angiogenezu), strukturni proteini (kao što su kolagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, aktin i miozin), proteini krvi (npr. trombin, serumski albumin, faktor VII, faktor VIII, insulin, faktor IX, faktor X, aktivator tkivnog plazminogena, protein C, von Wilebrandov faktor, antitrombin III, glukocerebrozidaza, eritropoetin, faktor stimulacije kolonije granulocita (GCSF) ili modifikovani faktor VIII ili antikoagulansi. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivni protein prema navodima je citokin koji je uključen u regulaciju limfoidne homeostaze, poželjno citokin koji je uključen i poželjno indukuje ili poboljšava razvoj, prajming, ekspanziju, diferencijaciju i/ili preživljavanje T ćelija. U jednom primeru izvođenja, citokin je interleukin, npr. IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, ili IL-21.

Inhibitor interferonske (IFN) signalizacije

[0241] Sledeći pogodni protein od interesa koji je kodiran otvorenim okvirom čitanja je inhibitor interferonske (IFN) signalizacije. Iako je objavljeno da vijabilnost ćelija, u koje je uvedena RNK za ekspresiju, može da bude smanjena, posebno ako se ćelije više puta transfektuju sa RNK, utvrđeno je da agensi koji inhibiraju IFN povećavaju vijabilnost ćelija u kojima RNK treba da bude eksprimirana (WO 2014/071963 A1). Poželjno, inhibitor je inhibitor signalizacije IFN tipa I. Sprečavanje vezivanja ekstracelularnog IFN za receptore za IFN i inhibiranje intracelularne IFN signalizacije u ćelijama omogućava stabilnu ekspresiju RNK u ćelijama. Alternativno ili dodatno, sprečavanje vezivanja ekstracelularnog IFN za receptore za IFN i inhibiranje intracelularne IFN signalizacije poboljšava preživljavanje ćelija, posebno ako se ćelije ponovljeno transfektuju sa RNK. Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, predviđa se da intracelularna IFN signalizacija može da dovede do inhibicije translacije i/ili degradacije RNK. Ovo može da se otkloni inhibicijom jednog ili više IFN-inducibilnih antivirusno aktivnih efektorskih proteina. IFN-inducibilni antivirusno aktivni efektorski protein može da se izabere iz grupe koja se sastoji od RNK-zavisne protein kinaze (PKR), 2',5'-oligoadenilat sintetaze (OAS) i RNazeL. Inhibiranje intracelularne IFN signalizacije može da uključuje inhibiciju PKR-zavisnog puta i/ili OAS-zavisnog puta. Pogodan protein od interesa je protein koji je sposoban da inhibira PKR-zavisni put i/ili OAS-zavisni put. Inhibiranje PKR-zavisnog puta može da obuhvata inhibiciju fosforilacije eIF2-alfa. Inhibicija PKR može da obuhvata tretiranje ćelije najmanje jednim inhibitorom PKR. Inhibitor PKR može da bude virusni inhibitor PKR. Poželjni virusni inhibitor PKR je E3 virusa vakcinije. Ako peptid ili protein (npr. E3, K3) treba da inhibira intracelularnu IFN signalizaciju, poželjna je intracelularna ekspresija peptida ili proteina. E3 virusa vakcinije je protein od 25 kDa koji vezuje dsRNA (kodiran genom E3L) koji vezuje i sekvestrira dsRNA da bi sprečio aktivaciju PKR i OAS. E3 može da se veže direktno za PKR i inhibira njegovu aktivnost, što dovodi do smanjene fosforilacije eIF2-alfa. Drugi pogodni inhibitori IFN signalizacije su ICP34.5 herpes simpleks virusa, NSs virusa Toskana, PK2 Bombyx mori nukleopolihedrovirusa i NS34A virusa HCV.

[0242] Inhibitor IFN signalizacije može da se obezbedi ćeliji u obliku sekvence nukleinske kiseline (npr. RNK) koja kodira inhibitor IFN signalizacije.

[0243] U jednom primeru izvođenja, inhibitor intracelularne ili ekstracelularne IFN signalizacije je kodiran molekulom iRNK. Taj molekul iRNK može da sadrži modifikaciju koja modifikuje sekvencu koja ne kodira polipeptid, kao što je ovde opisano, npr. kapa, 5’-UTR, 3’-UTR, poli(A) sekvencu, adaptaciju upotrebe kodona. Odgovarajući primeri izvođenja su ilustrovani npr. u primeru 3.

[0244] U alternativnom primeru izvođenja, inhibitor intracelularne ili ekstracelularne IFN signalizacije je kodiran replikonom, poželjno trans-replikonom ili trans-replikonom kao što je ovde opisano. Replikon sadrži elemente sekvence nukleinske kiseline koji omogućavaju replikaciju alfavirusnom replikazom, tipično CSE 1, CSE 2 i CSE 4; i poželjno takođe elemente sekvence nukleinske kiseline koji omogućavaju proizvodnju subgenomskog transkripta, tj. subgenomski promotor, koji tipično sadrži CSE 3. Replikon može dodatno da sadrži jednu ili više modifikacija sekvence koja ne kodira polipeptid, kao što je ovde opisano, npr. kapa, poli(A) sekvence, adaptaciju upotrebe kodona. Ako je na replikonu prisutno više otvorenih okvira čitanja, onda inhibitor intracelularne IFN signalizacije može da bude kodiran bilo kojim od njih, opciono pod kontrolom subgenomskog promotora, ili ne. U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor intracelularne IFN signalizacije je kodiran najushodnijim otvorenim okvirom čitanja replikona RNK. Kada je inhibitor intracelularne IFN signalizacije kodiran najushodnijim otvorenim okvirom čitanja replikona RNK, genetske informacije koje kodiraju inhibitor intracelularne IFN signalizacije će biti translatirane rano nakon uvođenja RNK replikona u ćeliju-domaćina, a rezultujući protein može zatim da inhibira intracelularnu IFN signalizaciju.

Funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein

[0245] Još jedan pogodan protein od interesa koji je kodiran otvorenim okvirom čitanja je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. Termin "alfavirusni nestrukturni protein" uključuje svaki ko- ili post-translaciono modifikovani oblik, uključujući oblike alfavirusnog nestrukturnog proteina modifikovane ugljenim hidratima (na primer, glikozilisane) i modifikovane lipidima.

[0246] U nekim primerima izvođenja, izraz "alfavirusni nestrukturni protein" odnosi se na bilo koji ili više pojedinačnih nestrukturnih proteina alfavirusnog porekla (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), ili na poliprotein koji sadrži polipeptidnu sekvencu više od jednog nestrukturnog proteina poreklom iz alfavirusa. U nekim primerima izvođenja, "alfavirusni nestrukturni protein" se odnosi na nsP123 i/ili na nsP4. U drugim primerima izvođenja, "alfavirusni nestrukturni protein" se odnosi na nsP1234. U jednom primeru izvođenja, protein od interesa koji je kodiran otvorenim okvirom čitanja sastoji se od svih od nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4 kao jednog pojedinačnog poliproteina nsP1234, koji opciono može da se iseca. U jednom primeru izvođenja, protein od interesa koji je kodiran otvorenim okvirom čitanja sastoji se od nsP1, nsP2 i nsP3 kao jednog pojedinačnog poliproteina nsP123, koji opciono može da se iseca. U tom primeru izvođenja, nsP4 može da bude dodatni protein od interesa i može da bude kodiran dodatnim otvorenim okvirom čitanja.

[0247] U nekim primerima izvođenja, alfavirusni nestrukturni protein je sposoban da formira kompleks ili asocijaciju, npr. u ćeliji-domaćinu. U nekim primerima izvođenja, "alfavirusni nestrukturni protein" se odnosi na kompleks ili asocijaciju nsP123 (sinonim P123) i nsP4. U nekim primerima izvođenja, "alfavirusni nestrukturni protein" se odnosi na kompleks ili asocijaciju nsP1, nsP2 i nsP3. U nekim primerima izvođenja, "alfavirusni nestrukturni protein" se odnosi na kompleks ili asocijaciju nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4. U nekim primerima izvođenja, "alfavirusni nestrukturni protein" se odnosi na kompleks ili asocijaciju bilo kog ili više odabranih iz grupe koja se sastoji od nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4. U nekim primerima izvođenja, alfavirusni nestrukturni protein sadrži najmanje nsP4.

[0248] Izrazi "kompleks" ili "asocijacija" odnose se na dva ili više istih ili različitih proteinskih molekula koji se nalaze u prostornoj blizini. Proteini kompleksa su poželjno u direktnom ili indirektnom fizičkom ili fizičko-hemijskom kontaktu jedan sa drugim. Kompleks ili asocijacija može da se sastoji od više različitih proteina (heteromultimer) i/ili od više kopija jednog određenog proteina (homomultimer). U kontekstu alfavirusnog nestrukturnog proteina, izraz "kompleks ili asocijacija" opisuje mnoštvo od najmanje dva proteinska molekula, od kojih je najmanje jedan alfavirusni nestrukturni protein. Kompleks ili asocijacija može da se sastoji od više kopija jednog određenog proteina (homomultimer) i/ili više različitih proteina (heteromultimer). U kontekstu multimera, "multi" znači više od jednog, kao što su dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više od deset.

[0249] Termin "funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein" uključuje alfavirusni nestrukturni protein koji ima funkciju replikaze. Dakle, "funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein" uključuje replikazu alfavirusa. "Funkcija replikaze" obuhvata funkciju RNK-zavisne RNK polimeraze (RdRP), odnosno enzima koji je sposoban da katalizira sintezu (-) lanca RNK na osnovu (+) lančanog RNK šablona, i/ili koji je sposoban da katalizuje sintezu (+) lanca RNK na osnovu (-) lančane RNK matrice. Dakle, termin "funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein" može da se odnosi na protein ili kompleks koji sintetiše (-) lančanu RNK, koristeći (+) lančanu (npr. genomsku) RNK kao matricu, na protein ili kompleks koji sintetiše novu (+) lančanu RNK, koristeći (-) lančani komplement genomske RNK kao matricu, i/ili na protein ili kompleks koji sintetiše subgenomski transkript, koristeći fragment (-) lančanog komplementa genomske RNK kao matricu. Funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može dodatno da ima jednu ili više dodatnih funkcija, kao što je npr. proteaza (za auto-isecanje), helikaza, terminalna adenililtransferaza (za dodavanje poli(A) repa), metiltransferaza i guanililtransferaza (za dodavanje 5'-kape nukleinskoj kiselini), mesta nuklearne lokalizacije, trifosfataza (Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., vol. 96, pp. 2483-500).

[0250] Prema navodima, termin "alfavirusna replikaza" se odnosi na alfavirusnu RNK-zavisnu RNK polimerazu, uključujući RNK-zavisnu RNK polimerazu iz prirodnog alfavirusa (alfavirusa koji se nalazi u prirodi) i RNK-zavisnu RNK polimerazu iz varijante ili derivata alfavirusa, kao što je atenuirani alfavirus. U kontekstu ovih navoda, termini "replikaza" i "alfavirusna replikaza" se koriste kao sinonimi, osim ako kontekst ne nalaže da bilo koja određena replikaza nije alfavirusna replikaza.

[0251] Termin "replikaza" obuhvata sve varijante, posebno posttranslaciono modifikovane varijante, konformacije, izoforme i homologne alfavirusne replikaze, koje eksprimiraju ćelije inficirane alfavirusom ili koje eksprimiraju ćelije koje su transfektovane nukleinskom kiselinom koja kodira alfavirusnu replikazu. Osim toga, termin "replikaza" obuhvata sve oblike replikaza koji su proizvedeni i mogu da budu proizvedeni rekombinantnim postupcima. Na primer, replikaza koja sadrži oznaku koja olakšava detekciju i/ili prečišćavanje replikaze u laboratoriji, npr. mycoznaku, HA-oznaku ili oligohistidinsku oznaku (His-oznaku) može da se proizvede rekombinantnim postupcima.

[0252] Opciono, alfavirusna replikaza je dodatno funkcionalno definisana kapacitetom vezivanja za bilo koji ili više od alfavirusnog konzervisanog elementa sekvence 1 (CSE 1) ili njegove komplementarne sekvence, konzervisanog elementa sekvence 2 (CSE 2) ili njegove komplementarne sekvence, konzervisanog elementa sekvence 3 (CSE 3) ili njegove komplementarne sekvence, konzervisanog elementa sekvence 4 (CSE 4) ili njegove komplementarne sekvence. Poželjno, replikaza je sposobna da se veže za CSE 2 [tj. za (+) lanac] i/ili CSE 4 [tj. za (+) lanac], ili za vezivanje za komplement CSE 1 [tj. za (-) lanac] i/ili za komplement CSE 3 [tj. za (-) lanac].

[0253] Poreklo replikaze nije ograničeno na bilo koji određeni alfavirus. U poželjnom primeru izvođenja, replikaza alfavirusa sadrži nestrukturni protein virusa Semliki šume, uključujući prirodni virus Semliki šume i varijantu ili derivat virusa Semliki šume, kao što je atenuirani virus Semliki šume. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikaza alfavirusa sadrži nestrukturni protein virusa Sindbis, uključujući virus Sindbis koji se prirodno pojavljuje i varijantu ili derivat virusa Sindbis, kao što je atenuirani virus Sindbis. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikaza alfavirusa sadrži nestrukturni protein virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa (VEEV), uključujući VEEV koji se prirodno pojavljuje i varijantu ili derivat VEEV, kao što je atenuirani VEEV. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikaza alfavirusa sadrži nestrukturni protein virusa Chikungunya (CHIKV), uključujući CHIKV koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat CHIKV, kao što je atenuirani CHIKV.

[0254] Replikaza takođe može da sadrži nestrukturne proteine iz više od jednog alfavirusa. Dakle, heterologni kompleksi ili asocijacije koji sadrže alfavirusni nestrukturni protein i koji imaju funkciju replikaze su podjednako obuhvaćeni ovim navodima. Samo u ilustrativne svrhe, replikaza može da sadrži jedan ili više nestrukturnih proteina (npr. nsP1, nsP2) iz prvog alfavirusa i jedan ili više nestrukturnih proteina (nsP3, nsP4) iz drugog alfavirusa. Nestrukturni proteini iz više različitih alfavirusa mogu da budu kodirani odvojenim otvorenim okvirima čitanja, ili mogu da budu kodirani jednim otvorenim okvirom čitanja kao poliprotein, npr. nsP1234.

[0255] U nekim primerima izvođenja, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je sposoban da formira membranske replikacione komplekse i/ili vakuole u ćelijama u kojima se funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein eksprimira.

[0256] Ako je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, tj. alfavirusni nestrukturni protein sa funkcijom replikaze, kodiran molekulom nukleinske kiseline prema ovim navodima, poželjno je da subgenomski promotor replikona, ako je prisutan, bude kompatibilan sa navedenom replikazom. Kompatibilnost u ovom kontekstu znači da je replikaza alfavirusa sposobna da prepozna subgenomski promotor, ako je prisutan. U jednom primeru izvođenja, ovo se postiže kada je subgenomski promotor nativan za alfavirus iz koga potiče replikaza, tj. prirodno poreklo ovih sekvenci je isti alfavirus. U alternativnom primeru izvođenja, subgenomski promotor nije nativan za alfavirus iz koga potiče replikaza alfavirusa, pod uslovom da je replikaza alfavirusa sposobna da prepozna subgenomski promotor. Drugim rečima, replikaza je kompatibilna sa subgenomskim promotorom (unakrsna kompatibilnost virusa). Primeri unakrsne kompatibilnosti u vezi sa subgenomskim promotorom i replikazom koji potiču iz različitih alfavirusa su poznati u tehnici. Bilo koja kombinacija subgenomskog promotora i replikaze je moguća sve dok postoji unakrsna kompatibilnost virusa. Stručnjak koji praktikuje ove navode može lako da ispita unakrsnu kompatibilnost virusa inkubacijom replikaze koja se ispituje sa RNK, pri čemu RNK ima subgenomski promotor koji treba da se ispita, u uslovima pogodnim za sintezu RNK sa subgenomskog promotora. Ako se subgenomski transkript dobije, potvrđuje se da su subgenomski promotor i replikaza kompatibilni. Poznati su različiti primeri unakrsne kompatibilnosti virusa (recenzirali Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562).

[0257] U jednom primeru izvođenja, alfavirusni nestrukturni protein nije kodiran kao fuzioni protein sa heterolognim proteinom, npr. ubikvitinom.

[0258] U predmetnim navodima, otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može da bude obezbeđen na RNK replikonu, ili alternativno, može da bude obezbeđen kao poseban molekul nukleinske kiseline, npr. molekul iRNK. Poseban molekul iRNK može opciono da sadrži npr. kapu, 5'-UTR, 3'-UTR, poli(A) sekvencu, i/ili adaptaciju upotrebe

1

kodona. Poseban molekul iRNK može da bude obezbeđen in trans, kako je ovde opisano za sistem prema predmetnim navodima.

[0259] Kada je na RNK replikonu obezbeđen otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, replikon poželjno može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. Konkretno, RNK replikon koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina koji je kodiran replikonom. Ovaj primer izvođenja je veoma poželjan kada nijedan molekul nukleinske kiseline koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein nije obezbeđen in trans. U ovom primeru izvođenja, cilj je cis-replikacija replikona. U poželjnom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, kao i dodatni otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. Ovaj primer izvođenja je posebno pogodan u nekim postupcima za proizvodnju proteina od interesa prema ovim navodima. Primer odgovarajućeg replikona je ilustrovan na sl. 1 ("cisReplikon Δ5ATG-RRS").

[0260] Ako replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, poželjno je da se otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ne preklapa sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije. U jednom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ne preklapa se sa subgenomskim promotorom, ako je prisutan. Primer odgovarajućeg replikona je ilustrovan na sl.

1 ("cisReplikon Δ5ATG-RRS").

[0261] Ako je na replikonu prisutno više otvorenih okvira čitanja, tada funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može da bude kodiran bilo kojim od njih, opciono pod kontrolom subgenomskog promotora ili ne, poželjno je da ne bude pod kontrolom subgenomskog promotora. U poželjnom primeru izvođenja, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je kodiran najushodnijim otvorenim okvirom čitanja RNK replikona. Kada je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein kodiran najushodnijim otvorenim okvirom čitanja RNK replikona, genetska informacija koja kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein biće translatirana rano nakon uvođenja RNK replikona u ćeliju-domaćina, a rezultujući protein može zatim da pokrene replikaciju, i opciono proizvodnju subgenomskog transkripta, u ćeliji-domaćinu. Primer odgovarajućeg replikona je ilustrovan na sl.1 ("cisReplikon Δ5ATG-RRS").

[0262] Prisustvo otvorenog okvira čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, bilo sadržan u replikonu, ili sadržan u posebnom molekulu nukleinske kiseline koji je obezbeđen in trans, omogućava da se replikon replikuje, i posledično, da se gen od interesa kodiran replikonom, opciono pod kontrolom subgenomskog promotora, eksprimira na visokom nivou. Ovo

2

je povezano sa povoljnijom cenom u poređenju sa drugim sistemima za transgenu ekspresiju. Na primer, u slučaju vakcinacije životinja, cena vakcine je ključna za njen uspeh u veterinarskoj i poljoprivrednoj zajednici. Pošto replikon prema ovim navodima može da se replikuje u prisustvu funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina, npr. u ćeliji vakcinisane životinje, visoki nivoi ekspresije gena od interesa mogu se postići čak i ako se primene relativno male količine replikonske RNK. Niske količine replikonske RNK pozitivno utiču na cenu vakcine po subjektu.

Pozicija najmanje jednog otvorenog okvira čitanja u RNK replikonu

[0263] RNK replikon je pogodan za ekspresiju jednog ili više gena koji kodiraju peptid od interesa ili protein od interesa, opciono pod kontrolom subgenomskog promotora. Mogući su različiti primeri izvođenja. Jedan ili više otvorenih okvira čitanja, od kojih svaki kodira peptid od interesa ili protein od interesa, može da bude prisutno na RNK replikonu. Najushodniji otvoreni okvir čitanja RNK replikona se naziva "prvi otvoreni okvir čitanja". U nekim primerima izvođenja, "prvi otvoreni okvir čitanja" je jedini otvoreni okvir čitanja RNK replikona. Opciono, jedan ili više dodatnih otvorenih okvira čitanja mogu da budu prisutni nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja. Jedan ili više dodatnih otvorenih okvira čitanja nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja može se nazvati "drugim otvorenim okvirom čitanja", "trećim otvorenim okvirom čitanja" i tako dalje, u redosledu (5' ka 3') u kome su prisutni nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja. Poželjno, svaki otvoreni okvir čitanja sadrži start kodon (bazni triplet), tipično AUG (u RNK molekulu), koji odgovara ATG (u odgovarajućem DNK molekulu).

[0264] Ako replikon sadrži 3' sekvencu prepoznavanja replikacije, poželjno je da svi otvoreni okviri čitanja budu lokalizovani ushodno od 3' sekvence prepoznavanja replikacije.

[0265] Kada se RNK replikon koji sadrži jedan ili više otvorenih okvira čitanja uvede u ćelijudomaćina, poželjno je da se translacija ne pokrene ni na jednoj poziciji ushodno od prvog otvorenog okvira čitanja, zbog uklanjanja najmanje jednog inicijacionog kodona iz 5' sekvence prepoznavanja replikacije. Stoga, replikon može da posluži direktno kao matrica za translaciju prvog otvorenog okvira čitanja. Poželjno, replikon sadrži od 5'-kapu. Ovo je korisno za ekspresiju gena kodiranog prvim otvorenim okvirom čitanja direktno sa replikona.

[0266] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan otvoreni okvir čitanja replikona je pod kontrolom subgenomskog promotora, poželjno subgenomskog promotora alfavirusa. Subgenomski promotor alfavirusa je veoma efikasan i stoga je pogodan za heterolognu ekspresiju gena na visokom nivou. Poželjno, subgenomski promotor je promotor za subgenomski transkript u alfavirusu. Ovo znači da je subgenomski promotor onaj koji je nativan za alfavirus i koji poželjno kontroliše transkripciju otvorenog okvira čitanja koji kodira jedan ili više strukturnih proteina u pomenutom alfavirusu. Alternativno, subgenomski promotor je varijanta subgenomskog promotora alfavirusa; svaka varijanta koja funkcioniše kao promotor za subgenomsku RNK transkripciju u ćeliji-domaćinu je pogodna. Ako replikon sadrži subgenomski promotor, poželjno je da replikon sadrži konzervisani element sekvence 3 (CSE 3) ili njegovu varijantu.

[0267] Poželjno, najmanje jedan otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora lokalizovan je nishodno od subgenomskog promotora. Poželjno, subgenomski promotor kontroliše proizvodnju subgenomske RNK koja sadrži transkript otvorenog okvira čitanja.

[0268] U nekim primerima izvođenja prvi otvoreni okvir čitanja je pod kontrolom subgenomskog promotora. Kada je prvi otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora, njegova lokalizacija liči na lokalizaciju otvorenog okvira čitanja koji kodira strukturne proteine u genomu alfavirusa. Kada je prvi otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora, gen koji je kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja može da bude eksprimiran sa replikona, kao i sa njegovog subgenomskog transkripta (u drugom slučaju, u prisustvu funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina). Odgovarajući primer izvođenja predstavlja replikon "Δ5ATG-RRS" na sl. 1. Poželjno, "Δ5ATG-RRS" ne sadrži nijedan inicijacioni kodon u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira C-terminalni fragment nsP4 (*nsP4). Jedan ili više dodatnih otvorenih okvira čitanja, svaki pod kontrolom subgenomskog promotora, mogu da budu prisutni nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja koji je pod kontrolom subgenomskog promotora (nije ilustrovano na sl.

1). Geni kodirani jednim ili većim brojem dodatnih otvorenih okvira čitanja, npr. drugim otvorenim okvirom čitanja, mogu da budu translatirani sa jednog ili više subgenomskih transkripata, svaki pod kontrolom subgenomskog promotora. Na primer, RNK replikon može da sadrži subgenomski promotor koji kontroliše proizvodnju transkripta koji kodira drugi protein od interesa.

[0269] U drugim primerima izvođenja prvi otvoreni okvir čitanja nije pod kontrolom subgenomskog promotora. Kada prvi otvoreni okvir čitanja nije pod kontrolom subgenomskog promotora, gen koji je kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja može da bude eksprimiran sa replikona. Odgovarajući primer izvođenja predstavlja replikon "Δ5ATG-RRS" na sl. 1. Jedan ili više dodatnih otvorenih okvira čitanja, svaki pod kontrolom subgenomskog promotora, mogu da budu prisutni nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja (za ilustraciju dva primera izvođenja, pogledajte "Δ5ATG-RRS - bicistronski" i "cisReplikon Δ5ATG-RRS" na sl. 1). Geni kodirani jednim ili većim brojem dodatnih otvorenih okvira čitanja mogu da budu eksprimirani sa subgenomskih transkripata.

[0270] U ćeliji koja sadrži replikon prema predmetnim navodima, replikon može da bude amplifikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. Dodatno, ako replikon

4

sadrži jedan ili više otvorenih okvira čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora, očekuje se da će jedan ili više subgenomskih transkripata biti pripremljeni pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina. Funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može da bude obezbeđen in trans, ili može da bude kodiran otvorenim okvirom čitanja replikona.

[0271] Ako replikon sadrži više od jednog otvorenog okvira čitanja koji kodira protein od interesa, poželjno je da svaki otvoreni okvir čitanja kodira drugačiji protein. Na primer, protein kodiran drugim otvorenim okvirom čitanja razlikuje se od proteina koji je kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja.

[0272] U nekim primerima izvođenja, protein od interesa koji je kodiran prvim i/ili dodatnim otvorenim okvirom čitanja, poželjno prvim otvorenim okvirom čitanja, je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ili inhibitor IFN signalizacije, npr. E3. U nekim primerima izvođenja, protein od interesa kodiran prvim i/ili dodatnim otvorenim okvirom čitanja, npr. drugim otvorenim okvirom čitanja, je farmaceutski aktivan peptid ili protein, ili reporterski protein.

[0273] U jednom primeru izvođenja, protein od interesa koji je kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. U tom primeru izvođenja replikon poželjno sadrži 5'-kapu. Naročito kada je protein od interesa koji je kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, i poželjno kada replikon sadrži 5'-kapu, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može efikasno da se translatira sa replikona, a rezultujući protein može naknadno da pokrene replikaciju replikona i pokrene sintezu jednog ili više subgenomskih transkripata. Ovaj primer izvođenja može da bude poželjan kada se ne koristi dodatni molekul nukleinske kiseline koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ili nije prisutan zajedno sa replikonom. U ovom primeru izvođenja, cilj je cis-replikacija replikona.

[0274] Jedan primer izvođenja u kome prvi otvoreni okvir čitanja kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein ilustrovan je pomoću "cisReplikon Δ5ATG-RRS" na sl.1. Nakon translacije sekvence nukleinske kiseline koja kodira nsP1234, proizvod translacije (nsP1234 ili njegov(i) fragment(i)) može da deluje kao replikaza i pokrene sintezu RNK, tj. replikaciju replikona i sintezu subgenomskog transkripta koji sadrži drugi otvoreni okvir čitanja ("Transgen" na sl.1).

Trans-replikacioni sistem

[0275] U drugom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju sistem koji sadrži:

RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina, RNK replikon u skladu sa prvim aspektom navoda, koji može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina in trans.

[0276] U drugom aspektu, poželjno je da RNK replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0277] Prema tome, predmetni navodi obezbeđuju sistem koji sadrži dva molekula nukleinske kiseline: prvi konstrukt RNK za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina (tj. kodiranje funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina); i drugi molekul RNK, RNK replikon. Konstrukt RNK za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina se ovde sinonimno naziva "konstrukt RNK za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina" ili "replikazni konstrukt".

[0278] Funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je kao što je gore definisano i tipično je kodiran otvorenim okvirom čitanja koji je sadržan u replikaznom konstruktu. Funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein kodiran replikaznim konstruktom može da bude bilo koji funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein koji je sposoban da replikuje replikon.

[0279] Kada se sistem ovih navoda uvede u ćeliju, poželjno eukariotsku ćeliju, otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein može da bude translatiran. Nakon translacije, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je sposoban da replikuje odvojeni molekul RNK (RNK replikon) in trans. Dakle, ovi navodi obezbeđuju sistem za replikaciju RNK in trans. Shodno tome, sistem prema predmetnim navodima je trans-replikacioni sistem. Prema drugom aspektu, replikon je trans-replikon.

[0280] Ovde, trans (npr. u kontekstu trans-delovanja, trans-regulatornog), uopšteno, znači "delovanje sa drugog molekula" (tj. intermolekularno). Predstavlja suprotnost cis (npr. u kontekstu cis-delovanja, cis-regulatornog), što, uopšteno, znači "delovanje sa istog molekula" (tj. intramolekularno). U kontekstu sinteze RNK (uključujući transkripciju i replikaciju RNK), element koji deluje u trans položaju uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži gen koji kodira enzim sposoban za sintezu RNK (RNK polimeraza). RNK polimeraza koristi drugi molekul nukleinske kiseline, tj. molekul nukleinske kiseline koji nije onaj kojim je kodirana, kao matricu za sintezu RNK. Kaže se da i RNK polimeraza i sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži gen koji kodira RNK polimerazu "deluju in trans" na drugi molekul nukleinske kiseline. U kontekstu ovih navoda, RNK polimeraza koju kodira RNK koja ispoljava trans-delovanje je funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. Funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein je sposoban da koristi drugi molekul nukleinske kiseline, koji je RNK replikon, kao matricu za sintezu RNK, uključujući replikaciju RNK replikona. RNK replikon koji može da se replikuje replikazom in trans prema predmetnim navodima se ovde sinonimno naziva "trans-replikon".

[0281] U sistemu prema predmetnim navodima, uloga funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina je da amplifikuje replikon i da pripremi subgenomski transkript, ako je subgenomski promotor prisutan na replikonu. Ako replikon kodira gen od interesa za ekspresiju, nivoi ekspresije gena od interesa i/ili trajanje ekspresije mogu se regulisati in trans modifikacijom nivoa funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

[0282] Činjenica da je alfavirusna replikaza generalno sposobna da prepozna i replikuje matričnu RNK in trans prvobitno je otkrivena 1980-ih, ali potencijal trans-replikacije za biomedicinsku primenu nije prepoznat, između ostalog zato što se smatralo da trans-replikovana RNK inhibira efikasnu replikaciju: otkrivena je u slučaju defektne interferirajuće (DI) RNK koja se ko-replikuje sa alfavirusnim genomima u inficiranim ćelijama (Barrett et al., 1984, J. Gen. Virol., vol.65 (Pt 8), pp.1273-1283; Lehtovaara et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol.78, pp.5353-5357; Pettersson, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, vol.78, pp.115-119). DI RNK su trans-replikoni koji mogu da se pojave kvazi-prirodno tokom infekcija ćelijskih linija sa visokim opterećenjem virusom. DI elementi se ko-replikuju tako efikasno da smanjuju virulenciju parentalnog virusa i na taj način deluju kao inhibitorna parazitska RNK (Barrett et al., 1984, J. Gen. Virol., vol.65 (Pt 11), pp. 1909- 1920). Iako potencijal za biomedicinsku primenu nije prepoznat, fenomen transreplikacije je korišćen u nekoliko bazičnih studija sa ciljem da se razjasne mehanizmi replikacije, bez potrebe za ekspresijom replikaze sa istog molekula in cis; dalje, razdvajanje replikaze i replikona takođe omogućava funkcionalne studije koje uključuju mutante virusnih proteina, čak i ako su odgovarajući mutanti bili mutanti sa gubitkom funkcije (Lemm et al., 1994, EMBO J., vol.

13, pp. 2925-2934). Ove studije gubitka funkcije i DI RNK nisu sugerisale da trans-aktivacioni sistemi zasnovani na alfavirusnim elementima mogu na kraju da postanu dostupni za upotrebu u terapijske svrhe.

[0283] Sistem prema predmetnim navodima obuhvata najmanje dva molekula nukleinske kiseline. Dakle, može da sadrži dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, ili deset ili više molekula nukleinske kiseline, koji su poželjno molekuli RNK. U poželjnom primeru izvođenja, sistem se sastoji od tačno dva molekula RNK, replikona i replikaznog konstrukta. U alternativnim poželjnim primerima izvođenja, sistem sadrži više od jednog replikona, od kojih svaki poželjno kodira najmanje jedan protein od interesa, a takođe sadrži replikazni konstrukt. U ovim primerima izvođenja, funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein kodiran replikaznim konstruktom može da deluje na svaki replikon da bi pokrenuo replikaciju i proizvodnju subgenomskih transkripata, respektivno. Na primer, svaki replikon može da kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Ovo je korisno npr. ako se želi vakcinacija subjekta protiv nekoliko različitih antigena.

[0284] Poželjno je da replikaznom konstruktu nedostaje najmanje jedan konzervisani element sekvence (CSE) koji je neophodan za sintezu (-) lanca na osnovu matričnog (+) lanca, i/ili za sintezu (+) lanca na osnovu matričnog (-) lanca. Još poželjnije, replikazni konstrukt ne sadrži nikakve alfavirusne konzervisane elemente sekvence (CSE). Konkretno, među četiri CSE alfavirusa (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol.4, pp. 837- 856), poželjno je da bilo koji ili veći broj od sledećih CSE nije prisutan na replikaznom konstruktu: CSE 1; CSE 2; CSE 3; CSE 4. Naročito u odsustvu bilo kog ili više alfavirusnih CSE, replikazni konstrukt prema ovim navodima mnogo više liči na tipičnu eukariotsku iRNK nego što liči na alfavirusnu genomsku RNK.

[0285] Replikazni konstrukt prema ovim navodima se poželjno razlikuje od alfavirusne genomske RNK barem po tome što nije sposoban za samoreplikaciju i/ili što ne sadrži otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora. Kada nije u stanju da se samoreplikuje, replikazni konstrukt može da bude označen i kao "suicidni konstrukt".

[0286] Trans-replikacioni sistem je povezan sa sledećim prednostima:

Prvo i najvažnije, univerzalnost trans-replikacionog sistema omogućava da replikon i replikazni konstrukt mogu da se dizajniraju i/ili pripreme u različito vreme i/ili na različitim mestima. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt se priprema u prvom vremenskom trenutku, a replikon se priprema u kasnijem vremenskom trenutku. Na primer, nakon njegove pripreme, replikazni konstrukt može da bude sačuvan za upotrebu u kasnijem vremenskom trenutku. Predmetni navodi obezbeđuju povećanu fleksibilnost u poređenju sa cis-replikonima: kada se pojavi novi patogen, sistem prema ovim navodima može da bude dizajniran za vakcinaciju, kloniranjem u replikon nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji izaziva imuni odgovor protiv novog patogena. Prethodno pripremljeni replikazni konstrukt može da se obnovi iz uskladištenog oblika. Dakle, nije potrebno da, u vreme kada se replikazni konstrukt dizajnira i priprema, priroda određenog patogena, ili jednog ili više antigena određenog patogena, bude poznata. Shodno tome, nije potrebno da, u vreme kada se replikazni konstrukt dizajnira i priprema, bude dostupan replikon koji kodira polipeptid koji izaziva imuni odgovor protiv određenog novog patogena. Drugim rečima, replikazni konstrukt može da bude dizajniran i pripremljen nezavisno od bilo kog konkretnog replikona. Ovo omogućava brzo reagovanje na pojavu novih patogena, ili na patogene koje karakteriše ekspresija najmanje jednog novog antigena, jer priprema replikona bez replikaze zahteva manje napora i resursa nego priprema cis-replikona. Istorija govori da je potreban sistem koji omogućava brzu reakciju na patogene: ovo je ilustrovano npr. pojavom patogena koji izazivaju teški akutni respiratorni sindrom (SARS), ebolu i različite podtipove virusa gripa poslednjih godina.

[0287] Drugo, trans-replikon prema predmetnim navodima je tipično kraći molekul nukleinske kiseline od tipičnog cis-replikona. Ovo omogućava brže kloniranje replikona koji kodira protein od interesa, npr. imunogeni polipeptid, i obezbeđuje visoke prinose proteina od interesa.

[0288] Dalje prednosti sistema prema predmetnim navodima uključuju nezavisnost od nuklearne transkripcije i prisustvo ključne genetske informacije na dva odvojena molekula RNK, što obezbeđuje slobodu dizajna bez presedana. S obzirom na njegove univerzalne elemente, koji mogu da se kombinuju jedan sa drugim, predmetni navodi omogućavaju da se optimizuje ekspresija replikaze za željeni nivo amplifikacije RNK, za željeni ciljni organizam, za željeni nivo proizvodnje proteina od interesa, itd. Sistem prema predmetnim navodima omogućava kotransfekciju različitih količina ili odnosa replikona i replikaznih konstrukta za bilo koji dati tip ćelije - u mirovanju ili u ćelijskom ciklusu, in vitro ili in vivo. Trans-replikacioni sistem prema predmetnim navodima je pogodan za inokulaciju ćelije-domaćina i za ekspresiju gena od interesa u ćeliji-domaćinu (videti npr. primere 2, 3 i 5).

[0289] Replikazni konstrukt prema predmetnim navodima je poželjno jednolančani RNK molekul. Replikazni konstrukt prema predmetnim navodima je tipično (+) lančani molekul RNK. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima je izolovani molekul nukleinske kiseline.

Poželjna svojstva opisanih molekula RNK

[0290] Molekuli RNK prema navodima mogu opciono da okarakterišu sledeća svojstva, npr.5’-kapa, 5’-UTR, 3’-UTR, poli(A) sekvenca, i/ili adaptacija upotrebe kodona. Detalji su opisani u nastavku teksta.

Kapa

[0291] U nekim primerima izvođenja, replikon prema predmetnim navodima sadrži 5'-kapu.

[0292] U nekim primerima izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 5'-kapu.

[0293] Termini "5'-kapa", "kapa", "struktura 5'-kape", "struktura kape" koriste se kao sinonimi da označe dinukleotid koji se nalazi na 5' kraju nekih eukariotskih primarnih transkripata kao što je prekursor informacione RNK. 5'-kapa je struktura u kojoj je (opciono modifikovani) guanozin vezan za prvi nukleotid molekula iRNK preko 5' - 5' trifosfatne veze (ili modifikovane trifosfatne veze u slučaju određenih analoga kape). Termini mogu da se odnose na uobičajenu kapu ili na analog kape. Za ilustraciju, neki konkretni dinukleotidi kape (uključujući dinukleotide analoga kape) prikazani su na sl. 6.

[0294] "RNK koja sadrži 5'-kapu" ili "RNK koja je snabdevena 5'-kapom" ili "RNK koja je modifikovana 5'-kapom" ili "kapovana RNK" odnosi se na RNK koja sadrži 5'-kapu. Na primer, snabdevanje RNK 5'-kapom može da se ostvari in vitro transkripcijom DNK matrice u prisustvu navedene 5'-kape, pri čemu se navedena 5'-kapa ko-transkripciono ugrađuje u generisani lanac RNK, ili RNK može da bude generisana, na primer, in vitro transkripcijom, i 5'-kapa može da se veže za RNK post-transkripciono upotrebom enzima za dodavanje kape, na primer, enzima za dodavanje kape vakcinija virusa. U RNK sa kapom, 3' pozicija prve baze molekula RNK (sa kapom) vezana je za 5' poziciju sledeće baze molekula RNK ("drugu bazu") preko fosfodiestarske veze.

[0295] Prisustvo kape na molekulu RNK je jako poželjno ako je poželjna translacija sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein u ranim stadijumima posle uvođenja odgovarajuće RNK u ćelije-domaćine ili u organizam-domaćin. Na primer, kao što je prikazano u primeru 4, prisustvo kape omogućava da se gen od interesa kodiran RNK replikonom translatira efikasno u ranim stadijumima nakon uvođenja odgovarajuće RNK u ćelije-domaćine. "Rani stadijumi" tipično znače tokom prvog časa, ili tokom prva dva časa, ili tokom prva tri časa nakon uvođenja RNK.

[0296] Prisustvo kape na molekulu RNK je takođe poželjno ako je poželjno da se translacija odvija u odsustvu funkcionalne replikaze, ili kada su samo minimalni nivoi replikaze prisutni u ćelijidomaćinu. Na primer, čak i ako je molekul nukleinske kiseline koja kodira replikazu uveden u ćeliju-domaćina, u ranim stadijumima posle uvođenja nivoi replikaze će tipično biti minimalni.

[0297] U sistemu prema navodima, poželjno je da konstrukt RNK za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina sadrži 5'-kapu.

[0298] Posebno kada RNK replikon prema predmetnim navodima nije upotrebljen ili obezbeđen zajedno sa drugim molekulom nukleinske kiseline (npr. iRNK) koja kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, poželjno je da RNK replikon sadrži 5'-kapu. Nezavisno, RNK replikon može da sadrži i 5'-kapu čak i kada je upotrebljen ili obezbeđen zajedno sa drugim molekulom nukleinske kiseline koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0299] Termin "konvencionalna 5'-kapa" odnosi se na prirodnu 5'-kapu, poželjno na 7-metilguanozinsku kapu. U 7-metilguanozinskoj kapi, guanozin kape je modifikovani guanozin pri čemu se modifikacija sastoji od metilacije na poziciji 7 (vrh sl.6).

[0300] U kontekstu predmetnih navoda, termin "analog 5'-kape" odnosi se na molekulsku strukturu koja liči na konvencionalnu 5'-kapu, ali je modifikovana kako bi imala sposobnost da stabilizuje RNK ako je vezana za nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji. Analog kape nije konvencionalna 5'-kapa.

[0301] U slučaju eukariotske iRNK, 5'-kapa je po pravilu opisana kao uključena u efikasnu translaciju iRNK: generalno, translacija se kod eukariota inicira samo na 5' kraju molekula informacione RNK (iRNK), osim u slučaju prisustva unutrašnjeg ribozomalnog ulaznog mesta (IRES). Eukariotske ćelije mogu da dodaju 5'-kapu na RNK tokom transkripcije u jedru: novosintetisane iRNK su obično modifikovane strukturom 5'-kape, npr. kada transkript dostigne dužinu od 20 do 30 nukleotida. Prvo, 5' terminalni nukleotid pppN (ppp predstavlja trifosfat; N predstavlja bilo koji nukleozid) se u ćeliji prevodi u 5' GpppN pomoću enzima za dodavanje kape koji ima RNK 5'-trifosfataznu i guanililtransferaznu aktivnost. GpppN može zatim da bude metilovan u ćeliji pomoću drugog enzima sa (guanin-7)-metiltransferaznom aktivnošću kako bi se formirala mono-metilovana m<7>GpppN kapa. U jednom primeru izvođenja, 5'-kapa upotrebljena u predmetnim navodima je prirodna 5'-kapa.

[0302] U predmetnim navodima, dinukleotid prirodne 5'-kape je tipično izabran iz grupe koja se sastoji od nemetilovanog dinukleotida kape (G(5')ppp(5')N; označenog i kao GpppN) i metilovanog dinukleotida kape ((m<7>G(5')ppp(5')N; označenog i kao m<7>GpppN). m<7>GpppN (gde N predstavlja G) prikazan je sledećom formulom:

[0303] RNK sa kapom prema predmetnim navodima može da se pripremi in vitro, i stoga ne zavisi od mašinerije za dodavanje kape u ćeliji-domaćinu. Najčešće korišćeni postupak za dobijanje RNK sa kapom in vitro je transkribovanje DNK matrice pomoću bakterijske ili bakteriofagne RNK polimeraze u prisustvu sva četiri ribonukleozid trifosfata i dinukleotida kape kao što je m<7>G(5')ppp(5')G (označen i kao m<7>GpppG). RNK polimeraza inicira transkripciju nukleofilnim napadom 3'-OH guanozinskog ostatka na m<7>GpppG na α-fosfat sledećeg matričnog nukleozid trifosfata (pppN), čime se dobija intermedijer m<7>GpppGpN (gde je N druga baza u molekulu RNK). Formiranje proizvoda pppGpN iniciranog kompetirajućim GTP suprimira se podešavanjem molarnog odnosa kape prema GTP između 5 i 10 tokom in vitro transkripcije.

[0304] U poželjnim primerima izvođenja predmetnih navoda, 5'-kapa (ako je prisutna) je analog 5'-kape. Ovi primeri izvođenja su posebno pogodni ako se RNK dobija in vitro transkripcijom, npr. predstavlja in vitro transkribovanu RNK (IVT-RNK). Analozi kape su inicijalno opisani da olakšaju sintezu velikih količina RNK transkripata putem in vitro transkripcije.

[0305] Neki analozi kape (sintetičke kape) za informacionu RNK su uopšteno opisani do danas, i svi oni mogu da se upotrebe u kontekstu predmetnih navoda. U idealnom slučaju, odabira se analog

1

kape koji je povezan sa većom efikasnošću translacije i/ili povećanu otpornost na in vivo degradaciju i/ili povećanu otpornost na in vitro degradaciju.

[0306] Poželjno, koristi se analog kape koji može da se ugradi u lanac RNK samo u jednoj orijentaciji. Pasquinelli et al. (1995, RNA J., vol., 1, pp. 957-967) je pokazao da tokom in vitro transkripcije, bakteriofagna RNK polimeraza koristi 7-metilguanozinsku jedinicu za inicijaciju transkripcije, pri čemu oko 40-50% transkripata sa kapom poseduje dinukleotid kape u obrnutoj orijentaciji (tj., inicijalni proizvod reakcije je Gpppm<7>GpN). U poređenju sa RNK sa ispravnom kapom, RNK sa obrnutom kapom nisu funkcionalne u pogledu translacije sekvence nukleinske kiseline u protein. Prema tome, poželjno je da se kapa ugradi u ispravnoj orijentaciji, tj., da rezultuje u RNK sa strukturom koja suštinski odgovara m<7>GpppGpN, itd. Pokazalo se da je obrnuta integracija dinukleotida kape inhibirana supstitucijom bilo 2'- ili 3'-OH grupe metilovane guanozinske jedinice (Stepinski et al., 2001; RNA J., vol.7, pp.1486-1495; Peng et al., 2002; Org. Lett., vol.24, pp.161-164). RNK koje se sintetišu u prisustvu takvih "analoga kape sa pravilnom orjentacijom" translatiraju se efikasnije od RNK koje se in vitro transkribuju u prisustvu konvencionalne 5'-kape m<7>GpppG. U tom cilju, opisan je jedan analog kape u kome je 3'-OH grupa metilovane guanozinske jedinice zamenjena sa OCH3npr. kod Holtkamp et al., 2006, Blood, vol.

108, pp.4009-4017 (7-metil(3'-O-metil)GpppG; analog kape sa pravilnom orjentacijom (ARCA)). ARCA je pogodan dinukleotid kape prema predmetnim navodima.

[0307] U poželjnom primeru izvođenja predmetnih navoda, RNK prema predmetnim navodima u suštini nije podložna uklanjanju kape. Ovo je važno jer je, generalno, količina proteina proizvedenog sa sintetičkih iRNK uvedenih u kulture ćelija sisara ograničena prirodnom degradacijom iRNK. Jedan in vivo put za degradaciju iRNK počinje uklanjanjem kape iRNK. Ovo uklanjanje je katalizovano heterodimernom pirofosfatazom, koja sadrži regulatornu podjedinicu (Dcp1) i katalitičku podjedinicu (Dcp2). Katalitička podjedinica iseca vezu između α i β fosfatnih grupa trifosfatnog mosta. U predmetnim navodima, može da bude odabran ili prisutan analog kape koji nije podložan, ili je manje podložan, tom tipu isecanja. Pogodan analog kape za ovu svrhu može da se izabere između dinukleotida kape prema formuli (I):

2

gde je R<1>izabran iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog alkila, opciono supstituisanog alkenila, opciono supstituisanog alkinila, opciono supstituisanog cikloalkila, opciono supstituisanog heterociklila, opciono supstituisanog arila i opciono supstituisanog heteroarila,

R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, halo, OH, i opciono supstituisanog alkoksi, ili R<2>i R<3>zajedno formiraju O-X-O, gde je X izabran iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3), i C(CH3)2, ili je R<2>kombinovan sa atomom vodonika na poziciji 4' prstena za koji je vezan R<2>kako bi se formirao -O-CH2- ili -CH2-O-,

R<5>je izabran iz grupe koja se sastoji od S, Se i BH3,

R<4>i R<6>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od O, S, Se i BH3.

n je 1, 2, ili 3.

[0308] Poželjni primeri izvođenja za R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>su opisani u WO 2011/015347 A1 i mogu da budu odabrani u skladu sa tim u predmetnim navodima.

[0309] Na primer, u poželjnom primeru izvođenja predmetnih navoda, RNK predmetnih navoda sadrži fosforotioatni analog kape. Fosforotioatni analozi kape su specifični analozi kape u kojima je jedan od tri nepremošćujućih O atoma u trifosfatnom lancu zamenjen S atomom, tj. jedan od R<4>, R<5>ili R<6>u formuli (I) je S. Fosforotioatni analozi kape su opisani kod J. Kowalska et al., 2008, RNA, vol.14, pp.1119-1131, kao rešenje za neželjeni proces uklanjanja kape, i time za povećanje stabilnosti RNK in vivo. Konkretno, supstitucija atoma kiseonika za atom sumpora na betafosfatnoj grupi 5'-kape rezultuje stabilizacijom protiv Dcp2. U tom primeru izvođenja, koji je poželjan u predmetnim navodima, R<5>u formuli (I) je S; a R<4>i R<6>su O.

[0310] U sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnih navoda, RNK predmetnih navoda sadrži fosforotioatni analog kape u kome je fosforotioatna modifikacija RNK 5'-kape kombinovana sa modifikacijom "analog kape sa pravilnom orjentacijom" (ARCA). Odgovarajući ARCA- fosforotioatni analozi kape su opisani u WO 2008/157688 A2, i svi oni mogu da se upotrebe u RNK predmetnih navoda. U tom primeru izvođenja, najmanje jedan od R<2>ili R<3>u formuli (I) nije OH, poželjno jedan od R<2>i R<3>je metoksi (OCH3), a drugi od R<2>i R<3>je poželjno OH.

[0311] U poželjnom primeru izvođenja, atom kiseonika je supstituisan za atom sumpora na betafosfatnoj grupi (tako da je R<5>u formuli (I) S; a R<4>i R<6>su O). Veruje se da fosforotioatna modifikacija ARCA osigurava da su α, β i γ fosforotioatne grupe precizno pozicionirane unutar aktivnih mesta proteina koji se vezuju za kapu i u translacionoj i u mašineriji za uklanjanje kape. Najmanje neki od ovih analoga su u suštini otporni na pirofosfatazu Dcp1/Dcp2. Opisano je da fosforotioatno-modifikovani ARCA imaju mnogo veći afinitet za elF4E od odgovarajućih ARCA kojima nedostaje fosforotioatna grupa.

[0312] Odgovarajući analog kape koji je posebno poželjan u predmetnim navodima, tj., m2'<7,2'-O>GppspG, označen je kao beta-S-ARCA (WO 2008/157688 A2; Kuhn et al., Gen Ther., 2010, vol.

17, pp.961-971). Prema tome, u jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, RNK predmetnih navoda je modifikovana sa beta-S-ARCA. Beta-S-ARCA je predstavljen sledećom strukturom:

[0313] Uopšteno, zamena atoma kiseonika za atom sumpora na premošćujućem fosfatu dovodi do fosforotioatnih dijastereomera koji su označeni kao D1 i D2, na osnovu njihovog obrasca eluiranja u HPLC. Ukratko, D1 dijastereomer beta-S-ARCA ili "beta-S-ARCA(D1)" je dijastereomer beta-S-ARCA koji se prvi eluira na HPLC koloni u poređenju sa D2 dijastereomerom beta-S-ARCA (beta-S-ARCA(D2)) i stoga pokazuje kraće vreme zadržavanja. Određivanje stereohemijske konfiguracije pomoću HPLC opisano je u WO 2011/015347 A1.

[0314] U prvom posebno poželjnom primeru izvođenja ovih navoda, RNK predmetnih navoda je modifikovana beta-S-ARCA(D2) dijastereomerom. Dva dijastereomera beta-S-ARCA razlikuju se po osetljivosti na nukleaze. Pokazalo se da je RNK koja nosi D2 dijastereomer beta-S-ARCA skoro u potpunosti otporna na isecanje pomoću Dcp2 (samo 6% isecanja u poređenju sa RNK koja je sintetizovana u prisustvu nemodifikovane ARCA 5'-kape), dok RNK sa beta-S-ARCA(D1) 5'-kapom pokazuje intermedijarnu osetljivost na isecanje pomoću Dcp2 (71% isecanja). Dalje je pokazano da povećana stabilnost protiv isecanja sa Dcp2 korelira sa povećanom ekspresijom proteina u ćelijama sisara. Konkretno, pokazalo se da se RNK koje nose beta-S-ARCA(D2) kapu efikasnije translatiraju u ćelijama sisara od RNK koje nose beta-S-ARCA(D1) kapu. Prema tome, u jednom aspektu predmetnih navoda, RNK predmetnih navoda je modifikovana analogom kape prema formuli (I), koju karakteriše stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>u formuli (I) koja odgovara onoj na Pβatomu D2 dijastereomera beta-S-ARCA. U tom primeru

4

izvođenja, R<5>u Formuli (I) je S; a R<4>i R<6>su O. Dodatno, najmanje jedan od R<2>ili R<3>u formuli (I) poželjno nije OH, poželjno je jedan od R<2>i R<3>metoksi (OCH3), a drugi od R<2>i R<3>je poželjno OH.

[0315] U drugom posebno poželjnom primeru izvođenja, RNK predmetnih navoda je modifikovana beta-S-ARCA(D1) dijastereomerom. Ovaj primer izvođenja je posebno pogodan za transfer RNK sa kapom u nezrele antigen-prezentujuće ćelije, na primer, u svrhu vakcinacije. Pokazalo se da je beta-S-ARCA(D1) dijastereomer, nakon transfera RNK sa odgovarajućom kapom u nezrele antigen-prezentujuće ćelije, posebno pogodan za povećanje stabilnosti RNK, povećavajući efikasnost translacije RNK, produžujući translaciju RNK, povećavajući ukupnu proteinsku ekspresiju RNK, i/ili povećavajući imuni odgovor protiv antigena ili antigenskog peptida kodiranog navedenom RNK (Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol.17, pp.961-971). Prema tome, u alternativnom primeru izvođenja predmetnih navoda, RNK predmetnih navoda je modifikovana analogom kape prema formuli (I), koju karakteriše stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>u formuli (I) koji odgovara onoj na Pβatomu D1 dijastereomera beta-S-ARCA. Odgovarajući analozi kape i njihovi primeri izvođenja su opisani u WO 2011/015347 A1 i Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971. Bilo koji analog kape opisan u WO 2011/015347 A1, u kome stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>odgovara onoj na Pβatomu D1 dijastereomera beta-S-ARCA, može da se koristi u predmetnim navodima. Poželjno, R<5>u formuli (I) je S; a R<4>i R<6>su O. Pored toga, najmanje jedan od R<2>ili R<3>u formuli (I) poželjno nije OH, poželjno je jedan od R<2>i R<3>metoksi (OCH3), a drugi od R<2>i R<3>je poželjno OH.

[0316] U jednom primeru izvođenja, RNK predmetnih navoda je modifikovana strukturom 5'-kape u skladu sa formulom (I) gde je bilo koja fosfatna grupa zamenjena boranofosfatnom grupom ili fosforoselenoatnom grupom. Takve kape imaju povećanu stabilnost i in vitro i in vivo. Opciono, odgovarajuće jedinjenje ima 2'-O- ili 3'-O-alkil grupu (gde je alkil poželjno metil); odgovarajući analozi kape nazivaju se BH3-ARCA ili Se-ARCA. Jedinjenja koja su posebno pogodna kao kape na iRNK uključuju β-BH3-ARCA i β-Se-ARCA, kao što je opisano u WO 2009/149253 A2. Za ova jedinjenja, poželjna je stereohemijska konfiguracija na atomu P koji sadrži supstituent R<5>u formuli (I) koja odgovara onoj na Pβatomu D1 dijastereomera beta-S-ARCA.

UTR

[0317] Izraz "netranslirani region" ili "UTR" odnosi se na region u molekulu DNK koji je transkribovan, ali nije translatiran u aminokiselinsku sekvencu, ili na odgovarajući region u molekulu RNK, kao što je molekul iRNK. Netranslatirani region (UTR) može da bude prisutan 5' (ushodno) od otvorenog okvira čitanja (5'-UTR) i/ili 3' (nishodno) od otvorenog okvira čitanja (3'-UTR).

[0318] 3'-UTR, ako je prisutan, nalazi se na 3' kraju gena, nishodno od terminacionog kodona regiona koji kodira proteine, ali termin "3'-UTR" poželjno ne uključuje poli(A) rep. Dakle, 3'-UTR je ushodno od poli(A) repa (ako je prisutan), npr. neposredno uz poli(A) rep.

[0319] 5'-UTR, ako je prisutan, nalazi se na 5' kraju gena, ushodno od start kodona regiona koji kodira protein.5'-UTR je nishodno od 5'-kape (ako postoji), npr. neposredno pored 5'-kape.

[0320] 5'- i/ili 3'-netranslirani regioni mogu, prema navodima, da budu funkcionalno povezani sa otvorenim okvirom čitanja, tako da ovi regioni budu povezani sa otvorenim okvirom čitanja na takav način da se stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK koja sadrži pomenuti otvoreni okvir čitanja povećava.

[0321] U nekim primerima izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR.

[0322] U poželjnom primeru izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži

(1) 5'-UTR,

(2) otvoreni okvir čitanja, i

(3) 3'-UTR.

[0323] UTR su uključeni u stabilnost i efikasnost translacije RNK. Oba se mogu poboljšati, osim strukturnih modifikacija koje se tiču 5'-kape i/ili 3' poli(A)-repa, kao što je ovde opisano, odabirom specifičnih 5' i/ili 3' netranslatiranih regiona (UTR). Uopšteno se smatra da elementi sekvence unutar UTR utiču na efikasnost translacije (uglavnom 5'-UTR) i stabilnost RNK (uglavnom 3'-UTR). Poželjno je da je prisutan 5'-UTR koji je aktivan u smislu povećanja efikasnosti translacije i/ili stabilnosti replikaznog konstrukta. Nezavisno ili dodatno, poželjno je da je prisutan 3'-UTR koji je aktivan u smislu povećanja efikasnosti translacije i/ili stabilnosti replikaznog konstrukta.

[0324] Izrazi "aktivan u smislu povećanja efikasnosti translacije" i/ili "aktivan u smislu povećanja stabilnosti", u odnosu na prvu sekvencu nukleinske kiseline (npr. UTR), znače da je prva sekvenca nukleinske kiseline sposobna da modifikuje, u zajedničkom transkriptu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline, efikasnost translacije i/ili stabilnost navedene druge sekvence nukleinske kiseline na takav način da je navedena efikasnost i/ili stabilnost translacije povećana u poređenju sa efikasnošću translacije i/ili stabilnošću navedene druge sekvence nukleinske kiseline u odsustvu navedene prve sekvence nukleinske kiseline.

[0325] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR koji je heterolog ili nije nativan za alfavirus iz kog potiče funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. Ovo omogućava da se netranslatirani regioni dizajniraju u skladu sa željenom efikasnošću translacije i stabilnošću RNK. Dakle, heterologni ili ne-nativni UTR omogućavaju visok stepen fleksibilnosti, a ova fleksibilnost je prednost u poređenju sa prirodnim alfavirusnim UTR. Konkretno, iako je poznato da alfavirusna (nativna) RNK takođe sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR, alfavirusni UTR ispunjavaju dvostruku funkciju, tj. (i) da pokreću replikaciju RNK, kao i (ii) da pokreću translaciju. Iako je objavljeno da su alfavirusni UTR neefikasni za translaciju (Berben-Bloemheuvel et al., 1992, Eur. J. Biochem., vol.208, pp. 581-587), oni obično ne mogu lako da se zamene efikasnijim UTR zbog njihove dvojne funkcije. U predmetnim navodima, međutim, 5'-UTR i/ili 3'-UTR sadržani u replikaznom konstruktu za replikaciju in trans mogu da budu izabrani nezavisno od njihovog potencijalnog uticaja na replikaciju RNK.

[0326] Poželjno je da replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR koji nije virusnog porekla; posebno ne alfavirusnog porekla. U jednom aspektu, replikazni konstrukt sadrži 5'-UTR poreklom iz eukariotskog 5'-UTR i/ili 3'-UTR poreklom iz eukariotskog 3'-UTR.

[0327] 5'-UTR prema predmetnim navodima može da sadrži bilo koju kombinaciju više od jedne sekvence nukleinske kiseline, opciono odvojene linkerom.3'-UTR prema predmetnim navodima može da sadrži bilo koju kombinaciju više od jedne sekvence nukleinske kiseline, opciono odvojene linkerom.

[0328] Termin "linker" prema navodima odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja je dodata između dve sekvence nukleinske kiseline da bi se navedene dve sekvence nukleinske kiseline povezale. Nema posebnih ograničenja u vezi sa sekvencom linkera.

[0329] 3'-UTR tipično ima dužinu od 200 do 2000 nukleotida, npr. 500 do 1500 nukleotida. 3'-netranslirani regioni iRNK imunoglobulina su relativno kratki (manje od oko 300 nukleotida), dok su 3'-netranslirani regioni drugih gena relativno dugi. Na primer, 3'-netranslirani region tPA je dugačak oko 800 nukleotida, kod faktora VIII je dužine oko 1800 nukleotida, a kod eritropoetina oko 560 nukleotida. 3'-netranslirani regioni iRNK sisara obično imaju region homologije poznat kao heksanukleotidna sekvenca AAUAAA. Ova sekvenca je verovatno signal vezivanja poli(A) i često se nalazi od 10 do 30 baza ushodno od mesta vezivanja poli(A). 3'-netranslatirani regioni mogu da sadrže jedan ili više invertovanih ponovaka koji mogu da se saviju da bi dali strukture drška-petlja koje deluju kao barijere za egzoribonukleaze ili stupaju u interakciju sa proteinima za koje je poznato da povećavaju stabilnost RNK (npr. RNK-vezujući proteini).

[0330] 3'-UTR humanog beta-globina, posebno dve uzastopne identične kopije 3'-UTR humanog beta-globina, doprinose visokoj stabilnosti transkripta i translacionoj efikasnosti (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol.108, pp. 4009-4017). Dakle, u jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži dve uzastopne identične kopije 3'-UTR humanog betaglobina. Dakle, sadrži u pravcu 5' → 3': (a) opciono 5'-UTR; (b) otvoreni okvir čitanja; (c) 3'-UTR; navedeni 3'-UTR sadrži dve uzastopne identične kopije 3'-UTR humanog beta-globina, njegovog fragmenta ili varijante 3'-UTR humanog beta-globina ili njegovog fragmenta.

[0331] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 3'-UTR koji je aktivan u smislu povećanja efikasnosti i/ili stabilnosti translacije, ali koji nije 3'-UTR humanog beta-globina, njegov fragment, ili varijanta 3'-UTR humanog beta-globina ili njegovog fragmenta.

[0332] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 5'-UTR koji je aktivan u smislu povećanja efikasnosti i/ili stabilnosti translacije.

[0333] Replikazni konstrukt koji sadrži UTR prema navodima može da se pripremi npr. in vitro transkripcijom. Ovo može da se postigne genetskom modifikacijom matričnog molekula nukleinske kiseline (npr. DNK) na takav način da omogućava transkripciju RNK sa 5'-UTR i/ili 3'-UTR.

[0334] Kao što je ilustrovano na sl. 1, i replikon može da se karakteriše sa 5'-UTR i/ili 3'-UTR. UTR replikona su tipično alfavirusni UTR ili njihove varijante.

Poli(A) sekvenca

[0335] U nekim primerima izvođenja replikon prema predmetnim navodima sadrži 3’-poli(A) sekvencu. Ako replikon sadrži konzervisani element sekvence 4 (CSE 4), 3'-poli(A) sekvenca replikona je poželjno prisutna nishodno od CSE 4, najpoželjnije neposredno pored CSE 4.

[0336] U nekim primerima izvođenja, replikazni konstrukt prema predmetnim navodima sadrži 3'-poli(A) sekvencu.

[0337] Prema navodima, u jednom primeru izvođenja, poli(A) sekvenca sadrži, ili se suštinski sastoji od, ili se sastoji od najmanje 20, poželjno najmanje 26, poželjno najmanje 40, poželjno najmanje 80, poželjno najmanje 100 i poželjno do 500, poželjno do 400, poželjno do 300, poželjno do 200, a posebno do 150, A nukleotida, i konkretno oko 120 A nukleotida. U ovom kontekstu "suštinski se sastoji od" znači da većina nukleotida u poli(A) sekvenci, obično najmanje 50%, a poželjno najmanje 75% od broja nukleotida u "poli(A) sekvenci", predstavljaju A nukleotidi (adenilat), ali dozvoljava da su preostali nukleotidi nukleotidi koji nisu A nukleotidi, kao što su U nukleotidi (uridilat), G nukleotidi (guanilat), C nukleotidi (citidilat). U ovom kontekstu "sastoji se od" znači da su svi nukleotidi u poli(A) sekvenci, tj.100% od broja nukleotida u poli(A) sekvenci, A nukleotidi. Termin "A nukleotid" ili "A" se odnosi na adenilat.

[0338] Zaista, pokazano je da 3' poli(A) sekvenca od oko 120 A nukleotida ima blagotvoran uticaj na nivoe RNK u transfektovanim eukariotskim ćelijama, kao i na nivoe proteina koji se translatiraju sa otvorenog okvira čitanja koji je prisutan ushodno (5') od 3' poli(A) sekvence (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol.108, pp.4009-4017).

[0339] Kod alfavirusa, smatra se da je 3' poli(A) sekvenca od najmanje 11 uzastopnih adenilatnih ostataka, ili najmanje 25 uzastopnih adenilatnih ostataka, važna za efikasnu sintezu minus lanca. Konkretno, u alfavirusima, smatra se da 3' poli(A) sekvenca od najmanje 25 uzastopnih adenilatnih ostataka deluje zajedno sa konzervisanim elementom sekvence 4 (CSE 4) tako što podstiče sintezu (-) lanca (Hardi & Rice, J. Virol., 2005, tom 79, pp.4630-4639).

[0340] Predmetni navodi obezbeđuju da 3' poli(A) sekvenca bude dodata tokom transkripcije RNK, tj. tokom pripreme in vitro transkribovane RNK, na osnovu DNK matrice koja sadrži ponovljene dT nukleotide (dezoksitimidilat) u lancu komplementarnom kodirajućem lancu. DNK sekvenca koja kodira poli(A) sekvencu (kodirajući lanac) se naziva poli(A) kaseta.

[0341] U poželjnom primeru izvođenja predmetnih navoda, 3' poli(A) kaseta prisutna u kodirajućem lancu DNK se u suštini sastoji od dA nukleotida, ali je prekinuta nasumičnom sekvencom koja ima ravnomernu distribuciju četiri nukleotida (dA, dC, dG, dT). Takva nasumična sekvenca može da bude duga 5 do 50, poželjno 10 do 30, poželjnije 10 do 20 nukleotida. Takva kaseta je opisana u WO 2016/005004 A1. Bilo koja poli(A) kaseta opisana u WO 2016/005004 A1 može da se upotrebi u predmetnim navodima. Poli(A) kaseta koja se suštinski sastoji od dA nukleotida, ali je prekinuta nasumičnom sekvencom koja ima ravnomernu distribuciju četiri nukleotida (dA, dC, dG, dT) i koja ima dužinu od npr., 5 do 50 nukleotida ispoljava, na nivou DNK, konstantnu propagaciju plazmidne DNK u E. coli i još uvek je povezana, na nivou RNK, sa korisnim svojstvima u pogledu podrške stabilnosti RNK i efikasnosti translacije.

[0342] Shodno tome, u poželjnom primeru izvođenja predmetnih navoda, 3' poli(A) sekvenca sadržana u molekulu RNK koji je ovde opisan suštinski se sastoji od A nukleotida, ali je prekinuta nasumičnom sekvencom koja ima ravnomernu distribuciju četiri nukleotida (A, C, G, U). Takva nasumična sekvenca može da bude duga 5 do 50, poželjno 10 do 30, poželjnije 10 do 20 nukleotida.

Upotreba kodona

[0343] Uopšteno, degeneracija genetskog koda će omogućiti supstituciju određenih kodona (baznih tripleta koji kodiraju aminokiselinu) koji su prisutni u sekvenci RNK drugim kodonima (baznim tripletima), uz održavanje istog kapaciteta kodiranja (tako da zamenski kodon kodira istu aminokiselinu kao zamenjeni kodon). U nekim primerima izvođenja predmetnih navoda, najmanje jedan kodon otvorenog okvira čitanja sadržan u molekulu RNK razlikuje se od odgovarajućeg kodona u odgovarajućem otvorenom okviru čitanja u vrsti iz koje potiče otvoreni okvir čitanja. U tom primeru izvođenja, za sekvencu kodiranja otvorenog okvira čitanja se kaže da je "prilagođena" ili "modifikovana". Kodirajuća sekvenca otvorenog okvira čitanja sadržana u replikonu može da se prilagodi. Alternativno ili dodatno, kodirajuća sekvenca za funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein sadržana u replikaznom konstruktu može da bude prilagođena.

[0344] Na primer, kada je kodirajuća sekvenca otvorenog okvira čitanja prilagođena, mogu da se izaberu često korišćeni kodoni: WO 2009/024567 A1 opisuje prilagođavanje kodirajuće sekvence molekula nukleinske kiseline, uključujući supstituciju retkih kodona češće korišćenim kodonima. Pošto učestalost upotrebe kodona zavisi od ćelije-domaćina ili organizma-domaćina, taj tip adaptacije je pogodan da se sekvenca nukleinske kiseline prilagodi ekspresiji u određenoj ćelijidomaćinu ili organizmu-domaćinu. Uopšteno govoreći, češće korišćeni kodoni se obično efikasnije prevode u ćeliji-domaćinu ili organizmu-domaćinu, iako nije uvek potrebna adaptacija svih kodona otvorenog okvira čitanja.

[0345] Na primer, kada je kodirajuća sekvenca otvorenog okvira čitanja prilagođena, sadržaj ostataka G (guanilat) i ostataka C (citidilat) može da se promeni izborom kodona sa najbogatijim sadržajem GC za svaku aminokiselinu. Objavljeno je da molekuli RNK sa otvorenim okvirima čitanja bogatim GC imaju potencijal da smanje imunološku aktivaciju i da poboljšaju translaciju i poluživot RNK (Thess et al., 2015, Mol. Ther.23, 1457-1465).

[0346] Kada replikon prema predmetnim navodima kodira alfavirusni nestrukturni protein, kodirajuća sekvenca za nestrukturni alfavirusni protein može da se prilagodi po želji. Ova sloboda je moguća jer se otvoreni okvir čitanja koji kodira alfavirusni nestrukturni protein ne preklapa sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije replikona.

Bezbednosna svojstva primera izvođenja predmetnih navoda

[0347] Sledeće karakteristike su poželjne u predmetnim navodima, same ili u bilo kojoj pogodnoj kombinaciji:

Poželjno, replikon ili sistem prema predmetnim navodima ne formira čestice. To znači da, nakon inokulacije ćelije-domaćina replikonom ili sistemom prema predmetnim navodima, ćelijadomaćin ne proizvodi virusne čestice, kao što su virusne čestice sledeće generacije. U jednom primeru izvođenja, svi molekuli RNK prema navodima su potpuno bez genetskih informacija koje kodiraju bilo koji strukturni protein alfavirusa, kao što je protein C jezgra nukleokapsida, protein omotača P62 i/ili protein omotača E1. Ovaj aspekt predmetnih navoda pruža dodatnu vrednost u smislu bezbednosti u odnosu na sisteme prethodnog stanja tehnike gde su strukturni proteini kodirani na trans-replikativnoj pomoćnoj RNK (npr. Bredenbeek et al., J. Virol, 1993, vol.67, pp.

6439- 6446).

[0348] Poželjno, sistem prema predmetnim navodima ne sadrži nijedan alfavirusni strukturni protein, kao što je protein C jezgra nukleokapsida, protein omotača P62 i/ili protein omotača E1.

[0349] Poželjno, replikon i replikazni konstrukt sistema prema predmetnim navodima nisu međusobno identični. U jednom primeru izvođenja, replikon ne kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein. U jednom primeru izvođenja, replikaznom konstruktu nedostaje najmanje jedan element sekvence (poželjno najmanje jedan CSE) koji je potreban za sintezu (-) lanca na osnovu matričnog (+) lanca, i/ili za sintezu (+) lanca na osnovu matričnog (-) lanca. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt ne sadrži CSE 1 i/ili CSE 4.

[0350] Poželjno, ni replikon prema predmetnim navodima ni replikazni konstrukt prema predmetnim navodima ne sadrže signal za pakovanje alfavirusa. Na primer, signal za pakovanja alfavirusa koji se nalazi u kodirajućem regionu nsP2 SFV (White et al.1998, J. Virol., vol.72, pp.

4320-4326) može da bude uklonjen, npr. delecijom ili mutacijom. Pogodan način uklanjanja signala za pakovanje alfavirusa uključuje prilagođavanje upotrebe kodona kodirajućeg regiona nsP2. Degeneracija genetskog koda može da omogući deleciju funkcije signala za pakovanje bez uticaja na aminokiselinsku sekvencu kodiranog nsP2.

[0351] U jednom primeru izvođenja, sistem prema predmetnim navodima je izolovani sistem. U tom primeru izvođenja, sistem nije prisutan unutar ćelije, kao što je sisarska ćelija, ili nije prisutan unutar kapsida virusa, na primer, unutar omotača koji sadrži alfavirusne strukturne proteine. U jednom primeru izvođenja, sistem prema predmetnim navodima prisutan je in vitro.

DNK

[0352] U trećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju DNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira RNK replikon prema prvom primeru izvođenja predmetnih navoda.

[0353] Poželjno, DNK je dvolančana.

[0354] U poželjnom primeru izvođenja, DNK prema trećem aspektu navoda je plazmid. Termin "plazmid", kako se ovde koristi, uopšteno se odnosi na konstrukt ekstrahromozomskog genetskog materijala, obično kružni dvolančani molekul DNK, koji može da se replikuje nezavisno od hromozomske DNK.

[0355] DNK predmetnih navoda može da sadrži promotor koji DNK-zavisna RNK-polimeraza može da prepozna. Ovo omogućava transkripciju kodirane RNK in vivo ili in vitro, npr. RNK predmetnih navoda. IVT vektori mogu da budu upotrebljeni na standardizovani način kao matrica za in vitro transkripciju. Primeri promotora koji su poželjni prema navodima su promotori za SP6, T3 ili T7 polimerazu.

1

[0356] U jednom primeru izvođenja, DNK predmetnih navoda je izolovani molekul nukleinske kiseline.

Postupci za pripremu RNK

[0357] Svaki RNK molekul prema predmetnim navodima, bilo da je deo sistema prema predmetnim navodima ili ne, može da se dobije in vitro transkripcijom. In vitro-transkribovana RNK (IVT-RNK) je od posebnog interesa u predmetnim navodima. IVT-RNK može da se dobije transkripcijom sa molekula nukleinske kiseline (posebno sa molekula DNK). Molekul(i) DNK prema trećem aspektu predmetnih navoda su pogodni u tu svrhu, posebno ako sadrže promotor koji može da prepozna DNK-zavisna RNK-polimeraza.

[0358] RNK prema predmetnim navodima može da bude sintetisana in vitro. Ovo omogućava dodavanje analoga kape u in vitro reakciju transkripcije. Tipično, poli(A) rep je kodiran poli-(dT) sekvencom na DNK matrici. Alternativno, dodavanje kape i poli(A) repa mogu da se postignu pomoću enzima posle transkripcije.

[0359] Stručnjaku u ovoj oblasti je poznata metodologija in vitro transkripcije. Na primer, kao što je pomenuto u WO 2011/015347A1, brojni kompleti za in vitro transkripciju su komercijalno dostupni.

Komplet

[0360] Predmetni navodi takođe obezbeđuju komplet koji sadrži RNK replikon prema prvom aspektu navoda ili sistem prema drugom aspektu navoda.

[0361] U jednom primeru izvođenja, sastojci kompleta su prisutni kao odvojeni entiteti. Na primer, jedan molekul nukleinske kiseline kompleta može da bude prisutan u jednom entitetu, a druga nukleinska kiselina kompleta može da bude prisutna u posebnom entitetu. Na primer, otvorena ili zatvorena posuda je pogodan entitet. Poželjna je zatvorena posuda. Upotrebljena posuda bi poželjno trebalo da bude bez RNAze ili suštinski bez RNAze.

[0362] U jednom primeru izvođenja, komplet prema predmetnim navodima sadrži RNK za inokulaciju ćelija i/ili za primenu kod humanog ili životinjskog subjekta.

[0363] Komplet prema predmetnim navodima opciono sadrži etiketu ili drugi oblik informacionog elementa, npr. nosač elektronskih podataka. Etiketa ili informacioni element poželjno sadrži uputstvo, npr. štampano pisano uputstvo ili uputstvo u elektronskom obliku koje opciono može da se odštampa. Uputstvo može da se odnosi na najmanje jednu pogodnu moguću upotrebu kompleta.

Farmaceutska kompozicija

2

[0364] Replikazni konstrukt i/ili replikon koji je ovde opisan može da bude prisutan u obliku farmaceutske kompozicije. Farmaceutska kompozicija prema navodima može da sadrži najmanje jedan molekul nukleinske kiseline prema predmetnim navodima. Farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač i/ili farmaceutski prihvatljiv ekscipijens i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili farmaceutski prihvatljiv vehikulum. Izbor farmaceutski prihvatljivog nosača, vehikuluma, ekscipijensa ili razblaživača nije posebno ograničen. Može da se upotrebi bilo koji pogodan farmaceutski prihvatljiv nosač, vehikulum, ekscipijens ili razblaživač poznat u stanju tehnike.

[0365] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži rastvarač kao što je vodeni rastvarač ili bilo koji rastvarač koji omogućava očuvanje integriteta RNK. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je vodeni rastvor koji sadrži RNK. Vodeni rastvor može opciono da sadrži rastvorene supstance, npr. soli.

[0366] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, farmaceutska kompozicija je u obliku kompozicije osušene zamrzavanjem. Kompozicija osušena zamrzavanjem može da se dobije sušenjem zamrzavanjem odgovarajuće vodene kompozicije.

[0367] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedan katjonski entitet. Uopšteno, katjonski lipidi, katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim naelektrisanjem mogu da formiraju komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Moguće je stabilizovati RNK prema navodima kompleksiranjem sa katjonskim jedinjenjima, poželjno polikatjonskim jedinjenjima kao što je na primer katjonski ili polikatjonski peptid ili protein. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema predmetnim navodima sadrži najmanje jedan katjonski molekul izabran iz grupe koja se sastoji od protamina, polietilen imina, poli-L-lizina, poli-L-arginina, histona ili katjonskog lipida.

[0368] Prema predmetnim navodima, katjonski lipid je katjonski amfifilni molekul, npr. molekul koji sadrži najmanje jedan hidrofilni i lipofilni deo. Katjonski lipid može da bude monokatjonski ili polikatjonski. Katjonski lipidi tipično imaju lipofilni deo, kao što je sterol, acil ili diacil lanac, i imaju ukupno neto pozitivno naelektrisanje. Glavna grupa lipida obično nosi pozitivno naelektrisanje. Katjonski lipid poželjno ima pozitivno naelektrisanje od 1 do 10 valenci, poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 do 3 valence, i još poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 valence. Primeri katjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propane; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propane; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE) i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA). Katjonski lipidi takođe uključuju lipide sa tercijarnom amino grupom, uključujući 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA). Katjonski lipidi su pogodni za formulisanje RNK u lipidnim formulacijama kao što je ovde opisano, kao što su lipozomi, emulzije i lipopleksi. Obično pozitivnim naelektrisanjem doprinosi najmanje jedan katjonski lipid, a negativnim naelektrisanjem doprinosi RNK. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedan pomoćni lipid, pored katjonskog lipida. Pomoćni lipid može da bude neutralni ili anjonski lipid. Pomoćni lipid može da bude prirodni lipid, kao što je fosfolipid, ili analog prirodnog lipida, ili potpuno sintetički lipid, ili molekul sličan lipidu, bez sličnosti sa prirodnim lipidima. U slučaju kada farmaceutska kompozicija uključuje i katjonski lipid i pomoćni lipid, molarni odnos katjonskog lipida prema neutralnom lipidu može da se odredi na odgovarajući način u pogledu stabilnosti formulacije i slično.

[0369] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema predmetnim navodima sadrži protamin. Prema navodima, protamin je koristan kao katjonski nosač. Termin "protamin" se odnosi na bilo koji od različitih izrazito baznih proteina relativno niske molekulske težine koji su bogati argininom i koji su povezani posebno sa DNK umesto somatskih histona u ćelijama sperme životinja kao što su ribe. Konkretno, termin "protamin" se odnosi na proteine koji se nalaze u spermi ribe koji su izrazito bazni, rastvorljivi u vodi, ne koaguliraju pod uticajem toplote i sadrže više monomera arginina. Prema navodima se podrazumeva da termin "protamin", kako se ovde koristi, sadrži bilo koju sekvencu aminokiselina protamina dobijenu ili izvedenu iz prirodnih ili bioloških izvora uključujući njihove fragmente i multimerne oblike navedene aminokiselinske sekvence ili njenog fragmenta. Osim toga, termin obuhvata (sintetizovane) polipeptide koji su veštački i posebno dizajnirani za specifične svrhe i ne mogu se izolovati iz prirodnih ili bioloških izvora.

[0370] U nekim primerima izvođenja, kompozicije navoda mogu da sadrže jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi se mogu dodati vakcinama da bi se stimulisao odgovor imunog sistema; adjuvansi obično sami ne obezbeđuju imunitet. Primeri adjuvanasa uključuju bez ograničenja sledeće: neorganska jedinjenja (npr. stipsa, aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, kalcijum fosfat hidroksid); mineralno ulje (npr. parafinsko ulje), citokini (npr. IL-1, IL-2, IL-12); imunostimulatorni polinukleotid (kao što je RNK ili DNK; npr. oligonukleotidi koji sadrže CpG); saponini (npr. biljni saponini iz kvilaje (Quillaja), soje, Polygala senega); uljane emulzije ili lipozomi; formulacije polioksi etilen etra i polioksi etilen estra; polifosfazen (PCPP); muramil peptidi; jedinjenja imidazohinolona; tiosemikarbazonska jedinjenja; ligand Flt3 (WO

4

2010/066418 A1); ili bilo koji drugi adjuvans koji je poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Poželjni adjuvans za primenu RNK prema predmetnim navodima je ligand Flt3 (WO 2010/066418 A1). Kada se ligand Flt3 primenjuje zajedno sa RNK koja kodira antigen, može da se zapazi snažan porast antigen-specifičnih CD8<+>T ćelija.

[0371] Farmaceutska kompozicija prema navodima može da bude puferisana (npr. acetatnim puferom, citratnim puferom, sukcinatnim puferom, Tris puferom, fosfatnim puferom).

Čestice koje sadrže RNK

[0372] U nekim primerima izvođenja, zbog nestabilnosti nezaštićene RNK, korisno je obezbediti molekule RNK prema predmetnim navodima u kompleksnom ili inkapsuliranom obliku. Odgovarajuće farmaceutske kompozicije su date u ovim navodima. Konkretno, u nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija prema ovim navodima sadrži čestice koje sadrže nukleinsku kiselinu, poželjno čestice koje sadrže RNK. Odgovarajuće farmaceutske kompozicije se nazivaju formulacijama u vidu čestica. U formulacijama u vidu čestica prema predmetnim navodima, čestica sadrži nukleinsku kiselinu prema navodima i farmaceutski prihvatljiv nosač ili farmaceutski prihvatljiv vehikulum koji je pogodan za isporuku nukleinske kiseline. Čestice koje sadrže nukleinsku kiselinu mogu da budu, na primer, u vidu proteinskih čestica ili u vidu čestica koje sadrže lipide. Pogodni proteini ili lipidi se nazivaju agensi za formiranje čestica. Proteinske čestice i čestice koje sadrže lipide su prethodno opisane kao pogodne za isporuku alfavirusne RNK u vidu čestica (npr. Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562). Konkretno, alfavirusni strukturni proteini (obezbeđeni, na primer, putem pomoćnog virusa) su pogodan nosač za isporuku RNK u vidu proteinskih čestica.

[0373] Kada se sistem prema predmetnim navodima formuliše kao formulacija u vidu čestica, moguće je da se svaka vrsta RNK (npr. replikon, replikazni konstrukt i opciono dodatne vrste RNK kao što je RNK koja kodira protein pogodan za inhibiciju IFN) posebno formuliše kao pojedinačna formulacija u vidu čestica. U tom slučaju, svaka pojedinačna formulacija u vidu čestica će sadržati jednu vrstu RNK. Pojedinačne formulacije u vidu čestica mogu da budu prisutne kao zasebni entiteti, npr. u posebnim posudama. Takve formulacije se mogu dobiti obezbeđivanjem svake vrste RNK odvojeno (obično svaka u obliku rastvora koji sadrži RNK) zajedno sa agensom za formiranje čestica, čime se omogućava formiranje čestica. Odgovarajuće čestice će sadržati isključivo specifične vrste RNK koje se obezbeđuju kada se čestice formiraju (pojedinačne formulacije u vidu čestica).

[0374] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži više od jedne pojedinačne formulacije u vidu čestica. Odgovarajuće farmaceutske kompozicije su označene kao mešane formulacije u vidu čestica. Mešane formulacije u vidu čestica prema navodima mogu da se dobiju formiranjem, odvojeno, pojedinačnih formulacija u vidu čestica, kao što je gore opisano, nakon čega sledi korak mešanja pojedinačnih formulacija u vidu čestica. U koraku mešanja, dobija se jedna formulacija koja sadrži mešanu populaciju čestica koje sadrže RNK (za ilustraciju: npr. prva populacija čestica može sadržati replikon prema navodima, a druga formulacija čestica može sadržati replikazni konstrukt prema navodima). Pojedinačne populacije čestica mogu da budu zajedno u jednoj posudi, čineći mešovitu populaciju pojedinačnih formulacija u vidu čestica.

[0375] Alternativno, moguće je da se sve vrste RNK farmaceutske kompozicije (npr. replikon, replikazni konstrukt i opciono dodatne vrste kao što je RNK koja kodira protein pogodan za inhibiciju IFN) formulišu zajedno kao kombinovana formulacija u vidu čestica. Takve formulacije se mogu dobiti obezbeđivanjem kombinovane formulacije (tipično kombinovanog rastvora) svih vrsta RNK zajedno sa agensom za formiranje čestica, čime se omogućava formiranje čestica. Za razliku od mešane formulacije u vidu čestica, kombinovana formulacija u vidu čestica će tipično sadržati čestice koje sadrže više od jedne vrste RNK. U kombinovanoj kompoziciji u vidu čestica različite vrste RNK su obično prisutne zajedno u jednoj čestici.

[0376] U jednom primeru izvođenja, formulacija u vidu čestica prema ovim navodima je formulacija u vidu nanočestica. U tom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnim navodima sadrži nukleinsku kiselinu prema navodima u obliku nanočestica. Formulacije u vidu nanočestica mogu da se dobiju različitim protokolima i različitim kompleksnim jedinjenjima. Lipidi, polimeri, oligomeri ili amfifili su tipični sastojci formulacija u vidu nanočestica.

[0377] Kako se ovde koristi, termin "nanočestica" se odnosi na bilo koju česticu prečnika koji čini česticu pogodnom za sistemsku, posebno parenteralnu primenu, posebno, nukleinskih kiselina, tipično prečnika 1000 nanometara (nm) ili manje. U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju prosečan prečnik u opsegu od oko 50 nm do oko 1000 nm, poželjno od oko 50 nm do oko 400 nm, poželjno oko 100 nm do oko 300 nm kao što je oko 150 nm do oko 200 nm. U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju prečnik u opsegu od oko 200 do oko 700 nm, oko 200 do oko 600 nm, poželjno oko 250 do oko 550 nm, naročito oko 300 do oko 500 nm ili oko 200 do oko 400 nm.

[0378] U jednom primeru izvođenja, indeks polidisperznosti (PI) ovde opisanih nanočestica, meren dinamičkim rasejanjem svetlosti, je 0.5 ili manje, poželjno 0.4 ili manje ili još poželjnije 0.3 ili manje. "Indeks polidisperznosti" (PI) predstavlja meru homogene ili heterogene raspodele veličine pojedinačnih čestica (kao što su lipozomi) u mešavini čestica i ukazuje na širinu raspodele čestica u smeši. PI se može odrediti, na primer, kao što je opisano u WO 2013/143555 A1.

[0379] Kako se ovde koristi, izraz "formulacija u vidu nanočestica" ili slični termini se odnose na bilo koju formulaciju u vidu čestica koja sadrži najmanje jednu nanočesticu. U nekim primerima izvođenja, kompozicija u vidu nanočestica je uniformna kolekcija nanočestica. U nekim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica je farmaceutska formulacija koja sadrži lipide, kao što je formulacija lipozoma ili emulzija.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže lipide

[0380] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnih navoda sadrži najmanje jedan lipid. Poželjno, najmanje jedan lipid je katjonski lipid. Navedena farmaceutska kompozicija koja sadrži lipide sadrži nukleinsku kiselinu prema predmetnim navodima. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži RNK inkapsuliranu u vezikuli, npr. u lipozomu. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži RNK u obliku emulzije. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži RNK u kompleksu sa katjonskim jedinjenjem, čime se formiraju npr. takozvani lipopleksi ili polipleksi. Inkapsulacija RNK unutar vezikula kao što su lipozomi razlikuje se od, na primer, kompleksa lipid/RNK. Kompleksi lipid/RNK mogu da se dobiju npr. kada se RNK npr. pomeša sa prethodno formiranim lipozomima.

[0381] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži RNK inkapsuliranu u vezikuli. Takva formulacija je posebna formulacija u vidu čestica prema navodima. Vezikula je lipidni dvosloj savijen u sferni omotač, koji obuhvata mali prostor i odvaja taj prostor od prostora izvan vezikule. Tipično, prostor unutar vezikule je vodeni prostor, odnosno sadrži vodu. Tipično, prostor izvan vezikule je vodeni prostor, tj. sadrži vodu. Lipidni dvosloj se formira od jednog ili više lipida (lipida koji formiraju vezikule). Membrana koja obuhvata vezikulu je lamelarna faza, slična onoj u plazma membrani. Vezikula prema predmetnim navodima može da bude multilamelarna vezikula, unilamelarna vezikula ili njihova mešavina. Kada se inkapsulira u vezikulu, RNK se obično odvaja od bilo kog spoljašnjeg medijuma. Stoga je prisutna u zaštićenom obliku, funkcionalno ekvivalentna zaštićenom obliku u prirodnom alfavirusu. Pogodne vezikule su čestice, posebno nanočestice, kao što je ovde opisano.

[0382] Na primer, RNK može da bude inkapsulirana u lipozomu. U tom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je, ili sadrži formulaciju lipozoma. Inkapsulacija unutar lipozoma će tipično zaštititi RNK od digestije enzimom RNazom. Moguće je da lipozomi uključuju nešto spoljašnje RNK (npr. na svojoj površini), ali najmanje polovina RNK (i idealno sva) je inkapsulirana unutar jezgra lipozoma.

[0383] Lipozomi su mikroskopske lipidne vezikule koje često imaju jedan ili više dvosloja lipida koji formira vezikule, kao što je fosfolipid, i sposobni su da inkapsuliraju lek, npr. RNK. Različiti tipovi lipozoma mogu da se koriste u kontekstu predmetnih navoda, uključujući, bez ograničenja, multilamelarne vezikule (MLV), male unilamelarne vezikule (SUV), velike unilamelarne vezikule (LUV), sterički stabilizovane lipozome (SSL), multivezikularne vezikule (MV), i velike multivezikularne vezikule (LMV), kao i druge dvoslojne oblike poznate u tehnici. Veličina i lamelarnost lipozoma zavisiće od načina pripreme. Postoji nekoliko drugih oblika supramolekularne organizacije u kojima lipidi mogu da budu prisutni u vodenom medijumu, uključujući lamelarne faze, heksagonalne i inverzne heksagonalne faze, kubične faze, micele, reverzne micele sastavljene od monoslojeva. Ove faze mogu takođe da se dobiju u kombinaciji sa DNK ili RNK, a interakcija sa RNK i DNK može značajno da utiče na fazno stanje. Takve faze mogu da budu prisutne u formulacijama RNK u vidu nanočestica prema predmetnim navodima.

[0384] Lipozomi mogu da se formiraju korišćenjem standardnih postupaka poznatih stručnjaku. Odgovarajući postupci uključuju postupak obrnutog isparavanja, postupak ubrizgavanja etanola, postupak dehidratacije-rehidratacije, sonikaciju ili druge pogodne postupke. Nakon formiranja lipozoma, lipozomi mogu da se dimenzioniraju tako da se dobije populacija lipozoma koji imaju suštinski homogen raspon veličina.

[0385] U poželjnom primeru izvođenja predmetnih navoda, RNK je prisutna u lipozomu koji uključuje najmanje jedan katjonski lipid. Odgovarajući lipozomi mogu da se formiraju iz jednog lipida ili iz mešavine lipida, pod uslovom da se koristi najmanje jedan katjonski lipid. Poželjni katjonski lipidi imaju atom azota koji može da se protonuje; poželjno, takvi katjonski lipidi su lipidi sa tercijarnom amino grupom. Posebno pogodan lipid sa tercijarnom amino grupom je 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA). U jednom primeru izvođenja, RNK prema predmetnim navodima je prisutna u formulaciji lipozoma kao što je opisano u WO 2012/006378 A1: lipozom koji ima dvosloj lipida koji inkapsulira vodeno jezgro koje uključuje RNK, pri čemu lipidni dvosloj sadrži lipid sa pKa u opsegu od 5.0 do 7.6, koji poželjno ima tercijarnu amino grupu. Poželjni katjonski lipidi sa tercijarnom amino grupom uključuju DLinDMA (pKa 5.8) i uopšteno su opisani u WO 2012/031046 A2. Prema WO 2012/031046 A2, lipozomi koji sadrže odgovarajuće jedinjenje su posebno pogodni za inkapsulaciju RNK i time lipozomalnu isporuku RNK. U jednom primeru izvođenja, RNK prema predmetnim navodima je prisutna u formulaciji lipozoma, pri čemu lipozom uključuje najmanje jedan katjonski lipid čija glavna grupa uključuje najmanje jedan atom azota (N) koji može da se protonuje, pri čemu lipozom i RNK imaju odnos N:P između 1:1 i 20:1. Prema predmetnim navodima, "odnos N:P" se odnosi na molarni odnos atoma azota (N) u katjonskom lipidu prema atomima fosfata (P) u RNK sadržanoj u čestici koja sadrži lipide (npr. lipozom), kao što je opisano u WO 2013/006825 A1. Odnos N:P između 1:1 i 20:1 je uključen u neto naelektrisanje lipozoma i efikasnost isporuke RNK u ćeliju kičmenjaka.

[0386] U jednom primeru izvođenja, RNK prema predmetnim navodima je prisutna u formulaciji lipozoma koja sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikolni (PEG) ostatak, pri čemu je RNK inkapsulirana unutar PEGilovanog lipozoma tako da je PEG ostatak prisutan na spoljašnjosti lipozoma, kao što je opisano u WO 2012/031043 A1 i WO 2013/033563 A1.

[0387] U jednom primeru izvođenja, RNK prema predmetnim navodima je prisutna u formulaciji lipozoma, pri čemu lipozom ima prečnik u opsegu od 60-180 nm, kao što je opisano u WO 2012/030901 A1.

[0388] U jednom primeru izvođenja, RNK prema predmetnim navodima je prisutna u formulaciji lipozoma, pri čemu lipozomi koji sadrže RNK imaju neto naelektrisanje blizu nule ili negativno, kao što je opisano u WO 2013/143555 A1.

[0389] U drugim primerima izvođenja, RNK prema predmetnim navodima prisutna je u obliku emulzije. Ranije je opisano da se emulzije koriste za isporuku molekula nukleinske kiseline, kao što su molekuli RNK, u ćelije. Ovde su poželjne emulzije ulje u vodi. Odgovarajuće čestice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid. Poželjnije su katjonske emulzije ulje u vodi u kojima je RNK prema predmetnim navodima kompleksirana sa česticama emulzije. Čestice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid. Katjonski lipid može da interaguje sa negativno naelektrisanom RNK, čime se RNK vezuje za čestice emulzije. U emulziji ulje u vodi, čestice emulzije su dispergovane u vodenoj kontinuiranoj fazi. Na primer, prosečni prečnik čestica emulzije može tipično da bude od oko 80 nm do 180 nm. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema ovim navodima je katjonska emulzija ulje u vodi, pri čemu čestice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid, kao što je opisano u WO 2012/006380 A2. RNK prema predmetnim navodima može da bude prisutna u obliku emulzije koja sadrži katjonski lipid pri čemu je odnos N:P emulzije najmanje 4:1, kao što je opisano u WO 2013/006834 A1. RNK prema predmetnim navodima može da bude prisutna u obliku katjonske lipidne emulzije, kao što je opisano u WO 2013/006837 A1. Konkretno, kompozicija može da sadrži RNK u kompleksu sa česticom katjonske emulzije ulje u vodi, pri čemu je odnos ulje/lipid najmanje oko 8:1 (mol:mol).

[0390] U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži RNK u obliku lipopleksa. Termin "lipopleks" ili "RNK lipopleks" se odnosi na kompleks lipida i nukleinskih kiselina kao što je RNK. Lipopleksi mogu da se formiraju od katjonskih (pozitivno naelektrisanih) lipozoma i anjonske (negativno naelektrisane) nukleinske kiseline. Katjonski lipozomi takođe mogu da uključuju neutralni "pomoćni" lipid. U najjednostavnijem slučaju, lipopleksi se formiraju spontano mešanjem nukleinske kiseline sa lipozomima uz određeni protokol mešanja, međutim, mogu da se primene različiti drugi protokoli. Podrazumeva se da su elektrostatičke interakcije između pozitivno naelektrisanih lipozoma i negativno naelektrisane nukleinske kiseline pokretačka sila za formiranje lipopleksa (WO 2013/143555 A1). U jednom primeru izvođenja prema ovim navodima, neto naelektrisanje čestica RNK lipopleksa je blizu nule ili negativno. Poznato je da je elektro-neutralno ili negativno naelektrisani lipopleksi RNK i lipozoma dovode do značajne ekspresije RNK u dendritskim ćelijama slezine (DC) nakon sistemske primene i da nisu povezani sa povišenom toksičnošću koja je prijavljena za pozitivno naelektrisane lipozome i lipoplekse (uporediti WO 2013/143555 A1). Stoga, u jednom primeru izvođenja prema ovim navodima, farmaceutska kompozicija prema navodima sadrži RNK u formatu nanočestica, poželjno nanočestica lipopleksa, u kojima (i) broj pozitivnih naelektrisanja u nanočesticama ne prelazi broj negativnih naelektrisanja u nanočesticama i/ili (ii) nanočestice imaju neutralno ili neto negativno naelektrisanje i/ili (iii) odnos naelektrisanja pozitivnih i negativnih naelektrisanja u nanočesticama je 1.4:1 ili manji i/ili (iv) zeta potencijal nanočestica je 0 ili manji. Kao što je opisano u WO 2013/143555 A1, zeta potencijal je naučni termin za elektrokinetički potencijal u koloidnim sistemima. U predmetnim navodima, (a) zeta potencijal i (b) odnos naelektrisanja katjonskog lipida prema RNK u nanočesticama mogu da se izračunaju kao što je opisano u WO 2013/143555 A1. Ukratko, farmaceutske kompozicije koje predstavljaju formulacije nanočestica lipopleksa sa definisanom veličinom čestica, pri čemu je neto naelektrisanje čestica blizu nule ili negativno, kao što je opisano u WO 2013/143555 A1, su poželjne farmaceutske kompozicije u kontekstu predmetnih navoda.

Postupci za proizvodnju proteina

[0391] U četvrtom aspektu, ovi navodi obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u ćeliji koji obuhvata korake:

(a) dobijanje RNK replikona prema prvom aspektu navoda, koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, koji može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i koji dalje sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i

(b) inokulacija RNK replikona u ćeliju.

[0392] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK replikon je kao što je gore definisano za RNK replikon prema navodima, sve dok replikon RNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein i otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

[0393] U petom aspektu, ovi navodi obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u ćeliji koji obuhvata korake:

(b) dobijanje RNK replikona u skladu sa prvim aspektom navoda, koji može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina prema (a) in trans i koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i

(c) ko-inokulacija RNK konstrukta za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i RNK replikona u ćeliju.

[0394] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i/ili RNK replikon su kao što je definisano gore za sistem prema navodima, sve dok RNK replikon može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa. RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i RNK replikon mogu da budu inokulisani u istom trenutku ili alternativno mogu da budu inokulisani u različitim vremenskim trenucima. U drugom slučaju, RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina se obično inokuliše u prvom vremenskom trenutku, a replikon se tipično inokuliše u drugom, kasnijem, vremenskom trenutku. U tom slučaju se pretpostavlja da će se replikon odmah replikovati pošto će replikaza već biti sintetizovana u ćeliji. Drugi vremenski trenutak je obično ubrzo nakon prvog vremenskog trenutka, npr.1 minut do 24 časa nakon prvog vremenskog trenutka.

[0395] Ćelija u koju može da se inokuliše jedan ili više molekula nukleinske kiseline može se nazvati "ćelija-domaćin". Prema navodima, termin "ćelija-domaćin" se odnosi na bilo koju ćeliju koja može da se transformiše ili transfektuje molekulom egzogene nukleinske kiseline. Termin "ćelija" je poželjno intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom koja nije oslobodila svoje normalne intracelularne komponente kao što su enzimi, organele ili genetski materijal. Poželjno je da je intaktna ćelija vijabilna ćelija, odnosno živa ćelija sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Termin "ćelija-domaćin" obuhvata, prema navodima, prokariotske (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. ljudske i životinjske ćelije, biljne ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Posebna prednost se daje ćelijama sisara kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, domaćih životinja uključujući konje, krave, ovce i koze, kao i primata. Ćelije mogu da potiču iz raznih tipova tkiva i obuhvataju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju

1

keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije koštane srži i embrionalne matične ćelije. U drugim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Nukleinska kiselina može da bude prisutna u ćeliji-domaćinu u jednoj ili u nekoliko kopija i, u jednom primeru izvođenja, eksprimirana je u ćeliji-domaćinu.

[0396] Ćelija može da bude prokariotska ili eukariotska ćelija. Prokariotske ćelije su ovde pogodne, npr. za propagaciju DNK prema navodima, a eukariotske ćelije su ovde pogodne, npr. za ekspresiju otvorenog okvira čitanja replikona.

[0397] U postupku prema ovim navodima može da se koristi bilo koji sistem prema navodima, ili komplet prema navodima, ili farmaceutska kompozicija prema navodima. RNK može da se upotrebi u obliku farmaceutske kompozicije, ili kao "gola" RNK, npr. za elektroporaciju.

[0398] Prema postupku u skladu sa ovim navodima, moguće je postići efikasnu ekspresiju gena od interesa u ćeliji-domaćinu (videti npr. primere 2 do 5).

[0399] U jednom primeru izvođenja, dodatni molekul RNK, poželjno molekul iRNK, može da bude inokulisan u ćeliju. Opciono, dodatni molekul RNK kodira protein pogodan za inhibiciju IFN, kao što je E3, kao što je ovde opisano. Opciono, dodatni molekul RNK može da bude inokulisan pre inokulacije replikona ili replikaznog konstrukta ili sistema prema navodima.

[0400] U postupku za proizvodnju proteina u ćeliji prema predmetnim navodima, ćelija može da bude antigen-prezentujuća ćelija, a postupak može da se koristi za ekspresiju RNK koja kodira antigen. U tom cilju, navodi mogu da uključuju uvođenje RNK koja kodira antigen u antigenprezentujuće ćelije, kao što su dendritske ćelije. Za transfekciju antigen-prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije, može da se koristi farmaceutska kompozicija koja sadrži RNK koja kodira antigen.

[0401] U jednom primeru izvođenja, postupak za proizvodnju proteina u ćeliji je in vitro postupak. U jednom primeru izvođenja, postupak za proizvodnju proteina u ćeliji ne obuhvata uklanjanje ćelije iz tela čoveka ili životinje operacijom ili terapijom.

[0402] U ovom primeru izvođenja, ćelija inokulisana u skladu sa četvrtim aspektom navoda može da se primeni kod subjekta tako da se protein proizvede u subjektu i subjektu obezbedi protein. Ćelija može da bude autologna, singena, alogena ili heterologna u odnosu na subjekt.

[0403] U drugim primerima izvođenja, ćelija u postupku za proizvodnju proteina u ćeliji može da bude prisutna u telu subjekta, kao što je pacijent. U ovim primerima izvođenja, postupak za proizvodnju proteina u ćeliji je in vivo postupak koji obuhvata davanje molekula RNK subjektu.

[0404] U tom smislu, navodi takođe obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u subjektu koji obuhvata korake:

2

(a) dobijanje RNK replikona u skladu sa prvim aspektom navoda, koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein, koji može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i koji dalje sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i

(b) primenu RNK replikona kod subjekta.

[0405] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK replikon je kao što je gore definisano za RNK replikon navoda, sve dok RNK replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein i otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, i može da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

[0406] Navodi dalje obezbeđuju postupak za proizvodnju proteina od interesa u subjektu koji obuhvata korake:

[0407] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i/ili replikon RNK su kao što je gore definisano za sistem prema navodima, sve dok replikon RNK može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa. RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina i RNK replikon mogu da se primenjuju ili u istom trenutku, ili alternativno mogu da se primene u različitim vremenskim trenucima. U drugom slučaju, RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina se obično primenjuje u prvom vremenskom trenutku, a replikon RNK se obično primenjuje u drugom, kasnijem, vremenskom trenutku. U tom slučaju se očekuje da se replikon odmah replikuje pošto će replikaza već biti sintetizovana u ćeliji. Drugi vremenski trenutak je obično ubrzo nakon prvog vremenskog trenutka, npr. 1 minut do 24 časa nakon prvog vremenskog trenutka. Poželjno je da se primena RNK replikona vrši na istom mestu i istim putem primene kao primena RNK konstrukta za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina, kako bi se povećali izgledi da RNK replikon i RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina dospeju u isto ciljno tkivo ili ćeliju. "Mesto" se odnosi na poziciju u telu subjekta. Pogodna mesta su, na primer, leva ruka, desna ruka itd.

[0408] U jednom primeru izvođenja, dodatni molekul RNK, poželjno molekul iRNK, može da bude primenjen kod subjekta. Opciono, dodatni molekul RNK kodira protein pogodan za inhibiciju IFN, kao što je E3, kao što je ovde opisano. Opciono, dodatni molekul RNK može da se primeni pre primene replikona ili replikaznog konstrukta ili sistema prema navodima.

[0409] Bilo koji od replikona RNK prema navodima, sistema prema navodima, ili kompleta prema navodima, ili farmaceutske kompozicije prema navodima može da se koristi u postupku za proizvodnju proteina u subjektu prema navodima. Na primer, u postupku prema navodima RNK može da se koristi u obliku farmaceutske kompozicije, npr. kao što je ovde opisano, ili kao "gola" RNK.

[0410] S obzirom na mogućnost da se primeni kod subjekta, svaki od RNK replikona prema navodima, sistema prema navodima, ili kompleta prema navodima, ili farmaceutske kompozicije prema navodima, može da se nazove "lekom" ili slično. Ovi navodi predviđaju da su RNK replikon, sistem, komplet, farmaceutska kompozicija prema ovim navodima obezbeđeni za upotrebu kao lek. Lek se može koristiti za lečenje subjekta. Pod "lečenjem" se podrazumeva davanje jedinjenja ili kompozicije ili drugog entiteta kao što je ovde opisano subjektu. Pojam obuhvata postupke za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.

[0411] Gore opisani lek obično ne sadrži DNK, i stoga je povezan sa dodatnim svojstvima bezopasnosti u poređenju sa DNK vakcinama opisanim u prethodnom stanju tehnike (npr. WO 2008/119827 A1).

[0412] Alternativna medicinska upotreba prema predmetnim navodima obuhvata postupak za proizvodnju proteina u ćeliji prema četvrtom aspektu ovih navoda, pri čemu ćelija može da bude antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritska ćelija, praćen uvođenjem navedene ćelije u telo subjekta. Na primer, RNK koja kodira farmaceutski aktivan protein, kao što je antigen, može da bude uvedena (transfektovana) u antigen-prezentujuće ćelije ex vivo, npr. antigen-prezentujuće ćelije uzete od subjekta, i antigen-prezentujuće ćelije, opciono klonalno razmnožene ex vivo, mogu da budu ponovo uvedene u telo istog ili drugog subjekta. Transfektovane ćelije mogu ponovo da se uvedu u telo subjekta upotrebom bilo kog načina poznatog u tehnici.

[0413] Lek prema predmetnim navodima može da se primeni kod subjekta kome je to potrebno. Lek prema predmetnim navodima može da se koristi u profilaktičkim, kao i u terapijskim postupcima lečenja subjekta.

[0414] Lek prema navodima se primenjuje u efektivnoj količini. "Efektivna količina" se odnosi na količinu koja je dovoljna, sama ili zajedno sa drugim dozama, da izazove reakciju ili željeno

4

dejstvo. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja kod subjekta, željeno dejstvo je inhibicija progresije bolesti. Ovo uključuje usporavanje progresije bolesti, posebno prekid progresije bolesti. Željeno dejstvo u lečenju bolesti ili stanja takođe može da bude odlaganje izbijanja bolesti ili inhibicija izbijanja bolesti.

[0415] Efektivna količina će zavisiti od stanja koje se leči, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, vrstu prateće terapije (ako postoji), specifičan način primene, i drugih faktora.

Vakcinacija

[0416] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" se generalno odnosi na postupak lečenja subjekta iz terapeutskih ili profilaktičkih razloga. Lečenje, posebno profilaktičko lečenje je, ili obuhvata, poželjno, lečenje koje ima za cilj da izazove ili poboljša imuni odgovor subjekta, npr. protiv jednog ili više antigena. Ako se, prema predmetnim navodima, želi indukovati ili pojačati imuni odgovor korišćenjem RNK kao što je ovde opisano, imuni odgovor može da bude pokrenut ili pojačan pomoću RNK. U jednom primeru izvođenja, navodi obezbeđuju profilaktičko lečenje koje je, ili obuhvata, poželjno, vakcinaciju subjekta. Primer izvođenja predmetnih navoda u kome replikon kodira, kao protein od interesa, farmaceutski aktivan peptid ili protein koji je imunološki aktivno jedinjenje ili antigen je posebno koristan za vakcinaciju.

[0417] RNK je ranije opisana za vakcinaciju protiv stranih agenasa uključujući patogene ili kancer (nedavno revidirano od strane Ulmer et al., 2012, Vaccine, vol.30, pp. 4414-4418). Za razliku od uobičajenih pristupa u prethodnom stanju tehnike, replikon prema predmetnim navodima je posebno pogodan element za efikasnu vakcinaciju zbog sposobnosti da se replikuje pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina kao što je ovde opisano. Vakcinacija prema predmetnim navodima može da se koristi, na primer, za indukciju imunog odgovora na slabo imunogene proteine. U slučaju RNK vakcina prema navodima, proteinski antigen nikada nije izložen serumskim antitelima, već ga proizvode same transfektovane ćelije nakon translacije RNK. Stoga anafilaksa ne bi trebalo da bude problem. Navodi stoga omogućavaju ponovljenu imunizaciju pacijenta bez rizika od alergijskih reakcija.

[0418] U postupcima koji uključuju vakcinaciju prema predmetnim navodima, lek prema predmetnim navodima se primenjuje kod subjekta, posebno ako je poželjno lečenje subjekta koji ima bolest koja uključuje antigen, ili postoji rizik da se razboli od bolesti koja uključuje antigen.

[0419] U postupcima koji uključuju vakcinaciju prema predmetnim navodima, protein od interesa koji je kodiran replikonom prema predmetnim navodima kodira, na primer, bakterijski antigen, protiv koga treba da se usmeri imuni odgovor, ili virusni antigen, protiv koga imuni odgovor treba da se usmeri, ili antigen kancera, protiv koga treba da se usmeri imuni odgovor, ili antigen jednoćelijskog organizma, protiv koga treba da se usmeri imuni odgovor. Efikasnost vakcinacije može da se proceni poznatim standardnim postupcima kao što je merenje antigen-specifičnih IgG antitela u organizmu. U postupcima koji uključuju imunoterapiju specifičnu za alergen prema predmetnim navodima, protein od interesa koji je kodiran replikonom prema predmetnim navodima kodira antigen relevantan za alergiju. Imunoterapija specifična za alergen (takođe poznata kao hiposenzibilizacija) se definiše kao davanje poželjno rastućih doza vakcine protiv alergena organizmu sa jednom ili više alergija, kako bi se postiglo stanje u kojem su simptomi povezani sa naknadnim izlaganjem uzročnog alergena ublaženi. Efikasnost imunoterapije specifične za alergen može se proceniti poznatim standardnim postupcima, kao što je merenje antitela IgG i IgE specifičnih za alergen u organizmu.

[0420] Lek prema ovim navodima može da se primeni kod subjekta, npr. za lečenje subjekta, uključujući vakcinaciju subjekta.

[0421] Termin "subjekat" se odnosi na kičmenjake, posebno na sisare. Na primer, sisari u kontekstu ovih navoda su ljudi, nehumani primati, pripitomljeni sisari kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci itd., kao i životinje u zatočeništvu kao što su životinje zooloških vrtova. Termin "subjekt" se takođe odnosi na kičmenjake koji nisu sisari kao što su ptice (posebno pripitomljene ptice kao što su kokoške, patke, guske, ćurke) i na ribe (posebno uzgajane ribe, npr. losos ili som). Termin "životinja" kako se ovde koristi takođe uključuje ljude.

[0422] Primena kod domaćih životinja kao što su psi, mačke, zečevi, zamorci, hrčci, ovce, goveda, koze, svinje, konji, kokoške, patke, guske, ćurke ili divlje životinje, npr. lisice, poželjno je u nekim primerima izvođenja. Na primer, profilaktička vakcinacija prema predmetnim navodima može da bude pogodna za vakcinaciju životinjske populacije, npr. u poljoprivrednoj industriji ili populaciji divljih životinja. Druge životinjske populacije u zatočeništvu, kao što su kućni ljubimci ili životinje iz zooloških vrtova, mogu da budu vakcinisane.

[0423] Kada se primenjuje kod subjekta, replikon i/ili replikazni konstrukt koji se koristi kao lek poželjno ne sadrži sekvence onog tipa alfavirusa koji je infektivan za vrstu ili rod kojem lečeni subjekt pripada. Poželjno, u tom slučaju, replikon i/ili replikazni konstrukt ne sadrže nikakvu nukleotidnu sekvencu iz alfavirusa koji može da inficira odgovarajuću vrstu ili rod. Ovaj primer izvođenja ima prednost u tome što nikakva rekombinacija sa infektivnim (npr. potpuno funkcionalnim ili virusom divljeg tipa) alfavirusom nije moguća, čak i ako je subjekt kome se daje RNK (npr. slučajno) pogođen infektivnim alfavirusom. Kao ilustrativan primer, za lečenje svinja, upotrebljeni replikon i/ili replikazni konstrukt ne sadrže nikakvu nukleotidnu sekvencu iz alfavirusa koji može da inficira svinje.

Način primene

[0424] Lek prema predmetnim navodima može da se primeni kod subjekta na bilo koji pogodan način.

[0425] Na primer, lek može da se primeni sistemski, na primer intravenozno (i.v.), subkutano (s.c.), intradermalno (i.d.) ili inhalacijom.

[0426] U jednom primeru izvođenja, lek prema predmetnim navodima se primenjuje u mišićno tkivo, kao što je skeletni mišić, ili kožu, npr. subkutano. Uopšteno se smatra da transfer RNK u kožu ili mišiće dovodi do visoke i produžene lokalne ekspresije, uporedo sa snažnom indukcijom humoralnih i ćelijskih imunih odgovora (Johansson et al. 2012, PLoS. One., 7, e29732; Geall et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. US A, vol. 109, pp.14604-14609).

[0427] Alternative davanju u mišićno tkivo ili kožu uključuju, ali nisu ograničene na: intradermalnu, intranazalnu, intraokularnu, intraperitonealnu, intravenoznu, intersticijalnu, bukalnu, transdermalnu ili sublingvalnu primenu. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjna načina.

[0428] Primena može da se ostvari na različite načine. U jednom primeru izvođenja, lek prema predmetnim navodima se daje injekcijom. U poželjnom primeru izvođenja, injekcija se daje putem igle. Injekcija bez igle može da se koristi kao alternativa.

[0429] Predmetni navodi su detaljno opisani i ilustrovani slikama i primerima, koji su upotrebljeni samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni da budu ograničavajući. Zahvaljujući opisu i primerima, stručnjaku su dostupni dodatni primeri izvođenja koji su takođe obuhvaćeni navodima.

Primeri

Materijal i metode:

[0430] Sledeći materijali i metode su korišćeni u primerima koji su opisani u nastavku.

Kloniranje plazmida, in vitro transkripcija, prečišćavanje RNK:

[0431] Plazmidi su klonirani korišćenjem standardne tehnologije. Detalji o kloniranju pojedinačnih plazmida koji se koriste u primerima prema ovim navodima su opisani u primeru 1. Transkripcija in vitro, korišćenjem plazmida opisanih u primeru 1 i T7 RNK-polimeraze, i prečišćavanje RNK su obavljeni kao što je prethodno opisano (Holtkamp et. al., 2006, Blood, vol.

108, pp.4009-4017; Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol.17, pp.961-971).

[0432] Kvalitet prečišćene RNK je procenjen spektrofotometrijom i analizom uređajem 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, SAD). Sva RNK transfektovana u ćelije u primerima je bila in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK).

Transfekcija RNK:

[0433] Za elektroporaciju, RNK je elektroporisana u ćelije sisara na sobnoj temperaturi korišćenjem uređaja za elektroporaciju kvadratnog talasa (BTX ECM 830, Harvard Apparatus, Holliston, MA, SAD) korišćenjem sledećih podešavanja: za BHK21 ćelije: 750 V/cm, 1 puls od 16 ms; za humane fibroblaste prepucijuma: 500V/cm, 1 puls od 24 ms. Smeše različitih vrsta RNK su pripremljene u epruvetama bez RNAze i držane na ledu do transfekcije. Za elektroporaciju, RNK ili mešavine RNK su resuspendovane u konačnoj zapremini od 62.5 µl/mm veličine otvora kivete.

[0434] Za lipofekciju, ćelije su zasejane u gustini od oko 20.000 ćelija/cm<2>površine za rast i transfektovane sa ukupnom količinom od 260 ng/cm<2>RNK i 1 µl/cm<2>MessengerMax reagensa prema uputstvima proizvođača (Life Technologies, Darmstadt, Nemačka).

Ćelijska kultura:

[0435] Sve medijume za rast, fetalni teleći serum (FCS), antibiotike i druge suplemente isporučio je Life Technologies/Gibco, osim kada je drugačije navedeno. Humani fibroblasti prepucijuma dobijeni od System Bioscience (HFF, neonatalni) ili ATCC (CCD-1079Sk) su kultivisani u minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) koji sadrži 15% FCS, 1% neesencijalnih amino kiselina, 1 mM natrijum piruvata na 37°C. Ćelije su uzgajane na 37°C u vlažnoj atmosferi uravnoteženoj na 5% CO2. BHK21 ćelije iz ćelijske linije "BHK21 [C13] (ATCC<®>CCL10™)", dostupne u Američkoj kolekciji tipova kultura, Manassas, Virdžinija, SAD, uzgajane su u Eagleovom minimalnom esencijalnom medijumu sa dodatkom 10% FCS.

Protočna citometrija:

[0436] Ekspresija RNK koja kodira GFP je merena protočnom citometrijom korišćenjem protočnog citometra FACS Canto II (BD Bioscience, Heidelberg, Nemačka), a dobijeni podaci su analizirani odgovarajućim Diva softverom ili softverom FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR, SAD).

Testovi sa luciferazom:

[0437] Da bi se procenila ekspresija luciferaze svica, transfektovane ćelije su zasejane u crne mikroploče sa 96 bunarčića, i supernatanti Nanoluc transfektovanih ćelija su prebačeni u crne mikroploče sa 96 bunarčića (Nunc, Langenselbold, Nemačka). Ekspresija luciferaze svica je merena korišćenjem sistema Bright-Glo Luciferase Assay System, ekspresija Nanoluc je merena korišćenjem sistema Nano-Glo Luciferase (oba Promega, Madison, WI, SAD) prema uputstvima proizvođača. Bioluminiscencija je merena korišćenjem čitača luminiscencije mikroploče Infinite M200 (Tecan Group, Mannedorf, Švajcarska). Podaci su predstavljeni u relativnim svetlosnim jedinicama [RLU], ćelije negativne na luciferazu su korišćene za oduzimanje pozadinskog signala.

Primer 1: Kloniranje plazmida

[0438] A. Plazmidi koji kodiraju replikon zasnovan na virusu Semliki šume (SFV) su dobijeni korišćenjem tehnika bešavnog kloniranja zasnovanih na PCR metodi. Bešavno kloniranje označava tehnike kloniranja zasnovane na rekombinaciji fragmenta generisanog PCR metodom u linearizovane vektore korišćenjem nizova homolognih sekvenci. Time je sekvenca DNK koja kodira replikon koji odgovara genomu SFV, osim odsustva otvorenog okvira čitanja koji kodira virusne strukturne gene, prebačena sa pSFV-gen-GFP (Ehrengruber & Lundstrom, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. US A, vol.96, pp.7041-7046; Lundstrom, 2001, Histochem. Cell Biol., tom 115, pp. 83-91) u pST1 plazmidni osnovni lanac (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017) neposredno nishodno od promotora RNK-polimeraze T7 faga. Plazmidom kodirana poli(A) kaseta od 120 adenilatnih ostataka (Holtkamp et al., iznad) - ili modifikovana poli(A) kaseta koja se sastoji od 30 i 70 adenilatnih ostataka, razdvojenih nasumičnom sekvencom od 10 nukleotida (WO 2016/005004 A1), dodata je odmah nishodno od poslednjeg nukleotida SFV 3'-UTR. Restrikciono mesto SapI je postavljeno odmah nishodno od poli(A) kasete ili modifikovane poli(A) kasete. Osim toga, kodirajuća sekvenca koja kodira myc-oznaku je umetnuta u XhoI mesto koje se nalazi u kodirajućem regionu za varijabilni region SFV nsP3. Insercije u varijabilni region nsP3 ne utiču na aktivnost poliproteina replikaze (Spuul et al., 2010, J. Virol, vol. 85, pp. 7543-7557). Dobijeni plazmid sadrži DNK sekvencu koja kodira 5' sekvencu prepoznavanja replikacije SFV pod kontrolom promotora za polimerazu T7. DNK sekvenca koja kodira 5' sekvencu prepoznavanja replikacije SFV je predstavljena kao SEQ ID NO: 4:

[0439] U gornjem prikazu SEQ ID NO: 4, prvi podvučeni ATG služi kao inicijacioni kodon za sintezu N-terminalnog fragmenta nsP1; baze prevedene u protein su predstavljene podebljanim slovima. Sledeći ATG unutar nsP1 regiona kodiranja su takođe podvučeni. Tokom in vitro transkripcije plazmida koji sadrži 5' sekvencu prepoznavanja replikacije SFV (predstavljenu kao SEQ ID NO: 4) pomoću T7 polimeraze, dobija se transkript koji sadrži sekvencu RNK koja odgovara SEQ ID NO: 3: 5' terminalni G odgovara prvom nukleotidu koji je transkribovan polimerazom T7. Ovaj G prethodi alfavirusnoj sekvenci i potreban je za efikasnu transkripciju polimerazom T7.

[0440] U gornjem prikazu SEQ ID NO: 3, pet specifičnih baznih tripleta ATG je podvučeno. Jedinstveno restriktivno mesto EcoRV u kodirajućem regionu za SFV replikazu (GATATC) je istaknuto podebljanim slovima.

[0441] Kao rezultat, dobijen je plazmid A. Plazmid A sadrži otvoreni okvir čitanja za funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

[0442] B. Plazmid koji kodira trans-replikon sa nemodifikovanom 5' sekvencom prepoznavanja replikacije dobijen je uklanjanjem sekvence koja kodira nestrukturni protein od EcoRV do SalI u plazmidu A (videti gore). Time je uklonjen veći deo otvorenog okvira čitanja koji kodira nsP1234, tj. sekvence koja se proteže od jedinstvenog restriktivnog mesta EcoRV do jedinstvenog restriktivnog mesta SalI. Za ilustraciju: GATATC (šest nukleotida SEQ ID NO: 3 najbližih 3', podebljano u gornjem prikazu) odgovara jedinstvenom restriktivnom mestu EcoRV kodirajuće sekvence SFV replikaze. Nakon uklanjanja većeg dela otvorenog okvira čitanja koji kodira nsP1234, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije i subgenomski promotor su i dalje prisutni. Zbog uklanjanja većeg dela otvorenog okvira čitanja koji kodira nsP1234, RNK koju kodira odgovarajući plazmid, kada je prisutna u ćeliji domaćinu, nije sposobna da pokrene replikaciju in cis, već za replikaciju zahteva prisustvo funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

[0443] Otvoreni okvir čitanja koji kodira luciferazu svica (transgen) je umetnut nishodno od subgenomskog promotora (SGP). Time je dobijen plazmid B. RNK replikon kodiran odgovarajućim plazmidom je ilustrovan kao " RNK matrica WT-RRS" na sl.1.

[0444] Upotrebom veb servera za predviđanje sekundarne strukture RNK (http://rna.urmc.rochester. edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html) potvrđeno je

1

predviđanje da se nemodifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije (RNK) savija u četiri strukture drška-petlja, koje se ne razlikuju od parentalne RNK i u skladu sa literaturom (Frolov, 2001, RNA, vol.7, pp.1638-1651).

[0445] C-1. Polazeći od plazmida B, plazmid koji kodira trans-replikon sa modifikacijom 5' sekvence prepoznavanja replikacije (koja obuhvata uklanjanje baznog tripleta ATG koji kodira prvi aminokiselinski ostatak nsP1, kao i uklanjanje četiri dodatna bazna tripleta ATG unutar 5' sekvence prepoznavanja replikacije) generisana je promenama jednog nukleotida, tj. supstitucijom jedne baze odgovarajućeg baznog tripleta ATG (tj. supstitucijom ili A ili T ili G) drugom bazom. Drugim rečima, oni bazni tripleti ATG u SEQ ID NO: 3 koji su podvučeni iznad su uklonjeni, svaki promenom jednog nukleotida (supstitucijom), respektivno.

[0446] Savijanje RNK trans-replikona kodiranog plazmidom je predviđeno korišćenjem veb servera za predviđanje sekundarne strukture RNK (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html) i Mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).

[0447] Predviđeno savijanje modifikovane 5' sekvence prepoznavanja replikacije koju karakteriše uklanjanje ATG upoređeno je sa predviđenim savijanjem odgovarajuće nemodifikovane 5' sekvence prepoznavanja replikacije. U slučaju kada je predviđanje otkrilo da se sekundarna struktura modifikovane 5' sekvence prepoznavanja replikacije razlikuje od sekundarne strukture nemodifikovane 5' sekvence prepoznavanja replikacije, uvedena je jedna ili više dodatnih izmena (supstitucija) nukleotida primenom pristupa pokušaja i greške, sve dok predviđeno savijanje RNK 5' sekvence prepoznavanja replikacije bez ATG (Δ5ATG-RRS) nije bilo identično savijanju RNK nemodifikovane 5' sekvence prepoznavanja replikacije kodirane plazmidom B. Kao rezultat toga, dobijena je sekvenca DNK prema SEQ ID NO: 5:

[0448] Plazmid koji kodira modifikovanu 5' sekvencu prepoznavanja replikacije koju karakteriše predviđeno identično savijanje, tj. plazmid koji sadrži SEQ ID NO: 5, ovde je označen kao C-1.

[0449] RNK replikon kodiran odgovarajućim plazmidom je ilustrovan na sl. 1, označen kao "Δ5ATG-RRS".

[0450] Razume se da će uklanjanje pet specifičnih ATG, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 5, sprečiti sintezu nsP1 ili njegovog fragmenta. Zahvaljujući uklanjanju prirodnog inicijacionog

1 1

kodona za nsP1, podrazumeva se da se sinteza proteina pokreće na prvom inicijacionom kodonu nishodno od subgenomskog promotora (SGP), što rezultuje transkripcijom otvorenog okvira čitanja koji kodira luciferazu svica (transgen).

[0451] C-2. Polazeći od C-1, SGP je uklonjen digestijom sa EcoRV i SmaI i ponovnom ligacijom. Odgovarajući RNK replikon je šematski prikazan na sl.1, označen kao "Δ5ATG-RRSΔSGP". Ako odgovarajući RNK replikon sadrži 5' kapu, transgen koji kodira luciferazu može da se stavi pod direktnu translacionu kontrolu 5'-kape.

[0452] C-3. Polazeći od C-1, otvoreni okvir čitanja koji kodira SFV replikazu je ubačen korišćenjem restrikcionih mesta EcoRV i SalI. Time je dobijen plazmid koji kodira RNK sposobnu za samoreplikaciju, pri čemu se ORF replikaze ne preklapa ni sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije niti sa subgenomskim promotorom. Odgovarajući RNK replikon je šematski prikazan na sl.1, označen kao "cisReplikon Δ5ATG-RRS".

[0453] D. Da bi se omogućila translacija sekvence nukleinske kiseline koja kodira replikazu sa nereplikativne iRNK, otvoreni okvir čitanja koji kodira SFV replikazu je kloniran u plazmid koji sadrži 5'-UTR humanog alfa-globina, sintetički 3'-UTR i plazmidom-kodirani poli(A) rep od 30 plus 70 adenilatnih ostataka, razdvojenih stabilizujućim linkerom od 10 nukleotida (10 nt) (WO 2016/005324 A1). Otvoreni okvir čitanja koji kodira SFV replikazu je kloniran nishodno od 5'-UTR humanog alfa-globina. Plazmid je sadržao T7 promotor za transkripciju otvorenog okvira čitanja koji kodira SFV replikazu.

[0454] E. Da bi se omogućila translacija sekvence nukleinske kiseline koja kodira inhibitor E3 protein kinaze R virusa vakcinije sa nereplicirajuće iRNK, otvoreni okvir čitanja koji kodira inhibitor E3 protein kinaze R virusa vakcinije ("E3") je kloniran u plazmid koji sadrži 5'-UTR humanog alfa-globina, sintetički 3'-UTR i plazmidom-kodiran poli(A) rep od 30 plus 70 adenilatnih ostataka, razdvojenih stabilizujućim linkerom od 10 nukleotida (10 nt) (WO 2016 /005324 A1). Otvoreni okvir čitanja koji kodira E3 je kloniran nishodno od 5'-UTR humanog alfaglobina. Plazmid je sadržao T7 promotor za transkripciju otvorenog okvira čitanja koji kodira E3.

Primer 2: Uklanjanje start kodona unutar 5' sekvence prepoznavanja replikacije ne utiče na replikaciju RNK trans-replikona.

[0455] BHK21 ćelije su ko-elektroporisane sa (i) 5 µg iRNK koja kodira SFV replikazu (kodiranu plazmidom D iz primera 1) i (ii) različitim količinama RNK trans-replikona (kodiranih plazmidima B ili C-1 iz primera 1; na sl.2: "matrica"). Trans-replikon kodira luciferazu svica; trans-replikon ili sadrži 5' sekvencu prepoznavanja replikacije divljeg tipa (sl. 2: "WT-RRS"; kodiranu plazmidom B); ili 5' sekvencu prepoznavanja replikacije koju karakteriše uklanjanje svih

1 2

inicijacionih kodona (sl.2: "Δ5ATG-RRS"; kodiranu plazmidom C-1). RNK trans-replikona nije imala kapu (bez kape). 5000 elektroporisanih BHK21 ćelija je zasejano u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića kako bi se izmerila ekspresija luciferaze 24 časa nakon elektroporacije. Rezultati su prikazani na sl.2B.

Primer 3: Uklanjanje start kodona unutar 5' sekvence prepoznavanja replikacije omogućava translaciju transgena pod kontrolom kape

[0456] Upotrebljen je trans-replikon koji se karakteriše uklanjanjem svih inicijacionih kodona, i koji sadrži subgenomski promotor (sl.3: "Δ5ATG-RRS"; kodiran plazmidom C-1 iz primera 1), trans-replikon koji se karakteriše uklanjanjem svih inicijacionih kodona, ali koji ne sadrži subgenomski promotor (sl.3: "Δ5ATG-RRSΔSGP"; kodiran plazmidom C-2 iz primera 1) i transreplikon koji ima sve inicijacione kodone i koji sadrži subgenomski promotor (sl.3 "RNK matrica WT-RRS"). Humani fibroblasti prepucijuma su ko-elektroporisani sa (i) 0.45 µg odgovarajuće RNK trans-replikona, kao što je prikazano na sl.3, i ili sa (ii-a) 2.5 µg iRNK koja kodira protein E3 virusa vakcinije (kodiran plazmidom E iz primera 1, na sl.3: "E3"), ili sa (ii-b) 2.5 µg iRNK koja kodira replikazu (kodiranu plazmidom D iz primera 1, na sl.3: "replikaza") plus 2.5 µg iRNK koja kodira protein E3 virusa vakcinije (kodiran plazmidom E iz primera 1). iRNK koja kodira protein E3 virusa vakcinije je dodata da bi se inhibirala aktivacija protein kinaze R i time podstakla ekspresija luciferaze i replikaze. RNK trans-replikona ili nije imala kapu (sl.3: "bez kape") ili je ko-transkripciono dodat analog kape betaS-ARCA(D2) (sl. 3: "D2-kapa"). Ekspresija luciferaze je procenjena nakon 24 časa. Rezultati su prikazani na sl.3 (desni panel).

[0457] Ovaj primer pokazuje da uklanjanje inicijacionih kodona iz 5' sekvence prepoznavanja replikacije omogućava da se transgen efikasno translatira direktno sa RNK trans-replikona sa kapom.

Primer 4: U ranim fazama nakon transfekcije, translacija zavisna od kape sa trans-replikona koji karakteriše uklanjanje start kodona unutar 5' sekvence prepoznavanja replikacije je jača nego sa subgenomske RNK.

[0458] Upotrebljen je trans-replikon okarakterisan uklanjanjem svih inicijacionih kodona, i koji sadrži subgenomski promotor (sl.4: "Δ5ATG-RRS"; kodiran plazmidom C-1 iz primera 1) i transreplikon koji se karakteriše uklanjanjem svih inicijacionih kodona, ali koji ne sadrži subgenomski promotor (na sl.4: "Δ5ATG-RRSΔSGP"; kodiran plazmidom C-2 iz primera 1). BHK21 ćelije su ko-elektroporisane sa (i) 0.45 µg odgovarajuće RNK trans-replikona i sa (ii) 2.5 µg iRNK koja kodira replikazu (kodiranu plazmidom D iz primera 1). RNK trans-replikona ili nije imala kapu

1

(sl. 4: "bez kape") ili je ko-transkripciono dodat analog kape beta-S-ARCA(D2) (sl.4: "D2-kapa"). Ekspresija luciferaze je procenjena tokom vremena. Rezultati su prikazani na sl. 4 (desni panel).

Primer 5: Translacija zavisna od kape sa trans-replikona koji karakteriše uklanjanje start kodona unutar 5' sekvence prepoznavanja replikacije omogućava ekspresiju transgena u ranim fazama, bez zavisnosti od prethodne ekspresije replikaze.

[0459] Korišćen je trans-replikon koji se odlikuje uklanjanjem svih inicijacionih kodona, ali koji ne sadrži subgenomski promotor (sl. 5: "Δ5ATG-RRSΔSGP"; kodiran plazmidom C-2 iz primera 1). RNK trans-replikona je bila ili bez kape (sl. 5: „bez kape“) ili joj je ko-transkripciono dodat analog kape beta-S-ARCA(D2) (sl.5: „D2-kapa“). BHK21 ćelije su elektroporisane sa (i) 0.45 µg odgovarajuće RNK trans-replikona, i, gde je naznačeno („replikaza“ na sl. 5), dodatno sa (ii) 2.5 µg iRNK koja kodira replikazu (kodiranu plazmidom D iz primera 1). Ekspresija luciferaze je ocenjivana tokom vremena. Rezultati su prikazani na sl.5 (desni panel).

[0460] Primer 6: Rekonstruisani cis-replikoni sa sekvencom prepoznavanja replikacije sa deletiranim ATG su funkcionalni. ORF SFV replikaze je ubačen u "Δ5ATG-RRS" (sl. 7A: "Δ5ATG-RRS"; kodiran plazmidom C-1 iz primera 1), što je za rezultat imalo dobijanje plazmida C-3 iz primera 1 "cisReplikonΔ5ATG-RRS" i kodiranje luciferaze svica nishodno od subgenomskog promotora (SGP). Unutar insertovane replikaze, regioni koji odgovaraju CSE2 i jezgru SGP su poremećeni nukleotidnim izmenama (isprekidani okviri) da bi se izbeglo dupliranje ovih regulatornih regiona. Ovo je rezultovalo rekonstruisanim cis-replikonom. BHK21 ćelije su ko-elektroporisane ili sa 2.5 µg "cis-replikon WT-RRS" ili "cis-replikon Δ5ATG-RRS". Ekspresija luciferaze je izmerena 24 časa nakon elektroporacije i pokazala je da je ovaj rekonstruisani cisReplikon funkcionalan (sl.7B).

[0461] Primer 7: Bicistronski trans-replikoni eksprimiraju oba transgena. Nano-luciferaza koja se izlučuje (SNL) je klonirana nishodno od subgenomskog promotora (SGP) trans-replikona WT-RSS (plazmid B iz primera 1). Položaj ushodno od SGP ne kodira transgen pošto nije dostupan za translaciju (sl.8A). U drugom konstruktu, SNL je klonirana nishodno od ΔATG-RSS (plazmid C-1 iz primera 1), a luciferaza svica (Luc) je ubačena nishodno od SGP. BHK21 ćelije su ko-elektroporisane sa 0.9 µg trans-replikativne RNK i 5 µg iRNK koja kodira replikazu SFV.

48 h nakon elektroporacije izmerena je ekspresija SNL i Luc (sl. 8B). Ovaj eksperiment pruža dokaze da se transgeni eksprimiraju sa obe pozicije unutar "Δ5ATG-RRS - bicistronskih" transreplikona.

[0462] Primer 8: Trans-replikoni virusa Sindbis kojima nedostaju start kodoni u sekvenci prepoznavanja replikacije se efikasno replikuju. Trans-replikoni su konstruisani iz genoma

1 4

virusa Sindbis sintezom gena slično konstruktima opisanim u primeru 1 za SFV. Pored transreplikona sa nemodifikovanom sekvencom prepoznavanja replikacije (WT-RSS) generisane su dve varijante. Prva (ΔATG-RRS) sadrži delecije originalnog start kodona plus 4 dodatna ATG i odgovarajuće kompenzatorne izmene nukleotida za očuvanje sekundarne strukture RNK. U sledećem koraku, region koji odgovara subgenomskom promotoru je dodatno deletiran da bi se dobio ΔATG-RRSΔSGP. GFP je ubačen u RNK trans-replikona neposredno nishodno od 5'RRS sa deletiranim ATG u vektorima Δ5ATG-RRSΔSGP, ili nishodno od subgenomskog promotora (SGP) u vektorima Δ5ATG-RRS i WT-RRS (sl.9A). BHK21 ćelije su ko-elektroporisane sa 0,1 µg trans-replikativne RNK i 2.4 µg iRNK koja kodira SFV replikazu i 24 h kasnije je ocenjena ekspresija GFP (stopa transfekcije [%] i srednji intenzitet fluorescencije (MFI) (sl. 9B)). Ovaj eksperiment pokazuje da se isti princip modifikacije sekvence koji je primenjen na konstruisane replikone SFV može primeniti na konstruisane replikone virusa Sindbis.

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži RNK replikon i opciono farmaceutski prihvatljiv razblaživač, i/ili farmaceutski prihvatljiv ekscipijens i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili farmaceutski prihvatljiv vehikulum, gde navedeni replikon sadrži modifikovanu 5' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa, pri čemu je modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije naznačena time, što su svi inicijacioni kodoni uklonjeni iz konzervisanog elementa sekvence 2 (CSE 2) nativne 5' sekvence prepoznavanja replikacije alfavirusa i gde modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije sadrži jednu ili više dodatnih nukleotidnih izmena koje kompenzuju poremećaje sparivanja nukleotida unutar jedne ili više struktura drška-petlja (SL) koji su uvedeni uklanjanjem inicijacionih kodona,

pri čemu se navedeni CSE 2 proteže od SL2 do SL4 i sadrži nativni inicijacioni kodon koji kodira prve aminokiselinske ostatke alfavirusnog nestrukturnog proteina nsP1, i gde se modifikovana 5' sekvenca prepoznavanja replikacije karakteriše predviđenom sekundarnom strukturom koja je ekvivalentna predviđenoj sekundarnoj strukturi 5' sekvence prepoznavanja replikacije alfavirusne genomske RNK.

2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, gde RNK replikon sadrži 3' sekvencu prepoznavanja replikacije.

3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde RNK replikon sadrži prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, pri čemu poželjno protein od interesa može da bude eksprimiran sa RNK replikona kao matrice.

4. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 3, gde RNK replikon sadrži subgenomski promotor koji kontroliše proizvodnju subgenomske RNK koja sadrži prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, pri čemu poželjno protein od interesa kodiran prvim otvorenim okvirom čitanja može da bude eksprimiran sa RNK replikona i subgenomske RNK.

5. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 3, gde RNK replikon sadrži subgenomski promotor koji kontroliše proizvodnju subgenomske RNK koja sadrži drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa, koji su poželjno smešteni nishodno od prvog otvorenog okvira čitanja koji kodira protein od interesa.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 5, gde je protein od interesa kodiran prvim i/ili drugim otvorenim okvirom čitanja funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

7. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 6, gde replikon može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina.

8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira funkcionalni alfavirusni nestrukturni protein.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i 8, koja dodatno sadrži RNK konstrukt za ekspresiju funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina,

gde RNK replikon može da bude replikovan pomoću funkcionalnog alfavirusnog nestrukturnog proteina in trans.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, gde je alfavirus virus Semliki šume.

11. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, koja sadrži formulaciju u vidu čestica RNK replikona, pri čemu je čestica ili proteinska čestica ili čestica koja sadrži lipide.

12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, gde čestica koja sadrži lipide sadrži najmanje jedan katjonski lipid i gde je navedeni katjonski lipid poželjno 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propani; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propani; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE) i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA), gde katjonski lipidi poželjno takođe uključuju lipide sa tercijarnom amino grupom, uključujući 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA).

13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, gde je čestica koja sadrži lipide kompleks lipid/RNK, lipozom, lipopleks ili polipleks i gde je lipopleks poželjno formiran od katjonskih lipozoma i opciono sadrži neutralni pomoćni lipid.

14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 za upotrebu u terapiji, pri čemu terapija obuhvata primenu farmaceutske kompozicije kod subjekta.

15. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde je primena intravenska (i.v.), subkutana (s.c.), intradermalna (i.d.), inhalaciona, intranazalna, intraokularna, intraperitonealna, intersticijalna, bukalna, transdermalna, ili sublingvalna primena.

1