RS63104A - Postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida - Google Patents

Abstract

Opisan je enzimatski postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida. Postupak koji je zasnovan na sposobnosti defibrotid da pojača enzimsku aktivnost plazmina, obuhvata faze: (a) dovođenja u kontakt defibrotida, plazmina i supstrata specifičnog za plazmin, dajući proizvod koji se može izmeriti i (b) merenje količine proizvoda dobijenog sukcesivnim ponavljanjem.

Description

Postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida

Pronalazak se odnosi na postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida i, detaljnije, odnosi se na indirektni enzimatski postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida.

Oblast tehnike

Defibrotid (Merck Index, 1996, no. 2915) je supstanca prirodnog porekla dobijena esktrakcijom životinjskih organa i koja je sastavljena od natrijumove soli polidezoksiribonukelotida male molekulske težine.

Defibrotid je predmet brojnih farmakoliških istraživanja koja ukazuju na to da se može koristiti u terapiji kao antitrombinski agens. (US 3,829,567).

Dodatno, defibrotid je takođe uspešno korišćen za lečenje periferalnih arteriopatija, akutne renalne insufijenicije (US 4,694,134) ili akutne ishemije miokarda (US 4,693,995).

Kao i druge biološke supstance koje su dobijene ekstrakcijom, defibrotid je takođe predmet ograničene raznovrsnosti preparata koji su tipični prirodni biopolimeri. Dobro poznat klasičan primer ovoga je heparin, čija različitost od jedne do druge serije u pogledu dužine lanca, molekulske težine, sastava, stepena sulfatacije itd.. Posledica ovoga je to da iste količine, kao težina defibrotida, mogu biti u ne-ekvivalentne sa tačke gledišta specifične biološke aktivnosti.

Postupak ekstrakcije, izolovanja i prečišćavanja nemože per seosigurati apsolutnu reproduktivnost proizvoda, zbog svoje prave biopolimerne prirode. Međutim, ako je dobro kontrolisana, moguće je smanjiti varijabilnost: u tu svrhu, ispitivani su standardni industrijski procesi za izolovanje defibrotida, ekstrakcijom iz organa, kao što je na primer opisano u

Patentnu Sjedinjenih Američkih Država US 4,985,552.

Proizvod dobijen u skladu sa gore navedenim postupkom je okarakterisan određivanjem nekih specifičnih fizičko-hemijskih parametara, kao na primer, elektroforetska pokretljivost, eksitncioni koeficijent, moć optičke rotacije i reverzibilna hiperhromnost. Međutim, ovi parametri u sonovi zavise od strukture defibrotida i ne mogu davat informacije o biološkoj aktivnosti.

Koliko je nama poznato, jedini postupci koji su do sada objavljeni za evaluaciju biološke aktinosti defibrotida je test vlakana fibrina i tromboelastografijsko snimanje vremena lize euglobulina [Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A.,Indagini

preliminari suU' attivita fibrinolitica, nell' animale e nell' uomo, di unci nuova sostanzapreselite

in diversi organi cinimali,Simposio Internazionale: La ricerca Scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Rome, 2-4 October 1975-11 Farmaco, Ed.Prat) (1969), 24, 552-561].

Međutim, gore pomenuti postupci su okarakterisani značajnom eksperimentalnom kompleksnosti, nezadovoljavajućom reproduktivnošću i preciznošću i u posebnom slučaju tromboelastografskog snimanja, linearnost reakcije koja se svodi na veoma ograničeni opseg koncentracija.

Prema tome, do sada su poznati postupci za određivanje biološke aktnosti defibrotida koji nisu potpuno validni, tačni i reproduktivni.

Mi smo otkrili jednostavne i pouzdane postupke za određivanje biološke aktivnosti defibrotida, koji omogućavaju kontrolu uzoraka dobijenih ekstrakcijom, te tako omogućavaju standardizaciju medicinskih preprata zasnovanih na defibrotidu.

Postupci na koje se ovaj pronalazak odnosi omogućava određivanje specifične biološke aktivnosti defibrotida u poređenju sa referentnim standardom, sa visokim stepenom preciznosti, brzinom i reproduktivnosli.

Opis pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za određivanje specifične biološke aktivnosti uzoraka defibrotida, pri čemu postupak obuhvata sledeće faze: (a) mešanje defibrotida, plazmina i plazmin specifičnih supstrata koji u reakciji sa

plazminom daju proizvod koji se može meriti i

(b) merenje količine dobijenog proizvoda

Postupak pronalaska je indirektanin vivopostupak za određivanje aktivnosti defibrotida, koji se bazira na funkcionalnoj interakciji između defibrotida i plazmina.

U literaturi je poznato daje plazmin, proteolitički emzim u kaskadnoj koagulaciji/fibrinolizi koji može da čepa fibrin, fibrinogen i druge plazma proteine.

Enzimska aktivnost plazmina se obično određuje različitim standardnimin vitrotestovima. Jedan od postupaka koji se najčešće koristi je spektrofotometrijsko ili fluorometrijsko određivanje hromogenskih ili fluorogenskih jedinjenja koja su oslobođena daestvom plazmina na odgovarajuće supstrate [Haemostasis, (1978), 7, 138-145]. Generalno se koriste peptidni supstrati formule A|-A2-A3-X , gdc su Aii A2, amino kiseline koje su pretežno ne-polarne, A3 je lizin ili arginin i X predstavlja oslobođeno jedinjenje koje se može izemeriti, na primer, />ara-nitroanilin (pNa) ili 2-naftilamin (NA) [Haemostasis, (1978), 7, 146-149]. Kao dodatak prethodno pomenutim peptidnim supstratima, uspeh je postignut korišćenjem drugih, jednostavnijih jedinjenja, kao na primer, /?-nirobenzil-/?-teluensulfonil-L-arginina [Haemostasis, (1978), 7, 105-108].

U ovim testovima, brzina kojom je jedinjenje X oslobođeno u medijum za inkubaciju, zasniva se na testu evaluacije plazmina kao što je ranije opisano, defibrotid povećava brzinu oslobađanja jedinjenja X, proporcionalno njegovoj koncentraciji.

Pastupak na koji se odnosi ovaj pronalazak, obezbeđuje pre svega stupanje u kontakt uzorka defibrotida, plazmina i supstrata plazmina, jedan sa drugim.

Uzorak defibrotida koji se koristi za određivanje u skladu sa pronalskom, generalno se dobija, ekstrakcijom iz organa prema poznatim postupcima, kao što je opisano u Patentnu Sjedinjenih Američkih Država 4,958,552, koji je već ranije pomenut.

Serija normalno industrijski proizvedenih defibrotida je izabrana kao referentni uzorak (standard) i korišćen je za dobijanje kalibracione krive u skladu sa postupkom ovog pronalaska.

Generalno, ovim postupkom dobijaju se tačna i precizna merenja defibrotida čak i u prisustvu nečistoća, kao na primer, RNK, heparin, degradirani defibrotid (defibrotid sa kojeg su uklonjeni purin i pirimidin) ili etanol, pod uslovom da su u koncentracijama, generalno manjim od 10 težinskih %, tako da ne oštećuju sistem.

Kao dodatak omogućvanju određivanja defibrotida, postupak takođe omogućava određivanje drugih biološki ekvivalentnih supstanci izvedenih iz defuibrotida, ako na primer, deaminisani defibrotid ili jednostavnije, defibrotid denaturisan zagrevanjem.

Ovaj pronalazak se dovoljno senzitivan da odredi koncentracije defibrotida koje su manje ili jednake 0.1 ug/ml (krajnja koncentracija u sistemu) i generalno pokazuje dobru korelaciju sa maksimalnim vrednostima za koncentracije veće ili jednake 100u.g/ml.

Korišćeni plazmin je generalno svaki plazmin sisara, kao na primer, bovicin, porcin ili humani plazmin, sa preferencom ka humanom plazminu.

Međutim, i pored toga sto je plazmin odabran enzim, primena drugih ekvivalnentih enzimskih sistema, kao na primer, prekursora plazmina, recimo plazminogen, ili plazmin-analogni enzimi koji su hemijski srodni i imaju slučnu funkcionalnost, takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom.

U postupku ovog pronalaska, supstrat za plazmin se može razumeti kao bilo koji supstrat specifičan za plazmin, koji pod uslovima ovog pronalaska, oslobađa hidrolizovani proizvod X, koji se može detektovati.

U zavisnosti od prirode grupe X koja se detektuje, mogu se primeniti alternativni sistemi detetkcije poznati prosečnom stručnjaku. Spektrofotometrijski ili fluorometrijski sistemi detekcije su posebno preferentni, posebno spektrofotometrijski sistem.

Supstrati koji se najčešće primenjuju su oni koji su plazmin-specifični. Preferentno je koristiti peptide formule Ai-A2-A3-X u kojima su Aii At, amino kiseline, koje su pretežno ne-polarne, A3 je lizin ili arginin i X je grupa koja se detektuje. Primeri ovih supstrata su Val-Leu-Lys-pNa, Val-Phe-Lys-pNa ili piroGlu-Phe-Lys-pNa gde je grupa X koja se može detektovati spektrofotometrijski,/?ara-nitroanilin (pNA). Ostali supsttrati, na primer Val-Gly-Arg-2NA, sadrži 2-naftilamin. koji se fluorometrijski može meriti. Posebno preferentan supstrat je jedinjenje H-D-Valyl-L-Leucil-L-Lysin-p-nitroanilin (H-D-Val-Leu-Lys-pNA).

Plazmini i specifični supstrati koji se koriste za određivanje defibrotida su obično komercijalno dostupni.

Postupak određivanje ovog pronalaska se odvija stavljanjem reagensa i uzorka defibrotida u vodeni rastvor, pri specifičnom pH i molaritetu.

Posebno, koncentracija plazmina može da varira obično od 0.0016 do 0.201.UVrnl, poželjno od 0.0064 do 0.050 I.U./ml, a bolje oko 0.0125I.U./ml.

Međutim, što se tiče supstrata za plazmin, koncentracije od 0.3 do 4 mM, poželjno od 2.5 do 3.5mM, a još bolje od 3mM se generalno koriste u slučaju hromogenog supstrata, dok se koncentracija u slučaju fluorogenog supstrata kreće od 0.05 do 0.15mM.

Postupak određivanja ovog pronalaska, kao i drugi enzimatski postupci su osetljivi na promene pH medij uma.

Dakle, generalno se ne mogu primeniti ekstremne pH vrednosti pošto bi enzimski sistem bio nedelotvoran..

Poželjno je da se pH medijuma ne podvrgne izmenama u bilo kom trenutku kada se vrši merenje, pa je rastvor obično puferovan sistemom pufera odabranim od onih koji se obično koriste u testovima određivanja plazmina. Odgovarajući puferski sistem može biti, na primer, fosfatni pufer, citratni pufer ili tri(hidroksimetil)aminometan hidrohlorini (TRIS) pufer. Proces se odvija u prisustvu TRIS. U ovom postupku, preferentno je održavati pH medijuma u opsegu od oko 7 do 8, a bolje oko 7.4

Dalje, preferentno je održavanje koncentracije puferskog sistema u opsegu od 10 do 200mM, poželjno oko 50mM.

Postupak pronalaska za određivanje defibrotida omogućava da se pomešaju plazmin, supstrat za plazmin i defibrotid. Posebno, da bi se tačno odredila merenja ovim postupkom, preferentno je da se doda plazmin ili spefivični supstrat, ili oba za puferovanje rastvora koji sadrži uzorak defibrotida pre početka merenja. Poželjno je da se plazmin doda poslednji.

Važni parametar u ovom pronalasku određivanja je temperatura. Preferentno je da se ista temperatura održava tokom trajanja celog merenja i za sve određene uzorke, i to u pogledu pripremanja standardne krive i u toku faze merenja. U tom pogledu, preferentno je koristiti aparat sa kontolom temperature i takođe, po potrebi, moguće je nastaviti sa merenjima, menjajući položaj uzorka kako bi se utvrdilo daje sistem maksimalno termalno homogen.

Generalno, postupak određivanja se primenjuje u temperaturskom opsegu od, na primer 25°C do 40°C, a bolje na 37°C.

U skladu sa ovim pronalaskom, merenja koncentracije jedinjenja X oslobođenog u medijumu, dajstvom plazmina, počinje kada se dodaju svi elementi i nastavlja se određeno vreme (čije je trajanje prethodno određeno) i i na prethodno ustanovljenoj frekvenci kao funkcija hemijske prirode X i sistema detekcije.

Slično drugim postupcima za biološko određivanje, postupak pronalaska takođ daje fazu kalibracije i fazu merenja koji se odvijaju paralelno, da bi se smanjila, koliko je to moguće, eksperimentalna varijabilnost.

Faza kalibracije obuhvata prikupljanje podataka o apsorbanci koji se odnose na uzorke pri poznatim povećanjima koncentracija defibotida (standard), statističke obrade ovih podataka i ekstrapolacije kalibracione krive, koja daje korelaciju između povećanja brzine enzimske reakcije ovog pronalaska i koncentracije defibrotida prisutnog u medijumu. U fazi merenja, zahvaljujući korelaciji dobijenoj u fazi kalibracije, moguće je odrediti nepoznate biološke aktivnosti uzorka defiboritda na osnovu vrednosti za apsorbancu i postupke pod istim uslovima.

Detaljnije, eksperimentali protokol, generalno nudi pripremu nekoliko uzoraka, i standarda i nepoznatog, pri različitim koncentracijama defibrotida. Uzorci defibrotida su pripremljeni progresivnim rastvaranjem osnovnog rastvora u skladu sa prethodno određenim faktorom razblaženja.

U ovom postupku, preferentno je pripremiti bar 4 koncentracije standarda i 5 koncentracija uzorka koji se testira, i to u 5 replika ili bolje 10 replika, za svaku koncentraciju standarda i slično, za svaku koncetraciju tesiranog uzorka, obično za sukcesivna 1:2 razblaženja osnovnog rastvora.

I standard i testiran uzorak koncetracija defibrotida se kreće od 0.1 do lOOpg/ml, poželjno od 0.3 do 50 ug/ml, a najbolje od 0.5 do 8 ug/ml.

Preferentno je da su koncentracije testiranog uzorka i koncentracije standarda, istog reda veličine.

U skladu sa prethodno datim ilustracijama, poželjno je da su merenja za svaku koncentraciju su izvedena na 2 mikrotitar ploče, gde je položaj uzorka, standarda i uzorka koji se testira, pri odgovarajućim koncentracijama, obrnuta na svakoj ploči. U skladu sa ovom shemom za postavljanje uzoraka, koja je detaljnije opisana u eksperimetnalnom delu, za svaku koncentraciju i standarda i testiranog uzoraka defibrotida, izmerene su najmanje 5, a poželjno je 10 vrednosti za apsorbancu.

Set merenja koji je ranije opisan, izvršenje u prethodno određenim intervalima, i to prvo u vreme to, koje je vreme kada su dodate sve komponente, pre nego što je enzimska reakcija počela, a zatim u tačno određenim intervalima i za vreme koje je dovoljno da se prikupli neophodni podaci.

Poželjno, merenja apsorbance su nastavljena maksimalno do 90 minuta, sa očitavanjima svakih 1-10 minuta. Dalje, očitavanja su izvršena u momentu toi dalje svakih 5 minuta u ukupnom trajanju od 20 do 50 minuta. Apsorbanca je očitavana pri talalsnoj dužini koja zavisi od prirode grupe X koja se detektuje, koja je oslobođena u toku enzimske hiodrolitičke reakcije. U specifičnom slučaju, kada jeX, p- NA,apsrobanca je merena na 405 nm.

Očitane vrednosti apsorbance za standard i nepoznate uzorke defibrotida, poznati kao neobrađeni podaci, obično sc dobijaju na istom aparatu; vrednosti su su date tablično, tako da je vrednosti za aposrbancu izražena za svako vreme i uzorak.

Dobijeni podaci se zatim obrađuju (procesiraju), na primer na Spread Sheet-Microsoft Excel®. Prva faza obrade podataka izračunava apsorbancu i odgovarajuće standardne devijacije, za svako vreme i svaki očitani set, svaki set sadži barem 5, a poželjno 10 replika za svaku koncentraciju i standarda i test uzorka defibrotida.

Naredna statistička obrada podataka se izvodi pomoću programa tipa Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago USA) koji uzima matematičke odnose koji se javljaju između vrednosti za apsorbancu uzoraka i vremena, za svaki set koncetracija defibrotida, za dobijanje pravih linija sa nagibom koji je proporcionalan koncetraciji defibrotida.

Tačnije, u intervalima u kojima postoji odgovarajuća linearnost, poželjno od 20 do 50 minuta, i za svaki od 5, a bolje, 10 replika iste koncetracije, program izračunava liniju regresije koja je okarakterisana koeficijentom linerne regresije "b", koeficijentom determinacije "r<2>" i presekom "a".

Prava linija dobijena u skladu sa ovim pronalaskom generalno pokazuje dobru korelaciju izraženu visokim vrednostima r<2>, generalno ne manju od 0.97, poželjno r<2>>0.99.

Podaci dobijeni programom mogu se reprodukovati kao tabularni digitalni podaci ili se mogu grafički predstaviti, za svaki set koncentracija.

Kao što je dato na Slici 1, zamenom vremena na osi i apsorbanci na ordinati, dobiće se prave linije sa nagibom "b" koji je proporcionalan brzini enzimske reakcije: povećanjem

koncentracije defibroitda, brzine hidrolize , porašće proporcionalno, vrednost "b". Na kraju, vrednosti za nagib, izračunate kao što je ranije dato za svaki set replika standarda defibrotida i test-uzorka defibrotida, u korelaciji su sa decimalnim logartmom koncentracija defibrotida na koji se odnose.

Grafički, korelacija raste sigmoidalno za standard i sigmidalno za test-uzorak (Slika 2); centralni deo sigmoide ima dve prave linije koje su obično paralelne i rastojanje između njih, koje je funkcija razlike u biološkoj aktivnosti između testiranog uzorka i standarda.

U ovom intervalu linearnosti, stepen nepoznatog uzorka defibrotida u poređenju sa standardom jc određena u skladu sa metodologijom biološkog određivanja pralelnim linijama, koju je opisao Finnev DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2nf ed. Ch. Griffin, London.

Ova terminologija se može primeniti kada je, kao u ovom pronalasku, biološka reakcija linearna funkcija logaritma koncetracija supstance koja se određuje i kada postoji paralelnost i lenarnost između pravih linija standarda i nepoznate koncentracije.

Preferentno, statistička obrada podata, izračunavanja stepena odnosa i određivanje nepoznate aktivnosti defibrotida su iz izvedene primenom softvera koji se zasniva na prethodno pomenutoj metodologiji.

Međutim, obrađivanje statističkih podataka, koji u opšto hemijskoj analizi i u ovom postupku, omogućava to da su greške eksperimetnalne promenljive svedene na minimum, ne vezuje se za postupak ovog pronalaska i jednostavno predstavlja postupak evaluiranja rezultata koji je dobro poznat prosečnom stručnjaku i često se koristi u tehnici.

Ovaj pronalazak se odnosi na komplete za određivanje biološke aktivnosti defibrotida u skladu sa postupcima pronalaska, koji se sastoji barem od: (a) merenja količine supstrata za plazmin kao što je ranije definisano i (b) merenja količine plazmina.

Preferentni kompleti sadrže od 20 do 30mg plazmin specifičnog supstrata po jedinici plazmina, a još bolje 25mg supstrata po jedinici plazmina.

U skladu sa ovim pronalaskom, posebno se ističe komplet koji sadrži H-D-Val-Leu-Lys-pNA, kao supstrat specifičan za plazmin i humani plazmin.

Komplet u skladu sa ovim pronalaskom može takođe da sadrži puferovani vodeni rastvor, poželjno rastvor puferovan sa TRISHC1 50mM, na Ph 7.4.

Po potrebi, kompleti ovog pronalaska takođe obuhvataju merenu količinu defibrotida (standard) kako bi se sprovela kontrolna merenja.

U preferentnom pristupu, standardni rastvori i rastvori uzorka defibrotida su određeni i uvedeni u odgovarajuća udubljenja (ćelije) mikrotitar ploče. Rastvor plazmina je dobij en u trenutku primene i distribuiran u ćelije mikrotitar ploče, koji sadrže defibrotide i na kraju je dodat rastvor koji sadrži susptrat za plazmin. Mikrotitar ploča je postavljena u termostatiran očitavač i posle brzog mešanja, očitane su apsorbance sistema u prethodno defmisanim intervalima u periodu koji je ranije definisan. Neobrađeni podaci su zatim procesirani i tako je određena nepoznata aktivnost uzoraka defibrotida.

Ovi i drugi asekti pronalaska će biti bolje objašnjeni u sledećim Primerima koji ni na koji način ne ograničavaju pronalazak.

PRIMERI

U ovde datim Primerima korišćeno je sledeće:

Aparati

-Detektor za 96-to ćelijsku mikrotitar ploču MRX TC1I (Dynex Technologies, Chanitilly, VA, USA), termo stati ranu i opremljenu sa programom enzimske kinetike. -96-ćelijska mikrotitar ploča sa ravnom osnovom (Greiner L., Kremunster, Austria, cat.655101) -Pipete sa kontinualnim podešavanjem zapremine Pipetman P200 (30-200ul) i 8x200 (20x200ul) i 200pl patrone, potvrđenog kvaliteta (Gilson, Milan, Italy)

-pH metar PHM85 radiometar (Analitica De Mori, Milan, Italy)

Programi

-Microsoft Exel® (Microsoft Soiporation, Redmond, WA, USA)

-Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago, USA)

Supstance

-Defibrotid (Gentnium)

-Human plasmin, 1-unit, P-4895 (Sigma Aldrich, Milan, Italy)

-hromogeni supstrat S-2251, 820332-39 (Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., Milan, Italy) -Tris(hidroksinetil)aminometan (TRIS), 255285-9 (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)

-IN HC1 (Merck)

-lNNaOH 1091411000 (Merck)

Rastvori

TRIS- HCL<p>ufer

2.42g TRIS-a je rastvoreno u destilovanoj vodi i razblaženo do zapremine od lOOml. Dodato je 16ml IN HC1 i zatim destilovana voda do zapremine od 400ml. pH ovog rastvora iznosi 7.40. Ukoliko su vrednosti različite, pH je korigovano dodatkom IN HC1 ili lNNaOH , do željene vrednosti.

Rastvor plazmina

Jedna jedinica (1 I.U.) humanog plazmina je rastvoreno u 4ml TRIS-HC1 pufera na 0°C. Radeći uvek na ledu, rastvor je podeljen u alikvote od 200ul, koji su čuvani na-20°C u plstičnim epruvetama od lOml.

Rastvor homogene supstance S- 2251

25mg S-2251 je rastvoreno u 15.15ml destilovane vode i čuvan na +4/+8°C.

Standardni rastvor defibrotida

Pripremanje standardnog rastvora

• (Finalna) koncentracija od 0.1 do 100 ug/ml

60mg defibrotida je rastvoreno u 3ml TRIS-HC1 puferu i razblaženo 1:15 rastvorom TRIS-HC1 pufera. Ovako dobijen rastvor , koncentracije od 1.333 mg/ml je zatim dalje podvrgnut seriji razblaženja 1:2, pri čemu se dobijaju rastvori koncentracija od 666ug/ml, 333g/ml i 166ug/ml.Ovaj poselnji rastvor , koji je korišćen kao osnocni rastvor, je dalje razblažen tako da se dobiju rastvori koncentracija 83.33ug/ml, 41.67u.g/ml, 33.33g/ml, 25u.g/ml, 16.66ug/ml, 8.33ug/ml, 8.33ug/ml, 5 ug/ml, 2.5u.g/ml, 1.66ug/ml, 0.83ug/ml, 05u.g/ml i na kraju 0.16ug/ml.

• (Finalna) koncentracija od 0.5 do 8 |ig/ml

60mg defibrotida je rastvoreno u 3ml TRIS-HC1 puferu i razblaženo 1:1500 rastvorom TR1S-HC1 pufera. Ovako dobijen rastvor , koncentracije od 13.33 mg/ml je zatim dalje podvrgnut seriji razblaženja 1:2, pri čemu se dobijaju rastvori koncentracija od 6.66ug/ml, 3.33g/ml i 1.66u.g/ml i 0.8pg/ml.

Postupak

Pipetirano je 150ul od svakog prethodno opisanog, standardnog rastvora defibrotida u ćelije mikrotitar ploče.

Rastvor plazmina je zatim brzo pripremljen dodatkom3.8ml TRIS-HC1 pufera u epruvetu sa 0.2ml rastvora plazmina na 0°C. Prilikom blagog mućkanja dolazi do rastvaranja i 50ul je pipetirano u ćelije mikrotitar ploče, pa je u svaku ćeliju dodato 5p.l S-2551.

Mikroploča, postavljena u MRx TCII očitavač podešena na 37°C, mućkana je oko 10 sekundi; apsorbanca je očitana na 405nm, polazeći od vremena toi to svaka 2 minuta u intervalima od 10 do 20 minuta u skladu sa enzimatskim kinetičkim programom.

Eksperimentalni podaci mereni za koncentracije defibrotida od 0.1 do lOOug/ml su zatim obrađeni (Excel and Sigma Plot programs) i predstavljeni grafički (linije regresije) kao što je prikazano na Slikama 1 i 2.

Vrednosti za koeficijente nagiba b (nagib) pravih linija koje odgovaraju standardu i test-uzorku defibrotida (Slika 1) su prikazane u odnosu na koncentracije defibrotida (logaritamska skala) (Slika 2).

Kao što se može videti sa grafika, linearnost koja omogućava identifikaciju prave linije je dobijena u centralnom delu krive. U tom intervalu linearnosti, određena je jačina nepoznatog uzorka defibrotida u poređenju sa standardom, u skladu sa metodologijom bioloških određivanja koje su ranije pomenute i opisane od strane Finnev DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2ng ed., Ch. Griffin, London. Da bi mogla da se primeni ova metodologija, važno je da se javlja dodatna linearnost, paralelnost između pravih linija koje se odnose na standard kao i na testirani defibrotid.

Test za određivanje biološke aktinosti nepoznatoh uzorka defibrotida, u poređenju sa standardnim defibrotidom, izvedena je primenom koncentracija koje podužu pravolinijski deo sigmoide. Posebno su preferentne koncentracije standarda i nepoznatog defibrotida u opsegu od 0.5 do 8ug/ml.

Raspored u ćelijama mikrotitar ploče, replika različitih koncetracija defibrotida za standard i za ispitivani uzorak je dat u daljem tekstu.

Standardni rastvor defibrotida je dat u kolonama 2-6 dok su uzorci defibrotida koji se određuju dati u kolonama 7-11, u prikazanim koncentracijama. Na drugoj mikrotitar ploči, poželjno je da položaj uzoraka obrnut. Spoljašnje kolone i redovi u mikrotittar ploči nisu korišćene za proces određivanja, ali su napunjenei vodom kako bi se maksimalno osigurala temperaturna homogenost u ćelom sistemu.

Mikrotitar ploča je postavljena u MRX TCII podešen na 37°C, mućkana oko 10 sekundi; izmerena je apsorbanca na 405nm, počevši od vremena toi svakih 5 minuta u periodu od 20 do 50-og minuta, u skladu sa enzimatskim kinetičkim programom.

Vrednosti izmerenih apsorbanci su zatim obrađeni (procesirani) (Excel i Sigma programima), dati tabelarno i prikazani slikom (linija regresije).

Tada je moguće izračunati odnos i odrediti aktivnost neopznatog uzorka defibrotida u poređenju sa standardom, korišćenjem istog sistema izračunavanja kao što je prethodno opisano.

U daljem tekstu dati su primeri uTablicama (1, 2 i 3) i grafika (Slike 3, 4 i 5) koji se odnose na uzorke defibrotida, testirane pri koncentraciji od 0.5pg/ml, 2.0ug/ml i 8.0ug/ml.

Claims (16)

1. Postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida, naznačen time, što se sastoji od faza: (a) dovođenja u kontakt defibrotida, plazmina i susptarta specifičnog za plazmin, koji prilikom reakcije sa enzimom daje proizvod koji se može izmeriti. (b) merenja količine proizvoda dobijenog sukcesivnim ponavljanjem.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je plazmin, plazmin sisara, preferentno humani plazmin.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je plazmin specifični supstrat, jedinjenje formule: gde su A1 i A2ne-polarne amino kiseline, A3 je lizin ili arginin i X je proizvod koji se može izmeriti.

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što je proizvod X koji se može izmeriti, odabran od /jara-nitroanilina i 2-naftilamina.

5. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što je supstrat za plazmin, H-D-Valyl-L-Leucyl-L-Lysin-/?-nitroanilin.

6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je koncentracija plazmina od oko 0.0064 do 0.050 I.U./ml i koncentarcija supstrata za plazmin od oko 2.5 do 3.5 mM.

7. Postupak prema zahtevu 6, naznačen time, što je koncentracija plazmina 0.0125 I.U./ml i koncentracija supstrata za plazmin je 3mM.

8. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je proizvod X koji se može izmeriti, meren spektrosfotometrijski.

9. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, sto je reakciona sredin, vodeni rastvor puferovan na pH od oko 7 do 8, poželjno do pH 7.4.

10. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je temperatura sistema održavana na od 35 do 39°C, preferentno na 37°C.

11. Postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotidaprema zahtevu 1, naznačen time, što se sastoji od faza: (a) određivanja brzine oslobađanja proizvoda X koji se može izmeriti u toku trajanja enzimske reakcije, za svaki uzorak defibrotida i standarda i uzorka za testiranje, (b) uspostavljanja međusodbnih odnosa, matematički i/ili grafički, prethodno pomenutih brzina oslobađanja i odgovarajućih koncentracija defibrotida, (c) dobij anje vrednosti za biološke aktivnosti testiranih uzoraka defibrotida.

12. Komplet za određivanje biološke aktinosti defibrotida prema prethodnim zahtevima, naznačen time, što se sastoji od najmanje: (a) odmerene količine supstrata za plazmin i (b) odmerene količine plazmina.

13. Komplet prema zahtevu 12, naznačen time, što je supstrat za plazmin, H-D-Val-Leu-Lys-p-NA i plazmin je humani plazmin.

14. Komplet prema zahtevu 12, naznačen time, što sadrži 20 do 30 mg plazmin specifičnog supstrata po jedinici plazmina, preferentno 25mg specifičnog supstrata po jedinici plazmina.

15. Komplet prema zahtevu 12, naznačen time, što sadrži 25mg plazmin specifičnog supstrata po jedinici plazmina.

16. Defibrotid naznačen time, što kada je predmet u postupcima 1 do 12, pri koncentraciji od 0.5, 2.0 i 8.0 ug/ml ima kinetiku oslobađanja paar-nitroanilina kao što je prikazano na slici 3,4r 5, pri čemu su kinetike oslobađanja određene pod sledećim eksperimentalnim uslovima: koncentracija humanog plazmina: 0.0125 I.U./ml; supstrat: H-D-Valil-L-leucil-L-Lizin-/>-nitroanilin; koncentracija supstrata: 3mM; pufer: tris(hidroksimetil)amino metan hidrohlorid, pH 7.4; reakciona temperatura: 37°C; spektrofotoetrijska talasna dužina: 405nm, podiže kinetičko otpuštanje/?aar-nitroanilina (pNA) prema reakciji gdeje: a = 0.6908±0.0291 b =0.31490±0.0437 X = koncentracija defibrotida (u.g/ml). Priložen je set novih zahteva koji treba da zamene one u podnetoj međunarodnoj prijavi; sledi objašnjene uvedenih izmenai Zahtevi 1- 10: neizmenjeni Zahtev 11 (nov): na osnovu str. 16, red 16-17 Zahtev 12 (prenumerisan, originalan zahtev 11) Zahtev 13: zasnovan na originalnom zahtevu 12 pri čemu je dodat podatak o količini susptrata od 20 do 30mg iz originalnog zahteva 14 Zahtev 15: odgovara originalnom zahtevu 14 pri čemu je izostavljena kolilina susptrata od 20 do 30mg. Zahtev 16 (nov zahtev) je zasnovan na: Slikama 3-5 i komentarima Eksperimentalni deo, detaljnije humani plazmin (str. 12, red 11) koncentracija humanog plazmina 0.0125 I.U./ml: izvedeno iz paragrafa "Rastvori plazmina" (str. 12, red 25-26) u kombinaciji sa paragrafom "Postupak" (str.13, 21d 21-22). Kao dodatak (preferentna) koncentracija plazmina je takođe izvedena iz zahteva 7. pupstrat S-2251 (str. 12, red 12, Chromogenix Instrumentation Laboratorv) koji odgovara H-D-Valil-L-Leucil-L-Lizin-p-nitroanilin (videti priložene tehničke detalje, prilog 2), je najpreferentniji supstrat (str.6, red 6-7) Koncentracija supstrata: 3mM, može se zaključiti iz paragrafa "Rastvori hromogenog supstrata S-2251" na strani 12, rd 30. pufer: str. 12, red 14-15 pH: str 12, red 22 Temperatura: str. 13, red 26 Spektofotometrijska talasna dužina: str 13, red 27 PNA = para-nitroanilin, str.4, red 13-14 + komentari koji prate slike. Zahtev 17 (nov), novi zahtev i odgovarajuća jednačina mogu se izvesti jednostavnim matematičkom i statističkom obradom podataka datih u tablicama 1-3. Ova vrsta obrade je uobičajena i deo je opšteg znanja prosečnog stručnjaka. Iz činjenica izvedenih iz podataka datih u Tablicama 1, 2 i 3 (orig.4) originalne prijave, moguće je izračunati uM/min p-Nitroanilina koje oslobađa dejstvom plazmina na hromogeni supstrat u prisustvu Defibrotida. Vrednosti za "b" date u Tablicama 1, 2 i 3 (nagibi kinetičke krive) predstvaljaju A Abs/ min X 1000 (kao što se često koristi, kako bi se izbegli brojevi sa zarezima, skala spektrofotometrijskih očitavanja na Slikama 2, 4 i 5 je podmožena sa 1000; kao poseldica, stvarna spektrofotometrijska apsorbanca je dobijena deljenjem "b" sa 1000). Iz literature je poznato da Mlarni Ekstincioni Koeficijent za p-Nitroanilin iznosi 8.270 M"'cm ', odgovara 0.008270 Jedinica Apsorbance po u.M p-Nitroanilina, iz čega sledi da: luM p-Nitroanilina: 0.008270 (apsorbanca) = XuM p-Nitroanilina : Spektrofotometrijskom očitavanju ("b'71000). Tako je moguće izračunati mikromole p-Nitroanilina oslobođene u opisanim eksperimentima, i koji su radi jasnoće dati u sledećoj Tablici: Korelacija između koncentracije Defibrotida i uM oslobođenog p-nitroanilina data jesledećim semi-logaritamskim grafikom. Linije regresije su određene linearnom korelacijom za 5 ponavljanja i predstvaljene su _ jednačinama: Replika 1: uM/min p-Nitroanilina = 0.7317 + 0.3820 logX Replika 2: uM/min p-Nitroanilina = 0.6625 + 0.29071ogX Replika 3: uM/min p-Nitroanilina = 0.6708 + 0.2741 logX Replika 4: uM/min p-Nitroanilina = 0.6792 + 0.2907 logX Replika 5: pM/min p-Nitroanilina = 0.7100 + 0.3323 logX Opšta jednačina koja opisuje oslobađanje p-nitroanilina je: gdeje: a = 06908±0.0291 (srednja vrednosttstandardna devijacija) b = 0.3140 ± 0.0437 (srednja vrednosttstandardna devijacija) X = koncentracija defibrotida (pg/ml). ili "a" (presek) može biti od 0.6625 do 0.7317 "b" (nagib) može biti od 0.2741 do 0.3820