RS63162B1

RS63162B1 - Biljni ekstrakti obogaćeni derivatima ipolamiida kao imunosupresanti za lečenje poremećaja imunološkog sistema

Info

Publication number: RS63162B1
Application number: RS20220241A
Authority: RS
Inventors: Cristiano Ruch Werneck Guimarães; Carlos Eduardo Vitor; Lisandra Ravanelli Pessa; Romulo Dragani Reis; Alessandra Mascarello; Fernando Henrique De Souza Gama
Original assignee: Ache Laboratorios Farmaceuticos Sa
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-19
Publication date: 2022-05-31
Also published as: AU2018221956B2; CY1125187T1; CA3259255A1; PL3583103T3; EP3583103A2; DK3583103T3; SMT202200121T1; SA519402443B1; WO2018148816A4; JP7349362B2; PE20200449A1; AU2022201835A1; KR20190121790A; PE20242300A1; ES2909387T3; KR20250145126A; AU2022201835B2; BR112019017128A2; MX2019009655A; NZ756074A

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana jedinjenja i ekstrakte sa imunosupresivnom aktivnošću i postupak za proizvodnju ekstrakata iz biljaka roda Stachytarpheta. Na ovaj način, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije i njihovu upotrebu za lečenje poremećaja imunološkog sistema. Ovaj pronalazak je u oblastima farmacije, medicine i hemije.

Pozadina pronalaska

Poremećaji imunološkog sistema

[0002] Poremećaji imunološkog sistema mogu se posmatrati kao bilo kakva neravnoteža ili disfunkcija imunološkog sistema. Ovaj sistem je primarno odgovoran za pomaganje u odbrani tela protiv spoljašnjih ili nepoznatih agenasa preko antitela koja prepoznaju i bore se protiv štetnih antigena.

[0003] Autoimune bolesti su primer poremećaja imunološkog sistema kod kojih organizam počinje da proizvodi antitela protiv svojih sopstvenih molekula, pri čemu ne pravi razliku između endogenih i egzogenih agenasa. U takvim slučajevima, lekovi sa imunosupresivnom aktivnošću bili bi veoma traženi da bi se pomoglo pacijentima da ublaže simptome izazvane ovom vrstom poremećaja.

[0004] Autoimune bolesti, osim reumatoidnog artritisa i autoimunog tiroiditisa, su pojedinačno retke, ali zajedno pogađaju približno 5% populacije zapadnih zemalja. Njihova etiologija nije u potpunosti razumljiva. Kod organ-specifičnih i sistemskih autoimunih bolesti, zapaža se gubitak kapaciteta imunološkog sistema da razlikuje ono što je sopstveno od onog što nije. Ova sposobnost, koja se naziva samotolerancija, održava se u imunokompetentnim B i T ćelijama i centralnim i perifernim mehanizmima. Gubitak samotolerancije može imati unutrašnje ili spoljašnje uzroke. Faktori sredine kao što su bakterijske i virusne infekcije, izlaganje fizičkim i hemijskim agensima kao što su UV, pesticidi i lekovi su primeri spoljašnjih uzroka. Unutrašnji uzroci, to jest, vezani za karakteristike samog pojedinca, obično su povezani sa polimorfizmom molekula histokompatibilnosti, komponenata urođenog imuniteta, kao što su sistem komplementa i Toll-slični receptori, komponenata stečenog imuniteta kao što su regulatorni limfociti i citokini, pored hormonskih faktora koji su pod genetskom kontrolom.

[0005] Terapeutska strategija u autoimunim bolestima uglavnom se sastoji od suzbijanja imunološkog sistema pomoću imunosupresanata, koji deluju na inhibiciju ranih stadijuma razvoja imuniteta. Ova terapija ne izvodi selektivnu imunosupresiju, koja dovodi do razvoja različitih antitela. Biološki agensi mogu da se koriste da bi se inhibiralo dejstvo citokina, kao što se javlja sa monoklonalnim antitelima protiv citokina ili upotrebom rastvorljivih receptora koji se vezuju za citokin i blokiraju njihove efekte na ciljane ćelije. Citokini se takođe koriste u biološkoj terapiji preko analognih rekombinantnih proteina koji imitiraju efekat originalnog citokina. Glavni terapeutski ciljevi u terapiji protiv citokina su proinflamatorni citokini interleukin-1 (IL-1), TNFα i IL-6, i glavna terapija agonistima citokina izvodi se upotrebom interferona tipa I (IFN). U porodici interferona tipa I, rekombinantni proteini IFNα i IFNβ koriste se u kliničkoj praksi, primarno za lečenje virusnog hepatitisa (hepatitis virus B i C) i multipla skleroze, redom. Za potonji, predložen mehanizam delovanja je antagonizam koji INFβ ispoljava protiv IFNγ, koji ima veliki značaj u fiziopatologiji multipla skleroze. IFNα se takođe koristi u lečenju mukokutanih, očnih i neuroloških manifestacija Behčetove bolesti i Čarg-Štrausovog sindroma.

Fontolizumab je humanizovan anti-IFNy agens, koji je ocenjen kod pacijenata sa abnormalnostima u dendritskim ćelijama sa dobrim rezultatima.

[0006] Monoklonalna antitela imaju prednosti u lečenju autoimunih bolesti u odnosu na konvencijalne terapije jer su ciljane terapije, sa specifičnošću i visokom selektivnošću. Međutim, koriste se kao druga linija lečenja kada nema efektivnosti u kontroli autoimunih bolesti sa konvencijalnim terapijama. Pored ograničenja efikasnosti, monoklonalna antitela imaju još nekoliko ograničenja koja se odnose na cenu i dostupnost. Za nekoliko autoimunih bolesti i dalje ne postoje efektivna lečenja, sa dobrom tolerancijom od strane pacijenata.

[0007] Prirodni proizvodi se koriste vekovima u lečenju različitih bolesti. Nedavno, veliki napori su uloženi u razvoj novih istraživanja biljnih proizvoda sa imunosupresivnim dejstvima. Na primer, nekoliko kliničkih proba izvedenih u Sjedinjenim Američkim Državama već je pokazalo značajne koristi od T. wilfordii ekstrakta kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom. Iako postoji nekoliko vrsta i njihovih aktivnih sastojaka sa opisanim mehanizmima delovanja, još uvek postoji ogromno polje koje treba istražiti koje se odnosi na in vitro i in vivo istraživanja i buduće kliničke probe za imunološki zasnovane bolesti. Ovi prirodni proizvodi trebalo bi da se formulišu u odgovarajuće farmaceutske kompozicije da bi se osigurala delotvornost lečenja autoimunih bolesti.

[0008] Autoimuna bolest za koju, do sada, nije bilo efikasnog leka, a još manje opcija za lekove dobijene od prirodnih ekstrakata, može se opisati putem primera za vitiligo. Vitiligo je obično povezan sa gubitkom funkcionalnih melanocita i smatra se za najčešći stečeni poremećaj depigmentacije kod ljudi, koji pogađa najmanje 0.5% svetske populacije. Karakteriše se razvojem belih mrlja, koje nastaju usled gubitka epidermalnih melanocita, što može dovesti do ćelijske destrukcije kroz specifičan citotoksični imunološki odgovor na melanocite i do oštećenja njihovog adhezionog sistema.

[0009] Više mehanizama je povezano sa vitiligom kao što su genetska predispozicija, aktivacije okoline, metaboličke anomalije i promene u imunološkim i zapaljenskim odgovorima. Pored toga, poznato je da uslovi kao što su izlaganje ultraljubičastom zračenju i oksidativni stres pogoršavaju ovo stanje.

[0010] Zbog nedostatka određenog znanja o inicijalnoj pojavi bolesti, nekoliko ispitivanja je pokušalo da rasvetli biološke puteve uključene u ovoj patogenezi. Većina njih ukazuje na složenost i izazove vezane za ovakvu bolest, jer je veoma teško naći efikasno lečenje. Ne sme se zaboraviti da većina poremećaja imunološkog sistema ima značajan socijalni uticaj, pri čemu izaziva visok nivo psihološkog stresa za pacijente. Do danas, ne postoji intervencija koja bi mogla da izleči vitiligo.

[0011] Na ovaj način, postoji eminentna potreba za identifikacijom novih jedinjenja koja mogu da promovišu imunosupresivnu aktivnost sa dugoročnim efektom. Prema tome, ovaj pronalazak rešava ovaj jaz u lečenju poremećaja imunološkog sistema pomoću jedinjenja koja, kada se izoluju, pokazuju imunosupresivnu aktivnost i aktivnih ekstrakata koji obuhvataju grupe aktivnih jedinjenja, koji se dobijaju na sledeći način.

[0012] Ističući složenost i nedostatak naučnih saznanja o vitiligu, do sada se verovalo da je struktura ipolamiida u njegovom netaknutom obliku mogla biti povezana sa imunosupresivnom aktivnošću, relevantnoj za lečenje pacijenata sa vitiligom. Međutim, u ovom pronalasku pokazalo se da ova aktivnost proizilazi od specifičnih derivata ipolamiida i ekstrakata koji obuhvataju takva jedinjenja, poželjno dobijenih u ovde opisanim postupcima proizvodnje. Imunosupresivnu aktivnost pokazuju i jedinjenja i ekstrakti što je potvrđeno eksperimentalno. Ova aktivnost je ovde demonstrirana blokiranjem aktivacije CD8+ T ćelija i smanjenjem IFN-γ izlučivanja. Pokazalo se da je ovaj mehanizam obećavajući za vitiligo u pogledu nedavnih kliničkih nalaza koji se odnose na kvantifikaciju ovih komponenata u koži pacijenata. Određenije, visoke koncentracije CD8+ T ćelija i IFN-γ povezane su sa apoptozom melanocita i, prema tome, njihova modulacija je obećavajući mehanizam delovanja.

[0013] WO 2016/128471 A1 opisuje imunološki aktivnu biljnu mešavinu koja obuhvata najmanje jedan biljni ekstrakt odabran od Asteraceae porodice, Verbenaceae porodice i/ili Burseraceae porodice.

[0014] WO 2008/098325 A1 opisuje postupak za dobijanje jedinjenja i standardnog farmaceutskog proizvoda iz jednog ili više delova biljaka Stachytarpheta (Verbenaceae porodica) vrsta.

[0015] WO 03/094946 A1 opisuje postupak za lečenje i/ili prevenciju stanja bolesti jetre kod sisara uključujući ljudska bića, davanjem kompozicije koja obuhvata 2'-p-hidroksi-benzoil-masaenozidnu kiselinu iz biljke Vitex negundo.

[0016] CN 103690551 A opisuje ekstrakte iridoid glikozida kod broćika, postupak ekstrakcije i njihove medicinske primene u aspektima protiv zapaljenja i zaštite nerava.

[0017] Adebajo A.C. et al., u Planta Medica 2007, vol.73, no.3, 241-250 opisuje upotrebu ekstrakata iz Stachytarpheta cayennensis listova za lečenje dijabetesa.

[0018] CN 103120699 A opisuje jedinjenja iridoida za pripremu lekova za lečenje ili sprečavanje SARS.

[0019] EP 1145709 A1 opisuje upotrebu biljnih ekstrakata iz porodice Solanaceae ili roda Physalis, Stachytarpheta ili Peumus za proizvodnju kozmetičkih preparata ili kao aktivni agens za proizvodnju kompozicije za povećanje metaboličke aktivnosti glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PDH).

[0020] EP 0045837 A1 opisuje derivate iridoida i postupak za njihovo pripremanje iz katapola kao prirodne supstance koja se lako dobija, kao i njihovu upotrebu kao intermedijara za proizvodnju prostanoida.

[0021] Bianco A. et al., u Tetrahedron Letters, 1978, vol.48, 4829-4832 opisuju iridoid aglikone, njihovu reaktivnost i nestabilnost u kiseloj sredini.

[0022] Khobrakova V.B. et al. u Pharmaceutical Chemistry Journal, 2017, vol.51, no.5, 384-387, opisuju biljne suve ekstrakte iz Gentiana algida Pall. koji imaju imunomodulirajuću aktivnost.

[0023] Hoki Kunihito et al. u Journal of Physical Chemistry B, 2004, vol.108, no.15, 4916-4921, opisuju ispitivanje hiralnog molekularnog motora.

[0024] Kunihito Hoki et al. u Journal of Chemical Physics, 2003, vol.119, no.23, 12393-12398, izveštavaju o ispitivanju molekularnog motora u kom je formil grupa obrtni deo motora.

[0025] Schloegl K. et al. u Monatshefte fuer chemie, 1964, vol.95, no.2, 558-575, opisuju pripremu asimetričnih amina i aldehida serija ferocena.

[0026] Benkeser Robert A. et al. u Journal of the American Chemical Society, 1964, vol.86, no.5, 890-895, izveštavaju o ispitivanju metalacije alkilferocena.

[0027] US 3703543 A opisuje hidroksamske kiseline alicikličnih aminokiselina i njihove estre koji imaju supresivno dejstvo imunološkog odgovora kod toplokrvnih životinja.

[0028] Orhan Ilkay Erdogan et al. u Industrial Crops and Products, 2016, vol.81, 117-121, izveštavaju o ispitivanju sposobnosti odabranih biljnih esencijalnih ulja da moduliraju humane ćelijske imunološke odgovore pomoću raznih inflamatornih parametara kao što su stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) iz fagocita cele krvi i izolovanih polimorfonuklearnih neutrofila (PMN).

[0029] Kobayashi Yuko et al. u Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2016, vol.80, no.6, 1172-1178, izveštavaju o ispitivanju antioksidativnih i antiinflamatornih efekata esencijalnog ulja geranijuma kao i njegove uloge u alergijskim reakcijama.

[0030] Lee Je-Hyuk et al. u Food Science and Biotechnology, 2009, vol.18, no.6, 1371-1378, izveštavaju o ispitivanju antiinflamatornih aktivnosti esencijalnog ulja iz Z.piperitum.

[0031] Lee Je-Hyuk et al. u Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, vol.89, no.10, 1762-1769, opisuju ispitivanje esencijalnog ulja iz Z.schinifolium i njegovu upotrebu kao alternativnog leka za ublažavanje i usporavanje imunoloških inflamatornih odgovora.

[0032] DE 19644422 A1 opisuje upotrebu jedinjenja terpena za imunosupresivna, antileukemijska i antiretrovirusna lečenja.

[0033] Yu Xia et al. u Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2009, vol.18, no.3, 232-235, opisuju ispitivanje ekstrakata iz kineske biljke mangrova Cerbera manghas L. koja sadrži novi linearni monoterpen.

[0034] EP 1371372 A1 opisuje upotrebu mešavina tokoferola i ekstrakata iz Harpagophytum procumbens (ili aktivnih agenasa ekstrakta odabranog od iridoid glukozida, harpagozida, harpagida i prokumbida) u proizvodnji lekova za borbu protiv reumatoidnog artritisa.

[0035] Elmasri Wael A. et al. u Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2016, vol.30, no.18, 2033-2042, opisuju postupak za izdvajanje i karakterizaciju iridoid glukozinolata permetilovanjem kombinovanim sa LC/MS analizom.

[0036] Baden Christian Ulrich et al. u Chemoecology, 2012, vol.22, no.2, 113-118, izveštavaju o istraživačkoj studiji na nekoliko vrsta iz porodice žižaka Mecininae koje su hranjene biljkama Plantaginaceae koje sadrže iridoid glikozid.

[0037] Akkol Esra Kupeli et al. u Pharmaceutical Biology, 2009, vol.47, no.3, 188-194, otkrivaju ispitivanje efekta davanja biljnih ekstrakata iz Linaria aucheri na miševe.

[0038] Viccini et al. u Journal of Molecular Structure, 2008, vol.875, no.1-3, 27-31, izveštavaju o strukturnoj i spektroskopskoj karakterizaciji ipolamiida i fulvoipolamiida izolovanih iz listova

od Stachytarpheta glabra.

[0039] Leitao Gilda Guimaraes et al. u Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 2005, vol.28, no.12-13, 2053-2060, izveštavaju o ispitivanju glikozilovanih fenilpropanoida i iridoida izolovanih iz etilacetatnog ekstrakta iz korena od Stachytarpheta cayennensis.

[0040] Schapoval Elfrides E.S. u Journal of Ethnopharmacology, 1998, vol.60, no.1, 53-59, izveštavaju o ispitivanju antiinflamatornih svojstava i antinociceptivne aktivnosti alkoholnih ekstrakata osušenih listova od Stachytarpheta cayennensis.

Suština pronalaska

[0041] Ovaj pronalazak je kao što je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

[0042] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja dobijena od ipolamiida, koja imaju imunosupresivnu aktivnost. Prema tome, mogu da se koriste za lečenje poremećaja imunološkog sistema. Pored toga, ovaj pronalazak opisuje biljne ekstrakte obogaćene pomenutim jedinjenjima, dobijenim od ipolamiida, koja se dobijaju predmetnim postupkom za proizvodnju, i koja takođe imaju imunosupresivnu aktivnost.

[0043] Prema tome, predmet ovog pronalaska su derivati ipolamiida koji su jedinjenja opšte formule C:

u kojoj R odgovara H, OH, OGlyc (Glikozid); R1, R1', R1"odgovaraju H, OH; R2odgovara H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3odgovara H, OH, CH3; R4, R4'odgovaraju H, OH, CH2OH, CH3.

[0044] U poželjnom načinu ostvarivanja, najmanje jedno poželjno jedinjenje ovog pronalaska može biti odabrano iz grupe koja obuhvata sledeće strukture:

[0045] Takođe, cilj ovog pronalaska je jedinjenje formule C za upotrebu kao imunosupresant u lečenju poremećaja imunološkog sistema. U poželjnom

načinu ostvarivanja, jedinjenje formule C za upotrebu je namenjeno za lečenje vitiliga.

[0046] Osim toga, predmet ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija za lečenje poremećaja imunološkog sistema, koja obuhvata najmanje jedno jedinjenje formule C i neki farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

[0047] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska dalje obuhvata jedinjenje ipolamiida.

[0048] Kao što je prethodno pomenuto, potvrđeno je da izolovan ipolamiid ne pokazuje imunosupresivnu aktivnost. S druge strane, određene grupe jedinjenja dobijene od ipolamiida imaju takvu aktivnost. Istovremeno, takođe su naznačene prednosti dobijanja biljnih lekova za lečenje bolesti, budući da ovi sistemi proizvodnje jedinjenja omogućavaju niz produktivnih interakcija između komponenata biljaka i aktivnih jedinjenja, često čak i sinergističke. Prema tome, da bi se dodatno dobio neki biljni lek koji obuhvata takva aktivna jedinjenja, razvijen je postupak za proizvodnju koji omogućava dobijanje ekstrakta obogaćenog jedinjenjima od interesa. Kao što je opisano u nastavku, postupak za proizvodnju ekstrakata ovog pronalaska obuhvata faze koje dovode do ekstrakata obogaćenih derivatima ipolamiida sa imunosupresivnom aktivnošću. Potvrđena je relevantnost prethodnog odabira ulaznih biljnih biomasa koje sadrže između 2.5% i 3.5% ipolamiida, pri čemu se dobija ekstrakt obogaćen ipolamiidom i jedinjenjima dobijenim od ipolamiida od oko 1% do oko 20%, poželjno od oko 8.5% do oko 11.5% sadržaja ipolamiida i derivata.

[0049] Kao što je prethodno predstavljeno, biljna biomasa koja sadrži ovo jedinjenje koristiće se kao polazni materijal za postupak za proizvodnju ekstrakta. Samo sa postupkom za proizvodnju ovog pronalaska, moguće je da se dobije ekstrakt obogaćen specifičnim jedinjenjima dobijenim od ipolamiida. Ovaj obogaćen ekstrakt dalje pokazuje imunosupresivnu aktivnost.

[0050] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je postupak za proizvodnju ekstrakta obogaćenog jedinjenjima dobijenim od ipolamiida formule C, koji suštinski obuhvata faze:

a) odabira ulazne biljne biomase sa sadržajem ipolamiida između 2.5% i 3.5% dobijene iz biljaka roda Stachytarpheta;

b) dovođenja odabrane biomase iz a) na sušenje u peći na temperaturi između 40 i 80 °C, dok se ne postigne stabilizacija vlažnosti između 10 i 12%;

c) mlevenja biljne biomase;

d) izvođenja ekstrakcije biljne biomase kroz faze:

i. zagrevanja biljne biomase na temperaturi između 70 i 100 °C, uz konstantno mešanje;

ii. maceracija biljne biomase na sobnoj temperaturi;

iii. zagrevanja biljne biomase sa temperaturom između 70 i 100 ºC.

[0051] U poželjnom načinu ostvarivanja, postupak za proizvodnju ovog pronalaska dalje obuhvata faze:

iv. filtriranja i koncentrovanja ekstrakta;

v. sušenja u sušnici na raspršivanje, tokom 1 do 60 sekundi, sa ulaznom temperaturom između 155 i 165 °C i izlaznom temperaturom između 85 i 95 °C, povezanoj sa odvlaživačem.

[0052] U poželjnom načinu ostvarivanja, postupak za ekstrakciju ovog pronalaska je vodeni ili hidroalkoholni postupak, još poželjnije vodeni postupak.

[0053] Prema tome, postupak za proizvodnju ovog pronalaska omogućava da se dobije standardizovan ekstrakt obogaćen jedinjenjima dobijenim od ipolamiida, poželjno sa prinosom od oko 8% do oko 10%.

[0054] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je ekstrakt obogaćen jedinjenjima dobijenim od ipolamiida dobijenog gorepomenutom procedurom.

[0055] Biljna biomasa ovog pronalaska obuhvata sve delove biljke roda Stachytarpheta. Poželjno, biljna biomasa obuhvata nadzemne delove biljaka, poželjnije, lišće.

[0056] U poželjnom načinu ostvarivanja, ulazna biljna biomasa obuhvata najmanje jednu biljnu biomasu sa ujednačenim sadržajem ipolamiida između 2.5% i 3.5%. U nekom opcionom načinu ostvarivanja, ulazna biljna biomasa obuhvata više od jedne biljne biomase, pri čemu različite biljne biomase imaju različite sadržaje ipolamiida nezavisno, ali zajedno postižu ujednačen sadržaj ipolamiida (između 2.5% i 3.5%).

[0057] U nekom drugom poželjnom načinu ostvarivanja, stvarni sadržaj ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi može da se koristi kao parametar za predviđanje teorijskog sadržaja ipolamiida i derivata u dobijenom ekstraktu. Ovo predviđanje može da se postigne postupkom koji obuhvata fazu primene Jednačine I na neke parametre dobijene eksperimentalno da bi se dobile idealne proporcije ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi, što poželjno projektuje sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu od 8.5% do 11.5% od. Jednačina I je definisana dole:

[0058] % Teorijskog sadržaja ipolamiida i derivata u ekstraktu = % Stvarnog sadržaja ipolamiida u biljnoj biomasi x DER / (< stvarni sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu/stvarni sadržaj ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi >) ± standardna devijacija (Jednačina I).

[0059] Na ovaj način, moguće je predvideti teorijski sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu iz stvarnog sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi. Poželjno, odnos između stvarnog sadržaja ipolamiida i derivata u ekstraktu/sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi je između oko 3.0 i oko 3.5.

[0060] U nekom još poželjnijem načinu ostvarivanja, biljke ovog pronalaska obuhvataju Stachytarpheta cayennensis.

[0061] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je ekstrakt obogaćen jedinjenjima formule C dobijenim od ipolamiida, dobijen iz biljaka roda Stachytarpheta za upotrebu kao lek sa imunosupresivnom aktivnošću.

[0062] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je najmanje jedna aktivna frakcija ekstrakta obogaćenog jedinjenjima dobijenim od ipolamiida. Poželjno, najmanje jedna frakcija obuhvata najmanje jedno jedinjenje dobijeno od ipolamiida formule (I), (II) i/ili (III).

[0063] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, aktivna frakcija obogaćenog ekstrakta dalje obuhvata ipolamiid.

[0064] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je upotreba najmanje jedne standardizovane frakcije obogaćene jedinjenjima dobijenim od ipolamiida, dobijene iz biljaka roda Stachytarpheta za proizvodnju leka sa imunosupresivnom aktivnošću.

[0065] Ovi i drugi predmeti ovog pronalaska biće cenjeni od strane stručnjaka u tehnici i kompanija koje su zainteresovane u ovom segmentu, i biće opisani u opisu u nastavku dovoljno detaljno radi njihove reprodukcije.

Detaljan opis slika

[0066]

Fig.1 – Sažetak dijagrama toka koji opisuje postupak za proizvodnju aktivnog ekstrakta obogaćenog derivatima ipolamiida dobijenim iz Stachytarpheta cayennensis.

Fig.2 - Efekat vodenog ekstrakta iz Stachytarpheta cayennensis (3, 10 i 30 µM, koncentracija izražena za ipolamiid) i izolovanog ipolamiida (3, 10 i 30 µM) na proliferaciju CD8+ T ćelija aktiviranu αCD3/CD28 (A) i IFNγ proizvodnju (B). Efekat skupa jedinjenja (IV do VIII) i pet izolovanih jedinjenja (IV do VIII) generisanih nakon kisele hidrolize ipolamiida (30 µM) takođe je ocenjen u istim eksperimentima, na proliferaciju CD8+ T ćelija aktiviranu αCD3/CD28 (C) i IFNγ proizvodnju (D). Takrolimus (0.5 µM) je korišćen kao pozitivna kontrola za sve eksperimente. Podaci su srednja vrednost ± SD tri kopije.

Fig.3 - Efekat kisele hidrolize ipolamiida na obrazovanje njegovih derivata. Hromatogram netaknutog ipolamiida (plav); Ipolamiid je hidrolizovan u 0.1 N HCI na 40 °C za 1h (zeleni);

Ipolamiid je hidrolizovan u 0.1 N HCI na 40 °C za 2h (crveni); Ipolamiid je hidrolizovan u 0.1 N HCI na 40 °C za 5h (magenta). IPO = Ipolamid.

Fig.4 - Hromatogram ekstrakta iz Stachytarpheta cayennensis dobijenog u postupku za proizvodnju ovde obuhvaćenom patentnim zahtevima. Slika prikazuje marker ipolamiida i njegove specifične derivate u vremenima zadržavanja: 5.5; 9.7; 12.0; 14.3; 17.3 min. IPO = Ipolamiid.

Detaljan opis pronalaska

Aktivna jedinjenja

[0067] Ovaj pronalazak odnosi se na grupe jedinjenja, koje obuhvataju sledeće opšte formule:

[0068] u kojima R odgovara H, OH, OGlyc (Glikozid); R1, R1', R1"odgovaraju H, OH; R2odgovara H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3odgovara H, OH, CH3; R4, R4'odgovaraju H, OH, CH2OH, CH3; R5, R5'odgovaraju H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; R6odgovara CHO, COOH, COOCH3; R7odgovara H, CH3; Rs, R8',

R8"odgovaraju CHO, CH3, CH2OH, COOH i isprekidane veze predstavljaju jednostruke (C-C) ili dvostruke (C=C) veze između atoma ugljenika (do dve dvostruke veze po strukturi).

[0069] Primer 1: Jedinjenja opšte formule (I) obuhvataju sledeće strukture.

1

[0070] Primer 2: Jedinjenja opšte formule (II) obuhvataju sledeće strukture.

[0071] Primer 3: Jedinjenja opšte formule (III) obuhvataju sledeće strukture.

[0072] Ove gorepomenute strukture predstavljaju primer okosnica hemijskih struktura uključenih u formulama (I), (II) ili (III).

Poremećaji imunološkog sistema

[0073] Pojam "poremećaji imunološkog sistema" ovog pronalaska obuhvata bilo kakvu disfunkciju imunološkog sistema. Obično se poremećaji mogu okarakterisati komponentama imunološkog sistema koje su pogođene ili nivoom aktivnosti imunološkog sistema. U ovom pronalasku, poželjno se poremećaji imunološkog sistema odnose na bolesti koje imaju neki dokaz autoimunosti. U ovom pronalasku može se smatrati da je vitiligo još poželjnije izabran među mogućim imunološkim poremećajima.

Postupak lečenja poremećaja imunološkog sistema

[0074] Ovaj opis obezbeđuje postupak lečenja poremećaja imunološkog sistema, koji obuhvata davanje jedinjenja opšte formule (I), (II) i/ili (III) pacijentu, u dovoljnoj količini da se obezbedi imunosupresivni efekat. Treba napomenuti da se, za svrhu ove prijave patenta, lečenje poremećaja imunološkog sistema može postići pomoću derivata ipolamiida i/ili frakcija i/ili ekstrakata koji sadrže derivate ipolamiida, pri čemu bilo koji od njih ima imunosupresivnu aktivnost. U poželjnom aspektu ovog opisa, postupak lečenja namenjen je za lečenje vitiliga.

Farmaceutska kompozicija koja obuhvata izolovana jedinjenja dobijena od ipolamiida.

[0075] U jednom aspektu ovog opisa, farmaceutska kompozicija obuhvata izolovane derivate ipolamiida, koji se koriste sami ili u kombinaciji, za lečenje poremećaja imunološkog sistema, pri čemu jedinjenja obuhvataju najmanje jedno jedinjenje odabrano iz grupe koja obuhvata:

i/ili

[0076] u kojima R odgovara H, OH, OGlyc (Glikozid); R1, R1', R1"odgovaraju H, OH; R2odgovara H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3odgovara H, OH, CH3; R4, R4'odgovaraju H, OH, CH2OH, CH3; R5, R5'odgovaraju H, CH3, COOCH3, CHO, CH2OH; R6odgovara CHO, COOH, COOCH3; R7odgovara H, CH3; Rs, R8',

R8"odgovaraju CHO, CH3, CH2OH, COOH i isprekidane veze predstavljaju jednostruke (C-C) ili dvostruke (C=C) veze između atoma ugljenika (do dve dvostruke veze po strukturi); i

d) farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

[0077] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, ova farmaceutska kompozicija dalje obuhvata jedinjenje ipolamiida.

[0078] U poželjnom aspektu ovog opisa, farmaceutska kompozicija obuhvata jedinjenja:

[0079] U ovom aspektu ovog opisa, jedinjenje opšte formule (I) obuhvata jedinjenja formule (IV), (V),(VIII) i (IX), jedinjenje opšte formule (II) obuhvata jedinjenje formule (VII), (X) i (XI) i jedinjenje opšte formule (III) obuhvata jedinjenje formule (VI).

[0080] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može dodatno da obuhvata sledeća jedinjenja:

i farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

Farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

[0081] Da bi sprovela svoju aktivnost, jedinjenja opšte formule (I), (II) i/ili (III) trebalo bi da se daju nekom životinjskom organizmu, sisaru, naročito čoveku, poželjno u obliku farmaceutske kompozicije, tj., zajedno sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumima koji su pogodni za svaki način davanja.

[0082] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska sadrže kao aktivni sastojak jedno ili više ovde predloženih jedinjenja, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih vehikuluma. Aktivni sastojak se obično umešava, razblažuje ili inkapsulira sa najmanje jednim vehikulumom.

[0083] Kada je vehikulum razblaživač, može biti u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku, pri čemu deluje kao nosač, ekscipijens ili sredina za aktivni sastojak. Prema tome, kompozicija može biti u obliku tableta, pilula, praškova, kesica, suspenzija, emulzija, rastvora, aerosoli (u čvrstoj ili tečnoj sredini), krema, tvrdih ili mekih kapsula, čepića, injekcionih rastvora.

[0084] U ovom pronalasku, poželjno se bilo koja supstanca koja se razlikuje od jedinjenja opšte formule (I), (II) ili (III) smatra farmaceutski pogodnim vehikulumom koji se namerno dodaje da bi se proizveo farmaceutski dozni oblik pogodan za način davanja. Neograničavajući primeri farmaceutskih ekscipijenasa pogodnih za pripremanje farmaceutskih kompozicija opisani su u Priručniku formulacija za proizvodnju farmaceutskih proizvoda - Vol.1 do 6 - 2004 - Sarfaraz K. Niazi - CRC Press e Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing.

1

[0085] Neograničavajući primeri načina davanja kompozicije koja obuhvata jedinjenje opšte formule (I), (II) ili (III) su topikalni, oralni, parenteralni, nazalni, rektalni, transmukozni, transdermalni načini.

[0086] Terapijska doza jedinjenja ovog pronalaska koja će se koristiti trebalo bi da se planira i izračuna prema odabranom načinu davanja, starosti, masi i stanju pacijenta i ozbiljnosti lečenog poremećaja. Uopšteno, jedinjenja ovog pronalaska se daju u terapijski efektivnim dozama. Efektivne doze mogu da se ekstrapoliraju iz krivih odgovora na dozu, dobijenih iz in vitro ili životinjskih modela. Obično, kliničar će davati jedinjenje do odgovarajuće doze da bi se postigao željeni efekat.

Postupak proizvodnje aktivnih jedinjenja

[0087] Ovaj opis detaljno prikazuje postupak proizvodnje aktivnih jedinjenja opšte formule (I), (II) i/ili (III). Suštinski, postupak proizvodnje izolovanih jedinjenja obuhvata fazu podvrgavanja najmanje jednog jedinjenja ipolamiida najmanje jednoj fazi zagrevanja na visokim temperaturama, u pogodnom rastvaraču, za dovoljno vremena da bi se dobila jedinjenja dobijena od ipolamiida opšte formule (I), (II) i/ili (III).

[0088] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska dalje obuhvata jedinjenje ipolamiida.

[0089] U poželjnom načinu ostvarivanja, rastvarač ovog pronalaska obuhvata vodu.

[0090] Pored toga, ovaj opis obezbeđuje postupak proizvodnje jedinjenja opšte formule (I), (II) i/ili (III), koji obuhvata fazu podvrgavanja najmanje jednog jedinjenja ipolamiida fazi zagrevanja na visokim temperaturama, u pogodnom rastvaraču, za dovoljno vremena da bi se dobila jedinjenja dobijena od ipolamiida opšte formule (I), (II) i/ili (III).

[0091] U poželjnom načinu ostvarivanja, visoke koncentracije jedinjenja formule (I), (II) i/ili (III) ovog pronalaska dobijaju se iz ukupne konverzije (100%) sadržaja ipolamiida korišćenog u odgovarajućem postupku za proizvodnju.

[0092] Još poželjnije, visoke koncentracije ovog opisa obuhvataju oko 0.5% do oko 45% svakog jedinjenja (IV do VIII) u mešavini. U ovom slučaju, koncentracije obuhvataju oko 1 do oko 5% jedinjenja IV, poželjno 4%; oko 15 do oko 25% jedinjenja V, poželjno 19%; oko 1% do oko 6% jedinjenja VI, poželjno 3%; oko 35% do oko 45% jedinjenja VII ili njegove izomere (npr. jedinjenje X ili jedinjenje XI), poželjno 37%; oko 0.5% do oko 4% jedinjenja VIII ili njegove izomere (npr. jedinjenje IX), poželjno 2%.

[0093] U poželjnom načinu ostvarivanja, visoke temperature ovog pronalaska obuhvataju temperature iznad 35 °C, poželjnije između 35 °C i 165 °C.

[0094] U nekom drugom poželjnom načinu ostvarivanja, rastvarač ovog pronalaska obuhvata druge pogodne rastvarače.

[0095] U poželjnom načinu ostvarivanja, postupak proizvodnje aktivnih jedinjenja dobijenih od ipolamiida obuhvata fazu hidrolize ili solvolize ipolamiida.

[0096] Još poželjnije, hidroliza ipolamiida može biti kiselog tipa. Među kiselinama pogodnim za kiselu hidrolizu ipolamiida mogu se pomenuti hlorovodonična kiselina, hlorovodonična, sumporna, azotna, fosforna i sirćetna kiselina, bez bilo kakvih specifičnih ograničenja na bilo koju od njih. U poželjnom načinu ostvarivanja u ovom pronalasku koristi se hlorovodonična kiselina.

[0097] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, hidroliza ipolamiida može biti baznog/alkalnog tipa. Među bazama pogodnim za baznu/alkalnu hidrolizu ipolamiida mogu se pomenuti hidroksidi alkalnih metala, bez bilo kakvih specifičnih ograničenja na bilo koji od njih. U poželjnom načinu ostvarivanja, u ovom pronalasku koristi se natrijumhidroksid.

[0098] U još poželjnijem načinu ostvarivanja, hidroliza u kiseloj sredini praćena je hidrolizom u baznoj/alkalnoj sredini. Kao primer, može se pomenuti postupak za proizvodnju koji obuhvata fazu dovođenja najmanje jednog jedinjenja ipolamiida na visoke temperature i 0.1 N (eq/L) hlorovodonične kiseline, praćeno inkubacijom tokom različitih vremenskih intervala koji mogu biti u opsegu od 0 do 120 minuta. Hidroliza se zatim prekida postupkom neutralizacije poželjno pomoću natrijumhidroksida 0.1 N.

[0099] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, postupak za proizvodnju jedinjenja opšte formule (I), (II) i/ili (III) obuhvata fazu hidrolize ipolamiida u baznoj sredini, koja se izvodi sa vodenim rastvorom natrijumhidroksida 0.1 N i održava na 40 °C tokom 2 sata.

Postupak za proizvodnju aktivnih frakcija/ekstrakata obogaćenih derivatima ipolamiida

[0100] Pronalazači su potvrdili da određena izolovana aktivna jedinjenja ovog pronalaska mogu da se dobiju tehnikama molekulskog dizajna i sinteze. Istovremeno, takođe su naznačene prednosti dobijanja biljnih lekova za lečenje bolesti, budući da ovi sistemi proizvodnje jedinjenja omogućavaju niz produktivnih interakcija između komponenata biljnih i aktivnih jedinjenja, često čak i sinergističke. Tako, da bi se dodatno dobio biljni lek koji obuhvata takva aktivna jedinjenja, razvijen je postupak za proizvodnju, koji omogućava dobijanje ekstrakta obogaćenog jedinjenjima od interesa.

[0101] Kao što je opisano u nastavku, postupak za proizvodnju ekstrakta ovog pronalaska obuhvata faze koje daju ekstrakte obogaćene derivatima ipolamiida sa imunosupresivnom aktivnošću. Potvrđen je značaj prethodnog odabira ulaznih biljnih biomasa koje sadrže između 2.5% i 3.5% ipolamiida, pri čemu se dobija ekstrakt obogaćen ipolamiidom i jedinjenjima dobijenim od ipolamiida od oko 8.5% do oko 11.5%. Kao što je prethodno predstavljeno, biljna biomasa koja sadrži ipolamiid koristiće se kao polazni materijal za postupak za proizvodnju ekstrakta. Samo sa ovim postupkom za proizvodnju ovog pronalaska moguće je da se dobije ekstrakt obogaćen specifičnim jedinjenjima dobijenim od ipolamiida. Ovaj obogaćen ekstrakt dalje pokazuje imunosupresivnu aktivnost.

1

[0102] Tako, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju standardizovanog ekstrakta obogaćenog derivatima ipolamiida iz biljaka roda Stachytarpheta.

[0103] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je postupak za proizvodnju ekstrakta obogaćenog jedinjenjima dobijenim od ipolamiida, koji suštinski obuhvata faze:

c) mlevenja biljne biomase;

d) izvođenja ekstrakcije biljne biomase kroz faze:

ii. maceracije biljne biomase na sobnoj temperaturi;

iii. zagrevanja biljne biomase na temperaturi između 70 i 100 ºC.

[0104] U poželjnom načinu ostvarivanja, postupak za proizvodnju ovog pronalaska dalje obuhvata faze:

iv. filtriranja i koncentrovanja ekstrakta;

[0105] U poželjnom načinu ostvarivanja, postupak za ekstrakciju ovog pronalaska je vodeni ili hidroalkoholni postupak, još poželjnije vodeni postupak.

[0106] Prema tome, postupak za proizvodnju ovog pronalaska omogućava dobijanje standardizovanog ekstrakta obogaćenog jedinjenjima dobijenim od ipolamiida, poželjno sa prinosom od oko 8% do oko 10%.

[0107] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je ekstrakt obogaćen jedinjenjima dobijenim od ipolamiida dobijenog gorepomenutom procedurom. Standardizovani ekstrakt obogaćen jedinjenjima dobijenim od ipolamiida ovog opisa obuhvata, poželjno, jedinjenja formule (I), (II) i/ili (III).

[0108] Biljna biomasa ovog pronalaska obuhvata sve delove biljaka roda Stachytarpheta. Poželjno, biljna biomasa obuhvata nadzemne delove biljaka, poželjnije, listove.

[0109] U poželjnom načinu ostvarivanja, ulazna biljna biomasa obuhvata najmanje jednu biljnu biomasu sa ujednačenim sadržajem ipolamiida između 2.5% i 3.5%. U nekom opcionom načinu ostvarivanja,

1

ulazna biljna biomasa obuhvata više od jedne biljne biomase, pri čemu različite biljne biomase imaju različite sadržaje ipolamiida nezavisno, ali zajedno postižu ujednačen sadržaj ipolamiida (između 2.5% i 3.5%).

[0110] U nekom drugom poželjnom načinu ostvarivanja, stvarni sadržaj ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi može da se koristi kao parametar za predviđanje teorijskog sadržaja ipolamiida i derivata u dobijenom ekstraktu. Ovo predviđanje može se postići postupkom koji obuhvata fazu primene Jednačine I na neke parametre dobijene eksperimentalno da bi se dobile idealne proporcije ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi, koje poželjno projektuju sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu od 8.5% do 11.5% od. Jednačina I je definisana u nastavku:

[0111] % Teorijskog sadržaja ipolamiida i derivata u ekstraktu = % Stvarnog sadržaja ipolamiida u biljnoj biomasi x DER / (< stvarni sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu/stvarni sadržaj ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi >) ± standardna devijacija (Jednačina I).

[0112] Na ovaj način, moguće je predvideti teorijski sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu iz stvarnog sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi. Poželjno, odnos između stvarnog sadržaja ipolamiida i derivata u ekstraktu/sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi je između oko 3.0 i oko 3.5.

[0113] Ovaj pronalazak dalje traži zaštitu standardizovanih ekstrakata obogaćenih jedinjenjima dobijenim od ipolamiida iz biljaka roda Stachytarpheta, dobijenih u postupku za proizvodnju opisanom gore.

[0114] U jednom načinu ostvarivanja, još poželjniji, biljke ovog pronalaska obuhvataju Stachytarpheta cayennensis.

[0115] Standardizovani ekstrakti iz biljaka roda Stachytarpheta se poželjno dobijaju gore opisanim postupkom za proizvodnju koji daje ekstrakt obogaćen ipolamiidom i jedinjenjima dobijenim od ipolamiida od oko 1% do oko 20%, poželjno od oko 8.5% do oko 11.5% sadržaja ipolamiida i derivata.

[0116] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je upotreba standardizovanih ekstrakata biljaka roda Stachytarpheta koji sadrže jedinjenja dobijena od ipolamiida za proizvodnju leka sa imunosupresivnom aktivnošću. Određenije, standardizovani ekstrakti biljaka roda Stachytarpheta koji sadrže jedinjenja dobijena od ipolamiida opšte formule (I), (II) i/ili (III) za proizvodnju leka sa imunosupresivnom aktivnošću.

[0117] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je najmanje jedna aktivna frakcija ekstrakta obogaćena jedinjenjima dobijenim od ipolamiida. Poželjno, najmanje jedna frakcija obuhvata najmanje jedno jedinjenje dobijeno od ipolamiida formule (I), (II) i/ili (III).

[0118] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, aktivna frakcija obogaćenog ekstrakta dalje obuhvata ipolamiid.

1

[0119] Prema tome, dodatni predmet ovog pronalaska je upotreba najmanje jedne standardizovane frakcije obogaćene jedinjenjima dobijenim od ipolamiida, dobijene iz biljaka roda Stachytarpheta za proizvodnju leka sa imunosupresivnom aktivnošću.

Primeri - Poželjan način ostvarivanja

Postupak proizvodnje i identifikacija aktivnih jedinjenja

[0120] Izolovana jedinjenja ovog pronalaska dobijena su podvrgavanjem jedinjenja ipolamida 0.1 N hlorovodoničnoj kiselini, na 40 °C i 100 °C, tokom 1h, 2h i 5h. Fig.3 prikazuje stanje na 40 °C. Iz ovog eksperimenta, može se primetiti nekoliko proizvoda ove hidrolize i, na osnovu hromatograma, identifikovati nekoliko derivata ipolamiida, kao što su, na primer, strukture opisane dole, kao što je prikazano na Fig.3.

[0121] Alternativno se hidroliza može izvesti variranjem koncentracije hlorovodonične kiseline između 0.1 i 1 N, i eksperimentalna temperatura može da varira između 35 °C i 165 °C. Pored toga, vreme hidrolize može da varira između 1 minuta i 24 sata da bi se olakšalo obrazovanje viših koncentracija određenih derivata ipolamiida.

Postupak za dobijanje ekstrakta

[0122] Prema ovom pronalasku, postupak za dobijanje vodenog ekstrakta iz Stachytarpheta cayennensis bogatog derivatima ipolamiida uglavnom obuhvata faze proizvodnje standardizovanog ekstrakta, prikazane u dijagramu toka na Fig.1, da bi se dobio materijal za razvoj predkliničkog istraživanja u imunologiji.

[0123] Kao prvo, semena poželjno odabrana genotipizacijom Stachytarpheta cayennensis podvrgnuta su postupku zasejavanja tokom dva meseca u kontrolisanoj sredini po pitanju temperature, vlažnosti i svetla. Zasejavanje je izvedeno u širokim polistirenskim tacnama ispunjenim supstratom i čuvanim u ovoj zaštićenoj sredini sa kontrolisanim navodnjavanjem. Sadnice su počele da se pojavljuju za 10 do 15 dana. Tacne su ostale u ovim uslovima dok sadnice nisu postigle veličinu i idealne uslove za trajno presađivanje.

1

[0124] Sadnice sa približnom visinom od 5 do 8 cm i sa 2 do 3 para konačnih listova presađene su na mesto za uzgoj, koje je poželjno imalo prosečnu godišnju temperaturu od 30ºC, prosečnu godišnju relativenu vlažnost manju od 55%, i u kojoj je zemljište imalo poželjno, ali bez ograničenja, rezultate specifičnih hemijskih i fizičkih analiza zemljišta, na primer, kiselost, kalcijum, azot i upotrebu organskog đubriva u svim oblastima.

[0125] Nakon sađenja sadnica, prva berba je izvedena nakon 6 meseci, i drugi ponovni rast svaka 4 meseca, čime se garantuje optimizovani životni ciklus za grm sa ciljem maksimiziranja sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi.

[0126] Nakon sadnje, biljna biomasa je stabilizovana postupkom sušenja u stakleniku, pod definisanim uslovima temperature i vlažnosti. Biljke su osušene u sušnici sa izmenjivačem toplote, prisilnom cirkulacijom vazduha i temperaturom koja je u opsegu od 50 do 70 °C, poželjno 60 °C. Sušenje se sastojalo od prolaska toplog vazduha kroz biljke, uklanjanja vlage, dok se biljna biomasa ne stabilizuje sa vlažnošću između 10 i 12%. U poželjnom načinu ostvarivanja, vreme sušenja je od 8 do 20 sati.

[0127] Kao što je prikazano na Fig.1, biljna biomasa je podvrgnuta postupku mlevenja pomoću čekića sa 1800 o/min i sitom od 19mm, pri čemu je dobijena produktivnost od 50 do 150 kg/sat na sobnoj temperaturi. Nakon mlevenja, biljna biomasa podvrgnuta je vodenoj ekstrakciji na temperaturi između 80 i 90 °C, uz konstantno mešanje tokom 15 min. Količina korišćenog ekstraktivnog rastvora trebalo je da bude 10× količina korišćene biljne biomase, pri čemu je zagarantovana iscrpna ekstrakcija supstance od interesa u biljnoj biomasi.

[0128] Nakon prethodne faze, materijal je podvrgnut postupku maceracije tokom 10h na sobnoj temperaturi. Naknadno, materijal je ponovo zagrejan na 80 do 90 °C za 15 min.

[0129] Materijal je filtriran na obrtnom filteru sa okcem poliestarskog sita od 40um. Nakon faze filtracije, materijal je koncentrovan na "Bernauer" isparivaču i/ili isparivaču padajuceg filma do oko 30% ukupnih čvrstih materija.

[0130] Proizvod ove faze podvrgnut je sušenju u sušnici na raspršivanje, sa ulaznom temperaturom između 155 i 165 °C i izlaznom temperaturom između 85 i 95 °C, povezanoj sa odvlaživačem, poželjno Bry-Air tipa, tokom 20 do 40 sekundi, sa ciljem dobijanja najmanjeg mogućeg sadržaja preostale vlage (Tabela 1). Ovaj postupak suštinski poboljšava kvalitet obogaćenog ekstrakta, budući da preostala vlaga u materijalu inicijalno ugrožava stabilnost komponenata od interesa, tokom roka trajanja biljnog ekstrakta/derivata. Ovaj ekstraktivni postupak rezultuje odnosom od 10 do 12:1 i prinosom koji varira između 8 i 10%.

Tabela 1 – Sadržaj vlage u ekstraktu samo nakon sušenja i nakon sušenja sa odvlaživačem

1

[0131] Ekstraktivni postupak koji je gore opisan garantovao je iscrpnu ekstrakciju ipolamiida da bi se osigurala imunosupresivna aktivnost ekstrakta zbog prisustva derivata ipolamiida zagarantovanih u postupku. Prema tome, bilo je potrebno da se uspostavi postupak u kom se kontroliše ulazna biljna biomasa, tako da je stvarni sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu bio između 8.5 i 11.5%, kao što sledi u Tabeli 2. Kontrola ipolamiida u biljnoj biomasi osigurava prisustvo derivata ipolamiida sa imunosupresivnom aktivnošću u ekstraktu generisanom postupkom opisanim ovde.

Tabela 2 - Sadržaj ipolamiida u biljnoj biomasi i u ekstraktu.

[0132] Zahvaljujući ovome, moguće je da se odredi postupak za predviđanje teorijskog sadržaja ipolamiida i njegovih derivata u obogaćenom aktivnom ekstraktu. Za ovu svrhu, korišćena je jednačina za projektovanje sadržaja koji bi se dobio postupkom ekstrakcije (teorijski) iz stvarnog sadržaja ipolamiida u biljnoj biomasi (Jednačina I).

[0133] % Teorijskog sadržaja ipolamiida i derivata u ekstraktu = % Stvarnog sadržaja ipolamiida u biljnoj biomasi x DER / (< stvarni sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu/stvarni sadržaj ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi >) ± standardna devijacija (Jednačina I).

[0134] U gore opisanoj jednačini, DER se može razumeti kao količina biljne biomase potrebna da bi se dobio 1 kilogram prirodnog ekstrakta. Odnos između stvarnog sadržaja ipolamiida i derivata na ekstrakt/ sadržaj ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi je, poželjno, između oko 3.0 i oko 3.5.

2

[0135] Tako, na prospektivan način, pomoću gornje jednačine, moguće je odabrati samo biljnu biomasu (čiji je sadržaj ipolamiida dobijen analitičkim postupcima, kao što je HPLC) koja projektuje adekvatni teorijski sadržaj ipolamiida i derivata u ekstraktu između 8.5 i 11.5% i odbacuje one koji neće projektovati ovaj opseg. U ovom pronalasku je potvrđeno da će odnos između stvarnog sadržaja ipolamiida i derivata u ekstraktu i sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi biti, poželjno, između 3.0 i 3.5.

[0136] HPLC analiza obuhvatala je faze pripreme rastvora uzoraka i standarda, i njihovo eluiranje, kao što sledi:

1. Priprema rastvora

[0137]

1.1 – Rastvor mravlje kiseline 0.1% (pokretna faza A): U volumetrijski sud od 1000 mL koji sadrži približno 800 ml ultračiste vode, dodat je 1 ml mravlje kiseline. Zapremina suda je dopunjena ultračistom vodom i dobro homogenizovana.

1.2 – Rastvor mravlje kiseline i razblaživača: metanol (1:1): U peharu je umešano 50 mL 0.1% rastvora mravlje kiseline sa 50 mL metanola.

2. Priprema uzorka:

[0138] Sirovi materijal (biljni): 1.0 g mlevenog bilja je odmereno i preneto u žuto-narandžasti erlenmajer od 250 ml ili prekriveno aluminijumskom folijom. Dodato je 50 mL destilovane vode i ekstrahovano pod refluksom na 80 °C za 2 sata. Rastvor je filtriran pomoću papira u volumetrijski sud od 50 mL i ispunjen je destilovanom vodom. Filtriran je kroz membranu od 0.22 ILI 0.45 µm u HPLC fiolicu.

3. Priprema standarda:

[0139] Standard ipolamiida od 100ppm: 1.0 mg standarda ipolamiida je izmereno i preneto u žutonarandžasti volumetrijski sud od 10mL. Dodato je 5 ml razblaživača, koji je ostavljen u ultrasoničnom kupatilu tokom 10 minuta ili do potpunog rastvaranja. Napunjen je razblaživačem i zatim je došlo do homogenizacije. Analiza vlažnosti po Karl Fischer-u izvedena je za standard ipolamiida.

4. Analiza pomoću HPLC:

4.1-PARAMETRI/OPREMA

[0140]

- Kolona: Zorbax SB-C18 (250 mm x 4 mm; 5um)

- Pokretna faza:

(A) 0.1% mravlja kiselina;

(B) Metanol.

Tabela 3 – Gradijent eluiranja ipolamiida

4.2 – IZRAČUNAVANJE SADRŽAJA IPOLAMIIDA

[0141] Sadržaj ipolamiida (%) = A uzorak x M standard x P standard x D uzorak x (100 - U standard);

gde:

A uzorak: Oblast pika ipolamiida u uzorku

M standard: Masa ipolamiida standarda u mg

P standard: Čistoća standarda u decimalnom obliku

D uzorak: Razblaženje uzorka u mL

A standard: Oblast pika ipolamiida u standardu

M uzorak: Masa korišćenog uzorka u g

D standard: Razblaženje standarda u L

U standard: Vlažnost standarda izračunata po Karl Fischer-u

10000: Konverzija jedinica

[0142] Rezultat sadržaja u ekstraktu dat je u suvoj bazi, to jest, vlažnost je smanjena. Prema tome, izračunavanje mase ekstrakta bilo je:

gde:

Masa = Masa suvog ekstrakta (u gramima)

U uzorak = Vlažnost suvog ekstrakta u procentima, prema iT2-052.

5. Analiza derivata ipolamiida pomoću HPLC

5.1 - PARAMETRI/OPREMA

[0143]

- Kolona: Eclipse XDB Agilent - C18 (150 X 4.6 MM) 5 MIKRONA

- Pokretna faza:

(A) 0.1% pufer mravlje kiseline;

(B) Acetonitril

Tabela 4 – Gradijent eluiranja derivata ipolamiida

5.2 IZRAČUNAVANJE SADRŽAJA DERIVATA IPOLAMIIDA

[0144] Za analizu datog derivata ipolamiida (Y), podvrgnut je rastvoru definisane koncentracije. Ova koncentracija je direktno u korelaciji sa površinom uočenoj na hromatogramu. Ova površina, kada se uporedi sa ukupnom površinom hromatograma, pomnožena sa prethodno definisanom koncentracijom, daje procentualnu vrednost pomenutog derivata (Y) u uzorku, kao što se može videti dole:

(Σ sadržaj derivata = % ukupnog sadržaja derivata ipolamiida u uzorku.)

2

Biološka / imunosupresivna aktivnost

[0145] Ocenjivanje in vitro biološke aktivnosti vodenog ekstrakta iz Stachytarpheta cayennensis kao i ipolamiida i njegovih derivata izvedeno je kao što je prethodno opisano.

[0146] Ekstrakt iz Stachytarpheta cayennensis, ipolamiid i derivati ispitivani su u eksperimentalnom in vitro imunološkom modelu koji uključuje CD8+ T ćelije i IFNγ. Cilj ovog ispitivanja je bio da se proceni da li ekstrakt i druge supstance, izolovane ili umešane, deluju tako što blokiraju aktivaciju CD8+ T ćelija i posledičnu sekreciju IFNγ.

[0147] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) od zdravih volontera izolovane su iz slojeva leukocita Ficoll-Hystopaque centrifugiranjem. Nakon toga, humane CD8+ T ćelije izolovane su pomoću kompleta za izolovanje CD8+ T ćelija (Miltenyi Biotec, #130-096-495). Ove ćelije (3×10<5>ćelija/bunarčić) inkubirane su u RPMI 10% FBS podlozi, aktivirane sa αCD3/CD28 (1 µg/mL) i tretirane različitim koncentracijama vodenog ekstrakta iz Stachytarpheta cayennensis standardizovanog u 10% ipolamiida, izolovanim ipolamiidom i derivatima ipolamiida dobijenim kiselom hidrolizom da bi se ispitalo njihovo dejstvo na prevenciju aktivacije CD8+ T ćelija i izlučivanje IFNγ. Za ocenjivanje proliferacije ćelija, bromodezoksiuridin (BrdU), analog timidina koji se obično koristi za testove proliferacije, korišćen je kao marker za proliferaciju. Određenije, ocenjena je inkorporacija BrdU pomoću Biotrak ELISA Sistema (GE Healthcare, RPN250) prema instrukcijama proizvođača. Metodologija za kvantifikaciju interferona gama obuhvatala je upotrebu Human IFNγ ELISA Ready-SET-Go kompleta (eBiosciences 88-7316-88), a prema instrukcija proizvođača. Kao što je ilustrovano u skupu grafikona na Fig.2, vodeni ekstrakt

iz Stachytarpheta cayennensis obogaćen derivatima ipolamiida blokirao je aktivaciju CD8+ T ćelija indukovanih od strane αCD3/CD28. Izolovan ipolamiid nije imao dejstvo na proliferaciju CD8+ T ćelija indukovanu od strane αCD3/CD28, ili na izlučivanje IFNγ. Međutim, jedinjenja dobijena od ipolamiida u mešavini dobijenoj za njegovu kiselu hidrolizu značajno su smanjila proliferaciju CD8+ T ćelija i izlučivanje IFNγ. Derivati ipolamiida izolovani iz ove mešavine takođe su demonstrirali statistički značajno smanjenje proliferacije CD8+ T ćelija i izlučivanja IFNγ. Takrolimus, dobro poznati imunosupresivni agens, korišćen je kao referentno jedinjenje i kao pozitivna kontrola za eksperiment. Efekat dobijen pomoću takrolimusa bio je sličan onom dobijenom sa hidrolizovanim ipolamiidom i u proliferaciji ćelija i u IFNγ proizvodnji.

[0148] Prema tome, rezultati su pokazali da imunosupresivna aktivnost potiče od derivata ipolamiida, a ne od netaknutog molekula. Važno je naglasiti da su jedinjenja dobijena u eksperimentalnim uslovima kisele hidrolize izolovanog ipolamiida prisutna u vodenom ekstraktu iz Stachytarpheta cayennensis, kao što je prikazano na Fig.4. Međutim, prisustvo takvih jedinjenja je zahvaljujući postupku ekstrakcije korišćenom u ovom pronalasku.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenja opšte formule C, koja su derivati ipolamiida
u kojoj R odgovara H, OH, OGlyc (Glikozid); R1, R1', R1"odgovaraju H, OH; R2odgovara H, COOH, COOCH3, CH3, CHO; R3odgovara H, OH, CH3; R4, R4'odgovaraju H, OH, CH2OH, CH3. 2. Jedinjenja formule C prema zahtevu 1, odabrana od:
3. Jedinjenja formule C kao što su definisana u zahtevima 1 ili 2, za upotrebu kao lek.
4. Jedinjenja formule C kao što su definisana u zahtevima 1 ili 2, za upotrebu kao imunosupresanti u lečenju poremećaja imunološkog sistema.
5. Jedinjenja formule C kao što su definisana u zahtevima 1 ili 2, za upotrebu u lečenju vitiliga.
6. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata derivate ipolamiida formule C kao što su definisani u zahtevima 1 ili 2, i farmaceutski prihvatljiv vehikulum, koja opciono dalje obuhvata ipolamiid.
7. Postupak za proizvodnju ekstrakta obogaćenog derivatima ipolamiida formule C kao što su definisani u zahtevima 1 ili 2, koji obuhvata faze: a) odabira ulazne biljne biomase sa sadržajem ipolamiida između 2.5% i 3.5% dobijene iz biljaka roda Stachytarpheta; b) dovođenja odabrane biomase iz a) na sušenje u peći na temperaturi između 40 i 80°C, dok se ne postigne stabilizacija vlažnosti između 10 i 12%; 2 c) mlevenja biljne biomase; d) izvođenja ekstrakcije biljne biomase kroz faze: i. zagrevanja biljne biomase na temperaturi između 70 i 100°C, uz konstantno mešanje; ii. maceracije biljne biomase na sobnoj temperaturi; iii. zagrevanja biljne biomase sa temperaturom između 70 i 100°C.
8. Postupak za proizvodnju ekstrakta prema zahtevu 7, koji dalje obuhvata faze: iv. filtriranja i koncentrovanja ekstrakta; v. sušenja u sušnici na raspršivanje, tokom 1 do 60 sekundi, sa ulaznom temperaturom između 155 i 165°C i izlaznom temperaturom između 85 i 95°C, povezanoj sa odvlaživačem.
9. Postupak za proizvodnju ekstrakta, prema zahtevu 7, u kom se zagrevanje biljne biomase iz tačke iii) pod d) izvodi tokom 5 do 30 minuta.
10. Postupak za proizvodnju ekstrakta, prema zahtevu 7, u kom se zagrevanje biljne biomase iz tačke i) pod d) izvodi tokom 5 do 15 sati.
11. Postupak za proizvodnju ekstrakta, prema zahtevu 7, u kom ulazna biljna biomasa obuhvata nadzemne delove biljaka roda Stachytarpheta.
12. Postupak za proizvodnju ekstrakta, prema zahtevu 7, u kom je biljka Stachytarpheta cayennensis.
13. Postupak za proizvodnju ekstrakta, prema zahtevu 7, u kom postupak obuhvata vodenu ekstrakciju.
14. Postupak za proizvodnju ekstrakta, prema bilo kom od zahteva 7 do 13, koji obuhvata fazu predviđanja teorijskog sadržaja ipolamiida i njegovih derivata formule C u ekstraktu iz stvarnog sadržaja ipolamiida u ulaznoj biljnoj biomasi na osnovu Jednačine I:
15. Ekstrakti iz biljaka roda Stachytarpheta obogaćeni derivatima ipolamiida formule C kao što su definisani u zahtevima 1 ili 2.
16. Ekstrakti iz biljaka roda Stachytarpheta obogaćeni derivatima ipolamiida formule C, dobijeni postupkom kao što je definisan u bilo kom od zahteva 7 do 14.
17. Ekstrakti iz biljaka roda Stachytarpheta prema zahtevu 15 ili zahtevu 16, koji sadrže od 1% do 20% ipolamiida ili derivata ipolamiida formule C.
18. Ekstrakti iz biljaka roda Stachytarpheta kao što su definisani u bilo kom od zahteva 15 do 17, za upotrebu kao imunosupresanti u lečenju poremećaja imunološkog sistema. 2