RS63279B1

RS63279B1 - Psma ligandi za snimanje i endoradioterapiju

Info

Publication number: RS63279B1
Application number: RS20220527A
Authority: RS
Inventors: Hans-Jürgen Wester; Alexander Schmidt; Mara Parzinger
Original assignee: Univ Muenchen Tech
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2022-06-30
Also published as: IL274072A; TN2020000072A1; EP3723815B1; CR20200241A; AU2018382479A1; FI4008359T3; CL2020001542A1; JP7572080B2; HUE069034T2; CN111182927B; CN116617421B; CN111182927A; PT4008359T; BR112020011727A2; AU2025200837A1; IL313103B2; KR20200097690A; US20230122957A1; EP4464341A3; IL313103A

Description

Opis

Ovaj pronalazak se odnosi na bolesti u koje je uključen prostata-specifični membranski antigen (PSMA). Obezbeđena su jedinjenja koja vezuju ili inhibiraju PSMA i, pored toga, nose najmanje jedan deo koji je odgovoran za radio-obeležavanje i njegovo korišćenje u snimanjima i endoradioterapiji, kako je definisano posredstvom patentnih zahteva.

Rak prostate (PCa) je, tokom poslednjih decenija, zadržao poziciju najčešće maligne bolesti kod muškaraca, sa visokom incidencijom niskih stopa preživljavanja. Zbog svoje prekomerne ekspresije u raku prostate (Silver, D.A., et al., Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clinical Cancer Research, 1997. 3(1): p.

81-85), prostata-specifični membranski antigen (PSMA) ili glutamat karboksipeptidaza II (GCP II) je dokazao svoju kvalifikovanost da bude izvrsna meta za razvijanje sredstava koja su visoko-senzitivni radio-obeleživači za endoradioterapiju i snimanja PCa (AfsharOromieh, A., et al., The diagnostic value of PET/CT imaging with the 68Ga-labelled PSMA ligand HBED-CC in the diagnosis of recurrent prostate cancer. European journal of nuclear medicine and molecular imaging, 2015. 42(2): p. 197-209; Benesová, M., et al., Preclinical Evaluation of a Tailor-Made DOTA-Conjugated PSMA Inhibitor with Optimized Linker Moiety for Imaging and Endoradiotherapy of Prostate Cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2015. 56(6): p. 914-920; Robu, S., et al., Preclinical evaluation and first patient application of 99mTc-PSMA-I&S for SPECT imaging and radioguided surgery in prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2016: p. jnumed. 116.178939; Weineisen, M., et al., Development and first in human evaluation of PSMA I&T-A ligand for diagnostic imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2014. 55(supplement 1): p. 1083-1083; Rowe, S., et al., PET imaging of prostate-specific membrane antigen in prostate cancer: current state of the art and future challenges.

Prostate cancer and prostatic diseases, 2016; Maurer, T., et al., Current use of PSMA-PET in prostate cancer management. Nature Reviews Urology, 2016). Prostataspecifični membranski antigen je ekstracelularna hidrolaza, čiji katalitički centar sadrži dva jona cinka (II) sa premoštavajućim hidroksido ligandom. Postoji visoka ushodna regulisanost u slučajevima metatatskih i hormon-refraktornih karcinoma prostate, ali se njihova fiziološka ekspresija beleži, isto tako, u bubrezima, pljuvačnim žlezdama, tankom crevu i mozgu, a u niskom stepenu, takođe, i u zdravom tkivu pristate. U crevu, PSMA olakšava apsorpciju folata, posredstvom konverzije pteroilpoli-g-glutamata u pteroilglutamat (folat). U mozgu, PSMA vrši hidrolizu N-acetil-L-aspartil-L-glutamata (NAAG) u N-acetil-L-aspartat i glutamat. Enzimska funkcija PSMA u normalnoj i oboleloj prostati nije još razjašnjena.

Molekuli sa ciljanim delovanjem na PSMA uglavnom sadrže vezujuću jedinicu koja uključuje grupu koja vezuje cink (kao što je urea (Zhou, J., et al., NAAG peptidase inhibitors and their potential for diagnosis and therapy. Nature Reviews Drug Discovery, 2005.4(12): p.1015-1026), fosfinat ili fosforamidat), koja je povezana na deo P1’ glutamata, koji omogućuje visoki afinitet i specifičnost za PSMA, i obično je dalje povezan na efektorske funkcionalne grupe (Machulkin, A.E., et al., Small-molecule PSMA ligands. Current state, SAR and perspectives. Journal of drug targeting, 2016: p. 1-15). Efektorski deo je fleksibilniji i do izvesnog stepena, tolerantniji prema strukturnim modifikacijama. Ulazni kanal PSMA se prilagođava drugim dvema istaknutim strukturnim karakteristikama, koje su od značaja za vezivanje liganda. Prvu predstavlja argininski sloj, pozitivno naelektrisana površina na zidu ulaznog levka i strukturno objašnjenje za prednost negativno naelektrisanih funkcionalnih grupa na P1 poziciji PSMA. Prilikom vezivanja, udruženo repozicioniranje argininskih bočnih lanaca može dovesti do otvaranja S1 hidrofobnog pomoćnog džepa, koji predstavlja drugu važnu strukturu, za koju se pokazalo da vrši prilagođavanje jodo-benzil grupe nekolicine inhibitora, na bazi uree, čime doprinosi njihovom viskom afinitetu za PSMA (Barinka, C., et al., Interactions between Human Glutamate Carboxypeptidase II and UreaBased Inhibitors: Structural Characterization†. Journal of medicinal chemistry, 2008.51(24): p.7737-7743).

Zhang i saradnici su otkrili udaljeni vezujući položaj PSMA, koji se može koristiti za bidentatni režim vezivanja (Zhang, A.X., et al., A remote arene-binding site on prostate specific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules. Journal of the American Chemical Society, 2010.132(36): p.12711-12716). Takozvani vezujući položaj za arene je jednostavni strukturni motiv, koji oblikuju bočni lanci Arg463, Arg511 i Trp541, i čini deo ulaznog kapka PSMA. Zauzimanje vezujućeg položaja za arene od strane distalnog dela inhibitora može dovesti do značajnog povećavanja afiniteta inhibitora za PSMA, zbog efekata aviditeta. PSMA I&T (vidi Sliku 1) je razvijen s namerom da tako vrši interakciju sa PSMA, iako nije raspoloživa analiza kristalne strukture vezujućeg režima. Neophodna karakteristika prema Zhangu i saradnicima je jedinica linkera (suberinska kiselina u slučaju PSMA I&T), koja olakšava formiranje otvorene konformacije ulaznog kapka PSMA, omogućujući, na taj način, dostupnost vezujućeg položaja za arene. Pokazalo se, pored toga, da strukturni sastav linkera ima značajni uticaj na ciljano delovanje na tumor i biološku aktivnost, kao i na kontrastna snimanja i farmakokinetiku (Liu, T., et al., Spacer length effects on in vitro imaging and surface accessibility of fluorescent inhibitors of prostate specific membrane antigen. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2011. 21(23): p. 7013-7016), što su karakteristike od presudnog značaja za visoki kvalitet snimka i efikasnu ciljanu endoradioterapiju.

Trenutno su, na kliničkim nivoima, u upotrebi dve kategorije inhibitora sa ciljanim delovanjem na PSMA. S jedne strane su obeleživački agensi sa helatirajućim jedinicama za stvaranje kompleksa sa radionuklidima, kao što su PSMA I&T ili srodna jedinjenja (Kiess, A.P., et al., Prostatespecific membrane antigen as a target for cancer imaging and therapy. The quarterly journal of nuclear medicine and molecular imaging: official publication of the Italian Association of Nuclear Medicine (AIMN)[and] the International Association of Radiopharmacology (IAR), [and] Section of the Society of...2015.59(3): p.241). S druge strane su mali molekuli, koji sadrže ciljnu jedinicu i efektorske molekule. U zavisnosti od korišćenog radionuklida/halogena, inhibitori PSMA, obeleženi radionuklidom mogu biti upotrebljeni za snimanja ili endoradioterapiju. Među inhibitorima malih molekula sa helatorskim agensima za snimanja, najčešće korišćena sredstva za selektivna PSMA snimanja su: PSMA HBED-CC (Eder, M., et al., 68Ga-complex lipophilicity and the targeting property of a urea-based PSMA inhibitor for PET imaging. Bioconjugate chemistry, 2012. 23(4): p. 688-697), PSMA-617 (Benesová, M., et al., Preclinical Evaluation of a Tailor-Made DOTA-Conjugated PSMA Inhibitor with Optimized Linker Moiety for Imaging and Endoradiotherapy of Prostate Cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2015. 56(6): p. 914-920) i PSMA I&T (Weineisen, M., et al., Development and first in human evaluation of PSMA I&T-A ligand for diagnostic imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2014. 55(supplement 1): p.

1083-1083). PSMA HBED-CC ili PSMA-11 je bio jedan od prvih inhibitora PSMA i trenutno se koristi za snimanje, budući da primene u terapeutske svrhe nisu moguće sa helatorom HBED-CC. Međutim, zbog jedinstvenih fizičkih karakteristika i prednosti<18>F za PET snimanja, poputdužeg polu-života i niske pozitronske energije, što dovodi do veće rezolucije snimaka i mogućnosti ciklotronske proizvodnje velikih razmera, fokusiralo se na nekoliko grupa pri razvijanju inhibitora na bazi uree, koji su obeleženi sa<18>F, a namenjeni su snimanjima PCa. Inhibitor PSMA na bazi uree, koji je obeležen sa<18>F, [<18>F]DCFPyl, demonstrirao je obećavajuće rezultate u otkrivanju primarnog i metastatskog PCa (Rowe, S.P., et al., PSMA-Based [18F] DCFPyL PET/CT Is Superior to Conventional Imaging for Lesion Detection in Patients with Metastatic Prostate Cancer. Molecular Imaging and Biology, 2016: p. 1-9) i superiornost u odnosu na [<68>Ga]PSMA-HBED-CC u komparativnoj studiji (Dietlein, M., et al., Comparison of [18F] DCFPyL and [68Ga] Ga-PSMA-HBED-CC for PSMA-PET imaging in patients with relapsed prostate cancer. Molecular Imaging and Biology, 2015.17(4): p.575-584).

PSMA DKFZ 617 (Benesová, M., et al., Preclinical Evaluation of a Tailor-Made DOTA-Conjugated PSMA Inhibitor with Optimized Linker Moiety for Imaging and Endoradiotherapy of Prostate Cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2015. 56(6): p. 914-920, Becker, A., et al., Nephro-and hepatotoxicity after radioligand therapy of metastatic castrateresistant prostate cancer with 177Lu-PSMA-617. Journal of Nuclear Medicine, 2016.

57(supplement 2): p.1430-1430; Rahbar, K., et al., Response and tolerability of a single dose of 177Lu-PSMA-617 in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer: a multicenter retrospective analysis. Journal of Nuclear Medicine, 2016: p. jnumed.116.173757) i PSMA I&T (Weineisen, M., et al., Development and first in human evaluation of PSMA I&T-A ligand for diagnostic imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2014. 55(supplement 1): p. 1083-1083, Eiber, M., et al., Systemic radioligand therapy with 177Lu-PSMA I&T in patients with metastatic castrationresistant prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2016.57(supplement 2): p.61-61; Schottelius, M., et al., [111 In] PSMA-I&T: expanding the spectrum of PSMA-I&T applications towards SPECT and radioguided surgery. EJNMMI research, 2015. 5(1): p. 1) se primenjuju na kliničkim nivoima za palijativno lečenje pacijenata sa rakom prostate. Helatirajuća jedinica DOTA i srodni DOTAGA, omogućuju ne samo snimanja, već, isto tako, i primene u terapeutske svrhe, budući da područje za moguće stvaranje helata sa radiometalom obuhvata, između ostalih,<111>In,<177>Lu,<90>Y i<213>Bi. [<111>In]PSMAI&T je već implementiran na kliničkom nivou za radio-navođenu hirurgiju za ispomoć hirurgu prilikom ekscizije malignog tkiva (Schottelius, M., et al., [111 In] PSMA-I&T: expanding the spectrum of PSMA-I&T applications towards SPECT and radioguided surgery. EJNMMI research, 2015.5(1): p.1). Isto tako, nedavno razvijeni i klinički testirani PSMA inhibitor, PSMA I&S (za snimanja i hirurgiju) pokazao je veoma ohrabrujuće rezultate (Robu, S., et al., Preclinical evaluation and first patient application of 99mTc-PSMA-I&S for SPECT imaging and radioguided surgery in prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2016: p. jnumed.

116.178939).

Endoradioterapeutski pristupi sa [<177>Lu]PSMA I&T pokazali su potencijale efikasnosti, podnošljivosti i visoke bezbednosti kod pacijenata, koji su primili do četiri ciklusa sa 7.4 GBq. Dobijene dozimetrijske vrednosti za zračenje organa, otkrile su da naročito bubrezi i pljuvačne žlezde primaju najveću dozu nakon tumorskih lezija. Slične vrednosti za zračenje prikazane su i za PSMA DKFZ 617 i [<18>F]DCFPyL (Rowe, S.P., et al., PSMA-Based [18F] DCFPyL PET/CT Is Superior to Conventional Imaging for Lesion Detection in Patients with Metastatic Prostate Cancer. Molecular Imaging and Biology, 2016: p. 1-9; Delker, A., et al., Dosimetry for 177Lu-DKFZ-PSMA-617: a new radiopharmaceutical for the treatment of metastatic prostate cancer.

European journal of nuclear medicine and molecular imaging, 2016.43(1): p.42-51; Kabasakal, L., et al., Pre-therapeutic dosimetry of normal organs and tissues of 177Lu-PSMA-617 prostatespecific membrane antigen (PSMA) inhibitor in patients with castration-resistant prostate cancer. European journal of nuclear medicine and molecular imaging, 2015. 42(13): p. 1976-1983; Yadav, M.P., et al., 177Lu-DKFZ-PSMA-617 therapy in metastatic castration resistant prostate cancer: safety, efficacy, and quality of life assessment. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2016: p. 1-11). Ove povišene brojeve je moguće objasniti fiziološkom ekspresijom PSMA (Silver, D.A., et al., Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clinical Cancer Research, 1997. 3(1): p.

81-85) i renalnom ekskrecijom jedinjenja, obeleženog radionuklidom. Povremena pojava renalnih i hematoloških toksičnih dejstava posle njihove primene uglavnom je reverzibilna, premda je legitimna zabrinutost u vezi sa hroničnom toksičnošću, posebno kod pacijenata sa ukupno uzevši dugim stepenima preživljavanjima, kao što je slučaj sa pacijentima sa PCa. Sledstveno tome, postoji potreba za pogodnim konceptom za smanjivanje neželjenog zračenja i istovremeno za povećanje prihvatanja od strane tumora.

WO 2017/165473 na jednaki način prikazuje sredstva viskog afiniteta sa ciljanim delovanjem na prostata specifični membranski antigen za potrebe endoradioterapije raka prostate.

S obzirom na prethodno navedeno, tehnički problem koji je u osnovi ovog pronalaska, može se razumeti u obezbeđivanju načina i sredstava za ublažavanje zračenjem izazvanih sporednih efekata radionuklidom obeleženih dijagnostičkih sredstava i terapeutskih sredstava sa ciljanim delovanjem na PSMA. Dalji tehnički problem može se razumeti u obezbeđivanju načina i postupaka za povećanje prihvata od strane tumora takvih dijagnostičkih sredstava i terapeutika. Uopštenije govoreći, tehnički problem se može shvatiti u smislu obezbeđivanja unapređenih sredstava koja vezuju PSMA.

Tehnički problem je razrešen posredstvom predmetne materije, sažeto prikazane u priključenim patentnim zahtevima, i detaljno objašnjene u nastavku.

Određenije, ovaj pronalazak obezbeđuje, u prvom aspektu, jedinjenje formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so,

pri čemu:

m je ceo broj od 2 do 6, poželjno 2 do 4, poželjnije 2;

n je ceo broj od 2 do 6, poželjno 2 do 4, poželjnije 2 ili 4;

R<1L>je CH2, NH ili O, poželjno NH;

R<2L>je C ili P(OH), poželjno C;

R<3L>je CH2, NH ili O, poželjno NH;

X<1>je odabran od amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, mosta uree i aminske veze, a poželjno je amidna veza;

L<1>je dvovalentna spajajuća grupa sa strukturom koja je odabrana od: oligoamida, oligoetra, oligotioetra, oligoestra, oligotioestra, oligouree, oligo(etar-amida), oligo(tioetar-amida), oligo(estar-amida), oligo(tioestar-amida), oligo(urea-amida), oligo(etar-tioetra), oligo(etar-estra), oligo(etar-tioestra), oligo(etar-uree), oligo(tioetarestra), oligo(tioetar-tioestra), oligo(tioestar-uree), oligo(estar-tioestra), oligo(estaruree) i oligo(tioestar-uree), poželjno sa strukturom, odabranom od oligoamida i oligo(estar-amida), čija spajajuća grupa može nositi EDS grupu;

X<2>je odabran od: amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, urea mosta i aminske veze, a poželjno je amidna veza;

R<2>je opciono supstituisana aril grupa ili opciono supstituisana aralkil grupa, pri čemu aril grupa ili aralkil grupa može biti supstituisana na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, odabranih od halogena, poželjno I, i -OH;

R<3>je opciono supstituisana aril grupa ili opciono supstituisana aralkil grupa, pri čemu aril grupa ili aralkil grupa može biti supstituisana na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i -OH;

r je 0 ili 1, poželjno 1;

p je 0 ili 1;

q je 0 ili 1; a poželjno p+q = 1;

R<4>je odabran od aril grupe i grupe EDS;

X<3>je odabran od: amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, mosta uree, aminske veze i grupe sa formulom

pri čemu obeležena veza na karbonilnoj grupi vezuje X<3>za R<M>, a druga obeležena veza vezuje X<3>za preostali deo jedinjenja formule (I);

a poželjno je amidna veza;

R<M>je marker grupa koja sadrži helatnu grupu, koja opciono sadrži helatizovani neradioaktivni ili radioaktivni katjon;

i pri čemu je EDS grupa sadržana najmanje jednom u jedinjenju formule (I) i ima strukturu koja je odabrana od: (E-1A), (E-1B), (E-2A) i (E-2B):

pri čemu

označava vezu koja povezuje EDS grupu za preostali deo jedinjenja formule (I);

s je 1, 2 ili 3, poželjno 1 ili 2, još poželjnije 1;

t je 1, 2 ili 3, poželjno 1 ili 2, još poželjnije 2;

R<5A>je, nezavisno za svako pojavljivanje kada je s > 1, supstituent koji povlači elektron, koji je poželjno odabran od –NO2i -COOH, i koji je, poželjnije -COOH, i pri čemu veza između R<5A>i prstena fenila ukazuje da s grupa R<5A>zamenjuje s vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na fenilnom prstenu;

R<5B>je, nezavisno, za svako pojavljivanje kada je s > 1, supstituent koji nosi elektronski jonski par na atomu, koji je direktno vezan za fenilni prsten, prikazan u formuli (E-1B), pri čemu je supstituent poželjno odabran od -OH i –NH2, i koji je još poželjnije –NH2, i pri čemu veza između R<5B>i prstena fenila pokazuje da s grupa R<5B>zamenjuje s vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na prstenu fenila;

R<6A>je, nezavisno za svako pojavljivanje kada je t > 1, supstituent koji povlači elektron, koji je poželjno odabran od –NO2i -COOH, i koji je, poželjnije -COOH, i pri čemu veza između R<6A>i prstena fenila pokazuje da t grupa R<6A>zamenjuje t vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na prstenu fenila; i

R<6B>je, nezavisno, za svako pojavljivanje kada je t > 1, supstituent koji nosi elektronski jonski par na atomu, koji je direktno vezan za fenilni prsten, prikazan u formuli (E-1B), pri čemu je supstituent poželjno odabran od -OH i –NH2, i koji je, još poželjnije, -OH, i pri čemu veza između R<6B>i prstena fenila pokazuje da t grupa R<6B>zamenjuje t atoma vodonika na bilo kojoj poziciji na fenilnom prstenu.

Uvođenje EDS supstituenta, kako je prethodno prikazan, pri čemu aromatični prsten nosi jedan ili više supstituenata sa visokom gustinom elektrona, koji su odabrani od supstituenta koji povlači elektron i supstituenta koji nosi elektronski jonski par, dovodi do nekoliko neočekivanih prednosti. Ove prednosti uključuju: pojačani afinitet, poboljšanu internalizaciju, povećano zadržavanje u tumorskim ćelijama, niže nespecifično vezivanje, smanjenu akumulaciju u bubrezima i povećano prihvatanje od strane tumora.

Posebno smanjeno nespecifično prihvatanje od strane organa koji nisu prostata dovodi do manjeg neželjenog zračenja i do smanjenja sporednih efekata, izazvanih zračenjem.

Da bi se ove prednosti prikazale posredstvom primera, ukazali smo na karakteristike posebno poželjnih jedinjenja, koja su ovde označena kao PSMA-71 i PSMA-66, što je detaljnije razmotreno u nastavku.

Određenije, nanomolarni afinitet (5.3 ± 2.0 nM vs. 7.9 ± 2.4 nM), koji je drastično unapredio internalizaciju (206.8 ± 1.7% vs.75.5 ± 1.6%), pokazuje superiornost [<177>Lu]PSMA-71kada se uporedi sa [<177>Lu]PSMA I&T. Podaci za biodistribuciju su otkrili da je [<177>Lu]PSMA-71 ispoljio značajno veći prihvat od strane tumora (14.29 ± 0.89 vs. 4.06 ± 1.12 %ID/g, redom) u poređenju sa [<177>Lu]PSMA I&T, dok je akumulacija u bubrezima bila slična (32.36 ± 2.49 vs.

34.66 ± 17.20 %ID/g).

Slično prethodnom, niži nanomolarni afinitet (3.8 ± 0.3 nM vs. 7.9 ± 2.4 nM), koji je drastično poboljšao internalizaciju (297.8 ± 2.0% vs.75.5 ± 1.6%), uvećao je in vitro retenciju u tumorskim ćelijama (90.1 ± 3.5% vs. 62.8 ± 0.4%, 60-minutna inkubacija), zajedno sa nižim nespecifičnim vezivanjem in vivo, smanjenom akumulacijom u bubrezima (117.5 ± 6.9% ID/g vs.

128.9 ± 10.7% ID/g) i više nego dvostruko uvećanim prihvatanjem od strane tumora (10.0 ± 0.4% vs.4.7 ± 1.0% ID/g), demonstrirao je superiornost [<177>Lu]PSMA-66 u direktnom poređenju sa [<177>Lu]PSMA I&T.

Kako je prethodno navedeno, soli jedinjenja pronalaska, uključujući jedinjenja formule (I) (i uključujući njihova poželjna ostvarenja), takođe su pogodna za korišćenje u okviru pronalaska. Podrazumevaće se da su ove soli opšti farmaceutski prihvatljivi oblici soli ovih jedinjenja, koje se mogu obrazovati, npr., putem protonacije atoma koji nosi elektronski jonski par, koji je podložan protonaciji, kao što je amino grupa, sa neorganskom ili organskom kiselinom, ili u vidu soli grupe karboksilne kiseline sa fiziološki prihvatljivim katjonom, kako je u struci dobro poznato. Primeri baznih adicionih soli uključuju, na primer, soli alkalnih metala, kao što su soli natrijuma ili kalijuma; soli zemno-alkalnih metala, kao što su soli kalcijuma ili magnezijuma; amonijumske soli; soli alifatskih amina, kao što su soli trimetilamina, trietilamina, dicikloheksilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, soli prokaina, soli meglumina, soli dietanol amina ili soli etilendiamina; aralkil aminske soli, kao što su soli N,N-dibenziletilendiamina, soli benetamina; heterociklične aromatične aminske soli, kao što su soli piridina, soli pikolina, soli hinolina ili soli izohinolina; kvaternerne amonijumske soli, kao što su tetrametilamonijumske soli, tetraetilamonijumske soli, benziltrimetilamonijumske soli, benziltrietilamonijumske soli, benziltributilamonijumske soli, metiltrioktilamonijumske soli ili tetrabutilamonijumske soli; i soli baznih aminokiselina, kao što su soli arginina ili soli lizina. Primeri kiselih adicionih soli obuhvataju, na primer, soli mineralnih kiselina, kao što su: hidrohloridne, hidrobromidne, hidrojodidne, sulfatne soli, nitratne soli, fosfatne soli (kao što su, npr., fosfatne, hidrogenfosfatne ili dihidrogenfosfatne soli), karbonatne soli, hidrogenkarbonatne soli ili perhloratne soli; soli organskih kiselina, kao što su acetatne, propionatne, butiratne, pentanoatne, heksanoatne, heptanoatne, oktanoatne, ciklopentanpropionatne, undekanoatne, laktatne, maleatne, oksalatne, fumaratne, tartratne, malatne, citratne, nikotinatne, benzoatne, salicilatne ili askorbatne soli; soli sulfonata, kao što su soli metansulfonata, etansulfonata, 2-hidroksietansulfonata, benzensulfonata, p-toluensulfonata (tosilat), 2-naftalensulfonata, 3-fenilsulfonata ili kamforsulfonata; i soli kiselih aminokiselina, kao što su aspartatne ili glutamatne soli.

Dalji primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, acetat, adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bisulfat, bitartrat, borat, bromid, butirat, kalcijum edetat, kamforat, kamforsulfonat, kamsilat, karbonat, hlorid, citrat, klavulanat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dihidrohlorid, dodecilsulfat, edetat, edisilat, estolat, esilat, etansulfonat, formijat, fumarat, gluceptat, glukoheptonat, glukonat, glutamat, glicerofosfat, glikolilarsanilat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, heksilrezorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidrojodid, 2-hidroksi-etansulfonat, hidroksinaftoat, jodid, izotionat, laktat, laktobionat, laurat, lauril sulfat, malat, maleat, malonat, mandelat, mezilat, metansulfonat, metilsulfat, mukat, 2-naftalensulfonat, napsilat, nikotinat, nitrat, N-metilglukamin amonijumsku so, oleat, oksalat, pamoat (embonat), palmitat, pantotenat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, fosfat/difosfat, pikrat, pivalat, poligalakturonat, propionat, salicilat, stearat, sulfat, subacetat, sukcinat, tanat, tartrat, teoklat, tosilat, trietjodid, undekanoat, valerat i slične soli (vidi, na primer, S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp.1-19 (1977)).

Podrazumevalo bi se da tokom tekuće specifikacije, izraz "jedinjenje" obuhvata solvate, polimorfe, prolekove, kolekove, kokristale, tautomere, racemate, enantiomere ili dijastereomere ili njihove mešavine, ukoliko nije navedeno drugačije.

Kada su jedinjenja ovog pronalaska obezbeđena u kristalnom obliku, struktura može sadržavati molekule rastvarača. Rastvarači su uobičajeni farmaceutski prihvatljivi rastvarači i uključuju, između ostalih, vodu (hidrati) ili organske rastvarače. Primeri mogućih solvata uključuju etanolate i izo-propanolate.

Izraz "kolek" se odnosi na dva ili više terapeutskih jedinjenja, povezanih preko kovalentne hemijske veze. Detaljna definicija se može naći, npr., u N. Das et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 41, 2010, 571-588.

Naziv "kokristal" se odnosi na višekomponentni kristal u kome su sve komponente u čvrstom stanju pod ambijentalnim uslovima, kada se nalaze u svom čistom obliku. Ove komponente koegzistiraju u vidu stehiometrijskog ili ne-stehiometrijskog odnosa ciljnog molekula ili jona (t.j, jedinjenje ovog pronalaska) i jednog ili više neutralnih gradivnih molekula kokristala. Detaljno razmatranje se može naći, na primer, u Ning Shan et al., Drug Discovery Today, 13(9/10), 2008, 440-446 i u D. J. Good et al., Cryst. Growth Des., 9(5), 2009, 2252-2264.

Jedinjenja ovog pronalaska, takođe, mogu biti obezbeđena u obliku proleka, to jest u vidu jedinjenja koje se in vivo metaboliše u aktivni metabolit. Pogodni prolekovi su, na primer, estri. Specifični primeri pogodnih grupa dati su, između ostalih, u US 2007/0072831, u pasusima [0082] do [0118] ispod naslova prolekova i zaštitnih grupa.

Podrazumeva se da su, sve dok jedinjenja pronalaska ispoljavaju pH-zavisno stanje naelektrisanja, sve moguća stanja naelektrisanosti obuhvaćena. U tom pogledu, poželjni raspon pH je od 0 do 14.

Sve do nivoa kada jedinjenje u skladu sa pronalaskom nosi neto naelektrisanje, podrazumeva se da je jedinjenje obezbeđeno u elektroneutralnom obliku. To se postiže uz pomoć jednog ili više jona suprotnog naelektrisanja, pri čemu su poželjni joni suprotnog naelektrisanja definisani u odnosu na prethodni naziv "so".

U formuli (I), m je ceo broj od 2 do 6. Poželjno, m je 2 do 4, još poželjnije 2. R<1L>jeCH2, NH ili O, poželjno NH. R<2L>je C ili P(OH), poželjno C. R<3L>je CH2, NH ili O, poželjno NH. Sledstveno tome, takođe su poželjna jedinjenja formule (I) ili njihove soli u kojima je m 2, R<1L>je NH, R<2L>je C, a R<3L>je NH.

n je ceo broj od 2 do 6, poželjno 2 do 4, još poželjnije 2 ili 4, a najpoželjnije 2.

Sledstveno tome, posebno su poželjna jedinjenja formule (I) ili njihove soli u kojima je m 2, n je 2 ili 4, R<1L>je NH, R<2L>je C, a R<3L>je NH. Poželjnija sa jedinjenja formule (I) ili njihove soli u kojima je m 2, n je 2, R<1L>je NH, R<2L>je C, a R<3L>je NH.

X<1>u formuli (I) je odabran od amidne veze (t.j., -C(O)-NH-), etarske veze (t.j., -O-), tioetarske veze (t.j.,. -S-), estarske veze (t.j., -C(O)-O-), tioestarske veze (t.j., -C(S)-O- ili -C(O)-S-), mosta uree (t.j., -NH-C(O)-NH-) i aminske veze (t.j., -NH-). Kao X<1>, poželjna je amidna veza.

Pored toga, dalje je poželjno da u formuli (I) n je 2 i X<1>je amidna veza, pri čemu je atom ugljenika amidne veze -C(O)-NH- vezan za grupu -(CH2)n-, ili da je n 4, a X<1>je amidna veza, pri čemu je atom ugljenika amidne veze -C(O)-NH- vezan za grupu -(CH2)n-. Među navedenim, poželjnija je opcija da je n 2, a X<1>je amidna veza, pri čemu je atom ugljenika amidne veze -C(O)-NH- vezan za grupu -(CH2)n-.

Sledstveno tome, posebno su poželjna jedinjenja formule (I) i njihove soli, pri čemu u formuli (I), m je 2, n je 2, R<1L>je NH, R<2L>je C, R<3L>je NH, a X<1>je amidna veza, pri čemu je atom ugljenika amidne veze -C(O)-NH- vezan za grupu -(CH2)n-.

L<1>u formuli (I) je dvovalentna spajajuća grupa sa strukturom, koja je odabrana od: oligoamida, oligoetra, oligotioetra, oligoestra, oligotioestra, oligouree, oligo(etar-amida), oligo(tioetar-amida), oligo(estar-amida), oligo(tioestar-amida), oligo(urea-amida), oligo(etartioetra), oligo(etar-estra), oligo(etar-tioestra), oligo(etar-uree), oligo(tioetar-estra), oligo(tioetartioestra), oligo(tioetar-uree), oligo(estar-tioestra), oligo(estar-uree) i oligo(tioestar-uree), poželjno sa strukturom, odabranom od oligoamida i oligo(estar-amida), i još poželjnije sa oligoamidnom strukturom, pri čemu spajajuća grupa može nositi EDS grupu.

Naziv "oligo", kako je korišćen u definiciji L<1>u smislu oligoamida, oligoetra, oligotioetra, oligoestra, oligotioestra, oligouree, oligo(etar-amida), oligo(tioetar-amida), oligo(estar-amida), oligo(tioestar-amida), oligo(urea-amida), oligo(etar-tioetra), oligo(etar-estra), oligo(etar-tioestra), oligo(etar-uree), oligo(tioetar-estra), oligo(tioetar-tioestra), oligo(tioetaruree), oligo(estar-tioestra), oligo(estar-uree) i oligo(tioestar-uree), poželjno bi trebalo da se shvati tako da se odnosi na grupu u kojoj je 2 do 20, još poželjnije u kojoj je 2 do 10 subjedinica povezano pomoću veza, čija vrsta je specifično navedena u istim nazivima. Kao što će biti razumljivo stručnom čitaocu, kada su u zagradama navedene dve različite vrste veza, obe vrste veza su sadržane u dotičnoj grupi (npr., u "oligo (ester-amidu)" su sadržane estarske veze i amidne veze).

Još je poželjnije da L<1>ima strukturu, odabranu od oligoamida, koji sadrži ukupno 1 do 5, poželjnije ukupno 1 do 3, a najpoželjnije ukupno 1 ili 2 amidne veze unutar svoje strukture, i oligo(estar-amida) koji sadrži ukupno 2 do 5, poželjnije ukupno 2 do 3, a najpoželjnije ukupno 2 amidne i estarske veze unutar svoje strukture. U posebno poželjnom ostvarenju, L<1>predstavlja dvovalentnu spajajuću grupu sa oligoamidnom strukturom koja sadrži 1 ili 2 amidne veze unutar svoje strukture.

Pored toga, L<1>može nositi EDS grupu (t.j., grupu koja nosi supstituent sa visokom gustinom elektrona ili "supstituent elektronske gustine") kako je ovde definisana, t.j., EDS grupu, koja je kovalentno vezana za L<1>. Poželjno, opciono je EDS grupa povezana kao supstituent za strukturu dvovalentne spajajuće grupe L<1>, pri čemu L<1>ima strukturu kao što je prethodno definisana, a odabrana je od: oligoamida, oligoetra, oligotioetra, oligoestra, oligotioestra, oligouree, oligo(etar-amida), oligo(tioetar-amida), oligo(estar-amida), oligo(tioestar-amida), oligo(urea-amida), oligo(etar-tioetra), oligo(etar-estra), oligo(etar-tioestra), oligo(etar-uree), oligo(tioetar-estra), oligo(tioetar-tioestra), oligo(tioetar-uree), oligo(estar-tioestra), oligo(estaruree) i oligo(tioestar-uree), poželjno ima strukturu, odabranu od oligoamida i oligo(estar-amida), a najpoželjnije ima oligoamidnu strukturu, pri čemu se struktura pruža između X<1>i X<2>u jedinjenju formule (I). Isto tako, s obzirom na navedeno, za dalje poželjne definicije za L<1>važi, t.j., poželjnije je da L<1>ima strukturu, odabranu od oligoamida, koji sadrži ukupno 1 do 5, još poželjnije ukupno 1 do 3, a najpoželjnije ukupno 1 ili 2 amidne veze unutar svoje strukture, i oligo(estar-amida) koji sadrži ukupno 2 do 5, poželjnije ukupno 2 do 3, a najpoželjnije ukupno 2 amidne i estarske veze unutar svoje strukture. U posebno poželjnom ostvarenju, L<1>predstavlja dvovalentnu vezujuću grupu sa oligoamidnom strukturom koja sadrži 1 ili 2 amidne veze unutar svoje strukture.

U skladu sa prethodno navedenim, L<1>može nositi jednu ili više, npr.,. 2 ili 3, EDS grupe. Međutim, poželjno je da L<1>ne nosi EDS grupu, ili da L<1>nosi jednu EDS grupu, a poželjnije je da L<1>nosi jednu EDS grupu.

Ukoliko L<1>nosi EDS grupu (uključujući poželjniji slučaj da EDS nosi jednu grupu EDS), poželjno je da EDS grupa ima strukturu koja je odabrana od (E-1A), (E-2A) i (E-2B). Još je poželjnije da EDS grupa ima strukturu, odabranu od (E-2A) i (E-2B), a najpoželjnije je da poseduje (E-2A) strukturu.

Kao što će stručnom čitaocu biti razumljivo, naznaka da L<1>može nositi EDS grupu služi kao informacija o mogućoj poziciji ove grupe u jedinjenjima u skladu sa pronalaskom. Činjenica da L<1>može nositi EDS grupu ne nameće ograničenje u vezi sa prisustvom drugih grupa koje se mogu nalaziti u jedinjenju, npr., u vidu alternativnih ili dodatnih supstituenata na strukturi L<1>. Na primer, poželjno je da spajajuća grupa L<1>sadrži jednu ili više, kao na primer dve, grupe koje su nezavisno odabrane od: -OH, -OCH3, -COOH, -COOCH3, -NH2i -NHC(NH)NH2koje su kao supstituenti vezani za njegovu strukturu. Još poželjnije, spajajuća grupa L<1>sadrži jednu ili više, kao što su dve, grupe -COOH, koje su kao supstituenti vezani za njegovu strukturu.

U formuli (I), X<2>je odabran od amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, mosta uree i aminske veze, a poželjno je amidna veza. Još je poželjnije da je atom azota amidne veze -C(O)-NH- vezan za L<1>.

Sledstveno tome, poželjno je, takođe da su i X<1>i X<2>amidne veze, posebno amidne veze koje su raspoređene u poželjnim orijentacijama, kako je prethodno definisano.

U skladu sa prethodno navedenim, poželjno je da deo X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu, koja je odabrana od:

*-C(O)-NH-R<7>-NH-C(O)-R<8>-C(O)-NH- (L-1),

*-C(O)-NH-R<9A>-NH-C(O)-R<10A>-C(O)-NH-R<11A>-NH-C(O)- (L-2A),

i

*-C(O)-NH-R<9B>-C(O)-NH-R<10B>-C(O)-NH-R<11B>-NH-C(O)- (L-2B);

pri čemu je amidna veza, označena sa *, vezana za atom ugljenika koji nosi R<2>u formuli (I), i pri čemu:

R<7>, R<8>, R<9A>, R<9B>, R<11A>i R<11B>su nezavisno odabrani od opciono supstituisanog C2 do C10 alkandiila, poželjno opciono supstituisanog linearnog C2 do C10 alkandiila, pri čemu svaka od alkandiil grupa može biti supstituisana sa jednim ili više supstituenata, nezavisno odabranih od: -OH, -OCH3, -COOH, -COOCH3, -NH2, -NHC(NH)NH2i grupe EDS, i

R<10A>i R<10B>su odabrani od opciono supstituisanog C2 do C10 alkandiila, poželjno opciono supstituisanog linearnog C2 do C10 alkandiila, i opciono supstituisanog C6 do C10 arendiila, poželjno fenilena, pri čemu svaka od alkandiil i arendiil grupa može biti supstituisana sa jednim ili više supstituenata, nezavisno odabranih od: -OH, -OCH3, -COOH, -COOCH3, -NH2, -NHC(NH)NH2i grupe EDS. R<10A>je poželjno opciono supstituisani C2 do C10 alkandiil, još poželjnije opciono supstituisani linearni C2 do C10 alkandiil kako je prethodno definisan. R<10B>je poželjno opciono supstituisani C6 do C10 arendiil, kao što je definisano prethodno, još poželjnije fenilen grupa, npr., para-fenilen grupa.

U grupama formule (L-1), (L-2A) i (L-2B), poželjno je da je opcioni supstituent na R<7>-COOH, da je opcioni supstituent na R<8>grupa EDS, da je opcioni supstituent na R<9A>i R<9B>-COOH, da je opcioni supstituent na R<10A>grupa EDS i da je opcioni supstituent na R<11A>i R<11B>-COOH.

Takođe je poželjno da svaka od grupa formule (L-1) i (L-2A) nosi EDS grupu kao najmanje jedan supstituent, kako je prethodno objašnjeno, poželjno kao supstituent na R<8>i R<10A>. Takođe, u ovom kontekstu, poželjno je da grupa EDS ima strukturu, odabranu od: (E-1A), (E-2A) i (E-2B). Još je poželjnije da grupa EDS ima strukturu, koja je odabrana od (E-2A) i (E-2B), a, najpoželjnije, ona poseduje strukturu (E-2A).

Pored toga, poželjno je da je ukupan broj atoma ugljenika u R<7>i R<8>formule (L-1) 6 do 20, još poželjnije 6 do 16, bez ugljeničnih atoma, koji se nalaze u opcionim supstituenata, da je ukupan broj atoma ugljenika u R<9A>, R<10A>i R<11A>formule (L-2A) 6 do 20, još poželjnije 6 do 16, bez atoma ugljenika, koji se nalaze u opcionim supstituentima, i da je ukupan broj ugljeničnih atoma u R<9B>, R<10B>i R<11B>formule (L-2B) 6 do 20, još poželjnije 6 do 16, bez atoma ugljenika koji se nalaze u opcionim supstituentima.

Iz podataka obezbeđenih u vezi sa prethodno datim poželjnim značenjima za n i X<1>podrazumevaće se da je dalje poželjno da -X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu (L-1), ukoliko je n 4, i da -X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu (L-2A) ili (L-2B), ukoliko je n 2.

U skladu sa prethodnim definicijama, dalje je čak poželjno da deo -X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu odabranu od:

*-C(O)-NH-CH(COOH)-R<12>-NH-C(O)-R<13>-C(O)-NH- (L-3),

*-C(O)-NH-CH(COOH)-R<14>-NH-C(O)-R<15>-C(O)-NH-R<16>-CH(COOH)-NH-C(O)-(L-4),

i

*-C(O)-NH-CH(COOH)-R<17>-C(O)-NH-R<18>-C(O)-NH-R<19>-CH(COOH)-NH-C(O)-(L-5);

pri čemu je veza, označena sa *, vezana za atom ugljenika koji nosi R<2>u formuli (I),

R<12>i R<14>su nezavisno odabrani od linearnog C2 do C6 alkandiila, poželjno od linearnog C3 do C6 alkandiila,

R<13>je linearni C2 do C10 alkandiil, poželjno linearni C4 do C8 alkandiil,

R<15>i R<16>su nezavisno odabrani od linearnog C2 do C6 alkandiila, poželjno od linearnog C2 do C4 alkandiila, i pri čemu svaki od R<13>i R<15>može nositi jednu grupu EDS u vidu supstituenta, i poželjno svaki od R<13>i R<15>nosi jednu EDS grupu kao supstituent, R<17>je linearni C2 do C6 alkandiil, poželjno linearni C2 do C4 alkandiil,

R<18>je fenilen grupa, npr., para-fenilen grupa i

R<19>je linearni C2 do C6 alkandiil, poželjno linearni C2 do C4 alkandiil.

Takođe, u ovom kontekstu, poželjno je da grupa EDS koja može biti vezana za R<13>i R<15>ima strukturu, koja je odabrana od: (E-1A), (E-2A) i (E-2B). Još je poželjnije da grupa EDS ima strukturu, koja je odabrana od (E-2A) i (E-2B), a, najpoželjnije, ona ima strukturu (E-2A).

Pored toga, poželjno je da je ukupni broj atoma ugljenika u R<12>i R<13>u formuli (L-3), bez atoma ugljenika, koji su sadržani u EDS grupi kao supstituent, 6 do 16, još poželjnije 6 do 14, a ukupni broj ugljeničnih atoma u R<14>, R<15>i R<16>u formuli (L-4), bez atoma ugljenika koji su u grupi EDS sadržani kao supstituent, je 6 do 16, još poželjnije 6 do 14.

Iz podataka obezbeđenih u vezi sa prethodno datim poželjnim značenjima za n i X<1>podrazumevaće se da je posebno poželjno da -X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu (L-3) ukoliko je n 4, i da -X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu (L-4) ili (L-5) ukoliko je n 2.

Određenije, poželjno je da je, u formuli (I), n 2 i da deo -X<2>-L<1>-X<1>- poseduje jednu od sledećih struktura:

*-C(O)-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(O)-CH(EDS)-CH2-C(O)-NH-(CH2)3-

CH(COOH)-NH-C(O)- (L-6)

*-C(O)-NH-CH(COOH)-(CH2)2-C(O)-NH-Ph-C(O)-NH-(CH2)8-CH(COOH)-NH-C(O)- (L-7)

pri čemu je veza, označena sa *, vezana za atom ugljenika koji nosi R<2>u formuli (I), EDS je grupa EDS, kako je definisana ovde, uključujući njihova poželjna ostvarenja, a Ph je parafenilen grupa.

Takođe, u ovom kontekstu, poželjno je da grupa EDS ima strukturu, koja je odabrana od: (E-1A), (E-2A) i (E-2B). Poželjnije je da grupa EDS ima strukturu, odabranu od (E-2A) i (E-2B), a, najpoželjnije, ona ima strukturu (E-2A).

U formuli (I), R<2>je opciono supstituisana aril grupa ili opciono supstituisana aralkil grupa, poželjno opciono supstituisana aralkil grupa. Kao što će se podrazumevati, izraz "aralkil grupa", kako je ovde definisana, odnosi se na alkil grupu u kojoj je atom vodonika zamenjen aril grupom kao supstituentom. Poželjno, aralkil grupa je grupa u kojoj je jedna aril grupa vezana za alkandiil grupu. Aril grupa ili aralkil grupa, koje su predstavljene sa R<2>mogu biti supstitutisane na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i -OH. Aril i arilni deo aralkil grupe poželjno su odabrani od fenila i naftila, kao što je 2-naftil. Alkandiil deo aralkil grupe je, poželjno, C1-C4 alkandiil grupa, još poželjnije -CH2-grupa. Sledstveno tome, R<2>je još poželjnije odabran od opciono supstituisanog -CH2-fenila, i opciono supstituisanog -CH2-naftila, posebno opciono supstituisanog -CH2-(2-naftila). Opciono supstituisani -CH2-(2-naftil) je posebno poželjna opcija za R<2>.

Opciono supstituisana aril grupa i arilni deo opciono supstituisane aralkil grupe, uključujući njihova poželjna ostvarenja, mogu biti supstituisani sa jednim ili više supstituenata, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i -OH. Sledstveno tome, može biti prisutan jedan ili više od jednog, npr., 2 ili 3, supstituenta, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i –OH. Poželjno je, međutim, da je R<2>ne-supstituisan.

S obzirom na prethodno navedeno, podrazumevaće se da je R<2>najpoželjnije nesupstituisani -CH2-(naftil), i da je naftil grupa najpoželjnije 2-naftil grupa, da bi se obezbedio R<2>kao -CH2-(2-naftil).

U formuli (I), R<3>je opciono supstituisana aril grupa ili opciono supstituisana aralkil grupa, poželjno opciono supstituisana aralkil grupa. Aril grupa ili aralkil grupa može biti supstituisana na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i -OH. Aril i arilni deo aralkil grupe su poželjno odabrani od fenila i naftila, kao što je 2-naftil. Poželjno je da su aril i arilni deo aralkila fenil. Alkandiil deo aralkil grupe je poželjno C1-C4 alkandiil grupa, još poželjnije -CH2- grupa. Sledstveno tome, R<3>je poželjnije opciono supstituisani -CH2-fenil.

Opciono supstituisana aril grupa i arilni deo opciono supstituisane aralkil grupe, uključujući njihova poželjna ostvarenja, mogu biti supstituisani sa jednim ili više supstituenata, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i -OH. Sledstveno tome, može biti prisutan jedan ili više od jednog, npr., 2 ili 3, supstituenta, koji su odabrani od halogena, poželjno I, i –OH.

Poželjno, R<3>je supstituisan sa jednim supstituentom koji je -OH, ili sa kombinacijom jednog supstituenta -OH i jednog supstituenta -I.

Sledstveno tome, posebno je poželjno da je R<3>-CH2-fenil, supstituisan na fenilnom prstenu sa jednim supstituentom koji je -OH, ili sa kombinacijom jednog supstituenta -OH i jednog supstituenta -I, a najpoželjnije je da je supstituent -OH prisutan na para-poziciji prstena fenila u odnosu na -CH2- grupu.

U skladu sa prethodno navedenim, poželjno je da je u formuli (I) R<2>grupa sa formulom

a R<3>je grupa formule

pri čemu

označava vezu koja spaja R<2>, odnosno R<3>, za preostali deo jedinjenja formule (I).

Čak je još poželjnija kombinacija R<2>i R<3>pri čemu je R<2>grupa formule

a R<3>je grupa formule

pri čemu

označava vezu koja spaja R<2>, odnosno R<3>, za preostali deo jedinjenja.

U formuli (I), r može biti 0 ili 1, a poželjno je da je r 1.

Pored toga, kako je prethodno objašnjeno, p je 0 ili 1, i q je 0 ili 1, a poželjno je da je p+q = 1. Još poželjnije, p je 0, a q je 1.

R<4>u formuli (I) je odabran od aril grupe i EDS grupe. Aril je poželjno odabran od fenila i naftila, kao što je 2-naftil. Sledstveno tome, R<4>je, poželjnije, odabran od: fenila, naftila, kao što je 2-naftil, i grupe EDS. Najpoželjnija je EDS grupa.

Ukoliko R<4>grupa EDS, poželjno je da EDS grupa ima strukturu, odabranu od: (E-1A), (E-2A) i (E-1B).

X<3>je odabran od amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, urea mosta, aminske veze i grupe formule

pri čemu obeležena veza na karbonilnoj grupi vezuje X<3>za R<M>, a druga obeležena veza vezuje X<3>za ostatak molekula.

Poželjno, X<3>je odabran od amidne veze i grupe formule

U poželjnijem ostvarenju, X<3>je amidna veza -C(O)-NH-, pri čemu je atom ugljenika vezan za R<M>.

R<M>je marker grupa koja sadrži helatirajuću grupu, koja opciono sadrži helatni neradioaktivni ili radioaktivni katjon.

Kao što će stručnom čitaocu biti razumljivo, prethodna definicija prema kojoj R<M>sadrži helatirajuću grupu, obuhvata slučaj da je R<M>helatirajuća grupa; u ovom slučaju, helatirajuća grupa je obično direktno vezana za X<3>; i slučaj da R<M>sadrži, zajedno sa helatirajućom grupom, npr., dodatni deo linkera; u ovom slučaju, helatirajuća grupa može biti indirektno vezana preko ovog dodatnog dela linkera za X<3>.

Helatirajuća grupa, obezbeđena posredstvom R<M>je pogodna za izradu helata sa radioaktivnim ili ne-radioaktivnim katjonom. Pogodne helatirajuće grupe za različite katjone su dobro poznate u ovoj oblasti i mogu se koristiti u kontekstu ovog pronalaska.

Helatirajuća grupa, koja opciono sadrži helatni neradioaktivni ili radioaktivni katjon, poželjno je odabrana od helatirajuće grupe koja sadrži najmanje jedno od sledećih

(i) makrociklična prstenasta struktura sa 8 do 20 atoma prstena, od kojih je 2 ili više, poželjno 3 ili više, atoma odabrano od atoma kiseonika, atoma sumpora i atoma azota; i (ii) aciklična helatirajuća struktura otvorenog lanca sa 8 do 20 atoma glavnog lanca, od kojih su 2 ili više, poželjno 3 ili više, atoma heteroatomi, koji su odabrani od atoma kiseonika, atoma sumpora i atoma azota.

Primer helatirajuće grupe, i sledstveno tome, takođe i primer R<M>grupe, je ostatakhelatirajućeg sredstva, koje je odabrano od: bis(karboksimetil)-1,4,8,11-tetraazabiciklo [6.6.2]heksadekana (CBTE2a), cikloheksil-1,2-diamintetrasirćetne kiseline (CDTA), 4-(1,4,8,11-tetraazaciklotetradec-1-il)-metilbenzojeve kiseline (CPTA), N’-[5-[acetil(hidroksi)amino]pentil]-N-[5-[[4-[5-aminopentil-(hidroksi)amino]-4-oksobutanoil]amino]pentil]-N-hidroksibutandiamida (DFO), 4,11-bis(karboksimetil)-1,4,8,11-tetraazabiciklo[6.6.2]heksadekana (DO2A) 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N’,N",N"’-tetrasirćetne kiseline (DOTA), 2-[1,4,7,10-tetraazaciklododekan-4,7,10-trisirćetna kiselina]-pentandionske kiseline (DOTAGA), N,N’-dipiridoksiletilendiamin-N,N’-diacetat-5,5’-bis(fosfat) (DPDP), dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA), etilendiamin-N,N’-tetrasirćetne kiseline (EDTA), etilenglikol-O,O-bis(2-aminoetil)-N,N,N’,N’-tetrasirćetne kiseline (EGTA), N,N-bis(hidroksibenzil)-etilendiamin-N,N’-disirćetne kiseline (HBED), hidroksietildiamintrisirćetne kiseline (HEDTA), 1-(p-nitrobenzil)-1,4,7,10-tetraazaciklodekan-4,7,10-triacetata (HP-DOA3), 6-hidrazinil-N-metilpiridin-3-karboksamida (HYNIC), 1,4,7-triazaciklononan-1-sukcinska kiselina-4,7-disirćetne kiseline (NODASA), 1-(1-karboksi-3-karboksipropil)-4,7-(karbooksi)-1,4,7-triazaciklononana (NODAGA), 1,4,7-triazaciklononantrisirćetne kiseline (NOTA), 4,11-bis(karboksimetil)-1,4,8,11-tetraazabiciklo[6.6.2]heksadekana (TE2A), 1,4,8,11-tetraazaciklododekan-1,4,8,11-tetrasirćetne kiseline (TETA), terpiridin-bis(metilenamintetrasirćetne kiseline (TMT), 1,4,7,10-tetraazaciklotridekan-N,N′,N″,N-tetrasirćetne kiseline (TRITA), trietilentetraaminheksasirćetne kiseline (TTHA), N,N’-bis[(6-karboksi-2-piridil)metil]-4,13-diaza-18-kruna-6 (H2makropa) i 4-amino-4-{2-[(3-hidroksi-1,6-dimetil-4-okso-1,4-dihidro-piridin-2-ilmetil)-karbamoil]-etil} heptandionska kiselina bis-[(3-hidroksi-1,6-dimetil-4-okso-1,4-dihidro-piridin-2-ilmetil)-amida] (THP); pri čemu je ostatak obezbeđen posredstvom kovalentnog vezivanja karboksil grupe, koja se nalazi u helatirajućem sredstvu, za ostatak jedinjenja, preko estarske ili amidne veze, poželjno amidne veze. Stručnom čitaocu će biti razumljivo da, u formuli (I), ova estarska ili amidna veza može, u ovom slučaju, biti uključena preko X<3>ili, poželjno, može biti predstavljena preko X<3>.

Među ovim helatirajućim sredstvima, poželjni su DOTA i DOTAGA.

Sledstveno tome, poželjno je, takođe, da je R<M>-X<3>- u formuli (I) grupa formule

pri čemu je veza, obeležena sa , vezana za ostatak jedinjenja formule (I), i pri čemu helatirajuća grupa može sadržavati helatni neradioaktivni ili radioaktivni katjon.

Primeri radioaktivnih katjona koji se opciono helatizuju uz pomoć helatirajućih grupa odabrani su od katjona:<44>Sc,<47>Sc,<51>Cr,<52m>Mn,<58>Co,<52>Fe,<56>Ni,<57>Ni,<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu,<66>Ga,<68>Ga,<67>Ga,<89>Zr,<90>Y,<89>Y,<94m>Tc,<99m>Tc,<97>Ru,<105>Rh,<109>Pd,<111>Ag,<110m>In,<111>In,<113m>In,<114m>In,<117m>Sn,<121>Sn,<127>Te,<142>Pr,<143>Pr,<149>Pm,<151>Pm,<149>Tb,<153>Sm,<157>Gd,<161>Tb,<166>Ho,<165>Dy,<169>Er,<169>Yb,<175>Yb,<172>Tm,<177>Lu,<186>Re,<188>Re,<191>Pt,<197>Hg,<198>Au,<199>Au,<212>Pb,<203>Pb,<211>At,<212>Bi,<213>Bi,<223>Ra,<225>Ac i<227>Th, ili katjonskog molekula koji sadrži<18>F, kao što je<18>F-[AlF]<2+>.

Poželjni helatni katjoni su odabrani od katjona:<44>Sc,<47>Sc,<64>Cu,<67>Cu,<68>Ga,<90>Y,<111>In,<161>Tb,<166>Ho,<177>Lu,<188>Re,<212>Pb,<212>Bi,<213>Bi,<225>Ac i<227>Th ili katjonskog molekula koji sadrži<18>F.

U formuli (I), EDS grupa je sadržana najmanje jednom, tako da mogu biti uključene, npr., jedna, dve ili tri grupe EDS. Poželjno, jedinjenja ili soli u skladu sa pronalaskom sadrže jednu grupu ili dve grupe EDS. Kako je prethodno objašnjeno, EDS grupu(grupe) može nositi L<1>, i/ili je može predstavljati R<4>.

Najpoželjnija jedinjenja formule (I) ili njihove soli su ona koja sadrže jednu grupu EDS, koju nosi spajajuća grupa L<1>, uključujući njihova poželjna ostvarenja kako su prethodno navedena, i ona koja sadrže dve grupe EDS, pri čemu jednu grupu predstavlja R<4>(t.j., r je 1), a jednu grupu nosi L<1>, uključujući njihova poželjna ostvarenja kako su prethodno navedena.

Kako je prethodno navedeno, EDS grupa ima strukturu, koja je odabrana od: (E-1A), (E-1B), (E-2A) i (E-2B):

pri čemu

označava vezu koja spaja EDS grupu za ostatak jedinjenja formule (I);

s je 1, 2 ili 3, poželjno 1 ili 2, još poželjnije 1;

t je 1, 2 ili 3, poželjno 1 ili 2, još poželjnije 2;

R<5B>je, nezavisno, za svako pojavljivanje kada je s > 1, supstituent koji nosi elektronski jonski par na atomu, koji je direktno vezan za fenilni prsten, prikazan u formuli (E-1B), pri čemu je supstituent poželjno odabran od -OH i –NH2, i koji je još poželjnije –NH2, i pri čemu veza između R<5B>i prstena fenila pokazuje da s grupa R<5B>zamenjuju s vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na prstenu fenila;

R<6B>je, nezavisno, za svako pojavljivanje kada je t > 1, supstituent koji nosi elektronski jonski par na atomu, koji je direktno vezan za fenilni prsten, prikazan u formuli (E-1B), pri čemu je supstituent poželjno odabran od -OH i –NH2, i koji je, još poželjnije, -OH, i pri čemu veza između R<6B>i prstena fenila pokazuje da t grupa R<6B>zamenjuju t atoma vodonika na bilo kojoj poziciji na fenilnom prstenu.

Uopšteno je poželjno da su, u grupi EDS (E-1A), supstituenti R<5A>isti kada je s > 1, a odabrani su od -NO2i -COOH, poželjnije -COOH, i da su, u grupi EDS (E-2A), supstituenti R<6A>isti kada je t > 1, a odabrani su od -NO2i -COOH, poželjnije -COOH.

Takođe je, uopšteno poželjno da su, u grupi EDS (E-1B), supstituenti R<5B>isti kada je s > 1, a odabrani su od -OH i -NH2, poželjnije -NH2, i da su, u grupi EDS (E-2B), supstituenti R<6B>isti kada je t > 1, a odabrani su od -OH i -NH2, poželjnije -OH.

Sledstveno tome, poželjno je dalje da jedinjenje formule (I) sadrži EDS grupu koja ima formulu (E-2A):

pri čemu

označava vezu koja spaja EDS grupu za ostatak jedinjenja formule (I); i t je 1 ili 2, a R<6A>je -NO2ili -COOH.

U kontekstu ovog pronalaska, kao grupa EDS najpoželjnija je grupa

U skladu sa prethodno navedenim, poželjna jedinjenja formule (I) su ilustrovana sledećom formulom (Ia)

pri čemu su: n, X<1>, L<1>, X<2>, R<2>, R<3>, R<4>, q, p, X<3>i R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je EDS grupa sadržana najmanje jednom i ima strukturu kao što je prethodno definisana, uključujući poželjna ostvarenja.

Još poželjnija jedinjenja formule (I) ilustrativno su prikazana posredstvom formule (Ib) koja sledi

pri čemu su: n, X<1>, L<1>, X<2>, R<2>, R<3>, R<4>, X<3>i R<M>R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je EDS grupa sadržana najmanje jednom i ima strukturu kao što je prethodno definisana, uključujući poželjna ostvarenja.

Još poželjnija jedinjenja formule (I) su ilustrovana sledećom formulom (Ic)

pri čemu su: n, X<1>, L<1>, X<2>, R<4>, X<3>i R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je EDS grupa sadržana najmanje jednom i ima strukturu kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja.

Još poželjnija jedinjenja formule (I) su ilustrativno prikazana sledećim formulama (Id) i (Ie):

pri čemu su: R<9A>, R<10A>, R<11A>, R<4>, X<3>i R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je ili (i) R<4>grupa EDS sa strukturom kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja, ili (ii) R<10A>nosi jednu grupu EDS sa strukturom kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja, ili važi i (i) i (ii);

pri čemu su R<9B>, R<10B>, R<11B>, R<4>, X<3>i R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je R<4>grupa EDS sa strukturom kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja.

Posebno poželjna jedinjenja formule (I) su ilustrativno prikazana sledećim formulama (If) i (Ig)

pri čemu su: R<9A>, R<10A>, R<11A>, R<4>, X<3>i R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je ili (i) R<4>grupa EDS sa strukturom kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja, ili (ii) R<10A>nosi jednu grupu EDS sa strukturom kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja, ili se primenjuju i (i) i (ii);

pri čemu su: R<9B>, R<10B>, R<11B>, R<4>, X<3>i R<M>definisani kao prethodno, uključujući njihova poželjna ostvarenja, i pri čemu je R<4>grupa EDS sa strukturom kao što je prethodno definisana, uključujući njihova poželjna ostvarenja.

U poželjnom ostvarenju, navedena helatirajuća grupa ima vezani radionuklid, pri čemu radionuklid emituje a-zračenje. Radionuklidi koji emituju a-zračenje uključuju:<212>Bi,<213>Bi i<225>Ac.

Kako je prethodno navedeno, uvođenje supstituenata sa deficijencijom elektrona, drastično je povećalo kapacitete internalizacije. Ova karakteristika za posledicu ima veći prihvat od strane tumora i, posebno, duže zadržavanje u tumorskom tkivu, kako je demonstrirano posredstvom in vitro eksperimenata (vidi primere). Budući da je kompleks helatora i radionuklida koji emituje alfa-čestice podložan dekompleksaciji, posredstvom fizičkog efekta trzanja, karakteristika produženog unutarćelijskog zadržavanja će smanjiti mogućnost prisustva slobodno cirkulišućih radionuklida in vivo, povećavajući, na taj način, bezbednost i smanjujući neželjeno zračenje.

Posebno poželjna jedinjenja pronalaska su sledeća:

DOTAGA-y(3-I)fk(L-Asu[KuE]-2,4-DNBA) (PSMA-36):

DOTAGA-F(4-NO2)-y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-52):

2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)-y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-53):

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-2,4-DNBA) (PSMA-61):

2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)y-2-nal-e(Abz-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-65):

DOTAGA-2-Nal-y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-71):

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-3,5-DHBA) (PSMA-78):

Povoljne karakteristike ovih jedinjenja pronalaska mogu se videti iz podataka u Tabelama 1 i 2, u nastavku, s tim što su podaci grafički predstavljeni na Slici 1.

Tabela 1. Sažeti prikaz svih in vitro ispitivanih parametara za PSMA inhibitore na bazi EuK. E označava Glu, u ureu, a K označava Lys. Pojedinačna mala slova (kao što je "y") označavaju D-oblike odgovarajuće aminokiseline. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) inhibitora PSMA je izmerena testom kompetitivnog vezivanja, uz korišćenje LNCaP ćelija (1.5 * 10<5>ćelija po reakcionoj čašici, 1 h, 4°C, HBSS 1% BSA) i ([<125>I]I-BA)KuE kao radioliganda. Aktivnost internalizacije je izražena u [%] kao relativni ćelijski prihvat za ([<125>I]I-BA)KuE (1.25 * 10<5>ćelija po reakcionoj čašici, ploče presvučene sa PLL, c = 0.2 nM za ([<125>I]I-BA)KuE i c = 1.0 nM za PSMA inhibitore, obeležene sa<177>Lu. DMEM/F-12 5% BSA, 37°C, 60 minuta). Podaci su korigovani za nespecifično vezivanje (10 µm 2-PMPA). Podaci za IC50i internalizaciju izraženi su kao srednje vrednosti ± SD (n=3). Lipofilnost je izražena kao logP (koeficijent distribucije u n-oktanol/PBS-u) inhibitora PSMA, obeleženih radioaktivnim agensom. Podaci za logP izraženi su kao srednja vrednost ± SD (n=6). Vezivanje albumina (HSA) izraženo je u [%] nakon logaritamskog iscrtavanja krive i kalibracije (n=1). Konfiguracija opisuje pojednostavljenu N- do C-terminalnu strukturnu kompoziciju peptidnih spejsera i linkera, bez helatora. n.d. = nije utvrđeno. "-II-" označava pojednostavljenu konjugaciju.

Tabela 2. Sažeti prikaz svih in vitro ispitivanih parametara za PSMA inhibitore na bazi EuE. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) inhibitora PSMA je izmerena testom kompetitivnog vezivanja, uz korišćenje LNCaP ćelija (1.5 * 10<5>ćelija po reakcionoj čašici, 1 h, 4°C, HBSS 1% BSA) i ([<125>I]I-BA)KuE kao radioliganda. Aktivnost internalizacije je izražena u [%] kao relativni ćelijski prihvat za ([<125>I]I-BA)KuE (1.25 * 10<5>ćelija po reakcionoj čašici, ploče presvučene sa PLL, c = 0.2 nM za ([<125>I]I-BA)KuE i c = 1.0 nM za PSMA inhibitore, obeležene sa<177>Lu. DMEM/F-12 5% BSA, 37°C, 60 minuta). Podaci su korigovani za nespecifično vezivanje (10 µm 2-PMPA). Podaci za IC50i internalizaciju izraženi su kao srednje vrednosti ± SD (n=3). Lipofilnost je izražena kao logP (koeficijent distribucije u n-oktanol/PBS-u) inhibitora PSMA, obeleženih radioaktivnim agensom. Podaci za logP izraženi su kao srednja vrednost ± SD (n=6). Vezivanje albumina (HSA) izraženo je u [%] nakon logaritamskog iscrtavanja krive i kalibracije (n=1). Konfiguracija opisuje pojednostavljenu N- do C-terminalnu strukturnu kompoziciju peptidnih spejsera i linkera, bez helatora. n.d. = nije utvrđeno. "-II-" označava pojednostavljenu konjugaciju.

[<nat/177>Lu] -F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>- 4.0 ± 0.2 343.9 ± 6.0 -4.12 ± 0.05 > 91.0 PSMA-62 orn-C<4>-EuE]-TMA)

[<nat/177>Lu] -Dap(TMA)y-2-nal-k(d[N<5>- 3.8 ± 0.3 297.8 ± 20 -4.25 ± 0.14<64.4>PSMA-66 orn-C<4>- EuE]-TMA)

[<nat/177>Lu] -2-Nal-y-2-nal-k(d[N<5>-orn- 5.3 ± 2.0 206.8 ± 1.7 -4.13 ± 0.09<98.2>PSMA-71 C-EuE]-TMA)

[<nat/177>Lu] -F(4-NH2)y-2-nal-k(Suc-N<5>- 2.5 ± 0.6 245.0 ± 4.2 -4.01 ± 0.11<74.2>PSMA-49 orn-C<4>-EuE)

[<nat/177>Lu] -F(4-NH2)y-2-nal-e(Abz-N<5>- 6.6 ± 1.5 267.4 ± 7.9 -3.85 ± 0.13 98.5 PSMA-60 orn-C<4>-EuE) n.d. n.d.

[<nat/177>Lu] -F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>- 3.9 ± 0.6 289.0 ± 6.2<n.d. n.d.>PSMA-78 orn-C<4>-EuE]-3,5-DHBA)

[<nat/177>Lu] 2,4-DNBA-Dap 3.5 ± 0.3 -4.15 ± 0.08 98.7 PSMA-65 (DOTAGA)y-2- nal-e(Abz- n.d. 340.2 ± 19.9 n.d. n.d.

N<5>-orn-C<4>-EuE)

Poželjne šeme obeležavanja za ova najpoželjnija jedinjenja su kao što su ovde prethodno definisane.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ili je sastavljena od jednog ili više jedinjenja ili soli pronalaska, kao što su ovde prethodno prikazani.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje dijagnostičku kompoziciju koja sadrži ili je sastavljena od jednog ili više jedinjenja ili soli pronalaska, kao što su ovde prethodno prikazani.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje terapeutsku kompoziciju koja sadrži ili je sastavljena od jednog ili više jedinjenja ili soli pronalaska, kao što su ovde prethodno prikazani.

Farmaceutska kompozicija može, dalje, sadržavati farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense i/ili razblaživače. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača, ekscipijenasa i/ili razblaživača dobro su poznati u ovoj oblasti, a uključuju slane rastvore, puferisane fosfatnim puferom, vodu, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, razne vrste vlažećih sredstava, sterilne rastvore, itd.. Kompozicije koje sadrže takve nosače mogu biti formulisane dobro poznatim konvencionalnim postupcima. Ove farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati ispitaniku u pogodnim dozama. Primena pogodnih kompozicija može se izvesti različitim putevima, npr., posredstvom intravenske, intraperitonealne, subkutane, intramuskularne, površinske, intradermalne, intranazalne ili intrabronhijalne primene. Posebno je poželjno da se navedena primena izvodi putem injiciranja i/ili oslobađanja, npr., na položaj u pankreasu ili u moždanoj arteriji ili direktno u moždano tkivo. Kompozicije se, takođe, mogu primenjivati direktno na ciljnu poziciju, npr., posredstvom biolističkog oslobađanja na spoljni ili unutrašnji ciljni položaj, kao što je gušterača ili mozak. Režime doziranja će odrediti ordinirajući lekar i klinički faktori. Kao što je u medicinskoj struci dobro poznato, dozaže za svakog pacijenta će zavisiti od brojnih faktora, koji uključuju, veličinu pacijenta, područje telesne površine, starost, određeno jedinjenje koje će se primenjivati, pol, vreme i put primene, opšte zdravstveno stanje i druge lekove koji se primenjuju istovremeno. Farmaceutski aktivna materija može biti prisutna u količinama koje se kreću između 0,1 ng i 10 mg po kg telesne težine po dozi; međutim, predviđene su i doze koje se nalaze ispod ili iznad ovog primernog raspona, posebno kada se uzmu u obzir prethodno pomenuti faktori.

U meri u kojoj prethodno izložena farmaceutska kompozicija, dijagnostička kompozicija i terapeutska kompozicija sadrži jedno ili više jedinjenja pronalaska, poželjno je da ne budu prisutna druga farmaceutski aktivna jedinjenja, dijagnostički aktivna jedinjenja ili terapeutski aktivna jedinjenja. Kao alternativa, mogu biti prisutna dodatna terapeutski aktivna, dijagnostički aktivna ili farmaceutski aktivna jedinjenja, kao što su, na primer, antikancerska sredstva.

Kombinacija terapeutskog tretmana jedinjenjima ovog pronalaska mogla bi imati sinergistički ili kumulativni efekat na lečenje, sličan tretmanu neuroendokrinih tumora sa<[177>Lu]DOTATATE radioterapijom u kombinaciji sa hemoterapijom ili imunoterapijama. Prva faza studije 3 koja upoređuje kombinaciju<177>Lu PRRT i kapecitabina (Xeloda; Genentech), oralnog hemoterapeutskog sredstva, sa samim [<177>Lu]DOTATATE, započela je 2017. na Erasmus MC, u Roterdamu (van Essen M, Krenning EP, Kam BL, de Herder WW, van Aken MO, Kwekkeboom DJ. Report on short-term side effects of treatments with 177Lu-octreotate in combination with capecitabine in seven patients with gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging.2008;35:743-748).

Dalje studije kombinovanih terapija, pod nazivom peptid receptorska hemoradionuklidna terapija (PRCRT), odskora su publikovane (Kong G, Callahan J, Hofman MS, et al. High clinical and morphologic response using 90YDOTA-octreotate sequenced with 177Lu-DOTA-octreotate induction peptide receptor chemoradionuclide therapy (PRCRT) for bulky neuroendocrine tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2017;44:476-489). Slični "kombinovani pristupi lečenju" biće izvođeni u bliskoj budućnosti, da bi se poboljšala efikasnost PSMA-ciljanih radioligandnih terapija.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje jedno ili više jedinjenja ili soli pronalaska, kao što su ovde ranije izložena, za korišćenje u medicinske svrhe.

Poželjna korišćenja u medicinske svrhe su korišćenja u nuklearnoj medicini, kao što su nuklearna dijagnostička snimanja, koja se, takođe, nazivaju i nuklearna molekulska snimanja, i/ili ciljana radioterapija bolesti, povezanih sa prekomernom ekspresijom, poželjno PSMA, primenom na obolelo tkivo.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje ili so pronalaska, kako je ovde prethodno definisano, za korišćenje u postupku dijagnostike i/ili klasifikacije maligne bolesti, poželjno raka prostate.

Poželjne indikacije su detekcija ili klasifikacija malignih bolesti, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, gliomi visokog gradusa, rak pluća i posebno rak prostate i metastazirani rak prostate, detektovanje metastatske bolesti kod pacijenata sa primarnim rakom prostate sa srednjim rizikom do visokog rizika, i detekcija metastatskih položaja, čak i pri niskim serumskim nivoima PSA kod pacijenata sa biohemijski rekurentnim rakom prostate. Druga poželjna indikacija je snimanje i vizualizacija neoangiogeneze.

U smislu medicinskih indikacija koje se podvrgavaju terapiji, posebno radioterapiji, poželjna indikacija je maligna bolest. Rak prostate je posebno poželjna indikacija.

Slike prikazuju:

<Slika 1: Web karta karakteristika za [nat/177>Lu]PSMA I&T i [<nat/177>Lu]PSMA-62 i[<nat/177Lu>]PSMA-66.

Slika 2: Kinetika eksternalizacije odabranih<177>Lu-obeleženih inhibitora PSMA iz LNCaP ćelija. 1.25 * 10<5>ćelija po reakcionoj čašici je inkubirano tokom 1 h sa odgovarajućim radioligandom (c = 1.0 nm) na 37°C u DMEM-rastvoru (5% BSA). Nakon toga je supernatant odstranjen i izvršeno je jedno ispiranje sa DMEM-rastvorom (5% BSA, 37°C). Nakon toga je izvršeno dodavanje radi zamene ili A) samo DMEM rastvora (5% BSA) ili B) blokada DMEM-rastvora (5% BSA, 10 µm 2-PMPA). Ukupna aktivnost ćelijske internalizacije pri t = 0 minuta korigovana je za ne-specifično vezivanje (10 µm 2-PMPA) i normalizovana je do 100 %. Svi podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD (n=3).

Slika 3: Biodistribucija (u %ID/g) za 2.5 do 3.0 MBq (0.15 do 0.25 nmol) za [<177>Lu]PSMA-66 i [<177>Lu]PSMA I&T na CB-17 SCID miševima koji nose LNCaP-tumor (n = 4, redom).

Slika 4: Projekcija maksimalnog intenziteta (MIP) µPET snimka kod CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP-tumor, nakon injiciranja približno 10.3 MBq (0.19 nmol obeleživača) [<68>Ga]PSMA-36 (dinamički skan, sumirani okviri 1 do 1.5 h p.i.) (gore levo). TAC-i (logaritamsko iscrtavanje) u %ID/mL za [<68>Ga]PSMA-36, dobijeni iz dinamičkih PET podataka (90 minuta vreme akvizicije, OSEM 3D rekonstrukcija) kod CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP-tumor za pul krvi (srce), bubreg, tumor, mišić, suzne žlezde i pljuvačne žlezde.

Slika 5: Projekcija maksimalnog intenziteta (MIP) µPET snimaka kod CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP-tumor, nakon injiciranja približno 11 i 13 MBq (0.15 do 0.25 nmol obeleživača)<68>Ga-obeleženog PSMA inhibitora, PSMA-62, odnosno PSMA-66 (dinamički skan, sumirani okviri 1 do 1.5 h p.i.) (gore levo). TAC-i (logaritamsko iscrtavanje) u %ID/mL odgovarajućega<68>Ga-obeleženog PSMA inhibitora, dobijeni iz dinamičkih PET podataka (90 minuta vreme akvizicije, OSEM 3D rekonstrukcija) kod CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP-tumor za pul krvi (srce), bubreg, tumor i mišić za oba<68>Ga-obeležena markera.

Slika 6: Biodistribucija (u %ID/g) za 2.5 do 6.0 MBq (0.15 do 0.25 nmol) za [<177>Lu]PSMA-62, [<177>Lu]PSMA-66, [<177>Lu]PSMA-71 i [<177>Lu]PSMA I&T na CB-17 SCID miševima koji nose LNCaP-tumor (n = 4, redom).

Primeri ilustruju pronalazak.

Primer 1: Materijali i postupci

1. Opšte informacije

Fmoc-(9-fluorenilmetoksikarbonil-) i svi ostali zaštićeni analozi aminokiselina nabavljeni su od Bachem-a (Bubendorf, Švajcarska) ili Iris Biotech-a (Marktredwitz, Nemačka).

Smola 2-hlorotritil hlorida (2-CTC) dobijena je od PepChem-a (Tübingen, Nemačka). Chematech (Dijon, Francuska) je dostavio helator DOTAGA-anhidrid. PSMA-DKFZ-617 je nabavljen od ABX advanced chemical compounds (Radeberg, Nemačka). Svi potrebni rastvarači i ostali organski reagensi nabavljeni su od Alfa Aesar-a (Karlsruhe, Nemačka), Sigma-Aldrich-a (Munich, Nemačka) ili VWR (Darmstadt, Nemačka). Sinteza peptida u čvrstoj fazi izvršena je manuelnim postupcima, uz korišćenje špric šejkera Intelli-Mixer (Neolab, Heidelberg, Nemačka). Analitička reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi (RP-HPLC) je izvedena na koloni Nucleosil 100 C18 (5 µm, 125 X 4.0 mm, CS GmbH, Langerwehe, Nemačka), uz korišćenje Shimadzu gradijentnog RP-HPLC sistema (Shimadzu Deutschland GmbH, Neufahrn, Nemačka). Analiza peptida je izvršena primenom različitih gradijenata 0.1% (v/v) trifluorosirćetne kiseline (TFA) u H2O (rastvarač A) i 0.1% TFA zajedno sa (vlv) u acetonitrilu (MeCN) (rastvarač B) sa konstantnim protokom od 1 mL/min (specifični gradijenti su navedeni u tekstu). Shimadzu SPD 20 A istaknuti UV/VIS detektor (Shimadzu Deutschland GmbH) je korišćen pri λ = 220 nm i 254 nm. Vezivanje HSA je utvrđeno uz korišćenje analitičke kolone Chiralpak HSA (5 µm, 50 x 3 mm), koja je povezana na Chiralpak HSA (5 µm, 10 X 3 mm) zaklonjeni kertridž (Daicel Chemical Industries), koji je nabavljen od kompanije Chiral Technologies Europe (Illkirch, Francuska). Ne-linearna regresija za vezivanje HSA dobijena je korišćenjem OriginPro 2016G (Northampron, SAD). Vremena retencije tRkao i faktori kapaciteta K’ navedeni su u tekstu. Preparativna RP-HPLC za peptide izvršena je na sistemu Shimadzu RP-HPLC, uz korišćenje kolone Multospher 100 RP 18-5 (250 X 20 mm, CS GmbH) sa konstantnim protokom od 5 mL/min. Analitička i preparativna Radio RP-HPLC za referentni ligand, uz jodiranje radioaktivnim jodom, izvršena je korišćenjem kolone Nucleosil 100 C18 (5 µm, 125 X 4.0 mm). Detekcija radioaktivnosti je izvršena posredstvom povezanosti izlaza UV-fotometra za Nal(TI) scintilacioni brojač za merenje na reakcionim čašicama od kompanije EG&G Ortec (Munich, Nemačka). Jedinjenja, obeležena sa<68>Ga- i<177>Lu-, analizirana su kao što je ranije objavljeno [1, 2]. Spektri masene spektrometrije sa elektrosprej jonizacijom (ESI-MS) dobijeni su na masenom spektrometru expression<L>-CMS (Advion Ltd., Harlow, Velika Britanija) i masenom spektrometru Varian 500-MS IT (Agilent Technologies, Santa Clara, SAD). Za test BradfordAssay korišćen je V-630 UV-Vis spektrofotometar od kompanije JASCO Germany GmbH (Gross-Umstadt, Nemačka), a centrifugiranje S9-frakcija je izvršeno u centrifugi Avanti JXN-26 od kompanije Beckman Coulter GmbH (Krefeld, Nemačka). Centrifugiranje testova radioaktivnih S9-metaboliita je izvedeno korišćenjem centrifuge Heraeus PICO 17 od Thermo Fisher Scientific Messtechnik GmbH (Munich, Nemačka). NMR podaci su dobijeni aplikovanjem 300 K, uz korišćenje AV 300 (300 MHz) ili AV 400 (400 MHz) od Brukera (Billerica, SAD).

Inkubacija S9-frakcija za analizu ex vivo metabolita izvršena je na termobloku Biometra UNO Thermoblock (Biometra, Göttingen, Nemačka).

2. Protokoli sinteze (SP)

SP-1: Punjenje 2-CTC-smole: 2-CTC-smola (1.6 mmol/g) je napunjena sa Fmoc-AA-OH (1.5 ekvivalenata) u anhidrovanom dihlorometanu (DCM) sa N,N-diizopropiletilaminom (DIPEA) (4.5 ekvivalenata) na sobnoj temperaturi (RT), tokom 2 h. Preostali tritilhlorid je prekriven dodavanjem 2 mL/g metanola (MeOH), tokom 15 minuta. Nakon toga, smola se filtrira i temeljito ispere, redom sa DCM (2<X>), sa dimetilformamidom (DMF) (2<X>) i MeOH (2<X>), a mešanje se vrši pod vakuumom preko noći. Punjenje se utvrđuje korišćenjem težinskih razlika:

(mukupno– mneto težina) x 1000

(M = mmol / g

As– MHCl) x mtežina smole

Formula 1. Određivanje punjenja smole: mukupno: masa napunjene smole (Fmoc-AA-OH i HCl); MAs: molarna masa aminokiseline; mnetotežina: masa korišćene smole; MHCl: molarna masa hlorovodonične kiseline

SP-2: Sinteza peptida posredstvom TBTU/HOBt kuplovanja: Rastvor Fmoc-AA-OH (2.0 ekv.), N,N,N’,N’-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronijum tetrafluoroborata (TBTU) (2.0 ekv.), N-hidroksibenzotriazola (HOBt) (2.0 ekv.), DIPEA (4.5 ekv.) u DMF (8 ml/g smole) je dodat slobodnom aminskom peptidu, vezanom na smolu, mućkan je tokom 2 h na RT i ispran je sa DMF (6<X>). Kuplovanje sa sekundarnim ili aromatičnim aminima je izvršeno uz korišćenje različitog protokola. Fmoc-AAOH (3.0 ekv.) je rastvoren u DMF (8 mL/g smole), zajedno sa 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluoro-fosfatom (HATU) (3.0 ekv.), 1-hidroksi-7-azabenzotriazolom (HOAt) (3.0 ekv.) i DIPEA (6.0 ekv.) i mešan je tokom 15 minuta. Prethodno aktivirani rastvor je dodat peptidu, vezanom na smolu, a mućkanje je vršeno tokom 2 h na RT. Nakon završetka reakcije, smola je isprana sa DMF (6<X>). Uopšteno, sve peptidne konstrukcije su sintetisane kao što je prethodno opisano (Weineisen, M.; Schottelius, M.; Simecek, J.; Eiber, M.; Schwaiger, M.; Wester, H. Development and first in human evaluation of PSMA I&T-A ligand for diagnostic imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine 2014, 55, 1083-1083; Weineisen, M.; Simecek, J.; Schottelius, M.; Schwaiger, M.; Wester, H.-J. Synthesis and preclinical evaluation of DOTAGA-conjugated PSMA ligands for functional imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. EJNMMI research 2014, 4, 1.).

SP-3: Deprotekcija Fmoc-a na smoli: Na smolu vezani peptid, zaštićen Fmoc-om, obrađen je sa 20%-tnim piperidinom u DMF (vlv), tokom 5 minuta, i drugi put tokom 15 minuta. Nakon toga, smola je temeljito isprana sa DMF (8<X>).

SP-4: Deprotekcija Dde na smoli: Peptid zaštićen jedinjenjem N-(1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheksiliden)-etil) (Dde) (1.0 ekv.) rastvoren je u rastvoru od 2.0% hidrazin monohidrata (N2H4·H2O) u DMF (vlv). Nakon 15 minuta, peptid kome je odstranjena zaštita, ukoliko je vezan na smolu, ispran je sa DMF (6<X>) ili je precipitiran u dietil etru (Et2O), da bi se dobio sirovi proizvod. Ukoliko su prisutne Fmoc- i Dde-zaštitne grupe, a neophodna je samo Dde-deprotekcija, peptid, vezan na smolu, obrađen je rastvorom, koji sadrži NH2OH·HCl (630 mg), imidazol (460 mg), DCM (0.5 mL), DMF (0.5 mL) i N-metil-2-pirolidon (NMP) (2.5 mL), tokom 3 h na RT. Nakon toga, peptid, vezan na smolu ispran je sa DMF (6<X>).

SP-5: Odstranjivanje Aloc/Alil zaštite na smoli: Aloc/Alil zaštitna grupa je odstranjena sa peptida, vezanog na smolu, korišćenjem rastvora DCM (6.0 mL), koji sadrži triizopropilsilan (TIPS) (50.0 ekv.) i (trifenil)paladijum(0) (Pd(PPh3)4) (0.3 ekv.). Smola je obrađena ovim rastvorom tokom 1.5 h, na RT. Po završetku, smola je isprana sa DCM (3<X>), da bi se odstranio Pd(PPh3)4.

SP-6: Odstranjivanje tBu/Boc zaštite: Odstranjivanje terc-butil (tBu)/tercbutiloksikarbonil (Boc)-zaštitnih grupa je izvršeno posredstvom rastvaranja sirovog proizvoda u TFA (približno 500 µL) i mešanja tokom 40 minuta na RT. Nakon toga, TFA je gotovo u potpunosti odstranjena korišćenjem struje azota. Nakon precipitacije u Et2O, sirovi proizvod je centrifugiran, a supernatant je odstranjen. Osušena sabijena masa je dalje korišćena za sledeće korake sinteze.

SP-7.1: A) Otcepljivanje peptida sa smole uz očuvanje zaštitnih grupa bočnih lanaca: Potpuno zaštićeni peptid, vezan na smolu, rastvoren je u mešavini DCM/trifluoroetanol (TFE)/sirćetna kiselina (AcOH) (6/3/1; v/v/v) i mućkan je tokom 30 minuta. Rastvoren je filtriran, a smola je rastvorena u drugom rastvoru za otcepljivanje tokom 30 minuta. Frakcije su sjedinjene, a rastvarač je ukoncentrisan pod sniženim pritiskom. Filtrat je ponovo rastvoren u toluenu i ukocentrisan je pod sniženim pritiskom, da bi se odstranio AcOH. Nakon precipitacije u vodi ili Et2O dobijen je sirovi peptid zaštićenog bočnog lanca.

SP-7.2: B) Otcepljivanje peptida sa smole uz istovremenu deprotekciju svih kiselolabilnih zaštitnih grupa: Potpuno zaštićeni peptid, vezan na smolu, rastvoren je u mešavini TFA/TIPS/voda (95/2.5/2.5; vlvlv) i mućkan je tokom 30 minuta. Rastvor je filtriran, a smola je obrađena na isti način, tokom narednih 30 minuta. Nakon toga, frakcije su sjedinjene, a rastvarač je ukoncentrisan pod konstantnim protokom azota. Sirovi peptid je precipitiran u Et2O i ostavljen je da se suši preko noći.

SP-8: Deacetilacija ugljenohidratnih delova: Deacetilacija je izvršena putem rastvaranja inhibitora PSMA u MeOH koji sadrži KCN (0.5 ekv.) (Herzig, J.; Nudelman, A.; Gottlieb, H. E.; Fischer, B. Studies in sugar chemistry.2. A simple method for O-deacylation of polyacylated sugars. The Journal of Organic Chemistry 1986, 51, 727-730.) uz istovremeno mešanje preko noći na RT. Završni proizvod je prečišćen uz pomoć RP-HPLC.

SP-9: Izrada inhibitora PSMA u kompleksu sa ne-radioaktivnim metalom:

SP-9.1:<nat>Ga-jedinjenja: Za izradu<nat>Ga -kompleksa, pomešano je 2.0 mm vodenog (aq.) rastvora inhibitora PSMA (50 µL) i 2.0 mm vodenog rastvora Ga(NO3)3(50 µL) i zagrevano je na 40°C tokom 30 minuta. Procena obrazovanja helata je izvedena korišćenjem RP-HPLC i ESI-MS. Dobijeni 1.0 mm rastvor je razblažen i korišćen je za in vitro određivanje IC50i određivanje vezivanja HSA.

SP-9.2:<nat>Lu-jedinjenja: Odgovarajući<nat>Lu -kompleksi su izrađeni iz 2.0 mm vodenog rastvora inhibitora PSMA sa 2.5 molarnim viškom LuCl3(20 mm vodeni rastvor) i zagrevani su do 95°C tokom 30 minuta. Nakon hlađenja, obrazovanje<nat>Lu -helata je potvrđeno korišćenjem RP-HPLC i ESI-MS. Dobijeni 1.0 mm vodeni rastvori odgovarajućih<nat>Lukompleksa su, zatim, razblaženi i korišćeni za ispitivanja in vitro IC50bez daljih postupaka.

3. Gradivni blokovi za PSMA-36 i inhibitore PSMA na bazi EuE

Di-terc-butil(((s)-6-amino-1-(terc-butoksi)-1-oksoheksan-2-il)karbamoil)-L-glutamat

Hemijska formula: C24H45N3O7

Molekulska težina: 487,64

((OtBu)KuE(OtBu)2) (1): Sinteza terc-butilom-zaštićenog Lys-urea-Glu vezujućeg motiva (EuK) se odvijala kako je prethodno opisano, putem sinteze u fazi rastvora [3]. Ukratko, rastvor DCM koji sadrži L-di-terc-butil-glutamat HCl (2.0 g, 7.71 mmol, 1.0 eq.) je hlađen na ledu tokom 30 min i, posle toga, obrađen sa trimetilaminom (TEA) (2.69 mL, 19.28 mmol, 2.5 eq.) i 4-(dimetilamino)piridinom (DMAP) (3.3 mg, 0.3 mmol, 0.04 eq.). Nakon dodatnog mešanja od 5.0 min, rastvori se 1,1’-karbonildiimidazol (CDI) (1.38 g, 8.84 mmol, 1.1 eq.) u DCM i polako se doda u toku perioda od 30 min. Reakciona smeša se dalje meša preko noći i ostavi da se zagreje do RT. Reakcija se zaustavlja korišćenjem zasićenog (sat.) rastvora NaHCO3(8 mL) uz istovremene korake ispiranja vodom (2<x>) i slanim rastvorom (2<x>) i osuši se preko sat. Na2SO4rastvora. Zaostali rastvarač se uklanja in vacuo i sirovi proizvod (S)-di-terc-butil 2-(1H-imidazol-1-karboksamido)pentandioat se koristi bez prethodnog prečišćavanja. RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 12.2 min; K’ = 5.8. Izračunata monoizotopska masa (C17H27N3O5): 353.4; dobijeno: m/z = 376.1 [M+Na]<+>. Sirovi proizvod (S)-di-terc-butil 2-(1H-imidazol-1-karboksamido)pentandioat (2.72 g, 7.71 mmol, 1.0 eq.) se rastvori u 1,2-dihloroetanu (DCE) i ohladi na ledu tokom 30 min. U ovaj rastvor se doda TEA (2.15 mL, 15.42 mmol, 2.0 eq.) i H-Lys(Cbz)-OtBu·HCl (2.87 g, 7.71 mmol, 1.0 eq.) i rastvor se meša na 40°C preko noći. Zaostali rastvarač se upari i sirovi proizvod prečisti korišćenjem silika gel flash-hromatografije sa eluent smešom koja sadrži etil acetat (EtOAc)/heksan/TEA (500/500/0.8; v/v/v). Posle uklanjanja rastvarača, u vidu bezbojnog ulja se dobija (9R,13S)-tri-terc-butil-3,11-diokso-1-fenil-2-oksa-4,10,12-triazapentadekan-9,13,15-trikarboksilat. RP-HPLC (40 do 100% B za 15 min): tR= 14.5 min; K’= 6.25. Izračunata monoizotopska masa (C32H51N3O9) = 621.8; dobijeno: m/z = 622.3 [M+H]<+>. Da bi se sintetisao (OtBu)KuE(OtBu)2(1), rastvori se (9R,13s)-tri-terc-butil-3,11-diokso-1-fenil-2-oksa-4,10,12-triazapentadekan-9,13,15-trikarboksilat (3.4 g, 5.47 mmol, 1.0 eq.) u etanolu (EtOH) (75 mL) i u rastvor se stavi paladijum na aktiviranom ugljenu (0.34 g, 0.57 mmol, 0.1 eq.) (10 %). Reakciona smeša sadržana u sudu se prvo pročisti strujom vodonika i, rastvor se ostavi da se meša na RT preko noći pod nisko vodoničnim pritiskom (balon). Sirovi proizvod se prečisti preko celita i rastvarač upari in vacuo. Željeni proizvod 1 je dobijen u vidu voskaste čvrste materije (1.9 g, 3.89 mmol, 71.6% prinos). RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 12.6 min; K’ = 6.4. Izračunata monoizotopska masa (C24H45N3O7) = 487.6; dobijeno: m/z = 488.3 [M+H]<+>, 510.3 [M+Na]<+>.

(s)-5-(terc-butoksi)-4-(3-((s)-1,5-di-terc-butoksi-1,5-dioksopentan-2-il)ureido)-5-oksopentanska kiselina ((Ot-Bu)EuE(OtBu)2) (2):

Hemijska formula: C23H40N2O9

Molekulska težina: 488,58

Sinteza terc-butilom-zaštićenog Glu-urea-Glu vezujućeg motiva (EuE) se slično odvijala, kako je opisano za jedinjenje 1 [3], korišćenjem H-L-Glu(OBzl)-OtBu·HCl umesto H-L-Lys(Cbz)-OtBu·HCl. Željeni proizvod je dobijen u vidu voskaste izrazito higroskopne čvrste materije (4.10 g, 8.39 mmol, 84% prinos). RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 11.3 min; K’ = 7.69. Izračunata monoizotopska masa (C23H49N2O9) = 488.3; dobijeno: m/z = 489.4 [M+H]<+>, 516.4 [M+Na]<+>.

(s)-NHFmoc-Asu(OtBu)-OBzl (5): U rastvor (S)-Fmoc-Asu(OtBu)-OH (50 mg, 107.0 µmol, 1.0 eq.) u DMF-u se doda HOAt (21.8 mg, 0.16 mmol, 1.5 eq.), HATU (61.0 mg, 161.0 µmol, 1.5 eq.) i DIPEA (73.2 µL, 0.48 mmol, 4.5 eq.). Posle 15 min mešanja na RT, doda se još i benzil alkohol (22.2 µL, 0.32 mmol, 3.0 eq.) i, rastvor se meša preko noći. Na kraju, rastvarač se ukloni in vacuo. Završetak reakcije za jedinjenje 5 se analizira pomoću RPHPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 17.1 min; K’ = 7.55. Izračunata monoizotopska masa za jedinjenje 5 (C34H39NO6) = 557.28; dobijeno: m/z = 580.7 [M+Na]<+>.

(s)-NHFmoc-Asu-OBzl (6): tBu deprotekcija sirovog proizvoda 5 se izvodi u (vlv) smeši TFA (95%) i DCM (5%) koja se meša na RT u toku 45 min. Posle uparavanja rastvarača, sirovi proizvod 6 se prečisti korišćenjem preparativne RP-HPLC (60 do 80% B za 15 min): tR= 9.3 min; K’ = 8.9. Izračunata monoizotopska masa za jedinjenje 6 (C30H31NO6) = 501.22; dobijeno m/z = 524.5 [M+Na]<+>.

OBzl-(s)-Fmoc-Asu[(OtBu)KuE(OtBu)2] (7): U rastvor jedinjenja 6 (51.8 mg, 10.3 µmol, 1.0 eq.) u DMF-u se doda HOBt (20.9 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq.), TBTU (36.3 mg, 15.5 µmol, 1.5 eq.) i DIPEA (79.4 µL, 59.7 mg, 0.46 mmol, 4.5 eq.). Posle 15 min mešanja, doda se jedinjenje 1 (75.6 mg, 15.5 µmol, 1.5 eq.) i nastavi se da se dalje meša još 20 h na RT. Sirovi proizvod 7 se prečisti korišćenjem preparativne RP-HPLC (70 do 80% B za 15 min): tR= 8.9 min; K’ = 1.97. Izračunata monoizotopska masa za jedinjenje 7 (C54H74N4O12) = 970.53; dobijeno: m/z = 971.8 [M+H]<+>.

(s)-Fmoc-Asu[(OtBu)KuE(OtBu)2] (8): Radi uklanjanja zaštite sa benzil alkohola (Bzl), jedinjenje 7 (57.2 mg, 65.0 µmol, 1.0 eq.) se rastvori u EtOH (2.0 mL) i doda se paladijum na aktiviranom ugljenu (10%) (5.72 mg, 9.0 µmol, 0.1 eq.). Balon je prethodno pročišćen pomoću struje vodonika i rastvor se meša pod blagim pritiskom vodonika (balon). Posle 70 min mešanja, sirovi proizvod se filtrira kroz celit, upari se EtOH in vacuo i proizvod prečisti korišćenjem preparativne RP-HPLC (70 do 70.5% B za 15 min): tR= 6.5 min; K’= 0.54. Izračunata monoizotopska masa za jedinjenje 5 (C47H68N4O12) = 880.48; dobijeno: m/z = 881.8 [M+H]<+>.

OPfp-(S)-Fmoc-Asu[(OtBu)KuE(OtBu)2] (9):

Hemijska formula: C53H67F5N4O12

Molekulska težina: 1047,13

U rastvor jedinjenja 8 (13.6 mg, 15.4 µmol, 1.0 eq.) u suvom DMF-u se doda DIC (4.77 µL, 1.94 mg, 30.8 µmol, 2.0 eq.) i PfpOH (5.67 mg, 30.8 µmol, 2.0 eq.). Posle 5 min mešanja, doda se piridin (2.49 µL, 31.0 µmol, 2.0 eq.) i rastvor se ostavlja da se meša na RT preko noći. Završetak reakcije za jedinjenje 9 se analizira pomoću RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 17.2 min; K’ = 7.6. Izračunata monoizotopska masa za jedinjenje 9 (C53H67F5N4O12) = 1046.47; dobijeno: m/z = 1069.8 [M+Na]<+>.

NHS-2,4-dinitrobenzoat (NHS-DNBA) (27):

Hemijska formula: C11H7N3O8

Molekulska težina: 309,19

U rastvor 2,4-dinitrobenzojeve kiseline (DNBA) (10.0 mg, 47.1 µmol, 1.0 eq.) u suvom THF-u se dodaju N, N’-dicikloheksilkarbodimid (DCC) (9.7 mg, 47.1 µmol, 1.0 eq.) i N-hidroksisukcinimid (NHS) (10.8 mg, 94.3 µmol, 2.0 eq.) i reakciona smeša se ostavi da se meša preko noći. Sirovi proizvod se prečisti korišćenjem RP-HPLC. RPHPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 10.21 min K’ = 4.1. Izračunata monoizotopska masa (C11H7N3O8) = 309.02; dobijeno: nedetektabilno putem ESI-MS.

DOTAGA-3-iodo-D-Tyr-D-Phe-D-Lys-OH (DOTAGA-y(3-I)fk) (30) :

Hemijska formula: C43H61IN8O14

Molekulska težina: 1040,91

Sinteza jedinjenja 30 se izvodi putem strategije čvrste faze kako je prethodno opisano [2, 3]. Ukratko: Polazna početna tačka je bila punjenje 2-CTC smole prema postupku u SP-1 sa Fmoc-D-Lys(Boc)-OH. Posle konjugovanja lizina, Fmoc se uklanja prema postupku iz SP-3 i Fmoc-D-fenilalanin se kupluje primenjujući postupak SP-2. Ista procedura je korišćena za kuplovanje Fmoc-D-Tyr(3-I)-OH. Kada se reakcija završi, Fmoc zaštitna grupa se otcepljuje postupkom prema SP-3 i peptid, vezan za smolu se kondenzuje sa helatorom korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.) u DMF-u. Reakcija se ostavlja da se meša u toku 48 h na RT. Konačno, sirovi proizvod se otcepljuje sa smole prema postupku iz SP-7.2 i istaloži u Et2O i centrifugira. Supernatant se uklanja i jedinjenje 30 prečisti pomoću RP-HPLC. RPHPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 6.2 min K’ = 2.1. Izračunata monoizotopska masa (C43H61IN8O14) = 1,040.34; dobijeno: m/z = 1,040.5 [M+H]<+>, m/z = 521.3 [M+2H]<2+>, m/z = 1,063.4 = [M+Na]<+>.

DOTAGA-y(3-I)fk(L-Asu[KuE]) (PSMA-8):

Hemijska formula: C63H93IN12O23

Molekulska težina: 1513,40

U DMF rastvor koji sadrži jedinjenje 30 (5.0 mg, 4.8 µmol, 1.0 eq.), dodaju se jedinjenje 9 (7.5 mg, 7.2 µmol, 1.5 eq.) i DIPEA (3.3 µL, 21.6 µmol, 4.0 eq.). Reakcioni rastvor se ostavlja da se meša preko noći na RT. Posle završetka reakcije, rastvarač se ukloni in vacuo i sirovi proizvod obradi sa smešom piperidina u DMF-u (20/80; vlv) tokom 15 min da bi se izvela Fmoc-deprotekcija. Rastvarač se smanji na otprilike 300 µL uparavanjem in vacuo, izvrši se taloženje u Et2O i centrifugiranje. Sa nastalim talogom se postupa prema SP-6 za uklanjanje tBu. Konačan proizvod se prečisti via RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 6.09 min K’ = 2.05. Izračunata monoizotopska masa (C63H93IN12O23) = 1,512.55; dobijeno: m/z = 1,513.9 [M+H]<+>, 757.8 [M+2H]<2+>.

DOTAGA-y(3-I)fk(L-Asu[KuE]-2,4-DNBA) (PSMA-36):

Hemijska formula: C70H95N14O28

Molekulska težina: 1707,50

Sinteza PSMA-36 je izvedena rastvaranjem PSMA-8 (3.0 mg, 3.3 µmol, 1.0 eq.) u DMF-u i dodavanjem jedinjenja 27 (4.1 mg, 13.2 µmol, 4.0 eq.) i DIPEA (2.3 µL, 13.2 µmol, 4.0 eq.). Rastvor se meša tokom 10 h na RT i konačni proizvod se prečisti putem RP-HPLC (10 do 50% B za 15 min): tR= 12.12 min K’ = 5.06. Izračunata monoizotopska masa (C70H95IN14O28) = 1,706.55; dobijeno: m/z = 1,707.8 [M+H]<+>, 854.7 [M+2H]<2+>.

[<nat>Lu]DOTAGA-y(3-I)fk(L-Asu[KuE]-2,4-DNBA) ([<nat>Lu]PSMA-36): RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 9.81 min K’ = 3.91. Izračunata monoizotopska masa (C70H92IN14O28Lu) = 1,878.47; dobijeno: m/z = 1,879.9 [M+H]<+>.

Šematski prikaz sinteze PSMA-36. (a) HOAt, HATU, DIPEA, benzilalkohol, [DMF]; (b) 95% TFA, 5% DCM; (c) 1, HOBt, TBTU, DIPEA, [DMF]; (d) Pd/C (10%), H2, [EtOH]; (e) DIC, PFP, piridin, [DMF]; (f) 30, DIPEA, [DMF]; (g) 20% piperidin u DMF, [DMF]; (h) TFA; (i) 27, DIPEA [DMF]

4. Sinteza PSMA inhibitora PSMA-52 i PSMA-53 na bazi EuE

DOTAGA-F(4-NO2)-y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-52):

Hemijska formula: C76H100N14O29

Molekulska težina: 1673,71

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH je izvedeno na način opisan u SP-1. Kada se Fmoc-zaštita ukloni prema postupku u SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) se kupluje sa D-Orn(NHDde) prema postupku u SP-2. U sledećem koraku, Dde zaštitna grupa se uklanja prema postupku iz SP-4 i slobodna amino grupa je tretirana sa sukcinskim anhidridom (4.0 eq.) i DIPEA (1.5 eq.) rastvorenim u DMF-u. Reakciona smeša se ostavi na RT preko noći da se reakcija odvija. Dalje, Fmoc-D-Lys-OtBu·HCl (1.5 eq.) se kupluje prema postupku iz SP-2 i uklanja se Fmoc-zaštita kako je opisano u SP-3. Izvode se sledeće konjugacije sa Fmoczaštićenim amino kiselinama Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-Phe(4-NO2)-OH na način opisan u SP-2. U završnom koraku, N-terminalna amino kiselina sa koje je uklonjena Fmoc-zaštita se konjuguje sa helatorom korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša 48 h na RT. Kada se reakcija sa DOTAGA-anhidridom završi, sa smole se otcepljuje peptid postupkom prema SP-7. Jedinjenje 2, sirovi proizvod istaložen u Et2O, centrifugira se i ukloni se supernatant. Konačni proizvod se prečisti putem RPHPLC.

RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 9.71 min K’ = 3.86. Izračunata monoizotopska masa (C76H100N14O29) = 1,672.68; dobijeno: m/z= 1,673.0 [M+H]<+>.

[<nat>Lu]DOTAGA-F(4-NO2)-y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) ([<nat>Lu]PSMA-52): RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 9.4 min K’ = 3.7. Izračunata monoizotopska masa (C76H97N14O29Lu) = 1,844.6; dobijeno: m/z = 1,846.0 [M+H]<+>.

2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)-y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-53):

Hemijska formula: C77H100N16O32

Molekulska težina: 1761,73

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH je izvedeno na način opisan u SP-1. Posle uklanjanja zaštite Fmoc postupkom prema SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) je kuplovano na D-Orn(NHDde) postupkom prema SP-2. U sledećem koraku, otcepljena je Dde zaštitna grupa postupkom prema SP-4 i slobodna amino grupa je tretirana sa sukcinskim anhidridom (4.0 eq.) i DIPEA (1.5 eq.) rastvorenim u DMF-u. Reakciona smeša se ostavi na RT preko noći da se reakcija odvija. Dalje, Fmoc-D-Lys-OtBu·HCl (1.5 eq.) se kupluje prema postupku u SP-2 i uklanja se Fmoc na način opisan u SP-3. Izvode se sledeća konjugovanja sa Fmoc-zaštićenim amino kiselinama Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-Dap(NHDde)-OH na način opisan u SP-2. Posle kuplovanja Fmoc-L-Dap(NHDde)-OH, izvodi se uklanjanje Fmoc na način koji je opisan u SP-3. Dalje, slobodna amino grupa se konjuguje sa 2,4-dintrobenzojevom kiselinom (2,4-DNBA) korišćenjem 2,4-DNBA (2.0 eq.), HOBt (2.0 eq.), TBTU (2.0 eq.) i DIPEA (4.0 eq.) u DMF-u. Posle završetka reakcije, uklanjanje zaštite se izvodi prema postupku u SP-5. U završnom koraku, N-terminalna slobodna amino kiselina L-Dap se konjuguje sa helatorom korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša 48 h na RT. Kada se reakcija sa DOTAGA-anhidridom završi, sa smole se otcepljuje peptid postupkom prema SP-7. Jedinjenje 2, sirovi proizvod istaložen u Et2O, centrifugira se iukloni se supernatant. Konačni proizvod se prečisti putem RP-HPLC.

RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 11.71 min K’ = 4.86. Izračunata monoizotopska masa (C77H100N16O32) = 1,760.67; dobijeno: m/z = 1,762.1 [M+H]<+>.

[<nat>Lu]2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)-y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) ([<nat>Lu]PSMA-53):

RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 8.3 min K’ = 3.15. Izračunata monoizotopska masa (C77H97N16O32Lu) = 1,932.59; dobijeno: m/z = 1,933.7 [M+H]<+>.

Šematski prikaz opšte sintetske procedure PSMA inhibitora PSMA-52 i PSMA-53 na bazi EuE, dat je kroz primer PSMA-52. (a) 20% piperidin u DMF, 2, HOBt, TBTU, DIPEA [DMF]; (b) sukcinski anhidrid, DIPEA [DMF]; (c) Fmoc-D/L-Lys-OAll·HCl, HOBt, TBTU, DIPEA [DMF]; (d) 20% piperidin u DMF, Fmoc-D-2-Nal-OH, HOBt, TBTU, DIPEA [DMF]; (e) 20% piperidin u DMF, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH, HOBt, TBTU, DIPEA [DMF]; (f) 20% piperidin u DMF, Fmoc-D-Phe(4-NH2)-OH, HOBt, TBTU, DIPEA [DMF]; (g) DOTAGA-anhidrid, DIPEA [DMF]; (h) TFA;

5. Sinteza PSMA-61 i PSMA-62

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-2,4-DNBA) (PSMA-61):

Hemijska formula: C83H105N17O32

Molekulska težina: 1852,84

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH je izvedeno na način opisan u SP-1. Posle uklanjanja zaštite Fmoc postupkom prema SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) je kuplovano na D-Orn(NHDde) postupkom prema SP-2. U sledećem koraku, otcepljena je Dde zaštitna grupa postupkom prema SP-4 i slobodna amino grupa je tretirana sa Fmoc-D-Asp-OAll·HCl (1.5 eq.) postupkom prema SP-2. Amino grupa u Fmoc-D-Asp-OAll·HCl je uklonjena postupkom prema SP-3 i izvršeno je konjugovanje sa 2,4-DNBA korišćenjem 2,4-DNBA (1.5 eq.), HOBt (2.0 eq.), TBTU (2.0 eq.) i DIPEA (4.0 eq.) u DMF. Kada se reakcija završi, izvodi se Allyldeprotekcija postupkom prema SP-5. Sledeći koraci obuhvataju ponavljajuće konjugacije sa Fmoc-D-Lys-OtBu·HCl (1.5 eq.), Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH postupkom prema SP-2. U završnom koraku, N-terminalna amino kiselina L-Phe(4-NHBoc)-OH kojoj je uklonjena Fmoc zaštita, konjuguje se sa helatorom korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša tokom 48 h na RT. Kada se reakcija sa DOTAGA-anhidridom završi, sa smole se otcepljuje peptid postupkom prema SP-7.2, sirovi proizvod precipitira u Et2O, centrifugira se i supernatant se ukloni. Konačni proizvod se prečisti putem RP-HPLC.

RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 6.40 min K’ = 2.2. Izračunata monoizotopska masa (C83H105N17O32) = 1,851.71; dobijeno: m/z= 1,852.5 [M+H]<+>, 926.7 [M+2H]<2+>. [<nat>Lu]DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-2,4-DNBA) ([<nat>Lu]PSMA-61):

RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 8.22 min K’ = 3.11. Izračunata monoizotopska masa (C83H102N17O32Lu) = 2,023.63; dobijeno: m/z = 1,013.1 [M+2H]<2+>.

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-62):

Hemijska formula: C85H107N15O32

Molekulska težina: 1850,86

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH je izvedeno na način koji je opisan u SP-1. Posle Fmoc-deprotekcije postupkom prema SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) se kupluje sa D-Orn(NHDde) postupkom prema SP-2. U sledećem koraku, otcepljena je Dde zaštitna grupa postupkom prema SP-4 i slobodna amino grupa je tretirana sa Fmoc-D-Asp-OAll·HCl (1.5 eq.) prema SP-2. Amino grupa u Fmoc-D-Asp-OAll·HCl se Fmoc-deprotektuje postupkom prema SP-3 i zaštiti se sa Dde-OH (2.0 eq.) i DIPEA (4.0 eq.) u DMF na RT. Reakciona smeša se ostavi da se meša preko noći. Posle toga, izvodi se Allyl-deprotekcija D-Asp postupkom prema SP-5. Sledeći koraci obuhvataju ponavljajuće konjugacije sa Fmoc-DLys-OtBu·HCl (1.5 eq.), Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH prema SP-2. U cilju konjugovanja TMA sa D-Asp, izvodi se selektivna Dde-deprotekcija primenom SP-4 kako se dobija slobodna amino grupa. TMA se kupluje korišćenjem TMA (2.0 eq.), HOBt (1.5 eq.), TBTU (1.5 eq.) i DIPEA (10 eq.) u DMF. Reakciona smeša se ostavlja da se meša u toku 8 h na RT. Posle konjugacije TMA, izvodi se uklanjanje Fmoc zaštite sa Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH primenom SP-3. N-terminalna Fmoc-deprotektovana amino kiselina L-Phe(4-NHBoc)-OH se konjuguje sa helatorom u završnom koraku korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša u toku 48 h na RT. Posle završetka reakcije sa DOTAGA-anhidridom, peptid se otcepljuje sa smole postupkom prema SP-7.2, sirovi proizvod istaloži u Et2O, centrifugira i supernatant se ukloni. Konačni proizvod se prečišćava putem RP-HPLC. RP-HPLC (10 do 70% B za 15 min): tR= 7.48 min K’ = 2.74. Izračunata monoizotopska masa (C85H107N15O32) = 1,849.72; dobijeno: m/z = 1,850.5 [M+H]<+>, 925.7 [M+2H]<2+>.

[<nat>Lu]DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) ([<nat>Lu]PSMA-62): RP-HPLC (10 do 70% B za 15 min): tR= 7.27 min K‘ = 2.64. Izračunata monoizotopska masa (C85H104N15O32Lu) = 2,021.64; dobijeno: m/z = 1,012.3 [M+2H]<2+>.

6. Sinteza PSMA-65, PSMA-66 i PSMA-71

2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)y-2-nal-e(Abz-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-65):

Hemijska formula: C79H96N16O32

Molekulska težina: 1781,72

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH se izvodi na način koji je opisan u SP-1. Posle Fmoc-deprotekcije postupkom prema SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) se kupluje sa D-Orn(NHDde) postupkom prema SP-2. U sledećem koraku, Dde zaštitna grupa se otcepljuje prema postupku iz SP-4 i slobodna amino grupa se tretira sa Fmoc-4-Abz-OH (1.5 eq.), HOAt (1.5 eq.), HATU (1.5 eq.) i DIPEA (4.0 eq.) u DMF. Reakciona smeša je ostavljena da se meša na RT preko noći. U sledećem koraku, sa Abz-ostatka se ukloni Fmoc-zaštita postupkom prema SP-3. Sledeći koraci obuhvataju ponavljanu konjugaciju sa Fmoc-D-Glu-OtBu, Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-Dap(Dde)-OH prema SP-2. Posle Fmoc-deprotekcije u Fmoc-L-Dap(Dde)-OH postupkom prema SP-3, 2,4-DNBA se kupluje korišćenjem 2,4-DNBA (1.5 eq.), HOBt (2.0 eq.), TBTU (2.0 eq.) i DIPEA (4.0 eq.) u DMF. Po završetku reakcije, L-Dap(Dde)-ostatku se uklanja Dde zaštita postupkom prema SP-4 i konjuguje se na helator korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša 48 h na RT. Posle završetka reakcije sa DOTAGA-anhidridom, peptid se otcepljuje sa smole postupkom prema SP-7.2, sirovi proizvod se istaloži u Et2O,centrifugira i supernatant se ukloni. Konačni proizvod se prečisti putem RP-HPLC. RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 10.2 min K’ = 4.1. Izračunata monoizotopska masa (C79H16N16O32= 1,780.64; dobijeno: m/z = 1,781.3 [M+H]<+>.

[<nat>Lu]2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)y-2-nal-e(Abz-N<5>-orn-C<4>-EuE) ([<nat>Lu]PSMA-65):

RP-HPLC (10 do 60% B za 15 min): tR= 9.8 min K’ = 3.9. Izračunata monoizotopska masa (C79H93N16O32Lu) = 1,952.56; dobijeno: m/z = 1,954.0 [M+H]<+>.

DOTAGA-Dap(TMA)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-66):

Hemijska formula: C88H107N15O37

Molekulska težina: 1966,89

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH se izvodi na način koji je opisan u SP-1. Posle Fmoc-deprotekcije postupkom prema SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) se kupluje sa D-Orn(NHDde) prema SP-2. U sledećem koraku, Dde zaštitna grupa se otcepljuje prema postupku iz SP-4 i slobodna amino grupa se tretira sa Fmoc-D-Asp-OAll·HCl (1.5 eq.) postupkom prema SP-2. Sa amino grupe u Fmoc-D-Asp-OAll·HC se uklanja Fmoc-zaštita postupkom prema SP-3 i vrši se zaštita sa 2.0 eq. Dde-OH i 4.0 eq. DIPEA u DMF. Reakciona smeša se ostavlja da se meša preko noći. Posle toga, izvodi se Allyl-deprotekcija u D-Asp primenom SP-5. Sledeći koraci obuhvataju ponavljanu konjugaciju sa Fmoc-D-Lys-OtBu·HCl (1.5 eq.), Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-Dap(Dde)-OH prema SP-2. U cilju konjugovanja TMA sa D-Asp i L-Dap, izvodi se selektivna Dde-deprotekcija primenom SP-4 kako se dobijaju slobodne amino grupe. TMA se kupluje korišćenjemTMA (4.0 eq.), HOBt (3.0 eq.), TBTU (3.0 eq.) i DIPEA (20 eq.) u DMF. Reakciona smeša se ostavi da se meša 8 h na RT. Posle konjugovanja TMA, izvodi se Fmoc-deprotekcija u Fmoc-L-Dap(TMA)-OH postupkom prema SP-3. N-terminalna Fmoc-deprotektovana amino kiselina L-Dap se konjuguje sa helatorom u poslednjem koraku, korišćenjem DOTAGAanhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša 48 h na RT. Posle kompletiranja reakcije sa DOTAGA-anhidridom, peptid se otcepljuje sa smole prema postupku iz SP-7.2, sirovi proizvod<se istaloži u Et>2O, centrifugira se i uklanja se supernatant. Konačan proizvod se prečišćava putem RP-HPLC. RP-HPLC (10 do 70% B za 15 min): tR= 7.48 min K’ = 2.74. Izračunata monoizotopska masa (C88H107N15O37) = 1,965.70; dobijeno: m/z = 1,966.4 [M+H]<+>, 984.1 [M+2H]<2+>.

[<nat>Lu]DOTAGA-Dap(TMA)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-66) RP-HPLC (10 do 70% B za 15 min): tR= 7.46 min K’ = 2.73. Izračunata monoizotopska masa (C88H108N15O37Lu) = 2,137.62; dobijeno: m/z = 1,070.4 [M+2H]<2+>.

DOTAGA-2-Nal-y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-71):

Početno punjenje smole sa Fmoc-D-Orn(NHDde)-OH je izvedeno na način koji je opisan u SP-1. Posle Fmoc-deprotekcije postupkom prema SP-3, jedinjenje 2 (1.5 eq.) se kupluje sa D-Orn(NHDde) postupkom prema SP-2. U sledećem koraku, otcepljena je Dde zaštitna grupa postupkom prema SP-4 i slobodna amino grupa je tretirana sa Fmoc-D-Asp-OAll·HCl (1.5 eq.) prema SP-2. Amino grupa u Fmoc-D-Asp-OAll·HCl se Fmoc-deprotektuje postupkom prema SP-3 i zaštiti se sa Dde-OH (2.0 eq.) i DIPEA (4.0 eq.) u DMF na RT. Reakciona smeša se ostavi da se meša preko noći. Posle toga, izvodi se Allyl-deprotekcija D-Asp postupkom prema SP-5. Sledeći koraci obuhvataju ponavljajuće konjugacije sa Fmoc-DLys-OtBu·HCl (1.5 eq.), Fmoc-D-2-Nal-OH, Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH i Fmoc-L-2-Nal-OH prema SP-2. U cilju konjugovanja TMA sa D-Asp, izvodi se selektivna Dde-deprotekcija primenom SP-4 kako se dobija slobodna amino grupa. TMA se kupluje korišćenjem TMA (2.0 eq.), HOBt (1.5 eq.), TBTU (1.5 eq.) i DIPEA (10 eq.) u DMF. Reakciona smeša se ostavlja da se meša u toku 8 h na RT. Posle konjugacije TMA, izvodi se uklanjanje Fmoc zaštite sa Fmoc-L-2-Nal-OH primenom SP-3. N-terminalna Fmoc-deprotektovana amino kiselina Fmoc-L-2-Nal-OH se konjuguje sa helatorom u završnom koraku korišćenjem DOTAGA-anhidrida (2.0 eq.) i DIPEA (2.0 eq.). Reakciona smeša se ostavlja da se meša u toku 48 h na RT. Posle završetka reakcije sa DOTAGA-anhidridom, peptid se otcepljuje sa smole postupkom prema SP-7.2, sirovi<proizvod istaloži u Et>2O, centrifugira i supernatant se ukloni. Konačni proizvod se prečišćava putem RP-HPLC. RP-HPLC (10 do 80% B za 15 min): tR= 7.57 min K’ = 2.79. Izračunata monoizotopska masa (C89H108N14O32) = 1,884.73; dobijeno: m/z = 1,886.1 [M+H]<+>, 943.5 [M+2H]<2+>.

[<nat>Lu]DOTAGA-2-Nal-y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) ([<nat>Lu]PSMA-67): RP-HPLC (10 do 90% B za 15 min): tR= 7.81 min K’ = 2.91. Izračunata monoizotopska masa (C89H105N14O32Lu) = 2,056.64; dobijeno: m/z = 1,029.7 [M+2H]<2+>.

7. Radio-obeležavanje

<68>Ga-obeležavanje: generator<68>Ge/<68>Ga se eluira sa aq. HCI (1.0 M), od čega se frakcija od 1.25 mL, koja otprilike sadrži 80% aktivnosti (600 do 800 MBq), prenese u reakcioni sud (ALLTECH, 5 mL). Sud je prethodno napunjen sa dotičnim jedinjenjem (5.0 nmol) i aq. rastvorom 2-(4-(2-hidroksietil)-1-piperazinil)-etansulfonske kiseline (HEPES) (950 µL, 2.7 M). Reakcioni sud se 5 min greje na 95°C uz naknadnu fiksaciju radio-obeleženog jedinjenja na prekondicioniran SPE kartridž (C8 light, SepPak). Posle pročišćavanja kartridža sa vodom (10 mL) koje se izvede unapred, elucija radio-obeleženog PSMA inhibitora sa kartridža se izvodi sa smešom EtOH i vode (1/1; v/v), slanim fosfatno puferovanim rastvorom (PBS) (1.0 mL) i ponovo vodom (1.0 mL). Na kraju radio-obeležavanja, EtOH se upari in vacuo i traser koristi bez prethodnog prečišćavanja. Radio-hemijska čistoća se kontroliše korišćenjem Radio-TLC (1.0 M natrijum citratni pufer i 0.06 M NH4OAc/MeOH pufer (1/1 ; v/v)).

<177>Lu-obeležavanje:<177>Lu-obeležena jedinjenja se proizvode kako je prethodno opisano [5] uz neznatne modifikacije i, koriste se bez prethodnog prečišćavanja. Ukratko, u NH4OAc-pufer (10 µL, 1.0 M, pH = 5.9) se doda dotični tracer (0.75 to 1.0 nmol, 7.5 do 10 µL), 177LuCl3(10 do 40 MBq; AS > 3000 GBq/mg, 740 MBq/mL, 0.04 M HCl, ITG, Garching, Germany) i na kraju se dopuni sa čistom vodom koja ne sadrži traser (do 100 µL) (Merck, Darmstadt, Germany). Reakciona smeša se greje tokom 40 min na 95°C i određuje se radiohemijska čistoća korišćenjem radio-TLC.

<125>l-obeležavanje: Ukratko, kalajni prekursor (SnBu3-BA)(OtBu)KuE(OtBu)2(PSMA-45) (approx.0.1 mg) se rastvori u rastvoru koji sadrži persirćetnu kiselinu (20 µL), [<125>I]Nal (5.0 µL, approx. 21.0 MBq) (74 TBq/mmol, 3.1 GBq/mL, 40 mM NaOH, Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany), MeCN (20 µL) i AcOH (10 µL). Reakcioni rastvor se inkubira u toku 10 min na RT, napuni u kartridž (C18 Sep Pak Plus, prekondicioniran sa 10 mL MeOH i 10 mL vode) i ispere sa vodom (10 mL). Posle eluacije sa smešom 1/1 (v/v) EtOH i MeCN (2.0 mL), rastvor se upari do suvog pod blagom strujom azota i obradi se sa TFA (200 µL) u toku 30 min uz naredno uparavanje TFA. Sirovi proizvod ([<125>I]I-BA)KuE se prečisti putem radio-RP-HPLC (20 do 40% B za 20 min): tR= 13.0 min; K’= 6.2.

8. Određivanje HSA vezivanja

Eksperimenti HSA vezivanja su izvedeni kako je ranije opisano [6]. Mobilna faza se sastojala od binarnog gradijent sistema sa konstantnom ukupnom brzinom protoka od 0.5 mL/min. Mobilna faza A je bila 50 mm pH 6.9 NH4OAc-rastvor, mobilna faza B je bila 2-propanol (RP-HPLC stepen čistoće, VWR, Germany). Gradijent mobilne faze A je bio 100% od 0 do 3 min i od 3 min do kraja svakog puštanja mobilne faze B koja je bila podešena na 20%. Svakog dana eksperimenta, kolona je kalibrisana sa devet referentnih supstanci kako bi se validiralo izvođenje i zasnovala ne-linearna regresija. PSMA inhibitori su rastvoreni u koncentraciji od 0.5 mg/mL u smeši 2-propanola i NH4OAc-pufera (50 mm pH 6.9) (1/1; vlv). Za svako puštanje, 10 µL rastvora koji sadrži inhibitor se injektuje u RP-HPLC sistem i izmeri se retenciono vreme. Literaturno HSA vezivanje [%] je dato u: Valko et. al. or Yamazaki et al. [6, 7]. Ne-linearna regresija je utvrđena pomoću OriginPro 2016G.

9. Određivanje lipofilnosti

Lipofilnost: Radio-obeleženi PSMA inhibitor (0.5 do 1.0 MBq) rastvoren u PBS (500 µL, pH = 7.4), doda se u n-oktanol (500 µL) u reakcionom sudu (1.5 mL), što se podvrgne intenzivmom mešanju na vorteksu tokom 3 min (n = 6). Za kvantitativno razdvajanje faza, smeša se podvrgne centrifugiranju na 6,000 g tokom 5 min (Biofuge 15, Heraus Sepatech, Osterode, Germany). Aktivnost iz uzoraka svake faze (100 µL) se izmeri na g-brojaču i tako se dobija logP(o/w)vrednost.

10. Eksperimenti na ćelijama

Ćelijska kultura: PSMA-pozitivne LNCAP ćelije (300265; Cell Lines Service GmbH) se uzgajaju u Dulbecco modifikovanom Eagle medijum/Nutrition Mixture F-12 (1/1) (DMEM-F12, Biochrom) koji je obogaćen fetalnim telećim serumom (FCS) (10%, Biochrom) i drže se na 37°C u vlažnoj CO2atmosferi (5%). Dan (24 h ± 2 h) pre izvođenja svih eksperimenata na LNCaP ćelijama, uzgojene ćelije se sakupe pomoću smeše tripsin/etilendiamintetraacetata (0.05%/0.02%) i PBS i, centrifugiraju se. Posle centrifugiranja, supernatant se odbaci dok se ćelijski talog resuspenduje u medijumu kulture. Posle toga, ćelije se izbroje pomoću hemocitometra (Neubauer) i zaseju u ploče sa po 24 pozicije. Odrede se IC50vrednosti prenošenjem 150,000 ćelija/mL po svakoj poziciji u pločama sa 24 pozicije, dok se internalizacione stope dobijaju prenošenjem 125,000 ćelija/mL po svakoj poziciji u pločama sa 24 pozicije, obložene sa PLL.

11. Afinitet (IC50)

Posle uklanjanja medijuma kulture, ćelije se tretiraju jednom sa HBSS (500 µL, Hankov balansirani slani rastvor, Biochrom, Berlin, Germany, sa dodatkom 1% BSA) i ostavljaju se 15 min na ledu radi uravnoteženja u HBSS (200 µL, 1% BSA). Dalje, dodaju se rastvori (25 µL po poziciji) koji sadrže ili HBSS (1% BSA, kontrola) ili dotični ligand u rastućim koncentracijama (10<-10>do 10<-4>m u HBSS (1% BSA)) a zatim se dodaje ([<125>I]I-BA)KuE (25 µL, 2.0 nm) u HBSS (1% BSA). Svi eksperimenti su izvedeni bar tri puta za svaku koncentraciju. Posle 60 min inkubacije na ledu, eksperiment se završava uklanjanjem medijuma i uzastopnim ispiranjem sa HBSS (200 µL). Medijumi iz oba koraka se spajaju u jednu frakciju i predstavljaju količinu slobodnog radioliganda. Posle toga, ćelije se liziraju sa NaOH (250 µL, 1.0 m) i sjedinjuju se sa HBSS (200 µL) iz sledećeg koraka ispiranja. Vezani i slobodni radioligand se kvantitativno određuju pomoću g-brojača.

12. Internalizacija

Posle uklanjanja medijuma kulture, ćelije su isprane jednom sa DMEM-F12-rastvorom (500 µL, 5% BSA) i ostavljene da se uravnoteže najmanje 15 min na 37°C u DMEM-F12-rastvoru (200 µL, 5% BSA). Posle toga, radi blokade, svaka pozicija je tretirana ili sa DMEM-F12-rastvorom (25 µL, 5% BSA) ili sa 2-PMPA-rastvorom (25 µL, 100 µm). Sledeće, pojedinačno se dodaju<68>Ga- ili<177>Lu-obeleženi PSMA inhibitor (25 µL; 2.0 nm odnosno 10 nm) i ćelije inkubiraju na 37°C u toku 5, 15, 30 i 60 min. Eksperiment se završava stavljanjem ploča sa 24 pozicije na led tokom 3 min i potom, uklanjanjem medijuma. Svaka pozicija se ispere sa HBSS (250 µL) i, spoje se frakcije iz ova dva prva koraka, što predstavlja količinu slobodnog radioliganda. Uklanjanje površinski vezane aktivnosti se postiže inkubacijom ćelija sa ledenohladnim 2-PMPA-rastvorom (250 µL, 10 µm u PBS) tokom 5 min i zatim, ispiranjem sa ledenohladnim PBS (250 µL). Internalizovana aktivnost se određuje preko inkubacije ćelija u NaOH (250 µL, 1.0 m) i kombinovanja sa frakcijom sledećeg koraka ispiranja sa ponovo NaOH (250 µL, 1.0 m). Svaki eksperiment (kontrola i blokada) je izveden u triplikatu u svakoj vremenskoj tački. Slobodna, površinski vezana i internalizovana aktivnost se kvantitativno određuje pomoću g-brojača.

13. Eksternalizacija

Kinetike eksternalizacije radio-obeleženih PSMA inhibitora se određuju korišćenjem LNCaP ćelija, koje se pripremaju na sličan način kao što je opisano za test internalizacije. Posle početnog koraka ispiranja ćelija sa DMEM-F12-rastvorom (5% BSA), ćelije se ostavljaju da se rekondicioniraju bar 15 min na 37°C. Zatim, LNCaP ćelije se inkubiraju sa pojedinačnim radioobeleženim peptidom (25 µL, 10.0 nm) na 37°C u toku 60 min u ukupnoj zapremini od 250 µL u svakoj poziciji. Posle 60 min, supernatant sa nevezanom slobodnom frakcijom se uklanja i meri na g-brojaču zbog računanja ukupno dodate radioaktivnosti. Korak ispiranja sa kiselinom se izbegava zbog garantovanja integriteta enzima tokom sledećeg ispitivanja eksternalizacije i recikliranja. Za određivanje brzine recikliranja, ćelijama se dodaje svež DMEM-F12-rastvor (250 µL, 5% BSA) da bi se omogućila re-internalizacija. Nasuprot tome, re-internalizacija se inhibira dodavanjem DMEM-F12-rastvora koji sadrži 2-PMPA (225 µL DMEM-F12 (5% BSA) i 25 µL 100 µm 2-PMPA-rastvora (PBS)). Ćelije se onda inkubiraju u toku 0, 20, 40 i 60 min na 37°C. Posle se uklanja supernatant i ćelije se ispiraju sa ledeno-hladnim HBSS (250 µL). Spojeni supernatant i zapremina uzastopnog koraka ispiranja sa HBSS (200 µL) se računaju za eksternalizovani radioligand u ispitivanoj vremenskoj tački. Dalje, ćelije se zatim ispiraju sa ledeno-hladnim 2-PMPA HBSS rastvorom (250 µL, 10 µm) dva puta, spoje i tako predstavljaju frakciju membranski vezanog radioliganda. Određivanje internalizovane frakcije se postiže lizom kako je opisano za test internalizacije, sa NaOH (250 µL, 1.0 m). Aktivnosti slobodnog, eksternalizovanog, membranski vezanog i internalizovanog radioliganda se kvantitativno određuju pomoću g-brojača.

14. Eksperimenti na životinjama

Svi eksperimenti na životinjama su izvedeni prema opštim regulativama o dobrobiti životinja u Nemačkoj (Deutsches Tierschutzgesetz, approval #55.2-1-54-2532-71-13). Za dobijanje modela tumora, LNCaP ćelije (approx. 10<7>ćelija) su suspendovane u medijumu DMEM-F12 bez seruma i Matrigelu (1/1; v/v) (BD Biosciences, Germany) i inokulisane su na desnom ramenu mužjaka, starih 6 do 8 nedelja, CB-17 SCID miševa (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany). Životinje su korišćene u eksperimentima kada je veličina tumora dostigla 4 do 8 mm u prečniku.

15. PET

Eksperimenti snimanja su izvedeni na PET instrumentu Siemens Inveon za male životinje i podaci su analizirani pomoću pridruženog Inveon Research Workplace softvera. Miševi su anestezirani izofluranom i, injektovano im je approx.4.0 do 17 MBq<68>Ga-obeleženog jedinjenja preko vene repa (approx.150 do 300 µL). Dinamičko snimanje je izvedeno posle onbed injekcije u toku 90 min. Snimanje statičke blokade se dobija posle 1 h p.i. sa 15 min vremenom akvizicije. PSMA-blokada se postiže istovremenim injektovanjem 8 mg/kg 2-PMPA-rastvora (PBS). Svi snimci su rekonstruisani primenom OSEM3D algoritma bez skenera i korekcije slabljenja.

16. Biodistribucija

Otprilike 4.0 do 12.0 MBq (approx. 150 do 300 µL)<68>Ga- odnosno<177>Lu-obeleženih PSMA inhibitora se injektuje u venu repa mužjaka CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP tumor, koji se nakon specifičnog vremenskog okvira žrtvuju (n = 4, pojedinačno). Odabrani organi se uklanjaju, odvagaju i mere pomoću g-brojača.

17. Reference u Primeru 1

1. Simecek, J., et al., A Monoreactive Bifunctional Triazacyclononane Phosphinate Chelator with High Selectivity for Gallium-68. ChemMedChem, 2012.7(8): p.1375-1378.

2. Weineisen, M., et al., Development and first in human evaluation of PSMA l&T-A ligand for diagnostic imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. Journal of Nuclear Medicine, 2014.55(supplement 1): p.1083-1083.

3. Weineisen, M., et al., Synthesis and preclinical evaluation of DOTAGA-conjugated PSMA ligands for functional imaging and endoradiotherapy of prostate cancer. EJNMMI research, 2014.4(1): p.1.

4. Weineisen, M., et al., 68Ga- and 177Lu-Labeled PSMA l&T: Optimization of a PSMA-Targeted Theranostic Concept and First Proof-of-Concept Human Studies. Journal of Nuclear Medicine, 2015.56(8): p.1169-1176.

5. Sosabowski, J.K. and S.J. Mather, Conjugation of DOTA-like chelating agents to peptides and radiolabeling with trivalent metallic isotopes. Nat. Protocols, 2006.1(2): p.972-976. 6. Valko, K., et al., Fast gradient HPLC method to determine compounds binding to human serum albumin. Relationships with octanol/water and immobilized artificial membrane lipophilicity. Journal of pharmaceutical sciences, 2003.92(11): p.2236-2248.

7. Yamazaki, K. and M. Kanaoka, Computational prediction of the plasma protein-binding percent of diverse pharmaceutical compounds. Journal of pharmaceutical sciences, 2004.

93(6): p.1480-1494.

Primer 2: Rezultati

1. Efekat uvođenja 2,4-dinitrobenzojeve kiseline u oblast linkera u PSMA I&T

DOTAGA-y(3-l)fk(Sub-KuE) (PSMA I&T):

Tabela 3

Neznatno veći afinitet i porast internalizacije za 251%.

. Vezujući motiv je izmenjen iz EuK u EuE i peptidni spejser iz -y(3-l)fk- u -y-2-nal-k-DOTAGA-y(3-l)fk(Sub-KuE) (PSMA I&T):

Tabela 4

→ U poređenju sa referentnim PSMA I&T, poboljšano referentno jedinjenje PSMA-46 ispoljava veću internalizaciju i ispoljava poboljšani afinitet. Tako, na osnovu strukture PSMA-46, aromatični ostaci koji su elektronski deficijentni se uvode u sledeći razvojni korak.

3.4-nitrofenilalanin i 2,4-DNBA su uvedeni u peptidni spejser u PSMA-46

DOTAGA-y-2-na)-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-46):

Tabela 5

→ Dok afinitet ostaje sličan, uvođenjem 4-nitrofenilalanina se blago povećava internalizacija, međutim, uvođenjem sledeće nitro grupe preko 2,4-DNBA, moguć je značajan porast internalizacije.

→ Poželjne su grupe koje povlače dva elektrona u cilju povećanja internalizacije.

4. Uvođenje 4-amino-fenilalanina

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(Suc-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-49):

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-62):

Tabela 6

→ Obe modifikacije, 2,4-DNBA i trimezinska kiselina, omogućile su dalje povećanje internalizacije.

5. Uvođenje grupe deficijentne u elektronima u peptidni spejser

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-e(Abz-N<5>-orn-C<4>-EuE)(PSMA-60):

Hemijska formula: C78H98N14O27

Molekulska težina: 1663,71

2,4-DNBA-Dap(DOTAGA)y-2-nal-e(Abz-N<5>-orn-C<4>-EuE) (PSMA-65):

Tabela 7

→ Elektronski deficijentna aromatična modifikacija 2,4-DNBA je bila u mogućnosti da poveća internalizaciju.

6. Trimezinska kiselina je ugrađena u linker i peptidni spejser u PSMA inhibitorima

DOTAGA-F(4-NH2)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-62):

DOTAGA-Dap(TMA)y-2-nal-k(d[N<5>-orn-C<4>-EuE]-TMA) (PSMA-66):

Tabela 8

→ Izmena 4-amino-fenilalanina u Dap(TMA) je dovela do sličnog afiniteta ali neznatno smanjenog kapaciteta internalizacije. Kako su se oba liganda činila veoma obećavajućim, u sledećim eksperimentima ispitana su oba trasera.

→ Zaključak ovih eksperimenata je da je elektron deficijentan aromatični ostatak prenosiv i da može povećati internalizaciju uz održan visok afinitet.

7. Uticaj internalizacije na ćelijsko zadržavanje in vitro ispitan je za jedinjenja [<177>Lu]PSMA-62 i [<177>Lu]PSMA-66 u poređenju sa [<177>Lu]PSMA I&T i [<177>Lu]PSMA-617

[<177>Lu]PSMA-66 ispoljilo je najveću intraćelijsku aktivnost u ćelijama tumora posle 1 h nakon [<177>Lu]PSMA-62, iako je dobijeno da je internalizacija [<177>Lu]PSMA-62 veća nego kod [<177>Lu]PSMA-66 (343.9% vs. 297.8%; pojedinačno). Zanimljivo, čak i kada se re-internalizacija blokira sa 100 µM 2-PMPA-rastvorom, intracelularni klirens [<177>Lu]PSMA-66 je bio manji od onog kod svih drugih ispitanih jedinjenja. Razlika u poređenju sa referentnim [<177>Lu]PSMA I&T je bila veća od dva puta, ukoliko je re-internalizacija bila blokirana.

[<177>Lu]PSMA-66 ima devet slobodnih karboksilnih grupa, koje su podjednako svih devet negativno naelektrisane in vivo (pH = 7.4). Osobine intenzivnog naelektrisanja ovog jedinjenja mogle bi biti moguće objašnjenje za prolongirano intraćelijsko zadržavanje zahvaljujući elektrostatičkim odbojnim efektima sa negativno naelektrisanih ćelijskih membrana.

8. In vivo eksperimenti: Biodistribucija

Tabela 9: Podaci o biodistribuciji [<177>Lu]PSMA-49, [<177>Lu]PSMA-62 i [<177>Lu]PSMA-66 (u % ID/g) kod CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP-tumorski ksenograft u 1. h p.i. (n = 4, pojedinačno). Injektovano je između 3.5 MBq i 5.5 MBq pojedinih<177>Lu-obeleženih radioliganada (0.15 do 0.25 nmol trasera).

Kada se uporedi upijanje [<177>Lu]PSMA I&T u tumor posle 1h p.i. (4.69 ± 0.95%), postignut je značajan porast tumorske aktivnosti putem poboljšanja internalizacije i afiniteta. Kao što je već zapaženo za [<177>Lu]PSMA-16, [<177>Lu]PSMA-40 i [<177>Lu]PSMA-41, proširenje peptidnog spejsera sa 4-amino-D-fenilalaninom dovelo je do visokog preuzimanja u bubregu i potvrđeno je da ova modifikacija povećava akumulaciju u bubregu.

Uvođenje trimezinske kiseline u linker u [<117>Lu]PSMA-62 dovodi do smanjenja preuzimanja u bubregu (106.45 ± 17.18% vs. 162.96 ± 23.20%, pojedinačno) i neznatno nižeg preuzimanja u tumoru u poređenju sa referencom. Kako je internalizacija za [<177>Lu]PSMA-62 bila veća u direktnom poređenju sa [<177>Lu]PSMA-49, niže preuzimanje u tumoru je bilo neočekivano. Nejasno je do kog stepena internalizacija doprinosi preuzimanju u tumoru kao i da li je manje važna od afiniteta. Direktno poređenje [<177>Lu]PSMA-49 i [<177>Lu]PSMA-62 ukazuje da je afinitet mnogo važniji jer [<177>Lu]PSMA-49 je imao veći afinitet prema PSMA (2.5 ± 0.6 nM vs.

4.0 ± 0.2 nM, pojedinačno).

Tabela 10: Podaci o biodistribuciji [<177>Lu]PSMA I&T, [<177>Lu]PSMA-62 i [<177>Lu]PSMA-66 i [<177>Lu]PSMA-71 (u % ID/g) kod CB-17 SCID miševa koji nose LNCaP-tumorski ksenograft posle 24 h p.i. (n = 4, pojedinačno). Injektovano je između 3.5 MBq i 5.5 MBq pojedinih<177>Luobeleženih radioliganada (0.15 do 0.25 nmol traser).

Rezultati u Tabeli 10 pokazuju izrazite razlike između ispitanih trasera [<177>Lu]PSMA-62, [<177>Lu]PSMA-66 i [<177>Lu]PSMA-71. Kada se pogleda renalni klirens, vidljivo se zapaža da kod svih liganada postoji pad u preuzimanju u bubregu u poređenju sa 1 h p.i. (Tabela 9). Dok [<177>Lu]PSMA I&T pokazuje najveće renalno preuzimanje posle 24 h p.i., [<177>Lu]PSMA-62 pokazuje najniže, što je u saglasnosti sa zapaženim renalnim klirensom u PET-studiji. Preuzimanje [<177>Lu]PSMA-61 u tumoru nakon 24 h p.i. ostaje gotovo potpuno stabilno tokom 23 h (8.00 ± 0.75 vs. 7.70 ± 1.35 %ID/g, 1 h p.i. i 24 h p.i., pojedinačno). Iako [<177>Lu]PSMA-62 i [<177>Lu]PSMA-66 pokazuju sličan in vitro parametar u pogledu internalizacije i afiniteta, preuzimanje [<177>Lu]PSMA-66 u tumoru opada većim stepenom od 1 h p.i. do 24 h p.i. (10.00 ± 0.44 vs. 5.73 ± 1.39 %ID/g, 1 h p.i. i 24 h p.i., pojedinačno) u poređenju sa [<177>Lu]PSMA-62. Veće zadržavanje u tumoru zajedno sa korisnijim odnosima tumor prema jetri i tumor prema mišiću čini [<177>Lu]PSMA-62 superiornim kada se uporedi sa [<177>Lu]PSMA-66. Veće preuzimanje u tumoru je zapaženo za PSMA-71, koji isto tako ispoljava i najveću vrednost HSA-vezivanja. Dok je preuzimanje u bubregu 24 h p.i. bilo slično kao za [<177>Lu]PSMA I&T, preuzimanje u tumoru je bilo više od tri puta veće za [<177>Lu]PSMA-71 (4.06 ± 1.12 vs. 14.29 ± 0.89 %ID/g, [<177>Lu]PSMA I&T i [<177>Lu]PSMA-71, pojedinačno).

Uzimajući ovo u obzir, [<177>Lu]PSMA-71 se može smatrati kao praktično vredan traser za endoradioterapeutsku primenu i kandidat je za kliničku primenu.

9. In vivo eksperimenti: PET-snimanje

Efekat 2,4-dinitrobenzojeve supstitucije linkera na inhibitorima na bazi EuK

Inhibitor PSMA-36 na EuK bazi je ispitan PET skenerom za male životinje kako bi se ispitao uticaj 2,4-dinitrobenzojeve kiseline u linkeru na in vivo distribuciju.

Logaritamski TACs grafički podaci pokazuju specifično preuzimanje [<68>Ga]PSMA-36 u bubregu i tumoru. Linearan pad aktivnosti u krvnom pulu, u mišićnom regionu nagovešteno nisko nespecifično vezivanje i brza ekskrecija. Tokom perioda posmatranja, nakupljanje u tumoru ostaje stabilno. Iako [<177>Lu]PSMA-36 ispoljava viši od tri puta veći stepen internalizacije od [<177>LU]PSMA I&T, preuzimanje u tumoru je bilo umereno sa 3.5% ID/mL posle 85 min p.i.. Najznačajnija razlika u poređenju sa [<68>Ga]PSMA I&T je bilo veliko i stabilno preuzimanje u suznoj i pljuvačnoj žlezdi, pokazujući approx. 2% ID/mL u oba regiona. Kako postoji samo strukturna razlika u odnosu na referentni [<68>Ga]PSMA I&T uvođenje 2,4-dinitrobenzojeve kiseline, modifikacija linkera mora biti razlog za ovo povećano preuzimanje. Međutim, potrebno je još ispitivanja da bi se ovaj efekat potvrdio.

Takođe je interesantno da je klirens u ovim regionima bio sporiji u poređenju sa pulom u krvi i mišićima, a to ukazuje da je upleten mehanizam izrazitog zadržavanja. Izvešteno je da PSMA učestvuje u angiogenezi tokom neovaskularizacije oka kod miševa i time bi se moglo objasniti preuzimanje [<68>Ga]PSMA-36 [1]. Nakupljanje trasera u pljuvačnim žlezdama je uobičajeni problem tokom kliničkih terapeutskih programa sa<177>Lu-obeleženim PSMA inhibitorima [2]. Preuzimanje leka u pljuvačne žlezde zavisi od intra- ili ekstracelularnih puteva i najčešće od jednostavne difuzije između fosfolipidnog dvostrukog sloja acinarnih ćelija. Koncentracije leka u salivi su pre svega odraz slobodne, ne-jonizovane frakcije u krvnoj plazmi što se tiče pasivne difuzije [3-5]. U ovom pogledu, čini se veoma neverovatnim da je pasivna difuzija odgovorna za preuzimanje u pljuvačnu žlezdu. Moraju biti uključeni drugi mehanizmi s obzirom na to da su PSMA inhibitori na bazi EuK visoko naelektrisani in vivo i zbog toga ispoljavaju visoki polaritet. Dalje, bila bi vizualizovana pasivna difuzija tokom PET skeniranja u svakom regionu kao visoka pozadinska aktivnost, što se međutim ne javlja kod većine PSMA liganada jer se traser uklanja iz pula krvi brzim klirensom.

Efekat trimezinske kiseline na inhibitore na bazi EuE

Supstitucija liganda PSMA sa aromatičnim sistemom sa deficijencijom elektrona dovela je do uvećanih stopa internalizacije za [<177>Lu]PSMA-62 i [<177>Lu]PSMA-66 (343.9%,odnosno 297.8%). Oba liganda su, sledstveno tome, evaluirana i upoređena jedan s drugim u PET ispitivanjima.

Oba obeleživača su ispoljila odličnu obeleživačku kinetiku u pogledu prihvatanja od strane bubrega, mišića i pula krvi. Specifično prihvatanje u bubrezima je bilo neznatno veće u slučaju korišćenja [<68>Ga]PSMA-66 kada se uporedi sa [<68>Ga]PSMA-62 (45.3% ID/mL, odnosno 34.8%). Veća renalna akumulacija na PET snimku za [<68>Ga]PSMA-66 u poređenju sa [<68>Ga]PSMA-62 bila je u dobroj korelaciji sa biodistribucionim eksperimentima. TAC-i za aktivnost u mišićima i pulu krvi su pokazali linearno prihvatanje i neprekidni klirens u ovim organima.

10. Reference u Primeru 2

1. Grant, C.L., et al., Prostate specific membrane antigen (PSMA) regulates angiogenesis independently of VEGF during ocular neovascularization. PloS one, 2012.7(7): p. e41285.

2. Kulkarni, H.R., et al., PSMA-Based Radioligand Therapy for Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer: The Bad Berka Experience Since 2013. Journal of Nuclear Medicine, 2016.57(Supplement 3): p.97S-104S.

3. Haeckel, R., Factors influencing the saliva/plasma ratio of drugs. Annals of the New York Academy of Sciences, 1993.694(1): p.128-142.

4. Jusko, W.J. i R.L. Milsap, Pharmacokinetic Principles of Drug Distribution in Salivaa. Annals of the New York Academy of Sciences, 1993.694(1): p.36-47.

5. Aps, J.K. i L.C. Martens, Review: the physiology of saliva and transfer of drugs into saliva. Forensic science international, 2005.150(2): p.119-131.

6. Young, J.D., et al., 68Ga-THP-PSMA: a PET imaging agent for prostate cancer offering rapid, room temperature, one-step kit-based radiolabeling. Journal of Nuclear Medicine, 2017: p. jnumed.117.191882.

7. Wüstemann, T., et al., Design of Internalizing PSMA-specific Glu-ureido-based Radiotherapeuticals. Theranostics, 2016.6(8): p.1085.

8. Hao, G., et al., A multivalent approach of imaging probe design to overcome an endogenous anion binding competition for noninvasive assessment of prostate specific membrane antigen. Molecular pharmaceutics, 2013.10(8): p.2975-2985.

9. Soret, M., S.L. Bacharach, i I. Buvat, Partial-volume effect in PET tumor imaging. Journal of Nuclear Medicine, 2007.48(6): p.932-945.

10. Bao, Q., et al., Performance evaluation of the inveon dedicated PET preclinical tomograph based on the NEMA NU-4 standards. Journal of Nuclear Medicine, 2009. 50(3): p. 401-408.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I), ili njegova farmaceutski prihvaljiva so,

pri čemu: m je ceo broj od 2 do 6; n je ceo broj od 2 do 6; R<1L>je CH2, NH ili O; R<2L>je C ili P(OH); R<3L>je CH2, NH ili O; X<1>je odabran od amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, mosta uree i aminske veze; L<1>je dvovalentna spajajuća grupa sa strukturom koja je odabrana od: oligoamida, oligoetra, oligotioetra, oligoestra, oligotioestra, oligouree, oligo(etar-amida), oligo(tioetar-amida), oligo(estar-amida), oligo(tioestar-amida), oligo(urea-amida), oligo(etar-tioetra), oligo(etarestra), oligo(etar-tioestra), oligo(etar-uree), oligo(tioetar-estra), oligo(tioetar-tioestra), oligo(tioetar-uree), oligo(estar-tioestra), oligo(estar-uree) i oligo(tioestar-uree), pri čemu spajajuća grupa može nositi EDS grupu; X<2>je odabran od: amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, mosta uree i aminske veze; R<2>je opciono supstituisana aril grupa ili opciono supstituisana aralkil grupa, pri čemu aril grupa ili aralkil grupa može biti supstituisana na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, odabranih od halogena i -OH; R<3>je opciono supstituisana aril grupa ili opciono supstituisana aralkil grupa, pri čemu aril grupa ili aralkil grupa može biti supstituisana na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, odabranih od halogena i -OH; r je 0 ili 1; p je 0 ili 1; q je 0 ili 1; R<4>je odabran od opciono supstituisane aril grupe i grupe EDS; pri čemu aril grupa može biti supstituisana na svom aromatičnom prstenu sa jednim ili više supstituenata, odabranih od halogena, -OH i NH2; X<3>je odabran od amidne veze, etarske veze, tioetarske veze, estarske veze, tioestarske veze, mosta uree, aminske veze i grupe sa formulom

pri čemu obeležena veza na karbonilnoj grupi vezuje X<3>za R<M>, a druga obeležena veza vezuje X<3>za preostali deo jedinjenja formule (I); R<M>je marker grupa koja sadrži helatnu grupu, koja opciono sadrži helirani neradioaktivni ili radioaktivni katjon; i pri čemu je EDS grupa sadržana najmanje jednom u jedinjenju formule (I) i ima strukturu odabranu od: (E-1A), (E-1B), (E-2A) i (E-2B):

pri čemu označava vezu koja povezuje EDS grupu za ostatak jedinjenja formule (I); s je 1, 2 ili 3, poželjno 1 ili 2, još poželjnije 1; t je 1, 2 ili 3, poželjno 1 ili 2, još poželjnije 2; R<5A>je, nezavisno za svako pojavljivanje kada je s > 1, supstituent koji povlači elektron, koji je poželjno odabran od –NO2i -COOH i koji je poželjnije -COOH, i pri čemu veza između R<5A>i prstena fenila ukazuje da s grupa R<5A>zamenjuju s vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na fenilnom prstenu; R<5B>je, nezavisno, za svako pojavljivanje kada je s > 1, supstituent koji nosi elektronski jonski par na atomu direktno vezan za fenilni prsten, prikazan u formuli (E-1B), pri čemu je supstituent poželjno odabran od -OH i –NH2, i koji je još poželjnije –NH2, i pri čemu veza između R<5B>i prstena fenila pokazuje da s grupe R<5B>zamenjuju s vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na prstenu fenila; R<6A>je, nezavisno za svako pojavljivanje kada je t > 1, supstituent koji povlači elektron, koji je poželjno odabran od –NO2i -COOH, i koji je poželjnije -COOH, i pri čemu veza između R<6A>i prstena fenila pokazuje da t grupe R<6A>zamenjuju t vodoničnih atoma na bilo kojoj poziciji na prstenu fenila; i R<6B>je, nezavisno, za svako pojavljivanje kada je t > 1, supstituent koji nosi usamljeni par elektrona na atomu direktno vezan za fenilni prsten, prikazan u formuli (E-1B), pri čemu je supstituent poželjno odabran od -OH i –NH2, i koji je, poželjnije, -OH, i pri čemu veza između R<6B>i prstena fenila pokazuje da t grupe R<6B>zamenjuju t atoma vodonika na bilo kojoj poziciji na fenilnom prstenu.
2. Jedinjenje ili so prema zahtevu 1, pri čemu: m je 2, n je 2 ili 4, R<1L>je NH, R<2L>je C i R<3L>je NH.
3. Jedinjenje ili so prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je L<1>dvovalentna vezujuća grupa sa strukturom, koja je odabrana od oligoamida, koji sadrži ukupno 1 do 5, poželjnije ukupno 1 do 3, a najpoželjnije ukupno 1 ili 2 amidne veze unutar svoje strukture i oligo(ester-amida) koji sadrži ukupno 2 do 5, poželjnije ukupno 2 do 3, a najpoželjnije ukupno 2 amidne i estarske veze unutar svoje strukture, pri čemu vezujuća grupa može nositi grupu EDS.
4. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu deo -X<2>-L<1>-X<1>- u formuli (I) ima strukturu odabranu od: *-C(O)-NH-R<7>-NH-C(O)-R<8>-C(O)-NH- (L-1), *-C(O)-NH-R<9A>-NH-C(O)-R<10A>-C(O)-NH-R<11A>-NH-C(O)- (L-2A), i *-C(O)-NH-R<9B>-C(O)-NH-R<10B>-C(O)-NH-R<11B>-NH-C(O)- (L-2B); pri čemu je amidna veza, označena sa * vezana za atom ugljenika koji nosi R<2>u formuli (I), i pri čemu R<7>, R<8>, R<9A>, R<9B>, R<11A>i R<11B>su nezavisno odabrani od opciono supstituisanog C2 do C10 alkandiila, pri čemu svaka od alkandiil grupa može biti supstituisana sa jednim ili više supstituenata, nezavisno odabranih od: -OH, -OCH3, -COOH, -COOCH3, -NH2, -NHC(NH)NH2i grupe EDS, i R<10A>i R<10B>su odabrani od opciono supstituisanog C2 do C10 alkandiila, i opciono supstituisanog C6 do C10 arendiila, pri čemu svaka od alkandiil i arendiil grupa može biti supstituisana sa jednim ili više supstituenata, nezavisno odabranih od: -OH, -OCH3, -COOH, -COOCH3, -NH2, -NHC(NH)NH2i grupe EDS.
5. Jedinjenje ili so prema zahtevu 4, pri čemu deo -X<2>-L<1>-X<1>- ima strukturu, odabranu od: *-C(O)-NH-CH(COOH)-R<12>-NH-C(O)-R<13>-C(O)-NH- (L-3), *-C(O)-NH-CH(COOH)-R<14>-NH-C(O)-R<15>-C(O)-NH-R<16>-CH(COOH)-NH-C(O)-(L-4), i *-C(O)-NH-CH(COOH)-R<17>-C(O)-NH-R<18>-C(O)-NH-R<19>-CH(COOH)-NH-C(O)-(L-5); pri čemu je veza, označena sa * vezana za atom ugljenika koji nosi R<2>u formuli (I), R<12>i R<14>su nezavisno odabrani od linearnog C2 do C6 alkandiila, R<13>je linearni C2 do C10 alkandiil, R<15>i R<16>su nezavisno odabrani od linearnog C2 do C6 alkandiila, i pri čemu svaki od R<13>i R<15>može nositi jednu grupu EDS kao supstituent, R<17>je linearni C2 do C6 alkandiil, R<18>je fenilen grupa, i R<19>je linearni C2 do C6 alkandiil.
6. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je R<2>opciono supstituisana aralkil grupa, odabrana od opciono supstituisanog –CH2-fenila i opciono supstituisanog –CH2-naftila, pri čemu su fenil i naftil grupa opciono supstituisane sa supstituentom odabranim od halogena, poželjno I, i -OH.
7. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je R<3>opciono supstituisana aralkil grupa, odabrana od opciono supstituisanog –CH2-fenila i opciono supstituisanog –CH2-naftila, pri čemu su fenil i naftil grupa opciono supstituisane sa supstituuentom odabranim od halogena i -OH.
8. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je r 1, i pri čemu je R<4>odabran od opciono supstituisanog fenila, opciono supstituisanog naftila, i grupe EDS, pri čemu su fenil grupa i naftil grupa opciono supstituisane sa supstituentom odabranim od halogena, -OH i – NH2.
9. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu je X<3>amidna veza ili grupa formule

pri čemu označena veza na karbonilnoj grupi vezuje X<3>za R<M>, a druga označena veza vezuje X<3>za ostatak molekula.
10. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu je R<M>helatna grupa koja opciono sadrži helirani neradioaktivni ili radioaktivni katjon.
11. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu jedinjenje formule (I) sadrži jednu grupu EDS koju nosi spajajuća grupa L<1>, ili sadrži dve grupe EDS, od kojih je jedna predstavljenja sa R<4>, a jednu nosi L<1>.
12. Jedinjenje ili so prema bilo kom od zahteva 1 do 11, koje sadrži grupu EDS koja ima formulu (E-2A):

pri čemu označava vezu koja vezuje EDS grupu za ostatak jedinjenja formule (I); i t je 1 ili 2, i R<6A>je odabran od –NO2i -COOH.
13. Jedinjenje ili njegova so prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu pomenuto jedinjenje ili so ima jednu od sledećih formula:
14. Farmaceutska ili dijagnostička kompozicija koja sadrži ili se sastoji od jednog ili više jedinjenja ili soli u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 13.
15. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 13 za upotrebu u postupku dijagnostikovanja i/ili lečenja (a) raka, uključujući rak prostate, ili (b) neoangiogeneze/angiogeneze.