RS63285B1 - L-valinat hidroksipropil tiazolidin karboksamidnog derivata, njegova so i njegov kristalni oblik - Google Patents

L-valinat hidroksipropil tiazolidin karboksamidnog derivata, njegova so i njegov kristalni oblik

Info

Publication number
RS63285B1
RS63285B1 RS20220547A RSP20220547A RS63285B1 RS 63285 B1 RS63285 B1 RS 63285B1 RS 20220547 A RS20220547 A RS 20220547A RS P20220547 A RSP20220547 A RS P20220547A RS 63285 B1 RS63285 B1 RS 63285B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
contractions
salt
subject
effects
Prior art date
Application number
RS20220547A
Other languages
English (en)
Inventor
Page Patrick Naxos
Matthias Schwarz
Catherine Jorand-Lebrun
Anna Quattropani
Vincent Pomel
Original Assignee
Merck Serono Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/987,586 external-priority patent/US9447055B1/en
Application filed by Merck Serono Sa filed Critical Merck Serono Sa
Publication of RS63285B1 publication Critical patent/RS63285B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/426—1,3-Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4422—1,4-Dihydropyridines, e.g. nifedipine, nicardipine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/095—Oxytocins; Vasopressins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/04—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/06—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike pronalaska
[0001] Pronalazak se odnosi na hemijske kompozicije, kao što su jedinjenja, soli i kristalni polimorfi, koji su sposobni da vezuju i inhibiraju aktivnost prostaglandinskog F2α (PGF2α) receptora, kao i na postupke prevencije prevremenog porođaja u ranoj gestacijskoj fazi, davanjem ovih kompozicija pacijentu kome je lečenje potrebno.
Stanje tehnike pronalaska
[0002] U razvijenom svetu, prevremeni porođaj predstavlja preovladavajući uzrok smrtnosti neposredno po rođenju i javlja se kod približno 7% do 10% od svih porođaja (Berkowitz i saradnici, Epidemiol. Rev. 15:414-443 (1993)). Težak morbiditet, prevashodno respiratorni distres sindrom, intraventrikularno krvarenje, bronhopulmonarna displazija i nekrotizirajući enterokolitis, mnogo su češći kod nedonoščadi nego kod novorođenčadi rođenih u teminu. Dugotrajna oštećenja, kao što su cerebralna paraliza, oštećenje vida i gubitak sluha, takođe su češći kod nedonoščadi. Trenutno, prevremeni porođaj ostaje vodeći uzrok smrtnosti i morbiditeta novorođenčadi u Sjedinjenim Državama, gde je, uprkos značajnim poboljšanjima u akušerskoj medicini, stopa smrtnosti novorođenčadi viša nego u mnogim drugim industrijalizovanim zemljama, što prouzrokuje troškove koji prelaze 5 milijardi dolara godišnje za neonatalnu intenzivnu negu beba sa niskom težinom na rođenju. Stvarni troškovi povezani sa ovakvom negom su čak viši kada se u razmatranje uzme i pružanje zdravstvene zaštite za bolesti povezane sa prevremenim porođajem, kao što su respiratorni distres sindrom, srčana oboljenja, cerebralna paraliza, epilepsija i teške smetnje u učenju.
[0003] Tokom proteklih 40 godina kliničkih istraživanja, kao i uprkos upotrebi višestrukih terapijskih agenasa, stopa prevremenog porođaja nije drastično opala. Prevencija prevremenog porođaja je sa brojnim teškoćama i mada tokolitička terapija ostaje kamen temeljac u kontroli prevremenog porođaja, ne postoji univerzalna saglasnost o vrednosti navedene terapije u ovom stanju. Dostupni tokolitički agensi sami po sebi ne produžavaju porođaj za više od 48 sati, a većinu ovih agenasa karakteriše nedostatak selektivnosti za matericu, usled čega oni mogu prouzrokovati potencijalno ozbiljne sporedne efekte, kako kod majke, tako i kod fetusa.
[0004] U osnovi, prođaj u terminu i prevremeni porođaj su slični procesi po tome što im je zajednička fiziološka krajnja tačka koju karakterišu kontrakcije materice, dilatacija grlića materice i aktivacija fetalnih membrana. Razlike leže u gestacijskoj starosti u kojoj se ti procesi javljaju i mehanizmima kojima se oni aktiviraju. Smatra se da je porođaj u terminu rezultat fiziološke aktivacije terminalnog puta, dok je prevremeni porođaj patološko stanje koje karakteriše višestruka etiologija u kojoj je jedna ili više komponenti ovog puta aberantno aktivirana.
[0005] Kontraktilnost materice stimulišu ili inhibiraju razni receptori u ćelijama miometrijuma. Pretpostavlja se da je aktivacija miometrijuma rezultat koordinisane ekspresije proteina povezanih sa kontrakcijama (CAP), uključujući aktin, miozin, koneksin-43 i receptore za oksitocin i prostaglandine. U principu, receptori koji izazivaju ulazak kalcijuma ili oslobađanje kalcijuma iz unutarćelijskih skladišta, stimulišu kontraktilnost. Ipak, receptori kuplovani sa proizvodnjom cikličnih nukleotida, kao što je ciklični adenozin monofosfat (cAMP), opuštaju matericu. Na primer, receptori za oksitocin i prostaglandin F (FP) su stimulativni, dok su β2 adrenoceptori i prostaglandinski E2 receptori, koji su kuplovani sa obrazovanjem cAMP, inhibitorni.
[0006] U tkivima materice, pokazano je da prostaglandini E2 (PGE2) i F2α (PGF2α) indukuju promene na grliću materice i izazivaju kontraktilnost materice, dva ključna događaja u fiziologiji porođaja i rađanja. Aktivacija FP receptora u humanom miometrijumu sa PGF2α dovodi do povišenja koncentracije unutarćelijskog kalcijuma, što zauzvrat dovodi do kontrakcije glatkih mišićnih ćelija materice (Abramovitz i saradnici, J. Biol. Chem. 269:2632-2636 (1994) i Senior i saradnici, Br. J. Pharmacol.108:501-506 (1993)). FP receptori se pozitivno regulišu u tkivima materice kako se vreme terminu bliži (Al-Matubsi i saradnici, Biol. Reprod. 65:1029-1037 (2001)). Inhibitori sinteze prostaglandina (kao što su indometacin i nimezulid) ispoljili su određeni tokolitički efekat, ali nisu lišeni sporednih efekata i njihova nelicencirana upotreba u klinici je izazvala zabrinutost u vezi sa bezbednošću za fetus (Norton i saradnici, New Engl. J. Med.329:1602-1067 (1993) i Peruzzi i saradnici, New Engl. J. Med.354:1615 (1999)). WO 2003/082278 opisuje derivate tiazolidin karboksamida koji mogu biti upotrebljeni za lečenje i/ili prevenciju prevremenog porođaja, prevremenog rođenja i dismenoreje, kao i za zaustavljanje porođaja pre porođaja carskim rezom. Ostaje potreba da se razviju terapeutici sa selektivnošću za miometrijum, koji bi dozvolili trajanje inhibicije kontrakcija materice koje dovode do porođaja i koji bi produžili trudnoću do stadijuma u kome povećano sazrevanje fetusa povećava njegove šanse za preživljavanje.
Suština pronalaska
[0007] Pronalazak obuhvata alfa-amino estre hidroksipropiltiazolidin karboksamidnog derivata, kao i njihove soli, koji su u stanju da antagonizuju interakciju između prostaglandina F2α (PGF2α) i prostaglandinskog F receptora. Ova jedinjenja mogu biti davana subjektu, kao što je trudna ženska osoba, u cilju lečenja ili prevencije prevremenog porođaja. Pronalazak dodatno obezbeđuje postupke za sintezu ovih jedinjenja kao i postupke za dobijanje njegovih kristalnih oblika.
[0008] Prema prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje jedinjenje predstavljeno formulom (I),
[0009] (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u lečenju ili prevenciji prevremenog porođaja kod humanog pacijenta, pri čemu se jedinjenje daje pacijentu sa dodatnim tokolitičkim agensom. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje je predstavljeno formulom (III), (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat hidrohlorid.
[0010] Prema drugom aspektu, pronalazak obuhvata jedinjenje predstavljeno formulom (III)
pri čemu je jedinjenje u kristalnom stanju.
[0011] U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od prethodno opisanih aspekata. Farmaceutska kompozicija može opciono sadržavati jedan ili više ekscipijenasa. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje i/ili farmaceutska kompozicija su formulisani za oralnu davanje subjektu. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je tableta, kapsula, gel kapsula, prah, tečni rastvor ili tečna suspenzija. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje i/ili farmaceutska kompozicija su formulisani za intravensku davanje subjektu.
[0012] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti davana subjektu da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja). U pojedinim primerima izvođenja, kod subjekta je započeo prevremeni porođaj. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se daje subjektu (npr. humanom subjektu) pre započinjanja prevremenog porođaja. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti davana subjektu (npr. humanom subjektu) da bi se sprečio porođaj pre porođaja carskim rezom. Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti davana subjektu (npr. humanom subjektu) radi lečenja ili prevencije dismenoreje. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema pronalasku može biti davana subjektu, kao što je trudna ženska osoba, da bi se ublažio jedan ili više simptoma povezanih sa porođajem, kao što su vaginalno krvarenje i ruptura membrana uterusa.
[0013] U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak sinteze jedinjenja prikazanog formulom (I).
ili njegove farmaceutski prihvatljive soli reagovanjem prekursora prikazanog formulom (IV)
sa prekursorom prikazanim formulom (V)
da bi se obrazovao aminoestar, u kome X je zaštitna grupa. Unekim izvođenjima, postupak obuhvata skidanje zaštite sa aminoestra. U nekim izvođenjima, jedinjenje je prikazano formulom (III).
[0014] U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata reagovanje aminoestra sa reagensom sposobnim da skine zaštitu sa amino estra.
[0015] Pronalazak je koristan u postupku lečenja prevremenog porođaja kod subjekta, davanjem subjektu terapijski efektivne količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz bilo kog od prethodno opisanih aspekata pronalaska.
[0016] Pronalazak je takođe koristan u postupku prevencije prevremenog porođaja kod subjekta, davanjem subjektu terapijski efektivne količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz bilo kog od prethodno opisanih aspekata pronalaska.
[0017] Pronalazak je koristan u postupku prevencije porođaja pre carskog reza kod subjekta, davanjem subjektu terapijski efektivne količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz bilo kog od prethodno opisanih aspekata pronalaska.
[0018] Pronalazak je takođe koristan u postupku lečenja ili prevencije dismenoreje kod subjekta, davanjem subjektu terapijski efektivne količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz bilo kog od prethodno opisanih aspekata pronalaska.
[0019] Pronalazak je koristan u postupku lečenja ili prevencije endometrioze kod subjekta, davanjem subjektu terapijski efektivne količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz bilo kog od prethodno opisanih aspekata pronalaska.
[0020] U pojedinim primerima izvođenja, subjekta karakteriše gestaciona starost od oko 24 do oko 34 nedelje. U nekim izvođenjima, subjekt je sisar kao što je čovek.
[0021] U pojedinim primerima izvođenja, postupak uključuje oralno davanje jedinjenja ili farmaceutske kompozicije subjektu. U pojedinim primerima izvođenja, postupak uključuje intravensko davanje jedinjenja ili farmaceutske kompozicije subjektu.
Definicije
[0022] Kao što se ovde upotrebljava, termin „oko” se odnosi na vrednost koja je unutar 10% iznad ili ispod vrednosti koja se opisuje.
[0023] Kao što se ovde upotrebljava, termin „afinitet” se odnosi na jačinu interakcije vezivanja između dva molekula, kao što su ligand i receptor. Predviđeno je da se termin „Ki", kako se ovde upotrebljava, odnosi na konstantu inhibicije antagoniste za određeni molekul od interesa, a izražava se kao molarna koncentracija (M). Kivrednosti za interakcije antagoniste i ciljnog molekula mogu biti određene, npr. upotrebom postupaka koji su ustanovljeni u oblasti tehnike. Postupci koji mogu biti upotrebljeni za određivanje Kiantagoniste za ciljni molekul uključuju kompetitivne eksperimente vezivanja, kao što su kompetitivni testovi vezivanja radioliganda, npr. kao što je opisano u US 8,415,480. Predviđeno je i da se termin „Kd", kako se ovde upotrebljava, odnosi na konstantu disocijacije, koja se može dobiti, npr. iz odnosa konstante stope disocijacije dva molekula (kd) sa konstatom stope asocijacije na dva molekula (ka), a izražava se kao molarna koncentracija (M). Kdvrednosti za interakcije receptora i liganda mogu biti određene, npr. upotrebom postupaka koji su ustanovljeni u oblasti tehnike. Postupci koji mogu biti upotrebljeni za određivanje Kdinterakcije receptor-ligand uključuju površinsku plazmonsku rezonanciju, npr. putem upotrebe biosenzorskog sistema kao što je BIACORE<®>sistem.
[0024] Kao što se ovde upotrebljava, termin „kortikosteroid” se odnosi na bilo koji od steroidnih hormona koji proizvodi kora nadbubrežne žlezde ili na njihove sintetičke ekvivalente. Kortikosteroidi za primer uključuju betametazon, deksametazon i hidrokortizon, između ostalih, kao i njihove varijante. Kortikosteroidi za zajedničku upotrebu sa kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani, uključuju one koji su sposobni da indukuju sazrevanje pluća fetusa, na primer, tako da se spreči razvoj respiratornog distres sindroma kod nedonoščadi. Primeri kortikosteroida za zajedničku upotrebu sa kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani, uključuju i one opisane od strane Jobe i saradnika, Am. J. Obstet. Gynecol.190:878-881 (2004) i Miracle i saradnici, J. Perinat. Med.36:191-196 (2008).
[0025] Kao što se ovde upotrebljava, termin „kristal” ili „kristalni oblik” označava fizičko stanje koje predstavlja pravilan trodimenzionalni niz atoma, jona, molekula ili molekulskih skupova. Kristalni oblici su sa nizom rešetaka od gradivnih blokova nazvanih asimetrične jedinice koji su raspoređeni u skladu sa dobro definisanim simetrijama u jedinične ćelije koje se ponavljaju u trodimenzionalnom prostoru. Nasuprot tome, termin „amorfno” ili „amorfni oblik” odnosi se na neorganizovanu strukturu (bez uređenja). Fizičko stanje terapijskog jedinjenja može biti određeno tehnikama za primer kao što su difrakcija rendgenskih zraka, mikroskopija sa polarizovanim svetlom i/ili diferencijalna skenirajuća kalorimetrija.
[0026] Kao što se ovde upotrebljava, termin „endogeni” opisuje molekul (npr. polipeptid, nukleinsku kiselinu ili kofaktor) koji se prirodno nalazi u određenom organizmu (npr. čoveku) ili na određenoj lokaciji unutar organizma (npr. u organu, tkivu ili ćeliji, kao što je humana ćelija).
[0027] Kao što se ovde upotrebljava, termin „egzogeni” opisuje molekul (npr. polipeptid, nukleinsku kiselinu ili kofaktor) koji se prirodno ne nalazi u određenom organizmu (npr. čoveku) ili na određenoj lokaciji unutar organizma (npr. u organu, tkivu ili ćeliji, kao što je humana ćelija). Egzogeni materijali uključuju one koji se organizmu obezbeđuju iz spoljašnjeg izvora ili kultivisanim materijama koji su iz njih ekstrahovani.
[0028] Kao što se ovde upotrebljava, termin „gestacijska starost” opisuje u kojoj je fazi određena trudnoća i meri se od prvog dana poslednjeg menstrualnog ciklusa trudne ženske osobe do trenutnog datuma. Kao što se ovde upotrebljava, termin „porođaj” (koji može biti označen kao rađanje) odnosi se na izbacivanje fetusa i placente iz materice trudne ženske osobe. Za normalnu trudnoću, porođaj se može javiti u gestacijskom dobu od oko 40 nedelja. „Prevremeni porođaj", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na stanje u kojem porođaj počinje više od tri nedelje pre potpunog gestacijskog perioda, što je obično oko 40 nedelja. Prevremeni porođaj se zapravo javlja u bilo kojoj fazi pre, npr.38. nedelje gestacije. Prevremeni porođaj obično vodi odvijanju porođaja ili fiziološkim promenama koje su povezane sa porođajem kod trudne ženske osobe, ukoliko se ne leči. Prevremeni porođaj može ili ne mora biti povezan sa vaginalnim krvarenjem ili rupturom membrana materice. Prevremeni porođaj se može takođe označiti kao porođaj pre sazrevanja. Izbegavanje prevremenog porođaja kod subjekta će produžiti trajanje trudnoće i stoga se time može izbeći prevremeno rađanje, čime se smanjuje rizik od neonatalnog mortaliteta i morbiditeta.
[0029] Kao što se ovde upotrebljava, termin „ICso” se odnosi na koncentraciju supstance (antagoniste) koja smanjuje efikasnost referentnog agoniste ili konstitutivnu aktivnost biološkog ciljnog molekula za 50%, npr. kao što se meri testom kompetitivnog vezivanja liganda. Testovi kompetitivnog vezivanja za primer uključuju kompetitivne testove vezivanja radioliganda, kompetitivne imunosorbentne testove povezane sa enzimom (ELISA) i testove zasnovane na fluorescentnoj anizotropiji, između ostalih koji su poznati u oblasti tehnike.
[0030] Kao što se ovde upotrebljava u kontekstu obezbeđivanja ili primene dva ili više terapijskih agensa subjektu, fraza „u kombinaciji sa” odnosi se na isporuku dva ili više terapijskih agenasa subjektu (npr. sisarskom subjektu, kao što je humani subjekat), na primer, istovremeno ili u različitim vremenima. Na primer, jedan terapijski agens može biti davan subjektu u kombinaciji sa drugim, davanjem oba agensa subjektu istovremeno, kao što je u jednoj farmaceutskoj kompoziciji ili u odvojenim kompozicijama koje se daju subjektu istovremeno (npr. različitim putevima primene). U drugom primeru, jedan terapijski agens može biti davan subjektu u kombinaciji sa drugim tako što se subjektu najpre daje jedan terapijski agens, a zatim se daje drugi terapijski agens, bilo istim ili različitim putem primene.
[0031] Kao što se ovde upotrebljava, termin „nolasiban” se odnosi na (3Z,5S)-5-(hidroksimetil)-1-[(2'-metil-1,1'-bifenil-4-il)karbonil]pirolidin-3-on O-metiloksim, predstavljen sledećom strukturnom formulom:
Nolasiban
Varijante, formulacije i kristalni oblik nolasibana su opisani, npr. u SAD patentu br. 7,115,754 i SAD patentnoj prijavi br.2015/0073032; 2015/0164859; i 2016/0002160.
[0032] Kao što se ovde upotrebljava, termin „oralna bioraspoloživost” se odnosi na frakciju jedinjenja datog subjektu, kao što je sisar (npr. čovek), koja dospeva u sistemsku cirkulaciju subjekta i koja se ne izdvaja u organu koji nije ciljni organ, ili izlučuje bez apsorpcije putem gastrointestinalnog trakta. Termin se odnosi na koncentraciju u krvnoj plazmi koja se integriše tokom vremena i obično se izražava kao procenat oralno primenjene doze.
[0033] Kao što se ovde upotrebljava, termin „antagonista oksitocinskog receptora” ili „antagonista oksitocina” odnosi se na jedinjenje sposobno da inhibira interakciju između oksitocina i oksitocinskog receptora, na primer, tako da je inhibirana aktivnost jednog ili više nishodnih signalnih molekula u kaskadi prenosa signala oksitocina. Antagonisti oksitocina za upotrebu sa kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani uključuju jedinjenja koja vezuju i inhibiraju oksitocinski receptor, kao što su atosiban, retosiban, barusiban, epelsiban i nolasiban, kao i njihove varijante, formulacije, kristalne oblike i derivate, uključujući one koji su ovde opisani, između ostalih.
[0034] Kao što se ovde upotrebljava, termin „farmaceutski prihvatljiv” se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili dozne oblike koji su pogodni za kontakt sa tkivima subjekta, kao što je sisar (npr. čovek) bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora i drugih problema komplikacija, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika.
[0035] Kao što se ovde upotrebljava, termin „farmaceutska kompozicija” označava smešu koja sadrži terapijsko jedinjenje koje se daje subjektu, kao što je sisar, npr. čovek, u cilju prevencije, lečenja ili kontrole određene bolesti ili stanja koje utiče na sisara, kao što je prevremeni porođaj ili dismenoreja, između ostalog, npr. kao što je ovde opisano.
[0036] Kao što se ovde upotrebljava, termin „zaštitna grupa” odnosi se na hemijski ostatak koji, kada je vezan za funkcionalnu grupu, čini funkcionalnu grupu inertnom za jednu ili više hemijskih reakcija. Takve reakcije mogu modifikovati jedan ili više supstituenata jedinjenja i, u odsustvu zaštitne grupe, mogu dovesti do neželjene hemijske modifikacije (npr. elektrofilne adicije, solvolize, oksidacije, redukcije ili interkonverzije funkcionalne grupe) ostatka od interesa (npr. amino, hidroksilnog, karboksilnog ili karboksamidnog ostatka). Zaštitne grupe mogu, u odgovarajuće vreme, hemijski reagovati tako da se obnovi prvobitna funkcionalna grupa. Identitet zaštitne grupe može biti izabran tako da bude kompatibilan sa ostatkom molekula, npr. tako da se zaštitna grupa ne uklanja tokom drugih koraka sinteze ili modifikacije molekula, a opciono i tako da reakcioni uslovi koji se upotrebljavaju za ostvarivanje uklanjanja zaštitne grupe ne rezultuju uklanjanjem različitih zaštitnih grupa koje se nalaze na drugim supstituentima u molekulu. Zaštitne grupe za primer uključuju one koje mogu biti kovalentno vezane za, npr. amino supstituent, kao što je amino grupa a-amino estra. Naknadno uklanjanje zaštitne grupe, označeno ovde kao „deprotekcija” hemijskog ostatka, može biti postignuta upotrebom reagenasa i uslova koji su poznati u oblasti tehnike. Primeri zaštitnih grupa uključuju, bez ograničenja, benzil, acetil, oksiacetil, karboksibenzil, 9-fluoreniloksikarbonil, 2-hloro-1-indanilmetoksi-karbonil, benz [f] inden-3-metoksikarbonil, 2-(terf-butilsulfonil)-2-propeniloksikarbonil, benzotiofen sulfon-2-metilkarbonil, terc-butoksikarbonil, terc-amiloksikarbonil, ß-trimetilsililetiloksikarbonil, adamantiloksikarbonil, 1-metilciklobutiloksikarbonil, 2-(pbifenilil)propil-2-oksikarbonil, 2-(p-fenilazofenil)propil-2- oksikarbonil, 2,2-dimetil-3,5-dimetiloksibenziloksikarbonil, 2-fenilpropil-2-oksikarbonil, benziloksikarbonil, ptoluensulfonilaminokarbonil, o-nitrofenilsulfenil, ditiasukcinoil, ftaloil, piperidinooksikarbonil, formil, trifluoroacetil, 2,4,6-trimetoksibenzil, 2,3,6-trimetil-4 metoksibenezensulfonil, terc-butoksimetil, pentametilhromansulfonil, adamantil, ß-trimetilsililetil, ß-trimetilililetiloksikarbonil, terc-butil, tercbutilbenzil, ciklopentil, trifenilmetil, benziloksikarbonil, formil i trifluoroacetil, između ostalih. Zaštitne grupe mogu biti pogodne za određeni hemijski supstituent. Na primer, primeri zaštitnih grupa za hidroksilnu grupu uključuju, bez ograničenja, benzil, p-metoksibenzil, p-nitrobenzil, alil, tricil, dialkilsililetre, kao što su dimetilsilil etar i trialkilsilil etri poput trimetilsilil etra, trietilsilil etra i tbutildimetilsilil etra; estre kao što su benzoil, acetil, fenilacetil, formil, mono-, di- i trihaloacetil poput hloroacetila, dihloroacetila, trihloroacetila, trifluoroacetila; i karbonate kao što su metil, etil, 2,2,2-trihloretil, alil, benzil i p-nitrofenil. Dodatni primeri zaštitnih grupa se mogu pronaći, npr. u Greene i Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. izdanje, 1991, John Wiley & Sons, kao i u McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, 1975, Plenum Press. Ostali primeri zaštitnih grupa su opisani, npr. u SAD patentima br.3,835,175; 4,508,657; 3,839,396; 4,581,167; 4,460,501; i 4,108,846.
[0037] Kao što se ovde upotrebljava u kontekstu terapijskog tretmana, termini „obezbediti” i „obezbeđivanje” odnose se na isporuku terapijskog agensa subjektu (npr. sisarskom subjektu, kao što je čovek) kome je tretman potreban, kao što je subjekat kod koga je započeo ili postoji rizik prevremenog porođaja. Terapijski agens može biti obezbeđen subjektu kome je potreban, na primer, direktnim davanjem terapijskog agensa subjektu, ili davanjem proleka koji se in vivo prevodi u terapijski agens, nakon davanja proleka subjektu. Prolekovi za primer uključuju, bez ograničenja, estre, fosfate i druge hemijske funkcionalnosti koje su podložne hidrolizi nakon davanja subjektu. Prolekovi uključuju one koji su poznati u oblasti tehnike, kao što su oni opisani, na primer, u Vig i saradnici, Adv. Drug Deliv. Rev.65:1370-1385 (2013), i Huttunen i saradnici, Pharmacol. Rev.63:750-771 (2011).
[0038] Kao što se ovde upotrebljava, termin „uzorak” se odnosi na biološki materijal (npr. krv, komponentu krvi (npr. serum ili plazmu), urin, pljuvačku, amnionsku tečnost, cerebrospinalnu tečnost, tkivo (npr. posteljicu ili dermalno tkivo), tečnost pankreasa, uzorak horionskih resica i ćelije) izolovano iz subjekta.
[0039] Kao što se ovde upotrebljava, fraze „specifično vezuje” i „vezuje” odnose se na reakciju vezivanja koja je određujuća za prisustvo određenog proteina u heterogenoj populaciji proteina i drugih bioloških molekula koju prepoznaje, npr. ligand sa određenom specifičnošću. Ligand (npr. protein, proteoglikan ili glikozaminoglikan) koji se specifično vezuje za protein, vezaće se za protein, npr. sa KDmanjom od 100 nM. Na primer, ligand koji se specifično vezuje za protein može vezivati protein sa KDdo 100 nM (npr. između 1 pM i 100 nM). Ligand koji ne ispoljava specifično vezivanje za protein ili njegov domen će karakterisati KDveća od 100 nM (npr. veća od 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nm, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 µM, 100 µM, 500 µM ili 1mM) za taj određeni protein ili njegov domen. Za određivanje afiniteta liganda za određeni protein mogu biti upotrebljeni raznovrsni formati testova. Na primer, ELISA testovi sa čvrstom fazom rutinski se upotrebljavaju za identifikaciju liganada koji specifično vezuju ciljni protein. Pogledati, npr. Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) i Harlow i Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999), za opis formata testova i uslova koji mogu biti upotrebljeni za određivanje specifičnog vezivanja proteina.
[0040] Kao što se ovde upotrebljava, termini „subjekat” i „pacijent” se mogu upotrebljavati naizmenično i odnose se na organizam koji prima terapiju za određenu bolest ili stanje koji su ovde opisani (kao što je prevremeni porođaj ili dismenoreja) ili za koga je postavljena dijagnoza bolesti ili stanja u skladu sa postupcima koji su ovde opisani. Primeri subjekata i pacijenata uključuju sisare, kao što su ljudi, koji primaju terapiju za bolest ili stanje, na primer prevremeni porođaj u ranom gestacijskom dobu (npr.24-34 nedelje).
[0041] Jedinjenje, oblik soli, kristalni polimorf, terapijski agens ili druga kompozicija koja je ovde opisana, mogu označavati one koji su okarakterisani grafičkim podacima „suštinski prikazanim na” slici. Takvi podaci mogu uključivati, bez ograničenja, rendgenske difraktograme praha, NMR spektre, krive diferencijalne skenirajuće kalorimetrije i krive termogravimetrijske analize, između ostalih. Kao što je poznato u oblasti tehnike, takvi grafički podaci mogu obezbediti dodatne tehničke informacije za dalje definisanje jedinjenja, oblika soli, kristalnog polimorfa, terapijskog agensa ili druge kompozicije. Kao što stručnjak iz oblasti tehnike i podrazumeva, takvi grafički prikazi podataka mogu biti podložni malim varijacijama, npr. u relativnim intenzitetima i pozicijama pikova, usled faktora kao što su varijacije u odgovoru instrumenta i varijacije u koncentraciji i čistoći uzorka. Bez obzira na navedeno, stručnjak iz oblasti tehnike će biti u stanju da lako uporedi grafičke podatke koji su ovde pirkazani na slikama, sa grafičkim podacima generisanim za jedinjenje, oblik soli, kristalni polimorf, terapijski agens i drugu kompoziciju, odnosno da potvrdi da li dva skupa grafičkih podataka karakterišu isti materijal ili dva različita materijala. Na primer, podrazumeva se da kristalni oblik (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat hidrohlorida, koji se ovde navodi kao okarakterisan grafičkim podacima koji su „suštinski kao što je prikazano na” slici, uključuje bilo koji kristalni oblik (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat hidrohlorida koga karakterišu grafički podaci, opciono oni sa jednom ili više manjih varijacija, npr. jednom ili više varijacija koje su prethodno opisane ili su poznate stručnjaku iz oblasti tehnike.
[0042] Kao što se ovde upotrebljava, termini „lečiti” ili „lečenje” odnose se na terapijski tretman, čiji je cilj da se spreči ili uspori (smanji) neželjena fiziološka promena ili poremećaj, kao što je napredovanje prevremenog porođaja u ranoj gestacijskoj starosti (npr. od 24-34 nedelje). Povoljni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, kao što su vaginalno krvarenje ili ruptura membrana, i odlaganje ili usporavanje porođaja. Oni kojima je tretman potreban uključuju, npr. trudne ženske osobe kod kojih se prevremeni porođaj već započeo, kao i one koje su sklone razvoju ovog stanja.
[0043] Kao što se ovde upotrebljava, termin „tokolitički agens” odnosi se na supstancu koja je u stanju da odloži početak porođaja kod subjekta (npr. sisarskog subjekta, kao što je humani subjekat). Tokolitički agensi mogu funkcionisati tako da suprimiraju kontraktilnost materice, na primer, povećavanjem nivoa cAMP-a u citoplazmi i inhibiranjem mobilizacije unutarćelijskog Ca<2+>. Tokolitički agensi za primer su opisani, na primer, u Haas i saradnici, Int. J. Womens Health. 6:343-349 (2014). Tokolitički agensi za upotrebu zajedno sa kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani uključuju, bez ograničenja, supstance navedene u vidu liste ispod, u Tabeli 1.
Tabela 1. Primeri tokolitičkih agenasa
Kratak opis slika Nacrta
[0044]
Slika 1 je grafik koji prikazuje efekat jedinjenja II i jedinjenja III na spontanu kontraktilnost materice kod pacova u kasnoj fazi trudnoće, nakon intravenske primene.
Slika 2 je grafik koji prikazuje dozno-zavisni i reverzibilni efekat jedinjenja I na spontanu kontrakciju materice kod pacova u kasnoj fazi trudnoće.
Slika 3 je grafik koji prikazuje efekat jedinjenja II i jedinjenja III na spontanu kontraktilnost materice kod pacova u kasnoj fazi trudnoće, nakon oralne primene.
Slika 4 je tabela koja sumira razne postupke upotrebljene za generisanje slobodne baze jedinjenja I, kao i zapažanja u vezi sa fizičkim karakteristikama i NMR spektrima jedinjenja I koje je dobijeno svakim od postupaka.
Slika 5 je tabela koja sumira razne postupke upotrebljene za generisanje soli jedinjenja I, kao i zapažanja u vezi sa fizičkim karakteristikama i NMR spektrima ovih soli dobijenih svakim od postupaka.
Slika 6 je tabela koja sumira fizičke karakteristike, kao i spektre difrakcije rendgenskih zraka prahom (XRPD), za razne soli jedinjenja I.
Slika 7 je tabela koja sumira postupke upotrebljene za generisanje kristalnih oblika raznih soli jedinjenja I, kao i zapažanja u vezi sa fizičkim osobinama i XRPD spektrima svakog kristalnog oblika.
Figura 8 je tabela koja sumira rastvorljivost raznih soli jedinjenja I u vodenom rastvoru.
Slika 9 je tabela koja sumira stabilnost kristalnih oblika raznih soli jedinjenja I pri naznačenoj relativnoj vlažnosti (RV).
Slika 10 je tabela koja sumira razne karakteristike jedinjenja III određene rendgenskom difraktometrijom praha (XRPD), diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC), termogravimetrijskom (TG) analizom, sorpcijom/desorpcijom vlage (MB) i<1>H nuklearnom magnetnom rezonancijom (NMR).
Slika 11 je tabela u kojoj su sumirane različite karakteristike hidrosulfatne soli jedinjenja I, određene rendgenskom difraktometrijom praha (XRPD), diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC), termogravimetrijskom (TG) analizom i<1>H nuklearnom magnetnom rezonancijom (NMR).
Slika 12 prikazuje XRPD spektar mezilatne soli jedinjenja I.
Slika 13 prikazuje<1>H NMR spektar mezilatne soli jedinjenja I.
Slika 14 prikazuje XRPD spektar slobodne baze jedinjenja I.
Slika 15 prikazuje<1>H NMR spektar slobodne baze jedinjenja I.
Slika 16 prikazuje Ramanov infracrveni spektar za slobodnu bazu jedinjenja I.
Slika 17 prikazuje<1>H NMR spektar mezilatne soli jedinjenja I. Mezilatna so je pripremana dodavanjem metansulfonske kiseline u rastvor slobodne baze jedinjenja I u dietil etru.
Slika 18 prikazuje seriju<1>H NMR spektara slobodne baze jedinjenja I e baze jedinjenja I koji su snimatni tokom eksperimenata homonuklearnog dekuplovanja.
Slika 19 prikazuje seriju XRPD spektara hloridne soli jedinjenja I proizvedene iz acetonske suspenzije (gore), nakon uparavanja smeše metilen hlorida:etil etra (drugi odozgo) i nakion sporog uparavanja smeše acetona:toluena odnosa 1:1 (druga odozdo i na dnu).
Slika 20 prikazuje preklapanja krive diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (raspona od oko -0,5 do oko 1,3 W/g) i krive termogravimetrijske analize (raspona od oko 0% do oko 100% po težini) snimljenih za hloridnu so jedinjenja I proizvedenu iz acetonske suspenzije.
Slika 21 prikazuje<1>H NMR spektar za hloridnu so jedinjenja I proizvedenu iz smeše aceton:toluen odnosa 1:1.
Slika 22 prikazuje seriju XRPD spektara hloridne soli jedinjenja I proizvedene iz acetonske suspenzije (na vrhu) i nakon sušenja u vakuumu na oko 50°C tokom 1 dana (na dnu).
Slika 23 prikazuje preklapanje krive diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (raspona od oko -1,0 do oko 0,2 W/g) i krive termogravimetrijske analize (raspona od oko 30% do oko 100% po težini) snimljenih za hloridnu so jedinjenja I nakon što je sušena u vakuumu na oko 50° C tokom 1 dana.
Slika 24 prikazuje preklapanje kriva termogravimetrijske analize za hloridnu so jedinjenja I proizvedenu iz acetonske suspenzije (na vrhu) i nakon sušenja u vakuumu na oko 50°C tokom 1 dana (na dnu).
Slika 25 prikazuje preklapanje kriva diferencijalne skenirajuće kalorimetrije snimljenih za hloridnu so jedinjenja I proizvedenu iz acetonske suspenzije (na vrhu) i nakon sušenja u vakuumu na oko 50°C tokom 1 dana (na dnu).
Slika 26 prikazuje krivu sorpcije/desorpcije vlage snimljenu za hloridnu so jedinjenja I. Vrednosti na y-osi pokazuju promenu težine hloridne soli u procentima, kao funkciju relativne vlažnosti (RV) u atmosferi koja okružuje so.
Slika 27 je tabela koja prikazuje podatke dobijene iz eksperimenata sorpcije/desorpcije vlage izvedenih sa hloridnom soli jedinjenja I.
Slika 28 prikazuje krivu sorpcije/desorpcije vlage snimljenu za hloridnu so jedinjenja I. Vrednosti na y-osi pokazuju promenu težine hloridne soli u procentima, kao funkciju vremena tokom kog je relativna vlažnost u atmosferi koja okružuje so bila izmenjena.
Slika 29 prikazuje preklapanje XRPD spektara hloridne soli jedinjenja I nakon (gore) i pre izvođenja (dole) eksperimenata sorpcije/desorpcije vlage.
Slika 30 prikazuje preklapanje XRPD spektra fumaratne soli jedinjenja I dobijenog sporim uparavanjem iz smeše metanol:toluen odnosa 1:1 (gore) i XRPD spekta za fumarnu kiselinu (dole).
Slika 31 prikazuje preklapanje XRPD spektra dihidrofosfatne soli jedinjenja I (gore) i XRPD hidrosulfatne soli jedinjenja I (dole).
Slika 32 prikazuje preklapanje krive diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (raspona od oko -1,9 do oko 0 W/g) i krive termogravimetrijske analize (raspona od oko 25% do oko 95% po težini) snimljenih za hidrosulfatnu so jedinjenja I.
Slika 33 prikazuje<1>H NMR spektar hidrosulfatne soli jedinjenja I.
Slika 34 prikazuje<1>H NMR spektar sulfatne soli jedinjenja I.
Slika 35 prikazuje XRPD spektar mezilatne soli jedinjenja I.
Slika 36 prikazuje XRPD spektar citratne soli jedinjenja I.
Slika 37 prikazuje XRPD spektar edizilatne soli jedinjenja I.
Slika 38 prikazuje XRPD spektar hidrosulfatne soli jedinjenja I.
Slika 39 prikazuje XRPD spektar citratne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše metanol:toluen odnosa 1:2.
Slika 40 prikazuje XRPD spektar hidrosulfatne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše etil acetat:heptan odnosa 6:1.
Slika 41 prikazuje XRPD spektar hidrosulfatne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše etil acetata.
Slika 42 prikazuje XRPD spektar dihidrofosfatne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše metanol:acetonitril odnosa 1:2.
Slika 43 prikazuje XRPD spektar dihidrofosfatne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše metil etil keton:n-butil acetat odnosa 1:1.
Slika 44 prikazuje XRPD spektar snimljen iz duplikata XRPD eksperimenta sa dihidrofosfatnom soli jedinjenja I proizvedenom sporim uparavanjem smeše metil etil keton:n-butil acetat odnosa 1:1.
Slika 45 prikazuje XRPD spektar hloridne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše aceton:toluen odnosa 1:1.
Slika 46 prikazuje XRPD spektar snimljen iz duplikata XRPD eksperimenata sa hloridnom solju jedinjenja I proizvedenom sporim uparavanjem smeše aceton:toluen odnosa 1:1.
Slika 47 prikazuje XRPD spektar hloridne soli jedinjenja I dobijene sporim uparavanjem smeše dietil etar:metilen hlorid.
Slika 48 prikazuje XRPD spektar hloridne soli jedinjenja I proizvedene iz acetonske suspenzije.
Slika 49 prikazuje XRPD spektar hloridne soli jedinjenja I nakon sušenja u vakuumu.
Slika 50 prikazuje XRPD spektar fumaratne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše metanol:toluen odnosa 1:1.
Slika 51 prikazuje XRPD spektar fumaratne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše metanol:etil acetat odnosa 1:1.
Slika 52 prikazuje XRPD spektar fumaratne soli jedinjenja I proizvedene sušenjem smeše metanol:toluen odnosa 1:1 u vakuumu.
Slika 53 prikazuje XRPD spektar edizilatne soli jedinjenja I proizvedene sporim uparavanjem smeše metanol:metil etil keton:toluen odnosa 1:1:1.
Slika 54 prikazuje preklapanje XRPD spektara hloridne soli jedinjenja I pre (dole) i nakon (gore) skladištenja na 40°C i pri relativnoj vlažnosti od 75%.
Slika 55 je tabela koja sumira stabilnost mezilatne soli jedinjenja I i jedinjenja II u puferu koji se upotrebljava u eksperimentima penetracije sa Caco-2 ćelijama, uz upotrebu Henkovog balansiranog rastvora soli (HBSS) kao pufera i finalne koncentracije DMSO-a od 2%.
Slika 56a je tabela u kojoj su prikazani podaci dobijeni analizom sposobnosti mezilatne soli jedinjenja I da pređe iz apikalnog u bazolateralni odeljak transbunara obloženog monoslojem Caco-2 ćelija. Istovremeno kultivisane Caco-2 ćelije su inkubirane sa naznačenom koncentracijom mezilatne soli jedinjenja I u apikalnom odeljku transbunara, a alikvoti iz bazolateralnog odeljka su uzorkovani u naznačenim vremenima uzorkovanja, da bi se utvrdilo prisustvo jedinjenja I ili jedinjenja II. Podaci prikazuju koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat naznačene početne koncentracije mezilatne soli jedinjenja I. Slika 56b je tabela u kojoj su prikazani podaci dobijeni analizom sposobnosti mezilatne soli jedinjenja I da pređe iz bazolateralnog u apikalni odeljak transbunara obloženog monoslojem Caco-2 ćelija. Kultivisane Caco-2 ćelije su inkubirane sa naznačenom koncentracijom mezilatne soli jedinjenja I u bazolateralnom odeljku transbunara, a alikvoti iz apikalnog odeljka su uzorkovani u naznačenim vremenima uzorkovanja da bi se utvrdilo prisustvo jedinjenja I ili jedinjenja II. Podaci prikazuju koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat naznačene početne koncentracije mezilatne soli jedinjenja I.
Slika 56c je grafik koji prikazuje relativnu koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat početne koncentracije mezilatne soli jedinjenja I u apikalnom odeljku. Slika 56d je grafik koji prikazuje relativnu koncentraciju jedinjenja II u apikalnom odeljku kao procenat početne koncentracije mezilatne soli jedinjenja I u bazolateralnom odeljku. Jedinjenje I nije detektovano u bazolateralnom odeljku nakon 60 ili 120 minuta inkubacije u apikalnom odeljku. Dodatno, jedinjenje I nije detektovano u apikalnom odeljku nakon 60 ili 120 minuta inkubacije u bazolateralnom odeljku. Umesto toga, jedinjenje II je detektovano u svakom od slučajeva. Slika 56e je tabela koja prikazuje ponovno javljanje jedinjenja I u apikalnim odeljcima nakon 120 minuta inkubacije. Početno jedinjenje je primarno obnovljeno u vidu de-esterifikovane varijante, jedinjenja II.
Slika 57a je tabela u kojoj su prikazani podaci dobijeni analizom sposobnosti jedinjenja II da pređe iz apikalnog u bazolateralni odeljak transbunara obloženog monoslojem Caco-2 ćelija. Kultivisane Caco-2 ćelije su inkubirane sa naznačenom koncentracijom jedinjenja II u apikalnom odeljku transbunara, a alikvoti iz bazolateralnog odeljka su uzorkovani u naznačenim vremenima uzorkovanja, da bi se utvrdilo prisustvo jedinjenja II. Podaci prikazuju koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat naznačene početne koncentracije jedinjenja II. Slika 57b je tabela u kojoj su prikazani podaci dobijeni analizom sposobnosti jedinjenja II da pređe iz bazolateralnog u apikalni odeljak transbunara obloženog monoslojem Caco-2 ćelija. Kultivisane Caco-2 ćelije su inkubirane sa naznačenom koncentracijom jedinjenja II u bazolateralnom odeljku transbunara, a alikvoti iz apikalnog odeljka su uzorkovani u naznačenim vremenima uzorkovanja da bi se utvrdilo prisustvo jedinjenja II. Podaci prikazuju koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat naznačene početne koncentracije jedinjenja II. Slika 57c je tabela koja prikazuje ponovnu pojavu jedinjenja II u apikalnom odeljku nakon 60 i 120 minuta inkubacije u bazolateralnom odeljku, kao i stopu propusnosti za jedinjenje II kroz monosloj Caco-2 ćelija. Slika 57d je grafik koji prikazuje relativnu koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat početne koncentracije jedinjenja II u apikalnom odeljku. Slika 57e je grafik koji prikazuje relativnu koncentraciju jedinjenja II u apikalnom odeljku kao procenat početne koncentracije jedinjenja II u bazolateralnom odeljku.
Slika 58a je tabela u kojoj su prikazani podaci dobijeni analizom sposobnosti mezilatne soli jedinjenja I da pređe iz apikalnog u bazolateralni odeljak transbunara obloženog monoslojem Caco-2 ćelija. Kultivisane Caco-2 ćelije su inkubirane sa naznačenom koncentracijom mezilatne soli jedinjenja I u apikalnom odeljku transbunara, a alikvoti iz bazolateralnog odeljka su uzorkovani u naznačenim vremenima uzorkovanja, da bi se utvrdilo prisustvo jedinjenja I ili jedinjenja II. Podaci prikazuju koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku kao procenat naznačene početne koncentracije mezilatne soli jedinjenja I. Jedinjenje I nije detektovano u bazolateralnom odeljku nakon 60 ili 120 minuta inkubacije u apikalnom odeljku. Slika 58b je grafik koji prikazuje relativnu koncentraciju jedinjenja II u bazolateralnom odeljku, kao procenat početne koncentracije mezilatne soli jedinjenja I u apikalnom odeljku. Slika 58c je tabela koja prikazuje ponovnu pojavu jedinjenja I u apikalnom odeljku nakon 120 minuta inkubacije. Početno jedinjenje se primarno javlja u obliku varijante de-esterifikovanog jedinjenja, kao jedinjenje II.
Slika 59 je tabela koja sumira parametre hromatografije i masene spektrometrije koji su upotrebljavani za analizu koncentracija jedinjenja I i jedinjenja II u ovde opisanim eksperimentima penetracije sa Caco-2 ćelijama.
Slika 60a je grafik koji ilustruje frakcionu vijabilnost potomaka CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili lipopolisaharidom (LPS) u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. Zvezdica označava p vrednost p<0,05. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa u odnosu na odgovarajuću grupu. Slika 60b je grafik koji ilustruje broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 61a je grafik koji ilustruje vreme od indukcije do rađanja prvog mladunca kod CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. Slike 61b i 61c su grafici koji ilustruju vreme od indukcije do završetka porođaja među CD-1 miševima tretiranim sa RU486 ili LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti duž Y-ose označavaju proporciju CD-1 miševa kod kojih je porođaj završen. Na svakoj slici, zvezdica označava p vrednost p<0,05. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa ili Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu.
Slika 62a je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano) i nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno) na frakcionu vijabilnost potomaka CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili lipopolisaharidom (LPS) u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. Zvezdica označava p vrednost p<0,05; „ns” označava p vrednost p>0,05. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa ili neuparenog t testa u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem.
Slika 62b je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano) i nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno) na broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 63a je grafik koji prikazuje efekte jedinjenja III (10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, primenjenog oralno) na frakcionu vijabilnost potomaka CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Slika 63b je grafik koji prikazuje efekte jedinjenja III (10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, primenjenog oralno) na broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih sa RU486 ili LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 64a je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na frakcionu vijabilnost potomaka CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 64b je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 65a je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na vreme od indukcije do rođenja prvog mladunca kod CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na odgovarajuću grupu; dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na odgovarajuću grupu. Nifedipin, jedinjenje III i kombinovane tretmane su karakterisale p vrednosti p=0,0576, p=0,0601 i p<0,001 (naznačena simbolom „$$$"), tim redom, u odnosu na grupu tretiranu samo nosačem. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa ili neuparenog t testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 65b je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na vreme od indukcije do završetka porađanja kod CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti duž Y-ose označavaju proporciju CD-1 miševa kod kojih je porođaj završen. Slika 65c je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka u grupi tretiranoj nosačem i kombinovanim tretmanima prikazanim na Slici 65b. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Logrank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 65d je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj jedinjenjem III i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 65b. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 65e je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka nakon tretmana nifedipinom i kombinovanim tretmanima prikazanim na Slici 65b. Dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa.
Slika 66a je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na frakcionu vijabilnost potomaka CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 66b je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih sa LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 67a je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na vreme od indukcije do rođenja prvog mladunca kod CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Atosiban, jedinjenje III i kombinovane tretmane su karakterisale p vrednosti p>0,05, p=0,0601 i p>0,05, tim redom, u odnosu na grupu tretiranu nosačem. Statističke analize su rađene upotrebom neuparenog t testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 67b je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na vreme od indukcije do završetka porađanja kod CD-1 miševa tretiranih sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti duž Y-ose označavaju proporciju CD-1 miševa kod kojih je porođaj završen. Slika 67c je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka u grupi tretiranoj nosačem i kombinovanim tretmanom prikazanima na Slici 67b. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 67d je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj jedinjenjem III i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 67b. Kombinovane tretmane je karakterisala p vrednost p=0,0832 u odnosu na tretman jedinjenjem III. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 67e je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj atosibanom i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 67b. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa.
Slika 68a je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihovih kombinacija, na frakcionu vijabilnost potomstva CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Tretman sa nifedipinom je karakterisala p vrednost p=0,0859 u odnosu na grupu tretiranu samo nosačem. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa ili neuparenog t testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 68b je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihovih kombinacija, na broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 69a je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihovih kombinacija, na vreme od indukcije do rađanja prvog mladunca kod CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. Dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na odgovarajuću grupu, što je određeno Mann-Whitney testom u odnosu na odgovarajuću grupu; „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu, što je određeno Mann-Whitney testom u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem, što je određeno neuparenim t testom u odnosu na odgovarajuću grupu; „nije ispitano” označava da za navedeni par nije urađen statistički test. Slika 69b je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (10 mg/kg, primenjenog oralno), i njihovih kombinacija, na vreme od indukcije do završetka porađanja kod CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Slika 69c je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (30 mg/kg, primenjenog oralno), i njihovih kombinacija, na vreme od indukcije do završetka porađanja kod CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Slika 69d je grafik koji prikazuje efekte nifedipina (5 mg/kg, primenjenog oralno), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihovih kombinacija, na vreme od indukcije do završetka porađanja kod CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Slika 69e je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka nakon tretmana nosačem i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69b. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu. Slika 69f je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj jedinjenjem III i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69b. Dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 69g je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj nifedipinom i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69b. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu. Slika 69h je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka nakon tretmana nosačem i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69c. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu. Slika 69i je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj jedinjenjem III i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69c. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu.
Slika 69j je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka nakon tretmana nifedipinom i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69c. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu. Slika 69k je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka nakon tretmana nosačem i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69d. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu. Slika 69I je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj jedinjenjem III i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69d. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu.
Slika 69m je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj nifedipinom i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 69d. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Logrank testa u odnosu na odgovarajuću grupu.
Slika 70a je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na frakcionu vijabilnost potomaka CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa ili neuparnog t testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 70b je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjen subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na broj vijabilnog i nevijabilnog potomstva CD-1 miševa tretiranih sa LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj.
Slika 71a je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na vreme od indukcije do rođenja prvog mladunca kod CD-1 miševa tretiranih sa LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost plus/minus standardnu grešku srednje vrednosti. „ns” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu; „NS” označava p vrednost p>0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem; „$” označava p vrednost p<0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu tretiranu nosačem. Kombinovane terapije je karakterisala p vrednost p=0,0909 u odnosu na grupu tretiranu samo atosibanom. Statističke analize su rađene upotrebom Mann-Whitney testa ili neuparnog t testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 71b je grafik koji prikazuje efekte atosibana (300 mg/kg, primenjenog subkutano), jedinjenja III (100 mg/kg, primenjenog oralno), i njihove kombinacije, na vreme od indukcije do završetka porađanja kod CD-1 miševa tretiranih sa LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana, da bi se indukovao porođaj. Slika 71c je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomaka nakon tretmana nosačem i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 71b. Dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 71d je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj jedinjenjem III i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 71b. Kombinovanu terapiju je karakterisala p vrednost p=0,0964 u odnosu na grupu tretiranu jedinjenjem III. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa. Slika 71e je grafik koji prikazuje vreme od indukcije do završetka rađanja potomstva u grupi tretiranoj atosibanom i kombinovanim tretmanima prikazanima na Slici 71b. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na odgovarajuću grupu. Statističke analize su rađene upotrebom Log-rank testa u odnosu na odgovarajuću grupu od interesa.
Slika 72a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u Krebovom rastvoru obogaćenom kiseonikom (oksigenovanom) i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na kontraktilnu frekvenciju tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija. Simbol „#” označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 72b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC") kod kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje Efekti jedinjenja II na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Simbol „#” označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 72c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Simbol „#” označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 72d je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2α, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje Efekti jedinjenja II na trajanje kontrakcija u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 72e je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na ukupan rad izvršen pri svim kontrakcijama (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) kod kontrakcija glatkih mišićnih ćelija indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na ukupan rad obavljen pri svim naknadnim kontrakcijama tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na ukupan rad obavljen kontrakcijama u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Simbol „#” označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu.
Slika 73a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih oksitocinom (OT), u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i efekti kontrole ili jedinjenja II na kontraktilnu frekvenciju su mereni tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 73b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC") kod kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 73c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu.
Slika 73d je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje II“. Efekti jedinjenja II na trajanje kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 73e je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (6 nM, 60 nM, 600 nM i 6000 nM) na ukupan rad obavljen od strane svih kontrakcija (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) tokom kontrakcija glatkih mišićnih ćelija indukovane sa OT, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili jedinjenje II, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili jedinjenja II na ukupan rad obavljen pri svim naknadnim kontrakcijama tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Jedinjenje Efekti jedinjenja II na ukupan rad obavljen kontrakcijama u prisustvu OT su dalje mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu.
Slika 74a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na xosi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban ("Ato"), u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na kontraktilnu frekvenciju tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 74b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC“) prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 74c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 74d je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na trajanje kontrakcija u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 74e je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na ukupan rad obavljen od strane svih kontrakcija (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) kod kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGF2a, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na xosi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na ukupan rad obavljen pri svim naknadnim kontrakcijama tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na ukupan rad obavljen kontrakcijama u prisustvu PGF2α naknadno su mereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGF2α (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGF2a 1 nM", „PGF2a 10 nM” i „PGF2a 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu.
Slika 75a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGE2, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na xosi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban (“Ato”), u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na kontraktilnu frekvenciju tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu PGE2 su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGE2 (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGE2 1 nM", „PGE2 10 nM” i „PGE2 100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 75b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC”) kod kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGE2, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu PGE2 su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGE2 (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGE21 nM", „PGE210 nM” i „PGE2100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 75c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGE2, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu PGE2 su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGE2 (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGE21 nM", „PGE210 nM” i „PGE2100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Slika 75d je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGE2, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na trajanje kontrakcija u prisustvu PGE2 su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGE2 (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGE21 nM", „PGE210 nM” i „PGE2100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 75e je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija atosibana (6 nM, 60 nM i 600 nM) na ukupan rad obavljen od strane svih kontrakcija (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa PGE2, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na xosi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili atosibana na ukupan rad obavljen pri svim naknadnim kontrakcijama tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Ato“. Efekti atosibana na ukupan rad obavljen kontrakcijama u prisustvu PGE2 su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija PGE2 (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „PGE21 nM", „PGE210 nM” i „PGE2100 nM", tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na DMSO kontrolu.
Slika 76a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), atosibana (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i atosibana na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=3 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili atosibana na kontraktilnu frekvenciju tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili atosibana na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 76b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), atosibana (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i atosibana na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC") prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=3 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, snimljena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili atosibana na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili atosibana na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu OT su naknadno izmereni izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 76c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), atosibana (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i atosibana na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=3 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili atosibana na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili atosibana na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 76d je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), atosibana (6 nM) i kombinacija jedinjenja II i atosibana na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=3 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili atosibana na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili atosibana na trajanje kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 76e je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), atosibana (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i atosibana na ukupan rad obavljen od strane svih kontrakcija (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=3 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili atosiban, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili atosibana na ukupan rad obavljen pri svim naknadnim kontrakcijama tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili atosibana na ukupan rad izvršen kontrakcijama u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na DMSO kontrolu. Dva simbola „#” označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na tretman atosibanom u koncentraciji od 6 nM.
Slika 77a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM i 10 µM) na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=2 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili nifedipina na kontraktilnu frekvenciju tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Nif“. Efekti nifedipina na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 77b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM i 10 µM) na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC”) tokom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=2 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili nifedipina na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Nif“. Efekti nifedipina na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 77c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM i 10 µM) na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=2 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili nifedipina na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Nif“. Efekti nifedipina na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 77d je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM i 10 µM) na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=2 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili nifedipina na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Nif“. Efekti nifedipina na trajanje kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 77e je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija nifedipina (1 nM, 6 nM, 60 nM, 600 nM i 10 µM) na ukupan rad obavljen svim kontrakcijama (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=2 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Nakon što su uspostavljene redovne kontrakcije u trajanju od najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kao kontrola ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole ili nifedipina na ukupan rad obavljen pri svim naknadnim kontrakcijama tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „Nif“. Efekti nifedipina na ukupan rad obavljen kontrakcijama u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija.
Slika 78a je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), nifedipina (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i nifedipina na učestalost kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=5 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija. Merenje učestalosti spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon". Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili nifedipina na kontraktilnu frekvenciju tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili nifedipina na kontraktilnu frekvenciju u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju učestalost kontrakcija kao procenat učestalosti spontanih bazalnih kontrakcija.
Slika 78b je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), nifedipina (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i nifedipina na rad obavljen po kontrakciji (površina ispod krive, ili „AUC") prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=5 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja spontanog rada po kontrakciji. Merenje spontanog rada obavljenog po kontrakciji je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili nifedipina na rad obavljen po kontrakciji tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili nifedipina na rad obavljen po kontrakciji u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju rad obavljen po kontrakciji kao procenat rada obavljenog po kontrakciji tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 78c je grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija jedinjenja II (60 nM i 600 nM), nifedipina (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i nifedipina na amplitudu pika kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=5 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja amplitude pika spontanih kontrakcija. Merenje amplitude pika spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili nifedipina na amplitudu pika kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili nifedipina na amplitudu pika kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju amplitudu pika kontrakcija kao procenat amplitude pika spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 78d je grafik koji prikazuje efekte jedinjenja II (60 nM i 600 nM), nifedipina (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i nifedipina na trajanje kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=5 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja trajanja spontanih kontrakcija. Merenje trajanja spontanih kontrakcija je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili nifedipina na trajanje kontrakcija tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili nifedipina na trajanje kontrakcija u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju trajanje kontrakcija kao procenat trajanja spontanih bazalnih kontrakcija. Slika 78e je grafik koji prikazuje efekte jedinjenja II (60 nM i 600 nM), nifedipina (6 nM) i kombinacije jedinjenja II i nifedipina na ukupan rad obavljen od strane svih kontrakcija (zbir površine ispod krive za sve kontrakcije) prilikom kontrakcija glatkih mišića indukovanih sa OT, u N=5 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Eksperimenti su izvođeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru i ADI Powerlab kompjuterskog programa. Jednom kada su redovne kontrakcije bile uspostavljene tokom najmanje 20 minuta, zabeležena su bazalna merenja rada obavljenog tokom svih narednih spontanih kontrakcija. Merenje obavljenog rada za sve spontane kontrakcije je predstavljeno na x-osi kao „Spon“. Svakom uzorku miometrijuma su zatim dodavani DMSO kontrola, jedinjenje II i/ili nifedipin, u naznačenim koncentracijama, i mereni su efekti kontrole, jedinjenja II i/ili nifedipina na ukupan rad obavljen za sve naredne kontrakcije tokom narednog perioda od 10 minuta. Ova vremenska tačka je predstavljena na x-osi kao „ANT“. Efekti jedinjenja II i/ili nifedipina na ukupan rad obavljen kontrakcijama u prisustvu OT su zatim mereni i izlaganjem uzoraka tkiva miometrijuma izazovu rastućih koncentracija OT (1 nM, 10 nM i 100 nM) u uzastopnim intervalima od po 10 minuta. Ove vremenske tačke su predstavljene na x-osi kao „OT 1 nM“, „OT 10 nM” i „OT 100 nM“, tim redom. Vrednosti duž y-ose predstavljaju ukupan rad obavljen kontrakcijama kao procenat ukupnog rada obavljenog tokom spontanih bazalnih kontrakcija. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na DMSO kontrolu. Dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na DMSO kontrolu. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na DMSO kontrolu. Tri simbola „+” označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na tretman sa jedinjenjem II u koncentraciji od 60 nM.
Slika 79a je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina, nolasibana i njihove kombinacije na ekspresiju fosforilisanog p65 (p-p65), fosforilisanog p38 (p-p38) i fosforilisane kinaze regulisane vanćelijskim signalom (p-ERK), u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani nolasibanom u koncentraciji od 1 µM ili tretirani i oksitocinom i nolasibanom u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 79b je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina i/ili različitih koncentracija jedinjenja II, opciono u kombinaciji sa nolasibanom, na ekspresiju p-p65, p-p38 i p-ERK, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani jedinjenjem II u koncentraciji od 3 µM ili tretirani i oksitocinom i jedinjenjem II u različitim koncentracijama jedinjenja II, kako u prisustvu tako i u odsustvu nolasibana u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 79c je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina, nolasibana i njihove kombinacije, na ekspresiju proinflamatornih gena ciklooksigenaze 2 (COX-2) i fosforilisane kalcijum zavisne fosfolipaze A2 (p-cPLA2), u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani nolasibanom u koncentraciji od 1 µM ili tretirani i oksitocinom i nolasibanom u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 79d je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina i/ili različitih koncentracija jedinjenja II, opciono u kombinaciji sa nolasibanom, na ekspresiju proinflamatornih gena COX-2 i p-cPLA2, u N=6 biopsija miometrijuma pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani jedinjenjem II u koncentraciji od 3 µM ili tretirani i oksitocinom i jedinjenjem II u različitim koncentracijama jedinjenja II, kako u prisustvu tako i u odsustvu nolasibana u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 79e je grafik koji kvantifikuje ekspresiju p-p65 prikazanu na Slikama 79a i 79b. Slika 79f je grafik koji kvantifikuje ekspresiju p-p38 prikazanu na Slikama 79a i 79b. Slika 79g je grafik koji kvantifikuje ekspresiju p-ERK prikazanu na Slikama 79a i 79b. Slika 79h je grafik koji kvantifikuje ekspresiju COX-2 prikazanu na Slikama 79c i 79d. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na nestimulisane („NS“) uzorke. Dve zvezdice označavaju p vrednost p<0,01 u odnosu na nestimulisane uzorke. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na nestimulisane uzorke. Tri simbola „#” označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na uzorke tretirane oksitocinom (OT). Slika 79i je grafik koji kvantifikuje ekspresiju p-cPLA2 prikazanu na Slikama 79c i 79d. Zvezdica označava p vrednost p<0,05 u odnosu na nestimulisane („NS“) uzorke. Tri zvezdice označavaju p vrednost p<0,001 u odnosu na nestimulisane uzorke.
Slika 80a je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina, nolasibana i njihove kombinacije na ekspresiju p-p65, p-p38 i p-ERK, u N=3 biopsija amniona pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani nolasibanom u koncentraciji od 1 µM ili tretirani i oksitocinom i nolasibanom u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 80b je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina i/ili različitih koncentracija jedinjenja II, opciono u kombinaciji sa nolasibanom, na ekspresiju p-p65, p-p38 i p-ERK, u N=3 biopsija amniona pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani jedinjenjem II u koncentraciji od 3 µM ili tretirani i oksitocinom i jedinjenjem II u različitim koncentracijama jedinjenja II, kako u prisustvu tako i u odsustvu nolasibana u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 80c je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina, nolasibana i njihove kombinacije na ekspresiju proinflamatornih gena COX-2 i p-cPLA2, u N=3 biopsija amniona pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani nolasibanom u koncentraciji od 1 µM ili tretirani i oksitocinom i nolasibanom u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola. Slika 80d je imunoblot koji prikazuje efekte oksitocina i/ili različitih koncentracija jedinjenja II, opciono u kombinaciji sa nolasibanom, na ekspresiju proinflamatornih gena COX-2 i p-cPLA2, u N=3 biopsija amniona pre porođaja u terminu, prikupljenih iz humanih ženskih subjekata koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Uzorci su bili ili nestimulisani („NS“), stimulisani oksitocinom („OT“), tretirani jedinjenjem II u koncentraciji od 3 µM ili tretirani i oksitocinom i jedinjenjem II u različitim koncentracijama jedinjenja II, kako u prisustvu tako i u odsustvu nolasibana u koncentraciji od 1 µM, tokom naznačenih vremenskih perioda. Blot inkubiran u anti-β-aktinskom antitelu je upotrebljavan kao kontrola.
Detaljan opis
[0045] Pronalazak se odnosi na (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil) propil L-valinat, kao i na njegove oblike soli i kristalne polimorfe. Ova jedinjenja su sposobna da inhibiraju aktivnost proteina iz familije prostaglandinskih F receptora (FP-R), kao što je prostaglandinski F2α (PGF2α) receptor. Ovde opisana jedinjenja, soli i kristalni polimorfi mogu biti upotrebljeni za inhibiranje aktivnosti prostaglandinskog F receptora in vitro i in vivo, i predstavljaju efektivne terapijske kompozicije za lečenje prevremenog porođaja. Jedinjenja, soli i kristalni polimorfi koji su ovde opisani, mogu biti dati subjektu (npr. sisaru, kao što je čovek) kod koga je započeo ili postoji rizik prevremenog porođaja u ranom gestacijskom dobu, npr. pre 38 nedelja (npr. od oko 20 do oko 37 nedelja, kao što je gestacijska starost od oko 20 nedelja, 21 nedelje, 22 nedelje, 23 nedelje, 24 nedelje, 25 nedelja, 26 nedelja, 27 nedelja, 28 nedelja, 29 nedelja, 30 nedelja, 31 nedelje, 32 nedelje, 33 nedelje, 34 nedelje, 35 nedelja, 36 nedelja ili 37 nedelja, poželjno od oko 24 do oko 34 nedelje, kao što je gestacijska starost od oko 24 nedelje, 25 nedelja, 26 nedelja, 27 nedelja, 28 nedelja, 29 nedelja, 30 nedelja, 31 nedelje, 32 nedelje, 33 nedelje ili 34 nedelje). Pronalazak dodatno obezbeđuje postupke sinteze (3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinata, kao i postupke pripreme njegovih oblika soli i kristalnih polimorfa. Pronalazak dalje obuhvata jedinjenje za upotrebu u postupcima lečenja prevremenog porođaja kod subjekta, davanjem alfa-amino estra pronalaska subjektu kome je lečenje potrebno, kao što je subjekt kod koga je došlo do prevremenog porođaja ili subjektu u riziku od prevremenog porođaja, opciono u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa, kao što je ovde opisano.
[0046] Pored gore navedenog, pronalazak obuhvata kompozicije koje se odnose na 3-([1,1'-bifenil]-4-ilsulfonil)-N-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropil]-1,3-tiazolidin-2-karboksamid. Kao što je ovde opisano, jedinjenje može biti obezbeđeno subjektu (npr. sisaru, kao što je čovek) koji je koga je započeo ili postoji rizik prevremenog porođaja u ranom gestacijskom dobu, npr. pre 38 nedelja (npr. od oko 20 do oko 37 nedelja, kao što je gestacijska starost od oko 20 nedelja, 21 nedelje, 22 nedelje, 23 nedelje, 24 nedelje, 25 nedelja, 26 nedelja, 27 nedelja, 28 nedelja, 29 nedelja, 30 nedelja, 31 nedelje, 32 nedelje, 33 nedelje, 34 nedelje, 35 nedelja, 36 nedelja ili 37 nedelja, poželjno od oko 24 do oko 34 nedelje, kao što je gestaciona starost od oko 24 nedelje, 25 nedelja, 26 nedelja, 27 nedelja, 28 nedelja, 29 nedelja, 30 nedelja, 31 nedelje, 32 nedelje, 33 nedelje ili 34 nedelje), opciono u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa, kao što je ovde opisano.
(3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat (Jedinjenje I)
[0047] Pronalazak se zasniva na otkriću da se jedinjenje I ((3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat, predstavljen formulom I u nastavku teksta) i njegove soli in vivo prevode u 3-([1,1'-bifenil]-4-ilsulfonil)-N-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropil]-1,3-tiazolidin-2-karboksamid (predstavljen formulom II u nastavku teksta). Jedinjenje II, prethodno opisano u US 8,415,480, antagonista je prostaglandinskog F receptora, pošto ovo jedinjenje karakteriše konstanta inhibicije (Ki) od 6 nM za humani FP-R, što je određeno kompetitivnim testovima vezivanja radioliganda (eksperimentalni detalji kompetitivnih testova vezivanja radioliganda korisni za određivanje Ki vrednosti su opisani, npr. u US 8,415,480, Primer 51). Nakon davanja subjektu, utvrđeno je da se jedinjenje I de-esterifikuje in vivo tako da obrazuje jedinjenje II, usled aktivnosti endogenih esteraza, poput onih koje su prisutne u gastrointestinalnom traktu.
[0048] Utvrđeno je da je jedinjenje I inhibitor prostaglandinskog F receptora, pošto jedinjenje I inhibira humani FP-R sa Ki od 1 nM. Jedinjenje I ispoljava poboljšanja u nekoliko fizičko-hemijskih karakteristika u odnosu na jedinjenje II, uključujući rastvorljivost u vodi, kao i u medijumima koji simuliraju sadržaj tankog creva u stanju ishrane (FeSSIF) i gladovanja (FaSSIF). Ovi podaci su sumirani ispod, u Tabeli 2.
Tabela 2. Poređenje fizičko-hemijskih osobina jedinjenja I i jedinjenja II
[0049] Pored ispoljavanja poboljšane rastvorljivosti u vodi, jedinjenje I i njegove soli karakteriše iznenađujući i koristan mehanizam apsorpcije. Kao što je opisano u Primerima koji slede, jedinjenje I se de-esterifikuje delovanjem ambijentalnih esteraza u tankom crevu i zatim pasivno prodire u epitel tankog creva. Iznenađujuće, jedinjenje I i njegove soli nisu supstrati za Pept1 transporterski protein, ko-transporter kuplovan sa protonima, koji posreduje u apsorpciji peptidnih hranljivih materija. Ovo otkriće predstavlja neočekivanu i farmakološki korisnu osobinu. Poznato je da Pept1 posreduje u apsorpciji raznih valinatnih estara, kao što je opisano, na primer, u Vig i saradnici, Adv. Drug Deliv. Rev.
65:1370-1385 (2013). Pept1 prikazuje široku specifičnosti za supstrate, o čemu svedoči strukturna raznolikost jedinjenja koja se transportuju kroz crevni epitel ovim proteinom. Uprkos prisustvu funkcionalne grupe valinatnog estra, apsorpcija jedinjenja I i njegovih soli kroz epitel tankog creva ne zavise od ovog transportera. Navedeno predstavlja prednost ovih jedinjenje, pošto jedinjenje I i njegove soli (na primer, jedinjenje III) time ne ulaze u kompeticiju sa prirodnim supstratima Pept1, kao što su peptidni hranljivi sastojci, u vezivanju za i transport ovim proteinom. Umesto toga, jedinjenje I i njegove soli se in vivo prevode u oblik koji se lako apsorbuje na način koji nije zavisan od enerigije i lokalnog gradijenta protona. Ova neočekivana osobina, zajedno sa visokom rastvorljivošću jedinjenja I i njegovih soli u vodi, kolektivno obezbeđuju povoljan farmakokinetički profil kojim se jedinjenja pronalaska lako rastvaraju u vodenoj sredini i zauzvrat prevode u oblik sposoban da bude apsorbovan nezavisno od transportera.
(3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat hidrohlorid (Jedinjenje III)
[0050] Utvrđeno je da hloridna so jedinjenja I, ((3S)-3-({[(2S)-3-(bifenil-4-ilsulfonil)-1,3-tiazolidin-2-il]karbonil}-amino)-3-(4-fluorofenil)propil L-valinat hidrohlorid (u nastavku teksta označen kao formula III) lako kristališe upotrebom nekoliko jasno različitih eksperimentalnih procedura, kao što je opisano u Primerima koji slede. Jedinjenje III poprima jedan, ponovljivi kristalni oblik nakon kristalizacije iz različitih medijuma i pod različitim ambijentalnim uslovima. Štaviše, ovaj kristalni oblik jedinjenja III karakteriše proširena stabilnost u uslovima okoline i u prisustvu povišene relativne vlažnosti. Kao što je detaljnije opisano u Primerima koji su predstavljeni u nastavku teksta, jedinjenje III karakteriše niska higroskopnost i ono stoga ne ispoljava sklonost da apsorbuje vlagu iz lokalne atmosfere. Jedinjenje III stoga karakteriše otpornost na hemijske promene, poput hidrolize, kao i otpornost na ugradnju nečistoća. Na primer, nečistoće povezane sa atmosferskom vodom se ne ugrađuju lako u kristalni oblik jedinjenja III. Jedinjenje III može biti davano subjektu, kao što je trudna ženska osoba, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja). Jedinjenje III može takođe
[0051] biti davano subjektu, kao što je trudna ženska osoba, da bi se ublažio jedan ili više simptoma koji su povezani sa porođajem, kao što su vaginalno krvarenje i ruptura membrana materice.
[0052] Jedinjenje I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kao što je jedinjenje III, daje se u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih agenasa, odnosno sa dodatnim terapeutskim agensom. Primeri dodatnih terapeutskih agenasa uključuju dodatne tokolitičke agense, kao što je antagonista oksitocinskog receptora koji je ovde opisan, uključujući, npr. atosiban, retosiban, barusiban, epelsiban i nolasiban, koji je (3Z, 5S)-5-(hidroksimetil)-1-[(2'-metil-1,1'-bifenil-4-il)karbonil]pirolidin-3-on O-metil oksim, ili njegovu varijantu, formulaciju, kristalni oblik ili derivat. Supresijom transdukcije signala oksitocina, antagonisti oksitocinskog receptora mogu sinergistički delovati sa sa antagonistima prostaglandinskog F2α receptora koji su ovde opisani, da bi se usporile ili zaustavile kontrakcije materice, na primer, kod pacijentkinja kod kojih je započeo ili postoji rizik prevremenog porođaja (npr. ispoljavaju jedan ili više od simptoma). Primeri dodatnih tokolitičkih agenasa uključuju betamimetike, kao što su terbutalin, ritodrin, heksoprenalin, albuterol, fenoterol, nilidrin i orciprenalin, koji mogu funkcionisati tako što inaktiviraju kinazu miozina lakih lanaca i/ili dovode do deplecije Ca<2+>rezervi u miometrijumu, povećanjem nivoa cAMP-a, čime se suprimira kontraktilnost materice. Inhibitori kanala za kalcijum, kao što su dihidropiridini (npr. nifedipin i nikardipin), mogu dodatno ili alternativno biti dati zajedno sa jedinjenjem pronalaska, na primer, radi modulacije miometrijskog [Ca<2+>] i suprimiranja aktivacije miozinskih filamenata koja je posredovana sa Ca<2+>, a koja dovodi do kontrakcija miometrijuma. Soli magnezijuma, poput magnezijum sulfata, mogu biti dodatno ili alternativno primenjene u kombinaciji sa jedinjenjem pronalaska, na primer, da bi se hiperpolarizovala plazma membrana i/ili da bi se ostvarila kompeticija sa Ca<2+>u vezivanju za laki lanac miozina. Dodatno ili alternativno, donori azot oksida, poput nitroglicerina, mogu biti dati zajedno sa ovde opisanim jedinjenjem, na primer, da bi se povećali nivoi cikličkog guanozin monofosfata u miometrijumu, čime se inaktiviraju filamenti miozina lakog lanca.
[0053] Jedinjenje prema pronalasku, kao što je Jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dodatno ili alternativno dati u kombinaciji sa progesteronom ili njegovom varijantom ili derivatom, kao što je 17-α-hidroksiprogesteron, da bi se suprimirala kontraktilnost materice kod subjekta kod koga je započeo ili postoji rizik prevremenog porođaja (npr. kod koga su se pojavili jedan ili više simptoma).
[0054] Dodatno ili alternativno, jedinjenje prema pronalasku može biti primenjeno zajedno sa kortikosteroidom koji je ovde opisan ili poznat u oblasti tehnike, na primer, da bi se podstaklo sazrevanje pluća fetusa i da bi se sprečilo pojavljivanje respiratornog distres sindroma, između ostalih poremećaja kod novorođenčeta.
[0055] Dodatno, jedinjenje III može biti formulisano u farmaceutsku kompoziciju, kao što je farmaceutska kompozicija formulisana kao što je opisano u nastavku teksta.
Postupci lečenja (postupci lečenja nisu deo pronalaska kako je zahtevano)
[0056] Jedinjenje I, kao i njegove soli, predstavljaju snažne inhibitore prostaglandinskog F receptora i mogu biti upotrebljeni za antagonizaciju interakcije između članova familije prostaglandina F, kao što je prostaglandin F2α, sa odgovarajućim prostaglandinskim F receptorom in vivo, da bi se ublažile kontrakcije materice. Jedinjenje I i njegove soli mogu biti dati subjektu, kao što je trudna ženska osoba, u cilju lečenja ili prevencije prevremenog porođaja. Endogeni prostaglandin F2α se sintetiše i oslobađa od strane epitelnih ćelija materice, kao odgovor na signalnu kaskadu koja se inicira oksitocinom. Nakon vezivanja PGF2α za PGF2α-R na vanćelijskoj površini miocita materice, fosfolipaza C cepa fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat (PIP2) da bi se dobili diacilglicerol (DAG) i inozitol-1,4,5-trisfosfat (IP3). IP3zauzvrat potencira oslobađanje unutarćelijskog kalcijuma (Ca<2+>) iz sarkoplazmatskog retikuluma. Naglo povećanje zaliha kalcijuma konačno dovodi do kontrakcija mišića materice i nekroze endotelnih ćelija žutog tela, strukture koja luči progesteron i podržava fetus u razvoju. Aberantno pokretanje kontrakcija materice i razgradnje žutog tela prouzrokovana nepravilnostima u regulaciji sekrecije PGF2α, može dovesti do prevremenog porođaja. Jedinjenje I i njegove soli, kao što je jedinjenje III, mogu umanjiti obrazovanje IP3posredovano fosfolipazom C, i naknadnu mobilizaciju unutarćelijskih zaliha kalcijuma, inhibiranjem udruživanja PGF2α sa PGF2αR. Jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, stoga mogu biti dati subjektima, kao što su trudne ženske osobe, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je npr. za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1314, 15 ili 16 nedelja). Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati subjektu da bi se sprečio porođaj pre porođaja carskim rezom. Dodatno, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati subjektu u cilju profilakse i/ili lečenja dismenoreje. Jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu takođe biti dati subjektu, kao što je trudna ženska osoba, da bi se ublažio jedan ili više simptoma koji su povezani sa porođajem, kao što su vaginalno krvarenje i ruptura membrana materice.
[0057] Dodatno, jedinjenja prema pronalasku mogu biti upotrebljena za lečenje endometrioze kod pacijenata (npr. humanog pacijenta). Prekomerna ekspresija prostaglandinskog F2α receptora je u korelaciji sa aberantnim rastom endometrijuma. Kao antagonisti aktivnosti prostaglandinskog F2α receptora, jedinjenja (npr. jedinjenje (I) ili njegova so, kao što je jedinjenje (III)) mogu biti dati pacijentkinji koji boluje od endometrioze, u cilju lečenja ove indikacije. Jedinjenja prema pronalasku Jedinjenja takođe mogu biti davana pacijentu da bi se ublažio jedan ili više simptoma endometrioze, kao što su bolni simptomi uključujući dismenoreju, dispareuniju, hroničan bol u karlici, disuriju i disheziju, tokom i/ili van menstrualnog ciklusa. Uspešno lečenje endometrioze davanjem jedinjenja pronalaska pacijentu može označavati, npr. smanjenje rasta endometrijalnog tkiva i/ili smanjenje bolnih simptoma tokom i/ili razdvojeno od menstrualnog ciklusa.
[0058] Pored prethodno navedenog, predmetni prikaz obezbeđuje postupke terapijskog tretmana za stanja koja su ovde opisana time što se subjektu kome je lečenje potrebno, daje jedinjenje II. Na primer, jedinjenje II može biti davano subjektu, kao što je trudna ženska osoba, u svrhu lečenja ili prevencije prevremenog porođaja. Jedinjenje II je kompetentni antagonista PGF2α receptora i može stoga inhibirati udruživanje ovog receptora sa PGF2α. Jedinjenje II stoga može biti davano subjektima, kao što su trudne ženske osobe, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja). Na primer, jedinjenje II može biti davano subjektu da bi se sprečio porođaj pre porođaja carskim rezom. Dodatno, jedinjenje II može biti davano subjektu u cilju profilakse i/ili lečenja dismenoreje. Jedinjenje II takođe može biti davano subjektu, kao što je trudna ženska osoba, da bi se ublažio jedan ili više simptoma koji su povezani sa porođajem, kao što su vaginalno krvarenje i ruptura membrana materice.
[0059] Dodatno, jedinjenje II može biti davano subjektu u svrhu lečenja endometrioze kod pacijenta (npr. humanog pacijenta). Kao antagonista PGF2α receptora, jedinjenje II može biti davano pacijentkinji koji boluje od endometrioze, u cilju lečenja ove indikacije. Jedinjenje II može biti davano pacijentkinji da bi se ublažio jedan ili više simptoma endometrioze, kao što su bolni simptomi uključujući dismenoreju, dispareuniju, hroničan bol u karlici, disuriju i disheziju, tokom i/ili van menstrualnog ciklusa. Uspešno lečenje endometrioze davanjem jedinjenja II subjektu može podrazumevati, npr. smanjenje rasta endometrijalnog tkiva i/ili smanjenje bolnih simptoma tokom i/ili van menstrualnog ciklusa.
Farmaceutske kompozicije
[0060] Jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti formulisani u farmaceutsku kompoziciju za davanje subjektu, kao što je trudna ženska osoba, u biološki kompatibilnom obliku pogodnom za primenu in vivo. Shodno tome, prema jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, u smeši sa odgovarajućim razblaživačem, nosačem ili ekscipijensom. Jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati, na primer, oralno ili intravenskim injeciranjem.
[0061] Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, farmaceutska kompozicija može sadržavati konzervans, npr. da bi se sprečio rast mikroorganizama. Konvencionalne procedure i sastojci za izbor i pripremu pogodnih formulacija opisani su, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2012, 22. izd.) i u The United States Pharmacopeia: The National Formulary (2015, USP 38 NF 33).
[0062] Farmaceutske kompozicije mogu uključivati sterilne vodene rastvore, disperzije ili praškove, npr. za ekstempornu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija. U svim ovim slučajevima, oblik može biti sterilisan upotrebom tehnika koje su poznate u oblasti tehnike i može biti fluidizovan do mere u kojoj se može lako davati subjektu kome je lečenje potrebno.
[0063] Farmaceutska kompozicija može biti davana subjektu, npr. humanom subjektu, samostalno ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, kao što je ovde navedeno, čiji se udeo može utvrditit na osnovu rastvorljivosti i/ili hemijske prirode jedinjenja, kao i na osnovu puta primene koji je izabran, a dalje i na osnovu standardne farmaceutske prakse.
Primeri
[0064] Primeri koji slede su navedeni da bi se stručnjacima iz oblasti tehnike obezbedio opis kako kompozicije i postupci koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni, napravljeni ili procenjivani, i namenjeni su da budu samo primeri pronalaska i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju njihovim pronalaskom.
Primer 1. Priprema jedinjenja I i III
[0065] Jedinjenje I i njegova hloridna so (jedinjenje III) su pripremani prema Šemi 1, prikazanoj u nastavku teksta. Ovaj primer će opisati svaku od faza koja je rađena da bi se sintetisalo jedinjenje I, a koje su označene kao Faze 1-6.
Šema 1. Priprema jedinjenja I i njegove hloridne soli
Faza 1: Priprema terc-butil estra 2-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropilkarbamoil]tiazolidin-3-karboksilne kiseline
[0066]
[0067] U balon odgovarajuće veličine (posuda A) najpre je dodata 3-(butoksikarbonil)-1,3-tiazolidin-(2S)-karboksilna kiselina (1 tež.), a potom je dodat i tetrahidrofuran, nakon čega je sadržaj balona ohlađen do od -35°C do oko -45°C. U balon je zatim dodat N-metilmorfolin (1,18 zapr.), uz održavanje temperature između -30°C i -40°C, nakon čega je dodat i izobutil hloroformat (0,58 zapr.), uz održavanje temperature između -30°C i - 40° C.
[0068] U posebnu posudu (posudu B) su dodati (3S)-amino-3-(4-fluorofenil)propan-1-ol (0,76 tež.) i THF i sadržaj posude je temeljno mešan dok se čvrsta masa nije rastvorila.
[0069] Rastvor (3S)-amino-3-(4-fluorofenil)propan-1-ola iz posude B je potom prebačen u reakcioni sud A, uz održavanje temperature između -30°C i -40°C. Sadržaj balona je zatim ostavljen da se zagreje do od 15° C do 25° C tokom perioda od 1 h do 24 h. Reakciona smeša je dalje mešana na 15°C do 25°C dok nije utvrđeno da se reakcija završila. Reakciona smeša je koncentrovana do suva, a ostatku je dodat etil acetat, a potom i zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida. Organska faza je odvojena i isprana zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida. Organska faza je još jednom odvojena i isprana je zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata. Organska faza je zatim osušena upotrebom natrijum sulfata, nakon čega je profiltrirana i filtrat je koncentrovan na 35°C do 40°C, sve dok sadržaj etil acetata nije iznosio ≤ 10 tež.% (w/w), a da bi se dobio terc-butil estar 2-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropilkarbamoil]tiazolidin-3-karboksilne kiseline.
Faza 2: Priprema [1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropil]-amida 3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karboksilne kiseline
[0070]
[0071] U balon odgovarajuće veličine (posuda A) najpre je dodat terc-butil estar 2-[1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropilkarbamoil]tiazolidin-3-karboksilne kiseline (1 tež.), a zatim je dodat i dihlorometan. Sadržaj balona je zatim ohlađen do od -15°C do -20°C. U balon je dalje dodavana hlorovodonična kiselina (3,3 zapr.), uz održavanje temperature između -15°C i -20°C, sve dok nije utvrđeno da se reakcija završila. Reakciona smeša je zatim ohlađena na -35°C do -40°C i u smešu je dodat tetrahidrofuran, uz održavanje temperature između -30°C i -40°C. U smešu je dalje dodat N,N-diizopropiletilamin (8,16 zapr.), uz održavanje temperature između -15°C i -45°C. U posudu je konačno dodat i 4-dimetilaminopiridin (0,032 tež.), uz održavanje temperature između -15°C i -45° C.
[0072] U odvojenu posudu (posudu B), sipan je 4-bifenilsulfonil hlorid (0,85 tež.), a zatim je dodat THF.
[0073] Rastvor 4-bifenilsulfonil hlorida iz posude B je prebačen u reakcioni sud A, uz održavanje temperature između -15°C i -45°C. Sadržaj reakcione smeše je zatim ostavljen da se zagreje do od 15°C do 25°C tokom perioda od 1 h do 24 h. Naknadno je u posudu dodat etil acetat, nakon čega je sledilo dodavanje zasićenog rastvora amonijum hlorida. Organska faza je odvojena i isprana zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida, a zatim i sa zasićenim vodenim rastvorom hidrogen karbonata. Organska faza je zatim osušena upotrebom natrijum sulfata i profiltrirana. Filtrat je koncentrovan na 35°C do 40°C dok nije dobijen čvrsti ostatak. Ostatku je zatim dodat dihlorometan i smeša je mešana na od 30°C do 35°C. Nakon uparavanja, ostatku je dodat etil acetat i suspenzija je prebačena u odgovarajući sud. Mešana suspenzija je zatim zagrejana do temperature refluksa, pa je dalje ohlađena do od 0°C do 5°C. Precipitirana čvrsta supstanca je prikupljena filtracijom. Filterski kolač je ispran najpre etil acetatom, a zatim i terc-butil metil etrom, nakon čega je filterski kolač sušen tokom 1 h do 24 h pod azotom da bi se dobio [1-(4-fluorofenil)-3- hidroksipropil]-amid 3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karboksilne kiseline.
Faza 3A: Priprema 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propil estra 2-terc-butoksikarbonilamino-3-metilbuterne kiseline
[0074]
[0075] U balon odgovarajuće veličine (posuda A), dodati su Boc-L-valin (0,48 tež.), dihlorometan i N,N-dimetilformamid, nakon čega je smeša mešana pod azotom na od 15°C do 25°C. U posudu su zatim dodati 1-hidroksibenzotriazol (HOBt, 0,3 tež.) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDCI, 0,42 tež.), uz održavanje temperature na 15°C do 25°C. Smeša je dalje mešana na 15°C do 25°C do rastvaranja čvrste mase, da bi se dobio rastvor A.
[0076] U posebnu posudu (posudu B), dodati su [1-(4-fluorofenil)-3-hidroksipropil]amid 3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karboksilne kiseline (1,0 tež.), dihlorometan i N,N-dimetilformamid, pa je smeša naknadno mešana na 15°C do 25°C pod azotom. U posudu je zatim dodat 4-dimetilaminopiridin (0,27 tež.), uz održavanje temperature između 15°C do 25°C. Smeša je mešana na ovoj temperaturi sve dok se čvrsta masa nije rastvorila (obično za 5 do 15 minuta), da bi se dobio rastvor B.
[0077] Rastvor A je zatim presut u rastvor B, uz održavanje temperature između 15°C i 30°C. Smeša je mešana na ovoj temperaturi dok nije utvrđeno da je reakcija završena. Reakciona smeša je zatim koncentrovana da bi se uklonili isparljivi rastvarači. U balon je dalje dodat etil acetat, a potom i 10% w/w vodeni rastvor limunske kiseline. Vodena faza je odvojena i ekstrahovana etil acetatom. Organske faze su spojene i isprane smešom 10% w/w vodenog rastvora limunske kiseline, pa je dodat zasićeni vodeni rastvor natrijum hlorida, nakon čega su dodati i zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida, zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogenkarbonata i zasićeni vodeni rastvor natrijum hlorida. Organska faza je zatim osušena upotrebom magnezijum sulfata, nakon čega je profiltrirana i filterski kolač je ispran etil acetatom. Filtrati su koncentrovani dok nije dobijen čvrsti ostatak, a da bi se dobio sirovi 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propil estar 2-tercbutoksikarbonilamino-3-metilbuterne kiseline.
Faza 3B: Prečišćavanje 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propil estra 2-terc-butoksikarbonilamino-3-metilbuterne kiseline
[0078]
[0079] U svrhu prečišćavanja 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propil estra 2-terc-butoksikarbonilamino-3-metilbuterne kiseline, sirovi proizvod (1 tež.) i dihlorometan su mešani u sudu dok se čvrste materije nisu rastvorile. Rastvor je zatim nanet na silicijum dioksid, pa je dodat dihlorometan. Proizvod je dalje eluiran sa smešom etil acetata i heptana. Frakcije koje su sadržavale proizvod su spojene i koncentrovane do suva pod vakuumom, na temperaturi vodenog kupatila od 35°C do 40°C, da bi se dobio prečišćeni 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propil estar 2-terc-butoksikarbonilamino-3-metilbuterne kiseline.
Faza 4: Priprema metansulfonata 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estra 2-amino-3-metilbuterne kiseline
[0080]
[0081] U tikvicu odgovarajuće veličine je dodat 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil)-3-propil estar 2-terc-butoksikarbonilamino-3-metilbuterne kiseline (1 tež.), a dalje je dodat i 1,4-dioksan, pa je smeša mešana pod azotom. Naknadno je dodata i metansulfonska kiselina (0,18 tež.) i sadržaj balona je zagrejan do od 68°C do 73°C. Reakciona smeša je zatim mešana na ovoj temperaturi sve dok<1>H NMR analizom nije utvrđeno da je reakcija završena. Reakciona smeša je zatim ohlađena do od 35°C do 40°C i koncentrovana je do suva na ovoj temperaturi. Ostatak je rastvoren u THF-u, nakon čega je koncentrovan do suva na 35°C do 40°C. Ovaj ciklus azeo sušenja je ponovljan sve dok sadržaj 1,4-dioksana nije bio manji od 1,0% w/w, da bi se dobio metansulfonat 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estra 2-amino-3-metilbuterne kiseline.
Faza 5: Priprema 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estra 2-amino-3-metilbuterne kiseline (Jedinjenje I)
[0082]
[0083] U balon odgovarajuće veličine, dodat je najpre metansulfonat 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estra 2-amino-3-metilbuterne kiseline (1 tež.), a zatim je dodat i dihlorometan. Sadržaj balone je ohlađen do od 5°C do 15°C. U smešu je dalje dodat vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata, uz održavanje temperature na od 5°C do 25°C. Faze su zatim razdvojene, pa je organska faza ponovo dodata u sud, nakon čega je dodat zasićen vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata uz održavanje temperature na od 5°C do 25°C. Vodeni i organski slojevi su potom razdvojeni i organska faza je osušena upotrebom magnezijum sulfata, nakon čega je profiltrirana i filterski kolač je ispran dihlorometanom. Organski slojevi su spojeni i koncentrovani do suva na 40°C do 45°C sve dok sadržaj dihlorometana nije iznosio ≤ 2% w/w, da bi se dobio 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estar 2-amino-3-metilbuterne kiseline (jedinjenje I).
Faza 6: Priprema hidrohlorida 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estra 2-amino-3-metilbuterne kiseline (jedinjenje III)
[0084]
[0085] U balon odgovarajuće veličine je dodata voda (1,66 zapr.), a zatim je dodata i hlorovodonična kiselina (0,18 zapr.), nakon čega je temperature smeše podešena na 15°C do 25°C. Rastvor je zatim profiltriran, a filtriranjem dobijen rastvor je dodat u balon odgovarajuće veličine (posuda A) u koji su dalje dodati etanol i etil acetat. Dobijena smeša je mešana pod azotom na 15°C do 25°C tokom najmanje 5 minuta.
[0086] U posudu odgovarajuće veličine (posudu B), dodat je 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estar 2-amino-3-metilbuterne kiseline (1 tež.), a zatim je dodat i etanol. Sadržaj tikvice je zatim promešan da bi se rastvorila čvrsta masa i razbistrio rastvor.
[0087] Rastvor iz posude B je zatim presut u posudu A, uz održavanje temperature na 15°C do 25°C. Mešana smeša je ohlađena do od 0°C do 5°C i mešana je na ovoj temperaturi tokom 50 do 70 minuta. Čvrsta supstanca je zatim prikupljena filtracijom i filterski kolač je sušen pod azotom tokom najmanje 12 sati, da bi se dobio sirovi hidrohlorid 3-{[3-(bifenil-4-sulfonil)tiazolidin-2-karbonil]amino}-3-(4-fluorofenil) propil estra 2-amino-3-metilbuterne kiseline.
Primer 2. Farmakodinamičke osobine jedinjenja I i njegovih soli
Neklinička farmakologija
[0088] Jedinjenje I i njegove soli se brzo prevode u jedinjenje II nakon primene u gastrointestinalni trakt. Jedinjenje II je kompetitivni i reverzibilni antagonista prostaglandinskog F2α receptora (za humani FP2α receptor Ki=6 nM) i trenutno je u razvoju za lečenje prevremenih porođaja, inhibicijom prevremenih kontrakcija materice. Efikasnost farmakologije (tokolitički efekat) je pokazana u modelu spontane aktivnosti materice kod pacova u kasnoj fazi trudnoće.
In vitro farmakologija
[0089] Potentnost inhibicije prostaglandinskog F2α receptora za jedinjenja I i jedinjenja II ispitivana je analizom afiniteta ovih jedinjenja za rekombinantni FP receptor eksprimiran u HEK293-EBNA ćelijama. Rezultati pokazuju visok afinitet vezivanja jedinjenja I i jedinjenja II za humani receptor (pogledati Tabelu 2).
[0090] Selektivnost jedinjenja II je isptivana u odnosu na sve od osam podtipova prostaglandinskih receptora. Selektivnost je iznosila približno 10 puta za prostaglandinski E receptor 2 (EP2) i bila je viša od 100 puta za druge receptore. Ispitivanje efekta 1 µM jedinjenja II u panelu sa 50 receptora, kanala i mesta vezivanja enzima, ukazala je na visoku selektivnost za FP.
[0091] Funkcionalna karakterizacija jedinjenja II u odnosu na humani FP rađena je u transfektovanim HEK293-EBNA ćelijama. Jedinjenje II je bilo u stanju da inhibira sintezu IP3 u zavisnosti od doze, sa IC50vrednošću od 60 nM. Kada je bilo dodavano u FP/HEK293-EBNA ćelije samostalno, jedinjenje II je ispitivano do 10 µM i nije indukovalo bilo kakvu sintezu IP3, što ukazuje da je jedinjenje lišeno agonističke aktivnosti.
In vivo farmakologija
[0092] Tokolitički efekti jedinjenja I i jedinjenja II su ispitivani u modelu spontane aktivnosti materice kod anesteziranih skotnih pacova u kasnoj fazi trudnoće (19-21 dan gestacije) (Kawarabayashi i saradnici, Am. J. Obstet. Gynecol. 175:1348-1355 (1996) i Shinkai i saradnici, J. Pharm. Pharmacol.
52:1417-1423 (2000)). Ukratko, skotne ženke pacova u kasnoj fazi trudnoće su anestezirane uretanom. Disekovan je jedan rog materice sa plodom i u šupljinu je uveden polietilenski kateter sa balonom od lateksa na vrhu, koji je bio ispunjen fiziološkim rastvorom. Kateter je povezan sa sistemom za pojačavanje/snimanje putem pretvarača pritiska. Oralno su zatim davane ili i.v. infuzijom tokom 10 minuta injecirane rastuće doze jedinjenja I (u vidu mezilatne soli) ili jedinjenja II. Za i.v. primenu, kontraktilna aktivnost materice je kvantifikovana izračunavanjem AUC tokom perioda injeciranja od 10 minuta.
[0093] Procenat varijacije AUC vrednosti u odnosu na spontani odgovor materice uočen nakon svake primene jedinjenja izračunavan je poređenjem sa vrednošću zabeleženom pre prve primene doze (bazalna vrednost). Efekat jedinjenja I ili jedinjenja II je procenjivan poređenjem vrednosti pritiska u šupljini materice pre i nakon tretmana. Kod oralne primene, davan je isti postupak izračunavanja u različitim vremenskim tačkama nakon tretmana. Statističke razlike između tretiranih grupa u svakoj vremenskoj tački su određene upotrebom jednofaktorske ANOVA, praćene Tukey testom. Oba jedinjenja koja su bila davana intravenski ili oralno, bila su u stanju da značajno smanje spontane kontrakcije materice za oko 40-50% (maksimalan efekat je dobijen za 30 mg/kg datih i.v. i za 60 mg/kg datih oralnim putem). Intravenska aktivnost je bila uporediva ili nešto viša u odnosu na onu koja je zapažena za tokolitički lek atosiban, licenciran u Evropskoj uniji.
[0094] Inhibitorni efekat nakon oralne primene se pojavio brzo (5-15 minuta nakon primene) i ostao je na održivom nivou do kraja perioda posmatranja od 3 sata. (Slika 3)
[0095] Jednokratnom oralnom dozom je postignuta značajna inhibicija kontrakcija materice sa dozom od 30 mg/kg.
[0096] In vitro farmakološke studije su stoga pokazale visok afinitet jedinjenja I i jedinjenja II za humani FP receptor. Kada su davana intravenskim ili oralnim putem, ova jedinjenja su bila u stanju da značajno smanje spontane kontrakcije materice za oko 40-50%, pri čemu su ispitivanja vršena u modelu spontane aktivnosti materice kod anesteziranih skotnih pacova u kasnoj fazi trudnoće (19.-21. dan gestacije).
Primer 3. Skrining kristala soli jedinjenja I
[0097] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene da bi se generisali i okarakterisali kristalni oblici soli jedinjenja I.
Rezime
[0098] Za mezilatnu so jedinjenja I, XRPD analizom je utvđeno da je amorfna. Pokušaji kristalizacije materijala nisu bili uspešni. Slobodna baza je sintetisana iz mezilatne soli i zatim je upotrebljena u pripremi raznovrsnih soli. Kristalna hidrosulfatna so je dobijena direktno iz sinteze soli. Tri soli su kristalisane upotrebom različitih smeša rastvarača i tehnika kristalizacije: hidrohlorid, fumarat i dihidrofosfat. Delovalo je da hidrohloridnu so karakteriše niska higroskopnost, produžena stabilnost pri povišenoj relativnoj vlažnosti (RH), kao i da ista poprima monokristalni oblik prilikom kristalizacije u raznovrsnim, jasno različitim eksperimentalnim uslovima.
[0099] Kristalna HCI so je dobijena u dva eksperimenta uparavanja i u eksperimentu sa suspenzijom. Isti XRPD obrazac je uočen u svakom od navedenih slučajeva. Na osnovu termičkih podataka, zaključeno je da je materijal sadržavao zaostali rastvarač; verovatna tačka topljenja je iznosila približno 146-147°C. Tokom topljenja se verovatno odvijalo i delimično raspadanje. Na osnovu podataka o ravnotežnoj vlažnosti, zaključeno je da hidrohloridna so nije bila higroskopna.
[0100] Kristalna hidrosulfatna so je verovatno bila solvatizovana i razložena iznad približno 100°C. Materijal je bio stabilan pri relativnoj vlažnosti do približno 65%.
[0101] Kristalna dihidrofosfatna i fumaratna so su bile higroskopne pri RV od približno 65%. Pokušaji povećanja prinosa soli nisu bili uspešni, usled visoke laboratorijske vlažnosti. Prema tome, bila je moguća samo delimična karakterizacija ovih soli.
[0102] Hidrohloridna, hidrosulfatna i fumaratna so su pokazale uporedivu rastvorljivost u vodi (ispod 1 mg/mL, pogledati Sliku 8).
Eksperimentalni postupak
[0103] Analize rendgenske difraktometrije praha koja je ovde opisana, rađena je upotrebom Shimadzu XRD-6000 rendgenskog difraktometra za prah i Cu Kα zračenja. Instrument je bio opremljen dugom rendgenskom cevi sa finim fokusom. Napon i amperaža cevi su bili podešeni na 40 kV i 40 mA, tim redom. Prorezi divergencije i rasejanja su bili postavljeni na 1°, a prorez za detekciju je bio postavljen na 0,15 mm. Difraktovano zračenje je detektovano sa NaJ scintilacionim detektorom. Upotrebljavano je teta-dva teta kontinuirano skeniranje sa 3 °/min (0,4 sek/koraku od 0,02°), od 2,5 do 40 °2θ. Svaki dan je analiziran i silicijumski standard, da bi se proverila kalibrisanost instrumenta. Uzorci su analizirani upotrebom silicijumskog držača za uzorke.
[0104] Analize rendgenske difraktometrije praha koje su ovde opisane, takođe su vršene upotrebom Inel XRG-3000 difraktometra, opremljenog sa zakrivljenim detektorom osetljivim na poziciju 2θ opsega od 120°. Podaci u realnom vremenu su prikupljeni upotrebom Cu Kα zračenja, počevši od približno 4 °2θ uz rezoluciju od 0,03 °2θ. Napon i amperaža cevi su bili podešeni na 40 kV i 30 mA, tim redom. Prorez monohromatora je bio postavljen na 5 mm, sa koracima od po 160 µm. Obrasci su prikazivani za od 2,5 do 40 °2θ. Uzorci su pripremani za analizu pakovanjem u staklene kapilare tankih zidova. Svaka kapilara je bila postavljena na glavu goniometra koja je bila motorizovana, da bi se omogućilo okretanje kapilare tokom prikupljanja podataka. Uzorci su analizirani tokom 5 ili 10 min. Kalibracija instrumenta je vršena svakodnevno, upotrebom silicijumskog referentnog standarda.
[0105] DSC analize koje su ovde opisane, vršene su upotrebom diferencijalnog skenirajućeg kalorimetra 2920 kompanije TA Instruments. Instrument je kalibrisan upotrebom indijuma kao referentnog materijala. Uzorci su postavljeni u standardnu aluminijumsku DSC posudu, nakon čega je posuda savijana i beležena je precizna težina. Uzorci su ekvilibrisani na 25 °C, nakon čega su grejani do 350 °C pod strujom azota, uz stopu od 10 °C/min. Kao standard za kalibraciju je upotrebljavan metalni indijum.
[0106] Ovde opisane TG analize su rađene upotrebom termogravimetrijskog analizatora 2950 kompanije TA Instruments. Standardi za kalibraciju su bili nikl i ALUMEL<™>. Uzorci su postavljeni u aluminijumsku posudu za uzorke, a zatim su ubacivani u TG peć. Uzorci su najpre ekvilibrisani na 25 °C, nakon čega su grejani pod strujom azota do 350 °C, uz stopu zagrevanja od 10 °C/min.
[0107] Ovde opisani spektri<1>H nuklearne magnetne rezonancije (NMR) za rastvore, dobijani su na temperaturi okoline upotrebom UNITYINOVA-400 spektrometra kompanije Varian, na<1>H Larmorovoj frekvenciji od 399,8 MHz. Uzorci su rastvorani u metanolu-d4, metilen hloridu-d2 ili hloroformu-d3. Spektri su snimani sa širinom pulsa<1>H od 7,8 ili 8,6 µs, sa vremenom akvizicije od 2,50 sekundi, kašnjenjem između skeniranja od 5 sekundi, pri čemu je širina spektra iznosila od 4095 ili 6400 Hz sa 20474 ili 32000 tačaka podataka, a rađeno je i 16 ili 40 dodatnih, istovremenih skeniranja. Slobodni indukcioni raspad (FID) je obrađivan upotrebom softvera VNMR 6.1 C kompanije Varian sa 65536 tačaka i faktorom eksponencijalnog širenja linije od 0,2 Hz, da bi se poboljšao odnos signala i šuma. Spektri su referentno obrađivani u odnosu na interni tetrametilsilan (TMS) na 0,0 ppm ili u odnosu na pik rezidualnog rastvarača.
[0108] FT-Ramanski spektri koji su ovde opisani, snimani su upotrebom FT-Raman 960 ili 860 spektrometra (Thermo Nicolet). Ovaj spektrometar koristi talasnu dužinu ekscitacije od 1064 nm. Za zračenje uzoraka je upotrebljavana snaga Nd:IVO4lasera od približno 0,5-0,7 W. Ramanski spektri su mereni detektorom od indijum galijum arsenida (InGaAs). Uzorci su pripremani za analizu postavljanjem materijala u staklenu kapilaru, a zatim u pozlaćeni držač kapilare kao dodatni pribor. Prikupljeno je ukupno 256 skenova uzoraka od 3600 do 100 cm-1 pri spektralnoj rezoluciji od 4 cm-1, upotrebom Happ-Genzel apodizacije. Kalibracija talasnih dužina je vršena upotrebom sumpora i cikloheksana.
[0109] Podaci o sorpciji/desorpciji vlage (MB) su prikupljani upotrebom VTI SGA-100 analizatora za sorpciju pare. Podaci o sorpciji i desorpciji su prikupljani u opsegu relativne vlažnosti (RV) od 5% do 95%, u intervalima RV od 10%, pod strujom azota. Uzorci nisu sušeni pre analize. Kriterijumi ravnoteže korišćeni za analizu su bili manji od 0,0100% promene težine u 5 minuta, sa maksimalnim vremenom ekvilibracije od 3 sata, ukoliko kriterijum težine nije bio ispunjen. Podaci nisu korigovani u odnosu na početni sadržaj vlage u uzorcima. Kao standardi za kalibraciju su upotrebljavani NaCl i PVP.
Priprema jedinjenja I
[0110] Učinjeno je više pokušaja da se dobije slobodna baza jedinjenja I iz mezilatne soli, čiji su rezultati opisani na Slici 4. U početku je upotrebljavan jedan ekvivalent natrijum hidroksida po ekvivalentu soli. Protonski NMR je ukazao na prisustvo pikova metansulfonske kiseline. Potpuna reakcija je postignuta kada su mezilatna so u metilen hloridu i rastvor NaOH u vodi pomešani u odnosu so:baza od 1:2. Organski sloj je odvojen nakon nekoliko ispiranja i uparen. Dobijeni materijal nalik pasti i vikozan uljani materijal su osušeni u vakuumu da bi se dobila amorfna čvrsta supstanca. Slobodna baza je analizirana<1>H NMR i Ramanskom spektroskopijom (Slika 15 i Slika 16, tim redom). U narednim studijama za skrining soli, kao početni materijal je korišćena slobodna baza (u kratkim crtama prikazano na Slikama 5-7).
Skrining soli jedinjenja I
[0111] Pripremljeno je dvanaest soli jedinjenja I. Kristalna hidrosulfatna so je istaložena dodavanjem približno 25 molarnog viška sumporne kiseline u rastvor slobodne baze u acetonu. Za ostale soli iz koraka sinteze je mikroskopijom ustanovljno da nisu sa birefrakcijom ili je XRPD analiza ukazala da su amorfne (Slike 5-7). Benzensulfonatne, citratne, etansulfonatne, hidrohloridne, hidrosulfatne i sulfatne soli su analizirane protonskim NMR postupkom.
[0112] Eksperimenti kristalizacije soli jedinjenja I su sumirani na Slikama 5-7. Kristalizovane su sledeće soli: hidrohloridna, fumaratna i dihidrofosfatna.
[0113] Hloridna so je kristalisana iz smeše acetona:toluena, smeše metilen hlorida:etil etra i suspenzije acetona odnosa 1:1. Isti XRPD obrazac je uočen u svim eksperimentima i označen je kao oblik A (Slika 7). Kristalna so fumarata je dobijena sporim uparavanjem rastvora metanol:toluen odnosa 1:1. Rendgenski obrazac je označen kao obrazac B. Hidrosulfatna i dihidrofosfatna so su ispoljile veoma slične XRPD obrasce (označene kao obrazac X). Joni suprotnog naelektrisanja, HSO4<->i H2PO4-, bili su slični po veličini i mali u poređenju sa molekulom slobodne baze, tako da je zaključeno da su slične kristalne strukture vrlo verovatne za hidrosulfatnu i dihidrofosfatnu so. Pokušaji kristalizacije mezilatne soli su doveli do nastanka viskoznih ili staklastih čvrstih materijala.
Karakterizacija slobodne baze i mezilatne soli jedinjenja I
[0114] Protonski NMR spektar slobodne baze je karakterisalo prisustvo dva dubleta na približno 1 ppm, a koji su odovarali metil grupama valinskog fragmenta. Metil grupe su u hiralnom centru ugljenika i, prema tome, nisu moigle biti ekvivalentne u protonskom NMR spektru. Dva dubleta za metil grupe su uočena za sledeće soli jedinjenja I: besilat, citrat, esilat, hidrosulfat (više preklapanja) i sulfat (više preklapanja). U<1>H NMR spektrima za mezilatne soli i hloridne soli, dublet na ~ 1ppm, koji odgovara grupi od šest atoma vodonika, rezultat je potpunog preklapanja dva dubleta metil grupa (Slika 13 i Slika 21).
[0115] Homonuklearno dekuplovanje u<1>H NMR eksperimentu za slobodnu bazu, potvrdilo je multiplitet metinskog (CH) vodonika na približno 2 ppm (Slika 18).<1>H NMR spektar slobodne baze snimljen u odsustvu prethodnog zračenja bilo koje metil grupe, prikazan je na dnu Slike 18. Rezultat zračenje svake metil grupe (gornji, srednji grafik) je bio uprošćen metinski multiplitet sa istim brojem linija (5). Ukoliko bi dva dubleta odgovarala različitim dijastereoizomerima, mogla bi se uočiti dva tipa multipliteta, originalan i pojednostavljen.
Karakterizacija hloridne soli jedinjenja I (jedinjenje III)
[0116] Kristalna hloridna so je analizirana termičkim tehnikama, upotrebom<1>H NMR i automatskom analizom sorpcije/desorpcije vlage. Endoterma na približno 147 °C u DSC je izgledala šire od one koja se obično uočava za endotermu topljenja. Uočen je gubitak težine od približno 4% na temperaturi od 25 do 160 °C (analiziran je uzorak acetonske suspenzije, Slika 20).<1>H NMR hloridne soli je bio u skladu sa strukturom (Slika 21). Međutim, podaci nisu mogli biti povezani sa gubitkom težine u termičkim analizama pošto je analiziran drugačiji uzorak (dobijen sporim uparavanjem iz smeše aceton:toluen odnosa 1:1). Hloridna so iz acetonske suspenzije je zatim sušena u vakuumu na približno 50 °C tokom 1 dana. Dobijeni uzorak je bio sličan originalnoj soli prema XRPD analizi (Slika 22). Termički podaci su predstavljeni na Slici 23. Na osnovu poređenja termičkih podataka, osušeni materijal je imao manje gubitke u težini između 25 i 100 °C (0,2% u odnosu na 0,6% za originalnu hloridnu so) i 100 i 160°C (2,5% u odnosu na 3,5%) (Slika 24). Navedeno ukazuje da je određeni deo rastvarača uklonjen pri sušenju u vakuumu. Ipak, endoterma na približno 146-147 °C u DSC je i dalje bila široka (Slika 25). Delimična razgradnja je verovatno nastala tokom topljenja (obratiti pažnju na bazalnu vrednost razlaganja i odgovarajući gubitak težine u TG).
[0117] Hloridna so jedinjenja I se nije raspala nakon 2 dana na relativnoj vlažnosti od približno 95%. Podaci o sorpciji/desorpciji vlage su sumirani na Slici 27 i prikazani su na Slikama 26 i 28. Minimalni gubitak težine je uočen za ekvilibracuju pri RV od 5%. Povećanje mase od približno 0,9% se javilo pri sorpciji na relativnoj vlažnosti od 5 do 95%. Uzorak je karakteriao gubitak težine nakon desorpcije od približno 0,7%. XRPD analiza na uzorku nakon MB pokazala je da je rendgenski obrazac sličan onom za početni materijal (Slika 29).
Karakterizacija hidrosulfatnih i sulfatnih soli jedinjenja I
[0118] Pripremljene su i hidrosulfatna i sulfatna so jedinjenja I. Hidrosulfatna so je istaložena iz acetonskog rastvora slobodne baze dodavanjem približno 25 molarnog viška sumporne kiseline. XRPD analizom je ustanovljeno da je talog bio kristalisan (Slika 38). Termalni podaci za hidrosulfatnu so su dati na Slici 32. Široka endoterma na približno 68 °C odgovarala je gubitku težine od približno 1% i verovatno je bila posledica desolvatacije (dehidratacije). Do raspada je došlo na višim temperaturama. Do pretvaranja u tečnosti nije došlo ni nakon 3 dana pri RV od približno 65% (Slika 32). Sulfatna so je pripremana upotrebom dva ekvivalenta slobodne baze po jednom ekvivalentu kiseline. Pokušaji kristalizacije sulfatne soli jedinjenja I nisu bili uspešni (Slike 5-7). Hidrosulfatna i sulfatna so su analizirani protonskim NMR postupkom (Slika 33 i Slika 34). Uočene su razlike u NMR spektrima. Na primer, delovalo je da su metil grupe fragmenta valina sa različitim kuplovanjem.
Karakterizacija dihidrofosfatne soli jedinjenja I
[0119] Dihidrofosfatna so je kristalisana iz smeše metil etil keton:n-butil acetat odnosa 1:1 (Slike 5-7). Rendgenski obrazac ove soli je bio sličan onom za hidrosulfatnu so (Slika 43). Karakterizacija dihidrofosfatne soli je bila ograničena na XRPD usled gubitka uzorka tokom analize. Pokušaji pripreme dodatnih količina kristalne soli nisu bili uspešni. Nisko kristalni materijal je generisan tokom prvog pokušaja (Slike 5-7). Rekristalizacija niskokristalne soli je dala viskoznu čvrstu supstancu. Materijal je ostao viskozan nakon što je osušen u vakuumu. Laboratorijska vlažnost je iznosila približno 62% za RV tokom kristalizacije povećanog obima i verovatno je uticala na materijal usled njegove higroskopnosti. Nisu preduzeti dalji pokušaji da se kristalizuje dihidrofosfatna so.
Karakterizacija fumaratne soli jedinjenja I
[0120] Mala količina fumaratne soli je kristalisana iz smeše metanol:toluen odnosa 1:1 (Slike 5-7). Pokušaji da se poveća obim dobijene kristalne soli vršeni su pri laboratorijskoj vlažnosti od približno 62% RV i nisu bili uspešni. Dobijeni su uglavnom uljasti materijali, iako je mikroskopijom utvrđeno prisustvo nešto kristalne čvrste supstance. Sušenjem viskozne čvrste supstance u vakuumu je dobijen uglavnom amorfan materijal. Prvobitno pripremljena kristalna so je upotrebljena za eksperimente sa zasejavanjem. Ipak, nisu dobijeni kristalni materijali. Higroskopna priroda fumaratne soli je potvrđena u studijama relativne vlažnosti.
[0121] Delovalo je da je fumaratna so osetljiva na vlagu. Kristalna so je bila stabilna pri relativnoj vlažnosti od 43 i 53%, a pretvaranje u tečnost je započeto unutar prvog dana pri RV od približno 65%. Nakon 3 dana pri RV od 65%, obrazovalo se žuto ulje (dobijena vlaga je iznosila približno 4%).
Zaključci
[0122] XRPD analizom je utvrđeno da je mezilatna so jedinjenja I amorfna. Pokušaji kristalizacije materijala nisu bili uspešni.
[0123] Slobodna baza jedinjenja I je sintetisana iz mezilatne soli i upotrebljena je za pripremu 12 soli. Kristalna hidrosulfatna so je dobijena direktno iz sinteze soli. Tri soli su kristalisane upotrebom različitih smeša rastvarača i tehnika kristalizacije: hidrohloridna, fumaratna i dihidrofosfatna. Delovalo je da je hloridna so najbolji kandidat za dalji razvoj. Kristalna hidrosulfatna so je verovatno bila solvatisana i razlagana iznad približno 100°C. Materijal je bio stabilan pri relativnoj vlažnosti do približno 65%. Kristalna HCI so je dobijena u dva eksperimenta uparavanja i u eksperimentu sa suspenzijom. Uočen je isti XRPD obrazac. Na osnovu termičkih podataka, ustanovljeno je da je materijal sadržavao nešto zaostalog rastvarača; verovatna tačka topljenja je bila približno 146-147°C. Delimično raspadanje se verovatno odvijalo tokom topljenja. Na osnovu podataka o ravnoteži vlage, ustanovljeno je i da hloridna so nije bila higroskopna. Kristalna dihidrofosfatna i fumaranta so su bile higroskopne pri RV od približno 65%. Pokušaji povećanja prinosa soli nisu bili uspešni usled visoke laboratorijske vlažnosti. Prema tome, bila je moguća samo delimična karakterizacija ovih soli.
Primer 4. Praćenje permeabilnosti mezilatne soli jedinjenja I u Caco-2 ćelijama
[0124] Bioraspoloživost oralno datih lekova u velikoj meri zavisi od njihove sposobnosti da se transportuju kroz crevne barijere. Caco-2 ćelije, izvedene iz humanog adenokarcinoma debelog creva, uspostavljene od strane J. Fogh-a usled njihove sposobnosti da postignu viši stepen enterocitne diferencijacije, i mogu biti upotrebljene kao in vitro model za ispitivanje transporta lekova kroz crevni epitel. Ove ćelije obrazuju monosloj polarizovanih epitelnih ćelija prilikom gajenja na polikarbonatnoj membrani obloženoj kolagenom. Diferencirane ćelije u jednom sloju predstavljaju relevantan model za epitel tankog creva. Proces diferencijacije započinje obrazovanjem konfluentnog sloja ćelija i vodi obrazovanju četkaste iviće sa dobro razvijenim mikroresicama, čvrstim apikalnim vezama i polarizovanom distribucijom membranskih komponenti, uključujući enzime, receptore, transportne sisteme, jonske kanale i lipidne molekule.
[0125] Svrha studije je u prvom koraku bila da se ispita nespecifično vezivanje jedinjenja I u Caco-2 ćelijskom test sistemu (bez ćelija) i, u drugom koraku, da se ispita prevođenje jedinjenja I u jedinjenje II, kao i da se utvrdi da li je transport jedinjenja I kroz monoslojeve Caco-2 ćelija posredovan PepT1 transporterskim proteinom.
Materijali
[0126] Caco-2 ćelijska linija (ćelije humanog adenokarcinoma debelog creva) dobijena je iz kontrolisanih banaka ćelija (Biosearch S.p.A, Gerenzano-Itali). Dulbecco-ov modifikovani Eagles-ov medijum (DMEM), fetalni goveđi serum, rastvor neesencijalnih aminokiselina, 200 mM L-glutamin, rastvor penicilina/streptomicina, rastvor tripsina-EDTA bez kalcijuma i magnezijuma nabavljeni su od kompanije Celbio (Milano, Italija). HEPES, Hankov balansirani rastvor soli (HBSS), Dulbecco-ov fiziološki rastvor puferisan sa fosfatom (PBS), dimetil sulfoksid (DMSO), glicin-sarkozin (Gly-Sar) su nabavljeni od komapnije Sigma (Milano, Italija).
Eksperimentalni postupak
[0127] Caco-2 ćelije su kultivisane u DMEM-u u koji je bilo dodato 10% fetalnog goveđeg seruma, 2% L-glutamina od 200mM i 1% rastvora neesencijalnih amino kiselina.
[0128] Ćelije su čuvane zamrznute u krioepruvetama, u tečnom azotu, u vidu ćelijskih suspenzija zapremine od po 1 mL, u fetalnom goveđem serumu koji je sadržavao 10% DMSO. Ćelije upotrebljavane u eksperimentima su kultivisane tokom ne duže od mesec dana.
[0129] Kada je bilo potrebno, zamrznute vajle sa Caco-2 ćelijama su brzo odmrzavane na 37°C u vodenom kupatilu, uz lagano vrtložno mešanje, do ne u potpunosti zavšenog odmrzavanja. U ćelijsku suspenziju je zatim u kapima dodavano 10 mL medijuma za kulturu. Ćelijska suspenzija je zatim centrifugirana tokom 7 minuta na 900-1000 obrt/min, pa je uklonjen supernatant i ćelijski talog je rekonstituisan u medijumu i zasejan u flask za kulturu ćelija od 75 cm<2>koji je sadržavao medijum. Flaskovi su inkubirani na 37°C, u atmosferi sa 5% CO2. Ćelije su dalje serijski subkulturisane kada je dobijan monosloj koji je bio blizu konfluentnosti. Medijum iz svakog flaska je uklanjan i monosloj ćelija je ispiran sa 10-15 mL Dulbecco-ovog fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom (PBS).
[0130] Ćelijskom monosloju je zatim dodavan rastvor tripsin-EDTA, nakon čega je sledila inkubacija na 37°C i lagano tapkanje u pravilnim intervalima, da bi se ćelije odlepile od podloge. Potpuno odvajanje i razlaganje ćelijskog monosloja je potvrđeno pregledom pod mikroskopom. Ćelije su zatim ponovo resuspendovane u 10 mL kompletnog medijuma i centrifugirane 7 minuta na 900-1000 rpm. Supernatant je odbačen; ćelije su resuspendovane u medijumu za kulturu i zasejane u gustini od 2,5x105 ćelija/mL u flaskove od 175 cm2.
[0131] Ćelije iz flaskova sa kulturama koje su bile blizu konfluentnosti, ovojene su od podloge i međusobno razdvojene tretmanom sa tripsinom, kao što je prethodno opisano. Ćelije su zatim resuspendovane u medijumu za kulturu i izbrojane. Ćelijska suspenzija je dalje razblažena sa medijumom da bi se dobila gustina ćelija od oko 1×10<6>ćelija/mL, nakon čega je po 300 µL ćelijske suspenzije postavljano na apikalni odeljak svakog Transbunara (prečnika 6,5 mm, veličina pora 0,4 µm). U bazolateralni odeljak je stavljano po 600 µL medijuma za kulturu. Ploče su inkubirane na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2 u vazduhu, tokom 15-21 dana, uz promenu medijuma na svakih 48-72 sata.
[0132] Integritet svakog monosloja Caco-2 ćelija je ispitivan merenjem transepitelnog električnog otpora (TEER), kako pre eksperimenta, tako i na kraju vremena inkubacije. TEER, izražen u vidu oma × cm<2>, izmeren je u Transbunarima upotrebom Millicell-ERS uređaja (Millipore). Monosloje se smatrao dobro diferenciranim kada je vrednost TEER bila veća od 800 oma × cm<2>.
[0133] Integritet svakog monosloja Caco-2 ćelija je ispitivan na kraju vremena inkubacije, upotrebom Lucifer žute boje. Nakon eksperimenta, Transbunari su dva puta isprani sa puferom za transfer. U svaki apikalni odeljak je zatim raspoređeno po 200 µL Lucifer žutog u koncentraciji od 100 µM, u HBSS-u, dok je po 400 µL HBSS dodavano u bazolateralni odeljak. Transbunari su inkubirani na 37°C tokom 1 sata. Količina Lucifer žutog je kvantifikovana u bazolateralnom odeljku, na talasnoj dužini od 535 nm, u odnosu na standardnu krivu Lucifer žutog u istom fiziološkom rastvoru, upotrebom spektrofluorometra za mikroploče (EG & G WALLAC). Smatralo se da monosloj nije oštećen ukoliko je u bazolateralnom odeljku detektovano <1% Lucifer žutog.
Ispitivanje nespecifičnog vezivanja za transbunare bez ćelija
[0135] Nespecifično vezivanje i ponovna pojava jedinjenja su ispitivani u transbunarima bez ćelija. Jedinjenje I je ispitivano u koncentracijama od 1,5, 3 i 6 µM, u po dva transbunara bez ćelija (duplikati). Ispitivanje je vršno uz gradijent pH između apikalnog i bazolateralnog odeljka. Apikalni odeljak (donorski) je sadržavao pufer sa pH od 6,5 dok je bazolateralni odeljak (prijemni) sadržavao pufer čiji je pH iznosio 7,4. Vremena uzorkovanja su bila sledeća: 60 i 120 min za bazolateralni odeljak (prijemni) i 120 min za apikalni odeljak (donorski). Dobijeni uzorci su analizirani LC-MS postupakom, a praćeni su i jedinjenje I i jedinjenje II da bi se utvrdio procenat oporavka.
Procena stabilnosti jedinjenja I i jedinjenja II
[0136] Tokom analize, ispitivana je stabilnost i jedinjenja I i jedinjenja II. Ova jedinjenja su rastvarana u HBSS puferu (sa finalnom koncentraciom DMSO-a od 1%) u koncentracijama od 1,5, 3 i 6 μM. Alikvot svakog rastvora je uziman u nultom vremenu (t=0) da bi se utvrdile početne koncentracije jedinjenja. Rastvori su zatim inkubirani na 37°C tokom trajanja eksperimenta transporta. Alikvot svakog rastvora je uziman i na kraju eksperimenta (t=120) da bi se odredile finalne koncentracije jedinjenja I i jedinjenja II. Uzorci su analizirani LC-MS postupkom.
Procena dvosmerne propusnosti za jedinjenje I
[0137] Jedinjenje I je bilo rastvoreno u HBSS puferu (sa finalnom koncentraciom DMSO-a od 1%) u koncentracijama od 1,5, 3 i 6 uM. Svaka koncentracija/vreme uzorkovanja je ispitivano u po dva bunara (duplikatu). Test je izvođen uz gradijent pH: apikalni odeljak (sluzokoža) je bio sa pH 6,5, dok je pH bazolateralnog odeljka (serozni) iznosio pH 7,4.
[0138] Transport od apiklanog ka bazolateralnom odeljku (A→B, mukozni ka seroznom): po 200 µL svake koncentracije jedinjenja I je dodavano u apikalni odeljak, dok je po 400 µL HBSS dodavano u bazolateralni odeljak. Ploče su inkubirane na 37°C. Alikvot bazolateralnog odeljka je uziman nakon 60 i 120 min (t=60 i t=120). Alikvot apikalnog odeljka je uziman u početnom vremenu (t=0) i nakon 120 min. (t=120).
[0139] Transport od bazolateralnog ka apiklanom odeljku (B→A, serozni ka mukoznom): po 400 µL svake koncentracije jedinjenja I je dodavano u bazolateralni odeljak, dok je po 200 µL HBSS-a dodavano u apikalni odeljak. Ploče su inkubirane na 37°C. Alikvot apikalnog odeljka je uziman nakon 60 i 120 min (t=60 i t=120). Alikvot bazolateralnog odeljka je uziman u početnom vremenu (t=0) i nakon 120 min. (t=120). Svi uzorci su analizirani LC/MS postupkom, praćenjem jedinjenja I i pojave jedinjenja II.
Procena dvosmerne propusnosti za jedinjenje II
[0140] Jedinjenje II je bilo rastvoreno u HBSS puferu (sa finalnom koncentraciom DMSO-a od 1%) u koncentracijama od 1,5, 3 i 6 uM. Svaka koncentracija/vreme uzorkovanja je ispitivano u u po dva bunara (duplikatu). Test je izvođen uz gradijent pH: apikalni odeljak (sluzokoža) je bio sa pH 6,5, dok je pH bazolateralnog odeljka (serozni) iznosio pH 7,4.
[0141] Transport od apiklanog ka bazolateralnom odeljku (A→B, mukozni ka seroznom): po 200 µL svake koncentracije jedinjenja II je dodavano u apikalni odeljak, dok je po 400 µL HBSS dodavano u bazolateralni odeljak. Ploče su inkubirane na 37°C. Alikvot bazolateralnog odeljka je uziman nakon 60 i 120 min (t=60 i t=120). Alikvot apikalnog odeljka je uziman u početnom vremenu (t=0) i nakon 120 min. (t=120).
[0142] Transport od bazolateralnog ka apiklanom odeljku (B→A, serozni ka mukoznom): po 400 µL svake koncentracije jedinjenja II je dodavano u bazolateralni odeljak, dok je po 200 µL HBSS-a dodavano u apikalni odeljak. Ploče su inkubirane na 37°C. Alikvot apikalnog odeljka je uziman nakon 60 i 120 min (t=60 i t=120). Alikvot bazolateralnog odeljka je uziman u početnom vremenu (t=0) i nakon 120 min. (t=120). Svi uzorci su analizirani LC/MS postupkom, praćenjem jedinjenja II.
Inhibicija transporta od mukoznog ka seroznom za jedinjenje I putem supstrata za PepT1 (Gly-Sar)
[0143] Diferencirane ćelije su prethodno tretirane tokom 30 min. sa 10 mM Gly-Sar, da bi se blokirao aktivni transporter PepT1.
[0144] Jedinjenje I je je bilo rastvoreno u HBSS puferu (sa finalnom koncentraciom DMSO-a od 1%) u koncentracijama od 1,5, 3 i 6 uM. Svaka koncentracija/vreme uzorkovanja je ispitivano u u po dva bunara (duplikat). Test je izvođen uz gradijent pH: apikalni odeljak (sluzokoža) je bio sa pH 6,5, dok je pH bazolateralnog odeljka (serozni) iznosio pH 7,4.
[0145] Transport od apiklanog ka bazolateralnom odeljku (A→B, mukozni ka seroznom): po 200 µL svake koncentracije jedinjenja I je dodavano u apikalni odeljak, dok je po 400 µL HBSS dodavano u bazolateralni odeljak. Ploče su inkubirane na 37°C. Alikvot bazolateralnog odeljka je uziman nakon 60 i 120 min (t=60 i t=120). Alikvot apikalnog odeljka je uziman u početnom vremenu (t=0) i nakon 120 min. (t=120). Svi uzorci su analizirani LC/MS postupkom praćenjem jedinjenja I i izgleda jedinjenja II.
Analitička određivanja
[0146] Koncentracije jedinjenja II i jedinjenja I u uzorcima nakon inkubacije, određivane su postupkom tečne hromatografije visokih performansi/masenom spektrometrijom (LC/MS) opisanom u Dodatnom materijalu (odeljak 7.1) bez daljeg razblaživanja.
Rezultati
[0147] TEER vrednosti pre eksperimenta za monoslojeve Caco-2 ćelija koji su upotrebljavani, bile su opsega od 850 do 1160 Ω× cm<2>, što ukazuje na konfluentan monosloj sa čvrstim ćelijskim vezama. Na kraju eksperimenata, vrednosti TEER su bile smanjene, u proseku za 170 Ω × cm<2>(od 680 do 990 Ω × cm<2>) bez uticaja na integritet monosloja ćelije. Test sa Lucifer žutim je potvrdio integritet svih monoslojeva nakon eksperimenata, a zapravo je količina Lucifer žutog koja je detektovana u bazolateralnim odeljcima nakon eksperimenata u svim bunarima uvek iznosila <1%. Slika 55 prikazuje podatke dobijene u testu nespecifičnog vezivanja za jedinjenje I. U uslovima ispitivanja, pokazano je da je jedinjenje I pronađeno u apikalnom odeljku u svim ispitivanim dozama. Jedinjenje I nije detektovano u bazolateralnom odeljku ni u jednoj od ispitivanih doza. Nespecifično vezivanje jedinjenja I je isključeno. Jedinjenje II nije detektovano ni u jednom od odeljaka. Slika 55 prikazuje podatke dobijene u testu stabilnosti jedinjenja I i jedinjenja II. Pokazano je da su oba jedinjenja stabilna u uslovima ispitivanja: HBSS pufer (finalna koncentracija DMSO-a od 2%) na 37°C tokom 60 i 120 minuta. Slike 56a-56e prikazuju podatke dobijene u dvosmernom testu propusnosti za jedinjenje I. Ovo jedinjenje nije prošlo kroz ćelijski monosloj. U testu prolaska od apikalnog ka bazolateralnom odeljku, jedinjenje I nije detektovano u prijemnom odeljku ni nakon 60 ni nakon 120 minuta, dok su povećane koncentracije jedinjenja II detektovane na kraju eksperimenta u bazolateralnom odeljku. Procenat prolaska jedinjenja II je prikazan u tabeli. Na kraju eksperimenta transporta od apikalnog ka bazolateralnom odeljku, u apikalnom odeljku je utvrđeno nisko izdvajanje jedinjenja I, dok su detektovane povećane koncentracije jedinjenja II (visok oporavak). Povećana koncentracija jedinjenja II nakon 120 minuta u apikalnim odeljcima može biti objašnjena prisustvom van- i unutarćeliskih esteraza u Caco-2 ćeliji koja su u stanju da de-esterifikuju jedinjenja (Kern i saradnici, J. Agric. Food Chem.51: 7884-7891 (2003)). U analizi transporta od bazolateralnog ka apikalnom odeljku, jedinjenje I nije detektovano u prijemom odeljku, dok je detektovana niska koncentracija jedinjenja II. Prema tome, jedinjenje I se verovatno prenosi i transportuje kao jedinjenje II kroz Caco-2 monosloj. Slike 57a57e prikazuju podatke dobijene u dvosmernom testu permeabilnosti za jedinjenje II. Ovo jedinjenje je pokazalo dobar procenat prolaznosti od apikalnog ka bazolateralnom odeljku i nisku stopu permeabilnosti od bazolateralnog ka apikalnom odeljku. Izračunavan je i Papp, pošto je koncentracija u donorskim odljekcima bila poznata. Jedinjenje II je bilo sa dobrim pasivnim prolaskom kroz Caco-2 monosloj. Nije detektovan ni efluks. Slike 58a-58c prikazuju podatke dobijene u testu inhibicije, u kome je monosloj Caco-2 ćelija prethodno tretiran sa 10 mM Gly-Sar (da bi se zasitio PepT1 transporter). Jedinjenje I nije detektovano u prijemnom odeljku, dok je prolazak jedinjenja II zapažen. Procenat prolaska u ovom testu nije bio linearan.
Diskusija
[0148] U ovoj studiji je ispitano i isključeno nespecifično vezivanje jedinjenja I u sistemu za ispitivanje sa Caco-2 ćelijama (bez ćelija). Jedinjenje I je bilo stabilno u uslovima ispitivanja. Konverzija jedinjenja I u jedinjenje II je takođe ispitivana i potvrđena u dvosmernom testu permeabilnosti. Jedinjenje I nije prošlo kroz ćelijski monosloj u uslovima ispitivanja. Jedinjenje I se stoga verovatno prenosi i transportuje kao de-esterifikovano jedinjenje II kroz monosloj Caco-2 ćelija.
[0149] U dvosmernom testu permeabilnosti, jedinjenje II je pokazalo dobar pasivni prolaz kroz monosloj Caco-2 ćelija. Nisu pronađeni dokazi da bi jedinjenje II moglo biti supstrat za efluksni transporter.
[0150] Test sa Gly-Sar predtretmanom (da bi se zasitio PepT1 transporter) ukazao je da nema prolaska jedinjenja I, kao i na stopu prolaska jedinjenja II. Transport jedinjenja I preko monoslojeva Caco-2 ćelija verovatno nije posredovan sa PepT1.
[0151] Navedeni eksperimenti ukazuju da intestinalna apsorpcija jedinjenja I i njegovih soli nije posredovana transporterskim proteinom Pept1. Umesto toga, prethodno navedeni rezultati pokazuju da je jedinjenje I de-esterifikovano esterazama iz okoline u tankom crevu i da nakon toga pasivno prodire u epitel tankog creva. Da jedinjenje I i njegove soli nisu supstrati za Pept1 predstavlja iznenađujuću i farmakološki korisnu osobinu. Pept1 je kotransporter čija aktivnost zavisi od pH i za koga je poznato da posreduje u apsorpciji raznovrsnih valinatnih estara, kao što je opisano, na primer, u Vig i saradnici, Adv. Drug Deliv. Rev. 65:1370-1385 (2013). Pept1 ispoljava široku specifičnost za supstrate, o čemu svedoči strukturna raznolikost jedinjenja koja se ovim proteinom transportuju kroz crevni epitel. Neočekivano, uprkos prisustvu funkcionalne grupe valinatnog estra, apsorpcija jedinjenje I i njegovih soli kroz epitel tankog creva ne zavisi od ovog transportera. Navedeno je prednost, pošto Jedinjenje I i njegove soli time ne ulaze u kompeticiju sa prirodnim supstratima Pept1, kao što su peptidne hranljive materije, u vezivanju i transportu posredstvom ovog proteina. Umesto toga, jedinjenje I i njegove soli se in vivo prevode u oblik koji se lako apsorbuje na način koji je nezavisan od energije i lokalnog gradijenta protona. Ovakva neočekivana osobina, zajedno sa visokom rastvorljivošću jedinjenja I i njegovih soli u vodi, obezbeđuju povoljan farmakokinetički profil zahvaljujući kome se ovi terapeutici lako rastvaraju u vodenoj sredini i zauzvrat prevode u oblik koji je u stanju da se apsorbuje nezavisno od transportera.
Primer 5. Kombinovana terapija koja uključuje dodatni tokolitički agens
[0152] Jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, daju se subjektu, kao što je humani subjekat, u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih agenasa, kao što je antagonista oksitocinskog receptora, betamimetik, inhibitor kanala za kalcijum, so magnezijuma ili donor azot oksida, na primer, da bi se smanjila pojava kontrakcija materice i odložio početak porođaja.
[0153] Lekar sa iskustvom u oblasti tehnike može dati jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, istovremeno sa, kao smešu sa, ili odvojeno od antagoniste oksitocinskog receptora. Primeri antagonista oksitocinskog receptora za zajedničku upotrebu sa kompozicijama i postupcima pronalaska uključuju atosiban, retosiban, barusiban, epelsiban i nolasiban, ili njihovu varijantu, formulaciju, kristalni oblik ili derivat. Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati pre, nakon ili istovremeno sa nolasibanom, ili njegovom varijantom, formulacijom, kristalnim oblikom ili derivatom, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja).
[0154] Dodatno ili alternativno, lekar sa iskustvom u oblasti tehnike može dati jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, istovremeno sa, kao smešu sa, ili odvojeno od betamimetika, kao što je ovde opisan betamimetik. Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati pre, nakon ili istovremeno sa betamimetikom koji je ovde opisan ili poznat u oblasti tehnike, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja).
[0155] Dodatno ili alternativno, lekar sa iskustvom u oblasti tehnike može dati jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, istovremeno sa, kao smešu sa, ili odvojeno od inhibitora kanala za kalcijum, kao što je ovde opisan inhibitor kanala za kalcijum. Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati pre, nakon ili istovremeno sa inhibitorom kanala za kalcijum koji je ovde opisan ili poznat u oblasti tehnike, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja).
[0156] Dodatno ili alternativno, lekar sa iskustvom u ovoj oblasti tehnike može dati jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, istovremeno sa, kao smešu sa ili odvojeno od soli magnezijuma, kao što je magnezijum sulfat. Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati pre, nakon ili istovremeno sa magnezijum sulfatom, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja).
[0157] Dodatno ili alternativno, lekar sa iskustvom u oblasti tehnike može dati jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, istovremeno sa, kao smešu sa, ili odvojeno od donora azot oksida, kao što je nitroglicerin. Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati pre, nakon ili istovremeno sa nitroglicerinom, da bi se odložio početak porođaja kod subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja).
[0158] Dodatno ili alternativno, lekar sa iskustvom u oblasti tehnike može dati jedinjenje I ili njegovu so, kao što je jedinjenje III, istovremeno sa, kao smešu sa, ili odvojeno od progesterona ili njegovog derivata ili varijante, kao što je ovde opisan derivat ili varijanta ili su to oni koji su poznati u oblasti tehnike. Na primer, jedinjenje I ili njegova so, kao što je jedinjenje III, mogu biti dati pre, nakon ili istovremeno sa progesteronom ili njegovom varijantom ili derivatom koji su ovde opisani ili poznati u oblasti tehnike, da bi se odložio početak porođaja u subjekta, npr. za jedan ili više dana ili nedelja, kao što je za od oko 1 dana do oko 16 nedelja (npr. za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana, ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja).
Primer 6. Tokolitički efekti jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli u kombinaciji sa nifedipinom i atosibanom u mišjim modelima prevremenog porođaja
[0159] Da bi se istražili terapijski efekti jedinjenja I u kombinaciji sa blokatorom kanala za kalcijum ili antagonistom oksitocinskog receptora u životinjskim modelima prevremenog porođaja, primigravidni skotni CD-1 miševi su tretirani utvrđenim induktorima porođaja u ranom gestacijsko dobu od 17 dana, a naknadno su im davane razne doze hloridne soli jedinjenja I (jedinjenje III; 10 mg/kg, 30 mg/kg ili 100 mg/kg, pri čemu je svaka bila davana oralno) samostalno ili u kombinaciji sa nifedipinom (5 mg/kg, primenjenog oralno) ili atosibanom (300 mg/kg, primenjenog subkutano). Tokolitički efekti su procenjivani merenjem vremena od indukcije do rađanja prvog mladunca kod svakog miša u kohorti tretmana i kontrolnoj kohorti, vremena od indukcije do završetka porođaja među svim miševima u svakoj kohorti, kao i shodno vijabilnosti potomaka među miševima u svakoj kohorti. Induktori prevremenog porođaja upotrebljeni u ovoj studiji su bili RU486 (označen takođe kao mifepriston), steroidni antiprogestin koji pospešuje dilataciju grlića materice i izaziva povećanu kontraktilnost materice i osetljivost na prostaglandine, kao i lipopolisaharid (LPS), posrednik inflamacije.
[0160] Da bi se indukovao porođaj u ranoj gestacijskoj dobi, svakom mišu je subkutano davana jednokratna doza RU486, sa 2,5 mg/kg (t=0). Miševi tretirani LPS-om su primili jednokratnu intraperitonealnu injekciju LPS-a od 2 mg/kg (t=0). Atosiban je davan CD-1 miševima subkutanim injeciranjem u dozi od 300 mg/kg na dva različita mesta. Ove injekcije su davane 5. sata (t=5) i 29. sata (t=29) nakon tretmana sa indukujućim agensom RU486 ili LPS-om. Nifedipin je davan CD-1 miševima oralno, u dozi od 5 mg/kg, 5 sati (t=5), 19 sati (t=19), 29 sati (t=29) i 43 sata (t=43) nakon tretmana sa indukujućim agensom RU486 ili LPS-om. Jedinjenje III je davano CD-1 miševima oralno u dozi od 10 mg/kg, 30 mg/kg ili 100 mg/kg, 5 sati (t=5), 19 sati (t=19), 29 sati (t=29) i 43 sata (t=43) nakon tretmana sa indukujućim agensom RU486 ili LPS-om. Nakon indukcije sa RU486 ili LPS-om i naknadne primene atosibana, nifedipina i/ili jedinjenja III, kohorte miševa su bile predmet kontinuiranog vizuelnog praćenja da bi se utvrdilo vreme koje je proteklo između indukcije i rađanja prvog mladunca kod svakog miša, kao i proporcija miševa u svakoj kohorti kod koje je došlo do porođaja u funkciji vremena. Vijabilnost mladunaca rođenih u svakoj kohorti je analizirana galenskom hidrostatičkom plućnom dokimazom.
[0161] Potvrđena je sposobnost RU486 i LPS-a da indukuju prevremeni porođaj, pošto je rezultat tretmana CD-1 miševa sa RU486 u gestacijskom dobu od 17 dana predstavljalo srednje vremene porođaja od oko 21 sat nakon indukcije (t=21; izračunata srednja vrednost=21 ± 1,00 sati), dok je kod CD-1 miševa tretiranih LPS-om u gestacijskom dobu od 17 dana srednje vreme rađanja iznosilo oko 26 sati nakon indukcije (t=26; izračunata srednja vrednost=26 ± 2,34 sata). Nasuprot navedenom, porođaj u terminu se kod CD-1 miševa javlja u gestacijskom dobu od oko 19. dana do oko 21. dana, više od 50 sati nakon 17. dana gestacije. Među mladuncima rođenim od miševa tretiranih sa RU486, 96% je bilo rođeno živo, dok je kod miševa tretiranih LPS-om 48% mladunaca bilo rođeno živo (Slike 60 i 61). Od miševa tretiranih sa RU486, 3% je iskučeno iz ovog istraživanja usled smrti ili žrtvovanja tokom studije; 34% miševa tretiranih LPS-om je isključeno iz ove istrage usled smrti ili žrtvovanja tokom studije.
[0162] Tokom istraživanja, uočeno je da tretman samo sa nifedipinom izaziva značajno povećanje srednjeg vremena do porođaja u poređenju sa davanjem samog nosača (23,53 ± 0,99 sati u odnosu na 21,19 ± 1,00 sati; Slika 65) kod miševa tretiranih sa RU486. Samostalni tretman nifedipinom je dodatno pospešio povećanje vremena do porođaja i značajno je povećao frakcionu vijabilnost potomstva kod miševa tretiranih LPS-om u poređenju sa grupom kojoj je davan nosač (90,39% ± 5,34% u odnosu na 48,20% ± 16,45%; Slike 68 i 69). Na sličan način je i primena atosibana dovela do povećanja vremena do rađanja, kod miševa tretiranih LPS-om (Slika 70).
[0163] Utvrđeno je da jedinjenje III pospešuje povećanje vremena do rađanja u poređenju sa grupom koja je tretirana nosačem, kod miševa tretiranih sa RU486 (Slike 65 i 67). Preciznije, miševi tretirani sa RU486 kojima je oralno davano i jedinjenje III u dozi od 30 mg/kg i 100 mg/kg, ispoljili su povećanja u vremena do rađanja u odnosu na grupu tretiranu nosačem (p=0,0871 i p=0,0601, tim redom). Dodatno, rezultat primene jedinjenja III kod miševa tretiranih LPS-om je bio povećanje frakcione vijabilnosti potomaka u zavisnosti od doze (69,41% ± 15,76% vijabilnosti uočene kao odgovor na 100 mg/kg jedinjenja III u odnosu na 48,20% ± 16,45% što je zabeleženo kao odgovor na primenu nosača; Slika 68).
[0164] Rezultat kombinacije nifedipina i jedinjenja III je bio prevshodno izražen tokolitički efekat (Slike 65 i 69). Oralna primena nifedipina (5 mg/kg) i jedinjenja III (100 mg/kg) kod miševa tretiranih sa RU486 dovela je do jasnog sinergističkog efekta, pošto je ova kombinacija indukovala zanačajan porastu u vremenu do rađanja u odnosu na grupu tretiranu nosačem (27,91 ± 0,35 sati u odnosu na 21,19 ± 1,00 sati), grupu tretiranu istom dozom nifedipina samostalno (27,91 ± 0,35 sati u odnosu na 23,53 ± 0,99 sati) i istom dozom jedinjenja III samostalno (27,91 ± 0,35 sati u odnosu na 23,60 ± 0,60 sati). Dodatno, oralna primena nifedipina (5 mg/kg) i jedinjenja III (10 mg/kg) miševima tretiranim LPS-om dovela je do značajnog povećanja u vremenu do rađanja u odnosu na kohortu tretiranu samo sa 10 mg/kg jedinjenja III (31,01 ± 1,89 sati u odnosu na 23,98 ± 0,66 sati). Oralna primena 10 mg/kg jedinjenja III u kombinaciji sa 5 mg/kg nifedipina takođe je podstakla porast u vijabilnosti mladunaca rođenih od strane miševa tretiranih LPS-om u odnosu na miševe kojima je samo davana ista doza jedinjenja III (94,23% ± 3,68 % u odnosu na 57,90% ± 14,89%), kao i u odnosu na miševe kojima je primenjen samo nosač (94,23% ± 3,68% u odnosu na 48,20% ± 16,45%; Slika 68).
[0165] Kombinacija atosibana i jedinjenja III dodatno je pojačala tokolitički efekat svakog jedinjenja u odnosu na isti kada su upotrebljavani samostalno. Subkutana primena atosibana (300 mg/kg) i oralna primena jedinjenja III (100 mg/kg) kod miševa tretiranih LPS-om indukovala je značajno povećanje vremena do porođaja u odnosu na miševe kojima je davan samo nosač (33,23 ± 2,95 sati u odnosu na 26,17). ± 1,98 sati), kao i u odnosu na miševe kojima je davana ista doza samog atosibana (33,23 ± 2,95 sati u odnosu na 28,41 ± 2,99 sati; Slika 71). Ovu kombinaciju je takođe karakterisala sklonost ka povećanju frakcione vijabilnosti potomaka u poređenju sa miševima tretiranim samo nosačem, istom dozom samog atosibana ili istom dozom samog jedinjenja III (Slika 70).
[0166] Ova studija dalje ilustruje tokolitički efekat soli jedinjenja I kao antagoniste FP u dva jasno različita životinjska modela prevremenog porođaja i podržava upotrebu jedinjenja I i njegovih soli u lečenju i prevenciji prevremenog porođaja, bez obzira na biohemijsku etiologiju u osnovi. Ovo istraživanje stoga dodatno podržava upotrebu FP antagonista, kao što su jedinjenje I i njegove soli (npr. jedinjenje III) u kombinaciji sa svakim od antagonista kanala za kalcijum i antagonista oksitocinskog receptora, i primenu u prevenciji prevremenog porođaja. Upotreba jedinjenja III u kombinaciji sa svakim od nifedipina i atosibana značajno je premašila terapijske efekte pojedinačnih komponenti i prikazuje da jedinjenje I i njegove soli, kao što je jedinjenje III, mogu sinergistički delovati sa dodatnim tokolitičkim agensima.
Primer 7. Tokolitički efekti jedinjenja II u kombinaciji sa nifedipinom, atosibanom i nolasibanom u uzorcima tkiva ljudi
[0167] Da bi se istražili terapijski efekti jedinjenja II, aktivnog metabolita jedinjenja I i njegovih soli (kao što je jedinjenje III), u kombinaciji sa antagonistima oksitocinskog receptora i blokatorima kanala za kalcijum, biopsije miometrijuma su dobijane iz ženskih subjekata pre porođaja u terminu koji su podvrgavani porođaju carskim rezom. Jedan od ciljeva ovog istraživanja je bio i da se okarakterišu efekti jedinjenja II, primenjenog samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim tokolitičkim agensima, na učestalost, amplitudu pika i trajanje kontrakcija miometrijuma, kao i na rad obavljen po kontrakciji i dalje ukupan rad za sve od kontrakcija. Shodno cilju, eksperimenti su rađeni upotrebom DMT miografa 800 MS (ADINSTRUMENTS<™>) u oksigenovanom Krebovom rastvoru upotrebom kompjuterskog programa ADI Powerlab, što je olakšalo istovremeno merenje više mišićnih preparata paralelno.
[0168] Eksperimenti sa biopsijama miometrijuma su započeti tako što su dozvoljavane kontrakcije glatkih mišića, da bi se ustanovila bazalna vrednot tokom najmanje 20 minuta. Nakon ovog vremenskog perioda, zabeležena su bazalna merenja učestalosti spontanih kontrakcija, amplituda pika, trajanje, obavljeni rad po kontrakciji i ukupan rad izvršen od strane svih kontrakcija. Uzorci biopsije miometrijuma su zatim tretirani sa DMSO-om kao kontrolom, jedinjenjem II, atosibanom, nifedipinom, kombinacijom jedinjenja II i atosibana, ili kombinacijom jedinjenja II i nifedipina. Efekti ovih agenasa na učestalost, amplitudu i trajanje, kao i na rad pri kontrakcijama miometrijuma naknadno su mereni tokom narednog perioda od 10 minuta. Uzorci miometrijuma su zatim izlagani izazovu dodavanja rastućih koncentracija agensa koji stimuliše kontrakcije, kao što su to oksitocin, PGF2α ili PGE2, tokom uzastopnih intervala od po 10 minuta, a potom su izmereni učestalost kontrakcije, amplituda pika, trajanje, rad po kontrakciji i ukupan rad za sve kontracije. Svaki od oksitocina, PGF2α i PGE predstavlja različite modulatore kontraktilnosti materice i prevremenog porođaja. Oksitocin direktno indukuje kontrakciju miometrijuma materice i pojačava sintezu i oslobađanje kontraktilnih prostaglandina iz endometrijuma i decidue materice. Za oksitocin je takođe pokazano da je uključen u podsticanje proizvodnje prostaglandina u ćelijama miometrijuma čoveka, putem potencijacije ciklooksigenaze 2 (COX-2). Pokazalo se i da prostaglandini PGF2α i PGE2 indukuju promene na grliću materice i izazivaju kontraktilnost materice, dva ključna događaja u fiziologiji porođaja i rađanja. Aktivacija FP receptora u humanom miometrijumu sa PGF2α dovodi do povišenja koncentracije unutarćelijskog kalcijuma, što, zauzvrat, dovodi do kontrakcije glatkih mišićnih ćelija materice. Prema tome, drugi cilj ovog istraživanja je bio da se proceni sposobnost jedinjenja II da ublaži kontraktilnu aktivnost materice indukovanu sa tri jasno različita biohemijska modaliteta.
[0169] Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da je samostalno primenjeno jedinjenje II sposbno da suprimira kontraktilnost miometrijuma indukovanu i sa PGF2α i OT, na način koji zavisi od doze (Slike 72 i 73). Štaviše, trenutno je utvrđeno da jedinjenje II karakteriše iznenađujući sinergistički efekat na smanjenje kontraktilnosti miometrijuma kada se upotrebljava u kombinaciji sa antagonistom oksitocinskog receptora atosibanom (Slika 76) i blokatorom kanala za kalcijum nifedipinom (Slika 78). Iznenađujuće, doze jedinjenja II koje su ispoljile nižu potentnost prema smanjenju kontraktilnosti miometrijuma, kada su upotrebljavane u odsustvu dodatnog tokolitičkog agensa (kao što je 60 nM, Slike 72 i 73), karakterisalo je upadljivo povećanje inhibitorne aktivnosti u kombinaciji sa atosibanom (Slika 76) i nifedipinom (Slika 78). Slično navedenom, doze atosibana (6 nM, Slike 74 i 75) i nifedipina (6 nM, Slika 77) za koje je utvrđeno da su suboptimalne za smanjenje kontraktilnosti miometrijuma kada se upotrebljavaju u odsustvu jedinjenja II, karakterisalo je neočekivano povećanje antikontraktilne potencije prilikom kombinovanja sa jedinjenjem II (Slike 76 i 78). Ovi podaci pokazuju da je jedinjenje II u stanju da sinergistički deluje sa dodatnim tokolitičkim agensima, kao što su antagonisti oksitocinskog receptora i blokatori kanala za kalcijum, a da bi se suprimirala kontraktilna aktivnost materice koja može dovesti do prevremenog porođaja.
[0170] Pored supresije kontraktilnosti miometrijuma, tokolitički efekti jedinjenja II se takođe manifestuju u sposobnosti ovog agensa da umanji ekspresiju nishodnih proinflamatornih gena u biopsijama humanog miometrijuma i amniona (Slike 79 i 80). Imunoblot analize su rađene da bi se okarakterisala sposobnost jedinjenja II, primenjenog samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim tokolitičkim agensima, da moduliše ekspresiju raznih proteina u uzorcima miometrijuma i amniona koji su izolovani iz ženskih osoba pre porođaja u terminu, a koje će biti podvrgnute porođaju carskim rezom. Rezultati ovih studija pokazuju da je jedinjenje II u stanju da smanji ekspresiju raznih proinflamatornih proteina i da ispoljava iznenađujuće sinergističko dejstvo kada se upotrebljava u kombinaciji sa nolasibanom u cilju smanjenja ekspresije COX-2.
[0171] Sveukupno posmatrano, podaci dobijeni iz ovih eksperimenata pokazuju da je jedinjenje II u stanju da suprimira aktivnost glatkih mišića koja može dovesti do prevremenog porođaja, poput onog indukovanog različitim modulatorima kontraktilnosti materice. Štaviše, jedinjenje II ispoljava neočekivano sinergističko delovanje na ublažavanje kontrakcija materice kada se upotrebljava u kombinaciji sa antagonistima oksitocinskog receptora i blokatorima kanala za kalcijum. Ovakvo sinergističko delovanje se manifestuje i na nivou aktivnosti glatkih mišića i u smanjenju ekspresije proinflamatornih gena u biopsijama miometrijuma i amniona, i ukazuje na razne koristi davanja jedinjenja II u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih tokolitičkih agenasa subjektu kome je lečenje potrebno, kao što je subjekt kod koga je započeo ili postoji rizik prevremenog porođaja.

Claims (13)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje predstavljeno formulom (I)
  2. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje prikazano formulom (III)
  3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, što je jedinenje u kristalnom stanju. 4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3. 5. Postupak sinteze jedinjenje prikazanog formulom (I)
  4. ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, postupak obuhvata reagovanje prekursora prikazanog formulom (IV)
  5. sa prekursorom prikazanim formulom (V)
  6. da bi se obrazovao aminoestar, gde je X zaštitna grupa i što postupak dalje obuhvata skidanje zaštite sa aminoestra. 6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, što je jedinjenje prikazano formulom (III)
  7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije prevremenog porođaja kod subjekta, postupak obuhvata davanje subjektu terapeutski prihvatljive količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije.
  8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4 za upotrebu u postupku prevencije porođaja pre carskog reza kod subjekta, postupak obuhvata davanje subjektu terapeutski prihvatljive količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije.
  9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije dismenoreje kod subjekta, postupak obuhvata davanje subjektu terapeutski prihvatljive količine jedinjenja ili farmaceutske kompozicije.
  10. 10. Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 7-9, pri čemu je subjekat čovek.
  11. 11. Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 7-10, što je subjekat, naznačen time, što je gestacijske starosti od 14 nedelje do 34 nedelje.
  12. 12. Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 7-11, što postupak obuhvata oralno davanje jedinjenja ili farmaceutske kompozicije subjektu.
  13. 13. Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 7-11, što postupak obuhvata intravensko davanje jedinjenja ili farmaceutske kompozicije subjektu.
RS20220547A 2016-01-04 2017-01-04 L-valinat hidroksipropil tiazolidin karboksamidnog derivata, njegova so i njegov kristalni oblik RS63285B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662274674P 2016-01-04 2016-01-04
US14/987,586 US9447055B1 (en) 2016-01-04 2016-01-04 α-amino esters of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and salt form, crystal polymorph thereof
US201662395664P 2016-09-16 2016-09-16
US201662407918P 2016-10-13 2016-10-13
PCT/EP2017/050101 WO2017118641A1 (en) 2016-01-04 2017-01-04 L-valinate of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and salt form, crystal polymorph thereof
EP17700392.8A EP3400217B1 (en) 2016-01-04 2017-01-04 L-valinate of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative, its salt and crystal form thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63285B1 true RS63285B1 (sr) 2022-06-30

Family

ID=57799697

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220548A RS63286B1 (sr) 2016-01-04 2017-01-04 Istovremeno davanje alfa-amino estra hidroksipropiltiazolidin karboksamidnog derivata i tokolitičkog agensa
RS20220547A RS63285B1 (sr) 2016-01-04 2017-01-04 L-valinat hidroksipropil tiazolidin karboksamidnog derivata, njegova so i njegov kristalni oblik

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220548A RS63286B1 (sr) 2016-01-04 2017-01-04 Istovremeno davanje alfa-amino estra hidroksipropiltiazolidin karboksamidnog derivata i tokolitičkog agensa

Country Status (25)

Country Link
EP (4) EP3397622B1 (sr)
JP (6) JP6933322B2 (sr)
KR (3) KR20180100120A (sr)
CN (1) CN108779087A (sr)
AU (5) AU2017205670B2 (sr)
CA (2) CA3009573A1 (sr)
CY (2) CY1125223T1 (sr)
DK (2) DK3400217T3 (sr)
EA (1) EA036990B1 (sr)
ES (2) ES2915948T3 (sr)
HR (2) HRP20220673T1 (sr)
HU (2) HUE058872T2 (sr)
IL (5) IL318222A (sr)
LT (2) LT3400217T (sr)
MA (2) MA43549A (sr)
MX (3) MX379544B (sr)
PL (2) PL3397622T3 (sr)
PT (2) PT3400217T (sr)
RS (2) RS63286B1 (sr)
SG (4) SG10202009723PA (sr)
SI (2) SI3400217T1 (sr)
SM (2) SMT202200248T1 (sr)
UA (2) UA125377C2 (sr)
WO (2) WO2017118639A1 (sr)
ZA (1) ZA201903769B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6933322B2 (ja) * 2016-01-04 2021-09-08 メルク セローノ エス．エー． ヒドロキシプロピルチアゾリジンカルボキサミド誘導体のｌ−バリネート及びその塩形態、結晶多形
RU2711615C1 (ru) * 2019-09-12 2020-01-17 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" Способ лечения эндометриоза на основании экспериментальной модели у крыс
JP2022548314A (ja) * 2019-09-23 2022-11-17 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 妊娠を遷延させるためおよび月経または妊娠の合併症の処置の方法
US12426782B2 (en) 2020-11-06 2025-09-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and temporal alignment methods for evaluation of gestational age and time to delivery
CA3204921A1 (en) * 2020-12-11 2022-06-16 Elise A. Olsen Compositions and methods for inhibiting hair growth

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3835175A (en) 1971-03-15 1974-09-10 Research Corp 9-fluorenylmethanol haloformates, carbonates and thiocarbonates
US3839396A (en) 1971-07-15 1974-10-01 Shionogi & Co 9-lower alkyl-9-fluorenyl carbonates
US4108846A (en) 1977-02-01 1978-08-22 Hoffmann-La Roche Inc. Solid phase synthesis with base N alpha-protecting group cleavage
SE430885B (sv) 1980-03-24 1983-12-19 Ferring Ab Oxytocin-derivat
US4581167A (en) 1982-01-19 1986-04-08 Research Corporation Peptide synthesis and amino acid blocking agents
US4508657A (en) 1982-01-19 1985-04-02 Research Corporation Peptide synthesis and amino acid blocking agents
EP0112809B1 (en) 1982-12-21 1986-05-28 Ferring AB Vasotocin derivatives
US4460501A (en) 1983-08-30 1984-07-17 Research Corporation Process for the synthesis of peptides utilizing thioxanthylmethyloxycarbonyl dioxides
US5370135A (en) * 1993-10-13 1994-12-06 Biex, Inc. Use of estriol measurement to monitor tocolytic therapy
DE4434488A1 (de) * 1994-09-14 1996-03-21 Schering Ag Steroidester und -amide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Verwendung
SE9604341D0 (sv) 1996-11-26 1996-11-26 Ferring Bv Hepta-peptide oxytocin analogue
IN188411B (sr) * 1997-03-27 2002-09-21 Yuhan Corp
CN1444587A (zh) * 2000-05-30 2003-09-24 奥索-麦克尼尔药品公司 二氢吡啶软药及相关组合物和方法
GB0130677D0 (en) 2001-12-21 2002-02-06 Glaxo Group Ltd Medicaments and novel compounds
EP1480998B1 (en) 2002-02-27 2006-11-22 Ferring BV Intermediates and methods for making heptapeptide oxytocin analogues
KR20040095311A (ko) 2002-03-28 2004-11-12 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. 프로스타글란딘 ｆ 수용체의 모듈레이터로서의 티아졸리딘카르복사미드 유도체
GB0208785D0 (en) * 2002-04-17 2002-05-29 Medical Res Council Treatment methtods
US7521530B2 (en) * 2002-06-11 2009-04-21 Universite De Montreal Peptides and peptidomimetics useful for inhibiting the activity of prostaglandin F2α receptor
UA78058C2 (en) 2002-07-05 2007-02-15 Applied Research Systems Pyrrolidine derivative as oxitocin antagonists
RU2005121904A (ru) * 2002-12-12 2006-01-20 Айденикс (Кайман) Лимитед (Ky) Способ получения 2`-разветвленных нуклеозидов
GB0314738D0 (en) 2003-06-24 2003-07-30 Glaxo Group Ltd Novel compounds
GB0414093D0 (en) 2004-06-23 2004-07-28 Glaxo Group Ltd Novel compounds
JP2013509391A (ja) 2009-10-30 2013-03-14 グラクソ グループ リミテッド （３ｒ，６ｒ）−３−（２，３−ジヒドロ−１ｈ−インデン−２−イル）−１−［（１ｒ）−１−（２，６−ジメチル−３−ピリジニル）−２−（４−モルホリニル）−２−オキソエチル］−６−［（１ｓ）−１−メチルプロピル］−２，５−ピペラジンジオンの新規結晶性形態
EP2845850A1 (en) 2013-09-10 2015-03-11 ObsEva S.A. Pyrrolidine derivatives as oxytocin/vasopressin V1a receptors antagonists
EP2886107A1 (en) 2013-12-17 2015-06-24 ObsEva S.A. Oral formulations of pyrrolydine derivatives
CN106999497A (zh) * 2014-06-16 2017-08-01 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 用于治疗早产的瑞托西班
AU2015283133B2 (en) 2014-07-02 2019-05-16 ObsEva SA Crystalline (3Z,5S)-5-(hydroxymethyl)-1-[(2'-methyl-1,1'-biphenyl-4-yl)carbonyl]pyrrolidin-3-one O-methyloxime useful in methods of treating conditions related to the OT-R activity
ES2716862T3 (es) 2014-12-22 2019-06-17 Ferring Bv Terapia con antagonistas del receptor de oxitocina en la fase lútea para la implantación y embarazo en mujeres que se someten a tecnologías de reproducción asistida
JP6933322B2 (ja) 2016-01-04 2021-09-08 メルク セローノ エス．エー． ヒドロキシプロピルチアゾリジンカルボキサミド誘導体のｌ−バリネート及びその塩形態、結晶多形
US9447055B1 (en) * 2016-01-04 2016-09-20 Merck Serono S.A. α-amino esters of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and salt form, crystal polymorph thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017205670B2 (en) 2021-05-20
MA43580A (fr) 2021-05-26
CA3009573A1 (en) 2017-07-13
SI3397622T1 (sl) 2022-07-29
MX379544B (es) 2025-03-11
DK3400217T3 (da) 2022-06-07
IL260286A (en) 2018-07-31
IL260286B (en) 2022-02-01
CN108779087A (zh) 2018-11-09
SI3400217T1 (sl) 2022-07-29
PL3400217T3 (pl) 2022-07-04
IL259742B (en) 2021-08-31
EA036990B1 (ru) 2021-01-25
JP2019501897A (ja) 2019-01-24
EP4140988A1 (en) 2023-03-01
JP2019500351A (ja) 2019-01-10
LT3397622T (lt) 2022-06-27
HRP20220673T1 (hr) 2022-07-08
MX2018008157A (es) 2018-09-03
ES2915948T3 (es) 2022-06-27
EP3397622A1 (en) 2018-11-07
CA3009576A1 (en) 2017-07-13
JP2026000959A (ja) 2026-01-06
IL318222A (en) 2025-03-01
AU2021218009B2 (en) 2023-06-22
JP7377588B2 (ja) 2023-11-10
PL3397622T3 (pl) 2022-07-04
MX2022000154A (es) 2022-02-21
SG11201804594YA (en) 2018-06-28
KR20180100120A (ko) 2018-09-07
IL284912A (en) 2021-08-31
HUE058872T2 (hu) 2022-09-28
CY1125231T1 (el) 2025-03-28
MA43549A (fr) 2021-05-26
KR20180099708A (ko) 2018-09-05
EP3397622B1 (en) 2022-03-09
IL284912B (en) 2022-07-01
IL289256A (en) 2022-02-01
AU2021218003A1 (en) 2021-09-02
JP2024012376A (ja) 2024-01-30
SMT202200249T1 (it) 2022-07-21
WO2017118641A1 (en) 2017-07-13
LT3400217T (lt) 2022-06-27
UA125118C2 (uk) 2022-01-12
EA201891095A1 (ru) 2019-01-31
SG11201804789QA (en) 2018-07-30
JP2023002668A (ja) 2023-01-10
KR102795275B1 (ko) 2025-04-11
EP4144351A1 (en) 2023-03-08
DK3397622T3 (en) 2022-06-07
KR20250107965A (ko) 2025-07-14
ZA201903769B (en) 2023-03-29
ES2916835T3 (es) 2022-07-06
IL259742A (en) 2018-07-31
RS63286B1 (sr) 2022-06-30
JP7432284B2 (ja) 2024-02-16
AU2025256134A1 (en) 2025-11-13
AU2017205670A1 (en) 2018-08-16
AU2017205254A1 (en) 2018-08-16
PT3400217T (pt) 2022-06-15
WO2017118639A1 (en) 2017-07-13
UA125377C2 (uk) 2022-03-02
AU2017205254B2 (en) 2021-05-20
CY1125223T1 (el) 2025-03-28
HUE058871T2 (hu) 2022-09-28
JP6933322B2 (ja) 2021-09-08
JP2021178858A (ja) 2021-11-18
MX389261B (es) 2025-03-20
AU2021218009A1 (en) 2021-09-09
EP3400217B1 (en) 2022-03-09
SG10202009769WA (en) 2020-11-27
SMT202200248T1 (it) 2022-07-21
AU2023233151A1 (en) 2023-10-12
MX2018008304A (es) 2019-01-24
SG10202009723PA (en) 2020-11-27
PT3397622T (pt) 2022-06-15
HRP20220674T1 (hr) 2022-07-22
EP3400217A1 (en) 2018-11-14
JP7169573B2 (ja) 2022-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230321052A1 (en) Alpha-amino esters of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and salt form, crystal polymorph thereof
JP7432284B2 (ja) ヒドロキシプロピルチアゾリジンカルボキサミド誘導体のｌ－バリネート及びその塩形態、結晶多形
US20180201591A1 (en) Alpha-amino esters of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and salt form, crystal polymorph thereof
HK40088419A (en) Hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivatives as inhibitors of the prostaglandin f receptor
HK40089880A (en) L-valinate of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and salt form, crystal polymorph thereof
HK1262486A1 (en) L-valinate of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative, its salt and crystal form thereof
HK1262486B (en) L-valinate of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative, its salt and crystal form thereof
HK40000026A (en) Co-administration of alpha-amino ester of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and a tocolytic agent
HK40000026B (en) Co-administration of alpha-amino ester of hydroxypropylthiazolidine carboxamide derivative and a tocolytic agent
EA039545B1 (ru) Способы предотвращения преждевременных родов с помощью комбинации ингибитора pgf2 и токолитического агента