RS63298B1 - Egf(a) analozi sa supstituentima masnih kiselina - Google Patents

Egf(a) analozi sa supstituentima masnih kiselina

Info

Publication number
RS63298B1
RS63298B1 RS20220538A RSP20220538A RS63298B1 RS 63298 B1 RS63298 B1 RS 63298B1 RS 20220538 A RS20220538 A RS 20220538A RS P20220538 A RSP20220538 A RS P20220538A RS 63298 B1 RS63298 B1 RS 63298B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ethoxy
peptide
egf
amino
acetyl
Prior art date
Application number
RS20220538A
Other languages
English (en)
Inventor
Jianhe Chen
Jesper F Lau
János Tibor Kodra
Birgit Wieczorek
Lars Linderoth
Henning Thøgersen
Salka Elbøl Rasmussen
Patrick William Garibay
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of RS63298B1 publication Critical patent/RS63298B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na EGF(A) analoge i njihove derivate, tačnije na EGF(A) analoge peptida sa supstituentom masne kiseline.
STANJE TEHNIKE
Visok nivo LDL-C (holesterola koji prenosi lipoprotein male gustine) i dislipidemija su dobro poznati pokretači kardiovaskularnih bolesti.
Statini su odobreni za lečenje dislipidemije već 25 godina. Ova klasa je pokazala značajno i dosledno smanjenje kardiovaskularnih događaja sa prihvatljivim bezbednosnim profilom. Najprodavaniji statin, atorvastatin (Lipitor<TM>) je bio najprodavaniji lek na svetu svih vremena, sa više od 125 milijardi dolara prodaje od 1996. do 2012. godine.
Uprkos dostupnosti i širokoj upotrebi statina i drugih sredstava za snižavanje lipida, mnogi pacijenti ne dostižu ciljne nivoe LDL-C i ostaju pod visokim rizikom od razvoja kardiovaskularnih bolesti. PCSK9 (proproteinska konvertaza suptilizin/keksin tipa 9) pospešuje degradaciju LDL-R (LDL receptora) jetre, čime se smanjuje površinska ekspresija LDL-R u jetri i posledično uklanjanje LDL čestica. Nasuprot tome, blokiranje PCSK9 povećava klirens LDL-C kao i drugih aterogenih lipoproteina. Zaista, LDL receptori doprinose uklanjanju aterogenih lipoproteina koji nisu LDL, kao što su lipoproteini srednje gustine, i remnantnih čestica. Povećani klirens lipoproteina srednje gustine i remnantnih čestica može imati terapeutske prednosti osim onih koje obezbeđuje smanjenje LDL-a.
Statini povećavaju ekspresiju i LDL-R i PCSK9 preko SREBP2 faktora transkripcije. Povećana ekspresija PCSK9 može da umanji efekat statina na klirens LDL-C iz cirkulacije. Inhibiranjem vezivanja PCSK9 za LDL-R i na taj način sprečavanjem degradacije LDL-R, efikasnost statina je poboljšana. Uzeto zajedno, inhibicija PCSK9 nudi novi pristup upravljanju lipidima.
Dva anti-PCSK9 antitela, alirokumab/Praluent<®>i evolokumab/Repatha<®>, nedavno su odobrena za lečenje visokih nivoa LDL-C. Daju se supkutanim injekcijama od 1 ml svake dve nedelje. Međutim, primena ovog režima doziranja supkutano primenjenog leka, posebno za asimptomatsko stanje, može biti dovedena u pitanje.
EGF(A) (domen A sličan epidermalnom faktoru rasta) sekvenca (40 amino-kiselina) LDL-R (LDL-R-(293-332)) je dobro prepoznata kao mesto za vezivanje PCSK9. Pokazalo se da izolovani EGF(A) peptid divljeg tipa inhibira vezivanje PCSK9 za LDL-R sa IC50u niskom µM opsegu (Biochemical and Biophysical Research Communications 375 (2008) 69–73). Ova slaba potencija će sprečiti praktičnu farmaceutsku upotrebu EGF(A) peptida. Štaviše, očekuje se da je poluživot takvih peptida suviše kratak da bi bio od terapijske upotrebe.
WO2012177741 i J. Mol. Biol. (2012) 422, 685-696 stavljaju na uvid javnosti analoge EGF(A) i njihove Fc-fuzije.
Još uvek postoji potreba da se poboljša tretman pacijenata, na primer, u smislu efikasnosti, takođe ili alternativno u smislu pogodnosti, udobnosti za pacijente, kao što su udobnost i pogodnost načina davanja, a samim tim i primena.
KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na nova EGF(A) jedinjenja koja imaju potencijal za poboljšane tretmane pacijenata, posebno u oblasti snižavanja holesterola, dislipidemije i kardiovaskularnih bolesti.
Pronalazak se u jednom aspektu odnosi na EGF(A) derivate koji sadrže analog EGF(A) peptida koji sadrži 301Leu i supstituent koji sadrži najmanje jednu grupu masnih kiselina, pri čemu analog EGF(A) peptida ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO:1 i pri čemu derivat ima Ki ispod 5 nM kada se meri u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R ovde opisanom u odeljku D1.1.
Pronalazak ovim obezbeđuje jedinjenja sa poboljšanim farmakokinetičkim (PK) svojstvima. Posebno, jedinjenja pronalaska imaju dug poluživot i još uvek pokazuju dobru sposobnost da inhibiraju PCSK9 u vezivanju za LDL-R.
U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa poboljšanom sposobnošću da inhibiraju vezivanje PCSK9 za LDL-R. U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje jedinjenja sa poboljšanim kapacitetom vezivanja za PCSK9. U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa produženim poluživotom. U jednoj realizaciji pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa produženim poluživotom i bez gubitka ili bez značajnog gubitka sposobnosti da inhibiraju vezivanje PCSK9 za LDL-R. U jednoj realizaciji pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa produženim poluživotom i očuvanim kapacitetom vezivanja. U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa visokom tečnom stabilnošću pogodnom za tečne formulacije. U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa visokom in vivo stabilnošću. U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje jedinjenja sa potencijalom za oralnu primenu. U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje EGF(A) jedinjenja sa potencijalom za pogodniji tretman za pacijenta. U jednoj realizaciji pronalazak obezbeđuje jedinjenja sa potencijalom za poboljšanu primenu kod pacijenata. Pronalazak, takođe, može da reši dalje probleme koji će biti očigledni iz stavljanja na uvid primera realizacije.
Pronalazak se odnosi na jedinjenje koje sadrži EGF(A) peptidni analog EGF(A) peptida definisan sekvencom SEQ ID NO: 1: Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-AlaGln-Arg-Arg-Cys-Glu, pri čemu peptidni analog sadrži 301Leu. Pronalazak se odnosi na derivat EGF(A) koji sadrži analog EGF(A) peptida koji sadrži 301Leu i najmanje jedan supstituent koji sadrži najmanje jednu grupu masnih kiselina.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) sadrži analog EGF(A) peptida gde je, kao što je gore opisano, amino-kiselina 301 Leu (L), dok peptid dalje sadrži ostatak(e) divljeg tipa na jednoj ili više pozicija 295 (Asn/N), 296 (Glu/E), 298 (Leu/L), 302 (Gly/G) i 310 (Asp/D).
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida derivata EGF(A) ima 1-15 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO.: 1.
U još jednoj realizaciji, supstituent derivata EGF(A) nije vezan za analog EGF(A) peptida preko aminokiselinskog ostatka na bilo kojoj poziciji 295, 298, 301, 302, 307 i 310.
U još jednoj realizaciji, supstituent je vezan za analog EGF(A) peptida preko aminokiselinskog ostatka koji nije na pozicijama 295, 298, 301, 302, 307 i 310.
U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na analog EGF(A) peptida koji ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO 1, pri čemu analog EGF (A) peptida sadrži 301Leu i 310Asp i pri čemu peptid nema supstituciju 299Asp na Glu, Val ili His i pri čemu analog ima Ki ispod 5 nM kada se meri u u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R kao što je opisano u odeljku D1.1.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na analog EGF(A) peptida koji ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO 1, pri čemu analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu, 310Asp i aminokiselinsku supstituciju 312Lis i pri čemu analog ima Ki ispod 5 nM kada se meri u PCSK9-LDL-R kompetitivnom ELISA testu kao što je ovde opisano u odeljku D1.1.
U daljim realizacijama, analozi EGF(A) peptida imaju jedan, dva, tri, četiri ili svih pet od sledećih aminokiselinskih ostataka (divljeg tipa) 295Asn, 296Glu, 298Leu, 302Gli i 310Asp/D).
U još jednoj realizaciji pomenuti peptidni analog sadrži tri disulfidna mosta na pozicijama 297Cys-308Cys, 304Cys-317Cys and 319Cys-331Cys.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenje prema pronalasku za upotrebu kao lek.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na medicinsku upotrebu jedinjenja prema pronalasku.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1 prikazuje nivoe ekspresije LDL-R u jetri kod miševa merene Vestern Blotom, predstavljene kao dijagram rasejanja za pojedinačne životinje.
Slika 2 prikazuje LDL holesterol u plazmi kod hrčaka tretiranih nosačem ili produženim EGF(A) jedinjenjima iz primera 2.
Slika 3 prikazuje ekspresiju LDL-R u jetri, u jetri hrčaka tretiranih nosačem ili produženim EGF(A) jedinjenjima iz primera 2 mereno Vestern Blotom.
KRATAK OPIS LISTINGA SEKVENCI
Aminokiselinska sekvenca divljeg tipa EGF(A) (LDL-R(293-332)) je uključena u listing sekvenci kao SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2-78 su amino-kiselinske sekvence EGF( A) peptidi specifičnih EGF(A) jedinjenja pronalaska.
OPIS
U daljem tekstu grčka slova mogu biti predstavljena njihovim simbolom ili odgovarajućim pisanim imenom, na primer: α = alfa; β = beta; ε = epsilon; γ = gama; δ = delta; ω = omega; itd. Takođe, grčko slovo μ može biti predstavljeno sa „u“, npr. u μl = ul, ili u μM = uM.
U daljem tekstu „a“ (u engleskoj verziji teksta) znači „jedan ili više“. Ako nije drugačije naznačeno u specifikaciji, izrazi predstavlјeni u obliku jednine takođe uklјučuju situaciju u množini.
Zvezdica (*) u hemijskoj formuli označava i) tačku vezivanja, ii) radikal i/ili iii) nedeljeni elektron.
Strukturne karakteristike
EGF(A) jedinjenje
Izraz „EGF(A) jedinjenje” se ovde koristi da se uopšteno označi jedinjenje koje sadrži EGF(A) peptid, obuhvatajući wt-LDL-R(293-332) kao što je definisano u SEQ ID NO: 1 i njegove analoge. Izraz EGF(A) jedinjenje obuhvata derivate EGF(A) peptida i njegov analog, tj. analog EGF(A) peptida sa supstituentom kako je ovde opisano je tipičan primer EGF(A) jedinjenja.
EGF(A) peptidi
Izraz „peptid”, kako npr. koristi u kontekstu pronalaska, odnosi se na jedinjenje koje sadrži niz amino-kiselina međusobno povezanih amidnim (ili peptidnim) vezama. U posebnoj realizaciji, peptid se sastoji od amino-kiselina međusobno povezanih peptidnim vezama.
Peptid pronalaska sadrži najmanje 35, kao što je 36, 37, 38, 39 ili najmanje 40 aminokiselina. U posebnoj realizaciji peptid se sastoji od 36, kao što je 38 ili 40 amino-kiselina. U dodatnoj posebnoj realizaciji, peptid se sastoji od 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 amino-kiselina.
U prisustvu adicija amino-kiselina, koji se ovde pominju kao elongacije N-kraja i C-kraja, peptid pronalaska može da sadrži do 140 amino-kiselina. U jednoj realizaciji, peptid pronalaska može da sadrži ili se sastoji od 41 aminokiselinskog ostatka. U posebnoj realizaciji, on sadrži 40-140, 40-120, 40-100, 40-80, 40-60 ili 40-50 amino-kiselina.
Izrazi „EGF(A) domen LDL-R”, „LDL-R (293-332)”, „nativni LDL-R (293-332), „EGF(A) (293-332)”, „divlji tip EGF(A)”, „wt-EGF(A)” ili „nativni EGF(A)” kako se ovde koriste odnose se na peptid koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1 je:
Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu.
U ovoj formuli numerisanje aminokiselinskih ostataka sledi numerisanje za EGF(A) domen LDL-R (LDL-R-(293-332)), pri čemu je prvi (N-terminalni) aminokiselinski ostatak numerisan ili mu je dodeljena pozicija br.293, a naredni aminokiselinski ostaci prema C-kraju su označeni brojevima 294, 295, 296 i tako dalje, sve do poslednjeg (C-terminalnog) aminokiselinskog ostatka, koji je u EGF(A) domenu LDL-R Glu sa brojem 332.
Numerisanje se vrši drugačije u listingu sekvenci, gde je prvom aminokiselinskom ostatku SEQ ID NO: 1 (Gly) dodeljen br.1, a poslednjem (Glu) br. 40. Isto važi i za druge sekvence liste sekvenci, tj. N-terminalnoj amino-kiselini dodeljen je br.1, bez obzira na njeno pozicioniranje u odnosu na 293Gly ili 293 supstituišući aminokiselinski ostatak pozivajući se na LDL-R(293-332). Međutim, ovde se numerisanje pozicija amino-kiselina odnosi na LDL-R(293-332), kao što je gore objašnjeno.
Ovde su otkriveni analozi EGF(A) peptida identifikovanog sa SEQ ID NO:1 i derivati takvih analoga EGF(A) peptida divljeg tipa EGF(A) domena LDLR definisanog SEQ ID NO: 1.
Izraz „analog” se generalno odnosi na peptid, čija sekvenca ima jednu ili više izmena amino-kiselina u poređenju sa referentnom sekvencom amino-kiselina.
Izrazi „analog pronalaska”, „peptidni analog pronalaska”, „analog LDL-R(293-332)”, „analog EGF(A)” ili „analog SEQ ID NO: 1” kako se ovde koriste mogu se nazivati peptidom, čija sekvenca obuhvata supstitucije amino-kiselina, tj. zamenu amino-kiselina, u odnosu na sekvencu SEQ ID NO: 1. „Analog” takođe može uključivati elongacije amino-kiselina na N-terminalnoj i/ili C- terminalnoj poziciji i/ili skraćivanja u N-terminalnim i/ili C-terminalnim pozicijama.
Nivo identičnosti sa SEQ ID NO.:1 može se izračunati određivanjem broja aminokiselina koje nisu promenjene u odnosu na SEQ ID NO.1. SEQ ID NO: 1 se sastoji od 40 aminokiselinskih ostataka i ako se uvedu tri aminokiselinske supstitucije, nivo identičnosti je 37/40%=92,5 %. Ako se promeni 5 aminokiselinskih ostataka, nivo identičnosti je 87,5 %. Ako je peptid sa elongacijom na N-kraju ili C-kraju, taj deo obično nije uključen u poređenje, dok brisanje jedne ili više amino-kiselina skraćuje komparator. Na primer, u gornjim primerima, ako se N-terminalna amino-kiselina izbriše, nivo identičnosti je blago smanjen na 36/39X100% i 34/39X100%, respektivno. Kada se diskutuje o identičnosti osnovne sekvence derivata, aminokiselinski ostatak supstituenta, npr. ostatak za koji je vezan supstituent, takođe nazvan aminokiselinski ostatak supstituenta, može biti ili divlji tip (wt) ili supstituisana amino-kiselina. Ako je amino-kiselinski ostatak supstituenta ostatak divljeg tipa, kao što je N-terminalni Gly ili 312K, ovaj ostatak je uključen u izračunavanje nivoa identičnosti, dok bi Lys na bilo kojoj drugoj poziciji od 293 do 332 bila aminokiselinska supstitucija i ne bi bila uključena pri izraćunavanju identičnosti amino-kiseline u SEQ ID NO.:1.
U jednoj realizaciji analog EGF(A) peptida ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO.: 1, kao što su 1-7, 1-6, 1-5 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa SEQ ID NO.: 1. U posebnoj realizaciji, do 7 supstitucija amino-kiselina može biti prisutno, na primer do 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino-kiselinska supstitucija može biti prisutna u analogu EGF-1 peptida.
U jednoj realizaciji, analog pronalaska ima najmanje 75% identičnosti, kao što je 80%, kao što je 85, kao što je 90 ili čak 95% identičnosti sa SEQ ID NO.:1 što odgovara do 10, 8, 6, 4 i 2 aminokiselinske supstitucije u odnosu na SEQ ID NO 1, respektivno u slučaju da nema skraćenja.
Svaki od peptidnih analoga pronalaska može se opisati pozivanjem na i) broj aminokiselinskog ostatka u prirodnom EGF(A) (LDL-R(293-332)) koji odgovara aminokiselinskom ostatku koji je izmenjen (tj. odgovarajuća pozicija u prirodnom LDL-R(293-332) EGF(A)), i ii) stvarnu izmenu.
Drugim rečima, peptidni analozi pronalaska se mogu opisati pozivanjem na prirodni LDL-R(293-332) EGF(A) peptid, naime kao njegova varijanta u kojoj je broj aminokiselinskih ostataka promenjen kada se uporedi sa nativnim LDL-R(293-332) EGF(A) (SEQ ID NO: 1). Ove promene mogu predstavljati, nezavisno, jednu ili više supstitucija amino-kiselina.
Sledeći su neograničavajući primeri odgovarajuće analogne nomenklature:
EGF(A) peptid ugrađen u derivat Primera 2 ovde se može nazvati sledećim LDL-R(293-332) EGF(A) analogom: (301Leu, 309Arg) LDL-R(293-332) EGF(A) ili (Leu301, Arg309)-LDL-R(293-332) EGF(A) ili (301L,309R) LDL-R(293-332) ili (L301,R309) LDL-R(293-332). To znači da kada je ovaj analog poravnat sa nativnim LDL-R(293-332), on ima i) Leu na poziciji u analogu koja odgovara, u skladu sa poravnanjem, poziciji 301 u prirodnom LDL-R(293-332) EGF(A), ii) Arg na poziciji u analogu koja odgovara poziciji 309 u prirodnom LDL-R(293-332) EGF(A).
Analozi koji „sadrže” određene specificirane promene mogu da dalje sadrže izmene, u poređenju sa SEQ ID NO: 1.
U posebnoj realizaciji, analog „ima” ili „sadrži” navedene izmene. U posebnoj realizaciji, analog se „sastoji od” izmena. Kada se izraz „sastoji” ili „koji se sastoji od” koristi u odnosu na analog npr. analog se sastoji ili koji se sastoji od grupe specificiranih aminokiselinskih supstitucija, treba razumeti da su specificirane aminokiselinske supstitucije jedine aminokiselinske supstitucije u analogu peptida. Nasuprot tome, analog „koji sadrži” grupu specificiranih supstitucija amino-kiselina može imati dodatne supstitucije.
Kao što je očigledno iz gornjih primera, aminokiselinski ostaci se mogu identifikovati njihovim punim imenom, njihovim kodom od jednog slova i/ili njihovim troslovnim kodom. Ova tri načina su potpuno jednaka.
Izrazi „pozicija ekvivalentna” ili „odgovarajuća pozicija” mogu se koristiti za karakterizaciju mesta izmene u varijanti LDL-R(293-332) EGF(A) sekvence pozivajući se na referentnu sekvencu nativnog LDL-R(293-332) EGF(A) (SEQ ID NO: 1). Ekvivalentne ili odgovarajuće pozicije, kao i broj izmena, lako se izvode, npr. jednostavnim rukopisom i pregledom pogledom; i/ili se može koristiti standardni program za poravnanje proteina ili peptida, kao što je „poravnanje” koji je zasnovan na Nidlman-Vunš algoritmu.
U onome što sledi, može se desiti da se hemijska formula definiše tako da dve uzastopne hemijske grupe mogu biti obe izabrane da budu „veza”. U takvim slučajevima, dve uzastopne hemijske grupe bi zapravo bile odsutne, a samo jedna veza bi povezivala okolne hemijske grupe.
Amino-kiseline su molekuli koji sadrže amino grupu i grupu karboksilne kiseline i, opciono, jednu ili više dodatnih grupa, koje se često nazivaju bočnim lancem.
Izraz „amino-kiselina” uključuje proteinogene (ili prirodne) amino-kiseline (među onih 20 standardnih amino-kiselina), kao i neproteinogene (ili neprirodne) amino-kiseline. Proteinogene amino-kiseline su one koje su prirodno ugrađene u proteine. Standardne amino-kiseline su one kodirane genetskim kodom. Neproteinogene amino-kiseline se ili ne nalaze u proteinima, ili ih ne proizvode standardna ćelijska aparatura (npr., možda su bile podvrgnute post-translacionoj modifikaciji). Neograničavajući primeri neproteinogenih amino-kiselina su Aib ( αaminoizobuterna kiselina ili 2-aminoizobuterna kiselina), norleucin, norvalin kao i D-izomeri proteinogenih amino-kiselina.
U daljem tekstu, svaka amino-kiselina peptida pronalaska za koju optički izomer nije naveden treba podrazumeti kao L-izomer (osim ako nije drugačije naznačeno).
Analozi peptida
Analozi peptida su definisani kao peptidi koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je analog SEQ ID NO: 1. Analozi peptida imaju sposobnost da se vežu za PCSK9 i imaju poboljšanu sposobnost vezivanja za PCSK9, na primer u poređenju sa prirodnim LDL- R(293-332) (nativni EGF-(A)) ili drugim jedinjenjima koja vezuju PCSK9. Analozi peptida dalje imaju sposobnost da inhibiraju vezivanje PCSK9 za LDL-R. Analozi peptida inhibiraju vezivanje PCSK9 za humani receptor lipoproteina niske gustine (LDL-R) i takvo vezivanje se može proceniti korišćenjem testa ovde opisanog u Primeru D.1.1.
Aspekt pronalaska se odnosi na analog EGF(A) peptida koji ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO 1, pri čemu je EGF( A) analog peptida koji sadrži 301Leu i 310Asp i pri čemu peptid nema supstituciju 299Asp na Glu, Val ili His i pri čemu analog ima Ki ispod 5 nM kada se meri u PCSK9-LDL-R kompetitivnom ELISA testu kao što je opisano u ovde odeljku D1.1.
Aspekt pronalaska se odnosi na analog EGF(A) peptida koji ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO 1, pri čemu je EGF(A) analog peptida sadrži 301Leu, 310Asp i aminokiselinsku supstituciju 312Lys i pri čemu analog ima Ki ispod 5 nM kada se meri u PCSK9-LDL-R kompetitivnom ELISA testu kao što je ovde opisano u odeljku D1.1.
U jednom aspektu, analozi peptida i derivati peptida pronalaska su peptidi inhibitori PCSK9 ili jednostavno PCSK9 inhibitori. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na peptidni analog SEQ ID NO.:1, gde je peptidni analog sposoban da inhibira vezivanje PCSK9 za humani receptor lipoproteina niske gustine (LDL-R).
U jednom aspektu, analozi peptida, jedinjenja ili PCSK9 inhibitori pronalaska imaju poboljšanu sposobnost vezivanja PCSK9 u poređenju sa EGF(A), LDL-R(293-332) (SEQ ID 1).
U jednom aspektu, peptidni analozi, jedinjenja ili PCSK9 inhibitori pronalaska imaju poboljšanu sposobnost vezivanja PCSK9 u poređenju sa Ex.48 (SEQ ID 2).
U jednom aspektu, Kianaloga peptida, jedinjenja ili PCSK9 inhibitora kao što je ovde opisano, kao što je izmereno u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R je ispod 10 nM, kao što je ispod 8 nM ili kao ispod 5 nM.
Funkcionalnost EGF-(A) analoga i derivata može se dalje okarakterisati njihovom sposobnošću da poboljšaju unos LDL, kao što je opisano u Primeru D1.2 ovde. U jednom aspektu, peptidni analozi, jedinjenja ili PCSK9 inhibitori pronalaska povećavaju unos LDL u prisustvu PCSK9. U jednom aspektu, peptidni analozi, jedinjenja ili PCSK9 inhibitori pronalaska su sposobni da preokrenu ili smanje PCSK9 posredovano smanjenje unosa LDL.
U jednoj realizaciji, analozi peptida, jedinjenja ili PCSK9 inhibitori pronalaska imaju EC50 izmeren u testu unosa LDL ispod 1500 nM, kao što je ispod 1000 nM ili ispod 500 nM.
U jednoj realizaciji, analog peptida pronalaska može se definisati tako da sadrži najmanje 1 supstituciju amino-kiseline u poređenju sa SEQ ID NO: 1, i opciono elongaciju. U jednoj realizaciji, analog peptida pronalaska može da se definiše kao da sadrži do 15, do 14, do 13, do 12, do 11, do 10, do 9, do 8, do 7 do 6, do 5, do 4, do 3, do 2 ili 1 supstitucije aminokiseline u poređenju sa SEQ ID NO: 1, i opciono elongaciju. To znači da peptid koji sadrži elongaciju na N-kraju i/ili u C-kraju može da sadrži do 15 aminokiselinskih supstitucija na pozicijama od 293 do 332 pored date elongacije.
„Elongacija” amino-kiselina se, takođe, može nazvati „produženjem”. U jednoj realizaciji, analozi peptida pronalaska sadrže elongaciju. Data elongacija može biti dodavanje do 50 aminokiselinskih ostataka na poziciji N-kraja SEQ ID NO: 1 ili njenog analoga, koje se takođe naziva N-terminalna elongacija, što znači da peptid pronalaska može sadržati do 50 amino-kiselina od pozicije 292 do, na primer, pozicije 242. Dodatno ili alternativno, dato produženje može biti dodavanje do 50 aminokiselinskih ostataka na poziciji C-kraja SEQ ID NO: 1 ili njenog analoga, koje se takođe naziva C-terminalna elongacija, što znači da peptid pronalaska može da sadrži do 50 amino-kiselina od pozicije 333 do, na primer, pozicije 383.
Data elongacija može biti prisutna na N-kraju, na C-kraju ili na oba. Data elongacija, takođe, može biti bilo koje dužine između 0 i 50 amino-kiselina na svakoj strani, nezavisno jedna od druge. U jednoj realizaciji, analozi peptida pronalaska sadrže N-terminalnu elongaciju od 1-50, 1-40, 10-40, 1-30, 10-30, 20-30, 20-40, 20-50, 30-50, 1-10, 11-20, 21-30, 31-40 ili 41-50 aminokiselinskih ostataka ili od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 aminokiselinskih ostataka. Dodatno ili alternativno, analozi peptida pronalaska mogu sadržati C-terminalnu elongaciju od 1-50, 1-40, 10-40, 1-30, 10-30, 20-30, 20-40, 20-50, 30-50, 1-10, 11-20, 21-30, 31-40 ili 41-50 aminokiselinskih ostataka ili od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 amino-kiselinskih ostataka.
Elongacija se u pojedinim situacijama može odnositi na supstituciju pošto se uvodi novi aminokiselinski ostatak, kao što su 292A, 292Lys ili 333Lys prikazani ovde.
Manja skraćenja na N-terminalnom i/ili C-terminalnom delu EGF(A) peptida mogu biti prisutna u analogu EGF(A) peptida.
U jednoj realizaciji, EGF(A) peptid sadrži najmanje 35 aminokiselinskih ostataka, kao što je 36 aminokiselinskih ostataka, kao što je 37 aminokiselinskih ostataka, kao što je 38 aminokiselinskih ostataka ili kao što je 39 aminokiselinskih ostataka. U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida u skladu sa tim sadrži N-terminalno skraćenje od 1-2 aminokiselinskih ostataka. U jednoj realizaciji jedan ili dva N-terminalna aminokiselinska ostatka su izbrisana. U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida shodno tome sadrži skraćenje N-kraja koje briše najmanje ili specifično amino-kiselinu 293Gly.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida obuhvata skraćenje N-terminala koje briše najmanje ili specifično 293Gly-294Thr.
U jednoj realizaciji analog EGF(A) peptida sadrži C-terminalni skraćenje od 1 aminokiselinskog ostatka. U jednoj realizaciji, jedan C-terminalni aminokiselinski ostatak je obrisan. U jednoj realizaciji analog peptida sadrži C-terminalno skraćenje koje briše specifično amino-kiselinu 332Glu.
1
Dodatno ili alternativno, peptidni analog pronalaska može da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku elongaciju na N-kraju ili C-kraju, na primer na poziciji 292 i/ili 333.
Analog EGF(A) peptida pronalaska obuhvata aminokiselinsku supstituciju aminokiselinskog ostatka 301 od Asn do Leu, takođe opisanu sa Asn301Leu ili jednostavno 301Leu. U specifičnoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži supstituciju 301Leu.
Dodatno ili alternativno, analog EGF(A) peptida sadrži aminokiselinske ostatke 297Cys, 304Cys, 308Cys, 317Cys, 319Cys i 331Cys. Ovi Cys ostaci su ostaci divljeg tipa koji mogu biti uključeni u disulfidne mostove, kao što su disulfidni mostovi između 297Cys i 308Cys, između 304Cys i 317Cys i između 319Cys i 331Cys.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu i niz daljih supstitucija aminokiselina, kao što je gore opisano.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu, 310Asp i aminokiselinsku supstituciju 312Lis.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu i 310Asp i pri čemu analog peptida nema supstituciju 299Asp za Glu, Val ili His.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu, 309Arg i 312Glu.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu i 309Arg uz uslov da analog peptida nema supstituciju 310Asp na 310Lys ili
U jednoj realizaciji, EGF(A) peptidni analog sadrži 301Leu i 309Arg uz uslov da analog peptida nema supstituciju 299Asp za Glu, Val ili His.
U još jednoj realizaciji, analog peptida nema nijednu od supstitucija D310K, D310N, D310Q, D310Q, D310R i D310A ili čak bilo koju supstituciju 310Asp.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri ostatka divljeg tipa: 295Asn, 296Glu, 298Leu i 302Gly.
U jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida sadrži jedan, dva, tri, četiri ili svih pet ostataka divljeg tipa: 295Asn, 296Glu, 298Leu, 302Gly i 310Asp.
U jednoj realizaciji, peptid ima 295Asn.
U jednoj realizaciji, analog peptida ima 296Glu. U jednoj realizaciji, analog peptida ima 298Leu. U jednoj realizaciji, analog peptida ima 302Gly. U jednoj realizaciji, analog peptida ima 310Asp.
U jednoj realizaciji, analog peptida ima dva ili više od 310Asp, 295Asn i 296Glu. U jednoj realizaciji, analog peptida ima sva tri od 310Asp, 295Asn i 296Glu.
Analog EGF(A) peptida može sadržati dalje supstitucije amino-kiselina kao što je ovde opisano. U jednoj realizaciji, analog pronalaska može dalje da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji(ima) izabranoj iz grupe pozicija: 293, 294, 296, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330 i 332.
U jednoj realizaciji, analog pronalaska može dalje da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji(ima) izabranoj iz grupe pozicija: 293, 294, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330, 331 i 332.
U jednoj realizaciji, analog pronalaska može dalje da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji(ima) izabranoj iz: 294, 299, 300, 303, 309, 312, 313, 314, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330 i 332.
U jednoj realizaciji, analog pronalaska može dalje da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji(ima) izabranoj iz: 299, 300, 309, 313, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 326, 328, 329, 330 i 332.
U jednoj realizaciji, analog pronalaska može dalje da sadrži jednu ili više supstitucija amino-kiseline na poziciji(ima) izabranoj iz grupe pozicija: 309, 312, 313, 321, 324, 328 i 332.
U još jednoj realizaciji, analog peptida sadrži ili aminokiselinski ostatak divljeg tipa ili drugi ostatak, tj. aminokiselinsku supstituciju, na određenim specifičnim pozicijama pored aminokiselinskih ostataka koji su ovde prethodno navedeni.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Gly(G) ili Asn(N) na poziciji 293.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Trp (V), Thr(T) ili Gly(G) na poziciji 294.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asp(D), Gly(G), Pro(P), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Thr(T), Asn(N), Gln(Q), Ala(A), Ile(I), Leu(L), Met(M), Phe(F), Tyr(Y) ili Trp(W) na poziciji 299.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asp(D), Gly(G), Pro (P), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Thr(T), Asn(N), Gln(Q), Ala(A), Met(M), Phe(F), Tyr(Y) ili Trp(W) na poziciji 299.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asp(D), Ser (S), Arg(R), Leu (L), Ala (A), Lys(K) ili Tyr(Y) na poziciji 299.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asp(D) ili Ala(A) na poziciji 299.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak His(H) ili Asn(N) na poziciji 300.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Val(V), Ser(S), Thr (T) ili Ile (I) na poziciji 307.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Val(V) ili Ile (I) na poziciji 307.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata Ser (S), Thr (T) ili Ile (I) na poziciji 307.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata Ile (I) na poziciji 307.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asn(N) , Glu (E), His (H,) Arg (R), Ser (S) ili Lys (K) na poziciji 309.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asn(N) , Arg (R), Ser (S) ili Lys (K) na poziciji 309.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asn(N), Arg (R) ili Ser (S) na poziciji 309.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Asn(N) ili Arg (R) na poziciji 309.
U jednoj takvoj realizaciji, analog pronalaska obuhvata aminokiselinski ostatak Lys(K) ili Arg (R) na poziciji 309.
Analog EGF(A) peptida može da sadrži nekoliko supstitucija amino-kiselina kao što je ovde opisano, kao što je jedna ili više supstitucija amino-kiselina izabranih iz grupe od: 299Ala, 307Ile i 321Glu.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida sadrži aminokiselinski ostatak Asp(D), Lys(K) ili Glu(E) na poziciji 321.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida sadrži aminokiselinski ostatak Asp(D) ili Glu(E) na poziciji 321.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida sadrži aminokiselinski ostatak Glu(E) na poziciji 321.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida sadrži aminokiselinski ostatak Gln (Q) ili Gly (G) na poziciji 324.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida sadrži aminokiselinski ostatak Arg (R) ili His (H) na poziciji 329.
U daljim realizacijama, analog EGF(A) peptida nema supstituciju 300Asn(N) u Pro(P).
EGF(A) domen LDL-R uključuje lizin na poziciji 312 koji može biti koristan za supstituciju kao što je ovde opisano. U realizacijama gde veza supstituenta za 312 nije poželjna, 312Lys može biti supstituisan drugom amino-kiselinom kao što je ovde opisano.
U jednoj realizaciji, Lys na poziciji 312 je supstituisan aminokiselinskim ostatkom izabranim iz: Gly, Pro, Asp, Glu, Arg, His, Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe i Tyr. U jednoj realizaciji, Lys na poziciji 312 je supstituisan aminokiselinskim ostatkom izabranim iz: Gly, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Ile, Leu, Phe i Tyr. U jednoj realizaciji, Lys na poziciji 312 je supstituisan aminokiselinskim ostatkom izabranim iz: Asp, Glu, Thr, Asn, Ile, Leu, Phe i Tyr. U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Asp, 312Glu, 312Thr, 312Asn, 312Ile ili 312Phe. U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Glu, 312Asp, 312Gln ili 312Arg.
1
U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Glu, 312Thr, 312Asn, 312Ile, 312Phe ili 312Tyr. U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Glu, 312Asn ili 312Ile.
U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Glu ili 312Arg. U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Arg. U jednoj realizaciji, 312Lys je supstituisan sa 312Glu.
Da bi se uključila opcija za vezivanje supstituenta na različitim pozicijama (vidi dalje dole), Lys se može uvesti supstitucijom amino-kiselina divljeg tipa ostatka SEQ ID NO.: 1 ili elongacijom peptida SEQ ID NO.: 1 , kao što je 292Lys ili 333Lys.
U slučajevima kada je poželjno više od jednog supstituenta, jedan može biti preko 312Lys, dok je drugi preko Lys uveden elongacijom ili supstitucijom peptida u SEQ ID NO.: 1.
U jednoj realizaciji analog peptida SEQ ID NO: 1 sadrži najmanje jedan Liys ostatak na poziciji izabranoj iz grupe od: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U jednoj realizaciji, analog peptida SEQ ID NO: 1 sadrži najmanje jedan Lys ostatak na poziciji izabranoj iz grupe od: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U jednoj realizaciji, analog peptida SEQ ID NO: 1 sadrži najmanje jedan Lys ostatak na poziciji izabranoj iz grupe od: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U jednoj realizaciji, analog peptida SEQ ID NO: 1 sadrži najmanje jedan Lys ostatak na poziciji izabranoj iz grupe od: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U jednoj realizaciji, analog peptida SEQ ID NO: 1 sadrži najmanje jedan Lys ostatak na poziciji izabranoj iz grupe od: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
Dodatno ili alternativno, analog peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 301Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz 292Lys, 293Lys, 294Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys,
1
325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys. U jednoj realizaciji, analozi peptida pronalaska ne sadrže nijednu od sledećih supstitucija: 296K, 298K, 301K, 302K i 307K.
U jednoj realizaciji, analozi peptida pronalaska ne sadrže nijednu od sledećih supstitucija: 296K, 298K, 301K, 302K, 307K i 310K.
U jednoj realizaciji, analozi peptida pronalaska ne sadrže nijednu od sledećih supstitucija: 296K, 298K, 301K, 302K, 307, i 295K.
U jednoj realizaciji, analozi peptida pronalaska ne sadrže nijednu od sledećih supstitucija: 296K, 298K, 301K, 302K, 307K i 295D.
U posebnoj realizaciji, analog peptida pronalaska sadrži 1 ili 2 takvih Lys supstitucija. Dodatno ili alternativno, peptid pronalaska može da sadrži 312Lys.
U jednoj realizaciji analog peptida pronalaska sadrži dva Lys ostatka. U jednoj realizaciji analog peptida pronalaska sadrži dva Lys ostatka izabrana iz parova koji se sastoje od:
i. 293K i 294K xiv. 313K i 321K
ii. 293K i 312K xv. 313K i 324K
iii. 293K i 333K xvi. 313K i 328K
iv. 309K i 313K xvii. 313K i 332K
v. 309K i 324K xviii. 313K i 333K
vi. 309K i 328K xix. 314K i 333K
vii. 309K i 332K xx. 321K i 332K
viii. 309K i 333K xxi. 321K i 333K
ix. 311K i 313K xxii. 324K i 333K
x. 312K i 333K xxiii. 324K i 328K
xi. 312K i 313K xxiv. 328K i 333K
xii. 312K i 314K xxv. 330K i 333K i
xiii. 313K i 314K xxvi. 332K i 333K.
Kao što se vidi ovde iznad, različiti analozi peptida su obezbeđeni predmetnim pronalaskom. U još jednoj realizaciji analog EGF(A) peptida prema pronalasku sadrži najmanje dve aminokiselinske supstitucije identifikovane bilo kojom od grupa i-xxiv prikazanim u daljem tekstu u poređenju sa SEQ ID NO.:1.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska se sastoji od supstitucija amino-kiselina identifikovanih bilo kojom od grupa i-xxiv kako je prikazano u daljem tekstu.
U još jednoj realizaciji analog EGF(A) peptida prema pronalasku sadrži najmanje dve aminokiselinske supstitucije identifikovane bilo kojom od grupa i-xvi prikazanim u daljem tekstu u poređenju sa SEQ ID NO.:1.
1
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska se sastoji od supstitucija amino-kiselina identifikovanih bilo kojom od grupa i-xvi kako je prikazano u daljem tekstu. i. 301Leu i 309Arg
ii. 301Leu, 309Arg, 312Glu
iii. 301Leu, 307Ile i 309Arg
iv. 301Leu, 307Ile, 309Arg i 312Glu
v. 301Leu, 309Arg i 321Glu
vi. 301Leu, 309Arg, 321Glu i 312Glu
vii. 301Leu, 307Ile, 309Arg i 299Ala
viii. 301Leu, 307Ile, 309Arg, 299Ala i 312Glu
ix. 301Leu i 309Arg i najmanje jednom Lys supstitucijom
x. 301Leu, 309Arg, 312Glu i najmanje jednom Lys supstitucijom
xi. 301Leu, 307Ile i 309Arg i najmanje jednom Lys supstitucijom
xii. 301Leu, 307Ile, 309Arg i 312Glu i najmanje jednom Lys supstitucijom
xiii. 301Leu, 309Arg i 321Glu i najmanje jednom Lys supstitucijom
xiv. 301Leu, 309Arg, 321Glu i 312Glu i najmanje jednom Lys supstitucijom
xv. 301Leu, 307Ile, 309Arg i 299Ala i najmanje jednom Lys supstitucijom ili xvi. 301Leu, 307Ile, 309Arg, 299Ala i 312Glu i najmanje jednom Lys supstitucijom.
U još jednoj realizaciji analog EGF(A) peptida prema pronalasku sadrži najmanje dve aminokiselinske supstitucije identifikovane bilo kojom od grupa xvii-xx prikazanim u daljem tekstu u poređenju sa SEQ ID NO.: 1.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska se sastoji od supstitucija amino-kiselina identifikovanih bilo kojom od grupa xvii-xx kako je prikazano u daljem tekstu.
xvii. 301Leu i 309Lys
xviii. 301Leu, 309Lys i 312Glu
xix. 301Leu i 309Lys i najmanje još jedna Lys supstitucija
xx. 301Leu, 309Lys i 312Glu i najmanje još jedna Lys supstitucija.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida prema pronalasku sadrži najmanje dve aminokiselinske supstitucije identifikovane bilo kojom od grupa xxi-xxiv prikazanim u daljem tekstu u poređenju sa SEQ ID NO.: 1.
U još jednoj realizaciji, analog EGF(A) peptida pronalaska se sastoji od supstitucije amino-kiseline identifikovane bilo kojom od grupa xxi-xxiv kao što je prikazano u daljem tekstu xxi. 301Leu i 307Ile,
xxii. 301Leu, 307Ile i 312Glu
xxiii. 301Leu i 307Ile i najmanje još jedna Lys supstitucija i
1
xxiv. 301Leu, 3307Ile i 312Glu and najmanje još jedna Lys supstitucija.
U daljim specifičnim realizacijama analog peptida ili analog peptida jedinjenja prema pronalasku obuhvata ili se sastoji od bilo koje od sekvenci amino-kiselina identifikovanih sa SEQ ID 1 do 106.
U jednoj realizaciji, analog peptida sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina identifikovanih sa SEQ ID NO.: 2-106.
U jednoj realizaciji analog peptida sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina identifikovanih sa SEQ ID NO.: 2-47 i 49-106.
U jednoj realizaciji analog peptida sadrži ili se sastoji od bilo koje sekvence aminokiselina identifikovane bilo kojom od sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO.: 2-44, 46, 47 i 49-106.
U jednoj realizaciji, analog peptida sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina identifikovanih sa SEQ ID NO.: 2-44, 46, 47, 49-53, 55, 58-106.
U jednoj realizaciji, analog peptida sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina identifikovanih sa SEQ ID NO.: 2-4, 6-44, 46, 47, 49-53, 55, 58-106.
U jednoj realizaciji, analog peptida sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina identifikovanih sa SEQ ID NO.: 2-4, 6-19, 21-44, 46, 47, 49-53, 55, 58-106.
Intermedijarna jedinjenja
Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na analoge peptida koji mogu biti ugrađeni u derivate pronalaska. Takvi analozi peptida se mogu nazvati „međuproizvodom” ili „intermedijarnim jedinjenjem”. Oni su u obliku novih LDL-R(293-332) analoga, koji kao što je gore opisano mogu biti ugrađeni u EGF(A) derivate pronalaska kao što je dalje opisano u nastavku. Takvi analozi peptida su kao što je definisano u gornjem odeljku.
Konkretno, analog peptida, ili intermedijarni peptid, prema predmetnom pronalasku, može se nazvati analogom peptida sekvence SEQ ID NO: 1.
U jednoj realizaciji pronalazak se odnosi na analog EGF(A) peptida kako je ovde opisan za upotrebu u proizvodnji EGF(A) jedinjenja, kao što je derivat EGF(A).
Druge karakteristike, definicije, aspekti i realizacije koje su ovde otkrivene u vezi sa peptidnim analozima pronalaska mogu, takođe, biti primenljive na intermedijarne proizvode pronalaska.
EGF(A) derivati
Analozi peptida mogu dalje da sadrže supstituent i na taj način postanu derivat jedinjenja.
1
Izraz „derivat” se generalno odnosi na jedinjenje koje se može dobiti od prirodnog peptida ili njegovog analoga hemijskom modifikacijom, posebno kovalentnim vezivanjem jednog ili dva supstituenta.
Izrazi „derivat pronalaska”, „EGF(A) derivat ”, „derivat EGF(A)“ ili „LDL-R(293-332) derivat“ ili „derivat LDL-R(293-332) analoga” kako se ovde koriste, odnose se na peptid za koji su vezani jedan ili dva supstituenta. Svaki od njih se takođe ili alternativno može nazvati bočnim lancem. Drugim rečima, „derivat pronalaska” obuhvata peptid, tj. peptidnu sekvencu, koja je ovde EGF(A) analog peptida, i najmanje jedan, uključujući jedan ili dva, supstituent(a).
Izazi „supstituent” se koristi da opišu deo koji je kovalentno vezan za EGF(A) peptid, npr. supstituent je deo koji nije deo samog EGF(A) peptida.
U jednoj realizaciji, jedan ili više supstituenata je/su vezano za atom azota analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji, jedan ili više supstituenata je/su vezani za amino grupu analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji, jedan ili više supstituenata je/su vezano za N-terminalnu amino-kiselinu analoga EGF(A) peptida ili za Lys ostatak analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji, jedan ili više supstituenata su vezani za N-terminalnu amino-kiselinu analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji jedan ili više supstituenata je/su vezani za alfa-azot N-terminalnog aminokiselinskog ostatka analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji jedan ili više supstituenata je/su vezan za Lys ostatak analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji, jedan ili više supstituenata je/su vezano za epsilon-azot Lys ostatka analoga EGF(A) peptida.
Primeri supstituenata su različiti i dalje su opisani u nastavku.
Aspekt pronalaska se odnosi na derivate EGF(A) koji sadrže analog EGF(A) peptida koji sadrži 301Leu i supstituent koji sadrži najmanje jednu grupu masnih kiselina, pri čemu analog EGF(A) peptida ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO:1, i pri čemu derivat ima Ki ispod 5 nM kada se meri u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R opisanom u ovde odeljku D1.1.
Za sve realizacije, izraz derivat EGF(A) takođe obuhvata bilo koju njegovu farmaceutski prihvatljivu so, amid ili estar.
Supstituenti
Supstituent je grupa vezana za analog EGF(A) peptida. Prema pronalasku, poželjno je da grupa npr. supstituent nema nikakav ili minimalan efekat na funkcionalnost EGF(A) peptida uz dodavanje drugih korisnih svojstava, kao što su duži poluživot i/ili poboljšano izlaganje nakon oralnog doziranja.
Sledi da derivati, kao i gore opisani analozi pronalaska, imaju sposobnost da se vezuju za PCSK9. Takvo vezivanje za PCSK9 inhibira vezivanje PCSK9 za LDL-R, čime se sprečava degradacija LDL-R, čime se povećava klirens LDL-C i aterogenih lipoproteina.
1
U specifičnoj realizaciji, derivati i analozi pronalaska imaju poboljšanu sposobnost vezivanja za PCSK9, na primer u poređenju sa prirodnim LDL-R(293-332) ili drugim jedinjenjima koja vezuju PCSK9. Analozi i derivati pronalaska mogu se, na primer, testirati na njihovu sposobnost da inhibiraju vezivanje PCSK9 za LDL-R korišćenjem testa ovde opisanog u Primeru D.1.1.
U jednoj realizaciji, supstituent ima za cilj poboljšanje funkcionalnosti peptida.
U jednoj realizaciji supstituent povećava poluživot analoga peptida na način da poluživot u plazmi derivata koji se sastoji od osnovnog peptida i supstituenta ima produženi poluživot u poređenju sa poluživotom osnovnog peptida kao što je prikazano Primerima 1 i 48 (Odeljak D2, tabela 7). Postupci za određivanje poluživota kod različitih vrsta su dobro poznati u tehnici i ovde su prikazani kao primeri za miševe i pse (Odeljak D2 i D5).
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku ima poluživot iznad 4 sata.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku ima poluvreme eliminacije iznad 6 sati, kao što je iznad 8 sati ili iznad 10 sati kod miševa mereno nakon supkutanog ili intravenoznog doziranja.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku ima poluživot iznad 25 sati kod pasa.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku ima poluživot iznad 50 sati, kao što je iznad 100 sati ili iznad 150 sati kod pasa.
U jednoj realizaciji, supstituent koji produžava poluživot je proteinska grupa. U sledećoj takvoj realizaciji proteinska grupa može da uključuje humani albumin, Fc-domen ili nestrukturirana proteinska ekstenzija. U još jednoj realizaciji, proteinska grupa može biti fuzionisana sa peptidnim analogom. U još jednoj realizaciji, proteinska grupa je Fc domen i Fc domen je fuzionisan sa peptidnim analogom. Kada se pripremi fuzija Fc, dobijeno jedinjenje će obično biti dvovalentno jer će dva Fc polipeptida formirati jedan Fc domen.
U jednoj realizaciji supstituent nije proteinska grupa. U jednoj realizaciji, supstituent nije proteinska grupa fuzionisana sa analogom EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji proteinska grupa nije Fc domen.
U još jednoj realizaciji, supstituent je neproteinska grupa.
U posebnoj realizaciji, supstituent je sposoban da formira nekovalentne komplekse sa albuminom, čime se promoviše cirkulacija derivata unutar krvotoka, a takođe ima efekat produženja vremena delovanja derivata. U posebnoj realizaciji, supstituent je sposoban da produži vreme delovanja EGF(A) jedinjenja bez značajnog smanjenja njegovog kapaciteta vezivanja za PCSK9.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) sadrži supstituent koji produžava poluživot. Različiti supstituenti koji produžavaju poluživot su dobro poznati u tehnici i uključuju posebno veziva za
2
albumin koja sadrže grupu masnih kiselina kao što je opisano dalje u tekstu, a takva veziva za albumin su neproteinski supstituenti.
Supstituent sadrži najmanje jednu grupu masnih kiselina.
U posebnoj realizaciji, grupa masnih kiselina sadrži ugljenični lanac koji sadrži najmanje 8 uzastopnih -CH2- grupa. U jednoj realizaciji grupa masnih kiselina sadrži najmanje 10 uzastopnih -CH2- grupa, kao što je najmanje 12 uzastopnih –CH2- grupa, najmanje 14 uzastopnih –CH2- grupa, najmanje 16 uzastopnih –CH2- grupa, najmanje 18 uzastopnih –CH2-grupa.
U jednoj realizaciji grupa masnih kiselina sadrži 8-20 uzastopnih –CH2- grupa. U jednoj realizaciji grupa masnih kiselina sadrži 10-18 uzastopnih –CH2- grupa. U jednoj realizaciji grupa masnih kiselina sadrži 12-18 uzastopnih –CH2- grupa. U jednoj realizaciji grupa masnih kiselina sadrži 14-18 uzastopnih –CH2- grupa.
U situacijama u kojima derivat sadrži dva supstituenta, produženi poluživot se može postići sa kraćim grupama masnih kiselina, tako da u jednoj realizaciji gde derivat sadrži dva supstituenta, grupe masnih kiselina mogu sadržati najmanje 8 uzastopnih –CH2- grupa, kao što je najmanje 10 uzastopnih –CH2- grupa, kao što je najmanje 12 uzastopnih –CH2- grupa, najmanje 14 uzastopnih –CH2- grupa, najmanje 16 uzastopnih –CH2- grupa.
U još jednoj realizaciji gde derivat sadrži dva supstituenta, svaki od supstituenata sadrži grupu masnih kiselina koja sadrži 8-18 uzastopnih –CH2- grupa. U daljim takvim realizacijama grupe masnih kiselina sadrže 10-18 uzastopnih –CH2- grupa, kao što je 12-18 uzastopnih –CH2- grupa, kao što je 14-18 uzastopnih –CH2- grupa.
Izraz „grupa masnih kiselina” kako se ovde koristi može se nazvati hemijskom grupom koja sadrži najmanje jednu funkcionalnu grupu koja je Brønsted-Lowry kiselina sa pKa < 7.
Neograničavajući primeri takvih funkcionalnih grupa koje su Brønsted-Lowry kiseline uključuju karboksilnu kiselinu (uključujući i karboksifenoksi), sulfonsku kiselinu, tetrazolnu grupu.
U jednoj realizaciji navedena grupa masnih kiselina sadrži funkcionalnu grupu izabranu iz karboksilne kiseline, sulfonske kiseline, tetrazolne grupe, metilsulfonilkarbamoilamino (MSU) grupe i 3-hidroksi-izoksazollzoksazol grupe. Shodno tome, supstituent koji produžava poluživot pronalaska u jednoj realizaciji obuhvata karboksilnu kiselinu, sulfonsku kiselinu, tetrazolnu grupu, metilsulfonilkarbamoilamino grupu ili hidroksi-izoksazollsoksazol grupu koja dalje uključuje 8-20 uzastopnih CH2-grupa koje definišu:
Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-* pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20, koji se takođe može nazvati C(n+2) dikiselina ili kao
Hem.1b:
n , pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20,
Hem.2: 5-tetrazolil-(CH2)n-CO-* pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20, koji se takođe može nazvati
Hem.2b: , pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20.
Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-* pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20, koji se takođe može nazvati
Hem.3b: pri čemu je karboksi g nrupa na poziciji 2, 3 ili 4 od (C6H4) grupe hem.3 i pri čemu je m ceo broj u rasponu od 8-11
Hem.4: HO-S(O)2-(CH2)n-CO-* pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20, koji se takođe može nazvati
Hem.4b: n , pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20,
Hem.5: MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)n-CO-* pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20, koji se takođe može nazvati.
pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20,
Hem.6: 3-HO-Izoksazol-(CH2)n-CO-* pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20, koji se takođe može nazvati
pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20.
Izraz funkcionalna grupa u svom kiselom obliku se naziva FG-H, a njen oblik kao konjugovana baza se naziva FG-. Izraz „funkcionalna grupa sa pKa < 7” kako se ovde koristi može se nazvati Brønsted-Lowry kiselinom koja u obliku svog metil derivata (CH3-FG-H) u vodenom rastvoru ima ravnotežni pKa ispod 7, pri čemu je pKa -log do konstante ravnoteže (Ka) ravnoteže prikazane u daljem tekstu:
Postupci za određivanje pKa su dobro poznati u tehnici. Takav postupak je, na primer, opisao Reijenga i dr. u Anal Chem Insights 2013 (2013; 8: 53–71).
Supstituenti prema pronalasku u jednoj realizaciji sadrže jedan ili više linker elemenata. Linker elementi mogu biti povezani sa grupom masnih kiselina amidnim vezama i nazivaju se Z2-Z10. Kao što je dalje definisano u nastavku, broj linker elemenata može biti najviše 10.
U specifičnoj realizaciji, supstituent je formule I:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I] pri čemu
Z1je izabran iz:
Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-* ili
Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-* ili
2
Hem.3b: pri čemu je karboksi grupa na poziciji 2, 3 ili 4 od (C6H4)-,
Hem. 4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-* ili
Hem.6: 3-HO-Izoksazol-(CH2)n-CO-* ili
pri čemu je n ceo broj u rasponu od 8-20 i m je ceo broj u rasponu od 8-11.
U posebnoj realizaciji, n je 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 u Hem.1 ili 1b. U posebnoj realizaciji, n je 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 u Hem.2 ili 2b. U posebnoj realizaciji, n je 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 u Hem.4 ili 4b. U posebnoj realizaciji, m je 8, 9, 10 ili 11 u Hem.3 ili 3b.
U posebnoj realizaciji, n je 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 u Hem.5 ili 5b.
U posebnoj realizaciji, n je 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 u Hem.6 ili 6b.
U posebnoj realizaciji, simbol * označava tačku vezivanja za azot u Z2. U drugoj varijanti, gde je Z2je veza, simbol * označava tačku vezivanja za azot susednog Z elementa.
Izraz „veza” kako se koristi u kontekstu Formule I označava kovalentnu vezu. Kada je komponenta Formule I (Z1-Z10) definisana kao veza, ekvivalentna je formuli I u kojoj je pomenuta komponenta odsutna.
U nastavku se navodi da je bilo koji od Z2-Z10veza se takođe može čitati kao da je bilo koji od Z2-Z10biti odsutan. Logično, „veza” ne može da sledi „vezu”. Indikacija „veza” ovde znači da je prethodni Z element kovalentno vezan za sledeći Z element koji nije „veza” (ili odsutan).
Linker elementi Z2-Z10su izabrani iz hemijskih grupa koje su sposobne da formiraju amidne veze, uključujući delove slične amino-kiselinama, kao što su Glu, γGlu (takođe nazvani gamal Glu ili gGlu i definisani sa *-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*), Gly, Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep, Aeeep i TtdSuc i dalje grupe definisane u nastavku.
Z2je izabran iz
Hem.7: *-NH-SO2-(CH2)3-CO-* ili
veza.
Z3izabran između γGlu, Glu ili veze.
Z3je izabran između γGlu, Glu ili veze kada je Z2je Hem.7 ili Hem.7b.
Z3je izabran između γGlu, Glu ili veze, pod uslovom da Z3se bira između γGlu, Glu kada je Z2je Hem.8.
Z3se bira između γGlu i Glu kada je Z2je Hem. 8.
Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su izabrani, nezavisno jedan od drugog, iz Glu, γGlu, Gly, Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep, Aeeep, TtdSuc i veze.
Glu, Gly, Ser, Ala, Thr su aminokiselinski ostaci dobro poznati u tehnici.
γGlu je formule Hem.9: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-* što je isto što i Hem.9b:
takođe se može nazvati gGlu.
O OH
2
TtdSuc je formule Hem.10:
*-NH-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2O-(CH2)3-NHCO* ili
*-NH-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NHCO* što je isto što i
Ado je formule Hem.11: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-* i takođe se može nazvati 8-amino-3,6-dioksaoktanskom kiselinom i što je isto kao
Aeep je formule Hem.12: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*, i takođe se može nazvati
Aeeep je formule Hem.13: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*, i takođe se može nazvati
U posebnoj realizaciji, kada Z10je Hem.14, supstituent je vezan za N-terminalnu amino grupu datog peptida.
U drugoj realizaciji, kada Z10je veza, dati supstituent je vezan za epsilon poziciju Lys ostatka prisutnog u datom peptidu ili za N-terminalni aminokiselinski ostatak datog peptida.
U jednoj realizaciji derivat sadrži dva supstituenta. U jednoj takvoj realizaciji, dva supstituenta su identična. U jednoj takvoj realizaciji, dva supstituenta su različita. U jednoj
2
realizaciji dva supstituenta su vezana za atome azota analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji dva supstituenta su vezana za amino grupe analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji dva supstituenta su vezana za N-terminalnu amino-kiselinu EGF(A) i za Lys ostatak analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji jedan supstituent je vezan za alfa-azot N-terminalnog aminokiselinskog ostatka analoga EGF(A) peptida i jedan supstituent je vezan za Lys ostatak analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji, dva supstituenta su vezana za N-terminalnu amino-kiselinu analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji, dva supstituenta su vezana za različite Lys ostatke analoga EGF(A) peptida. U jednoj realizaciji dva supstituenta su vezana za epsilon-azot različitih Lys ostataka u analogu EGF(A) peptida.
U jednoj realizaciji gde su prisutna dva supstituenta, Z10je Hem.14 u jednom supstituentu koji je vezan za N-terminalnu amino grupu analoga peptida i Z10je veza u drugom supstituentu koja je vezana za epsilon poziciju Lys ostatka prisutnog u datom peptidnom analogu.
U drugoj realizaciji gde su prisutna dva supstituenta, Z10je veza u jednom supstituentu koji je vezan za N-terminalnu amino grupu analoga peptida i Z10je veza u drugom supstituentu koja je vezana za epsilon poziciju Lys ostatka prisutnog u datom peptidnom analogu.
U drugoj realizaciji gde su prisutna dva supstituenta, Z10je veza u oba supstituenta i svaki od dva supstituenta je vezan za epsilon poziciju različitih Lys ostataka prisutnih u analogu peptida.
U posebnoj realizaciji, derivati pronalaska mogu biti pripremljeni od analoga EGF(A) peptida kovalentnim vezivanjem jednog ili dva supstituenta.
U posebnoj realizaciji, dva supstituenta su formule I: Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I]. Z1do Z10su kako je definisano u gornjem tekstu. U posebnoj realizaciji, dva supstituenta su formule I i identični su, što znači da su izabrani Z1do Z10su isti u oba supstituenta. U drugoj realizaciji, dva supstituenta su formule I i različiti su, što znači da se jedan ili više odabranih Z1do Z10razlikuju između jednog i drugog supstituenta.
Specifični substituenti
Kao što se vidi gore, različite supstituente mogu pripremiti stručnjaci u tehnici.
Supstituenti uključeni u ovu prijavu se stoga ne smatraju ograničavajućim za pronalazak.
U jednoj realizaciji, jedan ili dva supstituenta se biraju iz grupe supstituenata koja se sastoji od:
HOOC-(CH2)18-CO-gGlu-2xADO
HOOC-(CH2)18-CO-NH-CH2-(C6H10)-CO-gGlu-2xADO
HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2xADO
HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2xADO-NH-CH2-(C6H4)-CH2
2
HOOC-(CH2)16-CO-gGlu
HOOC-(CH2)16-CO-NH-CH2-(C6H10)-CO-gGlu-2xADO
HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-2xADO
HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-2xADO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-3xADO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-2xgGlu
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-3xGly
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-2xgGlu-2xADO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-TtdSuc
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)9-CO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-4xADO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-NH-CH2-(C6H10)-CO-gGlu-2xADO
4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)9-CO-gGlu-2xADO
3-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)9-CO-gGlu-2xADO
3-HO-Izoksazol-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO
HOS(O)2-(CH2)15-CO-gGlu-2xADO-NH-CH2-(C6H4)-CH2
HOS(O)2-(CH2)13-CO-gGlu-2xADO
Tetrazolil-(CH2)15-CO-NH-SO2-(CH2)3-CO-ADO-ADO-NH-CH2-(C6H4)-CH2
Tetrazolil-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO
Tetrazolil-(CH2)15-CO-gGlu-2xADO i
MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I u kojoj je Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i ostala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I u kojoj je Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, i Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I u kojoj je Z1je Hem. 1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 14 ili 16; Z2je veza; Z3je γGlu; i svi Z4, Z5, Z6, Z7, Z8 i Z9su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1veza. 1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16 ili 18; Z2je Hem 8 (Trx); Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i ostale četiri su veze; Z10je veza.
2
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.2: Tetrazolil-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 15; Z2je Hem 7 (sulfonimid); Z3je veza; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preosatala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.2: Tetrazolil-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 15; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preosatala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.2: Tetrazolil-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 12; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je veza; i svi Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i svi Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i jedan od Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9je γGlu i preostalih pet su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i jedan od Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9je γGlu i dva su Ado i preostala tri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i tri od Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9su Gly i preostala tri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i dva od Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i tri od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preostala tri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i četiri od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preostala dva su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; i jedan od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9je TtdSuc i preostalih pet su veze; Z10je veza.
2
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je Hem 8 (Trx); ; Z3je γGlu; i dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 9; Z2je veza; Z3je γGlu; i jedan od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9je TtdSuc i preostalih pet su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.4: HO-S(O)2-(CH2)n-CO- *, pri čemu je n 15; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.4: HO-S(O)2-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 15; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.5: MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)n-CO -*, pri čemu je n 12; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.6: 3-OH-Izoksazol-(CH2)12-CO-*, pri čemu je n 12; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
Specifične kombinacije supstituenata:
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 14; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 14; Z2je veza; Z3je γGlu; sva četiri Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta Formule I pri čemu Z1je Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta, od kojih je jedan Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*; drugi supstituent je formule I pri čemu je Z1Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta, od kojih je jedan Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*; drugi supstituent je Formule I pri čemu je Z1Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta, od kojih je jedan Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza; drugi supstituent je Formule I pri čemu je Z1je Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta, od kojih je jedan Formule I pri čemu Z1je Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, pri čemu je n 16; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su Ado i preostala četiri su veze; Z10je veza; i drugi supstituent je Formule I pri čemu je Z1je Hem.4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*, pri čemu je m 15; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*.
U jednoj realizaciji, jedinjenje pronalaska sadrži ili ima dva supstituenta, od kojih je jedan Formule I pri čemu Z1je Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, pri čemu je m 10; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5 ,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je veza; drugi supstituent je Formule I pri čemu je Z1je Hem.4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*, pri čemu je m 15; Z2je veza; Z3je γGlu; dva od Z4, Z5,Z6, Z7, Z8i Z9su Ado, preostala četiri su veze; Z10je Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*.
Peptid i mesto vezivanja
Derivat EGF(A) ili jedinjenje prema pronalasku sadrži analog EGF(A) peptida EGF(A) domena LDL-R kao što je definisano SEQ ID NO.: 1. Takva peptidna sekvenca je ovde prethodno detaljno opisana i peptid derivata ili jedinjenja pronalaska može biti opisan i definisan
1
identičnim izrazima. Derivat EGF(A) ili jedinjenje dalje ima najmanje jedan supstituent kao što je gore opisano koji je vezan za peptidnu sekvencu.
U jedinjenjima pronalaska, supstituent je kovalentno vezan za peptid, što znači za jedan aminokiselinski ostatak peptidne sekvence.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) pronalaska, sadrži supstituent koji nije vezan ni za jednu od sledećih pozicija: 295, 296, 298, 301, 302 i 307. U još jednoj realizaciji, supstituent nije vezan za bilo koji od sledećih položaja: 295, 296, 298, 301, 302, 307 i 310. U daljim takvim realizacijama, takođe nije vezan ni za jednu od sledećih pozicija: 299 i 320.
U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan preko bilo koje pozicije od 292 do 333 osim na bilo kojoj od pozicija 297, 304, 308, 317, 319 i 331.
U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan preko bilo koje pozicije od 292 do 333 osim na bilo kojoj od pozicija 297, 298, 301, 302, 304, 307, 308, 317, 319 i 331.
U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan preko bilo koje pozicije od 292 do 333 osim na bilo kojoj od pozicija 295, 296, 297, 298, 301, 302, 304, 307, 308, 317, 319 i 331. U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan preko bilo koje pozicije od 292 do 333 osim na bilo kojoj od pozicija 295, 296, 297, 298, 301, 302, 304, 307, 308, 310, 317, 319, 320 i 331. U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan preko bilo koje pozicije od 292 do 333 osim na bilo kojoj od pozicija 295, 296, 297, 298, 301, 302, 304, 307, 308, 309, 310, 317, 319, 320 i 331.
U jednoj realizaciji, supstituent(i) je(su) vezan(i) za bilo koju jednu ili dve pozicije 292, 293, 294, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332 i 333 analoga EGF(A) peptida.
U jednoj realizaciji, supstituent(i) je(su) vezan(i) za bilo koju jednu ili dve pozicije 292, 293, 294, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332 i 333 analoga EGF(A) peptida.
U jednoj realizaciji, supstituent(i) je(su) vezan(i) za bilo koju jednu ili dve pozicije 292, 293, 294, 300, 303, 305, 306, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332 i 333 analoga EGF(A) peptida.
U jednoj realizaciji, supstituent je vezan za N-terminalnu amino-kiselinu peptidne sekvence. U posebnoj realizaciji, N-terminalna amino-kiselina je Gly. U posebnoj realizaciji, N-terminalna amino-kiselina je 293Gly. U posebnoj realizaciji, N-terminalna amino-kiselina je 293Lys. U posebnoj realizaciji, N-terminalna amino-kiselina je 292Lys. To takođe može biti Lys ili Gly ili neki drugi aminokiselinski ostatak na N-terminalnoj poziciji koja može biti 293 ili bilo koja pozicija dalje od N-terminusa, kao što su 294Thr, 294Gly ili 294Lys ili 295Asn. U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan za alfa-azot N-terminalnog aminokiselinskog ostatka analoga peptida. U drugoj realizaciji, ako je N-terminalni aminokiselinski ostatak Lys, supstituent može biti kovalentno vezan za alfa-azot ili za epsilon amino grupu lizinskog ostatka.
2
U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan za ε-amino grupu Lys ostatka prisutnog u peptidu.
U drugoj realizaciji, supstituent je vezan za Lys na C-terminalnoj poziciji koja može biti pozicija 332, 333 ili bilo koja pozicija dalje prema C-kraju.
U realizacijama u kojima peptidi pronalaska sadrže elongaciju, bilo na N-terminalnom ili C-terminalnom delu, supstituent(i) može biti vezan za aminokiselinski ostatak date(ih) elongacije(a). U prisustvu N-terminalne elongacije, supstituent može biti vezan za N-terminalnu amino-kiselinu date elongacije ili za Lys prisutan unutar sekvence elongacije. U prisustvu elongacije C-terminala, supstituent može biti vezan za Lys ostatak na C-terminalnoj poziciji ili za Lys prisutan unutar sekvence elongacije.
U još jednoj realizaciji, supstituent je vezan za amino-kiselinu prisutnu u peptidnoj sekvenci. U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan za lizinski ostatak koji je prisutan u peptidu. U posebnoj realizaciji, supstituent je vezan za epsilon amino grupu lizinskog ostatka prisutnog u peptidu. Ostatak lizina za koji je vezan supstituent može biti lociran na bilo kojoj poziciji LDL-R(293-332) EGF(A) analoga, uključujući N-terminalnu poziciju ili C-terminalnu poziciju peptida, bilo koju poziciju unutar ili na ostatak N-terminalnog kraja N-terminalne elongacije ako je prisutna, bilo koju pozicija unutar ili na C-terminalnom krajnjem ostatku C-terminalne elongacije ako je prisutna.
Kao što je ovde gore opisano, analog EGF(A) peptida može imati jedan ili više Lys ostataka; i ti ostaci su korisni za vezivanje supstituenata.
U posebnoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz grupe od: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U posebnoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 301Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U posebnoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz 293Lys, 294Lys, 298Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz: 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U još jednoj realizaciji, lizin(i) za koji je(su) vezan(i) supstituent(i) je(su) izabrani iz: 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U realizacijama gde je supstituent vezan za C-terminalnu elongaciju, lizin za koji je supstituent vezan može biti izabran iz bilo koje pozicije od 333Lys do 242Lys i/ili bilo koje od 333Lys do 383Lys pozicije.
U realizacijama u kojima jedinjenja pronalaska imaju dva supstituenta, supstituenti mogu biti povezani nezavisno jedan od drugog kao što je gore definisano, što znači da bilo koji od njih može biti vezan za N-terminalnu amino-kiselinu peptida, za C-terminalnu amino-kiselinu peptida.ili na amino-kiselinu unutar aminokiselinske sekvence peptida.
U realizacijama gde je Lys prisutan na N-terminalnoj poziciji, dva supstituenta mogu biti oba povezana sa N-terminalnim Lys peptida. Jedan može biti povezan sa N-terminalnim alfaaminom datog Lys, dok drugi može biti vezan za epsilon azot datog Lys. Kada su prisutna dva supstituenta, jedan može biti vezan za N-terminalnu amino-kiselinu peptida, dok je drugi supstituent vezan za amino-kiselinu, kao što je Lys, unutar peptida. Alternativno, jedan supstituent može biti vezan za Lys na C-terminalnoj poziciji peptida, dok je drugi supstituent vezan za amino-kiselinu, kao što je Lys, u peptidu. Alternativno, jedan supstituent može biti vezan za aminokiselinski ostatak, kao što je Lys, unutar peptida, uključujući elongacije, dok je drugi supstituent može biti vezan za drugi aminokiselinski ostatak, kao što je Lys, unutar peptida, uključujući elongacije.
U jednoj realizaciji, jedinjenja pronalaska imaju jedan supstituent, dati supstituent je vezan za peptid na N-kraju; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 292Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 293Lys, ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji
4
299Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 300Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 309Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 311Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 312Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 313Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 314Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 315Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 316Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 318Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 320Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 321Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 322Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 323Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 324Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 325Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 326Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 328Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 329Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 330Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 332Lys; ili je dati supstituent vezan za peptid na poziciji 333Lys.
U jednoj realizaciji gde derivat pronalaska ima dva supstituenta, dati supstituenti mogu biti povezani sa peptidom preko N-kraja i bilo koje od gore datih Lys pozicija, kao što su 293Lys, 309Lys, 313Lys, 324Lys, 328Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
U daljim realizacijama gde derivat sadrži dva supstituenta, oni mogu biti povezani sa dva različita Lys ostatka, kao što je bilo koji od sledećih parova Lys ostataka
i. 293K i 294K xiv. 313K i 321K
ii. 293K i 312K xv. 313K i 324K
iii. 293K i 333K xvi. 313K i 328K
iv. 309K i 313K xvii. 313K i 332K
v. 309K i 324K xviii. 313K i 333K
vi. 309K i 328K xix. 314K i 333K
vii. 309K i 332K xx. 321K i 332K
viii. 309K i 333K xxi. 321K i 333K
ix. 311K i 313K xxii. 324K i 333K
x. 312K i 333K xxiii. 324K i 328K
xi. 312K i 313K xxiv. 328K i 333K
xii. 312K i 314K xxv. 330K i 333K i
xiii. 313K i 314K xxvi. 332K i 333K.
U jednoj realizaciji dva supstituenta su vezana preko 333Lys i Lys izabranog iz 293Lys, 309Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 321Lys, 324Lys, 328Lys, 330Lys i 332Lys.
U jednoj realizaciji dva supstituenta su vezana preko 333Lys i Lys izabranog iz 312Lys, 313Lys, 314Lys, 321Lys, 324Lys, 328Lys i 330Lys.
U jednoj realizaciji dva supstituenta su vezana preko 333Lys i Lys izabranog iz 313Lys, 324Lys i 328Lys.
Kao što je gore opisano, peptid može imati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje se mogu kombinovati sa specifičnim aminokiselinskim ostacima na specifičnim pozicijama kao što je ovde opisano. Takvi specifični aminokiselinski ostaci mogu biti aminokiselinski ostaci divljeg tipa koje treba zadržati, kao što su cisteini koji mogu u nizu poželjnih realizacija, npr. u kombinaciji sa drugim karakteristikama opisanim ovde, biti prisutni u peptidnom analogu. U takvim realizacijama, analog peptida sadrži tri disulfidna mosta na pozicijama 297Cys-308Cys, 304Cys-317Cys i 319Cys-331Cys. U daljem primeru takvih realizacija, analog peptida derivata peptida sadrži tri disulfidna mosta na pozicijama 297Cys-308Cys, 304Cys-317Cys i 319Cys-331Cys i najmanje jedan supstituent, pri čemu supstituent(i) nije vezan za poziciju(e) izabranu iz 295, 296, 298, 301, 302 i 307 datog analoga peptida. Stručnjak u tehnici će razumeti da kombinacije informacija o sekvenci peptida mogu biti kombinovane sa informacijama o poziciji i identitetu supstituenta da bi se definisale različite specifične realizacije predmetnog pronalaska.
U jednoj realizaciji, analog peptida ne sadrži Lys na drugim pozicijama osim na pozicijama za koje je vezan supstituent.
U jednoj realizaciji, jedinjenja pronalaska imaju jedan supstituent, dati supstituent je vezan ili na N-terminalnoj poziciji ili za Lys na bilo kojoj poziciji, a analog peptida ne sadrži Lys na svim drugim pozicijama. U jednoj realizaciji, jedinjenja pronalaska imaju jedan supstituent, dati supstituent je vezan za Lys na bilo kojoj poziciji osim na poziciji 312, a analog peptida sadrži Arg na poziciji 312Arg.
U jednoj realizaciji, jedinjenja pronalaska imaju dva supstituenta, a analog peptida ne sadrži Lys na drugim pozicijama osim na pozicijama za koje su supstituenti vezani.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku je izabran iz grupe derivata EGF(A) koju čine: Primeri 1-47, 51-102 i 106-159.
U daljim realizacijama, derivat EGF(A) prema pronalasku je pojedinačno izabran iz grupe derivata EGF(A) koju čine: Primeri 1-47, 51-102 i 106-159.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku je izabran iz grupe derivata EGF(A) koju čine: Primeri 1-44, 46-47, 51-55, 57, 60-64, 66-69, 71-102 i 106-159.
U jednoj realizaciji, derivat EGF(A) prema pronalasku je izabran iz grupe derivata EGF(A) koju čine: Primeri 31, 95, 128, 133, 143, 144, 150, 151, 152 i 153.
Farmaceutska kompozicija
Predmetna prijava se, takođe, odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje pronalaska, uklјučujući npr. analog peptida pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so, amid ili estar, i farmaceutski prihvatlјiv ekscipijens. Takve kompozicije se mogu pripremiti kao što je poznato u tehnici.
Izraz „ekscipijens” se široko odnosi na bilo koju komponentu osim aktivnog(ih) terapijskog sastojka(sastojaka). Pomoćna supstanca može biti inertna supstanca, neaktivna supstanca i/ili medicinski neaktivna supstanca. Ekscipijens može služiti u različite svrhe, npr. kao nosač, vehikulum, razblaživač, pomoćno sredstvo za tablete i/ili za pobolјšanje davanja i/ili apsorpcije aktivne supstance. Neograničavajući primeri ekscipijenasa su: rastvarači, razblaživači, puferi, konzervansi, agensi za regulisanje toničnosti, helatna sredstva i stabilizatori. Formulacija farmaceutski aktivnih sastojaka sa različitim ekscipijensima poznata je u tehnici, videti npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g.19<th>edition (1995), i sva kasnija izdanja).
Kompozicija može biti u obliku tečne formulacije, tj. vodene formulacije koja sadrži vodu. Tečna formulacija može biti rastvor ili suspenzija. Alternativno, to može biti čvrsta formulacija, npr. kompozicija osušena zamrzavanjem ili raspršivanjem.
Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži drugi aktivni sastojak, kao što je terapeutsko sredstvo, koji može da pojednostavi primenu u slučaju kombinovanih tretmana.
Kompozicija može biti oralna kompozicija, a način primene oralni. Jedinjenja, a posebno produžena jedinjenja, tj. derivati jedinjenja, su pogodna za oralnu primenu. Peptidi i jedinjenja mogu biti sastavljeni od oralne formulacije, tj. kompozicije koja je pogodna za oralnu primenu i sposobna da obezbedi odgovarajući nivo biodostupnosti. Mogu se koristiti tehnologije oralnih formulacija koje su poznate u tehnici. Ovo uključuje upotrebu soli N-(8-(2-hidroksibenzoil)amino)kaprilne kiseline, posebno natrijum N-(8-(2-hidroksibenzoil)amino)kaprilata (SNAC) kako je opisano u WO96/30036 i WO2008/028859 i GIPET formulacija uključujući natrijum kaprat kao što je opisano u EP1154761 i US 8053429.
Da bi se obezbedila jedinjenja za oralne kompozicije, pronalazači su potvrdili da derivati EGF(A) peptida prema pronalasku pokazuju gastrointestinalnu apsorpciju kod pacova (Tabela 10).
Alternativno, kompozicija može biti za parenteralnu primenu, npr. izvodi se supkutanim, intramuskularnim, intraperitonealnim ili intravenskim ubrizgavanjem. Naravno, jedinjenja namenjena za supkutanu primenu možda neće morati da pokazuju gastrointestinalnu apsorpciju, dok druge karakteristike kao što je visoka stabilnost tečne formulacije mogu biti poželjne.
Kombinovani tretman
Tretman analogom ili derivatom EGF(A) peptida, takođe, može biti kombinovan sa jednom ili više dodatnih farmakološki aktivnih supstanci, npr. izabranih iz antidijabetičkih sredstava, sredstava protiv gojaznosti, sredstava za regulisanje apetita, antihipertenzivnih sredstava, sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija koje nastaju ili su povezane sa dijabetesom i sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poremećaja koji su posledica ili su povezani sa gojaznošću.
Primeri ovih farmakološki aktivnih supstanci su: agonisti GLP-1 receptora, insulin, inhibitori DPP-IV (dipeptidil peptidaze-IV), agonisti amilina i agonisti receptora leptina. Posebni primeri takvih aktivnih supstanci su agonisti GLP-1 receptora liraglutid i semaglutid i insulinski degludek.
Farmaceutske indikacije
U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na upotrebu analoga EGF(A) peptida ili derivata EGF(A) kao što je ovde opisano za upotrebu u proizvodnji leka.
Prijava se, takođe, odnosi na jedinjenje pronalaska, npr. analog peptida ili derivat prema pronalasku, ili njegovu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu kao lek ili u proizvodnji leka.
Jedinjenje pronalaska ili njegova kompozicija može se koristiti za (i) poboljšanje lipidnih parametara, kao što je prevencija i/ili lečenje dislipidemije, snižavanje ukupnih lipida u serumu; snižavanje LDL-C, povećanje HDL; snižavanje malog, gustog LDL; snižavanje VLDL; snižavanje triglicerida; snižavanje holesterola; snižavanje nivoa lipoproteina a u plazmi (Lp(a)); inhibiranje stvaranja apolipoproteina A (apo(A)); (ii) prevenciju i/ili lečenje kardiovaskularnih bolesti, kao što su srčani sindrom X, ateroskleroza, infarkt miokarda, koronarna bolest srca, reperfuziona povreda, moždani udar, cerebralna ishemija, rana srčana ili rana kardiovaskularna bolest, hipertrofija leve komore, koronarna bolest arterija, hipertenzija, esencijalna hipertenzija, hitna akutna hipertenzivna kriza, kardiomiopatija, srčana insuficijencija, netolerancija na fizičku aktivnost, akutna i/ili hronična srčana insuficijencija, aritmija, srčana aritmija, sinkopija, angina pektoris, srčani bajpas i/ili reokluzija stenta, intermitentna klaudikacija (atheroschlerosis oblitterens), dijastolna disfunkcija i/ili sistolna disfunkcija; i/ili smanjenje krvnog pritiska, kao što je smanjenje sistolnog krvnog pritiska; lečenje kardiovaskularnih bolesti.
Prijava se, takođe, odnosi na postupak za (i) poboljšanje lipidnih parametara, kao što je prevencija i/ili lečenje dislipidemije, snižavanje ukupnih lipida u serumu; povećanje HDL-C; snižavanje LDL-C, snižavanje malog, gustog LDL-C; snižavanje VLDL-C; snižavanje triglicerida; snižavanje holesterola; snižavanje nivoa lipoproteina a u plazmi (Lp(a)); inhibiranje stvaranja apolipoproteina A (apo(A)); (ii) prevenciju i/ili lečenje kardiovaskularnih bolesti, kao što su srčani sindrom X, ateroskleroza, infarkt miokarda, koronarna bolest srca, reperfuziona povreda, moždani udar, cerebralna ishemija, rana srčana ili rana kardiovaskularna bolest, hipertrofija leve komore, bolest koronarne arterije hipertenzija, esencijalna hipertenzija, hitna akutna hipertenzivna kriza, kardiomiopatija, srčana insuficijencija, netolerancija na fizičku aktivnost, akutna i/ili hronična srčana insuficijencija, aritmija, srčana aritmija, sinkopija, angina pektoris, srčani bajpas i/ili reokluzija stenta, intermitentna klaudikacija (atheroschlerosis oblitterens), dijastolna disfunkcija i/ili sistolna disfunkcija; i/ili smanjenje krvnog pritiska, kao što je smanjenje sistolnog krvnog pritiska; lečenje kardiovaskularnih bolesti; pri čemu se primenjuje farmaceutski aktivna količina jedinjenja prema pronalasku, npr. analog peptida ili derivat prema pronalasku.
Iako su neke karakteristike pronalaska ovde prikazane i opisane, prosečnom stručnjaku u tehnici jasno je da će se dogoditi mnoge modifikacije, zamene, promene i ekvivalenti. Stoga se mora razumeti da su priloženi zahtevi namenjeni da pokriju sve takve modifikacije i promene.
PRIMERI
Ovaj eksperimentalni deo počinje listom skraćenica, a prati ga deo koji uključuje opšte postupke za sintezu i karakterizaciju analoga i derivata pronalaska. Zatim sledi niz primera koji se odnose na pripremu specifičnih EGF(A) jedinjenja pronalaska, uključujući analoge i derivate, a na kraju je uključen niz primera koji se odnose na aktivnost i svojstva ovih jedinjenja (odeljak sa naslovom farmakološki postupci).
Primeri služe da ilustruju pronalazak.
Lista skraćenica
AcOH: sirćetna kiselina
Ado: 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina
Aeep: 9-Amino-4,7-dioksanonanska kiselina
Aeeep: 12-Amino-4,7,10- trioksa-dodekanska kiselina
Alloc: Aliloksikarbonil
API: Aktivni farmaceutski sastojak
AUC: Oblast ispod krive
BG: Šećer u krvi
Boc: t-butiloksikarbonil
BSA: Albumin iz goveđeg seruma
Clt: 2-hlortritil
kolidin: 2,4,6-trimetilpiridin
DCM: dihlormetan
Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheksiliden)etil
DIC: diizopropilkarbodiimid
DIPEA: diizopropiletilamin
DMAP: 4-dimetilaminopiridin
EGF: Sličan epidermalnom faktoru rasta
EGF(A): Domen A sličan epidermalnom faktoru rasta F (tabela 5): Biodostupnost
Fmoc: 9-fluorenilmetiloksikarbonil
HDL: Lipoprotein visoke gustine
HEPES: 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansulfonska kiselina HFIP 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol ili heksafluorizopropanol HOAt: 1-hidroksi-7-azabenzotriazol
HOBt: 1-hidroksibenzotriazol
hPCKS9: humani PCSK9
HPLC: Tečna hromatografija visokih performansi
HSA: Albumin u humanom serumu
IC50: polovina maksimalne inhibitorne koncentracije
Inp: izonipekotinska kiselina
i.v. intravenozno
ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocicloheksilidene)-3-metilbutil LCMS: Tečna hromatografija-masena spektrometrija
LDL-R ili LDLr: LDL receptor
LDL: lipoprotein niske gustine
LDL-C: LDL holesterol
MeOH: metanol
Mmt: 4-metoksitritil
Mtt: 4-metiltritil
MRT: Srednje vreme zadržavanja
MSU: Metilsulfonilkarbamoilamino
NMP: N-metil pirolidon
OBz: benzoil estar
Ado: 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina
OSu: O-sukcinimidil estri (hidroksisukcinimidni estri) OtBu: terc butil estar
Oxyma Pure®: Etil estar cijano-hidroksiimino-sirćetne kiseline
Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil PBS: Fosfatno-puferni fiziološki rastvor
PD: Farmakodinamika
PK: Farmakokinetika
QC: Kontrola kvaliteta
RP: Reverzna faza
RP-HPLC: Reverzna faza tečne hromatografije visokih performansi
4
RT: Sobna temperatura
Rt: Vreme zadržavanja
s.c.: Supkutano
SD: Standardna devijacija
SEM: Standardna greška srednje vrednosti
SPPS: Sinteza peptida u čvrstoj fazi
tBu: terc butil
TFA: trifluorosirćetna kiselina
TIS ili TIPS: triizopropilsilan
Tmax: vreme da se dostigne Cmax
Tris: tris(hidroksimetil)aminometan ili 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol Trt: triphenilmetil (tritil)
Trx: traneksaminska kiselina
UPLC: Tečna hromatografija ultra performansi
TBS-T: Tris-puferni fiziološki rastvor
Hemijski postupci
Ovaj odeljak je podeljen na tri: Odeljak A koji se odnosi na opšte postupke pripreme jedinjenja pronalaska, odeljak B koji se odnosi na pripremu određenog broja specifičnih jedinjenja pronalaska, i odeljak C koji se odnosi na postupke detekcije i karakterizacije jedinjenja pronalaska i rezultate za niz specifičnih primera jedinjenja.
A. Postupci pripreme
Jedinjenja pronalaska se mogu dobiti postupkom opisanim u nastavku.
Priprema peptida, tj. EGF(A) peptida SEQ ID NO: 1 ili njegovih analoga: SPPS opšti postupci:
Fmoc-zaštićene amino-kiselinekoje će se koristiti mogu biti standardne preporučene: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH i Fmoc-Lys(Mtt)-OH ili Fmoc-Lys(Alloc)-OH koje snabdeva npr. Anaspec, Bachem, Iris Biotech ili NovabioChem. SPPS se može izvesti korišćenjem hemije zasnovane na Fmoc-u na Prelude Solid Phase Peptide Sintetizatoru iz Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 SAD). Pogodna smola za pripremu C-terminalnih karboksilnih kiselina je Vang smola prethodno napunjena amino-kiselinom kao što je Fmoc-Glu(tBu)-Wang smola (nisko punjenje, 0,35 mmol/g). U slučajevima kada je supstituent vezan za C-terminalni lizin, pogodna smola je prethodno napunjeni Fmoc-Lys(Mtt)-Wang. Pogodna smola za pripremu C-terminalnih peptidnih amida je H-Rink Amide-ChemMatrix smola (punjenje npr.0,52 nmol/g) ili Rink Amide AM polistirenska smola (Novabiochem, punjenje npr.0,62 mmol/g) ili slično. Fmoc-deprotekcija se postiže sa 20% piperidina u NMP. Kuplovanje peptida se vrši korišćenjem DIC/HOAt/kolidina ili DIC/Oxyma Pure sa ili bez kolidina sa ili bez preaktivacije ili korišćenjem DEPBt (3-(dietoksifosforiloksi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-jedan) /DIPEA za supresiju epimizacije npr. His tokom kuplovanja. Rastvori amino-kiselina/HOAt ili amino-kiselina/Oxyma Pure (0,3 M/0,3 M u NMP sa molarnim viškom od 3-10 puta) se dodaju u smolu, a zatim isti molarni ekvivalent DIC (3 M u NMP), a zatim kolidin (3 M u NMP). Na primer, sledeće količine 0,3 M rastvora amino-kiselina/HOAt mogu se koristiti po kuplovanju za sledeće količine reakcije: količina/mL, 0.05 mmol/1.5 mL, 0.10 mmol/3.0 mL, 0.25 mmol/7.5 mL.
Ako se koristi Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Mtt grupa se može ukloniti ispiranjem smole sa HFIP/DCM (75:25) (2 × 2 min), ispiranjem sa DCM i suspendovanjem smole u HFIP/DCM ( 75:25) (2 × 20 min) i naknadnim ispiranjem pre nego što se supstituent može uvesti na epsilonpoziciju lizinske grupe.
Ako se koristi Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Alloc grupa se može ukloniti tretiranjem smole sa Pd(PPh3)4(0.02 ekv) u prisustvu jednog ili više čistača u kombinaciji, npr. morfolin (6,0 ekv) i/ili kompleks dimetil borana (18,0 ekv) (30 min). Smola se zatim ispere sa MeOH, NMP ili DMF i IPA (izopropil alkoholom), tim redosledom, pre nego što se supstituent može uvesti na epsilonpoziciju lizinske grupe.
Vezivanje supstituenta (acilacija)
Supstituent se može uvesti u postupnom postupku pomoću Prelude Peptide sintetizatora kao što je gore opisano koristeći odgovarajuće zaštićene gradivne blokove, kao što su standardne amino-kiseline gore opisane, Fmoc-8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina ili Fmoc-Glu-OtBu. Uvođenje supstituenta se može postići korišćenjem gradivnog bloka, kao što je mono-terc-butil-estar oktadekandionske kiseline. Posle svakog koraka kuplovanja, neizreagovani peptidni intermedijer može biti zatvoren korišćenjem anhidrida sirćetne kiseline i kolidina u višku (> 10 ekv).
Uvođenje supstituenta na epsilon-azotu lizina postiže se korišćenjem lizina zaštićenog sa Mtt (Fmoc-Lys(Mtt)-OH), Alloc (Fmoc-Lys(Alloc)-OH) ili ivDde grupom (Fmoc- Lys(ivDde)-OH). Ugradnja γGlu ostataka u supstituent može se postići kuplovanjem sa amino-kiselinom Fmoc-Glu-OtBu.
Uvođenje svake grupe u supstituent može se postići korišćenjem produženog vremena kuplovanja (1 × 6 sati) nakon čega sledi zatvaranje anhidridom sirćetne kiseline ili alternativno sirćetnom kiselinom/DIC/HOAt/kolidinom.
Cepanje od smole
Nakon sinteze, smola se ispere sa DCM, a peptid se odcepi od smole tretmanom od 2-3 sata sa TFA/TIPS/vodom (95/2,5/2,5) ili TFA/EDT (1,2-etanditiol)/vodom (90/5/5) praćeno taloženjem sa Et2O (dietil etrom). Talog je ispran sa Et2O.
Oksidativno savijanje
Talog iz prethodnog koraka je rastvoren u DMSO i dodat u rastvor koji se sastoji od: 50 mM TRIS
5 mM CaCl2
3 mM Cisteina
0,3 mM Cistina
U MQ vodi, pH 8 do 8.8
Reakciona smeša je držana preko noći na sobnoj temperaturi ili dok LCMS ne pokaže potpunu reakciju.
Prečišćavanje i kvanitfikacija
Sirovi peptid (derivat) je zakišeljen sa TFA do pH 2-3 i prečišćen preparativnom HPLC reverzne faze (Waters Deltaprep 4000 ili Gilson) na koloni koja sadrži C8- ili C18-silika gel. Eluiranje je izvedeno sa rastućim gradijentom MeCN u vodi koja sadrži 0,1% TFA. Relevantne frakcije su proverene analitičkom HPLC ili UPLC. Frakcije koje sadrže čisti derivat ciljnog peptida se mešaju. Dodatni korak prečišćavanja može se uvesti korišćenjem drugog gradijenta, npr. koji sadrži 0,05 M NH4HCO3. Dobijeni rastvor se analizira (HPLC, LCMS) i proizvod (tj. derivat) se kvantifikuje korišćenjem hemiluminiscentnog azot specifičnog HPLC detektora (Antek 8060 HPLC-CLND) ili merenjem UV-apsorpcije na 280 nm. Proizvod je stavljen u staklene bočice. Bočice su zatvorene Millipore predfilterima od staklenih vlakana. Sušenje zamrzavanjem daje peptid trifluoroacetat kao belu čvrstu supstancu.
Vezivanje supstituenta (reduktivna alkilacija)
Prečišćeni analog peptida može biti podvrgnut reduktivnoj alkilaciji korišćenjem odgovarajućeg supstituenta za vezivanje albumina derivatizovanog sa aldehidnom funkcionalnošću.
Analog peptida je rastvoren u limunskoj kiselini pH = 5,5 i odgovarajući aldehid je rastvoren u vodi koja može da sadrži ciklodekstrin da bi se povećala rastvorljivost. Dodaje se redukcion sredstvo kao što je kompleks boran piridina rastvoren u MeOH i smeša se lagano mućka preko noći. Za optimalan prinos može biti potrebno naknadno dodavanje viška aldehida i redukcionog sredstva. Smeša se prečišćava korišćenjem gore opisane procedure.
4
B. Sinteza jedinjenja pronalaska
Jedinjenja pronalaska su pripremljena postupkom koji se suštinski ne razlikuje od opštih postupaka opisanih u nastavku.
Postupak A
Sinteza analoga LDL-R(293-332) peptida (bez supstituenta)
Korišćene amino-kiseline zaštićene Fmoc su standardno preporučene: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, BOC-Lys(Fmoc)-OH Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH i Fmoc-Lys(Mtt)-OH koje snabdeva npr. Anaspec, Bachem, Iris Biotech ili NovabioChem. SPPS je izveden korišćenjem hemije zasnovane na Fmoc na Prelude Solid Phase Peptide sintetizatoru iz Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 SAD). Korišćena je Wang smola prethodno napunjena amino-kiselinom kao što je Fmoc-Glu(tBu)-Wang smola (nisko punjenje, 0,35 mmol/g) ili slično. Fmoc-deprotekcija je postignuta sa 20% piperidina u NMP. Povezivanje peptida je izvedeno korišćenjem DIC/Oxyma Pure sa kolidinom. Rastvori amino-kiselina/Oxyma Pure (0,3 M/0,3 M u DMF-u u molarnom višku od 3-10 puta) su dodati u smolu, a zatim isti molarni ekvivalent DIC (3 M u NMP), a zatim kolidin (3 M u NMP).
Cepanje od smole
Posle sinteze, smola je isprana sa DCM, a peptid je odcepljen od smole tretmanom od 2-3 sata sa TFA/TIPS/DTT/vodom (92,5/2,5/2,5/2,5) nakon čega je usledilo taloženje dietil etrom. Talog je zatim ispran dietil etrom.
Oksidativno savijanje
Talog iz gornjeg koraka je rastvoren u DMSO i dodat u rastvor koji se sastoji od:
50 mM TRIS
5 mM CaCl2
3 mM Cisteina
0.3 mM Cistina
u MQ vodi, pH 8.0 do 8.8
Reakciona smeša je držana preko noći na sobnoj temperaturi ili dok LCMS nije pokazao potpunu reakciju.
Prečišćavanje i kvantifikacija
Sirovi peptid je zakiseljen sa TFA do pH 2-3 i prečišćen preparativnom HPLC reverzne faze (Waters Deltaprep 4000 ili Gilson) na koloni koja sadrži C8- ili C18-silika gel. Eluiranje je izvedeno sa rastućim gradijentom MeCN u vodi koja sadrži 0,1% TFA. Relevantne frakcije su analizirane korišćenjem UPLC. Frakcije koje sadrže čisti ciljni peptid su objedinjene. Dobijeni rastvor je analiziran (UPLC, LCMS) i peptidni derivat je kvantifikovan korišćenjem hemiluminiscentnog azot specifičnog HPLC detektora (Antek 8060 HPLC-CLND) ili merenjem UV-apsorpcije na 280 nm. Proizvod je stavljen u staklene bočice. Bočice su zatvorene Millipore predfilterima od staklenih vlakana. Sušenje zamrzavanjem je dalo trifluoracetatnu so peptida kao belu čvrstu supstancu.
Postupak B
Sinteza derivata analoga LDL-R(293-332) EGF(A) (sa supstituentom) (na smoli)
Sinteza EGF(A) peptida vezanog za smolu se odvija kao što je gore opisano.
Uvođenje supstituenta na epsilon-azot lizina na N-kraju sekvence je postignuto korišćenjem Boc-Lys(Fmoc)-OH. Uvođenje supstituenta na alfa-poziciju N-terminalne aminokiseline je postignuto korišćenjem standardne Fmoc-zaštićene amino-kiseline, tj. Fmoc-Gly-OH.
Za uvođenje supstituenta na epsilon-azot lizina u drugim pozicijama korišćen je Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Mtt grupa je uklonjena tretmanom sa HFIP/DCM (75:25) (2 × 2 min), nakon čega je usledilo ispiranje sa DCM. Smola je zatim resuspendovana u HFIP/DCM (75:25) (2×20 min ili 2×30 min) i zatim isprana sa DCM pre nego što je supstituent uveden na epsilon-poziciju lizinske grupe.
Grupe supstituenta su uvedene u postupnom postupku pomoću Prelude Peptide sintetizatora kao što je opisano u postupku A, koristeći odgovarajuće zaštićene gradivne blokove, kao što su standardne Fmoc zaštićene amino-kiseline opisane u postupku A, Fmoc-8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina ili Fmoc-Glu-OtBu. Uvođenje grupe masnih kiselina je postignuto korišćenjem odgovarajućeg gradivnog bloka, kao što je mono-terc-butil-estar oktadekandionske kiseline. U nekim slučajevima vreme kuplovanja je povećano ili je korak kuplovanja za svaki gradivni blok ponovljen.
Cepanje, oksidativno savijanje, prečišćavanje i kvantifikacija izvedeni su kako je opisano u postupku A.
Postupak C
Vezanje supstituenta u rastvoru (preko reduktivne alkilacije)
Prečišćeni peptid dobijen postupkom A je podvrgnut reduktivnoj alkilaciji korišćenjem pogodnog supstituenta derivatizovanog sa aldehidnom funkcionalnošću.
4
Liofilizirani peptidni prah je rastvoren u puferu limunske kiseline (40 mM, pH 5,55; koncentracija peptida: 4 mg/mL). Rastvor koji sadrži izabrani supstituent (10 ekv., 10 mg/mL) u 40% (w/v) vodenom rastvoru ciklodekstrina je dodat u rastvor peptida i lagano mešan okretanjem reakcione bočice. Ovom rastvoru je dodat boran piridin kompleks (100 ekv., 80 mg/mL rastvora u MeOH) u malim alikvotima, nakon čega je usledilo lagano okretanje reakcione bočice. Reakcioni rastvor je lagano mućkan na sobnoj temperaturi preko noći. Napredak reakcije je praćen pomoću LC-MS. Sledećeg jutra, reakcioni rastvor je zakišeljen do pH 2-3 korišćenjem TFA i prečišćen korišćenjem postupka opisanog iznad prema postupku A.
Postupak D
Vezivanje supstituenta (N-terminalna acilacija savijenog peptida u rastvoru)
Liofilizirani peptidni prah rastvoren je u K2HPO4puferu (20 mM, pH 8,15) do ciljne koncentracije od 5 mg/mL. Rastvor 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanske kiseline u DMSO (4 ekv.; 4 mg/mL) je dodat u četiri alikvota. Posle dodavanja svakog alikvota, rastvor peptida je nežno mešan inverzijom reakcione bočice. Zatim je izmerena pH vrednost reakcionog rastvora i podešena na pH 8.0-8.3 dodavanjem malih porcija N,N-diizopropiletilamina, nakon čega je rastvor ostavljen da stoji na sobnoj temperaturi. Napredovanje reakcije je praćeno LC-MS. Posle tri sata rastvor je zakiseljen do pH 5.9 sa TFA i prečišćen gore opisanim postupkom.
B.1. Sinteza protraktora i linker elemenata
Za sintezu mono-terc-butil estra oktadekandionske kiseline: videti patentnu prijavu WO 2010102886. Odgovarajući mono-terc-bitil estri C14-, C16- i C20 dikiseline mogu se pripremiti u skladu sa tim. Za sintezu 14-sulfo-heksadekanske kiseline i sulfonsira 16-sulfo-heksadekanske kiseline videti WO2015071355. Za sintezu 16-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanske kiseline i 13-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanske kiseline videti WO2006005667.
13-(metilsulfonilkarbamoilamino) tridekanska kiselina.
Hem.6-OH, pri čemu je n=12:
O O
4
Ovaj molekul je napravljen korišćenjem modifikovane procedure iz Luckhurst et al. Tetrahedron Letters Volume 48, Issue 50, 2007, str.8878–8882 http://dx.doi.org/10.1016/j.tetlet.2007.10.046
Trietilamin (4,46 mL, 32,0 mmol) i etil hloroformat (3,05 mL, 32,0 mmol) su zatim dodati u rastvor 14-(terc-butoksi)-14-oksotetradekanske kiseline (1, C14(OtBu)-gOH, 6,29 g, 20,0 mmol) u acetonu (176 mL) na 0°C. Posle 30 minuta na 0°C, dodat je rastvor natrijum azida (2,60 g, 40,0 mmol) u vodi (12 mL) i smeša je mešana 2 sata na 0°C. Smeša je koncentrovana pod vakumom (na 30°C) i sipana u vodu sa ledom (300 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana etil acetatom (3 × 250 mL); organski ekstrakti su kombinovani i isprani vodom (200 mL), 10% vodenim rastvorom natrijum hidrogenkarbonata (200 mL) i vodom (200 mL); osušeni preko anhidrovanog magnezijum sulfata i upareni do suva da bi se dobila smeša terc-butil 14-azido-14-oksotetradekanoata i terc-butil 14-izocijanat-14-oksotetradekanoata kao bledo žutog ulja.
Metansulfonamid (1,52 g, 16,0 mmol), kalijum karbonat (6,63 g, 48,0 mmol) dodati su u rastvor smeše terc-butil 14-azido-14-oksotetradekanoata i terc-butil 14-izocijanato-14-oksotetradekanoata (5.43 g, 16,0 mmol) u suvom toluenu (50 mL). Reakciona smeša je zagrevana na 85°C preko noći. Dodata je voda (100 mL), a zatim 1 M vodeni rastvor hlorovodonične kiseline (pH je podešen na pH=4). Smeša je ekstrahovana dietil etrom (4 × 150 mL), osušena preko anhidrovanog magnezijum sulfata i uparena u vakuumu da bi se dobio tercbutil 13-(3-(metilsulfonil)ureido)tridekanoat.
1H NMR spektar (300 MHz, DMSO, dH): 10,01 (s, 1 H); 6,42 (t, J=4,7 Hz, 1 H); 3,20 (s, 3 H); 3,02 (q, J=6,7 Hz, 2 H); 2,16 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 1,52-1,33 (m, 13 H); 1,30-1,11 (m, 16 H).
Trifluorosirćetna kiselina (21,0 mL) i voda (2,50 mL) se dodaju u kapima u rastvor tercbutil 13-(3-(metilsulfonil)ureido)tridekanoata (3, 6,30 g, 15,5 mmol) u dihlormetanu (30 mL). Reakciona smeša je mešana 3 sata na sobnoj temperaturi. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom, dajući 13-(3-(metilsulfonil)ureido)tridekansku kiselinu.
1H NMR spektar (300 MHz, DMSO, dH): 10,02 (s, 1 H); 6,43 (t, J=4,5 Hz, 1 H); 3,20 (s, 3 H); 3,02 (q, J=6,6 Hz, 2 H); 2,18 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 1,56-1,33 (m, 4 H); 1,24 (s, 16 H).
13-(3-Hidroksiisoksazol-5-il)tridecanska kiselina
Hem.5-OH, pri čemu je n=12:
4
O
Ovaj molekul je napravljen korišćenjem modifikovane procedure od Sørensen et al. J. Org. Chem., 2000, 65 (4), pp 1003–1007. DOI: 10.1021/jo991409d
14-(terc-Butoksi)-14-oksotetradekanska kiselina (1, 30,0 g, 95,4 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (43,3 g, 209 mmol) and 4-dimetilaminopiridin (25,6 g, 20,9 mmol) su rastvoreni u anhirdovanom dihlormetanu (700 mL) i 2,2-dimetil-1,3-dioksan-4,6-dion (2, 20,6 g, 143 mmol) je dodat u rastvor. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 sati.
Isparljive supstance su zatim uparene i smeša je razblažena dietil etrom (500 mL) i beli talog je filtriran. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, razblažen dietil etrom (300 mL) i ekstrahovan sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (3 × 100 mL) i slanim rastvorom (1 × 100 mL). Organski deo je osušen sa natrijum sulfatom i uparen pod sniženim pritiskom da bi se dobio terc-butil 14-(2,2-dimetil-4,6-diokso-1,3-dioksan-5-il)-14-oksotetradekanoat kao žuto ulje. Sirovi proizvod je korišćen za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 3,07 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 2,20 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 1,74 (s, 6 H); 1,71-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,36-1,23 (m, 16 H).
Sirovi proizvod odozgo je rastvoren u etanolu (300 mL) i dobijeni rastvor je mešan na 80°C tokom 3 sata, a zatim preko noći na sobnoj temperaturi. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,063 mm; eluent: cikloheksan/etil acetat 9:1) da bi se dobio 1-etil 16-metil 3-oksoheksadekandioat kao bezbojno ulje.
1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 4,21 (q, J=7,2 Hz, 2 H); 3,44 (s, 2 H); 2,54 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 2,21 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,38-1,21 (m, 19 H).
Natrijum hidroksid (1,09 g, 27,3 mmol) je rastvoren u metanolu (40,0 mL) i vodi (10,0 mL) na -30°C u atmosferi argona. Gorenavedeni estar (4, 10,0 g, 26,0 mmol) je rastvoren u metanolu (40 mL) i dimetoksietanu (50 mL) i dodat u kapima u reakcionu smešu na -30°C.
Nakon 20 minuta, rastvor hidroksilamin hidrohlorida (3,61 g, 52,0 mmol) i natrijum hidroksid (2,18 g, 54,6 mmol) u dimetoksietanu (10 mL) i voda (10,0 mL) su dodavani u kapima i reakciona smeša je mešana 3 sata na -30°C. Smeša je zatim ugašena acetonom ( 5 mL) i posle 5 minuta odjednom sipana u koncentrovanu hlorovodoničnu kiselinu (70 mL) i zagrevana 70 minuta na 80°C. Sve isparljive materije su zatim uklonjene pod sniženim pritiskom, čvrsta supstanca je rastvorena dihlormetanom (400 mL) i ekstrahovana destilovanom vodom (100 mL)
4
i slanim rastvorom (70 mL). Organski deo je osušen natrijum sulfatom. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,063 mm; eluent: cikloheksan/etil acetat 3:1) da bi se dobio metil 13-(3-hidroksiizoksazol-5-il)tridekanoat kao bela čvrsta supstanca.
1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 5,66 (s, 1 H); 3,67 (s, 3 H); 2,63 (t, J=7,6 Hz, 2 H); 2,31 (t, J=7,6 Hz, 1 H); 1,72-1,55 (m, 4 H); 1,40-1,19 (m, 16 H).
Metil 13-(3-hidroksiizoksazol-5-il)tridekanoat (5, 6,20 g, 19,9 mmol) je rastvoren u metanolu (60,0 mL) i vodi (20,0 mL), dodat je litijum hidroksid monohidrat (4,04 g, 96,3 mmol) i smeša je mešana 16 sati na sobnoj temperaturi. Isparljive materije su zatim uklonjene pod sniženim pritiskom i dodata je voda (50,0 mL), a zatim 1 M vodenog rastvora hlorovodonične kiseline (50,0 mL). Talog je filtriran i ispran vodom (2 × 100 mL), a zatim osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobila 13-(3-hidroksiizoksazol-5-il)tridekanska kiselina kao čvrsta supstanca bež boje.
1H NMR spektar (300 MHz, DMSO-d6, dH): 5,74 (s, 1 H); 2,57 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 2,18 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 1,63-1,41 (m, 4 H); 1,34-1,14 (m, 16 H).
B.2 Sinteza prekursora intermedijarnih supstituenata za reduktivnu alkilaciju
18-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-formilfenil)metilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-oksooktadekanska kiselina
2-Hlorotritil smola od 100-H20 O0 meša (42,6 g, 42,6 mmol) je ostavljena da nabubri u suvom dihlormetanu (205 mL) tokom 20 min. Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (13,7 g, 35,5 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (23,5 mL, 135 mmol) u suvom dihlormetanu (30 mL) je dodato u smolu i smeša je mućkana 3 sata. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-
4
diizopropiletilamina (12,4 mL, 70,9 mmol) u smeši metanol/dihlormetana (4:1, 250 mL, 2 × 5 min). Zatim je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 150 mL), dihlormetanom (3 × 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), 2-propanolom (2 × 150 mL) i dihlormetanom (200 mL, 2 × 150 mL). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (20,5 g, 53,2 mmol), O-(6-hloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 18,9 g, 53,2 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (16,7 mL, 95,7 mmol) u N,N-dimetilformamidu (100 mL) i dihlorometana (50 mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 1 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 150 mL), dihlormetanom (3 × 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (155 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), 2-propanolom (2 × 150 mL) i dihlormetanom (200 mL, 2 × 150 mL). Rastvor Fmoc-Glu-OtBu (22,6 g, 53,2 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 18,9 g, 53,2 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (16,7 mL, 95,7 mmol) u N,N-dimetilformamidu (155 mL) je dodat smoli i smeša je mućkana 1 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 150 mL), dihlormetanom (2 × 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (150 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), 2-propanolom (2 × 150 mL) i dihlormetanom (200 mL, 2 × 150 mL). Rastvor mono-terc-butil estra oktadekandionske kiseline (19,7 g, 53,2 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 18,9 g, 53,2 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (16,7 mL, 95,7 mmol) u smeši N,N-dimetilformamida/dihlormetana (1:4, 200 mL) je dodat u smolu. Smola je mućkana 2 sata, filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), dihlormetanom (2 × 150 mL), metanolom (2 × 150 mL) i dihlormetanom (300 mL, 6 × 150 mL). Proizvod je odvojen od smole tretmanom sa 2,2,2-trifluoroetanolom (200 mL) tokom 19 sati. Smola je filtrirana i isprana dihlormetanom (2 × 150 mL), smešom 2-propanola/dihlormetana (1:1, 2 × 150 mL), 2-propanolom (150 mL) i dihlormetanom (2 × 150 mL). Rastvori su kombinovani; rastvarač je uparen i sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan/metanol 1:0-9:1). Čisti proizvod je osušen pod vakumom i dobijen kao žuto ulje.
Prinos terc-butil estra 17-{(S)-1-terc-butoksikarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-karboksimetoksietoksi)-etilkarbamoil]-metoksi}-etoksi)-etilkarbamoil]-propilkarbamoil}- heptadekanske kiseline: 25,85 g (86%).
RF (SiO2, hloroform/metanol 85:15): 0,25.
1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,38 (bs, 1 H); 7,08 (bs, 1 H); 6,61 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 4,43 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,78-3,39 (m, 16 H); 2,31 (t, J=6,9 Hz, 2 H); 2,27-2,09 (m, 5 H); 2,01-1,84 (m, 1 H); 1,69-1,50 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,24 (bs, 24 H).
LC-MS m/z: 846,6 (M+H)+.
Terc-butil estar (4-Formil-benzil)-karbaminske kiseline (Boc-aminometilbenzaldehid, 1,54 g, 6,60 mmol) rastvoren je u dihlormetanu (50 mL) i dodat je rastvor hlorovodonične kiseline u dioksanu (3,8 M, 20 mL, 76 mmol). Smeša je mešana 16 sati i čvrsti materijal je istaložen iz rastvora. Svi rastvarači su uklonjeni isparavanjem. Terc butil estar 17-{(S)-1-terc-Butoksikarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-karboksimetoksi-etoksi)-etilkarbamoil]-metoksi}-etoksi)-etilkarbamoil]-propilkarbamoil}-heptadekanske kiseline (5,08 g, 6.00 mmol), etil-(N’,N’-dimetilamino)propilkarbodiimid hidrohlorid (EDC, 1,73 g, 9,00 mmol), N,N-dimetilaminopiridin (DMAP, 0,037 g, 0,30 mmol) and dihlormetan (50 mL) su dodati. Smeša je mešana i dodat je diizopropiletilamin (2 mL, 11,6 mmol) u 3 porcije. Reakciona smeša je mešana 2 sata i rastvarači su upareni. Ostatak je rastvoren u dihlormetanu (10 mL) i dodat je u kapima rastvor hlorovodonične kiseline dok pH nije bio niži od 5. Rastvor je podvrgnut hromatografiji na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5 ) da bi se obezbedio supstituent kao žuto ulje.
Prinos: 3,15 g (54%).
1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 9,99 (s, 1 H); 7,85 (d, J=7,9 Hz, 2 H); 7,54-7,43 (m, 3 H); 7,06 (t, J=5,5 Hz, 1 H); 6,86 (t, J=5,6 Hz, 1 H); 6,48 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 4,58 (d, J=6,2 Hz, 2 H); 4,45-4,36 (m, 1 H); 4,09 (s, 2 H); 3,94 (s, 2 H); 3,73-3,37 (m, 16 H); 2,32-2,05 (m, 7 H); 1,99-1,80 (m, 1 H); 1,69-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,33-1,20 (m, 24 H).
LC-MS m/z: 963,5 (M+H)+.
(2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-formilfenil)metilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-5-okso-2-(16-sulfoheksadekanoilamino)pentanska kiselina
HO O
2-Hlorotritil smola od 100-200 meša 1,8 mmol/g (1, 8,40 g, 14,3 mmol) je ostavljena da nabubri u suvom dihlormetanu (150 mL) tokom 30 minuta. Rastvor Fmoc-Ado-OH (2,82 g, 9,50 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,30 mL, 36,1 mmol) u suvom dihlormetanu (~150 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana 24 sata. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-
1
diizopropiletilamina (3,30 mL, 19,0 mmol) u smeši metanol/dihlormetana (4:1, 2 × 150 mL, 2 × 5 min). Zatim je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), dihlormetanom (3 × 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), 2-propanolom (3 × 150 mL) i dihlormetanom (3 × 150 mL). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-Ado-OH, 4,80 g, 16,2 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 5,74 g, 16,2 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (4,47 mL, 25,7 mmol) u N,N-dimetilformamidu (150 mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), dihlormetanom (3 × 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), 2-propanolom (3 × 150 mL) i dihlormetanom (3 × 150 mL). Rastvor 1-terc-butil estra (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-pentandionske kiseline (Fmoc-Glu-OtBu, 6,87 g, 16,2 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 5,74 g, 16,2 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (4,47 mL, 25,7 mmol) u N,N-dimetilformamidu (150 mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), dihlormetanom (3 × 150 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), 2-propanolom (3 × 150 mL) i dihlormetanom (3 × 150 mL). Rastvor 16-((4-((terc-butoksikarbonil)amino)-2,2-dimetilbutoksi)sulfonil)heksadekanske kiseline (6,62 g, 12,4 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TCTU, 4,39 g, 12,4 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (4,47 mL, 25,7 mmol) u smeši N,N-dimetilformamida/dihlormetana L1 (1/1, 150 mL) je dodat smoli i smeša je mućkana 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 × 150 mL), metanolom (5 × 150 mL) i dihlormetanom (10 × 150 mL). Proizvod je odvojen od smole tretmanom sa 2,2,2-trifluoroetanolom (150 mL) tokom 24 sata. Smola je filtrirana i isprana dihlormetanom (3 × 150 mL). Rastvori su kombinovani, rastvarači su upareni i sirovi proizvod (7,80 g) je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan/metanol 100:2 do jedinjenja dihlormetan/metanol 100:10) da bi se dobilo intermedijarno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca.
Prinos: 4,00 g (42%).
RF (SiO2, dihlormetan/metanol 8:1): 0,50.
1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,79-7,65 (m, 1 H); 7,36-7,20 (m, 1 H); 6,86 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 4,49-4,63 (m, 1 H); 4,44-4,29 (m, 1 H); 4,07-3,93 (m, 4 H); 3,90 (s, 2 H);
2
3,77-3,35 (m, 16 H); 3,25-3,02 (m, 4 H); 2,44-1,75 (m, 8 H); 1,72-1,38 (m, 22 H); 1,38-1,18 (m, 22 H); 1,00 (m, 6 H).
LC-MS m/z: 1012,3 (M+H)+.
Intermedijarno jedinjenje odozgo (3,77 g, 3,73 mmol), N,N-diizopropiletilamin (1,75 mL, 10,1 mmol), [1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-1-ol (HOAt, 0,51 g, 3,73 mmol), N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC·HCl, 1,43 g, 7,46 mmol) rastvoreni su u dihlormetanu (120 mL). Dodat je 4-formil-benzil-amonijum hlorid (5, 0,77 g, 4,48 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 24 sata. Posle ovog vremena reakciona smeša je uparena, rastvorena u etil acetatu (300 mL) i isprana sa 0,5 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (200 mL).
Organska faza je odvojena, isprana vodom (200 mL) i osušena preko magnezijum sulfata. Etil acetat je uparen i sirova smeša je prečišćena fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan u dihlormetanu/metanolu 100:5) da bi se dobio zaštićeni aldehid kao bela čvrsta supstanca.
Prinos: 3,00 g (71%).
RF (SiO2, dihlormetan/metanol 10:1): 0,70.
1H NMR spectrum (300 MHz, CDCl3, dH): 9,99 (s, 1 H); 7,85 (d, J=8,1 Hz, 2 H); 7,64-7,38 (m, 3 H); 7,14-6,97 (m, 1 H); 6,91-6,76 (m, 1 H); 6,54-6,43 (m, 1 H); 4,58 (d, J=6,2 Hz, 2 H); 4,47-4,32 (m, 1 H); 4,09 (s, 2 H); 3,88 (s, 2 H); 3,81-3,30 (m, 16 H); 3,22-3,02 (m, 4 H); 2,38-2,08 (m, 4 H); 1,96-1,71 (m, 5 H); 1,71-1,16 (m, 41 H); 0,99 (m, 6 H).
LC-MS m/z: 1129,5 (M+H)+.
Zaštićeni aldehid odozgo (3,00 g, 2,66 mmol) je mešan sa smešom trifluorosirćetne kiseline (15 mL) i vode (1 mL) tokom 3 sata. Posle ovog vremena smeša je uparena nekoliko puta sa dihlormetanom i toluenom pod sniženim pritiskom. Ostatak se sipa u smešu voda/acetonitril (1/1, 15 mL). pH je podešen na 8.0 sa zasićenim vodenim rastvorom trinatrijum fosfata i dobijeni rastvor je mešan 20 minuta na 50°C. pH je podešen na 6.0 sa zasićenim vodenim rastvorom kalijum hidrogen sulfata. Ostatak je desalinizovan hromatografijom reverzne faze (DeltaPak, C18, 15 mm 50 mm × 500 mm, acetonitril/voda 5-15%/15 min., 5-55%/180 min. 0,05% TFA). Rastvarači su uklonjeni sušenjem zamrzavanjem da bi se dobio supstituent kao beli prah.
Prinos: 0,66 g (28%).
H NMR spectrum (300 MHz, D2O, dH): 9,81 (s, 1 H); 7,79 (d, J=7,7 Hz, 2 H); 7,41 (d, J=7,9 Hz, 2 H); 4,44 (s, 2 H); 4,32-4,19 (m, 1 H); 4,05 (s, 2 H); 3,90 (s, 2 H); 3,74-3,43 (m, 12 H); 3,38-3,18 (m, 4 H); 2,83-2,60 (m, 2 H); 2,37-1,76 (m, 6 H); 1,76-1,37 (m, 4 H); 1,34-0,91 (m, 22 H).
LC-MS m/z: 873,8 (M+H)+.
N-((1-(4-Formilphenil)-3,12,21-triokso-5,8,14,17-tetraoksa-2,11,20-triazatetrakosan-24-il)sulfonil)-16-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanamid
Shema reakcije:
4 45%
Wang smola 0,68 mmol/g (20,5 g, 13,9 mmol) je ostavljena da nabubri u tetrahidrofuranu (200 mL) tokom 20 minuta. Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-Ado-OH, 16,1 g, 41,8 mmol) i 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 0,17 g , 1,39 mmol) i N,N'-diizopropilkarbodiimid (DIC, 6,47 mL, 41,8 mmol) u tetrahidrofuranu (200 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana 18 sati. Zatim je smola filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL), dihlormetanom (2 × 180 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL). Smola je tretirana rastvorom anhidrida sirćetne kiseline (13,2 mL, 139 mmol) i piridina (11,3 mL, 139 mmol) u N,N-dimetilformamidu (180 mL). Zatim je smola filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL), dihlormetanom (2 × 180 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 180 mL). Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL), dihlormetanom (2 × 180 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline
4
(Fmoc-Ado-OH, 10,8 g, 27,9 mmol), 5-hlor-1-(( dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1H-benzo[d][1,2,3]triazol 3-oksid tetrafluoroborata (TCTU, 9,91 g, 27,9 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (7,28 mL, 41,8 mmol) u N,N-dimetilformamidu (180 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana 2 sata. Zatim je smola filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL), dihlormetanom (2 × 180 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu (1 × 5 min, 1 × 30 min, 2 × 180 mL). Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL), dihlormetanom (2 × 180 mL) i N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL). Rastvor 4-(N-(16-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanoil)sulfamoil)butanske kiseline (THA-SBA-OH, 8,91 g, 18,8 mmol), 1-((dimetilamino)(dimetiliminio)metil)-1H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid heksafluorofosfata (HATU, 7,16 g, 18,8 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (5,71 mL, 32,8 mmol) u smeši NN,N-dimetilformamida (90 mL) i dihlormetana (90 mL) je dodato smoli i smeša je mućkana 18 sati.
Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 × 180 mL), dihlormetanom (2 × 180 mL), 2-propanolom (2 × 180 mL) i dihlormetanom (10 × 180 mL). Proizvod je odvojen od smole tretiranjem smešom trifluosirćetne kiseline (150 mL) i vode (7,5 mL) tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana dihlormetanom (2 × 150 mL). Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i ostatak je tretiran dietil etrom (100 mL). U rastvor intermedijera (7,90 g, 10,3 mmol) u tetrahidrofuranu (100 mL) dodat je litijum hidroksid monohidrat (1,74 g, 41,4 mmol) u vodi (100 mL). Rastvor je mešan 18 sati. Rastvor je zakišeljen sa 10% vodenim rastvorom kalijum hidrogen sulfata dok se ne postigne pH=3, nakon čega je usledilo zasićenje sa natrijum hloridom. Organska faza je uklonjena, vodena faza je ekstrahovana etil acetatom (1 × 300 mL). Kombinovane organske faze su osušene preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio intermedijer kao beli prah.
Prinos: 5,50 g (52%).
1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,22 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,83-3,61 (m, 12 H); 3,59-3,43 (m, 6 H); 3,02 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 2,49 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 2,41 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 2,22-2,09 (m, 2 H); 1,89-1,75 (m, 2 H); 1,74-1,60 (m, 2 H); 1,47-1,26 (m, 22 H).
Rastvor gornjeg jedinjenja (2,90 g, 3,80 mmol), 4-aminometilbenzaldehid hidrohlorida (0,78 g, 4,56 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodiimida (DCC, 0,78 g, 3,80 mmol) i 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 1,02 g.8,35 mmol) u suvom dihlormetanu (100 mL) je mešano 18 sati. Talog je odfiltriran i rastvor je ispran sa 10% vodenim rastvorom kalijum hidrogen sulfata (2 × 100 mL). Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, a ostatak je kristalizovan iz tetrahidrofurana (30 mL). Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,063 mm; eluent: dihlormetan/metanol, 20:1-5:1) dalo je krajnji proizvod u obliku bledo žutog praha.
Prinos: 1,51 g (45%).
1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 9,96 (s, 1H); 7,91 (d, J=7,9 Hz, 2 H); 7,92 (d, J=7,9 Hz, 2 H); 4,63 (s, 2 H); 4,21 (s, 2 H); 4,08 (s, 2 H); 3,81-3,57 (m, 12 H); 3,54-3,41 (m, 6 H); 3,02 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 2,47 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 2,38 (t, J=7,4 Hz, 2 H); 2,19-2,07 (m, 2 H); 1,86-1,72 (m, 2 H); 1,70-1,57 (m, 2 H); 1,43-1,23 (m, 22 H).
LC-MS čistoća: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm × 50 mm, acetonitril/voda 20:50 do 100:0 0,1% FA): 3,58 min.
LC-MS m/z: 882,0 (M+H)+.
Ukupno je pripremljeno 29 supstituenata koji su ovde dati u daljem tekstu specificirajući Z1-Z10 elemente pojedinačnih supstituenata.
Postupci za detekciju i karakterizaciju
LCMS postupci
LCMS01 (vidi Tabelu 1)
Tabela 1: LC-sistem: Waters Acquity UPLC. Linearni gradijent: 5 % do 95 % B.
LCMS027 (vidi Tabelu 2)
Tabela 2: Agilent 1290 infinity series UPLC, LC/MSD TOF, 6 min, 5% do 95% B, 100 – 3200 amu, C18
LCMS029 (vidi Tabelu 3):
Tabela 3: Waters Acquity UPLC sistem, 6min (3,5min), 5-(15-35)-100-100-5% B
C. Primerna jedinjenja
C.1. Priprema primernih jedinjenja
Primer 1
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino] metil]fenil]metil-[Ala299,Leu301,Ile307,Arg309,Lys310]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O H
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 2.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A i C
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1743,9; Pronađeno m/4 = 1308,1; Pronađeno m/5 = 1046,7; Izr. masa = 5229,1; Pronađena masa = 5229.6
Primer 2
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino] metil]fenil]metil-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptid
vaj peptid je SEQ ID NO: 3.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A i C
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1749,5; Pronađeno m/4 = 1312,4; Pronađeno m/5 = 1050,1; Izr. masa = 5246,0; Pronađena masa = 5246,4
Primer 3
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 4.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1314,6; Pronađeno m/5 = 1052,1; Izračunata masa = 5255,9
Primer 4
N{Epsilon-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 3.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1282,3; Pronađeno m/5 = 1026,3; Izračunata masa = 5126,8
Primer 5
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino] metil]fenil]metil-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 6.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A i C
LCMS029: Izr. masa = 5246,92; Pronađena masa = 5247,37
1
Primer 6
N{Epsilon-299}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys299,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 7.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1714,2; Pronađeno m/4 = 1286,1; Izr. masa = 5140,85
Primer 7
N{Epsilon-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O O
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 8.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1700,8; Pronađeno m/4 = 1275,8; Pronađeno m/5 = 1020,9, Izr. masa 5099,7; Pronađena masa = 5099,75
Primer 8
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(16-sulfoheksadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]me til]fenil]metil-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
2
3:Ovaj peptid je SEQ ID NO: 6.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A i C
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1757,1; Pronađeno m/4 = 1318,04; Izr. masa = 5268,95;
Pronađeno masa = 5269,39
Primer 9
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil],N{Ep silon-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-peptid
O
4:Ovaj peptid je SEQ ID NO: 8.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1939,2; Pronađeno m/4 = 1454,2; Izr. masa = 5815,6; Pronađena masa = 5816,1
Primer 10
N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 11.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1282,6; Pronađeno m/5 = 1026,3; Izr. masa = 5126,8
Primer 11
N{Epsilon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 12.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1300,6; Pronađeno m/5 = 1040,5; Izr. masa = 5198,9
Primer 12
N{Alfa}(N{Epsilon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O O O
vaj peptid je SEQ ID NO: 13.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
4
LCMS029: Pronađeno m/2 = 3022,4; Pronađeno m/3 = 2015,3; Pronađeno m/4 = 1511,8;
Pronađeno m/5 = 1209,6; Pronađena masa = 6043,6; Izr. masa = 6042,9
Primer 13
N{Alfa}(N{Epsilon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
O
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 13.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/2 = 3030,4; Pronađeno m/3 = 2020,7; Pronađeno m/4 = 1515,7;
Pronađeno m/5 = 1212,8; Pronađena masa = 6059,7; Izr. masa = 6058,8
Primer 14
N{Alfa}(N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
aj peptid je SEQ ID NO: 15.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1497,4; Pronađeno m/5 = 1198,3; Izr. masa = 5986,7
Primer 15
N{Alfa}(N{Epsilon-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
aj peptid je SEQ ID NO: 16.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1987,7; Pronađeno m/4 = 1491,0; Pronađeno m/5 = 1193,0; Izr. masa = 5959,7
Primer 16
N{Alfa}(N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
vaj peptid je SEQ ID NO: 17.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1500,9; Pronađeno m/5 = 1201,2; Izr. masa = 6000,8
Primer 17
N{Alfa}(N{Epsilon-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
vaj peptid je SEQ ID NO: 18.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1498,2; Pronađeno m/5 = 1198,7; Izr. masa = 5986,7
Primer 18
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O O
vaj peptid je SEQ ID NO: 19.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS027: Pronađeno m/2 = 2635,7; Pronađeno m/3 = 1757,5; Pronađeno m/4 = 1318,4; Pronađeno m/5 = 1054,9; Izr. masa = 5270,0 ; Pronađena masa = 5270,5
Primer 19
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 6.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A i C
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5127,8; Pronađeno m/3 = 1710,0; Pronađeno m/4 = 1282,3; Pronađeno m/5 = 1026,5; Izr. masa = 5127,8
Primer 20
N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptid
aj peptid je SEQ ID NO: 21.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1286,1; Pronađeno m/5 = 1029,1; Izr. masa = 5140,9
Primer 21
N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 22. O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1282,9; Pronađeno m/5 = 1026,5; Izr. masa = 5127,8
Primer 22
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Gln312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 23.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1709,8; Pronađeno m/4 = 1282,6; Izr. masa = 5126,8; Pronađena masa = 5127,3
Primer 23
N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O
vaj peptid je SEQ ID NO: 24.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/2 = 2571,2; Pronađeno m/3 = 1714,5; Pronađeno m/4 = 1286,1; Pronađeno m/z = 5141,4; Izr. masa = 5140,9
Primer 24
N{Epsilon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 2 S5.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/2 = 2607,2; Pronađeno m/3 = 1738,5; Pronađeno m/4 = 1304,1; Pronađena masa = 5213,5; Izr. masa = 5212,9
Primer 25
N{Alfa-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil],N{Ep silon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
O
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 26.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1479,7; Izr. masa = 5914,8 Da ; Pronađena masa = 5914,3
Primer 26
N{Epsilon-300}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys300,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
H
O O O
vaj peptid je SEQ ID NO: 27.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1286,9; Pronađeno m/5 = 1029,7; Izr. masa = 5141,8
Primer 27
N{Epsilon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Lys294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 28. O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5957,6; Pronađeno m/4 = 1490,4; Pronađeno m/5 = 1192,3; Izr. m/1 = 5957,7
Primer 28
N{Epsilon-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-
1
karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys293,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptid
O
vaj peptid je SEQ ID NO: 29.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5929,4; Pronađeno m/4 = 1483,3; Pronađeno m/5 = 1186,8; Izr. m/1 = 5929,7
Primer 29
N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 30.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1700,8; Pronađeno m/4 = 1275,8; Pronađeno m/5 = 1020,9; Izr. masa = 5099,8 (1A)
Primer 30
N{Epsilon-318}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys318]-LDL-R-(293-332)-peptid
2
vaj peptid je SEQ ID NO: 31.
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1286,5; Pronađeno m/5 = 1029,5; Izr. masa = 5142,8
Primer 31
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L
O N
H H
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 32. O
O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 6002,8; Pronađeno m/4 = 1501,6; Pronađeno m/5 = 1201,5; Calc m/1 = 6002,7
Primer 32
N{Epsilon-326}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys326]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 33.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1719,8; Pronađeno m/4 = 1290,1; Pronađeno m/5 = 1032,3; Izr. masa = 5156,8
Primer 33
N{Epsilon-325}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys325]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: S 34. S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1715,1; Pronađeno m/4 = 1286,6; Pronađeno m/5 = 1029,5; Izr. masa = 5142,8
Primer 34
N{Epsilon-323}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys323]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: S 35. S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5108,8; Pronađeno m/3 = 1703,8; Pronađeno m/4 = 1278,1;
Pronađeno m/5 = 1022,5
Primer 35
N{Epsilon-322}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys322]-LDL-R-(293-332)-peptid
4
<OH>
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 3 S6. S S S Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5198,9; Pronađeno m/3 = 1733,8; Pronađeno m/4 = 1300,6;
Pronađeno m/5 = 1040,7
Primer 36
N{Epsilon-320}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys320]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ova
S S S S
j peptid je SEQ ID NO: 37.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1720,4; Pronađeno m/4 = 1290,3; Pronađeno m/5 = 1032,5; Izr. masa = 5158,8
Primer 37
N{Epsilon-329}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys329]-LDL-R-(293-332)-peptid
S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 38. S S S Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/2 = 2550,7; Pronađeno m/3 = 1700,8; Pronađeno m/4 = 1275,9; Izr. masa = 5099,8; Pronađena masa = 5100,5
Primer 38
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptid
S
aj peptid je SEQ ID NO: 39.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5143,0; Pronađeno m/4 = 1286,0; Pronađeno m/5 = 1029,0; Izr. m/1 = 5142,8
Primer 39
N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: S S
40.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/2 = 2564,7; Pronađeno m/3 = 1710,2; Pronađeno m/4 = 1282,9; Pronađeno 5127,8; Izr. masa = 5128,5
Primer 40
N{Epsilon-316}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys316]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 41.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1709,7; Pronađeno m/4 = 1282,3; Pronađeno m/5 = 1026,1; Izr. masa = 5126,8
Primer 41
N{Epsilon-315}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys315]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 42.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1698,3; Pronađeno m/4 = 1273,8; Pronađeno m/5 = 1019,3; Izr. m/1 = 5092,8
Primer 42
N{Alfa}([His300,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 43.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5306,3; Pronađeno m/3 = 1768,7; Pronađeno m/4 = 1327,1;
Pronađeno m/5 = 1061,7
Primer 43
N{Epsilon-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys314]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 44.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1300,2; Pronađeno m/5 = 1040,2; Izr. masa = 5198,9
Primer 44
N{Epsilon-311}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Lys311,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 45.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1714,9; Pronađeno m/4 = 1286,2; Pronađeno m/5 = 1029,2; Izr.
masa = 5142,8
Primer 45(uporedni, ne prema patentnim zahtevima)
N{Epsilon-307}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O O
S S
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 46.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1919,8; Pronađeno m/4 = 1290,1; Pronađeno m/5 = 1032,3; Izr.
masa = 5156,8
Primer 46
N{Alfa}([Leu301,Ser309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 47.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1738,8; Pronađeno m/4 = 1304,1; Pronađeno m/5 = 1043,5;
Pronađena masa = 5214,3
Primer 47
N{Alfa}([Leu301,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 48.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/1 = 5187,2; Pronađeno m/3 = 1729,7; Pronađeno m/4 = 1297,2;
Pronađeno m/5 = 1038,4; Izr. m/1 = 5186,8
Primer 48
Ala299,Leu301,Ile307,Arg309,Lys310]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 2.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1465,3; Pronađeno m/4 = 1099,3; Pronađeno m/5 = 879,6; Izr. = 4391,0
Primer 49
[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 3.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A.
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1470,3; Pronađeno m/4 = 1103,0; Pronađeno m/5 = 882,6; Izr. = 4407,9
Primer 50
[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
vaj peptid je SEQ ID NO: 6. S S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A.
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1471,3; Pronađeno m/4 = 1103,7; Pronađeno m/5 = 883,2; Izr. = 4411,9
Primer 51
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Tir306,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 49.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1695,8; Izr. masa = 5085,1
Primer 52
N{Alfa-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Asn293,Leu301,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
H O O O
vaj peptid je SEQ ID NO: 50.
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1706,1, Izr. masa = 5115,7
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
Primer 53
N{Epsilon-306}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys306,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
vaj peptid je SEQ ID NO: 51.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1707,0; Pronađeno m/4 = 1280,3; Pronađeno m/5 = 1024,4; Izr. masa = 5118,8
Primer 54
N{Epsilon-305}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys305,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
1
vaj peptid je SEQ ID NO: 52.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1723,8 ; Pronađeno m/4 = 1292,8; Pronađeno m/5 = 1034,4; Izr. masa = 5168,8
Primer 55
N{Epsilon-303}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys303,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 53.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1733,7; Pronađeno m/4 = 1300,3; Pronađeno m/5 = 1040,5; Izr. masa = 5198,9
Primer 56 (uporedni, ne prema patentnim zahtevima)
N{Epsilon-302}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys302,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 54.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1733,7; Pronađeno m/4 = 1300,3; Pronađeno m/5 = 1040,5; Izr. masa = 5198,9
2
Primer 57
N{Alfa}([Asn293,His300,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys;
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 55.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1341,5; Pronađeno m/5 = 1073,3; Izr. masa = 5363
Primer 58 (uporedni, ne prema patentnim zahtevima)
N{Epsilon-301}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 56.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1715,2; Pronađeno m/4 = 1286,6; Pronađeno m/5 = 1029,5; Izr. masa = 5142,8
Primer 59 (uporedni, ne prema patentnim zahtevima)
N{Epsilon-298}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys298,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 57.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1715,1; Pronađeno m/4 = 1286,3; Pronađeno m/5 = 1029,3; Izr. m/z = 5142,8
Primer 60
N{Alfa}([Asn293,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 58.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1780,7; Pronađeno m/4 = 1335,5; Pronađeno m/5 = 1068,4; Izr. masa = 5340,1
Primer 61
N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Ile307,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 59.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1700,0; Pronađeno m/4 = 1275,1; Pronađeno m/5 = 1020,3; Izr. masa = 5097,8
Primer 62
N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Tyr306,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid;
4
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 60.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1704,3; Pronađeno m/4 = 1278,5; Pronađeno m/5 = 1030,4; Izr. m/z = 5110,8
Primer 63
N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Ile307,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
vaj peptid je SEQ ID NO: 61.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1700,3; Pronađeno m/4 = 1275,2; Pronađeno m/5 = Izr. masa = 5098,8
Primer 64
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino] metil]fenil]metil-[His300,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 62.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A C
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1757,1; Pronađeno m/4 = 1318,1; Pronađeno m/5 = 1054,2; Izr. masa = 5269,0
Primer 65 (uporedni, ne prema patentnim zahtevima)
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Pro300,Leu301,Ile307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
aj peptid je SEQ ID NO: 5.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1709,1; Izr. masa = 5124,8
Primer 66
N{Alfa}([Asn293,Leu301,Ile307,Arg309,Asp312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 9.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1329,1; Izr. masa = 5313,0
Primer 67
N{Alfa}([Asn293,Leu301,Arg309,Asp312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
Ovaj peptid je SEQ ID NO:S 10. S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1325,6; Izr. masa = 5299,0
Primer 68
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanoilsulfamoil]butanoilamino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]meti l]fenil]metil-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S
aj peptid je SEQ ID NO: 6.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom C
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1320,1; Izr. masa = 5276,98
Primer 69
N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328,His329]-LDL-R-(293-332)-peptid
<OH>
S S S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 6.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1278,09; Izr. masa = 5108,8 Da
Primer 70 (uporedni, ne prema patentnim zahtevima)
N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Asp295,Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 20.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1282,84; Izr. masa = 5127,8 Da
Primer 71
N{Epsilon-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 62. S S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1717,5 Pronađeno m/4 = 1288,2 Pronađeno m/5 = 1030,4 -Izr. masa = 5149,9 -
Primer 72
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Ile307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 26.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/4 = 1292,1; Izr. masa = 5164,8 Da
Primer 73
N{Epsilon-296}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys296,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 63.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1709,9; Pronađeno m/4 = 1282,6; Izr. masa 5126,8
Primer 74
N{Epsilon-294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Lys294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 64.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1289,7; Pronađeno m/5 = 1031,7; Izr. masa = 5154,8
Primer 75
N{Epsilon}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys[Le u301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 65.<OH>
S S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1752,9; Pronađeno m/4 = 1315,0; Izr. masa = 5255,9
Primer 76
N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Gly294,Leu301,Arg309,Glu312,Lys328],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-peptid
S S S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 66.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1676,6 Pronađeno m/4 = 1257,7 Pronađeno m/5 = 1006 ) -Izr. masa = 5026,7
Primer 77
N{Alfa}([Leu301,Asp306,Arg309,Glu312,Gly324]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 67.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1721,8; Izr. masa = 5162,8 Da
Primer 78
N{Alfa}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]a mino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Asp306,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
O
vaj peptid je SEQ ID NO: 68.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS029: Pronađeno m/3 = 1528,7; Izr. masa = 6110,8 Da
Primer 79
N{Alfa}(N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
OH
vaj peptid je SEQ ID NO: 17.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1493,9; Pronađeno m/5 = 1195,5; Izr. masa = 5972,7
1
Primer 80
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 4.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1743,6; Pronađeno m/4 = 1307,9; Pronađeno m/5 = 1046,4 Izr. masa = 5227,9
Primer 81
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 4.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1762,3; Pronađeno m/4 = 1321,7; Pronađeno m/5 = 1057,8; Izr. masa = 5284,0
Primer 82
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]Lys
2
S S
aj peptid je SEQ ID NO: 4.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1656,2; Pronađeno m/4 = 1242,4; Pronađeno m/5 = 994,0; Izr. masa = 4965,6
Primer 83
N{Alfa}(N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
H
Ovaj O peptid je SEQ ID NO: 17. O O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1958,5; Pronađeno m/4 = 1468,9; Pronađeno m/5 = 1175,3; Izr. masa = 5872,7
Primer 84
N{Alfa}(N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
aj peptid je SEQ ID NO: 17
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1483,1; Pronađeno m/5 = 1186,6; Izr. masa = 5928,8
Primer 85
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
Ovaj
O
peptid je SEQ ID NO: 69.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1500,1 Pronađeno m/5 = 1200,3 Pronađeno m/z = 1000. Izr. masa = 5997,7
Primer 86
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-
4
karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 70.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1469,3; Pronađeno m/5 = 1175,8; Izr. masa = 5874,6
Primer 87
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O
Ovaj peptid je SEQ ID NO:71.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1469,1; Pronađeno m/5 = 1175,5; Izr. masa = 5874,6
Primer 88
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 39.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1469,3; Pronađeno m/5 = 1175,7; Izr. masa = 5874,5
Primer 89
N{Alfa}(N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
H
Ovaj peptid je SEQ ID NO:72. O O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1497,6; Pronađeno m/5 = 1198,3; Izr. masa = 5987,7
Primer 90
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 73.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1472,6; Pronađeno m/5 = 1178,3; Izr. masa = 5887,6
Primer 91
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 74. O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LC-MS: Pronađeno m/3 = 1981, m/4 = 1486: Izračunata masa = 5940,6
Primer 92
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L
O N O N H O H
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 39. O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1507,3 Pronađeno m/5 = 1205,9 Izr. masa = 6025,7
Primer 93
N{292}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-Ala[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 75.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1487,1; Pronađeno m/5 = 1190,0; Izr. masa = 5945,6
Primer 94
N{294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 76.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1455,1; Izr. masa = 5817,5
Primer 95
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: S 76. S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1272,4 ; Pronađeno m/5 = 1017,9; Izr. masa = 5085,7
Primer 96
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
H
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 77. O O H Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1469,1; Pronađeno m/5 = 1175,5; Izr. masa = 5873,6
Primer 97
N{Alfa}(N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 78. O O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS28: Pronađeno m/3 = 1996,9; Pronađeno m/4 = 1497,9; Izr. masa = 5987,7
Primer 98
1
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]Lys
Ovaj peptid je SEQ ID NO:32. O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1808,1; Pronađeno m/4 = 1356,4; Pronađeno m/5 = 1085,3; Izr. masa = 5422,1
Primer 99
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]butanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]butanoil]Lys
O
aj peptid je SEQ ID NO: 32.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1894,2; Pronađeno m/4 = 1420,9; Pronađeno m/5 = 1136,9; Izr. masa = 5680,3
Primer 100
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[[2-[[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]acetil]amino]acetil]amino]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[[2-[[2-[[(4S)-4-
1 1
karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]acetil]amino]acetil]amino]acetil]Lys
O
aj peptid je SEQ ID NO: 32.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1922,2; Pronađeno m/4 = 1441,9; Pronađeno m/5 = 1153,7; Izr. masa = 5764,4
Primer 101
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoks i]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoks i]etoksi]acetil]Lys
Ovaj peptid je O SEQ ID NO: 32.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1566,2; Pronađeno m/5 = 1252,9; Izr. masa = 6260,9
Primer 102
1 2
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(3-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(3-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
vaj peptid je SEQ ID NO: 32.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4=1494,6; m/5= 1195,9 Izr. masa = 5974,6
Primer 103
Ala299,Leu301,Ile307,Arg309-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 79 S. S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A.
LCMS01: Pronađeno m/2 = 2191,4; Pronađeno m/3 = 1461,0; Izr. = 4381,0
Primer 104 (comparator, not according to claims)
Leu301,Arg309,Lys310-LDL-R-(293-332)-peptid
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 80 S S
.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1475,3; Pronađeno m/4 = 1107,0; Izr. = 4424,0
Primer 105
Leu301-LDL-R-(293-332)-peptid
1
S S
Ovaj peptid je SEQ ID NO: 81.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom A
LCMS01: Pronađeno m/3 = 1456,3; Pronađeno m/4 = 1217,0; Izr. = 4368,9
Primer 106
N{Alfa}([His300,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO:82.
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS027: Pronađeno m/3 = 1760,5; Pronađeno m/4 = 1320,6; Pronađeno m/5 = 1056,7; Izr. masa = 5279,0
Primer 107
N{Alfa}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
1 4
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 4 O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1996,9; Pronađeno m/4 = 1497,9; Pronađeno m/5 = 1198,6; Izr. masa = 5987,7
Primer 108
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(295-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[10-(4-karboksifenoksi)dekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 83
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1460,8; Pronađeno m/5 = 1168,7; Izr. masa = 5839,5
Primer 109
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(3-hidroksi-1,2-oksazol-5-il)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(3-hidroksi-1,2-oksazol-5-il)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
1
O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 69 O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1495,0; Pronađeno m/5 = 1196,0; Izr. masa = 5975,7
Primer 110
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(3-hidroksi-1,2-oksazol-5-il)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(3-hidroksi-1,2-oksazol-5-il)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32 O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1489,0; Pronađeno m/5 = 1191,0; Izr. masa = 5952,7
Primer 111
N{Alfa}(N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
1
O
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO:84
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1987,6; Pronađeno m/4 = 1490,9; Pronađeno m/5 = 1193,0; Izr. masa = 5959,7
Primer 112
N{Alfa}(N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Tyr306,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 85
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
1
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1991,6; Pronađeno m/4 = 1493,9; Pronađeno m/5 = 1195,1; Izr. masa = 5971,7
Primer 113
N{Alfa}(N{Epsilon-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys314]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
O OH
O
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 86
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 2028,3; Pronađeno m/4 = 1521,5; Izr. masa = 6081,8
Primer 114
N{Alfa}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Trp294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
ptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 87
1
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 2025,3; Pronađeno m/4 = 1519,2; Pronađeno m/5 = 1215,6; Izr. masa = 6072,8
Primer 115
N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptid
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 88 O O H O Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/2 = 2916,7; Pronađeno m/3 = 1944,9; Pronađeno m/4 = 1458,9; Izr. masa = 5831,5
Primer 116
N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptid
S
Peptidna kičma (osnova) jeS SEQ ID NO: 89
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2924,1; Pronađeno m/3 = 1949,6 Pronađeno m/4 = 1462,4; Izr. masa = 5846,5
1
Primer 117
N{Alfa}(N{294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L
O O N OH
O N O O H O O
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 90
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1977,6; Pronađeno m/4 = 1483,5; Pronađeno m/5 = 1187,2; Izr. masa = 5930,6
Primer 118
N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptid
O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 91 O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/2 = 2930,4; Pronađeno m/3 = 1953,9; Pronađeno m/4 = 1465,7; Izr. masa = 5859,6
11
Primer 119
N{Alfa}(N{292}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-Ala[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
O O eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 92
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 2020,6; Pronađeno m/4 = 1515,7; Pronađeno m/5 = 1212,8; Izr. masa = 6058,8
Primer 120
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Tyr306,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 93 H O O Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 2010,2; Pronađeno m/4 = 1508,2; Pronađeno m/5 = 1206,8; Izr. masa = 6028,7
Primer 121
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 11
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/2 = 2930,3; Pronađeno m/3 = 1953,7; Pronađeno m/4 = 1465,8; Izr. masa = 5858,6
Primer 122
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptid
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 40
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/2 = 2930,1; Pronađeno m/3 = 1953,9; Pronađeno m/4 = 1465,7; Izr. masa = 5859,6
Primer 123
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptid
O
H N O H
O H
O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 22
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2930,9; Pronađeno m/3 = 1954,3; Pronađeno m/4 = 1465,9; Izr. masa = 5859,6
Primer 124
11
N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
ptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 94
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2916,1; Pronađeno m/3 = 1944,2; Pronađeno m/4 = 1458,4; Izr. masa = 5830,6
Primer 125
N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptid
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 106
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2916,6; Pronađeno m/3 = 1944,5; Pronađeno m/4 = 1458,9; Izr. masa = 5831,5
Primer 126
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-peptid
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 30 O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2916,7; Pronađeno m/3 = 1944,6; Pronađeno m/4 = 1458,7; Izr. masa = 5831,5
Primer 127
N{Epsilon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
11
O OH
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID O NO: 95
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1958,3; Pronađeno m/4 = 1469,0; Izr. masa = 5871,6
Primer 128
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
H
O O O eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2966,28; Pronađeno m/3 = 1978,0; Pronađeno m/4 = 1483,5; Izr. masa = 5930,7
11
Primer 129
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]Lys
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2676,0; Pronađeno m/3 = 1784,2; Pronađeno m/4 = 1338,4; Izr. masa = 5330,1
Primer 130
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
O O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 96
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1966,7; Pronađeno m/4 = 1475,0; Izr. masa = 5896,6
Primer 131
11
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]propoksi]etoksi]etoksi]propilamino]-4-oksobutanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]propoksi]etoksi]etoksi]propilamino]-4-oksobutanoil]Lys
O OH
Peptidna kičma (osnova) je S OEQ ID NO: 32
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 2009,9; Pronađeno m/4 = 1507,7; Izr. masa = 6026,8
Primer 132
N{Epsilon-313}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]propoksi]etoksi]etoksi]propilamino]-4-oksobutanoil],N{Epsilon-332}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]propoksi]etoksi]etoksi]propilamino]-4-oksobutanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-peptid
11
ep na ma osnova e :
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1971,3; Pronađeno m/4 = 1478,9; Izr. masa = 5911,7
Primer 133
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 98
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1505,0; Pronađeno m/5 = 1204,3; Izr. masa = 6016,7
Primer 134
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
11
Peptidna kičma (osnova) je S S
SEQ ID NO: 19
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1766,7; Pronađeno m/5 = 1325,3; Izr. masa = 5258,0
Primer 135
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys314]-LDL-R-(293-332)-peptid
S
Peptidna kičma (osnova) jSe SEQ ID NO: 99
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1487,3; Pronađeno m/5 = 1190,0; Izr. masa =5945,6
Primer 136
N{Epsilon-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptid
S S
12
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 100
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1469,3; Pronađeno m/5 = 1175,5; Izr. masa =5873,6
Primer 137
N{Epsilon-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Lys314]-LDL-R-(293-332)-peptid
S
Peptidna kičma (osnova) jSe SEQ ID NO: 101
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1483,3; Pronađeno m/5 = 1186,8; Izr. masa =5929,7
Primer 138
N{Epsilon-311}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil], N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Lys311,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptid
Peptidna kičma (osnova)S je SEQ ID NO: 102 S
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1473,0; Pronađeno m/5 = 1178,6; Izr. masa =5889,5
Primer 139
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-11-(4-karboksifenoksi)undekanoil-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}11-(4-karboksifenoksi)undekanoilLys
Peptidna kičma (osno Ova) je SEQ ID NO: 69
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1297,4; Pronađeno m/5 = 1038,2; Izr. masa = 5186,9
Primer 140
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(1H-tetrazol-5-il)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(1H-tetrazol-5-il)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1481,6; Pronađeno m/5 = 1185,3; Izr. masa = 5922,7
Primer 141
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(14-sulfotetradekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4karboksi-4-(14-sulfotetradekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32 O O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS027: Pronađeno m/3 = 1992,6; Pronađeno m/4 = 1494,7; Pronađeno m/5 = 1196,0; Izr. masa = 5974,8
Primer 142
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(metilsulfonilkarbamoilamino)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]et oksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[13-(metilsulfonilkarbamoilamino)tridekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]et oksi]acetil]Lys
O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32 O O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS027: Pronađeno m/3 = 2020,7; Pronađeno m/4 = 1515,8; Pronađeno m/5 = 1212,8; Izr. masa = 6058,8
Primer 143
12
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]Lys
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 98 O
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 2719,0; Pronađeno m/3 = 1812,8; Pronađeno m/4 = 1359,8; Izr. masa = 5436,1
Primer 144
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O O O eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 98
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1982,2; Pronađeno m/4 = 1486,9; Pronađeno m/5 = 1189,7; Izr. masa = 5944,7
Primer 145
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[16-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil][Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[16-(1H-tetrazol-5-il)heksadekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32 O OH
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 2003,3; Pronađeno m/4 = 1502,7; Pronađeno m/5 = 1202,2; Izr. masa = 6006,8
Primer 146
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]Lys
O
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 98
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/3 = 1788,8; Pronađeno m/4 = 1341,9; Pronađeno m/5 = 1073,7; Izr. masa = 5364,1
Primer 147
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-
12
[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
H
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 103 O H O Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS29: Pronađeno m/2 = 3020,8; Pronađeno m/3 = 2014,3; Pronađeno m/4 = 1510,9; Izr. masa = 6039,8
Primer 148
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]a mino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]a mino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O N O N O H H H O O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ O ID NO: 32
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS027: Pronađeno m/3 = 2195,5; Pronađeno m/4 = 1646,9; Pronađeno m/5 = 1317,7; Izr. masa = 6583,3
Primer 149
12
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]L ys
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 74
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS027: Pronađeno m/3 = 1990,6; Pronađeno m/4 = 1493,2; Pronađeno m/5 = 1191,1; Izr. masa = 5968,7
Primer 150
N{Alfa}(N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 78
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/2 = 2958,7; Pronađeno m/3 = 1973,0; Pronađeno m/4 = 1480,0; Izr. masa = 5915,7
Primer 151
N{Alfa}(N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-
12
[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 104
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1483,2; Pronađeno m/5 = 1186,8; Izr. masa = 5930,0
Primer 152
N{Alfa}(N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 72
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS34: Pronađeno m/4 = 1974,6; Pronađeno m/5 = 1183,9; Izr. masa = 5915,7
Primer 153
N{Alfa}(N{Epsilon-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys324]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
12
O O O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 105
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1483,3 Pronađeno m/5 = 1186,8 Izr. masa = 5929,8
Primer 154
N{Alfa}(N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
O
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 104
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1497,3; Pronađeno m/5 = 1198,2; Izr. masa = 5985,9
Primer 155
N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil],N{Ep silon-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys321]-LDL-R-(293-332)-peptid
12
O
H N O
O O H O
Peptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO:72
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS01: Pronađeno m/4 = 1454,7; Pronađeno m/5 = 1164,0 Izr. masa = 5815,6
Primer 156
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[4-[[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]metil]cicloheksanekarbonil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi] acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[4-[[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]metil]cicloheksanekarbonil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi] acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 32
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/3 = 2094,6; Pronađeno m/4 = 1571,2; Izr. masa = 6281,1
Primer 157
N{Alfa}(N{Epsilon-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[4-[[11-(4-karboksifenoksi)undekanoilamino]metil]cicloheksanekarbonil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi] acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[4-[[11-(4-
1
karboksifenoksi)undekanoilamino]metil]cicloheksanekarbonil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi] acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
ptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 98
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/3 = 2099,3; Pronađeno m/4 = 1574,7; Izr. masa = 6295,1
Primer 158
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[4-[(19-karboksinonadekanoilamino)metil]cicloheksanekarbonil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil ]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
S S
ptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 19
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/3 = 1813,2; Pronađeno m/4 = 1360,2; Pronađeno m/5 = 1088,3; Izr. masa = 5437,2
Primer 159
N{Alfa}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-[[4-[(17-karboksiheptadekanoilamino)metil]cicloheksanekarbonil]amino]butanoil]amino]etoksi]etoksi]acet il]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys
1 1
S S
eptidna kičma (osnova) je SEQ ID NO: 19
Jedinjenje pripremljeno opštim postupkom B
LCMS27: Pronađeno m/3 = 1803,9; Pronađeno m/4 = 1353,1; Pronađeno m/5 = 1082,7; Izr. masa = 5409,2
Tabela 4. Zbirna tabela primernih jedinjenja 1-159
1 2
1
14
1
1
1
1
1
14
D. Opšti postupci za karakterizaciju
D.1.1 PCSK9-LDL-R vezujući kompetitivni (ELISA)
Cilj ovog testa je da se izmeri prividni afinitet vezivanja EGF(A) jedinjenja za PCSK9. Zbog njihove sposobnosti da inhibiraju interakciju PCSK9 sa LDL-R, jedinjenja pronalaska se, takođe, mogu nazvati PCSK9 inhibitorima.
Dan pre eksperimenta, rekombinantni humani receptor lipoproteina niske gustine (rhLDL-R; NSO-izveden; R & D sistemi # 2148-LD) rastvoren je u 1 µg/ml u 50 mM natrijum karbonatu, pH 9.6, a zatim 100 µl rastvora je dodato u svako ležište ploča za ispitivanje (Makisorp 96, NUNC # 439454) i obloženo preko noći na 4°C. Na dan eksperimenata, krive koncentracije u 8 tačaka EGF(A) jedinjenja koja sadrže biotinilovani PCSK9 (0,5 ug/ml, BioSite/BPSBioscience cat#71304) su napravljene u duplikatu. EGF(A) jedinjenje i biotinilovane PCSK9 smeše su pripremljeni i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi u puferu za ispitivanje koji sadrži 25 mM Hepesa, pH 7.2 (15630-056, 100 ml, 1M), 150 mM NaCl (Emsure 1.06404.1000) 1% HSA (Sigma A1887-25G) 0,05% Tween 20 (Calbiochem 655205) 2 mM CaCl2(Sigma 223506-500G). Obložene ploče za ispitivanje su zatim isprane 4x u 200 µl pufera za ispitivanje, a zatim je 100 µl smeše EGF(A) jedinjenja i biotinilovanog PCSK9 dodato na ploče i inkubirano 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane 4x u 200 ul pufera za ispitivanje i zatim inkubirane sa Streptevadin-HRP (25 ng/ml; VWR # 14-30-00) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija se detektuje dodavanjem 50 µl TMB-on (KEM-EN-TEC) i inkubirana je 10 minuta u mraku. Zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem 50 ul 4 M H3PO4u smešu, koja je dodata elektronskim višestrukim pipetiranjem. Ploče su zatim očitane u Spectramax-u na 450 i 620 nm u roku od 1 sata. Očitavanje od 620 nm je korišćeno za oduzimanje pozadine. IC50 vrednosti su izračunate korišćenjem Graphpad Prism, nelinearnom regresijom loga(inhibitora) naspram nagiba promenljive odgovora (četiri parametra) i pretvorene u Ki vrednosti korišćenjem sledeće formule: Ki=IC50/(1+(Biotin-PCSK9)/(kd(Biotin-PCSK9))), pri čemu je Kd biotin-PCSK9 1,096727714 µg/ml and [Biotin-PCSK9] = 0,5 (µg/ml).
Rezultati su prikazani u tabeli 5.1-5.5 u daljem tekstu. Više Ki vrednosti odražavaju niže očigledne afinitete vezivanja za PCSK9 i obrnuto. Primećeno je da nekoliko jedinjenja pokazuje Ki koji je znatno veći od vrednosti izmerene za EGF66, kao što je vrednost iznad 500 nM, što ukazuje da uočeno vezivanje nije specifično. I aminokiselinske supstitucije peptida i/ili jedna ili više derivacija bočnih lanaca mogu doprineti gubitku vezivanja za LDL-R. Generalno, veliki broj testiranih EGF(A) jedinjenja pokazao je sposobnost da inhibira PCSK9 u vezivanju za hLDL-R.
PCSK9 inhibitorni peptidi
Inicijalno, grupa peptida uključuje različite aminokiselinske supstitucije testirane kao što je opisano u odeljku D1.1 i rezultati su prikazani u tabeli 5.1.
Tabela 5.1 – Prividni afinitet vezivanja (Ki) za PCSK9 peptide
EGF66, identifikovan kao najpotentnija varijanta peptida u WO 2012177741, ima 5 mutacija. Kao što se vidi gore, pronalazači ovog slučaja su otkrili da nekoliko od ovih mutacija nije od velike važnosti za vrednost EC50 utvrđenu u testu opisanom u D1.1. Konkretno, pronalazači su otkrili da jedinjenja uključujući ostatak divljeg tipa Asp (D) na poziciji 310 imaju veću potentnost od jedinjenja sa 310K. Takođe se pokazalo da je ključna amino supstitucija 301L poželjno u kombinaciji sa 309R. Konačno, 307l i 299A su samo skromno doprineli afinitetu peptida.
N-terminalno vezivanje supstituenta
U sledećem eksperimentu je testirano da li je pričvršćivanje protraktora poluraspada npr. supstituenta za peptide utiče na EC50 kao što je određeno testom opisanim u D.1.1. Kao što je ovde opisano, supstituent može biti vezan različitim tehnologijama i pronalazači su prvobitno odlučili da primene vezivanje preko atoma azota koristeći N-terminalnu amino-kiselinu peptida. Ovo je kao što je opisano u odeljku B postignuto acilacijom (u rastvoru ili na smoli) i alkilacijom.
Kao što se vidi u Tabeli 5.2, sva testirana jedinjenja imaju Ki vrednost ispod 3,0 što sugeriše da se različiti protraktor i linker elementi dobro tolerišu. Ovo je bilo neobično jer na potentnost obično negativno utiče vezivanje bočnog lanca kao prethodnog posmatrača za peptide kao što je GLP-1.
Tabela 5.2 – Prividni Ki za N-terminalne supstituisane PCSK9 peptide
14
Lys vezivanje supstituenta
Da bi se procenile alternativne pozicije za vezivanje supstituenta sa PCSK9 inhibitornim peptidom pripremljen je niz jedinjenja. Osnovni peptid uključujući tri aminokiselinske supstitucije; N301L, N309R i K312E je korišćen osim u pr.58, 29 i 4 u kombinaciji sa Lys supstitucijom na različitim pozicijama. Sva testirana jedinjenja su uključivala 6 Cys amino-kiselina na pozicijama 297, 304, 308, 317, 319, 331 koje su obično uključene u cisteinske disulfidne mostove.312E je uključen da bi se obezbedila supstitucija specifična za mesto osim u primeru 4 gde je dobijeno vezivanje za wt 312K. Ekstenzija peptida sa jednim Lys-om je takođe testirana (Primer 75 i 3). Isti supstituent kao što je gore opisano uključujući C18 dikiselinski protraktor i gGlu-2kAdo linker je korišćen u svim jedinjenjima i vezan acilacijom. Rezultati su uključeni u Tabelu 5.3.
Tabela 5.3. - Prividni Ki za derivate PCSK sa supstituentom vezanim preko Lys ostatka
Analiza je pokazala da većina PCSK9 peptidnih inhibitora održava funkcionalnost. Izuzeci su bila supstitucija i derivacija Lys-a na bilo kojoj poziciji 298, 301, 302 i 307 koja je dovela do nefunkcionalnih peptida. Takođe je primećeno da uvođenje Lys-a i zamena na pozicijama 296, 299,315 i 320K smanjuje prividni afinitet.
Podaci tako takođe potvrđuju rezultat iz tabele 5.1 koji ukazuje da je supstitucija aminokiselina Asn(N) 301 u Leu (L) neophodna za vezivanje.
14
Nisu primećeni podaci za uvođenje Lys i supstituciju na pozicijama 295 i 310. Kao što je gore opisano, prethodno je utvrđeno da je zadržavanje Asp u 310 bilo poželjnije u odnosu na supstituciju 310K. Kao što se vidi u daljem tekstu, takođe je pronađeno da se vezivanje ukida uvođenjem Asp (D) na poziciju 295 (Primer 70).
Ukratko, zaključeno je da jedinjenja koja ne sadrže supstituent vezan na bilo kojoj od pozicija 295, 298, 302, 307i 310 ili na bilo kojoj od pozicija 295, 296, 298, 299, 302, 307, 310, 315 i 320 PCSK9 peptida su generalno funkcionalni. Dalje je zaključeno da supstitucija aminokiselina na bilo kojoj od pozicija 295, 298, 302 i 310 generalno nije privlačna. Kao što se vidi iz tabele 5.1 i 5.2, mutacija V307I se ipak čini prihvatljivom ili čak privlačnom u kombinaciji sa 301Leu.
Dalje se smatra da će peptidi sa supstitucijom amino-kiselina na jednoj od pozicija 295, 296, 298, 302, 310 verovatno imati nižu funkcionalnost, dok se čini da supstitucije na 299, 315 i 320 samo blago smanjuju funkcionalnost. Ovo, s druge strane, takođe sugeriše da može postojati visok stepen fleksibilnosti za preostale aminokiselinske ostatke jer će supstitucija Lys i vezivanje bočnog lanca uticati na peptide isto koliko i većina drugih supstitucija amino-kiselina.
PCSK9 inhibitori sa dva supstituenta
Pripremljen je niz jedinjenja sa dva supstituenta. Dvostruka supstitucija se može dobiti acilacijom, alkilacijom ili kombinacijom na N-kraju ili na Lys (K) ostacima. Ponovo, N-kraj može biti amino-kiselina 293G ili varijantni aminokiselinski ostatak kao što su 292A, 293G, 293K i 294T (u slučajevima kada je 293G izbrisan). Jedinjenja su pripremljena sa različitim supstituentima, iako su dva supstituenta na pojedinačnim jedinjenjima identična. Osnova (kičma) korišćena u ovoj studiji ponovo je uključivala supstituciju amino-kiselina N301L u kombinaciji sa N309R i različite N-terminalne i/ili Lys supstitucije kako je potrebno da bi se dobila specifična acilacija/alkilacija.
Tabela 5.4 - Prividni Ki za dvostruko supstituisane PCSK9 inhibitore
14
14
14
Ponovo su pronalazači zaključili da se supstituenti veoma dobro tolerišu u različitim pozicijaima i kombinacijama.
Dalji derivati PCSK9 inhibitora
Da bi se dalje istražila uloga različitih supstitucija amino-kiselina u peptidima PCSK9, pripremljena su i testirana dalja jedinjenja kao što je prikazano u tabeli 5.5. Sva jedinjenja uključuju jedan supstituent koji je vezan preko Lys ostatka uvedenog aminokiselinskom supstitucijom ili ekstenzijom sa 333K. Svi osnovni peptidi uključuju aminokiselinsku supstituciju N301L i opciono jedan ili više od N309R i I312E. Svi supstituenti uključuju masnu dikiselinu koja sadrži 16-20 atoma ugljenika i linker koji je ili sam gGlu ili proširen sa Ado-Ado i/ili traneksamskom kiselinskom (Trx) grupom.
Tabela 5.5 – Prividni Ki za dalje derivate PCSK9.
14
Rezultati u tabeli 5.5 iznad pokazuju da unutrašnji wt lizin na poziciji 312 može biti supstituisan sa Glu (E) kao i Gln (Q), Arg (R) ili Asp (D). Na osnovu ove varijacije, smatra se da će se širok spektar aminokiselinskih ostataka tolerisati na poziciji 312 bez ometanja inhibitorne funkcije peptida.
Pokazalo se da se i nekoliko drugih aminokiselinskih supstitucija dobro toleriše uključujući G293N, T294G, D299A, N300H, H306Y, H306D, N309S, Q324G i R329H, dok kao što je gore pomenuto, N295D i N300P nisu atraktivne aminokiselinske supstitucije.
D.1.2 test unosa LDL u HepG2 ćelije
Alternativni test za određivanje inhibitorne moći PCSK9 peptida i njihovih derivata koji meri unos LDL u HepG2 ćelije je opisan ovde u nastavku.
1
Načelo analize: Unos LDL-a prvenstveno je posredovan endogeno eksprimovanim hLDLR, pa je stoga kapacitet uzimanja LDL-a indirektna mera ekspresije LDLR-a. hLDLR se mogu redukovati inkubacijom sa egzogenim PCSK9 na način koji zavisi od doze. Tako će PCSK9 inkubacija smanjiti sposobnost ćelija da preuzmu LDL molekule. Ova redukcija LDL-a se zatim može antagonizirati dodavanjem jedinjenja koja neutrališu ili inhibiraju vezivanje PCSK9/LDLR. Shodno tome, PCSK9 inhibitori se mogu okarakterisati na osnovu njihovog kapaciteta da povećaju unos LDL-a u prisustvu PCSK9 i npr. suprotstave se PCSK9 posredovanoj redukciji hLDLR.
Test se izvodi korišćenjem HepG2 ćelija (Sigma Aldrich ECACC: Acc no.85011430) uzgojenih u fetalnom telećem serumu sa 10% nedostatkom lipoproteina (Sigma Aldrich #S5394) a kapacitet ćelija da preuzmu BODIPY fluorescentno označene LDL čestice (Life technologies Europe BV #L3483) se meri.
Protokol analize: Ploče sa 96 ležišta (Perkin Elmer, ViewPlate-96 Black #60005182) su obložene poli-D-lizinom (10mg/L ,Sigma Aldrich #P6407 rastvorenim u PBSGibco #14190-094) tokom 1 sata na 37°C u inkubatoru. Zatim su ploče isprane 2 x u 100 µl PBS (Gibco #14190-094). Pripremljene su testne kompozicije za krive koncentracije EGF(A) jedinjenja u 8 tačaka koje sadrže PCSK9 (10 ug/ml) razblažen u medijumu za ispitivanje (DMEM (Gibco #31966-021), 10% fetalnom telećem serumu sa nedostatkom lipoproteina (Sigma Aldrich # S5394) i 1% Pen Strepu (Cambrek #DE17-602E)), i dodati na ploče u zapremini od 50 µl/ležištu.
Nakon 30-60 minuta, 50.000 HepG2 ćelija (Sigma-Aldrich: ECACC: Atcc br.85011430 lot: 13B023), razblaženih u medijumu za ispitivanje, dodato je u zapremini od 50 µl/ležištu, a ploče su inkubirane 20 sati (na 37°C, 5 % CO2) u CO2 propustljivim plastičnim kesama Antalis Team, LDPE kesa 120/35x300x0,025mm #281604). Nakon toga, ploče su ispražnjene i odmah nakon toga 50 µl FL-LDL (Life technologies Europe BV #L3483) u koncentraciji od 10 µg/ml u medijumu za ispitivanje je dodato u svako ležište, a ploče su inkubirane 2 sata (na 37°C, 5 % CO2) u plastičnoj kesi koja propušta CO2 koristeći crni preklop na poklopcu radi zaštite od svetlosti. Ploče su ispražnjene i isprane 2 puta sa 100 µl PBS (Gibco #14190-094). Zatim je dodato 100 µl PBS-a (Gibco #14190-094) i u roku od 15 minuta nakon toga, ploče su očitane (očitavanje u daljem tekstu) korišćenjem sledećih filtera Ex (515 nm)/Em (520 nm) na SpecktraMax M4 (molekularne sonde, Invitrogen Detection Technologies).
Konačno, vrednosti EC50 su izračunate korišćenjem GraphPad Prism, uklapanje krive nelinearne regresije, sigmoidalna doza-odgovor (promenljivi nagib).
Rezultati su prikazani u donjoj Tabeli 6. Niže vrednosti EC50 odražavaju veći kapacitet da se preokrene PCSK9 posredovana redukcija unosa LDL-a, i obrnuto, visoka vrednost EC50 je indikativna za jedinjenje sa niskim kapacitetom da inhibira PCSK9 posredovanu redukciju unosa LDL-a.
1 1
Kao što se može videti, većina jedinjenja pokazuje EC50 u testu uzimanja LDL-a od 100-500 nM što ukazuje na jedinjenja sa visokim kapacitetom da preokrenu PCSK9 posredovanu redukciju unosa LDL-a.
Tabela 6 Podaci o unosu LDL u HepG2 ćelije (EC50)
1 2
D.2. PK kod miševa
Cilj ove studije je bio da se izmeri PK profil PCSK9 inhibitora kao što je gore identifikovano.
Postupak:
Korišćene su ženke C57bI/J miševa iz Taconica (Ri, Danska).
1
Doziranje jedinjenja: Jedinjenja su dozirana ili supkutano (s.c., 500 nmol/kg) ili intravenozno (i.v., 250 nmol/kg) u zapremini od 5 µL po gramu telesne težine.
Uzorkovanje krvi: Krv je oskudno uzorkovana nakon 2 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 60 minuta, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 8 sati, 18 sati, 24 sata, 30 sati i 48 sati. Krv (200 µL) je uzeta iz sublingvalne vene i prebačena u epruvete obložene EDTA (Microvette® VetMed 200 K3E, Sarstedt nr 09.1293.100). Plazma je izolovana i korišćena za kvantifikaciju anti-PCSK9 peptida.
Kvantifikacija: Uzorci plazme su korišćeni za kvantifikaciju PCSK9 inhibitora korišćenjem LC-MS.
Uzorkovanje i analiza:
Plazma je pipetirana u Micronic epruvete na suvom ledu i držana na -20°C dok se ne analizira koncentracija u plazmi odgovarajućih inhibitora PCSK9 korišćenjem LC-MS. Uzorci plazme (uključujući standardnu krivu i QC uzorke koji su korišćeni za kvantifikaciju nepoznatih i pripremljeni od prazne plazme spajkovane PCSK9 inhibitorimaa u rasponu koncentracija od 0,5-1000 nM) su precipitirani proteinom korišćenjem tri zapremine 100% metanola ili acetonitrila sa 1% mravlje kiseline (u zavisnosti od anti-PCSK9 peptida) i centrifugirani (16000 x g, 4 ºC, 20 min). Supernatanti su ubrizgani u hromatografski sistem (TurboFlow Transcend 1250 & 10 valve VIM, Thermo Fisher Scientific) koji se sastojao od početne Turboflow Cyclone kolone za prečišćavanje 0,5 x 50 mm (Thermo Fischer Scientific) i eluirane Aeris peptid 3.6 µm XB - C18 kolone 2,1 x 50 mm (Phenomenex) čuvane na 60°C. Anti-PCSK9 peptid je eluiran korišćenjem hromatografskog gradijenta sa mobilnim fazama koje se sastoje od smeše vode i acetonitrila sa 0,1% ili 1% mravlje kiseline (u zavisnosti od EGF(A) analoga ili derivata). Anti-PCSK9 peptid je detektovan i kvantifikovan nakon on-line infuzije LC protoka u LTQ OrbiTrap ili Q Exactive maseni spektrometar (Thermo Fischer Scientific) opremljen interfejsom za elektrosprej koji radi u pozitivnom režimu, ESI+.
Izračunavanje PK svojstava:
Profili koncentracija-vreme u plazmi su analizirani nekompartmentalnom farmakokinetičkom analizom korišćenjem softvera Phoenix WinNonlin 6.4. Proračuni i za I.V. i za S.C. podatke su izvedeni korišćenjem linearne trapezoidne linearne interpolacije, sa ponderom 1/Y^Y. Bioraspoloživost je izračunata deljenjem AUC/doze za S.C. profil sa AUC/dozom za I.V. profil.
Rezultati:
Rezultati su prikazani u tabeli 7. U tabeli 7, Tmax označava vreme za dostizanje maksimalne koncentracije u plazmi testiranog analoga ili derivata EGF(A). T1⁄2 je poluživot
1 4
EGF(A) analoga ili derivata. MRT je srednje vreme zadržavanja. F (s.c.) je bioraspoloživost analoga ili derivata EGF(A) nakon supkutane injekcije. Više vrednosti T1⁄2 odražavaju duži poluživot testiranog jedinjenja.
Rezultati pokazuju da PCSK9 inhibitori pronalaska, posebno analozi LDL-R(293-332) supstituisani sa supstituentom masne kiseline, pokazuju produženi poluživot.
Tabela 7 Farmakokinetička svojstva analoga i derivata LDL-R(293-332) kod miševa
D.3. hPCSK9 model izazova
Cilj ovog istraživanja bio je da se pokaže promena nivoa ekspresije LDL receptora u jetri miša kao odgovor na inhibiciju delovanja intravenski ubrizganog hPCSK9 sa anti-PCSK9 peptidom.
Postupak
Zdravim mužjacima BaIBC ili NMRI miševa (Charles River, Nemačka) se ubrizgava anti-PCSK9 peptid, bilo s.c. ili i.v.15-120 minuta pre ubrizgavanja hPCSK9 (Sino Biologicals, Kina) intravenozno u repnu venu u dozi od 0,4 mg/kg. Šezdeset minuta nakon injekcije hPCSK9, životinje su anestezirane u izofluranu i eutanazirane dislokacijom vrata. Jetra se zatim brzo vadi i zamrzava u tečnom azotu. Jetre se drže na -80 stepeni Celzijusa do analize.
LDL-R Western blotting:
1
Uzorci tkiva jetre (100 mg) su homogenizovani u 500 µl pufera za lizu (Life Technology, FNN0011) koji sadrži koktel inhibitora fosfataze; PhosStop (Roche, 04906837001) i koktel inhibitora proteaze; Complete (Roche, 04693159001). Nakon dodavanja 1 čelične perle, tkiva su homogenizovana 2,5 min na 30 Hz. Posle centrifugiranja na 5000kg tokom 5 minuta, ukupan sadržaj proteina je određen korišćenjem BCA Protein Assay Kit (Pierce, 23225). Jednake količine proteina (60 µg) u puferu za uzorke (Life Technology, NP0007) su kuvane 10 minuta i centrifugirane 2 minuta na 14000 obrtaja u minuti pre nego što su stavljene na Criterion XT 3-8 % Tris-Acetatne gelove (BioRad#345-0131) i podvrgnute SDS-PAGE. Proteini su prebačeni na nitrocelulozne membrane (iBlot 2 NC Regular stacks, novex # IB23001) prema uputstvima proizvođača (Life Technology). Jednak transfer proteina je potvrđen putem Ponceau S (Sigma, P7170) bojenjem membrana i membrane su dalje blokirane u puferu za blokiranje (TBS-T, 2% Tween). LDL-r proteini su detektovani sa primarnim zečjim anti LDLr antitelom (Cayman Chemical Company #10012422), dok su beta-aktin proteini detektovani korišćenjem primarnog zečjeg anti beta-aktinskog antitela (abcam # ab6276). Oba proteina su dalje vizualizovana sa kozjim anti-zečjim sekundarnim antitelima konjugovanim sa peroksidazom (Biorad #170-6516) korišćenjem WesternBright Quantum Chemiluminscent-a (Advansta # K-12042-D10) i snimljena pomoću CCD kamere (LAS3000, FujiFilm). Kvantitativna analiza hemiluminiscentnih signala iz Western blotova urađena je pomoću MultiGauge softvera (Fujifilm).
Rezultati
Slika 1 prikazuje nivoe ekspresije LDL-R u jetri merene Western Blot-om, predstavljene kao dijagram raspršenosti za pojedinačne životinje, n=3-6. „Nosač-nosač“ je grupa zdravih kontrola (osnovni nivo), „nosač-hPCSK9” je grupa kojoj je ubrizgan samo hPCSK9.
Rezultati pokazuju da hPCSK9 smanjuje nivo ekspresije LDL-R i ovaj efekat je inhibiran ispitivanim PCSK9 inhibitorima.
U tabeli 8, podaci su predstavljeni kao procentualna promena u odnosu na prozor između osnovnog nivoa kod zdravih kontrolnih životinja (podešenog na 100 %) i nivoa nakon restrikcije pomoću samo hPCSK9 (podešenog na 0 %).
Svih 6 testiranih primera su u stanju da inhibiraju dejstvo hPCSK9 na nivou ekspresije LDL-R, a uočeni nivo inhibicije je sličan nivou inhibicije primećenom upotrebom kontrolnog molekula Alirokumab.
Tabela 8:
1
Zaključak
Nekoliko primera jedinjenja pokazalo je efikasnost u inhibiciji smanjenja nivoa ekspresije LDL-R od strane hPCSK9.
D.4. Smanjenje LDL holesterola kod hrčaka
Cilj studije je bio da se proceni efekat PCSK9 inhibitora na LDL-C kod zlatnih sirijskih hrčaka koji su hranjeni standardnom ishranom.
Postupak
U istraživanju su korišćeni mužjaci zlatnih sirijskih hrčaka (Janvier Elevage, Saint Isle, Francuska), starosti 6 nedelja (91-100 g). Posle 1 nedelje aklimatizacije, hrčci na 4-časovnom gladovanju (post počinje u ~08:00) su izmereni i uzeta im je krv (100 µL/EDTA) retro-orbitalnim krvarenjem pod anestezijom izofluranom oko podne radi merenja ukupnog holesterola, LDL holesterola i HDL holesterola. Hrčci su nasumično podeljeni u 5 homogenih grupa (n=10/grupa) prema njihovom 1) LDL holesterolu, 2) HDL holesterolu i 3) ukupnom holesterolu. Nakon podele, hrčci su tretirani supkutanom injekcijom jednom dnevno tokom 5 dana. Telesna težina je merena dnevno tokom perioda tretmana.
Tokom 3 dana tretmana, hrčci na 4-časovnom gladovanju su izmereni i uzeta im je krv (100 µL/EDTA) retro-orbitalnim krvarenjem pod anestezijom izofluranom oko 1 sat nakon jutarnjih doza (u podne) da bi se izmerio ukupni holesterol, LDL holesterol i HDL holesterol.
Posle 5 dana lečenja, hrčci na 4-časovnom gladovanju su izmereni i uzeta im je krv (maksimalni volumen krvi/EDTA) retro-orbitalnim krvarenjem pod anestezijom izofluranom oko 1 sat nakon jutarnjih doza (u podne).
Plazma je odmah izolovana. Za svakog pojedinca, održavan je volumen plazme od ~15 µL za merenje ukupnog holesterola, LDL holesterola i HDL holesterola. Druga zapremina plazme (~50 µL) svakog pojedinca je zatim korišćena da se napravi skup plazme za svaku
1
tretiranu grupu (tj.1 bazen od ~500 uL po grupi, 5 bazena) za FPLC profil ukupnog holesterola. Hrčci su zatim žrtvovani pod anestezijom izofluranom dislokacijom vrata i uzeta im je krv. Jetra je sakupljena, izmerena i 2 uzorka jetre (~50 mg i ~100 mg, težina nije zabeležena) su brzo zamrznuta u tečnom azotu, a zatim uskladištena na -80°C.
Uzorci od ~50 mg su korišćeni za procenu ekspresije proteina jetrenog LDL-receptora i pan-kadherina (kontrola opterećenja) pomoću Western Blot analize i denzitometrijske analize (softver Slika J). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost /- SEM. Za statističku analizu korišćeni su jednosmerni ili dvosmerni ANOVA sa Dunett ili Bonferroni post-testovi. P<0,05 se smatra značajnim.
Rezultati
Slika 2 prikazuje LDL holesterol u plazmi tokom perioda tretmana kod hrčaka tretiranih supkutanom injekcijom jednom dnevno tokom 5 dana sa nosačem ili 10 nmol/kg, 30 nmol/kg, 100 nmol/kg ili 300 nmol/kg Primera 2. (* *p<0,01 i ***p<0,001 u odnosu na test nosač, dvosmerna ANOVA, Dunetsova post hoc analiza).
Slika 3 prikazuje ekspresiju LDL-R u jetri za punjenje kontrolnog pan-kadherina iz uzoraka jetre hrčaka tretiranih supkutanom injekcijom jednom dnevno tokom 5 dana sa nosačem ili sa Primerom 2: 10 nmol/kg, Primerom 2: 30 nmol/kg, Primerom 2: 100 nmol /kg ili Primer 2: 300 nmol/kg) (*p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001 u odnosu na nosač, jednosmerna ANOVA, Dunetsova post hoc analiza).
U poređenju sa telesnom težinom nosača i povećanjem telesne težine nije bio uticajan nijedan tretman (podaci nisu prikazani). Sve doze su smanjile LDL holesterol (videti sliku 2). Ovaj efekat nije bio značajan za najnižu dozu Primera 2, ali veće doze od 100 i 300 nmol/kg smanjile su nivoe LDL holesterola do 35% na dan 5. Ovi trendovi su dalje potvrđeni FPLC analizom, koja je pokazala značajno smanjenje u nivoima ukupnog holesterola u frakcijama koje odgovaraju LDL i HDL kada su hrčci tretirani sa test stavkama Primera 2 (podaci nisu prikazani). Takođe je pokazano istovremeno povećanje nivoa ekspresije LDL-R u jetri zavisno od doze (videti slike 2 i 3).
Zaključak
Studija odgovora na dozu pokazuje da je moguće postići značajan efekat na LDL holesterol najmanje sa dozom od 30 nmol/kg nakon 3 i 5 dana doziranja kod zlatnih sirijskih hrčaka na normalnoj ishrani. Efekat na LDL holesterol prati značajno više nivoe ekspresije LDL receptora u jetri.
1
D.5 i.v. PK studija kod pasa
Za određivanje i.v. PK profila kod pasa, 3-4 psa bigl (mužjak, 10-16 kg) je dozirano i.v. (2 nmol/kg, 0,1 ml/kg) sa jednim ili više analoga PCSK9 u 70 mM natrijum hlorida; 50 mM fosfata, 70 ppm polisorbata 20; pH=7,4. Pre doziranja, psi su izglednjivani preko noći sa slobodnim pristupom vodi iz slavine. Analozi su dozirani kroz safenu ili cefaličnu venu jednokratnom injekcijom kroz iglu (20 G) ili uzastopnim doziranjem kroz umetnuti venflon.0,8 ml uzorka krvi biće sakupljeno u svaku epruvetu obloženu EDTA na 0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 288 sati nakon doziranja. Za prva 4 sata uzorkovanja, krv je sakupljena kroz umetnuti venflon kada su psi bili vezani na platformi.
Ostatak tačaka uzorkovanja nakon 4 sata je sakupljen kroz jugularnu venu jednim bodenjem iglom (20 G). Neposredno nakon uzimanja krvi, svaki uzorak je lagano obrnut 3-4 puta i brzo prebačen na ledenu kutiju pre pripreme plazme (10 min, 4<0>C, 4000 rpm). Uzorci plazme su držani na -20<0>C pre bioanalize. Maksimalno odstupanje za uzorkovanje krvi je 1 min na dan doziranja do 120. minuta nakon doziranja, 5 min za vremenske tačke od 4 do 10 sati i od 1 sata tokom ostatka dana.
Analiza plazme:
Plazma iz studije kodoziranja je pipetirana u Micronic epruvete na suvom ledu i držana na -20°C dok se ne analizira koncentracija u plazmi odgovarajućih derivata PCSK9 korišćenjem masene spektrometrije tečne hromatografije (LC-MS). Uzorci plazme (uključujući standardnu krivu i QC uzorke koji su korišćeni za kvantifikaciju nepoznatih i pripremljeni od prazne plazme sa dodacima PCSK9 derivata u rasponu nominalne koncentracije od 0,5-500 nM) su precipitirani na protein korišćenjem tri zapremine metanola (uključujući Primer 4 kao interni standard) i centrifugirani (16000 x g, 4 ºC, 30 min). Supernatanti su ubrizgani u hromatografski sistem (TurboFlow Transcend 1250 & 10 valve VIM, Thermo Fisher Scientific) koji se sastojao od početne Turboflow Cyclone kolone za prečišćavanje 0,5 x 50 mm (Thermo Fischer Scientific) i eluirane Aeris 3.6 µm XB - C18 kolone 2.1 x 50 mm (Phenomenex) čuvane na 60°C. Derivati PCSK9 su eluirani korišćenjem hromatografskog gradijenta sa mobilnim fazama koje se sastoje od smeša vode i acetonitrila/metanola 50/50 v/v% sa 1 v/v% mravlje kiseline. Derivati PCSK9 su detektovani i kvantifikovani nakon on-line infuzije LC toka u Q Exactive maseni spektrometar (Thermo Fischer Scientific) opremljen interfejsom za elektrosprej koji radi u pozitivnom režimu, ESI+. Tokom bioanalize uzoraka plazme, primećen je različit stepen izomerizacije za različite derivate PCSK9. Svi izomeri imaju identične monoizotopske mase i kvantitativni su zajedno.
PK parametri svakog testiranog analoga (npr. T1/2) su analizirani nekompartmentalnom analizom (NCA) korišćenjem softvera Phoenix WinNonlin, a proračuni poluživota su zasnovani na nivoima izloženosti ukupno svih izomera sa istom molekulskom masom.
1
Tabela 9: Poluživot derivata EGF(A) kod pasa posle i.v. doziranja
D.6 Studija oralnog unosa kod pacova
Predmetne studije su istraživale gastrointestinalnu apsorpciju koformulisanih peptida koji su dozirani peroralno zdravim pacovima.
Životinje:
Mužjaci pacova Sprague Dawley iz Taconica, Danska, 250 g po dolasku. Pacovi su aklimatizovani najmanje nedelju dana u životinjskoj jedinici, Novo Nordisk A/S, pre studije. Telesna težina na početku studije bila je približno 280-300 g. Pacovi su izgladnjivani 18 sati pre doziranja.
Koformulacija peptida
Izvršena je priprema tečnih formulacija za oralno zajedničko doziranje analoga PCSK9i in vivo (pacovima) kako je opisano u daljem tekstu.
Ciljna koncentracija EGF(A) peptida bila je 200 µM svakog analoga, formulisanog u ciljnoj koncentraciji od 55 mg/ml natrijum dekanoata i vode. Pet do šest različitih analoga peptida je formulisano zajedno u istoj formulaciji.
1
Ukratko, osnovni rastvor (110 mg/mL) natrijum dekanoata je pripremljen korišćenjem ultra čiste vode i pH rastvora je podešen na 8.0 korišćenjem HCl.
API su prebačeni u staklenu bočicu od 20 mL i dodato je 5 g ultra čiste vode (pod pretpostavkom gustine 1 mg/mL) i API su ostavljeni da se rastvore na sobnoj temperaturi na valjkastom mikseru. pH rastvora je zatim podešen na 8.0 sa NaOH dok se pH ne stabilizuje, nakon čega je dodato 6,5 g natrijum dekanoata (konačna koncentracija 55 mg/mL), nakon čega je pH podešen na pH 8.0. Rastvor je zatim držan na sobnoj temperaturi na valjkastom mikseru preko noći (zaštićen od svetlosti). Sledećeg dana izvršeno je konačno podešavanje pH na pH 8.0 ako je potrebno korišćenjem NaOH.
Konačna težina formulacije je podešena na 13 g korišćenjem ultra čiste vode i zatim filtrirana kroz filter od 0,22 µm. Sadržaj API i natrijum dekanoata određen je na konačnoj formulaciji da bi se obezbedilo tačno doziranje. Formulacije su čuvane na 4°C do dalje upotrebe.
Koncentracija svakog API u tečnoj formulaciji određena je UV apsorbancijom na 215 nm. LC postupci su razvijeni kako bi se osiguralo da se svaki API za zajedničko doziranje eluira odvojeno jedan od drugog. Standardi poznatih koncentracija (određenih od strane CLND) za svaki API su pomešani zajedno, a ukupno pet koncentracija standarda je korišćeno da se generišu kalibracione krive. Konačna utvrđena koncentracija bila je prosek uzet iz tri uzorka, svaki sa dva eksperimentalna ponavljanja. Koncentracija kaprata u tečnoj formulaciji određena je na sličan način, korišćenjem kalibracione krive koja se sastoji od tri koncentracije standarda.
Doziranje:
Životinje su dozirane peroralno, gavažom, sa ciljnom dozom od 1000 nmol/kg svakog peptida i zapreminom od 5 ml/kg u trenutku = 0
Uzorkovanje krvi i odvajanje plazme
Uzorci krvi su uzimani u vremenima: 15, 30, 60 i 120 minuta nakon doziranja. Uzorci krvi (200 µl) su sakupljeni u epruvete obložene EDTA bodenjem jezičnih vena kod pacova pri svesti. Uzorci su centrifugirani 5 minuta na 8000G sa 4<0>C. Plazma (60-75 µl) je odvojena i pipetirana u mikronske epruvete (75 µl) i odmah zamrznuta na -20<0>C.
Analiza plazme:
Plazma iz studije kodoziranja je pipetirana u Micronic epruvete na suvom ledu i držana na -20°C dok se ne analizira koncentracija u plazmi odgovarajućih derivata PCSK9 korišćenjem masene spektrometrije tečne hromatografije (LC-MS). Uzorci plazme (uključujući standardnu krivu i QC uzorke koji su korišćeni za kvantifikaciju nepoznatih i pripremljeni od prazne plazme sa dodacima PCSK9 derivata pri nominalnom rasponu koncentracije od 0,5-500 nM) su
1 1
precipitirani proteinom korišćenjem tri zapremine metanola ili acetonitrila sa 1 v/v % mravlje kiseline (uključujući Primer 4 kao interni standard) i centrifugirani (16000 x g, 4 ºC, 30 min). Supernatanti su ubrizgani u hromatografski sistem (TurboFlow Transcend 1250 & 10 valve VIM, Thermo Fisher Scientific) koji se sastojao od početne Turboflow Cyclone kolone za prečišćavanje 0,5 x 50 mm (Thermo Fischer Scientific) i eluirane Aeris peptidne 3.6 µm XB -C18 kolone 2.1 x 50 mm (Phenomenex) čuvane na 60°C. Derivati PCSK9 su eluirani korišćenjem hromatografskog gradijenta sa mobilnim fazama koje se sastoje od smeša vode i acetonitrila/metanola 50/50 v/v% sa 1 v/v% mravlje kiseline. Derivati PCSK9 su detektovani i kvantifikovani nakon on-line infuzije LC protoka na Q Exactive ili LTQ OrbiTrap Discovery mass maseni spektrometar (Thermo Fischer Scientific) opremljen interfejsom za elektrosprej koji radi u pozitivnom režimu, ESI+. Tokom bioanalize uzoraka plazme, primećen je različit stepen izomerizacije za različite derivate PCSK9. Svi izomeri imaju identične monoizotopske mase i kvantitatifokovni su zajedno.
Izračunavanje podataka:
Iz koncentracija u plazmi koje su određene pomoću LC-MS, ekstrahovane su maksimalne koncentracije u plazmi (Cmax) za svaki peptid kod svakog pacova i Cmax/doza je izračunata kao srednje vrednosti ± SD za n = 6-8 pacova. Doza je izračunata kao zapremina injekcije, prilagođena telesnoj težini, pomnožena sa stvarnom koncentracijom peptida, pri čemu je jedinica pmol/kg.
U svaku koformulisanu grupu uključen je referentni peptid (primer 3). U tabeli ispod, Cmax/doza (kg/I) je data za 8 različitih peptida zajedno sa Cmax/dozom (kg/I) za referentni peptid (Primer 3). Cmax proračuni su zasnovani na nivoima izloženosti ukupno svih izomera sa istom molekulskom masom. Rezultati pokazuju da se derivati EGF(A) generalno dobro apsorbuju.
Tabela 10. Koncentracije u plazmi podeljene sa dozom kod pacova nakon oralnog kodoziranja derivata EGF(A)
1 2
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22

Claims (23)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Derivat EGF(A) koji sadrži analog EGF(A) peptida koji sadrži 301Leu i supstituent koji sadrži najmanje jednu grupu masnih kiselina, naznačen time što analog EGF(A) peptida ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO:1 i što derivat ima Ki ispod 5 nM kada se meri u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R koji se vezuje kao što je opisano u odeljku D1.1 opisa pronalaska.
  2. 2. Derivat EGF(A) prema zahtevu 1, naznačen time što dati supstituent sadrži karboksilnu kiselinu, sulfonsku kiselinu, tetrazolnu grupu, metilsulfonilkarbamoilamino grupu ili 3-hidroksiizoksazol grupu i 8-20 uzastopnih –CH2- grupa.
  3. 3. Derivat EGF(A) prema zahtevu 1, naznačen time što dati supstituent ima formulu I: Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I] pri čemu Z1je izabran iz: Hem.1: HOOC-(CH2)n-CO-*, Hem.2: tetrazolil-(CH2)n-CO-*, Hem.3: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*, Hem.4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*, Hem.5: MeS(O)2NH(CO)N-(CH2)n-CO-* i Hem.6: 3-HO-Izoksazol-(CH2)n-CO-* naznačen time što n je ceo broj u rasponu od 8-20, m je ceo broj u rasponu od 8-11, -COOH grupa u Hem.3 se može pričvrstiti na poziciju 2, 3 ili 4 na fenil prstenu, a simbol ∗ označava tačku vezivanja za azot u Z2ili, ako Z2je veza za azot na susednom Z elementu; Z2je izabran iz: Hem.7: *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*, Hem.8: *-NH-CH2-(C6H10)-CO-* i veze; Z3je izabran iz: γGlu, Glu i veze; Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9su izabrani, nezavisno jedan od drugog, iz: Glu, γGlu, Gly, Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep, Aeeep, TtdSuc i veze; Z10je izabran iz: 22 Hem.14: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-* i veze.
  4. 4. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što derivat EGF(A) sadrži jedan ili dva supstituenta izabrana iz grupe koju čine: HOOC-(CH2)18-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)18-CO-NH-CH2-(C6H10)-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2xADO-NH-CH2-(C6H4)-CH2-HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-HOOC-(CH2)16-CO-NH-CH2-(C6H10)-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-2xADO-HOOC-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-2xADO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-3xADO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-2xgGlu-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-3xGly-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-2xgGlu-2xADO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-TtdSuc-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)9-CO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-gGlu-4xADO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)10-CO-NH-CH2-(C6H10)-CO-gGlu-2xADO-4-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)9-CO-gGlu-2xADO-3-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)9-CO-gGlu-2xADO-3-HO-Izoksazol-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO-HOS(O)2-(CH2)15-CO-gGlu-2xADO-NH-CH2-(C6H4)-CH2-HOS(O)2-(CH2)13-CO-gGlu-2xADO-Tetrazolil-(CH2)15-CO-NH-SO2-(CH2)3-CO-ADO-ADO-NH-CH2-(C6H4)-CH2-Tetrazolil-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO-Tetrazolil-(CH2)15-CO-gGlu-2xADO- i MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)12-CO-gGlu-2xADO-.
  5. 5. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži jedan, dva, tri, četiri ili svih pet od sledećih aminokiselinskog ostataka (divljeg tipa): 295Asn, 296Glu, 298Leu, 302Gly i 310Asp.
  6. 6. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži ostatak divljeg tipa 310Asp.
  7. 7. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži ostatak divljeg tipa 295Asn.
  8. 8. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži 299Asp (D) ili 299Ala (A).
  9. 9. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži 307Ile (I).
  10. 10. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži 309Arg (R).
  11. 11. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži supstituciju 312Lys sa amino-kiselinom izabranom iz grupe koju čine: 312Glu, 312Asp, 312Gln i 312Arg.
  12. 12. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži najmanje dve aminokiselinske supstitucije identifikovane bilo kojom od grupa: i. 301Leu i 309Arg ii. 301Leu, 309Arg, 312Glu iii. 301Leu, 307lle i 309Arg iv. 301Leu, 307lle, 309Arg i 312Glu v. 301Leu, 309Arg i 321Glu vi. 301Leu, 309Arg, 321Glu i 312Glu vii. 301Leu, 307lle, 309Arg i 299Ala viii. 301Leu, 307lle, 309Arg, 299Ala i 312Glu ix. 301Leu i 309Arg i najmanje jedne Lys supstitucije x. 301Leu, 309Arg, 312Glu i najmanje jedne Lys supstitucije xi. 301Leu, 307lle i 309Arg i najmanje jedne Lys supstitucije xii. 301Leu, 307lle, 309Arg i 312Glu i najmanje jedne Lys supstitucije xiii. 301Leu, 309Arg i 321Glu i najmanje jedne Lys supstitucije xiv. 301Leu, 309Arg, 321Glu i 312Glu i najmanje jedne Lys supstitucije 2 xv. 301Leu, 307lle, 309Arg i 299Ala i najmanje jedne Lys supstitucije i xvi. 301Leu, 307lle, 309Arg, 299Ala i 312Glu i najmanje jedne Lys supstitucije.
  13. 13. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva naznačen time što je najmanje jedan supstituent vezan za Lys ostatak u analogu EGF(A) peptida izabran iz grupe koju čine: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys.
  14. 14. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži najmanje jedan Lys ostatak izabran iz grupe koju čine: 313Lys, 324Lys, 328Lys i 333Lys.
  15. 15. Derivat EGF(A) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što su jedan ili dva supstituenta vezana za Lys ostatak u analogu EGF(A) peptida.
  16. 16. Derivat EGF(A) prema zahtevu 1, naznačen time što je derivat EGF(A) izabran iz grupe derivata EGF(A) koju čine: Primeri jedinjenja 1-44, 46-47, 51-55, 57, 60-64, 66-69, 71-102 i 106-159 opisani u odeljku C.1 i tabeli 4 opisa pronalaska.
  17. 17. Derivat EGF(A) izabran iz grupe koju čine: i. Primerno jedinjenje 31
    pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID NO: 32, 2 1 ii. Primerno jedinjenje 95,
    S S pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID NO: 76, iii. Primerno jedinjenje 128
    O O pri čemu je aminokis Oelinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID NO: 32, iv. Primerno jedinjenje 133,
    H pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne o O H snove SEQ ID NO: 98, O 2 2 v. Primerno jedinjenje 143,
    pri čemu je aminokiselinska sekvenca O peptidne osnove SEQ ID NO: 98, vi. Primerno jedinjenje 144,
    O O pri čemu je aminokis Oelinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID NO:98, vii. Primerno jedinjenje 150,
    pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID N OO:78, 2 viii. Primerno jedinjenje 151,
    pri čemu je aminokiselinska sekven Oca peptidne osnove SEQ O ID NO:104, ix. Primerno jedinjenje 152
    pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID NO:72, i x. Primerno jedinjenje 153
    pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID NO:105.
  18. 18. Derivat EGF(A) N{Alfa}(N{Epsilon-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]Lys (primer jedinjenja 151), 2 4
    pri čemu je aminokiselinska sekvenca peptidne osnove SEQ ID N OO:104.
  19. 19. Analog EGF(A) peptida koji ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO 1, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu, 310Asp i aminokiselinsku supstituciju 312Lys i pri naznačen time što analog ima Ki ispod 5 nM kada se meri u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R kao što je opisano u odeljku D1.1 opisa pronalaska.
  20. 20. Analog EGF(A) peptida koji ima 1-8 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa EGF(A) domenom, amino-kiseline 293-332 LDL-R, definisane SEQ ID NO 1, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži 301Leu i 310Asp i naznačen time što peptid nema supstituciju 299Asp za Glu, Val ili His i naznačen time što analog ima Ki ispod 5 nM kada se meri u kompetitivnom ELISA testu vezivanja PCSK9-LDL-R kao što je opisano u opisu odeljka D1.1.
  21. 21. Analog EGF(A) peptida prema zahtevu 19 ili 20, naznačen time što analog EGF(A) peptida sadrži Cys ostatke 297Cys, 304Cys, 308Cys, 317Cys, 319Cys i 331Cys.
  22. 22. Analog EGF(A) peptida prema bilo kom od prethodnih zahteva 19-21, naznačen time što je analog EGF(A) peptida definisan kao analog EGF(A) peptida u bilo kom od zahteva 5-12.
  23. 23. Analog EGF(A) peptida prema bilo kom od prethodnih zahteva 19-22, EGF(A) dalje sadrži najmanje jednu Lys supstituciju izabranu iz grupe koju čine: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys i 333Lys. 2
RS20220538A 2016-01-13 2017-01-13 Egf(a) analozi sa supstituentima masnih kiselina RS63298B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2016070791 2016-01-13
CN2016076580 2016-03-17
EP16195965 2016-10-27
PCT/EP2017/050668 WO2017121850A1 (en) 2016-01-13 2017-01-13 Egf(a) analogues with fatty acid substituents
EP17701078.2A EP3402811B1 (en) 2016-01-13 2017-01-13 Egf(a) analogues with fatty acid substituents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63298B1 true RS63298B1 (sr) 2022-07-29

Family

ID=57868232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220538A RS63298B1 (sr) 2016-01-13 2017-01-13 Egf(a) analozi sa supstituentima masnih kiselina

Country Status (26)

Country Link
US (2) US10822385B2 (sr)
EP (1) EP3402811B1 (sr)
JP (2) JP6797926B2 (sr)
KR (1) KR102417487B1 (sr)
CN (1) CN108473550B (sr)
AU (1) AU2017207862B2 (sr)
BR (1) BR112018013820A2 (sr)
CA (1) CA3010756A1 (sr)
CL (1) CL2018001868A1 (sr)
CO (1) CO2018007440A2 (sr)
DK (1) DK3402811T3 (sr)
ES (1) ES2916998T3 (sr)
HR (1) HRP20220720T1 (sr)
HU (1) HUE058647T2 (sr)
IL (1) IL260043A (sr)
LT (1) LT3402811T (sr)
MX (1) MX2018008681A (sr)
MY (1) MY195199A (sr)
PE (1) PE20181376A1 (sr)
PH (1) PH12018501502A1 (sr)
PL (1) PL3402811T3 (sr)
RS (1) RS63298B1 (sr)
RU (1) RU2747877C2 (sr)
SA (1) SA518391996B1 (sr)
SI (1) SI3402811T1 (sr)
WO (1) WO2017121850A1 (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3402782T1 (sl) 2016-01-13 2020-11-30 Grunenthal Gmbh 8-amino-2-okso-1,3-diaza-spiro-(4,5)-dekanski derivati
US20170197947A1 (en) 2016-01-13 2017-07-13 Gruenenthal Gmbh 3-((Hetero-)Aryl)-Alkyl-8-Amino-2-Oxo-1,3-Diaza-Spiro-[4.5]-Decane Derivatives
JP6854823B2 (ja) 2016-01-13 2021-04-07 グリュネンタール・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング ３−（カルボキシメチル）−８−アミノ−２−オキソ−１，３−ジアザ−スピロ−［４．５］−デカン誘導体
EP3722284B1 (en) 2016-01-13 2025-01-22 Grünenthal GmbH 3-((hetero-)aryl)-8-amino-2-oxo-1,3-diaza-spiro-[4.5]-decane derivatives
US10822385B2 (en) 2016-01-13 2020-11-03 Novo Nordisk A/S EGF(A) analogues with fatty acid substituents
WO2019016300A1 (en) * 2017-07-19 2019-01-24 Novo Nordisk A/S EGF ANALOGUES (A), PREPARATION, FORMULATIONS AND USES THEREOF
EP3655427A1 (en) 2017-07-19 2020-05-27 Novo Nordisk A/S Bifunctional compounds
WO2019023295A1 (en) * 2017-07-27 2019-01-31 Saint Louis University Fatty acid modified human epidermal growth factor
IL279363B2 (en) 2018-06-21 2025-12-01 Merck Sharp & Dohme Pcsk9 antagonist compounds
TW202028229A (zh) * 2018-10-05 2020-08-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 包含胰島素肽及ｅｇｆ（ａ）肽之雙功能化合物
JP7526738B2 (ja) 2019-03-22 2024-08-01 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 監視システムを有する落下防止システム
CN110357969B (zh) * 2019-05-27 2022-03-08 北京志道生物科技有限公司 一种GLP1-EGFa异源二聚体蛋白、功能及方法
KR20220046565A (ko) 2019-08-07 2022-04-14 노보 노르디스크 에이/에스 Egf(a) 유도체 및 n-(8-(2-하이드록시벤조일)아미노)카프릴산의 염을 포함하는 고형 조성물
IL291893A (en) 2019-11-07 2022-06-01 Novo Nordisk As Solid preparations comprising a pcsk9 inhibitor and a salt of n-(8-(2-hydroxybenzoyl)amino) caprylic acid
US12577259B2 (en) 2019-12-20 2026-03-17 Merck Sharp & Dohme Llc PCSK9 antagonist compounds
EP4556431A3 (en) 2021-07-02 2025-08-13 3M Innovative Properties Co. Aerial lift interlocked with fall-protection safety apparatus
WO2023012263A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Novo Nordisk A/S Solid oral peptide formulations

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090175795A1 (en) 2005-07-29 2009-07-09 Amprotein Corporation Chimeric therapeutic agents
EP2330124B1 (en) 2005-08-11 2015-02-25 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
EP2178910B1 (en) 2007-08-15 2014-10-08 Novo Nordisk A/S Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids
US9994923B2 (en) 2008-04-23 2018-06-12 Amgen Inc. Neutralizing proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) variants and uses thereof
WO2009143633A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Institut De Recherches Cliniques De Montreal Pcsk9 inhibitors and methods of use thereof
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN103052900A (zh) * 2010-08-02 2013-04-17 日本电气株式会社 偏振器和发光装置
CN102153652A (zh) 2010-12-10 2011-08-17 浙江大学 一种融合蛋白的表达方法及用途
CN103370075A (zh) 2011-02-15 2013-10-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 长效il-1受体拮抗剂
EP2721063A4 (en) * 2011-06-20 2015-01-14 Hoffmann La Roche PCSK9 BINDING POLYPEPTIDES AND METHOD OF USE THEREOF
RU2610175C2 (ru) * 2011-09-23 2017-02-08 Ново Нордиск А/С Новые аналоги глюкагона
TW201315742A (zh) 2011-09-26 2013-04-16 Novartis Ag 治療代謝病症之雙功能蛋白質
US20140357838A1 (en) * 2011-12-21 2014-12-04 Novo Nordisk A/S N-Terminally Modified Insulin Derivatives
WO2013170636A1 (zh) 2012-05-18 2013-11-21 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用
TW201420606A (zh) 2012-08-22 2014-06-01 Lilly Co Eli 同源二聚體蛋白
WO2014037373A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Sanofi Fusion proteins for treating a metabolic syndrome
SI2986313T1 (sl) * 2013-04-18 2019-09-30 Novo Nordisk A/S Stabilni koagonisti GLP-1 / glukagonskega receptorja z dolgotrajnim učinkom za medicinsko uporabo
JP2016538829A (ja) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド
EP3107937A4 (en) 2014-02-21 2017-11-15 MedImmune, LLC Anti-pcsk9~glp-1 fusions and methods for use
US10570184B2 (en) * 2014-06-04 2020-02-25 Novo Nordisk A/S GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
CN104558198A (zh) 2014-07-25 2015-04-29 成都贝爱特生物科技有限公司 GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途
US20180207223A1 (en) * 2015-03-19 2018-07-26 Institut De Cardiologie De Montreal Pcsk9 inhibitory polypolypeptides and methods of use
CN105367884A (zh) 2015-11-02 2016-03-02 陈薇 一种绝缘耐火抗辐射的屏蔽电缆材料及其制备方法
US10822385B2 (en) 2016-01-13 2020-11-03 Novo Nordisk A/S EGF(A) analogues with fatty acid substituents
WO2019016300A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Novo Nordisk A/S EGF ANALOGUES (A), PREPARATION, FORMULATIONS AND USES THEREOF
EP3655427A1 (en) 2017-07-19 2020-05-27 Novo Nordisk A/S Bifunctional compounds

Also Published As

Publication number Publication date
DK3402811T3 (da) 2022-06-13
JP2019505521A (ja) 2019-02-28
BR112018013820A2 (pt) 2018-12-11
MX2018008681A (es) 2018-09-17
KR20180100177A (ko) 2018-09-07
CA3010756A1 (en) 2017-07-20
US20200407409A1 (en) 2020-12-31
LT3402811T (lt) 2022-06-10
IL260043A (en) 2018-07-31
JP2021035989A (ja) 2021-03-04
PL3402811T3 (pl) 2022-07-11
CO2018007440A2 (es) 2018-09-28
MY195199A (en) 2023-01-11
CL2018001868A1 (es) 2018-08-31
AU2017207862A1 (en) 2018-07-05
PE20181376A1 (es) 2018-09-05
ES2916998T3 (es) 2022-07-06
HUE058647T2 (hu) 2022-09-28
SI3402811T1 (sl) 2022-06-30
US20190016768A1 (en) 2019-01-17
EP3402811A1 (en) 2018-11-21
JP6797926B2 (ja) 2020-12-09
SA518391996B1 (ar) 2021-07-14
RU2018127882A3 (sr) 2020-06-19
RU2747877C2 (ru) 2021-05-17
HRP20220720T1 (hr) 2022-09-30
CN108473550A (zh) 2018-08-31
AU2017207862B2 (en) 2020-12-17
EP3402811B1 (en) 2022-03-30
US10822385B2 (en) 2020-11-03
RU2018127882A (ru) 2020-02-13
PH12018501502A1 (en) 2019-03-25
CN108473550B (zh) 2022-11-22
KR102417487B1 (ko) 2022-07-06
WO2017121850A1 (en) 2017-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS63298B1 (sr) Egf(a) analozi sa supstituentima masnih kiselina
KR101205272B1 (ko) 아실화된 ｇｌｐ-1 화합물
JP7434299B2 (ja) インスリンペプチドおよびｅｇｆ（ａ）ペプチドを含む二官能性化合物
CN101005857A (zh) 多肽延长标记
EA020326B1 (ru) Агонисты смешанного действия на основе глюкозозависимого инсулинотропного пептида для лечения нарушений обмена веществ и ожирения
JP2018505146A (ja) Ｆｇｆ２１誘導体及びその使用
ES2384963T9 (es) Péptidos que reducen los niveles de glucosa en sangre
CN102918056A (zh) 新的胰高血糖素类似物
KR20230104118A (ko) Glp-1 전구약물 및 이의 용도
JP2007537981A (ja) 新規の血漿タンパク質親和性タグ
CN101665538A (zh) 与白蛋白样物质相连的新glp-1类似物
KR20070120112A (ko) 연장형 ｇｌｐ-1 화합물
US20200165313A1 (en) Egf(a) analogues, preparation, formulations and uses thereof
KR20080021636A (ko) Ｇｌｐ-1 아고니스트인 신규 화합물
JP2025517672A (ja) プロドラッグおよびその使用
CA3195872A1 (en) Glp-1 prodrugs and uses hereof
HK1262866B (en) Egf(a) analogues with fatty acid substituents