RS63392B1 - Kompozicije koje sadrže aminokiseline za upotrebu u lečenju gojaznosti - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj opis se uopšteno odnosi na kompozicije koje sadrže aminokiseline. Tačnije, opis se odnosi na kompozicije koje sadrže amino kiseline za upotrebu u medicini, posebno za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa mitohondrijalnom disfunkcijom, gde je navedena bolest gojaznost.

Pozadina pronalaska

[0002] Mitohondrije su ćelijske organele čija je primarna funkcija oksidativna fosforilacija, proces kroz koji se energija dobijena metabolizmom glukoze ili masnih kiselina pretvara u adenozin trifosfat (ATP). ATP se zatim koristi za pokretanje različitih biosintetičkih reakcija koje zahtevaju energiju i druge metaboličke aktivnosti.

[0003] Mitohondrijalna disfunkcija može uticati na bilo koje tkivo sa rezultujućim velikim brojem simptoma, u zavisnosti od stepena u kome su različita tkiva uključena. Bolesti koje proističu iz mitohondrijalne disfunkcije mogu uključivati, na primer, oticanje mitohondrija usled potencijalnog neispravnosti mitohondrijske membrane, funkcionalne poremećaje usled oksidativnog stresa kao što je dejstvo reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) ili slobodnih radikala, funkcionalne poremećaje usled genetskih mutacija i bolesti usled funkcionalnog nedostatka mehanizama oksidativne fosforilacije za proizvodnju energije. Mitohondrije propadaju sa godinama, gube respiratornu aktivnost, akumuliraju oštećenja na njihovoj DNK (mtDNK) i proizvode prekomerne količine reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).

[0004] Nedavni dokazi ukazuju na uključenost mitohondrijalne disfunkcije u nekoliko bolesti, uključujući metaboličke i kardiovaskularne poremećaje povezane sa starenjem (aterosklerozu), pored glavnih neurodegenerativnih bolesti kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Hantingtonova bolest i hronična opstruktivna plućna bolest (HOBP). Mitohondrijalna disfunkcija je takođe pronađena kod gojaznosti i povezanih poremećaja, uključujući dijabetes melitus tipa 2, visok krvni pritisak, dislipidemiju, srčanu insuficijenciju, bolest bubrega i osteoporozu. Naročito, sarkopenija, definisana kao jedan od najvažnijih uzroka funkcionalnog opadanja i gubitka nezavisnosti kod starijih osoba usled nevoljnog gubitka mase i snage skeletnih mišića, i ključna karakteristika tzv. sindroma slabosti, nastaje usled smanjene mase i funkcija mitohondrija. Poznate su i druge bolesti i poremećaji gubitka mišića, uključujući, na primer, kaheksiju. Kaheksija ili sindrom iscrpljivanja se definiše kao nenamerni gubitak telesne težine, atrofija mišića, umor i slabost. Kaheksija se javlja kod ljudi sa rakom, AIDS-om, celijakijom, HOBP, multiplom sklerozom, reumatoidnim artritisom, kongestivnom srčanom insuficijencijom, tuberkulozom i anoreksijom nervozom. Nisu pronađeni lekovi ili hranljive materije za sprečavanje i/ili lečenje ovog stanja.

[0005] Dakle, imajući u vidu svetske epidemije gojaznosti i sve veće starenje stanovništva, najčešći pacijenti predstojećoj budućnosti biće sarkopeni, gojazni stariji subjekti.

[0006] Gojaznost i povezane bolesti, kao što su insulinska rezistencija i dijabetes tipa 2, danas su veliki zdravstveni problem, sa više od 1,4 milijarde odraslih osoba sa prekomernom težinom (Svetska zdravstvena organizacija. Gojaznost i prekomerna težina. Medija centar SZO). Među njima, ~500 miliona je gojazno i 40 miliona dece mlađe od 5 godina trenutno je klasifikovano kao dete prekomerne težine ili gojazno (Svetska zdravstvena organizacija. Gojaznost i prekomerna težina. Medija centar SZO).

[0007] Sa metaboličke tačke gledišta, gojaznost se javlja kada unos energije premašuje potrošnju energije (EE) kao posledica smanjene funkcije mitohondrija; stoga, pored dijetetskih intervencija koje imaju za cilj smanjenje unosa energije, drugi pristup je povećanje potrošnje energije putem, na primer, fizičkog vežbanja. Međutim, ovo nije jednostavan zadatak, posebno za gojazne osobe, koje često pokazuju mišićnu disfunkciju povezanu sa gojaznošću (Wells et al., 2008).

[0008] Stoga, postoji rastuća potreba za novim terapijskim pristupima koji imaju za cilj postizanje gubitka težine i smanjenje društvenog i medicinskog uticaja ove bolesti.

Suština pronalaska

[0009] Ovaj opis ima za cilj da obezbedi nove kompozicije zasnovane na amino kiselinama koje su posebno efikasne u povećanju mitohondrijalne funkcije, a time i u lečenju gojaznosti i srodnih poremećaja. Prema sadašnjem opisu, gorenavedeni cilj je postignut zahvaljujući predmetu koji je posebno pomenut u patentnim zahtevima koji slede, a koji se shvataju kao sastavni deo ovog pronalaska.

[0010] Ovaj opis obezbeđuje kompoziciju za promovisanje mitohondrijalne biogeneze i poboljšanje mitohondrijalne funkcije kod subjekta, kompozicija koja sadrži aktivno sredstvo, navedeno aktivno sredstvo koje sadrži aminokiseline leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu, jabučna kiselina.

[0011] U jednom ili više izvođenja, aktivni agens kompozicije dalje sadrži jednu ili više amino kiselinu odabranih iz grupe koju čine histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, cistein i tirozin.

[0012] U jednom ili više izvođenja, ovde otkrivene kompozicije mogu se koristiti u medicini.

[0013] Kompozicije se mogu koristiti u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, pri čemu je navedena bolest gojaznost.

Kratak opis crteža

[0014] Pronalazak će sada biti opisan, samo kao primer, pozivajući se na priložene slike, pri čemu:

- Slika 1 prikazuje sadržaj mitohondrijalne DNK (mtDNK) analiziran pomoću kvantitativne PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim različitim kompozicijama na bazi amino kiselina tokom 48 sati (48 sati, 2 dana). Kvantitativni PCR je izveden u triplikatu i normalizovan na genomsku DNK koja kodira GAPDH (n = 3, prosečna vrednost ± SEM). Vrednost netretiranih ćelija (CT) se uzima kao 1,0 (*p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, #p < 0,05 u odnosu na BCAAem i B2).

- Slika 2 prikazuje nivoe mRNK mitohondrijalnog markera biogeneze (Tfam, PGC-1a, Cyt c) analizirane pomoću kvantitativne PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi amino kiselina tokom 24 sata (1 d). Kvantitativni PCR je izveden u triplikatu i normalizovan na GAPDH (n = 3, prosečna vrednost ± SEM). *p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, izraženo kao 1,0. #p < 0,05 u odnosu na BCAAem.

Slika 3 prikazuje nivoe mRNK mitohondrijalnog markera biogeneze (Tfam, PGC-1a, Cyt c) analizirane kvantitativnim PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi amino kiselina tokom 48 sati (2 dana). Kvantitativni PCR je izveden u triplikatu i normalizovan na GAPDH (n = 3, prosečna vrednost ± SEM). *p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, izraženo kao 1,0. #p < 0,05 u odnosu na BCAAem.

- Slika 4 prikazuje nivoe mRNK Krüppel-like faktora 15 (KFL15) i člana porodice protein fosfataze 2C ciljanog na mitohondrijalni matriks (PP2CM), koji su proteini koji regulišu katabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA). PP2CM i KFL15 su analizirani kvantitativnim PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi aminokiselina tokom 24 sata (1 dan) ili 48 sati (2 dana). Kvantitativni PCR je izveden u triplikatu i normalizovan na GAPDH (n = 3, prosečna vrednost ± SEM). *p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, izraženo kao 1,0; #p < 0,05 u odnosu na BCAAem i B2.

- Slika 5 prikazuje procenu brzine potrošnje kiseonika (OCR). Potrošnja kiseonika u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi amino kiselina ili DETA-NO tokom 48 sati. ****p < 0,001 u odnosu na netretiranu ćeliju; ####p < 0,001 u odnosu na BCAAem i B2.

- Slika 6 prikazuje ekspresiju UCP1 u besmrtnim smeđim adipocitima (Seale et al., 2007) posle tretmana od 48 sati (2d). CT: netretirane, kontrolne ćelije. Vrednost netretiranih ćelija (CT) se uzima kao 1,0. * značajno u odnosu na CT. # značajan u odnosu na BCAAem; RT-PCR se izvodi u triplikatu i normalizuje na GAPDH (n = 3, prosečna vrednost ± SEM).

- Slika 7 prikazuje ekspresiju PGC-1a u besmrtnim smeđim adipocitima posle tretmana od 48 sati (2d). CT: netretirane, kontrolne ćelije, Vrednost netretiranih ćelija (CT) se uzima kao 1,0. * značajno u odnosu na CT. # značajan u odnosu na BCAAem. PCR je izveden u triplikatu i normalizovan na GAPDH (n = 3, prosečno 6 SEM).

Detaljan opis prioritetnih izvođenja

[0015] U sledećem opisu, dati su brojni specifični detalji kako bi se pružilo temeljno razumevanje izvođenja. Izvođenja se mogu praktikovati bez jednog ili više specifičnih detalja, ili sa drugim metodama, komponentama, materijalima, itd. U drugim slučajevima, dobro poznate strukture, materijali ili operacije nisu prikazane niti opisane detaljno da bi se izbeglo prikrivanje aspekata izvođenja.

[0016] Referenca u ovoj specifikaciji na "jedno izvođenje" ili "izvođenje" znači da je određena odlika, struktura ili karakteristika opisana u vezi sa izvođenjem uključena u najmanje jedno izvođenje. Prema tome, pojavljivanje fraza "u jednom izvođenjenju" ili "u izvođenju" na različitim mestima u ovoj specifikaciji ne mora nužno da se odnosi na isto izvođenje. Š taviše, posebne odlike, strukture ili karakteristike mogu se kombinovati na bilo koji pogodan način u jednom ili više izvođenja. Ovde su dati naslovi samo radi pogodnosti i ne tumače obim ili značenje izvođenja.

[0017] U jednom ili više izvođenja, kompozicija koja je ovde otkrivena sadrži aktivni agens, aktivni agens koji sadrži aminokiseline leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i kiseline limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu, jabučnu kiselinu.

[0018] Kompozicija koja sadrži aminokiseline - kao što je otkriveno u EP 2196 203 B1 - davana je sisarima kao alternativno rešenje da bi se obezbedila korist od ograničenja kalorija (CR); Pokazano je da takav sastav aminokiselina (koji se u ovom tekstu naziva "BCAAem") dovodi do povećane biogeneze mitohondrija i u srčanim i skeletnim mišićima (D’Antona et al., 2010.). Ovi efekti su posredovani ekspresijom endotelne sintaze azot oksida (eNOS) i posledičnom proizvodnjom azot oksida (NO) (D’Antona et al., 2010).

[0019] Pronalazač trenutne aplikacije je iznenađujuće otkrio da se dodavanjem specifičnih kiselina u kompoziciju koja sadrži sličnu kombinaciju leucina, izoleucina, valina, treonina i lizina može postići značajno povećanje mitohondrijalne funkcije ćelije, a time i potrošnje energije (EE).

[0020] Pronalazač trenutne aplikacije je testirao brojne različite kompozicije u smislu kiselina koje se u njima nalaze i otkrio da kompozicije koje kao aktivni agens sadrže kombinaciju limunske kiseline, sukcinsku kiseline i jabučne kiseline sa leucinom, izoleucinom, valinom, treoninom i lizinom su veoma efikasni za naznačene svrhe. Zaista, kompozicije koje sadrže gore navedeni aktivni agens kao i kompozicije koje sadrže gore navedeno aktivno sredstvo uključujući dalje specifične aminokiseline (navedene u tabeli 1 ispod) su značajno efikasnije od prethodno testirane kompozicije zasnovane na amino kiselinama (BCAAm) u promovisanju mitohondrijalne biogeneze i poboljšanju mitohondrijalne funkcije.

[0021] Kompozicije su testirane na ćelijskoj liniji srčanog mišića (HL-1), odnosno ćelijama koje predstavljaju in vitro model srčane funkcionalnosti. Rezultati dobijeni analizom ovih kardiomiocita mogu se koristiti za verifikaciju efikasnosti novih kompozicija u prevenciji srčane insuficijencije.

[0022] Pored toga, ovde otkrivene kompozicije su testirane na besmrtnim smeđim adipocitima, in vitro modelu smeđe masti. Nedavni prnalazak je pokazalo pojavu smeđeg masnog tkiva (SMT) kod ljudi (Traihu Trayhurn rn, 2016).

[0023] Za razliku od belog masnog tkiva (BMT), koje je uglavnom organ za skladištenje energije u obliku masti (triglicerida), smeđe masno tkivo (SMT) koristi energiju iz hrane za proizvodnju toplote (termogeneza), čime se povećava potrošnja energije (EE).

[0024] Ovaj proces se aktivira kao odgovor i na uticaje životne sredine (tj. izlaganje hladnoći) i nutritivne znake (znake ishrane), pomoću povećane ekspresije i aktivnosti odvajajućeg proteina 1 (UCP1; Cannon i Nedergaard, 2004).

[0025] Podaci dati u trenutnoj aplikaciji pokazuju efikasnost kompozicija koje su ovde otkrivene u povećanju ekspresije UCP1 čime se potvrđuje njihova korisnost u medicini, posebno u lečenju gojaznosti i srodnih poremećaja, kao što su na primer insulinska rezistencija i tip 2 dijabetes.

[0026] U jednom ili više izvođenja, kompozicija koja je ovde otkrivena sadrži aktivno sredstvo, navedeno aktivno sredstvo koje sadrži limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu i jabučnu kiselinu u kombinaciji sa leucinom, izoleucinom, valinom, treoninom, lizinom, pri čemu je maseni odnos između ukupne količine limunske kiseline, sukcinske kiselina i jabučne kiselina i ukupne količine aminokiselina leucina, izoleucina, valina, treonina, lizina između 0,05 i 0,3, poželjno između 0,1 i 0,25.

[0027] U daljem izvođenju, aktivni agens kompozicije koja je ovde otkrivena može takođe uključiti asparaginsku kiselinu i/ili ornitin L-alfa ketoglutarat (OKG). Prema jednom izvođenju, kompozicija sadrži aktivni agens, aktivni agens koji se sastoji od leucina, izoleucina, valina, treonina, lizina, histidina, fenilalanina, metionina, triptofana, cisteina i opciono tirozina, kao i limunske kiseline, jabučne kiseline i sukcinske kiseline kiseline, pri čemu su navedene amino kiseline jedine aminokiseline sadržane u kompoziciji.

[0028] U daljem izvođenju, kompozicija može da sadrži aminokiseline izoleucin, leucin i valin u količini između 35% i 65% po težini, poželjno između 42% i 56% po težini u odnosu na masu aktivnog sredstva.

[0029] U jednom ili više izvođenja, maseni odnos između leucina i limunske kiseline je između 5 i 1, poželjno između 2,5 i 3,5.

[0030] U daljem izvođenju, masa ili molarna količina limunske kiseline je veća od mase ili molarne količine svake od jabučne kiseline i sukcinske kiseline. Poželjno je da je mase ili molarna količina limunske kiseline veća od ukupne mase ili molarne količine jabučne kiseline plus sukcinske kiseline. U daljem izvođenju, maseni odnos između limunske kiseline i zbira jabučne kiseline i sukcinske kiseline je između 1,0 i 4,0, poželjno između 1,5 i 2,5. U poželjnom izvođenju, maseni odnos limunska kiselina:jabučna kiselina: sukcinska kiselina je između 10:1:1 i 2:1,5:1,5, poželjno između 7:1:1 i 1,5:1:1, poželjnije između 5: 1:1 i 3:1:1.

[0031] Prema nekim izvođenjima ovog pronalaska, poželjni molarni odnos izoleucin:leucin je u opsegu 0,2-0,7, poželjno u opsegu 0,30-0,60 i/ili poželjni maseni odnos valin:leucin je u opsegu 0,2-0,70 , poželjno u opsegu 0,30-0,65.

[0032] U daljem izvođenju, molarni odnos treonin:leucin se nalazi u opsegu od 0,10-0,90, poželjno u opsegu 0,20-0,70 i/ili maseni odnos lizin:leucin je u opsegu od 0,20-1,00, poželjno u opsegu 0,40-0,90.

[0033] U poželjnom izvođenju, odnos između ukupne molarne količine limunske kiseline, jabučne kiseline, sukcinske kiseline i ukupne molarne količine metionina, fenilalanina, histidina i triptofana je veći od 1,35.

[0034] U jednom ili više izvođenja, maseni odnos između zbira limunske kiseline, jabučne kiseline, sukcinske kiseline i zbira amino kiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina je između 0,1 i 0,4, poželjno između 0,15 i 0,35.

[0035] U daljem izvođenju, ukupna masena količina amino kiselina razgranatog lanca leucin, izoleucin, valin plus treonin i lizin je veća od ukupne masene količine tri kiseline (limunska kiselina, jabučna kiselina, sukcinska kiselina). Poželjno, masena količina pojedinačnih kiselina (limunska kiselina, sukcinska kiselina ili jabučna kiselina) je manja od masene količine svake pojedinačne aminokiseline leucina, izoleucina, valina, treonina i lizina.

[0036] U poželjnom izvođenju, maseni odnos između zbira limunske kiseline, jabučne kiseline, sukcinske kiseline i zbira amino kiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina plus lizina i treonina je između 0,05 i 0,30, poželjno između 0,25 i 0,25.

[0037] U daljem izvođenju, ukupna molarna količina lizina i treonina je veća od ukupne molarne količine tri kiseline limunske, sukcinske i jabučne kiseline. Poželjno, odnos između ukupne molarne količine tri kiseline limunske kiseline, sukcinske kiseline, jabučne kiseline i ukupne molarne količine lizina i treonina je između 0,10 i 0,70, poželjno između 0,15 i 0,55.

[0038] U jednom ili više izvođenja, kompozicija koja je ovde otkrivena dalje sadrži vitamine, poželjno odabrane iz grupe vitamina B, kao što je vitamin B1 i/ili vitamin B6.

[0039] U daljem izvođenju ovog pronalaska, kompozicija može uključivati ugljene hidrate, aditive i/ili aromatične supstance.

[0040] Dalje, posebno kada se pripremaju kompozicije u skladu sa trenutnim pronalaskom, a posebno aktivni agens, poželjno je izbegavati aminokiselinu arginin.

[0041] Pored toga, dalje aminokiseline koje su poželjno isključene kompozicijom koja je ovde otkrivena su serin, prolin, alanin.

[0042] Takve amino kiseline mogu biti kontraproduktivne ili čak štetne u nekim koncentracijama ili stehiometrijskim odnosima unutar kompozicije.

[0043] Amino kiseline otkrivene u ovom opisu mogu biti zamenjene odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim derivatima, naime solima.

[0044] Kao što će se jasno pokazati u daljem tekstu, primena kompozicija prema ovom pronalasku je posebno efikasna u promovisanju mitohondrijalne biogeneze i mitohondrijalne funkcije.

[0045] Otkrivene kompozicije se mogu koristiti u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, pri čemu je navedena bolest gojaznost.

[0046] Prema sledećem izvođenju, aminokiselinske kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive ekscipijente, kao što su na primer proteini, vitamini, ugljeni hidrati, prirodni i veštački zaslađivači i/ili aromatične supstance. U poželjnom izvođenju, farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti mogu biti odabrani između proteina surutke, maltodekstrina, fruktoze, kalcijum kazeinata, ribljeg ulja, limunske kiseline ili njenih soli, sukraloze, estara saharoze, vitamina D3, vitamina B grupe.

[0047] Za oralnu upotrebu, kompozicije prema opisu mogu biti u obliku tableta, kapsula, granula, gela, praha za geliranje, praha.

[0048] Dalje specifikacije, u smislu količina i odnosa između različitih aminokiselina predviđenih kompozicijama, sadržane su u priloženim zahtevima, koji čine sastavni deo tehničkog učenja datog ovde u vezi sa pronalaskom.

PRIMERI

[0049] Tabela 1 pokazuje različite kompozicije zasnovane na amino kiselinama testirane na HL-1 ćelijama i na besmrtnim smeđim adipocitima kao što je otkriveno u nastavku.

[0050] Konkretno, BCAAem kompozicija je kompozicija otkrivena u EP 2196203 B1.

[0051] Kompozicija pod nazivom "B2" kao aktivni agens ima kombinaciju aminokiselina sličnu onoj u BCAAem kompoziciji, ali dalje uključuje limunsku kiselinu. Takav sastav takođe sadrži vitamine B1 i B6. Kompozicije nazvane alfa 5 (α5), alfa 6 (α6), alfa 7 (α7) sadrže aktivni agens koji sadrži aminokiseline i limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu i jabučnu kiselinu. Pored toga, aktivni agens kompozicije alfa 7 takođe sadrži OKG (ornitin L-a ketoglutarat) i aminokiselinu aspartat (L-asparaginsku kiselinu).

[0052] Kompozicije iz tabele 1 iznad mogu se prvo pripremiti prosejavanjem svih komponenti sa 0,8 mesh. Da bi se dobila predsmeša, svaki sastojak (u količini <10% mase ukupne količine) se stavlja u polietilensku kesu zajedno sa delom L-lizin HCl tako da se dobije 10% mase ukupne količine. sastav. Kesa se zatim ručno mućka 5 minuta. Predsmeša se zatim stavlja u mikser (Planetaria) zajedno sa ostatkom sastojaka i meša 15 minuta na 120 obrtaja u minuti da bi se dobila homogena konačna kompozicija.

[0053] Kompozicije navedene u Tabeli 1 date su HL-1 kardiomiocitima i besmrtnim smeđim adipocitima, a mitohondrijalna funkcija je procenjena kao što je otkriveno u nastavku.

METODE

Ćelije i tretmani

HL-1 kardiomiociti

[0054] HL-1 kardiomiociti (poklon od W.C. Claycomb, New Orleans, School of Medicine) su postavljeni u boce obložene fibronektinom/želatinom, uzgajane do 70%-80% konfluencije u Claycomb medijumu (JRH Biosciences) sa dodatkom 100 mM norepinefrina (iz osnovnog rastvora 10 mM norepinefrina [Sigma-Aldrich] koji je rastvoren u 30 mM L-askorbinske kiseline [Sigma-Aldrich]), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina i 10% FBS (JRH Biosciences) kako je otkriveno u Claycomb et al., 1998.

[0055] Ćelije su tretirane sa 1% (v/v) kompozicija (rastvorenih u Claycomb medijumu) prikazanih u Tabeli 1 tokom 24 h ili 48 h.

[0056] Na kraju ovih perioda, mRNA i DNK su ekstrahovani iz ćelija ili su ćelije korišćene za procenu potrošnje kiseonika. Kontrolne ćelije su tretirane samo Claycomb medijumom.

Besmrtni smeđi adipociti

[0057] Besmrtni smeđi adipociti su nabavljeni od prof. Patrick Seale (University of Pennsylvania, Philadelphia, USA).

[0058] Ovo su SV40 besmrtne ćelijske linije izvedene iz SMT-a koje su, nakon odgovarajućeg protokola stimulacije, u stanju da se diferenciraju u zrelim smeđim adipocitima.

[0059] Ćelije su rutinski održavane u F12/DMEM (Gibco by Life technologies) sa 10% FBS; za diferencijaciju, konfluentne ć elije su tretirane medijumom koji sadrži 10% FBS plus 0,5 mM izobutilmetilksantina, 125 nM indometacina, 1 mM deksametazona, 20 nM insulina, 1 nM T3.

[0060] Posle 48 sati, ćelije su prebačene na medijum koji sadrži 10% FBS, 20 nM insulina i 1 nM T3

[0061] Preliminarni eksperimenti su potvrdili da je 6-7 dana inkubacije sa ovim medijumom dovoljno da se indukuje ekspresija UCP1 i drugih markera smeđih adipocita. Konkretno, ekspresija PRDM16, 140 kDa PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolognog) proteina koji sadrži domen i koji je marker diferencijacije braon adipocita (Seale et al., 2007) je povećana u diferenciranim ćelijama. Prema tome, posle 6 dana, ćelije su tretirane sa 1% (v/v) različitih kompozicija prikazanih u Tabeli 1 (BCAAem, B2, a5) rastvorenih u F12/DMEM. Kontrolne ćelije su hranjene samo medijumom. Zatim, posle 48 sati, ćelije su sakupljene i RNK je ekstrahovana za analizu genske ekspresije.

Ekspresija gena i metode mitohondrijalne biogeneze

[0062] Ukupna RNK je izolovana iz HL-1 kardiomiocita i iz besmrtnih smeđih adipocita korišćenjem RNeasy Mini Kit (Qiagen); jedan mikrogram ukupne RNK je reverzno transkribovan u cDNK korišćenjem iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) kao što je opisano u D’Antona et al. (2010).

[0063] Relativni nivo gena je izračunat kao 2-DDCT, u kome je DDCT odgovarao razlici između DCT bilo kojeg tretmana i DCT netretirane grupe koristeći GAPDH kao internu kontrolu. Algoritam Delta-Delta-CT (DDCT) je metoda aproksimacije za određivanje relativne ekspresije gena pomoću kvantitativnih PCR (qRT-PCR) eksperimenata u realnom vremenu (videti Livak and Schmittgen, 2001).

[0064] Prajmeri (sekvenca prikazana u tabeli 2 ispod) su dizajnirani korišćenjem softvera Beacon Designer 2.6 (Premier Biosoft International). Vrednosti su normalizovane ekspresijom gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH).,

Tabela 2

[0065] Za analizu mitohondrijalne DNK (mtDNK), ukupna DNK je ekstrahovana pomoću QIAamp DNA extraction kit (QIAGEN). mtDNK je amplifikovana korišćenjem prajmera specifičnih za gen mitohondrijalne DNK (mtDNK) i normalizovana na genomsku DNK amplifikacijom DNK gena GAPDH. Prajmeri, dizajnirani korišćenjem softvera Beacon Designer 2.6 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) prikazani su u tabeli 2 za gDNK.

Statistička analiza

[0066] Za sve podatke o ekspresiji gena, korišćeni su dvostrani t testovi uparenih uzoraka da se uporede vrednosti između kontrolnih i tretiranih ćelija. P vrednost <0,05 se smatra statistički značajnom.

Potrošnja kiseonika

[0067] Količina od 1 ml HL-1 kardiomiocita tretiranih kompozicijama prikazanim u Tabeli 1 je ponovo suspendovana u Henk-ovom izbalansiranom rastvoru soli (Sigma) i centrifugirana da bi se dobio ćelijski talog. Jedan broj HL-1 ćelija je takođe dopunjen donorom azot monoksida (NO), posebno dietilentriaminom-NO koji se takođe naziva DETA-NO (Sigma-Aldrich, Milano, Italija), kao pozitivna kontrola.

[0068] Zatim su ćelije ponovo suspendovane u respiratnom puferu (0,3 M manitol, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM K2PO4, pH 7,4) pri gustini od 3,0x10<6>/ml.

[0069] Uzorci su analizirani na 37°C u vijali opremljenoj kiseoničkom elektrodom tipa Clark (Rank Brothers Ltd.) povezanom sa snimačem grafikona.

[0070] Kiseonička elektroda je kalibrisana pod pretpostavkom da je koncentracija kiseonika u medijumu za inkubaciju 200 mmol/l na 37°C.

[0071] Potrošnja kiseonika je procenjena uz neprekidno mešanje oko deset minuta. Nagib snimljene krive je zatim korišćen za izračunavanje potrošnje kiseonika. Sadržaj kiseonika može da varira u zavisnosti od količine ćelija. Dakle, sadržaj proteina, koji je u direktnoj korelaciji sa sadržajem ćelije, korišćen je za normalizaciju potrošnje kiseonika u ćelijskim uzorcima. Sadržaj proteina je određen korišćenjem testa proteina bicinhoninske kiseline (BCA).

REZULTATI

HL-1 kardiomiociti Mitohondrijska DNK (mtDNK)

[0072] Mitohondrijalna DNK (mtDNK) je prvo procenjena u ćelijama tretiranim različitim kompozicijama aminokiselina da bi se potvrdili njihovi efekti na mitohondrijalnu masu.

[0073] Kao što je prikazano na slici 1, HL-1 kardiomiociti tretirani α5 kompozicijom pokazali su najznačajnije povećanje mtDNK u odnosu na mtDNK procenjenu u kontrolnim ćelijama (CT), u ćelijama tretiranim B2 i, što je veoma interesantno, u ćelijama tretiranim sa BCAAem kompozicijom.

HL-1 kardiomiociti PGC-1α, Tfam i Cyt c

[0074] Efekat različitih sastava aminokiselina je takođe testiran na mitohondrijalnu biogenezu. Konkretno, procenjena je ekspresija HL-1 kardiomiocita sledećih markera:

- gama koaktivator 1-alfa receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma (PGC-1α), glavni regulator mitohondrijalne biogeneze,

- faktor transkripcije mitohondrijalne DNK A (Tfam), faktor transkripcije mtDNK koji reguliše replikaciju mtDNK, - citokromski kompleks (Cyt c), protein respiratornog kompleksa.

[0075] Poređenje rezultata dobijenih nakon davanja BCAAem kompozicije, kompozicije B2 (tj. kompozicije koja je slična BCAAem kompoziciji, ali takođe sadrži limunsku kiselinu), α5 (tj. kompozicije koja kao aktivni agens osim amino kiselina sadrži i limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu, jabučnu kiselinu) su pokazali da je α5 kompozicija najefikasnija u promovisanju ekspresije navedenih markera u ćelijama kardiomiocita HL-1.

[0076] Štaviše, primećen je efekat vremenskog toka: nakon suplementacije od 48 sati sa α5 kompozicijom koja sadrži aminokiseline navedene u tabeli 1 zajedno sa tri karboksilne kiseline zaista je povećanje bilo još izraženije u odnosu na bazalne vrednosti.

[0077] Povećanje je takođe bilo statistički značajno u odnosu na vrednost sastava BCAAem za Tfam u poređenju sa tretmanom od 24 sata (slika 2) i za PGC-1α i za Cyt c nakon tretmana od 48 sati (slika 3).

HL-1 kardiomiociti KFL15 i PP2CM

[0078] Krüppel-like faktor 15 (KFL15) i član porodice protein fosfataze 2C ciljane na mitohondrijalni matriks (PP2CM) su proteini koji regulišu katabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA).

[0079] Prvi koraci u BCAA katabolizmu su zajednički za tri BCAA i zahtevaju mitohondrijalne enzime BCAA aminotransferazu (BCAT) i kompleks dehidrogenaze α-keto kiseline (BCKDC) razgranatog lanca.

[0080] U prvom i potpuno reverzibilnom koraku degradacije, mitohondrijski BCAT prenosi amino grupu sa BCAA na α-ketoglutarat da bi se formirale odgovarajuće α-keto kiseline (BCKA) i glutamat.

[0081] Nakon toga, BCKDC katalizuje dekarboksilaciju karboksilnih grupa BCKA, da bi formirao odgovarajuće acil-CoA estre razgranatog lanca.

[0082] Ova reakcija je ireverzibilna i stoga dovodi do razgradnje BCAA.

[0083] Aktivnost BCKDC je regulisana alosteričnom inhibicijom krajnjeg proizvoda NADH, α-ketoizokaproatom i acil-CoA estrima razgranatog lanca.

[0084] Aktivnost BCKDC je određena statusom fosforilacije njegove regulatorne podjedinice E1a.

[0085] Kada je nivo BCAA nizak, E1a je hiperfosforiliran BCKD kinazom, što dovodi do inhibicije BCKDC aktivnosti i očuvanja slobodnih BCAA.

[0086] Kada je nivo BCAA visok, E1a se defosforiliše pomoću mitohondrijalno ciljane 2C tipske Ser/Thr protein fosfataze nazvane PP2C u mitohondrijima (PP2CM) ili protein fosfataze, Mg<2+>/Mn<2+>zavisne 1K (PPM1K), š to dovodi do aktivacije BCKDC i smanjenja ukupnih BCAA (Bifari i Nisoli, 2016).

[0087] Pored toga, utvrđeno je da KLF15 povećava ekspresiju gena BCAT, BCKDC i PP2CM u srcu (Sun et al., 2016). Procena nivoa mRNK PP2Cm i KFL13 pokazala je da sastav α5 povećava nivoe PP2CM i KLF15 mRNK u odnosu na bazalnu vrednost u HL-1 kardiomiocitima. Povećanje je bilo značajno čak i u odnosu na sastav BCAAem (slika 4).

[0088] Ovi rezultati pokazuju da su kompozicije koje sadrže aktivno sredstvo, aktivno sredstvo koje sadrži leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu i jabučnu kiselinu, veoma efikasne u promovisanju mitohondrijalne funkcije i efikasnije aktiviraju mitohondrijalnu biogenezu čak i u odnosu na sastav BCAAem u metabolički aktivnim ćelijama.

HL-1 kardiomiociti Potrošnja kiseonika (OCR)

[0089] Testirana je potrošnja kiseonika HL-1 ćelija dopunjenih različitim kompozicijama. Takođe su testirane ćelije sa dodatkom dietilentriamina-NO (DETA-NO) kao pozitivne kontrole. Pokazan je efekat DETA-NO na povećanje potrošnje kiseonika u ćelijama (Nisoli et al., 2003). Utvrđeno je da NO pokreće mitohondrijalnu biogenezu u ćelijama koje su različite kao što su smeđi adipociti i ćelije 3T3-L1, U937 i HeLa. Ovaj efekat azotmonoksida zavisio je od cikličnog gvanozin 3’,5’-monofosfata (cGMP) i bio je posredovan indukcijom PGC-1α, glavnog regulatora mitohondrijalne biogeneze (Nisoli et al., 2003).

[0090] Posle 48h tretmana DETA-NO, primećen je porast potrošnje kiseonika, kao što se očekivalo.

[0091] Najvažnije, primećeno je značajno povećanje potrošnje kiseonika kada su HL-1 ćelije dopunjene α5 kompozicijom tokom 48 sati, što ukazuje na porast mitohondrijalne aktivnosti (Slika 5).

[0092] Povećanje je značajno veće od onog uočenog nakon primene kompozicija B2 i BCAAem.

Ekspresija UCP1 u besmrtnim smeđim adipocitima

[0093] Kao što je prikazano na slici 6, tretman od 48 sati sa otkrivenim kompozicijama povećao je, iako u različitoj meri, ekspresiju UCP1 u besmrtnim smeđim adipocitima.

[0094] Među različitim smešama, α5 je bio najefikasniji u indukovanju ekspresije UCP1 u odnosu na netretirane ćelije (p = 0,04 u odnosu na CT); α5 je takođe povećao UCP1 mRNA efikasnije u poređenju sa mešavinom BCAAem (p = 0,05).

Ekspresija PGC-1a u besmrtnim smeđim adipocitima

[0095] U skladu sa podacima UCP1, α5 smeša je takođe značajno povećala ekspresiju PGC-1α (p = 0,01), potvrđujući na taj način sposobnost ove kompozicije da aktivira mitohondrijalnu biogenezu (slika 7). Treba napomenuti da je α5 takođe bio efikasniji od BCAAem kompozicije u povećanju ekspresije PGC-1α.

[0096] Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju da je kompozicija koja sadrži aktivni agens, aktivni agens koji sadrži kombinaciju leucina, izoleucina, valina, treonina, lizina, limunske kiseline, sukcinske kiseline i jabučne kiseline značajno aktivniji u promovisanju mitohondrijalne biogeneze, funkcije mitohondrija i katabolizama BCAA.

[0097] Veruje se da kompozicija alfa 6 (α6) i alfa 7 (α7), koja obezbeđuje aktivni sastojak koji sadrži BCAA, treonin i lizin, kao i limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu i jabučnu kiselinu, ima slične prednosti.

[0098] Treba napomenuti da katabolizam BCAA, koji su obogaćeni kompozicijom, pored acetil-CoA, obezbeđuje sukcinil-CoA. Ovo poslednje bi moglo da aktivira reakciju sukcinil-Coa sintetaze, koja zauzvrat proizvodi sukcinat kao supstrat za naknadnu reakciju sukcinat dehidrogenaze.

[0099] Obezbeđivanje sukcinata, zajedno sa BCAA, u smeši bi stoga takođe moglo stimulisati reakciju sukcinat dehidrogenaze, čime bi se dodatno pojačao ciklus. Treba napomenuti da je sukcinat dehidrogenaza, direktno obezbeđujući FADH2, takođe deo mitohondrijalnog lanca transporta elektrona (kompleks II). Njegova stimulacija sukcinatom bi stoga mogla direktno da aktivira mitohondrijalne redoks nosače i poveća membranski potencijal, čime se povećava protonski gradijent, potrošnja kiseonika i sinteza ATP-a.

[0100] Istovremeno, suplement malata može aktivirati reakciju malat dehidrogenaze i povećati nivoe NADH; ovo bi takođe obezbedilo supstrate za kompleks I i samim tim povećalo nivoe ATP-a, na isti način kao FADH2dobijen sukcinatom. S druge strane, malat bi mogao da stimuliše aktivnost malat-aspartatnog puta. Ovo bi pogodovalo ulasku takođe citosolnog NADH u mitohondrije, koji bi inače bili nepropusni kroz mitohondrijalnu membranu, čime bi bili dostupni za mitohondrijalnu oksidaciju. Ovo bi dodatno povećalo mitohondrijalnu aktivnost i potrošnju kiseonika.

[0101] Pored toga, energija dobijena razgradnjom ugljenih hidrata ili masti se dobija procesom mitohondrijalne oksidativne fosforilacije. Katabolizam glukoze i masnih kiselina ciklusom TCA (trikarboksilne kiseline) obezbeđuje NADH i FADH2molekule. Elektroni iz NADH i FADH2se zatim prenose na molekularni kiseonik kroz proteinske komplekse u unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani i ovaj proces je stvorio protonski gradijent preko mitohondrijalne membrane. Protoni ponovo ulaze u mitohondrije preko kompleksa ATP sintaze, koji koristi energiju iz gradijenta da bi sintetisao adenozin trifosfat (ATP). Na ovaj način, transport elektrona je povezan sa sintezom ATP-a.

[0102] S druge strane, UCP1, mitohondrijski transmembranski protein koji se aktivira u SMT-u nakon hladnoće ili viška hranljivih materija, raspršuje protonski gradijent kroz unutrašnju membranu mitohondrija, a to dovodi do razdvajanja oksidativne fosforilacije. Energija dobijena iz protonskog gradijenta više nije dostupna za sintezu

1

ATP-a i, pošto UCP1 ne formira ATP, energija iz gradijenta protona se stoga oslobađa kao toplota. Povećana biogeneza i broj mitohondrija takođe leži u osnovi termogenog programa koji se javlja u SMT-u kao odgovor na gore pomenute stimuluse, a ključnu ulogu u ovom procesu imaju gama koaktivator 1-alfa receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma (PGC-1α), transkripcioni koaktivator koji se indukuje hladnoćom sposoban da reguliše ekspresiju i UCP1 i drugi faktori uključeni u mitohondrijalnu biogenezu (Scarpulla, 2011). Shodno tome, stimulacija aktivnosti UCP1 i proizvodnje toplote u SMT-u može biti potencijalni terapijski pristup za preokretanje gojaznosti, a postoji veliko interesovanje za traženje agenasa i/ili nutritivnih strategija koje bi stimulisale aktivnost ovog tkiva.

[0103] Takođe je vredno napomenuti da je, u skorije vreme, treći tip masti, pored BMTi SMT, prepoznat u nekim BMT depoima i opisan je kao bež ili "brite" mast. Kao odgovor na iste stimuluse koji indukuju termogenezu u SMT-u, ovo tkivo prolazi kroz proces „smeđivanja“, pojačavajući ekspresiju termogenih proteina, kao što je UCP1, i takođe indukujući tipične markere smeđe masti i, posledično, dovodeći do poboljšanja potrošnje energije (EE, Song et al., 2017). Ovi nalazi, stoga, dovode u pitanje uobičajeni pogled na BMT kao metabolički inertan organ i jačaju hipoteze o plastičnijem i ciljnom tkivu podložnijem lekovima, čineći tako "brite" mast drugom potencijalnom metom za terapeutski ili nutritivni pristup protiv gojaznosti.

[0104] Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da su kompozicije koje su ovde otkrivene u stanju da povećaju biogenezu i funkciju mitohondrija, katabolizam BCAA u HL-1 kardiomiocitima i da promovišu ekspresiju markera smeđih adipocita.

[0105] Iz prethodnog, jasno proizilazi kako su kompozicije prema ovom pronalasku korisne za lečenje patoloških stanja koja se razlikuju po nedovoljnoj mitohondrijalnoj funkciji kod ljudi i životinja.

REFERENCE

[0106]

Bifari F, Nisoli E. Branched-chain amino acids differently modulate catabolic or anabolic states in mammals: a pharmacological point of view. Br J Pharmacol. 2016 Sep 17. doi: 10.1111/bph.13624. [Epub ahead of print]. Cannon B, Nedergaard J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 2004 Jan;84(1):277-359. Review

Claycomb WC, Lanson NA Jr, Stallworth BS, Egeland DB, Delcarpio JB, Bahinski A, Izzo NJ Jr. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci USA 95: 2979-2984, 1998.

D’Antona G, Ragni M, Cardile A, Tedesco L, Dossena M, Bruttini F, Caliaro F, Corsetti G, Bottinelli R, Carruba MO, Valerio A, Nisoli E. Branched-chain amino acid supplementation promotes survival and supports cardiac and skeletal muscle mitochondrial biogenesis in middle-aged mice. Cell Metab. 12: 362-372, 2010.

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402-408, 2001.

Nisoli E, Clementi E, Paolucci C, Cozzi V, Tonello C, Sciorati C, Bracale R, Valerio A, Francolini M, Moncada S, Carruba MO. Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Science: 299(5608):896-9, 2003.

Nisoli E, Tonello C, Cardile A, Cozzi V, Bracale R, Tedesco L, Falcone S, Valerio A, Cantoni O, Clementi E, Moncada S, Carruba MO. Calorie restriction promotes mitochondrial biogenesis by inducing the expression of eNOS. Science 310: 314-317, 2005.

Seale P, Kajimura S, Yang W, Chin S, Rohas LM, Uldry M, Tavernier G, Langin D,Spiegelman BM. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metab. 6: 38-54, 2007

Song NJ et al. Induction of thermogenic adipocytes: molecular targets and thermogenic small molecules. Exp Mol Med. 2017 Jul 7;49(7):e353. doi: 10.1038/emm.2017.70. Review. PubMed PMID: 28684864.

Sun H, Olson KC, Gao C, Prosdocimo DA, Zhou M, Wang Z, Jeyaraj D, Youn JY, Ren S, Liu Y, Rau CD, Shah S, Ilkayeva O, Gui WJ, William NS, Wynn RM, Newgard CB, Cai H, Xiao X, Chuang DT, Schulze PC, Lynch C, Jain MK, Wang Y. Catabolic Defect of Branched-Chain Amino Acids Promotes Heart Failure. Circulation 133: 2038-2049, 2016.

Scarpulla RC. Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network. Biochim Biophys Acta. 2011;1813(7):1269-78

Trayhurn P. Recruiting Brown Adipose Tissue in Human Obesity. Diabetes. 2016;65(5):1158-60.

Wells GD, Noseworthy MD, Hamilton J, Tarnopolski M, Tein I. Skeletal muscle metabolic dysfunction in obesity and metabolic syndrome. Can J Neurol Sci. 2008;35 (1):31-40. Review

World Health Organization. Obesity and overweight. WHO

Media Centre.Updated August 2014. Available from http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/

1

1

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, pri čemu je bolest koja je povezana sa mitohondrijalnom disfunkcijom gojaznost, kompozicija koja sadrži aktivno sredstvo, navedeno aktivno sredstvo koje sadrži aminokiseline leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i limunsku kiselinu, sukcinsku kiselinu, jabučnu kiselinu.

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je maseni odnos između zbira limunske kiseline, jabučne kiseline, sukcinske kiseline i zbira amino kiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina plus lizina i treonina između 0,05 i 0,3, poželjno između 0,1 i 0,25.

3. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je maseni odnos između ukupne količine limunske kiseline, jabučne kiseline, sukcinske kiseline i ukupne količine aminokiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina između 0,1 i 0,4, poželjno između 0,15 i 0,35.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je maseni odnos između limunske kiseline i zbira jabučne kiseline i sukcinske kiseline između 1,0 i 4,0, poželjno između 1,5 i 2,5.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je maseni odnos limunska kiselina:jabučna kiselina:sukcinska kiselina između 10:1:1 i 2:1,5:1,5, poželjno između 7:1:1 i 1,5 :1:1, poželjnije između 5:1:1 i 3:1:1.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti aktivni agens dalje sadrži najmanje jednu amino kiselinu izabranu iz grupe koju čine histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, tirozin, cistein.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti aktivni agens dalje sadrži histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, cistein i opciono tirozin.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je odnos između ukupne molarne količine limunske kiseline, jabučne kiseline, sukcinske kiseline i ukupne molarne količine metionina, fenilalanina, histidina i triptofana veći od 1,35.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je odnos između ukupne molarne količine tri kiseline limunske kiseline, sukcinske kiseline, jabučne kiseline i ukupne molarne količine lizina i treonina između 0,1 i 0,7, poželjno između 0,15 i 0,55.

10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je masa ili molarna količina limunske kiseline veća od ukupne mase ili molarne količine jabučne kiseline i sukcinske kiseline.

11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je maseni odnos između leucina i limunske kiseline između 5 i 1, poželjno između 2,50 i 3,50.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeni aktivni agens ne sadrži arginin.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu kompozicija dalje sadrži jedan ili više vitamina, poželjno odabranih iz grupe vitamina B, poželjnije vitamin B1 i/ili vitamin B6.