RS63404B1 - Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen - Google Patents

Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Info

Publication number
RS63404B1
RS63404B1 RS20220689A RSP20220689A RS63404B1 RS 63404 B1 RS63404 B1 RS 63404B1 RS 20220689 A RS20220689 A RS 20220689A RS P20220689 A RSP20220689 A RS P20220689A RS 63404 B1 RS63404 B1 RS 63404B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
liposomes
liposome
lipid
replicon
Prior art date
Application number
RS20220689A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Geall
Ayush Verma
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44645813&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63404(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS63404B1 publication Critical patent/RS63404B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE
Ovaj pronalazak je u oblasti ne-virusne isporuke RNK za imunizaciju.
OSNOVA TEHNIKE
Isporuka nukleinskih kiselina za imunizaciju životinja je cilj već nekoliko godina. Testirani su različiti pristupi, uključujući upotrebu DNK ili RNK, virusnih ili nevirusnih nosača za isporuku (ili čak bez nosača za isporuku, u „goloj“ vakcini), vektora koji se repliciraju ili se ne repliciraju, ili virusnih ili nereplicirajućih vektora.
US 5750390 opisuje upotrebu ribozima za cepanje iRNK povezane sa kancerom.
Ostaje potreba za daljim i poboljšanim vakcinama nukleinske kiseline i, posebno, za poboljšanim načinima isporuke vakcina nukleinske kiseline.
OPIS PRONALASKA
Prema pronalasku, imunizacija nukleinskom kiselinom se postiže isporukom RNK inkapsulirane unutar lipozoma koji sadrži lipid sa katjonskom grupom glave, lipid sa cviterjonskom grupom glave. RNK kodira imunogen od interesa koji je spajk glikoprotein, a lipozom ima prečnik u opsegu od 60-180 nm, a idealno u opsegu 80-160 nm. Ova veličina se može porediti sa, na primer, prečnikom od ~40 nm za izometrijski proteinski kapsid alfavirusa bez omotača. Kombinacija efikasne inkapsulacije RNK (posebno RNK koja se samoreplicira) unutar malog lipozoma omogućava efikasnu isporuku da izazove snažan imuni odgovor.
Stoga, pronalazak obezbeđuje lipozom u kome je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen od interesa, pri čemu lipozom sadrži lipid sa katjonskom grupom glave, lipid sa cviterjonskom grupom glave i ima prečnik u opsegu od 60-180 nm, i gde imunogen je spajk glikoprotein. Ovi lipozomi su pogodni za in vivo isporuku RNK u ćeliju kičmenjaka i stoga su korisni kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti.
Lipozom
Pronalazak koristi lipozome unutar kojih je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen. Tako je RNK (kao u prirodnom virusu) odvojena od bilo kog spoljašnjeg medijuma. Utvrđeno je da inkapsulacija unutar lipozoma štiti RNK od digestije sa RNKazom. Lipozomi mogu uključivati neku spoljašnju RNK (npr. na njihovoj površini), ali najmanje polovina RNK (i idealno cela) je inkapsulirana u jezgru lipozoma. Inkapsulacija unutar lipozoma se razlikuje od, na primer, kompleksa lipid/RNK opisanih u referenci 1, gde je RNK pomešana sa prethodno formiranim lipozomima.
Različiti amfifilni lipidi mogu formirati dvoslojne slojeve u vodenom okruženju da inkapsuliraju vodeno jezgro koje sadrži RNK kao lipozom. Ovi lipidi mogu imati anjonsku, katjonsku ili cviterjonsku hidrofilnu grupu glave. Formiranje lipozoma iz anjonskih fosfolipida datira još od 1960-ih, a katjonski lipidi koji formiraju lipozom se proučavaju od 1990-ih. Neki fosfolipidi su anjonski, dok su drugi cviterjonski, a drugi su katjoni. Pogodne klase fosfolipida uključuju, ali nisu ograničene na, dioleoil trimetilamonijum propan (DOTAP), l,2-disteariloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DSDMA), 1,2-dioleiloksi-N,Ndimetil- 3-aminopropan (DODMA), l,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA), 1,2- dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA), l,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3- aminopropan (DLenDMA). Cviterjonski lipidi uključuju, ali nisu oganičeni na, acil cviterjonske lipide i etar cviterjonske lipide. Primeri korisnih cviterjoskih lipida su DPPC, DOPC, DSPC, dodecilfosfoholin, l,2-dioleoil-sn-glicero-3-pfosfatidiletanolamin (DOPE), i 1,2- difitanoil-snglicero-3-fosfoetanolamin (DPyPE). Lipidi mogu biti zasićeni ili nezasićeni. Poželjna je upotreba najmanje jednog nezasićenog lipida za pripremu lipozoma. Ako nezasićeni lipid ima dva repa, oba repa mogu biti nezasićena, ili može imati jedan zasićeni rep i jedan nezasićeni rep. Lipid može uključiti steroidnu grupu u jednom repu, npr. kao u RV05 (videti takođe SLIKE 16A & C-K).
Stoga, u nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje lipozom koji ima dvosloj lipida koji inkapsulira vodeno jezgro, pri čemu: (i) lipozom sadrži lipid sa katjonskom grupom glave, lipid sa cviterjonskom grupom glave i ima prečnik u opsegu od 60-180nm; i (ii) vodeno jezgro uključuje RNK koja kodira imunogen pri čemu je imunogen spajk glikoprotein.
Lipozomi pronalaska se formiraju iz mešavine lipida. Mešavina može da sadrži i zasićene i nezasićene lipide. Na primer, smeša može da sadrži DSPC (cviterjonski, zasićeni), DlinDMA (katjonski, nezasićeni) i/ili DMG (anjonski, zasićeni). Kada se koristi mešavina lipida, ne moraju svi komponentni lipidi u smeši biti amfifilni, npr. amfifilni lipidi se mogu mešati sa holesterolom.
Poželjno je da udeo tih lipida koji je katjonski bude između 20-80% ukupne količine lipida, npr. između 30-70%, ili između 40-60%. Ostatak se može napraviti od npr. Holesterola (npr. 35-50% holesterola) i/ili DMG (opciono PEGilovan) i/ili DSPC. Takve smeše se koriste u nastavku. Ove procentualne vrednosti su molski procenti.
Lipozom može uključivati amfifilni lipid čiji je hidrofilni deo PEGilovan (tj. modifikovan kovalentnim vezivanjem polietilen glikola). Ova modifikacija može povećati stabilnost i sprečiti nespecifičnu adsorpciju lipozoma. Na primer, lipidi se mogu konjugovati sa PEG korišćenjem tehnika kao što su one otkrivene u referencama 2 i 3. PEG obezbeđuje lipozomima omotač koji može dati povoljne farmakokinetičke karakteristike. Mogu se koristiti različite dužine PEG, npr. između 0,5-8 kDa.
Stoga se lipozom može formirati od katjonskog lipida (npr. DlinDMA, RV05), cviterjonskog lipida (npr. DSPC, DPyPE), holesterola i PEG-ilovanog lipida. U primerima je korišćena mešavina DSPC, DlinDMA, PEG-DMG i holesterola, kao i nekoliko dodatnih smeša.
Lipozomi se obično dele u tri grupe: multilamelarne vezikule (MLV); male unilamelarne vezikule (SUV); i velike unilamelarne vezikule (LUV). MLV imaju više dvoslojnih slojeva u svakoj vezikuli, formirajući nekoliko odvojenih vodenih pregrada. SUV i LUV imaju jedan dvosloj koji obuhvata vodeno jezgro; SUV obično imaju prečnik <50nm, a LUV-ovi imaju prečnik >50nm. Lipozomi pronalaska su idealno LUV sa prečnikom u opsegu od 60-180 nm, a poželjno u opsegu od 80-160 nm. Poželjno je da su lipozomi u suštini sferni. Ako nisu sferni, termin „prečnik“ se odnosi na najveći prečnik poprečnog preseka lipozoma.
Lipozom ovog pronalaska može biti deo kompozicije koja sadrži veći broj lipozoma, a lipozomi unutar grupe mogu imati opseg prečnika. Za kompoziciju koja sadrži populaciju lipozoma različitih prečnika: (i) najmanje 80% po broju lipozoma treba da ima prečnike u opsegu od 60-180nm, a poželjno u opsegu od 80-160nm, i/ili (ii ) prosečni prečnik (prema intenzitetu, npr. Z-proseku) populacije je idealno u opsegu od 60-180 nm, a poželjno u opsegu od 80-160 nm.
U idealnom slučaju, distribucija veličina lipozoma (prema intenzitetu) ima samo jedan maksimum, tj. postoji jedna populacija lipozoma raspoređenih oko proseka (modus), umesto da ima dva maksimuma. Prečnici unutar populacije lipozoma bi idealno trebalo da imaju indeks polidisperznosti <0,2, a ponekad i <0,1. Očekuje se da kompleksi lipozom/RNK iz reference 1 imaju prečnik u opsegu od 600-800 nm i da imaju visoku polidisperznost.
Aparati za određivanje prosečnog prečnika čestica u suspenziji lipozoma i raspodele veličine su komercijalno dostupni. Oni obično koriste tehnike dinamičkog rasejanja svetlosti i/ili optičkog sensinga jedne čestice, npr. Accusizer™ i Nicomp™ serije instrumenata dostupnih od Particle Sizing Systems (Santa Barbara, USA), ili Zetasizer™ instrumenata iz Malvern Instruments (UK), ili instrumenata Particle Size Distribution Analyzer iz Horiba (Kjoto, Japan). Dinamičko rasipanje svetlosti je poželjan postupka kojim se određuju prečnici lipozoma. Za populaciju lipozoma, poželjan postupak za definisanje prosečnog prečnika lipozoma u kompoziciji pronalaska je Z-prosek, tj. srednja hidrodinamička veličina ponderisana intenzitetom kolekcije lipozoma izmerene dinamičkim rasejanjem svetlosti (DLS). Z-prosek je izveden iz kumulantne analize izmerene korelacione krive, pri čemu se pretpostavlja jedna veličina čestice (prečnik lipozoma) i jedno eksponencijalno uklapanje se primenjuje na funkciju autokorelacije. Algoritam analize kumulanti ne daje distribuciju, ali, pored Z-proseka ponderisanog intenzitetom, daje indeks polidisperznosti.
Tehnike za dobijanje pogodnih lipozoma su dobro poznate u tehnici, npr. videti reference 4 do 6. Jedan koristan postupak je opisan u referenci 7 i uključuje mešanje (i) etanolnog rastvora lipida (ii) vodeni rastvor nukleinske kiseline i (iii) pufer, nakon čega sledi mešanje, ekvilibracija, razblaživanje i prečišćavanje. Poželjni lipozomi pronalaska se mogu dobiti ovim postupkom mešanja. Da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom(prečnicima), mešanje se može izvesti korišćenjem procesa u kome se dve struje vodenog rastvora RNK kombinuju u jednoj zoni mešanja sa jednom strujom etanolnog rastvora lipida, sve pri istoj brzini protoka, npr. u mikrofluidnom kanalu kao što je opisano u nastavku.
RNK
Lipozomi pronalaska uključuju molekul RNK koji (za razliku od siRNA) kodira imunogen koji je spajk glikoprotein. Nakon in vivo primene čestica, RNK se oslobađa iz čestica i prevodi unutar ćelije da bi se obezbedio imunogen in situ.
RNK je -lančana, i tako je mogu prevesti ćelije bez potrebe za bilo kakvim koracima replikacije kao što je reverzna transkripcija. Takođe se može vezati za TLR7 receptore koje eksprimiraju imune ćelije, čime se inicira ađuvantni efekat.
Poželjne -lančane RNK se samorepliciraju. Molekul RNK koji se samoreplicira (replikon) može, kada se isporuči u ćeliju kičmenjaka čak i bez ikakvih proteina, da dovede do proizvodnje više ćerki RNK transkripcijom iz same sebe (preko antisens kopije koju generiše od sebe). Molekul RNK koji se samoreplicira je stoga tipično molekul -lanca koji se može direktno prevesti nakon isporuke u ćeliju, a ovaj prevod obezbeđuje RNK-zavisnu RNK polimerazu koja zatim proizvodi i antisense i sens transkripte iz isporučene RNK. Tako isporučena RNK dovodi do proizvodnje više ćerki RNK. Ove ćerke RNK, kao i kolinearni subgenomski transkripti, mogu sami da se prevedu da obezbede in situ ekspresiju kodiranog imunogena, ili mogu biti transkribovani da obezbede dalje transkripte koji ima isti sens kao isporučena RNK koja se prevodi da obezbedi in situ ekspresiju imunogen. Ukupni rezultat ove sekvence transkripcija je ogromno povećanje broja uvedenih replikonskih RNK i tako kodirani imunogen postaje glavni polipeptidni proizvod ćelija.
Jedan pogodan sistem za postizanje samoreplikacije je upotreba replikona RNK zasnovanog na alfavirusu. Ovi -lančani replikoni se prevode nakon isporuke u ćeliju da bi se dobila replikaza (ili replikaza-transkriptaza). Replikaza je prevedena kao poliprotein koji se sam cepa da bi obezbedio replikacioni kompleks koji stvara genomske kopije lanaca -lanca isporučene RNK. Ovi transkripti lanaca mogu sami biti transkribovani da daju dalje kopije -lančane roditeljske RNK i takođe da daju subgenomski transkript koji kodira imunogen. Translacija subgenomskog transkripta tako dovodi do in situ ekspresije imunogena od strane inficirane ćelije. Odgovarajući replikoni alfavirusa mogu da koriste replikazu iz virusa Sindbis, Semliki forest virusa, virusa istočnog konjskog encefalitisa, virusa venecuelanskog encefalitisa konja, itd. Mogu se koristiti mutantne ili virusne sekvence divljeg tipa npr. atenuirani TC83 mutant VEEV-a je korišćen u replikonima [8].
Poželjni molekul RNK koji se samoreplicira tako kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može transkribovati RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen. -4-polimeraza može biti replikaza alfavirusa, npr. koja sadrži jedan ili više alfavirusnih proteina nsPl, nsP2, nsP3 i nsP4.
Dok prirodni genomi alfavirusa kodiraju strukturne virionske proteine pored poliproteina nestrukturne replikaze, poželjno je da samoreplicirajući RNK molekul pronalaska ne kodira strukturne proteine alfavirusa. Stoga poželjna samoreplicirajuća RNK može dovesti do proizvodnje sopstvenih kopija genomske RNK u ćeliji, ali ne i do proizvodnje viriona koji sadrže RNK. Nemogućnost proizvodnje ovih viriona znači da, za razliku od alfavirusa divljeg tipa, molekul RNK koji se samoreplicira ne može da se perpetuira u infektivnom obliku. Strukturni proteini alfavirusa koji su neophodni za perpetuaciju u virusima divljeg tipa su odsutni u samoreplicirajućim RNK prema pronalasku i njihovo mesto zauzimaju geni koji kodiraju imunogen od interesa, tako da subgenomski transkript kodira imunogen, a ne strukturni alfavirus virion proteini.
Prema tome, molekul RNK koji se samoreplicira, koristan sa pronalaskom, može imati dva otvorena okvira čitanja. Prvi (5') otvoreni okvir čitanja kodira replikazu; drugi (3') otvoreni okvir za čitanje kodira imunogen. U nekim primerima izvođenja RNK može imati dodatne (npr. nizvodno) otvorene okvire čitanja, npr. za kodiranje daljih imunogena (videti u nastavku) ili za kodiranje pomoćnih polipeptida.
Molekul RNK koji se samoreplicira može imati 5' sekvencu koja je kompatibilna sa kodiranom replikazom.
Molekuli RNK koji se samorepliciraju mogu imati različite dužine, ali su tipično dugački 5000-25000 nukleotida, npr.8000-15000 nukleotida, ili 9000-12000 nukleotida. Stoga je RNK duža nego što se vidi u isporučenoj siRNA.
Molekul RNK koji je koristan sa pronalaskom može imati 5' kapu (npr. 7-metilguanozin). Ova kapa može poboljšati in vivo translaciju RNK.
5' nukleotid molekula RNK koji je koristan sa pronalaskom može imati 5' trifosfatnu grupu. U RNK sa kapom ovo može biti povezano sa 7-metilguanozinom preko 5'-do-5' mosta. 5' trifosfat može poboljšati vezivanje RIG-I i tako podstaći adjuvantne efekte.
Molekul RNK može imati 3' poli-A rep. Takođe može da sadrži sekvencu prepoznavanja poli-A polimeraze (npr. AAUAAA) blizu njenog 3' kraja.
Molekul RNK koristan sa pronalaskom će tipično biti jednolančani. Jednolančane RNK generalno mogu inicirati adjuvantni efekat vezivanjem za TLR7, TLR8, RNK helikaze i/ili PKR. RNK isporučena u dvolančanom obliku (dsRNA) može se vezati za TLR3, a ovaj receptor takođe može biti pokrenut sa dsRNA koja se formira ili tokom replikacije jednolančane RNK ili unutar sekundarne strukture jednolančane RNK.
Molekul RNK koristan sa pronalaskom može se pogodno pripremiti in vitro transkripcijom (IVT). IVT može da koristi (cDNK) šablon kreiran i razmnožen u obliku plazmida u bakterijama, ili stvoren sintetički (na primer, sintezom gena i/ili postupcima inženjeringa lančane reakcije polimeraze). Na primer, RNK polimeraza zavisna od DNK (kao što su RNK polimeraze bakteriofaga T7, T3 ili SP6) može se koristiti za transkripciju RNK sa DNK šablona. Odgovarajuće stavljanje kape i reakcije dodavanja poli-A mogu se koristiti po potrebi (iako je poli-A replikona obično kodiran unutar DNK šablona). Ove RNK polimeraze mogu imati stroge zahteve za transkribovane 5' nukleotide i u nekim primerima izvođenja ovi zahtevi moraju biti usklađeni sa zahtevima kodirane replike, kako bi se osiguralo da IVT-transkribovana RNK može efikasno da funkcioniše kao supstrat za sopstveno kodiranu replikazu.
Kao što je razmatrano u referenci 9, samo-replicirajuća RNK može uključivati (dodatno bilo kojoj strukturi 5' kape) jedan ili više nukleotida koji imaju miodifikovanu nukleobazu. Stoga RNK može sadržati m5C (5- metilcitidin), m5U (5-metiluridin), m6A (N6-metiladenozin), s2U (2-tiouridin), Um (2'- O-metiluridin), mlA (1-metiladenozin); m2A (2-metiladenozin); Am (2'-O- metiladenozin); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenozin); i6A (N6-izopenteniladenozin); ms2i6A (2-metiltio-N6izopenteniladenozin); io6A (N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cishidroksiisopentenil) adenozin); g6A (N6- glicinilkarbamoiladenozin); t6A (N6-treonil karbamoiladenozin); ms2t6A (2-metiltio-N6- treonil karbamoiladenozin); m6t6A (N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin); hn6A(N6.- hidroksinorvalilkarbamoil adenozin); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroksinorvalil karbamoiladenozin); Ar(p) (2'-O-ribosiladenozin (fosfate)); I (inozin); mil (1-metilinozin); m'lm (l,2'-O-dimetilinozin); m3C (3-metilcitidin); Cm (2T-O-metilcitidin); s2C (2-tiocitidin); ac4C (N4-acetilcitidin); f5C (5-fonnilcitidin); m5Cm (5,2-0- dimetilcitidin); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidin); k2C (lizidin); mlG (1-metilguanozin); m2G (N2-metilguanozin); m7G (7-metilguanozin); Gm (2'-O-metilguanozin); m22G (N2,N2-dimetilguanozin); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanozin); m22Gm (N2,N2,2'-O- trimetilguanozin); Gr(p) (2'-O-ribosilguanozin (fosfate)) ; i W (vibutozin); o2iW (peroksivibutozin); OHiW (hidroksivibutozin); OHiW* (podmodifikovani hidroksivibutozin); imG (viozin); mimG (metilguanozin); Q (kveuozin); oQ (epoksikveuozin); galQ (galtaktozil- kveuozin); manQ (manozsil-kveuozin); preQo (7-cijano-7-deazaguanozin); preQi (7-aminometil-7-deazaguanozin); G* (arheozin); D (dihidrouridin); m5Um (5,2'-O- dimetiluridin); s4U (4-tiouridin); m5s2U (5-metil-2-tiouridin); s2Um (2-tio-2'-O- metiluridin); acp3U (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin); ho5U (5-hidroksiuridin); mo5U (5- metoksiuridin); cmo5U (uridin 5-oksisirćetna kiselina); mcmo5U (uridin metil ester 5-oksisirćetne kiseline); chm5U (5-(karboksihidroksimetil)uridin)); mchm5U (5-(karboksihidroksimetil)uridin metil ester); mcm5U (5-metoksikarbonil metiluridin); mcm5Um (S-metoksikarbonilmetil-2- O-metiluridin); mcm5s2U (5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin); nm5s2U (5-aminometil-2- tiouridin); mnm5U (5-metilaminometiluridin); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridin); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridin); ncm5U (5-karbamoilmetil uridin); ncm5Um (5-karbamoilmetil-2'-O-metiluridin); cmnm5U (5- karboksimetilaminometiluridin); cnmmSUm (5-karboksimetilaminometil-2-L-Ometiluridin); cmnm5s2U (5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin); m62A (N6,N6- dimetiladenozin); Tm (2'-O-metilinozin); m4C (N4-metilcitidin); m4Cm (N4,2-O- dimetilcitidin); hm5C (5-hidroksimetilcitidin); m3U (3-metil uridin); cm5U (5- karboksimetiluridin); m6Am (N6,T-O-dimetiladenozin); m62Am (N6,N6,O-2- trimetiladenozin); m2'7G (N2,7-dimetilguanozin); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanozin); m3Um (3,2T-O-dimetiluridin); m5D (5-metildihidrouridin); f5Cm (5-formil-2'-O- metilcitidin); ml Gm (l,2'-O-dimetilguanozin); m'Am (1,2-O-dimetil adenozin) irinometiluridin); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridin)); imG-14 (4-demetil guanozin); imG2 (izoguanozin); ili ac6A (N6-acetiladenozin), hipoksantin, inozin, 8-okso-adenin, njegovi 7-supstituisani derivati, dihidrouracil, pseudouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-aminouracil, 5-(Cl-C6)-alkiluracil, 5-metiluracil, 5-(C2-C6)-alkeniluracil, 5-(C2-C6)-alkiniluracil, 5- (hidroksimetil)uracil, 5-hlorouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hidroksicitozin, 5-(Cl-C6 )-alkilcitozin, 5-metilcitozin, 5-(C2-C6)-alkenilcitozin, 5-(C2-C6)-alkinilcitozin, 5- hlorocitozin, 5-fluorocitozin, 5-bromocitozin, N2-dimetilguanin, 7-deazaguanin, 8- azaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin, 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin, 7-deaza-8-supstituisani guanin, 8-hidroksiguanin, 6-tioguanin, 8-oksoguanin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurin, 2,4-diaminopurin, 2,6-diaminopurin, 8-azapurin, supstituisani 7-deazapurin, 7-deaza-7-supstituisani purin, 7-deaza-8-supstituisani purine, ili abazni nukleotid. Na primer, samo-replicirajuća RNK može uključivati jednu ili više modifikovanih pirimidinskih nukleobaza, kao što je pseudouridin i/ili 5-metilcitozin ostaci. U nekim primerima izvođenja, međutim, RNK ne uključuje modifikovane nukleobaze, i može da ne uključuje modifikovane nukleotide tj. svi nukleotidi u RNK su standardni A, C, G i U ribonukleotidi (osim bilo koje strukture 5' kape, koja može uključivati 7'-metilguanozin). >U drugim primerima izvođenja, RNK može uključivati 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, i prvih 1, 2 ili 35' ribonukleotida može biti metilovano na 2' položaju riboze. RNK koja se koristi u pronalasku idealno uključuje samo fosfodiestarske veze između nukleozida, ali u nekim realizacijama može da sadrži fosfororamidne, fosforotioatne i/ili metilfosfonatne veze.
U idealnom slučaju, lipozom uključuje manje od 10 različitih vrsta RNK, npr.5, 4, 3 ili 2 različite vrste; najpoželjnije, lipozom uključuje jednu vrstu RNK, tj. svi molekuli RNK u lipozomu imaju istu sekvencu i istu dužinu.
Količina RNK po lipozomu može varirati. Broj pojedinačnih samoreplicirajućih RNK molekula po lipozomu je tipično <50, npr. <20, <10, <5 ili 1-4 po lipozomu.
Imunogen
Molekuli RNK koji se koriste u pronalasku kodiraju polipeptidni imunogen koji je spajk glikoprotein. Nakon primene lipozoma, RNK se prevodi in vivo i imunogen može izazvati imuni odgovor kod primaoca. Imuni odgovor može da obuhvata odgovor antitela (obično uključujući IgG) i/ili imuni odgovor posredovan ćelijama. Imunogen je površinski polipeptid koji je spajk glikoprotein.
Molekul RNK može da kodira jedan polipeptidni imunogen ili više polipeptida. Više imunogena može biti predstavljeno kao jedan polipeptidni imunogen (fuzioni polipeptid) ili kao zasebni polipeptidi. Ako se imunogeni eksprimiraju kao odvojeni polipeptidi iz replikona, onda jedan ili više njih mogu biti obezbeđeni uzvodnim IRES ili dodatnim elementom virusnog promotera. Alternativno, višestruki imunogeni mogu biti eksprimirani iz poliproteina koji kodira pojedinačne imunogene fuzionisane sa kratkom autokatalitičkom proteazom (npr. protein virusa slinavke i šapa 2A) ili kao inteini.
Za razliku od referenci 1 i 10, RNK kodira imunogen koji je spajk glikoprotein. Da ne bi bilo sumnje, pronalazak ne obuhvata RNK koja kodira luciferazu svica ili koja kodira fuzioni protein E.coli P-galaktozidazu ili koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Takvi polipeptidi mogu biti korisni kao markeri, ili čak u kontekstu genske terapije, ali pronalazak se odnosi na isporuku RNK za izazivanje sistema imunološkog odgovora. Optimalni prečnik lipozoma za gensku terapiju može se razlikovati od lipozoma za potrebe imunizacije jer se ciljne ćelije i tkiva razlikuju za ova dva pristupa. Dakle, imunogen takođe nije sopstveni protein koji se isporučuje kao dopuna ili zamena za defektni protein domaćina (kao u genskoj terapiji). Takođe, RNK nije totalna RNK timusa miša.
U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jednog od ovih virusa:
Orthomyxovirus: Korisni imunogeni mogu biti iz virusa gripa A, B ili C, kao što su hemaglutinin, neuraminidaza ili matriksni M2 proteini. Tamo gde je imunogen hemaglutinin virusa influence A, on može biti iz bilo kog podtipa, npr. Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ili H16.
Paramyxoviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Pneumo virusa (npr. respiratorni sincicijski virus, RSV), Rubulavirusa (npr. virusa zauški), paramiksovirusa (npr. virusa parainfluence), Metapneumovirusa (npr. virusa Morbillivirusa).
Poxviridae:Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Orthopoxvirus kao što je Variola vera, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Variola major i Variola minor.
Picornavirus. Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pikorna virusa, kao što su enterovirusi, rinovirusi, heparnavirusi, kardiovirusi i Aftovirusi. U jednom aspektu, enterovirus je poliovirus, npr. poliovirus tipa 1, tipa 2 i/ili tipa 3. U drugom aspektu, enterovirus je EV71 enterovirus. U drugom aspektu, enterovirus je koksaki A ili B virus.
Bunyavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Orthobunyavirus, kao što je virus kalifornijskog encefalitisa, flebovirus, kao što je virus Rift Valley groznice, ili Nairovirus, kao što je virus Krimske-Kongo hemoragične groznice.
Heparnavirus. Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Heparnavirus, kao što je virus hepatitisa A (HAV).
Filovirus. Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od filovirusa, kao što je virus ebole (uključujući ebolavirus Zaira, Obale Slonovače, Restona ili Sudana) ili Marburg virus.
Togavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Togavirus, kao što su Rubivirus, Alfavirus ili Arterivirus. Ovo uključuje virus rubeole.
Flavivirus. Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Flavivirus, kao što je virus krpeljnog encefalitisa (TBE), virus Denga (tipovi 1, 2, 3 ili 4), virus žute groznice, virus japanskog encefalitisa, Kyasanur Forest virus, virus encefalitisa Zapadnog Nila, virus encefalitisa Sent Luisa, virus ruskog prolećno-letnjeg encefalitisa, virus Powassan encefalitisa.
Pestivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pestivirusa, kao što je goveđa virusna dijareja (BVDV), klasična svinjska kuga (CSFV) ili granična bolest (BDV).
Hepadnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Hepadnavirus, kao što je virus hepatitisa B. Kompozicija može uključivati površinski antigen virusa hepatitisa B (HBsAg).
Drugi virusi hepatitisa: Kompozicija može uključivati imunogen iz virusa hepatitisa C, virusa delta hepatitisa, virusa hepatitisa E ili virusa hepatitisa G.
Rhabdovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od rabdovirusa, kao što je Lyssavirus (npr. virus besnila) i Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Calciviridae, kao što je virus Norwalk (Norovirus) i virusi slični Norwalk, kao što su virus Havaja i Snow Mountain virus.
Coronavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od SARS koronavirusa, infektivnog bronhitisa ptica (IBV), virusa mišjeg hepatitisa (MHV) i svinjski virus prenosivog gastroenteritisa (TGEV). Imunogen za koronavirus može biti spajk polipeptid.
Retrovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od onkovirusa, lentivirusa (npr. HIV-1 ili HIV-2) ili Spumavirus.
Reovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od ortoreovirusa, rotavirusa, orbivirusa ili kolitivirusa.
Parvovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Parvovirusa B19. Herpesvirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od humanog herpes virusa, kao što su, samo kao primer, virusi herpes simpleksa (HSV) (npr. HSV tipovi 1 i 2), virus Varicella-zoster (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), citomegalovirus (CMV), humani herpesvirus 6 (HHV6), humani herpesvirus 7 (HHV7) i humani herpesvirus 8 (HHV8).
Papovavirusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od papiloma virusa i polioma virusa. (Humani) papiloma virus može biti serotipa 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ili 65 npr. od jednog ili više serotipova 6, 11, 16 i/ili 18.
Adenovirus: Virusni imunogeni uključuju one izvedene iz adenovirusa serotipa 36 (Ad-36).
U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv virusa koji inficira ribu, kao što su: virus infektivne anemije lososa (ISAV), virus bolesti pankreasa lososa (SPDV), virus infektivne pankreasne nekroze (IPNV), virus kanalnog soma (CCV) , virus bolesti limfocistisa riba (FLDV), virus infektivne hematopoetske nekroze (IHNV), koi herpesvirus, virus sličan pikorni lososa (takođe poznat kao virus atlantskog lososa sličan pikorni), virus lososa koji nema izlaz na more (LSV), rotavirus atlantskog lososa (ASR ), virus bolesti crvenila pastrmke (TSD), virus tumora koho lososa (CSTV) ili virus virusne hemoragične septikemije (VHSV).
Farmaceutske kompozicije
Lipozomi pronalaska su korisni kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Ove kompozicije će tipično uključiti farmaceutski prihvatljiv nosač pored lipozoma. Detaljna rasprava o farmaceutski prihvatljivim nosačima dostupna je u referenci 29. Farmaceutska kompozicija pronalaska može da sadrži jedan ili više imunopotencijatora malih molekula. Na primer, kompozicija može uključivati TLR2 agonist (npr. Pam3CSK4), TLR4 agonist (npr. aminoalkil glukozaminid fosfat, kao što je E6020), TLR7 agonist (npr. imikvimod), TLR8 agonist (npr.) i/resikvimod9 agonist (npr. IC31). Svaki takav agonist idealno ima molekulsku težinu od <2000Da. U nekim primerima izvođenja, takvi agonisti su takođe inkapsulirani sa RNK unutar lipozoma, ali u drugim realizacijama oni su nekapsulirani.
Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključiti lipozome u običnoj vodi (npr. v.f.i.) ili u puferu, npr. fosfatni pufer, Tris pufer, boratni pufer, sukcinatni pufer, histidinski pufer ili citratni pufer. Puferske soli će obično biti uključene u opsegu 5-20 mM.
Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati pH između 5,0 i 9,5, npr. između 6,0 i 8,0.
Kompozicije pronalaska mogu uključivati natrijumove soli (npr. natrijum hlorid) da daju toničnost. Koncentracija od 10±2 mg/ml NaCl je tipična npr. oko 9 mg/ml.
Kompozicije pronalaska mogu uključivati helatore metalnih jona. Oni mogu produžiti stabilnost RNK uklanjanjem jona koji mogu ubrzati hidrolizu fosfodiestara. Prema tome, kompozicija može uključivati jedan ili više od EDTA, EGTA, BAPTA, pentetinske kiseline, itd. Takvi helatori su tipično prisutni između 10-500 µM, npr. 0.lmM. Citratna so, kao što je natrijum citrat, takođe može delovati kao helator, dok je povoljno takođe da obezbedi pufersku aktivnost.
Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati osmolalnost između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg, npr. između 240-360 mOsm/kg, ili između 290-310 mOsm/kg.
Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati jedan ili više konzervansa, kao što su tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjne su kompozicije bez žive i mogu se pripremiti vakcine bez konzervansa. Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno sterilne.
Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno nepirogene, npr. koji sadrži <1 EU (jedinica endotoksina, standardna mera) po dozi, a poželjno <0,1 EU po dozi.
Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno bez glutena.
Farmaceutske kompozicije pronalaska se mogu pripremiti u obliku jedinične doze. U nekim primerima izvođenja jedinična doza može imati zapreminu između 0,1-1,0 ml, npr. oko 0,5 ml.
Kompozicije se mogu pripremiti kao injekcije, bilo kao rastvori ili suspenzije. Kompozicija se može pripremiti za plućnu primenu, npr. pomoću inhalatora, koristeći fini sprej. Kompozicija se može pripremiti za nazalnu, ušnu ili okularnu primenu, npr. kao sprej ili kapi. Tipične su injekcije za intramuskularnu primenu.
Kompozicije sadrže imunološki efikasnu količinu lipozoma, kao i bilo koje druge komponente, po potrebi. Pod „imunološki efikasnom količinom“ podrazumeva se da je primena te količine pojedincu, bilo u jednoj dozi ili kao deo serije, efikasna za lečenje ili prevenciju. Ova količina varira u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja pojedinca koji se leči, starosti, taksonomske grupe pojedinca koji se leči (npr. ne-humani primat, primat, itd.), kapaciteta imunog sistema pojedinca da sintetiše antitela , željeni stepen zaštite, formulaciju vakcine, procenu lekara o zdravstvenoj situaciji i druge relevantne faktore. Očekuje se da će količina biti u relativno širokom rasponu koji se može utvrditi kroz rutinska ispitivanja. Sadržaj lipozoma i RNK u kompozicijama pronalaska će generalno biti izražen u smislu količine RNK po dozi. Poželjna doza ima <100µg RNK (npr. od 10-100µg, kao što je oko l0µg, 25µg, 50µg, 75µg ili l00µg), ali ekspresija se može videti na mnogo nižim nivoima, npr. <lµg/doza, <100ng/doza, <10ng/doza, <lng/doza, itd.
Pronalazak takođe obezbeđuje uređaj za isporuku (npr. špric, nebulizator, raspršivač, inhalator, dermalni flaster, itd.) koji sadrži farmaceutsku kompoziciju pronalaska. Ovaj uređaj se može koristiti za davanje kompozicije kičmenjaku.
Lipozomi pronalaska ne sadrže ribozome.
Medicinske upotrebe
Za razliku od čestica otkrivenih u referenci 10, lipozomi i farmaceutske kompozicije pronalaska su za in vivo upotrebu za izazivanje imunog odgovora protiv imunogena od interesa.
Pronalazak takođe obezbeđuje lipozom ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku za podizanje imunog odgovora kod kičmenjaka.
Podizanjem imunološkog odgovora kod kičmenjaka ovim upotrebama, kičmenjak se može zaštititi od različitih bolesti i/ili infekcija. Lipozomi i kompozicije su imunogeni, i poželjnije su kompozicije vakcine. Vakcine prema pronalasku mogu biti ili profilaktičke (tj. za sprečavanje infekcije) ili terapeutske (tj. za lečenje infekcije), ali će tipično biti profilaktičke.
Kičmenjak je poželjno sisar, kao što je čovek ili veliki veterinarski sisar (npr. konji, goveda, jeleni, koze, svinje). Kada je vakcina za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete (npr. malo dete ili novorođenče) ili tinejdžer; gde je vakcina za terapeutsku upotrebu, čovek je poželjno tinejdžer ili odrasla osoba. Vakcina namenjena deci može se davati i odraslima, npr. za procenu bezbednosti, doze, imunogenosti itd.
Vakcine pripremljene prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje i dece i odraslih. Dakle, humani pacijent može biti star manje od 1 godine, manje od 5 godina, 1-5 godina, 5-15 godina, 15-55 godina ili najmanje 55 godina. Poželjni pacijenti za primanje vakcina su starije osobe (npr. >50 godina, >60 godina, a poželjno >65 godina), mladi (npr. <5 godina), hospitalizovani pacijenti, zdravstveni radnici, oružane snage i vojno osoblje, trudnice, hronični bolesnici ili pacijenti sa imunodeficijencijom. Međutim, vakcine nisu pogodne samo za ove grupe i mogu se koristiti generalno u populaciji.
Kompozicije pronalaska će se generalno davati direktno pacijentu. Direktna isporuka se može postići parenteralnom injekcijom (npr. subkutano, intraperitonealno, intravenski, intramuskularno, intradermalno ili u intersticijalni prostor tkiva; za razliku od reference 1, intraglosalna injekcija se obično ne koristi u ovom pronalasku). Alternativni putevi isporuke uključuju rektalnu, oralnu (npr. tablete, sprej), bukalnu, sublingvalnu, vaginalnu, topikalnu, transdermalnu ili transkutanu, intranazalnu, okularnu, auralnu, plućnu ili drugu mukoznu primenu. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjna načina. Injekcija može biti putem igle (npr. hipodermalna igla), ali se alternativno može koristiti injekcija bez igle. Tipična intramuskularna doza je 0,5 ml.
Pronalazak se može koristiti za izazivanje sistemskog i/ili mukoznog imuniteta, poželjno za izazivanje poboljšanog sistemskog i/ili mukoznog imuniteta.
Doziranje može biti prema rasporedu jedne doze ili rasporedu višestrukih doza. Višestruke doze se mogu koristiti u rasporedu primarne imunizacije i/ili u rasporedu dopunske imunizacije. U shemi višestrukih doza različite doze se mogu davati istim ili različitim putevima, npr. parenteralno primanje i pojačavanje sluzokože, mukozno primanje i parenteralno pojačavanje, itd. Više doza će se obično primenjivati u razmaku od najmanje 1 nedelje (npr. oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 6 nedelja, oko 8 nedelja, oko 10 nedelja, oko 12 nedelja, oko 16 nedelja, itd.). U jednom aspektu, višestruke doze se mogu primeniti približno 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja nakon rođenja, npr. u dobi od 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja, kako se često koristi u Proširenom programu imunizacije Svetske zdravstvene organizacije („EPI“). U alternativnom izvođenju, dve primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon druge primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon druge primarne doze. U daljem izvođenju, tri primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon treće primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon treće primarne doze.
Opšte
Praksa ovog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, reference 30-36, itd.
Termin „sadrži“ obuhvata „uključujući“ kao i „sastoji se“, npr. kompozicija „koja sadrži“ X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno, npr. X Y.
Termin „oko“ u odnosu na numeričku vrednost x je opcioni i znači, na primer, x+10%.
Reč „suštinski“ ne isključuje „potpuno“, npr. kompozicija koja je "suštinski oslobođena" od Y može biti potpuno slobodna od Y. Gde je potrebno, reč "u suštini" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
Reference na naelektrisanje, katjone, anjone, cviterjone, itd., uzimaju se pri pH 7.
TLR3 je receptor 3 sličan Toll. To je receptor koji se proteže kroz membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR3 uključuju poli(I:C). „TLR3“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 11849. RefSeq sekvenca za humani TLR3 gen je GE2459625.
TLR7 je receptor 7 sličan Toll. To je receptor koji se proteže kroz membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR7 uključuju npr. imikvimod. „TLR7“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 15631. RefSeq sekvenca za humani TLR7 gen je GE67944638.
TLR8 je receptor 8 sličan Toll. To je receptor koji se proteže kroz membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR8 uključuju npr. resikvimod. „TLR8“ je odobreni HGNC naziv za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 15632. RefSeq sekvenca za humani TLR8 gen je GI:20302165.
Porodica receptora sličnih RIG-I („RLR“) uključuje različite RNK helikaze koje igraju ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu[37], RLR-1 (takođe poznat kao RIG-I ili gen I inducibilan retinojskom kiselinom) ima dva domena za regrutovanje kaspaze blizu njegovog N-kraja. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-1 helikazu je „DDKS58“ (za DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNCT9102. RefSeq sekvenca za humani gen RLR-1 je GE77732514. RLR-2 (takođe poznat kao MDA5 ili gen 5 povezan sa diferencijacijom melanoma) takođe ima dva domena za regrutovanje kaspaze u blizini svog N-terminusa. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-2 helikazu je „IFIH1“ (za interferon indukovan domenom helikaze C 1), a jedinstveni HGNC ID je HGNCT8873. RefSeq sekvenca za humani RLR-2 gen je GI: 27886567. RLR-3 (takođe poznat kao LGP2 ili laboratorija za genetiku i fiziologiju 2) nema domene za regrutovanje kaspaze. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-3 helikazu je „DHKS58“ (za DEKSH (Asp-Glu-Ks-His) box polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:29517. RefSeq sekvenca za humani RLR-3 gen je GI: 149408121.
PKR je dvolančana RNK zavisna protein kinaza. On igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. „EIF2AK2“ (za eukariotski faktor inicijacije translacije 2-alfa kinaze 2) je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj enzim, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:9437. RefSeq sekvenca za humani PKR gen je GE208431825.
KRATAK OPIS CRTEŽA
SL. 1 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon nakon tretmana RNazom (4) replikon inkapsuliran u lipozomu (5) lipozom nakon tretmana RNaze (6) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
SL. 2 je elektronska mikrografija lipozoma.
SL. 3 prikazuje ekspresiju proteina (kao relativne svetlosne jedinice, RLU) u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke RNK u velikim (donja linija) ili malim (gornja linija) lipozomima.
SL. 4 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon inkapsuliran u lipozomu (4) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
SL. 5 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke RNK u vidu replikona upakovanog virionima (kvadrati), kao gole RNK (dijamanti), ili u lipozomima (+ = 0.l µg, k = 1 µg). SL. 6 prikazuje ekspresiju proteina 1, 3 i 6 dana nakon isporuke četiri različite doze RNK inkapsulirane lipozomima.
SL. 7 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju replikon upakovan u virion (VRP ili VSRP), 1µg golu RNK i 1 µg RNK inkapsuliranu u lipozomima.
SL. 8 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju VRP, 1µg golu RNK i 0,1 g ili 1µg inkapsuliranu RNK u lipozomima.
SL. 9 prikazuje titre neutralizujućih antitela kod životinja koje primaju VRP ili 0,1 g ili 1µg lipozomom inkapsuliranu RNK.
SL. 10 prikazuje nivoe ekspresije nakon isporuke replikona kao gola RNK (krugovi), RNK inkapsulirana lipozomima (trougao i kvadrat) ili kao lipopleks (obrnuti trougao).
SL. 11 prikazuje F-specifične titre IgG (2 nedelje nakon druge doze) nakon isporuke replikona kao gole RNK (0,01-1µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0,01-l0µg) ili pakovane kao virion (VRP, 106 infektivnih jedinica ili IU).
SL. 12 prikazuje F-specifične IgG titre (krugovi) i PRNT titre (kvadrati) nakon isporuke replikona kao gole RNK (1µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0,1 ili 1µg), ili upakovane kao virion (VRP, 106IU). Prikazani su i titri kod naivnih miševa. Pune linije pokazuju geometrijske sredine.
SL. 13 prikazuje intracelularnu proizvodnju citokina nakon restimulacije sa sintetičkim peptidima koji predstavljaju glavne epitope u F proteinu, 4 nedelje nakon druge doze. Y-osa prikazuje % citokina+ CD8+CD4-.
SL. 14 prikazuje F-specifične IgG titre (srednji titri logv std dev) tokom 210 dana nakon imunizacije teladi. Tri linije se lako razlikuju 63. dana i to su, odozdo prema gore: PBS negativna kontrola; RNK isporučena lipozomima; i proizvod „Triangle 4“.
SL. 15 prikazuje ekspresiju anti-F titra (relativnu) dve nedelje nakon prve doze replikona koji kodira F protein. Titri su ucrtani u odnosu na srednji prečnik lipozoma Z (nm).
SL. 16A do 16M prikazuju strukturu alternativnih katjonskih lipida: (A) RV05; (B) RV02; (C) RV04; (D) RV07; (E) RV03; (F) RV08; (G) RV09; (H) RV14; (I) RV10; (J) RV11; (K) RV15; (L) RV16; (M) RV17.
SL. 17 prikazuje strukturu korisnog "razdvojenog" PEG-konjugovanog lipida. Ukupna molekulska težina PEG unutar boksa je 2000 u testiranim lipozomima.
SL. 18A do 18E prikazuju strukture različitih PEG-konjugovanih lipida, gde R je PEG željene dužine.
REFERENTNI PRIMERI
RNK replikoni
U nastavku se koriste različiti replikoni. Generalno, oni su zasnovani na hibridnom genomu alfavirusa sa nestrukturnim proteinima iz venecuelanskog virusa konjskog encefalitisa (VEEV), signalu pakovanja iz VEEV i 3' UTR iz Sindbis virusa ili VEEV mutanta. Replikon je dugačak oko l0kb i ima poli-A rep.
Plazmidna DNK koja kodira replikone alfavirusa (nazvana: pT7-mVEEV-FL.RSVF ili A317; pT7-mVEEV-SEAP ili A306; pSP6-VCR-GFP ili A50) služila je kao šablon za sintezu RNK in vitro. Replikoni sadrže genetske elemente alfavirusa koji su potrebni za replikaciju RNK, ali nemaju one koji kodiraju genske proizvode neophodne za sklapanje čestica; strukturni proteini su umesto toga zamenjeni proteinom od interesa (bilo reporterom, kao što je SEAP ili GFP, ili imunogenom, kao što je RSV F protein pune dužine) i tako replikoni nisu u stanju da indukuju stvaranje infektivnih čestica. Promotor bakteriofaga (T7 ili SP6) uzvodno od cDNK alfavirusa olakšava sintezu replikonske RNK in vitro, a ribozim virusa hepatitisa delta (HDV) odmah nizvodno od poli(A)-repa generiše ispravan 3'-kraj preko svoje aktivnosti sopstvenog isecanja.
Nakon linearizacije plazmidne DNK nizvodno od HDV ribozima sa odgovarajućom restrikcionom endonukleazom, „run-off“ transkripti su sintetisani in vitro korišćenjem DNK-zavisne RNK polimeraze T7 ili SP6 bakteriofaga. Transkripcije su vršene 2 sata na 37°C u prisustvu 7,5 mM (T7 RNK polimeraza) ili 5 mM (SP6 RNK polimeraza) svakog od nukleozid trifosfata (ATP, CTP, GTP i UTP) prema uputstvima koja je dao proizvođač (Ambion). Nakon transkripcije, šablonska DNK je digestirana sa TURBO DNase (Ambion). Replikon RNK je precipitiran sa LiCl i rekonstituisan u vodi bez nukleaza. RNK bez kape je zatvorena posle transkripcije sa Vaccinia Capping Enzime (VCE) korišćenjem ScriptCap m7G Capping System (Epicentre Biotechnologies) kao što je navedeno u korisničkom priručniku; replikoni ograničeni na ovaj način dobijaju prefiks „v“, npr. vA317 je replikon A317 kome je kapa postavljena sa VCE. RNK sa post-transkripciono stavljenom kapom je precipitirana sa LiCl i rekonstituisana u vodi bez nukleaza. Koncentracija uzoraka RNK određena je merenjem OD260nm. Integritet in vitro transkripata je potvrđen elektroforezom denaturišućeg agaroznog gela.
Lipozomalna inkapsulacija
RNK je inkapsulirana u lipozome napravljene u suštini postupkom iz referenci 7 i 38. Lipozomi su napravljeni od 10% DSPC (cviterjonski), 40% DlinDMA (katjonski), 48% holesterola i 2% PEG-konjugovanog DMG (2kDa PEG). Ove proporcije se odnose na % mola u ukupnom lipozomu.
DlinDMA (l,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan) je sintetizovan primenom procedure iz reference 2. DSPC (l,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfoholin) je nabavljen od Genzime. Holesterol je dobijen od Sigma-Aldrich. PEG-konjugovani DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol), amonijum so), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan, hloridna so) i DC-hol (3P-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-karbamoil]holesterol hidrohlorid) su iz Avanti Polar Lipids.
Ukratko, lipidi su rastvoreni u etanolu (2ml), replikon RNK je rastvoren u puferu (2ml, 100 mM natrijum citrata, pH 6) i pomešani su sa 2ml pufera nakon čega je usledio 1 sat ekvilibracije. Smeša je razblažena sa 6 ml pufera, a zatim filtrirana. Dobijeni proizvod je sadržao lipozome, sa -95% efikasnosti inkapsulacije.
Na primer, u jednom posebnom postupku, sveži osnovni rastvori lipida su pripremljeni u etanolu. Izmereno je 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG-DMG i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 755 µL stok materijala dodato u 1,245 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 µg RNK. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz stok rastvora ~1µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away (Molecular BioProducts) i isprane sa dosta MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNaze. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je opisano kasnije). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK™ 500 pm ID spoj, Idex Health Science) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilenpropilen; sve korišćene FEP cevi su imale unutrašnji prečnik 2 mm i spoljašnji prečnik 3 mm; dobijene od Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa posebnim komadom cevi. Svi špricevi su zatim pokrenuta brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. 4 ml smeše je stavljeno u špric od 5 cc, koji je bio spojen na komad FEP cevi i u drugom špricu od 5 cc spojenom na FEP cev iste dužine, jednaka količina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je bila napunjena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špric i konačna smeša sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim je smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) propuštena kroz Mustang Q membranu (podloga za izmenu anjona koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijena od Pall Corporation). Pre upotrebe ove membrane za lipozome, kroz nju je sukcesivno propušteno 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6). Lipozomi su zagrevani 10 minuta na 37° C pre nego što su prošli kroz membranu. Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina 1X PBS korišćenjem filtracije tangencijalnog protoka pre dobijanja konačnog proizvoda. TFF sistem i membrane za filtriranje šupljih vlakana kupljeni su od Spectrum Labs (Rancho Dominguez) i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćene su filterske membrane od šupljih vlakana od polisulfona sa ograničenjem veličine pora od 100 kD i površinom od 8 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa IX PBS. SL. 2 prikazuje primer elektronske mikrografije lipozoma pripremljenih ovim postupcima. Ovi lipozomi sadrže inkapsuliranu RNK koja kodira RSV F antigen pune dužine. Dinamičko rasipanje svetlosti jedne serije pokazalo je prosečan prečnik od 141 nm (po intenzitetu) ili 78 nm (po broju). Procenat inkapsulirane RNK i RNK koncentracije je određen Quant-iT RiboGreen RNA kompletom reagensa (Invitrogen), prateći uputstva proizvođača. Standard ribosomske RNK koji se nalazi u kompletu je korišćen za generisanje standardne krive. Lipozomi su razblaženi l0x ili l00x u 1X TE puferu (iz kompleta) pre dodavanja boje. Odvojeno, lipozomi su razblaženi l0x ili l00x u 1X TE puferu koji sadrži 0,5% Triton X pre dodavanja boje (da bi se poremetili lipozomi i na taj način ispitala ukupna RNK). Nakon toga je jednaka količina boje dodata svakom rastvoru, a zatim ~180 µL svakog rastvora nakon dodavanja boje je stavljeno u duplikatu u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Fluorescencija (Ex 485 nm, Em 528 nm) je očitana na čitaču mikroploče. Sve formulacije lipozoma su dozirane in vivo na osnovu inkapsulirane količine RNK.
Pokazalo se da inkapsulacija u lipozomima štiti RNK od digestije sa RNKazom. Eksperimenti su koristili 3,8 mAU RNaze A po mikrogramu RNK, inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. RNaza je inaktivirana proteinazom K na 55°C tokom 10 minuta. Zatim je dodata mešavina uzorka 1:1 zapr/zapr do 25:24:1 zapr/zapr/zapr, fenol:hloroform:izoamil alkohol da bi se RNK ekstrahovala iz lipida u vodenu fazu. Uzorci su vorteksovani nekoliko sekundi, a zatim stavljeni na centrifugu na 15 minuta na 12x RPM. Vodena faza (koja sadrži RNK) je uklonjena i korišćena za analizu RNK. Pre punjenja (400 ng RNK po bunarčiću) svi uzorci su inkubirani sa bojom za punjenje formaldehida, denaturisani 10 minuta na 65°C i ohlađeni na sobnu temperaturu. Ambion Millennium markeri su korišćeni za aproksimaciju molekulske težine RNK konstrukta. Gel je pokrenut na 90 V. Gel je obojen korišćenjem 0,1% SYBR gold prema uputstvima proizvođača u vodi na rokeru na sobnoj temperaturi 1 sat. SL. 1 pokazuje da RNaza potpuno digestira RNK u odsustvu inkapsulacije (traka 3). RNK se ne može detektovati nakon inkapsulacije (traka 4) i nikakva promena se ne vidi ako se ovi lipozomi tretiraju RNazom (traka 4). Nakon tretiranja RNazom lipozomi se podvrgavaju ekstrakciji fenola, vidi se nedigestirana RNK (traka 6). Čak i posle 1 nedelje na 4°C, RNK se mogla videti bez ikakve fragmentacije (Slika 4, strelica). Ekspresija proteina in vivo ostala je nepromenjena nakon 6 nedelja na 4 °C i jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Stoga je RNK inkapsulirana u lipozomima stabilna. Da bi se procenila in vivo ekspresija RNK, enzim reporter (SEAP; izlučena alkalna fosfataza) je kodiran u replikonu, a ne imunogen. Nivoi ekspresije su mereni u serumima razblaženim 1:4 u puferu za razblaživanje 1X Phospha-Light korišćenjem hemiluminiscentnog alkalnog fosfatnog supstrata. BALB/c miševima starim od 8-10 nedelja (5/grupa) je ubrizgano intramuskularno dana 0, 50 µl po nozi sa dozom od 0,1 µg ili 1µg RNK. Isti vektor je takođe primenjen bez lipozoma (u 1X PBS bez RNaze) na 1µg. Takođe su testirani replikoni upakovani virionom. Replikoni upakovani u virion koji se ovde koriste (koji se nazivaju „VRPs“) dobijeni su postupcima reference 39, gde je replikon alfavirusa izveden iz mutantnog VEEV ili himere izvedene iz genoma VEEV konstruisanog da sadrži 3' UTR od Sindbis virusa i signal za pakovanje Sindbis virusa (PS), upakovani ko-elektroporacijom u BHK ćelije sa defektnim pomoćnim RNK koje kodiraju kapsid i glikoproteinske gene Sindbis virusa.
Kao što je prikazano na Sl. 5, inkapsulacija je povećala nivoe SEAP-a za oko 1⁄2 log pri 1µg dozi, a na dan 6 ekspresija iz 0,1 µg inkapsulirane doze odgovara nivoima viđenim sa 1µg nekapsuliranom dozom. Do trećeg dana nivoi ekspresije su premašili one postignute sa VRP (kvadrati). Stoga je ekspresija povećana kada je RNK formulisana u lipozomima u odnosu na kontrolu gole RNK, čak i pri 10x nižoj dozi. Ekspresija je takođe bila veća u odnosu na VRP kontrolu, ali je kinetika ekspresije bila veoma različita (videti SLIKU 5). Isporuka RNK elektroporacijom je rezultovala povećanom ekspresijom u odnosu na kontrolu gole RNK, ali ovi nivoi su bili niži nego kod lipozoma.
Da bi se procenilo da li je efekat primećen u grupama lipozoma bio posledica samo komponenti lipozoma, ili je bio povezan sa inkapsulacijom, replikon je davan u inkapsuliranom obliku (sa dva različita protokola prečišćavanja, 0,1 µg RNK), ili pomešan sa lipozomima nakon njihovog formiranja (nekapsulirani „lipopleks”, 0,1 µg RNK), ili kao gola RNK (1µg). SL.10 pokazuje da je lipopleks dao najniže nivoe ekspresije, pokazujući da je inkapsulacija neophodna za moćnu ekspresiju.
Dalji SEAP eksperimenti su pokazali jasan odgovor na dozu in vivo, sa ekspresijom koja je viđena nakon isporuke samo 1ng RNK (slika 6). Dalji eksperimenti upoređujući ekspresiju iz inkapsuliranih i golih replikona pokazali su da je 0,01 µg inkapsulirane RNK ekvivalentno 1µg gole RNK. U dozi od 0,5 µg RNK, inkapsulirani materijal je dao 12 puta veću ekspresiju 6. dana; pri 0.lµg nivoi doze bili su 24 puta veći 6. dana.
Umesto da se posmatraju prosečni nivoi u grupi, proučavane su i pojedinačne životinje. Dok nekoliko životinja nije reagovalo na gole replikone, inkapsulacija je eliminisala one koji nisu reagovali.
Dalji eksperimenti zamenili su DlinDMA sa DOTAP. Iako su DOTAP lipozomi dali bolju ekspresiju od golog replikona, oni su bili inferiorni u odnosu na DlinDMA lipozome (2- do 3-struka razlika na dan 1). Da bi se procenila imunogenost in vivo, konstruisan je replikon za ekspresiju F proteina pune dužine iz respiratornog sincicijalnog virusa (RSV). Ovo je isporučeno golo (1µg), kapsulirano u lipozome (0,1 ili 1µg), ili upakovano u virione (10<6>IU; "VRP") dana 0 i 21. Sl. Slika 7 pokazuje titre anti-F IgG 2 nedelje nakon druge doze, a lipozomi jasno povećavaju imunogenost. SL. 8 prikazuje titre 2 nedelje kasnije, do kada nije bilo statističke razlike između inkapsulirane RNK na 0,1 µg, inkapsulirane RNK na 1µg, ili VRP grupe. Titri neutralizacije (mereni kao smanjenje plaka od 60%, “PRNT60”) nisu se značajno razlikovali u ove tri grupe 2 nedelje nakon druge doze (Slika 9). SL. 12 prikazuje titre IgG i PRNT 4 nedelje nakon druge doze.
SL. 13 potvrđuje da RNK izaziva snažan odgovor CD8 T ćelija.
Dalji eksperimenti su upoređivali titre F-specifičnih IgG kod miševa koji su primali VRP, 0,1 µg RNK inkapsulirane lipozomima ili RNK inkapsulirane 1µg lipozomima. Odnosi titra (VRP: lipozom) u različitim vremenima nakon druge doze bili su sledeći:
Stoga RNK inkapsulirana u lipozomima indukuje u suštini istu veličinu imunog odgovora kao što se vidi kod isporuke viriona.
Dalji eksperimenti su pokazali superiorne F-specifične IgG odgovore sa 10µg dozom, ekvivalentne odgovore za 1µg i doze od 0,1 µg, i niži odgovor sa dozom od 0,01 µg. SL.11 prikazuje titre IgG kod miševa koji primaju replikon u golom obliku u 3 različite doze, u lipozomima u 4 različite doze, ili kao VRP (10<6>IU). Odgovor uočen sa RNK inkapsuliranom 1µg lipozomima bio je statistički beznačajan (ANOVA) u poređenju sa VRP, ali je veći odgovor primećen sa RNK inkapsuliranom lipozomom 10µg bio je statistički značajan (p<0,05) u poređenju sa obe ove grupe.
Dalja studija je potvrdila da je 0,1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima dalo mnogo veće anti-F IgG odgovore (15 dana nakon druge doze) od 0,1 µg isporučene DNK, i čak je bio imunogeniji od 20 µg plazmidne DNK koji kodira F antigen, isporučuje se elektroporacijom (Eigen™ DNK Delivery System, Inovio).
Pamučni pacovi
Istraživanje je sprovedeno na pamučnim pacovima (Sigmodon hispidis) umesto na miševima. Inkapsulacija lipozoma sa 1µg dozom povećala je F-specifične titre IgG za 8,3 puta u poređenju sa golom RNK i povećala titre PRNT za 9,5 puta. Veličina odgovora antitela bila je ekvivalentna onom izazvanom 5x10<6>IU VRP. I gola i RNK inkapsulirana u lipozomima su bile u stanju da zaštite pamučne pacove od izazivanja RSV-a (1x10<5>jedinica koje formiraju plak), smanjujući virusno opterećenje pluća za najmanje 3,5 log. Inkapsulacija je povećala smanjenje za oko 2 puta.
Dalji rad na pamučnim pacovima koristio je četiri različita replikona: vA317 eksprimira RSV-F pune dužine; vA318 5 izražava skraćeni (transmembranski i citoplazmatski rep uklonjen) RSV-F; vA142 eksprimira RSV-F sa deletiranim fuzionim peptidom; vA140 eksprimira skraćeni RSV-F takođe bez njegovog peptida. Pamučnim pacovima, 4 do 8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL na jednoj nozi) dana 0 i 21 sa četiri različita replikona u dve doze (1,0 i 0.1µg) formulisanim u lipozomima napravljenim korišćenjem 2kDa PEG-konjugovanog DMGbi postupkom (D), ali sa veličinom serije od 150 µg RNK. Kontrolnih 10 grupa primilo je RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvantom stipse (8 životinja/grupa), VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1x10<6>IU, 8 životinja/grupi) ili naivnu kontrolu (4 životinje/ grupa). Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21. i 34. dana.
F-specifični titri IgG u serumu i titri antitela koji neutrališu serum RSV 21. i 34. dana bili su:
Sva četiri replikona procenjena u ovoj studiji (vA317, vA318, vA142, vA140) bila su imunogena kod pamučnih pacova kada su isporučeni lipozomom, iako su titri neutralizacije seruma bili najmanje deset puta niži od onih indukovanih proteinskim vakcinama sa adjuvantom ili VRP. Lipozomske/RNK vakcine su izazvale serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije, a druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovor. F-specifični titri IgG posle druge vakcinacije sa 1µg replikonom bili su 2 do 3 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0,1 µg replikonom. Četiri replikona su izazvala uporedive titre antitela, što sugeriše da su RSV-F pune dužine i skraćeni, svaki sa ili bez fuzionog peptida, slično imunogeni kod pamučnih pacova.
Dalji rad na pamučnim pacovima ponovo je koristio replikone vA317, vA318 i vA142. Pamučnim pacovima, 2-8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL na jednoj nozi) 0. i 21. dana sa replikonima (0,1 ili 1µg) inkapsuliranim u RV01 lipozome (sa PEG-2000) napravljene postupkom (D) ali sa veličinom serije od 150 µg RNK. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvantom sa stipsom ili VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1x10<6>IU, 8 životinja/grupi). Sve ove životinje su primile treću vakcinaciju (56. dan) sa RSV-F podjediničnom proteinskom vakcinom (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom. Pored toga, postojala je i naivna kontrola (4 životinje/grupa). Dodatno, dodatnoj grupi su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 56. dana sa 1µg vA317 RNK u lipozomima, ali nije primila treću vakcinu sa podjediničnom proteinskom vakcinom.
Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35, 56, 70, plus dana 14, 28 i 42 za dodatnu grupu. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
Titri neutralizacije seruma su bili sledeći (60% titri neutralizacije RSV za 2 grupe od 3-4 životinje po grupi, GMT od ova 2 pula po grupi):
Titri seruma i titri neutralizacije za dodatnu grupu bili su sledeći:
Tako su replikoni potvrđeni kao imunogeni kod pamučnih pacova, izazivajući serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije. Druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovore. F-specifični IgG titri posle druge vakcinacije sa 1,0 µg replikona bili su 1,5 do 4 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0,1 µg replikona.
Treća vakcinacija (protein 56. dana) nije povećala titre kod pamučnih pacova koji su prethodno vakcinisani sa F trimer podjedinicom stipsa, ali je pružila veliko povećanje titra kod pamučnih pacova prethodno vakcinisanih replikonom. U većini slučajeva titar neutralizacije RSV seruma nakon dve vakcinacije replikona praćeno povećanjem proteina bili su jednaki ili veći od titara izazvanih sa dve ili tri uzastopne proteinske vakcinacije.
Ova studija je takođe procenila kinetiku odgovora antitela na 1,0 µg vA317. F-specifični serumski IgG i RSV neutralizacioni titri indukovani jednom vakcinacijom dostigli su svoj vrhunac oko 21. dana i održavani su tokom najmanje 56. dana (50-70% pad titra F-specifičnog IgG, mala promena u titru neutralizacije RSV). Homologna druga vakcinacija je data ovim životinjama 56. dana, a titri antitela su povećani do nivoa koji je najmanje jednak onom postignutom kada je druga vakcinacija primenjena 21. dana.
Dalji eksperimenti su uključivali virusni izazov. Replikon vA368 kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV pune dužine sa deletiranim fuzionim peptidom, sa ekspresijom koju pokreće EV71 IRES. Pamučnim pacovima, 7 po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL po nozi) dana 0 i 21 sa vA368 u lipozomima pripremljenim metodom (H), veličine serije 175 µg RNK ili sa VRP-ovima koji imaju isti replikon. Lipozomi su uključivali 2kDa PEG, konjugovan sa DMG. Kontrolna grupa je primila 5 µg proteina sa adjuvantom stpsom, a uključena je i naivna kontrolna grupa.
Sve grupe su primile intranazalni izazov (i.n.) sa 1x10<6>PFU RSV četiri nedelje nakon konačne imunizacije. Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35 dana. Titri virusa pluća su mereni 5 dana nakon izazivanja. Rezultati su bili sledeći:
Stoga je RNK vakcina smanjila virusno opterećenje pluća za više od tri log, sa približno 10<6>PFU/g kod nevakcinisanih kontrolnih pamučnih pacova na manje od 10<3>PFU/g kod vakcinisanih pamučnih pacova.
Studija na velikim sisarima
Studija na velikim životinjama je sprovedena na govedima. Telad (4-6 nedelja stara, -60-80 kg, 5 po grupi) je imunizovana sa 66 µg replikona vA317 koji kodira RSV F protein pune dužine u danima 0, 21, 86 i 146. Replikoni su formulisani unutar lipozoma napravljenih postupkom (E) ali sa veličinom serije RNK od 1,5 mg; imali su 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-2000 konjugovanog sa DMG. Samo PBS je korišćen kao negativna kontrola, a licencirana vakcina je korišćena kao pozitivna kontrola („Triangle 4“ iz Fort Dodge, koja sadrži ubijeni virus). Sva telad su primila 15 µg F protein adjuvansa sa MF59 emulzijom 146. dana.
RNK vakcine su kodirale humani RSV F, dok vakcina „Triangle 4“ sadrži goveđi RSV F, ali RSV F protein je visoko očuvan između BRSV i HRSV.
Telad su primila po 2 ml svake eksperimentalne vakcine, primenjene intramuskularno po 2x1 ml na svaku stranu vrata. Nasuprot tome, vakcina „Triangle 4“ je data kao pojedinačna doza od 2 ml u vrat. Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 18, 181. i 202. Ako je pojedinačna životinja imala titar ispod granice detekcije, dodeljen joj je titar 5.
SL. 14 prikazuje F-specifične titre IgG tokom 210 dana. Tokom prva 63 dana replikon RNK je bio imunogen kod krava preko lipozoma, iako je davao niže titre od licencirane vakcine. Sve vakcinisane krave su pokazale F-specifična antitela posle druge doze, a titri su bili veoma stabilni u periodu od 2 do 6 nedelja nakon druge doze (i bili su posebno stabilni za RNK vakcine). Titri do 202. dana bili su sledeći:
Titri antitela koji neutrališu serum RSV bili su sledeći:
Materijal korišćen za drugu dozu lipozoma nije bio sveže pripremljen, a ista partija RNK je pokazala smanjenje potencije u studiji imunogenosti kod miševa. Stoga je moguće da bi vakcina bila imunogenija da je za sve vakcinacije korišćen svež materijal.
Kada su testirani sa komplementom, neutralizujuća antitela su otkrivena kod svih vakcinisanih krava. U ovom testu, sva vakcinisana telad imala su dobre titre neutralizujućih antitela posle druge RNK vakcinacije.
Dodatno, RNK vakcina je izazvala F-specifične titre IgG u serumu koji su otkriveni kod nekoliko teladi posle druge vakcinacije i kod svih teladi posle treće.
RSV-F sa adjuvansom MF59 je bio u stanju da pojača IgG odgovor kod svih prethodno vakcinisanih teladi i da pojača titre neutralizacije nezavisne od komplementa teladi koja su prethodno vakcinisana sa RNK.
Dokaz koncepta za RNK vakcine kod velikih životinja je posebno važan u svetlu gubitka potencije koji je ranije primećen kod vakcina zasnovanih na DNK kada se prelazi sa modela malih životinja na veće životinje i ljude. Tipična doza za DNK vakcinu krava bi bila 0,5-1 mg [40, 41] i stoga je veoma ohrabrujuće da su imuni odgovori indukovani sa samo 66 µg RNK.
Uticaj prečnika lipozoma
Da bi se dobili manji lipozomi, postupak šprica/cevi je zamenjen postupkom u kom se rastvori lipida i RNK mešaju u kanalima na mikrofluidnom čipu.
Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. Izmereno je 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG-DMG i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 226,7 µL stok materijala dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Radni rastvor RNK od 4 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora ~1µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Četiri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNK. Dve bočice su korišćene za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK. Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Syrris, deo br.3000158) korišćenjem PTFE cevi 0,03 inča ID x 1/16 inča OD, (Syrris) koristeći 4-smernu ivični konektor. Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm x 105 µm) čipa. Brzina protoka sve tri struje je održavana na 1,5 mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je postavljen tako da se mešavine sakupljaju u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc koji je postavljen na komad PTFE cevi 0,03 inča ID x l/16 inča OD i u drugi špric od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, jednaku zapreminu 100 mM citratnog pufera (pH 6 ) je učitano. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem pumpe za špriceve i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani protiv 10-15 zapremina 1X PBS korišćenjem TFF sistema pre dobijanja konačnog proizvoda. Korišćena je filtraciona membrana od šupljih vlakana sa presekom veličine pora od 100 kDa i površinom od 20 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa 1X PBS.
Dok su lipozomi pripremljeni postupkom šprica/cevi sa 75 µg RNK imali Z prosečan prečnik od 148 nm i indeks polidisperznosti od 0,122, mešanje čipova dalo je lipozome sa Z prosečnim prečnikom od 97 nm i indeksom polidisperznosti od 0,086. Udeo inkapsulirane RNK se blago smanjio sa 90% na 87%. Ovi prečnici i indeksi polidisperznosti su mereni korišćenjem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) prema uputstvima proizvođača. Lipozomi su razblaženi u 1X PBS pre merenja.
Lipozomi su davani 8-10 nedelja starim BALB/c miševima intramuskularnom injekcijom dana 0, 50 µl po nozi. Orbitalna krvarenja iz sinusa su uzeta 1. i 3. dana, a terminalno krvarenje 6. dana. Nivoi SEAP u serumu su mereni hemiluminescentnim testom. Kao što je prikazano na Sl. 3, manji lipozomi su povećali nivoe SEAP-a za ~ 2 puta na dan 1 i za ~ 5 puta na dan 6.
Lipozomi pripremljeni pomoću dva različita postupka takođe su procenjeni za isporuku replikona koji kodira RSV-F protein pune dužine. F-specifični titri IgG u serumu miševa, 8 životinja po grupi, mereni su nakon intramuskularne vakcinacije 0 i 21 dana. Serumi su sakupljeni za analizu antitela 14. dana (2 wpl) i 35. (2 wp2). Ako je pojedinačna životinja imala titar <25 (granica detekcije), dodeljen joj je titar 5. Podaci su prikazani ispod kao geometrijski srednji titri svake grupe:
Tako su manji lipozomi pomešani sa čipovima dali ~2 puta veći GMT pri 2wpl i 2wp2.
Različiti lipozomi različitih prečnika su takođe korišćeni za isporuku replikona koji kodira RSV F protein pune dužine. Ukupni titri IgG protiv F proteina dve nedelje nakon prve doze su ucrtani u odnosu na prečnik lipozoma na Sl.15.
Postupci proizvodnje lipozoma
Generalno, korišćeno je osam različitih postupaka za pripremu lipozoma prema pronalasku. Oni se u tekstu pominju kao postupak (A) do (H) i razlikuju se uglavnom u odnosu na korake filtracije i TFF. Detalji su sledeći:
(A) Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG DMG 2000 je izmereno i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 755 µL stok materijala dodato u 1,245 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 µg RNK. Takođe je pripremljen radni rastvor RNK od 2 mL iz osnovnog rastvora ~1 µg/µL u 100 mM citratni pufer (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNaze. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je opisano kasnije). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37 ° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve.2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK™ 500 pm ID spoj, Idex Health Science, Oak Harbor, VA) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; al FEP cev ima unutrašnji prečnik 2 mm x 3 mm spoljašnji prečnika, isporučuje Idex Health Science).
Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa zasebnim komadom FEP cevi. Svi špricevi su zatim vođeni brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. 4 ml smeše je stavljeno u špric od 5 cc, koji je bio spojen na komad FEP cevi i u drugom špricu od 5 cc spojenom na FEP cev iste dužine, jednaka količina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je bila napunjena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem pumpe za špriceve i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je propuštena kroz Mustang Q membranu (podloga za izmenu anjona koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijena od Pall Corporation, AnnArbor, MI, SAD). Pre prolaska kroz lipozome, 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6) su sukcesivno propušteni kroz Mustang membranu. Lipozomi su zagrevani 10 minuta na 37° C pre nego što su prošli kroz membranu. Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina 1X PBS korišćenjem TFF pre dobijanja konačnog proizvoda. TFF sistem i membrane za filtriranje šupljih vlakana kupljeni su od Spectrum Labs i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćene su polisulfonske filterske membrane od šupljih vlakana (kataloški broj P/N: Ks1AB-100-20P) sa ograničenjem veličine pora od 100 kD i površinom od 8 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa 1X PBS.
(B) Kao postupak (A) osim što je, nakon ljuljanja, 226,7 µL stok materijala dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni lipidni osnovni rastvor od 2 mL, modifikujući tako odnos lipid:RNK.
(C) Kao postupak (B) osim što je Mustang filtracija izostavljena, pa su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(D) Kao postupak (C) osim što je TFF koristio polietersulfonske (PES) membrane od šupljih vlakana (broj dela P-Cl-100E-100-01N) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i površinom od 20 cm<2>.
(E) Kao postupak (D) osim što je korišćena Mustang membrana, kao u postupku (A).
(F) Kao postupak (A) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(G) Kao postupak (D) osim što je radni rastvor RNK od 4 mL pripremljen iz stok rastvora ~1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Zatim su četiri staklene bočice od 20 mL pripremljene na isti način. Dva od njih su korišćena za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a drugi za sakupljanje mešavine lipida i RNK, kao u (C). Umesto da koriste T mikser, špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Syrris, deo br.3000158) korišćenjem PTFE cevi (0,03 inča unutrašnjeg prečnika x 1/16 inča spoljašnjeg prečnika) koristeći 4-smerni ivični konektor (Syrris). Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm k 105 µm) čipa. Brzina protoka sve tri struje je održavana na 1,5 mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je postavljen tako da se mešavine sakupljaju u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 h. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc, koji je postavljen na drugi komad PTFE cevi; u još jedan špric od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, stavljena je jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem pumpe za špriceve i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina 1X PBS koristeći TFF, kao u (D).
(H) Kao postupak (A) osim što je 2 mL radnog stok rastvora lipida napravljeno mešanjem 120,9 µL lipidnog osnovnog rastvora sa 1,879 mL etanola. Takođe, nakon mešanja u T mikseru, lipozomi iz bočice od 20 mL su stavljeni u Pierce Slide-A-Lyzer kasetu za dijalizu (Thermo Scientific, ekstra jačine, 0,5-3 mL kapaciteta) i dijalizirani protiv 400-500 mL 1X PBS preko noći na 4°C u autoklaviranoj plastičnoj posudi pre nego što se dobije konačni proizvod.
RSV imunogenost
Samoreplicirajući replikon vA317 koji kodira RSV F protein davan je BALB/c miševima, 4 ili 8 životinja po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom (1 µg) samim ili formulisanim kao lipozomi sa DlinDMA ("RV01") ili DOTAP ("RV13") ili lipida prikazanim na SL. 16A do 16M („RV05“). RV01 lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG, ali sa različitim količinama RNK. RV05 lipozomi su imali ili 40% RV05, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG ili 60% RV05, 38% holesterola i 2% PEGDMG. RV13 lipozomi su imali 40% DOTAP, 10% DOPE, 48% holesterola i 2% PEG-DMG. Poređenja radi, gola plazmidna DNK (20 µg) koja eksprimira isti RSV-F antigen je isporučena ili korišćenjem elektroporacije ili sa RV01(10) lipozomima (0,lµg DNK). Četiri miša su korišćena kao naivna kontrolna grupa.
Lipozomi su pripremljeni postupkom (A) ili postupkom (B). Za neke lipozome napravljene postupkom (A) korišćena je dupla ili polovina količine RNK. Z prosečni prečnik čestica i indeks polidisperznosti su bili:
Serum je sakupljen za analizu antitela 14., 36. i 49. dana. Slezine su sakupljene od miševa 49. dana za analizu T ćelija.
F-specifični serumski IgG titri (GMT) bili su sledeći:
Udeo T ćelija koje su pozitivne na citokine i specifične za RSV F51-66 peptid je sledeći, pokazujući samo brojke koje su statistički značajno iznad nule:
Stoga su formulacije lipozoma značajno poboljšale imunogenost u odnosu na gole RNK kontrole, što je određeno povećanim F-specifičnim titarima IgG i frekvencijama T ćelija. Plazmidna DNK formulisana sa lipozomima, ili isporučena gola korišćenjem elektroporacije, bila je značajno manje imunogena od samoreplicirajuće RNK formulisane lipozomima.
Dalji RV01 lipozomi su pripremljeni postupkom (H), korišćenjem kratkog (2kDa) ili dugog (5kDa) PEG konjugovanog sa DMG, i ili inkapsuliranjem 150 µg RNK (vA375 replikon koji kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV) ili kapsuliranjem samo pufera. Tako su ovi lipozomi imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Choi i 2% PEG-DMG. Veličine i inkapsulacija su bile sledeće:
Lipozomi su davani BALB/c miševima (10 po grupi) bilateralnom intramuskularnom injekcijom (50 µl po nozi) dana 0 i 21. Doze su bile 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 ili 1 µg. F-specifični titri IgG u serumu i PRNT60 (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon prve ili druge injekcije:
Lipozomi — zahtevi za inkapsulaciju
Kao što je gore pomenuto, pozivajući se na Sl. 10, inkapsulacija je neophodna za snažnu ekspresiju. Dalji eksperimenti su koristili tri različite RNK: (i) 'vA317' replikon koji eksprimira RSV-F, tj. površinski fuzioni glikoprotein RSV-a; (ii) „vA17“ replikon koji eksprimira GFP; i (iii) „vA336“ koji je defektan u replikaciji i kodira GFP. RNK su isporučene ili gole ili sa lipozomima napravljenim postupkom (D). Prazni lipozomi su napravljeni postupkom (D) ali bez ikakve RNK. Formulacije lipozoma su imale ove karakteristike:
BALB/c miševima, 5 životinja po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa:
Grupa 1 gola samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0,1 µg)
Grupa 2 samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0,1 µg) inkapsulirana u lipozomima
Grupa 3 samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0,1 µg) dodata praznim lipozomima
Protein podjedinice grupe 4 F (5 µg)
Serum je sakupljen za analizu antitela 14., 35. i 51. dana. Mereni su F-specifični titri IgG u serumu (GMT); ako je pojedinačna životinja imala titar <25 (granica detekcije), dodeljen joj je titar 5. Pored toga, slezine su sakupljene od miševa 51. dana za analizu T ćelija, da bi se odredile ćelije koje su bile pozitivne na citokine i specifične za RSV F51-66 peptid (CD4+) ili za RSV F peptide F85-93 i F249-258 (CD8+).
IgG titri su bili sledeći u 10 grupa i kod neimunizovanih kontrolnih miševa:
Titri neutralizacije RSV seruma 51. dana bili su sledeći:
Životinje koje pokazuju RSV F-specifične CD4+ T ćelije slezine 51. dana bile su sledeće, gde je broj (% pozitivnih ćelija) dat samo ako je stimulisani odgovor bio statistički značajno iznad nule:
Životinje koje su 51. dana pokazale RSV F-specifične CD8+ T ćelije slezine bile su sledeće, gde je broj daje se samo ako je stimulisani odgovor bio statistički značajno iznad nule:
Stoga je inkapsulacija RNK unutar lipozoma neophodna za visoku imunogenost, pošto jednostavna mešavina RNK i lipozoma (grupa 3) nije bila imunogena (u stvari, manje imunogena od gole RNK).
Različiti katjonski lipidi sa vA317RSV replikonom
Dalji eksperimenti su upoređivali četiri različita katjonska lipida (DlinDMA, RV02, RV04 i RV07). Svi lipozomi su sadržali 2% PEG-DMG 2000, ali su ostali sastavi lipida varirali. Sastav i fizičke karakteristike su bile sledeće:
BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) dana 0 i 21 sa golim replikonom (1 µg) ili 0,1 µginkapsuliranom RNK. F-specifični serumski IgGtiteri (GMT) 2 nedelje nakon ove dve injekcije bili su sledeći:
Za RV07 odsustvo DSPC je izazvalo veliko smanjenje imunogenosti.
Dalji lipidi (RV03, RV08, RV09, RV14 [42]) su testirani na isti način:
Lipozom M (sa DC-holesterolom) je bio loš, čak i ispod kontrole gole RNK. Nasuprot tome, preostali katjonski lipidi dali su korisne rezultate. Lipozom N je pripremljen drugačijim postupkom mešanja (postupak (G) sa mikrofluidnim čipom) od lipozoma G (postupak (D)) i ovaj manji lipozom je dao bolje rezultate sa približno istom inkapsulacijom.
Dalji lipidi (RV01, RV10, RV11, RV15) su testirani na isti način:
Osim lipozoma K, svaki od ovih lipozoma je bio bolji od kontrole. RV10 lipid u lipozomu K ima pKa od 7,86 što se čini previsokim da bi bilo korisno in vivo. Čak i unutar korisnog opsega pKa 10 od 5,0 do 7,6, međutim, iako su rezultati bili dobri, nijedan od lipida sa jednim alkilnim repom i jednim repom koji sadrži steroide nije dao rezultate tako dobre kao RV01.
Dalji lipozomi su napravljeni sa RV05. Svi lipozomi su imali 40% RV05 i 2% PEGilovanog lipida, ali su preostale komponente varirale (iako je holesterol uvek bio uključen). Fizičke karakteristike su bile:
αGC = α-galaktozilceramid
BALB/c miševi su testirani kao i ranije:
Za katjonski lipid sa asimetričnim lipidnim repovima (alkil holesterol), promena neutralnog lipida sa DSPC (zasićeni C18 lipidni rep) u 18:2 ili 18:3 PC (sa 2 i 3 nezasićene dvostruke veze po repu) povećala je ukupne IgG titri. Uporedivi rezultati su primećeni zamenom DSPC sa DPyPE.
Dodatni različiti katjonski lipidi sa vA317RSV replikonom
Katjonski lipidi otkriveni u referenci 43 su takođe korišćeni za pripremu lipozoma za vA317 replikon. Ovi katjonski lipidi imaju pKa između 5,8 i 6,1. Za poređenje DODMA, DlinDMA i DOTMA su takođe testirani. Katjonski lipid je uvek bio prisutan na 40%. Svi lipozomi su uključivali holesterola i 2% PEGilovanog DMG (PEG2000, osim lipozoma E koji su imali PEG5000) i napravljeni su postupkom (H). Fizičke karakteristike su bile sledeće:
Ovi lipozomi su korišćeni za vakcinaciju BALB/c miševa kao i ranije. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
Prema tome, RV05 lipozomi su bili više imunogeni od gole RNK, ali manje imunogeni od RV01 lipozoma.
Slezine su sakupljene 49. dana za analizu T ćelija. Svi lipozomi su dali F-specifične citokin-pozitivne T ćelijske frekvencije (CD4+ i CD8+) koje su bile statistički značajno iznad nule.
Različiti lipidi i PEG dužine
Replikon vA317 je davan u lipozomima koji imaju niz različitih lipida sa različitim PEG dužinama. Svi lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC i 48% holesterola, ali je 10 preostalih 2% bilo različito, sa različitim PEGilovanim lipidima (npr. SLIKE 18A tol8E) i različitim PEG dužinama.
Fizičke karakteristike lipozoma, napravljenih postupkom (H), bile su:
BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0 i 21 dana sa replikonom, bilo golim (1µg) ili inkapsuliranim (0,1 µg). Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana.
F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon dve injekcije (2wpl):
Rezultati pokazuju trend, koji ukazuje da su grupe PEG glava veće molekularne težine imunogenije. Kako se dužina DMG-konjugovanog PEG-a povećava sa l000 Da na 3000 Da, titar IgG specifičnih za 2wp2 raste sa 7412 na 15659 na 22378.
Promena regiona linkera iz estra u etar nije značajno uticala na titre. Takođe, pri istoj molekulskoj težini glavene grupe (2000) postojao je trend da povećanje dužine lipidnih repova snižava titar (H sa C14 dialkilom naspram I sa Cl8 dialkilom). Zamena repa PEG di-alkil lipida holesterolom je imala mali uticaj na imunogenost (A sa DMG naspram G sa holesterolom).
Slični eksperimenti su izvedeni sa različitim lipidima u kojima je 2kDa PEG podeljen na 2x 1kDa grupe (Slika 17). Replikon vA317 je ponovo korišćen, sa BALB/c miševima, 8 po grupi, kojima su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0 i 21 dana sa 1 µg golom RNK ili 0,1 µg lipozomom inkapsuliranom RNK. Svi lipozomi su imali 40% katjonskog lipida (DlinDMA), 10% DSPC i 48% holesterola, ali preostalih 2% je bilo različito, sa različitim PEGiliranim lipidima (ali svi sa 2kDa PEG). Napravljeni su postupkom (H).
Fizičke karakteristike lipozoma su bile:
Dodatni lipozomi su napravljeni sa RV05. Svi lipozomi su imali 40% katjonskog lipida (RV05) i 2% PEGilovanog lipida (2kDa PEG), ali su preostale komponente varirale (iako je holesterol uvek bio uključen). Lipozomi su napravljeni postupkom (H) ali sa pH 5. Fizičke karakteristike su:
αGC = α-galaktozilceramid
BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0 i 21 dana sa replikonom, bilo golim (1 µg) ili inkapsuliranim (0,1 µg). Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) su bili sledeći, 2 nedelje 10 nakon dve injekcije (2 wp1):
Razdvajanje grupa PEG glava je na taj način snizilo in vivo titre. Uključivanje dvostruke veze (1 stepen nezasićenosti po alkilnom repu) u PEG lipidnim repovima povećalo je titre IgG, 6 puta 14. i 7 puta 35. dana. Za katjonski lipid sa asimetričnim lipidnim repovima (alkil holesterol), promena neutralni lipid iz DSPC (zasićeni Cl8 lipidni rep) do 18:2 ili 18:3 PC (sa 2 i 3 nezasićene dvostruke veze po repu) povećao je ukupne titre IgG. Uporedivi rezultati su primećeni sa zamenom DSPC sa DPyPE.
CMV imunogenost
RV01 lipozomi sa DLinDMA kao katjonskim lipidom korišćeni su za isporuku RNK replikona koji kodiraju glikoproteine citomegalovirusa (CMV). Replikon „vA160” kodira glikoproteine pune dužine H i L (gH/gL), dok „vA322” replikon kodira rastvorljiv oblik (gHsol/gL). Dva proteina su pod kontrolom odvojenih subgenomskih promotera u jednom replikonu; istovremena primena dva odvojena vektora, jednog koji kodira gH i jednog koji kodira gL, nije dala dobre rezultate.
BALB/c miševima, 10 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0, 21. i 42. dana sa VRPs koji eksprimiraju gH/gL (1xl0<6>IU), VRPs koji izražavaju gHsol/gL (1xl0<6>IU) i PBS kao kontrole. Dve test grupe su primile 1 µg replikona vA160 ili vA322 formulisanog u lipozomima (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Hol, 2% PEG-DMG; napravljen korišćenjem postupka (D) ali sa veličinom serije od 150 µg RNK).
Lipozomi vA160 su imali Zav prečnik od 168,8 nm, pdl od 0,144 i 87,4% inkapsulacije. Lipozomi vA322 su imali Zav prečnik od 162 nm, pdl od 0,131 i 90% inkapsulaciju.
Replikoni su bili u stanju da eksprimiraju dva proteina iz jednog vektora.
Serumi su sakupljeni za imunološku analizu 63. dana (3wp3). Titri neutralizacije CMV (recipročna vrednost razblaženja seruma koja dovodi do 50% smanjenja broja pozitivnih žarišta virusa po bunarčiću, u odnosu na kontrole) bili su sledeći:
gH/gL VRP gHsol/gL VRP gH/gL lipozom gHsol/gL lipozom
4576 2393 4240 10062
RNK koja je eksprimirala ili punu dužinu ili rastvorljivu formu CMV gH/gL kompleksa je tako izazvala visoke titre neutralizujućih antitela, kao što je ispitano na epitelnim ćelijama. Prosečni titri izazvani RNK inkapsuliranim u lipozomima bili su najmanje visoki kao za odgovarajuće VRP.
Ponovljeni eksperimenti su potvrdili da je replikon bio u stanju da izrazi dva proteina iz jednog vektora. Replikon RNK je dao titar 3wp3 od 11457, u poređenju sa 5516 sa VRP.
REFERENCE
[1] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495-1501.
[2] Heyes etal. (2005) J Controlled Release 107:276-87.
[3] WO2005/121348.
[4] Lipozomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols, (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X.
[5] Lipozome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006.
[6] Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & lipozomes), (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002.
[7] Jeffs etal. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372.
[8] W02005/113782.
[9] WO2011/005799.
[10] El Ouahabi etal. (1996)FEBSLetts 380:108-12.
[29] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[30] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)
[31] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)
[32] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[33] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)
[34] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[35] Molecular Biology Techniques: an intensive laboratory course (Ream, eds. 1998 Academic Press)
[36] PCR (Introduction to Biotechniques Series'), 2nd ed. (Newton & Graham eds. 1997, Springer Verlag)
[37] Yoneyama & Fujita (2007) Cytokine & Growth Factor Reviews 18:545-51.
[38] Maurer etal. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326.
[39] Pern etal. (2003) J Ezra/77:10394-10403.
[40] Boxus et al. (2007) J Virol 81:6879-89.
[41] Taylor etal. (2005) Vaccine 23:1242-50.
[42] WO2011/076807.
[43] WO2011/057020.

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Lipozom unutar kojeg je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen od interesa, naznačen time da lipozom sadrži lipid sa katjonskom grupom glave, lipid sa cviterjonskom grupom glave i ima prečnik u opsegu od 60-180 nm, pri čemu je imunogen spajk glikoprotein.
2. Lipozom prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da lipozom ima prečnik u opsegu od 80-160 nm.
3. Lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da je RNK samoreplicirajuća RNK.
4. Lipozom prema patentnom zahtevu 3, naznačen time da molekul RNK koji se samoreplicira kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može da transkribuje RNK iz samoreplicirajućeg RNK molekula i (ii) imunogen.
5. Lipozom prema patentnom zahtevu 4, naznačen time da molekul RNK ima dva otvorena okvira čitanja, od kojih prvi kodira replikazu alfavirusa, a drugi kodira imunogen.
6. Lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da je molekul RNK dugačak 9000-12000 nukleotida.
7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži populaciju lipozoma prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time da je Z-prosečan prečnik lipozoma u populaciji između 60 nm i 180 nm uključujući i njih.
9. Lipozom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, za upotrebu u postupku za podizanje zaštitnog imunog odgovora kod kičmenjaka, naznačen time da navedeni postupak obuhvata korak davanja kičmenjaku efektivne količine navedenog lipozoma.
10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7 ili 8, za upotrebu u postupku za podizanje zaštitnog imunološkog odgovora kod kičmenjaka, naznačena time da navedeni postupak obuhvata korak davanja kičmenjaku efektivne količine pomenute farmaceutske kompozicije
RS20220689A 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen RS63404B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37883110P 2010-08-31 2010-08-31
EP11755497.2A EP2611467B1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
PCT/US2011/049873 WO2012030901A1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63404B1 true RS63404B1 (sr) 2022-08-31

Family

ID=44645813

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220689A RS63404B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230136A RS63984B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230223A RS64084B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230006A RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230136A RS63984B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230223A RS64084B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230006A RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Country Status (21)

Country Link
US (1) US9254265B2 (sr)
EP (6) EP4008357B1 (sr)
JP (2) JP2013538569A (sr)
CN (1) CN103179989A (sr)
AU (8) AU2011296062A1 (sr)
BR (1) BR112013004879A2 (sr)
CA (1) CA2809678A1 (sr)
DK (4) DK4043040T3 (sr)
ES (4) ES2923634T3 (sr)
FI (3) FI4066819T3 (sr)
HR (4) HRP20230501T1 (sr)
HU (4) HUE060958T2 (sr)
LT (4) LT4066819T (sr)
MX (1) MX341989B (sr)
PL (4) PL2611467T3 (sr)
PT (4) PT4043040T (sr)
RS (4) RS63404B1 (sr)
RU (1) RU2671482C2 (sr)
SI (4) SI4043040T1 (sr)
SM (4) SMT202300096T1 (sr)
WO (1) WO2012030901A1 (sr)

Families Citing this family (250)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
MX342608B (es) * 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012051211A2 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP4115875A1 (en) * 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
MX366055B (es) * 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2013143555A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
US10501513B2 (en) * 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
CN109045294A (zh) * 2013-01-10 2018-12-21 思齐乐 流感病毒免疫原性组合物及其应用
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
DK2970948T3 (en) 2013-03-15 2019-04-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa METHODS OF RNA PURIFICATION
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3798229A1 (en) 2014-03-25 2021-03-31 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
PL4023249T3 (pl) * 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
HUE060907T2 (hu) 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
EP4353257A3 (en) 2015-04-13 2024-08-07 CureVac Manufacturing GmbH Method for producing rna compositions
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
PT3313829T (pt) 2015-06-29 2024-07-08 Acuitas Therapeutics Inc Formulações de lípidos e de nanopartículas lipídicas para a administração de ácidos nucleicos
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
WO2017070601A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
AU2016342376A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
EP4011451A1 (en) 2015-10-22 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Metapneumovirus mrna vaccines
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
HRP20230209T1 (hr) 2015-10-28 2023-04-14 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
PL3394093T3 (pl) 2015-12-23 2022-05-16 Modernatx, Inc. Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Polynucleotides encoding relaxin
BE1024796B9 (fr) 2016-06-02 2019-01-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Constructions antigeniques du virus zika
CN118108847A (zh) 2016-08-07 2024-05-31 诺华股份有限公司 mRNA介导的免疫方法
CN109715205A (zh) 2016-08-19 2019-05-03 库瑞瓦格股份公司 用于癌症治疗的rna
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
MA46766A (fr) 2016-11-11 2019-09-18 Modernatx Inc Vaccin antigrippal
WO2018091540A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
EP3551230A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 CureVac AG Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
WO2018115527A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
US11464847B2 (en) 2016-12-23 2022-10-11 Curevac Ag Lassa virus vaccine
BR112019015797A2 (pt) * 2017-02-01 2020-03-17 Modernatx, Inc. Composições de mrna terapêuticas imunomoduladoras que codificam peptídeos de mutação de oncogene de ativação
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
JP2020514370A (ja) 2017-03-17 2020-05-21 キュアバック アーゲー 組合せ抗癌療法のためのｒｎａワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
SG11201906297QA (en) 2017-03-24 2019-10-30 Curevac Ag Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
EP3395365A1 (en) * 2017-04-28 2018-10-31 Ajinomoto Co., Inc. Immunostimulating agent
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
JP7285220B2 (ja) 2017-05-18 2023-06-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド 連結したインターロイキン－１２（ｉｌ１２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
BR112019025104A2 (pt) * 2017-05-30 2020-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Método de fabricar um sistema de entrega não viral, sistema de entrega não viral, e, composição
GB2600653B (en) 2017-05-30 2022-11-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
ES3039647T3 (en) 2017-05-31 2025-10-23 Arcturus Therapeutics Inc Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
SG11201911430PA (en) 2017-07-04 2020-01-30 Curevac Ag Novel nucleic acid molecules
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
EP3681904A1 (en) 2017-09-13 2020-07-22 Biontech Cell&Gene Therapies GmbH Rna replicon for expressing a t cell receptor or an artificial t cell receptor
EP3681993B1 (en) 2017-09-13 2026-04-01 BioNTech SE Rna replicon for reprogramming somatic cells
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
US20220233568A1 (en) 2017-10-19 2022-07-28 Curevac Ag Novel artificial nucleic acid molecules
WO2019094702A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
EP3714045A1 (en) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
CA3079428A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
MA51523A (fr) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des anticorps anti-virus du chikungunya
CA3088485A1 (en) * 2018-01-18 2019-07-25 Etherna Immunotherapies Nv Lipid nanoparticles
AU2019210204B2 (en) * 2018-01-18 2024-05-16 EndoProtech, Inc. Treating microvascular dysfunction
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
EP3773745A1 (en) 2018-04-11 2021-02-17 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
WO2019226650A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
US12083174B2 (en) 2018-08-17 2024-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
WO2020047201A1 (en) 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
MX2021003015A (es) 2018-09-13 2021-07-15 Modernatx Inc Polinucleotidos que codifican glucosa-6-fosfatasa para el tratamiento de la glucogenosis.
WO2020056155A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
JP2022500444A (ja) 2018-09-14 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL281615B2 (en) 2018-09-21 2026-01-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
EP3856233A1 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
WO2020097409A2 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
EP3886901A1 (en) 2018-11-29 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020144295A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Localized administration of rna molecules for therapy
PT3908568T (pt) 2019-01-11 2024-09-30 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos para a administração de agentes ativos por nanopartículas lipídicas
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
JP2022532078A (ja) 2019-05-08 2022-07-13 アストラゼネカ アクチボラグ 皮膚及び創傷のための組成物並びにその使用の方法
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
US20220387628A1 (en) 2019-06-24 2022-12-08 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof
EP3987027A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
CN112237628A (zh) * 2019-07-17 2021-01-19 四川大学华西医院 靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
EP3999097B1 (en) 2019-07-18 2024-05-29 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Rac2 mutant for use in ablating hematopoiesis and in the treatment of hematopoietic malignancies
US20220273789A1 (en) 2019-07-21 2022-09-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
EP4021407A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
EP4048807A1 (en) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
EP3819377A1 (en) 2019-11-08 2021-05-12 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular rna and uses thereof for inhibiting rna-binding proteins
CR20220220A (es) 2019-11-18 2022-09-20 Janssen Biotech Inc Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
AU2021236068A1 (en) 2020-03-09 2022-10-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
WO2021209970A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sars cov-2 spike protein construct
IL297419B2 (en) * 2020-04-22 2025-02-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
EP4153223A1 (en) * 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Immunogenic compositions and uses thereof
EP4158005A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 ModernaTX, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
JP7769644B2 (ja) 2020-06-04 2025-11-13 バイオエヌテック エスエー 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
WO2022002783A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
ES3054438T3 (en) 2020-07-16 2026-02-03 Acuitas Therapeutics Inc Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
EP4196128A4 (en) 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022104131A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4008785A1 (en) 2020-12-03 2022-06-08 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses
US11918643B2 (en) 2020-12-22 2024-03-05 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
US12263217B2 (en) 2020-12-23 2025-04-01 Daykin Molecular Systems, LLC Nucleic acid stabilizing solution for vaccines, therapy, diagnostics, storage, and transport
EP4267593A2 (en) 2020-12-23 2023-11-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Self-amplifying messenger rna
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
WO2022204370A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
US20240216288A1 (en) 2021-03-24 2024-07-04 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
US20240226025A1 (en) 2021-03-24 2024-07-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
CA3212653A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
CN113230394B (zh) * 2021-04-30 2024-04-30 广州源博医药科技有限公司 一种用于牛病毒性腹泻的rna疫苗及其构建方法
WO2022248353A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
EP4352247A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
EP4355882A2 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
US20240342206A1 (en) 2021-07-30 2024-10-17 CureVac SE mRNAS FOR TREATMENT OR PROPHYLAXIS OF LIVER DISEASES
US20240350410A1 (en) 2021-08-16 2024-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
EP4387596A1 (en) 2021-08-16 2024-06-26 GlaxoSmithKline Biologicals SA Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
CA3229889A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
EP4419708A1 (en) 2021-10-18 2024-08-28 BioNTech SE Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use
EP4419695A1 (en) 2021-10-18 2024-08-28 BioNTech SE Modified replicable rna and related compositions and their use
CA3242402A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
JP2025502257A (ja) 2022-01-17 2025-01-24 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 固形腫瘍細胞の集団の細胞死を誘導する方法
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
CN116554125B (zh) * 2022-01-27 2024-04-05 广州立得生物医药科技有限公司 一种阳离子脂质类似物、其组合物及应用
US20250064899A1 (en) 2022-02-14 2025-02-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of the 15-lipoxygenase for the treatment of lymphedema
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
US20250221931A1 (en) 2022-03-25 2025-07-10 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023213378A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 BioNTech SE Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
AU2023316015A1 (en) 2022-07-25 2025-02-13 Centre Hospitalier Universitaire De Toulouse Use of apelin for the treatment of lymphedema
WO2024026254A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
WO2024044147A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 Modernatx, Inc. Methods for purification of ionizable lipids
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
CA3267295A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 TRON – TRANSLATIONALE ONKOLOGIE AN DER UNIVERSITATSMEDIZIN DER JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAT MAINZ GEMEINNUTZIGE GMBH-Aysegul YILDIZ SYSTEMS AND COMPOSITIONS CONTAINING TRANS-AMPLIFYING RNA VECTORS WITH MIARN
AU2023353931A1 (en) 2022-09-26 2025-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
EP4608442A1 (en) 2022-10-28 2025-09-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Nucleic acid based vaccine
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
WO2024121378A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel human antiviral genes related to the eleos and lamassu prokaryotic systems
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
JP2026503277A (ja) 2023-01-09 2026-01-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 心筋梗塞を経験した患者における有害な虚血後心臓リモデリングを処置するためのアンジオポエチン様４の組み換えフィブリノーゲン様ドメインの使用
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
JP2026503627A (ja) 2023-01-27 2026-01-29 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 血管透過性亢進の処置方法におけるアンフィレグリン（ａｒｅｇ）の使用
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
WO2024194484A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Modulating the expression and/or activity of gas7 for modulating viral replication
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
AU2024260120A1 (en) 2023-04-27 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
EP4704816A1 (en) 2023-05-03 2026-03-11 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
IL326711A (en) 2023-08-24 2026-04-01 BioNTech SE Systems and compositions comprising highly active trans-amplifying replicases
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025051381A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 BioNTech SE Methods and compositions for localized expression of administered rna
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
WO2025083211A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of factor h for the treatment of dementia
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025215072A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Class i lanthipeptides with anti-viral function
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
WO2025235862A1 (en) 2024-05-10 2025-11-13 Inndura Therapeutics Inc. A modified immune cell receptor comprising a target-binding domain and the extracellular domain of cd16a
WO2025248096A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antimicrobial peptides having liquid-liquid phase separation activities
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
CA2489769A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5750390A (en) * 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
US5693535A (en) * 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
EP0786522A2 (en) * 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
EP1624068A1 (en) 1993-06-01 2006-02-08 Life Technologies Inc. Genetic immunization with cationic lipids
US6264957B1 (en) * 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6432925B1 (en) * 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP1222289B1 (en) * 1999-10-20 2008-04-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
US8541008B2 (en) * 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030077251A1 (en) * 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
RU2294192C2 (ru) * 2001-05-30 2007-02-27 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Система доставки нуклеиновых кислот
ES2330202T5 (es) * 2001-09-06 2014-01-20 Alphavax, Inc. Sistemas vectores basados en replicones de alfavirus
AU2003211103A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Northeastern University Intracellular delivery of therapeutic agents
EP1499727A1 (en) * 2002-04-26 2005-01-26 Pfizer Inc. Hepatitis c virus replicon containing a reporter gene and a selectable marker gene
BR0314236A (pt) 2002-09-13 2005-08-09 Replicor Inc Formulação de oligonucleotìdeo, composição farmacêutica, kit, composto antiviral, preparação de oligonucleotìdeo e métodos para seleção de um oligonucleotìdeo antiviral para uso como um agente antiviral, para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um paciente, para tratamento profilático de câncer causado por oncovìrus, para identificação de um composto que altera a ligação de um oligonucleotìdeo a pelo menos um componente viral, para purificação da ligação de oligonucleotìdeos a pelo menos um componente viral e para enriquecimento de oligonucleotìdeos a partir de um agrupamento de oligonucleotìdeos
EP1637144A4 (en) * 2003-05-30 2010-01-13 Nippon Shinyaku Co Ltd OLIGONUCLEIC ACID CONTAINING COMPOSITE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
DE602004021260D1 (de) 2003-07-11 2009-07-09 Alphavax Inc Cytomegalovirusimpfstoffe, die auf dem alphavirus basieren
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
CN1989250B (zh) * 2004-05-18 2013-11-20 阿尔法瓦克斯公司 Tc-83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法
EP2848692B1 (en) 2004-05-21 2017-08-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
EP1773857A4 (en) * 2004-07-02 2009-05-13 Protiva Biotherapeutics Inc THE IMMUNE SYSTEM STIMULATING SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
US20060051405A1 (en) * 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
CA2626253A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
JP2007112768A (ja) * 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
CA2658484A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Vical Incorporated Compositions and methods for vaccinating against hsv-2
CA2689042A1 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
HUE040417T2 (hu) 2007-05-04 2019-03-28 Marina Biotech Inc Aminosavlipidek és alkalmazásuk
CA2692546C (en) * 2007-07-09 2018-03-13 Esther H. Chang Methods for generating immune response using cationic-liposome-mediated nucleic acid delivery
WO2009111088A2 (en) 2008-01-02 2009-09-11 The Johns Hopkins University Antitumor immunization by liposomal delivery of vaccine to the spleen
WO2009086558A1 (en) * 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009132259A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 National Oilwell Varco, L.P. Torque member for threaded connections
US20100040650A1 (en) * 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
CL2008002322A1 (es) 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
EP2450031B1 (en) * 2009-07-02 2018-08-29 Konica Minolta Holdings, Inc. Method for producing liposomes by two-stage emulsification method using outer aqueous phase containing specific dispersing agent, method for producing liposome dispersion or dry powder thereof using the method for producing liposomes, and liposome dispersion or dry powder thereof produced thereby
CA2766907A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
CA2768186A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
AU2010315124B2 (en) 2009-11-04 2016-12-01 Marina Biotech, Inc. Activity generating delivery molecules
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
CA3009891C (en) 2009-12-23 2020-09-15 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
ES2557382T3 (es) * 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
MX342608B (es) * 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
MX2013002332A (es) * 2010-08-31 2013-03-18 Novartis Ag Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina.
EP4115875A1 (en) * 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
PT3313829T (pt) 2015-06-29 2024-07-08 Acuitas Therapeutics Inc Formulações de lípidos e de nanopartículas lipídicas para a administração de ácidos nucleicos
HRP20230209T1 (hr) 2015-10-28 2023-04-14 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US11918643B2 (en) 2020-12-22 2024-03-05 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
EP4274607A1 (en) 2021-01-11 2023-11-15 ModernaTX, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
HUE061275T2 (hu) 2023-06-28
PT4043040T (pt) 2023-03-24
SI4043040T1 (sl) 2023-04-28
SI4066819T1 (sl) 2023-07-31
SI2611467T1 (sl) 2022-10-28
MX2013002337A (es) 2013-03-18
AU2022204491B2 (en) 2022-12-15
EP4066819B1 (en) 2023-03-01
PT4008357T (pt) 2023-01-11
EP4066819A1 (en) 2022-10-05
PL4043040T3 (pl) 2023-04-17
EP4008357A1 (en) 2022-06-08
EP4233841A3 (en) 2023-11-01
JP2016169230A (ja) 2016-09-23
PL2611467T3 (pl) 2022-08-16
EP4122451A8 (en) 2023-08-30
LT4066819T (lt) 2023-04-11
DK4043040T3 (da) 2023-03-20
PT2611467T (pt) 2022-08-01
ES2935542T3 (es) 2023-03-07
AU2022271508A1 (en) 2022-12-22
PL4008357T3 (pl) 2023-03-06
RU2671482C2 (ru) 2018-10-31
HUE061463T2 (hu) 2023-06-28
HRP20221048T1 (hr) 2022-11-11
EP4043040A8 (en) 2022-09-28
CA2809678A1 (en) 2012-03-08
FI4043040T3 (fi) 2023-04-04
BR112013004879A2 (pt) 2018-04-24
HRP20230326T1 (hr) 2023-06-09
EP4043040B1 (en) 2023-01-11
AU2022204487A1 (en) 2022-07-14
CN103179989A (zh) 2013-06-26
AU2022204491A1 (en) 2022-07-14
HRP20230501T1 (hr) 2023-08-04
LT2611467T (lt) 2022-08-10
SI4008357T1 (sl) 2023-04-28
PL4066819T3 (pl) 2023-06-05
RS64084B1 (sr) 2023-04-28
US9254265B2 (en) 2016-02-09
ES2939732T3 (es) 2023-04-26
RS63890B1 (sr) 2023-02-28
SMT202300144T1 (it) 2023-07-20
AU2020205236B2 (en) 2022-11-17
EP4043040A1 (en) 2022-08-17
EP4233841A2 (en) 2023-08-30
EP4008357B1 (en) 2022-12-28
EP2611467B1 (en) 2022-07-20
AU2022205179A1 (en) 2022-07-28
HUE059214T2 (hu) 2022-10-28
AU2020205236A1 (en) 2020-07-30
MX341989B (es) 2016-09-09
LT4043040T (lt) 2023-03-27
ES2923634T3 (es) 2022-09-29
ES2941244T3 (es) 2023-05-19
RS63984B1 (sr) 2023-03-31
SMT202200312T1 (it) 2022-09-14
HUE060958T2 (hu) 2023-04-28
FI4008357T3 (fi) 2023-01-13
DK4008357T3 (da) 2023-02-20
AU2022205179B2 (en) 2022-12-15
AU2018204178B2 (en) 2020-04-16
PT4066819T (pt) 2023-03-30
EP4122451A1 (en) 2023-01-25
AU2018204178A1 (en) 2018-07-05
SMT202300096T1 (it) 2023-05-12
US20130195969A1 (en) 2013-08-01
SMT202200504T1 (it) 2023-01-13
WO2012030901A1 (en) 2012-03-08
AU2016213772A1 (en) 2016-09-01
RU2013114392A (ru) 2014-10-10
LT4008357T (lt) 2023-01-25
DK2611467T3 (da) 2022-08-01
EP2611467A1 (en) 2013-07-10
AU2022204487B2 (en) 2022-12-15
HRP20230017T1 (hr) 2023-02-17
DK4066819T3 (da) 2023-04-24
JP2013538569A (ja) 2013-10-17
FI4066819T3 (fi) 2023-05-19
AU2011296062A1 (en) 2013-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2611467B1 (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP4066856B1 (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP2590626B1 (en) Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
EP4005592B1 (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
CN103384515A (zh) 适用于脂质体递送编码蛋白质的rna的脂质
HK40076055B (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079415B (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40082652B (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40078743B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079351B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40081868B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062524B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40071976B (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40087666A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40092401A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna