RS63410B1 - Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks - Google Patents

Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks

Info

Publication number
RS63410B1
RS63410B1 RS20220700A RSP20220700A RS63410B1 RS 63410 B1 RS63410 B1 RS 63410B1 RS 20220700 A RS20220700 A RS 20220700A RS P20220700 A RSP20220700 A RS P20220700A RS 63410 B1 RS63410 B1 RS 63410B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
antigen
protein
acid sequence
human
Prior art date
Application number
RS20220700A
Other languages
English (en)
Inventor
Kara L Olson
Eric Smith
Ka-Man Venus Lai
Andrew J Murphy
Gavin Thurston
Dayong Guo
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54849703&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63410(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS63410B1 publication Critical patent/RS63410B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Dat je genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani CD3ε, humanizovani CD3δ i humanizovani CD3γ. Tako su obezbeđeni genetski modifikovani miševi koji eksprimiraju humanizovani CD3 kompleks. Ovde je takođe dat model za predkliničko ispitivanje terapije zasnovane na CD3, npr., antitela zasnovana na CD3, npr., bispecifična antitela zasnovana na CD3.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Pored podjedinica receptora za T ćelije, npr., visoko varijabilni TCRα i TCRβ, kompleks T ćelija na površini T ćelije sadrži nepromenljive lance CD3ε, CD3δ i CD3γ, koji formiraju heterodimere koji se sastoje iz CD3εδ i CPB3εγ Takođe povezani sa TCR/CD3 kompleksom je ζ lanac koji je prisutan kao homodimer vezan za disulfid.
[0003] CD3 lanci igraju presudnu ulogu u sklapanju receptora T ćelija, transportu na površinu ćelije, endocitozi površinskih receptora, razvoju T ćelija i signalizaciji T ćelija. Na primer, demonstrirano je kroz ispitivanja nedostataka različitih CD3 podjedinica, da su CD3 lanci važni za dvostruko negativne (CD4-CD8 ili DN) da dvostruko pozitivne (CD4+CD8+ ili DP) pređu u jedno pozitivne (CD4+ ili CD8+ ili SP) T ćelije. Pored toga, svaki od lanaca CD3ε, CD3δ, i CD3γ sadrži po jedan motiv aktiviranja na osnovu imunoreceptora tirozin (ITAM), dok dimer ζ lanca sadrži ukupno 6 ITAM-ova. Ovi motivi služe kao signalni moduli i fosforilišu se od povezanih kinaza nakon angažovanja TCR.
[0004] Pokazano je da antitela protiv CD3 skupljaju CD3 na T ćelijama, uzrokujući tako aktivaciju T ćelija na način sličan angažovanju TCR molekulima MHC opterećenim peptidima. Stoga su antitela na CD3 predložena kao terapijski kandidati usmereni na aktivaciju T ćelija. Pored toga, bispecifična antitela koja su sposobna da vezuju CD3 i ciljni antigen su predložena za terapeutsku upotrebu koja uključuje ciljanje imunih odgovora T ćelija na tkiva i ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen.
[0005] Pogodan životinjski model za predkliničko ispitivanje mono- i bispecifičnih terapijskih antitela zasnovanih na CD3 je posebno poželjan. WO2003/006639 obelodanjuje transgensku životinju koja sadrži humani polipeptid koji je uključen u prepoznavanje i/ili antigensku aktivaciju od strane T ćelija. Kuhn i dr., Sci Transl Med. 3(68):68ra10 (2011), obelodanjuje transgenske miševe koji eksprimiraju humani ε lanac kompleksa CD3.
REZIME PRONALASKA
[0006] Ovde je dat genetski modifikovani miš prema patentnom zahtevu 1. Endogeni mišji CD3 lokus je genetski modifikovan da kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, vanćelijski domen humanog CD3δ i vanćelijski domen humanog mišijeg CD3γ. Endogeni CD3 lokus je genetski modifikovan tako da ne eksprimira funkcionalni vanćelijski domen (domene) odgovarajućeg mišjeg proteina. U jednom otelotvorenju, endogeni mišji CD3 lokus dalje kodira transmembranske i citoplazmatske domene mišjih odgovarajućih endogenih CD3 proteina, pri čemu životinja eksprimira himerni CD3 protein na površini svojih T ćelija koje sadrže vanćelijski domen humanog CD3 proteina i transmembranski i citoplazmatski domen endogenog mišjeg CD3 proteina. U jednom otelotvorenju, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vanćelijski domen humanog mišjeg CD3 u miša operativno su povezane sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju transmembranski i citoplazmatski domen odgovarajućeg endogenog mišjeg CD3 proteina. U posebnom otelotvorenju, ne-humana životinja sadrži (a) na endogenom CD3ε lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen endogenog mišjeg CD3ε, (b) na endogenom CD3δ lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3δ operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene endogenog mišjeg CD3δ, i (c) na endogenom CD3γ lokusu sekvenca nukleinske kiseline kodirajući vanćelijski domen humanog CD3γ koji je operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene endogenog mišjeg CD3γ, pri čemu miš eksprimira himerne CD3ε, CD3δ i CD3γ proteine na površini svojih T ćelija. U nekim primerima, vanćelijski domen humanog CD3 proteina u mišu sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO:33, primera mišjeg SEQ ID NO:34 i SEQ ID NO:35. U nekim primerima, miš sadrži vanćelijske domene humanih CD3 proteina koji sadrže sekvence SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 i
[0007] U nekim otelotvorenjima, ovde opisana genetski modifikovana ne-humana životinja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina koji je operativno povezan sa CD3 promoterom. Tako, u nekim otelotvorenjima, ovde opisan miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, operativno povezan sa CD3 promoterom, vanćelijski domen humanog CD3δ, operativno povezan sa CD3 promoterom, i vanćelijski domen humani CD3γ operativno povezan sa CD3 promoterom. U jednom otelotvorenju, CD3 promoter je ne-humani životinjski CD3 promoter. U jednom otelotvorenju, CD3 promoter je humani CD3 promoter. U jednom otelotvorenju, CD3 promoter je endogeni mišji CD3 promoter.
[0008] Stoga, u jednom otelotvorenju, ovde datom genetski modifikovanom mišu, gde miš sadrži (a) na endogenom mišjem CD3ε lokus sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene endogenog mišjeg CD3ε, (b) na endogenom mišjem CD3δ lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3δ operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen endogenog mišjeg CD3δ, i (c) na endogenom mišjem CD3γ lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3γ operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene endogenog mišjeg CD3γ, a miš eksprimira humanizovane CD3ε, CD3δ i CD3γ proteine na površini njegovih T ćelija. Aminokiselinska sekvenca humanizovanog CD3ε proteina u pomenutom mišu navedena je u SEQ ID NO:24, aminokiselinska sekvenca humanizovanog CD3δ proteina je navedena u SEQ ID NO:25, i aminokiselinska sekvenca humanizovanog CD3γ proteina izloženo je u SEQ ID NO:26. U jednom otelotvorenju, ovde obezbeđeni genetski modifikovani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 operativno povezan sa mišjim CD3 promoterom. U jednom otelotvorenju, promoter je endogeni mišji CD3 promoter. U drugom otelotvorenju, ovde obezbeđeni genetski modifikovani miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 operativno povezan sa mišjim CD3 promoterom. U jednom otelotvorenju, miš pokazuje sličan odnos CD4+ do CD8+ ćelija u timusu u poređenju sa mišem koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovane CD3 proteine. U jednom otelotvorenju, odnos CD4+ i CD8+ T ćelija miša u timusu je unutar 30%, unutar 25%, unutar 20%, unutar 15%, unutar 12%, unutar 10%, unutar 5% ili unutar 2% odnosa CD4+ prema CD8+ ćelija miša koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovane CD3 proteine. U jednom otelotvorenju, miš pokazuje sličan procenat T i B ćelija u slezini, limfnim čvorovima i perifernoj krvi kao miš koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovane CD3 proteine. U jednom otelotvorenju, miš prikazuje sličan broj belih krvnih zrnaca, limfocita, monocita, neutrofila, eozinofila i bazofila kao miš koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovane CD3 proteine.
[0009] Ovde je obelodanjen genetski modifikovani miš koji sadrži na endogenom mišjem CD3 lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina, pri čemu je humani CD3 protein izabran iz grupe koju čine CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ i kombinacija od toga. Miš prema pronalasku sadrži vanćelijske domene humanih CD3ε, CD3δ i CD3γ. U jednom primeru, vanćelijski domen humanog CD3ε je izložen u SEQ ID NO:33, vanćelijskom domenu humanog CD3δ je prikazan u SEQ ID NO:34, a vanćelijski domen humanog CD3γ je prikazan u SEQ ID NO:35. Miš eksprimira humanizovani CD3ε, humanizovani CD3δ i humanizovani CD3γ. U jednom otelotvorenju miša, humanizovani CD3ε je eksprimiran u SEQ ID NO:24, humanizovani CD3δ je izložen u SEQ ID NO:25, a humanizovani CD3γ je izložen u SEQ ID NO:26. Miš dalje sadrži miš CD3ε, CD3δ i CD3γ transmembranski i citoplazmatski domen. U jednom otelotvorenju, miš dalje sadrži endogene mišje CD3ε, CD3δ i CD3γ transmembranske i citoplazmatske domene.
[0010] U drugom otelotvorenju, ovde je dat postupak za stvaranje genetski modifikovanog miša koji eksprimira humanizovani CD3 protein, prema patentnom zahtevu 6. U jednom otelotvorenju postupka, životinja ne sadrži mišji funkcionalni vanćelijski domen(e) odgovarajućeg mišjeg proteina. U jednom primeru postupka, vanćelijski domen humanog CD3ε je izložen u SEQ ID NO:33, vanćelijskom domenu humanog CD3δ je prikazan u SEQ ID NO:34, a vanćelijski domen humanog CD3γ je prikazan u SEQ ID NO:35. U jednom otelotvorenju postupka, životinja ne sadrži mišji funkcionalni vanćelijski domen(e) odgovarajućeg mišjeg proteina. U jednom određenom otelotvorenju, postupak obuhvata zamenu na endogenom CD3 lokusu vanćelijskog domena ne-humanih CD3 proteina sa odgovarajućim vanćelijskim domenom humanog CD3 proteina. U jednom otelotvorenju postupka, životinja dalje sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene odgovarajućih endogenih mišjih CD3 proteina. U jednom otelotvorenju postupka, zamena je na endogenom CD3 lokusu miša. Miš eksprimira humanizovani CD3 protein odabran iz grupe koja se sastoji iz humanizovanog CD3ε izloženih u SEQ ID NO: 24, humanizovani CD3δ naveden u SEQ ID NO:25, humanizovani CD3γ naveden u SEQ ID NO:26, i njihova kombinacija. U jednom otelotvorenju postupka, zamena se vrši u jednoj ES ćeliji, a pojedinačna ES ćelija se uvodi u mišji embrion da bi se stvorio miš.
[0011] U još jednom aspektu, ovde dat model miša, npr., model miša za ispitivanje bispecifičnog proteina koji veže antigen na bazi CD3, pri čemu je protein koji vezuje antigen sposoban da veže i CD3 i antigen od interesa, mišji model koji sadrži miša genetski modifikovanog da kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina, pri čemu je humani CD3 protein CD3ε, CD3δ i CD3γ i sadrži ćeliju koja eksprimira ili sadrži ne-mišji antigen od interesa. U jednom otelotvorenju modela miša, sekvence nukleinske kiseline humanizovanog CD3 proteina nalaze se na endogenom CD3 lokusu. U jednom otelotvorenju modela miša, protein koji vezuje antigen je uveden u pomenutog miša. Miš dalje eksprimira humane vanćelijske domene CD3ε, CD3δ i CD3γ. Miš dalje eksprimira mišje CD3ε, CD3δ i CD3γ transmembranske i citoplazmatske domene.
[0012] U jednom otelotvorenju modela miša, miš sadrži ksenograft tumora koji eksprimira antigen od interesa. U jednom otelotvorenju modela miša, ćelija koja eksprimira ili sadrži antigen od interesa je tumorska ćelija. U jednom otelotvorenju modela miša, odabrani bispecifični protein koji vezuje antigen vezuje se i za humanizovani CD3 protein i za antigen od interesa. U jednom otelotvorenju modela miša, antigen od interesa je humani antigen. U jednom otelotvorenju modela miša, protein koji vezuje antigen je sposoban da vezuje CD3 protein majmuna. U jednom otelotvorenju modela miša, antigen od interesa je antigen povezan sa tumorom. U takvom otelotvorenju, antigen povezan sa tumorom može se odabrati iz grupe koja se sastoji iz ALK, BAGE proteina, BIRC5 (survivin), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR varijanta III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE proteina, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV-izveden LMP2, L1CAM, MAGE proteina, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteina, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Thompson-nouvelle antigena, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.
[0013] U još jednom otelotvorenju, antigen od interesa je antigen povezan sa zaraznom bolešću. U takvom otelotvorenju, miš može biti zaražen infektivnim sredstvom. U jednom takvom otelotvorenju, antigen povezan sa zaraznom bolešću može biti virusni antigen, a virusni antigen je izabran iz grupe koja se sastoji iz HIV, hepatitisa A, hepatitisa B, hepatitisa C, herpes virusa (npr., HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, Epštajn-Barov virus), adenovirus, virus gripa, flavivirus, echo virus, rinovirus, koksaki virus, korona virus, respiratorni sincicijski virus, virus zaušnjaka, rotavirus, virus ospica, virus rubeole, parvovirus, virus vakcinije, HTLV , virus denge, papiloma virus, virus mekušaca, poliovirus, virus besnila, JC virus, virus ebole i antigen virusa arbovirusnog encefalitisa. U još jednom takvom otelotvorenju, antigen povezan sa zaraznom bolešću može biti bakterijski antigen, a bakterijski antigen se bira iz grupe koju čine hlamidija, rikecija, mikobakterije, stafilokoki, streptokoki, pneumonokoke, meningokoke, gonokoke, klebsiela, proteus, serratia, pseudomo legionella, difterija, salmonela, bacili, kolera, tetanus, botulizam, antraks, kuga, leptospira i bakterijski antigen Lajmske bolesti.
[0014] U jednom otelotvorenju datog modela miša, protein koji vezuje antigen zasnovan na CD3 je antitelo. U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen zasnovan na CD3 je humani ili humanizovani protein koji vezuje antigen. Takav model miša može da omogući ispitivanje efikasnosti i/ili toksičnosti proteina koji vezuje antigen kod miša.
[0015] Takođe je ovde obezbeđen postupak skrininga kandidata za lek koji cilja antigen od interesa koji se sastoji od (a) uvođenja antigena od interesa u genetski modifikovanog miša koji sadrži endogeni mišji CD3 lokus genetski modifikovan da kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina, i pri čemu je humani CD3 protein CD3ε, CD35 i CD3γ, (b) kontaktiranje miša sa kandidatom za lek koji je od interesa, pri čemu je kandidat za lek usmeren protiv humanog CD3 i antigena od interesa, i (c) utvrđivanje da li lek kandidat je efikasan u sprečavanju, smanjenju ili uklanjanju ćelija koje karakteriše prisustvo ili ekspresija antigena od interesa. U postupku, genetski modifikovan miš sadrži na endogenom CD3 lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, vanćelijski domen humanog CD3δ i vanćelijski domen humanog CD3γ. U jednom otelotvorenju postupka, miš ne sadrži funkcionalni vanćelijski domen(e) odgovarajućeg mišjeg proteina. U postupku, miš sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju transmembranske i citoplazmatske domene odgovarajućih endogenih mišjih CD3 proteina. U postupku, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vanćelijski domen humanog CD3 operativno su povezane sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju transmembranski i citoplazmatski domen odgovarajućeg endogenog mišjeg CD3 proteina. U jednom primeru vanćelijski domen humanog CD3ε je izložen u SEQ ID NO:33, vanćelijskom domenu humanog CD3δ je prikazan u SEQ ID NO:34, a vanćelijski domen humanog CD3γ je prikazan u SEQ ID NO:35. Miš eksprimira humanizovani CD3ε protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO:24, humanizovani CD3δ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO:25, i humanizovani CD3γ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO:26.
[0016] U posebnom otelotvorenju ovde opisanog postupka skrininga kandidata za lekove, korak uvođenja antigena od interesa u ovde opisanog miša uključuje ekspresiju kod miša antigena od interesa. U jednom otelotvorenju, korak ekspresije antigena od interesa kod miša uključuje genetsku modifikaciju miša da eksprimira antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, korak uvođenja antigena od interesa uključuje infekciju miša antigenom od interesa. U jednom otelotvorenju postupka, korak uvođenja uključuje uvođenje ćelije u pomenuti miš koja eksprimira antigen od interesa. U različitim otelotvorenjima postupka, ćelija može biti tumorska ćelija, bakterijska ćelija ili ćelija zaražena virusom. Prema tome, u nekim otelotvorenjima postupka, miš uključuje i infekciju koja je ili virusna ili bakterijska infekcija. Dakle, antigen od interesa može biti antigen povezan sa zaraznom bolešću. U jednom otelotvorenju, antigen od interesa je virusni antigen, a virusni antigen je izabran iz grupe koju čine HIV, hepatitisa A, hepatitisa B, hepatitisa C, herpes virusa (npr., HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, Epštajn Barov virus), sincicijski virus, virus zaušnjaka, rotavirus, virus ospica, virus rubeole, parvovirus, virus vakcinije, HTLV, virus denge, papiloma virus, virus mekušaca, poliovirus, virus besnila, JC virus, virus ebole i antigen virusa arbovirusnog encefalitisa. U još jednom otelotvorenju, antigen od interesa je antigen povezan sa zaraznom bolešću, koji je bakterijski antigen odabran iz grupe koja se sastoji iz hlamidije, rikecija, mikobakterija, stafilokoka, streptokoka, pneumonokoke, meningokoke, gonokoke, klebsiela, proteus, serratia, pseudomonas legionella, difterija, salmonela, bacili, kolera, tetanus, botulizam, antraks, kuga, leptospira i bakterijski antigen Lajmske bolesti.
[0017] U još jednom otelotvorenju postupka skrininga kandidata za lek, antigen od interesa je antigen povezan sa tumorom. U jednom otelotvorenju postupka, antigen povezan sa tumorom je izabran iz grupe koju čine ALK, BAGE proteina, BIRC5 (survivin), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR varijanta III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE proteina, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV-izveden LMP2, L1CAM, MAGE proteina, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteina, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Thompson-nouvelle antigen, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.
[0018] U nekim otelotvorenjima postupka skrininga kandidata za lek, miš je imunokompetentni miš. U nekim otelotvorenjima ovde opisanog postupka, antigen od interesa je humani antigen od interesa.
[0019] U nekim otelotvorenjima postupka, kandidat za lek je antitelo. U nekim otelotvorenjima, kandidat za lek je protein koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, kandidat za lek je bispecifično antitelo ili bispecifični protein koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, bispecifični protein koji vezuje antigen je sposoban da vezuje i humani CD3 protein i antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, kandidat za lek je sposoban da prepozna majmunski CD3 protein.
[0020] U nekim otelotvorenjima postupka skrininga kandidata za lek, kandidat za lek je sposoban da smanji, eliminiše ili spreči rast tumora u poređenju sa sredstvom koje ne cilja antigen od interesa. U nekim otelotvorenjima takvog postupka, korak utvrđivanja da li je kandidat za lek efikasan u sprečavanju, smanjenju ili uklanjanju ćelija koje karakteriše prisustvo ili ekspresija antigena od interesa uključuje test zapremine tumora ili test ubijanja tumorskih ćelija posredovanih T ćelijama.
[0021] U drugim otelotvorenjima, kandidat za lek je sposoban da smanji, eliminiše ili spreči bakterijsku ili virusnu infekciju u poređenju sa sredstvom koje ne cilja antigen od interesa. U nekim takvim otelotvorenjima, korak utvrđivanja da li je kandidat za lek efikasan u sprečavanju, smanjenju ili uklanjanju ćelija koje karakteriše prisustvo ili ekspresija antigena od interesa uključuje merenje virusnih ili bakterijskih titra.
Obelodanjivanje
[0022] Ovde je dat model miša za ispitivanje bezbednosti, efikasnosti i farmakokinetike kombinovanih terapija lekovima, gde kombinovana terapija uključuje lek, npr., protein koji vezuje antigen, koji vezuje molekul humanog CD3. Takve kombinovane terapije imaju za cilj ciljanje specifičnih tumora, infekcija ili drugih ovde opisanih bolesti koje mogu imati koristi od regrutovanja i/ili aktivacije T ćelija.
KRATAK OPIS SLIKA
[0023]
Sl. 1 prikazuje strukturu kompleksa receptora za T ćelije. Kompleks sadrži dve CD3ε podjedinice, jednu CD3δ podjedinicu, jednu CD3γ podjedinicu i dve CD3ζ podjedinice, složene sa TCRαβ heterodimerom na površini T ćelije. Zvezdice označavaju lokacije ITAM motiva.
SL. 2A i B su šematski prikaz (ne u razmeri) humanizovanog vektora za ciljanje CD3γδε. Sl. 2A prikazuje veliki ciljni vektor pre brisanja selekcione kasete (Neo), sa naznačenim mestima za zakucavanje sekvence CD3E, CD3D i CD3G. A, B, C, D, E, F, i G ukazuju na lokaciju spojnih sekvenci nukleinskih kiselina predstavljenih u Tabeli 1. Sl. 2B prikazuje veliki ciljni vektor nakon brisanja selekcione kasete (Neo); slično kao na SL.2A, naznačene su lokacije humanih CD3E, CD3D i CD3G. A, B, C, D, E, F, i G su lokacije spojnih sekvenci nukleinskih kiselina predstavljenih u Tabelama 1 i 3.
Sl. 3 prikazuje sekvence aminokiselina humanizovanih CD3 proteina u humanizovanim CD3γδε miševima. Podvučene su sekvence proteina CD3 humanog porekla.
Sl. 4 prikazuje poravnanje između sekvenci CD3e, CD3d i CD3g miša i čoveka.5' i 3' krajevi humanih sekvenci koje su uvedene u mišje CD3 lokuse označeni su sa *, odnosno **, respektivno.
Sl. 5A, gornji red, je analiza FACs analize koja pokazuje normalnu distribuciju CD4+ i CD8+ timocita u divljem tipu (WT), heterozigotnim humanizovanim CD3yδε (HET) ili homozigotnim humanizovanim CD3γδε (HO) miševima. Slika 5B, gornji red, su podaci koji prikazuju procente kao i broj B i T ćelija u perifernoj krvi naznačenih životinja. Sl. 5B, donji red su podaci koji prikazuju procenat T i B ćelija u slezini naznačenih životinja. Sl.5C pokazuje Vβ repertoarnu poliklonalnost u CD4+ i CD8+ T ćelijama dobijenim od slezine humanizovanih CD3γδε miševa.
SL. 6A-B su demonstracija virusnih LCMV titra u slezinama bilo divljeg kontrolnog miša ili humanizovanih CD3γδε miševa kod miševa zaraženih LCMV Klon 13 (SL. 6A), ili LCMV klon 13 nakon prethodne infekcije LCMV Armstrong klonom (SL.6B).
Sl. 7 su podaci iz FACS analize splenocita divljeg tipa (WT), heterozigotnih humanizovanih CD3γδε (hCD3yδε Het) ili homozigotnih humanizovanih CD3γδε (hCD3γδεHo) miševa sortiranih sa dva antihumana CD3 antitela koja takođe unakrsno reaguju sa CD3 majmuna ah/mfCD3-2 i ah/mfCD3-1), dva anti-humana CD3 antitela koja su specifična za humani CD3 (ahCD3-1 i ahCD3-2), kontrolišu CD3 protiv miša (amCD3-2C11), nepovezani kontrolni humani IgG (kontrola hIgG) i samo sekundarna kontrola antitela (samo 2.). Vrednosti MFI navedene su u tabelama ispod svakog grafikona.
Sl. 8 pokazuje odgovor na anti-CD3 antitela kod humanizovanih CD3γδε miševa. Sl. 8A pokazuje prolazno iscrpljivanje T i B ćelija u krvi miševa lečenih anti-CD3 antitelima; ili iscrpljivanje T ćelija 1. dana za svako naznačeno antitelo (leva slika), ili iscrpljivanje T i B ćelija i oporavak tokom 14 dana za svako testirano antitelo (srednja i desna slika). Sl. 8B prikazuje porast koncentracije oslobođenih citokina (IFNγ, KC, TNFα, IL-6 i IL-10) 2 sata nakon tretmana sa naznačenim antitelima.
Sl. 9 prikazuje proliferaciju splenocita (mereno kao aktivacija u više navrata preko ćelija) nakon tretmana sa sve većim količinama naznačenih antitela kod divljeg tipa (WT) i humanizovanih CD3γδε homozigotnih (hCD3γδε Ho) miševa.
Sl. 10 je tabela koja sumira različita svojstva humanizovanog CD3 modela miša.
Sl. 11A pokazuje efekat anti-CD3 antitela (Ab-1; bispecifično antitelo koje prepoznaje CD3 i CD20, testirano u dve različite koncentracije) na zapreminu tumora B16F10.9/CD20 kada se lečenje započinje istovremeno sa implantacijom tumora (profilaktički model). Sl.11B pokazuje efekat anti-CD3 antitela (Ab-1; bispecifično antitelo koje prepoznaje CD3 i CD20, testirano u dve različite koncentracije) na zapremini tumora već uspostavljenih tumora B16F10.9/CD20 (terapijski model).
DETALJNI OPIS
Definicije
[0024] Predmetni pronalazak obezbeđuje genetski modifikovane miševe prema patentnom zahtevu 1. Ovde su obelodanjeni genetski modifikovani miševi koji sadrže u svom genomu, npr., u njihovoj germinacijskoj liniji, genetski modifikovani CD3 lokusi koji kodiraju humanizovane CD3 proteine, npr., himerni humani/mišji CD3 proteini. Takođe su obelodanjeni embrioni, ćelije i tkiva koja se sastoje od istog, postupci pravljenja istih, kao i postupci njihovog korišćenja. Ukoliko nije drugačije definisano, svi termini i fraze korišćeni ovde uključuju značenja koja su termini i fraze stekli u struci, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se termin ili fraza koristi.
[0025] "CD3", kako se ovde koristi, uključuje antigen koji se eksprimira na T ćelijama kao deo kompleksa multi molekularnih receptora T ćelija (TCR); multi molekularni TCR kompleks nastao od udruživanja homodimera i/ili heterodimera koji se sastoje od jednog ili više sledećih lanaca receptora: CD3-epsilon (ε), CD3-delta (δ), CD3-zeta (ζ) i CD3-gama (γ) (videti SL. 1). Sekvence i pristupni brojevi GenBank-a CD3-delta, CD3-zeta i CD3-gama čoveka i miša predstavljeni su u Tabeli 4 ispod. Kroz aplikaciju, ε ili epsilon se takođe mogu pisati kao E, δ ili delta se takođe mogu pisati kao D, ζ ili zeta se takođe mogu pisati kao Z, a γ ili gama se takođe mogu pisati kao G.
[0026] Kako se ovde koristi, "antitelo koje vezuje CD3" ili "anti-CD3 antitelo" uključuje antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji specifično prepoznaju jednu CD3 podjedinicu (npr., epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično prepoznaju dimerni kompleks dve CD3 podjedinice (npr., gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimeri). Antitela i fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu da vezuju rastvorljivi CD3 i/ili CD3 eksprimirani na površini ćelije. Rastvorljivi CD3 uključuje prirodne CD3 proteine, kao i varijante rekombinantnih CD3 proteina, kao što su, na primer, monomerni i dimerni CD3 konstrukti, kojima nedostaje transmembranski domen ili su na neki drugi način nepovezani sa ćelijskom membranom.
[0027] Termin "konzervativni", kada se koristi za opis konzervativne supstitucije aminokiselina, uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., punjenje ili hidrofobnost). Konzervativne zamene aminokiselina mogu se postići modifikovanjem nukleotidne sekvence tako da se uvede nukleotidna promena koja će kodirati konzervativnu supstituciju. Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalna svojstva koja su od značaja za protein, na primer, sposobnost CD3 proteina da igraju ulogu u sastavljanju i signalizaciji receptora T ćelija. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju alifatske bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatično-hidroksilni bočni lanci kao što su serin i treonin; bočni lanci koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatični bočni lanci kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovni bočni lanci kao što su lizin, arginin i histidin; kiseli bočni lanci kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočni lanci koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izolevcin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim otelotvorenjima, konzervativna supstitucija aminokiselina može biti supstitucija bilo kog izvornog ostatka u proteinu alaninom, kao što se koristi u, na primer, mutagenezi skeniranja alanina. U nekim otelotvorenjima je napravljena konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici log-nalik verovatnoće obelodanjene u Gonnet i dr. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim otelotvorenjima, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima ne negativnu vrednost u PAM250 matrici verovatnoće log.
[0028] Stoga je pronalaskom obuhvaćen genetski modifikovani miš koji eksprimira humanizovani CD3 protein(e) koji sadrži konzervativne supstitucije aminokiselina u ovde opisanoj aminokiselinskoj sekvenci.
[0029] Stručnjak u ovoj oblasti bi razumeo da pored ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju ovde opisane humanizovane CD3 proteine, zbog degeneracije genetskog koda, druge nukleinske kiseline mogu kodirati polipeptide pronalaska. Prema tome, pored genetski modifikovanog miša koji sadrži u svojim genomskim nukleotidnim sekvencama koje kodiraju ovde opisane humanizovane CD3 proteine miša, obezbeđen je i miš koji sadrži u svojim genomskim nukleotidnim sekvencama koje se razlikuju od ovde opisanih zbog degeneracije genetskog koda.
[0030] Termin "identitet" kada se koristi u vezi sa sekvencom uključuje identitet utvrđen brojem različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotidnih i/ili aminokiselinskih sekvenci. U nekim ovde prikazanim otelotvorenjima, identiteti se određuju pomoću poravnanja ClustalW v.
1,83 (sporo) primenom kazne za otvoreni jaz od 10,0, kazne za produženi jaz od 0,1 i upotrebom matrice sličnosti Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identitetom sekvenci zavisiće od određenih sekvenci. U različitim otelotvorenjima, identitet se određuje upoređivanjem sekvence zrelog proteina od njegovog N-završetka do njegovog C-završetka. U različitim otelotvorenjima, kada se upoređuje humanizovana sekvenca sa humanom sekvencom, humani deo humanizovane sekvence (ali ne i ne-humani deo) koristi se u poređenju u svrhu utvrđivanja nivoa identiteta između humane sekvence i humanizovane sekvence.
[0031] Termin "operativno povezan" uključuje suprotstavljanje u kome su tako opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kao takva, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može biti operativno povezana sa regulatornim sekvencama (npr., promoter, pojačivač, prigušivač sekvence, itd.) tako da zadrži odgovarajuću regulaciju transkripcije. Pored toga, različiti delovi humanizovanog proteina pronalaska mogu biti operativno povezani kako bi se zadržalo pravilno presavijanje, obrada, ciljanje, ekspresija i druga funkcionalna svojstva proteina u ćeliji. Ukoliko nije drugačije naznačeno, različiti domeni humanizovanog proteina pronalaska operativno su povezani jedni sa drugima. Operativna veza humanog vanćelijskog domena CD3 proteina i ne-humanih transmembranskih i citoplazmatskih domena može se postići ekspresijom ovih komponenata kao susednog fuzionog proteina iz kodirajuće sekvence nukleinske kiseline.
[0032] Termin "zamena" u odnosu na zamenu gena uključuje postavljanje egzogenog genetskog materijala na endogeni genetski lokus, čime se zamenjuje ceo ili deo endogenog gena ortološkom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. U jednom slučaju, endogeni ne-humani gen ili njegov fragment se zamenjuje odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Na primer, DNK koja kodira vanćelijski domen miša ili drugi ne-humani CD3 protein može se zameniti sa DNK koja kodira vanćelijski domen odgovarajućeg humanog proteina A odgovarajućeg humanog gena ili njegovog fragmenta koji je humani gen ili fragment koji je ortolog, homolog, ili je u suštini identičan ili isti po strukturi i/ili funkciji, kao endogeni ne-humani gen ili njegov fragment koji je zamenjen. Kao što je prikazano u primerima ispod, nukleotidne sekvence koje kodiraju endogene ne-humane CD3 vanćelijske domene zamenjene su nukleotidnim sekvencama koje odgovaraju humanim CD3 vanćelijskim domenima.
[0033] "Funkcionalni", kako se ovde koristi, na primer, u odnosu na funkcionalni protein, uključuje protein koji zadržava najmanje jednu biološku aktivnost koja je normalno povezana sa izvornim proteinom. Na primer, u nekim otelotvorenjima pronalaska, zamena na endogenom lokusu (npr., zamena na endogenim ne-humanim CD3 lokusima) rezultira lokusom koji ne eksprimira funkcionalni endogeni protein.
[0034] Termin "lokus" kao u CD3 lokusu uključuje genomsku DNK koja sadrži CD3 kodirajući region. Različiti CD3 geni CD3ε, CD3δ, CD3γ mapiraju se međusobno blizu istog hromozoma. Prema tome, u zavisnosti od konteksta, upućivanje na endogeni CD3 lokus može se odnositi na lokus koji uključuje neke ili sve ove kodirajuće regione ili pojedinačni kodirajući region. Na primer, ako se samo jedan od humanih CD3, kao što je CD3ε, uvede u životinju koja nije čovek, tada nukleinska kiselina koja kodira taj CD3 poželjno modifikuje lokus odgovarajućeg ne-humanog CD3. Ako se nekoliko humanihCD3 uvede u životinju koja nije čovek, kao što su CD3ε, CD3δ, CD3γ, tada modifikovani endogeni lokus uključuje kodirajuće regione svakog od CD3ε, CD3δ i CD3γ. Lokus CD3 takođe se može odnositi na lokus CD3ζ, koji zauzima hromozom različit od CD3ε, CD3δ i CD3γ. Ako se humani CD3ζ uvede zajedno sa bilo kojim od humanih CD3ε, CD3δ ili CD3γ tada se dva ili više CD3 lokusa mogu modifikovati na različitim hromozomima. U CD3 lokus mogu se uključiti i druge sekvence koje su uvedene u svrhu genetske manipulacije, npr., selekcione kasete, mesta restrikcije itd.
[0035] Termin "germinacijska linija" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline imunoglobulina uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja se može preneti na potomstvo.
[0036] Termin „molekul imunoglobulina“ uključuje dva teška lanca imunoglobulina i dva lagana lanca imunoglobulina. Teški lanci mogu biti identični ili različiti, a laki lanci mogu biti identični ili različiti.
[0037] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, uključuje molekule imunoglobulina koji se sastoje iz četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži promenljivi domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni region lakog lanca (CL). Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji determinišu komplementarnost (CDR), prošarani regionima koji su konzervativniji, nazvanim regionima okvira čitanja (FR). Svaki varijabilni domen teškog i lakog lanca sadrži tri CDR i četiri FR, poređane od amino-završetka do karboksi-završetka u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR teškog lanca mogu biti skraćeni kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; CDR lakog lanca mogu biti skraćeni kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3).
[0038] Termin "antitelo sa visokim afinitetom" odnosi se na antitelo koje ima KDu odnosu na ciljni epitop oko 10<-9>M ili niži (npr., oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M).
[0039] Termin "bispecifično antitelo" uključuje antitelo sposobno da selektivno vezuje dva epitopa. Bispecifična antitela obično sadrže dva kraka, od kojih svaki vezuje različiti epitop (npr., dva teška lanca sa različitim specifičnostima), bilo na dva različita molekula (npr., različiti epitopi na dva različita imunogena) ili na isti molekul (npr., različiti epitopi na isti imunogen). Ako je bispecifično antitelo sposobno da selektivno vezuje dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet prvog kraka antitela za prvi epitop će obično biti najmanje jedan do dva ili tri ili četiri ili više redova veličine niži od afiniteta prvog kraka antitela za drugi epitop i obrnuto. Epitopi specifično vezani za bispecifično antitelo mogu biti na istoj ili različitoj meta (npr., na istom ili drugom proteinu). Primeri bispecifičnih antitela uključuju ona sa prvim krakom antitela specifičnim za tumorski antigen i drugim krakom antitela specifičnim za citotoksični marker, npr., Fc receptor (npr., FcγRI, FcγRII, FcyRIII, itd.) Ili marker T ćelija (npr., CD3, CD28, itd.). U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, jedan krak bispecifičnog antitela je specifičan za CD3. Dalje, bispecifično antitelo sa prvim krakom specifičnim za tumorski antigen i drugim krakom specifičnim za toksin može se upariti tako da isporuči toksin (npr., saporin, vinka alkaloid, itd.) u ćeliju tumora. Druga primerna bispecifična antitela uključuju ona sa prvim krakom specifičnim za aktivirajući receptor (npr., receptor B ćelija, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRI, T ćelijski receptor, itd.) i drugim krakom specifičnim za inhibitorni receptor (npr., FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a itd.). Takva bispecifična antitela mogu se konstruisati za terapijske uslove povezane sa aktivacijom ćelija (npr., alergija i astma). Bispecifična antitela se mogu stvoriti, na primer, kombinovanjem teških lanaca koji prepoznaju različite epitope istog imunogena. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne sekvence teškog lanca koje prepoznaju različite epitope istog imunogena mogu se spojiti sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju iste ili različite konstantne regione teškog lanca, a takve sekvence mogu se izraziti u ćeliji koja izražava svetlo imunoglobulina lanac. Tipično bispecifično antitelo ima dva teška lanca, od kojih svaki ima po tri CDR teškog lanca, zatim (N-završetka do C-završetka) CH1 domen, šarka, CH2 domen i CH3 domen, i laki lanac imunoglobulina koji ili ima ne daju specifičnost za vezivanje epitopa, ali se mogu povezati sa svakim teškim lancem ili se mogu povezati sa svakim teškim lancem i koji mogu povezati jedan ili više epitopa vezanih za regione za vezivanje epitopa teškog lanca ili koji se mogu povezati sa svakim teškim lanca i omogućavaju vezivanje jednog ili oba teška lanca za jedan ili oba epitopa. Slično tome, fraza „multispecifično antitelo“ uključuje antitelo sposobno da selektivno vezuje više epitopa (npr., dva, tri, četiri epitopa).
[0040] Termin „region koji determiniše komplementarnost“ ili termin „CDR“ uključuje aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom nukleinske kiseline u genima imunoglobulina u organizmu koji se normalno (tj., kod divljeg tipa životinje) pojavljuje između dva regiona okvira čitanja u varijabilni region lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina. CDR može biti kodiran, na primer, sekcijom germinacijske linije ili preuređenom ili neuređenom sekvencom, i, na primer, naivnom ili zrelom B ćelijom. CDR može biti somatski mutiran (npr., varira od sekvence kodirane u životinjskoj liniji soja), humanizovan i/ili modifikovan supstitucijama aminokiselina, dodavanjima ili delecijama. U nekim okolnostima (npr., za CDR3), CDR mogu biti kodirani sa dve ili više sekvenci (npr., germinacijskoj sekvenci) koje nisu susedne (npr., u neuređenoj sekvenci nukleinske kiseline), ali su susedne u sekvenci nukleinske kiseline B ćelije, npr., kao rezultat spajanja ili povezivanja sekvenci (npr., VDJ rekombinacija da bi se formirao CDR3 teškog lanca).
[0041] Termin „funkcionalni fragment“ uključuje fragmente proteina koji vezuju antigen, kao što su antitela koja se mogu ekspresovati, izlučiti i posebno vezati za epitop sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu. Specifično prepoznavanje uključuje posedovanje KDkoji je najmanje u mikromolarnom opsegu, nanomolarnom opsegu ili pikomolarnom opsegu.
[0042] Termin „teški lanac“ ili „teški lanac imunoglobulina“ uključuje sekvencu teškog lanca imunoglobulina, uključujući sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, iz bilo kog organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri CDR teškog lanca i četiri FR regiona, ukoliko nije drugačije naznačeno. Fragmenti teških lanaca uključuju CDR, CDR i FR i njihove kombinacije. Tipični teški lanac ima, sledeći varijabilni domen (od N-završetka do C-završetka), CH1 domen, šarku, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment koji je sposoban da specifično prepozna epitop (npr., prepozna epitop sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban za ekspresiju i sekreciju iz ćelije, i koji sadrži najmanje jedan CDR. Varijabilni domen teškog lanca kodiran je sekvencom gena promenljive regije, koja generalno sadrži VH, DHi JHsegmente izvedene iz repertoara VH, DHi JHsegmenata prisutnih u germinacijskoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za segmente teškog lanca V, D i J za različite organizme mogu se naći na veb lokaciji za Međunarodni imunogenetski informacioni sistem (baza podataka IMGT).
[0043] Termin „laki lanac“ uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, a ukoliko nije drugačije naznačeno, uključuju se humani kappa i lambda laki lanci i VpreB, kao i surogatni laki lanci. Varijabilni domeni lakog lanca obično uključuju tri CDR lakog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, osim ako nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino završetka do karboksilnog završetka, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i konstantni region lakog lanca. Varijabilni domen lakog lanca kodiran je sekvencom gena varijabilnog regiona lakog lanca, koji generalno sadrži VLi JLsegmente, izvedene iz repertoara V i J segmenata prisutnih u germinacijskoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za segmente lakog lanca V i J za različite organizme mogu se naći na veb lokaciji za Međunarodni imunogenetski informacioni sistem (baza podataka IMGT). Laki lanci uključuju one, na primer, koji ne selektivno vezuju nijedan epitop prepoznat od proteina koji vezuje antigen (npr., antitelo) u kojem se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji se vezuju i prepoznaju ili pomažu teškom lancu u vezivanju i prepoznavanju jednog ili više epitopa selektivno vezanih za protein koji vezuje antigen (npr., antitelo) u kojem se pojavljuju.
[0044] Termin "protein koji vezuje antigen", kako se ovde koristi, uključuje antitela i razne prirodno proizvedene i konstruisane molekule koji mogu da vezuje antigen od interesa. Takva uključuju, na primer, antitela specifična za domen, antitela za pojedinačne domene (npr., dobijena od kamelija i riba, itd.), antitela za uklanjanje domena, himerna antitela, CDR-kalemljena antitela, antitela, triatela, tetratela, minitela, nanotela, monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP), varijabilni IgNAR domeni ajkule itd. Protein koji vezuje antigen može takođe da sadrži fragmente koji vežu antigen, kao što su, npr., (i) Fab fragmenti; (ii) F(ab')2 fragmenti; (iii) Fd fragmenti; (iv) Fv fragmenti; (v) jednolančani Fv (scFv) molekuli; (vi) dAb fragmenti; i (vii) jedinice za minimalno prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR), kao što je CDR3 peptid), itd.
[0045] Termin "ćelija" uključuje bilo koju ćeliju koja je pogodna za ekspresiju sekvence rekombinantne nukleinske kiseline. Ćelije uključuju stanice prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr., sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., Itd.), ćelije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, ćelije insekata zaražene bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), ne-humane životinjske ćelije, humane ćelije ili ćelijske fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, gorile, hrčka, pacova ili miša. U nekim otelotvorenjima, ćelija je eukariotska i izabrana je iz sledećih ćelija: CHO (npr., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr., COS-7), ćelije mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalne), CV-1, U937, 3T3, L ćelije, C127 ćelije, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertolijeve ćelije, BRL 3A ćelije, HT1080 ćelije, ćelije mijeloma, ćelije tumora, i ćelijske linije izvedena iz iznad pomenute ćelije. U nekim otelotvorenjima, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćelija mrežnjače koja eksprimira virusni gen (npr., PER.C6™ ćelija). U nekim otelotvorenjima, ćelija je ES ćelija.
[0046] Humanizovani CD3 protein znači CD3 protein u kome je, u jednom otelotvorenju, vanćelijski domen humane sekvence. Transmembranski i citoplazmatski domeni takođe mogu biti humani, ali poželjno su nehumane endogene sekvence. CD3 protein, uključujući sekvence različitih vrsta, naročito humani vanćelijski domen, i ne-humani transmembranski i citoplazmatski domen, takođe se mogu označiti kao himerni CD3 protein.
Genetički modifikovane humanizovane CD3 životinje
[0047] Ovde su obelodanjene genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodari, npr., miševi ili pacovi) koji u svom genomu (npr., u genomu germinacijske linije) sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani CD3 protein (npr., humanizovani CD3ε, CD3γ, CD3δ ili njihova kombinacija). Predmetni pronalazak obezbeđuje genetski modifikovane miševe koji u svom genomu sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju humanizovane CD3δ, humanizovane CD3γ i humanizovane CD3ε proteine. Stoga, u nekim otelotvorenjima pronalaska, miš izražava humanizovani CD3γδε kompleks na površini svojih T ćelija tako da humanizovani CDCD3γδε formira kompleks sa receptorima T ćelija eksprimiranim na istoj T ćeliji.
[0048] Molekul CD3 je obično meta sredstava koji imaju za cilj modulaciju imuniteta T ćelija, a u tu svrhu je razvijeno nekoliko antitela na CD3 (npr., muromonab-CD3 ili OKT3). Anti-CD3 antitela kao što je OKT3 koriste se kao imunosupresivna sredstva (npr., kod odbacivanja transplantata), ali se takođe proučavaju i njihov
1
terapeutski potencijal kod autoimunih bolesti (npr., Kronova bolest, dijabetes tipa I, ulcerozni kolitis, itd.).
[0049] Pored toga, molekuli CD3 se takođe proučavaju kao ciljevi za bispecifična sredstva, npr., bispecifična antitela, zbog sposobnosti anti-CD3 bispecifičnih antitela da regrutuju T ćelije do ciljne ćelije, npr., ćelije koja izražava određeni antigen od interesa. Primeri anti-CD3 bispecifičnih antitela su opisani u objavi patentne prijave SAD br.2014/0088295, i SAD. objavi patentne prijave SAD br.2015/0266966.
[0050] Tokom pretkliničke faze razvoja lekova, kandidati za lekove se obično proučavaju na osnovu njihove efikasnosti, toksičnosti i drugih farmakokinetičkih i farmakodinamičkih svojstava. Kandidati sredstava, kao što su antitela, obično ciljaju humani antigen - jer je krajnji cilj istrage razvijanje humane terapije. Mnoga predklinička ispitivanja sprovode se na velikim životinjama kao što su primati, jer su njihova fiziologija i metabolizam lekova najsličniji ljudima. Poznato je da nekoliko antitela razvijenih na CD3 (npr., OKT3) ne reaguje unakrsno na ne-humani CD3, posebno na CD3 primata. Da bi se sprovele efikasne pretkliničke istrage koje se odnose na efikasnost, toksičnost i druge parametre kandidata za lek, prvo se mora utvrditi da kandidat za lek prepoznaje molekul CD3 primata.
[0051] Međutim, zaseban faktor koji otežava razvoj anti-CD3 terapije je taj što su ugroženi veliki primati, kao što su šimpanze, a u mnogim zemljama su ispitivanja na šimpanzama zabranjena; dok ispitivanja na drugim primatima, npr., majmunima cinomolgus (Macaca fascicularis), mogu izazvati etičku zabrinutost. Na primer, iz svih iznad navedenih razloga, do danas ne postoji efikasan model ljudskih tumora kod primata. Prema tome, bilo koji preliminarni podaci o određenom terapijskom kandidatu koji se mogu dobiti na manjem životinjskom modelu, poput glodara, npr., miša, mogu biti korisni u određivanju daljeg napretka predkliničkih ispitivanja kod velikih primata.
[0052] Predklinička ispitivanja na modelima malih životinja, kao što su miševi, tradicionalno su se izvodila pomoću surogata lekova. Na primer, kada je klinički kandidat koji cilja specifični humani antigen u razvoju, neki predklinički podaci se generišu kod miša koristeći molekul, na primer, protein koji vezuje antigen ili antitelo, koje posebno cilja mišji homolog antigena od interesa. Informacije o efikasnosti, raznim režimima doziranja, toksičnosti i neželjenim efektima i drugim aspektima davanja lekova prikupljaju se iz takvih surogat ispitivanja. Međutim, takvi nalazi su ograničeni jer se ne proučava stvarni lek koji je u fazi razvoja ili njegova ljudska meta.
[0053] Dakle, najkorisniji model malih životinja za provođenje preliminarnih predkliničkih ispitivanja je životinja koja nije čovek, npr., glodar, koji eksprimira humani ili humanizovani CD3 protein i omogućava ispitivanje kandidata za anti-CD3 koji takođe unakrsno reaguju sa CD3 cinomolgus majmuna, omogućavajući naredna predklinička ispitivanja na primatima. Predmetni pronalazak pruža tako složen model miša.
[0054] Prema tome, ovde je data genetski modifikovana ne-humana životinja koja u svom genomu sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vanćelijski domen humanog CD3 proteina. U nekim primerima, CD3 protein je izabran iz grupe koja se sastoji iz CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, i primera, i njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, CD3 protein je izabran iz grupe koja se sastoji iz CD3γ, CD3δ, CD3ε i njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, CD3 protein sadrži polipeptidne lance CD3γ, CD3δ i CD3ε. Dakle, genetski modifikovani miš sadrži u svom genomu sekvencu(e) nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen čoveka CD3γ, vanćelijski domen humanog CD3δ i vanćelijski domen humanog CD3ε. U nekim takvim otelotvorenjima, vanćelijski domeni humanog CD3γ, CD3δ i CD3ε mogu biti kodirani jednom nukleinskom kiselinom. U nekim otelotvorenjima, vanćelijski domeni humanog CD3γ, CD3δ i CD3ε su kodirani odvojenim nukleinskim kiselinama.
[0055] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani miš zadržava endogene ne-humane CD3 promotere i/ili regulatorne elemente (npr., endogeni ne-humani CD3γ, CD3δ i/ili CD3ε promotere i/ili regulatorne mišje elemente). U drugim otelotvorenjima, miš sadrži humane CD3 promotere i regulatorne elemente.
[0056] Iako se pretpostavljalo da većina antitela generisanih protiv CD3 prepoznaje CD3ε epitope (videti, Tunnacliffe i dr. (1989) International Immunology, 1(5):546-50), postoji čitav niz sredstava koja mogu prepoznati druge CD3 podjedinice (npr., CD3γ ili CD3δ) ili zahtevati sastavljanje CD3 kompleksa za vezivanje. Dakle, genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vanćelijski domen čoveka CD3γ, vanćelijski domen humanog CD3δ i vanćelijski domen humanog CD3ε, pruža prednost jer može primiti sredstvo koje bi povezalo bilo koju CD3 podjedinicu ili CD3 kompleks.
[0057] Primeri CD3 proteina su predstavljeni u poravnanju na SL.4. Proteinska sekvenca miša CD3ε može se naći u GenBank pristupnom broju NP_031674 i SEQ ID NO:27, dok se proteinska sekvenca humanog CD3ε može naći u GenBank pristupnom broju NP_000724 i SEQ ID NO:28. Proteinska sekvenca miša CD3δ može se naći u GenBank pristupnom broju NP_038515 i SEQ ID NO:29, dok se proteinska sekvenca humanog CD3δ može naći u GenBank pristupnom broju NP_000723 i SEQ ID NO:30. Proteinska sekvenca miša CD3γ može se naći u GenBank pristupnom broju NP_033980 i SEQ ID NO:31, dok se proteinska sekvenca humanog CD3γ može naći u GenBank pristupnom broju NP_000064 i SEQ ID NO:32.
[0058] U ovom pronalasku, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vanćelijski domen humanog CD3, na primer, vanćelijski domen humanog CD3γ, humani CD3δ i humani CD3ε, nalaze se na endogenom mišjem CD3 lokusu. Drugim rečima, takva nukleinska kiselina modifikuje endogeni CD3 lokus da kodira humani CD3 polipeptid. U nekim otelotvorenjima pronalaska, miš ne sadrži funkcionalni vanćelijski domen odgovarajućeg mišjeg CD3 proteina zbog genetske modifikacije endogenog lokusa, tako da funkcionalni vanćelijski domen nije eksprimiran. U nekim otelotvorenjima pronalaska, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju vanćelijski domen humanog CD3 zamenjuju odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju endogeni CD3 miša. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3γ zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen endogenog mišjeg CD3γ, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3δ zamenjuje kodiranje nukleinske kiseline vanćelijski domen endogenog mišjeg CD3δ, a sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen endogenog mišjeg CD3ε. U nekim otelotvorenjima, zamena ne uključuje zamenu sekvence nukleinske kiseline koja kodira endogenu signalnu sekvencu. U još jednom otelotvorenju, zamena uključuje zamenu sekvence nukleinske kiseline koja kodira endogeni signalni niz sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira sekvencu humanih signala.
[0059] U nekim aspektima pronalaska, vanćelijski domen obuhvata region proteina koji nije transmembranski ili citoplazmatski domen, npr., region proteina koji se pojavljuje na površini ćelije i koji delimično kada su sastavljeni u kompleks, komunicira sa vanćelijskim domenima drugih komponenti TCR signalnog kompleksa, npr., TCR alfa i beta vanćelijskih domena. U raznim otelotvorenjima koja su ovde opisane, vanćelijski domen se odnosi na domen proteina eksprimiranog na površini ćelije i, ukoliko nije drugačije naznačeno, ne uključuje signalnu sekvencu koja je tipično proteolitički odsečena pre prodaje površinske ekspresije. U nekim otelotvorenjima pronalaska, vanćelijski domen CD3ε sadrži aminokiseline 17-130 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:24 (izložene odvojeno kao SEQ ID NO:33). U nekim takvim otelotvorenjima, životinja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira endogenu CD3ε signalnu sekvencu, npr., signalnu sekvencu na aminokiselinama 1-16 SEQ ID NO:24. U drugim otelotvorenjima pronalaska, životinja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu CD3ε signalnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima pronalaska, vanćelijski domen CD3δ sadrži aminokiseline 19-105 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:25 (izložene odvojeno kao SEQ ID NO:34). U nekim takvim otelotvorenjima, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira endogenu CD3δ signalnu sekvencu, npr., signalnu sekvencu na aminokiselinama 1-18 SEQ ID NO:25. U drugim otelotvorenjima pronalaska, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu CD3δ signalnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima, vanćelijski domen CD3γ sadrži aminokiseline 20-116 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:26 (izložene mišje odvojeno kao SEQ ID NO:35). U nekim takvim otelotvorenjima, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira endogenu CD3γ signalnu sekvencu, npr., signalnu sekvencu na aminokiselinama 1-19 SEQ ID NO:26. U drugim otelotvorenjima pronalaska miša, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu CD3γ signalnu sekvencu.
[0060] U nekim aspektima pronalaska, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen endogenog CD3 proteina, na primer, odgovarajući endogeni CD3 protein. Prema tome, u jednom otelotvorenju miša, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene miša odgovarajućeg endogenog CD3 proteina miša, tako da himerni protein koji sadrži vanćelijski domen humanog CD3 proteina i transmembranski i citoplazmatski domeni odgovarajućeg endogenog mišjeg CD3 proteina je eksprimiran. Dakle, u jednom aspektu, životinja sadrži na endogenom CD3 lokusu sekvencu(e) nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina operativno povezan sa sekvencom (nukleinskim kiselinama) koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen endogenog mišjeg CD3. U jednom otelotvorenju, miš sadrži na endogenom CD3ε lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene endogenog miša na endogenom CD3δ lokusu nukleinske kiseline sekvenca koja kodira vanćelijski domen humanog CD3δ operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira transmembranske i citoplazmatske domene endogenog CD3δ miša, a na endogenom CD3γ lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3γ operativno povezana sa nukleinskom kiselinska sekvenca koja kodira transmembranski i citoplazmatski domen endogenog mišjeg CD3γ. Upotreba himernih CD3 proteina sa humanim vanćelijskim domenom i endogenim transmembranskim i citoplazmatskim domenima omogućava interakciju lekova specifičnih za humani CD3, ali takođe može omogućiti rekapitulaciju interakcije sa endogenim receptorima T-ćelija i njegovim komponentama za transdukciju signala u poređenju sa potpuno humani protein CD3.
[0061] Miš eksprimira vanćelijske domene humanog proteina CD3. U nekim primerima, miš eksprimira vanćelijski domen humanog CD3ε naveden u SEQ ID NO:33. U nekim primerima, miš eksprimira vanćelijski domen humanog CD3δ naveden u SEQ ID NO:34. U nekim primerima, miš eksprimira vanćelijski domen humanog CD3γ naveden u SEQ ID NO:35.
[0062] Životinja koja nije čovek je miš.
[0063] U jednom otelotvorenju, miš je soja C57BL odabranog iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U još jednom otelotvorenju, miš je 129. soja, odabranim iz grupe koja se sastoji iz soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti npr., Festing i dr. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, videti takođe, Auerbach i dr (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- i C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U specifičnom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je mešavina iznad pomenutog soja 129 i iznad pomenutog soja C57BL/6. U još jednom specifičnom otelotvorenju, miš je mešavina iznad pomenutih 129 sojeva ili mešavina iznad pomenutih sojeva BL/6. U specifičnom otelotvorenju, soj 129 smeše je soj 129S6 (129/SvEvTac). U još jednom otelotvorenju, miš je soj BALB, na primer, soj BALB/c. U još jednom otelotvorenju, miš je mešavina soja BALB i drugog iznad pomenutog soja.
[0064] Životinja koja nije čovek je miš. Prema tome, u jednom otelotvorenju, genetski modifikovana životinja je miš, a miš sadrži endogeni mišji CD3 lokus nukleotidnu sekvencu koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina. Miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3δ i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3γ. U nekim primerima, vanćelijski domen humanog CD3ε sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:33, vanćelijski domen humanog CD3δ sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO:34, a vanćelijski domen humani CD3γ sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:35. U nekim otelotvorenjima, miš sadrži sekvence koje kodiraju endogenu mišju CD3 signalnu sekvencu(e). U nekim otelotvorenjima, miš sadrži sekvence koje kodiraju humane sekvence CD3 signala.
[0065] Miš iz pronalaska eksprimira humanizovani CD3 protein(e). Miš eksprimira humanizovane CD3ε, humanizovane CD3δ i humanizovane CD3γ proteine. U nekim otelotvorenjima pronalaska, miš eksprimira humani CD3ε vanćelijski domen i endogeni mišji CD3ε transmembranski i citoplazmatski domen, humani CD3δ vanćelijski domen i endogeni mišji CD3δ transmembranski i citoplazmatski domeni i humani CD3γ vanćelijski domen i endogeni mišji CD3γ transmembranski i citoplazmatski domeni. Miš eksprimira humanizovane CD3 proteine, pri čemu su humanizovani CD3 proteini humanizovani CD3ε navedeni u SEQ ID NO:24, humanizovani CD3δ navedeni u SEQ ID NO:25, i humanizovani CD3γ navedeni u SEQ ID NO:26.
[0066] U nekim aspektima pronalaska, genetski projektovan miš je imunokompetentni miš. U nekim otelotvorenjima pronalaska, uvođenje humanizovanog CD3 proteina ne utiče na funkciju imunološkog sistema miša. U nekim otelotvorenjima pronalaska, miš sadrži normalan odnos T i B ćelija. U nekim otelotvorenjima pronalaska, miš je sposoban da postigne normalan odgovor na infekciju mišem. U nekim aspektima, miš pokazuje sličan odnos CD4+ do CD8+ ćelija u timusu u poređenju sa mišem divljeg tipa, npr., mišem koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovani CD3 protein(e). U nekim otelotvorenjima pronalaska, odnos CD4+ prema CD8+ u timusu miša je unutar 30%, npr., unutar 20%, npr., unutar 15%, npr., unutar 12%, npr., unutar 10%, npr., unutar 5%, npr., unutar 2%, odnosa CD4+ prema CD8+ ćelija miša koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovani CD3 protein(e). U nekim aspektima, miš pokazuje sličan procenat T i B ćelija u slezini, limfnim čvorovima i perifernoj krvi kao miš divljeg tipa, npr., miš koji nije genetski modifikovan da eksprimira humanizovani protein CD3. U nekim aspektima, miš prikazuje sličan broj belih krvnih zrnaca u cirkulaciji, limfocita, monocita, neutrofila, eozinofila i bazofila kao miš divljeg tipa, npr., miš koji nije genetski modifikovan da izrazi humanizovani CD3 protein(e).
[0067] Ovde su takođe dati postupci za izradu ovde opisanog genetski modifikovanog miša. U nekim primerima, postupak stvaranja genetski modifikovanog miša, pri čemu životinja eksprimira humanizovani CD3 protein, uključuje uvođenje u endogeni ne-humani životinjski CD3 lokus sekvence nukleinske kiseline
1
koja kodira vanćelijski domen humanog CD3 proteina, pri čemu humani CD3 protein je odabran iz grupe koju čine CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ i njihova kombinacija. Ako se uvede višestruki humani CD3 protein, oni se mogu uvesti zajedno na jednoj nukleinskoj kiselini (kao u ovim primerima) ili odvojeno. Ako je ovo poslednje, pojedinačna ćelijska linija (npr., ES ćelijska linija) može biti podvrgnuta uzastopnim modifikacijama dok se ne modifikuje tako da uključuje nukleinske kiseline koje kodiraju svaki od željenih humanih CD3. U jednom otelotvorenju životinja ne sadrži funkcionalni vanćelijski domen odgovarajućeg ne-humanog CD3 proteina. Miš sadrži na endogenom mišjem CD3 lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, vanćelijski domen humanog CD3δ i vanćelijski domen humanog CD3γ. U nekim primerima, vanćelijski domen humanog CD3ε je izložen u SEQ ID NO:33, vanćelijski domen humanog CD3δ je izložen u SEQ ID NO: 34, a vanćelijski domen humanog CD3γ izložen je u SEQ ID NO:35. U jednom otelotvorenju životinja ne sadrži funkcionalni vanćelijski domen odgovarajućeg ne-humanog CD3 proteina.
[0068] U nekim otelotvorenjima, postupak stvaranja genetski modifikovanog mišjeg miša prema pronalasku obuhvata zamenu na endogenom CD3 lokusu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski domen mišjeg CD3 proteina, nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski domen odgovarajućeg humanog CD3 proteina. U jednom otelotvorenju, životinja zadržava mišji transmembranski i citoplazmatski domen mišjeg CD3 proteina. U nekim otelotvorenjima, zamena rezultira himernim proteinima koji sadrže vanćelijski domen humanog CD3 proteina i transmembranski i mišji citoplazmatski domen odgovarajućih endogenih mišjih CD3 proteina.
[0069] Nukleinske kiseline koje kodiraju humani protein CD3 obično se unose u ćeliju miša, a miš se širi iz ćelije. U nekim otelotvorenjima, postupak zamene koristi konstrukciju ciljanja napravljenu upotrebom tehnologije VELOCIGENE®, uvođenjem konstrukcije u ES ćelije i uvođenjem ciljanih klonova ES ćelija u embrion miša korišćenjem VELOCIMOUSE® tehnologije, kao što je opisano u primerima.
[0070] U jednom otelotvorenju, gde postupak uključuje zamenu mišje nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski domen endogenog mišjeg CD3ε nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε proteina, postupak obuhvata zamenu delimične sekvence endogenih mišjih kodirajućih egzona 2 do 4 miša CD3ε gena sa delimičnom sekvencom humanih kodirajućih egzona 2 do 5 humanog gena CD3ε. U jednom otelotvorenju, gde postupak uključuje zamenu nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski domen endogenog mišjeg CD3δ nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski domen humanog CD3δ, postupak obuhvata zamenu delimične sekvence endogenih mišjih kodirajućih egzona 2 do 3 miša CD3δ sa delimičnom sekvencom humanih kodirajućih egzona 2 do 3 humanog gena CD3δ. U jednom otelotvorenju, gde postupak uključuje zamenu nukleotidne mišje sekvence koja kodira vanćelijski domen endogenog mišjeg CD3γ nukleotidnom sekvencom koja kodira vanćelijski domen humanog CD3γ, postupak obuhvata zamenu delimične sekvence mišjih kodirajućih egzona 2 do 4 miša CD3γ sa delimičnom sekvencom humanih kodirajućih egzona 2 do 4 humanog gena CD3γ. U jednom otelotvorenju pronalaska, zamena uključuje zamenu sekvence CD3ε, CD3δ i CD3γ. U takvom otelotvorenju, zamena se može postići stvaranjem velikog ciljnog vektora koji uključuje sekvencijalnu genetsku modifikaciju u sva tri lokusa i zatim uvođenjem vektora velikog ciljanja u ES ćelije miša da bi se stvorio miš, npr., kako je opisano u Primeru 1.
[0071] Stoga je ovde otkriveni veliki ciljni vektor za stvaranje genetski modifikovane životinje prema pronalasku. U jednom primeru, veliki ciljni vektor sadrži 5' i 3' mišje ruke za homologiju; fragment DNK koji sadrži CD3ε gen koji sadrži zamenu delimične sekvence mišjeg CD3ε koja kodira eksone 2 do 4 delimičnom sekvencom humanog CD3ε koja kodira eksone 2 do 5; fragment DNK koji sadrži CD3δ gen koji sadrži zamenu delimične sekvence mišjeg CD3δ koja kodira eksone 2 do 3 delimičnom sekvencom humanog CD3δ koja kodira eksone 2 do 3; fragment DNK koji sadrži CD3γ gen koji sadrži zamenu delimične sekvence mišjeg CD3γ koja kodira eksone 2 do 4 delimičnom sekvencom humanog CD3γ koja kodira eksone 2 do 4; i selekcionu kasetu.
[0072] Selekciona kaseta je nukleotidna sekvenca umetnuta u konstrukciju za ciljanje da bi se olakšao odabir ćelija (npr., bakterijskih ćelija, ES ćelija) koje su integrisale konstrukt od interesa. U struci je poznat niz pogodnih selekcionih kaseta (Neo, Hig, Pur, CM, SPEC, itd.). Pored toga, selekciona kaseta može biti uz bok mestima rekombinacije, koja omogućavaju brisanje selekcione kasete nakon tretmana enzimima rekombinaze. Uobičajena mesta rekombinacije su loxP i Frt, prepoznata od strane Cre i Flp enzima, ali druga su poznata u tehnici. Kaseta za odabir može se nalaziti na primer bilo gde u konstrukciji izvan područja kodiranja. U jednom primeru, selekciona kaseta je umetnuta uzvodno od umetnute sekvence humanog CD3ε.
[0073] Po završetku ciljanja gena, ES ćelije ili genetski modifikovani miševi se pregledaju kako bi se potvrdilo uspešno ugradnju egzogenog nukleotidnog niza od interesa ili ekspresije egzogenog polipeptida. Stručnjacima su poznate brojne tehnike, koje uključuju (ali nisu ograničene na) Saudern blot, dugu PCR, kvantitativnu PCR (npr. PCR u realnom vremenu pomoću TAKMAN®), fluorescentnu hibridizaciju in situ, Severno blotovanje, protočnu citometriju, Zapadna analiza, imunocitohemija, imunohistohemija, itd. U jednom primeru, nehumane životinje (npr., miševi) koje nose genetsku modifikaciju od interesa mogu se identifikovati skriningom na gubitak alela miša i/ili dobit od alela čoveka korišćenjem modifikacije test alela opisan u Valenzuela i dr. (2003) Inženjering genoma miša velike propusnosti, zajedno sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech. 21(6):652-659. Drugi testovi koji identifikuju specifične sekvence nukleotida ili aminokiselina u genetski modifikovanim životinjama poznati su stručnjacima u ovoj oblasti.
[0074] Heterozigoti koji su rezultat gore navedenih metoda mogu se uzgajati da bi se generisali homozigoti.
[0075] Obelodanjen je postupak za dobijanje himernog humanog/ne-humanog CD3 molekula, koji uključuje ekspresiju u jednoj ćeliji himernog CD3 proteina iz nukleotidne konstrukcije kako je ovde opisano. U jednom primeru, nukleotidni konstrukt je virusni vektor; u konkretnom primeru, virusni vektor je lentivirusni vektor. U jednom primeru, ćelija je izabrana između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije mrežnjače koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).
[0076] Otkrivena je ćelija koja eksprimira himerni humani/ne-humani CD3 protein. U jednom primeru, ćelija sadrži ekspresijski vektor koji sadrži himernu CD3 sekvencu kako je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija je izabrana između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije mrežnjače koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).
[0077] Takođe je obelodanjen himerni CD3 molekul koji je napravio miš, kao što je ovde opisano, gde, u jednom primeru, himerni CD3 molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu svih ili u suštini svih vanćelijskih domena humanog CD3 proteina, i najmanje transmembranske i citoplazmatski domeni iz ne-humanog CD3 proteina, npr., mišjeg CD3 proteina.
[0078] Pored genetski inženjerskog miša, obelodanjen je i embrion koji nije čovek (npr., glodar, npr., embrion miša ili pacova), pri čemu embrion sadrži ES ćeliju davaoca koja potiče od životinje koja nije čovek (npr., primer glodara, npr., miša ili pacova) kako je ovde opisano. U jednom primeru, embrion sadrži ćeliju ES donora koja sadrži himerni CD3 gen i ćelije domaćina embriona.
[0079] Takođe je obelodanjeno tkivo, pri čemu je tkivo izvedeno od životinje koja nije čovek (npr., glodara, npr., miša ili pacova), kao što je ovde opisano, i eksprimira himerni CD3 protein.
[0080] Pored toga, obelodanjena je ne-humana ćelija izolovana od ne-humane životinje kako je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija je ES ćelija. U jednom primeru, ćelija je T ćelija. U jednom primeru, ćelija je CD8+ T ćelija. U drugom primeru, ćelija je CD4+ T ćelija.
[0081] U jednom primeru, ovde takođe obelodanjeni su genetski lokusi koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisani humanizovani CD3 protein(e).
Model miša za ispitivanje ljudskih terapija
[0082] U nekim aspektima, ovde dat model miša za ispitivanje CD3 ciljanih ("anti-CD3") terapijskih sredstava prema patentnom zahtevu 9. Stoga, ovde je dat model miša za testiranje anti-CD3 proteina koji vezuju antigen. U nekim otelotvorenjima, ovde dat model miša za ispitivanje antitela na CD3. U nekim takvim otelotvorenjima obezbeđen je model miša za testiranje multispecifičnih anti-CD3, npr. bispecifični proteini koji vezuju antigen ili anti-CD3 bispecifična antitela. Kao takav, anti-CD3 multispecifični protein koji vezuje antigen, npr. anti-CD3 bispecifični protein koji vezuje antigen, cilja ili specifično vezuje navedeni humanizovani CD3 protein i bar još jedan antigen od interesa. U različitim aspektima, model miša za ispitivanje anti-CD3 bispecifičnih proteina koji vezuju antigen, pri čemu je protein koji vezuje antigen sposoban da vezuje i CD3, a antigen od interesa, sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanizovani CD3 protein, pri čemu humanizovani CD3 protein sadrži CD3ε, CD3δ, CD3γ i njihovu kombinaciju, i ćeliju koja eksprimira ili sadrži antigen od interesa. Miš sadrži T ćeliju koja eksprimira pomenuti humanizovani CD3 protein(e).
[0083] U jednom otelotvorenju, ispitivanje monospecifičnog ili bispecifičnog proteina koji vezuje antigen uključuje izvođenje testa ili ispitivanja koji omogućava određivanje efekta proteina koji vezuje antigen na T ćeliju koja eksprimira pomenuti humanizovani CD3 protein. U još jednom otelotvorenju, ispitivanje bispecifičnog proteina koji vezuje antigen uključuje izvođenje testa ili ispitivanja koji omogućava određivanje efekta proteina koji vezuje antigen i na T ćeliju koja eksprimira pomenuti humanizovani CD3 protein i na ćeliju koja eksprimira ili sadrži antigen od interesa, ili interakcija između pomenute CD3 ekspresione T ćelije i ćelije koja eksprimira ili sadrži antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, ispitivanje monospecifičnog ili bispecifičnog proteina koji vezuje antigen uključuje izvođenje testa ili ispitivanja koje omogućava određivanje
1
efekta T ćelije koja eksprimira pomenuti humanizovani CD3 protein na ćeliju koja eksprimira ili sadrži navedeni antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, takav test meri, na primer, broj ćelija koje eksprimiraju antigen od interesa, imuni odgovor, ćelijske interakcije, ćelijska citotoksičnost, oslobađanje citokina, ćelijska aktivacija, proliferacija ćelija, rast ili regresija tumora, promene u patologiji ili slično. Razni testovi uključuju, ali nisu ograničeni na merenja citotoksičnosti usmerene na komplement (CDC), citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP), proliferacije PBMC, aktivacije CD69, histološke analize tkiva, analize tkiva i ćelija biomarkeri (npr., ćelije ili tkivo se mogu ekstrahovati iz miša u svrhu ispitivanja ili analizirati radiografijom, MRI, PET, SPECT, BLI i modalitetima snimanja zasnovanim na fluorescenciji).
[0084] U nekim otelotvorenjima pronalaska, u takvom modelu miša, antigen od interesa je uveden u pomenutog miša. Antigen od interesa može se uvesti pomoću nekoliko postupaka koji su poznati stručnjacima. Neki neograničavajući postupci uključuju transgenezu, injekcije, infekcije, transplantaciju tkiva ili ćelija. Antigen od interesa ili njegov fragment (npr., fragment koji prepoznaje protein koji se vezuje za antigen) može biti ciljan ili eksprimiran na određenim tipovima ćelija. U nekim otelotvorenjima, antigen od interesa je humanizovani antigen od interesa kodiran mišjim genomom.
[0085] Antigen od interesa može biti protein vezan za membranu tako da se eksprimira samo na površini ćelije. Alternativno, antigen od interesa ili njegov fragment (npr., fragment koji prepoznaje protein koji se vezuje za antigen) može biti prikazan na ćelijskoj površini složenoj sa drugim proteinom ili delom. Neki antigeni na ćelijskoj površini mogu se povezati sa drugim proteinima kao kompleksi ko-receptora ili se vezuju ili imaju afinitet za vanćelijske molekule. Tako se model miša može koristiti za testiranje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen i koji stupaju u interakciju sa T ćelijama u različitim ćelijskim sistemima.
[0086] Mode miša eksprimira humane vanćelijske domene CD3ε, CD3δ i CD3γ. U jednom otelotvorenju, miš eksprimira mišji transmembranski i citoplazmatski domen CD3ε, CD3δ i CD3γ; u jednom otelotvorenju, transmembranski i citoplazmatski domeni su endogeni mišji domeni. U jednom otelotvorenju, model miša eksprimira CD3ε, CD3δ, i CD3γ, od kojih svaki sadrži humani vanćelijski domen i miša, npr., endogeni mišji, transmembranski i citoplazmatski domen.
[0087] Protein koji vezuje antigen vezuje i CD3 i antigen od interesa u mišjem modelu. U jednom otelotvorenju, antigen od interesa je humani antigen. U jednom otelotvorenju, antigen od interesa je antigen primata, na primer, antigen majmuna cinomolgus. U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen je sposoban da vezuje isti antigen od interesa i za poreklo čoveka i majmuna. U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen je sposoban da vezuje i CD3 čoveka i majmuna.
[0088] U jednom otelotvorenju, model miša sadrži ksenograft tumora koji eksprimira antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, ćelija koja eksprimira ili sadrži antigen od interesa kod pomenutog miša je imortalizovana ćelija, kao što je tumorska ćelija. Stoga, model miša se koristi za testiranje aktivnosti anti-CD3 bispecifičnih proteina koji vezuju antigen u blokiranju ili uticaju na ćeliju tumora koja eksprimira antigen od interesa.
[0089] Dakle, u otelotvorenju pronalaska, gde je ćelija koja eksprimira ili sadrži antigen od interesa tumorska ćelija, antigen od interesa može biti antigen povezan sa tumorom (TAA). Razni tumorski antigeni su navedeni u bazi tumorskih antigena definisanih T ćelijama (van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Baza podataka o peptidima: Tumorski antigeni definisani T ćelijama. Cancer Immun 2013). Primeri antigena povezanih sa tumorom uključuju, ali nisu ograničeni na ALK, BAGE proteine, BIRC5 (survivin), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR varijantu III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE proteini, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV-izveden LMP2, L1CAM, MAGE proteine, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteine, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Thompsonnouvelle antigen, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1. U jednom primeru, kao što je ovde opisano u primeru 3, antigen od interesa može biti CD20, npr., humani ili humanizovani CD20.
[0090] U još jednom otelotvorenju pronalaska, model miša se koristi za određivanje da li je kandidat bispecifični protein koji vezuje antigen sposoban da blokira ili utiče na antigen od interesa koji je antigen povezan sa zaraznom bolešću. U jednom otelotvorenju pronalaska, miš je zaražen infektivnim sredstvom. U jednom otelotvorenju pronalaska, antigen povezan sa zaraznom bolešću je virusni antigen. U jednom aspektu,
1
virusni antigen je izabran iz grupe koju čine HIV, hepatitisa A, hepatitisa B, hepatitisa C, herpes virusa (npr., HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, Epštajn Barov virus), adenovirus, virus gripa, flavivirus, echo virus, rinovirus, koksaki virus, korona virus, respiratorni sincicijski virus, virus zaušnjaka, rotavirus, virus ospica, virus rubeole, parvovirus, virus vakcinije, HTLV , virus denge, papiloma virus, virus mekušaca, poliovirus, virus besnila, JC virus, virus ebole i antigen virusa arbovirusnog encefalitisa.
[0091] U sledećem otelotvorenju pronalaska, gde je antigen od interesa antigen povezan sa zaraznom bolešću, antigen od interesa je bakterijski antigen. U nekim aspektima pronalaska, bakterijski antigen je izabran iz grupe koju čine hlamidija, rikecija, mikobakterije, stafilokoki, streptokoki, pneumonokoke, meningokoke, gonokoke, klebsiela, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difterija, kola, tetanus, botulizam, antraks, kuga, leptospira i bakterijski antigen Lajmske bolesti.
[0092] U nekim aspektima pronalaska, bispecifični protein koji vezuje antigen zasnovan na CD3 je humani protein koji vezuje antigen baziran na CD3. U jednom otelotvorenju, protein koji vezuje antigen je antitelo, npr., humano antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0093] U nekim otelotvorenjima pronalaska, model miša je imunokompetentni model miša. U nekim otelotvorenjima pronalaska, model miša omogućava ispitivanje efikasnosti i/ili toksičnosti proteina koji vezuje antigen od interesa. Mere efikasnosti će zavisiti od antigena od interesa koji cilja bispecifično sredstvo. U nekim otelotvorenjima, mera efikasnosti je ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen T ćelija. U drugim otelotvorenjima, mera efikasnosti je neutralizacija virusa. U drugom otelotvorenju, mera efikasnosti može biti održivost životi U još jednom otelotvorenju, mera efikasnosti može biti uklanjanje ćelija koje eksprimiraju antigen od interesa, proliferacija T ćelija, proizvodnja citokina (npr., IFNg, TNFa, IL-1, IL-2, IL-10, IL4, IL -6, granzim, perforin, itd.)
[0094] U nekim otelotvorenjima pronalaska, toksičnost kod životinje može se meriti kao neželjeni događaj kod životinje, npr., promena telesne težine, apetita, probavnih promena, promena broja krvnih zrnaca, splenomegalija, histološke promene organa, promena u funkciji enzima jetre, promene u analizi urina, toksičnost organa, krvarenje, dehidratacija, gubitak krzna i čupavost ili drugi znaci morbiditeta. Jedna od mera može biti određivanje unakrsne reaktivnosti proteina koji vezuje antigen sa irelevantnim antigenima, što se u jednom otelotvorenju može otkriti histologijom organa, konkretno detekcijom proteina koji vezuje antigen u tkivima ili tipovima ćelija za koje nije poznato da eksprimiraju antigen od interesa.
Upotreba genetski modifikovanih ne-humanih životinja
[0095] Pronalazak takođe pruža različite postupke upotrebe ovde opisanih genetski modifikovanih miševa.
[0096] U jednom otelotvorenju, ovde obezbeđeni postupak skrininga terapijskih kandidata za lekove koji ciljaju antigen od interesa, obuhvata (a) obezbeđivanje ili prijem genetski modifikovanog miša koji sadrži na svom endogenom mišjem CD3 lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, CD3δ i CD3γ, (b) uvođenje u pomenutog genetski modifikovanog miša antigena od interesa, (c) kontaktiranje navedenog miša sa kandidatom za lek koji je od interesa, pri čemu je kandidat za lek usmeren protiv humanog CD3 i antigena od interesa, i (d) utvrđivanje da li je kandidat za lek efikasan u sprečavanju, smanjenju ili uklanjanju ćelija koje karakteriše prisustvo ili ekspresija antigena od interesa. Miš eksprimira funkcionalni humanizovani CD3 protein na površini svojih T ćelija. Genetski modifikovan miš sadrži na endogenom CD3 lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski domen humanog CD3ε, vanćelijski domen humanog CD3δ i vanćelijski domen humanog CD3γ. U jednom otelotvorenju ovde opisani postupci, miš ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni vanćelijski domen odgovarajućeg mišjeg proteina. U nekim otelotvorenjima postupka, vanćelijski domen(i) humanog CD3 proteina su operativno povezani sa transmembranskim i citoplazmatskim domenom (domenima) odgovarajućeg endogenog mišjeg CD3 proteina. U nekim primerima, vanćelijski domen humanog CD3ε je izložen u SEQ ID NO:33, vanćelijskom domenu humanog CD3δ je prikazan u SEQ ID NO:34, a vanćelijski domen humanog CD3y je prikazan kao SEQ ID NO:35. Miš eksprimira humanizovani CD3ε protein naveden u SEQ ID NO:24, humanizovani CD3δ protein naveden u SEQ ID NO:25, i humanizovani CD3γ prikazan u SEQ ID NO:26.
[0097] U različitim otelotvorenjima ovde opisanog postupka, uvođenje antigena od interesa u ovde opisanog genetski modifikovanog miša može se postići bilo kojim postupcima poznatim stručnjacima, koji mogu, bez ograničenja, uključivati transgenezu, injekcije, infekcije, tkivo ili transplantacija ćelija. Kao takvo, uvođenje se može postići ekspresijom na mišu antigena od interesa, koji može sadržati genetsku modifikaciju pomenutog miša da eksprimira antigen od interesa. Alternativno, uvođenje može sadržati uvođenje ćelije u pomenute
1
miševe koja eksprimira antigen od interesa, na primer, kao kod transplantacije ćelija ili tkiva. Uvod takođe može obuhvatati infekciju pomenutog miša antigenom od interesa, npr., kao kod bakterijske ili virusne infekcije. U jednom otelotvorenju, antigen od interesa može biti humani antigen od interesa. U još jednom otelotvorenju, to može biti bakterijski ili virusni antigen od interesa.
[0098] Antigen od interesa može biti antigen povezan sa tumorom, kao što je iznad detaljno opisano. Antigen može takođe biti antigen povezan sa zaraznom bolešću, npr., bakterijski ili virusni antigen, kao što je detaljno opisano iznad.
[0099] U različitim otelotvorenjima postupaka skrininga terapijskog kandidata za lek, kandidat za lek može biti protein koji vezuje antigen, npr., antitelo, npr., bispecifično antitelo. U različitim aspektima, takav kandidat za lek može da vezuje i humani CD3 i antigen od interesa. Antigen od interesa može biti humani antigen. Antigen od interesa može takođe biti antigen primata, npr., majmuna. Dakle, kandidat za lek koji se koristi za skrining može biti sposoban da vezuje i humani antigen i odgovarajući antigen primata, uz vezivanje humanog CD3. Kandidat za lek takođe može biti sposoban da vezuje CD3 primata, npr., majmuna. Dakle, kandidat za lek može biti sposoban da vezuje CD3 i čoveka i primata, npr., majmuna; i takođe, u jednom otelotvorenju, biti sposoban da vezuje humani antigen od interesa. U još jednom otelotvorenju, antigen od interesa može biti bakterijski ili virusni antigen, a kandidat za lek može biti sposoban da vezuje CD3 i čoveka i primata, npr., majmuna, i bakterijski ili virusni antigen od interesa.
[0100] U nekim aspektima, terapeutski kandidat je antitelo, koje je humano antitelo. U drugim aspektima, to može biti humanizovano antitelo. Na primer, terapeutski kandidat može biti antitelo generisano kod VELOCIMMUNE® mice (patentni broj SAD 8,502,018, tako da početni kandidat za antitelo može sadržati humani varijabilni region i mišji konstantni region. Mišji konstantni region kandidata za antitelo može se redizajnirati da bude humanog porekla izražavanjem humanog varijabilnog regiona odabranog u VELOCIMMUNE® miševa u operabilnoj vezi sa humanim konstantnim regionom.
[0101] U različitim otelotvorenjima ovde opisanih postupaka, terapeutski kandidat je sposoban da smanji, eliminiše ili spreči bolest. U jednom otelotvorenju, bolest je tumor, a terapeutski kandidat je sposoban da smanji, eliminiše ili spreči rast tumora u poređenju sa sredstvom koje ne cilja antigen od interesa. U takvom otelotvorenju postupka, određivanje da li je kandidat za lek efikasan u sprečavanju, smanjenju ili uklanjanju ćelija koje karakterišu prisustvo ili ekspresija antigena od interesa može se izvršiti pomoću testa zapremine tumora, testa ubijanja tumorskih ćelija, indukcije apoptotički markeri u tumorima, smanjenje rasta krvnih sudova u tumorima, infiltracija imunih ćelija u tumore, itd. U još jednom otelotvorenju, bolest je zarazna bolest, a terapeutski kandidat je sposoban da smanji, eliminiše ili spreči bakterijsku ili virusnu bolest infekcija u poređenju sa sredstvom koji ne cilja antigen od interesa. U takvom otelotvorenju postupka, određivanje da li je kandidat za lek efikasan u sprečavanju, smanjenju ili uklanjanju ćelija koje karakterišu prisustvo ili ekspresija antigena od interesa može se izvršiti korišćenjem mere bakterijskih ili virusnih titra, indukcije apoptotičkih markera u zaražene ćelije itd.
[0102] Takođe su obelodanjeni i drugi postupci upotrebe humanizovanih CD3 miševa iz ovog pronalaska. Na primer, ovde obelodanjena ne-humana životinja, na primer, humanizovani CD3 miš, može se koristiti za proučavanje mehanizma delovanja leka. Pre razvoja sadašnje životinje, bilo je teško proučavati mehanizam delovanja lekova, jer se takve studije obično ne sprovode na ljudima i primatima, a često zahtevaju imunokompetentni životinjski model. Razumevanje mehanizma delovanja lekova može dovesti do razvoja boljih antitela. U različitim otelotvorenjima pronalaska, humanizovani CD3 miš je imunokompetentni miš. Na primer, humanizovani CD3 miš iz pronalaska, koji sadrži zdrav normalan imuni sistem sa netaknutim razvojem i potpunim komplementom svih tipova imunih ćelija i netaknutih imunoloških signalnih puteva, može se koristiti za proučavanje efekata različitih terapijskih kandidata na određene tipove ćelija, citokina, hemokina, itd. Miš se zatim može koristiti za odgovaranje na mehanička pitanja koja se odnose na funkciju kandidata za lek.
[0103] Pored toga, humanizovani CD3 miševi mogu se koristiti u postupcima koji uključuju ispitivanje efekta bispecifičnih kandidata za anti-CD3 lekove na transplantate tumora. Ranije razvijeni modeli miša bili su imunokompromitovani modeli miša kako bi se omogućilo pravilno ugrađivanje humanog tumora. Humanizovani CD3 miš je u potpunosti imunokompetentan i omogućava uvođenje i rast tumorskih ćelija koje eksprimiraju antigen od interesa, pa se može proučavati puni uticaj na imuni odgovor, uključujući, ali ne ograničavajući se na odgovore na mehanička pitanja, pitanja rane toksičnosti, pitanja rane efikasnosti itd.
[0104] U još jednom otelotvorenju, humanizovani CD3 miš može se koristiti za proučavanje efekata kombinovanih terapija lekovima na životinjskim modelima, posebno kombinovanih terapija lekovima, na
1
primer, gde je jedan lek protein koji vezuje antigen i koji vezuje CD3, a drugi lek koji je sredstvo koji je prethodno odobren za određenu indikaciju. Konkretna pitanja u vezi sa doziranjem lekova i njegovim efektima mogu se adresirati na životinjskom modelu pre bilo kog ispitivanja na ljudima.
PRIMERI
[0105] Sledeći primeri su dati kako bi stručnjacima u struci opisali kako da naprave i koriste postupke i sastave pronalaska i nisu namenjeni ograničavanju obima onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperature itd.), ali treba uzeti u obzir i neke eksperimentalne greške i odstupanja. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih postupaka koji bi bili dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti (tehnike molekularnog kloniranja, itd.). Ako nije drugačije naznačeno, delovi su maseni delovi, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je naznačena u Celzijusu, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Konstruisanje humanizovanog CD3 lokusa
Primer 1,1. Konstruisanje humanizovanog CD3γδε
[0106] Lokus miša CD3 je humanizovan konstrukcijom jedinstvenih vektora ciljanja iz DNK veštačkih hromozoma čoveka (BAC) čoveka i miša koristeći VELOCIGENE® tehnologiju (videti, na primer., patent SAD br. 6,586,251 i Valenzuela i dr. (2003) Inženjering velike propusnosti para genoma miša sa analizom ekspresije visoke rezolucije. Nat. Biotech.21(6): 652-659).
[0107] DNK iz mišjeg BAC bMQ-425K11 modifikovana je homolognom rekombinacijom da bi zamenila delove koji kodiraju genomsku DNK miša CD3ε, CD3δ i CD3γ gena (geni CD3 miša koji se nalaze u neposrednoj blizini hromozoma 9) sa odgovarajućim delovima CD3ε, CD3δ i CD3γ geni izvedeni iz humanog BAC RP11-414G21 (humani CD3 geni se nalaze u neposrednoj blizini hromozoma 11).
[0108] Preciznije, da bi se generisali humanizovani CD3γδε miševi, miš BAC je prvo modifikovan zamenom 714 bp mišje Cd3d sekvence (koja odgovara delimičnoj sekvenci mišjih kodirajućih egzona 2-3 gena Cd3d) sa 939 bp humane CD3D sekvence (koja odgovara delimičnoj sekvenci) humanih kodirajućih egzona 2-3 gena CD3D) u jednom događaju ciljanja koristeći ciljni vektor koji sadrži Spec kasetu koristeći mišje homološke krake.
[0109] Miš BAC koji se sastoji od zamene delimične sekvence mišjih kodirajućih egzona 2-3 CD3d gena sa odgovarajućom humanom sekvencom naknadno je modifikovan zamenom 1,738bp mišje Cd3g sekvence (koja odgovara delimičnoj sekvenci mišjih kodirajućih egzona 2-4 gena Cd3g) sa 1,639 bp humane sekvence CD3G (što odgovara delimičnoj sekvenci humanih kodirajućih eksona 2-4 gena CD3G), takođe u jednom ciljnom događaju, koristeći druge Spec kasete koje sadrže vektor i mišje homološke krake.
[0110] Konačno, BAC koji se sastoji od zamene gena CD3d i CD3g miša odgovarajućim humanim genima, dalje je modifikovan zamenom sekvence CD3e miša od 6,213bp sa 6,817bp sekvence čoveka (što odgovara zameni delimične sekvence miša koji kodira eksone 2 do 4 miša CD3e gen sa delimičnom sekvencom humanih kodirajućih egzona 2 do 5 humanog CD3E gena). Fiksirana kaseta od neomicina od 4,996 bp je umetnuta uzvodno od ubacivanja sekvence humanog CD3E.
[0111] Rezultujući humanizovani veliki ciljni vektor za umetanje u ES ćelije prikazan je na SL.2A, sa A, B, C, D, E, F i G koji označavaju različite spojeve miš/čovek ili miš/NEO kaseta ili čovek/NEO kaseta. Sekvence na spojevima su prikazane u Tabeli 1 ispod.
Tabela 1. Sekcije preseka vektora većeg ciljanja
1
[0112] Ciljana BAC DNK je korišćena za elektroporisanje mišjih ES ćelija koje sadrže deleciju u mišjem CD3 lokusu da bi se stvorile modifikovane ES ćelije za generisanje miševa koji eksprimiraju humanizovane CD3ε, CD3δ i CD3γ na površini njihovih T ćelija. ES ćelije koje sadrže insercije humanih sekvenci CD3ε, CD3δ i CD3γ identifikovane su kvantitativnim TAQMAN™ testom (videti npr.., Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48. Specifični setovi prajmera i sonde su dizajnirani za otkrivanje umetanja ljudskih sekvenci (dobitak alela, GOA) i brisanja sekvenci miša (gubitak alela, LOA). Tabela 2 identifikuje imena i lokacije svakog od primera/setova sondi koji se koriste u kvantitativnim PCR testovima.
2
Tabela 2: Parovi prajmera/sonde koji se koriste za genotipizaciju
[0113] Iznad opisane ciljane ES ćelije su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miša postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., Pat. SAD br. 7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) Miševi generacije F0 koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz ES ćelija ciljanih na donatorske gene, omogućavajući neposredne fenotipske analize Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi u potpunosti izvedeni iz donatorske ES ćelije) koji nezavisno nose humanizovane CD3 gene identifikovani su genotipizacijom pomoću modifikacije testa alela (videti iznad) koja otkriva prisustvo jedinstvenih humanih sekvenci CD3 gena.
[0114] Selekciona kaseta se može ukloniti postupcima poznatim stručnjaku. Na primer, ES ćelije koje nose humanizovani CD3 lokus mogu se transfektovati konstrukcijom koja izražava Cre kako bi se uklonila floksovana kaseta. Selekciona kaseta se opciono može ukloniti uzgojem miševa koji eksprimiraju Cre rekombinazu. Po želji se selekciona kaseta zadržava na miševima. Spoj miša/čoveka humanizovanog alela CD3ε nakon uklanjanja kasete za odabir (prikazan kao A-B na SL. 2B), predstavljen je u tabeli 3 ispod. Preostale sekvence spoja iste su kao u ciljanom vektoru i predstavljene su u Tabeli 1 iznad.
Tabela 3. Spojne sekvence humanizovanog alela
[0115] Sekvenca rezultujućih humanizovanih proteina CD3ε, CD3δ i CD3y prikazana je na SL.3 i uključeni u spisak sekvenci. Pored toga, poravnanje sekvenci miš-čovek i spojeva na 5' i 3' umetnute ljudske sekvence prikazano je na SL. 4 kao * i **, respektivno. Pristupni brojevi proteina GenBank za proteine CD3ε, CD3δ i CD3γ su sumirani u nastavku u Tabeli 4.
Tabela 4 Pristupni brojevi proteina GenBank
Primer 2. Karakterizacija humanizovanih CD3 miševa
Primer 2.1. Razvoj imune ćelije kod humanizovanih CD3 miševa
[0116] Razvoj imunoloških ćelija u timusu i na periferiji humanih CD3εδγ miševa procenjen je korišćenjem analize sortiranja ćelija aktivirane fluorescencijom (FACS) i diferencijalnog brojanja ćelija. Timus, slezina i limfni čvorovi ubrani su od kohorta divljeg tipa (WT, bez humanog CD3γδε), heterozigotnih (Het, jedan alel hCD3γδε) i homozigotnih (Ho, dva alela hCD3γδε) miševa. Periferna krv je dobijena srčanom punkcijom ili retro-orbitalnim krvarenjem u epruvete obložene EDTA Microtainer epruvete (BD). Suspenzije pojedinačnih ćelija su pripremljene iz slezine, LN i timusa koristeći mehanički poremećaj, a crvene krvne ćelije su uklonjene iz slezine, timusa i cele krvi liziranjem sa puferom AKC Liza. Ćelije su inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi sa prečišćenim antitelima na CD16/CD32 (FcBlock) da blokiraju nespecifično vezivanje preko Fc receptora, a zatim inkubirane 30 minuta na 4°C sa koktelom direktno konjugovanih antitela na T i B markeri ćelija. Ćelije su isprane dva puta hladnim PBS koji sadrži 1% BSA, resuspendovani u puferu i analizirani protočnom citometrijom na protočnom citometru FACSCanto II™ (BD Biosciences). Timociti su prvo identifikovani rasipanjem unapred i bočno, a zatim getiranjem na populaciji B220-. Na periferiji, T ćelije su identifikovane kao CD45+/TCRb+/B220-, a B ćelije su identifikovane kao CD45+/TCRb-/B220+. Apsolutno brojanje dobijeno je na hematološkom analizatoru Hemavet 950FS.
[0117] Kao što je prikazano na SL. 5A i 5B, izgleda da humanizovani CD3γδε miševi imaju normalan razvoj timocita i normalan odnos T ćelija i B ćelija u timusu, perifernoj krvi i slezini. Pored toga, postoci T i B ćelija izgledali su normalno u limfnim čvorovima, a apsolutni broj ćelija slezine i limfnih čvorova (podaci nisu prikazani) bio je u granicama normale. Broj CD4 i CD8 ćelija u krvi bio je sličan među WT, Het i Ho miševima. Bele krvne ćelije u cirkulaciji, limfociti, monociti, neutrofili, eozinofili i bazofili pojavili su se u normalnim granicama (podaci nisu prikazani). Tako se kod humanizovanih CD3εδγ miševa primećuje normalan razvoj imunih ćelija.
[0118] Da bi se utvrdilo da li humanizovani CD3εδγ miševi pokazuju poliklonski repertoar Vβ CD4+ i CD8+ T ćelija, splenociti su izolovani od četiri humanizovana i pet kontrolnih miševa koji se podudaraju sa sojem i ispitani na upotrebu TCR Vβ. Bere se slezina i pripremaju se jednoćelijski splenociti, kao što je iznad opisano. Ćelije su inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi sa prečišćenim antitelima na CD16/CD32 (FcBlock; Biolegend) da blokira nespecifično vezivanje preko Fc receptora, a zatim resuspenduje u koktelu direktno konjugovanih antitela na mišji CD4 (Biolegend) i mišji CD8 (Biolegend). Direktno konjugovana antitela na TCR Vβ su zatim dodata u pojedinačna udubljenja i inkubirana su 30 minuta na 4°C. Ćelije su isprane hladnim PBS-om i inkubirane bojom za održivost (LIVE/DEAD fiksirajuća mrlja od ćelija Aqua Dead, Life Technologies) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane hladnim PBS-om koji sadrži 2% FBS-a, zatim resuspendovane u puferu i fiksirane sa BD stabilizacionim puferom pre nego što su analizirane protočnom citometrijom na protočnom citometru LSR Fortessa™ (BD Biosciences). CD4 i CD8 T ćelije su prvo identifikovane rasejanjem unapred i bočno, a zatim getiranjem žive populacije. Zatim su ispitane CD4 T ćelije (CD4+CD8-) i CD8 T ćelije (CD4-CD8+) na upotrebu TCR Vβ.
[0119] Kao što se može videti sa SL. Repertoar 5C, Vβ koji koriste i CD4 i CD8 T ćelije u humanizovanim CD3εδγ miševima pokazuje poliklonalnost, uz upotrebu koja se ne razlikuje značajno od kontrolnih miševa koji se podudaraju sa sojem.
Primer 2.2. Odgovor T ćelija na infekciju kod humanizovanih CD3 miševa
[0120] Da bi se utvrdilo da li su humanizovani CD3 miševi (humanizovani CD3γδε miševi) pokazali normalan odgovor na infekciju, testirana je sposobnost humanizovanih miševa da očiste limfocitni horiomeningitis virus (LCMV). LCMV je tropski virus miša, gde sudbina infekcije zavisi od virusnog soja. Infekcija sojem Armstrong rezultira akutnom infekcijom, gde miševi mogu brzo da uspostave odgovor T ćelija protiv virusa i očiste infekciju za oko nedelju dana. S druge strane, virus Klon 13 ne može se očistiti, a T ćelije se „iscrpljuju“ i uspostavlja se hronična infekcija. Kako i hronične i akutne infekcije zavise od aktivnosti T ćelija, LCMV je idealan model za testiranje funkcije T ćelija.
[0121] 6-8 nedelja stari humanizovani CD3 ili kontrolni miševi koji se podudaraju sa sojem zaraženi su sa 2x10<5>ffu Armstrong i.p. i/ili 2x10<6>ffu Klona 13 i.v. za infekciju Klonom 13, dve nedelje nakon infekcije slezine i titri virusa su izmereni testom plaka. Virusni titri bili su slični i kod kontrolnih i kod huCD3 miševa (SL.6A), što ukazuje da humanizacija CD3 nije imala efekta na fenotip iscrpljenosti T-ćelija, jer T-ćelije mogu da kontrolišu virus na slične nivoe u oba soja miševa. Za infekciju sojem Armstrong, dve nedelje nakon početne infekcije sojem Armstrong, miševima je izazvan Klon 13 i dve nedelje nakon merenja virusnih titra Klone 13 u slezinama. Nijedan virus nije otkriven ni kod kontrolnih ni kod humanizovanih CD3 miševa (SL.6B). Podaci sugerišu da je akutna Armstrongova infekcija očišćena. Pored toga, ovo pokazuje da je memorija T-ćelija koja je izazvana Armstrong infekcijom bila dovoljna da zaštiti miševe od naknadne infekcije Klonom 13 u oba soja miševa.
Primer 3. Humanizovani CD3 miševi kao model za ispitivanje zasnovanih na anti-CD3
Terapijski kandidati
Primer 3.1. Humanizovani CD3 miš za ispitivanje unakrsnih reaktivnih anti-humanih CD3 antitela majmuna Cinomolgus
[0122] Sposobnost različitih humanih ograničenih ili cinomolgus unakrsnih reaktivnih anti-CD3 antitela da vezuju splenocite divljeg tipa (WT) ili humanizovanih CD3γδε (Ho = homozigotni, Het = heterozigotni) miševi testirani su korišćenjem analize sortiranja ćelija aktivirane fluorescencijom (FACS).
[0123] Sveže izolovani splenociti (2x10<5>po udubljenju) inkubirani su sa anti-CD3 antitelima (15 ug/ml) tokom 30 minuta na 4°C. Posle inkubacije, ćelije su isprane dva puta i dodata su odgovarajuća sekundarna antitela (npr. PE anti-humani IgG sa fluorescentnim oznakama i direktno konjugovana antitela na markere T ćelija) i inkubirana dodatnih 30 minuta na 4°C, a zatim isprana dva puta. Korišćena su sledeća antitela: ah/mfCD3-2 i ah/mfCD3-1 su dva antitela koja prepoznaju i CD3 čoveka i majmuna; ahCD3-2 i ahCD3-1 su dva antitela koja prepoznaju samo humani CD3, amCD3-2C11 je antitelo koje prepoznaje samo mišji CD3, kontrolni humani IgG je nepovezano kontrolno antitelo, a drugo samo je sekundarna kontrola antitela. Ćelije su isprane dva puta hladnim PBS koji sadrži 1% BSA, resuspendovani u puferu i analizirani protočnom citometrijom na protočnom citometru FACSCanto II™ (BD Biosciences). T ćelije su identifikovane kao CD45+/TCRb+/B220-. Anti-mCD3-2C11 konstruisan da sadrži hIgG1 korišćen je za identifikaciju T ćelija na splenocitima VT miša.
[0124] Kao što je prikazano na SL. 7, antitela na CD3 koja su prepoznala samo humani CD3, mogla su da vezuju CD3 na površini splenocita od humanizovanih CD3γδε miševa; na sličan način anti-CD3 antitela koja su prepoznala CD3 čoveka i majmuna bila su u mogućnosti da vezuju CD3 na površinu humanizovanih CD3γδε miševa. Stoga su miševi humanizovani za sva tri CD3ε, CD3δ i CD3γ relevantni za rana predklinička ispitivanja kandidata za lekove zasnovane na CD3, što može biti praćeno ispitivanjima efikasnosti i toksičnosti na majmunima cinomolgus.
Primer 3.2. Aktiviranje T ćelija kod humanizovanih CD3 miševa
[0125] Testirana je sposobnost anti-humanih CD3 antitela da izazovu imuni odgovor kod humanizovanih CD3 miševa. Miševi humanizovani za CD3gde (n od 2/grupa), injektirani su intraperitonealno sa 10 ug različitih humanih restriktivnih ili cinomolgus unakrsnih reaktivnih anti-CD3 antitela (sva hIgG1). Da bi se dobio ćelijski sastav i nivoi citokina u plazmi, krv je uzimana u epruvete obložene EDTA-om Microtainer epruvete (BD) iz retro-orbitalnog sinusa, počev od 2 sata nakon injekcije. Broj perifernih T i B ćelija procenjen je pomoću FACS. Ukratko, 50 ul cele krvi inkubirano je 30 minuta na 4°C sa koktelom direktno konjugovanih antitela na T i B ćelijske markere. Crvene krvne ćelije su uklonjene liziranjem sa puferom AKC Liza, a obeležene ćelije su isprane jednom hladnim PBS-om koji sadrži 1% BSA. Posle pranja, ćelije su ponovo suspendovane u hladnom puferu i analizirane protočnom citometrijom na protočnom citometru FACSCANTO II™ (BD Biosciences). T ćelije su identifikovane kao živi CD45 /TCRb /B220-, a B ćelije su identifikovane kao živi CD45 /TCRb-/B220 . Apsolutno brojanje ćelija je određeno dodavanjem poznate količine CountBright TM zrnaca apsolutnog brojanja. Nivoi citokina u plazmi su procenjeni pomoću Miš Proinflamatornog 7-Plex ultra-osetljivog kompleta (Meso-Scale Discovery) iz krvi dobijene 2 sata nakon injekcije.
2
[0126] Kao što je prikazano na SL.8A, injekcija 10 ug anti-CD3 antitela izazvala je privremeno iscrpljivanje T i B ćelija, koje je u velikoj meri obnovljeno do 4. dana nakon početnog tretmana antitelima. Pored toga, injekcija anti-CD3 antitela (obe antitela na CD3 koja prepoznaju samo humani CD3 (ahCD3-1 i ahCD3-3) i anti-CD3 antitela koja prepoznaju i ljudski i majmunski CD3 (ah/mfCD3-1 i ah/mfCD3-2)) indukovana proizvodnja citokina u humanizovanih miševa CD3γδε (Sl.8B).
[0127] Pored toga, procenjena je sposobnost anti-humanog CD3, anti-humanog/cinomolgus CD3 ili antitela protiv miša da indukuju proliferaciju splenocita dobijenih od divljeg tipa ili humanizovanih CD3γδε miševa korišćenjem ATP katalizovane kvantifikacije (CellTiter Glo®). Aktivacija mišjih splenocita rezultira oslobađanjem citokina, koji pokreću ćelijsku proliferaciju. Podaci o širenju su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: splenociti (5x10<5>/udubljenju) izvedeni iz divljeg tipa (WT) ili humanizovanog homozigotnog CD3γδε (hCD3γδεHo) dodani su u ploče sa 96 udubljenja koje su presvučene preko noći na 4°C sa smanjenim količinama humanih ograničenih, unakrsnih reaktivnih reakcija cinomolgusa ili specifičnih za miš, antitela CD3. Kulturama je dodato 500 ng/ml CD-a protiv miša, a ploče su inkubirane 72 sata na 37°C. Nakon inkubacije, dodan je CellTiter Glo® i merena je luminiscencija pomoću VICTOR X5 čitača pločica sa više etiketa (PerkinElmer). EC50 ćelijske održivosti (ATP katalizovana kvantifikacija) određena je primenom Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Vrednosti su izračunate pomoću 4-parametarske nelinearne regresione analize.
[0128] Kao što je prikazano na SL.9, splenociti humanizovanih CD3γδε miševa podstaknuti su na proliferaciju pomoću CD3 antitela koja prelaze preko majmuna cinomolgus.
[0129] Sažetak različitih svojstava WT i CD3γδε miševa predstavljen je na Sl. 10. Kao što se može videti, limfociti od CD3γδε miševa sposobni su da vežu anti-humana CD3 antitela i odgovaraju na anti-humana CD3 antitela, posebno ona za koja je poznato da unakrsno reaguju sa majmunskim CD3, što je važan aspekt za terapijska sredstva kao predklinička ispitivanja o kandidatima za droge često se izvode na velikim životinjama poput majmuna cinomolgus.
Primer 3.3. Ispitivanja iscrpljenosti tumora na humanizovanom CD3 mišu
[0130] Miševi dvostruko humanizovani i za CD3 (humanizovani CD3γδε miševi opisani gore) i za CD20 su proizvedeni ukrštanjem miševa humanizovanih na CD3 lokusu sa miševima humanizovanih na CD20 lokusu. Dobijene životinje su izrazile oba humanizovana proteina. Konkretno, za proizvodnju humanizovanih CD20 miševa, celokupno mišje područje kodiranja Ms4a1 (Cd20) od 2. aminokiseline (prvo je zajedničko Met) do 167 bp nizvodno 3' neprevedenog regiona, u rasponu od 9312 bp (Murine Chr.19) zamenjen je odgovarajućim CD20 humanim kodirajućim regionom od 2. aminokiseline do 107 bp nizvodno 3'neprevedenog regiona, u rasponu od 8482bp (Human Chr.11). I mišji i humani CD20 imaju šest egzona. Životinje korišćene u eksperimentu opisanom dole su bile homozigotne za zamenu i na CD3 i na CD20 lokusima i proizvedene ukrštanjem miševa modifikovanih na pojedinačnim lokusima.
[0131] Humanizovani CD3/CD20 miševi implantirani su subkutano sa 2x10<5>B16F10.9 tumorskih ćelija melanoma transdukovanih humanim CD20. Počev od Dana 0 (dan transplantacije tumora), miševi su lečeni intraperitonealno 2 puta nedeljno sa bilo kojim nosačem (PBS; n = 5), 0,4 mg/kg kontrole Ab 2 (kontrolno antitelo koje ne pokazuje unakrsnu reaktivnost na CD20 antigen; n=5), 0.4 mg/kg od Ab 1 (anti-CD3/CD20 bispecifično antitelo, videti WO2014121087A1, objavljeno 7. avgusta 2014, N=5), ili 0.004 mg/kg Ab 1 (n=5). Zapremine tumora su merene kako je prikazano na Sl. 11A. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu veću od oko 1500 mm<3>. Kao što je prikazano na Sl.11A, lečenje Ab 1 je odložilo rast tumora kada je tretman započet istovremeno sa transplantacijom tumora.
[0132] U odvojenom eksperimentu takođe je ispitana sposobnost Ab 1 da inhibira rast tumora u već utvrđenom tumoru (Sl.11B). Humanizovani CD3/CD20 miševi implantirani su subkutano sa 2x10<5>B16F10.9 tumorskih ćelija melanoma koji eksprimiraju humani CD20.10. dana nakon implantacije tumora, miševi su nasumično postavljeni na osnovu veličine tumora i organizovani u sledeće grupe za lečenje, po 5 miševa u svakoj grupi: nosač (PBS), 4 mg/kg kontrole Ab 2 (kontrolno antitelo koje ne pokazuje unakrsnu reaktivnost na CD20 antigen), 4 mg/kg Ab 1 ili 0,4 mg/kg Ab 1. Svi miševi su tretirani i.p. 2 puta nedeljno. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu veću od oko 1500 mm<3>. Kao što je prikazano na Sl.11B, lečenje sa Ab 1 odlaže rast tumora već uspostavljenih tumora, pokazujući da su humanizovani CD3 miševi korisni za rana ispitivanja kandidata za lek.
Ekvivalenti
[0133] Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće ili će moći da utvrde, koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente ovde opisanih specifičnih primera pronalaska. Takvi ekvivalenti su predviđeni da budu obuhvaćeni sledećim patentnim zahtevima.
[0134] Ako je pristupni broj ili neki drugi citat povezan sa različitim sadržajem u različito vreme, podrazumeva se sadržaj na snazi na dan stupanja na snagu prijave, pri čemu je datum stupanja na snagu datum podnošenja najranije prioritetne prijave koja upućuje na navod ili ako nijedan, stvarni datum podnošenja.
[0135] Ako iz konteksta nije drugačije vidljivo, bilo koje ostvarenje, aspekt, element, karakteristika, korak ili slično mogu se kombinovati sa bilo kojim drugim.
2
2
2
2
2
1
2
4

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Genetski modifikovani miš koji sadrži
na endogenom mišjem CD3ε lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3ε protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24, na endogenom mišjem CD3δ lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3δ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:25, i na endogenom mišjem CD3γ lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3γ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:26, pri čemu miš na površini svojih T ćelija eksprimira funkcionalni humanizovani CD3 kompleks koji sadrži himerne humane/mišje CD3ε, CD3δ i CD3γ proteine i pri čemu su endogeni mišji CD3ε, CD3δ i CD3γ lokusi genetski modifikovani da ne eksprimiraju funkcionalne vanćelijske domene endogenih mišjih proteina CD3ε, CD3δ i CD3γ.
2. Genetski modifikovana mišja embrionalna matična ćelija (ES) koja sadrži
na endogenom mišjem CD3ε lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3ε protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24, na endogenom mišjem CD3δ lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3δ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:25, i na endogenom mišjem CD3γ lokusu, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3γ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:26.
3. Miš prema patentnom zahtevu 1 ili ES ćelija miša prema patentnom zahtevu 2,
pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3ε protein zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira odgovarajući endogeni mišji CD3ε protein, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3δ protein zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira odgovarajući endogeni mišji CD3δ protein, i pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3γ protein zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira odgovarajući endogeni mišji CD3γ protein.
4. Mišja ćelija ili mišja ES ćelija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koja je heterozigotna za modifikovane endogene mišje CD3 lokuse.
5. Mišja ćelija ili mišja ES ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koja je homozigotna za modifikovani endogeni mišji CD3 lokus.
6. Postupak izrade genetski modifikovanog miša kako je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3-5, koji sadrži:
a) unošenje u genom embrionalne matične (ES) ćelije miša
na endogenom mišjem CD3ε lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3ε protein koja sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24,
na endogenom mišjem CD3δ lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3δ protein koja sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:25, i
na endogenom mišjem CD3γ lokusu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3γ protein koja sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:26; i
b) generisanje genetski modifikovanog miša iz ćelije, opciono, pri čemu je ćelija pojedinačna ES ćelija, a pojedinačna ES ćelija se uvodi u mišji embrion da bi generisala miša.
7. Postupak za izradu genetički modifikovane ES ćelije miša kako je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 2-5, koji sadrži:
uvođenje u genom ES ćelije
na endogenom mišjem CD3ε lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3ε protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24, na endogenom mišjem CD3δ lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3δ protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:25, i na endogenom mišjem CD3γ lokusu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3γ protein koji sadrži v aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:26.
8. Postupak prema patentnom zahtevu 6 ili 7,
pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3ε protein zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira odgovarajući endogeni mišji CD3ε protein, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3δ protein zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira odgovarajući endogeni mišji CD3δ protein, i pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni humani/mišji CD3γ protein zamenjuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira odgovarajući endogeni mišji CD3γ protein.
9. Model miša za ispitivanje bispecifičnog proteina koji vezuje antigen zasnovan na CD3, pri čemu je protein koji vezuje antigen sposoban da vezuje i CD3 i anti-mišji antigen od interesa, koji sadrži: a) miš čiji je genom genetski modifikovan tako da na površini svojih T ćelija eksprimira funkcionalni humanizovani CD3 kompleks koji sadrži himerne humane/mišje CD3ε, CD3δ i CD3γ proteine,
pri čemu himerni humani/mišji CD3ε protein sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24,
pri čemu himerni humani/mišji CD3δ protein sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:25, i
pri čemu himerni humani/mišji CD3γ protein sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:26, i
b) ćelija koja eksprimira ili sadrži ne-mišji antigen od interesa, opciono gde je antigen od interesa humani antigen od interesa.
10. Postupak skrininga proteina koji vezuje protein koji vezuje humani CD3 i antigen od interesa, koji sadrži:
a. Uvođenje antigena od interesa u genetski modifikovanog miša kako je definisano u jednom od patentnih zahteva 1 i 3-5 ili napravljeno prema postupku iz patentnog zahteva 6 ili 8, b. kontaktiranje miša sa proteinom koji vezuje antigen i
c. utvrđivanje da li je protein koji vezuje antigen efikasan u aktiviranju mišjih T ćelija koje eksprimiraju funkcionalni CD3.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, gde korak uvođenja uključuje genetsku modifikaciju miša da eksprimira antigen od interesa; zaraza miša antigenom od interesa, opciono vršenjem virusne ili bakterijske infekcije; i/ili uvođenje ćelije u pomenutog miša koja eksprimira antigen od interesa.
12. Model miša ili postupak prema patentnom zahtevu 9 ili 11, gde je ćelija tumorska ćelija ili bakterijska ćelija.
13. Model miša ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 9-12, gde je miš imunokompetentni miš.
14. Model ili postupak miša prema bilo kom od zahteva 9-13, gde je antigen od interesa
(a) antigen povezan sa tumorom, koji opciono može biti izabran iz grupe koju čine ALK, BAGE proteini, BIRC5 (survivin), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR varijanta III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, GAGE proteini, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, EBV-izveden LMP2, L1CAM, MAGE proteini, MLANA, MSLN, MUC1,
4
MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteini, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Thompson-nouvelle antigen, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.
(b) antigen zarazne bolesti, koji opciono može biti virusni antigen, kao što je HIV; hepatitis A; hepatitis B; hepatitis C; virus herpesa kao što je HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, i Epstein-Barrov virus; adenovirus; virus influence; flavivirus; echo virus; rinovirus; koksaki virus; korona virus; respiratorni sincicijalni virus; virus zaušnjaka; rotavirus; morbilli virus; virus rubeole; parvovirus; virus vakcinije; HTLV; virus denga; papilomavirus; virus mekušaca; poliovirus; virus besnila; JC virus; virus ebole; i antigen virusa arbovirusnog encefalitisa; ili
(c) bakterijski antigen, koji po izboru može biti hlamidija, rikecija, mikobakterije, stafilokoke, streptokoke, pneumonokoke, meningokoke, gonokoke, klebsiela, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difterija, salmonela, bacili, kolera, tetanus, botulizam, antraks, kuga, leptospira i bakterijski antigen Lajmske bolesti.
15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10-14, gde je protein koji vezuje antigen
a) antitelo, bispecifično antitelo ili bispecifični protein koji vezuje antigen i/ili
b) je sposoban da prepozna majmunski CD3 protein.
16. Postupak prema patentnom zahtevu 12, gde je protein koji vezuje antigen
a) sposoban da smanji, eliminiše ili spreči rast tumora u poređenju sa sredstvom koje ne cilja antigen od interesa i pri čemu korak određivanja opciono sadrži test zapremine tumora ili test ubijanja tumorskih ćelija posredovanih T ćelijama, ili
b) sposoban da smanji, eliminiše ili spreči bakterijsku ili virusnu infekciju u poređenju sa sredstvom koje ne cilja antigen od interesa i pri čemu korak određivanja opciono uključuje merenje titra virusa ili bakterija.
RS20220700A 2014-11-24 2015-11-23 Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks RS63410B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462083653P 2014-11-24 2014-11-24
US201562106999P 2015-01-23 2015-01-23
EP20160251.3A EP3689140B1 (en) 2014-11-24 2015-11-23 Non-human animals expressing humanized cd3 complex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63410B1 true RS63410B1 (sr) 2022-08-31

Family

ID=54849703

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201402A RS61080B1 (sr) 2014-11-24 2015-11-23 Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks
RS20220700A RS63410B1 (sr) 2014-11-24 2015-11-23 Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201402A RS61080B1 (sr) 2014-11-24 2015-11-23 Ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovani cd3 kompleks

Country Status (25)

Country Link
US (4) US20170164588A1 (sr)
EP (3) EP3223605B9 (sr)
JP (5) JP7018314B2 (sr)
KR (2) KR20240055876A (sr)
CN (2) CN113016720B (sr)
AU (2) AU2015353705C9 (sr)
BR (1) BR112017010793A2 (sr)
CA (1) CA2967823A1 (sr)
CY (2) CY1123714T1 (sr)
DK (2) DK3223605T3 (sr)
ES (2) ES2844000T3 (sr)
HR (2) HRP20220904T1 (sr)
HU (2) HUE059417T2 (sr)
IL (2) IL286414B2 (sr)
LT (2) LT3689140T (sr)
MA (1) MA50679A (sr)
MX (1) MX2017006802A (sr)
PL (2) PL3689140T3 (sr)
PT (2) PT3689140T (sr)
RS (2) RS61080B1 (sr)
RU (2) RU2020122439A (sr)
SG (1) SG11201703800PA (sr)
SI (2) SI3223605T1 (sr)
SM (2) SMT202200438T1 (sr)
WO (1) WO2016085889A1 (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2020122439A (ru) * 2014-11-24 2020-09-24 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3
SI3086637T1 (sl) 2014-12-05 2019-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nehumane živali s humaniziranim označevalcem diferenciacije gena CD47
HUE052606T2 (hu) 2014-12-09 2021-05-28 Regeneron Pharma Humanizált differenciációs klaszter 274 génnel rendelkezõ nem humán állatok
WO2017010423A1 (ja) 2015-07-10 2017-01-19 中外製薬株式会社 内因性ｃｄ３遺伝子をヒトｃｄ３遺伝子に置換した非ヒト動物
SG11201803409UA (en) 2015-11-20 2018-05-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
CN109068621B (zh) * 2016-02-29 2021-07-20 再生元制药公司 具有人源化的tmprss基因的啮齿类动物
JP7125347B2 (ja) * 2016-08-22 2022-08-24 中外製薬株式会社 ヒトｇｐｃ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物
EP4484562A3 (en) * 2017-06-27 2025-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus
PT3687287T (pt) * 2017-09-29 2023-11-03 Regeneron Pharma Roedores que expressam complexo c1q humanizado
IL310006A (en) 2017-11-30 2024-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a humanized TRKB locus
WO2019114768A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC CD3e
KR20250121150A (ko) 2018-03-26 2025-08-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제를 시험하기 위한 인간화된 설치류
US10463029B1 (en) * 2018-06-07 2019-11-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent model of steel syndrome
IL278267B2 (en) 2018-07-16 2025-02-01 Regeneron Pharma Non-human animal models of DITRA disease and their uses
CN109355309B (zh) * 2018-10-18 2021-02-05 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种cd3e基因修饰人源化动物模型的构建方法
CN112300265B (zh) * 2019-07-29 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il33基因人源化的非人动物的构建方法和应用
WO2021197448A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd38
CN115803340A (zh) * 2020-04-24 2023-03-14 纪念斯隆凯特琳癌症中心 抗cd3抗体及其用途
WO2022099032A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Bioventures, Llc T cells and bifunctional protein against human papillomavirus
CN112458117B (zh) * 2021-02-02 2021-05-04 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Cd155基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN114621971A (zh) * 2021-02-19 2022-06-14 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 经遗传修饰的非人动物及其构建方法和应用
KR20250151441A (ko) 2023-02-17 2025-10-21 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Cd3/taa 이중특이적 항체에 대해 반응성인 유도된 nk 세포
TW202520975A (zh) 2023-08-09 2025-06-01 英商劍橋企業有限公司 基因改造之囓齒動物及囓齒動物細胞以及其等用途

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69123241T2 (de) * 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
FR2827302B1 (fr) * 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
EP1476547B1 (en) 2002-01-23 2006-12-06 The University of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
EP1344824A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-17 Institut de la Santé et de la Recherche Médicale Mutated gene coding for a LAT protein and the biological applications thereof
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CN1984931B (zh) * 2004-06-03 2012-11-28 诺维莫尼公司 抗-cd3抗体及其使用方法
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
WO2008119565A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain
WO2008119566A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
US8632768B2 (en) * 2008-05-30 2014-01-21 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Human facilitating cells
NZ591087A (en) * 2008-10-01 2012-08-31 Micromet Ag Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
WO2010085660A2 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 Roger Williams Hospital Viral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
ES2738101T3 (es) 2009-07-31 2020-01-20 Smc Global Asset Inc Ratón modelo de esteatohepatitis-cáncer de hígado
US8883496B2 (en) * 2009-12-21 2014-11-11 Regeneron Phamaceuticals, Inc. Humanized FcgR mice
US20110165161A1 (en) * 2009-12-23 2011-07-07 Shih-Yao Lin Anti-epcam antibodies that induce apoptosis of cancer cells and methods using same
SI2770821T1 (en) 2011-10-28 2018-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex of mice
WO2013063556A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-6 and il-6 receptor
LT3424947T (lt) * 2011-10-28 2021-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos t ląstelių receptorių pelės
DK3590332T3 (da) 2011-10-28 2022-05-23 Regeneron Pharma Genmodificerede mus, der eksprimerer kimære major histokompatibilitetskompleks (MHC) II-molekyler
WO2014028776A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Zyngenia, Inc. Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
WO2014030049A2 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Glaxo Group Limited Compositions comprising a single variable domain and camostat mesylate (cm)
WO2014042251A1 (ja) 2012-09-13 2014-03-20 中外製薬株式会社 遺伝子ノックイン非ヒト動物
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
EP2904016B1 (en) * 2012-10-08 2018-11-14 Roche Glycart AG Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
CA2887706C (en) 2012-11-05 2022-08-02 Regeneron Pharmaceuticals Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
KR102714111B1 (ko) 2013-02-20 2024-10-11 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람화된 ｔ-세포 보조-수용체를 발현하는 마우스
PL2958937T3 (pl) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy ekspresjonujące humanizowany główny układ zgodności tkankowej
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
CN103509122B (zh) * 2013-09-23 2015-04-15 武汉友芝友生物制药有限公司 一种cd3抗原及其制备方法和用途
CN105592695B (zh) 2013-09-23 2018-04-10 瑞泽恩制药公司 具有人源化信号调节蛋白基因的非人动物
CA2929846C (en) 2013-11-19 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
HUE051088T2 (hu) 2014-04-08 2021-03-01 Regeneron Pharma Humanizált FC-gamma receptorokkal rendelkezõ nem humán élõlények
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
SG10202002187WA (en) 2014-05-19 2020-04-29 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals expressing human epo
ES2783424T3 (es) 2014-06-19 2020-09-17 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen de muerte celular programada 1 humanizado
RU2020122439A (ru) * 2014-11-24 2020-09-24 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015353705C9 (en) 2022-09-01
CY1125424T1 (el) 2025-05-09
EP4088572A1 (en) 2022-11-16
LT3223605T (lt) 2021-01-11
JP2017536126A (ja) 2017-12-07
US10932455B2 (en) 2021-03-02
PL3223605T3 (pl) 2021-04-19
HUE052603T2 (hu) 2021-05-28
WO2016085889A1 (en) 2016-06-02
JP7269214B2 (ja) 2023-05-08
JP2023101757A (ja) 2023-07-21
EP3223605B1 (en) 2020-10-14
US12419282B2 (en) 2025-09-23
JP2022066476A (ja) 2022-04-28
US20200275642A1 (en) 2020-09-03
JP7591094B2 (ja) 2024-11-27
CY1123714T1 (el) 2022-03-24
AU2015353705C1 (en) 2022-08-11
RS61080B1 (sr) 2020-12-31
CN113016720B (zh) 2023-02-21
JP7524240B2 (ja) 2024-07-29
DK3223605T3 (da) 2020-11-16
PT3223605T (pt) 2020-12-24
RU2017122038A (ru) 2018-12-26
SMT202200438T1 (it) 2023-01-13
RU2017122038A3 (sr) 2019-07-17
RU2020122439A (ru) 2020-09-24
JP2021035397A (ja) 2021-03-04
IL286414A (en) 2021-10-31
IL286414B1 (en) 2023-12-01
US20170164588A1 (en) 2017-06-15
US20240306616A1 (en) 2024-09-19
AU2022202578A1 (en) 2022-05-12
EP3689140A1 (en) 2020-08-05
CN107105633B (zh) 2021-02-12
AU2022202578B2 (en) 2025-06-05
US11937587B2 (en) 2024-03-26
SI3223605T1 (sl) 2021-03-31
CA2967823A1 (en) 2016-06-02
EP3223605A1 (en) 2017-10-04
SG11201703800PA (en) 2017-06-29
SI3689140T1 (sl) 2022-10-28
HRP20220904T1 (hr) 2022-10-14
IL286414B2 (en) 2024-04-01
IL252202A0 (en) 2017-07-31
JP2024114974A (ja) 2024-08-23
MX2017006802A (es) 2018-01-30
RU2726446C2 (ru) 2020-07-14
PT3689140T (pt) 2022-07-27
HRP20201938T1 (hr) 2021-02-05
EP3223605B9 (en) 2021-08-18
LT3689140T (lt) 2022-08-25
IL252202B (en) 2021-10-31
CN113016720A (zh) 2021-06-25
ES2844000T3 (es) 2021-07-21
JP7018314B2 (ja) 2022-02-10
DK3689140T3 (da) 2022-08-01
KR20170120090A (ko) 2017-10-30
KR102659123B1 (ko) 2024-04-22
AU2015353705A1 (en) 2017-06-08
US20210100229A1 (en) 2021-04-08
KR20240055876A (ko) 2024-04-29
PL3689140T3 (pl) 2022-09-05
ES2923775T3 (es) 2022-09-30
CN107105633A (zh) 2017-08-29
MA50679A (fr) 2021-03-17
SMT202100181T1 (it) 2021-05-07
BR112017010793A2 (pt) 2017-12-26
EP3689140B1 (en) 2022-05-11
HUE059417T2 (hu) 2022-11-28
AU2015353705B2 (en) 2022-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7591094B2 (ja) ヒト化ｃｄ３複合体を発現する非ヒト動物
DK2825036T3 (en) Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents to generate them
HK40084561A (en) Non-human animals expressing humanized cd3 complex
HK40034537B (en) Non-human animals expressing humanized cd3 complex
HK40034537A (en) Non-human animals expressing humanized cd3 complex
HK1237589A1 (en) Non-human animals expressing humanized cd3 complex
HK1237589B (en) Non-human animals expressing humanized cd3 complex