RS63419B2 - Sekvenciranje nukleinske kiseline upotrebom afinitetnih reagenasa - Google Patents

Sekvenciranje nukleinske kiseline upotrebom afinitetnih reagenasa

Info

Publication number
RS63419B2
RS63419B2 RS20220695A RSP20220695A RS63419B2 RS 63419 B2 RS63419 B2 RS 63419B2 RS 20220695 A RS20220695 A RS 20220695A RS P20220695 A RSP20220695 A RS P20220695A RS 63419 B2 RS63419 B2 RS 63419B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
affinity
affinity reagent
reversible
nlrt
blocking group
Prior art date
Application number
RS20220695A
Other languages
English (en)
Inventor
Radoje Drmanac
Snezana Drmanac
Handong Li
Xun Xu
Matthew J Callow
Leon Eckhardt
Naibo Yang
Original Assignee
Mgi Tech Co Ltd
Bgi Shenzhen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=62791177&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63419(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Mgi Tech Co Ltd, Bgi Shenzhen filed Critical Mgi Tech Co Ltd
Publication of RS63419B1 publication Critical patent/RS63419B1/sr
Publication of RS63419B2 publication Critical patent/RS63419B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNO POVEZIVANJE SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava zahteva pravo prvenstva prema S.A.D. privremenoj prijavi br.62/442,263, koja je podneta 4. januara 2017. i S.A.D. privremenoj prijavi br. 62/490,511, koja je podneta 26. aprila 2017. godine.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Potreba za jeftinim, visoko-propusnim, postupcima za sekvenciranje i re-sekvenciranje nukleinske kiseline dovela je do razvoja tehnologija "masivnog paralelnog sekvenciranja" (MPS). Jedan uobičajeno upotrebljavani postupak za sekvenciranje DNK označava se kao "sekvenciranje-pomoću-sinteze" (SBS), kao što je objavljeno u Ronaghi et al., Science, 281:363-365, 1998; Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:414-419, 2003; Metzker, Nat Rev Genet. 11:31-46, 2010; Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:19635-19640, 2006; Bentley et al., Nature 456:53-59, 2008; i u S.A.D. patentima br. 6,210,891, 6,828,100, 6,833,246, i 6,911,345 i S.A.D. pat. publ. N2016/0130647.
[0003] SBS zahteva kontrolisano (tj. jedan po jedan) inkorporisanje ispravnog komplementarnog nukleotida nasuprot oligonukleotidu koji se sekvencira. Ovo omogućava tačno sekvenciranje dodavanjem nukleotida u više ciklusa pošto se svaki nukleotidni ostatak sekvencira jedan po jedan, čime se sprečava da se dese nekontrolisane serije inkorporisanja. U jednom pristupu reverzibilni terminator nukleotidi (RT) upotrebljavaju se za određivanje sekvence DNK templata. U najčešće upotrebljavanom SBS pristupu, svaki RT sadrži modifikovani nukleotid koji uključuje (1) blokirajuću grupu koja obezbeđuje da samo jedna baza može biti dodata pomoću enzima DNK polimeraze na 3' kraj rastućeg lanca kopije DNK, i (2) fluorescentni obeleživač koji se može detektovati pomoću kamere. U najčešćim SBS postupcima, templati i prajmeri za sekvenciranje fiksirani su na čvrsti nosač i nosač je izložen svakom od četiri analoga DNK nukleotida, od kojih svaki sadrži različitu fluoroforu prikačenu za azotnu bazu pomoću linkera koji se može isecati, i 3'-O-azidometil grupu na 3'-OH poziciji dezoksiriboze, i DNK polimerazi. Samo ispravna, komplementarna baza se vezuje za cilj i naknadno se inkorporiše na 3' terminus prajmera. Nukleotidi koji nisu inkorporisani se ispiraju i čvrsti nosač se snima. TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin) se introdukuje kako bi se isekao linker i oslobodile fluorofore i kako bi se uklonila 3'-O-azidometil grupa, regenerišući 3'-OH. Ciklus se zatim može ponoviti (Bentley et al., Nature 456, 53-59, 2008). Za svaku od četiri baze upotrebljava se obeleživač drugačije fluorescentne boje, tako da se u svakom ciklusu sekvenciranja identitet RT koji je inkorporisan može identifikovati po njegovoj boji. WO 2014/114665 A1 opisuje postupak sekvenciranja zasnovan na imobilisanoj nukleinskoj kiselini na površini koji može da upotrebljava neobeležene dNTP. WO 03/073088 A2 opisuje senzorski aparat koji upotrebljava tranzistor sa efektom polja osetljiv na jone da detektuje događaje koji se dešavaju tokom hemijske reakcije, navodno omogućavajući praćenje insercija neobeleženih dNTP.
[0004] Uprkos širokoj upotrebi SBS, poboljšanja su i dalje potrebna. Na primer, trenutni SBS postupci zahtevaju skupe reverzibilno terminisane dNTP (RT) sa obeleživačem (npr. bojom) na bazi povezane sa linkerom koji se može isecati što rezultuje a) hemijskim ožiljkom koji ostaje na inkorporisanim bazama posle isecanja obeleživača, b) manje efikasnim inkorporisanjem, c) gašenjem, d) završetkom produžavanja koje je indukovano ekscitovanom bojom, i redukovanim signalom u svakom ciklusu sekvenciranja.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke i kompozicije za analizu i sekvenciranje nukleinske kiseline. Ovde se objavljuje SBS postupak sekvenciranja u kome se poslednja inkorporisana nukleotidna baza identifikuje vezivanjem afinitetnog reagensa (npr. antitelo, aptamer, afimer, „knottin“, itd.) koji prepoznaje bazu i blokirajuću grupu koja se može isecati, u poslednjem inkorporisnom nukleotidu. Vezivanje je direktno ili indirektno asocirano sa proizvodnjom detektabilnog signala. Pri tome, u svim postupcima, DNK čipovima i kompletima prema pronalasku za koji se traži zaštita, koristi se, ili je prisutan, najmanje jedan afinitetni reagens koji se vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupa inkorporisanog nukleotida.
[0006] Kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za izvođenje reakcije sekvenciranja-pomoću-sinteze, navedeni postupak sadrži korake:
(a) obezbeđivanje mnoštva imobilisanih templat nukleinskih kiselina koje sadrže mnoštvo različitih sekvenci;
(b) vezivanje oligonukleotidnih prajmera za templat nukleinske kiseline pri čemu oligonukleotidni prajmeri hibridizuju sa unapred određenim pozicijama na templat nukleinskim kiselinama;
(c) kombinovanje templat nukleinskih kiselina i prajmera koji su vezani za njih sa polimerazom i četiri različita reverzibilna terminator dezoksiribonukleotid trifosfata (dNTP) svaki dezoksiribonukleotid sadrži nukleobazu (N), funkcionalnu grupu šećera, i reverzibilnu blokirajuću grupu,
pri čemu je N adenin (A) ili njegov analog, guanin (G) ili njegov analog, timin (T) ili njegov analog, i citozin (C) ili njegov analog,
pri čemu je barem jedan od navedena četiri različita dNTP neobeležen, pod uslovima u kojima se mnoštvo oligonukleotidnih prajmera produžava inkorporisanjem jednog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida kako bi se proizvelo mnoštvo proizvoda produžetka prajmera, od kojih neki sadrže A ili A' inkorporisan na 3' terminusu, od kojih neki sadrže T ili T' inkorporisan na 3' terminusu, od kojih neki sadrže G ili G' inkorporisan na 3' terminusu, i od kojih neki sadrže C ili C' inkorporisan na 3' terminusu;
(d) dovođenje u kontakt mnoštva proizvoda produžetka prajmera sa jednim ili više prvih afinitetnih reagenasa pod uslovima u kojima se svaki od navedenih jednog ili više prvih afinitetnih reagenasa vezuje za samo jedan od četiri različita inkorporisana reverzibilna terminator dezoksiribonukleotida, pri čemu se prvi afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu navedenog jednog od četiri različita inkorporisana reverzibilna terminator dezoksiribonukleotida;
(e) detektovanje vezivanja jednog ili više prvih afinitetnih reagenasa, pri čemu vezivanje prvog afinitetnog reagensa za proizvod produžetka prajmera koji sadrži inkorporisani reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid identifikuje nukleobazu inkorporisanog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida i nukleobazu komplementarnog dezoksiribonukleotida u templatu.
[0007] Kao što je definisano u patentnom zahtevu 20, predmetni pronalazak obezbeđuje DNK čip koji sadrži:
različite templat DNK molekule imobilisane na različitim lokacijama na čipu, pri čemu mnoštvo templat DNK molekula sadrži komplementarne proizvode produžetka prajmera koji su vezani na njih
pri čemu proizvodi produžetka prajmera sadrže 3' reverzibilne terminator dezoksiribonukleotide koji sadrže A, T, G ili C nukleobaze ili njihove analoge; i afinitetni reagens specifično vezan za barem neke od reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida.
[0008] Kao što je definisano u patentnom zahtevu 22, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži (i) prvi afinitetni reagens koji vezuje prvi reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži prvu nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog i (ii) drugi afinitetni reagens koji vezuje drugi reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži drugu nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog, pri čemu su prva i druga nukleobaza različite, i pri čemu komplet opciono sadrži (iii) treći afinitetni reagens koji vezuje treći reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži treću nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog, pri čemu su prva, druga i treća nukleobaza međusobno različite, i pri čemu komplet opciono dodatno sadrži (iv) četvrti afinitetni reagens koji vezuje četvrti reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži četvrtu nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog, pri čemu su prva, druga, treća i četvrta nukleobaza međusobno različite; pri čemu se svaki afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida za koji se vezuje.
[0009] U skladu sa jednim primerom izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke sekvenciranja koji koriste neobeležene reverzibilne terminator (NLRT) nukleotide. Reverzibilni terminator (RT) nukleotid je modifikovani dezoksinukleotid trifosfat (dNTP) ili analog dNTP koji sadrži blokirajuću grupu koja se može ukloniti koja osigurava da samo jedna baza može biti dodata pomoću enzima DNK polimeraze na 3' kraj rastućeg lanca kopije DNK. Kao što je dobro poznato, inkorporisanje dNTP (2'-dezoksinukleozid trifosfata) na 3' kraj rastućeg lanca tokom sinteze DNK uključuje oslobađanje pirofosfata, i kada se dNTP inkorporiše u DNK lanac inkorporisani deo je nukleotid monofosfat (ili preciznije, nukleotidni monomer povezan fosfodiestarskom vezom(ama) za jedan ili dva susedna nukleotidna monomera). Reverzibilni terminator (RT) nukleotid je modifikovani dezoksinukleotid trifosfat (dNTP) ili analog dNTP koji sadrži blokirajuću grupu koja se može ukloniti koja osigurava da samo jedna baza može biti dodata pomoću enzima DNK polimeraze na 3' kraj rastućeg lanca kopije DNK. Neobeleženi RT nukleotid ne sadrži detektabilni obeleživač. U svakom ciklusu sekvenciranja, nukleotid ili nukleotidni analog se inkorporiše pomoću polimeraze, produžavajući 3' kraj lanca kopije DNK za jednu bazu, i neinkorporisani nukleotidi ili analozi nukleotida se ispiraju. Introdukuje se afinitetni reagens koji specifično prepoznaje i vezuje se za epitop(e) novoinkorporisanih nukleotida ili analoga nukleotida. Posle snimanja slike, blokirajuća grupa i obeleženi afinitetni reagens se uklanjaju sa DNK, omogućavajući da započne sledeći ciklus sekvenciranja. U nekim primerima izvođenja, epitop prepoznat od strane afinitetnog reagensa formiran je od samog inkorporisanog nukleozida (to jest, baza plus šećer) ili nukleozida i 3' blokirajuće grupe. U nekim primerima izvođenja, epitop prepoznat od strane afinitetnog reagensa formiran je od samog reverzibilnog terminatora, reverzibilnog terminatora u kombinaciji sa dezoksiribozom, ili reverzibilnog terminatora u kombinaciji sa nukleobazom ili nukleobazom i dezoksiribozom.
[0010] Kao što je definisano u patentnom zahtevu 15, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za sekvenciranje nukleinske kiseline, koji sadrži:
(a) obezbeđivanje DNK čipa koji sadrži (i) mnoštvo templat DNK molekula, pri čemu svaki templat DNK molekul sadrži vezujuće mesto prajmera i fragment nukleinske kiseline, pri čemu je svaki od navedenog mnoštva templat DNK molekula prikačen na poziciji čipa,
(b) dovođenje u kontakt DNK čipa sa prajmerom nukleinske kiseline komplementarnim sa vezujućim mestom prajmera, polimerazom, i neobeleženim reverzibilnim terminator nukleotidom (RT) Formule I:
pri čemu
R1je 3'-O reverzibilna blokirajuća grupa;
R2je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), timina (T), i njihovih analoga; i
R3se sastoji od jednog ili više fosfata;
pod uslovima pri čemu prajmer hibridizuje sa vezujućim mestima prajmera templat DNK molekula i pri čemu se barem neki hibridizovani prajmeri produžavaju da inkorporišu neobeleženi RT u sekvencu komplementarnu templat DNK molekulu, čime se proizvode neobeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT;
(c) dovođenje u kontakt neobeleženih proizvoda produžetka sa afinitetnim reagensom pod uslovima pri čemu se afinitetni reagens specifično vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu inkorporisanog RT, pri čemu je afinitetni reagens direktno ili indirektno asociran sa detektabilnim obeleživačem kako bi se proizveli obeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; i
(d) identifikovanje RT u obeleženim proizvodima produžetka kako bi se identifikovao barem deo sekvence navedene nukleinske kiseline.
[0011] U dNTP analozima koji se uobičajeno upotrebljavaju za sekvenciranje pomoću sinteze, nukleobaza je konjugovana za linker koji se može isecati koji spaja bazu sa detektabilnim obeleživačem kao što je fluorofora. Videti, npr. S.A.D. pat. publ.
2002/0227131. Nasuprot tome, u dNTP analozima iz predmetnog pronalaska generalno R2nije nukleobaza konjugovana za boju ili drugi detektabilni obeleživač pomoću linkera.
[0012] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, takav postupak dodatno sadrži (e) uklanjanje reverzibilne blokirajuće grupe sa RT kako bi se proizveo 3'-OH; i (f) uklanjanje afinitetnog reagensa sa RT.
[0013] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, takav postupak dodatno sadrži ponavljanje koraka postupka jednom ili više puta, to jest, izvođenje više ciklusa sekvenciranja, pri čemu je određen barem deo sekvence navedene templat nukleinske kiseline.
[0014] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, takav postupak sadrži uklanjanje reverzibilne blokirajuće grupe i afinitetnog reagensa u istoj reakciji.
[0015] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, takav postupak sadrži uklanjanje afinitetnog reagensa(asa) bez uklanjanja reverzibilne blokirajuće grupe(a) i ponovno ispitivanje sa različitim afinitetnim reagensima.
[0016] U takvim postupcima, afinitetni reagens može uključivati antitela (uključujući vezujuće fragmente antitela, jednolančana antitela, bispecifična antitela, i slično), aptamere, „knottins“, afimere, ili bilo koji drugi poznati agens koji vezuje inkorporisani NLRT sa pogodnom specifičnošću i afinitetom. U jednom primeru izvođenja, afinitetni reagens je antitelo. U sledećem primeru izvođenja, afinitetni reagens je antitelo koje sadrži detektabilni obeleživač koji je fluorescentni obeleživač.
[0017] U skladu sa jednim primerom izvođenja, R1je odabran iz grupe koja se sastoji od alila, azidometila, aminoalkoksila, 2-cijanoetila, supstituisanog alkila, nesupstituisanog alkila, supstituisanog alkenila, nesupstituisanog alkenila, supstituisanog alkinila, nesupstituisanog alkinila, supstituisanog heteroalkila, nesupstituisanog heteroalkila, supstituisanog heteroalkenila, nesupstituisanog heteroalkenila, supstituisanog heteroalkinila, nesupstituisanog heteroalkinila, alenila, cis-cijanoetenila, trans-cijanoetenila, ciscijanofluoroetenila, trans-cijanofluoroetenila, cis-trifluorometiletenila, transtrifluorometiletenila, biscijanoetenila, bisfluoroetenila, cis-propenila, trans-propenila, nitroetenila, acetoetenila, metilkarbonoetenila, amidoetenila, metilsulfonoetenila, metilsulfonoetila, formimidata, formhidroksimata, viniloetenila, etilenoetenila, cijanoetilenila, nitroetilenila, amidoetilenila, amino, cijanoetenila, cijanoetila, alkoksi, acila, metoksimetila, aminoksila, karbonila, nitrobenzila, kumarinila, i nitronaftalenila.
[0018] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, R2je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), i timina (T).
[0019] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, R3se sastoji od ili sadrži jedan ili više fosfata.
[0020] Termin neobeleženi reverzibilni terminator (NLRT) može označavati trifosfatni oblik nukleotidnog analoga, ili može označavati inkorporisani NLRT.
[0021] U skladu sa sledećim primerom izvođenja pronalaska, obezbeđeni se postupci za sekvenciranje nukleinske kiseline, koji sadrže: (a) obezbeđivanje DNK čipa koji sadrži (i) mnoštvo templat DNK molekula, svaki templat DNK molekul sadrži fragment nukleinske kiseline, pri čemu je svaki od navedenog mnoštva templat DNK molekula prikačen na poziciji čipa, (b) dovođenje u kontakt DNK čipa sa prajmerom nukleinske kiseline komplementarnim delu svakog od navedenih templat DNK molekula, polimerazom, i neobeleženim RT Formule I:
pri čemu: R1je 3'-O reverzibilna blokirajuća grupa; R2je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), timina (T), i njihovih analoga; i R3se sastoji od ili sadrži jedan ili više fosfata; pod uslovima pri čemu se prajmer produžava da inkorporiše neobeleženi RT u sekvencu komplementarnu barem nekom od navedenog mnoštva navedenih templat DNK molekula, čime se proizvode neobeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; (c) dovođenje u kontakt neobeleženih proizvoda produžetka sa afinitetnim reagensom koji sadrži detektabilni obeleživač pod uslovima pri čemu se afinitetni reagens specifično vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu u RT kako bi se proizveli obeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; i (d) identifikovanje RT u obeleženim proizvodima produžetka kako bi se identifikovao barem deo sekvence navedene nukleinske kiseline.
[0022] U skladu sa jednim primerom izvođenja pronalaska, takav postupak sadrži: (b) dovođenje u kontakt DNK čipa sa prajmerom nukleinske kiseline komplementarnim delu svakog od navedenih templat DNK molekula, polimerazom, i skupom neobeleženih RT Formule I koji sadrži prvi RT u kome je R2A, drugi RT u kome je R2T, treći RT u kome je R2C, i četvrti RT u kome je R2G, pod uslovima u kojima se prajmer produžava da inkorporiše neobeležene RT u sekvence komplementarne barem nekim od navedenog mnoštva navedenih templat DNK molekula, čime se proizvode neobeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; (c) dovođenje u kontakt neobeleženih proizvoda produžetka sa skupom afinitetnih reagenasa pod uslovima u kojima se skup afinitetnih reagenasa specifično vezuje za inkorporisane RT kako bi se proizveli obeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT, pri čemu: (i) skup afinitetnih reagenasa sadrži prvi afinitetni reagens koji se specifično vezuje za prvi RT, drugi afinitetni reagens koji se specifično vezuje za drugi RT, treći afinitetni reagens koji se specifično vezuje za treći RT, i, opciono, četvrti afinitetni reagens koji se specifično vezuje za četvrti RT; pri čemu se najmanje jedan afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu u RT za koji se vezuje (ii) svaki od navedenog prvog, drugog, i trećeg afinitetnog reagensa sadrži detektabilni obeleživač; i (d) identifikovanje RT u obeleženim proizvodima produžetka identifikovanjem obeleživača afinitetnog reagensa vezanog za RT na njihovim respektivnim pozicijama na čipu kako bi se identifikovao barem deo (npr. jedna baza po ciklusu) sekvence navedene nukleinske kiseline. U skladu sa srodnim primerom izvođenja, svaki od navedenog prvog, drugog, trećeg i četvrtog afinitetnog reagensa sadrži detektabilni obeleživač. U skladu sa sledećim srodnim primerom izvođenja, svaki od navedenog prvog, drugog, i trećeg afinitetnog reagensa sadrži različiti detektabilni obeleživač. U skladu sa sledećim srodnim primerom izvođenja, svaki od prvog, drugog, i trećeg afinitetnog reagensa sadrži isti obeleživač (npr. istu fluoroforu(e)) u različitim količinama, što rezultuje signalima različitog intenziteta. U skladu sa sledećim primerom izvođenja, afinitetni reagensi vezani za inkorporisane RT nisu direktno obeleženi već su indirektno obeleženi upotrebom sekundarnih afinitetnih reagenasa.
[0023] U skladu sa sledećim primerom izvođenja predmetnog pronalaska, obezbeđeni su DNK čipovi. Takvi čipovi sadrže: mnoštvo templat DNK molekula, svaki DNK molekul prikačen na poziciji čipa, komplementarnu DNK sekvencu bazno-sparenu sa delom templat DNK molekula na više pozicija, pri čemu komplementarna DNK sekvenca sadrži na svom 3' kraju inkorporisani RT; i afinitetni reagens specifično prikačen za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu barem nekih od RT, afinitetni reagens sadrži detektabilni obeleživač koji identifikuje RT za koji je prikačen.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0024]
Slika 1 je dijagram toka koji ilustruje primer postupka sekvenciranja iz pronalaska. Slika 2 je dijagram toka koji ilustruje primer bojenja antitelom procesa pokazanog na Slici 1.
Slika 3 pokazuje primere NLRT struktura: Sl. 3A 3'-O-azidometil-2'-dezoksiguanin; Sl.
3B 3'-O-amino-2'-dezoksiguanin; Sl. 3C 3'-O-cijanoetilen-2'-dezoksiguanin; Sl. 3D 3’-O-fosfo; Sl. 3E: 3'-etildisulfid-metilen-2'-dezoksitimin.
Slika 4 ilustruje različite blokirajuće grupe koje se mogu upotrebljavati u praksi pronalaska. Na Slici 4, " " označava tačku prikačinjanja molekula za ostatak strukture. Slika 5 ilustruje sintezu aktivnog estra 3’-O-azidometil-2’-dezoksiguanina (G4).
Slika 6 ilustruje sintezu aktivnog estra 3’-O-azidometil-2’- (C8)
Slika 7 ilustruje sintezu aktivnog estra 3’-O-azidometil-2’-dezoksiadenina (A12).
Slika 8 ilustruje sintezu aktivnog estra 3’-O-azidometil-2’-dezoksitimina (T16).
Slika 9 ilustruje (upotrebom 3'-O-azidometil-2'-dezoksicitozina) konjugaciju 3'-O-azidometil-dC-NHS estra za BSA, KHL i agaroznu smolu za upotrebu kao imunogen, monitor titra, i supstrat za afinitetno prečišćavanje.
Slike 10A i 10B pokazuju Rho za 5 i 10 ciklusa sekvenciranja upotrebom tri obeležena RT i jednog NLRT.
Slike 10C i 10D prikazuju odnose signal-šum (SNR) za 5 i 10 ciklusa sekvenciranja upotrebom tri obeležena RT i jednog NLRT.
Slike 11A i 11B ilustruju metriku podataka sekvenciranja dobijenu upotrebom BGISEQ-1000 DNK sekvencera sa neobeleženim 3'-azidometil-dGTP detektovanim anti-3'-azidometil-dG zečjim primarnim antitelom i anti-zečjim AF647 fragment sekundarnim antitelom za 50 ciklusa sekvenciranja-pomoću-sinteze.
Slike 12A i 12B ilustruju rezultate iz 25 ciklusa sekvenciranja genomske DNK E. coli na BGISEQ-500 instrumentu upotrebom fluorescentnih direktno obeleženih antiazidometil-baza antitela.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
1. Pregled
[0025] U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke i kompozicije za sekvenciranje-pomoću-sinteze (SBS) ili kombinatorno proba sidro sekvenciranje (cPAS) nukleinskih kiselina koje koriste neobeležene reverzibilne terminator nukleotide. U jednom pristupu, SBS se izvodi proizvodnjom imobilisanih jednolančanih templat DNK na pozicijama na čipu. U većini pristupa, svaka imobilisana jednolančana templat DNK je na poziciji sa velikim brojem kopija (npr. amplikona) slične sekvence. Na primer, most PCR (bridge PCR) se može upotrebljavati za generisanje klastera templat sekvenci na poziciji na čipu (Illumina), ili se replikacija mehanizmom kotrljajućeg kruga („rolling circle replication“) može upotrebljavati za generisanje jednolančanog konkatemera, ili DNK nanolopte (DNB), sa mnogo kopija templat sekvenci (Complete Genomics, Inc.). SBS se izvodi hibridizacijom jednog ili više prajmera sa templat DNK i produžavanjem prajmera kako bi se proizveo produženi prajmer, ili rastući DNK lanac (GDS). Produžavanje prajmera označava adiciju ("inkorporacija" ili "inkorporisanje") nukleotida na 3' kraju prajmera DNK lanca dok je hibridizovan sa templatom. Nukleotid inkorporisan na 3' terminusu je komplementaran odgovarajućem nukleotidu prajmera tako da se određivanjem identiteta inkorporisanog nukleotida u svakom ciklusu sekvenciranja može odrediti nukleotidna sekvenca templata.
[0026] U jednom pristupu iz stanja tehnike, obeleženi analozi nukleotida su inkorporisani u GDS. Generalno obeleženi analozi nukleotida sadrže blokirajuću grupu koja osigurava da se samo jedan nukleotid po koraku može inkorporisati i boju (tipično fluorescentna boja) koja je prikačena za nukleotid putem linkera koji se može isecati. Svaki ciklus sekvenciranja obuhvata inkorporisanje obeleženog analoga nukleotida na kraju GDS, detektovanje obeleživača inkorporisanog obeleženog analoga nukleotida, uklanjanje obeleživača sa inkorporisanog analoga nukleotida, i uklanjanje blokirajuće grupe sa inkorporisanog analoga nukleotida kako bi se omogućilo inkorporisanje novog obeleženog analoga nukleotida. Nasuprot tome, predmetni pronalazak ne zahteva obeležene analoge nukleotida koji uključuju boju koja je prikačena za bazu ili šećer putem linkera koji se može isecati.
[0027] U alternativnom pristupu koji je opisan u S.A.D. pat. publ. US 2017/0240961, analog nukleotida, kada je inkorporisan, sadrži afinitetnu oznaku prikačenu putem linkera za nukleotid. Afinitetna oznaka je jedan član specifično vezujućeg para (SBP). U jednom pristupu afinitetna oznaka je biotin. Posle inkorporisanja inkorporisani nukleotid je izložen afinitetnom reagensu koji sadrži drugi član SBP (npr. streptavidin) i detektabilni obeleživač. Detektabilni obeleživač se detektuje kako bi se identifikovao inkorporisani nukleotid. Nakon detekcije, inkorporisani analog nukleotida-afinitetni reagens kompleks se tretira kako bi se isekao linker i oslobodio detektabilni obeleživač. U jednom pristupu afinitetna oznaka je antigen i afinitetni reagens je fluorescentno obeleženo antitelo koje specifično vezuje antigen. Nasuprot tome, predmetni pronalazak ne zahteva afinitetnu oznaku i koristi, u nekim aspektima, afinitetni reagens koji vezuje nukleobazu, funkcionalnu grupu šećera, blokirajuću grupu koja se može isecati ili njihovu kombinaciju, pre nego afinitetnu oznaku.
[0028] U skladu sa jednim aspektom postupka koji je ovde objavljen, neobeleženi reverzibilni terminator, tj. analog nukleotida koji uključuje reverzibilni terminator ili blokirajuću grupu (neobeleženi reverzibilni terminator, ili NLRT), inkorporisan je na 3' terminusu GDS, i zatim se izlaže afinitetnom reagensu (npr. antitelu) koje se specifično vezuje za inkorporisani NLRT ("događaj vezivanja"). Posle detekcije događaja vezivanja, afinitetni reagens se uklanja. U jednom pristupu, analog nukleotida koji sadrži reverzibilnu blokirajuću grupu inkorporisan je na 3ꞌ terminusu GDS, i posle detekcije događaja vezivanja, reverzibilna blokirajuća grupa i afinitetni reagens se uklanjaju, opciono u istom koraku. U ovom pristupu, svaki ciklus sekvenciranja uključuje: (i) inkorporisanje NLRT koji sadrži blokirajuću grupu pomoću DNK polimeraze, nakon čega sledi ispiranje neinkorporisanog(ih) NLRT; (ii) dovođenje u kontakt inkorporisanog analoga nukleotida sa obeleženim afinitetnim reagensom koji prepoznaje i specifično se vezuje za inkorporisani NLRT; (iii) detekciju vezivanja afinitetnog reagensa; (iv) uklanjanje blokirajuće grupe na način koji omogućava inkorporisanje dodatnog analoga nukleotida (npr. proizvodi hidroksilnu grupu na 3ꞌ poziciji dezoksiriboze), i (v) uklanjanje afinitetnog reagensa. Ovaj korak može biti praćen novim ciklusom ili ciklusima u kojima se inkorporiše i detektuje novi analog nukleotida. Afinitetni reagens (npr. antitelo) može biti direktno obeleženo (npr. fluorescentno obeleženo antitelo) ili može biti detektovano indirektno (npr. vezivanjem obeleženog anti-afinitetni reagens sekundarnog afinitetnog reagensa). Stoga, ceniće se da "obeleženi afinitetni reagens" može biti direktno obeležen pomoću, na primer, konjugacije sa fluoroforom, ili indirektno obeležen.
[0029] U sledećem pristupu, analog nukleotida koji sadrži reverzibilnu blokirajuću grupu inkorporisan je na 3' terminusu GDS, i posle detekcije događaja vezivanja, reverzibilna blokirajuća grupa i afinitetni reagens se uklanjaju. U ovom pristupu, svaki ciklus sekvenciranja uključuje: (i) inkorporisanje NLRT koji sadrži blokirajuću grupu pomoću DNK polimeraze, opciono praćeno ispiranjem neinkorporisanog(ih) NLRT; (ii) uklanjanje blokirajuće grupe na način koji regeneriše hidroksi (OH) grupu na 3' poziciji dezoksiribonukleotida; (iii) uklanjanje blokirajuće grupe omogućava inkorporisanje dodatnog analoga nukleotida (npr. proizvodi hidroksilnu grupu na 3' poziciji dezoksiriboze) dovodeći u kontakt inkorporisani analog nukleotida sa obeleženim afinitetnim reagensom koji prepoznaje i specifično se vezuje za inkorporisani NLRT; (iii) detekciju vezivanja afinitetnog reagensa; i (v) uklanjanje afinitetnog reagensa. Ovaj korak može biti praćen novim ciklusom ili ciklusima u kojima se inkorporiše i detektuje novi analog nukleotida. Afinitetni reagens (npr. antitelo) može biti direktno obeleženo (npr. fluorescentno obeleženo antitelo) ili može biti detektovano indirektno (npr. vezivanjem obeleženog anti-afinitetni reagens sekundarnog afinitetnog reagensa). Stoga, ceniće se da "obeleženi afinitetni reagens" može biti direktno obeležen pomoću, na primer, konjugacije sa fluoroforom, ili indirektno obeležen.
[0030] SBS uključuje dva ili više ciklusa produžetka prajmera u kojima je nukleotid inkorporisan na 3' terminusu produženog prajmera. Predmetni pronalazak upotrebljava afinitetne reagense, kao što su antitela, da (i) detektuje nukleotid inkorporisan na 3' terminusu produženog prajmera ("3' terminusni nukleotid") i (ii) identifikuje nukleobazu tog 3' terminusnog nukleotida i razlikuje jednu nukleobazu od druge (npr. A od G). Bez namere da budemo vezani određenim mehanizmom, ovo je moguće zato što je svaki afinitetni reagens dizajniran da razlikuje 3' terminusni nukleotid od drugih, "unutrašnjih" nukleotida produženog prajmera, čak i kada 3' terminusni nukleotid i unutrašnji nukleotidi sadrže istu nukleobazu. Svaki afinitetni reagens (ili u nekim slučajevima kombinacija afinitetnih reagenasa) je takođe dizajniran da detektuje svojstva 3' terminusnog nukleotida koja identifikuju nukleobazu asociranu sa 3' terminusnim nukleotidom. Za izvođenje ovih i drugih koraka obezbeđene su brojne strategije, postupci, i materijali. Ovaj odeljak obezbeđuje pregled u kom su mnoge varijacije izostavljene, i ne treba ga smatrati ograničavajućim na bilo koji način.
[0031] U nekim pristupima, SBS reakcije iz pronalaska izvode se upotrebom nukleotida sa 3' reverzibilnim terminator funkcionalnim grupama. U ovim pristupima, inkorporisani 3' terminusni nukleotid se razlikuje od unutrašnjih nukleotida na osnovu prisustva reverzibilne terminator funkcionalne grupe. Stoga, afinitetni reagens koji se vezuje za reverzibilnu terminator funkcionalnu grupu u produženom prajmeru vezuje se za (i time detektuje) 3' terminusni nukleotid, što ga razlikuje od unutrašnjih nukleotida. U drugačijem pristupu inkorporisani 3' teminusni nukleotid se razlikuje od unutrašnjih nukleotida na osnovu prisustva slobodne 3'-OH (hidroksi) grupe koja nije prisutna na unutrašnjim nukleotidima. Stoga, afinitetni reagens koji se vezuje za slobodnu 3'-OH grupu u produženom prajmeru vezuje se za 3' teminusni nukleotid i vezuje se za (i time detektuje) 3' teminusni nukleotid, što ga razlikuje od unutrašnjih nukleotida. U nekim pristupima, slobodna 3'-OH grupa se generiše isecanjem reverzibilnog terminatora u inkorporisanom analogu nukleotida. U sledećem pristupu, slobodna 3'-OH grupa je rezultat inkorporisanja nukleotida koji ne sadrži reverzibilnu terminator funkcionalnu grupu, kao što je nukleotid koji se javlja u prirodi. U dodatnom pristupu, koji se može kombinovati sa bilo kojim od dva prethodno opisana pristupa, inkorporisani 3' teminusni nukleotid se razlikuje od unutrašnjih nukleotida na osnovu drugih strukturnih razlika karakterističnih za 3' teminusni nukleotid uključujući, ali ne ograničavajući se na, veću dostupnost afinitetnog reagensa dezoksiriboznom šećeru 3' teminusnog nukleotida u odnosu na dezoksiribozu unutrašnjih nukleotida, veću dostupnost afinitetnog reagensa nukleobazi 3' teminusnog nukleotida afinitetnom reagensu u odnosu na dezoksiribozu unutrašnjih nukleotida, i druge molekulske i konformacione razlike između 3' teminusnog nukleotida i unutrašnjih nukleozida.
[0032] Stoga, u aspektu predmetnog pronalaska, i kao što je opisano u Primerima u nastavku, afinitetni reagensi se upotrebljavaju za detektovanje ovih strukturnih razlika između 3' terminusnog nukleotida produženog prajmera i drugih nukleotida.
[0033] Takođe su obezbeđene brojne strategije, postupci i materijali za detektovanje svojstava 3ꞌ teminusnog nukleotida koji identifikuju nukleobazu 3ꞌ teminusnog nukleotida. U jednom pristupu, nukleotidi koji se javljaju u prirodi, ili analozi nukleotida koji sadrže nukleobaze koje se javljaju u prirodi (npr. A, T, C i G), upotrebljavaju se u reakciji sekvenciranja i inkorporišu se u proizvod produžetka prajmera. Afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za jednu nukleobazu (npr. A) i razlikuju tu nukleobazu od drugih za koje se ne vezuju (npr. T, C i G) upotrebljavaju se za identifikaciju nukleobaze 3' teminusnog nukleotida. U sledećem pristupu, analozi nukleotida koji sadrže modifikovane (tj. koje se ne javljaju u prirodi) nukleobaze upotrebljavaju se u reakciji sekvenciranja i inkorporišu se u proizvod produžetka prajmera. Afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za jednu modifikovanu nukleobazu (npr. modifikovani A) i razlikuju tu modifikovanu nukleobazu od drugih modifikovanih ili prirodnih nukleobaza. Afinitetni reagens koji se specifično vezuje za modifikovanu nukleobazu generalno prepoznaje modifikaciju, tako da se vezivanje za modifikovanu nukleobazu razlikuje od vezivanja za nukleobazu bez modifikacije koja se javlja u prirodi. Na primer, afinitetni reagens koji se vezuje za analog adenozina u kome je azot na poziciji 7 (N<7>) zamenjen metilovanim ugljenikom (videti Strukturu XV, u nastavku) možda se ne vezuje za adenozinsku nukleobazu koja se javlja u prirodi (nemodifikovanu), ili se može vezati sa manjim afinitetom. Bez namere da budemo vezani određenim mehanizmom, veruje se da afinitetni reagens koji specifično prepoznaje modifikovanu funkcionalnu grupu (u ovom slučaju modifikovanu nukleobazu) to čini vezivanjem modifikovanog svojstva (u ovom slučaju, deo modifikovanog adenozina koji sadrži metilovani ugljenik). Drugačije rečeno, afinitetni reagens vezuje epitop koji uključuje metilovani ugljenik. Razumeće se da afinitetni reagens takođe vezuje druge delove inkorporisanog nukleotida.
[0034] U još jednom pristupu, nukleotidi sa 3' reverzibilnim blokirajućim grupama (reverzibilni terminator nukleotidi) inkorporisani su u proizvod produžetka prajmera. Blokirajuće grupe se uklanjaju u svakom ciklusu sekvenciranja, tako da samo poslednji inkorporisani nukleotid proizvoda produžetka prajmera sadrži blokirajuću grupu. U ovom pristupu se upotrebljavaju afinitetni reagensi koji vezuju blokirajuće grupe. U ovom pristupu, barem dva analoga nukleotida (tj. sa različitim nukleobazama) upotrebljena u reakciji sekvenciranja sadrže različite blokirajuće grupe. Ilustracije radi, upotrebom prve blokirajuće grupe (npr.3'-O-azidometil) za nukleotid koji sadrži adenin ili analog adenina, druge, različite blokirajuće grupe (npr. 3'-O-cijanoetilen) za nukleotid koji sadrži guanin ili analog guanina, itd., specifičnost afinitetnog reagensa će identifikovati asociranu nukleobazu. Na primer, produženje prethodne ilustracije, ukoliko je 3' terminusni nukleotid prepoznat od strane afinitetnog reagensa specifičnog za 3'-O-cijanoetilen, to ukazuje da je asocirana nukleobaza guanin ili analog guanina i da je baza templata na ovoj poziciji citozin. U varijaciji ovog pristupa mogu se upotrebljavati blokirajuće grupe koje se razlikuju samo po malom svojstvu, i afinitetni reagens vezuje epitop koji uključuje prepoznatljivo malo svojstvo.
[0035] Kao što je ovde opisano u nastavku, u jednom aspektu predmetnog pronalaska, upotrebljavaju se afinitetni reagensi koji prepoznaju i specifično se vezuju za nukleotide ili analoge nukleotida na osnovu kombinacije strukturnih svojstava (npr. afinitetni reagens koji prepoznaje određenu blokirajuću grupu i specifičnu nukleobazu sa određenim modifikacijama). U ovom aspektu, nukleotidi ili analozi nukleotida su dizajnirani i/ili odabrani za svojstvo da mogu biti prepoznati od strane specifičnog afinitetnog reagensa. U nekim slučajevima, afinitetni reagens koji vezuje više strukturnih svojstava ima prednost jačeg i specifičnijeg vezivanja afinitetnog reagensa. TABELA A, u nastavku, je neiscrpna zbirka primera strukturnih razlika koje mogu biti prepoznate od strane afinitetnog reagensa kako bi se razlikovali nukleotidi koji imaju različite nukleobaze (2. kolona) i funkcionalne grupe u poslednjem inkorporisanom nukleotidu koje mogu biti vezane od strane afinitetnog reagensa kako bi se obezbedila dovoljna efikasnost vezivanja i/ili koja razlikuje poslednji inkorporisani nukleotid od unutrašnjih nukleotida na osnovu tih svojstava (3. kolona).
TABELA A
[0036] Kao što se detaljno diskutuje u nastavku, deo inkorporisanog analoga nukleotida za koji se vezuje obeleženi afinitetni reagens može uključivati, na primer i bez ograničenja, nukleobazu i blokirajuću grupu, ili nukleobazu i/ili blokirajuću grupu u kombinaciji sa funkcionalnom grupom šećera analoga nukleotida; pri čemu se najmanje jedan afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu inkorporisanog analoga nukleotida. Videti Tabelu A. Vezivanje obeleženog afinitetnog reagensa može zavisiti od pozicije ciljnog nukleotida, npr. razlikovanja između analoga nukleotida koji ima blokirajuću grupu na 3ꞌ terminusu GDS, i sličnog analoga nukleotida (kom nedostaje blokirajuća grupa) koji je lociran unutar ili interno u GDS. Vezivanje obeleženog afinitetnog reagensa takođe zavisi od same nukleobaze, tako da se afinitetni reagensi vezuju za jedan ciljni NLRT (npr. NLRT-A) koji je inkorporisan na kraju GDS na jednoj poziciji na čipu, ali ne i za druge NLRT (npr. NLRT-C, -T, ili -G) koji su inkorporisani na kraju GDS na različitoj poziciji na čipu.
[0037] Predmetni pronalazak ima prednosti u odnosu na druge SBS postupke. Uklanjanje obeleženog afinitetnog reagensa ne ostavlja za sobom hemijski "ožiljak" koji rezultira od grupa koje su ostale prikačene za dNTP posle isecanja linkera. Ovo je korisno zato što takvi "ožiljci" mogu redukovati efikasnost inkorporisanja dNTP pomoću polimeraze. Pored toga, u ovom pristupu afinitetni reagens može uključivati više fluorescentnih funkcionalnih grupa i obezbediti jači signal od jedne fluorescentne boje koja je prikačena za dNTP u skladu sa uobičajeno upotrebljavanim postupcima. Ovaj pristup takođe može prouzrokovati manje fotooštećenja, pošto se može upotrebljavati niža snaga ekscitacije ili kraće vreme ekspozicije. Očekuje se da će pristup koji je ovde objavljen omogućiti duža očitavanja (npr. očitavanja koja su duža od 500 baza, ili duža od 1000 baza) i/ili tačnija očitavanja duža od 50, 100 ili 200 baza, (npr. sa manje grešaka od jedne u 2000 baza ili jedne u 5000 baza). Kompozicije i postupci iz predmetnog pronalaska takođe mogu biti ekonomičniji od postupaka obeleženog reverzibilnog terminatora (RT) koji se uobičajeno upotrebljavaju za SBS. Neobeleženi RT koštaju manje od obeleženih RT. U standardnom SBS koje upotrebljava obeležene RT, visoke koncentracije obeleženih RT se upotrebljavaju da dovedu do kompletiranja inkorporisanja RT, i većina obeleženih RT (70-99% ili više) nije inkorporisana pomoću polimeraze i ispira se. Upotreba jeftinijih neobeleženih RT stoga smanjuje ovaj trošak. Štaviše, u koraku obeležavanja iz predmetnog pronalaska, u kome se upotrebljava obeleženi afinitetni reagens, može biti dovoljno da samo mali procenat ciljnih templata bude vezan od strane afinitetnog reagensa koji ima više čak 30% može biti dovoljno sa efikasno obeleženim bajnderima sa više molekula obeleživača na jedan molekul bajndera; da bude obeleženo (npr. oko 5%, ili oko 10%, ili manje od oko 15%, manje od oko 20%, manje od oko 25%, ili manje od oko 30%) kako bi se dobio dovoljan signal za snimanje, posebno ukoliko se afinitetni reagens efikasno vezuje za ciljni dNTP i sadrži više molekula obeleživača. Viši nivo vezivanja može biti poželjan ukoliko afinitetni reagens nosi samo jedan molekul obeleživača (npr.70 procenata ili više).
2. Definicije i termini
[0038] Kao što se ovde upotrebljava, u kontekstu analoga nukleotida, termini "neobeleženi" i "ne-obeleženi" upotrebljavaju se naizmenično.
[0039] Kao što se ovde upotrebljava, osim ukoliko nije drugačije očigledno iz konteksta, "neobeleženi reverzibilni terminator [nukleotid]", "NLRT", "reverzibilni terminator nukleotid", "reverzibilni terminator", "RT", i slično upotrebljavaju se da označe reagens za sekvenciranje koji sadrži nukleobazu ili analog, dezoksiribozu ili analog, i blokirajuću grupu koja se može isecati. Neobeleženi reverzibilni terminator nukleotid može označavati dNTP (tj. supstrat za polimerazu) ili reverzibilni terminator nukleotid inkorporisan u proizvod produžetka prajmera, inicijalno na 3' terminusu i, nakon dopunskih ciklusa inkorporisanja, ukoliko ih ima, u "unutrašnjem" delu proizvoda produžetka prajmera.
[0040] Kao što se ovde upotrebljava, "dNTP" uključuje i dezoksiribonukleotid trifosfate koji se javljaju u prirodi i njihove analoge, uključujući analoge sa 3'-O blokirajućom grupom koja se može isecati.
[0041] Kao što se ovde upotrebljava, u kontekstu blokirajuće grupe koja se može isecati analoga nukleotida, oznaka 3'-O-" se ponekad podrazumeva pre nego što je eksplicitna. Na primer, termini "azidometil", "3'-O-azidometil" su naizmenični kao što će biti očigledno iz konteksta.
[0042] "Amplikon" znači proizvod reakcije amplifikacije polinukleotida, naime, populaciju polinukleotida koji su replicirani iz jedne ili više početnih sekvenci. Amplikoni se mogu proizvesti različitim reakcijama amplifikacije, uključujući, ali ne ograničavajući se na lančane reakcije polimerazom (PCR), linearne reakcije polimerazom, amplifikaciju zasnovanu na sekvenci nukleinske kiseline, amplifikaciju mehanizmom kotrljajućeg kruga i slične reakcije (videti, npr. S.A.D. patente br. 4,683,195; 4,965,188; 4,683,202; 4,800,159; 5,210,015; 6,174,670; 5,399,491; 6,287,824 i 5,854,033; i S.A.D. publ. br.2006/0024711).
[0043] "Antigen" kao što se ovde upotrebljava znači jedinjenje koje može biti specifično vezano od strane antitela. Neki antigeni su imunogeni (videti, Janeway, et al., Immunobiology, 5th Edition, 2001, Garland Publishing). Neki antigeni su hapteni koje prepoznaje antitelo, ali koji ne izazivaju imunski odgovor osim ukoliko nisu konjugovani za protein. Primeri antigena uključuju NLRT, reverzibilne terminator blokirajuće grupe, dNTP, polipeptide, male molekule, lipide, ili nukleinske kiseline.
[0044] "Čip" ili "mikročip" znači čvrsti nosač (ili kolekciju čvrstih nosača kao što su perle) koji ima površinu, poželjno, ali ne isključivo planarnu ili suštinski planarnu površinu, koja nosi kolekciju mesta koja sadrže nukleinske kiseline tako da je svako mesto kolekcije prostorno definisano i ne preklapa se sa drugim mestima na čipu; to jest, mesta su prostorno diskretna. Čip ili mikročip takođe može da sadrži neplanarnu strukturu koja se može ispitivati sa površinom kao što je perla ili bunarić. Oligonukleotidi ili polinukleotidi čipa mogu biti kovalentno vezani za čvrsti nosač, ili mogu biti nekovalentno vezani. Konvencionalna tehnologija mikročipa je pregledno prikazana u, npr. Schena, Ed. (2000), Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford). Kao što se ovde upotrebljava, "nasumični čip" ili "nasumični mikročip" označava mikročip gde se identitet oligonukleotida ili polinukleotida ne može uočiti, barem inicijalno, sa njihove lokacije, ali se može odrediti određenom tehnikom biohemijske detekcije na čipu. Videti, npr. S.A.D. patente br. 6,396,995; 6,544,732; 6,401,267; i 7,070,927; PCT publikacije WO 2006/073504 i 2005/082098; i S.A.D. patentne publ. br.2007/0207482 i 2007/0087362.
[0045] Termini "reverzibilna", "koja se može ukloniti" i "koja se može isecati" u odnosu na blokirajuću grupu imaju isto značenje.
[0046] Termini "reverzibilna blokirajuća grupa" reverzibilnog terminator nukleotida mogu se takođe označavati kao "blokirajuća grupa koja se može ukloniti", "linker koji se može isecati", "blokirajuća funkcionalna grupa", "blokirajuća grupa", "reverzibilna terminator blokirajuća grupa" i slično. Reverzibilna blokirajuća grupa je hemijska funkcionalna grupa koja je prikačena za nukleotidni šećer (npr. dezoksiribozu), uobičajeno na 3’-O poziciji funkcionalne grupe šećera, što sprečava dodavanje nukleotida pomoću polimeraze na toj poziciji. Reverzibilna blokirajuća grupa se može isecati enzimom (npr. fosfataza ili esteraza), hemijskom reakcijom, toplotom, svetlošću, itd., kako bi se obezbedila hidroksilna grupa na 3'-poziciji nukleozida ili nukleotida tako da može doći do adicije nukleotida pomoću polimeraze.
[0047] "Derivat" ili "analog" znači jedinjenje ili molekul čija je struktura jezgra ista kao ili blisko podseća na ono roditeljskog jedinjenja, ali koje ima hemijsku ili fizičku modifikaciju, kao što je druga ili dopunska bočna grupa, ili 2' i/ili 3' blokirajuće grupe, što omogućava da se derivat nukleotida ili nukleozida poveže sa sledećim molekulom. Na primer, baza može biti deazapurin. Derivati bi trebalo da budu sposobni za Votson-Krik (Watson-Crick) sparivanje. "Derivat" i "analog" takođe znače derivat sintetičkog nukleotida ili nukleozida koji ima modifikovane funkcionalne grupe baze i/ili modifikovane funkcionalne grupe šećera. O takvim derivatima i analozima se govori u, npr. Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) i Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Analozi nukleotida mogu takođe da sadrže modifikovane fosfodiestarske veze, uključujući fosforotioatne, fosforoditioatne, alkil-fosfonatne, fosforanilidatne i fosforamidatne veze. Analozi bi trebalo da budu sposobni za Votson-Krik sparivanje baza. Na primer, analozi dezoksiadenozina uključuju didanozin (ddl) i vidarabin, a analozi adenozina uključuju, BCX4430; analozi dezoksicitidina uključuju citarabin, gemcitabin, emtricitabin (FTC), lamivudin (3TC), i zalcitabin (ddC); analozi guanozina i dezoksiguanozina uključuju abakavir, aciklovir, i entekavir; analozi timidina i dezoksitimidina uključuju stavudin (d4T), telbivudin, i zidovudin (azidotimidin, ili AZT); a analozi dezoksiuridina uključuju idoksuridin i trifluridin. "Derivat", "analog" i "modifikovan" kao što se ovde upotrebljava, mogu se upotrebljavati naizmenično, i obuhvaćeni su terminima "nukleotid" i "nukleozid" koji su ovde definisani.
[0048] "Inkorporisati" znači postati deo molekula nukleinske kiseline. U SBS, inkorporisanje RT se dešava kada polimeraza dodaje RT rastućem DNK lancu preko formiranja fosfodiestarske ili modifikovane fosfodiestarske veze između 3' pozicije pentoze jednog nukleotida, to jest, 3' nukleotida na DNK lancu, i 5' pozicije pentoze na susednom nukleotidu, to jest, RT se dodaje DNK lancu.
[0049] "Obeleživač", u kontekstu obeleženog afinitetnog reagensa, znači bilo koji atom ili molekul koji se može upotrebljavati za obezbeđivanje signala koji se može detektovati i/ili kvantifikovati. Pogodni obeleživači uključuju radioizotope, fluorofore, hromofore, obeleživače mase, elektronski guste čestice, magnetne čestice, spin obeleživače, molekule koji emituju hemiluminescenciju, elektrohemijski aktivne molekule, enzime, kofaktore, i supstrate enzima. U nekim primerima izvođenja, obeleživač za detekciju je molekul koji sadrži naelektrisanu grupu (npr. molekul koji sadrži katjonsku grupu ili molekul koji sadrži anjonsku grupu), fluorescentni molekul (npr. fluorescentna boja), fluorogeni molekul, ili metal. Opciono, obeleživač za detekciju je fluorogeni obeleživač. Fluorogeni obeleživač može biti bilo koji obeleživač koji je sposoban da emituje svetlost kada je u neugašenom obliku (npr. kada nije ugašen drugim agensom). Fluorescentna funkcionalna grupa emituje svetlosnu energiju (tj. fluorescira) na specifičnoj talasnoj dužini emisije kada je ekscitovana odgovarajućom talasnom dužinom ekscitacije. Kada su fluorescentna funkcionalna grupa i funkcionalna grupa za gašenje u neposrednoj blizini, svetlosna energija koju emituje fluorescentna funkcionalna grupa se apsorbuje od strane funkcionalne grupe za gašenje. U nekim primerima izvođenja, fluorogena boja je fluorescein, rodamin, fenoksazin, akridin, kumarin, ili njihov derivat. U nekim primerima izvođenja, fluorogena boja je karboksifluorescein. Dodatni primeri pogodnih fluorogenih boja uključuju fluorogene boje koje su komercijalno dostupne u okviru linije proizvoda Alexa Fluor<®>(Life Technologies, Carlsbad, CA). Alternativno, mogu se upotrebljavati nefluorogeni obeleživači, uključujući bez ograničavanja, redoksgene obeleživače, redukcione oznake, molekule koji sadrže tio- ili tiol, supstituisane ili nesupstituisane alkile, fluorescentne proteine, nefluorescentne boje, i luminescentne proteine.
[0050] "Nukleobaza" znači azotnu bazu koja može da se bazno spari sa komplementarnom azotnom bazom templat nukleinske kiseline. Primeri nukleobaza uključuju adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T), uracil (U), inozin (I) i njihove derivate. Pozivanja na timin ovde treba razumeti da se odnose podjednako na uracil osim ukoliko nije drugačije jasno iz konteksta. Kao što se ovde upotrebljava, termini "nukleobaza", "azotna baza", i "baza" upotrebljavaju se naizmenično.
[0051] "Nukleobaza koja se javlja u prirodi", kao što se ovde upotrebljava, znači adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T), ili uracil (U). U nekim slučajevima, nukleobaza koja se javlja u prirodi označava A, C, G i T (baze koje se javljaju u prirodi koje se nalaze u DNK).
[0052] "Nukleotid" se sastoji od nukleobaze, šećera, i jedne ili više fosfatnih grupa. Oni su monomerne jedinice sekvence nukleinske kiseline. U RNK, šećer je riboza, a u DNK dezoksiriboza, tj. šećer kom nedostaje hidroksilna grupa koja je prisutna u ribozi. Azotna baza je derivat purina ili pirimidina. Purini su adenin (A) i guanin (G), a pirimidini su citozin (C) i timin (T) (ili u kontekstu RNK, uracil (U)). C-1 atom dezoksiriboze je vezan za N-1 pirimidina ili N-9 purina. Nukleotid je takođe fosfatni estar ili nukleozid, pri čemu se esterifikacija dešava na hidroksilnoj grupi prikačenoj za C-5 šećera. Nukleotidi su uobičajeno mono, di- ili trifosfati. "Nukleozid" je strukturno sličan nukleotidu, ali ne uključuje fosfatne funkcionalne grupe. Uobičajene skraćenice uključuju "dNTP" za dezoksinukleotid trifosfat.
[0053] "Nukleinska kiselina" znači polimer nukleotidnih monomera. Kao što se ovde upotrebljava, termini mogu označavati jednolančane ili dvolančane oblike. Monomeri koji čine nukleinske kiseline i oligonukleotide sposobni su da se specifično vežu za prirodni polinukleotid putem regularnog obrasca interakcija monomer-sa-monomerom, kao što je Votson-Krik tip sparivanja baza, slaganje baza, Hugstin (Hoogsteen) ili reverzni Hugstin tipovi sparivanja baza, ili slično, kako bi se formirali dupleks ili tripleks oblici. Takvi monomeri i njihove internukleozidne veze mogu biti oni koji se javljaju u prirodi ili mogu biti njihovi analozi, npr. analozi koji se javljaju u prirodi ili koji se ne javljaju u prirodi. Analozi koji se ne javljaju u prirodi mogu uključivati peptidne nukleinske kiseline, zaključane nukleinske kiseline, fosforotioatne internukleozidne veze, baze koje sadrže vezujuće grupe koje dozvoljavaju prikačinjanje obeleživača, kao što su fluorofore, ili hapteni, i slično. Nukleinske kiseline tipično imaju opseg veličine od nekoliko monomernih jedinica, npr.5-40, kada se uobičajeno označavaju kao "oligonukleotidi", do nekoliko stotina hiljada ili više monomernih jedinica. Kad god je nukleinska kiselina ili oligonukleotid predstavljen nizom slova (velikim ili malim slovima), kao što je "ATGCCTG", podrazumevaće se da su nukleotidi u redosledu 5ꞌ do 3ꞌ sleva nadesno i da "A" označava dezoksiadenozin, "C" označava dezoksicitidin, "G" označava dezoksiguanozin, i "T" označava timidin, "I" označava dezoksiinozin, "U" označava uridin, osim ukoliko nije drugačije napomenuto ili očigledno iz konteksta. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, terminologija i konvencije o numerisanju atoma će slediti one koje su objavljene u Strachan and Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999). Uobičajeno nukleinske kiseline sadrže prirodne nukleozide (npr. dezoksiadenozin, dezoksicitidin, dezoksiguanozin, dezoksitimidin za DNK ili njihove ribozne parnjake za RNK) povezane fosfodiestarskim vezama; međutim, one takođe mogu da sadrže neprirodne analoge nukleotida, npr. modifikovane baze, šećere, ili internukleozidne veze. Za one sa iskustvom u sturci, gde enzim ima zahteve za specifičnim supstratom oligonukleotidom ili nukleinskom kiselinom za aktivnost, npr. jednolančana DNK, RNK/DNK dupleks, ili slično, tada je odabir odgovarajuće kompozicije za supstrate oligonukleotida ili nukleinske kiseline dobro u okviru znanja nekog sa prosečnim iskustvom, naročito uz uputstva iz diskusija, kao što su Sambrook et al., Molecular Cloning, Second edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989), i slične reference.
[0054] "Prajmer" znači oligonukleotid, bilo prirodan ili sintetički, koji je sposoban, nakon formiranja dupleksa sa polinukleotidnim templatom, da deluje kao tačka inicijacije sinteze nukleinske kiseline i da se produži sa svog 3' kraja duž templata tako da se formira produženi dupleks. Sekvenca nukleotida dodatih tokom procesa produžavanja određena je sekvencom templat polinukleotida. Uobičajeno se prajmeri produžavaju pomoću DNK polimeraze. Prajmeri uobičajeno imaju dužinu u opsegu od 9 do 40 nukleotida, ili u nekim primerima izvođenja, od 14 do 36 nukleotida.
[0055] "Polinukleotid" se upotrebljava naizmenično sa terminom "nukleinska kiselina" da znači DNK, RNK, i hibridne i sintetičke nukleinske kiseline i može biti jednolančan ili dvolančan. "Oligonukleotidi" su kratki polinukleotidi dužine između oko 6 i oko 300 nukleotida. "Komplementarni polinukleotid" označava polinukleotid komplementaran ciljnoj nukleinskoj kiselini.
[0056] "Čvrsti nosač" i "nosač" se upotrebljavaju naizmenično i označavaju materijal ili grupu materijala koji imaju krutu ili polukrutu površinu ili površine. Mikročipovi uobičajeno sadrže barem jedan planarni nosač čvrste faze, kao što je staklena mikroskopska pločica.
[0057] Kao što se upotrebljava ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine neodređenih i određenih članova uključuju pozivanje na množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Stoga, na primer, pozivanje na "polimerazu" označava jedan agens ili smešu takvih agenasa, a pozivanje na "postupak" uključuje pozivanje na ekvivalentne korake i/ili postupke poznate onima sa iskustvom u struci.
[0058] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje koje uobičajeno razume onaj sa prosečnim iskustvom u struci kojoj ovaj pronalazak pripada.
[0059] Kada je obezbeđen opseg vrednosti, podrazumeva se da je svaka međuvrednost, do desetine jedinice donje granice osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granice tog opsega i bilo koje druge navedene ili međuvrednosti u tom navedenom opsegu obuhvaćena pronalaskom. Gornje i donje granice ovih manjih opsega mogu nezavisno biti uključene u manje opsege takođe su obuhvaćene pronalaskom, podložne bilo kojoj specifično isključenoj granici u navedenom opsegu. Tamo gde navedeni opseg uključuje jednu ili obe granice, opsezi koji isključuju bilo koje od ovih uključenih granica su takođe uključeni u pronalazak.
[0060] U sledećem opisu, brojni specifični detalji su izneti kako bi se obezbedilo detaljnije razumevanje predmetnog pronalaska. Međutim, onima sa iskustvom u struci biće očigledno da se predmetni pronalazak može praktikovati bez jednog ili više od ovih specifičnih detalja. U drugim slučajevima, dobro poznata svojstva i procedure koje su dobro poznate onima sa iskustvom u struci nisu opisane kako bi se izbeglo činjenje pronalaska nerazumljivim.
[0061] Iako je predmetni pronalazak opisan prvenstveno sa pozivanjem na specifične primere izvođenja, takođe je predviđeno da će drugi primeri izvođenja postati očigledni onima sa iskustvom u struci pošto pročitaju predmetnu objavu, i predviđeno je da takvi primeri izvođenja budu sadržani u postupcima predmetnog pronalaska.
[0062] Praksa predmetnog pronalaska može da koristi, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike i opise organske hemije, tehnologije polimera, molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), ćelijske biologije, biohemije, i imunologije, koji su u okviru veštine struke. Takve konvencionalne tehnike uključuju sintezu polimernog niza, hibridizaciju, ligaciju, i detekciju hibridizacije upotrebom obeleživača. Specifične ilustracije pogodnih tehnika mogu se dobiti pozivanjem na primer ovde u nastavku. Međutim, mogu se, naravno, upotrebljavati i druge ekvivalentne konvencionalne procedure. Takve konvencionalne tehnike i opisi mogu se pronaći u standardnim laboratorijskim priručnicima kao što su Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, i Molecular Cloning: A Laboratory Manual (svi od Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, N.Y., Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y. i Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.
3. Nukleotidi i analozi nukleotida
[0063] U različitim primerima izvođenja SBS u skladu sa pronalaskom može da upotrebljava neobeležene reverzibilne terminatore ("NLRT") (npr. analog nukleotida sa blokirajućom grupom), neobeležene nukleotide koji se javljaju u prirodi (npr. dATP, dTTP, dCTP i dGTP), ili neobeležene analoge nukleotida koji ne uključuju blokirajuću grupu.
3.1 Neobeleženi reverzibilni terminatori (NLRT)
[0064] Neobeleženi reverzibilni terminatori ("NLRT") iz pronalaska su analozi nukleotida koji sadrže blokirajuću grupu koja se može ukloniti na 3’-OH poziciji dezoksiriboze. Iako su opisani brojni reverzibilni terminatori, i reverzibilni terminatori se široko upotrebljavaju u SBS, neobeleženi reverzibilni terminatori koji se upotrebljavaju u skladu sa predmetnim pronalaskom razlikuju se od onih u komercijalnoj upotrebi zato što nisu obeleženi i zato što se upotrebljavaju zajedno sa afinitetnim reagensima koji su ovde opisani u nastavku. U jednom aspektu NLRT iz pronalaska su neobeleženi. U jednom primeru izvođenja, neobeležen znači da NLRT ne sadrži fluorescentnu boju. U jednom primeru izvođenja, neobeležen znači da NLRT ne sadrži hemiluminescentnu boju. U jednom primeru izvođenja, neobeležen znači da NLRT ne sadrži funkcionalnu grupu koja emituje svetlost.
[0065] U nekim primerima izvođenja, primeri NLRT imaju Strukturu I, u nastavku, pre inkorporisanja NLRT u DNK lanac.
gde je R13'-O reverzibilna blokirajuća grupa, R2je, ili uključuje, nukleobazu; i R3sadrži barem jednu fosfatnu grupu ili njen analog.
[0066] Reverzibilne blokirajuće grupe R1mogu biti uklonjene posle inkorporisanja NLRT u DNK lanac. Posle inkorporisanja analoga na 3' terminus DNK lanca, uklanjanje blokirajuće grupe rezultuje sa 3'-OH. Može se upotrebljavati bilo koja reverzibilna blokirajuća grupa. Primeri reverzibilnih blokirajućih grupa su opisani u nastavku.
[0067] Nukleobaze R2mogu biti, na primer, adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T), uracil (U), ili inozin (I) ili njihovi analozi. NLRT se mogu označiti u skladu sa nukleobazom; na primer, NLRT koji ima A nukleobazu se označava kao NLRT-A. Stoga, odgovarajući NLRT se ovde označavaju kao "NLRT-A", "NLRT-C", "NLRT-G", "NLRT-T", "NLRT-U", i "NLRT-I", respektivno. NLRT-T i NLRT-C se mogu označiti kao NLRT-pirimidini. NLRT-G i NLRT-A se mogu označiti kao NLRT-purini.
[0068] Nukleobaza R2može biti bilo koja nukleobaza ili analog nukleobaze (npr. analog adenina, citozina, guanina, timina, uracila, ili inozina). Na primer, može se izvršiti modifikacija nukleobaze koja se javlja u prirodi kako bi se povećao imunski odgovor na analog pri stvaranju antitela, ili kako bi se povećala specifičnost jednog ili više antitela za specifičnu nukleobazu.
[0069] R3može biti 1-10 fosfatnih grupa ili analoga fosfatnih grupa. Analozi fosfata uključuju fosforotioat (PS), u kome fosforotioatna veza zamenjuje atom sumpora za nepremošćujući kiseonik u fosfatnoj okosnici DNK, ili bilo koji drugi pogodan analog fosfata poznat u struci. U nekim slučajevima, R3može biti 1-10 fosfatnih grupa. U nekim slučajevima, R3može biti 3-12 fosfatnih grupa. U nekim slučajevima, analog nukleotida je nukleozid trifosfat.
[0070] U određenim primerima izvođenja R1iz Formule I ima MW manju od 184, često manju od 174, često manju od 164, često manju od 154, često manju od 144, često manju od 134, često manju od 124, često manju od 114, često manju od 104, često manju od 94, i ponekad manju od 84. R1može delovati kao hapten i izazvati imunski odgovor kada je konjugovan za veći molekul nosač kao što je KLH.
[0071] Ceniće se da je neinkorporisani analog nukleotida NLRT pogodan kao supstrat za enzim sa aktivnošću DNK polimeraze i može se inkorporisati u DNK lanac na 3' terminusu. Na primer, reverzibilna blokirajuća grupa treba da ima veličinu i strukturu tako da je NLRT supstrat za barem neke DNK polimeraze. Inkorporisanje NLRT se može postići putem terminusne transferaze, polimeraze ili reverzne transkriptaze. Može se koristiti bilo koja DNK polimeraza koja se upotrebljava u sekvenciranju, uključujući, na primer, DNK polimerazu iz Thermococcus sp., kao što je 9° N ili njeni mutanti, uključujući A485L, uključujući dvostruke mutante Y409V i A485L. Kao što je poznato u struci, polimeraze su veoma diskriminišuće u pogledu prirode 3' blokirajuće grupe. Kao rezultat toga, mutacije proteina polimeraze su često potrebne kako bi se pokrenulo efikasno inkorporisanje. Primeri DNK polimeraza i postupaka koji se mogu upotrebljavati u pronalasku uključuju one koji su opisani u Chen, C., 2014, "DNA Polymerases Drive DNA Sequencing-By-Synthesis Technologies: Both Past and Present" Frontiers in Microbiology, Vol. 5, Article 305, Pinheiro, V. et al. 2012 "Polymerase Engineering: From PCR and Sequencing to Synthetic Biology" Protein Engineering Handbook: Volume 3:279-302. Međunarodne patentne publikacije WO2005/024010 i WO2006/120433. U nekim slučajevima polimeraza je DNK polimeraza iz Thermococcus sp., kao što je 9° N ili njeni mutanti, uključujući A485L, uključujući dvostruke mutante Y409V i A485L. Drugi primeri uključuju E. coli DNK polimerazu I, Klenov (Klenow) fragment DNK polimeraze I, T7 ili T5 bakteriofag DNK polimerazu, HIV reverznu transkriptazu; Phi29 polimerazu, i Bst DNK polimerazu.
[0072] Podrazumevaće se da modifikacije blokirajuće grupe ne bi trebalo da ometaju funkciju reverzibilnog terminatora. To jest, trebalo bi da se mogu isecati kako bi se proizveo 3'-OH dezoksiribonukleotid.
[0073] U jednom primeru izvođenja, RT ima Strukturu II, u nastavku, pre inkorporisanja RT u DNK lanac.
gde je R13ꞌ-O reverzibilna blokirajuća grupa, R4je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), timina (T), i uracila (U); i R3sadrži barem jedan (npr.1-10) fosfat. U nekim slučajevima, R3je trifosfat.
[0074] U jednom primeru izvođenja, RT ima Strukturu III, u nastavku, posle inkorporisanja RT u DNK lanac.
gde je R13'-O reverzibilna blokirajuća grupa, R2je nukleobaza kao što su adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T), uracil (U), ili inozin (I) ili njihovi analozi, a X je polinukleotid (npr. GDS) koji sadrži 10-1000 nukleozida povezanih fosfat-šećer vezama (npr. fosfodiestarske veze koje povezuju 3' atom ugljenika molekula šećera jednog nukleozida i 5' atom ugljenika molekula šećera drugog nukleozida).
[0075] U sledećem primeru izvođenja, RT imaju Strukturu IV, posle inkorporisanja i uklanjanja reverzibilne blokirajuće grupe.
R6je H i R7je polinukleotid (npr. GDS) koji sadrži 10-1000 nukleozida povezanih fosfatšećer vezama, kao što je prethodno definisano, ili je R3, kao što je prethodno definisano.
[0076] U određenim primerima izvođenja Struktura I, III i IV, R2je analog nukleobaze (npr. analog A, T, G, C, U) sa modifikacijama koje ne menjaju specifičnost vezivanja baze (tj. analog A vezuje T, analog T vezuje A, itd.) i (ii) ali to može učiniti analog imunogenijim od baze koja se javlja u prirodi. U nekim primerima izvođenja modifikacija može da sadrži dodavanja grupe koja ne sadrži više od 3 ugljenika. Dodata grupa se ne uklanja sa nukleozida kako se oni inkorporišu u GDS tako da GDS sadrži mnoštvo nukleotida koji sadrže modifikaciju. U takvim primerima izvođenja afinitetni reagens vezuje terminusni analog nukleotida, uključujući modifikaciju, ali vezuje unutrašnje nukleotide sa modifikacijom sa mnogo nižim afinitetom.
[0077] U primenama u kojima postoji više od jednog terminusnog nukleotida na datom kraju (npr. 3ꞌ kraj), mogu se upotrebljavati različiti postupci za blokiranje krajeva koji nisu od interesa, npr. različitim blokirajućim grupama ili prikačinjanjem "kontaminirajućeg" kraja na nosač. Za DNB sekvenciranje, na primer, mogu postojati 3ꞌ krajevi pored 3ꞌ kraja koji se upotrebljava za sekvenciranje. U PCR klasterima proizvedenim pomoću most PCR, templati za sekvenciranje su prikačeni za 5' kraj, stoga se 3' kraj templata ne može produžiti sa RT ili modifikovati da spreči vezivanje sa molekulskim bajnderima koji su ovde opisani.
3.2 Blokirajuće grupe reverzibilnog terminatora
[0078] NLRT koji se upotrebljava u predmetnom pronalasku može uključivati bilo koju pogodnu blokirajuću grupu. U nekim primerima izvođenja pogodna blokirajuća grupa je ona koja se može ukloniti hemijskim ili enzimskim tretmanom kako bi se proizvela 3'-OH grupa. Hemijski tretman ne bi trebalo značajno da degradira templat ili lanac produžetak prajmera. Različite molekulske funkcionalne grupe su opisane za 3' blokirajuću grupu reverzibilnih terminatora kao što je 3'-O-alil grupa (Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 19635-19640, 2006), 3'-O-azidometil-dNTP (Guo et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 9145-9150, 2008), aminoalkoksil grupe (Hutter et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 29:879-895, 2010) i 3'-O-(2-cijanoetil) grupa (Knapp et al., Chem. Eur. J., 17, 2903 - 2915, 2011). Primeri RT blokirajućih grupa uključuju -O-azidometil i -O-cijanoetenil. Drugi primeri RT blokirajućih grupa, radi ilustracije a ne radi ograničavanja, pokazani su na SLIKAMA 3 i 4.
[0079] U drugim primerima izvođenja, R1iz Formule I (supra) je supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani alkenil, supstituisani ili nesupstituisani alkinil, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkenil, ili supstituisani ili nesupstituisani heteroalkinil. U nekim primerima, R1može biti odabran iz grupe koja se sastoji od alenila, cis-cijanoetenila, trans-cijanoetenila, ciscijanofluoroetenila, trans-cijanofluoroetenila, cis-trifluorometiletenila, transtrifluorometiletenila, biscijanoetenila, bisfluoroetenila, cis-propenila, trans-propenila, nitroetenila, acetoetenila, metilkarbonoetenila, amidoetenila, metilsulfonoetenila, metilsulfonoetila, formimidata, formhidroksimata, viniloetenila, etilenoetenila, cijanoetilenila, nitroetilenila, amidoetilenila, 3-oksobut-1-inila, i 3-metoksi-3-oksoprop-1-inila.
[0080] Različite 3'-O reverzibilne blokirajuće grupe (R1u Formuli I) mogu se upotrebljavati u praksi pronalaska. U skladu sa jednim primera izvođenja postupaka iz pronalaska, R1je odabran iz grupe koja se sastoji od alila, azidometila, aminoalkoksila, 2-cijanoetila, supstituisanog alkila, nesupstituisanog alkila, supstituisanog alkenila, nesupstituisanog alkenila, supstituisanog alkinila, nesupstituisanog alkinila, supstituisanog heteroalkila, nesupstituisanog heteroalkila, supstituisanog heteroalkenila, nesupstituisanog heteroalkenila, supstituisanog heteroalkinila, nesupstituisanog heteroalkinila, alenila, cis-cijanoetenila, transcijanoetenila, cis-cijanofluoroetenila, trans-cijanofluoroetenila, cis-trifluorometiletenila, transtrifluorometiletenila, biscijanoetenila, bisfluoroetenila, cis-propenila, trans-propenila, nitroetenila, acetoetenila, metilkarbonoetenila, amidoetenila, metilsulfonoetenila, metilsulfonoetila, formimidata, formhidroksimata, viniloetenila, etilenoetenila, cijanoetilenila, nitroetilenila, amidoetilenila, amino, cijanoetenila, cijanoetila, alkoksi, acila, metoksimetila, aminoksila, karbonila, nitrobenzila, kumarinila, i nitronaftalenila.
[0081] Kao što se ovde upotrebljava, termini "alkil", "alkenil", i "alkinil" uključuju monovalentne supstituente ravnog i razgranatog lanca. Primeri uključuju metil, etil, izobutil, 3-butinil, i slično. Opsezi ovih grupa koje su korisne sa jedinjenjima i postupcima koji su ovde opisani uključuju C1-C10alkil, C2-C10alkenil, i C2-C10alkinil. Dodatni opsezi ovih grupa koje su korisne sa jedinjenjima i postupcima koji su ovde opisani uključuju C1-C8alkil, C2-C8alkenil, C2-C8alkinil, C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, C1-C4alkil, C2-C4alkenil, i C2-C4alkinil.
[0082] "Heteroalkil", "heteroalkenil", i "heteroalkinil" su definisani slično kao alkil, alkenil, i alkinil, ali mogu da sadrže O, S, ili N heteroatome ili njihove kombinacije unutar okosnice. Opsezi ovih grupa koje su korisne sa jedinjenjima i postupcima koji su ovde opisani uključuju C1-C10heteroalkil, C2-C10heteroalkenil, i C2-C10heteroalkinil. Dodatni opsezi ovih grupa koje su korisne sa jedinjenjima i postupcima koji su ovde opisani uključuju C1-C8heteroalkil, C2-C8heteroalkenil, C2-C8heteroalkinil, C1-C6heteroalkil, C2-C6heteroalkenil, C2-C6heteroalkinil, C1-C4heteroalkil, C2-C4heteroalkenil, i C2-C4heteroalkinil.
[0083] Alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, ili heteroalkinil molekuli koji se ovde upotrebljavaju mogu biti supstituisani ili nesupstituisani. Kao što se ovde upotrebljava, termin supstituisan uključuje dodavanje alkoksi, ariloksi, amino, alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, heteroaril, cikloalkil, ili heterocikloalkil grupe na poziciju prikačenu za glavni lanac alkoksi, ariloksi, amino, alkila, alkenila, alkinila, arila, heteroalkila, heteroalkenila, heteroalkinila, heteroarila, cikloalkila, ili heterocikloalkila, npr. zamena vodonika jednim od ovih molekula. Primeri supstitucionih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, hidroksi, halogene (npr. F, Br, Cl, ili I), i karboksilne grupe. Nasuprot tome, kao što se ovde upotrebljava, termin nesupstituisan ukazuje na to da alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, ili heteroalkinil ima puni komplement vodonika, tj. srazmeran svom nivou zasićenja, bez supstitucija, npr. linearni butan (-(CH2)3-CH3).
[0084] U drugim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je blokirajuća grupa koja sadrži amino (npr. NH2-). Videti, Hutter et al., 2010, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 29(11), koji opisuje primere reverzibilnih blokirajućih grupa koje sadrže amino. U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je blokirajuća grupa koja sadrži alil (npr. CH2=CHCH2-). U nekim primerima izvođenja reverzibilna blokirajuća grupa sadrži cijano grupu (npr. cijanoetenil ili cijanoetil grupu). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je blokirajuća grupa koja sadrži azido (npr. N3-). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je azidometil (N3CH2-). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je blokirajuća grupa koja sadrži alkoksi (npr. CH3CH2O-). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa sadrži polietilen glikol (PEG) funkcionalnu grupu sa jednom ili više jedinica etilen glikola. U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je supstituisani ili nesupstituisani alkil (tj. supstituisani ili nesupstituisani ugljovodonik). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je acil. Videti, S.A.D. pat. br. 6,232,465. U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je ili sadrži metoksimetil. U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je ili sadrži aminoksil (H2NO-). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je ili sadrži karbonil (O=CH-). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa sadrži estarsku ili fosfatnu grupu.
[0085] U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je nitrobenzil (C6H4(NO2)-CH2-). U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je kumarinil (tj. sadrži funkcionalnu grupu kumarina ili njen derivat) pri čemu je, npr. bilo koji od CH ugljenika kumarinil reverzibilne blokirajuće grupe kovalentno prikačen za 3'-O analoga nukleotida.
[0086] U nekim primerima izvođenja, reverzibilna blokirajuća grupa je nitronaftalenil (tj. sadrži funkcionalnu grupu nitronaftalena ili njen derivat) pri čemu je, npr. bilo koji od CH ugljenika nitronaftalenil reverzibilne blokirajuće grupe kovalentno prikačen za 3'-O analoga nukleozida.
[0087] U nekim primerima izvođenja reverzibilna blokirajuća grupa je odabrana iz grupe:
gde su R3i R4H ili alkil, i R5je alkil, cikloalkil, alkenil, cikloalkenil, i benzil. U određenim primerima izvođenja određivanje R3-R5je ograničeno ovde opisanim MW ograničenjima (npr. videti Odeljak 3.2.1).
[0088] Druge reverzibilne blokirajuće grupe pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku opisane su u literaturi kao blokirajuće grupe obeleženog reverzibilnog terminatora. Generalno, bilo koja pogodna reverzibilna blokirajuća grupa koja se upotrebljava u sekvenciranjupomoću-sinteze može se upotrebljavati u praksi pronalaska.
3.2.1 Svojstva blokirajućih grupa reverzibilnog terminatora i nukleotida koji ih sadrže
[0089] Poželjno, za primene sekvenciranja, blokirajuća grupa RT se može ukloniti pod reakcionim uslovima koji ne ometaju integritet DNK koja se sekvencira. Idealna blokirajuća grupa će pokazati dugoročnu stabilnost, biće efikasno inkorporisana pomoću enzima polimeraze, uzrokovaće potpuno blokiranje sekundarnog ili dodatnog inkorporisanja i imaće sposobnost da se ukloni pod blagim uslovima koji ne uzrokuju oštećenje polinukleotidne strukture, poželjno u vodenim uslovima.
[0090] U određenim primerima izvođenja pronalaska, blokirajuća grupa (uključujući 3' atom kiseonika dezoksiriboze) ima molekulsku težinu (MW) manju od 200, često manju od 190, često manju od 180, često manju od 170, često manju od 160, često manju od 150, često manju od 140, često manju od 130, često manju od 120, često manju od 110, i ponekad manju od 100). Drugačije rečeno, u određenim primerima izvođenja R3iz Formule I ima MW manju od 184, često manju od 174, često manju od 164, često manju od 154, često manju od 144, često manju od 134, često manju od 124, često manju od 114, često manju od 104, često manju od 94, i ponekad manju od 84.
[0091] Molekulske težine dezoksiribonukleotid monofosfata su u opsegu od oko 307 do 322 (dAMP 331,2, dCMP 307,2, dGMP 347,2 i dTMP 322,2). U određenim primerima izvođenja, NLRT funkcionalna grupa kada je inkorporisana u GDS (tj. ne uključujući pirofosfat dNTP) ima molekulsku težinu manju od 550, često manju od 540, često manju od 530, često manju od 520, često manju od 510, često manju od 500, često manju od 490, često manju od 480, često manju od 470, i ponekad manju od 460.
3.3 Funkcionalne grupe koje sadrže fosfat
[0092] U nekim primerima izvođenja R3funkcionalna grupa sadrži jednu ili više funkcionalnih grupa fosfata i/ili analoga fosfata. U nekim primerima izvođenja R3funkcionalna grupa može imati strukturu u nastavku (Struktura XIV) gde je n = 0 do 12 (uobičajeno 0, 1, 3, 4, 5 ili 6) i X je H ili bilo koja struktura kompatibilna sa inkorporisanjem pomoću polimeraze u reakciji produženja prajmera. Na primer, X može biti alkil ili bilo koji od niza linkera koji su opisani u struci. Videti, npr. S.A.D. pat. br.9,702,001. Biće cenjeno da se u procesu inkorporisanja reverzibilnog terminatora u GDS, funkcionalna grupa X uklanja sa nukleotida (zajedno sa svim osim alfa fosfata) tako da X nije prisutan u inkorporisanom reverzibilnom terminator dezoksiribonukleotidu. U određenim primerima izvođenja X može biti detektabilni obeleživač ili afinitetna oznaka, pod uslovom da se afinitetni reagensi iz pronalaska ne vezuju za funkcionalnu grupu X, niti razlikuju među reverzibilnim terminatorima na osnovu prisustva, odsustva ili strukture funkcionalne grupe X, i da X nije prisutan u inkorporisanom reverzibilnom terminator dezoksiribonukleotidu.
3.4 NLRT skupovi
[0093] U nekim pristupima SBS sekvenciranje u skladu sa pronalaskom sadrži dovođenje u kontakt sekvencionog čipa sa više NLRT (npr. NLRT-A, NLRT-T, NLRT-C i NLRT-G). Dovođenje u kontakt se može vršiti uzastopno, jedan po jedan NLRT. Alternativno, četiri NLRT mogu biti dovedena u kontakt sa sekvencionim čipom u isto vreme, najčešće kao smeša četiri NLRT. Zajedno, četiri NLRT čine "NLRT skup". NLRT iz NLRT skupa mogu biti upakovani kao smeša ili mogu biti upakovani kao komplet koji sadrži svaki različiti NLRT u zasebnom kontejneru. Smeša četiri NLRT može uključivati svaku bazu u jednakim razmerama ili može uključivati nejednake količine.
[0094] U jednom primeru izvođenja svaki NLRT u NLRT skupu sadrži istu blokirajuću grupu (npr. azidometil). U jednom primeru izvođenja NLRT u NLRT skupu sadrže različite blokirajuće grupe (npr. NLRT-A sadrži azidometil i NLRT-T sadrži cijanoetenil; ili NLRT-A i NLRT-G sadrže azidometil i NLRT-C i NLRT-T sadrže cijanoetenil). Ukoliko se upotrebljavaju različite blokirajuće grupe, takve blokirajuće grupe su opciono odabrane tako da se različita blokirajuća grupa može ukloniti istim tretmanom. Alternativno, blokirajuće grupe mogu biti odabrane tako da budu uklonjene različitim tretmanima, opciono u različito vreme. U jednom primeru izvođenja jedan ili više NLRT u skupu sadrži modifikovanu (koja se ne javlja u prirodi) nukleobazu.
[0095] NLRT koji su ovde opisani mogu se obezbediti ili upotrebljavati u obliku smeše. Na primer, smeša može da sadrži dva, tri, ili četiri (ili više) strukturno različitih NLRT. Strukturno različiti NLRT mogu se razlikovati u svojim respektivnim nukleobazama. Na primer, smeša može da sadrži četiri strukturno različita NLRT od kojih svaki sadrži jednu od četiri prirodne DNK nukleobaze (tj. adenin, citozin, guanin, i timin), ili njihove derivate.
[0096] U svrhe sekvenciranja, različiti NLRT u NLRT skupu mogu biti odvojeno upakovani, a zatim pomešani na samom sekvenceru (npr. pre isporuke u protočnu ćeliju) ili mogu biti upakovani zajedno (tj. prethodno pomešani). Mogu biti obezbeđeni kompleti koji sadrže NLRT skupove (sa različitim NLRT upakovanim u zasebne kontejnere ili kao smešu u istom kontejneru).
3.5 Analozi nukleobaze sa grupama koje poboljšavaju vezivanje afinitetnog reagensa
[0097] U jednom primeru izvođenja nukleobaza uključuje hemijsku grupu koja se ne može ukloniti koja povećava specifičnost ili afinitet afinitetnog reagensa za nukleobazu kada je prisutna na 3' terminusu rastućeg DNK lanca (tj. kao poslednja inkorporisana baza), ali koja nije prepoznata od strane afinitetnog reagensa ili mu nije dostupna u internim nukleotidima u proizvodu produžetka prajmera. U jednom pristupu modifikacija se prepoznaje od strane ili vezuje od strane afinitetnog reagensa, ali sa nižim afinitetom ili nižom efikasnošću u odnosu na istu modifikaciju u 3' terminusnom nukleotidu.
[0098] Za ilustraciju, i ne za ograničavanje, primeri takvih modifikovanih nukleobaza uključuju:
R6, R7, R8, i R9: mogu biti isti ili različiti, svaki odabran od H, I, Br, F, Strukture XIX-XXVIII, ili bilo koje grupe koje ne ometaju sparivanje baza. Imajte na umu da kada je Rg metil Struktura XVIII u timidinu. U nekim slučajevima, modifikacija ima dopunsku korist od povećanja antigenosti nukleotida.
[0099] Molekulske težine nukleobaza koje se javljaju u prirodi su: adenin 135; guanin 151, timin 126 i citozin 111. U nekim primerima izvođenja analog nukleobaze ima molekulsku težinu koja ne prelazi onu prirodne baze za više od 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 Da.
3.6 Deblokirani dNTP
[0100] U jednom primeru izvođenja, prirodni dNTP (npr. dATP, dGTP, dCTP ili dTTP) ili analozi dNTP bez 3’-O- blokirajuće grupe se upotrebljavaju za sekvenciranje. U nekim primerima izvođenja, nukleotidi se inkorporišu jedan po jedan u procesu sekvenciranja, kao u pirosekvenciranju ili pomoću polimeraze koja se zaustavlja posle inkorporisanja jedne baze. Primeri postupaka su opisani u literaturi (videti, npr. Ju et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:19635-40, 2006; Guo, Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 9145-50, 2008, i Ronaghi et al., Science, 281:363-365, 1998) koji se mogu modifikovati za upotrebu u predmetnom pronalasku uklanjanjem obeleživača i/ili linkera koji povezuje obeleživač sa RT. U nekim pristupima, dNTP sa različitim nukleobazama se dodaju i inkorporišu uzastopno (npr. A, zatim G, itd.). Uobičajeno se nukleobaza odvojeno snima pre dodavanja sledećeg dNTP.
3.7 Analozi dezoksiriboze
[0101] U nekim primerima izvođenja pronalaska, funkcionalna grupa šećer (dezoksiriboza) je modifikovana. Na primer, NLRT sa adenin nukleobazom, azidometil blokirajućom grupom, i dezoksiriboza šećerom može se razlikovati od NLRT sa citozin nukleobazom, azidometil blokirajućom grupom, i modifikovanim-dezoksiriboza šećerom upotrebom afinitetnog reagensa koji prepoznaje blokirajuću grupu i funkcionalne grupe šećere.
3.8 Nukleotidi bez 3ꞌ-O reverzibilnih terminatora
[0102] Prethodno dati primeri uključuju reverzibilne blokirajuće grupe prikačene za nukleotid putem 3'-O funkcionalne grupe šećera dezoksiriboze. Predmetni pronalazak takođe uključuje NLRT sa reverzibilnim i nereverzibilnim blokirajućim grupama prikačenim za 2'-O-dezoksiriboza šećera. Ovi primeri izvođenja mogu se upotrebljavati za detekciju jedne baze (produžetak prajmera sa jednom ili nekoliko baza), praćenje praznina i prekida u DNK i druge postupke detekcije. Stoga će neko sa prosečnim iskustvom u struci moći da primeni ovde date postupke i informacije na NLRT sa 2', umesto 3', blokirajućim grupama.
4. Afinitetni reagensi
[0103] Predmetni pronalazak upotrebljava afinitetne reagense koji se specifično vezuju za NLRT na 3' kraju GDS, npr. posle inkorporisanja pomoću polimeraze na kraj rastućeg DNK lanca tokom SBS. U jednom primeru izvođenja, afinitetni reagens vezuje NLRT Strukture III. U jednom primeru izvođenja, afinitetni reagens vezuje NLRT Strukture IV.
4.1 Afinitetni reagensi generalno
[0104] U jednom aspektu pronalazak se odnosi na afinitetne reagense koji se upotrebljavaju za detekciju prisustva ili odsustva NLRT koji je inkorporisan na 3' kraju nukleinske kiseline. Afinitetni reagens je molekul ili makromolekul koji specifično vezuje NLRT na osnovu strukturnog svojstva inkorporisanog NLRT. Na primer, afinitetni reagens se može specifično vezati za NLRT koji ima, npr. određenu bazu i/ili određenu reverzibilnu blokirajuću grupu. Za ilustraciju, jedan primer afinitetnog reagensa je monoklonalno antitelo (mAb) koje se sa visokim afinitetom vezuje za inkorporisani NLRT na 3' kraju DNK lanca kada NLRT sadrži adenozin nukleobazu i azidometil reverzibilnu blokirajuću grupu, ali se ne vezuje sa visokim afinitetom za NLRT inkorporisan na 3' kraju DNK lanca kada NLRT sadrži adenozin nukleobazu, ali ima 3' hidroksilnu grupu, a ne azidometil reverzibilni blokator, i ne vezuje se sa visokim afinitetom za NLRT inkorporisan na 3' terminusu DNK lanca koji sadrži citozin, guanin, ili timin nukleobazu, svaku sa ili bez azidometil reverzibilne blokirajuće grupe. Afinitetni reagensi mogu biti direktno ili indirektno obeleženi.
[0105] "Specifičnost" je stepen kojim afinitetni reagens pravi razliku između različitih molekula (npr. NLRT) kao što je izmereno, na primer, relativnim afinitetima vezivanja afinitetnog reagensa za molekule. Što se tiče afinitetnih reagenasa iz predmetnog pronalaska, afinitetni reagens bi trebalo da ima znatno veći afinitet za jedan NLRT (njegov ciljni RT) nego za druge NLRT (na primer, afinitetni reagens se vezuje za analog nukleozida C, ali ne i za A, T ili G). Takođe, afinitetni reagens se vezuje za svoj ciljni analog nukleozida na kraju polinukleotida kada je inkorporisan pomoću polimeraze na 3ꞌ kraju rastućeg DNK lanca, ali ne i za nukleotidnu bazu negde drugde u DNK lancu. Afinitetni reagens je specifičan za određeni NLRT, kao što je NLRT-A, ukoliko je u prisustvu mnoštva (npr. čip) templat polinukleotida prisutnih u kojima 3'-terminusi GDS uključuju NLRT-A, NLRT-T, NLRT-C, NLRT-G (npr. u čipu) afinitetni reagens se vezuje poželjno za NLRT-A pod reakcionim uslovima koji se upotrebljavaju u SBS sekvenciranju. Kao što se ovde upotrebljava, "poželjno vezivanje" afinitetnog agensa za prvu strukturu u poređenju sa drugom strukturom znači da afinitetni agens vezuje prvu strukturu, ali ne vezuje drugu strukturu ili vezuje drugu strukturu manje snažno (tj. sa nižim afinitetom) ili manje efikasno.
[0106] U kontekstu vezivanja afinitetnog reagensa za inkorporisani NLRT, termini "specifično vezivanje", "specifično vezuje", i slični označavaju poželjnu asocijaciju afinitetnog reagensa sa određenim NLRT (npr. NLRT-A koji ima 3'-O azido grupu) u poređenju sa NLRT sa različitom nukleobazom (NLRT-T, -C, ili -G), različitom blokirajućom grupom, ili bez blokirajuće grupe (npr. dezoksiadenozin sa 3'-OH). Specifično vezivanje između afinitetnog reagensa i NLRT ponekad znači afinitet od barem 10<-6>M<-1>(tj. afinitet koji ima nižu numeričku vrednost od 10<-6>M<-1>kao što je izmereno konstantom disocijacije Kd). Poželjni su afiniteti veći od 10<-8>M<-1>. Specifično vezivanje se može odrediti upotrebom bilo kog testa za vezivanje (npr. vezivanje antitela) poznatog u struci, uključujući Western blot, enzimski imunosorbentni test (ELISA), protočnu citometriju, imunohistohemiju, i detekciju fluorescentno obeleženog afinitetnog reagensa vezanog za ciljni NLRT u reakciji sekvenciranja. Kao što se diskutuje ovde u nastavku, specifičnost vezivanja se može odrediti pozitivnim i negativnim testovima vezivanja.
[0107] Interakcija specifičnog vezivanja između afinitetnog reagensa, kao što je antitelo, i inkorporisanog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida može se opisati na različite načine uključujući pozivanje na deo, ili funkcionalnu grupu inkorporisanog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida odgovornog za specifičnost. Ovde je korisna analogija: Zamislite protein sa dva domena, domenom 1 i domenom 2. Dva različita antitela mogu specifično da vežu protein. Međutim, oni mogu prepoznati različite epitope. Na primer, jedno antitelo može da vezuje epitop u domenu 1, a drugo antitelo može da vezuje epitop u domenu 2. U ovoj hipotezi, ukoliko se modifikacije naprave u domenu 1, to može uticati na vezivanje proteina od strane prvog antitela, bez promene vezivanja od strane drugog antitela. U ovom slučaju može se reći da je vezivanje proteina od strane prvog antitela "zavisno od" domena 1, što znači da će promena u domenu 1 (npr. promena u amino-kiselinskoj sekvenci) promeniti svojstva vezivanja antitela 1 (npr. ukinuti vezivanje, povećati afinitet vezivanja, redukovati afinitet vezivanja, itd.). Ekvivalentno, za domen 1 se može reći da je "odgovoran za" vezivanje od strane antitela 1. U slučaju inkorporisanog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida, specifičnost vezivanja može biti posledica strukturnog svojstva jedne funkcionalne grupe (npr. blokirajuće grupe) i na to neće uticati struktura drugih funkcionalnih grupa (npr. nukleobaza) od strane drugih funkcionalnih grupa. Alternativno, specifičnost vezivanja može biti posledica strukturnih svojstava više funkcionalnih grupa (npr. i nukleobaze i blokirajuće grupe), itd. Tamo gde vezivanje afinitetnog reagensa za inkorporisani reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid zahteva prisustvo određenih strukturnih svojstava funkcionalne grupe, vezivanje od strane afinitetnog reagensa može "biti specifično za" ili "na osnovu" prisustva ili odsustva funkcionalne grupe sa tim strukturnim svojstvima. Ekvivalentno, funkcionalna grupa sa tim strukturnim svojstvima može biti "odgovorna" za vezivanje od strane afinitetnog reagensa, ili vezivanje afinitetnog reagensa može biti "zavisno" od prisustva funkcionalne grupe sa tim strukturnim svojstvima.
[0108] Takođe treba napomenuti da "specifičnost" može zavisiti od okruženja. Na primer, zamislite afinitetni reagens koji vezuje i A i A', ali ne vezuje B, C ili D. U reakciji ili uzorku koji sadrži A, A', B i C, afinitetni reagens može da vezuje i A i A', i stoga se ne može smatrati da "specifično vezuje" A. Međutim, u reakciji ili uzorku koji sadrži A, B, C i D, afinitetni reagens bi vezao samo A, i u tom okruženju bi se reklo da specifično vezuje A. U sledećem primeru, u uzorku koji sadrži A, A', B i C, afinitetni reagens može da vezuje A i A' sa različitim afinitetima, ili efikasnošću, tako da se vezivanje za A i vezivanje za A' može razlikovati na ovim osnovama.
[0109] Sledeći srodni termin je "diskriminisati" (ili ponekad "razlikuje"). Za afinitetni reagens koji vezuje inkorporisane reverzibilne terminator dezoksiribonukleotide samo ukoliko je prisutna određena blokirajuća grupa (npr. azidometil), ali se vezuje za inkorporisane reverzibilne terminator dezoksiribonukleotide sa azidometil blokirajućim grupama bez obzira na to koja je nukleobaza prisutna, može se reći da pravi "diskriminaciju" između inkorporisanih reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida sa i bez azidometil blokirajuće grupe ili, šire, može se reći da "diskriminiše na osnovu blokirajuće grupe".
[0110] Specifičnost afinitetnog reagensa je rezultat procesa koji se upotrebljava za pravljenje afinitetnog reagensa. Na primer, reagens koji prepoznaje azidometil blokirajuću funkcionalnu grupu može biti testiran empirijski sa pozitivnim i negativnim testovima vezivanja. Za ilustraciju, u jednom pristupu reagens je antitelo koje vezuje NLRT na osnovu prisustva O-azidometil blokirajuće funkcionalne grupe. U jednom pristupu antitela se stvaraju prema hapten O-azidometilu upotrebom azidometila konjugovanog za hemocijanin iz puža prilepka ključaonice („keyhole limpet“). Željeno antitelo se može odabrati za vezivanje za 3'-O-azidometil-2'-dezoksiguanin, ali protiv vezivanja za druge dezoksiguanin nukleotide kao što su 3'-O-2-(cijanoetoksi)metil-2'-dezoksiguanin; 3'-O-(2-nitrobenzil)-2'-dezoksiguanin; i 3'-Oalil-2'-dezoksiguanin; i protiv vezivanja drugih azidometil NLRT kao što su 3'-O-azidometil-2'-dezoksiadenozin; 3'-O-azidometil-2'-dezoksicitozin; i 3'-O-azidometil-2'-dezoksitimin.
[0111] Priroda antitelo-hapten interakcija takođe može da se odredi upotrebom postupaka koji su poznati u struci, kao što su oni koji su opisani u Al Qaraghuli, 2015, "Defining the complementarities between antibodies and haptens to refine our understanding and aid the prediction of a successful binding interaction" BMC Biotechnology, 15(1)p.1; Britta et al., 2005, "Generation of hapten-specific recombinant antibodies: Antibody phage display technology: A review" Vet Med. 50:231-52; Charlton et al., 2002. "Isolation of anti-hapten specific antibody fragments from combinatorial libraries" Methods Mol Biol. 178:159-71; i Hongtao et al., 2014, "Molecular Modeling Application on Hapten Epitope Prediction: An Enantioselective Immunoassay for Ofloxacin Optical Isomers" J. Agric. Food Chem. 62 (31) pp 7804-7812. Podrazumevaće se da opisivanje afinitetnog reagensa kao onog koji vezuje određene funkcionalne grupe (npr. nukleobaza i šećer funkcionalna grupa) ne isključuje vezivanje za druge delove inkorporisanog nukleotida. Na primer, afinitetni reagens koji vezuje nukleobazu i šećer funkcionalnu grupu takođe može da vezuje blokirajuću grupu.
[0112] Primeri korisnih afinitetnih reagenasa uključuju antitela (uključujući vezujuće fragmente antitela, jednolančana antitela, bispecifična antitela, i slično), aptamere, „knottins“, afimere, obeležene dNTP koji formiraju trostruki heliks sa jednom bazom, guanin nukleotid vezujući proteini (G-proteini), ili bilo koji drugi poznati agens koji vezuje inkorporisani NLRT sa pogodnom specifičnošću i afinitetom.
[0113] Afinitetni reagens može specifično prepoznati nukleobazu, šećer (npr. dezoksiribozu), blokirajuću grupu, ili bilo koju drugu funkcionalnu grupu ili njihovu kombinaciju u ciljnom NLRT; pri čemu se najmanje jedan afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu ciljnog NLRT. U jednom pristupu, afinitetni reagens prepoznaje epitop koji sadrži blokirajuću grupu. U sledećem pristupu, afinitetni reagens prepoznaje epitop koji sadrži nukleobazu. U sledećem pristupu, afinitetni reagens prepoznaje epitop koji sadrži nukleobazu i blokirajuću grupu. Podrazumeva se da čak i ukoliko afinitetni reagens ne dođe u kontakt sa funkcionalnom grupom, ta grupa može da diktira poziciju drugih funkcionalnih grupa. Na primer, za afinitetni reagens koji razlikuje NLRT na osnovu nukleobaze i 3' blokirajuće grupe, funkcionalna grupa dezoksiriboza je potrebno da pozicionira nukleobazu i 3' blokirajuću grupu radi prepoznavanja.
[0114] U slučaju afinitetnih reagenasa koji su antitela, specifično vezivanje se može odrediti upotrebom bilo kog testa za vezivanje antitela koji je poznat u struci, uključujući Western blot, enzimski imunosorbentni test (ELISA), protočnu citometriju, ili hromatografiju na koloni. U jednom pristupu specifično vezivanje je demonstrirano upotrebom testa tipa ELISA. Na primer, serumska antitela stvorena prema 3'-azidometil-dC mogu se serijski titrirati prema vezanom supstratu 3'-O-azidometil-dC (test pozitivne specifičnosti) i nukleotidu(ima) kao što je 3'-O-azidometil-dG ili -dA ili 3'-OH-dC (test negativne specifičnosti).
[0115] U nekim primerima izvođenja, bazno-specifično vezivanje afinitetnog reagensa za njegov ciljni nukleozid je 2-100 puta veće od vezivanja za druge nukleozide ili analoge. U nekim primerima izvođenja bazno-specifično vezivanje afinitetnog reagensa za njegov ciljni nukleozid je barem 10 puta veće od vezivanja za druge nukleozide, ili barem 30 puta veće, ili barem 100 puta veće.
[0116] Poželjna efikasnost vezivanja antitela za specifičnu bazu je pri koncentraciji nižoj od 100 pM, ili nižoj od 1 nM, ili nižoj od 10 nM, ili nižoj od 1 μM.
[0117] Afinitetni reagensi sa željenom specifičnošću mogu se odabrati upotrebom postupaka koji su poznati u struci. Na primer, afinitetni reagens kao što je antitelo može biti identifikovan, odabran, ili prečišćen krugovima pozitivne selekcije (tj. vezuje se za ciljni molekul) i negativne selekcije (tj. ne vezuje se za molekule koji nisu ciljni molekul).
[0118] Afinitetni reagens može da vezuje i dNTP u rastvoru i odgovarajući nukleotid inkorporisan na 3ꞌ terminusu proizvoda produžetka prajmera. U nekim primerima izvođenja, afinitetni reagens se ne vezuje za neinkorporisani NLRT (npr. NLRT u rastvoru) ili se vezuje sa značajno nižom specifičnošću. Generalno, međutim, vezivanje neinkorporisanih NLRT od strane afinitetnih reagenasa se ne dešava u procesu sekvenciranja zato što se neinkorporisani NLRT uklanjaju (ispiraju) pre introdukovanja afinitetnih reagenasa. Alternativno, kompleksi formirani od strane afinitetnih reagenasa vezanih za NLRT se uklanjaju (ispiraju) pre snimanja.
[0119] U jednom pristupu, afinitetni reagens se specifično vezuje za nukleobazu i razlikuje različite baze (npr. A, T, G, C) delimično na osnovu prisustva ili odsustva 3'-OH grupe. U ovom pristupu, afinitetni reagens razlikuje nukleotid na 3' kraju GDS sa 3'-OH od inkorporisanih nukleotida unutar GDS (ne na 3' kraju). U nekim slučajevima afinitetni reagens koji prepoznaje specifičnu nukleobazu takođe pravi razliku između prisustva ili odsustva 3'-OH grupa, čime prepoznaje inkorporisani NLRT kao 3' terminusni nukleotid sa određenom nukleobazom.
[0120] U jednom pristupu afinitetni reagens prepoznaje epitop koji sadrži blokirajuću grupu, ali ne pravi razliku između baza; pri čemu se najmanje jedan afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu NLRT. Na primer, mogu se proizvesti afinitetni reagensi s obzirom na date četiri RT blokirajuće grupe [A. azidometil, B. 2(cijanoetoksi)metil, C. 3ꞌ-O-(2-nitrobenzil), i D. 3ꞌ-O-alil] koji razlikuju četiri blokirajuće grupe. Za ilustraciju, s obzirom na analoge dezoksiguanina označene od A do D u nastavku, može se odabrati afinitetni reagens koji prepoznaje samo jedan, ali ne i ostala tri, NLRT.
A. 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksiguanin
B. 3ꞌ-O-2-(cijanoetoksi)metil-2ꞌ-dezoksiguanin
C. 3ꞌ-O-(2-nitrobenzil)-2’-dezoksiguanin
D. 3ꞌ-O-alil-2ꞌ-dezoksiguanin
[0121] U nekim primerima izvođenja, odabrani afinitetni reagens ne pravi razliku između nukleotida sa različitim nukleobazama pod uslovom da dele istu blokirajuću grupu. Na primer, afinitetni reagens koji prepoznaje B (3'-O-2-(cijanoetoksi)metil-2'-dezoksiguanin), gore, takođe može prepoznati 3'-O-2-(cijanoetoksi)metil-2'-dezoksiadenin; 3'-O-2-(cijanoetoksi)metil-2'-dezoksitimin; i 3'-O-2-(cijanoetoksi)metil-2'-dezoksicitozin.
[0122] Generisanje afinitetnih reagenasa (npr. monoklonalnih antitela) koji različito prepoznaju RT blokirajuće grupe je u okviru veštine onoga sa prosečnim iskustvom u struci vođenog ovom objavom. U jednom pristupu, antitelo se stvara prema hapten O-azidometilu (npr. -O-azidometil ili azidometil konjugovan sa hemocijaninom iz puža prilepka ključaonice) i pozitivno i negativno se testira na vezivanje za 3'-O-azidometil-2'-dNM nukleotid na 3' kraju GDS TP (gde je N svaki od A, T, G ili C) i za nevezivanje za 3'-O-X-2'-dNM gde je O-X različita blokirajuća grupa prisutna u reakciji sekvenciranja. Biće prepoznato da u drugim primerima izvođenja, hapten može biti dezoksiriboza sa 3'-O blokirajućom grupom, nukleotid (npr. monofosfat ili trifosfat sa 3'-O blokirajućom grupom), ili slično, sve dok proces odabira identifikuje afinitetne reagense sa željenom specifičnošću.
[0123] Iako je prethodni primer opisao primer izvođenja u kom su četiri nukleotida imala različite blokirajuće grupe sa veoma izraženim strukturnim razlikama (npr. azidometil naspram 2-(cijanoetoksi)metila, u nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska postoje samo male razlike između blokirajućih grupa vezanih od strane različitih afinitetnih reagenasa. Na primer, u blokirajućoj grupi atom vodonika može biti zamenjen atomom fluora ili metil grupom kako bi se generisale tri srodne blokirajuće grupe [blokirajuća grupa, F supstituisana blokirajuća grupa, metil supstituisana blokirajuća grupa] koje se mogu razlikovati po skupu afinitetnih reagenasa.
[0124] U nekim primerima izvođenja pronalaska sekvenciranje se izvodi upotrebom četiri NLRT, od kojih svaki ima 3'-O-blokirajuću grupu u kojoj su 2 ili više blokirajuće grupe, alternativno 3 ili više, alternativno sve 4 strukturno slične u smislu da (1) imaju isti broj atoma ili se broj atoma razlikuje samo za mali broj (npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10); (2) molekulske formule blokirajućih funkcionalnih grupa se razlikuju za 1 do 10 atoma (npr. pojedinačni H zamenjen sa CH3je 3 razlike; H zamenjen sa F, O zamenjen sa S), npr.1 atom, 2 atoma, 3 atoma, 4 atoma, 6 atoma, 7 atoma, 8 atoma, 9 atoma ili 10 atoma. U ovim i drugim primerima izvođenja, blokirajuća funkcionalna grupa može imati bilo koje od svojstava koja su opisana prethodno ovde u odeljku pod naslovom "Svojstva blokirajućih grupa reverzibilnog terminatora i nukleotida koji ih sadrže".
[0125] U nekim primerima izvođenja, afinitetni reagens se vezuje za NLRT (npr. 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksiguanin), ali se ne vezuje za odgovarajući deblokirani nukleotid (npr. 3ꞌ-OH-2ꞌ-dezoksiguanin).
[0126] U jednom primeru izvođenja, afinitetni reagens se vezuje za NLRT (npr. 3'-O-azidometil-2'-dezoksiguanin), ali se disasocira sa nukleotidnog analoga posle tretmana za uklanjanje blokirajuće grupe (npr. posle tretmana sa TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin)).
[0127] Afinitetni reagens koji specifično prepoznaje NLRT-A je označen kao antiA. Afinitetni reagens koji specifično prepoznaje NLRT-T je označen kao antiT. Afinitetni reagens koji specifično prepoznaje NLRT-G je označen kao antiG. Afinitetni reagens koji specifično prepoznaje NLRT-C je označen kao antiC. Afinitetni reagens koji specifično prepoznaje NLRT-U je označen kao antiU. Iako je ova nomenklatura slična onoj koja se upotrebljava za opisivanje specifičnosti imunoglobulina, upotreba ove terminologije u predmetnom pronalasku nije namenjena da ukaže da je afinitetni reagens nužno antitelo.
[0128] Afinitetni reagensi mogu biti direktno obeleženi. Alternativno, afinitetni reagensi mogu biti neobeleženi primarni afinitetni reagens koji je detektabilan upotrebom obeleženog sekundarnog afinitetnog reagensa. Na primer, neobeleženi primarni afinitetni reagens koji specifično vezuje NLRT može biti detektovan sa obeleženim sekundarnim afinitetnim reagensom koji vezuje primarni afinitetni reagens (na primer, obeleženo antitelo koje vezuje primarni afinitetni reagens). Videti odeljak 4.5 u nastavku.
4.2 Primeri afinitetnih reagenasa
[0129] U nekim primerima izvođenja, afinitetni reagens je antitelo. Može se koristiti bilo koji postupak za proizvodnju antitela koji je poznat u struci.
4.2.1 Antitela
[0130] Kao što se ovde upotrebljava, "antitelo" označava molekul ili kompoziciju imunoglobulina (npr. monoklonalna i poliklonalna antitela), kao i genetički projektovane oblike kao što su himerna, humanizovana i humana antitela, heterokonjugatna antitela (npr. bispecifična antitela), i fragmenti antitela. Antitelo može biti iz rekombinantnih izvora i/ili proizvedeno u životinjama, uključujući bez ograničenja transgene životinje. Termin "antitelo" kao što se ovde upotrebljava uključuje "fragmente antitela", uključujući bez ograničenja Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dimere, minitela, nanotela, dijatela, i njihove multimere i fragmente bispecifičnog antitela. Antitela se mogu fragmentisati upotrebom konvencionalnih tehnika. Na primer, F(ab')2fragmenti se mogu generisati tretiranjem antitela pepsinom. Rezultujući F(ab')2fragment se može tretirati kako bi se redukovali disulfidni mostovi kako bi se proizveli Fab' fragmenti. Digestija papainom može dovesti do formiranja Fab fragmenata. Fab, Fab' i F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dimeri, minitela, dijatela, fragmenti bispecifičnih antitela i drugi fragmenti takođe mogu biti sintetisani rekombinantnim tehnikama. Antitela mogu biti u bilo kom korisnom izotipu, uključujući IgM i IgG, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U nekim primerima izvođenja, afinitetni reagensi su minitela. Minitela su projektovani konstrukti antitela koji sadrže domene varijabilnog teškog (VH) i varijabilnog lakog (VL) lanca nativnog antitela fuzionisane za zglobni region i za CH3 domen molekula imunoglobulina. Minitela su stoga male verzije celih antitela kodiranih u jednom proteinskom lancu koje zadržavaju antigen vezujući region, CH3 domen kako bi se dozvolilo sklapanje u dvovalentni molekul i zglob antitela kako bi se prilagodila dimerizacija disulfidnim vezama. Antitelo sa jednim domenom (sdAb) se takođe može upotrebljavati. Antitelo sa jednim domenom, ili NANOTELO (Ablynx), je približno fragment antitela sa jednim monomernim varijabilnim domenom antitela. Antitela sa jednim domenom se selektivno vezuju za specifične antigene i manja su (MW 12-15 kDa) od konvencionalnih antitela.
4.2.1.1 Proizvodnja antitela
[0131] Postupci za stvaranje poliklonalnih antitela su poznati i mogu se upotrebljavati za proizvodnju NLRT-specifičnih antitela. Za jedan pristup videti Primer 2 u nastavku. U skladu sa jednim postupkom za stvaranje poliklonalnih antitela specifičnih za određeni NLRT, npr. NLRT-A, zecu se injektira NLRT-A (konjugovan za imunogen) kako bi se stvorila antitela, i antitela se odabiraju tako da se ne vezuju za: istu strukturu kojoj nedostaje blokirajuća grupa (npr. koja ima 3'-OH), i druge NLRT (NLRT-T, NLRT-G, i NLRT-C). Stoga, proizvedena poliklonalna antitela prepoznaju specifičan NLRT koji je inkorporisan na 3' kraju rastućeg DNK lanca na određenoj poziciji na sekvencionom čipu, ali ne i taj isti nukleozid na drugim unutrašnjim pozicijama rastućeg lanca ili druge NLRT koji mogu biti inkorporisani negde drugde na čipu. (Poliklonalna antitela mogu takođe prepoznati neinkorporisani NLRT-A, ali neinkorporisani NLRT su isprani pre nego što se inkorporisani NLRT ispitaju upotrebom obeleženih afinitetnih reagenasa.
[0132] Biće prepoznato da, u zavisnosti od potreba istražitelja, nije uvek potrebno stvarati antitela prema celokupnom NLRT. Na primer, ukoliko su poželjna antitela specifična za blokirajuću grupu, hapten može biti dezoksiriboza sa 3'-O-blokirajućom grupom (tj. bez nukleobaze) ili sama 3'-O-blokirajuća grupa. U nekim primerima izvođenja antitela su stvorena prema polinukleotidu sa NLRT od interesa na 3' kraju. U nekim primerima izvođenja antitela su stvorena prema polinukleotidu koji je vezan za templat molekul.
[0133] Kako bi se proizvela monoklonalna antitela, ćelije koje proizvode antitela (limfociti) mogu biti sakupljene iz životinje imunizovane imunogenom koji sadrži NLRT i fuzionisane sa ćelijama mijeloma standardnim procedurama fuzije somatskih ćelija čime se ove ćelije imortalizuju i daju ćelije hibridoma. Takve tehnike su dobro poznate u struci (npr. tehnika hibridoma koju su prvobitno razvili Koler i Milštajn (Kohler i Milstein Nature 256:495-497, 1975), kao i druge tehnike kao što je tehnika hibridoma humane B-ćelije (Kozbor et. al., 1983, Immunol. Today 4:72), tehnika EBV-hibridoma za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela (Cole et al., 1986, Methods Enzymol, 121:140-67), i pregled kombinatornih biblioteka antitela (Huse et al. al., 1989, Science 246:1275). Ćelije hibridoma se mogu imunohemijski pregledati za proizvodnju antitela koja su specifično reaktivna sa određenim RT i monoklonalna antitela se mogu izolovati.
[0134] Specifična antitela, ili fragmenti antitela, reaktivni prema određenim antigenima ili molekulima, takođe mogu biti generisani pregledom ekspresionih biblioteka koje kodiraju gene imunoglobulina, ili njihove delove, eksprimirane u bakterijama sa komponentama ćelijske površine. Na primer, kompletni Fab fragmenti, VH regioni i FV regioni mogu biti eksprimirani u bakterijama upotrebom ekspresionih biblioteka faga (videti na primer Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; Huse et al. Science 246:1275, 1989; i McCafferty et al. Nature 348:552-554, 1990).
[0135] Pored toga, antitela specifična za ciljni NLRT lako se izoluju pregledom biblioteka faga za displej antitela. Na primer, biblioteka faga antitela se opciono pregleda upotrebom za identifikaciju fragmenata antitela specifičnih za ciljni NLRT. Postupci za pregled biblioteka faga antitela su dobro poznati u struci.
[0136] Anti-NLRT antitela se takođe mogu proizvesti u sistemu bez ćelija. Neograničavajući primeri sistema bez ćelija su opisani, npr. u Sitaraman et al., Methods Mol. Biol.498: 229-44, 2009; Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45, 2004; i Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713, 2003.
4.2.1.2 Prečišćavanje antitela
[0137] Anti-NLRT antitela se mogu prečistiti bilo kojim pogodnim postupkom. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu afinitetnih matriksa ili hromatografije hidrofobnih interakcija. Hromatografija hidrofobnih interakcija, na primer, butil ili fenil kolona, takođe može biti pogodna za prečišćavanje nekih polipeptida. Videti odeljak 8.4, u nastavku. Mnogi postupci prečišćavanja polipeptida su poznati u struci. Afinitetno prečišćavanje anti-NLRT antitela iz poliklonalnog antiseruma opisano je u Primeru 2 u nastavku.
4.2.1.3 Obeležavanje antitela
[0138] Antitela se mogu obeležiti upotrebom bilo kojih postupaka koji su poznati u struci. Postupci za povezivanje antitela i drugih afinitetnih reagenasa sa reporterskim molekulima, npr. proteinima koji generišu signal uključujući enzime i fluorescentne/luminescentne proteine su dobro poznati u struci (Wild, The Immunoassay Handbook, 4th ed.; Elsevier: Amsterdam, Holandija, 2013; Kobayashi i Oyama, Analyst 136:642-651, 2011).
4.2.2 Aptameri
[0139] Aptamer je oligonukleotidni ili peptidni molekul koji se vezuje za specifični ciljni molekul. Aptameri se mogu klasifikovati kao: (a) DNK ili RNK ili XNA aptameri, koji se sastoje od (uobičajeno kratkih) lanaca oligonukleotida; i (b) peptidni aptameri, koji se sastoje od jednog (ili više) kratkih varijabilnih peptidnih domena, pričvršćenih na oba kraja za proteinsku skelu.
[0140] Aptameri nukleinske kiseline su vrste nukleinskih kiselina koje su projektovane kroz ponovljene krugove in vitro selekcije ili ekvivalentno, SELEX (sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem) da se vezuju za različite molekulske ciljeve, npr. NLRT. Na primer, aptameri sa afinitetom za ciljni NLRT mogu se odabrati iz velike biblioteke oligonukleotida putem SELEX, iterativnog procesa u kome se nevezujući aptameri odbacuju a aptameri koji se vezuju za predloženi cilj umnožavaju. Početni krugovi pozitivne selekcije ponekad su praćeni negativnom selekcijom. Ovo poboljšava selektivnost rezultujućih kandidata za aptamer. U ovom procesu, ciljni NLRT je imobilisan na afinitetnu kolonu. Biblioteka aptamera se primenjuje i dozvoljava da se vezuje. Slabo vezani se isperu, a vezani aptameri se eluiraju i amplifikuju upotrebom PCR. Zatim se pul amplifikovanih aptamera ponovo primenjuje na ciljeve. Proces se ponavlja više puta pod sve većom strogošću dok se ne dobiju aptameri željene selektivnosti i afiniteta. Videti, npr. Jayasena, et al., Clinical Chemistry 45:1628-1650, 1999. Selekcija peptidnog aptamera može se izvršiti upotrebom različitih sistema, uključujući i dvohibridni sistem kvasca. Peptidni aptameri se takođe mogu odabrati iz kombinatornih peptidnih biblioteka konstruisanih pomoću displej faga i drugih tehnologija površinskog displeja kao što su displej iRNK, displej ribozoma, displej bakterija i displej kvasca. Ove eksperimentalne procedure su takođe poznate kao biopaninzi (biopannings). Videti, npr. Reverdatto et al., 2015, Curr. Top. Med. Chem. 15:1082-1101.
4.2.3 Afimeri
[0141] Afimeri su mali (12-14 kDa), veoma stabilni proteini koji vezuju svoje ciljne molekule sa specifičnošću i afinitetom sličnim onima od antitela. Ovi proteini dele zajedničku tercijarnu strukturu alfa-heliksa koja leži na vrhu anti-paralelne beta ploče. Afimer proteini prikazuju dve peptidne petlje i N-terminusnu sekvencu koji se svi mogu randomizovati da se vezuje za željene ciljne proteine sa visokim afinitetom i specifičnošću na sličan način kao i monoklonalna antitela. Stabilizacija dva peptida pomoću proteinske skele ograničava moguće konformacije koje peptidi mogu da poprime, povećavajući afinitet i specifičnost vezivanja u poređenju sa bibliotekama slobodnih peptida.
[0142] Afimeri specifični za NLRT mogu da se odaberu upotrebom biblioteka faga za displej koje se pregledaju kako bi se identifikovao afimer protein sa visoko-specifičnim vezivanjem za ciljni NLRT i visokim afinitetima vezivanja (npr. u opsegu nM). Mnogi različiti obeleživači, oznake i fuzioni proteini, kao što su fluorofore, konjugovane su za afimer proteine za upotrebu u različitim primenama. Videti, npr. S.A.D. patente br. 8,481,491, US 8,063,019, i WO 2009/136182. Videti takođe Crawford et al., Brief Funct. Genomic Proteomic, 2:72-79, 2003.
4.2.4 Knottins
[0143] "Knottin" ili "inhibitor cistinskog čvora" (ICK) je proteinski strukturni motiv koji sadrži tri disulfidna mosta. Zajedno sa delovima polipeptida između njih, dva disulfida formiraju petlju kroz koju prolazi treća disulfidna veza (povezujući treći i šesti cistein u sekvenci) formirajući čvor. Novi vezujući epitopi se mogu introdukovati u prirodne knottins upotrebom projektovanja proteina, i knottins su projektovani tako da ciljaju širok spektar ciljeva. Jedan pristup proizvodnji knottins koji su specifični za NLRT je kreiranje i pregled knottin biblioteka upotrebgom displeja površine kvasca i sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom. Za informacije u vezi sa proizvodnjom „knottins“ sa selektivnošću i visokim afinitetom za ciljni NLRT i obeležavanjem takvih „knottins“ za upotrebu u vezi sa predmetnim pronalaskom, videti, npr. Kintzing and Cochran, Curr. Opin. Chem. Biol.34:143-150, 2016; Moore et al., Drug Discovery Today: Technologies 9(1):e3-e11, 2012; i Moore and Cochran, Meth. Enzymol.503:223-51, 2012.
4.3 Obeleženi afinitetni reagensi
[0144] Obeleženi afinitetni reagensi se mogu upotrebljavati za sekvenciranje templat nukleinske kiseline različitim postupcima. Oni se takođe mogu upotrebljavati u različitim primenama osim sekvenciranja, kao što će biti očigledno onima sa iskustvom u struci. Može se upotrebljavati bilo koji postupak obeležavanja antitela i drugih afinitetnih reagenasa iz pronalaska.
4.3.1 Fluorescentni detektabilni obeleživači
[0145] Afinitetni reagensi koji se upotrebljavaju u praksi pronalaska, uključujući antitela, aptamere, afimere, „knottins“ i druge afinitetne reagense koji su ovde opisani, mogu biti detektabilno obeleženi. Na primer, afinitetni reagensi koji su ovde opisani mogu biti detektabilno obeleženi fluorescentnim bojama ili fluoroforama. "Fluorescentna boja" znači fluoroforu (hemijsko jedinjenje koje apsorbuje svetlosnu energiju specifične talasne dužine i ponovo emituje svetlost na većoj talasnoj dužini). Fluorescentne boje tipično imaju maksimalni molski koeficijent ekstinkcije na talasnoj dužini između oko 300 nm do oko 1.000 nm ili od barem oko 5.000, poželjnije barem oko 10.000, i najpoželjnije barem oko 50.000 cm-1 M-1, i kvantni prinos od barem oko 0,05, poželjno barem oko 0,1, poželjnije barem oko 0,5, i najpoželjnije od oko 0,1 do oko 1.
[0146] U literaturi postoji veliki broj praktičnih uputstava za odabir odgovarajućih detektabilnih obeleživača za prikačinjanje za afinitetni reagens, kao što je na primer prikazano u sledećim referencama: Grimm et al., Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 113:1-34, 2013; Oushiki et al., Anal. Chem. 84:4404-4410, 2012; Medintz & Hildebrandt, editors, 2013, "FRET - Förster Resonance Energy Transfer: from theory to applications", (John Wiley & Sons); i slično. Literatura takođe uključuje reference koje obezbeđuju liste fluorescentnih molekula, i njihovih relevantnih optičkih svojstava za odabir fluorofora ili parova reporter-gasilac, npr. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 2005); i slično. Dodatno, postoje opsežna uputstva u literaturi za derivatizovanje reporterskih molekula za kovalentno prikačinjanje putem uobičajenih reaktivnih grupa koje se mogu dodati RT ili njegovom delu, kao što je na primer pokazano od strane: Ullman et al., S.A.D. pat. br.3,996,345; Khanna et al., S.A.D. pat. br. 4,351,760; i slično.
[0147] Primeri fluorescentnih boja uključuju, bez ograničenja, akridinske boje, cijaninske boje, fluoronske boje, oksazinske boje, fenantridinske boje, i rodaminske boje. Primeri fluorescentnih boja uključuju, bez ograničenja, fluorescein, FITC, Texas Red, ROX, Cy3, Alexa Fluor boje (npr. Alexa Fluor 647 ili 488), ATTO boje (npr. ATTO 532 ili 655), i Cy5. Primeri fluorescentnih boja mogu dodatno da uključuju boje koje se upotrebljavaju u, ili su kompatibilne sa dvo- ili četvorokanalnim SBS hemijama i radnim tokovima.
[0148] Primeri molekula za obeležavanje mogu biti odabrani od ksantenskih boja, uključujući fluoresceine, i rodaminskih boja. Mnogi pogodni oblici ovih jedinjenja su komercijalno široko dostupni sa supstituentima na njihovim fenilnim funkcionalnim grupama koje se mogu upotrebljavati kao mesto za povezivanje sa afinitetnim reagensom. Sledeća grupa fluorescentnih jedinjenja su naftilamini, koji imaju amino grupu na alfa ili beta poziciji. Uključena u takva naftilamino jedinjenja su 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonat, 1-anilino-8-naftalen sulfonat, i 2-p-toluidinil-6-naftalen sulfonat. Drugi obeleživači uključuju 3-fenil-7-izocijanatokumarin; akridine, kao što su 9-izotiocijanatoakridin i akridin oranž; N-(p-(2-benzoksazolil)fenil)maleimid; benzoksadiazole; stilbene; pirene; i slično.
[0149] U nekim primerima izvođenja, obeleživači su odabrani od fluoresceinskih i rodaminskih boja. Ove boje i odgovarajuće metodologije povezivanja su opisane u mnogim referencama, npr. Khanna et al. (prethodno citirano); Marshall, Histochemical J., 7:299-303 (1975); Menchen et al., S.A.D. pat. br. 5,188,934; Menchen et al., Evropska pat. prij. br.
87310256.0; i Bergot et al., Međunarodna prijava PCT/US90/05565. Fluorofore koje se mogu upotrebljavati kao detektabilni obeleživači za afinitetne reagense ili analoge nukleozida uključuju, ali nisu ograničene na, rodamin, cijanin 3 (Cy 3), cijanin 5 (Cy 5), fluorescein, Vic™, Liz™, Tamra™, 5-Fam™, 6-Fam™, 6-HEX, CAL Fluor Green 520, CAL Fluor Gold 540, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 615, CAL Fluor Red 635, i Texas Red (Molecular Probes).
[0150] Razumnim odabirom obeleživača, mogu se sprovesti analize u kojima se različiti obeleživači ekscituju i/ili detektuju na različitim talasnim dužinama u jednoj reakciji. Videti, npr. Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., Eds.) Marcel Dekker, New York, (1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Press, New York, (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976); Indicators (Bishop, Ed.). Pergamon Press, Oxford, 1972; i Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (2005).
4.3.2 Enzimski obeleženi afinitetni reagensi
[0151] U jednom pristupu, afinitetni reagens (npr. antitelo ili afimer) je enzimski obeležen i, u prisustvu supstrata, enzim asociran sa afinitetnim reagensom vezan za proizvod produžetka prajmera proizvodi detektabilni signal. Na primer i bez ograničenja, enzimi uključuju peroksidazu, fosfatazu, luciferazu, itd. U jednom pristupu enzim je peroksidaza. U jednom pristupu afinitetni reagens (npr. antitelo ili afimer) je direktno obeležen enzimski. U jednom pristupu, na primer, antitelo ili drugi afinitetni reagens je obeležen upotrebom peroksidaze, kao što je peroksidaza rena (HRP) ili fosfataze, kao što je alkalna fosfataza (Beyzavi et al., Annals Clin Biochem 24:145-152, 1987). U jednom pristupu, afinitetni reagens je kuplovan sa (ili je deo fuzionog proteina sa) luciferazom ili drugim proteinom koji se može upotrebljavati za proizvodnju hemiluminescentnog signala. U sledećem pristupu, afinitetni reagens može biti kuplovan/fuzionisan sa enzimskim sistemom koji je odabran da proizvodi neoptički signal, kao što je promena pH gde se protoni mogu detektovati, na primer, sekvenciranjem jonskog poluprovodnika (npr. Torent sekvenceri; Life Technologies Corporation, Grand Island, NY). Upotreba afinitetnih reagenasa obeleženih enzimima ima određene prednosti, uključujući visoku osetljivost koja je rezultat amplifikacije signala i mogućnost prilagođavanja postupka sekvenciranja različitim instrumentima. Enzimski reporterski sistemi su pregledno prikazani u Rashidian et al., Bioconjugate Chem. 24:1277-1294, 2013.
4.3.3 Afinitetni reagensi fuzionog antitela
[0152] Pored toga, mogu se upotrebljavati fuzije koje direktno povezuju rekombinantne fragmente antitela, npr. jednolančane Fv fragmente (scFv) sa reporterskim proteinima (Skerra i Plückthun, Science 240:1038-1041, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Methods Enzymol 203:46-88, 1991; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol. 2012:1, 2012). Na primer, fotoproteini sa bioluminescentnim svojstvima, npr. luciferaze i ekuorin, mogu se upotrebljavati kao reporterski proteini u fuzionim proteinima sa fragmentima antitela, peptidima epitopa i streptavidinom, na primer (Oyama et al., Anal Chem 87:12387-12395, 2015; Wang et al., Anal Chim Acta 435:255-263, 2001; Desai et al., Anal Biochem 294:132-140, 2001; Inouye et al., Biosci Biotechnol Biochem 75:568-571, 2011).
4.4 Postupci indirektne i direktne detekcije
[0153] Afinitetni reagens može biti direktno obeležen (npr. konjugacijom za obeleživač, npr. putem kovalentne veze, za fluoroforu) ili indirektno obeležen, npr. vezivanjem obeleženog sekundarnog afinitetnog reagensa koji vezuje primarni afinitetni reagens koji je direktno vezan za produženi prajmer sa 3' NLRT. Neobeleženi primarni afinitetni reagensi vezuju ciljni nukleotid, a obeleženi sekundarni afinitetni reagensi (npr. antitela, aptameri, afimeri ili knottins) vezuju primarne afinitetne reagense. U nekim pristupima primarni i/ili sekundarni afinitetni reagens je antitelo. Na primer, u jednom pristupu afinitetni reagens je "primarno" antitelo (npr. zečje anti-NLRT-C antitelo), a sekundarni bajnder je obeleženo anti-primarno antitelo (npr. bojom obeleženo kozje anti-zečje antitelo). U nekim pristupima, upotreba sekundarnog afinitetnog reagensa obezbeđuje povoljnu amplifikaciju signala.
[0154] U slučaju indirektne detekcije, test sadrži dva različita dela: prvo, postoji period inkubacije (uobičajeno jedan sat) sa neobeleženim primarnim antitelom, tokom koga se antitelo vezuje za antigen (pod pretpostavkom naravno, da je antigen prisutan). Višak nevezanog primarnog antitela se zatim ispere i dodaje se obeleženi sekundarni reagens. Posle perioda inkubacije (opet jedan sat), višak sekundarnog reagensa se ispere i kvantifikuje se količina obeleživača asociranog sa primarnim antitelom (tj. indirektno putem sekundarnog reagensa). Obeleživač uobičajeno rezultuje proizvodnjom obojene supstance ili povećanjem količine svetlosti koja se emituje na određenoj talasnoj dužini, ukoliko je antigen prisutan. U odsustvu antigena nema vezivanja primarnog antitela i nema vezivanja sekundarnog reagensa, a stoga ni signala. Sa direktnom detekcijom, prethodno kovalentno prikačinjanje obeleživača za primarno antitelo znači da je potreban samo jedan korak inkubacije sa antigenom i samo jedan krug koraka ispiranja, za razliku od dva kruga inkubacije i koraka ispiranja sa indirektnom detekcijom.
4.4.1 Specifičnost sekundarnog antitela
[0155] Primarna i sekundarna antitela mogu biti odabrana da razlikuju više antigena (npr. da međusobno razlikuju RT-A, RT-C, RT-G i RT-T). Neobeležena primarna antitela (tipično monoklonalna ili projektovana antitela) mogu imati različite izotipove i/ili imati sekvence karakteristične za različite vrste (npr. poliklonalna antitela stvorena u različitim životinjama ili odgovarajuća monoklonalna antitela ili drugi afinitetni reagensi). U takvim slučajevima, obeležena sekundarna (tj. anti-primarna) antitela za svaki antigen treba da budu specifična za odgovarajući izotip ili sekvencu vrste. Na primer, primarna antitela izotipova IgG1, IgG2a, IgG2b, i IgG3 mogu se upotrebljavati sa sekundarnim antitelima specifičnim za izotip.
4.4.2 Prethodno kombinovana primarna i sekundarna antitela
[0156] Primarna i sekundarna antitela ili drugi agensi mogu se dodati sekvencionom čipu uzastopno, istovremeno, mogu se prethodno kombinovati pod uslovima u kojima se sekundarno(a) antitelo(a) vezuju za primarno antitelo i dodaju čipu kao kompleks. Videti Sliku 2 i Primer 7.
4.5 Sekvenciranje u jednoj, dve, tri, ili četiri boje
[0157] Sekvenciranje upotrebom postupaka iz pronalaska može biti sekvenciranje u dve, tri, ili četiri boje. U jednom pristupu (sekvenciranje u četiri boje) svaki afinitetni reagens je direktno ili indirektno obeležen sa različitim detektabilnim obeleživačem (npr. fluorescentnom bojom) ili kombinacijom obeleživača koji proizvode jedinstveni signal. Biće cenjeno da kada se jedan antigen prepozna sa dve ili više boja (ili drugim obeleživačima), moguće je, ali nije neophodno, obeležiti jedan molekul afinitetnog reagensa sa obe (ili svim) bojama ili drugim obeleživačima. Radije, deo (npr. 50%) molekula afinitetnog reagensa specifičnih za jedan antigen može biti obeležen jednom bojom, a drugi deo (npr. 50%) molekula afinitetnog reagensa specifičnih za jedan antigen može biti obeležen drugom bojom.
[0158] U skladu sa jednim takvim postupkom, obezbeđen je čip koji sadrži jednolančane templat nukleinske kiseline raspoređene na pozicijama na površini. Sekvenciranje pomoću produžavanja, ili SBS, izvodi se kako bi se odredio identitet nukleotida na pozicijama detekcije u templatima nukleinske kiseline u više ciklusa sekvenciranja: (i) vezivanjem (ili inkorporisanjem) neobeleženog komplementarnog nukleotida (NLRT) za nukleotid na poziciji detekcije, (ii) obeležavanjem NLRT vezivanjem za njega direktno ili indirektno obeleženog afinitetnog reagensa koji se specifično vezuje za takav NLRT; (iii) detektovanjem prisustva ili odsustva jednog ili više signala asociranih sa komplementarnim NLRT na mestu detekcije, signala koji je rezultat obeleživača (npr. fluorescentni signal); pri čemu (1) detektovanje prvog signala, i ne drugog signala na poziciji detekcije identifikuje komplementarni NLRT kao odabran od NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G, i NLRT-C; (2) detektovanje drugog signala, i ne prvog signala na poziciji detekcije identifikuje komplementarni NLRT kao NLRT odabran od NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G, ili NLRT-C koji je različit od NLRT odabranog u (1); (3) detektovanje i prvog signala i drugog signala na poziciji detekcije identifikuje komplementarni NLRT kao NLRT odabran od NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G, i NLRT-C koji je različit od nukleotida odabranih u (1) i (2); i (4) detektovanje ni prvog signala ni drugog signala na poziciji identifikuje komplementarni NLRT kao NLRT odabran od NLRT-A, NLRT-T, NLRT-G, i NLRT-C koji je različit od nukleotida odabranih u (1), (2) i (3); i (iii) dedukcijom o identitetu nukleotida na poziciji detekcije u templat nukleinskoj kiselini na osnovu identiteta komplementarnog NLRT.
[0159] Sledeći takav postupak sadrži: obezbeđivanje mnoštva templata nukleinske kiseline od kojih svaki sadrži vezujuće mesto prajmera i, neposredno pored vezujućeg mesta prajmera, ciljnu sekvencu nukleinske kiseline; izvođenje reakcija sekvenciranja na mnoštvu različitih templata nukleinske kiseline hibridizacijom prajmera sa vezujućim mestom prajmera i produžavanjem pojedinačnih prajmera za jedan nukleotid po ciklusu u jednom ili više ciklusa sekvenciranja-pomoću-sinteze upotrebom skupa NLRT i odgovarajućeg skupa afinitetnih reagenasa, npr.: (i) prvi NLRT i prvi afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za prve NLRT i koji sadrže prvi obeleživač; (ii) drugi NLRT i drugi afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za drugi NLRT i koji sadrže drugi obeleživač; (iii) treći NLRT i treći afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za treći NLRT i koji sadrže i prvi obeleživač i drugi obeleživač; i (iv) četvrti NLRT i četvrti afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za četvrti NLRT i koji ne sadrže ni prvi obeleživač ni drugi obeleživač, pri čemu su prvi obeleživač i drugi obeleživač međusobno različiti; i u svakom ciklusu sekvenciranja-pomoćusinteze, određivanje identiteta NLRT na pozicijama detekcije detektovanjem prisustva ili odsustva prvog obeleživača i prisustva ili odsustva drugog obeleživača kako bi se odredile sekvence ciljne nukleinske kiseline. Alternativa prethodnom postupku je upotreba smeše trećih afinitetnih reagenasa koji se specifično vezuju za treći NLRT, od kojih neki sadrže prvi obeleživač, a neki sadrže drugi obeleživač (npr. jednaku smešu).
[0160] U postupku sekvenciranja u jednoj boji, afinitetni reagensi uključuju detektabilni obeleživač koji je prisutan u različitim intenzitetima. Na primer, u skladu sa jednim takvim primerom izvođenja, takav postupak sadrži: obezbeđivanje mnoštva templata nukleinske kiseline od kojih svaki sadrži vezujuće mesto prajmera i, neposredno pored vezujućeg mesta prajmera, ciljnu sekvencu nukleinske kiseline; izvođenje reakcija sekvenciranja na mnoštvu različitih templata nukleinske kiseline hibridizacijom prajmera sa vezujućim mestom prajmera i produžavanjem pojedinačnih prajmera za jedan nukleotid po ciklusu u jednom ili više ciklusa sekvenciranja-pomoću-sinteze upotrebom skupa NLRT i odgovarajućeg skupa afinitetnih reagenasa, npr.: (i) prvi NLRT i prvi afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za prve NLRT i koji sadrže obeleživač prvog intenziteta; (ii) drugi NLRT i drugi afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za drugi NLRT i koji sadrže obeleživač drugog intenziteta; (iii) treći NLRT i treći afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za treći NLRT i koji sadrže obeleživač trećeg intenziteta; i (iv) četvrti NLRT i četvrti afinitetni reagensi koji se specifično vezuju za četvrti NLRT i koji su neobeleženi (ili, alternativno, skup afinitetnih reagenasa uključuje samo prvi, drugi i treći afinitetni reagens i ne uključuje četvrti afinitetni reagens koji se vezuje za četvrti NLRT); i u svakom ciklusu sekvenciranja-pomoću-sinteze, određivanje identiteta NLRT na pozicijama detekcije detektovanjem prisustva i intenziteta (ili odsustva) obeleživača kako bi se odredile sekvence ciljne nukleinske kiseline.
[0161] U sledećem pristupu, upotrebljavaju se afinitetni reagensi koji su obeleženi sa jednim ili istim brojem molekula jedne boje, a ipak prave diskriminaciju između četiri NLRT kao rezultat različite efikasnosti vezivanja (tj. prosečan broj afinitetnih reagenasa koji su vezani za jedno mesto na čipu, npr. 10% svih kopija ciljnog molekula DNK za NLRT-A, 30% za NLRT-T, i 60% za NLRT-C (i nula procenata ili malo detektabilnog vezivanja za NLRT-G). U jednom pristupu, ciljevi imaju istu blokirajuću grupu i odabrani su afinitetni reagensi koji imaju različite afinitete za svoj cilj. U sledećem pristupu blokirajuće grupe mogu biti modifikovane sa malim hemijskim promenama kako bi se podesila efikasnost vezivanja istog afinitetnog reagensa, stoga generišući nivoe signala specifične za bazu. Na primer, nemodifikovana blokirajuća grupa može proizvesti najveći signal (100% signala), blokirajuća grupa sa modifikacijom 1 može proizvesti niži nivo signala (npr. 50%), blokirajuća grupa sa modifikacijom 2 može proizvesti još niži signal sa još manje (25%), itd.
[0162] U srodnom pristupu, upotrebom 2 različite blokirajuće grupe (azidometil i cijanoetoksimetil) i jedne hemijske varijante svake (azidometil-prajm i cijanoetoksimetilprajm) i dva antitela mogu se upotrebljavati za sekvenciranje u 2 boje (2-boje x 2-intenziteta). Za ilustraciju,
azidometil-dA Afinitetni agens 1, boja 1, nizak intenzitet (0-40%) azidometil-prajm - dC Afinitetni agens 1, boja 1, visok intenzitet (60-100%) cijanoetoksimetil - dG Afinitetni agens 2, boja 2, nizak intenzitet (0-40%) cijanoetoksimetil-prajm - dT Afinitetni agens 2, boja 2, visok intenzitet (60-100%)
[0163] U jednom primeru izvođenja, Afinitetni agens 1, boja 1, niskog intenziteta ima intenzitet signala blizu nule, a Afinitetni agens 2, boja 2, niskog intenziteta ima viši intenzitet signala (25-40%).
[0164] U srodnom primeru izvođenja pristupa, sekvenciranje u 2 boje može da se izvede u kome se jedna vrsta nukleotida upotrebljava kao smeša nukleotida u kojoj je deo obeležen sa jednom blokirajućom grupom a ostatak je obeležen sa drugom blokirajućom grupom. Za ilustraciju:
azidometil - dA Blokirajuća grupa 1
cijanoetoksimetil - dG Blokirajuća grupa 2
azidometil-prajm - dC Smeša sa 70% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 1 i 30% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 2
cijanoetoksimetil-prajm - dT Smeša sa 30% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 1 i 70% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 2
[0165] U sledećem pristupu, upotrebljava se samo jedan afinitetni reagens. Smeše nukleotida sa različitim proporcijama blokirajuće grupe koju prepoznaje afinitetni reagens upotrebljavaju se za generisanje nivoa signala koji se mogu razlikovati. Ostatak nukleotida u smešama ima blokirajuću grupu bez odgovarajućeg afinitetnog reagensa. Za ilustraciju:
azidometil - dA Blokirajuća grupa 1
cijanoetoksimetil - dG Blokirajuća grupa 2
azidometil-prajm - dC Smeša sa 70% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 1 i 30% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 2
cijanoetoksimetil-prajm - dT Smeša sa 30% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 1 i 70% nukleotida koji imaju blokirajuću grupu 2
[0166] U sledećem primeru izvođenja, antitelo bi moglo da prepozna dve baze (nukleotidni dimer) gde je nizvodna baza modifikovana adicijom grupe koja se može isecati ili koja se ne može isecati.
[0167] U sledećem primeru izvođenja, poslednja inkorporisana baza se identifikuje vezivanjem dva afinitetna reagensa u kombinaciji: jedan afinitetni reagens specifično prepoznaje i vezuje se za nukleobazu, a drugi afinitetni reagens specifično prepoznaje i vezuje se za blokirajuću grupu. Samo kada se oba afinitetna reagensa vezuju i/ili su u prostornoj blizini, može se izvršiti određivanje identiteta terminusne baze, kao kada dva afinitetna reagensa uključuju FRET donor-akceptor par kao svoje respektivne "obeleživače". Alternativno, vezivanje jednog od afinitetnih reagenasa može dovesti do konformacione promene koja dozvoljava ili poboljšava vezivanje drugog afinitetnog reagensa.
[0168] Analozi nukleozida koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati u različitim postupcima sekvenciranja. Na primer, analozi se mogu upotrebljavati u postupcima sekvenciranja sa jednim obeleživačem (ponekad se nazivaju "bez obeleživača"), dva obeleživača, tri obeleživača, ili četiri obeleživača, u kojima se neobeleženi analozi sparuju sa afinitetnim reagensima direktno ili indirektno obeleženim u skladu sa šemom sa jednim, dva, tri, ili četiri obeleživača.
[0169] Primeri postupaka sekvenciranja sa jednim obeleživačem uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke u kojima se analozi nukleozida koji imaju različite nukleobaze (npr. A, C, G, T) isporučuju sukcesivno i inkorporisanje se detektuje detektovanjem prisustva ili odsustva istog signala ili obeleživača za svaku različitu nukleobazu. Stoga su postupci sa jednim obeleživačem ponekad poznati kao postupci u jednoj boji zato što je detekcioni signal i/ili obeleživač isti za sve nukleobaze, iako se može razlikovati po intenzitetu (ili biti odsutan) za svaki analog nukleozida.
[0170] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, sekvenciranje sa dva obeleživača, ili u dve boje može se izvesti upotrebom RT i afinitetnih reagenasa koji su ovde opisani, upotrebom dva signala koja se mogu razlikovati na kombinatorni način kako bi se detektovalo inkorporisanje četiri različita RT. Primeri sistema, postupaka i kompozicija sa dva obeleživača uključuju, bez ograničenja, one opisane u S.A.D. pat. br. 8,617,811. Ukratko, u sekvenciranju sa dva obeleživača, inkorporisanje prvog RT (npr. RT-A) detektuje se obeležavanjem novoinkorporisanog RT specifičnim vezivanjem prvog afinitetnog reagensa koji uključuje prvi obeleživač, a zatim detektovanjem prisustva prvog obeleživača. Inkorporisanje drugog RT (npr. RT-C) detektuje se obeležavanjem drugog RT specifičnim vezivanjem drugog afinitetnog reagensa koji uključuje drugi obeleživač, a zatim detektovanjem prisustva drugog obeleživača. Inkorporisanje trećeg RT (npr. RT-T) detektuje se obeležavanjem trećeg RT specifičnim vezivanjem trećeg afinitetnog reagensa koji uključuje i prvi i drugi obeleživač, a zatim detektovanjem prisustva i prvog i drugog obeleživača; i, inkorporisanje četvrtog RT (npr. RT-G) detektuje se detektovanjem odsustva i prvog i drugog obeleživača, bilo da je to rezultat vezivanja četvrtog afinitetnog reagensa koji nije obeležen ili zbog činjenice da nema četvrtog afinitetnog reagensa uključenog u skup afinitetnih reagenasa koji se upotrebljava. U sekvenciranju u dve boje prvi obeleživač se razlikuje od drugog obeleživača, a kombinacija prvog i drugog obeleživača može se razlikovati od prvog i drugog obeleživača uzetih samih.
[0171] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, sekvenciranje sa tri obeleživača može se izvesti upotrebom prvog RT koji je obeležen specifičnim vezivanjem prvog afinitetnog reagensa koji uključuje prvi obeleživač, drugog RT koji je obeležen specifičnim vezivanjem drugog afinitetnog reagensa koji uključuje drugi obeleživač, trećeg RT koji je obeležen specifičnim vezivanjem trećeg afinitetnog reagensa koji uključuje treći obeleživač. Za četvrti RT, odgovarajući afinitetni reagens je izostavljen iz skupa afinitetnih reagenasa, ili je neobeležen, ili uključuje kombinaciju dva ili više od prvog, drugog, i trećeg obeleživača (ili smešu afinitetnih reagenasa koji su obeleženi sa različitim od obeleživača i koja se specifično vezuje za četvrti RT). Prvi, drugi i treći obeleživač su međusobno različiti.
[0172] Slično, sekvenciranje sa četiri obeleživača može koristiti prvi NLRT koji je obeležen specifičnim vezivanjem prvog afinitetnog reagensa koji uključuje prvi obeleživač, drugi NLRT koji je obeležen specifičnim vezivanjem drugog afinitetnog reagensa koji uključuje drugi obeleživač, treći NLRT koji je obeležen specifičnim vezivanjem trećeg afinitetnog reagensa koji uključuje treći obeleživač, i četvrti NLRT koji je obeležen specifičnim vezivanjem četvrtog afinitetnog reagensa koji uključuje četvrti obeleživač. Ponovo, prvi, drugi, treći i četvrti obeleživači su međusobno različiti.
4.6 Afinitetni reagensi koji se upotrebljavaju u kombinaciji
[0173] Afinitetni reagensi koji prepoznaju različite epitope jednog NLRT mogu se upotrebljavati u kombinaciji. Na primer, prvi afinitetni reagens koji prepoznaje deo nukleobaze inkorporisanog NLRT može se upotrebljavati sa drugim afinitetnim reagensom koji prepoznaje blokirajuću grupu. Bojenje se može vršiti istovremeno ili uzastopno. U uzastopnom bojenju drugi afinitetni reagens se može primeniti dok prvi afinitetni reagens ostaje vezan za NLRT ili posle uklanjanja prvog afinitetnog reagensa u slučaju ponovnog ispitivanja (o čemu se diskutuje u nastavku).
4.7 Skupovi afinitentih reagenasa
[0174] "Skupovi afinitetnih reagenasa" se upotrebljavaju za obeležavanje RT koji se upotrebljavaju u SBS. Na primer, u jednom primeru izvođenja, za RT skup koji uključuje četiri RT (RT-A, RT-T, RT-C i RT-G), može postojati odgovarajući skup afinitetnih reagenasa od četiri afinitetna reagensa, od kojih svaki specifično prepoznaje i vezuje se za jedan od RT (antiA, antiT, antiC i antiG). Skupovi afinitetnih reagenasa opisuju kombinacije afinitetnih reagenasa koji se mogu (i) obezbediti u obliku kompleta, kao smeša ili u zasebnim kontejnerima i/ili (ii) biti u kontaktu sa, ili kombinovani na sekvencionom čipu (npr. unutar sekvencione protočne ćelije).
[0175] U skladu sa jednim primerom izvođenja, svaki član skupa afinitetnih reagenasa ima drugačiji, detektabilni obeleživač koji se može razlikovati, kao u SBS u četiri boje.
[0176] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, jedan član skupa afinitetnih reagenasa je neobeležen, dok su ostali članovi obeleženi. Alternativno, skup afinitetnih reagenasa može jednostavno isključivati neobeleženi afinitetni reagens i uključivati samo obeležene afinitetne reagense.
[0177] Na primer, u skladu sa jednim primerom izvođenja, jedan afinitetni reagens je obeležen sa prvim obeleživačem (npr. antiA); drugi afinitetni reagens je obeležen sa drugim obeleživačem (npr. antiT); treći afinitetni reagens je obeležen sa trećim obeleživačem (npr. antiC); a četvrti afinitetni reagens je neobeležen ili jednostavno isključen iz skupa afinitetnih reagenasa (npr. antiG). Takav skup afinitetnih reagenasa bio bi koristan za sekvenciranje u tri boje.
[0178] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, jedan afinitetni reagens (npr. antiA) je obeležen sa prvim obeleživačem; drugi afinitetni reagens (npr. antiT) je obeležen sa drugim obeleživačem; treći afinitetni reagens (npr. antiC) je obeležen i sa prvim obeleživačem i sa drugim obeleživačem; a četvrti afinitetni reagens (npr. antiG) je neobeležen (ili isključen iz skupa afinitetnih reagenasa). Alternativno, treći afinitetni reagens može uključivati smešu molekula afinitetnog reagensa, od kojih se svi specifično vezuju za određenu bazu (npr. svi su antiC), ali neki uključuju prvi obeleživač, a neki uključuju drugi obeleživač. Takvi skupovi afinitetnih reagenasa bili bi korisni za sekvenciranje u dve boje.
[0179] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, upotrebljava se samo jedan detektabilni obeleživač (ili jedna kombinacija dva ili više obeleživača), ali se razlikuje po intenzitetu među članovima skupa, kao kada afinitetni reagens uključuje različite količine obeleživača (ili barem jednog obeleživača iz kombinacije dva ili više obeleživača). Na primer, u jednom primeru izvođenja, prvi afinitetni reagens (npr. antiA) je obeležen sa obeleživačem prvog intenziteta; drugi afinitetni reagens (npr. antiT) je obeležen sa istim obeleživačem, ali drugog intenziteta; treći afinitetni reagens (npr. antiC) je obeležen sa istim obeleživačem, ali sa trećim intenzitetom; a četvrti afinitetni reagens (npr. antiG) je neobeležen (ili je četvrti afinitetni reagens isključen iz skupa afinitetnih reagenasa). U sladećem primeru izvođenja, prvi afinitetni reagens (npr. antiA) je obeležen sa prvim obeleživačem prvog intenziteta i drugim obeleživačem; drugi afinitetni reagens (npr. antiT) je obeležen sa istim prvim obeleživačem, ali drugog intenziteta i istim drugim obeleživačem; treći afinitetni reagens (npr. antiC) je obeležen istim prvim obeleživačem, ali trećeg intenziteta i istim drugim obeleživačem; a četvrti afinitetni reagens (npr. antiG) je neobeležen, obeležen je samo sa drugim obeleživačem, ili je isključen iz skupa afinitetnih reagenasa.
4.8 Reakcione smeše
[0180] Analozi nukleozida (npr. NLRT) i oligo- ili polinukleotidi koji sadrže takve analoge nukleozida ili njihove reakcione proizvode mogu se upotrebljavati kao komponenta reakcione smeše. Na primer, takve komponente se mogu upotrebljavati u reakcionim smešama za sekvenciranje nukleinske kiseline (npr. SBS). Primeri reakcionih smeša uključuju, ali nisu ograničeni na, one koje sadrže (a) templat nukleinsku kiselinu; (b) polimerazu; (c) oligonukleotidni prajmer; (d) 3'-O reverzibilno blokiran analog nukleozida, ili smešu 3'-O reverzibilno blokiranih analoga nukleozida koji imaju strukturno različite nukleobaze; i (e) obeleženi afinitetni reagens. Primeri sekvencionih reakcionih smeša iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, čipove koji sadrže mnoštvo različitih templat nukleinskih kiselina imobilisanih na različitim lokacijama na čipu; (b) polimerazu; (c) oligonukleotidni prajmer; (d) i jedan ili smešu NLRT. Primeri sekvencionih reakcionih smeša iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, čipove koji sadrže mnoštvo različitih templat nukleinskih kiselina imobilisanih na različitim lokacijama na čipu; (b) rastuće DNK lance (GDS) (koji mogu da sadrže 3ꞌ NLRT; i (c) jedan ili više afinitetnih reagenasa (npr. skup afinitetnih reagenasa kao što je prethodno opisano).
5. Templat nukleinske kiseline i čipovi nukleinske kiseline
[0181] U različitim primerima izvođenja, templat polinukleotid je DNK (npr. cDNA, genomska DNK, DNK transkriptoma ili mikrobioma, proizvodi amplifikacije, itd.) ili RNK. U različitim primerima izvođenja, polinukleotid je bilo dvolančan ili jednolančan.
[0182] U nekim primerima izvođenja, templat nukleinska kiselina je imobilisana na čvrstoj površini. U nekim primerima izvođenja, templat nukleinska kiselina je imobilisana na supstratu (npr. perla, protočna ćelija, jastučić, kanal u mikrofluidnom uređaju i slično). Supstrat može da sadrži silicijum, staklo, zlato, polimer, PDMS, i slično.
[0183] U nekim primerima izvođenja, templat nukleinska kiselina je imobilisana ili sadržana unutar kapljice (opciono imobilisana na perli ili drugom supstratu unutar kapljice).
[0184] U nekim primerima izvođenja, templat nukleinska kiselina je imobilisani DNK konkatemer koji sadrži više kopija ciljne sekvence. U nekim primerima izvođenja, templat nukleinska kiselina je predstavljena kao DNK konkatemer, kao što je DNK nanolopta (DNB) koja sadrži više kopija ciljne sekvence i "adaptorske sekvence". Videti PCT pat. publ. WO 2007/133831. U nekim primerima izvođenja templat je jedan polinukleotidni molekul. U nekim primerima izvođenja templat je prisutan kao klonska populacija templat molekula (npr. klonska populacija proizvedena most amplifikacijom ili Wildfire amplifikacijom).
[0185] Podrazumeva se da postupak nije ograničen na određeni oblik templata, i templat može biti bilo koji templat kao što je, na primer, DNK konkatemer, dendrimer, klonska populacija templata (npr. proizvedena most amplifikacijom ili Wildfire amplifikacijom) ili jedan polinukleotidni molekul. Stoga, specifikaciju treba čitati kao da svako pozivanje na templat može alternativno označavati templat konkatemera, dendrimer, klonsku populaciju, npr. kratkih linearnih templata, templat jednog molekula (npr. u talasovodu nultog moda), i template u drugim oblicima.
[0186] Pogodne templat nukleinske kiseline, uključujući DNB, klastere, polonije, i njihove čipove ili grupe, dodatno su opisane u S.A.D. patentnima br. 8,440,397; 8,445,194; 8,133,719; 8,445,196; 8,445,197; 7,709,197; 12/335,168, 7,901,891; 7,960,104; 7,910,354; 7,910,302; 8,105,771; 7,910,304; 7,906,285; 8,278,039; 7,901,890; 7,897,344; 8,298,768; 8,415,099; 8,671,811; 7,115,400; 8,236,499, i S.A.D. patentnim publ. br. 2015/0353926; 2010/0311602; 2014/0228223; i 2013/0338008.
[0187] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje DNK čip koji sadrži: mnoštvo templat DNK molekula, svaki molekul DNK prikačen na poziciji čipa, komplementarne DNK sekvence bazno sparene sa delom templat DNK molekula na mnoštvu pozicija, pri čemu komplementarna DNK sekvenca sadrži na svom 3' kraju inkorporisani prvi reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid; i prvi afinitetni reagens specifično vezan za barem neke od prvih reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida. U jednom pristupu, DNK čip sadrži proizvode produžetka prajmera sa 3' terminusnim nukleotidima koji sadrže A, T, G ili C nukleobaze ili njihove analoge, i afinitetne reagense vezane za proizvode produžetka prajmera.
6. Kompleti
[0188] Mogu se obezbediti kompleti za praksu pronalaska. Kao što je prethodno opisano, NLRT i skupovi NLRT mogu biti obezbeđeni u obliku kompleta. Takođe, kao što je prethodno opisano, afinitetni reagensi i skupovi afinitetnih reagenasa mogu biti obezbeđeni u obliku kompleta. Takođe se razmatraju kompleti koji sadrže i NLRT i skupove NLRT i afinitetne reagense ili skupove afinitetnih reagenasa. Na primer, pronalazak obezbeđuje komplete koji uključuju, bez ograničenja (a) reverzibilni terminator nukleotid (RT) ili skup RT koji uključuje jedan, dva, tri, četiri ili više različitih pojedinačnih RT; (b) odgovarajući afinitetni reagens ili skup afinitetnih reagenasa koji uključuje barem dva, ili opciono tri, četiri ili više afinitetnih reagenasa, od kojih je svaki specifičan za jedan od RT; i (c) materijale za pakovanje i/ili uputstva za upotrebu.
[0189] U skladu sa sledećim primerom izvođenja, takav komplet sadrži mnoštvo RT, pri čemu svaki RT sadrži različitu nukleobazu, i mnoštvo afinitetnih reagenasa, pri čemu se svaki afinitetni reagens specifično vezuje za jedan od RT.
[0190] U jednom primeru, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži (a) reverzibilni terminator nukleotid kao što je ovde opisano koji može biti inkorporisan u proizvod produžetka prajmera; (b) prvi afinitetni reagens koji se specifično vezuje za reverzibilni terminator nukleotid kada je inkorporisan na 3ꞌ terminusu proizvoda produžetka prajmera; i (c) pakovanje za (a) i (b). U jednom pristupu, komplet sadrži mnoštvo reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida, pri čemu svaki reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid sadrži različitu nukleobazu, i mnoštvo prvih afinitetnih reagenasa, pri čemu svaki prvi afinitetni reagens specifično vezuje različit od reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida. U nekim primerima izvođenja prvi afinitetni reagensi su detektabilno obeleženi i mogu se međusobno razlikovati. U nekim primerima izvođenja komplet sadrži sekundarne afinitetne reagense. U nekim primerima izvođenja, prvi i/ili drugi afinitetni reagensi su antitela.
[0191] U jednom primeru, reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid ima strukturu Formule I:
pri čemu je R13'-O reverzibilna blokirajuća grupa; R2je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), timina (T), i njihovih analoga; i R3sadrži jedan ili više fosfata.
7. Primene
[0192] Pored primena SBS koje su prethodno opisane, novi afinitetni reagensi, NLRT, kompleti i postupci koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati u mnogim drugim primenama, kao što je detektovanje onoga što je na kraju prirodno ili eksperimentalno fragmentisane DNK (ili u DNK prazninama); hvatanje oligonukleotida ili polinukleotida sa specifičnom krajnjom bazom (kraj molekula ili kraj unutar praznina lanca) sa ili bez specifične modifikacije. Mogu se detektovati i 5ꞌ ili 3ꞌ kraj/praznina baze. Afinitetni reagensi se mogu upotrebljavati za ligaciju, hibridizaciju, i drugu detekciju.
[0193] Biće cenjeno da se postupci iz pronalaska mogu takođe upotrebljavati za direktno sekvenciranje RNK.
8. Postupci
8.1 Uklanjanje blokirajućih grupa, uklanjanje afinitetnih reagenasa, i detekcija
[0194] Uklanjanje blokirajućih grupa i afinitetnih reagenasa može se desiti istovremeno. U jednom pristupu, čip se izlaže uslovima u kojima se blokirajuće grupe i afinitetni reagensi uklanjaju istovremeno. U jednom čip se dovodi u kontakt sa rastvorom sa kombinacijom agenasa od kojih neki rezultuju uklanjanjem afinitetnih reagenasa (npr. visok sadržaj soli, kompetitori malog molekula, proteaze, itd.) kombinovanih sa agensima koji isecaju blokirajuću grupu.
[0195] U nekim slučajevima, uklanjanje 3' blokirajuće grupe rezultuje uklanjanjem afinitetnog reagensa. Bez namere da budemo vezani određenim mehanizmom, veruje se da u ovim slučajevima uklanjanje blokirajuće funkcionalne grupe uništava epitop potreban za vezivanje antitela ili drugog afinitetnog reagensa.
[0196] U drugačijem pristupu, uklanjanje afinitetnog reagensa i blokirajuće grupe je odvojeno, tako da se afinitetni reagens uklanja, ali blokirajuća grupa se ne iseca sa nukleotidnog šećera. Ovo je korisno kada se želi ponovno ispitivanje. Videti Sliku 2, Odeljak 9, u nastavku, i Primer 11.
[0197] Biće cenjeno da će uslovi za uslove uklanjanja za uklanjanje afinitetnih reagenasa i/ili blokirajućih grupa biti odabrani kako bi se očuvao integritet DNK koja se sekvencira.
8.1.1 Uklanjanje blokirajućih grupa
[0198] Analozi nukleozida ili NLRT uključuju one koji su 3'-O reverzibilno blokirani. U nekim aspektima, blokirajuća grupa obezbeđuje kontrolisano inkorporisanje jednog 3'-O reverzibilno blokiranog NLRT na 3'-kraj prajmera, npr. GDS koji je produžen u prethodnom ciklusu sekvenciranja.
[0199] Generalno, u svakom ciklusu sekvenciranja u kom se upotrebljavaju NLRT, blokirajuća grupa se uklanja i afinitetni reagens se disasocira sa NLRT. Ovi koraci se mogu izvoditi istovremeno. Na primer, azidometil blokirajuća grupa se može ukloniti tretmanom sa fosfinom (proces koji se široko upotrebljava), i afinitetni reagens antitelo može se ukloniti tretmanom sa niskom pH (npr. 100 mM glicin pH 2,8) ili visokom pH (npr. 100 mM glicin pH 10), visokim sadržajem soli, ili puferom za haotropno skidanje. U jednom primeru izvođenja, jedan tretman ili uslov može se upotrebljavati za uklanjanje i NLRT i afinitetnog reagensa (npr. fosfin u puferu sa visokim sadržajem soli). U nekim primerima izvođenja, uklanjanje blokirajuće grupe rezultuje disocijacijom afinitetnog reagensa ukoliko je, na primer, blokirajuća grupa potrebna za vezivanje afinitetnog reagensa.
[0200] 3ꞌ-O reverzibilna blokirajuća grupa može se ukloniti enzimskim isecanjem ili hemijskim isecanjem (npr. hidrolizom). Uslove za uklanjanje može da odabere neko sa prosečnim iskustvom u struci na osnovu ovde obezbeđenih opisa, hemijskog identiteta blokirajuće grupe koja treba da se iseca, i hemijskih principa nukleinske kiseline koji su poznati u struci. U nekim primerima izvođenja, blokirajuća grupa se uklanja dovođenjem u kontakt reverzibilno blokiranog nukleozida sa redukujućim agensom kao što je ditiotreitol (DTT), ili fosfinskim reagensom kao što je tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), tris(hidroksimetil)fosfin (THP), ili tris(hidroksipropil) fosfin. U nekim slučajevima, blokirajuća grupa se uklanja ispiranjem blokirajuće grupe sa inkorporisanog analoga nukleotida upotrebom redukujućeg agensa kao što je fosfinski reagens. U nekim slučajevima, blokirajuća grupa je fotolabilna, i blokirajuća grupa se može ukloniti primenom, npr. UV svetla. U nekim slučajevima, blokirajuća grupa se može ukloniti dovođenjem u kontakt analoga nukleozida sa reakcijom katalizovanom prelaznim metalom upotrebom, npr. vodenog rastvora paladijuma (Pd). U nekim slučajevima, blokirajuća grupa se može ukloniti dovođenjem u kontakt analoga nukleozida sa vodenim rastvorom nitrita. Dopunski, ili alternativno, blokirajuća grupa se može ukloniti promenom pH rastvora ili smeše koja sadrži inkorporisani analog nukleotida. Na primer, u nekim slučajevima, blokirajuća grupa se može ukloniti dovođenjem u kontakt analoga nukleozida sa kiselinom ili puferisanim vodenim rastvorom sa niskom pH (npr. manjom od 4). Kao sledeći primer, u nekim slučajevima, blokirajuća grupa se može ukloniti dovođenjem u kontakt analoga nukleozida sa bazom ili puferisanim vodenim rastvorom sa visokom pH (npr. većom od 10).
[0201] 3'-O reverzibilne blokirajuće grupe koje mogu da se isecaju pomoću redukujućeg agensa, kao što je fosfin, uključuju, ali nisu ograničene na, azidometil. 3ꞌ-O reverzibilne blokirajuće grupe koje mogu da se isecaju UV svetlom uključuju, ali nisu ograničene na, nitrobenzil. 3'-O reverzibilne blokirajuće grupe koje mogu da se isecaju dovođenjem u kontakt sa vodenim rastvorom Pd uključuju, ali nisu ograničene na, alil. 3'-O reverzibilne blokirajuće grupe koje mogu da se isecaju pomoću kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, metoksimetil. 3’-O reverzibilne blokirajuće grupe koje mogu da se isecaju dovođenjem u kontakt sa puferisanim vodenim (pH 5,5) rastvorom natrijum nitrita uključuju, ali nisu ograničene na, aminoalkoksil.
8.1.2 Uklanjanje afinitetnih reagenasa
[0202] Afinitetni reagensi zasnovani na antitelu mogu se ukloniti pomoću niske pH, visoke pH, visokog ili niskog sadržaja soli, ili denaturišućih agenasa kao što je pufer za haotropno skidanje. Druge klase afinitetnih reagenasa (npr. aptameri) mogu se ukloniti na bilo koji način koji je poznat u struci. Pored toga, afinitetni reagensi, kao što su antitela, mogu se ukloniti introdukovanjem agensa koji je u kompeticiji sa vezanim epitopom za vezivanje afinitetnog reagensa, na primer kao što je ilustrovano u Primeru 10 u nastavku.
[0203] Pored toga, afinitetni reagensi se takođe mogu ukloniti narušavanjem sposobnosti agensa da vezuje inkorporisani NLRT. Tipično ovo se dešava kada se 3' blokirajuća grupa iseče sa inkorporisanog analoga nukleotida. U slučajevima u kojima vezivanje afinitetnog reagensa zavisi od prisustva blokirajuće grupe (na primer, u slučajevima u kojima epitop prepoznat od strane 1° antitela uključuje blokirajuću grupu ili njen deo), uklanjanje blokirajuće grupe takođe rezultuje oslobađanjem afinitetnog reagensa.
[0204] Istovremeno uklanjanje afinitetnih reagenasa i blokirajućih grupa takođe može da se desi istovremeno, takođe može da se postigne dodavanjem rastvora koji sadrži komponentu koja iseca blokirajuću grupu (npr. fosfinski reagens) i agens za oslobađanje afinitetnog reagensa (npr. visok sadržaj soli).
[0205] Alternativno, afinitetni reagens se može ukloniti bez uklanjanja 3' blokirajuće grupe. Ovaj pristup je koristan kada se želi ponovno ispitivanje (kao što je opisano u Odeljku 9, u nastavku).
8.1.3 Detekcija
[0206] Postupci za detektovanje događaja vezivanja će varirati u zavisnosti od prirode detektabilnog(ih) obeleživača koji se upotrebljavaju i dobro su poznati u struci. Detekcija (npr. fluorescentnog signala) se generalno izvodi pre uklanjanja blokirajuće grupe. Međutim, detekcija se može izvršiti ili pre ili posle uklanjanja blokirajuće grupe sve dok obeleženi afinitetni reagens ostaje vezan.
8.2 Proizvodnja antitela
[0207] Na primer, mala jedinjenja (lekovi ili peptidi) nisu dovoljno složena sama po sebi da indukuju imunski odgovor ili da budu obrađena na način koji izaziva proizvodnju specifičnih antitela. Kako bi proizvodnja antitela bila uspešna sa malim antigenima, oni moraju biti hemijski konjugovani za imunogene proteine nosače kao što je hemocijanin iz puža prilepka ključaonice (KLH). Adjuvansi se mogu pomešati i injektirati sa imunogenom kako bi se povećao intenzitet imunskog odgovora. Konjugacija proteina nosača, upotreba adjuvansa i druga pitanja u vezi sa pripremom uzoraka za injekcije opisani su u ovom odeljku o proizvodnji antitela. Mogu se upotrebljavati standardne procedure za generisanje, prečišćavanje i modifikovanje antitela za upotrebu kao antigen-specifične probe. Videti, npr. Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988) i Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual" (1999).
[0208] Hapteni: Mali molekuli koji se upotrebljavaju kao antigeni označavaju se kao hapteni. Oni su u stanju da deluju kao mesta prepoznavanja za proizvodnju specifičnih antitela, ali ne mogu sami da stimulišu neophodan imunski odgovor. Hapteni se mogu učiniti imunogenim njihovim kuplovanjem za pogodan molekul nosač.
[0209] Epitopi: Epitop je specifično mesto na antigenu za koje se vezuje antitelo. Za veoma male antigene, praktično cela hemijska struktura može delovati kao jedan epitop. U zavisnosti od svoje složenosti i veličine, antigen može uticati na proizvodnju antitela usmerenih na brojne epitope. Poliklonalna antitela su smeše serumskih imunoglobulina i verovatno će se zajedno vezati za više epitopa na antigenu.
[0210] Hemocijanin iz puža prilepka ključaonice (KLH). Hemocijanin iz puža prilepka ključaonice (KLH) je najšire upotrebljavani protein nosač.
[0211] Goveđi serumski albumin. Goveđi serumski albumin (BSA; 67 kDa) pripada klasi serumskih proteina koji se nazivaju albumini.
8.3 Protokoli imunizacije
[0212] Protokoli imunizacije su dobro poznati i ovde su samo generalno opisani. Videti Primer 2, u nastavku za dopunske opise. Koncentracija imunogena pre mešanja sa adjuvansom će na kraju odrediti količinu konjugata koji će biti primenjen po injekciji. Raspored imunizacije za miševe: Dan 0: Sakupiti preimunski serum iz miša kako bi se upotrebio kao blanko kada se izvodi ELISA pregled posle imunizacije. Čuvati zamrznuto. Injektirati 50 do 100 μg imunogena (jednako 100 do 200 μl smeše antigen-adjuvans) po mišu. Tipični putevi injektiranja uključuju intraperitonealno (i.p.) ili subkutano (s.c.). Jedna ili dve takve injekcije se mogu dati po životinji. Dan 14: Podstaći sa ekvivalentnom količinom imunogena u adjuvansu. Dan 21: Uzeti krv za test i testirati odgovor antitela pomoću ELISA testa. (Tipično, miševima se krv uzima pod anestezijom iz repne vene ili retro-orbitalnog pleksusa). Dan 28: Ponovo podstaći ukoliko je potrebno. Nastaviti sa sličnim rasporedom naizmeničnih injetiranja podsticanja i uzimanja krvi za test dok se ne uoči zadovoljavajući odgovor. Za proizvodnju monoklonalnih antitela, injektirati ili i.p. ili intravenski (i.v.) 4 do 5 dana pre fuzije sa imunogenom rastvorenim u fiziološkom rastvoru (bez adjuvansa).
[0213] Raspored imunizacije za zečeve: Dan 0: Sakupiti preimunski serum iz zeca kako bi se upotrebio kao blanko kada se izvodi ELISA posle imunizacije. Čuvati zamrznuto. Injektirati 100 μg imunogena (jednako oko 200 μl smeše antigen-adjuvans) u svako od 8 do 10 subkutanih mesta na leđima zeca. Mogu se upotrebljavati i drugi putevi injektiranja, ali je kod zeca ovo daleko najlakše. Dan 14: Podstaći sa ekvivalentnom količinom adjuvansa. Dan 21: Uzeti krv za test i testirati odgovor antitela pomoću ELISA testa. (Tipično, zečevima se krv uzima iz ušne vene bez anestetika). Nije teško sakupiti 5 do 10 ml krvi, što je više nego dovoljno za merenje odgovora antitela. Dan 28: Ponovo podstaći ukoliko je potrebno. Nastaviti sa sličnim rasporedom naizmeničnih podsticanja i uzimanja krvi za test dok se ne uoči zadovoljavajući odgovor.
[0214] Generalno prečišćavanje imunoglobulina. Pošto antitela imaju predvidljivu strukturu, uključujući relativno nepromenljive domene, moguće je identifikovati određene proteinske ligande koji su sposobni da se generalno vezuju za antitela, bez obzira na specifičnost antitela za antigen. Protein A, Protein G i Protein L su tri bakterijska proteina čija su svojstva vezivanja antitela dobro okarakterisana. Ovi proteini se proizvode rekombinantno i upotrebljavaju se rutinski za afinitetno prečišćavanje ključnih tipova antitela iz različitih vrsta. Dostupan je i genetički projektovan rekombinantni oblik Proteina A i G, nazvan Protein A/G. Ovi proteini koji vezuju antitela dostupni su imobilisani na agaroza smolu u obliku perli.
8.4 Afinitetno prečišćavanje antitela
[0215] Upotrebljavaju se različiti postupci za obogaćivanje ili prečišćavanje proteina od interesa od drugih proteina i komponenti u sirovom ćelijskom lizatu ili drugom uzorku. Najsnažniji od ovih postupaka je afinitetna hromatografija, takođe nazvana afinitetno prečišćavanje, pri čemu se protein od interesa prečišćava na osnovu svojih specifičnih svojstava vezivanja za imobilisani ligand.
[0216] Proteini i drugi makromolekuli od interesa mogu se prečistiti iz sirovih ekstrakata ili drugih složenih smeša različitim postupcima. Selektivna precipitacija je možda najjednostavniji postupak za odvajanje jednog tipa makromolekula od druge.
[0217] Većina postupaka prečišćavanja, međutim, uključuje neki oblik hromatografije pri čemu se molekuli u rastvoru (mobilna faza) odvajaju na osnovu razlika u hemijskoj ili fizičkoj interakciji sa stacionarnim materijalom (čvrsta faza). Gel filtracija (takođe nazvana ekskluziona hromatografija ili SEC) upotrebljava materijal porozne smole za odvajanje molekula na osnovu veličine (tj. fizičko isključivanje). U jonoizmenjivačkoj hromatografiji, molekuli se odvajaju u skladu sa jačinom svoje ukupne jonske interakcije sa materijalom čvrste faze (tj. nespecifične interakcije).
[0218] Nasuprot tome, afinitetna hromatografija (takođe se naziva afinitetno prečišćavanje) upotrebljava specifične interakcije vezivanja između molekula. Određeni ligand se hemijski imobiliše ili "kupluje" za čvrst nosač tako da kada se kompleksna smeša propusti preko kolone, oni molekuli koji imaju specifičan afinitet vezivanja za ligand postaju vezani. Pošto se druge komponente uzorka isperu, vezani molekul se skida sa podloge, što rezultuje njegovim prečišćavanjem iz originalnog uzorka.
[0219] Svaki specifični afinitetni sistem zahteva sopstveni skup uslova i prezentuje svoje specifične izazove za datu svrhu istraživanja. Drugi članci o postupcima sa proteinima opisuju faktore i uslove povezane sa određenim sistemima prečišćavanja.
8.5 Obeležavanje antitela
[0220] Struktura antitela i mesta modifikacije. Antitela, kao i drugi proteini, mogu biti kovalentno modifikovana na mnogo načina kako bi odgovarala svrsi određenog testa. Mnogi imunološki postupci uključuju upotrebu obeleženih antitela i kreirani su različiti reagensi koji omogućavaju obeležavanje antitela. Enzimi, biotin, fluorofore i radioaktivni izotopi se uobičajeno upotrebljavaju za obezbeđivanje detekcionog signala u biološkim testovima. Razumevanje funkcionalnih grupa koje su dostupne na antitelu je ključ za izbor najboljeg postupka za modifikaciju, bilo da se radi o obeležavanju, unakrsnom povezivanju ili kovalentnom imobilisanju. Većina strategija obeležavanja antitela upotrebljava jedan od tri cilja: (1) Primarni amini (-NH2): oni se javljaju na ostacima lizina i N-terminusu svakog polipeptidnog lanca. Oni su brojni i raspoređeni su po celom antitelu. (2) Sulfhidrilne grupe (-SH): one se javljaju na ostacima cisteina i postoje kao disulfidne veze koje stabilizuju strukturu celog molekula. Disulfidi zglobnog regiona mogu se selektivno redukovati kako bi se napravili slobodni sulfhidrili dostupni za ciljano obeležavanje. (3) Ugljeni hidrati (šećeri): glikozilacija se javlja prvenstveno u Fc regionu antitela (IgG). Komponentni šećeri u ovim polisaharidnim funkcionalnim grupama koji sadrže cis-diole mogu se oksidovati kako bi se kreirali aktivni aldehidi (-CHO) za kuplovanje.
[0221] Postupci obeležavanja antitela. Bilo koji poznati postupak za obeležavanje antitela može se upotrebljavati u praksi predmetnog pronalaska. Antitela kao i svi proteini su sačinjeni od amino-kiselina, i bočni lanac lizina, koji se završava primarnim aminom (-NH2), se uobičajeno upotrebljava za kovalentno povezivanje obeleživača sa molekulima antitela.
[0222] Četiri glavna hemijska pristupa za obeležavanje antitela su sažeta u nastavku:
1. NHS estri. U slučaju obeleživača fluorescentne boje uobičajeno je kupiti aktivirani oblik obeleživača sa ugrađenim NHS estrom (koji se takođe naziva 'sukcinimidil estar'). Aktivirana boja može da reaguje pod odgovarajućim uslovima sa antitelima (od kojih sva imaju više grupa lizina). Višak reaktivne boje se uklanja jednim od nekoliko mogućih postupaka (često hromatografija na koloni) pre nego što se obeleženo antitelo može upotrebljavati u imunotestu.
2. Heterobifunkcionalni reagensi. Ukoliko je obeleživač proteinski molekul (npr. peroksidaza rena [HRP], alkalna fosfataza, ili fikoeritrin), procedura obeležavanja antitela je zakomplikovan činjenicom da antitelo i obeleživač imaju više amina. U ovoj situaciji je uobičajeno da se modifikuju neki od lizina na jednom molekulu (npr. antitelu) kako bi se kreirala nova reaktivna grupa (X) i lizini na obeleživaču kako bi se kreirala druga reaktivna grupa (Y). 'Heterobifunkcionalni reagens' se upotrebljava za introdukovanje Y grupa, koje naknadno reaguju sa X grupama kada se antitelo i obeleživač pomešaju, kreirajući stoga heterodimerne konjugate. Postoji mnogo varijacija na ovu temu i naći ćete stotine primera u literaturi o upotrebi heterobifunkcionalnih reagenasa za kreiranje obeleženih antitela i drugih obeleženih biomolekula.
3. Karbodiimidi. Ovi reagensi (EDC je jedan veoma čest primer) se upotrebljavaju za kreiranje kovalentnih veza između molekula koji sadrže amin i karboksil. Karbodiimidi aktiviraju karboksilne grupe, i aktivirani intermedijar je zatim napadnut od strane amina (npr. obezbeđen od strane ostatka lizina na antitelu). Karbodiimidi se uobičajeno upotrebljavaju za konjugaciju antitela za karboksilovane čestice (npr. čestice lateksa, magnetne perle), i za druge karboksilovane površine, kao što su ploče sa mikrobunarićima ili površine čipa. Karbodiimidi se retko upotrebljavaju za prikačinjanje boja ili proteinskih obeleživača za antitela, iako su važni u proizvodnji boja koje aktivira NHS (videti prethodno).
4. Natrijum perjodat. Ova hemikalija se ne može koristiti sa velikom većinom obeleživača ali je prilično važan reagens zato što je primenljiv na HRP, najpopularniji dijagnostički enzim. Perjodat aktivira lance ugljenih hidrata na HRP molekulu kako bi se kreirale aldehidne grupe, koje su sposobne da reaguju sa lizinima na molekulima antitela. Pošto sam HRP ima veoma malo lizina, relativno je lako kreirati antitelo-HRP konjugate bez značajne HRP polimerizacije.
[0223] U bilo kom određenom klonu antitela, lizini (primarni amini) mogu se javiti prominentno unutar antigen-vezujućeg mesta. Stoga, jedini nedostatak ove strategije obeležavanja je to što ona povremeno uzrokuje značajno smanjenje antigen-vezujuće aktivnosti antitela. Smanjenje može biti posebno izraženo kada se radi sa monoklonalnim antitelima ili kada se pokušava dodati visoka gustina obeleživača po molekulu antitela.
9. Ponovno ispitivanje
[0224] Kao što je prethodno navedeno u Odeljku 8, u skladu sa pronalaskom moguće je odvojiti uklanjanje afinitetnih reagenasa (npr. antitela) i 3' zaštitne grupe(a). Pošto afinitetni reagensi mogu da se uklone bez uklanjanja blokirajuće funkcionalne grupe, poželjno je moguće ponovo ispitati neke ili sve pozicije baze kako bi se povećala tačnost određivanja baza („base calling“), testirao integritet čipa, ili zbog drugih razloga. Videti Primer 11, u nastavku, i Sliku 2. Bilo koja data pozicija baze može se ispitati jednom i ponovo ispitati 0, 1, 2 ili više od 2 puta. Uobičajeno, jedan krug ponovnog ispitivanja se smatra dovoljnim. Isključivo radi pogodnosti, u slučaju kada se pozicija baze ispituje dva puta, prvi krug ispitivanja se može označiti kao prvi poluciklus, i drugi krug ispitivanja može se označiti kao drugi poluciklus.
[0225] Prilikom ponovnog ispitivanja, moguće je ispitati svaku poziciju dva puta sa istim afinitetnim reagensom, npr. istim primarnim antitelom. Češće se upotrebljava različit afinitetni reagens, kao što je različit preparat antitela (npr. različito monoklonalno antitelo), različita klasa afinitetnog reagensa (npr. ispitivanje sa antitelom u prvom poluciklusu i sa aptamerom u drugom poluciklusu), ili afinitetni reagens sa različitom specifičnošću. Na primer, u prvom poluciklusu čip može biti ispitan sa anti-A, anti-T, anti-C i anti-G, a u drugom poluciklusu čip može biti ispitan sa anti-purinom i anti-pirimidinom koji se upotrebljavaju.
[0226] U jednom pristupu četiri NLRT se blokiraju upotrebom dve blokirajuće grupe, npr. azidometil-T, azidometil-G, cijanoetenil-C i cijanoetenil-A i čip se ispituje jednom sa dva afinitetna reagensa (jedan specifičan za 3'-O-azidometil- 2'-dezoksiribozu i drugi specifičan za 3'-O-cijanoetenil-2'-dezoksiribozu) i ispituje drugi put sa različitim parom afinitetnih reagenasa (jedan specifičan za purine i jedan specifičan za pirimidine). Adresa na čipu koja pokazuje signal karakterističan za 3'-O-azidometil-2'-dezoksiribozu i purin bi se identifikovala kao da ima guaninsku bazu, i tako dalje.
10. Proces sekvenciranja
[0227] SLIKE 1 i 2 obezbeđuju dopunske smernice čitaocu, ali ih ne treba tumačiti kao ograničavajuće. Na primer, kada se upotrebljava afinitetni reagens za detekciju terminusnog 3ꞌ-OH proizvoda produžetka (videti prethodni Odeljak 3.8), blokirajuća grupa će biti uklonjena (Korak 8b) pre bojenja antitelom (Korak 5).
[0228] Kao što je prethodno diskutovano, u jednom aspektu pronalazak je usmeren na postupak sekvenciranja-pomoću-sinteze (SBS) upotrebom neobeleženih reverzibilnih terminator nukleotida. SBS postupci su dobro poznati uključujući, ali ne ograničavajući se na, postupke koji su opisani u ovde citiranim referencama. Tipično SBS određuje sekvencu jednolančanog templata nukleinske kiseline imobilisane na poziciji na površini. Kao što je poznato čitaocu sa prosečnim iskustvom u struci, uobičajeno postoji mnogo kopija templata na poziciji na površini. Radi ilustracije, a ne ograničenja, kopije templata se najčešće proizvode upotrebom postupaka DNK nanolopte (DNB) ili postupaka most PCR. DNB postupci rezultuju jednolančanim konkatemerom sa mnogo kopija templata (npr. sekvence genomske DNK i susedna vezujuća mesta prajmera). Postupci most PCR rezultuju klonskim klasterom molekula templata (npr. sekvence genomske DNK koje su omeđene adaptorima koji mogu poslužiti kao vezujuća mesta prajmera). U most PCR mogu biti prisutna oba lanca templat nukleinske kiseline, kao odvojeni pojedinačni lanci. Razumeće se da ovde pozivanja na "templat" nukleinsku kiselinu (tj. gramatički oblik u jednini), ili ekvivalentne termine, takođe označavaju mnoštvo kopija templata na datoj poziciji na supstratu. Takođe će biti prepoznato da, iako se ovde može upućivati na određivanje sekvence od templat nukleinske kiseline ili sekvence templata nukleinske kiseline (tj. gramatički oblik u jednini), smatra se da se postupci iz pronalaska izvode upotrebom čipova koji sadrže mnoštvo (često stotine miliona) pozicija koje sadrže jedan ili mnoštvo molekula templat nukleinske kiseline.
[0229] Kao što se upotrebljava u ovom kontekstu, "čip" se upotrebljava u najširem smislu i uključuje, osim ukoliko nije drugačije specificirano, uređene čipove (što znači da su vezujući regioni templata raspoređeni u uređenom, tipično pravolinijskom, obrascu, kao što je mreža, spirala, ili drugi obrasci) i neuređene čipove (što znači da su vezujući regioni templata na nasumičnim pozicijama). U jednom pristupu, identitet templata na bilo kojoj specifičnoj poziciji (ili "adresi") na čipu može biti poznat pre sekvenciranja templata. Češće, čip je "nasumični čip" u kome identitet templata na datoj adresi nije poznat pre sekvenciranja. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, u ovoj objavi "čip" nije ograničen na pozicije na planarnoj površini, već može uključivati perla čipove, kapljica čipove, i slično.
[0230] Različiti SBS postupci mogu se upotrebljavati sa analozima nukleozida i afinitetnim reagensima iz predmetnog pronalaska. U nekim aspektima, SBS postupci mogu biti odabrani od onih koji su opisani u S.A.D. patentima br. 6,210,891; 6,828,100, 6,833,246; 6,911,345; 6,969,488; 6,897,023; 6,833,246; i 6,787,308; S.A.D. pat. publikacijama br. 2003/0064398; 2003/0022207; 2016/0130647; i PCT pat. publ. WO 2016/133764; Margulies et al., 2005, Nature 437:376-380; Ronaghi et al., 1996, Anal. Biochem. 242:84-89; Constans, A, 2003, The Scientist 17(13):36; i Bentley et al., 2008, Nature 456(7218):53-59. DNK sekvenceri koji izvode sekvenciranje pomoću sinteze su komercijalno dostupni, na primer, od Illumina Inc. (San Diego, Ca), uključujući sisteme sekvenciranja MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, HiSeq X, i NovaSeq. Drugi sistemi DNK sekvenciranja koji se mogu upotrebljavati sa kompozicijama i postupcima iz predmetnog pronalaska uključuju BGISEQ-50, BGISEQ-500, BGISEQ-1000, MGI-200, i MGISEQ-2000 (BGI, Shenzhen, Narodna Republika Kina); i GeneReader platformu za sekvenciranje (QIAGEN, Manchester, Ujedinjeno Kraljevstvo).
[0231] Neki primeri izvođenja SBS uključuju detekciju protona koji se oslobađa nakon inkorporisanja nukleotida u proizvod produžetka. Na primer, sekvenciranje zasnovano na detekciji oslobođenih protona može da upotrebljava električni detektor i asocirane tehnike koje su komercijalno dostupne od Ion Torrent (Guilford, Conn., podružnica Life Technologies) ili postupke i sisteme sekvenciranja koji su opisani u S.A.D. publikacijama pat. prij. br.2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; ili 2010/0282617 A1.
[0232] Sledeće procedure sekvenciranja koje upotrebljavaju ciklične reakcije mogu se upotrebljavati zajedno sa kompozicijama i postupcima iz predmetnog pronalaska, kao što je, na primer, pirosekvenciranje. Pirosekvenciranje detektuje oslobađanje neorganskog pirofosfata (PPi) pošto su određeni nukleotidi inkorporisani u nascentni lanac nukleinske kiseline (Ronaghi et al., Anal Biochem 242:84-89, 1996; Ronaghi, Genome Res. 11:3-11, 2001; Ronaghi et al., Science 281:363, 1998); i S.A.D. patenti br. 6,210,891; 6,258,568 i 6,274,320. U pirosekvenciranju, oslobođeni PPi se može detektovati tako što se konvertuje u adenozin trifosfat (ATP) pomoću ATP sulfurilaze, i rezultujući ATP se može detektovati putem fotona proizvedenih luciferazom. Stoga, reakcija sekvenciranja može se pratiti putem sistema za detekciju luminescencije. Izvori ekscitacionog zračenja koji se upotrebljavaju za sisteme detekcije zasnovane na fluorescenciji nisu neophodni za procedure pirosekvenciranja. Korisni fluidni sistemi, detektori i procedure koje se mogu upotrebljavati za primenu pirosekvenciranja na čipove iz predmetne objave opisani su, na primer, u WIPO pat. prij. ser. br. PCT/US11/57111, S.A.D. publ. pat. prij. br.2005/0191698 A1, S.A.D. pat. br.7,595,883, i S.A.D. pat. br.7,244,559.
[0233] U nekim aspektima, sekvenciranje postupcima ligacije može biti odabrano od onih koji su opisani u PCT pat. publikacijama WO 1999/019341; WO 2005/082098; WO 2006/073504; i Shendure et al., 2005, Science, 309: 1728-1739. SBS postupci mogu koristiti uređene DNK čipove nanolopti koji su opisani, na primer, u S.A.D. pat. publikacijama 2010/0105052, 2007/099208, i US 2009/0264299) i PCT pat. publikacijama WO 2007/120208, WO 2006/073504, i WO 2007/133831.
[0234] U skladu sa jednim primerom izvođenja, sekvenciranje se izvodi na uređenim čipovima DNK nanolopti (DNB). DNB se proizvode replikacijom mehanizmom kotrljajućeg kruga biblioteke cirkularnih konstrukata, od kojih svaki sadrži fragment genoma ili drugu ciljnu nukleinsku kiselinu od interesa, što rezultuje linearnim jednolančanim DNK konkatemerom koji sadrži mnoštvo kopija cirkularnog konstrukta koji kolabira u vodenom rastvoru i formira kompaktnu loptastu strukturu. DNB su raspoređene na površini dvodimenzionalnog planarnog supstrata kako bi formirale nasumični čip pojedinačnih molekula. DNB se mogu fiksirati direktno ili indirektno na površinu različitim tehnikama, uključujući kovalentno prikačinjanje i nekovalentno prikačinjanje. U nekim primerima izvođenja, supstrati sa obrascem sa dvodimenzionalnim čipovima tačaka se upotrebljavaju za proizvodnju DNB čipa. Tačke se aktiviraju kako bi uhvatile i zadržale DNB, dok DNB ne ostaju u oblastima između tačaka. Generalno, DNB na tački će odbiti druge DNB, što rezultuje jednom DNB po tački. Pošto su DNB trodimenzionalne (tj. nisu linearni kratki delovi DNK), čipovi iz pronalaska rezultuju sa više DNK kopija po kvadratnom nanometru površine vezivanja nego tradicionalni DNK čipovi. Ovaj trodimenzionalni kvalitet dodatno redukuje količinu potrebnih reagenasa za sekvenciranje, što rezultuje svetlijim tačkama i efikasnijim snimanjem. Popunjenost DNB čipova često prelazi 90%, ali može biti u opsegu od 50% do 100% popunjenosti. Pošto se DNB raspoređuju na površinu i zatim se lepe za aktivirane tačke u ovim primerima izvođenja, DNB čip visoke gustine se u suštini "samoasemblira" od DNB u rastvoru.
[0235] Kada se takvi DNB čipovi upotrebljavaju u sekvenciranju-pomoću-sinteze, DNB čip dolazi u kontakt sa prajmerom i prajmer se produžava za jednu komplementarnu bazu pomoću polimeraze u svakom ciklusu sekvenciranja. Identitet RT inkorporisanog pomoću polimeraze na svakoj poziciji u čipu otkriva se kao rezultat vezivanja specifičnog afinitetnog reagensa za njegov odgovarajući RT. U sekvenciranju u četiri boje, na primer, rezultat je čip DNB, od kojih je svaki obeležen sa afinitetnim reagensom, tako da se identitet RT inkorporisanog na određenoj poziciji na čipu može identifikovati pomoću fluorescentnog obeleživača (ili drugog detektabilnog obeleživača) koji je deo afinitetnog reagensa koji je vezan za RT.
[0236] U SBS postupcima koji upotrebljavaju reverzibilne terminatore, templat nukleinska kiselina je imobilisana na površini i oligonukleotidni prajmer je hibridizovan sa unapred određenom pozicijom na templatu (tj. vezujućim mestom prajmera). Analog nukleotida u kome je 3ꞌ-OH dezoksiriboze zamenjena blokirajućom funkcionalnom grupom koja se može ukloniti, npr. 3ꞌ-O-azidometilom, inkorporisan je na 3ꞌ-terminus prajmera u reakciji produžavanja prajmera. Inkorporisani analog nukleotida je komplementaran nukleotidu na odgovarajućoj poziciji na templatu i bazno se sparuje sa njim. Konvencionalno, analog nukleotida uključuje detektabilni obeleživač koji identifikuje nukleobazu inkorporisanog analoga nukleotida, i prema tome takođe identifikuje bazu komplementarnog nukleotida u templatu. U uobičajeno upotrebljavanim SBS postupcima, analog nukleotida uključuje fluorescentni obeleživač prikačen za nukleobazu pomoću linkera koji se može isecati.
[0237] U SBS postupcima koji upotrebljavaju reverzibilne terminatore, pošto se detektuje inkorporisanje analoga nukleotida, blokirajuća grupa se uklanja, tipično hemijski ili enzimski, kako bi se proizveo inkorporisani nukleotid sa 3ꞌ-OH grupom. Dodatni krugovi inkorporisanja 3' blokiranih analoga nukleotida, detekcija, i deblokiranje mogu se izvršiti u dopunskim reakcijama produžavanja prajmera. Iako se u svakom krugu prajmerskog produžavanja dodaje nukleotid, proces se može označiti kao produžavanje prajmera, mada bi moglo biti preciznije da se kaže da je proizvod produžavanja iz prethodnog kruga (a ne originalni oligonukleotidni prajmer) produžen. Lanac produžetka prajmera može se označiti na različite načine, uključujući i kao "rastući DNK lanac (GDS)", "proizvod produžetka prajmera" ili "produženi prajmer."
[0238] Biće cenjeno da kada se dNTP (tj. nukleozid trifosfat) doda na 3' terminus prajmera, pirofosfat se uklanja tako da se inkorporiše nukleozid monofosfat (ili nukleotid). Neobeleženi ili ne-obeleženi reverzibilni terminator nukleotid može označavati bilo koji oblik (slobodni nukleozid trifosfat ili inkorporisani nukleotid monofosfat), osim ukoliko nije drugačije specificirano, kao što će biti jasno iz konteksta. Neobeleženi ili ne-obeleženi reverzibilni terminator, nukleotid se može označavati kao NLRT.
[0239] U aspektu predmetnog pronalaska, dNTP analog(zi) koji su inkorporisani nisu detektabilno obeleženi. U ovom kontekstu "nije detektabilno obeležen" znači da inkorporisani dNTP nije konjugovan za boju koja proizvodi detektabilni (npr. fluorescentni) signal ili enzim koji u prisustvu supstrata proizvodi detektabilni (npr. hemiluminescentni) signal. Kao što se ovde upotrebljava, "reverzibilni terminator nukleotid" označava nukleotid koji se javlja u prirodi, ili analog nukleotida, u kome je 3'-OH dezoksiriboze zamenjena blokirajućom funkcionalnom grupom koja se može ukloniti, npr.3'-O-azidometilom.
[0240] U aspektu predmetnog pronalaska, u reakciji sekvenciranja, inkorporisani NLRT se detektuje pomoću afinitetnog reagensa(a), kao što je antitelo(a), koje razlikuje 3' terminusne nukleotide proizvoda produžetka prajmera i na taj način identifikuje nukleobazu 3' terminusnog nukleotida iz templata. U jednom pristupu, afinitetni reagens se specifično vezuje za inkorporisani NLRT koji sadrži specifičnu bazu (npr. A, T, G, ili C), ili analog specifične baze, sa mnogo većim afinitetom nego što se vezuje za inkorporisani NLRT sa drugim bazama ili drugim analozima baze koji su prisutni u reakciji sekvenciranja. U sledećem pristupu, afinitetni reagens se vezuje za inkorporisani NLRT koji sadrži specifičnu bazu (npr. A, T, G, ili C), ili analog specifične baze, sa karakterističnim afinitetom ili efikasnošću koje su različite od afiniteta ili efikasnosti sa kojima se vezuje za druge baze, ili druge analoge baze koji su prisutni u reakciji sekvenciranja.
[0241] U skladu sa pronalaskom, afinitetni reagensi takođe mogu razlikovati NLRT inkorporisan na 3ꞌ terminusu proizvoda produžetka prajmera od prethodno inkorporisanih, "unutrašnjih" nukleotida koji nisu na 3ꞌ terminusu. Generalno, NLRT na 3' terminusu proizvoda produžetka prajmera razlikuje se od prethodno inkorporisanih nukleotida po prisustvu slobodne 3'-OH (koja je u unutrašnjim nukleotidima zamenjena fosfodiestarskom vezom) ili prisustvu 3' blokirajuće funkcionalne grupe, kao i diferencijalnoj dostupnosti šećera i nukleobaze.
[0242] U skladu sa predmetnim pronalaskom SBS reakcije se izvode upotrebom četiri NLRT sa različitim azotnim bazama (npr. A, T, G i C). U SBS reakciji, upotrebljavaju se različiti afinitetni reagensi (npr.2, 3 ili 4 različita afinitetna reagensa), od kojih svaki vezuje NLRT sa specifičnom azotnom bazom i ne vezuje NLRT sa različitim azotnim bazama ili, u nekim primerima izvođenja, vezuje NLRT sa različitim azotnim bazama ili neidentičnom blokirajućom grupom, ali to čini na različitim nivoima efikasnosti.
[0243] Afinitetni reagens može razlikovati jedan inkorporisani NLRT od drugačijeg NLRT na osnovu strukturnih razlika u azotnoj bazi, šećeru, blokirajućoj grupi koja se može isecati ili kombinaciji ovih elemenata. U nekim slučajevima, različiti NLRT se razlikuju zbog, na primer, značajnih strukturnih razlika u azotnoj bazi (npr. adenozin naspram guanina) i/ili značajnih strukturnih razlika u blokirajućoj grupi (npr. azidometil naspram cijanoetenila).
[0244] Pored toga, afinitetni reagens može razlikovati jedan inkorporisani NLRT od drugačijeg NLRT na osnovu malih strukturnih razlika (npr. u nekim slučajevima, adicija ili supstitucija manje od 5 atoma) poželjno u kombinaciji sa prirodnim razlikama. Ove male strukturne promene mogu se napraviti u azotnoj bazi, šećeru, i/ili blokirajućoj grupi. Mogu se napraviti afinitetni reagensi kao što su antitela koja razlikuju tako male razlike između različitih NLRT.
[0245] U skladu sa jednim aspektom pronalaska, svaki od afinitetnih reagenasa se može razlikovati od drugog(ih) koji su prisutni u reakciji sekvenciranja (na primer, zato što je svaki različito obeležen) ili je vezan od strane različitih sekundarnih bajndera.
[0246] U skladu sa pronalaskom postoje ograničenja za strukture svakog od azotne baze, šećera, i blokirajuće grupe koja se može isecati.
[0247] Na primer, pogodne modifikovane baze će zadržati normalnu specifičnost Votson-Krik vezivanja i treba da budu kompatibilne sa inkorporisanjem pomoću DNK polimeraze. U nekim primerima izvođenja, analog baze nema fluorescentna svojstva (Renatus et al., 2010, Chem Rev. 110(5): 2579-2619).
[0248] Slično tome, šećerni deo NLRT može biti modifikovan. Nukleinske kiseline sa takvim modifikovanim NLRT treba da zadrže sposobnost da se vezuju za templat lanac i treba da budu kompatibilne sa inkorporisanjem pomoću DNK polimeraze.
[0249] Slično tome, mogu se upotrebljavati NLRT sa blokirajućim grupama koje se samo neznatno razlikuju. Na primer, mogu se upotrebljavati 2, 3, ili 4 različita takva NLRT.
[0250] U određenim primerima izvođenja pronalaska, blokirajuća grupa (ne uključujući 3' atom kiseonika dezoksiriboze) ima molekulsku težinu (MW) manju od 184, često manju od 174, često manju od 164, često manju od 154, često manju od 144, često manju od 134, često manju od 124, često manju od 114, često manju od 104, često manju od 94, i ponekad manju od 84.
[0251] U određenim primerima izvođenja, molekulske težine dezoksiribonukleotid monofosfata su u opsegu od oko 300 do 325 (dAMP 331,2, dCMP 307,2, dGMP 347,2 i dTMP 322,2). U određenim primerima izvođenja, NLRT funkcionalna grupa kada se inkorporiše u proizvod produžetka prajmera (tj. uključujući reverzibilnu terminator blokirajuću grupu, ali ne uključujući pirofosfat dNTP) ima molekulsku težinu manju od 700, manju od 600, manju od 550, često manju od 540, često manju od 530, često manju od 520, često manju od 510, često manju od 500, često manju od 490, često manju od 480, često manju od 470, i ponekad manju od 460.
[0252] U određenim primerima izvođenja, postupci iz pronalaska se upotrebljavaju za generisanje očitavanja sekvenciranja dužih od 1000 nukleotida, ponekad 10-500 nukleotida, ponekad 10-250, ponekad više od 25, ponekad više od 50 nukleotida. U nekim slučajevima se sekvenciranje vrši sa manje od jedne greške na 2000 baza, jedne greške na 5000 baza.
11. Primeri
11.1 Primer 1. Priprema konjugovanih 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dG, -dC, -dA i -dT antigena.
[0253] Sinteza aktivnog estra 3'-O-azidometil-2'-dezoksiguanina. Sinteza amino-reaktivnog N-hidroksisukcinimid (NHS) estra 3'-O-azidometil-2'-dezoksiguanina pokazana je na Slici 5. Jedinjenje G1 (416 mg, 0,708 mmol), anhidrovani DMF (3 ml) i 1,1'-karbonildiimidazol (CDI) (171 mg, 1,054 mmol) dodati su u flask od 50 ml. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 h. Dodati su etil 4-aminobutirat hidrohlorid (384 mg, 2,29 mmol) i trietilamin (300 μl, 2,155 mmol). Smeša je mešana na 40 °C tokom 10 h. Većina DMF je uklonjena na rotacionom isparivaču (ili rotovapu) pod vakuumom da da sirovo jedinjenje G2.
[0254] Sirovom jedinjenju G2 dodati su EtOH (5 ml) i 1N NaOH/H2O (7 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom tri dana. Dodata je 1N HCl/H2O kako bi se pH podesila na 7,4. Većina EtOH je uklonjena na rotovapu i zatim filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC upotrebom 25 mM TEAB pufera (trietilamin bikarbonat, pH 8,0 na sobnoj temperaturi) i CH3CN da da jedinjenje G3 (341 mg) kao belu čvrstu supstancu. LCMS: 452,1 (MS<+>).
[0255] U bočicu od 5 ml dodati su, jedinjenje G3 (42 mg, 0,076 mmol), anhidrovani dimetilformamid (DMF) (0,6 ml) i O-(N-sukcinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TSTU) (19 mg, 0,063 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i dobijen je željeni aktivirani NHS estar G4 za pravljenje bioloških konjugata. LCMS: 548 (MS<+>).
[0256] Konjugovanje 3ꞌ-O-azidometil-dG sa goveđim serumskim albuminom (BSA). 20 mg BSA (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 5 mg Jedinjenja G4. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (Bio-Gel<®>P poliakrilamidne perle [P6DG perle], Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0257] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dG sa hemocijaninom iz puža prilepka ključaonice (KLH). 20 mg KLH (10 mg/ml) u 50 mM natrijum bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 7 mg jedinjenja G4. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom jednog sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P-6DG perle) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0258] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dC-NHS estra sa BSA, KLH i agaroznom smolom je pokazano na SLICI 9, upotrebom sintetičkog postupka koji se malo razlikuje od onog koji je pokazan na Slici 5 u kom je upotrebljen drugačiji linker.
[0259] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dG sa agaroznom smolom aktiviranom aminom.20 ml vlažne agarozne smole aktivirane aminom (5 μmola aktivirane grupe/ml) isprano je sa 30 ml 50 mM natrijum bikarbonatnog pufera (pH=9,0) i 150 mM NaCl.70 mg jedinjenja G4 dodato je u 20 ml vlažnih perli, reakcija je inkubirana i rotirana na sobnoj temperaturi (RT) tokom dva sata. Posle reakcije, smola je isprana sa 50 ml fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora sve dok apsorbanca od 260 nm nije bila niža od 0,02 da da željenu smolu za prečišćavanje.
[0260] Sinteza amino-reaktivnog NHS estra 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksicitozina (C8). Sinteza amino-reaktivnog NHS estra 3'-O-azidometil-2'-dezoksicitozina (C8) pokazana je na Slici 6. Jedinjenje C5 (410 mg, 1,061 mmol), anhidrovani DMF (3 ml) i 1,1'-karbonildiimidazol (CDI) (213 mg, 1,314 mmol) dodati su u flask od 50 ml. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 sati. Dodati su etil 4-aminobutirat hidrohlorid (223 mg, 1,330 mmol) i trietilamin (200 μl, 1,437 mmol). Smeša je mešana na 40 °C tokom 6 sati. Većina DMF je uklonjena na rotovapu pod vakuumom da da sirovo jedinjenje C6.
[0261] Sirovom jedinjenju C6 dodati su EtOH (5 ml) i 1N NaOH/H2O (5 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Dodata je 1N HCl/H2O kako bi se pH podesila na 7,4, većina EtOH je uklonjena na rotovapu, i smeša je zatim filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC upotrebom 25 mM TEAB pufera i CH3CN da da jedinjenje C7 (518 mg) kao belu čvrstu supstancu. LCMS: 412,1 (MS<+>).
[0262] U bočicu od 5 ml dodati su jedinjenje C7 (49 mg, 0,096 mmol), anhidrovani DMF (0,8 ml) i TSTU (27 mg, 0,090 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i dobijen je željeni aktivirani NHS estar C8 za pravljenje bioloških konjugata. LCMS: 509,2 (MS<+>).
[0263] Konjugovanje 3ꞌ-O-azidometil-dC sa goveđim serumskim albuminom (BSA). 20 mg BSA (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 5 mg Jedinjenja C8. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P6DG perle) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0264] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dC sa hemocijaninom iz puža prilepka ključaonice (KLH). 20 mg KLH (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 7 mg Jedinjenja C8. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P-6DG perle, Bio-Rad Laboratories, Inc.) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0265] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dC sa agaroznom smolom aktiviranom aminom. 20 ml vlažne agarozne smole aktivirane aminom (5 μmola aktivirane grupe/ml) isprano je sa 30 ml 50 mM natrijum bikarbonatnog pufera (pH=9,0) i 150 mM NaCl.70 mg Jedinjenja C8 dodato je u 20 ml vlažnih perli, reakcija je inkubirana i rotirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Posle reakcije, smola je isprana sa 50 ml fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora sve dok apsorbanca od 260 nm nije bila niža od 0,02 da da željenu smolu za prečišćavanje.
[0266] Sinteza amino-reaktivnog NHS estra 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksiadenina (A12). Sinteza amino-reaktivnog NHS estra 3'-O-azidometil-2'-dezoksiadenina (A12) pokazana je na Slici 7. Jedinjenje A9 (111 mg, 0,270 mmol), anhidrovani DMF (1 ml) i 1,1'-karbonildiimidazol (CDI) (70 mg, 0,431 mmol) dodati su u flask od 25 ml. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Dodati su etil 4-aminobutirat hidrohlorid (78 mg, 0,465 mmol) i trietilamin (75 μl, 0,539 mmol). Smeša je mešana na 40 °C tokom 16 h. Većina DMF je uklonjena na rotovapu pod vakuumom da da sirovo jedinjenje 10.
[0267] Sirovom jedinjenju A10 dodati su EtOH (2 ml) i 1N NaOH/H2O (4 ml). Smeša je mešana na 40 °C tokom 24 sata. Dodata je 1N HCl/H2O kako bi se pH podesila na 8,5, većina EtOH je uklonjena na rotovapu, i zatim je smeša filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC upotrebom 25 mM TEAB pufera i CH3CN da da jedinjenje A11 (107 mg) kao belu čvrstu supstancu. LCMS: 435,9 (MS<+>).
[0268] U bočicu od 5 ml dodati su jedinjenje 11 (61 mg, 0,114 mmol), anhidrovani DMF (1 ml) i TSTU (20 mg, 0,066 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i dobijen je željeni aktivirani NHS estar A12 za pravljenje bioloških konjugata. LCMS: 555,2 (MS<+>).
[0269] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dA sa goveđim serumskim albuminom (BSA). 20 mg BSA (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 5 mg Jedinjenja A12. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P-6DG perle) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0270] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dA sa hemocijaninom iz puža prilepka ključaonice (KLH). 20 mg KLH (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 7 mg Jedinjenja A12. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P-6DG perle) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0271] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dC sa agaroznom smolom aktiviranom aminom. 20 ml vlažne agarozne smole aktivirane aminom (5 μmola aktivirane grupe/ml) isprano je sa 30 ml 50 mM natrijum bikarbonatnog pufera (pH=9,0) i 150 mM NaCl. 70 mg jedinjenja A12 dodato je u 20 ml vlažnih perli, reakcija je inkubirana i rotirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Posle reakcije, smola je isprana sa 50 ml fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora sve dok apsorbanca od 260 nm nije bila niža od 0,02 da da željenu smolu za prečišćavanje.
[0272] Sinteza amino-reaktivnog NHS estra 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksitimina (T16). Sinteza amino-reaktivnog NHS estra 3'-O-azidometil-2'-dezoksitimina (T16) pokazana je na Slici 8. Jedinjenje T13 (108 mg, 0,363 mmol), anhidrovani DMF (1 ml) i 1,1'-karbonildiimidazol (CDI) (74 mg, 0,456 mmol) dodati su u flask od 25 ml. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Dodati su etil 4-aminobutirat hidrohlorid (80 mg, 0,477 mmol) i trietilamin (75 μl, 0,539 mmol). Smeša je mešana na 40 °C tokom 6 sati. Većina DMF je uklonjena na rotovapu pod vakuumom da da sirovo jedinjenje T14.
[0273] Sirovom jedinjenju T14 dodati su EtOH (2 ml) i 1N NaOH/H2O (2 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Dodata je 1N HCl/H2O kako bi se pH podesila na 7,5, zatim je većina EtOH uklonjena na rotovapu, i smeša je zatim filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC upotrebom 25 mM TEAB pufera i CH3CN da da jedinjenje T15 (286 mg) kao belu čvrstu supstancu. LCMS: 426,5 (MS<+>).
[0274] U bočicu od 5 ml, dodati su Jedinjenje 15 (121 mg, 0,225 mmol), anhidrovani DMF (1 mL) i TSTU (40 mg, 0,132 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i dobijen je željeni aktivirani NHS estar T16 za pravljenje bioloških konjugata. LCMS: 546,1 (MS+Na<+>).
[0275] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dT sa goveđim serumskim albuminom (BSA). 20 mg BSA (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 5 mg Jedinjenja T16. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P-6DG perle) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0276] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dT sa hemocijaninom iz puža prilepka ključaonice (KLH). 20 mg KLH (10 mg/ml) u 50 mM Na bikarbonatnom puferu (pH=9,0) sa 150 mM NaCl reagovalo je sa 7 mg Jedinjenja T16. Reakcija je vođena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, i reakciona smeša je prečišćena pomoću kolone za desalinaciju (P-6DG perle) u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Konjugat je liofilizovan da da beli prah.
[0277] Konjugovanje 3'-O-azidometil-dT sa agaroznom smolom aktiviranom aminom. 20 ml vlažne agarozne smole aktivirane aminom (5 μmola aktivirane grupe/ml) isprano je sa 30 ml 50 mM natrijum bikarbonatnog pufera (pH=9,0) i 150 mM NaCl. 70 mg Jedinjenja T16 dodato je u 20 ml vlažnih perli, reakcija je inkubirana i rotirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Posle reakcije, smola je isprana sa 50 ml fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora sve dok apsorbanca od 260 nm nije bila niža od 0,02 da da željenu smolu za prečišćavanje.
11.2 Primer 2. Pravljenje poliklonalnih antitela prema neobeleženim reverzibilnim terminatorima (NLRT)
[0278] Ovaj primer opisuje protokole koji se upotrebljavaju za imunizaciju i prečišćavanje antitela koja se upotrebljavaju za proizvodnju reagenasa za sekvenciranje. Ovaj protokol se upotrebljava za pravljenje poliklonalnih antiseruma sa antitelima specifičnim za NLRT-A, -T, -G, i -C sa azidometilom kao 3' blokirajućom grupom.
[0279] Materijali: Sledeći materijali su upotrebljavani za imunizaciju zečeva: 3 mg KLH-antigena (za injektiranje zeca), 3 mg BSA-antigena (do titra), i 2-3 ml Sepharose-antigena (za prečišćavanje).
[0280] Imunizacija dva zeca: Zečevi su imunizovani sa KLH-antigenima koji su opisani u Primeru 1.
[0281] U jednom pristupu praćen je 70-dnevni raspored imunizacije: Prva imunizacija je bila dana 1; drugi dan imunizacije bio je dan 20; treći dan imunizacije bio je dan 40; četvrti dan imunizacije bio je dan 60. 5 ml preimunskog seruma je sakupljeno pre prve imunizacije, i 5 ml uzete krvi za test sakupljeno je posle treće imunizacije radi kontrole kvaliteta. Konačno, ukupno 100 ml antiseruma je sakupljeno od dva zeca posle 10 dana od četvrte imunizacije.
[0282] Titar poliklonalnih antitela: Sledeći protokol je upotrebljen za praćenje titara:
a) Obložiti svaki bunarić ploče sa 3'-O-azidometil-2'-dezoksi guanin-BSA u koncentraciji od 1 ug/po bunariću (100 μl) preko noći 4 °C ili 2-3 sata na 37 °C.
b) Dodati 100 ul serijski razblaženih antiseruma iz tela imunizovanih zečeva u svaki bunarić i inkubirati tokom 30 min na 37 °C.
c) Isprati tri puta sa viškom 1 X PBS.
d) Dodati 100 ul HRP-konjugovanog kozjeg anti-zečjeg IgG (1:4000) u svaki bunarić i inkubirati tokom 30 min na 37 °C.
e) Isprati tri puta sa viškom 1 X PBS.
f) Dodati 100 ul rastvora ABTS supstrata u svaki bunarić i inkubirati na sobnoj temperaturi tokom 20 min.
g) Očitati ploču na A405nm.
Isti protokol je upotrebljen za generisanje antiseruma za 3'-O-azidometil-2'-dezoksi-citozin, -adenin i -timin.
[0283] Prečišćavanje: Sledeći protokol je upotrebljen za prečišćavanje antitela iz seruma. Affi-Gel (Bio-Rad) je pripremljen konjugovanjem 3'-azidometil-2'-dezoksiribo-nukleobaze sa Sepharose 6B preko linkera aminokaproične kiseline i kolona za prečišćavanje je napunjena sa Affi-Gel. Antiserumi dobijeni od jednog ili dva zeca (do 100 ml) primenjeni su na afinitetnu kolonu Sepharose 6G imobilisanu sa azido-dG, azido-dC, azido-dA, ili azido-dT. Dobijen je visok titar poliklonalnih antitela specifičnih za svaki od 3'-azidometil NLRT.
[0284] Takođe smo upotrebljavali 50-dnevne i 90-dnevne programe imunizacije za stvaranje poliklonalnih antitela. Na primer, četiri zeca su imunizovana sa antigen KLH-3ꞌ-azido-2ꞌdezoksiguanozin konjugatom. Raspored imunizacija je bio sledeći: prva imunizacija, dan 1; druga imunizacija, dan 14; treća imunizacija, dan 28; i četvrta imunizacija, dan 42. 5 ml preimunskog seruma je sakupljeno pre prve imunizacije, i 5 ml uzete krvi za test sakupljeno je posle treće imunizacije radi kontrole kvaliteta. Konačno, ukupno 100 ml antiseruma je sakupljeno od dva zeca posle 10 dana od četvrte imunizacije.
11.3 Primer 3. Priprema biblioteke DNK E. coli
[0285] DNK nanolopta (DNB) čipovi biblioteke genomske DNK E. coli upotrebljeni su u eksperimentima sekvenciranja koji su opisani u Primerima. DNB i DNB čipovi su opisani u, npr. Drmanac et al., 2010, "Human genome sequencing using unchained base reads on selfassembling DNA nanoarrays," Science 327:78-81. Tokom pripreme uzorka, cirkularni bibliotečki konstrukti napravljeni su od fragmenata genomske DNK E. coli, i bibliotečki konstrukti su amplifikovani pomoću amplifikacije mehanizmom kotrljajućeg kruga (RCA) kako bi se proizvele DNB koje sadrže genomske DNK inserte sa susednim vezujućim mestima prajmera. DNB su postavljene u protočnu ćeliju za sekvenciranje DNK (npr. protočnu ćeliju BGISEQ-500 ili protočnu ćeliju BGISEQ-1000) i sekvenciranje je izvedeno upotrebom BGISEQ-500 (BGI, Shenzhen, Kina; videti Huang et al., 2017, "A reference human genome dataset of the BGISEQ-500 sequencer" Gigascience 6:1-9) ili BGISEQ-1000 (BGI, Shenzhen, Kina).
11.4 Primer 4. Upotreba dN-azidometil-specifičnih zečjih poliklonalnih antitela i obeleženih kozjih anti zečjih sekundarnih antitela za detekciju inkorporisanih NLRT u DNB čipu
[0286] U ovom eksperimentu su upotrebljena antitela poreklom iz seruma stvorena prema KLH konjugatima 3ꞌ-azidometil-dA, 3ꞌ-azidometil-dC, 3ꞌ-azidometil-dG, ili 3ꞌ-azidometil-dT kao što je opisano u Primeru 2. Četiri (4) različita preparata za prečišćavanje anti-NLRT antitela pripremljena su za svaku od četiri baze (tj. RT-A, RT-C, RT-G i RT-T), rezultujući sa šesnaest (16) preparata antitela označenih kao A1-A4, C1-C4, G1-G4, i T1-T4. DNB čipovi koji sadrže inserte genomske DNK E. coli, kao što je opisano u Primeru 4, prajmovani su i prajmeri su produženi upotrebom BG9 DNK polimeraze (BGI Shenzhen, Kina), polimeraze koja je projektovana da inkorporiše 3' modifikovane dNTP i četiri neobeležena reverzibilna terminatora sa 3'-azidometil blokirajućom grupom (npr.3'-azidometil-dATP, -dCTP, -dGTP i -dTTP). Šesnaest (16) preparata antitela je pojedinačno primenjeno na odvojenim linijama na DNB čipovima pri 10 μg/ml i inkubirano na 35 °C tokom 5 min (16 odvojenih inkubacija). Na kraju inkubacije nevezano primarno antitelo čipa uklonjeno je ispiranjem puferom za antitela (AbB) (Tris puferisan fiziološki rastvor pH 7,4 0,1% BSA i 0,05% Tween-20) na 35 °C. Čip je zatim inkubiran sa AF488-obeleženim kozjim anti-zečjim sekundarnim antitelom (Fab fragment) dobijenim od Jackson Immune Research (West Grove, PA, SAD) tokom 5 min na 35 °C. Čip je ispran sa AbB kako bi se uklonilo nevezano sekundarno antitelo i snimljen je upotrebom BGISEQ-1000 sistema za sekvenciranje. Ceniće se da se očekuje da se svaki od 16 preparata antitela obojenih sa jednim primarnim antitelom veže za inkorporisane NLRT na približno 25% DNK mesta.
[0287] Četiri kontrolne linije u sekvencionim čipovima generisane su prajmovanjem DNB i produžavanjem prajmera upotrebom sva četiri 3'-azidometil dNTP obeležena fluoroforom prikačenom za bazu putem linkera koji se može isecati. Vrednosti kontrolnog signala koje su pokazane ovde su za C-AF488.
[0288] TABELA 1 pokazuje signal dobijen upotrebom kontrolnog čipa i čipova sa antitelima. Najviši nivo signala posredovanog antitelom pokazan je masnim fontom. Iako je uočena varijacija u intenzitetu signala između čipova (u zavisnosti od specifičnog preparata zečjeg poliklonalnog antitela koje je upotrebljeno), rezultati pokazuju da je moguće dostići ili premašiti intenzitet kontrolnog signala pri relativno niskim koncentracijama antitela upotrebom ove tehnike indirektne detekcije.
11.5 Primer 5. Sekvenciranje DNK upotrebom fluorescentno obeleženih RT-A, -C i -T i neobeleženog RT-G
[0289] DNK nanolopta biblioteke genomske DNK E. coli sekvencirana je upotrebom fluorescentno obeleženih RT-A, -C i -T i neobeleženog RT-G, svi sa 3ꞌ-azidometil blokirajućim grupama. Sekvenciranje je obavljeno upotrebom BGISEQ-500 sekvencera (BGI, Shenzhen, Kina) i podaci su analizirani upotrebom izveštaja o analizi određivanja baza koji je obezbeđen uz sekvencer. Sekvenciranje je izvršeno za 5 ciklusa (SLIKE 10A i 10C) ili 10 ciklusa (SLIKE 10B i 10D). SLIKE 10A i 10C pokazuju Rho vrednost. (Rho vrednosti se izračunavaju oduzimanjem pozadine od intenziteta signala dobijenih posle analize snimka.
Takođe je primenjena normalizacija signala uključujući korekciju unakrsne interakcije.) SLIKE 10B i 10D pokazuju odnos signal-šum (SNR).
[0290] Podaci, uključujući Rho intenziteta i SNS (odnos signal-šum) iz izveštaja o uspešnom određivanju baza, ukazuju na to da se sekvenciranje može uspešno izvesti sa neobeleženim RT i obeleženim afinitetnim reagensima koji se specifično vezuju za RT.
11.6 Primer 6. Sekvenciranje DNK upotrebom četiri neobeležena RT i neobeleženih anti-NLRT poliklonalnih antitela
[0291] TABELA 2 ilustruje podatke sekvenciranja generisane upotrebom BGISEQ-1000 sekvencera (BGI, Shenzhen, Kina) sa 8-linijskim mikroniz čipovima (videti Fehlmann et al., Clin. Epigenetics 8:123, 2016). Kolona 5 pokazuje rezultate upotrebom neobeleženih reverzibilnih terminatora u kojima je blokirajuća funkcionalna grupa koja se može isecati 3'-O-azidometil (NLRT-A, -T, -C i -G) i poliklonalnih antitela ("1° antitela") usmerenih prema svakom od četiri NLRT. Vezivanje antitela je detektovano upotrebom 2° antitela (AF488-obeležen kozji anti-zečji Fab fragment dobijen od Jackson Immune Research). Signal je izmeren u FIT kanalu. U nekontrolnim linijama (npr. TABELA 2, kolone 3-8, svako primarno antitelo se posebno primenjuje (tj. primenjuje se u posebnom kanalu) i detektuje. Pokazane su sirove vrednosti signala.
[0292] Redovi TABELE 2 odgovaraju jednom NLRT sa 3' azidometil grupom koja se može isecati kao reverzibilnom blokirajućom grupom. Svaki red TABELE 2 odnosi se na jedan ciljni dNTP, i svaka kolona pokazuje test prema tom cilju. Kolone su sledeće:
Kolona 1: Specifičnost i koncentracija (u μg/ml) 1° antitela upotrebljenog u koloni 5 (pozitivna kontrola 2).
Kolone 2 i 9: Produžavanje je izvršeno upotrebom četiri fluorescentno obeležena ("vruća") reverzibilna terminatora dNTP (sa fluorescentnom bojom prikačenom za bazu putem linkera koji se može isecati. (Pozitivne kontrole za DNK čipove).
Kolona 3: Produžavanje je izvršeno upotrebom BG9 DNK polimeraze. Sva četiri 1° antitela pri koncentraciji od 100 μg/ml (pozitivna kontrola 1).
Kolona 4: Primarna antitela su izostavljena (negativna kontrola; samo pozadina sekundarnog antitela).
Kolona 5: Produžavanje je izvršeno upotrebom četiri (4) neobeležena azidometil NLRT. Rezultati pokazuju bojenje svakim primarnim antitelom koje je upotrebljeno pri koncentraciji u Koloni 1.
Kolona 6: Produžavanje je izvršeno izostavljajući ciljni NLRT ali uključujući 3 ne-ciljna NLRT (kontrola specifičnosti antitela 1);
Kolona 7: Negativna kontrola u kojoj ciljna baza na 3ꞌ terminusu GDS ima 3ꞌ-OH pre nego azidometil blokirajuću grupu (kontrola specifičnosti antitela 2).
Kolona 8: Negativna kontrola u kojoj se ne upotrebljava prajmer za sekvenciranje (kontrola specifičnosti 3).
TABELA 2
11.7 Primer 7. 50 ciklusa sekvenciranja u kojima se detektuje neobeleženi RT-G upotrebom anti-RT-G zečjeg primarnog antitela i obeleženog kozjeg anti-zečjeg sekundarnog antitela
[0293] Ovaj primer pokazuje rezultate pedeset (50) ciklusa sekvenciranja-pomoću-sinteze (SBS) koji su izvršeni upotrebom BGISEQ-1000 DNK sekvencera i genomske DNB biblioteke E. coli. DNK prajmer komplementaran sekvenci koja omeđava genomski DNK insert hibridizovan je na DNB čipu i produžavanje prajmera je izvršeno upotrebom 3'-azidometil reverzibilnih terminatora (RT-A, -C, -G, -T) pri koncentraciji od 2 μM svaki. Tri reverzibilna terminatora (azidometil-A, -C, -T) su fluorescentno obeležena putem linkera koji se može isecati prikačenog za bazu (upotrebljenog u odnosu 50% obeleženih/50% neobeleženih) i jedan reverzibilni terminator (3'-azidometil-dGTP) je bio neobeležen. Produžavanje prajmera je izvršeno na 35 °C tokom 2 min upotrebom BG9 DNK.
[0294] Posle jednog ciklusa produžavanja prajmera, čip je ispran kako bi se uklonili neinkorporisani nukleotidi. Inkorporisani 3'-azidometil-dG je detektovan pomoću inkubacije sa anti-3'-azidometil-dG zečjim primarnim antitelom prethodno kombinovanim sa AF647obeleženim kozjim anti-zečjim fluorescentno obeleženim Fab fragmentom. Primarno antitelo i sekundarna antitela (Fab fragment) su prethodno kombinovana njihovom zajedničkom inkubacijom tokom 15 min na 35 °C. Ovaj prethodno kombinovani kompleks je inkubiran na čipu pri koncentraciji od 25 μg/ml primarnog i 50 μg/ml sekundarnog tokom 10 min na 35 °C i čip je ispran tri puta kako bi se uklonila sva nevezana antitela.
[0295] Posle inkubacije antitela, tri obeležena RT (RT-A, -C, -T) detektovana su upotrebom njihovog jedinstvenog fluorescentnog obeleživača, a neobeležena baza (RT-G) je detektovana upotrebom fluorescentnog obeleživača konjugovanog za kozje anti-zečje fragment sekundarno antitelo. Pošto je DNB identitet baze određen putem detekcije talasne dužine fluorescencije, linker za obeležavanje (RT-A, -C, -T) i 3' blokirajuća grupa (RT-G, -A, -C, -T) su uklonjeni pomoću redukcije sa THPP pri 13 mM tokom 2 min na 35 °C, dozvoljavajući regeneraciju 3'-OH grupe i sposobnost dodatnog produžavanja nascentnog DNK lanca. Ova serija koraka (produžavanje, inkubacija antitela, detekcija, i deblokiranje) je ponovljena za ukupno 50 ciklusa identifikacije sekvence.
[0296] SLIKA 11A pokazuje procenat sadržaja informacija o određivanju baza (BIC). Ovaj grafikon pokazuje da identitet neobeležene baze kada se indirektno detektuje preko anti-3'-azidometil-dG zečjeg primarnog antitela prethodno kombinovanog sa anti-zečjim AF647 fluorescentno obeleženim fragment sekundarnim antitelom obezbeđuje dovoljno informacija za analizu određivanja baza i identifikaciju nepoznatog DNK ostatka(aka).
[0297] SLIKA 11B pokazuje intenzitete signala i trendove za svaki od jedinstvenih fluorescentnih obeleživača. Tri nukleotida (dATP, dCTP, dTTP) koji su sadržali fluorescentno obeleženi linker koji se može isecati prikačen za bazu upotrebljena su u odnosu 50% obeleženih/50% neobeleženih i odgovaraju Cy3, FITC, i TxR respektivno. Neobeleženi 3'-azidometil-dGTP detektovan je anti-3'-azidometil-dG zečjim primarnim antitelom prethodno kombinovanim sa anti-zečjim AF647 fluorescentno obeleženim fragment sekundarnim antitelom. Ovi podaci pokazuju da je stopa degradacije intenziteta signala za neobeleženu 3'-azidometil-dG bazu manja od one nukleotida obeleženih linkerom koji se može isecati. Ova redukovana degradacija intenziteta signala ukazuje da upotrebom ove tehnike mogu biti moguća duža očitavanja nego upotrebom konvencionalnih postupaka koji upotrebljavaju dNTP obeležene upotrebom linkera koji se može isecati.
11.8 Primer 8. Antitela vezuju NLRT sa dovoljnom specifičnošću da generišu vrednosti odnosa signal-šum (SNR) pogodne za analizu određivanja baza
[0298] Podaci u TABELAMA 3, 4, 5 i 6 pokazuju top signal, Rho (pozadinski i signal unakrsne interakcije oduzeti), pozadinski signal ("pozadi") i vrednosti odnosa signal-šum (SNR) dobijene bojenjem neobeleženih reverzibilnih terminatora na genomskoj DNK E. coli upotrebom direktno obeleženih anti-azidometil-baza antitelima i za kontrolne čipove upotrebom obeleženih azidometil-baza. Eksperiment je izveden na BGISEQ-500 čipu sa protočnim ćelijama sa bibliotekom genomske DNK E. coli i skeniran na BGISEQ-500 DNK sekvenceru.
[0299] Kontrolne vrednosti su rezultati sekvenciranja upotrebom četiri obeležena 3ꞌazidometil RT (obeleživači povezani sa bazom putem linkera koji se može isecati). 3 ꞌazidometil RT su upotrebljeni u odnosu od 60% obeleženih ("vruće"), 40% neobeleženih ("hladno") u TABELAMA 4, 5 i 6 i 25% obeleženih i 75% neobeleženih u TABELI 3.
[0300] Vrednosti pre bojenja su skenirane posle jednog kruga produžavanja prajmera, ali pre dodavanja antitela.
[0301] Obojene vrednosti su dobijene skeniranjem posle inkubacije (2 X 2 min na 35 °C) sa odgovarajućim anti-azidometil-baza antitelima u naznačenim koncentracijama. Antiazidometil-baza antitela su direktno obeležena sa pokazanom fluoroforom. Vrednosti koje odgovaraju vezivanju anti-azidometil-baze napisane su masnim slovima.
[0302] TABELA 3 pokazuje rezultate upotrebom poliklonalnih antitela prema 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksiadeninu. TABELA 4 pokazuje rezultate upotrebom poliklonalnih antitela prema 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksicitozinu. TABELA 5 pokazuje rezultate upotrebom poliklonalnih antitela prema 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksiguaninu. TABELA 6 pokazuje rezultate upotrebom poliklonalnih antitela prema 3ꞌ-O-azidometil-2ꞌ-dezoksitimidinu.
TABELA 3
TABELA 4
TABELA 5
TABELA 6
11.9 Primer 9. Sekvenciranje za 25 ciklusa upotrebom obeleženih anti NLRT poliklonalnih antitela
[0303] Biblioteka genomske DNK E. coli napravljena je kao što je opisano u Primeru 2, i postavljena na BGISEQ-500 protočnu ćeliju. Dodati su prajmeri i sekvenciranje pomoću sinteze je izvedeno produžavanjem prajmera upotrebom neobeleženih nukleotidnih 3ꞌazidometil reverzibilnih terminatora (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Neobeleženi 3'-blokirani dNTP bili su prisutni pri koncentraciji od 1 μM svaki i inkorporisani su upotrebom BG9 DNK na 55 °C tokom 1 min po ciklusu. Posle inkorporisanja i ispiranja kako bi se uklonili neinkorporisani nukleotidi, četiri 3'-azidometil-baza nukleotida detektovana su dovođenjem u kontakt čipa sa smešom četiri direktno obeležena anti-3'-azidometil-baza antitela u koncentracijama pokazanim u TABELI 11 (opseg od 10-100 μg/ml) koja su inkubirana na čipu na 35 °C 2 X 2 min po ciklusu. "2 X 2" označava inkubaciju sa antitelom tokom dva minuta, nakon čega sledi još 2 minuta inkubacije posle dodavanja dopunskog antitela. Čip je ispran tri puta kako bi se uklonila sva nevezana antitela. TABELA 7 pokazuje identitet fluorofore direktno konjugovane za svako detekciono antitelo.
TABELA 7
[0304] Signal fluorescencije na svakoj poziciji na DNB čipu određen je skeniranjem tokom 80 ms za vreme laserske ekscitacije fluorofore. Pošto je određen identitet DNB baze, 3' blokirajuća grupa je uklonjena pomoću redukcije sa THPP (13 mM) tokom 2 min na 35 °C, dozvoljavajući regeneraciju 3'-OH grupe i omogućavajući dodatno produžavanje nascentnog DNK lanca. Uklanjanje 3' blokirajuće grupe je takođe rezultovalo disocijacijom antitela sa proizvoda produžetka prajmera.
[0305] Ova serija koraka (produžavanje, inkubacija antitela, detekcija, i deblokiranje) je ponovljena za ukupno 25 ciklusa identiteta DNK sekvence.
[0306] SLIKE 12A i 12B pokazuju Rho i odnos signal/šum (SNR) za svaku bazu u svakom ciklusu sekvenciranja. TABELA 8 pokazuje broj očitanih DNB, kao i mapiranje i stope grešaka u poređenju sa referentnim genomom E. coli.
[0307] Ovi podaci, uključujući Rho intenziteta i SNR iz izveštaja o uspešnom određivanju baza, demonstriraju da se višestruki ciklusi sekvenciranja DNK mogu izvršiti upotrebom neobeleženih reverzibilnih terminatora i antitela koja vezuju blokirajuću grupu i bazu.
TABELA 8
11.10 Primer 10: Skupovi različito obeleženih antitela daju uporedive rezultate
[0308] TABELE 9 i 10 pokazuju (Top signal), Rho (pozadinski i signal unakrsne interakcije oduzeti), pozadinski signal i vrednosti odnosa signal-šum (SNR) dobijene bojenjem neobeleženih reverzibilnih terminatora na genomskoj DNK E. coli upotrebom direktno obeleženih anti-azidometil-baza antitela. Ovaj eksperiment je izveden na BGISEQ-500 čipu sa protočnim ćelijama sa bibliotekom genomske DNK E. coli i skeniran na BGISEQ-500 DNK sekvenceru. Prajmeri su hibridizovani sa imobilisanim DNB i produženi u prisustvu sva četiri neobeležena nukleotidna 3'-azidometil RT (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) pri 1 μM koncentracije svaki tokom 2 min na 35 °C upotrebom BG9 polimeraze. Posle inkorporisanja i ispiranja kako bi se uklonili neinkorporisani nukleotidi, inkorporisani 3'-azidometil-baza nukleotidi detektovani su istovremeno inkubiranjem sva četiri obeležena anti-3'-azidometilbaza antitela (skup antitela 1) u pokazanim koncentracijama (npr. "@30" znači 30 ug/ml) za dve uzastopne inkubacije od dva minuta svaka na 35 °C.
[0309] Pošto je drugi čip ispitivan upotrebom skupa antitela 2. Skup antitela 2 sadrži iste preparate antitela, ali su antitela različito obeležena. TABELA 10 pokazuje signal posle primene skupa antitela 2. Podaci demonstriraju da su vrednosti signala i SNR pogodne za analizu određivanja baza nezavisno od identiteta fluorofore za direktno obeležavanje.
TABELA 9
TABELA 10
11.11 Primer 11: Uklanjanje anti-NLRT antitela bez uklanjanja 3ꞌ blokirajuće grupe
[0310] Kao što je diskutovano ovde na drugom mestu, uklanjanje antitela (disocijacija sa proizvoda produžetka prajmera) može da se odvoji od isecanja i uklanjanja 3ꞌ blokirajuće grupe, TABELA 11 pokazuje rezultate eksperimenta u kome je antitelo uklonjeno specifičnom kompeticijom. Produžavanje prajmera je izvršeno na DNB čipu koji sadrži biblioteku E. coli upotrebom četiri neobeležena 3'-azidometil-baza nukleotida. Bojenje je bilo istovremeno inkubiranjem sva četiri anti-3'-azidometil-baza antitela direktno obeležena sa fluoroforama skupa boje 1 (videti Primer 10). Specifična kompeticija je upotrebljena za uklanjanje afinitetnog reagensa za detekciju inkubiranjem u prisustvu 20 μM slobodnog antigena (3'-O-azidometil-2'-dezoksiguanin, dezoksiadenin, dezoksicitozin, dezoksitimin, svaki u obliku trifosfata) na 57 °C tokom 2 min u 50% WB1, 50% Ab puferu. Postupak uklanjanja Ab je (1) WB1, 55 °C; (2) rastvor za uklanjanje; (3) WB1, 20 °C; (4) WB2; (5) SRE. WB1: NaCl 0,75 M, natrijum citrat 0,075 M, Tween 200,05%, pH 7,0; WB2 NaCl 50 mM, Tris-HCI pH9 50 mM, Tween 200,05%, EDTA 1 mM. pH 9,0; SRE NaCl 400 mM, Tris HCl pH71000 mM, natrijum L askorbat 100 mM, Tween 200,05%, pH 7,0.
[0311] Podaci pokazuju da su signal i SNR značajno redukovani, što ukazuje na uklanjanje većine afinitetnih reagenasa za detekciju sa DNB čipa.
TABELA 11
11.12 Primer 12: Uklanjanje anti-NLRT antitela i ponovno ispitivanje u više ciklusa sekvenciranja
[0312] Primer opisuje proces u kome je (1) identitet baze na prvoj poziciji određen detekcijom vezivanja od strane prvog primarnog antitela specifičnog za bazu i 3ꞌ blokirajuću grupu; (2) uklanjanjem prvog primarnog antitela bez uklanjanja 3ꞌ blokirajuće grupe; (3) ponovnim ispitivanjem iste pozicije upotrebom drugog primarnog antitela specifičnog za bazu i 3ꞌ blokirajuću grupu. Rezultati ovih eksperimenata su sažeti u TABELI 12.
[0313] TABELA 12 ilustruje poboljšanu stopu mapiranja identiteta DNK sekvence kada se kombinuju dva nezavisna očitavanja iz različitih kombinacija fluorescentnih boja (kao što je opisano u Primeru 10) za svaku poziciju nascentnog lanca sekvenciranog-pomoću-sinteze za ukupno 20 očitanih pozicija. "Prvo nezavisno" („Odd indep“) predstavlja početno očitavanje u "konvencionalnim bojama" za svaku poziciju sekvenciranja. "Naknadno nezavisno" („Even indep“) predstavlja naknadno očitavanje u "alternativnim bojama" posle uklanjanja specifičnom kompeticijom upotrebom procedure prikazane u TABELI 12. "Kombo" predstavlja rezultat poređenja svakog od dva nezavisna očitavanja i ponderisanja rezultata prema višem intenzitetu i prema tome višoj vrednosti poverenja od dva očitavanja. Rezultati pokazuju značajno više stope mapiranja i značajno niže stope neusklađenosti kada se dva nezavisna očitavanja kombinuju upotrebom ove tehnike.
TABELA 12

Claims (32)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak za izvođenje reakcije sekvenciranja-pomoću-sinteze, naznačen time što navedeni postupak sadrži korake: (a) obezbeđivanje mnoštva imobilisanih templat nukleinskih kiselina koje sadrže mnoštvo različitih sekvenci; (b) vezivanje oligonukleotidnih prajmera za templat nukleinske kiseline pri čemu oligonukleotidni prajmeri hibridizuju sa unapred određenim pozicijama na templat nukleinskim kiselinama; (c) kombinovanje templat nukleinskih kiselina i prajmera koji su vezani za njih sa polimerazom i četiri različita reverzibilna terminator dezoksiribonukleotid trifosfata (dNTP) svaki dezoksiribonukleotid sadrži nukleobazu (N), funkcionalnu grupu šećera, i reverzibilnu blokirajuću grupu, pri čemu je N adenin (A) ili njegov analog, guanin (G) ili njegov analog, timin (T) ili njegov analog, i citozin (C) ili njegov analog, pri čemu je barem jedan od navedena četiri različita dNTP neobeležen, pod uslovima u kojima se mnoštvo oligonukleotidnih prajmera produžava inkorporisanjem jednog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida kako bi se proizvelo mnoštvo proizvoda produžetka prajmera, od kojih neki sadrže A ili A' inkorporisan na 3' terminusu, od kojih neki sadrže T ili T' inkorporisan na 3' terminusu, od kojih neki sadrže G ili G' inkorporisan na 3' terminusu, i od kojih neki sadrže C ili C' inkorporisan na 3' terminusu; (d) dovođenje u kontakt mnoštva proizvoda produžetka prajmera sa jednim ili više prvih afinitetnih reagenasa pod uslovima u kojima se svaki od navedenih jednog ili više prvih afinitetnih reagenasa vezuje za samo jedan od četiri različita inkorporisana reverzibilna terminator dezoksiribonukleotida, pri čemu se prvi afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu navedenog jednog od četiri različita inkorporisana reverzibilna terminator dezoksiribonukleotida; (e) detektovanje vezivanja jednog ili više prvih afinitetnih reagenasa, pri čemu vezivanje prvog afinitetnog reagensa za proizvod produžetka prajmera koji sadrži inkorporisani reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid identifikuje nukleobazu inkorporisanog reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida i nukleobazu komplementarnog dezoksiribonukleotida u templatu.
  2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1 naznačen time što su sva četiri različita dNTP neobeležena.
  3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2 naznačen time što se u koracima (d) i (e) upotrebljavaju dva, tri, ili četiri prva afinitetna reagensa.
  4. 4. Postupak prema patentnom zahtevu 2 naznačen time što su četiri dNTP neobeležena i u koraku (d) se upotrebljavaju četiri prva afinitetna reagensa, svaki se specifično vezuje za jedan od četiri inkorporisana reverzibilna terminator dezoksiribonukleotida.
  5. 5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 naznačen time što barem jedan, i opciono sva četiri dNTP sadrže prirodnu nukleobazu odabranu od adenina (A), guanina (G), timina (T), citozina (C), i uracila (U).
  6. 6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 naznačen time što barem jedan, i opciono sva četiri dNTP sadrže analog nukleobaze.
  7. 7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 naznačen time što dodatno sadrži (f) uklanjanje prvog afinitetnog reagensa(asa).
  8. 8. Postupak prema patentnom zahtevu 7 naznačen time što dodatno sadrži (g) uklanjanje reverzibilne blokirajuće grupe(a) kako bi se proizveo 3ꞌ-OH dezoksiribonukleotid(i).
  9. 9. Postupak prema patentnom zahtevu 8 naznačen time što sadrži uklanjanje reverzibilne blokirajuće grupe(a) i afinitetnog reagensa(asa) u istoj reakciji.
  10. 10. Postupak prema patentnom zahtevu 8 naznačen time što sadrži ponavljanje koraka (c) do (g) za željeni broj ciklusa kako bi se identifikovale dopunske nukleobaze u templatu, pri čemu su prajmeri u koraku (c) proizvodi produžetka prajmera iz prethodnog ciklusa.
  11. 11. Postupak prema patentnom zahtevu 10 naznačen time što je željeni broj ciklusa 25 ili više.
  12. 12. Postupak prema patentnim zahtevima 1-11 naznačen time što je u koraku (d) prvi afinitetni reagens(i) konjugovan za ili vezan za detektabilni obeleživač, i u koraku (e) detektovanje vezivanja prvog afinitetnog reagensa(asa) za inkorporisani reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid sadrži detektovanje signala sa detektabilnog obeleživača, ili u koraku (d) prvi afinitetni reagens(i) nije obeležen i korak detektovanja vezivanja prvog afinitetnog reagensa(asa) za inkorporisani reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid(e) sadrži (i) vezivanje jednog ili više sekundarnih afinitetnih reagenasa za svaki prvi afinitetni reagens, pri čemu svaki sekundarni afinitetni reagens sadrži detektabilni obeleživač, i (ii) detektovanje vezivanja prvog afinitetnog reagensa za inkorporisani reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid sadrži detektovanje signala sa detektabilnog obeleživača.
  13. 13. Postupak prema patentnom zahtevu 12 naznačen time što detektabilni obeleživač proizvodi fluorescentni ili hemiluminescentni signal.
  14. 14. Postupak prema patentnim zahtevima 1-13 naznačen time što su prvi afinitetni reagensi antitela, opciono monoklonalna antitela.
  15. 15. Postupak za sekvenciranje nukleinske kiseline, naznačen time što sadrži: (a) obezbeđivanje DNK čipa koji sadrži (i) mnoštvo templat DNK molekula, svaki templat DNK molekul sadrži vezujuće mesto prajmera i fragment nukleinske kiseline, pri čemu je svaki od navedenog mnoštva templat DNK molekula prikačen na poziciji čipa, (b) dovođenje u kontakt DNK čipa sa prajmerom nukleinske kiseline komplementarnim sa vezujućim mestom prajmera, polimerazom, i neobeleženim reverzibilnim terminator nukleotidom (RT) Formule I: pri čemu R1je 3'-O reverzibilna blokirajuća grupa; R2je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), timina (T), i njihovih analoga; i R3se sastoji od jednog ili više fosfata; pod uslovima pri čemu prajmer hibridizuje sa vezujućim mestima prajmera templat DNK molekula i pri čemu se barem neki hibridizovani prajmeri produžavaju da inkorporišu neobeleženi RT u sekvencu komplementarnu templat DNK molekulu, čime se proizvode neobeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; (c) dovođenje u kontakt neobeleženih proizvoda produžetka sa afinitetnim reagensom pod uslovima pri čemu se afinitetni reagens specifično vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu inkorporisanog RT, pri čemu je afinitetni reagens direktno ili indirektno asociran sa detektabilnim obeleživačem kako bi se proizveli obeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; i (d) identifikovanje RT u obeleženim proizvodima produžetka kako bi se identifikovao barem deo sekvence navedene nukleinske kiseline.
  16. 16. Postupak prema patentnom zahtevu 15 naznačen time što sadrži: (a) dovođenje u kontakt DNK čipa sa prajmerom nukleinske kiseline komplementarnim delu svakog od navedenih templat DNK molekula, polimerazom, i skupom neobeleženih RT Formule I koji sadrži prvi RT pri čemu je R2adenin (A) ili njegov analog, drugi RT pri čemu je R2timin (T) ili njegov analog, treći RT pri čemu je R2citozin (C) ili njegov analog, i četvrti RT pri čemu je R2guanin (G) ili njegov analog, pod uslovima pri čemu se prajmer produžava da inkorporiše neobeležene RT u sekvencu komplementarnu barem nekim od navedenog mnoštva navedenih templat DNK molekula, čime se proizvode neobeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT; (b) dovođenje u kontakt neobeleženih proizvoda produžetka sa skupom afinitetnih reagenasa pod uslovima pri čemu se skup afinitetnih reagenasa specifično vezuje za RT kako bi se proizveli obeleženi proizvodi produžetka koji sadrže RT, pri čemu: (i) skup afinitetnih reagenasa sadrži prvi afinitetni reagens koji se specifično vezuje za prvi RT, drugi afinitetni reagens koji se specifično vezuje za drugi RT, treći afinitetni reagens koji se specifično vezuje za treći RT, i, opciono, četvrti afinitetni reagens koji se specifično vezuje za četvrti RT; i (ii) barem prvi, drugi, i treći afinitetni reagensi sadrže detektabilne obeleživače; i (c) identifikovanje RT u obeleženim proizvodima produžetka identifikovanjem obeleživača obeleženih afinitetnih reagenasa vezanih za RT na njihovim respektivnim pozicijama na čipu kako bi se identifikovao barem deo sekvence navedene nukleinske kiseline.
  17. 17. Postupak prema patentnom zahtevu 16 naznačen time što R2je A u prvom RT, R2je T u drugom RT, R2je C u trećem RT, i R2je G u četvrtom RT.
  18. 18. Postupak prema patentnom zahtevu 15 naznačen time što dodatno sadrži: (d) uklanjanje reverzibilne blokirajuće grupe sa RT kako bi se proizveo 3ꞌ-OH; i (e) uklanjanje afinitetnog reagensa sa RT.
  19. 19. Postupak prema patentnom zahtevu 16 naznačen time što dodatno sadrži: (d) uklanjanje reverzibilne blokirajuće grupe sa prvog, drugog, trećeg i četvrtog RT kako bi se proizveo 3ꞌ-OH; i (e) uklanjanje afinitetnih reagenasa sa RT.
  20. 20. DNK čip naznačen time što sadrži: različite templat DNK molekule imobilisane na različitim lokacijama na čipu, pri čemu mnoštvo templat DNK molekula sadrži komplementarne proizvode produžetka prajmera koji su vezani za njih pri čemu proizvodi produžetka prajmera sadrže 3' reverzibilne terminator dezoksiribonukleotide koji sadrže A, T, G ili C nukleobaze ili njihove analoge; i afinitetni reagens specifično vezan za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu barem nekih od reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida.
  21. 21. Postupak prema patentnom zahtevu 15 ili DNK čip prema patentnom zahtevu 18 naznačeno time što su templat DNK molekuli, imobilisani na različitim lokacijama na čipu, DNK nanolopte ili su klonske populacije amplikona proizvedene upotrebom most amplifikacije.
  22. 22. Komplet naznačen time što sadrži (i) prvi afinitetni reagens koji vezuje prvi reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži prvu nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog i (ii) drugi afinitetni reagens koji vezuje drugi reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži drugu nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog, pri čemu su prva i druga nukleobaza različite, i pri čemu komplet opciono sadrži (iii) treći afinitetni reagens koji vezuje treći reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži treću nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog, pri čemu su prva, druga i treća nukleobaza međusobno različite, i pri čemu komplet opciono dodatno sadrži (iv) četvrti afinitetni reagens koji vezuje četvrti reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid koji sadrži četvrtu nukleobazu koja se javlja u prirodi ili njen analog, pri čemu su prva, druga, treća i četvrta nukleobaza međusobno različite, pri čemu se svaki afinitetni reagens vezuje za nukleobazu i reverzibilnu blokirajuću grupu reverzibilnog terminator dezoksiribonukleotida za koji se vezuje.
  23. 23. Komplet prema patentnom zahtevu 22 naznačen time što afinitetni reagensi vezuju reverzibilne terminator dezoksiribonukleotide koji su inkorporisani na 3ꞌ kraju proizvoda produžetka prajmera koji je vezan za templat.
  24. 24. Komplet prema patentnom zahtevu 22 ili 23 naznačen time što svaki od navedenog prvog, drugog, trećeg i četvrtog afinitetnog reagensa sadrži detektabilni obeleživač, opciono pri čemu svaki od navedenog prvog, drugog, i trećeg afinitetnog reagensa sadrži različit detektabilni obeleživač, ili pri čemu svaki od navedenog prvog, drugog, i trećeg afinitetnog reagensa sadrži isti obeleživač u različitim količinama ili intenzitetima.
  25. 25. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 22-24 naznačen time što sadrži reverzibilne terminator dezoksiribonukleotide.
  26. 26. Komplet prema patentnom zahtevu 22 naznačen time što sadrži: (a) mnoštvo neobeleženih reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida Formule I:
    pri čemu R1je 3'-O reverzibilna blokirajuća grupa; R2je nukleobaza odabrana od adenina (A), citozina (C), guanina (G), timina (T), i njihovih analoga i svaki reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid sadrži različitu nukleobazu; i R3sadrži jedan ili više fosfata; (b) mnoštvo prvih afinitetnih reagenasa pri čemu svaki prvi afinitetni reagens vezuje različit od reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida kada je inkorporisan na 3ꞌ terminusu proizvoda produžetka prajmera.
  27. 27. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 19, čip prema patentnim zahtevima 20-21, ili komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 22-26 naznačeno time što reverzibilni terminator dezoksiribonukleotid(i) sadrži reverzibilnu blokirajuću grupu(e) odabranu iz grupe koja se sastoji od alila, azidometila, aminoalkoksila, 2-cijanoetila, supstituisanog alkila, nesupstituisanog alkila, supstituisanog alkenila, nesupstituisanog alkenila, supstituisanog alkinila, nesupstituisanog alkinila, supstituisanog heteroalkila, nesupstituisanog heteroalkila, supstituisanog heteroalkenila, nesupstituisanog heteroalkenila, supstituisanog heteroalkinila, nesupstituisanog heteroalkinila, alenila, cis-cijanoetenila, trans-cijanoetenila, cis-cijanofluoroetenila, trans-cijanofluoroetenila, cis-trifluorometiletenila, trans-trifluorometiletenila, biscijanoetenila, bisfluoroetenila, cis-propenila, trans-propenila, nitroetenila, acetoetenila, metilkarbonoetenila, amidoetenila, metilsulfonoetenila, metilsulfonoetila, formimidata, formhidroksimata, viniloetenila, etilenoetenila, cijanoetilenila, nitroetilenila, amidoetilenila, amino, cijanoetenila, cijanoetila, alkoksi, acila, metoksimetila, aminoksila, karbonila, nitrobenzila, kumarinila, i nitronaftalenila.
  28. 28. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14 naznačen time što su templat nukleinske kiseline DNK nanolopte ili klonske populacije kratkih linearnih templata.
  29. 29. Postupak prema patentnim zahtevima 16-19 naznačen time što barem dva od neobeleženih reverzibilnih terminator nukleotida sadrže različite reverzibilne blokirajuće grupe.
  30. 30. Komplet prema patentnom zahtevu 22 naznačen time što barem dva od reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida sadrže različite reverzibilne blokirajuće grupe.
  31. 31. Postupak prema patentnom zahtevu 29 naznačen time što je barem jedan od neobeleženih reverzibilnih terminator nukleotida azidometil ili komplet prema patentnom zahtevu 30 pri čemu je barem jedan od reverzibilnih terminator dezoksiribonukleotida azidometil.
  32. 32. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 15-19, čip prema bilo kom od patentnih zahteva 20-21, ili komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 22-26 naznačeno time što je afinitetni reagens(i) antitelo, opciono monoklonalno antitelo.
RS20220695A 2017-01-04 2018-01-04 Sekvenciranje nukleinske kiseline upotrebom afinitetnih reagenasa RS63419B2 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762442263P 2017-01-04 2017-01-04
US201762490511P 2017-04-26 2017-04-26
EP18736171.2A EP3565905B2 (en) 2017-01-04 2018-01-04 Nucleic acid sequencing using affinity reagents
PCT/US2018/012425 WO2018129214A1 (en) 2017-01-04 2018-01-04 Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS63419B1 RS63419B1 (sr) 2022-08-31
RS63419B2 true RS63419B2 (sr) 2025-10-31

Family

ID=62791177

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220695A RS63419B2 (sr) 2017-01-04 2018-01-04 Sekvenciranje nukleinske kiseline upotrebom afinitetnih reagenasa
RS20250404A RS66810B1 (sr) 2017-01-04 2018-01-04 Stepenasto sekvenciranje pomoću neobeleženih reverzibilnih terminatora ili prirodnih nukleotida

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250404A RS66810B1 (sr) 2017-01-04 2018-01-04 Stepenasto sekvenciranje pomoću neobeleženih reverzibilnih terminatora ili prirodnih nukleotida

Country Status (18)

Country Link
US (3) US10851410B2 (sr)
EP (3) EP4112741B1 (sr)
JP (2) JP2020508037A (sr)
KR (1) KR102349259B1 (sr)
CN (2) CN110418847B (sr)
AU (2) AU2018205472B2 (sr)
BR (1) BR112019013715B1 (sr)
CA (1) CA3048486A1 (sr)
DK (2) DK4112741T3 (sr)
ES (2) ES2924223T5 (sr)
FI (2) FI4112741T3 (sr)
HU (2) HUE071446T2 (sr)
IL (1) IL267836B2 (sr)
MX (2) MX2019008016A (sr)
PL (2) PL3565905T5 (sr)
PT (2) PT3565905T (sr)
RS (2) RS63419B2 (sr)
WO (1) WO2018129214A1 (sr)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10851410B2 (en) 2017-01-04 2020-12-01 Mgi Tech Co., Ltd. Nucleic acid sequencing using affinity reagents
WO2019067635A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Ultima Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING
EP3878968A4 (en) * 2018-11-07 2022-08-17 EGI Tech (Shen Zhen) Co., Limited PROCEDURE FOR SEQUENCING POLYNUCLEOTIDS
CN113272448B (zh) * 2018-11-09 2025-02-07 深圳华大智造科技股份有限公司 使用未标记的核苷酸进行大规模平行测序
US12497649B2 (en) 2018-12-05 2025-12-16 Qingdao MGI Tech Co., Ltd Rolling circle amplification method, method for preparing sequencing library, and DNA nanosphere prepared therefrom
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group
EP3702474A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-02 QIAGEN GmbH Sequencing method and kit
US12565677B2 (en) 2019-05-15 2026-03-03 Qingdao MGI Tech Co., Ltd. Single-channel sequencing method based on self-luminescence
EP4010484A4 (en) 2019-08-07 2024-02-07 MGI Holdings Co., Limited ACRIDINIUM ESTER-CONTAINING COMPOUNDS AND METHOD FOR USE THEREOF FOR CHEMILUMINESCENCE-BASED SINGLE COLOR SEQUENCING
IL286668B1 (en) * 2019-12-16 2026-04-01 Illumina Cambridge Ltd Kits and flow cells
KR20220111315A (ko) * 2019-12-18 2022-08-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 연속 표지화 방식을 사용하는 합성에 의한 시퀀싱 방법
US12448648B2 (en) 2019-12-23 2025-10-21 Mgi Tech Co., Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
US12110548B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Bi-directional in situ analysis
US20230129228A1 (en) 2020-03-18 2023-04-27 Mgi Tech Co. Ltd. Restoring phase in massively parallel sequencing
WO2021213321A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Mgi Tech Co., Ltd. Dna protection agent in dna imaging buffer
CN115997030A (zh) 2020-04-30 2023-04-21 德迈逊科技有限公司 用于大分子操作的装置和方法
IL316161A (en) 2020-06-22 2024-12-01 Illumina Cambridge Ltd Nucleotides and nucleosides with a 3' masking group
US11981964B2 (en) 2020-07-28 2024-05-14 Illumina Cambridge Limited Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels
US20230366023A1 (en) * 2020-10-09 2023-11-16 Bgi Shenzhen Co., Ltd. Methods and compositions for bioluminescence-based sequencing
GB2599729A (en) * 2020-10-12 2022-04-13 Sumitomo Chemical Co Method comprising light emitting marker
CN116438446A (zh) * 2020-10-12 2023-07-14 深圳华大智造科技股份有限公司 使用核苷标记进行蛋白质检测和追踪
WO2022083686A1 (zh) 2020-10-21 2022-04-28 深圳华大生命科学研究院 修饰的核苷或核苷酸
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
US20220195517A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Long stokes shift chromenoquinoline dyes and uses in sequencing applications
US20220195196A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Alkylpyridinium coumarin dyes and uses in sequencing applications
US20220195518A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2022197589A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 President And Fellows Of Harvard College Methods for in situ sequencing
US20240209439A1 (en) 2021-04-01 2024-06-27 Bgi Shenzhen Nucleotide analogue for sequencing
JP2024516191A (ja) 2021-05-05 2024-04-12 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ビス－ホウ素縮合複素環を含有する蛍光色素及び配列決定における使用
CN113372402A (zh) * 2021-06-15 2021-09-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 3’-o-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用
AU2022413575A1 (en) 2021-12-16 2024-01-18 Illumina, Inc. Methods for metal directed cleavage of surface-bound polynucleotides
AU2022421156A1 (en) 2021-12-20 2024-01-18 Illumina, Inc. Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
CN117940577A (zh) 2021-12-20 2024-04-26 因美纳有限公司 用于化学裂解表面结合的多核苷酸的高碘酸盐组合物和方法
EP4499872B1 (en) 2022-03-29 2026-04-29 Illumina, Inc. Systems and methods of sequencing polynucleotides
CA3223037A1 (en) 2022-03-30 2023-10-05 Oliver MILLER Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
US20230357845A1 (en) 2022-03-31 2023-11-09 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
AU2023244351A1 (en) * 2022-03-31 2024-01-18 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis
CN119213143A (zh) 2022-05-11 2024-12-27 10X基因组学有限公司 用于原位测序的组合物和方法
WO2024003087A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Illumina, Inc. Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
WO2024050815A1 (zh) 2022-09-09 2024-03-14 深圳华大生命科学研究院 杂芳环化合物在核酸检测中的用途
US20250297306A1 (en) 2022-09-28 2025-09-25 Mgi Tech Co., Ltd. Sequencing method
CA3246518A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Compositions and methods for reducing photolesions during sequencing
WO2024123866A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3´ blocking groups and cleavable linkers
EP4638795A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Illumina, Inc. Transition-metal catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
CA3246545A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Illumina, Inc. PALLADIUM CATALYST COMPOSITIONS AND SYNTHETIC SEQUENCE PROCESSES
CN119095984A (zh) 2022-12-27 2024-12-06 伊路米纳有限公司 使用3'烯丙基封端的核苷酸的测序方法
WO2024206407A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Illumina, Inc. Naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing
CN119452101A (zh) 2023-03-30 2025-02-14 因美纳公司 用于核酸测序的组合物和方法
WO2024216163A1 (en) * 2023-04-13 2024-10-17 Esbiolab Llc Methods and compositions for nucleic acid sequencing using predominantly unlabeled nucleotides
CN119061122A (zh) * 2023-05-30 2024-12-03 深圳市真迈生物科技有限公司 单分子测序方法
CN116536399A (zh) * 2023-07-07 2023-08-04 之江实验室 一种基于微珠测序的基因芯片编解码方法及基因芯片
US20250137048A1 (en) 2023-10-26 2025-05-01 Illumina, Inc. 4,5-substituted naphthalimide dyes and uses in nucleic acid sequencing
US20250215493A1 (en) 2023-12-28 2025-07-03 Illumina, Inc. Nucleotides with enzymatically cleavable 3'-o-glycoside blocking groups for sequencing
WO2025144711A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Illumina, Inc. Tricyclic polymethine dyes for nucleic acid sequencing
WO2025184226A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Illumina, Inc. Nucleotides with terminal phosphate capping
WO2025188906A1 (en) 2024-03-08 2025-09-12 Illumina, Inc. Modified adenosine nucleotides
WO2025230914A1 (en) 2024-04-29 2025-11-06 Illumina, Inc. Nucleotides with enzyme-triggered self-immolative linkers for sequencing by synthesis
CN118496347B (zh) * 2024-05-30 2024-10-25 北京航空航天大学杭州创新研究院 一种用于抗体寡核苷酸偶联的方法
WO2026000160A1 (zh) * 2024-06-25 2026-01-02 深圳华大智造科技股份有限公司 修饰的染料及其应用

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2713102A (en) 1952-06-25 1955-07-12 Railroad Accessories Corp Test terminal
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5053336A (en) * 1989-07-17 1991-10-01 Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies for the separate detection of halodeoxyuridines and method for their use
US5188934A (en) 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
US6232465B1 (en) 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
EP1033411B1 (en) 1996-06-04 2006-02-22 University of Utah Research Foundation Fluorescent donor-acceptor pair
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6432360B1 (en) 1997-10-10 2002-08-13 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6743605B1 (en) 1998-06-24 2004-06-01 Enzo Life Sciences, Inc. Linear amplification of specific nucleic acid sequences
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
EP1114184A2 (en) 1998-09-15 2001-07-11 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
US20050181440A1 (en) 1999-04-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
DE60030436T2 (de) 1999-05-20 2007-03-29 Illumina, Inc., San Diego Vorrichtung zur halterung und präsentation von mindestens einer mikrokugelmatrix zu lösungen und/oder zu optischen abbildungssystemen
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
WO2001023610A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
JP2001245698A (ja) * 1999-11-22 2001-09-11 Xiao Bing Wang 核酸検出法
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
JP3852555B2 (ja) 2000-09-01 2006-11-29 三菱電機株式会社 熱制御装置、宇宙機および熱制御方法
AU2001293163A1 (en) 2000-09-27 2002-04-08 Lynx Therapeutics, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
JP2004510433A (ja) 2000-10-06 2004-04-08 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク Ｄｎａおよびｒｎａを解読するための大量並行方法
GB0105831D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Toumaz Technology Ltd Method for dna sequencing utilising enzyme linked field effect transistors
US7488577B2 (en) * 2001-06-14 2009-02-10 Cavidi Tech Ab Method for measuring DNA polymerization and applications of the method
US20030124560A1 (en) * 2001-06-14 2003-07-03 Yoshihiko Makino Method for analyzing a target nucleic acid fragment and a kit for analyzing a target nucleic acid fragment
JP4500540B2 (ja) * 2001-06-29 2010-07-14 ヴェリ‐キュー，インコーポレイテッド 化学的に合成された核酸の純度を決定し、かつ化学的に合成された核酸を精製するための方法および組成物
FR2836995B1 (fr) * 2002-03-05 2006-09-22 Centre Nat Rech Scient Utilisation de derives de nucleosides comportant un groupement citrate pour la production d'anticorps ayant une affinite pour des nucleosides triphosphorylees et leurs applications
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
WO2005003375A2 (en) * 2003-01-29 2005-01-13 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2004074503A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-02 Hoser Mark J Nucleic acid sequencing methods, kits and reagents
EP2365095A1 (en) 2003-02-26 2011-09-14 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
JP2007526772A (ja) 2004-02-27 2007-09-20 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ インサイチュー配列決定用ポロニー蛍光ビーズ
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
WO2006120433A1 (en) 2005-05-10 2006-11-16 Solexa Limited Improved polymerases
CA2610976C (en) 2005-06-10 2020-11-24 Robbie Woodman Use of stefin a as a scaffold protein
JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2013-10-30 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
SG170028A1 (en) 2006-02-24 2011-04-29 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
CA2643700A1 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
WO2008045575A2 (en) 2006-10-13 2008-04-17 J. Craig Venter Institute, Inc. Sequencing method
WO2008070352A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US7948015B2 (en) 2006-12-14 2011-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US7897344B2 (en) 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
WO2009061840A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
WO2009120374A2 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sample preparation
GB0807065D0 (en) 2008-04-18 2008-05-21 Univ Leeds Novel scaffolds
CN104263816B (zh) * 2008-05-16 2018-10-19 生命技术公司 用于测量细胞增殖的双标记法
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2010075188A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Illumina Inc. Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols
US20140228223A1 (en) 2010-05-10 2014-08-14 Andreas Gnirke High throughput paired-end sequencing of large-insert clone libraries
US9005565B2 (en) 2010-06-24 2015-04-14 Hamid-Reza Jahangiri-Famenini Method and apparatus for forming graphene
WO2012027625A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Scaffold-based polymerase enzyme substrates
CA2859660C (en) 2011-09-23 2021-02-09 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US8671811B2 (en) 2011-09-30 2014-03-18 Robert Bosch Gmbh Pivoting saw system
GB201301178D0 (en) * 2013-01-23 2013-03-06 Dynamic Biosensors Gmbh Method for sequencing a template nucleic acid immobilized on a substrate
US9650406B2 (en) 2013-02-28 2017-05-16 Centrillion Technology Holdings Corporation Reversible terminator molecules and methods of their use
US9944924B2 (en) 2014-01-16 2018-04-17 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
WO2016065248A1 (en) * 2014-10-23 2016-04-28 Complete Genomics, Inc. Signal confinement sequencing (scs) and nucleotide analogues for signal confinement sequencing
CN104448001A (zh) 2014-11-14 2015-03-25 杭州博谱医药科技有限公司 抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及其应用
AU2016220404B2 (en) 2015-02-17 2021-05-27 Mgi Tech Co., Ltd. DNA sequencing using controlled strand displacement
CN105001292A (zh) * 2015-07-14 2015-10-28 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物及其在dna或rna测序中的用途
US20170240961A1 (en) 2016-02-23 2017-08-24 Complete Genomics, Inc. Affinity tag labeled nucleosides and uses
CN109790196B (zh) 2016-04-22 2022-09-27 深圳华大智造科技股份有限公司 可逆封闭的核苷类似物及其用途
KR102230444B1 (ko) 2016-08-15 2021-03-23 옴니옴 인코포레이티드 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법 및 시스템
US10851410B2 (en) 2017-01-04 2020-12-01 Mgi Tech Co., Ltd. Nucleic acid sequencing using affinity reagents

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019013715B1 (pt) 2021-08-24
JP2022046677A (ja) 2022-03-23
EP3565905A4 (en) 2020-11-04
AU2018205472A1 (en) 2019-07-25
KR102349259B1 (ko) 2022-01-07
EP4575499A3 (en) 2025-07-09
PL3565905T3 (pl) 2022-09-26
US11788138B2 (en) 2023-10-17
DK3565905T4 (da) 2025-09-01
CN120485343A (zh) 2025-08-15
JP7025595B1 (ja) 2022-02-24
PT3565905T (pt) 2022-08-02
BR112019013715A2 (pt) 2020-03-03
PL4112741T3 (pl) 2025-06-16
ES2924223T5 (en) 2025-10-23
EP4112741A1 (en) 2023-01-04
IL267836B1 (en) 2023-05-01
US20180223358A1 (en) 2018-08-09
US10851410B2 (en) 2020-12-01
PT4112741T (pt) 2025-05-05
KR20190141120A (ko) 2019-12-23
AU2023201547A1 (en) 2023-04-13
HUE059673T2 (hu) 2022-12-28
ES3026859T3 (en) 2025-06-12
PL3565905T5 (pl) 2025-09-22
IL267836A (en) 2019-09-26
DK4112741T3 (da) 2025-05-19
ES2924223T3 (es) 2022-10-05
EP3565905B2 (en) 2025-07-30
IL267836B2 (en) 2023-09-01
RS66810B1 (sr) 2025-06-30
AU2018205472B2 (en) 2022-12-15
US20240117425A1 (en) 2024-04-11
KR102349259B9 (ko) 2022-07-20
MX2019008016A (es) 2019-10-15
EP3565905B1 (en) 2022-05-25
CA3048486A1 (en) 2018-07-12
FI3565905T4 (fi) 2025-09-10
HUE071446T2 (hu) 2025-09-28
CN110418847B (zh) 2025-04-18
FI4112741T3 (fi) 2025-05-15
RS63419B1 (sr) 2022-08-31
DK3565905T3 (da) 2022-07-25
WO2018129214A1 (en) 2018-07-12
MX2024006412A (es) 2024-06-05
EP4575499A2 (en) 2025-06-25
EP4112741B1 (en) 2025-02-26
US20210254150A1 (en) 2021-08-19
CN110418847A (zh) 2019-11-05
EP3565905A1 (en) 2019-11-13
JP2020508037A (ja) 2020-03-19
AU2023201547B2 (en) 2025-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240117425A1 (en) Nucleic acid sequencing using affinity reagents
CN113272448B (zh) 使用未标记的核苷酸进行大规模平行测序
KR102607124B1 (ko) 핵산 분석을 위한 다가 결합 조성물
HK40077211A (en) Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides
HK40077211B (en) Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides
CN116438446A (zh) 使用核苷标记进行蛋白质检测和追踪
HK40015111A (en) Nucleic acid sequencing using affinity reagents
HK40015111B (en) Nucleic acid sequencing using affinity reagents
HK40015864A (en) Nucleic acid sequencing using affinity reagents
HK40015864B (zh) 使用亲和试剂进行核酸测序
HK40050304A (en) Massively parallel sequencing using unlabeled nucleotides
HK40050304B (zh) 使用未标记的核苷酸进行大规模平行测序