RS63744B1 - Test za antitela protiv jc virusa - Google Patents

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva prioritet od SAD privremene prijave br.61/294,048, koja je podneta 11.01.2010. i SAD privremene prijave br.61/316,193, od 22.03.2010.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Pronalazak se odnosi na postupke za ispitivanje uzoraka na prisustvo antitela protiv JC virusa.

OSNOVA PRONALASKA

[0003] Progresivna multifokalna leukoencefalopatija (PML) je oportunistička infekcija centralnog nervnog sistema (CNS) koja je povezana sa izlaganjem JC virusu (JCV), polioma virusu za koji se veruje da je patogen kod ljudi samo pod uslovima perzistentne imunosupresije ili imunomodulacije. Dok je prisustvo JCV potrebno za razvoj PML, rizik od PML se smatra, na način koji nije sasvim jasan, povezanim sa konvergencijom višestrukih virusnih faktora i faktora povezanih sa domaćinom koji dovode do toga da virus postane patogen (Major, „Progressive Multifocal Leukoencephalopathy in Patients on Immunomodulatory Therapies“ Annu. Rev. Med 61:35-47 (2010) [31.08.2009, E-objava pre štampe]). Objavljena ispitivanja prijavljuju da prevalencija infekcije sa JCV u humanoj populaciji varira. Ova informacija se zasniva na različitim vrstama ispitivanja uključujući PCR analizu za virusnu DNK i detekciju antitela na JCV. Uprkos prevalenciji JCV u populaciji, infekcija sa JCV retko rezultuje u PML, čak i kod osoba sa dokumentovanom imunosupresijom.

[0004] Objavljeni izveštaji o detekciji DNK JCV sugerišu da je postupak neosetljiv i ograničene upotrebljivosti za procenjivanje izloženosti JCV jer je DNK JCV bila retko i nekonzistentno detektovana u plazmi, serumu ili mononuklearnim ćelijama periferne krvi pacijenata sa PML inficiranih sa JCV. Detekcija anti-JCV antitela izgleda da predstavlja osetljiviji marker za infekciju sa JCV; međutim prijavljeni rezultati su varijabilni. Godine 1973, Padgett i Walker su objavili studiju koja izveštava o seroprevalenciji JCV od 65-84% korišćenjem testa inhibicije hemaglutinacije (HI) (Padgett and Walker, „Prevalence of antibodies in human sera agains JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy“ J. Infect. Dis.

127:467-70, 1973). Kasniji izveštaji o stopama seroprevalencije JCV korišćenjem testa HI ili ELISA testa varirali su između 33-91%. Različite stope seroprevalencije u ovim studijama verovatno su nastale zbog značajnih razlika u veličini i demografiji ispitivanja, i, možda najznačajnije, razlika u postupcima testova.

[0005] Zbog toga je poželjno implementirati pouzdan i osetljiv test za određivanje prisustva antitela na JCV koji može da se koristi, na primer, za procenu da li je osoba bila izložena JCV.

REZIME PRONALASKA

[0006] Pronalazak se odnosi na razvoj analitički validiranog, osetljivog testa za detekciju prisustva antitela protiv JCV u biološkom fluidu, npr., serumu ili plazmi. Obim pronalaska je definisan priloženim zahtevima. Primeri izvođenja, navodi, aspekti, primeri i opisi koji nisu obuhvaćeni obimom priloženih zahteva smatraju se samo primerima pogodnim za razumevanje pronalaska.

[0007] Pronalazak je in vitro postupak za identifikaciju subjekta sa povećanim rizikom od PML, pri čemu se subjekt identifikuje kao neko ko je izložen povećanom riziku od PML ako je biološki uzorak dobijen od subjekta pozitivan na antitelo protiv JCV, pri čemu se nivo antitela protiv JCV određuje: (a) dovođenjem u kontakt biološkog uzorka uzetog od subjekta sa visoko prečišćenim česticama sličnim virusu (HPVLP), koje se uglavnom sastoje od VP1 proteina JC virusa (JCV), u rastvoru pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela protiv JCV u uzorku za HPVLP, čime se dobija preinkubirani uzorak; (b) dovođenjem u kontakt preinkubiranog uzorka sa česticama HPVLP, koje se uglavnom sastoje od VP1 proteina JCV, imobilizovanim na čvrstoj podlozi, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela protiv JCV u uzorku za HPVLP; (c) detektovanjem nivoa antitela protiv JCV u preinkubiranom uzorku koja se vezuju za imobilizovane HPVLP; (d) dovođenjem u kontakt dela biološkog uzorka koji je inkubiran u rastvoru bez HPVLP pod istim uslovima korišćenim u koraku (b), i detektovanjem nivoa antitela protiv JCV koja se vezuju za imobilizovane HPVLP i (e) upoređivanjem detektovanog nivoa antitela protiv JCV u preinkubiranom uzorku iz koraka (a) do (c) sa nivoom antitela protiv JCV detektovanim u uzorku iz koraka (d); pri čemu snižavanje detektovanog nivoa antitela protiv JCV u preinkubiranom uzorku, u poređenju sa uzorkom dobijenim od subjekta koji je inkubiran u rastvoru bez HPVLP, ukazuje na to da je uzorak pozitivan na antitelo protiv JCV, a promena u detektovanom nivou antitela protiv JCV ispod određenog procenta ukazuje na to da antitelo specifično za JCV nije prisutno u uzorku, pri čemu su HPVLP sačinjene od više od 5, najmanje 50, 150 ili 360 polipeptida VP1; pri čemu postupak dodatno uključuje određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta u uzorku uzetom kasnijeg datuma od vremena uzimanja početnog uzorka, poređenje nivoa anti-JCV antitela u uzorku uzetom kasnijeg datuma sa nivoom u uzorku iz početnog uzorka; i utvrđivanje da li je subjekt izložen povećanom riziku od PML kasnijeg datuma, u odnosu na vreme uzimanja početnog uzorka.

[0008] U jednom primeru izvođenja, dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa HPVLP u rastvoru traje tokom vremenskog perioda odabranog od 30 minuta, jednog časa, ili preko noći na 4°C.

[0009] U poželjnom primeru izvođenja, specifikovani procenat je 40%. Poželjno, test daje lažno negativnu stopu od 3% ili manje za detekciju antitela protiv JCV u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, gde najpoželjnije test daje lažno negativnu stopu od 1% ili manje za detekciju antitela protiv JCV u biološkom uzorku dobijenom od subjekta.

[0010] U poželjnom primeru izvođenja, HPVLP sadrže više od 1, najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 72 VP1 pentamera. U nekim primerima izvođenja, HPVLP dodatno sadrži najmanje jedno od JCV VP2, ili JCV VP3; ili je VP1 u HPVLP rekombinantni VP1; ili je najmanje jedan VP1 u HPVLP mutantni VP1.

[0011] Poželjno, biološki uzorak je serum. U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak potiče od subjekta kome je propisan imunomodulator, subjekta koji razmatra uzimanje imunomodulatora, pri čemu je imunomodulator odabran od anti-VLA-4 terapije, anti-CD20 terapije, anti-CD11a terapije, ili mikofenolat mofetila. U nekim primerima izvođenja, subjekt nije prethodno primao imunomodulator. U drugim primerima izvođenja, subjekt je prethodno primio jednu ili više doza imunomodulatora. Imunomodulator je poželjno natalizumab.

[0012] U nekim primerima izvođenja, subjekt za koga je utvrđeno da u biološkom uzorku nema antitela protiv JCV u početnom testiranju, podvrgava se ponovnom testiranju na antitela protiv JCV najmanje jednom godišnje nakon početnog testiranja.

[0013] U veoma poželjnim primerima izvođenja, subjekt ima multiplu sklerozu (MS) ili Kronovu bolest (CD).

[0014] U jednom slučaju, najmanje oko 10% HPVLP čestica u preparatu prečišćenih HPVLP sadrži više od pet polipeptida VP1 po HPVLP. U drugim slučajevima, najmanje oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 80% ili oko 90% HPVLP u preparatu prečišćenih HPVLP čestica sadrži više od pet polipeptida VP1 po HPVLP.

[0015] Čvrsta podloga može da bude mikrotitar ploča ili predmetno staklo. U nekim primerima izvođenja, HPVLP se sastoji uglavnom od VP1 virusnog proteina. HPVLP može dodatno da uključuje druge virusne proteine, na primer najmanje jedan od VP2 ili VP3 JCV. Virusni protein(i) u HPVLP mogu da budu rekombinantno dobijeni (npr., VP1 soja MAD1) ili mogu da budu prirodni virusni proteini (npr., dobijeni iz prirodnog izvora). Postupak može da se izvede korišćenjem, na primer, biološkog uzorka dobijenog od subjekta koji se trenutno leči imunomodulatornim lekom, subjekta kod koga se razmatra započinjanje lečenja imunomodulatornim lekom, ili subjekta za koga se sumnja da ima progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML).

[0016] Postupak za koji se traži zaštita obuhvata postupak sekundarnog potvrdnog testa koji uključuje dovođenje u kontakt dela biološkog uzorka uzetog od subjekta sa HPVLP česticama u rastvoru (pre inkubacije uzorka sa HPVLP česticama vezanim za čvrsti supstrat), čime se dobija sekundarni uzorak; dovođenje u kontakt sekundarnog uzorka sa HPVLP česticama pod istim uslovima koji se koriste za primarni test; detektovanje nivoa antitela protiv JCV koja se vezuju za HPVLP česticama u sekundarnom uzorku; i upoređivanje detektovanog nivoa antitela protiv JCV u sekundarnom uzorku sa nivoom antitela protiv JCV u uzorku koji nije bio prethodno inkubiran sa rastvorljivim HPVLP česticama, tako da smanjenje detektovanog nivoa u sekundarnom uzorku analize u poređenju sa uzorkom koji nije prethodno inkubiran označava da je uzorak pozitivan na antitela protiv JCV, a promena detektovanog nivoa ispod određenog procenta ukazuje na to da u uzorku nema antitela specifičnog za JCV.

[0017] Ovde opisani test može da se koristi za ispitivanje prisustva antitela protiv JCV kod subjekta koji nikad nije primao terapiju imunomodulatorom; ili kod subjekta koji je prethodno primao imunomodulator, ali koji više ne prima terapiju imunomodulatorom; ili kod subjekta koji je trenutno podvrgnut lečenju imunomodulatorom.

[0018] Detekcija antitela protiv JCV koja se vezuju za HPVLP čestice u testu prikazanom u pronalasku može da ukazuje na to je subjekt izložen povećanom riziku od PML. Detekcija antitela protiv JCV može takođe da ukazuje na to da je subjekt izložen povećanom riziku od neželjenih simptoma, kao što je razvoj PML, po primeni određenih terapijskih sredstava, kao što su izvesni imunomodulatori, i zbog toga subjekt nije kandidat za lečenje ovim sredstvima. Na primer, detekcija antitela protiv JCV u uzorku uzetom od subjekta može da ukazuje na to da subjekt nije kandidat za lečenje anti-VLA-4 terapijskim sredstvom, kao što je natalizumab. U određenim primerima izvođenja, detekcija antitela protiv JCV u biološkom uzorku može da ukazuje na to da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom, kao što je natalizumab, osim što će subjekt biti podvrgnut pojačanom praćenju tokom lečenja u odnosu na subjekta koji nema detektabilna antitela protiv JVC. Na primer, pojačano praćenje može da uključuje praćenje neželjenih simptoma, kao što su simptomi koji mogu da ukazuju na razvoj PML.

[0019] Izostanak detekcije antitela protiv JCV koja se vezuju za HPVLP čestice u testu prikazanom u pronalasku može da ukazuje na to da je subjekt kandidat za primanje terapije imunomodulatorom, kao što je natalizumab, i u jednom slučaju, kod subjekta se dodatno primenjuje imunomodulator. Subjekt za koga je utvrđeno da nema antitela protiv JCV može da bude ponovo testiran najmanje jednom godišnje (npr., najmanje svaka 3 meseca, svakih 6 meseci, svakih 9 meseci, ili svakih 12 meseci) da bi se odredilo da li je subjekt razvio antitela protiv JCV, što može da ukazuje na to da je subjekt inficiran sa JCV. Subjekt koji prethodno nije imao detektabilna antitela protiv JCV u biološkom uzorku, i koji je kasnije razvio antitela protiv JCV u biološkom uzorku, može da prestane da prima terapiju imunomodulatorom.

[0020] U nekim primerima izvođenja, subjekt za koga je prethodno utvrđeno da ima antitela protiv JCV, može naknadno da bude ispitan kasnijeg datuma i da bude utvrđeno da nema antitela protiv JCV. Ovi subjekti mogu da budu određeni kao kandidati za primanje terapije imunomodulatorom, kao što je natalizumab. U jednom slučaju, kod subjekta čiji je rezultat testa prethodno bio pozitivan na prisustvo antitela protiv JCV i kod koga je zatim rezultat testa bio negativan na antitela protiv JCV može da se primeni imunomodulator, i da se subjekt podvrgne pojačanom praćenju u poređenju sa subjektom čiji rezultat testa nikad nije bio pozitivna na antitela protiv JCV, kao što je praćenje simptoma koji mogu da ukazuju na razvoj PML.

[0021] Test opisan u pronalasku je koristan za lečenje subjekta koji ima imunološku bolest ili poremećaj, kao što je multipla skleroza (MS) ili Kronova bolest (CD).

[0022] Test za koji se traži zaštita je validiran za upotrebu kod pacijenata sa MS i CD, pokazivanjem da je test efikasan u detekciji antitela protiv JCV kod pacijenata sa MS i CD u testu u kontrolisanom okruženju, kao što je u kliničkom ispitivanju.

[0023] U drugom aspektu, navodi koji nisu deo pronalaska, odnose se na komplet koji sadrži HPVLP i bar jedan reagens za izvođenje testa za identifikovanje nivoa antitela protiv JCV u uzorku, kao što je biološki uzorak.

[0024] U drugim aspektima, navodi koji nisu deo pronalaska, odnose se na rastvor koji sadrži čestice HPVLP koje se sastoje pretežno od čestica koje sadrže VP1 većih od VP1 pentamera, npr., koje sadrže oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 72 pentamere ili sadrže oko 25 molekula VP1, oko 50 molekula VP1, oko 100 molekula VP1, oko 150 molekula VP1, oko 200 molekula VP1, oko 300 molekula VP1, oko 350 molekula VP1 ili oko 360 molekula VP1.

[0025] Još jedan aspekt, koji se javlja u navodima koji nisu deo pronalaska, je postupak za pripremu rastvora HPVLP čestica, gde postupak obuhvata uklanjanje iz rastvora čestica koje sadrže VP1 koje su veličine pentamera VP1 ili manje. U jednom postupku polipeptidi VP1 se eksprimiraju u ćelijama, npr., u ćelijama insekata ili sisarskim ćelijama. Ćelije se liziraju, i ćelije se zatim obrađuju nukleazom, kao što je benzonaza. Ćelijski ostaci se uklanjaju taloženjem, kao što je taloženjem pomoću soli (npr., amonijum sulfatom), i potom se supernatant koji sadrži VP1 koncentruje i dodatno prečišćava korišćenjem dijafiltracije, primera radi pomoću jednog ili dva prolaska kroz membranu, npr., membranu za filtraciju sa tangencijalnim protokom (TFF). Rastvor koji sadrži čestice koje sadrže VP1, npr., HPVLP čestice, se zatim dodatno prečišćava pomoću koraka jonske izmene, i izvodi se eluiranje HPVLP čestica, npr., puferom. Čistoća VP1 može da se proceni, npr., elektroforezom (npr., SDS-PAGE) ili masenom spektrometrijom. Prisustvo HPVLP čestica može da se potvrdi mikroskopijom, npr., elektronskom mikroskopijom. Procenat ukupnog proteina u obliku HPVLP čestica može da se odredi analitičkim ultracentrifugiranjem metodom sedimentacione brzine.

[0026] U jednom aspektu, navodi koji nisu deo pronalaska prikazuju postupak identifikacije subjekta sa rizikom od razvoja PML, na primer, uzimanjem biološkog uzorka od subjekta; dovođenjem u kontakt biološkog uzorka sa HPVLP česticama pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JC virus (JCV) u uzorku za HPVLP; detektovanjem nivoa antitela protiv JCV koje se vezuje u uzorku za HPVLP čestice; i dovođenjem u korelaciju detektovanog nivoa sa referentnim setom, gde je subjekt u povećanom riziku od PML ako je vezivanje antitela protiv JCV detektovano. Referentni set se bira tako da pokazuje lažno negativnu stopu od oko 5%, oko 3%, oko 1% ili manje.

[0027] U drugom aspektu, navodi koji nisu deo pronalaska prikazuju postupak identifikovanja rizika od PML kod subjekta određivanjem nivoa anti-JCV antitela u uzorku uzetom od subjekta, kao što je uzorak plazme, krvi ili seruma; i određivanja nivoa rizika subjektu u skladu sa nivoom anti-JCV antitela u uzorku. Subjekt može da prima imunomodulatornu terapiju, kao što je anti-VLA4 tretman, npr., natalizumabom, ili može da bude kandidat za dobijanje imunomodulatorne terapije. U nekim slučajevima, kod subjekta je dijagnostikovana imunološka bolest ili poremećaj, kao što je multipla skleroza ili Kronova bolest. U pronalasku, nivo anti-JCV antitela se određuje korišćenjem dvostepenog testa. Dvostepeni test može da uključuje ELISA test. Postupak za koji se traži zaštita uključuje određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta u uzorku uzetom kasnijeg datuma od vremena uzimanja početnog uzorka, poređenje nivoa anti-JCV antitela u uzorku uzetom kasnijeg datuma sa nivoom u uzorku iz početnog uzorka; i utvrđivanje da li je subjekt izložen povećanom riziku od PML kasnijeg datuma, u odnosu na vreme uzimanja početnog uzorka.

[0028] Postupak za koji se traži zaštita može da se koristi za praćenje rizika od PML kod subjekta, postupak obuhvata određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta korišćenjem uzorka od prvog datuma; određivanje rizika od PML (npr., visok, ili umeren ili nizak rizik) na osnovu nivoa anti-JCV antitela kod subjekta prvog datuma; određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta korišćenjem uzorka od drugog datuma; i određivanje rizika od PML (npr., visok, ili umeren ili nizak rizik) na osnovu nivoa anti-JCV antitela kod subjekta drugog datuma.

[0029] Kako se ovde koristi, „HPVLP“ je visoko prečišćena VLP („čestica slična virusu“) koja se pretežno sastoji od VP1 proteina. „HPVLP“ koja je prikazana u pronalasku, sačinjena je uglavnom od glavnog proteina kapsida „VP1“, koji može da bude prirodni VP1 ili rekombinantni VP1, iz poliomavirusa, JC virusa (JCV). HPVLP može da bude sačinjena od, npr., više od jedne pentamerne subjedinice, najmanje 10 pentamernih subjedinica, najmanje 20 pentamernih subjedinica, najmanje 30 pentamernih subjedinica, najmanje 50 pentamernih subjedinica, najmanje sedamdeset dve pentamerne subjedinice ili više VP1. HPVLP može da sadrži polipeptide VP1 u neodređenoj konfiguraciji (npr., polipeptidi mogu ali ne moraju da budu organizovani u pentamere), u kom slučaju HPVLP može da bude sačinjen od više od 5 polipeptida VP1, najmanje 50 polipeptida VP1, najmanje 150 polipeptida VP1, najmanje 360 polipeptida VP1 ili više. HPVLP čestice uključuju kapsomere, koje sadrže oko 10 do 24 pentamera. HPVLP prikazana u pronalasku može da veže antitela protiv prirodnog, intaktnog JC virusa. U nekim primerima izvođenja, HPVLP uključuje drugi, i izborno treći, tip polipeptida koji predstavlja manji protein kapsida JC virusa, npr., najmanje jedan polipeptid VP2 ili VP3. VP2 ili VP3 mogu da budu rekombinantni, ili prirodni, ili polipeptidi koji potiču prirodnih polipeptida.

[0030] Takve „visoko prečišćene“ čestice sadrže više od jedne VP1 pentamere, npr., najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 72 VP1 pentamera, ili manje od 100 VP1 pentamera. Takve visoko prečišćene čestice mogu da se dobiju, na primer, postupkom koji uključuje dvostruku filtraciju. Na primer, visoko prečišćeni preparat VLP se dobija prečišćavanjem čestica najmanje dva puta centrifugiranjem, npr., kroz saharozni sloj. Uopšteno, preparat HPVLP može da se identifikuje preko njegove aktivnosti u ELISA testu korišćenjem definisanih kontrolnih uzoraka. U nekim slučajevima, takvi kontrolni uzorci su negativne kontrole i/ili kontrolni uzorci koji sadrže niske nivoe antitela protiv JCV.

[0031] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što uobičajeno podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

[0032] Detalji jednog ili više primera izvođenja pronalaska su prikazani na pratećim crtežima i u opisu u nastavku teksta. Predmetni pronalazak i primeri njegovog izvođenja navedeni su u priloženim patentnim zahtevima.

OPIS CRTEŽA

[0033]

SL. 1 je grafikon koji prikazuje rezultate ELISA testa HPVLP na uzorcima uzetim od subjekata pozitivnih na DNK JCV u uzorku urina (uro-pozitivni) i negativnih na DNK JCV u uzorku urina (uro-negativni). Oblast ograničena četvorouglom predstavlja interkvartilni (IQR) opseg sa linijom medijane u sredini; zagrade predstavljaju zapažanja unutar 1.5 puta IQR. „+“ znakovi predstavljaju zapažanja izvan 1.5 puta IQR (odstupanja). *Man-Vitnijev U test.

SL. 2 je grafikon koji prikazuje nivoe anti-JCV antitela merene ELISA testom nasuprot nivoa DNK JCV u urinu mereno pomoću qPCR (n=204). Prazni krugovi predstavljaju uzorke urina i seruma sakupljene u istovremenim vremenskim tačkama STRATA. Puni krugovi predstavljaju uzorke sakupljene u različitim vremenskim tačkama. Za 17 uzoraka sa rezultatima DNK testa ispod nivoa kvantitativnog određivanja (<500 kopija/mL) nivo je podešen na graničnu vrednost detekcije.

SL. 3 je grafikon koji prikazuje podatke o unakrsnoj reaktivnosti BKV-JCV iz jednog zeca imunizovanog sa BKV. Antiserum zeca imunizovanog sa BKV vezivao je BKV VLP sa visokim afinitetom (EC50 = 1:100 000) i unakrsno reagovao sa JCV VLP (EC50 = 1:5 000).

SL. 4A i 4B prikazuju test anti-JCV reaktivnosti uzoraka seruma uzetih od uro-negativnih (n=311) (SL. 4A) i uro-pozitivnih (n=204) (SL. 4B) pacijenata u skrining i potvrdnim ELISA testovima. Prikazana je raspodela serološke reaktivnosti uzoraka u skrining ELISA testu, sa naglašenim donjim (nOD450= 0.10) i gornjim (nOD450= 0.25) graničnim vrednostima (levi paneli). U dodatnom potvrdnom ELISA testu (desni paneli), naglašena je granična vrednost inhibicije od 40% (vertikalna linija) sa osenčenim regionima koji označavaju uzorke za koje nije potvrđeno da imaju anti-JCV specifična antitela (nOD450≤ 0.25 i procenat inhibicije ≤ 40%).

SL. 5A i 5B su histogrami koji prikazuju učestalost zapažanja unutar svakog opsega inhibicije od 10% za sve pacijente (n=515) (SL.5A) i uro-pozitivne pacijente (n=204) (SL.

5B). Raspodela se sastojala od dva jasno definisana pika, najoptimalnije odvojena na 40% inhibicije. Nivo inhibicije od 40% odgovarao je približno donjem petom percentilu raspodele odgovora uro-pozitivnih uzoraka.

SL. 6A i 6B su grafički prikazi vrednosti nOD450iz skrining ELISA testa (SL.6A) nasuprot vrednostima procenta inhibicije iz potvrdnog ELISA testa (SL.5B) za 11 pre-PML uzoraka. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti nOD450od 0.10 i 0.25, vertikalna linija predstavlja procenat inhibicije od 40%.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0034] Osetljivi test za antitela protiv JCV koji smanjuje na najmanju meru lažno negativne rezultate i smanjuje na najmanju meru detekciju unakrsno reaktivnih antitela koristan je za identifikaciju pojedinaca koji su bili izloženi JCV. Upotreba takvog testa može biti korisna u identifikaciji pojedinaca koji imaju trenutnu infekciju sa JCV ili su bili prethodno dovoljno izloženi JCV da razviju antitela protiv virusa. Takav test može takođe da obezbedi alat za pomoć kliničarima u kliničkoj vigilanci i stratifikaciji rizika kod PML. Na primer, takav test može da bude koristan za stručnjake i pacijente kao deo procene rizika koji pacijent ima od razvoja PML pomoću precizne procene da li je subjekt bio izložen JCV. U nekim slučajevima, analiza može da uključuje određivanje nivoa antitela protiv JCV u biološkom uzorku uzetom od pacijenta.

[0035] Neke poteškoće leže u razvoju korisnog testa za antitela protiv JCV, na primer, uspostavljanje validiranih graničnih vrednosti. Podnosioci su rešili ovaj problem korišćenjem podataka dobijenih iz testova na uzorcima urina i plazme uzetim od pacijenata koji su uro-pozitivni ili uro-negativni na DNK JCV. Drugi problem je razvoj testa koji ima specifičnost i ponovljivost. Podnosioci su rešili ovaj problem korišćenjem visoko prečišćene čestice koja sadrži virusni protein u testu za antitelo. Dodatno, podnosioci su otkrili da upotreba sekundarnog testa za razrešavanje uzoraka sa dvosmislenim rezultatima u primarnom testu poboljšava korisnost testa za obezbeđivanje upotrebljivog rezultata za takve uzorke.

[0036] Prema tome, razvijen je analitički validirani test koji koristi visoko prečišćenu česticu sličnu virusu (VLP) koja sadrži VP1 za detekciju prisustva antitela protiv JCV u telesnom fluidu, kao što je serum, plazma, urin, CSF, ili drugi telesni fluid koji sadrži antitela. U eksperimentima za validaciju novog testa, identifikovana je prevalencija antitela protiv JCV od približno 54% u populaciji pacijenata sa MS uključenih u kliničko ispitivanje. Ključno svojstvo testa koji je ovde opisan je upotreba visoko prečišćene čestice slične virusu (HPVLP).

[0037] Jedna prednost testa koji je ovde opisan je ta što ima relativno nisku lažno negativnu stopu, npr., lažno negativnu stopu od oko 10%, oko 8%, oko 6%, oko 4%, oko 3%, oko 1% ili manje za detekciju antitela na JCV. Uopšteno, test ima lažno negativnu stopu od samo oko 3% ili manje za detekciju antitela na JCV. Kao što je ovde opisano novi test može da se koristi za praćenje stope serokonverzije za JCV. Na primer, test je korišćen za otkrivanje godišnje stope serokonverzije od ne više od oko 2% u ispitivanoj kohorti subjekata koji su bili inicijalno negativni na antitelo protiv JCV. Ovo pokazuje da test može da bude koristan za praćenje statusa izloženosti JCV pojedinca tokom vremena.

[0038] Test može da se koristi za detekciju antitela protiv JCV kod bilo kog humanog subjekta, uključujući subjekta kod koga se razmatra lečenje imunomodulatorom, na primer anti-VLA-4 terapija (npr., natalizumab), anti-CD20 terapija (npr., rituksimab), anti-CD11a terapija (npr., efalizumab), ili mikofenolat mofetil; subjekta koji se trenutno leči imunomodulatorom; ili subjekta koji je prekinuo lečenje imunomodulatorom. Test može da bude koristan i za druge koji mogu biti podložni PML, kao što su osobe koje imaju limfoproliferativne poremećaje, kao što je multipli mijelom ili limfom; osobe inficirane humanim virusom imunodeficijencije (HIV), ili imaju stečeni sindrom imunodeficijencije (AIDS), hematološke malignitete, ili autoimunsku bolest kao što je sistemski lupus eritematozus (SLE), inflamatornu bolest creva, kao što je Kronova bolest (CD) ili ulcerozni kolitis, multiplu sklerozu (MS) ili artritis, npr., reumatoidni artritis (RA). Test može takođe da bude koristan za subjekte koji primaju imunosupresivne ili imunomodulatorne terapije, kao što su pacijenti nakon transplantacije. Primeri imunosupresivnih ili imunomodulatornih terapija uključuju natalizumab, rituksimab, efalizumab, i mikofenolat mofetil. Test može da bude koristan za detekciju antitela protiv JCV kod subjekta koji ima poremećaj, ili se leči lekom, opisanim kod Piccinni et al. „Stronger association of drug-induced progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) with biological immunomodulating agents“ Eur. J. Clin. Pharmacol.

66:199-206, 2010.

VP1

[0039] Otkriveno je da upotreba HPVLP čestica u testu za antitela protiv JCV može da poboljša tačnost testa i korisna je u testu pogodnom za analitičke i dijagnostičke svrhe. VP1 za upotrebu u proizvodnji HPVLP čestica može da bude proizveden korišćenjem postupaka poznatih u struci i može da bude ili prirodni VP1 ili rekombinantno proizvedeni VP1, npr., VP1 iz JCV virusa. Uopšteno, VP1 koji se koristi je VP1 iz MAD1 soja JCV. U nekim primerima izvođenja, VP1 koji se koristi u testu sadrži VP1 iz više od jednog soja JCV, na primer, iz jednog ili više sojeva 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4 i 7. Nakon pripreme VP1, npr., rekombinantno sintetizovanog VP1, VP1 za upotrebu u ovde opisanim testovima se zatim dodatno prečišćava standardnim biohemijskim postupcima uključujući postupke ultracentrifugiranja u gradijentu gustine, ili serije koraka hemijske precipitacije, koncentrovanja/dijafiltracije i jonoizmenjivačke hromatografije. Postupci prečišćavanja tipično uključuju korak za uklanjanje manjih proteina uključujući monomer polipeptida VP1, ili pentamer VP1. Uklanjanje ovih manjih čestica može da se izvede, na primer, u jednom koraku ili u dva koraka (npr., prvi korak filtracije za uklanjanje VP1 monomera, a zatim drugi korak filtracije za uklanjanje čestica pentamera VP1). Takvi biohemijski postupci prečišćavanja su poznati stručnjacima u oblasti. Primeri 1 i 7 obezbeđuju dva različita postupka prečišćavanja VP1-VLP JCV.

[0040] HPVLP može da se pripremi iz rekombinantnog VP1 ili prirodnog VP1 (npr., izolovanog iz virusa ili virusnog kapsida). U nekim primerima izvođenja, dodatne komponente JCV, kao što je jedan ili oba od manjih proteina kapsida iz JC virusa, npr., VP2 ili VP3, su uključene u česticu HPVLP ili su povezane sa supstratom.

[0041] U nekim slučajevima, rekombinantno eksprimirani VP1 može da se ne sklopi u pentamere ili HPVLP čestice koje liče na prirodne virusne kapside, na primer, rekombinantno eksprimirani VP1 može da se sklopi u cevčice ili druge geometrijske oblike koji nisu sferni. Prema tome, navodi koji nisu deo pronalaska se odnose na postupke za proizvodnju HPVLP koje su suštinski sfernog geometrijskog oblika, npr. preparate HPVLP gde najmanje oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% HPVLP čestica u preparatu nalikuju prirodnom JCV kapsidu (npr., imaju ikozaedralnu ili suštinski sfernu konfiguraciju). U nekim aspektima, preparat HPVLP sadrži najmanje 10%, 15%, 20%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili 99% HPVLP čestica u preparatu koje nalikuju prirodnom JCV kapsidu. Takvi postupci mogu da uključuju eksprimiranje virusnih proteina pod uslovima koji rezultuju u takvom preparatu i/ili izolovanje i prečišćavanje eksprimiranih virusnih proteina kao što je ovde opisano za proizvodnju takvog preparata.

Postupci za pravljenje HPVLP

[0042] HPVLP čestice mogu da se naprave, na primer, transformacijom bakulovirusa vektorom koji eksprimira VP1 gen, kao što je VP1 gen iz JC virusa. Bakulovirus se koristi za infekciju ćelijske kulture, kao što je insekatska ćelijska kultura (npr., SF9 ćelije) ili sisarska ćelijska kultura, i ćelije eksprimiraju VP1 protein. HPVLP čestice se izdvajaju liziranjem ćelija, i prečišćavanjem čestica kroz serije koraka centrifugiranja i ultrafiltracije. Uopšteno, prečišćavanje se izvodi korišćenjem postupaka kao što je sedimentacija u sloju saharoze, izopikničko ultracentrifugiranje i ekstenzivna ultrafiltracija ili drugi postupci poznati stručnjacima u ovoj oblasti. U određenim aspektima, prečišćavanje će uključivati dva centrifugiranja čestica kroz sloj saharoze. U alternativnom postupku prečišćavanja, ćelije se liziraju, i čestice se izdvajaju pomoću serija koraka precipitacije i koncentrovanja/dijafiltracije sa završnim korakom jonske izmene.

[0043] Čistoća može da se proceni korišćenjem bilo kojih pogodnih tehnika poznatih u struci, na primer, analitičkim ultracentrifugiranjem, elektronskom mikroskopijom, PAGE analizom, masenom spektrometrijom, pomoću koncentracije proteina, ili aktivnošću u ELISA testu sa kontrolnim serumima. Nedovoljno prečišćene VLP čestice rezultiraju u visokom pozadinskom šumu koji daje lažno visoke nivoe antitela protiv JCV ili izračunate stope izlaganja.

[0044] U nekim primerima izvođenja, HPVLP čestice sadrže VP1 kao jedini protein JC virusa.

[0045] U nekim primerima izvođenja, HPVLP čestice su heterogene čestice, i stoga uključuju VP1 protein, i najmanje jedan od manjih proteina kapsida JC virusa, npr., VP2 ili VP3. U drugom primeru izvođenja, HPVLP uključuje VP1, VP2 i VP3 proteine. HPVLP koja uključuje VP1 i VP2 može da se proizvede korišćenjem postupaka poznatih u struci, na primer, transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom koja uključuje gen za VP1 i VP2, na primer pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura se inficira bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1 i VP2, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. U jednom primeru izvođenja, geni za VP1 i VP2 su na različitim molekulima DNK, molekuli DNK se transformišu u različite bakuloviruse i bakulovirusi se koriste za transfekciju ćelija u istoj kulturi. Ćelije eksprimiraju VP1 i VP2 proteine, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. U nekim slučajevima, heterogena HPVLP će uključivati, npr., jedan ili dva VP2 polipeptida za svakih pet polipeptida VP1. Uopšteno, HPVLP će sadržati više polipeptida VP1 nego VP2 polipeptida, kao što je slučaj u prirodnom JC virusu.

[0046] HPVLP koja uključuje i VP1 i VP3 ili i VP1 i VP2 molekule može da se proizvede, na primer, transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom koja uključuje VP1 i VP3 gen ili VP1 i VP2 gen, redom, pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura se inficira bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1 i VP3 ili VP1 i VP2, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. U nekim primerima izvođenja, geni za VP1 i VP3 ili VP1 i VP2 su na različitim molekulima DNK, molekuli DNK se transformišu u različite bakuloviruse i bakulovirusi se koriste za transfekciju ćelija u istoj kulturi. Ćelije eksprimiraju VP1 i VP3 proteine ili VP1 i VP2 gene, redom, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. HPVLP čestice mogu da budu izdvojene iz takvih preparata korišćenjem postupaka poznatih u struci kao što su oni koji se koriste za izdvajanje kapsida JCV.

[0047] Tipično, VP1 pentamer koji se nalazi u heterogenoj HPVLP će uključivati, npr., pet polipeptida VP1 i jedan VP3 polipeptid i/ili jedan VP2 polipeptid, u zavisnosti od toga da li je VP3 gen ili VP2 gen korišćen za pravljenje konstrukata. Biće tipično više polipeptida VP1 nego VP3 ili VP2 polipeptida u HPVLP. U nekim slučajevima, VP2 ili VP3 je iz polioma virusa koji nije JC virus, npr., BK virusni polipeptid.

[0048] HPVLP koja uključuje sva tri molekula, VP1 i VP2 i VP3, može da se proizvede transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom (npr., cirkularnom DNK, npr., < 5.5 kb) koja uključuje VP1, VP2 i VP3 gen, na primer pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura, kao što je sisarska ćelijska kultura, inficira se bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1, VP2 i VP3 proteine. Nakon toga, obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju sva tri tipa proteina. U jednom primeru izvođenja, VP1, i bilo koji ili oba od VP2 i VP3 gena su na različitim molekulima DNK, molekuli DNK se transformišu u iste ili različite bakuloviruse, i bakulovirusi se koriste za infekciju ćelija u istoj ili odvojenim kulturama. Ćelije eksprimiraju VP1, VP2 i VP3 proteine, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. Heterogena HPVLP može da uključuje, npr., pet polipeptida VP1 i po jedan od svakog VP2 i VP3 polipeptida, mada odnosi mogu da variraju u preparatu. Tipično će biti više polipeptida VP1 nego VP2 i VP3 polipeptida u HPVLP.

[0049] U nekim primerima izvođenja, HPVLP će biti veća nego VP1 pentamer. Pod većom, podrazumeva se da je masa proteina sadržanog u čestici HPVLP veća od pentamera koji sadrži samo VP1.

[0050] U drugim aspektima, postupak pripremanja rastvora HPVLP može da uključuje uklanjanje iz rastvora čestica (npr., VP1 monomera ili malih čestica koje sadrže VP1) koje su veličine VP1 pentamera ili manje. Postupci kao što je centrifugiranje i ekskluziona hromatografija mogu da se koriste za izvođenje koraka prečišćavanja. U nekim aspektima, drugi postupci poznati u struci, npr., jonoizmenjivačka hromatografija, mogu da se koriste u pripremi HPVLP čestica koje su veće od VP1 pentamera. Uopšteno, HPVLP preparat pogodan za upotrebu u testu će sadržati najmanje 20% HPVLP, najmanje 25% HPVLP, najmanje 40% HPVLP, najmanje 60% HPVLP, najmanje 65% HPVLP, najmanje 70% HPVLP, najmanje 80% HPVLP, najmanje 85% HPVLP, najmanje 90% HPVLP, najmanje 95% HPVLP, ili najmanje 99% HPVPL u poređenju sa česticama koje nisu HLVLP (npr., po procentu pentamera u poređenju sa VP1 monomerima i agregatima koji sadrže manje od pet molekula VP1).

Granična vrednost

[0051] Pronalazak obezbeđuje postupke za ispitivanje koji koriste „granične vrednosti“ za smanjenje lažno negativnih i lažno pozitivnih stopa. Granične vrednosti se uspostavljaju na osnovu podataka iz HPVLP testova (npr., za detekciju antitela protiv JCV u biološkom uzorku), određuje se srednja vrednost, na primer, ispitivanih uzoraka u duplikatu i višestrukih ponavljanja (na primer, najmanje dva, najmanje četiri, ili najmanje osam ponavljanja kontrolnih uzoraka).

[0052] U jednoj verziji testa prema ovim navodima koji nisu deo pronalaska, rezultati inicijalnih HPVLP skrining testova, npr., ELISA testova, će dovesti do toga da ispitivani uzorak bude klasifikovan kao da ima ili nema antitela specifična za JCV. Ako uzorak ne potpada pod jednu od ove dve klasifikacije, tada će uzorak biti podvrgnut potvrdnom ispitivanju, tj. postupku za koji se traži zaštita. Na primer, uzorci koji daju rezultat u HPVLP ELISA testu koji je manji od uspostavljenog nivoa (npr., nOD450< 0.1) biće klasifikovani kao oni kojima nedostaju antitela specifična za JCV, a uzorci koji daju rezultat u ELISA testu veći od uspostavljenog nivoa (npr., nOD450> 0.25) biće klasifikovani kao pozitivni na antitela specifična za JCV. Uzorci koji ne pripadaju jasno jednoj od ovih klasifikacija (npr., 0.1 < OD450 < 0.25) biće ispitani u potvrdnom testu, tj. postupku za koji se traži zaštita. U postupku za koji se traži zaštita, potvrdni test zahteva preinkubacioni korak, u kome se ispitivani uzorak preinkubira sa puferom (ili drugim pogodnim rastvorom) kao kontrolom ili sa HPVLP česticama (u puferu ili drugom pogodnom rastvoru) za preadsorpciju antitela specifičnih za JCV pre ispitivanja u HPVLP ELISA testu, kao što je detaljnije opisano u nastavku teksta. U jednom primeru izvođenja, ako nakon preinkubacije sa HPVLP reakcija u primarnom testu opadne za manje od 40% u poređenju sa puferskom kontrolom, tada se uzorak tumači kao negativan na prisustvo antitela specifičnih za JCV. Ako rezultati pokazuju smanjenje ≥40% u reakciji u poređenju sa puferskom kontrolom u primarnom testu posle preinkubacije sa HPVLP, tada se tumači da uzorak sadrži antitela specifična za JCV.

[0053] Primer postupka za izbor i potvrđivanje pogodnih graničnih vrednosti obezbeđen je u primeru 4.

Podloga

[0054] Bilo koja pogodna čvrsta podloga može da se koristi za format HPVLP testa. U nekim primerima izvođenja, podloga je mikrotitar ploča (npr., ploča sa 96 bunarčića), predmetno staklo, perla, ili kolona. Podloga može da bude pogodna za hromogene ili hemiluminiscentne postupke detekcije.

Test

[0055] Testovi se izvode dodavanjem biološkog uzorka podlozi koja je obložena sa HPVLP i detektuju korišćenjem postupaka poznatih u struci. Uopšteno, koristi se platforma na čvrstoj osnovi, kao što je mikrotitar ploča (na primer, ploča sa 96 bunarčića); mada drugi formati poznati u struci mogu da se koriste. U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak se razblažuje pre upotrebe u testu.

[0056] U određenim primerima izvođenja, format testa je enzimski vezan imunoesej (ELISA). Uopšteno, postupak tipično uključuje oblaganje podloge antigenom za hvatanje ciljnog molekula kao što je HPVLP, inkubiranje uzorka koji sadrži vezujuća antitela usmerena na reagens za hvatanje ciljnog molekula, pranje za uklanjanje nespecifično vezanih vrsta, i detektovanje vezanih imunskih kompleksa, npr., pomoću hromogenog ili hemiluminiscentnog testa. Hromogeni supstrati proizvode obojene krajnje proizvode, koji mogu da se detektuju i mere vizuelno ili upotrebom spektrofotometra. Hemiluminiscentni supstrati proizvode svetlost, koja može da se meri korišćenjem luminometra.

[0057] Oblaganje ploče sa HPVLP uopšteno uključuje inkubiranje čvrste podloge (kao što su bunarčići mikrotitar ploče) sa rastvorom HPVLP u pogodnoj koncentraciji (npr., 1 µg/ml), ili preko noći ili tokom određenog broja sati. HPVLP može da uključuje VP1 kao jedinu komponentu JCV virusa, ili HPVLP može da bude heterologa čestica, koja sadrži najmanje jedan od VP2 ili VP3 po čestici ili najmanje po jedan od svakog VP2 i VP3 po čestici. Nakon oblaganja sa HPVLP, bunarčići ploče se ispiraju. Podloga se zatim „oblaže“ nespecifičnim proteinom koji je antigeno neutralan u odnosu na uzorke koji se ispituju. Pogodni materijali za oblaganje su poznati u struci i uključuju goveđi serum albumin (BSA), kazein ili rastvore mleka u prahu.

[0058] Uzorak ili referentni uzorak se inkubira na pripremljenoj podlozi pod uslovima koji su efikasni da omoguće obrazovanje kompleksa (HPVLP/antitelo protiv JCV), obrazujući tako kompleks koji je vezan. Detekcija vezanog kompleksa izvodi se korišćenjem obeleženog antitela koje može da se veže za humano antitelo. Uopšteno, obeleženo antitelo može da detektuje humani IgG ili humani IgG i IgM. U nekim slučajevima, test može da se izvede korišćenjem sekundarnih ili tercijarnih postupaka detekcije.

[0059] Referentni uzorak može da bude isti biološki materijal (npr., plazma, serum, urin, ili CSF) izolovan iz osobe za koju je poznato da je inficirana JC virusom na osnovu prisustva DNK JCV u urinu osobe (uro-pozitivna). Referentni uzorak se koristi za uspostavljanje granične vrednosti testa tako da lažno negativna stopa testa nije veća od 1%-3%.

[0060] „Pod uslovima koji su efikasni da omoguće obrazovanje kompleksa“ uopšteno se podrazumevaju uslovi u kojima su reagensi razblaženi da bi se smanjio pozadinski šum i obezbedila očitavanja rezultata koji se nalaze u određenom opsegu. Razblaživači mogu da uključuju, u neograničavajućim primerima, rastvore koji uključuju BSA, fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS), ili PBS koji sadrži Tween.

[0061] „Pogodni“ uslovi takođe uključuju uslove koji predstavljaju temperaturu i/ili vremenski period dovoljan da omogući efikasno vezivanje. Inkubacije su tipično od oko jednog do dva sata ili jednog do četiri sata, na temperaturama od približno 25°C do 27°C, ili mogu da budu preko noći na oko 4°C. Međutim, stručnjaci u oblasti će razumeti da drugi uslovi mogu da budu pogodni.

[0062] Uopšteno, jedno ili više ispiranja se sprovode između inkubacija u testu. Odgovarajući rastvori za ispiranje uključuju pufer za razblaživanje (npr., PBS ili PBS/Tween) ili boratni pufer.

[0063] Uopšteno, detekcija antitela vezanog za HPVLP se izvodi korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci. Uopšteno, takvi postupci se zasnivaju na detekciji obeleživača ili markera, kao što je radioaktivni, fluorescentni, biološki ili enzimski obeleživač. SAD patenti koji se bave upotrebom takvih obeleživača uključuju, na primer, SAD pat. br.3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. Uopšteno, detekcija vezivanja antitela protiv JCV se obavlja korišćenjem sekundarnog antitela koje je obeleženo. Uopšteno, sekundarno antitelo je specifično za detektovanje humanog IgG. Kvantitativno određivanje se postiže merenjem stepena razvijanja boje, npr., korišćenjem spektrofotometra u vidljivom spektru.

[0064] Primer 2 ilustruje postupak izvođenja testa i stručnjaci u oblasti će razumeti da pogodne modifikacije mogu da se izvedu.

[0065] U jednom primeru izvođenja, test se izvodi u lekarskoj ordinaciji, na primer od strane zdravstvenog radnika, npr., doktora, medicinske sestre ili tehničara, koji su zaposleni u objektu gde je biološki uzorak uzet od pacijenta. U drugom primeru izvođenja, biološki uzorak uzet od pacijenta se transportuje u drugi objekat, npr., u objekat treće strane, u kome se izvodi test. U poslednjem slučaju, rezultati testa mogu da budu prijavljeni zdravstvenom radniku, na primer putem formulara, koji se može dostaviti poštom ili elektronskim putem (npr., putem faksa ili elektronske pošte) ili putem baze podataka postavljene na internetu. U jednom primeru izvođenja, rezultati testa (uključujući skrining test i, izborno, potvrdni test) mogu da se čuvaju u bazi podataka i zdravstveni radnik može da im pristupi na primer preko interneta.

Sekundarni test

[0066] U predmetnom pronalasku, primenjuje se sekundarni test (ovde označen i kao „potvrdni test“) uzorka. Za sekundarni test, koriste se dva alikvota biološkog uzorka. Prvi se priprema pre upotrebe u testu preinkubiranjem uzorka u prisustvu pufera za test u rastvoru tokom određenog perioda vremena (npr., 30 minuta, jedan čas, ili duže kao što je preko noći na 4°C). Drugi alikvot se priprema pre upotrebe u testu preinkubiranjem uzorka u prisustvu HPVLP u rastvoru tokom određenog perioda vremena (npr., 30 minuta, jedan čas, ili duže). Dva alikvota se zatim koriste u HPVLP testu kao što je ovde opisano, i obavlja se opredeljivanje uzorka kao pozitivnog ili negativnog na antitelo protiv JCV. Ako su rezultati testa za alikvot inkubiran sa HPVLP u rastvoru isti kao za prvi uzorak inkubiran sa puferom u primarnom testu (tj., približno ista OD), tada se uzorak tumači kao negativan na prisustvo antitela specifičnih za JCV. Ako su rezultati testa niži nakon preinkubacije (tj., u sekundarnom testu), tada se tumači da uzorak sadrži antitela specifična za JCV.

[0067] Test prikazan u pronalasku koji koristi sekundarni test ovde je takođe označen ka „dvostepeni test“ ili „dvostepeni ogled“.

Izveštavanje o rezultatima testa

[0068] U nekim primerima izvođenja, test uključuje očitavanje koje može da predstavlja nivo (npr., OD) izražen u odnosu na referentni uzorak ili očitavanje koje predstavlja procenu da li je uzorak pozitivan, negativan, ili neopredeljen na prisustvo antitela protiv JCV. U nekim slučajevima, koji nisu deo pronalaska, obezbeđen je komplet koji uključuje najmanje HPVLP i izborno, druge komponente za test. Na primer, komplet može da uključuje pozitivne i negativne kontrole testa, pufere i supstrate (npr., mikrotitar ploče) za pripremu alata za izvođenje primarnog ELISA testa, i sekundarnog potvrdnog testa. Komplet može da uključuje, npr., rastvarače ili pufere, kontrole, stabilizator, konzervans, sekundarno antitelo, npr., anti-HRP antitelo (IgG) i reagens za detekciju.

[0069] HPVLP može da bude obezbeđen u bilo kom obliku, npr., tečnom, suvom, polu-suvom, ili liofilizovanom obliku, ili u obliku za skladištenje u zamrznutom stanju. U nekim slučajevima, pripremljene HPVLP čestice se stalože i čuvaju u polu-čvrstom obliku.

[0070] Tipično, HPVLP čestice se obezbeđuju u obliku koji je sterilan. Kada je HPVLP obezbeđena u tečnom rastvoru, tečni rastvor uopšteno je vodeni rastvor, npr., sterilni vodeni rastvor. Kada je HPVLP obezbeđena u suvom obliku, rekonstitucija se uopšteno postiže dodatkom pogodnog rastvarača. Rastvarač, npr., sterilni pufer, može izborno da bude obezbeđen u kompletu.

[0071] Komplet može da uključuje jedan ili više kontejnera za kompoziciju koja sadrži HPVLP čestice u koncentraciji pogodnoj za upotrebu u testu ili sa uputstvima za razblaživanje za upotrebu u testu. U nekim slučajevima, komplet sadrži odvojene kontejnere, razdvajače ili odeljke za HPVLP i komponente testa, i informativni materijal. Na primer, HPVLP čestice mogu da se nalaze u boci ili fioli, i informativni materijal može da se nalazi u plastičnom omotu ili pakovanju. U drugim slučajevima, odvojeni elementi kompleta su sadržani u jednom, nepodeljenom kontejneru. Na primer, kompozicija HPVLP se nalazi u boci ili fioli koja ima pričvršćen informativni materijal u obliku etikete. U nekim aspektima, komplet uključuje mnoštvo (npr., pakovanje) pojedinačnih kontejnera, od kojih svaki sadrži jedan ili više jediničnih doznih oblika (npr., za upotrebu u jednom testu) HPVLP. Na primer, komplet uključuje mnoštvo ampula, pakovanja u foliji, ili blister pakovanja, od kojih svaki sadrži pojedinačnu jedinicu HPVLP za upotrebu u skrining ili potvrdnom testu. Kontejneri u kompletima mogu biti čvrsto zatvoreni i/ili vodootporni. Kontejner može da bude obeležen za upotrebu.

[0072] U jednom slučaju, komplet može da uključuje informativni materijal za izvođenje i tumačenje testa. U drugom slučaju, komplet može da obezbeđuje smernice gde prijaviti rezultate testa, npr., centru lečenje ili zdravstvenom radniku. Komplet može da uključuje formulare za prijavljivanje rezultata HPVLP testa koji je ovde opisan, i informacija o adresi i kontaktu u pogledu toga gde da se pošalju takvi formulari ili druge povezane informacije; ili URL (jedinstveni lokator resursa) adresu za prijavljivanje rezultata u bazi podataka na internetu ili aplikaciji na internetu (npr., aplikacija). U drugom slučaju, informativni materijal može da uključuje smernice da li pacijent treba da primi tretman imunomodulatornim lekom, u zavisnosti od rezultata testa.

[0073] Informativni materijal u kompletima nije ograničen po svom obliku. U mnogim slučajevima, informativni materijal, npr., uputstva, obezbeđen je u štampanom obliku, npr., štampani tekst, crtež, i/ili fotografija, npr., etiketa ili štampani list. Međutim, informativni materijal može takođe da bude obezbeđen u drugim formatima, kao što je računarski čitljiv materijal, video zapis, ili audio zapis. U drugom slučaju, informativni materijal u kompletu je kontakt informacija, npr., fizička adresa, adresa elektronske pošte, veb stranica, ili telefonski broj, gde korisnik kompleta može da dobije suštinske informacije o HPVP testu i/ili njegovoj upotrebi u ovde opisanim postupcima. Naravno, informativni materijal može takođe da bude obezbeđen u bilo kojoj kombinaciji formata.

[0074] U nekim slučajevima, biološki uzorak se obezbeđuje davaocu usluge ispitivanja, npr., pružaocu usluge (kao što je objekat treće strane) ili zdravstvenom radniku, koji procenjuje uzorak u testu i obezbeđuje očitavanje. Na primer, u jednom slučaju, davalac usluge ispitivanja prima biološki uzorak od subjekta, kao što je uzorak plazme, krvi ili seruma, i procenjuje uzorak korišćenjem testa koji je ovde opisan, i određuje da uzorak sadrži antitela protiv JCV. Davalac usluge ispitivanja, npr., pružalac usluge ili zdravstveni radnik, može zatim da zaključi da je subjekt pod povišenim rizikom od PML. Davalac usluge ispitivanja može dodatno da odredi da subjekt nije kandidat za primanje tretmana imunomodulatorom, kao što je anti-VLA terapija, kao što je natalizumab, ili da subjekt jeste kandidat za primanje terapije imunomodulatorom, ali će kandidat biti podvrgnut pojačanom praćenju u poređenju sa subjektom za koga je utvrđeno da nema antitela protiv JCV. Na primer, kandidat će češće biti ispitivan za pojavu neželjenih simptoma, kao što su simptomi koji mogu da ukažu na razvoj PML.

[0075] U jednom primeru izvođenja, davalac usluge ispitivanja izvodi test koji je ovde opisan i određuje da subjekt nema detektabilna antitela protiv JCV. Davalac usluge ispitivanja dalje određuje da je subjekt kandidat za primanje tretmana imunomodulatorom, kao što je natalizumab. U jednom primeru izvođenja, davalac usluge ispitivanja obaveštava zdravstvenog radnika da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom, i kod kandidata se primenjuje imunomodulator.

[0076] Davalac usluge ispitivanja može da obezbedi rezultate procene, i izborno, zaključke u pogledu jedne ili više dijagnoza, prognoza, ili pogodnih opcija za terapiju, na primer, zdravstvenom radniku, ili pacijentu, ili osiguravajućoj kompaniji, u bilo kom pogodnom formatu, kao poštom ili elektronski, ili putem baze podataka na internetu. Informacija koju je davalac usluge ispitivanja sakupio i obezbedio može da se skladišti u bazi podataka.

[0077] Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima, koje ne treba shvatiti kao dodatno ograničavajuće.

PRIMERI

Primer 1: Sinteza i prečišćavanje visoko prečišćenih VP1 čestica

[0078] HPVLP čestice koje se sastoje od VP1 proteina kapsida JCV ili BKV proizvedene su u insekatskim ćelijama SF9 transficiranim rekombinantnim bakulovirusom. U slučaju čestica koje sadrže JCV VP1, rekombinantni bakulovirus je transformisan nukleinskom kiselinom koja eksprimira VP1 iz Mad-1 soja JCV. Rekombinantni VLP je sakupljen pre lize ćelija i prečišćen diferencijalnim ultracentrifugiranjem, pranjem deterdžentom i ultrafiltracijom.

[0079] Ukratko, ćelije inficirane bakulovirusom su sakupljene oko tri dana nakon infekcije centrifugiranjem na 3000 x G i čuvane zamrznute do prečišćavanja HPVLP čestica. Prečišćavanje je izvedeno korišćenjem oko 100 grama zamrznutih ćelijskih taloga. Odmrznute ćelije su lizirane u 500 ml PBS sa dodatkom 0.1 mM CaCl2(PBS-C). Ćelije su razbijene propuštanjem ćelijske suspenzije dva puta kroz Microfluidics Microfluidizer®. Ćelijski ostaci se uklanjaju taloženjem na 8000 x G tokom 15 minuta. Zapremina supernatanta je podešena do 720 ml sa PBS-C i naneta na 5 ml slojeva 40% saharoze. HPVLP čestice su dva puta staložene kroz slojeve saharoze u SW28 rotoru na 100000 × G tokom 5 časova. Talozi HPVLP su resuspendovani u PBS-CaCl2i zatim obrađeni sa 0.25% deoksiholatom 1 čas na 37°C nakon čega je dodato 4 M NaCl obogaćenog sa 0.1 mM CaCl2tokom 1 časa na 4°C. Staloženi materijal je uklonjen centrifugiranjem na 8000 x G tokom 15 minuta. Dobijeni supernatant je koncentrovan i pufer izmenjen ultrafiltracijom kroz membranu Pelicon-2 od 500000 MWCO (Millipore). Koncentrovane VLP čestice su nanesene u sredinu stepenastog gradijenta od 25-40% Optiprep™ (Sigma, St. Louis, MO) i raspoređene u trake na 190 000 g tokom 17 časova u rotoru tipa 50.2. Trake VLP su sakupljene i zatim podvrgnute koncentrovanju i zameni pufera u Amicon ćeliji sa mešanjem (Millipore) sa membranom od 300000 MWCO (granična vrednost molekulske težine). Koncentrovani materijal je filtriran kroz 0.22 µ PES (polietarsulfon) filter i skladišten na 4°C. VLP čestice pripremljene na ovaj način se ovde nazivaju HPVLP čestice. Kvalitet VLP se uopšteno određuje gel elektroforezom i elektronskom mikroskopijom.

[0080] Za denaturaciju VLP čestica za određivanje proteina, dodati su EDTA, DTT i SDS do finalnih koncentracija od 2mM, 2mM i 2% redom. Koncentracija potpuno denaturisanog proteina određena je korišćenjem testa Pierce BCA (bicinhoninska kiselina).

[0081] Za ispitivanje gel elektroforezom, zapremina dovoljna da bi se dobilo 2 µg do 5 µg ukupnog proteina je nanesena na gotove poliakrilamidne gelove od 4% do 20% (NOVEX, San Diego, CA) korišćenjem NuPAGE® puferskog sistema morfolinetansulfonska kiselina-SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Gelovi su podvrgnuti elektroforezi na konstantnoj struji od 70 mA/gel do 80 mA/gel tokom 30 minuta. Proteinske trake su fiksirane 50% metanolom i 10% sirćetnom kiselinom u destilovanoj vodi i vizuelizovane komercijalnim koloidnim komazi plavo reagensom (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača.

[0082] VLP čestice su procenjene korišćenjem elektronske mikroskopije. VLP uzorci su smešteni na ugljenične mreže, blago oprani u vodi i negativno obojeni uranil acetatom i ostavljeni da se osuše. Mreže su pogledane i snimljene pomoću Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN TEM.

[0083] Alternativni postupak za prečišćavanje JCV VP1-VLP prikazan je u nastavku teksta, u primeru 7.

Primer 2: Primer testa za antitela na bazi HPVLP koji nije deo pronalaska

[0084] Osetljivi test za anti-JCV antitela razvijen je korišćenjem ovde opisanih HPVLP čestica i može da se koristi zajedno sa potvrdnim testom koji predstavlja postupak za koji se traži zaštita. On je ovde označen kao HPVLP test. U primeru testa, mikrotitar ploče sa 96 bunarčića su pripremljene dodavanjem rastvora koji sadrži HPVLP u koncentraciji od 1 µg/ml i inkubiranjem ploče preko noći na 4°C. Bunarčići su isprani puferom za razblaživanje i zatim blokirani jedan čas na sobnoj temperaturi kazein puferom za blokiranje i isprani puferom za razblaživanje. Kontrole testa i uzorci seruma ili plazme su razblaženi 1:200 u razblaživaču za test. Razblaženi uzorci i kontrole su dodati u bunarčiće i inkubirani jedan čas na sobnoj temperaturi i isprani puferom za razblaživanje. Detekcija je izvedena korišćenjem magarećeg anti-humanog-HRP antitela (IgG), koje je dodato u bunarčiće i inkubirano na sobnoj temperaturi jedan čas. Ploče su zatim isprane i TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin) pufer (Chromagen, Inc., San Diego, CA) je dodat. Nakon razvijanja tokom vremena pogodnog da se dozvoli da se boja razvije (oko 20 minuta), reakcija je zaustavljena dodatkom 1 N H2SO4, i apsorbanca na 450 nm je očitana. Nivoi anti-JCV antitela u uzorcima su izraženi kao OD jedinice.

[0085] Test je interpretiran kao što je dole opisano korišćenjem OD jedinica za određivanje nivoa.

[0086] Ako su nepoznati uzorci proizveli kompetitivnu inhibiciju vezivanja za HPVLP u rastvoru veću od 40%, uzorak je smatran JCV+ (JCV pozitivan), sa inhibicijom <40% ocenjen je kao JCV-(JCV negativan).

[0087] Inicijalno, uzorci sa vrednostima OD većim od granične vrednosti OD (srednja vrednost OD negativne kontrole x 1.23) definisani su kao pozitivni na prisustvo antitela protiv JCV, dok su uzorci sa vrednostima OD jednakim ili manjim od granične vrednosti OD definisani kao negativni.

[0088] Kontrole korišćene u testu su odabrane na osnovu ciljne OD i specifičnosti (određeno u sekundarnom potvrdnom testu za specifičnost (dole opisanom) i uključuju pozitivnu kontrolu 1, koja je predstavljala sakupljene serume davalaca sa visokom reaktivnošću u testu definisanom tako da ima ciljnu vrednost OD od oko 1.0 i za specifičnost, u kompeticiji sa JCV >80%; pozitivnu kontrolu 2, koja je sadržala sakupljene serume davalaca sa nižom reaktivnošću u testu definisanom tako da ima ciljnu vrednost OD od oko 0.25 u testu; i za specifičnost, u kompeticiji sa JCV >80%; i negativnu kontrolu, koja je predstavljala sakupljene serume davalaca sa reaktivnošću sličnom onoj kod kontrole pufera u testu koja ima ciljnu vrednost OD od približno 0.07 (zapaziti da pufer za test ima vrednost O.D. od približno 0.045).

[0089] U nekim slučajevima, izveden je test titracije u kome su pozitivni uzorci bili ispitivani u višestrukim razblaženjima, i najveće razblaženje koje daje vrednost OD veću od granične vrednosti OD definisano je kao titar JCV IgG.

[0090] Testovi su validirani u pogledu specifičnosti, preciznosti, interferencije sa matricom, robusnosti i stabilnosti reagensa.

Primer 3: Sekundarni potvrdni test

[0091] U postupku prema pronalasku, sekundarni potvrdni test (sekundarni test) izveden je dodatno uz gore opisani test. U potvrdnom testu, uzorci (plazma ili serum) su inkubirani sa HPVLP (finalna koncentracija VLP = 1 µg/mL; finalno razblaženje uzorka = 1:200) jedan čas na sobnoj temperaturi pre upotrebe u testu. Kontrolni uzorci su inkubirani u puferu za test, a ne u prisustvu HPVLP. Test je zatim izveden kao što je gore opisano. Procenat inhibicije nOD450izračunat je kao: % inhibicije = 100 x [1- (prosečna nOD450) (uzorci preinkubirani sa JCV MAD-1 VLP) ÷ (prosečna nOD450) (uzorci inkubirani sa puferom)].

[0092] Ako su rezultati testa bili isti nakon preinkubacije sa puferom kao u primarnom testu (tj., približno ista O.D.), tada je uzorak protumačen kao negativan na prisustvo antitela specifičnih za JCV. Ako su rezultati testa bili niži nakon preinkubacije sa HPVLP česticama (tj., u sekundarnom testu), tada je protumačeno da uzorak sadrži antitela specifična za JCV.

Primer 4: Algoritam za graničnu vrednost skrining/potvrdnog testa

[0093] Serološki test (test za antitela protiv JCV) je konfigurisan kao dvostepeni test: skrining ELISA i dodatni potvrdni ELISA (sekundarni test).

[0094] Za poređenje rezultata između test ploča, ciklusa testa, i analitičara, rezultati uzoraka su normalizovani na vrednost optičke gustine (OD450) pozitivne kontrole na ploči i prijavljeni kao normalizovana OD450kao što je dole opisano.

[0095] Za implementiranje upotrebe HPVP testa, granične vrednosti su izvedene korišćenjem Vejbulovog trokomponentnog modela sa mešovitom raspodelom. U ovim određivanjima, korišćene su sledeće definicije:

[0096] Na primer:

Prosečna vrednost (uzorak_OD_duplikati) = 0.60

Prosečna vrednost (pozitivna kontrola 1 OD_replikati) = 1.20

Normalizovana OD=0.60/1.20=0.50.

[0097] Za potvrdni test

[0098] U dodatnom potvrdnom ELISA testu, korišćena je rastvorljiva HPVLP za preadsorpciju visoko afinitetnih antitela protiv JCV u uzorcima pre procene uzoraka u skrining ELISA testu. Rezultati su izračunati kao procenat inhibicije za određivanje smanjenja reaktivnosti u skrining ELISA testu nakon što su uzorci preadsorbovani sa HPVLP [% inhibicije = 100 x [1- (prosečna nOD450uzoraka preinkubiranih sa HPVLP) ÷ (prosečna nOD450uzoraka inkubiranih sa puferom)].

[0099] Lažno pozitivne i lažno negativne stope su definisane kao što sledi. Lažno negativna stopa je proporcija istinski pozitivnih uzoraka na JC virus za koje je pomoću testa određeno da su negativni na antitelo. Seropozitivna stopa je proporcija uzoraka za koje je određeno da su seropozitivni (tj., imaju antitela protiv JCV što je određeno korišćenjem algoritma za graničnu vrednost skrining/potvrdnog anti-JCV testa).

[0100] Podaci su analizirani korišćenjem SAS v9. Podaci koji ne pokazuju normalnu raspodelu su analizirani pomoću Man-Vitnijevog U testa. Kategorijski podaci su analizirani korišćenjem Pirsonovog χ2 testa ili Fišerovog egzaktnog testa u zavisnosti od veličine uzorka. Pirsonov koeficijent korelacije je korišćen za procenu odnosa između nOD450i nivoa DNK JCV u urinu. Svi testovi su bili dvostrani pri alfa nivou od 0.05. Intervali poverenja za seroprevalenciju i lažnonegativne stope su dobijeni pomoću „bootstrap“ percentilnog postupka (6) korišćenjem 10 000 „bootstrap“ ponavljanja.

Primer 4(a): Serološka reaktivnost na JCV

[0101] Ispitivanje je sprovedeno da bi se uspostavio test za detekciju anti-JCV antitela kod MS pacijenata i da bi se izvela preliminarna procena potencijalne kliničke korisnosti testa za stratifikaciju rizika od PML. Za karakterizaciju odgovora antitela na infekciju agensima kod ljudi, bilo je kritično imati referentne serume od inficiranih i neinficiranih osoba. Dok asimptomatska priroda infekcije sa JCV čini nemogućom identifikaciju „istinski“ negativnih osoba, podnosioci su mogli da identifikuju populaciju „istinski“ pozitivnih osoba merenjem DNK JCV u urinu „uropozitivnih“ osoba.

[0102] Nivoi DNK JCV u urinu (prikupljeni u STRATA (ponovno uspostavljanje doziranja natalizumaba) protokolu kliničkog ispitivanja) određeni su testom kvantitativne lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (q-PCR) (ViraCor Laboratories, Lee's Summit, MO) sa granicom kvantitativnog određivanja od 500 kopija/mL i granicom detekcije od 50 kopija/mL.

[0103] Status anti-JCV antitela 831 uzorka seruma pacijenata sa MS, koji uključuju uzorke uzete od 204 JCV uro-pozitivnih pacijenata, su inicijalno procenjeni za anti-JCV antitela u skrining ELISA testu za određivanje raspodele seroloških odgovora. Rezultati testa prema DNK statusu urina pokazali su prisustvo dve preklapajuće, a ipak odvojene populacije reaktivnosti IgG protiv JCV (SL. 1). Srednji nivo reaktivnosti za pacijente sa MS čiji je urin pozitivan na DNK JCV (nOD450= 0.895) bio je značajno viši nego za pacijente sa MS čiji je urin negativan na DNK JCV (nOD450= 0.131; p<0.001), i niko od uro-pozitivnih pacijenata nije pokazao reaktivnost u testu ispod nOD450od 0.10. Stoga, niža granična vrednost za test uspostavljena je na nOD4500.10, dok je empirijska lažno-negativna stopa u negativnoj zoni bila 0%.

[0104] Mnogi pacijenti bez detektabilne DNK JCV u urinu (uro-negativni) imali su serološku reaktivnost sličnu onoj kod uro-pozitivnih pacijenata. Ovi rezultati su konzistentni sa pretpostavkom da test na DNK JCV u urinu verovatno neće uspeti da detektuje sve osobe inficirane sa JCV.

Primer 4(b): Opterećenje urina sa DNK JCV i serološka aktivnost

[0105] Da bi se rešila potencijalna zabrinutost da pacijenti inficirani sa JCV sa niskim nivoima virusne replikacije mogu da imaju niske serumske nivoe antitela koji se ne detektuju u serološkom testu (potencijalno lažno negativni) ispitivana je korelacija nivoa virusa i reaktivnosti antitela. SL.

2 prikazuje podatke za 204 DNK JCV uro-pozitivnih STRATA pacijenata, i ilustruje da nema detektabilne veze između nivoa DNK JCV u urinu i nivoa anti-JCV antitela u uzorcima sa nOD450ispod 0.60 (Pirsonov koeficijent korelacije = 0.048, p=0.751). Ovaj rezultat važi čak i ako su urin i serum sakupljeni u istoj vremenskoj tački STRATA ispitivanja (Pirsonov koeficijent korelacije = 0.002, p=0.993). Pri nOD450> 0.60, primećena je jača korelacija sa većom proporcijom uzoraka seruma osoba sa velikim brojem DNK JCV kopija/mL koji ispoljavaju više vrednosti nOD450, konzistentno sa izveštajima u literaturi (npr., Egli et al., J. Infect. Dis. 199:837-846, 2009). Ovi podaci sugerišu da seronegativni rezultati verovatno nastaju zbog odsustva infekcije sa JCV, pre nego zbog veoma niskih nivoa virusa.

Primer 4(c): Procena unakrsne reaktivnosti BKV-JCV

[0106] Postavljanje jedinstvene konzervativne granične vrednosti koja kontroliše lažno negativnu stopu na 0% verovatno neće isključiti detekciju antitela koja unakrsno reaguju sa drugim uobičajenim polioma virusima (lažno pozitivno), kao što su anti-BKV antitela, koja dele visok stepen identičnosti sa JCV u VP1 proteinu kapsida. Dodatno, takva unakrsna reaktivnost antitela može da se dogodi putem izlaganja očuvanih virusnih epitopa kada se HPVLP direktno obloži na ELISA ploču. Budući da kod ljudi može da dođe do dualnih infekcija sa BKV i JCV i da nije moguće pouzdano identifikovati pacijente koji su inficirani sa BKV a ne sa JCV, problem unakrsne reaktivnosti je ispitan na zečevima, vrsti kod koje prirodna infekcija ni sa jednim od BKV ili JCV ne može da se dogodi.

[0107] Zečevi su imunizovani sa BKV subkutanom injekcijom proteina u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru bez adjuvansa, praćeno sa tri buster injekcije tokom perioda od tri meseca. Serumski uzorci su ispitani za direktno vezivanje za JCV ili BKV pomoću ELISA testa. Antiserumi zečeva imunizovanih sa BKV vezivali su BKV VLP čestice sa visokim afinitetom (EC50 = 1:100000) i unakrsno reagovali sa HPVLP česticama sa nižim afinitetom (EC50 = 1:5 000). Preimunski serumi nisu pokazali reaktivnost. Reprezentativni podaci za jednog zeca prikazani su na SL.3.

[0108] Budući da BKV antitela unakrsno reaguju sa JCV, ovo proizvodi lažno pozitivni signal u anti-JCV testu (SL. 3), nizak nivo reaktivnosti JCV kod ljudi može da predstavlja nizak afinitet anti-BKV antitela koja unakrsno reaguju sa JCV da bi proizvela lažno pozitivne signale.

Primer 4(d): Merenje odgovora antitela specifičnog za JCV (dodatni potvrdni ELISA test)

[0109] Da bi se razlikovali pacijenti sa antitelima specifičnim za JCV od onih sa unakrsno reaktivnim antitelima, potencijalno niskog afiniteta, razvijen je kompetetivni ELISA test korišćenjem rastvorljive HPVLP (sekundarni test). Očekuje se da antitela višeg afiniteta specifična za JCV budu u efikasnijoj kompeticiji sa rastvorljivim antigenom, dok antitela sa nižim afinitetom mogu da se odvoje iz kompleksa obrazovanih sa JCV antigenom u rastvoru i vežu za JCV VLP kojim je obložena ELISA ploča. Podset od 515 serumskih uzoraka od uro-pozitivnih (n=204) i uro-negativnih (n=311) pacijenata je sistematski i neproporcionalno uzorkovan za procenu u ELISA testu nakon preadsorpcije ili sa rastvorljivim JCV VLP ili puferom za test. Na SL.4A i 4B, uporedno je prikazana reaktivnost serumskih uzoraka od uro-negativnih ili uro-pozitivnih pacijenata u skrining i potvrdnim testovima. Uzorci sa jakom reaktivnošću prema JCV bili su visoko inhibirani preadsorpcijom antitela sa rastvorljivim JCV, dok su uzorci sa niskim nivoima antitela protiv JCV pokazali diferencijalnu kompeticiju. Odgovori antitela kod većine uropozitivnih pacijenata bili su u jakoj kompeticiji (SL. 4B). Ovi rezultati podržavaju ideju da značajna proporcija niske serumske reaktivnosti na JCV može da bude posledica unakrsne reaktivnosti antitela koja nisu specifična za JCV.

[0110] Raspodela serumskih odgovora u potvrdnom ELISA testu sastojala se od dva definisana pika, najoptimalnije razdvojena na 40% inhibicije (SL.5A) što približno odgovara donjem petom percentilu raspodele odgovora uro-pozitivnih uzoraka (SL. 5B). Stoga, nivo inhibicije od 40% odabran je kao granična vrednost za potvrdni ELISA test.

Primer 4(e): Finalizovani dvostepeni anti-JCV serološki test

[0111] Kombinovanjem skrining i potvrdnih testova, verovatnoća detektovanja uzoraka sa „istinskim“ antitelima specifičnim za JCV je značajno povećana. U finalnoj analizi, uzorci sa vrednostima nOD450<0.10 u skrining ELISA testu smatraju se negativnim na antitela protiv JCV, a oni sa vrednostima nOD450>0.25 u skrining ELISA testu smatraju se pozitivnim na antitela protiv JCV. Uzorci sa aktivnošću između vrednosti nOD 0.10 do 0.25 su dodatno ispitivani u potvrdnom ELISA testu. U potvrdnom ELISA testu, svi uzorci koji ispoljavaju inhibiciju > 40% svrstani su kao pozitivni (SL. 4). Pri vrednostima nOD450>0.25 verovatnoća zapažanja inhibicije >40% bila je približno 95%.

Primer 4(f): Seropozitivnost na JCV u STRATA kohorti i lažno negativna stopa

[0112] Na osnovu gore prikazanog algoritma, stopa seroprevalencije u populaciji STRATA procenjena je na 53.6% sa 95% granicama poverenja određenim „bootstrap“ metodom u opsegu od 49.9% do 57.3% [0.536 = 0.451 (verovatnoća nOD450>0.25 u skrining ELISA testu) 0.085 (verovatnoća da se nOD450nalazi između 0.10 i 0.25 u skrining ELISA testu, i %-inhibicije >40% u dodatnom potvrdnom ELISA testu)]. Ovaj proračun seroprevalencije je podrazumevao potvrdu anti-JCV antitela u jednakim proporcijama uzoraka od uro-pozitivnih i uro-negativnih subjekata u oblasti nOD između 0.10 i 0.25. (procenat inhibicije >40%); ova pretpostavka je podržana dvostranim Fišerovim egzaktnim testom sa p-vrednošću od 0.702.

[0113] Od 204 uro-pozitivna pacijenta, pet je imalo nOD450između 0.10 i 0.25 i za njih nije potvrđeno da imaju antitela specifična za JCV (procenat inhibicije ≤40%; SL.4B).

Primer 5: Validacija testa

[0114] Validacija testa urađena je pomoću Focus Diagnostics, Inc. (Cypress, CA), u kojoj su pokazani parametri performanse uključujući preciznost između i unutar testa, specifičnost, osetljivost i stabilnost reagenasa za test i kontrole. Parametri performanse testa uključujući preciznost između i unutar testa, specifičnost, osetljivost i stabilnost reagenasa za test i kontrole su pokazani. Parametri preciznosti su procenjivani pomoću tri nezavisna analitičara, i sa plazmom i sa serumom, u četiri različita dana korišćenjem nezavisnih preparata kontrola za test. Za demonstraciju specifičnosti testa, deset pojedinačnih uzoraka seruma i plazme zdravih dobrovoljaca ili pacijenata sa MS (TYSABRI<®>(natalizumab) naivni) je preinkubirano ili sa puferom za test ili sa definisanom koncentracijom HPVLP ili BKV VLP u rastvoru. Robusnost je procenjena variranjem gornjih i donjih granica vremena inkubacije za korake dodavanja uzorka, konjugata i supstrata i različite serije reagensa za oblaganje HPVLP su procenjene da bi se pokazala konzistentnost performanse kontrole za test. Interferencija matrice procenjena je određivanjem procenta oporavka u uzorcima u koje su dodate unapred određene koncentracije anti-JCV antitela i dodavanjem u uzorke koji sadrže antitela specifična za JCV različitih koncentracija irelevantnih humanih monoklonskih antitela.

Primer 6: Određivanje statusa antitela za JCV kod pacijenata sa PML

[0115] Uzorci plazme i seruma (pojedinačne vremenske tačke slučajno odabrane iz niza sakupljanja) dobijeni su od ukupno 831 pacijenta iz studije bezbednosti ponovnog doziranja i lečenja lekom TYSABRI (STRATA). STRATA je otvoreno obeleženo, multinacionalno ispitivanje (Severna Amerika, Evropa, Australija i Novi Zeland) sa jednom grupom pacijenata u kojoj svi pacijenti primaju natalizumab u dozi od 300 mg intravenskom infuzijom svake 4 nedelje tokom 48 nedelja. Uzorci urina sakupljeni prema protokolu STRATA ispitivani su na prisustvo DNK JCV.

[0116] Od odobrenja za plasiranje na tržište TYSABRI<®>u junu 2006. do 9. februara 2010, prijavljeno je 35 slučajeva PML pri lečenju natalizumabom. Dodatno, bila su tri slučaja PML u kliničkim ispitivanjima pre odobrenja natalizumaba (10, 13, 25). Skladišteni uzorci dobijeni su iz što je više moguće slučajeva PML u vremenskim tačkama pre dijagnostikovanja PML (pre-PML). Uzorci plazme ili seruma bili su dostupni samo od 11 pacijenata sa PML lečenih natalizumabom (10 pacijenata sa MS i 1 pacijent sa Kronovom bolešću: Tabela 1). Ispitivani su uzorci seruma koji su uzeti od jedne do tri godine pre dijagnostikovanja PML. Skoro svi od ovih uzoraka sakupljeni su od pacijenata koji su učestvovali u registracijama ili kliničkim ispitivanjima i skladišteni su na -70C° do ispitivanja. Primetno, anti-JCV antitela detektovana su kod svih 11 pacijenata (100%) preko kombinacije skrining ELISA testa za serološki status i dodatnog potvrdnog ELISA testa (SL.

6A i 6B) koji su gore opisani. Korišćenjem Fišerovog egzaktnog testa na jednom uzorku, ovaj rezultat bio je značajno drugačiji od očekivane proporcije (53.6%) sa p-vrednošću od 0.002.

[0117] Ovi podaci ukazuju na to da test predmetnog pronalaska može da se koristi za određivanje prisustva ili odsustva antitela protiv JCV kod subjekata kao deo ukupne procene rizika razvoja PML.

Tabela 1. Uzorci 11 pacijenata sa PML lečenih natalizumabom čiji su uzorci krvi pre dijagnostikovanja bili dostupni.

*Kronova bolest; SENTINEL = bezbednost i efikasnost natalizumaba u kombinaciji sa interferonom Beta-1a kod pacijenata sa relapsnom remitentnom multiplom sklerozom; STRATA = bezbednost redoziranja i lečenja lekom TYSABRI; qd=4 x dnevno; qwk = 1 x nedeljno SENTINEL = bezbednost i efikasnost natalizumaba u kombinaciji sa interferonom Beta-1a kod pacijenata sa relapsnom remitentnom multiplom sklerozom; STRATA = bezbednost redoziranja i lečenja lekom TYSABRI®; ROW = ostatak sveta; qd=4 x dnevno; qwk = 1 x nedeljno; *I prethodno i istovremeno lečenje sa natalizumabom

[0118] Podaci iz longitudinalnog ispitivanja drugih subjekata koji su uzimali imunomodulator takođe su procenjivani (tj., višestruki uzorci sakupljeni u različitim trenucima od jedne osobe). Podaci iz longitudinalnog ispitivanja ukazali su da, za razliku od povremenog ispitivanja lučenja DNK u urinu, HPVLP test može pouzdano da se koristi za procenu statusa anti-JCV antitela, i da status antitela protiv JCV ostaje relativno stabilan (u odsustvu ponovljene infekcije).

Primer 7: Alternativni postupak za prečišćavanje VP1-VLP JCV

[0119] Ovaj postupak je primer alternative postupku gradijent gustine/ultracentrifugiranje koji je gore opisan za prečišćavanje JCV VP1-VLP čestica iz insekatskih ćelija. Opšti koraci protokola su liza, obrada benzonazom, taloženje deoksiholatom, taloženje amonijum sulfatom i koncentrovanje/dijafiltracija, sa finalnim korakom jonske izmene korišćenjem TMAE fraktogela.

[0120] Ćelije Sf9 inficirane JCV-VP1 bakulovirusom lizirane su u PBS, 0.1 mM CaCl2propuštanjem dva puta kroz mikrofluidizirajući razbijač ćelija na 5000 psi. Ćelijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem na maloj brzini i supernatant obrađen sa 40 jedinica/ml benzonaze (EMD Biosciences 71206-3) 1 čas na sobnoj temperaturi. Za korak taloženja sa deoksiholatom, jedna desetina zapremine 2.5% deoksiholata dodata je lizatu (0.25% finalni deoksiholat), i lizat je inkubiran na 37°C tokom 1 časa uz pažljivo mešanje. Lizatu je dodat 0.1 mM NaCl zapremine jednake 4 M NaCl, i lizat je inkubiran na ledu 1 čas. Talog je uklonjen centrifugiranjem na maloj brzini. Supernatant je zatim staložen sa 40% amonijum sulfata da bi se uklonili kontaminirajući proteini. Finalnih 40% dobijeno je korišćenjem 232 g čvrstog amonijum sulfata po litru rastvora. Uz pažljivo mešanje rastvora na 4°C, dodavan je amonijum sulfat po petinu u jednom trenutku, ostavljajući da se svaki dodatak rastvara 10 do 15 minuta pre dodavanja sledeće frakcije. Rastvor je pažljivo mešan preko noći na 4°C. Talog amonijum sulfata je uklonjen centrifugiranjem na maloj brzini i supernatant koji sadrži VP1 je filtriran korišćenjem filtera od 0.45 µm i prenet u sledeći korak. Rastvor je koncentrovan 5 do 10 puta korišćenjem NMWL TFF membrane od 100 kDa (Pellicon 2 Mini UF Mod Biomax-100 C 0.1m<2>, P2B100C01) i zamenjen puferom za sklapanje (25 mM tris, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.5) razblaživanjem 5 puta i ponovnim koncentrovanjem na polaznu zapreminu dva puta. Rastvor je skladišten na 4°C >/= 36 časova. Rastvor je zatim podvrgnut dijafiltraciji korišćenjem NMWL TFF membrane od 500 kDa (Pellicon 2 Mini UF Mod Biomax-500 V, Millipore part # P2B500V01) korišćenjem 40 zapremina TMA pufera za hromatografiju (25 mM tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 8.0). Za hromatografiju, približno 1 ml smole je potreban na 2 g polazne ćelijske mase. Protein je nanesen na TMAE kolonu odgovarajuće veličine (Fractogel® EMD TMAE HiCap (M) - EMD Biosciences kat. br.1.10316) i ispran sa 3 zapremine kolone pufera za hromatografiju. VLP čestice su eluirane sa 25 mM tris, 600 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 8.0. Čistoća VP1 je procenjena pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije, prisustvo VLP je potvrđeno elektronskom mikroskopijom, i procenat ukupnog proteina u obliku VLP čestica određen je analitičkim ultracentrifugiranjem metodom sedimentacione brzine. Ovaj postupak rezultovao je u HPVLP preparatima od oko 80% HPVLP čestica.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. In vitro postupak za identifikovanje subjekta kao izloženog povećanom riziku od progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), pri čemu se subjekt identifikuje kao onaj koji je izložen povećanom riziku od PML ako je biološki uzorak uzet od subjekta pozitivan na antitelo protiv JCV, pri čemu se nivo antitela protiv JCV određuje:

(a) dovođenjem u kontakt biološkog uzorka uzetog od subjekta sa visoko prečišćenim česticama sličnim virusu (HPVLP), koje se sastoje pretežno od proteina VP1 JC virusa (JCV), u rastvoru pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela protiv JCV u uzorku za HPVLP, čime se obezbeđuje preinkubirani uzorak;

(b) dovođenjem u kontakt preinkubiranog uzorka sa HPVLP, koje se sastoje pretežno od proteina VP1 JCV, imobilizovanim na čvrstoj podlozi, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela protiv JCV u uzorku za HPVLP;

(c) detektovanjem nivoa antitela protiv JCV u preinkubiranom uzorku koje se vezuje za imobilizovane HPVLP;

(d) dovođenjem u kontakt dela biološkog uzorka koji je inkubiran u rastvoru bez HPVLP pod istim uslovima upotrebljenim u koraku (b), i detektovanjem nivoa antitela protiv JCV koje se vezuje za imobilizovanu HPVLP, i

(e) poređenjem detektovanog nivoa antitela protiv JCV u preinkubiranom uzorku iz koraka (a) do (c) sa nivoom antitela protiv JCV detektovanim u uzorku iz koraka (d);

pri čemu smanjenje detektovanog nivoa antitela protiv JCV u preinkubiranom uzorku u poređenju sa uzorkom uzetim od subjekta koji je bio inkubiran u rastvoru bez HPVLP ukazuje na to da je uzorak pozitivan na antitelo protiv JCV,

a promena detektovanog nivoa antitela protiv JCV ispod određenog procenta ukazuje na to da antitelo specifično prema JCV nije prisutno u uzorku,

pri čemu su HPVLP čestice sačinjene od više od 5, najmanje 50, 150 ili 360 polipeptida VP1; pri čemu postupak dodatno uključuje određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta u uzorku uzetom kasnijeg datuma od vremena uzimanja početnog uzorka, poređenje nivoa anti-JCV antitela u uzorku uzetom kasnijeg datuma sa nivoom u uzorku iz početnog uzorka; i utvrđivanje da li je subjekt izložen povećanom riziku od PML kasnijeg datuma, u odnosu na vreme uzimanja početnog uzorka.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, u kome se biološki uzorak dovodi u kontakt sa HPVLP česticama u rastvoru tokom vremenskog perioda odabranog od 30 minuta, jednog časa, ili preko noći na 4°C.

3. Postupak prema jednom od patentnih zahteva 1 ili 2, gde određeni procenat predstavlja 40%.

4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u kome test daje lažno negativnu stopu od 3% ili manje za detekciju antitela protiv JCV u biološkom uzorku uzetom od subjekta.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, u kome test daje lažno negativnu stopu od 1% ili manje za detekciju antitela protiv JCV u biološkom uzorku uzetom od subjekta.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, u kome HPVLP čestice sadrže više od 1, najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 72 pentamere VP1.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, u kome:

(i) HPVLP dodatno sadrži najmanje jedno od JCV VP2, ili JCV VP3; ili

(ii) VP1 u HPVLP je rekombinantni VP1; ili

(iii) najmanje jedan VP1 u HPVLP je mutantni VP1.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, u kome je biološki uzorak serum.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, u kome biološki uzorak potiče od subjekta kome je propisan imunomodulator ili subjekta koji razmatra uzimanje imunomodulatora, gde je imunomodulator odabran od anti-VLA-4 terapije, anti-CD20-terapije, anti-CD11a terapije, ili mikofenolat mofetila.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, gde subjekt:

(a) nije ranije primao imunomodulator, ili

(b) primio je ranije jednu ili više doza imunomodulatora.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, gde se subjekt za čiji je biološki uzorak u početnom ispitivanju utvrđeno da nema antitela protiv JCV, ponovo podvrgava ispitivanju najmanje jednom godišnje na prisustvo antitela protiv JCV nakon početnog ispitivanja.

12. Postupak prema jednom od patentnih zahteva 9 ili 10, u kome je imunomodulator natalizumab.

13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, gde subjekt ima multiplu sklerozu (MS) ili Kronovu bolest (CD).