RS66509B1 - Test za antitela na jc virus - Google Patents

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova patentna prijava zahteva prioritet od SAD privremene patentne prijave br.

61/294,048, koja je podneta 11.01.2010. i SAD privremene patentne prijave br. 61/316,193, od 22.03.2010.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Pronalazak se odnosi na postupke za analizu prisustva antitela na JC virus u uzorcima.

OSNOV PRONALASKA

[0003] Progresivna multifokalna leukoencefalopatija (PML) je oportunistička infekcija centralnog nervnog sistema (CNS) koja je povezana sa izlaganjem JC virusu (JCV), polioma virusu za koji se veruje da je patogen kod ljudi samo pod uslovima perzistentne imunosupresije ili imunomodulacije. Dok je prisustvo JCV potrebno za razvoj PML, smatra se da je rizik od PML, na način koji nije sasvim jasan, povezan sa konvergencijom višestrukih virusnih faktora i faktora povezanih sa domaćinom koji dovode do toga da virus postane patogen (Major, "Progressive Multifocal Leukoencephalopathy in Patients on Immunomodulatory Therapies" Annu. Rev. Med.61:35-47 (2010) [2009 Aug. 31, Epub ahead of print]). Objavljene studije koje govore o prevalencija infekcije sa JCV u humanoj populaciji su raznovrsne. Ova informacija se zasniva na različitim tipovima studija uključujući PCR analizu za virusnu DNK i detekciju antitela na JCV. Uprkos prevalenciji JCV u populaciji, infekcija sa JCV retko rezultuje sa PML, čak i kod osoba sa dokumentovanom imunosupresijom.

[0004] Objavljeni izveštaji o detekciji JCV DNK sugerišu da je postupak neosetljiv i ograničene upotrebljivosti za procenjivanje izloženosti JCV jer je JCV DNK bila retko i nekonzistentno detektovana u plazmi, serumu ili mononuklearnim ćelijama periferne krvi pacijenata sa PML inficiranih sa JCV. Čini se da detekcija anti-JCV antitela predstavlja senzitivniji marker za infekciju sa JCV; međutim postojeći rezultati su raznovrsni. Godine 1973, autori Pedžet i Voker su objavili studiju koja izveštava o seroprevalenciji JCV od 65-84% korišćenjem testa inhibicije hemaglutinacije (HI) (Padgett and Walker, „Prevalence of antibodies in human sera agains JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy" J. Infect. Dis.

127:467-70, 1973). Kasniji izveštaji o stopama seroprevalencije JCV korišćenjem HI testa ili ELISA testa varirali su između 33-91%. Varijabilne stope seroprevalencije u ovim studijama verovatno nastaju zbog značajnih razlika u veličini i demografskim karakteristikama studija, i, možda u najvećoj meri, zbog razlika u postupcima testova.

[0005] Zbog toga je poželjno implementirati pouzdan i osetljiv test za određivanje prisustva antitela na JCV koji može da se koristi, na primer, za procenu da li je osoba bila izložena JCV.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Pronalazak se odnosi na razvoj analitički validiranog, senzitivnog testa za detekciju prisustva antitela na JCV u biološkom fluidu, npr. serumu ili plazmi. Obim pronalaska je definisan priloženim patentnim zahtevima. Smatra se da primeri izvođenja, prikazi, aspekti, slučajevi i opisi, koji nisu obuhvaćeni obimom priloženih patentnih zahteva, predstavljaju samo primere pogodne za razumevanje pronalaska.

[0007] Predmetni pronalazak je in vitro postupak za identifikaciju subjekta u riziku od razvoja progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), koji obuhvata primarni i sekundarni test; pri čemu primarni test obuhvata: (a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka dobijenog od subjekta, sa visoko prečišćenim česticama VP1 (HPVLP), koje se pretežno sastoje od VP1 proteina iz JCV, imobilisanog na čvrstom supstratu, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JC virus (JCV) iz uzorka, za HPVLP; (b) detektovanje nivoa vezivanja antitela na JCV iz uzorka za HPVLP čestice; i (c) korelisanja detektovanog nivoa sa referentnim nivoom dobijenim iz kontrolnog uzorka ili skupa uzoraka koji se obrađuje sa uzorkom dobijenim od subjekta; i pri čemu sekundarni test obuhvata: (a) dovođenje u kontakt dela biološkog uzorka dobijenog od subjekta, sa visoko prečišćenim česticama sličnim virusu (HPVLP), koje se pretežno sastoje od VP1 proteina iz JCV, u rastvoru, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JCV iz uzorka za HPVLP, čime se dobija preinkubirani uzorak; (b) dovođenje u kontakt preinkubiranog uzorka sa HPVLP česticama koje se pretežno sastoje od VP1 proteina JCV, imobilisanih na čvrstom supstratu pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JCV iz uzorka za HPVLP; (c) detektovanje nivoa antitela na JCV u preinkubiranom uzorku, koja se vezuju za imobilisane HPVLP čestice; i (d) upoređivanje detektovanog nivoa antitela na JCV u preinkubiranom biološkom uzorku sa nivoom antitela na JCV koji je detektovan u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, koji je preinkubiran u rastvoru bez HPVLP čestica, i koji je bio u kontaktu sa HPVLP imobilisanim na čvrstom supstratu, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JCV iz uzorka za HPVLP, pri čemu su HPVLP čestice sastavljene od više od 5, najmanje 50, 150 ili 360 VP1 polipeptida; pri čemu smanjenje detektovanog nivoa antitela na JCV u preinkubiranom biološkom uzorku u poređenju sa biološkim uzorkom dobijenim od subjekta, koji je preinkubiran u rastvoru bez HPVLP čestica, ukazuje na to da je uzorak pozitivan za antitelo na JCV i da je subjekt u povećanom riziku od razvoja PML, a promena u detektovanom nivou antitela na JCV ispod specifično navedenog procenta ukazuje na to da u uzorku nije prisutno antitelo specifično za JCV.

[0008] U jednom primeru izvođenja, dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa HPVLP česticama u rastvoru traje tokom vremenskog perioda odabranog od 30 minuta, jednog sata ili preko noći, na 4°C.

[0009] U poželjnom primeru izvođenja, specifično navedeni procenat je 40% i u postupku se koristi HPVLP ELISA test. Poželjno, referentni nivo je izabran tako da obezbeđuje lažno negativnu stopu od 3% ili manje za detekciju antitela na JCV u uzorku dobijenom od subjekta. Najpoželjnije, referentni nivo je izabran tako da obezbeđuje lažno negativnu stopu od 1% ili manje za detekciju antitela na JCV u uzorku dobijenom od subjekta.

[0010] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak dobijen od subjekta se klasifikuje kao negativan za antitela na JCV, kada je nivo antitela na JCV u preinkubiranom biološkom uzorku koji se vezuje za imobilisane HPVLP čestice približno isti kao nivo antitela na JCV koji je detektovan u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, koji je preinkubiran u rastvoru bez HPVLP čestica.

[0011] U poželjnom primeru izvođenja, HPVLP čestice sadrže više od 1, najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 72 VP1 pentamera. U nekim primerima izvođenja, HPVLP dodatno sadrži najmanje jedno od JCV VP2 ili JCV VP3; ili je VP1 u HPVLP rekombinantni VP1; ili je najmanje jedan VP1 u HPVLP mutantni VP1.

[0012] Poželjno, biološki uzorak je serum. U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak potiče od subjekta kome je prepisan imunomodulator ili subjekta koji razmatra uzimanje imunomodulatora, pri čemu je imunomodulator izabran od anti-VLA-4 terapije, anti-CD20 terapije, anti-CD11a terapije ili mikofenolat mofetila. Imunomodulator je poželjno natalizumab. U nekim primerima izvođenja, kod subjekta kome je prepisan imunomodulator ili koji razmatra uzimanje imunomodulatora, prethodno nije primenjen imunomodulator. U drugim primerima izvođenja, subjekt je prethodno primio jednu ili više doza imunomodulatora.

[0013] U nekim primerima izvođenja, detekcija vezivanja antitela na JCV za HPVLP čestice ukazuje na to da subjekt: (i) nije kandidat za lečenje imunomodulatorom ako je biološki uzorak pozitivan na JCV antitelo; ili (ii) jeste kandidat za lečenje imunomodulatorom i intenzivnije praćenje neželjenih simptoma nakon tretmana imunomodulatorom, opciono, pri čemu neželjeni simptomi ukazuju na razvoj PML.

[0014] U nekim primerima izvođenja, nemogućnost da se detektuje vezivanja antitela na JCV za HPVLP čestice ukazuje na to da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom. Imunomodulator je poželjno natalizumab.

[0015] U nekim primerima izvođenja, subjekt koji ima biološki uzorak za koji je utvrđeno da nema antitela na JCV u inicijalnom testiranju, podvrgava se ponovnom testiranju na prisustvo antitela na JCV najmanje jednom godišnje nakon inicijalnog testiranja. U nekim primerima izvođenja, subjekt za koga je na prvom terminu utvrđeno da ima antitela na JCV testira se kasnije ponovo, kako bi se utvrdilo da subjekt nema JCV antitela.

[0016] U veoma poželjnim primerima izvođenja, subjekt ima multiplu sklerozu (MS) ili Kronovu bolest (CD).

[0017] U nekim primerima izvođenja, referenca je izabrana tako da ukazuje na lažno negativnu stopu koja nije veća od 3% i minimalnu unakrsnu reaktivnost na druge komponente uzorka, kao što su antitela na druge polioma viruse, npr. BK virus (BKV). Referenca je dobijena iz kontrolnog uzorka ili skupa uzoraka koji se obrađuju sa uzorkom dobijenim od subjekta. U nekim primerima izvođenja, referenca je izabrana tako da lažno negativna stopa testa nije veća od 1%.

[0018] U jednom slučaju, najmanje oko 10% HPVLP čestica u preparaciji prečišćenih HPVLP čestica sadrži više od pet VP1 polipeptida po HPVLP. U drugim slučajevima, najmanje oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 80% ili oko 90% HPVLP čestica u prepaciji prečišćenih HPVLP čestica, sadrži više od pet VP1 polipeptida po HPVLP.

[0019] HPVLP je imobilisana na čvrstoj podlozi kao što je mikrotitarska ploča ili mikroskopska pločica. HPVLP se sastoji u osnovi od VP1 virusnog proteina. HPVLP može dodatno da uključuje druge virusne proteine, na primer najmanje jedan od VP2 ili VP3 iz JCV. Virusni protein(i) u HPVLP može da bude rekombinantno dobijen (npr. VP1 soja MAD1) ili može da bude prirodni virusni protein (npr. dobijen iz prirodnog izvora). Postupak može da se izvede korišćenjem, na primer, biološkog uzorka dobijenog od subjekta koji se trenutno leči imunomodulatornim lekom, subjekta kod koga se razmatra započinjanje lečenja imunomodulatornim lekom ili subjekta za koga se sumnja da ima progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML). Postupak za koji se traži zaštita

[0020] je dvostepeni test koji uključuje proces sekundarnog konfirmacionog testa koji uključuje dovođenje u kontakt dela biološkog uzorka dobijenog od subjekta sa HPVLP u rastvoru (pre inkubacije uzorka sa HPVLP česticama vezanim za čvrstu podlogu), čime se dobija sekundarni uzorak; dovođenje u kontakt sekundarnog uzorka sa HPVLP pod istim uslovima koji se koriste za primarni test; detektovanje nivoa antitela ma JCV koja se vezuju za HPVLP u sekundarnom uzorku; i upoređivanje detektovanog nivoa antitela na JCV u sekundarnom uzorku sa nivoom antitela na JCV u uzorku koji nije bio preinkubiran sa rastvorljivim HPVLP, tako da smanjenje detektovanog nivoa u uzorku sekundarnog testa u poređenju sa uzorkom koji nije bio preinkubiran označava da je uzorak pozitivan za antitela na JCV, a promena detektovanog nivoa ispod određenog procenta ukazuje na to da u uzorku nije prisutno antitelo specifično za JCV.

[0021] Ovde opisani test može da se koristi za ispitivanje prisustva antitela na JCV kod subjekta koji nikad nije primao terapiju imunomodulatorom; ili kod subjekta koji je prethodno primao imunomodulator, ali koji više ne prima terapiju imunomodulatorom; ili kod subjekta koji je trenutno podvrgnut lečenju imunomodulatorom.

[0022] Detekcija antitela na JCV koja se vezuju za HPVLP čestice u testu prikazanom u pronalasku može da ukazuje na to je subjekt izložen povećanom riziku od PML. Detekcija antitela na JCV može takođe da ukazuje na to da je subjekt izložen povećanom riziku od neželjenih simptoma, kao što je razvoj PML, po primeni određenih terapijskih sredstava, kao što su izvesni imunomodulatori, i zbog toga subjekt nije kandidat za lečenje ovim sredstvima. Na primer, detekcija antitela na JCV u uzorku uzetom od subjekta može da ukazuje na to da subjekt nije kandidat za lečenje anti-VLA-4 terapijskim sredstvom, kao što je natalizumab. U određenim primerima izvođenja, detekcija antitela na JCV u biološkom uzorku može da ukazuje na to da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom, kao što je natalizumab, osim što će subjekt biti podvrgnut pojačanom praćenju tokom lečenja u odnosu na subjekta koji nema detektabilna antitela na JVC. Na primer, pojačano praćenje može da uključuje praćenje neželjenih simptoma, kao što su simptomi koji mogu da ukazuju na razvoj PML.

[0023] Izostanak detekcije antitela na JCV koja se vezuju za HPVLP čestice u testu prikazanom u pronalasku može da ukazuje na to da je subjekt kandidat za primanje terapije imunomodulatorom, kao što je natalizumab, i u jednom slučaju, kod subjekta se dodatno primenjuje imunomodulator. Subjekt za koga je utvrđeno da nema antitela na JCV može da bude ponovo testiran najmanje jednom godišnje (npr. najmanje svaka 3 meseca, svakih 6 meseci, svakih 9 meseci, ili svakih 12 meseci) da bi se odredilo da li je subjekt razvio antitela na JCV, što može da ukazuje na to da je subjekt inficiran sa JCV. Subjekt koji prethodno nije imao detektabilna antitela na JCV u biološkom uzorku, i koji je kasnije razvio antitela na JCV u biološkom uzorku, može da prestane da prima terapiju imunomodulatorom.

[0024] U nekim primerima izvođenja, subjekt za koga je prethodno utvrđeno da ima antitela na JCV, može naknadno da bude ispitan kasnijeg datuma i da bude utvrđeno da nema antitela na JCV. Ovi subjekti mogu da budu određeni kao kandidati za primanje terapije imunomodulatorom, kao što je natalizumab. U jednom slučaju, kod subjekta čiji je rezultat testa prethodno bio pozitivan na prisustvo antitela na JCV i kod koga je zatim rezultat testa bio negativan na antitela na JCV može da se primeni imunomodulator, i da se subjekt podvrgne pojačanom praćenju u poređenju sa subjektom čiji rezultat testa nikad nije bio pozitivna na antitela na JCV, kao što je praćenje simptoma koji mogu da ukazuju na razvoj PML.

[0025] Test koji se nalazi u pronalasku je koristan za lečenje subjekta koji ima imunološku bolest ili poremećaj, kao što je multipla skleroza (MS) ili Kronova bolest. Test za koji se traži zaštita je validiran za upotrebu kod pacijenata sa MS i CD i efikasan je za detekciju antitela na JCV kod pacijenata sa MS i CD u kontrolisanom okruženju testiranja, kao što je u kliničkom ispitivanju.

[0026] U jednom aspektu, prikaz daje postupak za identifikaciju subjekta sa rizikom od razvoja PML, na primer, uzimanjem biološkog uzorka od subjekta; dovođenjem u kontakt biološkog uzorka sa HPVLP česticama pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JC virus (JCV) u uzorku za HPVLP; detektovanjem nivoa antitela na JCV koje se vezuje u uzorku za HPVLP čestice; i dovođenjem u korelaciju detektovanog nivoa sa referentnim setom, gde je subjekt u povećanom riziku od PML ako je vezivanje antitela na JCV detektovano. Referentni skup se bira tako da ukazuje na lažno negativnu stopu od oko 5%, oko 3%, oko 1% ili manje.

[0027] U drugom aspektu, prikaz daje postupak za identifikaciju rizika od PML kod subjekta, određivanjem nivoa anti-JCV antitela u uzorku dobijenom od subjekta, kao što je uzorak plazme, krvi ili seruma; i dodeljivanja nivoa rizika subjektu, u skladu sa nivoom anti-JCV antitela u uzorku. Subjekt može da prima imunomodulatornu terapiju, kao što je anti-VLA4 tretman, npr. natalizumab, ili može da bude kandidat za primanje imunomodulatorne terapije. U nekim slučajevima, kod subjekta je dijagnostifikovana imunološka bolest ili poremećaj, kao što je multipla skleroza ili Kronova bolest. U pronalasku, nivo anti-JCV antitela se određuje korišćenjem dvostepenog testa. Dvostepeni test može da uključuje ELISA test.

[0028] Postupak za koji se traži zaštita uključuje određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta u uzorku uzetom kasnijeg datuma od vremena uzimanja početnog uzorka, poređenje nivoa anti-JCV antitela u uzorku uzetom kasnijeg datuma sa nivoom u uzorku iz početnog uzorka; i utvrđivanje da li je subjekt izložen povećanom riziku od PML kasnijeg datuma, u odnosu na vreme uzimanja početnog uzorka.

[0029] Postupak za koji se traži zaštita može da se koristi za praćenje rizika od PML kod subjekta, postupak obuhvata određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta korišćenjem uzorka od prvog datuma; određivanje rizika od PML (npr. visok, ili umeren ili nizak rizik) na osnovu nivoa anti-JCV antitela kod subjekta prvog datuma; određivanje nivoa anti-JCV antitela kod subjekta korišćenjem uzorka od drugog datuma; i određivanje rizika od PML (npr. visok, ili umeren ili nizak rizik) na osnovu nivoa anti-JCV antitela kod subjekta drugog datuma.

[0030] Kao što se ovde koristi, "HPVLP" je visoko prečišćeni VLP ("čestica slična virusu") koja se sastoji pretežno od VP1 proteina. „HPVLP" koja je prikazana u pronalasku, sačinjena je uglavnom od glavnog proteina kapsida „VP1", koji može da bude prirodni VP1 ili rekombinantni VP1, iz poliomavirusa, JC virusa (JCV). HPVLP može da bude sačinjena od, npr. više od jedne pentamerne subjedinice, najmanje 10 pentamernih subjedinica, najmanje 20 pentamernih subjedinica, najmanje 30 pentamernih subjedinica, najmanje 50 pentamernih subjedinica, najmanje sedamdeset dve pentamerne subjedinice ili više VP1. HPVLP može da sadrži polipeptide VP1 u neodređenoj konfiguraciji (npr. polipeptidi mogu ali ne moraju da budu organizovani u pentamere), u kom slučaju HPVLP može da bude sačinjen od više od 5 VP1 polipeptida, najmanje 50 VP1 polipeptida, najmanje 150 VP1 polipeptida, najmanje 360 VP1 polipeptida ili više. HPVLP čestice uključuju kapsomere, koje sadrže oko 10 do 24 pentamera. HPVLP prikazana u pronalasku može da veže antitela protiv prirodnog, intaktnog JC virusa. U nekim primerima izvođenja, HPVLP uključuje drugi, i izborno treći, tip polipeptida koji predstavlja manji protein kapsida JC virusa, npr. najmanje jedan polipeptid VP2 ili VP3. VP2 ili VP3 mogu da budu rekombinantni, ili prirodni, ili polipeptidi koji potiču prirodnih polipeptida.

[0031] Takve „visoko prečišćene" čestice sadrže više od jedne VP1 pentamere, npr. najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 72 VP1 pentamera, ili manje od 100 VP1 pentamera. Takve visoko prečišćene čestice mogu da se dobiju, na primer, postupkom koji uključuje dvostruku filtraciju. Na primer, visoko prečišćeni preparat VLP se dobija prečišćavanjem čestica najmanje dva puta centrifugiranjem, npr. kroz sloj saharoze. Uopšteno, preparat HPVLP može da se identifikuje preko njegove aktivnosti u ELISA testu korišćenjem definisanih kontrolnih uzoraka. U nekim slučajevima, takvi kontrolni uzorci su negativne kontrole i/ili kontrolni uzorci koji sadrže niske nivoe antitela na JCV.

[0032] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje uobičajeno podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nije predviđeno da budu ograničavajući.

[0033] Detalji jednog ili više primera izvođenja prema pronalasku su prikazani na pratećim crtežima i u opisu u nastavku teksta. Predmetni pronalazak i njegovi primeri izvođenja navedeni su u priloženim patentnim zahtevima.

OPIS CRTEŽA

[0034]

SL. 1 je grafikon koji prikazuje rezultate HPVLP ELISA testa na uzorcima dobijenim od subjekata pozitivnih za JCV DNK u njihovom urinu (uropozitivni) i negativnih za JCV DNK u uzorku urina (uronegativni). Oblast ograničena četvorouglom predstavlja interkvartilni (IQR) opseg sa linijom medijane u sredini; zagrade predstavljaju registrovanja u okviru 1,5 puta IQR. „+" znakovi predstavljaju registrovanja izvan 1,5 puta IQR (odstupanja). *Man-Vitnijev U test. SL. 2 je grafikon koji prikazuje nivoe anti-JCV antitela merene ELISA testom nasuprot nivoa JCV DNK u urinu, mereno tehnikom qPCR (n=204). Prazni krugovi predstavljaju uzorke urina i seruma sakupljene u istovremenim vremenskim tačkama STRATA. Puni krugovi predstavljaju uzorke sakupljene u različitim vremenskim tačkama. Za 17 uzoraka sa rezultatima DNK testa ispod nivoa kvantitativnog određivanja (<500 kopija/mL) nivo je podešen na graničnu vrednost detekcije.

SL. 3 je grafikon koji prikazuje podatke o unakrsnoj reaktivnosti BKV-JCV iz jednog zeca imunizovanog sa BKV. Antiserumi zeca imunizovanog sa BKV vezivali su BKV VLP čestice sa visokim afinitetom (EC50 = 1:100000) i unakrsno reagovali sa JCV VLP česticama (EC50 = 1:5000).

SL. 4A i 4B prikazuju anti-JCV test reaktivnosti uzoraka seruma od uronegativnih (n = 311) (SL.

4A) i uropozitivnih (n = 204) (SL. 4B) pacijenata u ELISA testovima za skrining i potvrđivanje. Prikazana je raspodela serološke reaktivnosti uzoraka u skrining ELISA testu, sa naglašenim donjim (nOD450= 0,10) i gornjim (nOD450= 0,25) graničnim vrednostima (levi paneli). U dodatnom konfirmacionom ELISA testu (desni paneli), naglašena je granična vrednost inhibicije od 40% (vertikalna linija) sa osenčenim regionima koji označavaju uzorke za koje nije potvrđeno da imaju anti-JCV specifična antitela (nOD450≤ 0,25 i procenat inhibicije ≤ 40%).

SL. 5A i 5B su histogrami koji prikazuju učestalost registrovanja unutar svakog opsega inhibicije od 10% za sve pacijente (n=515) (SL. 5A) i uropozitivne pacijente (n=204) (SL.5B). Raspodela se sastojala od dva jasno definisana pika, najoptimalnije odvojena na 40% inhibicije. Nivo inhibicije od 40% odgovarao je približno donjem petom percentilu raspodele odgovora uropozitivnih uzoraka.

SL. 6A i 6B su grafikoni sa nOD450vrednostima iz skrining ELISA testa (SL. 6A) prikazanim naspram procentualnih vrednosti inhibicije iz konfirmacionog ELISA testa (SL. 5B) za 11 pre-PML uzoraka. Horizontalne linije predstavljaju vrednosti nOD450od 0,10 i 0,25, vertikalna linija predstavlja procenat inhibicije od 40%.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0035] Osetljivi test za antitela na JCV koji smanjuje na najmanju meru lažno negativne rezultate i smanjuje na najmanju meru detekciju unakrsno reaktivnih antitela, koristan je za identifikaciju pojedinaca koji su bili izloženi JCV. Upotreba takvog testa može da bude korisna u identifikaciji pojedinaca koji su trenutno zaraženi sa JCV ili su bili prethodno dovoljno izloženi JCV da razviju antitela protiv virusa. Takav test može takođe da obezbedi alat za pomoć kliničkim lekarima u kliničkoj vigilanci i stratifikaciji rizika kod PML. Na primer, takav test može da bude koristan za stručnjake i pacijente, kao deo procene rizika od razvoja PML kod pacijenta, pomoću precizne procene da li je subjekt bio izložen JCV. U nekim slučajevima, analiza može da uključuje određivanje nivoa antitela na JCV u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta.

[0036] Neke poteškoće leže u razvoju korisnog testa za antitela na JCV, na primer, u uspostavljanju validiranih graničnih vrednosti. Podnosioci su rešili ovaj problem korišćenjem podataka dobijenih iz testova na uzorcima urina i plazme dobijenim od pacijenata koji su uropozitivni ili uronegativni za JCV DNK. Drugi problem je razvoj testa koji ima specifičnost i ponovljivost. Podnosioci su rešili ovaj problem korišćenjem visoko prečišćene čestice koja sadrži virusni protein, u testu za antitelo. Dodatno, podnosioci su otkrili da upotreba sekundarnog testa za razrešavanje uzoraka sa dvosmislenim rezultatima u primarnom testu poboljšava korisnost testa za obezbeđivanje upotrebljivog rezultata za takve uzorke.

[0037] Prema tome, razvijen je analitički validiran test u kome se koristi visoko prečišćena čestica slična virusu (VLP) koja sadrži VP1, za detekciju prisustva antitela na JCV u telesnom fluidu, kao što je serum, plazma, urin, CSF, ili drugi telesni fluid koji sadrži antitela. U eksperimentima za validaciju novog testa, identifikovana je prevalencija antitela na JCV od približno 54% u populaciji pacijenata sa MS uključenih u kliničko ispitivanje. Ključno svojstvo testa koji je ovde opisan je upotreba visoko prečišćene čestice slične virusu (HPVLP).

[0038] Jedna prednost testa koji je ovde opisan je to što ima relativno nisku lažno negativnu stopu, npr. lažno negativnu stopu od oko 10%, oko 8%, oko 6%, oko 4%, oko 3%, oko 1% ili manje, za detekciju antitela na JCV. Uopšteno, test ima lažno negativnu stopu od samo oko 3% ili manje, za detekciju antitela na JCV. Kao što je ovde opisano novi test može da se koristi za praćenje stope serokonverzije za JCV. Na primer, test je korišćen za otkrivanje godišnje stope serokonverzije od ne više od oko 2% u ispitivanoj kohorti subjekata koji su bili inicijalno negativni za antitelo na JCV. Ovo pokazuje da test može da bude koristan za praćenje statusa izloženosti pojedinca JCV virusu tokom vremena.

[0039] Test može da se koristi za detekciju antitela na JCV kod bilo kog humanog subjekta, uključujući subjekta kod koga se razmatra lečenje imunomodulatorom, na primer anti-VLA-4 terapija (npr. natalizumabom), anti-CD20 terapija (npr. rituksimabom), anti-CD11a terapija (npr. efalizumabom) ili mikofenolat mofetil; subjekta koji se trenutno leči imunomodulatorom; ili subjekta koji je prekinuo lečenje imunomodulatorom. Test može da bude koristan i za druge koji mogu biti podložni PML, kao što su osobe koje imaju limfoproliferativne poremećaje, kao što je multipli mijelom ili limfom; osobe inficirane humanim virusom imunodeficijencije (HIV), ili koje imaju stečeni sindrom imunodeficijencije (AIDS), hematološke malignitete ili autoimunsku bolest kao što je sistemski lupus eritematozus (SLE), inflamatornu bolest creva, kao što je Kronova bolest (CD) ili ulcerozni kolitis, multiplu sklerozu (MS) ili artritis, npr. reumatoidni artritis (RA). Test može takođe da bude koristan za subjekte koji primaju imunosupresivne ili imunomodulatorne terapije, kao što su pacijenti nakon transplantacije. Primeri imunosupresivnih ili imunomodulatornih terapija uključuju natalizumab, rituksimab, efalizumab i mikofenolat mofetil. Test može da bude koristan za detekciju antitela na JCV kod subjekta koji ima poremećaj, ili se leči lekom, opisanim kod Piccinni et al. „Stronger association of drug-induced

1

progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) with biological immunomodulating agents" Eur. J. Clin. Pharmacol.66:199-206, 2010.

VP1

[0040] Otkriveno je da upotreba HPVLP čestica u testu za antitela na JCV može da poboljša tačnost testa i da je korisna u testu pogodnom za analitičke i dijagnostičke svrhe. VP1 za upotrebu u proizvodnji HPVLP čestica može da se generiše korišćenjem postupaka poznatih u struci i može da bude ili prirodni VP1 ili rekombinantno proizvedeni VP1, npr. VP1 iz JCV virusa. U principu, VP1 koji se koristi je VP1 iz MAD1 soja JCV. VP1 koji se koristi u testu može da sadrži VP1 iz više od jednog JCV soja, na primer, iz jednog ili više od sojeva 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4 i 7. Nakon pripreme VP1, npr. rekombinantno sintetisanog VP1, VP1 za upotrebu u ovde opisanim testovima se zatim dodatno prečišćava standardnim biohemijskim postupcima uključujući postupke ultracentrifugiranja u gradijentu gustine, ili seriju koraka hemijske precipitacije, koncentrovanja/dijafiltracije i jonoizmenjivačke hromatografije. Postupci prečišćavanja tipično uključuju korak za uklanjanje manjih proteina uključujući monomerne VP1 polipeptide ili pentamerni VP1. Uklanjanje ovih manjih čestica može da se izvede, na primer, u jednom koraku ili u dva koraka (npr. prvi korak filtracije za uklanjanje VP1 monomera, a zatim drugi korak filtracije za uklanjanje čestica VP1 pentamera). Takve biohemijske metode prečišćavanja su poznate stručnjacima u bolasti. Primeri 1 i 7 obezbeđuju dve različite metode JCV VP1-VLP prečišćavanja. HPVLP može da se pripremi iz rekombinantnog VP1 ili prirodnog VP1 (npr. izolovanog iz virusa ili virusnog kapsida). U nekim primerima izvođenja, dodatne komponente JCV, kao što je jedan ili oba manja proteina kapsida iz JC virusa, npr. VP2 ili VP3, su uključene u česticu HPVLP ili su povezane sa nosačem.

[0041] U nekim slučajevima, rekombinantno eksprimirani VP1 može da se ne sklopi u pentamere ili HPVLP čestice koje liče na prirodne virusne kapside, na primer, rekombinantno eksprimirani VP1 može da se sklopi u cevčice ili druge geometrijske oblike koji nisu sferni.

Postupci za pravljenje HPVLP

[0042] HPVLP čestice mogu da se naprave, na primer, transformacijom bakulovirusa vektorom koji eksprimira VP1 gen, kao što je VP1 gen iz JC virusa. Bakulovirus se koristi za infekciju ćelijske kulture, kao što je insekatska ćelijska kultura (npr. SF9 ćelije) ili sisarska ćelijska kultura, pa ćelije eksprimiraju VP1 protein. HPVLP čestice se izdvajaju liziranjem ćelija, i prečišćavanjem čestica serijom koraka centrifugiranja i ultrafiltracije. U principu, prečišćavanje se izvodi korišćenjem postupaka kao što je sedimentacija u sloju saharoze, izopikničko ultracentrifugiranje i ekstenzivna ultrafiltracija ili drugi postupci poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Prečišćavanje može da uključuje centrifugiranje čestica kroz sloj saharoze dva puta. U alternativnom postupku prečišćavanja, ćelije se liziraju, i čestice se izdvajaju pomoću serija koraka precipitacije i koncentrovanja/dijafiltracije sa završnim korakom jonske izmene.

[0043] Čistoća može da se proceni korišćenjem bilo koje pogodne tehnike poznate u struci, na primer, analitičkim ultracentrifugiranjem, elektronskom mikroskopijom, PAGE analizom, masenom spektrometrijom, koncentrovanjem proteina ili aktivnošću u ELISA testu sa kontrolnim serumima. Nedovoljno prečišćene VLP čestice dovode do visokog pozadinskog šuma koji daje lažno visoke nivoe antitela na JCV ili izračunatih stopa izlaganja.

[0044] U nekim primerima izvođenja, HPVLP čestice sadrže VP1 kao jedini protein JC virusa.

[0045] U nekim primerima izvođenja, HPVLP čestice su heterogene čestice, i stoga uključuju VP1 protein, i najmanje jedan od manjih proteina kapsida JC virusa, npr. VP2 ili VP3. U drugom primeru izvođenja, HPVLP uključuje VP1, VP2 i VP3 proteine. HPVLP koja uključuje VP1 i VP2 može da se proizvede korišćenjem postupaka poznatih u struci, na primer, transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom koja uključuje gen za VP1 i VP2, na primer pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura se inficira bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1 i VP2, pa se obrazuju HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. VP1 i VP2 geni su na različitim molekulima DNK, molekuli DNK se transformišu u različite bakuloviruse i bakulovirusi se koriste za transfekciju ćelija u istoj kulturi. Ćelije eksprimiraju VP1 i VP2 proteine, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. U nekim slučajevima, heterogena HPVLP će uključivati, npr. jedan ili dva VP2 polipeptida na svakih pet VP1 polipeptida. U principu, HPVLP će sadržati više VP1 polipeptida nego VP2 polipeptida, kao što je slučaj u prirodnom JC virusu.

[0046] HPVLP koja uključuje i VP1 i VP3 ili i VP1 i VP2 molekule može da se proizvede, na primer, transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom koja uključuje VP1 i VP3 gen ili VP1 i VP2 gen, redom, pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura se inficira bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1 i VP3 ili VP1 i VP2, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. VP1 i VP3 ili VP1 i VP2 geni mogu da budu na različitim molekulima DNK, molekuli DNK se transformišu u različite bakuloviruse i bakulovirusi se koriste za transfekciju ćelija u istoj kulturi. Ćelije eksprimiraju VP1 i VP3 proteine ili VP1 i VP2 gene, redom, i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. HPVLP čestice mogu da se izoluju iz ovih preparacija korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što su postupci koji se koriste za izolaciju kapsida JCV.

[0047] Tipično, VP1 pentamer koji se nalazi u heterogenoj HPVLP će uključivati, npr. pet VP1 polipeptida i jedan VP3 polipeptid i/ili jedan VP2 polipeptid, u zavisnosti od toga da li je VP3 gen ili VP2 gen korišćen za pravljenje konstrukata. U HPVLP će tipično biti više VP1 polipeptida nego VP3 ili VP2 polipeptida. U nekim slučajevima, VP2 ili VP3 je iz polioma virusa koji nije JC virus, npr. polipeptid BK virusa.

[0048] HPVLP koja uključuje sva tri molekula, VP1 i VP2 i VP3, može da se proizvede transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom (npr., cirkularnom DNK, npr. < 5.5 kb) koja uključuje gen za VP1, VP2 i VP3, na primer pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura, kao što je sisarska ćelijska kultura, inficira se bakulovirusom i ćelije eksprimiraju VP1, VP2 i VP3 proteine. Posledično, obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju sva tri tipa proteina. VP1, i bilo koji od VP2 i VP3 gena, ili oba ova gena, mogu da budu na različitim molekulima DNK, molekuli DNK se transformišu u iste ili različite bakuloviruse, i bakulovirusi se koriste za infekciju ćelija u istoj ili zasebnim kulturama. Ćelije eksprimiraju VP1, VP2 i VP3 proteine i obrazuju se HPVLP čestice koje uključuju oba tipa proteina. Heterogena HPVLP može da uključuje, npr. pet VP1 polipeptida i po jedan VP2 i VP3 polipeptid, mada odnosi unutar preparacije mogu da variraju. Tipično će u HPVLP biti više VP1 polipeptida nego VP2 i VP3 polipeptida.

[0049] HPVLP može da bude veća od VP1 pentamera. Pod veća se misli na to da je masa proteina sadržanog u HPVLP čestici veća od pentamera koji sadrži samo VP1.

[0050] U principu, HPVLP preparat pogodan za upotrebu u testu će sadržati najmanje 20% HPVLP čestica, najmanje 25% HPVLP čestica, najmanje 40% HPVLP čestica, najmanje 60% HPVLP čestica, najmanje 65% HPVLP čestica, najmanje 70% HPVLP čestica, najmanje 80% HPVLP čestica, najmanje 85% HPVLP čestica, najmanje 90% HPVLP čestica, najmanje 95% HPVLP čestica, ili najmanje 99% HPVPL čestica, u poređenju sa česticama koje nisu HLVLP (npr. po procentu pentamera u poređenju sa VP1 monomerima i agregatima koji sadrže manje od pet VP1 molekula).

Granična vrednost

[0051] Pronalazak obezbeđuje postupke analize u kojima se koriste „granične vrednosti" za smanjenje lažno negativnih i lažno pozitivnih stopa. Granične vrednosti se uspostavljaju na osnovu podataka iz HPVLP testova (npr. za detekciju antitela na JCV u biološkom uzorku), određuje se srednja vrednost, na primer, ispitivanih uzoraka u duplikatu i višestrukih ponavljanja (na primer, najmanje dva, najmanje četiri, ili najmanje osam ponavljanja kontrolnih uzoraka).

[0052] U jednoj verziji testa, prema predmetnom prikazu, rezultati inicijalnih HPVLP skrining testova, npr. ELISA testova, dovešće do toga da se testirani uzorak klasifikuje kao uzorak koji ima ili uzorak koji nema antitela specifična za JCV, ili ukoliko uzorak ne spada u jednu od ovih klasifikacija, onda će biti podvrgnut dodatnom konfirmacionom testu. Na primer, uzorci koji daju rezultat u HPVLP ELISA testu prema pronalasku, koji je manji od ustanovljenog nivoa (npr.

1

nOD450< 0,1) biće klasifikovani kao uzorci koji nemaju antitela specifična za JCV, a uzorci koji u ELISA testu daju rezultat veći od ustanovljenog nivoa (npr. nOD450> 0,25) biće klasifikovani kao pozitivni za antitela specifična za JCV. Uzorci koji ne pripadaju jasno jednoj od ovih klasifikacija (npr. 0,1 < OD450 < 0,25) mogu da budu testirani u konfirmacionom testu. U postupku za koji se traži zaštita, konfirmacioni test zahteva preinkubacioni korak, u kome se ispitivani uzorak preinkubira sa puferom (ili drugim pogodnim rastvorom) kao kontrolom ili sa HPVLP česticama (u puferu ili drugom pogodnom rastvoru) za preadsorpciju antitela specifičnih za JCV pre ispitivanja u HPVLP ELISA testu, kao što je detaljnije opisano u nastavku teksta. U jednom primeru izvođenja, ako nakon preinkubacije sa HPVLP reakcija u primarnom testu opadne za manje od 40% u poređenju sa puferskom kontrolom, tada se uzorak tumači kao negativan na prisustvo antitela specifičnih za JCV. Ako rezultati pokazuju smanjenje ≥40% u reakciji u poređenju sa puferskom kontrolom u primarnom testu posle preinkubacije sa HPVLP, tada se tumači da uzorak sadrži antitela specifična za JCV.

[0053] Primer postupka za izbor i verifikovanje pogodnih graničnih vrednosti obezbeđen je u primeru 4.

Podloga

[0054] Bilo koja pogodna čvrsta podloga može da se koristi za format HPVLP testa. Podloga može da bude mikrotitar ploča (npr. ploča sa 96 bunarčića), mikroskopska pločica, perla, ili kolona. Podloga može da bude pogodna za postupke hromogene ili hemiluminescentne detekcije.

Test

[0055] Testovi se sprovode tako što se biološki uzorak dodaje na supstrat koji je obložen sa HPVLP i detektovan korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike. Generalno, koristi se čvrsta osnovna platforma, kao što je mikrotitar ploča (na primer, ploča sa 96 bunarčića); iako mogu da se koriste i drugi formati poznati u stanju tehnike. Biološki uzorak može da se razblaži pre upotrebe u testu.

[0056] Format testa je enzimski vezan imunotest (ELISA). Uopšteno, postupak tipično uključuje oblaganje podloge antigenom za hvatanje, kao što je HPVLP, inkubiranje uzorka koji sadrži vezujuća antitela usmerena na reagens za hvatanje, pranje za uklanjanje nespecifično vezanih vrsta, i detektovanje vezanih imunskih kompleksa, npr. pomoću hromogenog ili hemiluminiscentnog testa. Hromogeni supstrati proizvode obojene krajnje proizvode, koji mogu da se detektuju i mere vizuelno ili upotrebom spektrofotometra. Hemiluminiscentni supstrati proizvode svetlost, koja može da se meri korišćenjem luminometra.

[0057] Oblaganje ploče sa HPVLP uopšteno uključuje inkubiranje čvrste podloge (kao što su bunarčići mikrotitar ploče) sa rastvorom HPVLP u pogodnoj koncentraciji (npr. 1 µg/ml), ili preko noći ili tokom određenog broja sati. HPVLP može da uključuje VP1 kao jedinu komponentu JCV virusa, ili HPVLP može da bude heterologa čestica, koja sadrži najmanje jedan od VP2 ili VP3 po čestici ili najmanje po jedan VP2 i VP3 po čestici. Nakon oblaganja sa HPVLP, bunarčići ploče se ispiraju. Podloga se zatim „oblaže" nespecifičnim proteinom koji je antigeno neutralan u odnosu na uzorke koji se testiraju. Pogodni materijali za oblaganje su poznati u stanju tehnike i uključuju goveđi serumski albumin (BSA), kazein ili rastvore mleka u prahu.

[0058] Uzorak ili referentni uzorak se inkubira na pripremljenoj podlozi pod uslovima koji su deluju tako što omogućavaju obrazovanje kompleksa (HPVLP/antitelo na JCV), obrazujući tako kompleks koji je vezan. Detekcija vezanog kompleksa izvodi se korišćenjem obeleženog antitela koje može da se veže za humano antitelo. U principu, obeleženo antitelo može da detektuje humani IgG ili humani IgG i IgM. U nekim slučajevima, test može da se izvede korišćenjem sekundarnih ili tercijarnih postupaka detekcije.

[0059] Referentni uzorak može da bude od istog biološkog materijala (npr. plazma, serum, urin ili CSF) izolovanog iz osobe za koju je poznato da je inficirana JC virusom na osnovu prisustva JCV DNK u urinu te osobe (uropozitivna). Referentni uzorak se koristi za uspostavljanje granične vrednosti testa tako da lažno negativna stopa testa nije veća od 1%-3%.

[0060] „Pod uslovima koji deluju tako da dozvoljavaju obrazovanje kompleksa" uopšteno se misli na uslove u kojima su reagensi razblaženi kako bi se smanjio pozadinski šum i obezbedila očitavanja rezultata koji se nalaze u određenom opsegu. Razblaživači mogu da uključuju, u neograničavajućim primerima, rastvore koji uključuju BSA, fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS) ili PBS koji sadrži Tween.

[0061] „Pogodni" uslovi takođe uključuju uslove koji predstavljaju temperaturu i/ili vremenski period dovoljan da omogući efikasno vezivanje. Inkubacije su tipično od oko jednog do dva sata ili jednog do četiri sata, na temperaturama od približno 25°C do 27°C, ili mogu da budu preko noći na oko 4°C. Međutim, stručnjaci u oblasti će razumeti da drugi uslovi mogu da budu pogodni.

[0062] U principu, između inkubacija u testu se sprovodi jedno ili više ispiranja. Odgovarajući rastvori za ispiranje uključuju pufer za razblaživanje (npr. PBS ili PBS/Tween) ili boratni pufer.

[0063] U principu, detekcija antitela vezanih za HPVLP izvodi se korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike. U principu, ovi postupci se metode se zasnivaju na detekciji oznake ili markera, kao što je radioaktivna, fluorescentna, biološka ili enzimska oznaka. SAD patenti koji se odnose na upotrebu ovih oznaka uključuju, na primer, SAD patente br.3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. U principu, detekcija

1

vezivanja antitela na JCV se obavlja korišćenjem sekundarnog antitela koje je obeleženo. U principu, sekundarno antitelo je specifično za detektovanje humanog IgG. Kvantitativno određivanje se postiže merenjem stepena razvijanja boje, npr. korišćenjem spektrofotometra u vidljivom spektru.

[0064] Primer 2 ilustruje postupak izvođenja testa i stručnjaci u oblasti će razumeti da je moguće izvesti pogodne modifikacije.

[0065] Test može da se izvodi u lekarskoj ordinaciji, na primer od strane zdravstvenog radnika, npr. doktora, medicinske sestre ili tehničara, koji su zaposleni u ustanovi u kojoj se biološki uzorak uzima od pacijenta. Biološki uzorak uzet od pacijenta može da se transportuje u drugu ustanovu, npr. u ustanovu trećeg lica, u kojoj se test izvodi. U ovom drugom slučaju, rezultati testa mogu da budu prijavljeni zdravstvenom radniku, na primer putem formulara, koji se može dostaviti poštom ili elektronskim putem (npr. putem faksa ili elektronske pošte) ili putem baze podataka postavljene na internetu. Rezultati testa (uključujući skrining test i, izborno, konfirmacioni test) mogu da se čuvaju u bazi podataka i zdravstveni radnik može da im pristupi na primer preko interneta.

Sekundarni test

[0066] U predmetnom pronalasku, primenjuje se sekundarni test (ovde označen i kao „konfirmacioni test") uzorka. Za sekundarni test se koriste dva alikvota biološkog uzorka. Prvi se priprema pre upotrebe u testu, tako što se uzorak preinkubira u prisustvu pufera za test u rastvoru tokom određenog perioda vremena (npr. 30 minuta, jedan sat, ili duže, kao što je preko noći, na 4°C). Drugi alikvot se priprema pre upotrebe u testu, tako što se uzorak preinkubira u prisustvu HPVLP u rastvoru tokom određenog perioda vremena (npr. 30 minuta, jedan sat, ili duže). Dva alikvota se zatim koriste u HPVLP testu kao što je ovde opisano, i obavlja se opredeljivanje uzorka kao pozitivnog ili negativnog za antitelo na JCV. Ako su rezultati testa za alikvot inkubiran sa HPVLP u rastvoru isti kao za prvi uzorak inkubiran sa puferom u primarnom testu (tj. približno ista OD), tada se uzorak tumači kao negativan na prisustvo antitela specifičnih za JCV. Ako su rezultati testa niži nakon preinkubacije (tj. u sekundarnom testu), tada se tumači da uzorak sadrži antitela specifična za JCV.

[0067] Test prema pronalasku ovde je takođe označen kao „dvostepeni ogled" ili „dvostepeni test".

Izveštavanje o rezultatima testa

[0068] Test uključuje očitavanje koje može da predstavlja nivo (npr. OD) izražen u odnosu na referentni uzorak ili očitavanje koje predstavlja procenu da li je uzorak pozitivan, negativan, ili

1

neopredeljen za prisustvo antitela na JCV.

[0069] HPVLP može da bude obezbeđen u bilo kom obliku, npr. tečnom, suvom, polu-suvom ili liofilizovanom obliku, ili u obliku za skladištenje u zamrznutom stanju. Pripremljene HPVLP čestice se stalože i čuvaju u polu-čvrstom obliku.

[0070] Tipično, HPVLP čestice su obezbeđene u obliku koji je sterilan. Kada je HPVLP obezbeđena u tečnom rastvoru, tečni rastvor je u principu vodeni rastvor, npr. sterilni vodeni rastvor. Kada je HPVLP obezbeđena u suvom obliku, rekonstitucija se u principu postiže dodatkom pogodnog rastvarača. Rastvarač, npr. sterilni pufer, može opciono da bude obezbeđen u kompletu.

[0071] U nekim slučajevima, biološki uzorak se obezbeđuje izvođaču testa, npr. pružaocu usluge (kao što je ustanova trećeg lica) ili zdravstvenom radniku, koji procenjuje uzorak u testu i obezbeđuje očitavanje. Na primer, u jednom slučaju, izvođač testa prima biološki uzorak dobijen od subjekta, kao što je uzorak plazme, krvi ili seruma, i procenjuje uzorak korišćenjem testa koji je ovde opisan, i određuje da uzorak sadrži antitela na JCV. Izvođač testa, npr. pružalac usluge ili zdravstveni radnik, može zatim da zaključi da je subjekt u povišenom riziku od PML. Izvođač testa može dodatno da odredi da subjekt nije kandidat za lečenje imunomodulatorom, kao što je anti-VLA terapija, kao što je natalizumab, ili da subjekt jeste kandidat za primanje terapije imunomodulatorom, ali će kandidat biti podvrgnut pojačanom praćenju u poređenju sa subjektom za koga je utvrđeno da nema antitela na JCV. Na primer, kandidat će češće biti ispitivan za pojavu neželjenih simptoma, kao što su simptomi koji mogu da ukažu na razvoj PML.

[0072] Izvođač testa može da izvede test koji je ovde opisan i utvrđuje da subjekt nema detektabilna antitela na JCV. Izvođač testa dalje utvrđuje da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom kao što je natalizumab. Izvođač testa obaveštava zdravstvenog radnika da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom, i kod kandidata se primenjuje i munomodulator.

[0073] Izvođač testa može da obezbedi rezultate procene, i opciono, zaključke u pogledu jedne ili više od, dijagnoze, prognoze ili pogodnih opcija za terapiju, na primer, zdravstvenom radniku ili pacijentu ili osiguravajućoj kompaniji, u bilo kom pogodnom formatu, kao što je poštom ili elektronski, ili putem baze podataka na internetu. Informacije koje je sakupio i obezbedio izvođač testa, mogu da se čuvaju u bazi podataka.

[0074] Pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima, koje ne treba shvatiti kao dodatno ograničavajuće.

PRIMERI

Primer 1: Sinteza i prečišćavanje visoko prečišćenih VP1 čestica

1

[0075] HPVLP čestice koje se sastoje od VP1 proteina kapsida JCV ili BKV proizvedene su u insekatskim ćelijama SF9 koje su transfektovane rekombinantnim bakulovirusom. U slučaju čestica koje sadrže JCV VP1, rekombinantni bakulovirus je transformisan nukleinskom kiselinom koja eksprimira VP1 iz Mad-1 soja JCV. Rekombinantni VLP je sakupljen pre liziranja ćelija i prečišćen diferencijalnim ultracentrifugiranjem, pranjem deterdžentom i ultrafiltracijom.

[0076] Ukratko, ćelije inficirane bakulovirusom su sakupljene oko tri dana nakon infekcije, centrifugiranjem na 3000 x G i čuvane zamrznute do prečišćavanja HPVLP čestica. Prečišćavanje je izvedeno korišćenjem oko 100 grama zamrznutih ćelijskih taloga. Odmrznute ćelije su lizirane u 500 ml PBS sa dodatkom 0,1 mM CaCl2(PBS-C). Ćelije su razbijene propuštanjem ćelijske suspenzije dva puta kroz Microfluidics Microfluidizer<®>. Ćelijski ostaci su uklonjeni taloženjem na 8000 x G tokom 15 minuta. Zapremina supernatanta je podešena na 720 ml sa PBS-C i naneta na slojeve 40% saharoze od 5 ml. HPVLP čestice su dva puta staložene kroz slojeve saharoze u SW28 rotoru na 100 000xG tokom 5 sati. Talozi HPVLP su resuspendovani u PBS-CaCl2i zatim tretirani sa 0,25% deoksiholatom 1 sat na 37°C nakon čega je dodato 4 M NaCl obogaćenog sa 0,1 mM CaCl2tokom 1 sata na 4°C. Staloženi materijal je uklonjen centrifugiranjem na 8000 × G tokom 15 minuta. Dobijeni supernatant je koncentrovan i pufer izmenjen ultrafiltracijom kroz membranu Pelicon-2 od 500000 MWCO (Millipore). Koncentrovane VLP čestice su nanesene u sredinu stepenastog gradijenta od 25-40% Optiprep<™>(Sigma, St. Louis, MO) i raspoređene u trake na 190000 g tokom 17 sati u rotoru tipa 50.2. Trake VLP su sakupljene i zatim podvrgnute koncentrovanju i zameni pufera u Amicon ćeliji sa mešanjem (Millipore) sa membranom od 300000 MWCO (granična vrednost molekulske težine). Koncentrovani materijal je filtriran kroz 0,22 µ PES (polietarsulfon) filter i čuvan na 4°C. VLP čestice pripremljene na ovaj način se ovde nazivaju HPVLP čestice. Kvalitet VLP se uopšteno određuje gel elektroforezom i elektronskom mikroskopijom.

[0077] Da bi se denaturisale VLP čestica u cilju određivanja proteina, dodati su EDTA, DTT i SDS do finalnih koncentracija od 2mM, 2mM i 2%, redom. Koncentracija potpuno denaturisanih proteina određena je korišćenjem testa Pierce BCA (bicinhoninska kiselina).

[0078] Za analizu gel elektroforezom, zapremina dovoljna da bi se dobilo 2 µg do 5 µg ukupnih proteina je nanesena na gotove poliakrilamidne gelove od 4% do 20% (NOVEX, San Diego, CA) korišćenjem NuPAGE<®>puferskog sistema morfolinetansulfonska kiselina-SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Gelovi su podvrgnuti elektroforezi pri konstantnoj struji od 70 mA/gel do 80 mA/gel tokom 30 minuta. Proteinske trake su fiksirane 50% metanolom i 10% sirćetnom kiselinom u destilovanoj vodi i vizuelizovane komercijalnim koloidnim komazi plavo reagensom (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača.

[0079] VLP čestice su procenjene korišćenjem elektronske mikroskopije. VLP uzorci su

1

smešteni na ugljenične rešetke, blago oprani u vodi i negativno obojeni uranil acetatom i ostavljeni da se osuše. Rešetke su posmatrane i snimane na Tecnai<™>G2 Spirit BioTWIN TEM.

[0080] Alternativni postupak za prečišćavanje JCV VP1-VLP prikazan je u nastavku teksta, u primeru 7.

Primer 2: Primer HPVLP testa za antitela koji nije deo pronalaska

[0081] Osetljivi test za anti-JCV antitela razvijen je korišćenjem HPVLP čestica i može da se koristi zajedno sa konfirmatornim testom koji predstavlja postupak za koji se traži zaštita. On je ovde opisan i označen kao HPVLP test. U primeru testa, mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića su pripremljene dodavanjem rastvora koji sadrži HPVLP u koncentraciji od 1 μg/ml i inkubacijom ploče preko noći na 4°C. Bunarčići su isprani sa puferom za razblaživanje, a zatim blokirani tokom jednog sata na sobnoj temperaturi sa kazeinskim puferom za blokiranje i isprani sa puferom za razblaživanje. Kontrole za test i uzorci seruma ili plazme su razblaženi 1:200 u razblaživaču za test. Razblaženi uzorci i kontrole su dodati u bunarčiće i inkubirani jedan sat na sobnoj temperaturi i isprani puferom za razblaživanje. Detekcija je izvedena korišćenjem magarećeg anti-humanog-HRP antitela (IgG), koje je dodato u bunarčiće i inkubirano na sobnoj temperaturi jedan sat. Ploče su zatim isprane i dodat je TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin) pufer (Chromagen, Inc., San Diego, CA). Nakon razvijanja tokom vremena pogodnog da se dozvoli da se boja razvije (oko 20 minuta), reakcija je zaustavljena dodatkom 1 N H2SO4, i očitana je apsorbanca na 450 nm. Nivoi anti-JCV antitela u uzorcima su izraženi kao OD jedinice.

[0082] Test je interpretiran kao što je opisano u nastavku teksta, korišćenjem OD jedinica za određivanje nivoa.

[0083] Ako su nepoznati uzorci proizveli kompetitivnu inhibiciju vezivanja za HPVLP u rastvoru veću od 40%, smatrano je da je uzorak JCV+ (JCV pozitivan), gde je inhibicija <40% ocenjena kao JCV- (JCV negativan).

[0084] Inicijalno, uzorci sa vrednostima OD većim od granične vrednosti OD (srednja vrednost OD negativne kontrole × 1,23) definisani su kao pozitivni za prisustvo antitela na JCV, dok su uzorci sa vrednostima OD jednakim ili manjim od granične vrednosti OD definisani kao negativni.

[0085] Kontrole korišćene u testu su odabrane na osnovu ciljne OD i specifičnosti (kao što je određeno u sekundarnom konfirmacionom testu za specifičnost (opisano infra) i uključuju pozitivnu kontrolu 1, koja je predstavljala združene serume davalaca sa visokom reaktivnošću u testu definisanom tako da ima ciljnu vrednost OD od oko 1,0 i za specifičnost, u kompeticiji sa JCV >80%; pozitivnu kontrolu 2, koja je sadržala sakupljene serume davalaca sa nižom reaktivnošću u testu definisanom tako da ima ciljnu vrednost OD od oko 0,25 u testu; i za

1

specifičnost, u kompeticiji sa JCV >80%; i negativnu kontrolu, koja je predstavljala sakupljene serume davalaca sa reaktivnošću sličnom onoj kod kontrole za pufer u testu koja ima ciljnu vrednost OD od približno 0,07 (zapaziti da pufer za test ima vrednost O.D. od približno 0,045).

[0086] U nekim slučajevima, izveden je test titracije u kome su pozitivni uzorci bili testirani u većem broju razblaženja, i najveće razblaženje koje daje vrednost OD veću od granične vrednosti OD definisano je kao titar JCV IgG.

[0087] Testovi su validirani u pogledu specifičnosti, preciznosti, interferencije sa matriksom, robusnosti i stabilnosti reagenasa.

Primer 3: Sekundarni konfirmacioni test

[0088] U postupku prema pronalasku, sekundarni konfirmacioni test (sekundarni test) izveden je dodatno uz test opisan supra.U konfirmacionom testu, uzorci (plazma ili serum) su inkubirani sa HPVLP (finalna koncentracija VLP = 1 µg/mL; finalno razblaženje uzorka = 1:200) jedan sat na sobnoj temperaturi pre upotrebe u testu. Kontrolni uzorci su inkubirani u puferu za test, i ne u prisustvu HPVLP. Test je zatim izveden kao što je opisano prethodno u tekstu. Procenat inhibicije nOD450izračunat je kao: % inhibicije = 100 × [1- (prosečna nOD450) (uzorci preinkubirani sa JCV MAD-1 VLP) ÷ (prosečna nOD450) (uzorci inkubirani sa puferom)].

[0089] Ako su rezultati testa nakon preinkubacije sa puferom bili isti kao i u primarnom testu (tj. približno ista O.D.), tada je uzorak interpretiran kao negativan na prisustvo antitela specifičnih za JCV. Ako su rezultati testa bili niži nakon preinkubacije sa HPVLP česticama (tj. u sekundarnom testu), tada je uzorak interpretiran kao da sadrži antitela specifična za JCV.

Primer 4: Algoritam za graničnu vrednost skrining/konfirmacionog testa

[0090] Serološki test (test za antitela na JCV) je konfigurisan kao dvostepeni test: skrining ELISA i dodatni konfirmacioni ELISA test (sekundarni test).

[0091] Za poređenje rezultata između test ploča, ciklusa testa, i analitičara, rezultati uzoraka su normalizovani pomoću vrednosti optičke gustine (OD450) pozitivne kontrole na ploči i prijavljeni kao normalizovana OD450, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0092] Za implementiranje upotrebe HPVP testa, granične vrednosti su izvedene korišćenjem Vejbulovog trokomponentnog modela sa mešovitom raspodelom. U ovim određivanjima, korišćene su sledeće definicije:

[0093] Na primer:

2

Prosečna vrednost (uzorak_OD_duplikati) = 0,60

Prosečna vrednost (pozitivna kontrola 1 OD_replikati) = 1,20

Normalizovana OD=0,60/1,20=0,50.

Za konfirmacioni test

[0094]

[0095] U dodatnom konfirmacionom ELISA testu, korišćena je rastvorljiva HPVLP za preadsorpciju visoko afinitetnih antitela na JCV u uzorcima, pre procene uzoraka u skrining ELISA testu. Rezultati su izračunati kao procenat inhibicije za određivanje smanjenja reaktivnosti u skrining ELISA testu nakon što su uzorci preadsorbovani sa HPVLP [% inhibicije = 100 × [1- (prosečna nOD450uzoraka preinkubiranih sa HPVLP) ÷ (prosečna nOD450uzoraka inkubiranih sa puferom)].

[0096] Lažno pozitivne i lažno negativne stope su definisane kao što sledi. Lažno negativna stopa je proporcija istinski pozitivnih uzoraka na JC virus za koje je pomoću testa određeno da su negativni na antitelo. Seropozitivna stopa je proporcija uzoraka za koje je utvređeno da su seropozitivni (tj. da imaju antitela na JCV, što je određeno korišćenjem algoritma za graničnu vrednost skrining/konfirmacionog anti-JCV testa).

[0097] Podaci su analizirani korišćenjem SAS v9. Podaci koji ne pokazuju normalnu raspodelu su analizirani pomoću Man-Vitnijevog U testa. Kategorijski podaci su analizirani korišćenjem Pirsonovog χ2 testa ili Fišerovog egzaktnog testa u zavisnosti od veličine uzorka. Pirsonov koeficijent korelacije je korišćen za procenu odnosa između nOD450i nivoa JCV DNK u urinu. Svi testovi su bili dvostrani pri alfa nivou od 0,05. Intervali poverenja za seroprevalenciju i lažno-negativne stope su dobijeni pomoću „bootstrap" percentilnog postupka (6) korišćenjem 10000 „bootstrap" ponavljanja.

Primer 4(a): Serološka reaktivnost na JCV

[0098] Ispitivanje je sprovedeno da bi se uspostavio test za detekciju anti-JCV antitela kod MS pacijenata i da bi se izvela preliminarna procena potencijalne kliničke korisnosti testa za stratifikaciju rizika od PML. Za karakterizaciju odgovora antitela na infektivne agense kod ljudi, bilo je kritično posedovanje referentnih seruma, kako od zaraženih, tako i od nezaraženihosoba. Iako asimptomatska priroda JCV infekcije onemogućava da se identifikuju „istinski" negativnih osoba, podnosioci prijave su mogli da identifikuju populaciju „istinski" pozitivnih osoba merenjem JCV DNK u urinu „uropozitivnih" osoba.

[0099] Nivoi JCV DNK u urinu (prikupljeni u STRATA (reinicijacija doziranja natalizumaba) protokolu kliničkog ispitivanja) određeni su testom kvantitativne lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (q-PCR) (ViraCor Laboratories, Lee's Summit, MO) sa granicom kvantitativnog određivanja od 500 kopija/mL i granicom detekcije od 50 kopija/mL.

[0100] Status anti-JCV antitela u 831 uzorku seruma pacijenata sa MS, koji uključuju uzorke uzete od 204 JCV uropozitivna pacijenata, inicijalno su procenjeni za anti-JCV antitela u skrining ELISA testu za određivanje raspodele seroloških odgovora. Rezultati testa prema DNK statusu urina pokazali su prisustvo dve preklapajuće, a ipak različite populacije IgG reaktivnosti na JCV (SL.1). Medijana za nivo reaktivnosti kod pacijenata sa MS čiji je urin pozitivan na JCV DNK (nOD450= 0,895) bio je značajno viši nego kod pacijenata sa MS čiji je urin negativan na JCV DNK (nOD450= 0,131; p<0,001), i nijedan uropozitivni pacijent nije pokazao reaktivnost u testu ispod nOD450od 0,10. Stoga je niža granična vrednost za test uspostavljena na nOD450od 0,10, dok je empirijska lažno-negativna stopa u negativnoj zoni bila 0%.

[0101] Mnogi pacijenti bez detektabilne JCV DNK u urinu (uronegativni) imali su serološku reaktivnost sličnu onoj kod uropozitivnih pacijenata. Ovi rezultati su konzistentni sa pretpostavkom da test na JCV DNK u urinu verovatno neće uspeti da detektuje sve osobe zaražene sa JCV.

Primer 4(b): Opterećenje urina sa JCV DNK i serološka aktivnost

[0102] Da bi se rešio potencijalni problem da pacijenti inficirani sa JCV sa niskim nivoima virusne replikacije mogu da imaju niske serumske nivoe antitela koji se ne detektuju u serološkom testu (potencijalno lažno negativni) ispitivana je korelacija nivoa virusa i reaktivnosti antitela. SL. 2 prikazuje podatke za 204 JCV DNK uropozitivna STRATA pacijenata, i ilustruje da nema detektabilnog odnosa između nivoa JCV DNK u urinu i nivoa anti-JCV antitela u uzorcima sa nOD450ispod 0,60 (Pirsonov koeficijent korelacije = 0,048, p=0,751). Ovaj rezultat važi čak i ako su urin i serum sakupljeni u istoj vremenskoj tački STRATA ispitivanja (Pirsonov koeficijent korelacije = 0,002, p=0,993). Pri nOD450> 0.60, primećena je jača korelacija sa većom proporcijom uzoraka seruma osoba sa velikim brojem JCV DNK kopija/mL koji ispoljavaju više vrednosti nOD450, konzistentno sa izveštajima u literaturi (npr. Egli et al., J. Infect. Dis. 199:837-846, 2009). Ovi podaci ukazuju na to da seronegativni rezultati verovatno nastaju zbog odsustva infekcije sa JCV, pre nego zbog veoma niskih nivoa virusa.

Primer 4(c): Procena unakrsne reaktivnosti BKV-JCV

[0103] Dodeljivanje jedinstvene konzervativne granične vrednosti koja kontroliše lažno negativnu stopu na 0% verovatno neće isključiti detekciju antitela koja unakrsno reaguju sa drugim uobičajenim polioma virusima (lažno pozitivni), kao što su anti-BKV antitela, koja imaju visok stepen identičnosti sa JCV u VP1 proteinu kapsida. Dodatno, ova unakrsna reaktivnost antitela može da se javi usled izlaganja očuvanih virusnih epitopa kada se ELISA ploča direktno oblaže sa HPVLP. Budući da kod ljudi može da dođe do dualnih infekcija sa BKV i JCV i da nije moguće pouzdano identifikovati pacijente koji su inficirani sa BKV a ne sa JCV, problem unakrsne reaktivnosti je ispitan na zečevima, vrsti kod koje ne može da se javi prirodna infekcija ni sa BKV, ni sa JCV.

[0104] Zečevi su imunizovani sa BKV subkutanom injekcijom proteina u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru bez adjuvansa, praćeno sa tri buster injekcije tokom perioda od tri meseca. Direktno vezivanje za JCV ili BKV u uzorcima seruma je testirano pomoću ELISA testa. Antiserumi zečeva imunizovanih sa BKV vezivali su BKV VLP čestice sa visokim afinitetom (EC50 = 1:100000) i unakrsno reagovali sa HPVLP česticama sa nižim afinitetom (EC50 = 1:5000). Preimunski serumi nisu pokazali reaktivnost. Reprezentativni podaci za jednog zeca prikazani su na SL.3.

[0105] Usled toga što BKV antitela unakrsno reaguju sa JCV, produkujući tako lažno pozitivni signal u anti-JCV testu (SL. 3), nizak nivo reaktivnosti na JCV kod ljudi može da predstavlja nisko afinitetna anti-BKV antitela koja unakrsno reaguju sa JCV i produkuju lažno pozitivne signale.

Primer 4(d): Merenje odgovora antitela specifičnog za JCV (dodatni konfirmacioni ELISA test)

[0106] Da bi se razlikovali pacijenti sa antitelima specifičnim za JCV od pacijenata sa unakrsno reaktivnim antitelima, potencijalno niskog afiniteta, razvijen je kompetetivni ELISA test u kome se koriste rastvorljive HPVLP (sekundarni test). Očekuje se da rastvorljivi antigen bude efikasniji u kompeticiji za antitela sa višim afinitetom, specifična za JCV, dok antitela sa nižim afinitetom mogu da se odvoje iz kompleksa obrazovanih sa JCV antigenom u rastvoru i vežu za JCV VLP kojima je obložena ploča za ELISA test. Podskup od 515 uzoraka seruma od uropozitivnih (n=204) i uronegativnih (n=311) pacijenata je sistematski i neproporcionalno uzorkovan za procenu u ELISA testu nakon preadsorpcije ili sa rastvorljivim JCV VLP ili sa puferom za test. Na SL. 4A i 4B, uporedno je prikazana reaktivnost uzoraka seruma od uronegativnih ili uropozitivnih pacijenata u skrining testovima i konfirmacionim testovima. Uzorci sa jakom reaktivnošću na JCV bili su visoko inhibirani preadsorpcijom antitela sa rastvorljivim JCV, dok su uzorci sa niskim nivoima antitela na JCV pokazali diferencijalnu kompeticiju. Postojala je jaka kompeticija za odgovore antitela kod većine uropozitivnih pacijenata (SL. 4B). Ovi rezultati podržavaju ideju da značajna proporcija niske serumske

2

reaktivnosti na JCV može da bude posledica unakrsne reaktivnosti antitela koja nisu specifična za JCV.

[0107] Raspodela serumskih odgovora u konfirmacionom ELISA testu sastojala se od dva definisana vrha, najoptimalnije razdvojena na 40% inhibicije (SL. 5A) koja odgovara približno donjem 5. percentilu distribucije odgovora uropozitivnih uzoraka (SL. 5B). Stoga je nivo inhibicije od 40% odabran kao granična vrednost za konfirmacioni ELISA test.

Primer 4(e): Finalizovani dvostepeni anti-JCV serološki test

[0108] Kombinovanjem skrining i konfirmacionih testova, verovatnoća detektovanja uzoraka sa „istinskim" antitelima specifičnim za JCV je značajno povećana. U finalnoj analizi, uzorci sa vrednostima nOD450<0,10 u skrining ELISA testu smatraju se negativnim za antitela na JCV, a oni sa vrednostima nOD450>0,25 u skrining ELISA testu smatraju se pozitivnim za antitela na JCV. Uzorci sa reaktivnošću između vrednosti nOD od 0,10 do 0,25 su dodatno ispitivani u konfirmacionom ELISA testu. U konfirmacionom ELISA testu, svi uzorci koji ispoljavaju inhibiciju > 40% klasifikovani su kao pozitivni (SL. 4). Pri vrednostima nOD450>0,25 verovatnoća beleženja inhibicije >40% bila je približno 95%.

Primer 4(f): Seropozitivnost na JCV u STRATA kohorti i lažno negativna stopa

[0109] Na osnovu algoritma koji je prikazan prethodno u tekstu, stopa seroprevalencije u populaciji STRATA procenjena je na 53,6% sa 95% granicama poverenja određenim „bootstrap" metodom u opsegu od 49,9% do 57,3% [0,536 = 0,451 (verovatnoća nOD450>0,25 u skrining ELISA testu) 0,085 (verovatnoća da se nOD450nalazi između 0,10 i 0,25 u skrining ELISA testu, i %-inhibicije >40% u dodatnom konfirmacionom ELISA testu)]. Ovo izračunavanje seroprevalencije je pretpostavilo potvrdu anti-JCV antitela u jednakim proporcijama uzoraka od uropozitivnih i uronegativnih subjekata u oblasti nOD između 0,10 i 0,25. (procenat inhibicije >40%); ova pretpostavka je podržana dvostranim Fišerovim egzaktnim testom sa pvrednošću od 0,702.

[0110] Od 204 uropozitivna pacijenta, pet je imalo nOD450između 0.10 i 0,25 i za njih nije potvrđeno da imaju antitela specifična za JCV (procenat inhibicije ≤40%; SL.4B).

Primer 5: Validacija testa

[0111] Validaciju testa je sprovela firma Focus Diagnostics, Inc. (Cypress, CA), gde su demonstrirani parametri performanse uključujući preciznost za različite testove i unutar jednog testa, specifičnost, osetljivost i stabilnost reagenasa za test, i kontrola. Demonstrirani su parametri performanse uključujući preciznost za različite testove i unutar jednog testa, specifičnost, osetljivost i stabilnost reagenasa za test, i kontrola. Parametri preciznosti su procenjivani od strane tri nezavisna analitičara, kako u plazmi, tako i u serumu, u četiri različita dana korišćenjem nezavisnih preparacija kontrola za test. Za demonstraciju specifičnosti testa, deset pojedinačnih uzoraka seruma i plazme zdravih dobrovoljaca ili pacijenata sa MS (naivni za TYSABRI<®>(natalizumab)) je preinkubirano ili sa puferom za test ili sa definisanom koncentracijom HPVLP ili BKV VLP u rastvoru. Robusnost je procenjena variranjem gornjih i donjih granica vremena inkubacije za korake dodavanja uzorka, konjugata i supstrata i različite serije HPVLP reagensa za oblaganje su procenjene kako bi se demonstrirala konzistentnost performanse kontrole za test. Interferencija sa matriksom je procenjena određivanjem procentualnog izdvajanja u uzorcima u koje su dodate predefinisane koncentracije anti-JCV antitela i dodavanjem u uzorke koji sadrže antitela specifična za JCV različitih koncentracija irelevantnih humanih monoklonskih antitela.

Primer 6: Određivanje statusa antitela na JCV kod pacijenata sa PML

[0112] Uzorci plazme i seruma (pojedinačne vremenske tačke slučajno odabrane iz niza sakupljanja) dobijeni su od ukupno 831 pacijenta iz studije bezbednosti ponovnog doziranja i lečenja lekom TYSABRI (STRATA). STRATA je otvorena, multinacionalna studija (Severna Amerika, Evropa, Australija i Novi Zeland) sa jednom grupom pacijenata, u kojoj svi pacijenti primaju natalizumab u dozi od 300 mg intravenskom infuzijom svake 4 nedelje tokom 48 nedelja. U uzorcima urina sakupljenim prema protokolu STRATA ispitivano je prisustvo JCV DNK.

[0113] Od odobrenja za plasiranje na tržište leka TYSABRI<®>u junu 2006. do 9. februara 2010, prijavljeno je 35 slučajeva PML pri lečenju natalizumabom. Dodatno, tri slučaja PML su postojala u kliničkim ispitivanjima pre odobrenja natalizumaba (10, 13, 25). Uskladišteni uzorci dobijeni su iz što je više moguće slučajeva PML u vremenskim tačkama pre postavljanja dijagnoze PML (pre-PML). Uzorci plazme ili seruma bili su dostupni samo od 11 pacijenata sa PML lečenih natalizumabom (10 pacijenata sa MS i 1 pacijent sa Kronovom bolešću: Tabela 1). Testirani su uzorci seruma koji su dobijeni od jedne do tri godine pre postavljanja dijagnoze PML. Skoro svi ovi uzorci su sakupljeni od pacijenata koji su učestvovali u registracijama ili kliničkim ispitivanjima i čuvani su na -70C° do ispitivanja. Značajno je da su anti-JCV antitela detektovana kod svih 11 pacijenata (100%) putem kombinacije skrining ELISA testa za serološki status i dodatnog konfirmacionog ELISA testa (SL. 6A i 6B) koji je opisan prethodno u tekstu. Korišćenjem Fišerovog egzaktnog testa na jednom uzorku, ovaj rezultat bio je značajno drugačiji od očekivane proporcije (53,6%) sa p-vrednošću od 0,002.

[0114] Ovi podaci ukazuju na to da test prema predmetnom pronalasku može da se koristi za

2

određivanje prisustva ili odsustva antitela na JCV kod subjekata, kao deo ukupne procene rizika za oboljevanje od PML.

Tabela 1. Uzorci 11 pacijenata sa PML, lečenih natalizumabom, čiji su uzorci krvi pre postavljanja dijagnoze bili dostupni.

2

[0115] Podaci iz longitudinalnog ispitivanja drugih subjekata koji su uzimali imunomodulator takođe su procenjivani (tj. veći broj uzoraka sakupljenih u različitim trenucima od jedne osobe). Podaci iz longitudinalnog ispitivanja ukazali su da, za razliku od povremenog ispitivanja izbacivanja DNK u urinu, HPVLP test može pouzdano da se koristi za procenu statusa anti-JCV antitela, i da status antitela na JCV ostaje relativno stabilan (u odsustvu de novo infekcije).

Primer 7: Alternativni postupak za prečišćavanje VP1-VLP iz JCV

[0116] Ovaj postupak je primer alternative postupku ultracentrifugiranja ugradijent gustin koji je opisan prethodno u tekstu za prečišćavanje JCV VP1-VLP čestica iz insekatskih ćelija. Opšti koraci protokola su liziranje, tretman benzonazom, taloženje deoksiholatom, taloženje amonijum sulfatom i koncentrovanje/dijafiltracija, sa finalnim korakom jonske izmene u kome se koristi TMAE fraktogel.

[0117] Ćelije Sf9 inficirane JCV-VP1 bakulovirusom lizirane su u PBS, 0,1 mM CaCl2propuštanjem dva puta kroz mikrofluidizirajući razbijač ćelija na 5000 psi. Ćelijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem na maloj brzini i supernatant je tretiran sa 40 jedinica/ml benzonaze (EMD Biosciences 71206-3) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Za korak taloženja sa deoksiholatom, jedna desetina zapremine 2,5% deoksiholata dodata je lizatu (0,25% finalni deoksiholat), i lizat je inkubiran na 37°C tokom 1 sata uz pažljivo mešanje. Lizatu je dodat 0.1 mM NaCl zapremine jednake 4 M NaCl, i lizat je inkubiran na ledu 1 sat. Talog je uklonjen centrifugiranjem na maloj brzini. Supernatant je zatim istaložen sa 40% amonijum sulfata da bi se uklonili kontaminirajući proteini. Finalnih 40% dobijeno je korišćenjem 232 g čvrstog amonijum sulfata po litru rastvora. Uz pažljivo mešanje rastvora na 4°C, amonijum sulfat je dodavan po petinu odjednom, ostavljajući da se svaki dodatak rastvara 10 do 15 minuta pre dodavanja sledeće frakcije. Rastvor je pažljivo mešan preko noći na 4°C. Talog amonijum sulfata je uklonjen centrifugiranjem na maloj brzini i supernatant koji sadrži VP1 je filtriran korišćenjem

2

filtera od 0,45 µm i prenet u sledeći korak. Rastvor je koncentrovan 5 do 10 puta korišćenjem NMWL TFF membrane od 100 kDa (Pellicon 2 Mini UF Mod Biomax-100 C 0.1m<2>, P2B100C01) i zamenjen puferom za sklapanje (25 mM tris, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,5) razblaživanjem 5 puta i ponovnim koncentrovanjem na polaznu zapreminu dva puta. Rastvor je čuvan na 4°C >/= 36 sati. Rastvor je zatim podvrgnut dijafiltraciji korišćenjem NMWL TFF membrane od 500 kDa (Pellicon 2 Mini UF Mod Biomax-500 V, Millipore part # P2B500V01) korišćenjem 40 zapremina TMA pufera za hromatografiju (25 mM tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 8,0). Za hromatografiju, približno 1 ml smole je potreban na 2 g polazne ćelijske mase. Protein je nanesen na TMAE kolonu odgovarajuće veličine (Fractogel<®>EMD TMAE HiCap (M) - EMD Biosciences kat. 1.10316) i ispran sa 3 zapremine kolone pufera za hromatografiju. VLP čestice su eluirane sa 25 mM tris, 600 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 8,0. Čistoća VP1 je procenjena pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije, prisustvo VLP čestica je potvrđeno elektronskom mikroskopijom, i procenat ukupnog proteina u obliku VLP čestica određen je analitičkim ultracentrifugiranjem metodom sedimentacione brzine. Ovaj postupak rezultovao je u HPVLP preparacijama sa oko 80% HPVLP čestica.

2

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. In vitro postupak za identifikaciju subjekta u riziku od razvoja progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), koji obuhvata primarni i sekundarni test;

pri čemu primarni test obuhvata:

(a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka, dobijenog od subjekta, sa visoko prečišćenim VP1 česticama (HPVLP česticama) koje se sastoje pretežno od VP1 proteina iz JCV, imobilisanim na čvrstoj podlozi, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JC virus (JCV) u uzorku, za HPVLP;

(b) detekciju nivoa vezivanja antitela na JCV u uzorku, za HPVLP čestice; i

(c) korelisanje detektovanog nivoa sa referentnim nivoom dobijenim od kontrolnog uzorka ili skupa uzoraka koji se obrađuju sa uzorkom dobijeni od subjekta;

i pri čemu sekundarni test obuhvata:

(a) dovođenje u kontakt dela biološkog uzorka, dobijenog od subjekta, sa visoko prečišćenim česticama sličnim virusu (HPVLP česticama), koje se sastoje pretežno od VP1 proteina JCV, u rastvoru, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JCV u uzorku, za HPVLP, čime se obezbeđuje preinkubirani uzorak;

(b) dovođenje u kontakt preinkubiranog uzorka sa HPVLP česticama koje se sastoje pretežno od VP1 proteina iz JCV, imobilisanim na čvrstoj podlozi, pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JCV u uzorku, za HPVLP;

(c) detektovanje nivoa antitela na JCV u preinkubiranom uzorku, koja se vezuju za imobilisane HPVLP čestice; i

(d) upoređivanje detektovanog nivoa antitela na JCV u preinkubiranom biološkom uzorku sa nivoom antitela na JCV u detektovanom u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, koji je preinkubiran u rastvoru bez HPVLP čestica, i koji je bio u kontaktu sa HPVLP imobilisanim na čvrstoj podlozi pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela na JCV u uzorku, za HPVLP, pri čemu se HPVLP čestice sastoje od više od 5, najmanje 50, 150 ili 360 VP1 polipeptida; pri čemu smanjenje detektovanog nivoa antitela na JCV u preinkubiranom biološkom uzorku u poređenju sa biološkim uzorkom dobijenim od subjekta, koji je preinkubiran u rastvoru bez HPVLP čestica, ukazuje na to da je uzorak pozitivan za antitela na JCV i da je subjekt u povećanom riziku od razvoja PML,

a promena detektovanog nivoa antitela na JCV ispod specifičnog procenta ukazuje na to da u uzorku nije prisutno antitelo specifično za JCV.

2

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se biološki uzorak dovodi u kontakt sa HPVLP česticama u rastvoru tokom vremenskog perioda odabranog od 30 minuta, jednog sata ili preko noći, na 4°C.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je specifično navedeni procenat 40%, i u postupku se koristi HPVLP ELISA test.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je referentni nivo odabran tako da obezbeđuje lažno negativnu stopu od 3% ili manje, za detekciju antitela na JCV, u uzorku dobijenom od subjekta.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je referentni nivo odabran tako da obezbeđuje lažno negativnu stopu od 1% ili manje, za detekciju antitela na JCV, u uzorku dobijenom od subjekta.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se biološki uzorak dobijen od subjekta klasifikuje kao negativan za antitela na JCV, kada je nivo antitela na JCV u preinkubiranom biološkom uzorku, koji se vezuje za imobilisane HPVLP čestice, približno isti kao nivo antitela na JCV koji je detektovan u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, koji je preinkubiran u rastvoru bez HPVLP čestica.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što HPVLP čestice sadrže više od 1, najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 72 VP1 pentamera.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što:

(i) HPVLP dodatno sadrži najmanje jedno od, VP2 iz JCV ili VP3 iz JCV; ili

(ii) VP1 u HPVLP je rekombinantni VP1; ili

(iii) najmanje jedan VP1 u HPVLP je mutantni VP1.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je biološki uzorak serum.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što biološki uzorak potiče od subjekta kome je prepisan imunomodulator ili subjekta koji razmatra uzimanje imunomodulatora, gde je imunomodulator izabran od anti-VLA-4 terapije, anti-CD20-terapije, anti-CD11a terapije ili mikofenolat mofetila.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što kod subjekta kome je prepisan imunomodulator, ili koji razmatra uzimanje imunomodulatora, prethodno nije primenjen imunomodulator.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je subjekat prethodno primio jednu ili više doza imunomodulatora.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što detekcija vezivanja antitela na JCV za HPVLP čestice ukazuje na to da subjekat:

(i) nije kandidat za lečenje imunomodulatorom ako je biološki uzorak pozitivan na JCV antitelo; ili

(ii) jeste kandidat za lečenje imunomodulatorom i za pojačano praćenje neželjenih simptoma nakon tretmana imunomodulatorom, pri čemu, opciono, neželjeni simptomi ukazuju na razvoj PML.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što nemogućnost da se detektuje vezivanje antitela na JCV za HPVLP čestice, ukazuje na to da je subjekt kandidat za lečenje imunomodulatorom.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se subjekt za čiji je biološki uzorak u inicijalnom ispitivanju utvrđeno da nema antitela na JCV, ponovo podvrgava testiranju za prisustvo antitela na JCV, najmanje jednom godišnje nakon inicijalnog testiranja.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se subjekt za koga je prvog datuma, postupkom prema patentnom zahtevu 1 utvrđeno da ima antitela na JCV ponovo, kasnijeg datuma, podvrgava testiranju da bi se utvrdilo da li subjekt nema antitela na JCV .

17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10-14, naznačen time što je imunomodulator natalizumab.

18. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što subjekt ima multiplu sklerozu (MS) ili Kronovu bolest (CD).

1