RS63812B1 - Il-22 fc kompozicije i postupci primene - Google Patents

Il-22 fc kompozicije i postupci primene

Info

Publication number
RS63812B1
RS63812B1 RS20221131A RSP20221131A RS63812B1 RS 63812 B1 RS63812 B1 RS 63812B1 RS 20221131 A RS20221131 A RS 20221131A RS P20221131 A RSP20221131 A RS P20221131A RS 63812 B1 RS63812 B1 RS 63812B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
months
pharmaceutical composition
fusion protein
aspects
amino acid
Prior art date
Application number
RS20221131A
Other languages
English (en)
Inventor
Bruce Kabakoff
Man Sai Cecilia Wong
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS63812B1 publication Critical patent/RS63812B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/40—Cyclodextrins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Macromonomer-Based Addition Polymer (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži Fc fuzioni protein IL-22 i nosač, pri čemu Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera, i postupke za izradu, prečišćavanje i korišćenje istog.
OSNOVE PRONALASKA
Interleukin (IL)-22 je član IL-10 porodice citokina koje proizvode, npr. ćelije Th22, NK ćelije, ćelije induktora limfoidnog tkiva (LTi), dendritske ćelije, i Th17 ćelije. IL-22 se vezuje za kompleks receptora IL-22R1/IL-10R2, koji se eksprimira u urođenim ćelijama (npr. epitelnim ćelijama, hepatocitima, i keratinocitima) i u barijernim epitelnim tkivima nekoliko organa (npr. dermis, pankreas, creva, i respiratorni sistem).
IL-22 igra važnu ulogu u imunitetu sluzokože, posredujući ranu odbranu domaćina od vezivanja i izlivanja bakterijskih patogena. IL-22 promoviše proizvodnju antimikrobnih peptida i proinflamatornih citokina iz epitelnih ćelija i podstiče proliferaciju i migraciju epitelnih ćelija debelog creva u crevima. Nakon bakterijske infekcije, IL-22 nokaut miševi pokazali su pogoršanu regeneraciju epitela creva, veliko bakterijsko opterećenje i povećanu smrtnost. Slično tome, infekcija IL-22 nokaut miševa virusom gripa dovela je do ozbiljnog gubitka težine i pogoršane regeneracije trahealnih i bronhijalnih epitelnih ćelija. Tako, IL-22 ima proinflamatornu ulogu u suzbijanju mikrobne infekcije, kao i antiinflamatornu zaštitnu ulogu u regeneraciji epitela u inflamatornim odgovorima.
Ostaje potreba za poboljšanim kompozicijama i postupcima lečenja inflamatorne bolesti creva (IBC), uključujući ulcerozni kolitis i Kronovu bolest, kao i druge poremećaje povezane sa IL-22, uključujući mikrobnu infekciju, akutnu povredu bubrega, akutni pankreatitis, rane, kardiovaskularna stanja, metabolički sindrom, akutnu endotoksemiju, bolest kalem protiv domaćina (GVHD) i sepsu.
SAŽETAK PRONALASKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži IL-22 Fc fuzioni protein i nosač, pri čemu Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera, i postupke za izradu i korišćenje istog.
Pronalazak je okarakterisan farmaceutskom kompozicijom koja sadrži Fc fuzioni protein IL-22 i nosač, pri čemu Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22, oko 5 mM metionin i oko 0,02% (m/V) polisorbata 20, pH 7,1, konačne koncentracije. Farmaceutska kompozicija dalje sadrži oko 10 mM natrijum fosfata i oko 240 mM saharoze. U nekim aspektima otkrića, natrijum fosfat je smeša monobaznog natrijum fosfata i dvobaznog natrijum fosfata.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija je u obliku jedinične doze.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, nosač je voda.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija je stabilna tokom jednog ili više ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja.
U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je stabilna tokom tri ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 2 nedelje ili duže na oko 25°C. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 4 nedelje ili duže na oko 25°C.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 48 meseci ili duže na -20°C. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 60 meseci ili duže na -20°C.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću tečne hromatografije visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC). U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 90% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC tokom oko 36 meseci ili duže na oko 5°C. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC tokom oko 42 meseca ili duže na oko 5°C. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC tokom oko 42 meseca na oko 5°C.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 75% ili više, kao što je procenjeno kapilarnom elektroforezom prosejavanjem bez gela sa natrijum dodecil sulfatom (CE-SDS-NGS) (npr. neredukovana (NR) CE-SDS-NGS). U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 80% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS) tokom oko 36 meseci ili duže na oko 5°C. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS) tokom oko 42 meseca ili duže na oko 5°C. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS tokom oko 42 meseca na oko 5°C. U bilo kom od prethodnih otelotvorenja, CE-SDS-NGS može biti NR CE-SDS-NGS.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija je formulisana za intravensku, subkutanu, intraperitonealnu ili topikalnu primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana za intravensku primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana za subkutanu primenu.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija ne sadrži konzervans. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida i/ili razblaživačem. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja razblaživačem. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida i razblaživačem. U nekim otelotvorenjima, izotonični rastvor natrijum hlorida sadrži oko 0,1% do oko 2% NaCl. U nekim otelotvorenjima, izotonični rastvor natrijum hlorida sadrži oko 0,5% do oko 1,5% NaCl. U nekim otelotvorenjima, izotonični rastvor natrijum hlorida sadrži oko 0,9% (m/V) NaCl. U nekim otelotvorenjima, razblaživač sadrži pufersko sredstvo, sredstvo za toničnost i surfaktant. U nekim otelotvorenjima, razblaživač sadrži oko 10 mM natrijum fosfat, oko 240 mM saharozu, oko 0,02% (m/V) polisorbata 20, pH 7,1, konačnu koncentraciju.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, polipeptid IL-22 je glikozilovan. U nekim otelotvorenjima, polipeptid IL-22 je N-glikozilovan. U nekim otelotvorenjima, Fc region nije glikozilovan. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je glicin (Gly). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je alanin (Ala). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na poziciji 299 kao u EU indeksu Fc regiona je Ala, Gly ili valin (Val).
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG1 ili IgG4. U nekim otelotvorenjima, Fc region sadrži CH2 i CH3 domen IgG4. U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, fuzioni protein IL-22 Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein IL-22 Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 96% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein IL-22 Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 97% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein IL-22 Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein IL-22 Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO:16. U nekim otelotvorenjima, IL-22 Fc fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, Fc fuzioni protein IL-22 sastoji se od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8. U nekim otelotvorenjima, IL-22 Fc fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10. U nekim otelotvorenjima, Fc fuzioni protein IL-22 sastoji se od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:10. U nekim otelotvorenjima, IL-22 Fc fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16. U nekim otelotvorenjima, Fc fuzioni protein IL-22 sastoji se od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16. U nekim otelotvorenjima, Fc region nije N-glikozilovan.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija dalje sadrži dodatni terapeutski agens.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija dalje sadrži sredstvo za želiranje. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za geliranje je polisaharid. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za želiranje je celulozno sredstvo. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za želiranje je metilceluloza, hidroksietil celuloza, karboksimetil celuloza, hidroksipropil celuloza, POE-POP blok polimeri, alginat, hijaluronska kiselina, poliakrilna kiselina, hidroksietil metilceluloza ili hidroksipropil metilceluloza. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za želiranje je hidroksipropil metilceluloza. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija je za topikalnu primenu.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, farmaceutska kompozicija je namenjena za upotrebu kao lek.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti creva (IBC). U nekim otelotvorenjima, IBC je ulcerozni kolitis ili Kronova bolest. U nekim otelotvorenjima, IBC je ulcerozni kolitis. U nekim otelotvorenjima, ulcerozni kolitis je umereni do teški ulcerozni kolitis. U nekim otelotvorenjima, IBC je Kronova bolest.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u inhibiranju mikrobne infekcije u crevima, očuvanju peharskih ćelija u crevima tokom mikrobne infekcije, povećanju integriteta epitelnih ćelija, proliferacije epitelnih ćelija, diferencijacije epitelnih ćelija, migracije epitelnih ćelija ili epitelnog zarastanja rana u crevima. U nekim otelotvorenjima, epitelna ćelija je epitelna ćelija creva.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži farmaceutski sastav za upotrebu u lečenju akutne povrede bubrega ili akutnog pankreatitisa.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u ubrzavanju ili poboljšavanju zarastanja rana kod ispitanika kojem je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, rana je hronična rana ili inficirana rana. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je dijabetičar. U nekim otelotvorenjima, ispitanik sa dijabetesom ima dijabetes tipa II. U nekim otelotvorenjima, rana je čir stopala dijabetičara. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se primenjuje dok ne dođe do potpunog zarastanja rane.
U drugom aspektu, pronalazak je okarakterisan farmaceutskom kompozicijom za upotrebu u sprečavanju ili lečenju kardiovaskularnog stanja kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu to stanje uključuje patologiju formiranja aterosklerotskog plaka. U nekim otelotvorenjima, kardiovaskularna bolest je bolest koronarnih arterija, koronarna mikrovaskularna bolest, moždani udar, bolest karotidnih arterija, bolest perifernih arterija ili hronična bolest bubrega. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata usporavanje progresije formiranja aterosklerotskog plaka ili sprečavanje znakova ateroskleroze. U nekim otelotvorenjima, znaci ateroskleroze uključuju akumulaciju plaka ili vaskularnu inflamaciju.
KRATAK OPIS SLIKA SL. 1 je hromatogram koji daje prikaz tečne hromatografije visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC) farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22, uključujući 10 mg/ml u 20 mM histidin acetatu, 240 mM saharozi, 0,02% polisorbata 20 (PS20) (m/V) na pH 5,5 nakon 4 nedelje na 40°C i 5°C.
SL. 2A je grafikon koji prikazuje toplotnu stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) pri 10 mg/ml u 20 mM histidin acetatu, 240 mM saharozi, 0,02% PS20 (m/V) na pH 5,5.
SL. 2B je grafikon koji prikazuje toplotnu stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 pomoću DSC pri 10 mg/ml u PBS-u na pH 7,4. Početna temperatura topljenja (Tm) za IgG4 je približno 34°C u poređenju sa PBS-om, pH 7,4 sa Tmod približno 45°C.
SL. 3A je grafikon koji upoređuje DSC profile Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM histidin acetatu na pH 5,5, 6,0, 6,5 i 7,0.
SL. 3B je grafikon koji prikazuje profile DSC i intrinzične triptofanske (Trp) fluorescencije IFc fuzionog proteina L-22 u 10 mM histidin acetatu na pH 6,0.
SL. 3C je grafikon koji prikazuje profile DSC i Trp fluorescencije Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM histidin acetatu na pH 6,5.
SL. 3D je grafikon koji prikazuje profile DSC i Trp fluorescencije Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM histidin acetatu na pH 7,0.
SL. 3E je niz grafikona koji prikazuju SE-HPLC analize, predstavljene kao procenat velike molekulske mase (% HMW) u odnosu na vreme (levi panel),% glavnog pika u odnosu na vreme (centralni panel) i % dimera u odnosu na vreme (desni panel), Fc fuzionog proteina IL-22 pod termičkim stresom u 10 mM histidin acetatu na pH 5,5, 6,0, 6,5 i 7,0 posle 4 nedelje na 30°C.
SL. 4 je grafikon koji prikazuje DSC profil farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 na pH 6,5, 7,0, 7,3 i 7,6 u 10 mM natrijum fosfatu i pH 7,3 u 20 mM tris.
SL. 5A-5B su nizovi grafikona koji pokazuju brzinu razgradnje glavnog pika (5A) i procenat agregacije tokom vremena (5B) Fc fuzionog proteina IL-22 pomoću SE-HPLC u 10 mM natrijum fosfatu, 240 mM saharozi, 0,02% polisorbata 20, pH 7,1 nakon T=0 i 6 nedelja skladištenja na 30°C.
SL. 5C-5D su nizovi grafikona koji pokazuju brzinu razgradnje glavnog pika (5C) i procenat agregacije tokom vremena (5D) fuzionog proteina IL-22 Fc pomoću SE-HPLC u 10 mM natrijum fosfatu, 240 mM saharozi, 0,02% polisorbata 20, pH 7,1 posle T=0 i 6 nedelja skladištenja na 40°C.
SL. 6 je grafikon koji prikazuje brzinu formiranja pikova kiseline pomoću snimanja kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (ICIEF) Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM natrijum fosfatu, 240 mM saharozi, 0,02% polisorbata 20, pH 7,1 nakon T = 0 i 4 nedelje skladištenja na 30°C.
SL. 7 daje hromatograme koji prikazuju SE-HPLC profile Fc fuzionog proteina IL-22 nakon studije agitacije.
SL. 8 je grafikon koji prikazuje oksidaciju metionina osam tripsinskih peptida koji sadrže metionin Fc fuzionog proteina IL-22 nakon tretmana 2,2'-azobis-2-metilpropanimidamidom, dihidrohloridom (AAPH) i tripsinskim mapiranjem peptida pomoću tečne hromatografije tandemske masene spektrometrije (LC-MS-MS). Oksidacija metionina za svaki tripsinski peptid se prijavljuje kao procenat odnosa oksidisanog tripsinskog peptida prema ukupnom tripsinskom peptidu (nativni oksidisani).
SL. 9 pokazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci zrelog IL-22 različitih vrsta sisara: ljudski (GenBank pristupni br.Q9GZX6, SEQ ID NO:4, šimpanze (GenBank pristupni br.XP_003313906, SEQ ID NO:48), orangutana (GenBank pristupni br. XP_002823544, SEQ ID NO:49), miša (GenBank pristupni br. Q9JJY9, SEQ ID NO:50) i psa (GenBank pristupni br.XP_538274, SEQ ID NO:51).
DETALJAN OPIS
I. DEFINICIJE
Ako nije drugačije definisano, predviđeno je da svi stručni termini, napomene i druga naučna terminologija koji se ovde koriste imaju značenje koje je obično poznato stručnjacima za oblast kojoj ovaj pronalazak pripada. U nekim slučajevima, pojmovi sa uobičajeno poznatim značenjem su ovde definisani radi jasnoće i/ili jednostavne reference, a uključivanje takvih definicija ovde ne bi trebalo nužno tumačiti tako da predstavlja značajnu razliku u odnosu na ono što se generalno shvata u struci.
Termin „oko“ koji se ovde koristi se odnosi na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost dobro poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko“ za vrednost ili parametar u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) otelotvorenja koja se odnose na tu vrednost ili parametar sam po sebi.
Kao što se ovde koristi, jednina i množina uključuje množinu, osim ako kontekst izričito ne nalaže drugačije. Na primer, referenca na „izolovani peptid“ znači jedan ili više izolovanih peptida.
U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, podrazumeva se da reč „sadrži,“ ili varijacije kao što je „koji sadrži“ podrazumevaju uključivanje navedenog celog broja ili grupe celih brojeva, ali ne i isključenje bilo kog drugog celog broja ili grupe celih brojeva.
Termin „Fc fuzioni protein IL-22“ ili „fuzioni protein IL-22“ ili „Ig fuzioni protein IL-22“ kako se ovde koristi, odnosi se na fuzioni protein u kome je protein ili polipeptid IL-22 povezan, direktno ili indirektno, sa Fc regionom IgG. U nekim aspektima otkrića, protein ili polipeptid IL-22 je glikozilovan. U određenim poželjnim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži humani protein ili polipeptid IL-22 povezan sa humanim Fc regionom IgG. U određenim aspektima otkrića, humani protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4. Međutim, podrazumeva se da se ovde razmatraju i manje varijacije sekvenci kao što su umetanja, delecije, supstitucije, naročito konzervativne supstitucije aminokiselina IL-22 ili Fc koje ne utiču na funkciju i/ili aktivnost IL-22 ili Fc fuzionog proteina IL-22. Ovde opisani Fc fuzioni protein IL-22 može da se vezuje za receptor IL-22, što može dovesti do nishodne signalizacije receptora IL-22. U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 je sposoban da se veže za receptor IL-22, i/ili je sposoban da dovede do nishodne signalizacije receptora IL-22. Funkcije i/ili aktivnosti Fc fuzionog proteina IL-22 mogu da se testiraju metodama poznatim u struci, uključujući, bez ograničenja, ELISA, test vezivanja ligandreceptor i test Stat3 luciferaze. U određenim aspektima otkrića, obezbeđen je Fc fuzioni protein IL-22 koji se vezuje za receptor IL-22, pri čemu vezivanje može dovesti do nishodne signalizacije receptora IL-22, pri čemu Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, i SEQ ID NO:16, i pri čemu Fc region nije glikozilovan. U određenim aspektima otkrića, Fc region fuzionog proteina IL-22 ne poseduje efektorske aktivnosti (npr. ne vezuje se za FcγIIIR) ili pokazuje znatno nižu efektorsku aktivnost od celine (npr. divljeg tipa) IgG antitela. U određenim drugim aspektima otkrića, Fc region Fc fuzionog proteina IL-22 ne pokreće citotoksičnost kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). Osim ako nije drugačije naznačeno, „fuzioni protein IL-22“, „Fc fuzija IL-22“, „Ig fuzioni protein IL-22“, „Fc fuzioni protein IL-22“ ili „Fc IL-22“ koriste se naizmenično u ovoj prijavi.
Termin „IL-22“ ili „polipeptid IL-22“ ili „protein IL-22“, kako se ovde koristi, široko ukazuje na bilo koji prirodni IL-22 iz bilo kog izvora sisara, uključujući primate (npr. ljude) i glodare (npr. miševe i pacove), osim ako nije drugačije naznačeno. Termin obuhvata neobrađeni IL-22 „pune dužine“, kao i svaki oblik IL-22 koji je rezultat obrade u ćeliji. Na primer, obuhvaćen je i IL-22 kompletne dužine koji sadrži N-terminalnu lidersku sekvencu i zreli oblik IL-22. Liderska sekvenca (ili signalni peptid) može biti endogena liderska sekvenca IL-22 ili egzogena liderska sekvenca drugog sekretornog proteina sisara. U određenim aspektima otkrića, liderska sekvenca može biti iz eukariotskog ili prokariotskog sekretornog proteina. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante IL-22, npr. splajsovane ili alelne varijante. Sekvenca aminokiselina primera humanog IL-22 je prikazana u SEQ ID NO:4 (zreli oblik, bez signalnog peptida). U određenim aspektima otkrića, aminokiselinska sekvenca proteina IL-22 pune dužine sa endogenom liderskom sekvencom obezbeđena je u SEQ ID NO:71; dok je u drugim aspektima otkrića, aminokiselinska sekvenca zrelog proteina IL-22 sa egzogenom liderskom sekvencom obezbeđena u SEQ ID NO:2. Manje varijacije sekvence, posebno konzervativne aminokiselinske supstitucije IL-22 koje ne utiču na funkciju i/ili aktivnost IL-22 (npr. vezivanje za receptor IL-22) takođe se razmatraju. Slika 9 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci zrelog IL-22 nekoliko primera vrsta sisara. Zvezdice ukazuju na visoko očuvane ostatke aminokiselina među vrstama koje su verovatno važne za funkcije i/ili aktivnosti IL-22. Shodno tome, u određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid IL-22 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:4. U nekim drugim otelotvorenjima, protein IL-22 ima 95% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:71, 96% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:71, 97% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:71; 98% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:71; ili 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:71. Polipeptidi IL-22, opisani u ovom dokumentu, mogu se izolovati iz različitih izvora, kao što su humana tkiva, ili iz drugih izvora, ili se pripremaju rekombinantnim ili sintetičkim postupcima.
Termin „receptor IL-22“ ili „IL-22R“ odnosi se na heterodimer koji se sastoji od IL-22R1 i IL-10R2 ili njihovih alelnih varijanti koje se prirodno javljaju. Pogledajte npr., Ouyang et al., 2011, Annu. Rev. Immunol. 29:159-63. IL-10R2 sveprisutno eksprimiraju mnogi tipovi ćelija, a IL-22R1 se eksprimira samo u urođenim ćelijama, kao što su epitelne ćelije, hepatociti i keratinociti. IL-22R1 je poznat i kao IL-22Ra1 ili IL-22Rα1. IL-22R1 može biti uparen sa drugim polipeptidima da bi se formirali heterodimerni receptori za druge članove porodice IL-10, na primer IL-20 ili IL-24. Pogledajte npr., Ouyang et al., 2011, supra. Sekvenca aminokiselina primera IL-22R1 polipeptida pune dužine prikazana je u SEQ ID NO:81. Ova sekvenca pune dužine IL-22R1 uključuje N-terminalnu signalnu sekvencu (aminokiseline 1-15) koja se cepa u finalni funkcionalni molekul (za koji je primer sekvence aminokiselina prikazan u SEQ ID NO:82). Sekvenca aminokiselina primera IL10R2 polipeptida pune dužine prikazana je u SEQ ID NO:83. Ova sekvenca pune dužine IL10R2 uključuje N-terminalnu signalnu sekvencu (aminokiseline 1-19) koja se cepa u finalni funkcionalni molekul (za koji je primer sekvence aminokiselina prikazan u SEQ ID NO:84).
„Nativna sekvenca polipeptida IL-22“ ili „nativna sekvenca polipeptida IL-22R“ odnosi se na polipeptid koji sadrži istu sekvencu aminokiselina kao odgovarajući polipeptid IL-22 ili IL-22R izveden iz prirode. Takve nativne sekvence polipeptida IL-22 ili IL-22R mogu se izolovati iz prirode ili proizvesti rekombinantnim ili sintetičkim putem. Izrazi posebno obuhvataju prirodno prisutne skraćene ili izlučene oblike specifičnog polipeptida IL-22 ili IL-22R (npr. IL-22 kojem nedostaje povezani signalni peptid), varijante oblika koji se javljaju u prirodi (npr. alternativno splajsovani oblici) i prirodne alelne varijante polipeptida. U različitim aspektima otkrića, nativna sekvenca polipeptida IL-22 ili IL-22R koji su ovde objavljeni su
1
zreli ili polipeptidi nativne sekvence pune dužine. Primer za nativni ljudski IL-22 pune dužine prikazan je u SEQ ID NO:70 (DNK) i SEQ ID NO:71 (protein). Mada je pokazano da polipeptidne sekvence IL-22 i IL-22R počinju sa ostacima metionina koji su ovde označeni kao aminokiselinska pozicija 1, moguće je da se drugi ostaci metionina koji se nalaze ushodno ili nishodno od aminokiselinske pozicije 1 mogu koristiti kao početni aminokiselinski ostatak za polipeptide IL-22 ili IL-22R.
„Varijanta IL-22“, „varijanta IL-22R“, „varijanta polipeptida IL-22“ ili „varijanta polipeptida IL-22R“ označava aktivni polipeptid IL-22 ili IL-22R kao što je gore definisano, koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence aminokiselina sa prirodnom sekvencom kompletne dužine IL-22 ili polipeptidnom sekvencom IL-22R. Obično, varijanta polipeptida IL-22 ili IL-22R će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 81% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 82% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 83% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 84% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 85% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 86% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 87% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 88% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 89% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 90% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 91% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 92% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 93% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 94% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 95% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 96% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 97% identičnosti sekvence aminokiselina, alternativno najmanje oko 98% identičnosti sekvence aminokiselina, i alternativno najmanje oko 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom pune dužine ili zrelom nativnom sekvencom IL-22 ili polipeptidnom sekvencom IL-22R.
Izraz „Fc region“, „Fc domen“ ili „Fc“ odnosi se na C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji se ne vezuje za antigen, koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne Fc regione i varijante Fc regiona. U određenim aspektima otkrića, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226 do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lis447) Fc regiona može ili ne mora biti prisutan, bez uticaja na strukturu ili stabilnost Fc regiona. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u IgG ili Fc regionu je prema EU sistemu numeracije antitela, koji se zove i EU indeks, kao što je opisano u: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
U određenim aspektima otkrića, Fc region se odnosi na konstantni region teškog lanca imunoglobulina IgG koji sadrži region šarke (počevši od Cys226), CH2 domen IgG i CH3 domen. Izraz „region šarke“ ili „sekvenca šarke“, kako se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinsku sekvencu koja se nalazi između linkera i CH2 domena. U određenim aspektima otkrića, region šarke sadrži aminokiselinsku sekvencu CPPCP (SEQ ID NO:31). U određenim otelotvorenjima, region šarke za Fc fuzioni protein IL-22 IgG4 sadrži CPPCP sekvencu (SEQ ID NO:31), sekvencu koja se nalazi u nativnom regionu šarke 1gG1, kako bi se olakšala dimerizacija. U određenim drugim aspektima otkrića, Fc region počinje od regiona šarke i proteže se do C-terminusa teškog lanca IgG. U određenim konkretnim aspektima otkrića, Fc region obuhvata Fc region ljudskog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U određenim aspektima otkrića, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG4. U određenim drugim posebnim aspektima otkrića, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG1.
U određenim aspektima otkrića, domen CH2 IgG počinje na Ala 231. U određenim drugim aspektima otkrića, domen CH3 počinje na Gly 341. Podrazumeva se da C-terminalni Lys ostatak ljudskog IgG može biti opciono odsutan. Takođe se podrazumeva da se konzervativne aminokiselinske supstitucije Fc regiona bez uticaja na željenu strukturu i/ili stabilnost Fc razmatraju u okviru otkrića.
U određenim aspektima otkrića, IL-22 je povezan sa Fc regionom preko linkera. U određenim aspektima otkrića, linker je peptid koji povezuje C-kraj IL-22 sa Fc regionom kako je ovde opisano. U određenim otelotvorenjima, nativne sekvence IgG su prisutne u regionu linkera i/ili šarke kako bi se minimizovao i/ili izbegao rizik od imunogenosti. U drugim aspektima otkrića, manje varijacije sekvence mogu se uvesti u nativne sekvence kako bi se olakšala proizvodnja. IL-22 Fc fuzione konstrukcije koje sadrže sekvence egzogenog linkera ili šarke koje pokazuju visoku aktivnost (mereno, npr. testom luciferaze) takođe su u okviru otkrića. U određenim aspektima otkrića, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je dugačka 8-20 aminokiselina, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 11-16, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili 16 aminokiselina. U nekim drugim aspektima otkrića, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu DKTHT (SEQ ID NO:32). U određenim aspektima otkrića, linker ne sadrži sekvencu Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:45), Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:46), ili Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:47).
U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera. Izraz „povezan sa“ ili „spojen sa“ odnosi se na kovalentnu vezu, npr. peptidnu vezu, formiranu između dva dela.
Termini „glikozilacija“ i „glikozilovani“, kako se ovde koriste, odnose se na prisustvo ugljovodonika (npr. oligosaharida ili polisaharida, koji se takođe naziva „glikan“) vezanog za biološki molekul (npr. protein ili lipid). U određenim aspektima otkrića, glikozilacija se odnosi na prisustvo glikana (npr. N-glikana) vezanog za protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) ili deo proteina od interesa (npr. IL-22 polipeptidni deo Fc fuzionog proteina IL-22). N-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje ugljovodoničnog ostatka na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence, asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljovodoničnog ostatka za bočni lanac asparagina. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin u O-vezanoj glikozilaciji. Za pregled glikozilacije pogledajte npr. Varki et al., Essentials of Glycobiology, 3. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015-2017.
Termini „aglikozilovani“ i „neglikozilovani“, kako se ovde koriste naizmenično, odnose se na protein ili deo proteina od interesa (npr. Fc region Fc fuzionog proteina IL-22) koji nije glikozilovan (npr. nije N-glikozilovan). Treba shvatiti da se u nekim aspektima otkrića deo proteina od interesa (npr. Fc fuzioni protein IL-22) glikoziluje (npr. deo IL-22 polipeptida Fc fuzionog proteina IL-22), dok drugi deo proteina od interesa nije glikozilovan (npr. Fc region Fc fuzionog proteina IL-22).
U nekim aspektima otkrića, ovde su navedeni IL-22 Fc fuzioni proteini u kojima Fc region ili CH2 domen nije glikozilovan. U određenim aspektima otkrića, mesto N-glikozilacije u domenu CH2 je mutirano da bi se sprečila glikozilacija. Na primer, Fc fuzioni protein IL-22 sa aglikozilovanim Fc regionom može da se napravi mutagenezom aminokiselinskog ostatka na poziciji 297 kao u EU indeksu u CH2 domenu Fc regiona (npr. N297). U određenim aspektima otkrića, glikozilacija u CH2 domenu Fc regiona može da se eliminiše promenom mesta konsenzusa glikozilacije, tj. Asn na poziciji 297 nakon kog sledi bilo koji aminokiselinski ostatak (u slučaju humanog IgG, Ser) i Thr. Mesto glikozilacije može da se izmeni nsercijama, brisanjem i/ili supstitucijama aminokiselina. Na primer, jedan ili više aminokiselinskih ostataka može se umetnuti između Asn i Ser ili između Ser i Thr da bi se promenilo originalno mesto glikozilacije, pri čemu umeci ne regenerišu mesto N-glikozilacije. U određenim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu (npr. N-glikozilovano mesto u Fc) unutar CH2 domena humanog IgG Fc je mutirano da bi se ukinulo
1
mesto glikozilacije. U određenim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu (npr. N297) menja se u Gly, Ala, Gln, Asp ili Glu. U nekim posebnim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu (npr. N297) menja se u Gly ili Ala. U drugim posebnim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu (npr. N297) menja se u Gly. U nekim drugim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 299 kao u EU indeksu može biti zamenjen drugom aminokiselinom, na primer, Ala, Val ili Gly. U određenim aspektima otkrića, mutacije koje dovode do aglikozilovanog Fc ne utiču na strukturu i/ili stabilnost Fc fuzionog proteina IL-22.
U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži Fc region u kojem je aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu u CH2 domenu mutiran. U određenim aspektima otkrića, ostatak aminokiselina na poziciji 297 kao u EU indeksu menja se u Gly ili Ala, poželjno u Gly. U nekim drugim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu se briše. U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 koji sadrži Fc koji ima supstituciju aminokiselina na aminokiselinskom ostatku na poziciji 297 kao u EU indeksu je aglikozilovan ili nije glikozilovan.
U drugim aspektima otkrića, N-glikan vezan za ostatak aminokiselina divljeg tipa na poziciji 297 kao u EU indeksu (npr. N297) može se enzimski ukloniti, npr. deglikozilacijom. Pogodni glikolitički enzimi uključuju, bez ograničenja, peptid-N-glikozidazu (PNGaza).
Termin „afukozilacija“, „afukozilovan“, „defukozilacija“ ili „defukozilovan“ odnosi se na odsustvo ili uklanjanje fukoze jezgra iz N-glikana, npr. N-glikana vezanog za protein ili deo proteina (npr. CH2 domen Fc).
Termin „dimerni Fc fuzioni protein IL-22“ odnosi se na dimer u kojem svaki monomer sadrži Fc fuzioni protein IL-22. Termin „monomerni Fc fuzioni protein IL-22“ odnosi se na dimer u kome jedan monomer sadrži Fc fuzioni protein IL-22 (Fc krak IL-22), dok drugi monomer sadrži Fc region bez polipeptida IL-22 (Fc krak). Shodno tome, dimerni Fc fuzioni protein IL-22 je dvovalentan u odnosu na vezivanje IL-22R, dok je monomerni Fc fuzioni protein IL-22 jednovalentan u odnosu na vezivanje IL-22R. Heterodimerizacija monomernog Fc fuzionog proteina IL-22 može biti olakšana metodama poznatim u struci, uključujući, bez ograničenja, heterodimerizaciju tehnologijom dugme u rupici. Struktura i postupak sklapanja tehnologije dugme u rupici mogu se naći, na primer, u US5,821,333, US7,642,228, SAD 2011/0287009 i PCT/US2012/059810. Ova tehnologija je razvijena uvođenjem „dugmeta“ (ili izbočine) zamenom malog aminokiselinskog ostatka velikim ostatkom u CH3 domenu jednog Fc, i uvođenjem „rupice“ (ili šupljine) u domenu CH3 drugog Fc zamenom jednog ili više velikih aminokiselinskih ostataka manjim ostacima. U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni krak IL-22 sadrži dugme, a krak samo sa Fc sadrži rupicu.
Poželjni ostaci za formiranje dugmeta su uglavnom prirodni ostaci aminokiselina, i poželjno su izabrani od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) i triptofana (W). Najpoželjniji su triptofan i tirozin. U jednom aspektu otkrića, originalni ostatak za formiranje dugmeta ima malu zapreminu bočnog lanca, kao što je alanin, asparagin, asparaginska kiselina, glicin, serin, treonin ili valin. Primeri aminokiselinskih supstitucija u domenu CH3 za formiranje dugmeta uključuju, bez ograničenja, supstituciju T366W, T366Y ili F405W.
Poželjni ostaci za formiranje rupice su obično prirodni aminokiselinski ostaci i poželjno su izabrani od alanina (A), serina (S), treonina (T) i valina (V). U jednom aspektu otkrića, originalni ostatak za formiranje rupice ima veliku zapreminu bočnog lanca, kao što je tirozin, arginin, fenilalanin ili triptofan. Primeri aminokiselinskih supstitucija u domenu CH3 za generisanje rupice uključuju, bez ograničenja, supstitucije T366S, L368A, F405A, Y407A, Y407T i Y407V. U određenim aspektima otkrića, dugme sadrži supstituciju T366W, a rupica sadrži supstitucije T366S/L368A/Y407V. U određenim aspektima otkrića, Fc region monomernog Fc fuzionog proteina IL-22 sadrži Fc region IgG1. U određenim aspektima otkrića, monomerna IgG1 Fc fuzija IL-22 sadrži krak sa Fc dugmetom IL-22 i krak sa Fc rupicom. U određenim otelotvorenjima, Fc krak dugmeta IL-22 sadrži supstituciju T366W (SEQ ID NO:61), a Fc krak rupice sadrži T366S, L368A i Y407V (SEQ ID NO:62). U određenim drugim aspektima otkrića, Fc region oba kraka dalje obuhvata mutaciju N297G ili N297A. U određenim aspektima otkrića, monomerni Fc fuzioni protein IL-22 se eksprimira u ćelijama E. coli. Podrazumeva se da su i druge modifikacije Fc regiona poznate u struci, koje olakšavaju heterodimerizaciju, takođe razmatrane i obuhvaćene predmetnom prijavom.
Termin „rana“ odnosi se na povredu, posebno onu kod koje je koža ili druga spoljna površina pocepana, probijena, posečena ili na drugi način oštećena.
Termin „čir“ je mesto oštećenja kože ili sluzokože koje se često karakteriše stvaranjem gnoja, smrću tkiva, i često je praćen upalnom reakcijom.
Termini „creva“ ili „stomak“ kako se ovde naizmenično koriste široko obuhvataju tanko crevo i debelo crevo.
Termin „ubrzavanje zarastanja rana“ ili „ubrzavanje zalečenja rana“ odnosi se na povećanje brzine zarastanja, npr. smanjenje vremena dok ne dođe do potpunog zatvaranja rane ili smanjenja vremena dok ne dođe do procentualnog (%) smanjenja područja rane.
„Dijabetička rana“ je rana koja je povezana sa dijabetesom.
„Dijabetički čir“ je čir koji je povezan sa dijabetesom.
„Hronična rana“ odnosi se na ranu koja ne zarasta. Pogledajte, na primer, Lazarus et al.,
1
Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Hronične rane uključuju, na primer, arterijske čireve, dijabetičke čireve, dekubitis ili rane od ležanja, venske čireve, i slično. Akutna rana se može razviti u hroničnu ranu. Akutne rane uključuju rane izazvane, npr. termičkim povredama (npr. opekotinama), traumom, hirurgijom, ekscizijom ekstenzivnog raka kože, dubokim gljivičnim i bakterijskim infekcijama, vaskulitisom, sklerodermom, pemfigusom, toksičnom epidermalnom nekrolizom, i slično. Pogledajte, na primer, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, objavljeno: 24. oktobra 2001. Dakle, u određenim aspektima otkrića, hronična rana je zaražena rana. „Normalna rana“ odnosi se na ranu koja prolazi normalan proces zarastanja rane.
„Afinitet“ se odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. ligand ili antitelo) i njegovog partnera u vezivanju (npr. receptor ili antigen). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. Fc fuzioni protein IL-22 i receptor IL-22). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu.
Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv), i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
„Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Izraz „efektorske funkcije“ ili „efektorske aktivnosti“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje variraju u zavisnosti od izotipa
1
antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplementzavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodno regulisanje površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija. U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 ne pokazuje nikakvu efektorsku funkciju ili bilo koju detektabilnu efektorsku funkciju. U određenim drugim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 pokazuje značajno smanjenu efektorsku funkciju, npr. oko 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% smanjenu efektorsku funkciju.
„Delotvorna količina“ ili „terapeutski delotvorna količina“ agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima delotvorna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Na primer, u slučaju kardiovaskularne bolesti ili stanja, terapeutski efikasna količina Fc fuzionog proteina IL-22 može smanjiti stepen stvaranja aterosklerotskog plaka; smanjiti veličinu aterosklerotskog plaka; inhibirati (tj. usporiti u određenoj meri i poželjno zaustaviti) aterosklerotični plak; inhibirati (tj. usporiti do određene mere i poželjno zaustaviti) trombozu ili rupturu aterosklerotskog plaka; i/ili u određenoj meri ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem.
Pod „smanjiti ili inhibirati” podrazumeva se sposobnost da se uzrokuje opšte smanjenje poželjno od 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, a najpoželjnije od 75%, 85%, 90%, 95% ili više. Smanjenje ili inhibicija može se odnositi na simptome poremećaja koji se leči, prisustvo ili veličinu aterosklerotskih plakova ili broj aterosklerotskih plakova.
„Suboptimalna količina“ odnosi se na količinu manju od optimalne količine terapeutskog sredstva koja se obično koristi za određeni tretman. Kada se ispitaniku daju dva terapeutska sredstva, bilo istovremeno ili uzastopno, svako terapeutsko sredstvo se može dati u suboptimalnoj količini u poređenju sa lečenjem kada se svako terapeutsko sredstvo daje samostalno. Na primer, u određenim aspektima otkrića, na ispitaniku kome je potrebno lečenje za IBC primenjuje se farmaceutska kompozicijaa koj sadrži Fc fuzioni protein IL-22 i deksametazon u suboptimalnoj količini.
Izrazi „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.
Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelije domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“,
1
koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Transformisana ćelija uključuje prolazno ili stabilno transformisanu ćeliju. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji. U određenim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prolazno transficirana egzogenom nukleinskom kiselinom. U nekim drugim otelotvorenjima, ćelij domaćina je stabilno transficirana egzogenom nukleinskom kiselinom.
„Imunokonjugat“ je antitelo ili fragment antitela konjugovan sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali bez ograničenja, citotoksični agens.
„Pojedinac“, „ispitanik“ ili „pacijent“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, poput majmuna), zečeve i glodare (npr. miševi i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pojedinac, ispitanik ili pacijent je čovek.
„Izolovani“ Fc fuzioni protein IL-22 je onaj koji je izdvojen iz sredine ćelije domaćina koja rekombinantno proizvodi fuzioni protein. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 je prečišćen do čistoće veće od 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno-faznim HPLC postupkom).
"Izolovana" nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
Termin „izolovana nukleinska kiselina koja kodira Fc fuzioni protein IL-22“ odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju Fc fuzioni protein IL-22, uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, takve molekule nukleinske kiseline prolazno ili stabilno transficirane u ćeliji domaćinu, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „kontrolne sekvence” se odnosi na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, opciono operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere,
1
poliadenilacione signale i pojačivače.
Nukleinska kiselina je „operativno povezana“ kada se stavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider su operativno povezani sa DNK za polipeptid ako se eksprimiraju kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Uopšteno, „operativno povezan“ znači da su sekvence DNK koje su povezane susedne, i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u okviru faze čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.
Termin „monoklonsko antitelo“, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koja sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti ovde u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničenja, postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
„Nativna antitela“ ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove
1
varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., str.91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VL odnosno VH domena. Pogledajte npr. Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Termin „vektor“, kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori“.
„Fc region nativne sekvence“ sadrži aminokiselinsku sekvencu identičnu sa aminokiselinskom sekvencom Fc regiona koja se nalazi u prirodi. Humani Fc regioni nativne sekvence uključuju, bez ograničenja, humani Fc region nativne sekvence IgG1 (ne-A i A alotipi); humani Fc region nativne sekvence IgG2; humani Fc region nativne sekvence IgG3; i humani Fc region nativne sekvence IgG4, kao i njihove varijante koje se javljaju u prirodi.
„Varijanta Fc regiona” sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one u sklopu nativne sekvence Fc regiona u pogledu najmanje jedne modifikacije aminokiseline, poželjno jedne ili više supstitucija aminokiseline. Poželjno je da varijanta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju aminokiselina u poređenju sa Fc regionom prirodne sekvence ili Fc regionom matičnog polipeptida, npr. od oko jedan do deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedan do pet aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu u prirodnoj sekvenci ili u Fc regionu matičnog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde će poželjno imati najmanje oko 80% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida, a najpoželjnije najmanje oko 90% homologije sa njom, poželjnije najmanje oko 95% homologije sa njom. U određenim aspektima otkrića, varijanta Fc regiona nije glikozilovana.
2
„Poremećaj“, „bolest“ ili „stanje“, kako se ovde koristi naizmenično, predstavlja svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja kompozicijom (npr. farmaceutskom kompozicijom) koja je opisana ovde, npr. kompozicijom (npr. farmaceutskom kompozicijom) koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22. To uključuje hronične i akutne poremećaje i bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj. U nekim aspektima otkrića, poremećaj je poremećaj povezan sa IL-22. Primeri poremećaja uključuju IBC (npr. UK ili Kronova bolest), mikrobnu infekciju, akutnu povredu bubrega, akutni pankreatitis, rane, kardiovaskularna stanja, metabolički sindrom, akutnu endotoksemiju i sepsu.
Termini „inflamatorni poremećaj creva“, „inflamatorna bolest creva“ ili „IBC“, kako se ovde koriste naizmenično, ovde se koriste u najširem smislu, i obuhvataju sve bolesti i patološka stanja čija patogeneza uključuje ponavljajuće upale u crevima, uključujući tanko crevo i debelo crevo. IBC uključuje, na primer, ulcerozni kolitis (UK) i Kronovu bolest. IBC nije ograničen na UK i KB. Manifestacije bolesti uključuju upalu i smanjenje epitelnog integriteta u crevima.
Termini „kardiovaskularna bolest“ ili „kardiovaskularni poremećaj“ se ovde koriste u najširem smislu, i obuhvataju sve bolesti i patološka stanja čija patogeneza uključuje abnormalnosti krvnih sudova, kao što je, na primer, formiranje aterosklerotskog plaka (uključujući stabilne ili nestabilne/ranjive plakove), ateroskleroza, arterioskleroza, arterioloskleroza i povišena sistemska izloženost lipopolisaharidu (LPS). Termin dodatno uključuje bolesti i patološka stanja koja imaju koristi od inhibicije formiranja aterosklerotskih plakova. Kardiovaskularne bolesti uključuju, bez ograničenja, aterosklerozu koronarnih arterija, koronarnu mikrovaskularnu bolest, moždani udar, bolest karotidnih arterija, perifernu arterijsku bolest, ishemiju, koronarnu arterijsku bolest (CAD), akutni koronarni sindrom (ACS), koronarnu bolest srca (CHD), stanja povezana sa CAD i CHD, cerebrovaskularnu bolest, perifernu vaskularnu bolest, aneurizam, vaskulitis, vensku trombozu, dijabetes melitus, metaboličku sindromhroničnu bolest bubrega, povredu udaljenog tkiva nakon ishemije i reperfuzije, i kardiopulmonalni bajpas. Posebno uključene u ovu grupu su sve kardiovaskularne bolesti povezane sa pojavom, razvojem ili napredovanjem koji se mogu kontrolisati inhibicijom formiranja aterosklerotskog plaka.
Termin „kardiovaskularno stanje“ se ovde koristi u najširem smislu, i obuhvata sva kardiovaskularna stanja i bolesti čija patologija uključuje formiranje aterosklerotskog plaka (uključujući stabilne ili nestabilne/ranjive plakove), aterosklerozu, arteriosklerozu, arteriolosklerozu i povišenu sistemsku izloženost lipopolisaharidu (LPS). Konkretno uključeni u ovu grupu su sva kardiovaskularna stanja i bolesti povezane sa formiranjem aterosklerotskog plaka, čija pojava, razvoj ili progresija mogu da se kontrolišu inhibicijom formiranja aterosklerotskog plaka. Termin specifično uključuje bolesti i patološka stanja koja imaju koristi od inhibicije formiranja aterosklerotskih plakova. Kardiovaskularna stanja uključuju, bez ograničenja, aterosklerozu koronarnih arterija, koronarnu mikrovaskularnu bolest, moždani udar, bolest karotidnih arterija, bolest perifernih arterija, ishemiju, koronarnu bolest arterija (CAD), koronarnu bolest srca (CHD), stanja povezana sa CAD i CHD, cerebrovaskularnu bolest i stanja povezana sa cerebrovaskularnom bolešću, perifernu vaskularnu bolest i stanja povezana sa perifernom vaskularnom bolešću, aneurizam, vaskulitis, vensku trombozu, dijabetes melitus, metaboličku sindromhroničnu bolest bubrega, povredu udaljenog tkiva nakon ishemije i reperfuzije, i kardiopulmonalni bajpas. „Stanja povezana sa cerebrovaskularnom bolešću“, kako se ovde koristi, uključuju, na primer, prolazni ishemijski napad (TIA) i moždani udar. „Stanja povezana sa perifernim vaskularnim bolestima“, kako se ovde koristi, uključuju, na primer, klaudikaciju. Posebno uključene u ovu grupu su sve kardiovaskularne bolesti i stanja povezana sa pojavom, razvojem ili napredovanjem koji se mogu kontrolisati inhibicijom formiranja aterosklerotskog plaka.
Formiranje aterosklerotskog plaka može nastati kao rezultat urođenog imunog odgovora na metaboličku endotoksemiju, koju karakterišu povišeni nivoi sistemskih lipopolisaharida (LPS) koji potiču iz mikrobiote creva i gubitak funkcionalnog integriteta u crevnoj mukoznoj barijeri. Urođeni imuni odgovor na endotoksemiju dovodi do hronične upale niskog stepena koja je odgovorna za stvaranje plaka.
Termin „metabolički sindrom“ se ovde koristi u najširem smislu. Metabolički sindrom uključuje istovremenu pojavu kod odraslog ispitanika nekoliko metaboličkih faktora rizika, uključujući najmanje tri od sledećih pet osobina: abdominalna gojaznost, koja može biti, na primer, obim struka kod muškaraca veći ili jednak 90 cm i kod žena veći ili jednak 80 cm; povišeni serumski trigliceridi, koji mogu biti, na primer, veći ili jednaki 150 mg/dl, ili lečenje lekovima za povišene trigliceride; smanjeni nivo HDL holesterola u serumu, koji može biti, na primer, ispod 40 mg/dl kod muškaraca i ispod 50 mg/dl kod žena, ili lečenje lekovima za nizak HDL holesterol; hipertenzija, koja može biti, na primer, sistolni krvni pritisak veći od 130 mmHg i dijastolni krvni pritisak veći od 85 mmHg, ili lečenje lekovima za hipertenziju; i povišena glukoza u plazmi natašte, koja može biti, na primer, veća ili jednaka 100 mg/dl, lečenje lekovima za povišenu glukozu ili prethodno dijagnostikovan dijabetes tipa 2.
Za decu stariju od 16 godina mogu se koristiti gore navedeni kriterijumi za odrasle. Za decu između 10-16 godina, metabolički sindrom uključuje zajedničku pojavu kod ispitanika nekoliko metaboličkih faktora rizika, uključujući najmanje tri od sledećih pet osobina: abdominalna gojaznost, koja može biti, na primer, obim struka veći od 90. percentila; povišeni serumski trigliceridi, koji mogu biti, na primer, veći ili jednaki 110 mg/dl, veći od 95. percentila, ili lečenje lekovima za povišene trigliceride; smanjen nivo HDL holesterola u serumu, koji može biti, na primer, ispod 40 mg/dl, manji od 5. percentila ili lečenje lekovima za niski HDL holesterol; hipertenzija, koja može biti, na primer, sistolni krvni pritisak veći od 130 mmHg i dijastolni krvni pritisak veći od 85 mmHg, veći od 90. percentila, ili lečenje lekovima za hipertenziju; i povišena glukoza u plazmi natašte, koja može biti, na primer, veća ili jednaka 100 mg/dl, poremećena tolerancija na glukozu, lečenje lekovima za povišenu glukozu ili prethodno dijagnostikovan dijabetes tipa 2.
Uopšteno govoreći, faktori rizika koji se zajedno javljaju kod metaboličkog sindroma uključuju gojaznost (poput abdominalne gojaznosti), hiperglikemiju, dislipidemiju, insulinsku rezistenciju i/ili hipertenziju. Svi ovi faktori rizika promovišu razvoj aterosklerotskih kardiovaskularnih bolesti, dijabetesa ili oboje. Metabolički sindrom takođe može da obuhvata hroničnu upalu masnog tkiva.
Metabolički sindrom se može prepoznati kao proinflamatorno, protrombično stanje, i može biti povezan sa povišenim nivoima jednog ili više C-reaktivnih proteina, IL-6, LPS i inhibitora aktivatora plazminogena 1; takvi markeri mogu biti povezani sa povećanim rizikom za kasniji razvoj aterosklerotske kardiovaskularne bolesti, dijabetesa ili oba.
Metabolički sindrom može biti povezan sa nekoliko poremećaja povezanih sa gojaznošću, uključujući jedno ili više od bolesti masne jetre sa steatozom, fibrozom i cirozom, hepatocelularnog i intrahepatičnog holangiokarcinoma, hronične bolesti bubrega, sindroma policističnih jajnika, poremećenog disanja tokom spavanja, uključujući opstruktivnu apneju u snu, i hiperurikemiju i giht.
Termin „poremećaj povezan sa insulinom“ obuhvata bolesti ili stanja koja karakteriše poremećena tolerancija glukoze. U jednom otelotvorenju, poremećaj povezan sa insulinom je dijabetes melitus, uključujući, bez ograničenja, dijabetes tipa I (dijabetes melitus zavisan od insulina ili IDDM), tip II (dijabetes melitus koji nije zavisan od insulina ili NIDDM), gestacijski dijabetes i bilo koji drugi poremećaj koji bi imao koristi od agenasa koji stimulišu sekreciju insulina. U drugom otelotvorenju, poremećaj povezan sa insulinom karakteriše insulinska rezistencija.
Termin „sepsa“ se koristi u najširem smislu i može obuhvatiti sistemsko inflamatorno stanje izazvano teškom infekcijom. Sepsa može biti prouzrokovana odgovorom imunskog sistema na ozbiljnu infekciju, najčešće bakterije, ali i gljivice, viruse i parazite u krvi,
2
urinarnom traktu, plućima, koži ili drugim tkivima.
Termin „akutna endotoksemija“ se koristi u svom najširem smislu, i može obuhvatiti stanje povišenog bakterijskog lipopolisaharida (LPS) u plazmi. Akutna endotoksemija zauzvrat može dovesti do sepse. Povećani LPS u sistemskoj cirkulaciji će izazvati hroničnu upalu niskog stepena, što dovodi do aktivacije endogenog zaštitnog odgovora domaćina da podigne lipide u plazmi, što kod hroničnog stanja doprinosi gojaznosti izazvanoj ishranom, insulinskoj rezistenciji i aterosklerozi i eventualnim CVD događajima.
Termin „bolest kalem protiv domaćina (GVHD)“ odnosi se na komplikaciju alogene transplantacije matičnih ćelija. Kod GVHD, donorske hematopoetske matične ćelije prepoznaju primaoca transplantata kao strano telo i napadaju pacijentova tkiva i organe, što može narušiti funkciju tkiva ili organa, ili prouzrokovati neuspeh. Kao što se ovde koristi, GVHD uključuje, na primer, akutni GVHD ili hronični GVHD. Dalje, neograničavajući primeri uključuju crevni GVHD.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti“) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu.
Na primer, što se tiče IBC, „lečenje“ se može odnositi na smanjenje verovatnoće razvoja IBC, smanjenje brzine razvoja IBC i smanjenje težine bolesti. Kao drugi primer, što se tiče formiranja aterosklerotskog plaka, „lečenje“ se može odnositi na smanjenje verovatnoće razvoja aterosklerotskih naslaga plaka, smanjenje brzine razvoja naslaga, smanjenje broja ili veličine postojećih naslaga ili poboljšanu stabilnost plaka. Oni kojima je lečenje neophodno obuhvataju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih poremećaj treba sprečiti. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje bolesti, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, ovde otkriveni Fc fuzioni proteini IL-22 se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
U određenim otelotvorenjima, „ispitanik kome je to potrebno“ u kontekstu sprečavanja ili lečenja kardiovaskularnog stanja odnosi se na ispitanika sa dijagnozom kardiovaskularne bolesti ili kardiovaskularnog stanja (CVD) ili metaboličkog sindroma ili koji pokazuje jedno ili više stanja povezanih sa CVD ili metaboličkim sindromom, ispitanika kome je u prošlosti dijagnostikovano ili je ispoljio jedno ili više stanja povezanih sa CVD ili metaboličkim sindromom, ili ispitanika za koga se smatra da je pod rizikom od razvoja CVD ili metaboličkog sindroma ili jednog ili više stanja povezanih sa CVD ili metaboličkim sindromom u budućnosti zbog naslednih faktora ili faktora životne sredine. Stoga, u određenim otelotvorenjima, ispitanik kome je to potrebno može biti ispitanik koji ispoljava CVD ili metabolički sindrom ili stanje povezano sa CVD ili metaboličkim sindromom ili ispitanik koji je u prošlosti iispoljio CVD ili metabolički sindrom ili stanje povezano sa CVD ili metaboličkim sindromom ili se smatra da je podrizikom da razvije CVD ili metabolički sindrom ili stanje povezano sa CVD ili metaboličkim sindromom u budućnosti.
U lečenju kardiovaskularne bolesti ili stanja, terapeutsko sredstvo može direktno promeniti veličinu odgovora komponente imunog odgovora ili učiniti bolest podložnijom lečenju drugim terapeutskim sredstvima, npr. antibioticima, antifungalnim sredstvima, antiinflamatornim agensima, hemoterapeutskim agensima, itd. U lečenju arterijske bolesti, lečenje može, na primer, sprečiti ili usporiti napredovanje bolesti. Dakle, lečenje arterijske bolesti posebno uključuje prevenciju, inhibiciju ili usporavanje razvoja stanja ili napredovanje iz jedne faze stanja u drugu, napredniju fazu ili u teže, povezano stanje.
„Patologija“ bolesti ili stanja uključuje sve pojave koje ugrožavaju dobrobit ispitanika. U slučaju kardiovaskularne bolesti ili stanja, ovo uključuje, bez ograničenja, stvaranje aterosklerotskog plaka (uključujući stabilne ili nestabilne/ranjive plakove), aterosklerozu, arteriosklerozu, arteriolosklerozu i povišenu sistemsku izloženost lipopolisaharidu (LPS).
„Ublaženo“, „ublažavanje“ ili njihovi ekvivalenti, odnose se i na terapijsko lečenje i na profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je cilj poboljšanje, sprečavanje, usporavanje (smanjenje) ili inhibiranje bolesti ili stanja, npr. stvaranja aterosklerotskih plakova. Oni kojima je lečenje neophodno obuhvataju one koji već imaju bolest ili stanje, kao i one koji su skloni tome da imaju bolest ili stanje, ili one kod kojih bolest ili stanje treba sprečiti.
„Hronična“ primena se odnosi na primenu agensa (agenasa) u kontinuiranom režimu za razliku od akutnog režima, kako bi se održao početni terapeutski efekat tokom dužeg vremenskog perioda.
„Intermitentna“ primena je lečenje koji se ne vrši uzastopno bez prekida, već je ciklične prirode.
Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u
2
vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti
2
% identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
Ispod su primeri kako izračunati % identičnosti aminokiselinske sekvence označene kao „Protein za poređenje“ ili „Referentni protein“ sa aminokiselinskom sekvencom označenom sa „IL-22“, pri čemu „IL-22“ predstavlja aminokiselinsku sekvencu IL-22 polipeptida od interesa, „Protein za poređenje“ predstavlja aminokiselinsku sekvencu polipeptida sa kojom se upoređuje „IL-22“ polipeptid od interesa, a „X“, „Y“ i „Z“ predstavljaju različite aminokiselinske ostatke.
IL-22 (dužina = 15 aminokiselina)
Referentni protein (dužina = 12 aminokiselina)
% identičnosti aminokiselinske sekvence =
(broj identičnih podudaranja aminokiselinskih ostataka između dve polipeptidne sekvence) podeljen sa (ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka polipeptida IL-22) =
5 podeljeno sa 15 = 33,3%
IL-22 (dužina = 10 aminokiselina)
Referentni protein (dužina = 15 aminokiselina)
% identičnosti aminokiselinske sekvence =
(broj identičnih podudaranja aminokiselinskih ostataka između dve polipeptidne sekvence) podeljen sa (ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka polipeptida IL-22) = 5 podeljeno sa 10 =50%
Termin „agonist” se koristi u najširem smislu i uključuje bilo koji molekul koji delimično ili potpuno oponaša biološku aktivnost IL-22 polipeptida. Takođe obuhvaćeni terminom „agonist“ su molekuli koji stimulišu transkripciju ili translaciju mRNK koja kodira polipeptid.
Pogodni molekuli agonista uključuju, na primer, antitela agonista ili fragmente antitela; nativni polipeptid; fragmente ili varijante aminokiselinske sekvence nativnog polipeptida; peptide; antisens oligonukleotide; male organske molekule; i nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide agoniste ili antitela. Referenca na jedan agonist obuhvata jedan agonist ili kombinaciju dva ili više različitih agonista.
Termin „agonist IL-22“ se koristi u najširem smislu, i obuhvata bilo koji molekul koji oponaša kvalitativnu biološku aktivnost (kao što je u daljem tekstu definisano) nativne sekvence polipeptida IL-22. Agonisti IL-22 specifično uključuju IL-22-Fc ili IL-22 Ig polipeptide (imunoadhezine), ali i male molekule koji oponašaju najmanje jednu biološku
2
aktivnost IL-22. Poželjno, biološka aktivnost je vezivanje receptora IL-22, interakcija sa IL-22BP, olakšavanje urođenog puta imunog odgovora, ili u slučaju kardiovaskularne bolesti ili stanja, uticaj na formiranje aterosklerotskih plakova, naročito da inhibira stvaranje aterosklerotskog plaka. Inhibicija stvaranja plaka se može proceniti bilo kojim pogodnim postupkom snimanja poznatim osobama sa uobičajenim veštinama u struci.
IL-22R1 se uparuje sa drugim proteinima da bi formirao heterodimere kao receptore za određene članove porodice IL-10. Pogledajte Ouyang et al., 2011, supra. Prema tome, u određenim aspektima otkrića, agonisti IL-22 mogu uključivati agonist receptora IL-22, uključujući citokin (ili njegov fuzioni protein ili agonist) koji se vezuje i pokreće nishodnu signalizaciju IL-22R1. U određenim aspektima otkrića, agonisti IL-22 uključuju agonist IL-22R1, uključujući, bez ograničenja, anti-IL-22R1 agonističko antitelo; agonist IL-20, uključujući, bez ograničenja, polipeptid IL-20 ili Fc fuzioni protein IL-20; i agonist IL-24, uključujući, bez ograničenja, polipeptid IL-24 ili fuzioni protein IL-24. U određenim drugim aspektima otkrića, agonisti IL-22R1 uključuju agonist IL-19, uključujući, bez ograničenja, polipeptid IL-19 ili Fc fuzioni protein IL-19; i agonist IL-26, uključujući, bez ograničenja, polipeptid IL-26 ili Fc fuzioni protein IL-26. Primeri sekvenci za IL-19 (GenBank pristupni br. AAG16755.1, SEQ ID NO:77), IL-20 (GenBank pristupni br. AAH69311.1, SEQ ID NO:78), IL-24 (GenBank pristupni br. AAH09681.1, SEQ ID NO:79) i IL-26 (GenBank pristupni br. NP_060872.1, SEQ ID NO:80) navedeni su ovde. U određenim aspektima otkrića, polipeptid IL-19 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77 ili zreli protein bez signalnog peptida. U nekim drugim aspektima otkrića, polipeptid IL-20 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78 ili zreli protein bez signalnog peptida. U još nekim drugim aspektima otkrića, polipeptid IL-24 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79 ili zreli protein bez signalnog peptida. U nekim drugim aspektima otkrića, polipeptid IL-26 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:80 ili zreli protein bez signalnog peptida.
Ovde je „mali molekul“ definisan kao onaj koji ima molekulsku masu manju od oko 600, poželjno manju od oko 1000 daltona.
„Agonističko antitelo“, kako se ovde koristi, je antitelo koje delimično ili u potpunosti oponaša biološku aktivnost polipeptida IL-22.
Termini „farmaceutska formulacija“ ili „farmaceutska kompozicija“ se ovde koriste naizmenično, i odnose se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
2
„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, razblaživač, stabilizator ili konzervans.
Termin „rok trajanja“ odnosi se na dužinu vremena tokom kojeg proizvod (npr protein (npr Fc fuzioni protein. IL-22) može da se skladišti a da ne postane nepodoban za upotrebu (npr. primena na ispitaniku) ili prodaju. U nekim otelotvorenjima, rok trajanja je dužina vremena u kome je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) stabilna. Na primer, u nekim aspektima otkrića, kompozicija ovde ima rok trajanja od najmanje 36 meseci kada se čuva na 5°C ± 3°C i zaštićena je od svetlosti. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ovde ima rok trajanja od najmanje 48 meseci kada se čuva na -20°C. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ovde ima rok trajanja od najmanje 60 meseci kada se čuva na -20°C.
„Stabilna“ farmaceutska formulacija je ona u kojoj protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) u njoj suštinski zadržava fizičku stabilnost i/ili hemijsku stabilnost i/ili biološku aktivnost nakon skladištenja. Poželjno je da formulacija suštinski zadrži svoju fizičku i hemijsku stabilnost, kao i svoju biološku aktivnost nakon skladištenja. Period skladištenja se tipično bira na osnovu predviđenog roka trajanja formulacije. U ovoj oblasti su dostupne razne analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina, a prikazane su u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), na primer. Stabilnost se može meriti pri izabranoj količini izlaganja svetlosti i/ili temperaturi za izabrani vremenski period. Stabilnost se može proceniti kvalitativno i/ili kvantitativno na različite načine, uključujući procenu formiranja agregata (na primer, korišćenjem hromatografije na molekulskim sitima, merenjem zamućenosti i/ili vizuelnim pregledom); evaluaciju formiranja ROS (na primer, korišćenjem testa svetlosnog stresa ili testa stresa sa 2,2'-azobis(2-amidinopropan) dihidrohloridom (AAPH)); oksidaciju specifičnih aminokiselinskih ostataka proteina (na primer, Met ostatak Fc fuzionog proteina IL-22); procenu heterogenosti naelektrisanja korišćenjem katjonoizmenjivačke hromatografije, snimanje kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (ICiEF) ili kapilarne zonske elektroforeze; analizu amino-terminalne ili karboksi-terminalne sekvence; analizu masene spektrometrije; SDS-PAGE analizu za upoređivanje redukovanih i netaknutih polipeptida (npr. Fc fuzionih proteina IL-22); analizu peptidne mape (na primer, tripsinska ili LYS-C); procenjivanje biološke aktivnosti ili funkcija vezivanja cilja proteina (npr vezivanje Fc fuzionog proteina IL-22 za IL-22 receptor); i slično. Nestabilnost može da uključuje jedno ili više od: agregacije, deamidacije (npr Asn deamidacije), oksidacije (npr Met oksidacije i/ili Trp oksidacije), izomerizacije (npr Asp izomerizacija), isecanja/hidrolize/fragmentacije (npr.
2
fragmentacija regiona šarke), formiranja sukcinimida, nesparenog cisteina, N-terminalne ekstenzije, C-terminalne obrada, razlike u glikozilaciji, i slično.
Protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) „zadržava svoju fizičku stabilnost“ u farmaceutskoj formulaciji ako ne pokazuje nikakve znakove ili pokazuje vrlo malu agregaciju, taloženje, fragmentaciju i/ili denaturaciju nakon vizuelnog pregleda boje i/ili bistrine, ili mereno rasipanjem UV zračenja ili hromatografijom na bazi molekulskih sita.
Protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) „zadržava svoju hemijsku stabilnost“ u farmaceutskoj formulaciji, ako je hemijska stabilnost u određenom trenutku takva da razmatrani protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) i dalje zadržava svoju biološku aktivnost, kao što je u nastavku definisano. Hemijska stabilnost može da se proceni otkrivanjem i kvantifikacijom hemijski izmenjenih oblika proteina (npr. Fc fuzioni protein IL-22). Hemijska promena može uključivati oksidaciju proteina koja se može proceniti, na primer, korišćenjem tripsinskog peptidnog mapiranja, reversno fazne tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC/MS). Ostale vrste hemijskih promena uključuju promene naelektrisanja proteina (npr. Fc fuzionog proteina IL-22) koje se mogu proceniti, na primer, jonoizmenjivačkom hromatografijom ili icIEF-om.
Protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) „zadržava svoju biološku aktivnost“ u farmaceutskoj formulaciji, ako je biološka aktivnost proteina (npr. Fc fuzioni protein IL-22) u datom trenutku oko 20% (recimo oko 10%) biološke aktivnosti ispoljene u vreme kada je farmaceutska formulacija pripremljena (u okviru greške testa), kao što je određeno, na primer, testom vezivanja receptora.
Kao što se ovde koristi, „biološka aktivnost“ proteina (npr. Fc fuzionog proteina IL-22) odnosi se na sposobnost proteina (npr. Fc fuzionog proteina IL-22) da veže svoj cilj, na primer, Fc sposobnost fuzionog proteina IL-22 da veže receptor IL-22. Može dalje uključivati biološki odgovor koji se može meriti in vitro ili in vivo. Takva aktivnost može biti antagonistička ili agonistička. U određenim otelotvorenjima, aktivnost je agonistička (npr aktivacija receptora).
Protein (npr. Fc fuzioni protein IL-22) koji je „podložan oksidaciji“ je onaj koji sadrži jedan ili više ostataka za koje je utvrđeno da su skloni oksidaciji kao što su, bez ograničenja, metionin (Met), cistein (Cis), histidin (His), triptofan (Trp) i tirozin (Tyr). Na primer, jedan ili više ostataka metionina u polipeptidu IL-22 mogu biti podložni oksidaciji.
Termin „procentualna oksidacija“ odnosi se na procenat proteina (npr. Fc fuzionih proteina IL-22) u formulaciji (npr. farmaceutskoj kompoziciji) koji su oksidisani na određenom aminokiselinskom ostatku, na primer, Met ostatku. Procenat oksidacije se može odrediti, npr. masenom spektrometrijskom analizom (MS) jednog ili više tripsinskih peptida, u kojima se nalazi jedan ili više specifičnih ostataka aminokiselina sklonih oksidaciji. Procenat oksidacije može se odrediti, na primer, nakon testa AAPH stresa, u roku od 9 meseci, 12 meseci, 18 meseci, ili dve godine od početne proizvodnje proteina (npr. Fc fuzionog proteina IL-22) ili njegove farmaceutske kompozicije.
Termin „procenjeno testom AAPH stresa“, kako se ovde koristi, znači da se procenat oksidacije na određenom aminokiselinskom ostatku (na primer, Met ostatak) određuje analizom masene spektrometrije tripsinskih peptida nakon formulisanja proteina (npr. Fc fuzionog proteina IL-22) sa AAPH (npr. oko 0 mM AAPH, oko 1 mM AAPH, oko 3 mM AAPH, oko 3,5 mM AAPH, ili oko 5 mM AAPH), na primer, u formulaciji od oko 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22, oko 10 mM natrijum fosfata, oko 240 mM saharoze, oko 0,02 (m/V) polisorbat 20, pH oko 7,1 oko 24 sata na oko 40°C. Protein izložen stresu (npr. Fc fuzioni protein IL-22) digestuje se tripsinom, i digestovani peptidi se podvrgavaju LC-MS-MS analizi da bi se odredio procenat oksidacije.
U smislu ovog dokumenta, „pufer“ se odnosi na puferisani rastvor koji odoleva promenama pH vrednosti delovanjem kiselinsko-baznih komponenata konjugata (ovde se takođe nazivaju „puferski agensi“). U nekim aspektima otkrića, pufer ima pH vrednost u opsegu od oko 6 do oko 8. U nekim aspektima otkrića, pufer ima pH koji je suštinski neutralan. Pufer poželjno ima pH u opsegu od oko 6,8 do oko 7,4 (npr. oko 6,8, oko 6,9, oko 7,0, oko 7,1, oko 7,2, oko 7,3, ili oko 7,4), npr, pH oko 7,1. Primeri puferski agensa za upotrebu ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, fosfat, sukcinat, acetat, histidin ili njihovu kombinaciju. U nekim aspektima otkrića, fosfat je monobazni natrijum fosfat, dvobazni natrijum fosfat, trobazni natrijum fosfat, monobazni kalijum fosfat, dvobazni kalijum fosfat, trobazni kalijum fosfat, ili njihova smeša. U nekim aspektima otkrića, fosfat je monobazni natrijum fosfat. U nekim aspektima otkrića, fosfat je dvobazni natrijum fosfat. U nekim aspektima otkrića, fosfat je smeša monobaznog natrijum fosfata i dvobaznog natrijum fosfata.
Izraz „suštinski neutralan“, kako se ovde koristi, odnosi se na opseg pH od oko 6,6 do oko 8 (npr. oko 6,6, oko 6,7, oko 6,8, oko 6,9, oko 7,0, oko 7,1, oko 7,2, oko 7,3, oko 7,4, oko 7,5, oko 7,6, oko 7,7, oko 7,8, oko 7,9 ili oko 8,0), mereno na temperaturi od oko 20°C do oko 30°C (npr. oko 20°C, oko 21°C, oko 22°C, oko 23°C, oko 24°C, oko 25°C, oko 26°C, oko 27°C, oko 28°C, oko 29°C, oko 30°C).
U smislu ovog dokumenta „surfaktant“ se odnosi na površinski aktivni agens, poželjno nejonski površinski aktivni agens. Primeri za surfaktante ovde uključuju polisorbat (na primer, polisorbat 20 i polisorbat 80); poloksamer (npr. poloksamer 188); TRITON®; natrijum oktil glikozid; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-
1
sarkozin; linoleil-, miristil- ili cetil-betain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil- ili dinatrijum metil oleil-taurat; i seriju MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietil glikol, polipropil glikol i kopolimere etilen i propilen glikola (npr. blok kopolimeri tipa PLURONIC®, npr. PLURONIC® F-68); i slično. U jednom aspektu otkrića, surfaktant je ovde polisorbat 20.
„Konzervans“ je jedinjenje koje se po izboru može uključiti u formulaciju kako bi se suštinski smanjilo delovanje bakterija u njemu, čime se olakšava, na primer, proizvodnja višenamenske formulacije. Primeri mogućih konzervansa uključuju oktadecilldimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (mešavina alkilbenzildimetilamonijum hlorida u kojoj su alkilne grupe dugolančana jedinjenja) i benzetonijum hlorid. Ostale vrste konzervansa uključuju aromatske alkohole poput fenol, butil i benzil alkohola, alkil parabene poput metil ili propil parabena, katehola, resorcinola, cikloheksanola, 3-pentanola i m-krezola. U jednom aspektu otkrića, konzervans je ovde benzil alkohol. U nekim aspektima otkrića, formulacija ne uključuje konzervans.
U okviru ove primene, osim ako nije drugačije navedeno, tehnike koje se koriste mogu se naći u bilo kojoj od nekoliko poznatih referenci kao što su: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), i Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Prema potrebi, postupci koji uključuju upotrebu komercijalno dostupnih kompleta i reagensa generalno se sprovode u skladu sa proizvođačevim definisanim protokolima i/ili parametrima, osim ako nije drugačije naznačeno.
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje uključuju Fc fuzione proteine IL-22, i njihovu upotrebu, na primer, za lečenje bolesti povezanih sa IL-22, kao što su IBC (npr. ulcerozni kolitis (UK) i Kronova bolest), kardiovaskularnih stanja, metaboličkog sindroma, GVHD, i za ubrzavanje zarastanja rana (npr. zarastanje rana dijabetičara). Takođe, ovde su obezbeđeni postupci izrade kompozicije.
Pronalazak se zasniva barem delimično na predmetnom otkriću da određene formulacije Fc fuzionih proteina IL-22 opisanih ovde pružaju povoljna svojstva, npr. kao što je opisano u predmetnim primerima. U određenim aspektima, takva povoljna svojstva
2
uključuju povećanu stabilnost i/ili povećani rok trajanja predmetno opisanih Fc fuzionih proteina IL-22 i kompozicija koje sadrže Fc fuzione proteine IL-22. Dalje, trenutno je otkriveno da Fc proteini IL-22 opisani ovde neočekivano imaju veću toplotnu stabilnost na višim pH vrednostima, kao što je opisano, npr. u primeru 1. Ove i druge korisne osobine trenutno otkrivenih kompozicija opisane su detaljnije u nastavku.
A. Farmaceutske kompozicije
Ovde su obezbeđene kompozicije (npr farmaceutske kompozicije) koje uključuju Fc fuzione proteine IL-22 sa poboljšanim rokom trajanja i stabilnošću. Bilo koji od ovde opisanih Fc fuzionih proteina IL-22 može se koristiti u kompozicijama, ali treba shvatiti da se mogu koristiti i drugi Fc fuzioni proteini (npr. Fc fuzioni proteini koji uključuju druge interleukine).
Na primer, u jednom aspektu, obezbeđena je kompozicija (npr farmaceutska kompozicija) koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22 i nosač, pri čemu kompozicija ima rok trajanja od najmanje oko 12 meseci (npr, najmanje oko 12 meseci, oko 18 meseci, oko 24 meseca, oko 30 meseci, oko 36 meseci, oko 42 meseca, oko 48 meseci, oko 54 meseca, oko 60 meseci, oko 66 meseci ili oko 72 meseca) kada se čuvaju na 5°C ± 3°C i zaštićeni od svetlosti, i pri čemu Fc fuzioni protein IL-22 uključuje IL-22 polipeptid povezan sa Fc regionom pomoću linkera. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima rok trajanja od najmanje 36 meseci kada se čuva na 5°C ± 3°C i zaštićena od svetlosti. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ima rok trajanja od najmanje 42 meseca kada se čuva na 5°C ± 3°C i zaštićena od svetlosti. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ima rok trajanja od najmanje 48 meseca kada se čuva na 5°C ± 3°C i zaštićena od svetlosti.
Na primer, u nekim aspektima otkrića, rok trajanja kada se čuva na 5°C ± 3°C i zaštićena od svetlosti je od oko 1 meseca do oko 72 meseca (npr. oko 1 mesec, oko 5 meseci, oko 10 meseci, oko 15 meseci, oko 20 meseci, oko 24 meseca, oko 25 meseci, oko 30 meseci, oko 35 meseci, oko 40 meseci, oko 45 meseci, oko 48 meseci, oko 50 meseci, oko 55 meseci, oko 60 meseci, oko 65 meseci, oko 70 meseci ili oko 72 meseca). U nekim aspektima otkrića, rok trajanja kada se čuva na 5°C ± 3°C i zaštićena od svetlosti je od oko 1 mesec do oko 72 meseca, oko 1 mesec i oko 70 meseci, oko 1 mesec i oko 65 meseci, oko 1 mesec i oko 60 meseci, oko 1 mesec i oko 55 meseci, oko 1 mesec i oko 50 meseci, oko 1 mesec i oko 48 meseci, oko 1 mesec i oko 45 meseci, oko 1 mesec i oko 40 meseci, oko 1 mesec i oko 35 meseci, oko 1 mesec i oko 30 meseci, oko 1 mesec i oko 25 meseci, oko 1 mesec i oko 24 meseca, oko 1 mesec i oko 20 meseci, oko 1 mesec i oko 18 meseci, oko 1 mesec i oko 15 meseci, oko 1 mesec i oko 12 meseci, oko 1 mesec i oko 9 meseci, oko 1 mesec i oko 6 meseci, oko 1 mesec i oko 3 meseca, oko 5 meseci i oko 72 meseca, oko 5 meseci i oko 70 meseci, oko 5 meseci i oko 65 meseci,oko 5 meseci i oko 60 meseci, oko 5 meseci i oko 55 meseci, oko 5 meseci i oko 50 meseci, oko 5 meseci i oko 48 meseci, oko 5 meseci i oko 45 meseci, oko 5 meseci i oko 40 meseci, oko 5 meseci i oko 35 meseci, oko 5 meseci i oko 30 meseci, oko 5 meseci i oko 25 meseci, oko 5 meseci i oko 24 meseca, oko 5 meseci i oko 20 meseci, oko 5 meseci i oko 18 meseci, oko 5 meseci i oko 15 meseci, oko 5 meseci i oko 12 meseci, oko 5 meseci i oko 9 meseci, oko 5 meseci i oko 6 meseci, oko 10 meseci i oko 72 meseca, oko 10 meseci i oko 70 meseci, oko 10 meseci i oko 65 meseci, oko 10 meseci i oko 60 meseci, oko 10 meseci i oko 55 meseci, oko 10 meseci i oko 50 meseci, oko 10 meseci i oko 48 meseci, oko 10 meseci i oko 45 meseci, oko 10 meseci i oko 40 meseci, oko 10 meseci i oko 35 meseci, oko 10 meseci i oko 30 meseci, oko 10 meseci i oko 25 meseci, oko 10 meseci i oko 24 meseca, oko 10 meseci i oko 20 meseci, oko 10 meseci i oko 18 meseci, oko 10 meseci i oko 15 meseci, oko 10 meseci i oko 12 meseci, oko 12 meseci i oko 72 meseca, oko 12 meseci i oko 70 meseci, oko 12 meseci i oko 65 meseci, oko 12 meseci i oko 60 meseci, oko 12 meseci i oko 55 meseci, oko 12 meseci i oko 50 meseci, oko 12 meseci i oko 48 meseci, oko 12 meseci i oko 45 meseci, oko 12 meseci i oko 40 meseci, oko 12 meseci i oko 40 meseci, oko 12 meseci i oko 35 meseci, oko 12 meseci i oko 30 meseci, oko 12 meseci i oko 25 meseci, oko 12 meseci i oko 24 meseca, oko 12 meseci i oko 20 meseci, oko 12 meseci i oko 18 meseci, oko 12 meseci i oko 15 meseci, oko 18 meseci i oko 72 meseca, oko 18 meseci i oko 70 meseci, oko 18 meseci i oko 65 meseci, oko 18 meseci i oko 60 meseci, oko 18 meseci i oko 55 meseci, oko 18 meseci i oko 50 meseci, oko 18 meseci i oko 48 meseci, oko 18 meseci i oko 45 meseci, oko 18 meseci i oko 40 meseci, oko 18 meseci i oko 35 meseci, oko 18 meseci i oko 30 meseci, oko 18 meseci i oko 25 meseci, oko 18 meseci i oko 24 meseca, oko 18 meseci i oko 20 meseci, oko 24 meseca i oko 72 meseca, oko 24 meseca i oko 70 meseci, oko 24 meseca i oko 65 meseci, oko 24 meseca i oko 60 meseci, oko 24 meseca i oko 55 meseci, oko 24 meseca i oko 50 meseci, oko 24 meseca i oko 48 meseci, oko 24 meseca i oko 45 meseci, oko 24 meseca i oko 40 meseci, oko 24 meseca i oko 35 meseci, oko 24 meseca i oko 30 meseci, oko 24 meseca i oko 25 meseci, oko 30 meseci i oko 72 meseca, oko 30 meseci i oko 70 meseci, oko 30 meseci i oko 65 meseci, oko 30 meseci i oko 60 meseci, oko 30 meseci i oko 55 meseci, oko 30 meseci i oko 50 meseci, oko 30 meseci i oko 48 meseci, oko 30 meseci i oko 45 meseci, oko 30 meseci i oko 40 meseci, oko 30 meseci i oko 35 meseci, oko 30 meseci i oko 36 meseci, oko 36 meseci i oko 72 meseca, oko 36 meseci i oko 70 meseci, oko 36 meseci i oko 65 meseci, oko 36 meseci i oko 60 meseci, oko 36 meseci i oko 55 meseci, oko 36 meseci i oko 50 meseci, oko 36 meseci i oko 48 meseci, oko 36 meseci i oko 45 meseci, oko 36 meseci i oko 40 meseci, oko 40 meseci i oko 72 meseca, oko 40 meseci i oko 70 meseci, oko 40 meseci i oko 65 meseci, oko 40 meseci i oko 60 meseci, oko 40 meseci i oko 55 meseci,
4
oko 40 meseci i oko 50 meseci, oko 40 meseci i oko 48 meseci, oko 40 meseci i oko 45 meseci, oko 42 meseca i oko 72 meseca, oko 42 meseca i oko 70 meseci, oko 42 meseca i oko 65 meseci, oko 42 meseca i oko 60 meseci, oko 42 meseca i oko 55 meseci, oko 42 meseca i oko 50 meseci, oko 42 meseca i oko 48 meseci, oko 42 meseca i oko 45 meseci, oko 46 meseci i oko 72 meseca, oko 46 meseci i oko 70 meseci, oko 46 meseci i oko 65 meseci, oko 46 meseci i oko 60 meseci, oko 46 meseci i oko 55 meseci, oko 46 meseci i oko 50 meseci, oko 46 meseci i oko 48 meseci, oko 48 meseci i oko 72 meseca, oko 48 meseci i oko 70 meseci, oko 48 meseci i oko 65 meseci, oko 48 meseci i oko 60 meseci, oko 48 meseci i oko 55 meseci, oko 48 meseci i oko 50 meseci, oko 50 meseci i oko 72 meseca, oko 50 meseci i oko 70 meseci, oko 50 meseci i oko 65 meseci, oko 50 meseci i oko 60 meseci, oko 50 meseci i oko 55 meseci, oko 55 meseci i oko 72 meseca, oko 55 meseci i oko 70 meseci, oko 55 meseci i oko 65 meseci, oko 55 meseci i oko 60 meseci, oko 60 meseci i oko 72 meseca, oko 60 meseci i oko 70 meseci, ili oko 60 meseci i oko 65 meseci.
Kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) mogu imati bilo koju pogodnu koncentraciju Fc fuzionog proteina IL-22. Na primer, u bilo kojoj od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22 može biti oko 0,01 mg/ml do oko 30 mg/ml, npr. oko 0,01 mg/ml, oko 0,05 mg/ml, oko 0,1 mg/ml, oko 0,2 mg/ml, oko 0,3 mg/ml, oko 0,4 mg/ml, oko 0,5 mg/ml, oko 0,6 mg/ml, oko 0,7 mg/ml, oko 0,8 mg/ml, oko 0,9 mg/ml, oko 1 mg/ml, oko 2 mg/ml, oko 3 mg/ml, oko 4 mg/ml, oko 5 mg/ml, oko 6 mg/ml, oko 7 mg/ml, oko 8 mg/ml, oko 9 mg/ml, oko 10 mg/ml, oko 11 mg/ml, oko 12 mg/ml, oko 13 mg/ml, oko 14 mg/ml, oko 15 mg/ml, oko 16 mg/ml, oko 17 mg/ml, oko 18 mg/ml, oko 19 mg/ml, oko 20 mg/ml, oko 21 mg/ml, oko 22 mg/ml, oko 23 mg/ml, oko 24 mg/ml, oko 25 mg/ml, oko 26 mg/ml, oko 27 mg/ml, oko 28 mg/ml, oko 29 mg/ml, ili oko 30 mg/ml.
Na primer, u nekim aspektima otkrića, koncentracija Fc fuzije IL-22 je oko 1 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 2 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 3 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 4 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 5 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 6 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 7 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 8 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 9 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 11 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 12 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 13 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 14 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 15 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 20 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 25 mg/ml do oko 30 mg/ml, oko 1 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 2 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 3 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 4 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 5 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 6 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 7 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 8 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 9 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 11 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 12 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 13 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 14 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 15 mg/ml do oko 20 mg/ml, oko 1 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 2 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 3 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 4 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 5 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 6 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 7 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 8 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 9 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 10 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 11 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 12 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 13 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 14 mg/ml do oko 15 mg/ml, oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 2 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 3 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 4 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 5 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 6 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 7 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 8 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 9 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 1 mg/ml do oko 5 mg/ml, oko 2 mg/ml do oko 5 mg/ml, oko 3 mg/ml do oko 5 mg/ml, ili oko 4 mg/ml do oko 5 mg/ml.
U nekim aspektima otkrića, koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22 je oko 0,5 mg/ml do oko 20 mg/ml. U nekim aspektima otkrića, koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22 je oko 0,5 mg/ml do oko 5 mg/ml. U nekim aspektima, koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22 je oko 1 mg/ml. U drugim aspektima otkrića, koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22 je oko 8 mg/ml do oko 12 mg/ml. U nekim aspektima, koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22 je oko 10 mg/ml.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može da sadrži stabilizator. Može se koristiti bilo koji odgovarajući stabilizator. Na primer, u nekim aspektima otkrića, stabilizator je aminokiselina, tiosorbitol, askorbinska kiselina, monotioglicerol, ciklodekstrin, troloks (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina), piridoksin, manitol, metalni helator ili njihova kombinacija. U nekim aspektima otkrića, stabilizator je aminokiselina. U nekim aspektima otkrića, aminokiselina je metionin, cistein, triptofan ili njihova kombinacija. U nekim aspektima otkrića, aminokiselina je metionin.
Može se koristiti svaka odgovarajuća koncentracija stabilizatora. Na primer, u nekim aspektima otkrića bilo koje od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), koncentracija stabilizatora (npr. metionina) je oko 0,01 mM do oko 30 mM, npr. oko 0,01 mM, oko 0,05 mM, oko 0,1 mM, oko 0,2 mM, oko 0,3 mM, oko 0,4 mM, oko 0,5 mM, oko 0,6 mM, oko 0,7 mM, oko 0,8 mM, oko 0,9 mM, oko 1 mM, oko 2 mM, oko 3 mM, oko 4 mM, oko 5 mM, oko 6 mM, oko 7 mM, oko 8 mM, oko 9 mM, oko 10 mM, oko 11 mM, oko 12 mM, oko 13 mM, oko 14 mM, oko 15 mM, oko 16 mM, oko 17 mM, oko 18 mM, oko 19 mM, oko 20 mM, oko 21 mM, oko 22 mM, oko 23 mM, oko 24 mM, oko 25 mM, oko 26 mM, oko 27 mM, oko 28 mM, oko 29 mM ili oko 30 mM. U nekim aspektima otkrića, koncentracija stabilizatora (npr. metionina) je oko 1 mM do oko 30 mM, oko 2 mM do oko 30 mM, oko 3 mM do oko 30 mM, oko 4 mM do oko 30 mM, oko 5 mM do oko 30 mM, oko 6 mM do oko 30 mM, oko 7 mM do oko 30 mM, oko 8 mM do oko 30 mM, oko 9 mM do oko 30 mM, oko 10 mM do oko 30 mM, oko 11 mM do oko 30 mM, oko 12 mM do oko 30 mM, oko 13 mM do oko 30 mM, oko 14 mM do oko 30 mM, oko 15 mM do oko 30 mM, oko 20 mM do oko 30 mM, oko 25 mM do oko 30 mM, oko 1 mM do oko 20 mM, oko 2 mM do oko 20 mM, oko 3 mM do oko 20 mM, oko 4 mM do oko 20 mM, oko 5 mM do oko 20 mM, oko 6 mM do oko 20 mM, oko 7 mM do oko 20 mM, oko 8 mM do oko 20 mM, oko 9 mM do oko 20 mM, oko 10 mM do oko 20 mM, oko 11 mM do oko 20 mM, oko 12 mM do oko 20 mM, oko 13 mM do oko 20 mM, oko 14 mM do oko 20 mM, oko 15 mM do oko 20 mM, oko 1 mM do oko 15 mM, oko 2 mM do oko 15 mM, oko 3 mM do oko 15 mM, oko 4 mM do oko 15 mM, oko 5 mM do oko 15 mM, oko 6 mM do oko 15 mM, oko 7 mM do oko 15 mM, oko 8 mM do oko 15 mM, oko 9 mM do oko 15 mM, oko 10 mM do oko 15 mM, oko 11 mM do oko 15 mM, oko 12 mM do oko 15 mM, oko 13 mM do oko 15 mM, oko 14 mM do oko 15 mM, oko 1 mM do oko 10 mM, oko 2 mM do oko 10 mM, oko 3 mM do oko 10 mM, oko 4 mM do oko 10 mM, oko 5 mM do oko 10 mM, oko 6 mM do oko 10 mM, oko 7 mM do oko 10 mM, oko 8 mM do oko 10 mM, oko 9 mM do oko 10 mM, oko 1 mM do oko 5 mM, oko 2 mM do oko 5 mM, oko 3 mM do oko 5 mM, ili oko 4 mM do oko 5 mM. U nekim aspektima otkrića, koncentracija stabilizatora (npr. metionina) je oko 2 mM do oko 8 mM. U posebnim aspektima otkrića, koncentracija stabilizatora (npr. metionina) je oko 5 mM.
U bilo kojoj od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), oksidacija metionina na poziciji M25 ili M139 (na primer, u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4) je manja od oko 10%, kako je procenjeno testom AAPH stresa, npr. manja od oko 10% oko 9%, oko 8%, oko 7%, oko 6%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, oko 2%, oko 1%, ili manje. U nekim aspektima otkrića, oksidacija metionina na poziciji M25 SEQ ID NO:4 je manja od 5%, manja od 3%, ili manja od 2%. U nekim aspektima otkrića, oksidacija metionina na poziciji M139 SEQ ID NO:4 je manja od 7%, manja od 6%, ili manja od 5%.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može dalje da uključuje surfaktant. Može se koristiti bilo koji pogodan surfaktant. U nekim aspektima otkrića, surfaktant je nejonski surfaktant (npr. polisorbat, poloksamer, polioksietelen alkil etar, alkil fenil polioksietilen etar ili njihova kombinacija). U nekim aspektima otkrića, nejonski surfaktant je polisorbat (npr. polisorbat 20 ili polisorbat 80). U određenim aspektima, polisorbat je polisorbat 20. U drugim aspektima otkrića, nejonski surfaktant je poloksamer (npr. poloksamer 188).
Može se koristiti svaka pogodna koncentracija surfaktanta. Na primer, u nekim aspektima otkrića bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), koncentracija surfaktanta (npr. polisorbata 20 ili poloksamera 188) je oko 0,001% (m/V) do oko 2% (m/V), npr. oko 0,001%, oko 0,01%, oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1%, oko 1,1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4%, oko 1,5%, oko 1,6%, oko 1,7%, oko 1,8%, oko 1,9%, ili oko 2% (m/V). U nekim aspektima otkrića, koncentracija surfaktanta (npr. polisorbata 20 ili poloksamera 188) je oko 0,01% (m/V) do oko 0,05% (m/V). U nekim aspektima otkrića, koncentracija surfaktanta (npr. polisorbata 20 ili poloksamera 188) je oko 0,01% (m/V) do oko 0,07% (m/V). U određenim aspektima otkrića, koncentracija surfaktanta (npr. polisorbata 20 ili poloksamera 188) je oko 0,02% (m/V).
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može dalje da uključuje puferski agens. Može se koristiti bilo koji odgovarajući puferski agens. U nekim aspektima otkrića, pufersko sredstvo je fosfat, sukcinat, acetat, histidin ili njihova kombinacija. U nekim aspektima otkrića, fosfat je monobazni natrijum fosfat, dvobazni natrijum fosfat, trobazni natrijum fosfat, monobazni kalijum fosfat, dvobazni kalijum fosfat, trobazni kalijum fosfat, ili njihova smeša. U nekim aspektima otkrića, fosfat je monobazni natrijum fosfat. U nekim aspektima otkrića, fosfat je dvobazni natrijum fosfat. U nekim aspektima otkrića, fosfat je smeša monobaznog natrijum fosfata i dvobaznog natrijum fosfata.
Može se koristiti svaka odgovarajuća koncentracija puferskog sredstva. Na primer, u nekim aspektima otkrića bilo koje od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), koncentracija puferskog sredstva (npr. natrijum fosfata) je oko 0,01 mM do oko 50 mM, npr. oko 0,01 mM, oko 0,05 mM, oko 0,1 mM, oko 0,2 mM, oko 0,3 mM, oko 0,4 mM, oko 0,5 mM, oko 0,6 mM, oko 0,7 mM, oko 0,8 mM, oko 0,9 mM, oko 1 mM, oko 2 mM, oko 3 mM, oko 4 mM, oko 5 mM, oko 6 mM, oko 7 mM, oko 8 mM, oko 9 mM, oko 10 mM, oko 11 mM, oko 12 mM, oko 13 mM, oko 14 mM, oko 15 mM, oko 16 mM, oko 17 mM, oko 18 mM, oko 19 mM, oko 20 mM, oko 21 mM, oko 22 mM, oko 23 mM, oko 24 mM, oko 25 mM, oko 26 mM, oko 27 mM, oko 28 mM, oko 29 mM, oko 30 mM, oko 31 mM, oko 32 mM, oko 33 mM, oko 34 mM, oko 35 mM, oko 36 mM, oko 37 mM, oko 38 mM, oko 39 mM, oko 40 mM, oko 41 mM, oko 42 mM, oko 43 mM, oko 44 mM, oko 45 mM, oko 46 mM, oko 47 mM, oko 48 mM, oko 49 mM ili oko 50 mM. U nekim aspektima otkrića, koncentracija puferskog sredstva (npr. natrijum fosfata) je oko 5 mM do oko 20 mM. U nekim aspektima otkrića, koncentracija puferskog sredstva (npr. natrijum fosfata) je oko 8 mM do oko 12 mM. U određenim aspektima otkrića, koncentracija puferskog sredstva (npr. natrijum fosfata) je oko 10 mM.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može dalje da uključuje tonični agens. Može se koristiti bilo koje pogodno sredstvo za toničnost. U nekim aspektima otkrića, sredstvo za toničnost je šećer (npr. saharoza, glukoza, glicerol ili trehaloza), aminokiselina ili so (npr. natrijum hlorid ili kalijum hlorid). U nekim aspektima otkrića, tonični agens je saharoza.
Može se koristiti svaka odgovarajuća koncentracija sredstva za toničnost. Na primer, u nekim aspektima otkrića bilo koje od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), koncentracija agensa toničnosti (npr. saharoze) je oko 1 mM do oko 1 M, npr oko 1 mM, oko 2 mM, oko 3 mM, oko 4 mM, oko 5 mM, oko 6 mM, oko 7 mM, oko 8 mM, oko 9 mM, oko 10 mM, oko 11 mM, oko 12 mM, oko 13 mM, oko 14 mM, oko 15 mM, oko 16 mM, oko 17 mM, oko 18 mM, oko 19 mM, oko 20 mM, oko 21 mM, oko 22 mM, oko 23 mM, oko 24 mM, oko 25 mM, oko 26 mM, oko 27 mM, oko 28 mM, oko 29 mM, oko 30 mM, oko 31 mM, oko 32 mM, oko 33 mM, oko 34 mM, oko 35 mM, oko 36 mM, oko 37 mM, oko 38 mM, oko 39 mM, oko 40 mM, oko 41 mM, oko 42 mM, oko 43 mM, oko 44 mM, oko 45 mM, oko 46 mM, oko 47 mM, oko 48 mM, oko 49 mM, oko 50 mM, oko 60 mM, oko 70 mM, oko 80 mM, oko 90 mM, oko 100 mM, oko 110 mM, oko 120 mM, oko 130 mM, oko 140 mM, oko 150 mM, oko 160 mM, oko 170 mM, oko 180 mM, oko 190 mM, oko 200 mM, oko 210 mM, oko 220 mM, oko 230 mM, oko 240 mM, oko 250 mM, oko 260 mM, oko 270 mM, oko 280 mM, oko 290 mM, oko 300 mM, oko 310 mM, oko 320 mM, oko 330 mM, oko 340 mM, oko 350 mM, oko 360 mM, oko 370 mM, oko 380 mM, oko 390 mM, oko 400 mM, oko 410 mM, oko 420 mM, oko 430 mM, oko 440 mM, oko 450 mM, oko 460 mM, oko 470 mM, oko 480 mM, oko 490 mM, oko 500 mM, oko 510 mM, oko 520 mM, oko 530 mM, oko 540 mM, oko 550 mM, oko 560 mM, oko 570 mM, oko 580 mM, oko 590 mM, oko 600 mM, oko 700 mM, oko 800 mM, oko 900 mM, ili oko 1M. U nekim aspektima otkrića, koncentracija agensa toničnosti je oko 100 mM do oko 500 mM. U nekim aspektima otkrića, koncentracija agensa toničnosti je oko 200 mM do oko 300 mM. U nekim aspektima otkrića, koncentracija agensa toničnosti je oko 240 mM.
Kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) opisane ovde mogu imati bilo koji pogodan pH. Na primer, u nekim aspektima otkrića, pH kompozicije je oko 5 do oko 9, npr. oko 5, oko 5,5, oko 6, oko 6,5, oko 6,6, oko 6,7, oko 6,8, oko 6,9, oko 7,0, oko 7,1, oko 7,15, oko 7,2, oko 7,3, oko 7,4, oko 7,5, oko 8,0, oko 8,5 ili oko 9. Na primer, u nekim aspektima otkrića, pH je oko 6,0 do oko 8,0, oko 6,0 do oko 7,9, oko 6,0 do oko 7,8, oko 6,0 do oko 7,7, oko 6,0 do oko 7,6, oko 6,0 do oko 7,5, oko 6,0 do oko 7.4, oko 6,0 do oko 7,3, oko 6,0 do oko 7,2, oko 6,0 do oko 7,1, oko 6,0 do oko 7,0, oko 6,0 do oko 6,9, oko 6,0 do oko 6,8, oko 6,0 do oko 6,7, oko 6,0 do oko 6,6, oko 6,0 do oko 6,5, oko 6,0 do oko 6,4, oko 6,0 do oko 6,3, oko 6,0 do oko 6,2, oko 6,0 do oko 6,1, oko 6,5 do oko 8,0, oko 6,5 do oko 7,9, oko 6,5 do oko 7,8, oko 6,5 do oko 7,7, oko 6,5 do oko 7,6, oko 6,5 do oko 7,5, oko 6,5 do oko 7,4, oko 6,5 do oko 7,3, oko 6,5 do oko 7,2, oko 6,5 do oko 7,1, oko 6,5 do oko 7,0, oko 6,5 do oko 6,9, oko 6,5 do oko 6,8, oko 6,5 do oko 6,7, oko 6,5 do oko 6,6, oko 6.6 do oko 8.0, oko 6.6 do oko 7,9, oko 6,6 do oko 7,8, oko 6,6 do oko 7,7, oko 6,6 do oko 7,6, oko 6,6 do oko 7,5, oko 6,6 do oko 7,4, oko 6,6 do oko 7,3, oko 6,6 do oko 7,2, oko 6,6 do oko 7,1, oko 6,6 do oko 7,0, oko 6,6 do oko 6,9, oko 6,6 do oko 6,8, oko 6,6 do oko 6,7, oko 6,7 do oko 8,0, oko 6,7 do oko 7,9, oko 6,7 do oko 7,8, oko 6,7 do oko 7,7, oko 6,7 do oko 7,6, oko 6,7 do oko 7,5, oko 6,7 do oko 7,4, oko 6,7 do oko 7,3, oko 6,7 do oko 7,2, oko 6,7 do oko 7,1, oko 6,7 do oko 7,0, oko 6,7 do oko 6,9, oko 6,7 do oko 6,8, oko 6,8 do oko 8,0, oko 6,8 do oko 7,9, oko 6,8 do oko 7,8, oko 6,8 do oko 7,7, oko 6,8 do oko 7,6, oko 6,8 do oko 7,5, oko 6,8 do oko 7,4, oko 6,8 do oko 7,3, oko 6,8 do oko 7,2, oko 6,8 do oko 7,1, oko 6,8 do oko 7,0, oko 6,8 do oko 6,9, oko 6,9 do oko 8.0, oko 6.9 do oko 7,9, oko 6,9 do oko 7,8, oko 6,9 do oko 7,7, oko 6,9 do oko 7,6, oko 6,9 do oko 7,5, oko 6,9 do oko 7,4, oko 6,9 do oko 7,3, oko 6,9 do oko 7,2, oko 6,9 do oko 7,1, oko 6,9 do oko 7,0, oko 7,0 do oko 8,0, oko 7,0 do oko 7,9, oko 7,0 do 7,8, oko 7,0 do oko 7,7, oko 7,0 do oko 7,6, oko 7,0 do oko 7,5, oko 7,0 do oko 7,4, oko 7,0 do oko 7,3, oko 7,0 do oko 7,2, oko 7,0 do oko 7,1, oko 7,01 do oko 7,2, oko 7,02 do oko 7,2, oko 7,03 do oko 7,2, oko 7,04 do oko 7,2, oko 7,05 do oko 7,2, oko 7,06 do oko 7,2, oko 7,07 do oko 7,2, oko 7,08 do oko 7,2, oko 7,09 do oko 7,2, oko 7,1 do oko 7,2, oko 7,01 do oko 7,15, oko 7,02 do oko 7,15, oko 7,03 do oko 7,15, oko 7,04 do oko 7,15, oko 7,05 do oko 7,15, oko 7,06 do oko 7,15, oko 7,07 do oko 7,15, oko 7,08 do oko 7,15, oko 7,09 do oko 7,15, ili oko 7,1 do oko 7,15.
Na primer, u nekim aspektima otkrića, pH je suštinski neutralan. Na primer, u nekim aspektima otkrića, pH je oko 6,6 do oko 8 (npr. oko 6,6, oko 6,7, oko 6,8, oko 6,9, oko 7,0, oko 7,1, oko 7,15, oko 7,2, oko 7,3, oko 7,4, oko 7,5, oko 8,0). U nekim aspektima otkrića, pH je oko 6,8 do oko 7,4 (npr. oko 6,8, oko 6,85, oko 6,9, oko 6,95, oko 7,0, oko 7,05, oko 7,1, oko 7,15, oko 7,2, oko 7,25, oko 7,3, oko 7,35, ili oko 7,4). U određenim aspektima otkrića, pH vrednost je oko 7,1.
Na primer, ovde je navedena kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22 i nosač, Fc fuzioni protein IL-22 koji sadrži polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera, pri čemu farmaceutski sastav sadrži oko 0,01 mg/ml do oko 30 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22 (npr. oko 0,01 mg/ml, oko 0,05 mg/ml, oko 0,1 mg/ml, oko 0,2 mg/ml, oko 0,3 mg/ml, oko 0,4 mg/ml, oko 0,5 mg/ml, oko 0,6 mg/ml, oko 0,7 mg/ml, oko 0,8 mg/ml, oko 0,9 mg/ml, oko 1 mg/ml, oko 2 mg/ml, oko 3 mg/ml, oko 4 mg/ml, oko 5 mg/ml, oko 6 mg/ml, oko 7 mg/ml, oko 8 mg/ml, oko 9 mg/ml, oko 10 mg/ml, oko 11 mg/ml, oko 12 mg/ml, oko 13 mg/ml, oko 14 mg/ml, oko 15 mg/ml, oko 16 mg/ml, oko
4
17 mg/ml, oko 18 mg/ml, oko 19 mg/ml, oko 20 mg/ml, oko 21 mg/ml, oko 22 mg/ml, oko 23 mg/ml, oko 24 mg/ml, oko 25 mg/ml, oko 26 mg/ml, oko 27 mg/ml, oko 28 mg/ml, oko 29 mg/ml, ili oko 30 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22), oko 5 mM metionina i oko 0,02% (m/V) polisorbata 20, pH 7,1, konačna koncentracija. U nekim aspektima otkrića, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) uključuje oko 10 mM natrijum fosfata i oko 240 mM saharoze. U nekim aspektima otkrića, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) uključuje oko 1 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22. U nekim aspektima otkrića, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) uključuje oko 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22. U nekim aspektima otkrića, natrijum fosfat je smeša monobaznog natrijum fosfata i dvobaznog natrijum fosfata.
Bilo koja od kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) koje su ovde navedene može biti u jediničnom doznom obliku. U nekim aspektima otkrića, jedinični dozni oblik je tečna formulacija za infuziju. U nekim aspektima otkrića, jedinični dozni oblik je tečna formulacija za injekcije. U nekim aspektima otkrića, tečna formulacija (npr. za infuziju ili injekciju) isporučuje se u ambalaži nominalne zapremine manje od oko 100 ml, npr. manje od oko 100 ml, manje od oko 90 ml, manje od oko 80 ml, manje od oko 70 ml, manje od oko 60 ml, manje od oko 50 ml, manje od oko 40 ml, manje od oko 30 ml, manje od oko 20 ml, manje od oko 10 ml, ili manje od oko 5 ml. U nekim aspektima otkrića, zapremina tečne formulacije (npr. za infuziju ili injekciju) je od oko 1 ml do oko 2 ml, npr. oko 1 ml, oko 1,1 ml, oko 1,2 ml, oko 1,3 ml, oko 1,4 ml, oko 1,5 ml, oko 1,6 ml, oko 1,7 ml, oko 1,8 ml, oko 1,9 ml ili oko 2 ml. U nekim aspektima otkrića, zapremina tečne formulacije (npr. za infuziju ili injekciju) je oko 1 ml.
U aspektima otkrića bilo koje od kompozicija (npr. farmaceutskih kompozicija) koje su ovde navedene, broj čestica ≥ 10 µm prisutnih u ambalaži ne prelazi oko 10.000 čestica. Na primer, u nekim aspektima otkrića, broj čestica ≥ 10 µm prisutnih u ambalaži ne prelazi oko 10.000 čestica, oko 9000 čestica, oko 7000 čestica, oko 6000 čestica, oko 5000 čestica, oko 4000 čestica, oko 3000 čestica, oko 2000 čestica, oko 1000 čestica, oko 900 čestica, oko 800 čestica, oko 700 čestica, oko 600 čestica, oko 500 čestica, oko 400 čestica, oko 300 čestica, oko 200 čestica, ili oko 100 čestica. U nekim aspektima otkrića, broj čestica ≥ 10 µm prisutnih u ambalaži ne prelazi 6000 čestica.
U aspektima otkrića, za bilo koje kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) koje su ovde navedene, broj čestica ≥ 25 µm prisutnih u ambalaži ne prelazi oko 2000 čestica, npr. oko 2000 čestica, oko 1500 čestica, oko 1200 čestica, oko 1000 čestica, oko 900 čestica, oko 800 čestica, oko 700 čestica, oko 600 čestica, oko 500 čestica, oko 400 čestica, oko 300 čestica, oko 200 čestica, ili oko 100 čestica. U nekim aspektima otkrića, broj čestica ≥ 25 µm prisutnih u ambalaži ne prelazi 600 čestica.
Bilo koji pogodan nosač može da se koristi u bilo kojoj od kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) koje su ovde navedene. Na primer, u nekim aspektima otkrića, nosač je voda.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može biti stabilna tokom jednog ili više ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja, npr. jednog ili više, dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, ili deset ili više ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna tokom tri ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja.
U nekim aspektima otkrića, bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) stabilna je oko 1 mesec ili duže na oko 5°C, npr. oko 1 mesec ili duže, oko 2 meseca ili duže, oko 3 meseca ili duže, oko 4 meseca ili duže, oko 5 meseci ili duže, oko 6 meseci ili duže, oko 7 meseci ili duže, oko 8 meseci ili duže, oko 9 meseci ili duže, oko 10 meseci ili duže, oko 11 meseci ili duže, oko 12 meseci ili duže, oko 14 meseci ili duže, oko 16 meseci ili duže, oko 18 meseci ili duže, oko 20 meseci ili duže, oko 22 meseca ili duže, oko 24 meseca ili duže, oko 26 meseci ili duže, oko 28 meseci ili duže, oko 30 meseci ili duže, oko 32 meseca ili duže, oko 34 meseca ili duže, oko 36 meseci ili duže, oko 38 meseci ili duže, oko 40 meseci ili duže, oko 42 meseca ili duže, oko 44 meseca ili duže, oko 46 meseci ili duže, oko 48 meseci ili duže, oko 50 meseci ili duže, oko 52 meseca ili duže, oko 54 meseca ili duže, oko 56 meseci ili duže, oko 58 meseci ili duže, oko 60 meseci ili duže, oko 62 meseca ili duže, oko 64 meseca ili duže, oko 66 meseci ili duže, oko 68 meseci ili duže, oko 70 meseci ili duže, oko 72 meseca ili duže, oko 74 meseca ili duže, oko 76 meseci ili duže, oko 78 meseci ili duže, oko 80 meseci ili duže, oko 82 meseca ili duže, oko 84 meseca ili duže, oko 86 meseci ili duže, oko 88 meseci ili duže, oko 90 meseci ili duže, oko 92 meseca ili duže, oko 94 meseca ili duže, oko 96 meseci ili duže, oko 98 meseci ili duže, ili oko 100 meseci ili duže. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 24 meseca ili duže na 5°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 36 meseci ili duže na 5°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 42 meseca ili duže na 5°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 48 meseci ili duže na 5°C.
U nekim aspektima otkrića, bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) stabilna je oko 1 nedelju ili duže na oko 25°C, npr. oko 1 nedelju ili duže, oko 2 nedelje ili duže, oko 3 nedelje ili duže, oko 4 nedelje ili duže, oko 5 nedelja ili duže, oko 6 nedelja ili duže, oko 7 nedelja ili duže, oko 8 nedelja ili duže, oko 9 nedelja ili duže, oko 10 nedelja ili duže, oko 12 nedelja ili duže, oko 14 nedelja ili duže, oko 16 nedelja ili duže, oko 18 nedelja ili duže, oko 20 nedelja ili duže, oko 22 nedelje ili duže, oko 24 nedelje ili duže, oko 26 nedelja ili duže, oko 28 nedelja ili duže, oko 30 nedelja ili duže, oko 32 nedelje ili duže, oko 34 nedelje ili duže, oko 36 nedelja ili duže, oko 38 nedelja ili duže, oko 40 nedelja ili duže, oko 42 nedelje ili duže, oko 44 nedelje ili duže, oko 46 nedelja ili duže, oko 48 nedelja ili duže, oko 50 nedelja ili duže, ili oko 52 nedelje ili duže. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 2 nedelje ili duže na oko 25°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 4 nedelje ili duže na oko 25°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 8 nedelja ili duže na oko 25°C.
U nekim aspektima otkrića, bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) stabilna je oko 12 meseci ili duže na oko -20°C, npr. oko 12 meseci ili duže, oko 14 meseci ili duže, oko 16 meseci ili duže, oko 18 meseci ili duže, oko 20 meseci ili duže, oko 22 meseca ili duže, oko 24 meseca ili duže, oko 26 meseci ili duže, oko 28 meseci ili duže, oko 30 meseci ili duže, oko 32 meseca ili duže, oko 34 meseca ili duže, oko 36 meseci ili duže, oko 38 meseci ili duže, oko 40 meseci ili duže, oko 42 meseca ili duže, oko 44 meseca ili duže, oko 46 meseci ili duže, oko 48 meseci ili duže, oko 50 meseci ili duže, oko 52 meseca ili duže, oko 54 meseca ili duže, oko 56 meseci ili duže, oko 58 meseci ili duže, oko 60 meseci ili duže, oko 62 meseca ili duže, oko 64 meseca ili duže, oko 66 meseci ili duže, oko 68 meseci ili duže, oko 70 meseci ili duže, oko 72 meseca ili duže, oko 74 meseca ili duže, oko 76 meseci ili duže, oko 78 meseci ili duže, oko 80 meseci ili duže, oko 82 meseca ili duže, oko 84 meseca ili duže, oko 86 meseci ili duže, oko 88 meseci ili duže, oko 90 meseci ili duže, oko 92 meseca ili duže, oko 94 meseca ili duže, oko 96 meseci ili duže, oko 98 meseci ili duže, ili oko 100 meseci ili duže. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 48 meseci ili duže na -20°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 60 meseci ili duže na -20°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 72 meseca ili duže na -20°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 84 meseca ili duže na -20°C. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je stabilna oko 96 meseci ili duže na -20°C.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može imati čistoću od oko 70% ili više, na primer, kao što je procenjeno pomoću tečne hromatografije visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC). Na primer, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može imati čistoću od oko 70% ili više, oko 72% ili više, oko 74% ili više, oko 76% ili više, oko 78% ili više, oko 80% ili više, oko 82% ili više, oko 84% ili više, oko 86% ili više, oko 88% ili više, oko 90% ili više, oko 91% ili više, oko 92% ili više, oko
4
94% ili više, oko 95% ili više, oko 96% ili više, oko 97% ili više, oko 98% ili više, oko 99% ili više, ili oko 100%, procenjeno pomoću SE-HPLC. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, procenjeno pomoću SE-HPLC. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 90% ili više, procenjeno pomoću SE-HPLC. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, procenjeno pomoću SE-HPLC.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može imati čistoću od oko 70% ili više (npr. oko 70% ili više, oko 72% ili više, oko 74% ili više, oko 76% ili više, oko 78% ili više, oko 80% ili više, oko 82% ili više, oko 84% ili više, oko 86% ili više, oko 88% ili više, oko 90% ili više, oko 91% ili više, oko 92% ili više, oko 94% ili više, oko 95% ili više, oko 96% ili više, oko 97% ili više, oko 98% ili više, oko 99% ili više, ili oko 100%) procenjeno pomoću SE-HPLC, oko 6 meseci ili duže na oko 5°C, npr. oko 6 meseci ili duže, oko 7 meseci ili duže, oko 8 meseci ili duže, oko 9 meseci ili duže, oko 10 meseci ili duže, oko 11 meseci ili duže, oko 12 meseci ili duže, oko 14 meseci ili duže, oko 16 meseci ili duže, oko 18 meseci ili duže, oko 20 meseci ili duže, oko 22 meseca ili duže, oko 24 meseca ili duže, oko 26 meseci ili duže, oko 28 meseci ili duže, oko 30 meseci ili duže, oko 32 meseca ili duže, oko 34 meseca ili duže, oko 36 meseci ili duže, oko 38 meseci ili duže, oko 40 meseci ili duže, oko 42 meseca ili duže, oko 44 meseca ili duže, oko 46 meseci ili duže, oko 48 meseci ili duže, oko 50 meseci ili duže, oko 52 meseca ili duže, oko 54 meseca ili duže, oko 56 meseci ili duže, oko 58 meseci ili duže, oko 60 meseci ili duže, oko 62 meseca ili duže, oko 64 meseca ili duže, oko 66 meseci ili duže, oko 68 meseci ili duže, oko 70 meseci ili duže, oko 72 meseca ili duže, oko 74 meseca ili duže, oko 76 meseci ili duže, oko 78 meseci ili duže, oko 80 meseci ili duže, oko 82 meseca ili duže, oko 84 meseca ili duže, oko 86 meseci ili duže, oko 88 meseci ili duže, oko 90 meseci ili duže, oko 92 meseca ili duže, oko 94 meseca ili duže, oko 96 meseci ili duže, oko 98 meseci ili duže, ili oko 100 meseci ili duže. Na primer, u nekim aspektima otkrića, kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC tokom oko 36 meseci ili duže na oko 5°C. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC tokom oko 42 meseca ili duže na oko 5°C. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ima čistoću od oko 95% ili više, kao što je procenjeno pomoću SE-HPLC, tokom oko 48 meseci ili duže, na oko 5°C.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može imati čistoću od oko 65% ili više, na primer, kao što je procenjeno kapilarnom elektroforezom prosejavanjem bez gela sa natrijum dodecil sulfatom (CE-SDS-NGS), npr. NR CE-SDS-NGS. Na primer, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može imati čistoću od oko 65% ili više, oko 66% ili više, oko 67% ili više, oko 68% ili više, oko 69% ili više, oko 70% ili više, oko 72% ili više, oko 74% ili više, oko 76% ili više, oko 78% ili više, oko 80% ili više, oko 82% ili više, oko 84% ili više, oko 86% ili više, oko 88% ili više, oko 90% ili više, oko 91% ili više, oko 92% ili više, oko 94% ili više, oko 95% ili više, oko 96% ili više, oko 97% ili više, oko 98% ili više, oko 99% ili više, ili oko 100%, procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 75% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 80% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 90% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS). U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 55% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS).
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može imati čistoću od oko 65% ili više (npr oko 65% ili više, oko 66% ili više, oko 67% ili više, oko 68% ili više, oko 69% ili više, oko 70% ili više, oko 72% ili više, oko 74% ili više, oko 76% ili više, oko 78% ili više, oko 80% ili više, oko 82% ili više, oko 84% ili više, oko 86% ili više, oko 88% ili više, oko 90% ili više, oko 91% ili više, oko 92% ili više, oko 94% ili više, oko 95% ili više, oko 96% ili više, oko 97% ili više, oko 98% ili više, oko 99% ili više, ili oko 100%), procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS), oko 6 meseci ili duže na oko 5°C, npr. oko 6 meseci ili duže, oko 7 meseci ili duže, oko 8 meseci ili duže, oko 9 meseci ili duže, oko 10 meseci ili duže, oko 11 meseci ili duže, oko 12 meseci ili duže, oko 14 meseci ili duže, oko 16 meseci ili duže, oko 18 meseci ili duže, oko 20 meseci ili duže, oko 22 meseca ili duže, oko 24 meseca ili duže, oko 26 meseci ili duže, oko 28 meseci ili duže, oko 30 meseci ili duže, oko 32 meseca ili duže, oko 34 meseca ili duže, oko 36 meseci ili duže, oko 38 meseci ili duže, oko 40 meseci ili duže, oko 42 meseca ili duže, oko 44 meseca ili duže, oko 46 meseci ili duže, oko 48 meseci ili duže, oko 50 meseci ili duže, oko 52 meseca ili duže, oko 54 meseca ili duže, oko 56 meseci ili duže, oko 58 meseci ili duže, oko 60 meseci ili duže, oko 62 meseca ili duže, oko 64 meseca ili duže, oko 66 meseci ili duže, oko 68 meseci ili duže, oko 70 meseci ili duže, oko 72 meseca ili duže, oko 74 meseca ili duže, oko 76 meseci ili duže, oko 78 meseci ili duže, oko 80 meseci ili duže, oko 82 meseca ili duže, oko 84 meseca ili duže, oko 86 meseci ili duže, oko 88 meseci ili duže, oko 90 meseci ili duže, oko 92 meseca ili duže, oko 94 meseca ili duže, oko 96 meseci ili duže, oko 98 meseci ili duže, ili oko 100 meseci ili duže. Na primer, u nekim
4
aspektima otkrića, kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više kako je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS) tokom oko 36 meseci ili duže na oko 5°C. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, kao što je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. CE-SDS-NGS) tokom oko 42 meseca ili duže na oko 5°C. U nekim aspektima otkrića, kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više kako je procenjeno pomoću CE-SDS-NGS (npr. NR CE-SDS-NGS) tokom oko 48 meseci ili duže na oko 5°C.
Bilo koja od kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može se formulisati za primenu bilo kojim pogodnim putem primene. Na primer, u nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je formulisana za intravensku, subkutanu, intraperitonealnu ili topikalnu primenu. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je formulisana za intravensku primenu. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je formulisana za subkutanu primenu.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) može da sadrži konzervans. U drugim aspektima otkrića, bilo koja od prethodnih kompozicija ne sadrži konzervans.
Bilo koja od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može se formulisati za primenu (npr. infuzijom ili injekcijom) nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida i/ili razblaživačem. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja razblaživačem. U nekim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida i razblaživačem. Na primer, u nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se primenjuje na ispitaniku infuzijom Fc fuzionog proteina IL-22 koji je razblažen samo razblaživačem (npr. u špric pumpi). U drugim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se primenjuje na ispitaniku infuzijom Fc fuzionog proteina IL-22 koji je razblažen razblaživačem i fiziološkim rastvorom (npr. u kesi za i.v.). U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se primenjuje na ispitaniku infuzijom Fc fuzionog proteina IL-22 koji je razblažen direktno u fiziološki rastvor (npr. izotonični fiziološki rastvor). U nekim aspektima otkrića, izotonični rastvor natrijum hlorida uključuje oko 0,001% do oko 5% (m/V) NaCl. U nekim aspektima otkrića, izotonični rastvor natrijum hlorida uključuje oko 0,1% do oko 2% (m/V) NaCl. U nekim aspektima otkrića, izotonični rastvor natrijum hlorida uključuje oko 0,5% do oko 1,5% (m/V) NaCl. U nekim aspektima otkrića, izotonični rastvor natrijum hlorida uključuje oko 0,9% (m/V) NaCl. U nekim aspektima otkrića, razblaživač uključuje
4
pufersko sredstvo, sredstvo za toničnost i/ili surfaktant. Bilo koje od puferskih sredstava, sredstava za toničnost i/ili površinski aktivnih supstanci opisanih ovde, i u bilo kojoj koncentraciji opisanoj ovde, može se koristiti u razblaživaču. U nekim aspektima otkrića, razblaživač uključuje oko 10 mM natrijum fosfat, oko 240 mM saharozu, oko 0,02% (m/V) polisorbat 20, pH 7,1, konačnu koncentraciju.
U nekim aspektima otkrića bilo koje od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija), Fc region Fc fuzionog proteina IL-22 nije glikozilovan. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je Gly. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je Ala. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 299 kao u EU indeksu Fc regiona je Ala, Gly ili Val. U nekim aspektima otkrića, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG1 ili IgG4. U nekim aspektima otkrića, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG4.
U nekim aspektima otkrića bilo koje od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija), Fc fuzioni protein IL-22 sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, i SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 96% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 97% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:10. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni
4
protein IL-22 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, region Fc nije N-glikozilovan.
U bilo kojoj od prethodnih kompozicija (npr.farmaceutska kompozicija), Fc fuzioni protein IL-22 može biti dimerni Fc fuzioni protein IL-22. U drugim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 može biti monomerni Fc fuzioni protein IL-22.
U bilo kojoj od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija), Fc fuzioni protein IL-22 može uključivati humani polipeptid IL-22. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:4.
Bilo koji pogodan linker se može koristiti u Fc fuzionim proteinima IL-22 sadržanim u kompozicijama (npr. farmaceutske kompozicije) opisanim ovde. U nekim aspektima otkrića, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44). U nekim aspektima otkrića, linker se sastoji od aminokiselinske sekvence RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44).
U bilo kojem od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije), Fc fuzioni protein IL-22 može da se vezuje za receptor IL-22. U nekim aspektima otkrića, receptor IL-22 je humani receptor IL-22. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se vezuje za IL-22R1 i/ili IL-10R2. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se vezuje za IL-22R1. U nekim aspektima otkrića, humani receptor IL-22 sadrži heterodimer koji se sastoji od polipeptida IL-22R1 i polipeptida IL-10R2. U nekim aspektima otkrića, polipeptid IL-22R1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82 i polipeptid IL-10R2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84.
Kao jedan primer, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koji uključuje Fc fuzioni protein IL-22 i nosač (npr. vodu), gde Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8 ili SEQ ID NO:16, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži oko 5 mM metionin, oko 10 mM natrijum fosfat, oko 240 mM saharozu i oko 0,02% (m/V) polisorbat 20, pH 7,1, konačna koncentracija.
U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni proteini IL-22 sadržani u bilo kojoj od prethodnih kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) proizvode se metodom koja obuhvata korak uzgajanja ćelije domaćina sposobne da eksprimira Fc fuzioni protein IL-22 pod uslovima pogodnim za ekspresiju Fc fuzionog proteina IL-22. U nekim aspektima otkrića, metoda dalje obuhvata korak dobijanja Fc fuzionog proteina IL-22 iz ćelijske kulture ili medijuma kulture. U nekim aspektima otkrića, ćelija domaćin je CHO ćelija.
Kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koji sadrže Fc fuzione proteine IL-22) ovde će biti formulisane, dozirane i primenjene na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni
4
poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog ispitanika, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. U jednom aspektu otkrića, kompozicija se može koristiti za produženje trajanja preživljavanja ljudskog ispitanika koji je podložan ili ima dijagnostikovanu bolest ili stanje. Trajanje preživljavanja definiše se kao vreme od prve primene leka do smrti. U jednom aspektu otkrića, kompozicija se može koristiti za smanjenje jednog ili više simptoma kod ljudskog ispitanika koji je podložan ili ima dijagnostikovanu bolest ili stanje, na primer, bilo koji poremećaj opisan ovde (npr. IBC, npr. UK ili Kronova bolest).
Farmaceutske formulacije se mogu pripremiti pomoću standardnih postupaka poznatih u struci mešanjem aktivnog sastojka koji ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (pogledajte, npr. Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980) i Remington's Pharmaceutical Sciences 20. izdanje, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Opciono, formulacija sadrži farmaceutski prihvatljivu so, poželjno natrijum hlorid, i
4
poželjno u približno fiziološkim koncentracijama.
Opciono, formulacije kako su ovde otkrivene mogu sadržati farmaceutski prihvatljiv konzervans. U nekim aspektima otkrića, koncentracija konzervansa se kreće od 0,1 do 2,0%, obično V/V. Pogodni konzervansi uključuju one koji su poznati u farmaceutskoj struci. Benzil alkohol, fenol, m-krezol, metilparaben, benzalkonijum hlorid i propilparaben su poželjni konzervansi. Opciono, formulacije iz ovog pronalaska mogu da uključuju farmaceutski prihvatljiv surfaktant u koncentraciji od 0,005 do 0,02%.
Formulacija iz ovog dokumenta može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja, kao što je neophodno za konkretnu indikaciju koja se leči, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedno na drugo. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Primeri liofilizovanih formulacija opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije obuhvataju one opisane u US Patentu br.6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno dodatno obezbediti steroid, TNF antagonist ili druga antiinflamatorna terapeutska sredstva. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Farmaceutska kompozicija za topikalnu primenu može se formulisati, na primer, u obliku topikalnog gela. Pogledajte npr. US 4,717,717; US 5,130,298; US 5,427,778; US 5,457,093; US 5,705,485; US 6,331,309; i WO2006/138,468. U određenim aspektima otkrića, sastav se može formulisati u prisustvu derivata celuloze. U nekim drugim aspektima otkrića, topikalna formulacija se može rekonstituisati iz liofilizovane formulacije sa dovoljnim puferom ili razblaživačem pre primene. U određenim aspektima otkrića, polipeptid IL-22 ili Fc fuzioni protein IL-22 je formulisan za topikalnu primenu na ispitaniku koji ima problem sa zarastanjem epitelnih rana. U određenim posebnim aspektima otkrića, epitelno zarastanje rana se odvija u koži. U određenim drugim posebnim aspektima otkrića, ispitanik je čovek koji ima problem sa zarastanjem rana. U nekim drugim aspektima otkrića, topikalna formulacija koja sadrži Fc fuzioni protein IL-22 iz pronalaska može se koristiti za poboljšanje zarastanja rana nakon unutrašnjih ili spoljašnjih hirurških rezova.
U jednom aspektu otkrića, polipeptid IL-22 ili Fc fuzioni protein IL-22 za upotrebu u ubrzavanju, promovisanju ili poboljšanju zarastanja rana je u formulaciji topikalnog gela, npr. u prethodno napunjenom špricu ili ambalaži ili alternativno, jedinjenje iz ovog pronalaska može da se meša sa matricom gela neposredno pre topikalne primene na pacijentu. U određenim aspektima otkrića, dodatno terapeutsko sredstvo se takođe primenjuje topikalno, bilo istovremeno ili sekvencijalno. Drugi putevi primene se takođe mogu opciono koristiti, npr. primenjuju se bilo kojim pogodnim putem, uključujući, ali se ne ograničavajući na, parenteralnu, subkutanu, intraperitonealnu, intrapulmonalnu, intracerobrospinalnu, subkutanu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intratekalnu, oralnu i intranazalnu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu.
Tipično za zarastanje rana, Fc fuzioni protein IL-22 je formulisan za isporuku specifičnu za lokaciju. Kada se primenjuje topikalno, Fcfuzioni protein IL-22 je prikladno kombinovan sa drugim sastojcima, kao što su nosači i/ili adjuvansi. Ne postoje ograničenja u prirodi takvih drugih sastojaka, osim što oni moraju biti farmaceutski prihvatljivi i efikasni za nameravanu primenu i ne mogu umanjivati aktivnost aktivnih sastojaka sastava. Primeri odgovarajućih vehikuluma uključuju masti, kreme, gelove, sprejeve ili suspenzije, sa prečišćenim kolagenom ili bez prečišćenog kolagena. Sastavi takođe mogu biti impregnirani u sterilne obloge, transdermalne flastere, gipseve i zavoje, opciono u tečnom ili polutečnom obliku. Takođe se mogu koristiti oksidovane regenerisane celulozne/kolagenske matrice, npr. PROMOGRAN matrični zavoj za rane ili PROMOGRAN PRISMA MATRIX.
Za dobijanje formulacije gela, polipeptid IL-22 ili Fc fuzioni IL-22 protein formulisan u tečnoj kompoziciji može se mešati sa efikasnom količinom polisaharida rastvorljivog u vodi ili sintetičkog polimera da bi se formirao gel (npr. sredstvo za želiranje) kao što je polietilen glikol, da bi se formirala formulacija odgovarajuće viskoznosti za topikalnu primenu. Polisaharid ili sredstvo za želiranje koje se može koristiti uključuje, na primer, derivate celuloze kao što su eterifikovani derivati celuloze, uključujući alkil celuloze, hidroksialkil celuloze i alkilhidroksialkil celuloze, na primer, metilcelulozu, hidroksietil celulozu, karboksimetil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu i hidroksipropil celulozu; natrijum karboksimetil celulozu; POE-POP blok polimere: poloksamer USP različitih sastava; hijaluronsku kiselinu; poliakrilnu kiselinu kao što je karbopol 940; skrob i frakcionisani skrob; agar; alginsku kiselinu i alginate; arapsku gumu; pululan; agarozu; karagenan; dekstrane; dekstrin; fruktane; inulin; manane; ksilane; arabinane; hitozane; glikogene; glukane i sintetičke biopolimere; kao i gume kao što su ksantan guma; guar guma; guma rogača; arapska guma; tragakant guma; i karaja guma; i derivate, kombinacije i njihove smeše. U jednom aspektu otkrića, sredstvo za želiranje ovde je ono koje je, na primer, inertno prema biološkim sistemima, netoksično, jednostavno za pripremu, i/ili nije previše tečno ili viskozno, i neće
1
destabilizovati polipeptid IL-22 ili Fc fuziju IL-22 sadržanu u njemu.
U određenim aspektima otkrića, polisaharid je eterifikovani derivat celuloze, u drugom otelotvorenju onaj koji je dobro definisan, prečišćen i naveden u USP, npr. metilceluloza i derivati hidroksialkil celuloze, kao što su hidroksipropil celuloza, hidroksietil celuloza i hidroksipropil metilceluloza (zajedno se nazivaju celulozni agensi). U nekim aspektima otkrića, polisaharid je hidroksietil metilceluloza ili hidroksipropil metilceluloza.
Polietilen glikol koristan za želiranje je obično smeša polietilen glikola male i velike molekulske mase da bi se dobila odgovarajuća viskoznost. Na primer, smeša polietilen glikola molekulske mase 400-600 sa polietilen glikolom molekulske mase 1500 je efikasna u tu svrhu kada se pomeša u odgovarajućem odnosu da bi se dobila pasta.
Termin „rastvorljiv u vodi“ kako se primenjuje na polisaharide i polietilen glikole ima za cilj da uključuje koloidne rastvore i disperzije. Generalno, rastvorljivost derivata celuloze je određena stepenom supstitucije etarskih grupa, a stabilizujući derivati korisni ovde treba da imaju dovoljnu količinu takvih etarskih grupa po jedinici anhidroglukoze u lancu celuloze da bi derivati postali rastvorljivi u vodi. Stepen supstitucije etra od najmanje 0,35 etarskih grupa po jedinici anhidroglukoze je generalno dovoljan. Dodatno, derivati celuloze mogu biti u obliku soli alkalnih metala, na primer, soli Li, Na, K ili Cs.
U određenim aspektima otkrića, metilceluloza se koristi u gelu, na primer, ona sadrži oko 1-5%, ili oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4% ili oko 5%, gela i Fc fuzioni protein IL-22 je prisutan u količini od oko 50-2000 µg, 100-2000 µg, ili 100-1000 µg po ml gela. U određenim aspektima otkrića, delotvorna količina Fc fuzionog proteina IL-22 za zarastanje rana topikalnom primenom može biti oko 25 µg do oko 500 µg, oko 50 µg do oko 300 µg, oko 100 µg do oko 250 µg, oko 50 µg do oko 250 µg, oko 50 µg do oko 150 µg, oko 75 µg, oko 100 µg, oko 125 µg, oko 150 µg, oko 175 µg, oko 200 µg, oko 225 µg, oko 250 µg, oko 300 µg, ili oko 350 µg, po cm<2>površine rane.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
Predmetno otkriće daje doze za terapska sredstva zasnovana na Fc fuzionim proteinima IL-22. Na primer, u zavisnosti od tipa i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1-20 mg/kg) polipeptida je kandidat za početnu dozu za primenu na ispitaniku, bilo da je npr. putem jedne ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Međutim, mogu biti korisni i
2
drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza polipeptida (npr. Fc fuzionog proteina IL-22) (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste polipeptida, težine i toka bolesti, od toga da li se polipeptid primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije ispitanika i njegovog odgovora na polipeptid, kao i odluke nadležnog lekara. Polipeptid se pogodno primenjuje na ispitaniku jednokratno, ili kao serija terapija. Zavisno od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 20 mg/kg (npr.0,1 mg/kg-15 mg/kg) polipeptida može biti kandidat za početnu dozu za primenu na ispitaniku, na primer, putem jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedan primer za dozu polipeptidaje u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 20 mg/kg. Dakle, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg ili 20 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može biti primenjena na ispitaniku. U određenim aspektima otkrića, oko 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9,0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg ili 20 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se primeniti na ispitaniku. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr. svake nedelje, svake dve nedelje, ili svake tri nedelje (npr. tako da ispitanik primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza polipeptida). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Primer za dozni režim uključuje primenu inicijalne početne doze od oko 4 mg/kg, a zatim nedeljne doze održavanja od oko 2 mg/kg antitela. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Jedinjenja koja su ovde otkrivena za prevenciju ili lečenje kardiovaskularne bolesti ili stanja, metaboličkog sindroma, akutne endotoksemije ili sepse, GVHD ili dijabetesa obično se primenjuju putem intravenske injekcije.
Mogu se koristiti i druge metode primene, koje uključuju, ali nisu ograničene na, topikalnu, parenteralnu, kao intravensku, subkutanu, intraperitonealnu, intrapulmonalnu, intranazalnu, okularnu, intraokularnu, intravitrealnu, intralezionu, intracerobrospinalnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intratekalnu, oralnu ili inhalacionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Pored toga, ovde opisana jedinjenja se primenjuju na ljudskom ispitaniku, u skladu sa poznatim metodama, kao što je intravenska primena kao bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda.
1. Primeri Fc fuzionih proteina IL-22 za upotrebu u kompozicijama Generalno, Fc fuzioni proteini IL-22 uključuju polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera. Bilo koji od Fc fuzionih proteina IL-22 opisanih u U.S. patentu br.
9,815,880 može se koristiti u kompozicijama koje su ovde opisane. U nekim aspektima bilo kog od prethodnih Fc fuzionih proteina IL-22, Fc region nije glikozilovan. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je Gly. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je Ala. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinski ostatak na poziciji 299 kao u EU indeksu Fc regiona je Ala, Gly ili Val. U nekim aspektima otkrića, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG1 ili IgG4. U nekim aspektima otkrića ts, Fc region obuhvata CH2 i CH3 domen IgG4.
U nekim aspektima otkrića bilo kojeg od prethodnih Fc fuzionih proteina IL-22, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, i SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 96% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 97% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NQ:10. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži
4
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16. U nekim aspektima otkrića, region Fc nije N-glikozilovan.
Bilo koji od prethodnih Fc fuzionih proteina IL-22 može biti dimerni Fc fuzioni protein IL-22. U drugim aspektima otkrića, bilo koji od prethodnih Fc fuzionih proteina IL-22 može biti monomerni Fc fuzioni protein IL-22.
Bilo koji od prethodnih Fc fuzionih proteina IL-22 može uključivati humani polipeptid IL-22. U nekim aspektima otkrića, aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:4.
Bilo koji odgovarajući linker se može koristiti u ovde opisanim Fc fuzionim proteinima IL-22. U nekim aspektima otkrića, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44). U nekim aspektima otkrića, linker se sastoji od aminokiselinske sekvence RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44).
U nekim aspektima otkrića, bilo koji od ovde opisanih Fc fuzionih proteina IL-22 vezuje se za receptor IL-22. U nekim aspektima otkrića, receptor IL-22 je humani receptor IL-22. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se vezuje za IL-22RA1 i/ili IL-10R2. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 se vezuje za IL-22RA1.
U nekim aspektima otkrića, bilo koji od prethodnih Fc fuzionih proteina IL-22 se proizvodi metodom koja sadrži korak kultivisanja ćelije domaćina sposobne da eksprimira Fc fuzioni protein IL-22 pod uslovima pogodnim za ekspresiju Fc fuzionog proteina IL-22. U nekim aspektima otkrića, metoda dalje obuhvata korak dobijanja Fc fuzionog proteina IL-22 iz ćelijske kulture ili medijuma kulture. U nekim aspektima otkrića, ćelija domaćin je CHO ćelija.
U određenim aspektima otkrića, bilo koji od ovde opisanih Fc fuzionih proteina IL-22 vezuje se i indukuje aktivnost receptora IL-22 ili signalizaciju i/ili je agonist aktivnosti receptora IL-22.
U drugom aspektu, Fc fuzioni protein IL-22 koji je ovde opisan sadrži polipeptid sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:4. U nekim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence koja sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali Fc fuzioni protein IL-22 koji sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za receptor IL-22. U određenim aspektima otkrića, ukupno je zamenjena, umetnuta i/ili uklonjena 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:8, 10, 12, 14, 16, 24 ili 26. U nekim aspektima otkrića, supstitucije, dešavaju se umetanja ili uklanjanja u regionima izvan IL-22 (tj. u Fc). U nekim aspektima otkrića, supstitucije, umetanja ili brisanja mogu biti u linkeru, šarki, CH2 domenu, CH3 domenu Fc fuzionog proteina IL-22. U određenim posebnim aspektima otkrića, C-terminalni Lys ostatak Fc je izbačen. U nekim drugim aspektima otkrića, C-terminalni Gly i Lys ostaci Fc su izbačeni.
U nekim aspektima otkrića, obezbeđene su varijante Fc fuzionog proteina IL-22 koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli A pod naslovom „poželjne supstitucije”. Konkretnije izmene su date u Tabeli A pod naslovom „primeri supstitucija” i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u Fc fuzioni protein IL-22 i proizvodi testirani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje receptora IL-22, smanjena imunogenost ili poboljšana signalizacija receptora IL-22.
Tabela A
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:
(1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Korisni postupak za identifikaciju ostataka ili regiona proteina koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom”, a opisan je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) identifikuju se i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju proteina sa vezujućim partnerom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura proteinskog kompleksa (npr. kompleks citokin-receptor) može se koristiti za identifikaciju kontaktnih tačaka između proteina i njegovog vezujućeg partnera. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja.
Ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju Fc fuzione proteine IL-22. U nekim aspektima otkrića, nukleinska kiselina kodira Fc fuzioni protein IL-22 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24 ili SEQ ID NO:26, poželjno SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:16, poželjnije SEQ ID NO:8. U nekim drugim aspektima otkrića, nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:23 ili SEQ ID NO:25. U određenim specifičnim aspektima otkrića, nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:7 ili SEQ ID NO:11, poželjno SEQ ID NO:7. U određenim aspektima otkrića, izolovana nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:23 ili SEQ ID NO:25. U određenim aspektima otkrića, izolovana nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:23 ili SEQ ID NO:25, pri čemu je izolovana nukleinska kiselina sposobna da kodira Fc fuzioni protein IL-22 koji je sposoban da se veže za IL-22R i/ili da aktivira aktivnost IL-22R, i pri čemu Fc region Fc fuzionog proteina IL-22 nije glikozilovan. U određenim aspektima otkrića, izolovana nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:23 ili SEQ ID NO:25, pri čemu je izolovana nukleinska kiselina sposobna da kodira Fc fuzioni protein IL-22 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8, 10, 12 ili 14. U srodnim aspektima, obezbeđeni su vektori koji sadrže gore opisanu nukleinsku kiselinu i ćeliju domaćina koja sadrži vektor. U određenim aspektima otkrića, ćelija domaćin je prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija. U određenim posebnim aspektima otkrića, ćelija domaćin je prokariotska ćelija, uključujući, bez ograničenja, ćeliju E. coli. U nekim drugim aspektima otkrića, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, uključujući, bez ograničenja, CHO ćeliju. U određenim aspektima otkrića, ćelija domaćin sadrži vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Fc fuzioni protein IL-22 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8.
a) Varijante glikozilacije
U određenim aspektima otkrića, ovde navedeni Fc fuzioni protein IL-22 je izmenjen kako bi se povećao ili smanjio stepen u kojem je fuzioni protein ili njegov deo (npr. Fc deo fuzionog proteina) glikozilovan. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na proteinu može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.
Kada fuzioni protein sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti npr. Wright et al.
TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim aspektima otkrića, modifikacije oligosaharida u antitelu ili Fc regionu antitela mogu biti načinjene da bi se dobile Fc varijante sa određenim poboljšanim svojstvima.
Količina fukoze zakačene za CH2 domen Fc regiona može se odrediti izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 ili N297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte npr. US patentne publikacije br. US 2003/0157108; US 2004/0093621. Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ varijante antitela ili varijante „sa manjkom fukoze“ su sledeći: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Led13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); U.S. Pat. Appl. br. US 2003/0157108 A1; i WO 2004/056312 A1, naročito u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelija (pogledajte npr., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878; US patentu br.6,602,684 i US 2005/0123546. Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO1997/30087, WO1998/58964 i WO1999/22764.
b) Varijante Fc regiona
U određenim aspektima otkrića, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region Fc fuzionog proteina iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina. Na primer, šarka može da uključuje supstituciju Ser u Pro, na primer, kao što je prikazano podebljanim i podvučenim Pro ostatkom u aminokiselinskoj sekvenci CPPCP (SEQ ID NO:31). Takva supstitucija Ser u Pro može da poveća stabilnost molekula.
U određenim aspektima otkrića, razmatrana je varijanta Fc koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluživot antitela ili fuzionog proteina koji sadrži Fc region in vivo važan, dok su određene efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo ili Fc nema FcγR vezivanje (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula su opisani u US patentu br.5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); U.S. patentu br. 5,821,337 (pogledajte Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu da se koriste neradioaktivni testovi (pogledajte, na primer, ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CYTOTOX 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ili Fc ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova et al., Int’l. Immunol.
18(12): 1759-1769 (2006)).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
Opisane su pojedine varijante antitela ili Fc sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledajte, npr. US patent br. 6,737,056; WO2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži Fc varijantu sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju ADCC, npr. supstituciju na poziciji 297 Fc regiona radi uklanjanja mesta N-glikozilacije uz zadržavanje aktivnosti vezivanja FcRN (EU numerisanje ostataka).
U nekim aspektima otkrića, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat smanjeno vezivanje C1q i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al. J. imunol.164: 4178-4184 (2000).
Antitela sa povećanim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al. J. Immunol.24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.
7,371,826).
Pogledajte takođe Duncan i Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.
5,648,260; U.S. Patent br. 5,624,821; i WO94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.
c) Varijante konstruisane sa cisteinom
U nekim aspektima otkrića, može biti poželjno da se napravi Fc fuzioni protein projektovan sa cisteinom, kod koga je jedan ili više ostataka Fc regiona antitela ili zamenjeno ostacima cisteina. U posebnim aspektima otkrića, supstituisani ostaci se javljaju na
1
pristupačnim mestima na Fc. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na Fc, i mogu se koristiti za konjugovanje Fc sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. Na primer, S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona može biti zamenjen sa Cys. Pogledajte, npr. US patent br.7.521.541.
2. Primeri polipeptida IL-22
Na primer, u bilo kom od Fc fuzionih proteina IL-22 opisanih ovde, polipeptid IL-22 može da sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO:71 (humani IL-22 sa endogenom liderskom sekvencom IL-22), ili polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence) sa SEQ ID NO:71. U određenim aspektima otkrića, polipeptid IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO:4 (humani IL-22 bez liderske sekvence) ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvence) sa SEQ ID NO:4. U nekim aspektima otkrića, polipeptid IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO:4.
Priprema nativnih molekula IL-22, zajedno sa njihovim nukleinskim kiselinama i polipeptidnim sekvencama, može se postići metodama poznatim osobama sa uobičajenim veštinama u struci. Na primer, polipeptidi IL-22 se mogu proizvesti kultiviranjem ćelija transformisanih ili transficiranih vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu IL-22. Naravno, smatra se da se alternativni postupci, koji su dobro poznati u struci, mogu koristiti za dobijanje IL-22. Na primer, sekvenca IL-22, ili njeni delovi, mogu se proizvesti direktnom sintezom peptida koristeći tehnike u čvrstoj fazi (pogledajte, npr. Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149-2154). In vitro sinteza proteina može se izvesti ručnim tehnikama ili automatizacijom. Automatizovana sinteza se može postići, na primer, korišćenjem „Applied Biosystems Peptide Synthesizer“ (Foster City, CA) koristeći instrukcije proizvođača. Različiti delovi IL-22 mogu biti odvojeno hemijski sintetisani i kombinovani upotrebom hemijskih ili
2
enzimskih metoda da bi se proizveo IL-22 pune dužine.
Varijante IL-22 se mogu pripremiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u DNK koja kodira nativnu sekvencu polipeptida IL-22, ili sintezom željenog polipeptida IL-22. Stručnjaci za oblast će razumeti da promene aminokiselina mogu izmeniti post-translacione procese IL-22, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije ili promena karakteristika sidrenja membrane.
Varijacije u nativnoj sekvenci polipeptida IL-22 opisanih ovde mogu se napraviti, na primer, koristeći bilo koju od tehnika i smernica za konzervativne i nekonzervativne mutacije navedene, na primer, u U.S. Pat. br. 5,364,934. Varijacije mogu biti supstitucija, brisanje ili umetanje jednog ili više kodona koji kodiraju nativnu sekvencu ili varijantu IL-22, što dovodi do promene njegove aminokiselinske sekvence u poređenju sa odgovarajućom prirodnom sekvencom ili varijantom IL-22. Opciono, varijacija je zamenom najmanje jedne aminokiseline bilo kojom drugom aminokiselinom u jednom ili više domena nativne sekvence polipeptida IL-22. Smernice za određivanje koji aminokiselinski ostatak može biti ubačen, supstituisan ili izbrisan bez negativnog uticaja na željenu aktivnost mogu se naći upoređivanjem sekvence IL-22 sa homologno poznatim molekulima proteina i minimizovanjem broja promena aminokiselinskih sekvenci napravljenih u regionima visoke homologije. Supstitucije aminokiselina mogu biti rezultat zamene jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima slične strukturne i/ili hemijske osobine, kao što je zamena leucina serinom, tj. konzervativne zamene aminokiselina. Umetanja ili brisanja mogu opciono biti u opsegu od 1 do 5 aminokiselina. Dozvoljena varijacija se može odrediti sistematskim pravljenjem umetanja, brisanja ili supstitucija aminokiselina u sekvenci i testiranjem dobijenih varijanti na aktivnost, na primer, u in vitro testu opisanom u primeru ispod.
U određenim aspektima otkrića, konzervativne supstitucije od interesa prikazane su u tabeli A pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije dovode do promene biološke aktivnosti, onda se mogu uvesti značajnije promene, nazvane „primeri supstitucija“ u Tabeli A, ili kao što je dalje opisano u tekstu, u vezi sa klasama aminokiselina, i mogu se skenirati proizvodi.
Druga vrsta kovalentne modifikacije polipeptida IL-22 obuhvata promenu nativnog obrasca glikozilacije polipeptida. „Promena nativnog obrasca glikozilacije“ za svrhe ovog teksta znači brisanje jednog ili više ugljovodoničnih ostataka koji se mogu naći u prirodnoj sekvenci IL-22, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u prirodnoj sekvenci IL-22 i/ili izmenu odnosa i/ili kompozicije ostataka šećera vezanih za mesto(a) glikozilacije.
Glikozilacija polipeptida je tipično N-povezana ili O-povezana. Dodavanje mesta glikozilacije u IL-22 polipeptid može se postići promenom aminokiselinske sekvence. Izmena se može izvršiti, na primer, dodavanjem ili supstitucijom putem jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u nativnu sekvencu IL-22 (za N-vezana mesta glikozilacije), ili dodavanjem sekvence prepoznavanja za O-vezanu glikozilaciju. Sekvenca aminokiselina IL-22 može opciono biti izmenjena kroz promene na nivou DNK, naročito mutiranjem DNK koja kodira polipeptid IL-22 na unapred odabranim bazama tako da se generišu kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.
Drugi način za povećanje broja ugljovodoničnih ostataka na polipeptidu IL-22 je hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida sa polipeptidom. Takve metode su opisane u struci, na primer, u WO 87/05330 i u Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., str.259-306 (1981).
Uklanjanje ugljovodoničnih delova prisutnih na polipeptidu IL-22 se može postići hemijski ili enzimski ili mutacionom supstitucijom kodona koji kodiraju aminokiselinske ostatke koji služe kao ciljevi za glikozilaciju. Tehnike hemijske deglikozilacije su poznate u struci i opisane, na primer, u Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) i u Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981). Enzimsko cepanje ugljenohidratnih delova u polipeptidima se može postići upotrebom različitih endo i egzo glikozidaza, kao što opisuju Thotakura et al., Meth. Enzymol.138:350 (1987).
Varijacije se mogu napraviti korišćenjem metoda poznatih u struci, kao što je mutageneza posredovana oligonukleotidom (usmerena na lokaciju), skeniranje alanina i PCR mutageneza. Mutageneza usmerena na lokaciju (Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res.13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res. 10:6487), kasetna mutageneza (Wells et al., 1985, Gene 34:315), restriktivna selektivna mutageneza (Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London A 317:415), ili druge poznate tehnike mogu da se izvode na kloniranoj DNK da bi se proizvele DNK varijante IL-22.
Ovde su takođe otkriveni fragmenti polipeptida IL-22. Takvi fragmenti mogu biti skraćeni na N-terminusu ili C-terminusu, ili mogu da nedostaju unutrašnji ostaci, na primer, u poređenju sa prirodnim proteinom pune dužine. Određenim fragmentima nedostaju aminokiselinski ostaci koji nisu neophodni za željenu biološku aktivnost polipeptida IL-22 iz predmetnog pronalaska. Shodno tome, u određenim aspektima otkrića, fragment polipeptida IL-22 je biološki aktivan. U određenim aspektima otkrića, fragmentu IL-22 pune dužine nedostaje N-terminalna signalna peptidna sekvenca.
Kovalentne modifikacije nativne sekvence i varijante polipeptida IL-22 su uključene u obim ovog otkrića. Jedna vrsta kovalentne modifikacije uključuje reakciju ciljanih
4
aminokiselinskih ostataka IL-22 sa organskim derivatizujućim sredstvom koje može da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima polipeptida IL-22. Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima je korisna, na primer, za umrežavanje IL-22 sa matricom podloge ili površinom nerastvorljivom u vodi, na primer, za upotrebu u postupku za prečišćavanje anti-IL-22 antitela. Uobičajena sredstva za umrežavanje uključuju, npr. 1,1-bis(diazo-acetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidil-propionat), bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan, i agense kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat.
Druge modifikacije uključuju deamidaciju glutaminil i asparaginil ostataka do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka, odnosno, hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju α-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str.79-86i), acetilovanje N-terminalnog amina i amidacija C-terminalne karboksilne grupe.
Druga vrsta kovalentne modifikacije IL-22 obuhvata povezivanje polipeptida IL-22 sa jednim od mnogih neproteinskih polimera, npr. polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na primer, na način koji je naveden u U.S. Pat. br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; ili 4,179,337. Nativna sekvenca i varijanta IL-22 se takođe može modifikovati tako da se formira himerni molekul koji sadrži IL-22, uključujući fragmente IL-22, spojen sa drugim, heterolognim polipeptidom ili aminokiselinskom sekvencom.
U jednom aspektu otkrića, takav himerni molekul sadrži fuziju IL-22 sa označenim polipeptidom koji obezbeđuje epitop na koji neoznačeno antitelo može selektivno da se veže. Oznaka epitopa se uopšteno nalazi na amino ili karboksilnom kraju polipeptida IL-22. Prisustvo takvih oblika polipeptida IL-22 označenih epitopom se može detektovati upotrebom antitela na označeni polipeptid. Takođe, obezbeđivanje epitopske oznake omogućava da se polipeptid IL-22 lako prečisti afinitetnim prečišćavanjem koristeći neoznačeno antitelo ili drugi tip afinitetne matrice koji se vezuje za epitopsku oznaku. Različiti označeni polipeptidi i njihova odgovarajuća antitela su dobro poznati u struci. Primeri uključuju polihistidin (polyhis) ili polihistidin-glicin (poly-his-gly) oznake; HA tag polipeptid gripa i njegovo antitelo 12CA5 (Field et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165); c-myc-oznaku i 8F9, 3C7, 6E10, G4 i 9E10 antitela na njih (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol.5:3610-3616); i oznaku glikoproteina D virusa Herpes Simplex D (gD) i njegovo antitelo (Paborsky et al., 1990, Protein Engineering 3(6):547-553). Drugi označeni polipeptidi uključuju Flag-peptid (Hopp et al., 1988, Bio Technology 6:1204-1210); peptid KT3 epitopa (Martin et al., 1992, Science 255:192-194); peptid tubulinskog epitopa (Skinner et al., 1991, J. Biol. Chem.266:15163-15166); i T7 gen 10 protein peptidnu oznaku (Lutz-Freyermuth et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397).
U drugom aspektu otkrića, himerni molekul može da sadrži fuziju polipeptida IL-22 ili njegovog fragmenta sa imunoglobulinom ili određenim regionom imunoglobulina. Za dvovalentni oblik himernog molekula, takva fuzija može biti u Fc regionu molekula IgG. Ovi fuzioni polipeptidi su molekuli slični antitelima koji kombinuju specifičnost vezivanja heterolognog proteina („adhezina“) sa efektorskim funkcijama konstantnih domena imunoglobulina, i često se nazivaju imunoadhezini. Strukturno, imunoadhezini sadrže fuziju aminokiselinske sekvence IL-22, ili njene varijante, i sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Adhezinski deo imunoadhezinskog molekula tipično je susedna aminokiselinska sekvenca koja sadrži najmanje mesto vezivanja receptora ili liganda. Sekvenca konstantnog domena imunoglobulina u imunoadhezinu može se dobiti iz bilo kog imunoglobulina, kao što su podtipovi IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, IgA (uključujući IgA1 i IgA2), IgE, IgD ili IgM. U određenim aspektima otkrića, Fc fuzioni protein IL-22 pokazuje modifikovane efektorske aktivnosti.
Polipeptid IL-22, ili njegov fragment, može biti spojen, na primer, sa sekvencom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina da bi se proizveo fuzioni protein IL-22-Ig (npr. Fc fuzioni protein IL-22). Polipeptid IL-22 može biti humani ili mišji IL-22. Sekvenca konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina može biti konstantni region teškog lanca ljudskog ili mišjeg imunoglobulina
B. Postupci za izradu Fc fuzionih proteina IL-22 za upotrebu u kompozicijama Ovde opisani Fc fuzioni proteini IL-22 mogu se pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom, npr. uzgajanjem ćelija koje su transformisane ili transficirane vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Fc fuzioni protein IL-22, njegov fragment ili varijantu. Takođe su obezbeđene ćelije domaćina koje sadrže bilo koji takav vektor. Može se koristiti svaka odgovarajuća ćelija domaćin, npr. ćelije sisara (npr. CHO ćelije), E. coli ili kvasac. Procesi za proizvodnju bilo kog od ovde opisanih Fc fuzionih proteina IL-22 su dalje otkriveni i, uopšteno, uključuju uzgajanje ćelija domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju željenog Fc fuzionog proteina IL-22 i izolovanje, i opciono prečišćavanje, željenog Fc fuzionog proteina IL-22 iz ćelijske kulture. Na primer, može se koristiti bilo koja od metoda opisanih u U.S. privremenoj patentnoj prijavi br.62/622,762.
Ćelije domaćini se transficiraju ili transformišu sa ekspresionim ili kloniranim vektorima opisanim ovde za proizvodnju polipeptida IL-22 i uzgajaju u uobičajenim nutrijentnim medijima modifikovanim na odgovarajući način da indukuju promotere, odabiraju transformante ili amplifikuju gene koji kodiraju željene sekvence. Uslove uzgajanja, kao što je medijum, temperatura, pH i slično, može odabrati stručnjak za ovu oblast bez nepotrebnih eksperimenata. Generalno, principi, protokoli i praktične tehnike za postizanje maksimalne produktivnosti ćelijskih kultura mogu se naći u Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) i Sambrook et al., supra.
Postupci transfekcije će biti jasni osobi iz struke, na primer, CaPO4i elektroporacija. U zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi, transformacija se vrši korišćenjem standardnih tehnika odgovarajućih takvim ćelijama. Tretman kalcijumom u kome se koristi kalcijum hlorid, kao što je opisano u Sambrook et al., supra, ili elektroporacija se generalno koriste za prokariote ili druge ćelije koje sadrže značajne barijere u ćelijskim zidovima. Infekcija sa Agrobacterium tumefaciens se koristi za transformaciju određenih biljnih ćelija, kao što je opisano u Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) i WO 89/05859 objavljeno 29. juna 1989. Za ćelije sisara bez takvih ćelijskih zidova može se koristiti metoda taloženja kalcijum fosfatom čiji su autori Graham i van der Eb, Virology 52:456-457 (1978). Opšti aspekti transformacija ćelijskog sistema domaćina sisara opisani su u U.S. Pat. br.4,399,216. Transformacije u kvascu se obično izvode prema metodi čiji su autori Van Solingen et al., J. Bact, 130:946 (1977) i Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Međutim, mogu se koristiti i druge metode za uvođenje DNK u ćelije, recimo nuklearnom mikroinjekcijom, elektroporacijom, bakterijskom protoplastnom fuzijom sa netaknutim ćelijama, ili polikatjonima, npr. polibrenom, poliornitinom. Za razne tehnike transformacije ćelija sisara, pogledajte Keown et al. Methods in Enzymology 185:527-537 (1990) i Mansour et al., Nature 336:348-352 (1988).
Rekombinantno eksprimirani polipeptidi se mogu izolovati iz medijuma za uzgajanje ili iz lizata ćelije domaćina. Naredni postupci su primer prikladnih postupaka prečišćavanja: frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni; taloženje etanolom; reversno fazna HPLC; hromatografija na silika gelu ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli, kao što je DEAE; hromatofokusiranje; SDS-PAGE; taloženje amonijum sulfatom; gel filtracija koristeći, na primer, Sephadex G-75; kolone koje sadrže protein A sefarozu za uklanjanje zagađivača, kao što je IgG; i kolone koje sadrže metalne helatore za vezivanje epitopski označenih oblika polipeptida. Mogu se koristiti različite metode prečišćavanja proteina, i takve metode su poznate u struci i opisane, na primer, u Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Odabrani koraci prečišćavanja će zavisiti, na primer, od prirode proizvodnog procesa koji se koristi i određenog proizvedenog polipeptida.
Alternativni postupci, koji su dobro poznati u struci, mogu se koristiti za dobijanje polipeptida. Na primer, sekvenca koja kodira polipeptid ili njegov deo, može se proizvesti direktnom sintezom peptida koristeći tehnike u čvrstoj fazi (pogledajte, npr. Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, J.
1963, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154. In vitro sinteza proteina može se izvesti ručnim tehnikama ili automatizacijom. Automatizovana sinteza se može postići, na primer, korišćenjem „Applied Biosystems Peptide Synthesizer”(Foster City, CA) koristeći instrukcije proizvođača. Različiti delovi polipeptida ili njegovog dela mogu biti hemijski sintetisani odvojeno i kombinovani upotrebom hemijskih ili enzimskih metoda da bi se proizveo polipeptid kompletne dužine ili njegov deo.
U drugim aspektima otkrića, obezbeđeni su himerni molekuli koji sadrže bilo koji od ovde opisanih polipeptida spojeni sa heterolognim polipeptidom ili sekvencom aminokiselina. Primeri takvih himernih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na bilo koji od ovde opisanih polipeptida spojenih sa sekvencom epitopske oznake ili Fc regionom imunoglobulina.
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u ovde navedenim vektorima uključuju prokariotske, kvasne ili više eukariotske ćelije. Pogodni prokarioti uključuju, ali nisu ograničeni na eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je E. coli. Različiti sojevi E. coli su javno dostupni, kao što je E. coli K12 soj MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli soj W3110 (ATCC 27.325) i K5772 (ATCC 53.635).
Pored prokariota, eukariotski mikroorganizmi kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju IL-22. Saccharomyces cerevisiae je najčešće korišćeni niži eukariotski mikroorganizam domaćina.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanih IL-22 su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije insekata kao što su Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, kao i biljne ćeije. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) i COS ćelije. Specifičniji primeri uključuju CV1 ćelije bubrega majmuna transformisane sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ljudske embrionalne ćelije bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); sertolijeve ćelije miša (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); ćelije ljudskih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065); i ćelije tumora dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51). Smatra se da je izbor odgovarajuće ćelije domaćina poznat stručnjacima za oblast.
Nukleinska kiselina (npr. cDNK ili genomska DNK) koja kodira IL-22 može biti umetnuta u replikativni vektor za kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. Različiti vektori su javno dostupni. Vektor može, na primer, biti u obliku plazmida, kozmida, virusne čestice ili faga. Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline može se ubaciti u vektor raznovrsnim postupcima. Generalno, DNK se ubacuje u jedno ili više odgovarajućih restrikcionih mesta endonukleaze pomoću tehnika poznatih u struci. Komponente vektora generalno uključuju, bez ograničenja, jednu ili više signalnih sekvenci, mesto početka replikacije, jedan ili više marker gena, i element za pojačavanje, promoter, i terminalnu sekvencu za transkripciju. U konstrukciji pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više od ovih komponenti koriste se standardne tehnike ligacije, koje su poznate stručnjaku za ovu oblast.
Polipeptidi IL-22 se mogu proizvesti rekombinantno ne samo direktno, već i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, koji može biti signalna sekvenca, ili drugi polipeptid koji ima određeno mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida, kao i Fc fuzioni protein IL-22. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora, ili može biti deo DNK IL-22 koji se ubacuje u vektor. Sekvenca signala može biti prokariotska signalna sekvenca izabrana, na primer, iz grupe alkalne fosfataze, penicilinaze, 1 pp, ili toplotno stabilnog enterotoksina II lidera. Za sekreciju kvasca sekvenca signala može biti, na primer, lider invertaze kvasca, lider alfa faktora (uključujući Saccharomyces i Kluyveromyces alfafaktor lidera, potonji opisan u U.S. Pat. br. 5,010,182), ili lider kisele fosfataze, lider glukoamilaze C. albicans (EP 362,179 objavljen 4. aprila 1990), ili signal opisan u WO 90/13646 objavljenom 15. novembra 1990. U ekspresiji ćelija sisara, signalne sekvence sisara mogu se koristiti za usmeravanje sekrecije proteina, kao što su signalne sekvence iz izlučenih polipeptida iste ili srodne vrste, kao i virusni sekretorni lideri.
Vektori ekspresije i kloniranja sadrže sekvencu nukleinskih kiselina koja omogućava vektoru da se replikuje u jednoj ili više izabranih ćelija domaćina. Takve sekvence su dobro poznate za različite bakterije, kvasce i viruse. Mesto početka replikacije iz plazmida pBR322 je pogodno za većinu gram-negativnih bakterija, mesto početka plazmida 2: je pogodno za kvasac, a mesta početka različitih virusa (SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV) korisna su za kloniranje vektora u ćelijama sisara.
Vektori ekspresije i kloniranja će obično sadržati selekcioni gen, koji se takođe naziva selekcioni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) pružaju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr. ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ili (c) dovode kritične nutrijente koji nisu dostupni iz složenih medija, npr. gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.
Primer pogodnih selektabilnih markera za ćelije sisara je onaj koji omogućava identifikaciju ćelija sposobnih za preuzimanje nukleinske kiseline IL-22, kao što je DHFR ili timidin kinaza. Odgovarajuća ćelija domaćin, kada se koristi DHFR divljeg tipa, je CHO ćelijska linija koja nema aktivnost DHFR, pripremljena i propagirana kako su opisali Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Pogodan selekcioni gen za upotrebu u kvascu je gen trp1 prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (pogledajte npr. Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). Gen trp1 daje selekcioni marker za mutirani soj kvasca kojem nedostaje sposobnost rasta u triptofanu, na primer, ATCC br.44076 ili PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).
Vektori ekspresije i kloniranja obično sadrže promoter operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline IL-22 radi direktne sinteze mRNK. Promoteri prepoznati od strane različitih potencijalnih ćelija domaćina su dobro poznati. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju sisteme kvadratura-laktamaze i promotera laktoze (pogledajte npr. Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), alkalnu fosfatazu, sistem promotera triptofana (trp) (pogledajte npr. Goeddel, Nucleic Kiseline Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), i hibridne promotere kao što je tac promoter (pogledajte, npr, DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržati Shine-Dalgarno (SD) sekvencu koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom DNK IL-22.
Primeri pogodnih promoterskih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvascima uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu (pogledajte, npr. Hitzeman et al., J. Biol. Chem, 255:2073 (1980)) ili druge glikolitičke enzime (pogledajte, npr, Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, trifosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza.
Ostali promoteri kvasca, promoteri koji se mogu indukovati i koji imaju dodatnu prednost transkripcije pod kontrolom uslova rasta, predstavljaju regione promotera za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselinsku fosfatazu, razgradive enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za iskorišćenost maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za upotrebu u ekspresiji kvasca su dalje opisani u EP 73,657.
Transkripcija IL-22 iz vektora u ćelijama domaćina sisara se kontroliše, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa, kao što su polioma virus, virus živinskih boginja (UK 2,211,504 objavljeno 5. jula 1989.), adenovirus (poput Adenovirusa 2), goveđi papiloma virus, ptičji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B, i Simijan virus 40 (SV40), iz heterolognih promotera sisara, npr. promotera aktina ili imunoglobulinskog promotera, iz promotera toplotnog udara, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa ćelijskim sistemima domaćina.
Transkripcija kodirajuće DNK polipeptida IL-22 kod viših eukariota se može povećati umetanjem pojačivačke sekvence u vektor. Pojačivači su cis-delujući elementi DNK, obično od oko 10 do 300 bp, koji deluju na promoter da bi povećali njegovu transkripciju. Danas su poznate mnoge pojačivačke sekvence iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, obično će neko koristiti pojačivač iz virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani mesta početka replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani mesta početka replikacije i pojačivače adenovirusa. Pojačivač se može spojiti u vektor na položaju 5' ili 3' prema kodirajućoj sekvenci IL-22, ali poželjno je da se nalazi na mestu 5' od promotera. Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasac, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi ili nukleirane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) će takođe sadržati sekvence neophodne za prekid transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i ponekad 3' neprotumačenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente koji su transkribovani kao poliadenilovani fragmenti u neprotumačenom delu kodirajuće mRNK IL-22.
Pored toga, ostali postupci, vektori i ćelije domaćini pogodni za prilagođavanje sintezi IL-22 u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kičmenjaka opisani su u Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979); EP 117,060; i EP 117,058.
Genska amplifikacija i/ili ekspresija može se meriti u uzorku direktno, na primer, konvencionalnim sautern blotom, nortern blotom radi kvantifikacije transkripcije mRNK (pogledajte, npr. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), tačkastim blotom (DNK analiza), ili in situ hibridizacijom, koristeći odgovarajuće označenu sondu, na osnovu ovde navedenih sekvenci. Alternativno, mogu se koristiti antitela koja mogu prepoznati specifične duplekse, uključujući duplekse DNK, duplekse RNK i hibridne duplekse DNK-RNK ili duplekse DNK proteina. Antitela zauzvrat mogu biti obeležena i ispitivanje se može obaviti tamo gde je dupleks vezan za površinu, tako da se nakon formiranja dupleksa na površini može otkriti prisustvo antitela vezanog za dupleks.
Ekspresija gena se, alternativno, može meriti imunološkim metodama, kao što je
1
imunohistohemijsko bojenje ćelija ili tkivnih sekcija i ispitivanje ćelijske kulture ili telesnih tečnosti, da bi se direktno kvantifikovala ekspresija genskog proizvoda. Antitela koja su korisna za imunohistohemijsko bojenje i/ili ispitivanje uzorka tečnosti mogu biti monoklonska ili poliklonska, i mogu se pripremiti kod bilo kojeg sisara. Pogodno, antitela se mogu pripremiti protiv nativne sekvence polipeptida IL-22 ili protiv sintetičkog peptida zasnovanog na DNK sekvencama koje su ovde navedene ili protiv egzogene sekvence spojene sa DNK IL-22 i kodiranjem specifičnog epitopa antitela.
Fc fuzioni proteini IL-22 mogu se izolovati iz medijuma za uzgajanje ili iz lizata ćelije domaćina. Ako su vezani za membranu, mogu se odvojiti od membrane pomoću prikladnog deterdžentskog rastvora (npr. TRITON® X-100) ili cepanjem pomoću enzima. Ćelije korišćene u ekspresiji IL-22 mogu biti poremećene različitim fizičkim ili hemijskim sredstvima, kao što je ciklus zamrzavanja i otapanja, dejstvo ultrazvuka, mehaničko razaranje ili sredstva za liziranje ćelija.
Može biti poželjno prečišćavanje Fc fuzionih proteina IL-22 iz rekombinantnih ćelijskih proteina ili polipeptida. Naredni postupci su primer prikladnih postupaka prečišćavanja: frakcionisanje na jonoizmenjivačkim kolonama; taloženje etanolom; reversno fazna HPLC; hromatografija na silika gelu ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli, kao što je DEAE; hromatofokusiranje; SDS-PAGE; taloženje amonijum sulfatom; gel filtracija koristeći, na primer, Sephadex G-75; kolone koje sadrže protein A sefarozu za uklanjanje zagađivača, kao što je IgG; i kolone metalnih helatora za vezivanje epitopom označenih oblika polipeptida IL-22. Mogu se koristiti različite metode prečišćavanja proteina, i takve metode su poznate u struci i opisane, na primer, u Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Odabrani koraci prečišćavanja zavisiće, na primer, od prirode proizvodnog procesa koji se koristi i određenog proizvedenog IL-22. Gore opisane opšte metode mogu se primeniti i na pripremu Fc fuzionog proteina IL-2.
Slično tome, Fc fuzioni proteini IL-22 se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih metoda i kompozicija, kao što je opisano, npr. u Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) i PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA). U jednom aspektu otkrića, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira Fc fuzione proteine IL-22 koji su ovde opisani. U daljem aspektu otkrića, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem aspektu otkrića, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom aspektu
2
otkrića, ćelija domaćina sadrži (npr. transformisana je njim) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži Fc fuzioni protein IL-22. U određenom aspektu otkrića, vektor je ekspresioni vektor. U jednom aspektu otkrića, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20-ćelija). U jednom aspektu otkrića, obezbeđen je postupak za proizvodnju Fc fuzionog proteina IL-22, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Fc fuzioni protein IL-22, kako je prethodno navedeno, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju Fc fuzionog proteina i, eventualno, izolovanje Fc fuzionog proteina iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju Fc fuzionog proteina IL-22, nukleinska kiselina koja kodira Fc fuzioni protein, na primer, kao što je ovde opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju fuzioni protein). U određenim aspektima otkrića, prilikom pripreme Fc fuzionih proteina IL-22, nukleinska kiselina koja kodira polipeptid IL-22 ili njegov fragment može biti vezana na nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu konstantnog domena imunoglobulina na određenoj lokaciji na konstantnom domenu da bi rezultirala Fc fuzijom na C-terminusu IL-22; međutim moguće su i N-terminalne fuzije.
Kao primer konstruisanja Fc fuzionog proteina IL-22, DNK koja kodira IL-22 se cepa restrikcionim enzimom na 3' kraju ili blizu njega DNK koja kodira IL-22 i u tački ili blizu tačke DNK koja kodira N-terminalni kraj zrelog polipeptida (gde se razmatra upotreba različitog lidera) ili na N-terminalnom kodirajućem regionu ili blizu njega za IL-22 protein pune dužine (gde se koristi izvorni signal). Ovaj fragment DNK se zatim lako ubacuje u DNK koja kodira konstantni region lakog ili teškog lanca imunoglobulina i, ako je potrebno, prilagođena je delecionom mutagenezom. Poželjno, ovaj je humani imunoglobulin kada je fuzioni protein namenjen in vivo terapiji za ljude.
U nekim aspektima otkrića, IL-22-imunoglobulinske himere su sastavljene kao monomeri, hetero- ili homo-multimer, ili kao dimeri ili tetrameri. Generalno, ovi sastavljeni imunoglobulini imaće poznate jedinične strukture predstavljene sledećim dijagramima. Osnovna strukturna jedinica sa četiri lanca je oblik u kome postoje IgG, IgD i IgE. Jedinica sa četiri lanca se ponavlja u imunoglobulinama veće molekulske mase; IgM opšte postoji kao pentamer od četiri osnovne jedinice lanca koje se drže zajedno disulfidnim vezama. IgA globulin, a ponekad i IgG globulin, takođe mogu postojati u multimernom obliku u serumu. U slučaju multimera, svaka od četiri jedinice lanca može biti ista ili različita. Pogledajte takođe Capon et al. U.S. Patent br.5,116,964.
DNK koja kodira konstantne regione lakog ili teškog lanca imunoglobulina je poznata ili lako dostupna iz cDNK biblioteka ili se sintetizuje. Pogledajte na primer, Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 (1980); Dolby et al; P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980); Rice et al P.N.A.S USA 79:7862-7865 (1982); Falkner et al; Nature 298:286-288 (1982); i Morrison et al; Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984). DNK sekvenca koja kodira ljudski IL-22 sa endogenom liderskom sekvencom je ovde data (SEQ ID NO:70). DNK sekvence koje kodiraju druge željene vezujuće partnere koji su poznati ili lako dostupni iz cDNK biblioteka su pogodne u praksi.
DNK koja kodira Fc fuzioni protein IL-22 transficirana je u ćeliju domaćina radi ekspresije. Ako su poželjni multimeri, ćelija domaćin se transformiše sa DNK koja kodira svaki lanac koji će činiti multimer, pri čemu je ćelija domaćin optimalno odabrana da bude sposobna da sastavlja lance multimera na željeni način. Ako ćelija domaćin proizvodi imunoglobulin pre transfekcije, onda je potrebno transficirati samo sa vezujućim partnerom spojenim sa lakim ili teškim lancem da bi se proizvelo heteroantitelo. Pomenuti imunoglobulini koji imaju jedan ili više kraka koji nose domen vezujućeg partnera i jedan ili više krakova koji nose varijabilne regione pratioca daju dvostruku specifičnost ligandu vezujućeg partnera i antigenu ili terapeutskom ostatku. Višestruko kotransformisane ćelije se koriste sa gore opisanim rekombinantnim metodama za proizvodnju polipeptida koji imaju više specifičnosti, kao što su heterotetramerni imunoglobulini koji su gore opisani.
Iako prisustvo imunoglobulinskog lakog lanca nije potrebno, imunoglobulinski laki lanac može biti prisutan ili kovalentno povezan sa fuzionim polipeptidom imunoglobulinskog teškog lanca IL-22. U ovom slučaju, DNK koja kodira laki lanac imunoglobulina se tipično koeksprimira sa DNK koja kodira IL-22 imunoglobin teškog lanca fuzionog proteina. Nakon izlučivanja, hibridni teški i laki lanac će biti kovalentno vezani da bi obezbedili strukturu sličnu imunoglobulinu koja sadrži dva para teških i lakih lanaca imunoglobulina povezanih disulfidom. Postupci pogodni za pripremu takvih struktura su, na primer, objavljeni u U.S. Pat. br. 4,816,567 koji je izdat 28. marta 1989. Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju protein uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, Fc fuzioni protein IL-22 se može proizvesti u bakteriji, naročito kada glikozilacija i Fc efektorska funkcija nisu neophodni ili su štetni. Za ekspresiju polipeptida u bakteriji, pogledajte, npr. U.S. Patente br. 5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. Takođe pogledajte Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa,
4
NJ, 2003), str. 245-254, gde je opisana ekspresija fragmenata antitela u E. coli. Nakon ekspresije, Fc fuzioni protein može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Dalje metode prečišćavanja uključuju, bez ograničenja, prečišćavanje koristeći kolonu Proteina A.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Pogledajte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanih proteina su takođe izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte npr. US Patent br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (gde se opisuje tehnologija PLANTIBODIES™za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije kao što su opisane, npr., u Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje Sertolijeve ćelije (TM4 ćelije kao što su opisane, npr., u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre Buf pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).
C. Testovi
Kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) koje su ovde date, ili njihovi sastojci, mogu se identifikovati, pregledati ili okarakterisati po fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkim aktivnostima pomoću različitih testova poznatih u tehnici.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, Fc fuzioni protein IL-22 se testira na aktivnost vezivanja receptora, npr. poznatim metodama kao što su ELISA, vestern blot analiza, vezivanje površine ćelije po Skačardu, površinska plazmonska rezonanca. U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa Fc fuzionim proteinom IL-22 u vezivanju za receptor IL-22. U daljem aspektu, Fc fuzioni protein IL-22 se može koristiti za detekciju prisustva ili količine receptora IL-22 ili IL22-vezujućeg proteina (rastvorljivog receptora) prisutnog u biološkom uzorku. U daljem aspektu, Fc fuzioni protein IL-22 se može koristiti za detekciju prisustva ili količine receptora IL-22 prisutnog u biološkom uzorku. U određenim aspektima otkrića, biološki uzorak se prvo blokira nespecifičnim antitelom za kontrolu izotipa kako bi se zasitili bilo koji Fc receptori u uzorku.
2. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu otkrića, obezbeđeni su testovi za identifikaciju biološke aktivnosti kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22). Biološka aktivnost polipeptida IL-22 ili Fc fuzionog proteina IL-22 u kompoziciji (npr. farmaceutskoj kompoziciji) može uključivati, npr. vezivanje za receptor IL-22, stimulaciju IL-22 signalizacije i indukovanje ekspresije STAT3, Reglll i/ili PancrePAP. Nadalje, u slučaju kardiovaskularne bolesti ili stanja, biološka aktivnost može uključivati uticaj na formiranje aterosklerotskih plakova, posebno inhibiciju formiranja aterosklerotskog plaka. Inhibicija stvaranja plaka se može proceniti bilo kojim pogodnim postupkom snimanja poznatim osobama sa uobičajenim veštinama u struci.
3. Analize stabilnosti
U jednom aspektu otkrića, obezbeđeni su testovi za određivanje stabilnosti kompozicije. Na primer, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) može se proceniti kvalitativno i/ili kvantitativno na različite načine, uključujući procenu formiranja agregata (na primer, korišćenjem hromatografije na molekulskim sitima, merenjem zamućenosti i/ili vizuelnim pregledom); procenu formiranja ROS (na primer, korišćenjem testa svetlosnog stresa ili testa stresa pomoću 2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihidrohlorida (AAPH)); oksidaciju specifičnih aminokiselinskih ostataka proteina (na primer, Met ostatak Fc fuzionog proteina IL-22); procenu heterogenosti naelektrisanja korišćenjem katjonsko izmenjivačke hromatografije, snimanje kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (ICiEF) ili elektroforezu kapilarne zone; amino-terminalnu ili karboksi-terminalnu analizu sekvence; analizu masenom spektrometrijom; SDS-PAGE analizu za upoređivanje redukovanih i netaknutih polipeptida (npr. Fc fuzionih proteina IL-22); analizu peptidne mape (na primer, tripsinska ili LYS-C); procenu biološke aktivnosti ili ciljne funkcije vezivanja proteina (npr. vezivanje Fc fuzionog proteina IL-22 za receptor IL-22); i slično. Nestabilnost može da uključuje jedno ili više od: agregacije, deamidacije (npr Asn deamidacije), oksidacije (npr Met oksidacije i/ili Trp oksidacije), izomerizacije (npr Asp izomerizacija), isecanja/hidrolize/fragmentacije (npr. fragmentacija regiona šarke), formiranja sukcinimida, nesparenog cisteina, N-terminalne ekstenzije, C-terminalne obrada, razlike u glikozilaciji, i slično. Primeri testova su opisani u nastavku u Primerima.
D. Konjugati za upotrebu u kompozicijama
Takođe su otkrivene kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) koje uključuju konjugate koji sadrže Fc fuzioni protein IL-22 opisan ovde konjugovan sa jednim ili više sredstava za detekciju, formulaciju, produženje poluživota, ublažavanje imunogenosti ili penetraciju tkiva. Primeri konjugacije uključuju, bez ograničenja, PEGilovanje i vezivanje za radioaktivne izotope.
U drugom aspektu otkrića, konjugat sadrži Fc fuzioni protein IL-22, kao što je opisano u ovom dokumentu, konjugovan sa radioaktivnim atomom radi formiranja radiokonjugata. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili l123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznata kao magnetna rezonanca, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
E. Terapeutske metode i upotreba kompozicija
Bilo koja od kompozicija (npr. farmaceutskih kompozicija) koje su ovde navedene može da se koristi u terapeutskim metodama i primenama, na primer, bilo kojoj od terapeutskih metoda i upotreba opisanih u nastavku.
a) Inflamatorna bolest creva
U jednom aspektu, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koji uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu u lečenju IBC, uključujući UK i CD. U određenim aspektima otkrića, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu u metodi lečenja. U određenim aspektima, obezbeđen je sastav (npr. farmaceutski sastav koji uključuje IL-22 Fc fuzioni protein) za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima UC ili CD koji obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine fuzionog proteina IL-22 Fc. U jednom takvom aspektu, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano. U daljim aspektima otkrića, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu u poboljšanju epitelne proliferacije, diferencijacije i/ili migracije. U određenim posebnim aspektima, epitelno tkivo je crevno epitelno tkivo. U određenim aspektima, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu u postupku povećanja epitelne proliferacije, diferencijacije i/ili migracije kod pojedinca koji obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine kompozicije za poboljšanje epitelne proliferacije, diferencijacije i/ili migracije. U drugim aspektima otkrića, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu u lečenju dijabetesa, posebno dijabetesa tipa II, zarastanju dijabetičkih rana, metaboličkih sindroma i ateroskleroze. U određenim aspektima otkrića, obezbeđena je kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) za upotrebu u metodi lečenja dijabetesa, posebno dijabetesa tipa II, zarastanja dijabetičkih rana, metaboličkih sindroma i ateroskleroze kod pojedinca, koja obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine kompozicije. Pogledajte međunarodnu publikaciju patentne prijave br. WO 2014/145016. „Pojedinac“ ili „ispitanik“ ili „pacijent“ prema svakom od gornjih aspekata je poželjno čovek.
U daljem aspektu otkrića, obezbeđena je upotreba kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom aspektu, lek je za lečenje IBC i zarastanje rana. U daljem aspektu, lek je za upotrebu u postupku za lečenje IBC i zarastanje rana, koja uključuje davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima IBC. U jednom takvom aspektu, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano. U daljem aspektu, lek je za suzbijanje inflamatornog odgovora u epitelnim ćelijama creva. U daljem aspektu, lek je za upotrebu u metodi povećanja epitelne proliferacije, diferencijacije i/ili migracije kod pojedinca koja obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine leka za poboljšanje epitelne proliferacije, diferencijacije i/ili migracije. „Pojedinac“ prema bilo kom od gornjih aspekata može biti čovek.
b) Ostale terapijske indikacije
Predmetno otkriće obezbeđuje kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koje uključuju Fc fuzioni protein IL-22) za kardiovaskularne bolesti i stanja, metabolički sindrom, akutnu endotoksemiju i sepsu, bolest kalem protiv domaćina (GVHD) i dijabetes. Za sprečavanje, lečenje ili smanjenje ozbiljnosti date bolesti ili stanja, odgovarajuća doza kompozicije koja je ovde opisana zavisiće od tipa bolesti ili stanja koje treba lečiti, kao što je gore definisano, težine i toka bolesti ili stanja, od toga da li se agens primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije ispitanika i odgovora na jedinjenje, kao i od odluke nadležnog lekara. Jedinjenje se pogodno primenjuje na ispitaniku jednokratno, ili kao serija terapija. Poželjno je odrediti krivu zavisnosti doze i odgovora i farmaceutske kompozicije prvo in vitro, a zatim na korisnim životinjskim modelima pre testiranja na ljudima.
Kardiovaskularne bolesti i stanja
U jednom aspektu otkrića, Fc fuzioni proteini IL-22 pružaju terapeutsko, preventivno ili profilaktičko dejstvo protiv razvoja ili progresije kliničkih i/ili histoloških i/ili biohemijskih i/ili patoloških indikacija (uključujući i simptome i znakove) kardiovaskularnih bolesti ili stanja kod ispitanika. U jednom aspektu otkrića, bolest ili stanje je ateroskleroza. U jednom aspektu, indikacije uključuju formiranje aterosklerotskog plaka i/ili vaskularnu upalu. U drugom aspektu, ispitanik je pod rizikom od kardiovaskularnih bolesti. Generalno, ispitanik pod rizikom je prethodno imao kardiovaskularnu bolest ili stanje kako je ovde opisano, ili će imati genetsku predispoziciju za kardiovaskularne bolesti ili stanje.
Efikasnost lečenja kardiovaskularnih bolesti i stanja može se meriti različitim procenama koje se obično koriste u proceni kardiovaskularnih bolesti. Na primer, može se proceniti kardiovaskularno zdravlje. Kardiovaskularno zdravlje može da se proceni, bez ograničenja, npr. testovima krvi (npr. ukupni holesterol, LDL-C, HDL-C, trigliceridi, C-reaktivni protein, fibrinogen, homocistein, insulin prilikom gladovanja, feritin, lipoprotein i LPS), krvnim pritiskom, auskultacijom, elektrokardiogramom, testiranjem srčanog stresa, snimanjem srca (npr. koronarna kateterizacija, ehokardiogram, intravaskularni ultrazvuk, pozitronska emisiona tomografija, kompjuterizovana tomografija angiografija i magnetna rezonanca).
Metabolički sindrom
U jednom aspektu, kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koji uključuju Fc fuzioni protein IL-22) pružaju terapeutsko, preventivno ili profilaktičko dejstvo protiv razvoja ili progresije kliničkih i/ili histoloških i/ili biohemijskih i/ili patoloških indikacija (uključujući i simptome i znakove) metaboličkog sindroma (ili metaboličkog poremećaja ili bolesti) kod ispitanika. U jednom ili više otelotvorenja, ispitanik je pod rizikom od metaboličkog sindroma.
Efikasnost lečenja metaboličkog sindroma može se meriti različitim procenama koje se obično koriste u proceni metaboličkog sindroma. Na primer, može se meriti gojaznost. Kao dalji primer mogu se meriti hiperglikemija, dislipidemija, insulinska rezistencija, hronična upala masnog tkiva i/ili hipertenzija. Može se meriti smanjenje nivoa jednog ili više od C-reaktivnog proteina, IL-6, LPS i inhibitora aktivatora plazminogena 1. Ova merenja se mogu izvoditi bilo kojim metodama dobro poznatim u struci.
Poremećaji povezani sa insulinom
Za poremećaje povezane sa insulinom, termin „lečenje“ odnosi se i na terapijski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere za poremećaj, pri čemu je cilj sprečavanje ili usporavanje (smanjenje) ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Osobe kojima je potrebno lečenje uključuju osobe koje već imaju poremećaj povezan sa insulinom, kao i osobe koje su sklone da imaju takav poremećaj ili one kod kojih poremećaj treba sprečiti.
U jednom aspektu, kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koji uključuju Fc fuzioni protein IL-22) pružaju preventivno ili profilaktičko dejstvo protiv razvoja ili progresije kliničkih i/ili histoloških i/ili biohemijskih i/ili patoloških indikacija (uključujući i simptome i znakove) poremećaja povezanog sa insulinom kod ispitanika. U jednom aspektu otkrića, poremećaj je dijabetes tipa I, dijabetes tipa II ili gestacioni dijabetes. U jednom otelotvorenju, patologija ili patološke indikacije uključuju jedno ili više od: male ili nepostojeće proizvodnje insulina od strane pankreasa (npr. ćelijska ostrvca), insulinske rezistencije, i hiperglikemije. U drugom aspektu, ispitanik je pod rizikom od poremećaja povezanog sa insulinom. Generalno, ispitanik pod rizikom ima genetsku predispoziciju za poremećaj povezan sa insulinom, izložen je virusu koji pokreće autoimuno uništavanje ćelijskih ostrvaca (npr. Epštajn-Barov virus, koksaki virus, virus zauški ili citomegalovirus), gojazan je, pre-dijabetičar (nivoi šećera u krvi viši od normalnih), ili ima gestacioni dijabetes.
Efikasnost lečenja poremećaja povezanog sa insulinom može se meriti različitim procenama koje se obično koriste u proceni takvih poremećaja. Na primer, i dijabetes tipa I i tipa II mogu se proceniti pomoću jednog ili više od sledećeg: testa glikovanog hemoglobina (A1C), regularnog testa šećera u krvi i testa šećera u krvi prilikom gladovanja. Tip I se takođe može proceniti testiranjem na autoantitela u krvi i/ili ketone u urinu. Tip II se takođe može proceniti testiranjem oralne tolerancije na glukozu.
Akutna endotoksemija i sepsa
U jednom aspektu, kompozicijee (npr. farmaceutsk kompozicijee koj uključuju Fc fuzioni protein IL-22) pružaju terapeutsko, preventivno ili profilaktičko dejstvo protiv razvoja ili progresije kliničkih i/ili histoloških i/ili biohemijskih i/ili patoloških indikacija (uključujući i simptome i znakove) akutne endotoksemije, sepse ili oba, kod ispitanika. U jednom ili više aspekata otkrića, ispitanik je pod rizikom od akutne endotoksemije, sepse ili oba.
Efikasnost lečenja akutne endotoksemije, sepse ili oba može se meriti različitim procenama koje se obično koriste u proceni akutne endotoksemije, sepse ili oba. Na primer, može se meriti smanjenje nivoa LPS ili upalnih markera. Ova merenja se mogu izvoditi bilo kojim metodama dobro poznatim u struci.
Zarastanje rana
Postoji niz načina za merenje zarastanja rana. Često se snimaju slike za izračunavanje linearnih dimenzija, obima i površine. NIH ima besplatan program, slika J, koji omogućava merenje područja rane sa slike. Konačna prognoza zarastanja može se ekstrapolirati iz početnih brzina zarastanja na osnovu migracije periferije prema centru. Ovo se radi pomoću više matematičkih jednačina, od kojih je najčešća modifikovana Gilmanova jednačina. Pored vizuelnog pregleda, merenje zarastanja rana može se vršiti i spektroskopskim metodama ili putem MR. Pogledajte npr. Dargaville et al., Biosensors Bioelectronics, 2013, 41:30-42, Tan et al., 2007, British J. Radiol.80:939-48. Ako je zarastanje sporo/neadekvatno, mogu se uzeti biopsije ivica rane kako bi se isključila ili utvrdila infekcija i malignitet. U određenim aspektima, ubrzanje ili poboljšanje zarastanja rana može se proceniti upoređivanjem zatvaranja rane u ranama tretiranim sa IL-22 i kontrolnim ranama. U određenim aspektima otkrića, ubrzanje ili poboljšanje zarastanja rana je najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% brže ili bolje od kontrole.
U određenim aspektima, predviđene su metode za promovisanje/ubrzanje/poboljšanje zarastanja rane sa aktivnom infekcijom, mikrobnom kontaminacijom ili kolonizacijom u rani ili bez njih. Kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koje uključuju Fc fuzioni protein IL-22) mogu se koristiti za lečenje zaraženih rana ili promovisanje/ubrzavanje/poboljšanje zarastanja inficiranih rana. U određenim aspektima, kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koje uključuju Fc fuzioni protein IL-22) mogu se koristiti za lečenje rana, ili promovisanje/ubrzavanje/poboljšanje zarastanja rana, u prisustvu infekcije. U nekim aspektima, kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koje uključuju Fc fuzioni protein IL-22) mogu se koristiti za lečenje rana ili promovisanje/ubrzanje/poboljšanje zarastanja rana u prisustvu mikrobne kontaminacije ili kolonizacije sa rizikom od infekcije. U daljim aspektima, pacijent kojem je potrebno lečenje rana može biti dijabetičar. Shodno tome, u nekim aspektima, rana je dijabetička rana, na primer, dijabetički čir na stopalu. U nekim daljim aspektima, rana je zaražena dijabetička rana, na primer, inficirani dijabetički čir na stopalu.
GVHD
U jednom aspektu, Fc fuzioni proteini IL-22 mogu pružiti profilaktičko dejstvo protiv razvoja ili terapeutsko dejstvo protiv progresije kliničkih i/ili histoloških i/ili biohemijskih i/ili
1
patoloških indikacija (uključujući i simptome i znakove) GVHD-a. Primena Fc fuzionog proteina IL-22 ili njegove kompozicije kako je ovde opisana može smanjiti jedan ili više simptoma GVHD-a, uključujući bol, osip, zadebljanje kože, žutu kožu ili oči, suvoću usta ili čireve, abnormalnosti ukusa, suve oči, infekcije ili gubitak težine. Fc fuzioni proteini IL-22 ili njihove kompozicije mogu se primenjivati u kombinaciji sa dodatnom GVHD terapijom, uključujući, na primer, imunosupresivne agense (npr. ciklosporin, mikofenolat mofetil (MMF) ili takrolimus), inhibitore mTOR (npr. sirolimus ili everolimus), sredstva za hemoterapiju (npr. imatinib, pentostatin, metotreksat, ili talidomid), TNF antagoniste (npr. etanercept), steroide (npr. prednizolon, metilprednizolon, topikalni steroidi, ili steroidne kapi za oči), tretman svetlom (npr. ekstrakorporalna fotofereza), hidroksihlorokin, antifibrotičke agense (npr. halofugofuginon), monoklonska antitela (npr. alemtuzumab, infliksimab ili rituksimab), ili njihove kombinacije.
Kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) kako je ovde otkrivena može se primenjivati istovremeno sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom. U određenim aspektima, dodatni terapeutski agens je imunosupresiv koji smanjuje inflamatorni odgovor, uključujući, bez ograničenja, metotreksat, TNF inhibitor, TNF antagonist, mesalazin, steroid, deksametazon, azatioprin i njihovu kombinaciju. Pogodna dodatna terapeutska sredstva koja smanjuju inflamatorni odgovor uključuju, bez ograničenja, 5-aminosalicilnu kiselinu (5-ASA), merkaptopurin (takođe se naziva 6-merkaptopurin ili 6-MP) ili njihovu kombinaciju. U određenim aspektima, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se primenjivati zajedno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava koja smanjuju inflamatorni odgovor (na primer, 5-ASA, 6-MP ili TNF antagonist) za lečenje IBC. U određenim drugim aspektima, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se primenjivati zajedno sa antagonistom integrina kao što je etrolizumab, za lečenje IBC. U jednom aspektu, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) koristi se u kombinaciji sa agonistom IL-22.
Za ubrzavanje hroničnog zarastanja rana, kao što je za lečenje dijabetičkog čira na stopalu, primena kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se kombinovati sa jednim ili više dodatnih sredstava za zarastanje rana. Pogodna dodatna sredstva za zarastanje rana uključuju, bez ograničenja, faktore rasta (npr. EGF, FGF, IGF, PDGF, TGF i VEGF), faktor rasta nerva (NGF), faktore angiogeneze (npr. HGF, TNF-α,
2
angiogenin, IL-8, angiopoietini 1 i 2, Tie-2, integrin a5, matrične metaloproteinaze, azot oksid, i COX-2), članove porodice faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGF) (npr. PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C i PDGF-D), članove porodice faktora rasta insulina (IGF) (npr. IGF-I i IGF-II), članove porodice transformišućeg faktora rasta (TGF) (npr. TGF-α i TGF-β) i anabolički kiseonik (vakuumska terapija). U određenim aspektima otkrića, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se primenjivati zajedno sa jednim ili više dodatnih sredstava za zarastanje rana opisanih ovde i/ili jednim ili više antibakterijskih sredstava ili antibiotika pogodnih za upotrebu u topikalnim primenama. Pogledajte npr. WO 2006/138468. U takvim aspektima, antibiotik može biti sumporni antibiotik, uključujući, bez ograničenja, srebro sulfadiazin, tj. silvadeen. Istovremeno primenjeno jedno ili više dodatnih sredstava može se primenjivati istovremeno, naizmenično ili sekvencijalno sa kompozicijom (npr. farmaceutskom kompozicijom koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22).
U daljim primerima aspekata otkrića, ako je cilj prevencija ili lečenje kardiovaskularnih bolesti ili stanja ili metaboličkog sindroma, primena kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se kombinovati ili dopuniti primenu sredstava za snižavanje holesterola kao što su statini (npr. lovastatin, rosuvastatin, fluvastatin, atorvastatin, pravastatin i simvastatin), smole za vezivanje žučne kiseline (kolestipol, holestiramin saharoza i kolesevelam), ezetimib ili kombinacija ezetimib-simvastatin; agensi protiv trombocita kao što su inhibitori ciklooksigenaze (npr. aspirin), inhibitori receptora adenozin difosfata (ADP) (npr. klopidogrel, prasugrel, ticagrelor i tiklopidin), inhibitori fosfodiesteraze (npr. cilostazol), inhibitori glikoproteina IIB/IIIA (npr. abciksimab, eptifibatid, i tirofiban), inhibitori ponovnog preuzimanja adenozina (npr. dipiridamol), inhibitori tromboksana (npr. inhibitori tromboksan sintaze, antagonisti receptora tromboksana i terutroban); beta blokatori kao što su alprenolol, bucindolol, karteolol, karvedilol, labetalol, nadolol, oksprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol, timolol, kora eukomije, acebutolol, atenolol, betaksolol, bisoprolol, celiprolol, esmolol, metoprolol, nebivolol, butaksamin, ICI-118,551 i SR 59230A; inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE) kao što su kaptopril, zofenopril, agensi koji sadrže dikarboksilat (npr. enalapril, ramipril, kvinapril, perindopril, lizinopril, benazepril, imidapril i zofenopril), sredstva koja sadrže fosfonat (npr. fosinopril), kasokinini, laktokinini, laktotripeptidi (npr. Val-Pro-Pro i Ile-Pro-Pro proizvodi probiotika Lactobacillus helveticus ili izvedeni iz kazeina); blokatori kalcijumovih kanala kao što su dihidropiridini (npr. amlodipin, aranidipin, azelnidipin, barnidipin, benidipin, kilnidipin, klevidipin, izradipin, efonidipin, felodipin, lacidipin, lerkanidipin, manidipin, nikardipin, nifedipin, nilvadipin, nimodipin, nisoldipin, nitrendipin i pranidipin), fenilalkilamin (npr. verapamil), benzotiazepini (npr. diltiazem), mibefradil, bepridil, fluspirilen i fendilin; diuretici kao što su diuretici sa visokim plafonom petlje (npr. furosemid, etakrinska kiselina, torsemid i bumetanid), tiazidi (npr. hidrohlorotiazidna kiselina), inhibitori karboanhidraze (npr. acetazolamid i metazolamid), kalijum-štedeći diuretici (npr antagonisti aldosterona: spironolakton i epitelni blokatori natrijumovih kanala: amilorid i triamteren), diuretici koji štede kalcijum i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivati bilo čega od gore navedenog.
Za poremećaje povezane sa insulinom ili metabolički sindrom, primena kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se kombinovati sa različitim terapeutskim sredstvima ili dopuniti njihovu primenu. U slučaju dijabetesa tipa I (dijabetes melitus zavisan od insulina ili IDDM), ovde opisani Fc fuzioni protein IL-22 može se kombinovati sa jednom ili više regularnih supstitucionih terapija insulinom (uključujući insulin brzog i dugotrajnog dejstva), imunosupresijom, transplantacijom ostrvaca i terapijom matičnim ćelijama. U jednom aspektu, redovna terapija zamene insulina uključuje, bez ograničenja, regularni insulin (npr. HUMULIN R®, NOVOLIN R®), insulin izofan (npr. HUMULIN N®, NOVOLIN N®), insulin lispro (npr. HUMALOG®), insulin aspart (npr. NOVOLOG®), insulin glargin (npr. LANTUS®) i insulin detemir (npr. LEVEMIR®). U drugim aspektima otkrića, terapija zamene insulina dalje uključuje pramlintid (SYMLIN®).
U slučaju dijabetesa tipa II (dijabetes melitus koji nije zavisan od insulina ili NIDDM) ili metaboličkog sindroma, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) opisan ovde može se kombinovati sa jednom ili više terapija zamene insulina (kao što je gore rečeno), sredstvom za smanjenje proizvodnje glukoze u jetri, sredstvom za stimulaciju proizvodnje i oslobađanja insulina u pankreasu, agensom koji blokira enzimsku razgradnju ugljenih hidrata ili agensom koji povećava osetljivost na insulin. U jednom aspektu otkrića, sredstvo za smanjenje proizvodnje glukoze je metformin (npr. GLUCOPHAGE® i GLUMETZA®). U drugom aspektu, sredstvo za stimulaciju proizvodnje i oslobađanje insulina u pankreasu je glipizid (npr. GLUCOTROL® i GLUCOTROL XL®), gliburid (npr. DIABETA® i GLYLASE®) ili glimepirid (npr. AMARYL®). U jednom drugom aspektu, sredstvo koje blokira enzimsku razgradnju ugljenih hidrata ili povećava osetljivost na insulin je pioglitazon (npr. Actos). U drugom aspektu, Fc fuzioni protein IL-22 može se kombinovati sa jednom od sledećih zamena za metformin: sitagliptinom (npr. JANUVIA®), saksagliptinom (npr. ONGLYZA®), repaglinidom (npr. PRANDIN®) i nateglinidom (npr. STARLIX®), eksenatidom (npr. BYETTA®) i liraglutidom (npr.
4
VICTOZA®). U drugom aspektu, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koji uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može se kombinovati sa oralnim hipoglikemijskim agensom, npr. sulfonilurejama.
U slučaju gestacionog dijabetesa ili metaboličkog sindroma, kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) koji je ovde opisan može se kombinovati sa oralnim lekovima za kontrolu šećera u krvi. U jednom aspektu otkrića, lek je gliburid.
Kombinovana terapija može da obezbedi „sinergiju“ i da se pokaže kao „sinergijska“, tj. efekat postignut kada se aktivni sastojci zajedno koriste je veći od zbira efekata koji se dobijaju od odvojene primene komponenata. Sinergijski efekat se može postići kada su aktivni sastojci: (1) koformulisani i primenjeni ili isporučeni istovremeno u kombinovanoj, jediničnoj doznoj formulaciji; (2) isporučeni naizmenično ili paralelno kao odvojene formulacije; ili (3) primenjeni nekim drugim režimom. Kada se isporučuju kao naizmenična terapija, sinergijski efekat se može postići kada se komponente primenjuju ili isporučuju sekvencijalno, npr. različitim injekcijama u odvojenim brizgalicama. Generalno, tokom naizmenične terapije, efikasna doza svakog aktivnog sastojka se primenjuje sekvencijalno, tj. serijski, dok se kod kombinovane terapije efikasne doze dva ili više aktivnih sastojaka primenjuju zajedno.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agensa uključena u iste ili odvojene formulacije) i odvojenu primenu, u kom slučaju, primena kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) može da se odigra pre, istovremeno i/ili posle primene dodatnog terapeutskog agensa ili agenasa. U jednom aspektu otkrića, primena kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešava u roku od oko mesec dana, ili u roku od oko jedne, dve ili tri nedelje, ili u razmaku od jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest dana.
Kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) prema otkriću (i bilo koji dodatni terapeutski agens) može se primenjivati na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu, topikalnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) iz otkrića bi bila formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. Kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) ne mora biti, ali je opciono formulisana sa jednim ili više agensa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agensa zavisi od količine fuzionog proteina prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od tipa bolesti koja se leči, tipa Fc regiona, ozbiljnosti i toka bolesti, od toga da li se fuzioni protein primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na Fc fuzioni protein IL-22, kao i odluke nadležnog lekara. Kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje Fc fuzioni protein IL-22) prikladno se primenjuje na pacijentu jednokratno ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg -10 mg/kg) ili oko 0,1 µg/kg do 1,5 mg/kg (npr.0,01 mg/kg -1 mg/kg) Fc fuzionog proteina IL-22 može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, bilo, na primer, putem jedne ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedna doza Fc fuzionog proteina IL-22 navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Određene druge doze uključuju raspon od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 10 mg/kg, i oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Dakle, jedna ili više doza od oko 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se davati pacijentu. Za lokalno zarastanje rana, jedna ili više doza od oko 0,001 mg/cm<2>do oko 10 mg/cm<2>površine rane, oko 0,05 mg/cm<2>do oko 5 mg/cm<2>površine rane, oko 0,01 mg/cm<2>do oko 1 mg/cm<2>površine rane, oko 0,05 mg/cm<2>do oko 0,5 mg/cm<2>površine rane, oko 0,01 mg/cm<2>do oko 0,5 mg/cm<2>površine rane, oko 0,05 mg/cm<2>do oko 0,2 mg/cm<2>površine rane, ili oko 0,1 mg/cm<2>do oko 0,5 mg/cm<2>površine rane (ili bilo koja njihova kombinacija) može se davati pacijentu. U određenim aspektima otkrića, jedna ili više doza od oko 0,01 mg/cm<2>, 0,02 mg/cm<2>, 0,03 mg/cm<2>, 0,04 mg/cm<2>, 0,05 mg/cm<2>, 0,06 mg/cm<2>, 0,07 mg/cm<2>, 0,08 mg/cm<2>, 0,09 mg/cm<2>, 0,1 mg/cm<2>, 0,15 mg/cm<2>, 0,2 mg/cm<2>, 0,25 mg/cm<2>, 0,3 mg/cm<2>, 0,4 mg/cm<2>ili 0,5 mg/cm<2>površine rane može se davati pacijentu. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset ili npr. oko šest doza Fc fuzionog proteina IL-22). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
F. Proizvodi
U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod može uključivati bilo koju od kompozicija (npr. farmaceutskih kompozicija koje uključuju Fc fuzioni protein IL-22) koje su ovde navedene. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). U nekim aspektima otkrića, najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je Fc fuzioni protein IL-22. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. U nekim aspektima otkrića, proizvod ili pakovanje su zaštićeni od svetlosti. Proizvodi mogu uključivati bilo koju od kompozicija (npr. farmaceutske kompozicije) opisanih ovde.
U nekim aspektima otkrića, proizvod uključuje bočicu koja ima zapreminu od oko 1 ml ili više, na primer, oko 1 ml, oko 2 ml, oko 3 ml, oko 4 ml, oko 5 ml, oko 6 ml, oko 7 ml, oko 8 ml, oko 9 ml, oko 10 ml ili više. U nekim aspektima otkrića, pakovanje je bočica koja ima zapreminu od oko 2 ml. U nekim aspektima otkrića, bočica je za jednokratnu upotrebu. U nekim aspektima otkrića, bočica sadrži oko 1 mg, oko 2 mg, oko 3 mg, oko 4 mg, oko 5 mg, oko 6 mg, oko 7 mg, oko 8 mg, oko 9 mg, oko 10 mg, oko 11 mg, oko 12 mg, oko 13 mg, oko 14 mg, oko 15 mg, oko 16 mg, oko 17 mg, oko 18 mg, oko 19 mg, oko 20 mg ili više Fc fuzionog proteina IL-22. U nekim aspektima otkrića, bočica sadrži oko 10 mg Fc fuzionog proteina IL-22. U nekim otelotvorenjima, bočica sadrži Fc fuzioni protein IL-22 formulisan u 10 mM natrijum fosfatu, 5 mM metioninu, 240 mM saharozi, 0,02% (m/V) polisorbatu 20, pH 7,1. U nekim aspektima otkrića, sistem za zatvaranje pakovanja sadrži jedno ili više, ili sve od staklene bočice, zapušača i poklopca.
Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži Fc fuzioni protein IL-22; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni terapeutski agens. Proizvod u ovom aspektu otkrića može dodatno sadržati umetak za pakovanje koji ukazuje da se kompozicije mogu koristiti za lečenje određenog stanja (npr. IBC, npr. UK ili Kronove bolesti), ili bilo kog drugog poremećaja koji je opisan ovde. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
PRIMERI
Primer 1: Studije stabilnosti Fc fuzionih proteina IL-22
Svrha ovih studija bila je da se istraži stabilnost Fc fuzionog proteina IL-22 i mogućnosti proizvodnje tečne formulacije 10 mM natrijum fosfata, 240 mM saharoze, 5 mM metionina, 0,02% (m/V) polisorbata 20 (PS20), pH 7,1. Kompletno ispitivanje pH na predviđenim temperaturama skladištenja od -70, -20 i 5°C, i pod temperaturnim stresom od 25, 30 i 40°C obavljeno je za 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22 na pH 5,5-7,6. Rezultati su pokazali da je formulacija na pH 7,1 bila odgovarajuća na osnovu boje, izgleda i bistrine (CAC), koncentracije, pH, tečne hromatografije visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC), DSC, snimanja kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (ICIEF) i potentnosti.
Studija tresenja za 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22 sa 0,0%, 0,01%, 0,02% i 0,04% (m/V) polisorbata 20 obavljena je da bi se odredile odgovarajuće specifikacije koncentracije polisorbata 20 kako bi se farmaceutska kompozicija Fc fuzionog proteina IL-22 zaštitio od stresa putem tresenja. Iako je utvrđeno da je 0,01% polisorbat 20 pogodan za Fc fuzioni protein IL-22, ciljna preporuka je bila 0,02% da bi se uzeo u obzir opseg specifikacija. Pored ispitivanja formulacije za farmaceutsku kompoziciju Fc fuzionog proteina IL-22 na 10 mg/ml, obavljena je studija stabilnosti prilikom zamrzavanja i odmrzavanja za Fc fuzioni protein IL-22 pri 10 mg/ml u istoj gorepomenutoj formulaciji. Nije bilo značajnih promena za Fc fuzioni protein IL-22 koji se čuva na -20°C i 5°C tokom 1 nedelje i tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, na osnovu SE-HPLC. Studije stabilnosti pod AAPH stresom sprovedene su u odsustvu metionina ili u prisustvu metionina (3, 3,5 i 5 mM) kako bi se procenio oksidacioni potencijal metionina koji vezuju ključne receptore i zaštitna vrednost dodatog metionina. Ove studije pokazuju da je fizička i hemijska stabilnost Fc fuzionog proteina IL-22 formulisanog na 10 mg/ml za farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharozu, 5 mM metionin, 0,02% polisorbata 20, pH 7,1, prihvatljiva za upotrebu u vidu farmaceutske kompozicije, i da je proizvodnja Fc fuzionog proteina IL-22 podržana u ovoj formulaciji.
Materijali i metode
Materijali
Početni materijal farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 pri 10 mg/ml u 10 mM natrijum fosfatu i pH 5,5 je čuvan na 5°C pre početka studije. Ovaj materijal je korišćen za ispitivanja formulacije 1-3, kao i studije tresenja i smrzavanja/odmrzavanja. Preliminarne studije AAPH sprovedene su sa analitičkim standardom (bez metionina), a naknadne studije su sprovedene sa Fc fuzionim proteinom IL-22 formulisanim sa 0, 3, 3,5 i 5 mM metioninom.
Ispitivanje 1 formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
Stabilnost Fc fuzionog proteina IL-22 u ranoj formulaciji farmaceutske kompozicije pri 10 mg/ml u 20 mM histidin acetatu, 240 mM saharozi, pH 5,5, 0,02 % (m/V) polisorbatu 20 (PS20) procenjena je za preliminarno ispitivanje formulacije. Materijal je sterilno filtriran i 1,0 ml je aseptički napunjen u autoklavirane Forma Vitrum bočice od 2 cm<3>u laminatoru. Bočice su začepljene Daikyo čepovima prečnika 13 mm, zapečaćene aluminijumskim preklopnim zaptivkama i uskladištene uspravno na -20°C, 5°C, 25°C i 40°C. Uzorci su analizirani pomoću SE-HPLC i DSC.
Ispitivanje 2 formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
Polazni materijal pri 10 mg/ml je dijalizovan u odnosu na 10 mM histidin acetat i 240 mM saharozu, pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5, odnosno pH 7,0, sa dijaliznom kasetom Thermo Scientific. Nakon dijalize, PS20 je dodat u konačnoj koncentraciji od 0,02% (m/V). Koncentracija proteina nakon dijalize i koraka razblaživanja je volumetrijski određena. Da bi se pripremilo ispitivanje formulacije, materijal na pH 5,5, 6,0, pH 6,5 i pH 7,0 je sterilno filtriran, i 1,0 ml je aseptički napunjen u autoklavirane Forma Vitrum bočice od 2 cm<3>u laminatoru. Bočice su začepljene Daikyo čepovima prečnika 13 mm, zapečaćene aluminijumskim preklopnim zaptivkama i čuvane uspravno na -20°C, 5°C, 25°C i 30°C.
Pregled ovog ispitivanja je prikazan u Tabeli 1.
Tabela 1
Ispitivanje 3 formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
Polazni materijal pri 10 mg/ml je dijalizovan u odnosu na 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharozu, 0,02% (m/V) PS20, pH 6,5, pH 7,0, pH 7,3, 7,6, odnosno 20 mM Tris pH 7,3, sa kasetom za dijalizu Thermo Scientific. Koncentracija proteina nakon dijalize i koraka razblaživanja je volumetrijski određena. Da bi se pripremilo ispitivanje formulacije, materijal na pH 6,5, pH 7,0, pH 7,3, pH 7,6 i tris pH 7,3 sterilno su filtrirani, i 1,0 ml je aseptički napunjen u autoklavirane Forma Vitrum bočice od 2 cm<3>u laminatoru. Bočice su začepljene Daikyo čepovima prečnika 13 mm, zapečaćene aluminijumskim preklopnim zaptivkama i čuvane uspravno na -20°C, 5°C, 25°C i 30°C. Pregled ovog ispitivanja je prikazan u Tabeli 2.
Tabela 2
Studije tresenja Fc fuzionog proteina IL-22
Studija tresenja je sprovedena na sobnoj temperaturi sa različitim nivoima PS20. Početni materijal pri 10 mg/ml formulisan je u 10 mM natrijum fosfatu, 240 mM saharozi, pH 7,1 sa 0,0%, 0,01%, 0,02%, i 0,04% (m/V) PS20. Formulacije proteina su sterilno filtrirane i 1,0 ml je napunjen u bočice od 2 cm<3>kako je gore opisano. Bočice su postavljene horizontalno i podvrgnute neprekidnom tresenju koristeći stonu tresilicu pri brzini od 50 ciklusa u minuti (brzina motora 70) na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Kontrolni uzorci (0,0% PS20) postavljeni su pored tresenih uzoraka na sobnoj temperaturi bez tresenja.
Studije zamrzavanja-odmrzavanja Fc fuzionog proteina IL-22
Stabilnost farmaceutskih kompozicija zamrznutog-odmrznutog Fc fuzionog proteina IL-22 u bočicama je procenjena na formulacijama koje sadrže 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharozu, 0,02% (m/V) PS20 na pH 6,5, 7,0, 7,3 i 7,6, kao i jedna formulacija koja sadrži iste pomoćne supstance, osim sa puferom od 20 mM Tris na pH 7,3. Formulacije proteina su sterilno filtrirane i 1,0 ml je napunjen u bočice od 2 cm<3>kako je gore opisano. Bočice su stavljene na -20°C tokom T = 0 i 1 nedelja. Bočice su ukupno tri puta zamrznute i odmrznute do sobne temperature. Analizirani su samo ciklus T=0 i treći ciklus zamrzavanja i odmrzavanja.
Studije stabilnosti prilikom AAPH stresa za određivanje nivoa metionina u formulaciji Svrha ove studije bila je generisanje razloženih uzoraka koristeći 2,2'-azobis-2-metilpropanimidamid, dihidrohlorid (AAPH) za podršku razvoju ispitivanja i istraživanju oksidacije Fc fuzionog proteina IL-22. Farmaceutske formulacije Fc fuzionog proteina IL-22 pri 10 mg/ml u 10 mM natrijum fosfatu, 240 mM saharozi, 0,02% (m/V) PS20, pH 7,1 sa 0, 3, i 3,5 mM metioninom su podvrgnute AAPH stresu. Uzorci su inkubirani sa 1 mM AAPH tokom 24 sata na 40°C. Po završetku AAPH stresa, uzorcima je razmenjen pufer u pufer za formulaciju, alikvotirani su i zamrznuti na -70°C za naknadnu analizu. Gorenavedeni uzorci su upoređeni sa Fc fuzionim proteinom IL-22, 10 mM natrijum fosfatom, 240 mM saharozom, 0,02% PS20, pH 7,1, 5 mM metioninom, koji su prethodno podvrgnuti istom stresu.
Testovi
Boja, izgled i bistrina
Boja, izgled i bistrina uzoraka su vizuelno procenjeni pod belim fluorescentnim svetlom pomoću stanice za svetlosnu inspekciju sa crno-belom pozadinom.
pH
pH vrednost rastvora je merena korišćenjem pH-metra SevenMulti Mettler Toledo sa mikroelektrodom Beckman Coulter. Pre testiranja, izvršena je standardizacija pH-metra. Za kalibraciju su korišćeni standardni rastvori pH 7,0 i pH 4,0.
Volumetrijska koncentracija proteina (jačina)
Agilent 8453 je korišćen za merenje koncentracije ili jačine proteina pomoću apsorpcije. Pre merenja, uzorci su volumetrijski razblaženi na ~ 0,5 mg/ml odgovarajućim
1
puferima za formulaciju. Apsorpcija je izmerena u kvarcnoj kiveti sa dužinom staze od 1,0 cm. Instrument je podešen na nulu odgovarajućim puferima za formulaciju. Koncentracija proteina je izračunata korišćenjem apsorbance na 280 nm (Amax) i 320 nm (A320), i koeficijenta ekstinkcije (ε) od 0,98 (mg/ml)<-1>cm<1>.
(A razblaživanja (ml/ml) Koncentracija (mg/ml) =maks- A320) x faktor
ε x dužina putanje ćelije (cm)
Tečna hromatografija visokih performansi na molekulskim sitima (BE-HPCL) Hromatografija na molekulskim sitima je izvedena na aparatu Agilent 1100 HPLC. Razdvajanje je izvršeno na koloni TOSOH Bioscience TSKgel G3000SWXL od 30 cm na sobnoj temperaturi. Mobilna faza je održavana pri brzini protoka od 0,5 ml/min. Uzorci su injektovani nerazblaženi za ispitivanje formulacije 1, ali su razblaženi do 2 mg/ml u mobilnoj fazi 0,20 M kalijum fosfat, 0,25 M kalijum hlorid, pH 6,2 ± 0,1 pre injektovanja za naredna ispitivanja. Injektovanje 50 µg proteina po uzorku je detektovano na 280 nm. Vreme trajanja ciklusa svakog uzorka je bilo 30 minuta. Slepe probe reagensa su izvedene sa odgovarajućim puferima za formulaciju. Područja pika su integrisana u odnosu na baznu liniju.
Snimanje kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (ICIEF)
Distribucija varijanti naelektrisanja je procenjena pomoću analizatora iCE280 (ProteinSimple) sa PrinCE mikroinjektorom i kapilarnim kertridžom presvučenim fluorougljenikom od 100 pm x 5 cm (ProteinSimple). Da bi se uklonio ostatak teškog lanca C-terminalnog lizina, karboksipeptidaza B (CpB) dodata je svakom uzorku nakon koraka razblaživanja pri odnosu enzima i supstrata od 1:1000 (m/m). Pored toga, dodata je sijalidaza A da bi se uklonila sijalinska kiselina. Nakon dodavanja CpB i sijalidaze A, uzorci su inkubirani na 37°C tokom 10 minuta. Inkubirani uzorci su pomešani sa rastvorom amfolita koji se sastojao od smeše 700 µl 1% metil celuloze, 1218 µl prečišćene vode, 8 µl farmalita 8-10,5, 55 µl farmalita 5-8, 15 µl p markera 5,12, 4 µl pl markera 7,05. Uzorci su fokusirani uvođenjem potencijala od 1500 V tokom 1 minuta, nakon čega je sledio potencijal od 3000 V tokom 5 minuta sa anolitom od 80 mM fosforne kiseline, i katolitom od 100 mM natrijum hidroksida, oba u 0,1% metil celuloze. Slika fokusiranih varijanti naelektrisanja dobijena je prolaskom ultraljubičastog (UV) zračenja na 280 nm kroz kapilar i u sočivo digitalnog fotoaparata sa CCD senzorom.
Termička stabilnost na osnovu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) i unutrašnje fluorescencije triptofana
DSC je termoanalitička tehnika u kojoj se razlika u količini toplote potrebne za povećanje temperature uzorka meri kao funkcija temperature linearno. Tačke topljenja Tmi
2
početna temperatura topljenja mogu odrediti osetljivost proteina na termičko odmotavanje. Fuzioni molekul se topi na znatno nižoj temperaturi od monoklonskih antitela pune dužine. Zbog toga je DSC korišćena za brzu procenu uticaja pH na toplotnu stabilnost kako bi se dalje vodio razvoj formulacije. Fc fuzioni protein IL-22 je razblažen do 1 mg/ml u različitim puferima za formulaciju (pH 5,5-7,6). Uzorci su ubačeni u ploču sa 96 bunarčića, naizmenično sa bunarčićima koji sadrže 500 µl pufera za formulaciju sa odgovarajućim pH. Instrument je skenirao svaki par uzorak-pufer u temperaturnom opsegu 15-95°C brzinom od 1°C/min. Analiza podataka je izvršena korišćenjem softvera Origin (Originlab, Northampton, MA).
Studije termičke denaturacije korišćenjem emisionih spektara unutrašnje fluorescencije triptofana sprovedene su korišćenjem spektrometra Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4 sa Thermo Scientific NESLAB RTE 7 cirkulacionim vodenim kupatilom. Spektar emisije triptofana je sniman od 300 do 450 nm nakon ekscitacije na 295 nm. Merenje je ponovljeno u intervalima od 2°C od približno 5 do 65°C. Intenzitet fluorescencije na 350 nm (ʎmax) praćen je kako bi se procenila promena pika fluorescencije tokom termalnog rasta. Krive odmotavanja su generisane korišćenjem glavne komponente analize svih dobijenih spektara i Tonsetje definisana kao prva promena nagiba krive odmotavanja.
i
Analiza peptidnih mapa pomoću tečne hromatografije visoke rezolucije i tandem masene spektrometrije (LC-MS-MS) korišćena je za procenu oksidacije metionina. Uzorci Fc fuzionog peptida IL-22 su podvrgnuti denaturacionim uslovima sa gvanidinijum hidrohloridom, nakon čega sledi redukcija sa ditiotreitolom (DTT) i karboksimetilacija cisteina jodsirćetnom kiselinom (IAA). Redukovani i karboksimetilovani uzorci su zatim digestovani enzimom tripsinom tokom 4 sata na 37°C da bi se generisali tripsinski peptidi. Dobijeni tripsinski peptidi su odvojeni pomoću Agilent 1200 RP-HPLC spojenog sa masenim spektrometrom Thermo Orbitrap Elite III koji je sposoban za MS-MS. Analiza podataka odvojene smeše tripsinskih peptida izvršena je korišćenjem softvera Thermo Xcalibur. Postoji osam tripsinskih peptida koji sadrže metionin u Fc fuzionom proteinu IL-22. Ekstrahovani jonski hromatogrami (EIC) za mase nativnih tripsinskih peptida koji sadrže metionin upoređeni su sa EIC masa oksidovanih peptida koji sadrže metionin (ako su uočeni). Oksidacija metionina za svaki tripsinski peptid se prijavljuje kao procenat odnosa oksidisanog tripsinskog peptida prema ukupnom tripsinskom peptidu (nativni oksidisani).
Test potentnosti
Test potentnosti Fc fuzionog proteina IL-22 meri sposobnost Fc fuzionog proteina IL-22 da se veže za ekstracelularni domen (ECD) IL22-R1a. U testu, različite koncentracije referentnog standarda Fc fuzionog proteina IL-22, kontrola i uzorci su dodati na ploču sa 96 bunarčića presvučenu sa IL22-R1a ECD. Vezani Fc fuzioni protein IL-22 je detektovan sa kozjim anti-humanim IgG-HRP antitelom i rastvorom supstrata tetrametilbenzidina. Rezultati, izraženi u jedinicama optičke gustine (OD), iscrtani su naspram koncentracija Fc fuzionog proteina IL-22, a paralelni program krive je korišćen za izračunavanje izmerene potentnosti uzoraka Fc fuzionog proteina IL-22 u odnosu na referentni standard.
Da bi se odredila korigovana relativna vrednost potentnosti: prvo, predviđena relativna potentnost (i) za uzorak određena je unosom SA vrednosti (x) za uzorak i rešavanjem jednačine linije korelacije (y = 178,25 - 10,604x). Predviđena relativna vrednost potentnosti (i) je zatim oduzeta od 100. Ova vrednost je zatim dodata izmerenoj relativnoj potentnosti da bi se dobila korigovana relativna vrednost potentnosti za uzorak: Korigovana relativna potentnost = izmerena relativna potentnost (100 - y).
Nivo SA u uzorcima je praćen i kontrolisan primenom analitičke metode specifične za SA na kontrolnom sistemu. Kriterijum za prihvatanje kontrolnog sistema za sadržaj SA je 8 -12 mol/mol. Referentni standard ima sadržaj SA od 8 mol/mol, što je na donjoj granici kriterijuma prihvatljivosti za SA. Stoga, isključivo zbog negativne korelacije između SA i potentnosti, uzorci sa sadržajem SA većim od 8 mol/mol mogu se veštački činiti subpotentnim. Korišćenje linije korelacije za generisanje korigovanih relativnih vrednosti potentnosti obezbeđuje korekciju koja je specifična za sadržaj SA svakog uzorka. Specifičnost korekcije za svaki uzorak održava sposobnost testa potentnosti da otkrije molekularne promene koje bi mogle biti maskirane fiksnom vrednošću korekcije koja može prekomerno nadoknaditi uticaj SA na potentnost.
Rezultati
Ispitivanje 1 formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
Za početno ispitivanje korišćena je farmaceutska kompozicija koja ima koncentraciju Fc fuzionog proteina IL-2210 mg/ml u 20 mM histidin acetatu, 240 mM saharozi, pH 5,5, 0,02% (m/V) PS20. Nakon jedne nedelje na 40°C, rezultati SE-HPLC analize pokazali su povećanje vrsta sa veoma velikom molekulskom masom (vHMWS), što ukazuje na termičku denaturaciju (Tabela 3 i Slika 1). To je potvrđeno DSC merenjem početne temperature topljenja (Tm) Fc fuzionog proteina IL-22, koja je bila približno 34°C (slika 2A). To je dovelo do zabrinutosti zbog fizičke stabilnosti Fc fuzionog proteina IL-22 nakon primene. Zbog toga je Tmizmerena za Fc fuzioni protein IL-22 u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) na pH 7,4 da bi se imitirali fiziološki uslovi (slika 2B).
4
Tabela 3: SE-HPLC Fc fuzionog proteina IL-22 pri 10 mg/ml u 20 mM histidin acetatu, 240 mM saharozi, 0,02% PS20 (m/V) na pH 5,5 (ispitivanje 1)
Ispitivanje 2 formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
Rezultat DSC sa PBS na pH 7,4 neočekivano je sugerisao da bi Fc fuzioni protein IL-22 mogao imati bolju toplotnu stabilnost na višem pH. To je dovelo do drugog kruga DSC sa materijalom formulisanim u 10 mM histidin acetatu na pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5 i pH 7,0. Rezultati DSC, kao i studije termičke denaturacije koje koriste praćenje fluorescencije (Trp fluorescencija) pokazale su da se, kako se pH formulacije povećava, Tmtakođe povećava do ~ 12°C više na pH 7,0 (Tabela 4 i sl. 3A-3D). Analiza IFc fuzionog proteina L-22 izloženog termalnom stresu u ovim formulacijama pomoću SE-HPLC pokazala je da Fc fuzioni protein IL-22 postiže fizičku stabilnost na oko pH 6,5 i 7,0, dok su povećanja HMWS primećena na pH 5,5 i 6,0 (slika 3E). Tako je inicirno konačno ispitivanje sa ciljem pH 7,0 u puferima odgovarajućeg pKada bi se utvrdio prihvatljiv opseg pH za Fc fuzioni protein IL-22.
Tabela 4: Tmizmerena pomoću DSC i Trp fluorescencije Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM histidin acetatu na pH 5,5, 6,0, 6,5 i 7,0 (ispitivanje 2)
Ispitivanje 3 formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
Konačno ispitivanje formulacije je podešeno na pH 6,5, 7,0, 7,3 i 7,6 u 10 mM natrijum fosfatu i na pH 7,3 u 20 mM Tris. Ove formulacije su prvo procenjene pomoću DSC da bi se odredio početak Tm(slika 4). Na osnovu DSC, čini se da su postojali manji dobici u toplotnoj stabilnosti iznad pH 7,3. Na preporučenoj temperaturi skladištenja farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 na 5°C, nisu primećene promene za sve formulacije na pH 6,5, 7,0, 7,3 i 7,6 nakon 6 nedelja skladištenja, putem SE-HPLC i ICIEF (Tabele 5-9). Nije bilo promena u vizuelnom izgledu, pH i jačini za sve formulacije na -70°C, -20°C, 5°C, 25°C, 30°C i 40°C za sve termine. Posle 6 nedelja na 30°C (Sl.5A-5B) i 2 nedelje na 40°C (Sl. 5C-5D), brzine degradacije na osnovu SE-HPLC za formulacije na pH 7,0, 7,3 i 7,6 bile su uporedive. Na osnovu podataka za 30°C, brzina degradacije je bila veća na pH 6,5 i u skladu sa rezultatima DSC. Glavni gubitk pika bio je pretežno posledica povećanja HMWF (oblik velike molekulske mase) sa manjim povećanjem primećenim kod LMWF (oblik male molekulske masne). Na 30°C nakon 4 nedelje (Slika 6) postojao je jasan trend na osnovu ICIEF ka bržoj degradaciji i većoj brzini formiranja pikova kiseline kako se pH povećao sa 7,0 na 7,3 i na 7,6. Postojala je mala razlika brzine degradacije između pH 6,5 i 7,0. Nije primećen gubitak na testu potentnosti nakon skladištenja tokom 4 nedelje na 30°C i 1 nedelje na 40°C, pH 7,0 (Tabela 10). Ovo ispitivanje formulacije sugerisalo je da bi farmaceutska kompozicija koji sadrži 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM natrijum fosfatu, 240 mM saharozi, 0,02% polisorbata 20, pri pH 7,1 obezbedila ravnotežu u održavanju fizičke i hemijske stabilnosti. Zbog toga je za farmaceutsku formulaciju izabran pH 7,1.
Tabela 5: Stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbata 20, pH 6,5 skladištenog na -70, 20, 5, 25, 30 i 40°C do 6 nedelja (ispitivanje 3)
Tabela 6: Stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbata 20, pH 7,0 skladištenog na -70, 20, 5, 25, 30 i 40°C do 6 nedelja (ispitivanje 3)
Tabela 7: Stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbata 20, pH 7,3 skladištenog na -70, 20, 5, 25, 30 i 40°C do 6 nedelja (ispitivanje 3)
Tabela 8: Stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbata 20, pH 7,6 skladištenog na -70, -20, 5, 25, 30 i 40°C do 6 nedelja (ispitivanje 3)
Tabela 9: Stabilnost farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 20 mM Tris, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbat 20, pH 7,3 skladištenog na -70, -20, 5,
25 i 30°C do 6 nedelja (ispitivanje 3)
1
Tabela 10: Stabilnost potentnosti farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbat 20, pH 7,0 skladištenog na 30°C do 4 nedelje i na 40°C do 1 nedelje (ispitivanje 3)
Studije tresenja Fc fuzionog proteina IL-22
Da bi se utvrdio efekat PS20 na stabilnost proteina, izvedena je studija tresenja proteina sa Fc fuzionim proteinom IL-22. Rezultati studija tresenja nisu pokazali razliku među uzorcima sa 0,01%, 0,02% i 0,04% PS20 nakon 24 sata tresenja u poređenju sa kontrolama bez tresenja na osnovu CAC, SE-HPLC, ICIEF i zamućenosti (Tabela 11 i Slika 7). Mali porast agregata primećen je u tresenom uzorku koji nije sadržao surfaktant, sa malim povećanjem zamućenosti i bez uočenih vizuelnih čestica. Studija sugeriše da je 0,01% PS20 dovoljno da zaštiti Fc fuzioni protein IL-22 tokom tresenja.0,02% (m/V) PS20 je izabran u konačnoj formulaciji kako bi se osigurala mogućnost proizvodnje u opsegu specifikacija od 0,01% - 0,03% (m/V) PS20.
1 1
Tabela 11: Stabilnost prilikom tresenja farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza, 5 mM metionin i 0,02% polisorbata 20. pH 7,1
Zamrzavanje-odmrzavanje Fc fuzionog proteina IL-22
Nakon tri ciklusa zamrzavanja na -20°C i odmrzavanja na sobnoj temperaturi, nije bilo promena CAC, pH, jačine i SE-HPLC (Tabela 12). Tako je farmaceutska kompozicija Fc fuzionog proteina IL-22 dovoljno tolerantna na ponovljene cikluse zamrzavanja i odmrzavanja tokom proizvodnog procesa.
Tabela 12: Stabilnost farmaceutsk kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 u formulaciji 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza i 0,02% polisorbata 20, 5 mM metionin, pH 7,0 nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja
1 2
Studije AAPH stresa
Početne studije sa AAPH tretmanom analitičkog standarda Fc fuzionog proteina IL-22 pokazale su podložnost ključnih metionina (M25 i M139) oksidaciji (Slika 8). Zbog toga je u formulaciju dodat 5 mM metionin da bi se zaštitili ovi ostaci metionina. Pored toga, uzorci koji sadrže 3,5 mM i 3 mM metionin bili su pod AAPH stresom i analizirani kako bi se utvrdilo da li će nivoi niži od ciljnog nivoa 5 mM metionina pružiti zaštitu od oksidacije metionina. Analiza tripsinskih peptidnih mapa pomoću tečne hromatografije visoke rezolucije i tandem masene spektrometrije (LC-MS-MS) korišćena je za procenu oksidacije metionina. Podaci o mapi tripsinskih peptida iz referentne serije formulisane sa 3,5 mM i 3 mM uzoraka tretiranih sa AAPH upoređeni su sa referentnom serijom formulisanom sa 5 mM metioninom i tretiranih ili netretiranih sa AAPH. Podaci pokazuju da se oksidacija metionina ne povećava značajno u uzorcima metionina od 3 mM ili 3,5 mM u poređenju sa materijalom formulisanim sa 5 mM metioninom (Tabela 13). Tako je 3 mM metionin postavljen kao donja granica prihvatljive koncentracije u svrhu postavljanja kriterijuma prihvatljivosti.
Tabela 13: Rezultati LC-MS-MS mape tripsinskog peptida Studija AAPH stresa
1
Zaključci
Ova studija pokazuje da je Fc fuzioni protein IL-22 pogodan za upotrebu kada se formuliše pri 10 mg/ml za farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharozu, 5 mM metionin i 0,02% polisorbat 20, pH 7,1. Za zaštitu Fc fuzionog proteina IL-22 od stresova tresenjem, pogodne su koncentracije polisorbata između 0,01 i 0,04%. 10 mg/ml Fc fuzioni protein IL-22 u ovoj formulaciji bio je stabilan na -20°C i 5°C tokom 6 nedelja i nakon 3 ciklusa zamrzavanja na -20°C i odmrzavanja na sobnoj temperaturi.
Primer 2: Razvoj farmaceutske kompozicije iz pronalaska
Opis i sastav farmaceutske kompozicije iz pronalaska (Fc fuzioni protein IL-22, sterilna tečnost, 10 mg/ml)
Fc fuzioni protein IL-22 je obezbeđen kao sterilni blago smeđkasti žuti rastvor za intravensku infuziju, i ne sadrži konzervanse. Svaka bočica za pojedinačnu upotrebu od 2 ml sadrži 10 mg (nominalno) Fc fuzionog proteina IL-22 na ciljnom pH 7,1. Farmaceutska kompozicija iz pronalaska je formulisana kao Fc fuzioni protein IL-22 10 mg/ml sa kompozicijom datom u Tabeli 14.
Tabela 14: Sastav farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22
1 4
Farmaceutska kompozicija Fc fuzionog proteina IL-22
Fc fuzioni protein IL-22 je jedini aktivni sastojak u farmaceutskoj kompoziciji. Ne postoji nekompatibilnost između ekscipijenasa u formulaciji i aktivnog leka, što pokazuju podaci o stabilnosti Fc fuzionog proteina IL-22 i farmaceutske kompozicije.
Ekscipijensi
Tabela 15 sadrži spisak ekscipijenasa koji se koriste u farmaceutskoj kompoziciji iz pronalaska sa odgovarajućim funkcijama i koncentracijama.
Tabela 15: Ekscipijensi
Razvoj farmaceutske formulacije
Razvijena je farmaceutska formulacija za jednokratnu upotrebu dizajnirana kao rastvor za intravensku (i.v.) infuziju Fc fuzionog proteina IL-22. Farmaceutska kompozicija iz pronalaska se sastoji od 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM natrijum fosfatu, 5 mM metioninu, 240 mM saharozi, 0,02% (m/V) polisorbata 20, pH 7,1.
Da bi se odabrala farmaceutska formulacija za Fc fuzioni protein IL-22, izvršene su studije formulacije koje su pokazale da Fc fuzioni protein IL-22 ima prihvatljivu stabilnost u rastvoru koji sadrži natrijum fosfat, metionin, saharozu i polisorbat 20 na pH 7,1. Na osnovu rezultata ove studije, formulacija za farmaceutsku kompoziciju je definisana kao 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM natrijum fosfatu, 5 mM metioninu, 240 mM saharozi, 0,02% (m/V) polisorbata 20, pH 7,1.
Viškovi
Farmaceutska formulacija Fc fuzionog proteina IL-22 ne sadrži nikakve viškove. Fizičkohemijska i biološka svojstva
Sva ispitivanja karakterizacije su izvršena na Fc fuzionom proteinu IL-22. Kompozicija
1
ostaje stabilna u preporučenim uslovima skladištenja od 2°C - 8°C kada je zaštićena od svetlosti. Kao mera predostrožnosti, linijski filter (0,2 µm) koristi se za i.v. primenu kliničkog materijala.
Praćenje subvidljivih čestica veličine ≥2 µm i ≥5 µm biće sprovedeno kao proširena karakterizacija (pored ≥ 10µm i ≥25 µm, koje su deo strategije kontrole) korišćenjem metode zamračenja svetlosti kroz razvoj. Ove procene će biti sprovedene kao deo proširene karakterizacije izvedene sa farmaceutskom kompozicijom Fc fuzionog proteina IL-22 u trenutku oslobađanja i stabilnosti.
Rezultati studije stabilnosti zamrzavanja/odmrzavanja
Stabilnost zamrzavanja/odmrzavanja nadgledana je za referentnu standardnu seriju Fc fuzionog proteina IL-22 nakon tri ciklusa zamrzavanja na - 20°C i odmrzavanja na sobnoj temperaturi. Nisu primećene promene kvaliteta proizvoda nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja.
Mikrobiološki atributi
Tečna formulacija farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 ne sadrži konzervanse.
Kompatibilnost
Intravenska infuzija
Za i.v. primenu, farmaceutska formulacija Fc fuzionog proteina IL-22 (10 mg/ml) će se primenjivati infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida (0,9% NaCl) i razblaživačem, koji je pufer za formulaciju bez metionina (10 mM natrijum fosfat, 240 mM saharoza, 0,02% [m/V] polisorbat 20, pH 7,1). Kompatibilnost i stabilnost aktivnog sastojka testirani su pod sledećim simuliranim uslovima pripreme/primene.
a) Razblaživanje Fc fuzionog proteina IL-22 farmaceutske formulacije, klinička serija 1 sa razblaživačem i razblažena u fiziološkim kesama u opsegu 0,025-0,5 mg/ml da pokrije opseg doza za i.v. primenu u kliničkoj studiji.
b) Kratkotrajno izlaganje infuzionim kesama koje sadrže izotonični rastvor natrijum hlorida (površinski materijal kese za kontakt sa proizvodom koji se sastoji od polivinilhlorida [PVC] i poliolefina [PO]) za i.v. kompatibilnost).
c) Upotreba i.v. infuzionih linija i pomagala za infuziju sa površinama koje dodiruju proizvod od polivinil hlorida (PVC), polietilena (PE), polikarbonata (PC) i polietar uretana (PEU).
d) Upotreba 0,2 µm linijskih filtera za i.v. kompatibilnost (filter membrana od polietarsulfona [PES].
1
Za i.v. primenu, uzorci iz fizioloških kesa testirani su nakon 24 sata skladištenja na 2°C-8°C i 24 sata na 30°C uz izlaganje difuznoj svetlosti praćeno prolaskom kroz infuzionu liniju i linijski filter. Pri najnižoj koncentraciji u kesi sa fiziološkim rastvorom, bilo je potrebno prethodno razblažiti farmaceutsku kompoziciju Fc fuzionog proteina IL-22 razblaživačem pre dodavanja u kesu sa fiziološkim rastvorom kako bi se osigurala adekvatna pH vrednost za održavanje stabilnosti proizvoda.
Uzorci su testirani odgovarajućim metodama za procenu kvaliteta proizvoda na sledeći način: čistoća tečnom hromatografijom visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC) i snimanjem izoelektričnim fokusiranjem kapilarnom elektroforezom (CIEF) (za uzorke ≥ 1mg/ml), koncentracija proteina (ultraljubičastim), subvidljive čestice zatamnjenjem svetlosti, boja, bistrina/opalescencija i pH vrednost. Jedan uzorak je postavljen na 2 mg/ml u kesama sa fiziološkim rastvorom i ispitan putem snimanja CIEF kako bi se pokazalo da fiziološki rastvor nije imao negativan uticaj na hemijsku stabilnost proizvoda.
Serijska formula (Fc fuzioni protein IL-22, sterilna tečnost, 10 mg/ml)
Formulisani rastvor farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 ostaje nepromenjen u pogledu koncentracije i kompozicije u poređenju sa rastvorom Fc fuzionog proteina IL-22, tj. ne vrši se dalje sjedinjavanje ili razblaživanje tokom procesa proizvodnje farmaceutske kompozicije. Zapremina ukupne farmaceutske kompozicije je pet (5) litara. Stvarna veličina serije je podložna promeni. Tabela 16 sadrži informacije o formulaciji šarže za farmaceutsku kompoziciju Fc fuzionog proteina IL-22.
Tabela 16: Serijska formula za farmaceutsku kompoziciju Fc fuzionog proteina IL-22
1
Primer 3: Prošireno testiranje stabilnosti Fc fuzionog proteina IL-22 Prošireno ispitivanje stabilnosti kliničke serije 2 i referentne standardne serije Fc fuzionog proteina IL-22
Procedure i kriterijumi ljivosti
Svi uzorci su analizirani korišćenjem postupaka ispitivanja navedenih u Tabeli 17. Reprezentativna stabilnost se procenjuje u određenim vremenskim intervalima koristeći protokol naveden u Tabeli 18.
Tabela 17: Test procedure za procenu stabilnosti Fc fuzionog proteina IL-22
1
1
11 Rezultati
Rezultati proširenog ispitivanja stabilnosti Fc fuzionog proteina IL-22 iz kliničke serije 2 i 5 referentne standardne serije, sprovedenog na -20°C i 5°C kako je gore opisano, prikazani su u Tabeli 19 i Tabeli 20.
11
11 Rok trajanja i preporučeno skladištenje
Preporučeni uslov skladištenja Fc fuzionog proteina IL-22 je ≤ -20°C. Kod skladištenja na -20°C do 48 meseci i na 5°C do 6 meseci, nema značajnih promena koncentracije proteina, pH, boje, bistrine, potentnosti, hromatografije na molekulskim sitima (SEC), snimanja kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (icIEF) i neredukovane (NR) kapilarne elektroforezenatrijum dodecil sulfat (CE-SDS) (Tabela 20). Rezultati ispitivanja stabilnosti predstavljeni ovde pokazuju da je Fc fuzioni protein IL-22 stabilan tokom 48 meseci na -20°C. Ovi podaci podržavaju rok trajanja od 60 meseci ili više na -20°C. Pored toga, Fc fuzioni protein IL-22 se može čuvati do mesec dana na 5°C.
Fc fuzioni protein IL-22 je čuvan u kesi za biološku obradu od 50 cm<3>i stabilnost prilikom zamrzavanja-odmrzavanja praćena je nakon tri ciklusa zamrzavanja na -20°C i odmrzavanja na temperaturi okoline. Kesa za biološku obradu je odmrznuta u terminu 1,2 i 3 meseca, tako da podaci nakon 3 meseca predstavljaju tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Nisu primećene značajne promene koncentracije proteina, pH, boje, bistrine, potentnosti, SEC, icIEF i CE-SDS nakon 3 ciklusa zamrzavanja na -20°C i odmrzavanja na temperaturi okoline. Zbog toga se Fc fuzioni protein IL-22 može zamrznuti na -20°C i odmrznuti u najmanje tri ciklusa.
Prošireno ispitivanje stabilnosti kliničke serije 1 i referentne standardne serije Fc fuzionog proteina IL-22
Farmaceutska kompozicija Fc fuzionog proteina IL-22 je tečna formulacija koja se isporučuje u bočicama za jednokratnu upotrebu od 2 ml USP/Ph. Eur. staklenim, tipa I, koje sadrže 10 mg (nominalno) Fc fuzionog proteina IL-22. Farmaceutska formulacija iz ovog pronalaska je formulisana kao 10 mg Fc fuzionog proteina IL-22 u 10 mM natrijum fosfatu, 5 mM metioninu, 240 mM saharozi, 0,02% (m/V) polisorbat 20, pH 7,1.
Studija stabilnosti farmaceutske kompozicije započeta je sa kliničkom serijom 1 Fc fuzionog proteina IL-22. Pored toga, reprezentativne studije stabilnosti farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 započete su referentnom standardnom serijom (Tabela 21). Stabilnost je praćena na temperaturi od 5°C do 25°C za obe serije.
Dugotrajno skladištenje je testirano na 5°C ± 3°C, a ubrzane studije stabilnosti izedene su na 25°C ± 2°C (60% relativne vlažnosti [RH] ± 5% RH). U nastavku su temperature označene kao 5°C, odnosno 25°C.
Procedure i kriterijumi prihvatljivosti
Svi uzorci su analizirani korišćenjem postupaka ispitivanja navedenih u Tabeli 21. Reprezentativna stabilnost procenjena je u određenim vremenskim intervalima koristeći
11
protokol naveden u Tabeli 22 i Tabeli 23.
Tabela 21: Procedure ispitivanja za procenu stabilnosti farmaceutske formulacije Fc fuzionog proteina IL-22
11
Tabela 22: Protokol stabilnosti za studije stabilnosti farmaceutske formulacije Fc fuzionog proteina IL-22 - uslov studije: 5°C
11
Tabela 23: Protokol stabilnosti za studije stabilnosti farmaceutske formulacije Fc fuzionog proteina IL-22 - uslov studije: 25°C
Rezultati
Rezultati proširenog ispitivanja stabilnosti Fc fuzionog proteina IL-22 iz kliničke serije 1 i referentne standardne serije, sprovedenog na -20°C i 5°C kako je gore opisano, prikazani su u Tabeli 24 i Tabeli 25.
Primarni podaci o stabilnosti farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22
11
pokazali su slične trendove onima uočenim u podržavajućoj studiji stabilnosti. Podaci o stabilnosti podržavaju rok upotrebe od 42 meseca (36 meseci podataka u realnom vremenu plus 6 meseci privremenog datiranja) na 5°C za farmaceutsku kompoziciju Fc fuzionog proteina IL-22.
Rezultati podržavajućih studija stabilnosti pokazali su smanjenje glavnog pika od 0,7 procenta putem SE-HPLC, primećeno nakon 36 meseci sa prvenstvenim povećanjem koncentracije dimera. Smanjenje od 5 procenata glavnog pika primećeno je putem iCIEF sa prvenstvenim povećanjem pikova kiseline. Drugim metodama nije uočena promena farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 do 36 meseci skladištenja na 5°C. Nije primećena promena farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 do mesec dana skladištenja na 25°C. Promene farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 primećene su nakon skladištenja na 25°C tokom šest meseci. Snimljeni cIEF pokazao je smanjenje glavnog pika od 17,6 procenata sa prvenstvenim povećanjem od 18,3 procenata kiselih pikova. Smanjenje od 1,3 primećeno je u procentima glavnog pika putem SE-HPLC sa prvenstvenim povećanjem od 1,2 procenta vrsta veće molekulske mase (HMVS). Smanjenje glavnog pika od 2,7 u procentima primećeno je putem neredukovanog CE-SDS sa prvenstvenim povećanjem od 2,1 procenat korigovane površine pika (% CPA) u zbiru prethodnih pikova. Gubitak relativne potentnosti od 29% primećen je nakon skladištenja na 25°C tokom 6 meseci, dok nije primećena promena potentnosti nakon skladištenja na 25°C tokom tri meseca. Nisu primećene promene kod preostalih testova na 25°C tokom šest meseci.
12
��
Uporedno ispitivanje stabilnosti pod stresom kliničke serije 3 i referentne standardne serije Fc fuzionog proteina IL-22
Uporedivost između farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 referentne standardne serije i kliničke farmaceutske kompozicije utvrđena je korišćenjem referentne standardne serije i kliničke serije 3 Fc fuzionog proteina IL-22 (Tabela 26). Materijal iz obe serije ručno je napunjen u staklene bočice od 2 ml do zapremine punjenja od 1 ml. Ovi materijali su zatim procenjivani pod uslovima stresa od 40°C.
12
�� Tabela 26: Uporedni podaci o stabilnosti pod stresom za referentnu standardnu seriju i kliničku seriju 3 farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 (nast.)
Skraćenice: CE-SDS-NGS = kapilarna elektroforeza natrijum dodecil sulfat prosejavanje bez gela; cIEF = kapilarno izoelektrično fokusiranje; CL = bistro; CPA = korigovana površina pika; HMW = velika molekulska masa; LIQ = tečnost; LMW = mala molekulska masa; NR = nije potrebno; PFFP = praktično bez čestica; SE-HPLC = tečna hromatografija visokih performansi na molekulskim sitima.
Rezultati
Rezultati ove studije pokazuju da su brzine degradacije dva materijala uporedive na osnovu smanjenja od 2 - 4 procenta glavnog pika, određenog pomoću tečne hromatografije visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC), smanjenja od 15 - 16 procenata glavnog pika određenog snimanjem kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (CIEF) i smanjenja od 2 procenta glavnog pika određenog pomoću kapilarne elektroforeze natrijum dodecil sulfat prosejavanje bez gela (CE-SDS-NGS) i smanjenja relativne potentnosti od 28 -33% nakon skladištenja na 40°C tokom dve nedelje. Pored toga, hromatografski profili su uporedivi, a u kliničkoj seriji nisu primećeni novi pikovi u poređenju sa razvojnom serijom nakon skladištenja na 40°C tokom dve nedelje. Referentna standardna i klinička farmaceutska serija kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 imaju uporedivu stabilnost na osnovu predstavljenih podataka. Zbog toga su podaci o stabilnosti iz referentne standardne serije
12
korišćeni za dodeljivanje roka trajanja kliničke farmaceutske kompozicije.
Rok trajanja i preporučeno skladištenje
Preporučeni uslov za skladištenje farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 je 5°C ± 3°C, zaštićeno od svetlosti. Rok trajanja će se produžiti na osnovu dostupnih podataka o stabilnosti. Farmaceutska kompozicija Fc fuzionog proteina IL-22 stabilna je tokom 36 meseci na 5°C ± 3°C. Na osnovu dostupnih podataka, početni rok trajanja farmaceutske kompozicije Fc fuzionog proteina IL-22 trenutno je postavljen na 42 meseca ako se čuva na 5°C ± 3°C, zaštićeno od svetlosti.
Rezultati validacije analitičkih procedura
Tabela 27 prikazuje rezultate validacije analitičkih procedura.
Tabela 27: Validacija analitičkih procedura
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
�
1
14
14
14
14
14
14
14
�
11
12
1
14
1
�
1
1
�
1
11
��
1
14
�
1
1
�
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
�
1
1
1
1
1
11
��
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
�
24
�
2
�
2
�

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži Fc fuzioni protein IL-22 i nosač, gde Fc fuzioni protein IL-22 sadrži polipeptid IL-22 povezan sa Fc regionom pomoću linkera, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži
oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22,
oko 5 mM metionin,
oko 10 mM natrijum fosfat i oko 240 mM saharozu,
i oko 0,02% (m/V) polisorbata 20, pH 7,1, u konačnoj koncentraciji.
2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu je natrijum fosfat smeša monobaznog natrijum fosfata i dvobaznog natrijum fosfata.
3. Farmaceutska kompozicija prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži oko 10 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22.
4. Farmaceutska kompozicija prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži oko 1 mg/ml Fc fuzionog proteina IL-22.
5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu:
(i) farmaceutska kompozicija je u jediničnom doznom obliku;
(ii) nosač je voda;
(iii) farmaceutska kompozicija je stabilna tokom jednog ili više ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja;
(iv) farmaceutska kompozicija je stabilna oko 2 nedelje ili duže na oko 25°C;
(v) farmaceutska kompozicija je stabilna oko 48 meseci ili duže na -20°C;
(vi) farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 85% ili više, što se procenjuje tečnom hromatografijom visokih performansi na molekulskim sitima (SE-HPLC);
(vii) farmaceutska kompozicija ima čistoću od oko 75% ili više, što se procenjuje neredukovanom (NR) kapilarnom elektroforezom prosejavanjem bez gela sa natrijum dodecil sulfatom (CE-SDS-NGS);
(viii) farmaceutska kompozicija je formulisana za intravensku, subkutanu, intraperitonealnu ili topikalnu primenu;
(ix) farmaceutska kompozicija ne sadrži konzervans; i/ili
(x) farmaceutska kompozicija je formulisana za primenu infuzijom nakon razblaživanja izotoničnim rastvorom natrijum hlorida i/ili razblaživačem.
6. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu:
(i) polipeptid IL-22 je glikozilovan;
(ii) Fc region nije glikozilovan;
(iii) aminokiselinski ostatak na poziciji 297 kao u EU indeksu Fc regiona je Gly ili Ala i/ili aminokiselinski ostatak na poziciji 299 kao u EU indeksu Fc regiona je Ala, Gly ili Val;
(iv) Fc region sastoji se od CH2 i CH3 domena IgG1 ili IgG4; i/ili
(v) Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8.
7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu Fc fuzioni protein IL-22 sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:16.
8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu, Fc fuzioni protein IL-22 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8.
9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 8, koja dalje sadrži dodatno terapeutsko sredstvo i/ili sredstvo za želiranje.
10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski, subkutano, intraperitonealno ili topikalno.
11. Farmaceutska kompozicija iz bilo kog od zahteva 1 do 10 koja se upotrebljava kao lek.
12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 10 koja se upotrebljava (i) za lečenje inflamatorne bolesti creva (IBC),
(ii) za inhibiranje mikrobne infekcije u crevima, očuvanje peharskih ćelija u crevima tokom mikrobne infekcije, povećanje integriteta epitelnih ćelija, proliferacije epitelnih ćelija, diferencijacije epitelnih ćelija, migracije epitelnih ćelija ili zarastanje epitelnih rana u crevima, (iii) za lečenje akutne povrede bubrega ili akutnog pankreatitisa,
(iv) za ubrzavanje ili poboljšavanje zarastanja rana, ili
(v) za sprečavanje ili lečenje kardiovaskularnog stanja.
13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu, IBC je ulcerozni kolitis ili Kronova bolest.
14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu, ulcerozni kolitis je umereni do teški ulcerozni kolitis.
RS20221131A 2018-01-26 2019-01-25 Il-22 fc kompozicije i postupci primene RS63812B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862622704P 2018-01-26 2018-01-26
US201862697372P 2018-07-12 2018-07-12
EP19704966.1A EP3743088B1 (en) 2018-01-26 2019-01-25 Il-22 fc compositions and methods of use
PCT/US2019/015268 WO2019148020A1 (en) 2018-01-26 2019-01-25 Compositions and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63812B1 true RS63812B1 (sr) 2023-01-31

Family

ID=65409540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221131A RS63812B1 (sr) 2018-01-26 2019-01-25 Il-22 fc kompozicije i postupci primene

Country Status (21)

Country Link
US (2) US12171805B2 (sr)
EP (1) EP3743088B1 (sr)
JP (1) JP7345479B2 (sr)
KR (1) KR20200125590A (sr)
CN (1) CN112020365A (sr)
AU (1) AU2019212703A1 (sr)
BR (1) BR112020015016A2 (sr)
CA (1) CA3088763A1 (sr)
DK (1) DK3743088T3 (sr)
ES (1) ES2932861T3 (sr)
HR (1) HRP20221448T1 (sr)
HU (1) HUE060435T2 (sr)
IL (1) IL276135A (sr)
LT (1) LT3743088T (sr)
MX (1) MX2020007628A (sr)
PL (1) PL3743088T3 (sr)
PT (1) PT3743088T (sr)
RS (1) RS63812B1 (sr)
SI (1) SI3743088T1 (sr)
TW (1) TWI835773B (sr)
WO (1) WO2019148020A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
WO2017181143A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Generon (Shanghai) Corporation, Ltd. Use of il-22 in treating necrotizing enterocolitis
WO2020074957A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Sanotize Research And Development Corp. Gas-evolving compositions and container and delivery systems
CA3143633A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Matthew Kalo Dosing for prevention or treatment of graft versus host disease (gvhd) with il-22 fc fusion proteins
EP4106794A4 (en) * 2020-02-19 2024-03-20 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd METHOD FOR TREATING TRANSPLANT AND HOST DISEASE
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
EP4674865A3 (en) * 2021-03-09 2026-03-25 GI Innovation, Inc. Formulation of fusion protein including extracellular domain of alpha subunit of ige fc receptor
US11723955B1 (en) * 2022-05-13 2023-08-15 Allgenesis Biotherapeutics Inc. VEGFR fusion protein pharmaceutical composition
EP4792826A1 (en) * 2023-10-12 2026-08-19 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Ngf-fc fusion protein formulation and use thereof

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4717717A (en) 1986-11-05 1988-01-05 Ethicon, Inc. Stabilized compositions containing epidermal growth factor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
US5705485A (en) 1987-09-18 1998-01-06 Ethicon, Inc. Gel formulations containing growth factors
US5457093A (en) 1987-09-18 1995-10-10 Ethicon, Inc. Gel formulations containing growth factors
NZ226171A (en) 1987-09-18 1990-06-26 Ethicon Inc Gel formulation containing polypeptide growth factor
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
JPH04501201A (ja) 1987-12-21 1992-03-05 ジ・アップジョン・カンパニー 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5130298A (en) 1989-05-16 1992-07-14 Ethicon, Inc. Stabilized compositions containing epidermal growth factor
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
EP1107791B8 (en) 1998-09-04 2007-11-07 Scios Inc. Hydrogel compositions for the controlled release administration of growth factors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
BR0012429A (pt) * 1999-07-15 2002-09-17 Genetics Inst Fórmulações para il-11
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US20060287234A1 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Genentech, Inc. Wound healing
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
US20110152188A1 (en) 2009-12-23 2011-06-23 Hanns-Christian Mahler Pharmaceutical compositions of igf/i proteins
US20130121959A1 (en) * 2010-01-13 2013-05-16 Joseph R. Maxwell Il-22-fc and hepcidin activity
WO2011133886A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
AR084210A1 (es) * 2010-12-08 2013-05-02 Abbott Lab PROTEINAS DE UNION AL TNF-a
AR094821A1 (es) 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
UY35460A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Bayer Healthcare Llc Formulaciones de anticuerpos anti-receptor de prolactina
PL2970422T3 (pl) * 2013-03-15 2018-09-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Polipeptydy IL-22 i białka fuzyjne IL-22 Fc i sposoby zastosowania
AR105616A1 (es) * 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
KR102386735B1 (ko) * 2015-11-06 2022-04-14 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형
US10646569B2 (en) * 2017-05-16 2020-05-12 Bhami's Research Laboratory, Pvt. Ltd. High concentration protein formulations with reduced viscosity

Also Published As

Publication number Publication date
TW201938794A (zh) 2019-10-01
US20250213655A1 (en) 2025-07-03
SI3743088T1 (sl) 2023-01-31
JP2021511362A (ja) 2021-05-06
EP3743088A1 (en) 2020-12-02
HUE060435T2 (hu) 2023-03-28
ES2932861T3 (es) 2023-01-27
KR20200125590A (ko) 2020-11-04
EP3743088B1 (en) 2022-10-12
AU2019212703A1 (en) 2020-08-13
JP7345479B2 (ja) 2023-09-15
PL3743088T3 (pl) 2023-03-20
TWI835773B (zh) 2024-03-21
DK3743088T3 (da) 2022-12-19
CA3088763A1 (en) 2019-08-01
CN112020365A (zh) 2020-12-01
US12171805B2 (en) 2024-12-24
BR112020015016A2 (pt) 2020-12-29
PT3743088T (pt) 2022-12-05
MX2020007628A (es) 2020-10-12
LT3743088T (lt) 2022-12-27
HRP20221448T1 (hr) 2023-01-20
US20200353049A1 (en) 2020-11-12
IL276135A (en) 2020-09-30
WO2019148020A1 (en) 2019-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230063741A1 (en) IL-22 POLYPEPTIDES AND IL-22 Fc FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
US20250213655A1 (en) Compositions and methods of use
BR112020013420A2 (pt) composições, métodos para tratar doença, para inibir infecção, para tratar lesão, para acelerar ou aprimorar cura, para prevenir ou tratar uma afecção, para tratar síndrome, para tratar endotoxemia, para produzir uma composição, para selecionar um lote, para controlar o teor de ácido e uso
CN111757751A (zh) 用于使用IL-22 Fc融合蛋白的治疗的剂量方案
HK40041614A (en) Compositions and methods of use
TW202118793A (zh) 以 IL-22 Fc 融合蛋白預防或治療移植物抗宿主疾病 (GVHD) 之投藥
HK1261725A1 (en) Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use
NZ751498B2 (en) Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use