RS63897B1 - Antitela protiv ox40 i njihova primena - Google Patents

Description

Napomena na prvoj strani evropskog patenta sa bibliografskim podacima

Kompletan dokument koji uključuje referentnu tabelu(e) i listu(e) sekvenci, može se preuzeti sa veb stranice EPO-a.

Opis

LISTA SEKVENCI

[0001] Tekuća prijava sadrži listu sekvenci koja je podneta elektronski u ASCII formatu i ovim je uključena kao referenca u celosti. Navedena ASCII kopija, kreirana 26 maja 2016, je nazvana MXI_543PC_Sekvenca_Listing.txt i veličine je 417,528 bajtova.

STANJE TEHNIKE

[0002] OX40 (TNFRSF4), takođe poznat kao ACT35, IMD16, TXGP1L, i CD134, je transmembranski glikoprotein tipa I od 50-kD u TNFSFR familiji kostimulatornih receptora eksprimiranih na aktiviranim CD4+ T ćelijama. U kontekstu kancera, aktivirane T ćelije koje eksprimiraju OX40 nalaze se u limfocitima koji infiltriraju tumor. OX40 i njegov ligand, OX40-L, igraju ključnu ulogu u indukovanju i održavanju T-ćelijskih odgovora. Nedavne studije su pokazale korisnost poboljšanja funkcija antitumorskih T ćelija u borbi protiv kancera, sa ključnim komponentama efikasnog odgovora uključujući aktivaciju CD4+ T ćelija i promovisanje signala preživljavanja kroz memorijske i efektorske T ćelije. S obzirom na stalnu potrebu za poboljšanim strategijama za lečenje bolesti kao što je kancer kroz, npr., jačanje imunološkog odgovora kao što su odgovori T ćelija, novi agensi koji moduliraju odgovore T ćelija, kao što su oni koji ciljaju OX40, kao i terapije (npr., kombinovane terapije) koje primenjuju takve agense, bile bi terapijski korisne.

[0003] WO200907935 opisuje izolovane vezujuće molekule koji se vezuju za ljudski OX40, molekule nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu vezujućih molekula, vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline, ćelije domaćina koje sadrže vektore, postupke za dobijanje, farmaceutske kompozicije koje sadrže vezujuće molekule, i postupke za primenu vezujućih molekula ili kompozicija.

REZIME

[0004] Ovde su previđena antitela, kao što su humana monoklonska antitela, koja specifično vezuju OX40 i imaju poželjna funkcionalna svojstva. Ova svojstva uključuju visok afinitet vezivanja za humano OX40 i cinomolgus OX40 i sposobnost da stimulišu antigen-specifične T ćelijske odgovore, npr., kod subjekata koji imaju tumor. Ovde su takođe predviđeni postupci detekcije OX40 u uzorku.

[0005] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovana monoklonska antitela koja se vezuju za OX40, kako je definisano u patentnim zahtevima. U drugim aspektima, pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline kao što su definisane u zahtevima i ekspresione vektore koji sadrže ove nukleinske kiseline. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje ćelije kao što je definisano u patentnim zahtevima. Pronalazak takođe obezbeđuje, u drugom aspektu, farmaceutske kompozicije kao što je definisano u patentnim zahtevima. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitela i farmaceutske kompozicije za primenu u postupcima lečenja kancera, kao što je definisano u patentnim zahtevima.

[0006] Antitela se specifično vezuju za OX40 i pokazuju najmanje jedno od sledećih svojstava:

(1) vezivanje za rastvorljiv humani OX40, npr., sa KDod 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po Biacore;

(2) vezivanje za humani OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 1 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 1 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(3) vezivanje za cinomolgus OX40, npr., vezivanje cinomolgus OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(4) izazivanje ili pojačanje aktivnosti T ćelija, kao što dokazuje (i) povećana proizvodnja IL-2 i/ili IFN-γ u OX40-eksprimirajućim T ćelijama i/ili (ii) poboljšana proliferacija T ćelija;

(5) inhibiranje vezivanja OX40 liganda za OX40, npr., sa EC50od 1 nM ili manje kako je mereno sa FACS, npr., u eseju sa hOX40-293 ćelijama;

(6) vezivanje za epitop na ekstracelularnom delu zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO – SEK ID BR), npr., epitop sa regionom DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) ili DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) nadmetanje za vezivanje za human iOX40 sa 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11, 20B3, i 20C1;

(8) nadmetanje za vezivanje za humani OX40 sa 6E1-1, 6E1-2, 14A2-1, i 14A2-2.

[0007] Anti-OX40 antitela stimulišu anti-tumorski imunološki odgovor, na primer, antigenspecifičan T ćelijski odgovor. U određenim tehničkim rešenjima, antitela povećavaju proizvodnju citokina (npr., IL-2 i/ili IFN- γ) u T ćelijama koje eksprimiraju OX40 i/ili povećavaju proliferaciju T ćelija. U određenim tehničkim rešenjima, antitela se vezuju za C1q komponentu humanog komplementa. U određenim tehničkim rešenjima, antitela indukuju lizu posredovanu NK ćelijama aktiviranih CD4+ T ćelija. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo promoviše fagocitozu posredovanu makrofagom ćelija koje eksprimiraju OX40. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo inhibira regulatornu supresiju posredovanu T ćelijama proliferacije CD4+ T ćelija.

[0008] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela se vezuju za Fc receptore, kao što je jedan ili više aktivirajućih FcγRs. U određenim tehničkim rešenjima, antitela indukuju ili poboljšavaju aktivaciju T ćelija putem multivalentnog unakrsnog povezivanja.

[0009] Izolovana monoklonska antitela specifično se vezuju za OX40 i sadrže tri CDR varijabilnog teškog lanca i tri CDR varijabilnog lakog lanca koja su u paru varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca SEQ ID Nos (SEK ID sa brojevima): 318 i 94.

[0010] Monoklonska antitela za koja se zahteva zaštita se vezuju za OX40 i sadrže: sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 87, 317, i 89, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 90-92, redom. Aspekti objave za koje se ne zahteva zaštita takože uključuju antitela koja sadrže;

(a) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 11-13, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lancakoje sadrže SEQ ID NOs: 14-16, redom;

(b) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 19-21, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 22-24, redom;

(c) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 19-21, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 25-27, redom;

(d) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 31-33, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 34-36, redom;

(e) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 39-41, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 42-44, redom;

(f) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 39-41, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 45-47, redom;

(g) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 51-53, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 54-56, redom;

(h) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 59-61, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 62-64, redom;

(i) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 67-69, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 70-72, redom; (j) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 75-77, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 78-80, redom; (k) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 75-77, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 81-83, redom; ili

(l) sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 87-89, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 90-92, redom.

[0011] Ovde su predviđena monoklonska antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili njihovi antigen vezujući delovi, koji se vezuju za OX40 i sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 17, 28, 37, 48, 57, 65, 73, 84, i 93.

[0012] Ovde su predviđena izolovana monoklonska antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili njihovi antigen vezujući delovi, koji se vezuju za OX40 i sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvence koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18, 29, 30, 38, 49, 50, 58, 66, 74, 85, 86, i 94.

[0013] Ovde su predviđena izolovana monoklonska antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili njihovi antigen vezujući delovi, koji se vezuju za OX40 i sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje su najmanje 85% identične, na primer, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identične, aminokiselinskim sekvencama odabranim iz grupe koja se sastoji od: 17 i 18; 28 i 29; 28 i 30; 37 i 38; 48 i 49; 48 i 50; 57 i 58; 65 i 66; 73 i 74; 84 i 85; 84 i 86; 93 i 94.

[0014] U nekim tehničkim rešenjima, izolovana monoklonska antitela za koja se traži zaštita se vezuju za OX40 i sadrže sekvence teškog lanca i lakog lanca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, ili 100% identične aminokiselinskim sekvencama odabranim iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NOs: 124 i 116.

[0015] U određenim tehničkim rešenjima, izolovana monoklonska antitela za koja se zahteva zaštita (a) se vezuju za isti epitop na OX40 kao 20C1, i (b) inhibiraju vezivanje 20C1 za OX40 na aktiviranim T ćelijama za najmanje 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% kako je mereno, npr., FACS.

[0016] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela se vezuju unutar regiona DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) ili DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179) zrelog ekstracelularnog dela humanog OX40 (SEQ ID NO: 2). U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela, opisana ovde, se vezuju i za humani i cinomolgus OX40. U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela, opisana ovde, se ne vezuju za mišji i/ili OX40 pacova.

[0017] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela su IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela, ili njihove varijante. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela su humana ili humanizovana antitela. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela sadrže Fc koji ima poboljšano vezivanje za aktivirani FcγR.

[0018] Ovde su predviđena izolovana monoklonska antitela koja se vezuju za OX40 koji sadrži modifikovan konstantan region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob i najmanje jedan od CHI, CH2 i CH3 koji nije IgG2 izotipa.

[0019] U određenim tehničkim rešenjima, teški lanac anti-OX40 antitela za koje se zahteva zaštita sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 124 ili teški lanac koji se od njega razlikuje u najviše 10 aminokiselina ili je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 124.

[0020] U određenim tehničkim rešenjima, laki lanac anti-OX40 antitela za koje se zahteva zaštita sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 116, ili laki lanac koji se od njega razlikuje u najviše 10 aminokiselina ili je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 116.

[0021] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela nisu imunogena.

[0022] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelu nedostaje aminokiselinska sekvenca koja podleže izomerizaciji. Na primer, ako je aminokiselinska sekvenca Asp-Gly prisutna u sekvenci CDR teškog i/ili lakog lanca antitela, sekvenca je zamenjena sa aminokiselinskom sekvencom koja ne podleže izomerizaciji. Antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona CDR2 teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 88, ali u kojoj Gly u Asp-Gly sekvenci (AIDTDGGTFYADSVRG; SEQ ID NO: 88) je zamenjen sa aminokiselinskom sekvencom koja ne podleže izomerizaciji, tj. Asp-Ala.

[0023] U nekim tehničkim rešenjima, antitela za koja se zahteva zaštita sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 294-296. Aspekti za koje se ne zahteva zaštita objave predviđeni ovde su antitela koja se vezuju za OX40 koji sadrži aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 282-293. Takva antitela sadrže teški lanac koja se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 282-293.

[0024] Ovde su predviđeni bispecifični molekuli koji sadrže anti-OX40 antitelo povezano sa molekulom koji ima drugu specifičnost vezivanja.

[0025] Ovde su predviđene nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca od anti-OX40 antitela, ekspresioni vektori koji sadrže molekule nukleinskih kiselina, i ćelije koje su transformisane sa ekspresionim vektorima.

[0026] Ovde su predviđeni imunokonjugati koji sadrže anti-OX40 antitela opisana ovde, povezana sa agensom.

[0027] Ovde su predviđene kompozicije koje sadrže anti-OX40 antitela i nosač.

[0028] Ovde su predviđeni kompleti koji sadrže anti-OX40 antitela, i instrukcije za primenu. U određenim slučajevima, kompleti dalje sadrže anti-CTLA4 antitelo, anti-PD-1, ili anti-PD-Ll antitelo.

[0029] Ovde je predviđen postupak pripremanja anti-OX40 antitela, koji obuhvata eksprimiranje anti-OX40 antitela u ćeliji i izolovanje antitela iz ćelije.

[0030] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku stimulisanja antigenspecifičnog odgovora T ćelija koji obuhvata dovođenje u kontakt T ćelije sa anti-OX40 antitelom tako da se stimuliše antigen-specifičan odgovor T ćelija.

[0031] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku aktiviranja ili kostimulisanja T ćelije, npr., efektorske T ćelije, koji obuhvata dovođenje u kontakt želije, npr., efektorkse T ćelije, sa anti-OX40 antitelom, i CD3, pri čemu se efektorska T ćelija aktivira ili kostimuliše.

[0032] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku povećanja proizvodnje IL-2 i/ili IFN-γ u i/ili proliferacije T ćelije koji obuhvata dovođenje u kontakt T ćelije sa efikasnom količinom anti-OX40 antitela.

[0033] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku povećanja proizvodnje IL-2 i/ili IFN-γ u T ćeliji kod subjekta koji obuhvata administriranje efikasne količine anti-OX40 antitela, bispecifičnog molekula ili konjugata koji sadrže anti-OX40 antitelo, ili kompozicije koja sadrži anti-OX40 antitelo da se poveća proizvodnja IL-2 i/ili IFN-γ iz T ćelije.

[0034] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku smanjenja ili iscrpljivanje broja T regulatornih ćelija u tumoru kod subjekta kome je to potrebno koji obuhvata administriranje efikasne količine anti-OX40 antitela, bispecifičnog molekula ili konjugata pri čemu antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, ima efektorsku ili poboljšanu efektorsku funkciji, da smanji broj T regulatornih ćelija u tumoru.

[0035] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku stimulisanja imunološkog odgovora kod subjekta koji obuhvata administriranje efikasne količine anti-OX40 antitela, bispecifičnog molekula ili konjugata subjektu tako da se imunološki odgovor kod subjekta stimuliše. U određenim tehničkim rešenjima, subjekt ima tumor a imunološki odgovor protiv tumora se stimuliše.

[0036] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo za primenu u postupku inhibiranja rasta ćelija tumora kod subjekta koji obuhvata administriranje subjektu anti-OX40 antitela, bispecifičnog molekula ili konjugata tako da se inhibira rast tumora kod subjekta.

[0037] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo ili farmaceutska kompozicija za primenu u postupku lečenja kancera, npr., imunoterapijom, koji obuhvata administriranje subjektu kome je to potrebno terapijski efikasne količine anti-OX40 antitela, bispecifičnog molekula ili konjugata koji sadrži anti-OX40 antitelo, ili kompozicije koja sadrže anti-OX40 antitelo, da se leči kancer. U određenim tehničkim rešenjima, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od: kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer materice/grlića materice, kancer jajnika, kancer prostate, kancer testisa, kancer jednjaka, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer kolona, kancer bubrega, kancer glave i vrata, kancer pluća, kancer želuca, kancer germinativnih ćelija, kancer kostiju, kancer jetre, kancer štitne žlezde, kancer kože, neoplazma centralnog nervnog sistema, limfom, leukemija, mijelom, sarkom, i kancer povezan sa virusom. U određenim tehničkim rešenjima, kancer je metastatski kancer, refraktorni kancer, ili rekurentni kancer.

[0038] U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisani postupci dalje obuhvataju administriranje jednog ili više dodatnih terapeutika sa anti-OX40 antitelom, na primer, anti-PDl antitelom, LAG-3 antitelom, CTLA-4 antitelom, i/ili PD-L1 antitelom.

[0039] Ovde je predviđen za detektovanje prisustva OX40 u uzorku za koji se ne zahteva zaštita koji oduhvata dovođenje u kontakt uzorka sa anti-OX40 antitelom, ili njegovim antigen vezujućim delom, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog antigen vezujućeg dela, i OX40, i detektovanje formiranja kompleksa.

[0040] Ovde su predviđena anti-OX40 antitela opisana ovde za primenu u za lečenje kancera, stimulisanje imunološkog odgovora kod subjekta, stimulisanje antigen-specifičnog odgovora T ćelija, aktiviranje ili ko-stimulisanje T ćelije, povećanje proizvodnje citokina, kao što je IL-2 i/ili [0041] IFN-γ, u i/ili proliferaciju T ćelije, smanjenje ili iscrpljivanje broja T regulatornih ćelija u tumoru, i/ili inhibiranje rasta ćelija tumora. Takođe ovde su predviđena anti-OX40 antitela opisana ovde za primenu u pripremanju medikamenta za stimulisanje imunološkog odgovora kod subjekta, stimulisanje antigen-specifičanog odgovora T ćelija, aktiviranje ili ko-stimulisanje T ćelije, povećanje IL-2 i/ili IFN-γ proizvodnje u i/ili proliferaciju T ćelije, smanjenje ili iscrplivanje broja T regulatornih ćelija na tumoru, i/ili inhibiranje rasta ćelija tumora.

[0042] Ovde je predviđeno anti-OX40 antitelo ili farmaceutska kompozicija za primenu u postupku lečenja solidnih tumora kod humanog subjekta, postupak koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine anti-OX40 antitela koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 318, i CDR1, CDR2 i CDR3 dofmeni varijabilnog regiona lakog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 94, pri čemu postupak obuhvata najmanje jedan ciklus administriranja, pri čemu je ciklus period od dve nedelje, pri čemu za svaki od najmanje jednog ciklusa, jedna doza anti-OX40 antitela se administrira pri dozi od 1 mg/kg telesne težine; fiksnoj dozi od 20, 40, 80, 160, ili 320 mg; dozi od oko 1 mg/kg telesne težine; ili fiksnoj dozi od oko 20, 40, 80, 160, ili 320 mg.

[0043] U jednom tehničkom rešenju, postupak dalje obuhvata administriranje anti-PD-1 antitela koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 301, i CDR1, CDR2 iCDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 302, pri čemu postupak obuhvata najmanje jedan ciklus administriranja, pri čemu je ciklus period od dve, tri, ili četiri nedelje, pri čemu za svaki od najmanje jednog ciklusa, administrira jedna doza anti-OX40 antitela pri dozi od 1 mg/kg telesne težine; fiksna doza od 20, 40, 80, 160, ili 320 mg; doza od oko 1 mg/kg tekesne težine; ili fiksna doza od oko 20, 40, 80, 160, ili 320 mg, i jedna doza anti-PD-1 antitela se administrira pri dozi od 240, 360, ili 480 mg ili dozi od oko 240, 360, ili 480 mg.

[0044] U drugom tehničkom rešenju, postupak dalje obuhvata administriranje anti-CTLA-4 antitela koje sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 309, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 310, pri čemu postupak obuhvata najmanje jedan ciklus administriranja, pri čemu je ciklus period od tri nedelje, pri čemu za svaki od najmanje jednog ciklusa, jedna doza anti-OX40 antitela se administrira pri dozi od 1 mg/kg telesne težine; fiksnoj dozi od 20, 40, 80, 160, ili 320 mg; dozi od oko 1 mg/kg telesne težine; ili fiksnoj dozi od oko 20, 40, 80, 160, ili 320 mg, i jedna doza anti-CTLA-4 antitela se administrira pri dozi od 1 mg/kg ili dozi od oko 1 mg/kg, pri čemu se anti-OX40 antitela administrira zajedno sa anti-CTLA-4 antitelom tokom najmanje jednog ciklusa, zatim sledi monoterapija sa anti-OX40 antitelom tokom najmanje jednog ciklusa. U nekim tehničkim rešenjima, lečenje sa sastoji od 8 ciklusa. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira zajedno sa anti-CTLA-4 antitelom tokom prva 4 ciklusa, zatim sledi monoterapija sa anti-OX40 antitelom tokom poslednja 4 ciklusa.

[0045] U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži sekvence teškom i lakog lanca navedene u SEQ ID NOs: 124 i 116, redom.

[0046] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo, ili anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo, se formulišu za intravensko administriranje. U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se formulišu zajedno. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se formulišu odvojeno.

[0047] U nekim tehničkim rešenjima, lečenje se sastoji od 8 ciklusa. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo, ili anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo, se administriraju 1. dana svakog ciklusa.

[0048] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira pre administriranja anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira tokom oko 30 minuta pre administriranje anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira nakon administriranja anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela. U opet drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira istovremeno sa anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom.

[0049] U određenim tehničkim rešenjima, lečenje proizvodi najmanje jedan terapijski efekat odabran od smanjenja veličine tumora, smanjenje broja metastatskih lezija tokom vremena, potpunog odgovora, delimičnog odgovora, i stabilne bolesti. U nekim tehničkim rešenjima, tumor je povezan sa kancerom odabranim iz grupe koju čine: kancer grlića materice, kancer mokraćne bešike, kolorektalni rkancer, i kancer jajnika.

[0050] Ostale karakteristike i prednosti trenutne objave biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i primera, koje ne treba tumačiti kao ograničavajuće.

KRATAK OPIS SLIKA

[0051] Antitela pronalaska za koja se traži zaštita su označena sa "OX40.21" u opisu slika koji sledi. Antitela različita od onih za koja se traži zaštita su stavljena na uvid javnosti u nastavku za referentne svrhe i za potpuno razumevanje pronalaska.

Slika 1A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 126) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 17) varijabilnog regiona teškog lanca od 3F4 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 12) i CDR3 (SEQ ID NO: 13) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 1B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 127) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 18) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 3F4 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 15) i CDR3 (SEQ ID NO: 16) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 2A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 128) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 28) varijabilnog regiona teškog lanca od 14B6 (14B6-1 i 14B6-2) humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 20) i CDR3 (SEQ ID NO: 21) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 2B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 129) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 29) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 14B6-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 23) i CDR3 (SEQ ID NO: 24) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 2C prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 130) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 30) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 14B6-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 27) i CDR3 (SEQ ID NO: 28) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 3A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 131) i aminokiselinsku sekvencu(SEQ ID NO: 37) varijabilnog regiona lakog lanca od 23H3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 31), CDR2 (SEQ ID NO: 32) i CDR3 (SEQ ID NO: 33) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 3B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 132) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 38) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 23H3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 34), CDR2 (SEQ ID NO: 35) i CDR3 (SEQ ID NO: 36) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 4A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 133) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 48) varijabilnog regiona lakog lanca od 6E1 (6E1-1 i 6E1-2) humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 39), CDR2 (SEQ ID NO: 40) i CDR3 (SEQ ID NO: 41) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije Slika 4B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 134) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 49) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 6E1-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 42), CDR2 (SEQ ID NO: 43) i CDR3 (SEQ ID NO: 44) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 4C prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 135) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 50) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 6E1-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 46) i CDR3 (SEQ ID NO: 47) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 5A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 136) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 57) varijabilnog regiona lakog lanca od 18E9 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 52) i CDR3 (SEQ ID NO: 53) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 5B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 137) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 58) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 18E9 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 55) i CDR3 (SEQ ID NO: 56) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 6A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 138) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 65) varijabilnog regiona lakog lanca od 8B11 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 59), CDR2 (SEQ ID NO: 60) i CDR3 (SEQ ID NO: 61) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 6B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 139) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 66) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 8B11 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 62), CDR2 (SEQ ID NO: 63) i CDR3 (SEQ ID NO: 64) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 7A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 140) i aminokiselinsku sekvencu(SEQ ID NO: 73) varijabilnog regiona lakog lanca od 20B3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 67), CDR2 (SEQ ID NO: 68) i CDR3 (SEQ ID NO: 69) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 7B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 141) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 74) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 20B3 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 70), CDR2 (SEQ ID NO: 71) i CDR3 (SEQ ID NO: 72) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 8A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 142) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 84) varijabilnog regiona lakog lanca od 14A2 (14A2-1 i 14A2-2) humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 75), CDR2 (SEQ ID NO: 76) i CDR3 (SEQ ID NO: 77) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije Slika 8B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 143) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 85) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 14A2-1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 78), CDR2 (SEQ ID NO: 79) i CDR3 (SEQ ID NO: 80) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 8C prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 144) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 86) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 14A2-2 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 81), CDR2 (SEQ ID NO: 82) i CDR3 (SEQ ID NO: 83) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 9A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 145) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 93) varijabilnog regiona lakog lanca od 20C1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 87), CDR2 (SEQ ID NO: 88) i CDR3 (SEQ ID NO: 89) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V, D i J germinativne linije.

Slika 9B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 146) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 94) varijabilnog regiona kapa lakog lanca od 20C1 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) i CDR3 (SEQ ID NO: 92) regioni su ocrtani i prikazane su derivacije V i J germinativne linije.

Slika 10A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 176) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 124) teškog lanca od OX40.21 humanog monoklonskog antitela. Nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 168) i aminokiselinska sekvenca (SEQ ID NO: 116) lakog lanca je prikazana na slici 10B.

Slike 11A-11D prikazuju krive vezivanja i EC50s (in nM) raznih anti-OX40 antitela za aktivirane humane T ćelije, sa hIgG1 i sekundarnih antitela koje služe kao kontrola, kako je procenjeno sa FACS.

Slikas 12A-12C prikazuju krive vezivanja i EC50s (in nM) raznih anti-OX40 antitela za aktivirane cinomolgus T ćelije, sa hIgG1 i sekundarnih antitela koje služe kao kontrola, kako je procenjeno sa FACS.

Slikas 13A-13C prikazuju krive vezivanja i KDs od anti-OX40 antitela, OX40.21, za aktivirane humane T ćelije, HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humano OX40, i CHO ćelije koje prekomerno eksprimiraju OX40 cinomolgus majmuna, kako je procenjeno sa Scatchard analizom.

Slikas 14A prikazuje imunohistološko bojenje različitih delova zamrznutog ljudskog tkiva fiksiranih acetonom sa anti-OX40 antitelima OX40.8, OX40.6 i OX40.16. Slike prikazuju reprezentativno bojenje pri koncentraciji antitela od 1 µg/ml za hiperplazične krajnike i 5 µg/ml za druga tkiva, sa izuzetkom OX40.16 pri 10 µg/ml u endokardu i zaliscima. Dok su sva tri antitela pozitivno obojila mali podskup limfocita u krajnicima, OX40.8 je takođe obojio strukture nalik miofilamentima u srcu a OX40.6 je obojio srčane mišiće, matriks endotela/subendotela u malim arterijama krajnika, i endokard i zaliske u srcu. GC, germinalni centar (germinal center); MZ, zona plašta (mantle zone).

Slika 14B prikazuje prikazuje imunobojenje različitih delova zamrznutog ljudskog tkiva fiksiranih acetonom sa anti-OX40 antitelom OX40.21 (varijanta OX40.16). Slike prikazuju reprezentativno bojenje pri koncentraciji antitela od 5 µg/ml. Antitelo je pozitivno obojilo mali podskup limfocita u krajnicima i timusu. Pozitivne ćelije u krajniku bile su raspoređene u germinalnom centru, zoni plašta, i interfolikularnom regionu, dok su pozitivne ćelije u timusu bile primarno lokalizovane u meduli. Nije primećeno specifično bojenje u srcu, jetri, bubrezima i plućima. GC, germinalni centar; Me, medula; MZ, zona plašta.

Slika 15A prikazuje raspodelu OX40+ limfocita koji infiltriraju tumor u hepatocelularnom karcinomu (HCC - hepatocellular carcinoma), kolorektalnom karcinomu (CRC - colorectal carcinom ), karcinomu skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC - head and neck squamous cell carcinoma) i melanomu (Mel - melanoma). Ručni rezultat od 12 do 20 slučajeva za svaki tip tumora izveden je procenom broja pozitivnih ćelija pod 20x objektivom mikroskopa. Minimum, <1 ćelija po polju 20x objektiva; Blago, 1~<10 ćelija po polju 20x objektiva; Umereno, 10~<50 ćelija po polju 20x objektiva; Označeno, 50~<200 ćelija po 20x objektivu; Intenzivno, >200 ćelija po polju 20x objektiva.

Slike 15B i 15C prikazuju imunohistološko bojenje za CD3, FoxP3, i OX40 na susednim FFPE delovima iz uzoraka kolorektalnog karcinoma (CRC) i karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC). Slika 15B je prikaz pri malom uvećanju, koji pokazuje da su i OX40+ i FoxP3+ TIL-ovi mala frakcija od CD3+ TIL-a i primarno raspoređeni u stromi tumora. Slika 15C je prikaz po velikom uvećanju koji pokazuje potencijalnu delimičnu kolokalizaciju OX40+ i FoxP3+ (Treg) TIL-ova u CRC.

Slika 16 prikazuje sposobnost raznih anti-OX40 antitela da inhibiraju vezivanje OX40 liganda (OX40-L) za humane OX40-transfektovane 293 ćelije ("hOX40-293 ćelije"), sa hIgG1 kao kontrolom.

Slika 17 sumira odnose blokiranja OX40-L između različitih anti-OX40 antitela.

Slika 18 prikazuje sposobnost raznih anti-OX40 antitela da inhibiraju vezivanje klona L106 anti-OX40 antitela za hOX40-293 ćelije, kako je procenjeno sa FACS, sa samo PE-obeleženim L106, PE-obeleženim mIgG1, i neobojenim ćelijama kao kontrolama.

Slike 19A-19C prikazuje sposobnost raznih anti-OX40 antitela da inhibiraju vezivanje OX40.1 antitela konjugovanog sa alofikocijaninom (APC) za hOX40-293 (slike 19A i 19B) ili hOX40-HT1080 ćelije (Slika 19C), kako je procenjeno sa FACS. hIgG1 i/ili hIgG4 su korišćeni kao kontrole.

Slike 19D-19G prikazuje sposobnost raznih anti-OX40 antitela da inhibiraju vezivanje OX40.4 ili OX40.5 antitela konjugovanih sa biotinom za hOX40-293 ćelije. hIgG1 i streptavidin-APC su korišćeni kao kontrole.

Slika 19H sumira grupe epitopa (bins) u odnosu na OX40.1 na osnovu rezultata prikazanih na slikama 19A-19C.

Slika 191 sumira grupe epitopa u odnosu na OX40.5 ili OX40.4 na osnovu rezultata prikazanih na slikama 19D-19G.

Slika 20A prikazuje da OX40.21 vezuje samo neredukovani humani OX40, bez obzira na prisustvo šećera vezanih za N.

Slike 20B i 20C prikazuju dva N-glikopeptida koja su identifikovana peptidnim mapiranjem nakon deglikozilacije: 60% zauzetosti za AspN118 (slika 20B) i AspN12 (slika 20C).

Slika 20D prikazuje regione u OX40 vezane pomoću OX40.16, OX40.21, i OX40.8.

Slika 20E prikazuje identifikaciju peptida koji su prepoznati od OX40.16, OX40.21, i OX40.8 pomoću LC-MS.

Slike 21A-21D prikazuju efekte raznih anti-OX40 antitela na proliferaciju humanih primarnih CD4+ T ćelija kada su kultivisane zajedno sa CHO-CD3-CD32A ćelijama. Samo CHO ćelije, samo T ćelije, samo CHO ćelije kultivisane zajedno sa T ćelijama, i hIgG1 su korišćeni kao kontrole.

Slikas 22A-22D prikazuju efekte raznih anti-OX40 antitela na sekreciju interferona gama (IFN-y) iz humanih primarnih CD4+ T ćelija kultivisanih zajedno sa CHO-CD3-CD32A ćelijama. Samo CHO ćelije, samo T ćelije, samo CHO ćelije kultivisane zajedno sa T ćelijama, i hIgG1 su korišćeni kao kontrole.

Slike 23A-23F prikazuju efekte raznih anti-OX40 antitela na stimulaciju IL-2 sekrecije iz primarnih T ćelija u kulturama mononuklearnih ćelija ljudske periferne krvi aktiviranih enterotoksinom B (SEB) stafilokoka, koje su izolovane iz različitih donora.

Slika 24 prikazuju efekte raznih anti-OX40 antitela na lizu aktiviranih CD4+ ćelija izazvanu NK92 ćelijama.

Slike 25A i 25B prikazuju efekte različitih anti-OX40 antitela na lizu posredovanu primarnim NK ćelijama, aktiviranih CD4+ T ćelija izolovanih od dva donora sa odnosom NK:ciljne ćelije.

Slika 26 prikazuje efekte raznih anti-OX40 antitela na fagocitozu hOX40-293 ćelija sa primarnim humanim makrofazima.

Slika 27 prikazuje nivo vezivanja komponente humanog komplementa C1q za OX40.21. IgG1 i IgG1.1 (bez efektora) su korišćeni kao kontrole.

Slike28A-28C prikazuju da se OX40 eksprimira u limfocitima koji infiltriraju tumor, sa šablonom generalno ograničenim na CD4+ ćelije sa minimalnom ekspresijom na CD8+ ćelijama.

Slika 28D prikazuje da se OX40 eksprimira CD4+ T ćelijama i regulatornim T ćelijama u mišjim SalN tumorima.

Slika 28E prikazuje da se OX40 eksprimira CD4+ T ćelijama, CD8+ T ćelijama, i regulatornim T ćelijama u mišjim MC38 tumorima.

Slika 29 prikazuje sposobnost raznih anti-OX40 antitela da preokrenu supresiju humanih CD4+ T ćelija posredovanu regulatornimT (Treg) ćelijama. U prisustvu i u odsustvu Treg ćelija, anti-OX40 antitela povećavaju proliferaciju T responderskih (Tresp) ćelija u poređenju sa IgG1 izotipskom kontrolom.

Slike 30A i 30B prikazuju klirens intravenozno administriranog antitela OX40.6 od majmuna. Dva majmuna su pokazala ubrzani klirens, što je u korelaciji sa formiranjem antitela protiv lekova.

Slika 31 je grafikon koji prikazuje rezultate proliferacije T ćelija za procenat antigenosti za različita anti-OX40 antitela, kao i uzorke kontrole kvaliteta QC-1, QC-2, i QC-3.

Slike 32A-32C prikazuju efekte različitih izotipova himernog OX86 antitela (antitelo koje ima varijabilne regione OX86 pacova i konstantni region miša koje ne blokira interakciju između OX40 i OX40-L, tj., ne-blokirajuće antitelo) na anti-tumorsku aktivnost merenu promenama u zapremini tumora kod pojedinačnih miševa tretiranih sa ovim izotipovima (mIgG1 i mIgG2 izotipovi) u modelu MC38 adenokarcinoma kolona: (slika 32A) kontrolno mišje IgG1 antitelo ("kontrola"), (slika 32B) OX86 mIgG1 antitelo ( "OX-40 mIgG1"), (slika 32C) OX86 mIgG2 antitelo ("OX-40 mIgG2a).

Slike 33A-33C prikazuju efekte različitih izotipova (mIgG1i mIgG2a) OX86 antitela na broj CD4+ regulatornih T ćelija u tumorima i na periferiji, kao i na broj ćelija u slezini. Slike 34A-34C prikazuju efekte himernih OX86 antitela sa humanim IgG1 na antitumorsku aktivnost merenu promenama u zapremini tumora kod pojedinačnih miševa tretiranih sa naznačenim antitelima u modelu MC38 adenokarcinoma kolona: (slika 34A) humana IgG1 izotipska kontrola ("izotip"), (slika 34B) OX86-hIgG1 himerno antitelo ("OX86-hG1"), (slika 34C) OX86-hIgG1-S267E antitelo ("OX86-hG1-S267E"). S267E supstitucija u hIgG1 povećava njegovu efektorsku funkciju povećanjem vezivanja za FcRs (CD32A i CD32B). OX86-hIgG1 je pokazao snažnu antitumorsku aktivnost.

Slike 35A-35D prikazuju efekte himernog OX86 hIgG1 antitela na iscrpljivanje T regulatornih ćelija.

Slike 36A-36E prikazuju efekte blokiranja (tj., blokiraju interakciju između OX40 i OX40 liganda) anti-mišjeg OX40 antitela (8E5) hrčka pri različitim dozama na anti-tumorsku aktivnost promenama u zapreminama tumora kod pojedinačnih miševa tretiranih sa nazančenim antitelom u podkožnom modelu mišjeg CT-26 tumora. (Slika 36A) Ig kontrola hrčka, (slika 36B) 8E5 pri 10 mg/kg, (slika 36C) 8E5 pri 3 mg/kg, (slika 36D) 8E5 pri 1 mg/kg, (slika 36E) 8E5 pri 0.3 mg/kg.

Slike37A-37D prikazuju efekte kombinovane terapije sa OX86-rG1 antitelom i anti-PDl antitelom na anti-tumorsku aktivnost merenu promenama u zapreminama tumora kod pojedinačnih miševa tretiranih sa naznačenim antitelima i kombinacijom kod modela MC38 adenokarcinoma kolona: (slika 37A) izotipska kontrola, (slika 37B) anti-PDl antitelo, (slika 37C) OX86-rG1 ("anti-OX40"), (slika 36D) OX86-rG1 anti-PDl antitelo ("anti-OX40 anti-PD1").

Slike 38A i 38B prikazuju ex vivo odgovor opoziva KLH, CD69+ koje eksprimiraju CD4+CD8- T ćelije 22. i 41. dana, redom. Životinje su imunizovane sa KLH 1. dana studije. Tačke podataka predstavljaju rezultate pojedinačnih životinja (mužjaci i ženke) kao procenat CD4+CD8-T ćelija. Horizontalni stupci predstavljaju grupna sredstva.

Slika 39 prikazuje vezivanje antitela za FcyR-his proteine uhvaćene sa anti-his Fab. Odgovori vezivanja su prikazani kao procenat teorijskog Rmax uz pretpostavku 1:1 mAt(mAb):FcyR stehiometrije vezivanja. Stupci za svako antitelo su prikazani redosledom koji je predviđen legendama boja na dnu slajda.

Slika 40 prikazuje vezivanje antitela za FcgR-his proteine uhvaćene sa anti-his Fab. Odgovori vezivanja su prikazani kao procenat teorijskog Rmax uz pretpostavku 1:1 mAt:FcγR stehiometrije vezivanja. Stupci za svako antitelo su prikazani redosledom koji je predviđen legendama boja na dnu slajda.

Slike 41A-41D prikazuju efekte kombinovane terapije sa agonističkim anti-OX40 antitelom (OX86-rG1) i anti-CTLA-4 antitelom (9D9-mG2b) na anti-tumorsku aktivnost merenu promenama u zapremini tumora kod pojedinačnih miševa tretiranih sa naznačenim antitelima i kombinacijom u modelu CT26 adenokarcinoma kolona: (slika 41A) izotipska kontrola, (slika 41B) anti-CTLA-4 antitelo, (slika 41C) OX86-rG1, (slika 41D) OX86-rG1 anti-CTLA-4 antitelo.

Slika 42 je shematski prikaz protokola kliničkog ispitivanja faze 1/2a.

Slika 43 je shematski prikaz rasporeda studijske posete za kliničko ispitivanje faze 1/2a.

DETALJAN OPIS

[0052] Ovde su opisana izolovana antitela, posebno monoklonska antitela, npr., humana monoklonska antitela, koja se specifično vezuju za OX40 i time aktiviraju nishodnu OX40 signalizaciju ("agonist anti-OX40 antitela"). Antitela opisana ovde karakterišu posebne funkcionalne karakteristike i/ili sadrže posebne strukturne karakteristike, kao što su CDR regioni koji sadrže specifične sekvence aminokiselina. Ovde su obezbeđena izolovana antitela, postupci za proizvodnju takvih anti-OX40 antitela, imunokonjugati i bispecifični molekuli koji sadrže takva antitela, i farmaceutske kompozicije formulisane da sadrže antitela. Ovde su takođe obezbeđeni postupci za primenu antitela za poboljšanje imunološkog odgovora, sami ili u kombinaciji sa drugim imunostimulatornim agensima (npr., antitela) i/ili terapijama za kancer. Shodno tome, ovde opisana anti-OX40 antitela mogu da se koriste u lečenju u širokom spektru terapijskih primena, uključujući, na primer, inhibiciju rasta tumora i lečenje virusnih infekcija.

Definicije

[0053] Da bi se predmetni opis lakše razumeo, prvo se definišu određeni pojmovi. Dodatne definicije su izložene kroz detaljan opis.

[0054] Pojam "OX40" kako se ovde koristi odnosi se na receptor koji je član superfamilije TNF-receptora, koji se vezuju za OX40 ligand (OX40-L). OX40 se takođe pominju kao član 4 (TNFRSF4), ACT35, IMD16, TXGP1L, i CD134 superfamilije receptora faktora nekroze tumora. Pojam "OX40" uključuje sve varijante ili izoforme OX40 koji se prirodno eksprimiraju ćelijama. Shodno tome, ovde opisana antitela mogu unakrsno da reaguju sa OX40 iz vrsta koje nisu ljudske (npr., cinomolgus OX40). Alternativno, antitela mogu biti specifična za humani OX40 i možda ne pokazuju nikakvu unakrsnu reaktivnost sa drugim vrstama. OX40 ili bilo koje njegove varijante i izoforme, mogu ili biti izolovani iz ćelija ili tkiva koji ih prirodno eksprimiraju ili biti rekombinantno proizvedeni korišćenjem dobro poznatih tehnika u oblasti i/ili onih opisanih ovde.

[0055] Aminokiselinska sekvenca prekursora humanog OX40 (pristupni br. NP_003318.1) je navedena u SEQ ID NO: 1. Aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena zrelog humanog OX40 je navedena u SEQ ID NO: 2. Aminokiselinska sekvenca cinomolgusovog OX40 je navedena u SEQ ID NO: 3. Aminokiselinska sekvenca humanog OX40-L je navedena u SEQ ID NO: 4.

[0056] Pojmovi "programirana smrt 1," "programirana ćelijska smrt 1," "protein PD-1," "PD-1," PD1," "PDCD1," "hPD-1" i "hPD-I," kako se ovde koristi, su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, vrste homologne humanom PD-1, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa PD-1. Kompletna PD-1 sekvenca može se naći pod GenBank pristupnim br. U64863.

[0057] Pojam "antigen-4 povezan sa citotoksičnim T limfocitima," "CTLA-4," "CTLA4," "CTLA-4 antigen" i "CD152" (videti, npr., Murata (1999) Am. J. Pathol. 155:453-460) su korišćeni naizmenično, i uključuju varijante, izoforme, vrste homologne humanom CTLA-4, i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa CTLA-4 (videti, npr., Balzano (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:28-32). Kompletna sekvenca humanog CTLA-4 je navedena u GenBank pristupnim br. Ll 5006.

[0058] Pojam "antitelo" kako se koristi ovde može da uključuju cela antitela i bilo koje antigen vezujuće fragmente (tj., "antigen-vezujuće delove") ili pojedinačne lanace istih. "Antitelo" se odnosi na, u jednom tehničkom rešenju, glikoprotein koje sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezane disulfidnim vezama, ili antigen vezujućim delovima istih. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. U određenim IgG, IgD, i IgA antitelima koja se javljaju u prirodi, konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Kod nekih antitela koja se javljaju u prirodi, svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VHi VLregioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), isprepletane regionima koji su očuvaniji, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. PVarijabilni regioni teških i laki lanaca sadrže vezujući domen koji je u interakciji sa antigenom. Konstantni regioni antitele mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunološkog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0059] Antitela se tipično vezuju specifično za svoj srodni antigen sa visokim afinitetom, što se odražava konstantom disocijacije (KD) od 10<-7>do 10<-11>M ili manje. Smatra se da svaki KDveći od oko 10<-6>M ukazuje na nespecifično vezivanje. Kako se ovde koristi, antitelo koje se "specifično vezuje" za antigen odnosi se na antitelo koje se vezuje za antigen i suštinski identične antigene sa visokim afinitetom, što znači da ima KDod 10<-7>M ili manje, poželjno 10<-8>M ili manje, još poželjnije 5 x 10<-9>M ili manje, a najpoželjnije između 10<-8>M i 10<-10>M ili manje, ali se ne vezuje sa visokim afinitetom za nepovezane antigene. Antigen je "suštinski identičan" datom antigenu ako pokazuje visok stepen identičnosti sekvence sa datim antigenom, na primer, ako pokazuje najmanje 80%, najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjnije najmanje 97%, ili još poželjnije najmanje 99% sekvence identičnosti sa sekvencom datog antigena. Na primer, antitelo koji se specifično vezuje za humani OX40 može unakrsno reagovati sa OX40 iz određenih nehumanih vrsta primata (npr., cinomolgus majmun), ali ne može unakrsno reagovati sa OX40 iz drugih vrsta (npr., murinski OX40) ili sa antigenom koji nije OX40.

[0060] Imunoglobulin može biti bilo koji od opšte poznatih izotipova, uključujući ali ne ograničavajući se na IgA, sekretorni IgA, IgG i IgM. IgG izotip je podeljen u podklase kod određenih vrsta: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudi, i IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3 kod miševa. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde su podtipa IgG1 ili IgG2. Imunoglobulini, npr., IgG1, postoje u nekoliko alotipova, koji se međusobno razlikuju u najviše nekoliko aminokiselina. "Antitelo" može uključiti, na primer, antitela koja se javlja u prirodi i koja se ne javljaju u prirodi; monoklonska i poliklonska antitela; himerna i humanizovana antitela; ljudska antitela i antitela koja nisu ljudska; potpuno sintetička antitela; i jednolančana antitela.

[0061] Pojam "antigen-vezujući deo" antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., humani OX40). Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom "antigen-vezujući deo" antitela, npr., anti-OX40 antitela opisanog ovde, uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom nzglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward i sarad., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; i (vi) izolovani regioni koji određuju komplementarnost (CDR) ili (vii) kombinacija dva ili više izolovana CDR koji mogu po izboru biti spojeni preko sintetičkog veznika. Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni korišćenim rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkih veznika koji im omogućava da budu načinjeni kao jednostruki proteinski lanac u kojem se VLi VHregioni uparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); see npr., Bird i sar. (1988) Science 242:423-426; i Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela are su takođe predviđena da budu obuhvaćena sa pojmom "antigen-vetujući deo" antitela. Ovi i drugi potencijalni konstrukti su opisani u Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih prosečnim stručnjacima u oblasti, a fragmenti su pregledani za korisnost na isti način kao i intaktna antitela. Antigen-vezujući delovi mogu se proizvesti tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih imunoglobulina.

[0062] "Bispecifično" ili "bifunkcionalno antitelo" je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teški/laki lanac i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela se mogu proizvesti raznim postupcima uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol.79:315-321 (1990); Kostelny i sar., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

[0063] Pojam "monoklonsko antitelo," kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje ispoljava jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop ili kompozicija antitela u kojoj svi antitela pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Tipično, takva monoklonska antitela će biti izvedena iz jedne ćelije ili nukleinske kiseline koja kodira antitelo, i biće propagirana bez namernog uvođenja bilo kakvih promena sekvence. Shodno tome, pojam "humano monoklonska antitelo" se odnosi na monoklonsku antitelo koja ima varijabilne i po izboru konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humane germinativne linije. U jednom tehničkom rešenju, humana monoklonska antitela se proizvode hibridomom, na primer, dobijenim fuzijom B ćelije dobijenih od transgenih ili transhromozomskih nehumanih životinja (npr., transgeni miš koji ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i laki lanac), sa imortilizovanom ćelijom.

[0064] Pojam "rekombinantno humano antitelo," kako se ovde koristi, uključuje sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinja (npr., miša) koji je transgen ili transhromozomski za gene humanog imunoglobulina ili hibridom pripremljen od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisana da eksprimiraju antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz kombinatorne biblioteke rekombinantnih, humanih antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsing sekvenci gena humanog imunoglobulina na druge sekvence DNK. Takva rekombinantna humana antitela sadrže varijabilne i konstantne regione koji koriste određene sekvence humanog imunoglobulina germinativne linije koje su kodirane genima germinativne linije, ali uključuju naknadna preuređivanja i mutacije koje nastaju, na primer, tokom sazrevanja antitela. Kao što je poznato u oblasti (videti, npr., Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), varijabilni region sadrži antigen vezujući domen, koji je kodiran različitim genima koji se preuređuju da bi formirali antitelo specifično za strani antigen. Pored preuređivanja, varijabilni region se može dalje modifikovati višestrukim promenama pojedinačnih aminokiselina (koji se nazivaju somatska mutacija ili hipermutacija) da bi se povećala afinitet antitela prema stranom antigenu. Konstantni region će se promeniti u daljem odgovoru na antigen (tj., promena izotipa). Zbog toga, preuređene i somatski mutirane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide imunoglobulina lakog i teškog lanca kao odgovor na antigen možda neće biti identične originalnim sekvencama germinativne linije, ali će umesto toga biti suštinski identične ili slične (tj., imati najmanje 80 % identitičnosti).

[0065] "Humano" antitelo (HuMAt) odnosi se na antitelo koje ima varijabilne regione u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz sekvenci humanog imunoglobulina germinativne linije. Ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz sekvenci humanog imunoglobulina germinativne linije. Ovde opisana antitela mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina germinativne linije (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili mutagenezom i specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge vrste sisara, kao što je miš, kalemljene na humane okvirne sekvence. Pojmovi "humana" antitela i "potpuno humana" i su korišćeni naizmenično.

[0066] "Humanizovano" antitelo odnosi se na antitelo u kojem su neke, većina ili sve aminokiseline izvan CDR domena nehumanog antitela zamenjene sa odgovarajućim aminokiselinama izvednim iz humanih imunoglobulina. U jednom tehničkom rešenju humanizovanog oblika antitela, neke, većina, ili sve od aminokiselina izvan CDR domena su zamenjene sa aminokiselinama iz humanih imunoglobulina, dok su neke, većina, ili sve od aminokiselina u okviru jednog ili više CDR regiona nepromenjene. Male adicije, delecije, umetanja, supstitucije ili modifikacije aminokiselina su dozvoljena sve dok ne poništavaju sposobnost antitela da se vezuju za određeni antigen. "Humanizovano" antitelo zadržava antigensku specifičnost sličnu onoj od originalnog antitela.

[0067] "Himerno antitelo" odnosi se na antitelo u kojem su varijabilni regioni izvedeni iz jedne vrste a konstantni regioni su izvedeni iz drugih vrsta, kao što je antitelo u kojem su varijabilni regioni izvedeni iz mišjeg antitela a konstantni regioni su izvedeni iz humanog antitela.

[0068] Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, i IgE antitelo) koju kodiraju geni konstantnog regiona teškog lanca.

[0069] "Alotip" se odnosi na varijante koje se javljaju u prirodi unutar specifične izotipske grupe, koje se varijante razlikuju u nekoliko aminokiselina (videti, npr., Jefferis i sar. (2009) mAbs 1:1). Antitela opisana ovde mogu biti bilo kog alotipa. Kako se ovde koristi, antitela označena sa "IgG1f" ili "IgG1.1f" izotip su IgG1 i IgG1.1 antitela bez efektora efektorske funkcije, redom, alotipa "f," tj., imaju 214R, 356E i 358M u skladu sa EU indeksom kao u Kabat-u, kao što je prikazano, npr., u SEQ ID NO: 5 (videti podvučene ostatke u SEQ ID NO: 5 iz tabele 23).

[0070] Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično antigen" su ovde korišćeni naizmenično sa pojmom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen."

[0071] "Izolovano antitelo," kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za OX40 je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene osim OX40). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop od OX40 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost na druge OX40 proteine iz različitih vrsta.

[0072] Kako se ovde koristi, antitelo koje "inhibira vezivanje OX40-L za OX40" namenjeno je da se odnosi antitelo koje inhibira vezivanje OX40-L za OX40, npr., u testovima vezivanja koristeći hOX40-293 ćelije, sa EC50 od oko 1 µg/mL ili manje, kao što je oko 0.9 µg/mL ili manje, oko 0.85 µg/mL ili manje, oko 0.8 µg/mL ili manje, oko 0.75 µg/mL ili manje, oko 0.7 µg/mL ili manje, oko 0.65 µg/mL ili manje, oko 0.6 µg/mL ili manje, oko 0.55 µg/mL ili manje, oko 0.5 µg/mL ili manje, oko 0.45 µg/mL ili manje, oko 0.4 µg/mL ili manje, oko 0.35 µg/mL ili manje, oko 0.3 µg/mL ili manje, oko 0.25 µg/mL ili manje, oko 0.2 µg/mL ili manje, oko 0.15 µg/mL ili manje, ili oko 0.1 µg/mL ili manje, u postupcima koji su priznati u oblasti, npr., testovima vezivanja zasnovanih na FACS opisanih ovde.

[0073] "Efektorska funkcija" odnosi se na interakciju Fc regiona antitela sa Fc receptorom ili ligandom, ili biohemijski događaj koji je rezultat toga. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju Clq vezivanje, citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC - complement dependent cytotoxicity), vezivanje Fc receptora, FcγR-posredovane efektorske funkcije kao što su ADCC i ćelijski posredovana fagocitoza zavisna od antitela (ADCP - antibody dependent cellmediated phagocytosis) i negativna regulacija receptora na površini ćelije (npr., receptor B ćelija; BCR). Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju da se Fc region kombinuje sa domenom vezivanja (npr., varijabilnim domenom antitela).

[0074] "Fc receptor" ili "FcR" je receptor koji se vezuje za Fc region imunoglobulina. FcRs koji se vezuju za IgG antitelo sadrži receptore FcγR familije, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcyR familija se sastoji od tri aktivirajuća (FcyRI, FcyRIII, i FcyRIV kod miševa; FcyRIA, FcyRIIA, i FcyRIIIA, kod ljudi) i jednog inhibitornog (FcyRIIB) receptora. Različita svojstva humanih FcyR su sumirana u tabeli 1. Većina urođenih tipova efektorskih ćelija koeksprimira jedan ili više aktivirajućih FcyR i inhibitornih FcyRIIB, dok ćelije prirodnog ubice (NK) selektivno eksprimiraju jedan aktivirajući Fc receptor (FcyRIII kod miševa i FcyRIIIA kod ljudi), ali ne i inhibitorni FcyRIIB kod miševa i ljudi. Humani IgG1 se vezuje za većinu humanih Fc receptora i smatra se ekvivalentnim murinskom IgG2a s obzirom na tipove aktivirajućih Fc receptora za koje se vezuje.

Tabela 1. Svojstva humanih FcyR

[0075] "Fc region" (region koji može da kristalizuje fragment) ili "Fc domen" ili "Fc" odnosi se na C-terminalni region teškog lanca antitela koji posreduje u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući vezivanje za Fc receptore smeštene na različite ćelije imunološkog sistema (npr., efektorske ćelije) ili za prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. Prema tome, Fc region sadrži konstantan region antitela isključujući prvi konstantni imunoglobulinski domen regiona (npr., CH1 ili CL). Kod IgG, IgA i IgD izotipovima antitela, Fc region sadrži CH2i CH3konstantne domene u svakom od two teška lanaca antitela; IgM i IgE Fc regioni sadrže tri konstantna domena teškog lanca (CHdomeni 2-4) u svakom polipeptidnom lancu. Za IgG, Fc region sadrži imunoglobulinske domene Cγ2 i Cy3 i zglob između Cγ1 i Cγ2. Iako granice Fc regiona imunoglobulinskog teškog lanca mogu varirati, Fc region human IgG teškog lanca je obično definisan da se protegne od aminokiselinskog ostatka na položaju C226 ili P230 (ili aminokiseline između ove dve aminokiseline) do karboksi-terminusa teškog lanca, pri čemu numerisanje je prema EU indeksu kao u Kabatu. Kabat i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nacionalni institut za zdravlje, Betesda, MD; videti takođe sl.3C-3F U.S. prijave patenta sa br. objave 2008/0248028. CH2domen Fc regiona humanog IgG proteže se oko aminokiseline 231 dooko aminokiseline 340, dok je CH3domen pozicioniran na C-terminalnoj strani CH2domena u Fc regionu, tj., proteže se od oko aminokiseline 341 do oko aminokiseline 447 od IgG. Kako se ovde koristi, Fc region može biti FC sa nativnom sekvencom, uključujući bilo koju alotipsku varijantu, ili Fc varijantu (npr., Fc koji se ne javlja u prirodi). Fc se takođe može odnositi na ovaj region u izolaciji ili u kontekstu proteinskog polipeptida koji sadrži Fc kao što je "vezujući protein koji sadrži Fc region", koji se takođe naziva "Fc fuzioni protein" (npr., antitelo ili imunoadhezin).

[0076] "Zglob", "domen zgloba" ili "region zgloba " ili "region zgloba antitela" odnosi se na domen konstantnog regiona teškog lanca koji spaja CH1 domen za CH2 domen i uključuje gornje, srednje, i donje delove zgloba (Roux i sar. J. Immunol.1998 161:4083). Zglob obezbeđuje varirajuće nivoe fleksibilnosti između vezujućeg i efektorskog regiona antitela i takođe obezbeđuje mesta za intermolekularno, disulfidno vezivanje između dva konstantna regiona teškog lanca. Kako se ovde koristi, zglob počinje na Glu216 i završava se na Gly237 za sve izotipove IgG (Roux i sar., 1998 J Immunol 161:4083). Sekvence zglobova divljih tipova IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 prikazane su u tabelama 2 i 23.

Tabela 2. Aminokiseline regionа zgloba

[0077] Pojam "zglob" uključuje zglobove divljeg tipa (kao što su oni navedeni u tabeli 23), kao i njihove varijante (npr., zglobove koji se ne javljaju u prirodi ili modifikovane zglobove). Na primer, pojam "IgG2 zglob" uključuje IgG2 zglob divljeg tipa, kao što je prikazano u tabeli 23, i varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, dececije ili adicije. Primeri varijanti IgG2 zgloba uključuju IgG2 zglobove u kojima svaki 1, 2, 3 ili svi 4 cisteini (C219, C220, C226 i C229) se menjaju u drugu aminokiselinu. U specifičnom tehničkom rešenju, IgG2 sadrži supstituciju C219S. U određenim tehničkim rešenjima, zglob je hibridni zglob koji sadrži sekvence od najmanje dva izotipa. Na primer, zglob može da sadrži gornji, srednji ili donji zglob od jednog izotipa i ostatak zgloba od jednog ili više drugih izotipova. Na primer, zglob može biti IgG2/IgG1 zglob, i može da sadrži, npr., gornji i srednji zglob od IgG2 i donji zglob od IgG1. Zglob može imati efektorsku funkciju ili biti lišen efektorske funkcije. Na primer, donjzglob IgG1 divljeg tipa obezbeđuje efektorsku funkciju.

[0078] Pojam "CH1 domen" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji povezuje varijabilni domen zzglob u konstantnom domenu teškog lanca. Kako se ovde koristi, CH1 domen počinje na A118 i završava se na V215. Pojam "CH1 domen" uključuje CH1 domene divljeg tipa (kao što imaju SEQ ID NO: 202 za IgG1 i SEQ ID NO: 203 za IgG2; tabela 23), kao i njegove varijante (npr., CH1 domeni koji se ne javljaju u prirodi ili modifikovani CH1 domeni). Na primer, pojam "CH1 domen" uključuje CH1 domene divljeg tipa i varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. CH1 domeni uzeti kao primer uključuju CH1 domene sa mutacijama koje modifikuju biološku aktivnost antitela, kao što je ADCC, CDC ili poluživot. Modifikacije CH1 domena koje utiču na biološku aktivnost antitela su predviđene ovde.

[0079] Pojam "CH2 domen" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji povezuje zglob za CH3 domen u konstantnom domenu teškog lanca. Kako se ovde koristi, CH2 domen počinje na P238 i završava se na K340. Pojam "CH2 domen" uključuje CH2 domene divljeg tipa (kao što imaju SEQ ID NO: 204 za IgG1 i SEQ ID NO: 205 za IgG2; tabela 23), kao i njegove varijante (npr., CH2 domene koji se ne javljaju u prirodi ili modifikovane CH2 domene). Na primer, pojam "CH2 domen" uključuje CH2 domene divljeg tipa i varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. CH2 domeni uzeti kao primer uključuju CH2 domene sa mutacijama koje modifikuju biološku aktivnost antitela, kao što je ADCC, CDC ili poluživot. U određenim tehničkim rešenjima, CH2 domen sadrži supstituciju A330S/P331S koja smanjuje efektorsku funkciju. Druge modifikacije CH2 domena koje utiču na biološku aktivnost antitela su predviđene ovde.

[0080] Pojam "CH3 domen" odnosi se na konstantni region teškog lanca koji je C-terminalni za CH2 domen u konstantnom domenu teškog lanca. Kako se ovde koristi, CH3 domen počinje na G341 i završava se na K447. Pojam "CH3 domen" uključuje CH3 domene divljeg tipa (kao što imaju SEQ ID NO: 206 za IgG1 i SEQ ID NO: 207 za IgG2; tabela 23), kao i njegove varijante (npr., CH3 domeni koji se ne javljaju u prirodi ili modifikovani CH3 domeni). Na primer, pojam "CH3 domen" uključuje CH3 domene divljeg tipa i varijante koje imaju 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 i/ili najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 mutaciju, npr., supstitucije, delecije ili adicije. CH3 domeni uzeti kao primer uključuju CH3 domene sa mutacijama koje modifikuju bilošku aktivnost antitela, kao što je ADCC, CDC ili poluživot. Modifikacije CH3 domene koje utiču na biološku aktivnost antitela su predviđene ovde.

[0081] "Fc region sa nativnom sekvencom" ili "Fc sa nativnom sekvencom" sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona pronađenog u prirodi. Human Fc regioni sa nativnom sekvencom uključuju Fc region humanog IgG1 sa nativnom sekvencom; Fc region humanog IgG2 sa nativnom sekvencom; Fc region humanog IgG3 sa nativnom sekvencom; i Fc region humanog IgG4 sa nativnom sekvencom kao i njihove varijante koje se javljaju u prirodi. Fc sa nativnom sekvencom uključuju razne alotipove Fc-a (videti, npr., Jefferis i sar. (2009) mAbs 1:1).

[0082] Pojam "epitop" ili " antigena determinanta " odnosi se na mesto na antigenu (npr., OX40) za koje se imunoglobulin ili antitelo specifično vezuje. Epitopi unutar proteinskih antigena mogu se formirati i od susednih aminokiselina (obično linearni epitop) ili od nesusednih amino kiselina postavljenih nasuprot tercijarnom savijanju proteina (obično konformacioni epitop). Epitopi formirani od susednih aminokiselina se tipično, ali ne uvek, zadržavaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem tipično gube pri tretmanu sa denaturirajućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za određivanje koji epitopi su vezani datim antitelom (tj., mapiranje epitopa) su dobro poznati u oblasti i uključuju, na primer, testove imunoblotiranja i imunoprecipitacije, gde se preklapanje ili susedni peptidi (npr., iz OX40) testiraju zabog reaktivnosti sa datim antitelom (npr., anti-OX40 antitelom). Postupci određivanja prostorne konfirmacije epitopa uključuju tehnike iz oblasti i one opisane ovde, na primer, rendgenska kristalografija, 2-dimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca i HDX-MS (videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom.66, G. E. Morris, izd. (1996)).

[0083] Pojam "mapiranje epitopa" odnosi se na proces identifikovanja molekularnih determinanti antigena uključenih u prepoznavanje antitelo-antigena.

[0084] Pojam "vezuje se za isti epitop" sa osvrtom na dva ili više antitela označava da se antitela vezuju za istu grupu aminokiselinskih ostataka, kako je određeno datim postupkom. Tehnike za određivanje da li se antitela antitela vezuju za "isti epitop na OX40" sa antitelima opisanim ovde uključuju postupke mapiranja epitopa koje su priznate u oblasti tehnike, kao i rengenske analize kristala kompleksa antigen:antitelo koja pruža atomsku rezoluciju epitopa i masenu spektrometriju razmene vodonik/deuterijum (HDX-MS). Drugi postupci prate vezivanje antitela za fragmente antigena (npr., proteolitički fragmenti) ili za mutirane varijacije antigena gde se gubitak vezivanja usled modifikacije ostatka aminokiselina unutar sekvence antigena često smatra indikacijom komponente epitopa ( npr., mutageneza skeniranja alanina - Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081). Pored toga, mogu se takođe koristiti i računski kombinatorički postupci za mapiranje epitopa. Ovi postupci se oslanjaju na sposobnost antitela od interesa da afinitetno izoluje specifične kratke peptide iz kombinatornih peptidnih biblioteka prikaza faga. Očekuje se da se antitela koja imaju iste ili blisko povezane VH i VL ili iste CDR1, 2 i 3 sekvence vezuju za isti epitop.

[0085] Antitela koja se "takmiče sa drugim antitelom za vezivanje za cilj" odnose se na antitela koja (delimično ili potpuno) inhibiraju vezivanje drugog antitela za cilj. Da li se dva antitela takmiče jedno sa drugim za vezivanje za cilj, tj. da li i u kojoj meri jedno antitelo inhibira vezivanje drugog antitela za cilj, može se utvrditi korišćenjem poznatih kompetetivnih eksperimenata. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo se takmiči sa, i inhibira vezivanje drugog antitela za cilj za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. Nivo inhibicije ili kompeticije može biti različit u zavisnosti od toga koje je antitelo "blokirajuće antitelo" (tj., hladno antitelo koje se prvo inkubira sa ciljem). Kompetetivni testovi se mogu sprovesti kako je opisano, na primer, u Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 ili u poglavlju 11 „Using Antibodies" od Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, SAD 1999. Kompetetivna antitela se vezuju za isti epitop, epitop koji se preklapa, ili za susedne epitope (npr., o čemu svedoči sterična prepreka).

[0086] Drugi testovi kompetitivnog vezivanja koji su priznati u oblasti uključuju: direktan ili indirektan radioimuno test čvrste faze (RIA - radioimmunoassay), direktni ili indirektni enzimski imunotest (EIA - enzyme immunoassay), "sendvič" kompetetivni test (videti Stahli i sar., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); direktni biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi (videti Kirkland i sar., J. Immunol. 137:3614 (1986)); direktno obeleženi test na čvrstoj fazi, direktno obeleženi "sendvič" test na čvrstoj fazi (videti Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); direktni RIA sa obeležavanjem korišćenjem I-125 oznake na čvrstoj fazi (videti Morel i sar, Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); direktni biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi (Cheung i sar., Virology 176:546 (1990)); i direktno obeleženi RIA. (Moldenhauer i sar., Scand. J. Immunol.

32:77 (1990)).

[0087] Kako se ovde koristi, pojmovi "specifično vezivanje," "selektivno vezivanje," "selektivno vezuje," i "specifično vezuje," odnose se na vezivanje antitela za epitop na prethodno određenom antigenu ali ne za druge antigene. Tipično, antitelo (i) se vezuje sa konstantom ravnoteže disocijacije (KD) od približno manje od 10<-7>M, kao što je približno manje od 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M li čak niže kada se odredi, npr., tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR -surface plasmon resonance) u instrumentu BIACORE 2000 za površinsku plazmonsku rezonancu (SPR) koji koristi unapred određeni antigen, npr., rekombinantni humani OX40, kao analit i antitelo kao ligand, i (ii) vezuje se za unapred određeni antigen sa afinitetom koji je najmanje dva puta veći od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr., BSA, kazein) koji nije unapred određeni antigen ili blisko srodni antigen. Shodno tome, antitelo koje se "specifično vezuje za humani OX40" odnosi se na antitelo koje se vezuje za rastvorljiv ili ćelijski vezan humani OX40 sa KDod 10<-7>M ili manje, kao što je približno manje od 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili još manje. Antitelo koje "unakrsno reaguje sa cinomologus OX40" odnosi se na antitelo koje se vezuje za cinomologus OX40 sa KDod 10<-7>M ili manje, kao što je približno manje od 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili još manje. U određenim tehničkim rešenjima, antitela koja ne reaguju unakrsno sa OX40 iz vrste koja nije ljudska (npr., murinski OX40) pokazuju suštinski neotkriveno vezivanje za ove proteine u standardnim testovima vezivanja.

[0088] Pojam "kassoc" ili "ka", kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na konstantu brzine povezivanja određene interakcije antitelo-antigen, dok se pojam "kdis" ili "kd", kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Pojam "KD", kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije, koja se dobija iz odnosa kdprema ka(tj., kd/ka) i izražava se kao molarna koncentracija (M). KDvrednosti za antitela mogu se odrediti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Poželjni postupak za određivanje KDantitela je korišćenjem površinske plazmonske rezonance, poželjno korišćenjem biosenzorskog sistema kao što je Biacore® SPR sistem ili protočna citometrija i Scatchard analiza.

[0089] Kako se ovde koristi, pojam "visok afinitet" za IgG antitelo odnosi se na antitelo koje ima KDod 10<-8>M ili manje, poželjnije 10<-9>M ili manje i još poželjnije 10<-10>M ili manje za ciljani antigen. Međutim, vezivanje sa "visokim afinitetom" može da varira za druge izotipove antitela. Na primer, vezivanje sa "visokim afinitetom" za IgM izotip odnosi se na antitelo koje ima KDod 10<-7>M ili manje, poželjnije 10<-8>M ili manje.

[0090] Pojam "EC50" u kontekstu in vitro ili in vivo testa korišćenjem antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, odnosi se na koncentraciju antitela ili njegov antigen-vezujući deo koji indukuje odgovor koji je 50% maksimalan odgovor, tj., na pola puta između maksimalnog odgovora i osnovne linije.

[0091] Pojam "vezuje za imobilizovan OX40," odnosi se na sposobnost antitela opisanog ovde da se vezuju za OX40, na primer, eksprimiran na površini ćelije ili pričvršćen za čvrsti nosač.

[0092] Pojam "unakrsno reaguje," kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost antitela opisanog ovde da se vezuju za OX40 iz različitih vrsta. Na primer, antitelo opisano ovde koje vezuje humani OX40 može takođe da veže OX40 iz drugih vrsta (npr., cinomolgus OX40). Kako se ovde koristi, unakrsna reaktivnost može se meriti otkrivanjem specifične reaktivnosti sa prečišćenim antigenom u testovima vezivanja (npr., SPR, ELISA) ili vezivanjem za, ili na drugi način funkcionalno interakcijom sa, ćelijama koje fiziološki eksprimiraju OX40. Postupci za određivanje unakrsne reaktivnosti uključuju standardne testove vezivanja kao što je opisano ovde, na primer, BIACORE® analizom površinske plazmonske rezonance (SPR) korišćenjem BIACORE® 2000 SPR instrumenta (Biacore AB, Upsala, Švedska), ili tehnikama protočne citometrije.

[0093] Pojam "koji se javlja u prirodi" kako se ovde koristi kako se primenjuje na predmet odnosi se na činjenicu da se predmet može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može biti iz izvora u prirodi a koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji je koja se javlja u prirodi.

[0094] "Polipeptid" se odnosi na lanac koji sadrži najmanje dva uzastopno povezana aminokiselinska ostatka, bez gornje granice dužine lanca. Jedan ili više aminokiselinskih ostataka u proteinu može sadržati modifikaciju kao što je, ali bez ograničenja, glikozilacija, fosforilacija ili disulfidna veza. "Protein" može da sadrži jedan ili više polipeptida

[0095] Pojam "molekul nukleinske kiseline," kako se ovde koristi, namenjeno je da uključuju molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti može biti jednolančani ili dvolančani, i može biti cDNK.

[0096] Takođe su predviđene "konzervativne modifikacije sekvence" sekvenca navedenih ovde, npr., u tabeli 23, tj., modifikacije nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci koji ne poništavaju vezivanje antitela kodiranog nukleotidnom sekvencom ili koji sadrži aminokiselinsku sekvencu, za antigen. Takve konzervativne modifikacije sekvence uključuju konzervativne supstitucije nukleotida i aminokiselina, kao i adicije i delecije nukleotida i aminokiselina. Na primer, modifikacije se mogu uneti u sekvencu u tabeli 23 standardnim tehnikama poznatim u oblasti, kao što su mutageneza usmerena na mesto i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne modifikacije sekvence uključuju konzervativne supstitucije aminokiselina, u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u oblasti. Ove familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), betarazgranatim bočnim lancima (npr., treonin. valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, predviđeni neesencijalni ostatak aminokiselina u anti-OX40 antitelu poželjno je zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste familije bočnog lanca. Postupci identifikacije nukleotidnih i aminokiselina konzervativnih supstitucija koje ne eliminišu vezivanje antigena su dobro poznati u oblasti (videti, npr., Brummell i sar., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi i sar. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); i Burks i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 94:412-417 (1997)). Alternativno, u drugom tehničkom rešenju, mutacije se mogu uvesti nasumično duž cele ili dela sekvence koja kodira anti-OX40 antitelo, kao što je mutageneza zasićenja, a rezultujuća modifikovana anti-OX40 antitela mogu biti testirana na poboljšanu aktivnost vezivanja.

[0097] Za nukleinske kiseline, pojam "suštinska homologija" ukazuje da su dve nukleinske kiseline, ili njihove označene sekvence, kada su optimalno poravnate i upoređene, identične, sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama, u najmanje oko 80% nukleotida, obično najmanje oko 90% do 95%, a poželjnije najmanje oko 98% do 99.5% nukleotida. Alternativno, suštinska homologija postoji kada se segmenti hibridizuju pod uslovima selektivne hibridizacije, do komplementa lanca.

[0098] Za polipeptide, pojam "suštinska homologija" ukazuje da su na dva polipeptida, ili njihove označene sekvence, kada su optimalno poravnate i upoređene, identične, sa odgovarajućim aminokiselinskim insercijama ili delecijama, u najmanje oko 80% aminokiselina, obično najmanje oko 90% do 95%, a poželjnije najmanje oko 98% do 99.5% aminokiselina.

[0099] Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje dele sekvence kada su sekvence optimalno poravnate (tj., % homologije = br identičnih položaja/ukupan br položaja x 100), pri čemu je optimalno poravnanje određeno uzimajući u obzir broj gapova (praznina) i dužinu svakog gapa, koji treba uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u neograničavajućim primerima u nastavku.

[0100] Procenat identiteta između dve nukleotidne sekvence može se odrediti korišćenjem GAP programa u GCG softverskom paketu (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem NWSgapdna.CMP matriksa i težine gapa od 40, 50, 60, 70, ili 80 i dužine težine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Procenat identiteta između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može se takođe odrediti korišćenjem algoritma od E. Meyers i W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) koji je inkorporiran u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tablice za težinu ostataka, i vrednost dužine gapa (gap length penalty) od 12 i vrednosti gapa (gap penalty) od 4. Dodatno, procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se podrediti korišćenjem Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) algoritma koji je inkorporiran u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem ili Blossum 62 matriksa ili PAM250 matriksa, i težine gapa od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i dužine težine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.

[0101] Ovde opisane sekvence nukleinske kiseline i proteina mogu se dalje koristiti kao "sekvenca upita" da se izvrši pretraga u javnim bazama podataka da bi se, na primer, identifikovale povezane sekvence. Takve pretrage se mogu izvršiti korišćenjem NBLAST i XBLAST programa (verzija 2.0) od Altschul, i sar. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti pomoću NBLAST programa, skor = 100, dužina reči = 12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline opisanim ovde. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti pomoću XBLAST programa, skor = 50, dužina reči = 3 da bi se dobile sekvence aminokiselina koje su homologne molekulima proteina opisanim ovde. Da bi se dobila poravnanja sa prazninama u svrhu poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul i sar., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Videti www.ncbi.nlm.nih.gov.

[0102] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celoj ćeliji, u lizatu ćelije, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada se prečišćava dalje od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanta, npr., drugih ćelijskih nukleinskih kiselina (npr., drugih delova hromozoma) ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCl bojenje (banding), kolonsku hromatografiju, elektroforezu u agaroznom gelu i druge dobro poznate u oblasti tehnike. Videti, F. Ausubel, i sar., izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Njujork (1987).

[0103] Nukleinske kiseline, npr., cDNK, mogu biti mutirane, u skladu sa standardnim tehnikama da bi se obezbedile sekvence gena. Za kodiranje sekvenci, ove mutacije mogu uticati na aminokiselinsku sekvencu po želji. Konkretno, razmatrane su DNK sekvence koje su suštinski homologne ili izvedene iz nativne V, D, J, konstante, prekidača i drugih takvih sekvenci koje su opisane ovde.

[0104] Pojam "vektor" kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid," koji se odnosi odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu vezati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr., neepizomalni vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Generalno, ekspresioni vektori korisni u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" se mogu koristiti naizmenično pošto je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, uključeni su i drugi oblici ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr., retrovirusi sa defektnom replikacijom, adenovirusi i virusi povezani sa adeno), koji služe ekvivalentnim funkcijama.

[0105] Pojam "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćina"), kako se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu koja nije prisutna u ćeliji u prirodi, i može biti ćelija u koju je rekombinantni ekspresioni vektor uveden. Trebalo bi razumeti da se ovakvi pojmovi odnose ne samo na određenu ćeliju subjekta, već i na potomstvo takve ćelije. Pošto se u narednim generacijama mogu javiti određene modifikacije zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora, u stvari, biti identično roditeljskim ćelijama, ali je i dalje uključeno u okvir pojam "ćelija domaćina" kako se ovde koristi.

[0106] Kako se ovde koristi, pojam "antigen" odnosi se na bilo koju prirodnu ili sintetičku imunološkogenu supstancu, kao što je protein, peptid, ili hapten. Antigen može biti OX40 ili njegov fragment. Antigen takođe može biti tumorski antigen, protiv koga su poželjni zaštitni ili terapijski imunološki odgovori, npr., antigeni eksprimirani u tumorskoj ćeliji (npr., za primenu kao tumorska vakcina koja se primenjuje u kombinaciji sa anti-OX40 antitelom). Antigeni uključuju antigene povezane sa tumorom za prevenciju ili lečenje kancera. Primeri antigena povezanih sa tumorom uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje sadrže sve ili deo sekvenci βhCG, gp100 ili Pmel17, HER2/neu, WT1, mezotelin, CEA, gp100, MART1, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotip, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, Tirozinaza, Telomeraza, SSX2 i MUC-1 antigene, i tumorske antigene izvedene iz germinativnih ćelija. Antigeni povezani sa tumorom takođe uključuju antigene krvne grupe, na primer, Le<a>, Le<b>, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2 antigene. Alternativno, više od jednog antigena može biti uključeno u konstrukt. Na primer, MAGE antigen se može kombinovati sa drugim antigenima kao što su melanin A, tirozinaza, i gp100 zajedno sa pomoćnim sredstvima kao što su GM-CSF ili IL-12, i povezan sa anti-APC antitelom.

[0107] Sekvence prethodno navedenih antigena su dobro poznate u oblasti tehnike. Na primer, primer MAGE-3 cDNK sekvence je predviđen u US 6,235,525 (Ludwig Institute for Cancer Research); primeri NY-ESO-1 sekvenci nukleinskih kiselina i proteina su predviđene u US 5,804,381 i US 6,069,233 (Ludwig Institute for Cancer Research); primeri Melan-A sekvenci nukleinskih kiselina i proteina su predviđeni u US 5,620,886 i US 5,854,203 (Ludwig Institute for Cancer Research); primeri NY-BR-1 sekvenci nukleinskih kiselina i proteina su predviđeni u US 6,774,226 i US 6,911,529 (Ludwig Institute for Cancer Research) i primeri NY-CO-58 sekvenci nukleinskih kiselina i proteina su predviđeni u WO 02/90986 (Ludwig Institute for Cancer Research); primer aminokiselinskih sekvenci za HER-2/neu protein je dostupan pod GENBANK<®>pristupnim brojem. AAA58637; a nukleotidna sekvenca (mRNA) za humani karcinoembrionalni antigen-1 (CEA-1) je dostupna pod GENBANK<®>pristupnim br. NM020219.

[0108] "Imunološki odgovor" odnosi se na biološki odgovor unutar kičmenjaka protiv stranih agenasa, koji odgovor štiti organizam od ovih agenasa i bolesti izazvanih njima. Imunološki odgovor je posredovan delovanjem ćelije imunološkog sistema (na primer, T limfocit, B limfocit, (NK) ćelija prirodni ubica, makrofag, eozinofil, mast ćelija, dendritična ćelija ili neutrofil) i rastvorljivih makromolekula koje proizvodi bilo koja od ovih ćelija ili jetra (uključujući antitela, citokine, i komplement) što rezultira selektivnim ciljanjem, vezivanjem za, oštećenjem, uništavanjem, i/ili eliminacijom iz tela kičmenjaka invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kancerogene ili druge abnormalne ćelije, ili, u slučajevima autoimunosti ili patološke upale, normalne ljudske ćelije ili tkiva. Imunološka reakcija uključuje, npr., aktivaciju ili inhibiciju T ćelije, npr., efektorske T ćelije ili Th ćelije, kao što je CD4+ ili CD8+ T ćelija, ili inhibiciju Treg ćelije.

[0109] "Imunomodulator" ili "imunoregulator" se odnosi na agens, npr., komponentu signalnog puta, koja može biti uključena u modulaciju, regulisanje ili modifikovanje imunološkog odgovora. "Moduliranje", "regulisanje" ili "modifikovanje" imunološkog odgovora odnosi se na bilo koju promenu u ćeliji imunološkog sistema ili u aktivnosti takve ćelije (npr. efektor T ćelija). Takva modulacija uključuje stimulaciju ili supresiju imunološkog sistema što se može manifestovati povećanjem ili smanjenjem broja raznih tipova ćelija, povećanjem ili smanjenjem aktivnosti ovih ćelija, ili bilo kojim drugim promenama koje se mogu javiti u okviru imunološkog sistema. Identifikovani su i inhibitorni i stimulativni imunomodulatori, od kojih neki mogu imati poboljšanu funkciju u mikrookruženju tumora. U poželjnim tehničkim rešenjima, imunomodulator se nalazi na površini T ćelije. "Imunomodulatorni cilj " ili "imunoregulatorni cilj" je imunomodulator koji je ciljan za vezivanje, i čija je aktivnost promenjena vezivanjem supstance, agenasa, segmenta, jedinjenja ili molekula. Imunomodulatorni ciljevi uključuju, na primer, receptore na površini ćelije ("imunomodulatorni receptori") i receptorske ligande ("imunomodulatorni ligandi").

[0110] "Imunoterapija" se odnosi se lečenje subjekta koji je oboleo od bolesti ili je u riziku da dobije ili pati od ponovnog pojavljivanja bolesti postupkom koji sadrži izazivanje, pojačavanje, suzbijanje ili na drugi način modifikovanje imunološkog odgovora.

[0111] "Imunostimulirajuća terapija" ili "imunostimulatorna terapija" se odnosi na terapiju koja rezultira povećanjem (indukcijom ili pojačavanjem) imunološkog odgovora kod subjekta za, npr., lečenje kancera.

[0112] "Potenciranje endogenog imunološkog odgovora" znači povećanje efikasnosti ili potencije postojećeg imunološkog odgovora kod subjekta. Ovo povećanje efikasnosti i potencije može se postići, na primer, prevazilaženjem mehanizama koji potiskuju endogeni imuni odgovor domaćina ili stimulišući mehanizme koji pojačavaju endogeni imuni odgovor domaćina.

[0113] "T effektorske" ("Teff") ćelije odnosi se na T ćelije (npr., CD4+ i CD8+ T ćelije) sa citolitičkim aktivnostima kao i T pomoćne (Th) ćelije, koje luče citokine i aktiviraju i usmeravaju druge imune ćelije, ali ne uključuju regulatorne T ćelije (Treg ćelije). Anti-OX40 antitela opisana ovde aktiviraju Teffćelije, npr., CD4+ i CD8+ Teffćelije.

[0114] Povećana sposobnost da se stimuliše imunološki odgovor ili imunološki sistem, može biti rezultat pojačane agonističke aktivnosti koštanih receptora T ćelija i/ili pojačane antagonističke aktivnosti inhibitornih receptora. Povećana sposobnost da se stimuliše imunoločki odgovor ili imunoločki sistem može se odraziti na višestruko povećanje EC50ili maksimalnog nivoa aktivnosti u testu koji meri imunološki odgovor, npr., testu koji meri promene u oslobađanju citokina ili hemokina, citolitičku aktivnost (određena direktno na ciljnim ćelijama ili indirektno detekcijom CD107a ili granzima) i proliferaciju. Sposobnost da se stimuliše imunološki odgovor ili aktivnost imunološkog sistema može se povećati za najmanje 10%, 30%, 50%, 75%, 2 puta, 3 puta, 5 puta ili više.

[0115] Kako se ovde koristi, pojam "povezan" odnosi se na asocijaciju dva ili više molekula. Veza može biti kovalentna ili nekovalentna. Veza takođe može biti genetska (tj., rekombinantno spojena). Takve veze se mogu postići korišćenjem širokog spektra tehnika priznatih u oblasti, kao što su hemijska konjugacija i proizvodnja rekombinantnog proteina.

[0116] Kako se ovde koristi, "administriranje" odnosi se na fizičko uvođenje kompozicije koja sadrži terapijske agense subjektu, koristeći bilo koji od različitih postupaka i sistema isporuke poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Poželjni putevi administriranja za antitela opisana ovde uključuju intravenozno, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, spinalno ili druge parenteralne puteve administriranja, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralno administriranje" kako se ovde koristi označava druge načine administriranja osim enteralnog i lokalnog administriranja, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravenoznu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intralimfatičnu, intralezijsku, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju, kao i in vivo elektroporaciju. Alternativno, antitelo opisano ovde može se administrirati neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put administriranja, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili lokalno.

Administriranje se takođe može izvršiti, na primer, jednom, više puta, i/ili tokom jednog ili više produženih perioda.

[0117] Kako se ovde koristi, pojam "T ćelijski-posredovan odgovor" odnosi se na odgovor posredovan T ćelijama, uključujući efektorske T ćelije (npr., CD8<+>ćelije) i pomoćne T ćelije (npr., CD4<+>ćelije). Odgovor posredovan T ćelijama uključuju, na primer, citotoksičnost i proliferaciju T ćelija.

[0118] Kako se ovde koristi, pojam "odgovor citotoksičnih T limfocita (CTL)" odnosi se na imunološki odgovor indukovan citotoksiškim T ćelijama. CTL odgovori su primarno posredovani CD8<+>T ćelijama.

[0119] Kako se ovde koristi, pojmovi "inhibira" ili "blokira" (npr., koji se odnose na inhibiciju/blokiranje vezivanja OX40-L za OX40 na ćelijama) se koriste naizmenično i obuhvataju i delimičnu i potpunu inhibiciju/blokiranje. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo inhibira vezivanje OX40-L za OX40 za najmanje 50%, na primer, oko 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100%, određeno, npr., kao što je dalje opisano ovde. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo inhibira vezivanje OX40-L za OX40 za najmanje oko 50%, na primer, za oko 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ili 1%, određeno, npr., kao što je dalje opisano ovde.

[0120] Kako se ovde koristi, pojam "inhibira rast" tumora uključuje svako merljivo smanjenje rasta tumora, npr., inhibiciju rasta tumora za najmanje oko 10%, na primer, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 99%, ili 100%.

[0121] Kako se ovde koristi, "kancer" se odnosi na široku grupu bolesti koje karakteriše nekontrolisani rast abnormalnih ćelije u telu. Neregulisana podela ćelija može dovesti do stvaranja malignih tumora ili ćelija koje napadaju susedna tkiva i mogu metastazirati u udaljene delove tela kroz limfni sistem ili krvotok.

[0122] Pojmovi "lečiti", "lečenje" i "tretman", kako se ovde koriste, odnose se na bilo koju vrstu intervencije ili procesa koji se izvodi na, ili administriranje aktivnog agensa, subjektu sa ciljem preokretanja, ublažavanja, poboljšanja, inhibiranja ili usporavanja ili sprečavanja progresije, razvoja, ozbiljnosti ili ponovnog pojavljivanja simptoma, komplikacija, stanja ili biohemijskih indicija povezanih sa bolešću. Profilaksa se odnosi na administriranje subjektu koji nema bolest, da se spreči pojava bolesti ili umanje njene posledice ako je ima.

[0123] "Hematološki malignitet" uključuje limfom, leukemiju, mijelom ili limfoidni malignitet, kao i kancer slezine i limfnih čvorova. Primeri limfoma uključuju i limfome B ćelija (hematološki kancer B-ćelija) i limfome T ćelija. B-ćelijski limfomi uključuju i Hodgkin-ove limfome i većinu ne-Hodgkin-ovih limfoma. Neograničavajući primeri limfoma B ćelija uključuju difuzni veliki B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom limfnog tkiva povezan sa sluzokožom, limfocitni limfom malih ćelija (preklapa se sa hroničnom limfocitnom leukemijom), limfom ćelija plašta (MCL - mantle cell lymphoma), Burkitt-ov limfom, Medijastinalni limfom velikih B ćelija, Waldenström-ovu makroglobulinemiju, nodalni limfom marginalne zone B ćelija, limfom marginalne zone slezine, intravaskularni veliki B-ćelijski limfom, primarni efuzijski limfom, limfomatoidna granulomatoza. Neograničavajući primeri limfoma T ćelija uključuju ekstranodalni limfom T ćelija, kožni T ćelijski limfom, anaplastični limfom velikih ćelija, i angioimunoblastični limfom T ćelija. Hematološki maligniteti takođe uključuju leukemiju, kao što je, ali bez ograničenja, sekundarna leukemija, hronična limfocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija, hronična mijelogena leukemija, i akutna limfoblastna leukemija. Hematološki maligniteti dalje uključuju mijelome, kao što su, ali ne ograničavajući se na, multipli mijelom i tinjajući multipli mijelom. Drugi hematološki i/ili kanceri povezani sa B ćelijama ili T ćelijama su obuhvaćeni pojmom hematološki malignitet.

[0124] Pojam "efikasna doza" ili "efikasno doziranje" je definisan kao količina dovoljna da se postigne ili bar delimično postigne željeni efekat. "Terapijski efikasna količina" ili "terapijski efikasna doza" leka ili terapijskog agensa je bilo koja količina leka koja, kada se koristi sama ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, promoviše regresiju bolesti što je dokazano smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevencijom oštećenja ili invaliditeta usled bolesti.

[0125] U odnosu na solidne tumore, efikasna količina obuhvata količinu dovoljnu da izazove skupljanje tumora i/ili da smanji brzinu rasta tumora (kao što je suzbijanje rasta tumora) ili da spreči ili odloži drugu neželjenu proliferaciju ćelija. U određenim tehničkim rešenjima, efikasna količina je količina dovoljna da odloži razvoj tumora. U nekim tehničkim rešenjima, efikasna količina je količina dovoljna da spreči ili odloži ponavljanje tumora. Efikasna količina se može administrirati pri jednom ili više administriranja. Efikasna količina leka ili kompozicije može: (i) smanjiti broj ćelija kancera; (ii) smanjiti veličinu tumora; (iii) inhibirati, odložiti, usporiti, do neke mere i može zaustaviti infiltracija ćelija kancera u periferne organe; (iv) inhibirati, tj. usporiti do neke mere i može zaustaviti metastaze tumora; (v) inhibirati rast tumora; (vi) sprečiti ili odložiti pojavu i/ili ponovnu pojavu tumora; i/ili (vii) ublažiti do neke mere jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom. U jednom primeru, "efikasna količina" je količina anti-OX40 antitela i količina anti-PD-1 antitela (npr., nivolumab) ili anti-CTLA-4 antitela (npr., ipilimumab), koja u kombinaciji, klinički je dokazano da utiče na značajno smanjenje kancera ili usporavanje progresije kancera, kao što je uznapredovali solidni tumor. Kako se ovde koristi, pojmovi "fiksna doza", "ravna (flat) doza" i "ravna-fiksna doza" se koriste naizmenično i odnose se na dozu koja se daje pacijentu bez obzira na težinu ili površinu tela (BSA - body surface area) pacijent. Fiksna ili ravna doza se stoga ne daje kao doza mg/kg, već kao apsolutna količina agensa.

[0126] Kako se ovde koristi, "doza zasnovana na površini tela (BSA)" se odnosi na dozu koja je prilagođena površini tela (BSA) pojedinačnog pacijenta. Doza zasnovana na BSA može se dati kao mg/kg telesne težine. Objavljeni su različiti proračuni da bi se došlo do BSA bez direktnog merenja, od kojih je najčešće korišćena Du Bois-ijeva formula (videti Du Bois D, Du Bois EF (Jun 1916) Archives of Internal Medicine 17 (6): 863-71; iVerbraecken, J. I sar. (Apr 2006). Metabolism - Clinical and Experimental 55 (4): 515-24). Druge BSA formule uzete kao primer uključuju Mostelter-ovu formulu (Mosteller RD. N Engl J Med., 1987; 317:1098), Haycock-ovu formulu (Haycock GB, i sar., J Pediatr 1978, 93:62-66), Gehan i George-ovu formula (Gehan EA, George SL, Cancer Chemother Rep 1970, 54:225-235), Boyd-ovu formulu (Current, JD (1998), The Internet Journal of Anesthesiology 2 (2); i Boyd, Edith (1935), Univerzitet Minnesote. The Institute of Child Welfare, Monograph Series, br. x. London: Oxford University Press), Fujimotovu formulu (Fujimoto S, i sar., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50), Takahira formulu (Fujimoto S, i sar., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50), i Schlich-ovu formulu (Schlich E, i sar., Ernährungs Umschau 2010;57:178-183).

[0127] "Profilaktički efikasna količina" ili "profilaktički efikasna doza" leka je količina leka koja se, kada se administrira sama ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, subjektu koji je u riziku da razvije bolest ili pati od ponovnog pojavljivanja bolesti, inhibira razvoj ili ponovno pojavljivanje bolesti. Sposobnost terapijskog ili profilaktičkog agensa da promoviše regresiju bolesti ili inhibira razvoj ili ponovno pojavljivanje bolesti može se proceniti korišćenjem različitih postupaka poznatih kvalifikovanom praktičaru, kao što je kod ljudskih subjekata tokom kliničkih ispitivanja, u sistemima životinjskih modela koji predviđaju efikasnost kod ljudi, ili ispitivanjem aktivnosti agensa u in vitro testovima.

[0128] Na primer, agens protiv kancera je lek koji usporava progresiju kancera ili promoviše regresiju kancera kod subjekta. U poželjnim tehničkim rešenjima, terapijski efikasna količina leka promoviše regresiju kancera do tačke eliminacije kancera. "Promovisanje regresije kancera" znači da administriranje efikasne količine leka, samog ili u kombinaciji sa anti-neoplastičnim agensom, dovodi do smanjenja rasta ili veličine tumora, nekroze tumora, smanjenja težine najmanje jednog simptoma bolesti, povećanje učestalosti i trajanja perioda bolesti bez simptoma, prevencije oštećenja ili invaliditeta usled bolesti, ili na drugi način ublažavanja simptoma bolesti kod pacijenta. Farmakološka efikasnost se odnosi na sposobnost leka da promoviše regresiju kancera kod pacijenta. Fiziološka bezbednost se odnosi na prihvatljivo nizak nivo toksičnosti, ili drugih štetnih fizioloških efekata na nivou ćelije, organa i/ili organizma (štetni efekti) koji su rezultat administriranja leka.

[0129] Kao primer za lečenje tumora, terapijski efikasna količina ili doza leka poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, poželjnije za najmanje oko 40%, još poželjnije za najmanje oko 60%, i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na netretirane subjekte. U najpoželjnijim tehničkim rešenjima, terapeijski efikasna količina ili doza leka potpuno inhibira rast ćelija ili rast tumora, tj., poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za 100%. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora se može proceniti korišćenjem testova opisanih u nastavku. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije se može proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija, takva inhibicija se može meriti in vitro testovima poznatim kvalifikovanom praktičaru. U drugim poželjnim tehničkim rešenjima opisanim ovde, regresija tumora se može primetiti i može se nastaviti tokom perioda od najmanje oko 20 dana, poželjnije najmanje oko 40 dana, ili još poželjnije najmanje oko 60 dana.

[0130] Pojmovi "pacijent" i "subjekat" odnose se na bilo kog čoveka ili životinju koja prima bilo profilaktički ili terapijski tretman. Na primer, postupci i kompozicije opisane ovde mogu da se koriste za lečenje subjekta ili pacijenta koji boluje od kancera, kao što je uznapredovali solidni tumor. Pojam "životinja" uključuje sve kičmenjake, npr., sisare i koje nisu sisari, kao što su primati koji nisu ljudi, ovce, psi, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.

[0131] Različiti aspekti opisani ovde su detaljnije opisani u sledećim pododeljcima.

I. Anti-OX40 antitela

[0132] Ovde su opisana antitela, npr., potpuno humana antitela, koja su okarakterisana posebnim funkcionalnim karakteristikama ili svojstvima. Na primer, antitela specifično vezuju humani OX40. Pored toga, antitela mogu unakrsno da reaguju sa OX40 od jednog ili više primata koji nisu ljudi, kao što je cinomolgus OX40. Takva antitela su korisna u lečenju kancera kada se koriste kao monoterapija ili kada se koriste u kombinaciji sa imunoonkološkim agensom, kao što je anti-PD-1 antitelo (npr., nivolumab) ili anti-CTLA-4 antitelom (npr., ipilimumab).

[0133] Anti-OX40 antitela opisana ovde pokazuju jedno ili više ili sva sledeća funkcionalna svojstva:

(1) vezivanje za rastvorljivi humani OX40, npr., sa KDod 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po BIACORE<®>SPR analizi;

(2) vezivanje za humani OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 1 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 1 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(3) vezivanje za cinomolgus OX40, npr., vezivanje za cinomolgus OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(4) izazivanje ili pojačavanje aktivacije T ćelija, o čemu svedoči (i) povećana proizvodnja IL-2 i/ili IFN-γ u OX40-eksprimirajućim T ćelijama i/ili (ii) pojačana proliferacija T ćelija; (5) inhibiranje vezivanja OX40 liganda za OX40, npr., sa EC50od 1 nM ili manje kao što je mereno po FACS, npr., u testu sa hOX40-293 ćelijama;

(6) vezivanje za epitop na ekstracelularnom delu zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2), npr., epitop unutar regiona DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) ili

DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) takmičenje za vezivanje za humani OX40 sa 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11, 20B3, i 20C1;

(8) takmičenje za vezivanje za humani OX40 sa 6E1-1, 6E1-2, 14A2-1, i 14A2-2.

[0134] Poželjno, antitela se vezuju za OX40 sa visokim afinitetom, na primer, sa KDod 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-11>M ili manje, 10<-12>M ili manje, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-7>M, ili 10<-9>M do 10<-7>M. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se vezuje za rastvorljivi human iOX40, npr., kao što je određeno po BIACORE<®>SPR analizi, sa KDod 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M (1 nM) ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-7>M, 10<-9>M do 10<-7>M, ili 10<-8>M do 10<-7>M. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se vezuje za vezan (npr., vezan za membranu ćelije) humani OX40, kao što je na aktivirane humane T ćelije, npr., kao što je određeno sa protočnom citometrijom, sa KDod 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M (1 nM) ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-8>M, 10<-10>M do 10<-8>M, 10<-9>M do 10<-8>M, 10<-11>M do 10<-9>M, ili 10<-10>M do 10<-9>M. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se vezuje za vezan (npr., vezan za membranu ćelije) humani OX40, kao što je na aktivirane humane T ćelije, npr., kao što je određeno po FACS, sa EC50od 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M (1 nM) ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-8>M, 10<-10>M do 10<-8>M, 10<-9>M do 10<-8>M, 10<-11>M do 10<-9>M, ili 10<-10>M do 10<-9>M. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se vezuje za rastvorljivi humani OX40 sa KDod 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M (1 nM) ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-7>M, 10<-10>M do 10<-7>M, 10<-9>M do 10<-7>M, ili 10<-8>M do 10<-7>M, i za humani OX40 vezan za membranu sa KDili EC50od 10<-7>M ili manje, 10<-8>M ili manje, 10<-9>M (1 nM) ili manje, 10<-10>M ili manje, 10<-12>M do 10<-7>M, 10<-11>M do 10<-8>M, 10<-10>M do 10<-8>M, 10<-9>M do 10<-8>M, 10<-11>M do 10<-9>M, ili 10<-10>M do 10<-9>M.

[0135] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu da se vezuju za cinomolgus OX40, npr., vezuju se za cinomolgus OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 100 nM do 0.01 nM, 100 nM do 0.1 nM, 100 nM do 1 nM, ili 10 nM do 1 nM, npr., kao što je mereno po FACS (npr., kao što je opisano u primerima).

[0136] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu da stimulišu ili poboljšaju imunološki odgovor, npr., aktiviranjem Teffćelija, ograničavanjem supresije T efektorskih ćelija Treg ćelijama, iscrpljivanjem i/ili inhibiranjem tumorskih Treg ćelije i/ili aktiviranjem NK ćelija, npr., u tumoru. Na primer, anti-OX40 antitela mogu da aktiviraju ili kostimulišu Teffćelije, kao što se vidi, npr., pojačanom sekrecijom citokina (npr., IL-2 i IFN- γ) i/ili pojačanom proliferacijom. U određenim tehničkim rešenjima, CD3 stimulacija je takođe obezbeđena. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo OX40 povećava sekreciju IL-2 za faktor od 50%, 100% (tj., 2 puta), 3 puta, 4 puta, 5 puta ili više, po izboru sa maksimalno do 10 puta, 30 puta, 100 puta, kako što je mereno, npr., na primarnim humanim T ćelijama ili T ćelijama koje eksprimiraju humani OX40 (npr., kao što je dalje opisano u primerima). U određenim tehinčkim rešenjima, OX40 antitelo povećava sekreciju IFN- γ sa faktorom od 50%, 100% (tj., 2 puta), 3 puta, 4 puta, 5 puta ili više, po izboru sa maksimumom do 10 puta, 30 puta, 100 puta, kao što je mereno, npr., na primarnim humanim T ćelijama ili T ćelijama koje eksprimiraju humani OX40 (npr., kao što je dalje opisano u primerima).

[0137] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu inhibirati vezivanje humanog OX40L za humani OX40 na ćelijama, npr., 293 ćelijama koje eksprimiraju humani OX40 (tj., hOX40-293 ćelijama), npr., sa EC50od 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 0.01 nM do 10 nM, 0.1 nM do 10 nM, ili 0.1 nM do 1 nM (videti primer 6).

[0138] Anti-OX40 antitela opisana ovde se vezuju za epitop na OX40, kao što je određeno, na primer, vezivanjem za fragmente humanog OX40. Na primer, u određenim tehničkim rešenjima, antitelo se veže za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) humanog OX40 (SEQ ID NO: 2) kao što je određeno, na primer, sa HDX ili vezivanjem antitela za fragmente humanog OX40, nakon ćega sledi enzimsko cepanje (videti primer 11). U drugim tehničkim rešenjima, antitelo se vezuje za celu ili deo sekvence DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179) humanog OX40 (SEQ ID NO: 2).

[0139] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde se vezuju za za celu ili deo sekvence SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 182).

[0140] U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde se vezuju za celu ili deo sekvence PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183).

[0141] U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela koja se vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) dalje se vezuju za celu ili deo sekvence QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184).

[0142] U dodatnim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde se vezuju za celu ili deo sekvence SQNTVCRPCGPGFYN (SEQ ID NO: 185).

[0143] Anti-OX40 antitela opisana ovde se mogu takmičiti za vezivanje za OX40 sa (ili inhibirati vezivanje) anti-OX40 antitelima koja sadrže CDR ili varijabilne regione opisane ovde, npr., 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i/ili 20C1. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela inhibiraju vezivanje 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i/ili 20C1 za humani OX40 za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U određenim tehničkim rešenjima za koja se ne traži zaštita, 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A21, 14A2-2, i 20C1 inhibira vezivanje anti-OX40 antitela za humani OX40 za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.

[0144] U određenim tehničkim rešenjima, antitela indukuju ili pojačavaju aktivaciju T ćelija multivalentnim unakrsnim povezivanjem kroz, npr., FcR vezivanje. U određenim tehničkim rešenjima, antitela su multivalentna, npr, dvovalentna. U određenim tehničkim rešenjima, antitela nisu monovalentna.

[0145] U određenim tehničkim rešenjima, antitela imaju 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 od sledećih svojstava:

(1) vezivanje za rastvorljivi humani OX40, npr., sa KDod 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po BIACORE<®>SPR analizi;

(2) vezivanje za humani OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 1 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 1 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(3) vezivanje za cinomolgus OX40, npr., vezivanje za cinomolgus OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(4) izazivanje ili pojačavanje aktivacije T ćelija, o čemu svedoči (i) povećana proizvodnja IL-2 i/ili IFN-γ u OX40-eksprimirajućim T ćelijama i/ili (ii) pojačana proliferacija T ćelija; (5) inhibiranje vezivanja OX40 liganda za OX40, npr., sa EC50od 1 nM ili manje kao što je mereno po FACS, npr., u testu sa hOX40-293 ćelijama;

(6) vezivanje za epitop na ekstracelularnom delu zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2), npr., epitop unutar regiona DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) ili

DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) takmičenje za vezivanje za humani OX40 sa 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11, 20B3, i 20C1;

(8) takmičenje za vezivanje za humani OX40 with 6E1-1, 6E1-2, 14A2-1, i 14A2-2.

[0146] Shodno tome, smatraće se da se antitelo koje pokazuje jedno ili više ovih funkcionalnih svojstava (npr. biohemijske, imunohemijske, ćelijske, fiziološke ili druge biološke aktivnosti, ili slično) kao što je određeno u skladu sa metodologijama poznatim u oblasti i opisanim ovde, odnosi na statistički značajne razlike u određenoj aktivnosti u odnosu na onu koja se vidi u odsustvu antitela (npr., ili kada je prisutno kontrolno antitelo irelevantne specifičnosti). Poželjno, anti-OX40 antitelo povećava izmereni parametar (npr., proliferaciju T ćelija, proizvodnju citokina) za najmanje 10% izmerenog parametra, poželjnije za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70%, 80%, 90%, 95%, 100% (tj., 2 puta), 3 puta, 5 puta ili 10 puta. Nasuprot tome, antitelo može da smanji izmereni parametar (npr., zapreminu tumora, vezivanje OX40-L za OX40, količinu regulatornih T ćelija u tumorima) za najmanje 10% izmerenog parametra, poželjnije za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90%, 95%, ili 99%.

[0147] Standardni testovi za procenu sposobnosti vezivanja antitela za OX40 različitih vrsta su poznati u oblasti, uključujući, na primer, ELISA, Western blotove, i RIA. Pogodni testovi su detaljno opisani u primerima. Kinetika vezivanja (npr., afinitet vezivanja) antitela se takođe može proceniti standardnim testovima poznatim u oblastima, kao što je BIACORE® SPR analiza. Testovi za procenu efekata antitela na funkcionalna svojstva od OX40 (npr., vezivanje liganda, proliferacija T ćelija, proizvodnja citokina) su detaljnije opisani u nastavku i u primerima.

[0148] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela nisu nativna antitela ili nisu antitela koje se javljaju u prirodi, npr., anti-OX40 antitela sa post-translacionim modifikacijama koje se razlikuju od onih od antitela koja se javljaju u prirodi, kao što je da imaju više, manje, ili drugačiju vrstu post-translacione modifikacije.

II. Anti-OX40 antitela uzeta kao primer

[0149] Antitela za koja se zahteva zaštita imaju sekvencu VHi VLnavedenu u SEQ ID NO: 318 i 94 redom. Posebna antitela koja su takođe ovde opisana su antitela, npr., monoklonska antitela, koja imaju CDR i/ili sekvence varijabilnog regiona antitela 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1, izolovana i strukturno okarakterisana kao što je opisano u primeru 1, kao i antitela koja imaju najmanje 80% identičnosti (npr., najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identičnosti sa sekvencama varijabilnog regiona ili CDR antitela 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1. Aminokiselinske sekvence iz VHod 3F4, 14B6 (14B6-1 i 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 i 6E1-2), 18E9, 8B11, 20B3, 14A2 (14A2-1 i 14A2-2), i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 17, 28, 37, 48, 57, 65, 73, 84, i 93, redom. Aminokiselinske sekvence iz VLod 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 18, 29, 30, 38, 49, 50, 58, 66, 74, 85, 86, i 94, redom.

[0150] Shodno tome, ovde su predviđena antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili antigen vezujući deo istih, koja sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 17, 28, 37, 48, 57, 65, 73, 84, i 93.

[0151] Ovde su takođe predviđena antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili antigen vezujući deo istih, koja sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18, 29, 30, 38, 49, 50, 58, 66, 74, 85, i 86.

[0152] Ovde su predviđena antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili antigen vezujući deo istih, koja sadrže: sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 17 i 18; 28 i 29; 28 i 30; 37 i 38; 48 i 49; 48 i50; 57 i 58; 65 i 66; 73 i 74; 84 i 85; 84 i 86; 93 i 94.

[0153] Anti-OX40 antitela za koja se ne zahteva zaštita opisana ovde mogu da sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 regione teškog i lakog lakog od 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1, ili njihove kombinacije. Aminokiselinske sekvence CDR1 regiona iz VHod 3F4, 14B6 (14B6-1 i 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 i 6E1-2), 18E9, 8B11, 20B3, 14A2 (14A2-1 i 14A2-2), i 20C1 su navedene uSEQ ID NOs: 11, 19, 31, 39, 51, 59, 67, 75, i 87, redom. Aminokiselinske sekvence CDR2 regiona iz VHod 3F4, 14B6 (14B6-1 i 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 i 6E1-2), 18E9, 8B11, 20B3, 14A2 (14A2-1 i 14A2-2), i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 12, 20, 32, 40, 52, 60, 68, 76, i 88, redom. Aminokiselinske sekvence CDR3 regiona iz VHod 3F4, 14B6 (14B6-1 i 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 i 6E1-2), 18E9, 8B11, 20B3, 14A2 (14A2-1 i 14A2-2), i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 13, 21, 33, 41, 53, 61, 69, 77, i 89. Aminokiselinske sekvence CDR1 regiona iz VLod 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 14, 22, 25, 34, 42, 45, 54, 62, 70, 78, 81, i 90, redom. Aminokiselinske sekvence CDR2 regiona iz VLod 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 15, 23, 26, 35, 43, 46, 55, 63, 71, 79, 82, i 91, redom. Aminokiselinske sekvence CDR3 regiona iz VLod 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1 su navedene u SEQ ID NOs: 16, 24, 27, 36, 44, 47, 56, 64, 72, 80, 83, i 92, redom. CDR regioni su ocrtani korišćenjem Kabat sistema (Kabat, E. A, i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i usluga stanovništvu SAD-a, NIH objava br. 91-3242).

[0154] Imajući u vidu da se svako od ovih antitela vezuju za OX40 i da je specifičnost vezivanja antigena obezbeđuju primarno od CDR1, 2 i 3 regiona, sekvence CDR1, 2 i 3 iz VHi sekvence CDR1, 2 i 3 iz VLmogu se "pomešati i upariti" (tj., CDR regioni iz različitih antitela mogu se pomešati i upariti, iako svako antitelo mora da sadrži CDR1, 2 i 3 iz VHi CDR1, 2 i 3 iz VL) da stvore druga anti-OX40 vezujuća antitela. OX40 vezivanje takvih " pomešanih i uparenih" antitela može se testirati korišćenjem testova vezivanja opisanih iznad i u primerima (npr., ELISA testovi). Poželjno, kada su sekvence CDR iz VHpomešane i uparene, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz određene sekvence iz VHse zamenjuju sa strukturno sličnom(im) sekvencom(ama) CDR. Slično, kada su sekvence CDR iz VLpomešane i uparene, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz određene sekvence iz VLpoželjno se zamenjuju sa strukturno sličnom(im) sekvencom(ama) CDR. Običnom stručnjaku će biti jasno da se nove sekvence iz VHi VLmogu kreirati zamenom jedne ili više sekvenci CDR regiona iz VHi/ili VLsa strukturno sličnim sekvencama iz sekvenci CDR koje su ovde stavljene na uvid za monoklonalna antitela 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1. "Mešana i uparena" antitela koja imaju afinitet vezivanja, bioaktivnost i/ili druga svojstva koja su ekvivalentna ili superiorna u odnosu na specifična antitela koja su ovde stavljena na uvid, mogu se odabrati za primenu u postupcima predmetnog pronalaska.

[0155] Ovde su predviđena izolovana antitela za koja se ne zahteva zaštita, ili antigen vezujući deo istih koji sadrži:

(a) CDR1 varijabilini region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11, 19, 31, 39, 51, 59, 67, 75, i 87;

(b) CDR2 varijabilini region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 12, 20, 32, 40, 52, 60, 68, 76, i 88;

(c) CDR3 varijabilini region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 13, 21, 33, 41, 53, 61, 69, 77, i 89;

(d) CDR1 varijabilini region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 22, 25, 34, 42, 45, 54, 62, 70, 78, 81, i 90; (e) CDR2 varijabilini region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 15, 23, 26, 35, 43, 46, 55, 63, 71, 79, 82, i 91; i (f) CDR3 varijabilini region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 16, 24, 27, 36, 44, 47, 56, 64, 72, 80, 83, i 92; pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani OX40.

[0156] Antitelo za koja se zahteva zaštita sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži:

sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 87, 317, i 89, redom, i sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koje sadrže SEQ ID NOs: 90-92, redom;

pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani OX40.

[0157] VH domen, ili jedan ili više CDR istog, opisanih ovde mogu biti povezani sa konstantnim domenom za formiranje teškog lanca, npr., teškog lanca pune dužine. Slično, VL domen, ili jedan ili više CDR istog, opisanih ovde mogu biti povezani sa konstantnim domenom za formiranje lakog lanca, npr., lakog lanca pune dužine. Teški lanac pune dužine (sa izuzetkom C-terminalnog lizina (K) ili sa izuzetkom C-terminalnog glicina i lizina (GK), koji mogu biti odsutni) i laki lanac pune dužine kombinuju se da formiraju antitelo pune dužine. N-terminalni ostaci glutamina i glutamata se takođe mogu konvertovati u ostatke piroglutamata i na lakim i na teškim lancima.

[0158] VH domen opisan ovde može biti fuzionisan sa konstantnim domenom humanog IgG, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, koji su ili koji se juavljaju u prirodi ili modifikovani, npr., kao što je dalje ovde opisano. Na primer, teški lanac može da sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kog VH domena opisanog ovde fuzionisanu sa aminokiselinskom sekvencom humanog IgG1 navedenom u SEQ ID NO: 5.

[0159] Konstantni domen humanog IgG1 može takođe biti onaj od alotipske varijante. Na primer, Na primer, alotipska varijanta IgG1 obuhvata R107K, E189D i M191L (podvučeno iznad, sa numerisanjem prema onom u SEQ ID NO: 6). Unutar teškog regiona pune dužine, ove aminokiselinske supstitucije su označene brojevima R214K, E356D i M358L.

[0160] VL domen opisan ovde može biti fuzionisan sa konstantnim domenom humanog kapa ili lambda lakog lanca. Na primer, laki lanac može da sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kog VL domena opisanog ovde fuzinisanu sa aminokiselinskom sekvencom kapa lakog lanca humanog IgG1 navedenom u SEQ ID NO: 7.

[0161] U određenim tehničkim rešenjima, konstantni region teškog lanca sadrži lizin ili drugu amonokiselinu na C-terminusu, npr., sadrži sledeće poslednje aminokiseline: LSPGK (SEQ ID NO: 8) za teški lanac. U određenim tehničkim rešenjima, konstantnom regionu teškog lanca nedostaje jedna ili više aminokiselina na C-terminusu i ima, npr., C-terminalnu sekvencu LSPG (SEQ ID NO: 9) ili LSP.

[0162] Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca antitela za koje se zahteva zaštita i ne zahteva zaštita su navedene u tabeli 23 i odgovaraju SEQ ID NOs: 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 124 i 125 za teške lance i SEQ ID NOs: 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, i 122 za lake lance.

[0163] Teški i laki lansi koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ili 70% identična bilo kom od teških i lakih lanaca navedenih u tabeli 23 (ili njihovi varijabilni regioni), npr., SEQ ID NOs: 95 i 96; 97 i 98; 99 i 100; 101 i 102; 103 i 104; 105 i 106; 107 i 108; 109 i 110; 111 i 112; 113 i 114; 115 i 116; 117 i 118; 119 i 120; 121 i 122; 123 i 116; 124 i 116; i 125 i 116 mogu se koristiti za formiranje anti-humanih OX40 antitela koja imaju željene karakteristike, npr., one dalje opisane ovde. Varijante uzete kao primer su one koje sadrže alotipsku varijantu, npr., u konstantnom domenu, i/ili mutaciju u varijabilnim ili konstantnim regionima, kao što su mutacije ovde stavljene na uvid. Teški i laki lanci koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje u najviše 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 aminokiselini (supstitucijom, adicijom ili delecijom) od bilo kog od teških i lakih lanaca navedenih u tabeli 23 (ili njihovi varijabilni regioni) mogu se koristiti za formiranje anti-humanih OX40 antitela koja imaju željene karakteristike, npr., ona dalje opisana ovde.

[0164] U različitim tehničkim rešenjima, antitela opisana gore pokazuju jedno ili više, dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili sva sledeća funkcionalna svojstva:

(1) vezivanje za rastvorljiv humani OX40, npr., sa KDod 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po Biacore;

(2) vezivanje za humani OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 1 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 1 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(3) vezivanje za cinomolgus OX40, npr., vezivanje za cinomolgus OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(4) izazivanje ili pojačavanje aktivacije T ćelija, o čemu svedoči (i) povećana proizvodnja IL-2 i/ili IFN-γ u OX40-eksprimirajućim T ćelijama i/ili (ii) pojačana proliferacija T ćelija; (5) inhibiranje vezivanja OX40 liganda za OX40, npr., sa EC50od 1 nM ili manje kao što je mereno po FACS, npr., u testu sa hOX40-293 ćelijama;

(6) vezivanje za epitop na ekstracelularnom delu zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2), npr., epitop unutar regiona DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) ili

DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179); (7) competing for vezivanje za human OX40 with 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11, 20B3, i 20C1;

(8) takmičenje za vezivanje za humani OX40 sa 6E1-1, 6E1-2, 14A2-1, i 14A2-2.

[0165] Takva antitela uključuju, na primer, humana antitela, humanizovana antitela, ili himerna antitela.

[0166] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde se vezuju za aminokiselinske ostatke unutar sledećeg regiona zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2): DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178), koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 46-62 zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2).

[0167] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde se vezuju za aminokiselinske ostatke unutar sledećeg regiona zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2): DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179), koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 89-124 zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2).

[0168] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde koja se vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) se vezuju za celu ili deo sekvence SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 182).

[0169] U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde koja se vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) se vezuju za celu ili deo sekvence PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183).

[0170] U još drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela kojase vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) dalje se vezuju za celu ili deo sekvence QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184).

[0171] U dodatnim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde koja se vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) dalje se vezuju za celu ili deo sekvence SQNTVCRPCGPGFYN (SEQ ID NO: 185).

Modifikovani konstantni domeni teškog lanca

[0172] Konstantni region teškog lanca anti-OX40 antitela opisanih ovde može biti bilo kog izotipa, npr., IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, ili njihove kombinacije i/ili njihove modifikacije. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela sadrže modifikovani konstantni region teškog lanca koji menja svojstva antitela.

[0173] Kao što je dalje diskutovano ovde i u Ppimerima, unakrsno povezivanje anti-OX40 antitela sa nemodifikovanim hIgG1 konstantnim regionima (hIgG1 izotipska antitela) indukuje OX40 signalizaciju i promoviše aktivaciju T ćelija, a posebno za promovisanje proliferacije T ćelija, sekrecija IFN-γ, i sekrecija IL-2. Unakrsno povezivanje se može desiti, npr., vezivanjem za humane CD32A Fc γ receptore (FcγR) eksprimirane na površini transfektovanih CHO ćelija u testu koji koristi kokulture CHO-CD3-CD32A ćelija i humanih primarnih CD4 T ćelija. Unakrsno povezivanje se takođe može desiti, npr., dodavanjem rastvorljivog poliklonskog anti-humanog Fc γ antitela u kulturama humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC - peripheral blood mononuclear cell) aktiviranih enterotoksinom B stafilokoka (SEB - staphyloccus enterotoxin B).

[0174] Anti-OX40 antitela sa modifikovanim konstantnim regionima teškog lanca (npr., IgG1 konstantni region gde je CH1/zglobni region zamenjen sa hIgG2 CH1/zglobnim regionom) mogu imati sposobnost da promene aktivnosti antitela u odnosu na antitela sa potpunim IgG1 konstantnim regionom teškog lanca. Primeri aktivnosti koje se mogu promeniti uključuju, ali nisu ograničene na, (1) aktivaciju T ćelija u prisustvu ili odsustvu unakrsnog povezivanja, (2) proliferaciju T ćelija u prisustvu ili odsustvu unakrsnog povezivanja, i/ili ( 3) sekreciju citokina (npr., IFN-y, IL-2) u prisustvu ili odsustvu unakrsnog povezivanja. Metode opisane u primerima se mogu koristiti da se utvrdi da li anti-OX40 antitela sa modifikovanim konstantnim regionima teškog lanca pokazuju ove izmenjene aktivnosti (videti, npr., primer 27). U poželjnim tehničkim rešenjima, ove izmenjene aktivnosti ne utiču značajno na svojstva za vezivanja antigena antitela, što se može proceniti korišćenjem, npr., FACS, SPR).

[0175] Shodno navedenom, ovde su predviđeni postupci za promenu aktivnosti anti-OX40 antitela koji obuhvataju obezbeđivanje anti-OX40 antitela koje imzglob koji nije IgG2, i zamenu zgloba koji nije IgG2 sa IgG2 zglobom. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži zglob IgG2 izotipa ("IgG2 zglob") i CH1, CH2 i CH3 domen. U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni rgion teškog lanca sadrži IgG2 zglob i CH1, CH2 i CH3 domen, gden najmanje jedan od CH1, CH2 i CH3 domena nije IgG2 izotipa. IgG2 zglob može biti IgG2 zglob divljeg tipa, npr., humani IgG2 zglob divljeg tipa (npr., ERKCCVECPPCPAPPVAG; SEQ ID NO: 208) ili njegova varijanta, pod uslovom da IgG2 zglob zadržava sposobnost da antitelu dodeli izmenjenu aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži zglob koji nije IgG2. U određenim tehničkim rešenjima, varijante IgG2 zgloba zadržavaju sličnu rigidnost ili krutost kao i IgG2 zglob divljeg tipa. Rigidnost zglob se može odrediti, npr., kompjuterskim modelovanjem, elektronskom mikroskopijom, spektroskopijom kao što je nuklearna magnetna rezonanca (NMR), rendgenska kristalografija (B-faktori), ili analitička ultracentrifugacija za brzinu sedimentacije (AUC) za merenje ili poređenje radijusa rotacije antitela koji sadrži zglob. Zglob može imati sličnu ili veću rigidnost u odnosu na drugi zglob ako je antitelo koje sadrži zglob ima vrednost dobijenu iz jednog od testova opisanih u prethodnoj rečenici koja se razlikuje od vrednosti istog antitela sa različitim zglobom, npr., IgG1 zglobom, za manje od 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, ili 100%. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti bi mogla da utvrdi iz testova da li zglob ima bar sličnu rigidnost onoj drugog zgloba tumačenjem rezultata ovih testova. Varijanta humanog IgG2 jzgloba uzeta kao primer je IgG2 zglob koji sadrži supstituciju jednog ili više od četiri cisteinska ostatka (tj., C219, C220, C226 i C229). Cistein se može zameniti serinom. IgG2 zglob uzet kao primer je humani IgG2 zglob koji sadrži mutaciju C219S (npr., ERKSCVECPPCPAPPVAG; SEQ ID NO: 209). Druge varijante IgG2 zgloba koje se mogu koristiti uključuju humane IgG2 zglobove koje sadrže C220, C226 i/ili C229 supstituciju, npr., C220S, C226S ili C229S mutaciju (koja se može kombinovati sa C219S mutacijom). IgG2 zglob može takođe biti IgG2 zglob u kojoj je deo zgloba onaj od drugog izotipa (tj., to je himerni zglob), pod uslovom da je rigidnost himernog zgloba barem slična onoj kod IgG2 zgloba divljeg tipa. Na primer, IgG2 zglob može biti IgG2 zglob u kojoj je donji zglob (kao što je definisana u tabeli 2) IgG1 izotipa i, npr., IgG1 donji zglob divljeg tipa. Dodatne mutacije IgG2 zgloba koje se mogu koristiti u IgG2 zglobu uključuju SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E),

[0176] SEFF i GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) mutacije.

[0177] "Hibridni" ili "himerni" zglob se označava kao specifičan izotip ako je više od polovine uzastopnih aminokiselinzgloba iz tog izotipa. Na primer, zglob koji ima gornji i srednji zglob od IgG2 i donji zglob od IgG1 smatra se IgG2 zglobom.

[0178] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob koji sadržei jednu od sledećih sekvenci:

ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 208);

ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 209);

ERKCSVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 210);

ERKXCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 211);

ERKCXVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 212);

ERKCCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 213);

ERKSCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 214);

ERKCSVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 215);

ERKXCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 216);

ERKCXVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 217);

ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 218);

ERKSCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 219);

ERKCCSVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 220);

ERKXCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 221);

ERKCXVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222);

ERKCCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 223);

ERKSCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 224);

ERKCCSVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 225);

ERKXCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 226);

ERKCXVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 227);

ERKCCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 228);

ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 229);

ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 230);

ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 231); ili

ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 232),

gde je X bilo koja aminokiselina, osim cisteina,

ili bilo koja od gore navedenih sekvenci, u kojoj 1-5, 1-3, 1-2 ili 1 aminokiselina je umetnuta između aminokiselinskih ostataka CVE i CPP. U određenim tehničkim rešenjima, THT ili GGG je umetnuta. U određenim tehničkim rešenjima, 1, 1-2, ili 1-3 aminokiseline je umetnuto između zgloba i CH2 domena. Na primer, glicin može biti umetnut između zgloba i CH2 domena.

[0179] U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, ili 212, pri čemu 1, 2, 3 ili sve 4 aminokiseline P233,V234, A235 i G237 (koje odgovaraju C-terminalne 4 aminokiseline "PVAG" (SEQ ID NO: 233) su obrisane ili zamenjene sa drugom aminokiselinom, npr., aminokiselinama C-terminusa IgG1 zgloba (ELLG (SEQ ID NO: 234) ili ELLGG (SEQ ID NO: 235). U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, ili 212, gde V234, A235 i G237 su obrisane ili zamenjene sa drugom aminokiselinom. U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, ili 212, gde A235 i G237 su obrisane ili zamenjene sa drugom aminokiselinom. U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, ili 212, gde G237 je obrisana ili zamenjena sa drugom aminokiselinom. U određenim tehničkim rešenjima, zglob sadrži SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450, ili 451, gde su V234 i A235 obrisane ili zamenjene sa drugom aminokiselinom. Supstitucija PVAG (SEQ ID NO: 233) u IgG2 sa odgovarajućim aminokiselinama IgG1 zglobom, tj., (ELLG (SEQ ID NO: 234) ili ELLGG (SEQ ID NO: 235)) da se dobije hibridni zglob, npr., prikazan iznad, koji obezbeđuje zglob koji ima prednosti IgG2 zgloba i efektorsku funkciju IgG1 zglobova.

[0180] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži zglob koji se sastoji od ili suštinski sastoji od jedne od sekvenci prikazanih iznad, npr., bilo koja od SEQ ID NOs: 208-232, i u određenim tehničkim rešenjima, ne sadrži dodatne aminokiselinske ostatke zgloba.

[0181] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži CH1 domen koji je CH1 domen divljeg tipa od IgG1 ili IgG2 izotipa ("IgG1 CH1 domen" ili "IgG2 CH1 domena," redom). CH1 domeni izotipova IgG3 i IgG4 ("IgG3 CH1 domen i "IgG2 CH1 domen," redom) mogu se takođe koristiti. CH1 domen može takođe biti varijanta CH1 domena divljeg tipa, npr., varijanta IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 CH1 domena divljeg tipa. Varijante CH1 domena uzete kao primer uključuju A114C i T173C i/ili C131, npr., C131S.

[0182] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži CH2 domen koji je CH2 domen divljeg tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa ("CH2 domen iz IgG1," "CH2 domen iz IgG2," "CH2 domen i IgG3," ili "CH2 domen iz IgG4," redom). CH2 domen može biti varijanta CH2 domena divljeg tipa, npr., varijanta CH2 domena divljeg tipa iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Varijante CH2 domena uključuju varijante koje moduliraju biološku aktivnost Fc regiona antitela, kao što je ADCC ili CDC ili moduliraju poluživot antitela ili njegovu stabilnost. U jednom tehničkom rešenju, CH2 domen je humani CH2 domen iz sa A330S i P331S mutacijom, gde CH2 domen ima smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na istu mutaciju CH2 bez mutacije. Druge mutacije su dalje navedene na drugom mestu.

[0183] U određenim tehničkim rešenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca sadrži CH3 domen koji je CH3 domen divljeg tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa ("CH3 domen iz IgG1," "CH3 domen iz IgG2," "CH3 domen iz IgG13," ili "CH3 domen iz IgG4," redom). CH3 domen može takođe biti varijanta CH3 domena divljeg tipa, npr., varijanta CH3 domena divljeg tipa iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Varijante CH3 domena uzete kao primer uključuju varijante koje moduliraju biološku aktivnost Fc regiona antitela, kao što je ADCC ili CDC ili moduliraju poluživot antitela ili njegovu stabilnost.

[0184] Generalno, variants CH1, zgloba, CH2 ili CH3 domena mogu da sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više mutacija, i/ili najviše 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 mutaciju, ili 1-10 ili 1-5 mutacija, ili sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična onoj od odgovarajućeg domena divljeg tipa (CH1, zglob, CH2, ili CH3 domen, redom), pod uslovom da konstantni region teškog lanca koji sadrži pecifičnu varijantu zadržava neophodnu biološku aktivnost.

[0185] Tabela 3 prikazuje humane konstantne regione teškog lanca uzete kao primer koji sadrže humani CH1, zglob, CH2 i/ili CH3 domene, pri čemu svaki domen je ili domen divljeg tipa ili njegova varijanta koja pruža željenu bilošku aktivnost konstantnom regionu teškog lanca. Ne popinjene ćelije u tabeli 3 ukazuju na to da li je domen prisutan ili ne, i ako je prisutan, može biti bilo kog izotipa, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Na primer, antitelo koje sadrži konstantni region 1 teškog lanca u tabeli 3 je antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrže najmanje IgG2 zglob, i koji takođe može da sadrži CH1, CH2 i/ili CH3 domen, i ako je prisuan, CH1, CH2 i/ili CH3 domen je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa. Drugi primer za razumevanje tabele 3, antitelo koje sadrži konstantni region 8 teškog lanca je antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrže CH1 domen iz IgG1, i IgG2 zglob, CH2 domen iz IgG1, i koji može ili ne takođe da sadrži CH3 domen, koji ako je prisutan, može biti IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.

Tabela 3. Konfiguracije humanih konstantnih regiona teškog lanca uzete kao primer

[0186] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži konstantni region teškog lanca prikazan u tabeli 3 i može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadržei taj specifičan konstantni region teškog lanca. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca prikazan u tabeli 3 ili 4 može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koje ne sadrži IgG2 zglob ili isti IgG2 zglob. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca prikazan u tabeli 3 ili 4 može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2, i sadrži, npr., IgG1, IgG3 ili IgG4 zglob. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca prikazan u tabeli 3 ili 4 može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži jedan ili više istih CH1, zglobova, CH2 ili CH3 domena. Na primer, u određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca prikazan u tabeli 3 ili 4 može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob i CH1, CH2 i/ili CH3 domen specifičnog izotipa. Na primer, antitelo koje sadrži konstantni region 22 teškog lanca prikazan u tabeli 3, može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na (i) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 (npr., IgG1, IgG3 ili IgG4 zglob); (ii) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob i CH1 iz IgG1, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH1 koji nije iz IgG1; (iii) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob i CH2 iz IgG2, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH2 koji nije iz IgG2; (iv) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob i CH3 iz IgG1, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH3 koji nije iz iz IgG1; (v) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob, CH1 iz IgG1 i CH2 iz iz IgG2, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH1 koji nije iz IgG1i/ili CH2 koji nije iz iz IgG2; (vi) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob, CH1 iz iz IgG1 iz IgG1 , i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH1 koji nije iz IgG1i/ili CH3 koji nije iz IgG1; (vii) isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob, CH2 iz IgG2 i CH3 iz IgG1, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH koji nije iz IgG2 i/ili CH3 koji nije iz IgG1; (viii) ili isto antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca koji ne sadrži IgG2 zglob, CH1 iz IgG1, CH2 iz IgG2 i CH3 iz IgG1, i sadrži, npr., zglob koji nije IgG2 i/ili CH1koji nije iz IgG1 i/ili CH2 koji nije iz IgG2 i/ili CH3 koji nije iz IgG1.

[0187] Modifikovani konstantni regioni teškog lanca uzeti kao primer koji se mogu povezati sa anti-OX40 varijabilnim regionima, npr., varijabilnim regionima opisanim ovde, su predviđeni u tabeli 4, u kojoj se navodi identitet svakog od domena.

Tabela 4: Modifikovani konstantni regioni teškog lanca uzeti kao primer

[0188] Dodatni modifikovani konstantni regioni teškog lanca uzeti kao primer su predviđeni u tabeli 5.

Tabela 5.

[0189] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži IgG2 zglob koji sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 238, 239, 240, 241, i 208-232 ili njenu varijantu, kao što je IgG2 zglob koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se (i) razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 238, 239, 240, 241, i 208-232 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 238, 239, 240, 241, i 208-232 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije; (iii) razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 238, 239, 240, 241, i 208-232 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NOs: 238, 239, 240, 241, i 208-232, pri čemu u bilo kojem od (i)-(iv), aminokiselinska supstitucija može biti konzervativna aminokiselina supstitucija ili nekonzervativna aminokiselinska supstitucija; i gde modifikovani konstantni region teškog lanca obezbeđuje izmenjenu aktivnost anti-OX40 antitelu u odnosu na drugi konstantni region teškog lanca, npr., konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2 ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koniji nije IgG2.

[0190] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži CH1 domen iz IgG1 koji sadrži SEQ ID NO: 202 ili CH1 domen iz IgG2 koji sadrži SEQ ID NO: 203, ili varijantu SEQ ID NO: 202 ili 203, koja varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 202 ili 203 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 202 ili 203 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 202 ili 203 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 202 ili 203, pri čemu u bilo kom od (i)-(iv), aminokiselina supstitucija može biti konzervativna aminokiselinska supstitucija ili nekonzervativna aminokiselinska supstitucija; i pri čemu anti-OX40 antitelo koje sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca može imati izmenjenu aktivnost u odnosu na onu od anti-OX40 antitela ali sa drugim konstantnim regionom teškog lanca, npr., konstantnim regionom teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2 ili u ondosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2.

[0191] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži CH2 domen iz IgG1 koji sadrži SEQ ID NO: 204 ili 298, ičli varijantu SEQ ID NO: 204 ili 298, koja varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 204 ili 298 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 204 ili 298 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 204 ili 298 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 204 ili 298, pri čemu u bilo kom od (i)-(iv), aminokiselina supstitucija može biti konzervativna aminokiselinska supstitucija ili nekonzervativna aminokiselinska supstitucija; i pri čemu modifikovani konstantni region teškog lanca može pružiti izmenjenu aktivnost anti-OX40 antitelu u odnosu na onu od drugog konstantnog regiona teškog lanca, npr., konstantnog regiona teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2 u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2.

[0192] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži CH3 domen iz IgG1 koji sadrži SEQ ID NO: 206, ili varijantu SEQ ID NO: 206, koja varijanta se (i) razlikuje od SEQ ID NO: 206 u 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od SEQ ID NO: 206 u najviše 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od SEQ ID NO: 206 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ili 3-5 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 206, pri čemu u bilo kojem od (i)-(iv), aminokiselina supstitucija može biti konzervativna aminokiselinska supstitucija ili nekonzervativna aminokiselinska supstitucija; i pri čemu modifikovani konstantni region teškog lanca može pružiti izmenjenu aktivnost u odnosu na tu od drugog konstantnog regiona teškog lanca, npr., konstantnog regiona teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2 ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2.

[0193] Modifikovani konstantni regioni teškog lanca mogu takođe da sadrže kombinaciju CH1, zgloba, CH2 i CH3 domena opisanih iznad.

[0194] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 244-281, ili varijantu bilo koje od SEQ ID NOs: 244-281, koja varijanta se (i) razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 244-281 u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; (ii) razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 244-281 u najviše 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskoj supstituciji, adiciji ili deleciji; (iii) razlikuje od bilo koje od SEQ ID NOs: 244-281 u 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10, ili 5-10 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija i/ili (iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NOs: 244-281, pri čemu u bilo koje od (i)-(iv), aminokiselina supstitucija može biti konzervativna aminokiselinska supstitucija ili nekonzervativna aminokiselinska supstitucija; i pri čemu modifikovani konstantni region teškog lanca može pružiti izmenjenu aktivnost u odnosu na onu od drugog konstantnog regiona teškog lanca, npr., konstantnog regiona teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2 ili u odnosu na isti modifikovani konstantni region teškog lanca koji sadrži zglob koji nije IgG2.

[0195] Modifikovani konstantni region teškog lancas može imati (i) sličnu, smanjenu ili povećanu efektorsku funkciju (npr., vezivanje za FcyR) u odnosu na konstantni region teškog lanca divljeg tipa i ili (ii) sličan, smanjen ili povećan poluživot (ili vezivanje za FcRn receptor) u odnosu na konstantni region teškog lanca divljeg tipa.

III. Antitela koja imaju posebne sekvence germinativne linije

[0196] Kao što je diskutovano u primerima predmetne objave, pripremljena su humana antitela specifična za OX40 koja sadrže varijabilni region teškog lanca koja su proizvod ili su izvedena iz VH 1-08 gena, VH 6-6 gena, VH 5-51 gena, VH 3-9 gena, VH DP44 gena, VH 3-30.3 gena, VH 3-10 gena, i/ili VH 3-13 gena humane germinativne linije. Shodno tome, ovde su predviđena izolovana monoklonska antitela specifična za humani OX40, koja sadrže varijabilni region teškog lanca koja su proizvod ili su izvedena iz VH gena humane germinativne linije odabrane iz grupe koja se sastoji od: VH 1-08 gena, VH 6-6 gena, VH 5-51 gena, VH 3-9 gena, VH DP44 gena, VH 3-30.3 gena, VH 3-10 gena, i VH 3-13 gena.

[0197] Pripremljena su humana antitela specifična za OX40 koja sadrže varijabilni region lakog lanca koja su proizvod ili su izvedena iz VK L5 gena, VK L6 gena, VK L15 gena, VK A27 gena, i/ili VK O14/O4 gena humane germinativne linije. Prema tome, ovde su predviđena izolovana monoklonska antitela koja sadrže varijabilni region lakog lanca koja su proizvod ili su izvedena iz VK gena humane germinativne linije odabranog iz grupe koja se sastoji od: VK L5 gena, VK L6 gena, VK L15 gena, VK A27 gena, i VK O14/O4 gena.

[0198] Poželjna antitela za koja se ne zahteva zaštita opisana ovde su ona koja sadrže varijabilni region teškog lanca koja su proizvod ili su izvedena od jednog od VH gena humane germinativne linije navedenih iznad i koja takođe sadrži varijabilni region lakog lanca koja su proizvod ili su izvedena od jednog od VK gena humane germinativne linije navedenih iznad.

[0199] Kako se ovde koristi, human antitelo sadrži varijabilni region teškog i lakog lanca koje je "proizvod" ili je "izvedeno od" posebne sekvence germinativne linije ako su varijabilni regioni antitela dobijeni od sistema koji koristi imunoglobulinske gene humene germinativne linije. Takvi sistemi uključuju imunizovanje transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene sa antigenom od interesa ili skrining biblioteke humanih imunoglobulinskih gena prikazane na fagu sa antigenom od interesa. Humano antitelo koje je "proizvod" ili je "izvedeno od" sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može se identifikovati kao takvo poređenjem aminokiselinskih sekvenci humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije i odabirom sekvenci imunoglobulina humane germinativne linije koja je najbliža u sekvenci (tj., najveći % identiteta) sekvenci humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili je "izvedeno od" posebne sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa sekvencom germinativne linije, usled, na primer, somatskih mutacija koje se javljaju u prirodi ili namernim uvođenjem mutacija usmerenih na mesto. Međutim, odabrano humano antitelo tipično je najmanje 90% identično u aminokiselinskim sekvencama aminokiselinskoj sekvenci koja kodira humani imunoglobulinski gen germinativne linije i sadrži aminokiselinske ostatke koji identifikuju da je humano antitelo humano kada se porede sa imunoglobulinskim aminokiselinskim sekvencama germinativne linije drugih vrsta (npr., sekvence murinske germinativne linije). U određenim slučajevima, humano antitelo može biti najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci aminokiselinskoj sekvenci kodiranoj imunoglobulinskim genom germinativne linije. Tipično, human antitelo izvedeno od posebne sekvence humane germinativne linije pokazaće ne više od 10 razlika u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence kodirane imunoglobulinskim genom humane germinativne linije. U određenim slučajevima, humano antitelo može pokazati ne više od 5, pa čak ni više od 4, 3, 2 ili 1 razliku u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence kodirane imunoglobulinskim genom germinativne linije.

IV. Homologna antitela

[0200] Ovde su predviđena antitela za koja se ne zahteva zaštita koja imaju varijabiln region teškog i lakog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence koje su homologne aminokiselinskim sekvencama poželjnog antitela opisanog ovde, i u kojima antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva anti-OX40 antitela opisanog ovde.

[0201] Antitela za koja se ne zahteva zaštita može biti, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.

[0202] Anti-OX40 antitelo za koja se ne zahteva zaštita, ili njegov antigen vezujući deo, može da sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu:

(a) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja se sastoji od SEQ ID NO: 124, ili sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 promena u aminokiselinama (tj., aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 124;

(b) laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja se sastoji od SEQ ID NO: 116, ili sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ili 1-50 promena u aminokiselinama (tj., aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 116;

(c) Antitelo se specifično vezuje za OX40, i

(d) Antitelo ispoljava 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili sva od sledećih funkcionalnih svojstava:

(1) vezivanje za rastvorljivi humani OX40, npr., sa KDod 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po Biacore;

(2) vezivanje za humani OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 1 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 1 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(3) vezivanje za cinomolgus OX40, npr., vezivanje za cinomolgus OX40 vezan za membranu, npr., sa EC50od 10 nM ili manje (npr., 0.01 nM do 10 nM), npr., kao što je mereno po FACS;

(4) izazivanje ili pojačavanje aktivacije T ćelija, o čemu svedoči (i) povećana proizvodnja IL-2 i/ili IFN-γ u OX40-eksprimirajućim T ćelijama i/ili (ii) pojačana proliferacija T ćelija;

(5) inhibiranje vezivanja OX40 liganda za OX40, npr., sa EC50od 1 nM ili manje kao što je mereno po FACS, npr., u testu sa hOX40-293 ćelijema;

(6) vezivanje za epitop na ekstracelularnom delu zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2), npr., epitop sa regionom DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) ili DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) takmičenje za vezivanje za humani OX40 sa 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11, 20B3, i 20C1;

(8) takmičenje za vezivanje za humani OX40 sa 6E1-1, 6E1-2, 14A2-1, i 14A2-2.

[0203] Antitela za koja se ne zahteva zaštita koja imaju sekvence sa homologijom sa VHi VLregionima sa SEQ ID NOs: 124 i 116, ili CDR regionima mogu se dobiti mutagenezom (npr., mutagenezom usmerenom na mesto ili PCR posredovanom) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju SEQ ID NO: 124 i/ili SEQ ID NO: 116, nakon čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela za zadržanu funkciju (tj., funkcije navedene u (1) do (7) iznad) korišćenjem funkcionalnih testova opisanih ovde.

V. Antitela sa konzervativnim modifikacijama

[0204] Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu se načiniti u Fc regionu. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži kombinaciju konzervativne i ne konzervativne aminokiselinske modifikacije.

VI. Konkurentna antitela i ista antitela koja vezuju epitop

[0205] Ovde su takođe predviđena antitela za koja se ne zahteva zaštita koja se takmiče za vezivanje za OX40 sa anti-OX40 antitelima opisanim ovde (npr., antitela 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1). Takva konkurentna antitela mogu biti identifikovana na osnovu njihove sposobnosti da kompletno inhibiraju vezivanje za OX40 jednog ili više monoklonskih antitela 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1 u standardnom testu vezivanja za OX40. Na primer, mogu se koristiti standardni ELISA testovi ili kompetetivni ELISA testovi u kojima je rekombinantni humani OX40 protein imobilizovan na ploči, dodaju se različite koncentracije neobeleženog prvog antitela, ploča se ispere, doda se obeleženo drugo antitelo, ispere i izmeri se količina vezanog obeleživača. Ako sve veća koncentracija neobeleženog (prvog) antitela (koji se takođe naziva "blokirajuće antitelo") inhibira vezivanje obeleženog (drugog) antitela, za prvo antitelo se kaže da inhibira vezivanje drugog antitela za cilj na ploči, ili se kaže da se takmiči sa vezivanjem drugog antitela. Dodatno ili alternativno, BIACORE® SPR analiza se može koristiti za procenu sposobnosti antitela da se takmiče. Sposobnost test antitela da inhibira vezivanje anti-OX40 antitela opisanog ovde za OX40 pokazuje da se test antitelo može takmičiti sa antitelom za vezivanje za OX40.

[0206] Prema tome, ovde su predviđena anti-OX40 antitela koja inhibiraju vezivanje anti-OX40 antitela opisanog ovde za OX40 na ćelijama, npr., aktiviranim T ćelijama, najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili100%, korišćenjem, npr., FACS kako je opisano u primerima.

[0207] Ovde su predviđena anti-OX40 antitela za koja se ne zahteva zaštita koja se vezuju za isti epitop kao jedno ili više anti-OX40 antitela opisanih ovde (npr., antitela 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1), kao što je određeno korišćenjem tehnika mapiranja priznatih u oblasti, kao što su one opisane u nastavku.

[0208] Tehnike mapiranja priznate u oblasti uključuju, na primer, strukturne postupke, kao što je određivanje kristalne strukture rendgenskim zracima (npr., WO2005/044853), molekularno modelovanje i nuklearno magnetno rezonantna spektroskopija (NMR), uključujući NMR određivanje odnosa H-D razmene labilnih amidnih vodonika u OX40 kada su slobodni i kada su vezani u kompleksu sa antitelom od interesa (Zinn-Justin i sar. Biochemistry 1992;31:11335-47; Zinn-Justin i sar. Biochemistry 1993;32,6884-91).

[0209] Za rendgensku kristalografiju, kristalizacija se može postići korišćenjem bilo koje poznate metode u oblasti (npr. Giege i sar. Acta Crystallogr 1994;D50:339-50; McPherson, Eur J Biochem 1990;189:1-23), uključujući mikrošarže (npr. Chayen, Structure 19976;5:1269-74), difuziju pare tehnikom viseće kapi (npr. McPherson, J Biol Chem 1976;251:6300-3), ubacivanjem klica kristala i dijalizom. Poželjno je koristiti praparat proteina koji ima koncentraciju najmanje oko 1 mg/mL a poželjno oko 10 mg/mL do oko 20 mg/mL. Kristalizacija se može najbolje postići u rastvoru za taloženje koji sadrži polietilen glikol 1000-20,000 (PEG; prosečna molekulska masa koja varira od oko 1000 do oko 20,000 Da), poželjno oko 5000 do oko 7000 Da, poželjnije oko 6000 Da, sa koncentracijom koja varira od oko 10% do oko 30% (w/v). Može takođe biti poželjno da se uključi agens za stabilizaciju proteina, npr., glicerol pri koncentraciji koja varira od oko 0.5% do oko 20%. Pogodne soli, kao što je natrijum hlorid, litijum hlorid ili natrijum citrat mogu takođe biti poželjne u rastvoru za taloženje, poželjno u koncentraciji koja varira od oko 1 mM do oko 1000 mM. Talog se poželjno puferuje do pH od oko 3.0 do oko 5.0, poželjno oko 4.0. Specifični puferi korisni u rastvoru za taloženje mogu da variraju i dobro su poznati u oblasti tehnike (Scopes, Protein Purification: Principles i Practice, treće izd., (1994) Springer-Verlag, Njujork). Primeri takvih pufera uključuju, ali nisu ograničeni na, HEPES, Tris, MES i acetat. Kristali mogu da rastu u širokom opsegu temperatura, uključujući 2°C, 4°C, 8°C i 26°C. Kristali antitelo:antigen mogu se proučavati korišćenjem dobro poznatih tehnika difrakcije rendgenskih zraka i mogu se rafinisati korišćenjem kompjuterskog softvera kao što je X-PLOR (Yale University, 1992, distribuiranog od Molecular Simulations, Inc.; videti npr. Blundell & Johnson, Meth. Enzymol. 1985; 114 & 115, H. W. Wyckoff i sar., izd., Academic Press; U.S. prijava patenta sa br. objave 2004/0014194), i BUSTER (Bricogne, Acta Cryst 1993;D49:37-60; Bricogne, Meth Enzymol 1997;276A:361-423; Carter & Sweet, izd.; Roversi i sar., Acta Cryst.2000;D56:1313-23).

[0210] Druge metode mapiranja epitopa prate vezivanje antitela za fragmente antigena ili mutirane varijacije antigena gde se gubitak vezivanja usled modifikacije aminokiselinskog ostatka unutar sekvence antigena često smatra indikacijom komponente epitopa. Jedna takva metoda je mutageneza skeniranja alanina, kao što je opisano, , npr., od Cunningham i Wells, Science 1989;244:1081-5. Druga pogodna metoda je duboko mutaciono skeniranje (videti, npr., Araya i sar., Trends in Biotechnology 2011;29:435-42; Forsyth i sar., mAbs 2013;5:523-32).

[0211] Dodatno ili alternativno, mogu se koristiti računarske kombinatorne metode za mapiranje epitopa, uključujući mapiranje konformacionih diskontinuiranih epitopa.

[0212] Dodatno ili alternativno, mapiranje epitopa se može postići testiranjem vezivanja antitela za peptide koji sadrže fragmente OX40, npr., nedenaturisane ili denaturisane fragmente. Serija preklapajućih peptida koji obuhvataju sekvencu OX40 (npr., humani OX40) može se sintetizovati i testirati na vezivanje, npr., u direktnom ELISA, kompetitivnom ELISA (gde se procenjuje sposobnost peptida da spreči vezivanje antitela za OX40 vezan za bunarić mikrotitarske ploče) ili na čipu. Druge metode se oslanjaju na sposobnost antitela od interesa da afinitetno izoluju specifične kratke peptide (bilo u prirodnom trodimenzionalnom obliku ili u denaturisanom obliku) iz kombinatornih peptidnih biblioteka prikaza faga. Peptidi se tada smatraju vodećim za definiciju epitopa koji prepoznaje antitelo koje se koristi za skrining peptidne biblioteke.

[0213] Epitopi se takođe mogu identifikovati otiskom proteina zasnovanim na MS, kao što su masena spektrometrija izmene vodonika/deuterijuma (HDX-MS - Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry) i brza fotohemijska oksidacija proteina (FPOP - Fast Photochemical Oxidation of Proteins). HDX-MS se može izvesti, na primer, kao što je opisano u primerima ovde i od strane Wei i sar., Drug Discovery Today 2014;19:95. FPOP se može sprovesti, na primer, kako je opisano od strane Hambley i sar. (J American Soc Mass Spectrometry 2005;16:2057).

[0214] Antitela koja se takmiče za vezivanje sa anti-OX40 antitelima opisanim ovde mogu se proizvesti i identifikovati korišćenjem metoda poznatih u oblasti. Na primer, miševi mogu biti imunizovani sa humanim OX40 kao što je opisano ovde, hibridniomi proizvedeni, a rezultujuća monoklonska antitela skrinovana za sposobnost da se takmiče sa antitelom opisanim ovde za vezivanje za OX40 korišćenjem metoda opisanim iznad.

[0215] Antitela koja se vezuju za isti epitop kao anti-OX40 antitela opisana ovde mogu se proizvesti imunizacijom miševa manjim fragmentom OX40 koji sadrži epitop za koji se antitelo vezuje. Epitop ili region koji sadrži epitop može se identifikovati korišćenjem metoda opisanih iznad. Alternativno, metoda Jespers-a i sar. (Biotechnology 1994;12:899) se može koristiti za vođenje selekcije antitela koja prepoznaju isti epitop i stoga pokazuju slična svojstva kao anti-OX40 antitela opisana ovde. Na primer, korišćenjem displeja faga, prvo se teški lanac anti-OX40 antitela uparuje sa repertoarom (poželjno humanih) lakih lanaca da se izabere antitelo koje se vezuje za OX40, a zatim se novi laki lanac uparuje sa repertoarom (poželjno humanih) teških lanaca da se odabere (poželjno humano) antitelo koje se vezuje za OX40 koje prepoznaje isti epitop ili epitopski region na OX40 kao antitelo anti-OX40 opisano ovde. Alternativno, varijante ovde opisanog antitela mogu se dobiti mutagenezom cDNK koja kodira teški i laki lanac antitela.

[0216] U nekim tehničkim rešenjima, ovde su predviđena antitela koja se vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178), koja odgovaraju aminokiselinskim ostacima 46-62 zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2), kao što je određeno postupcima u primerima.

[0217] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde koja se vezuju za celu ili deo sekvence SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 182), kao što je određeno postupcima u primerima.

[0218] U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde koja se vezuju za celu ili deo sekvence PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183), kao što je određeno postupcima u primerima.

[0219] U još drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela koja se vezuju za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) dalje se vezuju za celu ili deo sekvence QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184), kao što je određeno postupcima u primerima.

[0220] U dodatnim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela opisana ovde koja se vezuju za celu ili deo sekvence SQNTVCRPCGPGFYN (SEQ ID NO: 185), kao što je određeno postupcima u primerima.

[0221] U dodatnim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se vezuje unutar region DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179), koji odgovara aminokiselinskim ostacima 89-124 zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2), kao što je određeno postupcima u primerima.

VII. Proizvedena inženjeringom i modifikovana antitela

Ciljano vezivanje antigena

[0222] U različitim tehničkim rešenjima, ovde opisana antitela su modifikovana da selektivno blokiraju vezivanje antigena u tkivima i sredinama gde bi vezivanje antigena bilo štetno, ali dozvoljavaju vezivanje antigena tamo gde bi to bilo korisno. U jednom tehničkom rešenju, stvara se blokirajuća peptidna "maska" koja se specifično vezuje za površinu antitela za vezivanje antigena i ometa vezivanje antigena, pri čemu je maska povezana sa svakim od veznih krakova antitela pomoću veznika koji se može cepati peptidazom. Videti, npr., U.S. pat. br.8,518,404 za CytomX. Takvi konstrukti su korisni za lečenje karcinoma kod kojih su nivoi proteaze značajno povećani u mikrookruženju tumora u poređenju sa netumorskim tkivima. Selektivno cepanje veznika koji se može cepati u mikrookruženju tumora omogućava odvajanje maskirajućeg/blokirajućeg peptida, omogućavajući selektivno vezivanje antigena u tumoru, pre nego u perifernim tkivima u kojima vezivanje antigena može izazvati neželjene sporedne efekte.

[0223] Alternativno, u srodnom tehničkom rešenju, razvijeno je dvovalentno jedinjenje za vezivanje ("ligand za maskiranje") koje sadrži dva domena za vezivanje antigena koji se vezuju za obe površine za vezivanje antigena (bivalentnog) antitela i ometaju vezivanje antigena, pri čemu su dve maske domena vezivanja povezane jedna sa drugom (ali ne i antitelo) pomoću linkera koji se može cepati, na primer koji se može cepati peptidazom. Videti, npr., međunarodnu prijavu patenta sa objavom WO 2010/077643 od Tegopharm Corp. Ligandi za maskiranje mogu da sadrže, ili da budu izvedeni iz antigena za koji je predviđeno da se antitelo vezuje, ili mogu biti nezavisno generisani. Takvi ligandi za maskiranje su korisni za lečenje kancera kod kojih su nivoi proteaze u velikoj meri povećani u mikrookruženju tumora u poređenju sa netumorskim tkivima. Selektivno cepanje veznika koji se može cepati u mikrookruženju tumora omogućava odvajanje dva domena za vezivanje jedan od drugog, smanjujući aviditet za površine antitela koje vezuju antigen. Nastala disocijacija liganda za maskiranje od antitela omogućava selektivno vezivanje antigena u tumoru, pre nego u perifernim tkivima u kojima vezivanje antigena može izazvati neželjene sporedne efekte.

Fcs i modifikovani Fcs

[0224] Pored aktivnosti terapijskog antitela koje proizilazi iz vezivanja antigen vezujućeg domena za antigen (npr. blokiranje srodnog liganda ili receptorskog proteina u slučaju antagonističkih antitela, ili indukovane signalizacije u slučaju agonističkih antitela), Fc deo antitela stupa u interakciju sa imunim sistemom generalno na složene načine da izazove bilo koji broj bioloških efekata. Efektorske funkcije, kao što je Fc region imunoglobulina, su odgovorne za mnoge važne funkcije antitela, kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena (ADCC - antigendependent cellular cytotoxicity), citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC - complement dependent cytotoxicity) i ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP - antibody-dependent cellmediated phagocytosis), rezultuju ubijanjem ciljnih ćelija, iako različitim mehanizmima. Postoji pet glavnih klasa, ili izotipova, konstantnog regiona teškog lanca (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM), svaka sa karakterističnim efektorskim funkcijama. Ovi izotipovi se mogu dalje podeliti na podklase, na primer, IgG je podeljen u četiri podklase poznate kao IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgG molekuli stupaju u interakciju sa tri klase Fcγ receptora (FcγR) specifičnih za IgG klasu antitela, naime FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Prijavljeno je da se važne sekvence za vezivanje IgG za FcγR receptore nalaze u CH2 i CH3 domenima. Na poluživot antitela u serumu utiče sposobnost tog antitela da se veže za neonatalni Fc receptor (FcRn).

[0225] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu da sadrže varijabilne domene pronalaska kombinovane sa konstantnim domenima koji sadrže različite Fc regione, odabrane na osnovu biloških aktivnosti (ako ih ima) antitela za nameravanu primenu. Salfeld (2007) Nat. Biotechnol.

25:1369. Humani IgG, na primer, mogu se klasifikovati u četiri podklase, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, i svaki od njih sadrži Fc region koji ima jedinstven profil za vezivanje za jedan ili više Fcγ receptora (aktivirajući receptori FcγRI (CD64), FcγRIIA, FcyRIIC (CD32); FcyRIIIA i FcyRIIIB (CD16) i inhibiorajući receptor FcyRIIB), i za prvu komponentu komplementa (C1q). Humani IgG1 i IgG3 se vezuju za sve Fcγ receptore; IgG2 se vezuju za FcγRIIAH131, i sa nižim afinitetom za FcγRIIAR131FcγRIIIAV158; IgG4 se vezuje za FcyRI, FcγRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, i FcγRIIIAV158; a inhibitorni receptor FcγRIIB ima niži afinitet za IgG1, IgG2 i IgG3 nego svi drugi Fcγ receptori. Bruhns i sar. (2009) Blood 113:3716. Studije su pokazale da se FcyRI ne vezuju za IgG2, i FcγRIIIB ne vezuju za IgG2 or IgG4. Id. Generalno, u odnosu na ADCC aktivnost, humani IgG1 ≧ IgG3 >> IgG4 ≧ IgG2. Kao posledica, na primer, IgG1 konstantni domen, pre nego IgG2 ili IgG4, može se izabrati za primenu u leku gde ADCC poželjna; IgG3 se može izabrati ako je aktivacija FcyRIIIA-eksprimirajućih NK ćelija, monocita, ili makrofaga; i IgG4 se može odabrati ako će se antitelo primeniti za desenzibilizaciju pacijenata sa alergijom. IgG4 se može takože izabrati ako je poželjno da antitelu nedostaju sve efektorske funkcije.

[0226] Prema tome, anti-OX40 varijabilni regioni opisani ovde mogu biti povezani (npr., kovalentno povezani ili fuzionisani) sa Fc, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc, koji mogu biti bilo kog alotipa, npr., za IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); for IgG2: G2m, G2m23(n); for IgG3: G3m, G3m21(gl), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); . Videti, npr., Jefferis i sar. (2009) mAbs 1:1). Na izbor alotipa mogu uticati potencijalni problemi imunogenosti, npr. da se minimizuje stvaranje antitela protiv lekova.

[0227] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 varijabilni regioni opisani ovde su povezani sa Fc koji se vezuje za jedan ili više aktivirajućih Fc receptora (FcyI/CD64, FcγIIa/CD32 ili FcγIIIa/CD16), i time stimulišu ADCC i mogu izazvati iscrpljivanjem T ćelija. U posebnim tehničkim rešenjima, anti-OX40 varijabilni regioni opisani ovde su povezani sa Fc što izaziva iscrpljivanje. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 varijabilni regioni opisani ovde su povezani sa humanim IgG1 ili IgG3 Fc, tj., antitela su IgG1 ili IgG3 izotipa. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela su iscrpljena antitela. Na primer, mogu da iscrpe Tregćelije koje su u miokrpookruženju tumora (i time poboljšavaju antitumorsku aktivnost), ali ne da značajno iscrpe Teffćelije ćelije koje su u miokrpookruženju tumora i posreduju u antitumorskom dejstvu, i/ili ne da značajno iscrpe Tregi Teffćelije koje su izvan tumora, npr., u periferiji. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela su izotipa, (bilo da se javlja u prirodi ili ne javlja u prirodi (npr., uključujući mutaciju(e)) izotipa koji stimuliše iscrpljivanje Tregćelija ili eliminaciju na mestu tumora i istovremenu aktivaciju Teffćelija. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela stvaraju povišen nivo Teffprema Tregna mestu tumora, što ukazuje na moćnu antitumorsku aktivnost, i poželjno bez značajnog iscrpljivanja i Tregi Teffćelija koje su izvan tumora, npr., na periferiji.

[0228] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela blokiraju imunosupresivnu aktivnost Tregćelija. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela imaju Fc receptor sa smanjenim ili eliminisanim FcR vezivanjem, npr., smanjeno vezivanje za aktiviranje FcR regiona. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela imaju Fc koji se vezuje ili ima poboljšano vezivanje za FcRIIb, što može obezbediti poboljčani agonizam. Videti, npr., WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson i sar. (2011) Cancer Cell 19:101; White i sar. (2011) J. Immunol.

187:1754.

[0229] Anti-OX40 varijabilni regioni opisani ovde mogu biti povezani sa Fc regionom koji se ne javlja u prirodi, npr., bez efektorske funkcije ili uglavnom bez efektorske funkcije Fc (npr., humani IgG2 ili IgG4) ili, alternativno, Fc sa poboljšanim vezivanjem za jedan ili više aktivirajućih Fc receptora (FcγI, FcγIIa ili FcγIIIa), tako da poboljša iscrpljivanje Tregu tumorskom okruženju.

[0230] Varijabilni regioni opisani ovde mogu biti povezani sa Fc koji sadrži jednu ili više modifikacija, tipično da promene jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora, i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena. Štaviše, ovde opisano antitelo može biti hemijski modifikovano (npr., jedan ili više hemijskih segmenata može biti vezano za antitelo) ili može biti modifikovano da promeni svoju glikozilaciju, da promeni jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svako od ovih tehničkih rešenja je detaljnije opisano u nastavku. Numeracija ostataka u Fc regionu je ona prema EU indeksu Kabat-a. Varijante sekvence ovde stavljene na uvid su date u odnosu na broj ostatka iza kojeg sledi aminokiselina koja je supstituisana umesto aminokiseline koja se pojavljuje u prirodi, kojoj po izboru prethodi ostatak na tom položaju koji se javlja u prirodi. Kada više aminokiselina može biti prisutno na datom položaju, npr. ako se sekvence razlikuju između izotipova koji se javljaju u prirodi, ili ako višestruke mutacije mogu biti supstituisane na položaju, one su odvojene kosim crtama (npr. "X/Y/Z").

[0231] Na primer, može se načiniti modifikacija u Fc regionu kako bi se generisala Fc varijanta sa (a) povećanom ili smanjenom ćelijski posredovanoj citotoksičnošću zavisnoj od antitela (ADCC), (b) povećanom ili smanjenom citotoksičnošću posredovanom komplementom (CDC), (c) povećanim ili smanjenim afinitetom za C1q i/ili (d) povećanim ili smanjenim afinitetom za Fc receptorom u odnosu na roditeljski Fc. Takve varijante Fc regiona će generalno da sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u Fc regionu. Smatra se da je kombinovanje modifikacija aminokiselina posebno poželjno. Na primer, varijantni Fc region može uključiti dve, tri, četiri, pet, itd supstitucija u njemu, npr. specifičnih položaja Fc regiona identifikovanih ovde. Primeri varijanti Fc sekvence su ovde stavljeni na uvid, a takođe su dati u U.S. pat. sa brojevima 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 6,194,551; 7,317,091; 8,101,720; PCT objavama patenata WO 00/42072; WO 01/58957; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 i WO 06/020114.

Funkcija redukcije efektora

[0232] ADCC aktivnost može biti smanjena modifikovanjem Fc regiona. U određenim tehničkim rešenjima, mesta koja utiču na vezivanje za Fc receptore mogu se ukloniti, poželjno mesta različita od spasonosnih mesta vezivanja receptora. U drugim tehničkim rešenjima, Fc region može biti modifikovan da se ukloni ADCC mesto. ADCC mesta su poznata u oblasti; videti, na primer, Sarmay i sar. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 u pogledu ADCC mesta u IgG1. U jednom tehničkom rešenju, G236R i L328R varijanta humanog IgG1 efikasno eliminiše Fc y R vezivanje. Horton i sar. (2011) J. Immunol.186:4223 i Chu i sar. (2008) Mol. Immunol.45:3926. U drugim tehničkim rešenjima, Fc koji ima smanjeno vezivanje za FcyR regione sadrži aminokiselinu supstituciju L234A, L235E i G237A. Gross i sar. (2001) Immunity 15:289.

[0233] CDC aktivnost takođe može biti smanjena modifikovanjem Fc regiona. Mutacije na IgG1 položajima D270, K322, P329 i P331, posebno mutacije alanina D270A, K322A, P329A i P331A, značajno smanjuju sposobnost odgovarajućeg antitela da veže C1q i aktivira komplement. Idusogie i sar. (2000) J. Immunol. 164:4178; WO 99/51642. Pokazalo se da modifikacija položaja 331 IgG1 (npr. P331S) smanjuje vezivanje komplementa. Tao i sar. (1993) J. Exp. Med.178:661 i Canfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483. U drugom primeru, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar aminokiselinskih položaja od 231 do 239 se menjaju da bi se na taj način smanjila sposobnost antitela da fiksira komplement. WO 94/29351.

[0234] U nekim tehničkim rešenjima, Fc sa smanjenim fiksiranjem komplementa ima aminokiselinske supstitucije A330S i P331S. Gross i sar. (2001) Immunity 15:289.

[0235] Za primene gde treba izbegavati funkciju efektora, npr. kada je samo vezivanje antigena dovoljno da generiše željenu terapijsku korist, a efektorska funkcija samo dovodi do (ili povećava rizik od) neželjenih sporednih pojava, mogu se koristiti IgG4 antitela, ili se mogu osmisliti antitela ili fragmenti kojima nedostaje Fc region ili njegov značajan deo, ili Fc može biti mutiran da bi se potpuno eliminisala glikozilacija (npr. N297A). Alternativno, hibridni konstrukt humanog IgG2 (CH1 domen i zglobni region) i humanog IgG4 (CH2 i CH3 domeni) je stvoren koji je lišen efektorske funkcije, nema sposobnost da veže FcyR (kao IgG2) i ne može da aktivira komplement (kao IgG4). Rother i sar. (2007) Nat. Biotechnol.25:1256. Videti takođe Mueller i sar. (1997) Mol.

Immunol. 34:441; Labrijn i sar. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479 (koji razmatraju Fc modifikacije da generalno smanje efektorsku funkciju).

[0236] U drugim tehničkim rešenjima, Fc region je promenjen menjanjem najmanje jednog aminokiselinskog ostatka različitim aminokiselinskim ostatkom da se smanji sve efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina odabrana od aminokiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 može se zameniti različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima smanjen afinitet za efektorski ligand ali zadržava sposobnost vezivanja antigena roditeljskog antitela. Efektorski ligand čiji se afinitet menja može biti, na primer, Fc receptor (ostaci 234, 235, 236, 237, 297) ili C1 komponenta komplementa (ostaci 297, 318, 320, 322). U.S. patenti sa brojevima 5,624,821 i 5,648,260, od Winter i sar.

[0237] Jedna ranija prijava patenta predložila je modifikacije u IgG Fc regionu da smanji vezivanje za FcyRI da se smanji ADCC (234A; 235E; 236A; G237A) ili blokira vezivanje za komponentu komplementa C1q da se eliminiše CDC (E318A ili V/K320A i K322A/Q). WO 88/007089. Videti takođe Duncan & Winter (1988) Nature 332:563; Chappel i sar. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (SAD) 88:9036; i Sondermann et al. (2000) Nature 406:267 (koji razmatraju efekte ovih mutacija na vetivanje FcyRIII).

[0238] Fc modifikacije koje smanjuju efektorsku funkciju takođe uključuju supstitucije, insercije, i delecije na položajima 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, i 328, kao što su 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, i 328R. Fc varijanta može da sadrži 236R/328R. Druge modifikacije za smanjenje interakcija FcyR i komplementa uključuju supstitucije 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, i 234V. Ove i druge modifikacije su recenzirane u Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. Efektorske funkcije (i ADCC i aktivacija komplementa) mogu biti smanjene, uz održavanje neonatalnog FcR vezivanja (održavanje poluživota), mutiranjem IgG ostataka na jednom ili više položaja 233 - 236 i 327 - 331, kao što su E233P, L234V, L235A, po izboru G236Δ, A327G, A330S i P331S u IgG1; E233P, F234V, L235A, po izboru G236Δ u IgG4; i A330S i P331S u IgG2. Videti Armour i sar. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; WO 99/58572. Druge koje smanjuju efektorsku funkciju uključuju L234A i L235A u IgG1 (Alegre i sar. (1994) Transplantation 57:1537); V234A i G237A u IgG2 (Cole i sar. (1997) J. Immunol. 159:3613; videti takođe U.S. pat. br.5,834,597); i S228P i L235E za IgG4 (Reddy i sar. (2000) J. Immunol. 164:1925). Druga kombinacija mutacija za smanjenje efektorske funkcije u humanom IgG1 uključuje L234F, L235E i P331S. Oganesyan i sar. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.64:700. Generalno videti Labrijn i sar. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479. Dodatne mutacije za koje je pronađeno da smanjuju efektorsku funkciju u kontekstu Fc (IgG1) fuzionog proteina (abatacept) su C226S, C229S i P238S (EU numerisanje ostatka Davis i sar. (2007) J. Immunol.34:2204.

[0239] Druge Fc varijante koje imaju smanjenu ADCC i/ili CDC su stavljne na uvid u Glaesner i sar. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287 (F234A i L235A da smanjuju ADCC i ADCP u IgG4); Hutchins i sar. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (SAD) 92:11980 (F234A, G237A i E318A U IgG4); An i sar. (2009) MAbs 1:572 i U.S. objava pat. prijave 2007/0148167 (H268Q, V309L, A330S i P331S u IgG2); McEarchern i sar. (2007) Blood 109:1185 (C226S, C229S, E233P, L234V, L235A u IgG1); Vafa i sar. (2014) Methods 65:114 (V234V, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S u IgG2).

[0240] U određenim tehničkim rešenjima, odabran je Fc koji u suštini nema efektorsku funkciju, tj. ima smanjeno vezivanje za FcyR i smanjenu fiksaciju komplementa. Primer Fc, na primer, IgG1 Fc, koji je bez efektora, obuhvata sledećih pet mutacija: L234A, L235E, G237A, A330S i P331S. Gross i sar. (2001) Immunity 15:289. Primeri teških lanaca koji sadrže ove mutacije su navedeni u Listi sekvenci, kao što je detaljno prikazano u tabela 23 (npr. SEQ ID NO: 11). Ovih pet supstitucija se mogu kombinovati sa N297A da bi se takođe eliminisala glikozilacija.

Poboljšanje efektorske funkcije

[0241] Alternativno, ADCC aktivnost može biti povećana modifikovanjem Fc regiona. U odnosu na ADCC aktivnost, humani IgG1 ≧ IgG3 » IgG4 ≧ IgG2, kao IgG1 konstantni domen, pre nego IgG2 ili IgG4, mogu biti odabrani za primenu u leku gde je ADCC poželjan. Alternativno, Fc region može biti modifikovan da bi se povećala ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i/ili da bi se povećao afinitet za Fcγ receptor modifikacijom jedne ili više aminokiselina na sledećim položajima: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325,326,327,329,330,331,332,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 ili 439. Videti WO 2012/142515; videti takođe WO 00/42072. Primeri supstitucija uključuju 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, i 332E. Primeri varijanti uključuju 239D/332E. 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, i 267E/268F/324T. Na primer, humani IgG1 Fc koji sadrže G236A varijantu, koja se po izboru može kombinovati sa I332E, pokazali su da povećavaju odnos afiniteta vezivanja FcγIIA / FcγIIB približno 15 puta. Richards i sar. (2008) Mol. Cancer Therap.

7:2517; Moore i sar. (2010) mAbs 2:181. Druge modifikacije za poboljšanje interakcija FcyR i komplementa uključuju ali nisu ograničene na supstitucije 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051, i 396L. Ove i druge modifikacije su recenzirane u Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. Konkretno, obe ADCC i CDC mogu biti poboljšane promenama položaju E333 IgG1, npr. E333A. Shields i sar. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591. Primena P247I i A339D/Q mutacije da se poboljša efektorska funkcija u IgG1 je stavljena na uvid u WO2006/020114, i D280H, K290S ± S298D/V je stavljena na uvid u WO2004/074455. K326A/W i E333A/S varijante su pokazale da povećavaju efektorsku funkciju u humanom IgG1, i E333S u IgG2. Idusogie i sar. (2001) J. Immunol. 166:2571.

[0242] Konkretno, mapirana su mesta vezivanja na humanom IgG1 za FcγR1, FcγRII, FcγRIII i FcRn, i varijante sa poboljšanim vezivanjem su opisane. Shields i sar. (2001) J. Biol. Chem.

276:6591-6604. Pokazalo se da specifične mutacije na položajima 256, 290, 298, 333, 334 i 339 poboljšavaju vezivanje za FcyRIII, uključujući kombinaciju mutanata T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A i S298A/E333A/K334A (koji imaju pojačano vezivanje FcγRIIIa i ADCC aktivnost). Druge IgG1 varijante sa poboljšanim vezivanjem za FcγRIIIa su identifikovane, uključujući varijante sa S239D/I332E i S239D/I332E/A330L mutacijama koje su pokazale najveće povećanje u afinitetu za FcyRIIIa, smanjenje u vazivanju FcyRIIb, i snažnu citotoksičnu aktivnost kod cinomolgus majmuna. Lazar i sar.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (SAD) 103:4005; Awan i sar. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res.

317:1278. Uvođenje trostrukih mutacija u antitela kao što je alemtuzumab (CD52-specifičan), trastuzumab (HER2/neu-specifičan), rituksimab (CD20-specifičan), i cetuksimab (EGFRspecifičan) prevedeno je u značajno pojačanu aktivnost ADCC in vitro, a varijanta S239D/I332E pokazala je povećan kapacitet za iscrpljivanje B ćelija kod majmuna. Lazar i sar. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (SAD) 103:4005. Dodatno, IgG1 mutanti koji sadrže L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I i P396L mutacije koje su ispoljile pojačano vezivanje za FcyRIIIa i uporedno pojačanu ADCC aktivnost kod transgenih miševa koji eksprimiraju humani FcyRIIIa u modelu maligniteta B ćelija i kanceru dojke su identifikovani. Stavenhagen i sar. (2007) Cancer Res. 67:8882; U.S. pat. br.8,652,466; Nordstrom i sar. (2011) Breast Cancer Res.13:R123.

[0243] Različiti IgG izotipovi takođe ispoljavaju diferencijalnu CDC aktivnost (IgG3>IgG1>>IgG2≈IgG4). Dangl i sar. (1988) EMBO J.7:1989. Za primenu kod koje je pojačan CDC poželjan, takođe je moguće uvesti mutacije koje povećavaju vezivanje za C1q. Sposobnost da se regrutuje komplement (CDC) može se poboljšati mutacijama na K326 i/ili E333 u IgG2, kao što je K326W ( što smanjuje ADCC aktivnost) i E333S, da se poveća vezivanje za C1qprve komponente kaskade komplemenata. Idusogie i sar. (2001) J. Immunol. 166:2571. Uvođenje S267E / H268F / S324T (samog ili u bilo kojoj kombinaciji) u humani IgG1 poboljšava vezivanje C1q. Moore i sar. (2010) mAb-a 2:181. Fc region IgG1/IgG3 hibridnog izotipskog antitela "113F" od Natsume i sar. (2008) Cancer Res. 68:3863 (slika 1 u njemu) takođe daje poboljšanu CDC. Videti takođe Michaelsen i sar. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553 i Redpath i sar. (1998) Immunology 93:595.

[0244] Dodatne mutacije koje mogu povećati ili smanjiti efektorsku funkciju su stavljene na uvid u Dall'Acqua i sar. (2006) J. Immunol.177:1129. Videti takođe Carter (2006) Nat. Rev. Immunol.

6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460.

[0245] Fc varijante koje poboljšavaju afinitet za inhibitorni receptor FcyRIIb mogu se takođe koristiti, npr. da bi se poboljšala aktivnost koja indukuje apoptozu ili pomoćnu aktivnost. Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'lAcad. Sci (SAD) 109:10966; U.S. objava prijave patenta 2014/0010812. Takve varijante mogu da obezbede antitelo sa imunomodulatornim aktivnostima koje se odnose na FcyR11b+ ćelije, uključujući na primer B ćelije i monocite. U jednom tehničkom rešenju, varijante Fc obezbeđuju selektivno pojačan afinitet prema FcyR11b u odnosu na jedan ili više aktivirajućih receptora. Modifikacije za promenu vezivanja za FcyR11b uključuju jednu ili više modifikacija na položaju izabranom iz grupe koja se sastoji od 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, i 332, u skladu sa EU indeksom. Primeri supstitucija za pojačanje FcyR11b afiniteta uključuju ali nisu ograničene na 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E.

266M, 267D. 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F. 328W, 328Y, i 332E. Primeri supstitucija uključuju 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, i 328Y. Druge Fc varijante za poboljšanje vezivanje za FcyRllb uključuju 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, i 267E/328F. Specifično, S267E, G236D, S239D, L328F i I332E varijante, uključujući S267E L328F dvostruku varijantu, humanog IgG1 su od posebne važnosti u specifičnom povećanju afiniteta za inhibitorni FcyR11b receptor. Chu i sar. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; U.S. objava prijave patenta 2006/024298; WO 2012/087928. Povećana specifičnost za FcγRIIb (kako se razlikuje od FcγRIIa<R131>) može se odbiti dodavanjem P238D supstitucija. Mimoto i sar. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589; WO 2012/115241.

[0246] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo je modifikovano da poveća svoj biloški poluživot. Različiti pristupi su mogući. Na primer, ovo se može izvesti povećanjem vezivanja afiniteta Fc regiona za FcRn. U jednom tehničkom rešenju, antitelo je izmenjeno unutar CH1 ili CL regiona da sadrži epitop koji se vezuje za spasonosni receptor uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što je opisano u U.S. patentima sa brojevima 5,869,046 i 6,121,022 od Presta i sar. Druge Fc varijante uzete kao primer koje povećavaju vezivanje za FcRn i/ili poboljšavaju farmakokinetička svojstva uključuju supstitucije na položajima 259, 308, i 434, uključujući na primer 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434P, 434Y, i 434M. Druge varijante koje povećavaju Fc vezivanje za FcRn uključuju: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton i sar., 2004, J. Biol. Chem.279(8): 6213-6216, Hinton i sar.2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields i sar. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W. 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall Acqua i sar. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua i sar., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Videti U.S. pat. br.8,367,805.

[0247] Modifikacija određenih sačuvanih ostataka u IgG Fc (I253/H310/Q311/H433/N434), kao što je N434A varijanta (Yeung i sar. (2009) J. Immunol.182:7663), je predložena kao način da se poveća afinitet FcRn, time povećavaju poluživot antitela u cirkulaciju. WO 98/023289. Kombinovana Fc varijanta koja sadrži M428L i N434S je pokazala da povećava vezivanje FcRn i povećava poluživot u serumu do pet puta. Zalevsky i sar. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157. Kombinovana Fc varijanta koja sadrži T307A, E380A i N434A modifikacije takođe produžava poluživot IgG1 antitela. Petkova i sar. (2006) Int. Immunol. 18:1759. Dodatno, kombinovana Fc varijanta koja sadrži M252Y/M428L, M428L/N434H, M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, M428L/N434M, i M428L/N434S varijante je takođe pokazala da produžava poluživot. WO 2009/086320.

[0248] Pored toga, kombinovana Fc varijanta koja sadrži M252Y, S254T i T256E, povećava poluživot skoro 4 puta. Dall'Acqua i sar. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514. Srodna IgG1 modifikacija koja pruža povećan afinitet FcRn ali smanjenu zavisnost od pH (M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F) je korišćena da se stvori IgG1 konstrukt ("MST-HN Abdeg") za primenu kao kompetitor da se spreči vezivanje drugog antitela za FcRn, što dovodi do povećanog klirensa tog drugog antitela, bilo endogenog IgG (npr. u autoimunom okruženju) ili drugog egzogenog (terapijskog) mAt. Vaccaro i sar. (2005) Nat. Biotechnol.23:1283; WO 2006/130834.

[0249] Druge modifikacije za povećanje vezivanje FcRn su opisane u Yeung i sar. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; 6,277,375; 6,821,505; WO 97/34631; WO 2002/060919.

[0250] U određenim tehničkim rešenjima, hibridni IgG izotipovi mogu se koristiti da povećaju vezivanje FcRn, i potencijalno povećaju poluživot. Na primer, IgG1/IgG3 hibridna varijanta može biti konstruisana supstitucijom IgG1 položaja u CH2 i/ili CH3 regionu sa aminokiselinama iz IgG3 na položajima gde se dva izotipa razlikuju. Tako se može konstruisati hibridna varijanta IgG antitela koje sadrži jednu ili više supstitucija, npr., 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, i 436F. U drugim tehničkim rešenjima opisanim ovde, IgG1/IgG2 hibridna varijanta može biti konstruisana supstitucijom IgG2 položaja u CH2 i/ili CH3 regionu sa aminokiselinama iz IgG1 na položajima gde se dva izotipa razlikuju. Tako hibridna varijanta IgG antitela može biti konstruisana da sadrži jednu ili više supstitucija, npr., jednu ili više od sledećih aminokiselinskih supstitucija: 233E, 234L, 235L, -236G (koji se odnosi na umetanje glicina na položaj 236), i 327A. Videti U.S. pat. br. 8,629,113. Hibridne IgG1/IgG2/IgG4 sekvence su stvorene dase navodno poveća poluživot u serumu i poboljša eksprimiranje. U.S. Pat. br.

7,867,491 (sekvenca broj 18 u njemu).

[0251] Poluživot u serumu antitela predmetnog pronalaska može takođe biti povećan pegilacijom. Antitelo može biti pegilovano da se, na primer, poveća biološki (npr., u serumu) poluživot antitela. Za pegilaciju antitela, antitelo, ili njegov fragment, obično reaguje sa polietilen glikolnim (PEG) reagensom, kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuju za antitelo ili fragment antitela. Poželjno, pegilacija se izvodi reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kako se ovde koristi, pojam "polietilen glikol" je namenjen da obuhvati bilo koji od oblika PEG-a koji su korišćeni za derivatizaciju drugih proteina, kao što su mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo koje se pegiluje je aglikozilovano antitelo. Postupci za pegilaciju proteina su poznati u oblasti tehnike i mogu se primeniti na ovde opisana antitela. Videti na primer, EP 0154316 od Nishimura i sar. i EP 0401384 od Ishikawa i sar.

[0252] Alternativno, pod određenim uslovima može biti poželjno da se smanji poluživot antitela, pre nego da se poveća. Modifikacije kao što su I253A (Hornick i sar. (2000) J. Nucl. Med.41:355) i H435A/R I253A ili H310A (Kim i sar. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819) u Fc humanog IgG1 može smanjiti vezivanje FcRn, tako smanjujući poluživot (povećavajući klirensa) za primenu u situacijama gde je poželjno brzo uklanjanje, kao što je medicinsko snimanje. Videti takođe Kenanova i sar. (2005) Cancer Res. 65:622. Drugi načini za poboljšanje klirensa uključuju formatiranje antigen vezujućih domena predmetnog pronalaska kao fragmenata antitela kojima nedostaje sposobnost da vežu FcRn, kao što su Fab fragmenti. Takva modifikacija može smanjiti poluživot antitela u cirkulaciji sa nekoliko nedelja na nekoliko sati. Selektivno PEGilacija fragmenata antitela se zatim može koristiti za fino podešavanje (povećavanje) poluživota fragmenata antitela ako je neophodno. Chapman i sar. (1999) Nat. Biotechnol.17:780. Fragmenti antitela takođe mogu biti fuzionisani sa humanim serumskim albuminom, npr., u konstruktu fuzionog proteina, da bi se produžio poluživot. Yeh i sar. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci.89:1904. Alternativno, bispecifični antitelo može biti konstruisano sa prvim antigen vezujućim domenom predmetnog pronalaska i drugim antigen vezujućim domenom koji se vezuje za humani serumski albumin (HSA). Videti međunarodnu objavu prijave patenta WO 2009/127691 i tamo citirane patentne reference. Alternativno, specijalizovane polipeptidne sekvence mogu se dodati fragmentima antitela da bi se produžio poluživot, npr. "XTEN" polipeptidne sekvence. Schellenberger i sar. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186; Međunarodna objava prijave patenta WO 2010/091122.

Dodatne Fc varijante

[0253] Kada se koristi IgG4 konstantni domen, poželjno je uključiti supstituciju S228P, koja oponaša sekvencu zgloba u IgG1 i tako stabiliše IgG4 molekule npr. smanjujući Fab-krak razmenu između terapijskog antitela i endogenog IgG4 u pacijentu koji se leči. Labrijn i sar. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy i sar. (2000) J. Immunol.164:1925.

[0254] Potencijalno mesto cepanja proteaze u zglobu IgG1 konstrukata može se eliminisati D221G i K222S modifikacijama, povećavajući stabilnost antitela. WO 2014/043344.

[0255] Afiniteti i svojstva vezivanja Fc varijante za njene ligande (Fc receptore) mogu se odrediti različitim in vitro metodama ispitivanja (biohemijski ili imunološki zasnovani testovi) poznatim u tehnici uključujući, ali ne ograničavajući se na, metode ravnoteže (npr., enzimski-vezan imunosorbentni test (ELISA - enzyme-linked immunoabsorbent assay), ili radioimunotest (RIA -radioimmunoassay)), ili kinetiku (npr. BIACORE<®>SPR analiza), i druge metode kao što su testovi indirektnog vezivanja, testovi kompetitivne inhibicije, fluorescentno rezonantni energetski transfer (FRET - fluorescence resonance energy transfer), gel elektroforeza i hromatografija (npr., gel filtracija). Ove i druge metode mogu da koriste oznaku na jednoj ili više komponenti koje se ispituju i/ili koriste različite metode detekcije uključujući, ali ne ograničavajući se na hromogene, fluorescentne, luminiscentne ili izotopske oznake. Detaljan opis afiniteta i kinetike vezivanja može se naći u Paul, W. E., izd., Fundamental Immunology, 4. izd., Lippincott-Raven, Filadelfija (1999), koji se fokusira na interakcije antitelo-imunogen.

[0256] U još nekim tehničkim rešenjima, glikozilacija antitela je modifikovana da bi se povećala ili smanjila efektorska funkcija. Na primer, može se napraviti aglikolizovano antitelo koje nema svu efektorsku funkciju mutacijom očuvanog ostatka asparagina na položaju 297 (npr. N297A), čime se ukida komplement i FcγRI vezivanje. Bolt i sar. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. Videti takođe Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (koji koristi N297Q u IgG1 da se eliminiše glikozilacija u položaju 297).

[0257] Iako aglikozilovanim antitelima generalno nedostaje efektorska funkcija, mutacije se mogu uvesti da se povrati ta funkcija. Aglikozilovana antitela, npr. oka koja su dobijena od N297A/C/D/ili H mutacije ili proizvedena u sistemima (npr. E. coli) koja ne glikoziluju proteine, mogu dalje biti mutirana da povrate vezivanje FcyR, npr. S298G i/ili T299A/G/ili H (WO 2009/079242), ili E382V i M428I (Jung i sar. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (SAD) 107:604).

[0258] Dodatno, antitelo sa pojačanom ADCC može se napraviti promenom glikozilacije. Na primer, pokazano je da uklanjanje fukoze iz teškog lanca Asn297-povezanih oligosaharida pojačava ADCC, na osnovu poboljšanog vezivanje za FcγRIIIa. Shields i sar. (2002) JBC 277:26733; Niwa i sar. (2005) J. Immunol. Postupci 306: 151; Cardarelli i sar. (2009) Clin. Cancer Res. 15:3376 (MDX-1401); Cardarelli i sar. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap.

59:257 (MDX-1342). Takva antitela sa niskim sadržajem fukoze mogu se proizvesti, npr., u ćelijama jajnika nokaut kineskog hrčka (CHO - Chinese hamster ovary) kojima nedostaje fukoziltransferaza (FUT8) (Yamane-Ohnuki i sar. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614), ili u drugim ćelijama koje stvaraju afukozilovane antitela. Videti, npr., Zhang i sar. (2011) mAbs 3:289 i Li i sar. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210 (oba opisuju proizvodnju antitela u glikoinženjeringu Pichia pastoris.); Mossner i sar. (2010) Blood 115:4393; Shields i sar. (2002) J. Biol. Chem.

277:26733; Shinkawa i sar. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466; EP 1176195B1. ADCC se takođe može poboljšati kao što je opisano u PCT objavi WO 03/035835, koja stavlja na uvid primenu varijante CHO ćelijske linije, Lec13, sa smanjenom sposobnošću vezivanja fukoze na ugljene hidrate povezane sa Asn(297), što takođe dovodi do hipofukozilacije antitela eksprimiranih u tu ćeliju domaćina (videti takođe Shields, R.L. i sar. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Alternativno, analozi fukoze se mogu dodati u medijum za kulturu tokom proizvodnje antitela da inhibiraju inkorporaciju fukoze u ugljene hidrate na antitelu (videti, npr., WO 2009/135181).

[0259] Povećanje GlcNac struktura koje se razdvajaju na pola u oligosaharidima vezanim za antitela takođe poboljšava ADCC. PCT objava WO 99/54342 od Umana i sar. opisuje ćelijske linije projektovane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil transferaze (npr., beta(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u ćelijskim linijama, dobijenim inženjeringom, pokazuju povećane GlcNac strukture koje se razdvajaju na pola, što dovodi do povećane ADCC aktivnosti antitela (videti takođe Umana i sar. (1999) Nat. Biotech.

17:176-180).

[0260] Razvijene su dodatne varijante glikozilacije koje su lišene ostataka galaktoze, sijalične kiseline, fukoze i ksiloze (tzv. GNGN glikoforme), koje pokazuju pojačanu ADCC i ADCP, ali smanjenu CDC, kao i druge koje su lišene sijalične kiseline, fukoze i ksiloze (tzv. G1/G2 glikoforme), koji pokazuju pojačanu ADCC, ADCP i CDC. U.S. objava pat. prijave br.

2013/0149300. Antitela koja imaju ove obrasce glikozilacije se po izboru proizvode u genetski modifikovanim biljkama N. benthamiana u kojima su endogeni geni ksilozil i fukozil transferaze su "nokautirani".

[0261] Glikoinženjering se takođe može koristiti za modifikovanje antiinflamatornih svojstava IgG konstrukta promenom sadržaja α2,6 sijalila u lancima ugljenih hidrata vezanih za Asn297 Fc regiona, pri čemu povećani udeo α2,6 sijalilovanih oblika dovodi do poboljšanja antiinflamatornih efekata. Videti Nimmerjahn i sar. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513. Suprotno tome, smanjenje udela antitela koja imaju α2,6 sijalilovane ugljene hidrate može biti korisno u slučajevima kada antiinflamatorna svojstva nisu željena. Postupci za modifikovanje sadržaja α2,6 sijalilacije antitela, na primer selektivnim prečišćavanjem α2,6 sijalilovanih oblika ili enzimskom modifikacijom, dati su u U.S. objavi prijave br. 2008/0206246. U drugim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca Fc regiona može biti modifikovana da bi oponašala efekat α2,6 sijalilacije, na primer uključivanjem modifikacije F241A (videti, npr., WO 2013/095966).

VIII. Fizička svojstva antitela

[0262] Ovde opisana antitela mogu da sadrže jedno ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca. Takva mesta glikozilacije mogu dovesti do povećane imunogenosti antitela ili promene pK antitela zbog izmenjenog vezivanja antigena (Marshall i sar (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala i Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick i sar (1988) J ExpMed 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh i sar (1985) Nature 316:452-7; Mimura i sar. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Poznato je da se glikozilacija dešava na motivima koji sadrže N-X-S/T sekvencu. U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo ne sadrži glikozilaciju varijabilnog regiona. Ovo se može postići ili odabirom antitela koja ne sadrže motiv glikozilacije u varijabilnom regionu ili mutiranjem ostataka unutar regiona glikozilacije.

[0263] U određenim tehničkim rešenjima, antitela opisana ovde ne sadrže mesta izomerizma asparagina. Deamidacija asparagina može se desiti na N-G ili D-G sekvencama i rezultuje stvaranjem ostatka izoasparaginske kiseline koji uvodi pregib u polipeptidni lanac i smanjuje njegovu stabilnost (efekat izoasparaginske kiseline). Na primer, ako je aminokiselinska sekvenca Asp-Gly prisutna u sekvencama CDR teškog i/ili lakog lanca antitela, sekvenca je supstituisana aminokiselinskom sekvencom koja ne prolazi kroz izomerizaciju.

[0264] Antitelo sadrži sekvencu CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 88, ali gde je Gly u Asp-Gly sekvenci (AIDTDGGTFYADSVRG; SEQ ID NO: 88) zamenjen sa aminokiselinskom sekvencom koja ne podleže izomerizaciji, tj. Asp-Ala.

[0265] Svako antitelo će imati jedinstvenu izoelektričnu tačku (pI), koja generalno pada u pH opsegu između 6 i 9.5. pI za IgG1 antitelo tipično spada u pH opseg od 7-9.5 a pI za IgG4 antitelo tipično spada u pH opseg od 6-8. Postoje spekulacije da antitela sa pI izvan normalnog opsega mogu imati izvesno odvijanje i nestabilnost u in vivo uslovima. Prema tome, poželjno je imati anti-OX40 antitelo koje sadrži pI vrednost koja je u normalnom opsegu. Ovo se može postići ili odabirom antitela sa pI u normalnom opsegu ili mutacijom naelektrisanih površinskih ostataka.

[0266] Svako antitelo će imati karakterističnu temperaturu topljenja, sa višom temperaturom topljenja koja ukazuje na veću ukupnu stabilnost in vivo (Krishnamurthy R i Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Generalno, poželjno je da TM1(temperatura početnog odvijanja veća od 60° C, poželjnije veća od 65° C., još poželjnije veća od 70° C. Tačka topljenja antitela se može meriti korišćenjem diferencijalne skenirajuća kalorimetrija (Chen i sar (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando i sar (1999) Immunol Lett 68:47-52) ili kružnog dihroizma (Murray i sar. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9). U poželjnom tehničkom rešenju, biraju se antitela koja se ne razgrađuju brzo. Degradacija antitela se može meriti korišćenjem kapilarne elektroforeze (CE) i MALDI-MS (Alexander A J i Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32). U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela ovde stavljena na uvid (npr., OX40.21 antitelo) imaju povećanu stabilnost.

[0267] Prema tome, u drugim tehničkim rešenjima, biraju se antitela koja imaju minimalne efekte agregacije, što može dovesti do pokretanja neželjenog imunološkog odgovora i/ili izmenjenih ili nepovoljnih farmakokinetičkih svojstava. Generalno, antitela su prihvatljiva sa agregacijom od 25% ili manje, poželjno 20% ili manje, još poželjnije 15% ili manje, još poželjnije 10% ili manje i još poželjnije 5% ili manje. Agregacija se može meriti pomoću

nekoliko tehnika, uključujući kolonu za isključenje veličine (SEC - size-exclusion column), tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC - high performance liquid chromatography), i rasejanje svetlosti.

IX. Postupci inženjeringa antitela

[0268] Kao što je ovde diskutovano, anti-OX40 antitela se mogu koristiti za stvaranje novih anti-OX40 antitela modifikovanjem konstantnog(ih) regiona antitela. Prema tome, u drugom tehničkom rešenju, strukturne karakteristike anti-OX40 antitela opisanih ovde se koriste za stvaranje strukturno povezanih anti-OX40 antitela koja zadržavaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo antitela opisanih ovde, kao što je vezivanje za humani OX40 i cinomolgus OX40.

[0269] Postupci mutacije su opisani u oblasti tehnike. Na primer, PCT objava WO 02/092780 od Short-a opisuje postupke za stvaranje i skrining mutacija antitela korišćenjem mutageneze zasićenja, sintetičkog povezivanja, ili njihove kombinacije. Alternativno, PCT objava WO 03/074679 od Lazar-a i sar. opisuje postupke korišćenja računarskih metoda skrininga za optimizaciju fizičkohemijskih svojstava antitela.

X. Molekuli nukleinskih kiselina

[0270] Ovde su takođe obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju ovde opisana antitela. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada se prečisti od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr., drugih ćelijskih nukleinskih kiselina (npr., druge hromozomske DNK, npr., hromozomske DNK koja je povezana sa izolovanom DNK u priroda) ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCl trake, kolonsku hromatografiju, restrikcione enzime, elektroforezu u agaroznom gelu i druge dobro poznate u tehnici. Videti, F. Ausubel, i sar., izd. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, Njujork. Nukleinska kiselina može biti, na primer, DNK ili RNK i može ili ne mora da sadrži intronske sekvence. U određenim tehničkim rešenjima, nukleinska kiselina je cDNK molekul.

[0271] Nukleinske kiseline predviđene ovde mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela eksprimirana hibridomima (npr., hibridomi pripremljeni od transgenih miševa koji nose humane imunoglobulinske gene kao što je opisano dalje u nastavku), cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela napravljenih od hibridoma mogu se dobiti standardnim PCR amplifikacijom ili tehnikama kloniranja cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke gena imunoglobulina (npr., korišćenjem tehnika prikaza faga), nukleinska kiselina koja kodira antitelo može se dobiti iz biblioteke. Primer DNK sekvence koja kodira VH sekvencu antitela za koja se traži zaštita je navedena u SEQA ID NO: 176. Primer DNK sekvence koja kodira sekvencu lakog lanca antitela za koje se traži zahtev je navedena u SEQ ID NO: 168.

[0272] Postupci za pravljenje anti-OX40 antitela predviženih ovde mogu uključiti ekspresiju teškog lanca i lakog lanca u ćelijskoj liniji koja sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju teške i lake lance sa signalnim peptidom. Ovde su takođe predviđene ćelije domaćini koje sadrže ove nukleotidne sekvence.

[0273] Kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL segmente, ovim fragmentima DNK se može dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer da se geni varijabilnog regiona konvertuju u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, fragment DNK koji kodira VL ili VH je operativno vezan za drugi DNK fragment koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni veznik. Pojam "operativno povezan", kako se koristi u ovom kontekstu, odnosi se na spajanje dva fragmenta DNK tako da sekvence aminokiselina koje kodiraju ostaju u okviru.

[0274] Izolovana DNK koja kodira VH region može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira VH sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (zglob, CH1, CH2 i/ili CH3). Sekvence gena humanog konstantnog regiona teškog lanca su poznate u oblasti tehnike (videti npr., Kabat, E.A., i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interes, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i usluga stanovništvu SAD-a, NIH objava br. 91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, na primer, IgG1 region. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VH može biti operativno povezana sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region CH1 teškog lanca.

[0275] Izolovana DNK koja kodira VL region može se konvertovati u gen lakog lanca pune dužine (kao i gen Fab lakog lanca) operativnim povezivanjem DNK koji kodira VL sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena humanog konstantnog regiona lakog lanca su poznate u oblasti (videti, npr., Kabat, E. A., i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i usluga stanovništvu SAD-a, NIH objava br 91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.

[0276] Da bi se stvorio scFv gen, fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL su operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni veznik, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4- Ser)3, tako da VH i VL sekvence mogu biti eksprimirane kao kontinualni jednolančani protein, sa VL i VH regionima spojenim fleksibilnim veznikom (videti npr., Bird i sar. (1988) Science 242:423-426; Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85:5879-5883; McCafferty i sar., (1990) Nature 348:552-554).

[0277] Ovde su takođe obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina za koje se ne traži zaštita koji kodiraju VH i VL sekvence koje su homologne onima od 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 14A21, 14A2-2 i 20C1 monoklonskih antitela. Primeri molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju VH i VL sekvence koje su najmanje 70% identične, na primer, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identične molekulima nukleinskih kiselina koje kodiraju VH i VL sekvence 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1 monoklonskih antitela. Ovde su takođe obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina sa konzervativnim supstitucijama (tj., supstitucije koje ne menjaju rezultujuću aminokiselinsku sekvencu nakon translacije molekula nukleinske kiseline), npr., za optimizaciju kodona.

XI. Stvaranje antitela

[0278] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu se proizvesti korišćenjem različitih poznatih tehnika, kao što je standardna tehnika hibridizacije somatskih ćelija koju su opisali Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su procedure hibridizacije somatskih ćelija poželjnije, u principu, mogu se koristiti i druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B limfocita, tehnika prikaza faga korišćenjem biblioteka gena humanih antitela.

[0279] Poželjni životinjski sistem za pripremu hibridoma je murinski sistem. Proizvodnja hibridoma kod miša je vrlo dobro uspostavljena procedura. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u oblasti. Takođe su poznati fuzioni partneri (npr., murinske ćelije mijeloma) i postupci fuzije.

[0280] Himerna ili humanizovana antitela koja su ovde opisana mogu se pripremiti na osnovu sekvence murinskog monoklonskog antitela pripremljenog kao što je opisano gore. DNK koja kodira imunoglobuline sa teškim i lakim lancem može se dobiti od murinskog hibridoma od interesa i proizvesti inženjeringom da sadrži nemurinske (npr., humane) imunoglobulinske sekvence korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerično antitelo, murinski varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima korišćenjem postupaka poznatih u oblasti (videti npr. U.S. patent br. 4,816,567 od Cabilly i sar.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, murinski CDR regioni se mogu ubaciti u humani okvir korišćenjem postupaka poznatih u oblasti (videti npr., U.S. patent br.5,225,539 od Winter, i U.S. patenti sa brojevima 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 od Queen i sar.).

[0281] U jednom tehničkom rešenju, antitela opisana ovde su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv OX40 mogu se stvoriti korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. Ovi transgeni ili transhromozomski miševi uključuju miševe koji se ovde nazivaju HuMAt miševi i KM miševi, redom, i ovde se zajednički nazivaju "humani Ig miševi."

[0282] HuMAb mouse<®>(Medarex, Inc.) sadrži minilokuse gena humanog imunoglobulina koji kodiraju nepreuređene humane sekvence teškog (µ i γ) i κ lakog lanca imunoglobulina, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanca (videti npr., Lonberg, i sar. (1994) Nature 368( 6474): 856-859). Shodno tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, a kao odgovor na imunizaciju, uvedeni humani transgeni teškog i lakog lanca prolaze kroz menjanje klasa i somatsku mutaciju da bi generisali humano monoklonalno IgCκ visokog afiniteta (Lonberg, N. i sar. (1994), supra; revidiran u Lonberg, N. (1994) Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, i Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Priprema i primena HuMat miševa, i genomske modifikacije koje nose takvi miševi, dalje je opisano u Taylor, L. i sar. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. i sar. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon i sar. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 90:3720-3724; Choi i sar. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. i sar. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon i sar. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. i sar. (1994) International Immunology 6: 579-591; i Fishwild, D. i sar. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Videti dalje, U.S. patent sa brojevima 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; svi od Lonberg i Kay; U.S. patent br.

5,545,807 od Surani i sar.; PCT objava sa brojevima WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962, sve od Lonberg i Kay; i PCT objava br. WO 01/14424 od Korman i sar.

[0283] U određenim tehničkim rešenjima, antitela opisana ovde se uzgajaju korišćenjem miša koji nosi sekvence humanog imunoglobulina na transgenima i transhomozomima, kao što je miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi, koji se ovde pominju kao "KM miševi", su detaljno opisani u PCT objavi WO 02/43478 od Ishida i sar.

[0284] Dalje, alternativni sistemi transgenih životinja koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u oblasti i mogu se koristiti za uzgajenje anti-OX40 antitela opisanih ovde. Na primer, može se koristiti alternativni transgeni sistem koji se naziva Xenomouse (Abgenix, Inc.); takvi miševi su opisani u, na primer, U.S. patentima sa brojevima 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 od Kucherlapati i sar.

[0285] Štaviše, alternativni sistemi transhromozomskih životinja koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u oblasti i mogu se koristiti za uzgajenje anti-OX40 antitela opisanih ovde. Na primer, miševi koji nose i hromozome humog teškog lanca i hromozome humanog lakog lanca, označene kao "TC miševi" mogu se koristiti; takvi miševi su opisani od strane Tomizuka i sar. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 97:722-727. Osim toga, krave koje nose transhromozome teškog i lakog lanca su opisani u oblasti (Kuroiwa i sar. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu se koristiti da se gaje anti-OX40 antitela opisana ovde.

[0286] Dodatni mišji sistemi opisani u oblasti za podizanje humanih antitela, npr., humana anti-OX40 antitela, uključuju (i) Veloclmmune® miša (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), u kome su endogeni varijabilni regioni teškog i lakog lanca miša zamenjeni, putem homologne rekombinacije, sa humanim varijabilnim regionima teškog i lakog lanca, koji su operativno povezani sa endogenim konstantnim regionima miša, tako da himerna antitela (humani V/miš C) se uzgajaju kod miševa, a zatim se konvertuju u potpuno humana antitela korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK; i (ii) MeMo® miša (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), u kojem miš sadrži nepreuređene humane varijabilne regione teškog lanca ali jedan preuređeni humani zajednički varijabilni region lakog lanca. Takvi miševi i njihova primena za uzgajanje antitela su opisani u, na primer, WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 i US 2012/0073004.

[0287] Human monoklonska antitela opisana ovde mogu se takođe pripremiti korišćenjem metoda prikaza faga za skrining biblioteka gena humaog imunoglobulina. Takve metode prikaza faga za izolovanje humanih antitela su uspostavljene u oblasti. Videti na primer: U.S. patenti sa brojevima 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 od Ladner i sar.; U.S. patenti sa brojevima. 5,427,908 i 5,580,717 od Dower i sar.; U.S. patenti sa brojevima 5,969,108 i 6,172,197 od McCafferty i sar.; i U.S. patent sa brojevima 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 od Griffiths i sar.

[0288] Humana monoklonska antitela opisana ovde mogu se takođe pripremiti korišćenjem SCID miševa u kojima su humane imune ćelije rekonstruisane tako da se može stvoriti odgovor humanog antitela nakon imunizacije. Takvi miševi su opisani u, na primer, U.S. patentima sa brojevima 5,476,996 i 5,698,767 od Wilson i sar.

Imunizacije

[0289] Kako bi se stvorrila potpuno humana antitela na OX40, transgeni ili transhromozomski koji sadrže gene humanog imunoglobulina (npr., HCo12, HCo7 ili KM miševi) mogu se imunizovati sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom OX40 antigena i/ili ćelija koje eksprimiraju OX40 ili njegovog fragmenta, kao što je opisano za druge antigene, na primer, od strane Lonberg i sar. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild i sar. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 i WO 98/24884. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira humani OX40 ili njegov fragment. Poželjno, miševi će biti starosti 6-16 nedelja nakon prve infuzije. Na primer, prečišćeni ili obogaćeni preparat (5-50 µg) rekombinantnog OX40 antigena može se koristiti da se imunizuju HuMAb miševi intraperitonealno. U slučaju da imunizacija koja koristi prečišćeni ili obogaćeni preparat OX40 antigena ne dovodi do pojave antitela, miševi se takođe mogu imunizovati sa ćelijama koje eksprimiraju OX40, npr., ćelijskom linijom, da se promovišu imunološki odgovori. Primeri ćelijskih linija uključuju stabilne CHO i Raji želijske linije koje prekomerno eksprimiraju OX40.

[0290] Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima pokazalo je da HuMAb transgeni miševi najbolje reaguju kada su inicijalno intraperitonealno (IP) ili subkutano (SC) imunizovani antigenom u Ribi-jevom adjuvansu, zatim svake druge nedelje IP/SC imunizacije (do ukupno 10) sa antigen u Ribi-jevom adjuvansu. Imunološki odgovor se može pratiti tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme koji se dobijaju retroorbitalnim krvarenjem. Plazma se može pregledati pomoću ELISA i FACS (kao što je opisano u nastavku), i miševi sa dovoljnim titarima anti-OX40 humanog imunoglobulina mogu se koristiti za fuzije. Miševi se mogu pojačati intravenozno antigenom 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine i limfnih čvorova. Očekuje se da će možda biti potrebno izvršiti 2-3 fuzije za svaku imunizaciju. Između 6 i 24 miša je tipično imunizovano za svaki antigen. Obično, koriste se HCo7, HCo12, i KM sojevi. Pored toga, oba HCo7 i HCo12 transgena mogu da se razmnože zajedno u jednom mišu koji ima dva različita transgena humanog teškog lanca (HCo7/HCo12).

Stvaranje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela na OX40

[0291] Da bi se stvorili hibridniomi koji proizvode antitela opisana ovde, splenociti i/ili ćelije limfnog čvora iz imunizovanih miševa mogu biti izolovani i spojeni sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. Dobijeni hibridniomi se mogu pregledati na proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Na primer, jednoćelijske suspenzije limfocita slezine iz imunizovanih miševi mogu se spojiti sa Sp2/0 nesekretujućim ćelijama mijeloma miša (ATCC, CRL 1581) sa 50% PEG. Ćelije su postavljene pri približno 2 × 10<5>u mikrotitarsku ploču sa ravnim dnom, nakon čega sledi dvonedeljna inkubacija u selektivnoj podlozi koja sadrži 10% fetalnog klonskog seruma, 18% "653" kondicioniranog medijuma, 5% origena (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanola, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma). Posle otprilike dve nedelje, ćelije se mogu uzgajati u medijumu u kome je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarići se zatim mogu skrinovati pomoću ELISA na humana monoklonska IgM i IgG antitela. Kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridnioma, medijum se obično može posmatrati nakon 10-14 dana. Antitelo-sekretirajući hibridniomi mogu da se zamene, ponovo pregledaju, i ako su i dalje pozitivni na humani IgG, monoklonska antitela se mogu subklonirati najmanje dva puta ograničavanjem razblaženja. Stabilni subklonovi se zatim mogu kultivisati in vitro da bi se stvorile male količine antitela u medijumu kulture tkiva za karakterizaciju.

[0292] Da bi se pričistila antitela, odabrani hibridniomi se mogu uzgajati u dvolitarskim spinerbocama za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti se mogu filtrirati i koncentrovati pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG se može proveriti gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi da bi se obezbedila čistoća. Rastvor pufera se može zameniti u PBS, i koncentracija se može odrediti pomoću OD280 koristeći koeficijent ekstinkcije 1.43. Antitela se tada mogu podeliti na alikvote i čuvati na -80° C.

Stvaranje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela na OX40

[0293] Antitela se mogu proizvesti u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena, kao što je dobro poznato u oblasti (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[0294] Na primer, za ekspresiju antitela ili njihovih fragmenata antitela, DNK koje kodiraju lake i teške lance delimične ili pune dužine, mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije (npr., PCR amplifikacija ili cDNK kloniranje korišćenjem hibridoma koji eksprimira antitelo od interesa) a DNK se mogu umetnuti u ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U ovom kontekstu, pojam "operativno vezan" znači da je gen antitela vezan u vektor tako da sekvence kontrole transkripcije i translacije unutar vektora služe svojoj predviđenoj funkciji regulacije transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije su izabrane da budu kompatibilne sa korišćenom ćelijom domaćinom za ekspresiju. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti umetnuti u poseban vektor ili oba gena se ubacuju u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se umeću u ekspresioni(e) vektor(e) standardnim postupcima (npr., ligacija komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektoru, ili tupim krajem ako nema restrikcijskih mesta). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca ovde opisanih antitela mogu se koristiti za stvaranje gena za antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela njihovim umetanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i konstantne regione lakog lanca željenog izotipa tako da je VHsegment operativno vezan za CHsegment(e) unutar vektora, a VLsegment je operativno vezan za CLsegment unutar vektora.

[0295] Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor tako da je signalni peptid vezan u okviru za amino terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina). Primeri signalnih sekvenci za primenu u teškim i lakim lancima antitela uključuju signalne sekvence prvobitno pronađene u anti-OX40 antitelima opisanim ovde.

[0296] Pored gena lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori mogu da nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Pojam "regulatorna sekvenca" treba da uključi promotere, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr., signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddelu (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Stručnjaci će ceniti da dizajn ekspresionih vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, nivo željene ekspresije proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju ćelije domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr., glavni kasni promoter adenovirusa (AdMLP - adenovirus major late promoter) i polioma. Alternativno, mogu se koristiti nevirusne regulatorne sekvence, kao što je promoter ubikvitina ili β-globin promoter. Još dalje, regulatorni elementi sastavljeni od sekvence iz različitih izvora, kao što je SRα sistem promotora, koji sadrži sekvence iz SV40 ranog promotera i dugotrajno terminalno ponavljanje virusa leukemije T ćelija tipa 1 (Takebe, Y. i sar. (1988) Mol. Cell. Biol.8:466-472).

[0297] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., poreklo replikacije) i selektivni markerski geni. Selektivni markerski gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti, npr., US Pat. sa brojevima 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve od Axel i sar.). Na primer, tipično selektivni markerski gen daje rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koju je vektor uveden. Poželjni selektivni markerski geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za primenu u dhfr ćelijama domaćina sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za G418 selekciju).

[0298] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lanake se transfektuje u ćelije domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici pojma "transfekcija" imaju za cilj da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotske ili eukariotske ćelije domaćina, npr., elektroporaciju, taloženje kalcijum-fosfatom, transfekciju DEAE-dekstranom i slično. Iako je teoretski moguće eksprimirati antitela opisana ovde bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, i najpoželjnije ćelijama domaćina sisara, je najpoželjnija jer je za takve eukariotske ćelije, a posebno ćelije sisara, verovatnije nego za prokariotske ćelije, da sastave i luče pravilno savijeno i imunološki aktivno antitelo. Prijavljeno je da je prokariotska ekspresija gena antitela neefikasna za proizvodnju visokih prinosa aktivnog antitela (Boss, M. A. i Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Antitela koja su ovde stavljena na uvid takođe se mogu proizvesti u sojevima kvasca Pichia pastoris kvasca Pichia pastoris. Li i sar. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210.

[0299] Poželjne ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnog antitela opisanog ovde uključuju jajnik kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77:4216-4220, korišćene sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Konkretno, za upotrebu sa NSO ćelijama mijeloma, drugi poželjni sistem ekspresije je GS sistem ekspresije gena stavljen na uvid javnosti u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338,841. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju antitelo gene unesu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili, što je još poželjnije, izlučivanje antitela u medijum za kulturu u kojima se gaje ćelije domaćina. Antitela se mogu dobiti iz medijuma kulture korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja proteina.

[0300] N- i C-terminusi polipeptidnih lanaca antitela predmetnog pronalaska mogu se razlikovati od očekivane sekvence usled najčešće primećene post-translacione modifikacije. Na primer, C-terminalni ostaci lizina često nedostaju u teškim lancima antitela. Dick i sar. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132. N-terminalni ostaci glutamina, i u manjoj meri ostaci glutamata, često se konvertuju u ostatke piroglutamata na oba laka i teška lanca terapijskog antitela. Dick i sar. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu i sar. (2011) JBC 28611211; Liu i sar. (2011) J. Biol. Chem.

286:11211.

XII. Testovi

[0301] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu se testirati na vezivanje za OX40 pomoću, na primer, standardnog ELISA. Ukratko, mikrotitarske ploče su obložene prečišćenim OX40 na 1-2 µg/ml u PBS, a zatim sam blokiran sa 5% goveđeg serumskog albumina u PBS. Razblaženja antitela (npr., razblaženja plazme iz imunizovanih miševa imunizovanih sa OX40) dodaju se u svaki bazenčić i inkubiraju 1-2 sata na 37°C. Ploče su isprane sa PBS/Tween a zatim su inkubirane sa sekundarnim reagensima (npr., za humana antitela, kozji anti-humani IgG Fc-specifični poliklonski reagens) konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) tokom 1 sata na 37°C. Nakon pranja, ploče se razvijaju sa ABTS supstratom (Moss Inc, proizvod: ABTS-1000) i analiziraju spektrofotometrom na OD 415-495. Serumi iz imunizovanih miševi se zatim dalje pregledaju protočnom citometrijom za vezivanje za ćelijsku liniju koja eksprimira humani OX40, ali ne i za kontrolnu ćelijsku liniju koja ne ekspresuje OX40. Ukratko, vezivanje anti-OX40 antitela se procenjuje inkubacijom CHO ćelije koje eksprimiraju OX40 sa anti-OX40 antitelom pri razblaženju 1:20. Ćelije se isperu i vezivanje se detektuje sa PE obeleženim anti-humanim IgG At. Protočne citometrijske analize se izvode korišćenjem FACScan protočne citometrije (Becton Dickinson, San Hoze, CA). Poželjno, miševi koji razviju najveće titre biće korišćeni za fuzije.

[0302] ELISA test kao što je opisano gore može se koristiti za skrining antitela i, prema tome, hibridnioma koji proizvode antitela koja pokazuju pozitivnu reaktivnost sa OX40 imunogenom. Hibridiomi koji proizvode antitelu koja se vezuju, poželjno sa visokim afinitetom, za OX40 mogu se zatim subklonirati i dalje karakterisati. Po jedan klon iz svakog hibridnioma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (sa ELISA), može se zatim izabrati za pravljenje banke ćelija, i za prečišćavanje antitela.

[0303] Za prečišćavanje anti-OX40 antitela, odabrani hibridniomi se mogu uzgajati u dvolitarskim spiner-bocama za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti se mogu filtrirati i koncentrovati pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluirani IgG se može proveriti gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi da bi se obezbedila čistoća. Rastvor pufera se može zameniti u PBS, i koncentracija se može odrediti pomoću OD280koristeći 1.43 koeficijent ekstinkcije. Monoklonska antitela se mogu deliti na alikvote i čuvati na -80 °C.

[0304] Da bi se utvrdilo da li se odabrani anti-OX40 antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo može biti biotinilovano korišćenjem komercijalno dostupnih reagensa (Pierce, Rockford, IL). Biotinilovano vezivanje MAt može se otkriti pomoću sonde označene streptavidinom. Studije konkurencije korišćenjem neobeleženih monoklonskih antitela i biotinilovanih monoklonskih antitela mogu se izvesti korišćenjem OX40 obloženih ELISA ploča kao što je gore opisano.

[0305] Da bi se odredio izotip prečišćenog antitela, izotip ELISA se može izvesti korišćenjem reagensa specifičnog za antitela određenog izotipa. Na primer, da bi se odredio izotip humanog monoklonskog antitela, bunarići mikrotitarskih ploča mogu se obložiti sa 1 µg/ml anti-humanog imunoglobulina preko noći na 4°C. Nakon blokiranja sa 1% BSA, ploče reaguju sa 1 µg /ml ili manje test monoklonskog antitela ili prečišćenih izotipskih kontrola, na temperaturi okoline jedan do dva sata. Bunarići zatim mogu reagovati ili sa humanim IgG1 ili humanim IgM-specifičnim sondama konjugovanim alkalnom fosfatazom. Ploče se razvijaju i analiziraju kao što je gore opisano.

[0306] Da bi se testiralo vezivanje antitela za žive ćelije koje eksprimiraju OX40, može se koristiti protočna citometrija, kao što je opisano u primerima. Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju OX40 vezan za membranu (odgajane u standardnim uslovima rasta) su pomešane sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u PBS-u koji sadrži 0.1% BSA na 4°C tokom 1 sata. Posle ispiranja, ćelije reaguju sa anti-IgG antitelom obeleženim fluoresceinom pod istim uslovima kao i primarno bojenje antitelom. Uzorci se mogu analizirati pomoću FACScan instrumenta korišćenjem svetlosti i svojstva bočnog rasejanja da bi se otvorile pojedinačne ćelije i odredilo se vezivanje obeleženih antitela. Alternativni test korišćenjem fluorescentne mikroskopije može se koristiti (pored ili umesto) testa protočne citometrije. Ćelije mogu biti obojene tačno kako je gore opisano i ispitane fluorescentnom mikroskopijom. Ova metoda omogućava vizualizaciju pojedinačnih ćelija, ali može imati smanjenu osetljivost u zavisnosti od gustine antigena.

[0307] Anti-OX40 antitela se mogu dalje testirati na reaktivnost sa OX40 antigenom pomoću Western blot-a. Ukratko, ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju OX40 mogu se pripremiti i podvrgnuti natrijum-dodecil sulfat poliakrilamidnnoj gel elektroforezi. Nakon elektroforeze, izdvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani sa 20% mišjeg seruma i ispitani monoklonskim antitelima koja će se testirati. Vezivanje IgG se može otkriti korišćenjem anti-IgG alkalne fosfataze i razviti sa BCIP/NBT supstratnim tabletama (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

[0308] Postupci za analiziranje afiniteta vezivanja, unakrsne reaktivnosti, i kinetike vezivanja uključuju standardne testove poznate u oblasti na primer, BIACORE<®>SPR analizu korišćenjem BIACORE<®>2000 SPR instrumenta (Biacore AB, Upsala, Švedska).

[0309] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se specifično vezuje za ekstracelularni region humanog OX40. Na primer, antitelo se može specifično vezivati za određeni domen (npr., funkcionalni domen) sa ekstracelularnim domenom odOX40. U odrešenom tehničkom rešenju, antitelo se specifično vezuje za mesto na OX40 za koje se OX40-L vezuje. U drugim tehničkim rešenjima, antitelo se specifično vezuje za ekstracelularni region humanog OX40 i ekstracelularni region cinomolgus OX40.

XIII. Imunokonjugati, derivati antitela i dijagnostika

[0310] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu se koristiti u dijagnostičke svrhe, uključujući testiranje uzoraka i in vivo snimanje, i u ovu svrhu antitelo (ili njegov vezujući fragment) mogu se konjugovati za odgovarajući agens koji se može detektovati, da formiraju imunokonjugat. U dijagnostičke svrhe, odgovarajući agensi su oznake koje se mogu detektovati koje uključuju radioizotipe, za snimanje celog tela, i radioizotope, enzime, fluorescentne oznake i druge pogodne oznake antitela za testiranje uzoraka.

[0311] Oznake koje se mogu detektovati mogu biti mogu biti bilo koji od različitih tipova koji se trenutno koriste u oblasti in vitro dijagnostike, uključujući oznake čestica uključujući metalne solove kao što je koloidno zlato, izotope kao što su I<125>ili Tc<99>predstavljene na primer sa peptidnim helatnim agensima tipa N2S2, N3S ili N4, hromofore uključujući fluorescentne markere, biotin, luminescentne markere, fosforescentne markere i slično kao i enzimske oznake koji konvertuju dati supstrat u marker koji se može detektovati, i polinukleotidne oznake koje se otkrivaju nakon amplifikacije kao što je lančana reakcija polimeraze. Biotinilovano antitelo bi se tada mogao detektovati vezivanjem avidinom ili streptavidinom. Pogodne enzimske oznake uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i slično. Na primer, oznaka može biti enzim alkalna fosfataza, detektovan merenjem prisustva ili formiranja hemiluminiscencije nakon konverzije 1,2 dioksetan supstrata kao što je adamantil metoksi fosforiloksi fenil dioksetan (AMPPD), dinatrijum 3-(4-(metoksispiro{1,2-dioksetan-3,2'-(5'-hloro)triciklo{3.3.1.13,7}dekan}-4-il) fenil fosfat (CSPD), kao i CDP i CDP-star<®>ili drugi luminescentni supstrati dobro poznati onima iz oblasti, na primer helati pogodnih lantanida kao što je terbium(III) i europijum(III). Sredstvo za detekciju se određuje izabranom oznakom. Izgled oznake ili njenih produkta reakcije može se postići golim okom, u slučaju kada je oznaka čestica i akumulira se na odgovarajućim nivoima, ili korišćenjem instrumenata kao što su spektrofotometar, luminometar, fluorimetar, i slično, sve u skladu sa standardnom praksom.

[0312] Poželjno, metode konjugacije rezultuju vezama koje su suštinski (ili skoro) neimunogene, npr., peptidne (tj. amidne-), sulfidne, (sterički ometane), disulfidne-, hidrazonske-, i etarske veze. Ove veze su skoro neimunogene i pokazuju razumnu stabilnost unutar seruma (videti npr. Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol.13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).

[0313] U zavisnosti od biohemijske prirode segmenta i antitela, mogu se primeniti različite strategije konjugacije. U slučaju da je segment prirodno prisutan ili rekombinantni polipeptid od između 50 i 500 aminokiselina, postoje standardne procedure u udžbenicima koji opisuju hemiju za sintezu proteinskih konjugata, koje kvalifikovani stručnjak može lako da prati (videti npr. Hackenberger, C. P. i Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 47 (2008) 10030-10074). U jednom tehničkom rešenju se koristi reakcija maleinimido segmenta sa cisteinskim ostatkom unutar antitela ili segmenta. Ovo je posebno pogodna hemija spajanja u slučaju da se npr. koristi Fab ili Fab’-fragment antitela. Alternativno, u jednom tehničkom rešenju izvodi se spajanje na C-terminalni kraj antitela ili segmenta. C-terminalna modifikacija proteina, npr. Fab-fragmenta može se npr. izvoditi kako je opisano (Sunbul, M. i Yin, J., Org. Biomol. Chem.7 (2009) 3361-3371).

[0314] Generalno, reakcija specifična za mesto i kovalentno spajanje se zasniva na transformaciji prirodne aminokiseline u aminokiselinu sa reaktivnošću koja je ortogonalna reaktivnosti drugih prisutnih funkcionalnih grupa. Na primer, specifični cistein unutar konteksta retke sekvence može biti enzimski konvertovan u aldehid (videti Frese, M. A., i Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). Takođe je moguće dobiti željenu modifikaciju aminokiselina korišćenjem specifične enzimske reaktivnosti određenih enzima sa prirodnom aminokiselinom u kontekstu date sekvence (videti, npr., Taki, M. i sar., Prot. Eng. Des. Sel.17 (2004) 119-126; Gautier, A. i sar. Chem. Biol.

15 (2008) 128-136; a formiranje C--N veza katalizovano proteazom je opisano u Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403).

[0315] Reakcija specifična za mesto i kovalentno spajanje se takođe mogu postići selektivnom reakcijom terminalnih aminokiselina sa odgovarajućim reagensima za modifikovanje.

[0316] Reaktivnost N-terminalnog cisteina sa benzonitrilima (videti Ren i sar., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.48 (2009) 9658-9662) može se koristiti za postizanje kovalentnog spajanja specifičnog za mesto.

[0317] Prirodna hemijska ligacija se takođe može osloniti na C-terminalne ostatke cisteina (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).

[0318] EP 1074563 opisuje opisuje postupak konjugacije koji se zasniva na bržoj reakciji cisteina unutar dela negativno naelektrisanih amino kiselina od cisteina koji se nalazi u delu pozitivno naelektrisanih amino kiselina.

[0319] Segment takođe može biti sintetički peptid ili imitator peptida. U slučaju da se polipeptid hemijski sintetiše, aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću mogu biti ugrađene tokom takve sinteze (videti npr. de Graaf i sar., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Pošto je veliki broj ortogonalnih funkcionalnih grupa u pitanju i mogu se uvesti u sintetički peptid, konjugacija takvog peptida sa veznikom je standardna hemija.

[0320] Da bi se dobio mono-obeleženi polipeptid, konjugat sa 1:1 stehiometrijom može da se odvoji hromatografijom od drugih sporednih proizvoda konjugacije. Ova procedura se može olakšati korišćenjem bojom obeleženog vezujućeg člana para i naelektrisanog veznika. Korišćenjem ove vrste obeleženog i veoma negativno naelektrisanog vezujućeg člana para, mono konjugovani polipeptidi se lako odvajaju od neobeleženih polipeptida i polipeptida koji nose više od jednog veznika, pošto se razlika u naelektrisanju i molekulskoj težini može koristiti za separaciju. Fluorescentna boja može biti korisna za prečišćavanje kompleksa od nevezanih komponenti, kao što je obeleženo monovalentno vezivo.

[0321] U jednom tehničkom rešenju, segment ezan za anti-OX40 antitelo je odabran iz grupe koja se sastoji od vezujućeg segmenta, segmenta za obeležavanje, i biološki aktivnog segmenta.

[0322] Anti-OX40 antitela opisana ovde takođe mogu biti konjugovana sa terapijskim agensom da bi se formirao imunokonjugat kao što je konjugat antitelo-lek (ADC - antibody-drug conjugate). Pogodni terapijski agensi uključuju antimetabolite, alkilirajuće agense, veziva za mali žljeb DNK, DNK interkalatore, DNK umreživače, inhibitore histon deacetilaze, inhibitore nuklearnog izvoza, inhibitore proteazoma, inhibitore topoizomeraze I ili II, inhibitore proteina toplotnog šoka, inhibitore tirozin kinaze, antibiotike, i anti-mitotičke agense. U ADC, antitelo i terapijski agens poželjno su konjugovani preko veznika koji se može cepati kao što je peptidil, disulfid, ili hidrazonski veznik. Još poželjnije, veznik je peptidil veznik kao što je Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 180), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, ili Glu. ADC se mogu pripremiti kao što je opisano u U.S. pat. sa brojevima 7,087,600; 6,989,452; i 7,129,261; PCT objavama WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; i WO 08/103693; U.S. patentnim objavama 20060024317; 20060004081; i 20060247295.

[0323] Tačnije, u ADC-u, antitelo je konjugovano sa lekom, pri čemu antitelo funkcioniše kao agens za ciljanje, za usmeravanje ADC-a na ciljanu ćeliju koja eksprimira svoj antigen, kao što je ćelija kancera. Poželjno, antigen je antigen povezan sa tumorom, tj., onaj koji je jedinstveno eksprimiran ili prekomerno eksprimiran od strane ćelije kancera. Jednom tamo, lek se oslobađa, bilo unutar ciljane ćelije ili u njenoj blizini, da deluje kao terapijski agens. Za pregled mehanizma delovanja i primeni ADC u terapiji kancera, videt Schrama i sar., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.

[0324] Za lečenje kancera, lek je poželjno citotoksični lek koji izaziva smrt ciljane ćelije kancera. Citotoksični lekovi koji se mogu koristiti u ADC uključuju sledeće vrste jedinjenja i njihove analoge i derivate:

(a) enediini kao što je kaliheamicin (videti, npr., Lee i sar., J. Am. Chem. Soc.1987, 109, 3464 i 3466) i uncialamicin (videti, npr., Davies i sar., WO 2007/038868 A2 (2007) i Chowdari i sar., US 8,709,431 B2 (2012));

(b) tubulizine (videti, npr., Domling i sar., US 7,778,814 B2 (2010); Cheng i sar., US 8,394,922 B2 (2013); i Cong i sar., US ser. br.14/177376, podneta 11. februara 2014)); (c) CC-1065 i duokarmicin (videti, npr., Boger, US 6,5458,530 B1 (2003); Sufi i sar., US 8,461,117 B2 (2013); i Zhang i sar., US 2012/0301490 A1 (2012));

(d) epotiloni (videti, npr., Vite i sar., US 2007/0275904 A1 (2007) i US RE42930 E (2011));

(e) auristatini (videti, npr., Senter i sar., US 6,844,869 B2 (2005) i Doronina i sar., US 7,498,298 B2 (2009));

(f) dimere pirolobezodiazepina (PBD) (videti, npr., Howard i sar., US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013); i WO 2013/041606 A1 (2013)); i

(g) majtanzinoidi kao što su DM1 i DM4 (videti, npr., Chari i sar., US 5,208,020 (1993) i Amphlett i sar., US 7,374,762 B2 (2008)).

[0325] U ADC, veznik kovalentno povezuje antitelo i lek. Tipično, postoji jedan molekul leka vezan za svaki veznik, ali veznik može biti razgranat, omogućavajući vezivanje više molekula leka da bi se povećalo opterećenje leka koji se isporučuje po ADC-u. Dalje, svako antitelo može imati više od jednog vezanog veznika. Broj molekula leka koje isporučuje ADC-u se naziva odnos lekantitelo (DAR - drug-antibody ratio). Na primer, ako svaki teški lanac antitela ima vezan jedan veznik koji zauzvrat ima vezan jedan molekul leka, DAR je 2. Poželjno, DAR je između 1 i 5, poželjnije između 2 i 4. Stručnjaci će takođe ceniti da, dok je u svakom pojedinačnom ADC antitelo konjugovano sa celim brojem molekula leka, kao celina, preparat ADC se može analizirati za DAR koji nije ceo broj, koji odražava statistički prosek. Ukratko, konstrukcija ADC-a može biti predstavljena sledećom formulom:

gde obično m je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 (poželjno 2, 3, ili 4) a n je 1, 2, ili 3.

[0326] U nekim tehničkim rešenjima, veznik sadrži grupu koja se može cepati i koja se cepa unutar ili u blizini ciljane ćelije, da bi se oslobodio lek. U drugim tehničkim rešenjima, veznik ne sadrži grupu koja se može cepati, već, radije, ADC se oslanja na katabolizam antitela da bi oslobodio lek.

[0327] Jedan tip grupe koja se može cepiti je pH osetljiva grupa. pH u krvnoj plazmi je malo iznad neutralnog, dok je pH unutar lizozoma - gde većina ADC-a završi nakon internalizacije unutar ciljane ćelije - kisela, oko 5. Dakle, grupa koja se može cepati, čije je cepanje katalizovano kiselinom će se cepati brzinom nekoliko redova veličine brže unutar lizozoma nego u krvnoj plazmi. Primeri grupa osetljivih na kiselinu uključuju cis-akonitil amide i hidrazone, kao što je opisano u Shen i sar., US 4,631,190 (1986); Shen i sar., US 5,144,011 (1992); Shen i sar., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981, 102, 1048; i Yang i sar., Proc. Nat'l Acad. Sci (SAD), 1988, 85, 1189.

[0328] U drugom tehničkom rešenju, grupa koja se može cepati je disulfid. Disulfidi se mogu cepati mehanizmom izmene tiol-disulfida, brzinom koja zavisi od koncentracije tiola u okruženju. Pošto je intracelularna koncentracija glutationa i drugih tiola viša od njihovih koncentracija u serumu, brzina cepanja disulfida će biti veća intracelularno, tj., nakon internalizacije ADC. Dalje, brzina razmene tiol-disulfida može se modulisati podešavanjem steričnih i elektronskih karakteristika disulfida (npr., alkil-aril disulfida u odnosu na alkil-alkil disulfide; supstitucija na aril prstenu, itd.), omogućavajući dizajn disulfidnih veza koje imaju poboljšanu stabilnost u seruma ili određenu brzinu cepanja. Za dodatne objave koje se odnose na disulfidne cepajuće grupe u konjugatima, videti, npr., Thorpe i sar., Cancer Res.1988, 48, 6396; Santi i sar., US 7,541,530 B2 (2009); Ng i sar., US 6,989,452 B2 (2006); Ng i sar., WO 2002/096910 A1 (2002); Boyd i sar., US 7,691,962 B2 (2010); i Sufi i sar., US 2010/0145036 A1 (2010).

[0329] Poželjna grupa koja se može cepati je peptid koji se selektivno cepa proteazom unutar ciljane ćelije, za razliku od proteaze u serumu. Tipično, peptidna grupa koja se može cepati sadrži od 1 do 20 aminokiselina, poželjno od 1 do 6 aminokiselina, poželjnije od 1 do 3 aminokiseline. Aminokiselina(e) mo(že)gu biti α-aminokiseline koje postoje i/ili ne u prirodi. Aminokiseline koje postoje u prirodi su one koje su kodirane genetskim kodom, kao i aminokiseline izvedene iz njih, na primer, hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, citrulin i O-fosfoserin. U ovom kontekstu, pojam "aminokiselina" takođe uključuje analoge aminokiselina i mimetike. Analozi su jedinjenja koja imaju istu opštu H2N(R)CHCO2H strukturu aminokiseline koja se pojavljuje u prirodi, osim što se R grupa nije ona koja je pronađena u aminokiselinama koje se pojavljuju u prirodi. Primeri analoga uključuju homoserin, norleucin, metionin-sulfoksid i metionin metil sulfonijum. Mimetik aminokiseline je jedinjenje koje ima strukturu različitu od opšte hemijske strukture αaminokiseline, ali funkcioniše na način sličan jednoj. Aminokiselina može biti "L" stereohemije genetski kodiranih aminokiselina, kao i enantiomerne "D" stereohemije.

[0330] Poželjno, peptidna grupa koja se može cepiti sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je sekvenca za prepoznavanje cepanja za proteazu. Mnoge sekvence za prepoznavanje cepanja su poznate u oblasti. Videti, npr., Matayoshi i sar. Science 247: 954 (1990); Dunn i sar. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah i sar. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth.

Enzymol. 244: 615 (1994); Weber i sar. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith i sar. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); i Bouvier i sar. Meth. Enzymol.248: 614 (1995).

[0331] Poželjnije, peptidna grupa koja se može cepiti sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana za cepanje pomoću endosomalne ili lizozomalne proteaze, posebno ove poslednje. Primeri takvih proteaza uključuju katepsine B, C, D, H, L i S, posebno katepsin B. Katepsin B prvenstveno cepa peptide u sekvenci -AA<2>-AA<1>- gde je AA<1>bazna ili jaka aminokiselina koja vezuje vodonik (kao što je lizin , arginin, ili citrulin) aAA<2>je hidrofobna aminokiselina (kao što je fenilalanin, valin, alanin, leucin, ili izoleucin), na primer Val-Cit (gde Cit označava citrulin) ili Val-Lys, napisana u N-do-C smeru. Za dodatne informacije u vezi sa grupama koje se mogu cepati katepsinom, videti Dubowchik i sar., Biorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 3341; Dubowchik i sar., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 3347; i Dubowchik i sar., Bioconjugate Chem.2002, 13, 855. Drugi enzim koji se može koristiti za cepanje peptidil veznika je legumain, lizozomalna cisteinska proteaza koja se prvenstveno cepa na Ala-Ala-Asn.

[0332] U poželjnim tehničkim rešenjima, veznik u ADC-ima sadrži di- ili tripeptid koji se prvenstveno cepa proteazom koja se nalazi unutar ciljane ćelije. Poželjno, di- ili tripeptid se može cepati katepsinom B, poželjnije Val-Cit ili Val-Lys dipeptidom.

[0333] Peptidne grupe sa jednom aminokiselinom koje se mogu cepati takođe se mogu koristiti, kao što je stavljeno na uvid u Chen i sar., US 2010/0113476 A1 (2010).

[0334] Za konjugate koji nisu namenjeni da budu internalizovani od strane ćelije, grupa koja se može cepati može se odabrati tako da je cepa proteaza prisutna u ekstracelularnom matriksu u blizini ciljane ćelije, npr., proteaza koju oslobađa obližnje umiruće ćelije ili proteaza povezana sa tumorom. Primeri ekstracelularnih proteaza povezanih sa tumorom su matriks metaloproteaze (MMP), plazmin, timet oligopeptidaza (TOP) i CD10. Videti, npr., Trouet i sar., US 5,962,216 (1999) i US 7,402,556 B2 (2008); Dubois i sar., US 7,425,541 B2 (2008); i Bebbington i sar., US 6,897,034 B2 (2005).

[0335] Veznik može da obavlja i druge funkcije pored kovalentnog povezivanja antitela i leka. Na primer, veznik može da sadrži poli(etilen glikol) (PEG) grupe, koje poboljšavaju rastvorljivost bilo tokom izvođenja hemije konjugacije ili u konačnom ADC proizvodu.

[0336] Veznik može dalje da uključuje "samožrtvujući" segment koji se nalazi pored peptidne grupe koja se može cepati. "Samožrtvujuća" grupa služi kao odstojnik koji sprečava da antitelo i/ili segment leka sterički ometaju cepanje peptidne grupe pomoću proteaze ali se nakon toga spontano oslobađa (tj., samožrtvuje) kako ne bi ometala delovanje leka. Videti Carl i sar., J. Med. Chem. 1981, 24 (3), 479; Carl i sar., WO 81/01145 (1981); Dubowchik i sar., Pharmacology & Therapeutics 1999, 83, 67; Firestone i sar., US 6,214,345 B1 (2001); Toki i sar., J. Org. Chem.

2002, 67, 1866; Doronina i sar., Nature Biotechnology 2003, 21 (7), 778 (štamparska greška, p.

941); de Groot i sar.,. Org. Chem. 2001, 66, 8815; Boyd i sar., US 7,691,962 B2 (2010); Boyd i sar., US 2008/0279868 A1 (2008); Sufi i sar., WO 2008/083312 A2 (2008); Feng, US 7,375,078 B2 (2008); Jeffrey, US 8,039,273 B2 (2011); i Senter i sar., US 2003/0096743 A1 (2003).

[0337] Poželjna "samožrtvujuća" grupa je p-aminobenzil oksikarbonil (PABC) grupa, čija struktura i mehanizam delovanja su prikazani u nastavku:

[0338] Prema tome, u poželjnom tehničkom rešenju, ADC ima veznik koji sadrži di- ili tripeptid koji se prvenstveno cepa proteazom koja se nalazi unutar ciljane ćelije i, pored di- ili tripeptida, "samožrtvujuću" grupu. Poželjno, di- ili tripeptid se može cepati katepsinom B. Poželjno, "samožrtvujuća" grupa je PABC grupa.

[0339] Brojne tehnike se mogu koristiti za konjugaciju antitela i leka. U poželjnoj, ε-amino grupa u bočnom lancu lizinskog ostatka u antitelu reaguje sa 2-iminotiolanom da bi se uvela slobodna tiolna (-SH) grupa. Tiol grupa može da reaguje sa maleimidnom ili drugom akceptorskom grupom nukleofila da bi izvršila konjugaciju, kao što je ilustrovano u nastavku:

[0340] Obično, postiže se nivo tiolacije od dva do tri tiola po antitelu. Za reprezentativnu proceduru, videti Chowdari i sar., US 8,709,431 B2 (2014). Dakle, u jednom tehničkom rešenju, antitelo ovog pronalaska ima jedan ili više lizinskih ostataka (poželjno dva ili tri) modifikovanih reakcijom sa iminotiolanom.

[0341] Alternativna tehnika konjugacije koristi "klik hemiju" bez bakra, u kojoj se azidna grupa dodaje preko zategnute alkinske veze ciklooktina da bi se formirao 1,2,3-triazolni prsten. Videti, npr., Agard i sar., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571. Azid se može nalaziti na antitelu, a ciklooktin na segmentu leka, ili obrnuto. Poželjna ciklooktinska grupa je dibenzociklooktin (DIBO). Različiti reagensi koji imaju DIBO grupu dostupni su od Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregon. Reakcija ispod ilustruje klik hemijsku konjugaciju za slučaj u kojem je DIBO grupa vezana za antitelo:

U ADC-u napravljenom ovom tehnikom, veznik sadrži 1,2,3-triazolni prsten.

[0342] Još jedna tehnika konjugacije uključuje uvođenje aminokiseline koja se ne pojavljuje u prirodi u antitelo, pri čemu aminokiselina koja se ne pojavljuje u prirodi obezbeđuje funkcionalnost za konjugaciju sa reaktivnom funkcionalnom grupom u segmentu leka. Na primer, aminokiselina koja se ne pojavljuje u prirodi p-acetilfenilalanin može biti ugrađena u antitelo ili drugi polipeptid, kao što je navedeno u Tian i sar., WO 2008/030612 A2 (2008). Ketonska grupa u p-acetilfenilaninu može biti mesto konjugacije formiranjem oksima sa hidroksilamino grupom na segmentu veznik-lek. Alternativno, aminokiselina koje se ne pojavljuje u prirodi pazidofenilalanin može biti ugrađena u antitelo da bi se obezbedila azidna funkcionalna grupa za konjugaciju putem klik hemije, kao što je gore objašnjeno. Aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi se takođe mogu ugraditi u antitelo ili drugi polipeptid korišćenjem postupaka bez ćelija, kao što je navedeno u Goerke i sar., US 2010/0093024 A1 (2010) i Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416. Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, antitelo ima jednu ili više aminokiselina zamenjenih aminokiselinom koja se ne pojavljuju u prirodi, koja je poželjno pacetilfenilalanin ili p-azidofenilalanin, poželjnije p-acetilfenilalanin.

[0343] Još jedna tehnika konjugacije koristi enzim transglutaminazu (poželjno bakterijsku transglutaminazu ili BTG), kako se podučava u Jeger i sar., Angew. Chem. Int. Ed.2010, 49, 9995. BTG formira amidnu vezu između bočnog lanca karboksamida glutamina i alkilenamino grupe, koja može biti, na primer, ε-amino grupa lizina ili 5-amino-n-pentil grupa. U tipičnoj reakciji konjugacije, glutaminski ostatak se nalazi na antitelu, dok se alkilenamino grupa nalazi na segmentu veznik-lek, kao što je prikazano u nastavku:

[0344] Pozicioniranje ostatka glutamina na polipeptidnom lancu ima veliki uticaj na njegovu osetljivost na BTG posredovanu transamidaciju. Nijedan od ostataka glutamina na antitelu nije normalno BTG supstrat. Međutim, ako je antitelo deglikozilovano - mesto glikozilacije je asparagin 297 (N297) - obližnji glutamin 295 (Q295) postaje osetljiv na BTG. Alternativno, antitelo se može sintetizovati bez glikozida uvođenjem mutacije N297A u konstantni region, da bi se eliminisalo mesto glikozilacije N297. Dalje, pokazano je da supstitucija N297Q u antitelu ne samo da eliminiše glikozilaciju, već i uvodi drugi ostatak glutamina (na položaju 297) koji je takođe podložan BTG-posredovanoj transamidaciji. Dakle, u jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo je deglikozilovano. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo ima N297Q supstituciju. Stručnjaci će ceniti da deglikozilacija modifikacijom nakon sinteze ili uvođenjem mutacije N297A generiše dva BTG-reaktivna glutaminskih ostataka po antitelu (jedan po teškom lancu, na položaju 295), dok će antitelo sa supstitucijom N297Q imati četiri BTG-reaktivna ostatka glutamina (dva po teškom lancu, na položajima 295 i 297).

[0345] Dalje, druga tehnika konjugacije koristi enzim Sortazu A, kako je podučeno u Levary i sar., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh i sar., WO 2010/087994 A2 (2010); i Mao i sar., WO 2005/051976 A2 (2005). Motiv prepoznavanja Sortaze A (obično LPXTG (SEQ ID NO: 181), gde je X bilo koja aminokiselina koja se javlja u prirodi) može biti vezan za antitelo, a motiv nukleofilnog akceptora (tipično GGG) može biti lociran na segmentu leka, ili obrnuto.

[0346] Anti-OX40 antitela opisana ovde takođe mogu da se koriste za detekciju OX40, kao što je humani Ox40, npr., humani Ox40 u tkivima ili uzorcima tkiva. Antitela se mogu koristiti, na primer, u ELISA testu ili u protočnoj citometriji. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo je u kontaktu sa ćelijama, npr., ćelijama u tkivu, tokom vremena koje je pogodno da dođe do specifičnog vezivanja, a zatim se dodaje reagens, npr., antitelo koje detektuje anti-OX40 antitelo. Primeri testova su dati u primerima. Anti-OX40 antitelo može biti potpuno humano antitelo, ili može biti himerno antitelo, kao što je antitelo koje ima humane varijabilne regione i mišje konstantne regione ili njihov deo. Primeri postupaka za detekciju OX40, npr., humanog OX40, u uzorku (uzorak ćelije ili tkiva) obuhvataju (i) dovođenje u kontakt uzorka sa anti-OX40 antitelom, tokom vremena dovoljnog da se omogući specifično vezivanje anti-OX40 antitela za OX40 u uzorku, i (2) dovođenje u kontakt uzorka sa reagensom za detekciju, npr., antitelom, koje se specifično vezuje za anti-OX40 antitelo, kao što je Fc region anti-OX40 antitela, da bi se na taj način otkrio OX40 vezan za anti-OX40 antitelo. Koraci ispiranja mogu biti uključeni nakon inkubacije sa antitelom i/ili reagensom za detekciju. Anti-OX40 antitela za upotrebu u ovim postupcima ne moraju da budu povezani sa oznakom ili agensima za detekciju, jer se može koristiti poseban agens za detekciju.

XIV. Bispecifični molekuli

[0347] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu da se koriste za formiranje bispecifičnih molekula. Na primer, antitelo ili njegovi antigen-vezujući delovi mogu biti derivatizovani ili povezani sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr., drugim antitelom ili ligandom za receptor) da bi se stvorio bispecifičan molekul koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljani molekuli. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo može biti povezano sa antitelom ili scFv koji se specifično vezuje za bilo koji protein koji se može koristiti kao potencijalna meta za kombinovane tretmane, kao što su proteini opisani ovde (npr., antitela na PD-1, PD-L1 ili LAG-3). Alternativno, antitelo može biti derivatizovano ili povezano sa više od jednog funkcionalnog molekula da bi se generisali multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljane molekule. Ovakvi multispecifični molekuli takođe treba da budu obuhvaćeni terminom "bispecifični molekul" kako se ovde koristi. Da bi se stvorio bispecifičan molekul opisan ovde, anti-OX40 antitelo može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili mimetik vezivanja, tako da se dobije bispecifičan molekul.

[0348] Prema tome, Ovde su predviđeni bispecifični molekuli koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za OX40 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljani epitop. U jednom tehničkom rešenju, bispecifičan molekul je multispecifičan, npr., molekul dalje uključuje treću specifičnost vezivanja.

[0349] U određenim tehničkim rešenjima, bispecifični molekuli sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo, ili njegov fragment antitela, uključujući, npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ili jedan lanac Fv (scFv). Antitelo takođe može biti dimer lakog ili teškog lanca, ili bilo koji njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisano uLadner i sar. U.S. Patent No.4,946,778.

[0350] Dok su humana monoklonska antitela poželjna, druga antitela se mogu koristiti u bispecifičnim molekulima opisanim ovde, uključujući, npr., murinska, himerna i humanizovana antitela.

[0351] Ovde predviđeni bispecifični molekuli mogu biti pripremljeni konjugovanjem specifičnosti vezivanja konstituenta korišćenjem postupaka poznatih u oblasti. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može se generisati odvojeno i zatim konjugovati jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju se mogu koristiti različiti agensi za kuplovanje ili unakrsno povezivanje. Primeri agenasa za unakrsno povezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N- sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti npr., Karpovsky i sar. (1984) J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA i sar. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Drugi postupci uključuju one opisane u Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan i sar. (1985) Science 229:81-83), i Glennie i sar. (1987) J. Immunol.139: 2367-2375). Poželji agensi za konjugovanje su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0352] Kada su specifičnosti vezivanja antitela, ona se mogu konjugovati preko sulfhidrilnog vezivanja C-terminalnih zglobnih regiona dva teška lanca. U posebno poželjnom tehničkom rešenju, zglobni region je modifikovan tako da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, poželjno jedan, pre konjugacije.

[0353] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu biti kodirane u istom vektoru i eksprimirane i sastavljene u istoj ćeliji domaćinu. Ova metoda je posebno korisna kada je bispecifični molekul mAt x mAt, mAt x Fab, mAt x (scFv)2, Fab × F(ab')2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifično antitelo može da sadrži antitelo koje sadrži scFv na C-terminusu svakog teškog lanca. Bispecifični molekul ovde opisan može biti jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Metode za pripremu bispecifičnih molekula opisane su na primer u U.S. patentu sa brojem 5,260,203; U.S. patentu sa brojem 5,455,030; U.S. patentu sa brojem 4,881,175; U.S. patentu sa brojem 5,132,405; U.S. patentu sa brojem 5,091,513; U.S. patentu sa brojem 5,476,786; U.S. patentu sa brojem 5,013,653; U.S. patentu sa brojem 5,258,498; i U.S. patentu sa brojem 5,482,858.

[0354] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može se potvrditi korišćenjem metoda koje su priznate u oblasti, kao što su enzimski-vezan imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), FACS analiza, biotest (npr., inhibicija rasta) ili Western blot test. Svaki od ovih testova generalno otkriva prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa korišćenjem obeleženog reagensa (npr., antitela) specifičnog za kompleks od interesa.

XV. Kompozicije

[0355] Dalje su obezbeđene kompozicije, npr., farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedno ili više anti-OX40 antitela, sama ili u kombinaciji sa antitelima na druge ciljeve, formulisane zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu uključivati jedno ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugate ili bispecifične molekule opisane ovde. Na primer, kompozicija može da sadrži kombinaciju antitela (ili imunokonjugata ili bispecifičnog molekula) opisanih ovde koja se vezuju za različite epitope na OX40 ili koja imaju komplementarne aktivnosti.

[0356] U određenim tehničkim rešenjima, kompozicija sadrži anti-OX40 antitelo u koncentraciji od najmanje 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml, ili 100-300 mg/ml.

[0357] Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu se takođe administrirati u kombinovanim terapijama, tj., kombinovane sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može uključiti administriranje anti-OX40 antitela opisanog ovde u kombinaciji sa najmanje jednim drugim agensom protiv kancera i/ili za stimulacija (npr., aktiviranje) T-ćelija. Primeri terapijskih agenasa koji se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji su detaljnije opisani u nastavku u odeljku o primeni ovde opisanih antitela.

[0358] U određenim tehničkim rešenjima, terapijske kompozicije ovde stavljene na uvid uključuju druga jedinjenja, lekove i/ili agense koji se koriste za lečenje kancera. Takva jedinjenja, lekovi i/ili agensi mogu uključivati, na primer, lekove za hemoterapiju, lekove sa malim molekulima ili antitela koja stimulišu imunski odgovor na dati kancer. U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu uključivati, na primer, jedno ili više anti-CTLA-4 antitela, anti-PD-1 antitela, anti-PDL-1 antitela, anti-GITR antitela, anti-CD137 antitela, ili anti-LAG-3 antitela.

[0359] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosači" uključuju sve rastvarače, disperzione medije, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za intravensko, intramuskularno, subkutano, parenteralno, spinalno ili epidermalno administriranje (npr., injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od načina administriranja, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, mogu biti obloženi materijalom da bi se jedinjenje zaštitilo od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.

[0360] Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu da uključuju jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S.M., i sar. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Primeri takvih soli uključuju adicione soli kiselina i adicione soli baza. Adicione soli kiselina uključuju one dobijene od netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforna i slično, kao i od netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, alkanoične kiseline supstituisane fenilom, hidroksi alkanoične kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Adicione soli baza uključuju one dobijene od zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i od netoksičnih organskih amina, kao što je N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokaine i slično.

[0361] Farmaceutske kompozicije opisane ovde takođe mogu da uključuju farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) agense za helatiranje metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0362] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu upotrebiti u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organski estri za injekcije, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i korišćenjem surfaktanata.

[0363] Ove kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i disperzioni agensi. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti i postupcima sterilizacije, navedenim iznad, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injekcionog farmaceutskog oblika može biti izazvana uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0364] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne prahove za ekstemporanu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. Primena takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti. Osim ako je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova primena u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama. Farmaceutska kompozicija može da sadrži konzervans ili može biti lišena konzervansa. Dodatna aktivna jedinjenja se mogu ugraditi u kompozicije.

[0365] Terapiske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuča fluidnost se može održati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličina čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

[0366] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih iznad, prema potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni transporter koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih koji su ovde nabrojani. U slučaju sterilnih prahova za pripremanje sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postuipci pripremanja su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.

[0367] Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača da bi se dobio jedan oblik doze variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči, i posebnog načina administriranja. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača za proizvodnju jednog doznog oblika generalno će biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, od sto posto, ova količina će se kretati od oko 0.01 posto do oko devedeset devet posto aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 posto do oko 70 posto, najpoželjnije od oko 1 posto do oko 30 posto aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0368] Režimi doziranja se prilagođavaju da bi se obezbedio optimalan željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, može se administrirati jedan bolus, može se administrirati nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno zahtevima terapijske situacije. Posebno je korisno formulisati parenteralne kompozicije u obliku dozne jedinice radi lakšeg ordiniranja i uniformnosti doziranja. Jedinični oblik doze kako se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji se tretirani; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za oblike dozne jedinice opisane ovde su diktirane i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji treba da se postigne, i (b) ograničenja svojstvenih veštini pravljenja takvog aktivnog jedinjenja. jedinjenje za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.

[0369] Za administriranje anti-OX40 antitela, doza varira od oko 0.0001 do 100 mg/kg, oko 0.01 do 5 mg/kg, oko 0.01 do 10 mg/kg, oko 0.1 do 1 mg/kg, oko 0.1 do 0.5 mg/kg, ili oko 0.5 do 0.8 mg/kg telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 0.2 mg/kg telesne težine, 0.3 mg/kg telesne težine, 0.5 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili unutar opsega od 1-10 mg/kg. U određenim tehničkim rešenjima, doza je 0.2 mg/kg. U nekim tehničkim rešenjima, doza je 0.25 mg/kg. U drugim tehničkim rešenjima, doza je 0.5 mg/kg. Režim lečenja uzet kao primer podrazumeva administriranje jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u 3 meseca ili jednom u svakoj tri do 6 meseci. Primeri režima doziranja za antitela ovde opisana uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine putem intravenskog administriranja, pri čemu se antitelo daje korišćenjem jednog od sledećih rasporeda doziranja: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne težine jednom zatim 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.

[0370] U određenim tehničkim rešenjima, za kombinovani tretman sa anti-OX40 antitelom i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom, antitela se administriraju pri fiksnoj dozi. Prema tome, u nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi odoko 25 do oko 320 mg, na primer, oko 25 do oko 160 mg, oko 25 do oko 80 mg, oko 25 do oko 40 mg, oko 40 do oko 320 mg, oko 40 do oko 160 mg, oko 40 do oko 80 mg, oko 80 do oko 320 mg, oko 30 do oko 160 mg, ili oko 160 do oko 320 mg. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi od 20 mg ili oko 20 mg. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi od 40 mg ili oko 40 mg. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi od 80 mg ili oko 80 mg. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi od 160 mg ili oko 160 mg. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi od 320 mg ili oko 320 mg.

[0371] U nekim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo se administrira pri fiksnoj dozi od oko 100 do 300 mg, Na primer, doza imunoonkloškog agensa može biti 240 mg ili oko 240 mg, 360 mg ili oko 360 mg, ili 480 mg ilioko 480 mg. U određenim tehničkim rešenjima, doza anti-PD1 antitela varira od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne težine ili oko 0.3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine ili oko 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine ili oko 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili oko 5 mg/kg telesne težine, ili 10 mg/kg telesne težine ili oko 10 mg/kg telesne težine, ili u okviru opsega od 1-10 mg/kg. U nekim tehničkim rešenjima, doza anti-PD-1 antitela je 240 mg ili oko 240 mg administrirana jednom svake 2 nedelje (Q2W). Ova doze se može prilagoditi proporcionalno (na 120 mg nedeljno) za duže ili kraće periode, npr., 360 mg administrirano jednom svake 3 nedelje (Q3W) ili 480 mg administrirano jednom svake 4 nedelje (Q4W).

[0372] U nekim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo se administrira pri odzi od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg ili oko 1 mg/kg ili 3 mg/kg ili oko 3 mg/kg, telesne težine domaćina.

[0373] Primeri režima doziranja za kombinovani tretman sa anti-OX40 i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom su dati ispod u odeljku pod naslovom "Primene i postupci."

[0374] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira pacijentu sa trajanjem infuzije od oko 15 minuta do oko 60 minuta, na primer, oko 30 minuta.

[0375] U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo (npr., nivolumab) se administrira pacijentu sa trajanjem infuzije od oko 15 minuta do oko 60 minuta, na primer, oko 30 minuta, kada se administrira pri dozi od 3 mg/kg (0.1 mg/kg/min). U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo se administrira pacijentu sa trajanjem infuzije od oko 45 minuta do 75 minuta, na primer, oko 60 minuta, kada se administrira pri dozi od 10 mg/kg.

[0376] U određenim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo (npr., ipilimumab) se administrira pacijentu sa trajanjem infuzije od oko 15 minuta do 120 minutes, na primer, oko 30 minuta kada se administrira pri dozi od 3 mg/kg. U određenim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo se administrira pacijentu sa trajanjem infuzije od oko 15 minuta do 120 minuta, na primer, 90 minuta, kada se administrira pri dozi od 10 mg/kg.

[0377] U određenim tehničkim rešenjima, kada se administrira istog dana, anti-OX40 antitelo se administrira pre anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, kada se administrira istog dana, anti-OX40 antitelo se administrira nakon anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela. U određenim tehničkim rešenjima, kada se administrira istog dana, anti-OX40 antitelo se administrira zajedno sa anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom.

[0378] U određenim tehničkim rešenjima, kada se administrira istog dana, anti-OX40 antitelo se administrira oko 15 do 45 minuta (npr., oko 30 minuta) pre anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela. U određenim tehničkim rešenjima, kada se administrira istog dana, anti-OX40 antitelo se administrira oko 15 do 45 minuta (npr., oko 30 minuta) nakon anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela.

[0379] Alternativno, anti-OX40 antitela obezbeđena ovde mogu se administrirati pri ravnoj dozi (ravnodozni režim).

[0380] Unekim slučajevima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja se administrirajuistovremeno, tako da doza svakog administriranog antitela spada u opsege iznad. Pored toga, antitela se obično administriraju u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca ili godišnje. Intervali takođe mogu biti nepravilni na šta ukazuje merenje nivoa antitela u krvi u odnosu na ciljani antigen kod pacijenta. U nekim metodama, doza se prilagođava da bi se postigla koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 µg /ml i u nekim metodama oko 25-300 µg/ml.

[0381] Anti-OX40 antitela opisana mogu da se administrirati sa drugim antitelom u režimu doziranja drugog antitela. Na primer, anti-OX40 antitelo se može administrirati sa anti-PD-1 antitelom, kao što je nivolumab (OPDIVO), svake dve nedelje kao i.v. infuzija tokom 60 minuta dok ne dođe do progresije bolesti ili neprihvatljive toksičnosti. Alternativno, anti-OX40 antitelo se može administrirati sa pembrolizumabom (KEYTRUDA) svake 3 nedelje kao i.v. infuzija tokom 30 minuta dok ne dođe do progresije bolesti ili neprihvatljive toksičnosti.

[0382] Antitela mogu se administrirati kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebno ređe administriranje. Doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela kod pacijenta. Uopšteno govoreći, humana antitela pokazuju najduži poluživot, a slede humanizovana antitela, himerna antitela, i nehumana antitela. Doziranje i učestalost administriranja mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapijski. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza se administrira u relativno retkim intervalima tokom dužeg perioda vremena. Neki pacijenti nastavljaju da se leče do kraja života. U terapijskim primenama, relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, a poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno ublažavanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može dati profilaktički režim.

[0383] Stvarni nivoi doze aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama opisanim ovde mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način padministriranja, a da nije toksična pacijentu. Odabrani nivo doze zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih kompozicija koje su ovde upotrebljene, ili njihovog estra, soli ili amida, načina administriranja, vremena administriranja, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanje lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj oblasti.

[0384] "Terapijski efikasne doze" antitela opisanog ovde poželjno rezultuju smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevencijom oštećenja ili invaliditeta usled bolesti. U kontekstu kancera, terapeutski efikasna doza poželjno dovodi do povećanog preživljavanja, i/ili prevencije daljeg pogoršanja fizičkih simptoma povezanih sa kancerom. Simptomi kancera su dobro poznati u oblasti uključuju, na primer, neobične karakteristike mladeža, promenu izgleda mladeža, uključujući asimetriju, ivicu, boju i/ili prečnik, novo pigmentovanu površinu kože, abnormalni mladež, zatamnjeno područje ispod nokta, kvržice na dojkama, promene na bradavicama, ciste na dojkama, bol u dojkama, smrt, gubitak težine, slabost, preterani umor, otežano jedenje, gubitak apetita, hronični kašalj, pogoršanje nedostatka vazduha, iskašljavanje krvi, krv u urinu, krv u stolici, mučnina, povraćanje, metastaze u jetri, metastaze u plućima, metastaze u kostima, abdominalnu punoću, nadimanje, tečnost u peritonealnoj šupljini, vaginalno krvarenje, konstipaciju, abdominalnu distenziju, perforaciju debelog creva, akutni peritonitis (infekciju, groznicu, bol), bol, povraćanje krvi, jako znojenje, groznicu, visok krvni pritisak, anemiju, dijareju, žuticu, vrtoglavicu, jezu, grčeve mišića, metastaze u debelom crevu, metastaze u plućima, metastaze u bešici, metastaze u jetri, metastaze u kostima, metastaze u bubrezima, i metastaze u pankreasu, otežano gutanje, i slično.

[0385] Terapijski efikasna doza može sprečiti ili odložiti pojavu kancera, što može biti poželjno kada su prisutni rani ili preliminarni znaci bolesti. Laboratorijski testovi koji se koriste u dijagnozi kancera uključuju hemijske testove (uključujući merenje nivoa OX40), hematologiju, serologiju i radiologiju. Shodno tome, bilo koji klinički ili biohemijski test koji prati bilo šta od prethodnog može se koristiti da bi se utvrdilo da li je određeni tretman terapijski efikasna doza za lečenje kancera. Običan stručnjak u ovoj oblasti bi mogao da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, ozbiljnost simptoma kod subjekta, i određena kompozicija ili odabrani način administriranja.

[0386] Antitela i kompozicije opisana ovde mogu se administrirati putem jednog ili više puteva administriranja korišćenjem jednog ili više različitih metoda poznatih u oblasti. Kao što će iskusni stručnjak shvatiti, put i/ili način administriranja će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi administriranja za antitela opisana ovde uključuju intravenozne, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, subkutane, spinalne ili druge parenteralne puteve administriranja, na primer injekcijom ili infuzijom. Fraza "parenteralno administriranje " kako se ovde koristi označava put administriranja, osim enteralnog i lokalnog administriranja, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0387] Alternativno, antitelo se može administrirati neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put administriranja, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.

[0388] Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere, i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polimlečna kiselina. Mnogi postupci za pripremanje takvih formulacija su patentirani ili opšte poznati stručnjacima u oblasti. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, izd., Marcel Dekker, Inc., Njujork, 1978.

[0389] Kompozicije antitela mogu se administrirati medicinskim uređajima poznatim u oblasti. Na primer, u jednom tehničkom rešenju, kompozicija se administrira sa uređajem za hipodermičku injekciju bez igle, kao što su uređaji stavljeni na uvid u U.S. patentima sa brojevima 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula za upotrebu u administriranju antitela uključuju: U.S. patent br.

4,487,603, koji stavlja na uvid implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za izdavanje lekova kontrolisanom brzinom; U.S. patent br. 4,486,194, koji stavlja na uvid terapijski uređaj za administriranje lekova kroz kožu; U.S. patent br.4,447,233, koji stavlja na uvid pumpu za infuziju lekova za isporuku leka preciznom brzinom infuzije; U.S. patent br.4,447,224, koji stavlja na uvid javnosti implantabilni infuzijski aparat sa promenljivim protokom za kontinuiranu isporuku leka; U.S. patent br. 4,439,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporuku leka koji ima višekomorne odeljke; i US patent br. 4,475,196, koji stavlja na uvid javnosti osmotski sistem za isporuku leka. Mnogi drugi takvi implantati, sistemi za isporuku i moduli, su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

[0390] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela su formulisana da obezbede pravilnu distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da antitela prelaze BBB (ako se želi, npr., za kancer mozga), mogu se formulisati, na primer, u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, videti, npr., U.S. patente 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu sadržati jedan ili više segmenata koji se selektivno transportuju u određene ćelije ili organe, čime se poboljšava ciljana isporuka leka (videti, npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Primeri ciljanih segmenata uključuju folat ili biotin (videti, npr., U.S. patent 5,416,016 od Low i sar.); manozide (Umezawa i sar., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman i sar. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais i sar. (1995) Antimicrob. Agenss Chemother. 39:180); receptor surfaktant proteina A (Briscoe i sar. (1995) Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier i sar. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.

346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

XVI. Primene i postupci

[0391] Anti-OX40 antitela i kompozicije opisana ovde imaju brojne in vitro i in vivo primene koje uključuju, na primer, poboljšanje imunološkog odgovora aktiviranjem OX40 signalizacije, ili detekciju OX40. U poželjnom tehničkom rešenju, antitela su humana antitela. Na primer, ovde opisana anti-OX40 antitela mogu da se dovedu u kontakt sa ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili da se administriraju ljudskim subjektima, npr., in vivo, da bi se poboljšao imunitet kod raznih bolesti. Shodno tome, ovde su obezbeđena antitela za primenu u postupcima modifikacije imunološkog odgovora kod subjekta koji obuhvata administriranje subjektu antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, ovde opisanog, tako da se imunološki odgovor kod subjekta modifikuje. Poželjnoje da je odgovor pojačan, stimulisan, ili pojačano regulisan.

[0392] Poželjni subjekti uključuju ljudske pacijente kod kojih bi bilo poželjno poboljšanje imunološkog odgovora. Postupci su posebno pogodni za lečenje ljudskih pacijenata koji imaju poremećaj koji se može lečiti povećanjem imunološkog odgovora (npr., imunološki odgovor posredovan T ćelijama, npr., antigen specifičan odgovor T ćelija). U posebnom tehničkom rešenju, antitela su za primenu u postupcima za lečenje kancera in vivo. Da bi se postiglo poboljšanje imuniteta specifičnog za antigen, ovde opisana anti-OX40 antitela mogu se administrirati zajedno sa antigenom od interesa ili antigen može već biti prisutan kod subjekta koji se leči (npr. subjekt koji ima tumor ili virus) . Kada se anti-OX40 antitela administriraju zajedno sa drugim agensom, ova dva se mogu administrirati odvojeno ili istovremeno.

[0393] Takođe su obuhvaćeni postupci za detekciju prisustva humanog OX40 antigena u uzorku, ili merenje količine humanog OX40 antigena, koji obuhvataju kontakt uzorka i kontrolnog uzorka, sa anti-OX40 antitelima (ili njihovim antigen vezujućim delovima) opisanim ovde, pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i humanog OX40. Zatim se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom ukazuje na prisustvo humanog OX40 antigena u uzorku. Anti-OX40 antitela opisana ovde takođe mogu da se koriste za prečišćavanje humanog OX40 putem imunoafinitetnog prečišćavanja.

[0394] S obzirom na sposobnost anti-OX40 antitela opisanih ovde da stimulišu ili kostimulišu odgovore T ćelija, npr., antigen-specifične odgovore T ćelija, ovde su takođe obezbeđeni in vitro i in vivo postupci korišćenja antitela za stimulaciju, pojačavanje ili povećanje antigen-specifičnih odgovora T ćelija, npr., antitumorski odgovori T ćelija. U određenim tehničkim rešenjima, CD3 stimulacija je takođe uključena (npr., kokubacijom sa ćelijom koja eksprimira membranski CD3), koja stimulacija može biti obezbeđena u isto vreme, pre, ili posle stimulacije anti-OX40 antitelom. U jednom tehničkom rešenju, postupak obuhvata dovođenje u kontakt T ćelija sa anti-OX40 antitelom opisanim ovde, i po izboru sa anti-CD3 antitelom, tako da se stimuliše antigen-specifičan odgovor T ćelija. Bilo koji pogodan indikator antigen-specifičnog odgovora T ćelija može se koristiti za merenje antigen-specifičnog odgovora T ćelija. Neograničavajući primeri takvih odgovarajućih indikatora uključuju povećanu proliferaciju T ćelija u prisustvu antitela i/ili povećanje proizvodnje citokina u prisustvu antitela. U poželjnom tehničkom rešenju, stimuliše se proizvodnja interleukina-2 i/ili interferona-y od strane antigen-specifičnih T ćelija.

[0395] T ćelije koje se mogu poboljšati ili kostimulisati anti-OX40 antitelima uključuju CD4+ T ćelije i CD8+ T ćelije. T ćelije mogu biti Teffćelije, npr., CD4+ Teffćelije, CD8+ Teffćelije, Tpomoćne (Th) ćelije i citotoksične T (Tc) ćelije.

[0396] Takođe su obezbeđena antitela za primenu u postupcima stimulisanja imunološkog odgovora (npr., antigen-specifičnog odgovora T ćelija) kod subjekta koji sadrže administriranje terapijski efikasne količine anti-OX40 antitela opisanog ovde subjektu tako da se imunološki odgovor (npr. antigen-specifičan odgovor T ćelija) stimuliše kod subjekta. U poželjnom tehničkom rešenju, subjekat je subjekat koji ima tumor i imunološki odgovor protiv tumor je stimulisan. Tumor može biti solidni tumor ili tečni tumor, na primer, hematološki malignitet. U određenim tehničkim rešenjimaa, tumor je imunogeni tumor. U određenim tehničkim rešenjima, tumor nije imunogen. U određenim tehničkim rešenjima, tumor je pozitivan na PD-L1. U određenim tehničkim rešenjima tumor je negativan na PD-L1. Subjekt takođe može biti subjekt koji nosi virus i imunološki odgovor protiv virusa je stimulisan.

[0397] Dalje su obezbeđena antitela za primenu u postupcima za inhibiranje rasta tumorskih ćelija kod subjekta koji obuhvata administriranje subjektu terapijske efikasne količine anti-OX40 antitela opisanog ovde tako da je rast tumora inhibiran kod subjekta. Takođe su obezbeđeni antitela za primenu u postupcima lečenja virusne infekcije kod subjekta koji obuhvata administriranje subjektu anti-OX40 antitelo opisana ovde tako da se virusna infekcija leči kod subjekta.

[0398] Ovde su takođe obuhvaćena antitela za koje se traži zaštita za primenu u postupcima za iscrpljivanje Tregćelija iz tumorskog mikrookruženja kod subjekta koji ima tumor, npr., kancerozni tumor, koji obuhvata administriranje subjektu terapijski efikasne količine anti-OX40 antitela opisanog ovde koji sadrži Fc koji stimuliše iscrpljivanjeTregćelija u mikrookruženju tumora. Fc može, npr., biti Fc sa efektorskom funkcijom ili poboljšanom efektorskom funkcijom, kao što je vezivanje ili ima pojačano vezivanje za jedan ili više aktivirajućih Fc receptora.

U poželjnom tehničkom rešenju, iscrpljivanje Tregse javlja bez značajnog iscrpljivanja ili inhibicije Teffu mikrookruženju tumora, i bez značajnog iscrpljivanja ili inhibicije Teffćelija i Tregćelija izvan tumorskog mikrookruženja, npr., na periferiji. U određenim tehničkim rešenjima, subjekt ima više nivoe OX40 na Tregćelijama nego na Teffćelijama, npr., u mikrookruženju tumora.

[0399] U određenim tehničkim rešenjima, subjekt se leči sa anti-OX40 antitelom koje ima Fc koji pojačava agonizam, npr., vezuje se za inhibitorni FcRIIb ili ima pojačano vezivanje za njega. Anti-OX40 antitela mogu iscrpiti Treg ćelije u tumorima i/ili Treg ćelije u limfocitima koji infiltriraju tumor (TIL - tumor infiltrating lymphocytes).

[0400] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se daje subjektu kao dodatna terapija. Lečenje subjekata koji imaju kancer sa anti-OX40 antitelom mogu dovesti do produženog preživljavanja, npr., dugotrajnog i trajnog odgovora u odnosu na trenutni standard nege; dugotrajno preživljavanje od najmanje 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ili više godina, ili preživljavanje bez ponovne pojave od najmanje 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci, 1, 2, 3 , 4, 5 ili 10 ili više godina. U određenim tehničkim rešenjima, lečenje subjekta koji ima kancer sa anti-OX40 antitelom sprečava ponovnu pojavu kancera ili odlaže ponovnu pojavu kancera za, npr., 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci, 1, 2, 3, 4, 5 ili 10 ili više godina. Lećenje sa anti-OX40 antitelom se može primeniti kao tretman prve, druge, ili treće linije.

[0401] U poželjnim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo nije značajno toksično. Na primer, antitelo nije značajno toksično za ljudski organ, npr., jedan ili više od jetre, bubrega, mozga, pluća, i srca, kao što je utvrđeno, na primer, u kliničkim ispitivanjima. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ne izaziva značajno neželjeni imunološki odgovor, npr., autoimunost ili inflamaciju.

[0402] U određenim tehničkim rešenjima, tretman subjekta sa anti-OX40 antitelom ne dovodi do preterane stimulacije imunološkog sistema do te mere da imunološki sistem subjekta zatim napada samog subjekta (npr., autoimuni odgovor) ili rezultuje, npr., anafilaksijom. Prema tome, poželjno je da antitela ne izazivaju anafilaksiju.

[0403] U određenim tehničkim rešenjima, tretman subjekta sa anti-OX40 antitelom ne izaziva značajne inflamatorne reakcije, npr., imunološki-posredovani pneumonitis, imunološkiposredovani kolitis, imunološki posredovani hepatitis, imunološki-posredovani nefritis ili disfunkcija bubrega, imunoločki-posredovan hipofizitis, imunološki-posredovani hipotireozu i hipertireozu, ili druge neželjene reakcije posredovane imunitetom.

[0404] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo obezbeđuje sinergističke antitumorske efekte u kombinaciji sa drugom terapijom kancera, kao što je jedinjenje koje stimuliše imunološki sistem (npr., imunoonkološki agens), npr., jedinjenje opisano ovde ili jedinjenje koje moduliše cilj koji je ovde opisan.

[0405] Ovi i drugi postupci opisani ovde su detaljnije razmotreni u nastavku.

Kancer

[0406] Aktivacija OX40 sa anti-OX40 antitelima može poboljšati imunološki odgovor na ćelije kancera kod pacijenta. Shodno tome, ovde su obezbeđena antitela za primenu u postupcima za lečenje subjekta koji boluje od kancera, koji obuhvataju administriranje subjektu ovde opisanih anti-OX40 antitela, tako da se subjekt leči, npr., tako da se inhibira ili smanjuje rast tumora kancera i/ili da tumori regresiraju i/ili da je postignuto produženo preživljavanje. Anti-OX40 antitelo se može koristiti samostalno za inhibiciju rasta kanceroznih tumora. Alternativno, anti-OX40 antitelo se može koristiti zajedno sa drugim agensom, npr., drugim imunogenim agensom, standardnim lečenjem kancera, ili drugim antitelom, kao što je opisano u nastavku.

[0407] Prema tome, ovde su obezbeđena antitela za primenu u postupcima lečenja kancera, npr., inhibicijom rasta ćelija tumora, kod subjekta, koji obuhvataju administriranje subjektu terapijski efikasne količine anti-OX40 antitela opisanih ovde. Antitelo može biti humano antitelo. Dodatno ili alternativno, antitelo može biti himerno ili humanizovano antitelo.

[0408] Ovde su takođe obezbeđena antitela za primenu u kombinovanim terapijama koje sadrže administriranje anti-OX40 antitela i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela za lečenje subjekata koji imaju tumore (npr., uznapredovali solidni tumori).

[0409] U određenim tehničkim rešenjima, ovde su obezbeđena antitela za primenu u postupcima lečenja kancera gde se anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo administriraju pacijentu sa tumorom (npr., uznapredovali solidni tumor) prema definisanom kliničkom režimu doziranja. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo je OX40.21. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je BMS-936558 (nivolumab). U određenim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo je ipilimumab (Yervoy<®>). U određenim tehničkim rešenjima, režimi doziranja su prilagođeni da obezbede optimalan željeni odgovor (npr., efikasan odgovor).

[0410] Kako se ovde koristi, dodatno ili kombinovano administriranje (koadministracija) uključuje istovremeno administriranje jedinjenja u istom ili različitom doznom obliku, ili odvojeno administriranje jedinjenja (npr., sekvencijalno administriranje). Prema tome, anti-OX40 i anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo mogu se istovremeno administrirati u jednoj formulaciji. Alternativno, anti-OX40 i anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo se mogu formulisati za odvojeno administriranje i administriraju se istovremeno ili uzastopno (npr., jedno antitelo se administrira u roku od oko 30 minuta pre administriranja drugog antitela).

[0411] Na primer, anti-PDl antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo može se administrirati prvo nakon čega sledi (npr., odmah sledi) administriranje anti-OX40 antitela, ili obrnuto. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo se administrira pre administriranja anti-OX40 antitela. U drugom tehničkom rešenju, anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo se administrira nakon administriranje anti-OX40 antitela. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 antitelo ili anti-CTLA-4 antitelo se administriraju istovremeno. Takvo istovremeno ili uzastopno administriranje poželjno dovodi do toga da su oba antitela istovremeno prisutna kod lečenih pacijenata.

[0412] Kanceri čiji rast može biti inhibiran anti-OX40 antitelima, ili kombinovanom terapijom sa anti-OX40 i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom, uključuju kancere koji obično reaguju na imunoterapiju i one koji obično ne reaguju na imunoterapiju. Kanceri mogu biti kanceri sa solidnim tumorima ili maligni tumori krvi (tečni tumori). Neograničavajući primeri kancera za lečenje uključuju karcinom skvamoznih ćelija, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, skvamozni nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC - non-small cell lung cancer), neskvamozni NSCLC, gliom, gastrointestinalni kancer, renalni kancer (npr. clear cell carcinoma), kancer jajnika, kancer jetre, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer bubrega (npr., renalni ćelijski karcinom (RCC - renal cell carcinoma)), kancer prostate (npr. hormonski refraktorni adenokarcinom prostate), kancer štitne žlezde, neuroblastom, kancer pankreasa, glioblastom (multiformni glioblastom), kancer grlića materice, kancer želuca, kancer mokraćne bešike, hepatom, kancer dojke, karcinom kolona, i kancer glave i vrata (ili karcinom), kancer želuca, tumor polnih ćelija, pedijatrijski sarkom, sinonazalni prirodni ubica, melanom (npr., metastatski maligni melanom, kao što je kožni ili intraokularni maligni melanom), kancer kostiju, kancer kože, kancer materice, kancer analnog regiona, kancer testisa, karcinom falopijevih tuba, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, solidni tumori u detinjstvu, kancer uretere, karcinom bubrežne karlice, neoplazma centralnog nervnog sistema (CNS), primarni CNS limfom, tumorska angiogeneza, tumor osovine kičme, kancer mozga, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, Kaposi-jev sarkom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija , T-ćelijski limfom, kanceri izazvani životnom sredinom uključujući one izazvane azbestom, kanceri povezani sa virusom ili kanceri virusnog porekla (npr., humani papiloma virus (tumori povezani sa ili poreklomod HPV-a)), i hematološki maligniteti koji potiču od bilo kog od dve glavne linije krvnih zrnaca, tj., mijeloidnu ćelijsku liniju (koja proizvodi granulocite, eritrocite, trombocite, makrofage, i mastocite) ili limfoidnu ćelijsku liniju (koja proizvodi B, T, NK i plazma ćelije), kao što su sve vrste leukemija, limfoma i mijeloma, npr., akutne, hronične, limfocitne i/ili mijelogene leukemije, kao što su akutna leukemija (ALL - acute leukemia), akutna mijelogena leukemija (AML - acute myelogenous leukemia), hronična limfocitna leukemija (CLL - chronic lymphocytic leukemia) i hronična mijelogena leukemija (CML - chronic myelogenous leukemia), nediferencirana AML (M0), mijeloblastna leukemija (M1), mijeloblastna leukemija (M2; sa sazrevanjem ćelija), promijelocitna leukemija (M3 ili M3 varijanta [M3V]), mijelomonocitna leukemija (M4 ili M4 varijanta sa eozinofilijom [M4E]), monocitna leukemija (M5)), eritroleukemija (M6), megakarioblastna leukemija (M7), izolovani granulocitni sarkom, i hlorom; limfomi, kao što su Hodgkin-ov limfom (HL), ne-Hodgkin-ov limfom (NHL), hematološki malignitet B ćelija, npr., B-ćelijski limfomi, T-ćelijski limfomi, limfoplazmacitoidni limfom, monocitoidni B-ćelijski limfom, limfom povezan sa mukozom (MALT - mucosa-associated lymphoid tissue) limfoma, anaplastični (npr., Ki 1+) limfom velikih ćelija, limfom zrelih T ćelija/leukemija, limfom ćelija plašta, angio imunoblastični T-ćelijski limfom, angiocentrični limfom, intestinalni T-ćelijski limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom, prekursor T-limfoblastni limfom, T-limfoblastični; i limfom/leukemija (T-Lbly/T-ALL), periferni T-ćelijski limfom, limfoblastični limfom, limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije, istinski histiocitni limfom, primarni limfom centralnog nervnog sistema, primarni limfomski izliv, limfom B ćelija, limfoblastni limfom (LBL - lymphoblastic lymphoma), hematopoetski tumori limfoidne loze, akutna limfoblastna leukemija, difuzni limfom velikih B-ćelija, Burkitt-ov limfom, folikularni limfom, difuzni histiocitni limfom (DHL - diffuse histiocytic lymphoma), imunoblastični limfom velikih ćelija, prekursor B-limfoblastni limfom, kožni T-ćelijski limfom (CTLC - cutaneous T-cell lymphoma) (koji se naziva i mycosis fungoides ili Sezary-ev sindrom), i limfoplazmacitoidni limfom (LPL) sa Waldenstrom-ovom makroglobulinemijom; mijelomi, kao što je IgG mijelom, mijelom lakog lanca, nesekretorni mijelom, tinjajući mijelom (takođe nazvan indolentni mijelom), usamljeni plazmocitom, i multipli mijelom, hronična limfocitna leukemija (CLL), limfom vlastastih ćelija; hematopoetski tumori mijeloidne linije, tumori mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom i rabdomioskarkoma; seminom, teratokarcinom, tumori centralnog i perifernog nervnog sistema, uključujući astrocitom, švanom; tumori mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom, rabdomioskarom, i osteosarkom; i drugi tumori, uključujući melanom, xeroderma pigmentosum, keratoakantom, seminom, folikularni karcinom štitne žlezde i teratokarcinom, hematopoetske tumore limfoidne loze, na primer tumore T-ćelija i B-ćelija, uključujući ali ne ograničavajući se na poremećaje T-ćelija kao što je T-prolimfocitna leukemija (T-PLL - T-prolymphocytic leukemia), uključujući tip malih ćelija i cerebriformnih ćelija; velika granularna limfocitna leukemija (LGL - large granular lymphocyte leukemia) poželjno tipa T-ćelija; a/d T-NHL hepatosplenični limfom; periferni/post-timski T ćelijski limfom (pleomorfni i imunoblastični podtipovi); angiocentrični (nazalni) T-ćelijski limfom; kancer glave ili vrata, kancer bubrega, kancer rektuma, kancer štitne žlezde; akutnog mijeloidnog limfoma, kao i bilo koje kombinacije navedenih kancera. Postupci opisani ovde se takođe mogu koristiti za lečenje metastatskih karcinoma, neresektabilnih i/ili refraktornih kancera (npr., kancera koji su otporni na prethodnu imunoterapiju, npr., sa blokirajućim CTLA-4 ili PD-1 antitelom), i rekurentnih kancera.

[0413] U određenim tehničkim rešenjima, pacijent koji se leči anti-OX40 antitelom, ili kombinacijom anti-OX40 antitela i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela, ima uznapredovali solidni tumor. Na primer, u jednom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima kancer grlića materice. U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima kolorektalni (CRC) kancer. U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima kancer bešike (npr., neresektabilan lokalno uznapredovali ili metastatski kancer bešike).U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima kancer jajnika (npr., neresektabilan lokalno uznapredovali ili metastatski kancer jajnika).

[0414] U jednom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči anti-OX40 antitelom, ili kombinacijom anti-OX40 antitela i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela, ima nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC). U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (SCCHN). U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima B-ćelijski ne-Hodgkin-ov limfom (B-NHL). U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima mijelom. U drugom tehničkom rešenju, pacijent ima melanom. U drugom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči ima difuzni veliki B-ćelijski limfom (DLBCL).

[0415] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira pacijentu koji ima kancer koji je pokazao neadekvatan odgovor na prethodno lečenje, npr., prethodno lečenje imunoonkološkim lekom, ili pacijentima koji imaju kancer koji je refraktoran ili otporan, bilo intrinzično refraktoran ili otporan (npr., refraktoran na antagonist PD-1 puta), ili pri čemu se stiče rezistencija ili refraktorno stanje. Na primer, subjekti koji ne reaguju ili koji ne reaguju dovoljno na prvu terapiju ili koji vide progresiju bolesti nakon lečenja, npr., lečenja sa anti-PD-1, mogu se lečiti primenom samo anti-OX40 antitela ili u kombinaciji sa drugom terapijom (npr., sa anti-PD-1 terapijom).

[0416] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira pacijentima koji nisu prethodno primili (tj., ili su lečeni sa) imunoonkoločkim agensom, npr., antagonistom PD-1 puta.

[0417] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo može biti administrirano sa standardnim tretmanom nege (npr., operacija, zračenje, i hemoterapija). U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se može administrirati kao terapija održavanja, npr., terapija koja je namenjena da spreči pojavu ili ponovnu pojavu tumora.

[0418] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se može administrirati sa drugim tretmanom, npr. zračenjem, operacijom, ili hemoterapijom. Na primer, pomoćna terapija anti-OX40 antitelom može se administrirati kada postoji rizik da mogu biti prisutne mikrometastaze i/ili da bi se smanjio rizik od relapsa.

[0419] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se može administrirati kao monoterapija, ili kao jedina ili kao jedina imunostimulirajuća terapija. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se takođe može kombinovati sa imunogenim agensom, kao što su ćelije kancera, prečišćeni tumorski antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i molekule ugljenih hidrata), ćelije, i ćelije transfektovane genima koji kodiraju citokine koji stimulišu imunitet (He i sar (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Neograničavajući primeri vakcina protiv tumora koje se mogu koristiti uključuju peptide antigena melanoma, kao što su peptidi gp100, MAGE antigeni, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaza, ili ćelije tumora transfektovane da eksprimiraju citokin GM-CSF (o čemu se dalje govori u nastavku).

[0420] Kod ljudi, pokazalo se da su neki tumori imunogeni, kao što su melanomi. Smanjenjem praga aktivacije T ćelija putem aktivacije OX40, odgovori tumora u domaćinu mogu da se aktiviraju, omogućavajući lečenje neimunogenih tumora ili onih koji imaju ograničenu imunogenost.

[0421] U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se može koristiti zajedno sa protokolom vakcinacije. Osmišljene su mnoge eksperimentalne strategije za vakcinaciju protiv tumora (videti Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; videti takođe Restifo, N. i Sznol, M., Cancer Vaccines, pog. 61, str. 3023-3043 u DeVita i sar. (izd.), 1997, Cancer: Principles i Practice of Oncology, peto izdanje). U jednoj takvoj strategiji, od ovih strategija, vakcina se priprema korišćenjem autologne ili alogene tumorske ćelije. Pokazalo se da su ove ćelijske vakcine najefikasnije kada se tumorske ćelije transduciraju da eksprimiraju GM-CSF. Pokazalo se da je GM-CSF snažan aktivator prezentacije antigena za vakcinaciju protiv tumora (Dranoff i sar. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.90: 3539-43).

[0422] Proučavanje ekspresije gena i obrazaca ekspresije gena velikih razmera kod različitih tumora dovelo je do definicije takozvanih tumor specifičnih antigena (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). U mnogim slučajevima, ovi tumor specifični antigeni su antigeni diferencijacije eksprimirani u tumorima i u ćeliji iz koje je tumor nastao, na primer melanocitni antigeni gp100, MAGE antigeni, i Trp-2. Što je još važnije, može se pokazati da su mnogi od ovih antigena ciljevi tumor specifičnih T ćelija koje se nalaze u domaćinu. OX40 aktivacija se može koristiti zajedno sa kolekcijom rekombinantnih proteina i/ili peptida eksprimiranih u tumoru da bi se stvorio imunološki odgovor na ove proteine. Ove proteine imunološki sistem obično posmatra kao sopstvene antigene i stoga su tolerantni na njih. Tumorski antigen može uključivati protein telomerazu, koji je neophodan za sintezu telomera hromozoma i koji se eksprira u više od 85% humanih kancera i samo u ograničenom broju somatskih tkiva (Kim i sar. (1994) Science 266: 2011-2013). Tumorski antigen takođe može biti "neo-antigeni" eksprimiran u ćelijama kancera zbog somatskih mutacije koje menjaju sekvencu proteina ili stvaraju fuzione proteine između dve nepovezane sekvence (tj., bcr-abl u Filadelfijski hromozom), ili idiotip iz tumora B ćelija.

[0423] Druge vakcine protiv tumora mogu uključivati proteine iz virusa koji su umešani u kancere kod ljudi, kao što su humani papiloma virusi (HPV), virusi hepatitisa (HBV i HCV) i Kaposi-jev sarkom uzrokovan herpes virusom (KHSV). Drugi oblik tumor specifičnog antigena koji se može koristiti zajedno sa aktivacijom OX40 su prečišćeni proteini toplotnog šoka (HSP - heat shock proteins) izolovani iz samog tumorskog tkiva. Ovi proteini toplotnog šoka sadrže fragmente proteina iz tumorskih ćelija i ovi HSP su veoma efikasni u isporuci ćelijama koje predstavljaju antigen za izazivanje imuniteta na tumor (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura i sar. (1997) Science 278:117-120).

[0424] Dendritske ćelije (DC) su potentne ćelije koje predstavljaju antigen i koje se mogu koristiti za primanje antigen-specifičnih odgovora. DC se mogu proizvoditi ex vivo i puniti različitim proteinskim i peptidnim antigenima, kao i ekstraktima tumorskih ćelija (Nestle i sar. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC se takođe mogu transducirati genetskim sredstvima da bi se eksprimirali i ovi tumorski antigeni. DC su takođe fuzionisani direktno sa tumorskim ćelijama u svrhu imunizacije (Kugler i sar. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Kao metod vakcinacije, DC imunizacija se može efikasno kombinovati sa aktivacijom OX40 za aktiviranje snažnijih antitumorskih odgovora.

[0425] Anti-OX40 antitela opisana ovde takođe mogu da se kombinuju sa hemoterapijskim režimima. U ovim slučajevima, može biti moguće smanjiti dozu administriranog hemoterapijskog reagensa (Mokyr i sar. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Na primer, anti-OX40 antitelo se može koristiti u kombinaciji sa dekarbazinom za lečenje melanoma. U drugom primeru, anti-OX40 antitelo se može koristiti u kombinaciji sa interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno obrazloženje iza kombinovane primene anti-OX40 antitela i hemoterapije je da ćelijska smrt, kao posledica citotoksičnog delovanja većine hemoterapijskih jedinjenja, treba da rezultuje povećanjem nivoa tumorskog antigena u putu prezentacije antigena. Druge kombinovane terapije koje mogu dovesti do sinergije sa anti-OX40 antitelima kroz ćelijsku smrt su zračenje, operacija, i nedostatak hormona. Svaki od ovih protokola stvara izvor tumorskog antigena u domaćinu. Inhibitori angiogeneze se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa anti-OX40 antitelom. Inhibicija angiogeneze dovodi do smrti tumorske ćelije koja može da unese tumorski antigen u puteve prezentacije antigena domaćina.

[0426] Anti-OX40 antitela opisana ovde mogu se takođe primeniti u kombinaciji sa bispecifičnim antitelima koja ciljaju efektorske ćelije koje eksprimiraju Fcα ili Fcγ receptor na ćelije tumora (videti, npr., U.S. patente br. 5,922,845 i 5,837,243). Bispecifična antitela se mogu koristiti za ciljanje dva odvojena antigena. Na primer, anti-Fc receptor/antitumorski antigen (npr., Her2/neu) bispecifična antitela su korišćena da ciljaju makrofage na mesta tumora. Ovo ciljanje može efikasnije aktivirati specifične odgovore za tumor. T ćelijski krak ovih odgovora bi bio uvećan aktivacijom OX40. Alternativno, antigen se može isporučiti direktno u DC upotrebom bispecifičnih antitela koja se vezuju za tumorski antigen i markera ćelijske površine specifične za dendritske ćelije.

[0427] Tumori izbegavaju imunološki nadzor domaćina pomoću velikog broja mehanizama. Mnogi od ovih mehanizama se mogu prevazići inaktivacijom proteina koji su eksprimirani u tumorima i koji su imunosupresivni. Ovo uključuje između ostalog TGF-β (Kehrl i sar. (1986) J. Exp. Med.163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), i Fas ligand (Hahne i sar. (1996) Science 274: 1363-1365). Antitela na svaki od ovi entiteta se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-OX40 antitelima da bi se suprotstavili efektima imunosupresivnog agensa i favorizovali imunološki odgovor tumora od strane domaćina.

[0428] Druga antitela koja aktiviraju imunološki odgovor domaćina mogu se koristiti u kombinaciji sa ovde opisanim anti-OX40 antitelima. Ovo uključuje molekule na površini dendritskih ćelija koji aktiviraju DC funkciju i prezentaciju antigena. Anti-CD40 antitela su u stanju da efikasno zamene aktivnost T pomoćnih ćelija (Ridge i sar. (1998) Nature 393: 474-478) mogu se koristiti zajedno sa anti-OX40 antitelima. Aktiviranje antitela na kostimulatorne molekule T ćelija kao što je CTLA-4 (npr., U.S. pat. br.5,811,097), OX-40 (Weinberg i sar. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero i sar. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), i ICOS (Hutloff i sar. (1999) Nature 397: 262-266) takođe mogu obezbediti povećanje nivoa aktivacije T ćelija. Inhibitori PD1 ili PD-L1 mogu takođe se koristi u kombinaciji sa anti-OX40 antitelima.

[0429] Transplantacija koštane srži se trenutno koristi za lečenje raznih tumora hematopoetskog porekla. Dok je bolest transplantata protiv domaćina posledica ovog tretmana, terapijska korist se može dobiti od odgovora transplantata nasuprot tumoru. Anti-OX40 antitela se mogu koristiti za povećanje efikasnosti T ćelija specifičnih za tumor usađene donorima.

[0430] Takođe postoji nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja koji uključuju ex vivo aktivaciju i ekspanziju T ćelija specifičnih za antigen i usvajanje ovih ćelija u primaoce kako bi se stimulisale antigen specifične T ćelije protiv tumora (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). These postupci se takođe mogu koristiti za aktiviranje odgovora T ćelija na infektivne agense kao što je CMV. Ex vivo aktivacija u prisustvu anti-OX40 antitela može povećati učestalost i aktivnost usvojeno prenetih T ćelija.

Infektivne bolesti

[0431] Ovde su takođe obezbeđena antitela za koja se traži zaštita za primenu u postupcima za lečenje pacijenata koji su bili izloženi određenim toksinima ili patogenima. Shodno tome, ovde su obezbeđeni postupci za lečenje infektivne bolesti kod subjekta koji obuhvataju administriranje subjektu anti-OX40 antitela opisanih ovde, tako da se subjekt leči od infektivne bolesti.

[0432] Slično primeni na tumore kao što je gore diskutovano, anti-OX40 antitela se mogu koristiti sama, ili kao adjuvansi, u kombinaciji sa vakcinama, da stimulišu imunološki odgovor na patogene, toksine i samo-antigene. Primeri patogena za koje ovaj terapijski pristup može biti posebno koristan uključuju patogene za koje trenutno ne postoji efikasna vakcina, ili patogene za koje su konvencionalne vakcine manje nego potpuno efikasne. Ove uključuju, ali nisu ograničeni na HIV, hepatitis (A, B, & C), grip, herpes, đardiju, malariju, lajšmaniju, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Anti-OX40 antitela mogu biti korisna protiv ustanovljenih infekcija agensima kao što je HIV koji predstavljaju izmenjene antigene tokom infekcije. Ovi novi epitopi su prepoznati kao strani u vreme primene anti-OX40 antitela, što izaziva snažan odgovor T ćelija.

[0433] Neki primeri patogenih virusa koji izazivaju infekcije koje se mogu lečiti postupcima opisanim ovde uključuju HIV, hepatitis (A, B, or C), virus herpesa (npr., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, i CMV, Epstein Barr-ov virus), adenovirus, virus gripa, flaviviruse, ecovirus, rinovirus, koksaki virus, koronavirus, respiratorni sincicijalni virus, virus zauški, rotavirus, virus malih boginja, virus rubeole, parvovirus, virus vakcinije, HTLV virus, denga virus, papiloma virus, molluscum virus, poliovirus, virus besnila, JC virus i virus arbovirusnog encefalitisa.

[0434] Neki primeri patogenih bakterija koje izazivaju infekcije koje se mogu lečiti ovde opisanim postupcima uključuju hlamidiju, rikecije bakterije, mikobakterije, stafilokoke, streptokoke, pneumonokoke, meningokoke i gonokoke, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteriju, salmonelu, bacilli, koleru, tetanus, botulizam, antraks, bakterije kuge, leptospiroze, i Lajmske bolesti.

[0435] Neki primeri patogenih gljivica koje izazivaju infekcije koje se mogu lečiti ovde opisanim postupcima uključuju Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis i Histoplasma capsulatum.

[0436] Neki primeri patogenih parazita koji izazivaju infekcije koje se mogu lečiti ovde opisanim postupcima uključuju Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.

[0437] U svim gore navedenim postupima, anti-OX40 antitela se mogu kombinovati sa drugim oblicima imunoterapije kao što je lečenje citokinima (npr., interferoni, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ili terapijama bispecifičnim antitelom, koje pružaju poboljšanu prezentaciju antigena tumora (videti, npr., Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).

Autoimune reakcije

[0438] Anti-OX40 antitela mogu da izazovu i pojačaju autoimunološke odgovore. Zaista, indukcija antitumorskih odgovora korišćenjem tumorskih ćelija i peptidnih vakcina otkriva da mnogi antitumorski odgovori uključuju anti-samoreaktivnost (van Elsas i sar. (2001) J. Exp. Med.

194:481-489; Overwijk, i sar. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4). Zbog toga se anti-OX40 antitela mogu koristiti u kombinaciji sa različitim sopstvenim proteinima kako bi se efikasno osmislili protokoli vakcinacije da efikasno stvore imunološke odgovore protiv ovih sopstvenih proteina za lečenje bolesti. Na primer, Alchajmerova bolest uključuje neodgovarajuću akumulaciju Aβ peptida u amiloidnim naslagama u mozgu; odgovori antitela protiv amiloida su u stanju da očiste ove amiloidne naslage (Schenk i sar., (1999) Nature 400: 173-177).

[0439] Drugi sopstveni proteini se takođe mogu koristiti kao ciljevi kao što su IgE za lečenje alergija i astme, i TNFc za reumatoidni artritis. Konačno, odgovori antitela na različite hormone mogu biti indukovani upotrebom anti-OX40 antitela. Neutralizirajući odgovori antitela na reproduktivne hormone mogu se koristiti za kontracepciju. Neutralizirajući odgovor antitela na hormone i druge rastvorljive faktore koji su potrebni za rast određenih tumora takođe se mogu smatrati mogućim ciljevima vakcinacije.

[0440] Analogni postupci kao što su gore opisani za primenu anti-OX40 antitela mogu se koristiti za indukciju terapijskih autoimunoloških odgovora za lečenje pacijenata koji imaju neodgovarajuću akumulaciju drugih sopstvenih antigena, kao što su amiloidni depoziti, uključujući Aβ kod Alchajmerove bolesti, citokini kao što su TNFα, i IgE.

Vakcine

[0441] Navedena anti-OX40 antitela mogu da se koriste za stimulisanje antigen-specifičnih imunoloških odgovora koadministriranjem antitela sa antigenom od interesa (npr., vakcina). Shodno tome, ovde su obezbeđena antitela za koja se traži zaštita za primenu u postupcima za poboljšanje imunološkog odgovora na antigen kod subjekta, koji obuhvataju administriranje subjektu: (i) antigena; i (ii) anti-OX40 antitela tako da je pojačan imunološki odgovor na antigen kod subjekta. Antitelo može biti humano anti-OX40 antitelo (kao što je bilo koje od humanih anti-OX40 antitela opisano ovde). Antigen može biti, na primer, tumorski antigen, virusni antigen, bakterijski antigen ili antigen iz patogena. Neograničavajući primeri takvih antigena obuhvataju one o kojima se govori u gornjim odeljcima, kao što su tumorski antigeni (ili tumorske vakcine) o kojima se raspravljalo gore, ili antigeni iz virusa, bakterija ili drugih patogena opisanih iznad.

[0442] Pogodni putevi administriranja kompozicija antitela (npr., humana monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) opisani ovde in vivo i in vitro su dobro poznati u oblasti i mogu biti odabrani od strane prosečnih stručnjaka. Na primer, kompozicije antitela se mogu administrirati injekcijom (npr,. intravenozno ili subkutano). Odgovarajuće doze korišćenih molekula će zavisiti od starosti i težine subjekta i koncentracije i/ili formulacije kompozicije antitela.

[0443] Kao što je prethodno opisano, ovde opisana anti-OX40 antitela mogu se administrirati zajedno sa jednim ili drugim terapijskim agensima, npr., citotoksičnim agensom, radiotoksičnim agensom ili imunosupresivnim agensom. Antitelo može biti povezano sa agensom (kao imunokompleks) ili se može administrirati odvojeno od agensa. U poslednjem slučaju (odvojeno administriranje), antitelo se može administrirati pre, posle ili istovremeno sa agensom ili se može koadministrirati sa drugim poznatim terapijama, npr., terapijom protiv kancera, npr. zračenjem. Takvi terapijski agensi uključuju, između ostalog, anti-neoplastične agense kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil, dakarbazin i ciklofosfamid hidroksiurea koji su, sami po sebi, efikasni samo na nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se administrira intravenozno kao doza od 100 mg/ml jednom u četiri nedelje a adriamicin se administrira intravenozno kao doza od 60-75 mg/ml jednom na svakih 21 dan. Koadministriranje anti-OX40 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, opisanih ovde sa hemoterapijskim agensima, obezbeđuje dva agensa protiv kancera koji deluju preko različitih mehanizama koji daju citotoksični efekat na ćelije tumora čoveka. Takvo koadministriranje može rešiti probleme u vezi sa razvojem rezistencije na lekove ili promenom antigenosti tumorskih ćelija koja bi ih učinila nereaktivnim sa antitelom.

[0444] Ovde su takođe obezbeđeni kompleti za koje se ne traži zaštita koji sadrže kompozicije anti-OX40 antitela ovde opisane (npr., humana antitela, bispecifični ili multispecifični molekuli, ili imunokonjugati) i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedno ili više dodatnih humanih antitela opisanih ovde (npr., humano antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop u OX40 različit od prvog humanog antitela). Kompleti obično uključuju oznaku koja označava nameravanu upotrebu sadržaja kompleta. Pojam oznaka uključuje bilo koji pisani ili snimljeni materijal koji se isporučuje uz ili sa kompletom, ili koji na drugi način prati komplet.

Protokoli lečenja

[0445] Pogodni protokoli, ali za koje se ne traži zaštita, za lečenje solidnih tumora (npr., napredovali solidni tumor) kod ljudskih pacijenata uključuju, na primer, administriranje pacijentu efikasne količine anti-OX40 antitela koje sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 318, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 94, gde postupak obuhvata najmanje jedan ciklus administriranja, pri čemu je ciklus period od dve nedelje (Q2W), gde za svaki od najmanje jednig ciklusa, najmanje jedna doza anti-OX40 antitela se administrira pri dozi od 1 mg/kg telesne težine; fiksnoj dozi od 20, 40, 80, 160, ili 320 mg; dozi od oko 1 mg/kg telesne težine; ili fiksnoj dozi od oko 20, 40, 80, 160, ili 320 mg.

[0446] Drugi pogodan protokol za lečenje solidnih tumora kod ljudskog pacijenta uključuje, na primer, administriranje pacijentu efikasne količine svakog od:

(a) anti-OX40 antitela koje sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 318, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 94, i (b) anti-PD-1 antitela koje sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvenca navedenu u SEQ ID NO: 301, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 302, pri čemu postupak obuhvata najmanje jedan ciklus administriranja, pri čemu je ciklus period od dve nedelje, pri čemu se za svaki od najmanje jednog ciklusa, najmanje jedna doza anti-OX40 antitela administrira pri dozi od 1 mg/kg telesne težine; fiksnoj dozi od 20, 40, 80, 160, ili 320 mg; dozi od oko 1 mg/kg telesne težine; ili fiksnoj dozi od oko 20, 40, 80, 160, ili 320 mg, i najmanje jedna doza anti-PD-1 antitelo se administrira pri ravnoj dozi od 240 mg ili ravnoj dozi od oko 240 mg. U nekim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo se administrira jednom svake tri nedelje (q3w) pri fiksnoj dozi od 360 mg, ili jednom svake četiri nedelje (q4w) pri dozi od 480 mg.

[0447] Drugi pogodan protokol za lečenje solidnog tumora kod ljudskih pacijenata uključuju, na primer, administriranje pacijentu efikasne količine svakog od:

(a) anti-OX40 antitelo koje sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 318, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 94, i (b) anti-CTLA-4 antitelo koje sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 309, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 310, pri čemu postupak obuhvata najmanje jedan ciklus administriranja, pri čemu je ciklus period od tri nedelje (q3w), pri čemu se za svaki od najmanje jednog ciklusa, najmanje jedna doza anti-OX40 antitela administrira pri dozi od 1 mg/kg telesne težine; fiksnoj dozi od 20, 40, 80, 160, ili 320 mg; dozi od oko 1 mg/kg telesne težine; ili fiksnoj dozi od oko 20, 40, 80, 160, ili 320 mg, i najmanje jedna doza anti-CTLA-4 antitela se administrira pri ravnoj dozi od 1 mg/kg telesne težine ili ravnoj dozi od oko 1 mg/kg telesne težine. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira zajedno sa anti-CTLA-4 antitelom tokom najmanje jednog ciklusa, zatim sledi monoterapija sa anti-OX40 antitelom tokom najmanje jednog ciklusa. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira zajedno sa ipilimumabom tokom inicijalna četiri ciklusa, zatim sledi monoterapija sa anti-OX40 antitelom za naknadne cikluse.

[0448] U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 antitelo se administriraju pri sledećim dozama:

(a) 1 mg/kg anti-OX40 antitela i 240 mg, 360 mg, ili 480 mg anti-PD-1 antitela;

(b) 20 mg anti-OX40 antitela i 240 mg, 360 mg, ili 480 mg anti-PD-1 antitela;

(c) 40 mg anti-OX40 antitela i 240 mg, 360 mg, ili 480 mg anti-PD-1 antitela;

(d) 80 mg anti-OX40 antitela i 240 mg, 360 mg, ili 480 mg anti-PD-1 antitela;

(e) 160 mg anti-OX40 antitela i 240 mg, 360 mg, ili 480 mg anti-PD-1 antitela; ili (f) 320 mg anti-OX40 antitela i 240 mg, 360 mg, ili 480 mg anti-PD-1 antitela.

[0449] U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo i anti-CTLA-4 se administriraju pri sledećim dozama:

(a) 1 mg/kg anti-OX40 antitela i 1 mg/kg anti-CTLA-4 antitela;

(b) 20 mg anti-OX40 antitela i 1 mg/kg anti-CTLA-4 antitela;

(c) 40 mg anti-OX40 antitela i 1 mg/kg anti-CTLA-4 antitela;

(d) 80 mg anti-OX40 antitela i 1 mg/kg anti-CTLA-4 antitela;

(e) 160 mg anti-OX40 antitela i 1 mg/kg anti-CTLA-4 antitela; ili

(f) 320 mg anti-OX40 antitela i 1 mg/kg anti-CTLA-4 antitela.

[0450] U jednom tehničkom rešenju, doza anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela se obračunava prema telesnoj težini, npr., mg/kg telesne težine. U drugom tehničkom rešenju, doza anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela je ravna-fiksna doza. U drugom tehničkom rešenju, doza anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela varira tokom vremena. Na primer, anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo može se inicijalno administrirati pri visokim dozama i može se sniziti tokom vremena. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se inicijalno administrira pri nižoj dozi i povećava se tokom vremena.

[0451] U drugom tehničkom rešenju, količina anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela se konstantno administrira za svaku dozu. U drugom tehničkom rešenju, količina administriranog antitela varira sa svakom dozom. Na primer, doza za održavanje (ili naknadna) doza antitela može biti veća ili ista kao doza punjenja koja se prvi put administriran. U drugom tehničkom rešenju, doza održavanja antitela može biti niža ili ista kao doza punjenja.

[0452] U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se formuliše kao instravensko administriranje. U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo, ili anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 or CTLA-4 antitelo, se administriraju 1 dana svakog ciklusa.

[0453] U nekim tehničkim rešenjima, anti-OX40 i/ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se administriraju nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, ili jednom svake četiri nedelje, ili sve dok se primećuje klinička korist ili dok ne dođe do potpunog odgovora, potvrđene progresivne bolesti ili nekontrolisane toksičnosti.

[0454] U jednom tehničkom rešenju, ciklus administriranja je dve nedelje, što se može ponoviti, ako je potrebno. U drugom tehničkom rešenju, ciklus je tri nedelje. U nekim tehničkim rešenjima, lečenje se sastoji od do osam ciklusa. U drugim tehničkim rešenjima, lečenje se sastoji od do 12 ciklusa.

[0455] U jednom tehničkom rešenju, jedna doza svakog od anti-OX40 antitela i anti-PD-1 antitela se administrira u ciklusu od dve nedelje. U drugom tehničkom rešenju, jedna doza svakog od anti-PD-1 antitela i anti-OX40 antitela se administrira u ciklusu od tri nedelje. U drugom tehničkom rešenju, jedna doza svakog od anti-PD-1 antitela i anti-OX40 antitela se administrira u ciklusu od četiri nedelje.

[0456] U jednom tehničkom rešenju, jedna doza anti-OX40 antitela i anti-CTLA-4 antitela se administrira tronedeljnim ciklusom. U nekim tehničkim rešenjima, jedna doza svakog od anti-OX40 antitela i anti-CTLA-4 antitela se administrira u ciklusu od tri nedelje tokom prva četiri ciklusa, nakon čega sledi monoterapija anti-OX40 antitelom od petog do osmog ciklusa.

[0457] U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se administriraju kao prva linija lečenja (npr., inicijalni ili prvi tretman). U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo se administriraju kao druga linija lečenja (npr., nakon inicijalnog ili prvog tretmana, uključujući nakon o relapsa i/ili gde je prvi tretman bio neuspešan).

[0458] U jednom aspektu, karakteristike pronalaska gore navedenih tehničkih rešenja, pronalazak karakteriše bilo koje od gore pomenutih tehničkih rešenja, gde je anti-PD-1 antitelo zamenjeno, ili kombinovano sa, anti-PD-L1 ili anti-PD-L2 antitelom.

[0459] U nekim tehničkim rešenjima, ljudski pacijent ima kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera grlića materice, kancera mokraćne bešike, kolorektalnog kancera, i kancera jajnika.

[0460] Anti-OX40 antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrži sekvence navedene u SEQ ID NOs: 318 i 94, redom. U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži sekvence teškog i lakog lanca koji sadrže sekvence navedene u SEQ ID NOs: 124 i 116, redom.

[0461] U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1, CDR2, i CDR3 koji sadrže sekvence navedene u SEQ ID NOs: 303-305, redom, i varijabilni region CDR1, CDR2, i CDR3 lakog lanca koji sadrži sekvence navedene u SEQ ID NOs: 306-308, redom. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca navedene u SEQ ID NOs: 301 i 302, redom. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo sadrži sekvence teškog i lakog lanca navedene u SEQ ID NOs: 299 i 300, redom.

[0462] U određenim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1, CDR2, i CDR3 koji sadrže sekvence navedene u SEQ ID NOs: 311-313, redom, i varijabilni region lakog lanca CDR1, CDR2, i CDR3 koji sadrže sekvence navedene u SEQ ID NOs: 314-316, redom. U određenim tehničkim rešenjima, anti-CTLA-4 antitelo sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca navedene u SEQ ID NOs: 309 i 310, redom.

Ishodi

[0463] Što se tiče ciljnih lezija, odgovori na terapiju mogu uključivati:

[0464] Što se tiče ciljnih lezija, odgovori na terapiju mogu uključivati:

[0465] Pacijenti lečeni prema postupcima koji su ovde navedeni, poželjno je da dožive poboljšanje u najmanje jednom znaku kancera. U jednom tehničkom rešenju, poboljšanje se meri smanjenjem količine i/ili veličine merljivih tumorskih lezija. U drugom tehničkom rešenju, lezije se mogu meriti na rendgenskim snimcima grudnog koša ili CT ili MRI filmovima. U drugom tehničkom rešenju, citologija ili histologija se mogu koristiti za procenu odgovora na terapiju.

[0466] U jednom tehničkom rešenju, pacijent koji se leči pokazuje potpuni odgovor (CR), delimični odgovor (PR), stabilnu bolest (SD), potpunu bolest povezanu sa imunološkim sistemom (irCR), delimični odgovor povezan sa imunološkim sistemom (irPR) ili stabilna bolest povezanu sa imunološkim sistemom (irSD). U drugom tehničkom rešenju, lečeni pacijent doživljava smanjenje tumora i/ili smanjenje brzine rasta, tj., supresiju rasta tumora. U drugom tehničkom rešenju, neželjena proliferacija ćelija je smanjena ili inhibirana. U još jednom tehničkom rešenju može se javiti jedno ili više od sledećeg: može se smanjiti broj ćelija kancera; veličina tumora se može smanjiti; infiltracija ćelija kancera u periferne organe može biti inhibirana, zaostala, usporena ili zaustavljena; metastaza tumora može biti usporena ili inhibirana; rast tumora može biti inhibiran; ponavljanje tumora se može sprečiti ili odložiti; jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom može se donekle ublažiti.

[0467] U drugim tehničkim rešenjima, administriranje efikasnih količina anti-OX40 antitela i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela prema bilo kom od ovde opisanih postupaka proizvodi najmanje jedan terapijski efekat odabran iz grupe koja se sastoji od smanjenja veličine tumor, smanjenje broja metastatskih lezija koje se pojavljuju tokom vremena, potpune remisije, delimične remisije ili stabilne bolesti. U još nekim tehničkim rešenjima, postupci lečenja daju uporedivu stopu kliničke koristi (CBR = CR+ PR+ SD ≥ 6 meseci) bolju od one koju postižu samo anti-OX40 antitelo ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelo. U drugim tehničkim rešenjima, poboljšanje stope kliničke koristi je oko 20% 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili više u poređenju sa samim anti-OX40 antitelom ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom.

Kombinovane terapije

[0468] Dodatno kombinovanim terapijama koje su iznad stavljene na uvid javnosti, anti-OX40 antitela opisana ovde se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji, kako je opisano ispod.

[0469] Postupci kombinovane terapije uključuju one u kojima se anti-OX40 antitelo, ili kombinacija anti-OX40 antitela i anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela, zajedno administrira sa jednim ili više dodatnih agenasa, npr. sitnomolekulskim lekovima, antitelima ili njihovim antigen vezujućim delovima, a koji su efikasni u stimulisanju imunološkog odgovora tako da dalje poboljšavaju, stimulišu ili pojačavaju imunološke odgovore kod ispitanika. Na primer, kao što je prikazano u primerima, administracija anti-OX40 antitela i antagonista anti-PD-1 antitela miševima može da dovede do sinergističnog efekta u inhibiranju rasta tumora.

[0470] Anti-OX40 antitelo može se kombinovati sa (i) agonistom stimulatornog (npr. kostimulatornog) molekula (npr. receptor ili ligand) i/ili (ii) antagonistom inhibitornog signala ili molekula (npr. receptor ili ligand) na imune ćelije, kao što su T ćelije, od kojih oba dovode do pojačavanja imunoloških odgovora, kao što su antigen-specifični T ćelijski odgovori. U određenim aspektima, imunoonkološki agens je (i) agonist stimulatornog (uključujući ko-stimulatorni) molekula (npr. receptor ili ligand) ili (ii) antagonist inhibitornog (uključujući ko-inhibitorni) molekula (npr. receptor ili ligand) na ćelijama uključenim u urođeni imunitet, npr. NK ćelije, i pri čemu imunoonkološki agens pojačava urođeni imunitet. Takvi imunoonkološki agensi se često nazivaju regulatorima imunih kontrolnih tačaka, npr. inhibitor imunih kontrolnih tačaka ili stimulator imunih kontrolnih tačaka.

[0471] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira sa agensom koji cilja stimulatorni ili inhibitorni molekul koji je član imunoglobulinske super familije (IgSF). Na primer, anti-OX40 antitelo se može administrirati subjektu sa agensom koji cilja člana IgSF familije da bi se pojačao imuni odgovor. U drugim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se može administrirati sa agensom koji cilja (ili se specifično vezuje za) člana B7 familije liganada, koji su vezani za membranu, koja uključuje B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), i B7-H6 ili kostimulatorni ili koinhibitorni receptor koji se specifično vezuje za člana B7 familije.

[0472] Anti-OX40 antitelo se takođe može administrirati sa agensom koji cilja člana TNF i TNFR familije molekula (ligande ili receptore), kao što je CD40 i CD40L, GITR, GITR-L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, Limfotoksin α/TNPβ, TNFR2, TNFα, LTβR, Limfotoksin α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, i NGFR (videti, npr. Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1).

[0473] T ćelijski odgovori mogu biti stimulisani kombinacijom anti-OX40 antitela i jednog ili više sledećih agenasa:

(1) Antagonista (inhibitor ili blokirajući agens) proteina koji inhibira T ćelijsku aktivaciju (npr. inhibitori imune kontrolne tačke), kao što je CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, i LAG-3, kao što je iznad opisano, i bilo kog od sledećih proteina: TIM-3, Galektin 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galektin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3, B7-H4, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, i TIM-4; i/ili

(2) Antagonista proteina koji stimuliše T ćelijsku aktivaciju, kao što je B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, GITR, GITR-L, CD70, CD27, CD40, DR3 i CD28H.

[0474] Primeri agenasa koji moduliraju jedan od gorepomenutih proteina i mogu da se kombinuju sa anti-OX40 antitelom za lečenje kancera, uključuju: Yervoy<™>(ipilimumab) ili Tremelimumab (na CTLA-4), galiksimab (na B7.1), BMS-936558 (na PD-1), MK-3475 (na PD-1), AMP224 (na B7DC), BMS-936559 (na B7-H1), MPDL3280A (na B7-H1), MEDI-570 (na ICOS), AMG557 (na B7H2), MGA271 (na B7H3), IMP321 (na LAG-3), BMS-663513 (na CD137), PF-05082566 (na CD137), CDX-1127 (na CD27), Atacicept (na TACI), CP-870893 (na CD40), Lukatumumab (na CD40), Dacetuzumab (na CD40), Muromonab-CD3 (na CD3), Ipilumumab (na CTLA-4).

[0475] Anti-OX40 antitela mogu takođe da se administriraju sa pidilizumabom (CT-011).

[0476] Drugi molekuli koji se mogu kombinovati sa anti-OX40 antitelom za lečenje kancera uključuju antagoniste inhibitornih receptora na NK ćelijama ili agoniste aktivacionih receptora na NK ćelijama. Na primer, anti-OX40 antitelo može se kombinovati sa antagonistima KIR-a (npr. lirilumabom).

[0477] T ćelijska aktivacija je takođe regulisana rastvorljivim citokinima, i anti-OX40 antitela mogu biti administrirana subjektu, npr. koji ima kancer, sa antagonistima citokina koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju ili agonistima citokina koji stimulišu T ćelijsku aktivaciju.

[0478] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitela se mogu koristiti u kombinaciji sa (i) antagonistima (ili inhibitorima ili blokirajućim agensima) proteina IgSF familije ili B7 familije ili TNF familije koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju ili antagonistima citokina koji inhibiraju T ćelijsku aktivaciju (npr. IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF; "imunosupresivni citokini") i/ili (ii) agonistima stimulatornih receptora IgSF familije, B7 familije ili TNF familije ili citokina koji stimulišu T ćelijsku aktivaciju, za stimulaciju imunog odgovora, npr. za lečenje proliferativnih bolesti, kao što je kancer.

[0479] Još drugi agensi za kombinovane terapije uključuju agense koji inhibiraju ili osiromašuju makrofage ili monocite, uključujući ali ne ograničeno na CSF-1R antagoniste kao što su CSF-1R antagonistička antitela koja uključuju RG7155

(WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) ili FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357).

[0480] Anti-OX40 antitela mogu takođe da se administriraju sa agensima koji inhibiraju TGF-β signaliziranje.

[0481] Dodatni agensi koji se mogu kombinovati sa anti-OX40 antitelima opisanim ovde uključuju agense koji povećavaju prezentaciju tumorskog antigena, npr. vakcine sa dendritskim ćelijama, GM-CSF sekretujuće celularne vakcine, CpG oligonukleotide, i imikvimod, ili terapije koje pojačavaju imunogenost tumorskih ćelija (npr. antraciklini).

[0482] Još druge terapije koje mogu da se kombinuju sa anti-OX40 antitelima uključuju terapije koje osiromašuju ili blokiraju Treg ćelije, npr. agens koji se specifično vezuje za CD25.

[0483] Druga terapija koja se može kombinovati sa anti-OX40 antitelima je terapija koja inhibira metabolički enzim kao što je indoleamin dioksigenaza (IDO), dioksigenaza, arginaza, ili azot oksid sintetaza.

[0484] Druga klasa agenasa koja se može primeniti sa anti-OX40 antitelima uključuje agense koji inhibiraju formaciju adenozina ili inhibiraju adenozinski A2A receptor.

[0485] Ostale terapije koje se mogu kombinovati sa anti-OX40 antitelima za lečenje kancera uključuju terapije koje preokreću/sprečavaju T ćelijsku anergiju ili iscrpljivanje i terapije koje pokreću urođenu imunu aktivaciju i/ili inflamaciju na mestu tumora.

[0486] Anti-OX40 antitelo se može kombinovati sa više od jednog imunoonkološkog agensa, i mogu se, npr. kombinovati sa kombinatornim pristupom koji okida višestruke elemente imunog puta, kao što je jedno ili više od sledećeg: terapija koja poboljšava prezentaciju antigena tumora (npr. vakcine sa dendritskim ćelijama, GM-CSF sekretujuće celularne vakcine, CpG oligonukleotidi, imikvimod); terapija koja inhibira negativnu imunu regulaciju npr. inhibiranjem CTLA-4 i/ili PD1/PD-L1/PD-L2 puta i/ili osiromašenje ili blokiranje Treg-a ili ostalih imuno supresivnih ćelija; terapija koja stimuliše pozitivnu imuno regulaciju, npr. agonistima koji stimulišu CD-137 i/ili GITR put i/ili stimulišu efektorsku funkciju T ćelija; terapija koja povećava sistemski frekvenciju antitumorskih T ćelija; terapija koja osiromašuje ili inhibira Treg, kao što su Treg u tumoru, npr. primenom antagonista od CD25 (npr. daklizumab) ili ex vivo osiromašenjem anti-CD25 zrnaca; terapija koja utiče na funkciju supresorskih mijeloidnih ćelija u tumoru; terapija koja poboljšava imunogenost tumorskih ćelija (npr. antraciklini); adoptivni transfer T ćelija ili NK ćelija uključujući genetički modifikovane ćelije, npr. ćelije modifikovane himernim antigen receptorima (CAR-T terapija); terapija koja inhibira metabolički enzim kao što je indoleamin dioksigenaza (IDO), dioksigenaza, arginaza, ili azot oksid sintetaza; terapija koja preokreće/sprečava T ćelijsku anergiju ili iscrpljivanje; terapija koja pokreće urođenu imunu aktivaciju i/ili inflamaciju na mestu tumora; administracija imunostimulatornih citokina; ili blokiranje imunorepresivnih citokina.

[0487] Anti-OX40 antitela se mogu primeniti zajedno sa jednim ili više agonističkih agenasa koji ligiraju pozitivne kostimulatorne receptore, blokirajućih agenasa koji ublažavaju signaliziranje preko inhibitornih receptora, antagonista, i jednim ili više agenasa koji sistemski povećavaju frekvenciju anti-tumorskih T ćelija, agenasa koji prevazilaze različite imunosupresivne puteve unutar tumorskog mikrookruženja (npr. blokiraju angažovanje inhibitornih receptora (npr. PD-L1/PD-1 interakcije), osiromašuju ili inhibiraju Treg (npr. primenom anti-CD25 monoklonskog antitela (npr. daklizumab) ili ex vivo osiromašivanjem anti-CD25 zrnaca), inhibiraju metaboličke enzime kao što je IDO, ili preokreću/sprečavaju anergiju ili iscrpljivanje T ćelija) i agenasa koji pokreću urođenu imunu aktivaciju i/ili inflamaciju na mestima tumora.

[0488] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira subjektu zajedno sa BRAF inhibitorom ukoliko je subjekt pozitivan na BRAF V600 mutaciju.

[0489] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira zajedno sa drugim imunostimulatornim antitelom.

[0490] Ovde su obezbeđena antitela za koja se traži zaštita za primenu u postupcima za stimulisanje imunog odgovora kod subjekta koji obuhvataju administriranje subjektu anti-OX40 antitela, i jednog ili više dodatnih imunostimulatornih antitela, kao što je anti-PD-1 antagonist, npr. antagonističko antitelo, anti-PD-Ll antagonist, npr. antagonističko antitelo, antagonistički anti-CTLA-4 antagonist, npr. antagonističko antitelo i/ili anti-LAG3 antagonist, npr. antagonističko antitelo, tako da je kod subjekta imuni odgovor stimulisan, na primer da se inhibira rast tumora ili da se stimuliše antivirusni odgovor. U jednom tehničkom rešenju, subjektu se administrira anti-OX40 antitelo i antagonističko anti-PD-1 antitelo. U jednom tehničkom rešenju, subjektu se administrira anti-OX40 antitelo i antagonističko anti-PD-Ll antitelo. U jednom tehničkom rešenju, subjektu se administrira anti-OX40 antitelo i antagonističko anti-CTLA-4 antitelo. U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo je humano antitelo. Alternativno, anti-OX40 antitelo može biti, na primer, himerno ili humanizovano antitelo. U jednom tehničkom rešenju, najmanje jedno dodatno imunostimulatorno antitelo (npr. antagonističko anti-PD-1, antagonističko anti-PD-Ll, antagonističko anti-CTLA-4 i/ili antagonističko anti-LAG3 antitelo) je humano antitelo. Alternativno, najmanje jedno dodatno imunostimulatorno antitelo može biti, na primer, himerno ili humanizovano antitelo (npr. pripremljeno iz mišjeg anti-PD-1, anti-PD-Ll, anti-CTLA-4 i/ili anti-LAG3 antitela).

[0491] Ovde su obezbeđena antitela za koja se traži zaštita za primenu u postupcima za lečenje hiperproliferativne bolesti (npr. kancera), koji obuhvataju administriranje anti-OX40 antitela sa antagonističkim PD-1 antitelom, antagonističkim PD-L1 antitelom, anti-CTLA-4 antitelom, ili anti-LAG3 antitelom subjektu. U određenim tehničkim rešenjima, jedno ili oba antitela se administriraju u subterapijskoj dozi. Takođe ovde su obezbeđena antitela za primenu u postupcima za izmenu neželjenog događaja koji je u vezi sa lečenjem hiperproliferativne bolesti imunostimulatornim agensom, koji obuhvataju administriranje anti-OX40 antitela i subterapijske doze anti-PD-1, anti-PD-Ll, anti-CTLA-4, ili anti-LAG3 antitela subjektu (npr. čoveku). U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sadrži CDR-ove ili varijabilne regione od 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, i 20C1, ili je drugo agonističko anti-OX40 antitelo opisano ovde.

[0492] Pogodni PD-1 antagonisti za primenu u postupcima opisanim ovde, uključuju, bez ograničenja, ligande, antitela (npr. monoklonska antitela i bispecifična antitela), i multivalentne agense. U jednom tehničkom rešenju, PD-1 antagonist je fuzioni protein, npr. Fc fuzioni protein, kao što je AMP-244. U jednom tehničkom rešenju, PD-1 antagonist je anti-PD-1 ili anti-PD-Ll antitelo.

[0493] Primer anti-PD-1 antitela je nivolumab (BMS-936558) ili antitelo koje sadrži CDR-ove ili varijabilne regione jednog od antitela 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 i 4A11 opisanih u WO 2006/121168. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PDl antitelo je MK-3475 (Lambrolizumab) opisano u WO2012/145493; i AMP-514 opisano u WO 2012/145493. Dalje poznata PD-1 antitela i ostali PD-1 inhibitori uključuju one opisane u WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, američkim patentima sa brojevima 7,635,757 i 8,217,149, i američkom patentu sa brojem objave 2009/0317368. Bilo koja od anti-PD-1 antitela koja su stavljena na uvid javnosti u WO2013/173223 mogu takođe da se koriste. Anti-PD-1 antitelo koje se takmiči za vezivanje sa, i/ili se vezuje za isti epitop na PD-1 kao, kao jedno od ovih antitela takođe se može koristiti u kombinovanim lečenjima. Drugi pristup za ciljanje PD-1 receptora je rekombinantni protein sačinjen od vanćelijskog domena od PD-L2 (B7-DC) fuzionisanog za Fc deo od IgG1, zvan AMP-224. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ima najmanje oko 90% identitičnosti aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona sa gorepomenutim antitelima.

[0494] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se koristi u kombinaciji sa nivolumabom, koje sadrži težak i lak lanac koji sadrže sekvence prikazane u SEQ ID NOs: 299 i 300, redom, ili antigen vezujuće fragmente i njihove varijacije. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ima CDR-ove teškog i lakog lanca ili varijabilne regione nivolumaba. U skladu sa tim, u jednom tehničkom rešenju, antitelo sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 domene od VH nivolumaba koji imaju sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 301, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene od VL nivolumaba koji imaju sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 302. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene koji sadrže sekvence predstavljene u SEQ ID NOs: 303-305, redom, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene koji sadrže sekvence predstavljene u SEQ ID NOs: 306-308, redom. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži VH i/ili VL regione koji sadrže aminokiselinske sekvence predstavljene u SEQ ID NO: 301 i/ili SEQ ID NO: 302, redom. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ima najmanje oko 90%, npr. najmanje oko 90%, 95%, ili 99% identitičnosti varijabilnog regiona sa SEQ ID NO: 301 ili SEQ ID NO: 302.

[0495] Primeri anti-PD-Ll antitela uključuju BMS-936559 (nazivan kao 12A4 u WO 2007/005874 i američkom patentu sa brojem 7,943,743), ili antitelo koje sadrži CDR-ove ili varijabilne regione od 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 i 13G4, koji su opisani u PCT objavi WO 07/005874 i američkom patentu sa brojem 7,943,743. U određenim tehničkim rešenjima, anti-PD-Ll antitelo je MEDI4736 (takođe poznato kao Anti-B7-H1), MPDL3280A (takođe poznato kao RG7446), MSB0010718C (WO2013/79174), ili rHigM12B7. Bilo koje od anti-PD-Ll antitela koja su stavljena na uvid javnosti u

WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, američkim patentima sa brojevima 7,635,757 i 8,217,149 i američkoj objavi sa brojem 2009/145493 se takođe može koristiti.

[0496] Primeri anti-CTLA-4 antitela uključuju Yervoy<™>(ipilimumab ili antitelo 10D1, opisano u PCT objavi WO 01/14424), tremelimumab (prethodno ticilimumab, CP-675,206), ili anti-CTLA-4 antitelo opisano u bilo kojoj od narednih objava: WO 98/42752; WO 00/37504; američkom patentu sa brojem 6,207,156; Hurwitz i ostali (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho i ostali (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Apstrakt br. 2505 (antitelo CP-675206); i Mokyr i ostali (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. Bilo koje od anti-CTLA-4 antitela koja su stavljena na uvid javnosti u WO2013/173223 takođe se može koristiti.

[0497] Primeri anti-LAG3 antitela uključuju antitela koja sadrže CDR-ove ili varijabilne regione antitela 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 ili 17E5, koji su opisani u objavi američkog patenta sa br. US2011/0150892, WO10/19570 i WO2014/008218. U jednom tehničkom rešenju, anti-LAG-3 antitelo je BMS-986016. Druga anti-LAG-3 antitela prepoznata u stanju tehnike koja se mogu koristiti uključuju IMP731 i IMP-321, opisane u US 2011/007023, WO08/132601, i WO09/44273.

[0498] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se koristi u kombinaciji sa ipilimumabom. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ima CDR-ove teškog i lakog lanca ili varijabilne regione ipilimumaba. U skladu sa tim, u jednom tehničkom rešenju, antitelo sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 domene od VH ipilimumaba koji imaju sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 309, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene od VL ipilimumaba koji imaju sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 310. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene koji sadrže sekvence predstavljene u SEQ ID NOs: 311-313, redom, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene koji sadrže sekvence predstavljene u SEQ ID NOs: 314-316, redom. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo sadrži VH i/ili VL regione koji sadrže aminokiselinske sekvence predstavljene u SEQ ID NO: 309 i/ili SEQ ID NO: 310, redom. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ima najmanje oko 90%, npr. najmanje oko 90%, 95%, ili 99% identitičnosti varijabilnog regiona sa SEQ ID NO: 309 ili SEQ ID NO: 310.

[0499] Administracija anti-OX40 antitela i antagonista, npr. antagonističkog antitela, na jedan ili više drugih ciljnih antigena kao što je LAG-3 i/ili CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 može da pojača imuni odgovor na kancerozne ćelije kod pacijenta. Kanceri čiji se rast može inhibirati primenom anti-OX40 antitela uključuju kancere tipično responsivne na imunoterapiju i one koji nisu tipično responsivni na imunoterapiju. Reprezentativni primeri kancera za lečenje sa kombinovanom terapijom iz predmetne objave uključuju one kancere koji su ovde navedeni.

[0500] U određenim tehničkim rešenjima, kombinacija terapijskih antitela o kojima se ovde diskutuje se može administrirati istovremeno kao pojedinačna kompozicija u farmaceutski prihvatljivom nosaču, ili istovremeno kao odvojene kompozicije sa svakim antitelom u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U drugom tehničkom rešenju, kombinacija terapijskih antitela se može administrirati u nizu. Pored toga, ukoliko se više od jedne doze kombinovane terapije administrira uzastopno, redosled uzastopne administracije može da se preokrene ili zadrži u istom redosledu u svakoj vremenskoj tački administracije, i uzastopne administracije se mogu kombinovati sa istovremenim administracijama, ili bilo kojom njhovom kombinacijom. Na primer, prva administracija kombinacije anti-OX40 antitela i anti-PDl antitela (i/ili anti-CTLA-4 antitela i/ili anti-PD-L1 antitela i/ili anti-LAG-3 antitela) može biti istovremena, druga administracija može biti uzastopna sa anti-PD1 antitelom prvo i anti-OX40 antitelom drugo, i treća administracija može biti uzastopna sa anti-OX40 antitelom prvo i anti-PDl antitelom drugo, itd. Druga reprezentativna dozna shema uključuje prvu administraciju koja je uzastopna sa anti-OX40 prvo i anti-PDl antitelom (i/ili anti-CTLA-4 antitelom i/ili anti-PD-L1 antitelom i/ili anti-LAG-3 antitelom) drugo, i naknadne administracije mogu biti istovremene.

[0501] U određenom tehničkom rešenju, subjekt koji pati od bolesti, a koji može imati koristi od stimulacije imunog sistema, npr. kancer ili infektivna bolest, je lečen administracijom subjektu anti-OX40 antitela i imunoonkološkog agensa. Primeri imunoonkoloških agenasa uključuju CD137 (4-1BB) agoniste (npr. agonističko CD137 antitelo kao što je urelumab ili PF-05082566 (WO12/32433)); GITR agoniste (npr. agonističko anti-GITR antitelo), CD40 agoniste (npr. agonističko CD40 antitelo); CD40 antagoniste (npr. antagonističko CD40 antitelo kao što je lukatumumab (HCD122), dacetuzumab (SGN-40), CP-870,893 ili Chi Lob 7/4); CD27 agoniste (npr. agonističko CD27 antitelo kao što je varlilumab (CDX-1127)), MGA271 (na B7H3) (WO11/109400)); KIR antagoniste (npr. lirilumab); IDO antagoniste (npr. INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoksimod, NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237) ili F001287); agoniste receptora nalik Toll-u (npr. TLR2/4 agoniste (npr. Bacillus Calmette-Guerin); TLR7 agoniste (npr. Hiltonol ili Imikvimod); TLR7/8 agoniste (npr. Rezikvimod); ili TLR9 agoniste (npr. CpG7909)); i TGF-β inhibitore (npr. GC1008, LY2157299, TEW7197, ili IMC-TR1).

[0502] U jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira pre administracije drugog agensa, npr. imunoonkološkog agensa. U drugom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira istovremeno sa drugim agensom, npr. imunološkoonkološkim agensom. U još jednom tehničkom rešenju, anti-OX40 antitelo se administrira nakon administracije drugog agensa. Administracija dva agensa može započeti u vremenima razdvojenim npr. 30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 3 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 3 dana, 5 dana, 7 dana, ili jednu ili više nedelja, ili administracija drugog agensa može započeti, npr.30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 3 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 3 dana, 5 dana, 7 dana, ili jednu ili više nedelja nakon što se prvi agens administrira.

[0503] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo i drugi agens, npr. imunoonkološki agens, se administriraju istovremeno, npr. istovremeno se daju infuzijom, npr. tokom perioda od 30 ili 60 minuta, pacijentu. Anti-OX40 antitelo se može zajednički formulisati sa drugim agensom, npr. imunoonkološkim agensom.

[0504] Opciono, anti-OX40 antitelo kao jedini imunoterapijski agens, ili kombinacija anti-OX40 antitela i jednog ili više dodatnih imunoterapijskih antitela (npr. anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 blokada), može dalje da se kombinuje sa imunogenim agensom, kao što su kancerozne ćelije, prečišćeni tumorski antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide, i karbohidratne molekule), ćelije, i ćelije transfektovane sa genima koji kodiraju imunostimulišuće citokine (He i ostali (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Neograničavajući primeri tumorskih vakcina koje se mogu koristiti uključuju peptide melanomskih antigena, kao što su peptidi od gp100, MAGE antigena, Trp-2, MART1 i/ili tirozinaze, ili tumorskih ćelija transfektovanih da eksprimiraju citokin GM-CSF (o kome će dodatno biti reči u daljem tekstu). Kombinacija anti-OX40 antitela i jednog ili više dodatnih antitela (npr. CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokada) se takođe može dalje kombinovati sa standardnim tretmanima za kancer. Na primer, kombinacija anti-OX40 antitela i jednog ili više dodatnih antitela (npr. CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokada) se može efikasno kombinovati sa hemoterapijskim režimima. U ovim slučajevima, doza drugog hemoterapijskog reagensa administrirana sa kombinacijom se može smanjiti (Mokyr i ostali (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Na primer, takva kombinacija može da uključi anti-OX40 antitelo sa ili bez i dodatno antitelo (npr. anti-CTLA-4 antitela i/ili anti-PD-1 antitela i/ili anti-PD-L1 antitela i/ili anti-LAG-3 antitela), dalje u kombinaciji sa dekarbazinom ili interleukinom-2 (IL-2) za lečenje melanoma. Naučno obrazloženje kominovanja agonističkog anti-OX40 antitela sa CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokadom sa hemoterapijom je da smrt ćelija, koja je posledica citotoksičnog dejstva većine hemoterapijskih jedinjenja, treba da dovede do povećanih nivoa tumorskog antigena u putu prezentacije antigena. Druge kombinacione terapije koje mogu dovesti do sinergije sa kombinacijom anti-OX40 antitela sa ili bez i CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokadom preko ćelijske smrti uključuju zračenje, operaciju, ili hormonsku deprivaciju. Svaki od ovih protokola formira izvor tumorskog antigena u domaćinu. Inhibitori angiogeneze se takođe mogu kombinovati sa kombinacijom anti-OX40 antitela i CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokadom. Inhibicija angiogeneze vodi smrti tumorskih ćelija, što može biti izvor tumorskog antigena dopremljenog u put prezentacije antigena kod domaćina.

[0505] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se može koristiti kao jedini imunoterapijski agens, ili se kombinacija anti-OX40 antitela i CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokirajućeg antitela, takođe može koristiti u kombinaciji sa bispecifičnim antitelima koja ciljaju efektorske ćelije koje eksprimiraju Fcα ili Fcγ receptor na tumorske ćelije (videti, npr. američke patente sa brojevima 5,922,845 i 5,837,243). Bispecifična antitela se mogu koristiti da ciljaju dva različita antigena. T ćelijski krak ovih odgovora bi bio uvećan primenom kombinacije anti-OX40 antitela i CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokade.

[0506] U drugom primeru, anti-OX40 antitelo se može koristiti kao jedini imunoterapijski agens, ili kombinacija anti-OX40 antitela i dodatnog imunostimulirajućeg agensa, npr. anti-CTLA-4 antitelo i/ili anti-PD-1 antitelo i/ili anti-PD-L1 antitelo i/ili LAG-3 agens (npr. antitelo) se može primeniti u vezi sa antineoplastičnim antitelom, kao što je Rituxan<®>(rituksimab), Herceptin<®>(trastuzumab), Bexxar<®>(tositumomab), Zevalin<®>(ibritumomab), Campath<®>(alemtuzumab), Lymphocide<®>(eprtuzumab), Avastin<®>(bevacizumab), i Tarceva<®>(erlotinib), i slično. Kao primer i bez namere vezivanja teorijom, lečenje antitelom protiv kancera ili antitelom protiv kancera konjugovanim sa toksinom može dovesti do smrti ćelija kancera (npr. tumorskih ćelija) što bi potenciralo imuni odgovor posredovan imunostimulirajućim agensom (npr. OX40, CTLA-4, PD-1, PD-L1 ili LAG-3 agens, npr. antitelo). U primeru tehničkog rešenja, lečenje hiperproliferativne bolesti (npr. kancerskog tumora) može da uključi agens protiv kancera (npr. antitelo) u kombinaciji sa anti-OX40 antitelom i opciono dodatni imunostimulirajući agens, npr. anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agens (npr. antitelo), istovremeno ili uzastopno ili bilo koju njihovu kombinacija, što može potencirati imunološke odgovore domaćina protiv tumora.

[0507] Tumori izbegavaju imuni nadzor domaćina raznovrsnim mehanizmima. Mnogi od ovih mehanizama mogu da se prevaziđu inaktivacijom proteina, koje eksprimiraju tumori i koji su imunosupresivni. Ovi uključuju, među ostalima, TGF-β (Kehrl i ostali (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), i Fas ligand (Hahne i ostali (1996) Science 274: 1363-1365). Antitela na svaki od ovih entiteta mogu se dalje kombinovati sa anti-OX40 antitelom sa ili bez dodatnog imunostimulatornog agensa, npr. anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agensom, kao što je antitelo, da se suprotstavi efektima imunosupresivnih agenasa i favorizuje antitumorske imunološke odgovore od strane domaćina.

[0508] Ostali agensi (npr. antitela) koji se mogu primeniti da aktiviraju imunu responsivnost domaćina mogu se dalje koristiti u kombinaciji sa anti-OX40 antitelom sa ili bez dodatnog imunostimulišućeg agensa, kao što je anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitelo. Ovi uključuju molekule na površini dendritičkih ćelija koje aktiviraju DC funkciju i antigensku prezentaciju. Anti-CD40 antitela (Ridge i ostali, supra) se mogu koristiti u vezi sa anti-OX40 antitelom i opciono dodatnim imunostimulirajućim agensom, npr. anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agensom, npr. antitelom. Druga aktivirajuća antitela na T ćelijske kostimulatorne molekule Weinberg i ostali, supra, Melero i ostali supra, Hutloff i ostali, supra, mogu takođe da obezbede povećane nivoe T ćelijske aktivacije.

[0509] Kao što je razmatrano iznad, transplantacija koštane srži se trenutno koristi da se leče raznoliki tumori hematopoetskog porekla. Anti-OX40 imunoterapija zasebno ili kombinovano sa CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokadom se može koristiti za povećanje efikasnosti donoru usađenih T ćelija specifičnih za tumor.

[0510] Nekoliko eksperimentalnih protokola lečenja uključuju ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen specifičnih T ćelija i adoptivnog transfera ovih ćelija u primaoce u cilju da antigenspecifične T ćelije protiv tumora (Greenberg & Riddell, supra). Ovi postupci se takođe mogu koristiti da aktiviraju T ćelijske odgovore na infektivne agense kao što je CMV. Može se očekivati da ex vivo aktivacija u prisustvu anti-OX40 antitela sa ili bez dodatne imunostimulatorne terapije, npr. anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitela poveća frekvencu i aktivnost adoptivno prenesenih T ćelija.

[0511] Ovde su obezbeđena antitela za primenu u postupcima za promenu neželjenog događaja koji je udružen salečenjem hiperproliferativne bolesti (npr. kancera) sa imunostimulatornim agensom, koji obuhvataju administriranje anti-OX40 antitela sa ili bez anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 agensa (npr. antitela), subjektu. Na primer, postupci opisani ovde obezbeđuju postupak smanjenja učestalosti imunostimulatornim terapijskim antitelom indukovanog kolitisa ili dijareje administriranjem neapsorbujućeg steroida pacijentu. Kao što je ovde korišćeno, "neapsorbujući steroid" je glukokortikoid koji ispoljava izrazit metabolizam prvog prolaza tako da je, nakon metabolizma u jetri, bioraspoloživost steroida niska, tj. manja od oko 20%. U jednom tehničkom rešenju, neapsorbujući steroid je budesonid. Budesonid je lokalo delujući glukokortikosteroid, koji se obimno metaboliše, primarno u jetri, nakon oralne administracije. ENTOCORT EC<®>(Astra-Zeneca) je pH- i vremenski zavisna oralna formulacija budesonida razvijena da se optimizuje isporuka leka u ileum i kroz debelo crevo. ENTOCORT EC<®>je odobren u SAD za lečenje blage do umerene Kronove bolesti koja uključuje ileum i/ili uzlazno debelo crevo. Uobičajena oralna doza ENTOCORT EC<®>za lečenje Kronove bolesti je 6 do 9 mg/dan. ENTOCORT EC<®>se oslobađa u crevima pre nego što se apsorbuje i zadrži u sluzokoži creva. Kad jednom prođe kroz ciljno tkivo sluzokože creva, ENTOCORT EC<®>se obimno metaboliše pomoću citohrom P450 sistema u jetri do metabolita sa zanemarljivom glukokortikoidnom aktivnošću. Stoga, bioraspoloživost je niska (oko 10%). Niska bioraspoloživost budesonida dovodi do poboljšanja terapijskog odnosa u poređenju sa ostalim glukokortikoidima sa manje obimnim metabolizmom prvog prolaza. Budesonid dovodi do manje neželjenih efekata, uključujući manju hipotalamus-hipofiznu supresiju, od kortikosteroida sa sistemskim dejstvom. Međutim, hronična administracija ENTOCORT EC<®>može da rezultira sistemskim efektima glukokortikoida kao što je hiperkorticizam i adrenalna supresija. Videti PDR 58. izdanje 2004; 608-610.

[0512] U daljim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo sa ili bez CTLA-4 i/ili PD-1 i/ili PD-L1 i/ili LAG-3 blokade (tj. anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitela) u vezi sa neapsorbujućim steroidom može dalje da se kombinuje sa salicilatom. Salicilati uključuju 5-ASA agense kao što su, na primer:

sulfasalazin (AZULFIDINE<®>, Pharmacia & UpJohn); olsalazin (DIPENTUM<®>, Pharmacia & UpJohn); balsalazid (COLAZAL<®>, Salix Pharmaceuticals, Inc.); i mesalamin (ASACOL<®>, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA<®>, Shire US; CANASA<®>, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA<®>, Solvej).

[0513] U skladu sa ovde opisanim postupcima, salicilat primenjen u kombinaciji sa anti-OX40 antitelom sa ili bez anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-Ll i/ili LAG-3 antitelima i neapsorbujućim steroidom može uključiti bilo koje preklapanje ili uzastopnu administraciju salicilata i neapsorbujućeg steroida u svrhu smanjenja frekvencije kolitisa izazvanog imunostimulatornim antitelima. Tako, na primer, postupci za smanjenje frekvencije kolitisa izazvanog imunostimulatornim antitelima koja su ovde opisana obuhvataju administriranje salicilata i neapsorbujućeg istovremeno ili uzastopno (npr. salicilat se administrira 6 sati nakon neapsorbujućeg steroida), ili njihove kombinacije. Dalje, salicilat i neapsorbujući steroid mogu se administrirati istim putem (npr. oba se administriraju oralno) ili različitim putevima (npr. salicilat se primenjuje oralno, a neapsorbujući steroid se primenjuje rektalno), što se može razlikovati od puta(eva) koji se koristi za administriranje anti-OX40 antitela i anti-CTLA-4 i/ili anti-PD-1 i/ili anti-PD-L1 i/ili anti-LAG-3 antitela.

[0514] Anti-OX40 antitela i kombinovane terapije antitela opisane ovde takođe mogu da se koriste zajedno sa drugim dobro poznatim terapijama koje su odabrane zbog njihove posebne koristi protiv indikacije koja se leči (npr. kancer). Kombinacije sa anti-OX40 antitelima mogu se koristiti uzastopno sa poznatim farmaceutski prihvatljivim agensom(ima).

[0515] Na primer, anti-OX40 antitela i kombinovane terapije antitelima opisane ovde se mogu primeniti u kombinaciji (npr. istovremeno ili odvojeno) sa dodatnim tretmanom, kao što je zračenje, hemoterapija (npr. primena kamptotecina (CPT-11), 5-fluorouracila (5-FU), cisplatina, doksorubicina, irinotekana, paklitaksela, gemcitabina, cisplatina, paklitaksela, karboplatinpaklitaksela (Taxol), doksorubicina, 5-fu, ili kamptotecin apo21/TRAIL (6X combo)), jednim ili više inhibitora proteazoma (npr. bortezomib ili MG132), jednim ili više Bcl-2 inhibitora (npr. BH3I-2' (bcl-xl inhibitor), inhibitor indoleamin dioksigenaze-1 (npr. INCB24360, indoksimod, NLG-919, ili F001287), AT-101 (R-(-)-gosipol derivat), ABT-263 (mali molekul), GX-15-070 (obatoklaks), ili MCL-1 (protein-1 diferencijacije mijeloidnih leukemijskih ćelija) antagonistima), iAP (inhibitorski protein apoptoze) antagonistima (npr. smac7, smac4, sitnomolekulski smac mimetik, sintetski smac peptidi (videti Fulda i ostali, Nat Med 2002;8:808-15), ISIS23722 (LY2181308), ili AEG-35156 (GEM-640)), HDAC (histon deacetilaza) inhibitorima, anti-CD20 antitelima (npr. rituksimab), inhibitorima angiogeneze (npr. bevacizumab), anti-angiogenim agensima koji ciljaju VEGF i VEGFR (npr. Avastin), sintetskim triterpenoidima (videti Hyer i ostali, Cancer Research 2005;65:4799-808), c-FLIP (celularni FLICE-inhibitorni protein) modulatorima (npr. prirodni i sintetski ligandi za PPARy (peroksizom proliferatorom aktivirani receptor γ), 5809354 ili 5569100), inhibitorima kinaze (npr. Sorafenib), Trastuzumab, Cetuksimab, Temsirolimus, mTOR inhibitorima kao što su rapamicin i temsirolimus, Bortezomibom, JAK2 inhibitorima, HSP90 inhibitorima, PI3K-AKT inhibitorima, Lenalildomidom, GSK3β inhibitorima, IAP inhibitorima i/ili genotoksičnim lekovima.

[0516] Anti-OX40 antitela i kombinovane terapije antitelima opisane ovde mogu dalje da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više antiproliferativnih citotoksičnih agenasa. Klase jedinjenja koja se mogu koristiti kao antiproliferativni citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:

Alkilujuće agense (uključujući, bez ograničenja, azotne iperite, derivate etilenimina, alkil sulfonate, nitrozouree i triazene): Uracil iperit, hlormetin, ciklofosfamid (CITOKSAN™) fosfamid, Melfalan, Hlorambucil, Pipobroman, Trietilenmelamin, Trietilentiofosforamin, Busulfan, Karmustin, Lomustin, Streptozocin, Dakarbazin i Temozolomid.

[0517] Antimetaboliti (uključujući, bez ograničenja, antagoniste folne kiseline, analoge pirimidina, analoge purina i inhibitore adenozin deaminaze): metotreksat, 5-fluorouracil, floksuridin, citarabin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, fludarabin fosfat, pentostatin i gemcitabin.

[0518] Pogodni anti-proliferativni agensi za kombinovanje sa anti-OX40 antitelima, bez ograničenja, taksani, paklitaksel (paklitaksel je komercijalno dostupan kao TAXOL<™>), docetaksel, diskodermolid (DDM), diktiostatin (DCT), Peloruzid A, epotiloni, epotilon A, epotilon B, epotilon C, epotilon D, epotilon E, epotilon F, furanoepotilon D, dezoksiepotilon Bl, [17]-dehidrodezoksiepotilon B, [18]dehidrodezoksiepotiloni B, C12,13-ciklopropil-epotilon A, C6-C8 premošćeni epotilon A, trans-9,10-dehidroepotilon D, cis-9,10- dehidroepotilon D, 16-desmetilepotilon B, epotilonB10, diskoderomolid, patupilon (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (Diskodermolid), TZT-1027 (soblidotin), ILX-651 (tasidotin hidrohlorid), Halihondrin B, Eribulin mesilat (E-7389), Hemiasterlin (HTI-286), E-7974, Cyrptophycins, LY-355703, Majtansinoid imunokonjugati (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobin, 17betaacetoksi-2-etoksi-6-okso-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciklostreptin, izolaulimalid, laulimalid, 4-epi-7-dehidroksi-14,16-didemetil-(+)-diskodermolidi, i kriptotilon 1, dodatno ostalim mikrotubulin stabilizujućim agensima poznatim u oblasti.

[0519] U slučajevima kada je poželjno da se aberantno proliferativne ćelije dovedu u stanje mirovanja u vezi sa ili pre tretmana sa anti-OX40 antitelom, hormonima i steroidima (uključujući sintetičke analoge), kao što su 17a-etinilestradiol, dietilstilbestrol, testosteron, prednizon, fluoksimesteron, dromostanolon propionat, testolakton, megestrolacetat, metilprednizolon, metiltestosteron, prednizolon, triamcinolon, hlorotrianizen, hidroksiprogesteron, aminoglutetimid, estramustin, medroksiprogesteronacetat, leuprolid, flutamid, toremifen, ZOLADEX<™>, takođe se može primeniti pacijentu. Kada se koriste postupci ili kompozicije opisane ovde, drugi agensi koji se koriste u modulaciji rasta tumora ili metastaza u kliničkom okruženju, kao što su antimimetici, takođe se mogu administrirati po želji.

[0520] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira u kombinaciji (istovremeno ili odvojeno) sa nivolumabom da se leči pacijent sa kancerom, na primer, kolorektalnim ili kancerom mokraćne bešike.

[0521] U određenim tehničkim rešenjima, anti-OX40 antitelo se administrira u kombinaciji (istovremeno ili odvojeno) sa ipilimumabom da se leči pacijent sa kancerom, na primer, kancerom jajnika, mokraćne bešike, ili prostate.

[0522] Stručnjacima su poznati postupci za bezbednu i efikasnu administraciju hemoterapijskih agenasa. Pored toga, njihova primena je opisana u standardnoj literaturi. Na primer, primena mnogih hemoterapijskih agenasa je opisana u Physicians' Desk Reference (PDR), npr. izdanje iz 1996. (Medical Economics Company, Montvale, N.J.07645-1742, SAD).

Hemoterapijski agens(i) i/ili terapija zračenjem se mogu primeniti u skladu sa terapijskim protokolima koji su dobro poznati u tehnici. Stručnjacima će biti očigledno da primena hemoterapijskog (hemoterapijskih) agensa (agenasa) i/ili terapije zračenjem može da varira u zavisnosti od bolesti koja se leči i poznatih efekata hemoterapijskog (hemoterapijskih) agensa (agenasa) i/ili terapije zračenjem na tu bolest. Takođe, u skladu sa znanjem kvalifikovanog kliničara, terapijski protokoli (npr. količine doziranja i vremena administracije) mogu da variraju u pogledu uočenih efekata administriranih terapijskih agenasa na pacijenta, kao i u pogledu uočenih odgovora bolesti na administrirane terapijske agense.

[0523] Predmetna objava je dalje ilustrovana pomoću sledećih primera, koji ne treba da se smatraju kao dodatno ograničavajući.

XVII. Kompleti i jedinični dozni oblici

[0524] Ovde su takođe obezbeđeni kompleti, ali za koje se ne traži zaštita, koji uključuju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-OX40 antitelo i anti-PD-1 (npr. nivolumab) ili anti-CTLA-4 (ipilimumab) antitelo, i farmaceutski prihvatljiv nosač, u terapijski efikasnoj količini prilagođenoj za primenu u prethodnim postupcima. Kompleti opciono takođe mogu da sadrže uputstva, na primer, koja sadrže raspored administriranja, kako bi se omogućilo lekaru (npr. lekaru, medicinskoj sestri ili pacijentu) da daju kompoziciju sadržanu u tome da daju kompoziciju pacijentu koji boluje od kancera (npr. solidnog tumora). Komplet takođe može uključivati špric.

[0525] Opciono, kompleti obuhvataju višestruka pakovanja farmaceutskih kompozicija sa jednom dozom, od kojih svaki sadrži efikasnu količinu anti-OX40 antitela ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela za jednokratnu administraciju u skladu sa gore navedenim postupcima. Instrumenti ili uređaji neophodni za administriranje farmaceutske(ih) kompozicije(a) takođe mogu biti uključeni u komplete. Na primer, komplet može da obezbedi jedan ili više unapred napunjenih špriceva koji sadrže određenu količinu anti-OX40 antitela ili anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitela.

[0526] U jednom slučaju, predmetna objava obezbeđuje komplet za lečenje solidnog tumora kod humanog pacijenta, komplet koji sadrži dozu anti-OX40 antitela koje sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 318, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 94, i uputstva za upotrebu u postupcima opisanim ovde. U određenim tehničkim rešenjima, komplet dalje sadrži (a) dozu anti-PD-1 antitela koje sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 301, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 302, ili (b) dozu anti-CTLA-4 antitela koje sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca koji imaju sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 309, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca koji imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 310.

PRIMERI

[0527] Antitela iz pronalaska za koji se traži zaštita su označena "OX40.21" u sledećem opisu slika. Antitela drugačija od onih za koje se traži zaštita su stavljena na uvid javnosti ispod u svrhe referenci za potpuno razumevanje pronalaska

Primer 1: Stvaranje anti-OX40 antitela

[0528] Human anti-OX40 monoklonska antitela se generišu u Hco7 , Hco12, Hco17, i Hco38 sojevima HuMAb<®>transgenih miševa ("HuMAb" je žig od Medarex-a, Inc. Prinston, Nju Džersi) i KM miševa (soj KM Mouse<®>sadrži SC20 transhromozom kao što je opisano u PCT objavi WO 02/43478) primenom rekombinantnog heksahistidin-OX40 antigena.

[0529] Ukupno 52 miša, uključujući 5 genotipova trensgenih miševa (KM, Hco7, Hco12, Hco17, i Hco38), su imunizovani različitim imunizacionim strategijama. Imunogen je huOX40-6xhis pripremljen interno i korišćen pri 2.0 mg/mL za ukupnu dozu od 20 µg po mišu. Putevi administracije uključuju: injekciju u bazu repa, imunizaciju u skočni zglob, intraperitonealnu (ip) i subkutanu (sc) injekciju, i adjuvans (Ribi, kat. br. S6322, Sigma). 27 fuzija iz 30 miševa je izvedeno i snimano. 541 ELISA antigen pozitivnih antitela je identifikovano iz ovih 27 fuzija, i dalja karakterizacija je vodila izolaciji antitela od posebnog interesa, uključujući antitela označena kao 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3 (takođe nazivana OX40.17), 14A2-1, 14A2-2, i 20C1. Njihove aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona i izotip su prikazani na slikama 1-9. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 3F4 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 17 i 18. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 14B6-1 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 28 i 29. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 14B6-2 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 28 i 30. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 23H3 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 37 i 38. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 6E1-1 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 48 i 49. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 6E1-2 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 48 i 50. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 18E9 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 57 i 58. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 8B11 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 65 i 66. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 20B3 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 73 i 74. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 14A2-1 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 84 i 85. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 14A2-2 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 84 i 86. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca od 20C1 se sastoje od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93 i 94.

[0530] cDNK sekvenciranje je identifikovalo jedan težak i jedan lak lanac za svako od antitela 3F4, 23H3, 18E9, 8B11, 20B3 (takođe nazivano OX40.17) i 20C1, i jedan težak lanac i dva laka lanca (laki lanac 1 ili "L1" i laki lanac 2 ili "L2") za svako od antitela 14B6, 14A2 i 6E1. Pomoću analize proteina, jedan laki lanac je identifikovan za antitela 14B6, 6E1 i 14A2, i N-terminalno sekvenciranje i određivanje molekularne mase je naznačilo da je to bio laki lanac L1 za 14B6 i 14A2 i laki lanac L2 za 6E1. Antitela 14B6-1 i 14B6-2 odgovaraju antitelu 14B6 sa lakim lancem L1 i L2, redom. Antitela 14A2-1 i 14A2-2 odgovaraju antitelu 14A2 sa lakim lancem L1 i L2, redom. Antitela 6E1-1 i 6E1-2 odgovaraju antitelu 6E1 sa lakim lancem L1 i L2, redom. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence svakog od lakih lanaca 3 antitela su obezbeđene u tabeli 23.

[0531] Za neka od gorenavedenih antitela, supstitucije u parentalnom antitelu su učinjene u HCDR2 da bi se uklonilo prisustvo izomerizacionog mesta (DG), i supstitucije okvira (usled izvođenja iz DP44 germinativne linije) su uvedene da bi okvir više ličio na uobičajeno eksprimirano antitelo. Za antitela zasnovana na 20C1, tri dodatna neuobičajena ostatka okvira su vraćena u germinativnu liniju (A2V, D24G, i G82bS). Reverzija G82bS okvira takođe eliminiše mesto deamidacije (NG). Rezime raznih supstitucija uvedenih u sekvence osnovnog hibridnog klona je dat u tabeli 6.

Tabela 6.

Primer 2: Vezivanje anti-OX40 antitela za aktivirane primarne humane T ćelije

[0532] Humana monoklonska anti-OX40 antitela generisana u primeru 1 su ispitana na sposobnost vezivanja za aktivirane primarne humane T ćelije.

[0533] Ćelije su aktivirane nekoliko dana pre testa vezivanja da bi se indukovalo OX40 eksprimiranje. Ukratko, PBMC su kultivisane tokom tri ili četiri dana sa magnetnim zrncima obloženim anti-humanim CD3 plus anti-humanim CD28, u prisustvu rekombinantnog humanog IL-2. Na dan testa, zrnca su uklonjena i ćelije su obojene titracijom svakog anti-OX40 antitela. Vezana antitela su detektovana fluorescentno konjugovanim anti-humanim IgG poliklonskim sekundarnim antitelom, i ćelije su zajedno obojene za CD4 i CD25 da se detektuju aktivirane CD4 T ćelije. Intenzitet fluorescencije bojenja je meren primenom FACSCanto II protočnog citometra (Becton Dickinson). Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (GMFI - geometric mean fluorescence intensity) ili medijana intenziteta fluorescencije (MedFI - median fluorescence intensity) bojenja anti-OX40 antitela je izračunata za CD4+CD25+ populaciju (FACSDiva softver). EC50za vezivanje antitela su izračunate primenom GraphPad Prism softvera.

[0534] Kao što je prikazano na slici11A, anti-OX40 antitela vezana za aktivirane primarne humane T ćelije sa subnanomolarnim EC50. Naročito, OX40.5 je pokazalo najniže ispitano vezivanje anti-OX40 antitela. Isti eksperiment je izveden sa anti-OX40 antitelima sa supstitucijama varijabilnog regiona. Početni eksperimenti su izvedeni primenom antitela u obliku supernatanata iz kultura ćelija domaćina transfektovanih sa ekspresionim vektorima rekombinantnog antitela. Kao što je prikazano na slici 11B, određene supstitucije izazvale su značajni gubitak vezivanja, naime za antitela OX40.7, OX40.9, OX40.14 i OX40.15. Skup antitela sa supstitucijama varijabilnog regiona je analiziran dalje primenom materijala prečišćenog antitela.

[0535] Kao što je prikazano na slikama 11C i 11D, sva ispitana antitela vezana sa subnanomolarnim EC50za OX40, izuzev za OX40.18, koje je prikazalo niže vezivanje od 3F4 hibridomskog parentalnog klona. OX40.5 je prikazalo najniže vezivanje među spiskom ispitanih antitela na slici 11B, dok je OX40.1 prikazalo najniže vezivanje među spiskom ispitanih antitela na slici 11C. Rezime EC50vrednosti je predstavljen u tabeli 7 ispod.

Tabela 7: EC50za vezivanje OX40 antitela za aktivirane humane primarne T ćelije.

Primer 3: Vezivanje anti-OX-40 antitela za aktivirane primarno cinomolgus makaka T ćelije

[0536] Humana monoklonska anti-OX-40 antitela koja su ispitana na vezivanje za aktivirane primarno humane T ćelije u primeru 1 su ispitane na sposobnost da se vezuju za aktivirane primarno cinomolgus makaka T ćelije.

[0537] Ukratko, ćelije su aktivirane nekoliko dana pre testa vezivanja da bi se indukovalo eksprimiranje OX40. Ukupni leukociti su izolovani iz periferne krvi cinomolgus makaka lizom crvenih krvnih zrnaca korišćenjem pufera amonijum hlorida. Leukociti su zatim kultivisani četiri do pet dana u posudama prethodno obloženim anti-humanim CD3 plus anti-humanim CD28 antitelima koja unakrsno reaguju sa cinomolgusnim makaka, u prisustvu rekombinantnog humanog IL-2, kako bi se proširili i aktivirali T ćelije. Na dan testa, ćelije su sakupljene i obojene titracijom svakog anti-OX40 antitela. Vezana antitela su otkrivena fluorescentno konjugovanim anti-humanim IgG poliklonskim sekundarnim antitelom, a ćelije su obojene zajedno za CD4 i CD25 da bi se otkrile aktivirane CD4 T ćelije. Intenzitet fluorescencije bojenja je meren korišćenjem FACSCanto II protočnog citometra (Becton Dickinson). Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (GMFI) ili medijana intenziteta fluorescencije (MedFI) bojenja anti-OX40 antitela izračunata je za CD4+CD25+ populaciju (softver FACSDiva). Generisane su krive doza-odgovor i EC50za vezivanje antitela su izračunate korišćenjem GraphPad Prism softvera.

[0538] Kao što je prikazano na slikama 12A i 12B, ispitana anti-OX40 antitela vezana sa visokom potencijom za aktivirane cinomolgus makaka CD4 T ćelije, sa EC50koji se kreću od 0.068 nM (20C1) do 1.4 nM (20B3).18E9 i 20B3 vezani sa EC50između 1 i 1.5 nM, dok su preostala antitela vezana sa EC50ispod 1 nM. OX40.1 je prikazalo najniže vezivanje među ispitanim anti-OX40 antitelima na slici 12A, a OX40.5 je prikazalo najniže vezivanje među ispitanim anti-OX40 antitelima na slici 12B. Isti eksperiment je izveden sa anti-OX40 antitelima sa supstitucijama varijabilnog regiona. Kao što je prikazano na slici 12C, OX40.6, OX40.8 i OX40.21 antitela su prikazala najvišu potenciju vezivanja, sa EC50od 0.12 nM ili nižim. OX40.1 je prikazalo mnogo niže vezivanje za cinomolgus makaka CD4 T ćelije. Otkriveno je da nema vezivanja OX40.21 antitela na aktivirane mišje ili pacovske CD4+ T ćelije. Rezime EC50vrednosti je predstavljen u tabeli 8 ispod.

Tabela 8:

Primer 4: Scatchard-ova analiza vezivanja anti-OX40 antitela za aktivirane primarne T ćelije i ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani i OX40 cinomolgus majmuna

[0539] Vezivanje OX40.21 (IgG1 izotip) za aktivirane humane T ćelije je dalje procenjeno primenom Scatchard-ove analize. Ukratko, OX40.21 je tretiran radioaktivnim jodom sa<125>I-Na (1mCi; PerkinElmer katalog NEZ033H001 MC) primenom IODO-GEN<®>reagensa za jodiranje u čvrstoj fazi (1,3,4,6-tetrahloro-3a-6a-difenilglikouril; Pierce katalog 28601). Aktivirane humane CD4+ T ćelije su izolovane iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), Donor W-326470, nabavljenih od Stanford banke krvi. CD4+ T ćelije su izolovane negativnom selekcijom (RosetteSep<™>koktel za obogaćivanje humanim CD4+ T ćelijama, StemCell Technologies katalog 15062) i zamrznute. Izolovane CD4+ T ćelije su aktivirane za četiri dana pre testa vezivanja kako bi se indukovalo OX40 eksprimiranje, kako sledi. Odmrznute ćelije su kultivisane tokom četiri dana sa magnetnim zrncima obloženim anti-humanim CD3 plus anti-humanim CD28 (humani T-ekspander CD3/CD28 Dynabeads, Invitrogen katalog 111.41D), pri 1:1 odnosu zrnce ćelija, u prisustvu 200 IU/mL rekombinantnog humanog IL-2 (Peprotech katalog 200-02).

[0540] Vezivanje radiojodiranog OX40.21 IgG1 za aktivirane humane T ćelije je prikazano inkubiranjem aktiviranih humanih T ćelija sa titracijom<125>I_OX40.21 IgG1. Nespecifično vezivanje je određeno vezivanjem u prisustvu titracije 100 – strukog molarnog viška neobeleženog antitela i oduzeto je od ukupnog CPM da se izračuna specifično vezivanje. Linearna standardna kriva<125>I_OX40.21 IgG1 koncentracije naspram CPM je primenjena da se ekstrapolira specifična aktivnost, maksimalno nM vezanog<125>I_OX40.21 IgG1 i tako izračuna broj receptora po ćeliji.

[0541] Kao što je prikazano u tabeli 9 i slici 13A, vezivanje OX40.21 IgG1 koje se može zasititi je primećeno na aktiviranim humanim T ćelijama koje endogeno eksprimiraju OX40, sa KDod 0.05 nM za svaka dva donora T ćelija.

Tabela 9. Vezivanje<125>I-OX40.21 za aktivirane humane T ćelije

[0542] Isti test je izveden primenom HEK293 ćelija koje prekomerno eksprimiraju humani OX40 ("hOX40-293"). Ukratko, vezivanje radiojodiranog OX40.21 za prekomerno eksprimiran humani OX40 je demonstrirano inkubiranjem hOX40-293 ćelija sa titracijom<125>I_OX40.21. Nespecifično vezivanje je određeno vezivanjem u prisustvu titracije 100 – strukog molarnog viška neobeleženog antitela i oduzeto je od ukupnog CPM da se izračuna specifično vezivanje. Linearna standardna kriva<125>I_OX40.21 koncentracije naspram CPM je primenjena da se ekstrapolira maksimalno nM vezanog<125>I_OX40.21 i time izračunaju brojevi receptora po ćeliji. Kao što je prikazano na slici 13B i Tabeli 10, vezivanje OX40.21 IgG1 koje se može zasititi je primenjeno za vezivanje za OX40 eksprimiran na hOX40-293 ćelijama. Prosečna KDza vezivanje iz dva uslova testiranja koristeći različite brojeve hOX40-293 ćelija po uzorku je bila 0.22 nM.

Tabela 10: OX40.21 Vezivanje za hOX40-293 ćelije

[0543] Isti test je izveden primenom CHO ćelija koje prekomerno eksprimiraju OX40 cinomolgus majmuna ("cinoOX40-CHO"). Ukratko, vezivanje radiojodiranog OX40.21 za cinomologusni OX40 je prikazano inkubiranjem cinoOX40-CHO ćelija sa titracijom<125>I_OX40.21. Nespecifično vezivanje je određeno vezivanjem u prisustvu titracije 100 – strukog molarnog viška neobeleženog antitela i oduzeto je od ukupnog CPM da se izračuna specifično vezivanje. Linearna standardna kriva<125>I_OX40.21 koncentracije naspram CPM je korišćena da se ekstrapolira maksimalno nM vezanog<125>I-OX40.21 i tako izračunaju brojevi receptora po ćeliji. Kao što je prikazano na slici 13C i Tabeli 11, vezivanje OX40.21 IgG1 koje se može zasititi je primećeno za vezivanje za cinomologusni OX40 eksprimiran na cinoOX40-CHO ćelijama. Prosečna KDza vezivanje iz dva uslova ispitivanja primenjujući različite brojeve ćelija po uzorku je bila 0.63 nM.

Tabela 11: OX40.21 Vezivanje za cinoOX40-CHO ćelije

Primer 5: Specifično vezivanje anti-OX40 antitela za limfocite

[0544] Specifičnost raznih OX40 antitela je ispitana na panelu od 22 tipa normalnog humanog tkiva, uključujući slezinu, krajnike, timus, veliki mozak, mali mozak, srce, jetru, pluća, bubreg, pankreas, hipofizu, periferne nerve, želudac, debelo crevo, tanko crevo, štitnu žlezdu, kožu, skeletni mišić, prostatu, matericu, testise, i placentu imunohistohemijom.

[0545] Sveža, zamrznuta i/ili OCT-usađena humana tkiva su nabavljena od raznih dobavljača/prodavaca (Asterand Inc. Detroit, MI; Cooperative Human Tissue Network, Filadelfija, PA; ProteoGenex Inc, Culver City, CA). Da bi se detektovalo vezivanje za tkivo, niz anti-OX40 antitela (OX40.6-FITC, OX40.8-FITC, 6E1-FITC, OX40.16-FITC, OX40.17-FITC, OX40.20-FITC, i OX40.21-FITC) je reagovao sa fluoresceinom i nanet na acetonom fiksirane kriostat sekcije, što je praćeno anti-FITC premošćavajućim antitelom i vizuelizacijom EnVision+ sistemom. Nespecifičan humani IgG1 tretiran fluoresceinom je korišćen kao izotipsko kontrolno antitelo. HT1080 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani OX40 (HT1080/huOX40) i hiperplazične sekcije tkiva humanog krajnika su korišćene kao pozitivne kontrolne ćelije i tkiva. Da bi se utvrdilo da li FITC konjugacija ima bilo kakav uticaj na svojstva vezivanja, i FITC-konjugovana i nekonjugovana anti-OX40 antitela su upoređena u HT1080/huOX40 ćelijama primenom anti-huIgG kao premošćavajućeg antitela. Obojena predmetna stakla su procenjena pod svetlosnim mikroskopom.

[0546] Inicijalni testovi su otkrili da oba i nekonjugovana i FITC-konjugovana anti-OX40 antitela specifično boje citoplazmu i membranu humanih OX40 transfektovanih ćelija ali ne parentalnih HT1080 ćelija. Nije bilo razlike između nekonjugovanih i FITC-konjugovanih anti-OX40 antitela. Ovi rezultati sugerišu da su antitela bila pogodna za imunohistohemijske analize i da FITC konjugacija nema uticaja na svojstva vezivanja tkiva.

[0547] Sva testirana anti-OX40 antitela su pokazala pozitivno bojenje u maloj podskupini, bilo kao rasute ili male grupe, mononuklearnih ćelija (MNC) u limfoidnim tkivima (krajnici, slezina i timus) i tkivima bogatim limfoidima (debelo crevo, želudac i tanka creva), kao i nekoliko rasutih MNC u više tkiva (pluća, koža i štitna žlezda). Na osnovu morfologije, ove pozitivne ćelije su prvenstveno limfociti.

[0548] Pored bojenja podskupa limfocita, antitelo OX40.6, blokator liganda, pokazalo je snažno bojenje u podskupovima endotelnog/subendotelnog matriksa i intersticijalnih elemenata, koji su češće povezani sa malim arterijama i adventicijom suda i okolnih vezivnih tkiva, u praktično sva pregledana tkiva (slika 14A), kao i specijalizovani elementi intersticijalnog tkiva kao što je intersticijum nalik sloju koji okružuje semeni kanalić u testisu. Antitelo OX40.8, koje nije blokator liganda, pozitivno je obeležene strukture slične miofilamentima u srčanim mišićima srca (slika 14A) i mezangijalnim ćelijama u glomerulu bubrega. Bojenje drugim ligandnim neblokatorom, odnosno antitelom 6E1, takođe je otkrilo bojenje u ćelijama srčanog mišića, kao i u neuronima i neuropilima velikog i malog mozga i podskupu epitelnih ćelija tubula u bubregu. Generalno, bojenje nelimfocita je detektovano samo kada su antitela korišćena u relativno visokim koncentracijama (3 ili 5 µg/ml), ali ne i u nižim koncentracijama (1 µg/ml), što sugeriše na vezivanje niskog afiniteta ili potencijalno vezivanje van cilja (eng. off-target binding - vezivanje sa isključenim ciljem).

[0549] Dalja ispitivanja drugih antitela koja blokiraju ligand, OX40.16 (Slika 14A) i OX40.17, otkrila su jasno bojenje podskupa limfocita, bez specifičnog bojenja drugih elemenata tkiva za sva pregledana tkiva. Antitelo OX40.21, varijanta antitela OX40.16, imalo je sličan obrazac vezivanja kao antitelo OX40.16 (Slika 14B). Imunohistohemija na sličnom panelu normalnih tkiva cinomolgusa otkrila je veoma sličan obrazac bojenja kao kod ljudi, demonstrirajući korisnost cinomolgus majmuna kao relevantne pretkliničke vrste.

Primer 6: Eksprimiranje OX40 u kancerima

[0550] FFPE (formalinom fiksirani u parafin ugrađeni) uzorci tkiva tumora kupljeni su od komercijalnih prodavaca tkiva (n=12-20 za svaki tip tumora). Da bi se otkrilo vezivanje za tkiva, razvijen je automatizovani IHC test sa komercijalnim anti-humanim OX40 antitelom koristeći Leica BondRX platformu. Ukratko, pronalaženje antigena izazvano toplotom (HIER - heatinduced antigen retrieval) je izvedeno u pH9 ER2 puferu (Leica) tokom 20 minuta na 95°C. Klon ACT35 mišjeg anti-humanog OX40 monoklonskog antitela (BD Pharmingen) je inkubiran pri 5 ug/ml tokom 60 minuta, praćeno Novolink Max polimerom (Leica) tokom 30 minuta. Konačno, predmetna stakla su reagovala sa rastvorom DAB supstrata i hromogena tokom 6 minuta, obojena Mayer-ovim hematoksilinom, dehidrirana, očišćena i prekrivena Permount-om. Dako proteinski blok je korišćen kao razblaživač za primarno antitelo.

[0551] Za profilisanje TIL-ova, komercijalno dostupna monoklonska antitela anti-CD3 (marker T ćelija) i anti-FoxP3 (Treg marker) korišćena su za bojenje susednih odeljaka. Komercijalni mišji IgG1 je korišćen kao negativna kontrola, a hiperplazično ljudsko tkivo krajnika je korišćeno kao pozitivna kontrola. Nakon imunološkog bojenja, predmetna stakla su ručno procenjena i ocenjena pod svetlosnim mikroskopom.

[0552] U četiri ispitivana tipa tumora, CD3+ TIL su bili prisutni u svim ispitivanim uzorcima, sa količinom TIL-ova koja je varirala u različitim uzorcima, a distribucija unutar istog tkiva bila je heterogena. U nekim slučajevima, TIL su bili značajnije raspoređeni u prostoru sučelja tumora i domaćina, kao što se očekivalo. Većina TIL je lokalizovana u stromi tumora u ogromnoj većini uzoraka tkiva. Međutim, u mnogim slučajevima su se lako nalazili u intratumoralnim gnezdima. Pozitivno bojenje OX40 primećeno je u maloj frakciji TIL-ova i primarno raspoređeno u stromi tumora. Uopšteno govoreći, obilje OX40+ TIL-ova je bilo proporcionalno broju CD3+ TIL-ova. Među četiri ispitana tipa tumora, OX40+ TIL su bili zastupljeniji u HCC i CRC (Slike 15A-15C).

Primer 7: Humana monoklonska anti-OX40 antitela koja blokiraju vezivanje OX-40L za OX-40

[0553] Nekoliko anti-OX40 antitela je ispitano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje rekombinantnog rastvorljivog OX40L za humane OX40-transfektovane 293 ćelije. Ukratko, 293 ćelije stabilno transfektovane humanim OX40 su prvo prethodno inkubirane sa raznim koncentracijama anti-OX40 antitela. Fiksna koncentracija (0.2 µg/mL) rekombinantnog rastvorljivog his-obeleženog humanog OX40L (OX40L-His, R & D Systems) je zatim dodata i uzorci su dalje inkubirani. Nakon pranja ćelija, vezani OX40L-His je detektovan primenom internog APC-obeleženog anti-His ciljnog antitela. Intenzitet fluorescencije bojenja je izmeren primenom FACSCanto II protočnog citometra (Becton Dickinson). Izračunata je geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (GMFI) APC-anti-His ciljno antitelo/OX40L-His bojenja za populaciju ćelija (FACSDiva softver). Krive doza odgovor su generisane i EC50za blokiranje antitelom vezivanja OX40L su izračunate primenom GraphPad Prism softvera; EC50su prikazane u tabeli 12.

Tabela 12. EC50 vrednosti za blokiranje OX40L/OX40 interakcije kao što je izmereno pomoću

FACS.

[0554] Kao što je prikazano na slici 16, većina testiranih anti-OX40 antitela u potpunosti je blokirala vezivanje rastvorljivog humanog OX40L za humani OX40 na površini transfektovanih ćelija, sa izuzetkom 6E1, OX40.4 i OX40.5. Nepotpuno blokiranje od strane OX40.5 može biti posledica niže snage vezivanja za humani OX40 u odnosu na druga testirana antitela ili vezivanja za preklapajući ali drugačiji epitop. Nasuprot tome, 6E1 i OX40.4 nisu blokirali vezivanje humanog OX-40L za OX40. Ovaj nedostatak blokiranja je verovatno zbog vezivanja za drugačiji epitop od preostalih antitela.

Primer 8: Kompeticija/sortiranje antitela

[0555] Eksperimenti sortiranja antitela su izvedeni na sledeći način. Jedno ili više anti-OX40 antitela je obloženo direktno na Biacore CM5 čipu primenom hemije spajanja amina. Anti-OX40 antitela, serijski razblažena (1:3) od početne koncentracije od 60 µg/mL, inkubirana su sa 20 nM OX40-6X-His antigena najmanje 1 sat. Inkubirani kompleks je tekao preko površina spojenih sa antitelom i posmatrano je unakrsno blokiranje. Vežba je ponovljena sa nekoliko antitela na površini da bi se napravila mapa epitopa zasnovana na međusobnom unakrsnom blokiranju svih antitela. OX40L je takođe bio premazan na površini da bi se identifikovala i sortirala antitela koja su mogla da blokiraju interakciju OX40-OX40L. Eksperimenti su izvedeni na Biacore T200 ili Biacore 3000 SPR instrumentima.

[0556] Kao što je rezimirano na slici 17, antitela 20C1, 20B3, 8B11, 23H3, 18E9, 14B6, OX40.1, i OX40.2 su blokatori liganda; antitelo 3F4 je delimični ligand blokator; i 14A2, 6E1, i OX40.5 nisu blokatori liganda.

Primer 9: Biofizička svojstva OX40 antitela

[0557] Afinitet nekoliko OX40 antitela za rastvorljivi humani OX40 je testiran SPR analizom. Ukratko, merenja afiniteta su sprovedena hvatanjem 1-10 µg/mL odgovarajućeg antitela na CM5 čipu obloženom anti-humanim-CH1. Korišćen je humani-OX40-6XHIS antigen ili u jednoj koncentraciji od 400 nM ili u serijskom razblaženju 1:2 od 400 nM. Eksperimenti su sprovedeni na BIACORE® T200 ili BIACORE® 3000 SPR instrumentima. Podaci su bili prilagođeni modelu 1:1.

[0558] Kao što je prikazano u tabeli 13, testirana anti-OX40 antitela su imala konstante disocijacije (KDs) u rasponu od 10<-8>M do 10<-9>M.

Tabela 13: KDvrednosti za OX-40 antitela

[0559] Termička stabilnost antitela OX40.21 je takođe testirana, sa rezultatima sažetim u tabeli 14. Termičke stabilnosti su određene korišćenjem GE Healthcare CAP-DSC. Uzorci su pušteni pri koncentraciji od 250 µg/mL u PBS-u. Brzina skeniranja je bila 60 °C/h. Podaci su bili podešeni prema modelu koji nije sa 2 stanja. Utvrđeno je da je antitelo OX40.21 jedno od stabilnijih testiranih antitela kada se razmatraju zajedno sa drugim obeležjima (npr. niski efekti van cilja, imunogenost, itd.).

Tabela 14:

[0560] Farmakokinetika antitela OX40.21 nakon jednokratne intravenske doze cinomolgus majmunima je takođe testirana. Antitelo OX40.21 pokazalo je prihvatljiva farmakokinetička (PK) svojstva nakon jednokratne intravenske (IV) doze cinomolgus majmunima sa linearnom PK (0.4 do 4 mg/kg) i dugim terminalnim poluživotom (6 dana).

Tabela 15: Farmakokinetički parametri OX40.1 nakon intravenske administracije cinomolgus majmunima (N=3)

[0561] Ljudski PK parametri za OX40.21 projektovani su iz PK podataka cinomolgus majmuna korišćenjem alometrijskog skaliranja (pod pretpostavkom da je eksponent snage = 0.85 za CLT i 1 za Vss). Procenjeno ljudsko t1/2bilo je 10 dana (tabela 16). PK parametri su izračunati metodom sa dva odeljka.

Tabela 16: Procenjeni humani farmakokinetički parametri za OX40.21

Primer 10: FACS unakrsno blokiranje PE-obeleženog klona L106 anti-OX40 antitela panelom neobeleženih anti-OX40 antitela

[0562] Nekoliko anti-OX40 antitela je testirano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje PE-obeleženog klona L106 anti-OX40 antitela za humanim OX40-transfektovane ćelije 293. Ukratko, 293 ćelije, stabilno transfektovane sa humanim OX40, su prvo inkubirane sa različitim koncentracijama neobeleženih anti-OX40 antitela. Ćelije su zatim isprane i inkubirane sa fiksnom koncentracijom od 2.5 µg/mL PE-obeleženog L106 antitela (BD Biosciences). Intenzitet fluorescencije bojenja je meren korišćenjem FACSCanto II protočnog citometra (Becton Dickinson). Izračunata je geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (GMFI) bojenja PE-L106 antitela za ćelijsku populaciju (softver FACSDiva). Krive doza-odgovor za blokiranje vezivanja L106 su generisane korišćenjem softvera GraphPad Prism.

[0563] Kako je prikazano na slici 18, 18E9 i OX40.1 antitela su u potpunosti blokirala L106 vezivanje za humane OX40-transfektovane ćelije, dok je 20B3 prikazalo delimično blokiranje. Preostala antitela su prikazala malo ili odsustvo blokiranja, indikujući da se 18E9 i OX40.1 vezuju za drugi epitop na OX40 nego druga testirana antitela.

Primer 11: Analiza ukrštenog blokiranja anti-OX40 antitela

[0564] Ovaj eksperiment je izveden da bi se testirala svojstva unakrsnog blokiranja različitih anti-OX40 antitela da bi se procenile specifičnosti vezivanja. Ukratko, OX40 antitelo OX40.1 je konjugovano sa alofikocijaninom (APC), a ljudska OX40 antitela OX40.4 i OX40.5 su biotinilovana. Panel nekonjugovanih humanih OX40 antitela je primenjen u dozi na projektovane 293 ili HT1080 ćelijske linije koje prekomerno eksprimiraju humani OX40 protein na svojoj površini i dozvoljeno im je da se vežu na 4°C tokom 30 minuta. Bez ispiranja nekonjugovanog At, APC-OX40.1 (1 µg/mL), biotin-OX40.4 (0,4 µg/mL) ili biotin-OX40.5 (0,4 µg/mL) je primenjen na ispitne bunariće i ostavljeno je da se veže na 4°C tokom 30 min. Ćelije su isprane i po potrebi dalje inkubirane u prisustvu konjugata streptavidin-APC pod istim uslovima. Nakon završnog ispiranja, ćelije su analizirane na FACSCanto protočnom citometru (BD Bioscience, San Jose, CA). Signal srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) bio je proporcionalan vezanom konjugovanom antitelu.

[0565] Kao što je prikazano na slikama 19A-19C, vezivanje APC-OX40.1 za ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani OX-40 protein je blokirano pomoću OX40.2 i OX40.5, ali samo umereno, ukoliko uopšte, pomoću OX40.4. Vezivanje APC-OX40.1 je blokirano pomoću 8B11.H9, 3F4.G11, 20B3.G2, i 14B6.C5, ali ne pomoću 6E1.A12 i 14A2.B9. Dijagram primećenih odnosa vezivanja između antitela procenjenih na slikama 19A-19C je prikazan na slici 19H.

[0566] Slike 19D-19E prikazuju da je vezivanje biotin-OX40.4 snažno blokirano pomoću 20B3.G2, umereno blokirano pomoću 20C1.F2, slabo blokirano, ukoliko uopšte, pomoću 3F4.G11 i 23H3.C6, i nije bilo blokirano pomoću 14A2.B9. Vezivanje biotin-OX40.5 je bilo snažno blokirano pomoću 20B3.G2, 23H3.C6, i 20C1.F2, umereno blokirano pomoću 3F4.G11, i slabo blokirano pomoću 14A2.B9.

[0567] Slike 19F-19G prikazuju da vezivanje biotin-OX40.4 nije bilo blokirano pomoću OX40.1 ili OX40.8, i samo je slabo blokirano, ukoliko uopšte, pomoću OX40.5 ili OX40.6. Vezivanje biotin-OX40.5 je bilo blokirano pomoću OX40.1, umereno blokirano pomoću OX40.6, i samo je veoma slabo blokirano, ukoliko uopšte, pomoću OX40.4 ili OX40.6.

[0568] Dijagram primećenih odnosa vezivanje između At-a procenjenih na slikama 19D-19G je prikazan na slici 191.

Primer 12: Anti-OX40 antitela se vezuju za konfirmacioni epitop/mapiranje epitopa

[0569] Ovaj primer prikazuje da se OX40.21 vezuje za nedenaturisani humani OX40, ali ne za denaturisani humani OX40, i da na vezivanje ne utiče N-glikozilacija.

[0570] Vezivanje OX40.21 za nativni ili denaturisani OX40 koji ima N-povezanu glikozilaciju ili ne određeno je na sledeći način. Uzorci nativnog (tj. nedenaturisanog) i denaturisanog humanog OX40 su inkubirani sa ili bez enzima N-glikanaze PNGaze F da bi se uklonila N-glikozilacija. Uzorci nativnog humanog OX40 sa ili bez N-povezane glikozilacije podvrgnuti su SDS gel elektroforezi, a uzorci denaturisanog humanog OX40 sa ili bez N-povezane glikozilacije podvrgnuti su denaturišućoj SDS gel elektroforezi.

[0571] Kao što je prikazano na slici 20A, OX40.21 se vezuje samo za nativni OX40, a ne za denaturisani oblik, a prisustvo ili odsustvo glikozilacije ne utiče na vezivanje za OX40. Slike 20B i 20C pokazuju da su dva N-glikopeptida identifikovana mapiranjem peptida nakon deglikozilacije (60% zauzetosti i za AspN1 18 i za AspN12).

[0572] Ovi podaci sugerišu da se OX40.21 vezuje za epitop koji je konformacioni i nezavisan od N-povezane glikozilacije.

[0573] Studije mapiranja epitopa su takođe sprovedene korišćenjem masene spektrometrije. Peptidni fragmenti humanog OX40 označenog sa his ("hOX40") su generisani enzimskom digestijom sa endoproteinazama. LC-MS je izvedena korišćenjem AB Sciex 5600 Triple-TOF.

[0574] Kao što je prikazano na slikama 20D i 20E, eksperimenti vezivanja iz nativnog hOX40 pomoću ograničene proteolize otkrili su da se OX40.16 i OX40.21 vezuju većinski za peptid DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178), koji odgovara aminokiselinama 46-62 vanćelijskog dela zrelog humanog OX-40 (SEQ ID NO: 2). OX40.8 se vezuje za peptid DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179), koji odgovara aminokiselinama 89-124 vanćelijskog dela zrelog humanog OX40 (SEQ ID NO: 2). Lokacija epitopa vezanog pomoću OX40.21 se preklapa sa delom mesta vezivanja OX40 liganda kako je određeno kristalnom strukturom humanog OX40/OX40L kompleksa (Banka podataka proteina (PDB – Protein Data Bank) ID kod 2HEV). Dodatni peptidi identifikovani masenom spektrometrijom za OX40.21 su prikazani u gornjem panelu slike 20E, i uključuju QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184), SQNTVCRPCGPGFYN (SEQ ID NO: 185),

[0575] SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 182), i PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183).

Primer 13: Anti-OX-40 antitela pospešuju T ćelijsku proliferaciju i indukuju IFA-γ i IL-2 sekreciju iz T ćelija

[0576] Anti-OX-40 antitela su ispitana na njihovu sposobnost da indukuju T ćelijsku aktivnost in vitro merenjem proliferacije i količinu IL-2 i IFN- y koje luče T ćelije inkubirane sa antitelima.

[0577] Transfektovana CHO ćelijska linija je generisana za upotrebu kao ćelije koje predstavljaju veštački antigen u primarnom testu aktivacije T ćelija. Ćelijska linija CHO-CD3-CD32A eksprimira anti-humano CD3 antitelo u jednolančanom Fv formatu, zajedno sa humanim Fc receptorom CD32A da bi predstavila anti-OX40 antitela na površini CHO ćelije. Ukratko, humane primarne CD4 T ćelije su izolovane negativnom selekcijom (RosetteSep™, StemCell Technologies) i zajedno kultivisane sa ozračenim CHO-CD3-CD32A ćelijama u odnosu 8:1 T:CHO, u prisustvu stepenovanih doza anti-OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela. Posle 3 do 4 dana u kulturi na 37 °C, supernatanti su sakupljeni za procenu aktivacije T ćelija merenjem izlučenog humanog IFNγ bilo ELISA (BD Biosciences) bilo HTRF testom (Cisbio), u skladu sa preporukama proizvođača. Nakon toga, dodat je timidin sa tricijumom tokom poslednjih približno 18 sati kultivacije da bi se izmerila T proliferacija ugradnjom timidina sa tricijumom, kao dodatna procena aktivacije T ćelija.

[0578] Kao što je prikazano na slikama 21A-21D i 22A-22D (i sažeto u tabeli 17 ispod), većina ispitanih anti-OX40 antitela snažno potencira aktivaciju humanih CD4 T ćelija stimulisanu CHO-CD3-CD32 ćelijama, na način koji zavisi od doze, kao što je mereno proliferacijom i IFNγ sekrecijom. Panel antitela ispitanih u ovom testu kostimuliše aktivaciju T ćelija najmanje isto kao ili bolje od OX40.1, OX40.4 i OX40.5.

Tabela 17.

[0579] Anti-humana OX40 antitela su takođe ispitana na njihov efekat na stimulaciju primarnih T ćelija u kulturama mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC) aktiviranih stafilokokusnim enterotoksinom B (SEB). Ljudska puna krv je dobijena od AllCells, Inc. (Berkeley, Kalifornija) ili od donatora u Bristol-Myers Squibb, Redwood City, CA pod okriljem internog programa flebotomije. PBMC su izolovane gradijentnim prečišćavanjem na Ficoll-Hypaque jastučetu i kultivisane 3 dana u medijumu za kulturu sa dodatkom fiksnog, suboptimalnog (85 ng/mL) superantigena stafilokokus enterotoksina B (SEB; Toxin Technologies, Sarasota, FL) u prisustvu stepenovane doze OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela zajedno sa 2 - 5 µg/mL rastvorljivog ukrštajućeg antitela, F(ab')2 kozjeg anti-humanog Fcγ. Posle kultivisanja tokom 3 dana na 37 °C, supernatanti su sakupljeni za procenu aktivacije T ćelija pomoću ELISA merenja izlučenog humanog IL-2. Ukratko, supernatanti kulture su razblaženi 1:10 u razblaživaču uzorka i ispitani na prisustvo humanog IL-2 pomoću ELISA (BD Bioscience) prema protokolu koji preporučuje proizvođač. Nakon dodavanja TMB supstrata, test ploče su očitane na Spectramax 340PC čitaču korišćenjem Softmax operativnog softvera na talasnoj dužini od 650 nm. Izmerene optičke gustine hromogenog supstrata bile su proporcionalne sa vezanim detekcionim antitelom.

[0580] Podaci iz PBMC izolovanih od različitih donatora prikazani su na slikama 23A-23F. Uopšteno govoreći, rastvorljivo umreženi klon 20C1.F2 izazvao je robusniji citokinski odgovor (EC50od 1.3 – 2.0 nM) u poređenju sa rastvorljivo umreženim klonovima 23H3.C6, 8B11.H9, 3F4.G11, 18E61.G5A1, 18E61.G5. i 20B3.G2 (Slike 23A-23C). Što se tiče antitela sa mutacijama varijabilnog regiona, OX-40.21, generalno, izazvao je snažniji citokinski odgovor u poređenju sa rastvorljivo umreženim antitelima OX-40.17, OX40.18, OX40.6 i OX40.8 (Slike 23D-23F). Podaci ovih donatora zajedno sa podacima od 8 dodatnih donatora, u kojima su testirana dodatna anti-OX40 antitela, zajedno pokazuju da je OX40.21 u proseku pokazao superiornu moć u poboljšanju T ćelijskih odgovora u poređenju sa OX40.1, OX40.2, OX40.4, OX40.5, OX40.17 i OX40.18. Ovi rezultati dalje pokazuju da OX40.21 izaziva odgovore koji su uporedivi sa onima koje izazivaju OX40.6 i OX40.8 (Tabela 18).

Primer 14: Pospešivanje anti-OX40 antitelom NK92-posredovane ćelijske lize primenom ćelijskih linija

[0581] Nekoliko anti-humanih OX40 antitela je ispitano na njihovu sposobnost da pospeše lizu aktiviranih CD4<+>T ćelija, posredovanu NK92 ćelijama, primenom oslobađanja kalceina kao očitavanja. Ukratko, CD4<+>T ćelije za primenu kao ciljnih ćelija su razdvojene pomoću negativne selekcije primenom magnetnih zrnaca i aktivirane tokom 72 sata zrncima obloženim sa anti-CD3 i anti-CD28. Nakon tri dana, NK92 ćelije su postavljene na ploču sa aktiviranim CD4<+>ćelijama obeleženim kalceinom AM u odnosu 5 prema 1. Titracija svakog anti-OX40 antitela je dodata i ćelije su inkubirane tokom dva sata. Oslobađanje kalceina je izmereno očitavanjem intenziteta fluorescencije medijuma primenom Envision čitača ploča (Perkin Elmer). Procenat ćelijske lize zavisne od antitela je izračunat na osnovu srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) sa sledećom formulom: [(ispitana MFI – srednja vrednost pozadine)/(srednja vrednost maksimuma – srednja vrednost pozadine)] × 100.

[0582] Kao što je prikazano na slici 24, OX40.8 i OX40.16 su indukovali najvišu vrednost specifične lize ciljnih ćelija (60% i 30%, redom). EC50za OX40.8 je bila 16 ng/mL, a za OX40.16 je bila 4 ng/mL. Sva ostala ispitana antitela indukovala su ADCC na nivoima suviše niskim za tačnu kvantifikaciju.

Primer 15: Pospešivanje anti-OX40 antitelom NK-posredovane ćelijske lize primarnih humanih CD4+ T ćelija

[0583] Nekoliko anti-humanih OX40 antitela je testirano na njihovu sposobnost da promovišu primarnu lizu aktiviranih CD4<+>T ćelija posredovanu NK ćelijama. Ukratko, CD4<+>T ćelije za upotrebu kao ciljne ćelije su odvojene od PBMC iz dva donatora magnetnom selekcijom i aktivirane tokom 72 sata sa zrncima obloženim anti-CD3 i anti-CD28. NK ćelije, za upotrebu kao efektori, odvojene su od zasebnog donora negativnom selekcijom pomoću magnetnih zrnaca i aktivirane sa IL-2 tokom 24 sata. Nakon perioda aktivacije, NK efektorske ćelije su pomešane sa ciljnim T ćelijama obeleženim kalceinom u odnosu 20:1, 10:1 ili 5:1 u prisustvu antitela pri 1 µg/ml tokom 2 sata. Nivo kalceina koji oslobađaju lizirane ciljne ćelije je meren očitavanjem intenziteta fluorescencije medijuma korišćenjem Envision čitača ploča (Perkin Elmer). Procenat ćelijske lize zavisne od antitela izračunat je na osnovu srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) sledećom formulom:

[0584] Kao što je prikazano na slikama 25A i 25B, aktivirani CD4+ T ćelijski ciljevi iz dva donora su lizirani najefikasnije pomoću OX40.8. Niži nivoi ADCC aktivnosti su primećeni sa oba OX40.21 i OX40.1.

Primer 16: Pospešivanje OX40 antitelom ćelijske fagocitoze posredovane makrofagama OX40-eksprimirajućih HEK293 ćelija

[0585] Da bi se odredila antitelom posredovana fagocitna aktivnost nekoliko OX40 antitela, primarni humani makrofagi su kultivisani četiri sata sa HEK293/OX40 ćelijama obeleženim sa CellTrace Violet i titracijom anti-OX40 antitela. Posle četiri sata, ćelije su sakupljene, obojene sa anti-CD64-APC i stavljene na protočni citometar. Smatralo se da su ćelije koje su obojene dvostruko pozitivno na CD64 i CellTrace Violet fagocitozovane. Procenat fagocitiranih ciljnih ćelija je izračunat korišćenjem formule: 100 x (Broj dvostruko pozitivnih ćelija / Ukupan broj CellTrace Violet pozitivnih ćelija).

[0586] Kao što je prikazano na slici 26, sva testirana anti-OX40 antitela su indukovala fagocitozu ciljnih ćelija koje eksprimiraju OX40 na način zavisan od doze. OX40.8 je imao najviši ukupni nivo fagocitoze i najnižu EC50koncentraciju od 6.2 ng/mL. Ovo pokazuje da humana IgG1 anti-OX40 antitela indukuju fagocitozu posredovanu sa FcR na način koji zavisi od doze.

Primer 17: Anti-OX40 antitela vezuju C1q komponentu humanog komplementa

[0587] Kolorimetrijski ELISA test je razvijen da se proceni da li C1q komponenta humanog serumskog komplementa vezuje OX40.21 antitelo. Sva ispitana antitela su bila obložena na ploči sa visokom stopom vezivanja pri 10 µg/mL. Nakon blokiranja nezauzetih mesta vezivanja proteina, stepenovane doze humanog C1q (3.125-200 µM) su dodate u bunariće, uključujući blokirane prazne bunariće koji su služili kao kontrole za nespecifično pozadinsko vezivanje C1q za ploču za ispitivanje. Vezivanje C1q za imobilizovana antitela detektovano je kombinacijom biotinilovanog mišjeg anti-C1q antitela i streptavidin-poli-HRP, zajedno sa tetrametilbenzidinskim supstratom. Rezultati su prikazani kao optička gustina očitana na 450 nm minus 630 nm.

[0588] Kao što je prikazano na slici 27, C1q se vezuje za OX40.21 (puni kvadrati) i kontrolu izotipa humanog IgG1 (otvoreni krugovi) na način koji zavisi od doze. Međutim, nivo vezivanja C1q za OX40.21 bio je niži nego za humano IgG1 izotipsko kontrolno antitelo. Kao što se očekivalo, bilo je malo pozadinskog signala (sivi krugovi) i nije bilo očiglednog vezivanja C1q za IgG1.1 izotipsku kontrolu (puni crni krugovi). IgG1.1 antitelo sadrži pet mutacija u delu Fc dizajniranih da eliminišu C1q vezivanje i FcR interakciju. Ovaj rezultat pokazuje da C1q komponenta humanog serumskog komplementa može da se veže za OX40.21 i ukazuje da OX40.21 može indukovati komplementom posredovanu lizu ćelija koje eksprimiraju OX40 in vivo.

Primer 18: OX40 je eksprimiran u limfocitima koji infiltriraju tumor

[0589] OX-40 se eksprimira u limfocitima koji infiltriraju tumor, sa obrascem koji je generalno ograničen na CD4+ ćelije (slika 28A) sa minimalnom ekspresijom na CD8+ T ćelijama (slika 28B) kod kancera debelog creva, pluća i jajnika (slika 28C).

[0590] Slično, OX40 se eksprimira pomoću CD4+ T ćelija i Treg-ova kod mišjih Sa1N tumora (slika 28D) i mišjih MC38 tumora (slika 28E). Za ispitivanje eksprimiranja mišjeg OX-40 u tumorima, 2x10<6>SA1N ćelija sarkoma ili 2x10<6>MC38 ćelija je implantirano subkutano u AJ ili B6 miševe redom. Dana 15. nakon implantacije, tumori su sakupljeni, disocirani u jednoćelijske suspenzije i obojeni za protočnu citometriju. Populacije T ćelija su identifikovane na osnovu njihovog eksprimiranja CD8, CD4 i Foxp3. Za Sa1N tumore, CD4+ Foxp3+ ćelije iz tumora su prikazane crvenim histogramom, CD4+ Foxp4- ćelije su plavim histogramom, a CD8+ ćelije su narandžastim histogramom (Slika 28D). Obojene ćelije izotipske kontrole su u zelenom histogramu. Za MC38 tumore, Treg-ovi su prikazani plavim histogramom, CD4+ ćelije su prikazane zelenim histogramom i CD8+ ćelije crvenim histogramom (Slika 28E).

Primer 19: Poništavanje anti-OX40 antitelom supresije posredovane Treg ćelijama

[0591] Nekoliko anti-humanih OX40 antitela je ispitano na njihovu sposobnost da preokrenu supresiju proliferacije humanih CD4<+>T ćelija posredovanu regulatornim T (Treg) ćelijama. Ukratko, Treg i T responder (Tresp) ćelije su izolovane obogaćivanjem PBMC za CD4<+>ćelije odvajanjem magnetnim zrncima i zatim sortiranjem CD4<+>CD25<hi>CD127<lo>Treg i CD4<+>CD25<lo>CD127<hi>CD45RO<+>Tresp ćelija. Tresp ćelije su zatim obeležene bojom za proliferaciju i postavljene na ploču sa titrirajućim brojem Treg ćelija, počevši od odnosa 1:1. Kulture su stimulisane sa 3 µg/mL anti-CD3 vezanog za ploču, 1 µg/mL rastvorljivog anti-CD28 i 2 µg/mL anti-OX40 vezanog na ploču ili izotipskom kontrolom. Posle 96 sati, proliferacija Tresp ćelija je merena procenom razblaženja boje korišćenjem protočne citometrije.

[0592] Kao što je prikazano na slici 29, i u prisustvu i u odsustvu Treg ćelija, anti-OX40 antitela su povećala proliferaciju Tresp ćelija u poređenju sa izotipskom kontrolom. Ovo sugeriše da su ispitana anti-OX40 antitela preokrenula supresivne efekte Treg ćelija na proliferaciju Tresp ćelija.

Primer 20: Studije toksičnosti

[0593] OX40.6 (2 mg/kg) je administrirano intravenozno majmunima 1. dana (slika 30A) i 29. (slika 30B) da bi se procenila svaka povezana toksičnost. Nisu primećeni dokazi o problemima podnošljivosti ili abnormalnosti kliničke patologije. OX40.6 je stimulisalo pojačan imuni odgovor na KLH, što je okarakterisano trendom povećanog eksprimiranja CD69 u CD4+ T ćelijama u ex vivo memorijskom KLH testu. Dva od 4 majmuna su pokazala ubrzani klirens, što je bilo u korelaciji sa formiranjem antitela na lek.

[0594] Koncentracija OX40.6 u uzorcima seruma majmuna cinomolgusa za gornji eksperiment je analizirana hemiluminiscentnim (CL) imunotestom. OX40. 6 antitelo je korišćeno za pripremu kalibratora i uzoraka za kontrolu kvaliteta (QC). Biotinilovani-humani-OX40-his je imobilizovan na mikropločama obloženim streptavidinom (Greiner Bio-on) kao molekul za hvatanje za OX40.6. Uzorci, standardi i uzorci za kontrolu kvaliteta dovedeni do konačne matrice od 10% cino seruma su inkubirani na pločama. Uzorci su analizirani pri minimalnom potrebnom razblaženju od 10% u 1% BSA/PBS/0.05% Tween 20 (PTB) koji sadrži 2% mišjeg seruma. Nevezani materijal je ispran i uhvaćeno antitelo OX40.6 je detektovano korišćenjem HRP-obeleženog mišjeg monoklonskog anti-humanog IgG antitela kao molekula za detekciju. Nakon dodavanja SuperSignal ELISA Pico hemiluminiscentnog supstrata (Thermo Scientific), koncentracija OX40.6 u uzorcima cino seruma je izračunata iz intenziteta luminescencije izmerenog čitačem ploča M5 korišćenjem 4-parametarske logističke (4-PL) kalibracione krive generisane iz kalibratora OX40.6 antitela. Opseg kalibracione krive antitela OX40.6 bio je od 5 do 5,000 ng/mL u cino serumu. Gornja i donja granica kvantifikacije bile su 5,000 i 10 ng/mL, redom (tj. ULOQ 5000 ng/mL, LLOQ 10 ng/mL). Uzorci za kontrolu kvaliteta su pripremljeni pri 3750, 400 i 20 ng/mL u serumu majmuna cinomolgusa i analizirani na svakoj ploči da bi se obezbedio prihvatljiv učinak testa. Kalibratori, QC i uzorci su razblaženi 5 puta u PTB-u koji sadrži 2% mišji serum. Za analizu uzoraka korišćene su četiri streptavidin ploče. Performanse testa su bile u prihvatljivom opsegu: međuploča % CV standarda je bio ispod 25%, a QC oporavak je bio unutar ± 30% nominalnih vrednosti.

[0595] Prisustvo antitela protiv leka na OX40.6 u serumu cinomolgus majmuna u prethodno opisanom eksperimentu određeno je imunotestom elektrohemiluminiscencijskim (ECL) premošćavanjem. Konkretno, mišje monoklonsko anti-humano IgG Fc antitelo je korišćeno za pripremu pozitivne kontrole. Biotinilovani-anti-OX40: anti-hOX40-his je korišćen pri 25 ng/mL kao molekul za hvatanje, a rutenilovani-anti-OX40:anti-hOX40-his je korišćen pri 25 ng/mL kao detekcioni molekul. Uzorci su analizirani u 100-strukom razblaženju u 1% BSA/PBS/0.05% Tween 20 (PTB) koji sadrži molekule za hvatanje i detekciju. Posle 2 sata inkubacije u polipropilenskim pločama, mešavina uzoraka je prebačena u MSD ploče obložene streptavidinom. Nakon jednočasovne inkubacije, nevezani materijal je ispran, dodat je MSD pufer za očitavanje, a ECL je izmeren pomoću čitača MSD ploča SI6000. Pozitivna kontrola (mišji anti-humani IgG Fc) je pripremljena pri 1000 (HPC), 100 (MPC) i 10 ng/mL (LPC) u serumu cinomolgusa. Skupljeni serum cinomolgusa je korišćen kao negativna kontrola (NC). Odnos signala za HPC, MPC i LPC u odnosu na NC bio je 102, 10 i 2, redom. Za analizu uzoraka korišćena je jedna ploča sa streptavidinom. Performanse testa su bile u prihvatljivom opsegu: % CV računara je bio ispod 10%, a sirovi signal za negativnu kontrolu (54 RLU) bio je uporediv sa sirovim signalom za uzorke predoziranja (48-55 RLU).

Primer 21: Studija procene rizika imunogenosti

[0596] In vitro testovi proliferacije T ćelija su sprovedeni za nekoliko anti-humanih OX40 antitela da bi se procenio njihov potencijal imunogenosti kod ljudi. Ukratko, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) zdravih dobrovoljaca izolovane su pomoću Ficoll-a (GE Healthcare) i gradijentnog centrifugiranja, a humani limfocitni antigen (HLA) Klase II je okarakterisan amplifikacijom reakcije lančane polimeraze (PCR) i hibridizacijom sa oligonukleotidnim sondama (Prolmmune).

[0597] Panel od 40 PBMC donatora koji imaju tipove HLA klase II koji se blisko podudaraju sa učestalostima svetske populacije korišćen je za testiranje. PBMC su obeležene sa CFSE (Invitrogen) da bi se pratila proliferacija i postavljeni na ploče sa 96 bunarića u 6 replikata sa 200,000 ćelija po bunariću u RPMI (Lonzo) koji sadrži 10% humani AB (Bioreclamation), neesencijalne aminokiseline (Gibco) i pen-strep (Gibco). Anti-humana OX40 antitela, kontrolni proteini, referentna antitela i ConA su kultivisani sa PBMC na 1 µM tokom 7 dana, nakon čega je medijum ispran i ćelije su obeležene anti-humanim CD4 APC (BD science) monoklonskim antitelom. Posle uklanjanja nevezanog anti-CD4 antitela u koraku ispiranja, ćelije su fiksirane sa 3.7% formalina (Sigma) u PBS-u, i analizirane protočnom citometrijom da bi se odredio procenat proliferirajućih CD4+ ćelija.

[0598] Procenat od 40 donora koji su pokazali pozitivan odgovor (definisan kao značajno povećanje proliferacije CD4+ T ćelija u odnosu na PBMC inkubirane u medijumu) za različita anti-humana OX40 antitela prikazan je na slici 31. Sve varijante anti-humanih OX40 antitela su pokazale nizak potencijal da aktiviraju CD4<+>ćelije u ovom testu, uporedive sa niskim QC proteinom, sa izuzetkom OX40.16 i OX40.21, koji nisu pokazali pozitivan odgovor na proliferaciju CD4 ni kod jednog od 40 donora. Ovi rezultati sugerišu da ova anti-humana OX40 antitela imaju mali potencijal da izazovu odgovor na antitela na lekove kod ljudi.

Primer 22: Vezivanje za aktivirane Fc receptore poboljšava anti-mOX40 aktivnost u modelu karcinoma debelog creva

[0599] Da bi se testirala uloga FcR vezivanja u aktivnosti anti-mišjih OX40 antitela u modelima tumora miševa, testirana su anti-OX40 antitela različitih izotipova. C57BL/6 miševima je subkutano ubrizgano 2 miliona tumorskih ćelija MC38. Posle 7 dana, zapremine tumora su određene i miševi su randomizovani u grupe za lečenje tako da su imali uporedive srednje vrednosti zapremina tumora. Antitela formulisana u PBS-u su administrirana intraperitonealno 7, 10. i 14. dana pri 200 µg po dozi u zapremini od 200 µl.

[0600] U modelima tumora singenih miševa, anti-mišja OX40 antitela (npr. OX86, IgG1 pacova) pokazuju antitumorsku aktivnost. Pošto variranje izotipova mnogih antitela specifičnih za površinske receptore T ćelija (i kostimulativni i koinhibitorni) može da promeni antitumorsku aktivnost ovih antitela, mišje Fc izotipske varijante OX86, antitela koje ne blokira OX40/OX40L interakciju, su generisane. Kao što je prikazano na slikama 32A-32C, OX86 formatiran kao mišji IgG2a Fc (Slika 32C) rezultira superiornom antitumorskom aktivnošću u poređenju sa OX86 formatiranim kao mišji IgG1 (Slika 32B). Ovo je verovatno zbog iscrpljivanja Treg ćelija na mestu tumora i ekspanzije T efektorskih ćelija usled agonizma OX40 posredovanog antitelom.

[0601] Da bi se potvrdili efekti različitih izotipova antitela na populacije T ćelija koje infiltriraju tumor, tumori MC38 miševa koji su tretirani različitim izotipovima procenjeni su protočnom citometrijom. Odabrani miševi su žrtvovani, a tumori i slezine su sakupljeni za analizu 15. dana nakon implantacije tumora. Pojedinačne ćelijske suspenzije su pripremljene disocijacijom tumora i limfnog čvora zadnjom stranom šprica u ploči sa 24 bunarića. Suspenzije ćelija su propuštene kroz filtere od 70 µm, peletirane, resuspendovane i izbrojane. Ćelije su zatim postavljene u ploče sa 96 bunarića sa 1×10<6>ćelija po bunariću za bojenje. Uzorci su zatim analizirani na FACS Canto protočnom citometru (BD). Analiza slezine i tumora miševa sa tumorom tretiranih anti-OX40 antitelima pokazuje da izotip IgG2a može iscrpeti CD4+ Treg u tumorima (slika 33A), i da izotipovi IgG1 i IgG2a mogu aktivirati ekspanziju T ćelija na periferiji (slika 33B) i rezultiraju povećanim brojem ćelija u slezini (slika 33C). Ovi rezultati sugerišu da agonizam OX40 (ali ne nužno blokiranje interakcije OX40/OX40L) i vezivanje antitela OX86 za Fc receptor promoviše antitumorsko delovanje.

[0602] Uloga ljudskih Fc i FcR testirana je korišćenjem miševa gde su FcR miša nokautirani i zamenjeni ljudskim FcR. Ovi eksperimenti su izvedeni korišćenjem sistema himera koštane srži gde su CD45.1 kongeni domaćini ozračeni, a zatim rekonstituisani humanim FcR transgenim ćelijama koštane srži. Zatim je ostavljeno da se ovi miševi rekonstituišu tokom 8 nedelja pre nego što su inokulisani sa 2x10<6>MC38 ćelija tumora. Posle 7 dana, zapremine tumora su određene i miševi su randomizovani u grupe za tretman tako da su imali uporedive srednje vrednosti zapremina tumora. Antitela formulisana u PBS-u su administrirana intraperitonealno 7, 10. i 14. dana pri 200 µg po dozi u zapremini od 200 µl. Miševi su tretirani ili kontrolnim humanim IgG1 (slika 34A), himernim OX-86 humanim G1 hibridnim At (slika 34B), ili OX-86 humanim G1 hibridom sa S267E mutacijom (slika 34C). Rezultati su bili slični onome što je primećeno kod izotipova miša, tj. humano IgG1 antitelo imalo je značajan antitumorski efekat jer se može vezati za aktivirirajuće FcR, dok je mutacija S267E koja povećava vezivanje i za CD32B i za CD32A imala veću aktivnost (slike 34A-34C). Ovaj viši nivo aktivnosti verovatno je posledica povećanog agonizma na efektorske T ćelije, kao i povećanog iscrpljivanja Treg-ova na mestu tumora.

[0603] Populacije T ćelija na mestu tumora i slezine miševa sa tumorom su ispitane kao što je ranije opisano. Treg-ovi su bili manje rasprostranjeni kod miševa tretiranih bilo sa G1 ili G1 S267E antitelom, sa većim efektom uočenim kod S267E izotipa (slika 35A). Povećanja u procentima CD8+ T ćelija (slika 35B) i CD4+ efektora (slika 35C) i na mestu tumora su takođe bila evidentna, a ova povećanja su bila veća sa G1 S267E antitelima. Takođe je zabeležena povećana celularnost u slezinama miševa tretiranih anti-OX-40 antitelima (slika 35D). Ovi rezultati sugerišu da je antitelo OX86-hIgG1 pokazalo snažno antitumorsko delovanje (slike 34A-34C) i merljivo smanjenje Treg-a (slike 35A-35D).

Primer 23: Blokirajuće anti-OX40 antitelo ispoljava dejstvo protiv tumora u modelu tumora kod miša

[0604] Sledeći eksperiment je sproveden da se odredi da li antitelo koje blokira interakciju između OX40/OX40L ispoljava snažno dejsvo protiv tumora. U tom cilju, generisano je antimišje OX40 antitelo hrčka koje blokira OX40/OX40L interakciju (IgG1 8E5 antitelo hrčka) i ispitano na njegovo antitumorsko dejstvo u subkutanom mišjem CT-26 modelu tumora. CT-26 je tumorska ćelija adenokarcinoma debelog creva kod miša čiji se rast solidnog tumora može pratiti kod BALB/c miševa kada se ćelije transplantiraju subkutano.

[0605] Ženke BALB/c miševa (Charles River Laboratories, Hollister, CA) su aklimatizovane najmanje tri dana pre početka studija. Miševi su smešteni po 5 životinja po kavezu, a kavezi su smešteni u mikroizolatorske ventilisane police. Kućište je bilo na 18-26°C i 50 20% relativne vlažnosti sa najmanje dvanaest izmena vazduha u prostoriji na sat. Održavan je ciklus svetlosti/tama od 12 sati. Životinje su dobile dezinfikovanu laboratorijsku hranu za glodare i komunalnu vodu ad libitum.

[0606] CT-26 ćelije su održavane u medijumu RPMI-1640 (Hyclone, kat. br. SH30096.01) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Hyclone, kat. br. SH30071.03). Otprilike dva puta nedeljno, ćelije sadržane u jednoj boci T175 su podeljene i proširene na četiri T175 boce u razblaženju 1:5 dok se ne dobije dovoljan broj ćelija za implantaciju tumora. Ćelije su sakupljene sa blizu 80% konfluencije, isprane i resuspendovane u PBS.

[0607] Dana 0, 1 × 10<6>CT-26 ćelija je implantirano u miševe pomoću šprica od 1 cc (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nj) i igle od 27 gejdža 5/8 inča. Tumori su zatim mereni dva puta nedeljno u 3 dimenzije elektronskim kaliperom (Mitutoio, Aurora, Ilinois) i snimani. Zapremine tumora (mm<3>) su izračunate po formuli: širina × dužina × visina × 0.5. Nakon merenja zapremine tumora 6. dana nakon implantacije, miševi su razvrstani prema zapremini tumora. Miševi sa prosečnom vrednošću zapremine tumora od 26 mm<3>su randomizovani u grupe i tretirani kao što je prikazano u tabeli 19.

[0608] Izotipsko kontrolno antitelo hrčka je inertno IgG monoklonsko antitelo jermenskog hrčka (mAt) na GST (klon PIP, kataloški br BE0260; BioXcell, Zapadni Liban, NH). Pripremljen je u PBS-u neposredno pre administracije da bi se obezbedile doze od 10 mg/kg po mišu putem intraperitonealne (IP) injekcije 6, 10. i 14. dana kao što je prikazano u tabeli 19.

[0609] Monoklonsko antitelo protiv mišjeg OX40 (klon 8E5) je pripremljeno u PBS-u neposredno pre administracije da bi se obezbedile doze od 10, 3, 1 ili 0.3 mg/kg po mišu putem IP injekcije 6, 10. i 13. dana, kao što je prikazano u tabeli 19.

Tabela 19:

[0610] Životinje su svakodnevno proveravane na posturalne promene, doterivanje i respiratorne promene, kao i na letargiju. Životinje su merene dva puta nedeljno i eutanazirane ako je gubitak težine bio ≥ 20%. Miševi su proveravani na prisustvo i veličinu tumora dva puta nedeljno do smrti ili eutanazije. Tumori su mereni u 3 dimenzije elektronskim kaliperom (Mitutoyo, Aurora, Ilinois) i snimljeni. Odgovor na jedinjenja za lečenje je meren kao funkcija rasta tumora. Ako je tumor dostigao zapreminu od ≥ 1500 mm<3>ili su bile sa ulceracijama, životinje su eutanazirane.

[0611] Kao što je prikazano na slikama 36A-36E, antimišje OX40 mAt hrčka (klon 8E5; slike 36B-36E koje prikazuju tretman različitim dozama 8E5) pokazalo je snažnu antitumorsku aktivnost u potkožnom CT-26 modelu u poređenju sa izotipskom kontrolnom grupom IgG hrčka (slika 36A). Antitelo 8E5 je administrirano u dozama u rasponu od 0.3 do 10 mg/kg, pa čak i pri najnižoj procenjenoj dozi (0.3 mg/kg), 10 od 12 miševa je bilo bez tumora (TF) na kraju perioda ispitivanja (dan 72). Iako se broj miševa bez tumora nije značajno razlikovao između svake dozne grupe, pri čemu je svaka grupa imala 9 ili 10 miševa bez tumora do kraja perioda studije, miševi lečeni bilo kojom od dve najveće doze (3 ili 10 mg/kg) su pokazali više kašnjenja u rastu tumora u poređenju sa miševima lečenim sa dve najniže doze (0.3 ili 1 mg/kg). Nije bilo miševa bez tumora u grupi lečenoj izotipskom kontrolom; svi miševi u toj grupi su žrtvovani do 39. dana kao rezultat ulceracije ili opterećenja tumorom (>1500 mm<3>).

[0612] Ovi podaci ukazuju na to da anti-OX40 antitelo koje blokira interakciju između OX40 i OX40-L pokazuje moćnu antitumorsku aktivnost u potkožnom mišjem CT-26 modelu tumora kada se administrira miševima sa utvrđenim tumorima.

Primer 24: OX40 agonizam sinergiše sa PD-1 blokadom u murinskom modelu karcinoma debelog creva MC38

[0613] Da bi se testirala sinergija između tretmana anti-OX-40 antitelom i anti-PD-1 antitelom, kombinacije ovih antitela su testirane na mišjem modelu MC38 tumora. C57BL/6 miševima je subkutano ubrizgano 2 miliona tumorskih ćelija MC38. Posle 7 dana, zapremine tumora su određene i miševi su randomizovani u grupe za tretman tako da su imali uporedive srednje vrednosti zapremina tumora. Antitela formulisana u PBS-u su administrirana intraperitonealno 7, 10. i 14. dana u dozi od 200 µg po dozi u zapremini od 200 µl.

[0614] Kao što je prikazano na slikama 37A-37D, i anti-PD-1 antitelo (slika 37B) i anti-OX40 antitelo (slika 37C) pokazali su minimalnu aktivnost kada se koriste zasebno, ali su imali značajnu antitumorsku aktivnost kada su kombinovani (slika 37D), sa ishodom da su 5 od 8 miševa bez tumora.

Primer 25: OX40 agonizam pojačava odgovor na vakcine kod cinomolgus majmuna

[0615] Povećanje imunološkog odgovora na vakcine je mereno da bi se procenila sposobnost antitela OX40.6 da stimuliše imune odgovore kod cinomolgus majmuna. Ovaj pristup je odabran zato što se željeni efekat, odnosno poboljšanje imunoloških odgovora na tumore, ne može proceniti kod zdravih primata koji nisu ljudi, jer nemaju tumore.

[0616] Majmuni su imunizovani hemocijaninom iz puža prilepka (KLH) 1. dana (10 mg, intramuskularno) i površinskim antigenom virusa hepatitisa B (HBsAg) (ENGERIX-B) (20 µg intramuskularno 1. i 29. dana). Nakon administracije vakcina, majmunima je intravenski administrirana doza od 0 ili 2 mg/kg OX40.6 antitela 1. i 29. dana. Imunološki odgovori su mereni 22. i 41. dana pomoću ex vivo odgovora T ćelija na KLH i odgovora antitela zavisnih od T ćelija na KLH i HBsAg. Kao što je prikazano na slikama 38A i 38B, nalazi u vezi sa OX40.6 pri 2 mg/kg 22. (Slika 38A) i 41. (Slika 38B) dana uključivali su povećanje ex vivo memorijskog odgovora na KLH, koje se karakteriše povećanjem srednje vrednosti procenta CD69+, IFN-gama+ i TNF-alfa+ eksprimiranja CD4+CD8-T ćelija.

Primer 26: Vezivanje Fc receptora za antitela sa dizajniranim konstantnim domenima

[0617] Ovaj primer prikazuje da se antitela koja imaju modifikovane konstantne regione teškog lanca koji sadrže CH1 i zglob IgG2 vezuju za FciR kada sadrže CH2 i CH3 domene od IgG1.

[0618] Pored vezivanja antigena pomoću varijabilnih domena, antitela mogu da angažuju Fc-gama receptore (FcgR) kroz interakciju sa konstantnim domenima. Ove interakcije posreduju efektorske funkcije kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP). Aktivnost efektorske funkcije je visoka za izotip IgG1, ali veoma niska ili odsutna za IgG2 i IgG4 zbog toga što ovi izotipovi imaju manji afinitet za FcgR. Pored toga, efektorska funkcija IgG1 može biti modifikovana mutacijom aminokiselinskih ostataka unutar konstantnih regiona da bi se promenio afinitet i selektivnost FcgR-a.

[0619] Vezivanje antitela za Fc gama receptore (FciR ili FcgR) proučavano je korišćenjem biosenzorskih tehnologija uključujući Biacore površinsku plazmonsku rezonancu (SPR) i Fortebio Interferometriju biosloja (BLI). SPR studije su izvedene na instrumentu Biacore T100 (GE Healthcare) na 25°C. Fab fragment iz murinskog anti-6xHis antitela je imobilisan na CM5 senzorskom čipu korišćenjem EDC/NHS do gustine od ~3000 RU. Različiti his-označeni FcgR (7 ug/ml) su uhvaćeni preko C-terminalne his-oznake, koristeći vreme kontakta od 30 s pri 10 ul/min, a vezivanje 1.0 uM antitela je procenjeno u radnom puferu od 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1. FcgR-i koji su korišćeni za ove eksperimente uključivali su CD64 (FcgRI), CD32aH131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), CD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1), i CD16B-NA2 (FcgRIIIb-NA2). BLI eksperimenti su izvedeni na instrumentu Fortebio Octet RED (Pall, Fortebio) na 25oC u 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1. Antitela su uhvaćena iz nerazblaženih ekspresionih supernatanata na senzorima obloženim proteinom A, nakon čega je usledilo vezivanje 1 µM hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158 ili 0.1 µM hCD64 analita.

[0620] Prvo su napravljena antitela koja sadrže modifikovane IgG1 Fc domene uključujući supstitucije S267E (SE) i S267E/L328F (SELF), kao i različite kombinacije mutacija P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, naznačene kao V4, V7, V8, V9 i V12. Vezivanje ovih antitela proučavano je pomoću Biacore SPR poređenjem sa IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) i IgG4.1 (IgG4-S228P) antitelima, kao i sa IgG1.1f antitelom koje je projektovano da smanji vezivanje za sve FcgR-e. Rezultati, koji su prikazani na slici 70, demonstriraju očekivana svojstva vezivanja FcgR-a za IgG1f, IgG2.3 i IgG4.1 i mutirana IgG1 antitela, uključujući povećano vezivanje CD32a-H131, CD32a-R131 i CD32b za SE i SELF, kao i povećanu selektivnost mutanata V4, V7, V8, V9 i V12 za CD32b u odnosu na CD32a-H131 i CD32a-R131 (Slika 39).

[0621] Sledeći set konstrukata je korišćen za inženjering efektorske funkcije u inače negativan IgG2 izotip efektorske funkcije. Za ovu studiju, mutacije opisane iznad su uvedene u kontekstu IgG2.3 konstantnog regiona, ili IgG2.3/IgG1f hibrida nazvanog IgG2.3G1-AY (tabela 20). Antitela su eksprimirana u malom obimu kao supernatanti i testirana na vezivanje za FcgR korišćenjem Fortebio Octet BioLayer interferometrijske tehnologije biosenzora. Pošto su antitela bila prisutna u niskoj koncentraciji u supernatantima, eksperiment je izveden hvatanjem antitela iz supernatanata korišćenjem senzora obloženih proteinom A, nakon čega je usledilo vezivanje FcgR analita u rastvoru. Prečišćeni i supernatantni kontrolni IgGlf, uključujući divlji tip IgG1, SE, P238D, V4 i V12 antitela su takođe obuhvaćeni za poređenje, i svako od ovih kontrolnih antitela je pokazalo očekivana svojstva vezivanja za FcgR (Slika 40). IgG2.3 antitelo je takođe pokazalo očekivani profil vezivanja, sa značajnim vezivanjem samo za CD32a-H131. Međutim, sve mutacije za uvođenje S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D ili E233D mutacija u IgG2.3 nisu uspele da rekapituliraju FcgR afinitet odgovarajućeg projektovanih IgG1 mAt (slika 40). Nasuprot tome, IgG2.3G1-AY konstrukt je bio u stanju da u potpunosti sačuva svojstva vezivanja FcgR divljeg tipa IgG1, dok je zadržao CH1 i zglobne regione IgG2.3. Pored toga, svi IgG2.3G1-AY mutanti koji sadrže S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D i E233D su pokazali svojstva vezivanja FcgR koja su uporediva sa mAt-ima verzije IgG1 koja sadrže istu mutaciju (slika 40). Ovo demonstrira uspešan inženjering antitela sa CH1 i zglobnim regionima IgG2 u kombinaciji sa efektorskom funkcijom divljeg tipa (WT) ili mutantnog IgG1.

Tabela 20: Projektovani IgG2 konstrukti

[0622] Ova inženjerska strategija je dalje istražena proizvodnjom drugih antitela formatiranih sa IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27), kao i varijantama IgG2-B-oblika (IgG2.5G1-AY i IgG2.5G1-AY-V27), i drugih hibridnih antitela koja sadrže različite kombinacije IgG1 i IgG2 konstantnih domena, i testiranjem vezivanja ovih antitela za anti-his Fab uhvaćene his-obeležene FcgR-e primenom Biacore SPR tehnologije. U skladu sa podacima oktet supernatanta, SPR podaci su prikazali da su IgG2.3G1-AY i IgG2.3G1-AY-V27 antitela imala uporediva svojstva FcgR vezivanja za IgGlf i IgG1f-S267E redom, uprkos tome što sadrže CH1 i zglobne regione IgG2 antitela A-oblika (IgG2.3) (Tabela 21). Slični podaci su takođe dobijeni primenom IgG2.5G1-AY i IgG2.5G1-AY-V27 antitela, prikazujući uspešan inženjering IgG2 antitela B-oblika (koja sadrže C131S mutaciju nazvanu IgG2.5) koja imaju IgGlf ili modifikovane IgGlf-u slične efektorske funkcije. Podaci za nekoliko drugih antitela sa IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY, ili IgG2.5G1-AY-V27 konstantnim regionima ali različitim varijabilnim regionima pokazali su da je ova inženjering strategija široko primenljiva na ostala antitela nezavisno od varijabilnih domena (Tabela 21).

Tabela 21: %Rmaks vrednosti za 1 uM antitela koja se vezuju za anti-his Fab uhvaćene FcgR-his proteine

Primer 27: Efekti anti-OX40 antitela sa modifikovanim konstantnim regionima teškog lanca na proliferaciju T ćelija i IFN-γ i IL-2 sekreciju iz T ćelija sa ili bez ukrštenog vezivanja.

[0623] Anti-OX40 antitela sa modifikovanim IgG2 CH1/zglobnim regionima mogu imati sposobnost da pospešuju aktivaciju T ćelija u odsustvu ukrštenog vezivanja, i tako mogu biti u stanju da pospešuju aktivaciju T ćelija in vivo u odsustvu ili pri niskom eksprimiranju ćelijskih tipova koji eksprimiraju FcγR-e, i po mogućstvu da pospešuju anti-tumorsku aktivnost u širem opsegu tipova tumora nego IgG1 izotipska antitela.

[0624] Alternativno, antitela sa modifikovanim CH1/zglobnim regionom mogu i dalje da zahtevaju ukršteno vezivanje kako bi se pospešila aktivacija T ćelija, ali mogu imati povećanu agonističku aktivnost kada su vezani za FcγR-e u poređenju sa IgG1 izotipskim antitelima, i tako budu potentniji u pospešivanju aktivacije T ćelija i anti-tumorske aktivnosti.

[0625] Anti-OX40 antitela koja imaju modifikovane konstantne regione teškog lanca koji sadrže sekvence prikazane u tabeli 22 su generisana i ispitana na njihove efekte na proliferaciju T ćelija i IFN-γ i IL-2 sekreciju iz T ćelija sa ili bez ukrštenog vezivanja primenom testova koji su opisani ispod. Sekvence lakog lanca za antitela OX40.6, 40.8, 40.16, i 40.21 odgovaraju SEQ ID NO: 96, 110, i 116 (za oba OX40.16 i 40.21), redom.

Tabela 22.

CHO-CD3 /- CD32 test

[0626] Anti-OX-40 antitela sa sekvencama prikazanim u tabeli 22 su ispitana na njihovu sposobnost da indukuju aktivnost T ćelija in vitro merenjem proliferacije i količine IL-2 i IFN-γ koje su izlučile T ćelije inkubirane sa antitelima.

[0627] Transfektovane CHO ćelijske linije su generisane za primenu kao veštačke antigenprezentujuće ćelije u testu aktivacije primarnih T ćelija. CHO-CD3-CD32A linija ćelija eksprimira anti-humano CD3 antitelo u jednolančanom Fv formatu, zajedno sa humanim Fc receptorom (FcR) CD32A da predstavi anti-OX40 antitela na površini CHO ćelija. CHO-CD3 linija ćelija eksprimira anti-humano CD3 antitelo u jednolančanom Fv formatu bez FcR.

[0628] Ukratko, humane primarne CD4 T ćelije su izolovane negativnom selekcijom (RosetteSep<™>, StemCell Technologies) i zajednički kultivisane bilo sa ozračenim CHO-CD3-CD32A ćelijama, ili ozračenim CHO-CD3 ćelijama, pri 8:1 T:CHO odnosu, u prisustvu stepenovanih doza anti-OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela. Nakon 3 do 4 dana u kulturi na 37 °C, supernatanti su prikupljeni za procenu T ćelijske aktivacije pomoću merenja izlučenog humanog IFN- γ bilo pomoću ELISA (BD Biosciences) ili HTRF testa (Cisbio), prateći preporuke proizvođača. Nakon toga, timidin sa tricijumom je dodat tokom konačnih približno 18 sati kultivacije da se izmeri T proliferacija inkorporacijom timidina s tricijumom, kao dodatna procena aktivacije T ćelija.

SEB PBMC test

[0629] Anti-OX-40 antitela sa sekvencama prikazanim u tabeli 22 su ispitana na njihove efekte na stimulaciju primarnih T ćelija u kulturama stafilokokusnim enterotoksom B (SEB)-aktiviranih humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Uzorci humane pune krvi su dobijeni od AlCells, Inc. (Berkeley, CA) ili od donora u Bristol-Myers Squibb, Redwood City, CA pod pokroviteljstvom internog programa flebotomije. PBMC su izolovane gradijentnim prečišćavanjem na Ficoll-Hypaque jastučetom i kultivisane tokom 3 dana u medijumu za kulturu sa dodatkom fiksnog, suboptimalnog (85 ng/mL) superantigena stafilokokus enterotoksina B (SEB; Toxin Technologies, Sarasota, FL) u prisustvu stepenovanih doza OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela. U nekim slučajevima, 2 - 5 µg/mL rastvorljivog antitela sa ukrštenim vezivanjem, F(ab')2 kozjeg anti-humanog Fcγ, je takođe dodato kulturama. Nakon kultivacije tokom 3 dana na 37 °C, supernatanti su prikupljani za procenu aktivacije T ćelija pomoću ELISA merenja izlučenih humanih IL-2. Ukratko, supernatanti kultura su razblaženi 1:10 u razblaživaču uzorka i ispitani na prisustvo humanog IL-2 pomoću ELISA (BD Bioscience) prema preporučenom protokolu proizvođača. Nakon dodatka TMB supstrata, test ploče su očitane na Spectramax 340PC čitaču korišćenjem softvera na talasnoj dužini od 650 nm. Merene optičke gustine hromogenog supstrata su bile proporcionalne sa vezanim detektujućim antitelom.

MLR test

[0630] Anti-OX-40 antitela sa sekvencama prikazanim u tabeli 22 ispitana na njihovu sposobnost da potenciraju proliferaciju primarnih humanih T ćelija i IFN-ysekreciju u T ćelija: dendritska ćelija alogenoj reakciji pomešanih limfocita (T:DC AlloMLR - Allogeneic Mixed Lymphocyte Reaction). Ukupne T ćelije su izolovane iz periferne krvi iz zdravih ljudskih donora negativnom selekcijom (RosetteSep, Stemcell Technologies). Monociti su izolovani iz periferne krvi iz zdravih ljudskih donora primenom CD14 mikrozrnaca (Miltenyi), i kultivisani tokom šest dana u prisustvu GM-CSF i IL-4 da bi se dobile nezrele dendritske ćelije (DC). DC i T ćelije su zajednički kultivisane u prisustvu stepenovanih doza OX40 antitela ili izotipskog kontrolnog antitela. U nekim slučajevima, 2 - 5 µg/mL rastvorljivog ukrštajućeg antitela, kao što je F(ab')2 kozje antihumano Fcγ, je takođe dodato kulturama. Supernatant iz svakog uzorka je prikupljen između 4. i 7. dana za merenje izlučenog IFN-γ pomoću ELISA (BD Biosciences) ili HTRF testa (Cisbio), prateći preporuke proizvođača. Nakon prikupljanja supernatanta, ćelijske kulture su pulsirane sa 1 µCi/bunariću<3>[H]-timidina tokom poslednjih 16-18 sati kulture. Ćelije su prikupljene na filter pločama, i<3>[H] brojanja po minuti u ćeliju ugrađenog<3>[H]-timidina su očitana kao mera proliferacije T ćelija.

Primer 28: Anti-tumorska aktivnost OX40 agonističkog mAt sa CTLA-4 blokadom u CT26 modelu

[0631] Da bi se testirala sinergija između tretmana anti-OX-40 antitelom i anti-CTLA-4 antitelom, kombinacije ovih antitela su testirane na CT26 modelu mišjeg tumora. Miševi su inokulisani sa CT26 tumorima i doziranje mAt je započeto na dan 3 nakon inokulacije (dozirano 3, 7. i 10. dana) sa 200 ug/mišu antitela prikazanih na slikama 41A-41D.

[0632] Kao što je prikazano na slikama 41A-41D i anti-CTLA-4 antitelo (slika 41B) i anti-OX40 antitelo (slika 41C) prikazala su minimalnu aktivnost kada su korišćena zasebno (1 od 8 miševa bez tumora tokom oba lečenja), ali su imala značajnu antitumorsku aktivnost kada se kombinuju (slika 41D), sa 4 od 8 miševa koji su oslobođeni tumora.

Primer 29: Faza 1/2a ispitivanja kod subjekta koji ima solidne tumore

[0633] Faza 1/2a studije OX40.21 administriranog zasebno ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom je izvedena kod subjekata koji imaju uznapredovale solidne tumore da se demonstrira efikasnost administriranja OX40.21 zasebno ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom.

1. Cilj

[0634] Primarni cilj studije je da se procene bezbednost, tolerabilnost, toksičnosti koje ograničavaju dozu (DLT), i maksimalna tolerantna doza (MTD)/preporučena doza faze 2 (RP2D) za OX40.21 administrirano zasebno ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom kod subjekata sa uznapredovalim malignim tumorima.

[0635] Sekundarni ciljevi uključuju ispitivanje preliminarne antitumorske aktivnosti OX40.21 koje je administrirano samo ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom kod subjekata sa uznapredovalim malignim tumorima; karakterisanje PK OX40.21 koje je administrirano samo i u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom; i karakterisanje imunogenosti OX40.21 koje je administrirano samo ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom i imunogenosti nivolumaba ili ipilimumaba administriranih sa OX40.21. Dodatni istraživački ciljevi uključuju istraživanje potencijalne povezanosti između antitumorske aktivnosti i odabranih mera biomarkera u uzorcima biopsije tumora i perifernoj krvi pre lečenja i posle administracije OX40.21 samog ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom; procena potencijalnog efekta monoterapije OX40.21 i kombinovane terapije na QTc interval; karakterizacija PK nivolumaba kod subjekata koji primaju kombinaciju nivolumaba i OX40.21; karakterizacija PK ipilimumaba kod subjekata koji primaju kombinaciju ipilimumaba i OX40.21; procena ukupnog preživljavanja (OS) kod subjekata lečenih samo sa OX40.21 i u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom; i istraživanje potencijalnih odnosa između doze/izloženosti i antitumorske aktivnosti, farmakodinamičkih (PD) efekata (odabrani biomarkeri u uzorcima periferne krvi i biopsije tumora) i ključnih bezbednosnih mera kod subjekata lečenih samo sa OX40.21 i u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumab.

2. Dizajn i trajanje studije

[0636] Ovo je faza 1/2a, otvorena studija za OX40.21 kod subjekata sa uznapredovalim solidnim tumorima koja integriše inicijalnu OX40.21 monoterapiju sa naknadnom kombinovanom terapijom sa nivolumabom ili ipilimumabom.

[0637] Odeljci studije (eskalacija doze i ekspanzija doze) nastavljaju se u faznom pristupu zasnovanom na podacima bezbednosti studije, PK i PD. Prvi odeljak studije počinje sa kohortama sa doznom eskalacijom OX40.21 monoterapije. Klinički podaci iz prve 3 kohorte sa monoterapijskom dozom služe kao osnova za pokretanje eskalacije doze OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom. Klinički podaci iz prve 3 kohorte sa monoterapijskom dozom kao dodatak kliničkim podacima iz prve kohorte OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom služe kao osnova za iniciranje eskalacije doze OX40.21 u kombinaciji sa ipilimumabom. Nakon uspostavljanja podnošljive i farmakološki aktivne RP2D za OX40.21 u odeljku za eskalaciju doze, započinje ekspanzija doze u specifičnim kohortama sa tumorom.

3. Eskalacija doze

[0638] Shema dizajna studije za deo 1A je prikazan na slici 42.

[0639] Faza eskalacije doze u studiji procenjuje bezbednost i tolerabilnost od OX40.21, zasebno ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom, kod subjekata sa napredovanim solidnim tumorima.

[0640] Početni nivo doze OX40.21 je 20 mg. Odluke o eskalaciji doze za naredne doze zasnivaju se na DLT korišćenjem BLRM modela (za monoterapiju OX40.21) ili BLRM (-kopula) modela (za OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom). Period DLT-a je 28 dana i za delove eskalacije doze monoterapije i kombinovane terapije. Stopa DLT-a se određuje na osnovu frekvencije, ozbiljnosti i trajanja AE koji se javljaju unutar DLT perioda i za koje se ne može identifikovati alternativni uzrok. Odabir doze za sledeću monoterapijsku kohortu/nivo doze uzima u obzir preporuku BLRM (-kopula) u kombinaciji sa svim dostupnim PK, PD i kliničkim i laboratorijskim podacima o bezbednosti od svih lečenih subjekata. Odabir početne doze OX40.21 za Deo 2A je određen korišćenjem podataka dostupnih iz Dela 1A, uključujući kliničke i laboratorijske procene bezbednosti, PK/PD podatke i preporuku za modeliranje u okviru Bajesovog hijerarhijskog okvira modeliranja ugrađivanjem profila toksičnosti jednog agensa za oba OX40.21 (Deo 1A) i nivolumab (CA209-003). Izbor početne doze OX40.21 za Deo 3A je određen korišćenjem podataka dostupnih iz Delova 1A i 2A, uključujući kliničke i laboratorijske procene bezbednosti, PK/PD podatke i preporuku za modeliranje u okviru Bajesovog okvira za modeliranje ugrađivanjem profila toksičnosti jednog agensa za oba OX40.21 (Deo 1A) i ipilimumab (CA184-022). Stvarne doze se mogu modifikovati prema BLRM (-kopula), ali ne prelaze udvostručenje prethodno testirane doze.

[0641] Tokom eskalacije doze za sve dozne kohorte, početni subjekt (kontrolni subjekt) se posmatra 5 dana pre lečenja dodatnih subjekata u toj kohorti ispitivanim lekom.

[0642] Približno 30 subjekata je upisano u svaki deo dozne eskalacije. Broj ispitanika u svakoj kohorti sa eskalacijom doze varira u zavisnosti od BLRM (-kopula) preporuka. U početku, približno 3 subjekta se leče početnim nivoima doze OX40.21 ili OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom. Dodatne kohorte od približno 3 subjekta, koji se mogu proceniti, se leče preporučenim nivoima doze po BLRM (-kopula) tokom faze eskalacije doze. Najmanje 6 subjekata sa procenjivim DLT se leči pri MTD.

[0643] Deo 1A: Upis počinje u Delu 1A, dozne eskalacija monoterapije OX40.21. Početna doza OX40.21 za Deo 1A je 20 mg, sa očekivanim naknadnim dozama od 40, 80, 160 i 320 mg. Stvarne doze se mogu modifikovati prema BLRM, ali ne prelaze udvostručenje prethodno testirane doze.

[0644] Deo 2A: Deo 2A je kombinovani ogranak sa OX40.21 sa nivolumabom koji započinje nakon što se utvrdi da se tolerišu najmanje 3 nivoa doze u monoterapijskoj doznoj eskalaciji ili je MTD utvrđena u doznoj eskalaciji monoterapije (Deo 1A). Početna doza OX40.21 u Delu 2A je najmanje 1 nivo doze ispod doze za koju je pokazano da se toleriše u Delu 1A da bi se obezbedila dalja bezbednost kombinacije. Ni u jednom trenutku doza za OX40.21 u Delu 2A ne prelazi najveću tolerisanu dozu u Delu 1A. Nivolumab se administrira u ravnoj dozi od 240 mg. Svaki ciklus lečenja traje 2 nedelje, a ispitivani lekovi se administriraju svake 2 nedelje počevši od 1. dana svakog ciklusa do 12 ciklusa.

[0645] Deo 3A: Deo 3A je kombinovani ogranak sa OX40.21 sa ipilimumabom koji započinje tek nakon što se utvrdi da se tolerišu najmanje 3 nivoa doze u doznoj eskalaciji monoterapije ili se MTD odredi u doznoj eskalaciji monoterapije (Deo 1A) i utvrdi da se najmanje 1 dozna kohorta toleriše u delu eskalacije doze OX40.21 sa nivolumabom. Početna doza OX40.21 u Delu 3A je najmanje 1 nivo doze ispod doze za koju je pokazano da se toleriše u Delu 1A. Ni u jednom trenutku doza za OX40.21 u Delu 3A ne prelazi najveću tolerisanu dozu u Delu 1A da bi se dodatno osigurala bezbednost kombinovanih doza kod lečenih subjekata. Ipilimumab se administrira u dozi od 1 mg/kg. Svaki ciklus lečenja traje 3 nedelje. OX40.21 se administrira svake 3 nedelje počevši od 1. dana ciklusa 1, do uključujući 8 ciklusa, a ipilimumab se administrira svake 3 nedelje počevši od 1. dana tokom 4 ciklusa. Samo OX40.21 se administrira u poslednja 4 ciklusa.

Ekspanzija doze:

[0646] Tretman u kohortama sa ekspanzijom doze započinje kada se MTD/RP2D odredi na osnovu procene ukupno raspoloživih podataka kliničke bezbednosti (DLT, značajni AE koji se javljaju nakon DLT perioda), PK, PD i modelovanja iz eskalacije doze (Delovi 1A, 2A i 3A). Približno 110 subjekata je lečeno u svim kohortama sa ekspanzijom doze.

[0647] Deo 1B je kohorta sa ekspanzijom doze monoterapije OX40.21 kod subjekata sa rakom grlića materice pri MTD/RP2D utvrđenoj u Delu 1A. Doziranje OX40.21 počinje 1. dana svakog ciklusa i primenjuje se svake 2 nedelje do 12 ciklusa. Približno 12 subjekata se leči u ovoj kohorti sa ekspanzijom.

[0648] Deo 2B je deo ekspanzije doze kombinovane terapije (OX40.21 sa nivolumabom) kod subjekata sa CRC pri MTD/RP2D određenoj u Delu 2A. Nivolumab se administrira u ravnoj dozi od 240 mg. Svaki ciklus lečenja traje 2 nedelje, a ispitivani lekovi se primenjuju svake 2 nedelje počevši od 1. dana svakog ciklusa do 12 ciklusa. Približno 35 subjekata se leči u ovoj kohorti sa ekspanzijom.

[0649] Deo 2C je deo ekspanzije doze kombinovane terapije (OX40.21 sa nivolumabom) kod subjekata sa BC pri MTD/RP2D određenoj u Delu 2A. Svaki ciklus lečenja traje 2 nedelje, a ispitivani lekovi se administriraju svake 2 nedelje počevši od 1. dana svakog ciklusa do 12 ciklusa. Približno 27 subjekata se leči u ovoj kohorti sa ekspanzijom.

[0650] Deo 3B je deo ekspanzije doze kombinovane terapije (OX40.21 sa ipilimumabom) kod subjekata sa OC pri MTD/RP2D određenoj u Delu 3A. Svaki ciklus lečenja traje 3 nedelje. Ipilimumab se administrira u početna 4 ciklusa u kombinaciji sa OX40.21. Zatim subjekt nastavlja sa monoterapijom OX40.21 do dodatna 4 ciklusa tokom ukupno do 24 nedelje (8 ciklusa) lečenja. Približno 35 ispitanika sa OC se leči u ovoj kohorti sa ekspanzijom.

Sažetak perioda studije:

[0651] Subjekti završavaju do 5 perioda u studiji: skrining (do 28 dana), lečenje (do 24 nedelje), praćenje bezbednosti (minimalno 100 dana), praćenje odgovora i dugotrajno praćenje preživljavanja (do otprilike 2 godine od prve doze) kao što je opisano u nastavku. Shema posete studiji je prikazana na slici 43.

Period skrininga:

[0652] Period skrininga traje do 28 dana. Period skrininga počinje utvrđivanjem početne podobnosti subjekta i potpisivanjem obrasca informisanog pristanka. Subjekti se upisuju primenom tehnologije interaktivnog odgovora (IRT).

Period lečenja:

[0653] Period lečenja se sastoji od do 24 nedelje doziranja. Nakon svakog ciklusa lečenja, odluka da se subjekt leči sledećim ciklusom ispitivane terapije, do 24 nedelje lečenja, zasniva se na proceni rizika/koristi i tumora. Procene tumora se vrše svakih 8 nedelja za svaki 2-nedeljni (q2w) režim doziranja i svakih 9 nedelja za svaki 3-nedeljni (q3w) režim doziranja. Procene delimičnog odgovora (PR) i potpunog odgovora (CR) su potvrđene najmanje 4 nedelje nakon početne procene.

Progresija tumora ili krajnje tačke odgovora se procenjuju korišćenjem kriterijuma za procenu odgovora kod solidnih tumora (RECIST) v1.1.

[0654] Subjekti sa odgovorom stabilne bolesti (SD), PR ili CR na kraju datog ciklusa nastavljaju na sledeći ciklus lečenja. Subjektima je generalno dozvoljeno da nastave studijsku terapiju do prve pojave jednog od sledećih: 1) završetka maksimalnog broja ciklusa; 2) progresivne bolesti; 3) kliničkog pogoršanja koje sugeriše da nije verovatna dalja korist od lečenja; 4) nepodnošljivost na terapiju; ili 5) ispunjavanje kriterijuma za prekid studijske terapije.

Praćenje bezbednosti:

[0655] Po završetku studijske terapije, subjekti ulaze u period praćenja bezbednosti. Nakon posete na kraju lečenja (EOT), subjekti se procenjuju na sve nove neželjene događaje (AE) najmanje 100 dana nakon poslednje doze terapije. Kontrolne posete se dešavaju 30, 60. i 100. dana nakon poslednje doze ili datuma prekida. Subjekti (osim onih koji povuku saglasnost za učešće u studiji) obave 3 posete za praćenje kliničke bezbednosti bez obzira da li su započeli novu terapiju protiv kancera.

Praćenje preživljavanja:

[0656] Nakon završetka perioda praćenja bezbednosti, subjekti ulaze u period praćenja preživljavanja. Subjekti se prate otprilike svaka 3 meseca (12 nedelja) do smrti, propusta praćenja, povlačenja pristanka ili završetka studije, šta god se prvo dogodi. Trajanje ove faze je do 2 godine nakon prve doze ispitivanog leka.

Praćenje odgovora:

[0657] Nakon završetka perioda praćenja bezbednosti, svi subjekti sa aktuelnim SD, PR ili CR tokom EOT posete ulaze u period praćenja odgovora, koji se dešava istovremeno sa periodom praćenja preživljavanja. Ovi subjekti nastavljaju da imaju radiološke i kliničke procene tumora svaka 3 meseca (12 nedelja) tokom perioda praćenja odgovora ili do progresije bolesti ili povlačenja pristanka na studiju. Radiološke procene tumora za subjekte koji imaju aktuelnu kliničku korist nastavljaju da se prikupljaju nakon što subjekti završe fazu preživljavanja studije. Subjekti koji imaju progresiju bolesti nakon početnog kursa studijske terapije se ne procenjuju za odgovor nakon EOT posete i dozvoljeno im je da prime drugu terapiju usmerenu na tumor prema potrebi.

Trajanje studije:

[0658] Ukupno trajanje studije za svakog pojedinačnog ispitanika je približno 2 godine. Studija se završava kada poslednji subjekt završi svoju poslednju studijsku posetu, što je otprilike 4 godine nakon početka studije.

Broj subjekata:

[0659] Približno 225 subjekata će biti upisano, a oko 200 subjekata će biti lečeno u studiji.

Populacija studije:

[0660] Subjekti imaju najmanje 18 godina i imaju histološku ili citološku potvrdu maligniteta koji je uznapredovao (metastatski, rekurentan, refraktoran i/ili neresektabilan) sa merljivom bolešću prema RECIST v1.1.

Eskalacija doze i pravila za prekidanje

[0661] U delovima 1A, 2A, i 3A, korišćeni su BLRM i BLRM (-kopula) modeli za preporuke eskalacije doze nakon što informacije o DLT postanu dostupne za svaku kohortu subjekata. Odabir OX40.21 doze za narednu kohortu/dozni nivo uzima u obzir BLRM (-kopula) preporuku u vezi sa kliničkom preporukom i svim dostupnim PK, PD, i kliničkim i laboratorijskim bezbednosnim podacima za sve lečene subjekte.

Toksičnosti koje ograničavaju dozu

[0662] Da bi se vodila eskalacija doze, DLT se definišu na osnovu učestalosti, intenziteta i trajanja AE za koje nije identifikovan jasan alternativni uzrok. Period DLT je 28 dana od početka primene ispitivanog leka (lekova). Za upravljanje subjektom, AE koji ispunjava DLT kriterijume, bez obzira na ciklus u kojem se javlja, dovodi do prekida uzimanja ispitivanog leka. Subjekti koji se povuku iz studije tokom intervala evaluacije DLT-a iz razloga koji nisu DLT mogu biti zamenjeni novim subjektom na istom nivou doze. Učestalost DLT-a tokom perioda evaluacije DLT se koristi u odlukama o eskalaciji doze i za definisanje MTD. AE koji se javljaju nakon DLT perioda razmatraju se u svrhu definisanja MTD, ako se utvrdi da nemaju jasan alternativni uzrok i nisu u vezi sa progresijom bolesti. Subjekti koji iskuse DLT se ne leče ponovo ispitivanim lekom i ulaze u period praćenja bezbednosti studije. AE se ocenjuju u skladu sa zajedničkim terminološkim kriterijumima Nacionalnog instituta za kancer (NCI) za neželjene događaje (CTCAE) v4.03.

Nehematološka DLT:

[0663]

A. Hepatična DLT

o Bilo kakvo povišenje AST, ALT, ili ukupnog bilirubina ≥ stepena 3

o AST ili ALT stepena 2 sa simptomatskom inflamacijom jetre (npr. osetljivost gornjeg desnog kvadranta, žutica, pruritis)

o AST ili ALT > 3 × ULN i istovremeni ukupni bilirubin > 2 × ULN bez početnih nalaza holestaze (povišena serumska alkalna fosfataza [ALP]) (npr. nalazi u skladu sa Hi-ovim zakonom ili FDA definicijom potencijalnog oštećenja jetre izazvanog lekom ili pDILI)

B. Nehepatična DLT

o uveitis, episkleritis, ili iritis stepena 2 ili više

o bilo koji drugi bol u oku stepena 2 ili zamagljeni vid koji ne odgovara na topikalnu terapiju i ne poboljšava se do težine stepena 1 unutar 2 nedelje ili zahteva sistemsko lečenje

o pneumonitis, bronhospazam, neurološka toksičnost, reakcija hipersenzitivnosti, ili reakcija infuzije stepena 3 ili većeg

o nedermatološka, nehepatična toksičnost bilo kog stepena 3 ili većeg će se smatrati kao DLT sa sledećim specifičnim izuzecima:

o abnormalnosti elektrolita stepena 3 ili stepena 4 koje nisu komplikovane udruženim kliničkim neželjenim iskustvima, traju manje od 72 sata, i ili povlače se spontano ili reaguju na konvencionalnu medicinsku intervenciju

o mučnina, povraćanje ili dijareja stepena 3 koja traje manje od 72 sata, i ili se povlači spontano ili odgovara na konvencionalnu medicinsku intervenciju o povišenje amilaze ili lipaze stepena 3 ili 4 koje nije u vezi sa kliničkim ili radiografskim dokazom pankreatitisa

o izolovana groznica stepena 3 koja nije u vezi sa hemodinamskim kompromisom (npr. hipotenzija, klinički, ili laboratorijski dokaz narušene perfuzije krajnjih) o endokrinopatija stepena 3 koja je dobro kontrolisana zamenom hormona o razbuktavanje tumora stepena 3 (definisano kao bol, iritacija, ili osip koji se lokalizuje na mesta poznatog ili suspektnog tumora)

o umor stepena 3 manje od 7 dana

o infuziona reakcija stepena 3 koja se vraća na stepen 1 za manje od 6 sati o

Dermatološka DLT

[0664]

• osip stepena 4

• osip stepena 3 ukoliko nema poboljšanja (tj. rezultira sa ≤ stepena 1) nakon 1- do 2-nedeljnog odlaganja infuzije. Subjekti koji nisu iskusili kožne AE stepena 3 mogu da nastave lečenje u prisustvu kožne toksičnosti stepena 2.

Hematološka DLT

[0665]

• neutropenija stepena 4, koja traje ≥ 5 dana

• trombocitopenija stepena 4 ili stepena 3 sa klinički značajnim krvarenjem, ili bilo kojim zahtevom za transfuziju trombocita

• anemija stepena 4 koja nije objašnjena osnovnom bolešću

• febrilna neutropenija stepena 4

• febrile neutropenija stepena 3 koja traje > 48 sati

• hemoliza stepena ≥ 3 (tj. koja zahteva transfuziju ili medicinsku intervenciju kao što su steroidi)

Lečenje dodatnim ciklusima posle 24 nedelje

[0666] Subjekti su lečeni tokom 24 nedelje sem ako su kriterijumi za prekid studijskog leka ranije zadovoljeni. Subjekti koji završavaju otprilike 24 nedelje lečenja sa aktuelnom kontrolom bolesti (CR, PR, ili SD) su adekvatni za dodatne 24 nedelje studijske terapije u monoterapiji (deo 1) i kombinovanoj terapiji (delovi 2 i 3) posle početne 24 nedelje kada procena rizika/koristi favorizuje nastavak administracije ispitivane terapije. Nakon završetka dodatne 24 nedelje ispitivane terapije, subjekti ulaze u period praćenja bezbednosti.

Lečenje posle progresije

[0667] Lečenje nakon progresije je dozvoljeno kod odabranih subjekata sa početnom progresivnom bolešću definisanom RECIST v1.1 nakon što se utvrdi da procena koristi/rizika favorizuje nastavak administracije studijske terapije (npr. subjekti nastavljaju da doživljavaju kliničku korist, tolerišu lečenje i ispunjavaju druge kriterijume).

Ponovno lečenje

[0668] Ponovno lečenje je dozvoljeno ako se potvrdi progresija bolesti tokom perioda praćenja odgovora. Subjekti koji završavaju približno 24 nedelje (ili dodatne cikluse lečenja, ako je potrebno) lečenja koji su ušli u period praćenja odgovora sa tekućom kontrolom bolesti (CR, PR ili SD) bez ikakve značajne toksičnosti, podobni su za ponovno lečenje. Takvi subjekti su podobni za ponovno lečenje od slučaja do slučaja nakon procene i utvrđivanja da li odnos rizik/korist podržava administraciju dalje studijske terapije, a subjekt nastavlja da ispunjava kriterijume podobnosti za lečenje studijskom terapijom. Subjekti koji ispunjavaju kriterijume za ponovno lečenje leče se prvobitno dodeljenim režimom monoterapije ili kombinovane terapije (npr. istom dozom i rasporedom doza kao što su primenjivani tokom prve 24 nedelje), osim ako se naknadno utvrdi da ta doza i raspored premašuju MTD, u kom slučaju se subjekt leči sledećom nižom dozom koja se smatra podnošljivom/bezbednom

Kriterijumi za uključivanje

[0669]

1) Potpisana pismena saglasnost

a) Subjekt mora potpisati obrazac informisanog pristanka pre izvođenja bilo kakvih procedura u vezi sa studijom koje se ne smatraju delom SOC-a.

b) Saglasnost za uzorke biopsije tumora (obavezne biopsije pre i tokom tretmana su potrebne za kohorte sa ekspanzijom doze i za dodatne subjekte dodane u bilo koju od prethodno završenih kohorti sa eskalacijom doze i opciono za kohorte sa eskalacijom doze).

2) Ciljna populacija

Subjekti moraju da imaju najmanje 18 godina i da imaju histološku ili citološku potvrdu maligniteta koji je uznapredovao (metastatski, rekurentan, refraktoran i/ili neresektabilan) sa merljivom bolešću prema RECIST v1.1.

A. Eskalacija doze:

Subjekti mora da su primili, a zatim napredovali, ili su bili refraktorni ili netolerantni na najmanje 1 standardni režim lečenja u uznapredovalom ili metastatskom okruženju, ako takva terapija postoji. Subjekti koji ne ispunjavaju uslove za bilo koju standardnu terapiju mogu da se upišu pod uslovom da je njihova nepodobnost dokumentovana u medicinskoj dokumentaciji. Sledeće histologije tumora su dozvoljene osim za subjekte sa primarnim tumorima centralnog nervnog sistema (CNS) ili sa CNS metastazama kao jedinim mestom aktivne bolesti.

(i) Melanom: status BRAF mutacije mora biti dokumentovan ako je poznat.

(ii) NSCLC: EGFR, ALK, KRAS i ROS1 mutacijski status mora biti dokumentovan ako je poznat (iii) kancer glave i vrata ograničen na karcinom skvamoznih ćelija. HPV status mora biti dokumentovan ako je poznat

(iv) Karcinom prelaznih ćelija genitourinarnog trakta

(v) Karcinom bubrežnih ćelija

(vi) Adenokarcinom pankreasa

(vii) CRC: MSI, KRAS i BRAF status mora biti dokumentovan ako je poznat.

(viii) Kancer grlića materice: HPV status mora biti dokumentovan ako je poznat.

(ik) HER2, ER i PR status trostruko negativnog karcinoma dojke mora biti dokumentovan (k) Adenokarcinom endometrijuma

(ki) Kancer jajnika

(kii) Adenokarcinom prostate

(kiii) Hepatocelularni kancer - Child Pugh A samo

(kiv) Sitnoćelijski kancer pluća

(kv) Kancer želuca i gastričnog ezofagealnog spoja: HER2 status mora biti dokumentovan ako je poznat.

B. Ekspanzija doze: delovi 1B, 2B, 2C, i 3B

Sledeći tipovi tumora će biti dozvoljeni:

(a) Kancer grlića materice - deo 1B

(i) Histološki potvrđen kancer grlića materice koji je neresektabilan, metastatski ili rekurentan sa dokumentovanom progresijom bolesti

(ii) Dokumentovati HPV status tumora ako je poznat. Ako je nepoznat, subjekti moraju da pristanu da dozvole testiranje njihovog dostavljenog arhiviranog uzorka tumorskog tkiva (blok ili neobojena predmetna stakla).

(iii) Prethodni zahtev za terapiju:

1. Mora da su primili i potom napredovali ili su bili netolerantni ili otporni na najmanje 1 standardnu sistemsku terapiju, za metastatsku i/ili neresektabilnu bolest (npr. paklitaksel/cisplatin, paklitaksel/cisplatin/bevacizumab). Istovremena hemoterapija primenjena sa primarnim zračenjem i adjuvantnom hemoterapijom koja se daje nakon završetka terapije zračenjem ne računaju se kao sistemski režimi hemoterapije.

(b) Kolorektalni kancer - deo 2B

(i) Histološki potvrđen CRC koji je metastatski ili rekurentan sa dokumentovanom progresijom bolesti

(ii) Dokumentovati status MSI, MMR, KRAS i BRAF ako je poznat. Ako je nepoznat, subjekti moraju da pristanu da dozvole testiranje njihovog dostavljenog arhiviranog uzorka tumorskog tkiva (blok ili neobojena predmetna stakla).

(iii) Prethodni zahtev za terapiju:

Subjekti mora da su primili i zatim napredovali ili su bili netolerantni ili otporni na najmanje 1 standardnu sistemsku terapiju, za metastatsku i/ili neresektabilnu bolest (ili su napredovali u roku od 6 meseci od adjuvantne terapije).

(c) Kancer mokraćne bešike - deo 2C

(i) Histološki ili citološki potvrđen urotelijalni karcinom (uključujući mešane histologije urotelijalnog karcinoma sa elementima drugih podtipova) bubrežne karlice, uretera, mokraćne bešike, ili uretre sa progresijom ili refraktornom bolešću

(ii) Prethodni zahtev za terapiju:

Subjekti mora da su primili i zatim napredovali ili su bili intolerantni ili refraktorni na najmanje 1 standardni režim sistemske terapije (npr. hemoterapija na bazi platine) za lečenje metastatske (stadijum IV) ili lokalne uznapredovale neresektabilne bolesti.

(d) Jajnika - deo 3B

(i) Histološki ili citološki potvrđen karcinom jajnika (uključujući epitelni OC, primarni peritonealni, ili karcinom jajovoda) sa dokumentovanom progresijom bolesti

(ii) Dokumentovani status mutacija BRCA germinativne linije, ukoliko je poznat. Ukoliko je nepoznat, subjekti moraju da pristanu da dozvole testiranje njihovog dostavljenog arhiviranog uzorka tkiva tumora (blok ili neobojena predmetna stakla).

(iii) Prethodni zahtev za terapiju:

Subjekti mora da su primili i zatim napredovali ili su bili intolerantni ili refraktorni na najmanje 1 standardnu sistemsku terapiju (npr. hemoterapiju na bazi platine), za metastatsku i/ili neresektabilnu bolest.

3) Status učinka Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG - Eastern Cooperative Oncology Group) ≤ 1.

4) Prisustvo najmanje 1 lezije sa merljivom bolešću kako je definisano pomoću RECIST v1.1 za procenu odgovora. Subjektima sa lezijama u prethodno ozračenom polju kao jedinom mestu merljive bolesti je dozvoljeno da učestvuju pod uslovom da je lezija(lezije) prikazala jasnu progresiju i da se može tačno izmeriti.

5) Za subjekte kojima je potrebna sveža biopsija tumora, subjekti moraju imati najmanje jednu leziju koja je dostupna za biopsiju pre i tokom lečenja, pored minimalne jedne RECIST v1.1 merljive lezije potrebne za procenu odgovora. Ova lezija treba da se razlikuje od indeksne lezije (lezija) koja se procenjuje za radiološki odgovor.

6) Subjektima koji su prethodno bili izloženi terapiji bilo kojim agensom koji je specifično usmeren na inhibiciju putanje kontrolne tačke (kao što su anti-PD-1, anti-PD-Ll, anti-PD-L2, anti-LAG-3 i anti-CTLA-4 antitelo) je dozvoljeno nakon perioda ispiranja bilo kojeg vremena dužeg od 4 nedelje od poslednjeg tretmana

Napomena: (i) Subjekti koji su imali prethodne imuno-posredovane AE 1. do 2. stepena u vezi sa terapijom kontrolne tačke moraju imati potvrđen oporavak od ovih događaja u vreme ulaska u studiju, osim endokrinopatija lečenih suplementacijom, kao što je dokumentovano razrešenjem svih kliničkih simptoma s tim u vezi, abnormalnim nalazima pri fizičkom pregledu, i/ili povezanim laboratorijskim abnormalnostima. Tamo gde je primenljivo, ovi subjekti takođe moraju da imaju završenu terapiju steroidima za lečenje ovih AE najmanje 14 dana pre početka lečenja studijskom terapijom. (ii) Podobnost subjekata sa prethodnim imunim AE ≥ stepena 3 koji se odnose na terapiju kontrolnih tačaka, će se razmatrati od slučaja do slučaja nakon razgovora sa medicinskim nadzornikom (npr, dozvoljeno je upisivanje asimptomatskih izolovanih povišenja lipaze stepena 3 bez kliničkih ili radioloških karakteristika pankreatitisa).

7) Subjekti sa prethodnom terapijom bilo kojim agensom koji je specifično usmeren na puteve kostimulacije T-ćelija osim anti-OX40 antitelo, anti-CD137, anti-GITR antitelo i anti-CD27 su dozvoljeni nakon perioda ispiranja u bilo kom periodu dužem od 4 nedelje od poslednjeg tretmana.

8) Prethodna palijativna radioterapija mora biti završena najmanje 2 nedelje pre prve doze ispitivanog leka. Subjekti sa simptomatskim tumorskim lezijama na početku koji mogu zahtevati palijativnu radioterapiju u roku od 4 nedelje od prve doze ispitivanog leka se snažno ohrabruju da prime palijativnu radioterapiju pre upisa.

9) Subjekti upisani u kohorte za eskalaciju i ekspanziju doze moraju da pristanu na nabavku postojećeg tumorskog tkiva fiksiranog formalinom, ugrađenog u parafin (FFPE), bilo blok ili najmanje 15 neobojenih predmetnih stakala (poželjno 25 predmetnih stakala), za izvođenje korelativnih studija. Ako arhivirani uzorak nije dostupan, subjekt mora da pristane na biopsiju tumora pre lečenja. Subjekti koji nisu u mogućnosti da obezbede arhivirani uzorak tumora i koji ili ne pristanu na biopsiju tumora pre lečenja ili nemaju pristupačne lezije nisu kvalifikovani. (Međutim, subjekti čija biopsija pre lečenja daje neadekvatnu količinu ili kvalitet tkiva neće biti nekvalifikovani samo po ovoj osnovi). Za sve dodatne subjekte dodate u bilo koju od prethodno završenih kohorti sa eskalacijom doze, obavezne su biopsije pre i tokom lečenja.

10) Subjekti koji su uključeni u kohortu sa ekspanzijom doze ili dodati u bilo koju prethodno završenu kohortu sa eskalacijom doze, moraju da se podvrgnu obaveznim biopsijama pre i tokom lečenja uz prihvatljiv klinički rizik. (a) Uzorak tkiva solidnog tumora mora biti biopsija širokom iglom (core needle biopsy), eksciziona ili inciziona. Biopsije finom iglom, drenaža pleuralnog izliva pomoću citospinova ili biopsije klještima (punch biopsy) se ne smatraju adekvatnim za pregled biomarkera. Biopsije lezija kostiju koje nemaju komponentu mekog tkiva ili uzorci tumora dekalcifikovanih kostiju takođe nisu prihvatljivi. (b) Biopsirane lezije treba da se razlikuju od indeksnih lezija koje se procenjuju za radiološki odgovor

11) Adekvatna funkcija organa za subjekte kako je definisano pomoću sledećeg:

(a) Neutrofili ≥1500/µL (stabilni bez bilo kakvog faktora rasta unutar 4 nedelje od prve administracije ispitivanog leka)

(b) Trombociti ≥80 × 103/µL (transfuzija za postizanje ovog nivoa nije dozvoljena unutar 2 nedelje od prve administracije ispitivanog leka)

(c) Hemoglobin ≥8 g/dL (transfuzija za postizanje ovog nivoa nije dozvoljena unutar 2 nedelje od prve administracije ispitivanog leka)

(d) ALT i AST ≤3× gornja granica normale (ULN)

(e) Ukupni bilirubin ≤1.5 × ULN (izuzev subjekata sa Gilbert-ovim sindromom koji moraju imati normalni direktni bilirubin)

(f) Normalna funkcija štitne žlezde ili stabilna na hormonskoj suplementaciji po proceni istraživača

(g) Albumin ≥ 2 mg/dl

(h) Serumski kreatinin ≤1.5 × ULN ili klirens kreatinina (CrCl) ≥40 ml/min (mereno primenom Cockcroft-Gault formule prikazane ispod):

12) Sposobnost pridržavanja lečenja, prikupljanje PK i PD uzoraka, i potrebno studijsko praćenje Uzrast i reproduktivni status

[0670]

a) Muškarci i žene, uzrasta ≥ 18 godina u vreme informisanog pristanka.

b) Žene u reproduktivnom periodu (WOCBP - Women of childbearing potential) moraju imati negativni test na trudnoću iz seruma ili urina (minimalna senzitivnost 25

IU/L ili ekvivalentne jedinice humanog horionskog gonadotropina [hCG]) u roku od 24 sata pre početka ispitivanog leka.

c) Žene ne smeju dojiti.

d) WOCBP mora da pristane da će pratiti uputstva za postupak (postupke) kontracepcije tokom trajanja lečenja ispitivanim lekom OX40.21 plus 5 poluživota ispitivanog leka plus 30 dana. Ovo trajanje bi trebalo da bude 12 nedelja za subjekte iz 1. i 3. dela (50 dana plus 30 dana) ili 23 nedelje za subjekte iz dela 2 (130 dana plus 30 dana [trajanje ovulacionog ciklusa]), ukupno do 160 dana nakon završetka lečenja.

e) Muškarci koji su seksualno aktivni sa WOCBP moraju da pristanu da poštuju uputstva za postupak (postupke) kontracepcije tokom trajanja lečenja ispitivanim lekom OX40.21 plus 5 poluživota ispitivanog leka plus 90 dana. Trajanje bi trebalo da bude 20 nedelja za subjekte 1. i 3. dela (50 dana plus 90 dana) ili 31 nedelja za subjekte iz dela 2 (završetak 130 dana. Pored toga, muški subjekti moraju biti spremni da se uzdrže od donacije sperme tokom ovog vremena. f) Azoospermični muškarci su izuzeti od zahteva za kontracepciju. WOCBP koje kontinuirano nisu heteroseksualno aktivne takođe su izuzete od zahteva za kontracepciju, ali se i dalje podvrgavaju testiranju na trudnoću.

Kriterijumi za isključenje

[0671]

1) Izuzeci za ciljne bolesti

a) Subjekti sa poznatim ili suspektnim CNS metastastazama ili nelečenim CNS metastazama, ili sa CNS kao jedinim mestom bolesti, su isključeni. Međutim, subjektima sa kontrolisanim metastazama na mozgu je dozvoljeno da učestvuju. Kontrolisane metastaze na mozgu su definisane kao bez radiografske progresije tokom najmanje 4 nedelje nakon zračenja i/ili hirurškog tretmana (ili 4 nedelje posmatranja ukoliko nije klinički indikovana intervencija), i bez steroida tokom najmanje 2 nedelje, i bez novih ili progresivnih neuroloških znakova i simptoma.

b) Subjekti sa karcinomatoznim meningitisom

c) Za kancer jajnika:

i) subjekti sa kancerom jajnika sa istorijom opstrukcije creva u prethodnih 6 meseci ili sa Tenckhoff kateterom su isključni.

ii) do 4 prethodna tretmana protiv kancera su dozvoljena (tj. hemoterapija, radioterapija, hormonska ili imunoterapija). Ponovno pokretanje istog režima nakon odmora od leka može se smatrati jednim režimom; međutim, to bi se računalo kao dva režima ako bi se između njih koristio bilo koji drugi režim. ) Istorija bolesti i istovremene bolesti

a) Subjekti sa prethodnim malignitetom, drugačijim od onog koji je korišćen za upis u ovu studiju, dijagnostikovanim u roku od manje od 2 godine pre ulaska u studiju su isključeni (osim nemelanomskih kancera kože i in situ kancera poput bešike, debelog creva, grlića materice/displazije, melanoma ili dojke). Pored toga, kvalifikovani su subjekti sa ostalim drugim malignitetima dijagnostikovanim pre više od 2 godine koji su primili terapiju sa kurativnom namerom bez dokaza o bolesti tokom intervala za koje se smatra da predstavljaju nizak rizik za recidiv.

b) Drugi aktivni malignitet koji zahteva istovremenu intervenciju

c) Prethodni alograft organa

d) Prethodni tretman:

i) Prethodni tretmani protiv kancera su dozvoljeni (tj. hemoterapija, radioterapija, hormonska ili imunoterapija)

ii) Toksičnost (izuzev alopecije) koja se odnosi na prethodnu terapiju protiv kancera i/ili operaciju se mora ili razrešiti, vratiti na početnu vrednost ili stepen 1 ili smatrati ireverzibilnom

iii) Za citotoksične agense mora proći najmanje 4 nedelje između poslednje doze pre tereapije protiv kancera i početka studijske terapije

iv) Za necitotoksične agense najmanje 4 nedelje ili 5 poluživota (šta god je kraće) mora proći od poslednje doze prethodne terapije protiv kancera i započinjanja studijske terapije.

e) Prethodna terapija sa anti-OX40 antitelom

f) Isključeni su subjekti sa aktivnom, poznatom ili suspektnom autoimunom bolešću. Subjekti sa vitiligom, dijabetes melitusom tipa 1, rezidualnim hipotireoidizmom zbog autoimunog stanja koje zahteva samo nadoknadu hormona, eutireoidni subjekti sa istorijom Graves-ove bolesti (subjekti sa suspektnim autoimunim poremećajima štitaste žlezde moraju biti negativni na antitela na tireoglobulin i tiroidnu peroksidazu i tiroidni stimulirajući imunoglobulin pre prve doze ispitivanog leka), psorijazom koja ne zahteva sistemsko lečenje ili stanjima za koja se ne očekuje da će se ponoviti u odsustvu spoljašnjeg okidača su dozvoljeni za upis. Subjekti sa dobro kontrolisanom astmom i/ili blagim alergijskim rinitisom (sezonske alergije) su podobni.

g) Subjekti sa istorijom toksičnosti koja je opasna po život u vezi sa prethodnom imunoterapijom (npr. anti-CTLA-4 ili anti-PD-1/PD-L1 tretman ili bilo koje drugo antitelo ili lek koji specifično cilja kostimulaciju T-ćelija ili imune puteve kontrolnih tačaka) osim onih za koje je malo verovatno da će se ponovo javiti sa standardnim kontramerama (npr. zamena hormona nakon krize nadbubrežne žlezde)

h) Subjekti sa intersticijskom bolešću pluća koja je simptomatska ili koja može ometati otkrivanje ili upravljanje suspektne plućne toksičnosti koja je u vezi sa lekovima i) Hronična opstruktivna plućna bolest koja zahteva rekurentne nalete steroida ili hronične steroide u dozama većim od 10 mg/dan prednizona ili ekvivalenta

j) Subjekti sa stanjem koje zahteva sistemsko lečenje bilo kortikosteroidima (> 10 mg dnevno ekvivalenata prednizona) ili drugim imunosupresivnim lekovima u roku od 14 dana od administracije ispitivanog leka, osim za adrenalne zamenske doze steroida > 10 mg dnevno ekvivalenta prednizona u odsustvu aktivne autoimune bolesti. Napomena: Dozvoljeno je kratkotrajno lečenje steroidima (< 5 dana) do 7 dana pre započinjanja ispitivanog leka.

k) Nekontrolisana ili značajna kardiovaskularna bolest, uključujući, ali ne ograničavajući se na bilo šta od sledećeg:

i) Infarkt miokarda ili moždani udar/tranzitorni ishemijski napad u poslednjih 6 meseci

ii) Nekontrolisana angina pektoris u poslednja 3 meseca

iii) Bilo koja istorija klinički značajnih aritmija (kao što je ventrikularna tahikardija, ventrikularna fibrilacija ili torsades de pointes)

iv) Istorija drugog klinički značajnog srčanog oboljenja (npr. kardiomiopatija, kongestivna srčana insuficijencija sa funkcionalnom klasifikacijom III-IV Njujorškog udruženja za srce, perikarditis, značajan perikardni izliv)

v) Potreba, u vezi sa kardiovaskularnim oboljenjem, za svakodnevnom dodatnom terapijom kiseonikom

vi) QT interval korigovan za otkucaje srca korišćenjem Fridericijine formule (QTcF) produženje >480 msek

l) Istorija bilo kog hroničnog hepatitis dokazanog pomoću sledećeg:

i) Pozitivni test na površinski antigen hepatitisa B

ii) Pozitivan test na kvalitativno opterećenje virusom hepatitisa C (pomoću PCR) Napomena: Subjekti sa pozitivnim antitelom na hepatitis C i negativnim kvantitativnim hepatitisom C pomoću PCR su podobni. Istorija rešene infekcije virusom hepatitisa A nije kriterijum za isključenje. Dozvoljeno je dodatno testiranje ili zamensko testiranje po institucionalnim smernicama da bi se isključila infekcija. m) Dokaz aktivne infekcije koja zahteva sistemsku antibakterijsku, antivirusnu ili antifungalnu terapiju ≤ 7 dana pre početka terapije ispitivanim lekovima (ne odnosi se na virusne infekcije za koje se pretpostavlja da su u vezi sa osnovnim tipom tumora koji je potreban za ulazak u studiju)

n) Poznata istorija pozitivnih testova na HIV ili poznati sindrom stečene imunodeficijencije.

o) Dokaz ili istorija aktivne ili latentne tuberkulozne infekcije uključujući PPD koji je nedavno konvertovan u pozitivan; rendgenski snimak grudnog koša sa dokazom infektivnog infiltrata; nedavne neobjašnjive promene u šablonima groznica/jeza.

p) Svaka veća operacija u roku od 4 nedelje od administracije ispitivanog leka. Subjekti se moraju oporaviti od efekata velike operacije ili značajne traumatske povrede najmanje 14 dana pre prve doze ispitivanog leka.

q) Upotreba neonkoloških vakcina koje sadrže živi virus za prevenciju zaraznih bolesti u roku od 4 nedelje pre ispitivanog leka. Upotreba inaktiviranih vakcina protiv sezonskog gripa, na primer, Fluzone<®>, je dozvoljeno.

r) Primena transfuzije pRBC ili trombocita u roku od 2 nedelje pre prve doze ispitivanog leka

s) Poznato ili osnovno medicinsko ili psihijatrijsko stanje i/ili društveni razlog koji može učiniti administriranje ispitivanog leka opasnim za subjekte ili može negativno uticati na sposobnost subjekta da se pridržava ili toleriše studiju.

3) Alergija i neželjena reakcija na lek

a) Istorija alergije na nivolumab ili ipilimumab (delovi 2 i 3 samo, redom)

b) Istorija bilo koje značajne alergije na lek (kao što je anafilaksa ili hepatotoksičnost) na prethodne imunomodulacione terapije protiv kancera (npr. inhibitori kontrolne tačke, kostimulatorna antitela T-ćelija)

Procene studije:

[0672] Fizički pregledi, merenja vitalnih znakova, elektrokardiogrami sa 12 elektroda (EKG) i kliničke laboratorijske evaluacije se obavljaju u odabrana vremena tokom intervala doziranja. Subjekti se pažljivo prate zbog AE tokom čitave studije.

• Procene bezbednosti: se procenjuju tokom studije i 100 dana nakon poslednjeg tretmana.

AE se procenjuju prema NCI CTCAE v4.03. Subjekti se prate sve dok se svi AE koji su u vezi sa lečenjem ne vrate na početnu vrednost ili dok se ne smatraju ireverzibilnim.

• Procene efikasnosti: Procena bolesti pomoću CT i/ili MRI prema potrebi se vrši na početku i svakih 8 nedelja (± 1 nedelja) za q2w režime doziranja i svakih 9 nedelja (± 1 nedelja) za q3w režime doziranja, zatim svakih 12 nedelja tokom faza lečenja i praćenja odgovora do prestanka lečenja ili povlačenja iz studije. Procene tumora u drugim vremenskim tačkama se vrše ako postoje zabrinutosti zbog progresije tumora. Procena odgovora tumora se vrši prema RECIST v1.1 za subjekte sa malignim tumorima.

• Procene farmakokinetike i imunogenosti: Uzorci za procenu PK i imunogenosti se prikupljaju za subjekte koji primaju OX40.21 sam ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom. PK za OX40.21 je okarakterisan metodom nekompartmentalne analize (NCA). Uzorci za imunogenost se analiziraju na anti-OX40.21 antitela i/ili anti-nivolumab antitela i/ili anti-ipilimumab antitela validiranim imunotestovima.

• Eksplorativne procene biomarkera: Da bi se istražili potencijalni prediktivni markeri za klinički odgovor na OX40.21 u odnosu na dozu i PK, 3 vrste uzoraka su dobijene od svih subjekata za testiranje biomarkera: (i) puna krv, (ii) serum/plazma i (iii) tumorsko tkivo.

Statistička razmatranja

Određivanje veličine uzorka

Eskalacija doze:

[0673] Kao ispitivanje eskalacije doze faze 1, veličina uzorka za svaku kohortu sa eskalacijom doze zavisi od uočene toksičnosti i posteriornog zaključivanja. Približno 30 subjekata se leči tokom svakog dela eskalacije doze (OX40.21 monoterapija [Deo 1A], OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom [Deo 2A] i OX40.21 u kombinaciji sa ipilimumabom [Deo 3A]) za kombinovano ukupno oko 90 subjekata u delovima 1A, 2A i 3A. U početku, približno 3 subjekta se leče početnim nivoima doze OX40.21 ili OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom. Dodatne kohorte od približno 3 subjekta koji se mogu proceniti se leče na preporučenim nivoima doze prema preporukama BLRM (-Kopula) tokom faze eskalacije doze. Najmanje 6 subjekata sa DLT koja se može proceniti se leči pri MTD.

Ekspanzija doze:

[0674] Uopšteno govoreći, određivanje veličine faze ekspanzije je zasnovano na ciljnim stopama odgovora (ciljna ukupna stopa odgovora) i sposobnosti da se identifikuje signal za takav klinički odgovor koji je iznad standarda nege (istorijska ukupna stopa odgovora).

[0675] Približno 12 subjekata se leči u kohorti ekspanzije doze Deo 1B. Približno 35 subjekata je lečeno u kohorti sa ekspanzijom doze Deo 2B. Približno 27 subjekata je lečeno u kohorti sa ekspanzijom doze Dela 2C. Približno 35 subjekata je lečeno u kohorti sa ekspanzijom doze Deo 3B.

Krajnje tačke

Primarne krajnje tačke

[0676] Procena bezbednosti se zasniva na incidenci AE, ozbiljnih AE, AE koji dovode do prekida terapije i smrti. Pored toga, ispituju se abnormalnosti kliničkih laboratorijskih testova.

Sekundarne krajnje tačke

[0677] Efikasnost: Aktivnost protiv tumora OX40.21 zasebno i OX40.21 u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom je merena pomoću ORR, trajanja odgovora, i stope odgovora bez progresije (PFSR) na 24 nedelje zasnovano na RECIST v1.1. Gore navedeno je određeno na osnovu merenja tumora koja se dešavaju pri početnim vrednostima, svakih 8 nedelja (± 1 nedelja) tokom q2w doznih režima i svakih 9 nedelja (± 1 nedelja) tokom q3w doznih režima tokom perioda lečenja, i svaka 3 meseca (12 nedelja) tokom perioda praćenja preživljavanja.

• Najbolji celokupni odgovor (BOR) je procenjen prema RECIST 1.1 kriterijumima.

• ORR je procenat svih lečenih subjekata čiji je BOR ili CR ili PR.

• Trajanje odgovora, izračunato za sve lečene subjekte sa BOR od CR ili PR, je vreme između datuma prvog odgovora i datuma progresije bolesti ili smrti, šta god se desi prvo. • PFSR na 24 nedelje je definisana kao procenat lečenih subjekata koji su ostali bez progresije i koji su preživeli 24 nedelje. Procenat je izračunat Kaplan-Meier-ovom procenom, koja uzima u obzir cenzurisane podatke.

Farmakokinetika

[0678] Odabrani parametri, kao što su Cmaks, Tmaks, AUC(0-t), i AUC(TAU), su procenjeni u 2 ciklusa u zavisnosti od rasporeda monoterapije ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom. Parametri kao što su Ctau, CLT, Css-proseč, indeks akumulacije (AI), i efikasni poluživot eliminacije (T-HALFeff) su procenjeni u drugom ciklusu kada se prikuplja intenzivna PK.

Imunogenost

[0679] Sekundarni cilj imunogenosti se procenjuje pomoću učestalosti pozitivne ADA na OX40.21 ili nivolumab ili ipilimumab.

Istraživačke krajnje tačke

[0680] Istraživački ciljevi koji se odnose na OS se procenjuju stopom OS u određenom vremenskom trenutku (npr. 2 godine). Stopa OS je procenat subjekata koji su živi u tom vremenskom trenutku. OS za subjekta je definisano vreme od datuma prve doze ispitivanog leka do datuma smrti od bilo kog uzroka. Istraživački ciljevi u vezi sa biomarkerima se procenjuju promenom u odnosu na početnu vrednost ili merenjem nivoa početne vrednosti biomarkera u perifernoj krvi (npr. rastvorljivi faktori uključujući, ali ne ograničavajući se na, citokine i hemokine) ili tumorsko tkivo (npr. limfociti koji infiltriraju tumor).

[0681] Za subjekte sa višestrukim ECG merenjima, sledeći parametri su po izboru procenjivani: promene u ECG intervalima QT, QTc, QRS, i P-R intervalu od početne vrednosti.

Analize

[0682] Bezbednosne analize: Svi zabeleženi AE su navedeni i tabelarno prikazani prema klasi sistema organa, željenom terminu i lečenju. Vitalni znaci i rezultati kliničkih laboratorijskih testova su navedeni i sumirani prema tretmanu. Takođe se beleže svi značajni nalazi fizičkog pregleda i klinički laboratorijski rezultati. Procenjuju se EKG očitavanja i primećuju se abnormalnosti, ako postoje.

[0683] Analize efikasnosti: Spisak merenja tumora je dat prema subjektu i danu istraživanja u svakom odeljku i nivou doze. BOR pojedinačnog subjekta se navodi na osnovu RECIST-a 1.1. Da bi se opisala antitumorska aktivnost OX40.21 samog ili u kombinaciji sa nivolumabom ili ipilimumabom, izračunava se ORR. ORR i odgovarajući dvostrani 95% CI po Clopper-Pearson metodi su obezbeđeni po tretmanu i/ili nivou doze i tipu tumora. Medijana trajanja odgovora i odgovarajući dvostrani 95% CI su prijavljeni prema tretmanu i/ili nivou doze i tipu tumora. Trajanje odgovora je analizirano Kaplan-Meier metodom. Pored toga, PFSR, verovatnoća da subjekt ostane bez progresije ili da preživi do 24 nedelje, procenjuje se Kaplan-Meier metodologijom prema tretmanu, tipu tumora i nivou doze. Odgovarajući 95% CI je izveden na osnovu Greenwood-ove formule. OS je iscrtan korišćenjem Kaplan-Meier-ove metode. Prijavljeni su medijana OS i odgovarajući dvostrani 95% CI.

[0684] Farmakokinetičke analize: Svi pojedinačni PK parametri su navedeni za svaki analit, uključujući sva isključenja i razloge za isključenje iz sažetaka. Zbirna statistika je tabelarno prikazana za svaki PK parametar prema tretmanu. Geometrijske sredine i koeficijenti varijacije su predstavljeni za Cmaks, AUC(0-t), AUC(TAU), Ctau, CLT, Cssproseč (Cssavg) i AI. Medijane i opsezi su predstavljeni za Tmaks. Srednje vrednosti i standardne devijacije su predstavljene za sve ostale PK parametre (npr. T-HALFeff).

[0685] Zavisnost od doze OX40.21 se procenjuje u monoterapiji sa eskalacijom doze. Da bi se opisala zavisnost od doze OX40.21, dati su grafikoni rasejanja Cmaks, AUC(0-t) i AUC(TAU) u odnosu na dozu za svaki izmereni dan. Izvršena je eksploratorna procena proporcionalnosti doze na osnovu modela snage i CI oko koeficijenta snage. Koncentracije nivolumaba i ipilimumaba na kraju infuzije i najniže (Ctrough) koncentracije i najniža koncentracija OX40.21 su prikazane u tabeli prema tretmanu i danu studije korišćenjem zbirne statistike. Ovi podaci se takođe mogu objediniti sa drugim skupovima podataka za populacionu PK analizu.

[0686] Analiza imunogenosti: Svi dostupni podaci o imunogenosti su dati prema tretmanu, dozi i statusu imunogenosti. Određena je učestalost ispitanika sa procenom pozitivnog ADA za OX40.21, nivolumab i ipilimumab.

[0687] Eksploratorne analize biomarkera: Zbirna statistika za biomarkere i njihove odgovarajuće promene (ili procentualne promene) u odnosu na početne vrednosti su tabelarno prikazane prema planiranom danu studije i dozi u svakom odeljku. Vremenski tok mera biomarkera je predstavljen grafički. Ako postoji indikacija smislenog uzorka tokom vremena, vrši se dalja analiza (npr. linearnim mešovitim modelom) da bi se okarakterisao odnos. Metode kao što je, ali ne ograničavajući se na, logistička regresija, koriste se za istraživanje mogućih veza između mera biomarkera iz periferne krvi ili biopsije tumora i kliničkih ishoda.

TABELA 23: REZIME SEKVENCI

[0688] Tabela 23 obezbeđuje sekvence zrelih varijabilnih regiona i teških i lakih lanaca i naznačene su, sekvence sa signalnim peptidima.

Ekvivalenti:

[0689] Stručnjaci u oblasti će prepoznati, ili će biti u stanju da utvrde primenom samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente specifičnih tehničkih rešenja koja su ovde stavljena na uvid javnosti.

Claims (22)

Patentni zahtevi

1. Izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za humani OX40, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 318 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 94.

2. Antitelo iz patentnog zahteva 1, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 124 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 116.

3. Antitelo iz patentnog zahteva 1, pri čemu antitelo sadrži konstantne regione teškog i lakog lanca.

4. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu konstantnom regionu teškog lanca nedostaje C-terminalni lizin.

5. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu antitelo stimuliše antigen-specifičan T ćelijski odgovor.

6. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu se antitelo vezuje za rastvorljiv humani OX40 sa KD od 10 nM ili manje, kako je izmereno pomoću Biacore.

7. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, pri čemu se antitelo vezuje za celu ili deo sekvence DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) humanog OX40 (SEQ ID NO: 2).

8. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-7, koje je IgG1 izotip.

9. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, koje je humano antitelo.

10. Nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region teškog i lakog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9.

11. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 10.

12. Ćelija transformisana (i) ekspresionim vektorom iz patentnog zahteva 11 ili (ii) ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 i zesebnim ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 i nosač.

14. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 13, koja dalje sadrži najmanje jedan drugi agens protiv kancera.

15. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 14, pri čemu najmanje jedan drugi agens protiv kancera je odabran iz grupe koja se sastoji od: anti-PDl antitela i CTLA-4 antitela.

16. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9 za primenu u postupku lečenja kancera pri čemu postupak obuhvata administriranje antitela subjektu.

17. Farmaceutska kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 13-15 za primenu u postupku lečenja kancera pri čemu postupak obuhvata administriranje kompozicije subjektu.

18. Antitelo za primenu iz patentnog zahteva 16 ili kompozicija za primenu iz patentnog zahteva 17, pri čemu je kancer odabran iz grupe koja se sastoji od: kancera grlića materice, kolorektalnog kancera, kancera mokraćne bešike, i kancera jajnika.

19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9, i anti-PD-1 antitelo nivolumab za primenu u postupku lečenja kancera, pri čemu postupak obuhvata administriranje kompozicije subjektu.

20. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9, i anti-CTLA-4 antitelo ipilimumab za primenu u postupku lečenja kancera, pri čemu postupak obuhvata administriranje kompozicije subjektu.

21. Antitelo za primenu iz patentnog zahteva 16, pri čemu postupak dalje obuhvata administriranje anti-PD-1 antitela nivolumab subjektu.

22. Antitelo za primenu iz patentnog zahteva 16, pri čemu postupak dalje obuhvata administriranje anti-CTLA-4 antitela ipilimumab subjektu.