RS55609B1 - Fc fuzioni proteini koji sadrže nove linkere ili aranžmane - Google Patents

Description

Opispronalska

STANJE TEHNIKE

Korist mnogih terapeutika, posebno bioloških kao što su peptidi, polipeptidi i polinukleotidi trpi usled neadekvatnog serumskog polu-života. Ovo iziskuje primenu ovakvih terapeutika u učestalim i/ili visokim dozama, ili primenu formulacija sa produženim oslobađanjem, kako bi se u serumu održao nivo koji ima terapijske efekte. Cesta sistemska primena lekova povezana je sa značajnim neželjenim dejstvima. Na primer, česta sistemska primena inekcija povezana je sa značajnom nelagodom kod subjekata i predstavlja visok rizik za dobijanje infekcija povezanih sa administracijom koje mogu da zahtevaju hospitalizaciju ili česte posete bolnici, posebno kada se terapeutik primenjuje intravenski. Staviše, kod dugotrajnih terapija dnevne intravenske inekcije mogu dovesti do značajnih negativnih posledica usled pojave ožiljačnog tkiva i vaskularnih patologija kao posledica ponovljenog probijanja krvnih sudova. Slični problemi poznati su kod svih čestih primena terapeutika kao što su npr. administracija insulina dijabetičarima ili interferona pacijentima koji pate od multiple skleroze. Svi ovi faktori vode ka smanjenoj saglasnosti pacijenata i povećanim troškovima u zdravstvenom sistemu.

Jedan od načina za povećanje serumskog polu-života proteina je povezivanje za farmakokinetičke ostatke. Jedan tip farmakokinetičkog ostatka koji je u upotrebi je "Fc" domen antitela. Antitela se sastoje iz dva funkcionalno nezavisna dela, varijabilnog domena koji se označava kao "Fab", i koji vezuje antigen, i konstantnog domena koji se označava kao "Fc", koji je povezan sa efektorskim funkcijama kao što su aktivacija komplementa i napad fagocitnih ćelija. Fc domen ima dug serumski polu-život. Capon et al. (1989), Nature 337: 525-31. Kada je fuzionisan sa terapeutskim proteinom, Fc domen omogućava duži poluživot ili uključuje funkcije kao što je vezivanje Fc receptora, vezivanje proteina A, fiksaciju komplementa i čak možda i transfer kroz placentu.

Konjugati molekula koji poseduju sposobnost vezivanja baziranu na fibronektinu i drugi ostaci kao što su Fc domeni opisani su u WO 2009/083804 i US 2011/009323.

Ova patentna prijava nudi nove Fc fuzione proteine koji povećavaju serumski poluživot raznih terapeutika, polipeptida koji imaju povećan serumski polu-život i nukleinskih kiselina koje kodiraju pomenute peptide. Dodatno, ovde su opisane metode za povećanje serumskog poluživota terapeutika.

REZIME

Ova patentna prijava obezbeđuje polipeptide koji se sastoje iz imunoglobulinskog Fc domena i<10>Fn3 domena, gde je<10>Fn3 domen spojen sa C=terminusom Fc domena preko polipeptidnog linkera koji se sastoji iz amino-kiselinske sekvence koja je barem 90% identična sekvenci sa identifikacionim brojem (SEQ ID NO): 84 ili SEQ ID NO:86.

U jednom aspektu, polipeptid sadrži: (a)<10>Fn3 domen koji ima izmenjene amino-kiselinske sekvence u odnosu na sekvencu divljeg tipa, pri čemu<10>Fn3 domen vezuje ciljani molekul sa Kdmanjom od 500 nM; (b) imunoglobulinski Fc domen i (c) sekvencu zgloba.

U određenim prikazima, polipeptidi mogu da imaju sledeću organizaciju od N-terminusa ka C-terminusu: zglob-Fc domen-linker-<10>Fn3 domen.

U jednom primeru, polipeptide je dimer. Dimer je se preferencijalno formira povezivanjem disulfidnom vezom između slobodnih cisteinskih ostataka u regionu zgloba.

U određenim prikazima, polipeptid se dalje sastoji od drugog<10>Fn3 domena koji ima izmenjenu amino-kiselinsku sekvencu u odnosu na sekvencu divljeg tipa i gde drugi<10>Fn3 domen vezuje ciljani molekule sa Kn manjom od 500 nM. Dva<10>Fn3 domena mogu da vezuju iste ili različite molekule.

U određenim prikazima, FC domen polipeptida može da potiče od IgG, IgM, IgD, IgE ili IgA. U pojedinim prikazima koji su navedeni kao primeri, Fc domen potiče od IgG molekula kao što je IgGl.

U različitim prikazima, sekvenca šake i Fc domen mogu da potiču od istih ili različitih Tg izotipova.

U određenim primerima region zgloba sadrži ostatke 104-119 iz SEQ ID NO: 22 ili sekvencu koja ima barem 90% identičnosti tome.

Ova aplikacija obezbeđuje polipeptid koji se sastoji od imunoglobulinskog Fc domena i<10>Fn3 domena, pri čemu je<10>Fn3 domen spojen sa C-terminusom Fc domena preko polipeptidnog linkera koji se sastoji od amino-kiselinske sekvence koja je barem 90% identična SEQ TD NO: 84 ili SEQ TD NO:86 koje su izvedene iz C-terminalnog regiona repa teškog lanca membranski vezanog imunoglobulina.

U određenim primerima, polipetidni linker se sastoji od bilo koje od SEQ ID NO: 51-54 ili 63-65.

U određenim primerima, polipeptid sadrži dva 10Fn3 domena, pri čemu dva<10>Fn3 domena mogu da vežu za iste ili različite molekule.

U drugom aspektu, patentna prijava obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju Fc fuzione proteine koji su ovde prikazani. Takođe obezbeđuje i vektore, uključujući ekspresione vektore, koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od ovde opisanih Fc fuzionih proteina. Takođe, ovde su opisane i ćelije domaćini koje sadrže takve vektore i metode za proizvodnju ovde opisanih Fc fuzionih proteina u ćelijama domaćinima.

KRATAK OPISCRTEŽA

Slika 1. Inhibicija PCSK9:EGFA (levi panel) i PCSK9:ATI-972 (desni panel) PRD460 u FRET eseju.

Slika 2. Inhibicija PCSK9-indukovanog LDLR depletiranja sa površine HepG2 ćelija anti-PCSK9 Adnektinima.

Slika 3. Inhibicija ulaska PCSK9-AF647 u HepG2 ćelije anti-PCSK9 Adnektinima.

Slika 4. Nivo nevezanog hPCSK9 u plazmi transgenih miševa tretiranih PRD460 (doziranih i.p.).

Slika 5. Efekat PRD460 (15 mg/kg i.v.) na LDL-C i slobodni PCSK9 kod makaki majmuna (srednja vrednost +/- SEM, n=3).

Slika 6. Farmakokinetika PRD460 i ATI-1081 nakon intravenske administracije makaki majmunima.

Slika 7. Farmakokinetika PRD460 i Adn-1 nakon intravenske administracije makaki majmunima. Figure 8. Farmakokinetika C7FLFc, Adn-2 i Adn-3 nakon intravenske administracije makaki majmunima. Figure 9. Farmakokinetika Adn-1 kod makaki majmuna nakon intravenske i subkutane administracije.

Slika 10. Farmakokinetika PRD460, PRD461, PRD239, PRD713, Adn-1, Adn-4, Adn-5, Adn-6 i Adn-7 nakon intravenske administracije miševima.

Slika 11. Farmakokinetika C7FLFc, Adn-8, Adn-3 i Adn-9 nakon intravenske administracije miševima.

Slika 12. Farmakokinetika PRD239 i PRD713 nakon intravenske administracije miševima.

Slika 13. Farmakokinetika PRD460 nakon intravenske administracije C57B1/6 i "nude" miševima.

Slika 14. Farmakokinetika PRD460 i PRD461 PRD713 nakon intravenske administracije miševima.

Slika 15. Inhibicija BaF3 proliferacije C7FL-Fc.

Slika 16. Inhibicija PCSK9-indukovanog LDLR depletiranja sa površine HepG2 ćelija anti-PCSK9 Fc-<10>Fn3 fuzionim proteinima.

Slika 17. Inhibicija PCSK9-indukovanog LDLR depletiranja sa površine HepG2 ćelija anti-PCSK9 Fc-<10>Fn3 fuzionim proteinima.

Slika 18. Prosečan prinos visoko-prometnih eksprimiranih Fc-'°Fn3 proteina kod sisara.

Slika 19. Momomerni rezultat visoko-prometnih eksprimiranih Fc-<10>Fn3 proteina kod sisara.

Slika 20. Prosečan prinos ekspresije Fc-<10>Fn3 proteina na srednjoj skali.

Slika 21. Momomerni rezultat ekspresije Fc-<10>Fn3 proteina na srednjoj skali.

Slika 22. LC-MS podaci Fc-<10>Fn3 proteina eksprimiranih na srednjoj skali.

Slika 23. DSC podaci Fc-<10>Fn3 proteina eksprimiranih na srednjoj skali.

Slika 24. SPR senzogramski podaci za vezivanje Fc-<10>Fn3 proteina eksprimiranih na srednjoj skali za ciljane molekule.

Slika 25. Poređenje amino-kiselinske sekvence divljeg tipa humanog yl konstantog FC regiona (Fcl) sa varijantama Fc4 do Fcl7. ChIdomen humanog yl konstantog regiona nije deo Fc i stoga nije prikazan. Lokacije regiona zgloba, Ch2 domena i Ch3 domena su naznačene. Cisteinski ostaci koji su normalno uključeni u disulfidno vezivanje konstantnog regiona lakog lanca (LC) i konstantnog regiona teškog lanca (HC) su naznačeni. Znak "." označava identičnost divljem tipu na toj poziciji. Znak "-" označava prazninu koja je uključena u sekvencu kako bi se optimizovalo poravnavanje sekvenci. Prikazane se samo lokacije na kojima se Fc varijante razlikuju u odnosu na divlji tip, u suprotnom Fc sekvence se slažu sa prikazanom sekvencom divljeg tipa. Pozicije amino-kiselina u sekvenci označene su prema univerzalno prihvaćenom EU Indeksu za obeležavanje imunoglobulinskih proteina.

<***>označava lokaciju karboksi terminusa i uključena je kako bi se razjasnila razlika između karboksi terminusa Fc6 u odnosu na druge Fc verzije.

Slika 26. Poređenje amino-kiselinske sekvence divljeg tipa BALB/c mišijeg y2a konstantnog Fc regiona (mFcl) i divljeg tipa C57BL/6 mišijeg y2c konstantnog Fc regiona (mFc3) sa Fc varijantama bez efektorske funkcije mFc2 i mFc4. Lokacija regiona zgloba, Ch2 domena i Ch3 domena su naznačene. Cisteinski ostaci koji su normalno uključeni u disulfidno vezivanje konstantnog regiona lakog lanca (LC) i konstantnog regiona teškog lanca (HC) su naznačeni. Znak "." označava identičnost divljem tipu na toj poziciji. Znak "-" označava prazninu koja je uključena u sekvencu kako bi se poboljšalo poravnavanje sekvenci. Pozicije amino-kiselina u sekvenci označene su prema univerzalno prihvaćenom EU Indeksu za obeležavanje imunoglobulinskih proteina.

Slika 27. Imunogenost 1571G04-PEG kod makaki majmuna.

Slika 28. Imunogenost 1571G04-Fc kod makaki majmuna.

DETALJAN OPIS

Definicije

Kao "polipeptid" se označava bilo sekvenca od dve ili više amino-kiseline, bez obzira na dužinu, post-translacione modifikacije ili funkciju. „Polipeptidi", „peptidi" i „proteini" se ovde naizmenično upotrebljavaju. Polipeptidi mogu da uključuju prirodne amino-kiseline i neprirodne amino-kiseline kao one opisane u Američkom patentu sa brojem 6,559,126. Polipeptidi mogu biti modifikovani na bilo koji od različitih načina za standardnu hemijsku modifikaciju (npr. amino-kiselina može biti modifikovana zaštitnom grupom, karboksi-terminalna amino-kiselina može biti prevedena u terminalnu amidnu grupu; amino-terminalni ostatak može biti modifikovan grupama da se npr. poveća lipofilnost; ili polipeptid može biti hemijski glikozilovan ili drugačije modifikovan da bi mu se povećala stabilnost ili poluživotin vivo).Modifikacije polipeptida mogu da uključuju vezivanje neke druge strukture kao što je ciklično jedinjenje ili neki drugi molekul, a takođe može da uključuje i polipetide koji sadrže jednu ili više amino-kiselina izmenjene konfiguracije (npr. R ili S; ili L ili D).

Procenat (%) identičnosti amino-kiselinske sekvence ovde je definisan kao procenat amino-kiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koje su identične amino-kiselinskim ostacima izabrane sekvence, nakon poravnavanja (alajnmenta) sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvenci, i ne uzimajući u obzir bilo koju konzerviranu supstituciju kao deo identičnosti sekvenci. Alajnment u svrhu određivanja procenta identičnosti amino-kiselinske sekvence može se postići na više načina poznatih u oblasti, kao što je npr. primena javno dostupnih kompjuterskih softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ili Megalign (DNASTAR). Prosečni poznavaoci oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje alajnmenta, uključujući i algoritme potrebne da bi se postigao maksimalan alajnment ćelom dužinom amino-kiselinske sekvence koja se poredi.. Za ovde primenjivane svrhe, međutim, vrednosti procenta identičnosti amino-kiselinskih sekvenci su dobij ene na dole opisan način korišćenjem kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. ALIGN-2 program za poređenje sekvence autorsko je delo kompanije Genentech, Tnc. Korisnička dokumentacija predata je američkoj kancelariji za zaštiti autorskih prava, Vašington D.C., 20559 gde je zavedena pod registarskim brojem TXU510087 i javno je dostupna preko Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija. ALIGN-2 program treba da bude postavljen pod UNIX operativnim sistemom, preferencijalno digitalnim UNIX V4.0D. Svi parametri za poređenje sekvenci postavljeni od strane samog ALIGN-2 programa i ne variraju.

Za ove potrebe, % identičnosti amino-kiselinske sekvence date amino-kiselinske sekvence A u odnosu na daru amino-kiselinsku sekvencu B (što se alternativno može sročiti kao data amino-kiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti amino-kiselinske sekvence u odnosu na datu amino-kiselinsku sekvencu B) računa se na sledeći način: 100 puta razlomak X/Y gde je X broj amino-kiselinskih ostataka koji su bodovani kao identična poklapanja prema programu ALING-2 u alajnmenta A i B tim programom, i gde je Y ukupni broj amino-kiselinskih ostataka u B. U slučaju da dužina amino-kiselinske sekvence A nije jednaka dužini amino-kiselinske sekvence B, % identičnosti amino-kiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti % identičnosti amino-kiselinske sekvence B u odnosu na A.

Oznake ,,mpk", ,,mg/kg" ili „mg po kg" označavaju miligrame po kilogramu. Sve oznake se koriste naizmenično kroz predmetni pronalazak.

„Poluživot" polipeptida može da se uopšteno definisati kao vreme koje potrebno da bi se serumska koncentracija polipeptida smanjila za 50%in vivo,npr. usled degradacije polipeptida i/ili klirensa ili sekvestracije polipeptida prirodnim mehanizmima. Poluživot može da se odredi na bilo koji poznat način, kao što je farmakokinetička analiza. Odgovarajuće tehnike biće poznate prosečnom poznavaocu oblasti i mogu na primer da uključuju korake administracije odgovarajuće doze polipeptida glodani ili primatu; skupljanje uzoraka krvi ili drugih uzoraka od spomenutog primata u regularnim intervalima; određivanje nivoa ili koncentracije polipeptida u pomenutom uzorku krvi; i računanje (sa grafika) tako dobijenih podataka do vremena kada se nivo ili koncentracija polipeptida smanjila za 50% u odnosu na početni nivo nakon doziranja. Metode za određivanje polu-života mogu se naći na primer u Kenneth et al., Chemical Stabilitv of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists

(1986); Peters et al, Pharmacokinete analvsis: A Practical Approach (1996); i "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, koju je objavio Marcel Dekker, 2nd Rev. edition

(1982).

Poluživot može da se izrazi korišćenjem parametara kao što su tl/2-alfa, tl/2-beta, HLLambdaz, i površina ispod krive (AUC). U opisu predmetnog pronalaska, „povećanje polu-života" odnosi se na povećanje bilo koga od ovih parametara, bilo koja dva parametra, bilo koja tri parametra ili sva četiri parametra. „Povećanje poluživota" posebno se odnosi na povećanje tl/2-beta i/ili HL Lambda z, sa ili bez povećanja tl/2-alfa i/ili AUC ili oba. Drugi PK parametri koji mogu da se prate uključuju zapreminsku distribuciju (VD), klirens (CL) i srednje vreme zadržavanja (MRT). U predmetnoj patentnoj specifikaciji, „promena u farmakokinetici" se odnosi na promenu bilo kog od datih parametara, bilo koja dva parametra, ili sva tri parametra, uz prisustvo ili odsustvo promena parametara vezanih za polu-život prethodno navedenih.

Fc fuzioni proteini

Ova patentna prijava otkriva nove Fc fuzione proteine koji imaju poboljšanje osobine.

Patentna prijava obezbeđuje Fc-X fuzione proteine koje imaju nove linkere koji dodeljuju željene osobine kao što su povećana ekspresija, smanjena imunogenost i/ili povećana rezistencija na proteaze. Patentna prijava se takođe odnosi na nove skafold polipeptide fuzionisane sa Fc, bazirane na fibronektinu, koje imaju poboljšane farmakokinetičke osobine u poređenju sa njihovim neFc-fuzionisanim oblicima. Novi ovde opisane FC fuzionisani skafold polipeptidi bazirani na fibronektinu mogu da se dizajniraju tako da vezuju bilo koji cilj od interesa. U određenim primerima cilj je antigen, polipeptid ili terapijski protein od interesa. Primeri terapijski poželjnih ciljeva uključuju na primer, faktor nekroze tumora alfa (TNF-alfa), delta-slični protein 4 (DLL4), interleukin 17 (IL-17), proprotein konvertraze subtilizina keksinskog tipa 9 (PCSK9), pregnanski X receptor (PXR), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), insulinu-slične receptore faktora rasta tipa 1 (IGF-1R), receptore vaskulamog endotelijalnog faktora rasta (VEGFR2) i interleukin 23 (IL-23).

Fc-X fuzioni proteini sa novim linkerima

U mnogim slučajevima, Fc fuzioni proteini koji imaju uređenje Fc-X (npr. heterologi polipeptid je vezan za C-terminus Fc domena) sadrže povezujuću sekvencu koja razdvaja imunoglobulinski domen (Ig domen) od heterologog polipeptida. Ovi linkeri su obično veštački fleksibilni domeni kao što su GGGGS. Međutim, ove sekvence nisu prirodne i mogu da dovedu do neželjenih osobina kao što je imunogenost. Shodno tome, u jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje nove, poboljšane Fc fuzione proteine koristeći linker sekvence koje potiču od prirodno postojećih sekvenci antitela, uključujući prirodne alelne ili splajs varijante. Posebno, patentna prijava obezbeđuje nove Fc fuzione proteine koji imaju sledeći aranžman od N-terminusa ka C-terminusu: Fc-Li-X, gde Fc je Fc domen (kako je dalje opisano dole), Li linker sekvenca izvedena iz prirodne sekvence repa membranski vezane forme antitela, i X je<10>Fn3 domen. Linker će biti pozicioniran u Fc fuzionom proteinu u svom prirodnom kontekstu, tj. na svom prirodnom mestu u Ig CH3 sekvence CH4. Ovi prirodni linkeri obezbediće konstrukciju Fc fuzionih proteina sa linkerima različite dužine koji će biti u svom prirodnom kontekstu i stoga će verovatno posedovati željene osobine u odnosu na ekspresiju, imunogenost i/ili rezistenciju na proteaze.

Većina imunoglobulina postoji u solubilnoj i membranski vezanoj izoformi. Membranski vezana izoforma sastoji se od solubilne forme sa alternativno splajsovanim repom u CH3 ili CH4 domenu ka C-terminusu pre stop kodona. Rep membranski vezane izoforme sastoji se od linkera, trans-membranskog segmenta i intracelularnog segmenta. Određeni imunoglobulini, kao što je IgA, poseduju repni segment u sekretornoj formi koji takođe može da se koristi kao linker.

U jednom primeru, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzioni protein koji ima uređenje Fc-Li-X, gde je Li linker sekvenca izvedena iz repne sekvence segmenta membranski vezane forme imunoglobulina. Primerne linker sekvenci uključuju na primer: (i) repni region membranske duge izoforme IgAl ((mali.): SCSVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 51), (ii) repni region membranske varijante duge izoforme IgAl (malLsa ekstra cys): SCCVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 52), (iii) repni region membranske kratke izoforme IgAl (mals sa delecijom 6 N-terminalnih amino-kiselina): DWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 53) i (iv) repni region membranski vezane forme IgA2: SCCVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 54). Dalje, repni region membranski vezane forme IgD: YLAMTPLEPQSKDENSDDYTTFDDVGS (SEQ ID NO: 55), repni region membranski vezane forme IgE: ELDVCVEEAEGEAPW (SEQ ID NO: 56), repni region membranski vezane forme IgG: ELQLEESCAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 57), i repni region membranski vezane forme IgM EGEVSADEEGFEN (SEQ ID NO: 58) kao što je ovde opisano.

Dodatno, patentna prijava opisuje Fc fuzioni protein koji ima aranžman Fc-Li-X, gde je Li linker sekvenca izvedena iz repnog segmenta sekretorne ili solubilne forme imunoglobulina. Primeme linker sekvence uključuju na primer: (i) repni region solubilne forme IgAl: KPTHVNVSWMAEVDGTCY (SEQ ID NO: 59); (ii) repni region solubilne forme IgA2: KPTHVNVSVVMAEVDGTCY (SEQ ID NO: 60), (iii) repni region solubilne forme TgD: YVTDHGPMK (SEQ TD NO: 61) i (iv) repni region solubilne forme TgM:

PTLYNVSLVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 62).

U određenim prikazima može biti poželjno da linker sekvenca sadrži slobodne cisteinske ostatke kako bi se omogućilo formiranje disulfidnih veza između linkera čime bi se formirali dimeri Fc fuzionih proteina. U drugim prikazima, može biti poželjno da se linker sekvenca izmeni kako bi se uklonili slobodni cisteinski ostaci, npr. mutacijom jednog ili više cisteinski ostataka u linkeru nekim drugim ostacima kao što su serin, alanin ili glicin. Primeri linker sekvenci koje su izvedene iz repnog regiona membranski vezanih imunoglobulina koji su izmenjeni kako bi se uklonili slobodni cisteinski ostaci uključuju: (i) SXSVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, gde je X is serin, alanin ili glicin (SEQ ID NO: 63), (ii) SXXVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, gde je X nezavisno odabran između serina, alanina ili glicina (SEQ ID NO: 64), (iii) SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN, gde je X nezavisno odabran između serina, alanina ili glicina (SEQ ID NO: 65), (iv) ELDVXVEEAEGEAPW, gde je X serin, alanin ili glicin (SEQ ID NO: 66), i (v) ELQLEESXAEAQDGELDG, gde je X serin, alanin ili glicin (SEQ ID NO: 67). Primeri linker sekvenci izvedeni iz repnog regiona sekretorne forme imunoglobulina koje su izmenjene da bi se uklonili slobodni cisteinski ostaci uključuju: (i) KPTHVNVSWMAEVDGTXY, gde je X serin, alanin ili glicin (SEQ ID NO: 68), (ii) KPTHVNVSVVMAEVDGTXY, gde je X serin, alanin ili glicin (SEQ ID NO: 69), i (iii) PTLYNVSLVMSDTAGTXY, gde je X serin, alanin ili glicin (SEQ ID NO: 70).

U jednom prikazu, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzione proteine koji imaju uređenje Fc-Li-X, gde je Li linker sekvenca koja sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od amino-kiselinske sekvence koja sadrži, koja se suštinski sastoji od ili se sastoji od bilo koje od SEQ ID NO: 51-54 ili 63-65. U određenim prikazima, linker sekvenca ne sadrži ostatke cisteina. U određenim prikazima, linker sekvenca može biti produžena u dužinu ponavljanjem, povezivanjem u lanac ili kombinovanjem bilo koje od SEQ ID NO: 51-70 ili njihovih fragmenata.

U određenim prikazima, Fc-Li-X fuzioni proteini ovde prikazani mogu da imaju povećanu ekspresiju, smanjenu imunogenost i/ili povećanu rezistenciju na proteaze u odnosu na Fc fuzione proteine koji imaju drugačije linker sekvence. Na primer, ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor koji kodira Fc-Li-X fuzioni protein ovde obezbeđen može da obezbedi najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 75% ili 100% veću ekspresiju nego ekvivalentni Fc fuzioni protein koji poseduje linker sekvencu koja se ne nalazi u prirodi ili barem 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko ili 10-struko veći nivo ekspresije nego ekvivalentni Fc fuzioni protein koji poseduje linker sekvencu koja se ne nalazi u prirodi. U određenim prikazima, Fc-Li-X fuzioni protein obezbeđen ovde može da poseduje manju imunogenost u odnosu na ekvivalentni Fc fuzioni protein koji poseduje linker sekvencu koja se ne nalazi u prirodi. Imunogenost ovde opisanih polipeptida može biti procenjena, na primer nekom od sledećih metoda: Vezivanjem za humani leukocitni antigen („HLA"),in silicopredviđanjem vezivanja HLA (npr., upotrebom Epimatriks programa),in vitroaktivacijom humanih T-ćelija,in vivoimunim odgovorom životinja, ili drugim metodama za ocenu imunogenog potencijala. U drugim prikazima, Fc-Li-X fuzioni protein ovde obezbeđen može da poseduje povećanu rezistenciju na proteaze u odnosu na ekvivalentni Fc fuzioni protein koji poseduje linker sekvencu koja se ne nalazi u prirodi.

Fc-Li-X fuzioni proteini ovde opisani sadrže X deo koji je polipeptid koji sadrži<10>Fn3 domen, koji uključuje, na primer, polipeptid koji sadrži<10>Fn3 domen koji vezuje mete kao što su faktor nekroze tumora alfa (TNF-alfa), delta-slični protein 4 (DDL4), interleukin 17 (IL-17), proprotein konvetraze subtilizina keksinskog tipa 9 (PCSK9), pregnanski X receptor (PXR), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), insulinu-slične receptore faktora rasta tipa 1 (IGF-1R), receptore vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGFR2) i interleukin 23 (IL-23).

Skafold protein- Fc fuzije bazirane na fibronektinu

Ovde su opisani Fc fuzioni proteini koji sadrže Fc domen fuzionisan za polipeptid koji vezuje metu. Polipeptid koji vezuje metu može da potiče od molekula fibronektina ili tenascina ili može da bude sintetički molekul baziran na sekvencama i strukturi fibronektina ili tenascina. Polipeptidi koji mogu da se koriste u Fc fuzionim proteinima su opisani npr. u WO2010/051274, WO2010/051310 i WO2009/086116.

U jednom aspektu, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzione proteine koji se sastoje od Fc domena spojenog sa polipeptidom koji sadrži<10>Fn3 domen i sekvencu zgloba. Ovi fuzioni proteini se kolektivno ovde označavaju kao Fc-10Fn3 fuzije. U<p>rimernom prikazu, Fc-10Fn3 fuzioni protein ima sledeći aranžman od N-terminusa ka C-terminusu: zglob-Fc domen-L2-<10>Fn3, gde se zglob odnosi na imunoglobulinsku sekvencu zgloba kao što je opisano u daljem tekstu, Fc se odnosi na imunoglobulinski Fc domen, L2se odnosi na linker kao što je ovde dalje definisano, i 10Fn3 se odnosi na polipeptid koji sadrži<10>Fn3 domen. Fc-<10>Fn3 fuzioni proteini ovde opisani mogu da sadrže N-terminalni metionin i/ili lider sekvencu (npr. za ekspresiju u sisarskim ćelijama).

U određenim primerima, Fc-<10>Fn3 fuzioni proteini ovde opisani sadrže sekvencu zgloba, poželjno sekvencu zgloba koja sadrži slobodni cisteinski ostatak koji je sposoban da formira disulfidnu vezu tako da Fc-<10>Fn3 fuzioni protein formira dimer. Sekvenca zgloba može prirodno da sadrži cisteinski ostatak ili može da bude projektovana da sadrži jedan ili više cisteinskih ostataka.

Fc-<10>Fn3 fuzioni proteini ovde opisani mogu da sadrže imunoglobulinski deo zgloba. Region zgloba može da bude izveden iz antitela koja pripadaju bilo kojoj od imunoglobulinskih klasa tj. IgA, IgD, IgG ili IgM. U određenim primerima region zgloba izveden je iz bilo koje od potklasa IgG tj. IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4. U nekim tehničkim rešenjima region zgloba može dodatno da uključuje i ostatke izvedene iz CH1 i CH2 regiona koje flankiraju sekvence jezgra zgloba, kako je objašnjeno u daljem tekstu.

Ispod su prikazane sekvence konstantog regiona humanog IgGl imunoglobulina i relativna pozicija svakog domena unutar konstantog domena naznačene su na osnovu EU formata za numeraciju:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

VKD YFPEP VTVS JVNSGAL TSG VHTFPA VLQSSGLYS

LSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTWICPPCFAFELLGGPSVFL

FP

PKTKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY R

WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

Q QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 22). Jezgro regiona zgloba je podvučeno, a CH1 region je u italici; CH2 i CH3 regioni su označeni običnim tekstom. Treba naglasiti da je C-terminalni lizin opcioni. U određenim prikazima, C-terminalni lizin IgG sekvence može biti uklonjen ili zamenjen sa ne-lizinskom amino-kiselinom kao što je alanin kako bi se dalje povećao serumski polu-život Fc fuzionog proteina.

U određenim tehničkim rešenjima Fc-<10>Fn3 fuzioni proteini ovde opisani sadrže region zgloba izveden iz humanog IgGl. U nekim primerima, region zgloba sadrži centralne ostatke regiona zgloba koji obuhvataju pozicije 104-119 iz SEQ ID NO: 22

(DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 23) IgGl, što odgovara pozicijama 221-236 prema EU numeraciji.

U određenim prikazima, sekvenca zgloba može da uključi supstitucije koje dodeljuju željene farmakokinetičke, biofizičke i/ili biološke osobine. Neke primerne sekvence zgloba uključuju EPKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 24; podvučeno jezgro regiona zgloba), EPKSS DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 25; podvučeno jezgro regiona zgloba), EPKSS GSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 26; podvučeno jezgro regiona zgloba), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 27; podvučeno jezgro regiona zgloba), i DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 28, podvučeno jezgro regiona zgloba). U jednom prikazu, sekvenca zgloba izvedena iz IgGl regiona zgloba koji sadrži P122S supstituciju bazirano na numeraciji u SEQ ID NO: 22 (EU numeracija 238) (tj. prolin na poziciji 122 u SEQ ID NO: 22 zamenjen je serinom). Supstitucija P122S uklanja Fc efektorsku funkciju što je dato za primer u zglobma koje se imaju bilo koju od SEQ ID NO: 25, 26, i 28. U drugom prikazu, sekvenca zgloba izvedena iz IgGl zgloba koji sadrži D104G i K105S supstitucije bazirano na numeraciji u SEQ ID NO: 22 (EU numeracija 221-222). Supstitucije D104G i K105S uklanjaju potencijalna mesta za sečenje te stoga povećavaju rezistenciju na proteaze kod fuzionih molekula. Zglob koje ima D104G i K105S supstitucije data je za primer u SEQ ID NO: 26. U drugom prikazu, sekvenca zgloba je izvedena iz IgGl zgloba koji sadrži C103S supstituciju baziranu na numeraciji SEQ ID NO: 22 (EU numeracija 220). Supstitucija C103S sprečava nepravilno formiranje cisteinske veze u odsustvu lakog lanca. Zglobovi koji imaju C103S supstituciju date su za primer u SEQ ID NO: 24-26.

U jednom prikazu, patentna prijava obezbeđuje Fc-<10>Fn3 fuzioni protein, u kome sekvenca zgloba obuhvata, u suštini se sastoji od ili se sastoji od amino-kiselinske sekvence koja je najmanje 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 24-28, ili obuhvata, u suštini se sastoji ili se sastoji od bilo koje od amino-kiselinskih sekvenci od SEQ ID NO: 24-28. U drugom primeru, patentna prijava obezbeđuje Fc-<10>Fn3 fuzioni protein u kome deo zgloba sadrži barem 2, 5, 10,12, 15, 18 ili 20 kontinuiranih amino-kiselinskih ostataka iz bilo koje od SEQ ID NO: 24-28 ili sekvencu koja sadrži 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 2-5, 2-10, 2-15, 2-20, 5-10, 5-15, 5-20, 10-15, 10-20, ili 15-20 kontinuiranih amino-kiselinskih ostataka iz bilo koje od SEQ ID NO: 24-28. U primernim prikazima sekvenca zgloba sadrži cisteinski ostatak.

U određenim prikazima, Fc fuzioni protein ne sadrži zglob. Na primer, Fc fuzioni protein može da sadrži Fc domen povezan sa heterologim proteinom, npr. u Fc-X ili X-Fc formatu, bez centralnog regiona ili regiona zgloba. U jednom primeru, Fc fuzioni protein ne sadrži sekvencu EPKSSDKTHTCPPCP (SEQ TD NO: 89) ili varijantu iste.

Fc-'°Fn3 fuzioni proteini ovde opisani sadrže Fc domen, kako je opisano u daljem tekstu. U određenim prikazima, Fc domen i region zgloba mogu da budu izvedeni iz jedne od klasa ili potklasa antitela. Na primer, region zgloba i Fc domen mogu da potiču od IgGl. U drugim prikazima, Fc domen i region zgloba mogu da potiču od različitih klasa ili potklasa antitela. Na primer, Fc domen može da potiče od IgG2 ili IgG4, a region zgloba može da potiče od IgGl.

U određenim prikazima Fc-<10>Fn3 fuzioni protein ovde opisan ima uređenje zglob-Fc domen- L2-<10>Fn3, gde je L2linker koji povezuje Fc domen sa polipeptidom koji sadrži<10>Fn3 domen. U primernim prikazima, L2linker je izabran iz grupe koja se sastoji od: bilo koje od SEQ ID NO: 51-54, 63-65, 84 i 86. U drugim prikazima, L2linker obuhvata, u suštini se sastoji ili se sastoji od amino-kiselinske sekvence koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 51-54, 63-65, 84 i 86, ili obuhvata, u suštini se sastoji ili se sastoji od bilo koje amino-kiselinske sekvence od SEQ ID NO: 51-54, 63-65, 84 i 86. U određenim prikazima, sekvenca L2linkera ne sadrži ostatak cisteina. U određenim primerima, sekvenca linkera može biti produžena ponavljanjem, povezivanjem u lanac ili kombinacijom bilo kojih od SEQ ID NO: 33, 37-38, 45-70, 81-88 i 90-98, ili fragmenata istih.

Odgovarajući Fc domeni i polipeptidi koji sadrže<10>Fn3 domen za upotrebu u Fc-<10>Fn3 fuzionim proteinima opisani su u daljem tekstu.

U određenim prikazima, Fc-<10>Fn3 fuzioni proteini koji su ovde prikazani mogu da imaju povećan serumski poluživot u odnosu na<10>Fn3 domene bez Fc fuzije ili u odnosu na<10>Fn3 domen spojen sa drugim farmakokinetičkim ostacima, kao što je na primer polietilen glikolni (PEG) ostatak. Na primer, Fc-<10>Fn3 fuzioni protein ovde obezbeđen može da ima serumski poluživot koji je najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 75% ili 100% veći od ekvivalentnog<10>Fn3 domena bez Fc domena ili u odnosu na ekvivalentni 10Fn3 domen spojen sa različitim farmakokinetičkim ostacima, kao što je, na primer polietilen glikolni (PEG) ostatak. U određenim prikazima, Fc-<10>Fn3 fuzioni protein ovde obezbeđen može da ima serumski polu-život koji je najmanje 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko ili 10-struko veći od ekvivalentnog inFn3 domena bez Fc domena ili u odnosu na ekvivalentni<l0>Fn3 domen spojen sa drugim farmakokinetičkim ostacima, kao što je na primer polietilen glikolni (PEG) ostatak.

U određenim prikazima, Fc fuzioni protein, npr.<10>Fn3-Fc fuzioni protein je dimer, kod koga svaki monomer sadrži fuzioni protein (homodimer). U određenim prikazima, Fc fuzioni protein npr.<l0>Fn3-Fc fuzioni protein, je heterodimer koji sadrži npr., monomer koji sadrži Fc fuzioni protein i monomer koji sadrži FC koji nije povezan sa heterologim proteinom. Fc deo monomera može da sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina (ili mutacija) u odnosu na divlji tip Fc kako bi se favorizovalo formiranje dimera sa drugim Fc. Na primer, Fc dimer može da sadrži „rupu", a drugi Fc može da sadrži „izbočinu" ili „čvor" kao što je opisano, npr. u WO96/027011; US 5,731,168 i US 5,821,333. Druge modifikacije, kao što su elektrostatičke modifikacije mogu biti korišćene kako bi se poboljšalo formiranje dimera. Primerne modifikacije opisane su npr. u WO2007/l 10205; WO2009/089004 i WO2010/129304. Takve promene posebno su korisne za pojačavanje asocijacije dva heterologa monomera u formu dimera, tako da takav dimer sadrži monomer koji sadrži Fc npr. nedostatka heterologog proteina. Monomeri u okviru dimera mogu biti kovalentno i neko valentno povezani jedan sa drugim.

U određenim prikazima, Fc fuzioni protein sadrži monomer koji ima X-Fc strukturu i monomer koji ima Fc-X (ili Fc-Y) strukturu, i gde svaki monomer može opciono da sadrži linker i zglob.

Fc Domeni

Ovde u opisane polipetidne fuzije koje sadrže Fc deo spojen sa<10>Fn3 domenom.

Kako se ovde koristi „Fc deo" obuhvata domene izvedene iz konstantog regiona imunoglobulina, poželjno humanog imunoglobulina, uključujući i fragment, analog, varijantu, mutant i derivat konstantnog regiona. Pogodni imunoglobulini uključuju IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 i druge klase kao što su IgA, IgD, IgE i IgM. Konstantni region imunoglobulina definisan je kao prirodno postojeći ili sintetički proizveden polipeptid koji je homologan C-terminalnom regionu imunoglobulina, i može da uključuje CH1 domen, zglob, CH2 domen, CH3 domen ili CH4 domen, odvojeno ili u kombinaciji.

Konstantni region imunoglobulina je odgovoran za mnoge važne funkcije antitela uključujući vezivanje Fc receptora (FcR) i fiksaciju komplementa. Postoji pet glavnih klasa konstantnog regiona teškog lanca koje su klasifikovane kao IgA, IgG, IgD, IgE i IgM svaka sa karakterističnim efektorskim funkcijama koje su označene izotipovima. Na primer, IgG je podeljen na četiri potklase poznate kao IgGl, IgG2, IgG3, i IgG4.

Ig molekuli interaguju sa raznim klasama ćelijskih receptora. Na primer IgG molekuli interaguju sa 3 klase Fcy receptora (FcyR) specifičnih za IgG klasu antitela, naime FcyR, FcyRII, i FcyRIII. Pokazano je da su važne sekvence za vezivanje IgG za FcyR receptore locirane u CH2 i CH3 domenima. Serumski poluživot antitela pod uticajem je sposobnosti tog antitela da veže Fc receptor (FcR). Slično, serumski poluživot fuzionih proteina takođe je pod uticajem sposobnosti da vežu takav receptor (Gillies S D et al., (1999) Cancer Res. 59:2159-66).

Fuzioni proteini ovde prikazani sadrže Fc deo koji uključuje najmanje jedan deo karboksi-terminalnog imunoglobulinskog teškog lanca. Na primer, Fc deo može da sadrži CH2 domen, CH3 domen, CH4 domen, CH2-CH3 domen, CH2-CH4 domen, CH2-CH3-CH4 domen, zglob CH2 domen, zglob-CH2-CH3 domen, zglob-CH2-CH4 domen ili zglob-CH2-CH3-CH4 domen. Fc domen može da bude izveden iz antitela koja pripadaju bilo kojoj od imunoglobulinskih klasa tj. IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM ili bilo kojoj od IgG potklasa tj. IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4. Fc domen može da bude sekvenca koja se prirodno javlja, uključujući prirodne alelske ili splajs varijante. Alternativno, Fc domen može da bude hibridni domen koji sadrži deo Fc domena od dva ili više različitih Ig izotipova, na primer IgG2/IgG4 hibridni Fc domen. U primernim prikazima, Fc domen je izveden iz humanog imunoglobulinskog molekula. Alternativno, Fc domen može da bude humanizovana ili deimunizovana verzija Fc domena iz nehumanoidne životinje, uključujući bez ograničenja miša, pacova, zeca, kamilu, lamu, dvogrbu kamilu i majmuna.

U određenim prikazima, Fc domen je varijanta Fc sekvence npr. Fc sekvence koja je modifikovana (npr. supstitucijom amino-kiselina, delecijom i/ili insercijom) u odnosu na roditeljsku Fc sekvencu (npr. neizmenjeni Fc polipeptid koji je zatim modifikovan kako bi se generisala varijanta) da bi se dobile odgovarajuće strukturne osobine i/ili biološka aktivnost.

Na primer, neko može da modifikuje Fc region kako bi se generisala Fc varijanta koja ima (a) povećanu ili smanjenu ćelijama posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), (b) povećanu ili smanjenu citotoksičnost posredovanu komplementom, (c) povećan ili smanjen afinitet za Clq i/ili (d) povećan ili smanjen afinitet za Fc receptor u odnosu na roditeljski Fc. Takve varijante Fc regiona će generalno sadržati barem jednu amino-kiselinsku modifikaciju u Fc regionu. Kombinacija modifikacija amino-kiselina smatra se posebno poželjnom. Na primer, varijanta Fc regiona može da uključuje dve, tri, četiri, pet itd. supstitucija npr. na specifičnim pozicijama u okviru datog Fc regiona.

Varijanta Fc domena može da sadrži i alteracije u sekvenci pri čemu su mesta uključena u formiranje disulfidnih mostova uklonjena. Takvim uklanjanjem može se izbeći reakcija sa drugim proteinima koji su bogati cisteinom unutar ćelije domaćina koja se koristi za proizvodnju molekula predmetnog pronalaska. U svrhu toga, segmenti koji sadrže cistein sa N-terminusa mogu biti skraćeni ili cisteinski ostaci mogu biti izbrisani ili zamenjeni drugim amino-kiselinama (tj. alanil, seril). Čak i kada su cisteinski ostaci uklonjeni, jednolančani Fc domen može da formira dimerni Fc domen koji je povezan ne-kovalentno. U drugim prikazima, nativni Fc domen može biti modifikovan kako bi se načinio kompatibilni]im sa odabranom ćelijom domaćinom. Na primer, može se ukloniti PA sekvenca blizu N-terminusa koja je tipična za nativni Fc, koju mogu da prepoznaju digestivni enzimiE. colikao što je prolin iminopeptidaza. Može se dodati i N-terminalni metioninski ostatak, posebno kada se molekul eksprimira rekombinantno u bakterijskoj ćeliji kao što jeE. coli.U drugom prikazu, deo N-terminusa prirodnog Fc domena je uklonjen kako bi se spečila N-terminalna heterogenost kada je eksprimiran u izabranoj ćeliji domaćinu. U ovu svrhu, bilo koji od prvih 20 N-terminalnih amino-kiselinskih ostataka može biti izbrisano, a posebno one na pozicijama 1, 2, 3, 4 i 5. U drugim prikazima, jedno ili više mesta glikozilacije u okviru Fc domena može biti uklonjeno. Ostaci koji su tipično glikozilovani (npr. asparagin) mogu da daju citolitičku aktivnost. Takvi ostaci mogu da budu izbrisani ili supstituisani neglikozilovanim ostacima (npr. alanin). U drugim prikazima, mesta uključena u interakciju sa komplementom, kao što je mesto za vezivanje Clq , mogu biti uklonjena iz Fc domena. Na primer, sekvenca EEK humanog IgGl može biti izbrisana ili supstituisana. U određenim prikazima, mesta koja imaju uticaj na vezivanje za Fc receptor mogu biti uklonjena, poželjno druga mesta od onih mesta koja služe za vezivanje za spasilačke receptore. U drugim primerima, Fc domen može biti modifikovan kako bi se uklonilo mesto za ADCC. ADCC mesta su poznata u oblasti; videti na primer Molec. Immunol. 29 (5): 633-9

(1992) u odnosu na ADCC mesta na IgGl. Specifični primeri varijanti Fc domena stavljeni su na uvid javnosti u na primer WO 97/34631 i WO 96/32478.

U određenim prikazima, ovde opisani Fc fuzioni protein sadrži CH2 i CH3 regione humanog IgGl kao što je niže prikazano: VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YN

STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RD

ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD

KS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ TD NO: 31). Treba razumeti da su glicin i lizin na kraju SEQ ID NO: 31 opcioni. U drugim prikazima, Fc fuzioni protein koji je ovde opisan sadrži Fc domen koji je 50%, 60%, 75%, 80%), 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%o, ili 99% identičan SEQ ID NO: 31. U drugim prikazima, ovde opisani Fc fuzioni protein sadrži Fc domen koji ima najmanje 50, 100 ili 150 kontinuiranih amino-kiselina iz SEQ ID NO: 31. U dugim prikazima, ovde opisani Fc fuzioni protein sadrži Fc domen koji ima od 50-100, 50-150 ili 100-150 kontinuiranih amino-kiselina iz SEQ ID NO: 31. U još nekim prikazima, ovde opisani Fc fuzioni protein sadrži Fc domen koji sadrži SEQ ID NO: 31 sa od 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, ili 1-25 supstitucija ili konzervativnih supstitucija.

Dodatne Fc varijante su opisane niže u tekstu. Podrazumeva se da Fc region predmetne objave sadrži shemu numeracije prema EU indeksu datom u Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.).

Predmetna objava obuhvata varijante Fc delova koji imaju izmenjene osobine vezivanja za Fc ligande u odnosu na nemodifikovani Fc roditeljski molekul. Na primer, Fc fuzioni protein ovde opisan može da sadrži Fc region koji ima jedan ili više amino-kiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 zamenjen drugim amino-kiselinskim ostatkom, tako da varijanta Fc regiona ima izmenjen afinitet za efektorski ligand npr. FC receptor ili Cl komponentu komplementa kao što je opisano u američkim patentima sa brojevima 5,624,821 i 5,648,260, oba od Winter et al.

U drugom primeru, jedan ili više amino-kiselinskih ostataka 329, 331 i 322 može biti zamenjen tako da varijanta Fc regiona ima izmenjeno Clq vezivanje i/ili redukovanu ili ukinutu citotoksičnost posredovanu komplementom (CDC) kako je opisano u američkom patentu sa brojem 6,194,551 od Idusogie et al.

U još jednom primeru, jedan ili više amino-kiselinskih ostataka u okviru amino-kiselinskih pozicija 231 i 239 može biti izmenjeno da bi se na taj način izmenila sposobnost varijante Fc regiona da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljnije opisan u WO 94/29351 od Bodmer et al.

U još jednom primeru, Fc region može biti modifikovan kako bi se povećala ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i/ili kako bi se povećao afinitet za Fcy receptor modifikacijom jedne ili više amino-kiselina na sledećim pozicijama: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 ili 439. Primeme supstitucije uključuju 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, i 332E. Primerne varijante uključuju 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, i 267E/268F/324T. Druge modifikacije u cilju poboljšanja interakcija FcyR i komplementa uključuju ali nisu ograničene na supstitucije 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051, i 396-L. Ove i druge modifikacije date su u preglednom članku Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnologv 20:685-691.

Fc modifikacije koje pojačavaju vezivanje za Fc gama receptor uključuju modifikacije amino-kiselina na jednoj ili više amino-kiselinskih pozicija: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439 u okviru Fc regiona, pri čemu je numeracija ostataka u Fc regionu takva kao u EU indeksu u Kabat (WO00/42072).

Druge FC modifikacije koje mogu biti načinjene Fc-ovima u cilju redukcije ili ukidanja vezivanja za FcyR i/ili proteine komplementa, tako redukujući ili ukidajući Fc-posredovane efektorske funkcije kao što su ADCC, ADCP i CDC. Primerne modifikacije uključuju ali nisu ograničene na supstitucije, insercije ili delecije na pozicijama 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, i 328, pri čemu je numeracija data prema EU indeksu. Primerne supstitucije uključuju ali nisu ograničenae na 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, i 328R, pri čemu je numeracija data prema EU indeksu. Fc varijanta može da sadrži 236R/328R. Druge modifikacije u cilju redukcije interakcija FcyR i komplementa uključuju supstitucije 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, i 234V, kao i uklanjanje glikozilacije na poziciji 297 mutacijom ili enzimski ili proizvodnjom u organizmu kao što je bakterija koji ne glikoziluje proteine. Ove i druge modifikacije date su u preglednom članku Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.

Opciono, Fc region može da se sadrži amino-kiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi na dodatnim i/ili alternativnim pozicijama koje su poznate prosečnim poznavaocima oblasti (videti američke patentne sa brojevima 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 6,194,551; 7,317,091; 8,101,720; PCT Patentne objave WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 i WO 06/020114).

Fc varijante koje pojačavaju afinitet za inhibitorni receptor FcvRllb takođe mogu biti korišćene. Takve varijante mogu da obezbede Fc fuzioni protein sa imuno-modulatornom aktivnošću u odnosu na FcyRl lb<+>ćelije, uključujući na primer B ćelije i monocite. U jednom prikazu, Fc varijante obezbeđuju selektivno pojačan afinitet za FcvRllb u odnosu na jedan ili više aktivacionih receptora. Modifikacije koje menjanju vezivanje za FcvRllb uključuju jednu ili više modifikacija na pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, i 332, prema EU indeksu. Primerne supstitucije za povećavanje afiniteta za FcyRl lb uključuju ali nisu ograničene na 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, i 332E. Primerne supstitucije uključuju 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, i 328Y. Druge varijante za povećavanje vezivanja za FcyRl lb uključuju 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, i 267E/328F.

Afiniteti i vezujuća svojstva Fc regiona za svoje Ugande može biti određena raznovrsnimin vitroesejima (biohemijskim ili imunološkim esejima) poznatim u oblasti, uključujući ali ne ograničavajući se na ravnotežne metode (npr. enzimski povezan imunosorbentni esej (ELISA) ili radioimunoesej (RIA)) ili kinetiku (npr. BIACORE analiza) i druge metode kao što su indirektni eseji za vezivanje, kompetetivni eseji za inhibiciju, transfer fluorescentne rezonantne energije (FRET), gel elektroforeza i hromatografija (npr. gel filtracija). Ove i druge metode mogu da koriste obeleživače na jednoj ili više ispitivanih komponenti i/ili koriste raznovrsne metode detekcije koje uključuju ali nisu ograničene na hromogene, fluorescentne, luminiscentne ili izotopske obeleživače. Detaljan opis afiniteta vezivanja i kinetike može se naći u Paul, W. E., ed., Fundamental Immunologv, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), koja se fokusira na antitelo-imunogen interakcije.

Fc fuzioni protein iz predmetne objave može takođe da sadrži Fc deo koji povećava serumski poluživot Fc-fuzionog proteina. Na primer, ovo može da se izvede povećanjem afiniteta vezivanja Fc regiona za FcRn. Na primer, jedan ili više sledećih ostataka može biti mutirano: 252, 254, 256, 433, 435, 436, kao što je opisano u Uameričkom patentu sa brojem 6,277,375.

Druge primerne varijante koje pojačavaju vezivanje za FcRn i/ili poboljšavaju farmakokinetičke osobine uključuju supstitucije na pozicijama 259, 308, 428, i 434, uključujući na primer 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, i 434M. Druge varijante koje pojačavanju vezivanje Fc za FcRn uključuju: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250O/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001 , 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dali Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171 -5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281 :23514-23524). Druge modifikacije za modulaciju vezivanja za FcRn opisane su u Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671. U određenim prikazima, mogu biti korišćeni hibridni IgG izotipovi sa posebnim biološkim karakteristikama. Na primer, IgGl/IgG3 hibridna varijanta može biti konstruisana supstituisanjem IgGl pozicija u CH2 i/ili CH3 regionu amino-kiselinama iz IgG3 na pozicijama gde se ti izotipovi razlikuju. Dakle, hibridna varijanta IgG antitela može biti konstruisana tako da sadrži jednu ili više supstitucija npr. 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, i 436F. U drugim prikazima predmetnog pronalaska, IgGl/IgG2 hibridna varijanta može biti konstruisana supstituisanjem IgG2 pozicija u CH2 i/ili CH3 regionu amino-kiselinama iz IgGl na pozicijama gde se ti izotipovi razlikuju. Dakle, hibridna IgG varijanta antitela može biti konstruisana tako da sadrži jednu ili više supstitucija npr. na jednoj ili više od sledećih amino-kiselinskih supstitucija: 233E, 234L, 235L, -236G (odnosi se na insertovanje glicina na poziciju 236), i 327A.

U određenim prikazima, glikozilacija Fc je modifikovana. Oligosaharidi koji su kovalentno vezani za Fc region mogu biti izmenjeni, na primer ekspresijom IgG u različitim organizmima ili ćelijskim linijama, konstruisanim ili drugačije (na primer Lec-13 CHO ćelije ili pacovske hibridomske YB2/0 ćelije), regulacijom enzima uključenih u puteve glikozilacije (na primer FUT8 [al,6-fukoziltranferaza] i/ili pi-4-N-acetilglukosaminiltransferasa III [GnTIII]), modifikacijom ugljenih hidrata nakon ekspresije IgG ili ekspresijom Fc fuzionog proteina u prisustvu fukoznih analoga kao enzimskih inhibitora. Druge metode za modifikaciju glikoformi Fc fuzionih proteina uključuju glikoprojektovane sojeve kvasca (Li et al, 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), mahovina (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8), i biljaka (Cox et al, 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591 -7). U jednom prikazu, Fc fuzioni proteini su glikoprojektovani tako da se je izmenjen nivo sijalilacije. Viši nivoi sijalilovanih Fc glikana u Fc molekulima može negativno da utiče na funkcionalnost (Scallon et al., 2007, Mol Immunol. 44(7): 1524-34), i razlike u nivou Fc sijalilacije mogu da za rezultat daju modifikovanu anti-inflamatornu aktivnost (Kaneko et al., 2006, Science 313:670-673). Nivo glikozilacije Fc molekula može da bude modifikovan specifičnim mutacijama. Na primer, mutacija na amino-kiselinskim pozicijama 297 ili 299 uklanja glikozilaciju na poziciji 297. takvi mutanti mogu biti korišćeni sa Fc fuzionim proteinima.

Druge modifikacije koje mogu da budu korišćene u Fc fuzionim proteinima uključuju one opisane u WO88/07054, WO88/07089, US 6,277,375, WO99/051642, WO01/058957, WO2003/074679, WO2004/029207, US 7,317,091 i WO2004/099249.

Šta više, sledeće Fc varijante mogu biti takođe korišćene za Fc deo Fc fuzionog proteina kako je ovde opisano. Slika 25 pokazuje poređenje divljeg tipa humanog yl konstantog Fc regiona (humani IgGl Fc: označen kao Fcl na slici 25) sa Fc4 (SEQ ID NO: 99), Fc5 (SEQ ID NO: 100), Fc6 (SEQ ID NO: 101), Fc7 (SEQ ID NO: 102), Fc8 (SEQ ID NO: 103), Fc9 (SEQ ID NO: 104), FclO (SEQ ID NO: 105), Fcll (SEQ ID NO: 106), Fcl2 (SEQ ID NO: 107), Fcl3 (SEQ ID NO: 108), Fcl4 (SEQ ID NO: 109), Fc-15 (SEQ ID NO: 110), Fcl6 (SEQ ID NO: 111), Fcl7 (SEQ ID NO: 112), Fcl8 (SEQ ID NO: 113), Fcl9(SEQ ID NO: 114), Fc21 (SEQ ID NO: 115), Fc22 (SEQ ID NO: 116), Fc23 (SEQ ID NO: 117). U nekim aspektima, Fc fuzioni protein koji je ovde opisan sadrži Fc domen koji ima najmanje 50, 100 ili 150 kontinuiranih amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 99-117. U drugim prikazima, Fc fuzioni protein ovde opisan sadrži Fc domen koji ima od 50-100, 50-150 ili 100-150 kontinuiranih amino-kiselina SEQ ID NO: 99-117. U nekim drugim prikazima, Fc fuzioni protein ovde opisan sadrži Fc domen koji sadrži SEQ ID NO: 99-117 sa 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, ili 1-25 supstitucija ili konzervativnih supstitucija. Sekvencu humanog divljeg tipa yl konstantnog regiona prvi put je opisala grupa Liroja Huda u Ellison et al., Nucl. Acids Res. 10:4071 (1982). Pozicije 356, 358 i 431 po EU indeksu definišu Glmyl haplotip. Sekvenca divljeg tipa ovde prikazana je od Glm(l), na pozicijama 356 i 368 i nGlm(2) na poziciji 431, haplotip.

Fc4 varijanta sadrži yl region zgloba, ali Arg 218 je uveden u region zgloba kako bi se uključila sekvenca koju prepoznaje restrikcioni enzim BgTIT čime je omogućeno kloniranje. Cys 220 je Cys ostatak koji formira disulfidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca u intaktanom imunoglobulinskom IgGl proteinu. Fc4 takođe uključuje supstituciju Ser za Cys kako bi se sprečili štetni efekti usled potencijalnog prisustva nesparene sulfhidrilne grupe. CH2 region Fc4 baziran je na yl CH2 i sadrži tri amino-kiselinske supstitucije koje redukuju vezivanje za Fc y receptor T (FcRyl). Ove supstitucije su na pozicijama 234, 235 i 237 po EU indeksu. Ove supstitucije opisala je grupa Grega Vintera u Duncan et al., Nature 332:563 (1988) i u tom raduje pokazano da smanjuju vezivanje za Fc y RI.

Dve amino-kiselinske supstitucije na mestu za vezivanje Clq komplementa uvedene su kako bi se redukovala fiksacija komplementa. Ove supstitucije su na pozicijama 330 i 331 po EU indeksu. Važnost, ili relevantnost, pozicija 330 i 331 za vezivanje Clq komplementa (ili nedostatak fiksacije ili aktivacije komplementa) opisala je grupa Seri Morison u Tao et al, J. Exp. Med. 178:661 (1993) i Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991). CH3 region Fc4 varijante ostaje isti kao kod divljeg tipa yl Fc.

Fc5 je varijanta Fc4. U Fc5 regionu zgloba Arg 218 supstitucija je vraćena u Lys 218 ostatak kao kod divljeg tipa. Fc5 sadrži istu supstituciju Cys 220 u Ser kao što je opisano za Fc4. Fc5 sadrži iste CH2 supstitucije kao i Fc4, i CH2 region Fc5 identičan je divljem tipu yl Fc.

Fc6 varijanta sadrži iste supstitucije u regionu zgloba kao Fc5 i sadrži iste CH2 supstitucije kao Fc4. CH3 region Fc6 ne sadrži karboksi terminalni ostatak lizina. Ovaj konkretni Lys ostatak nema dodeljen EU indeksni broj. Ovaj lizin je u različitoj meri uklonjen sa zrelih imunoglobulina i stoga dominantno nije nađen na cirkulišućim antitelima. Odsustvo ovog ostatka na rekombinantnom Fc fuzionom proteinu može da rezultuje u homogenijem proizvodu.

Fc7 varijanta identična je divljem tipu yl Fc u regionu zgloba. Njegov CH2 region baziran je na yl CH2, ali mesto vezivanja N-vezanih ugljenih hidrata na ostatku Asn-297 izmenjen je u Gln kako bi se dobio deglikozilovani Fc. (videti npr. Tao and Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595-2601). CH3 region identičan je divljem tipu yl Fc.

Fc8 varijanta ima region zgloba koji je identičan Fc4 i oba CH2 i CH3 regiona identična odgovarajućem divljem tipu yl Fc regiona.

Fc9 varijanta sadrži skraćen yl zglob počevši od Asp ostatka koji je karboksi terminalanan uodnosu na Cys ostatak koji je uključen u disulfidno vezivanje sa lakim lancem. Ostatak sekvence zgloba identičan je divljem tipu yl zgloba. Sekvence oba CH2 i CH3 regiona identične su odgovarajućem divljem tipu yl Fc regiona.

FclO varijanta sadrži iste supstitucije u regionu zgloba kao Fc5. Sekvence oba CH2 i CH3 regiona identične su odgovarajući regionima za divlji tip yl Fc.

Fcll varijanta sadrži iste supstitucije u regionu zgloba kao Fc5. Njegov CH2 domen baziran je na yl CH2, ali sadrži supstitucije kako bi se smanjilo vezivanje za Fcy receptor (supstitucije na EU indeksnim pozicijama 234, 235 i 237). Fcl 1 je divlji tip za Clq vezivanje i fiksaciju komplementa. CH3 domen Fcl 1 identičan je divljem tipu yl CH3.

Fcl2 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, i Cys 229 Ser supstitucijama, ima CH2 domen koji je identičan Fc5 i ima divlji tip yl CH3 domen.

Fcl3 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, i Cys 229 Ser supstitucijama, ima CH2 domen identičan onom kod Fc5 i ima divlji tip yl CH3 sa Tyr 407 Gly supstitucijom.

Fcl4 varijanta sadrži yl zglo sa Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, i Cys 229 Ser supstitucijama, ima divlji tip yl CH2 i ima divlji tip yl CH3 sa Tyr 407 Gly supstitucijom. Fcl5 varijanta sadrži y4 zglob sa Ser 228 Pro supstitucijom kako bi se smanjila IgG4 "Fab izmena", i ima divlji tip y4 CH2 i CH3 domene.

Fcl6 varijanta sadrži yl zglob koja sadrži Cys 220 Ser supstituciju, ima CH2 domen identičan yl CH2, i ima CH3 domen identičan divljem tipu y4 CH3.

Fcl7 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser supstitucijom, ima yl CH2 domen sa Phe 243 Ala supstitucijom, i ima CH3 domen identičan divljem tipu yl CH3.

Fcl8 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser supstitucijom, ima yl CH2 domen identičan divljem tipu yl CH2 i sadrži yl CH3 sa His 435 Ala supstitucijom.

Fcl9 varijanta sadrži zglob identičan sa Fc5, ima CH2 domen identičan Fc5, osim što je N-vezano mesto za vezivanje ugljenih hidrata na ostatku Asn-297 izmenjeno u Gln kako bi se dobio deglikozilovani Fc, i ima CH3 domen identičan divljem tipu yl CH3.

Fc21 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, i Cys 229 Ser supstitucijama, ima CH2 domen identičan Fc5 i ima yl CH3 sa Phe 405 Ala i Tyr 407 Gly supstitucijama.

Fc22 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, i Cys 229 Ser supstitucijama, ima CH2 domen identičan FC1 i ima yl CH3 sa Phe 405 Ala i Tyr 407 Gly supstitucijama.

Fc23 varijanta sadrži yl zglob sa Cys 220 Ser supstitucijom, ima yl CH2 domen sa Leu 234 Ala, Leu 235 Glu, Pro 331 Ser supstitucijama, i CH3 domen identičan divljem tipu yl Fc.

Slika 26 prikazuje alajnment dodatnih Fc varijanti koje mogu biti korišćene kao Fc deo ovde opisanih Fc fuzionih proteina. Slika 26 prikazuje poređenje amino-kiselinskih sekvenci divljeg tipa BALB/c mišijeg y2a konstantog regiona Fc (mFcl; SEQ ID NO: 118) i divljeg tipa C57BL/6 mišijeg y2c konstantog regiona Fc (mFc3; SEQ ID NO: 1198) sa dve mišije Fc varijante mFc2 (SEQ ID NO: 120) i mFc4 (SEQ ID NO: 121), koje imaju slabu do nikakvu efektorsku funkciju. Divlji tip C57BL/6 y2c inicijalno je izolovan i sekvenciran ranih 1980-tih i poznat je kao mišiji y2a,balotip (Schreier et al. PNAS 78:4495 (1981)). Dalja poređenja analiza sekvenci pokazale su da taj gen zapravo odgovara mišijem y2c (Fukui et al, J. Mol. Cell. Immunol. 1:321 (1984) i Morgado et al, EMBO J. 8:3245 (1989)). Treba napomenuti da nekoliko različitih alotipova postoji za obe y2a i y2c sekvence. Sekvenca mFcl odgovara pristupnom broju u banci gena V00825 dok sekvenca mFc3 odgovara pristupnom broju u banci gena Y10606.

U nekim aspektima, Fc fuzioni protein ovde opisan sadrži Fc domen koji ima najmanje 50, 100 ili 150 kontinuiranih amino-kiselina iz bilo koje od SEQ ID NO: 118-121. U drugim prikazima, Fc fuzioni proteini ovde opisani sadrže Fc domen koji ima od 50-100, 50-150 ili 100-150 kontinuiranih amino-kiselina iz SEQ ID NO: 118-121. U nekim drugim prikazima, Fc fuzioni proteini ovde opisani sadrže Fc domen koji sadrži SEQ ID NO: 118-121 sa od 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, ili 1-25 supstitucija ili konzervativnih supstitucija.

mFcl varijanta sadrži divlji tip BALB/c mišiji y2a Fc.

mFc2 varijanta sadrži BALB/c mišiju y2a zglob sa Gly 219 Ser supstitucijom. mFc2 CH2 domen sadrži amino-kiselinsku supstituciju u odnosu na mišiji divlji tip y2a na poziciji 235 (Leu u Glu) kako bi se inaktiviralo vezivanje za FcyRI i FcyRII kao što je opisano u Duncan et al., Nature 332:563 (1988) i Zheng et al., J Immunol. 163:4041 (1999). Tri dodatne promene su napravljene na Clq mestu za vezivanje komplementa kako bi se redukovala fiksacija komplementa na pozicijama 318, 320 i 322. Ove supstitucije takođe su opisane u Zhenget al.Interakciju IgG i Clq originalno su identifikovali Dankan i Vinter u Duncan and Winter, Nature 332:738 (1988). CH3 domen identičan je divljem tipu mišijeg y2a Fc.

mFc3 varijanta sadrži divlji tip C57BL/6 mišijeg y2c Fc.

mFc3 varijanta identična je mFc3 osim što sadrži Gly 219 Ser i Leu 235 Glu supstitucije prisutne u mFc2.

Druge modifikacije/supstitucije/adicije/delecije u Fc domenu biće očigledne prosečnom poznavaocu oblasti.

Polipeptidi koji sadrže 10Fn3 Domene

Fc fuzioni proteini ovde obezbeđeni sadrže<10>Fn3 domen, koji je skafold protein baziran na fibronektinu. Skafold protein baziran na fibronektinu generalno je skafold izveden iz fibronektina tipa III (Fn3) ili Fn3-sličnog domena i funkcionišu u maniru karakterističnom za prirodna ili dizajnirana antitela (to jest, poliklonska, monoklonska ili jednolančana antitela) i, dodatno, poseduje strukturne prednosti. Specifično, struktura ovih mimika antitela dizajnirana je za optimalno uvijanje, stabilnost i rastvorljivost, čak i u uslovima koji normalno vode gubitku strukture i funkcije antitela. Primer proteinske skele bazirane na fibronektinu su Adnektini - Adnectins™ (Adnexus, podružnica potpuno u vlasništvu Bristol-Myers Squibb). Skafold proteini bazirane na fibronektinu i Adnectins™ mogu biti monovalentni ili polivalentni.

Fn3 domen je mali, monomeran, solubilan i stabilan. Nema disulfidne mostove, te je stoga stabilan u redukujućim uslovima. Ukupna struktura Fn3 podseća na Ig savijanje. Fn3 domen sadrži, po redu od N-terminusa ka C-terminusu, beta ili beta-slični lanac, A; petlju AB; beta ili beta-slični lanac, B; petlju, BC; beta ili beta-slični lanac, C; petlju, CD; beta ili beta-slični lanac, D; petlju, DE; beta ili beta-slični lanac, E; petlju, EF; beta ili beta-slični lanac, F; petlju, FG i beta ili beta-slični lanac, G. Sedam anti-paralelnih pManaca uređeni su kao dve beta pločice koje formiraju stabilno jezgro, kreirajući dva „lica" sastavljena od petlji koje povezuju beta ili beta-slične lance. Petlje AB, CD i EF si locirane najednom licu, dok su petlje BC, DE i FG locirane na suprotnom licu. Bilo koja od petlji AB, BC, CD, DE, EF i FG može da participira u vezivanju Uganda. Postoji barem 15 različitih modula Fn3, i bez obzira na to što je homologija u sekvenci između modula niska, svi dele sličnu tercijarnu strukturu.

Amino-kiselinska sekvenca desetog domena humanog fibronektina III koji se javlja u prirodi tj. deseti modul humanog Fn3 (<10>Fn3), naveden je u SEQ ID NO: 1:

l^SDFPi?DZEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE TGGNSPVOEFTVPGSKST

ATI SGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISlNYRT (SEQ ID NO: 1) (AB, CG i EF

petlje su podvučene, BC, FG i DE petlje su naglašene podebljalim slovima.

U SEQ ID N0:1, AB petlja odgovara ostacima 15-16, BC petlja odgovara ostacima 21-30, CD petlja odgovara ostacima 39-45, DE petlja odgovara ostacima 51-56, EF petlja odgovara ostacima 60-66 i FG petlja odgovara ostacima 76-87. Videti npr. Xu et al., Chemistrv & Biologv 2002 9:933-942. BC, DE i FG petlje poravnavaju se duž jednog lica molekula (ponekad se nazivaju i petlje „severnog pola") i AB, CD i EF petlje poravnavaju se duž suprotnog lica molekula (ponekad se nazivaju i petlje "južnog pola"). U SEQ ID NO: l, beta lanac A odgovara ostacima 9-14, beta lanac B odgovara ostacima 17-20, beta lanac C odgovara ostacima 31-38, beta lanac D odgovara ostacima 46-50, beta lanac E odgovara ostacima 57-59, beta lanac F odgovara ostacima 67-75, i beta lanac G odgovara ostacima 88-94. Lanci su povezani jedan sa drugim preko odgovarajuće petlje npr. lanci A i B su povezani preko petlje AB u formaciji lanca A, petlje AB, lanca B itd. Prvih 8 amino-kiselina SEQ ID NO:l (prethodno navedenih u italici) mogu biti izbrisane ali tako da se vezivna sposobnost molekula zadrži. Ostaci koji su uključeni u formiranje hidrofobnog jezgra („jezgra amino-kiselinskih ostataka") uključuju amino-kiseline koje odgovaraju sledećim amino-kiselinama SEQ ID NO: 1: L8, VIO, A13, L18,120, W22, Y32,134, Y36, F48, V50, A57,159, L62, Y68, 170, V72, A74, 188, 190 i Y92, gde su amino-kiselinski ostaci jezgra predstavljeni jednoslovnim kodom praćeni pozicijom na kojoj su locirani u okviru SEQ ID NO: 1. Videti npr., Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236: 1079-1092 (1994).

<10>Fn3 domeni su strukturno i funkcionalno analogni antitelima, posebno varijabilnom regionu antitela. Dok se<10>Fn3 mogu opisati kao „mimici antitela" ili „antitelima-slični proteini" oni nude brojne prednosti u odnosu na konvencionalna antitela. Posebno, oni pokazuju bolje uvijanje i termostabilnost u odnosu na antitela, manjka im disulfidnih mostova koji znaju da ometaju ili sprečavaju pravilno uvijanje proteina u određenim uslovima.

Petlje BC, DE i FG<10>Fn3 domena analogne su regionima za determinaciju komplementarnosti (CRDs) kod imunoglobulina. Izmena u amino-kiselinskoj sekvenci u ovim regionima petlji menja specifičnost vezivanja<10>Fn3.<10>Fn3 domeni sa modifikacijama u AB, CD i EF petljama mogu takođe biti proizvedeni kako bi se dobili molekuli koji vezuju željene mete. Proteinske sekvence izvan petlji analogne su regionu okvira imunoglobulina i igraju ulogu u strukturnoj konformaciji<10>Fn3. Izmene u okvirnom regionu<10>Fn3 dopuštene su do stepena dokle god ne menjaju strukturnu konformaciju tako daje izmenjeno vezivanje liganada. Metode za generisanje<10>Fn3 specifičnih za vezivanje liganada opisane su u PCT publikacijama sa brojem WO 00/034787, WO 01/64942, i WO 02/032925, koje ostavljaju na uvid javnosti veznike za TNFa, PCT broj objave WO 2008/097497, koje ostavljaju na uvid javnosti veznike za VEGFR2, i PCT broj objave W0 2008/066752, koje ostavljaju na uvid javnosti veznike za IGFIR. Dodatne napomene koje razmatraju veznike za 10Fn3 i metode za izbor sredstva za vezivanje uključuju PCT objave sa brojem WO 98/056915, WO 02/081497, i WO 2008/031098 i američki broj objave 2003186385.

Kako je prethodno, opisano amino-kiselinski ostaci koji odgovaraju ostacima 21-30, 51-56 i 76-87 iz SEQ ID NO: 1 definišu petlje BC, DE i FG, respektivno. Međutim, potrebno je naglasiti da nije neophodno da se svaki ostatak u okviru regiona petlje izmeni kako bi se postiglo da veznike za<10>Fn3 poseduje visok afinitet za željenu metu. Na primer, u mnogim slučajevima, samo ostaci koji odgovaraju amino-kiselinama 23-30 BC petlje i 52-55 DE petlje su modifikovani što je za rezultat dalo veznike za<10>Fn3 sa visokim afinitetom. Shodno tome, u određenim prikazima, BC petlja može biti definisana amino-kiselinama koje odgovaraju ostacima 23-30 iz SEQ ID NO: 1, a DE petlja može biti definisana amino-kiselinama koje odgovaraju ostacima 52-55 DE petlje iz SEQ ID NO: 1. Dodatno, insercije i delecije u regionima petlje mogu biti izvedene ali tako da se proizvedu veznike za<10>Fn3 sa visokim afinitetom.

Shodno tome, u određenim prikazima, jedna ili više petlji odabranih između BC, DE i FG može biti produžena ili skraćena u dužini, u odnosu na odgovarajuću petlju divljeg tipa humanog<10>Fn3. U nekim prikazima, dužina petlje može biti povećana za 2-25 amino-kiselina. U nekim prikazima, dužina petlje može biti skraćena za 1-11 amino-kiselina. Posebno, Fg petlja<10>Fn3 je duga 12 ostataka, dok odgovarajuća petlja kod teškog lanca antitela ima između 4-28 ostataka. Kako bi se optimizovalo vezivanje antigena, stoga, dužina FG petlje<10>Fn3 može biti izmenjena kako u dužini, tako i u sekvenci, kako bi pokrio CDR3 opseg od 4-28 ostataka čime bi se obezbedila najveća moguća fleksibilnost i afinitet prilikom vezivanja antigena. U određenim prikazima, integrinski-vezivni motiv „arginin-glicin-asparaginska kiselina" (RGD) lociran je na ostacima 79-81 iz SEQ ID NO: 1 i može biti modifikovan kako bi se poremetilo vezivanje za integrin. Na primer, RGD sekvenca može biti zamenjena sa SGE ili RGE.

Kako je ovde opisano, ne-ligandno vezujuće sekvence 10Fn3 tj. ,,<10>Fn3 skafold" mogu biti izmenjene pod uslovom da<10>Fn3 zadrži funkciju ligandnog vezivanja i/ili strukturnu stabilnost. U nekim prikazima, jedan ili više Asp 7, Glu 9, i Asp 23 zamenjeni su drugim amino-kiselinama, kao što su na primer, ne-negativno naelektrisani amino-kiselinski ostaci (npr. Asn, Lys itd.). Prijavljeno je da ove mutacije imaju efekat u promociji veće stabilnosti mutanta<10>Fn3 na neutralnom pH u poređenju sa divljim tipom (videti PCT prijavu sa brojem objave WO 02/04523). Na uvid javnosti stavljene su i raznovrsne druge izmene<10>Fn3 skafolda koje su ili korisne ili nemaju efekta. Videti na primer, Batori et al, Protein Eng. 2002 15(12):1015-20; Koide et al., Biochemistrv 2001 40(34): 10326-33. U nekim prikazima, hidrofobne amino-kiseline jezgra nisu modifikovane u odnosu na sekvencu divljeg tipa. U drugim prikazima, sledeće hidrofobne amino-kiseline mogu biti mutirane: W22 i/ili L62.

<10>Fn3 skafold može biti modifikovan jednom ili više konzervativnih supstitucija. Koliko 5%, 10%, 20% ili čak 30% ili više amino-kiselina iz<10>Fn3 skafolda može biti izmenjeno konzervativnom supstitucijom bez suštinske izmene afiniteta<10>Fn3 za ligand. U određenim prikazima, skafold može da sadrži u rasponu od 0-15, 0-10, 0-8, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2-15, 2-10, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 5-15, ili 5-10 konzervativnih amino-kiselinskih supstitucija. U određenim prikazima, supstitucije u skafoldu ne uključuju supstitucije amino-kiselinskih ostataka iz hidrofobnog jezgra. Poželjno je da modifikacije skafolda redukuju afinitet vezivanja<10>Fn3 veznika za ligand za manje od 100-struko, 50-struko, 25- struko, 10- struko, 5- struko, ili 2- struko. Takve promene mogu da izmene imunogenost<10>Fn3in vivo,i tamo gde se imunogenost smanjuje, takve promene su poželjne. Kako se ovde koristi, „konzervativne supstitucije" odnose se na izmenu jedne amino-kiseline drugom amino-kiselinom koja je fizički ili funkcionalno slična amino-kiselini koja je zamenjena. To jest, konzervativna supstitucija i referentni ostatak imaju sličnu veličinu, oblik, elektrostatičko naelektrisanje, hemijske osobine uključujući i sposobnost formiranja kovalentnih ili vodoničnih veza i slično. Poželjne konzervativne supstitucije su one koje ispunjavaju kriterijume definisane za prihvaćene tačkaste mutacije u Davhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 (1978 & Supp.). Primeri konzervativnih supstitucija nalaze se u sledećim grupama: (a) valin, glicin; (b) glicin, alanin; (c) valin, izoleucin, leucin; (d) asparaginska kiselina, glutaminska kiselina; (e) asparagin, glutamin; (f) serin, treonin; (g) lizin, arginin, metionin; i (h) fenilalanin, tirozin.

U nekim prikazima, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzioni protein koji sadrži<10>Fn3 domen, u kome<l0>Fn3 polipeptid ima najmanje 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%), 85%, ili 90% identičnosti sa humanim<10>Fn3 domenom koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1. Najveći deo varijabilnosti generalno će se naći u jednoj ili većem broju petlji. Svaki od beta ili beta-sličnih lanaca<10>Fn3 domena u proteinskom skafoldu baziranom na fibronektinu može da sadrži, da se esencijalno sastoji ili da se sastoji od amino-kiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%), 90%, 95%) ili 100% identična sekvenci odgovarajućeg beta ili beta-sličnog lanca iz SEQ ID NO: 1, pod uslovom da takve varijacije ne remete stabilnost polipeptida u fiziološkim uslovima. U primernim prikazima,<10>Fn3 domen vezuje željenu metu sa Kdmanjom od 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM ili manje. U primernim prikazima, proteinski skafoldu baziran na fibronektinu specifično se vezuje za mete koje divlji tip<10>Fn3 domena ne vezuje, posebno humani divlji tip<10>Fn3 domena.

U nekim prikazima, patenta prijava obezbeđuje Fc fuzioni koji sadrži<l0>Fn3 domen, u kome<10>Fn3 polipeptid ima amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 98, ili 100% identična regionima koji nisu petlje iz SEQ ID NO: 1, gde je barem jedna petlja odabrana između BC, DE, i FG izmenjena. U nekim prikazima, izmenjena BC petlja ima do 10 amino-kiselinskih supstitucija, do 4 amino-kiselinske delecije, do 10 amino-kiselinskih insercija ili kombinaciju navedenih. U nekim prikazima, izmenjena DE petlja ima do 6 amino-kiselinskih supstitucija, do 4 amino-kiselinske delecije, do 13 amino-kiselinskih insercija ili kombinaciju navedenih. U nekim prikazima, FG petlja ima do 12 amino-kiselinskih supstitucija, do 11 amino-kiselinske delecija, do 25 amino-kiselinskih insercija ili kombinaciju navedenih.

U nekim prikazima, patenta prijava nudi Fc fuzioni protein koji sadrži<10>Fn3 domen, u kome<10>Fn3 domen sadrži petlju, AB; petlju, BC; petlju, CD; petlju, DE; petlju, EF; i petlju, FG; i najmanje jedna od petlji je izabrana između petlji BC, DE, i FG je sa izmenjenom amino-kiselinskom sekvencom u odnosu na odgovarajuću petlju humanog<10>Fn3 domena. U nekim prikazima, BC i FC petlje su izmenjene. U nekim prikazima, BC, DE, i FG petlje su izmenjene tj.<10>Fn3 domen sadrži petlje koje se ne javljaju u prirodi. Pod pojmom „izmenjen" podrazumeva se izmena jedne ili više amino-kiselina u odnosu na šablonsku sekvencu (tj. odgovarajući humani fibronektinski domen) i uključuje adicije, delecije i supstitucije amino-kiselina. Izmena amino-kiselinske sekvence može da se postigne namernom, izmenom na slepo ili spontanom varijacijom sekvence, generalno kodirajuće sekvence nukleinskih kiselina, korišćenjem bilo koje tehnike na primer PCR, PCR sklonog greškama ili hemijskom sintezom DNK.

U određenim prikazima, patentna prijava obezbeđuje FC fuzione proteine koji sadrže<10>Fn3 domen, u kome<10>Fn3 može biti generalno definisan sledećom amino-kiselinskom sekvencom jezgra:

U SEQ ID NO:2, petlja AB predstavljena je sa Xa, petlja CD predstavljena je saXb,petlja EF predstavljena je sa Xc, petlja BC predstavljena je sa X*, petlja DE predstavljena je sa Xy, i petlja FG predstavljena je sa Xz. X prestavlja bilo koji amino-kiselinu, a supskript do X predstavlja ceo broj broja amino kiselina. Posebno,amože biti bilo gde između 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, ili 1-2 amino-kiselina; ib, c, x, yi z mogu svaki nezavisno biti bilo gde između 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, ili 6-7 amino-kiselina. U poželjnim prikazima,a je2 amino-kiseline,b je7 amino-kiselina, c je 7 amino-kiselina,x je9 amino-kiselina,y je6 amino-kiselina, i z je 12 amino-kiselina. Sekvence beta lanaca (podvučene u SEQ ID NO: 2) mogu da imaju bilo koju vrednost od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2, od 0 do 1 supstitucija, delecija ili adicija kroz 7 regiona skele u odnosu na odgovarajuće amino-kiseline prikazane u SEQ ID NO: 2. U primernom prikazu, sekvence beta lanacamogu imati bilo koju vrednost od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2 ili od 0 do 1 konzervativnih supstitucija kroz 7 regiona skele u odnosu na odgovarajuće amino-kiseline prikazane u SEQ ID NO: 2. U određenim prikazima, hidrofobni amino-kiselinski ostaci jezgra su fiksirani i bilo kakve supstitucije, konzervativne supsticuje, delecije ili adicije se dešavaju na ostacima koji ne čine jezgro. U primernim prikazima, BC, DE i FG petlje predstavljene kao(X)*,(X)y, i (X)z, respektivno, su zamenjene polipeptidima koji sadrže sekvence BC, DE i FG petlje koje se vezuju za specifične mete.

U određenim prikazima, patenta prijava obezbeđuje Fc fuzione proteine koji sadrže<10>Fn3 domen, u kome<10>Fn3 domen generalno može biti definisan sekvencom:

U SEQ ID NO:3, BC petlja predstavljena je kao Xx, DE petlja predstavljena je kao Xy, i FG petlja predstavljena je kao Xz. X prestavlja bilo koji amino-kiselinu i supskript nakon X predstavlja ceo broj broja amino-kiselina. Posebno, x, y i z mogu svaki nezavisno biti bilo gde od 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, ili 6-7 amino-kiselina. U poželjnim prikazima, x je 9 amino-kiselina, y je 6 amino-kiselina i z je 12 amino-kiselina. Ove sekvence beta lanaca i petlji južnog pola (podvučene u SEQ ID NO: 3) mogu da imaju bilo gde od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 to 4, do 0 to 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 supstitucije, delecije ili adicije u svih 7 regiona skafolda i petlji južnog pola u odnosu na odgovarajuće amino kiseline prikazane u SEQ ID NO: 3. U primernim prikazima, sekvence beta lanaca i petlji južnog pola mogu da imaju bilo gde od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 to 4, do 0 to 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 konzervativne supstitucije u svih 7 regiona skafolda i petlji južnog pola u odnosu na odgovarajuće amino kiseline prikazane u SEQ ID NO: 3. U određenim prikazima, amino-kiselinski ostaci jezgra su fiksirani i bilo kakve supstitucije, konzervativne supstitucije, delecije ili adicije se dešavaju na ostacima koji nisu amino-kiselinski ostaci u jezgru. U primernim prikazima, BC, DE i FG petlje predstavljene kao (X)x, (X)y, i (X)z, respektivno, zamenjene su polipeptidima koji polipeptidima koji sadrže BC, DE i FG petlje čije sekvence se vezuju za specifične mete.

<10>Fn3 domen ovde opisan može opciono da sadrži modifikovane N- i/ili C-terminalne sekvence. Na primer, u odnosu na SEQ ID NO:2 ili 3,<10>Fn3 domen može da sadrži N-terminalnu ekstenziju i/ili C-terminalni rep kao što je opisano dalje u nastavku.

U određenim prikazima,<10>Fn3 domen prikazan u SEQ ID NO: 2 ili 3 može opciono da sadrži N-terminalnu ekstenziju od 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, ili 1 amino-kiselinu u dužinu. Primerne N-terminalne ekstenzije uključuju (predstavljene jednoslovnim kodom za amino-kiseline) M, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 4), VSDVPRDL (SEQ ID NO: 5), i GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 6), ili N-terminalna skraćenja bilo koje od SEQ ID NO: 4, 5 ili 6. Druge pogodne N-terminalne ekstenzije uključuju, na primer, XnSDVPRDL

(SEQ ID NO: 7), XnDVPRDL (SEQ ID NO: 8), XnVPRDL (SEQ ID NO: 9), XnPRDL (SEQ

ID NO: 10), XnRDL (SEQ ID NO: 11), XnDL (SEQ ID NO: 12), ili XnL, gde je n = 0, 1 ili 2 amino-kiseline, gde kada je n = 1, X je Met ili Gly, i kada je n = 2, X je Met-Gly. Kada je Met-Gly sekvenca dodata na N-terminus<10>Fn3 domena, M će obično biti odsečen, ostavljajući G na N-terminusu.

U određenim prikazima,<10>Fn3 domen kao što je prikazan u SEQ ID NO: 2 i 3 može opciono da sadrži C-terminalni rep koji je dug od 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, ili 1-4 amino-kiseline. Specifični primeri sekvence repa uključuju, na primer, polipeptide koji sadrže, suštinski se sastoje ili se sastoje od EIEK (SEQ ID NO: 13), EGSGC (SEQ ID NO: 14),

EIEKPCQ (SEQ ID NO: 15), EIEKPSQ (SEQ ID NO: 16), EIEKP (SEQ ID NO: 17),

EIEKPS (SEQ ID NO: 18), EIEKPC (SEQ ID NO: 19), EIDKPSQ (SEQ ID NO: 20), ili EIDKPSQLE (SEQ ID NO: 21). U određenim prikazima,<10>Fn3 domen sadrži C- terminalni rep koji sadrži sekvencu X(ED)n, gde je n ceo broj od 2-10, 2-8, 2-5, 3-10, 3-8, 3-7, 3-5, 4-7, ili gde je n 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, a X je opciono i kada je prisutan onda je kao E, I ili EI. Takvi ED ponovljeni repovi mogu da povećaju solubilnost i/ili da smanje agregaciju<10>Fn3 domena. U primernim prikazima, C-terminalni rep sadrži, suštinski se sastoji ili se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 15. U poželjnim prikazima, C-terminalnoj sekvenci nedostaju DK sekvence.

U određenim prikazima, proteinskai skaold baziran na fibronektinu sadrži<10>Fn3 domen koji ima i N-terminalnu ekstenziju i C-terminalni rep.

U određenim prikazima,<10>Fn3 domen je domen naveden u WO 2012/016245.

Multivalentni skafold proteini bazirani na fibronektinu

U određenim prikazima, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzioni protein koji sadrži polipeptid koji ima dva ili više<10>Fn3 domena, tj. multivalentni skafold protein baziran na fibronektinu. Na primer, multivalentni skafold protein baziran na fibronektinu može da sadrži 2, 3 ili više<10>Fn3 domena koji su kovalentno povezani. U primernim prikazima, skafold protein baziran na fibronektinu je bispecifični ili dimerni protein koji sadrži dva<10>Fn3 domena. U određenim prikazima, multivalentni skafold protein baziran na fibronektinu sadrži prvi l0Fn3 domen koji se vezuje za prvi ciljani molekul i drugi l0Fn3 domen koji se vezuje za drugi ciljani molekul. Prvi i drugi ciljani molekul mogu biti isti ili različiti ciljni molekuli. Kada su prvi i drugi ciljni molekul isti,<10>Fn3 domeni tj. vezujuće petlje mogu biti iste ili različite. Štaviše, kada prvi i drugi<10>Fn3 domeni vezuju istu metu mogu da se vezuju za iste ili različite epitope ciljanog molekula.

U primernim prikazima, svaki<10>Fn3 domen multivalentnog skafold proteina baziranog na fibronektinu vezuje željenu metu sa Kdmanjom od 1 mM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 500 nM, 100 nM, 10 nM , 1 nM, 500 pM, 100 pM ili manjom. U primernim prikazima, svaki<10>Fn3 domen multivalentnog skafold proteina baziranog na fibronektinu vezuje se za specifičnu metu koju ne vezuje divlji tip10Fn3 domena, posebno ne divlji tip humanog<10>Fn3 domena. U primernim prikazima, nijedan od<10>Fn3 domena multivalentnog skafold proteina baziranog na fibronektinu ne vezuje integrinski protein.

U slučaju multivalentnog skafold proteina baziranog na fibronektinu, poželjno je da ni jedan<10>Fn3 domena ne sadrži C-terminalni rep koji sadrži DK sekvencu. U primernim prikazima, multivalentni skafold protein baziran na fibronektinu sadrži dva ili više<10>Fn3 domena, od kojih svaki domen sadrži C-terminalni rep koji ne sadrže DK sekvencu. U određenim prikazima, multivalentni skafold protein baziran na fibronektinu sadrži dva ili više<10>Fn3 domena, od čega svaki domen sadrži C-terminalni rep koji ne sadrži DK sekvencu.

<10>Fn3 domeni multivalentnog skafold proteina baziranog na fibronektinu mogu da sadrže i peptidni linker. Primerni peptidni linkeri uključuju peptide koji imaju od 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, ili 1-2 amino-kiselina. Pogodni linkeri za povezivanje<10>Fn3 domena su oni koji omogućavaju različitim domenima da se nezavisno jedan od drugog uviju tako da

formiraju trodimenzionalnu strukturu koja omogućava visoko afinitetno vezivanje za ciljni molekul. U nekim prikazima, pogodni linkeri koju omogućavaju odvojenim domenima ili delovima da se uviju nezavisno jedan od drugog sadrže linkere bazirane na glicin-serinu, glicinu-prolin i prolinu-alaninu. Primeri opisani u WO 2009/142773 demonstriraju da Fn3 domeni povezani ovim linkerima zadržavaju funkcije vezivanja svojih ciljnih molekula. U nekim prikazima, linker je baziran na glicin-serinu. Ovi linkeri sadrže glicinske i serinske ostatke i mogu da budu dugi između 8 i 50, 10 i 30, i 10 i 20 amino-kiselina. Primeri takvih linkera uključuju GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 32), GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 33),

GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 34), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 80), i

GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 36). U nekim prikazima, linker je baziran na glicinu-prolinu. Ovi linkeri sadrže ostatke glicina i prolina i mogu da budu dugi između 3 i 30, 10 i 30, i 3 i 20 amino-kiselina. Primeri takvih linkera uključuju GPG (SEQ ID NO: 39), GPGPGPG (SEQ ID NO: 40) o GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 41). U nekim prikazima, linker je baziran na prolinu-alaninu. Ovi linkeri sadrže ostatke prolina i alanina i mogu da budu dugi između 3 i 30, 10 i 30, 3 i 20 i 6 i 18 amino-kiselina. Primeri takvih linkera uključuju PAPAPA (SEQ ID NO: 42), PAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 43) i PAPAPAPAPAPAPAPAPA (SEQ ID NO: 44). U drugim prikazima, linker sadrži sekvencu PSTSTST (SEQ ID NO: 71). Smatra se, da optimalna dužina linkera i amino-kiselinski sastav mogu biti određeni eksperimentalno na osnovu tehnika koje su ovde obezbeđene. U primernim prikazima, linker ne sadrži nijednu DK sekvencu.

Vektori & Polinukleotidi

U drugim prikazima, patentna prijava obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od Fc fuzionih proteina svaljenih na uvid javnosti. Upotreba kodona može biti izabrana kako bi se poboljšala ekspresija u ćeliji. Upotreba takvih kodona zavisiće od tipa ćelije koji je izabran. Specijalizovani obrasci upotrebe kodona razvijeni su zaE. colii druge bakterije, kao i za sisarske ćelije, biljne ćelije, ćelije kvasca i insekata. Videti na primer: Mavfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makrides et al., Microbiol Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996); i Sharp et at, Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991).

Opšte tehnike za manipulaciju nukleinskim kiselinama opisane su na primer u Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold

Spring Harbor Laboratorv Press (1989), ili Ausubel, F. et at., Current Protocols in Molecular Biologv, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) i povremeno ažuriranim izdanjima. Generalno, DNK koja kodira polipeptid operativno je povezana sa odgovarajućim tranksripcionim ili translacionim regulatornim elementima koji je izveden iz gena sisara, virusa ili insekata. Takvi regulatorni elementi uključuju transkripcioni promotor, opcionu operatorsku sekvencu koja kontroliše transkripciju, sekvencu koja kodira odgovarajuće mesto za vezivanje ribozomalne mRNK i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Sposobnost replikacije u domaćinu, obično određen mestom početka replikacije, a dodatno je inkorporiran gen koji olakšava prepoznavanje transformanata.

Fc fuzioni proteini ovde opisani mogu biti rekombinantno proizvedeni i to ne samo direktno, već i kao fuzioni polipeptid sa heterologim polipeptidom koji je preferencijalno signalna sekvence ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto za sečenje na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Poželjno je da odabrana heterologa signalna sekvenca bude takva daje prepoznaje i obrađuje (tj. bide odsečena signalnom peptidazom) ćelija domaćin. Primerna N-terminalna signalne lider sekvenca za produkciju polipeptida u sisarskim ćelijama je METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 29), koju ćelija domaćin uklanja nakon ekspresije.

Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju nativne signalne sekvence, signalna sekvenca se zamenjuje prokariotskom signalnom sekvencom, na primer, iz grupe alkalne fosfataze, penicilinaze, lpp ili termo-stabilnim liderima enterotoksina II.

Za sekreciju iz kvasaca nativna signalna sekvenca može da se zameni npr. lider-sekvencom za invertazu, lider-sekvencom za a faktor (uključujući Saccharomyces i Kluyveromyces lider-sekvence za alfa-faktor) ili lider-sekvencom za kiselu fosfatazu, lider-sekvencom za C. albicans glukoamilazu ili signalne sekvence opisane u američkom patentu sa brojem 5,631,144. Kod ekspresije u sisarskim ćelijama, dostupne su sisarske signalne sekvence kao i viralne sekretorne lider-sekvence na primer, herpes simpleks gD signal. DNK za takve prekursorske regione može biti ligirana u okvir rama čitanja DNK koja kodira ovaj protein.

I ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinskih kiselina koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Generalno, kod klonirajućih vektora ova sekvenca omogućava vektoru da se replicira nezavisno od hromozomske DNK domaćina i uključuje početak replikacije ili autonomno replicirajuće sekvence. Takve sekvence su dobro poznate za razne bakterije, kvasce i viruse. Početak replikacije iz plazmida pBR322 je odgovarajući za većinu Gram-negativnih bakterija, početak plazmida od 2 mikrona je odgovarajući za kvasce, a različiti viralni počeci replikacije (SV40, poliom, adenovirus, VSV ili BPV) su korisni za klonirajuće vektore u sisarskim ćelijama. Generalno, početak replikacije je komponenta koja nije neophodna za sisarske ekspresione vektore (SV40 početak replikacije tipično može da se koristi samo zato što sadrži rani promotor).

Ekspresioni i klonirajući vektori mogu da sadrže gen za selekciju, takođe nazvan i selekcioni marker. Tipični geni za selekciju kodiraju proteine koji (a) prenose rezistenciju na antibiotike ili druge toksine npr. ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) nadomešćuju autotrofne deficijencije ili (c) obezbeđuju kritične nutrijente koji nisu dostupni u kompleksnom medijumu npr. gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacilli.

Ekspresioni i klonirajući vektori obično sadrže promotor koji prepoznaje organizam domaćina i koji je operativno povezan sa nukleinskim kiselina koje kodiraju proteine ovde stavljene na uvid javnosti npr. skafold protein baziran na fibronektinu. Promotori pogodni za upotrebu u prokariotskim domaćinima uključuju phoA promotor, beta-laktamazne i laktozne promotorske sisteme, alkalnu fofatazu, triptofanski (trp) promotorski sistem i hibridne promotore kao što je tan promotor. Međutim, pogodni su i drugi bakterijski promotori. Promotori za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržati Sajn-Delgarnovu (S.D.) sekvencu operativno povezanu sa DNK koja kodira protein koji je ovde stavljen na uvid javnosti. Promotorske sekvence su poznate i za eukariote. Gotovo svi eukariotski geni imaju region bogat u AT koji je lociran približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta na kome se inicira transkripcija. Još jedna sekvenca koja se nalazi 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodatak poli A repa na 3" kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su pogodno ubačene u eukariotske ekspresione vektore.

Primeri pogodnih promotorskih sekvenci za upotrebu u kvascima kao domaćinima uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fofat dehidrogenza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukozo-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozefosfat izomeraza, fosfoglukozo izomeraza i glukokinaza.

Transkripcija sa vektora u sisarskim ćelijama domaćinima može biti kontrolisana, na primer, promotorima dobijenim iz viralnih genoma kao što su polioma virus, virus boginja pernate živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičiji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i najpoželjnije Simian Virus 40 (SV40), od heterologih sisarskih promotora npr. aktinski promotor ili imunoglobulinski promotor, promotori hit-šok proteina pod uslovom da su takvi promotori kompatibilni sa ćelijskim sistemima domaćina.

Transkripcija DNK koja kodira proteine koji su ovde stavljeni na uvid javnosti kod viših eukariota je često pojačana ubacivanjem sekvence za pojačavanje u vektor. Mnoge sekvence za pojačavanje su poznate za sisarske gene (globin, elastazu, albumin, a-fetoprotein i insulin) Tipično, međutim, će se koristiti pojačivač iz virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju SV40 pojačivač na kasnoj strani početka replikacije (bp 100-270), rani promotorski pojačivač citomegalovirusa, poliomski pojačivać na kasnoj strani početka replikacije i adenovirusne pojačivače. Videti takođe i Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) vezano za pojačivačke elemente za aktivaciju eukariotske ekspresije. Pojačivač može biti zalepljen u vektor na položaju 5' ili 3' u odnosu na peptid-kodirajuću sekvencu, ali poželjni je da bude lociran na 5' pozicije u odnosu na promotor.

Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima (npr. ćelije kvasca, gljiva, insekata, biljne, životinjske, humane ili nuklearne ćelije iz drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence neophodne za terminaciju transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence obično su dostupne sa 5" i povremeno 3" netransliranih regiona eukariotskih ili viralnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovane fragmente u netransliranom delu mRNK koja kodira protein koji je ovde stavljen na uvid javnosti. Jedna korisna komponenta za terminaciju translacije je poliadenilacioni region goveđeg hormona rasta. Videti W094/11026 i ekspresioni vektor koji je tu stavljen na uvid javnosti.

Rekombinantna DNK može da uključuje bilo koji tip proteinske oznake (taga) koji može biti koristan za prečišćavanje proteina. Primeri proteinskih tagova uključuju ali nisu ograničeni na histidinski tag, FLAG tag, myc tag, HA tag ili GST tag. Odgovarajuće kloniranje i ekspresioni vektori za upotrebu u bakterijskim, fungalnim, sisarskim i kvascima kao ćelijskim domaćinima mogu se naći u Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York(1985)).

Ekspresioni konstrukt se ubacuje u ćeliju domaćina koristeći metod koji je odgovarajući za ćeliju domaćina i očigledan je prosečnom poznavaocu oblasti. Razne metode da ubacivanje nukleinskih kiselina u ćeliju domaćina poznato je u oblasti i uključuje, bez ograničenja, elektroporaciju; transfekciju korišćenjem kalcijum hlorida, rubidijum hlorida, kalcijum fosfata, DEAE-dekstrana ili drugih supstanci; bombardovanje mikro-projektilima; lipofekciju i infekciju (gde je vektor infektivni agens).

Odgovarajuće ćelije domaćina uključuju prokariotske ćelije, ćelije kvasca i sisarske ćelije. Pogodne bakterije uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme na primer,E. coliiliBacillus spp.Kvasac, poželjno od vrsteSaccharomyces,kao što jeS. cerevisiae,može biti takođe korišćen za proizvodnju polipeptida. Različite sistemi za ćelijsku kulturu u sisarskim ili ćelijama insekata mogu biti upotrebljeni za ekspresiju rekombinantnih proteina. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterologih proteina u ćelijama insekata razmotreni su u Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988)). Primeri pogodnih sisarskih ćelijskih linija domaćina uključuju endotelijalne ćelije, COS-7 majmunske bubrežne ćelije, CV-1, L ćelije, C127, 3T3, ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), humane embrionalne bubrežne ćelije, HeLa, 293, 293T, i BHK ćelijske linije. Prečišćeni polipeptidi su pripremljeni kultivacijom odgovarajućeg sistema domaćin/vektor kako bi se eksprimirao rekombinantni protein. Za mnoge aplikacije, mala veličina polipeptida koji su ovde stavljeni na uvid javnosti čini ekspresijuuE. colipreferencijalnom metodom za ekspresiju. Protein je nakon toga prečišćen iz medij uma za gajenje ili ćelijskih ekstrakata.

Proizvodnja proteina

U drugim aspektima, patentna prijava obezbeđuje ćelije domaćine koji sadrže vektore koji kodiraju ovde opisane Fc fuzione proteine koji su ovde opisani i opisuje metode za proizvodnju ovde opisanih Fc fuzionih proteina. Ćelije domaćini mogu biti transformisane sa ovde opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za produkciju proteina i kultivaciju u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim za odgovarajuću indukciju promotora, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence. Ćelije domaćini koje su korisne za visoko-protočnu produkciju proteina (HTPP) i produkciju na srednjoj skali uključuju HMS174-bakterijske sojeve. Ćelije domaćini koji se koriste za proizvodnju proteina koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu biti gajene u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Hamov F10 (Sigma), Minimalni Esencijalni Medijum ((MEM), (Sigma)), RPMT-1640 (Sigma), i Dulbekov Modifikat Eaglovog Medijuma ((DMEM), Sigma)) su pogodni za gajenje ćelija domaćina. Dodatno, mnogi od medijuma opisani u Ham et al., Meth. Enzvmol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), američkim patentim asa brojevima. 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 5,122,469, 6,048,728, 5,672,502, ili američkom patentu sa brojem RE 30,985 mogu biti korišćeni kao medijumi za gajenje ćelija domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može po potrebi biti dopunjen hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što u insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukelotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je gentamicin), elementima u tragovima (definisanim kao neorganska jedinjenja obično prisutna u mikromolarnim koncentracijama) i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Svi drugi neophodni dodaci mogu uključeni u odgovarajućim koncentracijama što je će biti poznato prosečnim poznavaocima oblasti. Uslovi gajenja kao što su temperatura, pH i slični, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom koja je odabrana za ekspresiju i biće očigledni prosečnom poznavaocu oblasti.

Fc fuzioni proteini koji su ovde obezbeđeni mogu biti proizvedeni korišćenjem ćelijskih translacionih sistema. Za te svrhe nukleinske kiseline koje kodiraju fuzioni protein moraju biti modifikovane kako bi se omogućilain vitrotranskripcija da bi se proizvela mRNK i omogućila bez-ćelijska translacija mRNK u odabranom bez-ćelijskom sistemu koji se koristi (eukariotski kao što je sisarski ili bez-ćelijski translacioni sistem iz kvasca ili prokariotski kao što je bakterijski bez-ćelijski translacioni sistem).

Fc fuzioni proteini koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu biti proizvedeni hemijskom sintezom (npr. metodama koje su opisane u Solid Phase Peptide Svnthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Modifikacije Fc fuzionih proteina mogu biti dobijene hemijskom sintezom.

Fc fuzioni proteini koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu biti prečišćeni metodama za izolovanje/prečišćavanje proteina koje su opšte poznate u oblasti proteinske hernije. Ne-ograničavajući primeri uključuju ekstrakciju, rekristalizaciju, isoljavanje (npr. amonijum sulfatom ili natrijum sulfatom), centrifugiranje, dijalizu, ultrafiltraciju, adsorpcionu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, normalno-faznu hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, normalno-faznu hromatografiju, reverzno-faznu hromatografiju, gel filtraciju, hromatografiju permeacije gela, afinitetnu hromatografiju, elektroforezu, kontrajonsku distribuciju ili bilo koju kombinaciju istih. Nakon prečišćavanja, polipeptidi mogu biti izmenjeni u različite pufere i/ili koncentrovani različitim metodama koje su poznate u oblasti, uključujući bez ograničenja filtraciju i dijalizu.

Prečišćeni Fc fuzioni protein je poželjno najmanje 85% čist, ili poželjno najmanje 95% čist ili najpoželjnije 98% čist. Bez obzira na tačnu numeričku vrednost čistoće, Fc protein je dovoljno čist da bi se koristio kao farmaceutski proizvod.

Upotrebe navedene kao primeri

U jednom aspektu, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzione proteine koji su korisni kao dijagnostička ili terapijska sredstva. Fc fuzioni proteini korisni kao dijagnostička sredstva mogu biti obeleženi sa detektabilnim ostatkom. Fc fuzioni proteini mogu biti upotrebi) eni za različite dijagnostičke aplikacije. Detektabilni ostatak može biti takav da proizvodi direktno ili indirektno vidljiv signal. Na primer, detektabilni ostatak može biti radioizotop, kao što su H3, C14, C13, P32, S35, ili T131; fluorescentno ili hemiluminscentno jedinjenje kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin, ili enzim kao što su alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili peroksidaza iz rena.

Bilo koja metoda koja je poznata u oblasti za konjugovanje proteina za detektabilan ostatak može biti primenjena, uključujući metode koje su opisane u Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistrv 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); i Nvgren, J. Histochem. and Cvtochem. 30:407 (1982).In vitrometode uključuju hemijsku konjugaciju koja je dobro poznata u oblasti, uključujući herniju koja je kompatibilna sa proteinima, kao što je hernija specifična za amino-kiseline kao što su Cys i Lys. Kako bi se detektabilni ostatak vezao za Fc protein, koristi se povezujuća grupa ili reaktivna grupa. Pogodne povezujuće grupe poznate su oblasti i uključuju disulfidne grupe, tioetarske grupe, labilne kiselinske grupe, fotolabilne grupe, peptidazno labilne grupe i esterazno labilne grupe. Poželjne povezujuće grupe su zavisno od aplikacije disulfidne grupe i tioetarske grupe. Za polipeptide bez Cys amino-kiseline, Cys može biti ubačen na lokaciji koja omogućava postojanje proteinske aktivnosti dok u isto vreme kreira lokaciju za ko<n>jugaciju.

Fc fuzioni proteini povezani sa detektabilnim ostatkom korisni su zain vitroiliin vivosnimanje. Polipeptidi mogu biti povezani sa radio-kontrastnim sredstvom ili radiozotopom, administrirani subjektu, poželjno u krvotok tako da se prisustvo i lokacija obeleženog proteina unutar subjekta može ispitati. Ovakva tehnika za snimanje je korisna na primer za određivanju faze i tretmanu maligniteta kada se Fc fuzioni protein vezuje za metu povezanu sa kancerom. Fc fuzioni protein može biti obeležen bilo kakvim ostatkom koji može da se detektuje u subjektu, bilo nuklearnom magnetnom rezonancom, radiološki ili drugim vidovima detekcije koji su poznati u oblasti.

Fc fuzioni proteini su korisni kao sredstva za afinitetno prečišćavanje. U ovom procesu Fc fuzioni proteini su imobilisani na odgovarajući nosač, kao što je Sephadeks matriks ili filter papir, upotrebom metoda koje su dobro poznate u oblasti.

Fc fuzioni proteini mogu biti upotrebljeni u bilo kojoj metodi za ispitivanje kao što je test kompetetivnog vezivanja, direktni ili indirektni sendvič testovi i imunoprecipitacioni testovi (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).

Dalje, patentna prijava opisuje metode za detekciju ciljnih molekula u uzorku. Metoda može da sadrži kontakt uzorka sa ovde opisanim fuzionim proteinom, gde se navedeni kontakt odigrava pod takvim uslovima koji dozvoljavaju da se formira kompleks Fc-fuzioni protein-ciljani molekul; i detektovanje pomenutog kompleksa, time detektujući pomenutu metu u pomenutom uzoku. Detekcija može da se izvede korišćenjem neke od tehnika koje su poznate u oblasti, kao što u na primer radiografija, imunološki esej, detekcija fluorescencije, masena spektroskopija, površinska rezonancija plazme. Uzorak će često biti biološki uzorak kao što je biopsija, a posebno biopsija tumora ili potencijalnog tumora, gde se Fc fuzioni protein vezuje za metu koja je povezana sa tumorom. Uzorak može biti humani ili sisarski. Fc fuzioni protein može biti obeležen ostatkom za obeležavanje kao što je radioaktivni ostatak, fluorescentni ostatak, hromogeni ostatak, hemiluminiscentni ostatak ili haptenski ostatak. Fc fuzioni protein može biti imobilisan na čvrstoj podlozi.

U jednom aspektu, patentna prijava obezbeđuje Fc fuzione proteine koji su korisni za lečenje poremećaja. Bolest ili poremećaj koji mogu biti tretirani biće određeni prirodom proteina koji je spojen sa Fc domenom. Primerni terapeutski proteini koji mogu biti vezani za Fc domen uključuju, na primer, interferon alfa (za lečenje hepatitisa), L-asparaginazu (za lečenje akutne limfoblastične anemije) ili granulocitni stimulišući faktor rasta kolonija (za lečenje neutropenije indukovane kancerskom hemoterapijom). U određenim prikazima, ovde opisani Fc fuzioni proteini sadrže antitelo ili fragment istog, kao što je, na primer, anti-TNF alfa antitelo (za lečenje autoimunih bolesti kao što je reumatoidni artritis ili Kronova bolest). U svakom slučaju, ovde opisani Fc fuzioni protein sadrži<10>Fn3 domen, na primer<10>Fn3 domen koji vezuje mete kao što su faktor alfa nekroze tumora (TNF-alfa), delta-slični protein 4 (DDL4), interleukin 17 (IL-17), proprotein konvetraze subtilizina keksinskog tipa 9 (PCSK9), pregnanski X receptor (PXR), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), insulinu-sličan receptor faktora rasta tipa 1 (TGF-1R), receptore vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGFR2) i interleukin 23 (IL-23).<10>Fn3 domeni koji se vezuju za TNF-alfa mogu da se koriste za tretman autoimunih poremećaja kao što su reumatoidni artritis, inflamatorna bolest creva, psorijaza i astma,<10>Fn3 domeni koji vezuju IL-17 mogu da se koriste za lečenje astme;<10>Fn3 domeni koji vezuju DLL4. EGFR, VEGFR2 ili IGF-1R mogu da se koriste za tretman hiper-proliferativnih poremećaja ili bolesti koje su povezane sa neželjenom angiogenezom, kao što su kanceri i tumori; i<10>Fn3 domeni koji vezuju PCSK9 mogu da se koriste za tretman arteroskleroze, hiperholesterolemije i drugih bolesti povezanih sa holesterolom.

Patentna prijava takođe opisuje i metode za administraciju Fc fuzionih proteina subjektima. Subjekt može da bude čovek, Fc fuzioni proteini mogu biti farmaceutski prihvatljivi za sisare, a posebno ljude. Termin „farmaceutski prihvatljiv" preparat se odnosi na preparat koji može biti administriran životinji bez značajnih negativnih medicinskih posledica. Primeri farmaceutski prihvatljivih preparata uključuju preparate koje su suštinski bez endotoksina ili pirogeni odnosno imaju nizak nivo endotoksina ili pirogena.

Formulacija i administracija

Patentna prijava dalje opisuje farmaceutski prihvatljive kompozicije koje sadrže ovde opisane Fc fuzione proteine. Terapijske formulacije koje sadrže Fc fuzione proteine pripremljene su za skladištenje mešanjem opisanih proteina koji imaju željen nivo čistoće sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u formi vodenih rastvora, liofilizovanih ili drugačije osušenih formulacija. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfati, citrati i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askrobinsku kiselinu i metionin; prezervative (kao što su oktadecildimetilbenzilalkohol, amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol i m-krezol); nisko-molekularne (manje od 10 amino-kiselinskih ostataka) polipeptide; proteine kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofobne polimere kao što su polivinilpolipirolidon; amino-kiseline kao što glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate kao što su glukoza, manoza ili dekstrani; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinske komplekse) i/ili ne-jonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

Ove formulacije mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja ako je potrebno za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno one sa komplementarnim dejstvima koja ne utiču negativno jedno na drugo. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenjenu svrhu.

Fc fuzioni proteini mogu biti zarobljeni u mikrokapsularnim preparatima, na primer tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer u hidroksimetilceluloznim ili želatinskim mikrokapsulama i poli-(metilmetaciklatnim) mikrokapsulama, respektivno, u koloidnim sistemima za dostavu lekova (na primer lipozomima, albuminskim mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama) ili makroemulzijama. Takve tehnike su stavljene na uvid javnosti u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Formulacije koje će biti korišćenein vivomoraju biti sterilne. Ovo je lako postići filtracijom kroz sterilne membrane za filtraciju.

Mogu biti pripremljeni i preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polu-propustljive matrikse od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže ovde opisane skafold proteine bazirane na fibronektinu, gde su matriksi formirani u obliku predmeta npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (američki patent sa brojem 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimer mlečna kiselina-glikolna kiselina kao što je LUPRON DEPOT™

(injektabilne mikrosfere sastavljanje od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućuju otpuštanje molekula tokom 100 dana, određeni hidrogelovi otpuštaju proteine kraći vremenski period. Kada enkapsulirani proteini ostanu u telu duže vreme, mogu se denaturisati ili agregirati usled izlaganja vlazi na 37°C, rezultujući gubitkom biološke aktivnosti i potencijalnim promenama imunogenosti. Racionalne strategije za stabilizaciju mogu biti osmišljene zavisno od mehanizma koji je uključen. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije usled formiranja intramolekulske S—S veze preko tiodisulfidne razmene, stabilizacija može da se postigne modifikacijom sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvojem specifičnih polimernih matriks preparata.

Prosečni poznavalac oblasti razumeće da doziranje svakog FC fuzionog proteina zavisi od samog proteina, preferencijalne doze mogu da variraju od 10 mg/kvadratnom metru do 2000 mg/kvadratnom metru, a najbolje od 50 mg/kvadratnom metru do 1000 mg/kvadratnom metru.

Za terapijske primene, Fc fuzioni proteini mogu biti administrirani subjektu, u farmaceutski prihvatljivim dozama. One mogu biti administrirane intravenski kao bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom nekog vremenskog perioda, intramuskularno, subkutano, intraartikularno, intrasinovijalno, intratekalno, oralno, topikalno ili inhalaciono. Protein može biti administriran i intratumoralno, peritumoralno, intraleziono ili perileziono kako bi se postigli lokalni ali i sistemski terapijski efekti. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači, diluensi, ekscipijenti su dobro poznati i može ih odrediti prosečan poznavalac oblasti u kliničim situacijama. Primeri pogodnih nosača, diluenasa i/ili ekscipijenata uključuju (1) Dubelkov fosfatom puferisan fiziološki rastvor, pH oko 7,4 koji sadrži oko 1 mg/ml do 25 mg/ml humanog serumskog albumina, (2) 0,9 % fiziološki rastvor (0.9% w/v NaCl), i (3) 5%

(w/v) dekstrozue. Metode iz predmetnog pronalaska mogu biti primenjenein vitro, in vivo,ili

ex vivo.

Primena Fc fuzionih proteina sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava, bilo kao istovremena administracija ili uzastopna administracija, može da se dogodi kako je prethodno opisano u terapijskim aplikacijama. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači, diluensi i ekscipijenti za istovremenu administraciju biće jasni prosečnom poznavaocu oblasti i zavisiće od prirode specifičnog terapijskog sredstva koje se istovremeno administrira.

Kada je Fc fuzioni protein prisutan u vodenoj doznoj formi, pre nego u liofilizovanoj formi, protein će obično biti formulisan u koncentracijama od 0.1 mg/ml do 100 mg/ml, iako je veliki različitih koncentracija van ovog opsega dozvoljen. Za lečenje bolesti, odgovarajuća doza Fc fuzionih proteina zavisiće od tipa bolesti koja se leči, od težine i toka bolesti, da li su Fc fuzioni protein administrirani preventivno ili terapijski, toka prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na Fc fuzioni protein, i diskrecione odluke nadležnog lekara. Fc fuzioni protein se pogodno administrira pacijentu jednom ili tokom serije tretmana.

PRIMERI

U predmetnom pronalasku koji je do sada uopšteno opisan biće jasnije zbog upućivanja na sledeće primere koji su uključeni u svrhu ilustracije određenih aspekata i prikaza predmetnog pronalaska i nisu namenjeni da na bilo koji način ograniče predmetni pronalazak.

Primer 1: Anti-PCSK9 Adnektinski klonovi

<10>Fn3 domeni koji se afinitetno vezuju za PCSK9 identifikovani su upotrebom ProFusion metode. Videti npr., WO02/032925.

ATI-1174 je pegilovan anti-PCSK9 Adnektin koji ima sledeću amino-kiselinsku sekvencu:

ATI-1174 je kodiran sledećom nukleotidnom sekvencom:

ATI-1081 je anti-PCSK9 Adnektin koji ima sledeću amino-kiselinsku sekvencu i 6x His tag:

ATI-1081 je kodiran sledećom nukleotidnom sekvencom:

ATI-1114 je pegilovananti-PCSK9 adnektin, derivat ATI-1081 koji ima drugačiji C-terminalni rep i 6x His tag:

ATI-1114 je kodiran sledećom nukleotidnom sekvencom:

ATI-972 je biotinilovani anti-PCSK9 adnektin sa 6-histidinskim c-terminusom i biotinilacijom na cisteinu i koji ima sledeću sekvencu: MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWPPPSHGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPG KGTATISGLKPGVDYTITVYAVEYPYKHSGYYHRPISINYRTEIDKPCQ (SEQ ID NO: 78).

ATI-972 ie kodiran sledećom nukleotidnom sekvencom:

<10>Fn3 domen koji vezuje PCSK9 pokazan je u italici; sekvenca zgloba je podvučena, a CH2 i CH3 regioni prikazani regularnim tekstom izvedeni su iz IgGl.

Anti-PCSK9 adnektini mogu biti eksprimiraniu E. colisa N-terminalnim metioninom ili u sisarskim ćelijama nakon sledeće lider sekvence: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 29).

Primer2: Proizvodnja i prečišćavanje proteina

Ekspresija na srednjoj skali i prečišćavanje nerastvornih veznikaa za skafold protein

baziran na fibronektinu

Za ekspresiju nerastvornih klonova, klon(ovi) iza kojih se nalazi HIS6tag klonirani su u pET9d (EMD Bioscience, San Diego, CA) vektor i eksprimirani uE. coliHMS174 ćelijama. Dvadeset ml kulture inokuluma (dobijene iz jedne kolonije sa ploče) korišćeno je za inokulisanje 1 litra LB medijuma koji sadrži 50ug/ml karbenicilina i 34 ug/ml hloramfenikola. Kultura je gajena na at 37 °C do A6oo 0.6-1.0. Nakon indukcije sa 1 mM izoporopil- |3-tiogalaktozidom (IPTG) kultura je gajena 4 sata na 30 °C, a potom je odvojena centrifugiranjem 30 minuta na >10,000 g na 4 °C. Celijski pelet je zamrznut na -80 °C. Celijski pelet je resuspendovan u 25 ml pufera za lizu. (20mM NaH2P04, 0.5 M NaCl, lx Kompletni koktel inhibitora proteaza-bez EDTA (Roche), lmM PMSF, pH 7.4) korišćenjem Ultra-turrax homogenizatora (IKA works) na ledu. Liza ćelija postignuta je homogenizacijom pod visokim pritiskom (>18,000 psi) korišćenjem Model M-110S MICROFLUIDIZER®

(Microfluidics). Nerastvorna frakcija je odvojena centrifugiranjem na 23,300 g na 4 °C. Nerastvorni pelet odvojen je od centrifugiranog lizata i ispran 20 mM natrijum fosfatom/500 mM NaCl, pH 7.4. Pelet je resolubilizovan u 6.0 M guanidin hidrohloridu u 20 mM natrijum fosfatom/500 mM NaCl, pH 7.4 uz sonifikovanje koje je praćeno inkubacijom na 37 stepeni tokom 1-2 sata. Resolubilizovani pelet je filtriran kroz 0.45 um i nanet na Histrap kolonu koja je ekvilibrisana sa 20 mM natrijum fosfatom/500mM NaCl/6.0 M guanidin, pH 7.4 puferu. Nakon nanošenja, kolona je isprana sa dodatnih 25 CV istog pufera. Vezani protein je eluiran sa 50 mM imidazolom u 20 mM natrijum fosfatu/500 mM NaCl/6.0M guanidinu, pH

7.4. Prečišćeni protein je ponovo uvijen dijalizom naspram 50 mM natrijum acetata/150mM NaCl pH 4.5.

Ekspresija na srednjoj skali i prečišćavanje rastvornih veznika za skafold protein

baziran na fibronektinu

Za ekspresiju rastvornih klonova, klon(ovi) iza kojih se nalazi HlSćtag, klonirani su u pET9d (EMD Bioscience, San Diego, CA) vektor i eksprimiraniu E. coliHMS174 ćelijama. Dvadeset ml kulture inokuluma (dobijene iz jedne kolonije sa ploče) korišćeno je za inokulisanje 1 litra LB medijuma koji je sadržao 50|ug/ml karbenicilina i 34 |ug/ml hloramfenikola. Kultura je gajena na at 37 °C do A6oo 0.6-1.0. Nakon indukcije sa 1 mM izoporopil-P-tiogalaktozidom (TPTG), kultura je gajena 4 sata na 30 °C, a potom je sakupljena centrifugiranjem 30 minuta na >10,000 g na 4 °C. Celijski pelet je zamrznut na - 80 °C. Celijski pelet je resuspendovan u 25 ml pufera za lizu. (20mM NaFhPGH, 0.5 M NaCl, lx Kompletan koktel inhibitora proteaza-bez EDTA (Roche), lmM PMSF, pH 7.4) korišćenjem Ultra-turrax homogenizatora (IKA works) na ledu. Liza ćelija postignuta je homogenizacijom pod visokim pritiskom (>18,000 psi) korišćenjem Model M-110S MICROFLUIDIZER® (Microfluidics). Rastvorna frakcija je odvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta na 23,300 g na 4 °C. Supernatant je izbistren kroz 0.45 um filter. Bistar lizat je nanet na Histrap kolonu (GE) koja je prethodno ekvilibrisana sa 20 mM natrijum fosfatom/500 mM NaCl pH 7.4. Kolona je potom isprana sa 25 zapremina kolone istog pufera, a zatim sa 20 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/25 mM imidazola pH 7.4 i zatim 35 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/40 mM imidazola pH 7.4. Protein je eluiran sa 15 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/500 mM imidazol pH 7.4, a frakcije sakupljene na osnovu apsorbancije A280i dijalizovane naspram lx PBS, 50mM Tris, 150mM NaCl. pH 8.5 ili 50mM NaOAc; 150mM NaCl; pH4.5. Bilo kakav precipitat je uklonjen filtracijom kroz 0.22um.

Fc fuzioni proteini mogu biti napravljeni u ćelijama sisara iliE. coli.

Primer 3: PRD460 KDna SPR

Vektor koji kodira PRD460 transfektovan je u HEK-293 6E ćelije korišćenjem polietilenimina (PEI). Ćelije su gajene na 37 °C 5 dana na 80% vlažnosti i 5% CO2. Ćelije su istaložene, supernatant je propušten kroz 0.22 um filter i nanete na protein A kolonu. Kolona je isprana sa PBS-om, a protein je eluiran sa 20 mM glicinom, 150 mM NaCl pH 2.8. Eluirani protein je koncentrovan i propušten kroz Superdex 200 kolonu u 50mM MES, 100 mMNaCl pH 5.8.

Karakteristike vezivanja su karakterisane Površinskom rezonancijom plazme (SPR). Anti-humano antitelo je imobilizovano na Biacore čipu i PRD40 je uhvaćen na površinu čipa. Varirajuće koncentracije hPCSK9 su stavljene u protočni rastvor uz korišćenje MgC12 (3 M) za regeneraciju čipa između ciklusa. Zbor poređenja, ATT-1081 je uhvaćen na anti-His antitelo imobilizovano na Biacore čipu. Duplikat eksperimenata za PRD40 izveden je različitih dana. Kinetička određivanja su izvođena na 25 °C. Evaluacija kinetičkih parametara je izvedena korišćenjem 1:1 algoritma za vezivanje na the Biacore softveru za evaluaciju.

Pod ovim uslovima, ATI-1081 se vezao za humani PCSK9 sa konstantom disocijacije (Kd) od 6.7 nM na 25 °C, a PRD40 je vezan za humani PCSK9 sa konstantom disocijacije (Kd) od 3.29 +/- 0.55 nM na 25 °C, što ukazuje na ekvivalentan afinitet vezivanja Fc i n-Fc formata verzije ATI1081 (Tabela 1). Određivanje brzine odvajanja korišćenjem ovog tipa testa može biti veštački ograničena brzinom odvajanja uhvaćenog Uganda sa imobilizovanog uhvaćenog antitela, pa je test format u kome se koristi direktna imobilizacija PCSK9 tačniji odraz konstante disocijacije (Kd) ATI-1081.

Primer 4: PCSK9 vezivanje FRET esejom

Testovi bazirani na transferu rezonantne energije dve fluorescencije (FRET) su korišćeni za određivanje kompetetivnog vezivnog potencijala PRD40 i drugih adnektina za hPCSK9. PCSK9:EGFA FRET esej meri vezivanje PCSK9 za LDLR korišćenjem solubilnog prekursora homologa A epidermalnog faktora rasta (EGFA) i rekombinantnog humanog PCSK9. PCSK9:ATI972 FRET esej meri kompetetivno istiskivanje adnektina biotinilovanim adnektinom ATI-972, iz PCSK9.

U PCSK9:EGFA FRET eseju ( na 5 nM PCSK9), RD460 potpuno i potentno istiskuje EGFA iz PCSK9 vezivnog mesta sa with EC50 = 0.7 nM (Slika 1, levi panel). PRD460 je bio potentniji u ovom testu i od ATI-1174 (EC50 = 1.9 nM) ili ATI-1081 (EC50 = 3.7 nM) (Slika 1). Veća očigledna potentnost PRD40 u ovom testu može biti objašnjena bivalentnim (2:1) vezivanjem adnektina PRD460 za PCSK9 (teorijski) u poređenju sa monovalentnim (1:1) vezivanjem ATI-1081 i ATI-1174.

Korišćenjem PCSK9:ATI-972 FRET eseja (na 5 nM human PCSK9), PRD460 je inhibiran sa EC50 = 0.3 nM, u poređenju sa 0.8 nM za ATI-1114 i 2.8 nm za ATI-1081 (Slika 2). Ovi nalazi ukazuju da PRD460 potentno istiskuje biotinilovani adnektin ATI-972 sa vezivnog mesta na PCSK9. Veća potentnost PRD460 u odnosu na ATI-1081 i ATI-1174 konzistentna je sa bivalentnim vezivanjem PRD460.

Primer 5: Inhibicija PCSK9-indukovanog LDLR depletiranja u HepG2 ćelijama

Humani PCSK9 promoviše depletiranje LDLR sa površine HepG2 ćelija. Preinkubacija PCSK9 sa PCSK9 adnektinima inhibira vezivanje za LDLR i sprečava depletiranje LDLR sa ćelijske površine. Ovaj esej se koristi da bi se merila sposobnost ATI-1081, ATI-1174 i PRD460 da inhibiraju PCSK9 indukovano depletiranje LDLR sa površine ćelije.

Serija razblaženja PCSK9 adnektina je preinkubirana sa 10 mM PCSK9 1 sat na 37 stepeni, a potom je preinkubirana smeša dodata na HepG2 ćelije i ćelije su inkubirane 24 sata. Nakon ove inkubacije, nivo LDLR na HepG2 ćelijama meren je FACS analizom. Procenat inhibicije PCSK9-indukovane LDLR deplecije je izračunat i predstavljen grafički (Slika 2.) U ovom eseju ATI-1081, ATI-1174, i PRD460 su inhibirali PCSK9 sa uporedivim EC50 (9nM, 8nM i 6nM respektivno) iako je konstantno pomeranje krive-odgovora u levo primećeno za PRD460. Ove EC50 predstavljaju limit eseja.

Ovaj esej je takođe korišćen da bi se odredila važnost orijentacije Fc na biološku aktivnost Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina. U tom cilju, sposobnost 1784F03 (bez Fc), 1784F03-Fc (X-Fc orijentaciju, gde je X<l0>Fn3 domen) i Fc-1784F03 (Fc-X orijentacija) kako bi se inhibirala PCSK9 indukovano depletiranje LDLR sa površine ispitivanih ćelija. Sposobnost 1813E02 (bez Fc), 1813E02-Fc (X-Fc orijentacija) i Fc-1813E02 (Fc-X orijentacija) inhibiraju PCSK9 indukovano depletiranje LDLR sa površine ćelija je takođe ispitivana.

Serija razblaženja je pripremljena i preinkubirana kao što je prethodno opisano sa 10 nM humanim PCSK9 1 sat na 37 stepeni, onda je dodat HepG2 ćelijama i ćelije su inkubirane 24 sata. Nakon ove inkubacije nivo LDLR na HepG2 ćelijama je meren korišćenjem FACS analizom. Procenat inhibicije PCSK9-indukovane LDLR depletiranja je izračunat i predstavljen grafički (Slike 16-17 i Tabele 17-18). U ovom eseju 1784F03, 1784F03-Fc, 1813E02 i 1813E02-Fc inhibiraju PCSK9 sa uporedivim IC50 (13nM, 9nM, lOnM i 4nM, respektivno). Stoga, ovi rezultati pokazuju da X-FC orijentacija može da bude važna da bi PCSK9<10>Fn3 domeni zadržali biološku aktivnost kada su spojeni sa Fc ostatkom.

Primer6: Esej ulaska PCSK9 u HepG2 ćelije

PCSK9 vezivanje za LDLR na površini hepatocita rezultuje u ko-internalizaciji LDLR-PCSK9 kompleksa tokom LDLR endocitoze, što dovodi do pojačane degradacije LDLR. Esej baziran na ćelijama je razvijen kako bi se merio LDLR-zavistan ulazak fluorescentnog PCSK9 u ćelije. Humani PCSK9 je kovalentno obeležen korišćenjem ffuorofore Alexa Fluor-647(AF647). PCSK9-AF647 je inkubiran sa HepG2 ćelijama sa ili bez PCSK9-adnektina i unutarćelijska fluorescencija je kvantifikovana fluorescentnom mikroskopijom sa visokim kontrastom i analizom slika (Cellomics). Zavisnost PCSK9-AF647 ulaska u ćelije od LDLR endocitoze ustanovljena je tokom preliminarnih eksperimenata. HepG2 ćelije su inkubirane sa 10 Nm PCSK9-AF647 i varirajućim nivoom adnektina 4 sata na 37 stepeni. U ovom eseju, potentna inhibicija unutarćelijske fluorescencije PCSK9-AF647 je primećena za PRD460 (EC50 = 6 nM) kao i za ATI-1174 (EC50 = 10 nM) (Slika 3.) Ovi nalazi ukazuju da adnektin PRD460 i ATT-1174 efikasno i ekvivalentno blokiraju vezivanje PCSK9 za LDLR sa površine ćelije u kulturi ćelijske linije dobijene iz humane jetre, čime se redukuje internalizacija PCSK9-AF647 tokom LDLR endocitoze.

Primer7:In vivostudija na transgenim miševima

In vivostudije su sprovedene na liniji 66 genomskih hPCSK9 transgenog mišijeg modela razvijenog na BMS. Ova linija eksprimira fiziološke nivoe hPCSK9 (~l-5nM). Vezivanjem adnektina za PCSK9 u plazmi predviđeno je smanjenje u merenoj količini nevezanog (slobodnog) cirkulišućeg PCSK9. Smanjenje nevezanog PCSK9 je inicijalno farmakodinamički događaj koji rezultuje inhibicijom PCSK9-LDLR interakcije i snižavanjem LDL holesterola. Administracija pojedinačnih doza PRD460 (i.p. doze od 0.6 do 18 mg/kg) transgenim miševima, rezultuje u brzom, jakom smanjenju nivoa nevezanog hPCSK9 u plazmi (Slika 4.). Dozno zavisno smanjenje nevezanog PCSK9 primećeno je sa ED50<0,6 mg/kg u vremenskoj tački 3 sata. Ovi nalazi na modelu transgenih miševa koji normalno eksprimiraju humani PCSK9 pokazuje da se PRD460 jako i potentno vezuje za cirkulišući hPCSK9in vivo.

Primer 8:In vivofarmakodinamika kod makaki majmuna

Farmakodinamički efekti PCSK9 adnektina PRD460 su evaluirani kod makaki majmuna normalne debljine. PRD460 je administriran majmunima u intravenskim dozama od 15 mg/kg i uzorci plazme su sakupljani u intervalima od 4 nedelje kako bi se odredili nivoi LDL-C i slobodnog PCSK9. Jedna doza PRD460 je rapidno smanjila nivo LDL-C u plazmi majmuna dostižući prosečni maksimalni efekat od 42% osnovnog LDL-C (58% redukcije; n = 3 majmuna) u danu 3 nakon doziranja (Slika 5.). LDL-C nivoi su bili redukovani za 50% ili više nedelju dana nakon ove doze, ostajući značajno ispod osnovnog nivoa tokom 3 nedelje i vraćajući se na osnovni nivo u 4 nedelji. Ukupni holesterol je pokazao sličan obrazac ali nije primećen efekat na HDL (nije prikazano). Tretman sa PRD460 izazvao je momentalni pad skoro do nule (ispod donje granice kvantifikacije) nevezane, slobodne forme PCSK9 u plazmi (Slika 5.). Nivo slobodnog PCSK9 je ostao blizu donjeg limita detekcije nekoliko dana i postepeno se vratio na osnovni nivo na kraju 4 nedelje, dosledno sa uzrok/posledica odnosom sa LDL-C u plazmi. Ovi podaci ukazuju da se sniženje LDL u plazmi ogleda i u padu nivoa slobodnog PCSK9, dosledno sa regulacijom PCSK9 inhibicije LDLR funkcije nakonin vivotretmana sa PRD460. Farmakokinetička analiza u studiji na makaki majmunima otkrila je da je polu-život adnektina PRD460 u plazmi otprilike 70 sati. Ovi nalazi ukazuju da je PCSK9 adnektin-Fc fuzioni protein visoko efikasan i brzo-delujući sa robusnim, specifičnim i dugotrajnim efektima na snižavanje LDL-C na modlu makaki majmuna.

Primer 9. Farmakokinetičke osobine Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina

Farmakokinetičke osobine Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina evaluirane su na miševima i makaki majmunima. Rezultati ovih eksperimenata sumirani su u Tabeli 2.

Dizajnin vivostudije na majmunima

Kako bi se odredila PK različitih fuzionih Fc-<10>Fn3 proteina kod majmuna, majmuni su dozirani sa 0,5-15 mg/kg bilo IV ili SC sa fuzionim partnerom od interesa i uzorci seruma ili plazme su sakupljani u specifičnim vremenskim tačkama tokom 4 nedelje. Uzorci su sakupljeni u obrađeni u K2EDTA ili SST za plazmu ili serum respektivno, i čuvani na - 80°C do dalje analize.

ELISA/ ECLA metoda

U najvećem broju slučajeva, ELISA ili ECLA eseji su razvijeni kako bi se odredila koncentracija Fc-<10>Fn3 fuzija u plazmi miševa ili majmuna. Generalno, ili biotinilovana meta, meta-Fc fuzija ili anti-idiotipska antitela su korišćena za hvatanje Fc-<10>Fn3 fuzija u plazmi ili serumu. Detekcija je postizana ili anti-hu-Fc antitelom kuplovanim sa peroksidazom ili sulfo-tagom, ili antitelima koja se vezuju za konstantni region<l0>Fn3 domena u kombinaciji sa anti-zečijim-HRP ili sulfo-tagovanim poliklonskim antitelima. U jednom primeru, i hvatanje i detekcija su postignuti anti-hu-Fc polikloncima kod kojih je detekciono antitelo kuplovano za HRP. Očitavanje je bilo ili kolorimetrijsko upotrebom TMB-a ili elektohemiluminiscentno korišćenjem Mesoscale Discoverv platforme. Plazma koncentracije su obično računate na osnovu 4- ili 5-parametarskog fitovanja standardne krive od 8 tačaka.

LC/ MS/ MS metoda

U nekim slučajevima, LC/MS/MS metode su razvijene kako bi se odredila koncentracija Fc-<10>Fn3 fuzija u plazmi ili serumu miševa ili majmuna. Analiza koristi tripsinsku digestiju ciljanih proteina kako bi se generisao surogat peptid od adnektinske porcije molekula i surogat peptid iz Fc regiona. Surogat peptidi su detektovani tandemskom masenom spektrometrijom. Osnova kvantifikacije je stehiometrijski odnos između adnektinskih proteina i surogata.

Standardne krive su pripremljene u istom matriksu kao uzorci iz studije. Standardna kriva i uzorci iz studije podvrgnuti su termalnoj denaturaciji praćenoj tripsinskom digestijom pre precipitacije proteina, i praćeno LC/MS/MS analizom. Koncentracije u plazmi su tipično računate na osnovu kvadratnog fitovanja standardne krive.

Farmakokinetička analiza

Farmakokinetički (PK) parametri za Fc-<10>Fn3 fuzije su računate korišćenjem Phoenix WinNonlin verzije 6.2 (Pharsight Corp, Mountain View, Kalifornija) ne-kompartmentalizovanom analizom ili uporedivim softverom. Najveća koncentracija (Cmax) zabeležena je direktno iz eksperimentalnih opservacija. Vrednosti površine ispod krive (AUC) su izračunate korišćenjem kombinacije linearnog i log trapezoidnog sumiranja. Ukupni klirens iz plazme (CLFobs), zapreminska distribucija (VzFobs or Vss), terminalni poluživot (T-HALF) i srednje vreme zadržavanja su procenjeni (MRT).

Farmakokinetičke osobine Fc-10Fn3 fuzionih proteina kod makaki majmuna

Poluživot (ti/2) PCSK9 adnektina PRD460(Fc-<10>Fn3) i PCSK9 adnektina ATI-1081 (bez FC) određene su nakon administracije makaki majmunima. Rezultati pokazuju da Fc ostatak produžava poluživot<10>Fn3 proteina (Slika 6. i Tabele 2. i 3.)

Eksperiment je izveden kako bi se uporedio poluživot (ti/2) Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina koji ciljaju solubilne ligande. Farmakokinetika PCSK9 PRD460 i drugog Fc-<10>Fn3 fuzionog proteina na različite solubilne ligande (Adn-1) kao mete ocenjivana je nakon IV administracije makaki majmunima. Adn-1 je pokazao značajno duže ti/2nego PRD460 ukazujući da meta ili1<0>Fn3 mogu da utiču na PK osobine Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina. Rezultati su sumirani na Slici 7 i u Tabelama 2 i 4.

Još jedan eksperiment je izveden kako bi se uporedio poluživot (ti/2) Fc-<10>Fn3 fuzionog proteina koji cilja receptor na površini ćelije. Farmakokinetika anti-VEGFR2<10>Fn3-Fc fuzionog proteina (C7FLFc) i druga dva Fc-<10>Fn3 fuziona proteina na različite receptore na površini ćelije (Adn-2 i Adn-3) kao mete su evaluirani nakon IV administracije u makaki majmune. Vdi CL od Adn-2 i Adn-3 su bili slični kod jednog i drugog ali veći nego što je primećeno za C7FLFc, sugerišući na uticaj mete na PK osobine Fc-'°Fn3 fuzionih proteina. Rezultati su sumirani na Slici 8 i u Tabelama 2 i 5.

Još jedan eksperiment je izveden kako bi se odredila bio-dostupnost Fc-<10>Fn3 fuzionog proteina, Adn-1, kod makaki majmuna. Nakon intravenske (IV) administracije, zapreminska distribucija (Vd) Adn-1 bila je 81 mL/kg. Ukupni telesni klirens za Adn-1 je bio nizak (0.31 mL/h/kg) i poluživot (ti/2) je bio 188 h (Slika 9 i Tabela 6). Adn-1 je pokazao subkutanu (SC) bio-dostupnost od 92% (Slika 9 i Tabela 6).

Dizajnin vivostudije na miševima

Da bi se odredile farmakokinetičke osobine različitih Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina na miševima, miševi su dozirani ili IV ili SC sa fuzionim proteinom od interesa i uzorci seruma ili plazme su sakupljeni u određenim vremenskim tačkama tokom perioda od 2-3 nedelje. Uzorci su sakupljeni iz repne vene ili retro-orbitalnog sinusa u CPD ili K2EDTA za plazmu ili u SST za serum i čuvani na -80°C do analize. Detalji studije su izlistani u Tabeli 7 niže u tekstu.

Farmakokinetičke osobine Fc- 10Fn3 fuzionih proteina kod miševa

Serija eksperimenata je izvedena na miševima kako bi se ocenile PK osobine i poluživot (ti/2) različitih Fc-'°FN3 fuzionih proteina. Rezultati su sumirani na Slikama 10-14, i Tabelama 2, 8-10. PK profili Fc-<10>FN3 fuzionih proteina koji ciljaju solubilne ligande prikazani su na Slici 10, a poluživoti (ti/2s) su sumirani u Tabeli 2. Rezultati ukazuju na slične PK profile za većinu ispitanih f Fc-10FN3 fuzionih proteina. Poluživoti su varirali od 25-126 sati kod miševa. Dva Fc-<10>FN3 fuziona proteina pokazala su drugačije profile u odnosu na većinu grupe i ovi rezultati ukazuju na uticaj<10>FN3 komponente na PK.

PK profili Fc-<10>FN3 fuzionih proteina koji ciljaju receptore na površini ćelija prikazani su na Slici 11, a poluživoti (ti/2) su sumirani u Tabeli 2. Rezultati ukazuju na slične PK profile za većinu ispitanih Fc-<10>FN3 fuzionih proteina. Poluživoti su varirali od 23-73 sati kod miševa. Dva Fc-<10>FN3 fuziona proteina pokazala su drugačije profile u odnosu na većinu grupe i ovi rezultati ukazuju na uticaj<10>FN3 komponente i/ili mete na PK.

Eksperiment je izveden kako bi se utvrdilo da li X-Fc ili Fc-X orijentacija utiče na farmakokinetiku (PK) Fc-<10>FN3 fuzionih proteina. PK osobine PRD239 i PRD713, dva Fc-<10>FN3 fuziona proteina kreirana sa istom<10>FN3 komponentom ocenjeni su nakon IV administracije "nude" miševima. Kako je pokazano na Slici 12 i u Tabelama 2 i 8 orijentacija ne utiče na PK osobine kod miševa.

PRD713 X-Fc 65.6 ± 11.8 359.1 ±5 3.89 ±0.8 34.2 ± 6.4 81.4 ±17.1

Eksperiment je izveden kako bi se utvrdilo da li soj miševa utiče na farmakokinetiku (PK) Fc-<10>FN3 fuzionih proteina. PK osobine PRD460 su ocenjivane nakon IV administracije "nude" ili C57B1/6 miševima. Kako je pokazano na Slici 13 i Tabelama 2 i 9, soj miševa ne utiče na PK osobine Fc-<10>FN3 fuzionih proteina.

Eksperiment je izveden kako bi se utvrdili da li<l0>Fn3 komponenta utiče na farmakokinetiku (PK) Fc-<10>FN3 fuzionih proteina. PK osobine Fc-'°FN3 fuziona proteina koja ciljaju PCSK9, PRD460 i PRD461, evaluirana je nakon IV administracije "nude" miševima. Kako je pokazano na Slici 14 i u Tabelama 2 i 10 PCSK9<10>Fn3 komponenta može da utiče na PK osobine Fc-<10>FN3 fuzionog proteina.

Primer 10. Vezivanje Fc-<10>Fn3 fuzija za ne- Fc<10>Fn3 proteine

Osobine vezivanja Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina i ne- Fc<10>Fn3 proteina karakterisane su Površinskom rezonancijom plaze (SPR). Anti-humana ili anti-histidinska antitela su imobilizovana na Biacore čipu i<10>Fn3 proteini i Fc-<10>Fn3 fuzije su hvatane na površini čipa. Varirajuće koncentracije ciljanog proteina stavljane su u protočni rastvor uz upotrebu MgCk (3 M) za regeneraciju čipa između ciklusa. Kinetička određivanja su izvođena na 25 °C. Evaluacija kinetičkih parametara rađenja je korišćenjem 1:1 algoritma za vezivanje u Biacore softveru za evaluaciju.

Rezultati u prikazani u Tabeli 11 niže u tekstu. U nekim slučajevima, orijentacija<10>Fn3 u odnosu na Fc nije uticala na vezivanje, dok u nekim jeste. Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da prisustvo Fc ne utiče negativno na afinitet vezivanja.

Primer 11.EsejproliferacijeBa/F3

Sposobnost C7FL-Fc (anti-VEGFR2 Fc-<10>Fn3) da inhibira proliferaciju Ba/F3 ćelija poređena je sa inhibicijom sa CT322 (anti-VEGFR2<10>Fn3). Ba/F3 ćelije koje stabilno eksprimiraju VEGFR2 fuzioni protein (sadrži ekstracelularni domen hVEGFR2 i inracelularni domen hEpoR) zasejane su na ploče od 96 bunara, 25 000 ćelija/bunaru u 90 ul medijuma za rast koji je sadržao 15 ng/ml VEGF-A, VEGF-C ili VEGF-D. Serijska razblaženja CT322 ili C7FL-Fc su pripremljena kao 10x finalna koncentracija, i 10 jul CT322 ili C7FL-Fc je dodato u svaki bunar. Pločice su inkubirane na 37 °C/5% C02 48-72 sata. 20 ul CellTiter 96® vodenog jedno-rastvornog reagensa (Promega) dodato je u svaki bunar i pločice su dalje inkubirane 3-4 sata na 37°C. Na kraju perioda inkubacije, očitana je apsorbanca na 490 nm korišćenjem čitača za mikrotitar pločice. Slika 15 prikazuje da C7FL-Fc može da inhibira proliferaciju Ba/F3 ćelija ekvivalentno CT322. Rezultati su sumirani u Tabeli 12.

Primer12. Evaluacija linkera za generisanje Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina

Eksperimenti su izvedeni kako bi se ocenile performanse 8 različitih linkera na generisanje Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina. Fuzioni proteini su evaluirani na osnovu četiri kriterijuma: (i) koncentracija proteina, (ii) sadržaj monomera, (iii) temperatura topljenja i (iv) afinitet vezivanja za metu. Tabela 13 izlistava različite linkere odabrane u ovoj studiji.

Četiri različita<10>Fn3 molekula, svaki specifičan za različitu metu, fuzionisani sa svakim linkerom, u Fc-X orijentaciji. Četiri različita<10>Fn3 molekula su Adn-1, C7FL, Adn-10 i 2013. Ukupno su generisana i analizirana 32 različita Fc fuziona molekula

Analiza sisarski visoko- prometno eksprimiranih proteina ( HMEP)

Ekspresioni konstrukti koji kodiraju 32 Fc-<10>Fn3 fuzione proteine transfektovani su u 4 ml HEK-293-6E ćelijsku kulturu korišćenjem pločice sa 24 duboka bunara i inkubirani na 37°C. Pet dana nakon transfekcije, ćelije su lizirane i proteini su prečišćeni korišćenjem Protein A HP Multitrap. Dobij eni proteinski preparati su evaluirani u smislu prinosa korišćenjem BCA proteinskog eseja sa SGE (kontrolnim Adnektinom) kao proteinskim standardom.

Slika 18 je grafik koji sumira prosečan prinos po transfekcionoj zapremini svake Fc-<10>Fn3 fuzione serije. Dijamanti predstavljaju Adn-1 serije, kvadrati predstavljaju Fc-C7FL serije, a krstići Fc-2013 serije. Sve u svemu, Adn-1 serija je imala najveći prosečan prinos po transfekcionoj zapremini.

Gel-filtraciona hromatografija (SEC) izvedena je na Fc-<10>Fn3 fuzionom proteinima dobijenim od HMEP. SEC je izvođena na Superdex 200 5/150 ili Superdex 75 5/150 koloni (GE Healthcare) na Agilent 1100 ili 1200 HPLC sistemu sa UV detekcijom na A214nm i A280nm i sa fluorescentnom detekcijom (ekscitacija = 280 nm, emisija 350 nm). Korišćen je pufer 100 mM natrijum sulfat, 100 mM natrijum fosfat, 150 mM natrijum hlorid, pH 6.8 pri protoku koji je odgovarao korišćenoj SEC koloni. Standardi za gel-filtraciju (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) su korišćeni za kalibraciju molekulskih masa.

Slika 19 je grafik koji sumira monomerni skor svakog od Fc-<10>Fn3 fuzionih serija. Oznake su iste kao na slici 18. Rezultati pokazuju da Fc-<10>Fn3 fuzije sa linkerom 7 imaju visok procenat monomernog skora.

Analiza ekspresije na srednjoj skali

Serija Adn-1 linkera je odabrana za analizu na srednjoj skali. Ekspresioni konstrukti koji kodiraju seriju Adn-1 linkera transfektovani su u 175 ml HEK-293-6E. Pet dana posle transfekcije, ćelije su lizirane i protein je prečišćen korišćenjem Protein A prečišćavanja na AKTA 100 sistemu. Rezultujući proteinski preparat evaluiran u smislu prinosa korišćenjem BCA proteinskog eseja sa SGE (kontrolnim Adnektinom) kao proteinskim standardom.

Slika 20 predstavlja grafik koji sumira prosečan prinos za Adn-1 seriju linkera. Rezultati pokazuju daje prinos visok za većinu Adn-1 fuzija.

SEC analiza prečišćavanja na srednjoj skali Adn-1 fuzija pokazuju da većina Adn-1 fuzija ima visok monomerni sadržaj. Slika 21 je grafik koji sumira monomerni skor za svaku od Adn-1 fuzija.

Tečna hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS) izvedena je na prečišćenim Fc-<10>Fn3 fuzijama dobijenim na srednjoj skali. Slika 22 sumira rezultate LC-MS koji potvrđuju identitete sedam testiranih Adn-1 fuzija. Prikazani su reprezentativni LC-MS grafici za fuzione proteine sa linkerima 5 i 7.

Temperature topljenja na prečišćenih Fc-<10>Fn3 fuzija dobijenih na srednjoj skali merena je diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Rastvor koncentracije 1 mg/ml svakog od Fc-'°Fn3 fuzionih proteina je skeniran u N-DSC II kalorimetru (Calorimetrv Sciences Corp) podizanjem temperature od 5 °C do 95 °C brzinom od 1 stepena po minutu pod pritiskom od 3 atm. Podaci su analizirani u poređenju sa kontrolnim snimanjem odgovarajućeg pufera korišćenjem opcije najboljeg fitovanja u Origin Softveru (OrginLab Corp). Slika 23 prikazuje temperature topljenja svake od Adn-1 fuzija upoređenih sa kontrolom, koju su u ovom eksperimentu činili CH2 i CH3 domeni Fc. Sve u svemu, Adn-1 fuzije imaju temperature topljenja uporedive sa nemodifikovanim Adn-1 (bez Fc), za koji je prethodno određena temperatura topljena od 57 °C.

Vezivne karakteristike svakog od prečišćenih Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina dobijenih na srednjoj skali karakterisane su Površinskom rezonancijom plazme (SPR). Slika 24 sumira vezivne karakteristike Adn-1 serije naspram imobilizovane mete. Rezultati pokazuju da sve Adn-1 zadržavaju vezivni afinitet za metu.

Primer 13. Karakterizacija imunogenosti linkera korišćenih za generisanje Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina.

Adaptivni imuni odgovor započinje procesovanjem i digestijom internalizovanog proteina od strane antigen-prikazujćih ćelija (APC) kao što su dendritske ćelije. APC seče internalizovane proteine na kratke peptide i onda ih prikazuje na površini svojih MHC molekula klase II. Vezivno mesto za peptide na MHC molekulu klase II je dugo i usko, kao kifla za viršlu, u drži peptid u istegnutom formatu, sa prostorom za devet amino-kiselina na primarnom vezivnom mestu (i generalno omogućava kratke repove na svakoj od strana peptida). Određeni džepovi u MHC vezivnom mestu su dominantni za određivanje vezivanja peptida. Ovi džepovi odgovaraju amino-kiselinama na pozicijama 1, 4, 6 i 9 u usidrenom delu 9-mernog peptida. Peptid koji ima povoljne bočne ostatke na svakoj od ove četiri pozicije će se generalno dobro vezivati za HLA (MHC molekul klase II).

Smatra se da je na poziciji 1 najvažniji „sidro ostatak" uključen u vezivanje peptida i HLA molekula. Pozicija 1 generalno favorizuje hidrofobne bočne ostatke, pa će stoga 9-mer koji se vezuje za HLA često počinjati sa V, I, L, M, F, Y, ili W. Druge pozicije su mnogo varijabilni]e, pa različiti HLA aleli favorizuju različite setove amino-kiselina na svakom mestu.

HLA vezivanje može biti predviđenoin silico,na primer, korišćenjem EpiMatriks-a. EpiMatriks je računarski algoritam u vlasništvu kompanije EpiVax koja gaje razvila, i koristi se za skrining proteinskih sekvenci na prisustvo putativnih HLA vezujućih motiva. Ulazne sekvence se raščlanjuju na preklapajuće 9-mer okvire, gde se svaki okvir preklapa u barem 8 amino-kiselina. Svaki od rezultujućih okvira je bodovan za predviđen afinitet vezivanja u odnosu na panel uobičajenih HLA alela klase II (DRB1<*>0101, DRB1<*>0301, DRB1<*>0401, DRB1<*>0701, DRB1<*>0801, DRB1<*>1101, DRB1<*>1301, i DRB1<*>1501). Sirovi skorovi su normalizovani naspram skora velikog uzorka slučajno generisanih peptida. Dobijeni ,,Z" skoro je prijavljen. Bilo koji 9-merni peptid koji u EpiMatriks Z-skoru premaši 1,64 smatra se putativnim HLA vezujućim motivom.

Imunogenost linkera korišćenih za generisanje Fc-<10>Fn3 fuzionih proteina predviđen je prethodno opisanomin silicometodom. Tabela 14 izlistava amino-kiselinske sekvence linkera koji su analizirani (istaknuto sivom) sa bočnim regionima, u slučaju C-terminusa IgGl Fc i N-terminusa 10Fn3 domena.

Tabela 15 prikazuje Epi Matriks skorove za svaki od analiziranih linkera. Svi skorovi su veoma niski (negativni brojevi u EpiMatriks koloni Skor grupe), ukazujući da je predviđena veoma niska imunogenost linkera.

Primer14. Imunogenost fuzionog Fc-<10>Fn3 proteina kod makaki majmuna

Izvedeni su eksperimenti kako bi se ispitalo da li bi fuzije Fc kod makaki majmuna smanjile imunogenost<10>Fn3 proteina. U ovim eksperimentima, imunogeni odgovor kod makaki majmuna indukovan anti-IL23<10>Fn3-Fc (1571G04-Fc) poređen je sa imunogenim odgovorom na anti-IL23<10>Fn3-PEG (1571G04-PEG). Ova dva molekula imaju isti<10>Fn3 deo.

Tri makaki majmuna injektovana su i.v. sa 3 mg/kg 1571G04-PEG ili 1571G04-Fc u danima 1, 8 i 15. Uzorci plazme su sakupljeni u danima 1, 8, 15 pre injektovanja kao i 168, 240, 336, 408 i 504 sata nakon 3.doze. Plazma je analizirana na anti-adnektinska antitela u tipičnom ELISA eseju. Ukratko, 1571G04-PEG ili 1571G04-Fc su adsorbovani na mikrotitar pločice i anti-lek antitela u plazmi su hvatana i detektovana sa zečijim anti-humanim IgG-HRP konjugat antitelima. Pozitivan odgovor je definisan kao dva puta veći od nivoa šuma koji je primećen pre doze u 1 tački za svaku životinju.

Kako je prikazano na Slici 27, 1571G04-PEG je indukovao značajan anti-<10>Fn3 IgG odgovor tri nedelje nakon i.v. inekcije 3 mg/kg. Suprotno i kako je prikazano na Slici 28, 1571G04-Fc molekul je indukovao veoma mali anti-<10>Fn3 TgG odgovor, toliko da nismo primetili porast antitela u bilo kojoj analiziranoj vremenskoj tački.

Ovi rezultati sugerišu da fuzija<10>Fn3 proteina za majmunski Fc može da smanji inherentnu imunogenost<10>Fn3 proteina kod makaki majmuna, sugerišući da fuzionisanje humanog Fc za<10>Fn3 proteine može da smanji njihovu imunogenost kod ljudi.

Primer 15. STAT3 fosforilacija na Kit 225 ćelijkoj metodi

Parham et al. (A receptor for the heterodimeric cvtokine IL-23 is composed of IL-12Rbetal and a novel cvtokine receptor subunit, IL-23R. J Immunol. 2002 Jun 1; 168(11):5699-708) su klonirali IL-23R iz humane IL-2 zavisne T-ćelijske linije, Kit225. Ove ćelije su karakterisane ekspresijom oba IL-12RB1 i 1L-23R FACS analizom i odgovarale su na IL-23 stimulacijom pSTAT3 i na IL-12 stimulacijom pSTAT4. Kit225 ćelije su zasejavane u pločice od 96 bunara i utišavane u odsustvu FBS i IL-2 tokom 3 sata na 37°C. Nakon ove inkubacije, nanet je 10 pM humani rekombinantni IL-23 (ili 11-23 preinkubiran sa antagonistom 1 sat) i ćelije su vraćene u inkubator još 15 minuta na 37°C kako bi se stimulisala fosforilacija STAT3 (skraćeno p-STAT3). Svaki od uslova testiranje u duplikatu na pločici od 96 bunara. Stimulacija je zaustavljana stavljanjem pločice na led i dodavanjem ledenog PBS. Finalno, ćelije su istaložene i lizirane prateći standardni protokol i pSTAT3 proizvod je određen ELISA esejom.

Rezultati

Stimulacija IL23R sa IL23 u Kit225 ćelijama ocenjena je merenjem pSTAT3. Ova stimulacija je efikasno inhibirana u osnovi anti-IL23 Adnektinskim klonom 1571G04 rezultujući u ICso od 86.1 ± 8.1pM. 1123 inhibicija 1571G04-Fc fuzionim proteinom bila je uporediva sa neformatiranim Adnektinom dajući IC50od 153 ± 19pM. Alternativna orijentacija Fc-1571G04 rezultovala u značajnom gubitku aktivnosti u eseju (IC50= 692 ± 159 pM). Ovi rezultati su sumirani u Tabeli 16.

Primer 16.Amino-kiselinska Sekvenca fuzionih proteina korišćenih u Primerima PRD289:

PRD289 ima sledeći š zglob: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 26) I humani IgGl Fc.

PRD292:

PRD461 je fuzioni protein koji sadrži Fc vezan za anti-PCSK9 Adnektin 2013E01, čija sekvenca je data u WO2011/130354. Amino-kiselinske sekvence anti-PCSK9 adnektina 1784F03 i 1813E02 su date u WO2011/130354. Amino-kiselinska sekvenca anti-IL-23 adnektina 1571G04 data je u WO2011/103105.

Claims (14)

1. Polipeptid koji sadrži imunoglobulin Fc domen i<10>Fn3 domen, gde<10>Fn3 domen je fuzionisan za C-terminus Fc domena pomoću polipetidnog linkera koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO (sekvenca koja ima identifikacioni broj): 84 ili SEQ ID NO:86.

2. Polipeptid iz patentnog zahteva 1, gde<10>Fn3 domen ima izmenjenu aminokiselinsku sekvencu u odnosu na sekvencu divljeg tipa (wild type) prikazanu u SEQ ID NO:l, gde se izmenjeni<10>Fn3 domen vezuje za ciljni molekul sa Kdmanjom od 500 nM.

3. Polipeptid iz patentnog zahteva 1 ili 2, gde polipetidni linker sadrži SEQ ID NO: 86.

4. Polipeptid iz patentnog zahteva 1 ili 2, gde polipetidni linker sadrži SEQ ID NO: 84.

5. Polipeptid iz bilo kod od patentnih zahteva 1-4, gde polieptid ima sledeći aranžman od N-terminusa do C-terminusa: zglob-Fc domen-linker-<10>Fn3 domen.

6. Polipeptid iz bilo kod od patentnih zahteva 1-5, gde polipeptid sadrži drugi<10>Fn3 domen.

7. Polipeptid iz patentnog zahteva 6, gde se 10Fn3 domeni vezuju za različite targete.

8. Polipeptid iz bilo kod od patentnih zahteva 1-7, gde je Ig Fc domen izveden iz IgG, IgM, IgD, IgE, ili IgA.

9. Polipeptid iz patentnog zahteva 8, gde Tg Fc domen je izveden iz TgG.

10. Polipeptid iz patentnog zahteva 9, gde Ig Fc domen je izveden iz IgGl.

11. Nukleinska kiselina koja kodira polieptid iz bilo kod od patentnih zahteva 1-10.

12. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 11.

13. Vektor iz patentnog zahteva 12, gde je vektor ekspresioni vektor.

14. Ćelija domaćina koja sadrži vektor iz patentnog zahteva 13.