RS64172B1 - Postupci i kompozicije za ćelije prirodne ubice - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetna patentna prijava odnosi se uopšteno na kompozicije i postupke koji sadrže ćelije prirodne ubice (natural killer, NK). Tačnije, patentna prijava se odnosi na in vivo ili in vitro stimulaciju i ekspanziju endogenih ćelija prirodnih ubica (NK) koje su sposobne da napadnu i ubiju imunološke ćelije i ćelije kancera.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Transplantacija matičnih ćelija hematopoeze (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) iz genotipski HLA-podudarnog brata ili sestre poboljšala je dugoročno preživljavanja pacijenata sa hematološkim malignitetima i sindromima otkazivanja funkcije kostne srži. Svake godine više od 10 000 Amerikanaca dobije oboljenje koje ugrožava život, za koje jedina nada u izlečenje leži u transplantaciji kostne srži od nesrodnog davaoca ili u krvi sakupljenoj iz pupčane vrpce. Međutim, više od 70% pacijenata koji bi mogli imati koristi od transplantacije alogenih matičnih ćelija nemaju podudarnog brata ili sestru kao davaoca, (Henslee-Downey, et al. 1997). Ovakve situacije odlažu lečenje, zbog čega je nužno pribeći korišćenju davaoca koji nije optimalan već je delimično nepodudaran, što na kraju dovodi do povećane incidence bolesti kalema protiv domaćina (graft-versus-host disease, GVHD), otkazivanja kalema i recidiva, što sve dramatično smanjuje preživljavanje pacijenata (Drobyski, et al.2002), (Baker, et al.2009).

[0003] Dodatna ograničenja predstavljaju trajanje i visoki finansijski, mentalni i zdravstveni teret procesa transplantacije. Stoga je primena HSCT od nesrodnog davaoca ograničena na mlađe, zdravije pacijente sa odgovarajućom socioekonomskom potporom, koji mogu izdržati proces.

[0004] Dodatni izazov predstavlja visoka stopa recidiva, do kojeg dolazi zbog nemogućnosti iskorenjivanja zaostalih ćelija kancera. Iako se smatra da je HSCT lekovita, stope recidiva kancera su zapanjujuće. Prema tome, potrebne su nove, preciznije usmerene imunoterapije koje bi bile efikasnije, poželjno bez potrebe za odgovarajućim davaocem. Infuzija davaočevih limfocita (donor lymphocyte infusion, DLI), za lečenje recidiva akutne mijeloidne leukemije (acute myeloid leukemia, AML) posle HSCT, uvedena je 1990-ih. Ovaj pristup sastojao se od toga da se pacijentu sa AML, koji ima recidiv bolesti, daju limfociti poreklom iz originalnog davaoca. Ipak, klinička korist bila je ograničena i primećena samo kod malog broja pacijenata koji su imali manje tumorsko opterećenja, a GVHD posredovana T-ćelijama često je dodatno pogoršavala ishod.

Christian D.A. & Hunter C.A. (Immunotherapy, 2012, 4, 4, 425-441) daju pregled korišćenja citokina inkapsuliranih u čestice, u imunoterapiji. Anderson P.M. et al. (Cytokine, 1994, 6, 1, 92-101) objavljuju jednostavan, opšte primenljiv postupak inkorporisanja GM-CSF, IL-1α, IL-2, IL-6 i IFN-γ u lipozome koji sadrže dimiristoil fosfatidil holin. Lachman L.B. et al. (European Cytokine Network, 1996, 7, 4, 693-698) daju pregled upotrebe lipozoma koji sadrže citokine, kao dodatke vakcini. Van Broekhoven C.L. & Altin J.G. (International Journal of Cancer, 2002, 98,1, 63-72) objavljuju postupak modifikovanja plazmamembranskih vezikula korišćenjem helatorskog lipida, ditetradecilamina nitrilotrisirćetne kiseline, i upotrebu vezikula kao vakcine. WO 2005/018610 A1 odnosi se na kompoziciju koja sadrži antigen-sadržavajuće membranske vezikule ili antigen-sadržavajuće lipozome i ligand za receptor na dendritskim ćelijama za modulisanje imunosti in vivo usmeravanjem antigena ka dendritskim ćelijama. WO 2010/071836 A1 odnosi se na transgeni animalni model-sistem baziran na razvijanju transgenih miševa koji nose komponente imunskog sistema čoveka, uključujući veliki broj limfocita urođene imunosti kao što su zrele humane ćelije prirodne ubice (NK), γδ T ćelije, i NK-T ćelije kao i adaptivni CD4 i CD8 T limfociti. Denman, C. J. et al. (PLoS ONE, 2012, 7, 1, e30264) objavljuju upotrebu veštačkih antigenprezentujućih K562-baziranih ćelija sa IL-21 vezanim za membranu, za podržavanje proliferacije humanih NK-ćelija. Klempner M.S. et al. (J Cell Biol, 1980, 86, 1, 21-28) objavljuju postupak izolovanja plazma-membrane neutrofila, uz korišćenje kavitacije azotom za razaranje ćelija i kombinovanje diferencijalnog centrifugiranja i ravnotežnog ultracentrifugiranja na gradijentu dekstrana, za frakcionisanje membrane. WO 2013/175237 A1 odnosi se na kompozicije za pobuđivanje NK ćelija, koje sadrže ligaciono sredstvo CD2 i ligaciono sredstvo NKG2D. Objavljen je i supstrat za pobuđivanje NK ćelija, ili vezikula (na primer lipozom) koja sadrži ligaciono sredstvo CD2 i ligaciono sredstvo NKG2D. Colosimo, D. ([Teza), 2012, HIM 1990-2015, 1325] objavljuje postupak za ex vivo ekspanziju uz korišćenje k562 leukemijskih ćelijskih linija i rastvorljivih citokina, kao i upotrebu izolovanih plazma-membrana genetički inženjerisanih ćelijskih linija, za ekspanziju NK ćelija. Oyer J.L. et al. (Biol. Blood Marrow Transplant., 2015, 21, 4, 632-639) objavljuju postupak ekspanzije NK ćelija baziran na česticama, uz korišćenje plazma-membranskih čestica) poreklom iz K562-mbIL15-41BBL ćelija hraniteljica.

[0005] Postoji velika potreba za novim i poboljšanim postupcima koji za cilj imaju povećanje broja NK ćelija.

[0006] Dodatne prednosti objavljenog postupka i kompozicija biće navedene delom u opisu koji sledi, a delom će se razumeti na osnovu opisa, ili će se spoznati primenom objavljenog postupka i kompozicija. Prednosti objavljenog postupka i kompozicija uvideće se i postići putem elemenata i kombinacija posebno istaknutih u priloženim patentnim zahtevima. Podrazumeva se da su i gornji opšti opis i detaljni opis koji sledi samo primeri i objašnjenja i ne ograničavaju zahtevani pronalazak.

KRATAK SAŽETAK

[0007] Predmetni pronalazak odnosi se na kompoziciju koja sadrži plazma-membranske vezikule prečišćene iz ćelija hraniteljica NK ćelija. Ćelije hraniteljice NK ćelija su ozračene autologne ili alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), RPMI8866, HFWT, K562 ili EBVLCL. Plazma-membranska vezikula uključuje najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije. Najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije je IL-21 ili IL-15. Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu kompozicije za stimulaciju ili ekspanziju NK ćelija u populaciji NK ćelija in vitro, primenjivanjem kompozicije na populaciju NK ćelija in vitro. Pored toga, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju populacije ekspandiranih NK ćelija. Postupak uključuje dovođenje u kontakt prve populacije NK ćelija in vitro sa gore pomenutom kompozicijom. Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije. Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo za aktiviranje NK ćelija.

[0008] Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21, IL-2, 41BBL, IL-12, IL-18, MICA, 2B4, LFA-1, ili BCM1/SLAMF2.

[0009] Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21, ili 41BBL.

[0010] Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu plazmamembrana može sadržati dva ili više efektorskih sredstava za NK ćelije. Najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti citokin. Na primer, objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu plazma-membrana može sadržati IL-15 i 41BBL. U nekim aspektima, plazma-membrana može sadržati još i IL-21. Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu plazma-membrana može sadržati IL-21 i 41BBL.

[0011] Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu plazmamembranska vezikula okružuje mikročesticu.

[0012] Objavljene su kompozicije koje sadrže dve ili više plazma-membranskih vezikula, pri čemu plazma-membranske vezikule sadrže efektorsko sredstvo za NK ćelije.

[0013] Objavljene su kompozicije koje uključuju najmanje jednu kompoziciju koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije i najmanje jednu kompoziciju koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije.

[0014] Objavljene su kompozicije koje uključuju membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo koje aktivira NK ćelije. Objavljene su kompozicije koje uključuju membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21, IL-2, 41BBL, IL-12, IL-18, MICA, 2B4, LFA-1, i BCM1/SLAMF2.

[0015] Objavljene su kompozicije koje sadrže membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu je efektorsko sredstvo za NK ćelije IL-15, IL-21, ili 41BBL.

[0016] Objavljene su kompozicije koje sadrže membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu je membranski samoinsertujući peptid molekul koji promoviše insertovanje u membranu i koji može biti humani Fc, GPI, transmembranski T-ćelijski receptor, ili pHLIP.

[0017] Objavljene su kompozicije koje uključuju dve ili više kompozicija koje sadrže membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije.

[0018] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije. Najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo koje aktivira NK ćelije. U nekim aspektima, efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21, ili 41BBL.

[0019] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži dva ili više efektorskih sredstava za NK ćelije. Najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti citokin. Prema tome, objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži dva ili više efektorskih sredstava za NK ćelije, pri čemu plazmamembrana može sadržati IL-15 i 41BBL. U nekim aspektima, plazma-membrana može sadržati još i IL-21. Isto tako, objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži dva ili više efektorskih sredstava za NK ćelije, pri čemu plazmamembrana može sadržati IL-21 i 41BBL. Isto tako, objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazmamembransku vezikulu koja sadrži dva ili više efektorskih sredstava za NK ćelije, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži IL-15 i IL-21.

[0020] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu plazma-membranska vezikula može da se prečisti iz ćelija hraniteljica NK ćelija. Ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti ozračene autologne ili alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), RPMI8866, HFWT, K562, K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL), K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL, ili EBV-LCL. U nekim aspektima, ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL ili K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL.

[0021] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije stimuliše ekspanziju NK ćelija. U ovim postupcima može se koristiti bilo koja od objavljenih kompozicija plazma-membranskih vezikula.

[0022] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. Efikasna količina kompozicije može da stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0023] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu kompozicija sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa IL-15, IL-21, ili 41BBL.

[0024] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu membranski samoinsertujući peptid može biti humani Fc, GPI, transmembranski T-ćelijski receptor, ili pHLIP.

[0025] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu kompozicija može sadržati dva ili više membranskih samoinsertujućih peptida konjugovanih sa efektorskim sredstvom za NK ćelije.

[0026] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije. Efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo koje aktivira NK ćelije. U nekim aspektima, efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21 ili 41BBL.

[0027] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži IL-15 i IL-21. U nekim aspektima, plazma-membranska vezikula sadrži još i 41BBL.

[0028] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži IL-15 i 41BBL. U nekim aspektima, plazma-membranska vezikula može sadržati IL-21 i 41BBL.

[0029] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu plazma-membranska vezikula može biti prečišćena iz ćelija hraniteljica NK ćelija. Ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti ozračene autologne ili alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), RPMI8866, HFWT, K562, K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL), K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL, ili EBV-LCL. U nekim aspektima, ćelije hraniteljice NK ćelija mogu bit K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL ili K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL.

[0030] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0031] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu primena na ćelijskoj populaciji uključuje primenu kompozicije kod subjekta, pri čemu subjekt uključuje ćelijsku populaciju.

[0032] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije. Efikasna količina kompozicije može da stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0033] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu kompozicija sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa IL-15, IL-21, ili 41BBL.

[0034] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu membranski samoinsertujući peptid može biti humani Fc, GPI, transmembranski T-ćelijski receptor, ili pHLIP.

[0035] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu primena na ćelijskoj populaciji uključuje primenu kompozicije kod subjekta, pri čemu subjekt uključuje ćelijsku populaciju.

[0036] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije, pri čemu kompozicija uključuje najmanje dva membranska samoinsertujuća peptidna konjugata, pri čemu su membranski samoinsertujući peptidni konjugati konjugovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. Najmanje dva membranska samoinsertujuća peptidna konjugata mogu biti konjugovana sa istim ili različitim efektorskim sredstvima za NK ćelije.

[0037] Objavljeni su postupci za modulisanje imunskog sistema, koji uključuju primenu, kod subjekta, jedne ili više kompozicija koje uključuju membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije ili plazma-membransku vezikulu koja uključuje efektorsko sredstvo za NK ćelije. Postupci za modulisanje imunskog sistema mogu uključivati smanjenje broja aktiviranih T ćelija, ekspandiranje broja NK ćelija, ili smanjenje broja dendritskih ćelija.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0038] Priloženi crteži ilustruju nekoliko primera izvođenja objavljenog postupka i kompozicija i, zajedno sa opisom, služe za objašnjenje principa objavljenog postupka i kompozicija.

Slika 1 je prikaz plazma-membrane poreklom od K562-mb15-41BBL ćelija, koja sadrži samo stimulatorne ligande (IL-15 i 41BBL) ili sadrži i magnetne nano-čestice, C18-silika perlicu ili polistirensku perlicu, ili perlicu od silike.

Slika 2 prikazuje efektorska sredstva za NK ćelije, koja uključuju 41-BBL, IL-15, IL-21, MICA, 2B4, i druga. Druga uključuju, ali se ne ograničavaju na BCM1/SLAMF2, IL-2, IL-12. Prikazan je i generički membranski samoinsertujući peptid (MBI). Efektorsko sredstvo za NK ćelije i MBI mogu biti unakrsno povezani i samoinsertovani u tumorske ćelije.

Slika 3 predstavlja tačkaste dijagrame CD56-PE u odnosu na CD3-APC, koji pokazuju porast populacije CD56+CD3-NK ćelija sa porastom koncentracije K562-mb21 plazma-membrane u kulturi, posle 10 dana.

Slika 4 predstavlja grafikon sa stubićima koji prikazuje porast procenta NK ćelija u kultivisanim ćelijama, koji je rezultat povišenja koncentracije K562-mb15 ili K562-mb21 plazma-membrane.

Slika 5 predstavlja grafikone sa stubićima koji prikazuje porast ekspanzije NK ćelija sa porastom koncentracija PM-mb15-41BBL ili PM-mb21-41BBL membranskih vezikula u kulturi.

Slika 6 predstavlja grafikon sa stubićima koji prikazuje procenat citotoksičnosti mbIL15 K562, mbIL21 K562, mbIL15 PM, ili mbIL21 PM prema K562, KG1, i HL-60 ćelijama na dan 10 kulture. NK ćelije ekspandirane u prisustvu plazma-membrane poreklom od K562mb15 i K562mb21 pobuđuju uporedive citotoksične odgovore protiv ćelijskih linija AML (KG1 i HL-60) i CML (K562) kada se uporede sa NK ćelijama koje su kultivisane sa živim ćelijama hraniteljicama.

Slika 7 predstavlja histograme koji pokazuju IL-15-FITC i 41BBL-PE. Lateksne ili C18-silika perlice obavijene su K562mb15 plazma-membranom koja sadrži za membranu vezani IL15 i 41BBL. I lateksne i C18-silika perlice pokazale su prisustvo IL-15 i 41BBL posle obavijanja. Izotip je svetlije obojena linija.

Slike 8A i 8B prikazuju detritus nađen u kulturi posle ekspanzije NK ćelija. a) FSC prema. SSC PBMC (crveno) zajedno sa plazma-membranom na dan 10 kulture. b) FSC prema SSC PBMC (crveno) zajedno sa detritusom K562mb15 ćelija hraniteljica (zeleno). Gornja i donja slika predstavljaju zasebne kulture na dan 10. Gornja slika ima značajno više detritusa ćelija hraniteljica nego donja slika.

Slika 9 prikazuje da PM-mb15-41BBL vezikule efikasno ekspandiraju NK ćelije. PBMC su ko-kultivisane sa K562-mb15-41BBL hraniteljicama ili su stimulisane PMmb15-41BBL vezikulama (pri 100 ili 200 µg membranskog proteina/ml) tokom 21 dana. Ćelijski sadržaj testiran je svaka 2-3 dana i medijum je menjan po potrebi. Slika prikazuje jednu reprezentativnu ekspanziju od 3 izvedene sa PBMC poreklom iz 3 različita davaoca. Svaka tačka predstavlja prosek duplikata kultura.

Slika 10 prikazuje da PM-mb15-41BBL vezikule selektivno ekspandiraju NK ćelije. PBMC se stimulišu PM-mb15-41BBL vezikulama u prisustvu 200 µg membranskog proteina/ml, tokom 14 dana. Broj i sadržaj ćelija testiraju se svaka 2-3 dana bojenjem ćelija anti-CD56-PE i anti-CD3-APC antitelima i analiziranjem sadržaja na Accuri protočnom citometru. U svim do sada izvedenim eksperimentima CD56+ CD3- NK ćelije su ekspandirane u okviru PBMC u uslovima stimulacije PM-mb15-41BBL

1

vezikulama i do dana 14 činile su >95% ćelijskog sadržaja. Slika prikazuje jednu reprezentativnu ekspanziju od 3 izvedene sa PBMC poreklom iz 3 različita davaoca. Slika 11 prikazuje da sadržaj NK ćelija raste sa koncentracijom PMmb15-41BBL vezikula. PBMC se stimulišu različitim količinama plazma-membranskih vezikula tokom 14 dana. Ćelijski sadržaj meren je korišćenjem anti-CD56-PE i anti-CD3-APC. Svaka tačka predstavlja prosek duplikata kultura.

Slika 12 pokazuje da optimizovane PM-mb15-41BBL vezikule ekspandiraju NK ćelije jednako dobro kao žive ćelije hraniteljice. PBMC se ko-kultivišu sa optimizovanim (n=6) ili inicijalnim (n=4) preparatima PM vezikula u prisustvu 200 µg membranskog proteina/mL ili se ko-kultivišu sa 1 × 10<6>/mL K562-mb15-41BBL živih hraniteljica (n=6, pozitivna kontr. hraniteljica) ili 50 ng/mL rastvorljivog IL-15 i 50 ng/mL rastvorljivog 41BBL (n=6, SC kontr.), tokom najviše 20 dana. Dijagram prikazuje koliko je puta povećana ekspanzija NK ćelija posle 12-13 dana u kulturi.

Slika 13 pokazuje da stopa rasta NK ćelija ekspandiranih PM-mb15-41BBL vezikulama opada posle dve nedelje u kulturi. PBMC se ko-kultivišu sa PM vezikulama u prisustvu 200 µg membranskog proteina/mL u trajanju od preko 4 nedelje. 1⁄2 medijuma zamenjuje se svakog drugog dana posle dana 3. 100 µg PM vezikula zamenjuje se prilikom zamene medijuma, svakog drugog dana. Ćelijski sadržaj meren je korišćenjem anti-CD56-PE i anti-CD3-APC. Svaka tačka predstavlja prosečnu vrednost za duplikate kultura. Slika prikazuje jednu reprezentativnu ekspanziju od 3 izvedene sa PBMC poreklom iz 3 različita davaoca.

Slika 14 prikazuje da su NK ćelije ekspandirane PM-mb15-41BBL vezikulama citotoksične prema CML i AML ciljevima. Test citotoksičnosti izveden je na dan 13-14 korišćenjem PanToxiLux kita koji meri aktivnost kaspaze/granzima u obeleženim ciljnim ćelijama. Ciljne ćelije, 0.5 × 10<6>/mL, ko-inkubiraju se sa ekspandiranim NK ćelijama u različitim odnosima, u duplikatu, u trajanju od 1.5 sati, a zatim analiziraju protočnom citometrijom. Količina spontane smrti ciljnih ćelija određuje se korišćenjem "samo cilj" kontrole. Procenat citotoksičnosti određuje se oduzimanjem spontane ćelijske smrti od ćelijske smrti cilja i zatim deljenjem sa ukupnim ciljnim ćelijama. Slika prikazuje jedan reprezentativan test citotoksičnosti od 3 izvedene sa PBMC poreklom iz 3 različita davaoca.

Slika 15 prikazuje ciljne NK ćelije ekspandirane PM-mb15-41BBL vezikulama u poređenju sa sveže izolovanim NK ćelijama. Inicijalni test citotoksičnosti izveden je na sveže izolovanim NK ćelijama iz zdravih davalaca. Pre testiranja citotoksičnosti, NK izolovane iz PBMC na Ficollu uz korišćenje Stem Cell Technologies negativnog selekcionog kita, ostave se da miruju i preaktiviraju se preko noći u medijumu za rast FBS visoki nivo (1000 U/mL) IL2. Pre testiranja citotoksičnosti, NK ekspandirane iz PBMC PM vezikulama pri 200 µg membranskog proteina/mL tokom 13-14 dana, preaktiviraju se visokim (1000 U/mL) IL2 preko noći. Slika prikazuje jednu reprezentativnu ekspanziju od 3 izvedene sa PBMC poreklom iz 3 različita davaoca. Slika 16 pokazuje da su NK ćelije ekspandirane PM-mb15-41BBL vezikulama citotoksične za ćelije obolelih od primarne AML. Citotoksičnost NK ćelija kultivisanih sa PM vezikulama pri 200 µg membranskog proteina/mL tokom 13-14 dana testirana je protiv primarnog tumora poreklom od 2 različita pacijenta. Tumorske ćelije su sakupljene iz kostne srži ili periferne krvi pacijenata koji su potpisali informisani pristanak. Leukemijski blasti su razdvojeni na Ficollnom gradijentu i zamrznuti za buduće eksperimente. Pre korišćenja u testovima citotoksičnosti, odmrznuti uzorci tumora inkubirani su u medijumu preko noći radi oporavka. Ciljne tumorske ćelije su obojene TFL4 bojom da bi se razlikovale od efektora. Dodatno, tumorske ćelije su obojene anti-CD34-PE da bi se tumorske ćelije pacijenta razlikovale od PBMC zdravih pacijenata. Slika prikazuje jednu reprezentativnu ekspanziju od 3 izvedene sa PBMC poreklom iz 3 različita davaoca.

Slika 17 pokazuje da PM-mb15-41BBL vezikule ekspandiraju NK ćelije in vivo u NSG miševima. PBMC poreklom iz dva različita davaoca stimulišu se PMmb15-41BBL vezikulama pri 200 µg membranskog proteina/ml tokom 7 dana. Na dan sedam, ćelije se prebroje i analiziraju u pogledu ćelijskog sadržaja, centrifugiraju, resuspenduju pri 15 mln NK ćelija/mL u 100 µL bistrog RPMI sa 50 U/mL IL 2 i injektiraju u repnu venu NSG miša. Miševi se injektiraju 3 puta nedeljno PM-mb15-41BBL vezikulama (200 µg membranskog proteina/ml) i niskom 100 U ili dozom od 1000 U IL-2. Na dan 1 i 4 posle injekcije 50-100 µL mišje krvi uzme se i analizira u pogledu prisustva i broja humanih CD45+ limfocita, CD3-CD56+ NK ćelija i CD3+CD56-T ćelija. Grafikon predstavlja koliko je puta povećana ekspanzija NK ćelija između dana 1-3 posle injekcije.

DETALJAN OPIS

[0039] Objavljeni postupak i kompozicije mogu se lakše razumeti uz pozivanje na sledeći detaljan opis određenih primera izvođenja i Primera uključenih u njega i na Slike i njihov prethodni i naredni opis.

[0040] Podrazumeva se da objavljeni postupak i kompozicije nisu ograničeni na specifične postupke sinteze, specifične analitičke tehnike, ili na određene reagense, osim ako nije drugačije navedeno, i kao takvi mogu varirati. Treba razumeti takođe da je ovde korišćena terminologija namenjena samo opisivanju posebnih primera izvođena, bez namere da bude ograničavajuća.

[0041] Značajan deo efekta kalema protiv tumora (graft-versus-tumor, GVT) posredovanog infuzijom davaočevih limfocita može biti posledica dejstva ćelija prirodnih ubica (NK). Infuzija NK ćelija izolovanih iz krvi davaoca mogla bi proizvesti korisne GVT efekte bez izazivanja GVHD. Preklinički i klinički podaci pokazali su efikasnost infuzija NK ćelija, koja vodi ka potpunoj remisiji bez GVHD. Prema tome, infuzija NK ćelija, u kombinaciji sa autolognom transplantacijom ili kao samostalni tretman, nudi inovativnu i potencijalno veoma efikasnu alternativu za one pacijente koji nemaju odgovarajućeg davaoca, imaju recidiv ili ne ispunjavaju uslove za transplantaciju.

[0042] Infuzija NK ćelija predstavlja opciju lečenja za pacijente sa kancerima osetljivim na lizu NK ćelijama, uključujući kancere krvi (kao što je akutna mijeloidna leukemija ili multipli mijelom) i nekoliko vrsta solidnih tumora (npr. tumor mozga, Ewingov sarkom i rabdomiosarkom) (Harada, Saijo et. al. 2002.; Ruggeri, Capanni et al.2002.; Miller, Soignier et al. 2005.; Cho, Shook et al. 2010.). Povećani broj funkcionalnih NK ćelija takođe može značajno povećati efikasnost terapijskih antitela koja se koriste u lečenju nekoliko vrsta kancera, uključujući, između ostalih, limfome, kolorektalni kancer, kancer pluća i kancer dojke (Hatjiharissi, Xu et al.2007; Triulzi, Vertuani et al.2010; Houot, Kohrt et al.2011; Tai, Horton et al.2012). Ove vrste personalizovanih tretmana su, međutim, vrlo skupe, sa tipičnim režimom koji sadrži antitela koja koštaju desetine hiljada dolara. Pored toga, često se ne dostiže očekivana efikasnost postojećih postupaka zbog izostanka angažovanja imunskih ćelija kod imunski kompromitovanih pacijenata sa kancerom (Dewan, Takada et al. 2009; Mamessier, Sylvain et al.2011).

[0043] Da bi postupak lečenja kancera bio efikasan, poželjno je postići stupanj ekspanzije NK ćelija koji dostiže efikasnu terapijsku dozu. Nekoliko studija pokazalo je da NK ćelije u kulturi in vitro proliferišu eksponencijalno i preferentno u mešavini mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) kada su stimulisane kombinacijom citokina (kao što je IL-15 ili IL-21)

1

i liganda za aktivaciju receptora (kao što je 4-1BBL) koji se eksprimiraju na površini stimulatorskih ćelija (Imai, Iwamoto et al. 2005; Cho and Campana 2009; Lee, Verneris et al.

2010; Somanchi, Senyukov et al.2011).

[0044] Za citokine IL-15 i IL-21, unakrsna prezentacija interleukina vezanog za membranu, kao u normalnim dendritskim ćelijama, indukuje ekspanziju NK ćelija snažnije nego rastvorljivi oblik ovih citokina. Štaviše, pod takvim uslovima stimulacije, za preživljavanje NK ćelija potrebna je samo niska koncentracija rastvorljivog IL-2, čime se omogućava selektivna ekspanzija NK ćelija u mešavini PBMC, bez vidljive proliferacije T ćelija. Rastvorljivi oblik citokina IL-15 i IL-21 ili visoke doze IL-2 snažnije stimulišu proliferaciju T ćelija nego NK ćelija. Prethodno objavljena studija koju su sproveli Campana et al. pokazala je da u kulturi in vitro stimulacija NK ćelija ćelijskom linijom K562 koja ima za membranu vezane IL-15 i 4-1BBL dovodi do snažne ekspanzije NK ćelija koja nije zapažena sa K562 ćelijama koje eksprimiraju samo jedan od molekula (Imai, Iwamoto et al. 2005; Fujisaki, Kakuda et al. 2009). Međutim, ekspanzija NK ćelija bila je ograničena na nekoliko deoba i ćelije su dostigle senescenciju i prestale da se razmnožavaju, što je koincidiralo sa zapaženim skraćivanjem telomera. U studiji praćenja otkriveno je da stimulacija za membranu vezanim IL-21 umesto IL-15 podstiče kontinuiranu propagaciju NK ćelija tokom velikog broja generacija, omogućavajući kontinuiranu ekspanziju NK ćelija pod uslovom da se kultura povremeno dopunjava svežim stimulatorskim ćelijama (Somanchi, Senyukov et al. 2011; Denman, Senyukov et al. 2012). Iako ovi postupci omogućavaju efikasnu ekspanziju NK ćelija in vitro, potreba za živim ćelijama hraniteljicama otežava prenošenje postupka u kliničke uslove. Isto tako, NK ćelije koje se pacijentu daju infuzijom verovatno će prestati da se dele zbog nedostatka stalne stimulacije hraniteljicama. Pored toga, još uvek nedostaju informacije o sposobnosti in vitro kultivisanih NK ćelija da funkcionišu kako je predviđeno kada se reinfundiraju pacijentu (Miller 2009).

[0045] Primena IL-2 trenutno je jedini postupak ekspanzije NK ćelija in vivo koji je odobrila FDA. IL-15 se trenutno testira u fazi I kliničkog ispitivanja kao pristup alternativan primeni IL-2, ali se na osnovu pretkliničkih nalaza očekuje da će još uvek imati značajnu toksičnost u slučaju sistemske primene. Prema tome, oba postupka nose značajnu toksičnost za pacijente i takođe indukuju proliferaciju T-ćelija, uključujući regulatorne T-ćelije, što dovodi do kratke perzistencije (u proseku manje od 21 dana) NK ćelija.

[0046] Uspešna pilot-studija pokazala je da je infuzija prečišćenih NK ćelija izolovanih iz krvi davaoca bezbedna i da može dovesti do potpune remisije AML, bez GVHD. Da bi se dostigla terapijska doza, NK ćelije se ekspandiraju in vivo u pacijentima sa limfodeplecijom, svakodnevnom primenom visoke doze IL-2. Međutim, intenzivni režim kondicioniranja potreban za limfodepleciju i visoke doze IL-2 korišćene u ovoj studiji rezultovali su značajnom toksičnošću i produženom hospitalizacijom, a u mnogim slučajevima, niskom in vivo ekspanzijom NK ćelija. Štaviše, sistemska primena IL-2 dovodi do proliferacije regulatornih T ćelija koje suprimiraju broj i funkciju NK ćelija, čime se ograničava njihova perzistencija i efikasnost u pacijentu. Zbog toga su potrebni alternativni pristupi za in vivo ili ex vivo ekspanziju NK ćelija.

[0047] Efikasnost imunoterapije NK ćelijama zavisi od doze NK ćelija koja se daje pacijentu ili koja se postiže posle infuzije, ekspanzijom in vivo. Trenutno dostupne tehnike ograničene su nemogućnošću postizanja nivoa ekspanzije NK ćelija potrebnog za dostizanje terapijskog efekta kod pacijenta. Nedostatak kliničkog protokola ekspanzije glavna je prepreka napredovanju imunoterapije bazirane na NK ćelijama. U sadašnjim ex vivo protokolima ekspanzije koristi se kombinacija visokih doza citokina i aktivirajućih liganda eksprimiranih na hraniteljskim/stimulatorskim ćelijskim linijama leukemijskog porekla, što predstavlja značajan nedostatak za transfer u kliničke uslove u većini centara i nisu pogodni za direktnu in vivo ekspanziju. Ovde opisana upotreba tehnologije čestica eliminiše potrebu za stimulatorskim ćelijama, čime se pojednostavljuje postupak i omogućava direktna i selektivna ekspanzija in vivo.

[0048] Nekoliko grupa tragalo je za postupkom ekspanzije NK ćelija ex vivo. Međutim, većina trenutno razvijenih ex vivo postupaka oslanja se na sisteme ko-kulture tumorskih ćelijskih linija i NK ćelija u prisustvu visokih koncentracija različitih citokina, uglavnom IL-2 (pregled dat u Cho and Campana 2009; Suck and Koh 2010). Ćelije upotrebljene za pokretanje proliferacije NK ćelija uključuju ozračene autologne ili alogene PBMC, RPMI8866, HFWT, K562, K562-mb15-41BBL (K562 transfektovane 4-1BBL i za membranu vezanim IL-15), K562-mb21-41BBL iEBV-LCL (Harada, Saijo et al. 2004; Imai, Iwamoto et al. 2005; Berg, Lundqvist et al.2009; Fujisaki, Kakuda et al.2009; Siegler, Meyer-Monard et al. 2010). Iako ekspanzija NK ćelija nekom od ovih ćelijskih linija može biti značajna (30-10 000 puta u roku od 7-21 dana), upotreba ćelija hraniteljica predstavlja značajan nedostatak za transfer u kliničke uslove u većini centara zbog potrebe za postojanjem postrojenja u skladu sa aktuelnom dobrom proizvođačkom praksom (current Good Manufacturing Practice, cGMP), što košta nekoliko miliona dolara (pregled dat u Cho and Campana 2009; Suck and Koh 2010). Pored toga, kontinuirano kultivisanje ćelija hraniteljica je skupo i zahteva podršku

1

posvećenog osoblja. Nacionalni instituti za zdravlje (The National Institutes of Health, NIH) trenutno obezbeđuju podršku za proizvodnju ćelija za ćelijsku terapiju u vidu Pomoći u proizvodnji za ćelijsku terapiju (Production Assistance for Cellular Therapy, PACT). Međutim, izgleda da NK ćelije gube svoju aktivnost tokom krioprezervacije (prezentacija PACT radionice). Prema tome, skladištenje i transport ekspandiranih NK ćelija od mesta proizvodnje do centra za transplantaciju predstavljaju još jednu prepreku za uspešnu primenu terapije. Dodatnu brigu predstavlja mogućnost infuzije živih ćelija hraniteljica i/ili genetičkog materijala oslobođenog iz tih transformisanih ćelija i komponenti kulture (npr. fetalni goveđi serum) u pacijenta primaoca.

[0049] Miltenyi Biotech uveo je kit za in vitro ekspanziju, koji koristi perlice obložene antitelima za unakrsno povezivanje aktivirajućih receptora NK ćelija. Međutim, ovaj postupak zahteva upotrebu visoke koncentracije IL-2. Iako je koristan za laboratorijsku primenu, ovaj postupak ne može da se prevede u kliničke uslove jer NK ćelije kultivisane korišćenjem visokih koncentracija citokina podležu brzoj apoptozi posle infuzije, zbog povlačenja citokina (Miller 2009).

[0050] Saopšteno je da do ekspanzije NK ćelija u PBMC dolazi u prisustvu visoke koncentracije IL-2 i uz stimulaciju anti-CD3 antitelom, u toku prvih pet dana (Carlens, Gilljam et al. 2001; Alici, Sutlu et al. 2008). Ukupna ekspanzija NK ćelija bila je blizu 1000 puta, ali većinu NK ćelija činile su u stvari T ćelije slične NK ćelijama (Berg and Childs 2010). Prema tome, svi postupci nose sa sobom značajne probleme vezane za prenos u kliničke uslove i ni jedan od postupaka ne može da se koristi u direktnoj ekspanziji in vivo.

A. Plazma-membranske vezikule

[0051] Objavljene su plazma-membranske vezikule koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije. Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo za aktiviranje NK ćelija (tj. stimulatorni ligand). Primeri citokina mogu biti, ali se ne ograničavaju na IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 i IL-18. Primeri adhezivnih molekula mogu biti, ali se ne ograničavaju na LFA-1, MICA, BCM/SLAMF2. Primeri sredstava za aktivaciju NK ćelija mogu biti, ali se ne ograničavaju na 41BBL i BCM/SLAMF2. U nekim aspektima, član jedne grupe može biti i član druge grupe. Na primer, BCM/SLAMF2 može biti i adhezivni molekul i sredstvo za aktiviranje NK ćelija. Efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti, ali se ne ograničava na 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-18, MICA, LFA-1, 2B4 i BCM/SLAMF2. Plazma-membranske vezikule su prenosnici koji se koriste za prenošenje

1

efektorskih sredstava za NK ćelije. Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti vezana za membranu. Dok su efektorska sredstva za NK ćelije vezana za membranu, druga terapijska ili dijagnostička sredstva mogu se transportovati u unutrašnjosti plazma-membranske vezikule.

[0052] U nekim aspektima, plazma-membranska vezikula sadrži najmanje jedan citokin vezan za membranu. Prema tome, objavljene su plazma-membranske vezikule, pri čemu plazmamembranske vezikule sadrže efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu je efektorsko sredstvo za NK ćelije IL-15, IL-21 ili 41BBL.

[0053] Objavljene su kompozicije koje sadrže plazma-membranske vezikule, pri čemu plazma-membranske vezikule sadrže dva ili više efektorska sredstva za NK ćelije. U nekim aspektima, najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti citokin. Na primer, plazma-membrana može sadržati IL-15 i 41BBL; IL-15, 41BBL i IL-21; ili IL-21 i 41BBL. U nekim aspektima, plazma-membranska vezikula sadrži najmanje dva za membranu vezana citokina. Na primer, plazma-membranska vezikula može sadržati za membranu vezani IL-15 i za membranu vezani IL-21.

[0054] Plazma-membranske vezikule mogu da se koriste same, napunjene magnetnim nanočesticama ili vezane za čvrstu podlogu kao što je, bez ograničavanja perlica od silicijuma ili lateksa. U nekim aspektima, plazma-membranske vezikule mogu da okružuju ili obavijaju mikročesticu. Mikročestice obavijene plazma-membranom mogu da se naprave od bilo kojih ovde opisanih plazma-membranskih vezikula. Na primer, objavljene su mikročestice obavijene plazma-membranom, koje sadrže IL-15 i 41BBL ili IL-21 i 41BBL. Plazmamembranom obavijene mikročestice mogu biti napunjene magnetnim česticama, perlicama od silike, polistirenskim perlicama, lateksnim perlicama, kontrastnim sredstvima, ili poznatim lekovima kao što su lekovi za kancer.

[0055] Objavljene su kompozicije koje sadrže dve ili više plazma-membranskih vezikula, pri čemu plazma-membranske vezikule sadrže efektorsko sredstvo za NK ćelije. Na primer, kompozicije mogu sadržati plazma-membransku vezikulu koja sadrži IL-15 i 41BBL i plazma-membransku vezikulu koja sadrži IL-21 i 41BBL.

[0056] Objavljene su kompozicije koje uključuju najmanje jednu kompoziciju koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije i najmanje jednu kompoziciju koja sadrži plazma-membransku vezikulu, pri čemu plazmamembranska vezikula sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije. Efektorsko sredstvo za NK ćelije konjugovano sa membranskim samoinsertujućim peptidom može biti isto ili različito od efektorskog sredstva za NK ćelije koje se nalazi u plazma-membranskoj vezikuli.

1

[0057] Plazma-membranske vezikule su vezikule napravljene od plazma-membrane ćelije ili su napravljene veštački (tj. lipozomi). Plazma-membranske vezikule mogu da se pripreme korišćenjem tehnika poznatih u struci. Na primer, mogu se koristiti opšti protokoli za pripremanje plazma-membrane ili opšti protokoli za pripremanje lipozoma. Plazmamembranske vezikule mogu sadržati lipidni dvosloj ili jednostavno jedan sloj lipida. Plazmamembrane napravljene veštačkim putem, kao što su lipozomi, mogu se pripremiti korišćenjem lipidnog dvosloja i membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata kako je opisano u nastavku.

B. Membranski samoinsertujući peptidni konjugati

[0058] Objavljene su kompozicije koje sadrže membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. Ove kompozicije mogu da se označe i kao membranski samoinsertujući peptidni konjugati.

[0059] Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti citokin, adhezivni molekul, ili sredstvo koje aktivira NK ćelije (tj. stimulatorni ligand). Primeri citokina mogu biti, ali se ne ograničavaju na IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, i IL-18. Primeri adhezivnih molekula mogu biti, ali se ne ograničavaju na LFA-1, MICA, BCM/SLAMF2. Primeri sredstava koja aktiviraju NK ćelije mogu biti, ali se ne ograničavaju na 41BBL i BCM/SLAMF2. U nekim aspektima, član jedne grupe može biti i član druge grupe. Na primer, BCM/SLAMF2 može biti i adhezivni molekul i sredstvo koje aktivira NK ćelije. Efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti, ali se ne ograničava na 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-18, MICA, LFA-1, 2B4, i BCM/SLAMF2. Prema tome, objavljene su kompozicije koje sadrže membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21 ili 41BBL.

[0060] Objavljene su kompozicije koje sadrže membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu je membranski samoinsertujući peptid molekul koji promoviše inserciju u membranu i može biti humani Fc, GPI, transmembranski T-ćelijski receptor, ili pHLIP. Membranski samoinsertujući peptid može biti bilo koji peptid za koji je poznato da se insertuje u ćelijsku membranu. U zavisnosti od upotrebe membranskog samoinsertujućeg peptidnog konjugata, određeni membranski samoinsertujući peptidi mogu biti bolji izbor od nekih drugih. Stručnjak u oblasti će razumeti koji je membranski samoinsertujući peptid idealan pod različitim uslovima. Na primer, za in vivo upotrebu, može da se koristi pHLIP membranski samoinsertujući peptid. pHLIP

1

membranski samoinsertujući peptidi insertuju se u membranu samo u uslovima niskog pH. Prema tome, pHLIP konjugati neće se insertovati u ćelijske membrane pod normalnim fiziološkim uslovima. Međutim, posle injektiranja u tumorsko okruženje, pHLIP konjugat može da se insertuje u ćelijsku membranu tumorskih ćelija zbog toga što je tumorsko okruženje kiselije od normalnih fizioloških uslova. Ova insercija u tumorsko okruženje omogućava aktivaciju NK ćelija u oblasti tumora. Korišćenje pHLIP, prema tome, prevenira neželjenu nasumičnu inserciju u ćelijske membrane.

[0061] Objavljene su kompozicije koje sadrže dva ili više membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata, pri čemu su membranski samoinsertujući konjugati konjugovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. U ovim kompozicijama može da se koristi bilo koji od objavljenih membranskih samoinsertujućih konjugata opisanih ovde. Dva ili više membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata mogu sadržati isto ili različito efektorsko sredstvo za NK ćelije.

[0062] Membranski samoinsertujući peptidi mogu se konjugovati sa efektorskim sredstvom za NK ćelije na različite načine. Tehnike konjugacije dobro su poznate u struci. U nekim aspektima, membranski samoinsertujući peptidni konjugati mogu biti fuzioni proteini. Fuzioni proteini mogu se proizvoditi u bakterijskim ćelijama. Fuzioni proteini mogu se sastojati od efektorskog sredstva za NK ćelije konjugovanog sa alipofilnim molekulom kao što je hidrofobni peptid, GPI ili humani Fc, za ukotvljavanje u lipozome ili ćelijske membrane (Hunt, Rath et al.1997; Kueng, Leb et al.2007; Paulick, Forstner et al.2007; Paulick, Wise et al. 2007; Reshetnyak, Segala et al. 2007). cDNK vektori za ove fuzione proteine mogu biti povezani u ekspresioni plazmid koji omogućava ekspresiju u bakterijskim (E. coli), insekatskim, ili sisarskim ćelijama. cDNK vektor može biti FLAG- ili HIS- markiran. Bakterijske ćelije mogu da se transfektuju korišćenjem standardnih CaCl postupaka transfekcije, kao što je onaj opisan u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Bakterijske ćelije mogu da se kultivišu u LB medijumu i ćelije mogu da se sakupe i liziraju korišćenjem francuske prese. Proteini od interesa mogu da se prečiste iz lizata afinitetnom hromatografijom. Protein A konjugovan za palmitat i prečišćeni Fc fuzioni proteini mogu da se konjuguju, kao što je opisano u literaturi, mešanjem u odnosu 1:2 (tež/tež) na 4 stepena C (vidi Kim & Peacock, Journal of Immunological Methods, 1993 Jan. 14;158(1):57-65 i Liu et al., Journal of Immunology, 2007 Mar. 1; 178(5); 3301-3306). Konjugati zatim mogu da se direktno injektiraju u tumor ili mogu da se inkorporišu u lipozome.

1

[0063] Membranski samoinsertujući peptidni konjugati mogu da se inkorporišu u lipozome. Na primer, GPI može da se kupluje sa 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, MICA, 2B4, ili BCM/SLAMF1 i može da se inkorporiše u lipozome.

[0064] Lipozomi mogu da se pripreme rastvaranjem lipida u hloroformu i evaporisanjem u atmosferi azota da se formira film. Mali unilamelarni lipozomi mogu da se formiraju resuspendovanjem lipida u vodi i sonifikacijom u ultrazvučnoj kadici. Protein A/Fc fuzioni konjugati ili proteini kuplovani sa GPI mogu da se pomešaju sa lipozomima. Insercija proteina može biti takva da protein A ili GPI kao kotva mogu da se insertuju u lipidni dvosloj, ostavljajući funkcionalni stimulatorni protein na vanćelijskom regionu. Lipozomi zatim mogu da se PEGilišu da bi im se produžio životni vek. Lipozomi obloženi proteinom mogu zatim da se koriste za lečenje kancera ex vivo ekspanzijom imunskih efektorskih ćelija ili direktnom intravenskom injekcijom da bi se promovisala in vivo ekspanzija / aktivacija imunskih ćelija.

[0065] Tipovi konjugacije i postupci za konjugaciju poznati su u struci. Izraz "konjugat" odnosi se na membranski samoinsertujući peptid koji je konjugovan, kuplovan ili povezan sa drugom kompozicijom kao što je peptid ili protein. Na primer, membranski samoinsertujući peptidni konjugati mogu biti fuzioni proteini, pri čemu je membranski samoinsertujući peptid disulfidnom vezom konjugovan sa drugim proteinom. Spajanje ili konjugacija može značiti da postoji hemijska veza između membranskog samoinsertujućeg peptida i efektorskog sredstva za NK ćelije.

[0066] U nekim aspektima, efektorsko sredstvo za NK ćelije može da se konjuguje sa membranskim samoinsertujućim peptidima ili GPI kotvama, za in situ samoudruživanje. Na primer, 41-BBL i IL-21 mogu da se konjuguju u pHLIP peptid koji se insertuje u ćelijske membrane u uslovima kiselosti sredine, čime se omogućava ukotvljavanje stimulatornih liganada u ćelije u blizini tumora (Reshetnyak, et al.2006; Andreev, et al. 2007; Reshetnyak, et al. 2007). Efektorska sredstva za NK ćelije 41BBL, IL-2, IL- 12, IL-15, IL-21, i BCM/SLAMF2 mogu se proizvesti u bakterijskim ćelijama ili kupiti iz komercijalno dostupnih izvora. cDNK vektori za ove proteine mogu se vezati u pTriEX eekspresioni plazmid koji omogućava ekspresiju u bakterijskim (E. coli), insekatskim ili sisarskim ćelijama. cDNK vektor može da kodira ekspresiju FLAG- ili HIS-oznake. Bakterijske ćelije mogu da se transfektuju korišćenjem standardnih CaCl postupaka transfekcije. Bakterijske ćelije mogu da se kultivišu na LB medijumu. Ćelije mogu da se sakupe i liziraju korišćenjem francuske prese. Proteini od interesa mogu zatim da se prečiste iz lizata afinitetnom hromatografijom.

2

[0067] pHLIP može da se pripremi sintezom peptida na čvrstoj fazi uz korišćenje 9-fluorenilmetiloksikarbonila, a proizvod se može prečistiti na C18 koloni reverzno-faznom hromatografijom. pHLIP se tada može konjugovati sa stimulatornim humanim proteinskim ligandima inkubacijom sa sredstvom za unakrsno povezivanje, kao što je benzofenon-4-jodoacetamid. Posle nekoliko ispiranja, konjugovani pHLIP protein može da se resuspenduje u medijumu (fiziološki rastvor, na primer) i injektira intratumorski ili intravenski. Na osnovu ranije postojećih dokaza iz literature (Imai, Iwamoto et al. 2005; Liu, Breiter et al. 2007; Fujisaki, Kakuda et al. 2009; Somanchi, Senyukov et al. 2011; Denman, Senyukov et al.

2012) i prikazanih eksperimentalnih rezultata, interakcija NK ćelija sa stimulatornim ligandima kao što su IL-21 ili IL-15 i 41-BBL na površini tako modifikovanih tumorskih ćelija može stimulisati in situ ekspanziju NK ćelija i pokrenuti njihov citotoksični odgovor protiv tumora. Ovaj tip stimulatornog pristupa može da se koristi za lečenje solidnih tumora kao što je kancer ovarijuma gde NK stimulatorni ligandi koji se insertuju in situ u tumorske ćelije pod kiselim pH mogu da se insertuju u intraperitonealni prostor pacijenata u prisustvu samo niske doze IL-2 ili zajedno sa NK ćelijama (Geller, Cooley et al. 2011). Postoji jak dokaz da su citotoksični limfociti koji eksprimiraju visoke nivoe FCyIII R (CD16), kao što su NK ćelije, od ključnog značaja za efikasnost lečenja kancera terapijskim antitelima (Kute, Savage et al. 2009; Reim, Dombrowski et al. 2009; Mamessier, Sylvain et al. 2011). Prema tome, ovaj pristup može da se koristi i u kombinaciji sa terapijskim antitelima.

C. Kombinacija plazma-membranskih vezikula i membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata

[0068] Objavljene su kompozicije koje sadrže jednu ili više objavljenih plazma-membranskih vezikula i jedan ili više objavljenih membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata. Plazma-membranske vezikule i membranski samoinsertujući peptidni konjugat mogu sadržati isto efektorsko sredstvo za NK ćelije ili različita efektorska sredstva za NK ćelije.

D. Postupci ekspandiranja ćelija prirodnih ubica

[0069] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membranske vezikule koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija sadrži NK ćelije.

[0070] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija sadrži NK ćelije.

[0071] Objavljeni su i postupci ekspandiranja NK ćelija, koji uključuju primenu kompozicije koja sadrži jednu od objavljenih plazma-membranskih vezikula i kompoziciju koja sadrži jedan od objavljenih membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata. U nekim aspektima, jedna kompozicija može da se formuliše tako da sadrži jednu ili više plazma-membranskih vezikula i jedan ili više membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata.

[0072] Ekspandirane NK ćelije i/ili kompozicije, koje se koriste za ekspanziju NK ćelija mogu se koristiti kao postupak lečenja kod pacijenata sa kancerima osetljivim na lizu posredovanu NK ćelijama, kao i kod pacijenata koji su bili podvrgnuti transplantaciji hematopoetskih matičnih ćelija. Kompozicije koje ekspandiraju NK ćelija mogu se koristiti za povećanje količine citotoksičnih NK ćelija posle transplantacije matičnih ćelija za povećanje klirensa rezidualnih tumorskih ćelija i/ili za prevenciju recidiva. Kompozicije koje ekspandiraju NK ćelije takođe se mogu koristiti za lečenje pacijenata sa virusnom infekcijom.

[0073] Kompozicije za ekspandiranje NK ćelija mogu se koristiti kao postupak lečenja posle infuzije NK ćelija za povećanje broja i in vivo perzistencije citotoksičnih NK ćelija, za povećanje efikasnost terapije NK ćelijama (tj. broja pacijenata kod kojih dolazi do remisije i/ili koji ostaju u remisiji).

[0074] NK ćelije sa ili bez kompozicija za ekspandiranje NK ćelija koristiće se u kombinaciji sa terapijskim antitelima za lečenje raznih vrsta kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na limfome, kolorektalni kancer, kancer pluća, kancer debelog creva, kancer glave i vrata i kancer dojke, kako bi se povećao broj pacijenata koji odgovaraju na terapiju terapijskim antitelima i postižu remisiju i/ili ostaju u remisiji.

1. Ekspandiranje NK ćelije plazma-membranskim vezikulama

[0075] Plazma-membranske vezikule koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije mogu se koristiti za ekspanziju NK ćelija in vitro ili in vivo. Postupci ekspandiranja NK ćelija mogu uključivati primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije.

Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo za aktiviranje NK ćelija. Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija sadrži NK ćelije, pri čemu efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21 ili 41BBL. U nekim aspektima, plazma-membranske vezikule mogu sadržati bilo koju kombinaciju efektorskih sredstava za NK ćelije. Na primer, plazma-membranska vezikula može sadržati IL-15 i IL-21; IL-15 i 41BBL; IL-21 i 41BBL; ili IL-15, IL-21 i 41BBL. Prema tome, plazma-membranska vezikula koja sadrži bilo koju kombinaciju jednog ili više od IL-15, IL-21 i 41BBL može se upotrebiti za ekspanziju NK ćelija.

[0076] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu se plazma-membranska vezikula može prečistiti iz ćelija hraniteljica NK ćelija. Ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti ozračene autologne ili alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), RPMI8866, HFWT, K562, K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL), K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL, ili EBV-LCL. U nekim aspektima, ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL ili K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL.

[0077] U nekim aspektima, plazma-membranske vezikule koje se koriste u postupcima ekspanzije NK ćelija mogu biti poreklom iz bilo kojeg tipa ćelija. Plazma-membrana bilo koje ćelije može se promeniti tako da sadrži efektorska sredstva za NK ćelije od interesa.

[0078] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0079] Objavljeni su postupci za ekspandiranje NK ćelija, koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu primena na ćelijskoj populaciji uključuje primenu kompozicije kod subjekta, pri čemu subjekt uključuje ćelijsku populaciju.

2

[0080] U nekim aspektima postupaka, citotoksične NK ćelije se selektivno ekspandiraju in vivo u prisustvu kombinacije efektorskih sredstava za NK ćelije uključujući, ali ne ograničavajući se na citokine vezane za membranu, adhezivne molekule i sredstva za aktiviranje NK ćelija. Efektorska sredstva za NK ćelije mogu se dostaviti u obliku prazne ili napunjene plazma-membranske vezikule, lipozoma, perlice obavijene ćelijskom membranom ili perlice obavijene lipidima (Slika 1). Molekuli koji se mogu uneti u plazma-membranske vezikule uključuju, ali se ne ograničavaju na IL-2 za lokalnu dostavu na mesto ekspanzije NK ćelija, kontrastna detekciona sredstva za praćenje biodistribucije i klirensa ili supermagnetne čestice za dostavu čestica na određena mesta, npr. limfne čvorove ili tumore. Magnetne čestice takođe mogu omogućiti brzo uklanjanje i detekciju.

2. Ekspandiranje NK ćelija membranskim samoinsertujućim peptidnim konjugatima

[0081] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži najmanje jedan membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu ćelijska populacija uključuje NK ćelije. Membranski samoinsertujući peptidi konjugovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije mogu se upotrebiti za ekspandiranje NK ćelija. Membranski samoinsertujući peptidni konjugati mogu se primeniti kao peptidni konjugat ili se mogu upotrebiti za pravljenje kompozicije kao što su lipozomi koji sadrže membranske samoinsertujuće peptidne konjugate, a zatim se lipozomi mogu primeniti.

[0082] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0083] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0084] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu kompozicije može sadržati membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa IL-15. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa IL-21. U nekim aspektima, membranski samoinsertujući peptid konjugovan je sa 41BBL. U nekim aspektima efektorsko sredstvo za NK ćelije je bilo koji citokin, adhezivni molekul ili sredstvo koje aktivira NK ćelije.

[0085] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu membranski samoinsertujući peptid može biti humani Fc, GPI, transmembranski T-ćelijski receptor, ili pHLIP.

[0086] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu primena na ćelijskoj populaciji uključuje primenu kompozicije kod subjekta, pri čemu subjekt uključuje ćelijsku populaciju.

[0087] Objavljeni su postupci ekspandiranja NK ćelija koji uključuju primenu, na ćelijskoj populaciji, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu kompozicija sadrži najmanje dva membranska samoinsertujuća peptidna konjugata, pri čemu su membranski samoinsertujući peptidni konjugati konjugovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. Na primer, postupci ekspandiranja NK ćelija mogu uključiti primenu kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa citokinom i membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa sredstvom koje aktivira NK ćelije. U nekim aspektima, postupci ekspandiranja NK ćelija mogu uključivati primenu dveju ili više zasebnih kompozicija, pri čemu svaka kompozicija sadrži samo jedan membranski samoinsertujući peptidni konjugat.

3. NK ćelije

[0088] Humane NK ćelije su podgrupa limfocita periferne krvi definisanih ekspresijom CD56 ili CD16 i odsustvom T-ćelijskog receptora (CD3) (Ljunggren and Malmberg 2007; Woan and Reddy 2007). NK ćelije pronalaze i ubijaju ciljne ćelije koje ne poseduju molekule glavnog kompleksa histokompatibilnost (major histocompatibility complex, MHC)-klase I. Receptori za aktiviranje NK ćelija uključuju, pored ostalih, receptore prirodne citotoksičnosti (NKp30, NKp44 i NKp46), i lektinu slične receptore NKG2D i DNAM-1. Njihovi ligandi se eksprimiraju na stresiranim, transformisanim, ili inficiranim ćelijama, ali ne i na normalnim ćelijama, čineći normalne ćelije rezistentnim na ubijanje NK ćelijama (Bottino, Castriconi et al. 2005; Gasser, Orsulic et al. 2005; Lanier 2005). Aktivacija NK ćelija negativno je

2

regulisana posredstvom inhibitornih receptora, kao što su ubilački receptori slični imunoglobulinima (Ig) (killer immunoglobin (Ig)-like receptors, KIR), NKG2A /CD94, i leukocitni Ig sličan receptor-1 (leukocyte Ig-like receptor-1, LIR-1). Angažovanje jednog inhibitornog receptora može biti dovoljno za sprečavanje lize cilja (Bryceson, Ljunggren et al.

2009). Prema tome, NK ćelije efikasno ciljaju ćelije koje eksprimiraju mnoge stresom indukovane ligande, i malo MHC liganda klase I.

[0089] Različitim postupcima NK ćelije efikasno uništavaju tumorske ćelije, ćelije pod stresom i ćelije zaražene virusima. Prvi je direktnim zahvatanjem ciljnih ćelija, permeacijom njihovih membrana, i zatim ubrizgavanjem proteina koji seče i aktivira nekoliko apoptotskih proteina, čime se pokreće programirana ćelijska smrt (apoptoza) ciljane ćelije. Površina NK ćelija sadrži i proteinske ligande koji mogu da se vežu i aktiviraju receptore, na primer apoptoza-indukujući ligand povezan sa receptorom za faktor nekroze tumora (tumor-necrosis factor, TNF) (receptor for tumor-necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), na ciljnim ćelijama, koji pokreću unutrašnje signale za apoptotsku programiranu ćelijsku smrt. Kada su stimulisane, NK ćelije takođe mogu lučiti citokine kao što su INFγ i TNFα koji ne samo da inhibiraju viruse i tumore, već i signaliziraju invaziju drugim imunološkim ćelijama. Ova široka i multimodalna antikancerska aktivnost NK ćelija čini da su od velikog interesa u oblasti medicine.

[0090] Zbog toga što NK ćelije imaju istaknutu ulogu u imunskom sistemu, sposobnost ekspandiranja NK ćelija pruža mogućnosti lečenja koje su nisu bile moguće ili su bile manje efikasne sa malim brojem NK ćelija.

4. Ekspandiranje NK ćelija obezbeđuje druge opcije za NK ćelije

[0091] Postupci ekspandiranja NK ćelija korisni su za lečenje kancera, lečenje virusnih infekcija, proučavanje NK ćelija, lečenje multiple skleroze, imunski nadzor i lečenje reakcije kalema protiv domaćina. Bilo koji poremećaj povezan sa NK ćelijama može se lečiti ili se na njega može uticati ekspandiranjem NK ćelija. Na primer, bolesti kao što je multipla skleroza, kod kojih je poznato da postoji porast aktiviranih T ćelija, mogu se lečiti objavljenim kompozicijama jer ove kompozicije dovode do ekspanzije NK ćelija koje ciljaju i ubijaju aktivirane T ćelije. Prema tome objavljene kompozicije se mogu koristiti za smanjenje broja aktiviranih T ćelija.

E. Postupci lečenja kancera

2

[0092] Objavljeni su postupci lečenja kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membranske vezikule koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije.

[0093] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije.

[0094] Lečenje kancera plazma-membranskim vezikulama koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije ili membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije može biti rezultat ekspanzije NK ćelija u prisustvu ovih kompozicija. Ekspanzija NK ćelija dovodi do povećanja broja NK ćelija koje mogu ciljati i ubijati tumorske ćelije, čime dolazi do redukovanja broja tumorskih ćelija i na kraju lečenja kancera.

[0095] Plazma-membranske vezikule koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije ili membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije mogu pružiti preventivni efekat. Poznato je da NK ćelije obezbeđuju imunološki nadzor. Prema tome, primena kompozicije koja za rezultat ima ekspanziju NK ćelija obezbeđuje više NK ćelija koje će obezbediti imunološki nadzor i ciljno delovanje i ubijanje prekanceroznih ćelija pre pojave kancera.

[0096] U nekim aspektima, primena kod subjekta može uključiti primenu objavljenih kompozicija na ćelijskoj populaciji in vitro i zatim primenu tih tretiranih ćelija kod subjekta.

1. Lečenje plazma-membranskim vezikulama

[0097] Plazma-membranske vezikule koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije mogu se koristiti za lečenje kancera. Postupci lečenja kancera mogu uključiti primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije.

[0098] NK ćelijska efektorska sredstva mogu biti citokin, adhezivni molekul ili sredstvo za aktiviranje NK ćelija. Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti IL-15, IL-21 ili 41BBL. U nekim aspektima, plazma-membranske vezikule mogu sadržati bilo koju kombinaciju efektorskih sredstava za NK ćelije. Plazma-membrana može sadržati dva ili više efektorskih sredstava za NK ćelije. U nekim aspektima, najmanje jedno

2

efektorsko sredstvo za NK ćelije može biti citokin. Na primer, plazma-membranska vezikula može sadržati IL-15 i IL-21; IL-15 i 41BBL; IL-21 i 41BBL; ili IL-15, IL-21 i 41BBL. Prema tome, plazma-membranske vezikule koje sadrže bilo koju kombinaciju jednog ili više IL-15, IL-21 i 41BBL mogu koristiti za lečenje kancera.

[0099] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu se plazma-membranska vezikula može prečistiti iz ćelija hraniteljica NK ćelija. Ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti ozračene autologne ili alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), RPMI8866, HFWT, K562, K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL), K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL, ili EBV-LCL. U nekim aspektima, ćelije hraniteljice NK ćelija mogu biti K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL ili K562 ćelije transfektovane za membranu vezanim IL-15 i 41BBL.

[0100] U nekim aspektima, plazma-membranske vezikule koje se koriste u postupcima za lečenje kancera mogu biti poreklom iz bilo kojeg tipa ćelija. Plazma-membrana bilo koje ćelije može se izmeniti tako da sadrži efektorska sredstva za NK ćelije od interesa.

[0101] Objavljeni su postupci za lečenje kancera koji uključuju primenu kod subjekta efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0102] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži najmanje dve plazma-membranske vezikule, pri čemu plazma-membranska vezikula uključuje najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije. Najmanje dve plazma-membranske vezikule mogu sadržati isto ili različita efektorska sredstva za NK ćelije. Na primer, postupci za lečenje kancera mogu uključivati primenu kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži za membranu vezani citokin i plazma-membransku vezikulu koja sadrži za membranu vezano sredstvo koje aktivira NK ćelije. U nekim aspektima, postupci lečenja kancera mogu uključivati primenu dveju ili više zasebnih kompozicija, pri čemu svaka kompozicija sadrži samo jednu plazmamembransku vezikulu.

2. Lečenje membranskim samoinsertujućim peptidnim konjugatima

2

[0103] Membranski samoinsertujući peptidi konjugovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije mogu se koristiti za lečenje kancera. Membranski samoinsertujući peptidni konjugati mogu se primeniti kao peptidni konjugati ili se mogu koristiti za pravljenje kompozicije kao što su lipozomi koji sadrže membranske samoinsertujuće peptidne konjugate, a zatim se lipozomi mogu primeniti kod subjekta.

[0104] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu efikasna količina kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije stimuliše ekspanziju NK ćelija.

[0105] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu kompozicija može sadržati membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa IL-15. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa IL-21. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa 41BBL. U nekim aspektima, efektorsko sredstvo za NK ćelije je bilo koji citokin, adhezivni molekul ili sredstvo koje aktivira NK ćelije.

[0106] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu membranski samoinsertujući peptid može biti humani Fc, GPI, transmembranski T-ćelijski receptor, ili pHLIP.

[0107] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu kompozicija sadrži najmanje dva membranska samoinsertujuća peptidna konjugata, pri čemu su membranski samoinsertujući peptidni konjugati konjugovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. Najmanje dva membranska samoinsertujuća peptidna konjugata mogu bit konjugovana sa istim ili različitim efektorskim sredstvom za NK ćelije. Na primer, postupci lečenja kancera mogu uključiti primenu kompozicije koja sadrži membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa citokinom i membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa sredstvom koje aktivira NK ćelije. U nekim aspektima, postupci lečenja kancera mogu uključiti primenu dveju ili više zasebnih

2

kompozicija pri čemu svaka kompozicija sadrži samo jedan membranski samoinsertujući peptidni konjugat.

3. Kombinovano lečenje

[0108] Postupci lečenja kancera koji uključuju primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije ili membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, može se kombinovati sa drugim načinima lečenja kancera. Na primer, postupci mogu uključivati primenu, kod subjekta, efikasne količine kompozicije koja sadrži plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije ili membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije i lek protiv kancera.

[0109] U nekim aspektima, lek protiv kancera i plazma-membranska vezikula mogu biti formulisani u istoj kompoziciji. U nekim aspektima, lek protiv kancera i plazma-membranska vezikula mogu biti formulisani u različitim kompozicijama.

[0110] Kompozicije koje sadrže plazma-membransku vezikulu koja sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije i lek za kancer mogu se primeniti istovremeno ili u različito vreme.

[0111] Lekovi protiv kancera koji se mogu primeniti u kombinaciji sa plazma-membranskim vezikulama koje sadrže najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, mogu biti bilo koji poznati lekovi protiv kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na hemioterapijska sredstva i imunoterapijska sredstva, kao što su, bez ograničavanja, antitela i citokini.

F. Postupci za modulisanje imunskog sistema

[0112] Objavljeni su postupci za modulisanje imunskog sistema, koji uključuju primenu, kod subjekta, jedne ili više kompozicija, pri čemu kompozicije sadrže najmanje jednu plazmamembransku vezikulu koja sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije ili najmanje jedan membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije. U nekim aspektima, jedna ili više kompozicija sadrže kombinaciju plazma-membranskih vezikula i membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata.

[0113] Objavljeni su postupci za modulisanje imunskog sistema, koji uključuju primenu, kod subjekta, jedne ili više kompozicija, pri čemu kompozicije sadrže najmanje jednu plazmamembransku vezikulu koja sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije ili najmanje jedan membranski samoinsertujući peptid konjugovan sa efektorskim sredstvom za NK ćelije, pri čemu modulisanje imunskog sistema uključuje smanjenje broja aktiviranih T ćelija, ekspandiranje broja NK ćelija, smanjenje broja dendritskih ćelija, ili njihovu kombinaciju.

G. Kombinovano lečenje

[0114] Objavljeni su postupci za lečenje kancera, virusnih infekcija, multiple skleroze i bolesti kalema protiv domaćina, koji uključuju primenu, kod subjekta, jedne od objavljenih kompozicija u kombinaciji sa poznatim lekom za bolest ili poremećaj koji se leči. Na primer, objavljeni su postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu, kod subjekta, plazmamembranske vezikule koja sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije u kombinaciji sa poznatim lekom protiv kancera kao što je, bez ograničavanja, hemioterapijsko sredstvo, imunoterapijsko sredstvo, terapija zračenjem ili lek protiv bola.

[0115] Tokom kombinovanog tretmana, plazma-membranska vezikula ili membranski samoinsertujući peptidni konjugati objavljeni u ovom tekstu mogu se primeniti u isto vreme kao i poznati lek za bolest ili poremećaj koji se leči. U nekim aspektima, plazma-membranske vezikule ili konjugati membranskog samoinsertujućeg peptida primenjuju se 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili 31 dan pre ili posle poznatog leka za bolest ili poremećaj koji se leči. U nekim aspektima, plazmamembranske vezikule ili konjugati membranskog samoinsertujućeg peptida primenjuju se 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci pre ili posle poznatog leka za bolest ili poremećaj koji se leči.

H. Primena

[0116] Objavljene kompozicije mogu se primeniti in vitro ili in vivo. U nekim aspektima, postupci uključuju kombinaciju in vitro i in vivo primene. Kompozicije se mogu davati in vivo u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Pod "farmaceutski prihvatljivim" misli se na materijal koji nije biološki ili na neki drugi način nepoželjan, tj. materijal koji se može primeniti kod subjekta, zajedno sa plazma-membranskom vezikulom ili membranskim samoinsertujućim peptidnim konjugatom, bez izazivanja bilo kakvih neželjenih bioloških efekata ili štetnih interakcija sa bilo kojom drugom komponentom farmaceutske kompozicije koja ga sadrži. Nosač bi prirodno bio odabran tako da minimizira bilo kakvu degradaciju aktivnog sastojka i da minimizira sve štetne sporedne efekte kod subjekta, kako je dobro poznato stručnjaku u oblasti.

1

[0117] Kompozicije mogu da se primene oralno, parenteralno (npr. intravenski), intramuskularnom injekcijom, intraperitonealnom injekcijom, intratumorskom injekcijom, transdermalno, ekstrakorporalno, lokalno ili slično, uključujući površinsku intranazalnu primenu ili primenu inhalacijom. Kako se ovde koristi, "površinska intranazalna primena" označava isporuku kompozicije u nos i nosne puteve preko jedne ili obe nozdrve i može uključivati isporuku mehanizmom za raspršivanje ili mehanizmom kapljica, ili putem aerosolizacije plazma-membranske vezikule. Primena kompozicije inhalacijom može biti kroz nos ili usta, dostavom raspršivanjem ili mehanizmom kapljica. Dostava takođe može da se obavi direktno u bilo koje područje disajnog sistema (npr. pluća) putem intubacije. Tačna količina potrebnih kompozicija variraće od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti, težine i opšteg stanja subjekta, težine poremećaja koji se leči, posebne kompozicije koja se koristi, načina primene i slično. Stoga nije moguće odrediti tačnu količinu za svaku kompoziciju. Međutim, osoba prosečno obučena u oblasti može odrediti odgovarajuću količinu koristeći samo rutinske postupke eksperimentacije za koja su ovde data uputstva.

1. Farmaceutski prihvatljivi nosači

[0118] Kompozicije mogu da se koriste terapijski u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0119] Pogodni nosači i njihove formulacije opisani su u Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa.

1995. Tipično, odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli koristi se u formulaciji da bi se formulacija učinila izotoničnom. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju, ali se ne ograničavaju na fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, a poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dodatni nosači uključuju preparate za produženo oslobađanje kao što su polupropusni matriksi od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, matriksi su u vidu oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Stručnjacima u ovoj oblasti biće jasno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti, na primer, od puta primene i koncentracije kompozicije koja se primenjuje.

[0120] Farmaceutski nosači su poznati stručnjacima u oblasti. To su najčešće standardni nosači za primenu lekova kod ljudi, uključujući rastvore kao što su sterilna voda, fiziološki rastvor i rastvori puferisani na fiziološkom pH. Kompozicije se mogu primeniti

2

intramuskularno ili supkutano. Ostala jedinjenja primeniće se prema standardnim postupcima koje koriste stručnjaci u oblasti.

[0121] Pored molekula izbora, farmaceutske kompozicije mogu uključivati nosače, zgušnjivače, razređivače, pufere, konzervanse, površinski aktivna sredstva i slično. Farmaceutske kompozicije mogu uključivati i jedan ili više aktivnih sastojaka kao što su antimikrobna sredstva, antizapaljenska sredstva, anestetici i slično.

[0122] Farmaceutska kompozicija može se primeniti na više načina, u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje, kao i u zavisnosti od područja koje se leči. Primena može biti lokalna (uključujući oftalmičku, vaginalnu, rektalnu, intranazalnu), oralna, inhalacijom ili parenteralna, na primer intravenskom infuzijom, supkutanom, intraperitonealnom ili intramuskularnom injekcijom. Objavljena antitela mogu se primeniti intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, supkutano, intrakavitalno ili transdermalno.

[0123] Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i organski estri za injekcije kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane medijume. Parenteralni prenosnici uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringerov laktat ili fiksirana ulja. Intravenski prenosnici uključuju sredstva za nadoknađivanje tečnosti i hranljivih materija, sredstva za nadoknađivanje elektrolita (kao što su oni na bazi Ringerove dekstroze) i slično. Prisutni mogu biti i konzervansi i drugi aditivi kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, antioksidansi, helirajuća sredstva i inertni gasovi i slično.

[0124] Formulacije za lokalnu primenu mogu uključivati masti, losione, kremove, gelove, kapi, supozitorije, sprejove, tečnosti i praškove. Potrebni ili poželjni mogu biti konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, zgušnjivači i slično.

[0125] Kompozicije za oralnu primenu uključuju praškove ili granule, suspenzije ili rastvore u vodi ili nevodenom medijumu, kapsule, kesice ili tablete. Mogu biti poželjni zgušnjivači, arome, razređivači, emulgatori, sredstva za dispergovanje ili povezivači.

[0126] Neke od kompozicija mogu se potencijalno primeniti kao farmaceutski prihvatljive kisele ili bazne adicione soli, nastale reakcijom sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodična kiselina, bromovodična kiselina, perhlorna kiselina, azotna kiselina, tiocijanatna kiselina, sumporna kiselina i fosforna kiselina, i organskim kiselinama kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, pirogrožđana kiselina, oksalna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina i fumarna kiselina, ili reakcijom sa neorganskim bazama kao što su natrijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalijum hidroksid i organskim bazama kao što su mono-, di-, trialkil i aril amini i supstituisani etanolamini.

I. Uređaji

[0127] Objavljeni su uređaji koji sadrže plazma-membransku vezikulu koja sadrži efektorsko sredstvo za NK ćelije. Na primer, kontejner koji se koristi tokom afereze može sadržati plazma-membranske vezikule koje sadrže efektorska sredstva za NK ćelije. Dakle, tokom afereze ćelije koje prolaze kroz kontejner mogu se inkubirati ili dovesti u kontakt sa plazmamembranskim vezikulama što omogućava stimulaciju NK ćelija i konačno ekspanziju NK ćelija.

J. Kitovi

[0128] Gore opisani materijali, kao i drugi materijali, mogu se upakovati zajedno u bilo kojoj pogodnoj kombinaciji u vidu kita korisnog za izvođenje, ili pomoć u izvođenju, objavljenog postupka. Od koristi je da su komponente kita u datom kitu dizajnirane i prilagođene za zajedničko korišćenje u objavljenom postupku. Na primer, objavljeni su kitovi za pripremanje membranskih samoinsertujućih peptidnih konjugata, kit sadrži membranske samoinsertujuće peptide. Kitovi takođe mogu sadržati reagense koji se koriste za kuplovanje ili konjugovanje membranskog samoinsertujućeg peptida sa efektorskim sredstvom za NK ćelije.

[0129] Objavljeni kitovi mogu uključivati i efektorsko ili ekspanziono sredstvo za NK ćelije. Kitovi mogu sadržati još i komponente za pripremanje plazma-membrana ili lipozoma. U kitovima mogu biti obezbeđene nanočestice i mikročestice.

K. Definicije

[0130] Treba napomenuti da, kako se koriste ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini uključuju i oblike u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na "plazma-membransku vezikulu" uključuje veliki broj takvih plazmamembranskih vezikula, pozivanje na "efektorsko sredstvo za NK ćelije" je pozivanje na jedno ili više efektorskih sredstava za NK ćelije i njihove ekvivalente poznate stručnjacima u oblasti, i tako dalje.

4

[0131] "Plazma-membranska vezikula" odnosi se na preparat ćelijske plazma-membrane ili veštački napravljenu plazma-membranu ili lipozom.

[0132] "Membranski samoinsertujući peptidi" su peptidi koji mogu da se insertuju ili ukotvljuju u ćelijsku membranu.

[0133] "Membranski samoinsertujući peptidni konjugati" su membranski samoinsertujući peptidi konjugovani ili kuplovani sa efektorskim sredstvom za NK ćelije.

[0134] "Efektorska sredstva za NK ćelije" su sredstva koja izazivaju proliferaciju, stimulaciju, adheziju ili aktivaciju NK ćelija. Efektorska sredstva za NK ćelije mogu biti citokini, adhezivni molekuli ili sredstva koja aktiviraju NK ćelije.

[0135] "Sredstva koja aktiviraju NK ćelije" odnosi se na stimulatorne ligande koji se vezuju za aktivirajuće receptore koji se nalaze na površini NK ćelija.

[0136] "Moduliše" ili "modulisati", kako se ovde koristi, odnosi se na povećanje ili smanjenje. Rezultat modulisanja je bilo koja razlika u poređenju sa normalnom imunskom funkcijom. Prema tome, modulisanje imunskog sistema odnosi se na povećanje ili smanjenje broja imunskih ćelija.

[0137] "Opciono" ili "opcioni" znači da zatim opisani događaj, okolnost, ili materijal može ali ne mora da se desi ili bude prisutan, i taj opis uključuje slučajeve kada se događaj, okolnost, ili materijal desi ili je prisutan i slučajeve kada se ne desi ili nije prisutan.

[0138] Kako se ovde koristi, izraz "subjekt" odnosi se na bilo koji organizam na kojem se mogu primeniti objavljene kompozicije, npr. u eksperimentalne, dijagnostičke i/ili terapijske svrhe. Tipični subjekti uključuju životinje (npr. sisare kao što su primati koji nisu ljudi i ljudi; ptice; kućne ili domaće životinje kao što su mačke, psi, ovce, koze, goveda, konji i svinje; laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi i zamorci; zečeve; ribe; gmizavce; životinje u zoološkim vrtovima i u divljini). Tipično, "subjekti" su životinje, uključujući sisare kao što su ljudi i primati; i slično. Subjekt se može odnositi i na ćeliju ili ćelijsku liniju.

[0139] Rasponi se u ovom tekstu mogu iskazati kao od "oko" jedne određene vrednosti, i/ili do "oko" druge određene vrednosti. Kada je takav raspon iskazan, specifično se razmatra i smatra se objavljenim i raspon od jedne određene vrednosti i/ili do druge određene vrednosti osim ako kontekst specifično ne kazuje drugačije. Slično tome, kada se vrednosti izražavaju kao aproksimacije, upotrebom antecedenta "oko", podrazumevaće se da određena vrednost formira drugi, specifično razmatrani primer izvođenja koji treba smatrati objavljenim, osim ako kontekst specifično ne kazuje drugačije. Podrazumeva se još i to da su završne tačke svakog od raspona značajne i u odnosu na drugu završnu tačku, i nezavisno od drugih završnih tačaka, osim ako kontekst specifično ne kazuje drugačije. Konačno, treba razumeti da su sve pojedinačne vrednosti i podrasponi vrednosti sadržani unutar eksplicitno objavljenog raspona takođe specifično razmatrani i treba ih smatrati objavljenim, osim ako kontekst specifično ne kazuje drugačije. Prethodno se primenjuje bez obzira na to da li su u određenim slučajevima eksplicitno objavljeni neki ili svi od ovih primera izvođenja.

[0140] Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju značenja ista kao što su ona koja uobičajeno razume stručnjak u oblasti kojoj pripadaju objavljeni postupak i kompozicije. Iako se svi postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni ovde opisanim mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog postupka i kompozicija, opisani su posebno korisni postupci, uređaji i materijali. Ne priznaje se da bilo koja od referenci predstavlja prethodno stanje tehnike. U razmatranju literature navodi se ono što autori te literature tvrde, a podnosioci zadržavaju pravo osporavanja tačnosti i relevantnosti navedenih dokumenata. Treba jasno razumeti da, iako se ovaj tekst poziva na brojne publikacije, to pozivanje ne predstavlja priznanje da bilo koji od ovih dokumenata čini deo zajedničkog opšteg znanja u struci.

[0141] U celom opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, reč "sadrži" i varijacije reči, kao što su "sadržati" i "sadrže", znači "uključujući, ali ne ograničavajući se na" i nije namenjena isključivanju, na primer, drugih dodataka, komponenti, celih brojeva ili koraka. Konkretno, u postupcima za koje je navedeno da uključuju jedan ili više koraka ili operacija posebno se smatra da svaki korak sadrži ono što je navedeno (osim ako taj korak ne uključuje ograničavajući izraz kao što je "sastoji se od), što znači da svaki korak ne treba da isključi, na primer, druge dodatke, komponente, cele brojeve ili korake koji nisu navedeni u tom koraku.

[0142] Objavljeni su materijali, kompozicije i komponente koji se mogu koristiti za, mogu se koristiti u kombinaciji sa, mogu se koristiti u pripremi ili su proizvodi objavljenog postupka i kompozicija. Ovi i drugi materijali objavljeni su u ovom tekstu, i podrazumeva se da, kada su objavljene kombinacije, podgrupe, interakcije grupa, itd. ovih materijala, iako specifična referenca svake različite pojedinačne i kolektivne kombinacije i permutacije ovih jedinjenja ne mora biti eksplicitno objavljena, svaka je specifično razmatrana i opisana u ovom tekstu. Na primer, ako je objavljen i razmatran membranski samoinsertujući peptidni konjugat i ako su razmatrane brojne modifikacije koje se mogu napraviti na brojnim molekulima uključujući membranski samoinsertujući peptidni konjugat, svaka se i razmatra i opisuje u ovom tekstu. Na primer, ako je objavljen i razmatran membranski samoinsertujući peptidni konjugat i ako su razmatrane brojne modifikacije koje se mogu napraviti na brojnim molekulima uključujući membranski samoinsertujući peptidni konjugat, specifično su razmatrane svaka i sve kombinacije i permutacije membranskog samoinsertujućeg peptidnog konjugata i modifikacije koje su moguće, osim ako specifično nije navedeno suprotno. Prema tome, ako je objavljena klasa molekula A, B i C kao i klasa molekula D, E i F i ako je objavljen primer kombinacije molekula A-D, onda čak i ako svaki nije specifično naveden, svaki se razmatra pojedinačno i grupno. Prema tome, u ovom primeru, svaka od kombinacija A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, i C-F specifično se razmatra i treba da se smatra objavljenom na osnovu objave A, B, i C; D, E, i F; i primera kombinacije A-D. Slično tome, svaka njihova podgrupa ili kombinacija takođe je specifično razmatrana i objavljena. Tako na primer, podgrupe A-E, B-F, i C-E specifično su razmatrane i treba da se smatra objavljenim na osnovu objave A, B, i C; D, E, i F; i primera kombinacije A-D. Ovaj koncept važi za sve aspekte ove patentne prijave uključujući, ali ne ograničavajući se na korake u postupcima pravljenja i korišćenja objavljenih kompozicija. Prema tome, ako postoje različiti dodatni koraci koji mogu da se izvedu, podrazumeva se da svaki od ovih dodatnih koraka može da se izvede sa bilo kojim specifičnim primerom izvođenja ili kombinacijom primera izvođenja objavljenih postupaka, i da je svaka takva kombinacija specifično razmatrana i treba je smatrati objavljenom.

Primeri

A. Primer 1: In vivo generisanje citotoksičnih ćelija prirodnih ubica i pridruženi postupci lečenja kancera

[0143] Do ekspanzije NK ćelija može doći korišćenjem membranskih vezikula poreklom od stimulatorskih ćelija. Stimulatorske ćelije K562-mb15-41BBL i K562-mb21-41BBL selektovane su za stvaranje plazma-membranskih (PM) vezikula zato što je za ove ćelije bilo saopšteno da veoma robusno ekspandiraju NK ćelije i ne zahtevaju izolovanje NK ćelija iz smeše mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) pre inicijacije kulture. Pored toga, prisustvo stimulatornih liganada 41BBL i mbIL15 ili mbIL21 može se lako pratiti bojenjem antitelima, kako bi se potvrdila ekspresija ovih molekula na ćelijama hraniteljicama i njihovo prisustvo u izolovanim membranskim vezikulama, kao i na membranom obavijenim mikročesticama. Testirano je da li čestice koje se sastoje od prečišćenih membranskih vezikula poreklom od stimulatorskih ćelija podržavaju ekspanziju NK-ćelija na sličan način kao stimulatorske ćelije. Kada se PBMC u kulturi izlože delovanju 50 U/mL IL- 2 i rastućim koncentracijama PMmb15-41BBL ili PM-mb21-41BBL vezikula tokom perioda od 10 dana, sadržaj NK ćelija u smeši PBMC raste proporcionalno upotrebljenoj koncentraciji PM (Slike 3 i 4). Pri najvišoj testiranoj koncentraciji od 200 µg/mL plazma-membranskih proteina, rezultujući sadržaj NK ćelija bio je 70% i 82% u prisustvu PM-mb15-41BBL, odnosno PMmb21-41BBL. Radi poređenja, NK ćelije čine samo 22% ćelijskog sadržaja kultura koje su izložene samo IL-2. Pored toga, ukupan broj NK ćelija porastao je u kulturama koje su bile izložene PM vezikulama, a porast je bio proporcionalan upotrebljenoj koncentraciji PM. Prema tome, ekspanzija NK ćelija bila je najviša u kulturama koje su primile IL-2 sa 200 µg/mL plazma-membranskih proteina, gde su NK ćelije ekspandirale 24 i 22 puta tokom 14 dana u prisustvu PM-mb21-41BBL, odnosno PM-mb15-41BBL vezikula, dok u kontrolnoj kulturi ekspanzija nije zapažena (Slika 5). Prema tome, i nivo ekspanzije i sadržaj NK ćelija u kulturi bili su direktno proporcionalni upotrebljenoj koncentraciji membranskih čestica (Slike 3, 4 i 5). Iako je nivo ekspanzije u prisustvu PM čestica bio niži nego onaj zapažen u kontrolnim kulturama gde su ćelije ekspandirale za 88 i 150 puta u prisustvu živih K562-mb15-41BBL, odnosno K562-mb21-41BBL, ova ekspanzija je dovoljna da se stvore doze potrebne za kliničku primenu. Prema tome, ovi eksperimenti pokazuju da je moguće selektivno ekspandirati NK ćelije u smeši PBMC, korišćenjem čestica koje se sastoje od prečišćenih plazma-membranskih vezikula sa stimulatornim ligandima, bez hraniteljica.

[0144] NK ćelije ekspandirane kultivisanjem tokom 14 dana u prisustvu 200 µg/mL PM-mb15-41BBL ili PM-mb21-41BBL membranskih vezikula, testiraju se u pogledu funkcije citotoksičnosti, pri odnosu1:1 (E:T) prema ćelijskoj liniji hronične mijeloidne leukemije (CML) K562, i ćelijskim linijama akutne mijeloidne leukemije (AML) KG1 i HL-60. Nivo citotoksičnosti upoređuje se sa NK ćelijama kultivisanim sa K562-mb15-41BBL ili K562-mb21-41BBL živim ćelijama hraniteljicama (Slika 6). NK ćelije stimulisane sa PM-mb15-41BBL i PM-mb21-41BBL ubile su 60 i 78% K562 ciljnih ćelija, 44% i 54% KG1 ćelija i 9 i 15% HL-60 respektivno. Ovi nivoi citotoksičnog odgovora zapaženi sa PM-stimulisanim NK ćelijama bili su samo malo niži od onih koji su zapaženi sa NK ćelijama kultivisanim 14 dana uz korišćenje živih K562-mb15-41BBL ili K562-mb21-41BBL linija ćelija hraniteljica. Ovi rezultati ukazuju na to da su NK ćelije ekspandirane korišćenjem PMmb15-41BBL citotoksične prema ciljevima akutne mijeloidne leukemije i da su prema tome pogodne za terapijsku primenu u lečenju kancera.

[0145] Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da NK ćelije mogu da se selektivno ekspandiraju u ćelijskoj smeši PBMC korišćenjem membranskih vezikula koje sadrže stimulatorne ligande i u odsustvu ćelija hraniteljica. Ove ćelije su citotoksične prema različitim ciljevima leukemijskog porekla. Ovaj postupak ekspandiranja pogodan je za in vitro i in vivo ekspanziju NK ćelija za kliničku primenu. Pogodnost membranskih čestica za upotrebu u ekspanziji in vivo demonstrirana je povećanjem broja NK ćelija kod pacijenata lečenih kancerskom vakcinom sa egzozomima poreklom iz dendritskih ćelija (Dex) -membranskim česticama koje prirodno sekretuju dendritske i druge imunske ćelije (Viaud, Terme et al.2009).

[0146] Slika 7 prikazuje stvaranje lateksnih čestica obavijenih PM-mb15-41BBL membranama. Slika 7 prikazuje histograme koji pokazuju IL15-FITC (gore) i 41BBLPE (dole). Lateksne (levo) ili C18-silika (desno) perlice obavijene su K562mb15 plazmamembranom koja sadrži za membranu vezani IL-15 i 41BBL. I lateksne i C18-silika perlice pokazuju prisustvo IL-15 i 41BBL posle obavijanja (Izotip sivo). Za pripremanje membranom obavijenih lateksnih čestica, plazma-membranske vezikule prečišćene kako je opisano, koje sadrže stimulatorne molekule 41BBL i mbIL15, upotrebljene su i ugrađene na 5-mikrometarske lateksne mikroperlice uz korišćenje ranije uspostavljenog protokola. Sulfatne polistirenske lateksne mikrosfere (Inerfacial Dynamics) resuspenduju se u PBS, isperu i izbroje na hemocitometru. Da bi se perlice obložile, alikvot suspenzije perlica doda se PM-mb15-41BBL membranskom rastvoru uz sonifikaciju suspenzije. Rastvor perlice-membrana stavi se na rotator na 4 stepena C, 2 sata. Perlice se centrifugiraju i isperu tri puta. Perlice se obeleže antitelima i analiziraju protočnim citometrom da se potvrdi prisustvo stimulatornih proteina na površini perlica (levi paneli). Perlice obavijene membranom pokazuju pozitivno bojenje na IL-15 i 41BBL i nisko pozadinsko bojenje izotipskim kontrolnim antitelima. C18-silika perlice obložene su sa PM-mb15-41BBL na sličan način. Opet, bojenjem antitelima potvrđeno je prisustvo stimulatornih molekula (desni paneli). Ovi rezultati ukazuju na to da je moguće stvaranje čestica obavijenih ćelijskim membranama, koje sadrže stimulatorne molekule.

[0147] Slika 8 prikazuje detritus nađen u kulturama posle ekspanzije NK ćelija. a) FSC prema SSC PBMC (crveno) zajedno sa plazma-membranom na dan 10 kulture. b) FSC prema SSC PBMC (crveno) zajedno sa K562mb15 detritusom ćelija hraniteljica (zeleno). Slike gore i dole predstavljaju zasebne kulture na dan 10. Gornja slika ima značajno više detritusa ćelija hraniteljica nego donja.

1. Materijali i postupci

[0148] Korišćene su ćelijske linije K562-mb15-41BBL i K562-mb21-41BBL (K562-clone9.mbIL21). K562, KG1 i HL-60 ćelijske linije upotrebljene u testovima citotoksičnosti kupljene su od American Tissue Culture Collection (ATCC).

[0149] Analize su izvođene sa sledećim mišjim monoklonskim antitelima: CD56-PE (Miltenyi Biotech), CD3-APC, CD16-FITC (Beckman Coulter), CD19-PECy7, 41BBL-PE (BD Biosciences) i 41BBL (R&D).

[0150] Drugi korišćeni reagensi i kitovi uključili su sulfatne lateksne perlice (5 µm; Invitrogen), C18-silika perlice (10 µm; Sorbtec), RPMI medijum (Thermo Scientific), CellGro medijum (Cellgenix) fetalni goveđi serum (Invitrogen), IL-2 (Peprotec), Glutamax (Invitrogen). [0052] Pripremanje PM-mb15-41BBL i PM-mb21-41BBL plazma-membranskih vezikula izvedeno je na sledeći način. K562-mb15-41BBL i K562-mb21-41BBL kultivišu se u RPMI medijumu dopunjenom sa 10%FBS i kultura se povećava do 1L. Ćelije se sakupe centrifugiranjem na 1000xg, isperu hladnim PBS sa 10 mM EDTA i resuspenduju u litičkom puferu (50 mM HEPES, pH 7.4, koktel proteaznih inhibitora). Ćelije se razbiju Dounce homogenizerom i rastvor se centrifugira na 300xg, 15 minuta, da se uklone preostale cele ćelije. Sirove plazma-membrane se izdvoje od citosolnih komponenata centrifugiranjem u trajanju od 30 min na 4 °C (30000 o/min, 50Ti). Sirove membrane se resuspenduju u litičkom puferu i dodatno prečiste korišćenjem saharoznog gustinskog gradijenta da se dobiju čiste plazma-membranske vezikule, označene kao PM-mb15-41BBL ili PMmb21-41BBL. BCA test koristi se za određivanje koncentracije membranskog proteina dok se količina stimulatornog 41- BBL liganda određuje Western blotom.

[0151] Ekspanzija NK ćelija u smeši PBMC testira se u prisustvu rastućih koncentracija PM-mb15-41BBL ili PM-mb21-41BBL membranskih čestica. Upotrebljene količine bile su 40, 80, i 200 µg membranskog proteina po 1 mL kulture što je za PMmb15-41BBL kulturu odgovaralo 16, 32, 80 ng 41-BBL proteina po mL kulture. PBMC izolovane iz krvi na Ficol-Paque gustinskom gradijentu rasle su u SCGM Cell Gro medijumu dopunjenom sa 10% FBS i 10 ili 50 U/mL IL-2 i rastućim koncentracijama membranskih čestica. Ćelije su držane na 37 °C u humidifikovanoj atmosferi sa 5% CO2. Počevši od dana 5 kulture, medijumi su menjani svakog drugog dana zamenom polovine medijuma svežim medijumom kao i zamenom količine membrane uklonjene tokom zamene medijuma. Ćelije su brojane svakog drugog dana i sadržaj kulture je proveravan na dane 7, 10 i 14.

[0152] Testovi citotoksičnosti izvedeni su na sledeći način. Pre dodavanja efektorskih NK ćelija, leukemijske ciljne ćelijske linije K562, KG1, HR-60R obeležene su sa TFL4

4

(Oncoimmunin) ili CellTrace Far Red (CTFR; Invitrogen), sjajnim crvenim fluorescentnim markerom za dugotrajno obeležavanje ćelija. Ćelije su isprane dva puta korišćenjem PBS pufera sa 1% BSA.

[0153] Ciljne ćelije su zatim ko-inkubirane sa različitim količinama NK-ćelija tokom 90 minuta na 37° C u humidifikovanoj atmosferi vazduh/CO295/5%. Na kraju ko-inkubacije, ćelije su prenete u epruvete, stavljene na led i dodat im je supstrat za kaspazu/granzim (Pantoxilux kit, OncoImmunin) i obeležene su antitelima na površinske antigene. Ćelije su odmah analizirane protočnom citometrijom (BD FACS Canto-II). Ćelijska smrt indukovana NK ćelijama detektovana je korišćenjem ćelijski permeabilnog fluorogenog supstrata za kaspazu/granzim (OncoImmunin). Sečenje ovog supstrata granzimom, oslobođenim u ciljnoj ćeliji posle interakcije sa NK ćelijama, i nishodnom kaspazom, daje zelenu fluorescenciju u ciljnim umirućim ćelijama.

B. Primer 2: Optimizacija plazma-membranskih vezikula za ekspandiranje NK ćelija

1. Sažetak

[0154] Optimizovani su postupci za pripremanje plazma-membranskih vezikula kao i postupci za povećanje nivoa ekspandiranja NK ćelija u prisustvu vezikula. Određeno je da NK ćelije ekspandirane ovim postupcima ubijaju primarne leukemijske ćelije poreklom iz pacijenata. Procedura je količinski prilagođena za kultivisanje K562-mb15-41BBL ćelija i optimizovano pripremanje plazma-membranskih (PM) vezikula razbijanjem ćelija uz korišćenje postupka kavitacije azotom. Optimizovane plazma-membranske vezikule bile su homogenije i imale više nivoe stimulatornog liganda 41BBL. U testovima ekspanzije NK ćelija sa PBMC iz zdravih davalaca (n=3) kao polaznim materijalom, optimizovane PM vezikule prevazišle su prethodne preparate PM u stimulaciji rasta NK ćelija i dale nivoe selektivne ekspanzije NK ćelija uporedive sa onima koji se dobijaju sa živim K562-mb15-41BBL ćelijama hraniteljicama. Ekspresija brojnih površinskih markera relevantnih za funkciju NK ćelija na površini NK ćelija određena je u polaznom materijalu kao i u NK ćelijama ekspandiranim u prisustvu PM vezikula ili živih ćelija hraniteljica. Inicijalna analiza ukazala je na to da je aktivirani fenotip NK ćelija ekspandiranih sa PM sličan onome koji imaju ćelije ekspandirane živim K562-mb15-41BBL ćelijama hraniteljicama, i koji je značajno izmenjen u odnosu na fenotip mirujućeg stanja, određen kod svežih ćelija izolovanih iz periferne krvi. Funkcija sveže izolovanih i ekspandiranih NK ćelija testirana je merenjem nivoa citotoksičnosti prema obe linije leukemijskih ćelija (K562, KG1, HL-60, BDCM) i primarnim leukemijskim blastima (uzorci iz 3 različita AML pacijenta), pri različitim odnosima efektora prema cilju. Podaci ukazuju na to da NK ćelije ekspandirane stimulacijom PM-mb15-41BBL vezikulama ubijaju ćelijske linije i primarne AML ćelije i čine to efikasnije od sveže izolovanih NK ćelija. Izvedeno je in vivo testiranje u NSG ekspanzije NK ćelija pomoću PM i nađeno je da NK ćelije mogu da se ekspandiraju direktno in vivo u životinji, uz serijsko doziranje PM vezikula.

2. Rezultati

[0155] NK ekspanzija testirana je iz četiri različita davaoca uz korišćenje PM-mb15-41-BBL vezikule iz preparata optimizovane plazma-membrane. Optimizovana PMmb15-41-BBL vezikula efikasno i selektivno ekspandira NK ćelije u smeši PBMC i sadržaj NK ćelija raste sa porastom količine PM vezikula (Slike 9, 10, i 11). Broj NK ćelija porastao je prosečno 293 puta (raspon 104-557) posle 12-13 dana kulture u prisustvu optimizovanih PM vezikula i 173 puta (79-895) u prisustvu živih ćelija hraniteljica (Slika 12). Ovo pokazuje značajno poboljšanje u nivou ekspanzije NK ćelija, koje se postiže korišćenjem optimizovanih PM vezikula, u odnosu na inicijalne preparate (233 prema 23, respektivno). Stopa rasta NK ćelija stimulisanih PM vezikulama menja se tokom 28 dana kulture, sa eksponencijalnom fazom koja se dešava između dana 5 i 14 kulture, posle čega se rast usporava (Slika 13). Značajan napredak načinjen je u pristupu citotoksičnosti NK ćelija ekspandiranih korišćenjem PM vezikule. NK ćelije ekspandirane korišćenjem optimizovanih PM-mb15-41-BBL vezikula ubile su sve testirane leukemijske ciljne ćelijske linije jednako efikasno kao i NK ćelije ekspandirane korišćenjem živih K562-mb15-41-BBL ćelija hraniteljica (Slika 14) i pokazale su značajno višu citotoksičnost u poređenju sa sveže izolovanim NK ćelijama (Slika 15). Pored toga, NK ćelije ekspandirane sa PM vezikulom efikasno su ubile CD34+ AML blaste poreklom iz pacijenata, uz poštedu zdravih CD34- ćelija (Slika 16). U humanizovanom NSG mišjem animalnom modelu, NK ćelije preinkubirane 7 dana sa PMmb15-41-BBL vezikulom i injektirane i.v. i dodatno stimulisane PM-mb15-41-BBL vezikulama dostavljenim i.v. 3x nedeljno (M,W,F) zajedno sa niskim dozama IL-2, povećale su se brojčano 15-20 puta tokom perioda od 3 dana (Slika 17) dok su se kontrolne ćelije ekspandirane pod optimalnim uslovima kulture ekspandirale samo 8 puta tokom istog perioda.

[0156] Podrazumeva se da objavljeni postupak i kompozicije nisu ograničeni na određenu metodologiju, protokole i reagense koji su opisani, jer oni mogu varirati. Isto tako, podrazumeva se da ovde upotrebljena terminologija služi samo za opisivanje određenih primera izvođenja, i nije namera da se time ograniči obim predmetnog pronalaska koji će biti ograničen jedino pridruženim patentnim zahtevima.

[0157] Stručnjaci u oblasti će prepoznati ili će korišćenjem rutinskih eksperimenata moći da utvrde mnoge ekvivalente specifičnih primera izvođenja postupka i kompozicija opisanih u ovom tekstu. Namera je da takvi ekvivalenti budu obuhvaćeni patentnim zahtevima koji slede.

4

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Kompozicija koja sadrži plazma-membransku vezikulu prečišćenu iz ćelija hraniteljica NK ćelija, naznačena time, što su ćelije hraniteljice NK ćelija ozračene autologne ili alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), RPMI8866, HFWT, K562, ili EBV-LCL, pri čemu plazma-membranska vezikula sadrži najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije, i pri čemu je najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije IL-21 ili IL-15.

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što plazma-membranska vezikula sadrži još i najmanje jedno dodatno efektorsko sredstvo za NK ćelije, pri čemu se najmanje jedno dodatno efektorsko sredstvo za NK ćelije bira između citokina, adhezivnog molekula, i sredstva koje aktivira NK ćelije.

3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što se najmanje jedno dodatno efektorsko sredstvo za NK ćelije bira između IL-2, 41BBL, IL-12, IL-18, MICA, 2B4, LFA-1 i BCM1/SLAMF2.

4. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time, što je najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije IL21 i plazma-membranska vezikula sadrži još i najmanje jedno ili dva dodatna efektorska sredstva za NK ćelije koja se biraju između IL-15 i 41BBL.

5. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time, što je najmanje jedno efektorsko sredstvo za NK ćelije IL-15 i plazma-membranska vezikula sadrži još i 41BBL kao najmanje jedno dodatno efektorsko sredstvo za NK ćelije.

6. Kompozicija prema patentnom zahtevu 4, naznačena time, što plazma-membranska vezikula sadrži za membranu vezani IL-21 i 41BBL.

7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, naznačena time, što su ćelije hraniteljice ćelije K562 transfektovane za membranu vezanim IL-21 i 41BBL.

8. Upotreba kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 za stimulaciju ili ekspanziju NK ćelija u populaciji NK ćelija in vitro, primenom kompozicije na populaciji NK ćelija in vitro.

9. Postupak za proizvodnju populacije ekspandiranih NK ćelija, naznačen time, što uključuje dovođenje u kontakt prve populacije NK ćelija in vitro sa kompozicijom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.

10. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u lečenju kancera, virusnih infekcija, bolesti kalema protiv domaćina, ili multiple skleroze.

11. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je upotreba lečenje kancera, i pri čemu se kompozicija primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim terapijskim sredstvom za kancer.

12. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time, što plazmamembranska vezikula okružuje mikročesticu.

4