RS64177B1 - Jedinjenja pth sa niskim odnosima najviše i najniže koncentracije - Google Patents

Jedinjenja pth sa niskim odnosima najviše i najniže koncentracije

Info

Publication number
RS64177B1
RS64177B1 RS20230344A RSP20230344A RS64177B1 RS 64177 B1 RS64177 B1 RS 64177B1 RS 20230344 A RS20230344 A RS 20230344A RS P20230344 A RSP20230344 A RS P20230344A RS 64177 B1 RS64177 B1 RS 64177B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
pth
pharmaceutical composition
fragment
composition according
Prior art date
Application number
RS20230344A
Other languages
English (en)
Inventor
Kennett Sprogøe
Lars Holten-Andersen
David Brian Karpf
Original Assignee
Ascendis Pharma Bone Diseases As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ascendis Pharma Bone Diseases As filed Critical Ascendis Pharma Bone Diseases As
Publication of RS64177B1 publication Critical patent/RS64177B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/29—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays or needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A61P5/20—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of PTH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
  • Bipolar Transistors (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje PTH kao što je definisano u zahtevu 1.
[0002] Hipoparatireoidizam je redak endokrini poremećaj metabolizma kalcijuma i fosfata koji najčešće nastaje kao posledica oštećenja ili uklanjanja paratireoidne žlezde tokom operacije na štitnoj žlezdi. Hipoparatireoidizam je među endokrinim poremećajima neobičan po tome što se donedavno nije lečio nadoknađivanjem hormona koji nedostaje, paratireoidnog hormona ili PTH. Konvencionalna terapija hipoparatireoidizma uključuje velike doze vitamina D i oralnu suplementaciju kalcijuma, što je, iako često efikasno, povezano sa izraženim oscilacijama Ca<2+>u krvi koje rezultuju hiperkalcemijom i hipokalcemijom, prekomernim izlučivanjem kalcijuma u urinu i nefrokalcinozom.
[0003] Kalcijum je najzastupljeniji mineral u ljudskom telu, i njegova precizna regulacija je neophodna za mnoge ključne biološke funkcije, kao što su mineralizacija kostiju, kontrakcija mišića, nervna provodljivost, oslobađanje hormona i koagulacija krvi. Posebno je važno održavati koncentraciju kalcijuma što je moguće stabilnijom, zbog visoke osetljivosti različitih ćelijskih sistema ili organa, uključujući centralni nervni sistem, mišiće i egzo/endokrine žlezde, na male varijacije Ca<2+>. PTH je glavni regulator homeostaze kalcijuma.
[0004] Neodgovarajuće nizak nivo PTH u odnosu na koncentraciju Ca<2+>u serumu, karakterističan za hipoparatireoidizam, dovodi do smanjene renalne tubularne reapsorpcije Ca<2+>i istovremeno do povećane renalne tubularne reapsorpcije fosfata. Dakle, glavne biohemijske abnormalnosti hipoparatireoidizma su hipokalcemija i hiperfosfatemija. Kliničke karakteristike bolesti uključuju simptome hipokalcemije, kao što su perioralna utrnulost, parestezije i grčevi karpalnog/pedalnog mišića. Spazam larinksa, tetanija i napadi su ozbiljne, i potencijalno opasne po život, komplikacije. Hiperfosfatemija i povišeni nivo kalcijum-fosfatnog proizvoda doprinose ektopičnom taloženju nerastvorljivih kompleksa kalcijum fosfata u mekim tkivima, uključujući vaskulaturu, mozak, bubrege i druge organe.
[0005] Standardna terapija hipoparatireoidizma je oralna suplementacija kalcijuma i vitamina D. Ciljevi terapije su a) ublažavanje simptoma hipokalcemije; b) održavanje serumskog kalcijuma natašte unutar ili malo ispod niskog normalnog opsega; c) održavanje serumskog fosfora natašte unutar visokog normalnog opsega ili samo blago povišenog; d) izbegavanje ili minimiziranje hiperkalciurije; e) održavanje kalcijum-fosfatnog proizvoda na nivoima znatno ispod gornje granice normale i f) izbegavanje ektopične kalcifikacije bubrega (kamenje i nefrokalcinoza) i drugih mekih tkiva.
[0006] Izvesna zabrinutost se javlja kod produžene upotrebe kalcijuma i aktivnog vitamina D u velikim dozama, posebno u pogledu hiperkalciurije, kamena u bubregu, nefrokalcinoze i ektopične kalcifikacije mekog tkiva. Pored toga, konvencionalna terapija kalcijumom i aktivnim vitaminom D ne ublažava tegobe koje utiču na kvalitet života, niti poništava abnormalnosti u remodeliranju kostiju karakteristične za bolest. Ukratko, postoji velika potreba za poboljšanim terapijama za hipoparatireoidizam.
[0007] Lek Natpara, PTH(1-84), je 2015. godine odobren za primenu u vidu subkutane injekcije jednom dnevno, kao dodatak vitaminu D i kalcijumu kod pacijenata sa hipoparatireoidizmom. Natpara, PTH(1-84), je odobren za kontrolu hipokalcemije na osnovu ključnog ispitivanja koje je pokazalo da je 42 procenta učesnika lečenih pomoću PTH(1-84) postiglo normalne nivoe kalcijuma u krvi uz smanjene doze suplemenata kalcijuma i aktivnih oblika vitamina D, u poređenju sa 3 procenta učesnika koji su primali placebo. Nakon vremenskog perioda tokom koga je praćen serumski kalcijum posle injektovanja, 71 procenat pacijenata lečenih pomoću PTH(1-84) razvilo je hiperkalcemiju na jednom ili više merenja tokom perioda od 24 časa. PTH(1-84) je smanjio izlučivanje kalcijuma u urinu 2-8 časova nakon injektovanja, ali tokom perioda od 24 časa, izlučivanje kalcijuma u urinu se nije promenilo. Slično, izlučivanje fosfata u urinu se povećalo samo tokom prvih 8 časova nakon injekcije PTH(1-84).
[0008] Iako ovo predstavlja važan napredak u lečenju bolesti, Natpara nije pokazao sposobnost da smanji incidence hiperkalcemije (povišeni nivoi kalcijuma u serumu), hipokalcemije (nizak serumski kalcijum) ili hiperkalciurije (povišeni kalcijum u urinu) u odnosu na konvencionalnu terapiju kod pacijenata koji su lečeni.
[0009] S obzirom na to, postoji velika potreba za poboljšanim terapijama hipoparatireoidizma zasnovanim na PTH.
[0010] FDA je 2002. godine odobrila PTH(1-34), ili teriparatid, za lečenje osteoporoze. Uprkos tome što nije odobren za ovu indikaciju, PTH(1-34) se istorijski koristio za lečenje hipoparatireoidizma kod pacijenata koji primaju injekcije dva ili tri puta dnevno. Da bi se omogućilo postizanje fizioloških nivoa PTH, sprovedene su kliničke studije sa PTH(1-34) primenjenim putem isporuke pumpom u poređenju sa injekcijama dva puta dnevno. Tokom 6 meseci, pomoću isporuke pumpom dobijeni su normalni, stabilni nivoi kalcijuma sa minimalnom fluktuacijom i izbegnut je porast nivoa kalcijuma u serumu i urinu koji je očigledan ubrzo nakon injekcije PTH. Izraženo smanjenje izlučivanja kalcijuma urinom kada se PTH(1-34) primenjuje pomoću pumpe može da ukazuje na to da PTH mora da bude kontinuirano izložen bubrežnim tubulima da bi se ostvario efekat očuvanja kalcijuma u bubregu. Isporukom PTH(1-34) pumpom postignuta je istovremena normalizacija markera koštanog metaboličkog obrta, serumskog kalcijuma i izlučivanja kalcijuma u urinu. Ovi rezultati su postignuti nižom dnevnom dozom PTH(1-34) i smanjenom potrebom za suplementacijom magnezijuma u poređenju sa režimom injekcije PTH(1-34) dva puta dnevno.
[0011] Međutim, kontinuirana terapija pumpom je nezgodna i izazovna za pacijente, a cilj sadašnjeg pronalaska je da obezbedi pogodniju terapijsku opciju obezbeđivanja kontinuiranog izlaganja PTH.
[0012] Dugotrajna bolusna primena PTH je povezana sa progresivnim gubitkom kortikalne kosti usled povećanog metabolizma kostiju. Tokom 6-godišnjeg praćenja pacijenata lečenih pomoću PTH(1-84) (Rubin, JCEM 2016) markeri koštanog metaboličkog obrta ostali su veći od vrednosti pre lečenja, dostižući vrhunac u prvim godinama nakon početka primene PTH(1-84) i opadajući nakon toga, ali ostajući značajno viši od početnih vrednosti do 6. godine. Mineralna gustina kostiju (BMD) prema dvojnoj rendgenskoj apsorptometriji (DXA) bila je u skladu sa poznatim mesto-specifičnim efektima PTH, odnosno uvećanjem lumbalnog dela kičme i smanjenjem distalne 1/3 radijusa (i/3 radijus). Smanjenje primećeno na i/3 radijusu je u skladu sa poznatim efektima intermitentnog PTH na povećanje kortikalne poroznosti i intrakoštane resorpcije.
[0013] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi postupak za intermitentno davanje PTH, sa nižim porastom markera koštanog obrta u odnosu na PTH terapije koje se trenutno primenjuju. Intermitentna znači sa dnevnim intervalima.
[0014] U pretkliničkom programu razvoja i Forteo, PTH(1-34) i Natpara, PTH(1-84) primećeno je povećanje stope osteosarkoma zavisno od doze kod pacova tretiranih svakodnevnim injekcijama jedinjenja PTH. U studiji leka Natpara, davanje visokih doza pacovima je obustavljeno zbog prekomerne smrtnosti u ovoj grupi, prvenstveno od metastatskog osteosarkoma.
[0015] Stoga, cilj ovog pronalaska je da obezbedi intermitentnu zamensku terapiju za PTH koja obezbeđuje kontrolu simptoma sa nižom primenjenom dozom. Intermitentna znači sa dnevnim intervalima.
[0016] Ukratko, postoji potreba za pogodnijim i sigurnijim lečenjem hipoparatireoidizma sa smanjenim sporednim efektima.
[0017] Stoga je cilj ovog pronalaska da se bar delimično prevaziđu gore opisani nedostaci.
[0018] Ovaj cilj je postignut farmaceutskom kompozicijom koja sadrži jedinjenje PTH kao što je definisano u zahtevu 1.
[0019] Iznenađujuće je otkriveno da je takvo jedinjenje PTH sposobno da postigne stabilan profil PTH u plazmi koji obezbeđuje fiziološke nivoe kalcijuma u serumu i urinu ili čak smanjene nivoe kalcijuma u urinu uporedive sa onima izmerenim kod zdravih subjekata.
[0020] U okviru ovog pronalaska se koriste termini koji imaju sledeće značenje.
[0021] Kako se ovde koristi izraz "interval injektovanja" odnosi se na vreme između dve uzastopne primene farmaceutske kompozicije ovog pronalaska.
[0022] Kako se ovde koristi, termin "stabilno stanje" se odnosi na stanje postignuto nakon mnoštva konstantnih doza, kao što je nakon 3, 4, 5, 6, 7 ili više konstantnih doza, leka koji je primenjen kod pacijenta sa konstantnim vremenskim intervalima između dve uzastopne primene, ovo stanje se odlikuje time što nivoi jedinjenja PTH u plazmi, ako jedinjenje PTH ne oslobađa PTH, tj. predstavlja stabilno jedinjenje PTH, ili oslobođenog PTH, ako je jedinjenje PTH jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, na početku i na kraju intervala varira za ne više od 10%, poželjno ne više od 7.5%, još poželjnije ne više od 5%, još poželjnije ne više od 4% i najpoželjnije ne više od 3%. Termin "početak intervala" odnosi se na vremensku tačku u kojoj se primenjuje doza, a izraz "kraj intervala" se odnosi na vremensku tačku u kojoj se primenjuje sledeća doza.
[0023] Kako se ovde koristi izraz "odnos najviše i najniže koncentracije" odnosi se na odnos između najviše koncentracije u plazmi i najniže koncentracije u plazmi jedinjenja PTH u stabilnom stanju, ako jedinjenje PTH ne oslobađa PTH, tj. predstavlja stabilno jedinjenje PTH, ili oslobođenog PTH, ako je jedinjenje PTH jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, u vremenskom periodu između dve uzastopne primene kod primata koji nije čovek, poželjno kod makaki (Cynomolgus) majmuna. Međutim, kako postoji dobra korelacija između slobodnog PTH i ukupnog PTH (tj. zbira PTH koji je još uvek sadržan u jedinjenju PTH i oslobođenog PTH), tako ukupni PTH daje dovoljno dobru aproksimaciju. Vremenski period između dve uzastopne primene se takođe naziva "interval injektovanja", "interval primene" ili "interval".
[0024] Kako se ovde koristi, termin "jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem" odnosi se na bilo koje jedinjenje, konjugat, kristal ili smešu koja sadrži najmanje jedan molekul PTH ili fragment PTH, i iz kojeg se najmanje jedan molekul PTH ili fragment PTH oslobađa sa poluživotom oslobađanja od najmanje 12 časova.
[0025] Kako se ovde koriste, termini "poluživot oslobađanja" i "poluživot" odnose se na vreme koje je, pod fiziološkim uslovima (tj. vodeni pufer, pH 7.4, 37°C) potrebno da se polovina svih PTH, odnosno fragmenata PTH sadržanih u jedinjenju PTH sa kontrolisanim oslobađanjem oslobodi iz pomenutog jedinjenja PTH sa kontrolisanim oslobađanjem.
[0026] Kako se ovde koristi izraz "stabilno jedinjenje PTH" odnosi se na bilo koji kovalentni konjugat najmanje jednog fragmenta PTH sa drugim fragmentom, pri čemu je najmanje jedan fragment PTH povezan sa pomenutim drugim fragmentom preko stabilne veze.
[0027] Kako se ovde koristi, termin "PTH" se odnosi na sve polipeptide PTH, poželjno sisarskih vrsta, poželjnije čoveka i sisara, poželjnije čoveka i murinskih vrsta, kao i njihove varijante, analoge, ortologe, homologe i njihove derivate i fragmente, koji se odlikuju povećanjem serumskog kalcijuma i renalne ekskrecije fosfora i smanjenjem serumskog fosfora i renalne ekskrecije kalcijuma. Termin "PTH" se takođe odnosi na sve polipeptide povezane sa PTH (PTHrP), kao što je polipeptid SEQ ID NO: 121, koji se vezuju za zajednički PTH/PTHrP1 receptor i aktiviraju ga. Poželjno, termin "PTH" se odnosi na polipeptid PTH sa SEQ ID NO: 51 kao i na njegove varijante, homologe i derivate koji pokazuju suštinski istu biološku aktivnost, tj. povećanje serumskog kalcijuma i renalne ekskrecije fosfora i snižavanje serumskog fosfora i renalne ekskrecije kalcijuma.
[0028] Poželjno, termin "PTH" se odnosi na sledeće polipeptidne sekvence:
SEQ ID NO:1 (PTH 1-84)
SEQ ID NO:6 (PTH 1-79)
SEQ ID NO:16 (PTH 1-69)
SEQ ID NO:25 (PTH 1-60)
SEQ ID NO:27 (PTH 1-58)
SEQ ID NO:29 (PTH 1-56) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED SEQ ID NO:30 (PTH 1-55) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKE SEQ ID NO:31 (PTH 1-54) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKK SEQ ID NO:32 (PTH 1-53) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRK SEQ ID NO:33 (PTH 1-52) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPR SEQ ID NO:34 (PTH 1-51) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRP SEQ ID NO:35 (PTH 1-50) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQR SEQ ID NO:36 (PTH 1-49)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQ SEQ ID NO:37 (PTH 1-48) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGS SEQ ID NO:38 (PTH 1-47) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAG SEQ ID NO:39 (PTH 1-46) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDA SEQ ID NO:40 (PTH 1-45) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRD SEQ ID NO:41 (PTH 1-44) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPR SEQ ID NO:42 (PTH 1-43) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAP SEQ ID NO:43 (PTH 1-42) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLA SEQ ID NO:44 (PTH 1-41) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPL SEQ ID NO:45 (PTH 1-40) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAP SEQ ID NO:46 (PTH 1-39) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGA SEQ ID NO:47 (PTH 1-38) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALG SEQ ID NO:48 (PTH 1-37) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL
1
SEQ ID NO:49 (PTH 1-36) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVA SEQ ID NO:50 (PTH 1-35) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV SEQ ID NO:51 (PTH 1-34) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF SEQ ID NO:52 (PTH 1-33) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN SEQ ID NO:53 (PTH 1-32) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH SEQ ID NO:54 (PTH 1-31) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV SEQ ID NO:55 (PTH 1-30) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD SEQ ID NO:56 (PTH 1-29) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ SEQ ID NO:57 (PTH 1-28) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL SEQ ID NO:58 (PTH 1-27) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKK SEQ ID NO:59 (PTH 1-26) SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRK SEQ ID NO:60 (PTH 1-25) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLR SEQ ID NO:61 (amidovani PTH 1-84) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:62 (amidovani PTH 1-83)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKS; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:63 (amidovani PTH 1-82)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:64 (amidovani PTH 1-81)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKA; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:65 (amidovani PTH 1-80)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLTK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:66 (amidovani PTH 1-79)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVLT; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:67 (amidovani PTH 1-78)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNVL; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:68 (amidovani PTH 1-77)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVNV; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:69 (amidovani PTH 1-76)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADVN; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:70 (amidovani PTH 1-75)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKADV; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:71 (amidovani PTH 1-74)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKAD; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:72 (amidovani PTH 1-73)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADKA; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:73 (amidovani PTH 1-72)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEADK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:74 (amidovani PTH 1-71)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEAD; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:75 (amidovani PTH 1-70)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGEA; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:76 (amidovani PTH 1-69)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLGE; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:77 (amidovani PTH 1-68)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSLG; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:78 (amidovani PTH 1-67)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKSL; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:79 (amidovani PTH 1-66)
1
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEKS; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:80 (amidovani PTH 1-65)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHEK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:81 (amidovani PTH 1-64)
SVSEIQLMHNLGKBLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESHE; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:82 (amidovani PTH 1-63)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVESH; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:83 (amidovani PTH 1-62)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVES; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:84 (amidovani PTH 1-61)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLVE; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:85 (amidovani PTH 1-60)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVLV; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:86 (amidovani PTH 1-59)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NVL; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:87 (amidovani PTH 1-58)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED NV; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:88 (amidovani PTH 1-57)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED N; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:89 (amidovani PTH 1-56)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKED; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:90 (amidovani PTH 1-55)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKE; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:91 (amidovani PTH 1-54)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:92 (amidovani PTH 1-53)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:93 (amidovani PTH 1-52)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPR; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:94 (amidovani PTH 1-51)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRP; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:95 (amidovani PTH 1-50)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQR; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:96 (amidovani PTH 1-49)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQ; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:97 (amidovani PTH 1-48)
1
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGS; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:98 (amidovani PTH 1-47) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAG; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:99 (amidovani PTH 1-46) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDA; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:100 (amidovani PTH 1-45) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRD; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:101 (amidovani PTH 1-44) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPR; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:102 (amidovani PTH 1-43) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAP; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:103 (amidovani PTH 1-42) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLA; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:104 (amidovani PTH 1-41) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPL; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:105 (amidovani PTH 1-40) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAP; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:106 (amidovani PTH 1-39) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGA; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:107 (amidovani PTH 1-38) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALG; gde je C-kraj amidovan
1
SEQ ID NO:108 (amidovani PTH 1-37) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:109 (amidovani PTH 1-36) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVA; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:110 (amidovani PTH 1-35) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:111 (amidovani PTH 1-34) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:112 (amidovani PTH 1-33) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:113 (amidovani PTH 1-32) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:114 (amidovani PTH 1-31) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV; gde je C-kraj amidovan SEQ ID NO:115 (amidovani PTH 1-30) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQD; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:116 (amidovani PTH 1-29) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:117 (amidovani PTH 1-28) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKL; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:118 (amidovani PTH 1-27) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:119 (amidovani PTH 1-26) SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRK; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:120 (amidovani PTH 1-25)
1
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLR; gde je C-kraj amidovan
SEQ ID NO:121 (PTHrP)
[0029] Poželjnije, termin "PTH" se odnosi na sekvence SEQ ID NO:47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 i 115. Još poželjnije, termin "PTH" se odnosi na sekvencu SEQ ID NO:50, 51, 52, 110, 111 i 112. U posebno poželjnom primeru izvođenja termin "PTH" se odnosi na sekvencu SEQ ID NO:51.
[0030] Kako se ovde koristi, termin "varijanta polipeptida PTH" se odnosi na polipeptid iste vrste koji se razlikuje od referentnog polipeptida PTH ili PTHrP. Poželjno, takva referenca predstavlja sekvencu polipeptida PTH i ima sekvencu SEQ ID NO:51. Generalno, razlike su ograničene tako da su aminokiselinska sekvenca reference i varijante u celini blisko slične i, u mnogim regionima, identične. Poželjno, varijante polipeptida PTH su najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identične referentnom polipeptidu PTH ili PTHrP, poželjno polipeptidu PTH sa SEQ ID NO:51. Pod polipeptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje, na primer, 95% "identična" razmatranoj aminokiselinskoj sekvenci, podrazumeva se da je aminokiselinska sekvenca predmetnog polipeptida identična razmatranoj sekvenci, osim što sekvenca predmetnog polipeptida može da uključuje do pet aminokiselinskih alteracija na svakih 100 aminokiselina razmatrane aminokiselinske sekvence. Ove promene referentne sekvence mogu se desiti na amino (N-terminalnim) ili karboksi terminalnim (C-terminalnim) pozicijama referentne aminokiselinske sekvence, ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, raspoređene ili pojedinačno između ostataka u referentnoj sekvenci, ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Razmatrana sekvenca može da bude cela aminokiselinska sekvenca referentne sekvence ili bilo koji fragment naveden kao što je ovde opisano. Poželjno, razmatrana sekvenca je sekvenca SEQ ID NO:51.
[0031] Takve varijante polipeptida PTH mogu da budu varijante koje se javljaju u prirodi, kao što su prirodne alelne varijante kodirane jednim od nekoliko alternativnih oblika PTH ili PTHrP koji zauzimaju dati lokus na hromozomu ili organizmu, ili izoforme kodirane prirodnim varijantama splajsovanja poreklom iz jednog primarnog transkripta. Alternativno, varijanta polipeptida PTH može da bude varijanta za koju nije poznato da se javlja u prirodi i koja može da se napravi tehnikama mutageneze poznatim u tehnici.
1
[0032] U struci je poznato da jedna ili više aminokiselina mogu da budu deletirane sa N-kraja ili C-kraja bioaktivnog polipeptida bez značajnog gubitka biološke funkcije. Takve N- i/ili C-terminalne delecije su takođe obuhvaćene terminom varijanta polipeptida PTH.
[0033] Stručnjak u ovoj oblasti takođe prepoznaje da neke sekvence aminokiselina polipeptida PTH ili PTHrP mogu da variraju bez značajnog uticaja na strukturu ili funkciju polipeptida. Takvi mutanti uključuju delecije, insercije, inverzije, ponavljanja i supstitucije odabrane prema opštim pravilima poznatim u tehnici tako da imaju mali uticaj na aktivnost. Na primer, uputstvo o tome kako napraviti fenotipski tihe supstitucije aminokiselina dato je u tekstu Bowie et al. (1990), Science 247:1306-1310, koji je ovde uključen kao referenca u celosti, gde autori ukazuju da postoje dva glavna pristupa za proučavanje tolerancije aminokiselinske sekvence na promene.
[0034] Termin polipeptid PTH takođe obuhvata sve polipeptide PTH i PTHrP kodirane analozima, ortolozima i/ili homolozima vrste PTH i PTHrP. Stručnjak u ovoj oblasti takođe prepoznaje da se analozi PTHrP i PTHrP vezuju aktivirajući zajednički receptor PTH/PTHrP1, tako da termin polipeptid PTH takođe obuhvata sve analoge PTHrP. Kako se ovde koristi, termin "analog PTH" odnosi se na PTH i PTHrP različitih i nesrodnih organizama koji obavljaju iste funkcije u svakom organizmu, ali koji ne potiču od predačke strukture koju su preci organizama imali kao zajedničku. Umesto toga, analogni PTH i PTHrP su nastali odvojeno, a zatim su kasnije evoluirali tako da obavljaju iste ili slične funkcije. Drugim rečima, analogni polipeptidi PTH i PTHrP su polipeptidi sa prilično različitim sekvencama aminokiselina, ali koji vrše istu biološku aktivnost, naime povećavaju serumski kalcijum i renalno izlučivanje fosfora i snižavaju serumski fosfor i renalno izlučivanje kalcijuma.
[0035] Kako se ovde koristi termin "ortolog PTH" se odnosi na PTH i PTHrP unutar dve različite vrste čije su sekvence povezane jedna sa drugom preko zajedničkog homolognog PTH ili PTHrP u predačkoj vrsti, ali koje su evoluirale postajući različite jedna od druge.
[0036] Kako se ovde koristi, termin "homolog PTH" se odnosi na PTH i PTHrP različitih organizama koji obavljaju iste funkcije u svakom organizmu i koji potiču iz predačke strukture koju su preci organizama imali kao zajedničku. Drugim rečima, homologni polipeptidi PTH su polipeptidi sa prilično sličnim sekvencama aminokiselina koji vrše istu biološku aktivnost, naime povećavaju serumski kalcijum i renalno izlučivanje fosfora i snižavaju serumski fosfor i renalno izlučivanje kalcijuma. Poželjno, homolozi polipeptida PTH mogu da se definišu kao polipeptidi koji pokazuju najmanje 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sa referentnim polipeptidom PTH ili PTHrP, poželjno polipeptidom PTH sekvence SEQ ID NO:51.
[0037] Dakle, polipeptid PTH prema pronalasku može da bude, na primer: (i) onaj u kome je najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka supstituisan konzervisanim ili nekonzervisanim
1
aminokiselinskim ostatkom, poželjno konzervisanim aminokiselinskim ostatkom, a takav supstituisani aminokiselinski ostatak može, ali ne mora da bude onaj koji je kodiran genetskim kodom; i/ili (ii) onaj u kome najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka uključuje supstituentsku grupu; i/ili (iii) onaj u kome je polipeptid PTH fuzionisan sa drugim jedinjenjem, kao što je jedinjenje za povećanje poluživota polipeptida (na primer, polietilen glikol); i/ili (iv) onaj u kome su dodatne aminokiseline spojene sa polipeptidom PTH, kao što je polipeptid fuzionog regiona Fc IgG ili vodeća ili sekretorna sekvenca ili sekvenca koja se koristi za prečišćavanje gornjeg oblika polipeptida ili sekvenca prekursorskog proteina.
[0038] Kako se ovde koristi, termin "fragment polipeptida PTH" se odnosi na bilo koji polipeptid koji sadrži neprekidni niz dela aminokiselinske sekvence polipeptida PTH ili PTHrP, poželjno polipeptida sekvence SEQ ID NO:51.
[0039] Tačnije, fragment polipeptida PTH sadrži najmanje 6, kao što je najmanje 8, najmanje 10 ili najmanje 17 uzastopnih aminokiselina polipeptida PTH ili PTHrP, poželjnije polipeptida sekvence SEQ ID NO:51. Fragment polipeptida PTH može dodatno da se opiše kao pod-rodovi polipeptida PTH ili PTHrP koji sadrže najmanje 6 aminokiselina, pri čemu je "najmanje 6" definisano kao bilo koji ceo broj između 6 i celog broja koji predstavlja C-terminalnu aminokiselinu polipeptida PTH ili PTHrP, poželjno polipeptida sekvence SEQ ID NO:51. Dalje su uključene vrste polipeptidnih fragmenata PTH ili PTHrP dužine najmanje 6 aminokiselina, kao što je gore opisano, koje su dalje naznačene u smislu njihovih N-terminalnih i C-terminalnih pozicija. Takođe obuhvaćeni terminom "fragment polipeptida PTH" kao pojedinačne vrste su svi polipeptidni fragmenti PTH ili PTHrP, dužine najmanje 6 aminokiselina, kao što je gore opisano, koji mogu posebno da budu naznačeni N-terminalnim i C-terminalnim pozicijama. To jest, svaka kombinacija N-terminalne i C-terminalne pozicije koju bi fragment dužine od najmanje 6 susednih aminokiselinskih ostataka mogao da zauzme, na bilo kojoj datoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptida PTH ili PTHrP, poželjno polipeptida PTH sekvence SEQ ID:NO51, uključena je u ovaj pronalazak.
[0040] Termin "PTH" takođe uključuje poli(aminokiselinske) konjugate koji imaju sekvencu kao što je gore opisano, ali imaju osnovni lanac koji sadrži i amidne i neamidne veze, kao što su estarske veze, kao na primer depsipeptidi. Depsipeptidi su lanci aminokiselinskih ostataka u kojima osnovni lanac sadrži i amidne (peptidne) i estarske veze. Shodno tome, termin "bočni lanac", kako se ovde koristi, odnosi se ili na fragment vezan za alfa-ugljenik aminokiselinskog fragmenta, ako je aminokiselinski fragment povezan preko aminskih veza kao u polipeptidima, ili za bilo koji fragment koji sadrži atom ugljenika vezan za osnovni lanac poli(aminokiselinskog) konjugata, kao što je na primer u slučaju depsipeptida. Poželjno, termin
2
"PTH" se odnosi na polipeptide koji imaju osnovni lanac formiran preko amidnih (peptidnih) veza.
[0041] Kako termin PTH uključuje gore opisane varijante, analoge, ortologe, homologe, derivate i fragmente PTH i PTHrP, sve reference na specifične pozicije unutar referentne sekvence takođe uključuju ekvivalentne pozicije u varijantama, analozima, ortolozima, homolozima, derivatima i fragmentima fragmenta PTH ili PTHrP, čak i ako nije posebno pomenuto.
[0042] Kako se ovde koristi termin "micela" označava agregat amfifilnih molekula dispergovanih u tečnom koloidu. U vodenom rastvoru tipična micela formira agregat sa hidrofilnim delom molekula surfaktanta koji je okrenut ka okolnom rastvaraču i hidrofobnim delom molekula surfaktanta okrenutim ka unutra, koji se takođe naziva "micela normalne faze". "Inverzne micele" imaju hidrofilni deo okrenut ka unutra i hidrofobni deo okrenut ka okolnom rastvaraču.
[0043] Kako se ovde koristi termin "lipozom" se odnosi na vezikulu, poželjno sfernu vezikulu, koja ima najmanje jedan lipidni dvosloj. Poželjno, lipozomi sadrže fosfolipide, još poželjnije fosfatidilholin. Termin "lipozom" se odnosi na različite strukture i veličine, kao što su, na primer, multilamelarne lipozomske vezikule (MLV) koje imaju više od jednog koncentričnog lipidnog dvosloja sa prosečnim prečnikom od 100 do 1000 nm, male unilamelarne lipozomske vezikule (SUV) koje imaju jedan lipidni dvosloj i prosečan prečnik od 25 do 100 nm, velike unilamelarne lipozomske vezikule (LUV) koje imaju jedan lipidni dvosloj i prosečan prečnik od oko 1000 µm i gigantske unilamelarne vezikule (GUV) koje imaju jedan lipidni dvosloj i prosečan prečnik od 1 do 100 µm. Termin "lipozom" takođe uključuje elastične vezikule kao što su transferozomi i etozomi, na primer.
[0044] Kako se ovde koristi termin "akvazom" odnosi se na sferne nanočestice prečnika od 60 do 300 nm koje sadrže najmanje tri sloja samosklopive strukture, odnosno čvrstu fazu nanokristalnog jezgra obloženog oligomernim filmom na koji se molekuli leka adsorbuju sa ili bez modifikacije leka.
[0045] Kako se ovde koristi termin "etozom" odnosi se na lipidne vezikule koje sadrže fosfolipide i etanol i/ili izopropanol u relativno visokoj koncentraciji i vodu, čija veličina se kreće od desetina nanometara do mikrometara.
[0046] Kako se ovde koristi termin "LeciPlex" se odnosi na pozitivno naelektrisani vezikularni sistem na bazi fosfolipida koji sadrži sojin PC, katjonski agens i biokompatibilni rastvarač kao što su PEG 300, PEG 400, dietilen glikol monoetil etar, tetrahidrofurfuril alkohol polietilen glikol etar ili 2-pirolidon ili N-metil-2-pirolidon.
[0047] Kako se ovde koristi termin "niozom" se odnosi na unilamelarne ili multilamelarne vezikule koje sadrže nejonske surfaktante.
[0048] Kako se ovde koristi termin "farmakozom" se odnosi na ultrafine vezikularne, micelarne ili heksagonalne agregate iz lipida kovalentno vezanih za biološki aktivne fragmente.
[0049] Kako se ovde koristi termin "proniozom" se odnosi na suve formulacije nosača obloženog surfaktantom koji pri rehidrataciji i blagom mućkanju daje niozome.
[0050] Kako se ovde koristi termin "polimerzom" se odnosi na veštačku sfernu vezikulu koja sadrži membranu formiranu od amfifilnih sintetičkih blok kopolimera i može opciono da sadrži vodeni rastvor u svom jezgru. Polimerzom ima prečnik u rasponu od 50 nm do 5 µm i veći. Termin takođe uključuje sintozome, koji su polimerzomi konstruisani da sadrže kanale koji omogućavaju određenim hemikalijama da prođu kroz membranu u ili iz vezikule.
[0051] Kako se ovde koristi termin "sfingozom" se odnosi na koncentričnu, dvoslojnu vezikulu u kojoj je vodena zapremina u potpunosti zatvorena membranskim lipidnim dvoslojem koji je uglavnom sačinjen od prirodnog ili sintetičkog sfingolipida.
[0052] Kako se ovde koristi termin "transferozom" se odnosi na ultrafleksibilne lipidne vezikule, koje sadrže vodeno jezgro, formirane od mešavine uobičajenih polarnih i pogodnih lipida aktiviranih na ivicama, koji olakšavaju formiranje visoko zakrivljenih dvosloja koji transferozom čine visoko deformabilnim.
[0053] Kako se ovde koristi termin "ufazom" se odnosi na vezikulu koja sadrži nezasićene masne kiseline.
[0054] Kako se ovde koristi termin "polipeptid" se odnosi na peptid koji sadrži do i uključujući 50 aminokiselinskih monomera.
[0055] Kako se ovde koristi termin "protein" se odnosi na peptid sa više od 50 aminokiselinskih ostataka. Poželjno protein sadrži najviše 20000 aminokiselinskih ostataka, kao što je najviše 15000 aminokiselinskih ostataka, kao što je najviše 10000 aminokiselinskih ostataka, kao što je najviše 5000 aminokiselinskih ostataka, kao što je najviše 4000 aminokiselinskih ostataka, kao npr. najviše 3000 aminokiselinskih ostataka, kao što je najviše 2000 aminokiselinskih ostataka, kao što je najviše 1000 aminokiselinskih ostataka.
[0056] Kako se ovde koristi termin "fiziološki uslovi" se odnosi na vodeni pufer na pH 7.4, 37°C.
[0057] Kako se ovde koristi termin "farmaceutska kompozicija" odnosi se na kompoziciju koja sadrži jedan ili više aktivnih sastojaka, kao što je na primer najmanje jedno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem i jedan ili više ekscipijenasa, kao i bilo koji proizvod koji nastaje, direktno ili indirektno, kombinovanjem, kompleksiranjem ili agregacijom bilo koja dva ili više sastojaka kompozicije, ili disocijacijom jednog ili više sastojaka, ili drugim vrstama reakcija ili interakcija jednog ili više sastojaka. Shodno tome, farmaceutske kompozicije ovog pronalaska obuhvataju bilo koju kompoziciju napravljenu mešanjem jednog ili više jedinjenja PTH sa kontrolisanim oslobađanjem i farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa.
[0058] Kako se ovde koristi termin "tečna kompozicija" odnosi se na smešu koja sadrži jedinjenje PTH rastvorljivo u vodi, poželjno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem rastvorljivo u vodi i jedan ili više rastvarača, kao što je voda.
[0059] Termin "suspenziona kompozicija" se odnosi na smešu koja sadrži jedinjenje PTH nerastvorljivo u vodi, poželjno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem nerastvorljivo u vodi i jedan ili više rastvarača, kao što je voda.
[0060] Kako se ovde koristi, termin "suva kompozicija" znači da je farmaceutska kompozicija obezbeđena u suvom obliku. Pogodni postupci za sušenje su sušenje raspršivanjem i liofilizacija, tj. sušenje zamrzavanjem. Ovakva suva kompozicija proleka ima sadržaj zaostale vode od maksimalno 10%, poželjno manje od 5%, i poželjnije manje od 2%, određeno prema Karlu Fišeru. Poželjno, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska se suši liofilizacijom.
[0061] Termin "lek", kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu, kao što je PTH, koja se koristi u lečenju, izlečenju, prevenciji ili dijagnostici bolesti ili se koristi za poboljšanje fizičkog ili mentalnog blagostanja. Ako je lek konjugovan sa drugim fragmentom, fragment rezultujućeg proizvoda koji potiče iz leka naziva se "biološki aktivan fragment".
[0062] Kako se ovde koristi termin "prolek" odnosi se na konjugat u kome je biološki aktivan fragment reverzibilno i kovalentno povezan sa specijalizovanom zaštitnom grupom preko reverzibilnog linkerskog fragmenta, koji se takođe naziva "reverzibilni linkerski fragment proleka", koji obuhvata reverzibilnu vezu sa biološki aktivnim fragmentom i pri čemu specijalizovana zaštitna grupa menja ili eliminiše nepoželjna svojstva u ishodnom molekulu. Ovo takođe uključuje poboljšanje poželjnih svojstava leka i suzbijanje neželjenih svojstava. Specijalizovana netoksična zaštitna grupa se naziva "nosač". Prolek oslobađa reverzibilno i kovalentno vezan biološki aktivni fragment u obliku odgovarajućeg leka. Drugim rečima, prolek je konjugat koji sadrži biološki aktivni fragment koji je kovalentno i reverzibilno konjugovan sa fragmentom nosača preko reverzibilnog linkerskog fragmenta proleka, gde je kovalentna i reverzibilna konjugacija nosača sa reverzibilnim linkerskim fragmentom proleka ostvarena ili direktno, ili preko spejsera. Takav konjugat oslobađa ranije konjugovani biološki aktivni fragment u obliku slobodnog leka.
[0063] Kako se ovde koristi termin "reverzibilni linkerski fragment proleka je spejserski fragment koji povezuje biološki aktivni fragment, kao što je fragment PTH, sa fragmentom
2
nosača, bilo direktno ili preko dodatnog spejserskog fragmenta i pri čemu je veza između reverzibilnog linkerskog fragmenta proleka i biološki aktivnog fragmenta reverzibilna. Poželjno, veza između fragmenta nosača i reverzibilnog linkerskog fragmenta proleka je stabilna.
[0064] "Biološki razgradiva veza" ili "reverzibilna veza" je veza koja je hidrolitički razgradiva, tj. otcepiva, u odsustvu enzima u fiziološkim uslovima (vodeni pufer na pH 7.4, 37°C) sa poluživotom u rasponu od jednog časa do tri meseca, poželjno od jednog časa do dva meseca, još poželjnije od jednog časa do jednog meseca, još poželjnije od jednog časa do tri nedelje, najpoželjnije od jednog časa do dve nedelje. Shodno tome, "stabilna veza" je veza koja ima poluživot u fiziološkim uslovima (vodeni pufer na pH 7.4, 37°C) duži od tri meseca.
[0065] Kako se ovde koristi, termin "linker proleka bez tragova" označava reverzibilni linker proleka, tj. linkerski fragment koji reverzibilno i kovalentno povezuje biološki aktivni fragment sa nosačem, koji nakon cepanja oslobađa lek u njegovom slobodnom obliku. Kako se ovde koristi, termin "slobodna forma" leka označava lek u njegovom nemodifikovanom, farmakološki aktivnom obliku.
[0066] Kako se ovde koristi, termin "ekscipijens" se odnosi na razblaživač, adjuvans ili vehikulum sa kojim se primenjuje terapeutik, kao što je lek ili prolek. Takav farmaceutski ekscipijens mogu da budu sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, uključujući, ali bez ograničenja, ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda je poželjni ekscipijens kada se farmaceutska kompozicija daje oralno. Slani rastvor i vodeni rastvor dekstroze su poželjni ekscipijensi kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola se poželjno koriste kao tečni ekscipijensi za rastvore za injekcije. Pogodni farmaceutski ekscipijensi uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, manitol, trehalozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Farmaceutska kompozicija, po želji, takođe može da sadrži manje količine sredstava za vlaženje ili emulgovanje, pH pufera, kao što su, na primer, acetat, sukcinat, tris, karbonat, fosfat, HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina), MES (2-(A-morfolino)etansulfonska kiselina), ili mogu da sadrže deterdžente, kao što su Tween, poloksameri, poloksamini, CHAPS, Igepal ili aminokiseline kao što su, na primer, glicin, lizin ili histidin. Ove farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Farmaceutska kompozicija se može formulisati kao supozitorija, sa tradicionalnim vezivnim sredstvima i ekscipijensima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može da uključuje standardne ekscipijense farmaceutskog stepena čistoće, kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd. Takve kompozicije će sadržati terapeutski efikasnu količinu leka ili biološki aktivnog fragmenta, zajedno sa odgovarajućom količinom ekscipijensa kako bi se obezbedio oblik za pravilno davanje pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu primene.
[0067] Kako se ovde koristi, termin "reagens" označava hemijsko jedinjenje koje sadrži najmanje jednu funkcionalnu grupu za reakciju sa funkcionalnom grupom drugog hemijskog jedinjenja ili leka. Podrazumeva se da je lek koji sadrži funkcionalnu grupu (kao što je primarna ili sekundarna aminska ili hidroksilna funkcionalna grupa) takođe reagens.
[0068] Kako se ovde koristi, termin "fragment" označava deo molekula kome nedostaje jedan ili više atoma u poređenju sa odgovarajućim reagensom. Ako, na primer, reagens formule "H-X-H" reaguje sa drugim reagensom i postane deo reakcionog proizvoda, odgovarajući fragment reakcionog proizvoda ima strukturu "H-X-" ili "-X-", dok svaka "- " označava vezivanje za drugi fragment. Shodno tome, biološki aktivni fragment se oslobađa iz proleka kao lek.
[0069] Podrazumeva se da ako je data sekvenca ili hemijska struktura grupe atoma pri čemu je grupa atoma vezana za dva fragmenta ili je umetnuta u fragment, pomenuta sekvenca ili hemijska struktura može da bude vezana za dva fragmenta u bilo kojoj orijentaciji, osim ako nije eksplicitno navedeno drugačije. Na primer, fragment "-C(O)N(R<1>)-" može da bude vezan za dva fragmenta ili umetnut u fragment ili kao ili kao "-N(R<1>)C(O)-". Slično, fragment
može da bude vezan za dva fragmenta ili umetnut u fragment ili kao
[0070] Kako se ovde koristi, termin "funkcionalna grupa" označava grupu atoma koja može da reaguje sa drugim grupama atoma. Funkcionalne grupe uključuju, ali nisu ograničene na sledeće grupe: karboksilna kiselina (-(C=O)OH), primarni ili sekundarni amin (-NH2, -NH-), maleimid, tiol (-SH), sulfonska kiselina (-(O=S=O)OH), karbonat, karbamat (-O(C=O)N<), hidroksil (-OH), aldehid (-(C=O)H), keton (-(C=O)-), hidrazin (>N-N<), izocijanat, izotiocijanat, fosforna kiselina (-O(P=O)OHOH), fosfonska kiselina (-O(P=O)OHH), haloacetil, alkil halid, akriloil,
2
aril fluorid, hidroksilamin, disulfid, sulfonamid, sumporna kiselina, vinil sulfon, vinil keton, diazoalkan, oksiran i aziridin.
[0071] U slučaju da jedinjenje PTH, poželjno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, ovog pronalaska sadrži jednu ili više kiselih ili baznih grupa, pronalazak takođe obuhvata njegove odgovarajuće farmaceutski ili toksikološki prihvatljive soli, posebno njegove farmaceutski upotrebljive soli. Prema tome, jedinjenje PTH, poželjno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, ovog pronalaska koje sadrži kisele grupe može da se koristi prema pronalasku, na primer, kao soli alkalnih metala, soli zemnoalkalnih metala ili kao soli amonijuma. Precizniji primeri takvih soli obuhvataju soli natrijuma, soli kalijuma, soli kalcijuma, soli magnezijuma ili soli sa amonijakom ili organskim aminima kao što su, na primer, etilamin, etanolamin, trietanolamin ili aminokiseline. Jedinjenje PTH, poželjno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, ovog pronalaska koje sadrži jednu ili više baznih grupa, tj. grupa koje mogu da budu protonovane, može da bude prisutno i može da se koristi prema pronalasku u obliku svojih adicionih soli sa neorganskim ili organskim kiselinama. Primeri pogodnih kiselina uključuju hlorovodonik, bromovodonik, fosfornu kiselinu, sumpornu kiselinu, azotnu kiselinu, metansulfonsku kiselinu, p-toluensulfonsku kiselinu, naftalendisulfonske kiseline, oksalnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, vinsku kiselinu, mlečnu kiselinu, salicilnu kiselinu, benzojevu kiselinu, mravlju kiselinu, propionsku kiselinu, pivalinsku kiselinu, dietilsirćetnu kiselinu, malonsku kiselinu, jantarnu kiselinu, pimelinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, jabučnu kiselinu, sulfaminsku kiselinu, fenilpropionsku kiselinu, glukonsku kiselinu, askorbinsku kiselinu, izonikotinsku kiselinu, limunsku kiselinu, adipinsku kiselinu, i druge kiseline poznate stručnjaku. Stručnjacima u ovoj oblasti su poznati dalji postupci za pretvaranje bazne grupe u katjon, kao što je alkilacija aminske grupe koja rezultuje pozitivno naelektrisanom amonijumskom grupom i odgovarajućim protivjonom soli. Ako jedinjenje PTH, poželjno jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, ovog pronalaska istovremeno sadrži kisele i bazne grupe, pronalazak takođe uključuje, pored pomenutih oblika soli, unutrašnje soli ili betaine (cviterjone). Odgovarajuće soli mogu da se dobiju uobičajenim postupcima koji su poznati stručnjaku kao što su, na primer, dovođenjem ovih jedinjenja u kontakt sa organskom ili neorganskom kiselinom ili bazom u rastvaraču ili disperzantu, ili izmenom anjona ili izmenom katjona sa drugim solima. Ovaj pronalazak takođe uključuje sve soli jedinjenja iz ovog pronalaska koje, zbog niske fiziološke kompatibilnosti, nisu direktno pogodne za upotrebu u farmaceutskim proizvodima, ali koje se mogu koristiti, na primer, kao intermedijeri za hemijske reakcije ili za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli.
2
[0072] Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava supstancu koja ne uzrokuje štetu kada se daje pacijentu i poželjno sredstvo odobreno od strane regulatorne agencije, kao što je EMA (Evropa) i/ili FDA (SAD) i/ili bilo koja druga nacionalna regulatorna agencija za upotrebu kod životinja, poželjno za upotrebu kod ljudi.
[0073] Kako se ovde koristi, termin "oko" u kombinaciji sa numeričkom vrednošću se koristi za označavanje opsega u rasponu od i uključujući numeričku vrednost plus i minus ne više od 10% navedene numeričke vrednosti, poželjnije ne više od 8% navedene numeričke vrednosti, još poželjnije ne više od 5% navedene numeričke vrednosti i najpoželjnije ne više od 2% navedene numeričke vrednosti. Na primer, izraz "oko 200" se koristi da označi opseg u rasponu od i uključujući 200 /- 10%, tj. u rasponu od i uključujući 180 do 220; poželjno 200 /- 8%, tj. u rasponu od i uključujući 184 do 216; još poželjnije u rasponu od i uključujući 200 /-5%, tj. u rasponu od i uključujući 190 do 210; i najpoželjnije 200 /-2%, tj. u rasponu od i uključujući 196 do 204. Podrazumeva se da procenat dat kao "oko 20%" ne znači "20% /- 10%", tj. u rasponu od i uključujući 10 do 30%, već "oko 20%" znači u rasponu od i uključujući 18 do 22%, tj. plus i minus 10% numeričke vrednosti koja je 20.
[0074] Kako se ovde koristi, termin "polimer" označava molekul koji sadrži ponavljajuće strukturne jedinice, tj. monomere, povezane hemijskim vezama na linearan, kružni, razgranat, umrežen ili dendrimerni način ili njihovu kombinaciju, koji mogu da budu sintetičkog ili biološkog porekla ili kombinacija oba. Podrazumeva se da polimer može takođe da sadrži jednu ili više drugih hemijskih grupa i/ili fragmenata, kao što je, na primer, jedna ili više funkcionalnih grupa. Poželjno, rastvorljivi polimer ima molekulsku težinu od najmanje 0.5 kDa, npr. molekulsku težinu od najmanje 1 kDa, molekulsku težinu od najmanje 2 kDa, molekulsku težinu od najmanje 3 kDa ili molekulsku težinu od najmanje 5 kDa. Ako je polimer rastvorljiv, poželjno je da ima molekulsku težinu od najviše 1000 kDa, kao što je najviše 750 kDa, kao što je najviše 500 kDa, kao što je najviše 300 kDa, kao što je najviše 200 kDa, kao što je najviše 100 kDa. Podrazumeva se da se za nerastvorljive polimere, kao što su hidrogelovi, ne mogu dati relevantni rasponi molekulske težine. Podrazumeva se i da je protein polimer u kome su aminokiseline ponavljajuće strukturne jedinice, iako bočni lanci svake aminokiseline mogu da budu različiti. Kako se ovde koristi, termin "polimerni" označava reagens ili fragment koji sadrži jedan ili više polimera ili fragmenata polimera. Polimerni reagens ili fragment mogu opciono takođe da sadrže jedan ili više drugih fragmenata, koji se poželjno biraju iz grupe koja se sastoji od
• C1-50alkila, C2-50alkenila, C2-50alkinila, C3-10cikloalkila, 3- do 10-članog heterociklila, 8- do 11-članog heterobiciklila, fenila, naftila, indenila, indanila i tetralinila; i
• veza izabranih iz grupe koja sadrži
2
gde
isprekidane linije označavaju vezivanje za ostatak fragmenta ili reagensa, i
-R i -R<a>su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od -H, metila, etila, propila, butila, pentila i heksila.
[0075] Stručnjak u ovoj oblasti razume da proizvodi polimerizacije dobijeni reakcijom polimerizacije nemaju svi istu molekulsku težinu, već pokazuju određenu raspodelu molekulske težine. Shodno tome, opsezi molekulske težine, molekulske težine, opsezi broja monomera u polimeru i broj monomera u polimeru kako se ovde koristi, odnose se na brojčano prosečnu molekulsku težinu i prosek broja monomera, odnosno na aritmetičku sredinu molekulske težine polimera ili polimernog fragmenta i aritmetičku sredinu broja monomera u polimeru ili polimernom fragmentu.
[0076] Shodno tome, u polimernom fragmentu koji sadrži "x" monomernih jedinica bilo koji ceo broj dat za "x" stoga odgovara aritmetičkoj sredini broja monomera. Bilo koji opseg celih brojeva dat za "x" obezbeđuje opseg celih brojeva u kome se nalazi aritmetička sredina broja monomera. Ceo broj za "x" dat kao "oko x" znači da se aritmetička sredina broja monomera nalazi u opsegu celih brojeva x /- 10%, poželjno x /- 8%, poželjnije x /- 5% i najpoželjnije x /- 2%.
[0077] Kako se ovde koristi, termin "brojčano prosečna molekulska težina" označava uobičajenu aritmetičku sredinu molekulskih težina pojedinačnih polimera.
[0078] Kako se ovde koristi termin "rastvorljiv u vodi" u odnosu na nosač znači da kada je takav nosač deo jedinjenja PTH, poželjno jedinjenja PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, ovog pronalaska, najmanje 1 g jedinjenja PTH, poželjno jedinjenja PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, koje sadrži takav nosač rastvorljiv u vodi, može da se rastvori u jednom litru vode na 20°C formirajući homogeni rastvor. Shodno tome, termin "nerastvorljiv u vodi" u odnosu na nosač znači da, kada je takav nosač deo jedinjenja PTH, poželjno jedinjenja PTH sa
2
kontrolisanim oslobađanjem, ovog pronalaska, manje od 1 g jedinjenja PTH, poželjno jedinjenja PTH sa kontrolisanim oslobađanjem, koje sadrži takav u vodi nerastvorljiv nosač, može da se rastvori u jednom litru vode na 20°C formirajući homogeni rastvor.
[0079] Kako se ovde koristi termin "rastvorljiv u vodi" u odnosu na jedinjenje PTH znači da najmanje 1 g jedinjenja PTH može da se rastvori u jednom litru vode na 20°C formirajući homogeni rastvor. Shodno tome, termin "nerastvorljiv u vodi" u odnosu na jedinjenje PTH znači da manje od 1 g jedinjenja PTH može da se rastvori u jednom litru vode na 20°C formirajući homogeni rastvor.
[0080] Kako se ovde koristi, termin "hidrogel" označava hidrofilnu ili amfifilnu polimernu mrežu sačinjenu od homopolimera ili kopolimera, koja je nerastvorljiva zbog prisustva kovalentnih hemijskih umrežavanja. Unakrsne veze obezbeđuju strukturu mreže i fizički integritet.
[0081] Kako se ovde koristi termin "termogeliranje" označava jedinjenje koje je tečnost ili rastvor niskog viskoziteta sa viskozitetom manjim od 500 cps na 25°C pri brzini smicanja od oko 0.1/sekundi na niskoj temperaturi, u rasponu niskih temperatura između oko 0°C do oko 10°C, ali koje predstavlja jedinjenje većeg viskoziteta sa manje od 10000 cps na 25°C pri brzini smicanja od oko 0.1/sekundi na višoj temperaturi, gde se viša temperatura nalazi u rasponu između oko 30°C do oko 40°C, kao što je na oko 37°C.
[0082] Kako se ovde koristi, termin "na bazi PEG" u vezi sa fragmentom ili reagensom znači da taj fragment ili reagens sadrži PEG. Poželjno, fragment ili reagens na bazi PEG sadrži najmanje 10% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 20% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 30% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 40% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 50% (tež./tež.), kao što je najmanje 60 (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 70% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 80% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 90% (tež./tež.) PEG, kao što je najmanje 95%. Preostali težinski procenat fragmenta ili reagensa na bazi PEG su drugi fragmenti poželjno odabrani od sledećih fragmenata i veza:
• C1-50alkil, C2-50alkenil, C2-50alkinil, C3-10cikloalkil, 3- do 10-člani heterociklil, 8- do 11-člani heterobiciklil, fenil, naftil, indenil, indanil i tetralinil; i
• veze odabrane iz grupe koja sadrži
2
gde
isprekidane linije označavaju vezivanje za ostatak fragmenta ili reagensa, i
-R i -R<a>su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od -H, metila, etila, propila, butila, pentila i heksila.
[0083] Kako se ovde koristi, termin "na bazi PEG koji sadrži najmanje X% PEG" u vezi sa fragmentom ili reagensom znači da taj fragment ili reagens sadrži najmanje X% (tež./tež.) jedinica etilen glikola (-CH2CH2O-), pri čemu jedinice etilen glikola mogu da budu raspoređene u bloku, naizmenično ili mogu da budu nasumično raspoređene unutar fragmenta ili reagensa i poželjno je da su sve jedinice etilen glikola pomenutog fragmenta ili reagensa prisutne u jednom bloku; preostali težinski procenat fragmenta ili reagensa na bazi PEG su drugi fragmenti poželjno odabrani od sledećih fragmenata i veza:
• C1-50alkil, C2-50alkenil, C2-50alkinil, C3-10cikloalkil, 3- do 10-člani heterociklil, 8- do 11-člani heterobiciklil, fenil, naftil, indenil, indanil i tetralinil; i
• veze odabrane iz grupe koja sadrži
gde
isprekidane linije označavaju vezivanje za ostatak fragmenta ili reagensa, i
-R i -R<a>su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od -H, metila, etila, propila, butila, pentila i heksila.
[0084] Termin "na bazi hijaluronske kiseline koji sadrži najmanje X% hijaluronske kiseline" koristi se slično prethodnom.
[0085] Termin "spejserski fragment", kako se ovde koristi, označava bilo koji fragment koji povezuje dva druga fragmenta. Poželjno, spejserski fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od -T-, C1-50alkila, C2-50alkenila i C2-50alkinila; gde su -T-, C1-50alkil, C2-50alkenil i C2-50alkinil opciono supstituisani jednim ili većim brojem -R<y2>, koji su isti ili različiti i gde su C1-50alkil, C2-50alkenil i C2-50alkinil opciono prekinuti jednom ili većim brojem grupa izabranih iz grupe koja se sastoji od -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R<y3>)-, -S(O)2N(R<y3>)-, -S(O)N(R<y3>)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R<y3>)S(O)2N(R<y3a>)-, -S-, -N(R<y3>)-, -OC(OR<y3>)(R<y3a>)-, -N(R<y3>)C(O)N(R<y3a>)- i -OC(O)N(R<y3>)-;
svaki T je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, C3-10cikloalkila, 3- do 10-članog heterociklila, 8- do 30-članog karbopoliciklila i 8- do 30-članog heteropoliciklila; pri čemu je svaki T nezavisno opciono supstituisan jednim ili većim brojem -R<y2>, koji su isti ili različiti;
svaki -R<y2>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od halogena, -CN, okso (=O), -COOR<y5>, -OR<y5>, -C(O)R<y5>, -C(O)N(R<y5>R<y5a>), -S(O)2N(R<y5>R<y5a>), -S(O)N(R<y5>R<y5a>), -S(O)2R<y5>, -S(O)R<y5>, -N(R<y5>)S(O)2N(R<y5a>R<y5b>), -SR<y5>, -N(R<y5>R<y5a>), -NO2, -OC(O)R<y5>, -N(R<y5>)C(O)R<y5a>, -N(R<y5>)S(O)2R<y5a>, -N(R<y5>)S(O)R<y5a>, -N(R<y5>)C(O)OR<y5a>, -N(R<y5>)C(O)N(R<y5a>R<y5b>), -OC(O)N(R<y5>R<y5a>) i C1-6alkila; pri čemu je C1-6alkil opciono supstituisan jednim ili većim brojem halogena, koji su isti ili različiti; i
svaki -R<y3>, -R<y3a>, -R<y4>, -R<y4a>, -R<y5>, -R<y5a>i -R<y5b>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od -H i C1-6alkila, pri čemu je C1-6alkil opciono supstituisan jednim ili većim brojem halogena, koji su isti ili različiti.
[0086] Termin "supstituisan", kako se ovde koristi, označava da je jedan ili više -H atoma molekula ili fragmenta zamenjen drugačijim atomom ili grupom atoma, koji su označeni kao "supstituent".
[0087] Poželjno, jedan ili više dodatnih opcionih supstituenata su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od halogena, -CN, -COOR<x1>, -OR<x1>, -C(O)R<x1>, -C(O)N(R<x1>R<x1a>), -S(O)2N(R<x1>R<x1a>), -S(O)N(R<x1>R<x1a>), -S(O)2R<x1>, -S(O)R<x1>, -N(R<x1>)S(O)2N(R<x1a>R<x1b>), -SR<x1>, -N(R<x1>R<x1a>), -NO2, -OC(O)R<x1>, -N(R<x1>)C(O)R<x1a>, -N(R<x1>)S(O)2R<x1a>, -N(R<x1>)S(O)R<x1a>, -
1
N(R<x1>)C(O)OR<x1a>, -N(R<x1>)C(O)N(R<x1a>R<x1b>), -OC(O)N(R<x1>R<x1a>), -T<0>, C1-50alkila, C2-50alkenila i C2-50alkinila; pri čemu su -T<0>, C1-50alkil, C2-50alkenil i C2-50alkinil opciono supstituisani jednim ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti i pri čemu su C1-50alkil, C2-50alkenil i C2-50alkinil opciono prekinuti jednom ili većim brojem grupa izabranih iz grupe koja se sastoji od -T<0>-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R<x3>)-, -S(O)2N(R<x3>)-, -S(O)N(R<x3>)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R<x3>)S(O)2N(R<x3a>)-, -S-, -N(R<x3>)-, -OC(OR<x3>)(R<x3a>)-, -N(R<x3>)C(O)N(R<x3a>)- i -OC(O)N(R<x3>)-;
-R<x1>, -R<x1a>, -R<x1b>su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od -H, -T<0>, C1-50alkila, C2-50alkenila i C2-50alkinila; pri čemu su -T<0>, C1-50alkil, C2-50alkenil i C2-
50alkinil opciono supstituisani jednim ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti i pri čemu su C1-50alkil, C2-50alkenil i C2-50alkinil opciono prekinuti jednom ili većim brojem grupa izabranih iz grupe koja se sastoji od -T<0>-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R<x3>)-, -S(O)2N(R<x3>)-, -S(O)N(R<x3>)-; -S(O)2-, -S(O)-, -N(R<x3>)S(O)2N(R<x3a>)-, -S-, -N(R<x3>)-, -OC(OR<x3>)(R<x3a>)-, -N(R<x3>)C(O)N(R<x3a>)- i -OC(O)N(R<x3>)-;
svaki T<0>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, C3-10cikloalkila, 3- do 10-članog heterociklila, i 8- do 11-članog heterobiciklila; pri čemu je svaki T<0>nezavisno opciono supstituisan jednim ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti;
svaki -R<x2>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od halogena, -CN, okso (=O), -COOR<x4>, -OR<x4>, -C(O)R<x4>, -C(O)N(R<x4>R<x4a>), -S(O)2N(R<x4>R<x4a>), -S(O)N(R<x4>R<x4a>), -S(O)2R<x4>, -S(O)R<x4>, -N(R<x4>)S(O)2N(R<x4a>R<x4b>), -SR<x4>, -N(R<x4>R<x4a>), -NO2, -OC(O)R<x4>, -N(R<x4>)C(O)R<x4a>, -N(R<x4>)S(O)2R<x4a>, -N(R<x4>)S(O)R<x4a>, -N(R<x4>)C(O)OR<x4a>, -N(R<x4>)C(O)N(R<x4a>R<x4b>), -OC(O)N(R<x4>R<x4a>) i C1-6alkila; pri čemu je C1-6alkil opciono supstituisan jednim ili većim brojem halogena, koji su isti ili različiti;
svaki -R<x3>, -R<x3a>, -R<x4>, -R<x4a>, -R<x4b>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od -H i C1-
6alkila; pri čemu je C1-6alkil opciono supstituisan jednim ili većim brojem halogena, koji su isti ili različiti.
[0088] Poželjnije, jedan ili više dodatnih opcionih supstituenata su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od halogena, -CN, -COOR<x1>, -OR<x1>, -C(O)R<x1>, -C(O)N(R<x1>R<x1a>), -S(O)2N(R<x1>R<x1a>), -S(O)N(R<x1>R<x1a>), -S(O)2R<x1>, -S(O)R<x1>, -N(R<x1>)S(O)2N(R<x1a>R<x1b>), -SR<x1>, -N(R<x1>R<x1a>), -NO2, -OC(O)R<x1>, -N(R<x1>)C(O)R<x1a>, -N(R<x1>)S(O)2R<x1a>, -N(R<x1>)S(O)R<x1a>, -N(R<x1>)C(O)OR<x1a>, -N(R<x1>)C(O)N(R<x1a>R<x1b>), -OC(O)N(R<x1>R<x1a>), -T<0>, C1-10alkila, C2-10alkenila i C2-10alkinila; pri čemu su -T<0>, C1-10alkil, C2-10alkenil i C2-10alkinil opciono supstituisani jednim
2
ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti i pri čemu su C1-10alkil, C2-10alkenil i C2-10alkinil opciono prekinuti jednom ili većim brojem grupa izabranih iz grupe koja se sastoji od -T<0>-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R<x3>)-, -S(O)2N(R<x3>)-, -S(O)N(R<x3>)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R<x3>)S(O)2N(R<x3a>)-, -S-, -N(R<x3>)-, -OC(OR<x3>)(R<x3a>)-, -N(R<x3>)C(O)N(R<x3a>)- i -OC(O)N(R<x3>)-;
svaki -R<x1>, -R<x1a>, -R<x1b>, -R<x3>, -R<x3a>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od -H, halogena, C1-6alkila, C2-6alkenila i C2-6alkinila;
svaki T<0>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, C3-10cikloalkila, 3- do 10-članog heterociklila i 8- do 11-članog heterobiciklila; pri čemu je svaki T<0>nezavisno opciono supstituisan jednim ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti;
svaki -R<x2>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od halogena, -CN, okso (=O), -COOR<x4>, -OR<x4>, -C(O)R<x4>, -C(O)N(R<x4>R<x4a>), -S(O)2N(R<x4>R<x4a>), -S(O)N(R<x4>R<x4a>), -S(O)2R<x4>, -S(O)R<x4>, -N(R<x4>)S(O)2N(R<x4a>R<x4b>), -SR<x4>, -N(R<x4>R<x4a>), -NO2, -OC(O)R<x4>, -N(R<x4>)C(O)R<x4a>, -N(R<x4>)S(O)2R<x4a>, -N(R<x4>)S(O)R<x4a>, -N(R<x4>)C(O)OR<x4a>, -N(R<x4>)C(O)N(R<x4a>R<x4b>), -OC(O)N(R<x4>R<x4a>) i C1-6alkila; pri čemu je C1-6alkil opciono supstituisan jednim ili većim brojem halogen, koji su isti ili različiti;
svaki -R<x4>, -R<x4a>, -R<x4b>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od -H, halogena, C1-6alkila, C2-6alkenila i C2-6alkinila;
Još poželjnije, jedan ili više dodatnih opcionih supstituenata su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od halogena, -CN, -COOR<x1>, -OR<x1>, -C(O)R<x1>, -C(O)N(R<x1>R<x1a>), -S(O)2N(R<x1>R<x1a>), -S(O)N(R<x1>R<x1a>), -S(O)2R<x1>, -S(O)R<x1>, -N(R<x1>)S(O)2N(R<x1a>R<x1b>), -SR<x1>, -N(R<x1>R<x1a>), -NO2, -OC(O)R<x1>, -N(R<x1>)C(O)R<x1a>, -N(R<x1>)S(O)2R<x1a>, -N(R<x1>)S(O)R<x1a>, -N(R<x1>)C(O)OR<x1a>, -N(R<x1>)C(O)N(R<x1a>R<x1b>), -OC(O)N(R<x1>R<x1a>), -T<0>, C1-6alkila, C2-6alkenila i C2-6alkinila; pri čemu su -T<0>, C1-6alkil, C2-6alkenil i C2-6alkinil opciono supstituisani jednim ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti i pri čemu su C1-6alkil, C2-6alkenil i C2-6alkinil opciono prekinuti jednom ili većim brojem grupa izabranih iz grupe koja se sastoji od -T<0>-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R<x3>)-, -S(O)2N(R<x3>)-, -S(O)N(R<x3>)-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R<x3>)S(O)2N(R<x3a>)-, -S-, -N(R<x3>)-, -OC(OR<x3>)(R<x3a>)-, -N(R<x3>)C(O)N(R<x3a>)- i -OC(O)N(R<x3>)-;
svaki -R<x1>, -R<x1a>, -R<x1b>, -R<x2>, -R<x3>, -R<x3a>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od -H, halogena, C1-6alkila, C2-6alkenila i C2-6alkinila;
svaki T<0>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od fenila, naftila, indenila, indanila, tetralinila, C3-10cikloalkila, 3- do 10-članog heterociklila i 8- do 11-članog heterobiciklila; pri čemu je svaki T<0>nezavisno opciono supstituisan jednim ili većim brojem -R<x2>, koji su isti ili različiti.
[0089] Poželjno, najviše 6 -H atoma opciono supstituisanog molekula je nezavisno zamenjeno supstituentom, npr. 5 -H atoma je nezavisno zamenjeno supstituentom, 4 -H atoma su nezavisno zamenjena supstituentom, 3 -H atoma su nezavisno zamenjena supstituentom, 2 -H atoma su nezavisno zamenjena supstituentom, ili je 1 -H atom nezavisno zamenjen supstituentom.
[0090] Termin "prekinut" znači da je fragment umetnut između dva atoma ugljenika ili – ako je insercija na jednom od krajeva fragmenta – između ugljenika ili heteroatoma i atoma vodonika, poželjno između ugljenika i atoma vodonika.
[0091] Kako se ovde koristi, termin "C1-4alkil", sam ili u kombinaciji znači ravnolančani ili granati alkil fragment koji ima 1 do 4 atoma ugljenika. Ako je prisutan na kraju molekula, primeri ravnolančanog ili granatog C1-4alkila su metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil i terc-butil. Kada su dva fragmenta molekula povezana preko C1-4alkila, tada su primeri za takve C1-4alkil grupe -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-. Svaki vodonik C1-4alkil ugljenika može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, C1-4alkil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
[0092] Kako se ovde koristi, termin "C1-6alkil", sam ili u kombinaciji znači ravnolančani ili granati alkil fragment koji ima 1 do 6 atoma ugljenika. Ako je prisutna na kraju molekula, primeri ravnolančane i granate C1-6alkil grupe su metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, terc-butil, n-pentil, 2-metilbutil, 2,2-dimetilpropil, n-heksil, 2-metilpentil, 3-metilpentil, 2,2-dimetilbutil, 2,3-dimetilbutil i 3,3-dimetilpropil. Kada su dva fragmenta molekula povezana preko C1-6alkil grupe, tada su primeri za takve C1-6alkil grupe -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)- i -C(CH3)2-. Svaki atom vodonika C1-6ugljenika može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, C1-6alkil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
[0093] Prema tome, "C1-10alkil", "C1-20alkil" ili "C1-50alkil" označava alkil lanac koji ima 1 do 10, 1 do 20 ili 1 do 50 atoma ugljenika, redom, pri čemu svaki atom vodonika C1-10, C1-20ili C1-50ugljenika može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, C1-10ili C1-50alkil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
4
[0094] Kako se ovde koristi, termin "C2-6alkenil", sam ili u kombinaciji, znači ravnolančani ili granati ugljovodonični fragment koji sadrži najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i koji ima 2 do 6 atoma ugljenika. Ako je prisutan na kraju molekula, primeri su -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CHCH2-CH3i -CH=CH-CH=CH2. Kada su dva fragmenta molekula povezana preko C2-6alkenil grupa, tada je primer za takav C2-6alkenil -CH=CH-. Svaki atom vodonika u fragmentu C2-6alkenila može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, C2-6alkenil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
[0095] Prema tome, termin "C2-10alkenil", "C2-20alkenil" ili "C2-50alkenil", sam ili u kombinaciji znači ravnolančani ili granati ugljovodonični fragment koji sadrži najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i koji ima 2 do 10, 2 do 20 ili 2 do 50 atoma ugljenika. Svaki atom vodonika C2-10alkenil, C2-20alkenil ili C2-50alkenil grupe može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, C2-10alkenil, C2-20alkenil ili C2-50alkenil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
[0096] Kako se ovde koristi, termin "C2-6alkinil", sam ili u kombinaciji, znači ravnolančani ili granati ugljovodonični fragment koji sadrži najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i koji ima 2 do 6 atoma ugljenika. Ako je prisutan na kraju molekula, primeri su -C=CH, -CH2-C≡CH, Kada su dva fragmenta molekula povezana preko
alkinil grupe, tada je primer -C=C-. Svaki atom vodonika C2-6alkinil grupe može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, može da se javi jedna ili više dvostrukih veza. Opciono, C2-6alkinil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
[0097] Prema tome, kako se ovde koristi, termin "C2-10alkinil", "C2-20alkinil" i "C2-50alkinil", sam ili u kombinaciji, znači ravnolančani ili granati ugljovodonični fragment koji sadrži najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i koji ima 2 do 10, 2 do 20 ili 2 do 50 atoma ugljenika, redom. Svaki atom vodonika C2-10alkinil, C2-20alkinil ili C2-50alkinil grupe može opciono da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Opciono, može da se javi jedna ili više dvostrukih veza. Opciono, C2-10alkinil, C2-20alkinil ili C2-50alkinil može da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata kao što je dole definisano.
[0098] Kao što je gore pomenuto, C1-4alkil, C1-6alkil, C1-10alkil, C1-20alkil, C1-50alkil, C2-6alkenil, C2-10alkenil, C2-20alkenil, C2-50alkenil, C2-6alkinil, C2-10alkinil, C2-20alkenil ili C2-50alkinil može opciono da bude prekinut jednim ili većim brojem fragmenata koji su poželjno izabrani iz grupe koja se sastoji od
gde
isprekidane linije označavaju vezivanje za ostatak fragmenta ili reagensa; i
-R i -R<a>su nezavisno jedan od drugog izabrani iz grupe koja se sastoji od -H, metila, etila, propila, butila, pentila i heksila.
[0099] Kako se ovde koristi, termin "C3-10cikloalkil" označava ciklični alkilni lanac koji ima 3 do 10 atoma ugljenika, koji može da bude zasićen ili nezasićen, npr. ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheksenil, cikloheptil, ciklooktil, ciklononil ili ciklodecil. Svaki atom vodonika C3-10cikloalkilnog ugljenika može da bude zamenjen supstituentom kao što je gore definisano. Termin "C3-10cikloalkil" takođe uključuje premošćene bicikle kao što su norbornan ili norbornen.
[0100] Termin "8- do 30-člani karbopoliciklil" ili "8- do 30-člani karbopolicikl" označava ciklični fragment od dva ili više prstena sa 8 do 30 atoma u prstenu, gde dva susedna prstena dele najmanje jedan atom u prstenu i koji može da sadrži do maksimalnog broja dvostrukih veza (aromatični ili nearomatični prsten koji je potpuno zasićen, delimično zasićen ili nezasićen). Poželjno 8-do 30-člani karbopoliciklil označava ciklični fragment od dva, tri, četiri ili pet prstenova, poželjnije od dva, tri ili četiri prstena.
[0101] Kako se ovde koristi, termin "3- do 10-člani heterociklil" ili "3- do 10-člani heterocikl" označava prsten sa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 atoma u prstenu koji može da sadrži do maksimalnog broja dvostrukih veza (aromatični ili nearomatični prsten koji je potpuno, delimično zasićen ili nezasićen) pri čemu je najmanje jedan atom u prstenu do 4 atoma u prstenu zamenjen heteroatomom izabranim iz grupe koja se sastoji od sumpora (uključujući -S(O)-, -S(O)2-), kiseonika i azota (uključujući =N(O)-) i pri čemu je prsten vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili azota. Primeri za 3- do 10-člane heterocikle uključuju, ali nisu ograničeni na aziridin, oksiran, tiiran, azirin, oksiren, tiren, azetidin, oksetan, tietan, furan, tiofen, pirol, pirolin, imidazol, imidazolin, pirazol, pirazolin, oksazol, oksazolin, izoksazol, izoksazolin, tiazol, tiazolin, izotiazol, izotiazolin, tiadiazol, tiadiazolin, tetrahidrofuran, tetrahidrotiofen, pirolidin, imidazolidin, pirazolidin, oksazoliazolidin, izoksazolidin, tiazolidin, izotiazolidin, tiadiazolidin, sulfolan, piran, dihidropiran, tetrahidropiran, imidazolidin, piridin, piridazin, pirazin, pirimidin, piperazin, piperidin, morfolin, tetrazol, triazol, triazolidin, tetrazolidin, diazepan, azepin i homopiperazin. Svaki atom vodonika 3- do 10-člane heterociklil ili 3- do 10-člane heterociklične grupe može da bude zamenjen supstituentom kako je definisano u nastavku.
[0102] Kako se ovde koristi, termin "8- do 11-člani heterobiciklil" ili "8- do 11-člani heterobicikl" označava heterociklični fragment od dva prstena sa 8 do 11 atoma u prstenu, gde najmanje jedan atom prstena dele oba prstena i koji može da sadrži sve do maksimalnog broja dvostrukih veza (aromatični ili nearomatični prsten koji je potpuno zasićen, delimično zasićen ili nezasićen) pri čemu je najmanje jedan atom u prstenu, do 6 atoma u prstenu, zamenjen heteroatomom izabranim iz grupe koja se sastoji od sumpora (uključujući -S (O)-, -S(O)2-), kiseonika i azota (uključujući =N(O)-) i pri čemu je prsten vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili azota. Primeri za 8- do 11-člani heterobicikl su indol, indolin, benzofuran, benzotiofen, benzoksazol, benzizoksazol, benzotiazol, benzizotiazol, benzimidazol, benzimidazolin, hinolin, hinazolin, dihidrohinazolin, hinolin, dihidrohinolin, tetrahidrohinolin, dekahidrohinolin, izohinolin, dekahidroizohinolin, tetrahidroizohinolin, dihidroizohinolin, benzazepin, purin i pteridin. Termin 8- do 11-člani heterobicikl takođe uključuje spiro strukture od dva prstena poput 1,4-dioksa-8-azaspiro[4.5]dekana ili premošćene heterocikle kao što je 8-aza-biciklo[3.2.1]oktan. Svaki atom vodonika 8- do 11-članog heterobiciklila ili 8- do 11-članog heterobiciklilnog ugljenika može da bude zamenjen supstituentom kao što je definisano u nastavku.
[0103] Slično, termin "8- do 30-člani heteropoliciklil" ili "8- do 30-člani heteropolicikl" označava heterociklični fragment od više od dva prstena sa 8 do 30 atoma u prstenu, poželjno od tri, četiri ili pet prstenova, gde dva susedna prstena dele najmanje jedan atom prstena i koji može da sadrži do maksimalnog broja dvostrukih veza (aromatični ili nearomatični prsten koji je potpuno zasićen, delimično zasićen ili nezasićen), pri čemu je najmanje jedan atom u prstenu, do 10 atoma u prstenu, zamenjen heteroatomom izabranim iz grupe sumpora (uključujući -S(O)-, -S(O)2-), kiseonika i azota (uključujući =N(O)-) i gde je prsten vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili azota.
[0104] Podrazumeva se da izraz "par R<x>/R<y>je spojen sa atomom za koji je vezan, formirajući C3-
10cikloalkil ili 3- do 10-člani heterociklil" u vezi sa fragmentom strukture
znači da R<x>i R<y>formiraju sledeću strukturu:
gde R predstavlja C3-10cikloalkil ili 3- do 10-člani heterociklil.
[0105] Takođe se podrazumeva da izraz "par R<x>/R<y>je spojen sa atomima za koje je vezan, formirajući prsten A" u vezi sa fragmentom strukture
znači da R<x>i R<y>formiraju sledeću strukturu:
[0106] Kako se ovde koristi, "halogen" označava fluoro, hloro, bromo ili jodo. Uopšteno je poželjno da je halogen fluoro ili hloro.
[0107] Uopšteno, termin "sadrži" ili "koji sadrži" takođe obuhvata "sastoji se od" ili "koji se sastoji od".
[0108] Poželjno, jedinjenje PTH sadrži molekul PTH ili fragment PTH koji ima sekvencu SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 ili SEQ ID NO:115. Poželjnije molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 ili SEQ ID NO:112.
[0109] U jednom primeru izvođenja molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:50.
[0110] U još jednom primeru izvođenja molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:52.
[0111] U još jednom primeru izvođenja molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:110.
[0112] U još jednom primeru izvođenja molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:111.
[0113] U još jednom primeru izvođenja molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:112.
[0114] Najpoželjnije molekul PTH ili fragment PTH ima sekvencu SEQ ID NO:51.
[0115] Primena jedinjenja PTH se odvija subkutanom primenom.
[0116] Vremenski period između dve uzastopne primene, poželjno između dve uzastopne subkutane primene, tj. interval primene, iznosi 24 časa.
[0117] Odnos najviše i najniže koncentracije meren u svakom intervalu primene je manji od 4, poželjno manji od 3.8, poželjnije manji od 3.6, čak poželjnije manji od 3.4, čak poželjnije manji od 3.2, čak poželjnije manji od 3, čak poželjnije manji od 2.8, čak poželjnije manji od 2.6, čak poželjnije manji od 2.4, čak poželjnije manji od 2.2 i najpoželjnije manji od 2.
[0118] Subkutana primena je putem subkutane injekcije. Poželjno, navedena subkutana injekcija se primenjuje pomoću uređaja injekcioni pen.
[0119] Jedinjenje PTH je jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem.
[0120] Jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem je rastvorljivo u vodi.
[0121] Jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem rastvorljivo u vodi formule (IIf-i) spada u opseg formule (Ia) ili (Ib) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli
gde
- D je fragment PTH;
- L<1>- je reverzibilni linkerski fragment proleka povezan sa fragmentom PTH -D preko funkcionalne grupe PTH;
- L<2>- je jednostruka hemijska veza ili spejserski fragment;
- Z je fragment nosača rastvorljivog u vodi;
x je ceo broj izabran iz grupe koja se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16; i
y je ceo broj izabran iz grupe koja se sastoji od 1, 2, 3, 4 i 5.
[0122] Podrazumeva se da su jedinjenja formule (Ia) i (Ib) prolekovi PTH, tačnije prolekovi PTH rastvorljivi u vodi.
[0123] Poželjno, -D ima sekvencu SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 ili SEQ ID NO:115. Poželjnije -D ima sekvencu SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 ili SEQ ID NO:112.
[0124] U jednom primeru izvođenja -D ima sekvencu SEQ ID NO:50.
[0125] U još jednom primeru izvođenja -D ima sekvencu SEQ ID NO:52.
[0126] U još jednom primeru izvođenja -D ima sekvencu SEQ ID NO:110.
[0127] U još jednom primeru izvođenja -D ima sekvencu SEQ ID NO:111.
[0128] U još jednom primeru izvođenja -D ima sekvencu SEQ ID NO:112.
[0129] Najpoželjnije -D ima sekvencu SEQ ID NO:51.
[0130] Fragment -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca aminokiselinskog ostatka u -D, sa N-terminalnom aminskom funkcionalnom grupom u -D ili sa atomom azota u osnovnom lancu polipeptidnog lanca -D. Vezivanje za N-kraj može da bude direktno preko odgovarajuće aminske funkcionalne grupe.
[0131] Poželjno, aminokiselinski ostatak u PTH sa kojim je -L<1>- konjugovan sadrži primarnu aminsku funkcionalnu grupu.
[0132] Ako je fragment -L<1>- konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca aminokiselinskog ostatka PTH navedeni aminokiselinski ostatak je izabran iz grupe koja se sastoji od proteinogenih aminokiselinskih ostataka i ne-proteinogenih aminokiselinskih ostataka.
[0133] U jednom primeru izvođenja -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca ne-proteinogenog aminokiselinskog ostatka PTH. Jasno je da se takva ne-proteinogena aminokiselina ne nalazi u sekvenci nativnog PTH ili njegovih fragmenata i da može da bude prisutna samo u varijantama i derivatima PTH.
[0134] U još jednom primeru izvođenja -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca proteinogenog aminokiselinskog ostatka PTH. Poželjno, navedena aminokiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, lizina, triptofana i arginina.
[0135] U jednom primeru izvođenja -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca histidina u PTH.
[0136] U još jednom primeru izvođenja -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca lizina u PTH.
[0137] U još jednom primeru izvođenja -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca triptofana u PTH.
4
[0138] U još jednom primeru izvođenja -L<1>- je konjugovan sa funkcionalnom grupom bočnog lanca arginina u PTH.
[0139] Podrazumeva se da ne može svaki fragment PTH da sadrži sve ove aminokiselinske ostatke.
[0140] Poželjno, -L<1>- je direktno konjugovan sa N-terminalnom aminskom funkcionalnom grupom PTH. -L<1>- je povezan sa -D preko amidne veze.
[0141] Fragment -L<1>- je reverzibilni linker proleka iz koga se lek, tj. PTH, oslobađa u svom slobodnom obliku, tj. to je linker proleka koji se uklanja bez traga.
- L<1>- je u širem smislu opisan u WO 2009/095479 A2.
[0142] Fragment -L<1>- ima formulu (IIb-iii):
gde
isprekidana linija označava vezivanje za azot iz -D, koji predstavlja fragment PTH, formiranjem amidne veze; i gde je -L<1>- supstituisan sa -L<2>-Z, pod uslovom da vodonik obeležen zvezdicom u formuli (IIb-iii) nije zamenjen sa -L<2>-Z.
- L<1>- formule (IIb-iii) je supstituisan jednim fragmentom -L<2>-Z.
[0143] Fragment -L<1>- formule (IIb-iii) nije dodatno supstituisan.
[0144] Fragment -L<1>- ima formulu (IIb-iii’):
gde
isprekidana linija označava vezivanje za azot iz -D, koji predstavlja fragment PTH, formiranjem amidne veze;
isprekidana linija obeležena zvezdicom označava vezivanje -L<2>-Z.
[0145] U prolekovima predmetnog pronalaska -L<2>- je spejserski fragment.
[0146] Kako se ovde koristi, termin "dužina lanca", kada je u pitanju fragment -L<2>-, odnosi se na broj atoma -L<2>-presutnih u najkraćoj vezi između -L<1>- i -Z.
- L<2>- ima formulu (i)
gde
isprekidana linija obeležena zvezdicom označava vezivanje za -L<1>-;
neobeležena isprekidana linija označava vezivanje za -Z;
n je 6.
[0147] Fragment -L<1>-L<2>- je
gde
neobeležena isprekidana linija označava vezivanje za azot iz -D, koji predstavlja fragment PTH, formiranjem amidne veze; i
isprekidana linija obeležena zvezdicom označava vezivanje za -Z.
[0148] Jedinjenje PTH sa kontrolisanim oslobađanjem prema predmetnom pronalasku ima formulu (Ia) sa x = 1.
[0149] Nosač -Z sadrži poli(etilenglikol).
[0150] U poželjnom primeru izvođenja -Z ima molekulsku težinu od oko 40 kDa.
- Z je razgranati polimer na bazi PEG. -Z je razgranati polimer na bazi PEG koji ima jednu tačku grananja.
[0151] Tačka grananja je -CH<.
[0152] Takav razgranati fragment -Z ima molekulsku težinu od oko 40 kDa.
- Z sadrži fragment
- Z sadrži amidnu vezu.
- Z je fragment formule (b)
gde
isprekidana linija označava vezivanje za -L<2>-; i
m i p su nezavisno jedan od drugog ceo broj u opsegu od, i uključujući 400 do 500.
[0153] Poželjno, m i p formule (b) su isti ceo broj.
[0154] Najpoželjnije, m i p formule (b) su oko 450.
[0155] Prolek PTH predmetnog pronalaska ima formulu (IIf-i):
gde
neobeležena isprekidana linija označava vezivanje za azot iz -D, koji predstavlja fragment PTH, formiranjem amidne veze; i
isprekidana linija obeležena zvezdicom označava vezivanje za fragment
gde su
m i p nezavisno ceo broj u opsegu, i uključujući 400 do 500.
[0156] Poželjno, -D je vezan za prolek PTH formule (IIf-i) preko N-terminalne aminske funkcionalne grupe fragmenta PTH.
[0157] U poželjnom primeru izvođenja rezidualna aktivnost PTH sa kontrolisanim oslobađanjem u obliku proleka PTH je manja od 10%, poželjnije manja od 1%, čak poželjnije manja od 0.1%, čak poželjnije manja od 0.01%, čak poželjnije manja od 0.001% i najpoželjnije manja od 0.0001%.
[0158] Kako se ovde koristi, termin "rezidualna aktivnost" se odnosi na aktivnost koju pokazuje prolek PTH sa fragmentom PTH vezanim za nosač u odnosu na aktivnost koju pokazuje
4
odgovarajući slobodni PTH. U ovom kontekstu, termin "aktivnost" se odnosi na vezivanje za aktivacioni domen receptora PTH/PTHrP1 što dovodi do aktivacije adenilat ciklaze da stvara cAMP, fosfolipaze C da generiše intracelularni kalcijum, ili osteoblastične ekspresije RANKL (koji se vezuje za RANK (receptora aktivatora nuklearnog faktora kB) na osteoklastima. Podrazumeva se da je za merenje rezidualne aktivnosti proleka PTH ovog pronalaska potrebno vreme tokom kojeg se određena količina PTH može osloboditi iz proleka PTH ovog pronalaska, pri čemu će tako oslobođeni PTH izmeniti rezultate merenja dobijene za prolek PTH. Zbog toga je prihvaćena praksa da se testira rezidualna aktivnost proleka sa konjugatom u kome je fragment leka, u ovom slučaju PTH, nepovratno, odnosno stabilno, vezan za nosač, koji što je moguće više podseća na strukturu proleka PTH čija rezidualna aktivnost treba da se izmeri.
[0159] Poželjno, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska ima pH u rasponu od, i uključujući pH 3 do pH 8. Poželjnije, farmaceutska kompozicija ima pH u rasponu od, i uključujući pH 4 do pH 6. Najpoželjnije, farmaceutska kompozicija ima pH vrednost u rasponu od, i uključujući pH 4 do pH 5.
[0160] U jednom primeru izvođenja farmaceutska kompozicija ovog pronalaska je tečna formulacija.
[0161] U još jednom primeru izvođenja farmaceutska kompozicija ovog pronalaska je suva formulacija koja se rekonstituiše pre davanja pacijentu.
[0162] Takva tečna, suva ili rekonstituisana farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedan ekscipijens. Ekscipijensi koji se koriste u parenteralnim formulacijama mogu da budu kategorisani kao, na primer, agensi za puferovanje, modifikatori izotoničnosti, konzervansi, stabilizatori, agensi protiv adsorpcije, agensi za zaštitu od oksidacije, viskozifikatori/agensi za povećanje viskoznosti, ili drugi pomoćni agensi. Međutim, u nekim slučajevima, jedan ekscipijens može da ima dvostruku ili trostruku funkciju. Poželjno, najmanje jedan ekscipijens koji se nalazi u farmaceutskoj kompoziciji ovog pronalaska je izabran iz grupe koja se sastoji od
(i) Puferska sredstva: fiziološki tolerisani puferi za održavanje pH u željenom opsegu, kao što su natrijum fosfat, bikarbonat, sukcinat, histidin, citrat i acetat, sulfat, nitrat, hlorid, piruvat; antacidi kao što su Mg(OH)2ili ZnCO3takođe mogu da se koriste;
(ii) Modifikatori izotoničnosti: za smanjenje bola koji može da nastane usled oštećenja ćelija zbog razlika u osmotskom pritisku u injekcionom depou; primeri su glicerin i natrijum hlorid; efikasne koncentracije mogu da se odrede osmometrijom korišćenjem pretpostavljene osmolalnosti od 285-315 mOsmol/kg za serum;
(iii) Konzervansi i/ili antimikrobni lekovi: višedozne parenteralne formulacije zahtevaju dodavanje konzervanasa u dovoljnoj koncentraciji da se rizik od inficiranja pacijenata nakon injekcije svede na najmanju meru, i odgovarajući regulatorni zahtevi su utvrđeni; tipični konzervansi uključuju m-krezol, fenol, metilparaben, etilparaben, propilparaben, butilparaben, hlorobutanol, benzil alkohol, fenil živin nitrat, timerosol, sorbinsku kiselinu, kalijum sorbat, benzojevu kiselinu, hlorokrezol i benzalkonijum hlorid;
(iv) Stabilizatori: Stabilizacija se postiže jačanjem sila stabilizacije proteina, destabilizacijom denaturisanog stanja, ili direktnim vezivanjem ekscipijenasa za protein; stabilizatori mogu da budu aminokiseline kao što su alanin, arginin, asparaginska kiselina, glicin, histidin, lizin, prolin, šećeri kao što su glukoza, saharoza, trehaloza, polioli kao što su glicerol, manitol, sorbitol, soli kao što su kalijum fosfat, natrijum sulfat, helirajući agensi kao što su EDTA, heksafosfat, ligandi kao što su joni dvovalentnih metala (cink, kalcijum, itd.), druge soli ili organski molekuli kao što su fenolni derivati; pored toga, mogu da se koriste oligomeri ili polimeri kao što su ciklodekstrini, dekstran, dendrimeri, PEG ili PVP ili protamin ili HSA;
(v) Sredstva protiv adsorpcije: Za oblaganje ili kompetitivnu adsorpciju na unutrašnjoj površini kontejnera formulacije uglavnom se koriste jonski ili nejonski surfaktanti ili drugi proteini ili rastvorljivi polimeri; npr. poloksamer (Pluronic F-68), PEG dodecil etar (Brij 35), polisorbat 20 i 80, dekstran, polietilen glikol, PEG-polihistidin, BSA i HSA i želatini; izabrana koncentracija i tip ekscipijensa zavisi od efekta koji treba izbeći, ali se tipično formira monosloj surfaktanta na graničnoj površini faza neposredno iznad CMC vrednosti;
(vi) Sredstva za zaštitu od oksidacije: antioksidansi kao što su askorbinska kiselina, ektoin, metionin, glutation, monotioglicerol, morin, polietilenimin (PEI), propil galat i vitamin E; mogu da se koriste i helirajući agensi kao što su limunska kiselina, EDTA, heksafosfat i tioglikolna kiselina;
(vii) Viskozifikatori ili pojačivači viskoziteta: u slučaju suspenzije, usporavaju taloženje čestica u bočici i špricu i koriste se kako bi se olakšalo mešanje i resuspendovanje čestica i kako bi se suspenzija lakše ubrizgavala (tj. pomoću male sile primenjene na klip šprica); pogodni viskozifikatori ili pojačivači viskoziteta su, na primer, karbomerni viskozifikatori kao što su Carbopol 940, Carbopol Ultrez 10, derivati celuloze kao što su hidroksipropilmetilceluloza (hipromeloza, HPMC) ili dietilaminoetil celuloza (DEAE ili DEAE-C), koloidni magnezijum silikat (Veegum) ili natrijum silikat, hidroksiapatitni gel,
4
trikalcijum fosfatni gel, ksantani, karagenani kao što je guma Satia UTC 30, alifatične poli(hidroksi kiseline), kao što su poli(D,L- ili L-mlečna kiselina) (PLA) i poli(glikolna kiselina) (PGA) i njihovi kopolimeri (PLGA), terpolimeri D,L-laktida, glikolid i kaprolakton, poloksameri, hidrofilni poli(oksietilen) blokovi i hidrofobni poli(oksipropilen) blokovi koji čine triblok poli(oksietilen)-poli(oksipropilen)-poli(oksietilen) (npr. Pluronic<®>), polietarestarski kopolimer, kao što je kopolimer polietilen glikol tereftalat/polibutilen tereftalat, saharoza acetat izobutirat (SAIB), dekstran ili njegovi derivati, kombinacije dekstrana i PEG, polidimetilsiloksan, kolagen, kitozan, polivinil alkohol (PVA) i derivati, polialkilimidi, poli (akrilamid-ko-dialildimetil amonijum (DADMA)), polivinilpirolidon (PVP), glikozaminoglikani (GAG) kao što su dermatan sulfat, hondroitin sulfat, keratan sulfat, heparin, heparan sulfat, hijaluronan, ABA triblok ili AB blok kopolimeri sastavljeni od hidrofobnih A-blokova, kao što je polilaktid (PLA) ili poli(laktid-ko-glikolid) (PLGA) i hidrofilnih B-blokova, kao što je polietilen glikol (PEG) ili polivinil pirolidon; takvi blok kopolimeri, kao i gore pomenuti poloksameri, mogu da ispolje ponašanje reverzne termičke gelacije (tečno stanje na sobnoj temperaturi da bi se olakšalo davanje i stanje gela iznad temperature prelaza solgel na telesnoj temperaturi nakon injektovanja);
(viii) Sredstvo za rasprostiranje ili difuziju: modifikuje propustljivost vezivnog tkiva putem hidrolize komponenti vanćelijskog matriksa u intrasticijalnom prostoru, kao što je, ali bez ograničenja, hijaluronska kiselina, polisaharid koji se nalazi u međućelijskom prostoru vezivnog tkiva; sredstvo za rasprostiranje kao što je, ali bez ograničenja, hijaluronidaza, privremeno smanjuje viskozitet vanćelijskog matriksa i podstiče difuziju ubrizganih lekova; i
(ix) Drugi pomoćni agensi: kao što su sredstva za vlaženje, modifikatori viskoziteta, antibiotici, hijaluronidaza; kiseline i baze kao što su hlorovodonična kiselina i natrijum hidroksid su pomoćni agensi neophodni za podešavanje pH tokom proizvodnje.
Primeri
Materijal i metode
[0163] PTH(1-34) (SEQ ID NO:51) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP, koji ima zaštitnu grupu Boc na N-kraju i bočni lanac Lys26 zaštićen grupom ivDde (sintetisan primenom strategije Fmoc) nabavljen je od dobavljača koji obezbeđuju sintezu proteina posebne namene.
4
[0164] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu grupu Fmoc na N-kraju (sintetisan primenom strategije Fmoc) nabavljen je od dobavljača koji obezbeđuju sintezu proteina posebne namene.
[0165] PEG 2x20 kDa maleimid, Sunbright GL2-400MA je nabavljen od NOF Europe N.V., Grobbendonk, Belgija. S-Tritil-6-merkaptoheksanska kiselina je nabavljena od kompanije Polypeptide, Strasbourg, Francuska. HATU je dobijen od Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Nemačka. Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH je dobijen od Peptide International Inc., Louisville, KY, SAD. Fmoc-Aib-OH je nabavljen od Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Nemačka. Sve ostale hemikalije i reagensi su nabavljeni od Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen, Nemačka, osim ako nije pomenut drugi dobavljač.
[0166] Jedinjenje 11a (primeri 11-15) je sintetizovano prema proceduri opisanoj u patentu WO29095479A2, primer 1.
[0167] Špricevi opremljeni polietilenskim fritama (MultiSynTech GmbH, Witten, Nemačka) korišćeni su kao reakcioni sudovi ili za korake ispiranja peptidnih smola.
[0168] Opšti postupak za uklanjanje zaštitne grupe ivDde sa PTH sa zaštićenim bočnim lancem na smoli: Smola je prethodno ostavljena da nabubri u DMF tokom 30 min i rastvarač je odbačen. Grupa ivDde je uklonjena inkubacijom smole sa DMF/hidrazin hidratom 4/1 (zapr./zapr., 2.5 mL/g smole) tokom 8 x 15 min. Za svaki korak korišćen je svež rastvor DMF/hidrazin hidrata. Na kraju, smola je isprana sa DMF (10 x), DCM (10 x) i osušena u vakuumu.
[0169] Opšti postupak za uklanjanje zaštitne grupe Fmoc sa zaštićenog PTH na smoli: Smola je prethodno ostavljena da nabubri u DMF 30 min i rastvarač je odbačen. Grupa Fmoc je uklonjena inkubacijom smole sa DMF/piperidin/DBU 96/2/2 (zapr./zapr./zapr., 2.5 mL/g smole) tokom 3 x 10 min. Za svaki korak je korišćen svež rastvor DMF/piperidin/DBU. Na kraju, smola je isprana sa DMF (10 x), DCM (10 x) i osušena u vakuumu.
Prečišćavanje RP-HPLC metodom:
[0170] Za preparativnu RP-HPLC korišćen je kontroler Waters 600 i detektor 2487 Dual Absorbance Detector, opremljen sledećim kolonama: Waters XBridge™ BEH300 Prep C18 5 µm, 150 x 10 mm, protok 6 mL/min, ili Waters XBridge™ BEH300 Prep C1810 µm, 150 x 30 mm, protok 40 mL/min. Korišćeni su linearni gradijenti sistema rastvarača A (voda sa 0.1% TFA zapr./zapr.) i sistema rastvarača B (acetonitril sa 0.1% TFA zapr./zapr.). Frakcije HPLC koje sadrže proizvod su spojene i liofilizovane ako nije navedeno drugačije.
Fleš hromatografija:
4
[0171] Prečišćavanja fleš hromatografijom su izvedena na sistemu Isolera One kompanije Biotage AB, Švedska, upotrebom kaseta na bazi silike Biotage KP-Sil i n-heptana i etil acetata kao eluenata. Proizvodi su detektovani na 254 nm.
Jonoizmenjivačka hromatografija:
[0172] Jonoizmenjivačka hromatografija (IEX) je izvedena upotrebom sistema Amersham Bioscience AEKTAbasic opremljenog kolonom za izmenu katjona MacroCap SP (Amersham Bioscience/GE Healthcare). Kao mobilne faze, korišćene su 17 mM sirćetna kiselina pH 4.5 (rastvarač A) i 17 mM sirćetna kiselina, 1 M NaCl, pH 4.5 (rastvarač B).
Ekskluziona hromatografija:
[0173] Ekskluziona hromatografija (SEC) je izvedena upotrebom sistema Amersham Bioscience AEKTAbasic opremljenog kolonama za odsoljavanje HiPrep 26/10 (Amersham Bioscience/GE Healthcare). Kao mobilna faza, korišćena je 0.1% (zapr./zapr.) sirćetna kiselina.
Analitičke metode
[0174] Analitička LC (UPLC)-MS sa ultra-performansama izvedena je na sistemu Waters Acquity opremljenom C18 kolonom Waters BEH300 (2.1 x 50 mm, veličina čestica 1.7 µm, protok: 0.25 mL/min; rastvarač A: voda sa 0.04% TFA (zapr./zapr.), rastvarač B: acetonitril sa 0.05% TFA (zapr./zapr.)) povezanim sa masenim spektrometrom LTQ Orbitrap Discovery kompanije Thermo Scientific ili povezanim sa Waters Micromass ZQ.
Kvantitativno određivanje koncentracija ukupnog PTH(1-34) u plazmi:
[0175] Koncentracije ukupnog PTH(1-34) u plazmi su određene putem kvantitativnog određivanja identifikacionog peptida blizu N-kraja (sekvenca: IQLMHNLGK) i C-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: LQDVHNF) nakon precipitacije proteina plazme, praćene sekvencijalnom digestijom pomoću endoproteinaze Lys-C (poreklo: Lysobacter enzymogenes) i endoproteinaze Glu-C (poreklo: Staphylococcus aureus V8) supernatanta. Zatim je izvedena analiza reverzno-faznom tečnom hromatografijom i detekcija masenom spektrometrijom (RP-HPLC-MS).
[0176] Kalibracioni standardi za konjugat PTH(1-34) u blanku plazme tretirane pomoću heparina ili EDTA su pripremljeni u opsezima koncentracije od 1 do 1000 ng/mL PTH(1-34) ekv. (razblaženje sa plazmom pacova) i 1 do 1000 ng/mL PTH(1-34) ekv. (razblaženje sa plazmom majmuna).
4
[0177] Ovi rastvori su korišćeni za generisanje kalibracione krive. Za kontrolu kvaliteta, pripremljena su tri uzorka nezavisno od kalibracionih standardnih rastvora, na sledeći način. Koncentracije na donjem kraju (3-5-struka koncentracija odgovarajuće LLOQ), srednjeg opsega (0.05-0.1-struka koncentracija odgovarajuće ULOQ) i gornjem kraju (0.5-0.8-struka koncentracija odgovarajuće ULOQ).
[0178] Zapremine za pripremu uzorka mogu se menjati u zavisnosti od ciljanog odziva signala nakon pripreme uzorka. Ovde je opisan postupak obrade precipitacije proteina za analizu uzoraka plazme poreklom od pacova. Precipitacija proteina je prvo izvedena dodavanjem 100 µL internog standardnog rastvora (625 ng/mL deuterisanog konjugata), a zatim dodavanjem 400 µL acetonitrila u 50 µL uzorka plazme. U novu ploču sa bunarčićima preneto je 2 puta po 150 µL supernatanta i evaporisano do suva (pod blagom strujom azota na 50 °C). Za rastvaranje ostatka korišćeno je 50 µL rekonstitucionog rastvarača (50 mM Tris 0.5 mM CaCl2pufera, podešenog na pH 8.0). Proteolitička digestija je izvedena na sledeći način:
20 µg Lys-C (broj porudžbine 125-05061, Wako Chemicals GmbH, Neuss, Nemačka) je rastvoreno u 80 µL 10 mM sirćetne kiseline. U svaku šupljinu dodato je 3 µL rastvora Lys-C i uzorci su inkubirani 15 časova na 37°C. Nakon toga, u 25 µL vode rastvoreno je 10 µg Glu-C (broj porudžbine V1651, Promega GmbH, Mannheim, Nemačka), i u svaku šupljinu je dodat 1.5 µL rastvora Glu-C i inkubacija je nastavljena 1.5 čas na 37°C. Nakon inkubacije uzorci su acidifikovani sa 2 µL smeše voda/mravlja kiselina 4:6 (zapr./zapr.) i 10 µL je ubrizgano u sistem UPLC-MS.
[0179] Hromatografija je urađena na C18 analitičkoj koloni Waters Acquity BEH300 (veličina čestica 1.7 µm; dimenzije kolone 50 x 2.1 mm). Kao mobilna faza A korišćena je voda (UPLC čistoće) sa 0.1% mravlje kiseline (zapr./zapr.), a kao mobilna faza B acetonitril (UPLC čistoće) sa 0.1% mravlje kiseline.
[0180] Masena analiza je izvedena na AB Sciex 6500<+>QTrap u režimu praćenja višestrukih reakcija (MRM), praćenjem tranzicije m/z 352.0 - 462.1 (identifikacioni peptid IQLMHNLGK), 355.4 - 467.1 (identifikacioni peptid IQLMHNLGK, interni standard), 436.9 - 631.4 (identifikacioni peptid LQDVHNF) i 441.9 - 631.4 (identifikacioni peptid LQDVHNF, interni standard).
Kvantitativno određivanje koncentracija PEG u plazmi:
[0181] Ukupne koncentracije PEG u plazmi određene su kvantitativnim određivanjem polimernog dela konjugata PTH(1-34) nakon precipitacije proteina plazme i enzimske digestije
4
supernatanta. Nakon toga, urađene su analiza ekskluzionom hromatografijom i detekcija masenom spektrometrijom (SEC-MS).
[0182] Kalibracioni standardi konjugata PTH(1-34) u blanku heparinizovane plazme majmuna pripremljeni su u opsezima koncentracija od 50 do 4500 ng/mL ekvivalenata PEG.
[0183] Rastvori su upotrebljeni za generisanje kvadratne kalibracione krive. Kalibracione krive su ponderisane 1/x. Za kontrolu kvaliteta, pripremljena su tri uzorka nezavisno od kalibracionih standardnih rastvora, na sledeći način. Koncentracije na donjem kraju (2-4-struka koncentracija LLOQ), srednjeg opsega (0.1-0.2-struka koncentracija ULOQ) i gornjem kraju (0.8-struka koncentracija ULOQ). Precipitacija proteina izvedena je dodavanjem 200 µL prethodno ohlađenog (5-10 °C) metanola u 100 µL uzorka plazme. U novu ploču sa bunarčićima preneto je 180 µL supernatanta i evaporisano do suva (pod blagom strujom azota na 45 °C). Za rastvaranje ostatka korišćeno je 50 µL rekonstitucionog rastvarača (50 mM Tris 0.5 mM CaCl2pufera, podešenog na pH 8.0). Proteolitička digestija je izvedena na sledeći način: 20 µg Lys-C (broj porudžbine 125-05061, Wako Chemicals GmbH, Neuss, Nemačka) je rastvoreno u 80 µL 10 mM sirćetne kiseline. U svaku šupljinu dodato je 3 µL rastvora Lys-C i uzorci su inkubirani 15 časova na 37°C. Nakon toga, u 25 µL vode rastvoreno je 10 µg Glu-C (broj porudžbine V1651, Promega GmbH, Mannheim, Nemačka), i u svaku šupljinu je dodat 1.5 µL rastvora Glu-C i inkubacija je nastavljena 1.5 čas na 37°C. Nakon inkubacije uzorci su acidifikovani sa 2 µL smeše voda/mravlja kiselina 4:6 (zapr./zapr.) i 5 µL je ubrizgano u sistem SEC-MS.
[0184] Analiza SEC-MS je izvedena korišćenjem uređaja Agilent 1290 UPLC povezanog sa masenim spektrometrom Agilent 6460 TripleQuad preko sonde ESI. Dobijanje posebnog jonskog prekursora polimera je postignuto primenom visokonaponske fragmentacije u izvoru (200-300V) na MS interfejsu. Hromatografija je urađena na analitičkoj koloni TOSOH TSK Gel SuperAW3000 (veličina čestica 4.0 µm; dimenzije kolone 150 x 6.0 mm) pri protoku od 0.50 mL/min (T = 65 °C). Kao mobilna faza A korišćena je voda (UPLC čistoće) sa 0.1% mravlje kiseline (zapr./zapr.), a kao mobilna faza B acetonitril (UPLC čistoće) sa 0.1% mravlje kiseline. Hromatografska postavka za analizu uzorka obuhvata izokratsko eluiranje sa 50% B tokom 8 minuta.
[0185] Analiza mase je izvršena u režimu praćenja pojedinačne reakcije (SRM), praćenjem tranzicije m/z 133.1 - 45.1.
Kvantitativno određivanje koncentracija slobodnog PTH u plazmi:
[0186] Koncentracije slobodnog PTH u acidifikovanoj plazmi određene su kao zbir peptida PTH(1-34) i peptida PTH(1-33) nakon precipitacije proteina plazme, praćene ekstrakcijom čvrste faze. Zatim je izvedena analiza primenom razdvajanja tečnom hromatografijom i detekcija masenom spektrometrijom (LC-MS).
[0187] Kalibracioni standardi PTH(1-34) i PTH(1-33) u blanku acidifikovane plazme pacova tretirane sa EDTA pripremljeni su u opsegu koncentracija od 5.00 do 500 pg/mL u acidifikovanoj plazmi za svaki analit. Odgovarajući opseg koncentracija je 7.00 do 700 pg/mL za oba analita u čistoj plazmi, jer je plazma acidifikovana u zapreminskom odnosu plazma : 0.5 M citratni pufer pH 4 = 1 : 0.4 zapr./zapr.
[0188] Standardni rastvori su upotrebljeni za generisanje kalibracione krive. Za kontrolu kvaliteta, pripremljena su tri uzorka nezavisno od kalibracionih standardnih rastvora od 15.0, 150 i 400 pg/mL u acidifikovanoj plazmi.
[0189] Precipitacija proteina izvedena je dodavanjem 150 µL hladnog acetonitrila u 150 µL uzorka plazme nakon dodavanja 50.0 µL hladnog rastvora internog standarda, što je praćeno centrifugiranjem. Supernatant je dekantovan u novu polipropilensku epruvetu i dodato je 900 µL hladne vode. Nakon još jednog koraka centrifugiranja, epruvete su držane u ledenoj vodi do nanošenja na kolonu SPE.
[0190] Ekstrakcija čvrste faze: mikroelucione kolone HLB su kondicionirane sa 200 µL metanola, a nakon toga sa 200 µL vode. Na kolone je 3 puta naneto po 420 µL razblaženih uzoraka primenom pozitivnog pritiska. Kolone SPE su isprane sa 200 µL smeše metanol:voda 5:95 zapr./zapr. Uzorci su eluirani sa 40.0 µL SPE elucionog rastvarača (aceonitril:voda:trifluorosirćetna kiselina 60:40:1 zapr./zapr./zapr.), praćenog sa 40.0 µL vode. Elucioni rastvarač je ostavljen na kolonama 2 minuta, nakon čega je primenjen vrlo blag pritisak za eluiranje.
[0191] Razdvajanje metabolita i interferirajućih endogenih jedinjenja postignuto je pomoću LC-MS upotrebom C18 kolone Xselect CSH (2.1x100mm, 2.5 µm) na 50°C i upotrebom 0.2% mravlje kiseline i 0.5% dimetil sulfoksida u vodi kao mobilne faze A, 0.5% dimetil sulfoksida u smeši acetonitril:metanol (75:25, zapr./zapr.) kao mobilne faze B, i radeći sa gradijentom pri brzini protoka od 0.500 mL/min.
[0192] Za detekciju u režimu pozitivnih jona korišćen je trostruki kvadrupolni maseni spektrometar 6500 opremljen izvorom turbo jonskog spreja. Za PTH(1-34), PTH(1-33) i PTH(1-33) (Leu-d10)3, kvantifikacija je urađena brojanjem 5 puta iste SRM tranzicije.
Kvantifikacija se zasniva na praćenju višestrukih reakcija (MRM) prelaza m/z:
687.3-787.3 za PTH(1-34)
662.8-757.9 za PTH(1-33)
692.3-793.3 za PTH(1-34) (Leu-d10)3
1
667.8-763.9 za PTH(1-33) (Leu-d10)3
[0193] Za oba analita korišćena je linearna kalibraciona kriva sa faktorom ponderisanja 1/x<2>.
[0194] Koncentracije slobodnog PTH određena je u acidifikovanoj plazmi, kao sredstvo za stabilizovanje analita. Acidifikovana plazma je pripremljena razblaživanjem plazme pacova tretirane sa EDTA 1.4 puta (u slučaju blanka, nule, kalibracionih i QC uzoraka) ili pune krvi pacova (u slučaju ispitivanih uzoraka) 1.2 puta. Pretpostavljajući da je približno 50% (zapr./zapr.) pune krvi plazma, koncentracije u čistoj plazmi su približno 1.4 puta više od navedenih koncentracija u acidifikovanoj plazmi. Koncentracije slobodnog PTH su izračunate kao zbir slobodnog PTH (1-34) i slobodnog PTH (1-33) u ekvivalentima PTH(1-34)).
[0195] Zbog reverzibilne prirode vezivanja -L<1>- za -D, merenja aktivnosti PTH prema receptoru su urađena upotrebom stabilnih analoga prolekova PTH predmetnog pronalaska, tj. urađena su korišćenjem struktura sličnih onima kod prolekova PTH predmetnog pronalaska koje umesto reverzibilnog vezivanja -Z za -D imaju stabilno vezivanje.
[0196] Ovo je bilo neophodno, jer bi prolekovi PTH ovog pronalaska oslobađali PTH tokom eksperimenta i navedeni oslobođeni PTH bi uticao na rezultat.
Primer 1
Sinteza linkerskog reagensa 1f
[0197] Linkerski reagens 1f je sintetisan prema sledećoj šemi:
2
[0198] U rastvor N-metil-N-Boc-etilendiamina (2 g, 11.48 mmol) i NaCNBH3(819 mg, 12.63 mmol) u MeOH (20 mL) dodat je u porcijama 2,4,6-trimetoksibenzaldehid (2.08 g, 10.61 mmol). Smeša je mešana na rt 90 min, acidifikovana sa 3 M HCl (4 mL) i mešana još 15 min. Reakciona smeša je dodata u zasićeni rastvor NaHCO3(200 mL) i ekstrahovana 5 x sa DCM. Kombinovane organske faze su osušene nad Na2SO4i rastvarači su evaporisani u vakuumu. Dobijeni N-metil-N-Boc-N’-Tmob-etilendiamin 1a je osušen na visokom vakuumu i upotrebljen u sledećem koraku reakcije bez dodatnog prečišćavanja.
Prinos: 3.76 g (11.48 mmol, 89% čistoće, 1a: dvostruko Tmob zaštićen proizvod = 8 : 1) MS: m/z 355.22 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 354.21).
[0199] U rastvor 1a (2 g, 5.65 mmol) u DCM (24 mL) dodati su COMU (4.84 g, 11.3 mmol), N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH (2.08 g, 4.52 mmol) i 2,4,6-kolidin (2.65 mL, 20.34 mmol). Reakciona smeša je mešana 3 h na rt, razblažena sa DCM (250 mL) i isprana 3 x sa 0.1 M H2SO4(100 mL) i 3 x slanim rastvorom (100 mL). Vodene faze su re-ekstrahovane sa DCM (100 mL). Kombinovane organske faze su osušene nad Na2SO4, filtrirane i ostatak je koncentrovan do zapremine od 24 mL. Jedinjenje 1b je prečišćeno upotrebom fleš hromatografije.
Prinos: 5.31 g (148%, 6.66 mmol)
MS: m/z 796.38 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 795.37).
[0200] U rastvor 1b (5.31 g, maks. 4.52 mmol označen kao N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH) u THF (60 mL) dodat je DBU (1.8 mL, 3% zapr./zapr.). Rastvor je mešan 12 min na rt, razblažen sa DCM (400 mL) i ispran 3 x sa 0.1 M H2SO4(150 mL) i 3 x slanim rastvorom (150 mL). Vodene faze su re-ekstrahovane sa DCM (100 mL). Kombinovane organske faze su osušene nad Na2SO4i filtrirane. Jedinjenje 1c je izolovano nakon evaporacije rastvarača i upotrebljeno u sledećoj reakciji bez dodatnog prečišćavanja.
MS: m/z 574.31 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 573.30).
[0201] Jedinjenje 1c (5.31 g, 4.52 mmol, sirov) je rastvoreno u acetonitrilu (26 mL) i dodati su COMU (3.87 g, 9.04 mmol), 6-tritilmerkaptoheksanska kiselina (2.12 g, 5.42 mmol) i 2,4,6-kolidin (2.35 mL, 18.08 mmol). Reakciona smeša je mešana 4 h na rt, razblažena sa DCM (400 mL) i isprana 3 x sa 0.1 M H2SO4(100 mL) i 3 x slanim rastvorom (100 mL). Vodene faze su reekstrahovane sa DCM (100 mL). Kombinovane organske faze su osušene nad Na2SO4, filtrirane i jedinjenje 1d je izolovano nakon evaporacije rastvarača. Proizvod 1d je prečišćen upotrebom fleš hromatografije.
Prinos: 2.63 g (62%, 94% čistoće)
MS: m/z 856.41 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 855.41).
[0202] U rastvor 1d (2.63 g, 2.78 mmol) u i-PrOH (33 mL) i H2O (11 mL) dodat je LiOH (267 mg, 11.12 mmol) i reakciona smeša je mešana 70 min na rt. Smeša je razblažena sa DCM (200 mL) i isprana 3 x sa 0.1 M H2SO4(50 mL) i 3 x slanim rastvorom (50 mL). Vodene faze su reekstrahovane sa DCM (100 mL). Kombinovane organske faze su osušene nad Na2SO4, filtrirane i jedinjenje 1e je izolovano nakon evaporacije rastvarača. Jedinjenje 1e je prečišćeno upotrebom fleš hromatografije.
Prinos: 2.1 g (88%)
MS: m/z 878.4 = [M+Na]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 837.40).
[0203] U rastvor 1e (170 mg, 0.198 mmol) u anhidrovanom DCM (4 mL) dodat je DCC (123 mg, 0.59 mmol) i katalitička količina DMAP. Nakon 5 min, dodat je N-hidroksi-sukcinimid (114 mg, 0.99 mmol) i reakciona smeša je mešana na rt 1 h. Reakciona smeša je filtrirana, rastvarač je uklonjen u vakuumu i ostatak je rastvoren u 90% acetonitrilu sa 0.1% TFA (3.4 mL). Sirova smeša je prečišćena RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su neutralizovane sa 0.5 M pH 7.4 fosfatnog pufera i koncentrovane. Preostala vodena faza je ekstrahovana sa DCM i jedinjenje 1f je izolovano nakon evaporacije rastvarača.
Prinos: 154 mg (81%)
MS: m/z 953.4 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 952.43).
Primer 2
Sinteza linkerskog reagensa 2g
[0204]
4
[0205] 4-Metoksitrifenilmetil hlorid (3.00 g, 9.71 mmol) je rastvoren u DCM (20 mL) i ukapan uz mešanje u rastvor etilendiamin 2a (6.5 mL, 97.3 mmol) u DCM (20 mL). Reakciona smeša je mešana 2 h na rt nakon čega je razblažena dietil etrom (300 mL), isprana 3 x slanim rastvorom/0.1 M NaOH 30/1 (zapr./zapr.) i jednom slanim rastvorom. Organska faza je osušena nad Na2SO4i jedinjenje 2b je izolovano nakon evaporacije rastvarača.
Prinos: 3.18 g (98%)
[0206] Intermedijer 2b zaštićen sa Mmt (3.18 g, 9.56 mmol) je rastvoren u DCM (30 mL). Dodati su 6-(tritiltio)-heksanska kiselina (4.48 g, 11.5 mmol), PyBOP (5.67 g, 10.9 mmol) i DIPEA (5.0 mL, 28.6 mmol) i smeša je mešana 30 min na rt. Rastvor je razblažen dietil etrom (250 mL), ispran 3 x smešom slani rastvor/0.1 M NaOH 30/1 (zapr./zapr.) i jednom slanim rastvorom. Organska faza je osušena nad Na2SO4i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Jedinjenje 2c je prečišćeno fleš hromatografijom.
Prinos: 5.69 g (85%)
MS: m/z 705.4 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 704.34)
[0207] Jedinjenje 2c (3.19 g, 4.53 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom THF (50 mL), dodat je 1 M BH3·THF rastvor u THF (8.5 mL, 8.5 mmol) i smeša je mešana 16 h na rt. Dodato je još 1 M BH3·THF rastvora u THF (14 mL, 14.0 mmol) i smeša je mešana dodatnih 16 h na rt. Dodati su metanol (8.5 mL) i N,N’-dimetil-etilendiamin (3.00 mL, 27.9 mmol) i smeša je zagrevana pod refluksom 3 h. Smeša je ostavljena da se ohladi i dodat je etil acetat (300 mL). Rastvor je ispran 2 x vodenim Na2CO3i 2 x vodenim NaHCO3. Organska faza je osušena nad Na2SO4i rastvarač je uklonjen u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje 2d.
Prinos: 3.22 g (103%)
MS: m/z 691.4 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 690.36)
[0208] Di-terc-butil dikarbonat (2.32 g, 10.6 mmol) i DIPEA (3.09 mL, 17.7 mmol) su rastvoreni u DCM (5 mL) i dodati u rastvor 2d (2.45 g, 3.55 mmol) u DCM (5 mL). Smeša je mešana 30 min na rt. Rastvor je koncentrovan u vakuumu i prečišćen fleš hromatografijom da bi se dobio proizvod 2e.
Prinos: 2.09 g (74%)
MS: m/z 791.4 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 790.42)
[0209] Jedinjenje 2e (5.01 g, 6.34 mmol) je rastvoreno u acetonitrilu (80 mL). Dodato je 0.4 M vodene HCl (80 mL) praćene acetonitrilom (20 mL) i smeša je mešana 1 h na rt. pH je podešen na pH 5.5 dodavanjem vodenog 5 M NaOH. Organski rastvarač je uklonjen u vakuumu i preostali vodeni rastvor je ekstrahovan 4 x sa DCM. Kombinovane organske faze su osušene nad Na2SO4i rastvarač je uklonjen u vakuumu da bi se dobio proizvod 2f.
Prinos: 4.77 g (95%)
MS: m/z 519.3 = [M+H]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 518.30)
[0210] Jedinjenje 2f (5.27 g, 6.65 mmol) je rastvoreno u DCM (30 mL) i dodato u rastvor pnitrofenil hloroformata (2.01 g, 9.98 mmol) u DCM (25 mL). Dodat je 2,4,6-trimetilpiridin (4.38 mL, 33.3 mmol) i rastvor je mešan 45 min na rt. Rastvor je koncentrovan u vakuumu i prečišćen fleš hromatografijom da bi se dobio proizvod 2g.
Prinos: 4.04 g (89%)
MS: m/z 706.32 = [M+Na]<+>, (izračunata monoizotopska masa = 683.30).
Primer 3
Sinteza trajnog konjugata S1 PTH(1-34) 3
[0211]
[0212] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Fmoc grupu na N-kraju podvrgnut je uklanjanju zaštitne grupe Fmoc prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor 6-tritilmerkaptoheksanske kiseline (62.5 mg, 160 µmol), PyBOP (80.1 mg, 154 µmol) i DIPEA (53 µL, 306 µmol) u DMF (2 mL) dodat je u 0.21 g (51 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 80 min na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena u vakuumu. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 10 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 3 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 36 mg (14%), 3*8 TFA
MS: m/z 1062.31 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1062.30).
Primer 4
Sinteza trajnog konjugata K26 PTH(1-34) 4
[0213]
[0214] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Boc grupu na N-kraju i bočni lanac Lys26 sa zaštitnom ivDde grupom podvrgnut je uklanjanju zaštitne ivDde grupe prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor 6-tritilmerkaptoheksanske kiseline (107 mg, 273 µmol), PyBOP (141 mg, 273 µmol) i DIPEA (95 µL, 545 µmol) u DMF (3 mL) dodat je u 0.80 g (90.9 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 1 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena u vakuumu. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 6 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 4 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 40 mg (8%), 4*8 TFA
MS: m/z 1062.30 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1062.30).
Primer 5
Sinteza privremenog konjugata S1 PTH(1-34)
[0215]
[0216] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Fmoc grupu na N-kraju podvrgnut je uklanjanju zaštitne grupe Fmoc prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor Fmoc-Aib-OH (79 mg, 244 µmol), PyBOP (127 mg, 244 µmol) i DIPEA (64 µL, 365 µmol) u DMF (1.5 mL) dodat je u 0.60 g (61 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 16 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF i zaštitna grupa Fmoc je uklonjena kao što je gore opisano. Smoli je dodat rastvor 2g (167 mg, 244 µmol) i DIPEA (64 µL, 365 µmol) u DMF (1.5 mL). Suspenzija je mućkana 24 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena u vakuumu. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 7 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 5 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 78 mg (24%), 5*9 TFA
MS: m/z 1101.59 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1101.57).
Primer 6
Sinteza privremenog konjugata S1 PTH(1-34) 6
[0217]
[0218] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Fmoc grupu na N-kraju podvrgnut je uklanjanju zaštitne grupe Fmoc prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor Fmoc-Ala-OH (32 mg, 102 µmol), PyBOP (53 mg, 102 µmol) i DIPEA (27 µL, 152 µmol) u DMF (3 mL) dodat je u 0.25 g (25 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 1 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena pod vakuumom. Uklanjanje zaštitne Fmoc grupe je urađeno kao što je gore opisano. Smoli je dodat rastvor 2g (69 mg, 102 µmol) i DIPEA (27 µL, 152 µmol) u DMF (3 mL). Suspenzija je mućkana 1.5 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena u vakuumu. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 3 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 6 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 25 mg (18%), 6*9 TFA
MS: m/z 1098.75 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1098.07).
Primer 7
Sinteza privremenog konjugata S1 PTH(1-34) 7
[0219]
[0220] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Fmoc grupu na N-kraju podvrgnut je uklanjanju zaštitne grupe Fmoc prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor Fmoc-Ser(Trt)-OH (117 mg, 205 µmol), PyBOP (108 mg, 207 µmol) i DIPEA (53 µL, 305 µmol) u DMF (2 mL) dodat je u 0.50 g (51 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 1 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena pod vakuumom. Uklanjanje zaštitne Fmoc grupe je urađeno kao što je gore opisano. Rastvor 2g (144 mg, 211 µmol) i DIPEA (53 µL, 305 µmol) u DMF (1.8 mL) dodat je smoli. Suspenzija je mućkana 7 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena u vakuumu. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 6 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 7 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 54 mg (20%), 7*9 TFA
MS: m/z 1102.08 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1102.07).
Primer 8
Sinteza privremenog konjugata S1 PTH(1-34) 8
[0221]
[0222] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Fmoc grupu na N-kraju podvrgnut je uklanjanju zaštitne grupe Fmoc prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor Fmoc-Leu-OH (36 mg, 102 µmol), PyBOP (53 mg, 102 µmol) i DIPEA (27 µL, 152 µmol) u DMF (3 mL) dodat je u 0.25 g (25 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 1 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena pod vakuumom. Uklanjanje zaštitne Fmoc grupe je urađeno kao što je gore opisano. Rastvor 2g (69 mg, 102 µmol) i DIPEA (27 µL, 152 µmol) u DMF (3 mL) dodat je smoli. Suspenzija je mućkana 1.5 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena u vakuumu. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 3 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 8 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 31 mg (22%), 8*9 TFA
MS: m/z 1109.32 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1108.58).
Primer 9
Sinteza privremenog konjugata S1 PTH(1-34) 9
[0223]
[0224] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu Fmoc grupu na N-kraju podvrgnut je uklanjanju zaštitne grupe Fmoc prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor 1e (182 mg, 213 µmol), PyBOP (111 mg, 213 µmol) i DIPEA (93 µL, 532 µmol) u DMF (5 mL) dodat je u 2.00 g (107 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 16 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena pod vakuumom. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 20 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 9 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 47 mg (8%), 9*9 TFA
MS: m/z 1108.58 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1108.57).
Primer 10
Sinteza privremenog konjugata K26 PTH(1-34) 10
1
[0226] PTH(1-34) sa zaštićenim bočnim lancem na smoli TCP koji ima zaštitnu grupu Boc na N-kraju i bočni lanac Lys26 sa zaštitnom ivDde grupom podvrgnut je uklanjanju zaštitne ivDde grupe prema proceduri datoj u odeljku Materijal i metode. Rastvor 1f (867 mg, 910 µmol) i DIPEA (0.24 mL, 1.36 mmol) u DMF (5 mL) dodat je u 1.91 g (227 µmol) smole. Suspenzija je mućkana 1 h na rt. Smola je isprana 10 x sa DMF, 10 x sa DCM i osušena pod vakuumom. Isecanje peptida sa smole i uklanjanje zaštitnih grupa postignuto je dodavanjem 20 mL koktela za isecanje 100/3/3/2/1 (zapr./tež./zapr./zapr./zapr.) TFA/DTT/TES/voda/tioanizol i mućkanjem suspenzije 1 h na rt. Sirovo jedinjenje 10 je precipitirano u prethodno ohlađenom dietil etru (-18 °C). Precipitat je rastvoren u smeši ACN/voda i prečišćen RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 92 mg (7%), 10*9 TFA
MS: m/z 1108.58 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1108.57).
Primer 11
Sinteza niskomolekulskog privremenog konjugata S1 PEG 11b
[0227]
2
[0228] 0.15 mL 0.5 M pufera NaH2PO4(pH 7.4) dodato je u 0.5 mL 20 mg/mL rastvora tiola 5 (10 mg, 1.84 µmol) u 1/1 (zapr./zapr.) smeši acetonitril/voda sa 0.1% TFA (zapr./zapr.). Rastvor je inkubiran na rt 10 min, nakon čega je dodato 238 µL 10 mg/mL rastvora maleimida 11a (2.4 mg, 2.21 µmol) u 1/1 (zapr./zapr.) smeši acetonitril/voda sa 0.1% TFA (zapr./zapr.). Rastvor je inkubiran 20 min na rt. Dodato je 10 µL TFA i smeša je prečišćena RP-HPLC metodom. Frakcije proizvoda su osušene zamrzavanjem da bi se dobilo jedinjenje 11b.
Prinos: 3.1 mg (26%), 11b*9 TFA
MS: m/z 1097.00 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+5H]<5+>= 1096.99).
Primer 12
Sinteza niskomolekulskog privremenog konjugata S1 PEG 12
[0229]
[0230] Konjugat 12 je sintetisan kao što je opisano za 11b upotrebom tiola 6 (10 mg, 1.85 µmol) i maleimida 11a (2.4 mg, 2.21 µmol).
Prinos: 10 mg (83%), 12*9 TFA
MS: m/z 1094.20 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1094.19).
Primer 13
Sinteza niskomolekulskog privremenog konjugata S1 PEG 13
[0231]
[0232] Konjugat 13 je sintetisan kao što je opisano za 11b upotrebom tiola 7 (10 mg, 1.84 µmol) i maleimida 11a (2.4 mg, 2.21 µmol).
Prinos: 8 mg (67%), 13*9 TFA
MS: m/z 1097.40 = [M+5H]<5+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+5H]<5+>= 1097.39).
Primer 14
Sinteza niskomolekulskog privremenog konjugata S1 PEG 14
4
[0234] Konjugat 14 je sintetisan kao što je opisano za 11b upotrebom tiola 8 (10 mg, 1.83 µmol) i maleimida 11a (2.4 mg, 2.21 µmol).
Prinos: 4 mg (33%), 14*9 TFA
MS: m/z 1378.01 = [M+4H]<4+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+4H]<4+>= 1378.00).
Primer 15
Sinteza niskomolekulskog privremenog konjugata K26 PEG 15
[0235]
[0236] Konjugat 15 je sintetisan kao što je opisano za 11b upotrebom tiola 10 (5.2 mg, 0.95 µmol) i maleimida 11a (1.23 mg, 1.14 µmol).
Prinos: 2.1 mg (33%), 15*9 TFA
MS: m/z 1102.60 = [M+5H]<5+>, (izračunata monoizotopska masa za [M+5H]<5+>= 1102.59).
Primer 16
Sinteza trajnog konjugata 2x20 kDa S1 PEG 16
[0237]
[0238] 772 µL rastvora koji sadrži tiol 3 (19.4 mg/mL, 15 mg, 3.54 µmol) i 2.5 mg/mL Boc-L-Met u 1/1 (zapr./zapr.) smeši acetonitril/voda sa 0.1% TFA (zapr./zapr.) dodato je u 1.87 mL rastvora koji sadrži PEG 2x20 kDa maleimid (Sunbright GL2-400MA, 187 mg, 4.32 µmol) i 2.5 mg/mL Boc-L-Met u vodi sa 0.1% TFA (zapr./zapr.). Dodato je 0.5 M pufera NaH2PO4(0.66 mL, pH 7.0) i smeša je mešana 30 min na rt. Dodato je 10 µL 270 mg/mL rastvora 2-merkaptoetanola u vodi. Smeša je mešana 5 min na rt i dodato je 0.33 mL 1 M HCl. Konjugat 16 je prečišćen pomoću IEX što je praćeno RP-HPLC metodom upotrebom linearnog gradijenta sistema rastvarača A (voda sa 0.1% AcOH zapr./zapr.) i sistema rastvarača B (acetonitril sa 0.1% AcOH zapr./zapr.). Frakcije koje sadrže proizvod su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 97 mg (2.01 µmol, 57%) konjugat 16*8 AcOH
Primer 17
Sinteza trajnog konjugata 2x20 kDa K26 PEG 17
[0239]
[0240] Konjugat 17 je pripremljen kao što je opisano za 16 reakcijom tiola 4 (15 mg, 3.53 µmol) i PEG 2x20 kDa maleimida (Sunbright GL2-400MA, 187 mg, 4.32 µmol).
Prinos: 80 mg (1.79 µmol, 51%) konjugat 17*8 AcOH
Primer 18
Sinteza privremenog konjugata 2x20 kDa S1 PEG 18
[0242] Konjugat 18 je pripremljen kao što je opisano za 16 reakcijom tiola 5 (37 mg, 8.40 µmol) i PEG 2x20 kDa maleimida (Sunbright GL2-400MA, 445 mg, 9.24 µmol). Reakcija je ugašena dodatkom 50 µL TFA bez prethodnog dodavanja 2-merkaptoetanola. Konjugat 18 je prečišćen pomoću IEX što je praćeno SEC metodom za odsoljavanje. Frakcije koje sadrže proizvod su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 161 mg (3.33 µmol, 40%) konjugat 18*9 AcOH
Primer 19
Sinteza privremenog konjugata 2x20 kDa S1 PEG 19
[0243]
[0244] Konjugat 19 je pripremljen kao što je opisano za 16 reakcijom tiola 7 (27 mg, 6.14 µmol) i PEG 2x20 kDa maleimida (Sunbright GL2-400MA, 325 mg, 7.50 µmol).
Prinos: 249 mg (5.16 µmol, 84%) konjugat 19*9 AcOH
Primer 20
Sinteza privremenog konjugata 2x20 kDa S1 PEG 20
[0245]
[0246] Konjugat 20 je pripremljen kao što je opisano za 16 reakcijom tiola 9 (38 mg, 8.59 µmol) i PEG 2x20 kDa maleimida (Sunbright GL2-400MA, 455 mg, 9.45 µmol). Reakcija je ugašena dodatkom 50 µL TFA bez prethodnog dodavanja 2-merkaptoetanola. Konjugat 20 je prečišćen pomoću IEX što je praćeno SEC metodom za odsoljavanje. Frakcije koje sadrže proizvod su osušene zamrzavanjem.
Prinos: 194 mg (4.01 µmol, 47%) konjugat 20*9 AcOH
Primer 21
Sinteza privremenog konjugata 2x20 kDa K26 PEG 21
[0247]
[0248] Konjugat 21 je pripremljen kao što je opisano za 16 reakcijom tiola 10 (34 mg, 7.58 µmol) i PEG 2x20 kDa maleimida (Sunbright GL2-400MA, 401 mg, 9.26 µmol).
Prinos: 256 mg (5.30 µmol, 70%) konjugat 21*9 AcOH
Primer 22
In vitro kinetika oslobađanja privremenih niskomolekulskih PEG konjugata
[0249] Konjugati 11b, 12, 13, 14 i 15 su rastvoreni u fosfatnom puferu pH 7.4 (60 mM NaH2PO4, 3 mM EDTA, 0.01% Tween-20, podešenom na pH 7.4 pomoću NaOH) koji sadrži 0.05 mg/mL pentafluorofenola kao internog standarda u koncentraciji od približno 1 mg konjugata/mL. Rastvori su sterilno filtrirani i inkubirani na 37°C. U određenim vremenskim trenucima uzimani su alikvoti i analizirani metodama RP-HPLC i ESI-MS. Frakcija oslobođenog PTH u određenom vremenskom trenutku je izračunata iz odnosa površina UV pika oslobođenog PTH i PEG konjugata. Procenat oslobođenog PTH je grafički prikazan u odnosu na vreme inkubacije. Softver za prilagođavanje krive je primenjen za izračunavanje odgovarajućih poluvremena oslobađanja.
Rezultati:
[0250] Za konjugat 11b dobijeno je poluvreme oslobađanja od 3.2 dana.
[0251] Za konjugat 12 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 8.7 dana.
[0252] Za konjugat 13 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 10.8 dana.
[0253] Za konjugat 14 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 25.3 dana.
[0254] Za konjugat 15 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 6.9 dana.
Primer 23
In vitro kinetika oslobađanja privremenih 2x20 kDa PEG konjugata
[0255] Konjugati 18, 19, 20 i 21 su rastvoreni u fosfatnom puferu pH 7.4 (60 mM NaH2PO4, 3 mM EDTA, 0.01% Tween-20, podešenom na pH 7.4 pomoću NaOH) koji sadrži 0.08 mg/mL pentafluorofenola kao internog standarda u koncentraciji od približno 5 mg konjugata/mL. Rastvori su sterilno filtrirani i inkubirani na 37°C. U određenim vremenskim trenucima uzimani su alikvoti i analizirani RP-HPLC metodom. Frakcija oslobođenog PTH u određenom vremenskom trenutku je izračunata iz odnosa površina UV pika oslobođenog PTH i PEG konjugata. Procenat oslobođenog PTH je grafički prikazan u odnosu na vreme inkubacije. Softver za prilagođavanje krive je primenjen za izračunavanje odgovarajućih poluvremena oslobađanja.
Rezultati:
[0256] Za konjugat 18 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 2.8 dana.
[0257] Za konjugat 19 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 13.4 dana.
[0258] Za konjugat 20 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 1.3 dana
[0259] Za konjugat 21 dobijeno je poluvreme oslobađanja od 7.1 dana
Primer 24
Aktivnost PTH prema receptoru kod trajnih 2x20 kDa PEG konjugata 16 i 17 u testu na bazi ćelija
[0260] Rezidualna aktivnost PTH trajno PEG-ilovanih konjugata 16 i 17 kvantitativno je određena merenjem proizvodnje cAMP u ćelijama HEK293 koje prekomerno eksprimiraju receptor PTH/PTHrP1 (Hohenstein A, Hebell M, Zikry H, El Ghazaly M, Mueller F, Rohde, J. Development and validation of a novel cell-based assay for potency determination of human parathyroid hormone (PTH), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis September 2014, 98: 345-350). Kao referentni standard korišćen je PTH(1-34) iz NIBSC (Nacionalni institut za biološke standarde i kontrolu, UK).
Rezultati:
[0261] Za konjugat 16 nađena je aktivnost prema receptoru od 0.12% u odnosu na referentni PTH(1-34).
[0262] Za konjugat 17 nađena je aktivnost prema receptoru od 0.11% u odnosu na referentni PTH(1-34).
[0263] Rezultati pokazuju značajno snižavanje aktivnosti prema receptoru kod trajnih 2x20 kDa PEG konjugata 16 i 17. Može se zaključiti da su slični konjugati PTH sa privremeno vezanim Ser1 ili Lys26 (kao npr. 18 i 21) pogodni prolekovi PTH koji obezbeđuju nisku rezidualnu aktivnost prema receptoru. Neposredna analiza privremenih konjugata u testu na ćelijama nije moguća zbog isecanja linkera pod uslovima izvođenja testa. Oslobođeni PTH bi uticao na rezultat testa.
Primer 25
Farmakokinetička studija trajnih 2x20 kDa PEG konjugata 16 i 17 na pacovima
[0264] Mužjaci pacova Wistar (6 nedelja, 230-260 g) podvrgnuti su ili jednoj intravenskoj (2 grupe, n = 3 životinje svaka) ili jednoj subkutanoj (2 grupe, n = 3 životinje svaka) primeni konjugata 16 ili 17 u dozi od 29 µg/pacovu PTHekv, odnosno 31 µg/pacovu PTHekv. Uzorci krvi su sakupljani do 168 h nakon primene doze i izdvajana je plazma. Koncentracije PTH(1-34) u plazmi su određivane kvantitativnim određivanjem N-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: IQLMHNLGK) i C- terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: LQDVHNF) nakon digestije LysC i GluC kao što je opisano u odeljku Materijal i metode.
[0265] Rezultati: Primena doze se dobro podnosi bez vidljivih znakova nelagodnosti tokom primene i nakon primene. Reakcije na mestu primene doze nisu primećene u bilo kom trenutku tokom studije. Posle intravenske injekcije konjugata 16 i 17, tmaxza ukupni PTH(1-34) je zapaženo na 15 min (najranija ispitivana vremenska tačka), što je praćeno sporim opadanjem sadržaja ukupnog PTH(1-34) sa vremenom poluživota od približno 13 h, odnosno 11 h. Nakon subkutane injekcije, koncentracija ukupnog PTH(1-34) dostigla je najvišu vrednost na tmaxod 24 h za oba konjugata, 16 i 17, nakon čega je usledilo sporo opadanje sadržaja ukupnog PTH(1-34) sa vremenom poluživota od približno 1.5 dana za oba konjugata. Bioraspoloživost je bila približno 40%, odnosno 60%. Slične PK krive su dobijene za N- i C-terminalni identifikacioni peptid do 168 h nakon primene doze, što ukazuje na prisustvo intaktnog PTH(1-34) u konjugatu.
[0266] Povoljna dugotrajna PK i stabilnost PTH u konjugatima ukazuju na pogodnost trajnih 2x20 kDa PEG modela jedinjenja kao sporo oslobađajućih prolekova PTH nakon subkutane injekcije. Može se zaključiti da su slični konjugati PTH sa privremeno vezanim Ser1 (kao što je npr. 18) ili Lys26 pogodni prolekovi PTH koji obezbeđuju dugotrajne nivoe oslobođenog bioaktivnog PTH.
Primer 26
Farmakokinetička studija privremenih 2x20 kDa S1 PEG konjugata 19 na makaki majmunima
[0267] Mužjaci ranije tretiranih makaki majmuna (2-4 godine, 3.7-5.4 kg) podvrgnuti su jednoj subkutanoj (n = 3 životinje) primeni konjugata 19 u dozi od 70 µg/kg PTHekv. Uzorci krvi su sakupljani do 504 h nakon primene doze i plazma je izdvojena. Koncentracije ukupnog PTH(1-34) u plazmi su određene kvantifikacijom N-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: IQLMHNLGK) i C-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: LQDVHNF) nakon digestije LysC i GluC kao što je opisano u odeljku Materijal i metode. Koncentracije PEG su određene korišćenjem postupka opisanog u odeljku Materijal i metode.
[0268] Rezultati: Primena doze se dobro podnosi bez vidljivih znakova nelagodnosti tokom primene. Jedna životinja je pokazala vidljive znake nelagodnosti 72 h nakon primene doze, ali se narednih dana oporavila. Reakcije na mestu davanja doze nisu primećene u bilo kom trenutku tokom studije. Koncentracija ukupnog PTH(1-34) dostigla je maksimum na tmaxod 24 h, što je praćeno sporim opadanjem sadržaja ukupnog PTH(1-34) sa vremenom poluživota od približno 2.5 dana za N-terminalni identifikacioni peptid i 0.9 dana za C-terminalni identifikacioni peptid. Koncentracija PEG je dostigla maksimum na tmaxod 24 h, nakon čega je usledilo sporo opadanje koncentracije PEG sa vremenom poluživota od 3.5 dana.
1
[0269] Može se zaključiti da je konjugat 19 pogodan prolek za produženu isporuku PTH.
Primer 27
Farmakokinetička studija privremenog 2x20 kDa S1 PEG konjugata 18 na makaki majmunima
[0270] Ranije tretirani makaki majmuni (2-3 godine, 2.5-4 kg) podvrgnuti su dnevnoj subkutanoj (n = 2 životinje - 1 mužjak / 1 ženka) primeni konjugata 18 pri nivoima doze od 0.2, 0.5 i 1 µg/kg PTHekvtokom 28 dana. Uzorci krvi su sakupljani do 28 dana (1, 13. i 27. dana uzorci su sakupljani pre primene doze, na 2 h, 4 h, 8 h, 12 h i 24 h nakon primene doze) i izdvojena je plazma. Koncentracije PTH(1-34) u plazmi su određene kvantifikacijom N-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: IQLMHNLGK) i C-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: LQDVHNF) nakon digestije LysC i GluC kao što je opisano u odeljku Materijal i metode.
[0271] Rezultati: Sve primene doze su izvedene bez incidenata. Reakcije na mestu primene doze nisu primećene u bilo kom trenutku tokom studije. Linearnost doze je zapažena u tri grupe. Od 1. dana zapažen je steking-efekat doza, u poređenju sa 13. danom i 27. danom. Koncentracije ukupnog PTH(1-34) su kvantifikovane preko N-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: IQLMHNLGK) u stabilnom stanju (tokom 27. dana).
[0272] Nizak odnos najviše i najniže koncentracije ukupnog PTH(1-34) za sve dozne grupe, koji iznosi ispod 3, primećen je u stabilnom stanju posle dnevne subkutane primene kod makaki majmuna. Kako su koncentracije slobodnih peptida u stabilnom stanju u korelaciji sa koncentracijom ukupnog PTH(1-34), odnos najviše i najniže koncentracije slobodnog peptida je kod makaki majmuna ispod 4.
Primer 28
Farmakokinetička studija privremenog 2x20 kDa S1 PEG konjugata 18 na makaki majmunima
[0273] Makaki majmuni (2-3.5 godine, 2-5 kg) koji nisu prethodno tretirani (3-5 mužjaka / 3-5 ženki) podvrgnuti su dnevnim subkutanim primenama konjugata 18 pri nivoima doze od 0.2, 0.5 i 1.5 µg PTH/kg. Uzorci krvi su prikupljani 1. dana: pre primene doze, na 4 h, 8 h, 12 h, 18 h i 24 h posle primene doze, 8. dana: pre primene doze, 14. dana: pre primene doze, na 8 h i 12 h, i 28. dana: na 3 h, 6 h, 8 h, 12 h, 18 h, 24 h, 72 h, 168 h i 336 h) i izdvojena je plazma. Koncentracije ukupnog PTH u plazmi su određene kvantifikacijom N-terminalnog identifikacionog peptida
2
(sekvenca: IQLMHNLGK) nakon digestije LysC i GluC kao što je predstavljeno ranije u odeljku Materijal i metode.
[0274] Rezultati: Sistemska izloženost, izražena kao Cmaxi AUC, se povećavala na način približno proporcionalan dozi. Sistemska izloženost ukupnom PTH izražena kao AUC akumulirana je približno 3 puta od 1. dana do 28. dana.
[0275] Nizak srednji odnos najviše i najniže koncentracije ukupnog PTH za sve dozne grupe od 1.5 primećen je nakon dnevne subkutane primene kod makaki majmuna 28. dana (stabilno stanje je primećeno od 8. dana). Ovaj nizak srednji odnos najviše i najniže koncentracije ukupnog PTH može takođe da se prenese na slobodni PTH.
Primer 29
Farmakokinetička studija privremenog 2x20 kDa S1 PEG konjugata 18 na pacovima Sprague-Dawley
[0276] Pacovi Sprague-Dawley Crl:CD(SD) (početak doziranja u uzrastu od 8 nedelja) podvrgnuti su dnevnim subkutanim primenama konjugata 18 pri nivoima doze od 10, 30 i 60 µg PTH/kg tokom 28 dana. TK grupa koja je sadržala 9 mužjaka i 9 ženki po doznoj grupi podeljena je u 3 podgrupe sa 3 pacova po podgrupi. Uzorci krvi su prikupljani do 28 dana sa 3 pacova po polu, po vremenskoj tački uzorkovanja. Uzorci su sakupljani 1. dana: pre primene doze, na 4 h, 8 h, 12 h, 18 h i 24 h nakon primene doze, i 28. dana: na 3 h, 6 h, 8 h, 12 h, 18 h, 24 h i 336 h i izdvojena je plazma. Koncentracije ukupnog PTH u plazmi su određene kvantifikacijom N-terminalnog identifikacionog peptida (sekvenca: IQLMHNLGK) nakon digestije LysC i GluC kao što je predstavljeno ranije u odeljku Materijal i metode.
[0277] Koncentracije slobodnog PTH u plazmi su određene kvantifikacijom kao zbir PTH(1-34) i PTH(1-33) pomoću LC-MS/MS metode, kao što je predstavljeno ranije u odeljku Materijal i metode.
[0278] Rezultati: Sistemska izloženost ukupnom PTH i slobodnom PTH, izražena kao srednja Cmaxi AUC, povećavala se na način približno proporcionalan dozi. Sistemska izloženost ukupnom PTH izražena kao srednja AUC akumulirana je 3-6 puta od 1. do 28. dana, a slobodnom PTH izražena kao srednja AUC akumulirana je 2-3 puta od 1. do 28. dana. Sistemska izloženost ukupnom PTH kod ženki pacova bila je približno 2 puta veća nego kod mužjaka. Sistemska izloženost slobodnom PTH bila je nešto veća kod ženki pacova nego kod mužjaka.
[0279] Nizak srednji odnos najviše i najniže koncentracije ukupnog PTH za sve dozne grupe od 1.2 zapažen je posle dnevne subkutane primene kod pacova Sprague-Dawley 28. dana (stanje ravnoteže primećeno od 8. dana). Uočen je nizak srednji odnos najviše i najniže koncentracije slobodnog PTH u opsegu 1.5 – 2.4 nakon dnevne subkutane primene kod pacova Sprague-Dawley 28. dana.
Skraćenice:
[0280]
ACN acetonitril
AcOH sirćetna kiselina
Aib 2-aminoizobuterna kiselina
BMD mineralna gustina kostiju
Bn benzil
Boc terc-butiloksikarbonil
COMU (1-cijano-2-etoksi-2-oksoetilidenaminooksi)dimetilamino-morfolinokarbenijum heksafluorofosfat
cAMP ciklični adenozin monofosfat
d dan
DBU 1,3-diazabiciklo[5.4.0]undecen
DCC N,N’-dicikloheksilkarbodiimid
DCM dihlorometan
DIPEA N,N-diizopropiletilamin
DMAP dimetilamino-piridin
DMF N,N-dimetilformamid
DMSO dimetilsulfoksid
DTT ditiotreitol
EDTA etilendiamintetrasirćetna kiselina
eq stehiometrijski ekvivalent
ESI-MS elektrosprej jonizaciona masena spektrometrija
Et etil
Fmoc 9-fluorenilmetiloksikarbonil
Glu-C endoproteinaza Glu-C
h čas
HATU O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat HPLC tečna hromatografija visokih performansi
ivDde 4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)-3-metilbutil
LC tečna hromatografija
4
LTQ linearna kvadrupolna zamka
Lys-C endoproteinaza Lys-C
LLOQ donja granica kvantifikacije
Mal 3-maleimido propil
Me metil
MeOH metanol
min minuti
Mmt monometoksitritil
MS maseni spektar / masena spektrometrija
m/z odnos mase i naelektrisanja
OtBu terc-butiloksi
PEG poli(polietilen glikol)
pH potenca vodonika
PK farmakokinetika
Pr propil
PTH paratireoidni hormon
PyBOP benzotriazol-1-il-oksitripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat Q-TOF kvadrupol-vreme preleta jona
RP-HPLC reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi rt sobna temperatura
SIM praćenje pojedinačnih jona
SEC ekskluziona hromatografija
sc subkutano
t1/2poluživot
TCP tritil hlorid polistirol
TES trietilsilan
TFA trifluorosirćetna kiselina
THF tetrahidrofuran
Tmob 2,4,6-trimetoksibenzil
Trt trifenilmetil, tritil
ULOQ gornja granica kvantifikacije
UPLC tečna hromatografija veoma visokih performansi
UV ultraljubičasto
ZQ jednostruki kvadrupol

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje PTH, naznačena time, što nakon subkutane primene kod primata koji nije čovek, farmakokinetički profil jedinjenja PTH ispoljava odnos najviše i najniže koncentracije u plazmi manji od 4 unutar jednog intervala injektovanja u stabilnom stanju, pri čemu je vremenski period između dve uzastopne primene 24 časa i gde jedinjenje PTH ima formulu (IIf-i):
    u kojoj neobeležena isprekidana linija označava vezivanje za azot iz -D, koji predstavlja fragment PTH, formiranjem amidne veze; i isprekidana linija obeležena zvezdicom označava vezivanje za fragment
    gde su m i p nezavisno ceo broj u opsegu od, i uključujući, 400 do 500.
  2. 2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što -D ima sekvencu SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 ili SEQ ID NO:121.
  3. 3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time, što -D ima sekvencu SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 ili SEQ ID NO:115.
  4. 4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time, što -D ima sekvencu SEQ ID NO:51.
  5. 5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time, što je -D vezan za jedinjenje PTH formule (IIf-i) preko N-terminalne aminske funkcionalne grupe fragmenta PTH.
  6. 6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time, što se subkutana primena odvija putem subkutane injekcije.
  7. 7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time, što se subkutana primena odvija pomoću uređaja injekcioni pen.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time, što je odnos najviše i najniže koncentracije manji od 3.
  9. 9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time, što je odnos najviše i najniže koncentracije manji od 2.6.
  10. 10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačena time, što je odnos najviše i najniže koncentracije manji od 2.4.
  11. 11. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačena time, što je odnos najviše i najniže koncentracije manji od 2.2.
  12. 12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time, što je odnos najviše i najniže koncentracije manji od 2.
  13. 13. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačena time, što je primat koji nije čovek makaki majmun.
  14. 14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, naznačena time, što farmaceutska kompozicija ima pH u opsegu od, i uključujući, pH 3 do pH 8.
  15. 15. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, naznačena time, što farmaceutska kompozicija ima pH u opsegu od, i uključujući, pH 4 do pH 5. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20230344A 2016-09-29 2017-09-28 Jedinjenja pth sa niskim odnosima najviše i najniže koncentracije RS64177B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16191454 2016-09-29
EP17155846 2017-02-13
PCT/EP2017/074594 WO2018060312A1 (en) 2016-09-29 2017-09-28 Pth compounds with low peak-to-trough ratios
EP17781427.4A EP3518961B1 (en) 2016-09-29 2017-09-28 Pth compounds with low peak-to-trough ratios

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64177B1 true RS64177B1 (sr) 2023-05-31

Family

ID=60051489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230344A RS64177B1 (sr) 2016-09-29 2017-09-28 Jedinjenja pth sa niskim odnosima najviše i najniže koncentracije

Country Status (26)

Country Link
US (4) US11759504B2 (sr)
EP (2) EP4218795A3 (sr)
JP (2) JP7085535B2 (sr)
KR (2) KR102611820B1 (sr)
CN (2) CN109789188B (sr)
AU (1) AU2017336251B2 (sr)
BR (1) BR112019005793A2 (sr)
CA (1) CA3037447A1 (sr)
DK (1) DK3518961T5 (sr)
ES (1) ES2943720T3 (sr)
FI (1) FI3518961T3 (sr)
HR (1) HRP20230383T1 (sr)
HU (1) HUE062009T2 (sr)
IL (2) IL265601B2 (sr)
LT (1) LT3518961T (sr)
MA (1) MA46345A (sr)
MX (1) MX2019003182A (sr)
NZ (1) NZ751745A (sr)
PL (1) PL3518961T3 (sr)
RS (1) RS64177B1 (sr)
RU (1) RU2766959C2 (sr)
SG (1) SG11201901558VA (sr)
SI (1) SI3518961T1 (sr)
SM (1) SMT202300124T1 (sr)
WO (1) WO2018060312A1 (sr)
ZA (1) ZA201901813B (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
MY208384A (en) * 2016-03-01 2025-05-05 Ascendis Pharma Bone Diseases As Pth prodrugs
US12453778B2 (en) * 2016-09-29 2025-10-28 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Incremental dose finding in controlled-release PTH compounds
KR102627405B1 (ko) 2016-09-29 2024-01-18 아센디스 파마 본 디지즈 에이/에스 조절 방출 pth 화합물을 위한 투여 용법
HRP20230383T1 (hr) 2016-09-29 2023-07-07 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Pth spojevi s malim omjerima maksimalne prema minimalnoj koncentraciji
US11975050B2 (en) * 2018-03-16 2024-05-07 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone polypeptide conjugates and methods of their use
CN112334152A (zh) * 2018-05-18 2021-02-05 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 Pth缀合物的起始剂量
MY209748A (en) 2019-02-11 2025-07-31 Ascendis Pharma Bone Diseases As Liquid pharmaceutical formulations of pth conjugates
MX2022007371A (es) 2020-01-13 2022-07-12 Ascendis Pharma Bone Diseases As Tratamiento del hipoparatiroidismo.
CN116847870A (zh) * 2020-09-28 2023-10-03 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 甲状旁腺功能减退症患者身体及心理健康的改善
WO2022064035A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Improvement of physical and mental well-being of patients with hypoparathyroidism
IL311539A (en) 2021-09-22 2024-05-01 Ascendis Pharma Bone Diseases As Long-acting pth compound treatments
KR20250075704A (ko) 2022-09-30 2025-05-28 익스텐드 바이오사이언시즈, 인크. 장기-지속형 부갑상선 호르몬
JP2025537527A (ja) * 2022-11-02 2025-11-18 アセンディス ファーマ ボーン ディジージズ エー／エス ２つのｐｔｈ化合物を含むｐｔｈ治療レジメン

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744444A (en) 1989-10-27 1998-04-28 Haemopep Pharma Gmbh HPTH-fragment-(1-37), the preparation thereof, medicaments containing same and the use thereof
US5567439A (en) 1994-06-14 1996-10-22 Fuisz Technologies Ltd. Delivery of controlled-release systems(s)
ZA9811127B (en) 1997-12-09 2000-07-11 Lilly Co Eli Stabilized teriparatide solutions.
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
US20050124537A1 (en) 2000-04-27 2005-06-09 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
EP1477496A4 (en) 2002-02-01 2006-08-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PEG-CONJUGATED PTH BZW. PEG-CONJUGATED PTH DERIVATIVE
US6559293B1 (en) 2002-02-15 2003-05-06 Transform Pharmaceuticals, Inc. Topiramate sodium trihydrate
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US7332164B2 (en) 2003-03-21 2008-02-19 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Heterobifunctional polymeric bioconjugates
PL1620118T3 (pl) 2003-04-08 2014-11-28 Yeda Res & Dev Leki odwracalnie pegylowane
US7690003B2 (en) 2003-08-29 2010-03-30 Fuller Jeffrey C System and method for increasing data throughput using thread scheduling
BR122019021416A2 (sr) 2003-09-19 2019-12-21
CA2940803A1 (en) 2004-03-23 2005-10-27 Ascendis Pharma Gmbh Prodrug linker
CA2567056A1 (en) 2004-05-10 2005-12-08 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of parathyroid hormone
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
CN1597697A (zh) 2004-07-19 2005-03-23 中国药科大学 一种人的甲状旁腺素1－34肽相关肽－Pro－Pro－[Arg11]]hPTH(1－34)－Pro－Pro
US20060069021A1 (en) * 2004-08-13 2006-03-30 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for intranasal administration of inactive analogs of PTH or inactivated preparations of PTH or PTH analogs
WO2006059237A1 (en) 2004-08-30 2006-06-08 Lunamed, Inc. 4-phenylbutyric acid controlled-release formulations for therapeutic use
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
CN1298386C (zh) 2005-08-31 2007-02-07 上海交通大学 甲状旁腺激素缓释微球的制备方法
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
AU2007225056A1 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Alza Corporation Apparatus and method for transdermal delivery of parathyroid hormone agents to prevent or treat osteopenia
MX2009002859A (es) 2006-09-15 2009-03-30 Enzon Pharmaceuticals Inc Enlazadores biodegradables a base de ester impedido para suministro de oligonucleotidos.
BRPI0719885B8 (pt) * 2006-10-13 2021-05-25 Lilly Co Eli peptídeos peguilados como moduladores de receptores de pth, seus usos, e composição.
US8101729B2 (en) 2007-03-19 2012-01-24 Henry Joseph Niemczyk Pegylated amino acid derivatives and the process to synthesize the same
CA2930681C (en) 2007-04-09 2019-10-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Fusion protein of collagen-binding domain and parathyroid hormone
CN101063125A (zh) 2007-04-17 2007-10-31 江南大学 人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品
SI2173890T1 (sl) 2007-06-21 2011-06-30 Univ Muenchen Tech Biološko aktivni proteini, ki imajo povečano in vivo in/ali in vitro stabilnost
JP2010533202A (ja) 2007-07-11 2010-10-21 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 多置換芳香族部分を含むポリマー性薬剤送達システム
EP2052736A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Nycomed Danmark ApS Parathyroid hormone formulations und uses thereof
AU2009209565B2 (en) 2008-02-01 2013-09-19 Ascendis Pharma As Prodrug comprising a self-cleavable linker
MX344559B (es) 2008-04-29 2016-12-20 Ascendis Pharma As Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante unidos al peg.
WO2009143412A2 (en) 2008-05-23 2009-11-26 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric systems containing intracellular releasable disulfide linker for the delivery of oligonucleotides
WO2009156481A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Ascendis Pharma As Pegylated bnp
US20110195900A1 (en) 2008-08-19 2011-08-11 Ferring B.V. Peptidic pth receptor agonists
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
CA2769162C (en) 2009-07-31 2017-12-05 Ascendis Pharma As Biodegradable polyethylene glycol based water-insoluble hydrogels
WO2011012722A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ascendis Pharma As Prodrugs containing an aromatic amine connected by an amido bond to a linker
US9138462B2 (en) 2009-07-31 2015-09-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
WO2011012721A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Ascendis Pharma As Carrier linked pramipexole prodrugs
NZ597964A (en) * 2009-07-31 2014-04-30 Sanofi Aventis Deutschland Long acting insulin composition
WO2011012723A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Ascendis Pharma As Injectable sustained release compositions comprising a pramipexole prodrug
ITMI20091512A1 (it) 2009-08-28 2011-02-28 Al Ma C Packaging S R L Procedimento per il confezionamento di gruppi di contenitori per prodotti liquidi alimentari, in particolare bottiglie di acqua e/o bevande, e fardello ottenibile per mezzo di tale procedimento
EP2485767A1 (en) 2009-10-06 2012-08-15 Ascendis Pharma A/S Carrier linked paliperidone prodrugs
MX337432B (es) 2009-12-15 2016-03-04 Ascendis Pharma As Composicion de la hormona del crecimiento seca enlazada transitoriamente a un portador del polimero.
EP2519228A4 (en) 2009-12-31 2013-06-19 Enzon Pharmaceuticals Inc POLYMER CONJUGATES FROM AN AROMATIC AMINE WITH COMPOUNDS WITH A CLEANER UREA CONTAINER
WO2011089215A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
US9062094B2 (en) * 2010-01-22 2015-06-23 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aliphatic amine-containing drugs
US9561285B2 (en) * 2010-01-22 2017-02-07 Ascendis Pharma As Carrier-linked carbamate prodrug linkers
US20110229580A1 (en) 2010-03-22 2011-09-22 Indian Institute of Technology Bombay, School of Biosciences and Bioengineering Compositions and methods for nano-in-micro particles
ES2993140T3 (en) 2010-04-02 2024-12-23 Amunix Pharmaceuticals Inc Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
ES2584381T3 (es) 2010-05-05 2016-09-27 Prolynx Llc Liberación controlada de compuestos activos desde conjugados macromoleculares
EP2566334B1 (en) 2010-05-05 2018-04-18 Prolynx, LLC Controlled drug release from solid supports
MX358161B (es) 2010-05-13 2018-08-06 The General Hospital Corp Star Analogos de hormona paratiroidea y usos para los mismos.
US9221882B2 (en) 2010-05-21 2015-12-29 Technische Universitat Munchen Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses
US8865220B2 (en) * 2010-06-14 2014-10-21 Kaohsiung Medical University Method for controlled release of parathyroid hormone from encapsulated poly(lactic-glycolic)acid microspheres
CN102959585B (zh) 2010-06-30 2016-03-30 日本电气方案创新株式会社 属性确定方法、属性确定装置及属性确定系统
US20120040320A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Nadeau Daniel A Injection Simulation Device and Methods Thereof
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
HK1198358A1 (en) * 2011-08-12 2015-04-10 Ascendis Pharma A/S Sustained release composition of prostacyclin
CA2843506C (en) * 2011-08-12 2020-05-12 Ascendis Pharma A/S Carrier-linked prodrugs having reversible carboxylic ester linkages
EP2741778A1 (en) 2011-08-12 2014-06-18 Ascendis Pharma A/S Polymeric hyperbranched carrier-linked prodrugs
AU2012296951B2 (en) * 2011-08-12 2016-09-15 Ascendis Pharma A/S Protein carrier-linked prodrugs
MX349950B (es) 2011-08-12 2017-08-22 Ascendis Pharma As Profarmacos de treprostinil enlazados a un portador.
WO2013036857A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 Prolynx Llc Sulfone linkers
CA2849192C (en) * 2011-10-12 2019-09-24 Ascendis Pharma Ophthalmology Division A/S Prevention and treatment of ocular conditions
US8883862B2 (en) 2012-01-12 2014-11-11 Kaohsiung Medical University Method for controlled release of parathyroid hormone from cross-linked hyaluronic acid hydrogel
CA2868925C (en) 2012-04-25 2020-01-21 Ascendis Pharma A/S Prodrugs of hydroxyl-comprising drugs
US9457096B2 (en) 2012-07-06 2016-10-04 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Concet) Protozoan variant-specific surface proteins (VSP) as carriers for oral drug delivery
EP2890708B1 (en) 2012-08-28 2019-08-07 The Governors of the University of Alberta Parathyroid hormone, insulin, and related peptides conjugated to bone targeting moieties and methods of making and using thereof
MY186106A (en) * 2012-10-11 2021-06-22 Ascendis Pharma As Diagnosis, prevention and treatment of diseases of the joint
WO2014056923A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Ascendis Pharma Ophthalmology Division A/S Vegf neutralizing prodrugs for the treatment of ocular conditions
CA2883833C (en) * 2012-10-11 2020-10-27 Ascendis Pharma A/S Hydrogel prodrugs
WO2014060512A1 (en) 2012-10-17 2014-04-24 Novo Nordisk Health Care Ag Fatty acid acylated amino acids for growth hormone delivery
EP2928501B1 (en) * 2012-12-07 2020-05-06 Ascendis Pharma A/S Carrier-linked prostanoid prodrugs
GB201303771D0 (en) 2013-03-04 2013-04-17 Midatech Ltd Nanoparticles peptide compositions
AU2014257745B2 (en) 2013-04-22 2018-10-04 Ascendis Pharma A/S Hydrogel-linked prodrugs releasing modified drugs
US20150065423A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Perosphere, Inc. Rapid acting injectable formulations
EP3054981B1 (en) * 2013-10-08 2020-07-29 Ascendis Pharma A/S Protecting group comprising a purification tag
EP2868326A1 (en) 2013-11-04 2015-05-06 Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) Peptide inhibitors of TEAD/YAP-TAZ interaction
US11633487B2 (en) * 2014-08-06 2023-04-25 Ascendis Pharma A/S Prodrugs comprising an aminoalkyl glycine linker
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
EP3242689A1 (en) 2015-01-09 2017-11-15 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
MY208384A (en) 2016-03-01 2025-05-05 Ascendis Pharma Bone Diseases As Pth prodrugs
US12453778B2 (en) 2016-09-29 2025-10-28 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Incremental dose finding in controlled-release PTH compounds
US11564974B2 (en) 2016-09-29 2023-01-31 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Combination therapy with controlled-release CNP agonists
HRP20230383T1 (hr) 2016-09-29 2023-07-07 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Pth spojevi s malim omjerima maksimalne prema minimalnoj koncentraciji
KR102627405B1 (ko) 2016-09-29 2024-01-18 아센디스 파마 본 디지즈 에이/에스 조절 방출 pth 화합물을 위한 투여 용법
TW201832783A (zh) 2016-12-02 2018-09-16 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／胰高血糖素雙重激動劑、連接子和透明質酸的接合物
CN112334152A (zh) 2018-05-18 2021-02-05 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 Pth缀合物的起始剂量
MY209748A (en) 2019-02-11 2025-07-31 Ascendis Pharma Bone Diseases As Liquid pharmaceutical formulations of pth conjugates
MX2022007371A (es) 2020-01-13 2022-07-12 Ascendis Pharma Bone Diseases As Tratamiento del hipoparatiroidismo.

Also Published As

Publication number Publication date
DK3518961T5 (da) 2024-09-02
MA46345A (fr) 2019-08-07
KR20190062497A (ko) 2019-06-05
IL319949A (en) 2025-05-01
ES2943720T3 (es) 2023-06-15
DK3518961T3 (da) 2023-04-24
KR102611820B1 (ko) 2023-12-07
AU2017336251B2 (en) 2024-02-22
WO2018060312A1 (en) 2018-04-05
KR20230170810A (ko) 2023-12-19
US11857603B2 (en) 2024-01-02
US20190282668A1 (en) 2019-09-19
FI3518961T3 (fi) 2023-05-03
HUE062009T2 (hu) 2023-09-28
NZ792622A (en) 2025-08-29
CN109789188B (zh) 2023-07-14
JP2022116302A (ja) 2022-08-09
AU2017336251A1 (en) 2019-03-21
JP2019535649A (ja) 2019-12-12
BR112019005793A2 (pt) 2019-06-18
EP4218795A2 (en) 2023-08-02
MX2019003182A (es) 2019-08-05
SMT202300124T1 (it) 2023-05-12
NZ751745A (en) 2023-05-26
US11759504B2 (en) 2023-09-19
ZA201901813B (en) 2019-12-18
CA3037447A1 (en) 2018-04-05
US20230218722A1 (en) 2023-07-13
LT3518961T (lt) 2023-05-10
US20200360488A1 (en) 2020-11-19
IL265601A (en) 2019-05-30
IL265601B2 (en) 2025-09-01
HRP20230383T1 (hr) 2023-07-07
CN117257922A (zh) 2023-12-22
RU2019112919A3 (sr) 2021-01-19
IL265601B1 (en) 2025-05-01
SG11201901558VA (en) 2019-03-28
EP3518961B1 (en) 2023-02-22
US20240173385A1 (en) 2024-05-30
EP4218795A3 (en) 2023-08-30
JP7085535B2 (ja) 2022-06-16
PL3518961T3 (pl) 2023-08-14
CN109789188A (zh) 2019-05-21
JP7434419B2 (ja) 2024-02-20
EP3518961A1 (en) 2019-08-07
RU2019112919A (ru) 2020-10-30
SI3518961T1 (sl) 2023-07-31
RU2766959C2 (ru) 2022-03-16
KR102938857B1 (ko) 2026-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7434419B2 (ja) ピーク対トラフ比が小さいｐｔｈ化合物
JP7646888B2 (ja) 制御放出ｐｔｈ化合物の投薬レジメン
EP3518982B1 (en) Controlled-release pth compounds
HK40098351A (en) Pth compounds with low peak-to-trough ratios
RU2777357C2 (ru) Режим дозирования соединения pth контролируемого высвобождения
HK40099006A (en) Dosage regimen for a controlled-release pth compound
HK40011765B (en) Pth compounds with low peak-to-trough ratios
HK40011765A (en) Pth compounds with low peak-to-trough ratios
HK40011847A (en) Controlled-release pth compounds
HK40011847B (en) Controlled-release pth compounds
HK40007965B (en) Pth compounds with low peak-to-trough ratios
HK40011848B (en) Dosage regimen for a controlled-release pth compound
HK40011848A (en) Dosage regimen for a controlled-release pth compound