RS64273B1

RS64273B1 - Lečenje mitohondrijalnih bolesti

Info

Publication number: RS64273B1
Application number: RS20230259A
Authority: RS
Inventors: Seves Ramon Martí; Vioque Emiliano González; Bermejo Cora Blázquez; Torronteras Javier Torres; Pérez Raquel Cabrera; Navarro Yolanda Cámara
Original assignee: Fundacio Hospital Univ Vall Dhebron Institut De Recerca; Centro De Investig Biomedica En Red Ciber
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2023-07-31
Also published as: WO2016193421A1; JP2023123444A; US11998551B2; RU2745611C2; CN107820430A; FI3302499T3; US11337980B2; PL3302499T3; IL289747A; IL289747B2; JP2021121594A; CA2991271C; HUE062134T2; ES2944551T3; JP6885544B2; BR112017025839A2; AU2021282462B2; AU2016273340A1; IL320960A; DK3302499T3

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima od 1 do 6 i odnosi se na oblast medicine, posebno na lečenje mitohondrijalnih bolesti, a posebno na one mitohondrijalne bolesti uzrokovane brisanjem/ošteć enjem mitohondrijalne DNK (mtDNK).

STANJE TEHNIKE

[0002] Mitohondrijski genom (mtDNK) je 16,5 kb DNK molekul koji je normalno prisutan u vi še kopija u pojedinačnim mitohondrijama.

[0003] Važna grupa mendelskih mitohondrijalnih bolesti uzrokovana je mutacijama u nuklearnim genima čiji su proizvodi uključeni u replikaciju ili održavanje mtDNK. Ovi retki poremeć aji su takođe poznati kao defekti intergenomske komunikacije, bolesti deplecije mtDNK, bolesti vi šestrukih delecija mtDNK ili bolesti deplecije i delecija mitohondrija (MDDS). Ovi entiteti imaju specifi čne šifre ostataka: ORPHA35698 za sindrom iscrpljivanja mitohondrijalne DNK i ORPHA254807 za sindrom višestruke delecije mitohondrijske DNK, a takođe su prepoznati u bazi podataka OMIM pod PS603041 za depleciju mitohondrijske DNK i http://www.omim.org/phenotypicSeries/PS157640 za višestruka brisanja mitohondrijalne DNK. Ove bolesti su složena grupa genetski i klinički heterogenih bolesti koje karakteriše prisustvo mtDNK aberacija u jednom ili kombinaciji zahvać enih tkiva (npr. skeletni mi ši ć i, jetra, mozak).

[0004] Ozbiljnost i progresija ovih poremeć aja je takođe veoma varijabilna, u rasponu od blagih manifestacija (npr. progresivna spoljašnja oftalmoplegija) do teških fenotipova koji mogu dovesti do smrti tokom detinjstva ili ranog detinjstva, kao što je primeć eno kod klasičnih sindroma iscrpljivanja mtDNK.

[0005] Već ina gena koji su do sada bili povezani sa defektima u intergenomskoj komunikaciji su ili direktno uključeni u replikaciju mtDNK ili su uključeni u metabolizam deoksiribonukleozid trifosfata (dNTP), gradivnih blokova sinteze DNK. Međutim, sve već i broj mutacija koje dovode do MDDS-a se identifikuje u genima koji uzrokuju nestabilnost mtDNK patomehanizmom koji je jo š nepoznat (OPA1, MPV17, FBXL4, itd.). Klasično se smatralo da defekti u određenim genima specifično dovode do iscrpljivanja ili višestrukih delecija mtDNK. Na primer, DGUOK defekti obično dovode do iscrpljivanja mtDNK, dok OPA1 defekti obično izazivaju višestruka brisanja mtDNK. Bez obzira na to, sve je više dokaza da se iscrpljivanje mtDNK i višestruka brisanja mogu smatrati manifestacijama istih patogenih puteva koji utiču na replikaciju i oporavak mtDNK. Utvrđeno je da mutacije u genima koje su do nedavno bile povezane samo sa deplecijom mtDNK sa infantilnim početkom (TK2, DGUOK), dodatno uzrokuju višestruka brisanja mtDNK, sa početkom u odraslom dobu u nekim slučajevima.

[0006] Pošto su MDDS poremeć aji sa više organa, potreban je multidisciplinarni tim, uključuju ć i različite specijaliste, koji bi pružio podršku i simptomatski tretman za povezane komplikacije.

[0007] Do sada nisu razvijene efikasne terapije za lečenje ovih tako složenih bolesti. To je u osnovi zbog nedostatka informacija o tačnim faktorima i mehanizmima koji uzrokuju takve bolesti, varijabilnosti između jednog i drugog sindroma, itd.

[0008] Uprkos napred navedenom, učinjeni su neki pokušaji da se pronađu odgovarajuć e terapije za MDDS uzrokovane defektima u metabolizmu dNTP gde je poznato da je dostupnost dNTP ugro žena. Na primer, nedavne eksperimentalne studije su pokazale da se zaobilaženjem defektnog koraka u biosintezi deoksiribonukleotida, iscrpljivanje mtDNK može prevazić i. Konkretno, objavljeno je da dodavanje purinskih dN monofosfata (dNMP) može spasiti iscrpljivanje mtDNK kod TK2-KO miševa [1]. Štaviše, Camara I. et al. [2] su objavili da upotreba deoksiribonukleozida i/ili specifi čnih inhibitora njihovog katabolizma može biti efikasan farmakološki pristup za lečenje različitih MDDS-a zbog defekata u homeostazi dNTP.

[0009] Uprkos uloženim naporima, još uvek postoji potreba za terapijskim pristupima za ove i druge MODS varijante.

SUŠTINA PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazači su otkrili da primena deoksiribonukleozida omoguć ava obnavljanje nivoa mtDNK kod MDDS bolesti koje nisu uzrokovane defektom u metabolizmu dNTP, i stoga pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksicitidin i deoksitimidin za upotrebu u lečenju sindroma iscrpljivanja i/ili delecije mitohondrijalne DNK, pri čemu je sindrom posledica defekta u proteinu podjedinice DNK polimeraze gama-1 (POLG1).

[0011] Do sada je postojala opšta misao da primena nukleozida može biti efikasna samo u lečenju mitohondrijalnih bolesti uzrokovanih defektom u metabolizmu dNTP. U stvari, stanje tehnike je pretpostavilo da se bolest uzrokovana defektom u metabolizmu dNTP može prevazić i primenom „defektnog“ nukleozida [2]. Stoga se do sada očekivalo da ć e samo bolesti izazvane defektom u određenom nukleotidu mogu tretirati davanjem dovoljne količine "defektnog" nukleotida/nukleozida.

[0012] Suprotno učenjima iz prethodnog stanja tehnike, sadašnji pronalazači su dali dezoksiribonukleozide uzorcima fibroblasta kod pacijenata kojima je prethodno dijagnostikovan MDDS koji nose određene mutacije koje utiču na katalitičku podjedinicu polimeraze gama proteina 1 (jedan od enzima uključenih u mašinu za replikaciju mtDNK). Iznenađujuć e je otkriveno da je primena deoksiribonukleozida u te uzorke vratila nivoe mtDNK na "normalne" (zdrave) nivoe (videti tabelu 3, ispod) nezavisno od mutacije koju nosi pacijent. Bilo je nepredvidivo da se abnormalna funkcija enzima POLG1 (koja na kraju negativno utiče na pravilan rad sistema za replikaciju), uzrokovana različitim mutacijama, može prevazić i davanjem deoksiribonukleozida za sve tri ć elije izvedene od pacijenata u istom stepenu. Indikativno je da je oporavak nivoa mtDNK primenom deoksiribonukleozida nezavisan od mutacije odgovorne za defekt sistema za replikaciju mtDNK.

[0013] Eksperimentalni podaci su dobijeni u ć elijama dobijenim od pacijenata koji pate od razli čitih kliničkih manifestacija usled nedostatka POLG.

[0014] POLG je gen koji kodira katalitičku podjedinicu mitohondrijalne DNK polimeraze, nazvanu DNK gama polimeraza. U eukariotskim ć elijama, mitohondrijalna DNK se replicira pomo ć u DNK gama polimeraze, trimernog proteinskog kompleksa koji se sastoji od katalitičke podjedinice od 140 kDa koju kodira POLG gen i dimerne dodatne podjedinice od 55 kDa kodirane genom POLG2. Kataliti čka podjedinica sadrži tri enzimske aktivnosti, aktivnost DNK polimeraze, aktivnost egzonukleaze 3’-5’ kojakontroli še pogrešno ugrađene nukleotide i aktivnost 5’-dRP liaze potrebnu za oporavak ekscizije baze. U primerima navedenim u nastavku, pacijenti su patili od nedostatka POLG usled mutacija u domenu egzonukleaze ili polimeraze (R309C (u domenu egzonukleaze), i G848S i V1177L (u domenu polimeraze)) i u regionu linkera (W748S).

[0015] Sadašnji pronalazači su iznenađujuć e otkrili da primena dezoksiribonukleozida „radi“ za sve testirane POLG mutante i da, nezavisno od toga da li mutacija uti če na funkciju ili strukturu POLG, postoji značajno poboljšanje u enzimskoj aktivnosti mutiranog POLG oblika, u tolikoj meri da se nivoi mtDNK obnavljaju i budu u istom redosledu kao i oni koje pokazuje zdrav subjekt. Odnosno, primena dezoksiribonukleozida hiperstimuliše enzimski oblik POLG kome je, pre navedene primene, delimično nedostajala aktivnost polimeraze.

[0016] Eksperimentalni podaci dati u nastavku (sumirani u tabeli 3 ispod) dozvoljavaju zaklju čak da primena deoksiribonukleozida može biti dovoljna da ubrza brzinu polimerizacije mtDNK nezavisno od mutacije u POLG genu. Ali takođe, ovi nalazi takođe sugerišu da bilo koja druga MDDS bolest, za koju je poznato da se karakteriše smanjenjem mtDNK (bilo smanjenjem broja kopija mtDNK ili vi šestrukim brisanjem mtDNK), a koja je posledica mutacija u proteinima bilo usled replikacije same ma šine (POLG1, POLG2, koji kodira pomoć nu jedinicu polimeraze gama; PEO1, MGME1 i DNK2, između ostalog) ili indirektno uključeni u replikaciju mtDNK (kao što je MPV17), takođe se mogu efikasno lečiti hiperstimulacijom aktivnosti POLG enzima kroz davanje deoksiribonukleozida: poveć anjem aktivnosti POLG dolazi do značajnog poveć anja nivoa mtDNK, koji može "neutralisati" gubitak mtDNK, nezavisno od uzroka takvog gubitka (posebne mutacije u određenom proteinu), i vratiti "normalan" nivo.

[0017] Prema tome, terapijska strategija zasnovana na dNs bi tako mogla delimično ili u potpunosti da se suprotstavi iscrpljivanju mtDNK u bilo kom defektu gde je replikacija mtDNK izazvana bilo delimi čno ili potpuno aktivnom aktivnošć u polimeraze.

[0018] Iz eksperimenta prikazanog u nastavku takođe se može zaključiti da oporavak nivoa mitohondrijalne DNK može biti nezavisan od težine bolesti pacijenta, što pronalasku daje veliku terapeutsku vrednost.

[0019] Dalje prednosti povezane sa primenom deoksiribonukleozida u lečenju MDDS predmeta ovog pronalaska su cena (jeftina je) i da ne postoje posebni zahtevi za njihovu konzervaciju. Pored toga, kanonski dezoksiribonukleozidi su prirodna jedinjenja koja su normalno prisutna u svim živim organizmima.

KRATAK OPIS SLIKA

[0020]

SLIKA 1: amino kiselina POLG1 proteina prema NCBI bazi podataka. Istaknute su sledeć e mutacije: na poziciji 309 -> Arginin od strane cisteina, na poziciji 748 -> Triptofan po serinu, na poziciji 848 -> Glicin po serinu, na poziciji 1143 -> glutaminska kiselina prema glicinu, na poziciji 1177 -> valin od leucina.

SLIKA 2: Prikaz metaboličkih puteva uključenih u sindrome iscrpljivanja i delecije mtDNK (MDDS). Proteini čija je disfunkcija povezana sa MDDS označeni su brojem 1 (uključeni u dNTP metabolizam), sa brojem 2 (koji pripada sistemu za replikaciju) ili brojem 3 (povezan sa MDDS-om preko nepoznatog patomehanizma). Iako je dokumentovana povezanost SUCLA2 i SUCLG1 sa nukleotid difosfat kinazom, njihova veza sa metabolizmom dNTP nije jasno dokazana. Drugi proteini uključeni u metabolizam dNTP, ali koji još nisu bili povezani sa MDDS-om i specifičnim inhibitorima deoksiribonukleozidnih kataboličkih enzima su takođe prikazani: tetrahidrouridin (THU); 5-hloro-6-[1-(2-iminopirolidinil) metil] uracil hidrohlorid (TPI), imunocilin H (IH) i eritro-9-(2-hidroksi-3-nonil) adenin (EHNA). Skrać enice: ABAT: 4-aminobutirat aminotransferaza; ADA: adenozin deaminaza; ANT1: Translokator adenin nukleotida 1; CDA: citidin deaminaza; cdN: citosolna deoksiribonukleotidaza; dAdo: deoksiadenozin; dCK: deoksicitidin kinaza; dCTD: dCMP deaminaza; dCtd: deoksicitidin; dGK: deoksiguanozin kinaza; dGuo: deoksiguanozin; dlno: deoksiinozin; DNK2: helikaza replikacije DNK 2; dThd: timidin; dUrd: deoksiuridin; ENT1: ekvilibrativni nukleozidni transporter 1; FBKSL4: F-kutija i ponovljeni protein 4 bogat leucinom; mdN: mitohondrijalna deoksiribonukleotidaza; MFN2: Mitofusin-2; MGME1: egzonukleaza 1 za održavanje mitohondrijalnog genoma; MPV17: mitohondrijalna unutra šnja membrana MPV17; NDPK: nukleotid difosfat kinaza; NMPK: nukleotid monofosfat kinaza; OPA1: optička atrofija 1; PNP: purin nukleozid fosforilaza; POLG1: polimeraza gama podjedinica 1; POLG2: polimeraza gama podjedinica 2; RNR: ribonukleotid reduktaza; SAMHD1: SAM domen i protein 1 koji sadr ži HD domen; SUCLA2: β-podjedinica, sukcinat-CoA ligaza; SUCLG1: α-podjedinica, sukcinat-CoA ligaza; TK1: timidin kinaza 1; TK2: timidin kinaza 2; TP: timidin fosforilaza; TS: timidilat sintaza; Twinkle: mitohondrijska Twinkle helikaza.

SLIKA 3: Sledi šema eksperimentalnog dizajna za određivanje nivoa mtDNK u ć elijama prikupljenim u naznačeno vreme (t0, t7, t14, t21 i t26). Stabilnost dNs je prać ena u ć elijskom medijumu nakon 2-3 dana kulture (t16-t17).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Ovaj pronalazak je zasnovan na otkrić u da se oporavak nivoa mtDNK može posti ć i kada se dezoksiribonukleozidi daju pacijentima koji pate od MDDS-a uzrokovanog defektom koji nije defekt u metabolizmu dNTP. Nukleozidi su glikozilamini koji se mogu smatrati nukleotidima bez fosfatne grupe. Nukleozid se sastoji jednostavno od nukleobaze (koja se takođe naziva azotna baza) i šeć era sa 5 ugljenika (bilo riboze ili dezoksiriboze), dok se nukleotid sastoji od nukleobaze, šeć era sa pet ugljenika i jedne ili više fosfatnih grupa. U nukleozidu, baza je vezana za ribozu ili deoksiribozu preko beta-glikozidne veze. Primeri nukleozida uključuju citidin, uridin, adenozin, gvanozin, timidin i inozin.

[0022] Kao što je napred objašnjeno, MDDS bolesti su grupa bolesti uzrokovanih defektima u replikaciji mitohondrijalne DNK (mtDNK) i obuhvataju poremeć aje koje karakteri še smanjenje broja kopija mtDNK (sindrom iscrpljivanja mtDNK) ili višestruka brisanja mtDNK (sindrom brisanja mtDNK). Oni su dobro prepoznati entiteti u ostatku i u onlajn katalogu Mendelovog nasleđa u čoveku, koji su referentni sajtovi za stručnjake u ovoj vrsti patologija.

[0023] Ova grupa mitohondrijalnih bolesti čini dobro poznatu grupu poremeć aja uzrokovanih mutacijama u definisanoj grupi gena, i tako je dobro poznata stručnjacima za mitohondrijalne poremeć aje. U nekim slučajevima, naziv pod kojim je poznata ova grupa bolesti može biti promenljiv: sindromi deplecije i delecije mtDNK [3,4]; defekti intergenomske komunikacije (ili signalizacije) [5]; defekti replikacije mtDNK[6]; itd. Dva ili više ovih naziva ponekad koegzistiraju u istoj publikaciji.

[0024] Bolesti uzrokovane defektima u replikaciji mtDNK mogu biti uzrokovane mutacijama u:

A- Geni koji kodiraju proteine koji pripadaju sistemu za replikaciju mtDNK (ozna čeni brojem "2" na Slici 2)[7,8,9,10,11]

B- Geni koji kodiraju proteine koji učestvuju u katabolizmu ili anabolizmu nukleozida/nukleotida (označeni brojem "1" na Slici 2)[12,13,14,15]

C- Geni koji kodiraju proteine sa nepoznatom funkcijom, ili čija funkcija ne pripada kategorijama A ili B i ne mogu biti biohemijski povezani sa procesom replikacije mtDNK (obele žene brojem "3" na Slici 2).[16,17,18,19]. ,20,21,22,23,24]

[0025] Ova klasifikacija je eksplicitno priznata od strane stručnjaka u ovoj oblasti [3,4,6,25,26,27].

[0026] dNTP-ovi su potrebni na replikacionoj vilici kao supstrati za sintezu DNK. Ć elije sisara dobijaju prekursore za sintezu i popravku DNK iz dva različita metabolička izvora, citosolna de novo sinteza i putevi oporavka, poslednji zasnovani na dva paralelna skupa enzima smeštenih u citoplazmi i mitohondrijskom matriksu. Sinteza dNTP-a je povezana sa replikacijom nuklearne DNK, u trenutku kada su potrebe ć elija za prekursorima DNK najveć e. Skup dNTPs se značajno smanjuje kada se završi faza replikacije (S faza) ili u ć elijama koje se ne dele. De novo sinteza je zasnovana na citosolnoj aktivnosti ribonukleotid reduktaze (RNR) (sa izuzetkom dTMP-a za koji je nedavno identifikovana mitohondrijalna timidilat sintaza. RNR katalizuje alosterički uravnoteženu redukciju sva četiri ribonukleozid difosfata do odgovarajuć eg nukleosidedoksiribo), obezbeđujuć i ć eliji visoke koncentracije dNTP-a tokom S faze ć elijskog ciklusa. RNR je heterotetramer koji sadrži dve kopije velike podjedinice (R1) i dve male podjedinice (R2 ili p53R2). Dok R2 prolazi kroz proteazome-zavisna degradacija u kasnoj mitozi, p53R2 je prisutan tokom ć elijskog ciklusa i njegova ekspresija ostaje stabilna i u ć elijama koje se ne dele. Za razliku od replikacije nuklearnog genoma, sinteza mtDNK se odvija nezavisno od ć elijske deobe. Iako je citosolna de novo sinteza koju podržava p53R2 mnogo niža u poređenju sa onom koju obezbeđuje R2 tokom S faze, dokazano je da biti od suštinskog značaja za održavanje mtDNK jer mutacije na genu p53R2 dovode do iscrpljivanja mtDNK.

[0027] Put sinteze spasavanja se zasniva na sekvencijalnoj fosforijaciji nukleozida prekursora u dNMP, dNDP i konačno dNTP. Prvi korak koji ograničava brzinu na ovom putu je nepovratno katalizovan deoksinukleozid kinazama. Timidin kinaza 1 (TK1) i deoksicitidin kinaza (dCK) deluju u citosolu, dok se timidin kinaza 2 (TK2) i deoksiguanozin kinaza (dGK) lokalizuju unutar mitohondrija. Mutacije na mitohondrijalnim kinazama koje učestvuju u putu spasavanja, uzrokuju tešku MDDS koja pokazuje mitohondrijalnu zavisnost od spasavanja dNTP-a za održavanje i popravku DNK. Dodatne nukleotidne kinaze dovršavaju fosforilaciju sva četiri dNMP-a do konačnih odgovarajuć ih dNTP-a potrebnih za sintezu DNK. Citosol i mitohondrijski matriks su nezavisni odeljci, ali oni aktivno komuniciraju, dvosmerno razmenjujuć i komponente bazena kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu preko nosača koji su do danas slabo okarakterisani. Kao posledica ovog unakrsnog razgovora, veruje se da se promene u veli činama bazena dNTP-a dešavaju paralelno u oba odeljka. Zbog toga mitohondrije postaju ranjivije na defekte na sopstvenom spasenom snabdevanju dNTP u postmitotskim ć elijama, gde je citosolni bazen u velikoj meri smanjen.

[0028] Veličina dNTP bazena zavisi od ravnoteže između anaboličkih puteva kako su opisani napred, brzine inkorporacije u DNK i kataboličkih procesa odgovornih za degradaciju dNTP.

[0029] dNTP-ovi su potrebni na replikacionoj vilici kao supstrati koji se inkorporiraju u DNK pomoć u mitohondrijalne gama polimeraze (POLG). Iako se trenutno vodi debata o ta čnom načinu replikacije mtDNK, osnovni mitohondrijski replizom, formiran od gama polimeraze (sastavljen od kataliti čke podjedinice kodirane POLG1 i dve pomoć ne podjedinice kodirane POLG2), Twinkle helikaze i jednolančanog vezivanja (SSB) protein je rekonstituisan in vitro[28]. Potrebne su dodatne nepotpuno okarakterisane aktivnosti za potpunu in vivo replikaciju molekula mtDNK (npr. primaza, topoizomeraza) i za iniciranje i regulaciju procesa kao odgovor na različite stimuluse i stres. Neki primeri su MGME1 i DNK2 geni koji kodiraju proteine koji učestvuju na nekom nivou u procesu replikacije (sazrevanje 7S RNK, aktivnost helikaze) i čije su mutacije nedavno povezane sa MDDS.

[0030] Veruje se da se lečenje sindroma postiže poveć anjem aktivnosti gama polimeraze.

[0031] Deoksiribonukleozidi su kanonski deoksiribonukleozidi. Povoljno, sa takvim deoksiribonukleo-sa strane, početak efekta se može postić i ranije jer nije potrebna dodatna obrada metabolita. Pored toga, pošto su kanonski deoksiribonukleozidi u suštini identični endogenim deoksiribonukleozidima, može doć i do smanjenja rizika od neželjenih efekata povezanih sa lečenjem ove bolesti.

[0032] U pronalasku, sindrom je posledica defekta u mašini za replikaciju mitohondrijalne DNK.

[0033] U pronalasku, defekt je posledica jedne ili više mutacija u jednom ili više proteina mitohondrijalnog sistema za replikaciju DNK, gde je protein podjedinica DNK gama polimeraze-1 (POLG1).

[0034] Gama polimeraza je heterotrimer koji se sastoji od jedne katalitičke podjedinice (kodirane POLG1) i dve pomoć ne podjedinice koje deluju kao faktori procesivnosti i modulatori vezivanja DNK (kodirani pomoć u POLG2). Njegov pristupni broj u NCBI bazi podataka je NP_001119603.1 (takođe obezbeđen kao SIIKA 1 i SEK ID BR: 1).

[0035] Poremeć aji povezani sa POLG-om predstavljaju kontinuitet širokih i preklapaju ć ih fenotipova koji se pojavljuju od ranog detinjstva do kasnog odraslog doba. Klinički fenotipovi poremeć aja povezanih sa POLG-om uključuju autozomno recesivnu i dominantnu PEO kod odraslih, miokloničnu epilepsiju, miopatiju, sindrom senzorne ataksije (MEMSA), spektar ataksije-neuropatije uklju čujuć i mitohondrijalnu recesivnu ataksiju i sindrom senzorne neuropaksije (MIRAS), dizartrije, sindroma oftalmoplegije (SANDO) i hepatocerebralnog MDS (Alpers-Hutenloherov sindrom). Nedavno su identifikovane POLG mutacije kod osoba sa kliničkim karakteristikama MNGIE, ali bez leukoencefalopatije.

[0036] Incidencija Alpers-Huttenlocher sindroma je procenjena na ~1:50,000. To je najte ži fenotip povezan sa POLG mutacijama i karakteriše ga progresivna encefalopatija sa teškom epilepsijom i psihomotornim teškoćama, neuropatijom i insuficijencijom jetre. Pogođene osobe obično se javljaju između 2 i 4 godine sa napadima (fokalni, generalizovani, mioklonični, epilepsia partialis continua ili epileptični status), glavobolje koje su tipično povezane sa vizuelnim senzacijama ili vizuelnom aurom, hipotonijom i psihomotornom regresijom. Rano u toku bolesti prisutne su arefleksija i hipotonija, a kasnije ih prati spastična parapareza koja evoluira mesecima do godinama, što dovodi do psihomotorne regresije. Pogođene osobe razvijaju disfunkciju jetre sa povišenim transaminazama, hipoalbuminemijom, koagulopatijom, hipoglikemijom i hiperamonemijom. Zahvać enost jetre mo že brzo napredovati do završne faze otkazivanja jetre u roku od nekoliko meseci. CSF protein je generalno povi šen. Neuroimaging može pokazati gliozu i generalizovanu atrofiju mozga. Histologija jetre može pokazati makro- i mikrovezikularnu steatozu, centrilobularnu nekrozu, fibrozu, cirozu, proliferaciju žučnih kanala i proliferaciju mitohondrija. Sadržaj mtDNK je smanjen u jetri. Progresija bolesti je promenljiva, sa očekivanim životnim vekom od pojave simptoma u rasponu od 3 meseca do 12 godina.

[0037] U jednom aspektu, sindrom iscrpljivanja i/ili delecije mitohondrijalne DNK je uzrokovan defektom na putu replikacije mitohondrija, pri čemu je navedeni defekt posledica jedne ili više od sledeć ih mutacija u POLG1 proteinu: mutacija na poziciji 309 arginina cisteinom [29], mutacijom na poziciji 748 ostatka triptofana pomoć u serina (rs113994097), mutacijom na poziciji 848 glicina pomo ć u serina (rs113994098), mutacijom na poziciji 1143 glutaminske kiseline pomoć u glicina (rs174), i a mutacija na poziciji 1177 valin od leucina.

[0038] Alternativno, takođe su otkriveni tretmani gde je defekt posledica jedne ili vi še mutacija u jednom ili više proteina izabran iz grupe koju čine: ANT1, MPV17, SUCLA2, FBXL4, ABAT, SUCLG1, MFN2 i OPA1. U drugom aspektu prvog aspekta defekt je posledica jedne ili vi še mutacija u proteinu izabranom iz grupe koju čine: OPA1, SUCLA2 i SUCLG1.

[0039] U pronalasku, jedan ili više deoksiribonukleozida su kanonski deoksiribonukleozidi, posebno: deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksicitidin i deoksitimidin. U pronalasku, kompozicija sadr ži četiri kanonska deoksiribonukleozida i ne sadrži nijedan dalji nukleozid (što znači da kompozicija jedinstveno sadrži kao „dezoksiribonukleozidnu komponentu“ ova četiri deoksiribonukleozida, ali može uključivati ekscipijente, nosače, itd.) U pronalasku, kompozicija se sastoji od deoksiadenozina, deoksitimidina, deoksicitidina i deoksiguanozina. U pronalasku, kompozicija sadrži deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksicitidin i deoksiguanozin i ne sadrži nijedan dalji nukleozid (što znači da kompozicija jedinstveno sadrži kao "nukleozidnu komponentu" ova četiri nukleozida, ali može uključivati ekscipijente, nosače, itd.).

[0040] Stručnjak u ovoj oblasti je u stanju da odredi količinu svakog od dezoksiribonukleozida za obnavljanje nivoa mtDNK (tj., terapeutski efikasnu količinu za ublažavanje znakova i simptoma mitohondrijalnih poremeć aja). U drugom izvođenju, kada kompozicija sadrži više od jednog kanonskog deoksiribonukleozida, nukleozidi su prisutni u ekvimolarnom odnosu.

[0041] U jednom aspektu, kompozicija sadrži kombinaciju koja se sastoji od deoksiadenozina (dAdo), deoksicitidina (dCtd), deoksiguanozina (dGuo) i deoksitimidina (obi čno nazvan timidin, dThd), koji su svi nukleozidi u ekvimolarnom odnosu.

[0042] U drugom aspektu kompozicija dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih inhibitora degradacije nukleozida.

[0043] Postoje dobro poznati inhibitori degradacije nukleozida u stanju tehnike. Ilustrativni neograničavajuć i primeri su: inmucilin H ili forodesin, kao inhibitori degradacije dGuo, tetrahidrouridin kao inhibitor degradacije dCtd, 5-hloro-6-[1-(2-iminopirolidinil) metil] uracil hidrohlorid (TPI) kao inhibitor dThd degradacije, i eritro-9-(2-hidroksi-3-nonil)adenin (EHNA) kao inhibitor degradacije dAdo. SLIKA 1 pokazuje način delovanja ovih inhibitora.

[0044] Stručnjak u ovoj oblasti je u stanju da odredi količinu inhibitora(a) koja je potrebna da se garantuje biodostupnost nukleozida(a) za obnavljanje nivoa mtDNK.

[0045] U jednom aspektu kompozicija dalje sadrži jedan farmaceutski prihvatljiv inhibitor degradacije nukleozida. U sledeć oj varijanti, farmaceutski prihvatljiv inhibitor je inhibitor razgradnje deoksiadenozina. U drugom izvođenju inhibitor je eritro-9-(2-hidroksi-3-nonil)adenin (EHNA).

[0046] Aktivne komponente opisane za upotrebu ovde mogu biti formulisane sa farmaceutski pogodnim ekscipijentima ili nosačima, odabranim da učine takve kompozicije pogodnim za primenu oralno, rektalno, parenteralno (npr. intravenozno, intramuskularno, intraarterijsko, intraperitonealno i sli čno), ili inhalacionim putevima, osmotskom pumpom, lokalno, oftalmološki i slično.

[0039] Masti su polučvrsti preparati koji se sastoje od aktivnog sastojka ugrađenog u masnu, voštanu ili sintetičku bazu.

[0048] Primeri poželjnih krema uključuju, ali nisu ograničeni na, emulzije voda u ulju i ulje u vodi. Vodene kreme u ulju mogu se formulisati korišć enjem odgovaraju ć eg emulgatora sa sličnim svojstvima , ali bez ograničenja, masnim alkoholima kao što su cetil alkohol ili cetostearil alkohol i emulgujuć i vosak. Uljane kreme u vodi mogu se formulisati korišć enjem emulgatora kao što je cetomakrogol emulguju ć i vosak. Pogodna svojstva uključuju sposobnost modifikacije viskoziteta emulzije i fizičku i hemijsku stabilnost u širokom opsegu pH. Baza kreme rastvorljive u vodi ili koja se meša može sadržati sistem konzervansa i takođe može biti puferovana da bi se održao prihvatljiv fiziološki pH.

[0049] Pored napred opisanog topikalnog metoda primene, postoje različiti postupci sistemske administracije jedinjenja iz ovog pronalaska. Jedno takvo sredstvo bi uklju čivalo aerosolnu suspenziju čestica koje se mogu udisati i koje se sastoje od aktivnog jedinjenja, koje subjekt udi še. Aktivno jedinjenje bi se apsorbovalo u krvotok preko pluć a i kontaktiralo bi sistemsku cirkulaciju u farmaceutski efikasnoj količini. Čestice koje se mogu udahnuti mogu biti tečne ili čvrste, sa veličinom čestica dovoljno malim da prođu kroz usta i larinks nakon udisanja.

[0050] Drugi način sistemske administracije aktivnih jedinjenja subjektu bi uklju čivao davanje tečne/tečne suspenzije u obliku nazalnih kapi tečne formulacije, ili nazalnog spreja sa česticama koje se mogu udahnuti koje subjekt udiše. Tečna farmaceutska kompozicija aktivnog jedinjenja za proizvodnju nazalnog spreja ili kapi za nos može se pripremiti kombinovanjem aktivnog jedinjenja sa pogodnim nosačem, kao što je sterilna voda bez pirogena ili sterilni fiziološki rastvor tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0051] Drugi načini sistemske primene aktivnog jedinjenja bi uključivali oralnu primenu, u kojoj su farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja Formule I, u obliku čvrste supstance, rastvora, emulzije, disperzije, micele, lipozoma, i slično, pri čemu rezultujuć a formulacija sadrži aktivna jedinjenja predviđena za upotrebu kako je opisano ovde, u mešavini sa organskim ili neorganskim nosačem ili ekscipijensom pogodnim za nazalnu, enteralnu ili parenteralnu primenu. Aktivni sastojci se mogu kombinovati, na primer, sa uobičajenim netoksičnim, farmaceutskim fizički ili fiziološki prihvatljivim nosačem za tablete, pelete, kapsule, pastile, vodene ili uljane suspenzije, disperzibilne pra škove ili granule, supozitorije, rastvore, emulzije, suspenzije, tvrde ili meke kapsule, kapsule ili sirupe ili eliksire i bilo koje druge pogodne upotrebe. Nosači koji se mogu koristiti uključuju gumeni bagrem, želatin, manitol, skrobnu pastu, magnezijum trisilikat, talk, kukuruzni skrob, keratin, koloidni silicijum dioksid, krompirov skrob, ureu, trigliceride srednje dužine lanca, dekstrane i druge nosače pogodne za upotrebu u proizvodnji, preparate u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku. Pored toga, mogu se koristiti pomoć na sredstva, sredstva za stabilizaciju, zgušnjavanje i bojenje. Aktivna jedinjenja koja se ovde razmatraju za upotrebu su uključena u farmaceutsku formulaciju u količini koja je dovoljna da proizvede željeni efekat nakon primene (tj., terapeutski efikasna količina).

[0052] Prašak, rastvor, suspenzija ili tableta sadrži aktivno jedinjenje u fiziološki kompatibilnom nosaču, kao što stručnjaci u oblasti razvoja sistema za oralnu upotrebu mogu da izaberu kori šć enjem konvencionalnih kriterijuma. Na primer, takve formulacije mogu sadr žati jedan ili više agenasa odabranih od agensa za ukus (kao što je pepermint, ulje zimzelena ili trešnje), sredstava za bojenje, konzervansa i slično, da bi se obezbedili farmaceutski elegantni i ukusni preparati. Tablete koje sadr že aktivne sastojke u mešavini sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima mogu se takođe proizvoditi poznatim metodama. Korišć eni ekscipijenti mogu biti, na primer, (1) inertni razblaživači, kao što su kalcijum karbonat, laktoza, kalcijum fosfat, natrijum fosfat i slično; (2) sredstva za granulaciju i dezintegraciju, kao što su kukuruzni skrob, krompirov skrob, alginska kiselina i slično; (3) vezivna sredstva, kao što su tragakant gume, kukuruzni skrob, želatin, bagrem i slično; i (4) sredstva za podmazivanje, kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina, talk i slično. Tablete mogu biti neobložene ili mogu biti obložene poznatim tehnikama da se odloži dezintegracija i apsorpcija u gastrointestinalnom traktu, čime se obezbeđuje produženo dejstvo tokom dužeg perioda. Na primer, može se koristiti materijal za produženo dejstvo kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat.

[0053] Kada su formulacije za oralnu upotrebu u obliku tvrdih želatinskih kapsula, aktivni sastojci se mogu mešati sa inertnim čvrstim razblaživačem, na primer, kalcijum karbonatom, kalcijum fosfatom, kaolinom ili slično. Oni takođe mogu biti u obliku mekih želatinskih kapsula u kojima su aktivni sastojci pomešani sa vodom ili uljanim medijumom, na primer, uljem od kikirikija, tečnim parafinom, maslinovim uljem i slično.

[0054] Dodatni načini sistemske administracije aktivnog jedinjenja subjektu bi uključivali oblik supozitorija aktivnog jedinjenja, tako da terapeutski efikasna koli čina jedinjenja dospe u sistemsku cirkulaciju.

[0055] U zavisnosti od rastvorljivosti određene formulacije aktivnog jedinjenja koja se primenjuje, dnevna doza za ublažavanje znakova i simptoma mitohondrijalnih poremeć aja može se podeliti na jednu ili više administracija jediničnih doza.

[0056] U celom opisu i patentnim zahtevima reč "sadrži" i varijacije reči nemaju za cilj da isključe druge tehničke karakteristike, aditive, komponente ili korake. Dalje, reč „sastoji“ obuhvata slučaj „sastoji se od“. Dodatni ciljevi, prednosti i karakteristike pronalaska ć e postati očigledni stručnjacima u ovoj oblasti nakon ispitivanja opisa ili ć e se mo ć i uvideti primenom pronalaska. Slede ć i primeri su dati kao ilustracija i oni nemaju za cilj da ograničavaju ovaj pronalazak. Štaviše, ovaj pronalazak pokriva sve moguć e kombinacije posebnih i poželjnih izvođenja opisanih ovde.

PRIMERI 1.

Metode

Pacijenti

[0057]Ć elije izvedene od tri pacijenta koji pate od nedostatka POLG-a su uklju čene u studiji. Svi subjekti su dali informirani pristanak u skladu sa našim institucionalnim propisima za pregled i Helsinškom deklaracijom. Mutacije u POLG-u (RefSeq NP_001119603.1) su identifikovane kod sva 3 pacijenta pomoć u Sengerovog sekvenciranja. Ukupna DNK je izolovana iz fibroblasta pomoć u QiaAMP Mini (Qiagen) i fragmenata od približno 500 bp uključujuć i mesto mutacije od značaja su amplifikovana konvencionalnim PCR sa sledeć im parovima prajmera koji su navedeni u nastavku i rTaq (Takara):

Koriš ć eni prajmeri su:

Prajmeri 1 (R309C, 925 c->t)

Prosleđeni prajmer GTCCACACCACCAAGCAGT (SEK ID BR: 2)

Reverzni prajmer GGTCCCAAGCACTATGCTCC (SEK ID NO: 3)

Prajmeri 2 (V748S c. 2243G->C)

Prosleđeni prajmer CCTTGCTGAATGCAGGTGCT (SEK ID BR: 4)

Reverzni prajmer TGTGCCTGAAATCACACTCTGT (SEK ID BR: 5)

Prajmeri 3 (G848S c. 2542G->A)

Prosleđeni prajmer ATGGTCTGCTGAGTGGTTGT (SEK ID BR: 6)

Reverzni prajmer CCCTCAGAGCCCAGTTTCTAC (SEK ID BR: 7)

Prajmer 3 (E1143G c.3428A->G)

Prosleđeni prajmer CCCAGTTTATGACCAGCCGT (SEK ID BR: 8)

Reverzni prajmer CAAGGAACGCTCACCCAAAG (SEK ID BR: 9)

Prajmeri 4 (V1177L c.3529G->C)

Prosleđeni prajmer AGGGGAAGCCCTGCTCTAAG (SEK ID NO: 10)

Reverzni prajmer ACAAATGTGTTGTGCTCACCC (SEK ID NO: 11)

[0058] Reakcije sekvenciranja su sprovedene sa istim prajmerima i BigDye v3.1 kompletom za sekvenciranje (Life Technologies), prečišć enim BigDye X-Terminator kompletom za prečiš ć avanje (Life Technologies) i sekvencioniranim u ABI 3130 sekvenceru (Applied Biosystems). Pacijent 1 (homozigot za mutaciju p.R309C) je patio od teškog neurološkog fenotipa (neuropatija, encefalopatija, sličan MNGIE) koji je doveo do smrti u dobi od 20 godina; Pacijent 2 (složen heterozigot za mutacije p.W748S i p.G848S) je pretrpeo manje ozbiljan fenotip, ali i pretežno neurološki (neuropatija, psihijatrijski simptomi, slični MNGIE); Pacijent 3 (heterozigot za dve dominantne promene aminokiselina u cis p.V1177L i p.E1143G) je pokazao poznati obrazac dominantnog nasleđivanja PEO (progresivna spoljašnja oftalmoplegija), psihijatrijskih simptoma i slabosti proksimalnih mišić a. Skeletni miši ć i sva tri pacijenta su pokazali akumulaciju delecija mtDNK, ali bez značajnog iscrpljivanja.

Ć elijska kultura

[0059] Primarno kultivisani fibroblasti su dobijeni iz biopsija kože pacijenata 1-3 i 4 zdravih donora. Svi subjekti su dali informirani pristanak u skladu sa našim institucionalnim propisima za pregled i Helsinškom deklaracijom.

[0060] Ć elije su zasejane u ploče sa 6 bunarči ć a od 9,5 cm<2>u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) sa 4,5 g/L glukoze, sa dodatkom 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina i streptomicina, i 10 % fetalnog rastvora. Goveđi serum (FBS) (Invitrogen) u vlažnom inkubatoru na 37°C i 5 % CO2. Nakon što je postignuta čvrsta konfluencija, FBS je smanjen na 0,1 % da bi se izazvalo mirovanje i započet je istovremeni tretman sa 5 ng/ml EtBr (etidijum bromid, Merck) (dan 0, t0). Ć elijski medijum je zamenjen istim tretmanom svaka 2-3 dana tokom dve nedelje. Dana 14 (t14) EtBr je povu čen iz ć elijskog medijuma i započet je tretman skupa svih ć elija sa 200 µM sva četiri deoksinukleozida (dNs): dAdo (deoksiadenozin, Sigma), dCtd (deoksicitidin, Sigma), dGuo (deoksiguanozin, Sigma), dThd (deoksitimidin, Sigma) i 5 µM EHNA (Sigma). Skup ć elija je ostavljen neobrađen i svi parametri su pra ć eni paralelno. Ć elijski medijum je zamenjen istim tretmanom svaka 2-3 dana tokom dodatnih 12 dana. Dana 16. ili 17. medijumi su sakupljeni i čuvani na -20°C do dalje upotrebe. Za analizu DNK, ć elije su sakupljene 0, 7, 14, 21 i 26 dana tripsinizacijom, isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom, peletirane i čuvane na -20 °C do izolacije DNK (Slika 2). Ukupna DNK je izolovana korišć enjem QiaAMP DNK mini kompleta (Qiagen).

Procena stabilnosti deoksinukleozida u medijumu ć elijske kulture

[0061] dNs i neki srodni metaboliti su mereni tečnom hromatografijom u sprezi sa povezanom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS), korišć enjem Acquity UPLC-MS/MS aparata (Acquity UPLC-XevoTM TQ Mass Spectrometer, Waters, Milford, MA), kao što je prethodno opisano [2]. Ć elijski medijum je deproteinizovan ultrafiltracijom (3 kDa Amicon Ultra filters, Millipore) na 14,000 x g i 4°C tokom 30 minuta pre ubrizgavanja u LC-MS/MS sistem.

mtDNK ispitivanja

Broj kopija mtDNK je procenjen kvantitativnim PCR kao što je prethodno opisano [2].

Delecije mtDNK su istraživane PCR blotiranjem dugog dometa u skladu sa PCR uslovima i prajmerima otkrivenim u Nishigaki et al.[30]

Prosleđeni prajmer (F1142-1516):

ACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTATACTTCAAAGG (SEK ID BR: 12)

Reverzni prajmer (R1180-1146):

ACCGCCAGGTCCTTTGAGTTTTAAGCTGTGGCTCG (SEK ID BR: 13)

2. REZULTATI

Izlaganje EtBr izaziva već e iscrpljivanje mtDNK u mirnim fibroblastima sa nedostatkom POLG-a

[0062] Važno ograničenje pri testiranju potencijalnih tretmana za iscrpljivanje mtDNK je činjenica da u mnogim slučajevima ć elije izvedene od MDDS pacijenata ne pokazuju nikakve abnormalnosti mtDNK u ć elijskoj kulturi. Iz tog razloga, razvijeni su različiti modeli kako bi se demonstrirali molekularni defekti koji utiču na replikaciju mtDNK. Izlaganje EtBr je više puta korišć eno u stanju tehnike da bi se došlo do iscrpljivanja mtDNK u kultivisanim ć elijama i da se analizira njihova sposobnost replikacije da povrate normalne nivoe mtDNK (Pontarin et al. „Podjedinica ribonukleotidne reduktaze sisara p53R2 je potrebna za mitohondrijalnu replikaciju DNK oporavka DNK u ć elijama u mirovanju", 2012, PNAS, v. 109(33), strane 13302-13307). Smanjenje mtDNK izazvano je i kod zdravih kontrola i kod mirnih ć elija sa nedostatkom POLG-a 14-dnevnim izlaganjem 5 ng/ml EtBr. Uočeno je značajno smanjenje mtDNK u svim ć elijama. Međutim, sveć elije sa nedostatkom POLG iskusile su ve ć i stepen iscrpljivanja mtDNK u poređenju sa onim uočenim u linijama fibroblasta dobijenim od zdravih kontrola (prosečan procenat rezidualnih nivoa mtDNK ± SE : 17,5 ± 2,3%; u kontrolnim ć elijama: 39,68 ± 6,6% ). Ovi podaci sugerišu da bi molekularni defekt izazvan POLG mutacijama mogao pogoršati interferenciju EtBr u procesu replikacije.

Fibroblasti sa nedostatkom POLG-a u potpunosti oporavljaju nivoe mtDNK nakon iscrpljivanja izazvanog EtBr kada se leče kombinacijom dNs plus EHNA

[0063] Nakon povlačenja EtBr, proučavan je efekat koji bi dopunio medijum ć elijske kulture sa sva četiri dN koja su imala na oporavak nivoa mtDNK. Ranije je objavljeno da je dAdo bio posebno osetljiv na ekstracelularnu i intracelularnu enzimsku degradaciju, uglavnom pomoć u ADA (adenozin deaminaze) [2]. Tako je medijum dopunjen ekvimolarnom koncentracijom sva četiri kanonska dN (200 mM dGuo, dAdo, dThd i dCtd) plus 5 µM EHNA (Sigma) da bi se izvršila delimična inhibicija dAdo katabolizma i poboljšala njegova stabilnost. U danima 16-17 merena je koncentracija dodatih dN-a i nekih njihovih izvedenih metabolita u kondicioniranom medijumu u trajanju od 2-3 dana, po istom protokolu kao i onaj koji je otkriven u Camara Y. et al., 2014[2]. Uprkos delimičnoj degradaciji, koncentracija svih dN je u svim slučajevima ostala iznad 70 % prvobitno dodate (Tabela 2). Nisu primeć ene značajne razlike u stabilnosti dNs između kondicioniranih medijuma iz kontrolnih ć elija ili ć elija dobijenih od pacijenta.

Tabela 2: Koncentracija jedinjenja u medijumu nakon 2-3 dana tretmana

[0064] Oporavak mtDNK je prać en pre i posle povlačenja EtBr, bilo u prisustvu ili odsustvu suplementacije dNs (prateć i isti protokol kao onaj od Camara Y. et al., 2014[2]). Broj kopija mtDNK iz kontrolnih ć elija dostigao je vrednosti iznad 100 % početnih nivoa 12 dana nakon povlačenja EtBr bez obzira na tretman dNs (prosečan procenat rezidualnih nivoa mtDNK ± SE: 129,8 ± 35,2 % bez tretmana; 153,9 ± 40,6 % sa tretmanom). Suprotno tome, ć elije sa nedostatkom POLG-a nisu bile u stanju da povrate normalne nivoe mtDNK (26,6 ± 1,5 %) osim ako im se ne dodaju dNs.

Tabela 3: Nivoi mtDNK u mirnim fibroblastima u različitim vremenskim tačkama tokom eksperimenta.

[0065] Rezultati prikazani u tabeli 3 dozvoljavaju zaključak da primena kanonskih nukleozida omoguć ava postizanje nivoa mtDNK kod pacijenata sa MDDS uporedivim sa onima pronađenim kod zdravih subjekata (150,3 ± 21,9%, tabela 3). Stoga, ovi podaci su indikativni da primena nukleozida mo že da povrati nivoe mtDNK kod pacijenata koji pate od MDDS-a uzrokovanog defektom koji nije u metaboli čkom defektu dNTP, sve do nivoa povezanih sa "zdravim" stanjem, što ukazuje na terapeutski potencijal kombinacija u lečenju ove vrste bolesti.

REFERENCE NAVEDENE U PRIJAVI

[0066]

1. Garone C, Garcia-Diaz B, Emmanuele V, Lopez LC, Tadesse S, et al. (2014) Deoksipirimidin monofosfat bajpas terapija za nedostatak timidin kinaze 2. EMBO Mol Med 6: 1016-1027.

2. Camara Y, Gonzalez-Vioque E, Scarpelli M, Torres-Torronteras J, Caballero A, et al. (2014) Administracija deoksiribonukleozida ili inhibicija njihovog katabolizma kao farmakolo ški pristup za sindrom iscrpljivanja mitohondrijalne DNK. Hum Mol Genet 23: 2459-2467.

3. Camara Y, Gonzalez-Vioque E, Scarpelli M, Torres-Torronteras J, Marti R (2013) Hranjenje deoksiribonukleozidnog puta spasavanja za opstanak mitohondrijalne DNK. Drug Discov Today 18: 950-957.

4. Suomalainen A, Isohanni P (2010) Sindromi iscrpljivanja mitohondrijalne DNK--mnogih gena, zajednički mehanizmi. Neuromuscul Disord 20: 429-437.

5. Spinazzola A, Zeviani M (2005) Poremeć aji nuklearno-mitohondrijske intergenomske signalizacije. Gene 354: 162-168.

6. Copeland WC (2012) Defekti u replikaciji mitohondrijalne DNK i bolesti ljudi. Crit Rev Biochem Mol Biol 47: 64-74.

7. Naviaux RK, Nihan VL, Barshop BA, Poulton J, Markusic D, et al. (1999) Mitohondrijalna DNK gama polimeraza nedostatak i iscrpljivanje mtDNK kod deteta sa Alpersovim sindromom. Ann Neurol 45: 54-58.

8. Hakonen AH, Isohanni P, Paetau A, Herva R, Suomalainen A, et al. (2007) Recesivne Twinkle mutacije u encefalopatiji ranog početka sa iscrpljivanjem mtDNK. Brain 130: 3032-3040.

9. Kornblum C, Nicholls TJ, Haack TB, Scholer S, Peeva V, et al. (2013) Mutacije gubitka funkcije u MGME1 narušavaju replikaciju mtDNK i uzrokuju multisistemsku mitohondrijalnu bolest. Nat Genet.

10. Ronchi D, Di Fonzo A, Lin W, Bordoni A, Liu C, et al. (2013) Mutacije u DNK2 povezuju progresivnu miopatiju sa nestabilnošć u mitohondrijalne DNK. Am J Hum Genet.

11. Longley MJ, Clark S, Yu Wai Man C, Hudson G, Durham SE, et al. (2006) Mutant POLG2 gama podjedinice DNK polimeraze koja uzrokuje progresivnu spoljašnju oftalmoplegiju. Am J Hum Genet 78: 1026-1034.

12. Mandel H, Szargel R, Labai V, Elpeleg O, Saada A, et al. (2001) Gen deoksiguanozin kinaze je mutiran kod osoba sa osiromašenom hepatocerebralnom mitohondrijalnom DNK. Nat Genet 29: 337-341.

13. Saada A, Shaag A, Mandel H, Nevo I, Eriksson S, et al. (2001) Mutantna mitohondrijalna timidin kinaza u miopatiji iscrpljivanja mitohondrijske DNK. Nat Genet 29: 342-344.

14. Bourdon A, Minai L, Serre V, Jais JP, Sarzi E, et al. (2007) Mutacija RRM2B, koja kodira ribonukleotid reduktazu kontrolisanu p53 (p53R2), uzrokuje ozbiljno iscrpljivanje mitohondrijalne DNK. Nat Genet 39: 776-780.

15. Nishino I, Spinazzola A, Hirano M (1999) Mutacije gena timidin fosforilaze u MNGIE, humanom mitohondrijskom poremeć aju. Nauka 283: 689-692.

16. Rouzier C, Bannwarth S, Chaussenot A, Chevrolier A, Verschueren A, et al. (2012) MFN2 gen je odgovoran za nestabilnost mitohondrijalne DNK i fenotip „plus” optičke atrofije. Mozak 135: 23-34.

17. Renaldo F, Amati-Bonneau P, Slama A, Romana C, Forin V, et al. (2012) MFN2, novi gen odgovoran za iscrpljivanje mitohondrijalne DNK. Mozak.

18. Ostergaard E, Schwartz M, Batbayli M, Christensen E, Hjalmarson O, et al. (2005) Nova mutacija u SUCLG1 povezana sa deplecijom mitohondrijalne DNK, encefalomiopatski oblik, sa metilmalonskom acidurijom. EurJ Pediatr 169: 201-205.

19. Amati-Bonneau P, Valentino ML, Reynier P, Gallardo ME, Bornstein B, et al. (2008) OPA1 mutacije izazivaju nestabilnost mitohondrijalne DNK i fenotipove „plus” opti čke atrofije. Brain 131: 338-351.

20. Blakely EL, Butterworth A, Hadden RD, Bodi I, He L, et al. (2012) MPV17 mutacija uzrokuje neuropatiju i leukoencefalopatiju sa višestrukim brisanjem mtDNK u mišić ima. Neuromuscul Disord 22: 587-591.

21. Spinacola A, Viscomi C, Fernandez-Vizarra E, Carrara F, D'Adamo P, et al. (2006) MPV17 kodira protein unutrašnje mitohondrijalne membrane i mutiran je u infantilnom osiroma šenju mitohondrijalne DNK jetre. Nat Genet 38: 570-575.

22. Wedding IM, Koht J, Tran GT, Misceo D, Selmer KK, et al. (2014) Spastična paraplegija tipa 7 povezana je sa višestrukim brisanjem DNK mitohondrija. PLoS One 9: e86340.

23. Bonnen PE, Yarham JW, Besse A, Wu P, Faqeih EA, et al. (2013) Mutacije u FBKSL4 uzrokuju mitohondrijalnu encefalopatiju i poremeć aj održavanja mitohondrijalne DNK. Am J Hum Genet 93: 471-481.

24. Gai X, Ghezzi D, Johnson MA, Biagosch CA, Shamseldin HE, et al. (2013) Mutacije u FBKSL4, koje kodiraju mitohondrijalni protein, uzrokuju ranu mitohondrijalnu encefalomiopatiju. Am J Hum Genet 93: 482-495.

25. Nogueira C, Almeida LS, Nesti C, Pezzini I, Videira A, et al. (2014) Sindromi povezani sa iscrpljivanjem mitohondrijalne DNK. Ital J Pediatr 40: 34.

26. Copeland WC (2008) Nasledne mitohondrijalne bolesti replikacije DNK. Annu Rev Med 59: 131-146.

27. Copeland WC (2014) Defekti replikacije mitohondrijalne DNK. J Child Neurol 29: 1216-1224. 28. Korhonen JA, Pham XH, Pellegrini M, Falkenberg M (2004) Rekonstitucija minimalnog replizoma mtDNK in vitro. Embo J 23: 2423-2429.

29. Amiot A, Tchikviladze M, Joly F, Slama A, Hatem DC, et al. (2009) Učestalost mitohondrijalnih defekata kod pacijenata sa hroničnom intestinalnom pseudo-opstrukcijom. Gastroenterology 137: 101-109.

30. Nishigaki Y, Marti R, Hirano M (2004) ND5 je žarište za višestruke atipične mitohondrijalne delecije DNK u mitohondrijalnoj neurogastrointestinalnoj encefalomiopatiji. Hum Mol Genet 13: 91-101.

Claims

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksicitidin i deoksitimidin za upotrebu u lečenju sindroma iscrpljivanja i/ili delecije mitohondrijske DNK, pri čemu je sindrom posledica defekta u proteinu podjedinice DNK gama polimeraze -1 (POLG1).

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je sindrom iscrpljivanja i delecije mitohondrijalne DNK uzrokovan defektom na putu replikacije mitohondrija, pri čemu je navedeni defekt posledica jedne ili više od sledeć ih mutacija u POLG1 proteinu: R309C, W748S, V1177L, G848S, E1143 i E1143G, na pozicijama koje se odnose na SEK ID BR:1.

3. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2, koja ne sadr ži nijedan drugi dalji nukleozid.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu kompozicija dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih inhibitora degradacije nukleozida.

5. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je farmaceutski prihvatljiv inhibitor inhibitor razgradnje deoksiadenozina.

6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je inhibitor eritro-9-(2-hidroksi-3-nonil)adenin (EHNA).