RS64455B1 - Peptidi koji vezuju bakterije, za lečenje infektivnih bolesti i povezanih inflamatornih procesa - Google Patents

Peptidi koji vezuju bakterije, za lečenje infektivnih bolesti i povezanih inflamatornih procesa

Info

Publication number
RS64455B1
RS64455B1 RS20230680A RSP20230680A RS64455B1 RS 64455 B1 RS64455 B1 RS 64455B1 RS 20230680 A RS20230680 A RS 20230680A RS P20230680 A RSP20230680 A RS P20230680A RS 64455 B1 RS64455 B1 RS 64455B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
derivative
peptides
acid sequences
Prior art date
Application number
RS20230680A
Other languages
English (en)
Inventor
Soto Francisco Lozano
Florensa Mario Martínez
Original Assignee
Sepsia Therapeutics S L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sepsia Therapeutics S L filed Critical Sepsia Therapeutics S L
Publication of RS64455B1 publication Critical patent/RS64455B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Opis pronalaska
Oblast tehnike
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast medicine, a posebno na peptide koji vezuju bakterije humanog CD6 limfocitnog receptora sličnog skevendžerima, koji su korisni u terapijskom i/ili preventivnom lečenju infektivnih bolesti i inflamatornih stanja povezanih sa njima, kao i na uređaje koji sadrže peptide.
Poznato stanje tehnike
[0002] Sepsa je stanje opasno po život, prouzrokovano odgovorom domaćina na infektivni agens, najčešće bakterijski, ali i gljivični, virusni ili parazitski. Sepsa se smatra disregulisanim sindromom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), prouzrokovan infekcijom, koji vodi prekomernom i produženom proinflamatornom stanju. Nesposobnost imunskog sistema da kontroliše takav odgovor može završiti multiorganskom disfunkcijom (MOD) i kardiovaskularnim kolapsom (septičkim šokom), a, ukoliko se ne reši, smrću (Delano MJ i Ward PA, 2016, Sepsis-induced immune dysfunction: can immune therapies reduce mortality? J Clin Invest 126:23-31). Takav disfunkcionalan inflamatorni odgovor domaćina pokreću evolutivno očuvane strukture prisutne na zidovima mikrobnih ćelija pod nazivom molekulski obrasci patogena (PAMP). PAMP-ovi su esencijalna jedinjenja za mikrobnu fiziologiju, među kojima su LPS iz Gram-negativnih (G-) bakterija, lipoteihoična kiselina (LTA) i peptidoglikan (PGN) iz Gram-pozitivnih (G+) bakterija, β-glukan i manan iz gljivica, ili jedno/dvolančane nukleinske kiseline iz virusa (Janeway CA i Medzhitov R, 2002, Innate immune recognition, Annu Rev Immunol 20:197-216).
[0003] Sepsa može biti rezultat mnogih uzroka, ali obično biva pokrenuta nedijagnostikovanim i/ili nelečenim lokalnim infekcijama (npr. upalom pluća ili peritonitisom), indukovanim bilo spontano ili kao posledica traume, operacije, opekotina ili stanja koja slabe organizam kao što su kancer ili SIDA. Sepsa obično započinje sa tremorom, groznicom, padom krvnog pritiska (septičkim šokom), ubrzanim disanjem, ubrzanom stopom rada srca i lezijama kože. U roku od nekoliko sati, sepsa može prouzrokovati spontano zgrušavanje u krvnim sudovima, ozbiljnu hipotenziju, višestruko otkazivanje organa, šok, gangrenu i na kraju smrt.
[0004] Detekcija PAMP-ova se postiže receptorima za prepoznavanje obrazaca (PRR) prisutnim na imunskim ćelijama, koji su kodirani germinativnim linijama, neklonski raspoređeni i nepolimorfni. PRR pripadaju familijama različitih strukturnim i funkcionalnim proteinskih receptora (npr. receptora nalik Toll-receptorima, skevendžerskih receptora ili lektina tipa C), i doprinose ne samo detekciji patogena, već i angažovanju i modulaciji urođenih i adaptivnih imunskih odgovora (Palm NW i Medzhitov R, 2009, Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity, Immunol Rev 227:221-33).
[0005] Superfamilija skevendžerskih receptora bogatih cisteinom (SRCR-SF) je drevna i visoko evolutivno očuvana grupa proteinskih receptora koje karakteriše prisustvo jednog ili više ponavaka globularnog domena bogatog cisteinom dužine od 90-110 aminokiselina (Sarrias MR i saradnici, 2004, The Scavenger Receptor Cysteine-Rich (SRCR) Domain: An Ancient and Highly Conserved Protein Module of the Innate Immune System, Crit Rev Immunol 24:1-38). Kod sisara, SRCR-SF članove eksprimiraju ćelije poreklom od hemopoetskih i nehemopoetskih ćelija, pri čemu ove ćelije ispoljavaju višestruke funkcionalne sposobnosti. Iako ne postoji objedinjujuća uloga za sve članove SRCR-SF, pojedini od njih funkcionišu kao PRR-ovi. Ovakva grupa uključuje makrofagne (SR-Al, MARCO, CD163 i Spα), epitelne (SCARA5, DMBT1 i S5D-SRCRB) ili limfocitne (CD5 i CD6) receptore (Martinez VG i saradnici, 2011, The conserved scavenger receptor cysteine-rich superfamily in therapy and diagnosis, Pharmacol Rev 63:967-1000).
[0006] Danas, sepsa, teška sepsa i septički šok i dalje ostaju kao neostvarena klinička potreba, sa povećanjem pojave u odnosu na predviđeno, kao i sa ogromnim socio-ekonomskim opterećenjem usled starenja stanovništva, kao i porasta invazivnih medicinskih procedura, pojave bakterija sa višestrukom rezistencijom na lekove (MDR) i povećanjem prevalencije hroničnih bolesti (Okeke EB i Uzonna JE, 2016, In Search of a Cure for Sepsis: Taming the Monster in Critical Care Medicine, J Innate Immun 8:156-70). Sveukupan mortalitet od sepse i septičkog šoka još uvek ostaje visok (35% i 60%, tim redom) uprkos značajnim naprecima u pratećoj nezi i dostupnosti potentnih antibiotika širokog spektra.
[0007] Iako antibiotici čine neophodan deo lečenja sepse, oni verovatno nisu dovoljni da bi se značajno smanjio mortalitet povezan sa MOD koji je udružen sa teškom sepsom i septičkim šokom, posebno imajući u vidu porast broja MDR bakterija. Potrebni su stoga hitni inovativni razvoji ekonomičnih bioloških tretmana i/ili medicinskih uređaja, kao i terapija koje mogu biti alternativa ili dopuna antibioticima i pratećoj nezi.
[0008] Dodatne/alternativne terapije antibioticima uključuje pristupe usmerene na domaćina čiji je cilj da se urođeni odbrambeni mehanizmi učine potentnijim i/ili da se revertuje disfunkcija imunskih ćelija udružena sa smrtnošću od sepse (Delano MJ i Ward PA, 2016, Sepsis-induced immune dysfunction: can immune therapies reduce mortality? J Clin Invest 126:23-31). Neutralizacija patogenih mikrobnih faktora endogenim imunskim konstituentima domaćina predstavlja jedan takav pristup. U tom pogledu, pojedini članovi superfamilije sekvendžerskih receptora bogatih cisteinom (SRCR-SF) interaguju sa PAMP-ovima, kako iz Gram-negativnih (sa lipopolisaharidom, LPS) tako i iz Gram-pozitivnih (sa lipoteihoičnom kiselinom, LTA; i peptidoglikanom, PGN) bakterija (Martinez VG i saradnici, 2011, The conserved scavenger receptor cysteine-rich superfamily in therapy and diagnosis. Pharmacol Rev 63:967-1000).
[0009] Prototipski član SRCR-SF koji ispoljava osobine vezivanja bakterijskih PAMP-ova je Deletiran u malignim tumorima mozga-1 (DMBT-1), takođe poznat kao Salivary aglutinin (SAG) ili gp340 (Ligtenberg AJM i saradnici, 2010, Deleted in malignant brain tumors-1 protein (DMBT1): a pattern recognition receptor with multiple binding sites, Int J Mol Sci 11:5212-33; Madsen J i saradnici, 2010, Gp-340/DMBT1 in mucosal innate immunity, Innate Immun 16:160-7). DMBT-1/SAG je solubilan glikoprotein koji sadrži 14 SRCR, jednu zonu pelucidu i dva C1r/C1s Uegf Bmp1 domena. Osobine vezivanja za bakterije DMBT-1/SAG su precizno mapirane unutar njegovih SRCR domena, na 11-mernu konsenzusnu peptidnu sekvencu (DMBT-1/SAG.pbs1, GRVEVLYRGSW), iz koje je identifikovan 9-merni motiv (VEVLxxxxW) prisutan u 13 od njih 14 (Bikker FJ i saradnici, 2004, Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteinerich domains. J Biol Chem 279:47699-703).
[0010] Ostali SRCR-SF članovi sa osobinama vezivanja za bakterije uključuju Makrofagni skevendžerski receptor klase A tipa I (Peiser L i saradnici, 2000, Macrophage class A scavenger receptor-mediated phagocytosis of Escherichia coli: role of cell heterogeneity, microbial strain, and culture conditions in vitro Infect Immun 68:1953-63), makrofagni receptor sa kolagenskom strukturom (MARCO) (Brännström A i saradnici, 2002, Arginine residues in domain V have a central role for bacteria-binding activity of macrophage scavenger receptor MARCO. Biochem Biophys Res Commun 290:1462-9), Solubini protein α (Spα) (Sarrias MR i saradnici, 2005, A role for human Sp alpha as a pattern recognition receptor, J Biol Chem 280:35391-8), CD6 (Sarrias MR i saradnici, 2007, CD6 binds to pathogen-associated molecular patterns and protects from LPS-induced septic shock, Proc Natl Acad Sci USA 104:11724-9), CD163 (Fabriek BO i saradnici, 2009, The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria, Blood 113:887-92), člana 5 Skevendžerskih receptora klase A (Jiang Y i saradnici, 2006, Identification and characterization of murine SCARAS, a novel class A scavenger receptor that is expressed by populations of epithelial cells. J Biol Chem 281:11834-45) i člana Solubilnih skevendžerskih receptora bogatih cisteinom grupe B sa 5 domena (Miró-Julià C i saradnici, 2011, Molecular and functional characterization of mouse S5D-SRCRB: a new group B member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily, J Immunol 186(4):2344-54; Bessa Pereira C i saradnici, 2016, The Scavenger Receptor SSc5D Physically Interacts with Bacteria through the SRCR-Containing N-Terminal Domain, Front Immunol 7:416), čak i ukoliko su regioni vezivanja za bakterije samo bili funkcionalno mapirani za MARCO (Brännström A i saradnici, 2002, Arginine residues in domain V have a central role for bacteria-binding activity of macrophage scavenger receptor MARCO, Biochem Biophys Res Commun 290:1462-9) i CD163 (Fabriek BO i saradnici, 2009, The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria, Blood 113:887-92).
[0011] CD6 je limfocitni površinski receptor visoko homolog CD5, još jednom limfocitnom članu SRCR-SF. Oba receptora su verovatno izvedena duplikacijom iz zajedničkog gena pretka (Lecomte O, i saradnici, 1996, Molecular linkage of the mouse CD5 and CD6 genes, Immunogenetics 44:385-90) i uglavnom ih eksprimiraju T-ćelije i podskup B1a ćelija uključen u proizvodnju prirodnih antitela. CD6 i CD5 dele sličan vanćelijski region sastavljen od tri tandemska SRCR domena i citoplazmatski rep pogodan za transdukciju signala. Zaista, CD6 i CD5 su fizički povezani sa kompleksom T-ćelijskog receptora (TCR) (Gimferrer I i saradnici, 2004, Relevance of CD6-mediated interactions in T cell activation and proliferation, J Immunol 173:2262-70), a imaju i relevantnu ulogu u regulisanju procesa razvoja i aktivacije T-ćelija (Santos RF, i saradnici, 2016, Tuning T Cell Activation: The Function of CD6 at the Immunological Synapse and in T Cell Responses, Curr Drug Targets 17:630-9; Soldevila G, i saradnici, 2011, The immunomodulatory properties of the CD5 lymphocyte receptor in health and disease, Curr Opin Immunol 23:310-8). Vezivanje rshCD6 za bakterijske PAMP-ove kao što su LPS, LTA ili PGN odvija se sa Kdafinitetetima u nM opsegu, slično afinitetu vezivanja CD14 za iste PAMP-ove (Dziarski R, i saradnici, 1998, Binding of bacterial peptidoglycan to CD14, J Biol Chem 273:8680-90; Tobias PS, i saradnici, 1995, Lipopolysaccharide binding proteinmediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD14, J Biol Chem 270:10482-8). Štaviše, rshCD6 nishodno moduliše oslobađanje proinflamatornih citokina (IL-1β, IL-6, TNF-α) koje biva pokrenuto sa LPS-om ili LTA/PGN-om (Martínez-Florensa M, i saradnici, 2014, Targeting of key pathogenic factors from gram-positive bacteria by the soluble ectodomain of the scavenger-like lymphocyte receptor CD6, J Infect Dis 209:1077-86).
[0012] Profilaktička infuzija rekombinantnog solubilnog oblika humanog CD6 (rshCD6) značajno smanjuje mortalitet i nivoe proinflamatornih citokina u serumu (IL-1β, IL-6 i TNF-α) u mišjim modelima septičkog šoka koji su indukovani sa G+ i G- bakterijskim endotoksinima (LTA+PGN i LPS-om, tim redom), celim živim bakterijama (Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii) nezavisno od njihovog MDR fenotipa (S. aureus rezistentna na meticilin, A. baumanii rezistentna na kolistin), kao i u mono- i poli-mikrobnim modelima peritonitisa (Martínez-Florensa M, i saradnici, 2017, Effects of Human and Mouse Soluble Scavenger-Like CD6 Lymphocyte Receptor in a Lethal Model of Polymicrobial Sepsis, Antimicrob Agents Chemother 61:e01391-16; Martinez-Florensa M, i saradnici, 2014. Targeting of key pathogenic factors from grampositive bacteria by the soluble ectodomain of the scavenger-like lymphocyte receptor CD6, J Infect Dis 209:1077-1086; Sarrias MR, i saradnici, 2007, CD6 binds to pathogen-associated molecular patterns and protects from LPS-induced septic shock, Proc Natl Acad Sci USA 104:11724-9).
[0013] EP 2143436 opisuje da se intraperitonealno (i.p.) davanje rshCD6 suprotstavlja letalnim efektima prouzrokovanim septičkim šokom izazvanim sa LPS-om kod miševa, kao i da CD6 ima terapijski potencijal za intervenciju u slučaju sindroma septičkog šoka i drugih inflamatornih bolesti povezanih sa infektivnim bolestima.
[0014] Ipak, proizvodnja sisarskih rekombinantnih proteina je relativno složen proces, koji bi idealno trebao da razdvoji pravilno uvijen protein i protein sa post-translacionim modifikacijama, ukoliko su prisutne. Proces obično uključuje kloniranje željenog gena u sisarski ekspresioni vektor, prenos rekombinantnog gena u sisarski ćelijski sistem (npr. CHO ćelije) i prečišćavanje proteina hromatografskim postupcima. Ovaj postupak ima određena ograničenja, kao što su niska efikasnost proizvodnje i visoki troškovi. Stoga, deluje da je poželjno da se obezbede efektivna jedinjenja i kompozicije za prevenciju i lečenje infektivnih bolesti i inflamatornih stanja koja su povezana sa ovim infektivnim bolestima, poput sepse, a koji su lakši, i stoga jeftiniji, za proizvodnju.
Kratko izlaganje suštine pronalaska
[0015] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima i odnosi se na aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od SEQ ID No.: 3, i/ili SEQ ID No.: 1, i/ili SEQ ID No.: 2, ili njihovog derivata, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
[0016] Ovde je opisan proces za pripremu aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida.
[0017] Proces se izvodi sintezom peptida na čvrstoj fazi ili sintezom peptida u rastvoru. Sinteza peptida na čvrstoj fazi uključuje sledeće korake:
a) sintezu peptida na čvrstoj fazi,
b) cepanje peptida sa polimerne podloge,
c) izborno, ciklizaciju peptida u rastvoru, i
d) eliminisanje zaštitnih grupa
ili alternativno
i) sintezu peptida na čvrstoj fazi,
ii) izborno, ciklizaciju peptida na čvrstoj fazi, i
iii) cepanje peptida sa polimerne podloge i istovremeno eliminisanje zaštitnih grupa.
[0018] Ovde je opisana kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci.
[0019] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži kompoziciju koja je kao što je ovde opisano, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima.
[0020] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži aminokiselinske sekvence koje su kao što je ovde opisano, poželjno konjugat gde je jedna ili više aminokiselinskih sekvenci konjugovana (poželjno kovalentno vezana) sa nosačem, poželjno nesolubilnim nosačem, poželjnije nesolubilnim polimerom.
[0021] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na „komplet iz delova” koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci, koje su kao što je ovde opisano, i antibiotik, poželjno Imipenem.
[0022] Predmetna prijava dalje obezbeđuje jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje su kao što je ovde opisano, farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska za upotrebu u vidu medikamenta, posebno za upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara uključujući čoveka, i to infektivne bolesti ili inflamatornog stanja povezanog sa inflamatornom bolešću ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa.
[0023] Ovde je dalje opisan uređaj za selektivno vezivanje i razdvajanje najmanje jedne komponente iz vodenog rastvora, pri čemu uređaj sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje su kao što je ovde opisano.
[0024] Dodatno, ovde je opisan postupak za uklanjanje najmanje jedne komponente iz vodenog rastvora, pri čemu navedeni postupak obuhvata:
- obezbeđivanje vodenog rastvora koji potencijalno sadrži navedenu najmanje jednu komponentu,
- propuštanje vodenog rastvora kroz uređaj predmetnog pronalaska pod uslovima koji utiču na vezivanje navedene najmanje jedne komponente za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci sadržanih u uređaju, čime se uklanja najmanje jedna komponenta iz vodenog rastvora.
Kratak opis slika
[0025]
Slika 1. Strukturne karakteristike i očuvanje aminokiselinske sekvence CD6 peptida. (A) Analizirani su aminokiselinska sekvenca, molekulska težina (M.W.) i izoelektrična tačka (pl) CD5, CD6 i DMBT-1 peptida i proteina. (B) Trodimenzionalni površinski prikazi vanćelijskog regiona humanog CD6 koji prikazuju relativne pozicije CD6 peptida studije (obojeno tamno sivim). (C) Poravnanje aminokiselinskih sekvenci peptida izvedenih iz CD6 studije, iz vrsta primata (Homo sapiens, Macaca mulatto, Nomascus Leucogenys, Pan troglodytes, Tarsius syrichta), glodara (Mus musculus, Rattus norvegicus, Oryctolagus cuniculus, Mesocricetus auratus), riba (Poeciliopsis prolifica, Salmo solar), goveda (Bos Taurus), svinja (Sus scrofa) i gmizavaca (Alligator mississippiensis). Aminokiselinski identiteti su naznačeni sivom bojom.
Slika 2. Osobine bakterijske aglutinacije peptida izvedenih iz CD6. Rastuće koncentracije (5, 50 i 200 µg/mL) naznačenih peptida izvedenih iz CD6 (PD1, PD2 i PD3), DMBT-1 (pbs1; C+) i CD5 (PD2; C-) inkubirane su tokom 2 h na sobnoj temperaturi u pločama sa 96 bunarića, U oblika dna, sa suspenzijama živih bakterijskih ćelija (75 x 10<6>CFU/mL) u TTC puferu (50 mM Tris pH 7,5, sa 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 i 1 mM Ca<2+>). Bakterijska aglutinacija je procenjivana i usaglašena od strane dva nezavisna posmatrača kao -, /-, , + ili ++. (A) Sažetak rezultata aglutinacije dobijenih sa naznačenim panelom Gram-negativnih (višestruko rezistentnog na lekove, kliničkog izolata Acinetobacter baumanii; Enterobacter cloacae ATCC 23355; Escherichia coli ATCC 25922; Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; Listeria monocytogenes ATCC 19111; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) i Grampozitivnih (Staphyloccocus aureus ATCC 25923; kliničkog izolata Staphylococus aureus (MRSA) rezistentog na meticilin) bakterijskih sojeva. (B) Reprezentativni rezultati aglutinacije dobijeni za klinički izolat MRSA.
Slika 3. Vezivanje peptida izvedenih iz CD6 i obeleženih biotinom za imobilisane PAMP-ove poreklom iz Gram- i Gram+ bakterija. Rastuće koncentracije (5-20 µg/mL) biotinom obeleženih peptida izvedenih iz CD6- (PD1, PD2, PD3 i kons), DMBT1- (pbs1) i CD5- (PD1) dodavani su u ELISA ploče sa 96 bunarića koje su bili senzitivisane sa LPS-om E. coli O111:B4 (A) ili LTA S. aureus (B) (5 µg/mL svakog u PBS-u). Nakon inkubacije preko noći na 4 °C, vezani peptidi ili proteini su razvijani dodavanjem streptavidina obeleženog peroksidazom rena (HRP) i 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinskog (TMB) supstrata, nakon čega su detektovani očitavanjima na OD 405-620 nm. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD za duplike iz jednog reprezentativnog eksperimenta, od tri izvedena. Statistička analiza je urađena dvofaktorskom ANOVA (<∗>,P<0,05;<∗∗>, P<0,01;<∗∗∗>, P<0,001).
Slika 4. Kdanaliza LPS i LTA interakcije sa peptidima i proteinima izvedenim iz CD6.
Prikazane su prividne Kdvrednosti za vezivanja peptida i proteina ispitivanja za LPS i LTA, određivane fluorescentnom emisijom triptofanskih ostataka. Peptidi/proteini (10 µg/mL) su titrirani sa ili bez povećanja koncentracija Re-LPS-a ili LTA u PBS-u. Uzorci peptida (sa i bez Re-LPS-a ili LTA) i uzorci slepih proba (samo Re-LPS ili LTA) pobuđivani su na 295 nm, a emisioni spektri su snimani od 300 do 400 nm. Rezultati su izraženi kao promena fluorescencije peptida (ΔF) na talasnoj dužini emisionog maksimuma (353 nm za peptide i 337 nm za rshCD6 protein) u prisustvu i odsustvu bilo Re-LPS-a ili LTA. Rezultati su srednje vrednosti ± SD za 3 eksperimenta. Promene fluorescencije peptida na 353 nm su izračunate Hilovom jednačinom.
Slika 5. Analiza hidrodinamičke veličine peptida izvedenih iz CD6 u rastvoru. Prikazana je analiza hidrodinamičkog prečnika, dinamičkim rasejavanjem svetlosti (DLS), za peptide (10 µg/mL) izvedene iz CD6 (PD1, PD2, PD3 i Pkons) i DMBT-1/SAG (pbs1) u PBS-u. Y osa predstavlja relativan intenzitet rasejane svetlosti; x osa označava hidrodinamički prečnik čestica prisutnih u rastvoru. Prikazan je jedan reprezentativni eksperiment od četiri izvedena (levo). Numeričke vrednosti dobijene za svaki peptid su takođe prikazane (desno).
Slika 6. Efekat peptida izvedenih iz CD6 na in vitro oslobađanje citokina, indukovano sa LPS-om, od strane mišjih splenocita. Ukupne suspenzije ćelija slezine (2×10<5>) iz C57BL/6 miševa (n=7) stimulisane su u trilikatu tokom 48 h sa LPS-om (0,5 µg/mL), u prisustvu ili odsustvu rastućih koncentracija (0,5, 5 i 20 µg/mL) peptida izvedenih iz CD6 (PD1, PD2 i Pkons). Nivoi citokina u supernatantima kultura su određivani ELISA testom i rezultati su izraženi u pg/mL kao srednja vrednost ± SD triplikata. Vijabilnost u 48. h je iznosila >75% u svim eksperimentalnim uslovima. Statistička analiza je urađena upotrebom 2-smernog Mann-Whitney testa, sa intervalom poverenja od 95% (<∗>, P<0,05;<∗∗>, P<0,01;<∗∗∗>, P<0,001).
Slika 7. Uporedni terapijski efekti i.v. infuzijom primenjenih peptida izvedenih iz CD6, na preživljavanje miševa nakon sepse indukovane ligacijom i punkcijom cekuma (CLP). (A, B) C57BL/6J miševima je i.v. infuzijom primenjen fiziološki rastvor (n=25) ili jedna doza od 6 mg/kg neobeleženih peptida izvedenih iz CD6-(PD1, n=8; PD2, n=16; PD3, n=15; Pkons, n=12) ili DMBT1 (pbs1, n=13), 1 h nakon indukcije CLP-a Bila je uključena i šam grupa (n=3). U svim slučajevima, prosečan procenat preživljavanja je analiziran tokom vremena za svaku grupu i upoređivan je sa grupom koja je tretirana fiziološkim rastvorom, upotrebom long-rank t-testa (<∗>, P<0,05;<∗∗>, P<0,01;<∗∗∗>, P<0,001).
Figura 8. Efekti infuzije CD6.PD3 zavisni od doze, vremena i puta davanja, na preživljavanje miševa nakon sepse indukovne CLP-om. (A) C57BL/6 miševi su i.v. infuzijom primali fiziološki rastvor (n=26) ili pojedinačne rastuće doze (3 mg/kg, n=13; 6 mg/kg, n=15; i 12 mg/kg, n=8) CD6.PD3 peptida, 1 h nakon CLP-a. (B) C57BL/6 miševi su su i.v. infuzijom primali fiziološki rastvor (n=4) ili 6 mg/kg CD6.PD3 u različito vreme nakon CLP (+1h, n=5; 3h, n=5; 6h, n=6). (C) C57BL/6J miševi su i.v. (n=11) ili i.p. (n=9) infuzijom primili 6 mg/kg CD6.PD3 peptida ili fiziološki rastvor (n=9), 1 h nakon CLP-a. U svim slučajevima, prosečan procenat preživljavanja je analiziran tokom vremena i upoređivan je sa grupom koja je bila tretirana fiziološkim rastvorom, upotrebom log rang t-testa (n.s., nije značajno;<∗>, P<0,05.<∗∗>, P<0,01;<∗∗∗>, P<0,001).
Slika 9. Terapijski efekat infuzije CD6.PD3 na nivoe citokina i opterećenja bakterijama nakon sepse indukovane sa CLP. (A) C57BL/6J miševima je i.v. infuzijom primenjivan, 1 h nakon CLP-a, fiziološki rastvor (n=7) ili CD6.PD3 peptid (6 mg/kg; n=9), a nivoi citokina u plazmi su praćeni ELISA postupkom, u različitim vremenskim tačkama (4 h i 20 h) nakon toga. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD. (B) Kod istih grupa miševa kao u (A) praćeno je opterećenje bakterijama u krvi i slezini, 20 h nakon indukcije sa CLP. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SD, u CFU/mg (slezina) ili CFU/µL (krv). U svim slučajevima, statističke razlike su procenjivane upotrebom 2-smernog Studentovog t-testa (*, P<0,05).
Slika 10. Aditivni efekti kombinovanog davanja CD6.PD3 sa Imipenemom/Cilastatinom, na preživljavanje miševa nakon sepse indukovane sa CLP. C57BL/6J miševi su primali terapijski infuziju, 1 h nakon CLP-a, fiziološkog rastvora (n = 36), CD6.PD3 (6 mg/kg i.v.; n=25), Imipenema/Cilastatina (I/C, 50 mg/kg/12h i.p.; n = 9) ili kombinacije dva poslednje navedena (I/C+PD3, n=11). U svim slučajevima, prosečan procenat preživljavanja je analiziran tokom vremena za svaku grupu i upoređivan je sa I/C grupom koja je dobijala i CD6.PD3, upotrebom long-rank t-testa (<∗∗>, P<0,02;<∗∗∗>, P<0,002).
Slika 11. Testovi adsorpcije endotoksina na imobilisanim peptidima i proteinima izvedenim iz CD6. Eupergit<®>smola obložena različitim peptidima (PD2, PD3 i Pkons) (A) ili proteinima (rshCD5 i rshCD6) izvedenim iz CD6 (B) inkubirana je tokom različitih vremenskih perioda (0, 30, 90 i 150 min) sa 50 UI/mL rastvora endotoksina. Aktivnost aktivacije limulus amoebocitnog lizata (LAL aktivnost) supernatanata je zatim praćena tokom vremena, a predstavljena je OD za 405-620 nm. Smole obložene humanim serumskim albuminom (HSA) su upotrebljavane kao negativne kontrole. Prikazani su triplikati reprezentativnog eksperimenta iz dva nezavisna izvođenja. Statistička analiza je urađena upotrebom 2-smernog uparenog T testa sa intervalom poverenja od 95% (<∗∗∗>, P <0,001).
Detaljan opis pronalaska
Aminokiselinske sekvence i peptidi
[0026] Prema prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od jedne ili više od sekvenci koje slede („aminokiselinske sekvence predmetnog pronalaska”), ili njihovog derivata, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima:
CD6.PD1: GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1);
CD6.PD2: GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2); i
CD6.PD3: GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3).
[0027] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje jedan ili više od peptida koji slede („peptidi predmetnog pronalaska”), ili njihov derivat, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima:
CD6.PD1: GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1);
CD6.PD2: GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2); i
CD6.PD3: GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3).
[0028] U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3, CD6.PD3), ili njenog derivata. U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje CD6.PD3 peptid (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njegov derivat.
[0029] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1, CD6.PD1), ili njenog derivata. U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje CD6.PD1 peptid (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njegov derivat.
[0030] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2, CD6.PD2), ili njenog derivata. U poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje CD6.PD2 peptid (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njegov derivat.
[0031] U prethodno navedenim primerima izvođenja aminokiselinskih sekvenci, njihov naveden derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
[0032] Ovi peptidi su evolutivno očuvani kratki 11-merni peptidi koji mapiraju u okviru vanćelijskih SRCR domena humanog CD6. Ektodomen CD6 se sastoji od tri SRCR domena, intervenirajućih sekvenci i regiona „stabljike”.
[0033] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje aminokiselinske sekvence koje sadrže peptide CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) i/ili CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3). Aminokiselinska sekvenca može biti linearna ili ciklična. Poželjno, aminokiselinska sekvenca je sadržana unutar ektodomena humanog CD6. U poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca je sadržana unutar SEQ ID NO.: 4. U posebnom primeru izvođenja, linearna ili ciklična aminokiselinska sekvenca sadrži između 12 i 17 susednih aminokiselina koje čine peptide CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) ili CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3) i poželjno je sadržana unutar SEQ ID NO.: 4. Primeri poželjnih aminokiselinskih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na: CSGTVEVRLEASWEPAC (SEQ ID NO.: 13), SGTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 14), SGTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 15), SGTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 16), SGTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 17), GTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 18), GTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 19), GTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 20), CAGRVEMLEHGEWGSVC (SEQ ID NO.: 21), AGRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 22), AGRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 23), AGRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 24), AGRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 25), GRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 26), GRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 27), GRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 28), CEGQVEVHFRGVWNTVC (SEQ ID NO.: 29), EGQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 30), EGQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 31), EGQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 32), EGQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 33), GQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 34), GQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 35), GQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 36).
[0034] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „derivat aminokiselinske sekvence ili peptida predmetnog pronalaska” uključuje bilo koji derivat aminokiselinske sekvence ili peptida koji sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima. Prema jednom aspektu predmetnog pronalaska, navedeni derivati su u stanju da obavljaju biološku funkciju, npr. bilo koji derivat aminokiselinske sekvence ili peptida predmetnog pronalaska je u stanju da veže PAMP-ove široko distribuirane među Gram-negativnim (G-) (npr. LPS) i Gram-pozitivnim (G+) (npr. LTA) bakterijama. Aminokiselinske sekvence i peptidi pronalaska mogu uključivati modifikacije date sekvence. Takve modifikacije su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike. Prebacivanje supstituenata unutar aminokiselinskog ostatka, sa C atoma na N atom, da bi se proizveli peptoidi koji imaju veću rezistenciju na proteolizu, kao i druge modifikacije, poznate su i uključene unutar obima ovog pronalaska. Na primer, jedna ili više L-aminokiselina aminokiselinskih sekvenci i peptida predmetnog pronalaska, mogu biti zamenjene D-aminokiselinom, da bi se povećala njihova stabilnost. Na primer, N-acilacija i/ili C-amidacija ili C-esterifikacija peptida i/ili aminokiselinskih sekvenci predmetnog pronalaska može povećati njihovu rezistenciju na proteolizu. Na primer, ciklizacija jedne ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska može povećati njihovu stabilnost i permeabilnost. Na primer, jedna ili više aminokiselina aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska može biti N-alkilovana (uglavnom N-metilovana) da bi se poboljšala njihova stabilnost. Na primer, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska može biti konjugovana sa jednim ili sa više makromolekula (npr. sa polietilen glikolom (PEG), albuminom), da bi se poboljšala njihova stabilnost i/ili smanjio bubrežni klirens. Na primer, aminokiselinske sekvence i peptidi predmetnog pronalaska mogu sadržavati strukturu kape na N-ili C-kraju sa Cys ostacima, radi daljeg kovalentnog vezivanja za čvrstu fazu (npr. polipropilenske smole).
[0035] SEQ ID NO: 4 odgovara zreloj (potpuno obrađenoj) solubilnoj izoformi humanog CD6. Sekvenca humanog CD6 receptora je ona koja je identifikovana sa pristupnim brojem P30203 (CD6_HUMAN, poslednja izmena 15. decembra 2009. god., Verzija 3, u bazi podataka UniProtKB/Swiss-Prot) i koja odgovara receptoru u izoformi vezanoj za membranu. Još uvek nije u potpunosti utvrđeno da li se solubilna izoforma CD6 takođe generiše proteolitičkim cepanjem; SEQ ID NO. 4 se dobija dodavanjem stop kodona u region „stabljike„ koji prethodi transmembranskom regionu.
[0036] SEQ ID NO: 4 je rezultat transkripcije i translacije nukleotidnih sekvenci koje sadrže SEQ ID NO.: 5.
[0037] CD6.PD1 (u ovom dokumentu takođe označena kao „PD1” ili „P1”), CD6.PD2 (u ovom dokumentu takođe označena kao „PD2” ili „P2”) i CD6.PD3 (u ovom dokumentu takođe označena kao „PD3” ili „P3”) u stanju su da vežu PAMP-ove koji su široko rasprostranjeni među Gram-negativnim (G-) (npr. LPS) i Gram-pozitivnim (G+) (npr. LTA) bakterijama (pogledati, npr. Sliku 3). One takođe pokazuju visoka osobine bakterijske aglutinacije. Preciznije, PD1 i PD2 pokazuju veoma visok afinitet prema Re-LPS i LTA (pogledati, npr. Sliku 4). CD6.PD3 poboljšava preživljavanje miševa koji prolaze kroz polimikrobnu sepsu, na način koji zavisi od doze i vremena (pogledati Slike 7, 8 i 9). Kada se kombinuje sa antibiotikom Imipenemom/Cilastatinom, ovaj peptid deluje još bolje (pogledati, npr. Sliku 10), pokazujući aditivne efekte preživljavanja kod septičnih miševa.
[0038] Bilo koji postupak koji se obično koristi u oblasti tehnike, može biti iskorišćen za proizvodnju aminokiselinskih sekvenci i peptida, ili njihovih derivata, predmetnog pronalaska (CD6.PD1, CD6.PD2 i CD6.PD3). Na primer, oni mogu biti proizvedeni peptidnom sintezom na čvrstoj fazi (Albericio F i Kates SA, 2000, Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide, CRC Press, ISBN 9780824703592).
[0039] Jedinjenja pronalaska (aminokiselinske sekvence i peptidi, i njihovi derivati, kao što je prethodno opisano), njihovi stereoizomeri ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu biti sintetisani prema konvencionalnim postupcima poznatim u stanju tehnike. Prema jednom aspektu koji je ovde opisan, jedinjenja se sintetišu putem postupaka sinteze peptida u rastvoru ili na čvrstoj fazi.
[0040] Postupci sinteze na čvrstoj fazi su opisani na primer u [Stewart J.M. i Young J.D., 1984, „Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition” Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; Bodanzsky M. i Bodanzsky A., 1984 „The practice of Peptide Synthesis” Springer Verlag, New Cork; Lloyd-Williams P., Albericio F. i Giralt E. (1997) „Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins” CRC, Boca Raton, FL, USA]. Postupci sinteze u rastvoru i kombinacije postupaka sinteze u rastvora i na čvrstoj fazi su opisani u [Kullmann W. i saradnici, J. BioI. Chem., 1980, 255, 8234-8238].
[0041] Jedinjenja pronalaska (aminokiselinske sekvence i peptidi, i njihovi derivati, koji su kao što je prethodno opisano) mogu biti pripremani putem postupka koji obuhvata korake:
a) Sintezu peptida na čvrstoj fazi
b) Cepanje peptida sa polimerne podloge, poželjno putem tretmana kiselinom
c) Izborno, ciklizaciju peptida u rastvoru
d) Ukoliko je potrebno, eliminisanje zaštitnih grupa, poželjno sa trifluorosirćetnom kiselinom ili alternativno
i) Sintezu peptida na čvrstoj fazi
ii) Izborno, ciklizaciju peptida na čvrstoj fazi
iii) Cepanje peptida sa polimerne podloge i, ukoliko je potrebno, istovremeno eliminisanje zaštitnih grupa, poželjno putem tretmana sa trifluorosirćetnom kiselinom.
[0042] Poželjno, C-terminalni kraj je vezan za čvrstu podlogu i proces se razvija na čvrstoj fazi, a stoga obuhvata kuplovanje aminokiseline sa zaštićenim N-terminalnim krajem i slobodnim C-terminalnim krajem na aminokiselini sa slobodnog N-terminalnog kraja i C-terminalnog kraja vezanog za polimerni nosač; eliminisanje zaštitne grupe sa N-terminalnog kraja; i ponavljanje ove sekvence onoliko puta koliko je potrebno da bi se time dobila ciljna peptidna sekvenca, nakon čega sledi cepanje sintetisanog peptida sa originalne polimerne podloge. Funkcionalne grupe bočnih lanaca aminokiselina se održavaju pogodno zaštićenima sa privremenim ili trajnim zaštitnim grupama tokom čitave sinteze, a zaštitne grupe mogu zatim biti uklonjenje istovremeno ili ortogonalno u odnosu na proces cepanja peptida sa polimerne podloge.
[0043] Alternativno, sinteza na čvrstoj fazi može biti izvedena putem konvergentne strategije, kuplovanjem peptidnog fragmenta na polimernu podlogu ili na peptidni fragment koji je prethodno vezan za polimernu podlogu. Strategije konvergentne sinteze su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike i opisane su od strane Lloyd-Williams P. i saradnika u Tetrahedron 1993, 49, 11065-11133.
[0044] Proces može sadržavati dodatne korake uklanjanja zaštitnih grupa sa N-terminalnih i C-terminalnih krajeva i/ili cepanje peptida sa polimerne podloge po nasumičnom redosledu, upotrebom standardnih procesa i uslova poznatih u oblasti tehnike, nakon čega funkcionalne grupe navedenih krajeva mogu biti modifikovane. Izborna modifikacija N-terminalnih i C-terminalnih krajeva može biti izvedena sa peptidom formule (I) „usidrenim” za polimernu podlogu ili onda kada je peptid cepanjem odojen sa polimerne podloge.
[0045] Termin „zaštitna grupa” odnosi se na grupu koja blokira organsku funkcionalnu grupu i koja može biti uklonjena pod kontrolisanim uslovima. Stručnoj osobi iz oblasti tehnike su poznate zaštitne grupe, njihove relativne reaktivnosti i uslovi u kojima ostaju inertne.
[0046] Primeri reprezentativnih zaštitnih grupa za amino grupu su amidi, kao što su amid acetat, amid benzoat, amid pivalat; karbamati, kao što su benziloksikarbonil (Cbz ili Z), 2-hlorobenzil (CIZ), para-nitrobenziloksikarbonil (pNZ), terc-butiloksikarbonil (Boc), 2,2,2-trihloroetoksikarbonil (Troc), 2-(trimetilsilil)etoksikarbonil (Teoc), 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) ili aliloksikarbonil (Alloc), tricil (Trt), metoksitricil (Mtt), 2,4-dinitrofenil (Dnp), N-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)etil] (Dde), 1-(4,4-dimetil-2,6-diokso-cikloheksiliden)-3-metil-butil (ivDde), 1-(1-adamantil)-1-metiletoksi-karbonil (Adpoc), između ostalih; poželjno su Boc ili Fmoc.
[0047] Primeri reprezentativnih zaštitnih grupa za karboksilnu grupu su estri, kao što su tercbutil (tBu) estar, alil (All) estar, trifenilmetil estar (tricil estar, Trt), cikloheksil (cHx) estar, benzil (Bzl) estar, orto-nitrobenzil estar, para-nitrobenzil estar, para-metoksibenzil estar, trimetilsililetil estar, 2-fenilizopropil estar, fluorenilmetil (Fm) estar, 4-(N-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheksiliden)-3-metilbutil]amino)benzil (Dmab) estar, između ostalih; poželjne zaštitne grupe pronalaska su All, tBu, cHex, Bzl i Trt estri.
[0048] Trifunkcionalne aminokiseline mogu biti zaštićene tokom procesa sinteze sa privremenim ili trajnim zaštitnim grupama ortogonalno postavljenim u odnosu na zaštitne grupe N-terminalnih i C-terminalnih krajeva. Prethodno opisane zaštitne grupe za amino grupu se upotrebljavaju za zaštitu amino grupe bočnog lanca lizina, dok bočni lanac triptofana može biti zaštićen bilo kojom od zaštitnih grupa za amino grupu koja je prethodno opisana, ili ne mora biti zaštićen, a bočni lanac serina i treonina se štiti sa terc-butil (tBu) estarskom grupom, bočni lanac cisteina se štiti sa zaštitnom grupom izabranom iz grupe koja se sastoji od tricila i acetamidometila, dok bočni lanac asparagina može biti zaštićen zaštitnom grupom izabranom iz grupe koja se sastoji od metoksitricila, tricila i ksantila, ili ne mora biti zaštićen. Poželjne žaštitne grupe za trifunkcionalne aminokiseline pronalaska su tBu estri u bočnim lancima serina i treonina; Boc u bočnim lancima lizina, Trt u bočnim lancima cisteina i Fmoc ili Boc kao privremena zaštitna grupa N-terminalnog kraja.
[0049] Primeri ovih i drugih dodatnih zaštitnih grupa, njihovo uvođenje i njihovo uklanjanje, opisani su u literaturi [Greene T.W. i Wuts P.G.M., (1999) „Protective groups in organic synthesis” John Wiley & Sons, New York; Atherton B. i Sheppard R.C. (1989) „Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach” IRL Oxford University Press]. Termin „zaštitne grupe” takođe uključuje polimerne nosače koji se upotrebljavaju u sintezi na čvrstoj fazi.
[0050] Kada se sinteza izvodi delimično ili u potpunosti na čvrstoj fazi, polistiren, polietilen glikol uveden u polistirenske nosače i slično, mogu biti pomenuti kao čvrsta podloga koja će biti upotrebljena u procesu pronalaska kao što su, u vidu neograničavajućih primera, pmetilbenzhidrilaminske (MBHA) smole [Matsueda G.R. i saradnici, Peptides 1981, 2, 45-50], 2-hlorotricilne smole [Barlos K. i saradnici 1989 Tetrahedron Lett. 30:3943-3946; Barlos K. i saradnici, 1989 Tetrahedron Lett. 30, 3947-3951], TentaGel<®>smole (Rapp Polymere GmbH), ChemMatrix<®>smole (Matrix Innovation, Inc) i slično, koje mogu, ali ne moraju uključivati labilni linker, kao što je 5-(4-aminometil-3,5-dimetoksifenoksi)valerijanska kiselina (PAL) [Albericio F. i saradnici, 1990, J. Org. Chem. 55, 3730-3743], 2-[4-aminometil-(2,4-dimetoksifenil)]fenoksisirćetna kiselina (AM) [Rink H., 1987, Tetrahedron Lett.28, 3787-3790], Wang [Wang S.S., 1973, J. Am. Chem. Soc. 95, 1328-1333] i slično, koji omogućava cepanje poluzaštićenog peptida i obrazovanje ciklusa u rastvoru sa korakom uklanjanja zaštitne grupe u rastvoru ili ciklus na čvrstoj fazi i potonje uklanjanje žastitne grupe i istovremeno cepanje peptida.
Kombinacija
[0051] Drugi aspekt koji je ovde opisan, odnosi se na kombinaciju koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, ili njihove derivate, predmetnog pronalaska i najmanje jedan antibiotik. Poželjno, antibiotik je beta-laktamski antibiotik, poželjnije Imipenem. U poželjnom primeru izvođenja, kombinacija dalje sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin. Još poželjnije, kombinacija sadrži Imipenem i Cilastatin.
[0052] Drugi antibiotici mogu biti upotrebljeni u kombinaciji kao što je ovde opisano. Primeri drugih beta-laktamskih antibiotika su karbapenemi kao što su meropenem, ertapenem, doripenem, penicilini kao što su amoksicilin, ampicilin, propicilin, oksacilin, dikloksacilin, flukloksacilin, mezlocilin, piperacilin itd. Primeri drugih klasa antibiotika uključuju aminoglikozide kao što su streptomicin, gentamicin, tobramicin, netilmicin, amikacin itd.; tetracikline kao što su tetraciklin, doksiciklin, minociklin, hlortetraciklin, oksitetraciklin, demeklociklin, limeciklin, meklociklin, metaciklin, minociklin, rolitetraciklin itd., kao i hinolone kao što flumehin (Flubactin), oksolinska kiselina (Uroxin), rozoksacin (Eradacil), ciprofloksacin (Zoxan, Ciprobay, Cipro, Ciproxin), fleroksacin (Megalone, Roquinol), lomefloksacin (Maxaquin), nadifloksacin (Acuatim, Nadoxin, Nadixa), norfloksacin (Lexinor, Noroxin, Quinabic, Janacin), ofloksacin (Floxin, Oxaldin, Tarivid), pefloksacin (Peflacine), rufloksacin (Uroflox), balofloksacin (Baloxin), grepafloksacin (Raxar), levofloksacin (Cravit, Levaquin), pazufloksacin (Pasil, Pazucross), sparfloksacin (Zagam), temafloksacin (Omniflox), klinafloksacin, gatifloksacin (Zigat, Tequin) (Zymar -oft.), moksifloksacin (Avelox,Vigamox), sitafloksacin (Gracevit), prulifloksacin (Quisnon) i bezifloksacin (Besivance), poželjno fluorohinolone. Glikopeptidni antibiotici kao što su vankomicin, teikoplanin ili telavancin, ili makrolidni antibiotici kao što su eritromicin, spiramicin, roksitromicin, klaritromicin ili azitromicin, između ostalih, takođe se razmatraju.
[0053] Kombinacija takođe može sadržavati druge beta-laktamazne inhibitore, kao što su klavulanska kiselina, sulbaktam, tebipenem, 6-metiliden penem2, tazobaktam, avibaktam ili relebaktam.
[0054] Uobičajene kombinacije beta-laktamskih antibiotika i beta-laktamaznih inhibitora su, na primer, ampicilin/sulbaktam, amoksicilin/klavulanat ili piperacilin/tazobaktam.
[0055] U poželjnom primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
[0056] U drugom primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
[0057] U daljem primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
[0058] U daljem primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
[0059] U daljem primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
[0060] U daljem primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
[0061] U daljem primeru izvođenja, kombinacija koja je kao što je ovde opisano, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, i najmanje jednog antibiotika, poželjno Imipenema, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin.
Farmaceutske kompozicije
[0062] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, kao što je ovde prethodno opisano („kompozicija predmetnog pronalaska”). Na primer, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može sadržavati kombinaciju koja je kao što je ovde prethodno opisano.
[0063] U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0064] U drugom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0065] U daljem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0066] U daljem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0067] U daljem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0068] U daljem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0069] U daljem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0070] Kompozicija predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jednu ili više od sledećih izolovanih aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO.: 3, i/ili SEQ ID NO.: 1, i/ili SEQ ID NO.: 2, ili njihov derivat.
[0071] Derivat, koji je kao što je prethodno opisano u primerima izvođenja farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska, sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
[0072] Kao što je stručnjaku poznato, farmaceutska kompozicija može sadržavati, pored jednog ili više aktivnih sastojaka (npr. jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska), farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne ekscipijense. Dodatno, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska sadrži kompoziciju predmetnog pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima.
[0073] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač” označava netoksičan rastvarač, dispergujući agens, ekscipijens, adjuvans ili drugi materijal koji se meša sa aktivnim sastojkom(sastojcima) da bi se omogućilo obrazovanje farmaceutske kompozicije, tj. dozni oblik koji se može davati pacijentu. Jedan primer takvog nosača je farmaceutski prihvatljivo ulje koje se uobičajeno upotrebljava za parenteralno davanje.
[0074] Termin „farmaceutski prihvatljive soli”, kako se ovde upotrebljava, označava da soli jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljene u medicinskim preparatima. Druge soli mogu, međutim, biti korisne u pripremi jedinjenja prema pronalasku ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
[0075] Termin „nosač” se odnosi na razblaživača ili ekscipijensa sa kojim se aktivan sastojak(aktivni sastojci) daje(u). Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ona poreklom iz nafte ili ona koja su životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, a kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slična. Voda ili vodeni rastvori fiziološkog rastvora i vodeni rastvori dekstroze i glicerola, poželjno se upotrebljavaju kao nosači, posebno za rastvore koji se mogu injecirati. Pogodni farmaceutski nosači su opisani u „Remington's Pharmaceutical Sciences” od strane E.W. Martina, 1995.
[0076] „Adjuvans”, kako se ovde upotrebljava, predstavlja supstancu koja ima malo ili nimalo farmakoloških efekata sama po sebi, ali može povećati efikasnost ili potenciju drugih agenasa kada se daje u (suštinski) isto vreme i često (suštinski) istim putem davanja na (suštinski) istom mestu (npr. injekcijom u isti mišić) kao i drugi agens. Preciznije, kada se upotrebljava u kontekstu imunizacije, adjuvans je supstanca koja stimuliše ili koja može stimulisati imunski sistem i povećati odgovor na imunizacioni agens, bez ispoljavanja bilo kakvog specifičnog antigenskog efekta samog po sebi. Još preciznije, imunološki adjuvans može biti definisan kao supstanca koja deluje tako da ubrza, produži ili pojača antigen-specifične imunske odgovore kada se upotrebljava u kombinaciji sa specifičnim antigenskim agensom(agensima).
[0077] Nosači i pomoćne supstance koji su neophodni za proizvodnju željenog farmaceutskog doznog oblika farmaceutske kompozicije pronalaska zavisiće, između ostalih faktora, od izabranog farmaceutskog doznog oblika. Navedeni farmaceutski dozni oblici farmaceutske kompozicije pronalaska biće proizvedeni u skladu sa konvencionalnim postupcima koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0078] Primeri farmaceutskih kompozicija obuhvataju bilo koje čvrste (tablete, pilule, kapsule, granulate itd.) ili tečne (rastvore, suspenzije ili emulzije) kompozicije za oralno, topikalno ili parenteralno davanje, odnosno intraperitonealno, intravensko, intramuskularno ili subkutano davanje. Štaviše, farmaceutska kompozicija može sadržavati, prema potrebi, stabilizatore, suspenzije, konzervanse, surfaktante i slično.
[0079] Stručnjak iz oblasti tehnike će prilagoditi kompoziciju u zavisnosti od konkretnog načina davanja. Kompozicija predmetnog pronalaska može dalje sadržavati druge terapijske agense protiv infektivnih bolesti ili inflamatornih stanja povezanih sa njima, ili njihove kombinacije.
„Komplet iz delova”
[0080] Prema trećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje „komplet iz delova” koji sadrži, ili se, alternativno, sastoji od jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska (ili njihovih derivata) i najmanje jednog antibiotika. Poželjno, antibiotik je beta-laktamski antibiotik, poželjnije Imipenem („komplet iz delova predmetnog pronalaska”). U poželjnom primeru izvođenja, kombinacija dalje sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjnije Cilastatin. Još poželjnije, „komplet iz delova” sadrži Imipenem i Cilastatin.
[0081] Drugi antibiotici mogu biti upotrebljeni u „kompletu iz delova” predmetnog pronalaska. Primeri drugih beta-laktamskih antibiotika su karbapenemi kao što su meropenem, ertapenem, doripenem, penicilini kao što su amoksicilin, ampicilin, propicilin, oksacilin, dikloksacilin, flukloksacilin, mezlocilin, piperacilin itd. Primeri drugih klasa antibiotika uključuju aminoglikozide kao što su streptomicin, gentamicin, tobramicin, netilmicin, amikacin itd.; tetracikline kao što su tetraciklin, doksiciklin, minociklin, hlortetraciklin, oksitetraciklin, demeklociklin, limeciklin, meklociklin, metaciklin, minociklin, rolitetraciklin itd., kao i hinolone kao što flumehin (Flubactin), oksolinska kiselina (Uroxin), rozoksacin (Eradacil), ciprofloksacin (Zoxan, Ciprobay, Cipro, Ciproxin), fleroksacin (Megalone, Roquinol), lomefloksacin (Maxaquin), nadifloksacin (Acuatim, Nadoxin, Nadixa), norfloksacin (Lexinor, Noroxin, Quinabic, Janacin), ofloksacin (Floxin, Oxaldin, Tarivid), pefloksacin (Peflacine), rufloksacin (Uroflox), balofloksacin (Baloxin), grepafloksacin (Raxar), levofloksacin (Cravit, Levaquin), pazufloksacin (Pasil, Pazucross), sparfloksacin (Zagam), temafloksacin (Omniflox), klinafloksacin, gatifloksacin (Zigat, Tequin) (Zymar -oft.), moksifloksacin (Avelox,Vigamox), sitafloksacin (Gracevit), prulifloksacin (Quisnon) i bezifloksacin (Besivance), poželjno fluorohinolone. Glikopeptidni antibiotici kao što su vankomicin, teikoplanin ili telavancin, ili makrolidni antibiotici kao što su eritromicin, spiramicin, roksitromicin, klaritromicin ili azitromicin, između ostalih, takođe se razmatraju.
[0082] „Komplet iz delova” takođe može sadržavati druge beta-laktamazne inhibitore, kao što su klavulanska kiselina, sulbaktam, tebipenem, 6-metiliden penem2, tazobaktam, avibaktam ili relebaktam.
[0083] Uobičajene kombinacije beta-laktamskih antibiotika i beta-laktamaznih inhibitora su, na primer, ampicilin/sulbaktam, amoksicilin/klavulanat ili piperacilin/tazobaktam.
[0084] „Komplet iz delova” se takođe može označavati u predmetnom opisu kao „kombinovani proizvod” i/ili „farmaceutski proizvod”, a definisan je u kontekstu predmetne prijave kao proizvod ili višekomponentni sistem koji sadrži dve ili više komponenti, koje nisu nužno prisutne kao jedinstveni proizvod, npr. u kompoziciji, ali koje su dostupne za istovremenu, razdvojenu ili uzastopnu primenu ili davanje. Prema tome, komponente „kompleta iz delova” mogu biti fizički odvojene, u različitim kontejnerima, kao što će detaljno biti opisano u nastavku teksta.
[0085] Višekomponentni sistem može biti upotrebljen za skladištenje jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska u jednom kontejneru, kao i antibiotika (poželjno Imipenema), a koji poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor (poželjno Cilastatin) u drugom kontejneru. U odgovarajuće vreme, komponente mogu biti pomešane. Alternativno, komponente mogu biti upotrebljene odvojeno ili uzastopno, naime bez mešanja, pre davanja subjektu kome je to potrebno.
[0086] Preciznije, ovakav „komplet iz delova” može sadržavati ili se, alternativno, sastoji od: (a) prvog kontejnera koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska i (b) drugog kontejnera koji sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, i koji poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano.
[0087] „Komplet iz delova” predmetnog pronalaska može sadržavati, ili se, alternativno, sastojati od jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska i antibiotika, poželjno Imipenema, kao što je prethodno opisano, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, kao odvojene entitete (npr. sadržane u odvojenim kontejnerima), koji mogu biti davani subjektu (sisaru, poželjno čoveku) istovremeno, uzastopno ili odvojeno. U poželjnom primeru izvođenja, „komplet iz delova” predmetnog pronalaska sadrži ili se, alternativno, sastoji od jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska i antibiotika, poželjno Imipenema, kao što je prethodno opisano, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, kao odvojene entitete (npr. sadržane u odvojenim kontejnerima), koji mogu biti davani subjektu (sisaru, poželjno čoveku ili organizmu koji nije sisar) istovremeno, uzastopno ili odvojeno. U drugom primeru izvođenja, kontejneri se kombinuju u jedan proizvod koji ima pregradu između kontejnera. Ova pregrada može biti bilo uklonjena ili uništena, što omogućava mešanje komponenti u odgovarajućem trenutku.
[0088] Shodno navedenom, predmetni pronalazak obezbeđuje „komplet iz delova” predmetnog pronalaska za njegovu istovremenu, odvojenu ili uzastopnu upotrebu u vidu medikamenta, posebno u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara uključujući čoveka, i/ili kod organizma koji nije sisar, i to infektivnih bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa, kao što je definisano u nastavku teksta.
[0089] Na primer, sisar može biti glodar (kao što je miš ili pacov), primat (kao što je čovekoliki majmun, majmun ili lemur), pas, mačka, zec i kopitar kao što su goveda, konji ili svinje. U poželjnom primeru izvođenja, sisar je čovek.
[0090] Na primer, organizam koji nije sisar može biti kokoška, patka, guska, noj, golub, ćurka itd.).
[0091] „Komplet iz delova” predmetnog pronalaska može sadržavati, ili se, alternativno, sastojati od:
a) farmaceutske kompozicije koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, koji su kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljivih nosača, farmaceutski prihvatljivih soli, adjuvanasa i/ili pogodnih ekscipijenasa; i b) farmaceutske kompozicije koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, a poželjno takođe sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne eksipijense. Još poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži Imipenem, još poželjnije, zajedno sa Cilastatinom.
[0092] Obe farmaceutske kompozicije (a) i (b) su poželjno sadržane u „kompletu iz delova” predmetnog pronalaska kao odvojeni entiteti (npr. kao odvojene tečne ili čvrste kompozicije, u odvojenim kontejnerima, kao što je prethodno opisano), koji mogu biti davani subjektu (sisaru, poželjno čoveku, ili organizmu koji nije sisar) istovremeno, uzastopno ili odvojeno.
[0093] Kao što je prethodno pomenuto, i kao što će biti dalje opisano u nastavku teksta, farmaceutska kompozicija i/ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska mogu dalje poželjno sardržavati enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin. Enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, može biti sadržan u „kompletu iz delova” predmetnog pronalaska kao (treći) poseban entitet, u trećem odvojenom kontejneru, poželjno u obliku farmaceutske kompozicije koja sadrži enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili betalaktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima. Poželjno, enzimski inhibitor kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, je sadržan u istom entitetu (istom kontejneru) kao antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano (npr. kompozicija ili farmaceutska kompozicija sadrži Imipenem i Cilastatin).
[0094] Na primer, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne eksipijense) i antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno je zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano (ili farmaceutskom kompozicijom koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, a poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, kao i sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima) sadržani su u „kompletu iz delova” predmetnog pronalaska, poželjno kao odvojeni entiteti i mogu biti davani istovremeno (u isto vreme) subjektu (sisaru, poželjno čoveku).
[0095] Alternativno, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne eksipijense) i antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno je zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, kao i sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima) sadržani su u „kompletu iz delova” predmetnog pronalaska, poželjno kao odvojeni entiteti i mogu biti davani uzastopno subjektu (sisaru, poželjno čoveku); na primer, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli i soli/ili pomoćne supstance) mogu biti davani u prvo mesto, a nakon toga se subjektu (sisaru, poželjno čoveku) daje antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je ovde prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano i farmaceutski prihvatljivi nosači, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvansi i/ili pogodni ekscipijensi).
[0096] Poželjno, subjektu (sisaru, poželjno čoveku) se najpre daje antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, kao i sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima), nakon čega se subjektu daje jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, i farmaceutske prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne ekscipijense).
[0097] Alternativno, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, kao i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvase i/ili pogodne eksipijense) i antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno je zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, kao i sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima) sadržani su u „kompletu iz delova” predmetnog pronalaska, poželjno kao odvojeni entiteti i mogu biti davani odvojeno subjektu (sisaru, poželjno čoveku). Na primer, subjektu (sisaru, poželjno čoveku) koji već uzima antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je ovde prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao što je prethodno opisano, poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, farmaceutski prihvatljivim solima, adjuvansima i/ili pogodnim ekscipijensima) daju se i jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvase i/ili pogodne eksipijense), poželjno u jednoj dozi.
[0098] Shodno navedenom, komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska mogu biti davane subjektu (sisaru uključujući čoveka) istovremeno, uzastopno ili odvojeno, u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, poželjno infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa, kao što će biti opisano u nastavku teksta.
Imipenem
[0099] Imipenem je β-laktamski antibiotik koji pripada karbapenemskoj klasi antibiotika. Karbapenemi su visoko rezistentni na β-laktamazne enzime koje proizvode mnoge G- bakterije sa višestrukom rezistencijom na lekove. Imipenem deluje kao antimikrobni agens putem inhibicije sinteze ćelijskog zida raznovrsnih G+ i G- bakterija, čime se smanjuje količina PAMP-ova koji se oslobađaju tokom bakteriolize. Ostaje veoma stabilan u prisustvu β-laktamaze (i penicilinaze i cefalosporinaze) koje proizvode pojedine bakterije, a snažan je inhibitor βlaktamaza pojedinih G- bakterija koje su rezistentne na većinu β-laktamskih antibiotika. Sistematski IUPAC naziv za Imipenem je (5R,6S)-6-[(1R)-1-hidroksietil]-3-({2[(iminometil)amino]etil}tio)-7-okso-1-azabiciklo[3.2.0]hept-2-en-2-karboksilna kiselina, a njegov CAS registarski broj je 74431-23-5 i njegova hemijska formula je kao što je opisano ispod, u Formuli 1:
[0100] Kao što će biti detaljno opisano u nastavku teksta, Imipenem se generalno daje zajedno sa Cilastatinom.
Cilastatin
[0101] Cilastatin je jedinjenje koje inhibira humanu dehidropeptidazu, enzim odgovoran za in vivo razlaganje antibiotika Imipenema. Shodno tome, Cilastatin može biti primenjivan zajedno sa Imipenemom da bi se zaštitila njegova razgradnja dehidropeptidazom, čime se produžava poluživot u cirkulacije, a time i njegov antibakterijski efekat u telu. Cilastatin sam po sebi nema antibiotsku aktivnost. Kao što je stručnjak svestan, sam Imipenem je efikasan antibiotik i može biti primenjen bez Cilastatina. Ipak, poželjno je da se Imipenem primenjuje sa Cilastatinom, poželjno u odnosu Imipenem:Cilastatin od 1:1.
Efekti aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutske kompozicije i „kompleta iz delova” pronalaska
[0102] Prema jednom aspektu koji je ovde opisan, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida ili njihovih derivata, farmaceutska kompozicija i/ili komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska mogu biti davane sisaru, poželjno čoveku. Alternativno, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida ili njihovih derivata, farmaceutska kompozicija i/ili komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska mogu biti davane organizmima različitim od sisara, poželjno kokoški, patki, guski, noju, golubu i/ili ćurki. Svrha davanja jedne ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutske kompozicije i/ili komponenti „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska može biti preventivna (da bi se izbegao razvoj ovih bolesti) i/ili terapijska (lečenje ovih bolesti jednom kada su se one razvile/uspostavile).
[0103] Podrazumeva se da se jedna ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutska kompozicija i/ili komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska daju u farmaceutski prihvatljivom obliku. Stručnjaci iz oblasti tehnike mogu utvrditi pravilnu dozu upotrebom standardnih procedura. Podrazumeva se i da doza treba da bude efektivna količina jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida (ili njihovih derivata), sa ili bez antibiotika, poželjno Imipenema, kao što je ovde prethodno opisano (i sa ili bez enzimskog inhibitora kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano) u pogledu efekta koji dovodi do smanjenja inflamatornog kod tretiranog subjekta.
[0104] Specifično zajedničko davanje (istovremeno, uzastopno ili odvojeno) jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska (ili njihovih derivata), poželjno CD6.PD3, ili njenog derivata, i antibiotika, poželjno Imipenema (poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano), obezbeđuje jasno poboljšane aditivne terapijske efekte, posebno u lečenju i/ili prevenciji infektivnih bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa, kod sisara uključujući čoveka, i/ili kod organizma različitog od sisara, uključujući kokošku, patku, gusku, noja, goluba i/ili ćurku.
Postupci lečenja
[0105] Upućivanja na postupke lečenja u narednim paragrafima ovog opisa treba tumačiti kao upućivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela sa terapijom (ili za dijagnozu).
[0106] Prema daljem aspektu, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutska kompozicija i/ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijanti, može biti upotrebljen kao medikament, poželjno u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara, uključujući čoveka, i/ili organizma različitog od sisara, uključujući kokošku, patku, gusku, noja, goluba i/ili ćurku, i to od infektivne boleste, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa. Predmetni pronalazak stoga obezbeđuje jednu ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutsku kompoziciju i/ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijanti, za upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa, a što obuhvata davanje jedne ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutske kompozicije i/ili „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska sisaru i/ili organizmu koji nije sisar. Na primer, sisar može biti glodar (kao što je miš ili pacov), primat (kao što je čovekoliki majmun, majmun ili lemur), pas, mačka, zec i kopitar kao što su goveda, konji ili svinje. U poželjnom primeru izvođenja, sisar je čovek. Na primer, organizam različit od sisara može biti kokoška, patka, guska, noj, golub, ćurka itd.).
[0107] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje jednu ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutsku kompoziciju i/ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijanti, za upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa, a što obuhvata davanje sisaru, poželjno čoveku, i/ili organizmu koji nije sisar, kao što je prethodno opisano, aminokiselinske sekvence koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, ili davanje farmaceutske kompozicije i/ili „kompleta iz delova” koji su kao što je prethodno definisano, a koji sadrže aminokiselinsku sekvence koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0108] Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje jednu ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutsku kompoziciju i/ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijanti, za upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa, a koji obuhvata davanje sisaru, poželjno čoveku, i/ili organizmu koji nije sisar, kao što je prethodno opisano, aminokiselinske sekvence koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, ili davanje farmaceutske kompozicije i/ili „kompleta iz delova” koji su kao što je prethodno definisano, a koji sadrže aminokiselinsku sekvence koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0109] Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje jednu ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), farmaceutsku kompoziciju i/ili „komplet iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijanti, za upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa, a koji obuhvata davanje sisaru, poželjno čoveku, i/ili organizmu koji nije sisar, kao što je prethodno opisano, aminokiselinske sekvence koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, ili davanje farmaceutske kompozicije i/ili „kompleta iz delova” koji su kao što je prethodno definisano, a koji sadrže aminokiselinsku sekvence koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0110] Prema predmetnom pronalasku, prethodno pomenuti derivati sadrže jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
[0111] Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje „komplet iz delova” predmetnog pronalaska za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu upotrebu u vidu medikamenta. Preciznije, predmetni pronalazak obezbeđuje „komplet iz delova” predmetnog pronalaska za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara uključujući čoveka i/ili kod organizma različitog od sisara, kao što je prethodno opisano, i to infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog od infektivnog agensa.
[0112] U posebnom primeru izvođenja pronalaska, infektivna bolest je mikrobna infekcija. U konkretnijim primerima izvođenja, mikrobna infekcija je izabrana iz grupe koja se sastoji od bakterijske infekcije (bilo G+ ili G- bakterijama, saprofitnim ili patogenim, aerobnim ili anaerobnim), gljivične infekcije, virusne infekcije, parazitske infekcije i njihovih kombinacija (polimikrobna infekcija).
[0113] U još jednom posebnom primeru izvođenja, infektivna bolest je septikemija. Kao što se ovde upotrebljava, termin „septikemija” odnosi se na prisustvo bilo kog mikroba u krvotoku. Preciznije, septikemija je izabrana iz grupe koja se sastoji od bakteremije, fungemije, viremije, parazitemije i njihovih kombinacija.
[0114] Prisustvo vijabilnih mikroba se može naći u većini slučajeva inflamatornih stanja povezanih sa infektivnom bolešću, dok 20% do 30% pacijenata nema mikrobe identifikovane iz bilo kog izvora, već proizvode koji iz njih nastaju. Prema tome, u drugom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je povezano sa proizvodom nastalim iz infektivnog agensa. Preciznije, infektivni agens je izabran iz grupe koja se sastoji od bakterije (bilo G+ ili G- bakterija, saprofitna ili patogena, aerobna ili anaerobna), gljivice, virusa, parazita i/ili njihovih kombinacija.
[0115] Sepsa se definiše kao prisustvo ili pretpostavljeno prisustvo infekcije udružene sa dokazima o sistemskom odgovoru koji se naziva sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS). Za definiciju sepse, kao referenca može poslužiti članak „Severe sepsis and septic shock: review of the literature and emergency department management guidelines״, H.B. Nguyen i saradnici, Ann. Emergency Med.2006, vol.48, pp.28-54. Sepsu obično prouzrokuju bakterijske infekcije (bilo G+ ili G- bakterija), ali ona može biti prouzrokovana i drugim patogenima. Sepsu međutim najčešće izazivaju G+ i G- bakterijske infekcije. Ipak, povrede i simptomi koji se mogu pripisati sepsi nisu prouzrokovani samo celim živim bakterijama, već su takođe prouzrokovani komponentom bakterijskog ćelijskog zida koje su poznate kao endotoksini. Endotoksini (npr. LPS, LTA, PGN) su glikolipidi koji su sveprisutni u spoljašnjoj membrani G+ i G- bakterija. Endotoksini se oslobađaju kada imunski sistem uništi bakteriju koja napada organizam. Oslobođeni endotoksini se vezuju za imunske ćelije (monocite, makrofage, granulocite, limfocite i endotelne i epitelne ćelije), čime se pokreće proizvodnja raznih solubilnih medijatora inflamacije kao što su citokini (npr. TNF-α, IL-1β i IL-6) i hemokini (npr. IL-8), koji su glavni uzrok teških oblika sepse.
[0116] U posebnom primeru izvođenja pronalaska, inflamatorno stanje je SIRS (sindrom sistemskog inflamatornog odgovora). U drugom posebnom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je sepsa. SIRS se definiše kao prisustvo dva ili više od sledećeg: (1) temperature veće od 38°C ili manje od 36 °C; (2) brzine pulsa veće od 90 otkucaja/min; (3) stope disanja veće od 20 udisaja/min (ili PCOz manji od 32 tora); i (4) broj belih krvnih zrnaca veći od 12000/mm<3>ili manji od 4000/mm<3>, ili više od 10% nezrelih oblika leukocita.
[0117] U posebnom primeru izvođenja, sepsa je polimikrobna sepsa. Polimikrobna sepsa se definiše kao složena sistemska infekcija koja uključuje istovremeno prisustvo višestrukih infektivnih agenasa (npr. bakterijskih i gljivičnih; saprofitnih i patogenih; aerobnih i anaerobnih itd.).
[0118] U drugom posebnom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je teška sepsa. Teška sepsa se definiše kao sepsa koja je praćena jednom ili sa više disfunkcija organa. Disfunkcija organa može biti definisana kao akutna povreda pluća; abnormalnosti koagulacije; trombocitopenija; izmenjen mentalni status; bubrežna, insuficijencija jetre ili srca; ili hipoperfuzija sa laktatnom acidozom.
[0119] U drugom posebnom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je septički šok. Septički šok se definiše kao prisustvo sepse i refraktorne hipotenzije, tj. kao sistolni krvni pritisak manji od 90 mmHg, srednji arterijski pritisak manji od 65 mmHg, ili kao smanjenje sistolnog krvnog pritiska za 40 mmHg u poređenju sa početnom linijom koja ne reaguje na izazov sa kristaloidnom tečnošću od 20 do 40 ml/kg. Prema tome, septički šok je zapravo oblik teške sepse. Konačno, septički šok može biti septički šok izazvan endotoksinom.
[0120] Izvor infekcije može biti bilo koje od brojnih mesta širom tela. Uobičajena mesta infekcije koja mogu dovesti do sepse obuhvataju sledeće: zapaljenje slepog creva (apendicitis), divertikulitis, probleme sa crevima, infekciju trbušne duplje (peritonitis) i infekcije žučne kese ili jetre; upale ili infekcije mozga ili kičmene moždine (meningitis, encefalitis); infekcije pluća kao što je upala pluća; infekcije kože kroz rane ili kroz otvore napravljene intravenskim kateterima, celulitis (inflamacija vezivnog tkiva kože); infekcije urinarnog trakta, posebno ukoliko pacijent ima urinarni kateter za dreniranje urina; stomatološki i ginekološki pregledi ili tretmani; tupe ili penetrirajuće traume, operacije, i endokarditis.
[0121] Davanje jedne ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), kombinacije, kompozicije, farmaceutske kompozicije i/ili „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijatni, sisaru, uključujući čoveka, i/ili organizmu koji nije sisar, kao što je prethodno opisano, može biti urađeno intraperitonealno (i.p.) i/ili intravenski (i.v.).
[0122] Prema jednom aspektu koja je ovde opisan, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci, peptida (ili njihovih derivata), kao i farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njihovih varijanti, može biti data sisaru, uključujući čoveka, i/ili organizmu koji nije sisar, kao što je prethodno opisano, na sledeći način. Jedna doza jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, poželjno CD6.PD3, ili njenog derivata, (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, poželjno CD6.PD3, ili njihov derivat, kao i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne eksipijense) daje se što je ranije moguće, poželjno i.v., izborno tokom tretmana antibiotikom (poželjno Imipenemom) (poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano). Optimalna doza peptida kod miševa je 3-15 mg/kg, poželjno 6-12 mg/kg. Kao što bi stručnjak podrazumevao, optimalna doza peptida za druge sisare, uključujući ljude (i za organizme različite od sisara), trebalo bi ustanoviti u kliničkim testovima.
[0123] Prema drugom aspektu koji je ovde opisan, komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska mogu biti davane na sledeći način. Jedna doza jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, poželjno CD6.PD3, ili njihov derivat (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, poželjno CD6.PD3, ili njihov derivat, kao i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne eksipijense) daje se što je ranije moguće, poželjno i.v., a nakon toga se primenjuje antibiotik, poželjno Imipenem (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, kao i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne ekscipijense) (poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano) subjektu kome je to potrebno.
[0124] Prema drugom aspektu koji je ovde opisan, komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska mogu biti davane na sledeći način. Najpre se subjektu kome je to potrebno daje antibiotik, poželjno Imipenem (ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antibiotik, poželjno Imipenem, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljivih soli, adjuvanse i/ili pogodne ekscipijense) (poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin, kao što je prethodno opisano). Nakon toga, daje se jedna doza jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, poželjno CD6.PD3, ili njenog derivata, (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, poželjno CD6.PD3, ili njihov derivata, i farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne ekscipijense), poželjno i.v.
[0125] Alternativno, subjektu kome je to potrebno se ne daje samo jedna doza jedne ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihovih derivata, kao što je prethodno opisano, već subjektu kome je to potrebno može biti dato više od jedne doze, kao što su dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više doza koje mogu biti date subjektu kome je to potrebno. Kao što stručnjak može razumeti, jedna dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više doza, bilo pre, tokom ili nakon davanja antibiotika, poželjno Imipenema (poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin). Dodatno, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, ili njihovih derivata ne mora biti davana u dozama, već u vidu kontinuirane perfuzije (poželjno i.v.), bilo pre, tokom ili nakon davanja antibiotika, poželjno Imipenema (poželjno zajedno sa enzimskim inhibitorom kao što je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor, poželjno Cilastatin).
[0126] Naravno, subjekat kome je to potrebno, može biti pod tretmanom drugim lekovima kao što su drugi antibiotici, kada se daju jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida (ili njihovih derivata), kombinacija, kompozicija, farmaceutska kompozicija i/ili komponente „kompleta iz delova” predmetnog pronalaska, u bilo kojoj od njegovih varijanti.
[0127] „Terapijski efektivna količina” označava količinu jedinjenja koja je efektivna u lečenju imenovanog poremećaja ili stanja.
[0128] Termini „lečenje” ili „terapija” obuhvataju i profilaktičke i kurativne postupke lečenja bolesti, pošto su oba usmerena na održavanje ili obnavljanje zdravlja. Bez obzira na poreklo oštećenja, nelagodnosti ili nesposobnosti, olakšanje istih, davanjem odgovarajućeg agensa, treba tumačiti kao terapiju ili terapijsku upotrebu u kontekstu predmetne prijave.
[0129] Jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida (ili njihovih derivata), farmaceutska kompozicija i/ili „komplet iz delova” pronalaska mogu stoga biti upotrebljavani u postupku terapijskog tretmana (nakon kliničke manifestacije bolesti) i/ili profilaktičkog tretmana (pre kliničke manifestacije bolesti).
Konjugat
[0130] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska. Konjugat je poželjno konjugat gde je jedna ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida pronalaska konjugovana (poželjno kovalentno vezana) sa nosačem, poželjno polimerom, kao što je solubilni polimer ili, poželjno, nesolubilan polimer.
[0131] „Konjugat tipa peptid-nosač” ili „konjugat” je definisan kao hibridni konstrukt koji kombinuje aminokiselinske sekvence i/ili peptide sa nosačem. Veza sa nosačem može biti uspostavljena preko NH2ili COOH grupa aminokiselinske sekvence i/ili peptida ili preko bilo koje druge funkcionalne grupe bočnih lanaca aminokiselina. Nosač može biti solubilni polimer, ili nesolubilni polimer, u kojima su aminokiselinska sekvenca i/ili peptid imobilisani u vidu čvrstog ili materijala tipa hidrogela.
[0132] Da bi se jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptidi (ili njihovi derivata) konjugovali (ili fiksirali, ili zakačili, ili povezali, ili kuplovali, ili vezali, poželjno kovalentno) sa nosačem, nosač stoga može poželjno sadržavati jednu ili više funkcionalnih grupa. Reprezentativni primeri tih funkcionalnih grupa su sledeći: hidroksilna grupa, amino grupa, aldehidna grupa, karboksilna grupa, tiolska grupa, silanolna grupa, amidna grupa, epoksi grupa, halogena grupa, sukcinilimidna grupa i acil anhidridna grupa.
[0133] U poželjnom primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0134] U drugom primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0135] U daljem primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0136] U daljem primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0137] U daljem primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0138] U daljem primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0139] U daljem primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD3 (GQVEVHFRGVW, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD2 (GRVEMLEHGEW, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od CD6.PD1 (GTVEVRLEASW, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0140] U prethodnim primerima izvođenja konjugata predmetnog pronalaska, navedeni derivati sadrže jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
[0141] Konjugat predmetnog pronalaska može dalje sadržavati jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje sadrže peptide CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) i/ili CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3). Aminokiselinska sekvenca može biti linearna ili ciklična. Poželjno, aminokiselinska sekvenca se nalazi unutar ektodomena humanog CD6. U poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca je sadržana unutar SEQ ID NO.: 4. U posebnom primeru izvođenja, linearna ili ciklična aminokiselinska sekvenca sadrži između 12 i 17 susednih aminokiselina koje čine peptide CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) ili CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3) i poželjno je sadržana u SEQ ID NO.: 4. Primeri poželjnih aminokiselinskih sekvenci koje mogu biti sadržane u uređaju predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na: CSGTVEVRLEASWEPAC (SEQ ID NO.: 13), SGTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 14), SGTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 15), SGTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 16), SGTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 17), GTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 18), GTVEVRLEASWEP (SEQID NO.: 19), GTVEVRLEASWE (SEQID NO.: 20), CAGRVEMLEHGEWGSVC (SEQ ID NO.: 21), AGRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 22), AGRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 23), AGRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 24), AGRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 25), GRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 26), GRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 27), GRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 28), CEGQVEVHFRGVWNTVC (SEQ ID NO.:29), EGQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 30), EGQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 31), EGQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 32), EGQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 33), GQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 34), GQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 35), GQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 36).
[0142] Jedna ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska sadržanih u konjugatu mogu biti konjugovani (poželjno kovalentno vezani) sa nosačem. Nosač može biti nesolubilan nosač. Nesolubilan nosač može biti čvrsta podloga koja može sadržavati nesolubilan neorganski nosač kao što su staklena zrnca ili silika gel; sintetički polimer kao što je umreženi polivinil alkohol, umreženi poliakrilat, umreženi polimetakrilat, umreženi poliakrilamid, umreženi polikarbonat, umreženi polisulfon, umreženi polietar sulfon ili umreženi polistiren, ili organski nosač koji sadrži polisaharid kao što je kristalna celuloza, umrežena celuloza, umrežena agaroza ili umreženi dekstran, ili kompozitni nosač dobijen iz kombinacije prethodno pomenutih jedinjenja, kao što su organsko-organski nosač i organsko-neorganski nosač. Čvrsta podloga takođe može biti metalna podloga, kao što su magnetna zrnca.
[0143] Poželjno, nosač može biti porozan matriks koja ima veličinu čestica između 50 i 300 μm. Poželjno, čvrsta podloga je Eupergit<®>, koji predstavlja makroporozna zrnca sa prečnikom od 100-250 µm, napravljena kopolimerizacijom N,N'-metilen-bis-(metakrilamida), glicidil metakrilata, alil glicidil etra i metakrilamida.
[0144] U poželjnom primeru izvođenja, konjugat Eupergit<®>zrnaca obloženih peptidom se dobija tretmanom polimernih zrnaca sa rastvorom peptida pronalaska u pH puferu. Poželjno, polimerna zrnca se inkubiraju sa peptidima pronalaska na sobnoj temperaturi u natrijum fosfatnom puferu.
[0145] Jedna ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska sadržanih u konjugatu mogu biti konjugovani (poželjno kovalentno vezani) sa solubilnim nosačem, kao što je albumin, ili sa solubilnim polimerom, kao što su, na primer, PEG, dekstran, polisijalne kiseline, hijaluronska kiselina ili hidroksietil-skrob.
[0146] Konjugat pronalaska može biti upotrebljen u vidu medikamenta, poželjno u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara uključujući čoveka, ili kod organizma različitog od sisara, i to infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa.
Uređaj
[0147] Dalji aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na uređaj, poželjno medicinski uređaj, koji se takođe može označiti kao „adsorbent”, a koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida predmetnog pronalaska (“uređaj predmetnog pronalaska”).
[0148] Uređaj predmetnog pronalaska je uređaj za ekstrakorporalno uklanjanje najmanje jedne hemijske komponente površinskih struktura Gram- i/ili Gram+ bakterija, kao što je lipopolisaharid (LPS), lipoteihoična kiselina (LTA) i/ili peptidoglikan (PGN) iz telesne tečnosti životinje, kao što je sisar, poželjno čovek, pri čemu je poželjno da je navedena telesna tečnost krv, plazma, serum ili druga pogodna frakcija krvi, pri čemu uređaj sadrži čvrstu podlogu i sadrži jednu ili više od aminokiselinskih sekvenci koje sadrže ili se, alternativno, sastoje od sekvenci koje slede, ili njihovog derivata, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima:
CD6.PD1: GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1);
CD6.PD2: GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2); i/ili
CD6.PD3: GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3).
[0149] Dodatno, uređaj predmetnog pronalaska može sadržavati jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje sadrže peptide CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) i/ili CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3). Aminokiselinska sekvenca može biti linearna ili ciklična. Poželjno, aminokiselinska sekvenca je sadržana unutar ektodomena humanog CD6. U poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca je sadržana unutar SEQ ID NO.: 4. U posebnom primeru izvođenja, linearna ili ciklična aminokiselinska sekvenca sadrži između 12 i 17 susednih aminokiselina koje čine peptide CD6.PD1 (SEQ ID NO.: 1), CD6.PD2 (SEQ ID NO.: 2) ili CD6.PD3 (SEQ ID NO.: 3), a poželjno je sadržana unutar SEQ ID NO.: 4. Primeri poželjnih aminokiselinskih sekvenci koje mogu biti sadržane u uređaju predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na: CSGTVEVRLEASWEPAC (SEQ ID NO.: 13), SGTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 14), SGTVEVRLEASWEP (SEQ ID NO.: 15), SGTVEVRLEASWE (SEQ ID NO.: 16), SGTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 17), GTVEVRLEASWEPA (SEQ ID NO.: 18), GTVEVRLEASWEP (SEQID NO.: 19), GTVEVRLEASWE (SEQID NO.: 20), CAGRVEMLEHGEWGSVC (SEQ ID NO.: 21), AGRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 22), AGRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 23), AGRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 24), AGRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 25), GRVEMLEHGEWGSV (SEQ ID NO.: 26), GRVEMLEHGEWGS (SEQ ID NO.: 27), GRVEMLEHGEWG (SEQ ID NO.: 28), CEGQVEVHFRGVWNTVC (SEQ ID NO.:29), EGQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 30), EGQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 31), EGQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 32), EGQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 33), GQVEVHFRGVWNTV (SEQ ID NO.: 34), GQVEVHFRGVWNT (SEQ ID NO.: 35), GQVEVHFRGVWN (SEQ ID NO.: 36).
[0150] Poželjno, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata.
[0151] Na primer, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0152] Na primer, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0153] U poželjnom primeru izvođenja, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (CD6.PD2, SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata.
[0154] U daljem primeru izvođenja, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0155] U daljem primeru izvođenja, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (CD6.PD2 SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0156] U daljem poželjnom primeru izvođenja, uređaj predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GRVEMLEHGEW (CD6.PD2 SEQ ID NO.: 2), ili njenog derivata, aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GTVEVRLEASW (CD6.PD1, SEQ ID NO.: 1), ili njenog derivata, ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od GQVEVHFRGVW (CD6.PD3, SEQ ID NO.: 3), ili njenog derivata.
[0157] U prethodim primerima izvođenja uređaja predmetnog pronalaska, navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
[0158] Uređaj predmetnog pronalaska može sadržavati konjugat koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida predmetnog pronalaska. Konjugat je poželjno konjugat gde su jedna ili više aminokiselinskih sekvenci i/ili peptida pronalaska konjugovani (poželjno kovalentno vezani) sa nosačem, poželjno polimerom, poželjno nesolubilnim polimerom.
[0159] Uređaj je pogodan za selektivno vezivanje i razdvajanje najmanje jedne komponente iz vodenog rastvora, poželjno telesne tečnosti kao što su krv, plazma serum ili druge pogodne frakcije krvi. Vodeni rastvor potencijalno sadrži najmanje jednu komponentu koja se selektivno vezuje za i razdvaja uređajem pronalaska. Na primer, najmanje jedna komponenta potencijalno sadržana u vodenom rastvoru (koji je poželjno telesna tečnost kao što je krv, plazma serum ili druga odgovarajuća frakcija krvi) je jedna ili više hemijskih komponenti površinskih struktura Gram- i/ili Gram+ bakterija, kao što je endotoksin, poput LPS, LTA i/ili PGN.
[0160] Važne hemijske komponente površinskih struktura bakterija su sledeće (iz Medical Microbiology, 4. izdanje, Baron S, urednik; Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996):
‑ Peptidoglikani ćelijskog zida (PGN): I G+ i G- bakterije poseduju peptidoglikane ćelijskog zida, koji omogućavaju karakterističan ćelijski oblik i obezbeđuju ćeliji mehaničku zaštitu. Peptidoglikani su jedinstveni za prokariotske organizme i sastoje se od glikanske osovine muramske kiseline i glukozamina (oba su N-acetilisani) i peptidnih lanaca koji su visoko umreženi sa mostovima u G+ bakterijama (npr. Staphilococcus aureus) ili delimično umreženi u G- bakterijama (npr. Escherichia coli). Transpeptidazni enzimi unakrsnog povezivanja su neke od ciljnih molekula za β-laktamske antibiotike.
‑ Teihoične kiseline (TA): Teihoične kiseline su poliol fosfatni polimeri koji nose jako negativno naelektrisanje. One su kovalentno povezane sa peptidoglikanom u pojedinim G+ bakterijama. One su snažno antigene, ali su u principu odsutne u G- bakterijama.
● Lipoteihoične kiseline (LTA): Lipoteihoične kiseline kao membranske teihoične kiseline su polimeri amfifilnih glikofosfata sa lipofilnim glikolipidom i usidrene su u citoplazmatskoj membrani. One su antigene, citotoksične i adhezini (npr. Streptococcus pyogenes).
‑ Lipopolisaharidi (LPS): Jedna od glavnih komponenti spoljašnje membrane G- bakterija je lipopolisaharid (endotoksin), složeni molekul koji se sastoji od „sidra” u vidu lipida A, polisaharidnog jezgra i lanaca ugljenih hidrata. Šećeri u polisaharidnim lancima obezbeđuju serološku specifičnost.
‑ Oblici bez zida: Dve grupe bakterija lišene peptidoglikana ćelijskog zida su Mycoplasma vrste, koje poseduju površinsku membransku strukturu, i L-oblici koje nastaju bilo iz G+ ili G- bakterijskih ćelija koje su izgubile sposobnost da proizvode peptidoglikanske strukture.
[0161] Poželjno, medicinski uređaj predmetnog pronalaska je hemadsorpcioni medicinski uređaj, kao što je medicinski uređaj za ekstrakorporalno uklanjanje jedne ili više hemijskih komponenti površinskih struktura G- i/ili G+ bakterija, poput endotoksina (npr. LPS, LTA i/ili PGN) tokom hemoperfuzije.
[0162] Jedna ili više aminokiselinskih sekvenci, ili peptida predmetnog pronalaska, ili njihov derivat, koji su sadržani u uređaju predmetnog pronalaska, kao što je opisano u nastavku, može biti fiksiran na čvrstu podlogu. Čvrsta podloga može biti neorganski nosač koji je nerastvorljiv u vodi kao što su staklena zrnca ili silika gel; sintetički polimer kao što je umreženi polivinil alkohol, umreženi poliakrilat, umreženi polimetakrilat, umreženi poliakrilamid, umreženi polikarbonat, umreženi polikarbonat, umreženi polisulfon, umreženi polietar sulfon ili umreženi polistiren, ili organski nosač koji sadrži polisaharid, kao što je kristalna celuloza, umrežena celuloza, umrežena agaroza ili umreženi dekstran, ili kompozitni nosač dobijen iz kombinacije prethodno pomenutih jedinjenja, kao što je organsko-organski nosač i organsko-neorganski nosač. Čvrsta podloga može takođe biti metalna podloga, kao što su magnetna zrnca.
[0163] Čvrsta podloga može biti porozni matriks u granularnom obliku, u obliku zrnaca, vlakana, vlaknastih membrana, filmova ili gela.
[0164] Čvrsta podloga može biti porozan matriks koja ima veličinu čestica između 50 i 300 μm. Poželjno, čvrsta podloga je Eupergit<®>, koji predstavlja makroporozna zrnca sa prečnikom od 100-250 µm, napravljena kopolimerizacijom N,N'-metilen-bis-(metakrilamida), glicidil metakrilata, alil glicidil etra i metakrilamida.
[0165] Da bi se jedna ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida (ili njihovih derivata) fiksirali (ili zakačili, ili vezali, ili kuplovali) za čvrstu podlogu, čvrsta podloga stoga mora poželjno sadržavati jednu ili više funkcionalnih grupa. Reprezentativni primeri tih funkcionalnih grupa su sledeći: hidroksilna grupa, amino grupa, aldehidna grupa, karboksilna grupa, tiolska grupa, silanolna grupa, amidna grupa, epoksi grupa, halogena grupa, sukcinilimidna grupa i acid anhidridna grupa.
[0166] Medicinski uređaj predmetnog pronalaska je u stanju da efikasno veže i razdvoji najmanje jednu komponentu iz vodenog rastvora koji potencijalno sadrži navedenu najmanje jednu komponentu. Na primer, uređaj predmetnog pronalaska je u stanju da uhvati hemijske komponente površinskih struktura bakterija (G+ i/ili G-), kao što su endotoksini, poput LPS, LTA i/ili PGN, pošto bi se toksini vezali za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida (ili njihovih derivata) predmetnog pronalaska fiksiranih na čvrstoj podlozi uređaja. Poželjno, uređaj predmetnog pronalaska je u stanju da uhvati jednu ili više hemijskih komponenti površinskih struktura G- i/ili G+ bakterija, kao što su endotoksini poput LPS, LTA i/ili PGN, koji su potencijalno prisutni u vodenom rastvoru izabranom od vode, pune krvi ili telesnih tečnosti kao što su plazma, serum ili druge pogodne frakcije krvi. Ovo se postiže propuštanjem vodenog rastvora kao što su voda, krv ili druge telesne tečnosti kroz uređaj. Kada se upotrebljava klinički, uređaj poželjno može biti primenjen ekstrakorporalno.
[0167] Prema jednom aspektu, ovde je opisan postupak za uklanjanje, poželjno ekstrakorporalno uklanjanje, najmanje jedne komponente, poželjno jedne ili više hemijskih komponenti površinskih struktura G- i/ili G+ bakterija, kao što su endotoksini poput LPS, LTA i/ili PGN, iz vodenog rastvora koji potencijalno sadrži navedenu najmanje jednu komponentu, poželjno iz telesnih tečnosti životinja, kao što su sisari ili organizmi koji su različiti od sisara, kao što je prethodno opisano, a poželjno iz sisara, uključujući ljudska bića, kao što su krv, plazma, serum ili druge odgovarajuće frakcije krvi, pri čemu navedeni postupak obuhvata:
- obezbeđivanje vodenog rastvora, poželjno telesnih tečnosti iz životinje, kao što je sisar i/ili organizam različit od sisara, a poželjno je sisar, uključujući ljudsko biće, kao što su krv, plazma, serum ili druge odgovarajuće frakcije krvi, koje potencijalno sadrži navedenu najmanje jednu komponentu,
- propuštanje vodenog rastvora, poželjno telesnih tečnosti iz životinje, kao što je sisar i/ili organizam različit od sisara, a poželjno je sisar, uključujući ljudsko biće, kao što su krv, plazma, serum ili druge odgovarajuće frakcije krvi, kroz medicinski uređaj predmetnog pronalaska, pod uslovima koji utiču na vezivanje navedene najmanje jedne komponente, poželjno jedne ili više hemijskih komponenti površinskih struktura G- i/ili G+ bakterija, kao što su endotoksini poput LPS, LTA i/ili PGN, za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, ili njihovih derivata, fiksiranih na čvrstu podlogu medicinskog uređaja, uklanjajući time najmanje jednu komponentu iz vodenog rastvora.
[0168] U skladu sa navedenim, uređaj predmetnog pronalaska može biti upotrebljen u postupaki za uklanjanje, poželjno ekstrakorporalno uklanjanje, najmanje jedne komponente, poželjno najmanje jedne hemijske komponente površinskih struktura G- i/ili G+ bakterija, kao što su endotoksini poput LPS, LTA i/ili PGN, iz vodenog rastvora, poželjno telesnih tečnosti životinje, kao što je sisar i/ili organizam različit od sisara, a poželjno je sisar, uključujući ljudsko biće, kao što su krv, plazma, serum ili druge odgovarajuće frakcije krvi, kao što je opisano u nastavku teksta.
[0169] Na primer, sisar može biti glodar (kao što je miš ili pacov), primat (kao što je čovekoliki majmun, majmun ili lemur), pas, mačka, zec i kopitar kao što su goveda, konji ili svinje. U poželjnom primeru izvođenja, sisar je čovek. Na primer, organizam različit od sisara može biti kokoška, patka, guska, noj, golub, ćurka itd.).
[0170] Uređaj pronalaska može stoga biti uporebljen u vidu medikamenta, poželjno u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara uključujući čoveka, ili kod organizma različitog od sisara, i to lečenju infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa.
[0171] Prema drugom aspektu, ovde je opisan terapijski i/ili preventivni postupak lečenja infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja povezanog sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti povezane sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa, radi ekstrakorporalnog uklanjanja najmanje jedne komponente, poželjno jedne ili više hemijskih komponenti površinskih struktura G- i/ili G+ bakterija, kao što su endotoksini poput LPS, LTA i/ili PGN, iz vodenog rastvora, poželjno telesnih tečnosti životinje, poželjno sisara, uključujući ljudsko biće, ili iz organizma koji nije sisar, kao što su krv, plazma, serum ili druge odgovarajuće frakcije krvi.
[0172] Terapijski i/ili preventivni postupak lečenja obuhvata propuštanje vodenog rastvora koji potencijalno sadrži najmanje jednu komponentu, poželjno telesne tečnosti životinje, poželjno sisara, uključujući čoveka, ili kod organizma različitog od sisara, kao što je krv, plazma, serum ili druge pogodne frakcije krvi, kroz medicinski uređaj predmetnog pronalaska pod uslovima koji utiču na vezivanje navedene najmanje jedne komponente, poželjno jedne ili više hemisjskih komponenti površitnski struktura G- i/ili G+ bakterija, kao što su endotoksini poput LPS, LTA i/ili PGN, za jednu ili više aminokiselinskih sekvenci ili peptida, ili njihovih derivata, fiksiranih na čvrstu podlogu medicinskog uređaja, čime se iz vodenog rastvora uklanja najmanje jedna komponenta.
[0173] U posebnom primeru izvođenja, infektivna bolest je mikrobna infekcija. U konkretnijim primerima izvođenja, mikrobna infekcija je izabrana iz grupe koja se sastoji od bakterijske infekcije (bilo G+ ili G- bakterijama, saprofitnim ili patogenim, aerobnim ili anaerobnim), gljivične infekcije, virusne infekcije, parazitske infekcije i njihovih kombinacija (polimikrobna infekcija).
[0174] U još jednom posebnom primeru izvođenja, infektivna bolest je septikemija. Kao što se ovde upotrebljava, termin „septikemija” se odnosi na prisustvo bilo kog mikroba u krvotoku. Preciznije, septikemija je izabrana iz grupe koja se sastoji od bakterijemije, fungemije, viremije, parazitemije i njihovih kombinacija. U drugom posebnom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je teška sepsa. U posebnom primeru izvođenja, sepsa je polimikrobna sepsa. U posebnom primeru izvođenja pronalaska, inflamatorno stanje je SIRS (sindrom sistemskog inflamatornog odgovora). U drugom posebnom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je sepsa. U drugom posebnom primeru izvođenja, inflamatorno stanje je septički šok. Konačno, septički šok može biti septički šok indukovan endotoksinom.
[0175] Termini „lečenje” ili „terapija” obuhvataju i profilaktičke i kurativne postupke lečenja bolesti, pošto su oba usmerena na održavanje ili obnavljanje zdravlja. Bez obzira na poreklo oštećenja, nelagodnosti ili nesposobnosti, olakšanje istih, primenom odgovarajućeg agensa, treba tumačiti kao terapiju ili terapijsku upotrebu u kontekstu predmetne prijave.
[0176] Tokom opisa patentnih zahteva, nije predviđeno da reč „koji sadrži” i njene varijante isključuju druge tehničke karakteristike, aditive, komponente ili korake. Dodatno, termin „koji sadrži” može obuhvatiti i pojam „koji se sastoji od”.
[0177] Kao što se ovde upotrebljava, termin „oko” označava naznačenu vrednost ± 1% od njene vrednosti, ili termin „oko” označava naznačenu vrednost ± 2% od njene vrednosti, ili termin „oko” označava naznačenu vrednost ± 5% od njene vrednosti, termin „oko” označava naznačenu vrednost ± 10% od njene vrednosti, ili termin „oko” označava naznačenu vrednost ± 20% od njene vrednosti, ili termin „oko” označava naznačenu vrednost ± 30% od njene vrednosti; poželjno termin „oko” označava tačno naznačenu vrednost (± 0%).
[0178] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde upotrebljavani sa istim su značenjem koje se uobičajeno podrazumeva od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni u praksi predmetnog pronalaska. Dodatni ciljevi, prednosti i karakteristike pronalaska će postati očigledni stručnjacima iz oblasti tehnike nakon pregleda opisa ili mogu biti naučeni primenom pronalaska. Primeri i crteži koji slede su obezbeđeni kao ilustracije i nije predviđeno da budu ograničavajući za predmenti pronalazak.
PRIMERI
Materijali i postupci
Proizvodnja i prečišćavanje rekombinantnih proteina i peptida
[0179] rshCD6 i rshCD5 proteini su prečišćavani praćenjem postupaka koji su prethodno prijavljeni (Sarrias MR i saradnici, 2004, Biochemical characterization of recombinant and circulating human Sp alpha. Tissue Antigens 63:335-44; Sarrias MR i saradnici, 2007, CD6 binds to pathogen-associated molecular patterns and protects from LPS-induced septic shock. Proc Natl Acad Sci USA 104:11724-9) upotrebom klonova SURE CHO-M ćelijske linije<™>(Selexis SUREtechnology Platform™, Ženeva, Švajcarska) i protokola za ekskluzionu hromatografiju po veličini koji su razvijeni u PX'Therapeutics (Grenobl, Francuska). Humani i goveđi seroalbumin (HAS i BSA, tim redom) su nabavljeni od kompanije Sigma-Aldrich (Sent Luis, MO).
[0180] Peptidi (CD6.PD1, GTVEVRLEASW (SEQ ID NO.: 1); CD6.PD2, GRVEMLEHGEW (SEQ ID NO.: 2) i CD6.PD3, GQVEVHFRGVW (SEQ ID NO.: 3); CD5.PD1, GQLEVYLKDGW (SEQ ID NO: 6); CD5.PD2, GVVEFYSGSLG (SEQ ID NO: 7); DMBT-1.pbs1, GRVEVLYRGSW (SEQ ID NO.: 8); i Peptid CD6 Pkons (takođe označen kao „Pcon”, „CD6 con”, „CD6.con”, „CD6 cons”, „PCons” ili „CD6.cons”, GRVEVLFRGSW (SEQ ID NO.: 9) (čistoće od 80%) proizvedeni su Sintezom peptida na čvrstoj fazi od strane kompanije ProteoGenix (Shiltigheim, Francuska), a od njih su pripremljeni štok rastvori od 5 mg/mL sa razblaženim (1:3) acetonitrilom.
Testovi bakterijske aglutinacije
[0181] Pomešano je (1:1) 5 × 10<8>jedinica koje formiraju kolonije (CFU)/mL, razblaženih u TTC puferu (50 mM Tris pH 7,5 sa 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20 i 1 mM Ca<2+>), sa različitim koncentracijama peptida (0-200 µg/mL), u mikrotitarskim pločama sa 96 bunarića, U oblika dna (Biofil) (Bikker FJ i saradnici, 2002, Identification of the bacteria-binding peptide domain on salivary agglutinin (gp-340/DMBT1), a member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily, J Biol Chem 277:32109-15). Nakon inkubacije preko noći na 37 ºC, bakterijska aglutinacija je ispitivana svetlosnom mikroskopijom i ocenjivana je od - (odsutno) do ++ (maksimalno) od strane dva nezavisna posmatrača.
Bakterijski sojevi
[0182] Višestruko rezistentan klinički izolat Acinetobacter baumanii, Enterobacer cloacae ATCC 23355, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Listeria monocytogenes ATCC 19111, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphyloccocus aureus ATCC 25923 i klinički izolat Staphilococus aureus (MRSA) rezistentan na meticilin, obezbedio je dr Jordi Vila (Odeljenje za mikrobiologiju, Bolnička klinika Barselone) i gajeni su u Luria Bertoni ili agaru sa 5% ovčije krvi (Becton Dikinson) na 37 °C, osim L. monocytogenes koja je kultivisana u infuzionoj tečnoj podlozi tipa Brain Heart (Pronadisa).
Testovi vezivanja
[0183] Eksperimenti intrizičke fluorescencije. Da bi se istražila sposobnost različitih peptida/proteina da vežu LTA (Mr = 14000, iz S. aureus) i grubi LPS (Re-LPS, Mr = 2500, iz Salmonella minnesota serotipa Re 595), studije vezivanja su sprovođene u spektrofluorimetru tipa AB2 sa termostatiranim držačem kiveta (± 0,1 ºC), upotrebom kvarcne kivete dužine putanje 5x5 mm, kao što je opisano (Coya JM i saradnici, 2015, Natural Anti-Infective Pulmonary Proteins: In Vivo Cooperative Action of Surfactant Protein SP-A and the Lung Antimicrobial Peptide SP-BN, J Immunol 195:1628-36). Koncentracija Re-LPS je procenjivana kvantifikacijom 2-keto-3-deoksioktulozonske kiseline (Garcia-Verdugo I i saradnici, 2003, Effect of hydroxylation and N187-linked glycosylation on molecular and functional properties of recombinant human surfactant protein A, Biochemistry 42:9532-42). Uzorci peptida/proteina (10 µg/mL) su titrirani različitim količinama štok rastvora, bilo LTA ili Re-LPS-a u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) pH 7,2, a emisioni spektri fluorescencije Trp su snimljeni uz ekscitaciju na 295 nm. Očitavanja intenziteta fluorescencije su korigovana za razblaženja prouzrokovana dodavanjem peptida/proteina. Intenzitet pozadinskog šuma u uzorcima bez peptida/proteina usled LTA ili Re-PS, oduziman je od svakog snimanja. Prividna konstanta disocijacije (Kd) kompleksa peptid/protein-ligand dobijana je nelinearnom korekcijom i upotrebom postupka najmanjih kvadrata i Hilove jednačine za promene peptidne fluorescencije na 353 nm sa količinom dodatog LTA ili Re-LPS (Garcia-Verdugo I i saradnici, 2003, Effect of hydroxylation and N187-linked glycosylation on molecular and functional properties of recombinant human surfactant protein A, Biochemistry 42:9532-42): ΔF/ΔFmax= [L]<n>/([L]<n>+ Kd), gde je ΔF je promena intenziteta fluorescencije na 353 nm u odnosu na intenzitet slobodnog peptida; ΔFmaxje promena intenziteta fluorescencije pri zasićenim koncentracijama LTA ili Re-LPS; [L] je molarna koncentracija slobodnog liganda; i n je Hilov koeficijent.
[0184] Testovi vezivanja za čvrstu fazu. Mikrotitarske ploče sa 96 bunarića (Nunc, Roskilde, Danska) su oblagani preko noći na 4 °C sa 5 µg/mL prečišćenog LPS-a (E. coli O111:B4, Sigma L2630) ili LTA (S. aureus, Sigma L2515) u PBS-u, nakon čega su inkubirane tokom 2 h na sobnoj temperaturi u rastvoru za blokiranje (20 mM Tris-HCl pH 7,4 sa 0,05% Tween 20 i 1% BSA). Dodavani su zatim peptidi/proteini obeleženi biotinom (2,5-20 µg/mL) i ploče su inkubirane preko noći na 4 ºC u rastvoru za blokiranje. Nakon opsežnog ispiranja, vezani peptidi/proteini su detektovani dodavanjem streptavidina obeleženog peroksidazom rena (HRP) (razblaženje od 1:5,000; DAKO) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Boja je razvijena dodavanjem 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinskog (TMB) tečnog supstrata (Sigma), a optička gustina je očitavana na 405-620 nm.
Dinamičko rasejavanje svetlosti (DLS)
[0185] Hidrodinamički prečnici peptida (10 µg/mL u PBS-u) mereni su na 25 °C u Zetasizer Nano S insturmentu kompanije Malvern Instruments (Vorčesteršir, UK) koji je bio opremljen sa 633 nm HeNe laserom, kao što je opisano (Saenz A i saradnici, 2010, Fluidizing effects of Creactive protein on lung surfactant membranes: protective role of surfactant protein A, FASEB J 24:3662-73). Za svaki uzorak su vršena četiri skeniranja, a uzorci su analizirani u triplikatu.
In vitro ćelijske kulture
[0186] Slezine iz C57BL/6 miševa starih 6-8 nedelja (Charles River) razložene su filtriranjem kroz ćelijsko sito i, nakon lize eritrocita, ćelije su resuspendovane u RPMI 1640 sa L-glutaminom (Lonza) u koji je bilo dodato 10% fetalnog telećeg seruma (BioWest), 100 U/mL penicilina, 100 mg/mL streptomicina i 50 mM 2-β merkaptoetanola (Merck). Ćelije (2×10<5>) su stimulisane tokom 48 h (na 37 ºC, u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2) u pločama sa 96 bunarića, U oblika dna (Biofil) koji su sadržvale LPS (0,5 µg/mL; E. coli O111:B4), u prisustvu ili odsustvu rastućih koncentracija peptida (0,5-20 µg/mL). Supernatanti kultura su prikupljani i izmereni su mišji citokini ELISA testom prema uputstvima proizvođača (BD Biosciences OptElA setovi).
Postupak ligacije i punkcije cekuma (CLP)
[0187] Procedure na životinjama je odobrila Etička komisija za eksperimentisanje na životinjama Univerziteta u Barseloni. Smrtnost visokog stepena (mortalitet ≥90%, u prvih 48-72 h) septičkog šoka indukovanog sa CLP, indukovan je kod mužjaka C57BL/6J miševa starih 8-10 nedelja (20-25 g; Charles River) kao što je ranije prijavljeno (Martinez-Florensa M i saradnici, 2017, Protective Effects of Human and Mouse Soluble Scavenger-Like CD6 Lymphocyte Receptor in a Lethal Model of Polymicrobial Sepsis, Antimicrob Agents Chemother 61:e01391-16).
[0188] Za procenu opterećenja bakterijama, uzorci krvi i slezine iz miševa tretiranih sa CLP su prikupljani, homogenizovani i aseptično razblaženi u sterilnom PBS-u. Serijska razblaženja su zasejavana preko noći na agar sa 5% ovčije krvi (Becton Dickinson), na 37 °C. Broj vijabilnih bakterija je izražen kao CFU/mL (krv) ili po mg (slezina).
Imobilizacija proteina/peptida na Eupergit<®>smoli
[0189] Proteini ili peptidi (po 2,5 mg svakog) imobilisani su preko NH2grupe na makroporoznoj akrilnoj EUPERGIT<®>smoli (0,2 g; Röhm-Pharma GmbH, Nemačka) prema prethodno opisanom protokolu (Zimmermann M i saradnici, 1999, Endotoxin adsorbent based on immobilized human serum albumin. Clin Chem Lab Med 37:373-379). Eupergit<®>smola obložena peptidima ili proteinima dobijena je inkubacijom polimernih zrnaca na sobnoj temperaturi, uz mešanje, sa rastvorom peptida u natrijum fosfatnom puferu 100 mM pH 8, tokom 24 sata. Nakon inkubacije, zrnca su isprane 3 puta sa 3 M natrijum hloridom pH 7,0, 30 mM natrijum fosfatnim puferom pH 4,0 i 30 mM natrijum fosfatnim puferom pH 8,0. Konačno, u smolu obloženu peptidom ili proteinom je dodavan 154 mM rastvor natrijum hlorida pH 7,0.
Endotoksinski test
[0190] Detekcija LPS-a je vršena upotrebom turbidimetrijsko-kinetičkog Limulus Amebocyte lizata (LAL) iz kompleta QCL (50-650U, Lonza) prema uputstvima proizvođača. Eupergit<®>smola obložena peptidima ili proteinima je inkubirana u odnosu od 1:1 (v:v) sa obezbeđenim rastvorom endotoksina (50 UI/mL), tokom različitih vremenskih perioda (0-150 min), na sobnoj temperaturi, prema uputstvima proizvođača.
Statistička analiza
[0191] Testovi preživljavanja su analizirani Log-Rank χ<2>testom upotrebom softvera GraphPad Prism. Značajnost razlika između eksperimentalnih grupa je određivana 2-smernim uparenim T testom sa intervalom poverenja (CI) od 95%. P vrednosti su smatrane značajnim kada je P<0,05. Statistička analiza (srednja vrednost ± SEM) urađena je upotrebom 2-smernog Mann-Whitney testa, sa Cl od 95%.
Rezultati
Primer 1. In vitro i in vivo dokazi koji podržavaju osobine bakterijskog vezivanja peptida izvedenih iz CD6 širokog spektra.
Indukcija bakterijske aglutinacije peptidima izvedenim iz CD6
[0192] Sekvenca i fizičko-hemijske osobine ispitivanih peptida izvedenih iz CD6 koji mapiraju na SRCR domene 1 do 3 (CD6.PD1, CD6.PD2 i CD6.PD3, tim redom), kao i drugih peptida (CD6.cons, DMBT1.pbs1, CD5.PD1 i CD5.PD2) i proteina (rshCD6 (DQLNTSSAESELWEPGERLPVRLTNGSSSCSGTVEVRLEASWEPACGALWDSRAAEAV CRALGCGGAE AASQLAPPTPELPPPPAAGNTSVAANATLAGAPALLCSGAEWRLCEV VEHACRSDGRRARVTCAENRALRLVDGGGACAGRVEMLEHGEWGSVCDDTWDLEDA HVVCRQLGCGWAVQALPGLHFTPGRGPIHRD QVNCSGAEAYLWDCPGLPGQHYCGH-KEDAGAVCSEHQSWRLTGGADRCEGQVEVHFRGVWNTVCD SEWYPSEAKVLCQSLG-CGTAVERPKGLPHSLSGRMYYSCNGEELTLSNCSWRFNNSNLCSQSLAARVLCS ASRSLHNLSTPEVPASVQTVTIESSVTVKIENKESR, SEQ ID NO.: 10) i rshCD5 (RLTRSNSKCQGQLEVYLKDGWHMVCSQSWGRSSKQWEDPSQASKVCQRLNCGVPLS LGPFLVTYTPQ SSIICYGQLGSFSNCSHSRNDMCHSLGLTCLEPQKTTPPTTRPPPTT-TPEPTAPPRLQLVAQSGGQHCAGV VEFYSGSLGGTISYEAQDKTQDLENFLCNNLQC-GSFLKHLPETEAGRAQDPGEPREHQPLPIQWKIQNSS CTSLEHCFRKIKPQKSGRVLALL-CSGFQPKVQSRLVGGSSICEGTVEVRQGAQWAALCDSSSARSSLRWEE VCREQQCGSV-NSYRVLDAGDPTSRGLFCPHQKLSQCHELWERNSYCKKVFVTCQD, SEQ ID NO.: 11)) koji su upotrebljeni u ovoj studiji, navedeni su na Slici 1A. In silico strukturne analize prikazane na Slici 1B, pokazale su da su svi CD6 peptidi dostupni na površini CD6, sa CD6.PD1 (i CD6.PD3) koji je bio izložen na suprotnim stranama u odnosu na CD6.PD2. Kao što je ilustrovano na Slici 1C, očuvanje aminokiselina peptida izvedenih iz CD6 među različitim životinjskim vrstama je relativno visoko za CD6.PD2 i CD6.PD3, a niže za CD6.PD1.
[0193] Nijedan od peptida izvedenih iz CD6 nije u potpunosti odgovarao minimalnom 9-mernom konsenzusnom motivu (VEVLxxxxW) koji je ranije prijavljen za DMBT-1/SAG protein. Funkcionalnost peptida izvedenih iz CD6 je istraživana u testovima bakterijske aglutinacije, u kojima su peptidi DMBT1.pbs1 (takođe označen kao DMBT-1.pbs1 ili pbs1) i CD6.kons (takođe označen kao CD6 cons ili PCons) upotrebljavani kao pozitivne kontrole (Bikker FJ i saradnici, 2004, Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteine-rich domains, J Biol Chem 279:47699-703). Analogna peptidna sekvenca (CD5.PD2) prisutna u drugom SRCR domenu CD5 - visoko homolognog limfocitnog receptora za koji nisu prijavljene osobine vezivanja bakterija -korišćena je kao negativna kontrola. Kao što je ilustrovano Slikama 2A i 2B, aglutinacija različitih G+ i G- bakterijskih suspenzija (uključujući MDR sojeve) zavisna od doze, uočena je za CD6.PD1 i CD6.PD3, ali ne i za CD6.PD2.
Peptidi izvedeni iz CD6 direktno interaguju sa PAMP-ovima koji su konstituenti G- i G+ bakterija, sa različitim afinitetima
[0194] Vezivanje peptida izvedenih iz CD6 i obeleženih biotinom, za čvrstu fazu adsorbovanu sa LPS-om ili LTA, ispitivano je ELISA testom. Kao što je pokazano Slikama 3A i 3B, svi peptidi izvedeni iz CD6 pokazali su dozno-zavisno vezivanje za LPS i LTA, slično DMBT1.pbs1 i CD6.kons peptidima koji su upotrebljavani kao pozitivne kontrole. Ipak, peptid CD6.PD3 je bio izvanredan u svojoj sposobnosti da veže kako imobilisan LPS, tako i LTA, u poređenju sa drugim testiranim peptidima. Kao što je očekivano, nije uočeno značajno vezivanje za CD5.PD1 peptid. Ovi rezultati potvrđuju da peptidi izvedeni iz CD6 zadržavaju osobine vezivanja za LPS i LTA.
[0195] Za dalju validaciju i merenje vezivanja, afiniteti za interakciju u osnovi peptida izvedenih iz CD6 (CD6.PD1, CD6.PD2 i CD6.PD3) sa LPS-om i LTA, i odgovarajuće Kdvrednosti, određivani su emisijom fluorescencije triptofana. Konsenzusne sekvence DMBT1.pbs1 i CD6.Pkons opisane od strane Bikker FJ i saradnika, 2004 (Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteinerich domains, J Biol Chem 279:47699-703) (takođe označene kao Pcons ili Pcon, SEQ ID No.: 9, GRVEVLFRGSW) takođe su uključene u ovaj eksperiment. Kao što je sažeto na Slici 4, svi peptidi izvedeni iz CD6 su ispoljavali visoke afinitete i za LPS i za LTA, pri čemu je afinitet bio veći za CD6.PD1 i/ili CD6.PD2 u poređenju sa CD6.PD3 (PD1 ≥ PD2 > PD3). Kdvrednosti za CD6.PD1 i CD6.PD2 bile su niže od istih za prototipske DMBT1.pbs1 i CD6.kons peptide ili za sam rshCD6 protein. Uzeti zajedno, rezultati vezivanja nedvosmisleno podržavaju direktnu i značajnu interakciju peptida izvedenih iz CD6 sa esencijalnim komponentama ćelijskog zida iz G- i G+ bakterijskih sojeva.
[0196] Da bi se znalo da li su osobine samoagregacije peptida izvedenih iz CD6 povezane sa njihovim osobinama aglutinacije, hidrodinamička veličina peptida izvedenih iz CD6 u rastvoru analizirana je upotrebom DLS. Rezultati ukazuju da su peptidi izvedeni iz CD6 obrazovali čestice različitih hidrodinamičkih veličina u skladu sa svojim osobinama samoagregacije (Slika 5). CD6.PD3 čestice su pokazale dva pika, na 630 ± 3 i 5151 ± 7 nm, što ukazuje na samoagregaciju. Slična situacija se odnosila na CD6.PD1 (dva pika na 321 ± 5 i 1484 ± 8 nm), CD6.kons (dva pika na 1636 ± 6 i 5493 ± 7 nm) i DMBT1.pbs1 (dva pika na 169 ± 5 i 617 ± 4 nm). Nasuprot navedenom, CD6.PD2 je pokazao jedan pik sa centrom na 379 ± 5 nm, u skladu sa njegovim osobinama niže bakterijske aglutinacije u poređenju sa drugim peptidima izvedenim iz CD6 i DMBT1.
[0197] U sledećem koraku, ispitivan je funkcionalni značaj interakcije peptida izvedenih iz CD6, sa ključnim patogenim bakterijskim proizvodima, ex vivo. U tom cilju, testirani su modulatorni efekti rastućih koncentracija CD6-peptida na oslobađanje citokina od strane mišjih splenocita izloženih LPS-u. Kao što ilustruje Slika 6, samo su CD6.PD3 i CD6.kons peptidi pokazali inhibitorne efekte zavisne od doze na oslobađanje proinflamatornog IL-6 i IL-1β citokina, što je u prvom slučaju dostiglo statističku značajnost. Isti CD6.PD3 (ali ne CD6.kons) peptid je takođe indukovao povećano oslobađanje antiinflamatornog citokina IL-10 zavisno od doze, koje nije bilo statistički značajno.
In vivo efikasnost peptida izvedenih iz CD6 u septičkom šoku indukovanom sa CLP
[0198] Efekti peptida izvedenih iz CD6 in vivo su ispitivani na miševima koji su bili podvrgnuti septičkom šoku indukovanom sa CLP (Rittirsch D i saradnici, 2009, Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture, Nat Protoc 4:31-6). U tu svrhu, C57BL/6 miševima je infuzijom data jednokratna intravenska (i.v.) doza (6 mg/kg) različitih peptida, 1 h nakon indukcije CLP, nakon čega je praćeno preživljavanje. Kao što je prikazano na Slici 7A, značajno povećano preživljavanje je uočeno među miševima koji su dobili infuziju sa CD6.PD2 (12,5%, P<0,0005) i CD6.PD3 (36,36%, P<0,0001) u poređenju sa grupom koja je bila tretirana fiziološkim rastvorom, a ista činjenica je takođe uočena kod miševa kojima su infuzijom bili dati DMBT-1.pbs1 (23,07%, P<0,0025) i CD6.kons (25%, P<0,0101) peptidi (Slika 7B). Nisu uočeni značajni efekti na preživljavanje miševa za CD6.PD1 peptid.
[0199] Pošto su in vivo protektivne osobine CD6.PD3 protiv septičkog šoka nadmašila CD6.PD1 i CD6.PD2, sprovedeni su dodatni eksperimenti koji su istraživali njegove efekte u zavisnosti od vremena, doze i sistema. Kao što je prikazano na Slikama 8A i 8B, maksimalne stope preživljavanja nakon CLP-a su dobijene nakon infuzije CD6.PD3 u dozama od 6 ili 12 mg/kg (37,5% i 40%, tim redom, naspram 23,08% za 3 mg/kg), i 1 h nakon indukcije CLP-a (40% naspram 20% na 3h). Nisu uočene značajne razlike između intravenskog (i.v.) ili intraperitonealnog (i.p.) puta primene kada je CD6.PD3 peptid dat infuzijom u optimalnim uslovima (6 mg/kg, 1 h nakon CLP) (Slika 8C).
[0200] Dalje je praćen efekat optimalnih uslova za infuziju CD6.PD3 peptida na nivoe citokina u serumu i bakterijsko opterećenje nakon CLP-a. U tu svrhu, C57BL/6 miševi koji su bili podvrgnuti septičkom šoku indukovanom sa CLP, tretirani su fiziološkim rastvorom ili CD6.PD3 peptidom (jednokratna i.v. infuzija sa 6 mg/kg, 1 h nakon CLP-a), nakon čega su miševi bili izloženi krvarenju i žrtvovani su 4 h i 20 h kasnije, tim redom. Kao što je prikazano na Slici 9A, miševi tretirani sa CD6.PD3 su ispoljili značajno niže nivoe (P<0,05) proinflamatornih citokina IL-1β, IL-6 i TNF-α 20 h nakon CLP-a, u poređenju sa grupom koja je tretirana fiziološkim rastvorom. Slično navedenom, miševi tretirani sa istim CD6.PD3 su takođe pokazali niže CFU izolovane iz krvi i slezine kada su bili žrtvovani 20 h nakon CLP-a, u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom fiziološkim rastvorom (Slika 9B). Ovi rezultati ukazuju da CD6.PD3 peptid zadržava terapijske osobine prijavljene za rshCD6 protein, u eksperimentalnim modelima septičkog šoka (Martinez-Florensa M i saradnici, 2017, Protective Effects of Human and Mouse Soluble Scavenger-Like CD6 Lymphocyte Receptor in a Lethal Model of Polymicrobial Sepsis. Antimicrob Agents Chemother 61:e01391-16). Navedeno takođe važi za septične miševe koji su istovremeno lečeni sa CD6.PD3 i baktericidnim antibiotikom širokog spektra Imipenemom/Cilastatinom (I/C). Kao što je ilustrovano na Slici 10, kombinovana primena CD6.PD3 (6 mg/kg i.v.) i Imipenema/Cilastatina (50 mg/kg/12h i.p.), 1 h nakon septičkog šoka izazvanog CLP-om, rezultovala je statistički značajnim aditivnim/sinergističkim efektima na preživljavanje miševa (90,9%), u poređenju sa CD6.PD3 (30,8%; P=0,018) ili I/C (44,4%; P=0,0015) pojedinačno.
Diskusija
[0201] Navedeni primer pokazuje da kratki (11-mera dugi) intradomenski peptidi izvedeni iz CD6 zadržavaju in vitro i in vivo osobine bakterijskog prepoznavanja nativnog CD6 proteina. Takve sekvence (CD6.PD1, CD6.PD2 i CD6.PD3) mapiraju na površinski dostupna mesta tri SRCR domena CD6, i homologne su sa 11-mernim konsenzusnim peptidom (pbs1) koji je identifikovan u DMBT-1/SAG proteinu (Bikker FJ i saradnici, 2004, Bacteria binding by DMBT1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteinerich domains, J Biol Chem 279:47699-703).
[0202] Dok se i) slične homologne sekvence iz pojedinih SRCR-SF članova koji poseduju minimalni VEVLxxxxW konsenzusni motiv ne vezuju za bakterije (Bikker FJ i saradnici, 2004, Bacteria binding by DMBT-1/SAG/gp-340 is confined to the VEVLXXXXW motif in its scavenger receptor cysteine-rich domains, J Biol Chem 279:47699-703), i ii) nijedan od peptida izvedenih iz CD6 ne odgovara u potpunosti prethodno pomenutom konsenzusnom motivu, sva tri peptida izvedena iz CD6 interaguju sa LPS-om i LTA, iako sa različitim Kd, i sa raznovrsnim in vitro i in vivo funkcionalnim osobinama (npr. bakterijskom aglutinacijom ili prevencijom mortaliteta indukovanog sa CLP).
[0203] Peptid CD6.PD3 je obezbedio bolje in vivo rezultate kada je ispitivan u terapijske svrhe na mišjem modelu septičkog šoka indukovanog sa CLP, u poređenju sa drugim peptidima izvedenim iz CD6 (P=0,04 za CD6.PD2 i P=0,0005 za CD6.PD1). CD6.PD3 je takođe bio bolji od prototipskog DMBT-1.pbs1 peptida ili CD6.kons sekvence, iako razlike nisu dostigle statističku značajnost (P=0,1). Još jedan izvanredan nalaz je statistički značajan aditivni/sinergistički efekat CD6.PD3 peptida na preživljavanje miševa, kada je istovremeno davan sa Imipenemom/Cilastatinom, članom karbapenemske familije, koji se smatra tretmanom prvog izbora kod pacijenata u kritičnoj nezi koji prolaze kroz sepsu (Verwaest C, 2000, Belgian Multicenter Study Group. Meropenem versus Imipenem/cilastatin as empirical monotherapy for serious bacterial infections in the intensive care unit, Clin Microbiol Infect 6:294-302). CD6.PD3 stoga karkateriše većina antibakterijskih osobina rshCD6, što ga čini dobrom, ekonomičnom alternativom u odnosu na drugi slučaj, kao i dobrom dodatnom strategijom za antibiotsku terapiju.
[0204] U zaključku, nalazi predmetnog pronalaska pokazuju da kratke (11-merne) peptidne sekvence mogu zadržati osobine vezivanja za bakterije prisutne kod celokupnog vanćelijskog regiona CD6, otvarajući time ekonomične mogućnosti za razvoj novih alternativa trenutno dostupnim tretmanima sepse. Kompleksna fiziologija odgovora na sepsu zahteva multidisciplinarno i istovremeno proučavanje raznih vremenski-zavisnih faktora koji određuju kratkoročni i dugoročni ishod sepse.
Primer 2. Adsorpcija cirkulišućih bakterijskih toksina peptidima izvedenim iz CD6 koji su kovalentno kuplovani za čvrstu fazu
Rezultati
[0205] Rezultati dobijeni inkubacijom rastvora endotoksina (50 UI/mL LPS) sa Eupergit<®>smolom obloženom različitim peptidima koji su izvedeni iz CD6 (CD6.PD2, CD6.PD3 i CD6.kons) ili proteinima (HAS (UniProtKB - P02768, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCP FEDHVKLVNEVT EFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCA-KQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVR PEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF-YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKQRLKCASLQKF-GERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRAD LAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNY
-AEAKDVFLGMFL YEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKF QNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVG-SKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRV TKCCTESLVNRRPCFSALE-VDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL, SEQ ID NO.: 12), rshCD5 i rshCD6) tokom različitih vremenskih perioda, prikazani su na Slici 11. Smole obložene sa CD6.PD2-, CD6.PD3- i rshCD6 smanjile su nivoe endotoksina (što je detetkovano LAL testovima) u poređenju sa kontrolama obloženim sa HSA i rshCD5. Upotreba peptida izvedenih iz CD6 za ekstrakorporalnu hemoperfuziju je stoga sa prednostima u odnosu na postojeće uređaje poput kolona za prečišćavanje krvi sa imobilisanim vlaknastim Polimiksinom B (Esteban E i saradnici, 2013, Immunomodulation in sepsis: the role of endotoxin removal by polymyxin B-immobilized cartridge, Mediators Inflamm 2013:507539): i) prijavljen afinitet interakcije LPS/Polimiksina B (Kd100-900 nM, u zavisnosti od upotrebljenog G- soja) (Mclnerney MP i saradnici, 2016, Quantitation of Polymyxin-Lipopolysaccharide Interactions Using an Image-Based Fluorescent Probe, J Pharm Sci; 105:1006-10) je niži od CD6.PD1 i CD6.PD2 (Kd3,5±0,3 nM i 35±2 nM, tim redom), i ii) Polimiksin B se uglavnom vezuje za LPS, dok se CD6.PD1 i CD6.PD2 vezuju i za LTA, sa afinitetima Kd0,39±0,06 nM i 0,31±0,04 nM, tim redom. Shodno navedenom, peptidi izvedeni iz CD6 mogu takođe biti upotrebljeni u slučaju G+ infekcija, koje su odgovorne za preko 50% sepsa (Martin GS, 2012, Sepsis, severe sepsis and septic shock: changes in incidence, pathogens and outcomes, Expert Rev Anti Infect Ther 10:701-6).

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu ili više od sledećih izolovanih aminokiselinskih sekvenci, SEQ ID No.: 3 i/ili SEQ ID No.: 1 i/ili SEQ ID No.: 2, ili njihov derivat, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je farmaceutska kompozicija čvrsta kompozicija, poželjno u obliku tablete, pilule, kapsule ili granulata, ili tečna kompozicija, poželjno u obliku rastvora, suspenzije ili emulzije.
3. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, pri čemu farmaceutska kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljive nosače, farmaceutski prihvatljive soli, adjuvanse i/ili pogodne ekscipijense.
4. Konjugat koji sadrži jednu ili više od sledećih izolovanih aminokiselinskih sekvenci, SEQ ID No.: 3 i/ili SEQ ID No.: 1 i/ili SEQ ID No.: 2, ili njihov derivat, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima.
5. Konjugat prema patentnom zahtevu 4, gde je jedna ili više aminokiselinskih sekvenci SEQ ID No.: 3 i/ili SEQ ID No.: 1 i/ili SEQ ID No.: 2, ili njihov derivat, kao što je definisano u patentnom zahtevu 4, konjugovana sa polimerom kao što je solubilni polimer ili, poželjno, nesolubilni polimer.
6. „Komplet iz delova” koji sadrži:
a) jednu ili više od sledećih izolovanih aminokiselinskih sekvenci, SEQ ID No.: 3 i/ili SEQ ID No.: 1 i/ili SEQ ID No.: 2, ili njihov derivat, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima; i
b) antibiotik, poželjno koji dalje sadrži dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor.
7. „Komplet iz delova” prema patentnom zahtevu 6, gde je antibiotik Imipenem i/ili gde je dehidropeptidazni inhibitor ili beta-laktamazni inhibitor Cilastatin.
8. Farmaceutska kompozicija koja je kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, konjugat koji je kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5, ili „komplet iz delova” koji je kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 7, za upotrebu kao lek.
9. Farmaceutska kompozicija koja je kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, konjugat koji je kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5, ili „komplet iz delova” koji je kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 7, za upotrebu u terapijskom i/ili preventivnom postupku lečenja, kod sisara, uključujući čoveka, i/ili kod organizma koji nije sisar, infektivne bolesti, ili inflamatornog stanja koje je povezano sa infektivnom bolešću, ili inflamatorne bolesti koja je povezana sa prisustvom proizvoda nastalog iz infektivnog agensa.
10. Farmaceutska kompozicija, konjugat ili „komplet iz delova” za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je infektivna bolest mikrobna infekcija, poželjno septikemija, i/ili pri čemu je inflamatorno stanje sindrom sistemskog inflamatornog odgovora ili sepsa, i/ili pri čemu je infektivni agens izabran iz grupe koja se sastoji od bakterije, gljivice, virusa, parazita i njihovih kombinacija.
11. Uređaj za ekstrakorporalno uklanjanje najmanje jedne hemijske komponente površinskih struktura Gram- i/ili Gram+ bakterija kao što su lipopolisaharid (LPS), lipoteihoična kiselina (LTA) i/ili peptidoglikan (PGN), iz telesne tečnosti životinje kao što je sisar, poželjno čovek, pri čemu je poželjno da je navedena telesna tečnost krv, plazma, serum ili druge pogodne frakcije krvi, gde uređaj sadrži čvrstu podlogu; i gde je jedna ili više aminokiselinskih sekvenci SEQ ID No.: 3 i/ili SEQ ID No.: 1 i/ili SEQ ID No.: 2, ili njihov derivat, pri čemu njihov navedeni derivat sadrži jednu ili više modifikacija navedene aminokiselinske sekvence, izabranu iz grupe koja se sastoji od N-acilacije i/ili C-amidacije ili C-esterifikacije, N-alkilacije, zamene jedne ili više L-aminokiselina D-aminokiselinama, konjugacije sa biomolekulom kao što je polietilen glikol ili albumin i obrazovanja strukture kape na N- ili C-kraju sa Cys ostacima, a poželjno su aminokiselinske sekvence SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 1 i SEQ ID No.: 2 fiksirane na navedenu čvrstu podlogu.
12. Uređaj prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je navedeni uređaj hemadsorpcioni uređaj za ekstrakorporalno uklanjanje jedne ili više hemijskih komponenti površinskih struktura Gram- i/ili Gram+ bakterija, kao što su LPS, LTA i/ili PGN, tokom hemoperfuzije.
RS20230680A 2018-03-13 2019-03-13 Peptidi koji vezuju bakterije, za lečenje infektivnih bolesti i povezanih inflamatornih procesa RS64455B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18382164 2018-03-13
EP19710418.5A EP3765055B9 (en) 2018-03-13 2019-03-13 Bacterial-binding peptides for treatment of infectious diseases and related inflammatory processes
PCT/EP2019/056315 WO2019175261A1 (en) 2018-03-13 2019-03-13 Bacterial-binding peptides for treatment of infectious diseases and related inflammatory processes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64455B1 true RS64455B1 (sr) 2023-09-29

Family

ID=61768231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230680A RS64455B1 (sr) 2018-03-13 2019-03-13 Peptidi koji vezuju bakterije, za lečenje infektivnih bolesti i povezanih inflamatornih procesa

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11660326B2 (sr)
EP (1) EP3765055B9 (sr)
JP (1) JP7792115B2 (sr)
AU (1) AU2019233613B2 (sr)
CA (1) CA3133008A1 (sr)
ES (1) ES2953362T3 (sr)
HR (1) HRP20230984T1 (sr)
HU (1) HUE062829T2 (sr)
PL (1) PL3765055T3 (sr)
RS (1) RS64455B1 (sr)
WO (1) WO2019175261A1 (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017360043A1 (en) * 2016-11-18 2019-06-20 Hospital Clinic De Barcelona Combined CD6 and imipenem therapy for treatment of infectious diseases and related inflammatory processes
EP4272837A3 (en) 2019-08-02 2024-02-28 Fundacio de Recerca Clinic Barcelona-Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer Car t-cells against bcma for the treatment of multiple myeloma
US10881781B1 (en) 2020-04-29 2021-01-05 Orth Consulting, Llc Blood processing apparatus and method for detoxifying bacterial lipopolysaccharide

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003530838A (ja) * 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
WO2008119851A1 (es) 2007-03-28 2008-10-09 Universidad De Barcelona Producto proteico para el tratamiento de enfermedades infecciosas y procesos inflamatorios relacionados
JP2014516046A (ja) * 2011-05-26 2014-07-07 フンダシオ・クリニック・ペル・ア・ラ・レセルカ・ビオメディカ がん若しくは腫瘍の治療用の又はアジュバントとして使用される可溶性タンパク質ｃｄ５又はｃｄ６
DK3221313T3 (en) 2014-11-17 2019-04-08 Entasis Therapeutics Ltd COMBINATION THERAPY FOR TREATING INFECTIONS WITH RESISTANT BACTERIA
WO2018025052A1 (en) 2016-08-04 2018-02-08 Oxford University Innovation Limited Chimeric antigen receptors
AU2017360043A1 (en) 2016-11-18 2019-06-20 Hospital Clinic De Barcelona Combined CD6 and imipenem therapy for treatment of infectious diseases and related inflammatory processes

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019233613A1 (en) 2020-10-29
HUE062829T2 (hu) 2023-12-28
JP7792115B2 (ja) 2025-12-25
ES2953362T3 (es) 2023-11-10
EP3765055B9 (en) 2023-09-27
EP3765055B1 (en) 2023-06-07
EP3765055A1 (en) 2021-01-20
HRP20230984T1 (hr) 2023-12-08
US20210023162A1 (en) 2021-01-28
AU2019233613B2 (en) 2025-02-13
CA3133008A1 (en) 2019-09-19
EP3765055C0 (en) 2023-06-07
US11660326B2 (en) 2023-05-30
JP2021518426A (ja) 2021-08-02
PL3765055T3 (pl) 2023-11-27
US20230381266A1 (en) 2023-11-30
WO2019175261A1 (en) 2019-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5322108B2 (ja) 抗菌ペプチド
US20230381266A1 (en) Bacterial-binding peptides for treatment of infectious diseases and related inflammatory processes
KR101773368B1 (ko) 단백질 Ａ(ＳｐＡ) 변이체와 관련된 조성물 및 방법
JP6670106B2 (ja) ブドウ球菌コアグラーゼ抗原およびその使用方法
JP6158097B2 (ja) 炎症を抑制するためのペプチド
CN105377250A (zh) 用于对抗抗菌剂抗性细菌的组合物和方法
JP7643730B2 (ja) ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）変種を含む方法および組成物
CA2610791A1 (en) Hyaluronic acid binding peptides enhance host defense against pathogenic bacteria
Wang et al. Phage‐displayed heptapeptide sequence conjugation significantly improves the specific targeting ability of antimicrobial peptides against Staphylococcus aureus
Kumar Natural peptides and their synthetic congeners acting against Acinetobacter baumannii through the membrane and cell wall: latest progress
Matwiejczyk et al. Lysozyme monomer, dimer, and oligomers: a review with a focus on immunological potential
US20250163116A1 (en) New method to treat infectious diseases
JP6776254B2 (ja) Ｂ７リガンド二量体界面に由来する単離されたペプチドおよびそれらの使用
KR20110124060A (ko) Ｗｔａ를 유효성분으로 함유하는 백신 조성물
CN115960163A (zh) 抗菌肽、包含抗菌肽的药物组合物及其应用
RU2813626C1 (ru) Модифицированный эндолизин и антибактериальные композиции на его основе для лечения инфекций, вызванных бактериями Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli
JP2009506986A (ja) ペプチジルジアシルグリセリド
Izquierdo Gonzalez IsdB of Staphylococcus aureus induces IL-1β production via the TLR4-NLRP3-caspase-1 inflammasome cascade
JPWO2005084694A1 (ja) インフルエンザウイルス感染抑制剤
CN116284253A (zh) 一种靶向金黄色葡萄球菌且具有抑制群体感应信号和抗菌作用双重功能的抗菌肽
González Izquierdo IsdB of Staphylococcus aureus induces IL-1β production via the TLR4-NLRP3-caspase-1 inflammasome cascade
González IsdB of Staphylococcus aureus induces IL-1β production via the TLR4-NLRP3-caspase-1 inflammasome cascade
AU2006267817A1 (en) A vaccine for Staphylococcal infections