RS64521B1 - Postupci za proizvodnju biokonjugata polisaharida o-antigena e. coli, njihove kompozicije i postupci njihove primene - Google Patents

Postupci za proizvodnju biokonjugata polisaharida o-antigena e. coli, njihove kompozicije i postupci njihove primene

Info

Publication number
RS64521B1
RS64521B1 RS20230733A RSP20230733A RS64521B1 RS 64521 B1 RS64521 B1 RS 64521B1 RS 20230733 A RS20230733 A RS 20230733A RS P20230733 A RSP20230733 A RS P20230733A RS 64521 B1 RS64521 B1 RS 64521B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen
polysaccharide
coli
amino acid
seq
Prior art date
Application number
RS20230733A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeroen Geurtsen
Pieter Jan Burghout
Eveline Marleen Weerdenburg
Jan Theunis Poolman
Kellen Cristhina Fae
Yon Patricia Ibarra
Darren Robert Abbanat
Stefan Jochen Kemmler
Michael Thomas Kowarik
Manuela Mally
Fonck Veronica Gambillara
Martin Edward Braun
Sandmeier Maria Paula Carranza
Original Assignee
Janssen Pharmaceuticals Inc
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Pharmaceuticals Inc, Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Janssen Pharmaceuticals Inc
Publication of RS64521B1 publication Critical patent/RS64521B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C12Y204/99018—Dolichyl-diphosphooligosaccharide—protein glycotransferase (2.4.99.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/107—Vibrio
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
[0001] Sojevi ekstraintestinalnih patogenih bakterija Escherichia coli (ExPEC) bezopasni su stanovnici gastrointestinalnog trakta ljudi, zajedno sa komensalnim sojevima E. coli. Nije jednostavno razdvojiti izolate ExPEC od komensalnih izolata prema serotipu, uprkos tome što u mnogim klonskim linijama preovladava ExPEC, koji se odlikuje prisustvom serotipova O-antigena, kapsularnog antigena i flagelarnog antigena (skraćeno O:K:H, na primer O25:K1:H4). Za razliku od komensalnih sojeva E. coli, ExPEC sojevi eksprimiraju brojne virulentne faktore koji im omogućavaju da kolonizuju creva i izazovu različite ekstraintestinalne infekcije, što je povezano sa značajnim opterećenjem zdravstvene zaštite zbog potreba hospitalizacije bolesnika i smrtnog ishoda. Infekcijama ExPEC, uključujući tu i invazivnu ExPEC bolest (IED), posebno su podložni novorođenčad, starije osobe i imunokompromitovani pacijenti.
[0002] ExPEC sojevi su najčešći uzročnici infekcija urinarnog trakta (UTI) i značajno doprinose infekcijama operativnih rana, a doprinose i pojavi meningitisa kod odojčadi. Ovi sojevi takođe su povezani sa abdominalnim i karličnim infekcijama, kao i bolničkim pneumonijama, a dovode i do drugih ekstraintestinalnih infekcija, kao što su osteomijelitis, celulitis i infekcije rana. Ove primarne infekcije mogu dovesti do ExPEC-om indukovane bakteremije. ExPEC je najčešći uzrok komunalnih bakteremija i najznačajniji je patogen bolničkih bakteremija, prisutan u približno 17%-37% klinički značajnih krvnih izolata. Pacijenti sa ExPEC-pozitivnom hemokulturom obično su oboleli od sepse, teške sepse ili septičkog šoka. Uočena je povećana rezistentnost ExPEC na antibiotike prve linije odbrane, među koje se ubrajaju cefalosporini, fluorokinoloni i trimetoprim/sulfametoksazoli. Pojava i brzo globalno širenje ExPEC sekvence 131 (ST131) smatra se glavnim uzrokom povećane rezistencije na lekove, kao višestruke rezistencije na lekove. Pomenuti klon, koji se nalazi u 12.5-30% svih ExPEC kliničkih izolata, uglavnom ispoljava serotip O25b:H4 i visoku rezistenciju na fluorokinolone, što je često povezano i sa rezistencijom na trimetoprim/sulfametoksazol i na beta-laktamaze širokog spektra, što rezultuje rezistencijom na cefalosporine.
[0003] O-antigen je imunodominantna komponenta lipopolisaharida ćelijskog zida (LPS) gram-negativnih bakterija, uključujući E. coli. Danas je poznato > 180 serološki specifičnih O-antigena E. coli, sa najvećim brojem ExPEC izolata klasifikovanih unutar 20-ak serotipova O-antigena. O-antigeni E. coli pune dužine obično sadrže 10 do 25 ponovaka saharida koji su vezani za visoko konzervirano jezgro LPS molekula, pri čemu je svaki ponovak nezavisno vezan posredstvom enzima koji su kodirani rfb, odnosno, rfa genskim klasterima. Nakon polimerizacije, osnova O-antigena može se modifikovati dodavanjem acetilne grupe ili glukoze. Ove modifikacije dodatno povećavaju heterogenost serotipova, formirajući antigene različitih serotipova, koji sadrže istu polisaharidnu osnovu i različite bočne ogranke. Geni koji kodiraju enzime koji učestvuju u modifikaciji O-antigena obično su smešteni izvan rfb genskog klastera na hromozomu, a u nekim slučajevima, ovi geni se nalaze unutar lizogenih bakteriofaga.
[0004] U savremenim studijama nadozora uzoraka krvi u SAD i EU uobičajeno se identifikuju ExPEC izolati O4 serogrupe. Struktura polisaharida O4 je poznata i glasi: -->2) α-L-Rha (1->6) α-D-Glc (1->3) α-L-FucNAc (1->3) β-D-GlcNAc (1-> iz soja E. coli O4:K52 (Jann et al., Carbohydr. Res. (1993) v. 248, str. 241-250). Utvrđeno je da O4:K3, O4:K6 i O4:K12 sojevi imaju specifične strukturu polisaharida O4, kod kojeg je prethodno navedena struktura modifikovana dodavanjem α-D-Glc (1->3) koji je povezan sa ostatkom molekula ramnoze u polisaharidnom molekulu (Jann et al., 1993, supra), gde se takva struktura polisaharida u ovoj specifikaciji označava „glikozilovani O4“. Do danas nisu identifikovani enzimi odgovorni za modifikaciju O-antigena O4 sojeva E. coli.
[0005] Dosadašnji napori da se razviju vakcine protiv ExPEC infekcija usmereni su na razvoj konjugata polisaharida O-antigena. Dvanaestovalentna konjugatna vakcina na O-antigen sintetisana je ekstrakcijom i prečišćavanjem polisaharida O-antigena i hemijskom konjugacija sa detoksifikovanim egzotoksinom A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa, a bezbednost i imunogenost ove vakcine testirana je u fazi 1 kliničke studije (Cross et al., J. Infect. Dis. (1994) v.170, str. 834-40). Međutim, ova vakcina nikada nije odobrena za kliničku primenu. Nedavno je razvijen biokonjugacioni sistem u E. coli, u kome se i polisaharid antigena i proteinski nosač sintetišu in vivo, a zatim se i konjuguju in vivo posredstvom enzima oligosaharil-transferaze PglB, enzima poreklom iz Campilobacter jejuni, koji je eksprimiran u E. coli (Wacker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2006) v. 103, str. 7088-93). Ovaj sistem za N-glikozilaciju proteina sposoban je da prenose i veže različite polisaharide na proteinski nosač, što omogućava direktne postupke prečišćavanja konjugata.
[0006] Biokonjugacija je uspešno primenjena za dobijanje konjugovanog polisaharida u razvoju potencijalne četvorovalentne vakcine na O-antigen E. coli (Poolman i Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), str. 6-13). Međutim, da bi vakcina protiv ExPEC bila uspešna, potrebno je razviti vakcinu koja je usmerena na preovlađujuće serotipove, pri čemu prisustvo dodatnih modifikacija O-antigena u podskupovima ExPEC izolata predstavlja dodatni izazov u pokrivanju izolata koji sadrže nemodifikovani i modifikovani LPS. Osim toga, sve se više pažnje posvećuje efikasnosti proizvodnje pojedinačnih komponenti za složene vakcine koje su usmerene na više serotipova, pa i dalje postoji potreba za poboljšanjima u proizvodnji biokonjugata specifičnih O-antigena.
SAŽETAK PRONALASKA
[0007] Imajući u vidu sve veću rezistenciju na antibiotike postojećih ExPEC izolata, kao i prisustvo novih modifikacija O-antigena među dominantnim O-serotipovima, postoji potreba za unapređenjem profilaktičkih i terapijskih tretmana ovih infekcija. Predmetni pronalazak ispunjava ovu potrebu definisanjem genetičkog sastava kliničkih izolata, uključujući i identifikaciju gena koji kodiraju enzime koji učestvuju u modifikaciji O-antigena, što omogućava molekularno-biološko dizajniranje rekombinantnih ćelija-domaćina, sposobnih da sintetišu biokonjugate O-antigena, uključujući biokonjugate koji sadrže odabrane modifikacije O-antigena. Uz to, u jednom aspektu pronalaska, obezbeđene su ćelije-domaćina i postupci poboljšane proizvodnje biokonjugata konkretnih O-antigena, primenom varijanti oligosaharil-transferaze (OST), koji se zasnivaju na prednostima korišćenja konkretnih OST varijanti za biokonjugate konkretnih O-antigena E. coli na nepredvidiv serotip-zavisan način. Primena ovih OST varijanti može u nekim slučajevima uticati na obrazac glikozilacije biokonjugata, na primer, na povećanje relativnog broja glikana vezanih za protein, u odnosu na biokonjugate dobijene korišćenjem neizrođenih ili drugih varijanti OST, pa su pronalazak u jednom aspektu obezbeđuje nove biokonjugate proizvedene primenom tih postupaka.
[0008] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje dobijanje biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli kovalentno vezanog za proteinski nosač, gde postupak obuhvata:
(i) dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina koja sadrži:
a. nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid Ox-antigena; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač, čija sekvenca ima najmanje jedno mesto glikozilacije sa konsenzusnom sekvencom glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjno prema SEQ ID NO: 2; i
c. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy; i
(ii) kultivisanje rekombinantne ćelije-domaćina pod uslovima koji pogoduju proizvodnji biokonjugata, gde:
kada je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen glukozilovani polisaharid O4-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V, a rekombinantna ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira glukozil-transferazu GtrS koja je najmanje 80% istovetna sa sekvencom SEQ ID NO: 4 i koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, i dalje sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB, koje imaju najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, pri čemu je translokaza sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol, dok je glikozil-transferaza sposobna da glikoziluje baktoprenol;
kada je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669;
kada je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V;
kada je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; i
kada je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V,
pri čemu se u svim slučajevima aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6,
gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 antigena imaju strukturne formula (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, a da svako n nezavisno označava ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0009] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0010] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid glikozilovanog O4-antigena, a PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6. U jednom aspektu, Ox-antigen je glikozilovani polisaharid O4-antigena, a PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju Y77H i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6. U primerima izvođenja u kojima je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, a rekombinantna ćelija-domaćin sadrži sekvencu koja kodira GtrS koja je najmanje 80% istovetna sekvenci SEQ ID NO: 4, kao i nukleotidne sekvence koje kodiraju GtrA i GtrB koje su najmanje 80% istovetne sekvencama SEQ ID NO: 7, odnosno, 8.
[0011] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čije je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0012] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O8-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0013] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0014] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0015] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, i poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
[0016] U jednom primeru izvođenja, Ox-antigen je polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u
[0017] SEQ ID NO: 6.
[0018] U jednom posebnom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak dobijanja biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, gde postupak obuhvata:
(i) dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina koja sadrži:
a. nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid Ox-antigen ; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinsko jezgro, čija sekvenca ima najmanje jedno mesto glikozilacije sa konsenzusnom sekvencom glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjno SEQ ID NO: 2; i
c. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy; i
(ii) kultivisanje rekombinantne ćelije-domaćina pod uslovima koji pogoduju proizvodnji biokonjugata, gde PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, gde je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, polisaharid glikozilovanog O4-antigena, polisaharid O6A-antigena, polisaharid O15-antigena, polisaharid O16-antigena ili polisaharid O75-antigena, i
kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, rekombinantna ćelijadomaćina dalje sadrži sekvencu koja kodira glukozil-transferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glukozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, kao i da sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB, koje su najmanje 80% istovetne sekvencama SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol, dok je glikozil-transferaza sposobna da glikoziluje baktoprenol, i
gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O15, O16 i O75 antigena imaju strukture prema formulama (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, i da svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0019] U određenim primerima izvođenja, postupak dalje obuhvata izolovanje biokonjugata iz rekombinantne ćelije-domaćina.
[0020] U specifičnim primerima izvođenja, proteinski nosač izabira se iz grupe koju čine detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
[0021] U nekim primerima izvođenja, proteinski nosač je detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA). Poželjno je da proteinski nosač EPA sadrži 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4 mesta glikozilacije. U nekim primerima izvođenja, svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema sekvenci SEQ ID NO: 2. U nekim primerima izvođenja ovaj EPA proteinski nosač sadrži SEQ ID NO: 3.
[0022] U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija-domaćin je ćelija E. coli, na primer, soj K-12 E. coli, kao što je soj W3110.
[0023] U narednom aspektu, obezbeđen je biokonjugat proizveden postupkom kovalentnog vezivanja pripremljenog biokonjugata polisaharida Ox-antigena za proteinski nosač, kao što je ovde opisano.
[0024] U narednom aspektu, obezbeđena je kompozicija koja sadrži takav biokonjugat. U nekim primerima izvođenja, kompozicija sadrži najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjnije najmanje 5, još poželjnije najmanje 7 takvih biokonjugata.
[0025] U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde glikozilovani polisaharid O4-antigena ima strukturu formule (O4-Glc+), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde je n ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku dalje sadrži barem biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, pri čemu je polisaharid O25B-antigena ima strukturu formule (O25B), kao što je prikazano u Tabeli 1, i gde je n ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. U određenim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku dalje obuhvata barem biokonjugat polisaharida O2-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharid O2-antigena ima strukturu formule (O2), kao što je prikazano u Tabeli 1, i gde je n ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0026] U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži: (i) biokonjugat polisaharida O1A-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan sa proteinski nosač, (ii) biokonjugat polisaharida O2-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan sa proteinski nosač, (iii) biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, (iv) biokonjugat polisaharida O6A-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, (v) biokonjugat polisaharida O8-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, (vi) biokonjugat polisaharid O15-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, (vii) biokonjugat polisaharida O16-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinskim nosačem, (viii) biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, i (ix) biokonjugat polisaharida O75-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharidi antigena O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O25B i O75 imaju strukturu formule (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O25B), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, i gde je n nezavisno ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. U specifičnim primerima izvođenja, takva kompozicija dalje sadrži: (x) biokonjugat polisaharida O18A-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharid O18A-antigena ima strukturu formule (O18A), kao što je prikazano u Tabeli 1, i gde je n ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku je imunogena kompozicija.
[0027] U drugim aspektima, obezbeđen je postupak vakcinisanja subjekta protiv ekstraintestinalne patogene E. coli (ExPEC), koji obuhvata administraciju biokonjugata ili kompozicije subjektu, kao što je ovde opisano. U još jednom aspektu, obezbeđen je biokonjugat ili kompozicija, kao što je ovde opisano, za primenu u vakcinaciji protiv ekstraintestinalnih infekcija patogenim sojevima E. coli (ExPEC).
[0028] U ostalim aspektima, obezbeđene su rekombinantne ćelije-domaćina za dobijanje biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde rekombinantna ćelija-domaćina sadrži:
(a) nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid Ox-antigena;
(b) nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač koji ima najmanje jedno mesto glikozilacije sa konsenzusnom sekvencom glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjno SEQ ID NO: 2; i
(c) nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy,
gde:
kada je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V, a rekombinantna ćelija-domaćin dodatno sadrži sekvencu koja kodira glukoziltransferazu GtrS, koja ispoljava najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, kao i da sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikoziltransferazu GtrB, čije su sekvence najmanje 80% istovetne sa sekvencama SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol, dok je glikozil-transferaza sposobna da glikoziluje baktoprenol;
kada je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokislinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V;
kada je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; i
kada je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V, gde se u svim navedenim slučajevima aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, i
gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 antigena imaju strukture formule (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0029] U nekim primerima izvođenja, obezbeđene su ćelije-domaćina u kojima je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, a PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0030] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelijedomaćina u kojima je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, a PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6. U nekim primerima izvođenja, pronalaskom su obezbeđene rekombinantne ćelije-domaćina, u kojima je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, a PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju Y77H i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 6. U nekim primerima izvođenja, u kojima je Ox-antigen glukozilovani polisaharid O4-antigena, rekombinantna ćelija-domaćina sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira GtrS, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 4 i nukleotidne sekvence koji kodiraju GtrA i GtrB, čije su aminokiselinske sekvence date u SEQ ID NO: 7, odnosno, 8.
[0031] U nekim primerima izvođenja, pronalaskom su obezbeđene rekombinantne ćelijedomaćina, u kojima je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, i da PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0032] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelije-domaćina u kojima je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, PglBy ne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 6.
[0033] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelijedomaćina u kojima je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0034] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelije-domaćina gde je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0035] U nekim primerima izvođenja, pronalaskom su obezbeđene rekombinantne ćelijedomaćina, u kojima je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0036] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelije-domaćina, u kojima je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0037] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelije-domaćina, u kojima je proteinski nosač izabran iz grupe koju čine detoksifikovani egzotoksin A poreklom detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
[0038] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelije-domaćina, u kojima je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA). U određenim primerima izvođenja, EPA proteinski nosač obuhvata 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4 mesta glikozilacije. U određenim primerima izvođenja, svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije koja je data u SEQ ID NO: 2. U određenim primerima izvođenja, EPA proteinski nosač ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 3.
[0039] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelijedomaćina, u kojima je rekombinantna ćelija-domaćin ćelija E. coli, na primer, soj E. coli K-12, kao što je, na primer, W3110.
[0040] U nekim primerima izvođenja ćelije-domaćina i postupaka za dobijanje biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač prema pronalasku, rfb genski klaster za polisaharid O4-antigena E. coli, sadrži sekvencu koja kodira enzime koji učestvuju u kreiranju polisaharida O4-antigena E. coli (formule (O4-Glc-) u Tabeli 1), koja je najmanje 80%, na primer, najmanje 90%, na primer, najmanje 95%, na primer, najmanje 98% istovetna SEQ ID NO: 9. U nekim primerima izvođenja, rfb genski klaster sadrži SEQ ID NO: 9.
[0041] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska koji se odnose na ćelijudomaćina i postupke dobijanja biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena poreklom iz E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, glikozil-transferaza, koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli kako bi se dobio glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjno najmanje 98% istovetna sekvenci SEQ ID NO: 4. U nekim primerima izvođenja, glukozil-transferaza ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 4.
[0042] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska koji se odnose na realizaciju ćeliju-domaćina i postupke dobijanja biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena poreklom iz E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, translokaza je sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol, i ima sekvencu koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjno najmanje 98% istovetna sekvenci SEQ ID NO: 7. U određenim primerima izvođenja translokaza ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 7.
[0043] U nekim primerima izvođenja pronalaska, koji se odnose na ćelije-domaćina i postupke dobijanja biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena poreklom iz E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, glikozil-transferaza je sposobna da glikoziluje baktoprenol i ima sekvencu koja je najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjno najmanje 98% istovetna sekvenci SEQ ID NO: 8. U nekim primerima izvođenja, glikozil-transferaza ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 8.
KRATAK OPIS ILUSTRACIJA
[0044] Prethodni sažetak, kao i detaljan opis pronalaska koji sledi, biće pojašnjeni priloženim crtežima. Važno je naglasiti da pronalazak nije ograničen konkretnim primerima izvođenja koji su ilustrovani crtežima.
[0045] Na ilustracijama:
Sl. 1 prikazuje titar IgG antitela na nemodifikovan (GLC-) ili glukozom modifikovan (GLC+) O4-antigen LPS-a, određen ELISA postupkom iz seruma dva zeca imunizovana biokonjugatom Glc-modifikovanog O4-polisaharida, kao što je opisano u Primeru 4; titri su određeni u ELISA testu koji je urađen u kvadruplikatu;
Sl. 2 prikazuje titar IgG antitela iz celih ćelija sa spojenim serumima zečeva koji su imunizovani biokonjugatom Glc-modifikovanog O4-antigena nasuprot O4E. coli sa utvrđenim gtrS statusom, kao što je opisano u Primeru 4; gtrS-negativni su sledeći izolati: A2625, stGVXN4988, OC24784, OC24787 i OC24788; gtrS-pozitivni su naredni izolati: Y1382, E551, OC24334, stGVXN4983, stGVXN4994 i OC24794; uključen je i negativni kontrolni soj OC9487 (ATCC 35383; serotip O75);
Sl. 3 prikazuje imunoblotove LPS-a ekstrahovanog iz gtrS-pozitivnih i negativnih O4 izolata, imunotestiranih kombinovanim serumima dva zeca, imunizovana modifikovanim polisaharidom O4;
Sl. 4A i 4B prikazuju nivoe antitela indukovane glikozilovanim O4 (O4-Glc+)-EPA biokonjugatima; Sl. 4A prikazuje nivoe antitela u serumu, izmerene ELISA testom, u vremenskim tačkama 0, 14 i 42 dana nakon imunizacije; prikazani su pojedinačni titri (log10 EC50 titar) i GMT ± 95% CI; siva isprekidana linija označava prag iznad kojeg su dilucione krive uzoraka fitovane primenom 4PL modela; Sl. 4B prikazuje rezultate opsonofagocitnog (OPK) testa kojim je određena funkcionalnost antitela u uzorcima seruma prikupljenim 42 dana nakon imunizacije glikozilovanim O4 (O4-Glc+)-EPA biokonjugatom (4.0 µg); Wilcoxon-ov test zbira rangova i korekcija prema Bonferoni testu; *P<0,05, ***P<0,0001; Sl. 5 prikazuje indukcioni efekat glikozilovanog biokonjugata O4 (O4 Glc+)-EPA izazvan primenom tri doze kod Sprague Dawley pacova, kao što je opisano u Primeru 4; nivoi antitela u serumu izmereni su ELISA testom, 0, 14 i 42 dana nakon imunizacije; prikazani su pojedinačni titri (log10 EC50 titar) za svaku životinju; linije između tačaka povezuju titre IgG antitela za svaku životinju pojedinačno, tokom vremena; siva isprekidana linija označava prag iznad kojeg su krive razblaženja uzora fitovane primenom 4PL modela; statistička analiza značajnosti izvršena Wilcoxonovim testom predznaka i Bonferonijevom korekcijom za višestruka poređenja (poređenje 14. dan prema 0. danu, P = 0.012 za 4.0 µg/dozi; 42. dan prema 0. danu, P =0.006 za sve primenjene doze; 42. dan prema 14. danu, P = 0.006 za sve doze);
Sl. 6 prikazuje funkcionalnost antitela indukovanih O4-Glc+-EPA biokonjugatom; Sprague Dawley pacovi imunizovani su tri puta intramuskularnom injekcijom formulacije pufera ili biokonjugata O4(Glc+)-EPA u dozi od 4.00 µg/dozi; funkcionalnost antitela određena je opsonofagocitnim testom ubijanja (OPKA), primenom O4(Glc+) i O4(Glc-) sojeva E. coli; prikazani su pojedinačni titri opsonizacije (OI) i GMT ± 95% CI;
Sl. 7 daje rezultate kapilarne elektroforeze PglB pretraživanja, koji prikazuju proizvodnju biokonjugata O4-Glc+ za svaki testirani soj na blotu, primenom monoklonskih antitela za detekciju O4-Glc+ biokonjugata u frakciji periplazme. Monoglikozilovani proizvod ima približnu molekulsku težinu od 180 kDa, bi-glikozilovani proizvod je približno 320 kDa i triglikozilovani proizvod je približno 450 kDa molekulske težine. A) Prvi krug pretraživanja. Wt PglB u traci 3, N311V-PglB u trakama 2 i 4, prazan kontrolni soj u traci 1 i ostale varijante PglB-a u trakama 5 i 6. B) Drugi krug pretraživanja. Varijanta N311V PglB u traci 3, varijanta N311V+Y77H PglB u traci 9, prazan kontrolni soj u traci 1 i 2, ostale PglB varijante u preostalim trakama.
Sl. 8 prikazuje nivoe antitela indukovane ExPEC10V vakcinom kod novozelandskih belih zečeva. Životinje su tri puta imunizovane intramuskularnom injekcijom ExPEC10V ili fiziološkim rastvorom, u razmaku od po 2 nedelje između svake doze. ExPEC10V vakcina je administrirana u tri koncentracije (grupa 1: visoka doza, grupa 2: srednja doza i grupa 3: niska doza, Tabela), dok je kontrolna grupa primila samo fiziološki rastvor (grupa 4, 0.9% (tež./zapr.) rastvor natrijum hlorida). Nivoi antitela su izmereni ELISA testom, nultog (0) dana (pre vakcinacije) i 14, 27 i 42 dana nakon vakcinacije (post-vakcinacija). Prikazani su pojedinačni titri (EC50 titar) i geometrijski srednji titar (GMT) ± 95% CI. Wilcoxon-ov test sume ranga sa Bonferronijevom korekcijom za višestruka poređenja. Poređenje ExPEC10V vakcinisanih životinja (grupa 1, 2 i 3) sa fiziološkom kontrolom (grupa 4). *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. LOD: limit detekcije.
Sl. 9 prikazuje nivoe antitela izazvane ExPEC10V. Novozelandski beli zečevi imunizovani su tri puta intramuskularnom injekcijom ExPEC10V (105.6 µg ukupnog polisaharida) ili su dobili 0.9% tež./zapr. rastvora natrijum hlorida (kontrola). Titar IgG antitela određen je ELISA testom 1. dana (pre imunizacije, n = 20/grupa), 31. dana (post-imunizacija, n = 20/grupa) i 50. dana (postimunizacija, n = 10/grupa). Grafikoni pokazuju pojedinačne titre i geometrijsku sredinu ± 95% intervala pouzdanosti za svaku grupu. Razlike u IgG titrima između ExPEC10V i kontrolne grupe analizirane su primenom Tobitovog modela sa testom verovatnoće. P vrednosti ≤ 0.05 smatraju se značajnim. *P ≤ 0.05, ****P ≤ 0.0001.
Sl. 10 prikazuje ukupan dizajn studije 1/2a faze kliničkog ispitivanja ExPEC10V vakcine na ljudima. Sl. 10A prikazuje ukupan dizajn studije za kohortu 1, a Sl. 10B prikazuje ukupan dizajn studije za kohortu 2. Vidi Primer 11 za detalje.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0046] Osnova pronalaska i specifikacija pozivaju se na ili opisuju brojne publikacije, članke i patente. Razmatranja dokumenata, akata, materijala, uređaja, članaka i slično, uključena su u sadašnju specifikaciju kako bi se opisao kontekst pronalaska. Takva diskusija nije potvrda da bilo koje ili da sva ova pitanja čine deo prethodnog stanja tehnike u vezi sa bilo kojim pronalaskom ili otkrićem.
[0047] Osim ako nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini koji se koriste u specifikaciji imaju uobičajena značenja lako razumljiva stručnjaku u oblasti na koju se pronalazak odnosi. Značenja nekih termina su navedena u specifikaciji.
[0048] Potrebno je napomenuti da kako je korišćeno u tekstu i u pridruženim patentnim zahtevima, neodređeni i određen član jednine „jedan“, „neki“, „taj“ (u originalu, „a“, „an“ i „the“), odnose se i na množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0049] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, termin „najmanje“ koji prethodi nizu elemenata treba shvatiti da se odnosi na svaki od elemenata u seriji.
[0050] Stručnjaci u oblasti pronalaska prepoznaće ili će konstatovati koristeći se samo rutinskim eksperimentisanjem mnoge ekvivalente specifičnih primera izvođenja predmetnog pronalaska koji je obelodanjen. Takvi ekvivalenti su takođe obuhvaćeni pronalaskom.
[0051] U ovoj specifikaciji i pridruženim zahtevima, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrže“, i varijacije kao što su „sadrži“ i „koji sadrži“, podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. U značenju kako se ovde koristi, termin „koji sadrži“ može se zameniti terminima „koji obuhvata“ ili „koji uključuje“ ili u nekim slučajevim, „koji ima“.
[0052] U značenju kako se ovde koristi, „koji se sastoji od“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije konkretno naveden u elementu zahteva. U značenju kako se ovde koristi, „koji se sastoji u suštini od“ ne isključuje prisustvo materija ili koraka koji ne ostvaruju suštinski uticaj na osnovna i nova svojstva zahteva. Bilo koji od prethodno navedenih izraza „koji sadrži“, „koji obuhvata“, „koji uključuje“ i „koji ima“, kad god se ovde koristi u kontekstu aspekta ili primera izvođenja pronalaska, može se zameniti izrazom „koji se sastoji od“ ili „koji se sastoji u suštini od“ kako bi se promenio obim pronalaska.
[0053] U značenju kako se ovde koristi, konjunktivna forma „i/ili“ između više pomenutih elemenata uključuje kako pojedinačne, tako i kombinovane opcije. Na primer, kada su dva elementa povezana sa „i/ili“, prva opcija se odnosi na primenljivost prvog elementa bez drugog. Druga opcija se odnosi na primenljivost drugog elementa bez prvog. Treća opcija se odnosi na primenljivost prvog i drugog elementa zajedno. Smatra se da ova formulacija uključuje svaku od ove tri opcije, pa stoga zadovoljava primenu forme „i/ili“ kako se koristi ovde. Istovremena primenjivost više od jedne opcije takođe potpada pod značenje, pa stoga zadovoljava zahtev forme „i/ili“.
[0054] Otkrivanje strukturne modifikacije O-antigena, konkretno, bočnih ogranaka glukoze, unutar O4 serotipa E. coli (Jann et al., 1993) predstavlja izazov u procesu razvoja glikokonjugatne vakcine usmerene protiv bakterijskih izolata u okviru ovog serotipa. Nepoznato je koji udeo sadašnjih kliničkih O4 izolata eksprimira nemodifikovane (oni koji nemaju bočne ogranke glukoze) i modifikovane (oni koji imaju bočne ogranke glukoze) forme O4 antigena. Informacija o ovom svojstvu od ključnog su značaja za odabir relevantne antigenske strukture. Pored toga, nije poznat obim do kojeg antitela indukovana vakcinom protiv jedne forme O4-polisaharida unakrsno reaguju sa drugim oblicima. Razdvajanje i prečišćavanje O-antigena od lipida A i naredna hemijska konjugacija sa proteinskim nosačem dugotrajan je i zahtevan proces. Takođe, prečišćavanje, detoksifikacije lipida A i hemijske konjugacije mogu dovesti do gubitka epitopa, heterogenosti antigena i smanjene imunogenosti konjugovanog polisaharida. Biokonjugacija, kao pristup u sintezi glikokonjugata može da prevaziđe ograničenja klasičnog prečišćavanja i hemijske konjugacije, iako sinteza O4 O-antigena sa bočnim ograncima glukoze in vivo zahteva aktivnost odgovarajućeg enzima koji dodaje bočne grane polisaharida, a koji se nalazi izvan rfb genskog klastera. Do danas nije otkriveno koji je enzim odgovoran za modifikovanje O-antigena dodavanjem bočnih lanaca glukoze kod O4-antigena sojeva E. coli. Kloniranje rfb genskog klastera O4 u biokonjugacioni soj E. coli koji eksprimira PglB nije dovoljno da se sintetiše O4 glikokonjugat sa bočnim ograncima, već dovodi do nastanka nerazgranatih O4 biokonjugata (struktura njihovih glikana prikazana je u formuli (O4) u Tabeli 1). U značenju kako se ovde koristi, termini „glikozilovani O4“, „O4 sa bočnim ograncima glukoze“, „O4 Glc+“ i „Glc+ O4“ O antigen odnose se na O4 O-antigen sa bočnim ograncima glukoze, čija je struktura prikazana u formuli (O4-Glc+) u Tabela 1.
[0055] Pronalazak obelodanjuje gen koji kodira enzim koji učestvuje u modifikaciji O-antigena, dodavanjem bočnih grana glukoze na polisaharid O4-antigena E. coli. Takođe su opisane ćelije-domaćina, na primer, rekombinantno dizajnirane ćelije-domaćina koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju enzime sposobne da in vivo proizvodu biokonjugate koji sadrže glikozilovani polisaharid O4 antigena kovalentno vezan za proteinski nosač. Takve ćelije-domaćina se mogu koristiti za stvaranje biokonjugata koji sadrži glikozilovani O4 antigen vezan za proteinski nosač, koji se može koristiti za, na primer, formulaciji terapeutske i/ili profilaktičke kompozicije (na primer, vakcine). Takođe su obelodanjene kompozicije koje sadrže biokonjugate glikozilovanog polisaharida O4-antigena, samostalno ili u kombinaciji sa drugim antigenima E. coli (na primer, polisaharidi O1, O2, O6, O8, O15, O16, O18, O25 i/ili O75 antigena i njihove podserotipovi). Kompozicije se mogu koristiti u profilaktičkim i/ili terapijskim postupcima, na primer, u vakcinaciji domaćina protiv infekcije E. coli, a korisne su za stvaranje antitela u terapijskim postupcima kao što je imunizacija subjekata.
[0056] U značenju kako se ovde koristi, termini „O-antigen“, „polisaharid O-antigena“, „saharid O-antigena“ i „OPS“ odnose se na O-antigen gram-negativnih bakterija. Uobičajeno, O-antigen je polimer imunogenih polisaharidnih jedinica. U posebnom primeru izvođenja pronalaska, izrazi „O-antigen“, „polisaharid O-antigena“ i „OPS“ odnose se na O-antigen Escherichia coli. Različiti serotipovi E. coli eksprimiraju specifične O-antigene. U E. coli, gene koji su uključeni u biogenezu O-antigena kodirani su rfb genskim klasterom.
[0057] U značenju kako se ovde koristi, termini „rfb klaster“ i „rfb genski klaster“ odnose se na klaster gena koji kodira enzime sposobne da sintetiše osnovu O-antigena. Termin rfb klaster može se primeniti na bilo koji biosintetički klaster O-antigena, a poželjno se odnosi na klaster gena iz roda Escherichia, naročito na E. coli.
[0058] U značenju kako se ovde koristi, oznaka „O1A“ odnosi na O1A antigen E. coli (podserotip O1 serotipa E. coli). Oznaka „O2“ odnosi se na O2 antigen E. coli (podserotip O2 serotipa E. coli). Oznaka „O6A“ odnosi se na O6A antigen E. coli (jedan podserotip O6 serotipa E. coli). Oznaka „O8“ odnosi se na O8 antigen E. coli (O8 serotip E. coli). Oznaka „O15“ odnosi se na O15 antigen E. coli (O15 serotip E. coli). Oznaka „O16“ odnosi se na O16 antigen E. coli (O16 serotip E. coli). Oznaka „O18A“ odnosi se na O18A antigen E. coli (podserotip O18 serotipa E. coli). Oznaka „O25B“ odnosi se na O25B antigen poreklom iz E. coli (podserotip serotipa O25 E. coli). Oznaka „O75“ odnosi se na O75 antigen E. coli (serotip O75 E. coli).
[0059] Strukture polisaharida E. coli O-antigena koje se pominju u ovoj prijavi prikazane su ispod u Tabela 1. Prikazana je jedna jedinica koja se ponavlja za svaki polisaharid O-antigena E. coli.
lico E. na genti -a O
a rid ha lisa poratu uktr
1:S ael ab T
) vak sta a(n
[0060] Svi ovde opisani monosaharidi imaju svoje uobičajeno značenje poznato u tehnici. Monosaharidi mogu imati D ili L konfiguraciju. Ako D ili L konfiguracija nije naznačena, smatraće se da je šećer u D konfiguraciji. Monosaharidi se uobičajeno označavaju skraćenicama koje su opšte poznate i korišćene u tehnici. Na primer, Glc označava glukozu; D-Glc se odnosi na D-glukozu, dok se L-Glc odnosi na L-glukozu. Druge uobičajene skraćenice za monosaharide obuhvataju: Rha, ramnoza; GlcNAc, N-acetilglukozamin; GalNAc, N-acetilgalaktozamin; Fuc, fukoza; Man, manoza; Man3Me, 3-O-metil-manoza; Gal, galaktoza; FucNAc, N-acetilfukozamin; i Rib, riboza. Sufiks „f“ se odnosi na furanozu, dok se sufiks „p“ odnosi na piranozu.
[0061] Skraćenica „RU“, „jedinica koja se ponavlja“ i „ponovak“, u vezi sa O-antigenom odnose se na biološku ponavljajući jedinicu (BRU) O-antigena, onako kako se ta jedinica sintetiše in vivo posredstvom ćelijske mašinerije (na primer, glikozil-transferaze). Broj RU jedinica O-antigena može varirati zavisno od serotipa, a u primerima izvođenja pronalaska tipično varira od oko 1-100 RU, poželjno oko 1 do 50 RU, na primer, 1-50 RU, 1-40 RU, 1-30 RU, 1-20 RU i 1-10 RU, i više, poželjno najmanje 3 RU, najmanje 4 RU, najmanje 5 RU, na primer, 3-50 RU, poželjno 5-40 RU, na primer, 7-25 RU, na primer, 10-20 RU. Međutim, u nekim slučajevima, broj RU ponovaka u O-antigenu može biti 1-2. Strukturna formula svakog od ovde prikazanih O-antigena sadrži jedan RU, sa promenljivom brojem „n“ koji se odnosi na tačan broj RU u strukturi tog antigena. U svakom polisaharidu O-antigena u biokonjugatu prema predmetnom pronalasku, n nezavisno predstavlja ceo broj od 1-100, kao na primer, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, poželjno najmanje 3, poželjnije najmanje 5, kao što je 3-50, poželjno 5-40 (na primer, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40), ali u nekim slučajevima taj broj može biti 1-2. U nekim primerima izvođenja, n je nezavisno ceo broj od 7-25, na primer, od 10-20. Vrednosti mogu da variraju kod pojedinačnih polisaharida O-antigena u kompoziciji, a ovde su date kao prosečne vrednosti, odnosno, ako opisani biokonjugat ima n koji je nezavisno ceo broj od 5-40, u sastavu kompozicije većina polisaharida O-antigena sadrži 5-40 ponavljajućih jedinica, ali može sadržati neke polasaharide O-antigena koji imaju manje od 5 ponavljajućih jedinica ili više od 40 ponavljajućih jedinica.
[0062] Termin „glikokonjugat“ se odnosi na šećer ili saharidni antigen (na primer, oligo- i polisaharid)-proteinski konjugat, vezan za dodatnu hemijsku vrstu, uključujući bez ograničenja proteine, peptide, lipide, itd. Glikokonjugati se mogu dobiti hemijski, na primer, hemijskim (sintetičkim) povezivanjem proteina i šećera ili saharidnog antigena. Termin glikokonjugat takođe uključuje biokonjugate.
[0063] Termin „biokonjugat“ odnosi se na konjugat proteina (na primer, proteinskog nosača) i šećernog ili saharidnog antigena (na primer, oligo- i polisaharid), sintetisan u ćeliji-domaćina, poželjno u bakterijskoj ćeliji-domaćina, na primer, nekoj E. coli ćeliji-domaćina, pri čemu sintetska mašinerija ćelije-domaćina povezuje antigen sa proteinom (na primer uspostavlja N-veze). Poželjno se termin „biokonjugat“ odnosi na konjugat proteina (na primer, proteinskog nosača) i O-antigena, poželjno nekog O-antigena E. coli (na primer, O1A, O2, glikozilovani O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, O75, itd.), sintetisan u ćeliji-domaćina, pri čemu sintetska mašinerija ćelije-domaćina povezuje antigen sa proteinom (na primer, uspostavlja N-veze). Budući da se biokonjugati sintetišu u ćelijama-domaćina radom sintetske mašinerije ćelije-domaćina, antigen i protein u biokonjugatu su kovalentno povezani glikozidnom vezom. Biokonjugati se mogu pripremiti u rekombinantnim ćelijama-domaćina koje su konstruisane tako da eksprimiraju ćelijsku mašineriju potrebnu za sintezu O-antigena i/ili da mašineriju potrebni za povezivanje O-antigena sa ciljnim proteinom. Biokonjugati, kao što je ovde opisano, imaju poželjna svojstva u odnosu na hemijski sintetisane glikokonjugate u kojima su glikani prečišćeni iz ćelijskog zida bakterije, a zatim su hemijski spojeni sa proteinskim nosačem, jer biokonjugati zahtevaju manje hemijskih reagenasa u proizvodnji i konzistentniji su u pogledu konačnog proizvoda, a sadrže manje ili nimalo slobodnih glikana (odnosno, glikana koji nisu vezani za proteinski nosač). Stoga su u tipičnim primerima izvođenja pronalaska, biokonjugati poželjniji u odnosu na hemijski proizvedene glikokonjugate.
[0064] Termin „približno“, kada se koristi zajedno sa brojem, odnosi se na bilo koji broj unutar opsega ±1, ±5 ili ±10% u odnosu na navedeni broj.
[0065] Termin „procenat (%) istovetnosti sekvence“ ili „% istovetnosti“ opisuje broj podudaranja („pogodaka“) identičnih aminokiselina u dve ili više poravnatih aminokiselinskih sekvenci u odnosu na ukupan broj aminokiselina koje ulaze u sastav celokupne aminokiselinske sekvence. Drugim rečima, poravnanjem dve ili više sekvenci, procenat istovetnih aminokiselina (na primer, 90%, 95%, 97% ili 98% istovetnosti) određuje se upoređivanjem i utvrđivanjem maksimalne podudarnosti, primenom algoritama za poređenje sekvenci koji su poznati u stanju tehnike, ili manuelnim poravnanjem i vizuelnom inspekcijom. Sekvence koje se porede u cilju određivanja istovetnosti mogu se razlikovati u pogledu supstitucije/a, adicije/a ili delecije/a aminokiselina. Pogodni programi za poravnavanje proteinskih sekvenci poznati su stručnjacima u stanju tehnike. Procentualna istovetnost proteinskih sekvenci može se, primera radi, odrediti korišćenjem programa kao što su CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA ili BLAST, primenom NCBI BLAST algoritma (Altschul SF i sar. (1997), Nucleic Acids Res.25:3389-3402).
[0066] Za aminokiselinske sekvence, istovetnost sekvence i/ili sličnost može se odrediti primenom standardnih postupaka poznatih u stanju tehnike, uključujući, bez ograničenja, algoritam istovetnosti sekvence Smith-a i Waterman-a, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, algoritam poravnanja istovetnosti sekvence Needleman-a i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48:443, postupkom utvrđivanja sličnosti Pearson-a i Lipman-a, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. SAD 85:2444, kompjuterizovanih aplikacija za primenu ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u sastavu softverskog paketa Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit programa autora Devereux et al, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, uz podrazumevana podešavanja, ili uz nadzor. U nekim primerima izvođenja, procenat istovetnosti se izračunava primenom FastDB, na osnovu sledećih parametara: kazna nepodudaranja - 1; kazna praznine - 1; kazna veličine praznine -0,33; i spojna kazna od 30, „Current Methods in Sequence Comparison ana Analysis“, „Macromolecule Sequencing and Sinthesis, Selected Methods and Applications“, str.127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
[0067] Još jedan primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u:
Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res.
25:3389-3402; i Karin et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Posebno koristan BLAST program je program WU-BLAST-2, objavljen od Altschul et al, 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara za pretraživanje, od kojih je većina podešena na podrazumevane vrednosti.
[0068] Dodatni koristan algoritam je BLAST sa prazninom koji su objavili Altschul et al, 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402.
[0069] Izraz „Invazivna bolest ekstraintestinalnog patogena Escherichia coli (ExPEC) (IED)“ definiše se kao akutna bolest izazvana sistemskom bakterijskom infekcijom, koja je mikrobiološki potvrđena izolovanjem i identifikovanjem E. coli u krvi ili u drugim uobičajeno sterilnim uzorcima telesnih tečnosti, ili izolovanjem i identifikacijom E. coli iz urina pacijenata koji ispoljavaju znake i simptome invazivne bolesti (sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepse ili septičkog šoka), a nemaju druge identifikovane izvore infekcije.
Biokonjugati glikozilovanih polisaharida O4-antigena E. coli
[0070] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli koji je kovalentno povezan sa proteinskim nosačem. U značenju kako se ovde koristi, termin „O4“ se odnosi na O4 antigen poreklom iz E. coli (O4 serotip E. coli). Poznato je da postoji strukturna modifikacija O-antigena unutar O4 serotipa E. coli. Konkretno, neki O4 serotipovi eksprimiraju modifikovani O-antigen koji ima bočne ogranke glukoze. U značenju kako se ovde koristi, naredni izrazi „glikozilovani O4-antigen“, „glikozilovani polisaharid O4-antigena“, „polisaharid O4-Glc+ antigena“ i „O4-Glc+ antigen“ odnose se na O4-antigen (na primer, O4-antigen E. coli), koji sadrži bočni ogranak glukoze u kojem je D-glukoza povezana sa L-ramnozom u ponovku L-Rha→D-Glc→LFucNAc→D-GlcNAc. U posebnom primeru izvođenja, glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli ima strukturu formule (O4-Glc+), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1 do 100. U poželjnim primerima izvođenja, n je ceo broj od 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0071] Svi O4 sojevi E. coli, nezavisno od prisustva bočnih ogranaka glukoze, sadrže suštinski istovetan rfb genski klaster koji kodira gene zadužene za sintezu osnove polisaharida O4-antigena. Međutim, da bi se izvršila modifikacija O4-antigena ograncima glukoze in vivo neophodna je aktivnost specifičnog enzima koji je sposoban da katalizuje sintezu polisaharidnog ogranka, a gen koji kodira takav enzim nalazi se izvan rfb genskog klastera. Prema saznanjima pronalazača, do danas je nepoznat identitet enzima koji katalizuje dodavanje ogranka polisaharida za modifikaciju O4-antigena. Pronalazači predmetnog pronalaska su ovde obelodanili sekvencu enzima koji katalizuje dodavanje ogranaka polisaharida odgovornih za glikozilaciju i modifikaciju O4-antigena. Identifikovanje ovog enzima omogućuje proizvodnju biokonjugata glukozno modifikovanog polisaharida O4-antigena. Glukozom modifikovana forma polisaharida O4-antigena je prisutna je u dominantnim serotipovima, pa se stoga može koristiti za poboljšanje imunskog odgovora, na primer, za profilaktičku ili terapeutsku primenu.
[0072] Konkretno, pronalazak obezbeđuje sekvencu gtrS gena koji kodira enzim glukoziltransferazu specifčnu za O4-serotip E. coli, koja je sposbna da glikoziluje O4-antigen. Načelno govoreći, geni gtrA, gtrB i gtrS kodiraju enzime odgovorne za glikozilaciju O-antigena. Dok su gtrA i gtrB geni različitih serotipova homologi i međusobno zamenljivi, gtrS gen kodira glukozil-transferazu koja je specifična za serotip O-antigena. Gen gtrS serotipa O4 E. coli kodira GtrS enzim koji specifično modifikuje O4-antigen, uvođenjem ogranaka glukoze. Karakterizacija savremenih kliničkih izolata O4-serotipa E. coli otkrila je prisustvo gtrS u 78% testiranih izolata, što ukazuje da u savremenim infektivnim izolatima dominira polisaharid O4-antigena E. coli koji je modifikovan dodavanjem ogranaka glukoze.
[0073] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline gtrS gena poreklom iz O4 serotipa E. coli, koja kodira GtrS glukozil-transferazu, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 4. U drugom primeru izvođenja, nukleinska kiselina gtrS gena kodira GtrS protein O4 serotipa E. coli, koji je približno 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%, istovetan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4, poželjno 98%, 99% ili 100% istovetan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4. GtrS protein koji je najmanje 80% istovetan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4 sposoban je da izvrši glikozilaciju polisaharida O4-antigena E. coli kako bi se dobio glikozilovani O4-antigen strukturne formule (O4-Glc+), kao što je prikazano u Tabeli 1. Osoba sa uobičajenim veštinama u ovoj oblasti može da proizvede mutirane oblike GtrS proteina sa SEQ ID NO: 4, koji imaju najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 4, i da testira takve sekvence u pogledu glikozilujuće aktivnosti prema O4-antigenu E. coli u kontekstu ovog pronalaska. Dalje će ovom specifikacijom detaljnije biti opisane rekombinantne ćelije-domaćina koje sadrže sekvencu nukleinske kiseline gtrS gena, koji kodira glukozil-transferazu sposobnu da glikoziluje O4-serotip E. coli, kao i primenu rekombinantnih ćelija-domaćina u proizvodnji polisaharida O4-antigena modifikovanog glukozom i njihovih biokonjugata.
[0074] Sekvence proteina kodiranih gtrA i gtrB genima, koji imaju ulogu translokaze glukoze vezane za baktoprenol (GtrA, transportuje glukozu vezanu sa baktoprenol kroz unutrašnju membranu u periplazmu), odnosno, baktoprenol glukozil-transferaza (GtrB, katalizuje prenos glukoze i vezivanje za baktoprenol), mogu imati aminokiselinske sekvence koje su najmanje 80% istovetne SEQ ID NO: 7, odnosno, 8. U nekim primerima izvođenja, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine GtrA i GtrB, koji su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% istovetni sekvencama SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, i ispoljavaju aktivnost translokaze glukoze vezane za baktoprenol, odnosno, baktoprenol glukozil-transferaze, takođe su prisutne u ćelijama-domaćina saglasno pronalasku, gde ćelijedomaćina dalje sadrže O4-antigen specifičan rfb lokus, O4-specifičnu GtrS sekvencu koja kodira gore opisanu oligosaharil-transferazu i sekvencu koja kodira proteinski nosač, koji poseduje jednu ili više konsenzusnih sekvenci glikozilacije, kao što je opisano, za dobijanje biokonjugata glikozilovanog O4 serotipa E. coli (koji poseduje glikansku strukturu formule (O4-Glc+) u Tabeli 1).
[0075] Biokonjugati glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli obelodanjeni pronalaskom, kovalentno su vezani za proteinski nosač, poželjno glikozidnom vezom. U svetlu predmetnog pronalaska moguće je primeniti bilo koji proteinski nosač poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Pogodni proteinski nosači uključuju, bez ograničenja, detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae. Opisana je biokonjugacija sa različitim proteinskim nosačima koji sadrže potrebne konsenzusne sekvence glikozilacije, što ukazuje na to da se veliki broj proteina može glikozilovati primenom ove tehnologije (videti, na primer, WO 06/119987, WO 2015/124769, WO 2015/158403, WO 2015/82571, WO 2017/216286 i WO 2017/67964, koji svi zajedno pokazuju raznovrsne proteinske nosače koji su do sada uspešno korišćeni u biokonjugacijama).
[0076] U nekim primerima izvođenja, proteinski nosač je modifikovan, na primer, tako da je protein manje toksičan i/ili je podložniji glikozilaciji. U specifičnom primeru izvođenja, proteini-nosači koji se ovde koriste modifikovani su tako da se poveća broj mesta glikozilacije, što će omogućiti administraciju niže koncentracije proteina u imunogenoj kompoziciji, posebno u njenom biokonjugatnom obliku.
[0077] Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, opisani proteini-nosači modifikovani su tako da sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više mesta glikozilacije od onog broja koji se normalno nalazi u tom proteinskom nosaču (na primer, od broja glikozilacionih mesta u proteinskom nosaču u njegovom nativnom/prirodnom, odnosno, „neizrođenom“ obliku). Uvođenje novih mesta glikozilacije u proteinski nosač može se postići umetanjem konsenzusne sekvence glikozilacije na bilo koje mesto u primarnoj strukturi proteina, na primer, insercijom novih aminokiselina u primarnu strukturu proteina, tako da mesto glikozilacije dodaje u potpunosti ili delimično, ili mutacijom postojećih aminokiselina u proteinu kako bi se stvorilo novo mesto glikozilacije. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da se aminokiselinska sekvenca proteina može lako modifikovati primenom postupaka poznatih u stanju tehnike, na primer, primenom rekombinantnih pristupa koji uključuju modifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein. U specifičnim primerima izvođenja, konsenzusne sekvence glikozilacije uvode se u specifične regione proteinskog nosača, na primer, u površinsku strukturu proteina, na N- ili C-terminus proteina, i/ili u petlje koje su stabilizovane disulfidnim mostovima u osnovi proteina. U nekim primerima izvođenja, konsenzusna sekvenca glikozilacije može se produžiti dodavanjem aminokiseline lizin u cilju efikasnije glikozilacije.
[0078] Pogodni primeri konsenzusnih sekvenci glikozilacije koje se mogu umetnuti ili generisati u proteinskom nosaču obuhvataju Asn-X-Ser(Thr), gde X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 1); i Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), gde su X i Z nezavisno bilo koja aminokiselina, osim Pro (SEQ ID NO: 2).
[0079] U nekim primerima izvođenja, glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli kovalentno je vezan za aminokiselinski ostatak asparagina (Asn) u molekulu proteinskog nosača (na primer, N-vezom), gde je Asn deo motiva glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjnije koja ima SEQ ID NO: 2. Proteinski nosač uobičajeno sadrži 1-10 mesta glikozilacije, poželjno 2 do 4 mesta glikozilacije, najpoželjnije 4 mesta glikozilacije, kao što je 1-10, poželjno 2-4 i još poželjnije 4 mesta glikozilacije, od kojih svako sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 1, i poželjnije u SEQ ID NO: 2.
[0080] U konkretnim primerima izvođenja, proteinski nosač je detoksifikovani egzotoksin A P. aeruginosa. U literaturi si opisane različite detoksifikovane varijante EPA proteina koje se mogu koristiti kao proteinski nosači. Primera radi, prema Lukac i sar., 1988, Infect. Immun, 56: 3095-3098, i Ho et al., 2006, Hum Vaccin, 2:89-98, detoksifikacija se može postići mutiranjem ili delecijom katalitički važnih aminokiselina L552V i ΔE553. U značenju kako se ovde koristi, „EPA“ se odnosi na detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa. U primerima izvođenja gde se kao proteinski nosač koristi EPA, glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli može biti kovalentno vezan za Asn koji je deo mesta glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije SEQ ID NO: 1, i poželjno je kovalentno povezana sa Asn ostatkom na mestu glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije SEQ ID NO: 2. Poželjno, EPA proteinski nosač sadrži 1-10 mesta glikozilacije, poželjno 2 do 4 mesta glikozilacije, najpoželjnije 4 mesta glikozilacije, kao što je na primer, 1-10, poželjno 2-4 i još poželjnije 4 mesta glikozilacije, od kojih svako sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije, koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1, i poželjnije, aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2.
[0081] U nekim primerima izvođenja, EPA proteinski nosač sadrži četiri mesta glikozilacije od kojih svako sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije, na primer, mesto glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema SEQ ID NO: 2. U značenju kako se ovde koristi, termini „EPA-4 proteinski nosač“ i „EPA-4“ odnose se na detoksifikovani egzotoksin A proteinskog nosača P. Aeruginosa, koji sadrži četiri mesta glikozilacije od kojih svako sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije datu u SEQ ID NO: 2. Poželjan primer EPA-4 proteinskog nosača je EPA proteinski nosač koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3.
Kompozicije
[0082] U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli koji je kovalentno vezan za proteinski nosač. Kompozicije obezbeđene pronalaskom mogu uključiti bilo koji ovde opisan biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, koji je kovalentno povezan sa proteinskim nosačem (na primer, EPA).
[0083] U nekim primerima izvođenja, kompozicija je imunogena kompozicija. U značenju kako se ovde koristi, „imunogena kompozicija“ odnosi se na kompoziciju koja izaziva imunski odgovor domaćina ili subjekta kome je kompozicija administrirana. Imunogene kompozicije mogu dodatno da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, kompozicija je farmaceutska kompozicija koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. U značenju kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava diluent, pomoćno sredstvo, ekscipijens ili vehikulum sa kojim se kompozicija primenjuje, koji je netoksičan i koji ne bi trebalo da utiče na efikasnost aktivnog sastojka. Na primer, kao tečni nosači mogu se koristiti rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerola, posebno u rastvorima za injekcije. Pogodni ekscipijensi su skrob, glukoza, laktoza, saharoza, želatin, slad, pirinčano brašno, kreda, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen-glikol, voda, etanol i slično. Ostali primeri odgovarajućih farmaceutski prihvatljivih nosača dati su u knjizi „Remington’s Pharmaceutical Sciences“ E.W. Martina.
[0084] U jednom primeru izvođenja, kompozicija sadrži biokonjugate prema pronalasku, rastvorene u Tris-puferisanom fiziološkom rastvoru (TBS) pH 7,4 (na primer, rastvor koji sadrži Tris, NaCl i KCl, u koncentracijama od 25 mM, 137 mM, odnosno 2.7 mM). U drugim primerima izvođenja, kompozicije sadrže biokonjugate saglasno pronalasku u 10 mM KH2PO4/Na2HPO4puferu, pH oko 7.0, 5% (tež./zapr.) sorbitola, oko 10 mM metionina i oko 0.02% (tež./zapr.) polisorbata 80. U drugim primerima izvođenja, kompozicije saglasno pronalasku sadrže biokonjugate u puferu približnog sastava 10 mM KH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0, 8% saharoze (tež./zapr.), 1 mM EDTA i 0.02% polisorbata 80 (tež./zapr.), (videti, na primer, WO 2018/077853 za odgovarajuće pufere biokonjugata O-antigena E. coli kovalentno vezanog za EPA proteinski nosač).
[0085] U nekim primerima izvođenja, opisane kompozicije su monovalentne formulacije i sadrže jedan polisaharid O-antigena E. coli, na primer, u izolovanoj formi ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata, kao što je glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije (na primer, farmaceutske i/ili imunogene kompozicije), koje su multivalentne kompozicije, na primer, dvovalentne, trovalentne, četvorovalentne, itd. kompozicije. Na primer, multivalentna kompozicija sadrži više od jednog antigena, kao što je O-antigen E. coli, glikokonjugat ili njihov biokonjugat. U posebnim primerima izvođenja, multivalentne kompozicije prema pronalasku sadrže biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli i najmanje jedan dodatni antigen.
[0086] U jednom primeru izvođenja, kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) je monovalentna kompozicija koja sadrži bikonjugat polisaharida glikozilovanog O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, kao što je ovde opisano.
[0087] U narednom primeru izvođenja, kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) je multivalentna kompozicija koja sadrži glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, kao što je opisano, i najmanje jedan dodatni antigen.
[0088] U nekim primerima izvođenja, dodatni antigen je saharidni ili polisaharidni antigen, poželjnije polisaharid O-antigena E. coli, kao što su O-antigeni E. coli jednog ili više O1, O2, O6, O8, O15, O16, O18, O25 i O75 serotipova i njihovih podserotipova. U nekim primerima izvođenja, svaki od dodatnih polisaharida O-antigena E. coli je glikokonjugat, što znači da je polisaharid O-antigen E. coli kovalentno vezan za drugu hemijsku vrstu, na primer, protein, peptid, lipid, itd, najpoželjnije proteinski nosač, poželjno hemijskim ili enzimskim postupcima. U poželjnim primerima izvođenja, svaki od dodatnih polisaharida O-antigena E. coli je biokonjugat, u kojem je polisaharid O-antigena kovalentno vezan glikozidnom vezom za proteinski nosač, koja je uspostavljena enzimskim putem, posredstvom mašinerije ćelijedomaćina. Kompozicije obezbeđene specifičnim primerima izvođenja mogu sadržati 1-20 dodatnih glikokonjugata, poželjnije biokonjugata polisaharida O-antigena E. coli, kao što je na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 dodatnih glikokonjugata ili poželjno biokonjugata polisaharida O-antigena E. coli. U ove kompozicije mogu biti uključeni i drugi antigeni, na primer, peptidni, proteinski ili lipidni antigeni, itd.
[0089] U nekim primerima izvođenja, kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli i najmanje jedan dodatni polisaharidni antigen izabran iz grupe koju čine polisaharid O1A-antigena E. coli, polisaharid O2-antigena E. coli, polisaharid O6A-antigena E. coli, polisaharid O8-antigena E. coli, polisaharid O15-antigena E. coli, polisaharid O16-antigena E. coli, polisaharid O18A-antigena E. coli, polisaharid O25B-antigena E. coli i polisaharid O75-antigena E. coli. Poželjno, svaki od dodatnih polisaharida O-antigena je kovalentno vezan za proteinski nosač, i poželjnije je biokonjugat.
[0090] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O1A-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatima). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O1A-antigena sadrži strukturu formule (O1A), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno, polisaharid O1A- antigena je deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0091] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O2-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata), koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatima). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O2-antigena sadrži strukturu formule (O2), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je polisaharid O2-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0092] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O6A-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O6A-antigena ima strukturu formule (O6A), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je polisaharid O6A-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0093] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O8-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O8-antigena ima strukturu formule (O8), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer 5-40, na primer 7 do 25, na primer 10 do 20. Poželjno je polisaharid O8-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0094] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O15-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O15-antigena sadrži strukturu formule (O15), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je polisaharid O15-antigena deo biokonjugata i je kovalentno vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0095] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O16-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O16-antigena sadrži strukturu formule (O16), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je da je polisaharid O16-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0096] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O18A-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O18A-antigena sadrži strukturu formule (O18A), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je polisaharid O18A-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0097] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O25B-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O25B-antigena sadrži strukturu formule (O25B), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je polisaharid O25B-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0098] U jednom primeru izvođenja, polisaharid O75-antigena (na primer, u izolovanom obliku ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata), koristi se u kompoziciji prema pronalasku (na primer, u kombinaciji sa glikozilovanim polisaharidom O4-antigena ili njegovim biokonjugatom). U specifičnom primeru izvođenja, polisaharid O75-antigena sadrži strukturu formule (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n predstavlja ceo broj od 1-100, poželjno 3-50, na primer, 5-40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20. Poželjno je polisaharid O75-antigena deo biokonjugata i kovalentno je vezan za proteinski nosač, na primer, EPA.
[0099] U narednom primeru izvođenja, kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) sadrži barem polisaharide O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A i O25B-antigena E. coli, poželjno biokonjugate O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A i O25B antigena, kovalentno vezane za proteinski nosač, na primer, EPA (odnosno, petovalentna kompozicija).
[0100] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) sadrži barem polisaharide E. coli antigena O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O25B i O75, poželjno biokonjugate polisaharida O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O25B i O75 antigena, vezane za proteinski nosač, na primer, EPA (odnosno, 9-valentna kompozicija).
[0101] U narednom poželjnom primeru izvođenja, kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) sadrži barem polisaharide E. coli antigena O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75, poželjno biokonjugate polisaharida O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 antigena, kovalentno vezane za proteinski nosač, na primer, EPA (odnosno, 10-valentna kompozicija).
[0102] Pronalazak takođe predviđa kompozicije koje opciono sadrže dodatne O-antigene (na primer, u izolovanoj formi, ili kao deo glikokonjugata ili biokonjugata) drugih serotipova E. coli.
[0103] U nekim primerima izvođenja, svaki od dodatnih polisaharida O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i/ili O75 antigena E. coli je kovalentno vezan za proteinski nosač. Polisaharid O-antigena može biti vezan za proteinski nosač hemijskim ili drugim sintetskim postupcima, ili alternativno, polisaharid O-antigena može biti i poželjno jeste deo biokonjugata. Moguće je primeniti bilo koji proteinski nosač poznat stručnjacima u oblasti ovog otkrića. Pogodni proteinski nosači uključuju, bez ograničenja, detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltozavezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički” domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae. Poželjan proteinski nosač je EPA.
[0104] U nekim primerima izvođenja, svaki od dodatnih polisaharida O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i/ili O75 antigena E. coli, posebno kada je u sastavu biokonjugata, kovalentno je vezan za ostatak asparagina (Asn) u sastavu proteinskog nosača, gde se Asn nalazi u mestu glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asn-X-Ser(Thr), gde X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 1), poželjno gde se Asn nalazi na mestu glikozilacije, koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), gde su X i Z bilo koje nezavisno odabrane aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 2). Proteinski nosač može da sadrži 1-10 mesta glikozilacije, poželjno 2 do 4 mesta glikozilacije, najpoželjnije 4 mesta glikozilacije, od kojih svako sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije. U posebnom primeru izvođenja, proteinski nosač je EPA-4 proteinski nosač, na primer EPA-4 proteinski nosač koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.
[0105] U konkretnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje kompoziciju (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) koji sadrži: (i) biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. Aeruginosa, koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 3 (EPA-4 proteinski nosač), gde glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli ima strukturu formule (O4-Glc+); (ii) biokonjugat polisaharida O1A-antigena E. coli, kovalentno vezan za EPA-4 protein nosač, gde polisaharid O1A-antigena E. coli sadrži strukturu formule (O1A); (iii) biokonjugat polisaharida O2-antigena E. coli kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O2 antigena E. coli sadrži strukturu formule (O2); (iv) biokonjugat polisaharida O6A-antigena E. coli, kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O6A-antigena E. coli sadrži strukturu formule (O6A); (v) biokonjugat polisaharida O8-antigena E. coli kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O8-antigena E. coli ima strukturu formule (O8); (vi) biokonjugat polisaharida O15-antigena E. coli kovalentno vezan zna EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O15-antigena E. coli sadrži strukturu formule (O15); (vii) biokonjugat polisaharida O16-antigena E. coli, kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O16-antigena E. coli ima strukturu formule (O16); (viii) biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O25B-antigena E. coli ima strukturu formule (O25B); i (ik) biokonjugat polisaharida O75 antigena E. coli kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O75-antigena E. coli ima strukturu formule (O75), gde je svaka od formula predstavljena u Tabeli 1, i da za svaku od formula n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, na primer, 1 do 50, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40.
[0106] U posebnom primeru izvođenja, pomenuta kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena kompozicija) dalje sadrži: (k) biokonjugat polisaharida O18A-antigena E. coli, kovalentno vezan za EPA-4 proteinski nosač, gde polisaharid O18A-antigena E. coli sadrži strukturu formule (O18A) kao što je prikazano u Tabeli 1, gde n za ovu strukturu predstavlja ceo broj od 1 do 100, na primer, 1 do 50, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40.
[0107] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, i barem biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, gde je biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli prisutan u kompoziciji u koncentraciji koja je oko 1.5 do 6 puta većoj, na primer, oko 2 do 4 puta većoj, kao što je 1.5, 2, 3, 4, 5 ili 6 puta većoj od koncentracije bilo kog drugog biokonjugata u kompoziciji.
[0108] U konkretnim primerima izvođenja, kompozicija sadrži biokonjugate polisaharida O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O25B i O75 antigena E. coli, gde su biokonjugati O1A:O2:glikozilovani O4:O6A:O8:O15:O16:O25B:O75 prisutni u odnosima 1:1:1:1:1:1:1:2:1, ili 2:1:1:2:1:1:1:4:1 (prema masi polisaharida O-antigena).
[0109] U određenim primerima izvođenja, kompozicija sadrži biokonjugate polisaharida O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 antigena E. coli, gde su biokonjugati O1A:O2:glukozilovani O4:O6A:O8:O15:O16:O18A:O25B:O75 prisutni u odnosu 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1 ili 2:1:1:2:1:1:1:1:4:1 (prema masi polisaharida O-antigena).
[0110] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je kompozicija koja sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, i barem biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, gde je biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli prisutan u kompoziciji u koncentraciji od 2 do 50 µg/mL, poželjno 8 do 40 µg/mL, poželjnije 16-32 µg/mL, kao što je 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 µg/mL. U tim primerima izvođenja, poželjno je da koncentracija biokonjugata polisaharida O25B-antigena E. coli oko 1.5 do 6 puta, na primer, oko 2 do 4 puta veća, kao što je 1.5, 2, 3, 4, 5 ili 6 puta veća od koncentracije bilo kog drugog biokonjugata prisutnog u kompoziciji.
[0111] U konkretnim primerima izvođenja, ovde opisane kompozicije (na primer, farmaceutske i/ili imunogene kompozicije) sadrže ili se primenjuju u kombinaciji sa pomoćnim sredstvom. Adjuvans koji se primenjuje u kombinaciji sa opisanom kompozicijom može se primeniti pre (na primer, u roku od 72 sata, 48 sati, 24 sata, 12 sati, 6 sati, 2 sata, 1 sat, 10 minuta), istovremeno ili nakon (na primer, u roku od 72 sata, 48 sati, 24 sata, 12 sati, 6 sati, 2 sata, 1 sat, 10 minuta) administracije pomenute kompozicije. U značenju kako se ovde koristi, izraz „adjuvans“ označava jedinjenje koje, kada se daje zajedno sa ili u sastavu opisane kompozicije, povećava, pojačava i/ili indukuje imunski odgovor na polisaharid O-antigena E. coli u biokonjugatu, dok kada se takvo pomoćno sredstvo primeni samostalno, ne stvara imunski odgovor na polisaharid O-antigena E. coli u biokonjugatu. U nekim primerima izvođenja, adjuvans pojačava imunski odgovor na polisaharid O-antigena E. coli u biokonjugatu i ne izaziva alergije ili druge neželjene reakcije. Adjuvansi mogu poboljšati imunski odgovor posredstvom nekoliko mehanizama uključujući, na primer, regrutaciju limfocita, stimulaciju B i/ili T ćelija i stimulaciju makrofaga.
[0112] Primeri pogodnih pomoćnih sredstava uključuju, bez ograničenja soli aluminijuma (alum ili stipsa) (kao što je aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, aluminijum sulfat i aluminijum oksid, uključujući nanočestice koje sadrže alum ili nanoalum formulacije), kalcijum fosfat, monofosforil-lipid A (MPL) ili 3-de-O-acilovani monofosforil-lipid A (3D-MPL) (videti na primer, UK Patent GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919), AS01, AS02, AS03 i AS04 (svi od GlaxoSmithKline; videti na primer, EP1126876, US7357936 za AS04, EP0671948, EP0761231, US5750110 za AS02), MF59 (Novartis), imidazopiridinska jedinjenja (videti WO2007/109812), imidazohinoksalinska jedinjenja (videti WO2007/109813), delta-inulin, STING-aktivirajući sintetički ciklični di-nukleotidi (na primer, US20150056224), kombinacije homopolimera lecitina i karbomera (na primer, US6676958) i saponina, kao što su QuilA i QS21 (videti na primer, Zhu D i W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113), Matrix M, Iscoms, Iscomatrix, itd, opciono u kombinaciji sa QS7 (videti Kensil et al., u Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Povell & Newman, Plenum Press, NI, 1995); US Patent No. 5,057,540). U nekim primerima izvođenja, pomoćno sredstvo je Frojndov adjuvans (kompletni ili nekompletni). Ostali adjuvansi su emulzije ulje/voda (na primer, skvalen ili ulje od kikirikija), opciono u kombinaciji sa imuno-stimulansima, kao što je monofosforil-lipid A (videti Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Drugi pogodan adjuvans je CpG (Bioworld Today, 15. novembar 1998). Dalji primeri adjuvansa su lipozomi koji sadrže imuno-stimulanse, kao što su MPL i QS21, kao što su AS01E i AS01B (na primer, US 2011/0206758). Ostali primeri adjuvansa su CpG (Bioworld Today, 15. novembar 1998) i imidazohinolini (kao što su imikvimod i R848). Videti, na primer, Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608. U nekim primerima izvođenja, adjuvans sadrži agonist Toll-like receptora 4 (TLR4). TLR4 agonisti su dobro poznati u stanju tehnike, videti, na primer, Ireton GC i SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807. U nekim primerima izvođenja, adjuvans sadrži agonistu TLR4 receptora, koji sadrži lipid A, njegov analog ili derivat, kao što su MPL, 3D-MPL, RC529 (na primer, EP1385541), PET-lipid A, GLA (glikopiranozillipidni adjuvans, sintetički disaharid glikolipid; na primer, US20100310602, US8722064), SLA (na primer, Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63), koji opisuje strukturno-funkcionalni pristup optimizacije TLR4 liganada za primenu u humanim vakcinama), PHAD (fosforilovani heksa-acil disaharid), 3D-PHAD (čija je struktura ista kao GLA), 3D-(6-acil)-PHAD (3D(6A)-PHAD) (PHAD, 3D-PHAD i 3D(6A)PHAD su sintetičke varijante lipida A, videti, na primer. avantilipids.com/divisions/adjuvants, koji takođe obezbeđuju strukture ovih molekula), E6020 (CAS broj 287180-63-6), ONO4007, OM-174 i slično.
[0113] U nekim primerima izvođenja, opisane kompozicije ne sadrže i ne primenjuju se u kombinacija sa pomoćnim sredstvom.
[0114] U nekim primerima izvođenja, opisane kompozicije se formulišu tako da budu pogodne za namenjeni put administracije kod učesnika. Opisane kompozicije (na primer, farmaceutske i/ili imunogene), mogu se formulisati tako da budu pogodne za subkutanu, parenteralnu, oralnu, sublingvalnu, bukalnu, intradermalnu, transdermalnu, kolorektalnu, intraperitonealnu, rektalnu primenu, intravensku, intranazalnu, intratrahealnu, intramuskularnu, lokalnu, transdermalnu ili intradermalnu administraciju. U specifičnom primeru izvođenja, obezbeđena je kompozicija (na primer, farmaceutska i/ili imunogena) formulisana za intramuskularnu injekciju.
Postupci primene
[0115] Biokonjugati i kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti za indukciju antitela na glikozilovani O4-antigen E. coli kod subjekta, kao i za vakcinisanje subjekt protiv E. coli, posebno protiv ekstraintestinalnog patogenog soja E. coli (ExPEC). U značenju kako se ovde koristi, „subjekt“ označava bilo koju životinju, poželjno sisara, kojem će biti ili kome već jeste administriran biokonjugat ili kompozicija saglasno pronalasku. Termin „sisar“ kako se ovde koristi, obuhvata bilo koju vrstu sisara. Primeri sisara obuhvataju, bez ograničenja, krave, konje, ovce, svinje, mačke, pse, miševe, pacove, zečeve, zamorce, ne-humane primate (NHP), kao što su majmuni ili čovekoliki majmuni, ljudi, itd. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek. Čovek kao subjekt može biti bilo kog uzrasta. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek približnog uzrasta od dva meseca do 18 godina, na primer, od 1 godine do 18 godina. U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek uzrasta najmanje 18 godina. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek uzrasta 15 do 50 godina, na primer, 18 do 45 godina, na primer, 20 do 40 godina. U određenim primerima izvođenja, subjekt je muškarac. U nekim primerima izvođenja, subjekt je ljudsko biće. U nekim primerima izvođenja, subjekt je imunokompromitovan. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek najmanje 50 godina starosti, najmanje 55 godina, najmanje 60 godina, najmanje 65 godina. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek koji nije stariji od 100 godina, nije stariji od 95 godina, nije stariji od 90 godina, nije stariji od 85 godina, nije stariji od 80 godina, niti stariji od 75 godina. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek najmanje 60 godina starosti, a ne stariji od 85 godina. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek stabilnog zdravlja. U nekim primerima izvođenja, subjekt je odrasla osoba starosti najmanje 60 godina i ne više od 85 godina i stabilnog zdravlja. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek koji ima istoriju infekcija urinarnog trakta (UTI, odnosno, bakterijske infekcije uretre, bešike, uretera i/ili bubrega), odnosno, najmanje jednu epizodu UTI tokom njegovog ili njenog života. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek koji ima istoriju UTI tokom prošlih dvadeset, petnaest, dvanaest, deset, devet, osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jedne godine. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek koji ima istoriju UTI u poslednje dve godine. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek koji ima istoriju rekurentnih IMS, odnosno, najmanje dva UTI u šest meseci ili najmanje tri UTI u jednoj godini. U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek koji ima istoriju rekurentnih UTI u poslednje dve godine. U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek stariji od 60 godina i stabilnog zdravlja. U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek stariji od 60 godina koji ima istoriju UTI u poslednje dve godine. U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek je stariji od 60 godina i manje od 75 godina koji ima istoriju UTI u poslednje dve godine. U određenim primerima izvođenja, subjekat je osoba starija od 75 godina koja ima istoriju UTI u poslednje dve godine. U primerima izvođenja, subjekt je pacijent koji je zakazan za elektivne urogenitalne i/ili abdominalne procedure ili operacije, na primer, transrektalnu biopsiju prostate vođenu ultrazvučnom iglom (TRUS-PNB).
[0116] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak indukcije antitela usmerenih protiv glikozililovanog O4-antigena E. coli kod subjekta, gde postupak obuhvata administraciju subjektu biokonjugata glikozilovanog O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za opisani proteinski nosač, ili administraciju kompozicije koja sadrži biokonjugat glikozilovanog O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za protein, samostalno ili u kombinaciji sa drugim polisaharidima O-antigena E. coli ili njihovim glikokonjugatima ili biokonjugati.
[0117] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv glikozilovanog O4-antigena, koja su indukovana, izazvana ili identifikovana, poseduju opsonofagocitnu aktivnost. U posebnim primerima izvođenja, indukovana, izazvana ili identifikovana antitela su unakrsno reaktivna antitela sposobna da posreduju u opsonofagocitnom ubijanju i glikozilovanog i neglikozilovanog O4-antigena E. coli sojeva.
[0118] U nekim primerima izvođenja, indukovana, izazvana ili identifikovana antitela protiv glikozilovanog O4-antigena E. coli specifično prepoznaju nemodifikovani i glukozom modifikovani polisaharid O4-antigena. U konkretnim primerima izvođenja, indukovana, izazvana ili identifikovana antitela protiv glikozilovanog O4 antigena E. coli specifično prepoznaju O4-serotip E. coli. U specifičnim primerima izvođenja, antitela indukovana biokonjugatom glikozilovanog O4-antigena E. coli vezuju se prvenstveno za glikozilovani O4-antigen u odnosi na neglikozilovani O4-antigen.
[0119] Antitela indukovana opisanim biokonjugatima i kompozicijama mogu uključiti i molekule imunoglobulina i imunološki aktivni delovi molekula imunoglobulina, odnosno molekule koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje se specifično veže za polisaharid O-antigena E. coli, na primer, polisaharid glikozilovanog O4-antigena.
[0120] Indukovana, izazvana ili identifikovana antitela primenom opisanih biokonjugata ili kompozicija mogu se koristiti za praćenje efikasnosti terapije i/ili progresije bolesti. U ove svrhe može se koristiti bilo koji sistem imunotestiranja poznat u stanju tehnike, uključujući bez ograničenja, one koji se zasnivaju na kompetitivnim i nekompetitivnim analitičkim testovima, kao što su radioimunoeseji, ELISA (enzimski imunosorbentni testovi), elektrohemiluminiscencijski (ECL) imunotestovi, „sendvič“ imunotestovi, reakcije precipitacije, gel-difuzione reakcije precipitacije, imunodifuzioni testovi, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunotestovi, protein-A imunotestovi i imunoelektroforeza. Nekoliko ovih testova, na primer, imunološki testovi zasnovani na ECL, mogu se organizovati u multipleks formatu, koji je i poželjan.
[0121] Antitela indukovana, izazvana ili identifikovana korišćenjem biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli mogu se koristi za detekciju O4 sojeva E. coli, posebno glikozilovanih O4 sojeva, iz mnoštva sojeva E. coli i/ili za dijagnostikovanje infekcije O4 sojem ili glikozilovanim sojem O4 E. coli.
[0122] U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak vakcinacije subjekta protiv E. coli (na primer, ekstraintestinalnog patogenog soja E. coli, ExPEC), gde se postupak sastoji od administracije subjektu biokonjugata glikozilovanog O4-antigena E. coli, kovalentno vezanog za opisani proteinski nosač ili davanje kompozicije koja sadrži biokonjugat glikolizovanog O4-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, samostalno ili u kombinaciji sa drugim O-antigenima E. coli ili njihovim glikokonjugatima ili biokonjugatima. Stručnjak u ovoj oblasti razumeće da će subjekt biti vakcinisan protiv sojeva E. coli čiji su O-antigeni ili njihovi glikokonjugati ili biokonjugati bili prisutni u administriranoj kompoziciji. Na primer, kompozicija koja sadrži polisaharide O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, i O25B antigena može se koristiti za vakcinaciju subjekta protiv serotipova O1A, O2, O4, O6A, i O25B E. coli.
[0123] U određenim primerima izvođenja, vakcinacija se sprovodi radi sprečavanja invazivne ExPEC bolesti (IED), na primer, urosepse, bakteremije, sepse, itd. U nekim primerima izvođenja, cilj vakcinacije je da spreči ili smanji pojavu ili težinu infekcije urinarnog trakta. U nekim primerima izvođenja, IED se može dobiti u bolnici, na primer, kod pacijenata koji su podvrgnuti urogenitalnim i/ili abdominalnim procedurama ili operacijama. U nekim primerima izvođenja, IED može biti povezan sa zdravstvenom zaštitom, na primer, kod pacijenata koji primaju zdravstvenu negu zbog drugog medicisnkog stanja, posredstvom centralnih linija, katetera u bolnici, ambulantnim hirurškim centrima i centrima za dijalizu, u ustanovama za dugotrajnu negu, itd. U nekim primerima izvođenja, IED može biti komunalno stečen, na primer, kod pacijenta koji je nedavno nije bio izložen nekom zdravstvenom riziku.
[0124] U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak izazivanja imunskog odgovora kod subjekta protiv E. coli (na primer, ExPEC), koji obuhvata davanje subjektu nekog od biokonjugata glikolizovanog O4-antigena E. coli kovalentno vezanog za opisani proteinski nosač, ili kompozicije koja sadrži biokonjugat glikozilovanog O4-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, samostalno ili u kombinaciji sa drugim O-antigenima ili glikokonjugatima E. coli ili njihovim biokonjugatima. U jednom aspektu pronalaska, subjekt ima infekciju E. coli (na primer, ExPEC) u vreme administracije. U poželjnoj varijanti, subjekt nema infekciju E. coli (na primer, ExPEC) u vreme administracije.
[0125] U određenim primerima izvođenja, opisane kompozicije i biokonjugati mogu da se daju subjektu u cilju izazivanja imunskog odgovora koji uključuje proizvodnju antitela, poželjno antitela koja imaju opsonofagocitnu aktivnost. Takva antitela se mogu izolovati postupcima koji su poznati stručnjaku u oblasti (na primer, imunoafinitetna hromatografija, centrifugiranje, precipitacija itd.).
[0126] Sposobnost opisanih biokonjugata i kompozicija da izazovu imunski odgovor kod subjekta može se proceniti korišćenjem bilo kog pristupa koji je poznat stručnjacima u ovoj oblasti ili koji je ovde opisan. U nekim primerima izvođenja, sposobnost biokonjugata da izazove imunski odgovor kod subjekta može se proceniti imunizacijom subjekta (na primer, miš, pacov, zec ili majmun) ili grupe subjekata, opisanim biokonjugatom i imunizacijom još jednog subjekta (na primer, miš, pacov, zec ili majmun) ili grupe subjekata kontrolnim rastvorom (PBS). Subjekti ili grupa subjekata mogu se naknadno izložiti ExPEC-u i kod njih se može meriti sposobnost ExPEC-a da izazove bolest (na primer, UTI, bakteremija ili druga bolest). Stručnjaci će prepoznati da subjekat ili skup subjekata imunizovanih kontrolnim rastvorom obolevaju nakon izlaganja ExPEC-u, dok subjekat ili grupa subjekata imunizovanih biokonjugatom(ima) ili opisanom kompozicijom oboljevaju manje ili ne obolevaju od bolesti nakon izlaganja ExPEC-u, što znači da je biokonjugat sposoban da izazove imunski odgovor kod subjekta. Sposobnost biokonjugata(a) ili opisanih kompozicija biokonjugata da indukuju stvaranje antiseruma koji unakrsno reaguje sa O-antigenom ExPEC-a može biti testirana, imunotestovima, kao što je na primer, ELISA (videti na primer, Van den Dobbelsteen et al, 2016, Vaccine 34: 4152-4160), ili ECL- imunotest.
[0127] Sposobnost opisanih biokonjugata da izazovu imunski odgovor kod subjekta može se proceniti korišćenjem serumskog baktericidnog testa (SBA) ili testa opsonofagocitnog ubijanja (OPK test ili OPKA), što su utvrđeni i opšte prihvaćeni postupci koji se koristi u postupcima dobijanja dozvole za upotrebu vakcina na bazi glikokonjugata. Takvi testovi su dobro poznati u stanju tehnike i, ukratko, obuhvataju korake generisanja i izolovanja antitela razvijenog protiv antigena od interesa (na primer, polisaharida O-antigena, na primer, glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli), nakon što je subjektu (na primer, mišu, pacovu, zecu ili majmunu) administrirano jedinjenje koje izaziva takva antitela. Nakon toga, sposobnost baktericidnog delovanja antitela može se proceniti, kultivisanjem date bakterije (na primer, E. coli relevantnog serotipa) u prisustvu antitela i komplementa i - u zavisnosti od testa – neutrofilnih ćelija, i ispitivanjem sposobnosti antitela da posreduju u ubijanju i/ili neutralizaciji bakterija, na primer, primenom mikrobioloških pristupa. Za primer OPK testa za biokonjugatne vakcine protiv E. coli (videti, na primer, Abbanat i dr.2017, Clin. Vaccine Immunol. 24: e00123-17). OPK test se može izvesti u monopleks ili multipleks formatu, od kojih je multipleks format (na primer, testiranje više serotipova u isto vreme) obično poželjniji. Multipleksni OPK test se označava skraćenicom „MOP A“.
[0128] U nekim primerima izvođenja, opisani postupci obuhvataju davanje efektivne količine biokonjugata glikozilovanog O4-antigena E. coli, kovalentno povezanog sa opisanim proteinskim nosačem, ili davanje kompozicije koja sadrži biokonjugat glikozilovanog O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, samostalno ili u kombinaciji sa drugim O-antigenima E. coli ili njihovim glikokonjugatima ili biokonjugatima. U jednom primeru izvođenja, „efikasna količina“ je ona količina koja imunizuje subjekta protiv E. coli (na primer, ExPEC). U drugom primeru izvođenja, „efikasna količina“ je količina koja indukuje imunski odgovor protiv E. coli (na primer, ExPEC) kod subjekta, kao što je imunski odgovor koji uključuje proizvodnju antitela, poželjno antitela koja imaju opsonofagocitnu aktivnost.
[0129] U određenim primerima izvođenja, gde opisana kompozicija sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli i barem biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, efektivna količina polisaharida O25B- antigena E. coli je oko 1.5 do 6 puta veća, na primer, približno 2 do 4 puta veća, takva da je 1,5, 2, 3, 4, 5 ili 6 puta veća od koncentracije bilo kog drugog biokonjugata prisutnog u kompoziciji. U tim primerima izvođenja, efektivna količina polisaharida O25B-antigena E. coli je na primer oko 5 do 18 µg po dozi, kao što je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 µg po administraciji.
[0130] U nekim primerima izvođenja, biokonjugat ili kompozicija prema pronalasku daju se subjektu jednokratno. U nekim primerima izvođenja, biokonjugat ili kompozicija prema pronalasku se daje subjektu više puta, na primer, u režimu pojačanja primarnog odgovora. U određenim primerima izvođenja, vreme između dve primene je najmanje dve nedelje, najmanje mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje šest meseci, najmanje godinu dana, najmanje dve godine, najmanje pet godina, najmanje deset godina ili najmanje petnaest godina. Kod ljudi se tipično željeni imunski odgovor može generisati jednom primenom biokonjugata ili kompozicije prema pronalasku. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje ponovljenu primenu posle, na primer, deset godina.
Ćelije-domaćini
[0131] Pronalazak obezbeđuje ćelije-domaćina, na primer, prokariotske ćelije-domaćina, sposobne da proizvodu O-antigene E. coli i biokonjugate koji sadrže takve O-antigene E. coli. Poželjno je da su ćelije-domaćina prema pronalasku, modifikovane (na primer, putem genetskog inženjeringa) tako da sadrže jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju mašineriju ćelije-domaćina (na primer, glikozil-transferaze), koja se koristi za proizvodnju polisaharida O-antigena E. coli i/ili njihove biokonjugate.
[0132] Moguće je primeniti bilo koju ćeliju-domaćina koja je poznata stručnjacima za proizvodnju opisanih polisaharida O-antigena E. coli (na primer, glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli) i biokonjugata koji sadrže opisane polisaharidi O-antigena E. coli (na primer, biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli), uključujući arheje, prokariotske i eukariotske ćelije-domaćina. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin je prokariotska ćelija-domaćin. Primeri prokariotskih ćelija-domaćina za primenu u proizvodnji opisanih polisaharida O-antigena E. coli i biokonjugata koji sadrže opisane polisaharide Oantigena E. coli, uključuju bez ograničenja, vrste rodova Escherichia, vrste rodova Shigella, vrste rodova Klebsiella, vrste rodova Xhantomonas, vrste rodova Salmonella, vrste rodova Yersinia, vrste rodova Lactococcus, vrste rodova Lactobacillus, vrste rodova Pseudomonas, vrste rodova Corinebacterium, vrste rodova Streptomices, vrste rodova Streptococcus, vrste rodova Staphilococcus, vrste rodova Bacillus i vrste rodova Clostridium.
[0133] U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin koja se koristi za proizvodnju ovde opisanih polisaharida O-antigena E. coli i opisanih biokonjugata koji sadrže polisaharide O-antigena E. coli je prokariotska ćelija-domaćin, i poželjno je E. coli.
[0134] U nekim primerima izvođenja, ćelije-domaćina koje se koriste za proizvodnju opisanih polisaharida i biokonjugata O-antigena E. coli dizajnirane su tako da sadrže heterologne nukleinske kiseline, na primer, heterologne nukleinske kiseline koje sadrže rfb genski klaster željenog serotipa O-antigena, heterologne nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više proteinskih nosača i/ili glikozil-transferaze. U specifičnom primeru izvođenja, heterologni rfb geni i/ili heterologne nukleinske kiseline koje kodiraju proteine uključene u puteve glikozilacije (na primer, prokariotski i/ili eukariotski putevi glikozilacije), mogu biti uvedeni u ovde opisane ćelije-domaćina. Takve nukleinske kiseline mogu kodirati proteine uključujući, bez ograničenja, oligosaharil-transferaze i/ili glikozil-transferaze.
[0135] Sekvence različitih gena i klastera gena koji kodiraju glikozil-transferaze korisne u stvaranju rekombinantnih ćelija-domaćina koje se mogu koristiti za dobijanje opisanih polisaharida O-antigena E. coli i njihovih biokonjugata. Stručnjaci će ceniti da zbog izrođenosti genetskog koda, protein specifične aminokiselinska sekvenca može biti kodiran posredstvom više različitih nukleinskih kiselina. Osobe stručne u ovoj oblasti razumeju da se ovde navedena nukleinska kiselina može promeniti tako da se njena sekvenca razlikuje od sekvence koja je data, bez uticaja na aminokiselinsku sekvencu proteina kodiranog nukleinskom kiselinom.
[0136] Pronalazak obezbeđuje ćelije-domaćina (na primer, rekombinantne ćelije-domaćina) za proizvodnju biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, polisaharid O1A-antigena, polisaharida O2-antigena, polisaharida O6A-antigena, polisaharid O8-antigena, polisaharida O15-antigena, polisaharid O16-antigena, polisaharid O18A-antigena, polisaharida O25B-antigena ili polisaharida O75-antigena. Ćelije-domaćina obezbeđene pronalaskom sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju enzime (na primer, glikozil-transferazu) sposobne da proizvedu polisaharid O-antigena E. coli. Ovde navedene ćelije-domaćina prirodno eksprimiraju nukleinske kiseline sposobne da proizvodu O-antigen od interesa, ili, ćelije-domaćina mogu biti načinjene tako da eksprimiraju te nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline su heterologne za ćelije-domaćina i uvedene su u ćeliju-domaćina primenom genetičkih pristupa poznatih u stanju tehnike. Na primer, nukleinske kiseline je moguće je uvesti u ćeliju-domaćina genetskom manipulacijom (na primer, klaster gena je eksprimiran u plazmidu ili plazmidima ili integrisan u genom ćelijedomaćina (videti, na primer, objave međunarodnih patentnih prijava WO 2014/037585, WO 2014/057109, WO 2015/052344).
[0137] U jednom primeru izvođenja, pronalazak je obezbedio ćeliju-domaćina (na primer, rekombinantna ćelija-domaćin), sposobnu da proizvodi biokonjugat polisaharida glikozilovanog O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač. Takva ćelijadomaćina sadrži, poželjno konstruisanjem prekursorske ćelije, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira gtrS gen, što je prema najboljem znanja pronalazača, novo-identifikovani gen koji kodira enzim sposoban da prenese glukozu na O4-antigen E. coli (odnosno, glukoziltransferazu specifičnu za polisaharid O4-antigena E. coli), i to, specifično na L-Rha preko α-1,3-glikozidne veze. Aminokiselinska sekvenca takvog enzima koji katalizuje dodavanje bočnih ogranaka glukoze data je u SEQ ID NO: 4. Drugi primeri obuhvataju aminokiselinske sekvence koje su najmanje 80% istovetne sa prethodnom. Reprezentativni primeri sekvence nukleinske kiseline koja kodira gtrS gene specifične za polisaharide O4-antigena E. coli obuhvataju, bez ograničenja SEQ ID NO: 5, ili izrođene sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, ili sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju funkcionalne O4-specifične GtrS enzime koji su najmanje 80% istovetni sekvenci SEQ ID NO: 4.
[0138] U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelijadomaćin) koja je sposobna da proizvede biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira glukozil-transferazu koja ima najmanje 80% istovetnosti sa sekvencom SEQ ID NO: 4, kao što je na primer, približno 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 4. S obzirom na postojanje redundantnosti u genetskom kodu, stručnjak sa uobičajenim veštinama sposoban je da dizajnira varijante nukleinskih sekvenci koje kodiraju aminokiselinsku sekvencu glukoziltransferaze, korišćenjem kodon optimizovanih sekvenci.
[0139] U nekim primerima izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelijadomaćin), sposobna da proizvede biokonjugat glukozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za protein-nosač, i koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira glukozil-transferazu (GtrS) sa najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 4, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira translokazu glukoze vezane za baktoprenol (GtrA), koja ima najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, i nukleotidnu sekvencu koja kodira baktoprenol glukozil-transferazu (GtrB), koja ispoljava najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 8. U specifičnim primerima izvođenja, pomenute sekvence nukleinskih kiselina kodiraju GtrA i GtrB proteine koji su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% istovetni SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, i ispoljavaju aktivnost translokaze glukoze vezane za baktoprenol (SEQ ID NO: 7) i baktoprenol glukozil-transferaze (SEQ ID NO: 8). S obzirom na redundantnost genetskog koda, stručnjak sa uobičajenim veštinama u ovoj oblasti može da napravi varijante nukleotidnih sekvenci koje kodiraju aminokiselinske sekvence translokaze glukoze vezane za baktoprenol i baktoprenol glukoziltransferaze, korišćenjem kodon optimizovanih sekvenci.
[0140] Ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelija-domaćin) sposobna da proizvodi biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, dodatno sadrži nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid O4-antigena E. coli. Primer rfb genskog klastera korisnog za proizvodnju polisaharida O4-antigena E. coli ovde je dat kao SEQ ID NO: 9. Drugi primer se može naći u GenBank, lokus AY568960. Takođe se mogu koristiti izrođene sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju iste enzime koji su kodirani ovim sekvencama, ili sekvence koje kodiraju enzime koji su najmanje 80% istovetni, poželjno najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% istovetni.
[0141] U specifičnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje ćeliju-domaćina (na primer, rekombinantna ćelija-domaćin, poželjno rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin, poželjno rekombinantna ćelija domaćina E. coli), koja proizvodi polisaharid glikozilovanog O4 antigena, gde ćelija-domaćin sadrži gtrS gen, rfb genski klaster za polisaharid O4-antigena E. coli i nukleinsku kiselinu koja kodira proteinski nosač. Ovakve ćelije-domaćina mogu se konstruisati korišćenjem rekombinantne metodologije tako da sadrže jedan ili više plazmida sa ugrađenim gtrS genom, rfb genskim klasterom i/ili nukleinskom kiselinom koja kodira proteinski nosač, ili tako da sadrži neke ili sve relevantne gene, kao što su gtrS, rfb genski klaster i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira proteinski nosač, integrisane u genom te ćelije. U nekim primerima izvođenja, geni ili klasteri gena integrisani su u genom ćelije-domaćina promenom postupka homologne rekombinacije. Prednost integracije gena u genom ćelijadomaćina jeste stabilnost u odsustvu selekcije antibiotika.
[0142] U narednom specifičnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje ćelija-domaćina (na primer, rekombinantna ćelija domaćin, poželjno rekombinantna prokariotska ćelijadomaćin), koja proizvodi glikozilovani polisaharid O4 antigena, gde ćelija- domaćin sadrži GtrS (glukozil-transferaza), kao i enzime koje su kodirani O4 rfb genskim klasterom. U nekim primerima izvođenja, neki ili svi gore navedeni enzimi su heterologni za ćelijudomaćina.
[0143] U drugim specifičnim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje ćeliju-domaćina (na primer, rekombinantna ćelija-domaćin, poželjno rekombinantna prokariotska ćelijadomaćin), koja proizvodi glikozilovani polisaharid O4 antigena E. coli, poželjno biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, gde ćelija-domaćina dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu i/ili nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač. U jednom specifičnom primeru izvođenja, oligosaharil-transferaza je heterologna za ćeliju-domaćina. U drugom specifičnom primeru izvođenja, proteinski nosač je heterologan za ćeliju-domaćina. Ćelija-domaćin poželjno sadrži heterolognu nukleotidnu sekvencu koja kodira glukozil-transferazu čija je sekvenca najmanje 80% istovetna sekvenci SEQ ID NO: 4. U poželjnim primerima izvođenja, O4 rfb genski klasteri su heterologni za ćeliju-domaćina. Poželjno je da je sekvenca koja kodira enzim sposoban da uvede razgranate bočne lance glukoze na O4-antigen, odnosno, gtrS gen (koji kodira glukozil-transferazu koja ima najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO:4) heterologna za ćeliju-domaćina. Nukleinska kiselina je heterologna za ćeliju-domaćina, ukoliko ista sekvenca nije prirodno postojeća u pomenutoj ćeliji-domaćina. Moguće je genetskim inženjeringom uvesti heterolognu nukleinsku kiselinu u matičnu ćeliju, na primer, transformacijom (na primer, hemijskom transformacijom ili elektroporacijom) i/ili rekombinacijom. U nekim primerima izvođenja, heterologna nukleinska kiselina, kao što je željeni rfb lokus, gtrS kodirajuća sekvenca, sekvenca koja kodira proteinski nosač, i/ili sekvenca koja kodira glikoziltransferazu, integrisani su u genom ćelije-domaćina, poželjno, bakterijske ćelija-domaćina, poželjno u E. coli kao ćeliju-domaćina. U poželjnim primerima izvođenja, endogeni rfb lokus i kada je primenjivo, gtrS kodirajuća sekvenca inaktivirani su, odnosno, poželjno uklonjeni iz genoma rekombinantne ćelija-domaćina u odnosu na prethodničku ćeliju, a takođe je poželjno da se ove sekvence zamene željenim kodirajućim heterolognim rfb lokusom, i, ako je primenljivo, željenom gtrS sekvencom. U nekim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je K-12 soj E. coli (kao neograničavajući primer, E. coli soj W3110 je soj K-12), ili B soj E. coli (kao neograničavajući na primer, E. coli soj BL21 je B soj), ili bilo koji drugi dobro definisan soj E. coli, na primer, laboratorijski sojevi ili proizvodi sojevi, za razliku od primarnih izolata neizrođenog tipa. U poželjnim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je izvedena iz E. coli koja ne eksprimira O4-antigen ili glikozilovani O4-antigen, uvođenjem u takvu E. coli ćeliju rfb O4 lokusa i gtrS gena koji kodira glukozil-transferazu koja je najmanje 80% istovetna sa sekvencom SEQ ID NO:4. Prednosti korišćenja dobro okarakterisanih sojeva, kao što su K-12 ili B sojevi E. coli, kao prethodničkih ćelija za dobijanje ćelije-domaćina jesu mogućnosti korišćenja sličnih proizvodnih procesa za različite biokonjugate O-antigena, budući da su karakteristike proizvodnog soja precizno utvrđene. Naime, iako se biokonjugati različitih O-antigena različito ponašaju, a procesi ekspresije se optimizuju prema proizvodnom soju, korišćenje dobro definisanih prethodničkih sojeva omogućava da su osnovni procesi proizvodnje biokonjugata O-antigena predvidljiviji od korišćenja nepoznatih sojeva, kao što su izolati divljeg tipa, kao prethodnika za proizvodnju sojeva domaćina. Na ovaj način, iskustvo sa proizvodnjom ranije opisanih biokonjugata O-antigena E. coli, kao što su biokonjugati O1A, O2, O6A i O25B opisani, na primer u WO 2015/124769 i WO 2017/035181 može se koristiti kao osnova za dizajniranje proizvodnje drugih biokonjugata O-antigena E. coli. Za razliku od gtrS, lokusi gtrA i gtrB gena nisu specifični za serotip, a u nekim primerima izvođenja oni su homologni ćeliji-domaćinu (na primer, E. coli K12 soj W3110 poseduje gene gtrA i gtrB koji su sposobni da funkcionišu zajedno sa rekombinantno uvedenim gtrS genom specifičnim za O4-serotip, koji kodira glukozil-transferazu čija je sekvenca data prema SEQ ID NO: 4 ili glukozil-transferazu čija je sekvenca najmanje 80% istovetna sa prethodnom, zamenjujući endogeni gtrS gen). U drugim primerima izvođenja, jedan ili oba gtrA i gtrB gena (kodiraju GtrA i GtrB proteine koji su najmanje oko 80% istovetni sekvencama SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, i ispoljavaju aktivnost translokaze glukoze vezane za baktoprenol, odnosno, aktivnost baktoprenol glukozil- transferaze, rekombinantno su uvedeni u ćeliju-domaćina, na primer u slučaju da ćelija-domaćin nema endogene gtrA i/ili gtrB gene.
[0144] Pronalazak takođe obezbeđuje ćelije-domaćina (na primer, rekombinantne ćelijedomaćina) sposobne da proizvedu biokonjugat polisaharida O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B ili O75 antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač. Takve ćelijedomaćina (na primer, rekombinantne ćelije-domaćina) sadrže nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera specifičnog za polisaharid O-antigene. Klasteri rfb gena mogu se izolovati iz neizrođenih sojeva E. coli i kombinovati sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju oligosaharil-transferazu (na primer, PglB) i proteinski nosač (na primer, EPA) unutar jedne ćelije-domaćina, kako bi se proizvela rekombinantna ćelija-domaćina koja proizvodi E. coli O-antigen od interesa ili njegov biokonjugat. Na primer, takve ćelija-domaćina mogu biti konstruisane korišćenjem rekombinantnih pristupa, tako da sadrže jedan ili više plazmida koji sadrže rfb genski klaster, oligosaharil-transferazu (na primer, PglB) i proteinski nosač (na primer, EPA) korišćenjem tehnologije biokonjugacije, kao što je opisano u WO 2014/037585, WO 2009/104074 i WO 2009/089396. U poželjnom primeru izvođenja, ćelije-domaćina sadrže rfb genske klastere integrisane u genom ćelije. U nekim primerima izvođenja, u genom ćelije-domaćina takođe su integrisane nukleinske kiseline koje kodiraju oligosahariltransferazu, proteinski nosač, i gde je primenljivo, gtrS gen, takođe su integrisani u genom ćelije-domaćina. U nekim primerima izvođenja, heterologni ili homologni gtrA i gtrB geni takođe su integrisani u genom ćelije-domaćina.
[0145] Priprema biokonjugata O1A, O2, O6A i O25B antigena detaljno je opisano u WO 2015/124769 i WO 2017/035181. Opisani su primeri klastera gena za svaki O-antigen E. coli (rfb lokusi) u Iguchi A, et al, DNK Research, 2014, 1-7 (doi: 10.1093/dnares/dsu043), i u DebRoy C, et al, PLoS One. 2016, 11(1):e0147434 (doi: 10.1371/journal.pone.0147434; ispravka u: Plos One. 2016, 11(4):e0154551, doi: 10.1371/journal.pone.0154551). Sekvence nukleinskih kiselina rfb genskog klastera i sekvence aminokiselina za proteine koji su njima kodirani takođe se mogu naći u otvorenim bazama podataka, kao što je GenBank. Pronalazak obezbeđuje reprezentativne sekvence rfb genskog klastera koje se mogu koristiti u sojevima za proizvodnju biokonjugata sa polisaharidnim antigenima kao SEQ ID NO: 9 i 11-19. Dakle, za svaki od navedenih željenih biokonjugata, u ćeliju-domaćina je moguće uvesti odgovarajući rfb genski klaster, kako bi se dobile ćelije-domaćina sa specifičnim rfb genskim klasterom za željeni O-antigen, gde ćelije takođe sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira oligosaharil-transferazu i proteinski nosač. Iz prethodno navedenih razloga, poželjno je da su ćelije-domaćina rekombinantne ćelije-domaćina, i poželjno je da su izvedene iz sojeva sa relativno dobro poznatim karakteristikama, kao što su laboratorijski ili proizvodni sojevi E. coli, na primer, E. coli K12 ili E. coli BL21, itd. Poželjno, rfb genski klasteri su heterologni za ćeliju-domaćina, na primer, uvedeni u prekursorsku ćeliju ćelije-domaćina i poželjno, integrisani u njen genom. Poželjno je da je originalni rfb genski klaster, ako je bio prisutan u ćeliji prekursora, zamenjen rfb genskim klasterom za O-antigen od interesa u ćeliji-domaćina, kako bi se omogućila proizvodnja biokonjugata O-antigena od interesa. Poželjno, oligosaharil-transferaza je heterologna za ćeliju-domaćina, a u nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira takvu oligosaharil-transferazu je integrisana u genom ćelijedomaćina.
[0146] Svaka od ovde navedenih ćelija-domaćina (na primer, rekombinantne ćelije-domaćina, poželjno rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin) sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju dodatne enzime koji učestvuju u N-glikozilaciji proteina, na primer, obelodanjena ćelijadomaćina može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira oligosaharil-transferazu ili nukleinske kiseline koje kodiraju druge glikozil-transferaze.
[0147] Obelodanjene ćelije-domaćina sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira oligosahariltransferazu. Oligosaharil-transferaze prenose oligosaharide vezane za lipide na ostatke asparagina tokom polimerizacije polipeptidnih lanaca koji sadrže konsenzusni motiv za N-glikozilaciju. Nukleinska kiselina koja kodira oligosaharil-transferazu može biti nativna u ćeliju-domaćina ili se može uvesti u ćeliju-domaćina korišćenjem genetskih pristupa. U poželjnim primerima izvođenja, oligosaharil-transferaza je heterologna za ćeliju-domaćina. Ćelija E. coli normalno ne sadrži oligosaharil-transferazu, i stoga, ako se E. coli koristi kao ćelija-domaćin za proizvodnju biokonjugata, heterologna oligosaharil-transferaza koja se nalazi u takvoj ćeliji-domaćinu uvedena je genetskim inženjeringom. Oligosaharil-transferaza može biti iz bilo kojeg izvora poznatog u stanju tehnike u oblasti ovog otkrića.
[0148] U određenim primerima izvođenja, kao alternativa oligosaharil-transferazi sa aktivnošću N-glikoziltransferaze, kao što je O-glikoziltransferaza, može se bez ograničenja, koristiti na primer, PglL, koja ima drugačiju konsenzusnu sekvencu glikozilacije u proteinskom nosaču, kao što je opisano u WO 2016/82597. Kao oligosaharil-transferaze prema pronalasku, mogu se koristiti i druge glikozil-transferaze, kao što su O-glikoziltransferaze.
[0149] U nekim poželjnim primerima izvođenja, oligosaharil-transferaza je oligosahariltransferaza iz roda Campylobacter. Na primer, u jednom primeru izvođenja, oligosahariltransferaza je oligosaharil-transferaza poreklom iz Campylobacter jejuni (odnosno, pglB; videti, na primer, Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; videti takođe, na primer, NCBI Gene ID: 3231775, UniProt pristupni broj O86154). U narednom primeru izvođenja, oligosaharil-transferaza je oligosaharil-transferaza poreklom iz Campylobacter lari (vidi, na primer, NCBI gen ID: 7410986).
[0150] U specifičnim primerima izvođenja, oligosaharil-transferaza je PglB oligosahariltransferaza iz Campylobacter jejuni, uključujući prirodni protein (neizrođenog tipa) ili njegove varijante, poput onih opisanih u objavi međunarodne patentne prijave WO 2016/107818 i WO 2016/107819. PglB je enzim koji je sposaban da izvrši transfer oligosaharida vezanog za lipid na ostatke asparagina unutar konsenzusnih sekvenci SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. U posebnim primerima izvođenja, PglB oligosaharil-transferaza sadrži SEQ ID NO: 6, ili njenu varijantu. U nekim primerima izvođenja, mutirane su jedna ili više konsenzusnih sekvenci endogene glikozilacije unutar originalne sekvence PglB, čime se sprečava autoglikozilacija PglB, na primer, SEQ ID NO: 6 sadrži mutaciju N534K. Primeri varijanti PglB oligosaharil-transferaza pogodnih za primenu u rekombinantnim ćelijamadomaćina prema pronalasku, uključuju PglB oligosaharil-transferazu sa sekvencom SEQ ID NO: 6 koja obuhvata najmanje jednu mutacija izabranu iz grupe koju čine N311V, K482R, D483H, A669V, Y77H, S80R, Q287P i K289R. U jednom konkretnom primeru izvođenja, varijanta PglB oligosaharil-transferaze ima SEQ ID NO: 6 koja sadrži mutaciju N311V. U drugom posebnom primeru izvođenja, varijanta PglB oligosaharil-transferaze ima SEQ ID NO: 6, koja sadrži mutacije Y77H i N311V. U drugom posebnom primeru izvođenja, varijanta PglB oligosaharil-transferaze ima sekvencu SEQ ID NO: 6 koja sadrži mutacije N311V, K482R, D483H i A669V. U narednom primeru izvođenja, varijanta PglB oligosaharil-transferaze ima sekvencu SEQ ID NO: 6, koja sadrži mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V. Pronalazak obelodanjuje da izvesne varijante PglB oligosahariltransferaze rezultuju neočekivanim povećanjem prinosa u proizvodnji biokonjugata O-antigena E. coli specifičnih serotipova. Nije moguće predvideti poboljšanu ili optimalnu PglB varijantu za konkretan O-antigen E. coli. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke proizvodnje biokonjugata specifičnih O-antigena E. coli, koristeći specifične PglB varijante kao oligosaharil-transferaze. Za primenu u proizvodnji biokonjugata takođe se mogu koristiti i druge varijante PglB, koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% istovetne SEQ ID BR: 6, a ispoljavaju aktivnost oligosaharil-transferaze, poželjno imaju jednu ili više specifičnih aminokiselina na naznačenim pozicijama koje su ovde zbirno prikazane (na primer, 77Y, 80S, 287Q, 289K, 311N, 482K, 483D, 669A; ili 311V; ili 311V, 482R, 483H, 669V; ili 77H, 80R, 287P, 289R, 311V; ili 77H, 311V; itd.).
[0151] U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelijadomaćin) sposobna da proizvodi biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4 antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira PglB oligosaharil-transferazu poreklom iz Campylobacter jejuni čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID BR: 6, ili je poželjno SEQ ID NO: 6 sa mutacijama N311V, ili poželjnije SEQ ID NO: 6 sa mutacijama Y77H i N311V.
[0152] U drugim specifičnim primerima izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelija-domaćin) sposobna da proizvodi biokonjugat polisaharida O1A, O6A ili O15-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira PglB oligosaharil-transferazu poreklom iz Campilobacter jejuni, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, ili poželjno SEQ ID NO: 6 sa mutacijama N311V, K482R, D483H i A669V.
[0153] U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelijadomaćin) sposobna da proizvede biokonjugat polisaharida O16-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira PglB oligosaharil-transferazu poreklom iz Campylobacter jejuni, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, ili poželjno SEQ ID NO: 6 sa mutacijama Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V.
[0154] U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelijadomaćin), sposobna da proizvede biokonjugat polisaharida O75-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira PglB oligosaharil-transferazu poreklom iz Campylobacter jejuni, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, ili poželjno SEQ ID NO: 6 sa mutacijom N311V.
[0155] U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin (na primer, rekombinantna ćelijadomaćin), sposobna da proizvede biokonjugat polisaharida O8, O18A, O25B ili O2-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira PglB oligosaharil-transferazu poreklom iz Campylobacter jejuni, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID BR: 6, poželjno tako da SEQ ID NO: 6 ne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669.
[0156] U nekim primerima izvođenja, svaka od ovde navedenih ćelija-domaćina sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira proteinski nosač, na primer, protein koji može da formira biokonjugat kada se za njega veže polisaharid(i) O-antigena proizveden posredstvom mašinerije za glikozilaciju ćelije- domaćina. Ćelija-domaćina može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koji proteinski nosač poznat stručnjaku u oblasti pronalaska, uključujući, bez ograničenja, detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
[0157] U poželjnim primerima izvođenja, ćelija-domaćina dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira detoksifikovani egzotoksin A P.aeruginosa (EPA). Poželjno, EPA proteinski nosač sadrži 1-10 mesta glikozilacije, poželjno 2 do 4 mesta glikozilacije, najpoželjnije 4 mesta glikozilacije, kao što je 1-10, poželjno 2-4, i poželjnije 4 mesta glikozilacije, od kojeg svako mesto sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1, i poželjnije ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 2. U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćina dalje sadrži nukleinsku kiselinu koji kodira EPA-4 proteinski nosač, čija je sekvenca data u SEQ ID NO: 3.
[0158] U nekim primerima izvođenja, proteinski nosači koji se koriste u generisanju biokonjugata u opisanim ćelijama-domaćina sadrže „oznaku“, odnosno, sekvencu aminokiselina koja omogućava izolaciju i/ili identifikaciju proteinskog nosača. Dodavanje oznake u sekvencu proteinskog nosača korisno je za prečišćavanje tog proteina, odnosno prečišćavanje konjugovanih vakcina koje sadrže označeni proteinski nosač. Primeri oznaka koje se mogu koristiti prema pronalasku uključuju, bez ograničenja, histidinske (HIS) oznake (na primer, heksa-histidin-oznaku ili 6XHis-oznaku), FLAG-TAG i HA oznake. U određenim primerima izvođenja, oznake koje se koriste prema pronalasku mogu se ukloniti, na primer, hemijskim agensima ili enzimskim sredstvima, kada više nisu potrebni, na primer, nakon što je protein prečišćen. U drugim primerima izvođenja, proteinski nosač ne sadrži oznaku.
[0159] U određenim primerima izvođenja, ovde opisani proteiniski nosači sadrže signalnu sekvencu koja usmerava proteinski nosač u periplazmatski prostor ćelije-domaćina koja eksprimira proteinski nosač. U specifičnom primeru izvođenja, signalna sekvenca potiče iz DsbA proteina E. coli, porina A spoljašnje membrane (OmpA) E. coli, maltoza-vezujućeg proteina (MalE) E. coli, pektat lijaze Erwinia carotovorans (PelB), FlgI, NikA ili endoksilanaze Bacillus sp. (XynA), termosenzitivnog enterotoksina LTIIb E. coli, endoksilanaze XynA Bacillus ili flagelin E. coli (FlgI). U jednom aspektu, signalna sekvenca sadrži SEQ ID BR: 10. Signalna sekvenca se može iseći nakon translokacije proteina u periplazmu i stoga može da ne bude prisutna u konačnom proteinskom nosaču u sastavu biokonjugata.
[0160] U određenim primerima izvođenja, u opisane ćelije-domaćina mogu se uvesti dodatne modifikacije (na primer, korišćenjem rekombinantnih tehnika). Na primer, nukleinske kiseline ćelije-domaćina (na primer, geni), koje kodiraju proteine koji su deo mogućeg konkurentskog ili interferirajućeg puta glikozilacije (na primer, kompetiraju za ili ometaju jedan ili više heterolognih gena uključenih u glikozilaciju koji su rekombinantno uvedeni u ćelijudomaćina), mogu biti deletirane ili modifikovane u genomu ćelije-domaćina, tako da se učine neaktivnim/disfunkcionalnim (nukleinske kiseline ćelije-domaćina koje su isečene/modifikovane ne kodiraju funkcionalni protein). U određenim primerima izvođenja, kada su nukleinske kiseline uklonjene iz genoma opisanih ćelija-domaćina, one se zamenjuju poželjnom sekvencom, na primer, sekvencom koja je korisna za proizvodnju polisaharida O-antigena ili njegovog biokonjugata.
[0161] Primeri gena ili klastera gena koji mogu biti isečeni u ćelijama-domaćina (i, u nekim slučajevima, zamenjeni drugim željenim sekvencama nukleinske kiseline), uključuju gene ili klastere gena ćelija-domaćina koji imaju ulogu u biosintezu glikolipida, kao što je kao waaL (videti, na primer, Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), klaster biosinteze lipida A (waa), klaster galaktoze (gal), klaster arabinoze (ara), klaster kolonske kiseline (wc), kapsularni klaster polisaharida, geni za biosintezu undekaprenola (na primer, uppS, uppP), und-P reciklujući geni, metabolički enzimi uključeni u nukleotidima aktiviranu biosintezu šećera, enterobakterijski zajednički antigenski klaster (eca) i klasteri modifikacije O-antigena profaga, kao što je gtrABS klaster ili njegovi delovi. U specifičnom primeru izvođenja, opisane ćelije-domaćina modifikovane su tako da ne proizvode nijedan polisaharid O-antigens osim željenog polisaharida O-antigena, na primer, polisaharid O4-antigena.
[0162] U specifičnom primeru izvođenja, waaL gen je isečen ili je funkcionalno inaktiviran u genomu ćelije-domaćina (na primer, rekombinantna ćelija-domaćina). Termin „waaL“ i „waaL gen“ odnose se na gen ligaze O-antigena, koji kodira membranski enzim čije se aktivno mesto nalazi u periplazmi. Kodirani enzim katalizuje prenos O-antigena vezanog za undekaprenil-fosfat (UPP) na okosnicu lipida A, formirajući lipopolisaharid. Delecija ili oštećenje endogenog waaL gena (na primer, ΔvaaL sojevi) remeti prenos O-antigena na lipid A, a umesto toga pojačava prenos O-antigena na drugi biomolekul, kao što je proteinski nosač.
[0163] U drugom specifičnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje ćeliju-domaćina u kojoj je jedan ili više waaL gena, gtrA gena, gtrB gena, gtrS gena i rfb genski klaster gena isečeno ili funkcionalno inaktivirano iz originalnog genoma prokariotske ćelije-domaćina.
[0164] U jednom primeru izvođenja, ćelija-domaćin je E. coli koja proizvodi biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena, gde je waaL gen isečen ili funkcionalno inaktiviran u genomu ćelije-domaćina, a umetnut je gtrS gen specifičan za polisaharid O4-antigena E. coli. U određenim primerima izvođenja, za proizvodne sojeve biokonjugata glikozilovanog O4-antigena, gtrS gen koji kodira glukozil-transferazu sa najmanje 80% istovetnosti sekvence SEQ ID NO:4 umetnut je na mesto originalnog gtrS gena parenteralnog soja, kako bi se zamenio gtrS gen u tom parenteralnom soju onim koji je odgovoran za glikozilaciju O4-antigena. Primer takvog parenteralnog soja je E. coli K-12 soj W3110. Geni gtrA i gtrB mogu biti homologni roditeljskom soju ili alternativno, jedan ili oba gena mogu biti heterologna u odnosu na roditeljski soj. Tipično, i za razliku od gtrS gena, navedeni gtrA i gtrB geni nisu specifični za strukturu O-antigena.
[0165] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke za dobijanje rekombinantnih ćelija-domaćina. Rekombinantne ćelije-domaćina dobijene opisanim postupcima prema pronalasku mogu se koristiti u proizvodnji biokonjugata O-antigena E. coli. Postupci obuhvataju uvođenje jednog ili više molekula rekombinantne nukleinske kiseline u ćeliju, kako bi se proizvela rekombinantna ćelija-domaćina. Tipično, rekombinantni molekuli nukleinske kiseline su heterologni. Moguće je primeniti svaki postupak uvođenja rekombinantnog molekula nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina koji je poznat u stanju tehnike u oblasti ovog pronalaska. Rekombinantne nukleinske kiseline se mogu uvesti u opisane ćelije-domaćina korišćenjem postupaka koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, kao što su, na primer, elektroporacija, hemijska transformacija, toplotni šok, prirodna transformacija, fagna transdukcija i konjugacija. U specifičnim primerima izvođenja, rekombinantne nukleinske kiseline se uvode u opisane ćelije-domaćina korišćenjem plazmida. Na primer, heterologne nukleinske kiseline mogu se eksprimirati u ćelijama-domaćina pomoću plazmida (na primer, ekspresioni vektor). U drugom specifičnom primeru izvođenja, heterologne nukleinske kiseline se uvode u opisane ćelije-domaćina insercijom u genom, kao što je na primer opisano u objavi međunarodne patentne prijave WO 2014/037585, WO 2014/057109 ili WO 2015/052344.
[0166] U jednom primeru izvođenja, postupak dobijanja rekombinantne ćelije-domaćina za proizvodnju biokonjugata glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač obuhvata uvođenje jednog ili više rekombinantnih molekula nukleinske kiseline u ćeliju, poželjno u ćeliju E. coli, kako bi se proizvela rekombinantna ćelija-domaćina. U takvim primerima izvođenja, rekombinantni molekuli nukleinske kiseline uvedeni u ćeliju uključuju (i) nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid O4-antigena E. coli; (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira glukozil-transferazu koja ima najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 4, gde je glukozil-transferaza sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli, tako da se dobije glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli; (iii) nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač; i (iv) nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu sposobnu da kovalentno poveže glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli sa proteinskim nosačem, da bi se proizveo biokonjugat. U poželjnim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira glukozil- transferazu sa najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID BR: 4, zamenjuje endogeni gtrS gen. Prednost delecije endogenog gtrS sastoji se u tome što gen ne interferira sa nastankom strukture glikozilovanog polisaharida O4-antigena. U nekim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca rfb genskog klastera za polisaharid O4-antigena E. coli zamenjuje endogeni rfb genski klaster parenteralnog soja, koji je korišćen za dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina. Ako ćelija ne kodira gtrA i/ili gtrB gene, moguće je uvesti u ćeliju nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu (gtrA) i glikozil-transferazu (gtrB), sa najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8. U slučaju da ćelija sadrži gtrA i gtrB gene (kao na primer, E. coli K-12 soja W3110), nema potrebe za uvođenjem ili promenom ovih gena.
[0167] U specifičnom primeru izvođenja, glukozil-transferaza (gtrS specifična za dodavanje bočnih ogranaka glukoze na O4-antigen) ima SEQ ID NO: 4.
[0168] U specifičnom primeru izvođenja, oligosaharil-transferaza je PglB poreklom iz C. jejuni. U jednom takvom primeru izvođenja, oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 6. U drugom takvom primeru izvođenja, oligosahariltransferaza obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, koja sadrži mutaciju N311V. U još jednom takvom primeru izvođenja, oligosaharil-transferaza ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, koja sadrži mutacije Y77H i N311V.
[0169] U još jednom specifičnom primeru izvođenja, proteinski nosač sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije unutar kojeg se nalazi konsenzusna sekvenca glikozilacije SEQ ID NO: 1, poželjno SEQ ID NO: 2. U drugom specifičnom primeru izvođenja, proteinski nosač je EPA, poželjno EPA-4, kao što je EPA-4 koji sadrži SEQ ID NO: 3.
[0170] U određenim primerima izvođenja pronalaska, kao parentalne ćelije za dobijanje ćelije-domaćina mogu se koristiti sojevi E. coli, koji se rutinski koriste u molekularnoj biologiji, kao alat i kao model-organizam. Neograničavajući primeri uključuju E. coli K12 sojeve (na primer, kao što su W1485, W2637, W3110, MG1655, DH1, DH5α, DH10, itd.), B sojeve (na primer, BL-21, REL606, itd.), C sojeve ili W sojeve. U jednom specifičnom primeru izvođenja, soj domaćina je izveden iz parentalnog soja W3110. Ovaj soj se može nabaviti od E. coli Genetic Stock Center na Yale University. Za više informacija o E. coli, videti, na primer, Ecoliwiki.net.
Postupci za proizvodnju konjugata i biokonjugata
[0171] Pronalazak opisuje postupke proizvodnje glikokonjugata polisaharida O-antigena E. coli. Glikokonjugati, uključujući biokonjugate, mogu se pripremiti in vitro ili in vivo, na primer, korišćenjem opisanih rekombinantnih ćelije-domaćina za proizvodnju.
[0172] U nekim primerima izvođenja, glikokonjugati se mogu dobiti hemijskom sintezom, odnosno, mogu se dobiti van ćelije-domaćina (in vitro). Na primer, polisaharid O-antigena E. coli može se konjugovati sa proteinskim nosačem, primenom postupaka poznatih stručnjaku u ovoj oblasti, uključujući postupke aktivacije reaktivnih grupa u polisaharidu/oligosaharidu i u proteinskom nosaču. Videti, na primer, Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; i Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978). Takvi pristupi obuhvataju ekstrakciju antigenih polisaharida/oligosaharida iz ćelija-domaćina, prečišćavanje tih polisaharida/oligosaharida, hemijsku aktivaciju polisaharida/oligosaharida, i konjugovanje polisaharida/oligosaharida za proteinski nosač.
[0173] U nekim primerima izvođenja, opisane ćelije-domaćini mogu da se iskoriste za proizvodnju biokonjugata koji sadrže polisaharid O-antigena E. coli, kovalentno vezan za protein-nosač. Postupci proizvodnje takvih biokonjugata u ćelijama-domaćina poznati su u stanju tehnike. Videti, na primer, WO 2003/074687 i WO 2006/119987. Postupci obuhvataju kultivisanje neke od opisanih rekombinantnih ćelija-domaćina, u uslovima koji pogoduju proizvodnji biokonjugata. Biokonjugati mogu biti izolovani, odvojeni i/ili prečišćeni iz rekombinantnih ćelija-domaćina primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, biokonjugati se mogu prečistiti primenom postupaka prečišćavanja proteina poznatih u stanju tehnike, na primer, hromatografijom (kao što su jonsko-izmenjivačka, anjonsko-izmenjivačka, afinitetna i hromatografija na koloni zasnovana na veličini), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću ili bilo kojom drugim standardnim postupkom prečišćavanja proteina. Videti, na primer, postupke opisane u WO 2009/104074. Dalje, biokonjugati se mogu fuzionisani sa heterolognim polipeptidnim sekvencama, kako bi se olakšalo prečišćavanje. Konkretni uslovi za prečišćavanje određenog biokonjugata zavisiće delimično od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost i/ili hidrofilnost biokonjugata, i biće očigledni stručnjacima u stanju tehnike. Dobijanje biokonjugata O1A, O2, O6A i O25B antigena u opisanim ćelijama, kao i kompozicije vakcina koje ih sadrže, opisano je u WO 2015/124769 i u WO 2017/035181.
[0174] Obezbeđeni su i biokonjugati proizvedeni ovde opisanim postupcima, tj., upotrebom ovde opisanih rekombinantnih ćelija-domaćina.
[0175] U nekim primerima izvođenja, postupak dobijanja biokonjugata polisaharida O-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač obuhvata: (i) dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina koja sadrži (a) nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid O-antigena; (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač, poželjno EPA, sa najmanje jednim mestom glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjno SEQ ID NO: 2, a poželjnije sadrži četiri mesta glikozilacije od kojih svako sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema SEQ ID NO: 2; i (c) nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu, na primer PglB oligosahariltransferaza ili neku njenu varijantu.
[0176] U nekim primerima izvođenja, polisaharidi O-antigena E. coli proizvedeni korišćenjem ovde opisanih rekombinantnih ćelija-domaćina, kovalentno su vezani za proteinski nosač u određenom masenom odnosu (tež./tež.) količine polisaharida prema proteinu. Ovaj maseni odnos količine polisaharida O-antigena kovalentno vezanog za proteinski nosač naziva se „glikan/proteinski odnos“ ili „polisaharid/proteinski odnos“ ili „PS/proteinski odnos“. U nekim primerima izvođenja, polisaharid O-antigena kovalentno je vezan za proteinski nosač u odnosu polisaharida i proteina (tež./tež.) od oko 1:20 do 20:1, poželjno 1:10 do 10:1, poželjnije 1:3 do 3:1. U nekim neograničavajućim primerima izvođenja opisanih biokonjugata, glikan/proteinski odnos je oko 0.1 do 0.5, kao što je 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45 ili 0.5. U takvim primerima izvođenja, maseni odnos polisaharida O-antigen: proteinu je približno 1:10 do 1:2, kao što je 1:10: 1:9: 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 ili 1:2, zavisno od serotipa O-antigena. U nekim primerima izvođenja, glikan/proteinski odnos je od oko 0.15 do oko 0.45. Načelno, poželjna je veća vrednost glikan/proteinskog odnosa polisaharida O-antigena prema proteinskom nosaču, jer velika količina proteinskog nosača može, u nekim slučajevima, dovesti do imunoloških smetnji. Takođe, veća vrednost glikan/proteinskog odnosa olakšava dobijanje dovoljne količine polisaharida O-antigena doziranog u vidu biokonjugata, uz održavanje relativno niske količine proteinskog nosača, što je posebno korisno za dobijanje multivalentne kompozicije kojom je potrebno obuhvatiti više serotipova, na primer, kompozicije koje sadrže biokonjugate najmanje četiri različita O-antigena, najmanje pet različitih O-antigena, najmanje šest različitih O-antigena, najmanje sedam različitih O-antigena, najmanje osam različitih O-antigena, najmanje devet različitih O-antigena, najmanje deset različitih O-antigena, itd.
[0177] Vrednost glikan/proteinskog odnosa konjugata prema pronalasku može se odrediti na osnovu količine proteina i glikana. Količina proteina se određuje merenjem UV apsorbance na 280 nm (A280). Količina glikana se određuje jonskom hromatografijijom sa pulsnom amperometarskom detekcijom (IC-PAD) šećera u ponovku (na primer, Man za O8 u Tabeli 1 i GlcNAc za ostale glikane u Tabeli 1), nakon čega se strukturne informacije ponovka koriste za izračunavanje ukupne količine glikana (na primer, ponovak O1A ima molarnu masu od 845 Da i jedan mol takvog ponovka sadrži jedan mol GlcNAc, što omogućava izračunavanje ukupne količine glikana kada je količina GlcNAc određena pomoću IC-PAD).
[0178] U nekim primerima izvođenja, biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač i proizveden u rekombinantnoj ćeliji-domaćina, u skladu sa opisanim ćelijama i postupcima, ima određeni stepen acetilacije na poziciji 2 L-Rh šećera. Stepen O-acetilacije polisaharida O25B-antigena u biokonjugatu poželjno je najmanje 30%, poželjno najmanje 50%, kao što je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%.
[0179] Slično, stepen O-acetilacije polisaharida O16-antigena E. coli u biokonjugatu je poželjno najmanje 30%, poželjno najmanje 50%, kao što je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%.
[0180] U specifičnim primerima izvođenja, postupak za pripremu biokonjugata polisaharida O-antigena obuhvata dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira određeni enzim oligosaharil-transferazu, posebno PglB oligosaharil-transferazu ili varijantu ovog enzima, u zavisnosti od biokonjugata polisaharida O-antigena koji je potrebno proizvesti. Određena varijanta enzima oligosaharil-transferaze može uticati na prinos biokonjugata koju proizvodi ćelija-domaćin. Uobičajeno je poželjan veći prinos, jer prinos utiče na troškove proizvodnje specifičnog biokonjugata, što je posebno važno za multivalentne kompozicije koje sadrže nekoliko različitih biokonjugata. U nekim primerima izvođenja, postupak dalje obuhvata izolovanje biokonjugata iz rekombinantne ćelije- domaćina.
[0181] U jednom posebnom primeru izvođenja, kada je polisaharid O-antigena O1A, O6A ili O15, onda PglB oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V, gde se navedene aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
[0182] U još jednom posebnom primeru izvođenja, kada je O-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, onda PglB oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinsku mutaciju N311V, ili aminokiselinsku mutaciju Y77H i N311V, gde se aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 6.
[0183] U narednom primeru izvođenja, kada je O-antigen polisaharid O16-antigena, onda PglB oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V, gde se aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0184] U narednom posebnom primeru izvođenja, kada je O-antigen polisaharid O75-antigena, onda PglB oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinsku mutaciju N311V, gde se mutacija aminokiselina odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0185] U narednom primeru izvođenja, kada je O-antigen polisaharid O8, O18A, O25B ili O2 antigena, onda PglB oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, gde SEQ ID NO: 6 nema mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669. U određenim primerima izvođenja, PglB oligosaharil-transferaza sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 6.
[0186] U nekim primerima izvođenja, proteinski nosač se izabira iz grupe koju čine detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
[0187] U nekim primerima izvođenja, proteinski nosač je detoksifikovani egzotoksin A Pseuodomonas aeruginosa (EPA). Poželjno, proteinski nosač EPA sadrži 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4 mesta glikozilacije. Poželjno, svako mesto glikozilacije obuhvata konsenzusnu sekvencu glikozilacije, koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U specifičnom primeru izvođenja, ćelija-domaćin sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira EPA-4 proteinski nosač koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3.
[0188] U određenim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija-domaćina je ćelija E. coli, na primer, soj E. coli K-12, kao što je soj W3110.
[0189] Pronalazak takođe obezbeđuje biokonjugate polisaharida O-antigena proizvedene primenom rekombinantnih ćelija-domaćina koje kodiraju enzime oligosaharil-transferaze, prema navedenim parovima O-antigen/PglB oligosaharil-transferaza. Takođe su obezbeđene kompozicije koje sadrže takve biokonjugate. U određenim primerima izvođenja, kompozicija sadrži najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjnije najmanje 5, još poželjnije najmanje 7 takvih biokonjugata.
[0190] U nekim primerima izvođenja, biokonjugati polisaharida O-antigena proizvedeni u rekombinantnim ćelijama-domaćina koje kodiraju enzime oligosaharil-transferaze prema navedenim parovima O-antigen/PglB oligosaharil-transferaza, poželjno imaju jedan ili više opisanih osobina kao što je na primer, željenu vrednost glikan/proteinskog odnosa i/ili količinu ili odnos multi-glikozilovanog proteinskog nosača.
PRIMERI IZVOĐENJA
[0191] Primer izvođenja 1 je postupak pripreme biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, gde postupak obuhvata:
(i) dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina koja sadrži:
a. nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid Ox-antigena; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač unutar koje sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije sa konsenzusnom sekvencom glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjno prema SEQ ID NO: 2; i
c. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy; i
(ii) kultivisanje rekombinantne ćelije-domaćina pod uslovima koji pogoduju proizvodnji biokonjugata; gde
kada je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V, a rekombinantna ćelija-domaćina dodatno sadrži sekvencu koja kodira glukoziltransferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, kako bi se dobio glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli i sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB, sa najmanje 80% istovetnosti sekvence sa sekvencama SEQ ID NO: 7, odnosno, 8 gde je translokaza sposobna da izvrši transfer glukoze vezane za baktoprenol, dok je glikozil-transferaza sposobna da glikoziluje baktoprenol;
kada je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669;
kada je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V;
kada je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; i
kada je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V;
gde se u svakom navedenom slučaju mutacije aminokiselina odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, i gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 antigena imaju strukturu formule (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, a svako n, nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0192] Primer izvođenja 2 je postupak prema primeru izvođenja 1, gde Ox-antigen polisaharid O1A-antigena i da PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0193] Primer izvođenja 3 je postupak prema primeru izvođenja 1, gde je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, i da PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V, u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0194] Primer izvođenja 4 je postupak prema primeru izvođenja 3, gde rekombinantna ćelijadomaćin dalje sadrži sekvencu koji kodiraju GtrS čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 4, i nukleotidne sekvence koje kodiraju GtrA i GtrB, koje su date u SEQ ID NO: 7, odnosno, 8.
[0195] Primer izvođenja 5 je postupak prema primeru izvođenja 1, gde je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, i PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0196] Primer izvođenja 6 je postupak iz primera izvođenja 1, gde je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, i PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0197] Primer izvođenja 7 je postupak iz primera izvođenja 1, gde je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, i PglBysadrži aminokiselinska mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0198] Primer izvođenja 8 je postupak prema primeru izvođenja 1, gde je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, i PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0199] Primer izvođenja 9 je postupak prema primeru izvođenja 1, gde je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, i PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0200] Primer izvođenja 10 je postupak prema 1, gde je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, i PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0201] Primer izvođenja 11 je postupak dobijanja biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde postupak obuhvata:
(i) dobijanje rekombinantne ćelije-domaćina koja sadrži:
(a) nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid Ox-antigena; (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač, unutar koje postoji najmanje jedno mesto glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije datu u SEQ ID NO: 1, poželjno u SEQ ID NO: 2; i (c) nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy; i
(ii) kultivisanje rekombinantne ćelije-domaćina pod uslovima koji pogoduju proizvodnji biokonjugata,
gde PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, gde je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, polisaharid glikozilovanog O4-antigena, polisaharid O6A-antigena, polisaharid O15-antigena, polisaharid O16 antigena ili polisaharid O75-antigena, i kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, rekombinantna ćelijadomaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira glukozil-transferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, i sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikoziltransferazu GtrB sa najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da prenese glukozu vezanu za baktoprenol, i da je glikozil-transferaza sposobna da glikoziluje baktoprenol, i
gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O15, O16 i O75-antigena imaju strukture formule (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, i da svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0202] Primer izvođenja 12 je postupak prema bilo kojem od primera izvođenja 1 do 11, koji dalje obuhvata izolovanje biokonjugata iz rekombinantne ćelije-domaćina.
[0203] Primer izvođenja 13 je postupak prema bilo kojem od primera izvođenja 1 do 12, gde je proteinski nosač izabran iz grupe koju čine detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E. coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
[0204] Primer izvođenja 14 je postupak prema primeru izvođenja 13, gde je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA).
[0205] Primer izvođenja 15 je postupak prema primeru izvođenja 14, gde proteinski nosač EPA sadrži 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4 mesta glikozilacije.
[0206] Primer izvođenja 16 je postupak prema primeru izvođenja 15, gde svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilaciju datu u SEQ ID NO: 2.
[0207] Primer izvođenja 17 je postupak prema primeru izvođenja 16, gde EPA proteinski nosač ima sekvencu SEQ ID NO: 3.
[0208] Primer izvođenja 18 je postupak prema bilo kojem od primera izvođenja 1-17, gde je rekombinantna ćelija-domaćin, ćelija E. coli, na primer, soj K-12 E. coli, kao što je W3110.
[0209] Primer izvođenja 19 je biokonjugat proizveden postupkom prema bilo kom primeru izvođenja 1-18.
[0210] Primer izvođenja 20 je kompozicija koja sadrži biokonjugat prema primeru izvođenja 19.
[0211] Primer izvođenja 21 je kompozicija koja sadrži najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjnije najmanje 5, još poželjnije najmanje 7 biokonjugata prema primeru izvođenja 19.
[0212] Primer izvođenja 22 je kompozicija prema primeru izvođenja 20 ili 21, koja sadrži biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde glikozilovani polisaharid O4-antigena ima strukturu formule (O4-Glc+), kao što je prikazano u Tabeli 1, a n predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0213] Primer izvođenja 23 je kompozicija prema bilo kom od primera izvođenja 20 do 22, koja dalje sadrži barem biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharid O25B-antigena ima strukturu formule (O25B), kao što je prikazano u Tabeli 1, a n je ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0214] Primer izvođenja 24 je kompozicija prema bilo kom primeru izvođenja 20 do 23, koji dalje sadrži barem biokonjugat polisaharida O2-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharid O2-antigena ima strukturu formule (O2), kao što je prikazano u Tabeli 1, a n je ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0215] Primer izvođenja 25 je kompozicija prema bilo koje od primera izvođenja 20 do 24, koja sadrži:
(i) biokonjugat polisaharida O1A-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosačem, (ii) biokonjugat polisaharida O2-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, (iii) biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, (iv) biokonjugat polisaharida O6A-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, (v) biokonjugat polisaharida O8-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, (vi) biokonjugat polisaharida O15-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, (vii) biokonjugat polisaharida O16-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, (viii) biokonjugat polisaharida O25B-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, i (ix) biokonjugat polisaharida O75-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharidi O1A, O2, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O25B i O75 antigena imaju strukture formule (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O25B), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, a svako n je nezavisno ceo broj od 1 do 100, poželjno od 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0216] Primer izvođenja 26 je kompozicija prema primeru izvođenja 25, koja dalje sadrži: (x) biokonjugat polisaharida O18A-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač, gde polisaharid O18A-antigena ima strukturu formule (O18A), kao što je prikazano u Tabeli 1, a n je ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0217] Primer izvođenja 27 je kompozicija prema bilo kom primeru izvođenja 20 do 26, gde je kompozicija imunogena kompozicija.
[0218] Primer izvođenja 28 je postupak vakcinacije subjekta protiv E. coli, posebno protiv ekstraintestinalnih patogenih sojeva E. coli (ExPEC), koji se sastoji od administracije biokonjugata iz prema primeru izvođenja 19, ili kompozicije ili imunogene kompozicije prema bilo kom primeru izvođenja 20 do 27.
[0219] Primer izvođenja 29 je biokonjugat prema primeru izvođenja 19, ili kompozicija ili imunogena kompozicija prema bilo kom primeru izvođenja 20 do 27, za primenu u vakcinaciji protiv ekstraintestinalnog patogenog soja E. coli (ExPEC).
[0220] Primer izvođenja 30 je rekombinantna ćelija-domaćin za proizvodnju biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde rekombinantna ćelija-domaćina sadrži:
(a) nukleotidnu sekvencu rfb genskog klastera za polisaharid Ox-antigena;
(b) nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač koji ima najmanje jedno mesto glikozilacije, koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije prema SEQ ID NO: 1, poželjno prema SEQ ID NO: 2; i
(c) nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy;
gde:
kada je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiseline mutacije Y77H i N311V, a rekombinantna ćelija-domaćina dalje sadrži sekvencu koja kodira glukoziltransferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i koja je sposobna da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli, dodavanjem glukoze, kako bi nastao polisaharid glikozilovanog O4-antigena E. coli i sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB, sa najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da prenese glukozu vezanu za baktoprenol, dok je glikozil-transferaza sposobna da glikoziluje baktoprenol;
kada je Ox-antigen polisaharid O6A antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669;
kada je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V;
kada je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V;
kada je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; i
kada je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V;
gde se u svim slučajevima aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, i gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 antigena imaju strukture formule (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1, a svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0221] Primer izvođenja 31 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, a PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0222] Primer izvođenja 32 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, a PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0223] Primer izvođenja 33 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 32, gde rekombinantna ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira GtrS čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 4 i sadrži nukleotidne sekvence koji kodiraju GtrA i GtrB, čije su aminokiselinske sekvence date u SEQ ID NO: 7, odnosno, 8.
[0224] Primer izvođenja 34 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, a PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0225] Primer izvođenja 35 je rekombinantna ćelija-domaćin iz primera izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, a PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0226] Primer izvođenja 36 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, i PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0227] Primer izvođenja 37 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O16-antigena i PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB koji ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 6.
[0228] Primer izvođenja 38 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena i PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669 u odnosu na neizrođeni tip PglB čija je aminokiselinska sekvencu data u SEQ ID NO: 6.
[0229] Primer izvođenja 39 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 30, gde je Ox-antigen polisaharid O75-antigena i PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
[0230] Primer izvođenja 40 je rekombinantna ćelija-domaćin prema bilo kom primeru izvođenja 30 do 39, gde je proteinski detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelin E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A poreklom iz S. aureus, faktor zgrušavanja A, faktor zgrušavanja B, termolabilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, Sat protein E. coli, „putnički“ domen Sat proteina E.
coli, pneumolizin poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanin morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, protein spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i protein D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
[0231] Primer izvođenja 41 je rekombinantna ćelija-domaćin prema bilo kom primeru izvođenja 30-40, gde je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA).
[0232] Primer izvođenja 42 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 41, gde EPA proteinski nosač sadrži 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4, mesta glikozilacije.
[0233] Primer izvođenja 43 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 42, gde svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije koja je data u SEQ ID NO: 2.
[0234] Primer izvođenja 44 je rekombinantna ćelija-domaćin prema primeru izvođenja 43, gde EPA proteinski nosač sadrži SEQ ID NO: 3.
[0235] Primer izvođenja 45 je rekombinantna ćelija-domaćin prema bilo kom primeru izvođenja 30 do 44, gde je rekombinantna ćelija-domaćin neka ćelija E. coli, na primer soj K-12 E. coli, kao što je W3110.
[0236] Primer izvođenja 46 je biokonjugat prema primeru izvođenja 19, gde je biokonjugat polisaharid glukozilovanog O4-antigena E. coli, kovalentno vezan za proteinski nosač.
[0237] Primer izvođenja 47 je biokonjugat prema primeru izvođenja 46, gde je proteinski nosač EPA proteinski nosač koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 3.
[0238] Primer izvođenja 48 je biokonjugat prema primeru izvođenja 46 ili 47, gde glikozilovani polisaharid O4-antigena ima strukturu formule (O4-Glc+), kao što je prikazano u Tabeli 1, a n je ceo broj od 5 do 40.
[0239] Primer izvođenja 49 je kompozicija koja sadrži biokonjugat prema bilo kom primeru izvođenja 46-48.
[0240] Primer izvođenja 50 je kompozicija prema primeru izvođenja 49, koja dalje sadrži jedan ili više konjugata od kojih svaki sadrži polisaharid antigena E. coli kovalentno vezan za proteinski nosač.
[0241] Primer izvođenja 51 je kompozicija prema primeru izvođenja 50, gde jedan ili više konjugata obuhvata polisaharid antigena E. coli jednog ili više narednih serotipova E. coli: O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75, gde polisaharidi O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O25B i O75 antigena imaju strukture formule (O1A), (O2), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), (O25B), odnosno, (O75), kao što je prikazano u Tabeli 1 i svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, na primer, 5 do 40, na primer, 7 do 25, na primer, 10 do 20.
[0242] Primer izvođenja 52 je kompozicija prema primeru izvođenja 51, koja sadrži konjugate serotipova E. coli: O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75.
[0243] Primer izvođenja 53 je kompozicija prema primeru izvođenja 52, gde je svaki konjugat, biokonjugat.
PRIMERI
[0244] Naredni primeri izvođenja pronalaska treba dodatno da ilustruju prirodu pronalaska. Trebalo bi razumeti da primeri koji slede ne ograničavaju pronalazak, te da je obim pronalaska određen priloženim zahtevima.
Primer 1: Epidemiološki podaci o infekcijama E. coli
[0245] Sprovedene su studije globalnog nadzora kako bi se odredila distribucija O-serotipa E. coli koji izazivaju bakteremije. Između 2011. i 2017. godine, prikupljeno je više od 3200 izolata E. coli iz krvi pacijenata ≥ 60 godina starosti koji su bili hospitalizovani u zemljama Severne Amerike, Evrope, Azijsko-pacifičkog regiona i Južne Amerike. Svaki soj je analiziran na serotip O-antigena primenom klasičnih tehnika aglutinacije i O-genotipizacije zasnovane na sekvenci. Vidi Tabelu 2.
[0246] Izolovani uzorci ljudske krvi analizirani su kako bi se utvrdio identitet patogena i profil rezistencije na antibiotike. Izolati E. coli dobijeni su iz uzoraka nakon analize. Identitet E. coli verifikovan je primenom MALDI-TOF MS. Dalja analiza izolata E. coli obavljena je testom aglutinacije primenom antiseruma, kako bi se odredio njihov O-antigenski serotip (DebRoi et al. (2011) Animal Health Research Review/ Conference of Research Workers in Animals Diseases, 12, 169-185). Izolati koji nisu mogli biti tipizirani metodom aglutinacije, dalje su analizirani sekvenciranjem celog genoma, nakon čega je sledila O-genotipizacija na osnovu sekvenci wzy i wzx gena koji se specifični za O-serotip.
Tabela 2: Distribucija najčešćih O-serotipova E. coli povezanih sa bakteremijom, iz kolekcije od 3217 krvnih izolata prikupljenih širom sveta između 2011. i 2017. godine, koja je izvršena O-serotipizacijom na osnovu aglutinacije i dodatnom O-genotipizacijom izolata koji nisu mogli biti tipizirani aglutinacijom. Ispitanici su bili hospitalizovani u sledećim zemljama: SAD, Kanada, Argentina, Brazil, Velika Britanija, Nemačka, Španija, Italija, Holandija, Francuska, Japan, Tajland, Južna Koreja i Australija.
[0247] Stratifikacija celokupnog skupa bakteremija povezanih sa E. coli prema geografskoj lokaciji pokazala da je rasprostranjenost 10 najzastupljenijih O-serotipova nezavisna od lokacije, što sugeriše da su to preovlađujući O-serotipovi globalno povezani sa bakteremijama izazvanim bakterijom E. coli.
[0248] U globalnom skupu E. coli izolata koji ispoljavaju višestruku otpornost na lekove (n=345), odnosno, onih sojeva koji otporni su na najmanje tri klase klinički relevantnih antimikrobnih lekova, 10 najzastupljenijih O-serotipova čini rasprostranjenost od 75.4%.
[0249] Kada se uzmu u obzir sve informacije iz epidemiološke analize, procenjuje se da 10 preovlađujućih O-serotipova pokriva 60-80% bakteremija povezanih sa E. coli, računajući da su obuhvaćene porcije netipiziranih sojeva.
[0250] Multivalentna vakcina koja pokriva značajan deo serotipova E. coli koji su preovlađujući izazivači bakteremija bila bi stoga od velikog značaja. O-serotipovi prikazani u Tabeli 2 bi bili dobri kandidati za multivalentnu vakcinu zasnovanu na O-antigenu. Takva vakcina bi se mogla efikasno proizvesti primenom tehnologije biokonjugacije.
[0251] O4 je jedan od 10 najzastupljenijih serotipova (Tabela 2). Stoga bi bilo korisno proizvesti biokonjugovanu vakcinu koji uključuje polisaharid O-antigena E. coli serotipa O4 povezan sa proteinskim nosačem.
Primer 2: Karakterizacija savremenih O4 kliničkih izolata u pogledu gena koji kodiraju enzime za modifikovanje O-antigena
[0252] Opisane su dve varijante polisaharida O4-antigena E. coli (videti, na primer, Jann B, et al., 1993, Carbohydr. Res.248: 241-250), od kojih jedna varijanta ima nerazgranatu strukturu (struktura prikazana kao (O4-Glc-) u Tabeli 1), dok je druga supstituisana dodatnim bočnim lancem glukoze (struktura prikazana kao (O4-Glc+) u Tabeli 1). Proporcija u kojoj ove dve varijante se nalaze u savremenim kliničkim izolatima nije bila poznata. Iako obe varijante reaguju sa O4-antiserumima, nije bilo poznato da li postoje imunološke razlike između ovih varijanti. Takođe nije bio poznat enzim odgovoran za povezivanje bočnog ogranka glukoze kako bi se formirao polisaharid (O4-Glc+) antigena, a smatralo se da se pretpostavljena kodirajuća sekvenca verovatno nalazi izvan genskog rfb klastera O4 gena.
[0253] Skup od 32 O4-klinička izolata E. coli izolovana u periodu 2011-2012 u Sjedinjenim Državama i Evropskoj uniji, čiji je serotip potvrđen aglutinacijom, bio je podvrgnut analizi sekvence celog genoma. Ekstrahovane sekvence gena rfb klastera iz 32 sekvencionirana O4 izolata su poravnate sa onima iz referentnog soja i upoređena je nukleotidna sekvenca. Osim nekih prirodnih polimorfizama na nivou pojedinačnih nukleotida, svi okarakterisani izolati imali su rfb klastere istovetne referentnom O4 soju, što ukazuje da svi O4 sojevi E. coli, nezavisno od Glc-grananja, nose identičan rfb genski klaster. Dakle, za nastanak O4-Glc+ polisaharida antigena E. coli, neophodan je gen do sada nepoznate sekvence koji kodira enzim specifičan za O4-antigen E. coli, i koji se nužno nalazi izvan rfb klastera O4 gena E. coli. Da bi se proizveo biokonjugat koji sadrži O4-Glc+ polisaharid antigena E. coli u soju koji bi inače proizvodio samo biokonjugate O4-Glc- polisaharida antigena E. coli potrebno je da se nepoznati gen identifikuje i primeni.
[0254] Podaci dobijeni sekvenciranjem celog genoma analizirani su u pogledu identifikacije gena izvan klastera rfb gena koji mogu da kodiraju enzime koji modifikuju O-antigen. Tako su prvi put identifikovani homolozi gtrAB poreklom iz Shigella flekneri u O4 soju E. coli. Otvoreni okvir čitanja nizvodno od gtrAB u E. coli identifikovan je kao gtrS gen specifičan za O4 soj E. coli, koji kodira enzim Gtrs specifičan za O4 soj E. coli, koji je odgovoran za dodavanje bočnih ogranaka glukoze na O4 antigen E. coli.
[0255] Aminokiselinska sekvenca GtrS enzima specifičnog za O4 data je u SEQ ID NO: 4. Primer sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ovaj protein data je u SEQ ID NO: 5.
[0256] Od svih okarakterisanih O4 izolata E. coli, približno 80% sadrži obelodanjeni gtrS gen (odnosno, 26 od 32 izolata). Rasprostranjenost O4-specifične sekvence gtrS gena E. coli određena je postupkom PCR, korišćenjem specifične sekvence prajmera u nezavisnom setu od 20 kliničkih, aglutinacijom potvrđenih O4 izolata E. coli, izolovanih u periodu 2014-2016 od pacijenata u Sjedinjenim Državama i Evropskoj uniji. Analiza je pokazala da 17 od 20 O4 izolata sadrži gtrS sekvencu, što odgovara rasprostranjenosti od 85%.
Primer 3: Kloniranje gtrS O4 u E. coli soj W3110, proizvodnja i strukturna potvrda Glcmodifikovanih biokonjugata O4
[0257] Da bi se testirala mogućnost dobijanja biokonjugata koji sadrže polisaharid O4-antigena modifikovan dodavanjem bočnih ogranaka glukoze, konstruisani su proizvodni sojevi za dobijanje biokonjugata O4-antigena E. coli i EPA, koji sadrže pretpostavljeni enzim odgovoran za grananje. To je postignuto zamenom endogenog O16-gtrS gena pretpostavljenim O4-gtrS genom (SEQ ID NO: 5, videti Primer 2) i zamenom endogenog O16 rfb genskog klastera, O4 rfb genskim klasterom u E. coli soju W3110 ΔwzzE-wecG ΔwaaL ΔwbbI-J-K, homolognom rekombinacijom. Za neke sojeve alternativno, O4 rfb klaster je kodiran na plazmidu.
[0258] Nakon toga, u sojeve su uvedeni plazmidi koji kodiraju detoksifikovani egzotoksin A proteinskog nosača Pseudomonas aeruginosa (EPA) (varijanta koja ima 2 ili 4 konsenzusna mesta glikozilacije, koja nosi oznaku „EPA-2“, odnosno, „EPA-4“), i oligosaharil-transferazu PgIB. Proizvedeni su O4-EPA biokonjugati modifikovani Glc-om, kultivisanjem sojeva za proizvodnju E. coli u bioreaktorskim kulturama i indukcijom ekspresije PgIB i EPA pomoću IPTG, odnosno, arabinoze. O4-EPA biokonjugati su ekstrahovani iz periplazmatskog ekstrakta biomase.
[0259] Detaljan polisaharidni sastav i hemijska veza u O4-EPA biokonjugatima, određeni su višestrukim NMR eksperimentima koji su izvedeni na biokonjugatima koji sadrže EPA-4 proteinski nosač (podaci nisu prikazani). Dobijeni podaci su bili u skladu sa podacima iz literature (Jansson, P.E., et al., 1984, Carbohydr. Res. 134(2): 283-291; Jann B, et al., 1993, Carbohydr. Res. 248: 241-250).1D spektar snimljen na 313K pokazao je veliki HOD signal i male oštre signale sa O4 pentasaharida RU, sa pet anomernih, dva NAc i dva H6 signala (Rha i FucNAc).
[0260] 1D raspored protona potvrđen je primenom 2D proton-proton i proton-ugljenik korelacionih NMR eksperimenata. Najpre su 2D TOCSI (120 ms) eksperimenti pokazali očekivane unakrsne pikove sa H1 i H6 (za Rha i FucNAc) za O4 pentasaharid RU i male pikove sa terminalnog RU i EPA. U metil regionu, TOCSI je pokazao unakrsne vrhove sa H6 do H1 za α-Rha i H6 do H5 za α-FucNAc za O4 RU. Preostali uočeni vrhovi poticali su od EPA aminokiselina i terminalnog Rha (tRha). Drugo, NMR spektar ugljenika sadržao je dobro dispergovane i dijagnostičke pojedinačne vrhove za O4 RU. Ugljenični atomi su indirektno profilisani, posredstvom vezanih protona, primenom HSQC merenja. HSQC-DEPT eksperiment je dao obrnute pikove za CH2grupe. HSQC je dao unakrsne pikove za O4 pentasaharid RU [5 anomernih, prstenasti, dve N-acetil i dve metil (Rha & FucNAc)] grupe, kao i EPA aminokiseline u karakterističnim regionima. Svaki od parova proton/ugljenik za O4 se može odrediti na osnovu rasporeda protona i podataka iz literature.
[0261] Eksperimenti strukturne karakterizacije su na taj način potvrdili da se Glc-razgranati O4 biokonjugati (koji sadrže polisaharidne antigene čija je struktura naznačena formulom (O4-Glc+) u Tabeli 1) mogu proizvesti korišćenjem pretpostavljenog E. coli O4-gtrS gena identifikovanog u Primeru 2.
Primer 4: Imunogenost Glc-razgranatog O4 biokonjugata kod zečeva
[0262] Glc-modifikovani biokonjugati O4 (odnosno, oni koji imaju glikane strukturne formule (O4-Glc+), kao što je prikazano u Tabeli 1) korišćeni su u imunizaciji zečeva primenom brzog zečjeg protokola (Eurogentec). Serumi imunizovanih zečeva analizirani su ELISA metodom na prisustvo anti-O4 IgG antitela usmerenih protiv prečišćenog O4 lipopolisaharida (LPS) sa (Glc+; odnosno, glikozolivani O4 polisaharid) ili bez Glc-ogranaka (Glc-; odnosno, onaj koji sadrži neglikozilovani O4 polisaharid). Imunizacija biokonjugatom je rezultirala visokim titrima IgG kod oba zeca (Slika 1). U oba slučaja, titar antitela indukovan biokonjugatom O4 bio je veći za Glc+ LPS u odnosu na Glc-LPS.
[0263] Serumi su prikupljeni i spojeni i zatim korišćeni u ELISA merenjima na celim ćelijama sa test setovima O4 izolata E. coli sa okarakterisanim statusom gtrS gena. Testirano je pet gtrS-negativnih (bez Glc-ogranaka) i šest gtrS-pozitivnih (Glc-ogranci) O4 izolata E. coli, kao i negativan kontrolni soj. Objedinjeni serumi zečeva imunizovanih Glcmodifikovanim O4 biokonjugatom sadržali su visok titar IgG antitela koja specifično prepoznaju testirane izolate O4 (Slika 2). U skladu sa LPS ELISA, svi su testirani O4 izolati su prepoznati imunim serumima. gtrS-pozitivni izolati pokazali su ukupno veće vezivanje od gtrS-negativnih izolata (Slika 2). Konkretno, sledeći izolati bili su gtrS-pozitivni: Y1382, E551, OC24334, stGVXN4983, stGVXN4994 i OC24794, dok su anredni izolati bili gtrS-negativni: A2625, stGVXN4988, OC24784, OC24787 i OC24788. Imuni serumi nisu reagovali sa sojem negativne kontrole nesrodnog O-serotipa E. coli OC9487 (ATCC 35383).
[0264] Profili LPS-a ekstrahovani iz testiranog seta gtrS-pozitivnih i gtrS-negativnih izolata na srebrom obojenim poliakrilamidnim gelovima nisu ukazali na značajne razlike između izolata koji eksprimiraju nemodifikovane i modifikovane oblike O4 antigena, što potvrđuje da se uočene razlike ne mogu objasniti kvantitativnim razlikama u nivoima ekspresije LPS (podaci nisu prikazani).
[0265] Ekstrahovani LPS-ovi su imunoblotovani u prisustvu objedinjenih imunih seruma, kako bi se utvrdilo prepoznavanje O4 antigena i IgG antitela indukovanih imunizacijom Glcmodifikovanim O4 biokonjugatima. Uočeno je da se IgG antitela izolovana iz zečeva imunizovanih modifikovanim-O4 vezuju i za modifikovane i za nemodifikovane O4 LPS, uključujući i specifično prepoznavanje LPS traka širokog spektra veličina, kao i LPS trake na velikim molekulskim težinama (Slika 3).
[0266] Kada se u narednim eksperimentima pominje biokonjugat ili proizvodni soj „O4“ ili „EcoO4“, misli se na biokonjugat ili proizvodni soj Glc-razgranatog O4 (koji ima glikansku strukturu (O4-Glc+) u Tabeli 1), osim ako nije posebno naznačeno drugačije (oznake „O4“ i „O4-Glc+“ se stoga koriste naizmenično za biokonjugate ili proizvodne sojeve u tim eksperimentima).
Primer 5: Imunogenost Glc-razgranatog O4 biokonjugata kod pacova
[0267] Pacovi Sprague Dawley soja imunizovani su 3 puta, intramuskularnom injekcijom pufera za formulaciju ili injekcijom (O4-Glc+)-EPA biokonjugata (odnosno, biokonjugat glikozilovanog polisaharida O4 antigena, koji je kovalentno spojen sa EPA proteinskim nosačem; proteinski nosač je EPA-2, kao što je ranije opisano u Primeru 3), u 3 doze (0.04 µg, 0.40 µg ili 4.0 µg). Nivoi serumskim antitela izmereni su ELISA testom, 0, 14 i 42 dana nakon imunizacije.
[0268] Imunizacija sa 0.04 µg, 0.40 µg ili 4.0 µg (O4-Glc+)-EPA biokonjugata izazvala je značajno povećanje nivoa IgG antitela 42 dana nakon imunizacije u poređenju sa grupom koja je dobila pufer za formulaciju (Slika 4A). Antitela indukovana (O4-Glc+)-konjugatom bila su funkcionalna, odnosno sposobna da posreduju u ćelijskoj smrti (O4-Glc+) E. coli soja (Slika 4B).
[0269] Nivoi antitela indukovani 0.04 µg, 0.40 µg ili 4.0 µg (O4-Glc+)-EPA biokonjugatom bili su značajno povećani 42 dana nakon imunizacije u poređenju sa nivoom detektovanim na dan imunizacije (42. dan naspram 0. dana, P = 0.006 za sve doze) i 14. dana posle imunizacije (42. dan naspram 14. dana, P = 0.006 za sve doze) (Slika 5). U grupi koja je primila 4.0 µg biokonjugata, titri su takođe bili značajno povećani 14. dana u poređenju sa danom 0, što ukazuje da pojedinačna doza od 4.0 µg (O4-Glc+)-EPA biokonjugata izaziva značajno povećanje titra IgG (14. dan naspram 0. dana, P=0.012). Značajno povećanje titra IgG antitela uočeno između 14. i 42. dana, za sve tri testirane koncentracije biokonjugata pokazalo je da je treća doza (O4-Glc+)-EPA biokonjugata sposobna da pojača odgovore antitela (Slika 5).
[0270] Funkcionalnost antitela indukovanih O4-Glc+-EPA konjugatom kod pacova trostruko imunizovanih intramuskularno puferom za formulaciju ili biokonjugatom u dozi od 4.0 µg određena je testom opsonofagocitne ćelijske smrti (OPKA), korišćenjem sojeva O4(Glu+) i O4(Glu-) E. coli. Antitela indukovana (O4-Glc+)-EPA biokonjugatom bila su funkcionalna, odnosno, sposobna da posreduju u ćelijskoj smrti (O4-Glc+) soja E. coli (Slika 4B, Slika 6). Specifično, antitela izazvana (O4-Glc+)-EPA biokonjugatom bila su sposobna da posreduju u ćelijskoj smrti kako (O4-Glc+), tako i (O4-Glc-, odnosno, koji ima glikane strukturne formule (O4-Glc-) u Tabeli 1, odnosno, O4 polisaharid bez Glc-ogranaka) sojeva E. coli (Slika 6).
[0271] U zaključku, antitela indukovana O4-Glc+-EPA biokonjugatom unakrsno su reaktivna i sposobna da posreduju u ćelijskoj smrti O4 sojeva E. coli, sa i bez bočnih ogranaka glukoze.
Primer 6: Proizvodni sojevi biokonjugata O-antigena E. coli i rezultujući biokonjugatni proizvodi
[0272] Pored (O4-Glc+)-EPA biokonjugata pripremljenih kako je gore opisano, proizvedeno je još devet (9) drugih biokonjugata. Konkretno, preostali biokonjugati uključuju O1A-EPA biokonjugat, O2-EPA biokonjugat, O6A-EPA biokonjugat, O8-EPA biokonjugat, O15-EPA biokonjugat, O16-EPA biokonjugat, O18A-EPA biokonjugat, O25B-EPA biokonjugat i O75-EPA biokonjugat E. coli. Hemijske strukture glikana unutar ovih konjugata predstavljene su odgovarajućim formulama u Tabeli 1. Kompozicija koja sadrži 10 biokonjugata ovde je navedena kao „ExPEC10V“. Kompozicija koja se sastoji od biokonjugata O1A-EPA, O2-EPA, O6A-EPA i O25B-EPA nosi oznaku „ExPEC4V“ (i prethodno je opisana u, na primer, WO 2015/124769 i WO 2017/035181).
Parentalni soj Escherichia coli W3110
[0273] Nepatogeni E. coli soj K12, W3110 iskorišćen je kao parentalni soj za konstrukciju svih deset proizvodnih sojeva. Korišćeni E. coli K12 soj W3110 nabavljen je od E. coli Genetic Stock Centre (Yale University, New Haven (CT), USA, No. CGSC#4474). Genotip ovog soja je prethodno opisan u (E. coli W3110, F-,lambda-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1), dok je njegova genomska sekvenca objavljena (Hayashi K, et al., 2006, Mol. Syst. Biol. 2006.0007 (doi:10.1038/msb4100049). E. coli W3110 soj je genetski modifikovan tako da se omogući proizvodnja svakog od obelodanjenih biokonjugata O-antigena E. coli (Tabela 3).
Sojevi za proizvodnju biokonjugata
[0274] Kompozicije „ExPEC4V“ i „ExPEC10V“ sadrže O2-EPA i O25B-EPA biokonjugate iz istih proizvodnih sojeva. Kompozicija „ExPEC4V“ sadrži biokonjugat O1A-EPA iz stGVXN4411 ili stLMTB10217 proizvodnih sojeva, dok kompozicija „ExPEC10V“ sadrži biokonjugat O1A-EPA iz proizvodnog soja stLMTB10217. Kompozicija „ExPEC4V“ sadrži biokonjugat O6A-EPA iz proizvodnog soja stGVKSN4112, dok kompozicija „ExPEC10V“ sadrži biokonjugat O6A-EPA iz proizvodnog soja stLMTB10923. Takođe, kompozicija „ExPEC10V“ sadrži O4-EPA (odnosno, (O4-Glc+)-EPA), O8-EPA, O15-EPA, O16-EPA, O18A-EPA i O75-EPA biokonjugate iz proizvodnih sojeva koji nisu korišćeni za „ExPEC4V“. Proizvodni sojevi se razlikuju prema plazmidima za ekspresiju EPA proteinskog nosača i/ili na osnovu oligosaharil-transferaze PglB, kao što je naznačeno u nastavku. U Tabeli 3 je dat pregled nekoliko proizvodnih sojeva.
Tabela 3: Pregled genetskog inženjeringa sojeva E. coli za proizvodnju biokonjugata O-antigena za kompozicije vakcina ExPEC4V i ExPEC10V
Genski klaster (rfb) biosinteze O-antigena
[0275] U svim sojevima za proizvodnju O-antigena E. coli, genski klaster za biosintezu (rfb) prirodnog O16::IS5-antigena E. coli W3110 zamenjen je odabranim klasterima specifičnim za biosintezu O-antigena sojeva E. coli odabranog serotipa, koji kodira serotip-specifične strukture O-antigena (videti Tabelu 1 za sve O-antigene strukture). Deset donorskih rfb klastera odabrano je ili potvrđeno analizom celog genoma krvnih izolata E. coli. Zamena W3110 O16::IS5 genskog rfb klastera, koji je defektan u pogledu biosintezi O-antigena, izvršena je jednokratnom homolognom rekombinacijom. U slučaju genskog rfb klastera O16 i O18A, DNK donora je rekombinovana preko bočnih gnd i rmlCA gena, dok se rfb genski klaster za druge sojeve rekombinovao preko bočnih gnd i galF gena. Sekvence rfb klastera u proizvodnim sojevima date su u SEQ ID NO: 9 i 11-19.
Gen za O-antigen ligazu (waaL)
[0276] Svi sojevi za proizvodnju O-antigena E. coli sadrže eksperimentalno uvedenu deleciju waaL gena koji kodira genomsku ligazu O-antigena u E. coli W3110 soju. U ΔwaaL sojevima poremećen je transfer O-antigena na lipid A, usled čega se prenos O-antigena usmerava na proteinski nosač, čime se povećava prinos proizvoda.
Geni glikozilacije O-antigena (gtrABS)
[0277] U poizvodnim E. coli sojevima O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 deletirani su genomski gtrABS geni E. coli W3110, odgovorni za glikozilaciju O16 O-antigena. Za razliku od gtrA i gtrB gena koji su kod različitih serotipova visoko homologi i međusobno zamenjivi, gtrS gen kodira serotip-specifičnu glikozil-transferazu O-antigena. U E. coli W3110 soju, GtrS može da izvrši prenos glukoze (Glc) u molekul GlcNAc šećera u α-L-Rha-(1→3)-DglcNAc motivu O16 O-antigena E. coli. U proizvodnim sojevima O1A, O2 i O6A E. coli nema delecije niti zamene gtrABS gena. Ovi O-antigeni nemaju α-L-Rha-(1→3)-D-GlcNAc motiv, koji je prirodni supstrat gtrS enzima O16 soja E. coli. U proizvodnom O4 E. coli W3110 soju, gtrS gen je zamenjen gtrS genom O4 E. coli, kako bi se uspostavila odgovarajuća glikozilacija O4 O-antigena E. coli.
PglB oligosaharil-transferaza
[0278] Svi sojevi za proizvodnju O-antigena E. coli eksprimirali su varijantu glikoziltransferaze PglB poreklom iz C. jejuni, koja može da prenese i veže N-glikozilacijom O-antigen za konsenzusnu aminokiselinsku sekvencu prisutnu u proteinskom nosaču. PgIB ima široku supstratnu specifičnost, ali je zbog niskog proizvodnog prinosa pripremljeno nekoliko proizvodnih sojeva koji eksprimiraju varijante PglB sa modifikovanim supstratnim specifičnostima, što je povećalo prinos proizvoda (videti na primer, WO 2016/107818, WO 2016/107819). pglB gen je integrisan u plazmid iza izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG)-inducibilnog promotera. Tabela 4 prikazuje varijante PgIB kodirane plazmidima u proizvodnim sojevima E. coli za proizvodnju biokonjugata O-antigena za ranije opisane kompozicije ExPEC4V i ExPEC10V. Drugi plazmidi sa varijacijama u vektorskoj osnovi, markeri rezistencije na antibiotike i/ili sa alternativnim PglB varijantama takođe su uspešno testirani u proizvodnji biokonjugata.
Tabela 4: PglB i EPA plazmidi primenjeni u proizvodnim sojevima O-antigena E. coli
Proteinski nosač (EPA)
[0279] Svi sojevi za proizvodnju O-antigena E. coli eksprimirali su, kao proteinski nosač za O-antigen, genetski detoksifikovani toksoid ADP-riboziltransferaze (EPA) poreklom iz P. Aeruginosa. EPA toksoid se razlikuje od EPA toksina neizrođenog tipa u dva aminokiselinska ostatka: ostatak Leu552 je promenjen u Val, dok je Glu553 (u katalitičkom domenu) deletiran. Pokazano je da delecija Glu553 značajno smanjuju toksičnost. Uz ovu mutaciju koja doprinosi detoksifikaciji, uvedena su četiri (EPA-4) konsenzusna motiva N-glikozilacije. Gen epa je postavljen iza L-arabinoza (Ara)-inducibilnog promotera u plazmidu (Tabela 4). Tabela 4 prikazuje samo plazmide u proizvodnim sojevima za biokonjugate korišćene za dobijanje „ExPEC4V“ i „ExPEC10V“ kompozicija. Plazmidi sa varijacijama u osnovi vektora, markerima rezistencije na antibiotike i/ili EPA varijantama, na primer, različitim brojem konsenzusnih motiva mesta N-glikozilacije (na primer, EPA-2 ima dva takva motiva), takođe su uspešno testirani u proizvodnji biokonjugata.
Primer 7: Optimizacija oligosaharil-transferaze u proizvodnji biokonjugata sa glikozilovanim O4 (O4-Glc+) antigenom
[0280] Optimizacija prinosa u proizvodnju biokonjugata može se postići modifikacijom PglB oligosaharil-transferaze poreklom iz C. jejuni, čime se povećava efikasnost ili stepen N-glikozilacije O-antigena od interesa za EPA proteinski nosač. U proizvodnom soju E. coli za proizvodnju biokonjugata sa glikozilovanim polisaharidom O4 (O4-Glc+) O-antigena, primenjena je takva strategija optimizacije koja je rezultirala je (O4-Glc+)-specifično optimizovanom PglB varijantom koja je povećala prinos biokonjugovanog proizvoda.
[0281] U ovom pristupu, proizvodni soj polisaharida O4-Glc+ O-antigena koji sadrži EPA-ekspresioni plazmid transformisan je različitim PgIB-ekspresionim plazmidima, od kojih je svaki sadržao različitu aminokiselinsku supstituciju u PgIB proteinu, što je izmenilo supstratnu specifičnost ovog enzima. Nivo proizvodnje biokonjugata i profil svakog soja procenjen je u uslovima osmotskog šoka in vitro, a merenje je izvršeno imunotestovima kapilarne elektroforeze periplazmatskih ekstrakata, primenom monoklonskih antitela specifičnih za O4-Glc+.
[0282] Utvrđeno je da jedna od testiranih varijanti PglB koja sadrži aminokiselinsku supstituciju N311V značajno povećava prinos glikozilovanih O4 biokonjugata (Slika 7A).
[0283] U narednim poboljšanjima, N311V PglB varijanta dodatno je modifikovana supstitucijom Y77H koja je povećala prinos specifičnog proizvoda O4-Glc+ i stepen di- i triglikozilovanih proizvoda u odnosu na N311V PglB varijantu, dok su druge modifikacije ostale bez efekta ili su imale negativan uticaj na prinos proizvoda (Slika 7B). Plazmid pLMTB4008 (SpR) kodira PgIB varijantu sa mutacijama Y77H i N311V, koja je optimizovana na korišćenje kodona E. coli i optimizovana na (O4-Glc+)-supstrat.
[0284] Utvrđeno je da varijanta PgIB sa optimizovanom supstratnom specifičnošću prema O4-Glc+ polisaharidu O-antigena, koja sadrži N311V i Y77H aminokiselinske supstitucije u odnosu na neizrođeni tip (vt) glikozil-transferaze PglB poreklom iz C. jejuni, udvostručuje prinos biokonjugata u poređenju sa PglB-N311V varijantom optimizovanom u prvom krugu optimizacije.
[0285] Sličnim pretraživanjem određene su optimalne varijante PgIB u proizvodnji biokonjugata O-antigena E. coli za preostalih devet serotipova u sastavu ExPEC10V.
[0286] Za biokonjugate koji sadrže polisaharide O1A, O6A ili O15 antigena, utvrđeno je da PgIB varijante sa aminokiselinskim mutacijama N311V, K482R, D483H i A669V daju najveće prinose.
[0287] Za biokonjugate polisaharida O2, O8, O18A ili O25B antigena, najveći prinos daje PglB neizrođenog tipa (odnosno, ona koja nema aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669).
[0288] Za biokonjugate koji imaju polisaharid O16 antigena, najveći prinos se postiže PgIB varijantom koji sadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V.
[0289] Za biokonjugate koji imaju polisaharid O75antigena, najveći prinos se postiže PgIB varijantom koji sadrži aminokiselinsku mutaciju N311V.
[0290] Iz ovih rezultata se može videti da je za svaki od O-antigena optimalna varijanta PgIB različita, te da se optimalna PglB varijanta za proizvodnju biokonjugata sa datim polisaharidom O-antigena ne može predvideti.
Primer 8: Biokonjugati O-antigena 10 serotipova E. coli i njihove kvalitativne odlike
[0291] O-glikani ciljnih O-antigena strukturno su raznoliki i imaju promenljive ponovke. Specifičnost i afinitet glikozil-transferaze PglB zavisi od strukture glikana. Stoga je proizvodnja biokonjugata sa željenim odlikama, na primer, prečišćenost glikan/proteinski odnos, itd, izazovan i neizvesan zadatak. Prinos zavisi od prave kombinacije PgIB i EPA proteinskog nosača, što utiče na efikasnost glikozilacije. Optimizacijom PglB i proteinskog nosača, proizvedeni su biokonjugati koji imaju željene kvalitativne karakteristike. Može biti od značaja održavanje donje granične vrednosti proteinskog nosača, posebno kada se više biokonjugati O-antigena kombinuju u jednu kompoziciju ili vakcinu, jer veoma velika količina proteinskog nosača može izazvati imunske smetnje. Da bi se to sprečilo, poželjni su konjugati sa višom vrednošću glikan/proteinskog odnosa. Dakle, za proizvodnju ExPEC10V vakcine, razvijeni su biokonjugati sa najmanjim uporedivim (u odnosu na prethodno opisanu ExPEC4V vakcinu koja je bila predmet kliničkih ispitivanja) odnosom glikozilacije.
[0292] Svaki od biokonjugata proizveden je kultivisanjem odgovarajućih ćelija-domaćina (Primer 6, Tabela 3) u bioreaktorima (10L i/ili 200L zapremine) i uz ekspresiju biokonjugata, primenom prethodno opisanih postupaka. Lekovite supstance proizvedene su bakterijskom fermentacijom sa serijskim napajanjem, kako bi se dobila biomasa koja eksprimira biokonjugate odgovarajućeg polisaharidnog serotipa. Ćelije su kultivisane i indukovane dodavanjem IPTG i arabinoze. Biokonjugati su izolovani iz periplazmatskog dela ćelija u bioreaktorskim kulturama, primenom osmotskog šoka, uz naknadno hromatografsko prečišćavanje. Ovaj proces je izveden posebno za svaki od 10 biokonjugata.
[0293] Ovako pripremljeni biokonjugati O-antigena E. coli kao polazne supstance (DS) za ExPEC10V i ExPEC4V imaju uporedive odlike kvaliteta: (1) proces rezultuje stepenom prečišćenosti (određeno postupkom RP-HPLC) većim od 95%, (2) vrednost polisaharid/proteinskog odnosa kretao se između 0.1-0.5, uglavnom između 0.15 i 0.45, (3) bakterijski endotoksin (Ph. Eur. 2.2.3) činio je manje od 0.5 EU/µg polisaharida. Prosečna dužina pojedinačnih polisaharidnih lanaca tipično je bila između oko 10-20 ponovaka (određeno SDS-PAGE elektroforezom visoke rezolucije).
[0294] Potvrđena je da strukture polisaharidnih ponovaka (primenom NMR i MS/MS konjugata, intaktnih ili tripsinom razgrađenih), odgovaraju formulama serotipova prikazanim u Tabeli 1, za svih deset biokonjugata koji su DS za ranije opisanu kompoziciju ExPEC10V.
[0295] Od deset serotipova koji su korišćeni u proizvodnji biokonjugata za kompoziciju ExPEC10V, serotip O18 dao je najniži prinos.
[0296] ExPEC10V lekoviti proizvod (DP) sadrži mešavinu od deset ranije opisanih monovalentnih DS.
Primer 9: Toksikologija ExPEC10V vakcine
[0297] Pilot studija toksičnosti ExPEC10V i lokalne tolerancije pojedinačne doze (ne-GLP) sprovedena je na ženkama novozelandskih (NZW) zečeva. Jedna grupa životinja (n=2) je (na dan 0) primila intramuskularnu (IM) injekciju kontrolnog rastvora (fiziološki rastvor), a druga grupa (n=4) je primila IM injekciju ExPEC10V kompozicije, u količini od 105,6 µg ukupnih polisaharida (PS)/dozi (9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 19.2: 9.6 µg PS po dozi, za odgovarajuće O-serotipove O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75), u ukupnoj doznoj zapremini od 0.6 mL (176 µg PS/mL). Nekropsija je obavljena nakon 2 dana.
[0298] Nije primećena smrtnost. Pored toga, kliničkim posmatranjem nisu zabeleženi efekti vezani za vakcinu (uključujući efekte na mestu injekcije primenom Draize-ovog bodovanja), u pogledu telesne težine, unosa hrane i telesne temperature. Histopatološki nisu uočene promene u vezi sa vakcinom na mestu primene ili u drenirajućem (ilijačne) limfnom čvoru. Minimalno povećanje germinalnog centra u slezini primećeno je kod jedne od četiri tretirane životinje (Dan 2), što je smatrano normalnim, imunološkim odgovorom na ubrizganu vakcinu. Ukupno gledano, administracija jedne IM doze ExPEC10V dobro je tolerisana kod ženki zečeva.
Primer 10: Imunogenost kombinovane formulacije ExPEC10V kod zečeva
[0299] Od ranije je poznato da je ExPEC4V vakcina (koja sadrži biokonjugate O1A, O2, O6A i O25B serotipova E. coli) imunogena za ova četiri serotipa kod pacova, zečeva i ljudi (videti na primer, WO 2015/124769; WO 2017/035181; Huttner et al, 2017, Lancet Infect Dis, http://dk.doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30108-1; RV Frenck Jr, et al, Abstract 5587, ASM Microbe 2018). Imunogenost novih biokonjugata prema pronalasku, koji sadrže glikozilovani O4 serotip E. coli, pokazana je u ranijim Primerima 4 i 5. Odvojena primena kod pacova (monovalentna kompozicija) potvrdila je imunogenost biokonjugata O8, O15, O16, O18A i O75 serotipova E. coli (od kojih svi imaju EPA-2 kao proteinski nosač u ovom eksperimentu), u ELISA testu kojim je pokazano da svaki od pomenutih biokonjugata može indukovati visok nivo antitela specifičnih za O-antigen E. coli (nije prikazano).
[0300] Takođe je testirana imunogenost 10-to valentne vakcine koja je sadržala mešavinu 10 biokonjugata, kao što je prethodno opisano. Novozelandski beli (NZW) zečevi (ženke, 12-16 nedelja starosti) primili su 3 intramuskularne injekcije ExPEC10V ili fiziološkog rastvora u razmaku od 2 nedelje između svake doze (Tabela 5; primena dana 0, 14 i 27). Svih 10 polisaharida koji su deo ExPEC10V vakcine korišćene u ovim eksperimentima, konjugovani su sa EPA proteinskim nosačem koji sadrži 4 mesta glikozilacije (EPA-4). Vakcina je formulisana u 3 doze: Grupa 1 („visoka doza“): 8 µg/dozi O1A, O2, O6A, O4, O8, O15, O16, O18 i O75 i 16 µg/dozi O25B; Grupa 2 („srednja doza“): 4 µg/dozi O2, O4, O8, O15, O16, O18 i O75, 8 µg/dozi O1A i O6A i 16 µg/dozi O25B; Grupa 3 („niska doza“): 0.4 µg/dozi O2, O4, O8, O15, O16, O18 i O75, 0.8 µg/dozi O1A i O6A i 1.6 µg/dozi O25B. Životinje iz kontrolne grupe (Grupa 4) dobile su samo fiziološki rastvor (0.9% tež./zapr. natrijum hlorid) (Tabela 5).
[0301] Nivo indukovanih antitela procenjen je na dan 0 (pre imunizacije) i 14, 27 i 42 dana posle imunizacije. Serumski nivo antitela izazvan svakim od biokonjugata uključenih u vakcinu i EPA proteinskog nosača izmereni su ELISA testom (ukupni IgG), uz korišćenje tipno-specifičnog LPS kao materijala za oblaganje. Titri antitela iskazani su kao EC50 vrednosti, koje odgovaraju polovini maksimalne efektivne koncentracije, koja je određena 12-to stepenom krivom titracije u duplikatu, fitovanom 4-parametrijskim logističkim modelom nelinerane regresije. Funkcionalna aktivnost je određena na osnovu OPK.
Tabela 5. Opis eksperimentalnih grupa
[0302] Rezultati su prikazani na Slici 8 i sažeto u Tabeli 6.
Tabela 6. Sažetak odgovora specifičnih antitela na O-antigene E. coli indukovanih ExPEC10V vakcinom kod NZW zečeva
Tamno-sivi kvadrati prikazuju serotip-specifične odgovore antitela u kojima su p vrednosti statistički značajne. Svetlo-sivi kvadrati prikazuju serotip-specifične odgovore antitela u kojima p vrednosti nisu statistički značajne (ns). Wilcoxon-Rank test zbirova sa Bonferroni korekcijom za višestruka poređenja. Poređenja ExPEC10V vakcinisanih životinja (grupe 1, 2 i 3) u odnosu na fiziološku kontrolu (grupa 4). *p<0.05, **p≤0.01.<#>P vrednosti su bile statistički značajne nakon izbacivanja odudarajućih merenja iz grupe kontrolnih životinja (analiza osetljivosti).
[0303] Visoka doza ExPEC10V (Grupa 1) izazvala je značajno veći nivo IgG antitela u svim ispitivanim vremenskim tačkama (14, 27 i 42 dana nakon imunizacije) u odnosu na kontrole za O1A, O2, O4, O6A, O16, O18A i O25B (Slika 8, Tabela 6). Značajno veći titar antitela izazvan je konjugatima O8 i O75 u poređenju sa kontrolom, 27 i 42 dana nakon imunizacije (Slika 8, Tabela 6).
[0304] Srednja doza ExPEC10V (Grupa 2) i niska doza (Grupa 3) izazvale su značajno veće nivoe antitela u svim ispitivanim vremenskim tačkama (14, 27 i 42 dana nakon imunizacije), u poređenju sa kontrolom fiziološkog rastvora za O1A, O2, O4, O6A, O16 i O25B (Slika 8, Tabela 6). Primećeni su značajno veći titri antitela izazvani O8, O18A i O75 konjugatima u poređenju sa kontrolom fiziološkog rastvora 27 i 42 dana nakon imunizacije, što sugeriše da pojačana doza kod zečeva povećava odgovor na ove O-serotipove (Slika 8, Tabela 6).
[0305] Za konjugate O15-antigena, analiza osetljivosti uz izostavljanje odudarajućih životinja iz kontrolne grupe pokazala je da su sve tri doze ExPEC10V vakcine izazvale značajno povećanje nivoa antitela u poređenju sa kontrolom fiziološkog rastvora, u vremenskim tačkama 14, 27 i 42 nakon imunizacije (Slika 8, Tabela 6).
[0306] Nivo antitela indukovan EPA proteinskim nosačem bio je značajno veći od titara EPA antitela izazvan fiziološkim rastvorom (kontrolan) u sve tri testirane doze ExPEC10V (visoka, srednja i niska) i u svim ispitivanim vremenskim tačkama (14, 27 i 42 dana nakon imunizacije) (Slika 8).
[0307] Poređenje između doza (podaci nisu prikazani) pokazalo je da je 14 dana nakon vakcinacije, visoka doza ExPEC10V izazvala značajno veći odgovor antitela u poređenju sa niskom dozom za većinu testiranih konjugata (O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A i O25B). Srednja doza ExPEC10V takođe je izazvala značajno veći nivo antitela u poređenju sa niskom dozom za O1A, O2, O4, O18A, O25B i O75. Za O8 konjugat, sve tri formulacije ExPEC10V indukovale su sličan nivo antitela 14 dana nakon vakcinacije.
[0308] Niska doza ExPEC10V izazvala je značajno povećanje nivoa antitela 42 dana nakon vakcinacije (nakon prve i dve pojačavajuće doze), u poređenju sa visokim i srednjim dozama ExPEC10V za O1A, O2, O4, O16, O25B i O75 konjugate. Ovi nalazi saglasni su drugim iskustvima sa konjugovanim vakcinama, kod kojih, na primer, nije primećena postojanje odnosa između doze i magnitude odgovora antitela na primarnu vakcinaciju kod novorođenčadi vakcinisanih pneumokoknom konjugovanom vakcinom (Poolman JT, et al. Expert Rev Vaccines. 2013, 12(12):1379-94.)
[0309] Nije bilo značajnih razlika između tri doze ExPEC10V kada je testiranje izvršeno 42 dana nakon vakcinacije za O6A, O8 i O15 konjugate. Za konjugat O18A, visoka doza ExPEC10V izazvala je značajno veći odgovor antitela u poređenju sa srednjom dozom 42 dana nakon vakcinacije.
[0310] Za proteinski nosač (EPA), visoka i srednja doza ExPEC10V indukovala je značajno veće nivoe antitela u poređenju sa niskom dozom, 14 dana nakon vakcinacije. Visoka doza vakcine takođe je izazvala značajno veći odgovor antitela u poređenju sa niskom dozom, 42 dana nakon vakcinacije.
[0311] U zaključku, tri formulacije ExPEC10V vakcine (visoka, srednja i niska), primenjene u vidu intramuskularne injekcije 0, 14 i 27. dana ispoljile su imunogeno dejstvo kod zeca.
[0312] Funkcionalna antitela izazvana vakcinom kod zečeva sposobna da ubiju sojeve E. coli za sada su pokazana za serotipove O1A, O2, O4, O6A, O15, O16 i O25B.
[0313] U daljem eksperimentu, kao deo toksikološke studije proizvedena je GMP serija ExPEC10V vakcine (vidi raniji Primer 8 iznad za proizvodnju) i ubrizgana je NZW zečevima (Tabela 7). U ovoj studiji, NZW zečevi (mužjaci i ženke) primili su 3 intramuskularne injekcije (0.6 mL) ExPEC10V vakcine (1, 15 i 29 dana), dok je kontrolna grupa primila 0.9% (tež./zapr.) rastvor natrijum hlorida (fiziološki rastvor). Svaka doza vakcine sadržala je 9.6 µg polisaharida (PS) za serotipove O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 i 19.2 µg PS za serotipove O25B, što odgovara količini od 105,6 µg ukupnog PS (176 µg ukupnog PS/mL), odnosno, 382.8 µg ukupnog EPA (638 µg EPA/mL). Titar IgG antitela na O-antigene i proteinski nosač (EPA) određen je iz uzoraka prikupljenih tokom perioda pre tretmana (1. dan), kao i 31. dana i 50. dana posle imunizacije.
[0314] Primećeno je značajno povećanje nivoa antitela na sve O-antigene i EPA proteinski nosač, 31 i 50 dana nakon vakcinacije u grupi koja je primila ExPEC10V u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primila fiziološki rastvor (Slika 9, Tabela 8). Za O1A serotip, takođe je primećen značajno veći odgovor antitela na dan 1 (bazalni odgovor) kada se vakcinisane životinje uporede sa kontrolama. Ovi rezultati sugerišu da su neke životinje prethodno bile izloženi E. coli ili poseduju antitela koja unakrsno reaguju sa O1A-LPS.
Tabela 7. Eksperimentalne grupe i doze ExPEC10V korišćene kod NZW zečeva
Tabela 8. Imunogenost ExPEC10V kod NZW ZEČEVA, kao deo toksikološke studije
Odgovori antitela indukovani pomoću ExPEC10V. Svetlo sivi pravougaonici prikazuju serotipove kod kojih je zapaženo značajno povećanje odgovora antitela u vakcinalnoj grupi u odnosu na kontrolnu. Tobitov model sa testom verovatnoće. ****P ≤ 0.0001.
Primer 11: Faza 1/2a kliničkih ispitivanja ExPEC10V vakcine na ljudima
[0315] U ovom trenutku ne postoji vakcina koja bi sprečila IED. Serotipovi sadržani u ExPEC10V vakcini (O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75) odabrani su kako bi se pokrila invazivna bolest uzrokovana klinički relevantnim ExPEC sojevima koji čine većinu ExPEC izolata izazivača antimikrobno rezistentnih IED, uključujući ST131. Odabrani serotipovi su reprezentativni za deset preovlađujućih ExPEC O-serotipova izazivača krvnih infekcije kod starije populacije i odgovorni su za približno 70% krvnih infekcija izazvanih ExPEC sojevima.
[0316] S obzirom na to da se ne očekuje da mehanizam delovanja konjugovanih vakcina u prevenciji invazivnih bolesti zavisi od otpornosti na antibiotike, smatra se da ExPEC10V vakcina može da pruži zaštitu od IED uzrokovane O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 serotipovima, kako otpornim, tako i podložnim na dejstvo lekova.
[0317] Kada je reč o ExPEC4V vakcini, postoji kliničko iskustvo sa prethodnim kandidatom za vakcinu koja obuhvata grupu od četiri konjugata O-antigena E. coli (O1A, O2, O6A i O25B) u sastavu ExPEC10V. Na osnovu rezultata četiri kliničke studije (dve završene faze 1, jedna završena faza 2 i faze 2 koja je u toku), zaključuje se da učesnici studije dobro tolerišu ExPEC4V, a nisu primećeni bezbednosni signali vezani za vakcinu pri dozama do 16 µg polisaharida (PS) po serotipu (O1A, O2, O6A i O25B). Većina neželjenih događaja (AE) svrstava se u stepen 1 i 2, dok je prijavljeno veoma malo neželjenih događaja stepena 3. Primećeni su lokalni neželjeni efekti sa kasnim početkom (AE koji počinju pet dana nakon vakcinacije), i uglavnom pri višim dozama ExPEC4V. Svaka od studija je pokazala da je ExPEC4V vakcina imunogena, da izaziva dozno-zavisni imunski odgovor, i O-antigenspecifično povećanje titra imunoglobulina G, mereno enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA). Funkcionalna aktivnost antitela je dokazana ExPEC4V-optimizovanim opsonofagocitnim testom ubijanja (OPKA). Ko-analiza ELISA i OPKA testa pokazala je korelaciju između indukcije antitela (Pirsonov koeficijent korelacije ≥ 0.61 i ≥ 0.48 za 30. i 360. dan, u fazi 2 kliničkog ispitivanja [studija 4V-BAC2001]), podupirući upotrebu ELISA testa kao primarne mere nivoa ExPEC4V antitela i u predviđanju funkcionalne aktivnosti antitela. Analiza podataka imunogenosti ukazala je na trajnost imunskog odgovora u periodu od tri godine nakon vakcinacije ExPEC4V vakcinom. Primećeno je da serumi ljudi vakcinisanih ExPEC4V i sa razvijenim visokim titrom serotip-specifičnih opsonofagocitnih antitela, kada se pasivno prenesu u miševe koji su naknadno intraperitonealno imunizovani sojevima E. coli serotipa O25B ili O2, bili u stanju da pruže zaštitu in vivo (nije prikazano). Dakle, humana ExPEC4V-specifična opsonofagocitna antitela posreduju u ubijanju bakterijskih ćelija in vivo, što je u skladu sa drugim konjugatnim vakcinama, kod kojih je predloženi mehanizam delovanja indukcija opsonofagocitnih antitela koji posreduju u ubijanju bakterija.
[0318] ExPEC10V uključuje ukupno deset serotipova i povećava pokrivenost serotipova od oko 50% (ExPEC4V) na približno 70% krvnih infekcija izazvanih ExPEC kod odraslih osoba starijih od 60 godina. Na osnovu kliničkog iskustva sa ExPEC4V, i na osnovu prekliničkih podataka za ExPEC10V, kao što je objašnjeno u prethodnim primerima, očekuje se da primena ExPEC10V izaziva imunski odgovor na serotipove E. coli O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 kod ljudi.
[0319] Randomizovana, slepa studija faze 1/2a, prva kod ljudi, za procenu bezbednosti, reaktogenosti i imunogenosti tri doze ExPEC10V vakcine sprovedena je kod učesnika starosti od 60 do 85 godina sa stabilnim zdravstvenim stanjem (studija 10V-BAC1001). Dizajn studije uključuje 2 kohorte: Ukupno 1.004 učesnika je upisano u studiju, koju čini 404 učesnika (100 učesnika/ExPEC10V dozi) starosti ≥ 60 do ≤ 85 godina, stabilnog zdravlja u kohorti 1 i dodatnih 600 učesnika starosti ≥ 60 godina, stabilnog zdravlja sa istorijom UTI u poslednjih 5 godina u kohorti 2.
[0320] ExPEC10V vakcina je kandidat za 10-valentnu vakcinu u razvoju za prevenciju bolesti izazvanih invazivnim ekstraintestinalnim patogenom Escherichia coli (ExPEC) (IED) kod ljudi starijih od 60 godina. ExPEC10V se sastoji od polisaharidi O-antigena (PS) ExPEC serotipova O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 koji su nezavisno biokonjugovani sa proteinskim nosačem, koji je genetski detoksifikovani egzotoksin A (EPA) poreklom od Pseudomonas aeruginosa, čija je proizvodnja prethodno opisana. Polisaharid O4 PS je u glikozilovanom obliku i ima strukturnu formulu (O4-Glc+) u Tabeli 1.
CILJEVI I ISHODI
[0321] KOHORTA 1 - Faza 1/2a jednostruko slepog istraživanja sa otvorenim dugoročnim periodom praćenja (N=404):
[0322] KOHORTA 2 – Dvostruko-slepi period sa dvostruko slepim dugoročnim periodom praćenja (N=600):
CELOKUPAN DIZAJN
[0323] Ovo je randomizovana, multicentrična, interventna studija koja uključuje dve kohorte.
[0324] Za kohortu 1, studija je dizajnirana kao jednostruko slepa i aktivno kontrolisana, sa ukupno 404 učesnika starosti od ≥ 60 do ≤ 85 godina, stabilnog zdravlja sa ili bez istorije UTI. Dizajn studije za kohortu 1 obuhvata tri perioda: maksimalno 28-dnevni period skrininga, jednostruko slep period praćenja do 181 dana i otvoreni dugoroćni period praćenja od 182. dana do isteka 3 godine (1096. dan) nakon vakcinacije (Slika 10A). Samo učesnici iz grupe koja prima odabranu dozu ExPEC10V (približno 100 učesnika) i učesnici iz Prevnar 13 grupe prelaze u treći LTFU period ispitivanja. Završetak kohorte 1 je poslednja poseta učesnika u 3. godini (1096. dan).
[0325] U kohorti 2, dizajn studije je dvostruko slepa, placebo kontrolisana studija, sa ukupno 600 učesnika starosti ≥ 60 godina, stabilnog zdravlja sa istorijom UTI u poslednjih 5 godina. Odabir učesnika počinje nakon završetka primarne analize faze 1/2a i odabira doze ExPEC10V iz kohorte 1. Dizajn studije za kohortu 2 obuhvata tri perioda: najduže 28-dnevni period skrininga, dvostruko slepi period praćenja u trajanju od 181 dana sa vakcinacijom prvog dana i dvostruko slepim LTFU periodom, u trajanju od 182. dana do isteka 3 godine nakon vakcinacije (1096. dan) (Sl. 10B). Svi učesnici iz kohorti 2 prelaze u LTFU period. Kraj studije u kohorti 2 je poslednja poseta učesnika u 3. godini (1096. dan).
Kohorta 1: Faza 1
[0326] U fazi 1 kohorte 1, postepenim odabirom je uključeno ukupno 84 učesnika u protokol postepenog povećanja doze, uz prethodnu procenu bezbednosti, pre prelaženja na sledeći korak. Formiran je interni Komitet za pregled podataka (DRC), čije je zaduženje bilo da pregleda nalaze lekarskog pregleda (osnovni kao i ciljane), osnovne demografske podatke i 14-dnevne podatke o bezbednosti nakon vakcinacije (uključujući tražene lokalne i sistemske AE, netražene neželjene reakcije, SAE, kliničke laboratorijske podatke i vitalne znake) ovih 84 učesnika Faze 1. U ovoj fazi studije, odabir i randomizacija su obavljeni u šest koraka:
Korak 1: Odabrana su i randomizovana četiri sentinel učesnika; dva učesnika u grupi sa niskim dozama ExPEC10V (Tabela 11), i po jedan učesnik u grupama ExPEC4V i Prevnar 13.
Korak 2: Odabrana su i randomizovana dvadesetčetiri učesnika; 18 učesnika u grupi sa niskim dozama ExPEC10V (Tabela 11), i po tri učesnika u grupama ExPEC4V i Prevnar 13.
Korak 3: Odabrana su i randomizovana četiri sentinel; dva učesnika u srednjoj dozi ExPEC10V grupa (Tabela 11), i po jedan učesnik u grupama ExPEC4V i Prevnar 13. Korak 4: Odabrana su i randomizovana dvadeset četiri učesnika; 18 učesnika u srednjoj dozi ExPEC10V grupa (Tabela 11), i po tri učesnika u grupama EkPEC4V i Prevnar 13. Korak 5: Odabrana su i randomizovana četiri sentinel učesnika; dva učesnika u grupi sa visokim dozama ExPEC10V (Tabela 11), i po jedan učesnik u grupama ExPEC4V i Prevnar 13.
Korak 6: Odabrana su i randomizovana dvadeset četiri učesnika; 18 učesnika u grupi sa visokim dozama ExPEC10V (Tabela 11), i po tri učesnika u grupama ExPEC4V i Prevnar 13.
[0327] Svi učesnici su primili jednu intramuskularnu (IM) injekciju, bilo ExPEC10V (prva od 3 doze), ExPEC4V ili Prevnar 13 na dan 1, prema dodeljenim grupama vakcinacije. Četiri sentinel učesnika u koracima 1, 3 i 5 kontaktirano je telefonom 24 sata nakon vakcinacije radi prikupljanja informacija o bezbednosti. Slepe 24-časovne post-vakcinalne podatke o bezbednosnosti u svakoj grupi od četiri učesnika pregledao je glavni istraživač (PI), odgovorni lekar (SRP) i medicinski nadzor sponzora (SML). Randomizacija dodatnih učesnika za naredni korak zaustavljen je do završetka bezbednosne procene sentinel učesnika drugod dana.
[0328] U odsustvu klinički značajnih nalaza, odabrana su i randomizovana dodatna 24 učesnika (za korake 2, 4 i 6) u jednu od tri grupe za vakcinaciju (Tabela 11), kako bi primili jednu IM injekciju ExPEC10V (1 od 3 doze), ExPEC4V ili Prevnar 13 prvog dana.
[0329] Nakon što su vakcinisana dodatna 24 učesnika za svaku od tri doze (niska doza u koraku 2, srednja doza u koraku 4, i visoka doza u koraku 6), podatke 14-dnevnog nadzora bezbednosti vakcine svih 28 (4+24) učesnika za sva tri nivoa doze pregledao je DRC, pre nego što se prešlo na sledeću dozu ili Fazu 2a.
Kohorta 1: Faza 2a
[0330] Na osnovu prihvatljive procene o bezbednosti i reaktogenosti (u odsustvu bezbednosnih problema i događaja koji bi uslovili prekid studije) koju je načinio DRC na osnovu pregleda podataka o bezbednosti vakcine 14 dana nakon vakcinacije za početnu grupu od 84 učesnika, preostalih 320 učesnika iz kohorte 1 su randomizovani i dozirani u fazi 2a studije. Dodatnih 320 učesnika su paralelno odabrani i randomizovani, u odnosu 2:2:2:1:1 u jednu od pet grupa za vakcinaciju, kako bi primili jednu IM injekciju ExPEC10V (1 od 3 doze), ExPEC4V ili Prevnar 13 prvog dana (Tabela 11). Osim obavljanja 14-dnevnog izveštaja o bezbednosti za prvu grupu od 84 učesnika, DRC takođe procenjuje podatke o bezbednosti za Kohortu 1 tokom studije i procenjuje sve događaje koji ispunjavaju neko specifično pravilo koje se odnosi na pauziranja istraživanja vakcinacije ili bilo koje drugi sigurnosni problem koji se može pojaviti.
[0331] Za kohortu 1, primarna analiza se obavlja nakon što su svi učesnici obavili posetu predviđenu za 30. dan nakon vakcinacije (poseta 4) ili su ranije izašli iz istraživanja. Konačna analiza se obavlja nakon što su svi učesnici obavili posetu lekaru 181. dana nakon vakcinacije, ili ranije za one koji su prekinuli studiju. Za učesnike koji će preći u otvoreni period dugotrajnog praćenja (LTFU) (za izabranu dozu ExPEC10V i Prevnar 13 grupu), godišnje analize uključuju podatke o bezbednosti i imunogenosti (višestruki ECL- imunotest i MOPA) prikupljene do trenutka posete u godini 1 (dan 366), godini 2 (dan 731) i 3. godina (1096. dan) nakon vakcinacije.
Kohorta 2
[0332] U kohorti 2, bezbednost, reaktogenost i imunogenost izabrane doze ExPEC10V (na osnovu rezultati primarne analize kohorte 1) procenjuju se kod učesnika starosti ≥ 60 godina, stabilnog zdravlja sa istorijom UTI u poslednjih 5 godina. Za kohortu 2, studija ima dizajn dvostruko slepe, placebo kontrolisane studije, u kojoj je paralelno odabrano i randomizovano 600 učesnika u odnosu 2:1 (400 učesnika u ExPEC10V grupi i 200 u placebo grupi).
[0333] Svi učesnici primaju jednu IM injekciju odabrane doze ExPEC10V ili placebo, prvog dana na prema studijskoj grupi u koju se randomizovani (Tabela 11).
[0334] Za kohortu 2, primarna analiza, koja uključuje podatke o bezbednosti i imunogenosti, obaviće se nakon što su svi učesnici završili posetu 30. dana nakon vakcinacije (poseta 4) ili su ranije prekinuli istraživanje. Konačna analiza se obavlja nakon što su svi učesnici završili posetu 181. dana ili su ranije prekinuli istraživanje. Za sve učesnike, godišnje prateće analize uključuju podatke o bezbednosti i imunogenosti (višestruki ECL-imunotest i MOPA), prikupljene do trenutka posete u godini 1 (366. dan), godini 2 (731. dan) i godini 3 (1096. dan) nakon vakcinacije.
[0335] Analiza uzorka stolice obaviće se u odabranoj podgrupi učesnika, kako bi se procenio efekat ExPEC10V na rasprostranjenost patogena (na primer, Clostridium difficile) i ExPEC10V serotipova u crevnoj flori korišćenjem metagenomike.
BROJ UČESNIKA
[0336] Ukupno je upisano 1004 učesnika studije; 404 učesnika u kohorti 1 i 600 učesnika u kohorti 2.
INTERVENTNE GRUPE
Opis intervencija
[0337] ExPEC10V: biokonjugatna vakcina E. coli u fosfatnom puferu, koja sadrži serotipove O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i 075 PS O-antigena ExPEC, zasebno biokonjugovane sa EPA proteinskim nosačem. Pojedinačna IM (deltoidna) injekcija jedne od tri doze ExPEC10V, zapremine 0.5 mL prvog dana.
[0338] ExPEC4V: biokonjugatna vakcina E. coli u fiziološkom rastvoru, koja sadrži O1A, O2, O6A, O25B serotipove PS O-antigena ExPEC (4:4:4:8 µg PS/ExPEC serotipova), zasebno biokonjugovane sa EPA proteinskim nosačem. Pojedinačna IM (deltoidna) injekcija ExPEC4V, zapremine 0.5 mL prvog dana.
[0339] Prevnar 13: Sterilna suspenzija saharida kapsularnih antigena serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F i 23F Streptococcus pneumoniae, pojedinačno konjugovanim sa netoksičnim proteinom difterije CRM197. Jedna IM (deltoidna) injekcija zapremine 0.5 mL, prvog dana, administrirana u špricu za jednokratnu primenu.
[0340] Placebo: normalni fiziološki rastvor. Jedna IM (deltoidna) injekcija placeba u zapremini od 0.5 mL prvog dana.
[0341] Materijal interventne studije ExPEC opisan je u Tabeli 9.
ne kci vaC PE
Ex eanj živ
istra V
01M 10 C A
B
9.ela ab T
[0342] ExPEC10V vakcina se sastoji od 10 monovalentnih supstanci (DS). Za potrebe ove kliničke studije, proizvedene su dve koncentracije (srednja i visoka) lekovitog proizvoda (DP) (Tabela 10). Treća (niska) koncentracija je dobijena u klinici, razblaživanjem visoke koncentracije vakcine u puferu za razblaživanje, koji je isti kao pufer za formulaciju, u odnosu 1:1. Svaki DP je formulisan u natrijum/kalijum fosfatnom puferu na pH 7.0 (0.02% [tež./tež.] polisorbat 80, 5% [ tež./tež.] sorbitol, 10 mM metionin).
Tabela 10: Sastav ExPEC10V vakcine za kliničku studiju faze 1/2a Sastojak Količina (µg/mL)<a>
Aktivni<a>Niska Srednja Visoka koncentracija<b>koncentracija koncentracija Polisaharid O-antigena
EcoO1A 8 16 16 EcoO2 8 8 16 EcoO4 8 8 16 EcoO6A 8 16 16 EcoO8 8 8 16 EcoO15 8 8 16 EcoO16 8 8 16 EcoO18A 8 8 16 EcoO25B 16 32 32 EcoO75B 8 8 16 Protein-nosač
EPA 320 441 640
Eksipijensi
KH2PO46.19 mM
Na2HPO43.81 mM
Sorbitol 5% (tež./tež.)
Metionin 10 mM
Polisorbat 80 0.02% (tež./tež.)
EPA=genetski detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz P. aeruginosa, korišćen kao proteinski nosač.
<a>Aktivni sastojak je biološki sintetisani konjugat koji se sastoji od PS antigena i proteinskog nosača (EPA); doza je preračunata prema sadržaju PS.
<b>„Niska koncentracija“ je dobijena u klinici, razblaživanjem „visoke koncentracije“ puferom za razblaživanje, u odnosu 1:1.
PROCENA BEZBEDNOSTI
[0343] Ključne stavke procene bezbednosti obuhvataju tražene lokalne i sistemske AE, netražene AE, SAE, fizikalni pregled, merenja vitalnih znaka i klinička laboratorijska ispitivanja.
EVALUACIJE IMUNOGENOSTI
[0344] Ključne procene imunogenosti sakupljenih seruma uključuju procenu ExPEC10V i ExPEC4V serotip-specifičnih nivoa ukupnih IgG antitela izazvanih vakcinom i izmerenih višestrukim ECL-imunotestom, i određivanjem nivoa serotip-specifičnih ExPEC10V i ExPEC4V funkcionalnih antitela, izmerenih opsonofagocitnim testom ćelijske smrti (OPKA) u multipleks formatu (MOPA). Procene imunogenosti titara pneumokoknih antitela indukovanih Prevnar 13 vakcinom nisu izvedene.
[0345] Nivoi serumskih antitela indukovanih ExPEC10V mere se primenom multipleks elektrohemiluminiscentnog (ECL)-imunotesta. Ovaj test kombinuje visokovezujuće ugljenične elektrode u mikrotitar ploči sa 96 bunarića, obložene različitim antigenima O-LPS E. coli ili proteinskim nosačem EPA. Nivoi antigen-specifičnih antitela u uzorcima seruma detektuju se pomoću sekundarnog antitela (anti-humani IgG), obeleženih SULFO-TAG-om. Obeleživač SULFO-TAG emituje svetlost u prisustvu električne stimulacije, čiji se intenzitet povećava proporcionalno količini vezanih IgG antitela. Ovaj test je sertifikovan prema preporukama Međunarodne konferencije o harmonizaciji (International Conference on Harmonization, ICH).
[0346] Nivoi funkcionalnih antitela indukovanih ExPEC10V vakcinom mere se primenom višestrukog opsonofagocitnog testa (MOPA). Ukratko, toplotno inaktivirani uzorci seruma se serijski razblažuju i inkubiraju sa različitim sojevima E. coli koji su naročito otporni na više vrsta antibiotika. Nakon toga se u reakcionu smešu dodaju humani komplement i fagocitne ćelije (HL60) i, nakon drugog perioda inkubacije, alikvot reakcione smeše se prenosi na ploče sa membranskim filterima od hidrofilnog PVDF-a,koje sadrže medijum dopunjen specifičnim antibiotikom koji dozvoljava selektivan rast soja koji je otporan na taj specifični antibiotik. Nakon kultivisanja preko noći, broje se jedinice koje formiraju kolonije (CFU), kako bi se odredio broj preživelih bakterija. Ovaj test je sertifikovan prema ICH preporukama.
[0347] Za ExPEC10V serotipska antitela koja su merena višestrukim ECL-imunotestom i MOPA, i EPA izmerenih samo višestrukim ECL-imunotestom, procenjeni su sledeći aspekti imunogensti i tabelarno su predstavljeni po ispitivanim grupama vakcinacije, za sve vremenske tačke:
- procenat učesnika sa ≥ 2 puta i ≥ 4 puta povećanim titrom antitela u serumu u od dana 1 (pre vakcinacije)
- geometrijska srednja vrednost titra (GMT)
- GMR, stepen multiplikacije u odnosu na osnovnu vrednost, izračunat kao odnos vrednosti nakon vakcinacije i osnovne vrednosti.
Za LTFU period, obezbeđeni su opisni sažeci imunogenosti svakog serotipa.
[0348] Za odabir doze koja će biti primenjena u kasnijim fazama uzimaju se u obzir svi dokazi dostupni u vreme obavlajnja primarne analize u kohortu 1 (rezultati prikupljeni do 30. dana).
Tabela 11: Kohorta 2: Raspored vakcinacije
Vakcinalna studijska grupa Vakcinacija na dan 1 Ukupno
G6 EcPEC10V<a>400
G7 Placebo 200
Ukupno 600
<a>ExPEC10V sadrži polisaharide O-antigena (PS) serotipova O1A, 02, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B i O75 O-antigen ExPEC, koji su individualno biokonjugovani sa proteinskim nosačem, odnosno, genetski detoksifikovanim oblikom egzotoksina A (EPA) poreklom iz Pseudomonas aeruginosa.
[0349] Odnos broja randomiziranih učesnika odabranih u kohortu 2 istraživanja bio je 2:1 (ExPEC10V:Placebo). Doza ExPEC10V je doza koja se testira u kohorti 2, a zasniva se na rezultatima primarne analize (30. dan) u kohorti 1.
STATUS
[0350] Kompletiran je odabir i vakcinacija kohorte 1 ove studije. Slepa studija je u toku. Na osnovu do sada postojećih podataka o bezbednosti, nisu uočeni značajni bezbednosni problemi, pa ExPEC10V vakcina ima prihvatljiv bezbednosni profil.
[0351] U toku je slepa analiza imunogenosti kliničkih uzoraka u Kohorti 1. ECL podaci su u 100% granicama limita prihvatljivosti kvaliteta (AQL), provereni su i otpremljeni za dalje upravljanje podacima. U toku je MOPA analiza uzoraka. Obelodanjivanje podataka i statistička obrada odvijaju se u organizaciji za klinička istraživanja (CRO).
[0352] Vakcinacija u kohorti 2 započela je nakon što je određena doza ExPEC10V za tu kohortu, na osnovu završenih primarnih analiza rezultata u kohorti 1, nakon 30. dana.
SEKVENCE
[0353]
SEQ ID NO: 1 (Konsenzusna sekvenca glikozilacije)
Asn-X-Ser(Thr), gde X može da bude bilo koja aminokiselina osim Pro
SEQ ID NO: 2 (Optimizovana konsenzusna sekvenca glikozilacije)
Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), gde su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje aminokiseline osim Pro
SEQ ID NO: 3 (proteinski nosač EPA koji sadrži 4 konsenzusne sekvence glikozilacije (EPA-4))
SEQ ID NO: 4 (aminokiselinska sekvenca GtrS O4)
SEQ ID NO: 5 (Primer sekvence nukleinske kiseline gtrS O4)
SEQ ID NO: 6 (Primer sekvence PglB (’neizrođeni tip’))
SEQ ID NO: 7 (primer aminokiselinske sekvence gtrA; E. coli W3110 yfdG, GenBank: BAA16209.1)
SEQ ID NO: 8 (primer aminokiselinske sekvence gtrB -E. coli W3110 yfdH, GenBank: BAA16210.1)
SEQ ID NO: 9 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O4 - proizvodni soj O4-EPA BVEC-L-00684f)
SEQ ID NO: 10 (primer signalne sekvence proteina-nosača EPA) MKKIWLALAG LVLAFSASA SEQ ID NO: 11 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O1A - proizvodni soj O1A-EPA stGVXN4411 i stLMTB10217)
SEQ ID NO: 12 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O2 - proizvodni soj O2-EPA stGVXN4906)
SEQ ID NO: 13 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O6A - proizvodni soj O6A-EPA stGVXN4112 i stLMTB10923)
SEQ ID NO: 14 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O8 - proizvodni soj O8-EPA stLMTB11734)
SEQ ID NO: 15 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O15 - proizvodni soj O15-EPA stLMTB11738)
SEQ ID NO: 16 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O16 - proizvodni soj O16-EPA stLMTB11739)
SEQ ID NO: 17 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O18A - proizvodni soj O18A-EPA BVEC-L-00559)
SEQ ID NO: 18 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O25B - proizvodni soj O25B-EPA stGVXN4459)
SEQ ID NO: 19 (primer nukleotidne sekvence lokusa rfb O75 - proizvodni soj O75-EPA stLMTB11737)

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak za pripremu biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, gde postupak sadrži: (i) obezbeđivanje rekombinantne prokariotske ćelije-domaćina koja sadrži: a. nukleotidnu sekvencu genskog klastera rfb za polisaharid Ox-antigena; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač, koji sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije, koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asn-X-Ser(Thr), u kojoj je X bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 1), poželjno konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), u kojoj su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 2); i c. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy; i (ii) kultivisanje rekombinantne prokariotske ćelije-domaćina pod uslovima za proizvodnju biokonjugata, gde: kada je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V; kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V, a rekombinantna ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira glukoziltransferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i sposobna je da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glikozilovani polisaharid O4 antigena E. coli, i nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB, koje imaju najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol i glikoziltransferaza je sposobna da glikoziluje baktoprenol; kada je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V; kada je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; kada je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V; kada je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V; kada je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; i kada je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V, gde se u svim navedenim slučajevima aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, i gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 antigena imaju sledeće strukturne formule (O1A):
    (O8): α-D-Manp3Me-(1→[3)-β-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→]n (O15) [→2)-β-D-Galp-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n
    odnosno,
    i svako n je nezavisno ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, npr., 5 do 40, npr., 7 do 25, npr., 10 do 20.
  2. 2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, a PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6.
  3. 3. Postupak prema zahtevu 2, naznačen time što rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira GtrS, čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 4 i nukleotidne sekvence koje kodiraju GtrA i GtrB, čije su aminokiselinske sekvence date u SEQ ID NO: 7, odnosno, 8.
  4. 4. Postupak za pripremu biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli, kovalentno vezanog za proteinski nosač, gde postupak sadrži: (i) obezbeđivanje rekombinantne prokariotske ćelije-domaćina koja sadrži: a. nukleotidnu sekvencu genskog klastera rfb za polisaharid Ox-antigena; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač, koji sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asn-X-Ser(Thr), gde je X bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 1), poželjno konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), u kojoj su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje aminokiseline izuzev Pro (SEQ ID NO: 2); i c. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBy; i (ii) kultivisanje rekombinantne prokariotske ćelije-domaćina pod uslovima za proizvodnju biokonjugata, gde PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB čija je aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 6, gde je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, polisaharid glikozilovanog O4-antigena, polisaharid O6A-antigena, polisaharid O15-antigena, polisaharid O16-antigena ili polisaharid O75-antigena, i kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira glukoziltransferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i sposobna je da modifikuje polisaharid O4-antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, i nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB koje imaju najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol i glikozil-transferaza je sposobna da glikoziluje baktoprenol, i gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O15, O16 i O75 antigena imaju strukturu formule
    (O15): [→2)-β-D-Galp-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n,
    odnosno,
    i svako n je nezavisno ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, npr., 5 do 40, npr., 7 do 25, npr., 10 do 20.
  5. 5. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 4, koji dalje obuhvata izolovanje biokonjugata iz rekombinantne prokariotske ćelije-domaćina.
  6. 6. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 5, naznačen time što je proteinski nosač izabran iz grupe koja se sastoji od detoksifikovanog egzotoksina A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelina E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujućeg proteina (MBP), toksoida difterije, toksoida tetanusa, detoksifikovanog hemolizina A poreklom iz S. aureus, faktora zgrušavanja A, faktora zgrušavanja B, termolabilnog enterotoksina E. coli, detoksifikovanih varijanti termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksina kolere, detoksifikovanih varijanti toksina kolere, Sat proteina E. coli, „putničkog“ domena Sat proteina E. coli, pneumolizina poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanina morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, proteina spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i proteina D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
  7. 7. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 6, naznačen time što je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA), poželjno gde proteinski nosač EPA sadrži 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4 mesta glikozilacije, poželjno gde svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije koja ima SEQ ID NO: 2, poželjno gde EPA proteinski nosač sadrži SEQ ID NO: 3.
  8. 8. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 7, naznačen time što je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA), gde proteinski nosač EPA sadrži 2-4 mesta glikozilacije, gde svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije koja ima SEQ ID NO: 2.
  9. 9. Postupak prema bilo kom zahtevu 1-8, naznačen time što je rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin E. coli ćelija, npr., soj K-12 E. coli, kao što je soj W3110.
  10. 10. Rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin za pripremu biokonjugata polisaharida Ox-antigena E. coli koji je kovalentno vezan za proteinski nosač, gde rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin sadrži: a. nukleotidnu sekvencu genskog klastera rfb za polisaharid Ox-antigena; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira proteinski nosač, koji sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije, koje sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asn-X-Ser(Thr), gde X može da bude bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 1), poželjno konsenzusnu sekvencu glikozilacije Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), gde su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 2); i c. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil-transferazu PglBi gde: kada je Ox-antigen polisaharid O1A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V; kada je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V, a rekombinantna ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira glukoziltransferazu GtrS koja ima najmanje 80% istovetnosti sa SEQ ID NO: 4 i sposobna je da modifikuje polisaharid O4 antigena E. coli dodavanjem glukoze, čime nastaje glikozilovani polisaharid O4-antigena E. coli, i nukleotidne sekvence koje kodiraju translokazu GtrA i glikozil-transferazu GtrB koje imaju najmanje 80% istovetnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, odnosno, 8, gde je translokaza sposobna da translocira glukozu vezanu za baktoprenol i glikozil-transferaza je sposobna da glikoziluje baktoprenol; kada je Ox-antigen polisaharid O6A-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V; kada je Ox-antigen polisaharid O8-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; kada je Ox-antigen polisaharid O15-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije N311V, K482R, D483H i A669V; kada je Ox-antigen polisaharid O16-antigena, PglBysadrži aminokiselinske mutacije Y77H, S80R, Q287P, K289R i N311V; kada je Ox-antigen polisaharid O18A-antigena, PglByne sadrži aminokiselinske mutacije na pozicijama 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 i 669; i kada je Ox-antigen polisaharid O75-antigena, PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V, gde se u svakom navedenom slučaju aminokiselinske mutacije odnose na neizrođeni tip PglB, koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, i gde polisaharidi O1A, glikozilovanog O4, O6A, O8, O15, O16, O18A i O75 antigena imaju strukture formula
    (O8): α-D-Manp3Me-(1→[3)-β-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→]n (O15) [→2)-β-D-Galp-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n
    odnosno, (O75):
    i svako n je nezavisno ceo broj od 1 do 100, poželjno 3 do 50, npr., 5 do 40, npr., 7 do 25, npr., 10 do 20.
  11. 11. Rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin prema zahtevu 10, naznačena time da je Ox-antigen glikozilovani polisaharid O4-antigena, i PglBysadrži aminokiselinsku mutaciju N311V ili aminokiselinske mutacije Y77H i N311V u odnosu na neizrođeni tip PglB, koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
  12. 12. Rekombinantna ćelija-domaćin prema zahtevu 11, naznačena time što rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin dalje sadrži sekvencu koja kodira GtrS sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 4, i nukleotidne sekvence koje kodiraju GtrA i GtrB, koje imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, odnosno, 8.
  13. 13. Rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin prema bilo kom zahtevu 10 do 12, naznačena time što je proteinski nosač izabran iz grupe koja se sastoji od detoksifikovanog egzotoksina A poreklom iz P. aeruginosa (EPA), flagelina E. coli (FliC), CRM197, maltoza-vezujućeg proteina (MBP), toksoida difterije, toksoida tetanusa, detoksifikovanog hemolizina A poreklom iz S. aureus, faktora zgrušavanja A, faktora zgrušavanja B, termolabilnog enterotoksina E. coli, detoksifikovanih varijanti termolabilnog enterotoksina E. coli, subjedinice toksina kolere B (CTB), toksina kolere, detoksifikovanih varijanti toksina kolere, Sat proteina E. coli, „putničkog“ domena Sat proteina E. coli, pneumolizina poreklom iz Streptococcus pneumoniae, hemocijanina morskog puža (KLH), PcrV poreklom iz P. aeruginosa, proteina spoljašnje membrane Neisseria meningitidis (OMPC) i proteina D iz netipiziranog Haemophilus influenzae.
  14. 14. Rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin prema bilo kom zahtevu 10 do 13, naznačena time što je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA), poželjno gde proteinski nosač EPA sadrži 1-10, poželjno 2-4, poželjnije 4 mesta glikozilacije, poželjno gde svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije koja ima sekvencu SEQ ID NO: 2, poželjno gde proteinski nosač EPA sadrži sekvencu SEQ ID NO: 3.
  15. 15. Rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin prema bilo kom zahtevu 10 do 14, naznačena time što je proteinski nosač detoksifikovani egzotoksin A poreklom iz Pseudomonas aeruginosa (EPA), gde proteinski nosač EPA sadrži 2-4 mesta glikozilacije, gde svako mesto glikozilacije sadrži konsenzusnu sekvencu glikozilacije koja ima sekvencu SEQ ID NO: 2.
  16. 16. Rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin prema bilo kom zahtevu 10 do 15, naznačena time što je rekombinantna prokariotska ćelija-domaćin ćelija E. coli, npr., soj K-12 E. coli, kao što je soj W3110.
RS20230733A 2019-03-18 2020-03-18 Postupci za proizvodnju biokonjugata polisaharida o-antigena e. coli, njihove kompozicije i postupci njihove primene RS64521B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962819762P 2019-03-18 2019-03-18
PCT/US2020/023415 WO2020191088A1 (en) 2019-03-18 2020-03-18 Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
EP20718990.3A EP3942028B9 (en) 2019-03-18 2020-03-18 Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64521B1 true RS64521B1 (sr) 2023-09-29

Family

ID=70285928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230733A RS64521B1 (sr) 2019-03-18 2020-03-18 Postupci za proizvodnju biokonjugata polisaharida o-antigena e. coli, njihove kompozicije i postupci njihove primene

Country Status (24)

Country Link
US (3) US11491220B2 (sr)
EP (2) EP3942028B9 (sr)
JP (1) JP7589164B2 (sr)
KR (1) KR102574882B1 (sr)
CN (1) CN113950524B (sr)
AR (1) AR118389A1 (sr)
AU (1) AU2020240075A1 (sr)
BR (1) BR112021018258A2 (sr)
CA (1) CA3134045A1 (sr)
EA (1) EA202192392A1 (sr)
ES (1) ES2951442T3 (sr)
HR (1) HRP20231026T1 (sr)
HU (1) HUE063875T2 (sr)
IL (1) IL286467B2 (sr)
MA (1) MA55365B1 (sr)
MD (1) MD3942028T2 (sr)
MX (1) MX2021011418A (sr)
PL (1) PL3942028T3 (sr)
RS (1) RS64521B1 (sr)
SG (1) SG11202110303XA (sr)
SM (1) SMT202300265T1 (sr)
TW (1) TWI771663B (sr)
WO (1) WO2020191088A1 (sr)
ZA (1) ZA202107879B (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE038915T2 (hu) 2013-01-17 2018-12-28 Arsanis Biosciences Gmbh MDR E. colira fajlagos antitest
NZ723328A (en) 2014-02-24 2018-01-26 Glycovaxyn Ag Compositions comprising e. coli o25b antigen, uses thereof and methods of manufacture
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
CR20210522A (es) 2019-03-18 2021-12-17 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de antígenos–polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos
US20230226175A1 (en) 2020-06-25 2023-07-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified exotoxin a proteins
PE20231385A1 (es) 2020-09-17 2023-09-12 Janssen Pharmaceuticals Inc Composiciones de vacunas multivalentes y usos de las mismas
IL301880A (en) 2020-11-30 2023-06-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Analytical method for glycoconjugation using a capillary-based immunoassay system
KR20240005684A (ko) 2021-04-08 2024-01-12 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 바이오컨쥬게이트 생산 방법

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700612A (en) 1971-06-23 1972-10-24 Tenneco Chem Aqueous surface-coating compositions containing hydroxyalkyl ethers of galactomannan gums as thickeners
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422653D0 (en) 1984-09-07 1984-10-10 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5370872A (en) 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
DE69313134T2 (de) 1992-06-25 1998-02-26 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
AUPM399594A0 (en) 1994-02-21 1994-03-17 Csl Limited Antigenic preparation for treatment or prevention of helicobacter infection
FI102976B (fi) 1994-02-28 1999-03-31 Valtion Teknillinen Menetelmä lisäkeittokemikaalien tuottamiseksi sekä käyttämiseksi sulfa attiselluloosaprosessissa
US6491919B2 (en) 1997-04-01 2002-12-10 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A
AU743114B2 (en) 1997-04-01 2002-01-17 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compositions of monophosphoryl lipid A
US6858211B1 (en) 1998-07-20 2005-02-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccines against Escherichia coli O157 infection
ES2284287T3 (es) 1998-10-16 2007-11-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sistemas adyuvantes y vacunas.
WO2001078777A2 (en) 2000-04-13 2001-10-25 Mossman, Sally Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and qs-21
AU2001253568A1 (en) 2000-04-18 2001-10-30 Dan C. Deborde Lipopolysaccharide-conjugate vaccine for sepsis treatment
RU2189253C1 (ru) 2001-04-09 2002-09-20 Государственный научный центр прикладной микробиологии Диагностикум для идентификации escherichia coli o157 : h7 и способ его получения
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
US6676958B2 (en) 2001-06-19 2004-01-13 Advanced Bioadjuvants, Llc Adjuvant composition for mucosal and injection delivered vaccines
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
DK1481057T3 (da) 2002-03-07 2006-05-15 Eidgenoess Tech Hochschule System og fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante glycosylerede proteiner i en prokaryot vært
AU2003901008A0 (en) 2003-03-04 2003-03-20 Anadis Ltd Composition for the treatment and prevention of bacterial infections
CN1324134C (zh) * 2003-12-22 2007-07-04 南开大学 对大肠杆菌o81型的o－抗原特异的核苷酸
AU2005229434B2 (en) 2004-03-30 2010-09-30 Nsgene A/S Therapeutic use of a growth factor, NsG33
ES2535084T3 (es) 2005-05-11 2015-05-05 Eth Zurich Proteínas N-glicosiladas recombinantes procedentes de células procariotas
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
ATE539079T1 (de) 2006-03-23 2012-01-15 Novartis Ag Imidazochinoxalinverbindungen als immunmodulatoren
JP4791866B2 (ja) 2006-03-24 2011-10-12 国立大学法人秋田大学 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
WO2009036379A2 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Adimab, Inc. Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CN102037004A (zh) 2008-01-08 2011-04-27 生物种属学股份公司 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合
SI2257307T1 (sl) 2008-02-20 2018-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Biokonjugati, izdelani iz rekombinantnih N-glikoziliranih proteinov iz prokariontskih celic
MX2011011376A (es) 2009-04-27 2012-04-20 Immuron Ltd Preparacion de inmunoglobulina enriquecida con anti-lps, para utilizarse en tratamiento y/o profilaxis de un trastorno patologico.
CA2764374C (en) 2009-06-05 2019-11-19 Infectious Disease Research Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants
NO2501406T3 (sr) 2009-11-19 2018-05-19
MX381912B (es) 2010-07-16 2025-03-13 Adimab Llc Colecciones de anticuerpos.
US20130273098A1 (en) 2010-12-10 2013-10-17 Jeffrey T. Blue Novel formulations which mitigate agitation-induced aggregation of immunogenic compositions
CA2847621A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
US9932598B2 (en) 2012-08-02 2018-04-03 The Regents Of The University Of California Metabolic engineering of microbial organisms
WO2014037585A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
KR20150068998A (ko) 2012-10-12 2015-06-22 글리코박신 아게 숙주 세포 변형 방법
EP2917351B1 (en) 2012-11-07 2018-12-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Production of recombinant vaccine in e. coli by enzymatic conjugation
CA2896157A1 (en) 2012-12-27 2014-07-03 Glycovaxyn Ag Methods and compositions relating to crm197
HUE038915T2 (hu) 2013-01-17 2018-12-28 Arsanis Biosciences Gmbh MDR E. colira fajlagos antitest
CU24377B1 (es) 2013-05-18 2018-12-05 Aduro Biotech Inc Dinucléotidos de purina cíclicos y composiciones de los mismos útiles para inducir la producción de interferón de tipo i dependientes de sting
BR112016007727A8 (pt) 2013-10-11 2018-01-30 Glycovaxyn Ag célula hospedeira, e, método para produzir uma proteína n-glicosilada.
EP2870974A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
CN106163550A (zh) 2013-12-04 2016-11-23 格林考瓦因有限公司 通过大肠杆菌中合成的糖蛋白疫苗预防金黄色葡萄球菌感染
KR102301188B1 (ko) 2014-02-06 2021-09-13 엑스4 파마슈티컬스 (오스트리아) 게엠베하 이. 콜라이 특이성 항체 서열
NZ723328A (en) 2014-02-24 2018-01-26 Glycovaxyn Ag Compositions comprising e. coli o25b antigen, uses thereof and methods of manufacture
MX378857B (es) 2014-04-17 2025-03-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Celulas huespedes modificadas y usos de las mismas.
CN105695497B (zh) 2014-11-27 2019-09-24 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用
SI3240895T1 (sl) * 2014-12-30 2022-04-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sestavki in postopki za glikozilacijo proteinov
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
GB201721582D0 (en) * 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
CR20210522A (es) 2019-03-18 2021-12-17 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de antígenos–polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
FR3098334B1 (fr) 2019-07-05 2021-07-23 Airbus Operations Sas Procédé et système de surveillance d’un état de conscience d’un opérateur dans un poste de pilotage d’un aéronef
PE20231385A1 (es) 2020-09-17 2023-09-12 Janssen Pharmaceuticals Inc Composiciones de vacunas multivalentes y usos de las mismas
MX2023011697A (es) 2021-04-01 2023-10-19 Janssen Pharmaceuticals Inc Produccion de bioconjugados o18 de e. coli.

Also Published As

Publication number Publication date
US11491220B2 (en) 2022-11-08
JP2022525773A (ja) 2022-05-19
MA55365A (fr) 2022-01-26
TW202102670A (zh) 2021-01-16
ES2951442T3 (es) 2023-10-20
US20230190926A1 (en) 2023-06-22
PL3942028T3 (pl) 2023-10-23
AU2020240075A1 (en) 2021-10-14
EP3942028B1 (en) 2023-06-07
EP3942028C0 (en) 2023-06-07
US20200353073A1 (en) 2020-11-12
JP7589164B2 (ja) 2024-11-25
CN113950524B (zh) 2025-05-02
CA3134045A1 (en) 2020-09-24
EP3942028A1 (en) 2022-01-26
CN113950524A (zh) 2022-01-18
SG11202110303XA (en) 2021-10-28
EP4253554A2 (en) 2023-10-04
US12233121B2 (en) 2025-02-25
IL286467B1 (en) 2025-10-01
KR20210134044A (ko) 2021-11-08
EP4253554A3 (en) 2024-01-17
WO2020191088A1 (en) 2020-09-24
MX2021011418A (es) 2021-10-13
EA202192392A1 (ru) 2022-02-09
AU2020240075A8 (en) 2021-10-21
HRP20231026T1 (hr) 2023-12-08
BR112021018258A2 (pt) 2022-02-08
HUE063875T2 (hu) 2024-02-28
EP3942028B9 (en) 2023-08-23
ZA202107879B (en) 2025-04-30
MA55365B1 (fr) 2023-09-27
SMT202300265T1 (it) 2023-09-06
IL286467A (en) 2021-12-01
WO2020191088A9 (en) 2020-11-05
IL286467B2 (en) 2026-02-01
KR102574882B1 (ko) 2023-09-04
AR118389A1 (es) 2021-09-29
US20250222093A1 (en) 2025-07-10
TWI771663B (zh) 2022-07-21
MD3942028T2 (ro) 2023-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11931405B2 (en) Bioconjugates of E. coli O-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
US12233121B2 (en) Methods of producing bioconjugates of E. coli O-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
WO2022058945A1 (en) Multivalent vaccine compositions and uses thereof
HK40101412A (en) Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
HK40058952A (en) Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
HK40058952B (en) Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
EA046206B1 (ru) Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения
EA046636B1 (ru) Способы получения биоконъюгатов полисахаридных о-антигенов e. coli, их композиции и способы их применения
OA20646A (en) Bioconjugates of E. coli O-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof.