RS64678B1 - Inhibitori pi3k p-delta 110 za upotrebu u isporuci virusa u lečenju kancera - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovo otkriće se odnosi na poboljšani postupak za isporuku modifikovanih virusa pacijentima, na primer u lečenju kancera.

[0002] Modifikovani virusi su virusi koji su izabrani ili konstruisani za poboljšano ciljno delovanje i ubijanje ćelija kancera. Modifikovani virusi mogu uključivati viruse kompetentne za replikaciju, uslovno kompetentne za replikaciju, defektne za replikaciju i atenuirane viruse. Pored toga, modifikovani virusi takođe mogu da obezbede imunostimulativne signale neophodne za povećanje sopstvenog antikancerogenog odgovora domaćina.

[0003] Uprkos napretku u minimalno invazivnoj hirurgiji, hiperfrakcionisanoj radioterapiji i novim kombinacijama hemoterapeutskih sredstava, stope preživljavanja pacijenata sa mnogim tipovima solidnih tumora su ostale nepromenjene. Modifikovani virusi su atraktivni terapeutici za lečenje kancera koji su otporni na konvencionalne terapije.

[0004] Modifikovani virusi su odlična platforma za isporuku imunoterapije jer specifično ciljno deluju na tumorske ćelije, što dovodi do direktne lize i prezentacije antigena povezanih sa tumorom u kontekstu ekstravirusnih signala opasnosti koji stvaraju jak imuni odgovor. Drugo, mogu se konstruisati da sadrže transgene koji se eksprimiraju unutar tumorskog mikrookruženja što dovodi do sinergističkih sekundarnih imunomodulisanih antitumorskih efekata. Nedavno je T-VEC, genetski modifikovan virus HSV-1 naoružan humanim GM-CSF, licenciran od strane FDA za lečenje malignog melanoma intratumoralnom injekcijom (Andtbacka, et al., J Clin Oncol, 2015.33(25): p.2780-8). JKS594, još jedan soj vakcinije, isporučivan je sistemski kod ljudi sa uočljivim količinama ekspresije transgena (Breitbach, C.J., et al., Nature, 2011.

477(7362): p. 99-102), ali nije razvijena strategija koja bi omogućila efikasnu infekciju više tumorskih mesta nakon sistemske isporuke.

[0005] Idealalisib (5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-hinazolinon) je inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze; tačnije, blokira P110δ, delta izoformu enzima fosfoinozitid 3-kinaze. Prošao je kroz nekoliko ispitivanja koja su pokazala minimalnu toksičnost i koristi se za lečenje hronične limfocitne leukemije (Brown et al J Clin Oncol, 2013, supl. Abstract 7003); Furman, et al., N Engl J Med, 2014.370(11): p.997-1007); Gopal, et al., N Engl J Med, 2014. 370(11): p.1008-18.

[0006] Nedavno su objavljeni dokazi da inhibicija p110 delta može biti efikasna ne samo kod maligniteta hemopoeze, već i kod solidnih karcinoma (Ali et al, Nature, 2014. 509(7505): p.

407-11; Mouchemore et al. FEBS J, 2014.280(21): p.5228-36).

[0007] D1 (Ferguson, Mark et al., Abstract No. 649, Abstracts Of The ASGCT 18th Annual Meeting, vol. 23, no. Supp1.1., 1 May 2015, pages s258-s259) opisuje ciljno delovanje na urođeni imunitet domaćina preko PI3K delta pojačanja sistematske isporuke onkolitičkog vakcinija virusa.

[0008] D2 (US 2012/0100109) opisuje primenu onkolitičkog virusa koji potiče od HSV i inhibitora puta PI3K/AKT/mTOR za lečenje različitih tipova rezistentnih tumora.

[0009] (R. Kanai et al., Clinical Cancer Research, vol. 17, no. 11, 1 June 2011, pages 3686-3696) opisuje novi onkolitički herpes simpleks virus koji sinergizuje sa inhibitorima fosfoinozitid 3-kinaze/AKT puta kako bi ciljno delovao na matične ćelije glioblastoma.

[0010] D4 (Yin Tong et al., Oncology Reports, 11 February 2014) opisuje da inhibitor P13K, LI294002 inhibira aktivaciju AKT/mTOR puta indukovanog onkolitičkim adenovirusom koji eksprimira TRAIL i senzibilizira ćelije višestrukog mijeloma na onkolitički virus.

[0011] D5 (Nicole E. Forbes et al., Frontiers In Oncology, vol. 4, 23 July 2014) opisuje farmakološku modulaciju antitumorskog imuniteta izazvanog onkolitičkim virusima.

[0012] Do danas, većina pretkliničkih studija koje su ispitivale sistemsku isporuku virusa vakcinije koristile su gole miševe koji nose tumore ksenografta. Međutim, takvi eksperimentalni modeli nisu imunokompetentni i jasno je da je imunitet domaćina glavna prepreka uspešnoj primeni modifikovanih virusa za upotrebu u lečenju kancera. Stoga postoji potreba za poboljšanim postupcima isporuke takvih vektora.

[0013] Ovaj pronalazak obezbeđuje komplet delova koji sadrži inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K delta) i modifikovani virus vakcinije za upotrebu u postupku za lečenje kancera, pri čemu je gen za timidin kinazu deletiran iz virusnog genoma modifikovanog virusa vakcinije, pri čemu postupak sadrži primenu modifikovanog virusa vakcinije nakon primene inhibitora delta fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K delta), pri čemu je modifikovani virus vakcinije za intravensku primenu i pri čemu kancer je neresektabilni tumor.

[0014] Inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K delta) može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: IC-87114, PI-103, TGX221, A66, AS 604850, idelalisiba, vortmannina, alpelisiba, buparlisiba, copanlisiba, duvelisiba, rigosertiba i taselisiba, ili njegovog derivata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0015] Modifikovani virus vakcinije može biti dalje modifikovan insericijom gena koji kodira terapeutsko sredstvo, ili delecijom, ili inaktivacijom putem insercije virusnog gena.

[0016] Komplet može dalje da sadrži dodatno sredstvo protiv kancera ili citostatski lek.

[0017] Ovo otkriće opisuje postupak za poboljšanje sistemske isporuke modifikovanog virusa pacijentima.

[0018] Ovde je opisana kompozicija koja sadrži inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovani virus za odvojenu, naknadnu ili istovremenu upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je modifikovani virus za intravensku primenu.

[0019] Kompozicija može biti posebno korisna u lečenju uznapredovalog kancera, na primer u lečenju solidnih tumora kod onih pacijenata koji nisu uspeli sa konvencionalnom terapijom.

[0020] Pogodno, inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) je inhibitor PI3K delta, na primer selektivni inhibitor PI3K katalitičke podjedinice p110δ. Kao što je ovde opisano, inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) ima IC50vrednost od oko 5 nM do oko 0.5 µM.

[0021] Selektivni inhibitori PI3K delta su opisani u WO 2010/0249155 u skladu sa Formulom 1(S) i Formulom 1(R) koja je tamo opisana i WO 2014/072937 prema Formuli (I) opisanoj u njoj. WO 2010/0249155 opisuje jedinjenje IC-87114 (videti takođe Sadhu et al J. Immunology, vol. 170(5):2647-2654, 2003).

[0022] Inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: IC-87114, PI-103, TGX221, A66, AS 604850, idelalisiba, vortmanina, alpelisiba, buparlisiba, copanlisiba, duvelisiba, rigosertiba i taselisiba, ili njihovog derivata ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kao što je prikazano u tabeli 1 ispod.

Tabela 1

[0023] Pogodni derivati inhibitora fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) koji su ovde opisani uključuju sve supstitucije ili modifikacije koje suštinski ne menjaju svojstvo molekula da može da deluje kao inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K).

[0024] Farmaceutski prihvatljive soli inhibitora fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) koje su ovde opisane uključuju bilo koji pogodan oblik soli formiran sa kiselinom kao što je 1-hidroksi-2-naftojeva kiselina, 2,2-dihlorosirćetna kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina, 2-oksoglutarna kiselina, 4-acetamidobenzojeva kiselina, 4-aminosalicilna kiselina, sirćetna kiselina, adipinska kiselina, askorbinska kiselina (L), asparaginska kiselina (L), benzensulfonska kiselina, benzojeva kiselina, kamforna kiselina (+), kamfor-10-sulfonska kiselina (+), kaprinska kiselina (dekanoična kiselina), kapronska kiselina (heksanska kiselina), kaprilna kiselina (oktanska kiselina), ugljena kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, ciklamska kiselina, dodecilsumporna kiselina, etan-1,2-disulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, mravlja kiselina, fumarna kiselina, galaktarna kiselina, gentizinska kiselina, glukoheptonska kiselina (D), glukonska kiselina (D), glukuronska kiselina (D), glutaminska kiselina, glutarna kiselina, glicerofosforna kiselina, glikolna kiselina, hipurinska kiselina, bromovodonična kiselina, hlorovodonična kiselina, izobuterna kiselina, mlečna kiselina (DL), laktobionska kiselina, laurinska kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina (-L), malonska kiselina, bademova kiselina (DL), metansulfonska kiselina, naftalen-1,5-disulfonska kiselina, naftalen-2 -sulfonska kiselina, nikotinska kiselina, azotna kiselina, oleinska kiselina, oksalna kiselina, palmitinska kiselina, pamoična kiselina, fosforna kiselina, proprionska kiselina, piroglutaminska kiselina (-L), salicilna kiselina, sebacinska kiselina, stearinska kiselina, ćilibarna kiselina, sumporna kiselina, vinska kiselina (+ L), tiocijanska kiselina, toluensulfonska kiselina (p) ili undecilenska kiselina.

[0025] Modifikovani virusi mogu biti kompetentni za replikaciju, uslovno kompetentni za replikaciju, defektni za replikaciju ili atenuirani virus. Modifikovani virus za upotrebu u lečenju kancera može se stoga opisati kao onkolitički virus.

[0026] Modifikovani virus može biti virus vakcinije, herpes simpleks virus, adenovirus, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), virus malih boginja, virus Newcastle bolesti, poliovirus, reovirus, senekavirus ili enterični citopatski humani siroče virus (ECHO), ili njihove kombinacije. Modifikovani virus može da se generiše delecijom određenog specifičnog jednog ili više gena (na primer delecijom timidin kinaze) i/ili insercijom transgena koji kodira terapeutsko sredstvo.

[0027] Kao što je ovde opisano, modifikovani virus je virus vakcinije (VV). Virus vakcinije je dvolančani DNK virus sa mnogim karakteristikama koje ga čine atraktivnim kandidatom za modifikovanu virusnu terapiju. Pokazuje brzu replikaciju, efikasno širenje na tumore i jaku litičku sposobnost. Pored toga, vakcinija je opširno proučavana i ima dobro definisanu molekularnu biologiju sa velikim kapacitetom kloniranja i nizom komercijalno dostupnih prirodnih i sintetičkih promotora što je čini idealnom kao vektor za nošenje heterolognih sekvenci nukleinskih kiselina. Vakcinija ima dobro utvrđen bezbednosni profil i tretmani za nekontrolisane infekcije su lako dostupni. Pored toga, virus vakcinije je takođe u stanju da toleriše hipoksične uslove mikrookruženja u čvrstim tumorima (Hiley et al Gene Ther. 2010, 17:281-287).

[0028] Modifikovani virus vakcinije može biti izabran iz grupe koja se sastoji od sojeva Western Reserve, Wyeth i Lister. Pogodno, virus vakcinije je delecioni mutant jednog od ovih sojeva, na primer McCart et al (Cancer Res. 2001, 61; 8751-8757) opisuju verziju Western Reserve (WR) soja sa delecijom gena za timidin kinazu (TK) i gena virusnog faktora rasta (VGF) i Hung et al (Gene Therapy, 2007, 14; 20-29) opisuje soj Lister vakcinije sa deficijencijom TK. Modifikovani virus vakcinije može biti dalje modifikovan insercijom heterolognih gena, na primer gena koji kodiraju citokine u virus.

[0029] Pogodno, modifikovani virus vakcinije je delecioni mutant gde je gen za timidin kinazu deletiran iz virusnog genoma. Takvi virusi takođe mogu biti dalje modifikovani insercijom jednog ili više gena koji kodiraju terapeutsko sredstvo, na primer citokin, u virusni genom.

[0030] Modifikovani virus može biti adenovirus, na primer adenovirus-5, ili virus herpes simpleksa (HSV), na primer HSV-1 ili HSV-2. Primer modifikovanog virusa koji je virus HSV-1 je konstrukt virusa talimogen laherparepvec („T-VEC“) koji je atenuirani oblik HSV-1 (soj JS1) koji je modifikovan da ciljno deluje na ćelije kancera i da eksprimira GM-CSF. Primeri modifikovanog adenovirusa uključuju Oncorine<™>(H101), Onyx-015<™>(Ad2/5 dl1520) i enadenotucirev (A11/Ad3 himerni adenovirus grupe B).

[0031] Primeri pogodnih modifikovanih virusa vakcinije za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem uključuju, ali nisu ograničeni na virusne sojeve opisane u WO 2015/150809 (virus vakcinije), WO 2014/063601 (virus vakcinije i adenovirus tip 5), JKS-594 (virus vakcinije deletiran timidin kinazom sa genom koji kodira GM-CSF). Kao što je ovde opisano, modifikovani virus vakcinije je soj virusa vakcinije VVL15. Pogodno, soj virusa vakcinije je deletiran timidin kinazom i dodatno sadrži jedan ili više transgena koji kodiraju terapeutsko sredstvo (na primer jedan ili više od GM-CSF, IL-12 i/ili IL-21), izborno dodatni virusni geni u virusu mogu biti deletirani ili poremećeni insercijom gena ("nokaut" gena). Na primer, geni virusnog faktora rasta (VGF) i/ili NL1 mogu biti poremećeni ili inaktivirani.

[0032] Primeri terapeutskog sredstva pogodnog za ekspresiju modifikovanim virusom uključuju ali nisu ograničeni na citokine, hemokine i faktore rasta. Citokin može biti imunomodulatorno sredstvo kao što je interleukin (npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 i IL-36), interferon (INF-α, INF-β, INF-γ i INF-ω), faktor nekroze tumora (TNF) faktor stimulacije kolonije makrofaga granulocita (GM-CSF) ili inhibitor kontrolne tačke PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, TIGIT i njihovi odgovarajući ligandi, na primer PD-L1 ili PD-L2, CD80 ili CD86.

[0033] Kao što je ovde opisano, više od jednog modifikovanog virusa može biti prisutno u kompoziciji. Kompozicija stoga može da sadrži najmanje jedan modifikovani virus, na primer virus vakcinije i adenovirus.

[0034] Kompozicija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0035] Ovo otkriće se stoga proširuje na postupak lečenja kancera koji sadrži korak primene kompozicije koja sadrži inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovani virus na subjekta kome je to potrebno, gde se inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovani virus primenjuju odvojeno, naknadno ili istovremeno na subjekta, pri čemu se modifikovani virus primenjuje intravenski.

[0036] Otkriće stoga takođe opisuje upotrebu inhibitora fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovanog virusa u proizvodnji leka za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu je modifikovani virus za intravensku primenu.

[0037] Odvojena, naknadna ili istovremena primena inhibitora fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovanog virusa za upotrebu u lečenju kancera može se postići bilo kojim pogodnim putem gde se modifikovani virus za intravensku primenu i inhibitor PI3K primenjuju intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, oralno, intranazalno ili subkutano. Kao što je ovde opisano, inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) se primenjuje oralno, a modifikovani virus se primenjuje intravenski. Inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovani virus mogu se pripremiti kao kombinovani preparat ili se mogu pripremiti kao odvojene komponente.

[0038] Očekuje se da bi otkriće moglo da nađe najveću korist u lečenju humanih pacijenata. Subjekat koji se leči može biti sisar, na primer čovek. Subjekat može biti glodar, na primer pacov ili miš, ili životinja pratilac, na primer mačka ili pas. Subjekat može biti vrsta od značaja za poljoprivredu, na primer vrsta kopitara, tj. kopitar, govedo, svinja, koza ili ovca.

[0039] Intravenska isporuka može biti korisna jer bi trebalo da omogući istovremeno lečenje primarnih tumora i svih metastatskih naslaga ćelija kancera

[0040] Kompozicije pronalaska mogu biti za upotrebu u lečenju kancera, na primer u lečenju sarkoma, karcinoma ili limfoma. Primeri tipova karcinoma koji se mogu lečiti kompozicijama pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer pluća, kancer jetre, kancer dojke, kancer bešike, kancer debelog creva, kancer rektuma, kancer pankreasa, kancer kože (melanom, karcinom bazalnih ćelija ili karcinom skvamoznih ćelija), kancer želuca, kancer prostate, kancer kostiju, adenokarcinom, osteosarkom, kancer jajnika, kancer materice, kancer testisa, neuroendokrini kancer, endokrini kancer, kancer timusa, kancer štitne žlezde, kancer bubrega,

1

kancer glave i vrata, kancer jednjaka, kancer perifernog centralnog nervnog sistema ili kancer mozga. Reference na određeni kancer uključuju upućivanje na tumor formiran od ćelija kancera odgovarajućeg tkiva ili organa.

[0041] Tumor može biti neresektabilan pre lečenja i resektabilan posle tretmana. Tumor može biti rekurentni, primarni, metastatski i/ili tumor otporan na više lekova. Tumor može biti nemaligni tumor/hiperplazija.

[0042] Terapeutski efikasna količina je doza dovoljna da izazove lizu tumora (tj. dovoljna da izazove (omogući preživljavanje) terapeutski efikasne doze modifikovanog virusa). Doze za isporuku i primenu mogu se zasnivati na postojećim protokolima, empirijski utvrđenim, korišćenjem modela bolesti životinja ili izborno u kliničkim ispitivanjima na ljudima. Početne doze za proučavanje mogu biti zasnovane na studijama na životinjama koje su ovde izložene, na primer za miša. Doze mogu da variraju i zavise od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski, od tipa, početka, progresije, težine, učestalosti, trajanja ili verovatnoće bolesti na koju je lečenje usmereno, željene kliničke krajnje tačke, prethodnih ili istovremenih tretmana, opšteg zdravstvenog stanja, starosti, pola, rase ili imunološke kompetencije subjekta i drugih faktora koje će kvalifikovani stručnjak razumeti. Količina, broj, učestalost ili trajanje doze mogu biti proporcionalno povećani ili smanjeni, kao što je naznačeno bilo kojim neželjenim efektima, komplikacijama ili drugim faktorima rizika tretmana ili terapije i statusom subjekta. Stručnjak će razumeti faktore koji mogu uticati na dozu i vreme potrebno da se obezbedi količina dovoljna za pružanje terapeutske ili profilaktičke koristi.

[0043] Kao što je ovde opisano, postupak dalje sadrži primenu na subjekta dodatne terapije kancera. Terapija kancera, kako se ovde koristi, odnosi se na lečenje kancera bilo kojim medicinskim ili fizičkim sredstvima. Dodatna terapija kancera može biti hemoterapija, biološka terapija, radioterapija, imunoterapija, hormonska terapija, antivaskularna terapija, krioterapija, terapija toksinima i/ili operacija, uključujući njihove kombinacije. Kompozicija pronalaska stoga može da sadrži jedan ili više sredstava protiv kancera ili citostatičkih lekova.

[0044] Postupci i upotrebe otkrića kao što je ovde otkriveno mogu se praktikovati odmah ili danima, mesecima ili godinama nakon što je subjekat identifikovan da ima bolest koja je ciljana za lečenje.

[0045] Postupci uključuju primenu virusa po različitim rasporedima. Pojedinačna doza virusa može se primenjivati na subjekta ili tumor tokom perioda od 1, 2, 5, 10, 15, 20 ili 24 sata. Virus se može primenjivati tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana ili nedelja. Interval između injekcija može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dana ili nedelja. Tipično, višestruke doze se primenjuju na isti opšti ciljni region, kao što je blizina tumora ili u slučaju intravenske primene, određena ulazna tačka u krvotok ili limfni sistem subjekta. Vektor virusa vakcinije se može primeniti 1, 2, 3, 4, 5 ili više puta. Vektor virusa vakcinije može se dati pre resekcije tumora u različitim rasporedima i dozama.

[0046] Postupci uključuju primenu virusa u različitim koncentracijama virusa. U određenim aspektima, na subjekta se primenjuje najmanje 5×10<7>, 1×10<8>, 2 × 10<8>, 5 × 10<8>, 1 × 10<9>, 2 × 10<9>, 5 × 10<9>, 1 × 10<10>, 5 × 10<10>, 1 × 10<11>, 5 × 10<11>, 1 × 10<12>ili više virusnih čestica ili jedinica koje formiraju plak (pfu), uključujući različite vrednosti i opsege između njih. Virusna doza se može primeniti u 0.1 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL ili više, uključujući sve vrednosti i opsege između njih. Doza se može rasporediti tokom vremena ili odvojenom injekcijom.

[0047] Kompozicije i postupci otkriveni u ovom pronalasku mogu se koristiti u različitim tipovima genske terapije, na primer genska terapija za supresor tumora, genska terapija samoubistva, strategije imunizacije virusnih vektora, anti-angiogena terapija, genska terapija pro-apoptoze i terapija zamene gena. "Oncolytic Viruses for Cancer Therapy: Overcoming the Obstacles" (Wong et al. Viruses 2010, 2, 78-106).

[0048] Kompozicije i postupci otkriveni u ovom pronalasku mogu se koristiti u kombinaciji sa dodatnim terapijskim sredstvima ili postupcima u lečenju kancera, na primer hirurgija, hemoterapija, terapija zračenjem, molekularna terapija kancera ili dodatna genska terapija, koja se može koristiti za primenu gena koji se razlikuju od ovde opisanih nukleinskih kiselina iz pronalaska.

[0049] Takođe je opisan komplet koji sadrži inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i modifikovani virus za upotrebu u lečenju kancera, a prikladno takođe sadrži uputstva za upotrebu.

[0050] Poželjne karakteristike drugog i narednih aspekata otkrića su kao za prvi aspekt mutatis mutandis.

[0051] Otkriće će sada biti dalje opisano u vidu pozivanja na sledeće primere i crteže u kojima:

SLIKA 1A prikazuje da sistemska virusna infekcija značajno povećava nivoe p110 delta izoforme RNK u splenocitima imunokompetentnih miševa. Bilo divljim ili golim BALB/c miševima je injektirano 1×10<6>CT26 ćelija u njihove desne bokove pre jedne intravenske injekcije od 1 × 10<8>PFU VVL15 ili PBS. Tri miša u svakoj grupi (Nude/PBS, Nude/VVL15, Immunocompetent/PBS i Immunocompetent/VVL15) su žrtvovana odmah nakon injekcije u repnu venu ili tri sata kasnije. Količina p110 delta RNK u slezini je kvantitativno određena pomoću qPCR. Postoji značajno više p110 delta RNK nakon tri sata kod imunokompetentnih miševa tretiranih VVL15 u poređenju sa svim drugim stanjima (P<0.001).

SLIKA 1B prikazuje da je ekspresija p110 delta proteina povećana virusnom infekcijom. Makrofagi poreklom iz koštane srži prikupljenih iz dva divljeg tipa BALB/c miša su prethodno tretirani sa IC87114 pri 75 mg kg<-1>ili puferom vehikuluma 2 sata pre infekcije sa VVL15 na MOI 5 ili kontrolni 1 sat. Ekspresija p110 delta proteina je procenjena Western blot-om. Sama virusna infekcija povećava količinu otkrivenog p110 delta proteina, dok se čini da dodavanje IC87114 samog ili u kombinaciji sa VVL15 ne menja količinu otkrivenog p110 delta proteina.

SLIKA 1C prikazuje selektivnu inhibiciju p110 delta koja smanjuje vezivanje VVL15 za makrofage. U 2 odvojena eksperimenta, makrofagi izvedeni iz koštane srži prikupljeni iz dva divljeg tipa (VT) BALB/c miša su prethodno tretirani tokom 2 sata sa IC87114, selektivnim p110 delta inhibitorom, ili puferom za nosač. Zatim je preduzet test vezivanja virusa. Nakon toga, u prvom eksperimentu je izvedena konfokalna mikroskopija nakon što su ćelije obojene DAPI (plavo) i tubulinom (zeleno), virus vakcinije je obojen crvenom bojom (antitelo na protein omotača virusa vakcinija). U grupi tretiranoj IC87114 detektovano je manje virusa vakcinije. Drugi eksperiment je kvantitativno odredio količinu VVL15 prisutnog pomoću qPCR. Grupa tretirana inhibitorima se statistički značajno razlikovala od netretiranih makrofaga (P < 0.001).

SLIKA 1D prikazuje da IC87114 utiče na vezivanje virusa na p110 delta zavisan način. Makrofagi poreklom iz koštane srži prikupljeni od dva divlja tipa BALB/c miša ili četiri transgena miša sa ubačenom p110 delta (heterozigotni „knock in“ [n=2], homozigotni „knock in“ [n=2]) su kultivisani ex vivo i zatim je izveden test vezivanja virusa na transgenim makrofagima dok su makrofagi divljeg tipa prethodno tretirani 2 sata sa IC87114 ili puferom za nosač i zatim je sproveden test vezivanja virusa. Kako heterozigotni tako i homozigotni delta „knock in“ transgenim mišjim makrofagima pokazali su slično smanjenje vezivanja virusa za makrofage divljeg tipa tretirane sa IC87114, sve grupe su bile statistički značajne od netretiranih makrofaga divljeg tipa (P <0.05 ili P <0.01).

1

SLIKA 2A prikazuje prethodni tretman sa IC87114 pre nego što sistemska injekcija virusa vakcinije pojačava signal luminescencije tumora kod BALB/c miševa koji nose CT26 tumore boka. Jedanaest BALB/c miševa koji nose CT26 tumore boka primili su 75 mg kg<-1>IC87714 ili pufer vehikulum tri sata pre jedne intravenske injekcije 1×10<8>PFU VVL15. Biodistribucija VVL15 je određena pomoću IVIS. Detektovano je značajno više signala iz grupe koja je prethodno tretirana sa 75 mg kg<-1>IC87114 dana 1, 3, 4 i 5 (P<0.01 dana 1 i P<0.05 dana 3, 4 i 5). Ovo su kombinovani rezultati tri eksperimenta.

SLIKA 2B i SLIKA 2C prikazuju da tretman oralnim IC87114 i intravenskim virusom vakcinije značajno smanjuje opterećenje tumorom i poboljšava preživljavanje kod BALB/c miševa koji nose ortotopske 4T1 tumore ili CT26 tumore boka.

SLIKA 2B prikazuje BALB/c miševe koji nose CT26 tumore. Četrdeset miševa je subkutano injektirano u njihov obrijani desni bok sa 1 × 10<6>CT26 tumorskih ćelija. Miševi su prethodno tretirani ili puferom vehikulumom (grupe A i C) ili IC87114 na 50 mg kg<-1>(Grupe B i D) oralnom gavažom tri sata pre primanja bilo koje intravenske injekcije od 1×10<8>PFU VVL15 (grupe A i D) ili PBS (grupe B i C). Ovaj tretman je započet 8. dana nakon implantacije tumora i ponovljen 11. i 13. dana. Postoji značajno manje opterećenje tumorom u grupi prethodno tretiranoj IC87114 u poređenju sa svim ostalim grupama. Konkretno, Grupa D u poređenju sa Grupom A 11. i 13. dana (P<0.001). Grupa D u poređenju sa grupom B 11. i 13. dana (P<0.001). Grupa D u poređenju sa grupom C 11. dana (P<0.001). Analiza preživljavanja; podaci su predstavljeni na Kaplan-Meier-ovom grafikonu. Miševi prethodno tretirani sa IC87114 (Grupa D) preživeli su značajno duže od svih ostalih grupa. Konkretno, Grupa D u poređenju sa Grupom A (P<0.01). Grupa D u poređenju sa Grupom B (P<0.01). Grupa D u poređenju sa grupom C (P<0.05).

SLIKA 2C prikazuje BALB/c miševe koji nose ortotopske 4T1 tumore. Trideset šest BALB/c ženki miševa imalo je 1 × 10<5>4T1 ćelija u 50 µl PBS injektiranih ortotopski u levu donju torakalnu mlečnu žlezdu. Miševi su prethodno tretirani ili puferom za nosač (Grupe A i C) ili IC87114 na 75 mg kg<-1>(Grupe B i D) oralnom gavažom tri sata pre primanja bilo koje intravenske injekcije od 1×10<8>PFU VVL15 (grupe A i D) ili PBS (grupe B i C). Ovaj tretman je obavljen 12., 15. i 17. dana nakon implantacije tumora.

Postoji značajno manje opterećenje tumorom u grupi koja je prethodno tretirana IC87114 u poređenju sa svim ostalim grupama. Konkretno, Grupa D u poređenju sa Grupom A 16. i 19. dana (P<0.05 i P<0.001). Grupa D u poređenju sa grupom B 16. i 19. dana (P<0.001). Grupa D u poređenju sa grupom C 16., 19. i 21. dana (P<0.001). Analiza preživljavanja; podaci su predstavljeni na Kaplan-Meier-ovom grafikonu. Miševi prethodno tretirani sa IC87114 (Grupa D) preživeli su značajno duže od svih ostalih grupa. Konkretno, Grupa D u poređenju sa Grupom A (P<0.05). Grupa D u poređenju sa Grupom B (P<0.01). Grupa D u poređenju sa grupom C (P<0.01).

SLIKA 2D prikazuje da prethodni tretman sa IC87114 smanjuje lokalizaciju virusa vakcinije u slezini nakon sistemski isporučenog VVL15 in vivo.

SLIKA 2D(i) i SLIKA 2D(ii) prikazuju mikrofotografije poprečnih preseka slezine obojene hematoksilinom imunohistohemijskim bojenjem za protein omotača virusa vakcinije. Strelice označavaju virusno inficirane ćelije: (i) prethodno tretirane puferom za nosač; i (ii) Prethodno tretirane sa IC87114. SLIKA 2D(iii) prikazuje polukvantitativno određivanje ćelija koje se jako boje u nasumično odabranim poljima velike snage uvećanja x200. Broj ćelija imunoreaktivnih za protein omotača vakcinija je ručno prebrojan u svakom nasumičnom x200 polju uveličanja. Postoji statistički značajna razlika između grupa (P<0.001).

SLIKA 2E pokazuje da IC87114 slabi antivirusni imunitet, ali nema efekta na antitumorski imunitet. Interferon gama test na splenocitima dobijenim od BALB/c miševa koji nose CT26 tumore. Petnaest miševa je subkutano injektirano u njihov obrijani desni bok sa 1×10<6>CT26 tumorskih ćelija. Miševi su prethodno tretirani ili puferom za nosač (Grupe A i C) ili IC87114 na 75 mg kg<-1>(Grupe B i D) oralnom gavažom tri sata pre primanja bilo koje intravenske injekcije od 1×10<8>PFU VVL15 (grupe A i D) ili PBS (grupe B i C). Urađena je interferon (IFN) gama ELISA. Antitumorski imunitet: splenociti su stimulisani CT26 ćelijama tretiranim mitomicinom, nije bilo statistički značajne razlike između bilo koje grupe. Antivirusni imunitet: splenociti su stimulisani B8R proteinom, detektovano je više IFN gama u grupi A (bez inhibitora VVL15) u poređenju sa svim ostalim grupama (P<0.05).

1

[0052] Primeri su prisutni samo u svrhu ilustracije i ne treba ih tumačiti kao ograničenje otkrića. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

Metode

Ćelijske linije

[0053] Sve ćelijske linije su kultivisane u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) sa 5-10% fetalnog telećeg seruma (FCS) osim makrofaga koji su kultivisani u medijumu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sa 10% FCS, 28.6 µM beta merkaptoetanola (βMCE) i 1% streptomicina/penicilina. Ćelijske linije mišjeg kolorektalnog karcinoma CMT93 i CT26 i ćelijska linija kancera dojke 4T1 su sve dobijene iz banke ćelija Cancer Research UK. Normalna ćelijska linija bubrega afričkog zelenog majmuna, CV1, dobijena je iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, VA, SAD). Makrofagi dobijeni iz koštane srži iz p110 delta miševa bili su ljubazan poklon profesora Vanhaesebroeck (University College London, UK). Ćelijske linije su rutinski testirane na mikoplazmu i održavane su na 37°C sa 5% CO2ukoliko nije drugačije naznačeno. Za sve eksperimente korišćeni su slični brojevi pasaža. Za dugotrajno skladištenje, ćelije su istaložene centrifugiranjem i ćelijski talog je resuspendovan u DMEM koji sadrži 10% dimetil sulfoksida (DMSO) i 10% FBS. Posle čuvanja preko noći na -80°C ćelije su prebačene u tečni azot.

Reagensi

[0054] Merck je isporučio PI-103 (inhibitor alfa izoforme PI3 kinaze) i TGX221 (inhibitor izoforme PI3 kinaze beta) kao i pan-klase 1 inhibitora vortmanina. Tocris Bioscience je isporučio inhibitor Rac1 NSC23766, citohalazin D (inhibitor polimerizacije aktina), Y-27632 (inhibitor protein kinaze povezan sa Rho) i nokodazol (inhibitor polimerizacije mikrotubula). Santa Cruz Biotechnology je isporučio selektivni inhibitor PI3 kinaze alfa A66 klase 1a. Sigma-Aldrich je isporučila AS 604850, selektivni inhibitor gama izoforme PI3 kinaze klase 1b. U početku je Symansis isporučio IC87114, selektivni inhibitor klase 1a p110 delta izoforme, a zatim je kasnije, od marta 2012. godine, dobijen od Synkinase. Korišćene koncentracije su PI-103 u 80 nM, TGX221 u 0.1 µM, vortmanin u 0.5 µM, NSC23766 u 50 µM, A66 u 0.5 µM, Citohalazin D u 10 µM, Y-27632 u 10 µM, nokodazol u 10 µM, AS 604850 u 1 µM. IC87114 je korišćen u koncentraciji od 1 µM za sve in vitro testove osim ako nije drugačije navedeno.

1

Western blot antitela su bila anti-p110δ iz Santa Cruz Biotechnologies (sc-7176), i anti-vinkulin (V9131) i anti-aktin (SAB2500963) iz Sigma-Aldrich. Antitelo na virus vakcinije korišćeno za imunohistohemijske eksperimente bilo je poliklonsko antitelo zečjeg anti-vakcinija virusa koje je isporučio AbD Serotec, serijski broj 250906 i korišćeno je razblaženo 1:400. MACs pufer je bio fiziološki rastvor Dulbecco puferovan fosfatom 2mM EDTA 0.1% goveđi serum albumin (BSA). Pronazu je isporučila Roche Applied Science (kat. br. 10165921001) i rastvorila je u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) u 1 mg ml<-1>. MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum) i PMS (fenazin metosulfat) obezbedila je Promega. Medijum za kulturu T ćelija (TCM) je bio RPMI-1640, 10% FCS, 1% streptomicin, 1% penicilin i 1% natrijum piruvat. In vivo IC87114 je korišćen na 75 mg kg<-1>pomoću oralne gavaže. Rekombinantni faktor stimulacije kolonije makrofaga miša (M-CSF) je isporučen od strane R&D Sistems, kataloški br.415-ML. Korišćen je u koncentraciji od 30 ng ml<-1>. D-Luciferin je isporučila kompanija Caliper Life Sciences (broj serije: 124358465) i koristio se u dozi od 15 mg ml<-1>. Pufer vehikulum, koji se koristi ili kao kontrola ili za rastvaranje IC87114, napravljen je dodavanjem 0.25% Tween-20 i 0.5% karboksimetilceluloze u PBS.

Virus

[0055] VVL15 je bio ljubazan poklon profesora Istvan Fodor (Loma Linda University Campus, Loma Linda, CA, USA). Konstruisan je insercijom luciferaze svica i reporterskih gena lacZ u region timidin kinaze WLister pod kontrolom ranog-kasnog promotora vakcinije p7.5.

Primer 1: Infekcija tumorskih ćelija modifikovanim virusom u modelima golih miševa i imunokompetentnih miševa

[0056] Slika 1A prikazuje da postoji značajno više p110 delta RNK za tri sata u splenocitima imunokompetentnih miševa tretiranih VVL15 u poređenju sa svim drugim stanjima (P<0.001). Ovo implicira da postoji virusno indukovana ushodna regulacija p110 delta RNK u splenocitima dobijenim od imunokompetentnih miševa, ali ne i golih, pružajući dalje naznake o razlikama između modela i barem uverljivo dajući veću težinu konceptu da makrofagi slezine imaju centralnu ulogu u klirensu VVL15. Slika 1B pokazuje da se ova regulacija p110 delta RNK prevodi u ekspresiju proteina u imunokompetentnim mišjim makrofagima tretiranim

1

virusom u poređenju sa lažno tretiranim. Slika 1C pokazuje da inhibicija p110 delta od strane IC87114 (selektivni inhibitor) značajno smanjuje vezivanje VL15 za makrofage.

[0057] Iako se smatra da je IC87114 prilično specifičan, sigurno bi mogao da ometa druge kinaze (Camps et al., Nat Med, 2005.11(9): p.936-43). Stoga postoji potreba da se utvrdi da je uočeno smanjenje vezivanja VVL15 ustvari posledica što IC87114 blokira p110 delta aktivnost. Shodno tome, makrofagi poreklom iz koštane srži iz transgenog p110 delta „knock-in“ (ovo je mutacija koja inaktivira „mrtvu kinazu“) korišćeni su u testu vezivanja. Slika 1D pokazuje da postoji slično značajno smanjenje vezivanja VVL15 za makrofage divljeg tipa tretirane sa IC87114 u poređenju sa heterozigotnim i homozigotnim transgenim makrofagima (P<0.01 ili P<0.05). Ovi podaci sugerišu da je smanjenje vezivanja uočeno kod makrofaga divljeg tipa tretiranih sa IC87114 posledica selektivne inhibicije p110 delta. Stoga je logično sugerisati da je delta p110 uključena u proces vezivanja virusa za makrofag. Zanimljivo je da nema razlike u smanjenju vezivanja između heterozigotnih i homozigotnih p110 delta „knock-in“ makrofaga, što implicira da se nakon određenog nivoa delta blokade VVL15 vezuje za ćeliju na p110 delta nezavisan način.

[0058] U prikazanim primerima, odlučeno je da se koristi 75 mg kg<-1>kao doza IC87714. Odlučeno je da se ova doza primeni tri sata pre sistemske isporuke VVL15. Ovaj tajming je zasnovan na in vitro podacima prikazanim na slici 1C koji su pokazali da je došlo do smanjenja vezivanja virusa za makrofage nakon tri sata inkubacije sa IC87114 i farmakokinetičke studije sprovedene na pacovima koja pokazuje da je vreme do maksimalne koncentracije u plazmi nakon oralne primene IC87114 bilo 4 sata. Slika 2A pokazuje da 75mg kg<-1>doziranje proizvodi dosledno veću luminiscenciju tumora u poređenju sa kontrolom. IC87714 je primenjen oralno, nakon čega je usledila intravenska injekcija VVL15.

Primer 2: Studije efikasnosti

[0059] Nakon toga, ova kombinacija inhibitora i virusa je korišćena u dve studije efikasnosti na različitim modelima miševa (Slike 2B i 2C), od kojih je jedan optimizovan kao pouzdan ortotopski metastatski model koji odražava verovatnu kliničku primenu ovog tretmana. Ove studije su pokazale da IC87114 poboljšava anti-tumorsku efikasnost sistemski isporučenog VVL15 in vivo dajući kako smanjeno opterećenje tumorom tako i prednost u preživljavanju. Tumori kod miševa Grupe D (IC87114 VVL15, slike 2B i 2C) su na kraju počeli da se povećavaju i miševi su uginuli, ali VVL15 je virus deletiran timidin kinazom i daleko je manje

1

efikasan od drugih dostupnih modifikovanih virusa vakcinije naoružanih imunomodulirajućim transgenima.

[0060] Slika 2E ilustruje ex vivo interferon gama test izveden na splenocitima dobijenim od BALB/c miševa koji nose CT26 tumore. Ovo je pokazalo da su splenociti dobijeni od miševa tretiranih optimizovanim režimom razvili slične antitumorske IFN gama odgovore na sve druge testirane grupe. Međutim, splenociti izvedeni iz grupe IC87114 VVL15 su imali smanjene nivoe IFN gama nakon stimulacije virusnim proteinom B8R u poređenju sa splenocitima iz grupe lečene samo virusom. Stoga se čini da pre-tretman sa IC87114 umanjuje u veličini kasniji razvoj antivirusnog odgovora. Ovo bi potencijalno moglo značiti da osim efekta koji IC87114 ima na makrofage u ranoj vremenskoj tački, on ima poseban, trajniji efekat koji vodi smanjenom antivirusnom imunitetu i uspostavljanju efikasne infekcije tumora što dovodi do uočenog poboljšanja u efikasnost u poređenju sa samim virusom.

1

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Komplet delova koji sadrži inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K delta) i modifikovani virus vakcinije za upotrebu u postupku za lečenje kancera, pri čemu je gen za timidin kinazu deletiran iz virusnog genoma modifikovanog virusa vakcinije, pri čemu postupak sadrži primenu modifikovanog virusa vakcinije nakon primene inhibitora fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K delta), pri čemu je modifikovani virus vakcinije za intravensku primenu i pri čemu kancer je neresektabilni tumor.

2. Komplet delova za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u kome je inhibitor fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K delta) izabran iz grupe koja se sastoji od: IC-87114, PI-103, TGX221, A66, AS 604850, idelalisiba, vortmanina, alpelisiba, buparlisiba, copanlisiba, duvelisiba, rigosertiba i taselisiba, ili njihovog derivata ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

3. Komplet delova za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 u kome je modifikovani virus vakcinije dalje modifikovan insercijom gena koji kodira terapeutsko sredstvo, ili delecijom, ili inaktivacijom putem insercije virusnog gena.

4. Komplet delova za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u kome komplet dalje sadrži dodatno sredstvo protiv kancera ili citostatski lek.

2