RS64769B1 - Varijante adeno-asociranih virusa i postupci upotrebe - Google Patents

Varijante adeno-asociranih virusa i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS64769B1
RS64769B1 RS20231029A RSP20231029A RS64769B1 RS 64769 B1 RS64769 B1 RS 64769B1 RS 20231029 A RS20231029 A RS 20231029A RS P20231029 A RSP20231029 A RS P20231029A RS 64769 B1 RS64769 B1 RS 64769B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
aav
seq
neurons
viral
Prior art date
Application number
RS20231029A
Other languages
English (en)
Inventor
Joshua Dudman
Adam Hantman
Loren Looger
Kimberly Ritola
David Schaffer
Dougal Gowanlock Robinson Tervo
Sarada Viswanathan
Bum-Yeol Hwang
Alla Karpova
Original Assignee
Hughes Howard Med Inst
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hughes Howard Med Inst, Univ California filed Critical Hughes Howard Med Inst
Publication of RS64769B1 publication Critical patent/RS64769B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6027—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses ssDNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
[0001] Ovo otkriće se generalno odnosi na varijante adeno-asociranih virusa i postupke pripreme i upotrebe.
STANJE TEHNIKE
[0002] Funkcije mozga kao što su percepcija, kognicija i kontrola pokreta zavise od koordinisanog delovanja velikih neuronskih mreža, koje se sastoje od lokalnih modula kola koji obavljaju specifične proračune i povezani su vezama dugog dometa koje distribuiraju rezultate ovih proračuna. Takve veze dugog dometa su formirane od specijalizovanih projekcionih neurona koji često uključuju nekoliko pomešanih klasa, od kojih svaka projektuje na drugo nishodno ciljno mesto unutar mreže. Projekcioni neuroni su takođe umešani u širenje nekoliko neurodegenerativnih bolesti sa prostorno lokalizovanih mesta početka. Stoga će sposobnost selektivnog ciljnog delovanja na specifične klase projekcionih neurona za isporuku transgena (npr. za praćenje aktivnosti/manipulaciju ili uređivanje genoma za ciljano izbacivanje gena ili popravku patoloških mutacija) biti važna i za sticanje uvida u to kako mreže velikih razmera doprinose funkciji mozga i, dugoročno gledano, terapijskoj intervenciji kod neurodegenerativnih bolesti.
[0003] Virusni vektori predstavljaju važnu klasu alata za uvođenje transgena u specifične neuronske populacije i daleko su najbolja opcija za genetski pristup neuronima ciljne projekcije kroz ulazak na krajeve aksona i retrogradni transport njihovog korisnog opterećenja do jedara ćelija. Brojni prirodno evoluirani neurotropni virusi pokazuju retrogradno širenje kao deo svog životnog ciklusa, uključujući, između ostalog, besnilo, poliovirus i herpes simpleks virus (HSV). Od njih, virus besnila je posebno neuroinvazivan i brzo se širi kroz nervni sistem putem transcelularnog prenosa. Međutim, njegov potencijal i za biološka istraživanja i za gensku terapiju otežava prekomerna virulentnost, iako je napravljen napredak ka smanjenju njegove toksičnosti. Pored prirodno neurotropnih sojeva, mnogi drugi virusi mogu inficirati neurone kada se daju direktno u nervni sistem, sa "pseudobesnilom" (SuHV1, zapravo herpesvirus), adenovirusima i lentivirusima koji se najčešće koriste u istraživanjima na životinjama. Pasji adenovirus-2 (CAV-2) pokazuje najbolju infektivnost i retrogradni transport u ovoj klasi virusa i sve više postaje reagens izbora za pristup projekcionim neuronima. CAV-2, međutim, posreduje samo u skromnim nivoima ekspresije transgena, pokazuje potencijal za toksičnost i trenutno nije lako kompatibilan sa skalabilnom, robusnom proizvodnjom za stvaranje kliničkih studija ili čak velikih studija na životinjama. Stoga, ostaje hitna potreba za razvojem netoksičnog, lako proizvedenog virusnog vektora koji omogućava fleksibilno pakovanje različitih transgena, koji je robusno internalizovan i retrogradno transportovan aksonima, i podržava dugoročnu ekspresiju korisnog opterećenja na visokom nivou.
[0004] Lochrie et al., 2006, Virology, 353:68-82 opisuje adeno-asocirane virusne kapsidne gene izolovane iz genomske DNK jetre pacova i miša koji definišu dve vrste AAV koje su udaljene od AAV-5. Bello et al., 2014, Scientific Reports, 4:6644 opisuje adeno-asocirane viruse izvedene iz tkiva svinja koji transduciraju većinu glavnih organa kod miševa. WO 2016/054554 A1 opisuje rekombinantne adeno-asocirane viruse koji imaju različite sposobnosti ciljnog delovanja na tkiva. WO 2006/119150 A2 opisuje virusne kapsidne proteine sa povećanim ciljnim delovanjem na neurone i povećanim retrogradnim transportom. WO 2015/121501 A1 opisuje rekombinantni AAV vektor. Salegio et al., 2013, Gene Therapy, 20:348-352 opisuje aksonski transport adeno-asociranih virusnih vektora koji je zavisan od serotipa. Aschauer et al., 2013, Plos One, 8:e76310 opisuje analizu efikasnosti transdukcije, tropizma i aksonskog transporta AAV serotipova 1, 2, 5, 6, 8 i 9 u mozgu miša. WO 2015/038958 A1 opisuje postupke selektivnog skrininga, različite ciljne proteine i sekvence, kao i postupke njihove upotrebe.
REZIME
[0005] Efikasan retrogradni pristup projekcionim neuronima za isporuku senzora i efektora predstavlja važnu i omogućavajuću sposobnost za disekciju kola. Takav pristup bi takođe bio koristan za gensku terapiju, uključujući lečenje neurodegenerativnih poremećaja koje karakteriše patološko širenje kroz funkcionalno povezane i visoko distribuirane mreže. Virusni vektori su, posebno, moćna sredstva za isporuku gena za nervni sistem, ali svi dostupni alati pate od neefikasnog retrogradnog transporta ili ograničenog kliničkog potencijala. Da bismo odgovorili na ovu potrebu, in vivo usmerena evolucija je primenjena da se konstruiše moćna retrogradna funkcionalnost u kapsid adeno-asociranog virusa (AAV) - vektor koji je obećavajući u istraživanju neuronauke i klinici. Ovde opisana varijanta, nazvana rAAV2-retro, dozvoljava robustan retrogradni pristup projekcionim neuronima sa efikasnošću uporedivom sa klasičnim sintetičkim retrogradnim reagensima za obeležavanje, i omogućava visok nivo ekspresije koji je dovoljan za ispitivanje funkcionalnog kola i in vivo uređivanje genoma pomoću CRISPR/Cas9 u ciljanim neuronskim populacijama.
[0006] Pronalazak je kao što je navedeno u patentnim zahtevima. Virusni kapsidni proteini opisani u sledećim pasusima, ukoliko ne spadaju u obim zahteva, nisu deo pronalaska.
[0007] U jednom aspektu, obezbeđen je protein virusnog kapsida koji uključuje sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od xxDxTKx (SEQ ID NO:1) i xDxTKxx (SEQ ID NO:2), pri čemu protein virusnog kapsida ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 i 78. Protein virusnog kapsida može imati najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 ili 78. Virusni kapsid protein može imati sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 ili 78. Virusni kapsid protein može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja ima najmanje 95% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ili 77. Virusni kapsid protein može biti kodiran nukleinskom kiselinom koja ima sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 i 77.
[0008] U još jednom aspektu, obezbeđena je virusna čestica koja uključuje protein virusnog kapsida kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, virusna čestica pokazuje sklonost ka retrogradnom kretanju. U nekim primerima izvođenja, virusna čestica poseduje sposobnost retrogradnog transporta.
[0009] U nekim primerima izvođenja, virusna čestica kako je ovde opisana dalje uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira korisni teret. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira korisni teret uključuje promotorsku sekvencu koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom koja kodira korisni teret. Reprezentativne sekvence promotora uključuju, bez ograničenja, sinapsin-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1alfa, TRE i mDlx. U nekim primerima izvođenja, kodirajuća sekvenca koja kodira korisni teret je izabrana iz grupe koja se sastoji od gena koji kodira protein i inhibitorne RNK nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, inhibitorna RNK nukleinska kiselina je antisens oligonukleotid, siRNA ili RNAi.
[0010] U nekim primerima izvođenja, korisni teret je efektorski protein. Reprezentativni efektorski proteini uključuju, bez ograničenja, rekombinazu (npr. Cre ili Flp), sistem za uređivanje gena (npr. CRISPR/Cas9, TALEN, nukleaza cinkovog prsta), optogenetičke reagense (aktivatore (npr. kanalrodopsin ili njihove varijante) (npr. halorodopsin ili Arch)), hemogenetičke reagense (npr. aktivator/inhibitor verzije DREADD ili PSAM/PSEM sistema), aktivatore i/ili inhibitore puteva ćelijskog sistema i enzime za kontrolu epigenetike.
[0011] U nekim primerima izvođenja, korisni teret je optička reporterska konstrukcija. Reprezentativne optičke reporterske konstrukcije uključuju, bez ograničenja, GCaMP6 (s, m ili f), fluorofor (npr. zeleni fluorescentni protein (GFP), poboljšani GFP (EGFP), crveni fluorescentni protein (RFP), žuti fluorescentni protein (YFP)), tdTomato), konstrukt za okretanje boja (npr. korisni teret koji eksprimira jednan reporter u jednoj ćelijskoj populaciji i drugi reporter u drugoj populaciji), senzore glukoze, jRCaMP, jRGECO i CaMPARI, indikatore napona, sekundarne glasnike, signalizatore receptora, transkripcione reportere, epigenetičke reportere i reportere neuromodulatora.
[0012] U nekim primerima izvođenja, korisni teret je virusni protein. Reprezentativni virusni protein je G protein besnila. U nekim primerima izvođenja, virusni protein je protein koji dopunjuje funkciju virusa koji nije AAV ili protein koji se odnosi na ćelijski i transćelijski transport.
[0013] U nekim primerima izvođenja, kodirajuća sekvenca koja kodira korisni teret je terapeutski gen. U nekim primerima izvođenja, terapeutski gen je za lečenje neurodegenerativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, terapeutski gen je HSP104 za lečenje Alchajmerove bolesti ili drugih bolesti sa toksičnim proteinskim agregatima. U nekim primerima izvođenja, terapeutski gen je frataksin za lečenje Fridrihove ataksije. U nekim primerima izvođenja, terapeutski gen je lizozomalna glukocerebrozidaza (GBA) za lečenje Parkinsonove bolesti. U nekim primerima izvođenja, terapeutski gen je poliQ-vezujući protein za lečenje Hantingtonove bolesti. U nekim primerima izvođenja, terapeutski gen je motorni neuron 1 preživljavanja za lečenje spinalne mišićne atrofije, amiotrofne lateralne skleroze (ALS), autizma, demencije, periferne neuropatije, šizofrenije ili degeneracije retine.
[0014] U nekim primerima izvođenja, korisni teret je terapeutski deo. Reprezentativni terapeutski deo je antitelo ili njegov fragment. Reprezentativni terapeutski deo je imunomodulatorni protein. Reprezentativni terapeutski deo je interferentni molekul RNK.
[0015] U nekim primerima izvođenja, ovde opisane virusne čestice pokazuju do dva reda veličine veći retrogradni pristup neuronima kortiko-pontinske projekcije nego pseći adenovirus-2 (CAV-2). U nekim primerima izvođenja, retrogradni pristup neuronima kortikopontinske projekcije ili aferentima dorzomedijalnog strijatuma (DMS) je uporediv sa sintetičkim detektorom, fluorescentnim perlama fluoro-zlata.
[0016] Takođe je opisan postupak isporuke korisnog tereta jednom ili više neurona. Takav postupak obično uključuje dovođenje u kontakt jednog ili više neurona sa varijantnim adenoasociranim virusom (AAV) koji uključuje upakovano opterećenje, pri čemu varijanta AAV uključuje protein kapsida koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) i xDxTKxx (SEQ ID NO:2). U nekim primerima izvođenja, varijanta AAV pokazuje retrogradno kretanje u neuronima.
[0017] Sledeći aspekt je varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) koja se sastoji od korisnog tereta upakovanog u njega, za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog poremećaja, postupka koji sadrži dovođenje u kontakt jednog ili više neurona sa pomenutom varijantom AAV, pri čemu pomenuta varijanta AAV sadrži protein kapsida koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) i xDxTKxx (SEQ ID NO:2), pri čemu varijanta AAV ima sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 i 78.
[0018] U nekim primerima izvođenja, neuroni su projekcijski neuroni. U nekim primerima izvođenja, neuroni su u subjektu (npr. u centralnom nervnom sistemu (CNS) u subjektu). U nekim primerima izvođenja, subjekat je čovek. U nekim primerima izvođenja, subjekat je nečovek (npr. primat, glodar, gmizavac ili ptica). Korak dovođenja u kontakt može biti u ćelijskoj kulturi. U nekim primerima izvođenja, korak dovođenja u kontakt je in vivo putem intrakranijalne, intraspinalne ili intramuskularne injekcije.
[0019] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj pripadaju postupci i kompozicije materije.
OPIS CRTEŽA
[0020]
Slika 1 prikazuje usmerenu evoluciju rAAV2-retro. Panel A na slici 1 je šematski prikaz postupka usmerene evolucije. Biblioteke plazmida koje sadrže varijante AAV cap gena prethodno generisane PCR-om sklonim greškama, insersijom peptida, randomizacijom regiona petlje i mešanjem DNK su upakovane i ubrizgane u supstanciju nigru ili duboka jezgra malog mozga. Tri nedelje kasnije, strijatalno ili tkivo zadnjeg mozga je uklonjeno, virusni genomi su izolovani, a odabrani cap geni su amplifikovani i spakovani za sledeći krug selekcije. Panel B na Slici 1 prikazuje izmešane subpopulacije kortikalnih neurona koji se projektuju na strijatum (CP: caudate-putamen), talamus i superior colliculus (SC) retrogradno obeleženih ubrizgavanjem rAAV2-retro koji nose različite fluorescentne proteine u odgovarajućem aksonskom polju.
Slika 2 prikazuje rezultate eksperimenata za kvantitativno određivanje efikasnosti retrogradnog transporta. Panel A na Slici 2 prikazuje kortiko-pontinski trakt obeležen bazalnom injekcijom rAAV2-retro [Gornji panel Panela A prikazuje šemu eksperimenta; konzistentnost ciljnog delovanja i kvalitet injekcije praćeni su zajedničkim ubrizgavanjem AAV1-CAG-EGFP. Donji panel panela A pokazuje nivo ekspresije 3 nedelje nakon injekcije. Razmernik 1 mm]. Panel B na slici 2 prikazuje dizajn testa kvantitativnog određivanja [Gornji panel panela B prikazuje šemu eksperimenta; strelica pokazuje očekivano nuklearno obeležavanje GFP u kortikalnim neuronima kortiko-pontinskog trakta. Srednji panel panela B prikazuje reprezentativnu sliku mozga kome je ubrizgan AAV2. Donji panel panela B prikazuje reprezentativnu sliku mozga kome je ubrizgan rAAV2 retro. Razmernik: 1 mm]. Panel C na slici 2 prikazuje šemu poluautomatskih postupaka kvantitativnog određivanja. Fluorescentna jezgra (zeleno) su automatski otkrivena i prebrojana duž ručno nacrtane linije koja je pratila dužinu kortikalnog sloja V (crno). Panel D na slici 2 prikazuje efikasnost retrogradnog transporta za različite AAV serotipove i za pseći adenovirus-2 (CAV-2). Trake grešaka predstavljaju SEM. Takođe pogledati sliku 8.
Slika 3 prikazuje rezultate eksperimenata koji demonstriraju opštost retrogradnog transporta koji pruža rAAV2-retro. Panel A na slici 3 su reprezentativne slike koje prikazuju opsežno obeležavanje u glavnim ulaznim strukturama u dorzalni strijatum uključujući korteks (slika #1), amigdalu (slika #3) i talamus (slika #4). Panel B na slici 3 prikazuje šemu automatizovane kvantifikacije retrogradnog obeležavanja celog mozga. Snimljeni su mozgovi Rosa26-LSL-H2B-GFP kojima je ubrizgan rAAV2-retro hSyn1-Cre da bi se vizuelizovala jezgra obojena DAPI i zelena fluorescencija iz jedara koja eksprimiraju H2B-GFP. Zeleni kanal se koristi za otkrivanje obeleženih neurona; plavi kanal je usklađen sa Nissl slikama iz standardnog mozga miša iz Allen Brain Instituta. Poravnanje dozvoljava da se otkriveni neuroni dodeljuju različitim regionima koristeći napomenu koju daje atlas mozga. Razmernik: 1.25 mm. Panel C na slici 3 prikazuje kvantitativno određivanje retrogradnog obeležavanja celog mozga iz malog regiona dorzo-medijalnog strijatuma. Skraćenice za različite oblasti mozga date su prema Allen Brain Atlasu. Strelica ističe SNc. Trake grešaka predstavljaju SEM.
Na slici 4 su podaci iz eksperimenata u kojima je rAAV2-retro sistem kombinovan sa Cre drajverskim linijama. Panel A na slici 4 prikazuje šemu eksperimenta. rAAV2-retro koji nosi Cre-zavisni fluorescentni reporter koji okreće boju je ubrizgan u strijatum kortikalnog sloja V-specifične Cre-linije. Panel B na slici 4 prikazuje dva kortiko-strijatalna puta različito obeležena kroz Cre-zavisnu inverziju reportera na jednom putu, ali ne i na drugom.
Slika 5 su podaci iz eksperimenata koji pokazuju da rAAV2-retro podržava dovoljnu ekspresiju transgena za ispitivanje funkcionalnog kola. Panel A na slici 5 je šematski prikaz eksperimenta. Ekspresija indikatora kalcijuma GCaMP6f je ograničena na kortiko-pontinske neurone korišćenjem lokalizovane injekcije rAAV2-retro u bazalni most. Panel B na slici 5 je poprečni presek mozga koji pokazuje ekspresiju GCaMP6f kroz kortiko-pontinski trakt. Panel C na slici 5 prikazuje maksimalnu projekciju dvofotonske kalcijumske slike koja prikazuje some piramidalnog trakta sloja V i apikalne dendrite. Panel D na slici 5 prikazuje aktivnost 89 ROI tokom ponavljanja dohvata jedne ruke (isprekidana linija označava ton "kreni" signal). Panel E i Panel F na slici 5 su dva primera pojedinačnih kortiko-pontinskih neurona tokom 40 uzastopnih ispitivanja (ista životinja kao na panelu B i panelu D na slici 5).
Na slici 6 su podaci koji pokazuju da rAAV2-retro sistem omogućava in vivo uređivanje genoma pomoću CRISPR/Cas9. Panel A na slici 6 je šema eksperimenta [Gornji panel panela A pokazuje da je rAAV2-retro sistem korišćen za isporuku Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) - kombinacija RNK sa jednim vodičem dizajnirana da ukloni ekspresiju tdTomato. Donji panel panela A pokazuje da je rAAV2-retro koji nosi SaCas9-anti-tdTomato korisni teret ubrizgan u bazalni pons miševa koji eksprimiraju tdTomato iz jednog genomskog lokusa u neuronima sloja V]. Panel B na slici 6 prikazuje reprezentativne slike iz delova mozga životinja koje su primile CRISPR/Cas9 sistem usmeren na tdtomato ili koji nose neciljani vodič. SaCas9 je bio označen epitopom, što je omogućavalo identifikaciju retrogradno obeleženih neurona (zeleni kanal). Strelice nagore pokazuju očekivano obeležavanje nakon uspešne ablacije tdTomato; Strelice nadole pokazuju očekivano označavanje ako nema uticaja na tdTomato izraz. Panel C na slici 6 pokazuje efikasnost ablacije. Trake grešaka predstavljaju SEM.
Slika 7 je podatak koji pokazuje da rAAV2-retro posreduje u efikasnom pristupu projekcionim neuronima kod pacova (podaci prikazani na slici 7 povezani su sa podacima prikazanim na slici 1). Panel A na slici 7 je šematski prikaz ubrizgavanja. Odvojene količine rAAV2-retro ekspresije EGFP ili tdTomato su ubrizgane u strijatum ili superiorni kolikulus. Paneli B-E na slici 7 prikazuju neurone projekcije u različitim regionima mozga kojima se pristupa putem ovih lokalizovanih injekcija i snimljenih 3 nedelje nakon isporuke virusa.
Slika 8 su reprezentativne slike mozgova životinja kojima su ubrizgani različiti AAV serotipovi u bazalnom mostu, pokazujući da nijedan AAV serotip koji se javlja u prirodi ne odgovara rAAV2-retro performansama u kortiko-pontinskom kolu (podaci prikazani na slici 8 povezani su sa prikazanim podacima na slici 2).
Slika 9 su podaci koji pokazuju smanjeni afinitet heparina za rAAV2-retro u poređenju sa njegovim roditeljskim serotipom AAV2 (podaci prikazani na Slici 9 povezani su sa podacima prikazanim na Slici 1). Panel A na slici 9 je šema testa vezivanja heparina. Panel B na Slici 9 prikazuje frakciju virusa eluiranu sa rastućom koncentracijom NaCl nakon punjenja u 150 mM NaCl. Frakcija opterećenja predstavlja virus dobijen u protoku iz kolone nakon punjenja uzorka u 150 mM NaCl. Trake grešaka predstavljaju SD.
DETALJAN OPIS
[0021] Rekombinantni adeno-asocirani virusi (rAAV) su se pojavili kao efikasna platforma za in vivo gensku terapiju, pošto posreduju ekspresiju transgena visokog nivoa, nisu toksični i izazivaju minimalne imune odgovore. Ova svojstva su bila u osnovi odluke da se dodeli prvo potpuno regulatorno odobrenje za bilo koji tretman genskom terapijom za obnavljanje deficita lipoprotein lipaze posredovano preko rAAV (videti, na primer, Gaudet et al., 2010, Atherosclerosis Supplem., 11:55-60). rAAV su visoko obećavajući u kliničkim ispitivanjima za niz neuroloških poremećaja, i predstavljaju neke od najrasprostranjenijih vektora u istraživanju neuronauke. Od prvobitnog otkrića da AAV može da se podvrgne retrogradnom transportu (Kaspar et al., 2002, Mol. Ther., 5:50-56), rAAV su omogućili određeni stepen retrogradnog pristupa projekcionim neuronima u odabranim krugovima, ali je njihova prirodna sklonost retrogradnom transportu niska, što ometa napore da se pozabave ulogom projekcionih neurona u proračunima kola ili progresiji bolesti.
[0022] Ovo otkriće opisuje novu varijantu rAAV (rAAV2-retro) koja je, pored svoje redovne sposobnosti da inficira tela neuronskih ćelija na mestu izloženosti, robusno internalizovana aksonima i posreduje u retrogradnom pristupu projekcionim neuronima sa efikasnošću koja je uporediva sa klasičnim retrogradnim obeležavajućim reagensima kao što su sintetičke boje. Ovde opisani sistem za isporuku gena rAAV2-retro može se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa pokretačkim linijama Cre rekombinaze da bi se postigla dugoročna ekspresija transgena visokog nivoa koja je dovoljna za efikasno funkcionalno ispitivanje funkcije nervnog kola, kao i za uređivanje genoma u ciljanim neuronskim populacijama.
[0023] Retrogradni transport odvodi molekule i/ili organele od krajeva aksona ka telu ćelije. Retrogradni aksonski transport je posredovan citoplazmatskim dineinom i koristi se, na primer, za slanje hemijskih poruka i produkata endocitoze koji se kreću ka endolizozomima iz aksona nazad u ćeliju. Operativni in vivo pri prosečnim brzinama od približno 2 µm/sec, brzi retrogradni transport može pokriti 10-20 centimetara dnevno. Brzi retrogradni transport vraća korišćene sinaptičke vezikule i druge materijale u somu i obaveštava somu o uslovima na krajevima aksona. Dakle, kako se ovde koristi, "retrogradni" transport se odnosi na kretanje aksona ka njegovom ćelijskom telu.
Sekvence nukleinske kiseline i polipeptida virusa asociranog sa adeno (AAV)
[0024] Kao što je ovde opisano, identifikovane su konsenzus sekvence koje, kada su prisutne u AAV kapsidnom proteinu, dovode do dubokog poboljšanja u efikasnosti retrogradnog transporta. Te konsenzus sekvence su xxDxTKx (SEQ ID NO:1) ili xDxTKxx (SEQ ID NO:2). Da bi se demonstrirala efikasnost ovde opisanih konsenzusnih sekvenci za davanje sposobnosti retrogradnog transporta, sedamnaest različitih kapsidnih sekvenci, od kojih svaka sadrži konsenzus sekvence kao što je ovde opisano, generisano je i pokazalo se da pokazuju preferenciju za retrogradno kretanje u neuronima. Sekvenca nukleinske kiseline tih 40 kapsidnih sekvenci prikazana je u SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, i 77, i kodirani kapsidni polipeptidi koje sadrže jednu od konsenzus sekvenci opisanih ovde, prikazane su u SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 i 78, respektivno.
[0025] Pored kapsidnih polipeptida koji imaju sekvence prikazane u SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 i 78, polipeptidi koji su obezbeđeni imaju najmanje 95% identičnosti sekvence (npr., najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnost sekvence) sa kapsidnim polipeptidima koji imaju sekvence prikazane u SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 i 78. Slično, pored molekula nukleinske kiseline koji imaju sekvence prikazane u SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 i 77, obezbeđeni su molekuli nukleinske kiseline koji imaju najmanje 95% identičnosti sekvence (npr. najmanje 96%, na najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnost sekvence) sa molekulima nukleinske kiseline koji imaju sekvence prikazane u SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 i 77.
[0026] Prilikom izračunavanja procenta identičnosti sekvence, dve sekvence se poravnavaju i određuje se broj identičnih podudaranja nukleotida ili aminokiselinskih ostataka između dve sekvence. Broj identičnih poklapanja je podeljen dužinom poravnatog regiona (tj. brojem poređanih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka) i pomnožen sa 100 da bi se dobila vrednost procenta identičnosti sekvence. Biće jasno da dužina poravnatog regiona može biti deo jedne ili obe sekvence do veličine pune dužine najkraće sekvence. Takođe će biti jasno da se jedna sekvenca može poravnati sa više od jedne druge sekvence i stoga može imati različite procentualne vrednosti identičnosti sekvence u svakom poravnatom regionu.
[0027] Poravnavanje dve ili više sekvenci da bi se odredio procenat identičnosti sekvenci može se izvršiti korišćenjem algoritma opisanog od Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:3389 3402) kao ugrađeni u programe BLAST (osnovni alat za pretragu lokalnog poravnanja), koji su dostupni na ncbi.nlm.nih.gov na World Wide Web. BLAST pretrage se mogu izvršiti da bi se odredio procenat identičnosti sekvence između sekvence (nukleinske kiseline ili aminokiseline) i bilo koje druge sekvence ili njenog dela usklađenog korišćenjem Altschul et al. algoritma. BLASTN je program koji se koristi za usklađivanje i upoređivanje identičnosti između sekvenci nukleinskih kiselina, dok je BLASTP program koji se koristi za usklađivanje i poređenje identičnosti između aminokiselinskih sekvenci. Kada se BLAST programi koriste za izračunavanje procenta identičnosti između sekvence i druge sekvence, generalno se koriste podrazumevani parametri odgovarajućih programa.
[0028] Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide. Vektori, uključujući ekspresione vektore, su komercijalno dostupni ili se mogu proizvesti rekombinantnom tehnologijom. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline može imati jedan ili više elemenata za ekspresiju koji su operativno povezani sa takvim molekulom nukleinske kiseline, i dalje može uključivati sekvence kao što su one koje kodiraju selektabilni marker (npr. gen otpornosti na antibiotike) i/ili one koje može se koristiti u prečišćavanju polipeptida (npr.6xHis oznaka). Elementi za ekspresiju uključuju sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i regulišu ekspresiju kodirajućih sekvenci nukleinske kiseline. Jedan primer ekspresionog elementa je sekvenca promotera. Ekspresioni elementi takođe mogu uključivati jedan ili više introna, pojačivača sekvenci, elemenata odgovora ili inducibilnih elemenata koji moduliraju ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Ekspresioni elementi mogu biti poreklom od bakterija, kvasca, insekata, sisara ili virusa, a vektori mogu sadržati kombinaciju ekspresionih elemenata različitog porekla. Kako se ovde koristi, operabilno povezan znači da su elementi za ekspresiju pozicionirani u vektoru u odnosu na kodirajuću sekvencu na takav način da usmeravaju ili regulišu ekspresiju kodirajuće sekvence.
[0029] Molekul nukleinske kiseline, npr., molekul nukleinske kiseline u vektoru (npr. ekspresioni vektor, virusni vektor) može se uvesti u ćeliju domaćina. Termin "ćelija domaćin" se odnosi ne samo na određenu ćeliju(e) u koju je molekul nukleinske kiseline uveden, već i na potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Stručnjacima su poznate mnoge pogodne ćelije domaćina; ćelije domaćini mogu biti prokariotske ćelije (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. ćelije kvasca, ćelije insekata, ćelije biljaka, ćelije sisara). Reprezentativne ćelije domaćini mogu uključivati, bez ograničenja, A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, 293 ćelije, Saos, C2C12, L ćelije, HT1080, HepG2 i ćelije primarnih fibroblasta, hepatocita i mioblasta dobijene od sisara uključujući čoveka, majmuna, miša, pacova, zeca i hrčka. Postupci za uvođenje molekula nukleinske kiseline u ćelije domaćina su dobro poznati u tehnici i uključuju, bez ograničenja, precipitaciju kalcijum fosfata, elektroporaciju, toplotni šok, lipofekciju, mikroinjekciju i prenos nukleinske kiseline posredovan virusom (npr. transdukciju).
[0030] Što se tiče polipeptida, "prečišćen" se odnosi na polipeptid (tj. peptid ili polipeptid) koji je odvojen ili prečišćen od ćelijskih komponenti koje ga prirodno prate. Tipično, polipeptid se smatra „prečišćenim“ kada je najmanje 70% (npr. najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99%) po suvoj težini, bez polipeptida i prirodno molekule sa kojima je prirodno povezan. Pošto je polipeptid koji je hemijski sintetisan po prirodi odvojen od komponenti koje ga prirodno prate, sintetički polipeptid se smatra „prečišćenim“, ali se dalje može ukloniti iz komponenti koje se koriste za sintezu polipeptida (npr. aminokiselinski ostaci). Što se tiče molekula nukleinske kiseline, "izolovani" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od drugih molekula nukleinske kiseline koji su obično povezani sa njim u genomu. Pored toga, izolovani molekul nukleinske kiseline može uključivati projektovani molekul nukleinske kiseline kao što je rekombinantni ili sintetički molekul nukleinske kiseline.
[0031] Polipeptidi se mogu dobiti (npr., prečišćeni) iz prirodnih izvora (npr., biološki uzorak) poznatim postupcima kao što su DEAE jonska razmena, gel filtracija i/ili hromatografija na hidroksiapatitu. Prečišćeni polipeptid se takođe može dobiti, na primer, ekspresijom molekula nukleinske kiseline u vektoru ekspresije ili hemijskom sintezom. Stepen čistoće polipeptida se može meriti korišćenjem bilo kog odgovarajućeg postupka, npr. hromatografije na koloni, elektroforeze u poliakrilamidnom gelu ili HPLC analize. Slično, molekuli nukleinske kiseline se mogu dobiti (npr. izolovati) korišćenjem rutinskih postupaka kao što je, bez ograničenja, tehnologija rekombinantne nukleinske kiseline (npr. digestija i ligacija restrikcionim enzimom) ili lančana reakcija polimeraze (PCR; vidi npr. PCR Primer: Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Pored toga, izolovani molekuli nukleinske kiseline mogu se hemijski sintetisati.
Postupci pripreme virusnih čestica koje ispoljavaju sklonost retrogradnom kretanju u neuronima
[0032] Jednom kada se proizvede kapsidni polipeptid, ili kada se molekul nukleinske kiseline generiše i eksprimira da proizvodi kapsidni polipeptid, polipeptid se može sklopiti u virusnu česticu koristeći, na primer, ćeliju domaćina za pakovanje. Komponente virusne čestice (npr. rep sekvence, cap sekvence, sekvence invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR)) mogu se uvesti, prolazno ili stabilno, u ćeliju domaćina za pakovanje korišćenjem jednog ili više vektora. Dok kapsidni polipeptid virusne čestice može da sadrži konsenzusnu sekvencu kao što je ovde opisana, preostale komponente mogu biti iz jednog ili više poznatih AAV serotipova (npr., AAV2, AAV8, itd.).
[0033] Takve virusne čestice mogu se prečistiti rutinskim postupcima. Kako se ovde koristi, "prečišćene" virusne čestice se odnose na virusne čestice koje su uklonjene iz komponenti u smeši u kojoj su napravljene, kao što su, ali ne ograničavajući se na, virusne komponente (npr. rep sekvence, cap sekvence), pakovanje ćelija domaćina, i delimično ili nepotpuno sastavljene virusne čestice.
[0034] Jednom sklopljene, virusne čestice se mogu testirati na, na primer, sposobnost replikacije; svojstva transfera gena; sposobnost vezivanja receptora; i/ili seroprevalenciju u populaciji (npr. ljudska populacija). Utvrđivanje da li se virusna čestica može replicirati je rutinsko u tehnici i tipično uključuje inficiranje ćelije domaćina određenom količinom virusnih čestica i određivanje da li se broj virusnih čestica povećava tokom vremena. Utvrđivanje da li je virusna čestica sposobna da izvrši transfer gena takođe je rutinska u tehnici i tipično uključuje inficiranje ćelija domaćina virusnim česticama koje sadrže transgen (npr. transgen koji se može detektovati kao što je reporter gen). Nakon infekcije i uklanjanja virusa, ćelije domaćina se mogu proceniti na prisustvo ili odsustvo transgena. Određivanje da li se virusna čestica vezuje za svoj receptor je rutinsko u struci i takvi postupci se mogu izvesti in vitro ili in vivo.
[0035] Određivanje seroprevalencije virusne čestice se rutinski izvodi u tehnici i tipično uključuje korišćenje imunološkog testa za određivanje prevalencije jednog ili više antitela u uzorcima (npr., uzorcima krvi) iz određene populacije individua. Seroprevalencija se u tehnici podrazumeva da se odnosi na proporciju subjekata u populaciji koja je seropozitivna (tj., koja je bila izložena određenom patogenu ili imunogenu), a izračunava se kao broj subjekata u populaciji koji proizvode antitelo protiv određenog patogena ili imunogena podeljen sa ukupnim brojem individua u ispitivanoj populaciji. Imunološki testovi su dobro poznati u tehnici i uključuju, bez ograničenja, imunodot, Western blot, enzimski imunološki test (EIA), enzimski imunološki test (ELISA) ili radioimunološki test (RIA). Slično tome, dostupno je nekoliko postupaka za određivanje stepena neutralizirajućih antitela u uzorku seruma. Na primer, analiza neutralizujućih antitela meri titar na kome eksperimentalni uzorak sadrži koncentraciju antitela koja neutrališe infekciju za 50% ili više u poređenju sa kontrolnim uzorkom bez antitela. Takođe videti, Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12); i Manning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85).
Postupci upotrebe virusa koji pokazuju sklonost ka retrogradnom kretanju u neuronima
[0036] Virus ili njegov deo kako je ovde opisan može da se koristi u brojnim istraživačkim i/ili terapeutskim primenama. Na primer, virus ili njegov deo kako je ovde opisan može da se koristi u humanoj ili životinjskoj medicini za gensku terapiju (npr., u vektoru ili vektorskom sistemu za transfer gena) ili za vakcinaciju (npr., za prezentaciju antigena). Tačnije, virus ili njegov deo kako je ovde opisan može da se koristi za dodavanje gena, povećanje gena, genetsku isporuku polipeptidnog terapeutika, genetsku vakcinaciju, utišavanje gena, uređivanje genoma, gensku terapiju, isporuku RNAi, isporuku cDNK, isporuku iRNK, isporuku miRNK, uklanjanje miRNA, genetsku imunizaciju, optogenetsku gensku terapiju, transgenezu, DNK vakcinaciju ili DNK imunizaciju.
[0037] Ćelija domaćina može biti transdukovana ili inficirana virusom ili njegovim delom in vitro (npr., rast u kulturi) ili in vivo (npr., u subjektu, npr., čoveku ili ne-čoveku). Ćelije domaćini koje se mogu transducirati ili inficirati virusom ili njegovim delom in vitro su ovde opisani; ćelije domaćina koje se mogu transducirati ili inficirati virusom ili njegovim delom in vivo uključuju, bez ograničenja, projekcione neurone (npr., neurone projekcije kortiko-pontina, neurone simpatičke projekcije, neurone projekcije centralnog nervnog sistema), aferente na dorzomedijalni strijatum (DMS), spinalne kortikalne/gljivične neurone, pre-cerebelarne neurone, ulaze u bazalnu gangliju, pretalamičke neurone, motorne neurone, senzorne neurone ili druge neurone ili ćelije centralnog nervnog sistema.
[0038] Virus ili njegov deo kao što je ovde opisan može da se modifikuje da uključi korisni teret. Korisni teret tipično uključuje najmanje jednu nukleinsku kiselinu (npr., promotorsku sekvencu koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom koja kodira korisni teret). U određenim slučajevima, teret može biti inhibitorna nukleinska kiselina. Inhibitorne nukleinske kiseline su poznate u tehnici i uključuju, na primer, antisens oligonukleotide, kratke interferentne RNK (siRNA) i molekule interferencije RNK (RNAi). U određenim slučajevima, koristan teret može biti jedan ili više gena koji kodiraju proteine. Bez ograničenja, geni koji kodiraju proteine uključuju optički reporterski konstrukt, terapeutski gen ili efektorski protein.
[0039] Mnogi tipovi optičkih reporterskih konstrukcija su poznati u tehnici, a sledeća lista treba da bude reprezentativna i ne iscrpna. Na primer, optičke reporterske konstrukcije uključuju, bez ograničenja, GCaMP6 (GCaMP6s, GCaMP6m ili GCaMP6f; videti WO 2014/059154), fluorofor (npr., zeleni fluorescentni protein (GFP), pojačani GFP (EGFP), crveni fluorescentni protein (RFP), žuti fluorescentni protein (YFP), tdTomato), konstrukt za promenu boje (npr., korisni teret koji eksprimira jedan reporter u jednoj ćelijskoj populaciji i drugi reporter u drugoj populaciji), senzore glukoze (npr., US 2015/0111222), iRCaMP (U.S. Patent br. 9,644,007), iRGECO (npr., U.S. Patent br. 9,644,007), CAMPARI (npr. U.S. Patent br. 9,518,996), indikatore napona, sekundarne glasnike, signalizatore receptora, transkripcione reportere, epigenetičke reportere i reportere neuromodulatora.
[0040] Terapeutski geni su takođe poznati u tehnici i zavisiće od određene bolesti ili poremećaja koji se leči. Na primer, terapeutski gen može biti za lečenje neurodegenerativnog poremećaja. Reprezentativni terapeutski geni (ili kodirani polipeptid) i njihovi povezani neurodegenerativni poremećaji uključuju, bez ograničenja, HSP104 za lečenje Alchajmerove bolesti, ataksiju (npr. frataksin) za lečenje Fridrajhove ataksije, lizozomalnu glukocerebrozidazu (GBA) za lečenje Parkinsonove bolesti, poliQ-vezujući protein za lečenje Hantingtonove bolesti, motorni neuron 1 za preživljavanje za lečenje spinalne mišićne atrofije i amiotrofne lateralne skleroze (ALS), autizma, demencije, periferne neuropatije, šizofrenije i degeneracije mrežnjače. U nekim slučajevima, koristan teret može biti terapeutski deo (za razliku od gena). Terapeutski delovi uključuju, na primer, antitelo ili njegov fragment, imunomodulatorni protein ili molekul interferencije RNK (RNAi).
[0041] Kako se ovde koristi, "efektorski" protein se odnosi na bilo koji tip proteina koji daje efekat na ćeliju ili njen sadržaj (npr., nukleinske kiseline, proteine, organele ili procese koji uključuju bilo šta od gore navedenog). Na primer, efektorski proteini uključuju, bez ograničenja, rekombinaze (npr. Cre ili Flp), sisteme za uređivanje gena (npr. CRISPR/Cas9, TALEN, nukleaza cinkovog prsta), optogenetičke reagense (aktivatore (npr., kanalrodopsin ili njegove varijante) ili inhibitore (npr., halorodopsin ili Arch)), hemogenetički reagensi (npr.
aktivator/inhibitor verzije DREADD ili PSAM/PSEM sistema), aktivatore i/ili inhibitore puteva ćelijskog sistema i enzime za kontrolu epigenetike.
[0042] Bilo bi jasno da bi moglo biti poželjno da se isporuči virusni protein koji dopunjuje ili inhibira funkciju virusa (npr., virus koji nije AAV). Na primer, virusni protein koji je ulazni receptor (npr., G protein besnila, protein koji se odnosi na ćelijski i/ili transćelijski transport).
[0043] Bilo koji broj promotora se može koristiti za pokretanje sekvence koja kodira korisni teret. Konstitutivni promotori su poznati u tehnici, kao i tkivno-specifični promotori (npr. neuron-specifični promotori). Jednostavno, kao primer, promotor može biti sinapsin-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1alfa, mDlx ili TRE promotor.
[0044] Virus ili njegov deo, obično suspendovan u fiziološki kompatibilnom nosaču, može se primenjivati na subjekta (npr., čoveka ili ne-humanog subjekta (npr., primata, glodara, gmizavca ili pticu)). Pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, koji se može formulisati sa različitim puferskim rastvorima (npr., fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom), laktozom, saharozom, kalcijum fosfatom, želatinom, dekstranom, agarom, pektinom i vodom. Virus ili njegov deo se primenjuje u dovoljnim količinama da transduciraju ili inficiraju ćelije i da obezbede dovoljne nivoe prenosa i ekspresije gena da bi se obezbedila terapeutska korist bez nepotrebnih štetnih efekata. Konvencionalni i farmaceutski prihvatljivi putevi primene uključuju, ali nisu ograničeni na, intrakranijalnu, intraspinalnu ili intramuskularnu injekciju. Dodatni putevi primene uključuju, na primer, oralno, intranazalno, intratrahealno, inhalacijom, intravenski, intraokularno, subkutano, intradermalno, transmukozno ili drugim putevima primene. Putevi primene se mogu kombinovati, po želji.
[0045] Doza virusa ili njegovog dela koji se primenjuje na subjekta zavisiće prvenstveno od faktora kao što su stanje koje se leči, i starost, težina i zdravlje subjekta. Na primer, terapeutski efikasna doza virusa ili njegovog dela koji se primenjuje na humanog subjekta generalno je u opsegu od oko 0.1 ml do oko 10 ml rastvora koji sadrži koncentracije od oko 1 × 10<1>do 1 × 10<12>kopije genoma (GC) virusa (npr., oko 1 × 10<3>do 1 × 10<9>GC). Transdukcija i/ili ekspresija transgena može se pratiti u različitim vremenskim tačkama nakon primene DNK, RNK ili proteinskim testovima. U nekim slučajevima, nivoi ekspresije transgena se mogu pratiti da bi se odredila učestalost i/ili količina doze.
[0046] Značajno je da AAV-retro čestice koje su ovde opisane pokazuju do dva reda veličine veći retrogradni pristup neuronima kortiko-pontinske projekcije nego, na primer, pseći adenovirus-2 (CAV-2), i retrogradni pristup određenim neuronima (npr., neuroni kortikopontinske projekcije ili aferenti na dorzomedijalni strijatum (DMS)) uporedivi su sa onim uočenim sa sintetičkim trejserom kao što su Fluoro-Gold<®>fluorescentne kuglice.
[0047] U skladu sa ovim pronalaskom, mogu se koristiti konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, biohemije i rekombinantne DNK u okviru tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pronalazak će dalje biti opisan u sledećim primerima.
PRIMERI
Primer 1-Eksperimentalni postupci
[0048] Svi postupci su obavljeni u skladu sa protokolima koje su odobrili Janelia Research Campus and the University of California Berkeley Institutional Animal Care and Use Committees.
Primer 2 - Generisanje biblioteke i proizvodnja virusa
[0049] Četiri prethodno generisane virusne biblioteke su korišćene na početku postupka usmerene evolucije: 1) nasumična biblioteka mutageneze generisana podvrgavanjem AAV2 cap gena (koji kodira virusne proteine VP1-3 i protein koji aktivira skup (AAP)) PCR-u sklonom greškama (Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol., 24:198-204); 2) biblioteka varijanti AAV2 cap gena koja sadrži 7-merne peptidne inserte između N587 i R588 (Müller et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:1040-6); 3) biblioteka varijanti AAV2 cap gena koje sadrže randomizovane regione petlje (Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95); i 4) biblioteka za mešanje DNK generisana od divljih tipova AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8 i AAV9 cap genskih sekvenci (Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9). Svaki skup mutantne DNK je prvobitno bio subkloniran u plazmid za pakovanje AAV kompetentnog za replikaciju da bi se stvorila biblioteka virusnih plazmida koja, kada se upakuje u AAV virione, može biti odabrana za bilo koje novo svojstvo ili funkciju. AAV sistem kompetentan za replikaciju inkorporira mutant cap gen u virusni korisni teret, i stoga je genotip svake varijante povezan sa njenim fenotipom. Kapsidne sekvence željenog svojstva se zatim mogu dobiti analizom DNK sekvence inkapsuliranog AAV genoma.
[0050] Četiri AAV biblioteke kompetentne za replikaciju su upakovane prolaznom transfekcijom ćelija HEK293-T kalcijum fosfatom nakon čega je usledilo sakupljanje virusa, centrifugiranje u gradijentu jodiksanola i Amicon filtracija (Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol., 24:198-204).
Primer 3-In Vivo Injekcije virusa ili trejsera
[0051] Za lokalizovanu in vivo isporuku virusa, miševi ili pacovi su anestezirani izofluranom (-2% zapremine u O2; SurgiVet, Smiths Medical) i mala rupa je izbušena u lobanji iznad potrebnog mesta injekcije (videti tabelu 1). Za neka mesta ubrizgavanja, nekoliko injekcija je napravljeno na različitim dubinama (videti tabelu 1). Za virusne injekcije, ~ 50-100 nl (miševi) ili 250-500 nl (pacovi) rastvora koji sadrži virus se polako ubrizgava na svakoj dubini u tkivo. Za injekcije tragača, 50 nl 5% fluoro-zlata (Fluorochrome, Denver, CO) u 0.9% NaCl, ili 100 nl retro-perli (LumaFluor, Durham, NC) razblaženih 1:1 u 0.9% NaCl je ubrizgano na isti skup mesta za svako ciljno mesto injekcije. Injekcije su izvedene sa izvučenom staklenom pipetom (slomljenom i zakošenom do 25-30 µm (spoljni prečnik); Drummond Scientific, Wiretrol II Capillary Microdispenser) napunjenom mineralnim uljem. Ugrađeni klip je umetnut u pipetu i napredovao da se sadržaj izmešta pomoću hidrauličnog manipulatora (Narashige, MO-10).
[0052] Za punjenje pipete virusom korišćeno je povlačenje klipa. Injekciona pipeta je postavljena pomoću Sutter MP-285 manipulatora.
Tabela 1. Koordinate korišćene u ovoj studiji
Primer 4-Izbor biblioteke i evolucija
[0053] Četiri mutantne virusne biblioteke su objedinjene i ubrizgane ili u SNr ili u mali mozak adultnih (6-8 nedelja) divljeg tipa C57/Bl6J miševa (bilo kog pola; Charles River). Tri nedelje nakon injekcija, strijatalno ili tkivo zadnjeg mozga je u skladu s tim uklonjeno, DNK je ekstrahovana, a virioni koji su uspešno stigli do udaljenog retrogradnog ciljnog tkiva su PCR-amplifikovani i ponovo klonirani u plazmid za pakovanje rcAAV da bi se stvorila nova AAV biblioteka kompetentna za replikaciju za sledeći krug selekcije. Nakon tri koraka selekcije, spašeni cap geni su nasumično mutirani PCR-om sklonom greškama koristeći 5'-ACG CGG AAG CTT CGA TCA ACT ACG CAG-3' (SEQ ID NO:79) i 5'-AGA CCA AAG TTC AAC TGA AAC GAA TTA AAC GG-3' (SEQ ID NO:80) kao prednji i reverzni prajmeri, respektivno.
[0054] Izvedena su dva dodatna in vivo kruga selekcije. Pojedinačni izolati su sekvencirani nakon 4. i 5. kruga da bi se procenio stepen obogaćivanja biblioteke (Tabela 2).
i 5 4 a m darun u ne va lo izote jan rivaza
nci vesekih an ir serinih dnti
pepjaci
gener
onv K
2. a bel Ta
[0055] Sedamnaest varijanti je izabrano za sekundarni skrining na kraju 5. kruga, a odgovarajuće sekvence cap gena su ponovo klonirane u rAAV pomoćni plazmid. Pojedinačne pripreme visokog titra roditeljskog divljeg tipa AAV2 i svake od izabranih 17 mutantnih varijanti koje nose CMV-EGFP korisni teret su zatim izvedene sa Vector BioLabs, Inc (Philadelphia, PA). CMV promotor je obično slab u neuronima, i stoga je ovaj sekundarni skrining obezbedio strogi test efikasnosti retrogradnog transporta. Pojedinačne AAV varijante su ubrizgane ili u mali mozak ili u globus pallidus. Posle 3 nedelje, vizuelizovana je endogena, neamplifikovana fluorescencija EGFP u regionima za koje se očekuje da će biti obeleženi ako je retrogradni transport efikasan. Mutant 5R-Hind6 (SEQ ID NO:43 koji kodira SEQ ID NO:44) pokazao je najjači retrogradni transport u oba kruga, i stoga je izabran za dalju analizu i označen kao rAAV2-retro.
Primer 5 - Test vezivanja heparina
[0056] Heparinski afinitet AAV2-retro i divljeg tipa AAV2 je analiziran kao što je prethodno opisano (Jang et al., 2011, Mol. Ther., 19:667-75). Ukratko, otprilike 10<11>prečišćenih genomskih čestica je stavljeno na 1 mL HiTrap heparinsku kolonu (GE Healthcare Sciences, Piscatavai, NJ) prethodno ekvilibrisanu sa 150 mM NaCl i 50 mM Tris na pH 7.5. Eluiranje je zatim izvedeno povećanjem koncentracije NaCl u koracima od 50 mM do konačne koncentracije od 950 mM, nakon čega je usledilo ispiranje sa 1M NaCl. Mali deo svakog eluiranja je korišćen za inficiranje ćelija HEK293T, a procenat GFP pozitivnih ćelija je kvantitativno određen 48 sati nakon infekcije korišćenjem Guava EasyCyte 6HT protočnog citometra (EMD/Millipore).
Primer 6-Korisni tereti korišćeni u studiji
[0057] Za sve naredne eksperimente, CMV promotor je zamenjen promotorom za koji se zna da je robusniji u neuronima odraslih. Cre rekombinaza i GCaMP6f senzor kalcijuma su pokretani humanim promotorom sinapsina-1 (hSyn1). Svi fluorofori su pokretani CAG promotorom, a konstrukt za promenu boje pokretan je EF1-alfa promotorom.
Primer 7-Proizvodnja virusa za kvantitativno određivanje retrogradne efikasnosti
[0058] Korisno opterećenje hSin-Cre je upakovano korišćenjem AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, DJ i AAV2-retro kapsida u Janelia Viral Shared Resource. Svih sedam virusnih preparata obrađeno je paralelno, i prethodno je uparen titar in vivo injekcije. Sve serije su razblažene do najnižeg izmerenog titra (1.3E12 GC/ml), a svaki virus je ubrizgan u desno pontinsko jezgro tri odrasla Rosa26Lox-STOP-LoxH2B-GFP miša (He et al., 2012, Neuron, 73:35-48).
Primer 8-Histologija
[0059] Životinje su žrtvovane tri nedelje nakon injekcije virusa, u kom trenutku su sakupljeni mozgovi i desna hemisfera je sagitalno isečena na debljini od 50 µm. Isečci su postavljeni u VECTASHIELD Antifade Mounting Medium koji sadrži DAPI (Vector Laboratories) i snimljeni pomoću P-E Pannoramic skenera slajdova (3D Histech) upotrebom 20x objektiva i FITC i DAPI filtera.
Primer 9-Retrogradno transportno kvantitativno određivanje
[0060] Slike dobijene sa Pannoramic skenerom slajdova su spojene, a zatim analizirane korišćenjem prilagođenog softvera napisanog u Matlab-u (Mathworks) da bi se otkrila GFP obeležena jezgra preko korteksa. Region od interesa (ROI) je ručno nacrtan oko korteksa da bi se izolovala oblast na slici za automatsko brojanje ćelija. Da bi se poboljšala detekcija jedara, slika je zatim konvolvirana sa jezgrom "Mexican Hat" koje se sastoji od razlike dva Gausa (varijansa od 26.00 µm i varijansa od 3.25 µm). Šum slike je smanjen korišćenjem srednjeg filtera, a zatim je izvršena osnovna detekcija pikova.
Primer 10-Analiza opštosti retrogradnog transporta
[0061] Rosa26-LSL-H2B-GFP miševima je ubrizgano 25 nl rAAV2-retro hSyn1-Cre u dorzalni strijatum. Tri nedelje nakon injekcije, koronalno isečeni mozgovi su snimljeni korišćenjem Pannoramic skenera da bi se vizuelizovala DAPI obojena jezgra i zelena fluorescencija iz jedara koja eksprimiraju H2B-GFP. Zeleni kanal je savijen sa razlikom od dva Gausa, a pikovi su zatim detektovani kao lokalni maksimumi na ovim slikama praga korišćenjem prilagođenih funkcija napisanih u Matlab-u. Plavi kanal svake sekcije bio je usklađen sa Nissl slikama iz standardizovanog atlasa mozga miša iz Allen Brain Institute koristeći prilagođene rutinske analize napisane uz pomoć Matlab alata za obradu slika. Označeni regioni iz ABI-ovog atlasa mozga miša su zatim korišćeni za dodeljivanje otkrivenih neurona u poravnatim delovima određenim regionima mozga.
[0062] Primećeno je da konačna preciznost referentnog atlasa zajedno sa anatomskom varijabilnošću pojedinačnih mozgova ograničavaju robusnost ovog poluautomatizovanog postupka na istaknute aferentne ulaze.
Primer 11-Snimanje aktivnosti neuronske populacije In Vivo nakon retrogradne isporuke GCaMP6f
[0063] Sedam odraslih miševa je anestezirano izofluranom (2%) i stavljeno u stereotaktički okvir (Kopf Instruments; Tujunga, CA) na 37°C grejne ploče. Skalp i periosteum preko lobanje su uklonjeni, nanesen je sloj OptiBond lepka koji se očvršćava UV zracima (Kerr; Orange, CA) i izrađeni stub za glavu (Osborne and Dudman, 2014, PLoS One, 9(2):e89007) je pričvršćen zubnim cementom. AAV2-retro koji nosi hSynGCaMP6f korisni teret je ubrizgan u BPN (3.9 mm pozadi i 0.4 mm bočno od Bregme, dubine 5.8, 5.6 i 5.4 mm, 100 nl na svakoj dubini) korišćenjem Nanoliter 2010 injektora (WPI). Kranijalni prozor (jedno staklo od laserski rezanog stakla debljine 170 µm, prečnika 2 mm) postavljeno je preko primarnog motornog korteksa (centrirano na 0.7 mm napred i 1.6 mm bočno od Bregme).
[0064] Nakon operacije, subkutano su primenjivane injekcije ketoprofena (5 mg/kg) i buprenorfina (0.1 mg/kg; Henry Schein Animal Health; Melville, NY). Miševi su ostavljeni da se oporave nedelju dana nakon operacije, a zatim su nakratko snimljeni pod 2-fotonskim mikroskopom da bi se procenila ekspresija virusa. Sve životinje su vizuelno identifikovale ćelije koje eksprimiraju GCaMP6f u sloju V M1 nedelju dana nakon injekcije. Zatim su životinje naviknute na fiksaciju glave u aparatu po meri i obučene da izvuku kuglice hrane kao što je prethodno opisano (Guo et al., 2014, Nat. Med., 20:130-8).
[0065] GCaMP6f je ekscitovan na 920 nm (obično 20-40 mV na zadnjem otvoru) sa Ti: Sapphire laserom (Chameleon, Coherent) i snimljen preko Nikon 16x, 0.8-N.A. objektiva. Emisiona svetlost je prolazila kroz 565 DCXR dihroični filter (Chroma Technology) i ET525/70m-2p filter (Chroma Technology) i detektovala je GaAsP fotomultiplikator (10770PB-40, Hamamatsu). Slike (512 × 512 piksela) su dobijene na ~30 Hz sa rezonantnim skenerima koristeći ScanImage softver.
Primer 12 - Uređivanje genoma CRISPRlCas9
[0066] CMV promotor u pAAV-CMV-SaCas9-empty (Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8) je zamenjen sa hSyn1 da bi se generisao pAAV-hSyn1-SaCas9-empty. Oligonukleotidi koji kodiraju sekvence protospejsera sgRNA su prilagođeni, fosforilisani, hibridizovani i vezani u BsaI restrikciona mesta pAAV-hSyn1-SaCas9-emtpy da bi se generisali pAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1 do -10. Korišćene oligonukleotidne sekvence su:
tdTomato sgRNA 1 Fwd: CAC CGC AAG GGC GAG GAG GTC ATC A (SEQ ID NO:87) tdTomato sgRNA 1 Rev: AAA CTG ATG ACC TCC TCG CCC TTG C (SEQ ID NO:88) tdTomato sgRNA 2 Fwd: CAC CGT GGA GGG CTC CAT GAA CGG CC (SEQ ID NO:89) tdTomato sgRNA 2 Rev: AAA CGG CCG TTC ATG GAG CCC TCC AC (SEQ ID NO:90) tdTomato sgRNA 3 Fwd: CAC CGA GGA CGG CGG CCA CTA CCT GG (SEQ ID NO:91) tdTomato sgRNA 3 Rev: AAA CCC AGG TAG TGG CCG CCG TCC TC (SEQ ID NO:92) tdTomato sgRNA 4 Fwd: CAC CGA CAA CAA CAT GGC CGT CAT CA (SEQ ID NO:93) tdTomato sgRNA 4 Rev: AAA CTG ATG ACG GCC ATG TTG TTG TC (SEQ ID NO:94) tdTomato sgRNA 5 Fwd: CAC CGA AGG ACG GCG GCC ACT ACC TGG (SEQ ID NO:95) tdTomato sgRNA 5 Rev: AAA CCC AGG TAG TGG CCG CCG TCC TTC (SEQ ID NO:96) tdTomato sgRNA 6 Fwd: CAC CGA CAA CAA CAT GGC CGT CAT CA (SEQ ID NO:97) tdTomato sgRNA 6 Rev: AAA CTG ATG ACG GCC ATG TTG TTG TC (SEQ ID NO:98) tdTomato sgRNA 7 Fwd: CAC CGG TCA CCT TCA GCT TGG CGG T (SEQ ID NO:99) tdTomato sgRNA 7 Rev: AAA CAC CGC CAA GCT GAA GGT GAC C (SEQ ID NO:100) tdTomato sgRNA 8 Fwd: CAC CGC CGT ACA TGA ACT GGG GGG A (SEQ ID NO:101) tdTomato sgRNA 8 Rev: AAA CTC CCC CCA GTT CAT GTA CGG (SEQ ID NO:102) tdTomato sgRNA 9 Fwd: CAC CGT CTT GTA ATC GGG GAT GTC GG (SEQ ID NO:103) tdTomato sgRNA 9 Rev: AAA CCC GAC ATC CCC GAT TAC AAG AC (SEQ ID NO:104) tdTomato sgRNA 10 Fwd: CAC CGC CGT CCT GCA GGG AGG AGT C (SEQ ID NO:105) tdTomato sgRNA 10 Rev: AAA CGA CTC CTC CCT GCA GGA CGG C (SEQ ID NO:106)
[0067] Prvo je procenjena sposobnost svakog oligo da usmeri uređivanje genoma in vitro. Neuro2A ćelije su transfektovane sa 800 ng pAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1 do -10, 100 ng pAAV-FLEX-CAGtdTomato i 100 ng pAAV-CAG-EGFP korišćenjem polietilenimina.72 sata nakon transfekcije, ćelije su sakupljene i ~70.000 EGFP pozitivnih Neuro2A ćelija je izolovano sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) korišćenjem BD Influx Sorter (BD Biosciences). Zatim je ekstrahovana genomska DNK, a učestalost modifikacije tdTomato gena je procenjena pomoću Surveyor nukleaznog testa (Integrated DNA Technologies) kao što je prethodno opisano (Cong et al., 2013, Science, 339:819-23). sgRNA 7 - jedna od dve za koje se činilo da usmeravaju dva događaja cepanja unutar tdTomato sekvence - upakovana je u retro-AAV2 i korišćena za in vivo uređivanje genoma.
[0068] -100 nl (5 × 10<13>vektorski genomi (vg)/ml) AAV2-retro-hSyn1-SaCas9-tdTomato ili AAV2retro-hSyn1-SaCas9-empty je zatim ubrizgan u BPN miševa Rbp4-Cre × tdTomato kao što je gore opisano. Šest nedelja nakon injekcija, sakupljeni su mozgovi i isečeni koronalni preseci debljine 40 µm i obojeni protiv Cas9 označenog sa HA (anti-HA antitelo C29F4 iz Cell Signaling, razblaženo 1:1600; sekundarno antitelo: magareće anti-mišje Alexa Fluor 488 (1:250; Jackson ImmunoResearch) i protiv NeuN neuronskog markera (anti-NeuN antitelo A60 iz Millipore, razblaženo 1:250; sekundarno antitelo: magareći anti-zečji Alexa Fluor 647 (1:500; ThermoFisher, A-31573)) Nakon bojenja antitela, isečci su postavljeni na pločice sa VECTASHIELD Antifade Mounting Medium koji sadrži DAPI (Vector Laboratories) i vizuelizovani korišćenjem Zeiss Axio Observer A1 invertnog mikroskopa (Zeiss). Kvantitativno određivanje imunološkog bojenja je izvedeno korišćenjem softvera za analizu ImageJ (NIH).
Primer 13 - Usmerena evolucija rAAV2-retro
[0069] Za projektovanje novih rAAV sa poboljšanim retrogradnim transportom, dizajniran je pristup in vivo usmerene evolucije koji je obogaćen za varijante kapsida rAAV koje su efikasno transportovane u ćelijska tela neurona šaljući projekcije dugog dometa do mesta injekcije virusa u mozgu miša (Slika 1A). Da bi se maksimizovala verovatnoća izolacije varijante sa željenim svojstvima, raznovrsna mešavina prethodno opisanih biblioteka varijanti rAAV kapa (Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9; Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95; Koerber et al., 2006, Nat. Protocols, 1:701-6; Müller et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21: 1040-6) je korišćena kao početni materijal. Virusne čestice su upakovane na način koji je povezao svaku varijantu kapsida sa AAV genomom koji sadrži odgovarajući cap gen, a konačni skup varijanti kapsida uključivao je tačkaste mutante, varijante sa nasumičnom insercijom 7-mernog peptida u region koji AAV2 koristi da veže svoj ko-receptor, heparan sulfat i nasumične himere sekvenci kapsidnih gena iz sedam roditeljskih serotipova (Slika 1A). Da bi se identifikovale varijante sa širokim retrogradnim tropizmom, ciljno je delovano na dve nezavisne populacije projekcionih neurona: strijatalni GABAergični neuroni koji projektuju na substantia nigra pars reticulata (SNr) i glutamatergični neuroni zadnjeg mozga koji se projektuju u korteks malog mozga. Tri nedelje nakon injekcije celokupnog skupa varijanti rAAV u SNr ili mali mozak (jedna injekcija po životinji), strijatalno ili tkivo zadnjeg mozga je uklonjeno, cap sekvence su izolovane pomoću PCR i virus je ponovo upakovan (Slika 1B). Posle još dva koraka selekcije, izvršen je PCR sklon greškama da bi se dodatno diverzifikovala biblioteka, a zatim su usledila dva finalna in vivo koraka selekcije.
[0070] 30 varijanti kapa su sekvencionirane nakon 4. kruga evolucije, a većina je poticala iz biblioteke insercija i sadržala je egzogene 7-mer peptide između N587 i R588 divljeg tipa AAV2 VP1 kapsidnog gena. Intrigantno je da su svi izolovani inserti bili oblika LAxxDxTKxA (SEQ ID NO: 107) ili LAxDxTKxxA (SEQ ID NO: 108) (gde su boldirani, italik ostaci označeni iz inserta); mutacije na drugim mestima u sekvenci su takođe obogaćene (Tabela 2). Dodatna 22 klona su sekvencirana nakon 5. kruga evolucije, a sa ovim dodatnim krugom evolucije, sve sekvence su bile AAV2 mutanti sa LAxxDxTKxA (SEQ ID NO: 107) / LAxDxTKxxA (SEQ ID NO: 108) insercijama (Tabela 2), pokazujući značajan stepen dalje konvergencije. Takva konvergencija sugeriše da su specifične peptidne insercije u heparin-vezujuću petlju u velikoj meri odgovorne za retrogradnu funkcionalnost, sa potencijalnim sekundarnim doprinosom sa drugih mesta.
[0071] Zatim je ispitan sekundarni skrining sedamnaest izolovanih varijanti koje poseduju različite kombinacije peptidnih insercija i tačkastih mutacija u sekvenci kapsida. Da bi se primenio visok nivo stringentnosti, izabrane varijante su upakovane sa transgenom poboljšanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP) koji pokreće CMV promotor, koji je tipično slab u neuronima. Za svaku varijantu kapsida, procenjena je njena sposobnost da isporuči dovoljno korisnog tereta ćelijskim telima u ključnim aferentnim regionima kako bi se omogućilo otkrivanje EGFP signala koji nije pojačan antitelom tri nedelje nakon injekcije. Klon (insert LADQDYTKTA (SEQ ID NO:85) V708I N382D) koji je pokazao najjači retrogradni transport u dva nezavisna kruga u ovom sekundarnom skriningu (korteks do globus pallidus i inferiorno maslinovo/bazalno pontinsko jezgro do malog mozga) je izabran za dalju analizu i nazvan rAAV2-retro. Kada su procenjena dva dodatna promotora koji su češće korišćeni u in vivo studijama (CAG - Slika 1B, ili humani Synapsin-1, podaci nisu prikazani), primećena je izuzetna efikasnost retrogradnog obeležavanja sa ovom varijantom rAAV u nizu različitih kola kod miševa i pacova (Slika 1B i Slika 7). Zamena insercije 7-mera u jednu od drugih izolovanih sekvenci, ili dodavanje dodatnih tačkastih mutacija identifikovanih u skriningu, nije dovelo do daljeg povećanja retrogradnog transporta.
Primer 14 - Efikasan retrogradni pristup projekcionim neuronima
[0072] Unutar silaznih motornih puteva, kortiko-pontinski trakt je izuzetno konvergentan i poznato je da doprinosi preko 95% aferenata bazalnim pontinskim jezgrima (BPN). Ovaj put stoga predstavlja posebno povoljan sistem za kvantitativno određivanje efikasnosti unosa virusa i retrogradnog transporta aksonskim krajevima projekcionih neurona. Zaista, injekcija rAAV2-retro u BPN rezultovala je gustim obeležavanjem neurona sloja V (slika 2A), u skladu sa prethodnim trejsing studijama (Legg et al., 1989, J. Comp. Neurol., 286(4):427-41).
[0073] Zatim je upoređena efikasnost retrogradnog transporta u kortiko-pontinskom kolu za rAAV2-retro naspram nekoliko često korišćenih AAV serotipova pod identičnim uslovima infekcije i obrade (Slika 2B-D). Da bi se osigurala tačnost kvantitativnog određivanja i da bi se eliminisala moguća konfuzija varijabilnosti od ćelije do ćelije u nivou ekspresije transgena, AAV je korišćen za isporuku Cre rekombinaze kod Rosa26-Lox-STOP-Lox-H2B-GFP transgenih miševa (He et al., 2012, Neuron, 73:35-48). Pokazalo se da je čak i niska koncentracija Cre enzima dovoljna da uključi ekspresiju takve Cre-zavisne kasete, a stroga jedarna lokalizacija reportera spojenog sa histonima omogućava nedvosmislenu identifikaciju inficiranih ćelija, bez zbunjujućeg signala neuropila.
[0074] Poluautomatizovani postupak analize je korišćen za izračunavanje linearne gustine inficiranih neurona kortikalne projekcije u snimljenim sagitalnim presecima iz mozga miša sakupljenih tri nedelje nakon lokalne injekcije virusa u BPN (Slika 2C). Za životinje inficirane sa rAAV2, primećena je minimalna ekspresija kortikalnog GFP (linearna gustina 0.98 ± 0.20 neurona/mm, srednja vrednost ± sem, n=5; slike 2B, srednji panel). Nasuprot tome, i u skladu sa ranijim zapažanjima (Slika 2A), gust sloj GFP-pozitivnih neurona projekcije sloja V mogao bi se uočiti širom rostro-kaudalne ose korteksa kod životinja koje su retro injektirane rAAV2 (linearna gustina 130.11±11.08 neurona/mm, n=4; Slika 2B, donji panel). Nijedan od drugih uobičajeno korišćenih AAV serotipova, niti pseći adenovirus-2, nije odgovarao retrogradnoj efikasnosti projektovane rAAV2-retro varijante (linearna gustina AAV1: 0.05 ± 0.04, AAV2: 0.98 ± 0.2, AAV5: 2.38 ± 1.24, AAV8: 1.43 ± 1.43, AAV9: 1.98 ± 0.86, DJ: 24.82 ± 14.32, CAV-2: 5.56 ± 4.13, n=3 do 5 svaki; Slika 2D, Slika 8). pored toga, gustina neurona kortikalne projekcije označenih rAAV2-retro bila je uporediva sa onom postignutom sa Fluoro-Goldom (Schmued and Fallon, 1986, Brain Res., 377:147-54), robustan sintetički retrogradni trejser (linearna gustina 81.03 ± 11.08 neurona/mm, n= 3). Dakle, rAAV2-retro pokazuje poboljšanje do dva reda veličine u odnosu na postojeće serotipove u retrogradnom pristupu neuronima kortiko-pontinske projekcije, i parira efikasnosti sintetičkih retrogradnih trejsera.
Primer 15-Uopštenost retrogradne funkcionalnosti
[0075] Zatim je ispitano da li je retrogradna funkcionalnost rAAV2-retro proširena na druga kola, posebno karakterizacijom stepena do kojeg je obeležio različite aferente na dorzomedijalni strijatum (DMS) - deo bazalnih ganglija koji prima signale velikog dometa od različitih kortikalnih i subkortikalnih oblasti. Utvrđeno je da je efikasnost rAAV2-retroposredovanog retrogradnog pristupa najjačim aferentnim ulazima u DMS - korteksu, talamusu i amigdali - uporediva sa efikasnošću fluorescentnih kuglica koje se klasično koriste za retrogradno praćenje (slika 3A). Da bi se obezbedila nepristrasna procena broja retrogradno obeleženih neurona u svim oblastima mozga za koje je poznato da obezbeđuju značajan ulaz dugog dometa u DMS, razvijen je algoritam koji je svaku otkrivenu fluorescentnu oznaku u snimljenom delu mozga miša dodeljivao određenim oblastima mozga poravnavanjem odeljka sa obeleženim Allen Brain Atlas (Slika 3B-C). Kvantitativna analiza (slika 3C) je otkrila da je snažno retrogradno označavanje pronađeno u velikoj većini regiona za koje je ranije prijavljeno da šalju istaknute projekcije na strijatum (Pan et al., 2010, Front Neuroanat., 4: 147). U jednom uočljivom izuzetku, samo skromno obeležavanje primećeno je u supstantia nigra pars compacta, uprkos tome što je izvor snažnog dopaminergičkog unosa u DMS (slika 3C, strelica na broju ćelija za SNc). Utvrđeno je da je mali podskup klasa projekcionih neurona slično otporan na retrogradni pristup putem rAAV2-retro u nekim drugim testiranim krugovima (Tabela 3; imati na umu da svi drugi testirani AAV serotipovi takođe nisu uspeli da obeleže ove projekcije). Uprkos ovim izuzecima, rAAV2-retro je široko primenljiv u centralnom nervnom sistemu.
Tabela 3. Efikasnost rAAV2-retro u različitim kolima. Niska efikasnost, a ne odsustvo retrogradnog transporta u kortiko-talamičkim i kortiko-kolikularnim projekcijama, sugeriše se efikasnim obeležavanjem projekcionih neurona nakon lokalnog isporučivanja korisnih tereta zavisnih od Cre do tela projekcionih neuronskih ćelija
Primer 16-Retrogradni pristup genetski definisanim neuronskim populacijama
[0076] Takođe je utvrđeno da li se retrogradna funkcionalnost rAAV2-retro može kombinovati sa specifičnošću Cre transgenih linija kako bi se omogućilo ispitivanje specifičnih klasa projekcionih neurona. Konkretno, sprovedeni su eksperimenti da bi se utvrdilo da li se rAAV2-retro i Cre transgene linije mogu kombinovati da bi se odvojile dve funkcionalno različite veze dugog dometa koje se odvijaju paralelno između dve oblasti mozga. Projekcije od cerebralnog korteksa ka strijatumu nastaju prvenstveno od neurona u sloju V, ali neki neuroni u slojevima II i III takođe obezbeđuju strijatalne ulaze. Predloženo je da ulazi u strijatum iz različitih kortikalnih slojeva čine odvojene puteve, sa neuronima u sloju V koji se projektuju u odeljak zakrpe u strijatumu, a oni u slojevima II i III u matriks. Interdigitalna priroda mikrokompartmana zakrpa i matriksa otežava selektivno ciljno delovanje na ove puteve za funkcionalno ispitivanje samo pomoću rAAV2-retro sistema. Stoga je istraženo da li se dva ulaza mogu razdvojiti kombinovanjem rAAV2-retro sa transgenom linijom koja eksprimira Cre rekombinazu u svim neuronima sloja V (Gerfen et al., 2013, Neuron, 80:1368-83), ali ne u neuronima u slojevima II i III (slika 4A).
[0077] Da bi se istakla oba puta u istom eksperimentu, izabran je koristan teret za promenu boje zavisan od Cre, koje eksprimira tdtomato u odsustvu Cre, ali se invertuje da bi pokrenuo ekspresiju EGFP u Cre-pozitivnim ćelijama (Saunders et al., 2012, Front Neural Circuits, 6:47). Kada je rAAV2-retro koji nosi ovaj korisni teret ubrizgan u dorzo-medijalni strijatum sloja V-specifične Cre pokretačke linije, Rbp4_KL100 Cre (Gerfen et al., 2013, Neuron, 80: 1368-83), samo oni neuroni sloja V koji se projektuju na strijatum su eksprimirali EGFP. Pored toga, kortikostrijatalni put sloja II i III se jasno razlikovao po ekspresiji tdTomato (Slika 4B). U skladu sa topografskom prirodom kortiko-strijatalne projekcije, visoko lokalizovane injekcije virusa u dorzomedijalni strijatum dovele su do obeležavanja odgovarajućih malih delova korteksa. Međutim, sloj V i sloj II i III kortiko-strijatalne populacije su uvek bili zajedno obeleženi (Slika 4B, donji panel), što sugeriše da dva puta iz istog kortikalnog područja prolaze kroz susedni matriks i mikro-kompartmente zakrpe unutar strijatuma.
[0078] Iako je ovaj eksperiment istakao oba puta, izbor "Cre-on" ili "Cre-off" korisnog opterećenja će omogućiti selektivni pristup jednom uz isključenje drugog. Ovaj primer, stoga, naglašava dodatnu specifičnost ispitivanja kola koja se može postići kombinovanjem visoko efikasnog retrogradnog virusa sa dostupnim Cre (ili Flp) linijama pokretača.
Primer 17 - Korišćenje rAAV2-retro za ispitivanje kola i manipulaciju genima
[0079] Korist rAAV2-retro za ispitivanje kola zavisiće od njegove sposobnosti da posreduje u visokim nivoima ekspresije genetski kodiranih indikatora i efektora. Sposobnost praćenja neuronske aktivnosti u definisanim klasama projekcionih neurona prvo je procenjena kroz rAAV2-retro posredovanu ekspresiju GCaMP6f (Chen et al., 2013, Nature, 499:295-300) (Slika 5A-C). Koristeći in vivo dvofotonsko Ca<2+>snimanje, dendritski i somatski Ca<2+>tranzijenti su otkriveni u primarnom motornom korteksu već 7 dana nakon isporuke virusa u BPN (Slika 5D). Vremenski profil Ca<2+>signala je odražavao strukturu zadatka dostizanja signala, pri čemu je signal u mnogim kortiko-pontnskim neuronima čvrsto povezan sa znakom „kreni“ (Slika 5E-F) (Li et al., 2015, Nature, 519:51-6). Ponovljeni snimci sa identifikovanih neurona bili su mogući kako u ispitivanjima u okviru sesije u ranoj fazi ekspresije (Slika 5E, F), tako i tokom mnogih sesija ponašanja tokom više od dva meseca nakon infekcije. Dakle, rAAV2-retro daje mogućnost da se senzori eksprimiraju u neuronima projekcije na nivoima dovoljnim za snimanje, stvarajući mnoge nove mogućnosti za dešifrovanje doprinosa specifičnih projekcija proračunima kola.
[0080] Konačno, procenjena je korist rAAV2-retro za isporuku efektora, kao što je sistem za uređivanje gena CRISPR/Cas9, do projekcionih neurona (Slika 6). Konkretno, Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9 (Slaymeker et al., 2016, Science, 351:84-8)) i jedna vodeća RNK dizajnirana za ablaciju ekspresije tdtomato upakovane su u rAAv2-retro. Isporuka rAAV2-retro-SaCas9-antitdTomato na BPN životinje koje eksprimiraju tdTomato u ekscitatornim neuronima kortikalnog sloja V rezultirala je supresijom ekspresije tdTomato u 88.6 ± 0.7% neurona sloja V koji eksprimiraju SaCas9 (Slika 6B, donji panel i slika 6C, n = 3). Nasuprot tome, isporuka neciljanog SaCas9 nije dovela do bilo kakvih uočljivih promena, sa samo 4.4 ± 3.2% ćelija koje su pokazale potencijalno smanjenje ekspresije tdTomato (Slika 6B, gornji panel i slika 6C, n = 3). Pored toga, ekspresija tdTomato ostala je nepromenjena u neuronima sloja V koji su bili nedostupni putem injekcije u pons. rAAV2-retro sistem na taj način omogućava efikasnu modifikaciju gena selektivno u neuronima koji projektuju na specifična područja od interesa.
[0081] Zajedno, ova zapažanja uspostavljaju rAAV2-retro kao efikasan reagens za genetski pristup projekcionim neuronima za funkcionalno ispitivanje neuronskih kola i, dugoročno, za moguće terapeutske lekove.
Primer 18-Diskusija
[0082] Rekombinantni adeno-asocirani virusi mogu u velikoj meri olakšati funkcionalnu disekciju neuronskih kola sisara i obećavaju terapijske intervencije kod poremećaja nervnog sistema. Usmerena evolucija je korišćena da bi se AAV kapsid obogatio dodatnim kapacitetom za efikasan retrogradni pristup projekcionim neuronima u mnogim kolima. Novoprojektovani rAAV2-retro nudi do dva reda veličine poboljšanja u retrogradnom transportu u poređenju sa obično korišćenim AAV serotipovima, što odgovara efikasnosti sintetičkih retrogradnih trejsera u mnogim krugovima. Nivo ekspresije transgena postignut sa rAAV2-retro putem retrogradnog pristupa je dovoljan za ispitivanje funkcije nervnog kola, kao i za ciljane manipulacije neuronskog genoma. Stoga, omogućavanjem selektivnog praćenja i manipulacije projekcionim neuronima koji povezuju različite oblasti mozga, alati zasnovani na rAAV2 retro su spremni da pruže uvid u to kako velike mreže omogućavaju funkciju mozga i obećavaju terapijske intervencije u bolestima koje karakteriše progresivna disfunkcija mreže velikih razmera.
[0083] Izrazito povećana efikasnost retrogradnog pristupa koju pruža rAAV2-retro u poređenju sa njegovim roditeljskim serotipom AAV2 može biti omogućena putem poremećaja posredovanog insercijom nativnog mesta vezivanja za heparan sulfat i/ili kroz stvaranje nove površine vezivanja koja uključuje umetnuti peptid. Ova varijanta ima smanjen afinitet za heparin (Slika 9), što bi moglo smanjiti sekvestraciju virusa u ekstracelularnom matriksu sinaptičke pukotine i poboljšati lokalno širenje vektora, kao što je primećeno kod AAV1 i AAV6. Međutim, samo rezultirajuće povećanje širenja vektora ne može objasniti efikasnost retrogradnog transporta, pošto druge umetnute 7-merne sekvence na sličan način remete vezivanje heparina, ali ne utiču na retrogradni transport. Pored toga, AAV5 i AAV9 ne vezuju heparin, ali je njihova retrogradna transportna efikasnost slična onoj kod AAV2. U prilog alternativnom objašnjenju, peptidne insercije odabrane u originalnoj selekciji (LAxxDxTKxA (SEQ ID NO: 107) / LAxDxTKxxA (SEQ ID NO: 108)) dele istu ukupnu kompoziciju, samo se razlikuju u registru očuvanog motiva. Konstruisana peptidna insercija može podržati poboljšano vezivanje za postojeći ćelijski kofaktor na AAV putu (npr., nedavno identifikovani zajednički AAV receptor), ili može stvoriti novu interakciju sa ćelijskom mašinerijom -receptorom na površini ćelije i/ili komponentom prenosa vezikula ili nuklearnog puta.
[0084] Uprkos poboljšanju višestrukog reda veličine u retrogradnom transportu koje rAAV2-retro nudi u odnosu na postojeće serotipove, čini se da je mali skup klasa projekcionih neurona otporan na efikasnu retrogradnu infekciju ovom novorazvijenom varijantom rAAV (Tabela 3). Treba napomenuti, međutim, da drugi AAV serotipovi takođe ne obeležavaju ove projekcije. Da li je nivo ekspresije kritičnog ćelijskog faktora koji se povezuje sa ovom novom AAV varijantom u ovim neuronima samo izuzetno nizak - zaključak je podržan za kortiko-talamičke i kortiko-kolikularne projekcije, na primer, zapažanjem da rAAV2-retro još uvek može da isporučuje dovoljno Cre rekombinaze u ćelijska tela za usmeravanje visokog nivoa ekspresije za lokalno isporučene Cre-zavisne korisne terete (Tabela 3, istaknuti unosi) - ili da li faktor u potpunosti nedostaje, ostaje da se utvrdi u svakom slučaju. Dodatne buduće modifikacije kapsida za ovu ili druge varijante mogle bi omogućiti poboljšanu retrogradnu transdukciju ovih neuronskih klasa.
[0085] rAAV2-retro vektorski sistem pruža važan dodatak genetičkom kompletu alata za seciranje funkcije neuronskih kola, pošto će dobijanje pristupa pojedinačnim klasama projekcionih neurona biti kritičan korak koji omogućava da se razjasni kako se koordinišu dinamika lokalnog kola i funkcija mreže velikih razmera. Smatra se da proračuni lokalnog kola sve više zavise od dinamike celokupne neuronske populacije unutar određenog modula lokalnog kola. Kako se ova dinamika preslikava na različite klase projekcionih neurona - a samim tim i koje informacije se prenose na različite nizvodne ciljeve - ostaje nerešeno za većinu kola. Vektori zasnovani na rAAV2 retro, sami ili u kombinaciji sa specifičnim Cre transgenim linijama, dozvoljavaju genetski pristup specifičnim populacijama projekcionih neurona. Zauzvrat, rAAV2-retro koji nosi G glikoprotein besnila može se koristiti za transkomplementaciju novorazvijenog netoksičnog uslovnog vektora besnila za pristup presinaptičkim mikro-kolima koji utiču na određene klase projekcionih neurona. Rezultirajuća sposobnost da se selektivno nadgledaju i manipulišu aktivnošću pojedinačnih klasa projekcionih neurona i njihovih lokalnih mikrokola treba da pruži uvid u to kako projekcioni neuroni prevode dinamiku lokalnog kola za svoje mreže velikih razmera.
[0086] rAAV2-retro takođe obećava terapijsku intervenciju, sa nekoliko mogućih primena. Na primer, u situacijama kada patologija utiče na velike količine nervnog tkiva - kao što su Alchajmerova bolest ili bolesti lizozoma - višestruke injekcije predstavljaju bezbednosni rizik i mogu biti nedovoljne za postizanje potrebnih nivoa transdukcije. Međutim, mali broj injekcija na strateškim lokacijama može omogućiti vektorsku disperziju u velikim količinama (npr. kortiko-pontinski trakt od tačke konvergencije u BPN) ili teško dostupnom tkivu (npr., spinalni motorni neuroni iz mišića). Pored toga, funkcionalne mreže velikih razmera su umešane u širenje mnogih neurodegenerativnih poremećaja od njihovog prostorno lokalizovanog početka. Istaknuto gledište u nastajanju pretpostavlja da taloženje abnormalnih proteinskih sklopova u ranjivim neuronskim populacijama pokreće patološku kaskadu aberantne neuronske aktivnosti unutar i dezintegracije funkcionalnih mreža velikih razmera, što na kraju dovodi do neuspeha neuroloških funkcija. Intrigantno je da su pogođene neuronske mreže sposobne da prolazno prevaziđu aberantnu dinamiku u ranoj fazi bolesti, pošto pacijenti sa mnogim neurodegenerativnim bolestima često pokazuju periode dramatičnog poboljšanja. Dakle, rana intervencija usmerena na usporavanje širenja agregata iz kortikalnog porekla patologije može biti dovoljna da se stabilizuje, ili čak obnovi kognitivna funkcija. Iz ove perspektive, subkortikalno projektovani neuroni u mezokortikalnim regionima gde se prvi put pojavljuju patološki proteinski agregati, i kod Alchajmerove i kod Parkinsonove bolesti, predstavljaju privlačno ciljno mesto intervencije. Pristup tim projekcionim neuronima pomoću alata zasnovanih na rAAV2retro dizajniranim, na primer, da uvede mutaciju koja je sposobna da zaustavi dalju agregaciju u cis ili da isporuči pratioce koji su sposobni da rastavljaju agregate, ima potencijal da uspori napredovanje najonesposobljavajućih, kognitivnih, simptoma. Procena efikasnosti i dugoročne bezbednosti rAAV2-retro reagensa kod nehumanih primata otvoriće put njihovom eventualnom razmatranju ovih i drugih pristupa genske terapije.
[0087] Podrazumeva se da, dok su postupci i kompozicije materije ovde opisani u vezi sa brojnim različitim aspektima, prethodni opis različitih aspekata ima za cilj da ilustruje postupke i kompozicije materije.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Protein virusnog kapsida koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od xxDxTKx (SEQ ID NO:1) i xDxTKxx (SEQ ID NO:2), pri čemu protein virusnog kapsida ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, i 78.
2. Virusna čestica koja sadrži protein virusnog kapsida prema patentnom zahtevu 1.
3. Virusna čestica prema patentnom zahtevu 2, koja dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira korisni teret; poželjno naznačeno time da nukleinska kiselina koja kodira korisni teret sadrži promotorsku sekvencu koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom koja kodira korisni teret.
4. Virusna čestica prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što je promotor izabran iz grupe koja se sastoji od sinapsina-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1alfa, TRE i mDlx.
5. Virusna čestica prema patentnom zahtevu 4, naznačena time što je kodirajuća sekvenca koja kodira korisni teret izabrana iz grupe koja se sastoji od gena koji kodira protein i inhibitorne RNK nukleinske kiseline; poželjno pri čemu je inhibitorna RNK nukleinska kiselina antisens oligonukleotid, siRNA ili RNAi.
6. Virusna čestica prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što korisni teret je:
i) efektorski protein; poželjno pri čemu je efektorski protein izabran iz grupe koja se sastoji od rekombinaze (npr., Cre ili Flp), sistema za uređivanje gena (npr., CRISPR/Cas9, TALEN, nukleaza cinkovog prsta), optogenetskih reagenasa (aktivatora (npr., kanalrodopsina ili njegovih varijanti) ili inhibitora (npr. halorodopsina ili Arch)), hemogenetskih reagenasa (npr. aktivatora/inhibitora verzije DREADD ili PSAM/PSEM sistema), aktivatora i/ili inhibitora puteva ćelijskog sistema i enzima za kontrolu epigenetike;
ii) optički reporterski konstrukt; poželjno pri čemu je optički reporterski konstrukt izabran iz grupe koja se sastoji od GCaMP6 (s, m ili f), fluorofora (npr., zelenog fluorescentnog proteina (GFP), pojačanog GFP (EGFP), crvenog fluorescentnog proteina (RFP), žutog fluorescentnog proteina) proteina (YFP), tdTomato), konstrukta za promenu boje (npr., korisni teret koji eksprimira jedan reporter u jednoj ćelijskoj populaciji i drugi reporter u drugoj populaciji), senzora glukoze, jRCaMP, jRGECO i CaMPARI, indikatora napona, sekundarnih glasnika, signalizatora receptora, transkripcionih reportera, epigenetičkih reportera i reportera neuromodulatora; ili iii) virusni protein; poželjno pri čemu je virusni protein ili G protein besnila ili protein koji dopunjuje funkciju virusa koji nije AAV ili protein koji se odnosi na ćelijski i transćelijski transport.
7. Virusna čestica prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što kodirajuća sekvenca koja kodira korisni teret je terapeutski gen; poželjno pri čemu je terapeutski gen za lečenje neurodegenerativnog poremećaja; na primer pri čemu terapeutski gen je:
i) HSP104 za lečenje Alchajmerove bolesti ili drugih bolesti sa toksičnim proteinskim agregatima;
ii) frataksin za lečenje Fridrihove ataksije;
iii) lizozomalna glukocerebrozidaza (GBA) za lečenje Parkinsonove bolesti;
iv) poliQ-vezujući protein za lečenje Hantingtonove bolesti; ili
v) motorni neuron 1 za preživljavanje za lečenje spinalne mišićne atrofije, amiotrofne lateralne skleroze (ALS), autizma, demencije, periferne neuropatije, šizofrenije ili degeneracije mrežnjače.
8. Virusna čestica prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što korisni teret je terapeutski deo; poželjno pri čemu terapeutski deo je:
i) antitelo ili njegov fragment;
ii) imunomodulatorni protein; ili
iii) molekul interferencije RNK.
9. Virusna čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 8, naznačena time što je retrogradni pristup neuronima kortiko-pontinske projekcije ili aferentima dorzomedijalnog strijatuma (DMS) uporediv sa sintetičkim detektorom, fluorescentnim kuglicama fluoro-zlata.
10. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) koja sadrži koristan teret upakovan u njega, za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog poremećaja, pri čemu postupak sadrži dovođenje u kontakt jednog ili više neurona sa pomenutom varijantom AAV, pri čemu pomenuta varijanta AAV sadrži kapsidni protein koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od xxDxTKx (SEQ ID NO:1) and xDxTKxx (SEQ ID NO:2), pri čemu varijanta AAV ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 i 78.
11. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što neuroni su projekcioni neuroni.
12. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, naznačena time što neuroni su u subjektu; poželjno pri čemu neuroni su u centralnom nervnom sistemu (CNS) u subjektu.
13. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 12, naznačena time što subjekat je čovek.
14. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) za upotrebu prema patentnim zahtevima 10 do 12, naznačena time što subjekat je ne-humani; poželjno pri čemu je ne-humani subjekat izabran od primata, glodara, gmizavaca i ptice.
15. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 14, naznačena time što korak dovođenja u kontakt je in vivo putem intrakranijalne, intraspinalne ili intramuskularne injekcije.
16. Protein virusnog kapsida prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što protein virusnog kapsida ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44.
17. Varijanta adeno-asociranog virusa (AAV) za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što protein virusnog kapsida ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44.
RS20231029A 2016-06-15 2017-06-15 Varijante adeno-asociranih virusa i postupci upotrebe RS64769B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662350361P 2016-06-15 2016-06-15
US201662404585P 2016-10-05 2016-10-05
PCT/US2017/037781 WO2017218842A1 (en) 2016-06-15 2017-06-15 Variant adeno-associated viruses and methods of using
EP17734575.8A EP3472183B1 (en) 2016-06-15 2017-06-15 Variant adeno-associated viruses and methods of using

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64769B1 true RS64769B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=59258370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231029A RS64769B1 (sr) 2016-06-15 2017-06-15 Varijante adeno-asociranih virusa i postupci upotrebe

Country Status (28)

Country Link
US (2) US10961282B2 (sr)
EP (2) EP3472183B1 (sr)
JP (2) JP7094277B2 (sr)
KR (2) KR102522661B1 (sr)
CN (2) CN109641939B (sr)
AU (2) AU2017286652B2 (sr)
BR (1) BR112018076090A2 (sr)
CA (1) CA3028113A1 (sr)
DK (1) DK3472183T5 (sr)
EA (1) EA201990033A1 (sr)
ES (1) ES2962611T3 (sr)
FI (1) FI3472183T3 (sr)
HR (1) HRP20231403T1 (sr)
HU (1) HUE063755T2 (sr)
IL (2) IL300981A (sr)
LT (1) LT3472183T (sr)
MA (1) MA44546B1 (sr)
MX (2) MX2018015770A (sr)
MY (1) MY190221A (sr)
PH (1) PH12018502664A1 (sr)
PL (1) PL3472183T3 (sr)
PT (1) PT3472183T (sr)
RS (1) RS64769B1 (sr)
SG (1) SG11201811189RA (sr)
SI (1) SI3472183T1 (sr)
SM (1) SMT202300372T1 (sr)
WO (1) WO2017218842A1 (sr)
ZA (1) ZA201900278B (sr)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755044A (zh) * 2011-04-22 2016-07-13 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
EP3003391B1 (en) 2013-05-31 2021-09-22 The Regents of The University of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
US11364308B2 (en) * 2016-05-13 2022-06-21 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
MA44546B1 (fr) * 2016-06-15 2021-03-31 Univ California Virus adéno-associés variants et procédés d'utilisation
AU2017302013B2 (en) * 2016-07-29 2022-05-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CA3053154A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsids and methods of use thereof
JP2020534788A (ja) 2017-08-28 2020-12-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルスカプシド変異体及びその使用方法
US12043848B2 (en) 2017-10-16 2024-07-23 Vigeneron Gmbh AAV vectors
KR20210052450A (ko) * 2018-07-31 2021-05-10 코넬 유니버시티 기관 기능을 제어하기 위한 유전자 요법 방법
CN113966399A (zh) 2018-09-26 2022-01-21 加州理工学院 用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物
EP4007609A1 (en) * 2019-08-01 2022-06-08 Cornell University Targeted gene therapy to treat neurological diseases
US20230265453A1 (en) * 2020-07-08 2023-08-24 Baylor College Of Medicine Gene therapy for stxbp1 encephalopathy
CN111825772B (zh) * 2020-07-30 2023-10-20 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其应用
CN116390773A (zh) 2020-08-06 2023-07-04 应用医学研究基金会 用于通过基因疗法治疗诸如阿尔茨海默病的Tau蛋白病的病毒颗粒
CA3199756A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 The Children's Medical Center Corporation Adeno-associated virus vectors
EP4263575A4 (en) * 2020-12-16 2025-05-07 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus capsids and vectors
WO2022126188A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 Children's Medical Research Institute Aav capsids and vectors
KR20240054958A (ko) 2021-06-17 2024-04-26 메이라지티엑스 유케이 Ii 리미티드 Aav 제조 방법
WO2023285986A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Meiragtx Uk Ii Limited Kcnv2 gene therapy
WO2023288184A2 (en) * 2021-07-14 2023-01-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for treating chronic pain and for retrograde transduction of neurons
CN117980489A (zh) 2021-07-14 2024-05-03 梅里特斯英国第二有限公司 Retgc基因疗法
KR20240133712A (ko) 2021-12-15 2024-09-04 메이라지티엑스 유케이 Ii 리미티드 장 펩티드의 폴리시스트론 발현
US20250213722A1 (en) * 2022-03-30 2025-07-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Adeno-associated virus vectors for nucleic acid delivery to retinal ganglion cells and/or retinal pigment epithelium cells
EP4598941A2 (en) * 2022-09-13 2025-08-13 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid variants and methods of using the same
CA3267488A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 King's College London COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES
JP2025533994A (ja) 2022-10-11 2025-10-09 メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド Ａｔｐ７ｂ遺伝子療法
JP2025535115A (ja) 2022-10-11 2025-10-22 メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド Ｕｐｆ１発現構築物
JP2025535114A (ja) 2022-10-11 2025-10-22 メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド 中枢神経系における遺伝子発現のための核酸調節エレメント及び使用方法
CN120283059A (zh) 2022-10-11 2025-07-08 梅里特斯英国第二有限公司 纯化aav衣壳的色谱方法
JP2025533988A (ja) 2022-10-11 2025-10-09 メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド Ａａｖ遺伝子療法用の製剤
EP4634381A1 (en) 2022-12-14 2025-10-22 King's College London Compositions and methods for treating neurological diseases
AU2024206221A1 (en) * 2023-01-05 2025-07-03 Emugen Therapeutics Llc Retro-aav and use in treating neurodegenerative diseases
CN120752255A (zh) * 2023-01-05 2025-10-03 恩沐辑医药有限责任公司 神经元启动子及其用途
WO2024161022A2 (en) 2023-02-03 2024-08-08 King's College London Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024213660A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Meiragtx Uk Ii Limited Inflammation-inducible promoters
EP4698153A1 (en) * 2023-04-18 2026-02-25 University of Massachusetts Capsid variants and uses thereof
WO2024252182A1 (en) 2023-06-08 2024-12-12 Meiragtx Uk Ii Limited Cation exchange chromatography for aav capture
WO2025126153A2 (en) 2023-12-14 2025-06-19 Aviadobio Ltd. Compositions and methods for treating sod1-mediated neurological diseases

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US9233131B2 (en) * 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US20090215870A1 (en) 2005-04-29 2009-08-27 Terwilliger Ernest F Compositions and methods for targeting of viral vectors
WO2009108274A2 (en) 2008-02-26 2009-09-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for adeno-associated virus (aav) with hi loop mutations
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
CN105755044A (zh) * 2011-04-22 2016-07-13 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
US9719992B2 (en) 2011-10-07 2017-08-01 Howard Hughes Medical Institute Genetically encoded biosensors
WO2013174760A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Optimized aav-vectors for high transduction rates in dendritic cells
US9518980B2 (en) 2012-10-10 2016-12-13 Howard Hughes Medical Institute Genetically encoded calcium indicators
US9518996B2 (en) 2013-08-05 2016-12-13 Howard Hughes Medical Institute Fluorescent protein-based calcium integrators
ES2739288T3 (es) 2013-09-13 2020-01-30 California Inst Of Techn Recuperación selectiva
CN104592364B (zh) * 2013-10-30 2018-05-01 北京大学 定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015164757A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Oregon Health & Science University Methods of viral neutralizing antibody epitope mapping
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
EP4344741A3 (en) * 2014-11-21 2024-08-28 The University of North Carolina at Chapel Hill Aav vectors targeted to the central nervous system
US9644007B2 (en) 2014-12-23 2017-05-09 Howard Hughes Medical Institute Red genetically encoded calcium indicators and methods of use
US11364308B2 (en) * 2016-05-13 2022-06-21 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
MA44546B1 (fr) 2016-06-15 2021-03-31 Univ California Virus adéno-associés variants et procédés d'utilisation
AU2017302013B2 (en) * 2016-07-29 2022-05-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021225247B2 (en) 2023-02-16
HRP20231403T1 (hr) 2024-02-16
US11939355B2 (en) 2024-03-26
US20190300579A1 (en) 2019-10-03
KR20190039930A (ko) 2019-04-16
KR102800951B1 (ko) 2025-04-25
SG11201811189RA (en) 2019-01-30
US20210230231A1 (en) 2021-07-29
HUE063755T2 (hu) 2024-01-28
CA3028113A1 (en) 2017-12-21
JP7094277B2 (ja) 2022-07-01
EP4268852A3 (en) 2024-02-07
MA44546B1 (fr) 2021-03-31
EA201990033A1 (ru) 2019-06-28
PT3472183T (pt) 2023-11-16
KR102522661B1 (ko) 2023-04-18
IL263719A (en) 2019-01-31
KR20230054754A (ko) 2023-04-25
WO2017218842A1 (en) 2017-12-21
CN109641939B (zh) 2022-11-08
ZA201900278B (en) 2022-04-28
IL300981A (en) 2023-04-01
AU2021225247A1 (en) 2021-09-30
CN109641939A (zh) 2019-04-16
PL3472183T3 (pl) 2024-02-12
CN116003532A (zh) 2023-04-25
AU2017286652A1 (en) 2019-01-24
MA44546A1 (fr) 2019-07-31
DK3472183T3 (da) 2023-11-06
JP7579301B2 (ja) 2024-11-07
ES2962611T3 (es) 2024-03-20
FI3472183T3 (fi) 2023-11-03
US10961282B2 (en) 2021-03-30
BR112018076090A2 (pt) 2019-03-26
DK3472183T5 (da) 2024-09-09
JP2022126759A (ja) 2022-08-30
MY190221A (en) 2022-04-06
EP4268852A2 (en) 2023-11-01
SI3472183T1 (sl) 2023-11-30
EP3472183B1 (en) 2023-08-09
SMT202300372T1 (it) 2023-11-13
IL263719B1 (en) 2023-05-01
IL263719B2 (en) 2023-09-01
MX2024000505A (es) 2024-03-19
LT3472183T (lt) 2023-09-25
EP3472183A1 (en) 2019-04-24
PH12018502664A1 (en) 2019-10-07
AU2017286652B2 (en) 2021-10-07
MX2018015770A (es) 2019-08-29
JP2019518793A (ja) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7579301B2 (ja) バリアントアデノ随伴ウイルスおよび使用方法
JP7590962B2 (ja) 皮質興奮性ニューロンにおける遺伝子発現を選択的に調節するための人工発現構築物
US20220195457A1 (en) Interneuron-specific therapeutics for normalizing neuronal cell excitability and treating dravet syndrome
KR20220130150A (ko) 망막 신경절 세포의 재생
TW202221119A (zh) Dna結合域轉活化子及其用途
HK40091867A (zh) 变体腺伴随病毒及使用方法
HK40007187B (en) Variant adeno-associated viruses and methods of using
HK40007187A (en) Variant adeno-associated viruses and methods of using
NZ789365A (en) Variant adeno-associated viruses and methods of using
EA044679B1 (ru) Вариантные аденоассоциированные вирусы и способы их применения
US20250032646A1 (en) Enhancers for directed expression of genes in neuronal cell populations, compositions and methods thereof
TW202535908A (zh) 中樞神經系統靶向之ａａｖ衣殼之重定向