RS64830B1 - Anti-tnf-alfa antitela i njihovi funkcionalni fragmenti - Google Patents

Description

Opis pronalaska

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela i njihove funkcionalne fragmente, sposobne da se vezuju za faktor nekroze tumora alfa (TNFα), na postupke za njihovu proizvodnju i na njihove terapijske upotrebe.

STANJE TEHNIKE

[0002] TNFα je homo-trimerni proinflamatorni citokin koji se oslobađa od strane ćelija imunskog sistema, sa kojima stupa i u interakcije. Pokazano je takođe da je TNFα pozitivno regulisan u brojnim bolestima ljudi, uključujući hronične bolesti kao što su reumatoidni artritis, Kronova bolest, ulcerozni kolitis i multipla skleroza.

[0003] Antitela na TNFα su bila predložena za profilaksu i lečenje endotoksičnog šoka (Beutler i saradnici, Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer i saradnici (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) i Wherry i saradnici (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) razmatraju terapijski potencijal anti-TNFa antitela u lečenju septičkog šoka. Upotrebu anti-TNFa antitela u lečenju septičkog šoka takođe se razmatra u Kirschenbaum i saradnici (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Artritis indukovan kolagenom može biti efektivno lečen upotrebom anti-TNFa monoklonskog antitela (Williams i saradnici (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

[0004] Upotreba anti-TNFa antitela u lečenju reumatoidnog artritisa i Kronove bolesti razmatra se u Feldman i saradnici (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini i saradnici (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) i u Feldman i saradnici (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Antitela na TNFα, prethodno upotrebljavana u takvim tretmanima, uglavnom su himerna antitela, kao što su ona opisana u U.S. Pat. No.5,919,452.

[0005] Monoklonska antitela na TNFα su opisana u prethodnom stanju tehnike. Meager i saradnici (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) opisuju mišja monoklonska antitela na rekombinantan TNFα. Fendly i saradnici (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) opisuju upotrebu mišjih monoklonskih antitela na rekombinantan TNFα u definisanju neutrališućih epitopa na TNFα. Štaviše, u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO 92/11383, opisana su rekombinantna antitela, uključujući antitela sa CDR graftom, specifična za TNFα. Rankin i saradnici (British J.

[0006] Rheumatology, 34, 334-342, 1995) opisuju upotrebu takvih antitela sa CDR graftom, u lečenju reumatoidnog artritisa. U.S. Pat No.5,919,452 opisuje anti-TNFa himerna antitela i njihovu upotrebu u lečenju patologija povezanih sa prisustvom TNFα. Dalja anti-TNFa antitela su opisana u Stephens i saradnici (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570, GB-A-2 297 145, US 8,673,310, US 2014/0193400, EP 2390267 B1, US 8,293,235, US 8,697,074, WO 2009/155723 A2 i WO 2006/131013 A2.

[0007] Molekuli rekombinantnih anti-TNFa antitela iz prethodnog stanja tehnike generalno imaju smanjen afinitet za TNFα u poređenju sa antitelima iz kojih su izvedeni hipervarijabilni regioni ili CDR. Svi inhibitori TNFα koji se trenutno nalaze na tržištu, daju se intravenski ili subkutano, u nedeljnim ili dužim intervalima, kao bolusne injekcije, što dovodi do visokih početnih koncentracija koje se kontinuirano smanjuju do sledećeg injeciranja.

[0008] Trenutno odobreni anti-TNFa bioterapeutici uključuju (i) infliksimab, himerno IgG anti-humano monoklonsko antitelo (Remicade<®>; Wiekowski M i saradnici: „Infliximab (Remicade)”, Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, str. 885-9044); (ii) etanercept, TNFR2 dimerni fuzioni protein, sa IgG1 Fc (Enbrel<®>); (iii) adalimumab, potpuno humano monoklonsko antitelo (mAt) (Humira<®>; Kupper H i saradnici:"Adalimumab (Humira)”, Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, str.697-732); (iv) certolizumab, PEGovan Fab fragment (Cimzia®; Melmed G Y i saradnici: „Certolizumab pegol”, Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, GB, tom 7, br. 8, 2008-08-01, str. 641-642); (v) Golimumab, humano IgGIK monoklonsko antitelo (Simponi®; Mazumdar S i saradnici:"Golimumab”, mAbs, Landes Bioscience, US, tom 1, br.5, 2009-09-01, str. 422-431). Ipak, razni biosimilari su u razvoju, a mimik infliksimaba poznat kao Remsima je već odobren u Evropi.

[0009] Infliksimab ima relativno nizak afinitet za TNFα (KD> 0,2 nM; Weir i saradnici, 2006, Therapy 3: 535) i ograničenu potenciju neutralizacije u L929 testu. Dodatno, infliksimab suštinski ne pokazuje unakrsnu reaktivnost sa TNFα iz Cynomolgus ili Rhesus majmuna. Za anti-TNFα antitela, međutim, unakrsna reaktivnost sa TNFα iz majmuna je veoma poželjna, pošto ista omogućava testove na životinjama sa primatima, što u mnogim aspektima odražava situaciju kod ljudi.

[0010] Etanercept, iako dvovalentni molekul, vezuje TNFα u odnosu jedan trimer po jednom molekulu etanercepta, sprečavajući tako obrazovanje velikih kompleksa antigena i bioterapeutika (Wallis, 2008, Lancet Infect Dis, 8: 601). Ne inhibira ni sekreciju citokina inukovanu LPS-om u monocitima (Kirchner i saradnici, 2004, Cytokine, 28: 67).

[0011] Potencija adalimumaba je slična onoj za infliksimab. Još jedan nedostatak adalimumaba je njegova loša stabilnost, npr. kao što je utvrđeno u testu termičkog odvijanja. Utvrđeno je da temperatura topljenja (Tm) adalimumaba u takvom testu iznosi 67,5 °C. Što je niža vrednost Tmza antitelo, međutim, manja je i njegova opšta stabilnost. Niža Tmčini antitela manje pogodnim za farmaceutsku upotrebu, npr. za oralno davanje.

[0012] Potencija certolizumaba je nešto veća od one za infliksimab, ali još uvek nije zadovoljavajuća. Certolizumab ne inhibira proliferiju T-ćelija u MLR (Vos i saradnici, 2011, Gastroenterology, 140: 221).

[0013] EP2623515 A1 opisuje humanizovana anti-TNFα antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen (Fab). Kao što postaje jasno iz opisanih primera, potencija rezultujućih humanizovanih Fab fragmenata je uporediva sa onom za infliksimaba u L929 testu neutralizacije (pogledati Tabelu 2 i 5). Jedino se anti-TNFa IgG antitelo, čija je unakrsnu reaktivnost ispitivana, slabo vezuje za TNF-α rezus majmuna (pogledati [0069]; Sl.3). Unakrsna reaktivnost sa TNFα iz cinomolgus majmuna nije ispitivana. Štaviše, postoji slabo vezivanje za humani TNFβ (pogledati Sl.3). Prema tome, EP2623515 A1 ne opisuje anti-TNFa antitela, ili njihove funkcionalne fragmente, koji imaju potenciju da inhibiraju apoptozu indukovanu sa TNFa u L929 ćelijama koja je veća od one za infliksimab, a koja su i unakrsno reaktivna sa TNFα iz rezus i TNFα iz cinomolgus majmuna.

[0014] WO 2012/007880 A2 opisuje modifikovani jednodomenski molekul koji vezuje antigen (SDAB) u obliku fuzionih proteina koji sadrže jedan ili više pojedinačnih domena za vezivanje antigena, a koji se vezuju za jedan ili više ciljnih molekula (npr. TNFα), kao i linker i jedan ili više polimernih molekula. Jedini specifičan primer koji je dat, označen je kao SDAB-01, uključuje dva domena za vezivanje antigena koja se vezuju za TNFα, a koji su povezana sa fleksibilnim linkerom, i C-terminalni cistein koji podržava PEGilaciju specifičnu za mesto (pogledati Sl.3). WO 2012/007880 A2 nije uspeo da uporedi potenciju SDAB-01 sa poznatim TNFα antitelima poput infliksimaba, u testu neutralizacije zasnovanom na L929 ćelijama, ili da proceni druge parametre specifične za SDAB-01, kao što je efikasnost blokiranja interakcije TNFα i TNFRI/II i selektivnost vezivanja za TNFα u odnosu na TNFβ. U testu gde se tretman sa SDAB-01 i infliksimabom upoređivani, u transgenom mišjem modelu za poliartritis koji prekomerno eksprimira humani TNFα (pogledati stranu 54, Primer 8), deluje da su ova dva slično efektivna u prevenciji daljeg razvoja artritisa (npr. Sl.17 i 18). Ipak, doza data u ovom primeru navodi na pogrešne zaključke, pošto je molekulska težina SDAB-01 manja od polovine mase infliksimaba. WO 2012/007880 A2 stoga ne opisuje anti-TNFα antitela koja imaju potenciju da inhibiraju apoptozu indukovanu sa TNFα u L929 ćelijama koja je veća od one za infliksimab.

[0015] WO 2015/144852 A1 istražuje osobine anti-TNF-a scFv označenog kao „scFv1”. Ovaj scFv je pokazao kapacitet neutralizacije TNFα u PK-15 ćelijskom testu, koji je bio uporediv sa onim za infliksimab (pogledati [0236]). Dodatno, deluje da scFv ima izvesnu unakrsnu reaktivnost sa TNF-α iz rezus makaka i cinomolgus majmuna (pogledati Pr. 8). Podaci o afinitetu nisu prijavljeni u WO 2015/144852 A1.. Međutim, jednolančani fragment antitela, DLX105 (poznat i kao ESBA 105), za koga je poznato i da ima samo umeren afinitet (KD=157 pM; pogledati, Urech i saradnici, 2010 Ann Rheum Dis 69: 443), pokazuje bolje vezivanje za TNF-α u odnosu na scFv1 (pogledati Sl.1 iz WO 2015/144852 A1). WO 2015/144852 A1 stoga ne opisuje anti-TNF-α antitela koja imaju visok afinitet za humani TNFα (KD< 125 pM).

[0016] WO 2015/065987 A1 opisuje anti-TNF-a antitela, anti-IL-6 antitela i bispecifična antitela koja vezuju oba antigena. Određena anti-TNFα antitela su pokazala izvesnu unakrsnu reaktivnost sa TNFα iz cinomolgus majmuna (Sl.17). Anti-TNFα antitela su, međutim, ispoljila značajno nižu potenciju od infliksimaba u testu neutralizacije sa L929 ćelijama ([0152]; Sl.5). Prema tome, WO 2015/065987 A1 ne opisuje anti-TNF-a antitela koja imaju potenciju da inhibiraju apoptozu indukovanu sa TNFα u L929 ćelijama, a koja je veća od one za infliksimab.

[0017] Publikacija u Drugs in R&D, tom 4, br.3, 2003, strane 174-178, opisuje humanizovano antitelo „Humicade” (CDP 571; BAY 103356), monoklonsko anti-TNFα antitelo sa visokim afinitetom. Deluje, međutim, da je potencija Humicade da inhibira apoptozu indukovanu sa TNFα u L929 ćelijama ograničena (pogledati, npr. US 2003/0199679 A1 u [0189]). Referenca stoga ne opisuje anti-TNF-a antitela koja imaju potenciju da inhibiraju apoptozu indukovanu sa TNFα u L929 ćelijama, a koja je veća od one za infliksimab.

[0018] Publikacija Saldanha J W i saradnika: „Molecular Engineering I: Humanization”, Handbook of Therapeutic Antibodies, poglavlje 6, 2007-01-01, WILEY-VCH, Weinheim, str.119-144, opisuje različite strategije za humanizaciju monoklonskih antitela uključujući uvođenje CDR grafta, humanizaciju mišjih ostataka na izloženim površinama antitela (engl. Resurfacing/Veneering), SDR prenos i tehnologiju deimunizacije.

[0019] Postoji potreba za poboljšanim molekulima antitela za lečenje hroničnih inflamatornih bolesti, kao što su inflamatorni poremećaji creva. Molekuli antitela bi trebali da imaju najmanje (i) visok afinitet za humani TNFα (tj. KD< 125 pM), (ii) visoku potenciju inhibicije apoptoze indukovane sa TNFα u L929 ćelijama, (iii) visoku potenciju inhibiranja sekrecije citokina indukovane LPS-om, (iv) značajan afinitet za TNFα iz cinomolgus i rezus majmuna (npr. KD< 1 nM) i (v) visoku temperaturu topljenja za varijabilni domen, utvrđenu u ekperimentima termičkog odvijanja (npr. Tm> 70°C).

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0020] Pronalazači predmetne prijave su utvrdili da određena anti-TNFα antitela i njihovi funkcionalni fragmenti ispoljavaju kombinaciju povoljnih osobina, uključujući visok afinitet za humani TNFα (KD< 125 pM), potenciju da inhibiraju apoptozu indukovanu sa TNFα u L929 ćelijama koja je veća nego za infliksimab, potenciju da inhibiraju sekreciju citokina indukovanu LPS-om koja je veća nego za adalimumab, kao i značajan afinitet (KD< 1 nM) za TNFα iz životinja kao što su cinomolgus majmuni (Macaca fascicularis) i/ili rezus makaki (Macaca mulatta). Dodatno, antitela i njihovi funkcionalni fragmenti su bili specifični za TNFα po tome što se nisu značajno vezivali za TNFβ i ispoljavali su značajnu stabilnost, što je utvrđeno u testu termičkog odvijanja varijabilnog domena.

[0021] Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, sposoban da se specifično veuje za humani faktor nekroze tumora alfa (TNFα), pri čemu navedeno antitelo ili njegov funkcionalni fragment sadrže (i) VLdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:14, i (ii) VHdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:13, i pri čemu se specifično vezivanje odnosi na sposobnost antitela ili fragmenta da jasno razlikuju humani TNFα i humani TNFβ.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0022]

Slika 1: Šematski prikaz postupka humanizacije.

Slika 2: SE-HPLC hromatogrami prečišćenih humanizovanih scFv preparata za scFv. ScFv monomer se eluira sa retencionim vremenima između 8,5 i 9,5 minuta, dok se komponente pufera eluiraju na >10 min. Svi pikovi od mrtve zapremine kolone do odgovarajućeg scFv monomera, integrisani su kao agregati/oligomeri i upotrebljavani su za izračunavanje relativne površine pika.

Slika 3: Krive termičkog odvijanja iz DSF merenja za dva scFv konstrukta. Za svaki konstrukt su prikazani duplikati merenja. Dobijene Tm vrednosti su bile određivane ubacivanjem podataka u Bolcmanovu jednačinu, da bi se dobila srednja tačka prelaza.

Slika 4: Vremenski tok sadržaja monomera za dva scFv konstrukta tokom skladištenja. Sadržaj monomera je određivan SE-HPLC postupkom i podaci su unošeni u grafik za skladištenja u trajanju od 4 nedelje na temperaturama od 4, -20 i <-65°C.

Slika 5: Preklapanje SE-HPLC hromatograma za dva scFv molekula. Za svaki scFv je prikazan uzorak (10 mg/ml) 0. dana i nakon skladištenja od 4 nedelje na 4°C. Dodatno, prikazan je i hromatogram uzorka nakon 5 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja. Umetnuti grafik prikazuje uvećanje y-ose od pribl. 15 puta za svaki molekul, da bi se učinile vidljivima i minijaturne promene u sadržaju oligomera.

Slika 6: Vremenski tok sadržaja monomera humanizovanih scFv tokom skladištenja. Sadržaj monomera je određivan SE-HPLC postupkom i podaci su unošeni na grafik za uzorak od 10 mg/mL i skladištenje na temperaturi od 37°C tokom 4 nedelje.

Slika 7: Potencija neutralizacije humanog TNFα u L929 testu za dva scFv. Krive doznog ogovora za scFv i referentno antitelo infliksimab prikazane su za svaki eksperiment. Najviše koncentracije scFv i infliksimaba, kao i negativne kontrole, postavljene su kao vrednosti rasta od 100% i 0%.

Slika 8: Potencija dva scFv da neutrališu TNFα iz primata različitih od čoveka i humani TNFα, u testu sa L929 ćelijama. Prikazane su krive doznog odgovora za neutralizaciju TNFα čoveka, cinomolgus majmuna i rezus majmuna. Najviše koncentracije scFv i negativne kontrole su postavljene kao vrednosti rasta od 100% i 0%.

Slika 9: Potencija dva scFv da blokiraju interakciju TNFα-TNFRI. Prikazane su krive doznog odgovora. Najviše koncentracije scFv i negativne kontrole su postavljene kao vrednosti vezivanje TNFα za TNFRI od 0% i 100%.

Slika 10: Potencija dva scFv da blokiraju interakciju TNFα-TNFRII. Prikazane su krive doznog odgovora. Najviše koncentracije scFv i negativne kontrole su postavljene kao vrednosti vezivanje TNFα za TNFRII od 0% i 100%.

Slika 11: Ciljna specifičnost scFv. Potencijal inhibiranja interakcije biotiniziranog TNFα sa scFv, putem TNFα i TNFβ, analiziran je sa kompetitivnim ELISA testom. Prikazani su efekti TNFα i TNFβ zavisni od doze.

Slika 12 prikazuje obrazovanje 16-22-H5-scFv:TNFα kompleksa utvrđenih SE-HPLC postupkom (Primer 4).

Slika 13 prikazuje istovremeno vezivanje dva TNFα molekula za 16-22-H5-scDb, utvrđeno SPR postupkom (Primer 5).

Slika 14A prikazuje obrazovanje 16-22-H5-IgG:TNFα kompleksa (Primer 5).

Slika 14B prikazuje obrazovanje 16-22-H5-scDb:TNFα kompleksa (Primer 5).

Slika 15 prikazuje inhibiciju ćelijske proliferacije u MLR nakon anti-TNFα tretmana. *: p < 0,05; **: p < 0,01 u poređenju sa IgG kontrolom (Primer 6).

Slika 16 pokazuje sposobnost različitih formata antitela 16-22-H5 i adalimumaba da inhibiraju sekreciju IL-1β (Slika 16A) i TNFα (Slika 16B) indukovane LPS-om u monocitima, na način koji je zavisan od doze (Primer 7).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0023] Predmetni pronalazak se odnosi na antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, sposobne da se vezuju za humani TNFα, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Bilo koje pozivanje na postupke lečenja, u opisu se odnosi na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom.

[0024] U kontekstu predmetne prijave, termin „antitelo” se upotrebljava kao sinonim za „imunoglobulin” (Ig), koji je definisan kao protein koji pripada IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD klasi (ili bilo kojoj od njihovih potklasa) i uključuje sva konvencionalno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. U kontekstu predmetnog pronalaska, „funkcionalni fragment” antitela/imunoglobulina je definisan kao fragment koji vezuje antigen ili je drugi derivat matičnog antitela koji suštinski zadržava jednu ili više osobina takvog matičnog antitela koje su ovde prethodno navedene, u stavkama (1) do (26). „Fragment koji vezuje antigen” antitela/imunoglobulina je definisan kao fragment (npr. varijabilni region IgG) koji zadržava region koji vezuje antigen. „Region koji vezuje antigen” antitela obično se nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, tj. CDR-1, -2 i/ili -3 regionima. „Fragmenti koji vezuju antigen” pronalaska uključuju domen F(ab')2fragmenta i Fab fragmenta. „Funkcionalni fragmenti” pronalaska uključuju scFv, dsFv, diatela, triatela, tetratela i Fc fuzione proteine. F(ab')2ili Fab mogu biti konstruisani tako da se na minimum svede ili potpuno uklone međumolekulske disulfidne interakcije koje se javljaju između CH1 i CL domena. Antitela ili funkcionalni fragmenti predmetnog pronalaska mogu biti deo bi- ili multifunkcionalnih konstrukata.

[0025] Poželjni funkcionalni fragmenti u predmetnom pronalasku su scFv i diatela.

[0026] scFv je jednolančani Fv fragment u kome su varijabilni domeni lakih („VL”) i varijabilni domeni teških („VH”) lanaca povezani peptidnim mostom.

[0027] Diatelo je dimer koji se sastoji od dva fragmenta, od kojih svaki ima varijabilne regione spojene zajedno preko likera ili sličnog (u daljem tekstu su označeni kao fragmenti koji obrazuju diatelo), i obično sadrže dva VLi dva VH. Fragmenti koji obrazuju diatelo uključuju one koji se sastoje od VLi VH, VLi VL, VHi VHitd., poželjno VHi VL. U fragmentima koji obrazuju diatelo, linker koji spaja varijabilne regione nije posebno ograničen, ali poželjno je dovoljno kratak da se izbegnu nekovalentne veze između varijabilnih regiona u istom fragmentu. Dužinu takvog linkera, kao odgovarajuću, mogu utvrditi stručnjaci iz oblasti tehnike, ali ista obično iznosi 2-14 aminokiselina, poželjno 3-9 aminokiselina, posebno 4-6 aminokiselina. U ovom slučaju, VLi VHsu kodirani na istom fragmentu i spojeni su preko dovoljno kratkog linkera, da bi se izbegle nekovalentne veze između VLi VHna istom lancu, kao i da bi se izbeglo obrazovanje fragmenata jednolančanih varijabilnih regiona, a tako da se mogu obrazovati dimeri sa drugim fragmentom. Dimeri mogu biti obrazovani preko kovalentnih ili nekovalentnih veza, ili oba, između fragmenata koji obrazuju diatelo.

[0028] Štaviše, fragmenti koji obrazuju diatelo mogu biti spojeni preko linkera ili sličnog, da bi obrazovala jednolančana diatela (sc(Fv)2). Spajanjem fragmenata koji obrazuju diatelo, upotrebom dugog linkera od oko 15-20 aminokiselina, mogu se obrazovati nekovalentne veze između fragmenata koji obrazuju diatelo koji postoje u istom lancu, a da bi se obrazovala dimeri. Na osnovu istog principa kao i za dobijanje diatela, polimerizovana antitela, kao što su trimeri ili tetrameri, mogu takođe biti pripremljeni, spajanjem tri ili više fragmenata koji obrazuju diatela.

[0029] Poželjno, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska se specifično vezuju za TNFα. Kao što se ovde upotrebljava, antitelo ili njegov funkcionalni fragment „specifično prepoznaju”, ili se „specifično vezuje za” humani TNFα, kada je antitelo ili funkcionalni fragment u stanju da razlikuje između humanog TNFα i jednog ili više referentnih molekula. Poželjno, IC50vrednost vezivanja za svaki od referentnih molekula je najmanje 1000 puta veća od IC50vrednosti vezivanja za TNFα, posebno kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.4. U svom najopštijem obliku (i kada se ne pominje definisana referenca), „specifično vezivanje” se odnosi na sposobnost antitela ili funkcionalnog fragmenta da jasno razlikuje humani TNFα i nepovezani biomolekul, što se utvrđuje, na primer, u skladu sa postupcima ispitivanja specifičnosti koji su poznati u oblasti tehnike. Takvi postupci obuhvataju imunoblot i ELISA testove. Na primer, može biti izveden standardni ELISA test. Obično, određivanje specifičnosti vezivanja se vrši upotrebom ne samo jednog referentnog biomolekula, već skupa od oko tri do pet nesrodnih biomolekula, kao što su mleko u prahu, BSA, transferin ili slično. U jednom primeru izvođenja, specifično vezivanje se odnosi na sposobnost antitela ili fragmenta da prave jasnu razliku između humanog TNFα i humanog TNFβ.

[0030] Antitelo pronalaska, ili funkcionalni fragment pronalaska, sadrže VLdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je kao što je prikazano u SEQ ID NO:14 i VHdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je kao što je prikazano u SEQ ID NO:13. VLdomen obuhvata CDR1 region (CDRL1), CDR2 region (CDRL2), CDR3 region (CDRL3) i uokvirujuće regione. VHdomen obuhvata CDR1 region (CDRH1), CDR2 region (CDRH2), CDR3 region (CDRH3) i uokvirujuće regione.

[0031] Termin „CDR” se odnosi na jedan od šest hipervarijabilnih regiona unutar varijabilnih domena antitela, koji uglavnom doprinose vezivanju za antigen. Jednu od najčešće korišćenih definicija za šest CDR-ova, obezbedili su Kabat E.A. i saradnici (1991.) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Kao što se ovde upotrebljava, Kabatova definicija CDR se primenjuje samo na CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog domena lakog lanca (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ili L1, L2, L3), kao i na CDR2 i CDR3 varijabilnog domena teškog lanca (CDR H2, CDR H3 ili H2, H3). CDR1 varijabilnog domena teškog lanca (CDR H1 ili H1), međutim, kako se ovde upotrebljava, definisan je sledećim ostacima (po Kabat numeraciji): Počinje od pozicije 26 i završava se pre pozicije 36.

[0032] CDR1 region VLdomena se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:7.

[0033] CDR2 region VLdomena se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:8.

[0034] CDR3 region VLdomena se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:9.

[0035] CDR1 region VHdomena se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:10.

[0036] CDR2 region VHdomena se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:11.

[0037] CDR3 region VHdomena se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:12.

[0038] Antitelo pronalaska, ili funkcionalni fragment pronalaska, sadrže VHdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:13. Štaviše, antitelo ili funkcionalni fragment sadrži VLdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:14.

[0039] U posebno poželjnom primeru izvođenja, funkcionalni fragment je jednolančano antitelo (scFv) koje sadrži VHdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:13 i VLdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:14. VHdomen i VLdomena su poželjno povezani peptidnim linkerom. Peptidni linker (u daljem tekstu označen kao „linkerA") obično je dužine od oko 10 do oko 30 aminokiselina, a poželjnije je dužine od oko 15 do oko 25 aminokiselina. LinkerA obično sadrži ostatke Gly i Ser, ali su moguće i druge aminokiseline. U poželjnim primerima izvođenja, linker sadrži višestruke ponavke sekvence GGGGS (SEQ ID NO:50), npr.2 do 6, ili 3 do 5, ili 4 uzastopna ponovka aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:50. Najpoželjnije, linkerA se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:49. ScFv može imati sledeću strukturu (sa N-krajem prikazanim na levoj i C-krajem prikazanim na desnoj strani):

VL-LinkerA-VH; ili

VH-LinkerA-VL.

[0040] Poželjnije, funkcionalan fragment je jednolančano antitelo (scFv) koje se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:15.

[0041] U drugom posebno poželjnom primeru izvođenja, funkcionalan fragment je diatelo koje sadrži VHdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:13 i VLdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:14. VHdomen i VLdomena su povezani peptidnim linkerom. Peptidni linker (u daljem tekstu označen kao „linkerB") poželjno je dužine od oko 2 do oko 10 aminokiselina, a poželjnije od oko 5 aminokiselina. LinkerB obično sadrži ostatke Gly i Ser, ali su moguće i druge aminokiseline. Najpoželjnije, linkerB se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:50.

[0042] Diatelo je poželjno monospecifično diatelo, tj. usmereno je na samo jedan epitop. Diatelo je poželjno homodimer. Diatelo može biti dimer dva polipeptidna lanca koji su nekovalentno vezani jedan za drugi. Svaki monomer može biti polipeptidni lanac koji ima strukturu:

VL-LinkerB-VH; ili

VH-LinkerB-VL.

[0043] Štaviše, fragmenti koji obrazuju diatelo mogu biti spojeni preko linkeraA ili sličnog, da bi se obrazovala jednolančana diatela (sc(Fv)2). Spajanjem fragmenata koji obrazuju diatelo, upotrebom dugog linkera od oko 15-20 aminokiselina, mogu se obrazovati nekovalentne veze između fragmenata koji obrazuju diatelo, a koji postoje u istom lancu, da bi se obrazovala dimeri. Primeri rasporeda jednolančanih diatela uključuju sledeće.

VH- linkerB - VL- linkerA - VHlinker B - VL

VL- linkerB - VH- linkerA - VL- linkerB - VH

[0044] Poželjno, diatelo pronalaska ima sledeću strukturu:

VL- linkerB - VH- linkerA - VL- linkerB - VH

[0045] Najpoželjnije je da se diatelo sastoji od sekvence aminokiselina prikazane u SEQ ID NO:51.

[0046] Na osnovu istog principa kao i za pripremu diatela, polimerizovana antitela kao što su trimeri ili tetrameri, takođe mogu biti pripremljeni spajanjem tri ili više fragmenata koji obrazuju diatela.

[0047] U drugom posebnom primeru izvođenja, antitelo pronalaska je imunoglobulin, poželjno imunoglobulin G (IgG). Potklasa IgG pronalaska nije ograničena i uključuje IgG1, IgG2, IgG3i IgG4. Poželjno, IgG pronalaska je potklase 1, tj. prestavlja IgG1molekul. U jednom primeru izvođenja, svaki laki lanac IgG molekula pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:52, i/ili svaki teški lanac IgG molekula pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:53. Specifičan IgG pronalaska se sastoji od dva laka lanca i dva teška lanca, pri čemu svaki od dva laka lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:52, a svaki od dva teška lanca ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:53.

Afinitet

[0048] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska imaju visok afinitet prema humanom TNFα. Termin „KD” odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena. Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska se obično vezuju za humani TNFα sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) manjom od približno 2X10<-10>M, poželjno manjom od 1,5X10<-10>M, poželjno manjom od 1,25X10<-10>M, poželjnije manjom od 1X10<-10>M, najpoželjnije manjom od 7,5X10<-11>M ili čak manjom od 5X10<-11>M, što se utvrđuje upotrebom tehnologije rezonancije površinskog plazmona (SPR) u BIACORE instrumentu. Preciznije, utvrđivanje KDse vrši kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.1.

Unakrsna reaktivnost sa TNFα iz cinomolgus majmuna ili iz rezus makaka

[0049] U posebnim primerima izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska imaju značajan afinitet za TNFα iz životinja kao što su cinomolgus majmuni (Macaca fascicularis) i/ili rezus makaki (Macaca mulatta). Navedeno predstavlja prednost, pošto se pretklinički testovi anti-humanih TNFα antitela, kao što su studije toksičnosti, poželjno izvode na takvim životinjama. U skladu sa time, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska poželjno su unakrsno reaktivni sa TNFα iz životinja kao što su cinomolgus majmuni i/ili rezus makaki. Merenja afiniteta se vrše kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.1.

[0050] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska unakrsno su reaktivni sa TNFα iz Macaca fascicularis. Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska poželjno imaju afinitet za TNFα iz Macaca fascicularis koji je za manje od 20 puta, posebno manje od 10 puta, još posebnije manje od 5 puta različit od onog za humani TNFα. Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska se obično vezuju za TNFα iz Macaca fascicularis sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD), pri čemu je odnos RM.fascicularisjednak (i) KDvezivanja za TNFα iz Macaca fascicularis prema (ii) KDvezivanja za humani TNFα, koji je manji od 20.

KD(M. fascicularis)

RM.fascicularis

KD(čoveka)

[0051] RM.fascicularisje poželjno manji od 20, posebno manji od 10, još više posebno manji od 5.

[0052] U drugom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska su unakrsno reaktivni sa TNFα iz Macaca mulatta. Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska poželjno imaju afinitet za TNFα iz Macaca mulatta koji je za manje od 20 puta, preciznije za manje od 10 puta različit od onog za humani TNFα. Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska se stoga vezuju za TNFα iz Macaca mulatta sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD), gde je odnos RM.mulattajednak (i) KDvezivanja za TNFα iz Macaca mulatta prema (ii) KDvezivanja za humani TNFα, manji od 20.

KD(M. mulatta)

RM.mulatta

KD(čoveka)

[0053] RM.mulattaje poželjno manji od 20, posebno manji od 10.

[0054] U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska su unakrsno reaktivni sa TNFα iz Macaca fascicularis i sa TNFα iz Macaca mulatta. Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska poželjno imaju afinitet za TNFα iz Macaca fascicularis koji je za manje od 20 puta, posebno za manje od 10 puta, čak još više posebno za manje od 5 puta različit od onog za humani TNFα, a poželjno je i da imaju afinitet prema TNFα iz Macaca mulatta koji je za manje od 20 puta, preciznije za manje od 10 puta drugačiji od onog za humani TNFα. Odnos RM.fascicularisantitela ili funkcionalnog fragmenta je poželjno manji od 20, posebno manji od 10, još više posebno manji od 5, a odnos RM.mulattaantitela ili funkcionalnog fragmenta poželjno je manji od 20, posebno manji od 10.

Potencija inhibiranja apoptoze L929 ćelija indukovane sa TNFα

[0055] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska imaju visoku potenciju da inhibiraju apoptozu L929 ćelija indukovanu sa TNFα. U posebnom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska imaju potenciju da inhibiraju apoptozu L929 ćelija indukovanu sa TNFa koja je veća od one za poznato antitelo infliksimab.

[0056] Potencija u odnosu na infliksimab može biti utvrđena L929 testom kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.2 ove prijave. Relativna potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta pronalaska je veća od 1,5, poželjno je veća od 2, poželjnije veća je od 3, poželjnije veća je od 5, poželjnije veća je od 7,5 ili je čak veća od 10, pri čemu je relativna potencija odnos između (i) IC50vrednosti za infliksimab u L929 testu i (ii) IC50vrednosti za antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska u L929 testu, i pri čemu IC50označava koncentraciju odgovarajućeg molekula, u ng/mL, koja je neophodna za postizanje 50% od maksimalne inhibicije apoptoze L929 ćelija indukovane sa TNFa.

[0057] U drugom primeru izvođenja, relativna potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta pronalaska je veća od 1,5, poželjno je veća od 2, poželjnije je veća od 3, poželjnije je veća od 5, poželjnije je veća od 7,5 ili je čak veća od 10, pri čemu je relativna potencija odnos između (i) IC90vrednosti za infliksimab u L929 testu i (ii) IC90vrednosti za antitelo ili funkcionalan fragment pronalaska u L929 testu, i pri čemu IC90vrednost označava koncentraciju odgovarajućeg molekula, u ng/mL, koja je neophodna za postizanje maksimalne inhibicije apoptoze L929 ćelija indukovane sa TNFα od 90%.

Inhibicija sekrecije citokina indukovane LPS-om

[0058] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska su obično sposobni da inhibiraju sekreciju citokina iz monocita indukovanu LPS-om. Sekrecija citokina iz monocita indukovana LPS-om može biti utvrđena kao što je opisano u Primeru 7.

[0059] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska sposobni su da inhibiraju sekreciju interleukina-1β indukovanu LPS-om iz CD14<+>monociti. IC50vrednost inhibiranja sekrecije interleukina-1β indukovane LPS-om poželjno je manja od 1 nM i/ili je manja od 100 pg/mL. IC50vrednost inhibiranja sekrecije interleukina-1β indukovane LPS-om, na bazi molarnosti i/ili na bazi težine po zapremini, poželjno je niža od vrednosti za adalimumab.

[0060] U drugom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska sposobni su da inhibiraju sekreciju TNFα indukovanu LPS-om iz CD14<+>monocita. IC50vrednost za inhibiranje sekrecije TNFα indukovane LPS-om poželjno je manja od 1 nM i/ili manja je od 150 pg/mL. IC50vrednost inhibiranja sekrecije TNFα indukovane LPS-om, na bazi molarnosti i/ili na bazi težine po zapremini, poželjno je niža od vrednosti za adalimumab.

Inhibicija ćelijske proliferacije

[0061] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska obično su sposobni da inhibiraju ćelijsku proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi u mešovitoj limfocitnoj reakciji. Inhibicija ćelijske proliferacije može biti utvrđena kao što je opisano u Primeru 6. Indeks stimulacije za antitelo ili funkcionalni fragment, npr. scFv ili diatelo pronalaska, utvrđivan je prema Primeru i poželjno je manji od 5, poželjnije manji od 4,5. U posebnim primerima izvođenja, indeks stimulacije antitela, npr. IgG pronalaska, manji je od 4 ili je čak manji od 3.

Inhibicija interakcije između TNFα i TNF receptora

[0062] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska obično su sposobni da inhibiraju interakciju između humanog TNFα i TNF receptora tipa I (TNFRI). Inhibicija interakcije između humanog TNFα i TNFRI može biti utvrđena inhibitornim ELISA postupkom, kao što je opisano ispod, u Primeru 2, odeljak 2.1.3.

[0063] Potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta pronalaska da inhibiraju interakciju između humanog TNFα i TNFRI, u odnosu na onu za infliksimab (relativna potencija), što se utvrđuje inhibitornim ELISA postupkom, poželjno je najmanje 2, pri čemu je navedena relativna potencija odnos IC50vrednosti u ng/mL za infliksimab i IC50vrednosti u ng/mL za antitelo ili njegov funkcionalni fragment.

[0064] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska obično su sposobani da inhibiraju interakciju između humanog TNFα i TNF receptora tipa II (TNFRII). Inhibicija interakcije između humanog TNFα i TNFRII može biti utvrđena inhibitornim ELISA postupkom, kao što je opisano ispod, u Primeru 2, odeljak 2.1.3.

[0065] Potencija antitela ili funkcionalnog fragmenta pronalaska da inhibiraju interakciju između humanog TNFα i TNFRII, u odnosu na onu za infliksimab (relativna potencija), što se utvrđuje inhibitornim ELISA postupkom, poželjno je najmanje 2, poželjnije najmanje 3, pri čemu je navedena relativna potencija odnos IC50vrednosti u ng/mL za infliksimab i IC50vrednosti u ng/mL za antitelo ili njegov funkcionalni fragment.

Stehiometrija i umrežavanje

[0066] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska su obično sposobni da se vezuju za humani TNFαTrimeru stehiometriji (antitelo:TNFαTrimer) od najmanje 2. Stehiometrija (antitelo:TNFαTrimer) poželjno je veća od 2, ili je najmanje 2,5, ili je najmanje 3. U jednom primeru izvođenja, stehiometrija (antitelo:TNFαTrimer) je oko 3. Stehiometrija (antitelo:TNFαTrimer) može biti utvrđena kao što je opisano u nastavku teksta, u Primeru 4.

[0067] U drugom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska sposobni su da obrazuju kompleks sa humanim TNFα, pri čemu navedeni kompleks sadrži najmanje dva molekula TNFα i najmanje tri molekula antitela ili funkcionalnog fragmenta. Funkcionalni fragment u skladu sa ovim primerom izvođenja sadrži najmanje dva odvojena mesta vezivanja za TNFα, kao što je npr. slučaj sa diatelima. Obrazovanje kompleksa može biti utvrđeno kao što je opisano u nastavku teksta, u Primeru 5.

[0068] U jednom primeru izvođenja, antitelo je IgG, i sposobno je da obrazuje kompleks sa TNFα od najmanje 600 kDa. U drugom primeru izvođenja, funkcionalni fragment je diatelo i sposoban je da obrazuju kompleks sa TNFα od najmanje 300 kDa.

Selektivnost za ciljne molekule

[0069] U određenim primerima izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska imaju visoku selektivnost za ciljni molekul, tj. mogu jasno razlikovati TNFα i TNFβ. Poželjno, IC50vrednost za TNFβ je najmanje 1000 puta veća od IC50vrednosti za TNFα, što se utvrđuje kompetitivnim ELISA testom, kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.4. Poželjnije, IC50vrednost za TNPβ je najmanje 5.000 puta, najpoželjnije najmanje 10.000 veća od IC50vrednosti za TNFα, što se utvrđuje kompetitivnim ELISA testom kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.1.4.

Prinos ekspresije i prinos ponovnog uvijanja proteina

[0070] U drugim primerima izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska, poželjno scFv ili diatelo, mogu biti rekombinantno eksprimirani u visokom prinosu, u mikroorganizmima kao što su bakterije ili u drugim ćelijama. Poželjno, ekspresioni prinos u E. coli, utvrđen kao što je opisano u Primeru 2, iznosi najmanje 0,25 g/L. Navedeno se posebno odnosi na funkcionalne fragmente kao što su scFv.

[0071] Prinos ponovnog uvijanja, određen kao što je opisano u Primeru 2, iznosi najmanje 5 mg/L, poželjnije najmanje 10 mg/L, poželjnije najmanje 15 mg/L, a najpoželjnije najmanje 20 mg/L. Navedeno se posebno odnosi na funkcionalne fragmente kao što su scFv.

Stabilnost

[0072] Antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska, poželjno scFv ili diatelo, obično imaju visoku stabilnost. Stabilnost može biti procenjivana različitim metodologijama. „Temperatura topljenja” Tmvarijabilnog domena antitela ili funkcionalnog fragmenta pronalaska, određena diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF) kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.4, poželjno je najmanje 65°C, poželjnije najmanje 68°C, više poželjno je najmanje 70°C. „Temperatura topljenja varijabilnog domena”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na temperaturu topljenja scFv koji se sastoji od sekvence VL- LinkerA - VH, pri čemu se aminokiselinska sekvenca LinkerA sastoji od aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:49. Na primer, temperatura topljenja varijabilnog domena IgG definisana je kao temperatura topljenja njegovog odgovarajućeg scFv, kao što je prethodno definisano.

[0073] Gubitak sadržaja monomera (pri koncentraciji od 10 g/L; početni sadržaj monomera > 95%) nakon skladištenja tokom četiri nedelje na 4°C, određen analitičkom hromatografijom sa isključivanjem po veličini, kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.5, poželjno je manji od 5%, poželjnije manji je od 3%, poželjnije je manji od 1%, a najpoželjnije je manji od 0,5%. Gubitak sadržaja monomera (pri koncentraciji od 10 g/L; početni sadržaj monomera > 95%) nakon skladištenja tokom četiri nedelje na -20°C, određen analitičkom hromatografijom sa isključivanjem po veličini, kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.5, poželjno je manji od 5%, poželjnije manji je od 3%, poželjnije je manji od 1%, a najpoželjnije je manji od 0,5%. Gubitak sadržaja monomera (pri koncentraciji od 10 g/L; početni sadržaj monomera > 95%) nakon skladištenja tokom četiri nedelje na -65°C, određen analitičkom hromatografijom sa isključivanjem po veličini, kao što je opisano u Primeru 2, odeljak 2.2.5, poželjno je manji od 5%, poželjnije je manji od 3%, poželjnije je manji od 1%, a najpoželjnije je manji od 0,5%.

[0074] Gubitak monomera nakon pet uzastopnih ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, određen kao što je opisano u Primeru 2, manji je od 5%, poželjnije je manji od 1%, poželjnije je manji od 0,5%, a najpoželjnije je manji od 0,2%, npr. iznosi 0,1% ili 0,0%.

Antitela i funkcionalni fragmenti

[0075] Posebni primeri izvođenja pronalaska odnose se na funkcionalne fragmente antitela koja su ovde opisana. Funkcionalni fragmenti uključuju F(ab')2fragment, Fab fragment, scFv, diatela, triatela i tetratela. Poželjno, funkcionalni fragment je jednolančano antitelo (scFv) ili diatelo. Poželjnije, sekvence različite od CDR u scFv ili diatelu su humane sekvence.

[0076] Poželjno, da bi se potencijal imunogenosti kod ljudi sveo na minimum, izabrana akceptorska matrica se sastoji od uokvirujućih regiona izvedenih iz humanih konsenzusnih sekvenci ili humanih germinativnih sekvenci. Preciznije, uokvirujući regioni I do III varijabilnog domena lakog lanca sastoje se od humane VK1 konsenzusne sekvence u skladu sa SEQ ID NO: 56 do 58, dok je uokvirujući region IV sekvence zasnovane na λ germinativnoj sekvenci izabran od SEQ ID NO: 59 do 62. Pošto ostaci koji nisu ostaci humane konsenzusne ili humane germinativne sekvence mogu prouzrokovati imunološke reakcije, broj takvih ostataka u svakom varijabilnom domenu (VH ili VL) bi trebao da bude što je moguće niži, poželjno niži od 7, poželjnije niži od 4, a najpoželjniji 0.

[0077] Poželjno, antitelo je monoklonsko antitelo. Termin „monoklonsko antitelo”, kako se ovde upotrebljava, nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Termin „monoklonsko antitelo” odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, a ne postupak kojim se proizvodi. Monoklonska antitela mogu biti pripremljena upotrebom širokog spektra tehnika poznatih u oblasti tehnike, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantne i tehnologije prikazivanja u fagima, ili njihove kombinacije. (Harlow i Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual” CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

[0078] U drugim primerima izvođenja, uključujući primere izvođenja koje se odnose na in vivo upotrebu anti-TNFα antitela kod ljudi, mogu biti upotrebljena himerna, primatizovana, humanizovana ili humana antitela. U poželjnom primeru izvođenja, antitelo je humano antitelo ili humanizovano antitelo, poželjnije monoklonsko humano antitelo ili monoklonsko humanizovano antitelo.

[0079] Termin „himerno” antitelo, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo koje ima varijabilne sekvence izvedene iz imunoglobulina koji je različit od humanog, kao što je antitelo pacova ili miša, kao i konstantne regione humanih imunoglobulina, obično izabrane iz matrica humanih imunoglobulina. Postupci za proizvodnju himernih antitela su poznati u oblasti tehnike. Pogledati, npr. Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi i saradnici, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies i saradnici, 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; U.S. Pat. No.5,807,715; 4,816,567; i 4,816397.

[0080] Prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike su dostupne različite rekombinantne metodologije da bi se antitelo koje nije humano (npr. mišje je) učinilo sličnijim humanom, generisanjem imunoglobulina, imunoglobulinskih lanaca ili njihovih fragmenata (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili druge podsekvence antitela sa ciljanim delovanjem), koji sadrže minimalne sekvence izvedene iz takvog imunoglobulina koji nije humanog porekla. U principu, dobijeno rekombinantno antitelo će sadržavati suštinski sve od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz imunoglobulina koji nije poreklom iz čoveka, dok su svi ili suštinski svi FR regioni oni iz sekvence humanog imunoglobulina, posebno konsenzusne sekvence humanog imunoglobulina. Antitela sa CDR graftom su molekuli antitela koji imaju jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz antitela prvobitno generisanog u vrsti koja nije čovek, a koja vezuju željeni antigen i imaju uokvirujuće (FR) regione iz humanog imunoglobulinskog molekula (EP239400; PCT objava WO 91/09967; U.S. Patent No. 5,225,539; 5,530,101 i 5,585,089). Često, u procesu koji se naziva „humanizacija”, ostaci uokvirujućeg regiona u humanim uokvirujućim regionima dodatno će biti supstituisani sa odgovarajućim ostatkom iz CDR donorskog antitela da bi se izmenilo, poželjno poboljšalo, vezivanje antigena. Ovakve supstitucije u uokvirujućem regionu se identifikuju postupcima koji su dobro poznati u oblasti tehnike, npr. modelovanjem interakcija CDR i ostataka uokvirujućeg regiona, a da bi se identifikovali ostaci uokvirujućeg regiona koji su važni za vezivanja antigena, kao i poređenjem sekvenci, da bi se identifikovali neobični ostaci uokvirujućeg regiona na određenim pozicijama. Pogledati, npr. Riechmann i saradnici, 1988, Nature 332:323-7 i Queen i saradnici, U.S. Patent No: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370. Antitela mogu biti učinjenja više humanim upotrebom raznovrsnih dodatnih tehnika koje su poznate u oblasti tehnike, uključujuću, na primer, modifikacije površinski izloženih ostataka (engl. veneering/resurfacing; (EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnicka i saradnici, 1994, Prot. Eng.

7:805-814; Roguska i saradnici, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973, kao i mešanjem lanaca (U.S. Patent No. 5,565,332). Antitelo sa CDR graftom, ili humanizovano antitelo, mogu takođe sadržavati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično onaj izabran iz matrice humanih imunoglobulina.

[0081] U pojedinim primerima izvođenja, humanizovana antitela se pripremaju kao što je opisano u Queen i saradnici, U.S. Patent No: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370. Opisana su, iako nisu obuhvaćena patentnim zahtevima, anti-TNFα antitela koja su humana antitela. Potpuno „humana” anti-TNFα antitela mogu biti poželjna za terapijski tretman humanih pacijenata. Kao što se ovde upotrebljava, „humana antitela” obuhvataju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina, a koje ne eksprimiraju endogene imunoglobuline. Humana antitela mogu biti napravljena raznovrsnim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike, uključujući postupak prikazivanja u fagima koji je ovde prethodno opisan, kao i upotrebom biblioteka antitela izvedenih iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Pogledati, U.S. Patent No. 4,444,887 i 4,716,111; i PCT objave WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; i WO 91/10741. Humana antitela takođe mogu biti proizvedena upotrebom transgenih miševa koji nisu u stanju da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu eksprimirati humane imunoglobulinske gene. Pogledati, npr. PCT objave WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; U.S. Patent No.55,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; i 5,939,598. Potpuno humana antitela koja prepoznaju odabrani epitop mogu biti generisana upotrebom tehnike koja se ovde označava kao „vođena selekcija”. U ovom pristupu, izabrano monoklonsko antitelo koje nije humanog porekla, npr. mišje antitelo, upotrebljava se za usmeravanje selekcije potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (Jespers i saradnici, 1988, Biotechnology 12:899-903). Opisana su, iako nisu obuhvaćena patentnim zahtevima, anti-TNFα antitela koja su primatizovana antitela. Termin „primatizovano antitelo” se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilne regione majmuna i humane konstantne regione. Postupci za proizvodnju primatizovanih antitela su poznati u oblasti tehnike. Pogledati, npr. U.S. Patent No.5,658,570; 5,681,722; i 5,693,780.

[0082] U pojedinim primerima izvođenja, anti-TNFα antitela su derivatizovana antitela. Na primer, derivatizovana antitela koja su modifikovana, npr. glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom (pogledati u nastaku teksta diskusiju o konjugatima antitela) itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može biti sprovedena poznatim tehnikama, uključujući specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina itd. Dodatno, derivat može sadržavati jednu ili više aminokiselina koje nisu klasične.

[0083] Prema još drugim aspektima, anti-TNFα antitelo ima jednu ili više aminokiselina insertovanih u jedan ili više od njegovih hipervarijabilnih regiona, na primer, kao što je opisano u US 2007/0280931.

Konjugati antitela

[0084] U pojedinim primerima izvođenja, anti-TNFα antitela su konjugati antitela koji su modifikovani, npr. kovalentnim vezivanjem bilo kog tipa molekula za antitelo, a tako da kovalentno vezivanje ne ometa vezivanje za TNFα. Tehnike konjugovanja efektorskih struktura sa antitelima su dobro poznate u oblasti tehnike (pogledati, npr. Hellstrom i saradnici, Controlled Drag Delivery, 2, izd., na str.623-53 (Robinson i saradnici, ur., 1987)); Thorpe i saradnici, 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 i Dubowchik i saradnici, 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

[0085] U jednom primeru, antitelo ili njegov fragment su fuzionisani preko kovalentne veze (npr. peptidne veze), na opciono N-kraju ili C-kraju, sa aminokiselinskom sekvencom drugog proteina (ili njegovog dela; poželjno sa najmanje delom proteina od 10, 20 ili 50 aminokiselina). Poželjno je da je antitelo ili njegov fragment povezan sa drugim proteinom na N-kraju konstantnog domena antitela. Postupci rekombinantne DNK mogu biti upotrebljeni za stvaranje takvih fuzija, na primer, kao što je opisano u WO 86/01533 i EP0392745. U drugom primeru, efektorski molekul može povećati poluživot in vivo. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovog tipa uključuju polimere, albumin, proteine koji vezuju albumin ili jedinjenja koja vezuju albumin, kao što su ona opisana u WO 2005/117984.

[0086] U pojedinim primerima izvođenja, anti-TNFα antitela mogu biti vezana za poli(etilenglikolne) (PEG) ostatke. Na primer, ukoliko je antitelo fragment antitela, PEG ostaci mogu biti vezani preko bilo koje dostupne funkcionalne grupe aminokiselinskog bočnog lanca ili terminalne aminokiselinske funkcionalne grupe koja se nalazi u fragmentu antitela, na primer, preko bilo koje slobodne amino, imino, tiolne, hidroksilne ili karboksilne grupe. Takve aminokiseline se mogu javljati u prirodi u fragmentu antitela ili mogu biti insertovane u fragment genetičkim inženjeringom, upotrebom postupaka rekombinantne DNK. Pogledati, na primer, U.S. Patent No.5,219,996. Za vezivanje dva ili više PEG molekula mogu biti upotrebljena višestruka mesta. Poželjno je da su PEG ostaci kovalentno povezani preko tiolne grupe najmanje jednog od cisteinskih ostatka koji se nalaze u fragmentu antitela. Kada se kao tačka povezivanja upotrebljava tiolna grupa, mogu biti upotrebljeni odgovarajući aktivirani efektorski ostaci, na primer selektivni derivati tiola kao što su maleimidi i derivati cisteina.

[0087] U drugom primeru, konjugat anti-TNFα antitela je modifikovani Fab' fragment koji je PEGilovan, tj. ima PEG (poli(etilenglikol)) kovalentno vezan za njega, npr. prema postupku opisanom u EP0948544. Pogledati takođe, Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ur.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris i S. Zalipsky, ur., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); i Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam i A. Dent, ur., Grove Publishers, New York, 1998); i Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531- 545.

Farmaceutske kompozicije i lečenje

[0088] Lečenje bolesti obuhvata lečenje pacijenata kojima je već postavljena dijagnoza, odnosno koji imaju bilo koji oblik bolesti u bilo kojoj kliničkoj fazi ili manifestaciji; kao i odlaganje početka ili razvoja ili pogoršanje ili napredovanje simptoma ili znakova bolesti; i/ili sprečavanje i/ili smanjenje ozbiljnosti bolesti.

[0089] „Subjekat” ili „pacijent” kome se daje anti-TNFα antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, može biti sisar, kao što je sisar različit od primata (npr. krava, svinja, konj, mačka, pas, pacov itd.) ili primat (npr. majmun ili čovek). Prema određenim aspektima, čovek je pedijatrijski pacijent. Prema drugim aspektima, čovek je odrastao pacijent.

[0090] Ovde su opisane kompozicije koje sadrže anti-TNFα antitelo i, opciono, jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa, kao što su drugi terapijski agensi koji su opisani u nastavku teskta. Kompozicije se obično isporučuju kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka njegovog davanja pacijentu).

[0091] Anti-TNFα antitela i funkcionalni fragmenti mogu biti dati pacijentu raznovrsnim putevima davanja kao što su oralno, transdermalno, subkutano, intranazalno, intravensko, intramuskularno, intratekalno, topikalno ili lokalno davanje. Najpogodniji put za davanje u svakom datom slučaju zavisiće od određenog antitela, subjekta, prirode i ozbiljnosti bolesti i fizičkog stanja subjekta. Uobičajeno je i da se anti-TNFα antitelo ili njegov funkcionalni fragment daju intravenski.

[0092] U posebno poželjnom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska daju se oralno. Ukoliko je primena oralnim putem, funkcionalni fragment je poželjno jednolančano antitelo (scFv), diatelo ili IgG.

[0093] U uobičajenim primerima izvođenja, anti-TNFα antitelo ili funkcionalni fragment prisutni su u farmaceutskoj kompoziciji u koncentraciji koja je dovoljna da se omogući intravensko davanje u koncentraciji od 0,5 mg/kg telesne težine do 20 mg/kg telesne težine. U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija antitela ili fragmenta pogodna za upotrebu u kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani uključuje 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, ili je koncentracija opsega između bilo koje od prethodno navedenih vrednosti, npr.1 mg/kg do 10 mg/kg, 5 mg/kg do 15 mg/kg ili 10 mg/kg do 18 mg/kg.

[0094] Efektivna doza anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta može biti opsega od oko 0,001 do oko 750 mg/kg po pojedinačnom (npr. bolusnom) davanju, višestrukim davanjima ili kod kontinuiranog davanja, ili takva da se postigne koncentracija u serumu od 0,01-5000 µg/ml serumske koncentracije po jednom (npr. bolusnom) davanju, višestrukim davanjima ili kod kontinuiranog davanja, ili u bilo kom navedenom efektivnom opsegu ili vrednosti, u zavisnosti od stanja koje se leči, načina davanja i starosti, težine i stanja subjekta. U određenim primerima izvođenja, svaka doza može biti opsega od oko 0,5 mg do oko 50 mg po kilogramu telesne težine ili od oko 3 mg do oko 30 mg po kilogramu telesne težine. Antitelo može biti formulisano kao vodeni rastvor.

[0095] Farmaceutske kompozicije mogu biti konvencionalno pripremljene u jediničnim doznim oblicima koji sadrže unapred određenu količinu anti-TNFα antitela, ili funkcionalnog fragmenta, po dozi. Takva jedinica može sadržavati 0,5 mg do 5 g, na primer 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, ili bilo koji opseg između bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti, na primer, 10 mg do 1000 mg, 20 mg do 50 mg, ili 30 mg do 300 mg. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti u širokom spektru oblika, u zavisnosti, npr. od stanja koje se leči ili puta davanja.

[0096] Određivanje efektivne doze, ukupnog broja doza i dužine tretmana sa anti-TNFα antitelom, ili njegovim funkcionalnim fragmentom, u granicama je sposobnosti stručnjaka iz oblasti tehnike, i može biti utvrđena upotrebom standardne studije eskalacije doza.

[0097] Terapijske formulacije anti-TNFα antitela i funkcionalnih fragmenata, a koje su pogodne u postupcima koji su ovde opisani, mogu biti pripremane za skladištenje kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori, mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima koji se obično koriste u oblasti tehnike (svi su ovde označeni kao „nosači"), tj. puferskim agensima, stabilizatorima, konzervansima, izotonifikatorima, nejonskim deterdžentima, antioksidansima i drugim raznim aditivima. Pogledati, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje (Osol, ur.1980). Takvi aditivi moraju biti netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste.

[0098] Puferski agensi pomažu u održavanju pH u opsegu koji je približan fiziološkim uslovima. Oni mogu biti prisutni u koncentraciji opsega od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodni puferska agensi obuhvataju-organske-neorganske kiseline-njihove soli, kao što su citratni puferi (npr. smeša mononatrijum citrata-dinatrijum citrata, smeša limunske kiseline-trinatrijum citrata, smeša limunske kiseline-mononatrijum citrata itd.), sukcinatni puferi (npr. smeša sukcinske kiseline-mononatrijum sukcinata, smeša sukcinske kiseline-natrijum hidroksida, smeša sukcinske kiseline-dinatrijum sukcinata itd.), tartaratni puferi (npr. smeša tartarne kiseline-natrijum tartarata, smeša tartarne kiseline-kalijum tartrata, smeša tartarne kiseline-natrijum hidroksida itd.), fumaratni puferi (npr. smeša fumarne kiseline-mononatrijum fumarata, smeša fumarne kiseline-dinatrijum fumarata, smeša mononatrijum fumarata-dinatrijum fumarata itd.), glukonatni puferi (npr. smeša glukonske kiselinenatrijum glikonata, smeša glukonske kiseline-natrijum hidroskida, smeša glukonske kiseline-kalijum glukonata itd.), oksalatni pufer (npr. smeša oksalne kiseline-natrijum oksalata, smeša oksalne kiselinenatrijum hidroksida, smeša oksalne kiseline-kalijum oksalata itd.), laktatni puferi (npr. smeša laktatne kiseline-natrijum laktata, smeša laktatne kiseline-natrijum hidroksida, smeša laktatne kiseline-kalijum laktata itd.) i acetatni puferi (npr. smeša sirćetne kiseline-natrijum acetata, smeša sirćetne kiselinenatrijum hidroksida itd.). Dodatno, mogu biti upotrebljeni fosfatni puferi, histidinski puferi i trimetilaminske soli kao što je Tris.

[0099] Konzervansi mogu biti dodavani da bi se usporio rast mikroba, a mogu se dodavati u količinama opsega od 0,2%-1% (w/v). Pogodni konzervansi uključuju fenol, benzil alkohol, metakrezol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halide (npr. hlorid, bromid i jodid), heksametonijum hlorid i alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol i 3-pentanol. Izotonifikatori, ponekad poznati i kao „stabilizatori”, mogu biti dodati da bi se osigurala izotoničnost tečnih kompozicija i uključuju polihidrične šećerne alkohole, poželjno trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenasa koji mogu biti funkcije u opsegu od agenasa za povećanje zapremine do aditiva koji solubilizuju terapijski agens, ili koji pomažu da se spreči denaturacija ili adhezija za zid posude. Tipični stabilizatori mogu biti polihidrični šećerni alkoholi (nabrojani prethodno); aminokiseline kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što su laktoza, trehaloza, stahioza manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol i slično, uključujući ciklitole kao što je inozitol; polietilen glikol; polimere aminokiselina; redukujuće agense koji sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; polipeptide male molekulske težine (npr. peptidi od 10 ostataka ili manje); proteine kao što su humani serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što su polivinilpirolidon monosaharidi, kao što su ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi kao što su laktoza, maltoza, saharoza i trisaharidi kao što je rafinoza; i polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u opsegu od 0,1 do 10.000 težine po delu težine aktivnog proteina.

[0100] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (poznati i kao „agensi za vlaženje") mogu biti dodavani da bi se potpomogla solubilizacija terapijskog agensa, kao i da bi se zaštitio terapijski protein od agregacije indukovane agitacijom, što takođe omogućava da formulacija bude izložena stresu površinskog naprezanja bez prouzrokovanja denaturacije proteina. Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 80 itd.), polioksamere (184, 188 itd.), Pluronične poliole, polioksietilen sorbitan monoetere (TWEEN<®>-20, TWEEN<®>-80 itd.). Nejonski surfaktanti mogu biti prisutni u opsegu od oko 0,05 mg/ml do oko 1,0 mg/ml, ili u opsegu od oko 0,07 mg/ml do oko 0,2 mg/ml.

[0101] Dodatni raznovrsni ekscipijensti uključuju agense za povećanje zapremine (npr. skrob), helatorne agense (npr. EDTA), antioksidanse (npr. askorbinsku kiselinu, metionin, vitamin E), proteazne inhibitore i ko-rastvarače.

[0102] Formulacija koja je ovde opisana, pored anti-TNFα antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, može sadržavati i drugi terapijski agens. Primeri pogodnih drugih terapijskih agenasa navedeni su u nastavku teksta.

[0103] Raspored davanja doza može varirati od jednom mesečno do dnevnog davanja, u zavisnosti od brojnih kliničkih faktora, uključujući tip bolesti, ozbiljnost bolesti i osetljivost pacijenta na anti-TNFα antitelo ili funkcionalni fragment. U specifičnim primerima izvođenja, anti-TNFα antitelo ili njegov funkcionalni fragment se daju jednom dnevno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, svaki drugi dan, na svakih 5 dana, na svakih 10 dana, na svake dve nedelje, na svake tri nedelje, na svake četiri nedelje ili jednom mesečno, ili u bilo kom opsegu između bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti, na primer, od na svaka četiri dana do svakog meseca, od na svakih 10 dana do na svake dve nedelje, ili od dva do tri puta nedeljno itd.

[0104] Doza anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta koja će biti data, variraće u zavisnosti od određenog antitela, subjekta, prirode i ozbiljnosti bolesti, fizičkog stanja subjekta, terapijskog režima (npr. da li se upotrebljava drugi terapijski agens) i izabranog puta davanja; odgovarajuću dozu lako može utvrditi stručnjak iz oblasti tehnike.

[0105] Stručnjak iz oblasti tehnike će prepoznati da će optimalna količina i razmak između pojedinačnih doza anti-TNFα antitela, ili njegovog funkcionalnog fragmenta, biti određeni prirodom i obimom stanja koje se leči, oblikom, načinom i mestom davanja, kao i u zavisnosti od starosti i stanja određenog subjekta koji se leči, odnosno da će lekar konačno utvditi odgovarajuće doze koje će se upotrebljavati. Ovakve doza se može ponavljati onoliko često koliko je potrebno. Ukoliko se pojave neželjeni efekti, količina i/ili učestalost doziranja mogu biti izmenjeni ili smanjeni, u skladu sa uobičajenom kliničkom praksom.

Poremećaji koje će biti lečeni

[0106] Pronalazak se odnosi na postupak lečenja ili prevencije bolesti povezane sa humanim TNFα kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu antitela ili funkcionalnog fragmenta koji su kao što je ovde definisano. Termin „poremećaj povezan sa TNFα” ili „bolest vezana za TNFα” odnosi se na bilo koji poremećaj, čiji početak, napredovanje ili postojanost simptoma ili bolesnih stanja zahteva učešće TNFα. Primeri poremećaja povezanih sa TNFα uključuju hronična i/ili autoimuna stanja inflamacije uopšte, imunski posredovane inflamatorne poremećaje uopšte, inflamatorne bolesti CNS-a, inflamatorne bolesti koje utiču na oko, zglobove, kožu, sluzokožu, centralni nervni sistem, gastrointestinalni trakt, urinarni trakt ili na pluća, stanja uveitisa uopšte, retinitis, HLA-B27+ uveitis, Behčetovu bolest, sindrom suvog oka, glaukom, Sjogrenov sindrom, dijabetes melitus (uključujući dijabetsku neuropatiju), insulinsku rezistenciju, stanja artritisa uopšte, reumatoidni artritis, osteoartritis, reaktivni artritis i Riterov sindrom, juvenilni artritis, ankilozirajući spondilitis, multiplu sklerozu, Guillain-Barre-ov sindrom, mijasteniju gravis, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, sarkoidozu, glomerulonefritis, hroničnu bolest bubrega, cistitis, psorijazu (uklj. psorijatični artritis), hidradenitis supurativa, panikulitis, piodermu gangrenozum, SAPHO sindrom (sinovitis, akne, pustulozu, hiperostozu i osteitis), akne, Svitov sindrom, pemfigus, Kronovu bolest (uklj. ekstraintestinalne manifestacije), ulcerozni kolitis, bronhijalnu astmu, hipersenzitivni pneumonitis, opšte alergije, alergijski rinitis, alergijski sinusitis, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP), fibrozu pluća, Vegenerovu granulomatozu, Kavasakijev sindrom, arteritis gigantskih ćelija, Čarg-Štrausov vaskulitis, poliarteritis nodoza, opekotine, bolest „kalem protiv domaćina”, reakcije domaćina na transplantat, epizode odbacivanja nakon transplantacije organa ili koštane srži, sistemska i lokalna stanja vaskulitisa uopšte, sistemski i kožni eritematozni lupus, polimiozitis i dermatomiozitis, sklerodermiju, preeklampsiju, akutni i hronični pankreatitis, virusni hepatitis, alkoholni hepatitis, inflamacije nakon hirurških intervencija kao što su nakon operacije oka (npr. operacije katarakte (zamena očnog sočiva) ili glaukoma), operacije na zglobovima (uklj. artroskopske hirurgije), operacije na strukturama koje su povezane sa zglobovima (npr. ligamenatima), oralne i/ili stomatološke hirurgije, minimalno invazivne kardiovaskularne procedure (npr. PTCA, aterektomije, postavljanja stenta), laparoskopske i/ili endoskopske intra-abdominalne i ginekološke procedure, endoskopske urološke procedure (npr. hirurgije prostate, ureteroskopije, cistoskopije, intersticijskog cistitisa) ili perioperativnu inflamaciju (prevenciju) uopšte, bulozni dermatitis, neutrofilni dermatitis, toksičnu epidermalnu nekrolizu, pustularni dermatitis, cerebralnu malariju, hemolitički uremički sindrom, odbacivanje alografta, upalu srednjeg uha, ujed zmije, eritem nodozum, mijelodisplastične sindrome, primarni sklerozirajući holangitis, seronegativnu spondilarteropatiju, autoimunu hematolitičku anemiju, orofacijalnu granulamatozu, piostomatitis vegetans, aftozni stomatitis, geografski jezik, migratorni stoimatitis, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Hantingtonovu bolest, Belovu paralizu, Krojcfeld-Jakobovu bolest i neuro-degenerativna stanja uopšte.

[0107] Osteoliza povezana sa kancerom, inflamacija povezana sa kancerom, bol povezan sa kancerom, kaheksija povezana sa kancerom, metastaze u kostima, akutni i hronični oblici bola, bez obzira da li su uzrokovani centralnim ili perifernim efektima TNFα i da li su klasifikovani kao inflamatorni, nociceptivni ili neuropatski oblici bola, išijas, bol u donjem delu leđa, sindrom karpalnog tunela, sindrom kompleksnog regionalnog bola (CRPS), giht, postherpetična neuralgija, fibromijalgija, lokalna stanja bola, sindromi hroničnog bola usled metastatskog tumora, dismenoreja.

[0108] Posebni poremećaji koji se leče uključuju stanja artritisa uopšte, reumatoidni artritis, osteoartritis, reaktivni artritis, juvenilni artritis; psorijazu uklj. psorijatični artritis; inflamatornu bolest creva, uključujući Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, uklj. proktitis, sigmoiditis, levostrani kolitis, ekstenzivni kolitis i pankolitis, neutvrđeni kolitis, mikroskopski kolitis uklj. kolagenski i limfocitni kolitis, kolitis kod bolesti vezivnog tkiva, diverzioni kolitis, kolitis kod divertikularne bolesti, eozinofilni kolitis i poučitis.

[0109] Najpoželjnije, antitelo ili funkcionalni fragment pronalaska se upotrebljavaju za lečenje inflamatorne bolesti creva, posebno Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa ili mikroskopskog kolitisa. Kronova bolest može biti ileična, Kronova bolest kolona, ileokolona ili izolovana Kronova bolest gornjih delova gastrointestinalnog trakta (želuca, duodenuma i/ili jejunuma) uključujući nestrikturirajuća/nepenetrirajuća, strikturirajuća, penetrirajuća i perianalna bolesna ponašanja, što dozvoljava bilo koju kombinaciju lokalizacija i ponašanja bolesti kod bilo kojih od prethodno navedenih stanja. Ulcerozni kolitis može biti ulcerozni proktitis, proktosigmoiditis, levostrani kolitis, pan-ulcerozni kolitis i poučitis.

Kombinovana terapija i drugi aspekti

[0110] Poželjno, pacijent koji se leči anti-TNFα antitelom, ili njegovim funkcionalnim fragmentom, takođe se leči drugim konvencionalnim medikamentom. Na primer, pacijent koji boluje od inflamatorne bolesti creva, posebno ukoliko ima umeren do težak oblik bolesti, obično se takođe leči mesalazinom ili njegovim derivatima ili prolekovima, kortikosteroidima, npr. budezonidom ili prednizolonom (oralno ili i.v.), imunosupresivima, npr. azatioprin/6-merkaptopurinom (6-MP) ili metotreksatom, ciklosporinom ili takrolimusom. Drugi medikamenti koji mogu biti istovremeno davani pacijentu uključuju biološke lekove kao što su infliksimab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol ili druge. Dalji medikamenti koji mogu biti istovremeno davani pacijentu uključuju imunosupresive (npr. azatioprin/6-MP ili metotreksat ili oralni ciklosporin), da bi se održala stabilna i duža remisija. Još jedan aspekt pronalaska je upotreba anti-TNFα antitela ili funkcionalnog fragmenta kako je prethodno definisano, za smanjenje inflamacije.

[0111] Još jedan aspekt pronalaska je anti-TNFα antitelo, ili funkcionalni fragment, koji su kao što je prethodno definisano, za upotrebu u smanjenju inflamacije kod pacijenta koji boluje od inflamatornog stanja.

[0112] Sledeći aspekt koji je ovde opisan je postupak lečenja inflamatornog stanja, koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno, efektivne količine anti-TNFα antitela, ili funkcionalnog fragmenta, koji su kao što je ovde prethodno definisano. Inflamatorno stanje je poželjno jedno od prethodno opisanih stanja.

[0113] Sledeći aspekt koji je ovde opisan je postupak prevencije inflamatornog stanja, koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno, efektivne količine anti-TNFα antitela, ili funkcionalnog fragmenta, koji su kao što je ovde prethodno definisano. Inflamatorno stanje je poželjno jedno od prethodno opisanih stanja.

Tabela 1. Sažetak aminokiselinskih sekvenci

Primeri

Primer 1: Generisanje zečjih antitela usmerenih na humani TNFα

1. Rezultati

1.1 Imunizacija

[0114] Zečevi su imunizovani prečišćenim rekombinantnim humanim TNFα (Peprotech, kat. br.300-01A). Tokom imunizacije, jačina humoralnog imunskog odgovora na antigen je kvalitativno procenjivana određivanjem maksimalnog razblaženja (titra) seruma svakog zeca, koji je još uvek dovodio do vezivanja poliklonskih serumskih antitela za antigen koje se moglo detektovati. Delovanje titara serumskih antitela na imobilisan rekombinantan humani TNFα procenjivani su upotrebom enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA, pogledati 2.2.1). Sva tri zeca su pokazala veoma visoke titre, sa razblaženjima seruma od 10X10<6>koja su i dalje dovodila do pozitivnog signala (najmanje 3 puta većeg od signala dobijenog sa serumom iz naivne, nesrodne životinje koja je bila upotrebljena kao pozadinska kontrola) u ELISA testu. Pored toga, sposobnost različitih zečjih seruma da inhibiraju biološku aktivnost TNFα, procenjivana je upotrebom testa zasnovanog na mišjim L929 ćelijama (pogledati 2.2.3). Sva tri seruma su inhibirala apoptozu mišjih L929 fibroblasta indukovanu sa TNFα. Zec br.3 je pokazao najjaču neutrališuću aktivnost, sa inhibicijom od 50% (IC50), koja je postignuta pri razblaženju seruma od 1:155.000. U poređenju sa zecom br.3, zec br.2 i zec br.1 su pokazali približno 3 i 21 puta nižu aktivnost, dostižući inhibiciju od 50% pri razblaženju seruma od 1:55.500 i 1:7.210, tim redom.

[0115] Limfociti izolovani iz slezine sve tri životinje izabrani su za naknadne postupke identifikacije pogodaka. Životinjama je dodeljivan prioritet na osnovu sposobnosti da inhibiraju biološku aktivnost TNFα u L929 testu. Prema tome, najveći broj pogodaka koji je bio kultivisan potiče iz zeca br.3, dok je najmanji broj pogodaka dobijen za zeca br.1.

1.2 Identifikacija pogodaka

1.2.1 Sortiranje pogodaka

[0116] Pre procedure identifikacije pogodaka, razvijena je procedura sortiranja zasnovana na protočnoj citometriji koja specifično detektuje i omogućava izolaciju B-ćelija koje vezuju TNFα sa visokim afinitetom (pogledati 2.1).

[0117] Ukupno 33X10<6>limfocita (što odgovara 1,5% od ukupno izolovanih limfocita), dobijenih iz sva tri zeca, okarakterisani su u dve nezavisne serije sortiranja. Od 33X10<6>ukupno analiziranih ćelija, izolovano je 3452 B-ćelija koje eksprimiraju TNFα-specifična antitela (IgG). Broj kloniranih limfocita bio je različit za tri zeca, pošto je više ćelija bilo izolovano iz onih zečeva čiji su serumi pokazali snažnu inhibiciju TNFα u L929 testu. Od izolovanih B-ćelija, 792 klona su dobijena iz zeca br.1, 1144 klonova iz zeca br.2 i 1408 klonova iz zeca br.3. Za 108 klonova poreklo iz odgovarajućeg zeca nije bilo poznato, pošto su bili izvedeni iz mešavine rezidualnih limfocita sva 3 zeca, a da bi se omogućilo optimalno izdvajanje male količine limfocita iz bočica.

1.2.2 Skrining pogodaka

[0118] Rezultati dobijeni tokom faze skrininga bili su zasnovani na testovima izvedenim sa neprečišćenim antitelima iz supernatanata kulture ćelija koje luče antitela (ASC), pošto skala kulture visoke propusnosti ne dozvoljava prečišćavanje pojedinačnih zečjih antitela. Takvi supernatanti su upotrebljavani za rangiranje velikog broja antitela, jednih u odnosu na druge, ali ne i da bi se obezbedile apsolutne vrednosti (npr. za inhibiranje biološke aktivnosti TNFα), osim za afinitet vezivanja. Skrining ASC supernatanata u pogledu vezivanja za rekombinantni humani TNFα urađen je ELISA testom velikog obima. Supernatanti koji se vezuju za TNFα dalje su okarakterisani u pogledu vezivanja za TNFα cinomolgus majmuna ELISA testom, dok su kinetike vezivanja i njihov potencijal da neutrališu biološku aktivnost humanog TNFα ispitani u L929 testu. Sa izuzetkom kinetika vezivanja, prijavljene vrednosti skrininga visokog obima treba tumačiti kao odgovore „da” ili „ne”, koji se zasnivaju na merenjima u jednoj tački (bez doznog odgovora). Afinitet prema TNFα iz cinomolgus majmuna i miša je analiziran za svih 102 klonova koji su bili izabrani za amplifikaciju i sekvenciranje varijabilnih domena teškog i lakog lanca antitela.

1.2.2.1 Vezivanje za humani TNFα

[0119] Cilj primarnog skrininga bio je da se identifikuju ASC klonovi koji proizvode antitela specifična za humani TNFα. U tu svrhu, u supernatantima ćelijske kulture 3452 ASC klonova analizirano je prisustvo antitela na humani TNFα upotrebom ELISA postupka (pogledati 2.2.1). Upotrebljen ELISA postupak procenjuje „količinu” antitela IgG podtipa koja su vezana za rekombinantan humani TNFα, međutim, isti ne daje informacije o afinitetu ili koncentraciji antitela. U ovom testu, supernatanti iz 894 ASC klonova proizveli su signal koji je bio jasno iznad pozadine. Stopa pogodaka u skriningu bila je slična za zeca br. 1 i zeca br. 2, sa 153 pogotka od 792 (19,3%) identifikovanih kod zeca br. 1 i 225 pogodaka od 1144 identifikovanih kod zeca br.2 (19,7%). Zec br. 3 je pokazao značajno veću stopu pogodaka od 34,4% što je rezultovalo identifikacijom 484 pogotka od 1408. Sva 894 pogotka identifikovana u ovom primarnom skriningu, podvrgnuta su merenju kinetika vezivanja, SPR postupkom (sekundarni skrining).

1.2.2.2 Kinetike vezivanja TNFα

[0120] Cilj sekundarnog skrininga bio je da se dobiju kvantitativne informacije o kvalitetu vezivanja za ciljni molekul, za svaki pogodak iz primarnog skrininga, rezonancijom površinskog plazmona (SPR, pogledati, 2.2.2). Za razliku od ELISA postupka upotrebljenog tokom primarnog skrininga, ovaj postupak procenjuje kinetike vezivanja ciljnog molekula kao funkciju vremena. Navedeno omogućava određivanje konstanti stope asocijacije (ka) i disocijacije (kd) antitela od njegovog ciljnog molekula. Odnos kd/kaobezbeđuje ravnotežnu konstantu disocijacije (KD), koja odražava afinitet antitela prema njegovom ciljnom molekulu. Od 894 pogodaka identifikovanih u primarnom skriningu, afiniteti vezivanja za humani TNFα su mogli biti utvrđeni za 839 monoklonskih zečjih antitela. Za preostalih 55 antitela, afinitet nije mogao biti izmeren, pošto su koncentracije antitela u ASC supernatantu bila ispod granice detekcije SPR instrumenta u odgovarajućoj postavci. Za 839 anti-TNFα antitela koja su mogla biti izmerena, pokazano je da su konstante disocijacije (KD) bile opsega od ispod 1,36X10<-13>M do 1,14X10<-8>M. Zapravo, 69% od svih analiziranih antitela imalo je KDispod 0,5 nM.

[0121] Medijane KDod 2,21X10<-10>M i 2,09X10<-10>M bile su slične za pogotke skrininga identifikovane kod zečeva br. 2 i br. 3, dok je zec br. 1 pokazao oko 2 puta veće vrednosti, sa medijanom KDod 4,65X10<-10>M. Kada se razmatraju samo neutrališući pogoci skrininga, distribucije afiniteta su bile slične za sve tri životinje, sa nižim vrednostima za medijanu KD(medijana KDizmeđu 1,4X10<-10>M i 1,27X10<-10>M). Afiniteti ispod 0,041 nM, 0,029 nM i 0,026 nM bili su izmereni za 5% pogodaka skrininga kod zeca br. 1, br.2 i br.3, tim redom. Za 2% supernatanata, afiniteti su čak bili u niskom pikomolarnom opsegu (ispod 6,2 pM, 7,9 pM i 11 pM). Odličan prinos antitela visokog afiniteta kao rezultat sekundarnog skrininga obezbeđuje široku osnovu za izbor najprikladnijih antitela za humanizaciju i reformatiranje.

1.2.2.3 Potencija

[0122] Za procenu potencije, razvijen je test zasnovan na ćelijama (L929 test) (pogledati 2.2.3). Od 894 izabranih antitela (56,6%), 506 je inhibiralo apoptozu indukovanu sa TNFα u L929 testu za više od 50%. U skladu sa rezultatima dobijenim tokom analize titra, najveći procenat neutrališućih pogodaka je bio dobijen kod zeca br.3 sa stopom pogodaka od 62,8%, nakon čega je sledila stopa pogodaka od 56,4% kod zeca br.2 i najniža stopa pogodaka od 39,9% kod zeca br.1. Afiniteti ovih neutrališućih antitela bili su opsega između 1,36X10<-13>do 1,19X10<-9>M.

1.2.2.4 Unakrsna reaktivnost među vrstama (cinomolgus majmun)

[0123] Svih 894 pogotka identifikovanih u primarnom skriningu, analizirani su na unakrsnu reaktivnost među vrstama napre sa TNFα cinomolgus majmuna, ELISA postupkom (pogledati 2.2.1). Cilj ovog dodatnog skrininga je bio da se omogući selekcija ASC klonova za koje je poznato da unakrsno reaguju sa TNFα cinomolgus majmuna. Upotrebljen ELISA postupak procenjuje „količinu” antitela podtipa IgG, koji su vezani za rekombinantni TNFα cinomolgus majmuna, međutim, ne daje informacije o afinitetu ili koncentraciji antitela. Supernatanti iz 414 (46%) ASC klonova dali su jasan signal (optička gustina (OD) ≥ 1). Procenat pogodaka koji unakrstno reaguju sa TNFα cinomolgus majmuna bio je sličan za zeca br. 1 i zeca br. 3, sa 81 pogotkom od 153 (52,9%) koji su identifikovani kod zeca br. 1 i sa 236 pogodaka od 484 koji su identifikovani kod zeca br.3 (48,8%). Sa 37,8%, zec br.2 je pokazao nešto niži procenat pogodaka unakrsne reaktivnosti, što je rezultovalo identifikacijom 82 pogotka od 225.

1.2.2.5 Selekcija klonova za RT-PCR

[0124] Kao preduslov za potvrdu pogodaka, analizu genskih sekvenci i naknadnu humanizaciju zečjih antitela, bilo je potrebno pronaći genetičke informacije koje kodiraju varijabilni domen zečjeg antitela. Navedeno je urađeno reverznom transkripcijom (RT) odgovarajuće RNK u komplementarnu DNK (cDNK), nakon čega je usledila amplifikacija dvolančane DNK, lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Selekcija ASC klonova podvrgnutih RT-PCR-u prvenstveno je bila zasnovana na afinitetu i neutrališućoj aktivnosti. Kao dodatni kriterijum uzimana je u razmatranje unakrsna reaktivnost sa TNFα cinomolgus majmuna. Ukupno 102 ASC klona su izabrana za gensko kloniranje RT-PCR postupkom. Najpre, izabrana su 93 najbolje rangirana ASC (u pogledu afiniteta), sa KDispod 80 pM, koji su inhibirali biološku aktivnost TNFα u L929 testu za više od 50%, a koji su pokazivali i značajno vezivanje za TNFα cinomolgus majmuna. Dodatno, izabrano je i svih 9 najbolje rangiranih ASC klonova sa KDispod 20 pM, koji su neutralisali aktivnost TNFα za više od 50%, ali se ipak nisu vezali i za TNFα cinomolgus majmuna.

Ukupno, 12, 13 i 66 ASC klonova je uspešno amplifikovano i sekvencirano iz zečeva br.1, br.2 i br.3, tim redom.

1.2.2.6 Identifikacija srodnih klonova sa željenim osobinama

[0125] Da bi se okarakterisala genetička raznolikost panela izolovanih ASC klonova, sekvence regiona koji određuju komplementarost (CDR) su ekstrahovane i podvrgnute višestrukom poravnanjima sekvenci, čime je omogućeno grupisanje sekvenci u filogenetsko stablo.

[0126] Iako ova analiza s jedne strane omogućava odabir raznolikog skupa klonskih sekvenci sa kojima će biti nastavljen rad u eksperimentima humanizacije i reformatiranja, ona takođe identifikuje homologne klastere klonskih sekvenci za koje je delovalo da dele zajednički roditeljski klon B-ćelija kod zeca. Obeležje ovih klastera sekvenci je visoka homologija sekvenci u CDR-ovima, kao i konzistentan obrazac farmakodinamičkih osobina. Obe ove karakteristike su sumirane za klaster od osam klonova u Tabelama 2 i 3. Uprkos funkcionalnom očuvanju ovih klastera sekvenci, konsezusna sekvenca u Tabeli 3 ukazuje da se određena varijabilnost CDR toleriše, dovodeći i dalje do željenog farmakodinamičkog profila.

Tabela 2: Farmakodinamičke osobine monoklonskih antitela u ASC supernatantima.

Tabela 3: Podaci o sekvencama sa CDR dobijenim za prethodno navedene klonove:

1.2.2.7 Unakrsna reaktivnost sa TNFα cinomolgus majmuna (SPR postupak)

[0127] Zbog velikog broja pogodaka sa visokim afinitetom koji su snažno neutralisali TNFα, unakrsna reaktivnost među vrstama je procenjivana za sva monoklonska zečja antitela koja su bila podvrgnuta RT-PCR postupku, da bi se olakšao izbor ASC klonova za potvrdu pogodaka. Afiniteti za TNFα cinomolgus majmuna određivani su SPR merenjima na sličan način kao što je prethodno opisano (pogledati takođe 2.2.2). Afiniteti 93 testirana antitela za TNFα cinomolgus majmuna bili su opsega od 9,6X10<-12>do 2,1X10<-9>M. Od 93 unakrsno reaktivnih antitela, 38 je vezalo i humani i TNFα cinomolgus majmuna sa sličnim afinitetom (razlike u KDsu bile manje od dvostrukih). Štaviše, razlika u afinitetu između humanog i TNFα cinomolgus majmuna bila je manja od 20 puta za 79 od 93 unakrsno reaktivna antitela i manja od 10 puta za 62 od njih, što ih čini prihvatljivim za pretklinički razvoj kod cinomolgus majmuna.

2. Postupci

2.1 Test sortiranja

[0128] Procedura sortiranja zasnovana na protočnoj citometriji za izolaciju B-ćelija specifičnih za antigen, iz limfnog tkiva zeca, rađena je kao što je navedeno u Lalor i saradnici (Eur J Immunol.1992;22.3001-2011)

2.2 Testovi skrininga

2.2.1 ELISA test vezivanje za TNFα (humani i TNFα cinomolgus majmuna)

[0129] Rekombinantnim humanim TNFα (Peprotech, kat. br.300-01) obložene su ELISA mikrotitarske ploče sa 96 mesta. Vezivanje zečjih antitela iz supernatanata ASC kultura za imobilisani TNFα, detektovano je sekundarnim anti-zečjim IgG obeleženim sa HRP (Jacksonlmmuno Research, kat. br.

111-035-046). Dodat je zatim TMB supstrat (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin, KPL, kat. br.53-00-00), pa je reakcija boje zaustavljana dodavanjem H2SO4. Ploče su očitavane upotrebom čitača mikrotitarskih ploča (Infinity reader M200 Pro, Tecan) na talasnoj dužini od 450 nm.

[0130] Učinak testa tokom serija skrininga praćen je komercijalno dostupnim anti-TNFα zečjim poliklonskim antitelom kao pozitivnom kontrolom (AbD Serotec, kat. br. 9295-0174). U ovu svrhu, antitelo koje je poslužilo kao pozitivna kontrola je ispitivano u koncentraciji od 100 i 250 ng/ml, u duplikatu, na svakoj ploči za skrining. Robustnost i preciznost odgovora pozitivne kontrole praćeni su za svaku ploču. U uslovima konačnog testa, odnos signal-pozadina je bio između 30 i 40 za pozitivnu kontrolu u koncentraciji od 250 ng/ml, dok je koeficijent varijacije (CV) pozitivne kontrole bio ispod 10%. Signal sa optičkom gustinom ≥100% u odnosu na pozitivnu kontrolu od 250 ng/ml, smatran je primarnim pogotkom skrininga.

[0131] Za određivanje titra seruma, upotrebljavana je ista postavka ELISA postupka koja je prethodno opisana. Razblaženje seruma je smatrano pozitivnim kada je signal vezivanja imunskog seruma bio najmanje 3 puta veći u poređenju sa signalom za naivnu, nesrodnu životinju.

[0132] Unakrsna reaktivnost među vrstama za cinomolgus majmuna, određivana je upotrebom sličnog ELISA testa kao što je prethodno opisano. ELISA mikrotitarska ploča sa 96 mesta je najpre obložena rekombinantnim TNFα cinomolgus majmuna (Sino Biological, kat. br.90018-CNAE). Vezivanje zečjih antitela iz supernatanata ASC kultura za imobilisani TNFα cinomolgus majmuna, detektovano je sekundarnim antitelom koje je prethodno navedeno. Imunski serum iz zeca br.2 bio je upotrebljen kao pozitivna kontrola, u razblaženju od 1:80.000 i 1:320.000. Robustnost i preciznost odgovora pozitivne kontrole praćeni su za svaku ploču. U uslovima konačnog testa, odnos signal-pozadina je iznosio između 20 i 30 za pozitivnu kontrolu, pri razblaženju od 1:80.000, dok su CV pozitivne kontrole bili ispod 10%.

2.2.2 Kinetike vezivanja za TNFα utvrđene SPR postupkom (humani i cinomolgus majmun)

[0133] Afiniteti vezivanja antitela za humani TNFα mereni su rezonancijom površinskog plazmona (SPR) upotrebom MASS-1 SPR instrumenta (Sierra Sensors). Performanse instrumenta su kvalifikovane standardnim referentnim rastvorima, kao i analizom referentne interakcije antitelo-antigen, kao što je interakcija infliksimaba i TNFα.

[0134] Za skrining afiniteta, antitelo specifično za Fc region zečjih IgG (Bethyl Laboratories, kat. br. A120-11 1A) imobilisano je na senzorskom čipu (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) upotrebom standardnog postupka kuplovanja sa aminima. Zečja monoklonska antitela u ASC supernatantima hvatana su imobilisanim anti-zečjim IgG antitelom. Nakon hvatanja monoklonskih antitela, u protočne ćelije je tokom 3 minuta injeciran humani TNFα (Peprotech, kat. br. 300-01) u koncentraciji od 90 nM, nakon čega je dozvoljeno da se nastavi disocijacija proteina od IgG uhvaćenog na senzorskom čipu, tokom 5 min. Nakon svakog ciklusa injeciranja, površine su regenerisane sa dva injeciranja 10 mM glicina-HCl. Prividne konstante stope disocijacije (kd) i asocijacije (ka), kao i prividna ravnotežna konstanta disocijacije (KD), izračunavani su MASS-1 softverom za analizu (Analyzer, Sierra Sensors) upotrebom Langmuirovog modela vezivanja tipa jedan-na-jedan, a kvalitet zavisnosti je bio praćen relativnim Chi<2>vrednostima (Chi<2>normalizovaim na ekstrapolisani maksimalan nivo vezivanja analita), što je bila mera kvaliteta uklapanja u krivu. Za većinu pogodaka, relativna Chi<2>vrednost je bila ispod 15%. Rezultati su smatrani validnima ukoliko su jedinice odgovora (RU) za vezivanje liganda iznosile najmanje 2% od RU za hvatanje antitela. Smatrano je i da uzorci sa RU za vezivanje liganda manjim od 2% od RU za hvatanje antitela, ne pokazuju specifično vezivanje TNFα za uhvaćeno antitelo.

[0135] Unakrsna reaktivnost među vrstama za TNFα cinomolgus majmuna (Sino Biological, kat. br.

90018-CNAE) merena je upotrebom istih postavki testa i koncentracija TNFα, kao i primenom istih mera kvaliteta. Relativan Chi<2>je bio ispod 15% za većinu analiziranih ASC supernatanata.

2.2.3 Apoptoza indukovana sa TNFα u L929 fibroblastima

[0136] Sposobnost zečjih IgG iz supernatanata ASC kulture da neutrališu biološku aktivnost rekombinantnog humanog TNFα procenjivana je upotrebom mišjih L929 fibroblasta (ATCC/LGC Standards, kat. br. CCL-1). L929 ćelije su senzitizovane na apoptozu indukovanu sa TNFα, dodavanjem 1 µg/ml aktinomicina D. Ćelije su zatim kultivisane u mikrotitarskim pločama ravnog dna sa 96 mesta, u prisustvu supernatanta 50% ASC kulture i 100 pM (5,2 ng/ml) humanog TNFα (Peprotech, kat. br.

300-01) tokom 24 h. U poređenju sa prečišćenim antitelima, morale su biti upotrebljene veće koncentracije TNFα u prisustvu ASC supernatanta za skrining pogodaka. Preživljavanje ćelija je određivano kolorimetrijskim testom, upotrebom WST-8 (2-(2-metoksi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijuma, mononatrijumske soli) reagensa za ćelijsku proliferaciju (Sigma Aldrich, kat. br. 96992). WST-8 se redukuje ćelijskim dehidrogenazama u narandžasti formazanski proizvod. Količina proizvedenog formazana je direktno proporcionalna broju živih ćelija. Podaci su analizirani upotrebom četvoroparametrijske log krive i Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), a koncentracija infliksimaba potrebna za neutralizaciju apoptoze indukovane sa TNFα za 50% (IC50), izračunavana je pri koncentraciji od 36,2 ng/ml. Ustanovljena donja granica detekcije za ovaj test je stoga bila između 30 do 40 ng/ml. Ova vrednost je samo gruba procena granice detekcije, pošto potencijal da blokira TNFα ne zavisi samo od koncentracije monoklonskog antitela, već i od afiniteta antitela prema ciljnom molekulu. Ipak, osetljivost testa je bila dovoljna za skrining ASC supernatanata, pošto su koncentracije IgG u većini ASC supernatanata bile iznad koncentracije od 40 ng/ml. Pozitivnima su smatrani supernatanti koji su doveli do neutralizacije apoptoze indukovane sa TNFα od 50%.

[0137] Da bi se osigurala tačnost testa tokom serija skrininga, infliksimab kao pozitivno kontrolno antitelo, ispitivan je u koncentraciji od 115 ng/ml (0,8 nM) i 58 ng/ml (0,4 nM), u duplikatima, na svakoj ploči za skrining. Procenat inhibicije i preciznost odgovora za pozitivnu kontrolu, takođe su praćeni na svakoj ploči za skrining. Kriterijumi prihvatanja za svaku ploču postavljani su na sledeći način: inhibicija od najmanje 60% sa antitelom koje je pozitivna kontrola, u koncentraciji od 115 ng/ml, kao i sa koeficijentom varijacije (CV) ispod 20%.

Primer 2: Humanizacija i generisanje scFv

1. Rezultati

1.1 Potvrda pogodatka i selekcija pogodaka za humanizaciju

[0138] Tokom skrininga pogodataka i analize poravnanjima sekvenci, zahteve su ispunila 73 jedinstvena seta matičnih zečjih varijabilnih domena lakog i teškog lanca. Na osnovu rezultata testa skrininga i homologija sekvenci pojedinačnih zečjih IgG klonova, izabrano je 30 kandidata za potvrdu pogodaka. Proizvedeno je i 29 monoklonskih antitela, a za humanizaciju i generisanje vodećih kandidata su odabrani klonovi sa najboljim učinkom u pogledu afiniteta i potencije. Kriterijumi za selekciju klonova su bili i) neutralizacija humanog TNFα u L929 testu, ii) visok afinitet za humani TNFα, iii) unakrsna reaktivnost sa TNFα cinomolgus i rezus majmuna i iv) različitost sekvenci. Za humanizaciju je izabran jedan klon (16-22-H05) - jedan od IgG koji je bio najbolje rangiran u pogledu potencije da neutrališe humani TNFα u L929 testu. Što se tiče jačine vezivanja, bio je poželjan najbolji mogući afinitet, pošto se morao predvideti određen gubitak afiniteta kao rezultat humanizacije i promene formata u scFv format.

[0139] Podaci za IgG klon br.16-22-H05 sumirani su u Tabeli 4.

1.2 Generisanje i selekcija humanizovanih scFv fragmenata

[0140] Sekvence koje kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDR) prebačene su in silico kao graftovi CDR-petlji u matricu sekvence humanog varijabilnog domena, kao što je opisano u WO 2014/206561. Pored toga, generisan je drugi konstrukt po klonu zeca, kojim su prenete dodatne aminokiseline iz donorske sekvence na strukturno relevantne pozicije za imunoglobulinske domene i CDR pozicioniranje. Sintetisan je tako veštački gen (sa optimizovanom upotrebom kodona za bakterijsku ekspresiju) koji kodira odgovarajuće humanizovano jednolančano antitelo Fv (scFv) (iz odgovarajućih varijabilnih lakih i teških lanaca). Polipeptid je zatim proizveden i naknadno okarakterisan upotrebom sličnih testova kao što su oni opisani za potvrdu pogodaka.

1.2.1 Humanizacija i proizvodnja humanizovanih scFv (API)

[0141] Humanizacija izabranog klona obuhvatala je transfer zečjih CDR u scFv akceptorske uokvirujuće sekvence tipa Vκ1/VH3, kao što je opisano u WO 2014/206561. U ovom procesu, koji je šematski prikazan na Slici 1, aminokiselinska sekvenca šest CDR regiona je identifikovana na donorskoj sekvenci (mAb zeca) i u vidu grafta je preneta u matricu akceptorske sekvence, što je rezultovalo konstruktima označenim kao „CDR graftovi”.

[0142] Dodatno, dizajniran je drugi graft, koji je uključivao dodatne aminokiselinske modifikacije iz zečjeg donora na pozicijama L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 i H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (AHo numeracija), za koje je opisano da potencijalno utiču na pozicioniranje CDR, a time i na vezivanje antigena (Borras i saradnici, JBC. 2010; 285:9054-9066). Ovakav humanizovani konstrukt je označen kao „strukturni (STR) graft”. U slučaju da je poređenje podataka o karakterizaciji za ova dva početna konstrukta ukazalo na značajnu prednost STR konstrukta, dizajnirane su dodatne varijante koje kombinuju VL sa CDR graftom i VH sa STR graftom. Pokazano je i da je ova kombinacija često dovoljna da zadrži aktivnost STR grafta (Borras i saradnici, 2010, JBC, 285:9054-9066) i da bi generalno bila poželjna, pošto manje izmena u matrici humanog akceptora koje nisu humanog porekla, smanjuju rizik od narušene stabilnosti, a takođe i potencijal za imunogenost.

[0143] Kada je in-silico dizajn konstrukta koji je opisan u prethodnom odeljku jednom završen, sintetisani su odgovarajući geni i konstruisani su vektori za ekspresiju u bakterijama. Sekvenca ekspresionih konstrukata je potvrđena na nivou DNK i konstrukti su proizvedeni prema protokolima generičke ekspresije i prečišćavanja.

[0144] Heterologna ekspresija proteina je vršena u E.coli, u vidu nerastvorljivih inkluzionih tela. Kultura za ekspresiju je zatim inokulisana eksponencijalno rastućom starter kulturom. Kultivacija je vršena u pogodnim flaskovima i na orbitalnom šejkeru, upotrebom komercijalno dostupnih obogaćenih medijuma. Ćelije su gajene do definisanog OD600od 2 i ekspresija je indukovana preko noći sa 1 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG). Na kraju fermentacije, ćelije su prikupljene centrifugiranjem, nakon čega su homogenizovane sonikacijom. U ovom trenutku, nivo ekspresije različitih konstrukata je određivan SDS-PAGE analizom ćelijskog lizata. Inkluziona tela su zatim izolovana iz homogenizovanog taloga ćelija, dobijenog protokolom centrifugiranja koji je uključivao nekoliko koraka pranja, da bi se uklonio ćelijski debris i ostale nečistoće ćelija domaćina. Prečišćena inkluziona tela su rastvorena u puferu za denaturaciju (100 mM Tris/HCl pH 8,0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA), nakon čega su scFv ostavljeni da se ponovo uviju protokolom za postepeno, skalarno ponovno uvijanje koji je generisao miligramske količine nativno uvijenog, monomernog scFv. Za prečišćavanje scFv je dalje upotrebljen standardizovan protokol, koji je uključivao sledeće korake. Proizvod je nakon ponovnog uvijanja bio hvatan afinitetnom hromatografijom, korišćenjem Capto L agaroze (GE Healthcare), da bi se dobili prečišćeni scFv. Vodeći kandidati koji su ispunili kriterijume afiniteta i potencije u inicijalnom testiranju, bili su dalje prečišćeni hromatografijom razdvajanja po veličini sa mogućošću finog podešavanja, upotrebom HiLoad Superdex75 kolone (GE Healthcare). Nakon protokola prečišćavanja, proteini su formulisani u puferisanom fiziološkom rastvoru i okarakterisani su raznim biofizičkim, postupcima za interakcije proteina i biološkim postupcima, kao što je opisano u nastavku teskta. Proizvodnost različitih konstrukata je upoređivana određivanjem konačnog prinosa prečišćenog proteina po serijama i normalizacijom ove vrednosti na zapreminu rastvora za ponovno uvijenja od 1 L.

1.2.2 Biofizička karakterizacija humanizovanog scFv

[0145] Biofizička karakterizacija scFv u pogledu stabilnosti i proizvodnosti, sumirana je u Tabeli 5. Proizvodnost i stabilnost scFv konstrukta je okarakterisana različitim tačkama za prijavu podataka, kao što se razmatra u narednim pasusima.

[0146] ScFv je ispitivan prema određenim kriterijumima, kao što je objašnjeno u nastavku teksta.

[0147] Kriterijum proizvodnosti bi trebao da osigura da se izabrani scFv entite može eksprimirati, ponovno uviti i prečistiti u količinama koje su dovoljne da se omogući kasniji razvoj vodećeg molekula. Definisani kriterijumi su bili prinos ekspresije scFv po litru fermentacionog bujona, što je procenjivano sa SDS-PAGE, dok je prinos prečišćavanja postignut u generičkom procesu laboratorijskog obima, procenjivan merenjem količine prečišćenog proteina UV spektrometrijom, nakon čega je ponovno izračunavan za 1 litar rastvora za ponovno uvijanje.

[0148] Bilo je predviđeno i da kriterijumi za stabilnost procene sklonost agregaciji tokom procesa proizvodnje molekula i njihov strukturni integritet tokom skladištenja i daljeg rukovanja. Sadržaj monomera određivan je SE-HPLC postupkom koji omogućava procenu koloidne stabilnosti molekula tokom procesa prečišćavanja (2.2.3). U narednoj studiji stabilnosti, sadržaj monomera je ispitivan tokom perioda od 4 nedelje, za koncentracije od 1 i 10 mg/mL, a u uslovima skladištenja na 4, -20 i < -65°C. Pored toga, koloidna stabilnost proteina je ispitivana nakon 5 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja. Kao dodatni parametar koji pokazuje stabilnost, određivana je srednja tačka termičkog odvijanja koja je određivana diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF) (2.2.4), da bi se obezbedilo očitavanje konformacione stabilnosti vodećih kandidata.

Tabela 5: Sažetak podataka biofizičke karakterizacije za humanizovane scFv.

ID klona Konstukt Stabilnost Proizvodnost

Tm Skladištenje Zarmzavanje/o presija Prinos [°C] [Δ %] dmrzavanje Čistoća Eks prečišćavanja [Δ %] [%] [g/L] [mg/L]

-65°C 25°C 4°C

16-22-H05-sc01 CDR 74,2 nd nd nd nd 98,0 nd 19,1

1.2.2.1 Procena proizvodnosti

[0149] Molekuli vodećih scFv kandidata su eksprimirani fermentacijom u flasku za mućkanje, u vidu serija, i prečišćeni su generičkim procesom laboratorijske skale, da bi se dobili proteinski uzorci za dalju karakterizaciju. Tokom ovog procesa, praćeni su pojedini ključni parametri performansi, da bi se uporedili molekuli kandidati i da bi se identifikovali oni koji su potencijalno teški za razvoj konstrukata.

[0150] Titar ekspresije je određivan na nivou sirovog lizata E.coli, nakon prikupljanja ćelija centrifugiranjem. Tokom prikupljanja ćelija očekivan je mali gubitak ćelija, međutim, izabrano je i da se ovaj faktor zanemari za izračunavanje ekspresionog prinosa u korist konzervativnije procene proizvodnosti. Za kvantifikaciju scFv proizvoda u lizatu, izabrano je coomassie bojenje redukujućih SDS-PAGE gelova (2.2.1) zbog visoke specifičnosti postupka koji omogućava razlikovanje proizvoda od proteina ćelija domaćina u uzorku.

[0151] Drugi kriterijum za procenu proizvodnosti, bio je prinos prečišćavanja scFv, izračunavan po litri rastvora za ponovno uvijanje. Ovaj parametar ukazuje na potencijal „uskog grla” u predviđenom proizvodnom procesu, koji uključuje korak ponovnog uvijanja proteina. Pošto se pokazalo da je efikasnost postupka ponovnog uvijanja ograničavajuća u uporedivim proizvodnim procesima, odlučeno je da se uporede performanse različitih konstrukata u odnosu na proizvodnost normalizovanu na definisanu zapreminu rastvora za ponovno uvijanje. Za izračunavanje prinosa, konačni uzorak proteina iz svake serije je kvantifikovan UV apsorpcijom (2.2.2) i podeljen je sa stvarnom zapreminom rastvora za ponovno uvijanje odgovarajućeg prečišćavanja (Tabela 6).

Tabela 6: Sažetak podataka o proizvodnosti za dva humanizovana scFv. Titar ekspresije je određivan kvantitativnim SDS-PAGE sa lizatima ćelija iz finalnog koraka proizvodnje. Prinos serija je određivan merenjem UV apsorpcije finalnog, prečišćenog uzorka. Prinos prečišćavanja je izračunavan kao prečišćeni scFv po litri zapremine rastvora za ponovno uvijanje.

Proizvodnost

ID konstrukta Titar ekspresije Prinos serije Zapremina rastv. ja [g/L] [mg] za ponovno Prinos prečišćavan uvijanje [L] [mg/L]

16-22-H05-sc02 0,27 14,3 0,48 29,8

16-22-H05-sc04 0,26 11,9 0,49 24,1

1.2.2.2 Procena stabilnosti

[0152] Procena konformacione stabilnosti, monodisperznosti i strukturnog integriteta scFv konstrukata je integralna komponenta za rangiranje različitih molekula u pogledu njihovog kapaciteta za razvoj. Preduslov za smisleno poređenje različitih konstrukata je priprema prečišćenih molekula sličnog kvaliteta. Kriterijum „čistoća monomera”, određivana SE-HPLC postupkom, ima za cilj da osigura kompatibilan kvalitet različitih ispitivanih supstanci. Pored SE-HPLC analize, urađen je SDS-PAGE za određivanje čistoće i identiteta proteina, da bi se potvrdio uporediv kvalitet ispitivanih preparata.

[0153] SE-HPLC rezultati za dva scFv ukazali su da su svi preparati mogli biti prečišćeni do sadržaja monomera od ≥ 99% (Slika 2).

[0154] Ponašanje pri termičkom odvijanju za vodeće kandidate ispitivano je diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF), da bi se omogućilo rangiranje molekula u pogledu njihove očekivane konformacione stabilnosti. Normalizovani dijagram sirovih podataka fluorescencije prikazan je na Slici 3, koja prikazuje duplikate merenja za svaki uzorak. Uočeno je kooperativno ponašanje odvijanja. Dva molekula, 16-22-H05-sc02 i 16-22-H05-sc04, pokazala su Tmod 71,3 i 72,6°C, tim redom.

[0155] U drugom kraku procene stabilnosti, monodisperznost molekula je praćena tokom perioda od 4 nedelje, na različitim temperaturama. Rezultati studije stabilnosti i dobijeni sadržaj monomera prikazani su na Slici 4. Oba molekula (16-22-H05-sc02 i 16-22-H05-sc04) započela su sa sadržajem monomera koji prelazi minimum od 95% monomera i gube manje od 5% monomera u odnosu na odgovarajuću početnu vrednost, pri koncentraciji od 10 mg/ml. U smrznutom stanju na -20°C i <-65°C, uzorci su pokazali samo minimalne razlike tokom vremena. U najstrožim uslovima (4°C), molekul 16-22-H05-sc02 je izgubio samo 0,2% monomera tokom 4 nedelje. Dodatno, sprovedena je studija stabilnosti u uslovima stresa, na temperaturi od 37°C i pri koncentraciji scFv od 10 mg/ml, do 4 nedelje. Pod ovim uslovom se očekuje stroža diskriminacija sklonosti ka agregaciji kod različitih konstrukata. Dobijeni podaci sažeti su na Slici 6 i ukazuju na gubitak monomera od 15% nakon 28 dana. Oba scFv su pokazala dobru stabilnost monomera u uslovima stresa. Hromatogrami studije stabilnosti na 4°C, dati su na Slici 5, gde je prikazan uzorak 0. dana i nakon 28 dana na 4°C. U ovom preklapanju hromatograma su takođe prikazani rezultati stabilnosti nakon zamrzavanja/odmrzavanja. Za ovaj deo studije, uzorci su više puta zamrzavani i odmrzavani u ukupno 5 ciklusa. Dobijena kvantifikacija sadržaja monomera analitičkim SE-HPLC postupkom, nije ukazala na bilo kakve promene u dva uzorka (Tabela 5).

[0156] Urađena je i SDS-PAGE analiza za dva scFv, da bi se generisali podaci koji bi podržali kvantifikaciju UV apsorpcijom, potvrđujući čistoću pripreme uzorka i na taj način obezbeđujući specifičnost za kvantifikaciju sadržaja. Prema drugom aspektu ove analize, rezultati SDS-PAGE su ukazali na odsustvo degradacije proteina tokom studije stabilnosti (28 dana na 4°C i pri koncentraciji od 10 mg/ml, u poređenju sa uzorkom iz 0. dana koji je čuvan na <-65°C), što je važna karakteristika iz perspektive kapaciteta za razvoj.

[0157] Važno je napomenuti da se različite studije sprovedene u okviru ove procene, bave različitim mehaničkim aspektima stabilnosti proteina. Utvrđivanje temperature termičkog odvijanja proteina će dati rezultate komplementarne merenju monodisperznosti SE-HPLC postupkom, nakon skladištenja na povišenoj temperaturi. Iako su oba postupka dizajnirana tako da daju procenu potencijalnog roka trajanja i stabilnosti proizvoda, mehanizmi na koje ukazuju su značajno različiti. Srednja tačka prelaza (Tm) procenjena termičkim odvijanjem, kvalitativna je mera stabilnosti domena proteina (ne dozvoljava termodinamičko određivanje ΔG). Visoko stabilni proteinski domeni (visoki Tm) imaju manje šanse da se spontano odvijaju na ambijentalnoj temperaturi i stoga su manje skloni ireverzibilnoj agregaciji/precipitaciji indukovanoj interakcijama neuvijenih domena. Visoka stabilnost domena ukazuje na gusto pakovanje aminokiselinskih ostataka, što je takođe u korelaciji sa rezistencijom na cepanje proteazama. SE-HPLC procena, sa druge strane, kvantitativno određuje sadržaj monomerne frakcije, kao i rastvorljivih oligomera/agregata. Takvi rastvorljivi oligomeri su često reverzibilni i sa relativno labavim asocijacijama indukovanim elektrostatičkim ili hidrofobnim interakcijama između pravilno uvijenih proteina. Postoji određena korelacija između Tm procenjenog termičkim odvijanjem i sklonosti obrazovanju oligomera/agregata procenjenog SE-HPLC postupkom, posebno za proteine sa „graničnom” stabilnošću. Iznad određenog praga Tm od približno 60°C, varijabilni domeni antitela su generalno dovoljno stabilni da budu otporni na agregaciju/precipitaciju i proteolitičku degradaciju, usled delimičnog odvijanja domena na ambijentalnoj temperaturi. Međutim, oligomerizacija izazvana hidrofobnim i/ili elektrostatičkim interakcijama površinskih ostataka se ipak može desiti. Važno je stoga da se u ubrzanoj studiji stabilnosti (uslovi stresa) na povišenoj temperaturi (npr. 37°C) mogu istovremeno pojaviti različiti mehanizmi obrazovanja oligomera i taloženja.

1.2.3 Karakterizacija in vitro vezivanje i aktivnost humanizovanih scFv

[0158] U nastavku su okarakterisane osobine i potencije vezivanja humanizovanih scFv za njihov ciljni molekul in vitro. Analizirane su stoga kinetike vezivanja (ka, kd i KD) za humani TNFα i potencija neutralizacija apoptoze L929 fibroblasta koja je indukovana sa TNFα. Dodatno, utvrđena je i potencija inhibicije apoptoze indukovane sa TNFα iz cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) i rezus majmuna (Macaca mulatta), kao i potencija inhibicije interakcija između humanog TNFα i TNFRI/TNFRII ELISA postupkom, a dalje i selektivnost za ciljni molekul, odnosno vezivanje za TNFα u odnosu na TNFβ.

[0159] Za razumevanje rezultata koji su prikazani ispod, važno je napomenuti da oba, i prenos zečjih CDR u matricu humanih varijabilnih domena, kao i promena u formatu od IgG pune dužine do scFv fragmenta, mogu uticati na farmakološke osobine. Na primer, sa humanizacijom se obično povezuje određeni gubitak afiniteta. Dalje, usled manje veličine scFv u poređenju sa IgG, sposobnost scFv da interferira sa partnerima u interakciji kroz sterične smetnje je u velikoj meri smanjena. Na kraju, ali ne i najmanje važno, potrebno je napomenuti da afinitet matičnog IgG možda biti prijavljen kao previsok (SPR artefakt) usled njegovog bivalentnog načina vezivanja za homo-trimerni TNFα. Posledično, kada se porede afiniteti između matičnog dvovalentnog zečjeg IgG i humanizovanog monovalentnog scFv, prijavljeni „gubitak afiniteta” može biti precenjen.

1.2.3.1 Afinitet

[0160] Afinitet humanizovanih scFv za humani TNFα određivan je SPR merenjima (pogledati takođe 2.1.1). Afinitet je određivan upotrebom 2-strukih serijskih razblaženja odgovarajućih scFv. ScFv su bii izvedeni iz zečjeg monoklonskog antitela. Generisane su dve varijante scFv, nazvane „CDR” (CDR) i „strukturni graft” (STR). Da bi se procenio relativni doprinos supstitucija uokvirujućeg regiona u lakom i teškom lancu i da bi se eventualno smanjio broj zečjih aminokiselinskih ostataka uvedenih u humani uokvirujući region, izvedeni su eksperimenti mešanja domena. Za klon 16-22-H05 su stoga generisani scFv konstrukti koji sadrže laki lanac sa CDR graftom i teški lanci sa strukturnim graftom (CDR/STR).

[0161] Najbolje rangirani scFv, 16-22-H05-sc02 (STR) i 16-22-H05-sc04 (CDR/STR), vezivali su se sa afinitetima od 4,5X10<-11>i 1,1X10<-10>M, tim redom. 16-22-H05-sc04 je pokazao samo neznatno smanjenje afiniteta u poređenju sa njegovom varijantom sa „strukturnim graftom” (16-22-H04-sc02) (pogledati Tabelu 7). Ovi rezultati ukazuju da afinitet humanizovanih scFv uglavnom zavisi od nekoliko zečjih aminokiselina uvedenih u humani uokvirujući region teškog lanca.

1.2.3.2 Potencija

[0162] Sposobnost humanizovanih scFv da neutrališu humani TNFα analizirana je upotrebom L929 testa (pogledati takođe 2.1.2). Potencija (IC50i IC90) neutralizacije apoptoze indukovane sa TNFα analizirana je za scFv izvedene iz 16-22-H5 i upoređena je sa potencijom referentnog antitela infliksimaba, da bi se omogućilo direktno poređenje IC50i IC90vrednosti sa različitih ploča za analizu. Relativne IC50i IC90vrednosti su izračunavane u masenim jedinicama (ng/ml) infliksimaba i scFv. Analiza potencije je vršena nekoliko puta u različitim danima, sa različitim serijama fragmenata antitela. Slika 7 prikazuje reprezentativne krive odnosa doze i odgovora iz jednog eksperimenta, za svaki od dva scFv. Srednje vrednosti ponovljenih merenja su prikazane u Tabeli 7 (standardne devijacije su sumirane u legendi Tabele).

[0163] Humanizovani scFv su inhibirali apoptozu indukovanu sa TNFα, sa nižim IC50i IC90vrednostima u odnosu na infliksimaba (pogledati Tabelu 7). U skladu sa SPR rezultatima, varijanta sa izmešanim domenima 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) ispoljila je jednaku potenciju kada je poređena sa strukturnim graftom 16-22-H05-sc02 (STR). ScFv 16-22-H05-sc04 i 16-22-H05-sc02 su pokazali odlične aktivnosti neutralizacije TNFα, sa IC50vrednostima koje su bile za 14,6 i 13,1 puta bolje od infliksimaba, tim redom. IC90vrednosti 16-22-H05-sc04 i 16-22-H05-sc02 bile su 13,1 i 12,6 puta bolje nego za infliksimab, tim redom. Kao što je uočeno za matična zečja monoklonska antitela, nije postojala jasna korelacija između afiniteta i potencije antitela (korelacija nije prikazana). Ipak, scFv izveden iz 16-22-H05 koji pokazuje najveće afinitete (16-22-H05-sc02 (STR) i 16-22-H05-sc04 (CDR/STR)) takođe je pokazao najveću potenciju. Dodatno, rezultati testova neutralizacije ukazuju da je potrebno postići određeni prag afiniteta u cilju efikasne inhibicije TNFα signalizacije. Na primer, sva vezivanja scFv 16-14-D08-sc01 (CDR), 16-15-C09-sc01 (CDR), 16-24-H07-sc01 (CDR) i 17-20-G01-sc01 (CDR) za TNFα su bila sa afinitetima iznad 1 nM, što ukazuje na slab potencijal neutralizacije TNFα (nije prikazano).

1.2.3.3 Unakrsna reaktivnost među vrstama (TNFα cinomolgus i rezus majmuna)

[0164] Unakrsna reaktivnost među vrstama za najbolje rangirane scFv određivana je sa dva postupka za: 1) potenciju neutralizacije TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna u L929 testu i 2) afinitet za TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna, SPR postupkom. Potencija neutralizacije TNFα iz različitih vrsta određivana je testom L929 na sličan način kao što je prethodno opisano za humani TNFα, upotrebom TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna (pogledati takođe 2.1.2). TNFα iz obe vrste je pokazao vrlo sličnu potenciju indukovanja apoptoze L929 ćelija (podaci nisu prikazani). Prema tome, iste koncentracije humanog i majmunskog TNFα su bile upotrebljene za ispitivanje unakrsne reaktivnosti među vrstmama. Dodatno, kinetike vezivanja (SPR) za TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna, određivane su upotrebom sličnih testova kao za humani TNFα (pogledati takođe 2.1.1).

[0165] Svi scFv izvedeni iz klona 16-22-H05, pokazali su unakrsnu reaktivnost sa TNFα cinomolgus majmuna i rezus majmuna (pogledati Tabelu 7). Afiniteti su bili slični, odnosno 2,0X10<-10>i 2,3X10<-10>M kod cinomolgus majmuna i rezus majmuna, tim redom. Razlika u afinitetu između humanog i majmunskog TNFα bila je oko 5 puta. Potencije neutralizacije TNFα iz cinomolgus majmuna, rezus majmuna i humanog TNFα bile su u dobroj korelaciji sa afinitetima za odgovarajuće TNFα. Posledično, dva klona izvedena iz 16-22-H05 su pokazala potencije prema TNFα majmuna koje su bile između od 5 do 7 puta niže u poređenju sa onima za humani TNFα (pogledati Tabelu 7 i Sliku 8). Sumarno, dva scFv-a su pokazala unakrsnu reaktivnost među vrstama sa TNFα cinomolgus i rezus majmuna.

1.2.3.4 Blokiranje interakcije humanog TNFα-TNFRI/II

[0166] Pored L929 testa, potencija svakog humanizovanog scFv da inhibira interakciju između humanog TNFα i TNFRI/II procenjiavana je ELISA testom (pogledati 2.1.3). Slično L929 testu, pojedinačne IC50vrednosti na svakoj ploči su kalibrisane shodno IC50referentnog molekula infliksimaba, koji je uziman sa svake ploče, a relativne IC50i IC90vrednosti su izračunavane u masenim jedinicama (ng/ml) infliksimaba i scFv.

[0167] Testovi neutralizacije mogu razlikovati potencije antitela da blokiraju ciljni molekula samo ukoliko se vezuju za isti sa ravnotežnom konstantom vezivanja (KD) koja je veća od koncentracije ciljnog molekula upotrebljenog u testu potencije (KD > koncentracije ciljnog molekula). Za L929 test je upotrebljavana koncentracija TNFα od 5 pM, dok je u ELISA testu za inhibiranje TNFRI/II upotrebljavana koncentracija TNFα od 960 pM. Pošto su svi od analiziranih scFv pokazali KD ispod 960 pM, potencije između scFv sa različitim afinitetima (ali sličnim mehanizmom delovanja) mogu se razlikovati samo u L929 testu.

[0168] 16-22-H5-sc02 i 16-22-05-sc04 su ispoljili potencije blokiranja interakcije TNFα-TNFRI između 2,8 i 3,5 puta veće u poređenju sa infliksimabom, dok je potencija u poređenju sa infliksimabom u L929 testu bila značajno veća (13,1 i 14,6 puta). Kada su upoređene relativne IC50vrednosti za matični zečji IgG (pogledati Tabelu 2) sa relativnim IC50vrednostima za humanizovane scFv (Tabela 7), potencije scFv su generalno bile nešto veće u poređenju sa matičnim IgG, iako su afiniteti uglavnom bili istog opsega kao za matični zečji IgG. Pošto su potencije antitela i scFv bile upoređivane u masenim jedinicama, broj valenci (mesta vezivanja za TNFα) pri svakoj koncentraciji bio je oko 2,9 puta veći za monovalentne scFv u poređenju sa više od pet puta težim, ali dvovalentnim IgG. Kod scFv veoma visokog afiniteta vezivanja, navedeno je rezultovalo potentnijim blokiranjem interakcije TNFα i TNFRI/II, pošto nedostatak avidnosti više nije bio kritičan za aktivnost. Nasuprot tome, kod monovalentnih domena niskog afiniteta, prijavljeno je suprotono (Coppieters i saradnici, Arthritis & Rheumatism, 2006; 54:1856-1866). Iz prethodno navedenih razloga, rezultati inhibicije iz ELISA testa nisu bili upotrebljeni za utvrđivanje ranga potencija između različitih antitela, već prvenstveno za poređenje potencijala antitela da blokiraju interakciju sa TNFRI u odnosu na TNFRII. Izučavani scFv su blokirali interakciju između oba TNFα receptora sa uporedivim potencijalima (Tabela 9, Slika 9 i Slika 10).

1.2.3.5 Specifičnost za ciljni molekul (selektivnost vezivanja za TNFα u odnosu na TNFβ)

[0169] Specifičnost dva scFv-a (16-22-H05-sc02 i 16-22-H05-sc04) za TNFα u odnosu na TNFβ, potvrđena je procenom relativnog potencijala TNFβ u poređenju sa TNFα, da inhibira vezivanje TNFα do polovine maksimalne vrednosti, za svaki scFv, što je izmereno kompetitivnim ELISA testom (pogledati takođe 2.1.4). Kvalitet rekombinantnog humanog TNFβ bio je analiziran u pogledu 1) čistoće, SDS-page i HPLC analizama, i 2) biološke aktivnosti, testom citotoksičnosti sa mišjim L929 ćelijama, od strane proizvođača proteina. Kao što je prikazano na Slici 11, interakcija između svakog od scFv sa biotiniliziranim TNFα bila je blokirana neobeleženim TNFα, sa IC50vrednostima u opsegu od 60 do 260 ng/ml, dok TNFβ nije pokazao značajan efekat, čak ni pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji TNFβ (1250 µg/ml). Prema tome, svi analizirani scFv specifično su vezivali TNFα, ali ne i njegov najbliži homolog, TNFβ. TNFβ nije pokazao nikakvu značajnu inhibiciju vezivanja TNFα za scFv u ispitivanim koncentracijama. Koncentracija TNFβ potrebna za inhibiciju vezivanja za TNFα od polovine maksimalne vrednosti, mora biti značajno viša od najviše koncentracije TNFβ upotrebljene u testu (1250 µg/ml). Kada su upoređene koncentracije TNFα i TNFβ potrebne za inhibiciju vezivanja za TNFα od polovine maksimalne vrednosti za scFv, selektivnost vezivanja za TNFα u odnosu na TNFβ bila je značajno veća od približno 5000 do 20000 puta, za sve ispitivane fragmente (pogledati takođe Tabelu 7). Prema tome, deluje da je malo verovatno vezivanje bilo kog od scFv za molekule koji nisu ciljni.

[0170] Rezultati prethodno opisanih eksperimenata su sumirani u Tabelama 7 do 9.

Tabela 8. Specifikacije humanizovanih scFv predmetnog pronalaska.

Tabela 9. Potencija scFv da blokiraju interakciju TNFα-TNFR1 i TNFα-TNFR2.

2. Postupci

2.1 Testovi za karakterizaciju vodećih molekula

2.1.1 Kinetike vezivanja i unakrsna reaktivnost među vrstama (SPR)

[0171] Afiniteti vezivanja scFv za humani TNFα mereni su rezonancijom površinskog plazmona (SPR), upotrebom MASS-1 SPR instrumenta (Sierra Sensors). Učinak SPR testa je kvalifikovan analizom interakcije referentnog antitela sa antigenom, kao što je interakcija certolizumaba i TNFα. Pegilovani Fab-fragment certolizumaba izabran je kao referentan, zbog njegovog monovalentnog načina vezivanja sličnog onom kod scFv. Upotrebom iste postavke testa kao za merenja afiniteta scFv, određena je vrednost od 9,94X10<-11>M za afinitet certolizumaba za TNFα. Ova vrednost se dobro slaže sa objavljenim KDvrednostima od 9,02 ± 1,43X10<-11>M (BLA certolizumab; BLA broj: 125160; datum podnošenja: 30. april 2007. godine).

[0172] Za merenja afiniteta scFv, humani TNFα (Peprotech, kat. br. 300-01) je imobilisan na senzorskom čipu (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors), kuplovanjem preko amina, da bi se postigao nivo imobilizacije od 50 do 100 RU (nivoi imobilizacije postignuti tokom SPR analize bili su između 40 i 120 RU). U prvom koraku, sproveden je skrining afiniteta scFv upotrebom samo jedne koncentracije scFv (90 nM). U drugom koraku, za scFv sa najboljim učinkom, kinetike jednog ciklusa injeciranja (SiCK) merene su u okviru ciklusa jednog injeciranja, istovremenim injeciranjem šest uzoraka analita u različitim koncentracijama u svaki od osam paralelnih kanala MASS-1 sistema. Za skrining afiniteta, humanizovani scFv su injecirani u protočne ćelije u koncentraciji od 90 nM tokom tri minuta, a disocijacija je praćena tokom 12 minuta. Za naredna preciznija određivanja afiniteta, u protočne ćelije su tokom tri minuta injecirana dvostruka serijska razblaženja scFv opsega od 45 do 1,4 nM i ostavljeno je da se nastavi disocijacija proteina od TNFα koji je bio imobilisan na senzorskom čipu, tokom 12 minuta. Prividne stope konstanti disocijacije (kd) i asocijacije (ka), kao i prividna ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunavani su upotrebom MASS-1 softvera za analizu (Analyzer, Sierra Sensors) i Langmuirovog modela vezivanja tipa jedan-na-jedan, dok je kvalitet uklapanja bio praćen na osnovu Chi<2>, kao mere kvaliteta uklapanja u krivu. Što je vrednost za Chi<2>bila manja, uklapanje u krivu po Langmuirovom modelu vezivanja tipa jedan-na-jedan je bilo tačnije. Za skrining afiniteta, rezultati su smatrani validnima ukoliko je Chi<2>bio ispod 10 za analiziranu koncentraciju. U slučajevima kada je analizirano nekoliko koncentracija scFv, rezultati su se smatrali validnima ukoliko je prosečna Chi<2>u svim testiranim koncentracijama bila ispod 10. Kriterijumi prihvatanja su bili ispunjeni za sve ispitivane scFv.

[0173] Unakrsna reaktivnost među vrstama za TNFα (Peprotech, kat. br. 315-01A) cinomolgus majmuna (Sino Biological, kat. br. 90018-CNAE) i rezus majmuna (R&D Systems, kat. br. 1070-RM-025/CF) merena je upotrebom iste postavke za analizu i primenom istih mera kvaliteta kao što je prethodno opisano za humani TNFα. Za TNFα iz cinomolgus i rezus majmuna postignuti su nivoi imobilizacije opsega od 50 do 180 RU i od 90 do 250 RU, tim redom. ScFv su analizirani upotrebom dvostrukih serijskih razblaženja sa koncentracijama opsega od 45 do 1,4 nM. Prosečne Chi<2>vrednosti su bile ispod 10 za sve testirane scFv.

2.1.2 Apoptoza indukovana sa TNFα u L929 fibroblastima (neutralizacija humanim, nehumanih primata i TNFα sa scFv)

[0174] Sposobnost scFv da neutrališu biološku aktivnost rekombinantnog humanog TNFα procenjivana je upotrebom mišjih L929 fibroblasta (ATCC/LGC Standards, kat. br. CCL-1). L929 ćelije su bile senzitivisane na apoptozu indukovanu sa TNFα, dodavanjem 1 µg/ml aktinomicina D. Trostruka serijska razblaženja anti-TNFα referentnog antitela ili scFv (3000-0,05 ng/ml) i 5 pM rekombinantnog humanog TNFα, (Peprotech, kat. br.300-01) prethodno su inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Upotrebljena koncentracija TNFα (5 pM) indukuje submaksimalnu L929 apoptozu (EC90). Nakon dodavanja mešavine agoniste/inhibitora, ćelije su bile inkubirane 24 sata. Preživljavanje ćelija je određivano kolorimetrijskim testom, upotrebom WST-8 (2-(2-metoksi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijuma, mono-natrijumove soli) reagensa za ćelijsku proliferaciju (Sigma Aldrich, kat. br. 96992). WST-8 se redukuje ćelijskim dehidrogenazama u narandžasti formazanski proizvod. Količina proizvedenog formazana je direktno proporcionalna broju živih ćelija WST-8 se redukuje ćelijskim dehidrogenazama u narandžasti formazanski proizvod. Količina proizvedenog formazana je direktno proporcionalna broju živih ćelija. Podaci su analizirani upotrebom četvoroparametrijske log krive i Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), nakon čega je izračunavana koncentracija referentnog antitela ili scFv potrebna za neutralizaciju apoptoze indukovane sa TNFα za 50% i 90% (IC50i IC90) (pogledati takođe Sliku 7). Da bi se dobile IC50i IC90vrednosti koje su direktno uporedive između eksperimenata koji su bili izvođeni u različitim danima ili na različitim pločama za analizu, IC50i IC90vrednosti su kalibrisane prema referentnom antitelu, infliksimabu. Da bi se kontrolisala preciznost odgovora, analizirane su krive zavisnosti doze i odgovora u duplikatu. Standardne devijacije i CV su izračunavani za svaku tačku merenja (CV < 20%).

[0175] Unakrsna reaktivnost među vrstama za TNFα cinomolgus majmuna (Sino Biological, kat. br.

90018-CNAE) i rezus majmuna (R&D Systems, kat. br.1070-RM-025/CF) izmerena je upotrebom iste postavkle i primernom istih mera kvaliteta kao što je prethodno opisano za humani TNFα. Slično kao kod humanih parnjaka, koncentracije TNFα koje indukuju submaksimalnu apoptozu L929 (EC90) upotrebljene su i za ispitivanje unakrsne reaktivnosti među vrstama. TNFα iz obe vrste je pokazao vrlo sličnu potenciju kao humani TNFα u indukovanju apoptoze L929 mišjih fibroblasta. Shodno tome, ista koncentracija TNFα (5 pM) je upotrebljena za druge ispitivane vrste. Tokom ispitivanja unakrsne reaktivnosti među vrstama, CV većine tačaka merenja u duplikatu su bile ispod 10%.

2.1.3 ELISA za inhibiciju TNFα

[0176] Inhibitorni efekat scFv na vezivanje liganda je procenjivan upotrebom ELISA, biohemijskog postupka koji isključivo reprodukuje interakciju između TNFα i TNFRI i TNFRII.

[0177] Za prvi inhibitorni ELISA test, Maxisorp ELISA ploča sa 96 mesta je obložena vanćelijskim domenom TNFRI fuzionisanim sa Fc regionom humanog IgG (R&D Systems, kat. br. 372-RI), u koncentraciji od 0,5 μg/ml. Za drugu inhibitorni ELISA test, ploča je obložena vanćelijskim domenom TNFRII fuzionisanim sa Fc regionom humanog IgG (R&D Systems, kat. br.726-R2), u koncentraciji od 2 μg/ml. Svi naredni koraci su bili identični za oba testa. Da bi se detektovalo vezivanje TNFα za TNFRI i TNFRII, TNFα je pre njegove upotrebe bio biotiniziran. Biotiniziran humani TNFα (960 pM, 50 ng/ml) najpre je inkubiran sa serijskim razblaženjima od 3 puta sa humanizovanim anti-TNFα scFv i infliksimabom (10.000 ng/ml-0,2 ng/ml), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Smeše TNFα i fragmenata antitela su zatim prebacivane na ploče sa imobilisanim TNF receptorom, nakon čega je vezivanje neblokiranog TNFα za imobilisan TNFα receptor detektovano nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta, sa streptavidinom-HRP koji se vezuje za biotin (SDT Reagents, kat. br. SP40C). Dodavanje 3',5,5'-tetrametilbenzidinskog (TMB) supstrata rezultovalo je kolorimetrijskim očitavanjem koje je bilo proporcionalno vezivanju TNFα za TNFRI i TNFRII. Pre upotrebe u kompetitivnom ELISA testu, biološka aktivnost biotiniziranog TNFα je potvrđena u L929 testu. EC50biotiniziranog TNFα bio je sličan EC50neobeleženog TNFα (podaci nisu prikazani). Slično L929 testu koji je prethodno opisan, podaci su analizirani upotrebom četvoroparametrijske log krive i Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), nakon čega je izračunavana koncentracija scFv potrebna za inhibiciju interakcije TNFα i TNFR za 50% i 90% (IC50i IC90). Da bi se dobile IC50i IC90vrednosti koje su direktno uporedive između eksperimenata koji su bili izvođeni u različitim danima ili na različitim pločama za analizu, IC50i IC90vrednosti su kalibrisane prema referentnom antitelu, infliksimabu.

[0178] Da bi se kontrolisala preciznost odgovora, analizirane su krive zavisnosti doze i odgovora u duplikatu. Standardne devijacije i CV su izračunavani za svaku tačku merenja (CV < 25%).

2.1.4 Specifičnost za ciljne molekule

[0179] Da bi se potvrdila anti-TNFα specifičnost za scFv, procenjivano je vezivanje za najviše homolognog člana porodice, TNFβ. Potencijal da se inhibira interakcija biotiniziranih TNFα sa scFv i neobeleženih TNFβ (Peprotech, kat. br. 300-01B) i TNFα (Peprotech, kat. br. 300-01), analiziran je kompetitivnim ELISA testom. U tu svrhu, Maxisorp ELISA ploča sa 96 mesta je obložena sa scFv u koncentraciji od 1 µg/ml. Vezivanje biotiniziranog TNFα (75 ng/ml) za scFv kojim je bila obložena ploča, u prisustvu 5 puta serijski razblaženog neobeleženog TNFα (50 µg/ml - 0,00013 µg/ml) ili TNFβ (1250 µg/ml - 0,00013 µl/ml), detektovano je upotrebom streptavidin-HRP koji se vezuje za biotin (SDT Reagents, kat. br. SP40C), kao što je prethodno opisano. Za krivu zavisnosti doze i odgovora sa TNFα, podaci su analizirani upotrebom četvoroparametrijske log krive i Softmax softvera za analizu podataka (Molecular Devices), nakon čega je izračunavana koncentracija neobeleženog TNFα potrebna da se blokira interakcija biotiniziranog TNFα sa scFv kojim su bile obložene ploče za 50% (IC50). TNFβ nije pokazao nikakvu značajnu inhibiciju interakcije između biotiniziranog TNFα i scFv (pogledati takođe Sliku 11). Da bi se kvantifikovao relativan potencijal TNFβ da inhibira vezivanje TNFα za svaki scFv u poređenju sa TNFα, izračunat je i IC50inhibiranja interakcije TNFβ u odnosu na TNFα. Pošto nije uočena značajna inhibicija prilikom upotrebe TNFβ u približno 5.000 do 20.000 puta većoj koncentraciji od IC50za TNFα, utvrđeno je da je selektivnost vezivanja za TNFα u odnosu na TNFβ bila značajno veća od 5.000 do 20.000 puta. Da bi se kontrolisala preciznost odgovora, krive zavisnosti doze i odgovora su analizirane u duplikatu. Standardne devijacije i CV su izračunavani za svaku tačku merenja (CV < 25% za sve osim jedne od ispitivanih koncentracija TNFα/β). Svi scFv su ispunili ovaj kriterijum.

2.1 CMC analitici

2.2.1 Redukujući SDS-PAGE

[0180] Natrijum dodecil sulfat poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) je tehnika analize koja se upotrebljava za kvalitativnu karakterizaciju i kontrolu čistoće proteina. Prema Farmakopeji Sjedinjenih Država (USP) (USP, Poglavlje 1056) analitička gel elektroforeza je odgovarajući i rutinska postupak za identifikaciju i procenu homogenosti proteina u lekovitim supstancama.

[0181] Postupak je upotrebljavan za kvantifikaciju količine scFv proizvoda iz lizata E.coli, a da bi se dobio ekspresioni prinos nakon fermentacije. Druga primena postupka je bila da se potvrdi identitet ispitivanih supstanci na osnovu njihove molekulske težine u odnosu na teorijske vrednosti. U cilju podrške, ova postupak je upotrebljavan i za kvantifikaciju čistoće ispitivanih uzoraka u odnosu na nečistoće povezane sa procesom (u vidu proteina ćelija domaćina) i nečistoće povezane sa proizvodom (u vidu proizvoda razgradnje ili adukata).

[0182] SDS-PAGE analize su rađene sa komercijalno dostupnim gotovim gel sistemom „Mini Protean” nabavljenim od Bio-Rad Laboratories Inc. Humanizovani scFv su analizirani na „Any kD” gelovima za razdvajanje (kat. br. 456-9036). U oba slučaja je korišćen Tris/glicinski puferski sistem koji je preporučio proizvođač. Za detekciju proteinskih traka korišćeno je ili coomassie bojenje sa SimpliyBlueTM rastvorom za bojenje (Life Technologies Corp., kat. br. LC6060) ili bojenje srebrom sa Pierce Silver Stain kompletom (Thermo Fisher Scientific Inc., kat. br. 24612). Prilikom postupaka bojenja, poštovani su protokoli odgovarajućeg dobavljača.

[0183] Dokumentovanje i analiza obojenih proteinskih gelova rađeni su na sistemu za dokumentovanje ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories Inc., kat. br. 170-8265) i upotrebom softvera Image Lab, verzija 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., kat. br.170-9690).

Određivanje titra u uzorcima lizata

[0184] SDS-PAGE omogućava specifičnu detekciju proteina od interesa u smeši proteina ćelija domaćina. Referentna standardna serija razblaženja u linearnom opsegu postupka (koja je unapred određena), uključivana je na svaki gel. Linearna regresija intenziteta traka (izmerenih denzitometrijom), u odnosu na nominalne koncentracije referentnog standarda, upotrebljavana je za izračunavanje standardne krive, koja je zauzvrat korišćena za ekstrapolaciju sadržaja scFv u uzorku.

[0185] Uzorci lizata nepoznatih koncentracija proizvoda, nanošeni su u različitim razblaženjima (najmanje 1:10 u puferu za razblaživanje), da bi najmanje jedna koncentracija scFv bila u linearnom opsegu postupka. Količina proizvoda je izračunavana na osnovu izmerenih intenziteta traka scFv, nakon čega je koncentracija određivana upotrebom faktora razblaženja pri pripremi uzorka. Vrednosti su usrednjene za sve uzorke koji su bili u linearnom opsegu standardne krive.

[0186] Kao dodatni test podobnosti postupka za kvantifikaciju uzorka lizata, urađen je i test inhibicije/poboljšanja, dodavnjem poznate količine referentnog standarda u uzorke lizata (spajkovanje). Izračunavanje izdvajanja standarda pri razblaženju uzorka od 1:10 u puferu za razblaživanje, dalo je vrednost od 95,4%, koja je na istom nivou preciznosti koji je bio zabeležen i za referentni standard u puferu za razblaživanje. Prema tome, nije zapažena značajna interferencija matriksa u ćelijskim lizatima, tako da se postupak smatrao pogovnim za kvantifikaciju scFv sadržaja u ćelijskim lizatima.

Čistoća i sadržaj proteina

[0187] Da bi se pokazala prikladnost postupka za određivanje sadržaja, a time i čistoće ispitivanih uzoraka, donja granica detekcije (LOD) za referentni scFv određivana je vizuelno (identifikovanjem proteinske trake) pri nominalnoj količini uzorka od 0,02 µg, dok procena histograma intenziteta odgovarajuće trake pokazuje odnos signal-šum pri navedenoj količini uzorka od približno 2. Dodatno, linearni opseg za kvantifikaciju je određivan denzitometrijskom analizom glavnih traka.

[0188] Rezultat uklapanje podataka uz linearnu regresiju, bio je koeficijent određenosti (R<2>) od 0,9998, što ukazuje na dobar kvalitet uklapanja. Pored ukupnog kvaliteta uklapanja, određivana je i relativna greška svake pojedinačne tačke podataka, da bi se dokumentovala pogodnost postupka u izabranom opsegu. Relativne greške su bile ispod 10% za sve tačke podataka, što ukazuje na dobru pouzdanost ovog postupka.

2.2.2 UV apsorpcija na 280 nm

[0189] Postupak UV apsorbcije na 280 nm je test za ukupne proteine, kao što je u glavnim crtama navedeno u USP, poglavlju 1057. Proteinski rastvori apsorbuju UV svetlost na talasnoj dužini od 280 nm usled prisustva aromatičnih aminokiselina. UV apsorpcija je funkcija sadržaja tirozinskih i triptofanskih ostataka u proteinu i proporcionalna je koncentraciji proteina. Apsorpcija nepoznatog proteinskog rastvora može biti utvrđena prema USP, poglavlje 851, o spektroskopiji, primenom Berovog zakona: A= ε*I*c, gde je apsorpcija (A) jednaka proizvodu molarne apsorpcije (ε), dužina puta apsorpcije i koncentracija supstance. Molarna apsorpcija za scFv je izračunavana upotrebom Vector NTI<®>softvera (Life Technologies Corporation).

[0190] Merenje UV apsorpcije je rađeno na Infinity čitaču M200 Pro koji je bio opremljen Nanoquant pločom (Tecan Group Ltd.). Apsorpcija uzoraka proteina je merena na 280 nm i 310 nm, pri čemu je drugonavedena talasna dužina služila kao referentni signal, koji je oduziman od signala na 280 nm. Da bi se uračunala potencijalna interferencija matrice uzorka, rađeno je i oduzimanje vrednosti slepe probe za svako merenje. Konačni signal apsorpcije dobijen za proteinske urzoke je upotrebljavan za izračunavanje koncentracije proteina upotrebom Lambert-Berovog zakona.

[0191] Sva merenja su vršena unutar opsega navedenog u specifikacijama instrumenata, odnosno u opsegu merenja od 0-4 OD, gde proizvođač specifino navodi reproducibilnost < 1% i uniformnost < 3%.

2.2.3 SE-HPLC (tečna hromatografija pod visokim pritiskom za razdvajanje po veličini)

[0192] SE-HPLC je tehnika razdvajanja zasnovana na čvrstoj stacionarnoj fazi i tečnoj mobilnoj fazi, kao što je u glavnim crtama navedeno u USP, poglavlju 621. Ovaj postupak razdvaja molekule na osnovu njihove veličine i oblika, koristeći hidrofobnu stacionarnu fazu i vodenu mobilnu fazu. Razdvajanje molekula se odvija između zapremine praznine (V0) i ukupne zapremine permeacije (VT) određene kolone. Merenja SE-HPLC postupkom su vršena na Chromaster HPLC sistemu (Hitachi High-Technologies Corporation), opremljenom sa sistemom za automatizovano injeciranje uzoraka, kao i UV detektorom podešenim na talasnu dužinu detekcije od 280 nm. Oprema je bila kontrolisana EZChrom Elite softverom (Agilent Technologies, verzija 3.3.2 SP2) koji takođe podržava analizu rezultujućih hromatograma. Proteinski uzorci su izbistreni centrifugiranjem i držani su na temperaturi od 6°C u sistemu za automatizovano nanošenje uzoraka pre injeciranja. Za analizu scFv uzoraka korišćena je kolona Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc., kat. br. F6989201), sa standardizovanim puferisanim fiziološkim rastvorom kao mobilnom fazom (50 mM natrijum acetat pH 6,0, 250 mM natrijum hlorid) a preporučena brzina protoka je iznosila 0,35 mL/min. Nanošenje uzorka ciljnog molekula po injeciranju je iznosilo 5 µg. Uzorci su detektovani UV detektorom na talasnoj dužini od 280 nm, a podaci su snimani odgovarajućim softverskim paketom. Dobijeni hromatogrami su analizirani u opsegu V0do VT, čime su isključivani pikovi povezani sa matriksom u periodu eluiranja >10 min.

[0193] Da bi se osigurala srednja preciznost postupka, referentni standard je rutinski meren na početku i na kraju svakog HPLC ciklusa. Referentni standard upotrebljavan za ovaj test prikladnosti sistema bio je scFv, koji je proizveden kao serija i alikvotiran je tako da se upotrebljava za svaku vremensku tačku merenja.

2.2.4 DSF (diferencijalna skenirajuća fluorometrija)

[0194] Postupak DSF je neuobičajen postupak za merenje proteinskog odvijanja zavisnog od temperature. Merenje temperature termičkog odvijanja sa DSF vršeno je na MX3005P qPCR mašini (Agilent Technologies) kontrolisanoj MX Pro softverskim paketom (Agilent Technologies) i opremljenom setom filtera za pobuđivanje/emisiju na 492/610 nm. Reakcije su postavljane na Thermo fast 96 bele ploče za PCR (Abgene; kat. br. AB-0600/W). Za detekciju odvijanja proteina korišćen je komercijalno dostupan štok rastvor SYPRO narandžaste boje (Molecular Probes; kat. br. S6650) u finalnom razblaženju od 1:1.000. Uzorci proteina su razblaživani za merenja odvijanja do finalne koncentracije od 50 µg/mL, u standardizovanom puferisanom fiziološkom rastvoru. Termičko odvijanje je vršeno temperaturnim programom koji je započinjao na 25°C i koji se, u koracima od po 1°C, povećavao do 96°C, tokom 30 sekundi. Tokom temperaturnog programa je snimana emisija fluorescencije svakog uzorka. Snimljeni sirovi podaci su obrađivani i procenjivani upotrebom šablona iz Microsoft Excel paketa (Niesen, Nature Protocols 2007, tom 2, br. 9), a podaci o fluorescenciji su ubacivani u Bolcmanovu jednačinu upotrebom GraphPad Prism programa (GraphPad Software, Inc.), da bi se dobila srednja tačka prelaza (Tm).

[0195] Da bi se proizvela pouzdana i robusna merenja srednje tačke odvijanja, rađeni su najmanje duplikati merenja. U pogledu kvaliteta podataka, razmatrana su samo merenja sa dobrim uklapanjem (R<2>) >0,9900 i intervalom poverenja od 95% Tmkoji je bio manji od 0,5%.

[0196] Za procenu srednje preciznosti, uz svako merenje je uključivan i referentni standard (poznat, okarakterisani scFv), da bi se omogućilo poređenje performansi testa u različitim danima.

2.2.5 Studija stabilnosti

[0197] Da bi se procenila stabilnost različitih scFv konstrukata, kao mera kapaciteta razvoja ovih molekula, dizajniran je protokol za ispitivanje kratkoročne stabilnosti. Proteinski konstrukti su koncentrovani u jednostavnoj puferisanoj formulaciji fiziološkog rastvora (pogledati prethodno), do ciljnih koncentracija od 1 i 10 mg/mL. Sadržaj monomera je određivan SE-HPLC postupkom, da bi se potvrdilo da čistoća premašuje kriterijum podobnosti od > 95%. Nakon toga, proteinski uzorci su čuvani na <-65, -20, 4 i 37°C tokom 4 nedelje i alikvoti su analizirani u raznim vremenskim tačkama. Primarno očitavanje je bila SE-HPLC analiza, koja omogućava kvantifikaciju rastvorljivih oligomera i agregata veće molekulske težine. Kao pomoćno merenje, određivan je sadržaj proteina UV apsorpcijom na 280 nm, što ukazuje da li su tokom perioda skladištenja značajne količine proteina bile izgubljene precipitacijom. Za skladištenje su upotrebljavane epruvete sa čepom na navijajanje (Sarstedt, kat. br. 72.692.005) i količinom ispune od 30-1500 µg po alikvotu. Dodatno, čistoća je određivana sa SDS-PAGE, koja je ukazala na stabilnost konstrukta u pogledu degradacije ili kovalentne multimerizacije.

Primer 3: Generisanje humanizovanog diatela i IgG

[0198] Konstrukt jednolančana diatela je dizajniran raspoređivanjem varijabilnih domena u VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA konfiguraciju. U ovim konstruktima, VLA i VHA i VLB i VHB domeni zajedno obrazuju mesto vezivanja za TNFα. Peptidni linkeri L1-L3 koji povezuju varijabilne domene, konstruisani su od glicin/serinskih ponovaka. Dva kratka linkera, L1 i L3, sastojala su se od jednog G4S ponovka, dok je dugi linker L2 bio sastavljen od sekvence (G4S)4. Nukleotidne sekvence koje kodiraju humanizovane varijabilne domene (Primer 2; 1.2.1.) najpre su sintetisane de novo, pa su klonirane u prilagođen vektor za ekspresiju u E.coli koji se zasnivao na pET26b(+) okosnici (Novagen). Ekspresije i prečišćavanja su rađeni kao što je opisano za scFv u Primeru 2; 1.2.1.

[0199] Humanizovan IgG je konstruisan kloniranjem varijabilnih domena u pogodan sisarski ekspresioni vektor za privremenu heterolognu ekspresiju koji je sadržavao vodeću sekvencu i odgovarajuće konstantne domene, npr. pFUSE-rlgG vektor (Invivogen). Privremena ekspresija funkcionalnog IgG je rađena ko-transfekcijom vektora koji kodiraju teške i lake lance sa FreeStyle<™>MAX sistemom u CHO S ćelijame. Nakon kultivacije tokom nekoliko dana, supernatant ćelija koje luče antitela je prikupljan radi prečišćavanja. Izlučeni IgG su zatim afinitetno prečišćeni Protein A sefarozom (GE Healthcare). Frakcije eluiranja su analizirane sa SDS-PAGE, UV apsorpcijom na 280 nm i SE-HPLC postupkom.

[0200] Afiniteti molekula antitela su određivani upotrebom Biacore instrumenta, kao što je opisano u Primeru 2 pod 2.1.1).

[0201] Potencije molekula antitela su određivane u L929 testu (postupak je opisan u Primeru 2, pod 2.1.2).

Primer 4: Određivanje stehiometrije vezivanja TNFα

[0202] Stehiometrija vezivanja 16-22-H5 za TNFα određivana je upotrebom SE-HPLC postupka.16-22-H5-scFv i TNFα su inkubirani u dva različita molarna odnosa, zapravo u molarnom odnosu 1:1 i 4,5:1. Pošto TNFα postoji kao trimer u rastvoru, naznačeni molarni odnosi se odnosi na TNFαtrimer. Prema tome, u odnosu 4,5:1, 16-22-H5-scFv je bio u višku i trebao je da zauzima sve pozicije vezivanja na TNFαtrimeršto bi rezultovalo kompleksima jednog TNFαtrimerasa 3 scFv. Međutim, pod ekvimolarnim uslovima, nije bilo prisutno dovoljno scFv da bi se zasitila sva 3 teorijska mesta vezivanja TNFα. Očekivane su stoga i složene varijante, sa manje od 3 vezanih scFv. TNFα i 16-22-H5-scFv su inkubirani 2 sata na sobnoj temperaturi, da bi se omogućilo obrazovanje kompleksa. Uzorci su zatim centrifugirani na 4°C tokom 10 min. Analizirano je dalje po 10 μL svakog uzorka na SE-HPLC instrumentu. SE-HPLC analiza je izvedena sa 50 mM fosfatnog pufera pH 6,5, 300 mM NaCl kao eluentom i pri brzini protoka od 0,35 mL/min. Eluirani proteinski pikovi su detektovani na talasnoj dužini od 280 nm. Kolona je bila unapred kalibrisana, upotrebom kompleta za kalibraciju gel filtracije od kompanije GE Healthcare (LMW, HMW), radi određivanja prividne molekulske težine.

[0203] Donji panel na Slici 12 prikazuje elucioni profil sa ekvimolarnim količinama scFv i TNFα, preklopljen sa profilima dobijenim samo za NFαtrimeri samo za scFv. Usled trimerizacije TNFα u rastvoru, teorijski postoje do tri ekvivalentna mesta vezivanja za scFv koji su prisutni na svakom trimeru, zbog čega su scFv molekuli ograničavajući. U ovim uslovima, identifikovane su sve tri kompleksne vrste (3:1, 2:1, 1:1). Gornji panel na Slici 12 prikazuje elucioni profil kompleksa sa viškom scFv. Višak nevezanog scFv je bio eluiran u očekivanom retencionom vremenu. Pik TNFα je kvantitativno potrošen za obrazovanje kompleksa i potpuno je nestao. Pik ovog kompleksa se pomerio ka nižim retencionim vremenima i bio je u dobroj korelaciji sa retencionim vremenom pika sa najvećom molekulskom težinom iz ekvimolarne postavke. Iz tog razloga, zaključeno je da su sva raspoloživa mesta vezivanja na TNFα bila zauzeta sa scFv i da je stoga stehiometrija vezivanja 3:1 (scFv:TNFα) ukoliko je scFv dostupan u višku.

[0204] Pored ovih kvalitativnih zapažanja, prividna stehiometrija vezivanja je takođe izračunavana na osnovu prividne MW kompleksa 16-22-H5-scFv:TNFα, što je određivano sa SE-HPLC. Na osnovu retencionog vremena, izračunata je očigledna MW od 139,7 kDa. Prema jednačini (1) koja je navedena u nastavku teksta, izračunata je i prividna stehiometrija vezivanja od 3,3. Navedeno je u dobroj korelaciji sa teorijskim brojem od tri ekvivalentna mesta vezivanja koji su dostupni za scFv na TNFαtrimeru, kao i sa prethodno navedenim zapažanjima kojima je utvrđena stehiometrija vezivanja od 3:1.

Jednačina (1): stehiometrija vezivanja

sc v;

MW (kompleks, očigl.): 139,7 kDa

MW (TNFα, teorij.): 52,2 kDa

MW (scFv, teorij.): 26,5 kDa

Primer 5: Obrazovanje kompleksa TNFα:antitelo (unakrsno povezivanje TNFα)

[0205] Sposobnost 16-22-H5-scDb da se istovremeno vezuje za dva TNFα molekula ispitivana je na Biacore T200 instrumentu, u HEPES puferu koji je sadržavao 10 mM HEPES, 150 mM NaCl i 0,05% Tween. Biotinizirani TNFα (Aero Biosystems) „uhvaćen” je preko biotiniziranog ssDNK oligo, upotrebom Biotin CAPture kompleta (GE Healthcare), prema uputstvima proizvođača. Injecirano je zatim 0,25 µg/mL biotiniziranog TNFα, uz brzinu protoka od 10 µL/min tokom 3 minuta, da bi se dostigao nivo hvatanja od približno 200 do 300 RU (rezonantne jedinice). Antitela 16-22-H5-scDb i 16-22-H5-scFv, kao kontrole, injecirani su preko površine na kojoj je bio imobilisan TNFα, tokom 2 minuta i uz brzinu protoka od 30 µL/min, u koncentraciji od 90 nM. Nakon asocijacije sa fragmentima antitela, tokom 5 minuta je injeciran TNFα (Peprotech) uz brzinu protoka od 30 µL/min i u koncentraciji od 90 nM. Koncentracije antitela i TNFα su izabrane tako da budu blizu zasićenja vezivanja. Merenje je obavljano na 25°C. Slika 13 ilustruje da je dvovalentni 16-22-H5-scDb u stanju da veže dva TNFα molekula istovremeno, dok se, kako se i očekivalo, monovalentni 16-22-H5-scFv vezuje samo za jedan TNFα molekul.

[0206] Dalje, obrazovanje kompleksa TNFα i antitela je procenjivano za različite odnose TNFα i 16-22-H5 formata antitela, upotrebom SE-HPLC. Shodno mestima vezivanja, 16-22-H5-IgG (150 kDa) i 16-22-H5-scDb (52 kDa) su inkubirani sa TNFα (52 kDa) u različitim molarnim odnosima (1:3, 1:1, 3:1). Prema tome, IgG i scDb imaju 2, a TNFα ima 3 mesta vezivanja. Smeše antitela i TNFα su inkubirane najmanje 30 minuta na 37°C, nakon čega su hlađene tokom 10 min na sobnoj temperaturi i čuvane preko noći na 2-8°C. Pet do 10 uL mešavine proteina u koncentraciji od pribl. 1 mg/mL, injecirano je zatim na TOSHO TSKgel UP-SW3000 kolonu. Analiza je rađena sa 150 mM fosfatnog pufera pH 6,8, kao i sa 100 mM NaCl kao eluentom i pri brzini protoka od 0,3 mL/min. Eluirani proteinski pikovi su detektovani na talasnoj dužini od 214 nm. Kolona je bila unapred kalibrisana, upotrebom standardne BEH450 SEC mešavine proteina (Waters) za određivanje približne molekulske težine kompleksa. Slika 14A prikazuje obrazovanje 16-22-H5-IgG:TNFα kompleksa. Kompleksi koji su ≥ 600 kDa ukazuju na obrazovanje kompleksa koji se sastoje od ≥ 2 TNFα i ≥ 3 IgG molekula. Slika 14B prikazuje obrazovanje 16-22-H5-scDb:TNFα kompleksa. Kompleksi koji su ≥ 300 kDa ukazuju na obrazovanje kompleksa koji se sastojao od ≥ 2 TNFα i ≥ 3 scDb molekula.

Primer 6: Inhibicija ćelijske proliferacije

[0207] Kapacitet različitih formata antitela 16-22-H5 i adalimumaba da inhibiraju proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) ispitivan je u mešovitoj limfocitnoj reakciji (MLR). PBMC iz 2 zdrava donora su kultivisane (RPMI1640) u odnosu 1:1, u pločama sa 96 mesta, tokom 48 h na 37°C/5% CO2. Nakon aktivacije, ćelije su tretirane anti-TNFα antitelima ili IgG kontrolnim antitelom (svi u finalnoj koncentraciji od 10 µg/mL) u šestoplikatima, tokom dodatnih 5 dana na 37°C/5% CO2. U svaki bunarić je 24 h pre kraja inkubacije dodat BrdU (20 uL/bunariću) i proliferacija je određivana merenjem preuzimanja BrdU, upotrebom komercijalno dostupnog ELISA testa za ćelijsku proliferaciju (Roche Diagnostics). Indeks stimulacije je određivan izračunavanjem odnosa preuzimanja BrdU između ćelija tretiranih antitelom i ćelija tretiranih mitomicinom C (25 ng/mL). Tabela 12 i Slika 15 ilustruju da su svi testirani formati antitela 16-22-H5 značajno inhibirali proliferaciju T-ćelija, koja je bila uporediva sa adalimumabom.

Tabela 12

Primer 7: Inhibicija sekrecije citokina indukovane LPS-om

[0208] CD14<+>monociti u RPMI1640 su zasejavani u ploče sa 96 mesta i potom inkubirani tokom 16 h na 37°C/5% CO2u vlažnom inkubatoru. Ćelije su zatim tretirane anti-TNFα antitelima ili IgG kontrolnim antitelom u duplikatima, tokom 1 h, upotrebom finalnih koncentracija antitela u opsegu od 2 do 2000 ng/mL. Monociti su isprani 3 puta medijumom za ćelijsku kulturu i zatim inkubirani sa LPS-om (100 ng/mL), tokom 4 h na 37°C/5% CO2. Koncentracije IL-1β i TNFα u supernatantima ćelijske kulture određivane su upotrebom komercijalno dostupnih ELISA kompleta (R&D Systems). Rezultati su prikazani u Tabelama 13 i 14 i na Slikama 16A i B. IC50je određivan upotrebom četvoroparametarske log krive. U pogledu sekrecije IL-1β, IC50vrednosti za 16-22-H5-lgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv i adalimumab su sumirane ispod, u Tabeli 13.

Tabela 13. Sekrecija IL-1β

[0209] U kontekstu sekrecije TNFα, utvrđene IC50vrednosti za 16-22-H5-lgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv su sumirane u Tabeli 14.

Tabela 14. Sekrecija TNFα

Tabela 15. Vκ1 konsenzusne sekvence (preuređene)

Tabela 16: Sekvence uokvirujućeg regiona IV zasnovane na Vλ germinativnoj sekvenci

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, sposobno da se specifično vezuje za humani faktor nekroze tumora alfa (TNFα), pri čemu navedeno antitelo ili funkcionalni fragment sadrži (i) VLdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:14, i (ii) VHdomen sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:13, i pri čemu se specifično vezivanje odnosi na sposobnost antitela ili fragmenta da jasno razlikuje humani TNFα i humani TNFβ.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje je imunoglobulin G (IgG).

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je IgG potklase IgG1.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 2 ili 3, gde svaki laki lanac IgG ima aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:52.

5. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kom od prethodno navedenih patentnih zahteva.

6. Vektor ili plazmid koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 5.

7. Ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 5 ili vektor ili plazmid prema patentnom zahtevu 6.

8. Postupak pripreme antitela ili funkcionalnog fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji obuhvata kultivisanje ćelije prema patentnom zahtevu 7 u medijumu, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili funkcionalni fragment, i izdvajanje antitela ili funkcionalnog fragmenta iz ćelija ili iz medijuma.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili funkcionalni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens.

10. Antitelo ili funkcionalni fragment kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog poremećaja.

11. Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu navedeni inflamatorni poremećaj je inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta.

12. Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu navedeni inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je inflamatorna bolest creva.

13. Antitelo ili funkcionalni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili 12, pri čemu je navedeni inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta Kronova bolest ili ulcerozni kolitis.