RS65199B1

RS65199B1 - Humana monoklonska antitela na teški akutni respiratorni sindrom koronavirus 2 (sars-cov-2)

Info

Publication number: RS65199B1
Application number: RS20240202A
Authority: RS
Inventors: James E Crowe Jr; Seth Zost; Robert Carnahan; Pavlo Gilchuk
Original assignee: Univ Vanderbilt
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2024-03-29
Also published as: ECSP22083269A; JP2023518849A; LT4045533T; TW202200610A; US11345741B2; AU2021242306B2; CR20220545A; CN115768790A; PT4045533T; EP4045533B1; AU2021242306A1; MX2022011892A; EP4045533A1; HRP20240182T1; SI4045533T1; FI4045533T3; SMT202400070T1; US12216120B2; ES2973425T3; US20220281958A1

Description

Opis

POZADINA PRONALASKA

1. Polje otkrića

[0001] Ovo otkriće se generalno odnosi na oblasti medicine, zaraznih bolesti i imunologije. Konkretnije, otkriće se odnosi na humana antitela koja se vezuju za novi koronavirus označen kao SARS-CoV-2 i metode njihove upotrebe.

2. Pozadina pronalaska

[0002] Epidemija novog korona virusa (SARS-CoV-2) pogodila je kontinentalnu Kinu, zajedno sa slučajevima u 179 drugih zemalja i teritorija. Identifikovan je u Vuhanu, glavnom gradu kineske provincije Hubej, nakon što je 41 osoba dobila upalu pluća bez jasnog uzroka. Virus, koji izaziva akutnu respiratornu bolest označenu kao koronavirusna bolest 2019 (COVID-19), sposoban je da se širi sa osobe na osobu. Period inkubacije (vreme od izlaganja do pojave simptoma)

kreće se od 0 do 24 dana, sa srednjom vrednošću od 3-5 dana, ali može biti zarazan tokom ovog perioda i nakon oporavka. Simptomi uključuju groznicu, kašalj i teškoće sa disanjem. Procena stope smrtnosti u februaru 2020. godine bila je 2% potvrđenih slučajeva, više među onima koji su zahtevali prijem u bolnicu.

[0003] Do 10. februara 2020. godine potvrđeno je 40.627 slučajeva (6.495 teških), uključujući svaku podelu Kine na nivou pokrajine. Veći broj ljudi je možda zaražen, ali nije detektovan (posebno blagi slučajevi). Od 10. februara 2020. godine, virusu je pripisano 910 smrtnih slučajeva od prve potvrđene smrti 9. januara, sa 3.323 oporavka. Prvi lokalni prenos van Kine dogodio se u Vijetnamu između članova porodice, dok se prvi međunarodni prenos koji ne uključuje porodicu dogodio u Nemačkoj 22. januara. Prva smrt izvan Kine bila je na Filipinima, gde je 1. februara preminuo čovek iz Vuhana. Od 10. februara 2020. godine, broj smrtnih slučajeva od ovog virusa premašio je globalnu epidemiju SARS-a 2003. godine.

[0004] Od početka februara 2020. godine ne postoji licencirana vakcina i nema specifičnog lečenja, iako se istražuje nekoliko pristupa vakcinama i antivirusnim lekovima. Svetska zdravstvena organizacija (SZO) proglasila je epidemiju vanrednom situacijom od međunarodnog značaja za javno zdravlje (PHEIC), na osnovu mogućih efekata koje bi virus mogao da ima ako se proširi na zemlje sa slabijim zdravstvenim sistemima. Dakle, postoji hitna potreba za istraživanjem biologije i patologije SARS-CoV-2, kao i humanog imunološkog odgovora na ovaj virus.

[0005] Wang et al, Nat Commun 11, 2251 (2020), otkriva humano monoklonsko antitelo koje neutrališe SARS-CoV-2 (i SARS-CoV) u ćelijskoj kulturi.

[0006] Ng O-W et al.,PLoS ONE 9(7): e102415, otkriva mišja monoklonska antitela (mAt) koja ciljaju S2 podjedinicu S proteina sposobna su da neutrališu infekciju SARS-CoV in vitro.

SAŽETAK

[0007] Ovaj predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za površinski protein šiljka SARS-CoV-2, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:59, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:60, CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:61, CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:89, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:90, CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:91.

[0008] Ovaj predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za površinski protein šiljka SARS-CoV-2, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:68, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:69, CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:70, CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:98, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:99, CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 100.

[0009] Ovaj predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutski prihvatljiva kompozicija koja se sastoji od antitela ili fragmenta antitela predmetnog pronalaska, opciono pri čemu je kompozicija formulisana za intravensku primenu.

[0010] Ovaj predmetni pronalazak takođe pruža farmaceutski prihvatljiva kompozicija koja se sastoji od prvog antitela ili fragmenta antitela predmetnog pronalaska i drugog antitela ili fragmenta antitela predmetnog pronalaska.

[0011] Ovaj predmetni pronalazak takođe pruža kombinaciju prvog antitela ili fragmenta antitela koji se vezuje za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2 i drugog antitela ili fragmenta antitela koji se vezuje za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2 za upotrebu u metodi za lečenje ili sprečavanje infekcije virusom SARS-CoV-2 kod subjekta, pri čemu

prvo antitelo ili fragment antitela sadrži CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:59, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SeQ ID NO:60, CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:61, CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:89, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:90, CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina Seq ID NO:91; a

drugo antitelo ili fragment antitela obuhvata CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:68, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:69, CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:70, CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 98, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:99, CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 100.

[0012] Stoga, u skladu sa ovim otkrićem, ali ne delom predmetnog pronalaska, obezbeđena je metoda detektovanja infekcije COVID-19 virusom SARS-CoV-2 kod subjekta koji se sastoji od (a) kontaktiranja uzorka navedenog subjekta sa antitelom ili fragmentom antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno; i (b) detektovanja virusa SARS-CoV-2 u navedenom uzorku vezivanjem navedenog antitela ili fragmenta antitela za antigen virusa SARS-CoV-2 u navedenom uzorku. Uzorak može biti telesna tečnost, kao što su krv, ispljuvak, suze, pljuvačka, sluzokoža ili serum, sperma, cervikalni ili vaginalni sekret, amnionska tečnost, placentno tkivo, urin, eksudat, transudat, strugotine tkiva ili stolica. Detekcija može uključivati ELISA, RIA, test lateralnog toka ili Western blot test. Metoda može dalje da obuhvata izvođenje koraka (a) i (b) po drugi put i određivanje promene nivoa antigena SARS-CoV-2 u poređenju sa prvim testom. Antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili

varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju 100% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, ili varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. Antitelo ili fragment antitela može da se veže za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2. Fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment.

[0013] U drugom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, otkrkivena je metoda lečenja subjekta zaraženog SARS-CoV-2 ili smanjenja verovatnoće infekcije subjekta sa rizikom od dobijanja SARS-CoV-2, koji obuhvata isporuku pomenutom subjektu antitela ili fragmenta antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. Antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju 100% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, ili varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. Fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment.

Antitelo može biti himerno antitelo ili bispecifično antitelo. Antitelo može biti IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim glikozilirajućim obrascem. Antitelo ili fragment antitela može da se veže za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2. Antitelo ili fragment antitela se može primeniti pre infekcije ili nakon infekcije. Subjekt može biti stariji od 60 godina, može biti imunokompromitovan ili može patiti od respiratornog i/ili kardiovaskularnog poremećaja. Isporuka može da obuhvata primenu antitela ili fragmenta antitela, ili genetsku isporuku sa RNK ili DNK sekvencom ili vektorom koji kodira antitelo ili fragment antitela.

[0014] U još jednom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, obezbeđeno je monoklonsko antitelo, pri čemu antitelo ili fragment antitela karakterišu CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. Antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju 100% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, ili varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. Fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. Antitelo može biti himerno antitelo, bispecifično antitelo ili intratelo. Antitelo može biti IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim glikozilirajućim obrascem. Antitelo ili fragment antitela može da se veže za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2.

[0015] Hibridoma ili inženjeringovana ćelija koja kodira antitelo ili fragment antitela pri čemu antitelo ili fragment antitela karakterišu klonski uparene CDR sekvence teškog i lakog lanca iz tabela 3 i 4, respektivno. Antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju 100% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, ili varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. Fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. Antitelo može biti himerno antitelo, bispecifično antitelo ili intratelo. Antitelo može biti IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. Antitelo ili fragment antitela može da se veže za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2.

[0016] U još jednom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, obezbeđena je formulacija vakcine koja se sastoji od jednog ili više antitela ili fragmenata antitela koje karakterišu CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. Najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela može biti kodirano varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1, varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. Najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, ili može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. Najmanje jedan od navedenih fragmenata antitela je rekombinantno scFv (varijabla jednolančanog fragmenta) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. Najmanje jedno od navedenih antitela može biti himerno antitelo, bispecifično antitelo ili intratelo. Antitelo može biti IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. Antitelo ili fragment antitela može da se veže za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2.

[0017] U daljem otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, obezbeđena je formulacija vakcine koja se sastoji od jednog ili više vektora ekspresije koji kodiraju prvo antitelo ili fragment antitela kako je ovde opisano. Vektor(i) ekspresije mogu biti Sindbis virus ili VEE vektor(i). Vakcina se može formulisati za isporuku ubrizgavanjem igle, ubrizgavanjem mlaza ili elektroporacijom. Formulacija vakcine može dalje da sadrži jedan ili više vektora ekspresije koji kodiraju drugo antitelo ili fragment antitela, kao što je različito antitelo ili fragment antitela iz patentnih zahteva 26-34.

[0018] U daljem otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, obezbeđena je metoda zaštite zdravlja subjekta starosti 60 godina ili više, imunokompromitovanog subjekta ili subjekta koji boluje od respiratornog i/ili kardiovaskularnog poremećaja koji je zaražen SARS-CoV-2 ili je pod rizikom od infekcije SARS-CoV-2, koji obuhvata isporuku pomenutom subjektu antitela ili fragmenta antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. Antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju 100% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, ili varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. Fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. Antitelo može biti IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. Antitelo može biti himerno antitelo ili bispecifično antitelo. Navedeno antitelo ili fragment antitela može se primeniti pre infekcije ili nakon infekcije. Antitelo ili fragment antitela može da se veže za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2. Isporuka može da obuhvata primenu antitela ili fragmenta antitela, ili genetsku isporuku sa RNK ili DNK sekvencom ili vektorom koji kodira antitelo ili fragment antitela. Antitelo ili fragment antitela može poboljšati disanje subjekta u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom i/ili može smanjiti virusno opterećenje u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom.

[0019] U još jednom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, obezbeđena je metoda određivanja antigenskog integriteta, ispravne konformacije i/ili ispravne sekvence proteina površinskog šiljka SARS-CoV-2 koji se sastoji od (a) kontaktiranja uzorka koji se sastoji od navedenog antigena sa prvim antitelom ili fragmentom antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno; i (b) određivanja antigenskog integriteta, ispravne konformacije i/ili ispravne sekvence navedenog antigena detektabilnim vezivanjem navedenog prvog antitela ili fragmenta antitela za navedeni antigen. Uzorak može da se sastoji od rekombinantno proizvedenog antigena ili formulacije vakcine ili proizvodne serije vakcine. Detekcija može uključivati ELISA, RIA, Western blot test, biosenzor koji koristi površinsku plazmonsku rezonancu ili interferometriju biosloja ili bojenje protočnom citometrijom. Prvo antitelo ili fragment antitela može biti kodiran varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identičnosti sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Prvo antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sekvenci uparenih sa klonovima iz tabele 2, ili može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sekvenci uparenih sa klonovima iz tabele 2. Prvi fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment.

Metoda može dalje obuhvatiti izvođenje koraka (a) i (b) po drugi put za određivanje antigenske stabilnosti antigena tokom vremena.

[0020] Metoda može dalje da obuhvata (c) kontaktiranje uzorka koji se sastoji od navedenog antigena sa drugim antitelima ili fragmentom antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno; i (d) određivanje antigenskog integriteta navedenog antigena detektabilnim vezivanjem navedenog drugog antitela ili fragmenta antitela za navedeni antigen. Drugo antitelo ili fragment antitela mogu biti kodirani varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identičnosti sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1, ili varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. Drugo antitelo ili fragment antitela može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca u skladu sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2, može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sekvenci uparenih sa klonovima iz tabele 2, ili može da sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sekvenci uparenih sa klonovima iz tabele 2. Drugi prvi fragment antitela može biti rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. Metoda može dalje obuhvatiti izvođenje koraka (c) i (d) po drugi put za određivanje antigenske stabilnosti antigena tokom vremena.

[0021] Takođe je otkriveno, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, humano monoklonsko antitelo ili fragment antitela, ili hibridoma ili inženjeringovana ćelija koja proizvodi isto, pri čemu se navedeno antitelo vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2 antigena.

[0022] U jednom aspektu (A1) otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska datog u ovom dokumentu, metoda detektovanja infekcije COVID-19 virusom SARS-CoV-2 kod subjekta obuhvata: (a) kontaktiranje uzorka navedenog subjekta sa antitelima ili fragmentom antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno; i (b) detektovanje virusa SARS-CoV-2 u navedenom uzorku vezivanjem navedenog antitela ili fragmenta antitela za antigen virusa SARS-CoV-2 u navedenom uzorku. U jednom aspektu (A2) od A1, navedeni uzorak je telesna tečnost. U jednom aspektu (A3) od A1 ili A2, navedeni uzorak je krv, sputum, suze, pljuvačka, sluz ili serum, sperma, cervikalni ili vaginalni sekret,

1

amnionska tečnost, placentna tkiva, urin, eksudat, transudat, strugotine tkiva ili stolica. U jednom aspektu (A4) bilo kog od A1-A3, detekcija se sastoji od ELISA, RIA, testa lateralnog toka ili Western blot testa. U jednom aspektu (A5) bilo kog od A1-A4, metoda dalje obuhvata izvođenje koraka (a) i (b) po drugi put i određivanje promene nivoa antigena SARS-CoV-2 u poređenju sa prvim testom. U jednom aspektu (A6) bilo kog od A1-A5, antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A7) bilo kog od A1-A5, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A8) bilo kog od A1-A5, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju 100% identičnosti sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A9) bilo kog od A1-A5, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A10) bilo kog od A1-A5, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A11) bilo kog od A1-A10, navedeno antitelo ili fragment antitela se vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2. U jednom aspektu (A12) bilo kog od 1, fragment antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment.

[0023] U jednom aspektu (A13) otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska datog u ovom dokumentu, metoda lečenja subjekta zaraženog SARS-CoV-2 ili smanjenja verovatnoće infekcije subjekta kod koga postoji rizik od dobijanja SARS-CoV-2, sastoji se od isporuke pomenutom subjektu antitela ili fragmenta antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. U jednom aspektu (A14) od A13, antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A15) od A13 ili A14, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A16) od A13, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A17) od A13, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A18) od A13, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A19) bilo kog od A13-A18, fragment antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A20) bilo kog od A13-A19, navedeno antitelo je IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. U jednom aspektu (A21) bilo kog od A13-A18, navedeno antitelo je himerno antitelo ili bispecifično antitelo. U jednom aspektu (A22) bilo kog od A13-A21, navedeno antitelo ili fragment antitela se vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2. U jednom aspektu (A23) bilo kog od A13-A22, navedeno antitelo ili fragment antitela se primenjuje pre infekcije ili nakon infekcije. U jednom aspektu (A24) bilo kog od A13-A23, navedeni subjekt je starosti 60 godina ili više, imunokompromitovan je ili pati od respiratornog i/ili kardiovaskularnog poremećaja. U jednom aspektu (A25) bilo kog od A13-A24, isporuka se sastoji od primene antitela ili fragmenta antitela, ili genetske isporuke sa RNK ili DNK sekvencom ili vektorom koji kodira antitelo ili fragment antitela.

[0024] U jednom aspektu (A26) otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska datog u ovom dokumentu, je monoklonsko antitelo, pri čemu antitelo ili fragment antitela karakterišu CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. U jednom aspektu (A27) od A26, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A28) od A26, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A29) od A26, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A30) od A26, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A31) bilo kog od A26-A30, fragment antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A32) bilo kog od A26-A30, navedeno antitelo je himerno antitelo ili bispecifično antitelo. U jednom aspektu (A33) bilo kog od A26-A32, navedeno antitelo je IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. U jednom aspektu (A34) bilo kog od A26-A33, navedeno antitelo ili fragment antitela se vezuje za antigen SARS-CoV-2 kao što je protein površinskog šiljka. U jednom aspektu (A35) bilo kog od A26-A34, navedeno antitelo je intratelo.

[0025] U jednom aspektu (A36) otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska datog u ovom dokumentu, hibridoma ili inženjeringovana ćelija kodira antitelo ili fragment antitela pri čemu antitelo ili fragment antitela karakterišu CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. U jednom aspektu (A37) od A36, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A38) od A36, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A39) od A36, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A40) od A36, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A41) od A36, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A42) od A36, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A43) bilo kog od A36-A42, fragment antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A44) bilo kog od A36-A43, navedeno antitelo je himerno antitelo, bispecifično antitelo ili intratelo. U jednom aspektu (A45) bilo kog od A36-A43, navedeno antitelo je IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni

1

(eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. U jednom aspektu (A46) bilo kog od A36-A45, navedeno antitelo ili fragment antitela se vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2.

[0026] U jednom aspektu (A47) otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska datog u ovom dokumentu, formulacija vakcine se sastoji od jednog ili više antitela ili fragmenata antitela koje karakterišu CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4. U jednom aspektu (A48) od A47, najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela kodirano je varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A49) od A47, najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela kodirano je varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A50) od A47, najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela kodirano je varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A51) od A47, najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela sadrži varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A52) od A47, najmanje jedno od navedenih antitela ili fragmenata antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A53) bilo kog od A47-A52, najmanje jedan od navedenih fragmenata antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A54) bilo kog od A47-A52, najmanje jedno od navedenih antitela je himerno antitelo, bispecifično antitelo ili intratelo. U jednom aspektu (A55) bilo kog od A47-A54, navedeno antitelo je IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. U jednom aspektu (A56) bilo kog od A47-A55, navedeno antitelo ili fragment antitela se vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2.

[0027] U jednom aspektu (A57) otkrića, ali ne i u okviru ovog predmetnog pronalaska, formulacija vakcine se sastoji od jednog ili više vektora ekspresije koji kodiraju prvo antitelo ili fragment antitela u skladu sa bilo kojim od A26-A34. U jednom aspektu (A58) od A57, navedeni vektor(i) ekspresije je/su Sindbis virus ili VEE vektor(i). U jednom aspektu (A59) od A57 ili A58, formulacija vakcine je formulisana za isporuku ubrizgavanjem igle, ubrizgavanjem mlaza ili elektroporacijom. U jednom aspektu (A60) od A57, formulacija vakcine dalje sadrži jedan ili više vektora ekspresije koji kodiraju drugo antitelo ili fragment antitela, kao što je različito antitelo ili fragment antitela bilo kog od A26-A34.

[0028] U jednom aspektu (A61) otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska datog u ovom dokumentu, metoda zaštite zdravlja subjekta starosti 60 godina ili više, imunokompromitovanog subjekta ili subjekta koji boluje od respiratornog i/ili kardiovaskularnog poremećaja koji je zaražen SARS-CoV-2 ili je pod rizikom od infekcije SARS-CoV-2 obuhvata isporuku pomenutom subjektu antitela ili fragmenta antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno. U jednom aspektu (A62) od A61, antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A63) od A61 ili A62, antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca uparenim sa klonovima koje imaju najmanje 95% identiteta kao što je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A64) od A61 ili A62, navedeno antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A65) od A61, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A66) od A61, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A67) od A61, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A68) bilo kog od A61-A67, fragment antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A69) bilo kog od A61-A68, navedeno antitelo je IgG, ili rekombinantno IgG antitelo ili fragment antitela koji se sastoji od Fc dela mutiranog da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije, da poveća poluvreme i/ili poveća terapeutsku

1

efikasnost, kao što su LALA, LALA PG, N297, GASD/ALIE, DHS, YTE ili LS mutacija ili glikan modifikovan da izmeni (eliminiše ili poboljša) FcR interakcije kao što su enzimsko ili hemijsko dodavanje ili uklanjanje glikana ili ekspresija u ćelijskoj liniji inženjeringovanoj sa definisanim obrascem glikozilacije. U jednom aspektu (A70) bilo kog od A61-A67, navedeno antitelo je himerno antitelo ili bispecifično antitelo. U jednom aspektu (A71) bilo kog od A61-A70, navedeno antitelo ili fragment antitela se primenjuje pre infekcije ili nakon infekcije. U jednom aspektu (A72) bilo kog od A61-A71, navedeno antitelo ili fragment antitela se vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2. U jednom aspektu (A73) bilo kog od A61-A72, isporuka se sastoji od primene antitela ili fragmenta antitela, ili genetske isporuke sa RNK ili DNK sekvencom ili vektorom koji kodira antitelo ili fragment antitela. U jednom aspektu (A74) od A61, antitelo ili fragment antitela poboljšava disanje subjekta u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom. U jednom aspektu (A75) od A61, antitelo ili fragment antitela smanjuje virusno opterećenje u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom.

[0029] U jednom aspektu (A76) otkrića, ali ne i u okviru ovog predmetnog pronalaska, metoda određivanja antigenskog integriteta, ispravne konformacije i/ili ispravne sekvence proteina šiljka površine SARS-CoV-2 obuhvata: (a) kontaktiranje uzorka koji se sastoji od navedenog antigena sa prvim antitelom ili fragmentom antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4, respektivno; i (b) određivanje antigenskog integriteta, ispravne konformacije i/ili ispravne sekvence navedenog antigena detektabilnim vezivanjem navedenog prvog antitela ili fragmenta antitela za navedeni antigen. U jednom aspektu (A77) od A76, navedeni uzorak se sastoji od rekombinantno proizvedenog antigena. U jednom aspektu (A78) od A76, navedeni uzorak obuhvata formulaciju vakcine ili proizvodnu seriju vakcine. U jednom aspektu (A79) od A76-A78, detekcija se sastoji od ELISA, RIA, Western blot testa, biosenzora koji koristi površinsku plazmonsku rezonancu ili interferometriju biosloja ili bojenje protočnom citometrijom. U jednom aspektu (A80) od A76-A79, prvo antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A81) od A76-A79, navedeno prvo antitelo ili fragment antitela kodirani su varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A82) bilo kog od A76-A79, navedeno prvo antitelo ili fragment antitela kodirani su varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A83) bilo kog od A76-A79, navedeno prvo antitelo ili

1

fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A84) bilo kog od A76-A79, navedeno prvo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A85) bilo kog od A76-A79, navedeno prvo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A86) bilo kog od A76-A85, fragment prvog antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A87) bilo kog od A76-A86, metoda se dalje sastoji od izvođenja koraka (a) i (b) po drugi put za određivanje antigenske stabilnosti antigena tokom vremena. U jednom aspektu (A88) bilo kog od A76-A87, metoda se dalje sastoji od (c) kontaktiranja uzorka koji se sastoji od navedenog antigena sa drugim antitelom ili fragmentom antitela koji ima CDR sekvence teškog i lakog lanca uparene sa klonovima iz tabela 3 i 4; i (d) određivanja antigenskog integriteta navedenog antigena detektabilnim vezivanjem navedenog drugog antitela ili fragmenta antitela za navedeni antigen. U jednom aspektu (A89) od A88, drugo antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama uparenim sa klonovima kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A90) od A89, navedeno drugo antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 1. U jednom aspektu (A91) od A89, navedeno drugo antitelo ili fragment antitela je kodiran varijabilnim sekvencama lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonom kako je navedeno u tabeli 1. U jednom aspektu (A92) od A89, navedeno drugo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prema sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A93) od A89, navedeno drugo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 70%, 80% ili 90% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A94) od A89, navedeno drugo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca koje imaju najmanje 95% identiteta sa sekvencama uparenim sa klonovima iz tabele 2. U jednom aspektu (A95) od A89, fragment drugog antitela je rekombinantno scFv (jednolančani fragment varijable) antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili Fv fragment. U jednom aspektu (A96) od A89, metoda dalje obuhvata izvođenje koraka (c) i (d) po drugi put za određivanje antigenske stabilnosti antigena tokom vremena.

1

[0030] U jednom aspektu (A97) otkrića, ali ne i u okviru ovog predmetnog pronalaska, nalazi se humano monoklonsko antitelo ili fragment antitela, ili hibridoma ili inženjeringovana ćelija koja proizvodi isto, pri čemu se navedeno antitelo vezuje za protein površinskog šiljka SARS-CoV-2

[0031] Upotreba člana „a“ ili „an“ (u verziji na engleskom jeziku, odnosno jednine u verziji na srpskom jeziku), kada se koristi u vezi sa terminom „sadrži“ u patentnim zahtevima i/ili opisu može značiti „jedan“, ali je takođe u skladu sa značenjem „jedan ili više“, „najmanje jedan“ i „jedan ili više od jednog“. Reč „oko“ znači plus ili minus 5% navedenog broja.

[0032] Smatra se da se bilo koja metoda ili kompozicija opisana u ovom dokumentu može primeniti u odnosu na bilo koju drugu metodu ili kompoziciju opisanu u ovom dokumentu. Ostali predmeti, karakteristike i prednosti ovog otkrića postaće očigledni iz sledećeg detaljnog opisa. Međutim, treba shvatiti da su detaljan opis i konkretni primeri, dok ukazuju na specifična otelotvorenja otkrića, dati samo kao ilustracija.

KRATAK OPIS SLIKA

[0033] Datoteka patenta ili prijave sadrži najmanje jednu sliku izrađenu u boji. Kopije ove publikacije patenta ili prijave patenta sa slikama u boji, Kancelarija će obezbediti na zahtev i nakon plaćanja neophodne naknade.

[0034] Sledeće slike čine deo ove specifikacije i uključene su kako bi se dodatno demonstrirali određeni aspekti ovog otkrića. Otkriće se može bolje razumeti upućivanjem na jednu ili više ovih slika u kombinaciji sa detaljnim opisom ovde predstavljenih specifičnih otelotvorenja.

SL. 1. Matrica doza-odgovor za procenu sinergijske neutralizacione aktivnosti koktelom COV2-2196 COV2-2130 korišćenjem živog virusa BSL3 SARS-CoV-2. Kvalitativno je postojala mala frakcija ne-neutralizovanog virusa pri najvišim ispitivanim koncentracijama (250 ng/ml) pojedinačnih mAt (polja sa 0 ng/ml COV2-2196 250 ng/ml COV2-2130 i 250 ng/ml COV2-2196 0 ng/ml COV2-2130) ali puna neutralizacija (100%) u opsegu nižih koncentracija Ab kombinacijom. Polje sa 15,6 ng/ml COV2-2196 63 ng/ml COV2-2130 ukazuje na područje sa maksimalnom sinergijom sa 15,6 ng/ml mAt COV2-2196 i 63 ng/ml mAt COV2-2130 u kombinaciji koja je neutralisala 96% virusa, dok je pojedinačni Abs

1

pokazao samo 6 ili 0% neutralizacije, respektivno (ovalni pri 0 ng/ml COV2-2196 63 ng/ml COV2-2130 i 15,6 ng/ml COV2-2196 0 ng/ml COV2-2130). Prikazane su prosečne vrednosti za tri tehničke replikacije.

SL. 2A-B. Matrica doza-odgovor za procenu sinergijske neutralizacione aktivnosti koktelom mAt COV2-2196 mAt COV2-2130 korišćenjem živog virusa BSL3 SARS-CoV-2. Prikazan je prosek vrednosti tri primerka za tehničke replikacije. Podaci su vizuelizovani i sinergija je procenjena korišćenjem softvera SynergyFinder.

SL. 3. Matrica doza-odgovor za procenu sinergijske neutralizacione aktivnosti koktelom mAt COV2-2196 mAt COV2-2130 korišćenjem živog virusa BSL3 SARS-CoV-2.

Interpretacija rezultata sinergije:_<-10: interakcija će verovatno biti antagonistička; od -10 do 10: interakcija će verovatno biti aditivna; >10: interakcija će verovatno biti sinergijska.

SL. 4A-C. Terapijska efikasnost neutralizacije humanih mAt u odnosu na utvrđene infekcije SARS-CoV-2. (SL. 4A) Miševi su inokulisani intranazalnim putem sa 10<5>PFU MA-SARS-CoV-2 i 12 sati kasnije su im dati indikovani tretmani antitela intraperitonealnom injekcijom. Virusno opterećenje u plućima izmereno je 2 dana nakon virusnog izazova pomoću testa plaka. Prikazana su merenja od pojedinačnih miševa i medijana titra, a svaka grupa je upoređena sa kontrolnom grupom izotipa pomoću Kruskal-Wallis ANOVA sa Dunn-ovim post-testom (* p < 0,05). Podaci predstavljaju jedan eksperiment. (SL.4B) Deset do jedanaest nedelja stari BALB/c miševi (jedan eksperiment od 3 do 9 miševa po grupi) tretirani su sa anti-Ifnar1 mAt i transdukovani sa AdV-hACE2 intranazalnim putem jedan dan kasnije. Nakon četiri dana, miševi su inokulisani intranazalnim putem sa 10<5>FFU autentičnog SARS-CoV-2 i 12 sati kasnije su im dati indikovani tretmani mAt intraperitonealnom injekcijom. Virusno opterećenje u plućima izmereno je pri 2 dpi nakon virusnog izazova pomoću testa plaka. Dve kontrolne grupe za učinak testa neutralizacije plaka uključivale su homogenate pluća od pojedinačnih miševa tretiranih izotipom koji su pomešani 1:1 (zapremina:zapremina) sa homogenatima pluća od pojedinačnih neinficiranih ili miševa tretiranih mAt COV2-2196 COV2-2130 koktelom. Prikazana su merenja od pojedinačnih miševa i medijana titra, a svaka grupa je upoređena sa kontrolom izotipa pomoću Kruskal-Wallis ANOVA sa Dunnovim posttestom (* p < 0,01). Podaci predstavljaju jedan eksperiment. (SL. 4C) Ekspresija gena za citokine i hemokine merena je qPCR analizom iz pluća sakupljenih kao na sl.4B. Prikazana

1

su merenja od pojedinačnih miševa i srednje vrednosti. Grupe su upoređene pomoću Mann-Whitney U testa (* p < 0,05; ** p < 0,01).

SL. 5. Farmakokinetika antitela nakon infuzije humanog mAt u makakije.

SL. 6. Virusna opterećenja SARS-CoV-2 (merena kao subgenomska novostvorena RNK) u bronhoalveolarnoj lavaži makakija nakon intranazalnog i intratrahealnog izazova virusom divljeg tipa SARS-CoV-2.

SL. 7. Virusna opterećenja SARS-CoV-2 (merena kao subgenomska novostvorena RNK) u uzorcima nazalnog brisa makakija nakon intranazalnog i intratrahealnog izazova virusom divljeg tipa SARS-CoV-2.

SL. 8A-E. Kristalna struktura S proteina RBD u kompleksu sa Fab COV2-2196. (SL.8A) Slikovni prikaz COV2-2196 u kompleksu sa RBD. Teški lanac COV2-2196 prikazan je cijanom bojom, laki lanac magenta bojom, a RBD zelenom bojom. Boje su vidljive na sl.8A američki patent 63/161.890. (SL.8B) Struktura COV2-2196-RBD kompleksa se nadovezuje na strukturu RBD-humanog ACE2 kompleksa (PDB ID: 6M0J), koristeći RBD strukturu kao referencu. Šema boja kompleksa COV2-2196-RBD je ista kao na sl.8A. RBD u RBD-ACE2 kompleksu je obojen svetlo plavom bojom, humani ACE2 peptidazni domen sivom bojom. Boje su vidljive na sl. 8B američki patent 63/161.890. (SL. 8C) Struktura COV2-2196-RBD kompleksa se nadovezuje na strukturu šiljka sa jednim RBD u konformaciji „gore“ (PDB ID: 6XM4), koristeći RBD u konformaciji „gore“ kao referencu. Šema boja kompleksa COV2-2196-RBD je ista kao na sl. 8A. Tri podjedinice šiljka su obojene sivom, žutom ili svetlo plavom bojom (podjedinica sa svojim RBD-om u konformaciji „gore“ je žuta). Boje su vidljive na sl. 8C američki patent 63/161.890. (SL.8D) Površinski prikaz RBD epitopa prepoznatog COV2-2196. Ostaci epitopa su obojeni različitim nijansama zelene i označeni crnom bojom. Boje su vidljive na sl.8D američki patent 63/161.890. (SL.8E) Interakcije antitela i antigena između COV2-2196 i RBD. RBD je prikazan u istoj površinskoj zastupljenosti i orijentaciji kao na sl.8D. Ostaci paratopa COV2-2196 prikazani su štapićima. Teški lanac je obojen cijan bojom, a laki lanac je obojen magenta bojom. Boje su vidljive na sl. 8E američki patent 63/161.890.

2

SL. 9A-F. Kristalna struktura S proteina RBD u kompleksu sa Fab COV2-2196 i COV2-2130. (SL.9A) Slikovni prikaz kristalne strukture S proteina RBD u kompleksu sa COV2-2196 i COV2-2130 Fab. RBD je prikazan zelenom bojom, teški lanac COV2-2196 cijan bojom, laki lanac COV2-2196 magenta bojom, teški lanac COV2-2130 žutom bojom, a laki lanac COV2-2130 narandžastom bojom. CDR od COV2-2130 su označeni. Boje su vidljive na sl. 9A američki patent 63/161.890. (SL. 9B) Struktura COV2-2130-RBD kompleksa se nadovezuje na strukturu RBD-humanog ACE2 kompleksa (PDB ID: 6M0J), koristeći RBD strukturu kao referencu. Šema boja kompleksa COV2-2130-RBD je ista kao na sl.9A. RBD u RBD-ACE2 kompleksu je obojen svetlo plavom bojom, humani ACE2 peptidazni domen sivom bojom. Boje su vidljive na sl. 9B američkog patenta 63/161.890 (SL.9C) Struktura COV2-2130-RBD kompleksa je postavljena na strukturu šiljka sa svim RBD u konformaciji „dole“ (PDB ID: 6ZOY), koristeći RBD u jednom protomeru kao referencu. Šema boja kompleksa COV2-2130-RBD je ista kao na sl.9A. Tri protomera šiljka su obojena sivom, svetlo plavom ili ljubičastom bojom. Boje su vidljive na sl.9C američki patent 63/161.890. (SL.9D) Struktura COV2-2196-2130-RBD kompleksa se nadovezuje na strukturu šiljka sa jednim RBD u konformaciji „gore“ (PDB ID: 7CAK), koristeći RBD u konformaciji „gore“ kao referencu. Šema boja kompleksa COV2-2130-RBD je ista kao na sl. 9A. Tri protomera šiljka su obojena sivom, svetlo plavom ili ljubičastom bojom. Boje su vidljive na sl. 9D američki patent 63/161.890. (SL. 9E) Površinski prikaz RBD epitopa prepoznatog COV2-2130. Ostaci epitopa naznačeni su različitim bojama i označeni crnom bojom. Boje su vidljive na sl. 9E američki patent 63/161.890. (SL.9F) Interakcije ostataka paratopa COV2-2130 sa epitopom. RBD je prikazan u istoj površinskoj zastupljenosti i orijentaciji kao na sl. 9E. Ostaci paratopa prikazani su štapićima. Teški lanac je obojen žutom bojom, a laki lanac narandžastom. Boje su vidljive na sl. 9F američki patent 63/161.890.

SL. 10A-B. (SL.10A) IMGT/DomainGapAlign rezultati teških i lakih lanaca COV2-2196. Ključni ostaci u interakciji i njihovi odgovarajući ostaci u genima zametnih linija prikazani su u poljima. SEQ ID NO za sekvence na sl.10A su sledeći:

(SL. 10B) Krive vezivanja tačkastih mutanata COV2-2196. cDNK koje kodiraju tačkaste mutante za teški lanac, u polju iznad, dizajnirane su, sintetizovane kao DNK za pravljenje rekombinantnih IgG proteina i testirane na aktivnost vezivanja za protein šiljka. Mutanti ostatka D108 su u gornjem levom grafikonu, povratna mutacija zaključenih somatskih mutacija na sekvencu zametne linije je u gornjem desnom grafikonu, P99 mutanti su u donjem levom grafikonu, a mutant koji uklanja disulfidnu vezu u HCDR3 je u donjem desnom grafikonu.

SL. 11A-H. Identifikacija kritičnih ostataka za COV2-2196 i COV2-2130 putem dubokog mutacionog skeniranja u kombinaciji sa selekcijom rezistentnih varijanti. (Sl. 11A) Grafikoni logotipa frakcija izbegavanja mutacija svih RBD mesta sa snažnim izbegavanjem za COV2-2196 (levo) ili COV2-2130 (desno). Viša slova ukazuju na veće izbegavanje vezivanja antitela. Mutacije su obojene na osnovu stepena do kojeg smanjuju vezivanje RBD za humani ACE2. Prikazani podaci su prosek dva nezavisna eksperimenta selekcije izbegavanja korišćenjem dve nezavisne biblioteke kvasca; korelacije su prikazane na sl. 18B-C. Interaktivne verzije ovih grafikona logotipa koje se mogu zumirati nalaze se na jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/. Istraživači su odredili frakcije

2

izbegavanja, kao što je opisano u metodama, koje predstavljaju procenjenu frakciju ćelija koje izražavaju tu specifičnu varijantu koja spada u interval izbegavanja antitela, tako da vrednost 0 znači da je varijanta uvek vezana antitelima, a vrednost 1 znači da uvek izbegava vezivanje antitela. (SL. 11B) Grafikoni logotipa frakcija izbegavanja mutacija za COV2-2196 i COV2-2130 koji su dostupni putem pojedinačnih nukleotidnih supstitucija iz referentnog soja Wuhan-Hu-1 koji se koristi u selekcijama izbegavanja (SL. 11E-F). Efekat svake supstitucije na vezivanje ACE2 prikazan je kao na sl. 11A. (SL. 11C) Levi panel: mapiranje dubokog mutacionog skeniranja izbegavanja mutacija za COV2-2196 na površinu RBD u strukturi RBD-COV2-2196. Mutacije koje ukidaju vezivanje COV2-2196 prikazuju se na RBD strukturi pomoću toplotne mape, gde plava predstavlja RBD mesto sa najvećim kumulativnim izbegavanjem antitela, a bela predstavlja nedetektovano izbegavanje. Siva označava ostatke kod kojih su štetni efekti na ekspresiju RBD sprečili procenu efekta mutacije na vezivanje antitela. Desni panel: uvećanje levog panela koji prikazuje interakcione ostatke oko mesta najsnažnijih izbegavanja RBD. Teški lanac COV2-2196 je cijan boje, a laki lanac magenta boje. Dva ponavljanja su izvršena sa nezavisnim bibliotekama, kao što je opisano na sl.11A. Boje su vidljive na sl.11C američkog patenta 63/161.890 (SL. 11D) Desni panel: mapiranje dubokog mutacionog skeniranja izbegavanja mutacija za COV2-2130 na površinu RBD u strukturi RBD-COV2-2130. Mutacije koje ukidaju vezivanje COV2-2130 prikazuju se na RBD strukturi pomoću toplotne mape kao na sl.11C. Levi panel: uvećanje levog panela koji prikazuje interakcione ostatke oko mesta najsnažnijih izbegavanja RBD. Teški lanac COV2-2130 je žute boje, a laki lanac losos boje. Boje su vidljive na sl. 11D američki patent 63/161.890. (SL. 11E) Tabela koja prikazuje rezultate eksperimenata selekcije izbegavanja VSV-SARS-CoV-2 sa COV2-2196, COV2-2130 i njihovom kombinacijom. Zabeležen je broj selektovanih izbegavanja mutacija i ukupan broj izvršenih ponavljanja selekcija izbegavanja, kao i ostaci identifikovani sekvenciranjem izbegavanja mutantnih virusa. (SL. 11F) Tabela koja prikazuje rezultate pasaža SARS-CoV-2 u prisustvu sub-neutralizujućih koncentracija AZD8895 (na osnovu COV2-2196), AZD1061 (na osnovu COV2-2130) i AZD7442 (AZD8895 AZD1061). Označavaju se virusne mutacije povezane sa rezistencijom identifikovane sekvenciranjem plakova otpornih na neutralizaciju. (SL. 11G) Grafikon rasipanja koji prikazuje DMS podatke sa sl.11A, sa frakcijom zbegavanja mutacije na x-osi i efektom na vezivanje ACE2 na y-osi. Iksevi označavaju mutacije dostupne samo supstitucijama sa više nukleotida, dok krugovi označavaju mutacije dostupne supstitucijom sa jednim nukleotidom. Označavaju se supstitucije aminokiselina izabrane pomoću COV2-2130 u VSV-SARS-CoV-2 (K444R, K444E) ili autentičnog SARS-CoV-2 (R346I). (SL. 11H) Neutralizacija antitela merena sa FRNT prema referentnim sojevima i zabrinjavajućim varijantama SARS-CoV-2. Neutralizacioni testovi su izvršeni u duplikatu i ponovljeni dva puta, sa rezultatima prikazanim iz jednog eksperimentalnog ponavljanja. Linije grešaka označavaju opseg za svaku tačku. Označavaju se mutacije u poređenju sa referentnim sojem WA-1. B.1.

1.7-OXF sadrži deleciju 69-70 i 144-145 i sledeće supstitucije: N501Y, A570D, D614G, P681H i T716I.

SL. 12. Sloj podstrukture RBD-COV2-2196 u kompleksu RBD-COV2-2196-2130 i kristalnoj strukturi RBD-COV2-2196.

SL. 13A-F. Slični obrasci aromatičnog slaganja i hidrofobne interakcije na RBD mestu F486 podeljeni između kompleksa RBD-COV2-2196 i šiljka-S2E12. (SL. 13A i B) Isti obrazac vezivanja vodonika koji okružuje ostatak F486 u strukturama dva kompleksa. (SL.

13C) Detaljne interakcije između COV2-2196 i RBD. COV2-2196 teški lanac je obojen cijanom bojom, laki lanac je obojen magenta bojom, a RBD je obojen zelenom bojom. Važni interakcioni ostaci prikazani su štapićima. Molekuli vode uključeni u interakciju Ab-Ag predstavljeni su kao ružičaste sfere. Direktne vodonične veze su prikazane kao narandžaste isprekidane linije, a vodonične veze posredovane vodom kao žute isprekidane linije. Boje su vidljive u proširenim podacima sl. 2C američkog patenta 63/161.890. (SL. 13D) Superimpozicija krio-EM strukture S2E12/RBD na kristalnu strukturu COV2-2196/RBD, sa varijabilnim domenima antitela kao referencama. Teški lanac COV2-2196 je u cijan boji, a njegov laki lanac u magenta boji; teški lanac S2E12 je u bledo cijan boji, a njegov laki lanac u svetlo ružičastoj boji. Dve odgovarajuće RBD strukture su obojene zelenom ili žutom bojom. Boje su vidljive u proširenim podacima Sl. 2D američkog patenta 63/161.890. (SL. 13E) Detaljne interakcije između teškog lanca COV2-2130 i RBD. Ostaci paratopa prikazani su štapićima i obojeni žutom bojom, ostaci epitopa zelenim štapićima. Vodonične veze ili jake polarne interakcije predstavljene su kao isprekidane linije magenta boje. Boje su vidljive u proširenim podacima Sl. 2E američkog patenta 63/161.890. (SL. 13F) Detaljne interakcije između lakog lanca COV2-2130 i RBD. Ostaci paratopa prikazani su štapićima i obojeni narandžastom bojom, ostaci epitopa zelenim štapićima. Vodonične veze su predstavljene isprekidanim linijama magenta boje. Boje su vidljive u proširenim podacima Sl.2F američkog patenta 63/161.890.

2

SL. 14A-E. Uobičajeni klonotip anti-RBD antitela sa istim mehanizmom vezivanja. (SL.

14A) COV2-2196/RBD kristalna struktura. (SL. 14B) S2E12/RBD krio-EM struktura. (SL.

14C) Model homologije COV2-2381/RBD. COV2-2072 kodira sekvencu glikozilacije vezanu za N u HCDR3, na koju ukazuju sive sfere. Boje su vidljive u proširenim podacima Sl. 3D američkog patenta 63/161.890. (SL.14D) Model homologije COV2-2072/RBD. (SL.14E) Sloj kristalne strukture COV2-2196/RBD (SL.14A) i krio-EM strukture S2E12/RBD (SL.14B).

SL. 15A-B. Identifikacija pretpostavljenih članova javnog klonotipa genetski sličnih COV2-2196 u repertoaru varijabilnih gena antitela pojedinaca koji prethodno nisu bili zaraženi virusom. Sekvence varijabilnih gena antitela zdravih osoba sa istim karakteristikama sekvence kao i teški lanac COV2-2196 (SL.15A) i laki lanac (SL. 15A i 15B) su poravnate. Sekvence od tri različita davaoca, kao i krv iz pupčane vrpce, uključivale su sekvence sa karakteristikama javnog klonotipa. Karakteristike sekvence i kontaktni ostaci koji se koriste u COV2-2196 označeni su poljima ispod svakog poravnanja višestrukih sekvenci (polja su obojena crvenom bojom u proširenim podacima sl. 4A američki patent 63/161.890). SEQ ID NO za sekvence teškog lanca na sl. 15A su sledeći: HIP1: SEQ ID NO. 166, HIP2: SEQ ID NO. 167, HIP3: SEQ ID NO.168 i CORD: SEQ ID NO.169. SEQ ID NO za sekvence lakog lanca na sl. 15A su sledeći: HIP1: SEQ ID NO.170, HIP2: SEQ ID NO.171 i HIP3: SEQ ID NO. 172. SEQ ID NO za sekvence lakog lanca HIP1 na sl.15B su sledeći: SEQ ID NO.173, SEQ ID NO. 174, SEQ ID NO. 175, SEQ ID NO. 176 i SEQ ID NO. 177 (od vrha do dna). SEQ ID NO za sekvence lakog lanca HIP2 na sl. 15B su sledeći: SEQ ID NO.178, SEQ ID NO. 179, SEQ ID NO.180, SEQ ID NO.181 i SEQ ID NO.182 (od vrha do dna). SEQ ID NO za sekvence lakog lanca HIP3 na sl.15B su sledeći: SEQ ID NO.183, SEQ ID NO.184, SEQ ID NO.185, SEQ ID NO.186 i SEQ ID NO.187 (od vrha do dna).

SL. 16A-D. (SL.16A) Detaljna struktura petlje COV2-2130 HCDR3. Vodonične veze kratkog dometa, stabilizujući konformaciju petlje, prikazane su kao isprekidane linije (isprekidane linije su obojene magenta bojom na sl.5A proširenih podataka američkog patenta 63/161.890). (SL. 16B) Ostaci lakog lanca COV2-2130 formiraju aromatične interakcije slaganja i vodonične veze sa HCDR3 za dalju stabilizaciju petlje HCDR3. (SL. 16C) Dugi LCDR1, HCDR2 i HCDR3 formiraju komplementarnu površinu vezivanja za RBD epitop. RBD je prikazan kao površinski prikaz u sivoj boji. Teški lanac COV2-2130 obojen je žutom bojom sa HCDR3 u narandžastoj boji, a laki lanac u losos boji sa LCDR1 u magenta boji. Boje su vidljive

2

u proširenim podacima sl.3D američkog patenta 63/161.890. (SL.16D) Prikaz rotacije za 180° na sl.16C.

SL. 17. Interfejs između COV2-2196 i COV2-2130 u kristalnoj strukturi RBD u kompleksu sa COV2-2196 i COV2-2130. COV2-2196 teški ili laki lanac prikazani su kao slikovni prikaz u cijan ili magenta boji, odnosno COV2-2130 teški ili laki lanac u žutoj ili losos boji, respektivno. RBD je obojen zelenom bojom. Boje su vidljive u proširenim podacima sl.

6 američkog patenta 63/161.890. Ostaci interfejsa prikazani su štapićima.

SL. 18A-I. Identifikacija dubokim mutacionim skeniranjem mutacija koje utiču na vezivanje antitela i metoda selekcije mutanata rezistentnih na antitela sa virusom VSV-SARS-CoV-2. (SL. 18A) Vrh: Grafikoni protočne citometrije koji prikazuju reprezentativnu strategiju za slekciju pojedinačnih ćelija kvasca korišćenjem raspršivača napred i sa strane (prva tri panela) i selekcija ćelija kvasca koje izražavaju RBD (desni panel). Svaki grafikon je izveden iz prethodne ograde. Dno: Grafikoni protočne citometrije koji pokazuju ograđivanje za RBD<+>, antitela<->ćelije kvasca (tj., ćelije koje izražavaju RBD, ali gde mutacija sprečava vezivanje antitela). Selekcioni eksperimenti su prikazani za COV2-2196 ili COV2-2130, sa dve nezavisne biblioteke prikazane za svaki. (SL. 18B) Korelacija posmatranih mesta izbegavanja vezivanja antitela između eksperimenata selekcije biblioteke kvasca korišćenjem COV2-2196, COV2-2130 ili smeše COV2-2196 i COV2-2130 u razmeri 1:1. X-ose prikazuju kumulativnu frakciju izbegavanja za svako mesto za biblioteku 1, a y-ose prikazuju kumulativnu frakciju izbegavanja za svako mesto za biblioteku 2. Koeficijent korelacije i n se označavaju za svaki grafikon. (SL. 18C) Korelacija posmatranih mutacija koje izbegavaju vezivanje antitela između eksperimenata selekcije biblioteke kvasca korišćenjem COV2-2196, COV2-2130 ili smeše COV2-2196 i COV2-2130 u razmeri 1:1. X-ose prikazuju frakciju izbegavanja svake aminokiselinske mutacije za biblioteku 1, a y-ose prikazuju frakciju izbegavanja svake aminokiselinske mutacije za biblioteku 2. Koeficijent korelacije i n se označavaju za svaki grafikon. (SL.18D-F) DMS rezultati za COV2-2196 (SL.18D), COV2-2130 (SL. 18E), ili 1:1 smešu COV2-2196 i COV2 2130 (SL. 18F). Levi paneli: mesta izbegavanja preko celog RBD označena su pikovima koji odgovaraju grafikonima logotipa u srednjem i desnom panelu. Srednji panel: kao na sl 11A, grafikon logotipa kumulativnih frakcija izbegavanja mutacija svih RBD mesta sa snažnim izbegavanjima mutacija za COV2-2196, ili COV2-2130, ili COV2-2196+COV2-2130. Mutacije su obojene na osnovu stepena do kojeg poništavaju vezivanje RBD za humani ACE2. Desni panel: opet, grafikoni logotipa

2

pokazuju kumulativne frakcije izbegavanja, ali u boji na osnovu stepena u kojem mutacije utiču na ekspresiju RBD u sistemu za prikaz kvasca. Interaktivne verzije ovih grafikona logotipa koje se mogu zumirati nalaze se na jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZAbs/. Boje su vidljive u proširenim podacima sl. 7F američkog patenta 63/161.890 (SL. 18G) Reprezentativni RTCA senzogrami koji pokazuju virus koji je izbegao neutralizaciju antitela. Citopatski efekat (CPE) je kinetički praćen u Vero E6 ćelijama inokulisanim virusom u prisustvu zasićene koncentracije (5 µg/ml) antitela COV2-2130. Prikazani su reprezentativni slučajevi izbegavanja (magenta boja) ili nedostatak detektabilnog izegavanja (plava boja). Neinficirane ćelije (zelena boja) ili ćelije inokulisane virusom bez antitela (crvena boja) služe kao kontrolne grupe. Krive magenta i plave boje predstavljaju jednu reprezentativni bunar; crvene i zelene kontrolne grupe su srednja vrednost tehničkih duplikata. Boje su vidljive u proširenim podacima sl.7G američkog patenta 63/161.890. (SL.18H) Reprezentativni RTCA senzogrami koji potvrđuju da je varijantni virus izabran od strane COV2-2130 na sl.18G zaista izbegao COV2-2130 (magenta boja), ali je neutralizovan od strane COV2-2196 (svetlo plava boja). Boje su vidljive u proširenim podacima sl.7H američkog patenta 63/161.890. (SL.18I) Primer senzograma iz pojedinačnih bunara analize E-ploče sa 96 bunara za eksperimente slekcije izbegavanja sa COV2-2196, COV2-2130 ili smešom COV2-2196 i COV2-2130 u razmeri 1:1. Zabeleženi su slučajevi izbegavanja od COV2-2130, dok izbegavanje nije detektovano u prisustvu COV2-2196 ili COV2-2196 COV2-2130. Pozitivne i negativne kontrolne grupe su označene na prvoj ploči.

SL. 19. Metoda selekcije mutanata rezistentnih na antitela sa autentičnim virusom SARS-CoV-2.

SL. 20(A-I). Funkcionalne karakteristike neutralizacije SARS-CoV-2 mAt. (SL. 20A) Toplotna mapa aktivnosti neutralizacije mAt, aktivnosti blokiranja hACE2 i vezivanja za trimerni S2Pecto protein ili monomerni SRBD. mAt se uređuju po jačini neutralizacije (najviša na vrhu, najniža na dnu). Isprekidane linije označavaju 13 antitela sa vrednošću IC50 neutralizacije manjom od 150 ng/ml za virus divljeg tipa. Vrednosti IC50 se vizuelizuju za virusnu neutralizaciju i blokiranje hACE2, dok se vrednosti EC50 vizuelizuju za vezivanje. Rekombinantni oblik unakrsno reaktivnog SARS-CoV SRBD mAt CR3022 prikazano je kao pozitivna kontrolna grupa, dok je mAt 2D22 protiv denga virusa prikazano kao negativna kontrolna grupa. Podaci su reprezentativni za najmanje 2 nezavisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden u tehničkom duplikatu. Nema inhibicije koja ukazuje na vrednost IC50

2

od >10.000 ng/ml, pri čemu nema vezivanja koje ukazuje na vrednost EC50 od >10.000 ng/ml. (SL. 20B-E) Korelacija blokiranja hACE2, vezivanja S2Pecto trimera ili SRBD vezivanja mAt sa njihovom neutralizacionom aktivnošću. R2 vrednosti su prikazane za analizu linearne regresije log transformisanih vrednosti. Tamni krugovi (prikazani ljubičastom bojom na sl.1B-E primera 5 američkog patenta 63/161.890) ukazuju na mAt sa vrednošću IC50 neutralizacije nižom od 150 ng/ml. (SL.20E) Korelacija blokiranja hACE2 i vezivanja S2Pecto trimera. R2 vrednosti su prikazane za analizu linearne regresije log transformisanih vrednosti. (SL. 20F) Neutralizacione krive za COV2-2196 i COV2-2130 u testu neutralizacije u odnosu na autentični virus SARS-CoV-2. Izračunate vrednosti IC50 označene su na grafikonu. Linije grešaka označavaju standardnu devijaciju svake tačke. Podaci su reprezentativni za najmanje 2 nezavisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden u tehničkom duplikatu. (SL.20G) Krive neutralizacije za COV2-2196 i COV2-2130 u testu neutralizacije pseudovirusa. Linije grešaka označavaju standardnu devijaciju svake tačke. Prikazane vrednosti su tehnički duplikati jednog eksperimenta. Izračunate vrednosti IC50 iz najmanje 6 eksperimenata označene su na grafikonu. (SL. 20H) krive blokiranja hACE2 za COV2-2196, COV2-2130 i ne-blokirajuće SARS-CoV mAt rCR3022 u ELISA testu blokiranja hACE2. Izračunate vrednosti IC50 označene su na grafikonu. Linije grešaka označavaju standardnu devijaciju svake tačke. Prikazane vrednosti su tehnički triplikati iz reprezentativnog eksperimenta koji se ponavlja dva puta. (SL.20I) ELISA test vezivanja COV2-2196, COV2-2130 i rCR3022 za trimerni S2Pecto. Izračunate vrednosti EC50 označene su na grafikonu. Linije grešaka označavaju standardnu devijaciju svake tačke. Prikazane vrednosti su tehnički triplikati iz reprezentativnog eksperimenta koji se ponavlja dva puta.

SL. 21 (A-D). Mapiranje epitopa mAt analizom kompetitivnog vezivanja i sinergijskom neutralizacijom pomoću para mAt. (SL. 21A) Levo: bioslojni test kompetitivnog vezivanja zasnovan na interferometriji koji meri sposobnost mAt da spreče vezivanje referentnih mAt COV2-2196 i rCR3022 za RBD fuzionisan sa mišjim Fc (RBD-mFc) učitanim na biosenzore protiv mišjeg Fc. Vrednosti u kvadratima su % vezivanja referentnog mAt u prisustvu kompetitivnog mAt u odnosu na model kompetitivne kontrolne grupe. Crni kvadrati označavaju potpunu kompetitivnost (<33% vezivanja u odnosu na nekompetitivnu kontrolnu grupu), dok beli kvadrati označavaju da nema kompetitivnosti (>67% vezivanja u odnosu na nekompetitivnu kontrolnu grupu). Desno: bioslojni test kmpetitivnog vezivanja zasnovan na interferometriji kojim se meri sposobnost mAt da spreče vezivanje hACE2. Vrednosti označavaju % vezivanja hACE2, normalizovane na vezivanje hACE2 u odsustvu

2

kompetitivnosti. Senčenje označava kompetitivnost mAt sa hACE2. (Senčenje je prikazano crvenom bojom na sl. 2A primera 5 američkog patenta 63/161.890) (SL.21B) Kmpetitivnost neutralizacionog mAt panela sa referentnim mAt COV2-2130, COV2-2196 ili rCR3022. Referentni mAt su biotinilisani i mereno je vezivanje referentnih mAt za trimerni S2Pecto u prisustvu zasićenih količina svakog mAt u kompetitivnoj ELISA metodi. ELISA signal za svaki referentni mAt je normalizovan na signal u prisustvu nevezujućeg mAt 2D22 protiv denga virusa. Crna boja označava potpunu kompetitvnost (<25% vezivanje referentnog mAt), siva označava delimičnu kompetitivnost (25-60% vezivanje referentnog mAt), a bela označava da nema kompetitivnosti (>60% vezivanje referentnog mAt). (SL. 21C) Sinergijska neutralizacija divljeg tipa SARS-CoV-2 pomoću COV2-2196 i COV2-2130. Vrh: neutralizaciona matrica sa serijskim razblaživanjem svakog mAt. Eksperiment je izveden u tehničkom triplikatu. Prikazan je reprezentativan eksperiment o tome koliko je izvršeno u tehničkom triplikatu. % neutralizacije za svaku kombinaciju mAt prikazano je u svakom kvadratu. Belo-crna toplotna mapa označava 0% neutralizacije do 100% neutralizacije, respektivno. (Toplotna mapa prikazana belom do crvenom bojom na sl.2C primera 5 amričkog patenta 63/161.890) (SL. 21D) Matrica sinergije izračunata na osnovu neutralizacije SARS-CoV-2 na sl. 21C. Tamnija boja (prikazana crvenom bojom na sl. 2D primera 5 američkog patenta 63/161.890) označava područja u kojima je uočena sinergijska neutralizacija, a crno polje označava područje maksimalne sinergije između dva mAt.

SL. 22 (A-F). Identifikacija epitopa i strukturna karakterizacija mAt. (SL. 22A) Identifikacija kritičnih kontaktnih ostataka mutagenezom alanina i arginina. Vrh: vezivanje COV2-2130 (zlatna boja), COV2-2165 (kestenjasta boja) ili COV2-2196 (tamno ljubičasta boja) za konstrukte divljeg tipa (dt) ili mutantne SRBD konstrukte mereno interferometrijom biosloja. Na y osi prikazan je odgovor normalizovan na signal koji je primećen za vezivanje za SRBD divljeg tipa. Dno: reprezentativne krive vezivanja COV2-2196 za divlji tip ili SRBD konstrukte sa mutiranim kritičnim kontaktnim ostacima. Boje su vidljive na sl. 3A primera 5 američkog patenta 63/161.890. (SL. 22B) Kristalna struktura SARS-CoV-2 (plava boja) i hACE2 (zelena boja) (PDB (6M0J). Motiv prepoznavanja hACE2 je narandžaste boje. Kritični kontaktni ostaci za COV2-2130 prikazani su kao zlatne sfere, dok su kritični kontaktni ostaci za COV2-2196 prikazani kao ljubičaste sfere. Boje su vidljive na sl. 3B primera 5 američkog patenta 63/161.890. (SL. 22C) ELISA vezivanje mAt za motiv prepoznavanja hACE2 od 60 aminokiselina. r2D22, mAt protiv denga virusa, prikazan je kao negativna kontrolna grupa. Dno: struktura motiva prepoznavanja hACE2 narandžaste boje sa COV22196 kritičnim kontaktnim ostacima prikazanim ljubičastom bojom. Boje su vidljive na sl.3C primera 5 američkog patenta 63/161.890. (SL. 22D) Kompleksi trimera jednostrukog Fab:S2Pecto vizuelizovani elektronskom mikroskopijom sa negativnim bojenjem za COV2-2130 (zlatna boja), COV2-2165 (kestenjasta boja) ili COV2-2196 (tamno ljubičasta boja). RBD je prikazan plavom bojom, a S N-terminalni domen (NTD) crvenom bojom. Gustina elektrona je prikazana sivom bojom. Stanje trimera (otvoreno ili zatvoreno) označava se za svaki kompleks. Reprezentativni proseci 2D klase za svaki kompleks prikazani su na dnu (veličina polja 128 piksela). Boje su vidljive na sl.3D primera 5 američkog patenta 63/161.890. (SL. 22E) COV2-2130 i COV2-2196 Fab u kompleksu sa S2Pecto trimerom. Istovremeno vezivanje COV2-2130 (zlatna boja) i COV2-2196 (ljubičasta boja) Fab za S2Pecto trimer. Gustina elektrona je prikazana sivom bojom. Stanje trimera (otvoreno ili zatvoreno) je označeno. Reprezentativni proseci 2D klase za komplekse prikazani su na dnu (veličina polja 128 piksela). Sve slike su napravljene pomoću programa Chimera. Boje su vidljive na sl.3E primera 5 američkog patenta 63/161.890, (SL.22F) Analiza kompetitivnog vezivanja vizuelno prikazana na S2Pecto trimeru. Kristalna struktura CR3022 je usidrena u strukturu dvostrukog Fab:S2Pecto trimera. CR3022 je prikazan cijan bojom. Boje su vidljive na sl. 3F primera 5 američkog patenta 63/161.890. Dno: kvantitativni Venn dijagram beleži broj mAt u svakoj kompetitivnoj grupi i preklapanje između grupa.

SL. 23 (A-F). Zaštitna efikasnost neutralizacije humanih mAt u odnosu na infekciju SARS-CoV-2. (SL. 23A) SARS-CoV-2 model izazova. Deset do jedanaest nedelja stari BALB/c miševi (dva eksperimenta od 4-5 miševa po grupi) tretirani su anti-Ifnar1 mAt i transdukovani sa AdV-hACE2 putem i.n. rute jedan dan kasnije. Nakon četiri dana, miševi su tretirani putem i.p. rute sa 200 µg mAt CoV2-2196, -2130, ili kombinacijom (odnos 1:1) ili kontrolnim izotopom mAt. Dan kasnije, SARS-CoV-2 je inokulisan putem i.n. rute. Tkiva su sakupljena pri 7 dpi za analizu (SL.23C i 23D). (SL.23B) Promena telesne težine miševa u panelu a. (dvosmerna obična ANOVA sa Tukey-evim post-testom: * *** P < 0,0001). (SL.

2C) Virusno opterećenje u plućima, slezini i srcu mereno je pomoću RT-qPCR: Kruskal-Wallis ANOVA sa Dunn-ovim post-testom (*, P < 0,05, ** P < 0,01, * ** P < 0,001, * *** P < 0,0001). Isprekidana linija označava granicu detekcije testa. (SL.23D) Ekspresija gena za citokine i hemokine merena je qPCR analizom. Kruskal-Wallis ANOVA sa Dunn-ovim posttestom (*, P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001). (SL.23E) MA-SARS-CoV-2 model izazova. Dvanaestonedeljni BALB/c miševi (n=10) su inokulisani sa 105 PFU MA-SARS-CoV-2 putem i.n. rute. Prikazana je promena telesne težine miševa. (SL.23F) Virusno opterećenje u plućima

1

je izmereno pri 2 dpi pomoću RT-qPCR (levo) ili testa plaka (desno) sa (Slika 23E): Kruskal-Wallis ANOVA sa Dunn-ovim post-testom (* ** P < 0,001, * *** P < 0,0001).

SL. 24. Neutralizacione krive SARS-CoV-2 za mAt panel. Neutralizacija autentičnog SARS-CoV-2 putem humanih mAt. Prikazana je srednja vrednost ± SD tehničkih duplikata. Podaci predstavljaju jedan od dva ili više nezavisnih eksperimenata.

SL. 25A-B. Krive inhibicije za mAt inhibiciju vezivanja S2Pecto za hACE2. Blokiranje vezivanja hACE2 za S2Pecto anti-SARS-CoV-2 neutralizacijom humanih mAt. Prikazana je srednja vrednost ± SD triplikata jednog eksperimenta. Antitela CR3022 i 2D22 služila su kao kontrolne grupe.

SL. 26A-B. ELISA vezivanje anti-SARS-CoV-2 neutrališućih humanih mAt za trimerni SRBD, S2Pecto ili SARS-CoV S2Pecto antigen. Prikazana je srednja vrednost ± SD triplikata i reprezentativne grupe za dva eksperimenta. Antitela CR3022 i 2D22 služila su kao kontrolne grupe.

SL. 27A-B. Mapiranje mAt kritičnih kontaktnih ostataka mutagenezom alanina i arginina i interferometrijom biosloja. (SL. 27A) Levo: Vrednosti odgovora za vezivanje mAt za divlji tip ili mutantne SRBD konstrukte normalizovane na divlji tip. Zvezdice označavaju ostatke gde je uočena povećana disocijacija mAt, što verovatno ukazuje na to da je ostatak proksimalan sa epitopom mAt. Desno: krive punog odgovora za mAt asocijaciju i disocijaciju sa divljim tipom ili mutantnim SRBD konstruktima. (SL. 27B) Struktura RBD koja naglašava kritične kontaktne ostatke za nekoliko mAt i njihovo mesto na strukturi.

OPIS ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA

[0035] Kao što je gore pomenuto, SARS-CoV-2 je glavni zdravstveni problem sa aktivnim slučajevima koji se svakodnevno povećavaju. Stoga je razumevanje biologije ovog virusa i prirode i obima humanog imunološkog odgovora na virus od najveće važnosti. Istraživači su identifikovali sekvence humanih antitela na SARS-CoV-2. Te sekvence i upotrebe za takva antitela su ovde otkrivene.

2

[0036] Štaviše, detaljnim proučavanjem interakcije jednog antitela (COV2-2196) sa RBD, istraživači identifikuju molekularnu osnovu za selekciju javnog klonotipa za SARS-CoV-2 koji je vođen složenom strukturnom konfiguracijom koja uključuje i teške i lake lance. Zajedničke strukturne karakteristike ovog klonotipa doprinose stvaranju paratopa koji se sastoji od ostataka i u teškom i u lakom lancu, ali su izuzetno nezavisni od HCDR3 koji obično dominira u interakcijama antigen-antitelo. Istraživači pokazuju da je ovaj javni klonotip jedan od češće zajedničkih tipova potentnih neutrališućih antitela koje ljudi proizvode na protein SARS-CoV-2 S RBD. Detaljne strukturne studije otkrile su da često formirani paratop antitela doprinosi „aromatičnom kavezu“ formiranom od pet aromatičnih ostataka u paratopu koji okružuju interfejs teških i lakih lanaca. Ova struktura kaveza koordinira aromatični ostatak na proteinu SARS-CoV-2 S, uzimajući u obzir visoku specifičnost i afinitet ovih antitela. Izuzetno, iako su i teški i laki lanci potrebni za formiranje ovog javnog klonotipa (čime se definišu kanonski geni IGHV, IGHJ, IGLV i IGLJ u klonotipu), HCDR3 minimalno utiče na interakciju. Pošto su ove rekombinacije teškog lanca IGHV1-58-IGHJ3 i lakog lanca IGKV3-20-IGKJ1 uobičajene u predimunskom repertoaru B ćelija, mnogi pojedinci verovatno proizvode takve klonove tokom odgovora na SARS-CoV-2 infekciju ili vakcinaciju. Antigeno mesto prepoznato po složenoj unapred konfigurisanoj strukturi ovog javnog klonotipa verovatno je važna komponenta zaštitne vakcine za COVID-19 zbog učestalosti klona B ćelija u humanoj populaciji i neutrališuće i zaštitne potencije antitela kodiranih varijabilnim segmentima gena.

[0037] Ovi i drugi aspekti otkrića su detaljno opisani u nastavku.

I. Koronavirus 2019 (SARS-CoV-2)

[0038] SARS-CoV-2 je zarazni virus koji uzrokuje akutnu respiratornu bolest označenu kao koronavirusna bolest 2019 (COVID-19), respiratorna infekcija. To je uzrok aktuelne epidemije korona virusa 2019-20, globalne zdravstvene vanredne situacije. Genomsko sekvenciranje pokazalo je da se radi o pozitivnom, jednolančanom RNK koronavirusu.

[0039] Tokom epidemije koja je u toku, virus se u zajedničkom govoru često naziva „korona virus“, „novi korona virus“ i „korona virus iz Vuhana“, dok SZO preporučuje oznaku „SARS-CoV-2“. Međunarodni komitet za taksonomiju virusa (ICTV) saopštio je da je zvanični naziv virusa SARS-CoV-2.

[0040] Mnogi rani slučajevi bili su povezani sa velikom pijacom morskih plodova i životinja u kineskom gradu Vuhanu, a smatra se da virus ima zoonotsko poreklo. Poređenja genetskih sekvenci ovog virusa i drugih uzoraka virusa pokazala su sličnosti sa SARS-CoV (79,5%) i koronavirusima koji potiču od slepih miševa (96%). Ovaj nalaz čini krajnje poreklo od slepih miševa verovatnim, iako se prelazni domaćin, kao što je pangolin, ne može isključiti. Virus može biti rekombinantni virus formiran od dva ili više koronavirusa.

[0041] Potvrđen je prenos virusa sa čoveka na čoveka. Koronavirusi se prvenstveno šire bliskim kontaktom, posebno putem respiratornih kapljica od kašlja i kijanja u rasponu od oko 1,8 m. Virusna RNK je takođe pronađena u uzorcima stolice zaraženih pacijenata. Moguće je da virus može biti zarazan čak i tokom perioda inkubacije.

[0042] Prvobitno se sumnjalo da su životinje koje se prodaju za hranu rezervoar ili posredni domaćini SARS-CoV-2 jer su mnoge od prvih osoba za koje je utvrđeno da su zaražene virusom bili radnici na pijaci morskih plodova Huanan. Pijaca koja prodaje žive životinje za hranu takođe je okrivljena za epidemiju SARS 2003. godine; takve pijace se smatraju inkubatorima za nove patogene. Epidemija je dovela do privremene zabrane trgovine i konzumiranja divljih životinja u Kini. Međutim, neki istraživači su sugerisali da tržište morskih plodova Huanan možda nije originalni izvor prenošenja virusa na ljude.

[0043] Sa dovoljnim brojem sekvenciranih genoma, moguće je rekonstruisati filogenetsko stablo istorije mutacija porodice virusa. Istraživanje porekla epidemije SARS 2003 rezultiralo je otkrićem mnogih koronavirusa sličnih virusu SARS, od kojih većina potiče iz roda Rhinolophus potkovičastih slepih miševa. SARS-CoV-2 spada u ovu kategoriju koronavirusa povezanih sa virusom SARS. Dve sekvence genoma iz Rhinolophus sinicus objavljene 2015. i 2017. godine pokazuju sličnost od 80% sa SARS-CoV-2. Treći genom virusa iz Rhinolophus affinis, „RaTG13“ uzorkovan u provinciji Junan, ima 96% sličnosti sa SARS-CoV-2.<[28][29]>Radi poređenja, ova količina varijacija među virusima je slična količini mutacija uočenih tokom deset godina u soju virusa humanog gripa H3N2.

[0044] SARS-CoV-2 pripada širokoj porodici virusa poznatih kao koronavirusi; „nCoV“ je standardni termin koji se koristi za nove koronaviruse do izbora specifičnije oznake. To je jednolančani RNK (+ ssRNK) virus pozitivnog oblika. Drugi koronavirusi su sposobni da izazovu bolesti u rasponu od obične prehlade do težih bolesti kao što su respiratorni sindrom

4

Bliskog istoka (MERS) i teški akutni respiratorni sindrom (SARS). To je sedmi poznati koronavirus koji inficira ljude, nakon 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV i SARS-CoV.

[0045] Kao i SARS-CoV, SARS-CoV-2 je član podroda Sarbecovirus (Beta-CoV linija B). Njegova RNK sekvenca je dužine približno 30.000 baza. Do 12. januara, pet genoma SARS-CoV-2 je izolovano iz Vuhana i prijavljeno od strane Kineskog centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CCDC) i drugih institucija; broj genoma se povećao na 28 do 26. januara. Osim najranijeg genoma GenBank, genomi su pod embargom u GISAID-u. Filogenska analiza uzoraka je dostupna preko Nextstrain-a.

[0046] Objavljivanje genoma SARS-CoV-2 dovelo je do nekoliko eksperimenata modeliranja proteina na proteinu za vezivanje receptora (RBD) proteina šiljka (S) virusa. Rezultati ukazuju na to da S protein zadržava dovoljan afinitet prema receptoru angiotenzin konvertujućeg enzima 2 (ACE2) da bi ga koristio kao mehanizam ulaska ćelija. 22. januara, grupa u Kini koja je radila sa celim virusom i grupa u SAD koja je radila sa obrnutom genetikom nezavisno i eksperimentalno je pokazala humani ACE2 kao receptor za SARS-CoV-2.

[0047] Da bi se potražili potencijalni inhibitori proteaze, virusna 3C-slična proteaza M(pro) iz poliproteina ORF1a je takođe modelirana za eksperimente dokinga lekova. Innophore je proizveo dva računarska modela zasnovana na SARS proteazi, a Kineska akademija nauka je proizvela neobjavljenu eksperimentalnu strukturu rekombinantne SARS-CoV-2 proteaze. Pored toga, istraživači sa Univerziteta u Mičigenu su modelirali strukture svih zrelih peptida u genomu SARS-CoV-2 koristeći I-TASSER.

[0048] Prva poznata humana infekcija dogodila se početkom decembra 2019. godine. Epidemija SARS-CoV-2 prvi put je detektovana u Vuhanu, u Kini, sredinom decembra 2019. godine, i verovatno potiče od jedne zaražene životinje. Virus se potom proširio na sve kineske provincije i na više od dvadeset drugih zemalja u Aziji, Evropi, Severnoj Americi i Okeaniji. Širenje virusa sa čoveka na čoveka potvrđeno je u svim ovim regionima. SZO je 30. januara 2020. godine proglasila SARS-CoV-2 globalnom zdravstvenom vanrednom situacijom.

[0049] Na dan 10. februara 2020. godine (17:15 UTC) bilo je 40.645 potvrđenih slučajeva infekcije, od kojih je 40.196 bilo u kontinentalnoj Kini. U početku, skoro svi slučajevi izvan Kine dogodili su se kod ljudi koji su ili putovali iz Vuhana ili su bili u direktnom kontaktu sa nekim ko je putovao iz tog područja. Kasnije, širenje sa putnika na druge zemlje rezultiralo je trasmisijom u mnogim zemljama sveta. Dok udeo infekcija koje rezultiraju potvrđenom infekcijom ili napretkom ka dijagnostikovanoj akutnoj respiratornoj bolesti SARS-CoV-2 ostaje nejasan, ukupan broj smrtnih slučajeva pripisanih virusu bio je preko 19.000 na dan 25. marta 2020. godine.

[0050] Procenjuje se da je osnovni broj reprodukcije (R-nula) virusa između 1,4 i 3,9. To znači da, kada se ne proverava, virus obično rezultira sa 1,4 do 3,9 novih slučajeva po utvrđenoj infekciji. Utvrđeno je da je virus u stanju da se prenosi duž lanca od najmanje četiri osobe.

[0051] U januaru 2020. godine, više organizacija i institucija započelo je rad na kreiranju vakcina za SARS-CoV-2 na osnovu objavljenog genoma. U Kini, Kineski centar za kontrolu i prevenciju bolesti razvija vakcinu protiv novog koronavirusa. Univerzitet u Hongkongu saopštio je da se i tamo razvija vakcina. Šangajska istočna bolnica takođe razvija vakcinu u partnerstvu sa biotehnološkom kompanijom Stemirna Therapeutics.

[0052] Na drugim mestima, tri projekta razvoja vakcine podržana su od strane Koalicije za inovacije u pripravnosti za epidemije (CEPI), uključujući projekte biotehnoloških kompanija Moderna i Inovio Pharmaceuticals i još jedan od strane Univerziteta u Kvinslendu. Američki nacionalni instituti za zdravlje (NIH) sarađuju sa kompanijom Moderna na kreiranju RNK vakcine koja odgovara šiljku površine koronavirusa; klinička ispitivanja faze I počela su u martu 2020. godine. Kompanija Inovio Pharmaceuticals razvija vakcinu zasnovanu na DNK i sarađuje sa kineskom kompanijom kako bi ubrzala njeno prihvatanje od strane regulatornih organa u Kini, nadajući se da će sprovesti ispitivanja vakcine na ljudima u leto 2020. godine. U Australiji, Univerzitet u Kvinslendu istražuje potencijal molekularne vakcine koja bi genetski modifikovala virusne proteine kako bi imitirali koronavirus i stimulisali imunološku reakciju.

[0053] U nezavisnom projektu, Agencija za javno zdravlje Kanade dala je dozvolu Međunarodnom centru za vakcine (VIDO-InterVac) na Univerzitetu u Saskačevanu da započne rad na razvoju vakcine. VIDO-InterVac ima za cilj da započne proizvodnju i testiranje na životinjama u martu 2020. godine, a testiranje na ljudima 2021. godine. Medicinski fakultet Imperial koledža u Londonu sada je u fazi testiranja vakcine na životinjama.

[0054] COVID-19 akutna respiratorna bolest je virusna respiratorna bolest izazvana SARS-CoV-2. Prvi put je detektovan tokom epidemije koronavirusa u Vuhanu 2019-20. godine. Simptomi mogu uključivati groznicu, suv kašalj i nedostatak vazduha. Od marta 2020. godine ne postoji specifično licencirano lečenje, sa naporima usmerenim na ublažavanje simptoma i podržavanje funkcionisanja.

[0055] Inficirani mogu biti asimptomatski ili imati blage do teške simptome, kao što su groznica, kašalj, nedostatak vazduha. Dijareja ili gornji respiratorni simptomi (npr. kijanje, curenje iz nosa, bol u grlu) su ređi. Slučajevi teške infekcije mogu napredovati do teške upale pluća, otkazivanja više organa i smrti. Svetska zdravstvena organizacija procenjuje vreme od izlaganja do pojave simptoma na 2 do 10 dana, a američki Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) na 2 do 14 dana.

[0056] Globalne zdravstvene organizacije objavile su preventivne mere koje pojedinci mogu da preduzmu kako bi smanjili šanse za infekciju virusom SARS-CoV-2. Preporuke su slične onima koje su ranije objavljene za druge koronaviruse i uključuju: često pranje ruku sapunom i vodom; ne dodirivanje očiju, nosa ili usta neopranim rukama; i praktikovanje dobre respiratorne higijene.

[0057] SZO JE objavila nekoliko protokola testiranja na SARS-CoV-2. Testiranje koristi lančanu reakciju reverzne transkripcije polimeraze u realnom vremenu (rRT-PCR). Test se može uraditi na respiratornim uzorcima ili uzorcima krvi. Rezultati su obično dostupni u roku od nekoliko sati do nekoliko dana.

[0058] Istraživanje potencijalnih tretmana za bolest započeto je u januaru 2020. godine. Kineski Centar za kontrolu i prevenciju bolesti počeo je krajem januara da testira postojeće lekove za upalu pluća kod upale pluća povezane sa koronavirusom. Takođe je izvršeno ispitivanje inhibitora RNK polimeraze remdesivira i interferona beta. Krajem januara 2020. godine, kineski medicinski istraživači izrazili su nameru da započnu kliničko testiranje na remdesivir, hlorokin i lopinavir/ritonavir, za koje se činilo da imaju „prilično dobre inhibitorne efekte“ na SARS-CoV-2 na ćelijskom nivou u eksploratornim istraživanjima. Kina je 5. februara 2020. godine počela da patentira upotrebu remdesivira za bolest.

[0059] Ukupne stope mortaliteta i morbiditeta usled infekcije SARS-CoV-2 su nepoznate, kako zbog toga što se stopa smrtnosti slučajeva može menjati tokom vremena u trenutnoj epidemiji, tako i zato što proporcija infekcija koje napreduju u bolest koja se može dijagnostikovati ostaje nejasna. Međutim, preliminarno istraživanje akutne respiratorne bolesti SARS-CoV-2 pokazalo je stopu smrtnosti između 2% i 3%, a u januaru 2020. godine SZO je sugerisala da je stopa smrtnosti iznosila približno 3%. Nerevidirana studija pre štampanja Imperial koledža među 55 smrtnih slučajeva primetila je da rane procene smrtnosti mogu biti previsoke jer se propuštaju asimptomatske infekcije. Procenili su srednji koeficijent smrtnosti od infekcije (smrtnost među zaraženima) u rasponu od 0,8% kada se uključe asimptomatski nosioci do 18% kada se uključe samo simptomatski slučajevi iz provincije Hubei.

[0060] Rani podaci ukazuju na to da je među prvih 41 potvrđenih slučajeva primljenih u bolnice u Vuhanu, 13 (32%) osoba zahtevalo intenzivnu negu, a 6 (15%) osoba je preminulo. Od onih koji su preminuli, mnogi su u početku bili lošeg zdravlja, pokazujući stanja kao što su hipertenzija, dijabetes ili kardiovaskularne bolesti koje su oštetile njihov imuni sistem. U ranim slučajevima akutne respiratorne bolesti SARS-CoV-2 koja je rezultirala smrću, utvrđeno je da je srednje vreme bolesti 14 dana, sa ukupnim opsegom od šest do 41 dan.

II. Monoklonska antitela i njihova proizvodnja

[0061] „Izolovano antitelo“ je ono koje je izdvojeno i/ili preuzeto iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminantne komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapijsku upotrebu antitela, a mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U određenim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava: (1) do više od 95% po težini antitela kako je određeno Lowry metodom, a posebno više od 99% po težini; (2) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje sekvence aminokiselina korišćenjem sekvenatora; ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujučim ili neredukujućim uslovima korišćenjem Coomassie plave ili srebrne boje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, obično će se izolovano antitelo pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0062] Osnovna jedinica antitela sa četiri lanca je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica zajedno sa dodatnim polipeptidom nazvanim J lanac, i stoga sadrži 10 antigen vezujućih mesta, dok se sekretovana IgA antitela mogu polimerizovati tako da formiraju polivalentne skupove koji se sastoje od 2-5 osnovnih 4-lančanih jedinica zajedno sa J lancem. U slučaju IgG-a, 4-lančana jedinica je generalno oko 150.000 daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima redovno raspoređene disulfidne mostove unutar lanca. Svaki H lanac ima na N-terminusu, varijabilni region (VH) praćen sa tri konstantna domena (CH) za svaki od alfa i gama lanaca i četiri CHdomena za mi i izotipove. Svaki L lanac ima na N-terminusu, varijabilni region (VL) praćen konstantnim domenom (CL) na svom drugom kraju. VLje poravnat sa VHa CLje poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (CH1). Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između lakog lanca i varijabilnih regiona teškog lanca. Uparivanje VHi VLzajedno formira jedno antigen vezujuće mesto. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, pogledajte, npr. Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6.

[0063] L lanac od bilo koje vrste kičmenjaka može se dodeliti jednom od dva jasno različita tipa, nazvanim kappa i lambda na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena (CL). U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini se mogu dodeliti različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, koji imaju teške lance označene kao alfa, delta, epsilon, gama i mi, respektivno. Gama i alfa klase se dalje dele na potklase na osnovu relativno malih razlika u CHsekvenci i funkciji, ljudi izražavaju sledeće potklase: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2.

[0064] Termin „varijabla“ se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti V domena u velikoj meri razlikuju u sekvenci između antitela. V domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u rasponu od 110 aminokiselina varijabilnih regiona. Umesto toga, V regioni se sastoje od relativno nepromenljivih delova koji se nazivaju okvirni regioni (FR) od 15-30 aminokiselina razdvojenih kraćim regionima ekstremne varijabilnosti koji se nazivaju „hipervarijabilni regioni“ koji su dugi po 9-12 aminokiselina. Varijabilni regioni izvornih teških i lakih lanaca obuhvataju po četiri FR, uglavnom usvajajući konfiguraciju beta-liste, povezane sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima čine deo strukture beta-liste. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini od strane FR i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela (pogledajte Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, već pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), ćelijskoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP), neutrofilnoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADNP) i deponovanju komplementa zavisnog od antitela (ADCD).

[0065] Termin „hipervarijabilni region“ kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region generalno obuhvata aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost“ ili „CDR“ (npr. oko ostataka 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL, i oko 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u VHkada su numerisani u skladu sa Kabat sistemom numerisanja; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); i/ili one ostatke iz „hipervarijabilne petlje“ (npr. ostaci 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL, i 26-32 (H1), 52-56 (H2) i 95-101 (H3) u VHkada su numerisani u skladu sa sistemom numeracije Chothia; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)); i/ili one ostatke iz „hipervarijabilne petlje“/CDR (npr. ostaci 27-38 (L1), 56-65 (L2) i 105-120 (L3) u VL, i 27-38 (H1), 56-65 (H2) i 105-120 (H3) u VHkada su numerisani u skladu sa IMGT sistemom numerisanja; Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res.28:219-221 (2000)). Opciono, antitelo ima simetrične umetke na jednoj ili više sledećih tačaka 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) i 123 (L3) u VL, i 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) i 123 (H3) u VsubH kada su numerisani u skladu sa AHo; Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol.309:657-670 (2001)).

[0066] Pod „ostatkom nukleinske kiseline zametne linije“ se podrazumeva ostatak nukleinske kiseline koji se prirodno javlja u genu zametne linije koji kodira konstantan ili varijabilni region. „Gen zametne linije“ je DNK koji se nalazi u zametnoj ćeliji (npr. ćeliji kojoj je predodređeno da postane jaje ili u spermi). „Mutacija zametne linije“ se odnosi na naslednu promenu u

4

određenoj DNK koja se dogodila u zametnoj ćeliji ili zigoti u fazi jedne ćelije, a kada se prenese na potomstvo, takva mutacija je ugrađena u svaku ćeliju tela. Mutacija zametne linije je u suprotnosti sa somatskom mutacijom koja se stiče u jednoj ćeliji tela. U nekim slučajevima, nukleotidi u DNK sekvenci zametne linije koja kodira za varijabilni region su mutirani (npr. somatska mutacija) i zamenjeni drugim nukleotidom.

[0067] Termin „monoklonsko antitelo“ (mAt) koji se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodno prisutnih mutacija koje mogu da se jave u manjim količinama. Monoklonska antitela su veoma specifična, pošto su usmerena na samo jedno antigensko mesto. Dalje, za razliku od preparata poliklonalnih antitela koji uključuju različita antitela usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo je usmereno na jednu determinantu na antigenu. Pored njihove specifičnosti, monoklonska antitela su pogodna po tome što mogu da se sintetišu bez kontaminacije drugim antitelima. Modifikator „monoklonsko“ ne treba tumačiti kao zahtev da se antitelo proizvodi bilo kojom konkretnom metodom. Na primer, monoklonska antitela korisna u ovom otkriću mogu se pripremiti metodologijom hibridoma koju su prvi opisali Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili se može napraviti korišćenjem metoda rekombinantne DNK u bakterijskim, eukariotskim životinjskim ili biljnim ćelijama (pogledajte npr. američki patent 4.816.567) nakon sortiranja pojedinačnih ćelija B ćelije specifične za antigen, plazmablasta specifičnog za antigen koji reaguje na infekciju ili imunizaciju, ili hvatanja povezanih teških i lakih lanaca iz pojedinačnih ćelija u skupu sortirane kolekcije specifične za antigen. „Monoklonska antitela“ se takođe mogu izolovati iz biblioteka faga antitela korišćenjem tehnika opisanih u Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), na primer.

A. Opšte metode

[0068] Podrazumeva se da će monoklonska antitela koja se vezuju za SARS-CoV-2 imati nekoliko primena. To uključuje izradu dijagnostičkih setova za upotrebu u detektovanju i dijagnostikovanju infekcije SARS-CoV-2, kao i za lečenje iste. U ovim kontekstima, takva antitela se mogu povezati sa dijagnostičkim ili terapijskim agensima, koristiti kao agensi za hvatanje ili kompetitore u kompetitivnim testovima, ili se koristiti pojedinačno bez dodavanja dodatnih agenasa. Antitela mogu biti mutirana ili modifikovana, kao što je dalje objašnjeno u nastavku. Metode za pripremu i karakterizaciju antitela su dobro poznate u struci (pogledajte npr., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; američki patent 4.196.265).

[0069] Metode za generisanje monoklonskih antitela (mAt) generalno počinju na isti način kao i metode za pripremu poliklonalnih antitela. Prvi korak za obe ove metode je imunizacija odgovarajućeg domaćina ili identifikacija subjekata koji su imuni zbog prethodne prirodne infekcije ili vakcinacije licenciranom ili eksperimentalnom vakcinom. Kao što je dobro poznato u struci, data kompozicija za imunizaciju može varirati u svojoj imunogenosti. Stoga je često neophodno pojačati imuni sistem domaćina, što se može postići sprezanjem peptida ili polipeptidnog imunogena sa nosačem. Primerni i preferirani nosači su hemocijanin iz ključaonice (KLH) i albumin iz goveđeg seruma (BSA). Drugi albumini kao što su ovalbumin, serumski albumin miša ili serumski albumin kunića takođe se mogu koristiti kao nosači. Sredstva za konjugaciju polipeptida sa proteinom nosačem su dobro poznata u struci i uključuju glutaraldehid, m-maleimidobenkoil-N-hidroksisukcinimid estar, karbodiimid i bisbiazotizovani benzidin. Kao što je takođe dobro poznato u struci, imunogenost određene kompozicije imunogena može se poboljšati upotrebom nespecifičnih stimulatora imunog odgovora, poznatih kao adjuvansi. Primerni i preferirani adjuvansi kod životinja uključuju kompletan Freundov adjuvans (anon-specifični stimulator imunog odgovora koji sadrži ubijenu Mycobacterium tuberculosis), nepotpune Freundove adjuvanse i aluminijum hidroksid adjuvans, a kod ljudi uključuju alum, CPG, MFP59 i kombinacije imunostimulatornih molekula („Adjuvantni sistemi“, kao što su AS01 ili AS03). Mogući su dodatni eksperimentalni oblici inokulacije za indukciju B ćelija specifičnih za SARS-CoV-2, uključujući vakcine protiv nanočestica, ili genski kodirane antigene koji se isporučuju kao DNK ili RNK geni u fizičkom sistemu isporuke (kao što je lipidna nanočestica ili na zlatnoj biolističkoj kuglici) i isporučuju se sa iglom, genskim pištoljem, transkutanim uređajem za elektroporaciju. Gen antigena se takođe može preneti kao kodiran replikacionim kompetentnim ili defektnim virusnim vektorom kao što su adenovirus, adeno-asocirani virus, poksivirus, herpesvirus ili replikon alfavirusa, ili alternativno virus poput čestice.

[0070] U slučaju humanih antitela protiv prirodnih patogena, odgovarajući pristup je identifikacija subjekata koji su bili izloženi patogenima, kao što su oni kojima je dijagnostikovana zaraza, ili oni koji su vakcinisani radi stvaranja zaštitnog imuniteta protiv patogena ili radi testiranja bezbednosti ili efikasnosti eksperimentalne vakcine. Mogu se otkriti cirkulišuća antitela protiv patogena, a zatim se mogu dobiti antitela koja kodiraju ili proizvode B ćelije od subjekta pozitivnog na antitela.

[0071] Količina kompozicije imunogena koja se koristi u proizvodnji poliklonalnih antitela varira u zavisnosti od prirode imunogena, kao i životinje koja se koristi za imunizaciju. Za primenu imunogena mogu se koristiti različite rute (supkutano, intramuskularno, intradermalno, intravenski i intraperitonealno). Proizvodnja poliklonalnih antitela može se pratiti uzorkovanjem krvi imunizovane životinje u različitim tačkama nakon imunizacije. Može se dati i druga, dodatna injekcija. Proces pojačavanja i titriranja se ponavlja dok se ne postigne odgovarajući titar. Kada se postigne željeni nivo imunogenosti, imunizovana životinja se može iskrvariti, a serum izolovati i skladištiti, i/ili se životinja može koristiti za generisanje mAt.

[0072] Nakon imunizacije, somatske ćelije sa potencijalom za proizvodnju antitela, posebno B limfociti (B ćelije), biraju se za upotrebu u protokolu generisanja mAt. Ove ćelije se mogu dobiti iz biopsiranih slezina, limfnih čvorova, krajnika ili adenoida, aspirata koštane srži ili biopsija, biopsija tkiva iz mukoznih organa kao što su pluća ili gastrointestinalni trakt, ili iz cirkulišuće krvi. B limfociti koji proizvode antitela iz imunizovane životinje ili imunog čoveka se zatim spajaju sa ćelijama besmrtne ćelije mijeloma, generalno jedne iste vrste kao i životinja koja je imunizovana ili humanih ili humanih/mišjih himernih ćelija. Ćelijske linije mijeloma pogodne za upotrebu u postupcima fuzije koji proizvode hibridome po mogućnosti ne proizvode antitela, imaju visoku efikasnost fuzije i nedostatke enzima koji onda onemogućavaju rast u određenim selektivnim medijima koji podržavaju rast samo željenih spojenih ćelija (hibridomi). Može se koristiti bilo koja od brojnih ćelija mijeloma, kao što je poznato stručnjacima (Goding, pp.65-66, 1986; Campbell, pp.75-83, 1984). HMMA2.5 ćelije ili MFP-2 ćelije su posebno korisni primeri takvih ćelija.

[0073] Metode za generisanje hibrida ćelija slezine ili limfnih čvorova koje proizvode antitela i ćelija mijeloma obično obuhvataju mešanje somatskih ćelija sa ćelijama mijeloma u proporciji 2:1, iako proporcija može varirati od oko 20:1 do oko 1:1, respektivno, u prisustvu agensa ili agenasa (hemijskih ili električnih) koji promovišu fuziju ćelijskih membrana. U nekim slučajevima, transformacija humanih B ćelija sa Epstein Barr virusom (EBV) kao početnim korakom povećava veličinu B ćelija, poboljšavajući fuziju sa relativno velikim ćelijama mijeloma. Efikasnost transformacije EBV-om se poboljšava korišćenjem CpG i leka inhibitora Chk2 u transformacionom medijumu. Alternativno, humane B ćelije se mogu aktivirati ko-

4

kulturom sa transfektovanim ćelijskim linijama koje izražavaju CD40 ligand (CD154) u medijumu koji sadrži dodatne rastvorljive faktore, kao što su IL-21 i humani B ćelijski aktivacioni faktor (BAFF), član superfamilije TNF tipa II. Metode fuzije pomoću Sendai virusa opisali su Kohler i Milstein (1975; 1976), a oni koji koriste polietilen glikol (PEG), kao što je 37% (v/v) PEG, Gefter et al. (1977). Upotreba metoda električno indukovane fuzije je takođe odgovarajuća (Goding, pp.71-74, 1986) i postoje procesi za bolju efikasnost (Yu et al., 2008). Postupci fuzije obično proizvode održive hibride na niskim frekvencijama, oko 1 × 10<-6>do 1 × 10<-8>, ali optimizovanim postupcima može se postići efikasnost fuzije blizu 1 od 200 (Yu et al., 2008). Međutim, relativno niska efikasnost fuzije ne predstavlja problem, jer se održivi, fuzionisani hibridi razlikuju od roditeljskih, infundiranih ćelija (posebno infundiranih ćelija mijeloma koje bi normalno nastavile da se dele na neodređeno vreme) kultivacijom u selektivnom medijumu. Selektivni medijum je generalno onaj koji sadrži agens koji blokira de novo sintezu nukleotida u medijumu kulture tkiva. Primerni i preferirani agensi su aminopterin, metotreksat i azaserin. Aminopterin i metotreksat blokiraju de novo sintezu purina i pirimidina, dok azaserin blokira samo sintezu purina. Kada se koristi aminopterin ili metotreksat, medijum se dopunjuje hipoksantinom i timidinom kao izvorom nukleotida (HAT medijum). Tamo gde se koristi azaserin, medijum se dopunjava hipoksantinom. Ouabain se dodaje ako je izvor B ćelija EBV-transformisana humana B ćelijska linija, kako bi se eliminisale EBV-transformisane linije koje se nisu spojile sa mijelomom.

[0074] Preferirani medijum za odabir je HAT ili HAT sa ouabainom. Samo ćelije sposobne da upravljaju spasonosnim putevima nukleotida mogu da prežive u HAT medijumu. Ćelije mijeloma su defektne u ključnim enzimima spasonosnog puta, npr. hipoksantin fosforibozil transferazi (HPRT) i ne mogu da prežive. B ćelije mogu da upravljaju ovim putem, ali imaju ograničen životni vek u kulturi i generalno umiru u roku od oko dve nedelje. Dakle, jedine ćelije koje mogu da opstanu u selektivnom medijumu su oni hibridi formirani od mijeloma i B ćelija. Kada je izvor B ćelija koje se koriste za fuziju linija EBV-transformisanih B ćelija, kao što je ovde, ouabain se takođe može koristiti za selekciju lekova hibrida jer su EBV-transformisane B ćelije podložne ubijanju leka, dok je partner mijeloma koji se koristi izabran da bude ouabain rezistentan.

[0075] Kultivacija obezbeđuje populaciju hibrida iz kojih se biraju specifični hibridi. Tipično, selekcija hibrida se vrši kultivacijom ćelija razblaživanjem jednog klona u mikrotiterskim pločama, nakon čega sledi testiranje pojedinačnih klonskih supernatanata (nakon oko dve do tri nedelje) na željenu reaktivnost. Test treba da bude osetljiv, jednostavan i brz, kao što su radioimunološki testovi, enzimski imunološki testovi, testovi citotoksičnosti, testovi imunovezivanja plaka i slično. Izabrani hibridi se zatim serijski razblažuju ili jednoćelijski sortiraju protočnim citometrijskim sortiranjem i kloniraju u pojedinačne ćelijske linije koje proizvode antitela, koje se zatim mogu razmnožavati na neodređeno vreme kako bi se obezbedio mAt. Ćelijske linije se mogu iskoristiti za proizvodnju mAt na dva osnovna načina. Uzorak hibrida se može ubrizgati (često u peritonealnu šupljinu) u životinju (npr u miša). Opciono, životinje su napunjene ugljovodonikom, posebno uljima kao što je pristan (tetrametilpentadekan) pre injekcije. Kada se humani hibridomi koriste na ovaj način, optimalno je ubrizgati imunokompromitovane miševe, kao što su SCID miševi, da bi se sprečilo odbacivanje tumora. Životinja koja je ubrizgana razvija tumore koji luče specifično monoklonsko antitelo koje proizvodi hibrid fuzionisane ćelije. Telesne tečnosti životinje, kao što su serum ili ascitesna tečnost, mogu se zatim ispuštati da bi se obezbedila mAt u visokoj koncentraciji. Pojedinačne ćelijske linije se takođe mogu kultivisati in vitro, gde se mAt prirodno izlučuju u medijum za kulturu iz kojeg se mogu lako dobiti u visokim koncentracijama. Alternativno, linije ćelija humanog hibridoma mogu se koristiti in vitro za proizvodnju imunoglobulina u ćelijskom supernatantu. Ćelijske linije se mogu prilagoditi za rast u medijumu bez seruma kako bi se optimizovala sposobnost oporavka humanih monoklonskih imunoglobulina visoke čistoće.

[0076] mAt proizvedena bilo kojim sredstvom mogu se dalje prečišćavati, po želji, filtriranjem, centrifugiranjem i različitim hromatografskim metodama kao što su FPLC ili afinitetna hromatografija. Fragmenti monoklonskih antitela otkrića mogu se dobiti iz prečišćenih monoklonskih antitela metodama koje uključuju varenje enzimima, kao što su pepsin ili papain, i/ili cepanjem disulfidnih veza hemijskom redukcijom. Alternativno, fragmenti monoklonskih antitela obuhvaćeni ovim otkrićem mogu se sintetizovati pomoću automatizovanog peptidnog sintetizatora.

[0077] Takođe se razmatra da se pristup molekularnog kloniranja može koristiti za generisanje monoklonskih antitela. Pojedinačne B ćelije koje su identifikovane kao odgovor na infekciju ili vakcinaciju zbog plazmablasta ili aktiviranih B ćelija, ili memorijskih B ćelija obeleženih antigenom od interesa, mogu se fizički sortirati korišćenjem paramagnetne selekcije kuglica ili protočnog citometrijskog sortiranja, a zatim se RNK može izolovati iz pojedinačnih ćelija i gena antitela pojačanih RT-PCR-om. Dostupne su različite jednoćelijske RNK-sek metode za

4

dobijanje varijabilnih gena antitela iz pojedinačnih ćelija. Alternativno, antigen-specifične grupno sortirane populacije ćelija mogu se razdvojiti u mikrovezikule i podudarne varijabilne gene teškog i lakog lanca dobijene iz pojedinačnih ćelija koristeći fizičko povezivanje amplikona teškog i lakog lanca, ili zajedničko barkodiranje gena teškog i lakog lanca iz vezikule. Podudarni geni teškog i lakog lanca iz pojedinačnih ćelija takođe se mogu dobiti iz populacija B ćelija specifičnih za antigen tretiranjem ćelija nanočesticama koje prodiru u ćelije sa RT-PCR prajmerima i barkodovima za obeležavanje transkripata sa jednim barkodom po ćeliji. Varijabilni geni antitela se takođe mogu izolovati ekstrakcijom RNK linije hibridoma i gena antitela dobijenih RT-PCR-om i klonirati u vektor ekspresije imunoglobulina. Alternativno, kombinatorne imunoglobulinske fagemidne biblioteke se pripremaju iz RNK izolovane iz ćelijskih linija, a fagemidi koji eksprimiraju odgovarajuća antitela biraju se paningom koristeći virusne antigene. Prednosti ovog pristupa u odnosu na konvencionalne tehnike hibridoma su da se približno 10<4>puta više antitela može proizvesti i pregledati u jednoj rundi, i da se nove specifičnosti generišu kombinacijom H i L lanca, što dodatno povećava šansu za pronalaženje odgovarajućih antitela.

[0078] Drugi američki patenti koji podučavaju proizvodnju antitela korisnih u ovom otkriću uključuju američki patent 5.565.332, koji opisuje proizvodnju himernih antitela korišćenjem kombinatornog pristupa; američki patent 4.816.567 koji opisuje preparate rekombinantnog imunoglobulina; i američki patent 4.867.973 koji opisuje konjugate antitelo-terapijski agens.

B. Antitela ovog otkrića

[0079] Antitela prema ovom otkriću mogu se definisati, u prvom stepenu, njihovom specifičnošću vezivanja. Stručnjaci, procenom specifičnosti/afiniteta vezivanja datog antitela korišćenjem tehnika dobro poznatih stručnjacima, mogu utvrditi da li takva antitela spadaju u opseg trenutnih patentnih zahteva. Na primer, epitop na koji se određeno antitelo vezuje može se sastojati od jedne susedne sekvence od 3 ili više (npr. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20) aminokiselina koje se nalaze unutar molekula antigena (npr. linearni epitop u domenu). Alternativno, epitop se može sastojati od mnoštva nepovezanih aminokiselina (ili sekvenci aminokiselina) koje se nalaze unutar molekula antigena (npr. konformacioni epitop).

4

[0080] Dve glavne kategorije antigena SARS-CoV-2 su protein površinskog šiljka (S) i unutrašnji proteini, posebno nukleokapsidni (N) protein. Antitela na S protein će biti korisna za profilaksu, ili terapiju, ili dijagnostiku, ili za karakterizaciju vakcina. Antitela na S-proteinu će imati dodatnu specifičnost vezivanja sa tim proteinom, sa određenim antitelima koja se vezuju za ektodomen pune dužine proteina SARS-CoV-2 S (predstavljena kao monomer ili oligomer kao što je tajmer; sa našim stabilizirajućim mutacijama bez konformacije kao što je uvođenje prolina na kritičnim mestima („2P mutacija“)) i (a) antitela na anti-S proteinu koja se vezuju za domen vezivanja receptora (RBD), (b) antitela na anti-S proteinu koja se vezuju za domene koji nisu RBD. Neki od podskupova koji se vezuju za domene koji nisu RBD vezuju se za N terminalni domen (NTD), dok se drugi vezuju za epitop koji nije NTD ili RBD), i (c) može se dalje otkriti da antitela na S-proteinu neutrališu SARS-CoV-2 blokiranjem vezivanja SARS-CoV-2 S proteina za njegov receptor, humani angiotenzin-konvertujući enzim 2 (hACE2), sa drugima koji neutrališu, ali ne blokiraju vezivanje receptora. Konačno, antitela mogu unakrsno reagovati i sa proteinom SARS-CoV-2 S i sa S-proteinom drugih koronavirusa kao što su SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 i/ili HCoV-HKU1, kao i unakrsno neutralisati i SARS-CoV-2 i druge koronaviruse.

[0081] Druga specifičnost će biti antitela koja se vezuju za N antitela (ili drugeinterne mete) koja će imati primarnu dijagnostičku primenu. Na primer, antitela na N ili druge unutrašnje proteine SARS-CoV-2 koji specifično prepoznaju SARS-CoV-2 ili koji unakrsno reaktivno prepoznaju SARS-CoV-2 i druge koronaviruse kao što su SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63 i/ili HCoV-HKU1.

[0082] Različite tehnike poznate stručnjacima mogu se koristiti za utvrđivanje da li antitelo „stupa u interakciju sa jednom ili više aminokiselina“ unutar polipeptida ili proteina. Primeri tehnika uključuju, na primer, rutinske testove unakrsnog blokiranja, kao što je opisano u Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Unakrsno blokiranje se može meriti u različitim testovima vezivanja kao što su ELISA, interferometrija bioslojeva ili površinska plazmonska rezonanca. Ostale metode uključuju mutacionu analizu skeniranja alanina, analizu peptidnih blotova (Reineke, Methods Mol. Biol.248: 443-63, 2004), analizu cepanja peptida, tehnike elektronske mikroskopije visoke rezolucije korišćenjem rekonstrukcije jedne čestice, krioEM ili tomografiju, kristalografske studije i NMR analizu. Pored toga, mogu se primeniti metode kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer Prot. Sci.9: 487-496, 2000). Još jedna metoda koja se

4

može koristiti za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojima antitelo stupa u interakciju je razmena vodonika/deuterijuma detektovana masenom spektrometrijom. Generalno, metoda razmene vodonika/deuterijuma uključuje obeležavanje proteina od interesa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein označen deuterijumom. Zatim, kompleks proteina/antitela se prenosi u vodu i zamenljivi protoni unutar aminokiselina koje su zaštićene kompleksom antitela prolaze kroz razmenu deuterijuma u vodonik po sporijoj stopi nego zamenljivi protoni unutar aminokiselina koje nisu deo interfejsa. Kao rezultat toga, aminokiseline koje čine deo interfejsa protein/antitelo mogu zadržati deuterijum i stoga pokazuju relativno veću masu u poređenju sa aminokiselinama koje nisu uključene u interfejs. Nakon disocijacije antitela, ciljni protein se podvrgava analizi cepanja proteaze i masenoj spektrometriji, čime se otkrivaju ostaci označeni deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo stupa u interakciju. Pogledajte, npr. Ehring, Analytical Biochemistry 267: 252-259 (1999); Engen and Smith, Anal. Chem. 73: 256A-265A (2001). Kada antitelo neutrališe SARS-CoV-2, mutirani varijantni organizmi koji beže od antitela mogu se izolovati propagiranjem SARS-CoV-2 in vitro ili na životinjskim modelima u prisustvu visokih koncentracija antitela. Analiza sekvence gena SARS-CoV-2 koji kodira antigen koji je usmeren na antitelo otkriva mutaciju koja dovodi do izbegavanja antitela, ukazujući na ostatke u epitopu ili koji alosterno utiču na strukturu epitopa.

[0083] Termin „epitop“ se odnosi na mesto na antigenu na koje B i/ili T ćelije reaguju. Epitopi B-ćelija mogu se formirati i iz susednih aminokiselina ili iz nesusednih aminokiselina suprotstavljenih tercijarnom savijanju proteina. Epitopi formirani iz susednih aminokiselina se obično zadržavaju prilikom izlaganja denaturirajućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube prilikom tretmana denaturirajućim rastvaračima. Epitop obično sadrži najmanje 3, a češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.

[0084] Profilisanje potpomognuto modifikacijom (MAP), takođe poznato kao profilisanje antitela zasnovano na strukturi antigena (ASAP), je metoda koja kategorizuje veliki broj monoklonskih antitela (mAt) usmerenih na isti antigen u skladu sa sličnostima profila vezivanja svakog antitela na hemijski ili enzimski modifikovane površine antigena (pogledajte publikaciju američkog patenta 2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop ili se izrazito razlikovati od epitopa ili se delimično preklapati sa epitopom predstavljenim drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski

4

identičnih antitela, tako da se karakterizacija može fokusirati na genetski različita antitela. Kada se primeni na skrining hibrida, MAP može olakšati identifikaciju retkih klonova hibrida koji proizvode mAt koja imaju željene karakteristike. MAP se može koristiti za sortiranje antitela ovog otkrića u grupe antitela koje vezuju različite epitope.

[0085] Ovo otkriće uključuje antitela koja se mogu vezati za isti epitop ili deo epitopa. Isto tako, ovo otkriće takođe uključuje antitela koja se takmiče za vezivanje za metu ili njen fragment sa bilo kojim od specifičnih primera antitela opisanih u ovom dokumentu. Lako se može utvrditi da li se antitelo vezuje za isti epitop kao referentno antitelo ili se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelima korišćenjem rutinskih metoda poznatih u struci. Na primer, da bi se utvrdilo da li se test antitelo vezuje za isti epitop kao referentno, referentnom antitelu je dozvoljeno da se veže za metu pod uslovima zasićenja. Zatim se procenjuje sposobnost test antitela da se veže za ciljni molekul. Ako se test antitelo može vezati za ciljni molekul nakon vezivanja zasićenja sa referentnim antitelom, može se zaključiti da se test antitelo vezuje za drugačiji epitop od referentnog antitela. Sa druge strane, ako test antitelo nije u stanju da se veže za ciljni molekul nakon vezivanja zasićenja sa referentnim antitelom, onda se test antitelo može vezati za isti epitop kao i epitop vezan referentnim antitelom.

[0086] Da bi se utvrdilo da li se antitelo takmiči za vezivanje sa referentnim anti-SARS-CoV-2 antitelima, gore opisana metodologija vezivanja vrši se u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom antitelu je dozvoljeno da se veže za antigen SARS-CoV-2 pod uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja test antitela za molekul SARS-CoV-2. U drugoj orijentaciji, test antitelo se može vezati za molekul antigena SARS-CoV-2 pod uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja referentnog antitela za molekul SARS-CoV-2. Ako je, u obe orijentacije, samo prvo (zasićeno) antitelo sposobno da se veže za SARS-CoV-2, onda se zaključuje da se test antitelo i referentno antitelo takmiče za vezivanje za SARS-CoV-2. Kao što će razumeti stručnjak, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora nužno da se vezuje za identičan epitop kao referentno antitelo, ali može sterilno blokirati vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapajućeg ili susednog epitopa.

[0087] Dva antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop ako svako kompetitivno inhibira (blokira) vezivanje drugog za antigen. To jest, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog za najmanje 50%, ali po mogućnosti 75%, 90% ili čak 99%, kako je izmereno u testu kompetitivnog vezivanja (pogledajte npr. Junghans et al., Cancer Res.1990

4

50:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako u suštini sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ako neke mutacije aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. U nekim aspektima, antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za isti ili preklapajući epitop kao COV2-2196 se koristi u kombinaciji sa antitelom ili fragmentom antitela koji se vezuje za isti ili preklapajući epitop kao COV2-2130.

[0088] Zatim se mogu sprovesti dodatni rutinski eksperimenti (npr. analize mutacije i vezivanja peptida) kako bi se potvrdilo da li je uočeni nedostatak vezivanja test antitela zapravo posledica vezivanja za isti epitop kao i referentno antitelo ili ako je steričko blokiranje (ili drugi fenomen) odgovorno za nedostatak uočenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste mogu se izvoditi pomoću ELISA, RIA, površinske plazmonske rezonance, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela dostupnog u struci. Strukturne studije sa EM ili kristalografijom takođe mogu pokazati da li dva antitela koja se takmiče za vezivanje prepoznaju isti epitop.

[0089] U drugom aspektu, postoje monoklonska antitela koja imaju CDR uparene sa klonovima iz teških i lakih lanaca, kao što je prikazano u tabelama 3 i 4. Takva antitela mogu proizvesti klonovi o kojima se govori u nastavku u odeljku Primeri koristeći ovde opisane metode.

[0090] U drugom aspektu, antitela se mogu definisati njihovom varijabilnom sekvencom, koja uključuje dodatne „okvirne“ regione. Pored toga, sekvence antitela mogu se razlikovati od ovih sekvenci, opciono koristeći metode koje su detaljnije opisane u nastavku. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina mogu se razlikovati od onih gore navedenih u tome što (a) varijabilni regioni mogu biti odvojeni od konstantnih domena lakih i teških lanaca, (b) nukleinske kiseline mogu se razlikovati od onih gore navedenih, a da ne utiču na ostatke kodirane njima, (c) nukleinske kiseline mogu se razlikovati od onih gore navedenih za dati procenat, npr. 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologije, (d) nukleinske kiseline se mogu razlikovati od gore navedenih zbog sposobnosti hibridizacije pod uslovima visoke strogosti, kao što je prikazano uslovima niske soli i/ili visoke temperature, kao što je obezbeđeno sa oko 0,02 M do oko 0,15 M NaCl na temperaturama od oko 50°C do oko 70°C, (e) aminokiseline se mogu razlikovati od gore navedenih u datom procentu, npr. 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologije, ili (f) aminokiseline se mogu razlikovati od gore navedenih dozvoljavanjem konzervativnih supstitucija (o kojima se govori u nastavku). Sve gore navedeno se odnosi na sekvence nukleinskih kiselina i sekvence aminokiselina.

[0091] Kada se uporede polinukleotidne i polipeptidne sekvence, za dve sekvence se kaže da su „identične“ ako je sekvenca nukleotida ili aminokiselina u dve sekvence ista kada je poravnata za maksimalnu korespondenciju, kao što je opisano u nastavku. Poređenja između dve sekvence se obično vrše poređenjem sekvenci preko prozora za poređenje kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvenci. „Prozor za poređenje“ kao što se ovde koristi, odnosi se na segment od najmanje 20 susednih pozicija, obično 30 do oko 75, 40 do oko 50, u kojem se sekvenca može uporediti sa referentnom sekvencom istog broja susednih pozicija nakon što su dve sekvence optimalno poravnate.

[0092] Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se sprovesti korišćenjem programa Megalign u Lasergene paketu softvera za bioinformatiku (DNASTAR, Inc., Madison, WIS.), koristeći podrazumevane parametre. Ovaj program otelotvoruje nekoliko šema poravnanja opisanih u sledećim referencama: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol.5, Suppl. 3, pp.345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.

[0093] Alternativno, optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se sprovesti lokalnim algoritmom identiteta Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, algoritmom poravnanja identiteta Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48:443, traženjem metoda sličnosti Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.), ili inspekcijom.

1

[0094] Jedan poseban primer algoritama koji su pogodni za određivanje procentualnog identiteta sekvence i sličnosti sekvence su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 i Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.

215:403-410, respektivno. BLAST i BLAST 2.0 se mogu koristiti, na primer, sa parametrima opisanim u ovom dokumentu, za određivanje procentualnog identiteta sekvence za polinukleotide i polipeptide otkrića. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan preko Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Preuređena priroda sekvence antitela i varijabilna dužina svakog gena zahtevaju više rundi BLAST pretraga za jednu sekvencu antitela. Takođe, ručno sastavljanje različitih gena je teško i sklono greškama. Alat za analizu sekvenci IgBLAST (world-wide-web at ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) identifikuje podudaranja sa genima V, D i J zametne linije, detalje na spojevima preuređenja, razgraničenje okvirnih regiona Ig V domena i regiona koji određuju komplementarnost. IgBLAST može da analizira nukleotidne ili proteinske sekvence i može da obrađuje sekvence u serijama i omogućava istovremeno pretraživanje baza podataka gena zametne linije i drugih baza podataka sekvenci kako bi se smanjila mogućnost da se propusti možda najbolji gen za zametnu liniju V.

[0095] U jednom ilustrativnom primeru, kumulativni rezultati se mogu izračunati korišćenjem, za nukleotidne sekvence, parametara M (rezultat nagrade za par podudarnih ostataka; uvek >0) i N (rezultat kazne za nepodudarne ostatke; uvek <0). Produženje pogodaka reči u svakom pravcu se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja padne za količinu X od svoje maksimalne postignute vrednosti; kumulativni rezultat ide na nulu ili niže, zbog akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka sa negativnim rezultatom; ili se postigne kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. BLASTN program (za nukleotidne sekvence) kao podrazumevane vrednosti koristi dužinu reči (W) od 11, i očekivanje (E) od 10, i matricu bodovanja BLOSUM62 (pogledajte Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnanja, (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4 i poređenje oba lanca.

[0096] Za sekvence aminokiselina, matrica rezultata se može koristiti za izračunavanje kumulativnog rezultata. Produženje pogodaka reči u svakom pravcu se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja padne za količinu X od svoje maksimalne postignute vrednosti; kumulativni rezultat ide na nulu ili niže, zbog akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka

2

sa negativnim rezultatom; ili se postigne kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja.

[0097] U jednom pristupu, „procenat identiteta sekvence“ se određuje poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u okviru prozora poređenja od najmanje 20 pozicija, pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u prozoru poređenja može da sadrži dodatke ili delecije (tj. praznine) od 20 procenata ili manje, obično 5 do 15 procenata, ili 10 do 12 procenata, u poređenju sa referentnim sekvencama (koje ne sadrže dodatke ili delecije) za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se pojavljuju identične baze nukleinskih kiselina ili ostaci aminokiselina u obe sekvence kako bi se dobio broj podudarnih pozicija, deljenjem broja podudarnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u referentnoj sekvenci (tj. veličina prozora) i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvence.

[0098] Još jedan način definisanja antitela je kao „derivat“ bilo kog od dole opisanih antitela i njihovih fragmenata koji se vezuju za antigen. Termin „derivat“ se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se imunospecifično vezuje za antigen, ali koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, dodataka, delecija ili modifikacija u odnosu na „roditeljski“ (ili divlji) molekul. Takve aminokiselinske supstitucije ili dodaci mogu uvesti prirodno prisutne (tj. DNK-kodirane) ili neprirodno prisutne aminokiselinske ostatke. Termin „derivat“ obuhvata, na primer, varijante koje imaju izmenjene CH1, CH2, CH3 ili CH4 zglobne regione, tako da formiraju, na primer, antitela, itd. koji imaju varijantne Fc regione koji pokazuju poboljšane ili oštećene efektorske ili vezujuće karakteristike. Termin „derivat“ dodatno obuhvata modifikacije koje nisu aminokiseline, na primer, aminokiseline koje mogu biti glikozilirane (npr. imaju izmenjenu manozu, 2-N-acetilglukozamin, galaktozu, fukozu, glukozu, sijalinsku kiselinu, 5-N-acetilneuraminsku kiselinu, sadržaj 5-glikolineuraminske kiseline, itd.), acetilirane, pegilirane, fosforilirane, amidirane, derivatizovane poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, povezane sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinima, itd. U nekim otelotvorenjima, izmenjene modifikacije ugljenih hidrata moduliraju jedno ili više od sledećeg: solubilizaciju antitela, olakšavanje subćelijskog transporta i sekrecije antitela, promociju sklapanja antitela, konformacioni integritet i efektorsku funkciju posredovanu antitelima. U specifičnom otelotvorenju, izmenjene modifikacije ugljenih hidrata poboljšavaju efektorsku funkciju posredovanu antitelima u odnosu na antitelo kojem nedostaje modifikacija ugljenih hidrata.

Modifikacije ugljenih hidrata koje dovode do efektorske funkcije posredovane izmenjenim antitelima dobro su poznate u struci (na primer, pogledajte Shields, R. L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII," Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). Metode izmene sadržaja ugljenih hidrata poznate su stručnjacima, pogledajte npr. Wallick, S. C. et al. (1988) "Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen," J. Exp. Med.168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989) "Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role of Carbohydrate in The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region," J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995) "The Effect of Aglycosylation on The Immunogenicity of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody," Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003) "Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering," Nature Biotechnol.

21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002) "Lack of Fucose on Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740).

[0099] Derivativno antitelo ili fragment antitela mogu se generisati sa inženjeringovanom sekvencom ili stanjem glikozilacije kako bi se obezbedili željeni nivoi aktivnosti u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), ćelijskoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP), neutrofilnoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADNP) ili funkcijama deponovanja komplementa zavisnog od antitela (ADCD) mereno testovima zasnovaninm na kuglicama ili ćelijama ili in vivo studijama na životinjskim modelima.

[0100] Derivat antitela ili fragment antitela može se modifikovati hemijskim modifikacijama korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formulaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. U jednom otelotvorenju, derivat antitela će imati sličnu ili identičnu funkciju kao roditeljsko antitelo. U drugom otelotvorenju, derivat antitela će pokazati izmenjenu aktivnost u odnosu na roditeljsko antitelo. Na primer, derivativno antitelo (ili njegov fragment) može se čvršće vezati za svoj epitop ili biti otpornije na proteolizu od roditeljskog antitela.

4

C. Inženjering sekvenci antitela

[0101] U različitim otelotvorenjima, može se izabrati inženjering sekvenci identifikovanih antitela iz različitih razloga, kao što su poboljšana ekspresija, poboljšana unakrsna reaktivnost ili smanjeno vezivanje van mete. Modifikovana antitela mogu se napraviti bilo kojom tehnikom poznatom stručnjacima, uključujući ekspresiju standardnim molekularno biološkim tehnikama ili hemijskom sintezom polipeptida. Metode za rekombinantnu ekspresiju obrađene su na drugim mestima u ovom dokumentu. Sledi opšta diskusija o relevantnim tehnikama ciljeva za inženjering antitela.

[0102] Hibridomi se mogu kultivisati, zatim lizirati ćelije i ekstrahovati ukupnu RNK. Nasumični heksameri se mogu koristiti sa RT za generisanje cDNK kopija RNK, a zatim se PCR izvodi korišćenjem multipleks mešavine PCR prajmera za koje se očekuje da će pojačati sve sekvence humanih varijabilnih gena. PCR proizvod se može klonirati u pGEM-T Easy vektor, a zatim sekvencirati automatizovanim sekvenciranjem DNK korišćenjem standardnih vektorskih prajmera. Test vezivanja i neutralizacije može se izvršiti korišćenjem antitela prikupljenih iz supernatanata hibridoma i prečišćenih pomoću FPLC, koristeći protein-G kolone.

[0103] Rekombinantna IgG antitela pune dužine mogu se generisati subkloniranjem teškog i lakog lanca Fv DNK iz vektora kloniranja u IgG plazmidni vektor, transfektovan u 293 (npr. Freestyle) ćelije ili CHO ćelije, a antitela se mogu prikupiti i prečistiti iz supernatanta 293 ili CHO ćelija. Drugi odgovarajući sistemi ćelija domaćina uključuju bakterije, kao što je E. coli, ćelije insekata (S2, Sf9, Sf29, High Five), biljne ćelije (npr. duvan, sa ili bez inženjeringa za glikane slične humanim), alge ili razni ne-humani transgeni konteksti, kao što su miševi, pacovi, koze ili krave.

[0104] Takođe se razmatra ekspresija nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela, kako u svrhu naknadnog prečišćavanja antitela, tako i za imunizaciju domaćina. Sekvence kodiranja antitela mogu biti RNK, kao što je nativna RNK ili modifikovana RNK. Modifikovana RNK razmatra određene hemijske modifikacije koje daju povećanu stabilnost i nisku imunogenost iRNK, čime se olakšava ekspresija terapijski važnih proteina. Na primer, N1-metil-pseudouridin (N1mΨ) nadmašuje nekoliko drugih nukleozidnih modifikacija i njihovih kombinacija u smislu translacionog kapaciteta. Pored isključivanja imunološke/eIF2α fosforilacione zavisne inhibicije translacije, inkorporirani N1mΨ nukleotidi dramatično menjaju dinamiku procesa translacije povećanjem pauze ribozoma i gustine na iRNK. Povećano opterećenje ribosoma modifikovanim iRNK čini ih permisivnijim za iniciranje tako što favorizuje recikliranje ribosoma na istoj iRNK ili regrutovanje de novo ribosoma. Takve modifikacije se mogu koristiti za poboljšanje ekspresije antitela in vivo fnakon inokulacije sa RNK. RNK, bilo da je prirodna ili modifikovana, može se isporučiti kao gola RNK ili u sredstvu za isporuku, kao što je lipidna nanočestica.

[0105] Alternativno, DNK koja kodira antitelo može se koristiti u iste svrhe. DNK je uključena u ekspresionu kasetu koja sadrži promoter aktivan u ćeliji domaćinu za koju je dizajnirana. Ekspresiona kaseta je povoljno uključena u replicirajući vektor, kao što je konvencionalni plazmid ili minivektor. Razmatraju se vektori koji uključuju virusne vektore, kao što su poksvirusi, adenovirusi, herpesvirusi, adeno-povezani virusi i lentivirusi. Razmatraju se i replikoni koji kodiraju gene antitela kao što su replikoni alfavirusa zasnovani na VEE virusu ili Sindbis virusu. Isporuka takvih vektora može se izvršiti iglom kroz intramuskularne, subkutane ili intradermalne rute, ili transkutanom elektroporacijom kada se želi in vivo ekspresija.

[0106] Brza dostupnost antitela proizvedenog u istom procesu ćelije domaćina i ćelijske kulture kao finalni proces proizvodnje cGMP ima potencijal da smanji trajanje programa razvoja procesa. Lonza je razvila generičku metodu koristeći objedinjene transfektante koji se uzgajaju u CDACF medijumu, za brzu proizvodnju malih količina (do 50 g) antitela u CHO ćelijama. Iako nešto sporije od pravog prelaznog sistema, prednosti uključuju veću koncentraciju proizvoda i upotrebu istog domaćina i procesa kao proizvodna ćelijska linija. Primer rasta i produktivnosti GS-CHO pulova, koji izražavaju model antitela, u bioreaktoru za jednokratnu upotrebu: u kulturi bioreaktora za jednokratnu upotrebu (radna zapremina od 5 L) koja radi u režimu punjene serije, koncentracija antitela za sakupljanje od 2 g/L postignuta je u roku od 9 nedelja od transfekcije.

[0107] Molekuli antitela će se sastojati od fragmenata (kao što su F(ab'), F(ab')2) koji se proizvode, na primer, proteolitičkim cepanjem mAt, ili jednolančanim imunoglobulinima koji se mogu proizvesti, na primer, rekombinantnim sredstvima. Derivati F(ab') antitela su monovalentni, dok su derivati F(ab')2antitela bivalentni. U jednom otelotvorenju, takvi fragmenti se mogu kombinovati jedni sa drugima, ili sa drugim fragmentima antitela ili receptorskim ligandima da bi se formirali „himerni“ molekuli vezivanja. Značajno je da takvi himerni molekuli mogu da sadrže supstituente koji se mogu vezati za različite epitope istog molekula.

[0108] U srodnim otelotvorenjima, antitelo je derivat otkrivenih antitela, npr. antitelo koje se sastoji od CDR sekvenci identičnih onima u otkrivenim antitelima (npr. himerno ili CDR-graftovano antitelo). Alternativno, možda ćete želeti da napravite modifikacije, kao što je uvođenje konzervativnih promena u molekul antitela. Pri pravljenju takvih promena može se uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Značaj indeksa hidropatskih aminokiselina u dodeljivanju interaktivne biološke funkcije proteinu je opšte shvaćeno u struci (Kyte and Doolittle, 1982). Prihvatljivo je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi rezultirajućeg proteina, što zauzvrat definiše interakciju proteina sa drugim molekulima, na primer, enzimima, supstratima, receptorima, DNK, antitelima, antigenima i slično.

[0109] Takođe se podrazumeva u struci da se supstitucija sličnih aminokiselina može efikasno izvršiti na osnovu hidrofilnosti. Američki patent 4.554.101, navodi da je najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, kako je regulisano hidrofilnošću njegovih susednih aminokiselina, u korelaciji sa biološkim svojstvom proteina. Kao što je detaljno opisano u američkom patentu 4.554.101, sledeće vrednosti hidrofilnosti dodeljene su aminokiselinskim ostacima: osnovne aminokiseline: arginin (+3,0), lizin (+3,0) i histidin (-0,5); kisele aminokiseline: aspartat (+3,0 ± 1), glutamat (+3,0 ± 1), asparagin (+0,2) i glutamin (+0,2); hidrofilne, neionske aminokiseline: serin (+0,3), asparagin (+0,2), glutamin (+0,2) i treonin (-0,4), sumpor koji sadrži aminokiseline: cistein (-1,0) i metionin (-1,3); hidrofobne, nearomatske aminokiseline: valin (-1,5), leucin (-1,8), izoleucin (-1,8), prolin (-0,5 ± 1), alanin (-0,5) i glicin (0); hidrofobne, aromatične aminokiseline: triptofan (-3,4), fenilalanin (-2,5) i tirozin (-2,3).

[0110] Podrazumeva se da se aminokiselina može zameniti drugom koja ima sličnu hidrofilnost i proizvodi biološki ili imunološki modifikovan protein. U takvim promenama, preferira se supstitucija aminokiselina čije su vrednosti hidrofilnosti unutar ± 2, one koje su unutar ± 1 su posebno preferirane, a one unutar 0,5 su još više preferirane.

[0111] Kao što je gore navedeno, supstitucije aminokiselina se generalno zasnivaju na relativnoj sličnosti supstituenata bočnog lanca aminokiselina, na primer, njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanju, veličini i slično. Primeri supstitucija koje uzimaju u obzir različite gore navedene karakteristike dobro su poznate stručnjacima i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin.

[0112] Ovo otkriće takođe razmatra modifikaciju izotipa. Modifikacijom Fc regiona da ima drugačiji izotip, mogu se postići različite funkcionalnosti. Na primer, prelazak na IgG1može povećati citotoksičnost ćelija zavisnih od antitela, prelazak na klasu A može poboljšati distribuciju tkiva, a prelazak na klasu M može poboljšati valencu.

[0113] Alternativno ili dodatno, može biti korisno kombinovati modifikacije aminokiselina sa jednom ili više daljih modifikacija aminokiselina koje menjaju vezivanje C1q i/ili funkciju citotoksičnosti zavisnu od komplementa (CDC) Fc regiona vezujućeg molekula IL-23p19. Vezujući polipeptid od posebnog interesa može biti onaj koji se vezuje za C1q i pokazuje citotoksičnost zavisnu od komplementa. Polipeptidi sa već postojećom aktivnošću vezivanja C1q, opciono dalje sa sposobnošću da posreduju CDC, mogu se modifikovati tako da se pojača jedna ili obe ove aktivnosti. Modifikacije aminokiselina koje menjaju C1q i/ili modifikuju njegovu funkciju citotoksičnosti zavisnu od komplementa opisane su, na primer, u WO/0042072.

[0114] Može se dizajnirati Fc region antitela sa izmenjenom efektorskom funkcijom, npr. modifikovanjem C1q vezivanja i/ili FcyR vezivanja čime se menja CDC aktivnost i/ili ADCC aktivnost. „Efektorske funkcije“ su odgovorne za aktiviranje ili smanjenje biološke aktivnosti (npr. kod subjekta). Primeri efektorskih funkcija uključuju, ali nisu ograničeni na: vezivanje za C1q; citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC); vezivanje za Fc receptor; citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC); fagocitozu; smanjenu regulaciju receptora na površini ćelije (npr. B ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije mogu zahtevati da se Fc region kombinuje sa domenom vezivanja (npr. varijabilni domen antitela) i može se proceniti korišćenjem različitih testova (npr. testovi vezivanja Fc, ADCC testovi, CDC testovi, itd.).

[0115] Na primer, može se generisati varijanta Fc regiona antitela sa poboljšanim C1q vezivanjem i poboljšanim FcyRIII vezivanjem (npr. sa poboljšanom ADCC aktivnošću i poboljšanom CDC aktivnošću). Alternativno, ako se želi da se funkcija efektora smanji ili ablira, varijanta Fc regiona može biti projektovana sa smanjenom CDC aktivnošću i/ili smanjenom ADCC aktivnošću. U drugim otelotvorenjima, samo jedna od ovih aktivnosti može biti povećana, a opciono druga aktivnost smanjena (npr. za generisanje varijante Fc regiona sa poboljšanom ADCC aktivnošću, ali smanjenom CDC aktivnošću i obrnuto).

[0116] FcRn vezivanje. Fc mutacije se takođe mogu uvesti i inženjeringovati kako bi se promenila njihova interakcija sa neonatalnim Fc receptorom (FcRn) i poboljšala njihova farmakokinetička svojstva. Opisana je kolekcija humanih Fc varijanti sa poboljšanim vezivanjem za FcRn (Shields et al., (2001). Mapiranje visoke rezolucije mesta vezivanja humanog IgG1 za FcyRI, FcyRII, FcyRIII i FcRn i dizajn IgG1 varijanti sa poboljšanim vezivanjem za FcyR, (J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Poznate su brojne metode koje mogu dovesti do povećanog poluvremena (Kuo and Aveson, (2011)), uključujući modifikacije aminokiselina koje se mogu generisati tehnikama koje uključuju mutagenezu skeniranjem alanina, slučajnu mutagenezu i skrining za procenu vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) i/ili in vivo ponašanje. Računske strategije praćene mutagenezom takođe se mogu koristiti za selekciju jedne od mutacija aminokiselina za mutiranje.

[0117] Ovo otkriće stoga pruža varijantu proteina koji vezuje antigen sa optimizovanim vezivanjem za FcRn. U konkretnom otelotvorenju, navedena varijanta proteina koji vezuje antigen obuhvata najmanje jednu modifikaciju aminokiselina u Fc regionu navedenog proteina koji vezuje antigen, pri čemu se navedena modifikacija bira iz grupe koja se sastoji 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 i 447 od Fc regiona u poređenju sa navedenim roditeljskim polipeptidom, pri čemu je numeracija aminokiselina u Fc regionu ona EU indeksa u Kabatu. U daljem aspektu otkrića modifikacije su M252Y/S254T/T256E.

[0118] Pored toga, različite publikacije opisuju metode za dobijanje fiziološki aktivnih molekula čije je poluvreme modifikovano, pogledajte na primer Kontermann (2009), bilo uvođenjem FcRn-vezujućeg polipeptida u molekule ili spajanjem molekula sa antitelima čiji su FcRn-vezujući afiniteti očuvani, ali su afiniteti za druge Fc receptore znatno smanjeni ili spajanjem sa FcRn-vezujućim domenima antitela.

[0119] Derivatizovana antitela se mogu koristiti za promenu poluvremena (npr. poluvremena seruma) roditeljskih antitela kod sisara, posebno čoveka. Takve promene mogu dovesti do poluvremena trajanja dužeg od 15 dana, po mogućnosti dužeg od 20 dana, dužeg od 25 dana, dužeg od 30 dana, dužeg od 35 dana, dužeg od 40 dana, dužeg od 45 dana, dužeg od 2 meseca, dužeg od 3 meseca, dužeg od 4 meseca ili dužeg od 5 meseci. Povećano poluvreme antitela ovog otkrića ili njihovih fragmenata kod sisara, po mogućnosti čoveka, rezultira većim titrom seruma navedenih antitela ili fragmenata antitela kod sisara, i na taj način smanjuje učestalost primene navedenih antitela ili fragmenata antitela i/ili smanjuje koncentraciju navedenih antitela ili fragmenata antitela koje treba primeniti. Antitela ili njihovi fragmenti koji imaju povećano poluvreme in vivo mogu se generisati tehnikama poznatim stručnjacima. Na primer, antitela ili njihovi fragmenti sa povećanim poluvremenom in vivo mogu se generisati modifikacijom (npr. zamenom, delecijom ili dodavanjem) aminokiselinskih ostataka koji su identifikovani kao uključeni u interakciju između Fc domena i FcRn receptora.

[0120] Beltramello et al. (2010) su prethodno prijavili modifikaciju neutrališućih mAt, zbog njihove tendencije da poboljšaju infekciju virusom denge, generisanjem u kojem su ostaci leucina na pozicijama 1.3 i 1.2 CH2 domena (prema IMGT jedinstvenom numerisanju za C-domen) zamenjeni ostacima alanina. Ova modifikacija, poznata i kao mutacija „LALA“, ukida vezivanje antitela za FcyRI, FcyRII i FcyRIIIa, kako su opisali Hessell et al. (2007). Varijanta i nemodifikovana rekombinantna mAt upoređena su zbog njihove sposobnosti da neutrališu i poboljšaju infekciju četiri serotipa virusa denge. LALA varijante su zadržale istu neutralizacionu aktivnost kao nemodifikovana mAt, ali su bile potpuno lišene povećanja aktivnosti. LALA mutacije ove prirode se stoga razmatraju u kontekstu trenutno otkrivenih antitela.

[0121] Izmenjena glikozilacija. Konkretno otelotvorenje ovog otkrića je izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koje sadrži suštinski homogeni glikan bez sijalinske kiseline, galaktoze ili fukoze. Monoklonsko antitelo se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca, od kojih oba mogu biti vezana za konstantne regione teškog lanca ili lakog lanca. Gore navedeni suštinski homogeni glikan može biti kovalentno vezan za konstantni region teškog lanca.

[0122] Drugo otelotvorenje ovog otkrića obuhvata mAt sa novim Fc glikozilacionim obrascem. Izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, prisutno je u suštinski homogenoj kompoziciji predstavljenoj glikoformom GNGN ili G1/G2. Fc glikozilacija igra značajnu ulogu u antivirusnim i antikancerogenim svojstvima terapijskih mAt. Otkriće je u skladu sa nedavnom studijom koja pokazuje povećanu virusnu inhibiciju anti-HIV mAt bez fukoze posredovanu ćelijama in vitro. Ovo otelotvorenje ovog otkrića sa homogenim glikanima kojima nedostaje jezgro fukoze, pokazalo je povećanu zaštitu od specifičnih virusa za faktor veći od dvostrukog. Eliminacija jezgra fukoze dramatično poboljšava ADCC aktivnost mAt posredovanu prirodnim ćelijama ubicama (NK), ali izgleda da ima suprotan efekat na ADCC aktivnost polimorfonuklearnih ćelija (PMN).

[0123] Izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koje se sastoji od suštinski homogene kompozicije predstavljene glikoformom GNGN ili G1/G2, pokazuje povećani afinitet vezivanja za Fc gama RI i Fc gama RIII u poređenju sa istim antitelima bez suštinski homogenog glikoforma GNGN i sa glikoformama koje sadrže G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF ili GNGNFX. U jednom otelotvorenju ovog otkrića, antitelo se odvaja od Fc gama RI sa Kd od 1 × 10<-8>M ili manje i od Fc gama RIII sa Kd od 1 × 10<-7>M ili manje.

[0124] Glikozilacija Fc regiona je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenohidratnog dela za bočni lanac ostatka asparagina. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksi aminokiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se takođe može koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. Sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenih hidrata za peptidne sekvence asparaginskog bočnog lanca su asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina. Dakle, prisustvo bilo koje od ovih peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije.

[0125] Obrazac glikozilacije može biti izmenjen, na primer, delecijom jednog ili više mesta glikozilacije koja se nalaze u polipeptidu i/ili dodavanjem jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u polipeptidu. Dodavanje mesta glikozilacije u Fc region antitela se pogodno postiže promenom sekvence aminokiselina tako da sadrži jednu ili više gore opisanih

1

tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Primer varijante glikozilacije ima aminokiselinsku supstituciju ostatka Asn 297 teškog lanca. Promena se takođe može izvršiti dodavanjem ili zamenom jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka sekvenci originalnog polipeptida (za O-vezana mesta glikozilacije). Pored toga, promena Asn 297 u Ala može ukloniti jedno od mesta glikozilacije.

[0126] U određenim otelotvorenjima, antitelo se eksprimira u ćelijama koje eksprimiraju beta (1,4) -N-acetilglukozaminiltransferazu III (GnT iii), tako da GnT III dodaje GlcNAc antitelima IL-23p19. Metode za proizvodnju antitela na takav način date su u WO/9954342, WO/03011878, publikacija patenta 20030003097A1, i Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999. Ćelijske linije se mogu izmeniti kako bi se poboljšale ili smanjile ili eliminisale određene posttranslacione modifikacije, kao što je glikozilacija, korišćenjem tehnologije za uređivanje genoma kao što su klasterisana, pravilno raspoređena kratka palindromska ponavljanja (CRISPR). Na primer, CRISPR tehnologija se može koristiti za eliminisanje gena koji kodiraju glikozilirajuće enzime u 293 ili CHO ćelijama koje se koriste za izražavanje rekombinantnih monoklonskih antitela.

[0127] Eliminacija odgovornosti za proteinsku sekvencu monoklonskih antitela. Moguće je inženjeringovati varijabilne sekvence gena antitela dobijene iz humanih B ćelija kako bi se poboljšala njihova proizvodnost i bezbednost. Potencijalne obaveze sekvence proteina mogu se identifikovati pretraživanjem motiva sekvenci povezanih sa mestima koje sadrže:

1) Neuparene Cys ostatke,

2) N-vezanu glikozilaciju,

3) Asn deamidaciju,

4) Asp izomerizaciju,

5) SYE skraćenje,

6) Met oksidaciju,

2

7) Trp oksidacija,

8) N-terminalni glutamat,

9) Vezivanje integrina,

10) Vezivanje CD11c/CD18, ili

11) Fragmentaciju

Takvi motivi se mogu eliminisati promenom sintetičkog gena za cDNK koja kodira rekombinantna antitela.

[0128] Napori inženjeringa proteina u oblasti razvoja terapijskih antitela jasno otkrivaju da su određene sekvence ili ostaci povezani sa razlikama u rastvorljivosti (Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106 (29), 11937-11942, 2009; Voynov et al., Biocon. Chem., 21 (2), 385-392, 2010) Dokazi iz mutacija koje menjaju rastvorljivost u literaturi ukazuju na to da neki hidrofilni ostaci kao što su asparaginska kiselina, glutaminska kiselina i serin značajno povoljnije doprinose rastvorljivosti proteina od drugih hidrofilnih ostataka, kao što su asparagin, glutamin, treonin, lizin i arginin.

[0129] Stabilnost. Antitela se mogu inženjeringovati za poboljšana biofizička svojstva. Može se koristiti povišena temperatura za odmotavanje antitela za određivanje relativne stabilnosti, koristeći prosečne prividne temperature topljenja. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) meri toplotni kapacitet, Cp, molekula (toplota potrebna za zagrevanje, po stepenu) u funkciji temperature. DSC se može koristiti za proučavanje toplotne stabilnosti antitela. DSC podaci za mAt su posebno interesantni jer ponekad rešavaju odmotavanje pojedinih domena unutar mAt strukture, proizvodeći do tri pika u termogramu (od odmotavanja Fab, CH2, i CH3 domena). Tipično odmotavanje Fab domena proizvodi najjači pik. DSC profili i relativna stabilnost Fc dela pokazuju karakteristične razlike za humane podklase IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4(Garber and Demarest, Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 751-757, 2007). Takođe se može odrediti prosečna prividna temperatura topljenja pomoću cirkularnog dihroizma (CD), izvedenog CD spektrometrom. Far-UV CD spektri će se meriti za antitela u opsegu od 200 do 260 nm u koracima od 0,5 nm. Konačni spektri se mogu odrediti kao proseci od 20 akumulacija.

Vrednosti eliptičnosti ostataka mogu se izračunati nakon oduzimanja pozadine. Termalno odmotavanje antitela (0,1 mg/ml) može se pratiti na 235 nm od 25-95 °C i brzinom zagrevanja od 1 °C/min. Može se koristiti dinamičko rasipanje svetlosti (DLS) za procenu sklonosti ka agregaciji. DLS se koristi za karakterizaciju veličine različitih čestica, uključujući proteine. Ako sistem nije raspršen po veličini, može se odrediti srednji efektivni prečnik čestica. Ovo merenje zavisi od veličine jezgra čestica, veličine površinskih struktura i koncentracije čestica. Pošto DLS u suštini meri fluktuacije intenziteta raspršene svetlosti usled čestica, može se odrediti koeficijent difuzije čestica. DLS softver u komercijalnim DLA instrumentima prikazuje populaciju čestica na različitim prečnicima. Studije stabilnosti se mogu obaviti pogodno koristeći DLS. DLS merenja uzorka mogu pokazati da li se čestice agregiraju tokom vremena ili sa temperaturnom varijacijom određivanjem da li se hidrodinamički radijus čestice povećava. Ako se čestice agregiraju, može se videti veća populacija čestica sa većim radijusom. Stabilnost u zavisnosti od temperature može se analizirati kontrolom temperature in situ. Tehnike kapilarne elektroforeze (CE) uključuju dokazane metodologije za određivanje karakteristika stabilnosti antitela. Može se koristiti iCE pristup za rešavanje varijanti naelektrisanja proteina antitela usled deamidacije, C-terminalnih lizina, sijalilacije, oksidacije, glikozilacije i bilo koje druge promene proteina koja može dovesti do promene pI proteina. Svaki od izraženih proteina antitela može se proceniti visokom prpusnošću, izoelektričnim fokusiranjem slobodnog rastvora (IEF) u kapilarnoj koloni (cIEF), koristeći Protein Simple Maurice instrument. Detekcija UV apsorpcije cele kolone može se vršiti svakih 30 sekundi za praćenje molekula u realnom vremenu fokusirajući se na izoelektrične tačke (PI). Ovaj pristup kombinuje visoku rezoluciju tradicionalnog IEF gela sa prednostima kvantifikacije i automatizacije koje se nalaze u separacijama na bazi kolona, dok eliminiše potrebu za korakom mobilizacije. Tehnika daje ponovljivu, kvantitativnu analizu profila identiteta, čistoće i heterogenosti za izražena antitela. Rezultati identifikuju heterogenost naelektrisanja i molekularno dimenzionisanje antitela, sa režimima detekcije apsorbancije i nativne fluorescencije i sa osetljivošću detekcije do 0,7 µg/ml.

[0130] Rastvorljivost. Može se odrediti rezultat intrinzične rastvorljivosti sekvenci antitela. Rezultati intrinzične rastvorljivosti mogu se izračunati pomoću CamSol Intrinsic (Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015). Sekvence aminokiselina za ostatke 95-102 (Kabat numeracija) u HCDR3 svakog fragmenta antitela kao što je scFv mogu se proceniti putem onlajn programa za izračunavanje rezultata rastvorljivosti. Takođe se može odrediti rastvorljivost korišćenjem laboratorijskih tehnika. Postoje različite tehnike, uključujući

4

dodavanje liofilizovanog proteina rastvoru dok rastvor ne postane zasićen i dok se ne dostigne granica rastvorljivosti, ili koncentracija ultrafiltracijom u mikrokoncentratoru sa odgovarajućom graničnom vrednošću molekulske mase. Najjednostavnija metoda je indukcija amorfne precipitacije, koja meri rastvorljivost proteina metodom koja uključuje precipitaciju proteina korišćenjem amonijum sulfata (Trevino et al., J Mol Biol, 366: 449-460, 2007). Precipitacija amonijum sulfata daje brze i tačne informacije o relativnim vrednostima rastvorljivosti. Precipitacija amonijum sulfata proizvodi istaložene rastvore sa dobro definisanim vodenim i čvrstim fazama i zahteva relativno male količine proteina. Merenja rastvorljivosti koja se vrše indukcijom amorfnog taloženja amonijum sulfatom takođe se mogu lako vršiti pri različitim pH vrednostima. Rastvorljivost proteina je veoma zavisna od pH, a pH se smatra najvažnijim ekstrinzičnim faktorom koji utiče na rastvorljivost.

[0131] Autoreaktivnost. Generalno, smatra se da autoreaktivne klonove treba eliminisati tokom ontogeneze negativnom selekcijom, međutim, postalo je jasno da mnoga humana prirodna antitela sa autoreaktivnim svojstvima i dalje postoje u zrelim repertoarima odraslih, a autoreaktivnost može poboljšati antivirusnu funkciju mnogih antitela na patogene. Primećeno je da su HCDR3 petlje u antitelima tokom ranog razvoja B ćelija često bogate pozitivnim nabojem i pokazuju autoreaktivne obrasce (Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003). Može se testirati dato antitelo na autoreaktivnost procenom nivoa vezivanja za ćelije humanog porekla u mikroskopiji (koristeći adherentne HeLa ili HEp-2 epitelne ćelije) i bojenjem površine ćelije protočnom citometrijom (koristeći suspenziju Jurkat T ćelija i 293S humanih embrionalnih ćelija bubrega). Autoreaktivnost se takođe može ispitati pomoću procene vezivanja za tkiva u tkivnim nizovima.

[0132] Preferirani ostaci („Humana sličnost“). Dubinsko sekvenciranje humanih B ćelija od davalaca krvi na repertoaru B ćelija vrši se u širokom obimu u mnogim nedavnim studijama. Informacije o sekvenci o značajnom delu repertoara lhumanih antitela olakšavaju statističku procenu karakteristika sekvence antitela koje su uobičajene kod zdravih ljudi. Sa znanjem o karakteristikama sekvence antitela u referentnoj bazi podataka varijabilnih gena humanih rekombinovanih antitela, može se proceniti poziciono specifičan stepen „humane sličnosti“ (HL) sekvence antitela. Pokazalo se da je humana sličnost korisna za razvoj antitela u kliničkoj upotrebi, kao što su terapijska antitela ili antitela kao vakcine. Cilj je da se poveća humana sličnost antitela kako bi se smanjili potencijalni neželjeni efekti i imunološki odgovori antitela koji će dovesti do značajno smanjene efikasnosti leka antitela ili mogu izazvati ozbiljne zdravstvene implikacije. Mogu se proceniti karakteristike antitela kombinovanog repertoara antitela tri zdrava davaoca ljudske krvi od ukupno oko 400 miliona sekvenci i kreirati novi rezultat „relativne humane sličnosti“ (rHL) koji se fokusira na hipervarijabilni region antitela. Rezultat relativne humane sličnosti omogućava lako razlikovanje humanih (pozitivan rezultat) i nehumanih sekvenci (negativan rezultat). Antitela se mogu konstruisati tako da eliminišu ostatke koji nisu uobičajeni u humanim repertoarima.

D. Jednolančana antitela

[0133] Jednolančani varijabilni fragment (scFv) je fuzija varijabilnih regiona teških i lakih lanaca imunoglobulina, povezanih zajedno sa kratkim (obično serinskim, glicinskim) linkerom. Ovaj himerni molekul zadržava specifičnost originalnog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linker peptida. Ova modifikacija obično ostavlja specifičnost nepromenjenom. Ovi molekuli su istorijski stvoreni da olakšaju prikaz faga gde je veoma pogodno izraziti domen vezivanja antigena kao jedan peptid. Alternativno, scFv se može kreirati direktno iz subkloniranih teških i lakih lanaca izvedenih iz hibridoma ili B ćelije. Jednolančani varijabilni fragmenti nemaju konstantan Fc region koji se nalazi u kompletnim molekulima antitela, pa se stoga zajednička mesta vezivanja (npr. protein A/G) koriste za prečišćavanje antitela. Ovi fragmenti se često mogu prečistiti/imobilizovati korišćenjem proteina L jer protein L stupa u interakciju sa varijabilnim regionom kapa lakih lanaca.

[0134] Fleksibilni linkeri se generalno sastoje od aminokiselinskih ostataka koji promovišu heliks i okretanje kao što su alanin, serin i glicin. Međutim, i drugi ostaci mogu da funkcionišu. Tang et al. (1996) su koristili prikaz faga kao sredstvo brzog odabira prilagođenih linkera za jednolančana antitela (scFvs) iz biblioteka proteinskih linkera. Konstruisana je biblioteka nasumičnih linkera u kojoj su geni za varijabilne domene teškog i lakog lanca povezani segmentom koji kodira polipeptid sa 18 aminokiselina varijabilne kompozicije. ScFv repertoar (približno 5 × 10<6>različitih članova) prikazan je na filamentoznom fagu i podvrgnut selekciji afiniteta sa haptenom. Populacija odabranih varijanti pokazala je značajno povećanje aktivnosti vezivanja, ali je zadržala značajnu raznolikost sekvenci. Skrining 1054 pojedinačne varijante je naknadno dao katalitički aktivan scFv koji je proizveden efikasno u rastvorljivom obliku. Analiza sekvence otkrila je konzervirani prolin u linkeru dva ostatka nakon VHC terminusa i obilje arginina i prolina na drugim pozicijama kao jedine zajedničke karakteristike odabranih tetera.

[0135] Rekombinantna antitela ovog otkrića takođe mogu uključivati sekvence ili delove koji omogućavaju dimerizaciju ili multimerizaciju receptora. Takve sekvence uključuju one izvedene iz IgA, koje omogućavaju formiranje multimera u vezi sa J-lancem. Drugi domen multimerizacije je domen dimerizacije Gal4. U drugim otelotvorenjima, lanci se mogu modifikovati agensima kao što su biotin/avidin, koji omogućavaju kombinaciju dva antitela.

[0136] U drugom otelotvorenju, jednolančano antitelo se može kreirati spajanjem lakih i teških lanaca receptora pomoću nepeptidnog linkera ili hemijske jedinice. Generalno, laki i teški lanci će biti proizvedeni u različitim ćelijama, prečišćeni i naknadno povezani na odgovarajući način (tj. N-terminus teškog lanca će biti vezan za C-terminus lakog lanca preko odgovarajućeg hemijskog mosta).

[0137] Unakrsno povezujući reagensi se koriste za formiranje molekularnih mostova koji vezuju funkcionalne grupe dva različita molekula, npr. agens za stabilizaciju i koagulaciju. Međutim, razmatra se mogućnost stvaranja dimera ili multimera istih analognih ili heteromernih kompleksa koji se sastoje od različitih analoga. Da bi se postepeno povezala dva različita jedinjenja, mogu se koristiti heterobifunkcionalni unakrsni linkeri koji eliminišu neželjeno formiranje homopolimera.

[0138] Primerni hetero-bifunkcionalni unakrsni linker sadrži dve reaktivne grupe: jednu koja reaguje sa primarnom aminskom grupom (npr. N-hidroksi sukcinimid) i drugu koja reaguje sa tiolnom grupom (npr. piridil disulfid, maleimidi, halogeni, itd.). Kroz primarnu amin reaktivnu grupu, unakrsni linker može reagovati sa lizinskim ostatkom jednog proteina (npr. izabranim antitelima ili fragmentom) i kroz tiol reaktivnu grupu, unakrsni linker, već vezan za prvi protein, reaguje sa cisteinskim ostatkom (slobodna sulfhidrilna grupa) drugog proteina (npr. selektivni agens).

[0139] Preferira se da se koristi unakrsni linker koji ima razumnu stabilnost u krvi. Poznate su brojne vrste linkera koji sadrže disulfidne veze koje se mogu uspešno koristiti za konjugovanje ciljnih i terapijskih/preventivnih agenasa. Linkeri koji sadrže disulfidnu vezu koja je sterički ometana mogu se pokazati da daju veću stabilnost in vivo, sprečavajući oslobađanje ciljnog peptida pre nego što dostigne mesto delovanja. Ovi linkeri su stoga jedna grupa agenasa za povezivanje.

[0140] Drugi reagens za unakrsno povezivanje je SMPT, koji je bifunkcionalni unakrsni linker koji sadrži disulfidnu vezu koju „sterički ometaju“ susedni benzenski prsten i metil grupe. Smatra se da steričko ometanje disulfidne veze služi u funkciji zaštite veze od napada tiolatnih anjona kao što je glutation koji može biti prisutan u tkivima i krvi, i time pomaže u sprečavanju odvajanja konjugata pre isporuke pričvršćenog agensa na ciljno mesto.

[0141] SMPT reagens za unakrsno povezivanje, kao i mnogi drugi poznati reagensi za unakrsno povezivanje, omogućava unakrsno povezivanje funkcionalnih grupa kao što je SH cisteina ili primarnih amina (npr. epsilonska amino grupa lizina). Drugi mogući tip unakrsnog linkera uključuje heterobifunkcionalne fotoreaktivne fenilazide koji sadrže cepivu disulfidnu vezu kao što je sulfosukcinimidil-2-(p-azido salicilamido) etil-1,3'-ditiopropionat. N-hidroksisukcinimidilna grupa reaguje sa primarnim aminokiselinskim grupama, a fenilazid (nakon fotolize) reaguje neselektivno sa bilo kojim aminokiselinskim ostatkom.

[0142] Pored ometanih unakrsnih linkera, u skladu sa ovim mogu se koristiti i neometani linkeri. Ostali korisni unakrsni linkeri, za koje se ne smatra da sadrže ili generišu zaštićeni disulfid, uključuju SATA, SPDP i 2-iminotiolan (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). Upotreba takvih unakrsnih linkera dobro je shvaćena u struci. Drugo otelotvorenje uključuje upotrebu fleksibilnih linkera.

[0143] Američki patent 4.680.338, opisuje bifunkcionalne linkere korisne za proizvodnju konjugata liganda sa polimerima i/ili proteinima koji sadrže amin, posebno za formiranje konjugata antitela sa helatorima, lekovima, enzimima, detektabilnim oznakama i slično. Američki patenti 5.141.648 i 5.563.250 otkrivaju cepive konjugate koji sadrže labilnu vezu koja se može cepati u različitim blagim uslovima. Ovaj linker je posebno koristan po tome što agens od interesa može biti vezan direktno za linker, pri čemu cepanje dovodi do oslobađanja aktivnog agensa. Posebne upotrebe uključuju dodavanje slobodne amino ili slobodne sulfhidrilne grupe proteinu, kao što je antitelo ili lek.

[0144] Američki patent 5.856.456 obezbeđuje peptidne veze za upotrebu u povezivanju polipeptidnih sastojaka za pravljenje fuzionih proteina, npr. jednolančanih antitela. Linker je dužine do oko 50 aminokiselina, sadrži najmanje jednu pojavu naelektrisane aminokiseline (po mogućnosti arginina ili lizina) praćenu prolinom, a karakteriše ga veća stabilnost i smanjena agregacija. Američki patent 5.880.270 otkriva linkere koji sadrže aminooksi korisne u različitim imunodijagnostičkim i separativnim tehnikama.

E. Multispecifična antitela

[0145] U određenim otelotvorenjima otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, antitela ovog otkrića su bispecifična ili multispecifična. Bispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa. Primeri bispecifičnih antitela mogu se vezati za dva različita epitopa jednog antigena. Druga takva antitela mogu kombinovati mesto vezivanja prvog antigena sa mestom vezivanja za drugi antigen. Alternativno, antipatogena grupa se može kombinovati sa grupom koja se vezuje za pokretački molekul na leukocitu, kao što je molekul receptora T-ćelija (npr. CD3) ili Fc receptori za IgG (FcyR), kao što su FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) i Fc gama RIII (CD16), kako bi se fokusirali i lokalizovali mehanizmi ćelijske odbrane na inficiranu ćeliju. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa za inficirane ćelije. Ova antitela poseduju grupu koja vezuje patogene i grupu koja vezuje citotoksični agens (npr. saporin, anti-interferon-α, vinka alkaloid, lanac ricina A, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten). Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela (npr. F(ab')2bispecifična antitela). WO 96/16673 opisuje bispecifično anti-ErbB2/anti-Fc gama RIII antitelo, a ameročki patent 5.837.234 otkriva bispecifično anti-ErbB2/anti-Fc gama RI antitelo. Bispecifično anti-ErbB2/Fc alfa antitelo je prikazano u WO98/02463. Američki patent 5.821.337 govori o bispecifičnom anti-ErbB2/anti-CD3 antitelu.

[0146] Metode za pravljenje bispecifičnih antitela poznate su u struci. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine zasniva se na koekspresiji dva para teškog lanca imunoglobulina i lakog lanca, pri čemu dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Zbog slučajnog asortimana imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu često različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula, koje se obično vrši koracima afinitetne hromatografije, prilično je glomazno, a prinosi proizvoda su niski. Slični postupci su otkriveni u WO 93/08829, i u Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[0147] Prema drugačijem pristupu, varijabilni regioni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta kombinovanja antitela i antigena) spojeni su sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Po mogućnosti, fuzija je sa konstantnim domenom Ig teškog lanca, koji obuhvata najmanje deo CH2, i CH3zglobnih regiona. Preferira se da prvi konstantni region teškog lanca (CH1) sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutno u najmanje jednoj od fuzija. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina i, po želji, lakog lanca imunoglobulina, ubacuju se u odvojene vektore ekspresije i ko-transfektuju se u odgovarajuću ćeliju domaćina. Ovo obezbeđuje veću fleksibilnost u prilagođavanju međusobnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u otelotvorenjima kada nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca koji se koriste u konstrukciji pružaju optimalan prinos željenog bispecifičnog antitela. Međutim, moguće je ubaciti sekvence kodiranja za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan vektor ekspresije kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultira visokim prinosima ili kada odnosi nemaju značajan uticaj na prinos željene kombinacije lanca.

[0148] U konkretnom otelotvorenju ovog pristupa, bispecifična antitela se sastoje od hibridnog teškog lanca imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja u jednoj grupi i hibridnog para teškog lanca imunoglobulina i lakog lanca (pružajući drugu specifičnost vezivanja) u drugoj grupi. Utvrđeno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanca imunoglobulina, jer prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula omogućava lakši način odvajanja. Ovaj pristup je otkriven u WO 94/04690. Za više detalja o generisanju bispecifičnih antitela pogledajte, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

[0149] Prema drugom pristupu opisanom u američkom patentu 5.731.168, interfejs između para molekula antitela može biti projektovan tako da se maksimizira procenat heterodimera koji se oporavljaju iz rekombinantne ćelijske kulture. Preferirani interfejs obuhvata najmanje deo CH3domena. U ovoj metodi, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina iz interfejsa prvog molekula antitela zamenjuju se većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzacione „šupljine“ identične ili slične veličine kao veliki bočni lanci nastaju na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećavanje prinosa heterodimera umesto drugih neželjenih krajnjih proizvoda, kao što su homodimeri.

[0150] Bispecifična antitela uključuju unakrsno povezana ili „heterokonjugatna“ antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovano sa avidinom, drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena za ciljanje ćelija imunog sistema na neželjene ćelije (američki patent 4.676.980), kao i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Heterokonjugatna antitela se mogu napraviti korišćenjem bilo kojih pogodnih postupaka unakrsnog vezivanja. Pogodni agensi za unakrsno povezivanje su dobro poznati u struci i otkriveni su u američkom patentu 4.676.980, zajedno sa nizom tehnika unakrsnog povezivanja.

[0151] Tehnike za generisanje bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela su takođe opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela se mogu pripremiti hemijskim povezivanjem. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) opisuju proceduru u kojoj se netaknuta antitela proteolitički cepaju da bi se generisali F(ab')2fragmenti. Ovi fragmenti se redukuju u prisustvu agensa za kompleksiranje ditola, natrijum arsenita, radi stabilizacije vicinalnih ditola i sprečavanja stvaranja intermolekularnih disulfida. Generisani Fab' fragmenti se zatim pretvaraju u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata je zatim ponovo pretvoren u Fab'-tiol pomoću redukcije merkaptoetilaminom i pomešan je sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata kako bi nastalo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.

[0152] Postoje tehnike koje olakšavaju direktan oporavak Fab'-SH fragmenata iz E. coli, koji se mogu hemijski spojiti da bi se formirala bispecifična antitela. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisuju proizvodnju molekula humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab')2. Svaki Fab' fragment je odvojeno izlučen iz E. coli i podvrgnut direktnom hemijskom spajanju in vitro da bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo moglo je da se veže za ćelije koje prekomerno eksprimiraju receptor ErbB2 i normalne humane T ćelije, kao i da pokrene litičku aktivnost humanih citotoksičnih limfocita protiv humanih meta tumora dojke.

[0153] Opisane su i različite tehnike za pravljenje i izolaciju fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture (Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16, 677-681 (1998). doi:10.1038/nbt0798-677pmid:9661204). Na primer, bispecifična antitela su proizvedena pomoću leucinskih zatvarača (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992). Peptidi sa leucinskim zatvaračem iz Fos i Jun proteina povezani su sa Fab' delovima

1

dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u zglobnom regionu da bi se formirali monomeri, a zatim su ponovo oksidovani da bi se formirali heterodimeri antitela. Ovaj postupak takođe može da se koristi za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija „diatela“ koju su opisali Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) je obezbedila alternativni mehanizam za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti obuhvataju VHpovezan sa VLpreko linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VHi VLdomeni jednog fragmenta su primorani da se upare sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva mesta vezivanja antigena. Takođe je prijavljena još jedna strategija za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera. Pogledajte, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

[0154] U konkretnom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, bispecifično ili multispecifično antitelo može se formirati kao DOCK-AND-LOCK<™>(DNL<™>) kompleks (pogledajte, npr. američke patente 7.521.056; 7.527.787; 7.534.866; 7.550.143 i 7.666.400). generalno, tehnika koristi prednosti specifičnih interakcija vezivanja visokog afiniteta koje se javljaju između sekvence domena dimerizacije i dokinga (DDD) regulatornih (R) podjedinica cAMP-zavisne proteinske kinaze (PKA) i sekvence sidrenog domena (AD) izvedene iz bilo kog od različitih AKAP proteina (Baillie et al., FEES Letters.2005; 579:3264; Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.2004; 5: 959). DDD i AD peptidi mogu biti vezani za bilo koji protein, peptid ili drugi molekul. Pošto se DDD sekvence spontano dimerizuju i vezuju za AD sekvencu, tehnika omogućava formiranje kompleksa između bilo kojih izabranih molekula koji mogu biti vezani za DDD ili AD sekvence.

[0155] Razmatraju se antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela (Tutt et al., J. Imunol.147: 60, 1991; Xu et al., Science, 358(6359):85-90, 2017). Multivalentno antitelo može biti internalizovano (i/ili katabolizovano) brže od bivalentnog antitela od strane ćelije koja izražava antigen na koji se antitela vezuju. Antitela ovog

otkrića mogu biti multivalentna antitela sa tri ili više mesta vezivanja antigena (npr. tetravalentna antitela), koja se mogu lako proizvesti rekombinantnom ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela. Multivalentno antitelo može da sadrži domen za dimerizaciju i tri ili više antigen vezujućih mesta. Preferirani domen dimerizacije obuhvata

2

(ili se sastoji od) Fc regiona ili zglobnog regiona. U ovom scenariju, antitelo će se sastojati od Fc regiona i tri ili više amino-terminalnih mesta vezivanja antigena za Fc region. Preferirano multivalentno antitelo ovde uključuje (ili se sastoji od) tri do oko osam, ali poželjno četiri, mesta vezivanja antigena. Multivalentno antitelo se sastoji od najmanje jednog polipeptidnog lanca (i po mogućnosti dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanac(lanci) obuhvataju dva ili više varijabilnih regiona. Na primer, polipeptidni lanac može se sastojati od VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni region, VD2 je drugi varijabilni region, Fc je jedan polipeptidni lanac Fc regiona, X1 i X2 predstavljaju aminokiselinu ili polipeptid, a n je 0 ili 1. Na primer, polipeptidni lanci mogu da sadrže: VH-CH1-fleksibilni linker-VH-CH1-lanac Fc regiona; ili VH-CH1-VH-CH1-lanac Fc regiona. Multivalentno antitelo ovde poželjno dalje sadrži najmanje dva (i poželjno četiri) polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca. Multivalentno antitelo ovde može, na primer, da sadrži od oko dva do oko osam polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca. Ovde razmatrani polipeptidi varijabilnog regiona lakog lanca obuhvataju varijabilni region lakog lanca i, opciono, dalje obuhvataju domen CL.

[0156] Modifikacije punjenja su posebno korisne u kontekstu multispecifičnog antitela, gde supstitucije aminokiselina u molekulima Fab rezultiraju smanjenjem pogrešnog uparivanja lakih lanaca sa neuparenim teškim lancima (sporedni proizvodi tipa Bence-Jones), što se može javiti u proizvodnji bi-/multispecifičnih molekula vezanih za antigen na bazi Fab sa razmenom VH/VL u jednom (ili više, u slučaju molekula koji se sastoje od više od dva molekula Fab koji se vezuju za antigen) njihovih vezivnih grupa (pogledajte takođe publikaciju PCT br. WO 2015/150447, naročito primere u njoj).

[0157] Shodno tome, u određenim otelotvorenjima otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, antitelo koje se sastoji od terapijskog agensa obuhvata

(a) prvi Fab molekul koji se specifično vezuje za prvi antigen

(b) drugi Fab molekul koji se specifično vezuje za drugi antigen, i pri čemu se varijabilni domeni VL i VH Fab lakog lanca i Fab teškog lanca međusobno zamenjuju,

pri čemu je prvi antigen aktivirajući antigen T ćelije, a drugi antigen je antigen ciljne ćelije, ili je prvi antigen ciljne ćelije, a drugi antigen je aktivirajući antigen T ćelije; i

pri čemu je

i) u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 124 zamenjena pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (numerisanje prema Kabatu), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 zamenjena negativno naelektrisanom aminokiselinom (numerisanje prema Kabat EU indeksu); ili

ii) u konstantnom domenu CL drugog Fab molekula pod b) aminokiselina na poziciji 124 je zamenjena pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (numerisanje prema Kabatu), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 drugog Fab molekula pod b) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 zamenjena negativno naelektrisanom aminokiselinom (numerisanje prema Kabat EU indeksu).

Antitelo ne sme da sadrži obe modifikacije navedene pod i) i ii). Konstantni domeni CL i CH1 drugog Fab molekula se međusobno ne zamenjuju (tj. ostaju nepromenjeni).

[0158] U drugom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, antitelo, u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno zamenjena lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom preferiranom otelotvorenju nezavisno od lizina (K) ili arginina (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 je nezavisno zamenjena glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabat EU indeksu).

[0159] U daljem otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno zamenjena lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 147 je nezavisno zamenjena glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje prema Kabat EU indeksu).

4

[0160] U konkretnom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno zamenjena lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom preferiranom otelotvorenju nezavisno od lizina (K) ili arginina (R)), a aminokiselina na poziciji 123 je nezavisno zamenjena lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom preferiranom otelotvorenju nezavisno od lizina (K) ili arginina (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina na poziciji 147 je nezavisno zamenjena glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabat EU indeksu), a aminokiselina na poziciji 213 je nezavisno zamenjena glutaminskom kiselinom (E), kao partičnom kiselinom (D) (prema Kabat EU indeksu).

[0161] U konkretnijem otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 124 je zamenjena lizinom (K) (numerisanje prema Kabatu), a aminokiselina na poziciji 123 je zamenjena lizinom (K) ili argininom (R) (numerisanje prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 147 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numerisanje prema Kabat EU indeksu), a aminokiselina na poziciji 213 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numerisanje prema Kabat EU indeksu).

[0162] U još konkretnijem otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 124 je zamenjena lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), a aminokiselina na poziciji 123 je zamenjena argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina na poziciji 147 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabat EU indeksu), a aminokiselina na poziciji 213 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabat EU indeksu).

F. Himerni antigenski receptori

[0163] Veštački T-ćelijski receptori (takođe poznati kao himerni T-ćelijski receptori, himerni imunoreceptori, himerni antigenski receptori (CAR)) su inženjerski receptori, koji presađuju proizvoljnu specifičnost na imunološku efektorsku ćeliju. Tipično, ovi receptori se koriste za presađivanje specifičnosti monoklonskog antitela na T ćeliju, uz prenos njihove sekvence kodiranja olakšan retrovirusnim vektorima. Na ovaj način veliki broj T ćelija specifičnih za metu može da se generiše za adoptivni transfer ćelija. Klinička ispitivanja faze I ovog pristupa pokazuju efikasnost.

[0164] Najčešći oblik ovih molekula su fuzije jednolančanih promenljivih fragmenata (scFv) izvedenih iz monoklonskih antitela, spojenih sa CD3-zeta transmembranom i endodomenom. Takvi molekuli rezultiraju prenosom zeta signala kao odgovor na prepoznavanje mete od strane scFv. Primer takve konstrukcije je 14g2a-Zeta, koja je fuzija scFv izvedena iz hibridoma 14g2a (koji prepoznaje disialogangliozid GD2). Kada T ćelije eksprimiraju ovaj molekul (obično se postiže transdukcijom onkoretrovirusnog vektora), one prepoznaju i ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju GD2 (npr. ćelije neuroblastoma). Da bi ciljali maligne B ćelije, istraživači su preusmerili specifičnost T ćelija korišćenjem himernog imunoreceptora specifičnog za molekul B-linije, CD19.

[0165] Varijabilni delovi teškog i lakog lanca imunoglobulina spojeni su fleksibilnim linkerom kako bi se formirao scFv. Ovom scFv-u prethodi signalni peptid za usmeravanje novonastalog proteina na endoplazmatski retikulum i naknadnu površinsku ekspresiju (ovo se cepa). Fleksibilni odstojnik omogućava scFv-u da se orijentiše u različitim pravcima kako bi se omogućilo vezivanje antigena. Transmembranski domen je tipičan hidrofobni alfa heliks obično izveden iz originalnog molekula signalnog endodoma koji strši u ćeliju i prenosi željeni signal.

[0166] Proteini tipa I su u stvari dva proteinska domena povezana transmembranskim alfa heliksom između. Lipidni dvosloj ćelijske membrane, kroz koji prolazi transmembranski domen, deluje tako da izoluje unutrašnji deo (endodomen) od spoljašnjeg dela (ektodomen). Nije toliko iznenađujuće da vezivanje ektodomena sa jednog proteina na endodomen drugog proteina rezultira molekulom koji kombinuje prepoznavanje prvog sa signalom drugog.

[0167] Ektodomen. Signalni peptid usmerava novonastali protein u endoplazmatski retikulum. Ovo je od suštinskog značaja ako receptor treba da bude glikoziliran i usidren u ćelijskoj membrani. Svaka sekvenca peptida eukariotskog signala obično dobro funkcioniše. Generalno, koristi se signalni peptid koji je nativno vezan za većinu komponente amino-terminala (npr. u scFv sa orijentacionim lakim lancem - linkerom - teškim lancem, koristi se nativni signal lakog lanca).

[0168] Domen prepoznavanja antigena je obično scFv. Međutim, postoji mnogo alternativa. Opisan je domen za prepoznavanje antigena iz alfa i beta jednostrukih lanaca nativnih T-ćelija (TCR), kao i jednostavni ektodomeni (npr. ektodomen CD4 za prepoznavanje HIV inficiranih ćelija) i više egzotičnih komponenti za prepoznavanje kao što je povezani citokin (što dovodi do prepoznavanja ćelija koje nose citokinski receptor). U stvari, skoro sve što se vezuje za datu metu sa visokim afinitetom može se koristiti kao region prepoznavanja antigena.

[0169] Region odstojnika povezuje domen vezivanja antigena sa transmembranskim domenom. Trebalo bi da bude dovoljno fleksibilan da omogući da se domen vezivanja antigena orijentiše u različitim pravcima kako bi se olakšalo prepoznavanje antigena. Najjednostavniji oblik je zglobni region iz IgG1. Alternative uključuju CH2CH3region imunoglobulina i delove CD3. Za većinu konstrukcija zasnovanih na scFv-u dovoljan je IgG1 zglob. Međutim, najbolji odstojnik se često mora odrediti empirijski.

[0170] Transmembranski domen. Transmembranski domen je hidrofobni alfa heliks koji se prostire membranom. Generalno, koristi se transmembranski domen iz najviše membranske proksimalne komponente endodomena. Interesantno je da korišćenje CD3-zeta transmembranskog domena može dovesti do ugradnje veštačkog TCR-a u nativni TCR faktor koji zavisi od prisustva nativnog CD3-zeta transmembranskog naelektrisanog ostatka asparaginske kiseline. Različiti transmembranski domeni rezultiraju različitom stabilnošću receptora. Transmembranski domen CD28 rezultira svetlo izraženim, stabilnim receptorom.

[0171] Endodomen. Ovo je „poslovni kraj“ receptora. Nakon prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se prenosi u ćeliju. Najčešće korišćena komponenta endodomena je CD3-zeta koja sadrži 3 ITAM-a. Ovo prenosi signal aktivacije na T ćeliju nakon vezivanja antigena. CD3-zeta možda neće obezbediti potpuno kompetentan signal za aktivaciju i potrebna je dodatna kostimulatorna signalizacija.

[0172] CAR „prve generacije“ su obično imali intracelularni domen iz CD3 lanca, koji je primarni transmiter signala iz endogenih TCR. CAR „druge generacije“ dodaju intracelularne domene signalizacije iz različitih kostimulatornih receptora proteina (npr. CD28, 41BB, ICOS) u citoplazmatski rep CAR-a kako bi pružili dodatne signale T ćeliji. Pretkliničke studije su pokazale da druga generacija dizajna CAR poboljšava antitumorsku aktivnost T ćelija. Noviji, CAR „treće generacije“ kombinuju više domena signalizacije, kao što su CD3z-CD28-41BB ili CD3z-CD28-OX40, kako bi se dodatno povećala potencija.

G. ADC

[0173] Konjugati antitela i leka ili ADC su nova klasa visoko potentnih biofarmaceutskih lekova dizajniranih kao ciljana terapija za lečenje ljudi sa zaraznom bolešću. ADC su složeni molekuli koji se sastoje od antitela (celog mAt ili fragmenta antitela kao što je jednolančani varijabilni fragment ili scFv) povezanog, preko stabilnog hemijskog linkera sa labilnim vezama, sa biološki aktivnim citotoksičnim/antivirusnim korisnim teretom ili lekom. Konjugati antitela i leka su primeri biokonjugata i imunokonjugata.

[0174] Kombinovanjem jedinstvenih sposobnosti ciljanja monoklonskih antitela sa sposobnošću citotoksičnih lekova da ubiju karcinom, konjugati antitela i leka omogućavaju osetljivu diskriminaciju između zdravog i obolelog tkiva. To znači da, za razliku od tradicionalnih sistemskih pristupa, konjugati antitela i leka ciljaju i napadaju zaraženu ćeliju tako da su zdrave ćelije manje pogođene.

[0175] U razvojnim antitumorskim terapijama zasnovanim na ADC-u, lek protiv kancera (npr. ćelijski toksin ili citotoksin) se spaja sa antitelima koja specifično ciljaju određeni ćelijski marker (npr. protein koji se, u idealnom slučaju, može naći samo u ili na zaraženim ćelijama). Antitela prate ove proteine u telu i vezuju se za površinu ćelija kancera. Biohemijska reakcija između antitela i ciljnog proteina (antigena) pokreće signal u tumorskoj ćeliji, koja zatim apsorbuje ili internalizira antitelo zajedno sa citotoksinom. Nakon internalizacije ADC-a, citotoksični lek se oslobađa i ubija ćeliju ili narušava replikaciju virusa. Zbog ovog ciljanja, idealno bi bilo da lek ima manja neželjena dejstva i daje širi terapijski prozor od drugih agenasa.

[0176] Stabilna veza između antitela i citotoksičnog/antivirusnog agensa je ključni aspekt ADC-a. Linkeri se zasnivaju na hemijskim motivima koji uključuju disulfide, hidrazone ili peptide (koji se mogu cepati) ili tioetere (koji se ne mogu cepiti) i kontrolišu distribuciju i isporuku citotoksičnog agensa u ciljnu ćeliju. U pretkliničkim i kliničkim ispitivanjima dokazano je da su tipovi veza koji se mogu cepati i koji se ne mogu cepati bezbedni.

Brentuksimab vedotin uključuje enzimski osetljiv cepivi linker koji isporučuje potentni i visoko toksični antimikrotubularni agens Monometil auristatin E ili MMAE, sintetički antineoplastični agens, humanim specifičnim CD30-pozitivnim malignim ćelijama. Zbog svoje visoke toksičnosti, MMAE, koji inhibira deobu ćelija blokiranjem polimerizacije tubulina, ne može se koristiti kao hemoterapijski lek sa jednim agensom. Međutim, kombinacija MMAE povezana sa anti-CD30 monoklonskim antitelima (cAC10, protein ćelijske membrane faktora tumorske nekroze ili TNF receptora) pokazala se stabilnom u ekstracelularnoj tečnosti, cepivom katepsinom i bezbednom za terapiju. Trastuzumab emtanzin, drugi odobreni ADC, je kombinacija inhibitora formiranja mikrotubula mertanzina (DM-1), derivata majtanzina, i trastuzumaba antitela (Herceptin<®>/Genentech/Roche) vezanog stabilnim, necepivim linkerom.

Dostupnost boljih i stabilnijih linkera promenila je funkciju hemijske veze. Tip linkera, cepiv ili necepiv, daje specifična svojstva citotoksičnom (antikancerogenom) leku. Na primer, linker koji je necepiv drži lek unutar ćelije. Kao rezultat toga, celokupno antitelo, linker i citotoksični agens ulaze u ciljanu ćeliju kancera gde se antitelo razgrađuje do nivoa aminokiseline. Dobijeni kompleks - aminokiselina, linker i citotoksični agens - sada postaje aktivni lek. Nasuprot tome, cepivi linkeri se katalizuju enzimima u ćeliji domaćina gde oslobađaju citotoksični agens.

[0177] Druga vrsta cepivog linkera, koja je trenutno u razvoju, dodaje dodatni molekul između citotoksičnog/antivirusnog leka i mesta cepanja. Ova tehnologija linkera omogućava istraživačima da kreiraju ADC sa više fleksibilnosti bez brige o promeni kinetike cepanja. Istraživači takođe razvijaju novu metodu cepanja peptida zasnovanu na Edmanovoj degradaciji, metodu sekvenciranja aminokiselina u peptidu. Budući pravac u razvoju ADC takođe uključuje razvoj konjugacije specifične za mesto (TDC) za dalje poboljšanje stabilnosti i terapijskog indeksa i α emitujućih imunokonjugata i nanočestica konjugovanih antitelima.

H. BiTE

[0178] Bi-specifični antagonisti T-ćelija (BiTE) su klasa veštačkih bispecifičnih monoklonskih antitela koja se istražuju za upotrebu kao lekovi protiv kancera. Oni usmeravaju imunološki sistem domaćina, tačnije citotoksičnu aktivnost T ćelija, protiv zaraženih ćelija. BiTE je registrovani zaštitni znak kompanije Micromet AG.

[0179] BiTE su fuzioni proteini koji se sastoje od dva jednolančana promenljiva fragmenta (scFvs) različitih antitela, ili sekvenci aminokiselina iz četiri različita gena, na jednom peptidnom lancu od oko 55 kilodaltona. Jedan od scFvs se vezuje za T ćelije preko CD3 receptora, a drugi za zaraženu ćeliju preko specifičnog molekula.

[0180] Kao i druga bispecifična antitela, i za razliku od običnih monoklonskih antitela, BiTE formiraju vezu između T ćelija i ciljnih ćelija. To uzrokuje citotoksičnu/antivirusnu aktivnost T ćelija na zaraženim ćelijama proizvodnjom proteina kao što su perforin i granzimi, nezavisno od prisustva MHC I ili kostimulatornih molekula. Ovi proteini ulaze u inficirane ćelije i iniciraju apoptozu ćelije. Ovo delovanje oponaša fiziološke procese uočene tokom napada T ćelija na zaražene ćelije.

I. Intratela

[0181] U konkretnom otelotvorenju, antitelo je rekombinantno antitelo koje je pogodno za delovanje unutar ćelije - takva antitela su poznata kao „intratela“. Ova antitela mogu ometati ciljnu funkciju različitim mehanizmima, kao što su promena unutarćelijskog transfera proteina, ometanje enzimske funkcije i blokiranje interakcija protein-protein ili protein-DNK. Na mnogo načina, njihove strukture oponašaju ili su paralelne sa antitelima sa jednim lancem i jednim domenom, o kojima je gore diskutovano. Zaista, jednolančani transkript je važna karakteristika koja omogućava intracelularnu ekspresiju u ciljnoj ćeliji, a takođe čini tranzit proteina kroz ćelijske membrane izvodljivijim. Međutim, potrebne su dodatne funkcije.

[0182] Dva glavna problema koja utiču na primenu terapije intratelima su isporuka, uključujući ciljanje ćelija/tkiva i stabilnost. Što se tiče isporuke, primenjeni su različiti pristupi, kao što su isporuka usmerena na tkivo, upotreba promotera specifičnih za ćelijski tip, isporuka zasnovana na virusima i upotreba ćelijske propusnosti/membranskih translokacionih peptida. Što se tiče stabilnosti, pristup se generalno odnosi na pregled grubom silom, uključujući metode koje uključuju prikaz faga i mogu uključivati sazrevanje sekvenci ili razvoj konsenzusnih sekvenci, ili više usmerenih modifikacija kao što su sekvence za stabilizaciju umetanja (npr. Fc regioni, sekvence proteina pratioca, leucinski zatvarači) i zamena/modifikacija disulfida.

[0183] Dodatna karakteristika koja može biti potrebna intratelima je signal za intracelularno ciljanje. Vektori koji mogu ciljati intratela (ili druge proteine) na subcelularne regione kao što su citoplazma, jezgro, mitohondrije i ER su dizajnirani i komercijalno su dostupni (Invitrogen Corp.; Persic et al., 1997).

[0184] Zbog svoje sposobnosti da uđu u ćelije, intratela imaju dodatnu upotrebu koju druge vrste antitela možda neće postići. U slučaju prisutnih antitela, sposobnost interakcije sa citoplazmatskim domenom MUC 1 u živoj ćeliji može ometati funkcije povezane sa MUC 1 CD-om, kao što su signalne funkcije (vezivanje za druge molekule) ili formiranje oligomera. Konkretno, smatra se da se takva antitela mogu koristiti za inhibiciju formiranja MUC 1 dimera.

J. Prečišćavanje

[0185] U određenim otelotvorenjima, antitela ovog otkrića mogu biti prečišćena. Termin „prečišćen“, kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na kompoziciju, koja se može izolovati od drugih komponenti, pri čemu se protein prečišćava do bilo kog stepena u odnosu na njegovo prirodno dostižno stanje. Prečišćeni protein se stoga odnosi i na protein, bez okruženja u kojem se može prirodno pojaviti. Kada se koristi termin „suštinski prečišćen“, ova oznaka će se odnositi na kompoziciju u kojoj protein ili peptid čini glavnu komponentu kompozicije, kao što je oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95% ili više proteina u kompoziciji.

[0186] Tehnike prečišćavanja proteina su dobro poznate stručnjacima. Ove tehnike uključuju, na jednom nivou, sirovu frakcionaciju ćelijskog miljea na polipeptidne i nepolipeptidne frakcije. Nakon odvajanja polipeptida od drugih proteina, polipeptid od interesa se može dalje prečistiti hromatografskim i elektroforetskim tehnikama kako bi se postiglo delimično ili potpuno prečišćavanje (ili prečišćavanje do homogenosti). Analitičke metode posebno pogodne za pripremu čistog peptida su jonskoizmenjivačka hromatografija, ekskluziona hromatografija; poliakrilamidna gel elektroforeza; izoelektrično fokusiranje. Druge metode za prečišćavanje proteina uključuju precipitaciju amonijum sulfatom, PEG, antitelima i slično ili toplotnom denaturacijom, nakon čega sledi centrifugiranje; gel filtracija, reverzna faza, hidroksilapatit i afinitetna hromatografija; i kombinacije takvih i drugih tehnika.

[0187] U prečišćavanju antitela iz ovog otkrića, možda je poželjno eksprimirati polipeptid u prokariotskom ili eukariotskom sistemu ekspresije i ekstrahovati protein koristeći uslove denaturacije. Polipeptid se može prečistiti iz drugih ćelijskih komponenti korišćenjem

1

afinitetne kolone, koja se vezuje za označeni deo polipeptida. Kao što je opšte poznato u struci, veruje se da se redosled sprovođenja različitih koraka prečišćavanja može promeniti, ili da se određeni koraci mogu izostaviti, a ipak rezultirati odgovarajućom metodom za pripremu suštinski prečišćenog proteina ili peptida.

[0188] Kompletna antitela su obično frakcionisana korišćenjem agenasa (tj., protein A) koji vezuju Fc deo antitela. Alternativno, antigeni se mogu koristiti za istovremeno prečišćavanje i odabir odgovarajućih antitela. Takve metode često koriste selekcioni agens vezan za podlogu, kao što je kolona, filter ili kuglica. Antitela su vezana za podlogu, zagađivači su uklonjeni (npr. isprani), a antitela se oslobađaju primenom uslova (sol, toplota itd.).

[0189] Različite metode za kvantifikovanje stepena prečišćavanja proteina ili peptida biće poznate stručnjacima u svetlu ovog otkrića. To uključuje, na primer, određivanje specifične aktivnosti aktivne frakcije ili procenu količine polipeptida u okviru frakcije SDS/PAGE analizom. Drugi metod za procenu čistoće frakcije je da se izračuna specifična aktivnost frakcije, da se uporedi sa specifičnom aktivnošću početnog ekstrakta, i da se na taj način izračuna stepen čistoće. Stvarne jedinice koje se koriste za predstavljanje količine aktivnosti će, naravno, zavisiti od određene tehnike analize izabrane da prati prečišćavanje i od toga da li izraženi protein ili peptid pokazuje detektabilnu aktivnost.

[0190] Poznato je da migracija polipeptida može varirati, ponekad značajno, sa različitim SDS/PAGE uslovima (Capaldi et al., 1977). Stoga će se ceniti da u različitim uslovima elektroforeze, prividne molekulske težine prečišćenih ili delimično prečišćenih proizvoda ekspresije mogu varirati.

III. Aktivna/pasivna imunizacija i tretman/prevencija infekcije SARS-CoV-2

A. Formulacija i primena

[0191] Ovo otkriće pruža farmaceutske kompozicije koje se sastoje od anti-SARS-CoV-2 virusnih antitela i antigena za generisanje istih. Takve kompozicije obuhvataju profilaktički ili terapijski efikasnu količinu antitela ili njegovog fragmenta, ili peptidnog imunogena, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U konkretnom otelotvorenju, termin „farmaceutski prihvatljiv“ znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden

2

u američkoj farmakopeji ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi. Termin „nosač“ se odnosi na razblaživač, pomoćnu supstancu ili sredstvo sa kojim se primenjuje terapija. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući i one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda je poseban nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvor dekstroze i rastvori glicerola takođe mogu da se koriste kao tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Ostale pogodne farmaceutske pomoćne supstance uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silikagel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično.

[0192] Kompozicija, po želji, takođe može da sadrži manje količine agenasa za vlaženje ili emulgatora ili pH pufera. Ove kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim otpuštanjem, i slično. Oralne formulacije mogu uključivati standardne nosače kao što su farmaceutske klase manitola, laktoze, skroba, magnezijum stearata, natrijum saharina, celuloze, magnezijum karbonata, itd. Primeri odgovarajućih farmaceutskih agenasa opisani su u "Remington's Pharmaceutical Sciences." Takve kompozicije će sadržati profilaktički ili terapijski efikasnu količinu antitela ili njegovog fragmenta, po mogućnosti u prečišćenom obliku, zajedno sa odgovarajućom količinom nosača kako bi se obezbedio oblik za pravilnu primenu na pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu primene, koji može biti oralni, intravenski, intraarterijski, intrabukalni, intranazalni, nebulizovan, bronhijalna inhalacija, intrarektalni, vaginalni, topikalni ili isporučen mehaničkom ventilacijom.

[0193] Aktivne vakcine su takođe predviđene tamo gde se antitela poput onih koja su otkrivena proizvode in vivo kod subjekta sa rizikom od infekcije SARS-CoV-2. Takve vakcine se mogu formulisati za parenteralnu primenu, npr. formulisane za injekciju putem intradermalnih, intravenskih, intramuskularnih, subkutanih ili čak intraperitonealnih ruta. Razmatra se primena intradermalnom i intramuskularnom rutom. Vakcina se alternativno može primeniti topikalnim putem direktno na sluznicu, na primer, kapima za nos, inhalacijom, nebulizatorom ili intrarektalnom ili vaginalnom isporukom. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele soli i one koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonične ili fosforne kiseline, ili takve organske kiseline kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili feri hidroksidi, i takvih organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain i slično.

[0194] Pasivni transfer antitela, poznat kao veštački stečeni pasivni imunitet, generalno će uključivati upotrebu intravenskih ili intramuskularnih injekcija. Oblici antitela mogu biti humana ili životinjska krvna plazma ili serum, kao objedinjeni humani imunoglobulin za intravensku (IVIG) ili intramuskularnu (IG) upotrebu, kao humani IVIG visokog titra ili IG od imunizovanih ili od donatora koji se oporavljaju od bolesti, i kao monoklonska antitela (mAt). Takav imunitet uglavnom traje samo kratko vreme, a postoji i potencijalni rizik od reakcija preosetljivosti, i serumske bolesti, posebno od gama globulina nehumanog porekla. Međutim, pasivni imunitet pruža trenutnu zaštitu. Antitela će biti formulisana u nosaču pogodnom za injekciju, tj. sterilna i koja se mogu ubrizgati u špric.

[0195] Generalno, sastojci kompozicija otkrića isporučuju se ili odvojeno ili pomešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili kesica koja ukazuje na količinu aktivnog agensa. Kada se kompozicija primenjuje infuzijom, može se izdati infuzionom bočicom koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu ili fiziološki rastvor. Ako se kompozicija daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu pomešati pre primene

[0196] Kompozicije otkrića mogu se formulisati kao neutralni ili solni oblici. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one koje se formiraju sa anjonima kao što su oni dobijeni iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd. i one koje se formiraju sa katjonima kao što su oni dobijeni iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, itd.

2. ADCC

[0197] Ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) zavisna od antitela je imuni mehanizam koji dovodi do lize ciljnih ćelija obloženih antitelima od strane imunoloških efektorskih ćelija. Ciljne ćelije su ćelije na koje se antitela ili njihovi fragmenti koji se sastoje od Fc regiona

4

specifično vezuju, uglavnom preko proteinskog dela koji je N-terminalni za Fc region. Pod „antitelo koje ima povećanu/smanjenu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC) zavisnu od antitela“ se podrazumeva antitelo koje ima povećanu/smanjenu ADCC kako je utvrđeno bilo kojom odgovarajućom metodom poznatom stručnjacima.

[0198] Kao što se ovde koristi, termin „povećana/smanjena ADCC“ se definiše ili kao povećanje/smanjenje broja ciljnih ćelija koje se liziraju u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, mehanizmom gore definisanog ADCC, i/ili smanjenje/povećanje koncentracije antitela, u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potrebno za postizanje lize datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, mehanizmom ADCC. Povećanje/smanjenje ADCC je u odnosu na ADCC posredovan istim antitelima proizvedenim od strane istog tipa ćelija domaćina, koristeći iste standardne metode proizvodnje, prečišćavanja, formulacije i skladištenja (koje su poznate stručnjacima), ali koje nisu inženjeringovane. Na primer, povećanje ADCC posredovanog antitelima proizvedenim od strane ćelija domaćina koje imaju izmenjen obrazac glikozilacije (npr. za izražavanje glikoziltransferaze, GnTIII ili drugih glikoziltransferaza) metodama opisanim u ovom dokumentu, je u odnosu na ADCC posredovan istim antitelima proizvedenim od strane istog tipa neinženjeringovanih ćelija domaćina.

3. CDC

[0199] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) je funkcija sistema komplementa. Upravo procesi u imunološkom sistemu ubijaju patogene oštećujući njihove membrane bez uključivanja antitela ili ćelija imunološkog sistema. Postoje tri glavna procesa. Sva tri ubacuju jedan ili više membranskih napadačkih kompleksa (MAC) u patogen koji uzrokuju smrtonosno koloidno-osmotsko oticanje, tj., CDC. To je jedan od mehanizama kojim antitela ili fragmenti antitela imaju antivirusno dejstvo.

IV. Konjugati antitela

[0200] Antitela ovog otkrića mogu biti povezana sa najmanje jednim agensom kako bi se formirao konjugat antitela. Da bi se povećala efikasnost molekula antitela kao dijagnostičkih ili terapijskih agenasa, uobičajeno je povezati ili kovalentno vezati ili složiti najmanje jedan željeni molekul ili deo. Takav molekul ili deo može biti, ali nije ograničen na, najmanje jedan efektorski ili reporterski molekul. Efektorski molekuli obuhvataju molekule koji imaju željenu aktivnost, npr. citotoksičnu aktivnost. Neograničavajući primeri efektorskih molekula koji su vezani za antitela uključuju toksine, antitumorske agense, terapijske enzime, radionuklide, antivirusne agense, helatne agense, citokine, faktore rasta i oligo- ili polinukleotide. Nasuprot tome, reporterski molekul je definisan kao bilo koji deo koji se može detektovati pomoću testa. Neograničavajući primeri reporterskih molekula koji su konjugovani na antitela uključuju enzime, radiooznake, haptene, fluorescentne oznake, fosforescentne molekule, hemiluminiscentne molekule, hromofore, molekule fotoafiniteta, obojene čestice ili ligande, kao što je biotin.

[0201] Konjugati antitela se generalno preferiraju za upotrebu kao dijagnostički agensi. Dijagnostika antitela generealno spada u dve klase, one za upotrebu u in vitro dijagnostici, kao što su različiti imunološki testovi, i one za upotrebu in vivo dijagnostičkih protokola, opšte poznatih kao „snimanje usmereno na antitela“ U struci su poznata mnogi odgovarajući agensi za snimanje, kao i metode za njihovo vezivanje za antitela (pogledajte npr. američke patente 5.021.236, 4.938.948 i 4.472.509). Upotrebljeni delovi za snimanje mogu biti paramagnetni joni, radioaktivni izotopi, fluorohromi, supstance koje se mogu detektovati NMR-om i agensi za rendgensko snimanje.

[0202] U slučaju paramagnetnih jona, mogu se pomenuti, na primer, joni kao što su hrom (iii), mangan (II), gvožđe (iii), gvožđe (II), kobalt (II), nikl (II), bakar (II), neodimijum (iii), samarijum (iii), iterbijum (iii), gadolinijum (iii), vanadijum (II), terbijum (iii), disprozijum (iii), holmijum (iii) i/ili erbijum (iii), pri čemu se gadolinijum posebno preferira. Joni korisni u drugim kontekstima, kao što je rendgensko snimanje, uključuju, ali nisu ograničeni na lantan (iii), zlato (iii), olovo (II), a posebno bizmut (iii).

[0203] U slučaju radioaktivnih izotopa za terapijsku i/ili dijagnostičku primenu,može se pomenuti astatin<211>,<14>ugljenik,<51>hrom,<36>hlor,<57>kobalt,<58>kobalt, bakar<67>,<151>Eu, galijum<67>,<3>hidrogen, jod<123>, jod<125>, jod<131>, indijum<111>,<59>gvožđe,<32>fosforu, renijum<186>, renijum<188>,<75>selenijum,<35>sumpor, tehnicijum<99m>i/ili itrijum<90>.<125>I se često preferira za upotrebu u određenim otelotvorenjima, a tehnicijum<99m>i/ili indijum<111>se takođe često preferiraju zbog njihove niske energije i pogodnosti za detekciju na velikim udaljenostima. Radioaktivno označena monoklonska antitela ovog otkrića mogu se proizvesti prema dobro poznatim metodama u struci. Na primer, monoklonska antitela mogu biti jodirana kontaktom sa natrijum i/ili kalijum jodidom i hemijskim oksidacionim agensom kao što je natrijum hipohlorit ili enzimskim oksidacionim agensom, kao što je laktoperoksidaza. Monoklonska antitela prema otkriću mogu biti označena tehnecijumom<99m>procesom razmene liganda, na primer, redukcijom pertehnata kositarnim rastvorom, helacijom redukovanog tehnecijuma na Sephadex kolonu i primenom antitela na ovu kolonu. Alternativno, mogu se koristiti tehnike direktnog označavanja, npr. inkubacijom pertehnata, redukcionog agensa kao što je SNCl2, puferskog rastvora kao što je rastvor natrijum-kalijum ftalata i antitela. Posredničke funkcionalne grupe koje se često koriste za vezivanje radioizotopa koji postoje kao metalni joni za antitela su dietilentriamin-pentaacetatna kiselina (DTPA) ili etilen diaminetacetatna kiselina (EDTA).

[0204] Među fluorescentnim oznakama predviđenim za upotrebu kao konjugati su Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, TAMRA, TET, Tetramethylrhodamine i/ili Texas Red.

[0205] Dodatne vrste antitela razmatrane u ovom otkriću su one koje su prvenstveno namenjene za upotrebu in vitro, gde je antitelo povezano sa sekundarnim vezujućim ligandom i/ili enzimom (enzimska oznaka) koji će generisati obojeni proizvod u kontaktu sa hromogenim supstratom. Primeri pogodnih enzima uključuju ureazu, alkalnu fosfatazu, (hren) vodonik peroksidazu ili glukoznu oksidazu. Preferirani sekundarni vezujući ligandi su jedinjenja biotina i avidina i streptavidina. Upotreba takvih oznaka je dobro poznata stručnjacima i opisana je, na primer, u američkim patentima 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 i 4.366.241.

[0206] Još jedna poznata metoda vezivanja molekula za antitela specifična za mesto obuhvata reakciju antitela sa afinitetnim oznakama na bazi haptena. U suštini, afinitetne oznake zasnovane na haptenu reaguju sa aminokiselinama na mestu vezivanja antigena, čime uništavaju ovo mesto i blokiraju specifičnu reakciju antigena. Međutim, to možda neće biti korisno jer rezultira gubitkom vezivanja antigena od strane konjugata antitela.

[0207] Molekuli koji sadrže azido grupe takođe se mogu koristiti za formiranje kovalentnih veza sa proteinima putem reaktivnih nitrenskih intermedijera koji se generišu ultraljubičastim svetlom niskog intenziteta (Potter and Haley, 1983). Konkretno, 2- i 8-azido analozi purinskih nukleotida korišćeni su kao fotosonde usmerene na mesto za identifikaciju proteina koji vezuju nukleotide u ekstraktima sirovih ćelija (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985).2- i 8-azido nukleotidi su takođe korišćeni za mapiranje domena vezivanja nukleotida prečišćenih proteina (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989) i mogu se koristiti kao agensi za vezivanje antitela.

[0208] Nekoliko metoda je poznato u struci za vezivanje ili konjugaciju antitela na njegov konjugovani deo. Neke metode vezivanja uključuju upotrebu kompleksa metalnog helata koji koristi, na primer, organski helatni agens kao što je dietilentriamin-pentaoctena kiselina anhidrid (DTPA); etilentriaminetraoctena kiselina; N-hloro-p-toluensulfonamid; i/ili tetrahloro-3α-6α-difenilglikoril-3 vezan za antitelo (američki patenti 4.472.509 i 4.938.948). Monoklonska antitela takođe mogu reagovati sa enzimom u prisustvu agensa za spajanje kao što je glutaraldehid ili periodat. Konjugati sa markerima fluoresceina pripremaju se u prisustvu ovih agenasa za spajanje ili reakcijom sa izotiocijanatom. U američkom patentu 4.938.948, snimanje tumora dojke se postiže pomoću monoklonskih antitela, a detektabilni delovi slike se vezuju za antitelo pomoću linkera kao što su metil-p-hidroksibenzimidat ili N-sukcinimidil-3-(4-hidroksifenil)propionat.

[0209] U drugim otelotvorenjima, razmatra se derivatizacija imunoglobulina selektivnim uvođenjem sulfhidrilnih grupa u Fc region imunoglobulina, koristeći reakcione uslove koji ne menjaju mesto kombinovanja antitela. Konjugati antitela proizvedeni u skladu sa ovom metodologijom otkriveni su kako bi pokazali poboljšanu dugovečnost, specifičnost i osetljivost (američki patent 5.196.066). U literaturi je takođe otkriveno vezivanje reporterskih ili efektorskih molekula specifično za mesto, pri čemu je reporterski ili efektorski molekul konjugovan sa ostatkom ugljenih hidrata u Fc regionu (O'Shannessy et al., 1987). Prijavljeno je da ovaj pristup proizvodi dijagnostički i terapijski obećavajuća antitela koja su trenutno u kliničkoj proceni.

V. Metode imunodetekcije

[0210] U još daljim otelotvorenjima otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, ovo otkriće se odnosi na metode imunodetekcije za vezivanje, prečišćavanje, uklanjanje, kvantifikovanje i na drugi način generalno detektovanje SARS-CoV-2 i njegovih povezanih antigena. Iako se takve metode mogu primeniti u tradicionalnom smislu, druga upotreba će biti u kontroli kvaliteta i praćenju zaliha vakcina i drugih virusa, gde se antitela prema ovom otkriću mogu koristiti za procenu količine ili integriteta (tj., dugoročne stabilnosti) antigena u virusima. Alternativno, metode se mogu koristiti za pregled različitih antitela za odgovarajuće/željene profile reaktivnosti.

[0211] Druge metode imunodetekcije uključuju specifične testove za određivanje prisustva SARS-CoV-2 kod subjekta. Razmatra se širok spektar formata analize, ali posebno onih koji bi se koristili za detektovanje SARS-CoV-2 u tečnosti dobijenoj od subjekta, kao što su pljuvačka, krv, plazma, ispljuvak, sperma ili urin. Konkretno, sperma je dokazana kao održivi uzorak za detektovanje SARS-CoV-2 (Purpura et al., 2016; Mansuy et al., 2016; Barzon et al., 2016; Gornet et al., 2016; Duffy et al., 2009; CDC, 2016; Halfon et al., 2010; Elder et al.2005). Testovi mogu biti povoljno formatirani za nezdravstvenu (kućnu) upotrebu, uključujući testove lateralnog protoka (videti u nastavku) analogno kućnim testovima na trudnoću. Ovi testovi mogu biti upakovani u obliku kompleta sa odgovarajućim reagensima i uputstvima kako bi se omogućila upotreba od strane subjekta člana porodice.

[0212] Neke metode imunodetekcije uključuju imunološki test povezan sa enzimima (ELISA), radioimunološki test (RIA), imunoradiometrijski test, fluoroimunološki test, hemiluminiscentni test, bioluminiscentni test i Western blot, da pomenemo samo neke. Konkretno, obezbeđen je i kompetitivni test za detekciju i kvantifikaciju antitela SARS-CoV-2 usmerenih na specifične epitope parazita u uzorcima. Koraci različitih korisnih metoda imunodetekcije opisani su u naučnoj literaturi, kao što su npr. Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), i Nakamura et al. (1987). Generalno, metode imunovezivanja uključuju dobijanje uzorka za koji se sumnja da sadrži SARS-CoV-2 i kontaktiranje uzorka sa prvim antitelima u skladu sa ovim otkrićem, u zavisnosti od slučaja, pod uslovima koji omogućavaju formiranje imunokompleksa.

[0213] Ove metode uključuju metode za prečišćavanje SARS-CoV-2 ili srodnih antigena iz uzorka. Antitelo će po mogućnosti biti vezano za čvrstu podlogu, kao što je u obliku matrice kolone, a uzorak za koji se sumnja da sadrži SARS-CoV-2 ili antigensku komponentu biće primenjen na imobilisano antitelo. Neželjene komponente će se isprati iz kolone, ostavljajući antigen SARS-CoV-2 imunokompleksiran na imobilisano antitelo, koje se zatim prikuplja uklanjanjem organizma ili antigena iz kolone.

[0214] Metode imunovezivanja takođe uključuju metode za detekciju i kvantifikaciju količine SARS-CoV-2 ili srodnih komponenti u uzorku i detekciju i kvantifikaciju bilo kojih imunih kompleksa formiranih tokom procesa vezivanja. Ovde bi se dobio uzorak za koji se sumnja da sadrži SARS-CoV-2 ili njegove antigene i uzorak bi se kontaktirao antitelima koja se vezuju za SARS-CoV-2 ili njegove komponente, nakon čega bi se detektovala i kvantifikovala količina imunih kompleksa formiranih pod specifičnim uslovima. U pogledu detekcije antigena, analizirani biološki uzorak može biti bilo koji uzorak za koji se sumnja da sadrži antigen SARS-CoV-2 ili SARS-CoV-2, kao što je tkivni deo ili uzorak, homogenizovani ekstrakt tkiva, biološka tečnost, uključujući krv i serum, ili sekrecija, kao što su stolica ili urin.

[0215] Kontaktiranje izabranog biološkog uzorka sa antitelima pod efektivnim uslovima i tokom perioda dovoljnog da se omogući formiranje imunoloških kompleksa (primarni imunološki kompleksi) generalno je stvar jednostavnog dodavanja kompozicije antitela uzorku i inkubacije smeše dovoljno dugo da antitela formiraju imunološke komplekse sa, tj. da se vežu za prisutni SARS-CoV-2 ili antigene Nakon tog vremena, kompozicija uzorka i antitela, kao što su sekcija tkiva, ELISA ploča, dot blot ili Western blot, generalno će se oprati kako bi se uklonile sve vrste antitela koje nisu specifično vezane, omogućavajući detektovanje samo onih antitela koja su specifično vezana unutar primarnih imunih kompleksa.

[0216] Generalno, detektovanje formiranja imunokompleksa je dobro poznato u struci i može se postići primenom brojnih pristupa. Ove metode se generalno zasnivaju na detekciji oznake ili markera, kao što je bilo koja od tih radioaktivnih, fluorescentnih, bioloških i enzimskih oznaka. Patenti koji se odnose na upotrebu takvih oznaka uključuju američke patente 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 i 4.366.241. Naravno, dodatne prednosti se mogu naći korišćenjem sekundarnog vezivnog liganda kao što je drugo antitelo i/ili aranžman vezivanja biotin/avidin liganda, kao što je poznato u struci.

[0217] Samo antitelo koje se koristi za detekciju može biti povezano sa oznakom koja se može detektovati, pri čemu bi se onda jednostavno detektovala ova oznaka, čime bi se omogućilo određivanje količine primarnih imunih kompleksa u sastavu. Alternativno, prvo antitelo koje se veže unutar primarnih imunih kompleksa može se detektovati pomoću drugog vezujućeg liganda koji ima afinitet vezivanja za antitelo. U ovim slučajevima, drugi vezujući ligand može biti povezan sa oznakom koja se može detektovati. Drugi vezujući ligand je sam po sebi često antitelo, koje se stoga može nazvati „sekundarnim“ antitelom. Primarni imunološki kompleksi se kontaktiraju sa označenim, sekundarnim vezujućim ligandom ili antitelom, pod efektivnim uslovima i tokom perioda koji je dovoljan da omogući formiranje sekundarnih imunoloških kompleksa. Primarni imunološki kompleksi se kontaktiraju sa označenim, sekundarnim vezujućim ligandima ili antitelima, pod efektivnim uslovima i tokom perioda koji je dovoljan da omogući formiranje sekundarnih imunoloških kompleksa.

[0218] Dalje metode uključuju detekciju primarnih imunoloških kompleksa pristupom u dva koraka. Drugi vezujući ligand, kao što je antitelo koje ima afinitet vezivanja za antitelo, koristi se za formiranje sekundarnih imunih kompleksa, kao što je gore opisano. Nakon ispiranja, sekundarni imunološki kompleksi se kontaktiraju sa trećim vezujućim ligandom ili antitelom koje ima afinitet vezivanja za drugo antitelo, ponovo pod efektivnim uslovima i u vremenskom periodu dovoljnom da omogući formiranje imunoloških kompleksa (tercijarni imunološki kompleksi). Treći ligand ili antitelo je vezan za detektabilnu oznaku, što omogućava detekciju tako formiranih tercijarnih imunih kompleksa. Ovaj sistem može da obezbedi pojačanje signala ako je to poželjno.

[0219] Jedan metod imunodetekcije koristi dva različita antitela. Prvo biotinilisano antitelo se koristi za detektovanje ciljnog antigena, a drugo antitelo se zatim koristi za detektovanje biotina vezanog za kompleksni biotin. U toj metodi, uzorak koji treba testirati se prvo inkubira u rastvoru koji sadrži antitelo prvog koraka. Ako je ciljni antigen prisutan, deo antitela se vezuje za antigen i formira biotinilisano antitelo/kompleks antigena. Kompleks antitela/antigena se zatim pojačava inkubacijom u uzastopnim rastvorima streptavidina (ili avidina), biotinilovane DNK i/ili komplementarne biotinilovane DNK, pri čemu se u svakom koraku dodaju dodatna mesta biotina kompleksu antitela/antigena. Koraci amplifikacije se ponavljaju dok se ne postigne odgovarajući nivo amplifikacije, pri čemu se uzorak inkubira u rastvoru koji sadrži antitelo naspram biotina u drugom koraku. Ovaj drugi korak antitela je označen, na primer, enzimom koji se može koristiti za detektovanje prisustva kompleksa antitela/antigena histoenzimologijom koristeći supstrat hromogena. Uz odgovarajuću amplifikaciju može se proizvesti konjugat koji je makroskopski vidljiv.

1

[0220] Drugi poznati metod imunodetekcije koristi metodologiju imuno-PCR (lančana reakcija polimeraze). PCR metoda je slična Cantor metodi do inkubacije sa biotinilisanom DNK, međutim, umesto korišćenja višestrukih krugova streptavidina i biotinilisane DNK inkubacije, kompleks DNK/biotina/streptavidina/antitela se ispire niskim pH ili visokim puferom soli koji oslobađa antitelo. Dobijeni rastvor za ispiranje se zatim koristi za sprovođenje PCR reakcije sa odgovarajućim prajmerima sa odgovarajućim kontrolama. Barem u teoriji, ogromna sposobnost amplifikacije i specifičnost PCR-a mogu se koristiti za detektovanje jednog molekula antigena.

A. ELISA

[0221] Imunološki testovi, u svom najjednostavnijem i najdirektnijem smislu, su testovi vezivanja. Određeni poželjni imunološki testovi su različiti tipovi imunoloških testova povezanih sa enzimima (ELISA) i radioimunoloških testova (RIA) poznati u struci. Imunohistohemijska detekcija pomoću sekcija tkiva je takođe posebno korisna. Međutim, biće jasno da detekcija nije ograničena na takve tehnike, a mogu se koristiti i Western blot, dot blot, FACS analize i slično.

[0222] U jednom primeru ELISA testa, antitela otkrića su imobilizovana na odabranoj površini koja pokazuje afinitet prema proteinima, kao što je bunar u polistirenskoj mikrotiterskoj ploči. Zatim se u bunare dodaje test kompozicija za koju se sumnja da sadrži antigen SARS-CoV-2 ili SARS-CoV-2. Nakon vezivanja i ispiranja radi uklanjanja nespecifično vezanih imunih kompleksa, vezani antigen može biti detektovan. Detekcija se može postići dodavanjem drugog anti-SARS-CoV-2 antitela koje je povezano sa oznakom koja se može detektovati. Ovaj tip ELISA testa je jednostavan „sendvič“ ELISA test. Detekcija se takođe može postići dodavanjem drugog anti-SARS-CoV-2 antitela, nakon čega sledi dodavanje trećeg antitela koje ima afinitet vezivanja za drugo antitelo, pri čemu je treće antitelo povezano sa oznakom koja se može detektovati.

[0223] U drugom primernu ELISA testa, uzorci za koje se sumnja da sadrže antigen SARS-CoV-2 ili SARS-CoV-2 imobilizuju se na površinu bunara i zatim kontaktiraju sa anti-SARS-CoV-2 antitelima otkrića. Nakon vezivanja i pranja radi uklanjanja nespecifično vezanih imunih kompleksa, detektuju se vezana anti-SARS-CoV-2 antitela. Kada su inicijalna anti-SARS-CoV-2 antitela povezana sa oznakom koja se može detektovati, imunološki kompleksi

2

se mogu direktno detektovati. Opet, imunološki kompleksi se mogu detektovati korišćenjem drugog antitela koje ima afinitet vezivanja za prvo anti-SARS-CoV-2 antitelo, pri čemu je drugo antitelo povezano sa oznakom koja se može detektovati.

[0224] Bez obzira na korišćeni format, ELISA testovi imaju određene zajedničke karakteristike, kao što su premazivanje, inkubacija i vezivanje, pranje za uklanjanje nespecifično vezanih vrsta i detekcija vezanih imunoloških kompleksa. Ovo je opisano u nastavku.

[0225] Prilikom premazivanja ploče antigenom ili antitelima, obično će se inkubirati bunari ploče rastvorom antigena ili antitela, bilo preko noći ili tokom određenog perioda od nekoliko sati. Bunari ploče će se zatim isprati kako bi se uklonio nepotpuno adsorbovani materijal. Sve preostale dostupne površine bunara se zatim „premazuju“ nespecifičnim proteinom koji je antigenski neutralan u odnosu na test antiserum. To uključuje goveđi serumski albumin (BSA), kazein ili rastvore mleka u prahu. Premaz omogućava blokiranje nespecifičnih mesta adsorpcije na imobilizirajućoj površini i na taj način smanjuje pozadinu uzrokovanu nespecifičnim vezivanjem antiseruma za površinu.

[0226] U ELISA testovima, verovatno je uobičajenije koristiti sekundarna ili tercijarna sredstva za detekciju, a ne direktnu proceduru. Dakle, nakon vezivanja proteina ili antitela za bunar, premazivanja nereaktivnim materijalom za smanjenje pozadine i pranja za uklanjanje nevezanog materijala, imobilizujuća površina se kontaktira sa biološkim uzorkom koji se testira pod uslovima koji su efikasni da bi se omogućilo formiranje imunog kompleksa (antigen/antitelo). Detekcija imunog kompleksa zatim zahteva označeni sekundarni vezujući ligand ili antitelo i sekundarni vezujući ligand ili antitelo u kombinaciji sa označenim tercijarnim antitelima ili trećim vezujućim ligandom.

[0227] „Pod uslovima koji efikasno omogućavaju formiranje imunog kompleksa (antigen/antitelo)“ znači da uslovi po mogućnosti uključuju razblaživanje antigena i/ili antitela rastvorima kao što su BSA, goveđi gama globulin (BGG) ili fosfatni puferni fiziološki rastvor (PBS)/Tween. Ovi dodatni agensi takođe imaju tendenciju da pomognu u smanjenju nespecifične pozadine.

[0228] „Pogodni“ uslovi takođe znače da je inkubacija na temperaturi ili u vremenskom periodu dovoljnom da omogući efikasno vezivanje. Koraci inkubacije su obično od oko 1 do 2 do 4 sata ili slično, na temperaturama po mogućnosti od 25°C do 27°C, ili mogu biti preko noći na oko 4°C ili slično.

[0229] Nakon svih koraka inkubacije u ELISA testu, kontaktna površina se ispire tako da se ukloni nekompleksirani materijal. Preferirana procedura pranja uključuje pranje rastvorom kao što je PBS/Tween ili boratnim puferom. Nakon formiranja specifičnih imunih kompleksa između ispitivanog uzorka i prvobitno vezanog materijala, i naknadnog ispiranja, može se odrediti pojava čak i malih količina imunih kompleksa.

[0230] Da bi se obezbedilo sredstvo za detekciju, drugo ili treće antitelo će imati pridruženu oznaku koja će omogućiti detekciju. Po mogućnosti, to će biti enzim koji će generisati razvoj boje nakon inkubacije sa odgovarajućim hromogenim supstratom. Tako će, na primer, neko želeti da kontaktira ili inkubira prvi i drugi imunološki kompleks sa ureazom, glukoznom oksidazom, alkalnom fosfatazom ili antitelima konjugovanim vodonik peroksidazom u određenom vremenskom periodu i pod uslovima koji pogoduju razvoju daljeg formiranja imunološkog kompleksa (npr. inkubacija u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi u rastvoru koji sadrži PBS, kao što je PBS-Tween).

[0231] Nakon inkubacije sa označenim antitelom, a nakon ispranja radi uklanjanja nevezanog materijala, količina oznake se kvantifikuje, npr. inkubacijom sa hromogenim supstratom kao što je urea, ili bromokrezol ljubičasti, ili 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS), ili H2O2, u slučaju peroksidaze kao oznake enzima. Kvantifikacija se zatim postiže merenjem stepena generisane boje, npr. korišćenjem spektrofotometra vidljivog spektra.

[0232] U drugom otelotvorenju otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, ovo otkriće razmatra upotrebu kompetitivnih formata. Ovo je posebno korisno u otkrivanju antitela SARS-CoV-2 u uzorku. U testovima zasnovanim na kompetitivnosti, nepoznata količina analita ili antitela određena je njegovom sposobnošću da zameni poznatu količinu označenog antitela ili analita. Dakle, merljivi gubitak signala je pokazatelj količine nepoznatog antitela ili analita u uzorku.

[0233] Ovde istraživač predlaže upotrebu označenih SARS-CoV-2 monoklonskih antitela za određivanje količine SARS-CoV-2 antitela u uzorku. Osnovni format bi uključivao kontaktiranje poznate količine monoklonskog antitela SARS-CoV-2 (povezane sa

4

detektabilnom oznakom) sa SARS-CoV-2 antigenom ili česticom. SARS-CoV-2 antigen ili organizam je poželjno vezan za podlogu. Nakon vezivanja označenog monoklonskog antitela za podlogu, uzorak se dodaje i inkubira pod uslovima koji dozvoljavaju da se bilo koje neoznačeno antitelo u uzorku takmiči sa, a samim tim i istisne, označeno monoklonsko antitelo. Merenjem izgubljene oznake ili preostale oznake (i oduzimanjem od originalne količine vezane oznake), može se utvrditi koliko je neobeleženog antitela vezano za podlogu, a time i koliko je antitela bilo prisutno u uzorku.

B. Western blot

[0234] Western blot (alternativno, proteinski imunoblot) je analitička tehnika koja se koristi za otkrivanje specifičnih proteina u datom uzorku homogenata ili ekstrakta tkiva. Koristi gel elektroforezu za razdvajanje nativnih ili denaturisanih proteina po dužini polipeptida (uslovi denaturacije) ili po 3-D strukturi proteina (nativni/nedenaturisani uslovi). Proteini se zatim prenose na membranu (obično nitrocelulozu ili PVDF), gde se sondiraju (detektuju) korišćenjem antitela specifičnih za ciljni protein.

[0235] Uzorci se mogu uzeti iz celog tkiva ili iz ćelijske kulture. U većini slučajeva, čvrsta tkiva se prvo mehanički razlažu pomoću blendera (za veće zapremine uzorka), pomoću homogenizatora (manje zapremine) ili sonikacijom. Ćelije se takođe mogu razbiti jednom od gore navedenih mehaničkih metoda. Međutim, treba napomenuti da uzorci bakterija, virusa ili životne sredine mogu biti izvor proteina i stoga Western blot nije ograničen samo na ćelijske studije. Različiti deterdženti, soli i puferi mogu se koristiti za podsticanje lize ćelija i za rastvaranje proteina. Često se dodaju inhibitori proteaze i fosfataze kako bi se sprečilo varenje uzorka sopstvenim enzimima. Priprema tkiva se često vrši na hladnim temperaturama kako bi se izbeglo denaturisanje proteina.

[0236] Proteini uzorka se razdvajaju pomoću gel elektroforeze. Razdvajanje proteina može biti po izoelektričnoj tački (pI), molekularnoj težini, električnom naboju ili kombinaciji ovih faktora. Priroda razdvajanja zavisi od tretmana uzorka i prirode gela. Ovo je veoma koristan način za određivanje proteina. Takođe je moguće koristiti dvodimenzionalni (2-D) gel koji širi proteine iz jednog uzorka u dve dimenzije. Proteini se razdvajaju prema izoelektričnoj tački (pH na kojoj imaju neutralni neto naboj) u prvoj dimenziji, i prema njihovoj molekulskoj masi u drugoj dimenziji.

[0237] Da bi proteini bili dostupni za detekciju antitela, premeštaju se iz gela na membranu napravljenu od nitroceluloze ili poliviniliden difluorida (PVDF). Membrana se postavlja na vrh gela, a na nju se postavlja hrpa filter papira. Cela hrpa se stavlja u puferski rastvor koji se pomera uz papir kapilarnim delovanjem, donoseći proteine sa sobom. Druga metoda za prenos proteina naziva se elektroblotiranje i koristi električnu struju za povlačenje proteina iz gela u PVDF ili nitroceluloznu membranu. Proteini se kreću od unutar gela na membranu uz održavanje organizacije koju su imali unutar gela. Kao rezultat ovog procesa upijanja, proteini su izloženi na tankom površinskom sloju radi detekcije (videti u nastavku). Obe varijante membrane su izabrane zbog svojih nespecifičnih svojstava vezivanja za proteine (tj. podjednako dobro vezuju sve proteine). Vezivanje proteina se zasniva na hidrofobnim interakcijama, kao i na naelektrisanim interakcijama između membrane i proteina. Nitrocelulozne membrane su jeftinije od PVDF, ali su daleko krhkije i ne podnose dobro ponovljeno ispitivanje. Ujednačenost i ukupna efikasnost transfera proteina iz gela u membranu može se proveriti bojenjem membrane Coomassie Brilliant Blue ili Ponceau S bojama. Nakon transfera, proteini se detektuju korišćenjem označenih primarnih antitela ili neoznačenih primarnih antitela, nakon čega sledi indirektna detekcija korišćenjem označenog proteina A ili sekundarnih označenih antitela koja se vezuju za Fc region primarnih antitela.

C. Testovi lateralnog protoka

[0238] Testovi lateralnog protoka, takođe poznati kao imunohromatografski testovi lateralnog protoka, su jednostavni uređaji namenjeni za otkrivanje prisustva (ili odsustva) ciljnog analita u uzorku (matrici) bez potrebe za specijalizovanom i skupom opremom, iako postoje mnoge laboratorijske aplikacije koje su podržane opremom za čitanje. Obično se ovi testovi koriste kao medicinska dijagnostika sa malo resursa, bilo za kućno testiranje, testiranje na mestu nege ili laboratorijsku upotrebu. Široko rasprostranjena i dobro poznata primena je kućni test na trudnoću.

[0239] Tehnologija se zasniva na nizu kapilarnih slojeva, kao što su komadi poroznog papira ili sinterovanog polimera. Svaki od ovih elemenata ima kapacitet da spontano transportuje tečnost (npr. urin). Prvi element (podloga za uzorke) deluje kao sunđer i sadrži višak tečnosti za uzorke. Jednom natopljen, tečnost prelazi na drugi element (konjugovanu podlogu) u kojem je proizvođač uskladištio takozvani konjugat, osušeni format bioaktivnih čestica (videti u nastavku) u matrici soli i šećera koja sadrži sve kako bi se garantovala optimizovana hemijska reakcija između ciljnog molekula (npr. antigena) i njegovog hemijskog partnera (npr. antitela) koji je imobilisan na površini čestice. Dok tečnost uzorka rastvara matricu so-šećer, on takođe rastvara čestice i u jednom kombinovanom transportu se uzorak i konjugat mešaju dok prolaze kroz poroznu strukturu. Na taj način se analit vezuje za čestice dok dalje migrira kroz treći kapilarni sloj. Ovaj materijal ima jednu ili više oblasti (koje se često nazivaju prugama) gde je proizvođač imobilisao treći molekul. Do trenutka kada mešavina uzoraka i konjugata stigne do ovih traka, analit je vezan za česticu i treći molekul „hvatanja“ vezuje kompleks. Nakon nekog vremena, kada sve više i više tečnosti prođe pruge, čestice se akumuliraju i površina pruge menja boju. Obično postoje najmanje dve trake: jedna (kontrolna) koja hvata bilo koju česticu i time pokazuje da su reakcioni uslovi i tehnologija dobro funkcionisali, druga sadrži specifičan molekul hvatanja i hvata samo one čestice na koje je molekul analita imobilizovan. Nakon pasaže kroz ove reakcione zone, fluid ulazi u konačni porozni materijal - fitilj - koji jednostavno deluje kao kontejner za otpad. Testovi lateralnog protoka mogu da funkcionišu kao kompetitivni ili sendvični testovi. Testovi lateralnogg protoka su otkrivena u američkom patentu 6.485.982.

D. Imunohistohemija

[0240] Antitela iz ovog otkrića takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa svežim zamrznutim i/ili parafinskim blokovima tkiva fiksiranim formalinom pripremljenim za ispitivanje imunohistohemijom (IHC). Metoda pripreme tkivnih blokova iz ovih uzoraka čestica uspešno je korišćena u prethodnim IHC studijama različitih prognostičkih faktora i dobro je poznata stručnjacima (Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).

[0241] Ukratko, zamrznuti delovi se mogu pripremiti rehidriranjem 50 ng zamrznutog „usitnjenog“ tkiva na sobnoj temperaturi u fosfatnom puferiranom fiziološkom rastvoru (PBS) u malim plastičnim kapsulama; peletiranjem čestica centrifugiranjem; resuspendiranjem u viskoznom medijumu za ugradnju (OCT); inverzijom kapsule i/ili ponovnim peletiranjem centrifugiranjem; brzim zamrzavanjem u izopentanu -70°C; sečenjem plastične kapsule i/ili uklanjanjem zamrznutog cilindra tkiva; pričvršćivanjem cilindra tkiva na steznu glavu mikrotoma kriostata; i/ili sečenjem 25-50 serijskih sekcija iz kapsule. Alternativno, celi smrznuti uzorci tkiva mogu se koristiti za isečke serijskih sekcija.

[0242] Trajni delovi se mogu pripremiti sličnom metodom koja uključuje rehidrataciju uzorka od 50 mg u plastičnoj epruveti za mikrofugu; peletiranje; resuspendovanje u 10% formalina tokom 4 sata fiksiranja; pranje/peletiranje; resuspendovanje u toplom 2,5% agaru; peletiranje; hlađenje u ledenoj vodi da bi se agar očvrsnuo; uklanjanje bloka tkiva/agara iz epruvete; infiltriranje i/ili ugrađivanje bloka u parafin; i/ili sečenje do 50 serijskih trajnih delova. Opet, celi uzorci tkiva mogu biti zamenjeni.

E. Kompleti za imunodetekciju

[0243] U još daljim otelotvorenjima otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, ovo otkriće se odnosi na komplete za imunodetekciju za upotrebu sa gore opisanim metodama imunodetekcije. Pošto se antitela mogu koristiti za otkrivanje antigena SARS-CoV-2 ili SARS-CoV-2, antitela mogu biti uključena u komplet. Kompleti za imunodetekciju će stoga sadržati, u odgovarajućim posudama, prvo antitelo koje se vezuje za antigen SARS-CoV-2 ili SARS-CoV-2 i opciono reagens za imunodetekciju.

[0244] U određenim otelotvorenjima otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, antitelo SARS-CoV-2 može biti unapred vezano za čvrstu podlogu, kao što je matrica kolone i/ili bunar mikrotitarske ploče. Imunodetekcioni reagensi kompleta mogu imati bilo koji od različitih oblika, uključujući one detektabilne oznake koje su asocirane sa ili povezane sa datim antitelima. Takođe se razmatraju detektabilne oznake koje su povezane sa sekundarnim ligandom za vezivanje ili su pričvršćene za njega. Primer sekundarnih liganada su ona sekundarna antitela koja imaju afinitet vezivanja za prvo antitelo.

[0245] Dalji pogodni reagensi za imunodetekciju za upotrebu u ovim kompletima uključuju dvokomponentni reagens koji se sastoji od sekundarnog antitela koje ima afinitet vezivanja za prvo antitelo, zajedno sa trećim antitelom koje ima afinitet vezivanja za drugo antitelo, pri čemu je treće antitelo povezano sa oznakom koja se može detektovati. Kao što je gore navedeno, određeni broj primera oznaka je poznat u struci i sve takve oznake se mogu koristiti u vezi sa ovim otkrićem.

[0246] Kompleti mogu dalje da sadrže odgovarajući alikvotovani sastav antigena SARS-CoV-2 ili SARS-CoV-2, bilo da su označeni ili ne, što se može koristiti za pripremu standardne krive za test detekcije. Kompleti mogu sadržati konjugate sa oznakom antitela u potpuno konjugovanom obliku, u obliku intermedijera ili kao odvojene delove koje korisnik kompleta treba da konjuguje. Komponente kompleta mogu biti upakovane u vodenom medijumu ili u liofilizovanom obliku.

[0247] Sredstva za posude kompleta će generalno uključivati najmanje jednu bočicu, epruvetu, bocu, špric ili drugo sredstvo za posude, u koje se antitelo može staviti, ili po mogućnosti, odgovarajuće alikvotirati. Kompleti ovog otkrića će takođe obično uključivati sredstvo za sadržavanje antitela, antigena i bilo kojih drugih posuda reagensa u zatvorenom prostoru za komercijalnu prodaju. Takve posude mogu uključivati plastične posude za ubrizgavanje ili brizgane plastične posude u koje se stavljaju željene bočice.

F. Testovi kontrole kvaliteta vakcina i antigena

[0248] Ovo otkriće takođe razmatra upotrebu antitela i fragmenata antitela kao što je ovde opisano za upotrebu u proceni antigenskog integriteta virusnog antigena u uzorku. Biološki lekoviti proizvodi kao što su vakcine razlikuju se od hemijskih lekova po tome što se obično ne mogu molekularno okarakterisati; antitela su veliki molekuli značajne složenosti i imaju kapacitet da se veoma razlikuju od preparata do preparata. Takođe se primenjuju na zdravim pojedincima, uključujući decu po rođenju, i stoga se mora staviti snažan naglasak na njihov kvalitet kako bi se u najvećoj mogućoj meri osiguralo da su efikasni u sprečavanju ili lečenju bolesti opasnih po život, a da sami ne nanose štetu.

[0249] Sve veća globalizacija u proizvodnji i distribuciji vakcina otvorila je nove mogućnosti za bolje upravljanje problemima javnog zdravlja, ali je takođe pokrenula pitanja o ekvivalentnosti i zamenljivosti vakcina nabavljenih iz različitih izvora. Međunarodna standardizacija polaznih materijala, ispitivanja proizvodnje i kontrole kvaliteta, kao i postavljanje visokih očekivanja za regulatorni nadzor nad načinom proizvodnje i upotrebe ovih proizvoda, stoga su bili kamen temeljac za nastavak uspeha. Ali ono ostaje polje u stalnim promenama, a kontinuirani tehnički napredak na terenu nudi obećanje razvoja moćnog novog oružja protiv najstarijih pretnji javnom zdravlju, kao i novih - malarije, pandemijskog gripa i HIV-a, da pomenemo samo neke - ali i vrši veliki pritisak na proizvođače, regulatorne organe i širu medicinsku zajednicu kako bi se osiguralo da proizvodi i dalje ispunjavaju najviše standarde kvaliteta koji se mogu postići.

[0250] Dakle, može se dobiti antigen ili vakcina iz bilo kog izvora ili u bilo kom trenutku tokom proizvodnog procesa. Procesi kontrole kvaliteta stoga mogu početi pripremom uzorka za imunološki test koji identifikuje vezivanje antitela ili fragmenta koji su ovde otkriveni za virusni antigen. Takvi imunološki testovi su otkriveni na drugom mestu u ovom dokumentu, a bilo koji od njih se može koristiti za procenu strukturnog/antigenskog integriteta antigena. Regulatorne agencije mogu utvrditi standarde za utvrđivanje da uzorak sadrži prihvatljive količine antigenski ispravnog i netaknutog antigena.

[0251] Još jedno važno otelotvorenje otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska gde se procenjuje integritet antigena, je u određivanju roka trajanja i stabilnosti skladištenja. Većina lekova, uključujući vakcine, može vremenom da se pogorša. Stoga je od ključnog značaja utvrditi da li, tokom vremena, stepen do kog antigen, kao što je u vakcini, degradira ili destabilizuje tako da više nije antigenski i/ili sposoban da generiše imuni odgovor kada se daje subjektu. Opet, regulatorne agencije mogu uspostaviti standarde za pronalaženje uzorka koji sadrži prihvatljive količine antigenski netaknutog antigena.

[0252] U određenim otelotvorenjima otkrića, ali ne i u okviru predmetnog pronalaska, virusni antigeni mogu da sadrže više od jednog zaštitnog epitopa. U ovim slučajevima, može se pokazati korisnim primeniti testove koji posmatraju vezivanje više od jednog antitela, kao što su 2, 3, 4, 5 ili čak više antitela. Ova antitela se vezuju za blisko povezane epitope, tako da su susedna ili se čak preklapaju. S druge strane, oni mogu predstavljati različite epitope iz različitih delova antigena. Ispitivanjem integriteta više epitopa može se utvrditi potpunija slika ukupnog integriteta antigena, a samim tim i sposobnost stvaranja zaštitnog imunološkog odgovora.

[0253] Antitela i njihovi fragmenti kako je opisano u ovom otkriću takođe se mogu koristiti u kompletu za praćenje efikasnosti procedura vakcinacije otkrivanjem prisustva zaštitnih antitela na SARS-CoV-2. Antitela, fragment antitela ili njihove varijante i derivati, kako je opisano u ovom otkriću, takođe se mogu koristiti u kompletu za praćenje proizvodnje vakcine sa željenom imunogenošću.

1

G. Primeri

[0254] Sledeći primeri su uključeni kako bi se demonstrirala poželjna otelotvorenja. Treba ceniti od strane stručnjaka da tehnike otkrivene u primerima koji slede predstavljaju tehnike koje jeistraživač otkrio da dobro funkcionišu u praksi otelotvorenja, i stoga se može smatrati da predstavljaju poželjne načine za njegovu praksu. Međutim, stručnjaci treba, u svetlu ovog otkrića, da shvate da se mogu napraviti mnoge promene u specifičnim otelotvorenjima koja se otkrivaju i koja i dalje dobijaju isti ili sličan rezultat.

Primer 1 - Sinergija antitela

[0255] Sinergija je ovde definisana kao veća neutralizaciona aktivnost posredovana koktelom od dva mAt u poređenju sa onom posredovanom pojedinačnim mAt pri istoj ukupnoj koncentraciji (in vitro) ili dozi (in vivo) antitela. Da bi procenio da li se dva mAt sinergiziraju u koktelu za neutralizaciju SARS-CoV-2, istraživač je koristio prethodno prijavljeni pristup kvantitativnoj sinergiji (Ianevski A, He L, Aittokallio T, Tang J. Bioinformatics. 33, 2413-2415, 2017). Da bi se procenio značaj korisnog efekta kombinovanja mAt, posmatrani kombinovani odgovori (matrica doza-odgovor) upoređeni su sa očekivanim odgovorima izračunatim pomoću modela za ocenjivanje sinergije (Ianevski A, He L, Aittokallio T, Tang J. Bioinformatics. 33, 2413-2415, 2017). Neutralizacija virusa je izmerena u konvencionalnom testu neutralizacije smanjenja fokusa (FRNT) korišćenjem monoslojeva ćelijske kulture divljeg tipa SARS-CoV-2 i Vero-E2. Pojedinačnia mAt COV2-2196 i COV2-2130 su pomešana u različitim koncentracijama kako bi se procenila neutrališuća aktivnost različitih odnosa mAt u koktelu. Konkretno, svako od sedmostrukih razblaženja mAt COV2-2130 (počevši od 500 ng/ml) pomešano je sa svakim od devet razblaženja mAt COV2-2196 (počevši od 500 ng/ml) u ukupnoj zapremini od 50 µL po svakom stanju, a zatim inkubirano sa 50 µL živog SARS-CoV-2 u medijumu ćelijske kulture (RPMI-1640 medijum dopunjen sa 2% FBS) pre nanošenja na konfluentne Vero-E2 ćelije uzgojene u pločama sa 96 bunara. Kontrolne vrednosti su uključivale one za dozu-odgovor neutralizacione aktivnosti izmerene odvojeno za pojedinačna mAt COV2-2196 i COV2-2130 koja su procenjena u istim dozama kao u koktelu (pogledajte sl. 1-3). Svako merenje je izvršeno u duplikatu. Istraživač je zatim izračunao procentualnu neutralizaciju virusa za svako stanje, a zatim je izračunao vrednost rezultata sinergije, koja je definisala interakciju između ova dva mA u koktelu kao sinergističku (rezultat sinergije = 17,4). Imajte na umu da ocena sinergije manja od -10 ukazuje na antagonizam, ocena od -10 do 10 ukazuje na aditivni efekat, a ocena veća od 10 ukazuje na sinergijski efekat. Primer na sl. 1-3 prikazuje matricu doza-odgovor i pokazuje da je kombinovana doza mAt od 79 ng/ml u koktelu

1 1

(16 ng/ml COV2-2196 i 63 ng/ml COV2-2130) imala istu aktivnost kao 250 ng/ml svakog pojedinačnog mAt. Ovaj nalaz pokazuje da se u koktelu doza može smanjiti za više od 3 puta kako bi se postigla ista potencija u neutralizaciji virusa.

[0256] Da bi se procenila terapijska efikasnost lečenja, istraživači su prvo testirali mAt COV2-2196 ili COV2-2130 ili njihovu 1:1 kombinaciju koristeći MA-SARS-CoV-2 model izazova. Svi tretmani su smanjili infektivni virus u plućima mereno titrom plaka u plućnom tkivu 2 dana nakon vakcinacije protiv virusa. Tretman koktelom isporučen u dozi od 400 µg/miš (~ 20 mg/kg) bio je najefikasniji, jer je značajno smanjio opterećenje pluća do 3 × 10<4>-struko; 4 od 5 životinja iz ove terapijske grupe više nije imalo infektivni virus u plućima (SL.4A). Slično tome, lečenje miševa plućima transdukovanim rekombinantnim adenovirusom do ekspresije humanog receptora SARS-CoV-2 ACE2 (AdV-hACE2) sa 400 µg/miš mAt koktela 12 sati nakon autentičnog izazova virusa SARS-CoV-2 otkrilo je potpunu neutralizaciju infektivnog virusa u plućima in vivo (SL. 4B). Ekspresija INF-γ, IL-6, CXCL10 i CCL2 citokina i hemokinskih gena, koji su pokazatelji upale, takođe je smanjena u plućima miševa tretiranih koktelom mAt u poređenju sa plućima miševa tretiranih kontrolom izotipa (SL.4C). Zajedno, ovi rezultati su ukazali na efikasnost lečenja nakon izlaganja posredovanu koktelom COV2-2196 COV2-2130 u mišjim modelima izazova SARS-CoV-2.

Primer 2 - Ispitivanja izazova nehumanih primata

[0257] Proizvodnja i prečišćavanje mAt. Sekvence mAt koje su sintetizovane (Twist Bioscience) i klonirane u vektor monocistronske ekspresije IgG1 (označen kao pTwistmCis_G1) korišćene su za sekreciju mAt kulture ćelija sisara. Ovaj vektor sadrži poboljšanu 2A sekvencu i GSG linker koji omogućava istovremenu ekspresiju gena teškog i lakog lanca mAt iz jedne konstrukcije nakontransfekcije<1>. Prinalazači su prethodno opisali mikroskalnu ekspresiju mAt u 1 ml ExpiCHO kultura u pločama sa 96 bunara<2>. Za ekspresiju mAt većeg obima, istraživači su izvršili transfekciju (1 do 300 ml po antitelu) CHO ćelijskih kultura koristeći Gibco<™>ExpiCHO<™>sistem ekspresije i protokol za cevi mini bioreaktora od 50 ml (Corning) kako je opisao dobavljač. Supernatanti kulture su prečišćeni pomoću HiTrap MabSelect SuRe (Cytiva, ranije GE Healthcare Life Sciences) na sistemu paralelne proteinske hromatografije sa 24 kolone (Protein BioSolutions). Prečišćena mAtsu zamenjena puferom u PBS, koncentrovana korišćenjem Amicon<®>Ultra-4 50KDa fugalnih filterskih jedinica (Millipore Sigma) i čuvani na 4°C do upotrebe. Prečišćena mAt su rutinski testirana na nivoe

1 2

endotoksina za koje je utvrđeno da su <1 EU/mg IgG za studije NHP. Testiranje endotoksina izvršeno je pomoću PTS201F kertridža (Charles River), sa opsegom osetljivosti od 10 do 0,1 EU/mL, i Endosafe Nexgen-MCS instrumentom (Charles River).

[0258] Istraživači su testirali zaštitnu efikasnost mAt koristeći nedavno opisani model izazova SARS-CoV-2 nehumani primat (NHP)<3,4>. Za ovaj model, istraživači su testirali kao monoterapiju COV2-2196 neutralizujući mAt kodirano istim varijabilnim segmentima gena kao COV2-2196, ali koristeći niz značajnih razlika aminokiselina u HCDR3 i LCDR3. Životinje su primile jednu dozu od 50 mg/kg mAt COV2-2196 ili kontrolni izotip mAt intravenski 3. dana, a zatim su izazvane intranazalno i intratrahealno 0. dana dozom od 1.1 × 10<4>PFU SARS-CoV-2. Nakon izazova, istraživači su procenili virusnu RNK metodom RT-qPCR u bronhoalveolarnoj lavaži (BAL) i brisevima nosa. Visoki nivoi subgenomske virusne RNK primećeni su u NHP tretiranim izotipom mAt, sa srednjim maksimumom od 7,53 (u opsegu od 5,37 do 8,23) log10RNK kopija/bris u brisu nosa i srednjim maksimumom od 4.97 (opseg 3,81 do 5,24) log10RNK kopija/mL u BAL. Subgenomska virusna RNK nije otkrivena u uzorcima iz mAt terapijske grupe (LOD = 50 [1,7 log10] RNK kopija/bris ili po mL) koji pokazuju zaštitu. Farmakokinetička analiza je otkrila stabilne koncentracije cirkulišućih humanih mAt u NHP.

[0259] Studija NHP izazova. Istraživačke studije NHP su se pridržavale principa navedenih u osmom izdanju Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Objekat u kojem je sprovedeno ovo istraživanje (Bioqual Inc., Rockville, MD) je u potpunosti akreditovan od strane Asocijacije za procenu i akreditaciju Međunarodne laboratorije za negu životinja (AAALAC) i ima odobrenu Kancelariju za dobrobit laboratorijskih životinja. Studije NHP sprovedene su u skladu sa svim relevantnim lokalnim, državnim i saveznim propisima i odobrene su od strane relevantnog Komiteta za institucionalnu negu i upotrebu životinja (IACUC).

[0260] Proučavano je osam zdravih odraslih rezus makakija (Macaca mulatta) indijskog porekla (5 do 15 kg telesne težine). Životinje su nasumično raspoređene u grupu lečenja anti-SARS-CoV-2 mAt (n = 4 po grupi) i jednu kontrolnu grupu (tretiranu izotipom) (n = 4 po grupi). Životinje su primile jednu dozu od 50 mg/kg mAt COV2-2196 ili kontrolni izotip mAt intravenski 3. dana, a zatim su izazvane za tri dana sa 1.1 × 10<4>PFU SARS-CoV-2, primenjenim kao 1 ml i.n. rutom i 1 ml intratrahealnom rutom. Nakon izazova, virusna RNK

1

je procenjena pmoću RT-qPCR u bronhoalveolarnoj lavaži i brisevima nosa u više vremenskih tačaka kao što je opisano<5,6>. Sve životinje su bile podvrgnute sistematskim pregledima. Pored toga, sve životinje su svakodnevno praćene internim protokolom bodovanja koji je odobrio Odbor za institucionalnu negu i upotrebu životinja. Ove studije nisu bile slepe.

[0261] Detekcija cirkulišućih humanih mAt u NHP serumu. ELISA ploče su preko noći premazane na 4°C sa 1 µg/ml kozjeg antihumanog IgG (H+L) sekundarnog antitela (prethodno adsorbovanog od strane majmuna) (Novus Biological), a zatim blokirane 2 sata. Uzorci seruma su testirani na trostrukim razblaženjima počevši od razblaženja 1:3 u blokatoru kazeina u PBS (ThermoFisher) razblaživaču. Uzorci su inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim uklonjeni, a ploče su oprane. Bunari su zatim inkubirani 1 sat sa HRP-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (prethodno adsorbovanim od majmuna) (Southern Biotech) pri razblaživanju u 1:4.000. Bunari su isprani, a zatim inkubirani sa SureBlue Reserve TMB Microwell peroksidaznim supstratom (Seracare) (100 µL/bunar) tokom 3 minuta, nakon čega je usledio TMB Stop rastvor (Seracare) da bi se zaustavila reakcija (100 µL/bunar). Mikroploče su očitane na 450 nm. Koncentracije humanih mAt su interpolirane iz linearnog opsega prečišćenih humanih IgG (Sigma) standardnih krivih pomoću Prism softvera, verzija 8.0 (GraphPad).

Primer 3 - Materijali i metode za primer 4

[0262] Ekspresija i prečišćavanje domena vezivanja rekombinantnog receptora (RBD) proteina šiljka SARS-CoV-2. Segmenti DNK koji odgovaraju S proteinu RBD (ostaci 319 -528) optimizovani su za ekspresiju, sintetizovani i klonirani u pTwist-CMV ekspresiju DNK plazmida nizvodno od IL-2 signalnog peptida (MYRMQLLSCIALSLALVTNS) (Twist Bioscience). Tri aminokiselinska linkera (GSG) i Histag su ugrađeni na C-terminusu ekspresijskih konstrukata kako bi se olakšalo prečišćavanje proteina. Expi293F ćelije su transfektovane prolazno sa plazmidom koji kodira RBD, a supernatanti kulture su sakupljeni nakon 5 dana. RBD je prečišćen iz supernatanata hromatografijom afiniteta nikla sa HisTrap Excel kolonama (GE Healthcare Life Sciences). Za proizvodnju proteina koji se koriste u ispitivanjima kristalizacije, 5 µM kifunenzin je uključen u medijum za kulturu kako bi se proizveo RBD sa visokim manoza glikanima. Visoko manozni glikoproteini su naknadno tretirani endoglikozidazom F1 (Millipore) da bi se dobio homogeno deglikozilirani RBD.

1 4

[0263] Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnih COV2-2196 i COV2-2130 Fab. DNK fragmenti koji odgovaraju varijabilnim domenima teškog lanca COV2-2196 i COV2-2130 sa domenom humanog IgG1 CH1 i varijabilnim domenima lakog lanca sa konstantnim domenom humanog kapa lanca su sintetizovani i klonirani u pTwist vektor (Twist Bioscience). Ovaj vektor uključuje teški lanac svakog Fab, praćen GGGGS linkerom, mestom cepanja furina, mestom ribosomskog cepanja T2A i lakim lancem svakog Fab. Ekspresiju teškog i lakog lanca pokreće isti CMV promoter. COV2-2196 i COV2-2130 Fab su izraženi u ExpiCHO ćelijama prolaznom transfekcijom sa ekspresijom plazmida. Rekombinantni Fab je prečišćen iz supernatanta kulture pomoću kolone anti-CH1 CaptureSelect (Thermo Fisher Scientific). Za RBD/COV2-2196 kompleks, za ekspresiju je korišćena sekvenca divljeg tipa COV2-2196. Za kompleks RBD/COV2-2196/COV2-2130 korišćena je modifikovana verzija COV2-2196 Fab u kojoj su prve dve aminokiseline promenljivog regiona mutirane iz QM u EV.

[0264] Kristalizacija i strukturno određivanje kompleksa antitela i antigena. Prečišćeni COV2-2196 Fab je pomešan sa deglikoziliranim RBD u molarnom odnosu 1:1,5, a smeša je dalje prečišćena hromatografijom isključivanja veličine sa kolonom Superdex-200 Increase (GE Healthcare Life Sciences) da bi se dobio kompleks antitela i antigena. Da bi se dobio RBD/COV2-2196/COV2-2130 trostruki kompleks, prečišćeni i deglikozilirani RBD je pomešan sa COV2-2196 i COV2-2130 Fab u molarnom odnosu 1:1,5:1,5, a trostruki kompleks je prečišćen kolonom Superdex-200 Increase. Kompleksi su koncentrovani na oko 10 mg/ml i podvrgnuti ispitivanjima kristalizacije. Kompleks RBD/COV2-2196 je kristalizovan u 16% - 18% PEG 3350, 0,2 Tris-HCl pH 8,0 - 8,5, a kompleks RBD/COV2-2196/COV2-2130 je kristalizovan u 5% (w/v) PEG 1000, 100 mM natrijum fosfat dibazične/limunske kiseline pH 4,2, 40% (v/v) alkohola reagensa. Rastvor za krio-zaštitu je napravljen mešanjem rastvora za kristalizaciju sa 100% glicerolom u zapreminskom odnosu 20:7 za kristale oba kompleksa. Proteinski kristali su brzo zamrznuti tečnim azotom nakon brzog namakanja u rastvor za kriozaštitu. Podaci o difrakciji prikupljeni su na liniji snopa 21-ID-F za kompleks RBD/COV2-2196 i 21-ID-G za kompleks RBD/COV2-2196/COV2-2130 na naprednom izvoru fotona. Podaci o difrakciji su obrađeni sa XDS<58>i CCP4 paketom<59>. Kristalne strukture su rešene molekularnom zamenom korišćenjem strukture RBD u kompleksu sa Fab CC12.1 (PDB ID 6XC2) i Fab strukturom MR78 (PDB ID 5JRP) sa programomPhaser<60>. Konstrukcije su prerađene i obnovljene ručno sa Phenix<61>ili Coot<62>, respektivno. Modeli su deponovani u Banku podataka o proteinima. PyMOL softver<63>je korišćen za izradu svih strukturnih figura.

1

[0265] Eksperimenti sa masenom spektrometrijom vodoničnog deuterijuma (HDX-MS).

HDX-MS eksperimenti su sprovedeni korišćenjem automatizovanog robota za rukovanje uzorcima (LEAP Technologies, Fort Lauderdale, FL, USA) spojenog sa LC sistemom M-klase Acquity i HDX menadžerom (Waters Ltd., Wilmslow, UK). 7,6 µL od of 4.3 µM SARS-CoV-2 S2P trimera sa šiljkom, bilo samostalno, ili sa 1:1,12 molarnim odnosom AZD1061 ili AZD8895 je dodato u 52,4 µL pufera za označavanje (50 mM kalijum fosfat pD 6.2) i inkubirano 1 minut na 20°C. Nakon inkubacije, 50 µL ovog uzorka je dodato u rastvor za gašenje od 50 µL (50 mM kalijum fosfat, 200 mM TCEP, 2 M Gdn-HCl, pH 2,3) na 1°C. 50 µL gašenog uzorka je propušteno kroz imobilisanu BEH pepsinsku kolonu (Waters Ltd., Wilmslow, UK) na 20°C na 100 µL min<-1>(~4,000 psi) tokom 4 minuta pre nego što su dobijeni peptidi zarobljeni korišćenjem Vanguard prekolonske Acquity UPLC BEH C18 trap kolone (1,7 µm, 2,1 mm × 5 mm, Waters Ltd., Wilmslow, UK). Nakon prebacivanja ventila, peptidi su razdvojeni na 1°C gradijentnim eluiranjem od 0 do 35% MeCN (0.2% v/v mravlje kiseline) u H2O (0.2% v/v mravlje kiseline) tokom 6 minuta na 40 µL min<-1>koristeći Acquity UPLC BEH C18 analitičku kolonu (1.7 µm, 1 mm × 100 mm). Peptidi su analizirani pomoću Orbitrap Fusion masenog spektrometra (Thermo Fisher, Bremen, Nemačka) koji radi u režimu detekcije orbitrap pri rezoluciji od 120K (deuterizovani uzorci) ili orbitrap-iontrap DDA režimu (t=0 uzoraka). Peptidni MS/MS podaci koji se koriste za identifikaciju peptida analizirani su pomoću BioPharma Finder v3.0 (Thermo Fisher, Bremen, Nemačka), a unos deuterijuma kvantifikovan je pomoću HDExaminer v2.0 (Sierra Analytics). Rezultati pulova peptida i zbirna tabela unosa CSV izvoza iz HDExaminer su formatirani pomoću interne R: skripte kako bi se generisale cifre unosa i strukturne toplotne mape pomoću PAVED (University of Leeds)<64>.

[0266] Elisa vezivanje COV2-2196 mutanata. Bunari mikrotiterskih ploča sa 384 bunara obloženi su prečišćenim rekombinantnim proteinom SARS-CoV-2 S 6P na 4°C preko noći. Ploče su blokirane sa 2% nemasnog suvog mleka i 2% normalnog kozjeg seruma u DPBS-u koji sadrži 0,05% Tween-20 (DPBS-T) tokom 1 sata. Antitela su razblažena do 10 µg/ml i titrirana dva puta 23 puta u DPBS-T i dodata u bunare, nakon čega je usledila inkubacija 1 sat na sobnoj temperaturi. Vezana antitela su detektovana korišćenjem kozjeg antihumanog IgG konjugovanog sa peroksidazom hrena (Southern Biotech) i TMB supstratom (Thermo Fischer Scientific). Reakcije su ugašene sa 1 N hlorovodoničnom kiselinom i apsorbancija je izmerena na 450 nm pomoću spektrofotometra (Biotek).

1

[0267] Mapiranje svih mutacija koje izbegavaju vezivanje antitela. Sve mutacije koje izbegavaju vezivanje antitela mapirane su DMS pristupom<41>. Istraživači su koristili prethodno opisane biblioteke RBD mutanata sa prikazom kvasca<41,42>. Ukratko, duplirane biblioteke mutanata su konstruisane u domenu vezivanja receptora šiljka (RBD) iz SARS-CoV-2 (izolat Wuhan-Hu-1, Genbank pristupni broj MN908947, ostaci N331-T531) i sadrže 3.804 od 3.819 mogućih mutacija aminokiselina, sa >95% prisutnih kao pojedinačni mutanti. Svaka RBD varijanta je povezana sa jedinstvenom 16-nukleotidnom sekvencom barkoda kako bi se olakšalo nizvodno sekvenciranje. Kao što je prethodno opisano, biblioteke su sortirane za izražavanje RBD i vezivanje za ACE2 kako bi se eliminisale RBD varijante koje su potpuno pogrešno savijene ili nefunkcionalne (tj. nemaju skroman afinitet vezivanja za ACE2<41>).

[0268] Eksperimenti mapiranja izbegavanja antitela izvedeni su u biološkom duplikatu koristeći dve nezavisne mutantske RBD biblioteke, kao što je prethodno opisano<41>, sa manjim modifikacijama. Ukratko, biblioteke mutiranog kvasca indukovane da izraze RBD isprane su i inkubirane antitelima na 400 ng/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Nakon inkubacije antitela, biblioteke su sekundarno označene sa 1: 100 FITC-konjugovanim anti-MYC antitelima (Immunology Consultants Lab, CYMC-45F) za označavanje ekspresije RBD i 1:200 PE-konjugovanim anti-humanim-IgG (Jackson ImmunoResearch 109-115-098) za označavanje vezanih antitela. Protočno citometrijsko sortiranje je korišćeno za obogaćivanje ćelija koje izražavaju RBD varijante sa smanjenim vezivanjem antitela preko selekcione ograde nacrtane za hvatanje nemutiranih ćelija SARS-CoV-2 obeleženih sa 1% koncentracije antitela u uzorcima biblioteke. Za svaki uzorak, na citometru je obrađeno oko 10 miliona RBD+ ćelija. Ćelije sa antitelima su uzgojene preko noći u SD-CAA (6,7 g/L azotna baza kvasca, 5,0 g/L kazamino kiseline, 1,065 g/L mes kiselina i 2% m/v dekstroza) kako bi se proširile ćelije pre ekstrakcije plazmida.

[0269] Uzorci plazmida su pripremljeni iz predselekcije i noćnih kultura ćelija sa antitelima (Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II) kao što je prethodno opisano<41>. Sekvence barkoda od 16 nukleotida koje identifikuju svaku RBD varijantu pojačane su PCR-om i sekvencirane na Illumina HiSeq 2500 sa očitavanjem jednog kraja od 50 bp kao što je opisano<41,42>.

[0270] Frakcije izbegavanja su izračunate kako je opisano<41>, sa manjim izmenama kao što je navedeno u nastavku. Istraživači su koristili paket dms_varijants (jbloomlab.github.io/dms_variants/, version 0.8.2) za obradu Illumina sekvenci u brojevima

1

svake barkodirane RBD varijante u svakoj populaciji pre sortiranja i izbegavanja antitela koristeći prethodno opisanu tabelu za pregled barkoda/RBD<65>.

[0271] Za svaki izbor antitela, istraživači su izračunali „frakciju izbegavanja“ za svaku barkodiranu varijantu koristeći brojeve dubokog sekvenciranja za svaku varijantu u originalnoj populaciji i populaciji koja izbegava antitela i ukupan deo biblioteke koji je izbegao vezivanje antitela putem prethodno opisane formule<41>. Ove frakcije izbegavanja predstavljaju procenjeni deo ćelija koje izražavaju tu specifičnu varijantu koja spada u interval za izbegavanje antitela, tako da vrednost 0 znači da je varijanta uvek vezana serumom, a vrednost 1 znači da uvek izbegava vezivanje antitela. Istraživači su zatim primenili računarski filter za uklanjanje varijanti sa niskim brojem sekvenciranja ili veoma štetnim mutacijama koje mogu izazvati izbegavanje antitela jednostavno dovodeći do loše ekspresije pravilno savijenog RBD-a na površini ćelije kvasc<41,42>. Konkretno, uklonili su varijante koje su imale (ili su sadržale mutacije sa) ACE2 rezultatima vezivanja < -2,35 ili rezultatima ekspresije < -1, koristeći rezultate dubokog mutacionog skeniranja na nivou varijanti i mutacija kao što je prethodno opisano<42>. Imajte na umu da su ovi kriterijumi filtriranja nešto strožiji od onih koji su prethodno korišćeni za mapiranje panela humanih antitela<41>ali su identični onima koji su korišćeni u nedavnim studijama koje definišu ostatke RBD koji utiču na vezivanje mAt<65>i poliklonskogseruma<54>.

[0272] Istraživači su dalje razvrstali rezultate izbegavanja na nivou varijante u procene izbegavanja za pojedinačne mutacije korišćenjem globalnih modela epistaze<66>implementiranih u paketu dms_variants, kao što je detaljno prikazano na (jbloomlab.github.io/dms_variants/dms_variants.globalepistasis.html) i opisano<41>. Prijavljene frakcije izbegavanja u celom radu su prosek u svim bibliotekama (korelacije prikazane na sl.

18A-B); ovi rezultati su takođe u tabeli B. Mesta snažnog izbegavanja svakog antitela za isticanje u grafikonima logotipa su heuristički određena kao mesta čiji su sumirani rezultati izbegavanja mutacije bili najmanje 10 puta veći od srednjeg zbira izbora, i unutar 10-strukog zbira najsnažnijeg izabranog mesta. Kompletna dokumentacija računske analize je na github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs. Ovi rezultati su takođe dostupni u interaktivnoj formi na https://jbloomlab.github.io/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/.

[0273] Eksperimenti selekcije izbegavanja antitela sa VSV-SARS-CoV-2. Za eksperimente selekcije izbegavanja sa COV2-2196 i COV2-2130, istraživači su koristili replikacioni kompetitivni rekombinantni VSV virus koji kodira protein šiljka iz SARS-CoV-2 sa 21

1

aminokiselinskom C-terminalnomdelecijom<43>. Virus VSV koji izražava šiljak je razmnožen u MA104 ćelijama (afrički zeleni majmun, ATCC CRL-2378.1) kao što je prethodno opisano<43>, a virusne zalihe su titrirane na Vero E6 ćelijskim monoslojnim kulturama. Plakovi su vizuelizovani neutralnim crvenim bojama. Za pregled izbegavanja mutacija izabranih u prisustvu COV2-2196, COV2-2130 ili koktela sastavljenog od mešavine 1:1 COV2-2196 i COV2-2130, istraživači su koristili test analize ćelija u realnom vremenu (RTCA) i xCELLigence RTCA MP analizator (ACEA Biosciences Inc.) i prethodno opisanu šemu selekcije izbegavanja<41>. Ukratko, 50 µL medijuma ćelijske kulture (DMEM dopunjen sa 2% FBS) je dodato u svaki bunar E-ploče sa 96 bunara da bi se dobilo pozadinsko očitavanje. Po bunaru je zasejano osamnaest hiljada (18.000) Vero E6 ćelija u 50 µL ćelijske kulture, a na analizator su postavljene ploče. Merenja su vršena automatski svakih 15 minuta, a senzogrami su vizuelizovani pomoću RTCA softvera verzije 2.1.0 (ACEA Biosciences Inc). Virus VSV-SARS-CoV-2 (5e3 jedinice za formiranje plaka (PFU) po bunaru, -0,3 Moi) je pomešan sa zasićujućom neutralizujućom koncentracijom COV2-2196, COV2-2130 ili smešom 1:1 antitela COV2-2196 i COV2-2130 (ukupna koncentracija antitela 5 µg/ml) u ukupnoj zapremini od 100 µL i inkubiran 1 sat na 37°C. U 16-20 sati nakon zasejavanja ćelija, smeše virusa i antitela su dodate u ćelijske monoslojeve. Bunari koji sadrže samo virus u odsustvu antitela i bunari koji sadrže samo Vero E6 ćelije u medijumu uključeni su na svaku ploču kao kontrolne grupe. Ploče su merene neprekidno (svakih 15 min) tokom 72 h. Izbegavanja mutacija identifikovana su praćenjem ćelijskog indeksa na pad ćelijske vijabilnosti. Da bi se potvrdila selekcija izbegavanja antitela, bunari u kojima je primećen citopatski efekat u prisustvu COV2-2130 procenjeni su u naknadnom RTCA eksperimentu u prisustvu 10 µg/ml COV2-2130 ili COV2-2196. Nakon potvrde rezistencije selektovanih virusa na neutralizaciju pomoću COV2-2130, virusni izolati su ekspandirani na Vero E6 ćelije u prisustvu 10 µg/mL COV2-2130. Virusna RNK je izolovana korišćenjem QiAmp kompleta za ekstrakciju virusne RNK (QIAGEN) u skladu sa protokolom proizvođača, a gen za šiljak SARS-CoV-2 je obrnuto transkribovan i pojačan kompletom SuperScript IV One-Step RT-PCR (ThermoFisher Scientific) koristeći prajmere koji okružuju S gen. Amplifikovani PCR proizvod je prečišćen pomoću SPRI magnetnih kuglica (Beckman Coulter) u odnosu 1:1 i sekvenciran Sanger metodom, koristeći prajmere koji daju očitavanja RBD napred i nazad.

[0274] Serijska pasaža i testiranje SARS-CoV-2 za izbor mutacija rezistentnih na mAt.

SARS-CoV-2 soj USA-WA1/2020 je serijski pasažirao u Vero ćelijskim monoslojnim kulturama sa AZD8895, AZD1061 ili AZD7442, u koncentracijama počevši od njihovih

1

respektivnih IC50vrednosti i postepeno se povećavao do njihove IC90vrednosti sa svakom pasažom. Kao kontrolna grupa, virus je pasažirao u odsustvu antitela. Nakon konačne pasaže, procenjena je osetljivost virusa na recipročno antitelo u konačnoj koncentraciji 10 puta većoj od koncentracije IC90testom plaka. Plakovi (n=6) su nasumično izabrani za kulture AZD1061, a njihov gen za kodiranje virusa je sekvenciran.

[0275] Izolacija ili stvaranje autentičnih virusa SARS-CoV-2, uključujući viruse sa varijantnim ostacima. UK B.1.1.7-OXF izolat je dobijen iz brisa nazofarinksa zaražene osobe u Kentu, Engleska. Kliničke studije za dobijanje uzoraka nakon pisanog informisanog pristanka odobrila je bolnica John Radcliffe u Oksfordu, Ujedinjeno Kraljevstvo. Uzorak je razblažen u DMEM-u sa 2% FBS-a i prošao je kroz filter od 0,45 µm pre dodavanja u monoslojeve ćelija Vero-hACE2-TMPRSS2 (poklon A. Creanga i B. Graham). Dva dana kasnije, supernatant je sakupljen za uspostavljanje zaliha nultog pasaža (p0). 2019n-CoV/USA_WA1/2019 izolat SARS-CoV-2 dobijen je iz američkih centara za kontrolu bolesti (CDC) i prošao je na Vero E6 ćelijama. Pojedinačne tačkaste mutacije u genu šiljka (D614G i E484K/D614G) uvedene su u infektivni cDNK klon soja 2019n-CoV/USA_WA1/2019 kao što je prethodno opisano<67>. Nukleotidne supstitucije su uvedene u potklon puc57-CoV-2-F6 koji sadrži šiljasti gen divljeg tipa infektivnog klona SARS-CoV-2<68>. Zarazni cDNK klonovi pune dužine varijante virusa SARS-CoV-2 sastavljeni su in vitro ligacijom sedam susednih cDNK fragmenata u skladu sa prethodno opisanim protokolom<68>. In vitro transkripcija je zatim izvršena za sintezu genomske RNK pune dužine. Da bi se oporavili mutirani virusi, transkripti RNK su elektroporirani u Vero E6 ćelije. Virusi iz supernatanta ćelija sakupljeni su 40 sati kasnije i služili su kao zalihe p0. Sve zalihe virusa potvrđene su sekvenciranjem.

[0276] Test neutralizacije smanjenja fokusa. Serijska razblaženja mAt ili seruma inkubirana su sa 10<2>jedinice koje formiraju fokus (FFU) različitih sojeva ili varijanti SARS-CoV-2 tokom 1 sata na 37°C. Kompleksi antitela i virusa dodati su u ćelijske monoslojne kulture VerohACE2-TMPRSS2 u pločama sa 96 bunara i inkubirani na 37°C 1 sat. Nakon toga, ćelije su prekrivene 1% (m/v) metilcelulozom u MEM dopunjeno sa 2% FBS. Ploče su sakupljene 20 sati kasnije uklanjanjem slojeva i fiksirane sa 4% PFA u PBS-u 20 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i sekvencijalno inkubirane oligoklonalnim pulom anti-S mAt i HRP-konjugovanog kozjeg antihumanog IgG u PBS sa dodatkom 0,1% saponina i 0,1% goveđeg serumskog albumina. Ćelijski žarišta zaražena virusom SARS-CoV-2 vizualizovana

11

su pomoću TrueBlue supstrata peroksidaze (KPL) i kvantifikovana na mikroanalizatoru ImmunoSpot (Cellular Technologies).

[0277] Višestruka poravnanja sekvenci. Prinalazači su tražili varijabilne genske sekvence antitela koje potiču sa istim karakteristikama kao i one koje kodiraju COV2-2196 i preuzeli odgovarajuće sekvence iz repertoara svakog ispitanog pojedinca. Tražili su slične sekvence u javno dostupnim velikim repertoarima sekvenci antitela za tri zdrave osobe i repertoarima krvi iz pupčane vrpce (deponovanih na SRP174305). Parametri pretrage za teški lanac bile su sekvence sa IGHV1-58 i IGHJ3 sa P99, D108 i F110 ostacima. Pored toga, parametri pretrage za laki lanac bili su sekvence sa ostacima Y92 i W98. Sekvence iz odgovarajućeg klonotipa koje su pripadale svakom pojedincu bile su usklađene ili sa ClustalO (teškim lancima) ili sa MUSCLE (lakim lancima). Zatim, grafikoni logotipa poravnatih sekvenci su generisani pomoću WebLogo-a.

[0278] Dostupnost podataka i materijala: Kristalne strukture prijavljene u ovom radu deponovane su u Banku podataka o proteinima pod pristupnim brojevima 7L7D, 7L7E. Depozicija arhive sekvenci za usklađeni skup podataka genskog repertoara humanog antitela je deponovana u NCBI: PRJNA511481. Svi ostali podaci su dostupni u glavnom tekstu ili dopunskim materijalima.

[0279] Dostupnost softvera. Računski cevovod za duboku mutacionu analizu izbegavanja mutacija antitela dostupan je na GitHub: github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs. FASTQ datoteke su dostupne u NCBI arhivi za čitanje sekvenci pod BioSample SAMN17532001 kao deo BioProject PRJNA639956. Frakcije izbegavanja po mutaciji dostupne su na GitHub-u (github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_AZ_Abs/blob/main/results/supp_data/AZ_cocktail_raw_data.csv) i u tabeli B.

Primer 4 - Rezultat i diskusija

[0280] Antitelo zasnovano na COV2-2196 se ispituje za profilaksu ili terapiju u kombinaciji sa antitelima zasnovanim na nekompetitivnom RBD specifičnom antitelu COV2-2130. Da bi razumeli molekularne detalje prepoznavanja RBD pomoću COV2-2196 i COV2-2130, i moguće strukturne mehanizme koji su osnova sinergije prikazane u profilaktičkoj zaštiti dva nekokompetitivna mAt u životinjskim modelima<1>, istraživači su odredili kristalne strukture S proteina RBD u kompleksu sa COV2-2196 na 2,50 Å (slika 8A-E, tabela B) i u kompleksu sa COV2-2196 i COV2-2130 na 3,00 Å (slika 9A-F, tabela B). Podkonstrukcija RBD-COV2-2196 u kompleksu RBD-COV2-2196-2130 je superponirajuća sa konstrukcijom kompleksa RBD-COV2-2196 (SL. 12). Ukopana površina interfejsa između COV2-2196 i RBD je oko 650 Å<2>u obe kristalne strukture, a površina interfejsa između COV2-2130 i RBD je oko 740 Å<2>. COV2-2196 se vezuje za greben RBD koji se vezuje za receptor, a COV2-2130 se vezuje za jednu stranu ivice RBD oko ostatka K444 i sedlastog regiona motiva vezivanja receptora (RBM), preklapajući mesto vezivanja ACE2 (SL. 8A-B, SL. 9A-B). Ove karakteristike objašnjavaju kompetitivnost između antitela i ACE2 za vezivanje za RBD iz naše prethodne studije, npr. i COV2-2196 i COV2-2130 neutrališu virus blokiranjem pristupa RBD humanom receptoru ACE2<1>. Aromatični ostaci iz teških i lakih lanaca COV2-2196 formiraju hidrofobni džep koji okružuje RBD ostatak F486 i susedne ostatke (G485, N487) (SL. 8A, 8D i 8E; SL.13A-C). Ovaj način interakcije Ab-Ag je neobičan po tome što je formiranje džepa antitela uzrokovano širokim prostornim odvajanjem HCDR3 i LCDR3. Pored toga, iako antigeno mesto koje prepoznaje COV2-2196 nije ukopano na interfejsu između protomera S trimera per se, COV2-2196 nije u stanju da veže RBD u konformaciji „dole“ zbog sterilnih sukoba sa RBD u susednom S protomeru. Stoga se COV2-2196 vezuje za RBD samo u konformaciji „gore“ (SL. 8C). Preklapanja podkonstrukcije RBD u kompleksu sa COV2-2130 (sl. 9C) i strukture RBD u kompleksu sa COV2-2196 i COV2-2130 (sl. 9D) ukazuju da je COV2-2130 u stanju da veže RBD i u konformacijama S trimera „gore“ i „dole“. Ovi strukturni nalazi su u skladu sa našim prethodnim rezultatima niže rezolucije za kompleks korišćenjem elektronske mikroskopije sa negativnim bojenjem<1>.

[0281] Strukturna analiza COV2-2196 u kompleksu sa RBD otkriva kako COV2-2196 prepoznaje greben koji se vezuje za receptore na RBD. Jedan od glavnih kontaktnih ostataka, F486, nalazi se u centru mesta vezivanja, intenzivno interagujući sa hidrofobnim džepom (ostatak P99 teškog lanca i „aromatični kavez“ formiran sa 5 aromatičnih bočnih lanaca) između COV2-2196 teških/lakih lanaca preko hidrofobnog efekta i van der Waals interakcija (SL. 8D-E, SL. 13A-B). Mreža vodonične veze (H-veza), izgrađena sa 4 direktne Ab-Ag H-veze i 16 H-veza posredovanih vodom, okružuje ostatak F486 i jača Ab-Ag interakciju (SL.

13C). Važno je da su za sve ostatke osim jednog (ostatak P99 teškog lanca) koji imaju ekstenzivnu interakciju sa epitopom, oni kodirani sekvencama zametnih linija (IGHY1-58<∗>01 i IGHJ3<∗>02 za teški lanac, IGKY3-20<∗>01 i IGKJ1<∗>01 za laki lanac) (SL. 10A) ili su samo njihovi atomi okosnice uključeni u interakcije Ab-Ag, kao što su teški lanac N107 i G99 i laki lanac S94. Istraživači su u literaturi primetili još jedno antitelo, S2E12, koje je kodirano istim IGHV/IGHJ i IGKV/IGKJ rekombinacijama, sa sličnim, ali najverovatnije različitim IGHD genima od onih iz COV2-2196 (IGHD2-15 naspram IGHD2-2)<38>. Poređenje krio-EM strukture S2E12 u kompleksu sa S proteinom (PDB 7K4N) sugeriše da mAt S2E12 verovatno koristi skoro identične Ab-Ag interakcije kao i COV2-2196, iako se mogu videti varijacije u konformacijama bočnih lanaca interfejsa (SL. 13D). Na primer, za ostatak lakog lanca Y92, fenilni prsten u kristalnoj strukturi je upravan na taj prsten u EM strukturi kako je ugrađen.

[0282] Istraživači su pretražili genetske baze podataka kako bi utvrdili da li su ove strukturne karakteristike prisutne u dodatnim SARS-CoV-2 mAt izolovanim od strane drugih i pronašli dodatne članove klonotipa (SL. 10A). Dve druge studije su prijavile isti ili sličan klonotip antitela izolovanih od više pacijenata koji su se oporavili od virusa COVID-19<4,38>, a jedna studija je pronašla tri antitela sa istim uparivanjem IGHV1-58 i IGKV3-20 , bez pružanja informacija o upotrebi gena D ili J<39>. Prijavljeno je da se sva ova antitela snažno vezuju za SARS-CoV-2 RBD i neutrališu virus sa visokom potentnošću<1,4,38,39>. Za sada postoje samo dve strukture atomske rezolucije antitela kodiranih ovim VH(DH)JHi VK-JKrekombinacijama, struktura za COV2-2196 predstavljena ovde, i ona za S2E12<38>. Istraživači su izvršili homologno modeliranje za dva dodatna antitela ovog klonotipa iz sopstvenog panela anti-SARS-CoV-2 antitela, označenih COV2-2072 i COV2-2381. Kao što se i očekivalo, s obzirom na to da su ova antitela članovi zajedničkog genetskog klonotipa, modelirane strukture kompleksa COV2-2072/RBD i COV2-2381/RBD su praktično superimponabilne sa strukturama kompleksa COV2-2196/RBD i S2E12/RBD na Ab-Ag interfejsima (SL.14A-E). Pored toga, COV2-2072 kodira sekvencu glikozilacije vezanu za N u HCDR3 (SL.14D), što je neobična osobina za antitela, s obzirom na to da glikozilacija CDR-a može negativno uticati na prepoznavanje antigena. Međutim, struktura COV2-2196 pokazuje da je disulfidni HCDR3 u ovom klonotipu pod uglom udaljen od mesta vezivanja, objašnjavajući kako se ova neobična HCDR3 glikozilacija u COV2-2072 može tolerisati bez ugrožavanja vezivanja (SL.14E).

[0283] Istraživači su zatim utvrdili da li mogu da identifikuju potencijalne prekursore ovog javnog klonotipa u repertoaru varijabilnih gena antitela cirkulišućih B ćelija pojedinaca koji prethodno nisu bili zaraženi virusom SARS-CoV-2. Istraživači su tražili gene V(D)J i VJ u prethodno opisanim sveobuhvatnim skupovima podataka repertoara koji potiču od 3 zdrava ljudska donatora, bez istorije infekcije SARS-CoV-2, i u skupovima podataka iz krvi iz pupčane vrpce prikupljenih pre pandemije COVID-19<40>. Ukupno 386, 193, 47 ili 7 sekvenci

11

teških lanaca za ovaj reaktivni javni klonotip SARS-CoV-2 pronađeno je u svakom repertoaru donatora ili krvi iz pupčane vrpce (SL. 15A). Pored toga, istraživači su pronašli 516.738 sekvenci humanih antitela sa istom rekombinacijom lakog lanca (IGKV3-20-IGKJ1<∗>01). Za ovaj javni klonotip utvrđeno je ukupno 103.534, 191.039 ili 222.165 sekvenci lakog lanca kod svakog donatora. Zbog velikog broja sekvenci, prvih pet obilnih sekvenci je poravnato od svakog donatora. Višestruko poravnanje sekvenci je generisano za sekvence svakog donatora koristeći ClustalOmega, a generisani su i grafikoni logotipa. Top 5 sekvenci sa istim događajem rekombinacije kod svakog donatora bile su identične, što je rezultiralo istim grafičkim prikazima logotipa (SL.15A-B).

[0284] Istraživači su primetili da je 8 od 9 zajedničkih ostataka važnih za vezivanje u antitelima kodirano sekvencama gena zametne linije, i da su svi bili prisutni u svih 14 članova javnog klonotipa navedenih ovde iz četiri različita tima za otkrivanje antitela (SL. 10A). Da bi potvrdili značaj ovih karakteristika, izrazili su varijantna antitela sa tačkastim mutacijama u paratopu kako bi utvrdili efekat varijacije na konzervirane ostatke (SL.10B). Promena ostatka D108 u A, N ili E imala je mali efekat, ali uklanjanje disulfidne veze u HCDR3 koja je rigidovala tu petlju je smanjilo vezivanje. Ostatak P99 koji usmerava HCDR3 petlju dalje od mesta interakcije sa antigenom je takođe bio važan, jer je mutant P99G pokazao smanjeno vezivanje, a oblik revertanta zametne linije COV2-2196 sa P99 vezanim za antigen, ali P99G u pozadini revertanta zametne linije nije (SL.10B).

[0285] Antitelo zasnovano na varijabilnom regionu COV2-2196 se testira u kombinaciji sa antitelima zasnovanim na varijabilnom regionu COV2-2130 u kliničkim ispitivanjima. COV2-2130 HCDR3, sa 22 aminokiselinska ostatka, je relativno dug za humana antitela i visoko mutiran iz pretpostavljenog gena germinativne linije IGHD3 . HCDR3 formira dugu, strukturiranu petlju sastavljenu od malih petlji, stabilizovan je vodoničnim vezama kratkog dometa i hidrofobnim interakcijama/aromatičnim naslagama unutar HCDR3, a dodatno je ojačan svojim interakcijama (vodoničnim vezama i aromatičnim naslagama) sa ostacima lakog lanca (SL.16A-B). Teški i laki lanci COV2-2130 kodirani su genima zametne linije IGHV3-15 i IGKV4-1, respektivno, a dva gena kodiraju najduže petlje kodirane zametnom linijom HCDR2 (10 aa) i LCDR1 (12 aa), koje se koriste u COV2-2130. Rekombinacija teškim lancem V(D)J, mutacije HCDR3 i uparivanje teških i lakih lanaca rezultiraju vezivnim rascepom između teških i lakih lanaca, što odgovara obliku regiona RBD sa centrom u petlji S443 - Y449 (SL. 9A, SL. 16C). U bliskoj vezi sa ovim strukturnim karakteristikama, samo HCDR3, LCDR1, HCDR2 i LCDR2 su uključeni u formiranje paratopa (SL. 9E-F, SL. 13E-F). Inspekcija Ab-Ag interfejsa otkriva region koji verovatno pokreće veliki deo energije interakcije. Bočni lanac RBD ostatka K444 okružen je potpetljom Y104 - V109 petlje HCDR3, a pozitivno naelektrisanje na atomu NZ bočnog lanca neutrališe bočni lanac HCDR3 ostatka D107, tri atoma karbonilnog kiseonika glavnog lanca iz Y105, D107 i V109, kao i elektronsko lice fenilnog prstena Y104 (interakcija katjon-π) (SL. 13E). Pošto su atomi u interakciji potpuno zaštićeni od rastvarača, visoko koncentrisane interakcije unutar tako ograničenog prostora su energetski povoljne. Štaviše, ova „vruća tačka“ Ab-Ag interfejsa je okružena ili zaštićena od rastvarača Ab-Ag interakcijama sa manjim slobodnim energetskim dobicima, uključujući solni most između RBD ostatka R346 i HCDR2 D56, elektrostatičku interakciju između RBD R346 i glavnog lanca kiseonika HCDR3 Y106, vodoničnu vezu između RBD N450 i HCDR3 Y105 glavnog lanca kiseonika, vodoničnu vezu između RBD V445 glavnog lanca kiseonika i HCDR3 Y104 bočnog lanca, hidrofobnu interakciju između V445 bočnog lanca i bočnih lanaca HCDR3 L113 i F118 (SL. 13E). Takođe, aromatično slaganje između ostatka HCDR3 Y105 i ostatka LCDR2 W56 učestvuje u zaštiti „vruće tačke“ od rastvarača (SL. 13E). Pored toga, laki lanac COV2-2130 LCDR1 i LCDR2 ostvaruju opsežne kontakte sa RBD. Među njima, bočni lanac LCDR1 S32, kiseonik glavnog lanca S33, bočni lanac N34 i bočni lanac LCDR2 Y55 formiraju vodonične veze sa bočnim lancem RBD E484, azotom glavnog lanca S494, kiseonikom glavnog lanca Y449 i azotom glavnog lanca G446 (SL.13F). Ostaci LCDR1 K36, Y38 i LCDR2 W56 stupaju u interakciju sa RBD Y449 putem aromatičnih sabiranja i interakcija katjonom-π, formirajući „interakcioni klaster“ (SL. 13F), iako ove interakcije verovatno nisu energetski tako jake kao u slučaju RBD K444.

[0286] U kristalnoj strukturi RBD u kompleksu sa COV2-2196 i COV2-2130, istraživači su primetili interakciju između blisko razmaknutih COV2-2196 i COV2-2130 Fab (SL. 17). Moguće je da bi interakcije između dva Fab u RBD-vezanom stanju mogle doprineti sinergijskoj neutralizaciji SARS-CoV-2 uočenoj ranije<1>. Međutim, nije jasno koliko se sinergijskog efekta može pripisati ovoj Fab-Fab interakciji.

[0287] Da bi se bolje razumela mesta RBD kritična za vezivanje COV2-2196 i COV2-2130, istraživači su koristili pristup dubokog mutacionog skeniranja (DMS) kako bi mapirali sve mutacije na RBD koje izbegavaju vezivanje antitela<41>; (SL.18). Za oba antitela, identifikovano je nekoliko ključnih mesta, sva u strukturnom otisku antitela, gde su RBD mutacije snažno poremetile vezivanje (SL.11A-D). Istraživači su iskoristili naš prethodni rad na kvantifikaciji

11

efekata RBD mutacija na vezivanje ACE2<42>kako bi prekrili efekat na vezivanje ACE2 za mutacije koje su ukinule vezivanje antitela za RBD (SL. 11A-B). Za COV2-2196, mnoge mutacije na F486 i N487 imale su frakcije izbegavanja koje su se približavale 1 (tj. te RBD varijante su potpuno izbegle vezivanje antitela pod ispitivanim uslovima), što je pojačalo značaj doprinosa ova dva ostatka vezivanju antitela. Slično tome, za COV2-2130, mutacija na mestu K444 na bilo kojoj od ostalih 19 aminokiselina poništila je vezivanje antitela, što ukazuje na to da je lizin na ovoj poziciji kritičan za interakciju Ab-Ag.

[0288] Ipak, nisu svi ostaci u kontaktu sa antitelima identifikovani kao mesta na kojima su mutacije znatno smanjile vezivanje. Moguće je nekoliko objašnjenja: 1) neki ostaci na mestu vezivanja možda nisu kritični za vezivanje, 2) neki ostaci mogu koristiti svoje atome okosnice za interakciju sa svojim bočnim lancem koji je usmeren dalje od interfejsa vezivanja, ili 3) mutacije na nekim mestima možda neće biti tolerisane<42>. Na primer, ostaci L455, F456 i Q493 su deo strukturno definisanog mesta vezivanja za COV2-2196 (SL.8D), ali mutacije na ovim mestima nisu značajno uticale na vezivanje antitela (SL.11A i 11C), što ukazuje na to da ovi ostaci ne doprinose kritičnom vezivanju. Superimpozicija strukture COV2-2196/RBD na strukturu S2E12/RBD jasno pokazuje fleksibilni zglobni region između grebena RBD i ostatka RBD koji se održava kada je antitelo vezano (SL. 13D). Ovaj nalaz ukazuje na to da bi se mutacije na ova tri položaja mogle dobro tolerisati za vezivanje Ab-Ag i podržava neesencijalnu prirodu ovih određenih ostataka za vezivanje COV2-2196 ili S2E12.

[0289] Važno je da se COV2-2196 i COV2-2130 ne takmiče za vezivanje za RBD<1>, što ukazujena to da bi mogli da sadrže koktel otporan na izbegavanje za profilaktičku ili terapijsku upotrebu. Zaista, strukturna mesta vezivanja i mape varijanti izbegavanja za ova dva antitela se ne preklapaju. Da bi testirali da li postoje pojedinačne mutacije koje mogu da izbegnu vezivanje oba antitela, istraživači su izvršili eksperimente mapiranja varijante izbegavanja sa smešom antitela COV2-2196 i COV2-2130 u odnosu 1:1, ali nisu otkrili nijednu mutaciju koja je imala frakciju izbegavanja veću od 0,2, dok su mutacije sa najvećim efektima za svako od pojedinačnih antitela bile približno 1 (SL.18D).

[0290] Iako ovi eksperimenti mapiraju sve mutacije koje izbegavaju antitelo koje se vezuje za RBD, istraživači su takođe nastojali da utvrde koje mutacije imaju potencijal da nastanu tokom rasta virusa. Da bi odgovorili na ovo pitanje, prvo su pokušali da izaberu izbegavanja mutacije koristeći rekombinantni VSV koji izražava SARS-CoV-2 S glikoprotein (VSV-SARS-CoV-

11

2)<43>; (SL. 11E). Istraživači su očekivali da će jedine mutacije aminokiselina koje će biti izabrane tokom rasta virusa biti one 1) koje nastaju promenama jednostruke nukleotidne RNK, 2) koje izazivaju minimalno štetno dejstvo na vezivanje i ekspresiju ACE2 i 3) koje značajno utiču na vezivanje antitela<41,42>. Zaista, istraživači nisu otkrili nikakve mutacije izazvane COV2-2196 koje su i jednonukleotidima dostupne i koje se relativno dobro podnose u pogledu efekata na vezivanje za ACE2 (SL. 11B), što može objasniti zašto mutanti koji se izbegavaju nisu izabrani ni u jednom od 88 nezavisnih replikata rasta rekombinantnog VSV u prisustvu antitela (SL. 11E, SL. 18G). Za COV2-2130, mutacije na mestu K444, mestu koje je relativno tolerantno namutaciju<42>, pokazale su najčešće izbegavanje vezivanja antitela u selekciji izbegavanja antitela visoke propusnosti sa VSV himernim virusom. U 40% eksperimenata selekcije antitela, tokom rasta virusa pojavile su se dve mononukleotidne mutacije sa najvećim efektom na vezivanje antitela, K444R (izabrana u 6 od 20 ponavljanja) i K444E (izabrana u 2 od 20 ponavljanja) (SL.11E, SL.18G).

[0291] Da bi se istražila rezistencija sa autentičnim infektivnim virusom, SARS-CoV-2 soj USA-WA1/2020 je serijski pasažirao kroz Vero ćelijske monoslojne kulture sa kliničkim antitelima zasnovanim na COV2-2196 (AZD8895), COV2-2130 (AZD1061) ili njihovoj 1: 1 kombinaciji (AZD7442), u koncentracijama koje počinju na njihovim respektivnim IC50vrednostima i povećavaju se korak po korak do njihove IC90vrednosti sa svakim pasažom (SL.

19). Kao kontrolna grupa, virus je pasažirao u odsustvu antitela. Nakon konačne pasaže, procenjena je osetljivost virusa na recipročno antitelo u konačnoj koncentraciji 10 puta većoj od koncentracije IC90testom plaka. Istraživači nisu otkrili nikakve plakove otporne na neutralizaciju AZD8895 (na osnovu COV2-2196) ili koktel AZD7442. Virus koji je serijski pasažirao u AZD1061 formirao je plakove do titra 1,2 × 10<7>pfu/mL prisustvu 10 puta IC90vrednosti koncentracije AZD1061, ali plakovi nisu formirani sa AZD7442. Plakovi (n=6) su izabrani nasumično, a njihov gen za kodiranje virusa je sekvenciran, otkrivajući iste 3 promene aminokiselina u svih 6 nezavisno izabranih i sekvenciranih plakova: N74K, R346I i S686G (SL. 11F). Prethodno je prijavljeno da je promena S686G povezana sa serijskim pasažom SARS-CoV-2 u Vero ćelijama<44>, izolovana iz izazovnih studija na tvorovima<45>ili NHPs<46>, i predviđa se da će smanjiti aktivnostfurina<44>. Ostatak N74K se nalazi u N-terminalnom domenu izvan mesta vezivanja AZD1061 i rezultira gubitkom glikana<47>. Ostatak R346I se nalazi na mestu vezivanja AZD1061 i može biti povezan sa rezistencijom na AZD1061. Uticaj promena R346I na vezivanje AZD1061 (COV2-2130) za S protein prikazan je na sl.11G. Supstitucije K444R i K444E izabrane u sistemu VSV-SARS-CoV-2 i supstitucija R346I izabrane pasažom

11

sa autentičnim SARS-CoV-2 dostupne su supstitucijom jednog nukleotida i čuvaju aktivnost vezivanja ACE2 (SL. 11G), što ukazuje na to da je naša DMS analiza predvidela mutacije izabrane u prisustvu antitela COV2-2130. Zajedno, ovi rezultati sveobuhvatno mapiraju efekte svih supstitucija aminokiselina na vezivanje COV2-2196 i COV2-2130 i identifikuju mesta koja mogu biti zabrinjavajuća za evoluciju virusa. S tim u vezi, varijante koje sadrže mutacije na ostacima K444 i R346 su retke među svim sekvenciranim virusima prisutnim u GISAID bazama podataka (sve ≤ 0,01% kada se pristupi 23.12.2020.).

[0292] Nedavno su prijavljene virusne varijante sa povećanom prenosivošću i potencijalnim antigenskim mutacijama kod kliničkih izolata<48-51>. Istraživači su testirali da li će neki od varijantnih ostataka u ovim sojevima koji se brzo pojavljuju ukinuti aktivnost ovih potencijalno neutrališućih antitela. Testirali su virusni izolat iz nazalnog uzorka dobijenog u Oksfordu u Ujedinjenom Kraljevstvu (virus B.1.1.7 označen kao UK B.1.1.7-OXF), koji sadrži B.1.1.7 linije koje definišu promene gena šiljka, uključujući delecije 69-70 i 144-145 u NTD i supstitucije u N501Y, A570D, D614G i P681H<49>. Istraživači su takođe testirali izogene varijante D614G i E484K u pozadini soja WA-1 (2019n-CoV/USA_WA1/2019, [WA-1]), sve pripremljene kao autentični virusi SARS-CoV-2 i korišćene u testovima neutralizacije smanjenja fokusa<43>. Mutacija E484K je bila od posebnog interesa, jer se ovaj ostatak nalazi unutar 4,5 Å svakog od mAt u kompleksu Fab i RBD, iako na samoj periferiji otisaka Fab, prisutan je u novim linijama B.1.351 (501Y.V2)<50>i P.1 (501Y.V3)<51>, i dokazano je da menja vezivanje nekih monoklonskih antitela<52,53>kao i humanih poliklonalnih serumskih antitela<54>. Pokazalo se da su varijante koje sadrže E484K takođe manje efikasno neutralizovane oporavkom seruma i plazme od onih koji su preživeli SARS-CoV-2<55,56>. Za COV2-2196, COV2-2130 i COV2-2050 (treće neutrališuće antitelo koje su istraživači uključili za poređenje jer je u interakciji sa ostatkom E484), praktično nisu pronašli uticaj mutacije D614G ili skupa mutacija prisutnih u soju UK B.1.1.7-OXF; ako ništa drugo, istraživači su primetili trend ka blagom poboljšanju (2- do 3-struko smanjenje vrednosti IC50vrednosti) naspram potonjeg cirkulišućeg virusa (SL. 11H). Međutim, oni su primetili efekte na neutralizaciju virusom D614G/E484K. COV2-2050 je potpuno izgubio aktivnost neutralizacije, u skladu sa našom prethodnom studijom koja je definisala E484K kao mutaciju koja ukida vezivanje COV2-2050<41>. Nasuprot tome, COV2-2196, COV2-2130 i COV2-2196 COV2-2130 pokazali su samo nešto manji inhibicioni kapacitet (2- do 5-struko povećanje vrednosti IC50).

11

[0293] Diskusija. Ove strukturne analize definišu molekularnu osnovu za čestu selekciju javnog klonotipa humanih antitela koja dele rekombinacije teškog lanca V-D-J i lakog lanca V-J koje ciljaju isti region SARS-CoV-2 S RBD. Ostaci kodirani genom za antitela zametne linije u teškim i lakim lancima igraju vitalnu ulogu u prepoznavanju antigena, što ukazuje na to da je za sazrevanje antitela ovog klonotipa potrebno nekoliko somatskih mutacija. Disulfidna veza kodirana IGHD2- genom pruža dodatno ograničenje za HCDR3 da usvoji konformaciju sa oblikom i hemijskom komplementarnošću sa antigenim mestom na RBD. Čini se da tri različita IGHD2 gena (IGHD2-2, IGHD2-8, i IGHD2-15) kodiraju delove HCDR3 koji mogu da funkcionišu u kontekstu ovog klonotipa. Istraživači sugerišu da je ova pojava zajedničkih zametnih gena kodiranih antitela sa unapred konfigurisanim strukturnim karakteristikama koje omogućavaju visoku specifičnost i snažnu neutralizacionu aktivnost neočekivana i korisna karakteristika primarnog humanog imunog odgovora na SARS-CoV-2. Selekcija B ćelija iz ovog javnog klonotipa omogućio je brzu izolaciju ultra-potentnih neutrališućih antitela koja se odupiru izbegavanju i možda bi delimično mogla da objasni izuzetnu efikasnost vakcina na bazi S proteina koja se primećuje u klinici. Moglo bi se predvideti mogućnost da se izazovu titri neutrališućih antitela u serumu sa još većom potencijom neutralizacije korišćenjem dizajna vakcine zasnovane na domenu ili motivu za ovo antigeno mesto kako bi se pripremili humani imunološki odgovori kako bi se izazvao ovaj klonotip.

[0294] Strukturna analiza ovde predstavljenih kompleksa RBD-COV2-2196 i RBD-COV2-2130 sugeriše da se dva antitela vezuju za RBD antigen formiranjem interakcija „nalik zakovicama“ sa visokom gustinom energije po jedinici površine interfejsa, i ovaj nalaz objašnjava kako takva moćna antitela mogu imati tako relativno male (< 750 Å<2>) ukopane površine u Ab-Ag interfejsima. Mapiranje izbegavanja mutacija za dva antitela koja su ovde proučavana ukazalo je na to da su lokusi izbegavanja mutacija u skladu sa mestom vezivanja određenim našim Ab-Ag kristalnim strukturama, što dodatno potvrđuje preciznost DMS metodologije. Istraživači sugerišu da bi se podaci o frakciji izbegavanja u budućnosti mogli koristiti kao ograničenja za računarsko spajanje antitela na antigene ili generalno za proteine na proteine, jer na primer, ostaci K444 ili F486 sa najvećim frakcijama izbegavanja za COV2-2130 ili COV2-2196, respektivno, pokazuju najintenzivnije interakcije sa antitelima u strukturi kompleksa antigen-antitelo.

11

[0295] Nedavna pojava varijantnih virusnih linija sa povećanom prenosivošću i izmenjenim sekvencama na mnogim poznatim mestima neutralizacije zabrinjava zbog sposobnosti SARS-CoV-2 da izbegne trenutne kontramere antitela u razvoju i testiranju. Istraživači su testirali aktivnost antitela i koktela oba i pronašli održivu aktivnost naspram nekoliko važnih varijanti, uključujući virus koji sadrži mutaciju E484K i virus B.1.1.7 sa višestrukim varijacijama S gena. Genetska i strukturna osnova za ovu široku aktivnost otkrivena je u kristalnim strukturama i DMS studijama koje su ovde predstavili istraživači. Centralno prepoznavanje relativno nepromenljivog ostatka F486 od strane domena „aromatičnog kaveza“ u COV2-2196 je korisno, jer je varijacija ovog ostatka povezana sa smanjenom virusnom sposobnošću. Ciljanje ovog mesta vezivanja izgleda posebno efikasno u podešavanju sinergijske neutralizacije u kombinaciji sa mAt COV2-2130 koji prepoznaje i „otvorene“ i „zatvorene“ S trimere. Dakle, čini se da ova kombinacija nudi širok i moćan mehanizam inhibicije koji se odupire izbegavanju.

Proširena tabela podataka 1. Statistika prikupljanja i dorade podataka za kristale kompleksa RBD-COV2-2196 i RBD-COV2-2196-2130

[0296]

12

, gde jeIhkl(j)posmatrani intenzitet, a Ihklkonačni prosečni intenzitet.

Rwork= Σ ||Fobs| ||Fcalc|/Σ |Fobs| i Rfree= Σ ||Fobs| - |Fcalc||/Σ |Fobs|, gde se Rfreei Rworkizračunavaju korišćenjem nasumično izabranog test skupa od 5% podataka i svih refleksija, isključujući test skup od 5%, respektivno. Brojevi u zagradama su za najviše rezolucije.

REFERENCE ZA PRIMERE 1 I 2

[0297]

1. ter Meulen, J., et al. Human monoclonal antibody as prophylaxis for SARS coronavirus infection in ferrets. Lancet 363, 2139-2141 (2004).

2. Zhou, P., et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270-273 (2020).

3. Robbiani, D.F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 infection in convalescent individuals. bioRxiv, 2020.2005.2013.092619 (2020).

4. Brouwer, P.J.M., et al. Potent neutralizing antibodies from COVID-19 patients define multiple targets of vulnerability. bioRxiv, 2020.2005.2012.088716 (2020).

5. Niu, P., et al. Ultrapotent human neutralizing antibody repertoires against Middle East Respiratory Syndrome coronavirus from a recovered patient. J Infect Dis 218, 1249-1260 (2018).

6. Wang, L., et al. Importance of neutralizing monoclonal antibodies targeting multiple antigenic sites on the Middle East Respiratory Syndrome coronavirus spike glycoprotein to avoid neutralization escape. J Virol 92, e02002-17 (2018).

REFERENCE ZA PRIMERE 3 I 4

[0298]

1. 1 Zost, S. J. et al. Potently neutralizing and protective human antibodies against SARS-CoV-2. Nature 584, 443-449, doi:10.1038/s41586-020-2548-6 (2020).

2. 2 Yuan, M. et al. Structural basis of a shared antibody response to SARS-CoV-2.

Science 369, 1119-1123, doi:10.1126/science.abd2321 (2020).

3. 3 Nielsen, S. C. A. et al. Human B Cell Clonal Expansion and Convergent Antibody Responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 28, 516-525 e515, doi:10.1016/j.chom.2020.09.002 (2020).

4. 4 Robbiani, D. F. et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature 584, 437-442, doi:10.1038/s41586-020-2456-9 (2020).

5 Brouwer, P. J. M. et al. Potent neutralizing antibodies from COVID-19 patients define multiple targets of vulnerability. Science 369, 643-650, doi:10.1126/science.abc5902 (2020).

6 Zhou, P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270-273, doi:10.1038/s41586-020-2012-7 (2020).

7 Zhu, N. et al. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med 382, 727-733, doi: 10.1056/NEJMoa2001017 (2020).

8 Hoffmann, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 181, 271-280 e278, doi:10.1016/j.cell.2020.02.052 (2020).

9 Letko, M., Marzi, A. & Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat Microbiol 5, 562-569, doi:10.1038/s41564-020-0688-y (2020).

10 Wahba, L. et al. An Extensive Meta-Metagenomic Search Identifies SARS-CoV-2-Homologous Sequences in Pangolin Lung Viromes. mSphere 5, doi:10.1128/mSphere.00160-20 (2020).

11 Walls, A. C. et al. Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 11157-11162, doi:10.1073/pnas.1708727114 (2017).

12 Algaissi, A. et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Sci Rep 10, 16561, doi:10.1038/s41598-020-73491-5 (2020).

13 Long, Q. X. et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med 26, 845-848, doi:10.1038/s41591-020-0897-1 (2020).

12

14 Piccoli, L. et al. Mapping Neutralizing and Immunodominant Sites on the SARS-CoV-2 Spike Receptor-Binding Domain by Structure-Guided High-Resolution Serology. Cell, doi:10.1016/j.cell.2020.09.037 (2020).

15 Cao, Y. et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients' B Cells. Cell 182, 73-84 e16, doi:10.1016/j.cell.2020.05.025 (2020).

16 Hansen, J. et al. Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail. Science 369, 1010-1014, doi:10.1126/science.abd0827 (2020).

17 Ju, B. et al. Human neutralizing antibodies elicited by SARS-CoV-2 infection. Nature 584, 115-119, doi:10.1038/s41586-020-2380-z (2020).

18 Liu, L. et al. Potent neutralizing antibodies against multiple epitopes on SARS-CoV-2 spike. Nature 584, 450-456, doi:10.1038/s41586-020-2571-7 (2020).

19 Rogers, T. F. et al. Isolation of potent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and protection from disease in a small animal model. Science 369, 956-963, doi:10.1126/science.abc7520 (2020).

20 Shi, R. et al. A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2. Nature 584, 120-124, doi:10.1038/s41586-020-2381-y (2020).

21 Weitkamp, J. H. et al. Infant and adult human B cell responses to rotavirus share common immunodominant variable gene repertoires. J Immunol 171, 4680-4688, doi:10.4049/jimmunol.171.9.4680 (2003).

22 Benton, D. J. et al. Receptor binding and priming of the spike protein of SARS-CoV-2 for membrane fusion. Nature, doi:10.1038/s41586-020-2772-0 (2020).

23 Wrapp, D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263, doi:10.1126/science.abb2507 (2020).

24 Wrobel, A. G. et al. SARS-CoV-2 and bat RaTG13 spike glycoprotein structures inform on virus evolution and furin-cleavage effects. Nat Struct Mol Biol 27, 763-767, doi:10.1038/s41594-020-0468-7 (2020).

25 Zost, S. J. et al. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein. Nat Med 26, 1422-1427, doi:10.1038/s41591-020-0998-x (2020).

26 Tian, C. et al. Immunodominance of the VH1-46 antibody gene segment in the primary repertoire of human rotavirus-specific B cells is reduced in the memory compartment through somatic mutation of nondominant clones. J Immunol 180, 3279-3288, doi:10.4049/jimmunol.180.5.3279 (2008).

27 Wu, X. et al. Focused evolution of HIV-1 neutralizing antibodies revealed by structures and deep sequencing. Science 333, 1593-1602, doi:10.1126/science.1207532 (2011).

28 Zhou, T. et al. Structural Repertoire of HIV-1-Neutralizing Antibodies Targeting the CD4 Supersite in 14 Donors. Cell 161, 1280-1292, doi:10.1016/j.cell.2015.05.007 (2015).

29 Huang, C. C. et al. Structural basis of tyrosine sulfation and VH-gene usage in antibodies that recognize the HIV type 1 coreceptor-binding site on gp 120. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2706-2711, doi: 10.1073/pnas. 03085271 00 (2004).

30 Williams, W. B. et al. HIV-1 VACCINES. Diversion of HIV-1 vaccine-induced immunity by gp41-microbiota cross-reactive antibodies. Science 349, aab1253, doi:10.1126/science.aab1253 (2015).

31 Joyce, M. G. et al. Vaccine-Induced Antibodies that Neutralize Group 1 and Group 2 Influenza A Viruses. Cell 166, 609-623, doi:10.1016/j.cell.2016.06.043 (2016).

12

32 Pappas, L. et al. Rapid development of broadly influenza neutralizing antibodies through redundant mutations. Nature 516, 418-422, doi:10.1038/nature13764 (2014).

33 Sui, J. et al. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16, 265-273, doi:10.1038/nsmb.1566 (2009).

34 Wheatley, A. K. et al. H5N1 Vaccine-Elicited Memory B Cells Are Genetically Constrained by the IGHV Locus in the Recognition of a Neutralizing Epitope in the Hemagglutinin Stem. J Immunol 195, 602-610, doi:10.4049/jimmunol.1402835 (2015).

35 Bailey, J. R. et al. Broadly neutralizing antibodies with few somatic mutations and hepatitis C virus clearance. JCI Insight 2, doi:10.1172/jci.insight.92872 (2017).

36 Giang, E. et al. Human broadly neutralizing antibodies to the envelope glycoprotein complex of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 6205-6210, doi:10.1073/pnas.1114927109 (2012).

37 Rappuoli, R., Bottomley, M. J., D'Oro, U., Finco, O. & De Gregorio, E. Reverse vaccinology 2.0: Human immunology instructs vaccine antigen design. J Exp Med 213, 469-481, doi:10.1084/jem.20151960 (2016).

38 Tortorici, M. A. et al. Ultrapotent human antibodies protect against SARS-CoV-2 challenge via multiple mechanisms. Science, doi:10.1126/science.abe3354 (2020).

39 Kreer, C. et al. Longitudinal Isolation of Potent Near-Germline SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies from COVID-19 Patients. Cell 182, 843-854 e812, doi:10.1016/j.cell.2020.06.044 (2020).

40 Soto, C. et al. High frequency of shared clonotypes in human B cell receptor repertoires. Nature 566, 398-402, doi:10.1038/s41586-019-0934-8 (2019).

12

41 Greaney, A. J. et al. Complete mapping of mutations to the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain that escape antibody recognition. Cell Host Microbe, doi:10.1016/j.chom.2020.11.007 (2020).

42 Starr, T. N. et al. Deep mutational scanning of SARS-CoV-2 receptor binding domain reveals constraints on folding and ACE2 binding. Cell 182, 1295-1310 e1220, doi:10.1016/j.cell.2020.08.012 (2020).

43 Case, J. B. et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replicationcompetent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 28, 475-485 e475, doi:10.1016/j.chom.2020.06.021 (2020).

44 Klimstra, W. B. et al. SARS-CoV-2 growth, furin-cleavage-site adaptation and neutralization using serum from acutely infected hospitalized COVID-19 patients. J Gen Virol 101, 1156-1169, doi:10.1099/jgv.0.001481 (2020).

45 Sawatzki, K. et al. Ferrets not infected by SARS-CoV-2 in a high-exposure domestic setting. bioRxiv, 2020.2008.2021.254995, doi:10.1101/2020.08.21.254995 (2020).

46 Baum, A. et al. REGN-COV2 antibodies prevent and treat SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques and hamsters. Science 370, 1110-1115, doi:10.1126/science.abe2402 (2020).

47 Li, Q. et al. The impact of mutations in SARS-CoV-2 spike on viral infectivity and antigenicity. Cell 182, 1284-1294 e1289, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012 (2020).

48 Galloway, S. E. et al. Emergence of SARS-CoV-2 B.1.1.7 Lineage - United States, December 29, 2020-January 12, 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 70, 95-99, doi:10.15585/mmwr.mm7003e2 (2021).

49 Leung, K., Shum, M. H., Leung, G. M., Lam, T. T. & Wu, J. T. Early transmissibility assessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2 in the United Kingdom, October to November 2020. Euro Surveill 26, doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.26.1.2002106 (2021).

12

50 Tegally, H. et al. Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndromerelated coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa. medRxiv, 2020.2012.2021.20248640, doi:10.1101/2020.12.21.20248640 (2020).

51 Voloch, C. M. et al. Genomic characterization of a novel SARS-CoV-2 lineage from Rio de Janeiro, Brazil. medRxiv, 2020.2012.2023.20248598, doi:10.1101/2020.12.23.20248598 (2020).

52 Liu, Z. et al. Landscape analysis of escape variants identifies SARS-CoV-2 spike mutations that attenuate monoclonal and serum antibody neutralization. bioRxiv, 2020.2011.2006.372037, doi:10.1101/2020.11.06.372037 (2021).

53 Weisblum, Y. et al. Escape from neutralizing antibodies by SARS-CoV-2 spike protein variants. Elife 9, doi:10.7554/eLife.61312 (2020).

54 Greaney, A. J. et al. Comprehensive mapping of mutations to the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human serum antibodies. bioRxiv, 2020.2012.2031.425021, doi:10.1101/2020.12.31.425021 (2021).

55 Wibmer, C. K. et al. SARS-CoV-2501Y.V2 escapes neutralization by South African COVID-19 donor plasma. bioRxiv, 2021.2001.2018.427166, doi:10.1101/2021.01.18.427166 (2021).

56 Andreano, E. et al. SARS-CoV-2 escape in vitro from a highly neutralizing COVID-19 convalescent plasma. bioRxiv, 2020.2012.2028.424451, doi:10.1101/2020.12.28.424451 (2020).

57 Huo, J. et al. Neutralization of SARS-CoV-2 by destruction of the prefusion spike. Cell Host Microbe 28, 445-454 e446, doi:10.1016/j.chom.2020.06.010 (2020).

58 Kabsch, W. Xds. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-132, doi:10.1107/S0907444909047337 (2010).

12

59 Winn, M. D. et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 235-242, doi:10.1107/S0907444910045749 (2011).

60 McCoy, A. J. et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr 40, 658-674, doi:10.1107/S0021889807021206 (2007).

61 Adams, P. D. et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213-221, doi:10.1107/S0907444909052925 (2010).

62 Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132, doi:10.1107/S0907444904019158 (2004).

63 Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 (2015).

64 Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E. & Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and deltaN6 beta2-microglobulin. J Am Soc Mass Spectrom 29, 2413-2426, doi:10.1007/s13361-018-2067-y (2018).

65 Starr, T. N. et al. Prospective mapping of viral mutations that escape antibodies used to treat COVID-19. bioRxiv, doi:10.1101/2020.11.30.405472 (2020).

66 Otwinowski, J., McCandlish, D. M. & Plotkin, J. B. Inferring the shape of global epistasis. Proc Natl Acad Sci USA 115, E7550-E7558, doi:10.1073/pnas.1804015115 (2018).

67 Plante, J. A. et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature, doi:10.1038/s41586-020-2895-3 (2020).

68 Xie, X. et al. An infectious cDNA clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 27, 841-848 e843, doi:10.1016/j.chom.2020.04.004 (2020).

12

Tabela A - Podaci o aktivnosti

1 Primer 5: Potencijalno neutrališuća humana antitela koja blokiraju vezivanje za SARS-CoV-2 receptor i štite životinje

[0299] AUTORI: Seth J. Zost<1∗>, Pavlo Gilchuk<1∗>, James Brett Case<3>, Elad Binshtein<1>, Rita E. Chen<2,3>, Joseph X. Reidy<1>, Andrew Trivette<1>, Rachel S. Nargi<1>, Rachel E. Sutton<1>, Naveenchandra Suryadevara<1>, Lauren E. Williamson<4>, Elaine C. Chen<4>, Taylor Jones<1>, Samuel Day<1>, Luke Myers<1>, Ahmed O. Hassan<3>, Natasha M. Kafai<2,3>, Emma S. Winkler<2,3>, Julie M. Fox<3>, James J. Steinhardt<6>, Kuishu Ren<7>, Yueh-Ming Loo<7>, Nicole L. Kallewaard<7>, David R. Martinez<5>, Alexandra Schdfer<5>, Lisa E. Gralinski<5>, Ralph S. Baric<5>, Larissa B. Thackray<3>, Michael S. Diamond<2,3,8,9>, Robert H. Camahan<1,10∗ ∗>, James E. Crowe, Jr.<1,4,10∗ ∗>

Saradnici:

[0300]

<1>Vanderbilt Vaccine Center, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, USA

<2>Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

<3>Department of Medicine, Washington University School of Medicine, St. Louis, 63110, MO, USA<4>Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, USA

<5>Department of Epidemiology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, 27599, USA

<6>Antibody Discovery and Protein Engineering, BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca, Gaithersburg, Maryland, 20878, USA

<7>Microbial Sciences, BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca, Gaithersburg, Maryland, 20878, USA

1 1

<8>Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

<9>Andrew M. and Jane M. Bursky Center for Human Immunology and Immunotherapy Programs, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

<10>Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, USA

Kontakt informacije:

James E. Crowe, Jr., M.D. [GLAVNI KONTAKT]

Departments of Pediatrics, Pathology, Microbiology, and Immunology, and the Vanderbilt Vaccine Center

Pošta:

Vanderbilt Vaccine Center

11475 Medical Research Building IV

2213 Garland Avenue

Nashville, TN 37232-0417, USA

Telefon (615) 343-8064

Email james.crowe@vumc.org

Dodatne fusnote naslovne strane

* Ovi autori su podjednako doprineli

1 2

<∗ ∗>Odgovarajući autori

Ključne reči: Koronavirus; SARS-CoV-2; SARS-CoV; COVID-19; antitela, monoklonska; humani; adaptivni imunitet.

[0301] Pandemija COVID-19 je velika pretnja globalnom zdravlju za koju postoje samo ograničene medicinske kontramere, a nedostaje nam temeljno razumevanje mehanizama humoralnogimuniteta<1,2>. Iz panela monoklonskih antitela (mAt) koja ciljaju šiljak

(S), glikoprotein izolovan iz B ćelija zaraženih subjekata, identifikovali smo nekoliko mAt koja su pokazala snažnu neutrališuću aktivnost sa IC50 vrednostima od samo 0,9 ili 15 ng/ml u testovima neutralizacije pseudovirusa ili divljeg tipa (wt) SARS-CoV-2, respektivno. Najsnažniji mAt u potpunosti blokira interakciju domena vezivanja receptora S (SRBD) sa humanim ACE2. Studije vezane za kompetitivnost, strukturne i funkcionalne studije omogućile su grupisanje mAt u definisane klase koje prepoznaju različite epitope unutar glavnih antigenskih mesta na SRBD. Ispitivanja elektronskom mikroskopijom otkrila su da ova mAt prepoznaju različita konformaciona stanja trimernog S proteina. Potentna neutrališuća mAt koja prepoznaju jedinstvena mesta, COV2-2196 i COV2-2130, istovremeno vezana za S i sinergistički neutralizovan autentični SARS-CoV-2 virus. U dva mišja modela infekcije SARS-CoV-2, pasivni prenos samog COV2-2916 ili COV2-2130 ili kombinacije oba mAt zaštitio je miševe od teškog gubitka težine i smanjio virusno opterećenje i upalu u plućima. Ovi rezultati identifikuju zaštitne epitope na SRBD i pružaju okvir zasnovan na strukturi za racionalni dizajn vakcine i izbor robusnih imunoterapijskih koktela.

[0302] S protein SARS-CoV-2 je molekularna determinanta virusnog vezivanja, fuzije i ulaska u ćelije domaćina<3>. Krio-EM struktura prefuzijom stabilizovanog trimernog S proteinskog ektodomena (S2Pecto) za SARS-CoV-2 otkriva slične karakteristike kao i SARS-CoV S protein<4>. Ovaj integralni membranski protein tipa I i fuzioni protein klase I poseduje N-terminalnu podjedinicu (S1) koja posreduje u vezivanju za receptor i C-terminalnu podjedinicu (S2) koja posreduje u fuziji virus-ćelijske membrane. Podjedinica S1 sadrži N-terminalni domen (SNTD) i domen vezivanja receptora (SRBD). SARS-CoV-2 i SARS-CoV, koji dele približno 78% identiteta sekvence u svojim genomima<1>koriste humani angiotenzin-konvertujući enzim 2 (hACE2) kao ulazni receptor<5-7>. Prethodne studije humanog imuniteta na druge visoko

1

patogene zoonotske betakoronaviruse, uključujući SARS-CoV<8-12>i Bliskoistočni respiratorni sindrom (MERS)<13-22>pokazale su da At do virusnog površinskog šiljka (S) glikoproteina posreduju zaštitni imunitet. Čini se da najmoćnija mAt specifična za S protein neutrališu betakoronaviruse blokiranjem vezivanja virusa za ćelije domaćina vezivanjem za region na SRBD koji direktno posreduje u angažovanju receptora. Verovatno je da humano At ima obećava primenu u modifikovanju bolesti tokom infekcije SARS-CoV-2, kada se koristi za profilaksu, profilaksu nakon izlaganja ili lečenje infekcijeSARS-CoV-2<23>. Mnoge studije, uključujući randomizovana kontrolisana ispitivanja koja procenjuju oporavljenu plazmu i jedno ispitivanje koje procenjuje hiperimuni imunoglobulin, su u toku, ali još uvek nije jasno da li takvi tretmani mogu smanjiti morbiditet ili mortalitet<24>.

[0303] Izolovali smo veliki panel SARS-CoV-2 S protein-reaktivnih mAt iz B ćelija dve osobe koje su prethodno bile zaražene SARS-CoV-2 u Vuhanu u Kini<25>. Podgrupa tih antitela vezana je za domen koji se vezuje za receptor S (SRBD) i pokazala je neutrališuću aktivnost u brzom skrining testu sa autentičnim SARS-CoV-2<25>. Ovde smo definisali antigenski pejzaž SARS-CoV-2 i utvrdili koja mesta SRBD su meta zaštitnih mAt. Testirali smo panel od 40 anti-S humanih mAt koje smo prethodno unapred izabrali testom brzog skrininga neutralizacije u kvantitativnom testu neutralizacije smanjenja fokusa (FRNT) sa SARS-CoV-2 sojem WA1/2020. Ovi testovi su otkrili da panel pokazuje opseg vrednosti polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50), od 15 do preko 4.000 ng/ml (vizuelizovano kao toplotna mapa na sl. 20a, vrednosti prikazane u tabeli B i pune krive prikazane na sl.24). Pretpostavili smo da mnogi od ovih SRBD-reaktivnih mAt neutrališu infekciju virusom blokiranjem SRBD vezivanja za hACE2. Zaista, većina neutrališućih mAt koje smo testirali inhibirala je interakciju hACE2 sa trimernim S proteinom direktno (SL. 20a, SL. 25). U skladu sa ovim rezultatima, ova mAt se takođe snažno vezuju za trimerni S ektodomen (S2Pecto) protein ili monomerni SRBD (SL. 20a, SL. 26). Procenili smo da li S2Pectoili vezivanje ili hACE2-blokada predviđaju potenciju neutralizacije vezivanja nezavisno, ali nijedno od ovih merenja nije u korelaciji sa potencijom neutralizacije (SL.20b-d). Međutim, svaki od mAt u najvišem nivou neutrališuće potentnosti (IC50<150 ng/ml) takođe je otkrio najjaču aktivnost blokiranja protiv hACE2 (IC50< 150 ng/ml) i izuzetnu aktivnost vezivanja (EC50< 2 ng/ml) za S2Pecto trimer i SRBD (SL.20e). Reprezentativne krive neutralizacije za dva potencijalno neutrališuća mAt označena sa COV2-2196 i COV2-2130 prikazane su na (SL.20f). Potentna neutralizacija je potvrđena pomoću testova neutralizacije pseudovirusa, koji su otkrili daleko osetljivije fenotipove neutralizacije od virusa wt i pokazali zahtev za upotrebu testova živih virusa za

1 4

procenu potencije mAt (SL.20g). Oba ova mAt su se snažno vezala za S2Pectotrimer i potpuno blokirala vezivanje za hACE2 (SL.20h-i).

[0304] Zatim smo definisali glavna antigenska mesta na SRBD za neutralizaciju mAt analizom kompetitivnog vezivanja. Prvo smo koristili biološku interferometrijsku kompetitivnu analizu sa minimalnim SRBD domenom za testiranje na mAt koja su se takmičila za vezivanje sa potentno neutralizirajućim mAt COV2-2196 ili rekombinantnom verzijom prethodno opisanog SARS-CoV mAt CR3022, koje prepoznaje konzervirani šifrovani epitop<10,26>. Identifikovali smo tri glavne grupe kompetitivnih mAt (SL. 21a). Najveća grupa mAt je blokirala COV2-2196 ali ne i rCR3022, dok su neka mAt bila blokirana od strane rCR3022 ali ne i COV2-2196. Ni jedno referentno mAt nije blokiralo dva mAt, uključujući COV2-2130. Većina mAt se takmičila sa hACE2 za vezivanje, što sugeriše da su se vezali u blizini mesta vezivanja hACE2 SRBD. Koristili smo COV2-2196, COV2-2130 i rCR3022 u kompetitivnom testu zasnovanom na ELISA testu sa trimernim S2Pectoproteinom i takođe smo otkrili da SRBD sadrži tri glavna antigenska mesta, pri čemu neka mAt verovatno ostvaruju kontakte na više od jednog mesta (SL. 21b). Većina potencijalno neutrališućih mAt direktno se takmičila za vezivanje sa COV2-2196.

[0305] Pošto COV2-2196 i COV2-2130 nisu konkurisali za vezivanje za SRBD, procenili smo da li se ova mAt sinergiziraju za neutralizaciju virusa, fenomen koji je prethodno primećen za SARS-CoVmAt<10>. Testirali smo kombinovane odgovore (videti neutralizacionu matricu dozaodgovor, SL.21C) u FRNT koristeći SARS-CoV-2 i uporedili ove eksperimentalne vrednosti sa očekivanim odgovorima izračunatim modelima bodovanja sinergije<27>. Poređenjem je otkriveno da je kombinacija COV2-2196 COV2-2130 bila sinergijska (sa ocenom sinergije od 17,4, gde svaka ocena >10 ukazuje na sinergiju). Podaci na sl.21C pokazuju matricu sinergije doze i odgovora i pokazuju da je kombinovana doza mAt od 79 ng/ml u koktelu (16 ng/ml COV2-2196 i 63 ng/ml COV2-2130) imala istu aktivnost kao 250 ng/ml svakog pojedinačnog mAt (videti sl.21C). Ovaj nalaz pokazuje da se upotrebom koktela doza svakog mAt može smanjiti za više od tri puta kako bi se postigla ista jačina neutralizacije in vitro.

[0306] Zatim smo definisali epitope koje prepoznaju reprezentativna mAt u dve glavne grupe koje se kompetitivno vezuju i sinergiju za neutralizaciju. Sproveli smo studije mutageneze SRBD koristeći supstituciju alanina ili arginina kako bismo odredili kritične ostatke za vezivanje neutralizujućih mAt (SL.27). Studije gubitka vezivanja otkrile su F486A ili N487A

1

kao kritične ostatke za COV2-2196 i N487A kao kritične ostatke za COV2-2165, koji se međusobno takmiče za vezivanje, a takođe su studije mutageneze za COV2-2130 koristeći K444A i G447R mutante definisale ove ostatke kao kritične za prepoznavanje (SL. 22a). Prethodne strukturne studije definisale su interakciju između SRBD i hACE2 (SL. 22b)<28>. Većina interakcionih ostataka u SRBD sadržana je u linearnom peptidu sa 60 aminokiselina koji definiše motiv prepoznavanja hACE2 (SL. 22c). Zatim smo testirali vezivanje humanih mAt za ovaj minimalni peptid i otkrili da su potentni neutrališući članovi najveće grupe koja se kompetitivno vezuje, uključujući COV2-2196, COV2-2165 i COV2-2832, prepoznali ovaj peptid (SL. 22C), što ukazuje na to da ova mAt ostvaruju kritične kontakte unutar motiva prepoznavanja hACE2.

[0307] Koristili smo elektronsku mikroskopiju negativnog bojenja S2Pecto trimera/Fab kompleksa za strukturno određivanje epitopa za ova mAt. Potentno neutrališuća antitela COV2-2196 i COV2-2165 vezala su se za hACE2 motiv prepoznavanja SRBD i prepoznala „otvoreno“ konformaciono stanje S2Pectotrimera (SL.22d). Međutim, način angažovanja ova dva antitela se razlikovao, jer su se pozicija vezivanja i ugao u odnosu na šiljak za jedno telo razlikovali u poređenju sa drugim. COV2-2130, koji predstavlja drugu grupu kompetitivnog vezivanja, vezao se za RBD u S2Pectotrimer u „zatvorenom“ položaju (SL. 22d). Pošto se COV2-2196 i COV2-2130 nisu takmičili za vezivanje, pokušali smo da napravimo komplekse oba Fab vezana istovremeno za S2Pecto trimer. Utvrdili smo da su oba Fab vezana istovremeno kada je S2Pectotrimer bio u otvorenom položaju, što ukazuje na to da COV2-2130 može da prepozna SRBD u obe konformaciji (SL. 22e) Preklapanjem dva-Fab kompleksa sa strukturom RBD:CR3022 kompleksa<26>, primetili smo dase ova antitela vezuju za tri različita mesta na SRBD, kao što je predviđeno na osnovu naših studija kompetitivnih vezivanja (SL.

22f).

[0308] Zatim smo testirali profilaktičku efikasnost monoterapije COV2-2196 ili COV2-2130 ili kombinacije COV2-2196 COV2-2130 u novorazvijenom modelu infekcije SARS-CoV-2 kod BALB/c miševa kod kojih se hACE2 izražava u plućima nakon intranazalne transdukcije adenovirusa (AdV-hACE2). U ovom relativno strogom modelu bolesti, takođe smo dali jednu dozu anti-Ifnar1 antitela za povećanje virusne infekcije i patogeneze, što rezultira diseminiranom intersticijskom pneumonijom (A. Hassan i M. Diamond, dostavljeni za objavljivanje). Pasivno smo preneli jednu dozu mAt COV2-2196 (10 mg/kg), COV2-2130 (10 mg/kg), kombinaciju COV2-2196 COV2-2130 (po 5 mg/kg), ili kontrolni izotip mAt (10

1

mg/kg) na AdV-hACE2 transdukovane miševe jedan dan pre intranazalnog izazova sa 4 × 10<5>PFU SARS-CoV-2. Profilaksa sa COV2-2196 ili COV2-2130 ili njihovom kombinacijom sprečila je težak gubitak težine izazvan SARS-CoV-2 tokom prve nedelje infekcije (SL.23a). Nivoi virusne RNK su značajno smanjeni na 7 dpi u plućima i udaljenim mestima, uključujući srce i slezinu (SL.23b). Ekspresija gama interferona (INF-g), IL-6, CXCL10 i CCL2 citokina i hemokinskih gena, koji su pokazatelji upale, takođe je smanjena u plućima tretiranih miševa na 7 dpi - vrhu bolesti (SL.23c).

[0309] Takođe smo testirali COV2-2196 ili COV2-2130 ili njihovu kombinaciju na profilaktičku efikasnost u imunokompetentnom modelu koristeći virus SARS-CoV-2 prilagođen mišu<29>(SL.23d). In vitro testovi su pokazali da su vrednosti IC50 za neutralizaciju uporedive za WT i MA SARS- CoV-2 viruse za ove mAt (podaci nisu prikazani). Svaki od tretmana mAt primenjenih u dozi od 200 µg/miš (~ 8 mg/kg) smanjio je nivo virusne RNK do 10<5>-struko pri 2 dpi u plućima u poređenju sa kontrolnom grupom izotipa (SL. 23e, levo). Shodno tome, sve životinje iz COV2-2196 i COV2-2196 COV2-2130 terapijske grupe i 8 od 10 životinja iz COV2-2130 tretmana više nisu imale infektivni virus na 2 dpi u plućima mereno titrom plaka u plućnom tkivu (SL.23e, desno). Kolektivno, ovi rezultati kod miševa ukazuju na to da su COV2-2196 ili COV2-2130 sami ili u kombinaciji obećavajući kandidati za lečenje ili prevenciju COVID-19.

[0310] Ovde smo definisali antigenski pejzaž za veliki panel visoko potentnih mAt protiv SARS-CoV-2. Ove detaljne studije i skrining studije koje su identifikovale ovaj panel mAt iz većeg panela stotina<25>pokazuju da, iako su različita humana neutrališuća antitela izazvana prirodnom infekcijom SARS-CoV-2, samo mali podskup tih mAt ima visoku potenciju (IC50<50 ng/ml protiv živog virusa SARS-CoV-2) i stoga je pogodan za terapijski razvoj. Biohemijska i strukturna analiza ovih moćnih mAt definisala je tri glavna antigena mesta ranjivosti na neutralizaciju humanim mAt izazvanu prirodnom infekcijom SARS-CoV na SRBD. Reprezentativna mAt sa dva najmoćnija antigena mesta pokazuju sinergiju in vitro i štite kao in vivo koktel. Ovaj nalaz otkriva kritične karakteristike efikasnog humoralnog imuniteta na SARS-CoV-2 i sugeriše da treba dodatno istražiti ulogu sinergijske neutralizacione aktivnosti u poliklonskim odgovorima. Štaviše, kako SARS- CoV-2 nastavlja da cirkuliše, imunitet populacije izazvan prirodnom infekcijom može početi da bira antigenske varijante koje izbegavaju selektivni pritisak neutrališućih antitela, što pojačava potrebu za ciljanjem višestrukih epitopa S proteina u vakcinama ili imunoterapijama.

1

[0311] Do sada prijavljene varijante zajedničkog S gena širom sveta nalaze se na pozicijama D614G, V483A, L5F, Q675H, H655Y i S939F<30>, daleko od varijanti aminokiselina na ostacima 486 ili 487 identifikovanih u našim studijama mutacija za ovde proučavana glavna mAt. Racionalno odabrani terapeutski kokteli poput ovog opisanog ovde mogu ponuditi još veću otpornost na izbegavanje SARS-CoV-2. Ove studije su postavile osnovu za pretkliničku procenu i razvoj identifikovanih mAt kao kandidata za primenu kao COVID-19 imunoterapija kod ljudi.

[0312] Dostupnost podataka. EM mape su deponovane u Banci podataka elektronske mikroskopije sa pristupnim kodovima EMBD 21965 (S2Pectoapo), EMD-21974 (S2Pecto+ Fab COVs-2165), EMD-21975 (S2Pecto+ Fab COVs-2196), EMD-21976 (S2Pecto+ Fab COVs-2130) i EMD-21977 (S2Pecto+ Fab COV2-2196 Fab COV2-2130). Materijali prijavljeni u ovoj studiji će biti dostupni, ali mogu zahtevati potpisivanje Ugovora o prenosu materijala.

[0313] Zahvalnice. Posebno se zahvaljujemo: Angela Jones i osoblju laboratorije Vanderbilt VANTAGE Core za ubrzano sekvenciranje, Ross Trosseth za pomoć u upravljanju podacima i analizi, Robin Bombardi i Cinque Soto iz VUMC za tehničke konsultacije o genomičkim pristupima, Arthur Kim, Adam Bailey, Laura VanBlargan, James Earnest, Broc McCune i Swathi Shrihari iz WUSTL za eksperimentalnu pomoć i ključne reagense, i Kevin M. Tuffy, Seme Diallo, Patrick M. McTamney i Lori Clarke iz AstraZeneca za generisanje reagensa proteina i pseudovirusa i srodnih podataka. Ovu studiju su podržali grantovi od strane Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA), HR0011-18-2-0001 i HR00 11-18-3-0001, NIH ugovori 75N93019C00074 i 75N93019C00062 i the Dolly Parton COVID-19 Research Fund at Vanderbilt. Ovaj rad je podržan NIH grantom 1S10RR028106-01A1 for the Next Generation Nucleic Acid Sequencer, iz Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics (VANTAGE) i the Vanderbilt Institute for Clinical and Translational Research sa grantom (UL1TR002243 od NCATS/NIH). S.J.Z. je podržan od strane NIH T32 AI095202. J.B.C. je podržan putem postdoktorske stipendije od strane Helen Hay Whitney Foundation. D.R.M. je podržan od strane NIH T32 AI007151 and a Burroughs Wellcome Fund Postdoctoral Enrichment Program Award. J.E.C. je dobitik nagrade 2019 Future Insight Prize od strane Merck KGaA, Darmstadt Germany, koja je podržala ovo istraživanje bespovratnim sredstvima za istraživanje. Sadržaj je isključivo odgovornost autora i ne predstavlja nužno zvanične stavove vlade SAD ili drugih sponzora.

1

[0314] Doprinosi autora. Projekat osmislili: S.J.Z., P.G., R.H.C., L.B.T., M.S.D., J.E.C.; Sredstva obezbedili: J.E.C. i M.S.D. Izvršili laboratorijske ekperimente: S.J.Z., P.G., J.B.C., E.B., R.E.C., J.X.R., A.T., R.S.N., R.E.S., N.S., L.E.W., A.O.H., N.M.K., E.W., J.M.F., L.B.T., J.J.S., K.R., Y.-M.L., A.S., L.E.G., D.R.M.; Izvršili rad na računaru: E.C.C., T.J., S.D., L.M.; Nadzirali istraživanje: N.L.K, M.S.D., L.B.T., R.S.B., R.H.C., J.E.C. Napisali prvi nacrt rada: S.J.Z., P.G., R.H.C., J.E.C.; Svi autori su prošli reviziju i odobren im je finalni rukopis.

[0315] Konkurentski interesi. R.S.B. je bio konsultant za Takeda i Sanofi Pasteur po pitanjima vezanim za vakcine. M.S.D. je konsultant za Inbios, Vir Biotechnology, NGM Biopharmaceuticals, Eli Lilly, i član je Naučnog savetodavnog odbora kompanije Moderna, prethodni primalac nepovezanih bespovratnih sredstava za istraživanje od strane kompanije Modema i trenutni primalac nepovezanih bespovratnih sredstava za istraživanje od Emergent BioSolutions. J.E.C. je bio konsultant za Sanofi i član je naučnih savetodavnih odbora za CompuVax i Meissa Vaccines, primalac je prethodnih nepovratnih sredstava za istraživanje od kompanija Modema i Sanofi i osnivač IDBiologics, Inc. Univerzitet Vanderbilt je podneo zahtev za patente koji se odnose na antitela na SARS-CoV-2 koja su povezana sa ovim radom. AstraZeneca je podnela patente za materijale/nalaze koji se odnose na ovaj rad. J.J.S., K.R., Y.-M.L. i N.L.K. su zaposleni u kompaniji AstraZeneca i trenutno poseduju akcije ili opcije na akcije kompanije AstraZeneca. Svi ostali autori se nisu izjasnili o konkurentskim interesima.

Dodatne informacije

[0316] Dodatne informacije su dostupne za ovaj rad.

[0317] Korespondencija i zahtevi za materijale treba da budu upućeni na J.E.C.

REFERENCE

[0318]

1. Zhou, P., et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270-273 (2020).

1

hu, N., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N Engl J Med 382, 727-733 (2020).

illay, T.S. Gene of the month: the 2019-nCoV/SARS-CoV-2 novel coronavirus spike protein. J Clin Pathol (2020).

rapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263 (2020).

an, Y., Shang, J., Graham, R., Baric, R.S. & Li, F. Receptor recognition by the novel Coronavirus from Wuhan: an Analysis Based on Decade-Long Structural Studies of SARS Coronavirus. J Virol 94(2020).

offmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell 181, 271-280 e278 (2020).

i, W., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426, 450-454 (2003).

ui, J., et al. Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a human mAb to S1 protein that blocks receptor association. Proc Natl Acad Sci USA 101, 2536-2541 (2004).

r Meulen, J., et al. Human monoclonal antibody as prophylaxis for SARS coronavirus infection in ferrets. Lancet 363, 2139-2141 (2004).

ter Meulen, J., et al. Human monoclonal antibody combination against SARS coronavirus: synergy and coverage of escape mutants. PLoSMed 3, e237 (2006).

Zhu, Z., et al. Potent cross-reactive neutralization of SARS coronavirus isolates by human monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 104, 12123-12128 (2007).

14

Rockx, B., et al. Structural basis for potent cross-neutralizing human monoclonal antibody protection against lethal human and zoonotic severe acute respiratory syndrome coronavirus challenge. J Virol 82, 3220-3235 (2008).

Chen, Z., et al. Human neutralizing monoclonal antibody inhibition of Middle East respiratory syndrome coronavirus replication in the common marmoset. J Infect Dis 215, 1807-1815 (2017).

Choi, J.H., et al. Characterization of a human monoclonal antibody generated from a B- cell specific for a prefusion-stabilized spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. PLoS One 15, e0232757 (2020).

Niu, P., et al. Ultrapotent human neutralizing antibody repertoires against Middle East respiratory syndrome coronavirus from a recovered patient. J Infect Dis 218, 1249-1260 (2018).

Wang, L., et al. Importance of neutralizing monoclonal antibodies targeting multiple antigenic sites on the Middle East respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein to avoid neutralization escape. J Virol 92(2018).

Wang, N., et al. Structural definition of a neutralization-sensitive epitope on the MERS-CoV S1-NTD. Cell Rep 28, 3395-3405 e3396 (2019).

Zhang, S., et al. Structural definition of a unique neutralization epitope on the receptorbinding domain of MERS-CoV spike glycoprotein. Cell Rep 24, 441-452 (2018).

Corti, D., et al. Prophylactic and postexposure efficacy of a potent human monoclonal antibody against MERS coronavirus. Proc Natl Acad Sci USA 112, 10473-10478 (2015).

Jiang, L., et al. Potent neutralization of MERS-CoV by human neutralizing monoclonal antibodies to the viral spike glycoprotein. Sci Transl Med 6, 234ra259 (2014).

Tang, X.C., et al. Identification of human neutralizing antibodies against MERS-CoV and their role in virus adaptive evolution. Proc Natl Acad Sci USA 111, E2018-2026 (2014).

Ying, T., et al. Exceptionally potent neutralization of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies. J Virol 88, 7796-7805 (2014).

Jiang, S., Hillyer, C. & Du, L. Neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 and other human coronaviruses. Trends Immunol 41, 355-359 (2020).

Valk, S.J., et al. Convalescent plasma or hyperimmune immunoglobulin for people with COVID-19: a rapid review. Cochrane Database Syst Rev 5, CD013600 (2020).

Zost, S.J., et al. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein. bioRxiv, 2020.2005.2012.091462 (2020).

Yuan, M., et al. A highly conserved cryptic epitope in the receptor binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science 368, 630-633 (2020).

Ianevski, A., He, L., Aittokallio, T. & Tang, J. SynergyFinder: a web application for analyzing drug combination dose-response matrix data. Bioinformatics 33, 2413-2415 (2017).

Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature 581, 215-220 (2020).

Dinnon, K.H., et al. A mouse-adapted SARS-CoV-2 model for the evaluation of COVID- 19 medical countermeasures. bioRxiv, 2020.2005.2006.081497 (2020).

Laha, S., et al. Characterizations of SARS-CoV-2 mutational profile, spike protein stability and viral transmission. bioRxiv, 2020.2005.2003.066266 (2020).

14

*Prethodno prijavio, Zost et al., 2020 (reference 25).

Metode

[0319] Antitela. Humana antitela ispitivana u ovom radu izolovana su iz uzoraka krvi dva subjekta u Severnoj Americi sa prethodnom laboratorijski potvrđenom simptomatskom infekcijom SARS-CoV-2 koja je stečena u Kini. Originalne kliničke studije za dobijanje uzoraka nakon pisanog informisanog pristanka prethodno suo pisane<1>i odobrene su od strane Institucionalnog odbora za pregled Medicinskog centra Univerziteta Vanderbilt i Odbora za istraživačku etiku Univerziteta u Torontu. Subjekti (56-godišnji muškarac i 56-godišnja žena) su bračni par i stanovnici Vuhana u Kini koji su putovali u Toronto u Kanadi, gde su PBMC dobijeni leukoferezom 50 dana nakon pojave simptoma. Antitela su izolovana korišćenjem različitih alata za izolaciju i kloniranje pojedinačnih antigen-specifičnih B ćelija i varijabilnih gena antitela koji kodiraju monoklonskaantitela<1>.

[0320] Ćelijska kultura. Vero E6 (CRL-1586, American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, ATCC), Vero CCL81 (ATCC), HEK293 (ATCC) i HEK293T (ATCC) održavani su na 37°C u 5% CO2 u minimalnom esencijalnom medijumu (DMEM) kompanije Dulbecco koji sadrži 10% (vol/vol) termički inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS), 10 mM HEPES pH 7,3, 1 mM natrijum piruvat, 1× neesencijalne aminokiseline i 100 U/ml penicilin-streptomicina. Ćelije vero-furina su dobijene od T. Pierson (NIH) i prethodno

14

su opisane<2>. Expi293F ćelije (ThermoFisher Scientific, A1452) su održavane na 37°C u 8% CO2 u Expi293F ekspresijskom medijumu (ThermoFisher Scientific, A1435102). ExpiCHO ćelije (ThermoFisher Scientific, A29127) su održavane na 37°C u 8% CO2 u ExpiCHO ekspresijskom medijumu (ThermoFisher Scientific, A2910002). Testiranje mikoplazmi Expi293F i ExpiCHO kultura izvršeno je na mesečnom nivou korišćenjem kompleta za detekciju mikoplazmi zasnovanog na PCR-u (ATCC, 30-1012K).

[0321] Virusi. SARS-CoV-2 soj 2019 n-CoV/USA_WA1/2020 je dobijen od Centara za kontrolu i prevenciju bolesti (poklon Natalie Thornburg). Virus je prošao kroz Vero CCL81 ćelije i titriran testom plaka na Vero E6 ćelijama. Sav rad sa zaraznim virusom SARS-CoV-2 odobren je od strane Medicinskog fakulteta Univerziteta u Vašingtonu ili Komiteta za institucionalnu biološku bezbednost UNC-Chapel Hill i sproveden u odobrenim objektima BSL3 koristeći odgovarajuće respiratore za prečišćavanje vazduha i ličnu zaštitnu opremu.

[0322] Rekombinantni antigeni i proteini. Gen koji kodira ektodomen prefuzionom konformacijom stabilizovanog SARS-CoV-2 šiljastog (S2Pecto) proteina je sintetizovan i kloniran u vektor ekspresije DNK plazmida za ćelije sisara. Ranije je prijavljen slično dizajniran antigen S proteina sa dva prolina i uklanjanjem mesta cepanja furina radi stabilizacije prefuzionog oblika S<3>. Ukratko, ovaj gen uključuje ektodomen SARS-CoV-2 (do ostatka 1.208), domen trimerizacije T4 fibritina, AviTag biotinilacionu sekvencu specifičnu za lokaciju i C-terminalnu 8x-His oznaku. Da bismo stabilizovali konstrukt u konformaciji prefuzije, uključili smo supstitucije K986P i V987P i mutirali mesto cepanja furina na ostacima 682-685 od RRAR do ASVG. Ovaj rekombinantni protein stabilizovan na 2P (ovde označen kao S2Pecto) izolovan je hromatografijom afiniteta metala na HisTrap Excel kolonama (GE Healthcare), a proteinski preparati su dalje prečišćeni hromatografijom isključivanja veličine na koloni Superose 6 Increase 10/300 (GE Healthcare). Prisustvo proteina trimerne, prefuzione konformacije S verifikovano je elektronskom mikroskopijom sa negativnim bojenjem<1>. Za elektronsku mikroskopiju sa S i Fab, izrazili smo varijantu S2Pectokojoj nedostaje AviTag, ali sadrži C-terminalnu Twin-Strep-oznaku, sličnu onoj koja je prethodno opisana<3>. Izraženi protein je izolovan hromatografijom afiniteta metala na HisTrap Excel kolonama (GE Healthcare), nakon čega je usledilo dalje prečišćavanje na StrepTrap HP koloni (GE Healthcare) i hromatografija isključivanja veličine na TSKgel G4000SW XL (TOSOH). Da bi se izrazio poddomen SRBD proteina SARS-CoV-2 S, ostaci 319-541 su klonirani u vektor ekspresije sisara nizvodno od signalnog peptida IL-2 i uzvodno od mesta cepanja trombina, AviTag-a i

14

6x-His oznake. RBD protein spojen sa mišjim IgG1 Fc domenom (označen kao RBD-mFc), kupljen je od Sino Biological (40592-V05H). Za mapiranje epitopa skeniranjem alaninom, varijante SARS-CoV-2 RBD (ostaci 334-526) ili RBD sa jednom mutacijom klonirane su N-terminalnom CD33 sekvencom lidera i C-terminalnim GSSG linkerom, AviTag, GSSG linkerom i 8xHisTag. Proteini šiljka su izraženi u FreeStyle 293 ćelijama (Thermo Fisher) i izolovani afinitetnom hromatografijom koristeći HisTrap kolonu (GE Healthcare), nakon čega je usledila hromatografija isključivanja veličine sa Superdex200 kolonom (GE Healthcare). Pročišćeni proteini su analizirani od strane SDS-PAGE kako bi se osigurala čistoća i odgovarajuća molekulska težina.

[0323] Priprema rešetke za bojenje pomoću elektronske mikroskopije (EM), snimanje i obradu SARS-CoV-2 S2Pecto proteina ili S2Pecto/Fab kompleksa. Za izvođenje EM snimanja, Fab su proizvedeni varenjem rekombinantnih hromatografski pročišćenih IgG-a korišćenjem enzima cistein proteaze imobilizovanog smolom (FabALACTICA, Genovis). Do varenja je došlo u 100 mM natrijum fosfata, 150 mM NaCl pH 7,2 tokom ~16 sati na RT. Da bi se uklonili cepani Fc i intaktni IgG, mešavina za varenje je inkubirana sa CaptureSelect Fc smolom (Genovis) tokom 30 minuta na RT u PBS puferu. Ako je bilo potrebno, Fab pufer je zamenjen u Tris pufer centrifugiranjem sa Zeba spin kolonom (Thermo Scientific).

[0324] Za skrining i snimanje negativno obojenog (NS) SARS-CoV-2 S2Pectoproteina u kompleksu sa humanim Fab, proteini su inkubirani ~1 sat i približno 3 µL uzorka u koncentracijama od oko 10 do 15 µg/ml primenjeno je na sjajnu rešetku sa kontinuiranim ugljeničnim filmom na 400 kvadratnih mreža bakarnih EM mreža (nauka o elektronskoj mikroskopiji). Rešetke su obojene sa 0,75% uranil formata (UF)<4>. Slike su snimljene na Gatan US4000 4k × 4k CCD kameri pomoću FEI TF20 (TFS) transmisionog elektronskog mikroskopa koji radi na 200 keV i kontroliše se pomoću SerialEM<5>. Sve slike su snimljene sa uvećanjem od 50.000x sa veličinom piksela od 2,18 Å/pix u režimu niske doze pri defokusiranju od 1,5 do 1,8 µm. Ukupna doza za mikrografe bila je ~25 to 38 e-/Å<2>. Obrada slike je izvršena korišćenjem cryoSPARC softverskog paketa<6>. Slike su uvezene, a čestice procenjene CTF-om. Slike su zatim denoizovane i odabrane pomoću<7>. Čestice su ekstrahovane veličinom kutije od 256 piksela i sakupljene na 128 piksela. Izvršeni su proseci 2D klase i izabrane dobre klase za ab-initio model i doradu bez simetrije. Za priključenje proteina SARS-CoV-2 S2Pecto na EM model korišćen je zatvoreni model (PDB: 6VXX) u programu Chimera<8>za doking na EM mapu (videti takođe tabelu C za detalje). Za komplekse SARS-CoV-2

14

S2Pecto/Fab COV2-2165 i SARS- CoV-2 S2Pecto/Fab COV2-2165, otvoreni model SARS-CoV-2 (PDB: 6VYB) i Fab (Fab: 12E8) korišćen je u programu Chimera za doking na EM mape (videti takođe tabelu C za detalje). Za SARS-Cov-2 S2Pecto/Fab COV2-2130 kompleks, zatvoreni model i Fab (PDB: 12E8) korišćen je u programu Chimera za doking na EM mape (videti takođe tabelu C za detalje). Sve slike su napravljene pomoću programa Chimera.

[0325] Proizvodnja i prečišćavanje mAt. Sekvence mAt koje su sintetizovane (Twist Bioscience) i klonirane u vektor monocistronske ekspresije IgG1 (označen kao pTwistmCis_G1) korišćene su za sekreciju mAt kulture ćelija sisara. Ovaj vektor sadrži poboljšanu 2A sekvencu i GSG linker koji omogućava istovremenu ekspresiju gena teškog i lakog lanca mAt iz jedne konstrukcije nakontransfekcije<9>. Prethodno smo opisali mikroskalnu ekspresiju mAt u 1 mL ExpiCHO kulturama u pločama sa 96 bunara<1>. Za ekspresiju mAt većeg obima, izvršili smo transfekciju (1 do 300 ml po antitelu) CHO ćelijskih kultura koristeći Gibco<™>ExpiCHO<™>sistem ekspresije i protokol za cevi mini bioreaktora od 50 ml (Coming) kako je opisao dobavljač. Supernatanti kulture su prečišćeni pomoću HiTrap MabSelect SuRe (Cytiva, ranije GE Healthcare Life Sciences) na sistemu paralelne proteinske hromatografije sa 24 kolone (Protein BioSolutions). Prečišćena mAt su zamenjena puferom u PBS, koncentrovana korišćenjemAmicon<®>Ultra- 4 50KDa centrifugalnih filterskih jedinica (Millipore Sigma) i čuvani na 4°C do upotrebe.

[0326] ELISA testovi vezivanja. Bunari mikrotiterskih ploča sa 96 bunara obloženi su prečišćenim rekombinantnim SARS-CoV-2 S proteinom ili SARS-CoV-2 SRBD proteinom na 4°C preko noći. Ploče su blokirane sa 2% nemasnog suvog mleka i 2% normalnog kozjeg seruma u DPBS-u koji sadrži 0,05% Tween-20 (DPBS-T) tokom 1 sata. Vezana antitela su detektovana korišćenjem kozjeg antihumanog IgG konjugovanog sa HRP (hren peroksidazom) (Southern Biotech) i TMB (3,3',5,5' -tetrametilbenzidin) supstratom (Thermo Fisher Scientific). Praćen je razvoj boje, dodata je 1N hlorovodonična kiselina za zaustavljanje reakcije, a apsorbancija je izmerena na 450 nm pomoću spektrofotometra (Biotek). Za testove dozaodgovor, serijska razblaženja prečišćenih mAt primenjena su na bunare u tri primerka, a vezivanje mAt je otkriveno kao što je gore opisano. Vrednosti polu-maksimalne efektivne koncentracije (EC50) za vezivanje određene su pomoću softvera Prism v8.0 (GraphPad) nakon log transformacije koncentracije mAt korišćenjem sigmoidne analize nelinearne regresije između doze i odgovora.

14

[0327] ELISA test za RBD minimalni ACE2-vezujući motiv vezivanja peptida. Bunari mikrotiterskih ploča sa 384 bunara su preko noći obloženi sa 1 µg/ml streptavidina na 4°C. Ploče su blokirane sa 0,5% BSA u DPBS-u koji sadrži 0,05% Tween-20 (DPBS-T) tokom 1 sata. Ploče su isprane 4x sa 1x PBST-om i 2 µg/ml biotinilisanog-ACE2 motiv vezivanja peptida (kat. # LT5578, iz LifeTein, LLC) je dodat da veže streptavidin tokom 1 sata na RT. Prečišćeni mAt su razblaženi u puferu za blokiranje, dodati u bunare i inkubirani tokom 1 sata na RT. Vezana antitela su detektovana korišćenjem kozjeg antihumanog IgG konjugovanog sa HRP (hren peroksidazom) (kat. # 2014-05, Southern Biotech) i TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin) supstrat (ThermoFisher Scientific). Praćen je razvoj boje, dodata je 1N hlorovodonična kiselina za zaustavljanje reakcije, a apsorbancija je izmerena na 450 nm pomoću spektrofotometra (Biotek). Za testove doze i odgovora, serijska trostruka razblaženja počev od koncentracije prečišćenih mAt od 10 µg/ml primenjena su na bunare u tri primerka, a vezivanje mAt je otkriveno kao što je gore opisano.

[0328] Analiza vezivanja antitela za varijantne RBD proteine sa mutacijama alanin ili arginin tačke. Bioslojna svetlosna interferometrija (BLI) izvršena je korišćenjem instrumenta Octet RED96 (ForteBio; Pall Life Sciences) i divljeg tipa RBD proteina ili mutantnog RBD proteina sa jednom promenom aminokiselina na definisanim pozicijama u alanin ili arginin. Vezivanje RBD proteina potvrđeno je prvim hvatanjem okta-His-označenog RBD divljeg tipa ili mutantnog proteina iz rastvora od 10 µg/ml (≈200 nM) na Penta-His biosenzore tokom 300 sekundi. Vrhovi biosenzora su zatim potopljeni u pufer za vezivanje (PBS/0,2% Tween 20) za ispiranje od 60 sekundi, nakon čega je usledilo uranjanje u rastvor koji sadrži 150 nM mAt tokom 180 sekundi (asocijacija), nakon čega je usledilo uranjanje u pufer za vezivanje tokom 180 sekundi (disocijacija). Odgovor za svaki RBD mutirani protein je normalizovan na odgovor divljeg tipa RBD proteina.

[0329] Test neutralizacije redukcije fokusa (FRNT). Serijska razblaženja mAt su inkubirana sa 10<2>FFU SARS-CoV-2 tokom 1 sata na 37°C. Kompleksi mAt-virusa su dodati u monoslojeve ćelijske kulture Vero E6 u pločama sa 96 bunara tokom 1 sata na 37°C. Nakon toga, ćelije su obložene 1% (m/v) metilcelulozom u minimalnom esencijalnom medijumu (mem) dopunjenom tako da sadrži 2% FBS-a inaktiviranog toplotom. Ploče su fiksirane 30 sati kasnije uklanjanjem slojeva i fiksirane sa 4% PFA u PBS-u 20 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su sekvencijalno inkubirane sa 1 µg/ml rCR3022 anti-S antitela<10>i hrenperoksidaze (HRP) konjugovanog kozjeg antihumanog IgG u PBS-u dopunjenog sa 0,1% (w/v)

14

saponina (Sigma) i 0,1% goveđeg serumskog albumina (BSA). Ćelijski žarišta zaražena virusom SARS-CoV-2 vizualizovana su pomoću TrueBlue supstrata peroksidaze (KPL) i kvantifikovana na makro analizatoru ImmunoSpot 5.0.37 (Cellular Technologies). Podaci su obrađeni pomoću softvera Prism verzije 8.0 (GraphPad).

[0330] Generisanje pseudotipiziranog lentivirusa S proteina. Suspenzija 293 ćelije su zasejane i transfektovane lentivirusnim vektorom treće generacije zasnovanim na HIV-u koji izražava luciferazu zajedno sa plazmidima za pakovanje koji kodiraju za sledeće: protein šiljka SARS-CoV-2 sa C-terminalnom delecijom aminokiselina 19, Rev i Gag-pol. Medijum je promenjen 16 do 20 sati nakon transfekcije, a supernatant koji sadrži virus ubran je 24 sata kasnije. Ostaci ćelija su uklonjeni centrifugiranjem male brzine, a supernatant je prošao kroz jedinicu filtera od 0,45 µm. Pseudovirus je peletiran ultracentrifugiranjem i resuspendovan u PBS-u za 100 puta koncentrovanu zalihu.

[0331] Test neutralizacije pseudovirusa. Serijska razblaženja mAt pripremljena su u mikrotiterskoj ploči sa 384 bunara i predinkubirana pseudovirusom 30 minuta na 37°C, u koju su dodate 293 ćelije koje stabilno izražavaju humani ACE2. Ploča je vraćena u inkubator na 37°C, a zatim je 48 sati kasnije izmerena aktivnost luciferaze na EnVision 2105 multimodnom čitaču ploča (Perkin Elmer) pomoću sistema za ispitivanje luciferaze Bright-Glo<™>(Promega), u skladu sa preporukama proizvođača. Procenat inhibicije je izračunat u odnosu na kontrolu pseudovirusa. IC50 vrednosti su određene nelinearnom regresijom korišćenjem Prism softvera verzije 8.1.0 (GraphPad). Prosečna vrednost IC50 za svako antitelo određena je iz najmanje 3 nezavisna eksperimenta.

[0332] Merenje sinergijske neutralizacije kombinacijom antitela. Sinergija je definisana kao veća neutralizaciona aktivnost posredovana koktelom od dva mAt u poređenju sa onom posredovanom pojedinačnim mAt pri istoj ukupnoj koncentraciji antitela in vitro. Da bismo procenili da li se dva mAt sinergišu u koktelu za neutralizaciju SARS-CoV-2, koristili smo prethodno prijavljeni pristup kvantitativnoj sinergiji<11>. Da bi se procenio značaj korisnog efekta kombinovanja mAt, posmatrani kombinovani odgovori (matrica doza-odgovor) upoređeni su sa očekivanim odgovorima izračunatim pomoću modela bodovanja sinergije<11>. Neutralizacija virusa je izmerena u konvencionalnom testu neutralizacije smanjenja fokusa (FRNT) korišćenjem monoslojeva ćelijske kulture divljeg tipa SARS-CoV-2 i Vero E6. Pojedinačni mAt COV2-2196 i COV2-2130 su pomešani u različitim koncentracijama kako bi se procenila

1

neutrališuća aktivnost različitih odnosa mAt u koktelu. Konkretno, svako od sedmostrukih razblaženja mAt COV2-2130 (počevši od 500 ng/ml) pomešano je sa svakim od devet razblaženja mAt COV2-2196 (počevši od 500 ng/ml) u ukupnoj zapremini od 50 µL po svakom stanju, a zatim inkubirano sa 50 µL živog SARS-CoV-2 u medijumu ćelijske kulture (RPMI-1640 medijum dopunjen sa 2% FBS) pre nanošenja na konfluentne Vero E6 ćelije uzgojene u pločama sa 96 bunara. Kontrolne vrednosti su uključivale one za određivanje doze-odgovora neutralizacione aktivnosti izmerene odvojeno za pojedinačno mAt COV2-2196 ili COV2-2130, koje su procenjene u istim dozama kao u koktelu. Svako merenje je izvršeno u duplikatu. Zatim smo izračunali procenat neutralizacije virusa za svako stanje, a zatim izračunali vrednost rezultata sinergije, koja je definisala interakciju između ova dva mAt u koktelu. Ocena sinergije manja od -10 ukazuje na antagonizam, ocena od -10 do 10 ukazuje na aditivni efekat, a ocena veća od 10 ukazuje na sinergijski efekat<11>.

[0333] Kvantifikacija mAt. Kvantifikacija prečišćenih mAt izvršena je UV spektrofotometrijom pomoću NanoDrop spektrofotometra i uzimajući u obzir koeficijent ekstinkcije humanog IgG.

[0334] Analiza kompetitivnog vezivanja biološkom interferometrijom. Biosenzori za hvatanje Fc protiv mišjeg IgG (FortéBio 18-5089) na instrumentu za biološku interferometriju Octet HTX (FortéBio) natopljeni su 10 minuta u 1x kinetičkom puferu (Molekularni uređaji 18-1105), nakon čega je usledilo merenje osnovnog signala u trajanju od 60 sekundi. Rekombinantni SARS-CoV-2 RBD spojen sa mišem IgG1 (RBD-mFc, Sino Biological 40592-V05H) imobilisan je na vrhovima biosenzora 180 sekundi. Nakon koraka ispiranja u 1xkinetičkom puferu u trajanju od 30 sekundi, referentno antitelo (5 µg/ml) je inkubirano biosenzorom koji sadrži antigen u trajanju od 600 sekundi. Referentna antitela su uključivala SARS-CoV humano mAt CR3022 i COV2-2196. Nakon koraka ispiranja u 1x kinetičkom puferu u trajanju od 30 sekundi, vrhovi biosenzora su zatim uronjeni u drugo antitelo (5 µg/ml) u trajanju od 300 sekundi. Maksimalno vezivanje svakog antitela je normalizovano na kontrolu samo pufera. Samostalno blokiranje je oduzeto. Poređenje između maksimalnog signala svakog antitela korišćeno je za određivanje procenta vezivanja svakog antitela. Smanjenje maksimalnog signala na <33% nekompetitivnog signala smatralo se potpunim kompetitivnim vezivanjem za drugo antitelo u prisustvu referentnog antitela. Smanjenje maksimalnog signala na između 33 i 67% nekompetitivnog smatralo se srednjim kompetitivnim vezivanjem za drugo antitelo u prisustvu referentnog antitela. Procenat vezivanja maksimalnog signala >67%

1 1

smatrao se odsustvom kompetitivnosti vezivanja za drugo antitelo u prisustvu referentnog antitela.

[0335] Analiza inhibicije vezivanja ACE-2 visoke propusnosti. Bunari mikrotiterskih ploča sa 384 bunara obložene su prečišćenim rekombinantnim proteinom SARS-CoV-2 S2Pectona 4°C preko noći. Ploče su blokirane sa 2% nemasnog suvog mleka i 2% normalnog kozjeg seruma u DPBS-T tokom 1 sata. Prečišćena mAt iz mikroskopske ekspresije razblažena su dvostruko u puferu za blokiranje počevši od 10 µg/ml u tri primerka, dodata u bunare (20 µL/bunar) i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Rekombinantni humani ACE2 sa proteinskim OZNAKOM C-terminala dodat je u bunare pri 2 µg/ml u zapremini bunara od 5 µl (konačna koncentracija ACE2 od 0,4 µg/ml) bez ispiranja antitela, a zatim inkubiran 40 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, a vezani ACE2 je detektovan korišćenjem HRP-konjugovanog anti-FLAG antitela (Sigma) i TMB supstrata. Vezivanje ACE2 bez antitela služilo je kao kontrola. Signal dobijen za vezivanje ACE2 u prisustvu svakog razblaženja testiranog antitela izražen je kao procenat vezivanja ACE2 bez antitela nakon oduzimanja pozadinskog signala. Vrednosti polu-maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za inhibiciju vezivanja S2Pecto proteina za ACE2 od strane mAt utvrđene su nakon log transformacije koncentracije antitela korišćenjem sigmoidne nelinearne regresijske analize između doze i odgovora (Prism softver, GraphPad Prism verzija 8.0).

[0336] Test blokiranja ACE2 korišćenjem biosenzora interferometrije biosloja.

Biosenzori protiv mišjeg IgG na instrumentu za biološku interferometriju Octet HTX (FortéBio) natopljeni su 10 minuta u 1x kinetičkom puferu, nakon čega je usledilo merenje osnovnog signala u trajanju od 60 sekundi. Rekombinantni SARS- CoV-2 RBD spojen sa mišjim IgG1 (RBD-mFc, Sino Biological 40592-V05H) imobilisan je na vrhovima biosenzora 180 sekundi. Nakon koraka ispiranja u 1x kinetičkom puferu u trajanju od 30 sekundi, antitelo (5 µg/ml) je inkubirano sa biosenzorom obloženim antigenom u trajanju od 600 sekundi. Nakon koraka ispiranja u 1x kinetičkom puferu u trajanju od 30 sekundi, vrhovi biosenzora su zatim uronjeni u ACE2 receptor (20 µg/ml) (Sigma-Aldrich SAE0064) u trajanju od 300 sekundi. Maksimalno vezivanje ACE2 je normalizovano na kontrolu samo pufera. Procenat vezivanja ACE2 u prisustvu antitela upoređen je sa maksimalnim vezivanjem ACE2. Smanjenje maksimalnog signala na <30% smatralo se blokiranjem ACE2.

1 2

[0337] Analiza kompetitivnog vezivanja visoke propusnosti. Bunari mikrotiterskih ploča sa 384 bunara obloženi su prečišćenim rekombinantnim proteinom SARS-CoV-2 S na 4°C preko noći. Ploče su blokirane sa 2% BSA u DPBS-u koji sadrži 0,05% Tween-20 (DPBS-T) tokom 1 sata. Prečišćena neoznačena mAt mikro skale razblažena su deset puta u puferu za blokiranje, dodata u bunare (20 µL/bunar) u kvadruplikatima i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Biotinilisani preparat rekombinantnog mAt zasnovan na varijabilnoj genskoj sekvenci prethodno opisanog mAt CR3022<12>kao i novoidentifikovana mAt COV2-2096, -2130 i -2196 koja su prepoznala različite antigenske regione proteina SARS-CoV-2 S dodata su u svaku od četiri bunara sa odgovarajućim mAt na 2,5 µg/ml u zapremini bunara od 5 µl (konačna koncentracija biotinilisanog mAb od 0,5 µg/ml) bez ispiranja neoznačenog antitela, a zatim inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, a vezana antitela su detektovana pomoću HRP-konjugovanog avidina (Sigma) i TMB supstrata. Signal dobijen za vezivanje referentnog antitela obeleženog biotinom u prisustvu neoznačenog testiranog antitela izražen je kao procenat vezivanja samog referentnog antitela nakon oduzimanja signala pozadine. Testirana mAt su smatrana kompetitivnim ako je njihovo prisustvo smanjilo vezivanje referentnog antitela na manje od 41% njegovog maksimalnog vezivanja i nekompetitivnim ako je signal bio veći od 71%. Nivo od 40-70% se smatrao srednjom kompetitivnošću.

[0338] Analiza vezivanja mAt za alanin ili arginin RBD mutante. Bioslojna svetlosna interferometrija (BLI) izvršena je korišćenjem instrumenta Octet RED96 (ForteBio; Pall Life Sciences). Vezivanje je potvrđeno prvim hvatanjem okta-His-označenih RBD mutanata 10 µg/ml (≈200 nM) na Penta-His biosenzore tokom 300 s. Biosenzori su zatim potopljeni u pufer za vezivanje (PBS/0,2% IZMEĐU 20) za ispiranje tokom 60 sekundi, nakon čega je usledilo potapanje u rastvor koji sadrži 150 nM mAt tokom 180 sekundi (asocijacija), nakon čega je usledilo potapanje u pufer za vezivanje tokom 180 sekundi (disocijacija). Odgovor za svaki RBD mutant je normalizovan na odgovor divljeg tipa RBD.

[0339] Eksperimenti na miševima sa humanim hACE2-transdukovanim miševima.

Studije na životinjama sprovedene su u skladu sa preporukama iz Vodiča za negu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje. Protokoli su odobreni od strane Odbora za institucionalnu negu i upotrebu životinja na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Vašingtonu (broj osiguranja A3381-01). Inokulacije virusima obavljene su pod anestezijom koja je indukovana i održavana ketamin-hidrohloridom i ksilazinom, a uloženi su svi napori da se patnja životinja svede na najmanju moguću meru.

1

[0340] BALB/c miševi su kupljeni od Jackson Laboratories (soj 000651). Ženke miševa (10-11 nedelja) dobile su jednu intraperitonealnu injekciju od 2 mg anti-Ifnar1 mAt ( MAR1-5A3<13>, Leinco) jedan dan pre intranazalne primene 2,5 × 10<8>PFU AdV-hACE2. Pet dana nakon transdukcije AdV-a, miševi su inokulisani sa 4 × 10<5>PFU SARS-CoV-2 intranazalnim putem. Anti-SARS-CoV-2 humana mAt ili kontrolna mAt izotipa primenjena su 24 sata pre inokulacije SARS-CoV-2. Težine su praćene na dnevnom nivou, a životinje su žrtvovane 5. ili 7. dana nakon infekcije, a tkiva su uzeta.

[0341] Merenje virusnog opterećenja. Tkiva su izmerena i homogenizovana cirkonijevim kuglicama u instrumentu MagNA Lyser (Roche Life Science) u 1 ml DMEM medija dopunjenih sa 2% toplotno inaktiviranog FBS. Homogenati tkiva su razjašnjeni centrifugiranjem na 10.000 o/min tokom 5 minuta i čuvani na -80°C. RNK je ekstrahovana pomoću MagMax mirVana Total RNK izolacionog kompleta (Thermo Scientific) i Kingfisher Flex 96 mašine za ekstrakciju bušotine (Thermo Scientific). TaqMan prajmeri su dizajnirani da ciljaju konzervirani region N gena koristeći sekvencu SARS-CoV-2 (MN908947) kao vodič (L prajmer: ATGCTGCAATCGTGCTACAA; R prajmer: GACTGCCGCCTCTGCTC; sonda: /56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/). Da bismo uspostavili RNK standardnu krivu, generisali smo spojene segmente N gena u gBlocks fragmentu (IDT) i klonirali ga u PCR-II topo vektor (Invitrogen). Vektor je linearizovan, a in vitro T7- DNK zavisna RNK transkripcija je izvršena za generisanje materijala za kvantitativnu standardnu krivu.

[0342] Merenja mRNK citokina i hemokina. RNK je izolovana iz homogenata pluća na 7 dpi kao što je gore opisano. cDNK je sintetizovana iz RNK tretirane DNazom korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Thermo Scientific) uz dodatak inhibitora RNaze, u skladu sa protokolom proizvođača. Ekspresija citokina i hemokina određena je pomoću TaqMan Fast Universal PCR master mix (Thermo Scientific) sa komercijalnim prajmerima/setovima sondi specifičnim za IFNγ (IDT: Mm.PT.58.41769240), IL-6 (Mm.PT.58.10005566), CXCL10 (Mm.PT.58.43575827), CCL2 (Mm.PT.58.42151692 a rezultati su normalizovani na nivoe GAPDH (Mm.PT.39a.1). Promena savijanja je utvrđena korišćenjem metode 2<-ΔΔCt>koja upoređuje miševe tretirane anti-SARS-CoV-2 specifičnim ili izotipnim kontrolnim mAt sa netretiranim kontrolnim grupama.

1 4

[0343] Eksperimenti na miševima koristeći miševe divljeg tipa. Studije na životinjama sprovedene su u skladu sa preporukama iz Vodiča za negu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje. Protokoli su odobreni od strane Odbora za institucionalnu negu i upotrebu životinja na Medicinskom fakultetu UNC Chapel Hill (nih/PHS broj osiguranja dobrobiti životinja je D16-00256 (A3410-01)). Inokulacije virusima obavljene su pod anestezijom koja je indukovana i održavana ketamin-hidrohloridom i ksilazinom, a uloženi su svi napori da se patnja životinja svede na najmanju moguću meru.

[0344] Virus SARS-CoV-2 (MA-SARS-CoV-2) prilagođen mišu. Virus je generisan kao što je prethodno opisano<14>. Virus je razmnožen u Vero E6 ćelijama koje se uzgajaju u DMEM-u sa 10% fetalnog klona II i 1% pen/streptokoka. Titer virusa je određen testom plaka. Ukratko, virus je serijski razblažen i inokulisan na konfluentne monoslojeve Vero E6 ćelija, nakon čega je usledio agarozni sloj. Plakovi su vizuelizovani 2. dana nakon infekcije nakon bojenja neutralnom crvenom bojom.

[0345] Miševi divljeg tipa. U eksperimentima su korišćeni 12-mesečni BALB/c miševi iz Enviga. Miševi su aklimatizovani u BSL3 najmanje 72 sata pre početka eksperimenata.6 sati pre infekcije, miševi su profilaktički tretirani sa 200 µg humanih monoklonskih antitela putem intraperitonealne injekcije. Sutradan su miševi anestezirani smešom ketamina i ksilazina i intranazalno inficirani sa 10<5>PFU MA-SARS-CoV-2 razblaženih u PBS. Izmeren je dnevni gubitak težine, a dva dana nakon infekcije miševi su eutanazirani predoziranjem izofluranom pre uzimanja tkiva.

[0346] Test plaka homogenata plućnog tkiva. Donji režanj desnog plućnog krila homogenizovan je u 1 mL PBS-a pomoću MagnaLyser-a (Roche). Serijska razblaženja virusa su titrirana na monoslojevima ćelijske kulture Vero E6, a virusni plakovi su vizualizovani neutralnim crvenim bojama dva dana nakon inokulacije. Granica detekcije za test je 100 PFU po plućima.

[0347] Kvantifikacija i statistička analiza. Srednja vrednost deskriptivne statistike ± Pem ili srednja vrednost ± SD određena je za kontinuirane promenljive kao što je navedeno. Tehničke i biološke replikacije opisane su u legendama slika. U studijama na miševima, analiza promene težine i virusnog opterećenja in vivo utvrđena je dvosmernim ANOVA i Mann-Whitney testovima, respektivno. Statističke analize su izvršene pomoću PRISM v8.0 (GraphPad).

1

Reference za onlajn metode

[0348]

1. Zost SJ, G. P., Chen RE, Case JB, Reidy JX, Trivette A, Nargi RS, Sutton RE, Suryadevara N, Chen EC, Binshtein E, Shrihari S, Ostrowski M, Chu HY, Didier JE, MacRenaris KW, Jones T, Day S, Myers L, Lee FE-H, Nguyen DC, Sanz I, Martinez DR, Baric RS, Thackray LB,. Diamond MS, Carnahan RH, Crowe JE Jr.. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein. bioRxiv 2020.05.12.091462; doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.091462 (2020)

2. Mukherjee, S. et al. Enhancing dengue virus maturation using a stable furin overexpressing cell line. Virology 497, 33-40, doi:10.1016/j.virol.2016.06.022 (2016).

3. Wrapp, D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263, doi:10.1126/science.abb2507 (2020).

4. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y. & Walz, T. Negative staining and image classification -Powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online 6, 23-34, doi:10.1251/bpo70 (2004).

5. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol 152, 36-51, doi:10.1016/j.jsb.2005.07.007 (2005).

6. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J. & Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods 14, 290-296, doi:10.1038/nmeth.4169 (2017).

7. Bepler, T., Noble, A. J., and Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM. bioRxiv. doi:10.1101/838920 (2019).

1

Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem 25, 1605-1612, doi:10.1002/jcc.20084 (2004).

Chng, J. et al. Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells. MAbs 7, 403-412, doi:10.1080/19420862.2015.1008351 (2015).

Yuan, M. et al. A highly conserved cryptic epitope in the receptor binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science 368, 630-633, doi:10.1126/science.abb7269 (2020).

Ianevski, A., He, L., Aittokallio, T. & Tang, J. SynergyFinder: a web application for analyzing drug combination dose-response matrix data. Bioinformatics 33, 2413-2415, doi:10.1093/bioinformatics/btx162 (2017).

ter Meulen, J. et al. Human monoclonal antibody as prophylaxis for SARS coronavirus infection in ferrets. Lancet 363, 2139-2141, doi:10.1016/S0140-6736(04)16506-9 (2004).

Sheehan, K. C. et al. Blocking monoclonal antibodies specific for mouse IFN-alpha/beta receptor subunit 1 (IFNAR-1) from mice immunized by in vivo hydrodynamic transfection. J Interferon Cytokine Res 26, 804-819 (2006).

Dinnon KH, et al. A mouse-adapted SARS-CoV-2 model for the evaluation of COVID-19 medical countermeasures. bioRxiv 2020.05.06.081497; doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.06.081497 (2020).

1

TABELA 1 - NUKLEOTIDNE SEKVENCE ZA PROMENLJIVI REGION ANTITELA

1

11

12

1

TABELA 2 - SEKVENCE PROTEINA ZA VARIJABILNI REGION ANTITELA

Klon SeqID Lanac Region varijabilne sekvence

1 4

Klon SeqID Lanac Region varijabilne sekvence

1

Klon SeqID Lanac Region varijabilne sekvence

1

Klon SeqID Lanac Region varijabilne sekvence

1

Klon SeqID Lanac Region varijabilne sekvence

1

Klon CDRH1 CDRH2 CDRH3

COV2- GFTFRDVW IKSKIDGGTT TTAGSYYYDTVGPGLPEGKFDY

2130

TABELA 4

1

[0349] Svi sastavi i metode koji su ovde otkriveni i za koje se tvrdi da su ovde navedeni mogu se izraditi i izvršiti bez nepotrebnog eksperimentisanja u svetlu ovog otkrića. Iako su sastavi i metode ovog otkrića opisani u smislu poželjnih otelotvorenja, stručnjacima će biti očigledno da se varijacije mogu primeniti na sastave i metode i u koracima ili u nizu koraka ovde opisane metode. Preciznije, biće očigledno da određeni agensi koji su i hemijski i fiziološki povezani mogu biti zamenjeni ovde opisanim sredstvima, dok bi se postigli isti ili slični rezultati.

VII. REFERENCE

[0350] Sledeće reference, u meri u kojoj pružaju primere proceduralnih ili drugih detalja koji dopunjuju one navedene u ovom dokumentu, otkrivene su u nastavku.

Američki patent 3.817.837

Američki patent 3.850.752

Američki patent 3.939.350

Američki patent 3.996.345

Američki patent 4.196.265

Američki patent 4.275.149

Američki patent 4.277.437

Američki patent 4.366.241

Američki patent 4.472.509

Američki patent 4.554.101

Američki patent 4.680.338

1

Američki patent 4.816.567

Američki patent 4.867.973

Američki patent 4.938.948

Američki patent 5.021.236

Američki patent 5.141.648

Američki patent 5.196.066

Američki patent 5.563.250

Američki patent 5.565.332

Američki patent 5.856.456

Američki patent 5.880.270

Američki patent 6.485.982

"Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

Abbondanzo et al., Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 12(4), 480-489, 1990.

Allred et al., Arch. Surg., 125(1), 107-113, 1990.

Atherton et al., Biol. of Reproduction, 32, 155-171, 1985.

Barzon et al., Euro Surveill.2016 Aug 11; 21(32).

1 1

Beltramello et al., Cell Host Microbe 8, 271-283, 2010.

Brown et al., J. Immunol. Meth., 12;130(1), :111-121, 1990.

Campbell, In: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp.

75-83, Amsterdam, Elsevier, 1984.

Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 74(2):425-433, 1977.

De Jager et al., Semin. Nucl. Med.23(2), 165-179, 1993.

Dholakia et al., J. Biol. Chem., 264, 20638-20642, 1989.

Diamond et al., J Virol 77, 2578-2586, 2003.

Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol. Biol., 109, :215-237, 1999.

Duffy et al., N. Engl. J. Med.360, 2536-2543, 2009.

Elder et al. Infections, infertility and assisted reproduction. Part II: Infections in reproductive medicine & Part III: Infections and the assisted reproductive laboratory. Cambridge UK: Cambridge University Press; 2005.

Gefter et al., Somatic Cell Genet., 3:231-236, 1977.

Gomet et al., Semin ReprodMed.2016 Sep; 34(5):285-292. Epub 2016 Sep 14.

Gulbis and Galand, Hum. Pathol.24(12), 1271-1285, 1993.

Halfon et al., PLoS ONE 2010; 5 (5) e10569

Hessell et al., Nature 449, 101-4, 2007.

1 2

Khatoon et al., Ann. of Neurology, 26, 210-219, 1989.

King et al., J. Biol. Chem., 269, 10210-10218, 1989.

Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976.

Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975.

Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982.

Mansuy et al., Lancet Infect Dis.2016 Oct; 16(10):1106-7.

Nakamura et al., In: Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Chapter 27, 1987.

O'Shannessy et al., J. Immun. Meth., 99, 153-161, 1987.

Persic et al., Gene 187:1, 1997

Potter and Haley, Meth. Enzymol., 91, 613-633, 1983.

Purpura et al., Lancet Infect Dis.2016 Oct; 16(10):1107-8. Epub 2016 Sep 19.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., 3:624-652, 1990.

Tang et al., J. Biol. Chem., 271:28324-28330, 1996.

Wawrzynczak & Thorpe, In: Immunoconjugates, Antibody Conuugates In Radioimaging And Therapy Of Cancer, Vogel (Ed.), NY, Oxford University Press, 28, 1987.

Yu et al., J Immunol Methods 336, 142-151, doi:10.1016/j.jim.2008.04.008, 2008.

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za površinski protein šiljka SARS-CoV-2, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:59, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:60, CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:61, CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:89, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:90, CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:91.

2. Antitelo ili fragment antitela iz patentnog zahteva 1, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata promenljive sekvence teškog i lakog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:33 i aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:34.

3. Antitelo ili fragment antitela iz patentnog zahteva 1, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:33 i varijabilnu sekvencu lakog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:34.

4. Antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za površinski protein šiljka SARS-CoV-2, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:68, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:69, CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:70, CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:98, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:99, CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:100.

5. Antitelo ili fragment antitela iz patentnog zahteva 4, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata promenljive sekvence teškog i lakog lanca koje imaju najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identiteta sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:39 i aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:40.

6. Antitelo ili fragment antitela iz patentnog zahteva 4, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:39 i varijabilnu sekvencu lakog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:40.

7. Antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, pri čemu antitelo ili fragment antitela obuhvata mutaciju YTE.

8. Antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-7, pri čemu je antitelo ili fragment antitela IgG antitelo ili fragment.

9. Antitelo ili fragment antitela iz patentnog zahteva 8, pri čemu je IgG antitelo ili fragment IgG1 antitelo.

10. Farmaceutski prihvatljiv sastav koji se sastoji od antitela ili fragmenta antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9, opciono pri čemu je sastav formulisan za intravensku primenu.

11. Farmaceutski prihvatljiv sastav koji se sastoji od prvog antitela ili fragmenta antitela koji je antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3 i drugog antitela ili fragmenta antitela koji je antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 4-6.

12. Farmaceutski prihvatljiv sastav prema zahtevu 11, pri čemu prvo antitelo ili fragment antitela obuhvata mutaciju YTE, a drugo antitelo ili fragment antitela obuhvata mutaciju YTE.

13. Farmaceutski prihvatljiv sastav iz patentnog zahteva 11 ili 12, pri čemu je prvo antitelo ili fragment antitela IgG1 antitelo, a drugo antitelo ili fragment antitela je IgG1 antitelo.

14. Kombinacija prvog antitela ili fragmenta antitela koji se vezuje za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2 i drugog antitela ili fragmenta antitela koji se vezuje za protein površinskog šiljka virusa SARS-CoV-2 za upotrebu u metodi za lečenje ili sprečavanje infekcije virusom SARS-CoV-2 kod subjekta, pri čemu

prvo antitelo ili fragment antitela sadrži CDRH1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:59, CDRH2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SeQ

1

ID NO:60, CDRH3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:61, CDRL1 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:89, CDRL2 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:90, CDRL3 koji se sastoji od sekvence aminokiselina Seq ID NO:91; a

15. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu prvo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:33 i varijabilne sekvence lakog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:34

16. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14 ili 15, pri čemu drugo antitelo ili fragment antitela obuhvata varijabilnu sekvencu teškog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:39 i varijabilne sekvence lakog lanca koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:40.

17. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-16, pri čemu prvo antitelo ili fragment antitela sadrži YTE mutaciju, a drugo antitelo ili fragment antitela sadrži YTE mutaciju.

18. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-17, pri čemu je prvo antitelo ili fragment antitela IgG antitelo ili fragment, a drugo antitelo ili fragment antitela je IgG antitelo ili fragment.

19. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-18, pri čemu je prvo antitelo ili fragment antitela IgG1 antitelo; a drugo antitelo ili fragment antitela je IgG1 antitelo.

1

20. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-19, pri čemu je prvo antitelo ili fragment antitela formulisan za intravensku primenu i/ili je drugo antitelo ili fragment antitela formulisan za intravensku primenu.

21. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-20, pri čemu su prvo antitelo ili fragment antitela i drugo antitelo ili fragment antitela u istom farmaceutski prihvatljivom sastavu.

22. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14-21, pri čemu subjekt:

(i) ima 60 ili više godina,

(ii) imunokompromitovan je, ili

(iii) boluje od respiratornog i/ili kardiovaskularnog poremećaja.

1