RS65262B1

RS65262B1 - Antigenski peptidi za prevenciju i lečenje maligniteta b ćelija

Info

Publication number: RS65262B1
Application number: RS20240132A
Authority: RS
Inventors: Laurent Chene; Francesco Strozzi; Joao Gamelas Magalhaes; Guillaume Kulakowski
Original assignee: Enterome S A
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2024-03-29
Also published as: AU2020384926A1; WO2021094562A3; US20240033335A1; HRP20240116T1; DK4021487T3; DK4021487T5; AU2020384926B2; LT4021487T; SI4021487T1; US11759508B2; ES2971929T3; FI4021487T3; JP2023501204A; EP4357356A2; HUE065075T2; EP4021487B1; MX2022005704A; CN114746112A; BR112022009100A2; PL4021487T3

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast terapije raka, tačnije imunoterapijske metode. Konkretno, predmetni pronalazak obezbeđuje peptid, koji je koristan u imunoterapiji raka, posebno za prevenciju i lečenje maligniteta B ćelija.

[0002] Među svim malignitetima B ćelija, kao što su B ćelijski limfomi, ne-Hočkinov limfom (NHL) je sedmi vodeći uzrok novih slučajeva raka i čini približno 3% smrtnih slučajeva povezanih sa rakom u Sjedinjenim Državama. Među svim NHL, difuzni veliki B ćelijski limfom (DLBCL) je najčešći podtip limfoma koji obuhvata 32,5% svih novodijagnostikovanih slučajeva, zatim folikularni limfom (FL) sa 17,1% i limfom ćelija plašta (MCL) koji predstavlјa 3-5%. Preko 25.000 novih slučajeva DLBCL se dijagnostikuje godišnje u Sjedinjenim Državama, što predstavlja stopu incidencije od 6,9 na 100.000. Dodavanje anti-CD20 monoklonskog antitela, odnosno rituksimaba, standardnoj hemoterapiji, R-CHOP, rezultiralo je značajnim poboljšanjem stope potpunog odgovora (CR), stope bez događaja (EFS) i ukupnog (OS) preživljavanja kod DLBCL. Nažalost, kod otprilike 30-40% slučajeva dolazi do recidiva ili napredovanja nakon R-CHOP. Postoje specifične podgrupe pacijenata koji će imati loše odgovore i rezultate na standardni R-CHOP, kao što su MYC-preuređeni DLBCL, B ćelijski limfomi visokog stepena sa MYC, BCL2 ili BCL preuređenjima, aktivirani B ćelijski (ABC) DLBCL koji bi mogli imati koristi od novih pristupa (Chavez et al., CAR T-cell therapy for B-cell lymphomas: clinical trial results of available products; Ther Adv Hematol.2019).

[0003] Među novim pristupima, T ćelije himernog antigenskog receptora (CAR), kao što su CD19 ciljane CAR T ćelije, predstavljaju novi standard brige za pacijente sa DLBCL koji je otporan na najmanje dve prethodne linije terapije. Dva proizvoda CAR T ćelija [axicabtagene ciloleucel (axi-cel) (KTE-019) i tisagenlecleucel (CTL019) su dobila odobrenje Američke administracije za hranu i lekove za lečenje refraktornog DLBCL nakon dve linije terapije. Iako ovo predstavlja značajan dodatak lečenju DLBCL-a, otprilike 50% slučajeva će nastaviti da podleže svojoj bolesti. Kao rezultat toga, buduća istraživanja moraju se fokusirati na identifikaciju faktora bolesti, lečenja ili pacijenata koji mogu pomoći da se uspešno predvide ishodi lečenja.

[0004] Vakcinacija zasnovana na tumorskim antigenima otuda predstavlja jedinstven pristup terapiji raka koji je zadobio veliko interesovanje jer može da angažuje imuni sistem pacijenta da prepozna, napadne i uništi tumore, na specifičan i trajan način. Zaista je poznato da tumorske ćelije eksprimuju veliki broj peptidnih antigena podložnih prepoznavanju od strane imunog sistema. Vakcine zasnovane na takvim antigenima stoga pružaju velike mogućnosti ne samo za poboljšanje ukupnog preživljavanja pacijenata već i za praćenje imunoloških odgovora i pripremu proizvoda GMP-klase zahvaljujući niskoj toksičnosti i maloj molekularnoj težini tumorskih antigena. Primeri tumorskih antigena uključuju, između ostalog, nusproizvode proteina transkribovanih iz normalno tihih gena ili prekomerno eksprimovanih gena i iz proteina eksprimovanih onkovirusom (Kvistborg et al., Human cancer regression antigens. Curr Opin Immunol.2013 Apr; 25(2):284-90), i neo-antigene, koji su rezultat tačkastih mutacija ćelijskih proteina. Na primer, WO 2019/197567 A2 stavlja na uvid javnosti antigene peptide, koji se razlikuju od fragmenata tumorskih antigena humanih, ali imaju sličnost sa amino-kiselinama za lečenje glioma, raka bubrega, raka kože, posebno melanoma, raka pluća, raka jajnika, raka dojke, kolorektalnog karcinoma, raka jetre, raka pankreasa, raka glave i vrata, raka urotela i raka prostate. WO 2019/072871 A2 stavlja na uvid javnosti varijante sekvenci mikrobiote sekvenci antigenskih epitopa povezanih sa tumorom i njihovu upotrebu u terapiji raka. Međutim, većina antigena povezanih sa tumorom (TAA) i tumor-specifičnih antigena (TSA) su (postojeći) humani proteini i stoga se smatraju autoantigenima. Tokom procesa timusne selekcije, T ćelije koje prepoznaju komplekse peptid/samo MHC sa dovoljnim afinitetom su klonalno iscrpljene. Nudeći zaštitu od autoimune bolesti, ovaj mehanizam selekcije repertoara T ćelija, takođe, smanjuje mogućnost razvoja imuniteta protiv TAA i TSA. Ovo je ilustrovano činjenicom da su TCR reaktivni na rak uglavnom slabog afiniteta. Štaviše, do sada većina ispitivanja vakcine obavljena sa odabranim TAA i TSA sa visokim afinitetom vezivanja za MHC nije pokazala da izaziva jak imunitet, što verovatno odražava posledicu timusne selekcije. Snažan antitumorski odgovor će stoga zavisiti od prezentacije imunoreaktivnih peptida i prisustva dovoljnog broja reaktivnih ćelija „obučenih“ da prepoznaju ove antigene. Stoga postoji potreba u tehnici da se identifikuju alternativni antigenski peptidi, koji mogu da prevaziđu ograničenja na koja se susreću u ovoj oblasti.

[0005] Pronalazak ima za cilj da zadovolji gore navedene potrebe. Ovaj cilj se postiže pomoću predmeta koji je izložen u priloženim patentnim zahtevima.

[0006] Pronalazak je detaljnije opisan u daljem tekstu.

DEFINICIJE

[0007] Osim ako nije drugačije definisano ovde, naučni i tehnički izrazi koji se koriste u predmetnoj prijavi imaće značenja koja su razumljiva prosečnom stručnjaku u tehnici. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, nomenklature koje se ovde koriste i tehnike kulture ćelija i tkiva su one koje su dobro poznate i koje se obično koriste u tehnici.

[0008] Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi, kao npr. Owen et al. (Kuby Immunology, 7th, edition, 2013 - W. H. Freeman) i Sambrook et al. (Molecular cloning: A laboratory manual 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 2012).

[0009] Ipak, s obzirom na upotrebu različitih izraza u predmetnoj specifikaciji, sledeće definicije se secifičnije primenjuju.

[0010] Izrazi „peptid”, „polipeptid”, „protein” i varijacije ovih izraza odnose se na peptide, oligopeptide, polipeptide ili proteine koji sadrže najmanje dve amino-kiseline povezane jedna sa drugom, poželjno normalnom peptidnom vezom, ili, alternativno, pomoću modifikovane peptidne veze, kao što je na primer u slučajevima izosteričnih peptida. Izraz „(poli)peptid” se odnosi na peptid i/ili na polipeptid. Konkretno, izrazi „peptid”, „polipeptid” i „protein” odnose se na sekvencijalni lanac amino-kiselina bilo koje dužine povezanih zajedno preko peptidnih veza (-NHCO-). Peptidi, polipeptidi i proteini mogu igrati strukturnu i/ili funkcionalnu ulogu u ćeliji in vitro i/ili in vivo. Izrazi „peptid”, „polipeptid”, „protein” poželjno obuhvataju lance amino-kiselina veličine u rasponu od 2 do najmanje oko 1000 aminokiselinskih ostataka. Izraz „peptid” poželjno obuhvata ovde lance amino-kiselina veličine manje od oko 30 amino-kiselina, dok izrazi „polipeptid” i „protein” poželjno obuhvataju lance amino-kiselina veličine najmanje 30 amino-kiselina. Izrazi „polipeptid” i „protein” se ovde koriste naizmenično. U poželjnoj realizaciji, izrazi „peptid”, „polipeptid”, „protein” takođe obuhvataju „peptidomimetike” koji su definisani kao analozi peptida koji sadrže nepeptidne strukturne elemente, a ti peptidi su sposobni da oponašaju ili antagonizuju biološko dejstvo(a) prirodnog roditeljskog peptida. Peptidomimetiku nedostaju klasične peptidne karakteristike kao što su enzimski cepajuće peptidne veze. Konkretno, peptid, polipeptid ili protein mogu da sadrže amino-kiseline koje nisu 20 amino-kiselina definisanih genetskim kodom uz ove amino-kiseline, ili mogu da budu sastavljeni od amino-kiselina koje nisu 20 amino-kiselina definisanih genetskim kodom. Konkretno, peptid, polipeptid ili protein u kontekstu predmetnog pronalaska može da se podjednako sastoji od amino-kiselina modifikovanih prirodnim procesima, kao što su procesi posttranslacionog sazrevanja ili hemijskim procesima, koji su dobro poznati stručnjaku u tehnici. Takve modifikacije su detaljno opisane u literaturi. Ove modifikacije se mogu pojaviti bilo gde u polipeptidu: u peptidnom skeletu, u lancu amino-kiselina ili čak na karboksi ili amino krajevima. Konkretno, peptid ili polipeptid može biti razgranat nakon ubikvitinacije ili biti cikličan sa grananjem ili bez njega. Ova vrsta modifikacije može biti rezultat prirodnih ili sintetičkih posttranslacionih procesa koji su dobro poznati stručnjacima u tehnici. Izrazi „peptid”, „polipeptid”, „protein” u kontekstu predmetnog pronalaska posebno, takođe, obuhvataju i modifikovane peptide, polipeptide i proteine. Na primer, modifikacije peptida, polipeptida ili proteina mogu da uključuju acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentnu fiksaciju nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentnu fiksaciju lipida ili derivata lipida, kovalentnu fiksaciju fosfatidilinozitola, kovalentno ili nekovalentno umrežavanje, ciklizacija, formiranje disulfidne veze, demetilacija, glikozilacija uključujući pegilaciju, hidroksilaciju, jodizaciju, metilaciju, miristoilaciju, oksidaciju, proteolitičke procese, fosforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, senelojlaciju, sulfataciju, aminokiselinske adicije kao što je aminorgilacija ili ubikvitinacija. Takve modifikacije su detaljno opisane u literaturi (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York ; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York ; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol.182: 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). Shodno tome, izrazi „peptid”, „polipeptid”, „protein” poželjno uključuju na primer lipopeptide, lipoproteine, glikopeptide i glikoproteine.

[0011] U poželjnoj realizaciji, (poli)peptid ili protein je „klasični” (poli)peptid ili protein, pri čemu se „klasični” (poli)peptid ili protein obično sastoji od amino-kiselina izabranih iz 20 amino-kiselina definisanih genetskim kodom, međusobno povezanih normalnom peptidnom vezom.

[0012] Kao što je dobro poznato u tehnici, peptidi, polipeptidi i proteini mogu biti kodirani nukleinskim kiselinama. Izrazi „nukleinska kiselina”, „molekul nukleinske kiseline”, „sekvenca nukleinske kiseline”, „polinukleotid”, „nukleotidna sekvenca” se ovde koriste kao zamenljivi i odnose se na precizan niz prirodnih nukleotida (npr. A, T, G, C i U), ili sintetičkih nukleotida, tj. na lanac od najmanje dva nukleotida. Posebno, izrazi „nukleinska kiselina”, „molekul nukleinske kiseline”, „sekvenca nukleinske kiseline”, „polinukleotid”, „nukleotidna sekvenca” odnose se na DNK ili RNK. Nukleinske kiseline poželjno obuhvataju jednolančanu, dvolančanu ili delimično dvolančanu DNK ili RNK, poželjno izabranu iz genomske DNK (gDNK), komplementarne DNK (cDNK), ribozomske DNK (rDNK) i proizvoda transkripcije date DNK, kao što je RNK. Poželjni primeri nukleinskih kiselina uključuju ribozomsku RNK (rRNK), informacionu RNK (mRNK); antisens DNK, antisens RNK; komplementarne RNK i/ili DNK sekvence, ribozim, (komplementarne) RNK/DNK sekvence sa ili bez ekspresionih elemenata, vektor; mini-gen, fragmente gena, regulatorne elemente, promotore i njihove kombinacije. Dalji poželjni primeri nukleinske kiseline (molekula) i/ili polinukleotida uključuju, na primer, rekombinantni polinukleotid, vektor, oligonukleotid, RNK molekul kao što je rRNK, mRNK ili transportnu RNK (tRNK) ili molekul DNK kao što je gore opisano. Stoga je poželjno da nukleinska kiselina (molekul) bude molekul DNK ili RNK molekul; poželjno izabran iz gDNK; cDNK; rRNK; mRNK; antisens DNK; antisens RNK; komplementarne RNK i/ili DNK sekvence; RNK i/ili DNK sekvence sa ili bez ekspresionih elemenata, regulatornih elemenata i/ili promotora; vektora; i njihove kombinacije. U okviru je veštine stručnjaka u tehnici da odredi nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju specifičnu sekvencu amino-kiseline.

[0013] (Poli)peptidi i/ili nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti pripremljeni bilo kojim poznatim postupkom u tehnici uključujući bilo koji sintetički postupak, bilo koji rekombinantni postupak, bilo koju ex vivo metodu generisanja i bilo koju njihovu kombinaciju. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi kao što je gore pomenuto.

[0014] Izraz „antigenski peptid” kako se ovde koristi odnosi se na peptid, koji je sklon da izazove/pokrene, poveća, produži ili održi imuni odgovor kod subjekta kome se daje. Posebno, antigenski peptid je varijanta sekvence (fragmenta/epitopa) (humanog) tumorskog antigena. Drugim rečima, antigenski peptid je poželjno različit od (fragmenta/epitopa) (humanog) tumorskog antigena, ali poželjno ima sličnost amino-kiselina sa (fragmentom/epitom) (humanog) tumorskog antigena. Važno je da antigenski peptid deli istu glavnu sekvencu sa odgovarajućim (fragmentom/epitopom) (humanog) tumorskog antigena. Poželjno, imuni odgovor indukovan/izazvan, povećan, produžen ili održavan antigenskim peptidom (takođe) cilja na odgovarajući (fragment/epitop) (humanog) tumorskog antigena.

[0015] Kako se ovde koristi, izraz „tumorski antigen” obuhvata tumor-specifične antigene i antigene povezane sa tumorom. Uopšteno, izraz „tumorski antigen” ili „tumorski protein” ovde označava antigenu supstancu proizvedenu u tumorskim ćelijama, a ponekad i u normalnim ćelijama, a koja može da izazove imuni odgovor nakon davanja subjektu. Kod ljudi, oni su klasifikovani prema njihovom obrascu ekspresije, funkciji ili genetskom poreklu i uključuju prekomerno eksprimovane auto-antigene (kao što je BIRC5); antigene raka testisa (CT) (kao što je MAGE-1); mutacione antigene, takođe poznate i kao neoantigeni (kao što su mutanti iz p53); tkivno-specifične antigene diferencijacije (kao što su antigeni melanoma Melan A/MART-1); virusne antigene koji se eksprimuju onkovirusima (kao što su HPV, EBV); onkofetalne antigene (kao što je alfa-fetoprotein AFP i karcinoembrionalni antigen CEA); i univerzalne antigene (telomerazu).

[0016] Izraz „tumorski antigen B ćelije”, kako se ovde koristi, odnosi se na antigen povezan sa i/ili uključen u etiologiju maligniteta B ćelije, npr. je uključen ili eksprimovan u malignomu B ćelija. Drugim rečima, antigen se eksprimuje od strane ili na B ćelijama, uključujući humane B ćelije, kao što je kod bilo kog od brojnih poznatih markera B ćelija. Poželjno je da je tumorski antigen B ćelija visoko eksprimovan (prekomerno eksprimovan) u B ćelijskim limfomima kao što su CD19, CD20, CD22, CD37 ili TNFRSF13C. Antigenski peptid „izveden iz” tumorskog antigena B ćelije obično deli istu glavnu sekvencu kao epitop („referentni epitop”) datog tumorskog antigena B ćelije.

[0017] Izraz „glavna sekvenca”, kako se ovde koristi, odnosi se na amino-kiseline u sredini sekvence (takođe nazvane „centralne amino-kiseline” sekvence), npr. u sredini antigenskog peptida i/ili (referentnog) epitopa. Shodno tome, glavna sekvenca se sastoji od svih amino-kiselina osim dve najkrajnje N-terminalne i dve najkrajnje C-terminalne amino-kiseline. Na primer, u peptidu od devet amino-kiselina (npr. antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili odgovarajući (fragment/epitop) (humanog) tumorskog antigena), pet srednjih amino kiselina predstavljaju glavnu sekvencu i promene mogu samo se javljaju na bilo kojoj od dve N-terminalne i dve C-terminalne aminokiselinske pozicije. Shodno tome, „zajednička glavna sekvenca ” (ili „zadržana” glavna sekvenca) obično znači da su mutacije/razlike dozvoljene samo u dve najkrajnje N-terminalne i u dve najkrajnje C-terminalne amino-kiseline (referentnog) epitopa/sekvence.

[0018] Izraz „prevalenca”, kako se ovde koristi, odnosi se na kumulativnu učestalost svakog proteina humane mikrobiote u kojoj je glavna sekvenca koja se deli sa odgovarajućim (fragmentom/epitopom) (humanog) tumorskog antigena) pronađena i prisutna u antigenu peptida. Zaista, glavna sekvenca od interesa može biti prisutna u jednom ili više različitih antigenskih peptida, a svaki od takvih antigenskih peptida može biti prisutan u jednom ili različitim proteinima eksprimovanim u humanoj mikrobioti. Shodno tome, globalna prevalenca glavne sekvence izvedena je iz učestalosti svakog proteina humane mikrobiote pri čemu se glavna sekvenca deli sa odgovarajućim (fragmentom/epitopom) (humanog) tumorskog antigena) i uzimajući u obzir frekvencije svakog proteina humane mikrobiote gde su pronađeni slični peptidi (tj. različiti antigeni peptidi) koji dele isto glavna sekvenca.

[0019] Izraz „mikrobiota”, kako se ovde koristi, odnosi se na komenzalne mikroorganizme pronađene u i na svim višećelijskim organizmima koji su do sada proučavani, od biljaka do životinja. Posebno, utvrđeno je da je mikrobiota ključna za imunološku, hormonsku i metaboličku homeostazu svog domaćina. Mikrobiota uključuje bakterije, arheje, protiste, gljive i viruse. Shodno tome, „varijanta sekvence mikrobiote” (ili „mikrobiota varijanta“) je varijanta sekvence (humane) referentne sekvence (naročito epitop/fragment humanog tumorskog antigena), koja se javlja u mikrobioti, kao što je bakterija (npr. može biti sadržana u proteinu mikrobiote, kao što je bakterijski protein). Poželjno, antigenski peptid pronalaska je varijanta sekvence mikrobiote (referentnog epitopa/fragmenta humanog tumorskog antigena B ćelije). Shodno tome, antigenski peptid je poželjno prisutan (npr. sadržan u) u najmanje jednom proteinu koji je eksprimovan u humanoj mikrobioti.

[0020] „Varijanta sekvence” tipično deli, posebno po celoj dužini sekvence, najmanje 50% identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, naime, fragmentom/epitopom (referentnog) tumorskog antigena. Poželjno, varijanta sekvence deli najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, posebno poželjno najmanje 95%, a najpoželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa referentnom sekvencom, naime, fragmentom/epitopom (referentnog) tumorskog antigena. Identitet sekvence se može izračunati kao što je poznato u tehnici, posebno kao što je opisano u nastavku teksta. Poželjno, varijanta sekvence čuva specifičnu funkciju referentne sekvence, na primer, njenu funkciju epitopa tumora i/ili njenu sposobnost da izazove ili održi imuni odgovor. Varijanta sekvence mikrobiote je poželjno izabrana iz grupe koju čine varijante bakterijske sekvence, varijante sekvence arheja, varijante sekvence protista, varijante sekvence gljiva i varijante sekvence virusa. Još poželjnije, varijanta sekvence mikrobiote je varijanta bakterijske sekvence.

[0021] Anatomski, mikrobiota se nalazi na ili unutar bilo kojeg od brojnih tkiva i biofluida, uključujući kožu, konjuktivu, mlečne žlezde, vaginu, placentu, semensku tečnost, matericu, folikule jajnika, pluća, pljuvačku, oralnu duplju (posebno oralnu sluzokožu), i gastrointestinalni trakt, posebno creva. U kontekstu predmetnog pronalaska, varijanta sekvence mikrobiote je poželjno varijanta sekvence mikrobiote gastrointestinalnog trakta (mikroorganizmi koji žive u gastrointestinalnom traktu), poželjnije varijanta sekvence mikrobiote creva (mikroorganizmi koji žive u crevima). Shodno tome, najpoželjnije je da varijanta sekvence mikrobiote bude varijanta sekvence bakterije (humanog) creva (tj. varijanta sekvence bakterija koje borave u (ljudskom) crevu).

[0022] Dok se mikrobiota može naći u i na mnogim višećelijskim organizmima (svim višećelijskim organizmima proučavanim do danas, od biljaka do životinja), mikrobioti koja se nalazi u i na ljudima se daje prednost. Takva mikrobiota se ovde pominje kao „ljudska/humana mikrobiota” (gde se izraz čovek odnosi specifično na lokalizaciju/prebivalište mikrobiote). U kontekstu predmetnog pronalaska, varijanta sekvence mikrobiote je varijanta sekvence humane mikrobiote.

[0023] Poželjno, antigenski peptid kao što je ovde opisan može se ko-administrirati ili povezati, na primer, kovalentnom ili nekovalentnom vezom, sa proteinom/peptidom koji ima imuno-adjuvantna svojstva, kao što je obezbeđivanje stimulacije CD4+ Th1 ćelija. Dok se antigenski peptid, kako je ovde opisan, poželjno vezuje za MHC klasu I, CD4+ epitopi pomagači mogu se dodatno koristiti da bi se obezbedio efikasan imuni odgovor. Th1 ćelije pomagači su u stanju da održe efikasnu aktivaciju dendritskih ćelija (DC) i specifičnu aktivaciju CTL tako što luče interferon-gama (IFN-γ), faktor nekroze tumora-alfa (TNF-α) i interleukin-2 (IL-2) i pojačavaju ekspresiju kostimulatornog signala na DC i T ćelijama (Galaine et al., Interest of Tumor-Specific CD4 T Helper 1 Cells for Therapeutic Anticancer Vaccine. Vaccines (Basel).2015 Jun 30;3(3):490-502).

[0024] Na primer, adjuvantni peptid/protein može poželjno da se razlikuje od antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku. Poželjno, adjuvantni peptid/protein je sposoban da opozove imunološku memoriju ili obezbedi nespecifičnu pomoć ili može da bude specifični peptid pomagač. Nekoliko peptida pomagača je opisano u literaturi za pružanje nespecifične pomoći T ćelijama, kao što je peptid pomagač tetanusa, peptid hemocijanina ključaonice ili PADRE peptid (Adotévi et al., Targeting antitumor CD4 helper T cells with universal tumor-reactive helper peptides derived from telomerase for cancer vaccine. Hum Vaccin Immunother. 2013 May;9(5):1073-7, Slingluff CL, The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Cancer J.2011 Sep- Oct;17(5):343-50). Shodno tome, peptid pomagač tetanusa, peptid hemocijanina ključaonice i PADRE peptid su poželjni primeri takvih adjuvantnih peptida/proteina. HHD-DR3 peptid sekvence MAKTIAYDEEARRGLERGLN (SEQ ID NO: 473). Ovaj peptid predstavlja još jedan primer peptida pomagača (koji ima svojstva imuno-adjuvansa), koji je poželjan u kontekstu predmetnog pronalaska. Drugi poželjni primer je h-pAg T13L (sekvenca: TPPAYRPPNAPIL; SEQ ID NO: 474; Bhasin M, Singh H, Raghava GP (2003) MHCBN: sveobuhvatna baza podataka o MHC vezujućim i nevezujućim peptidima. Bioinformatics 19: 665-666). Dalji primeri poželjnih peptida pomagača uključuju UCP2 peptid (na primer, kako je opisano u WO 2013/135553 A1 ili u Dosset M, Godet Y, Vauchy C, Beziaud L, Lone YC, Sedlik C, Liard C, Levionnois E, Clerc B, Sandoval F, Daguindau E, Wain-Hobson S, Tartour E, Langlade-Demoyen P, Borg C, Adotévi O: Universal cancer peptide-based therapeutic vaccine breaks tolerance against telomerase and eradicates established tumor. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6284-95. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0896. Epub 2. oktobar 2012) i BIRC5 peptid (na primer kako je opisano u EP2119726 A1 ili u Widenmeyer M, Griesemann H, Stevanovic ́ S, Feyerabend S, Klein R, Attig S, Hennenlotter J, Wernet D, Kuprash DV, Sazykin AY, Pascolo S, Stenzl A, Gouttefangeas C, Rammensee HG: Promiscuous survivin peptide induces robust CD4+ T-cell responses in the majority of vaccinated cancer patients. Int J Cancer. 1. jul 2012;131(1):140-9. doi: 10.1002/ijc.26365. Epub 14. septembar 2011). Najpoželjniji peptid pomagač je UCP2 peptid (sekvenca amino-kiseline: KSVWSKLQSIGIRQH; SEQ ID NO: 475, na primer kako je opisanu u WO 2013/135553 A1 ili u Dosset et al., Clin Cancer Res.15. novembar 2012;18(22):6284-95. Posebno, antigenski peptid kako je ovde opisan, ili polipeptid koji sadrži dati antigenski peptid, može biti vezan, na primer kovalentnom ili nekovalentnom vezom, za peptid pomagač.

[0025] Kako se ovde koristi, izraz „imunogena kompozicija” se odnosi na kompoziciju koja je u stanju da izazove, indukuje, poveća, produži ili održi imuni odgovor, posebno koja izaziva, indukuje, povećava, produžava ili održava imuni odgovor, kada se primenjuje kod sisara, a posebno kada se daje ljudskom pojedincu. Poželjno, imunogena kompozicija dalje sadrži jednu ili više imuno-adjuvansnih supstanci.

[0026] Pod „farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom ili nosačem”, ovde se misli na jedinjenje farmaceutskog kvaliteta koje poboljšava isporuku, stabilnost ili biodostupnost aktivnog sredstva, i može se metabolisati od strane subjekta kome je administrirano i za koga je netoksično. Poželjni ekscipijensi i nosači prema pronalasku uključuju bilo koji od ekscipijenasa ili nosača koji se obično koriste u farmaceutskim proizvodima, kao što su, na primer, voda, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferovan fosfatom, dekstroza, glicerol, etanol, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciju. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi ili nosači mogu dalje da sadrže manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za vlaženje ili emulgatori, ili konzervanse.

[0027] Pod „vakcinom” se ovde podrazumeva kompozicija koja je sposobna da stimuliše imuni sistem živog organizma tako da se obezbedi zaštita od štetnog antigena, bilo kroz profilaksu ili kroz terapiju. Poželjne su profilaktičke vakcine. Poželjno, vakcina ili kompozicija vakcine dalje sadrži jednu ili više imuno-adjuvantnih supstanci.

[0028] U skladu sa različitim aspektima i realizacijama pronalaska koji su ovde opisani, „subjekat” ili „domaćin” se prvenstveno odnosi na sisara, a najpoželjnije na ljudsko biće. Dati subjekt može imati, ili se sumnja da ima, rizik od razvoja malignih B ćelija.

[0029] Izraz „malignost B ćelija” odnosi se na bolesti povezane sa transformacijom B ćelija. Obuhvata, između ostalog, B ćelijske limfome, akutnu limfocitnu (ili limfoblastnu) leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL, Rihterova). U kontekstu predmetnog pronalaska, poželjni su B ćelijski limfomi, kao što je ne-Hočkinov limfom (NHL). Na primer, NHL se bira iz grupe koju čine indolentni (sporo rastući) NHL, agresivni NHL, difuzni B-krupnoćelijski limfom (DLBCL), NOS (de novo i transformisan iz indolentnog), primarni medijastinalni B-krupnoćelijski limfom (PMBCL), B-krupnoćelijski limfom bogat T ćelijama/histocitima (TCHRBCL), Burkitov limfom, Mantel-ćelijski limfom (MCL) i/ili folikularni limfom (FL), opciono, folikularni limfom stepena 3B (FL3B).

[0030] Kako se ovde koristi, izraz „koji prevenira”, „prevencija”, „profilaksa” ili „sprečavanje” uopšteno znači izbegavanje ili minimiziranje početka ili razvoja bolesti ili stanja pre njenog početka, dok izraz „koji leči, „lečenje” ili „lečiti” obuhvata smanjenje, poboljšanje ili izlečenje bolesti ili stanja (ili simptoma bolesti ili stanja) nakon njenog početka. Izraz „prevencija” obuhvata „smanjenje verovatnoće pojave” ili „smanjenje verovatnoće ponovnog pojavljivanja”.

[0031] „Efektivna količina” ili „efikasna doza” kako se ovde koristi je količina koja obezbeđuje željeni efekat. Za terapeutske svrhe, efektivna količina je količina dovoljna da obezbedi koristan ili željeni klinički rezultat. Poželjnu efektivnu količinu za datu primenu stručnjak može lako odrediti uzimajući u obzir, na primer, veličinu, starost, težinu subjekta, tip bolesti/poremećaja koji treba sprečiti ili lečiti, i količinu vremena otkako je bolest/poremećaj počeo. U kontekstu predmetnog pronalaska, u smislu prevencije ili lečenja, efektivna količina kompozicije je količina koja je dovoljna da izazove humoralni i/ili ćelijski posredovan imuni odgovor usmeren protiv bolesti/poremećaja.

[0032] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, izraz „sadrži” i varijacije kao što su „sadrže” i „koji sadrži”, podrazumevaće uključivanje navedenog elementa, celog broja ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog nenavedenog elementa, celog broja ili koraka. Izraz „sastoji se od” je posebna realizacija izraza „sadrži”, pri čemu je isključen bilo koji drugi nenavedeni element, ceo broj ili korak. U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz „sadrži” obuhvata izraz „sastoji se od”. Izraz „sadrži” stoga obuhvata „uključuje” kao i „koji se sastoji od” npr., kompozicija „koja sadrži” X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno npr. X Y.

[0033] Izrazi „a” i „an” i „the” (u engleskoj verziji) i slične reference koje se koriste u kontekstu opisa pronalaska (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba da se tumače tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ako je drugačije naznačeno ovde ili je jasno naznačeno suprotno kontekstom.

[0034] Izraz „u suštini” ne isključuje „potpuno”, npr., kompozicija koja je „u suštini bez” od Y može biti potpuno bez Y. Gde je potrebno, izraz „u suštini” može biti izostavljen iz definicije pronalaska.

[0035] Izraz „oko” u odnosu na numeričku vrednost x znači x 610%.

[0036] Dodatne definicije su date kroz čitavu specifikaciju.

[0037] Predmetni pronalazak se može lakše razumeti uz upućivanje na sledeći detaljni opis, uključujući poželjne realizacije pronalaska i primere ovde uključene.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Antigenski peptid prema predmetnom pronalasku i drugi antigenski peptidi

[0038] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antigenski peptid koji se sastoji od sekvence aminokiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO:65 prema zahtevu 1.

[0039] Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 koji se koristi u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema patentnom zahtevu 8 koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u bilo kom od SEQ ID NOs 1 - 64, 66 - 257 i 476-500 u farmaceutskoj kompoziciji. Dodatni antigenski peptid farmaceutske kompozicije sastoji se od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 - 64, 66 - 257 i 476-500 (bez mutacija). Sekvence amino-kiseline prema SEQ ID NOs 1 - 257 i 476-500 su varijante sekvence mikrobiote (varijante mikrobiote, posebno varijante bakterijske sekvence) epitopa humanog tumora, posebno referentnih epitopa/fragmenata tumorskih antigena humanih B ćelija. Drugim rečima, sekvence amino-kiselina prema SEQ ID NOs 1 - 64, 66 - 257 i 476-500 mogu se naći u bakterijskim proteinima i pokazuju sličnost sekvence sa referentnim epitopima/fragmentima humanih B ćelijskih tumorskih antigena, kao što je detaljno prikazano u tabeli 1A.

[0040] Predmetni pronalazači su identifikovali skup antigenskih peptida koji se mogu koristiti da izazovu specifičan imuni odgovor protiv tumorskih ćelija. Ti antigenski peptidi se razlikuju od (fragmenata) humanih tumorskih antigena, ali imaju sličnost sa amino-kiselinama, posebno tumorskih antigena koji su visoko eksprimovani u limfomima B ćelija kao što su CD19, CD20, CD22, CD37 ili TNFRSF13C, kao što je prikazano u Tabeli 1A, Tabeli 1B i Tabeli 1C. Važno je da antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani imaju glavnu sekvencu identičnu sa glavnom sekvencom sekvence epitopa (fragmenta) referentnog tumorskog antigena. Štaviše, glavna sekvenca pokazuje visoku prevalencu zasnovanu na učestalosti proteina prisutnih u humanoj mikrobioti gde se nalazi glavna sekvenca.

[0041] Posebno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kao što je ovde opisano, su sadržani u polipeptidima i proteinima koje proizvode komenzalne bakterije iz creva čoveka. Shodno tome, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani nisu humane sekvence, već bakterijske sekvence. Bez želje da budu vezani nekom posebnom teorijom, pronalazači veruju da humani imunološki repertoar sadrži klonove T ćelija koji su reaktivni na bakterijske peptide (sadrže ih proteini koje proizvode komenzalne bakterije iz creva), koji imaju sličnost amino-kiselina sa fragmentima humanih tumorskih antigena. Posebno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde mogu izazvati jači imuni odgovor od odgovarajućih humanih peptida, pošto su T ćelije sposobne da prepoznaju striktno humane peptide iscrpljene da prepoznaju autoantigene tokom sazrevanja, što nije slučaj za antigene peptide prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani. Ovo može objasniti zašto su antigenski peptidi opisani ovde u stanju da indukuju imuni odgovor, a posebno T ćelijski odgovor, kada se ovi peptidi daju (ljudskom) pojedincu.

[0042] Shodno tome, bez vezivanja za bilo koju teoriju, pronalazači veruju da su proteini koje proizvode komenzalne bakterije iz creva u stanju da „imitiraju” tumorske antigene i da se mogu koristiti za pokretanje specifičnog imunološkog odgovora protiv tumorskih ćelija. Ovi nalazi pružaju dodatne dokaze da komenzalne bakterije mogu doprineti iskorenjivanju tumorskih ćelija.

[0043] Antigenski peptidi koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu biti pripremljeni korišćenjem dobro poznatih tehnika. Na primer,

peptidi se mogu pripremiti sintetički, tehnologijom rekombinantne DNK ili hemijskom sintezom. Peptidi koji su ovde opisani mogu se sintetizovati pojedinačno ili kao duži polipeptidi koji sadrže dva ili više peptida (npr. dva ili više peptida ili peptid i nepeptid). Antigenski peptidi mogu biti izolovani, tj. prečišćeni da budu suštinski bez drugih proteina koji se prirodno javljaju u ćeliji domaćina i njihovih fragmenata, npr. najmanje oko 70%, 80% ili 90% prečišćeni. Poželjno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kao što su ovde opisani su izolovani antigenski peptidi.

[0044] Prema tome, glavna sekvenca predstavlja glavnu karakteristiku antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku ili antigenskih peptida kako je ovde opisano. Pronalazači su na taj način identifikovali glavne sekvence od velikog značaja sa visokom prevalencom pošto su prisutne u nekoliko varijanti sekvence fragmenta (referentnog) tumorskog antigena i/ili u nekoliko proteina humane mikrobiote sa visokom frekvencijom u značajnom delu opšte humane populacije. Pronalazači su odabrali antigenske peptide pronalaska koji mogu da izazovu najbolji unakrsno reaktivni tumor-specifičan citotoksični imuni odgovor T ćelija u cilju prevencije i lečenja maligniteta B ćelija.

[0045] Generalno, zajednička glavna sekvenca ima visoku prevalencu u humanoj mikrobioti, kada je prevalenca veća od 30%, poželjno veća od 40%, poželjno veća od 50%, poželjnije veća od 60%, još poželjnije veća od 70 %, još poželjnije veća od 80%, posebno poželjno veća od 90%, a najpoželjnije veća od 95%.

[0046] Prevalenca glavne sekvence izvedena je iz učestalosti svakog proteina humane mikrobiote, pri čemu je nađena glavna sekvenca koja se deli sa odgovarajućim (fragmentom/epitopom) (humanog) tumorskog antigena) i uzimajući u obzir frekvencije svakog proteina humane mikrobiote gde su pronađeni slični peptidi (tj. različiti antigenski peptidi) koji dele istu glavnu sekvencu. Na primer, da bi se procenilo da li glavna sekvenca ima visoku prevalencu, učestalost svakog proteina prisutnog u humanoj mikrobioti, gde se pronađena data glavna sekvenca izračunava iz baze podataka sekvenci mikrobiote. Prevalenca se zatim izvodi iz kumulativne učestalosti izračunate za svaki protein humane mikrobiote gde je glavna sekvenca od interesa pronađeno i prisutno u antigenskom peptidu. Takva baza podataka može poželjno da sadrži podatke o mikrobioti (sekvenciji) više pojedinaca (subjekata). Primer takve baze podataka je „Integrisani referentni katalog mikrobioma humanog creva” (Integrated reference catalog of the human gut microbiome) (verzija 1.0, mart 2014 Li et al. MetaHIT Consortium. Integrisani katalog referentnih gena u mikrobiomu humanog creva. Nat Biotechnol. 2014. avgust;32(8):834-41 URL: http://meta.genomics.cn/meta/home), koji uključuje podatke iz glavnih napora za profilisanje humanog mikrobioma, Projekta američkog Nacionalnog instituta za zdravlje humanog mikrobioma (NIH-HMP) i Evropske inicijative za metagenomiku intestinalnog trakta čoveka (MetaHIT).

[0047] Shodno tome, pronalazak se odnosi na antigenske peptide koji imaju aminokiselinsku sličnost sa tumorskim antigenom pošto su izvedeni iz ovog tumorskog antigena (ili tumorskog epitopa). Izraz „koji ima sličnost amino-kiselina sa tumorskim antigenom” kako se ovde koristi, odnosi se posebno na varijantu sekvence fragmenata (referentnog) humanog tumorskog antigena, kao što je CD22 ili druge date primere humanih tumorskih antigena opisanih ispod u Tabelama 1A, 1B i 1C. „Varijanta sekvence” obično deli, posebno po celoj dužini sekvence, najmanje 50% identiteta sekvence sa referentnom sekvencom, naime, fragmentom (referentnog) tumorskog antigena. Poželjno, varijanta sekvence deli najmanje 55%, poželjno najmanje 60%, poželjno 66%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 77%, još poželjnije najmanje 80%, čak još poželjnije najmanje 88%, još više poželjno najmanje 90% identiteta sekvence sa referentnom sekvencom, naime, fragmentom (referentnog) tumorskog antigena. Identitet sekvence se može izračunati kao što je poznato u tehnici, posebno kao što je opisano u nastavku teksta. Poželjno, varijanta sekvence čuva specifičnu funkciju referentne sekvence, na primer, njenu funkciju epitopa tumora i/ili njenu sposobnost da izazove ili održi imuni odgovor. Posebno, varijanta sekvence amino-kiseline ima izmenjenu sekvencu u kojoj je jedna ili više amino-kiselina u referentnoj sekvenci mutirana, npr. obrisana ili supstituisana, ili je jedna ili više amino-kiselina umetnuta u sekvencu referentne sekvence aminokiseline. Na primer, varijantne sekvence koje su najmanje 90% identične nemaju više od 10 alteracija, tj. bilo koje kombinacije delecija, insercija ili supstitucija, na 100 amino-kiselina referentne sekvence.

[0048] Postupci za poređenje identiteta (sličnosti) dve ili više sekvenci su dobro poznati u tehnici. Procenat u kome su dve sekvence identične može se, npr., odrediti korišćenjem matematičkog algoritma. Poželjan, ali ne limitirajući, primer matematičkog algoritma koji se može koristiti je algoritam od Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Takav algoritam je integrisan u BLAST familiju programa, npr. BLAST ili NBLAST program (videti, takođe, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215, 403-410 ili Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), koji su dostupni preko početne stranice NCBI na sajtu ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol.183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448). Ovi programi mogu identifikovati sekvence koje su u određenoj meri identične drugim sekvencama. Štaviše, programi dostupni u Wisconsin Sequence Analysis Package, verzija 9.1 (Devereux et a/., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), na primer, programi BESTFIT i GAP, takođe mogu da se koriste za određivanje % identiteta između dva polinukleotida i % identiteta između dve (poli)peptidne sekvence. BESTFIT koristi algoritam „lokalne homologije” od Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol.147, 195-197 i pronalazi najbolji pojedinačni region sličnosti između dve sekvence.

[0049] Generalno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku se vezuje za molekule MHC klase I (glavni kompleks histokompatibilnosti klase I, MHC I).

[0050] Molekuli MHC klase I predstavljaju epitope T ćelijama ubica, koje se takođe nazivaju citotoksični T limfociti (CTL). CTL eksprimuje CD8 receptore, pored TCR-a (T ćelijskih receptora). Kada se CTL-ov CD8 receptor spoji sa molekulom MHC klase I, ako CTL-ov TCR odgovara epitopu unutar molekula MHC klase I, CTL pokreće ćeliju da se podvrgne programiranoj ćelijskoj smrti apoptozom. Ovaj put je posebno koristan u prevenciji i/ili lečenju raka, jer su ćelije raka direktno napadnute. Kod ljudi, MHC klasa I obuhvata HLA-A, HLA-B i HLA-C molekule. Obično, peptidi (epitopi) koji imaju dužinu od 8 - 10 amino-kiselina su predstavljeni sa MHC I.

[0051] Slično tome, „fragment/epitop” (referentnog) tumorskog antigena, koji obično služi kao referentna sekvenca, poželjno sadrži 9 uzastopnih amino-kiselina tumorskog antigena i eventualno 10 amino-kiselina. Podrazumeva se da „fragment/epitop” (referentnog) tumorskog antigena nije tumorski antigen (protein) pune dužine.

[0052] „Fragment” (proteina ili nukleinske kiseline (sekvence)), kako se ovde koristi, poželjno ima maksimalnu dužinu od 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% (referentnog) proteina/nukleinske kiseline/sekvencije pune dužine. U nekim realizacijama, dužina ne prelazi 50% dužine (referentnog) proteina/nukleinske kiseline (pune dužine). U drugim realizacijama, dužina fragmenta (referentnog) proteina/nukleinske kiseline ne prelazi 20% ili 10% dužine (referentnog) proteina/nukleinske kiseline (pune dužine).

[0053] Opštije rečeno, ovde je stavljen na uvid javnosti antigenski peptid, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence fragmenta/epitopa humanog (referentnog) tumorskog antigena, posebno varijante sekvence mikrobiote fragmenta/epitopa humanog tumorskog antigena. Antigen humanog tumora može biti izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD37 i TNFRSF13C. Fragment/epitop humanog (referentnog) tumorskog antigena može biti izabran iz grupe koja se sastoji od bilo koje od SEQ ID 258-280.

[0054] Na primer, ovde je stavljen na uvid javnosti antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante mikrobiote humanog referentnog peptida prema bilo kojoj od SEQ ID NOs 258 - 280. Posebno, SEQ ID NOs 258 - 280 se odnose na epitope humanog tumora, posebno na referentne epitope/fragmente tumorskih antigena humanih B ćelija. Primeri mikrobiota varijanti humanih referentnih peptida prema bilo kojoj od SEQ ID NOs 258 - 280 su peptidi prema SEQ ID NOs 1 - 257 i 476-500 (kao što je prikazano u Tabeli 1A u daljem tekstu). Poželjne varijante sekvence mikrobiote (varijante mikrobiote) su varijante bakterijske sekvence. Drugim rečima, sekvence amino-kiselina prema SEQ ID NOs 1 - 257 i 476-500 mogu se naći u bakterijskim proteinima i pokazuju sličnost sekvenci sa referentnim epitopima/fragmentima tumorskih antigena humanih B ćelija, kao što je detaljno prikazano u Tabeli 1A.

[0055] Antigenski peptid može da se veže umereno, snažno ili veoma snažno za molekule MHC klase I (glavni kompleks histokompatibilnosti klase I, MHC I).

[0056] Vezivanje najmanje jednog antigenskog peptida za molekule MHC klase I (glavni kompleks histokompatibilnosti klase I) može da se testira pomoću MHC I in silico ili in vitro testovima vezivanja kao što je ovde opisano. Shodno tome, jaka i veoma jaka veziva mogu se odabrati kao što je gore opisano. Vezivanje za MHC I se može testirati (in silico i/ili in vitro kao što je ovde opisano) za najmanje jedan antigenski peptid za MHC I molekule i, dodatno, za (odgovarajući referentni) tumorski antigen (fragment/epitop (referentnog) tumorskog antigena) za MHC I molekule, a afiniteti vezivanja su poželjno dobijeni za oba (fragment/epitop tumorskog antigena i antigenski peptid).

[0057] Nakon testa vezivanja, mogu se odabrati takvi antigenski peptidi koji se vezuju umereno, snažno ili veoma snažno za MHC I.

[0058] Predviđanje vezivanja MHC klase I (MHC in silico test vezivanja) može se izvesti korišćenjem javno dostupnih alata, kao što je „NetMHCpan”, na primer „NetMHCpan 3.0 Server” ili „NetMHCpan 4.0 Server” (Centar za analizu biološke sekvence, Tehnički univerzitet Danske DTU; URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/). NetMHCpan postupak, posebno NetMHCpan 3.0 ili novija verzija, obučen je na više od 180000 kvantitativnih podataka o vezivanju koji pokrivaju 172 MHC molekula iz humanih (HLA-A, B, C, E) i drugih vrsta. Uopšteno, afinitet se može predvideti ostavljanjem podrazumevanih pragova za jaka i slaba veziva. Na primer, za HLA-A*0201 izračunati afinitet ispod 50 nM može ukazivati na „jaka veziva”, a afinitet između 50 i 300 nM može ukazivati na „umerena veziva”. U NetMHCpan-u, na primer, u NetMHCpan-u 3.0 ili u NetMHCpan-u 4.0, rang predviđenog afiniteta se može uporediti sa skupom od 400000 nasumičnih prirodnih peptida, koji se mogu koristiti kao mera % ranga afiniteta vezivanja. Na ovu vrednost ne utiče inherentna pristrasnost određenih molekula ka višim ili nižim srednjim predviđenim afinitetima. Na primer (npr. za HLA-A*0201), veoma jaka veziva mogu da se definišu kao da imaju % ranga < 0,5, jaka veziva mogu da se definišu kao da imaju % ranga < 1,0, umerena veziva mogu da se definišu kao da imaju % ranga od 1 ,0 do 2,0, a slaba veziva mogu da se definišu kao da imaju % ranga > 2,0. Postupak za in vitro testiranje je dobro poznat stručnjaku. Na primer, stručna osoba može da koristi eksperimentalni protokol koji je potvrđen za peptide predstavljene od strane HLA-A∗0201 u Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1 - associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(1 2):341 1 -21. U ovom kontekstu, referentni peptid, kao što je HIV pol 589-597, može se dodatno koristiti u testu. Ovo omogućava izračunavanje in vitro afiniteta u odnosu na vezivanje uočeno kod referentnog peptida, npr. po sledećoj jednačini: Relativni afinitet = koncentracija svakog peptida koji indukuje 20% ekspresije HLA-A*0201 / koncentracija referentnog peptida koji indukuje 20% ekspresije HLA-A*0201 (gde je 100% nivo HLA- A*0201 ekspresije detektovane sa referentnim peptidom, npr. HIV pol 589-597, na primer korišćenim u koncentraciji od 100 µ). Na primer, peptid koji pokazuje relativni afinitet ispod 1 može se smatrati „snažnim vezivom”, peptid koji pokazuje relativni afinitet između 1 i 2 može se smatrati „umerenim vezivom”, a peptid koji pokazuje relativni afinitet veći od 3 može se smatrati „slabim vezivom”.

[0059] Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju molekule MHC klase I (MHC-molekuli ljudi su, takođe, označeni kao humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B, i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-A* 24 i HLA-A*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji se mogu eksprimovati iz ovih lokusa. Na primer, antigenski peptid prema pronalasku može da se veže za molekule HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-A*24 i HLA-B*07. Konkretno, antigenski peptid prema pronalasku se vezuje za HLA-A*02.

[0060] Ćelijska lokalizacija, posebno da li se protein izlučuje ili sadrži transmembranski domen, može se testirati in silico ili in vitro metodama koje su dobro poznate stručnjaku. Na primer, „SignalP 4.1 Server” (Centar za analizu biološke sekvence, Tehnički univerzitet Danske DTU; URL: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) i/ili „Phobius” (kombinovani transmembranski prediktor topologije i signalnih peptida, Stockholm Bioinformatics Centre; URL: phobius.sbc.su.se) se mogu koristiti. Poželjno, dva alata za predviđanje (npr. SignalP 4.1 Server i Phobius) se mogu kombinovati.

[0061] Na primer, da bi se testiralo da li se protein luči, može se procenjivati prisustvo signalnog peptida. Signalni peptidi su sveprisutni signali za sortiranje proteina koji ciljaju svoj putnički (teretni) protein za translokaciju kroz citoplazmatsku membranu kod prokariota. Za testiranje prisustva signalnog peptida, na primer „SignalP 4.1 Server” (Centar za analizu biološke sekvence, Tehnički univerzitet Danske DTU; URL: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) i/ili „Phobijus” (Kombinovana transmembranska topologija i prediktor signalnih peptida, Stockholm Bioinformatics Centre; URL: phobius.sbc.su.se) se mogu koristiti. Poželjno, dva alata za predviđanje (npr. SignalP 4.1 Server i Phobius) mogu se kombinovati.

[0062] Štaviše, može se utvrditi da li protein sadrži transmembranski domen. I signalni peptidi i transmembranski domeni su hidrofobni, ali transmembranske spirale obično imaju duže hidrofobne regione. Na primer, SignalP 4.1 Server i Phobius imaju kapacitet da razlikuju signalne peptide od transmembranskih domena. Poželjno je da se postavi minimalni broj od dve predviđene transmembranske spirale da bi se napravila razlika između membranskih i citoplazmatskih proteina da bi se isporučila konačna lista konsenzusa.

[0063] U jednom aspektu, varijanta sekvence mikrobiote fragmenta/epitopa humanog tumorskog antigena je predstavljena u celini nakon cepanja bakterijskog proteina eksprimovanog u humanoj mikrobioti. U ovom kontekstu, izraz „cepanje” se odnosi na obradu peptida za prezentaciju MHC, posebno na obradu MHC-I. Na primer, rezultat predviđanja cepanja i/ili afinitet se može koristiti za predviđanje antigenog cepanja za pravilno vezivanje MHC (za prezentaciju na CD8 T ćelijama). Takav „skor verovatnoće cepanja” može se izračunati pomoću softvera (poželjno je da je takav rezultat veći od 70%, poželjno veći od 80%, poželjnije veći od 90%). Na primer, „IEDB” (izvor baze podataka i analize imunog epitopa, resurs za analizu IEDB, podržan ugovorom Nacionalnog instituta za alergije i zarazne bolesti, komponentom Nacionalnog instituta za zdravlje u Ministarstvu zdravlja i ljudskih službi;), koji obezbeđuje, na primer, predviđanja obrade MHC-I (URL: http://tools.iedb.org/mhcnp/) se može koristiti. U drugom primeru, NetChop3 (The role of the proteasome in generating cytotoxic T cell epitopes: Insightsobtained from improved predictions of proteasomal cleavage. M. Nielsen, C. Lundegaard, O. Lund, and C. Kesmir. Immunogenetics., 57(1-2):33-41, 2005; Prediction of proteasome cleavage motifs by neural networks. C. Kesmir, A. Nussbaum, Hansjorg Schild, Vincent Detours, and S. Brunak, Prot. Eng., 15(4): 287-296, 2002; URL: http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/) se može koristiti za predviđanje cepanja. Ovaj algoritam je zasnovan na neuronskoj mreži obučenoj na eksperimentalnim podacima o cepanju proteazoma in vitro i poznatim HLA ligandima. Rezultat mreže bio je skor između 0,0 i 1,0. Nasumični prediktor bi postigao 0,5, a savršeni prediktor bi postigao 1. Shodno tome, visok rezultat (skor) za peptid (npr. iznad 0,7, poželjno iznad 0,8, poželjnije iznad 0,9, kao što je gore opisano) sugeriše da se on efikasno cepa na svom N- i/ili C-kraju (a ne na svom centru), dok je nizak rezultat povezan sa peptidima koji se cepaju u svom centru. Na taj način, informacije u vezi sa proteazomskim cepanjem, TAP transportom i alatima za analizu MHC klase 1 mogu se kombinovati za predviđanje prezentacije peptida.

[0064] U jednom aspektu, antigenski peptid indukuje unakrsnu reaktivnost T ćelija protiv humanog epitopa (referentnog) tumorskog antigena. Unakrsna reaktivnost T ćelija je fenomen imunog sistema definisan kao prepoznavanje dva ili više kompleksa peptid-MHC (pMHC) od strane T ćelijskog receptora (TCR).

[0065] Mimikrija epitopa se odnosi na koncept sličnosti sekvence i strukture između stranih antigena i sopstvenih antigena kao pokretačkog mehanizma za izazivanje unakrsnog reaktivnog imunološkog odgovora protiv autoantigena. Zanimljivo je da takva mimikrija epitopa nudi mogući način da se zaobiđe ograničenje repertoara humanih T ćelija zbog klonskog iscrpljivanja T ćelija koje prepoznaju antiantigene.

[0066] Konkretno, antigeni (tj. antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani) različiti od autoantigena (npr. humani epitop tumorskog antigena), ali dele sličnost sekvence sa autoantigenom, (i) još uvek se mogu prepoznati zbog unakrsne reaktivnosti receptora T ćelija i (ii) očekuje se da takve antigene prepoznaju T ćelije/TCR koji nisu iscrpljeni tokom procesa obrazovanja T ćelija. Shodno tome, takvi antigeni su u stanju da izazovu jak imuni odgovor koji dovodi do klonske ekspanzije T ćelija sa potencijalnom unakrsnom reaktivnošću sa autoantigenima.

[0067] Unakrsna reaktivnost receptora T ćelija sa epitopom humanog (referentnog) tumorskog antigena može se meriti kao što je prikazano u odeljku PRIMERI pomoću ELISPOT-IFNy testa. Ukratko HLA-A2 transgeni miševi (npr. HHD DR1 miševi koji eksprimuju humani HLA-A2 i HLA-DR1 MHC i nemaju mišje H-2 klase I i klase II MHC i/ili HHD DR3 miševi koji eksprimuju humani HLA-A2 i HLA-DR3 MHC ) su imunizovani na dan 0 (d0) sa primarnom injekcijom, a na d14 sa pojačanom injekcijom sa antigenskim peptidom predmetnog pronalaska i epitopom humanog (referentnog) tumorskog antigena. Sedam dana nakon buster injekcije (tj. na d21), miševi su eutanazirani i splenociti su stimulisani in vitro sa antigenskim peptidom iz predmetnog pronalaska da proceni njihov kapacitet da luče IFN-gama kao što je procenjeno pomoću ELISPOT.

[0068] Konkretno, predmetni pronalazak obezbeđuje antigenski peptid u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema patentnom zahtevu 1, koji je varijanta sekvence mikrobiote fragmenta/epitopa humanog tumorskog antigena, pri čemu epitop humanog tumorskog antigena može da se sastoji od bilo koje SEQ ID NOs.1-64, 66-257 i 476-500.

[0069] Tabela 1A u nastavku daje pregled antigenskih peptida prema predmetnom pronalasku ili dalje antigenske peptide kao što su ovde opisani sa njihovim sekvencama amino-kiselina i SEQ ID NOs i sa odgovarajućim fragmentom/epitopom humanog tumorskog antigena (koji se ovde, takođe, naziva „humani referentni peptid”). Tabela 1A takođe pruža informacije o tome na koji tumorski antigen se odnosi svaki antigenski peptid prema predmetnom pronalasku. SEQ ID NOs 1 do 64, 66 do 257 i 476-500 se odnose na HLA-A*02 antigenske peptide kako je ovde opisano.

Tabela 1A. HLA-A*02 Antigenski peptid prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisan.

(nastavak)

[0070] Tabela 1B u nastavku daje pregled konsenzus sekvenci (konsenzus sekvence MHC Klase I) antigenskih peptida opisanih ovde sa njihovim sekvencama amino-kiselina i SEQ ID NOs i sa odgovarajućim fragmentom/epitopom humanog tumorskog antigena (koji se ovde, takođe, naziva „humani referentni peptid”), kao i njihovim jezgrom sekvence.

Tabela 1B. Konsenzus sekvence MHC Klase I antigenskih peptida.

(nastavak)

[0071] Tabela 1C u daljem tekstu daje pregled konsenzus sekvenci HLA-A*02 antigenskih peptida farmaceutske kompozicije ili korišćenih u kombinaciji u skladu sa predmetnim pronalaskom sa njihovim sekvencama aminokiselina i SEQ ID NO, i sa odgovarajućom glavnom sekvencom humanog tumorskog antigena. Tabela 1C, takođe, obezbeđuje informacije za koju glavnu sekvencu i konsenzus sekvencu HLA-A*02 je svaki antigenski peptid.

Tabela 1C. HLA-A*02 Konsenzus sekvence antigenskog peptida prema pronalasku ili kako je ovde opisano.

(nastavak)

[0072] Kao što se može izvući iz tabela 1A-1C, antigenski peptidi opisani ovde i oni prema predmetnom pronalasku mogu se kategorizovati prema odgovarajućem humanom tumorskom antigenu, prema odgovarajućoj glavnoj sekvenci i prema odgovarajućoj MHC klasi I i/ili HLA-A *02 konsenzus sekvenci.

[0073] Shodno tome, antigenski peptid može da sadrži (glavnu) sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs 281 -303. Poželjno, antigenski peptid sadrži (glavnu) sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs 281, 283 - 289, 293, 294, 302 i 303. Još poželjnije, antigenski peptid sadrži (glavnu) sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs 283, 287, 293, 294, 302 i 303. Još poželjnije, antigenski peptid sadrži (glavnu) sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs 287, 293, 294 i 302. Antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji ili u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska je varijanta sekvence mikrobiote fragmenta tumorskog antigena CD19, kao što su antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 - 40. Poželjnije, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku je varijanta sekvence CD19 fragmenta (humani referentni peptid) „FLLFLTPME” (SEQ ID NO: 258), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1-12, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 10. Takođe je poželjnije da antigenski peptid prema predmetnom pronalasku bude varijanta sekvence CD19 fragmenta (humani referentni peptid) „KLSLGLPGL” ( SEQ ID NO: 259), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 13-33. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD19 fragmenta (humani referentni peptid) „SLVGILHLQ” (SEQ ID NO: 260), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 34-35, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 34 ili 35. Takođe je poželjnije da je antigen varijanta sekvence CD19 fragmenta (humani referentni peptid) „TLAYLIFCL” (SEQ ID NO: 261), kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 36-39, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 39. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD19 fragmenta (humani referentni peptid) „QQMGGFYLC” (SEQ ID NO: 262 ), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40, npr. antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40.

[0074] Antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji i u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD20 (MS4A1; humani referentni peptid), kao što je „IALGGLLMI” (SEQ ID NO: 263), „IMNSLSLFA” (SEQ ID NO: 264), „LMIPAGIYA” (SEQ ID NO: 265) ili „SLFLGILSV” (SEQ ID NO: 266). Konkretno, antigenski peptid prema varijanti sekvence fragmenta tumorskog antigena CD20, kao što su antigenski peptidi koji imaju glavnu skevencu koja se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 286 - 289. Shodno tome, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD20 koja sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID br.309-312. U posebnoj realizaciji, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD20 koji se vezuje za određeni HLA molekul (HLA-A2*02), kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od HLA-A2*02 konsenzus sekvence kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID br. 347-374. Još poželjnije, antigenski peptid je varijanta sekvence mikrobiote fragmenta tumorskog antigena CD20, kao što su antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 41 - 87. Poželjnije, antigenski peptid je varijanta sekvence CD20 fragmenta (humani referentni peptid) „IALGGLLMI” (SEQ ID NO: 263), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 41-64, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 61. Antigenski peptid prema predmetnom pronalasku je varijanta sekvence CD20 fragmenta (humani referentni peptid) „IMNSLSLFA” (SEQ ID NO: 264), antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 65. Dalji antigenski peptidi koji se koriste u kombinaciji ili u farmaceutskoj kompoziciji pronalaska sastoje se od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 70 i 476 - 484, npr. antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68, 70 i 477. Takođe je poželjnije da antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji ili u farmaceutskoj kompoziciji bude varijanta sekvence CD20 fragmenta (humani referentni peptid) „LMIPAGIYA” (SEQ ID NO: 265), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 71-80, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 72. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid prema varijanti sekvence CD20 fragmenta (humani referentni peptid) „SLFLGILSV” (SEQ ID NO: 266), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 81-87, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 86.

[0075] U jednom aspektu, antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji ili u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD22 (humani referentni peptid), kao što je „FLSNDTVQL” (SEQ ID NO: 267), „HLLGPWLLL” (SEQ ID NO: 268), „ILILAICGL” (SEQ ID NO: 269) ili „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270). U poželjnoj realizaciji, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD22, kao što su antigenski peptidi koji imaju glavnu sekvencu koja se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 290 - 293. Prema tome, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD22 koja sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID br.313 - 316. Konkretno, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD22 koji se vezuje za određeni HLA molekul (HLA-A2*02), kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od HLA-A2*02 konsenzus sekvence kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 375-390. Još poželjnije, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku je varijanta sekvence mikrobiote fragmenta tumorskog antigena CD22, kao što su antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 88 - 110. Poželjnije, antigenski peptid je varijanta sekvence CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „FLSNDTVQL” (SEQ ID NO: 267), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 88-96. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „HLLGPWLLL” (SEQ ID NO: 268), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 97-101. Takođe je poželjnije da antigenski peptid prema predmetnom pronalasku bude varijanta sekvence CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „ILILAICGL” (SEQ ID NO: 269), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 102-105. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid prema predmetnom pronalasku varijanta sekvence CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 106-110 i 485 -488, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 107, 108, 109 i 110.

[0076] Antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji ili farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD37 (humani referentni peptid), kao što je „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), „GLYFGMLLL” (SEQ ID NO: 272), „ILILAICGL” (SEQ ID NO: 273), „LLLLFATQI” (SEQ ID NO: 274), „SIVGICLGV” (SEQ ID NO: 275) ili „SLIKYFLFV” (SEQ ID NO: 276). U poželjnoj realizaciji, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD37, kao što su antigenski peptidi koji imaju glavnu sekvencu koja se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 294 - 299. Prema tome, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD37 koja sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 317 - 322. Konkretno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena CD37 koji se vezuje za određeni HLA molekul (HLA-A2*02), kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od HLA-A2*02 konsenzus sekvence kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 391-425. Poželjnije, antigenski peptid je varijanta sekvence mikrobiote fragmenta tumorskog antigena CD37, kao što su antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 111 - 162. Još poželjnije, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku je varijanta sekvence CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u SEQ ID NO: 111- 130, 400-402 i 489 - 493, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 114, 117, 119, 120, 491 i 493. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „GLYFGMLLL” (SEQ ID NO: 272), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 131-136. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „ILILAICGL” (SEQ ID NO: 273), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 137-147. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „LLLLFATQI” (SEQ ID NO: 274), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 148-155. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „SIVGICLGV” (SEQ ID NO: 275), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 156-157. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „SLIKIFLFV” (SEQ ID NO: 276), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 158-162.

[0077] Antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji i u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena TNFRSF13C (humani referentni peptid), kao što je „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 277), „GLALVLALV” (SEQ ID NO: 278), „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), „PLPGLLFGA” ili (SEQ ID NO: 280). U poželjnoj realizaciji, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena TNFRSF13C, kao što su antigenski peptidi koji imaju glavnu sekvencu koja se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 300-303. Prema tome, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena TNFRSF13C koja sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO. 323 - 326. Konkretno, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta tumorskog antigena TNFRSF13C koji se vezuje za određeni HLA molekul (HLA-A2*02), kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od HLA-A2*02 konsenzus sekvence kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO.426 -472. Poželjnije, antigenski peptid je varijanta sekvence mikrobiote fragmenta tumorskog antigena TNFRSF13C, kao što su antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 163 - 257. Poželjnije, antigenski peptid je varijanta sekvence fragmenta TNFRSF13C (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 277), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 163-170. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid prema predmetnom pronalasku varijanta sekvence fragmenta TNFRSF13C (humani referentni peptid) „GLALVLALV” (SEQ ID NO: 278), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 171-209. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid varijanta sekvence fragmenta TNFRSF13C (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO: 210-225, i 494 - 500, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 212, 217, 220 i 224. Takođe je poželjnije da je antigenski peptid prema predmetnom pronalasku varijanta sekvence TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 226-257, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 227.

[0078] Poželjno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO.304-312, 315-316 i 325. Poželjnije, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od HLA-A*02 konsenzus sekvence kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO.330, 332-333, 336, 341-344,346, 354-355, 360, 363-364, 367, 371-372, 374,387, 390, 392-393, 402 i 450.

[0079] U nekim realizacijama, antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema patentnom zahtevu 1 sastoji se od sekvence amino-kiseline koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 - 12, 34 - 35, 36 - 39, 40, 41 - 64, 65 - 70, 476 - 484, 71 - 80, 81 - 87, 106 - 110, 485 - 488, 111 - 130, 489 - 493, 210 -225, 494 - 500 i 226 - 257; poželjno je da se antigenski peptid sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 34 - 35, 65 - 70, 476 - 484, 106 - 110, 485 - 488, 111 - 130, 489 - 493, 210 -225, 494 - 500 i 226 - 257; poželjnije da se antigenski peptid sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 65 - 70, 476 - 484, 106 - 110, 485 - 488, 111 - 130, 489 - 493, 210 - 225 i 494 – 500.

[0080] U nekim realizacijama, antigenski peptid koji se koristi u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema patentnom zahtevu 1 sastoji se od sekvence amino-kiseline koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 34, 35, 39, 40, 61, 68, 70, 72, 86, 107 - 110, 114, 117, 119, 120, 212, 217, 220, 224, 227, 231, 477, 491 i 493. Još poželjnije, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 61, 65, 68, 72, 86, 110, 114 i 220. Još poželjnije, antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 110, 114 i 220. Najpoželjnije, antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 110, 114 i 220. Još poželjnije, antigenski peptidi se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 65, 110, 114 i 220. Antigenski peptid pronalaska koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 65. U nekim realizacijama antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 110. U nekim realizacijama antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 114. U nekim realizacijama antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220.

[0081] Kao što je prikazano u primerima ovde, specifični antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kao što ovde opisani omogućavaju podizanje snažnog imunološkog odgovora protiv samih sebe, i što je najvažnije, omogućavaju podizanje snažnog imunog odgovora protiv peptida koji imaju sličnosti aminokiselina sa njima, a koji su sadržani u tumorskom antigenu, čak i ako humani referentni peptidi sadržani u tumorskom antigenu mogu biti tolerogeni.

[0082] Povoljno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani mogu biti u obliku imunogenih jedinjenja, posebno za upotrebu u prevenciji ili u lečenju maligniteta B ćelija.

Peptid-MHC (pMHC) multimeri koji sadrže antigenski peptid

[0083] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje peptid-MHC (pMHC) multimer koji sadrži antigenski peptid prema zahtevu 1.

[0084] Kako se ovde koristi, izraz „peptid-MHC multimer” (pMHC) se odnosi na stabilan multimerni kompleks sastavljen od proteinskih podjedinica glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) napunjenih antigenskim peptidom pronalaska. Generalno, „MHC multimeri” su oligomerni oblici MHC molekula. Glavna funkcija MHC molekula je da se veže za antigen. Prema pronalasku, dati antigen je antigenski peptid prema pronalasku. Shodno tome, kompleks MHC proteina „napunjen” antigenskim peptidom pronalaska obično znači da je antigenski peptid pronalaska vezan za jedan ili više MHC proteina. „Peptid-MHC multimeri” (pMHC) pronalaska uključuju peptid-MHC dimer, trimer, tetramer, pentamer, heksamer, heptamer ili oktamer. MHC tetrameri i pentameri su poželjni. Izraz „Glavni kompleks histokompatibilnosti” (MHC) je generička oznaka namenjena da obuhvati sisteme antigena histokompatibilnosti opisane u različitim vrstama, uključujući humane leukocitne antigene (HLA). Kod ljudi postoje tri glavna različita genska lokusa koji kodiraju molekule MHC klase I: HLA- A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-A*11 su primeri različitih alela MHC klase I koji se mogu eksprimovati iz ovih lokusa.

[0085] U jednoj realizaciji pronalaska, pMHC multimer je peptidni/MHC klase I multimer. U drugoj posebnoj realizaciji, pMHC multimer je HLA koji odgovara MHC klasi I / peptidnom multimeru. Shodno tome, pMHC multimer može biti HLA-peptidni multimer izabran iz grupe koju čine HLA-A-peptidni multimer, HLA-B-peptidni multimer, HLA-C-peptidni multimer, HLA-E-peptidni multimer, MICA-peptidni multimer i MICB-peptidni multimer.

[0086] Postupci za dobijanje pHMC multimera su poznati u tehnici i opisani, na primer, u WO96/26962 i WO01/18053.

[0087] Pored MHC molekula i antigenskog peptida pronalaska, pMHC može sadržati dalje komponente, kao što je agens za multimerizaciju i/ili oznaku (npr. za vizuelizaciju). Primeri oznaka uključuju fluorescentne oznake, npr. fluorescentno obeležene proteine, kao što je streptavidin. Fluorescentne oznake uključuju alofikocijanin (APC), fikoeritrin (PE), R-fikoeritrin (R-PE) i fluorescein izotiocijanat (FITC). Poželjna oznaka je biotin.

[0088] U jednoj realizaciji pronalaska, dati pMHC multimer može da se koristi za vizuelizaciju populacija T ćelija koje su specifične za peptidni kompleks MHC klase I ili HLA koji odgovaraju MHC klasi I/peptidnom kompleksu kao što je gore opisano. Na primer, pMHC multimer može biti multimer gde je teški lanac MHC biotinilovan, što omogućava kombinaciju kao tetramer sa streptavidinom. Takav pMHC tetramer ima povećanu avidnost za odgovarajuće TCR-nosače T limfocite i stoga se može koristiti za vizuelizaciju reaktivnih populacija imunofluorescencijom. U drugoj realizaciji pronalaska, dati pMHC multimer se može koristiti za detekciju i/ili izolaciju skriningom (protočnom citometrijom ili imunomagnetnim skriningom) populacija T ćelija koje su specifične za pMHC kompleks kao što je gore opisano.

Citotoksični T limfociti (CTL) specifični za antigenski peptid

[0089] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje citotoksični T limfocit (CTL) specifičan za antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1, posebno aktivirani citotoksični T limfocit (CTL) specifičan za antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1.

[0090] Ovde je dalje stavljen na uvid javnosti postupak za proizvodnju citotoksičnih T limfocita (CTL) specifičnih za antigenski peptid prema pronalasku, posebno aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL) specifičnih za antigenski peptid prema pronalasku, pri čemu postupak obuhvata kontakt in vitro CTL sa antigenom napunjenim humanim molekulom MHC klase I ili II eksprimovanim na površini ćelije koja predstavlja antigen ili veštačkim konstruktom koji imitira ćeliju koja predstavlja antigen, pri čemu je dati antigen antigenski peptid prema pronalasku. Poželjne ćelije koje predstavljaju antigen uključuju dendritske ćelije. Veštački konstrukt koji oponaša ćeliju koja predstavlja antigen može biti, na primer, peptid-MHC multimer prema pronalasku. Korak kontakta CTL sa antigenom napunjenim humanim molekulom MHC klase I ili II eksprimovanim na površini ćelije koja prezentuje antigen ili veštačkim konstruktom koji imitira ćeliju koja predstavlja antigen može se izvesti tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da se aktivira dati CTL na antigen specifičan način. Poželjno, antigenski peptid je poželjni antigenski peptid kao što je gore opisano, kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 65, 110, 114 i 220.

[0091] (Aktivirane) T ćelije koje su usmerene protiv antigenskih peptida pronalaska su korisne u terapiji. (Aktivirani) citotoksični T limfociti (CTL) u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji su specifični za antigenski peptid pronalaska, mogu imati (ispoljavati/eksprimovati) memorijske markere. Takvi memorijski markeri su poželjno memorijski markeri memorijskih ćelija creva, kao što su CCR9, CXCR3, CD103, CX3CR1 i α4β7+.

[0092] (Aktivirani) citotoksični T limfociti (CTL) prema predmetnom pronalasku, koji su specifični za antigenski peptid pronalaska, poželjno su više/dodatno pojačani nakon vakcinacije antigenskim peptidom pronalaska (izvedenim iz sekvenci humane mikrobiote) u poređenju sa vakcinacijom peptidima koji nisu izvedeni iz sekvenci mikrobiote, kao što je humana (referentna) sekvenca i/ili sintetički peptid (npr. uključujući mutacije, koje su, na primer, veštački uvedene). Drugim rečima, vakcinacija subjekata antigenskim peptidom pronalaska poželjno povećava broj (aktiviranih) citotoksičnih T limfocita (CTL) prema predmetnom pronalasku, koji su specifični za dati antigenski peptid pronalaska, više nego vakcinacija sa odgovarajućim humanim peptidima ili sintetičkim peptidima (koji nisu izvedeni iz mikrobiote), koji se odnose na isti referentni epitop.

[0093] (Aktivirani) citotoksični T limfociti (CTL) prema predmetnom pronalasku, koji su specifični za antigenski peptid pronalaska, poželjno su više/dodatno i/ili brže pojačani nakon vakcinacije kod subjekata koji imaju navedeni peptid u crevima (eksprimovano mikrobiotom subjekta), npr. peptid se može naći u uzorku stolice subjekta, u poređenju sa subjektima koji nemaju navedeni peptid u crevima (nije eksprimovan mikrobiotom subjekta), npr. subjekti kod kojih se navedeni peptid ne može detektovati u uzorcima stolice. Posebno, subjekti koji imaju dati peptid u crevima (eksperimovan mikrobiotom subjekta), mogu brže da reaguju (brža ekspanzija T ćelija) i/ili imaju T ćelije željenog tipa Tc1.

Ćelije napunjene antigenskim peptidom

[0094] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje ćeliju napunjenu antigenskim peptidom prema zahtevu 1. Posebno, poželjne realizacije antigenskog peptida kao što je gore opisano takođe se primenjuju na takvu ćeliju prema predmetnom pronalasku. Na primer, antigenski peptid napunjen u ćeliju uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 poželjno sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC Klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID Nos 304-326, kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 do 64, 66 do 247 i 476-500. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 61, 65, 68, 72, 86, 110, 114 i 220 su još poželjniji. Na primer, antigenski peptidi kako su ovde opisani koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 110, 114 i 220 su posebno poželjni. Na primer, antigenski peptidi kako su ovde opisani koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 110, 114 i 220 su posebno poželjni. Na primer, kompozicija antigenskog peptida prema zahtevu 9 koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 65, 110, 114 i 220 su posebno poželjni. Takođe su poželjne njihove kombinacije, naime, ćelije napunjene različitim antigenskim peptidima kombinovanim sa antigenskim peptidom prema patentnom zahtevu 1.

[0095] Poželjna ćelija napunjena antigenskim peptidom prema predmetnom pronalasku je antigen prezentujuća ćelija (APC), poželjnije dendritska ćelija (DC).

[0096] APC su od posebnog interesa, jer je njihova glavna funkcija da obrađuju antigene i da ih na površini ćelije prezentuju T ćelijama imunog sistema, kako bi inicirali i modulirali odgovore T ćelija in vivo. U kontekstu predmetnog pronalaska, poželjno je da su APC napunjeni antigenskim peptidom prema pronalasku. Ovo se može postići izlaganjem APC-a in vitro sa datim antigenskim peptidom (kao što je opisano u Rizzo MM, Alaniz L, Mazzolini G. Ex vivo loading of autologous dendritic cells with tumor antigens. Methods Mol Biol. 2014;1139:41-4; Rolinski J, Hus I. Breaking immunotolerance of tumors: a new perspective for dendritic cell therapy. J Immunotoxicol. 2014 Oct;11(4):311-8).

[0097] Poželjni APC prema pronalasku su dendritske ćelije (DC). Zaista može biti korisno kombinovati najmanje jedan antigenski peptid sa DC, pošto su oni najmoćniji APC i za koje se prijavljuje da su često funkcionalno defektni kod pacijenata sa rakom. Stručnjak u ovoj oblasti može lako da dobije DC ili od zdravih kompatibilnih donora (tj. DC su povezani sa HLA) ili od samog pacijenta pod uslovom da su funkcionalni (tj. DC su autologni), na primer direktnom izolacijom iz periferne krvi ili derivacijom iz ćelija periferne krvi kao što su CD14+ monociti ili CD34+ hematopoetski prekursori (Figdor CG, de Vries IJ, Lesterhuis WJ, Melief CJ. Dendritic cell immunotherapy: mapping the way. Nat Med.2004 May;10(5):475-80). DC se zaista mogu razlikovati od drugih ćelija periferne krvi po svojim površinskim markerima, kao što su S100, p55, CD83 i/ili OX62, i stoga mogu biti izolovani i prečišćeni na osnovu navedenih markera korišćenjem tehnika ćelijskih kultura koje su dobro poznate u tehnici.

Nukleinske kiseline koje kodiraju antigene peptide i ćelije domaćina koje sadrže nukleinske kiseline

[0098] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira antigenski peptid prema zahtevu 1. Posebno, poželjne realizacije antigenskog peptida kao što je gore opisano, takođe, se primenjuju na takvu nukleinsku kiselinu prema predmetnom pronalasku.

[0099] Nukleinske kiseline poželjno obuhvataju jednolančane, dvolančane ili delimično dvolančane nukleinske kiseline, poželjno izabrane iz gDNK, cDNK, RNK, antisens DNK, antisens RNK, komplementarnih RNK/DNK sekvenci sa ili bez ekspresionih elemenata, mini-geni, fragmenati gena, regulatorni elementi, promotori i njihove kombinacije. Dalji poželjni primeri nukleinske kiseline (molekula) i/ili polinukleotida uključuju, npr., rekombinantni polinukleotid, vektor, oligonukleotid, RNK molekul kao što je rRNK, mRNK ili tRNK, ili DNK molekul kao što je gore opisano. Stoga je poželjno da nukleinska kiselina (molekul) bude molekul DNK ili RNK molekul; poželjno izabran iz gDNK; cDNK; rRNK; mRNK; antisens DNK; antisens RNK; komplementarne RNK i/ili DNK sekvence; RNK i/ili DNK sekvence sa ili bez ekspresionih elemenata, regulatornih elemenata i/ili promotora; vektor; i njihove kombinacije.

[0100] Od velikog je interesovanja u oblastima terapije, dijagnostike, reagenasa i bioloških testova da se može isporučiti nukleinska kiselina, na primer, ribonukleinska kiselina (RNK) unutar ćelije, bilo in vitro, in vivo, in situ ili ex vivo, kako bi se izazvala intracelularna translacija nukleinske kiseline i proizvodnja kodiranog peptida od interesa. Od posebnog značaja je isporuka i funkcija neintegrativnog polinukleotida. Shodno tome, poželjne su nukleinske kiseline, koje se ne integrišu u hromozome domaćina, kao što je mRNK. Generalno, nukleinske kiseline, kao što je mRNK, mogu biti optimizovane za ekspresiju antigenskog peptida pronalaska, npr. postupcima poznatim u tehnici, kao što je optimizacija kodona. Pored toga, nukleinska kiselina može biti modifikovana, na primer, da bi se poboljšala njena stabilnost, produžio njen životni vek i/ili da bi se povećala ekspresija antigenskog peptida pronalaska. Shodno tome, poželjna je optimizovana ili modifikovana mRNK (mmRNK), koja kodira antigenski peptid prema predmetnom pronalasku. mmRNK se razlikuje od mRNK divljeg tipa po svojim funkcionalnim i/ili strukturnim karakteristikama dizajna za optimalnu isporuku mRNK i/ili za optimalnu ekspresiju antigenskog peptida pronalaska (na primer kako je opisano u WO 2013/151672 A2, WO 2013/101690 A1, WO2013/052523 A). Uopšteno, nukleinske kiseline se mogu isporučiti „gole” ili povezane sa nosačem, npr. katjonskim nosačem. Katjonski nosači (pozitivno naelektrisani) se obično lako povezuju sa nukleinskim kiselinama, koje su negativno naelektrisane. Nosač može biti bilo koje vrste uključujući, na primer, polimere, proteine, lipide i nanočestice. Katjonski lipidi i nanočestice (naročito lipidne nanočestice, LNP) su poželjni za isporuku nukleinske kiseline. Shodno tome, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje nukleinsku kiselinu kako je ovde opisana povezanu sa nosačem (npr. lipid, posebno katjonski lipid ili LNP).

[0101] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline može biti vektor. Izraz „vektor”, kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na molekul nukleinske kiseline, poželjno na molekul veštačke nukleinske kiseline, tj. na molekul nukleinske kiseline koji se ne pojavljuje u prirodi. Vektor u kontekstu predmetnog pronalaska je pogodan za inkorporaciju ili ukotvljavanje željene sekvence nukleinske kiseline. Takvi vektori mogu biti vektori za skladištenje, ekspresioni vektori, vektori za kloniranje, vektori za prenos itd. Vektor za skladištenje je vektor koji omogućava pogodno skladištenje molekula nukleinske kiseline. Dakle, vektor može da sadrži sekvencu koja odgovara, npr., željenom antigenskom peptidu prema predmetnom pronalasku. Ekspresioni vektor se može koristiti za proizvodnju ekspresionih proizvoda kao što je RNK, npr. mRNK, ili peptidi, polipeptidi ili proteini. Na primer, ekspresioni vektor može da sadrži sekvence potrebne za transkripciju dela sekvence vektora, kao što je sekvenca promotora. Vektor za kloniranje je obično vektor koji sadrži mesto za kloniranje, koje se može koristiti za inkorporiranje sekvenci nukleinske kiseline u vektor. Vektor za kloniranje može biti, na primer, vektor plazmida ili vektor bakteriofaga. Vektor za prenos može biti vektor koji je pogodan za prenos molekula nukleinske kiseline u ćelije ili organizme, na primer, virusni vektor. Vektor u kontekstu predmetnog pronalaska može biti, na primer, RNK vektor ili DNK vektor. Poželjno, vektor je molekul DNK. Na primer, vektor u smislu ove prijave sadrži mesto kloniranja, selekcioni marker, kao što je faktor otpornosti na antibiotike, i sekvencu pogodnu za umnožavanje vektora, kao što je početak replikacije. Poželjno, vektor u kontekstu predmetne prijave je plazmidni vektor. Poželjno, vektor u kontekstu predmetne prijave je ekspresioni vektor. Poželjni vektor je vektor za ekspresiju u bakterijskim ćelijama. Još poželjnije, vektor je koristan za ekspresiju u takozvanim „vektorima žive bakterijske vakcine”, pri čemu žive bakterijske ćelije (kao što su bakterije ili bakterijske spore, npr. endospore, egzospore ili mikrobne ciste) mogu da služe kao vakcine. Nјihovi poželjni primeri su opisani u da Silva et al., Live bacterial vaccine vectors: an overview; Braz J Microbiol.4. mart 2015;45(4):1117-29.

[0102] Nukleinske kiseline koje kodiraju antigenski peptid prema pronalasku ili antigenski peptidi kako je ovde opisano

ovde mogu biti u obliku golih nukleinskih kiselina, ili nukleinskih kiselina kloniranih u plazmide ili virusne vektore (Tregoning and Kinnear, Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiol Spectr.2014 Dec;2(6). doi: 10.1128/microbiolspec.PLAS-0028-2014), ovo drugo je posebno poželjno. Primeri pogodnih virusnih vektora prema pronalasku obuhvataju vektore retrovirusa, adenovirusa, adeno asociranog virusa (AAV), virusa herpesa i poksvirusa. U okviru veštine stručnjaka u tehnici je da klonira nukleinsku kiselinu u plazmid ili virusni vektor, koristeći standardne rekombinantne tehnike u stanju tehnike.

[0103] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 4. Takođe su poželjne njihove kombinacije, naime ćelije domaćina koje sadrže različite nukleinske kiseline koje kodiraju različite antigenske peptide kao što je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1.

[0104] Poželjno, nukleinska kiselina sadržana u ćeliji domaćinu je poželjno vektor. Poželjno, ćelija domaćin je bakterijska ćelija. Takva ćelija domaćin može se poželjno koristiti za proizvodnju antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku. Štaviše, takva ćelija domaćina, takođe, može biti aktivna komponenta u vakcini.

[0105] Poželjno, ćelija domaćin je bakterijska ćelija, poželjnije bakterijska ćelija creva. Izraz „bakterijska ćelija creva” odnosi se na bakterije koje žive u (ljudskim) crevima.

[0106] Takva bakterijska ćelija domaćin može poslužiti kao „živi bakterijski vektor vakcine”, pri čemu žive bakterijske ćelije (kao što su bakterije ili bakterijske spore, npr. endospore, egzospore ili mikrobne ciste) mogu da služe kao vakcine. Nјihovi poželjni primeri su opisani u da Silva et al., Live bacterial vaccine vectors: an overview; Braz J Microbiol.4. mart 2015;45(4):1117-29.

[0107] Bakterijske ćelije (kao što su bakterije ili bakterijske spore, na primer, endospore, egzospore ili mikrobne ciste), posebno (čitave) vrste crevnih bakterija, mogu biti od prednosti, jer imaju potencijal da izazovu veći imuni odgovor od (poli)peptida ili nukleinske kiseline koje sadrže.

[0108] Alternativno, bakterijske ćelije, posebno crevne bakterije, prema pronalasku mogu biti u obliku probiotika, tj. žive crevne bakterije, koje se na taj način mogu koristiti kao dodatak uz ishranu zbog zdravstvenih koristi koje mogu da pruže. Oni mogu biti, na primer, liofilizovani u granulama, pilulama ili kapsulama, ili direktno pomešani sa mlečnim proizvodima za konzumaciju.

Nanočestice koje sadrže antigenski peptid

[0109] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje nanočesticu koja sadrži, naročito nanočesticu napunjenu antigenskim peptidom prema zahtevu 1 i, opcionalno, sa adjuvansom.

[0110] Posebno, poželjne realizacije antigenskog peptida kao što je gore opisano, takođe se primenjuju na takve nanočestice koje su prema predmetnom pronalasku. Na primer, antigenski peptid napunjen nanočesticom u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema zahtevu 1, poželjno sadrži ili se sastoji od konsenzus sekvence MHC Klase I kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID Nos 304-326 kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID Nos 1-64, 66 do 247 i 476-500. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 61, 68, 72, 86, 110, 114 i 220 su još poželjniji. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 110, 114 i 220 su posebno poželjni. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 110, 114 i 220 su posebno poželjni. Na primer, antigenski peptidi kako su ovde opisani u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema zahtevu 1 koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 65, 110, 114 i 220 su poželjni. Takođe su poželjne njihove kombinacije, naime, nanočestice napunjene različitim antigenskim peptidima kao što je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1.

[0111] Nanočestice, posebno za upotrebu kao vakcine, poznate su u tehnici i opisane, na primer, u Shao et al., Nanoparticle-based immunotherapy for cancer, ACS Nano 2015, 9(1):16-30; Zhao et al., Nanoparticle vaccines, Vaccine 2014, 32(3):327-37; i u Gregory et al., Vaccine delivery using nanoparticles, Front Cell Infect Microbiol.

2013, 3:13, doi: 10.3389/fcimb.2013.00013. eCollection 2013, Review. Posebno, nanočestica se koristi za isporuku antigenskog peptida i opciono može, takođe, da deluje kao pomoćno sredstvo. Antigenski peptid je obično ili inkapsuliran unutar nanočestice ili povezan/vezan za (dekorisan na) površinu nanočestice („prevlaka”). U poređenju sa konvencionalnim pristupima, nanočestice mogu da zaštite teret (antigen/adjuvans) od okolnog biološkog miljea, povećaju poluživot, minimiziraju sistemsku toksičnost, promovišu isporuku u APC, ili čak direktno pokrenu aktivaciju TAA-specifičnih T- ćelija. Poželjno, nanočestica ima veličinu (prečnik) ne veću od 300 nm, poželjnije ne više od 200 nm i najpoželjnije ne više od 100 nm. Takve nanočestice su adekvatno zaštićene od unosa fagocita, sa visokim strukturnim integritetom u cirkulaciji i dugim vremenima cirkulacije, sposobne su da se akumuliraju na mestima rasta tumora i sposobne da prodru duboko u tumorsku masu.

[0112] Primeri nanočestica uključuju polimerne nanočestice kao što su poli(etilen glikol) (PEG) i poli (D,L-mlečnakoglikolna kiselina) (PLGA); neorganske nanočestice kao što su nanočestice zlata, zrna od gvožđe-oksida, nanočestice cink-oksida gvožđe-oksida, ugljenične nanocevi i mezoporozne nanočestice silicijum dioksida; lipozomi, kao što su katjonski lipozomi; imunostimulirajući kompleksi (ISCOM); čestice slične virusu (VLP); i proteini koji se samosastavljaju.

[0113] Polimerne nanočestice su nanočestice zasnovane na/sastoje se od polimera, kao što su poli(D,L-laktid-koglikolid) (PLG), poli(D,L-mlečna-koglikolna kiselina)(PLGA), poli(i-glutaminska kiselina) (γ-PGA), poli(etilen glikol) (PEG) i polistiren. Polimerne nanočestice mogu da zarobe antigen (npr. antigenski peptid ili (poli)peptid koji ga sadrži) ili da se vežu za/konjugiraju sa antigenom (npr. antigenski peptid ili (poli)peptid koji ga sadrži). Polimerne nanočestice se mogu koristiti za isporuku, npr. određenim ćelijama, ili za održavanje oslobađanja antigena zahvaljujući njihovoj sporoj stopi biorazgradnje. Na primer, g-PGA nanočestice se mogu koristiti za inkapsulaciju hidrofobnih antigena. Nanočestice polistirena mogu se konjugovati sa različitim antigenima jer mogu biti površinski modifikovane različitim funkcionalnim grupama. Polimeri, kao što su poli(L-mlečna kiselina) (PLA), PLGA, PEG, i prirodni polimeri kao što su polisaharidi se, takođe, mogu koristiti za sintezu hidrogelnih nanočestica, koje su tip nano-veličine hidrofilne trodimenzionalne polimerne mreže. Nanogeli imaju povoljna svojstva uključujući fleksibilnu veličinu mreže, veliku površinu za multivalentnu konjugaciju, visok sadržaj vode i visok kapacitet punjenja za antigene. Shodno tome, poželjna nanočestica je nanogel, kao što je hitozan nanogel. Poželjne polimerne nanočestice su nanočestice zasnovane na / koje sadrže PEG i PLGA.

[0114] Neorganske nanočestice su nanočestice zasnovane na / koje sastoje se od neorganskih supstanci, a primeri takvih nanočestica uključuju nanočestice zlata, zrna oksida gvožđa, nanočestice cink-oksida gvožđe-oksida, nanočestice ugljenika (npr. ugljenične nanocevi) i mezoporozne nanočestice silicijum dioksida. Neorganske nanočestice obezbeđuju krutu strukturu i kontrolisanu sintezu. Na primer, nanočestice zlata mogu se lako proizvesti u različitim oblicima, kao što su sfere, šipke, kocke. Neorganske nanočestice mogu biti površinski modifikovane, npr. sa ugljenim hidratima. Ugljenične nanočestice obezbeđuju dobru biokompatibilnost i mogu se proizvoditi, na primer, kao nanocevi ili (mezoporozne) sfere. Na primer, više kopija antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku (ili (poli)peptida koji ga sadrži) mogu biti konjugovane na nanočestice ugljenika, npr. ugljenične nanocevi. Mezoporozne ugljenične nanočestice su poželjnije za oralnu primenu. Nanočestice na bazi silicijumdioksida (SiNP) su, takođe, poželjne. SiNPs su biokompatibilni i pokazuju odlična svojstva u selektivnom ciljanju tumora i isporuci vakcine. Obilne silanolne grupe na površini SiNP-a mogu se koristiti za dalju modifikaciju da bi se uvela dodatna funkcionalnost, kao što je prepoznavanje ćelija, apsorpcija specifičnih biomolekula, poboljšanje interakcije sa ćelijama i poboljšanje ćelijskog preuzimanja. Mezoporozne nanočestice dioksida su posebno poželjne.

[0115] Lipozomi se obično formiraju od fosfolipida, kao što je 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum propan (DOTAP). Generalno, poželjni su katjonski lipozomi. Lipozomi se samosastavljaju sa fosfolipidnom dvoslojnom membranom i vodenim jezgrom. Lipozomi se mogu generisati kao jednoslojni vezikuli (koji imaju jedan fosfolipidni dvosloj) ili kao višeslojni vezikuli (koji imaju nekoliko koncentričnih fosfolipidnih membrana razdvojenih slojevima vode). Shodno tome, antigeni mogu biti inkapsulirani u jezgru ili između različitih slojeva/membrana. Sistemi liposoma kojima se daje prednost su oni odobreni za upotrebu kod ljudi, kao što je Inflexal<®>V i Epaxal<®>.

[0116] Imunostimulišući kompleksi (ISCOM) su čestice poput kaveza od oko 40 nm (prečnika), koje su micele koje sadrže koloidni saponin, na primer, napravljene od pomoćnog saponina Quil-A, holesterola, fosfolipida i (poli)peptidnog antigena (kao što je antigenski peptid ili polipeptid koji ga sadrži). Ove sferne čestice mogu uhvatiti antigen apolarnim interakcijama. Opisana su dva tipa ISCOM-a, od kojih se oba sastoje od holesterola, fosfolipida (obično ili fosfatidiletanolamina ili fosfatidilholina) i saponina (kao što je Quil-A).

[0117] Čestice slične virusu (VLP) su samosastavljajuće nanočestice formirane samosastavljanjem biokompatibilnih kapsidnih proteina. Zbog prirodno optimizovane veličine nanočestica i ponavljajućeg strukturnog reda, VLP mogu da izazovu moćne imune odgovore. VLP-ovi mogu biti izvedeni iz različitih virusa sa veličinama u rasponu od 20 nm do 800 nm, obično u rasponu od 20 - 150 nm. VLP-ovi se mogu konstruisati da eksprimuju dodatne peptide ili proteine bilo spajanjem ovih peptida/proteina sa česticom ili ekspresijom više antigena. Štaviše, antigeni se mogu hemijski spojiti na površinu virusa da bi se proizveli biokonjugovani VLP.

[0118] Primeri samosastavljajućih proteina uključuju feritin i glavni svodni protein (MVP). Feritin je protein koji se može samostalno sastaviti u skoro sferičnu strukturu od 10 nm. Devedeset šest jedinica MVP-a može se samostalno sastaviti u nanočesticu svoda u obliku burenceta, veličine približno od 40 nm u širinu i 70 nm u dužinu. Antigeni koji su genetski fuzionisani sa minimalnim domenom interakcije mogu se upakovati u nanočestice svoda procesom samosastavljanja kada se pomešaju sa MVP-ovima. Shodno tome, antigen (kao što je antigenski peptid prema predmetnom pronalasku polipeptida koji ga sadrži) može biti fuzionisan sa samosastavljajućim proteinom ili sa njegovim fragmentom/domenom, kao što je domen minimalne interakcije MVP-a. Shodno tome, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži samosastavljajući protein (ili njegov fragment/domen) i antigenski peptid prema predmetnom pronalasku.

[0119] Generalno, poželjni primeri nanočestica (NP) uključuju zrna od gvožđe oksida, polistirenske mikrosfere, poli(y-glutaminske kiseline) (γ-PGA) NP, gvožđe oksid-cink oksid NP, katjonizovane želatinske NP, pluronski stabilizovani poli(propilen sulfid) (PPS) NP, PLGA NP, (katjonske) lipozome, (pH-reagujuće) polimerne micele, PLGA, PLGA obložene membranom ćelija raka, lipid-kalcijum-fosfatne (LCP) NP, NP lipozoma-protaminhijaluronske kiseline (LPH), zrna od polistirenskog lateksa, magnetna zrna, čestice gvožđe-dekstran i nanokristale kvantnih tačaka.

[0120] Poželjno, nanočestica dalje sadrži pomoćno sredstvo, na primer agonist toličnih receptora (TLR). Na taj način, antigenski peptid se može isporučiti zajedno sa adjuvansom, na primer, u antigen prezentujuće ćelije (APC), kao što su dendritske ćelije (DC). Adjuvans može biti inkapsuliran sa nanočesticama ili vezan/konjugovan sa površinom nanočestice, poželjno slično antigenskom peptidu.

[0121] Posebno poželjni adjuvansi su poliinozinska:policitidilna kiselina (takođe nazvana „poli I:C”) i/ili njen derivat poli-ICLC. Poli I:C je neusklađena dvolančana RNK pri čemu je jedan lanac polimer inozinske kiseline, a drugi polimer citidilne kiseline. Poli I:C je imunostimulant za koji je poznato da reaguje sa toličnim receptorom 3 (TLR3). Poli I:C je strukturno sličan dvolančanoj RNK, koja je „prirodni” stimulans TLR3. Shodno tome, poli I:C se može smatrati sintetičkim analogom dvolančane RNK. Poli-ICLC je sintetički kompleks karboksimetilceluloze, poliinozinske-policitidilne kiseline i dvolančane RNK poli-L-lizina. Slično poli I:C, takođe poli-ICLC je ligand za TLR3. Poli I:C i poli-ICLC obično stimulišu oslobađanje citotoksičnih citokina. Poželjni primer poli-ICLC je Hiltonol<®>.

Farmaceutske kompozicije

[0122] U daljem aspektu, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno od sledećeg:

- antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO:65 prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano,

- nanočestice prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano,

- ćeliju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana i, opciono, jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača.

[0123] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedan antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 i, opciono, najmanje jedan antigenski peptid kako je definisan patentnim zahtevom 8. Štaviše, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (najmanje) jednu nanočesticu prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano. Štaviše, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (najmanje) jednu ćeliju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano.

[0124] Konkretno, u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1, nanočestica, ćelija, poželjno dalje sadrži amino-kiselinsku sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 do 64, 66 do 247 i 476-500. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 61, 68, 72, 86, 110, 114 i 220 su još poželjniji kao dalje komponente farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku. Na primer, antigenski peptidi kako su ovde opisani koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 110, 114 i 220 su još poželjniji kao dalje komponente farmaceutskih kompozicija prema pronalasku. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 110, 114 i 220 su još poželjniji kao dalje komponente farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku. Farmaceutske kompozicije koje sadrže antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 i dva ili tri različita antigenska peptida kako su ovde opisani koji se sastoje od sekvence amino-kiseline koja je navedena u bilo kom od SEQ ID NOs 110, 114 i 220 su posebno poželjne.

[0125] Takođe su poželjne njihove kombinacije, naime, farmaceutske kompozicije koje sadrže različite antigenske peptide kao što je ovde opisano. Na primer, farmaceutska kompozicija može da sadrži

(i) antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 i najmanje jedan različit antigenski peptid kao što je ovde opisano; ili

(ii) najmanje dve različite nanočestice prema predmetnom pronalasku.

[0126] Shodno tome, farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje „dve različite komponente” (farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku), poželjno tri ili četiri različite komponente. Uopšteno, izraz „različite komponente”, kako se ovde koristi, odnosi se na

(1) prvu komponentu, kao što je antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 kako je ovde opisan, nanočesticu prema patentnom zahtevu 2 kako je ovde opisana, ćeliju prema patentnom zahtevu 3 kako je ovde opisana; i (2) najmanje jednu drugu komponentu (koja se razlikuje od prve komponente; dok se u slučaju više od dve različite komponente svaka komponenta razlikuje jedna od druge), kao što je terapeutsko sredstvo protiv raka kao što je gore opisano, poseban antigenski peptid kao što je ovde opisan, posebno imunogeno jedinjenje kao što je ovde opisano, posebna nanočestica prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, posebna ćelija prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, posebna nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, posebna ćelija domaćin u skladu sa predmetnim pronalaskom kako je ovde opisana, poseban citotoksični T limfocit prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisan, ili jedan ili više (fragmenata) humanih tumorskih antigena u bilo kom obliku („goli”), kao imunogeno jedinjenje kao što je ovde opisano, kao nanočestice kao što je ovde opisano, kao ćelija (domaćin) kao što je ovde opisano, ili kao nukleinska kiselina kao što je ovde opisano). Prema tome, „različite komponente” su poželjno aktivne komponente (kao što je gore opisano) u kontekstu bolesti ( malignitet B ćelija) koje treba sprečiti i/ili lečiti. Drugim rečima, svaka od različitih komponenti, takođe, može biti korisna za prevenciju i/ili lečenje datog raka, ako se primenjuje odvojeno (ne u kombinaciji kako je ovde opisano) - iako kombinacija (tj. kombinovana primena) obično pojačava njihovu prevenciju i /ili terapeutski efekat (kao što je imuni odgovor), posebno na sinergistički način.

[0127] Poželjno je da su „posebne/različite komponente” istog tipa (npr. različiti antigenski peptidi, različite nanočestice, različite ćelije, različite nukleinske kiseline, različite ćelije domaćina ili različiti citotoksični T limfociti) i da se razlikuju jedne od drugih samo po tome što se odnose na različite antigenske peptide kako je ovde opisano.

[0128] Na primer, najmanje tri ili četiri različite aktivne komponente koje se koriste u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema patentnom zahtevu 1 su poželjno istog tipa, ali se razlikuju (samo) po tome što se svaka od njih odnosi na poseban antigenski peptid. Poželjnije,

- prva komponenta se odnosi na antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiota) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22;

- (različita) druga komponenta se odnosi na antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiota) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37;

- (različita) treća komponenta se odnosi na antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiota) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C; i

- (različita) četvrta komponenta se odnosi na antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 koji se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena MS4A1 (CD20).

[0129] Najpoželjnija farmaceutska kompozicija sadrži:

- Prvu komponentu koja se odnosi na antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 65;

- (različitu) drugu komponentu koja se odnosi na antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 114;

- (različitu) treću komponentu koja se odnosi na antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220; i

- opciono, (različitu) četvrtu komponentu koja se odnosi na antigenski peptid koji se sastoji od sekvence aminokiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 110.

[0130] Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje dva različita antigenska peptida kao što je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1.

[0131] Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži – uključujući antigenski peptid iz zahteva 1 – prvi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, i drugi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji obuhvata ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C. Poželjno, prvi antigenski peptid sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u SEQ ID NO: 106-110 i 485-488, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 107, 108, 109 i 110, a drugi antigenski peptid sadrži ili se sastoji od varijante (mikrobiote) sekvence TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 210-225 i 494 - 500, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 212, 217, 220 i 224, posebno kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450. Poželjnije, prvi antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 110 a drugi antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450. Još poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 110 i antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 220.

[0132] Poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje tri različita antigenska peptida kako je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1.

[0133] Posebno, farmaceutska kompozicija može da sadrži – uključujući antigenski peptid iz zahteva 1 – prvi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence mikrobiote fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C i treći antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37. Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje sadrži prvi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 106-110, i 485 - 488, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 107, 108, 109 i 110, drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante (mikrobiote) sekvence TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid ) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 210-225, 447-455 i 494-500, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 212, 217, 220 i 224, posebno kako je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450 i treći antigenski peptid koji se sastoji od ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiota) CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 111-130 i 489 - 493, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 114, 117, 119, 120, 491 i 493, posebno kao što je navedeno u SEQ ID NO: 113-116.

[0134] Još poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje četiri različita antigenska peptida kako je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1.

[0135] Konkretno, farmaceutska kompozicija može da sadrži – uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 – prvi antigenski peptid, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, drugi antigenski peptid, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C, treći antigenski peptid, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiota) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37, četvrti antigenski peptid, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD19 ili CD20. Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži – uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 – prvi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiota) CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je kao antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 106-110 i 485-488, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 107, 108, 109 i 110; drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO: 210-225 i 494 - 500, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 212, 217, 220 i 224, posebno kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450; treći antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 111-130 i 489 - 493, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 114, 117, 119, 120, 491 i 493, posebno kako je navedeno u SEQ ID NO: 113-116; i četvrti antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD20 (MS4A1) fragmenta (humani referentni peptid) „IMNSLSLFA” (SEQ ID NO: 264), kao što je antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 66-70, i 476 - 484, npr. antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68, 70 i 477.

[0136] Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1:

- prvi antigenski peptid kao što je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22,

- drugi antigenski peptid kao što je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C,

- treći antigenski peptid kao što je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37, i

- opciono, četvrti antigenski peptid kao što je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD20.

[0137] Poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži - uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1: - prvi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO: 106-110,

- drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450,

- treći antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO: 113-116, i

- opciono, četvrti antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD20 fragmenta (humani referentni peptid) „IMNSLSLFA” (SEQ ID NO: 264), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u SEQ ID NO: 66-70.

[0138] Još poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 i antigenske peptide koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NOs 110, 114, 220.

[0139] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija ne sadrži dalje antigenske peptide (pored antigenskih peptida pronalaska kako je gore opisano).

[0140] Podrazumeva se da farmaceutska kompozicija može takođe da sadrži - umesto gore opisanih poželjnih kombinacija antigenskih peptida - odgovarajuću kombinaciju nanočestica pronalaska.

[0141] Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača.

[0142] Farmaceutska kompozicija pronalaska može biti u bilo kom obliku pogodnom za svrhe pronalaska. Na primer, data kompozicija može biti u obliku pogodnom za parenteralnu, enteralnu ili topikalnu primenu, kao što je tečna suspenzija, čvrsti dozni oblik (granule, pilule, kapsule ili tablete) ili pasta ili gel. U okviru veštine stručnjaka u tehnici je da odabere odgovarajući oblik kompozicije za predviđenu svrhu.

[0143] Kompozicija prema pronalasku može dalje da sadrži druga aktivna sredstva, na primer takva koja mogu da pojačaju efekte antigenskog peptida ili imunogenog jedinjenja. Alternativno, kompozicija može da ne sadrži bilo koje druge aktivne agense (tj. osim antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku, imunogenog jedinjenja prema predmetnom pronalasku, nanočestice prema predmetnom pronalasku, ćelije prema predmetnom pronalasku, nukleinsku kiselinu prema predmetnom pronalasku, i/ili ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku).

[0144] Farmaceutska kompozicija kako je ovde definisana je poželjno imunogena kompozicija, tj. kompozicija koja je u stanju da indukuje, poveća, produži ili održi imuni odgovor. Ovo se može postići antigenskim peptidom prema predmetnom pronalasku ili imunogenim jedinjenjem prema predmetnom pronalasku koje se nalazi u datoj kompoziciji. Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje sadrži jednu ili više supstanci imuno-adjuvansa. Farmaceutska kompozicija, posebno imunogena kompozicija, se takođe može nazvati „kompozicija vakcine” u predmetnoj specifikaciji.

[0145] Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje sadrži najmanje jedno imunostimulatorno sredstvo, posebno da bi se povećao, pojačao, produžio ili održao imunološki odgovor posredovan antigenskim peptidom. Poželjna imunostimulatorna sredstva prema pronalasku uključuju, ali bez ograničavanja, imunološke adjuvanse, antigen prezentujuće ćelije i njihove kombinacije. Poželjno, imunostimulatorno sredstvo je imunološki adjuvans ili antigen prezentujuće ćelije (APC).

[0146] Poželjno, imunostimulatorno sredstvo je imunološki adjuvans. Neki imunološki adjuvansi su sposobni da favorizuju i produže trajanje interakcije između antigena i imunog sistema, dok su drugi sposobni da regrutuju i aktiviraju ćelije prirodnog imuniteta tako da izazovu adaptivni odgovor. Adjuvansi koji pripadaju prvoj kategoriji uključuju, bez ograničavanja, mineralna jedinjenja kao što su stipsa, aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, kalcijum fosfat hidroksid; i emulzije na bazi ulja kao što su parafinsko ulje, skrobno ulje, Frojndov kompletan/nepotpuni adjuvans (FCA/FIA), saponini (npr. iz biljaka kvilaja, soja, senega). Adjuvansi koji pripadaju poslednjoj kategoriji uključuju, bez ograničavanja, imunostimulativne komplekse (ISCOM) kao što su citokini (npr. GM-CSF; interleukine kao što su IL-1, IL-2, IL6, IL8 ili IL12; faktore tumorske nekroze (TNF) kao što je TNFα ili TNFβ ; Interferone IFNS kao što su IFNα, IFNβ, IFNγ IFNδ, itd); ligande toličnih receptora (TLR) kao što su imikvimod, resikvimod ili MPL; egzozome kao što su egzozomi izvedeni iz dendritskih ćelija (DC) ili iz tumorskih ćelija; bakterijske proizvode kao što su proteini toplotnog šoka (HSP-ovi kao što su gp96, hsp90, hsp70, kalretikulin, hsp110, hsp170), molekularne obrasce povezane sa patogenom (PAMP), dimikolat (TDM), muramildipeptid (MDP), polisaharid (PLS) kao što je kao polisaharid-K.

[0147] Još poželjnije, imunološki adjuvans je protein/peptid koji ima svojstva imuno-adjuvansa, kao što je obezbeđivanje stimulacije CD4+ Th1 ćelija, kao što je ovde opisano („pomagači“ peptidi). Njegov poželjan primer je netumorski antigen koji podseća na imunološku memoriju ili pruža nespecifičnu pomoć ili može biti specifičan peptid pomagač dobijen iz tumora, kao što je peptid pomagač tetanusa, peptid hemocijanina ključaonice ili PADRE peptid, kao što je ovde opisano. Drugi primer je specifični peptid pomagač izveden iz tumora, koji može biti predstavljen sa MHC II, posebno sa HLA-DR, HLA-DP ili HLA-DQ, kao što su fragmenti zajedničkih prekomerno eksprimovanih tumorskih antigena, npr. HER2, NY-ESO-1, hTERT ili IL13RA2, kao što je gore opisano. Posebno, imunološki adjuvans može biti HHD-DR3 peptid sekvence MAKTIAYDEEARRGLERGLN (SEQ ID NO: 473). Ovaj peptid predstavlja još jedan primer peptida pomagača (koji ima svojstva imuno-adjuvansa). Drugi primer je h-pAg T13L (sekvenca: TPPAYRPPNAPIL; SEQ ID NO: 474; Bhasin M, Singh H, Raghava GP (2003) MHCBN: sveobuhvatna baza podataka o MHC vezujućim i nevezujućim peptidima. Bioinformatics 19: 665-666). Dalji primeri imunoloških adjuvansa, posebno peptida pomagača, uključuju UCP2 peptid (na primer, kako je opisano u WO 2013/135553 A1 ili u Dosset et al.,. Clin Cancer Res.2012 Nov 15;18(22):6284-95) i BIRC5 peptid (na primer, kako je opisano u EP2119726 A1 ili u Widenmeyer et al., Int J Cancer. 2012 Jul 1;131(1):140-9). Najpoželjniji peptid pomagač je UCP2 peptid (sekvenca amino-kiselina: KSVWSKLQSIGIRQH; SEQ ID NO: 475).

[0148] Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje dva različita antigenska peptida kao što je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1, i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NO: 475).

[0149] Posebno, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži prvi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, i drugi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji obuhvata ili se sastoji od varijante sekvence fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C i peptida pomagača, poželjno UCP2 peptida (SEQ ID NO: 475). Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje sadrži prvi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence fragmenta CD22 (humani referentni peptid) „WVFEHPETL ” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 106-110 drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence fragmenta TNFRSF13C (humani referentni peptid) „LLFGAPALL ” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220, 325, i 450; i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NO: 475). Još poželjnije, prvi antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline koja je navedena u SEQ ID NO: 110, a drugi antigenski peptid se sastoji od sekvence amino kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450. Čak još poželjnije, farmaceutska kompozicija dalje sadrži antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 110; antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 220; i UCP2 peptid pomagač (SEQ ID NO: 475).

[0150] Još poželjnije, farmaceutska kompozicija dalje sadrži najmanje tri različita antigenska peptida kao što je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NO: 475).

[0151] Posebno, farmaceutska kompozicija može da sadrži – uključujući antigenski peptid iz zahteva 1 - prvi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, drugi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C, treći antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37 i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NE: 475). Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje se sastoji od prvog antigenskog peptida koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u SEQ ID BR: 106-110; drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” (SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID BR: 220 ili 450; a treći antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta CD37 (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 113-116, i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NO: 475).

[0152] Najpoželjnije, farmaceutska kompozicija dalje sadrži najmanje četiri različita antigenska peptida kao što je ovde opisano i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NO: 475).

[0153] Posebno, farmaceutska kompozicija može da sadrži – uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 - prvi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, drugi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C, treći antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37, četvrti antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD19 ili CD20, i peptid pomagač, poželjno UCP2 peptid (SEQ ID NE: 475).

[0154] Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži - uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 - prvi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD22, drugi antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena TNFRSF13C, treći antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD37, (opciono) četvrti antigenski peptid kako je ovde opisano, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) fragmenta humanog tumorskog antigena CD20, i peptida pomagača, poželjno peptida UCP2 (SEQ ID NO: 475). Poželjnije, farmaceutska kompozicija sadrži - uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 -prvi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD22 fragmenta (humani referentni peptid) „WVFEHPETL” (SEQ ID NO: 270), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 106-110, drugi antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) TNFRSF13C fragmenta (humani referentni peptid) „LLFGAPALL” ( SEQ ID NO: 279), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220 i 450, treći antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD37 fragmenta (humani referentni peptid) „GLAFVPLQI” (SEQ ID NO: 271), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 113-116, (opciono) četvrti antigenski peptid koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence (mikrobiote) CD20 fragmenta (humani referentni peptid) „IMNSLSLFA” (SEQ ID NO: 264), kao što je antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kako je navedeno u SEQ ID NO: 66-70, i peptida pomagača, poželjno UCP2 peptida (SEQ ID NO: 475).

[0155] Posebno poželjni imunološki adjuvansi su poliinozinska:policitidilna kiselina (takođe nazvana „poli I:C”) i/ili njen derivat poli-ICLC. Poli I:C je neusklađena dvolančana RNK pri čemu je jedan lanac polimer inozinske kiseline, a drugi polimer citidilne kiseline. Poli I:C je imunostimulant za koji je poznato da reaguje sa toličnim receptorom 3 (TLR3). Poli I:C je strukturno sličan dvolančanoj RNK, koja je „prirodni” stimulans TLR3. Shodno tome, poli I:C se može smatrati sintetičkim analogom dvolančane RNK. Poli-ICLC je sintetički kompleks karboksimetilceluloze, poliinozinske-policitidilne kiseline i dvolančane RNK poli-L-lizina. Slično poli I:C, takođe poli-ICLC je ligand za TLR3. Poli I:C i poli-ICLC obično stimulišu oslobađanje citotoksičnih citokina. Poželjni primer poli-ICLC je Hiltonol<®>.

[0156] Najpoželjnije, pomoćno sredstvo je Montanid, kao što je Montanide ISA 51 VG i/ili Montanide ISA 720 VG. Ovi adjuvansi daju stabilne emulzije voda u ulju kada se pomešaju sa antigenskim medijumima na bazi vode. Montanide ISA 51 VG je baziran na smeši manid monooleatnog surfaktanta i mineralnog ulja, dok Montanide ISA 720 VG koristi nemineralno ulje (Aucouturier J, Dupuis L, Deville S, Ascarateil S, Ganne V. Montanide ISA 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines. Expert Rev Vaccines. 2002 Jun;1(1):111-8; Ascarateil S, Puget A, Koziol M-E. Safety data of Montanide ISA 51 VG and Montanide ISA 720 VG, two adjuvants dedicated to human therapeutic vaccines. Journal for Immunotherapy of Cancer.2015;3(Suppl 2):P428. doi:10.1186/2051-1426-3-S2-P428).

[0157] Takođe je poželjno da imunostimulatorno sredstvo bude antigen prezentujuća ćelija (APC). APC su, takođe, od posebnog interesa, jer je njihova glavna funkcija da obrađuju antigene i da ih na površini ćelije prezentuju T ćelijama imunog sistema, kako bi inicirali i modulirali odgovore T ćelija in vivo. U predmetnoj kompoziciji, poželjno je da su APC napunjeni antigenskim peptidom(ima) i/ili imunogenim jedinjenjem(ima) prema pronalasku, što se može uraditi izlaganjem APC in vitro datom antigenskom peptidom(ima) (Rizzo et al., Methods Mol Biol.

2014;1139:41-4; Rolinski and Hus, J Immunotoxicol.2014 Oct;11(4):311-8).

[0158] Poželjno je da je APC dendritska ćelija (DC). DC su najmoćniji APC i prijavljeno je da su često funkcionalno defektni kod pacijenata sa rakom. DC može lako dobiti stručnjak u tehnici ili od zdravih kompatibilnih donora (tj. dendritske ćelije su povezane sa HLA) ili od samog pacijenta pod uslovom da su funkcionalne (tj. DC su autologne), na primer, direktnom izolacijom iz periferne krvi ili derivacijom iz ćelija periferne krvi kao što su CD14+ monociti ili CD34+ hematopoetski prekursori (Emens et al., 2008). DC se zaista mogu razlikovati od drugih ćelija periferne krvi po svojim površinskim markerima, kao što su S100, p55, CD83 i/ili OX62, i stoga mogu biti izolovani i prečišćeni na osnovu navedenih markera korišćenjem tehnika ćelijskih kultura koje su dobro poznate u tehnici.

[0159] U skladu sa poželjnom realizacijom, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži najmanje jedno terapeutsko sredstvo protiv raka. Dato terapeutsko sredstvo je stoga poželjno sposobno da spreči i/ili leči isti tip raka za koji se koristi antigenski peptid prema pronalasku. Poželjno, terapeutsko sredstvo protiv raka je izabrano iz antitela, CAR-T ćelija, lizata tumorskih ćelija, hemoterapeutskih sredstava, radioterapeutskih sredstva, modulatora imunoloških kontrolnih tačaka i njihovih kombinacija.

[0160] Antitela su posebno korisna u terapiji raka jer se mogu ili vezati za specifične antigene na površini ćelija raka, usmeravajući tako terapiju na tumor (tj. ona se nazivaju antitela koja ciljaju tumor), ili blokiraju imunološke kontrolne tačke koje su neregulisane kod raka (tj. ona se ovde nazivaju imunomodulatorna antitela). Svrha drugog tipa antitela je da inhibira imunološku otpornost na rak, koja se može primetiti protiv T ćelija koje su specifične za tumorske antigene. Zaista, kao što je dobro poznato u tehnici, u normalnim fiziološkim uslovima, imunološke kontrolne tačke su ključne za održavanje samotolerancije (tj. prevenciju autoimunosti) i štite tkiva od oštećenja kada imuni sistem reaguje na patogenu infekciju. Međutim, kod raka, ekspresija imunoloških kontrolnih tačaka može biti disregulisana kao važan mehanizam imunološke rezistencije. Data rezistencija je naročito primećena kod melanoma, karcinoma jajnika, pluća, glioblastoma, dojke i pankreasa u pogledu kontrolne tačke PD-L1 (Konishi et al., B7-H1 expression on non-small cell lung cancer cells and its relationship with tumor- infiltrating lymphocytes and their PD-1 expression. Clin Cancer Res. 2004 Aug 1;10(15):5094-100; Ghebeh et al., The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk prognostic factors. Neoplasia. 2006 Mar;8(3):190-8; Hino et al., Tumor cell expression of programmed cell death-1 ligand 1 is a prognostic factor for malignant melanoma. Cancer.2010 Apr 1;116(7):1757-66). Drugi primeri imunoloških kontrolnih tačaka uključuju, bez ograničavanja, PD-L2, PD-1, CD80, CD86, CTLA-4, B7H3, B7H4, PVR, TIGIT, GAL9, LAG-3, GITR, CD137, TIM3, VISTA, VISTA-R (Pico de Coana et al., Checkpoint blockade for cancer therapy: revitalizing a suppressed immune system. Trends Mol Med.2015 Aug;21 (8):482-91; Pardoll DM. The blockade of immune check- points in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4):252-64).

[0161] Antitela se obično koriste za gore navedene svrhe ili u obliku golih monoklonskih antitela (tj. nekonjugovanih), ili konjugovanih sa drugim molekulom koji može biti toksičan za ćelije ili radioaktivan.

[0162] Primeri dobro poznatih monoklonskih antitela za ciljanje tumora koji se koriste u imunoterapiji raka uključuju, bez ograničavanja, alemtuzumab (hronična limfocitna leukemija), bevacizumab (kolorektalni rak, multiformni glioblastom, rak grlića materice, rak pluća, rak bubrega), brentuksimab/vedotin (limfomi), blinatumumab (akutna limfoblastna leukemija), katumaksomab (maligni ascites kod EPCAM+ raka), cetuksimab (rak glave i vrata, kolorektalni rak), denosumab (rak dojke, prostate i kostiju), gemtuzumab/ozogamicin (akutna mijeloidna keulemija), ibritumomab/tiuksetan (Nekočkinovi limfomi), panitumumab (korektalni karcinom), pertuzumab (rak dojke), obinutuzumab (hronična limfocitna leukemija), ofatumumab (hronična limfocitna leukemija), opilimumab (melanom), ramucirumab (rak želuca i gastroezofagealni rak), rituksimab (hronična limfocitna leukemija i Nehočkinovi limfomi), siltuksimab (multicentrična Katslemanova bolest), tositumomab (Nehočkinovi limfomi) i trastuzumab (rak dojke, želuca i gastroeazofagijalni); dok primeri imunomodulatornih antitela uključuju ipilimumab (melanom) koji blokira imunološku kontrolnu tačku zavisnu od CTLA4, nivolumab (melanom, rak pluća) i prembrolizubmab (melanom) koji oba blokiraju imunološku kontrolnu tačku zavisnu od PDCD1, kao i MPDL3280A, MEDI4736, MEDI0680, i MSB0010718C koji svi blokiraju imunološku kontrolnu tačku zavisnu od PD-L1 (Sharma and Allison, The future of immune checkpoint therapy. Science.2015 Apr 3;348(6230):56-61).

[0163] Druga antitela za imunoterapiju raka su opisana Buqué et al., Trial Watch: Immunomodulatory monoclonal antibodies for oncological indications. Oncoimmunology.2015 Mar 2;4(4):e1008814. eCollection 2015 Apr; Redman et al., Mechanisms of action of therapeutic antibodies for cancer. Mol Immunol.2015 Oct;67(2 Pt A):28-45; Simpson and Caballero, Monoclonal antibodies for the therapy of cancer MC Proc. 2014; 8(Suppl 4): O6 kao i na internet sajtu društva za antitela (lista terapeutskih monoklonskih antitela odobrenih ili na pregledu u Evropskoj uniji ili Sjedinjenim Državama dostupna na linku http://www.antibodysociety.org/news/approved_mabs.php).

[0164] Adoptivna ćelijska imunoterapija sa T ćelijama himernog antigenskog receptora (CAR) promenila je situaciju kod lečenja B ćelijskog ne-Hočkinovog limfoma (NHL), posebno za agresivne B ćelijske limfome. Na primer, CD19 ciljane CAR T ćelije, predstavljaju novi standard nege za pacijente sa DLBCL koji su otporni na najmanje dve prethodne linije terapije. Dva CAR T ćelijska proizvoda axicabtagene ciloleucel (axi-cel) (KTE-019) (YESCARTA™) and tisagenlecleucel (CTL019) (KYMRIAH™) su dobila odobrenje američke Uprave za hranu i lekove za lečenje refraktornog DLBCL nakon dve linije terapije. Treći proizvod, lisocabtagene maraleucel (liso-cel) (JCAR017), trenutno se procenjuje u kliničkim ispitivanjima. Ostale CAR T ćelije uključuju CD20-CAR-T ćelije.

[0165] Lizati tumorskih ćelija se, takođe, mogu kombinovati sa antigenskim peptidom(ima) prema pronalasku. Tumorske ćelije su zaista sposobne da aktiviraju imuni odgovor, predstavljanjem endogenih peptida-MHC kompleksa, kao i preko dendritskih ćelija (DC) domaćina koje mogu da obrađuju i prezentuju antigen koji isporučuju navedeni lizati. Na taj način se povećava raspon antigena protiv kojih se može indukovati imuni odgovor. Lizati tumorskih ćelija mogu se lako dobiti tretiranjem tumorskih ćelija toplotnim šokom i/ili hemijskim tretmanom, i mogu biti autologni (tj. izolovani od pacijenta), ili alogeni (tj. izolovani od drugog subjekta).

[0166] Standardni hemoterapeutski lekovi i radioterapeutska sredstva ne moraju biti dalje opisani ovde jer su oni opširno opisani u literaturi, posebno od strane Baskar et al. (Baskar et al., Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int J Med Sci.2012;9(3):193-9), Paci et al., (Paci et al., Review of therapeutic drug monitoring of anticancer drugs part 1--cytotoxics. Eur J Cancer.2014 Aug;50(12):2010-9) i Widmer et al. (Widmer et al., Review of therapeutic drug monitoring of anticancer drugs part twotargeted therapies. Eur J Cancer. 2014 Aug;50(12):2020-36). Spisak takvih lekova i sredstava je, takođe, dostupan na vebsajtu cancer.gov (http://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs).

[0167] Poželjno, modulator imunološke kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom kako je ovde definisan je aktivator ili inhibitor jednog ili više molekula imunske kontrolne tačke izabranih iz CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR i/ili FasR/DcR3; ili aktivator ili inhibitor jednog ili više njihovih liganada.

[0168] Još poželjnije, modulator imunološke kontrolne tačke je aktivator (ko-)stimulativnog molekula kontrolne tačke ili inhibitor molekula inhibitorne kontrolne tačke ili njihova kombinacija. Shodno tome, modulator imunološke kontrolne tačke je poželjnije (i) aktivator CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR i/ili ICOS ili (ii) inhibitor A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR i/ili FasR/DcR3.

[0169] Još poželjnije, modulator imunološke kontrolne tačke je inhibitor molekula inhibitorne kontrolne tačke (ali poželjno nije inhibitor molekula stimulativne kontrolne tačke). Shodno tome, modulator imunološke kontrolne tačke je još poželjnije inhibitor A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR i/ili DcR3 ili njihovog liganda.

[0170] Takođe je poželjno da modulator imunološke kontrolne tačke bude aktivator stimulativnog ili kostimulativnog molekula kontrolne tačke (ali poželjno nije aktivator inhibitornog molekula kontrolne tačke). Shodno tome, modulator imunološke kontrolne tačke je poželjnije aktivator CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR i/ili ICOS ili njihovog liganda.

[0171] Još je poželjnije da modulator imunološke kontrolne tačke bude modulator CD40 puta, IDO puta, LAG3 puta, CTLA-4 puta i/ili PD-1 puta. Posebno, modulator imunološke kontrolne tačke je poželjno modulator CD40, LAG3, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 i/ili IDO, poželjnije je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, LAG3 i/ili IDO ili aktivator CD40, još poželjnije da je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor CTLA-4, PD-L1, PD-1, LAG3 i/ ili IDO, još poželjnije da je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor LAG3, CTLA-4 i/ili PD-1, a najpoželjnije je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor CTLA-4 i/ili PD-1.

[0172] Shodno tome, modulator kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom može biti izabran između poznatih modulatora CTLA-4 puta ili PD-1 puta. Poželjno, modulator kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom kako je ovde definisan može biti izabran iz poznatih modulatora CTLA-4 puta ili PD-1 puta. Posebno poželjno, modulator imunološke kontrolne tačke je PD-1 inhibitor. Poželjni inhibitori CTLA-4 puta i PD-1 puta uključuju monoklonska antitela Yervoy<®>(Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) i Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) kao i Opdivo<®>(Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda<®>(Pembrolizumab, poznat i kao Lambrolizumab ili MK-3475; Merck), Imfinzi<®>(Durvalumab, poznat i kao MEDI4736; MedImmune/Astra-Zeneca), Tecentriq<®>(Atezolizumab, poznat i kao MPDL3280A; Roche/Genentech), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), Bavencio<®>(Avelumab; Merck KGaA/Pfizer, poznat i kao MSB-0010718C), MIH1 (Affymetrix), LY3300054 (Eli Lilly) i Spartalizumab (poznat i kao PDR001; Novartis). Poželjniji inhibitori kontrolnih tačaka uključuju CTLA-4 inhibitore Yervoy<®>(Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) i Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) kao i PD-1 inhibitore Opdivo<®>(Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda<®>(Pembrolizumab; Merck), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), AMP-224 (PD-L2 Fc fuzionisani protein; Medlmmune).

[0173] Takođe je poželjno da modulator imunološke kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom kako je ovde definisan bude izabran iz grupe koju čine Pembrolizumab, Ipilimumab, Nivolumab, Atezolizumab, Durvalumab, Tremelimumab, Avelumab, Spartalizumab, LAG525 (anti-LAG-3 monoklonsko antitelo), Epacadostat (takođe poznat kao INCB24360; IDO inhibitor), Varlilumab (anti-CD27 monoklonsko antitelo), Urelumab (anti-CD137 monoklonsko antitelo), AMP-224 i CM-24 (anti-CEACAM1 monoklonsko antitelo).

[0174] U okviru veštine prosečnog stručnjaka u tehnici je da izabere odgovarajuće imunološko terapeutsko sredstvo protiv raka za svrhe pronalaska. Na primer, ako neko želi da spreči ili leči melanom, poželjno je da se koristi lizat ćelija melanoma i/ili antitelo Ipilimumab, zajedno sa odgovarajućim antigenskim peptidom. Odgovarajući antigenski peptidi mogu biti odabrani (i) izborom odgovarajućeg tumorskog antigena za određeni tip raka kao što je poznato u tehnici i/ili kao što je ovde opisano u tabeli 1B i (ii) izborom odgovarajućeg antigenskog peptida prema pronalasku za izabrani tumorski antigen, kao što je gore opisano, npr. u tabeli 1A.

[0175] Terapeutsko sredstvo protiv raka može da se, takođe, daje u kombinaciji sa kompozicijom pronalaska, bilo istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Ako se kompozicija i terapeutsko sredstvo primenjuju na odvojen ili sekvencijelni način, oni se mogu primeniti u različitim farmaceutskim oblicima.

[0176] Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju pronalaska i najmanje jedno terapeutsko sredstvo protiv raka kao što je gore opisano, kao kombinovani preparat za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu. Drugim rečima, pronalazak predlaže kombinovanu upotrebu kompozicije prema pronalasku i najmanje jednog terapeutskog sredstva protiv raka kao što je gore opisano, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu.

Medicinski tretman i upotreba

[0177] Kao što je gore navedeno, kompozicija pronalaska može biti posebno korisna u terapeutske svrhe (kao lek), naročito za pokretanje specifičnog imunološkog odgovora prema određenom tumorskom antigenu/proteinu, na primer, za prevenciju ili lečenje maligniteta B ćelije (kao što je limfom B ćelije) kod pacijenta kome je to potrebno.

[0178] S obzirom na to, predmetni pronalazak obezbeđuje

- antigenski peptid prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisan,

- nanočestice prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano,

- citotoksične T limfocite (CTL) prema pronalasku kako je ovde opisano,

- ćeliju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano,

- Nukleinsku kiselinu prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano,

- ćeliju domaćina prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano,

- farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano, ili

- kombinacija prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana

za upotrebu u medicini, posebno u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelija.

[0179] Posebno, poželjne realizacije antigenskog peptida prema zahtevu 1 kao što je gore opisano takođe se primenjuju za upotrebu prema predmetnom pronalasku u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Na primer, antigenski peptid koji se koristi u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelija ili antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1 koji se sastoji od bilo koje nanočestice, ćelije, nukleinske kiseline, ćelije domaćina ili farmaceutske kompozicije koja se koristi u prevenciji i/ili u lečenju raka, poželjno u kombinaciji sa antigenskim peptidima koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs SEQ ID NOs 1 do 64, 66 do 257 i 476-500. U nekim realizacijama, antigenski peptidi se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 - 12, 34 - 35, 36 - 39, 40, 41 - 64, 65 - 70, 476 - 484, 71 - 80, 81 - 87, 106 - 110, 485 - 488, 111 - 130, 489 - 493, 210 - 225, 494 - 500 i 226 - 257; poželjno je da se antigenski peptid sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 34 - 35, 65 - 70, 476 - 484, 106 - 110, 485 - 488, 111 - 130, 489 - 493, 210 - 225, 494 - 500 i 226 - 257; poželjnije da se antigenski peptid sastoji od sekvence aminokiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 65 - 70, 476 - 484, 106 - 110, 485 - 488, 111 - 130, 489 -493, 210 - 225 i 494 - 500. Još poželjnije, antigenski peptid se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 34, 35, 39, 40, 61, 68, 70, 72, 86, 107 - 110, 114, 117, 119, 120, 212, 217, 220, 224, 227, 231, 477, 491 i 493. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 61, 65, 68, 72, 86, 110, 114 i 220 su još poželjniji. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 21, 33, 35, 39, 40, 110, 114 i 220 su još poželjniji. Na primer, antigenski peptidi koji se sastoje od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 10, 110, 114 i 220 su još poželjniji. Kombinacija antigenskih peptida prema predmetnom pronalasku koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs NOs 65, 110, 114 i 220 je poželjnija.

[0180] Takođe su poželjne njihove kombinacije, naime, različiti antigenski peptidi kako su ovde opisani u kombinaciji sa antigenskim peptidom prema predmetnom pronalasku za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Posebno, više od jedne od gore opisanih komponenti može se koristiti u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Na primer, najmanje dva različita antigenska peptida, najmanje dva imunogena jedinjenja, najmanje dve različite nanočestice, najmanje dve različite ćelije, najmanje dve različite nukleinske kiseline, najmanje dve različite ćelije domaćini, i/ili najmanje dve različite farmaceutske kompozicije mogu se koristiti u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Poželjno, takve različite komponente koje se koriste u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije kao što je gore opisano razlikuju se u antigenskim peptidima, na primer, jedna komponenta koja se odnosi na prvi antigenski peptid, i jedna komponenta koja se odnosi na drugi antigenski peptid (razlikuje se od prvog antigenskog peptida). Na primer, najmanje dva različita imunogena jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije.. Na primer, najmanje dva različita antigenska peptida kako su ovde opisana uključujući antigenski peptid prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije.. Na primer, najmanje dve različite nanočestice prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije.. Na primer, najmanje dve različite nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije..

[0181] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje (najmanje jedan) antigenski peptid prema zahtevu 1 kako je ovde opisan za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Štaviše, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje (najmanje jednu) nanočesticu prema zahtevu 2 kako je ovde opisano za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Štaviše, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje (najmanje jednu) ćeliju prema zahtevu 3 kako je ovde opisano za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Štaviše, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje (najmanje jednu) nukleinsku kiselinu prema zahtevu 4 kako je ovde opisano za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije.. Štaviše, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje (najmanje jednu) ćeliju domaćina prema zahtevu 5 kako je ovde opisano za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije. Štaviše, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje (najmanje jednu) farmaceutsku kompoziciju prema zahtevu 7 kako je ovde opisano za upotrebu u prevenciji i/ili u lečenju maligniteta B ćelije.

[0182] Prema tome, predmetni opis (čija se zaštita ne traži) opisuje postupak za prevenciju (smanjenje pojave) i/ili lečenje maligniteta B ćelija ili iniciranje, pojačavanje ili produženje anti-tumorskog odgovora protiv maligniteta B ćelija kod subjekta koji imaju potrebu za tim obuhvata davanje subjektu

- antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku,

- nanočestica prema predmetnom pronalasku,

- ćelija prema predmetnom pronalasku,

- citotoksičnih T limfocita (CTL) prema pronalasku kako je ovde opisano,

- nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku,

- ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku,

- farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku, ili

- kombinacija prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana.

[0183] Poželjno, malignitet B ćelija koji se leči uključuje leukemiju i limfom, na primer, akutnu mijeloidnu (ili mijelogenu) leukemiju (AML), hroničnu mijeloidnu (ili mijelogenu) leukemiju (CML), akutnu limfocitnu (ili limfoblastnu) leukemiju (ALL), B-hroničnu limfocitnu leukemiju (BCLL), hroničnu limfocitnu leukemijua (CLL, Rihterovu), leukemiju vlasastih ćelija (HCL), limfoplazmacitni limfom (LPC) ili Valdenstromovu makroglobulinemiju, prolimfocitnu leukemiju (PLL), sitnoćelijski limfocitni limfom (SLL), limfom ćelija plašta (MCL), limfom marginalne zone (MZL), Burkitov limfom (BL), Hočkinov limfom (HL), ne-Hočkinov limfom (NHL), anaplastični krupnoćelijski limfom (ALCL), folikularni limfom (FL), refraktorni folikularni difuzni limfom, difuzni B krupnoćelijski limfom (DLBCL) i multipli mijelom (MM). U nekim realizacijama, malignitet B ćelija je izabran iz akutne limfoblastne leukemije (ALL), ALL odraslih, hronične limfoblastne leukemije (CLL), ne-Hočkinovog limfoma (NHL) i difuznog B krupnoćelijskog limfoma (DLBCL). U nekim realizacijama, bolest ili stanje je NHL i NHL se bira iz grupe koju čine indolentni (sporo rastući) NHL, agresivni NHL, difuzni B krupnoćelijski limfom (DLBCL), NOS (de novo i transformisan iz indolentnog), primarni medijastinalni B krupnoćelijski limfom (PMBCL), difuzni B krupnoćelijski limfom bogat T ćelijama/histocitima (TCHRBCL), Burkitov limfom, mantle-ćelijski limfom (MCL) i/ili folikularni limfom (FL), opciono, folikularni limfom stepen 3B (FL3B).

[0184] Štaviše, predmetni opis (čija se zaštita ne traži) obezbeđuje postupak za izazivanje ili poboljšanje, kod subjekta, imunološkog odgovora protiv jednog ili više epitopa koji zavise od CD8<+>citotoksične T ćelije, pri čemu dati postupak obuhvata davanje navedenom subjektu bilo kog od:

- antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku,

- nanočestica prema predmetnom pronalasku,

- citotoksičnih T limfocita (CTL) prema pronalasku kako je ovde opisano,

- ćelije prema predmetnom pronalasku,

- nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku,

- ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku,

- farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku, ili

- kombinacija prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana.

[0185] Imuni odgovor koji zavisi od CD8<+>odgovora se može odrediti procenom inflamatornog odgovora, odgovora proinflamatornog citokina, uključujući povećanje ekspresije jednog ili više od IFN-γ, TNF-α i IL-2 mRNK ili proteina u odnosu na nivo pre primene jedinjenja pronalaska. Takođe se može meriti povećanjem frekvencije ili apsolutnog broja T ćelija specifičnih za antigen nakon primene jedinjenja pronalaska, mereno multimernim bojenjem HLA-peptida, ELISPOT testovima i testovima preosetljivosti odloženog tipa. Takođe se može indirektno meriti povećanjem serumskih antitela specifičnih za antigen koja zavise od T pomoćnih ćelija specifičnih za antigen.

[0186] Predmetni opis (čija se zaštita ne traži), takođe, obezbeđuje postupak za izazivanje ili poboljšanje, kod subjekta, imunološkog odgovora protiv jednog ili više antigena ili antigenskih epitopa koji je ograničen višestrukim molekulima MHC klase I, pri čemu dati postupak obuhvata davanje datom subjektu bilo kog jedan od:

- antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku,

- nanočestica prema predmetnom pronalasku,

- citotoksičnih T limfocita (CTL) prema pronalasku kako je ovde opisano,

- ćelije prema predmetnom pronalasku,

- nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku,

- ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku,

- farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku, ili

- kombinacija prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana.

[0187] Postupak za izazivanje ili poboljšanje, kod subjekta, imunog odgovora protiv više epitopa kako je ovde opisano, koji je ograničen višestrukim molekulima MHC klase I, može se odrediti procenom odgovora citokina, uključujući povećanje ekspresije jednog ili više od IFN-γ, TNF-α i IL-2 mRNK ili proteina u odnosu na nivo pre primene jedinjenja pronalaska, posle in vitro stimulacije T ćelija sa pojedinačnim peptidima koji se vezuju za diskretne molekule MHC klase I na ćelijama koje predstavljaju antigen. Restrikcija na molekule MHC klase I se, takođe, može potvrditi korišćenjem ćelija koje predstavljaju antigen koje eksprimuju molekule MHC klase I, ili korišćenjem antitela koja blokiraju MHC klase I. Takođe se može meriti povećanjem frekvencije ili apsolutnog broja T ćelija specifičnih za antigen nakon primene jedinjenja pronalaska, mereno multimernim bojenjem HLA-peptida, korišćenjem multimera sastavljenih sa molekulima MHC klase I.

[0188] Tako, u drugom aspektu, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje

- antigenski peptid prema predmetnom pronalasku,

- nanočestice prema predmetnom pronalasku,

- ćeliju prema predmetnom pronalasku,

- farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku, ili

- kombinaciju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana.

za upotrebu kao lek.

[0189] Pronalazak se posebno odnosi na kompoziciju kako je gore definisano, za upotrebu kao vakcina za imunoterapiju. Štaviše,

- antigenski peptid prema predmetnom pronalasku,

- nanočestice prema predmetnom pronalasku,

- citotoksični T limfocit (CTL) prema pronalasku,

- ćelija prema predmetnom pronalasku,

- nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku,

- ćelija domaćin prema predmetnom pronalasku,

- farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku, ili

- kombinacija prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana

može se koristiti kao vakcina, naročito za imunoterapiju (raka).

[0190] Kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, izraz „vakcina” se odnosi na (biološki) preparat koji obezbeđuje urođeni i/ili adaptivni imunitet, po pravilu za određenu bolest, poželjno malignitet B ćelije. Dakle, vakcina posebno podržava urođeni i/ili adaptivni imuni odgovor imunog sistema subjekta koji se leči. Na primer, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku obično dovodi do ili podržava adaptivni imuni odgovor kod pacijenta koji se leči.

[0191] U kontekstu predmetnog pronalaska, vakcina (kompozicija) može da izazove specifičan imuni odgovor protiv tumorskog antigena, i stoga se poželjno koristi za prevenciju ili lečenje maligniteta B ćelije.

[0192] Shodno tome, u poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na kompoziciju kako je gore definisano, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju raka kod subjekta kome je to potrebno. Još poželjnije, kompozicija pronalaska može da se koristi za proizvodnju leka za prevenciju ili lečenje raka kod subjekta kome je to potrebno. Drugim rečima, pronalazak se odnosi na upotrebu u postupku za prevenciju ili lečenje raka kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje efikasne količine kompozicije pronalaska, datom subjektu.

[0193] Poželjno rak treba sprečiti i/ili lečiti

- antigenskim peptidom prema predmetnom pronalasku,

- ćelijom prema predmetnom pronalasku,

- farmaceutskom kompozicijom prema predmetnom pronalasku, ili

- kombinacijom prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana

koja se odnosi na (referentni) tumorski antigen antigenskog peptida kako je ovde opisano. Naime, odgovarajući antigenski peptidi mogu biti odabrani (i) izborom odgovarajućeg tumorskog antigena za određeni tip raka kao što je poznato u tehnici i (ii) izborom odgovarajućeg antigenskog peptida prema pronalasku za izabrani tumorski antigen, kao što je gore opisano, npr. u tabeli 1A. Stručnjak u tehnici lako će razumeti da se antigenski peptid iz pronalaska može izabrati na osnovu prirode maligniteta B ćelije koji treba sprečiti ili lečiti, i/ili na osnovu humanog gena/ humanog tumorskog antigena uključenog u dati malignitet B ćelije.

[0194] Uopšteno govoreći, antigenski peptidi pronalaska se mogu davati „goli” ili u obliku imunogenih jedinjenja prema predmetnom pronalasku, ćelija napunjenih njima prema predmetnom pronalasku, nanočestica prema predmetnom pronalasku, i/ili farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku.

[0195] U poželjnoj realizaciji, oni se mogu primeniti u obliku mikroorganizma kao što je vrsta crevnih bakterija. Celokupne bakterijske vrste creva, takođe, mogu biti korisne jer imaju potencijal da izazovu veći imuni odgovor od (poli)peptida ili nukleinskih kiselina koje sadrže. Alternativno, crevne bakterije prema pronalasku mogu biti u obliku probiotika, tj. žive crevne bakterije, koje se stoga mogu koristiti kao dodatak uz ishranu zahvaljujući zdravstvenim prednostima koje mogu da pruže. Oni mogu biti, na primer, liofilizovani u granulama, pilulama ili kapsulama, ili direktno pomešani sa mlečnim proizvodima za konzumaciju.

[0196] Postupci primene su dobro poznati stručnjacima u tehnici. Što se tiče kompozicije pronalaska, može se direktno dati subjektu, u zahvaćeni organ (tj. lokalna primena) ili sistemski (tj. enteralna ili parenteralna primena), ili čak primeniti ex vivo ćelijama dobijenim od subjekta ili humane ćelijske linije koje se naknadno daju subjektu, ili čak koriste in vitro da se izabere subpopulacija imunih ćelija izvedenih od subjekta, koje se zatim ponovo daju datom subjektu. Enteralne primene obuhvataju oralno i rektalno davanje, kao i davanja putem gastrične sonde, duodenalne sonde za hranjenje ili gastrostome, dok parenteralne primene uključuju, između ostalog, subkutane, intravenske, intramuskularne, intraarterijalne, intradermalne, intraosealne, intracerebralne i intratekalne injekcije. Postupak davanja će često zavisiti od antigenskog/ih peptida i/ili imunogenog(ih) jedinjenja prisutnih u kompoziciji, i tipa raka koji se leči i drugih aktivnih agenasa koji se mogu nalaziti u datoj kompoziciji. Na primer, primena je poželjno intramuskularno ili intradermalno ubrizgavanje ako je imunogeno jedinjenje nukleinska kiselina kao što je gore definisano, pri čemu je oralna/nazalna primena posebno poželjna ako je navedena nukleinska kiselina klonirana u virusni vektor. Alternativno, primena je poželjno intramuskularna, intradermalna ili oralna primena ako je antigenski peptid i/ili imunogeno jedinjenje (poli)peptid kao što je gore definisan ili ako je napunjen u/na nanočestici kao što je ovde opisano. Ipak, još uvek alternativno, primena je poželjno oralna primena ako se antigenski peptid i/ili imunogeno jedinjenje isporučuje u obliku crevne bakterije kao što je gore definisano, posebno ako je crevna bakterija u obliku probiotika.

[0197] Antigenski peptidi i nukleinske kiseline prema pronalasku mogu dalje biti inkapsulirani tako da se olakša njihovo davanje subjektu kome je to potrebno. Na primer, oni mogu biti inkapsulirani u peptidne nanonosače (poželjno ako je imunogeno jedinjenje nukleinska kiselina ili (poli)peptid), u virozome (poželjno ako je imunogeno jedinjenje nukleinska kiselina ili (poli)peptid), ili u sisteme nosača zasnovane na lipidima, kao što je kompleks lipozom-polikacija-DNK (poželjno ako je imunogen nukleinska kiselina ili (poli)peptid), (Trovato M, De Berardinis P. Novel antigen delivery systems. World J Virol.2015 Aug 12;4(3):156-68; Saade F, Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb;11(2):189-209; Li et al., Peptide Vaccine: Progress and Challenges. Vaccines (Basel).2014 Jul 2;2(3):515-36).

[0198] Kompozicija se, takođe, može primeniti više puta da bi se postigao željeni efekat. U poželjnoj realizaciji, data kompozicija se primenjuje više puta, najmanje dva puta, a poželjno više od dva puta. Ovo se može uraditi tokom dužeg vremenskog perioda, na primer jednom nedeljno, svake druge nedelje, mesečno, godišnje ili čak nekoliko godina nakon prve primene kako bi se osiguralo da je subjekt pravilno imunizovan.

Kombinovana terapija

[0199] Primena antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku, ćelije prema predmetnom pronalasku i farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku, posebno u postupcima i upotrebama prema pronalasku, može biti sprovedeno samostalno ili u kombinaciji sa ko-agensom korisnim za lečenje i/ili prevenciju raka, kao što je terapeutsko sredstvo protiv raka.

[0200] Dato terapeutsko sredstvo je stoga poželjno sposobno da spreči i/ili leči isti tip raka kao onaj za koji se koristi antigenski peptid prema pronalasku.

[0201] Naročito poželjna terapeutska sredstva protiv raka prema pronalasku uključuju, bez ograničavanja, antitela, CAR-T ćelije, lizate tumorskih ćelija, hemoterapeutska sredstva, radioterapeutska sredstva, modulatore imunoloških kontrolnih tačaka i njihove kombinacije.

[0202] Antitela su posebno korisna u terapiji raka jer se mogu ili vezati za specifične antigene na površini ćelija raka, usmeravajući tako terapiju na tumor (tj. ona se nazivaju antitela koja ciljaju tumor), ili blokiraju imunološke kontrolne tačke koje su neregulisane kod raka (tj. ona se ovde nazivaju imunomodulatorna antitela). Svrha drugog tipa antitela je da inhibira imunološku otpornost na rak, koja se može primetiti protiv T ćelija koje su specifične za tumorske antigene. Zaista, kao što je dobro poznato u tehnici, u normalnim fiziološkim uslovima, imunološke kontrolne tačke su ključne za održavanje samotolerancije (tj. prevenciju autoimunosti) i štite tkiva od oštećenja kada imuni sistem reaguje na patogenu infekciju. Međutim, kod raka, ekspresija imunoloških kontrolnih tačaka može biti disregulisana kao važan mehanizam imunološke rezistencije. Data rezistencija je naročito primećena kod melanoma, karcinoma jajnika, pluća, glioblastoma, dojke i pankreasa u pogledu kontrolne tačke PD-L1 (Konishi et al., B7-H1 expression on non-small cell lung cancer cells and its relationship with tumor- infiltrating lymphocytes and their PD-1 expression. Clin Cancer Res. 2004 Aug 1;10(15):5094-100; Ghebeh et al., The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk prognostic factors. Neoplasia. 2006 Mar;8(3):190-8; Hino et al., Tumor cell expression of programmed cell death-1 ligand 1 is a prognostic factor for malignant melanoma. Cancer.2010 Apr 1;116(7):1757-66).

Drugi primeri imunoloških kontrolnih tačaka uključuju, bez ograničavanja, PD-L2, PD-1, CD80, CD86, CTLA4, B7H3, B7H4, PVR, TIGIT, GAL9, LAG-3, GITR, CD137, TIM3, VISTA, VISTA-R (Pico de Coana et al., Checkpoint blockade for cancer therapy: revitalizing a suppressed immune system. Trends Mol Med.2015 Aug;21(8):482-91; Pardoll DM1. The blockade of immune check- points in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4):252-64).

[0203] Antitela se obično koriste za gore navedene svrhe ili u obliku golih monoklonskih antitela (tj. nekonjugovanih), ili konjugovanih sa drugim molekulom koji može biti toksičan za ćelije ili radioaktivan.

[0204] Primeri dobro poznatih monoklonskih antitela za ciljanje tumora koji se koriste u imunoterapiji raka uključuju, bez ograničavanja, alemtuzumab (hronična limfocitna leukemija), bevacizumab (kolorektalni rak, multiformni glioblastom, rak grlića materice, rak pluća, rak bubrega), brentuksimab/vedotin (limfomi), blinatumumab (akutna limfoblastna leukemija), katumaksomab (maligni ascites kod EPCAM+ raka), cetuksimab (rak glave i vrata, kolorektalni rak), denosumab (rak dojke, prostate i kostiju), gemtuzumab/ozogamicin (akutna mijeloidna keulemija), ibritumomab/tiuksetan (Nekočkinovi limfomi), panitumumab (korektalni karcinom), pertuzumab (rak dojke), obinutuzumab (hronična limfocitna leukemija), ofatumumab (hronična limfocitna leukemija), opilimumab (melanom), ramucirumab (rak želuca i gastroezofagealni rak), rituksimab (hronična limfocitna leukemija i Nehočkinovi limfomi), siltuksimab (multicentrična Katslemanova bolest), tositumomab (Nehočkinovi limfomi) i trastuzumab (rak dojke, želuca i gastroeazofagijalni); dok primeri imunomodulatornih antitela uključuju ipilimumab (melanom) koji blokira imunološku kontrolnu tačku zavisnu od CTLA4, nivolumab (melanom, rak pluća) i prembrolizubmab (melanom) koji oba blokiraju imunološku kontrolnu tačku zavisnu od PDCD1, kao i MPDL3280A, MEDI4736, MEDI0680, i MSB0010718C koji svi blokiraju imunološku kontrolnu tačku zavisnu od PD-L1 (Sharma and Allison, The future of immune checkpoint therapy. Science.2015 Apr 3;348(6230):56-61).

[0205] Druga antitela za imunoterapiju raka opisana su u Buqué et al. (Buqué et al., Trial Watch: Immunomodulatory monoclonal antibodies for oncological indications. Oncoimmunology. 2015 Mar 2;4(4):e1008814. eCollection 2015 Apr), Redman et al. (Redman et al., Mechanisms of action of therapeutic antibodies for cancer. Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt A):28-45), and in Simpson and Caballero, Monoclonal antibodies for the therapy of cancer MC Proc.2014; 8(Suppl 4): O6 kao i na internet sajtu društva za antitela (lista terapeutskih monoklonskih antitela odobrenih ili na pregledu u Evropskoj Uniji ili Sjedinjenim Državama dostupna na linku http://www.antibodysociety.org/news/approved_mabs.php).

[0206] Adoptivna ćelijska imunoterapija sa T ćelijama himernog antigenskog receptora (CAR) promenila je situaciju kod lečenja B ćelijskog ne-Hočkinovog limfoma (NHL), posebno za agresivne B ćelijske limfome. Na primer, CD19 ciljane CAR T ćelije, predstavljaju novi standard nege za pacijente sa DLBCL koji su otporni na najmanje dve prethodne linije terapije. Dva CAR T ćelijska proizvoda axicabtagene ciloleucel (axi-cel) (KTE-019) (YESCARTA™) i tisagenlecleucel (CTL019) (KYMRIAH™) su dobila odobrenje američke Uprave za hranu i lekove za lečenje refraktornog DLBCL nakon dve linije terapije. Treći proizvod, lisocabtagene maraleucel (liso-cel) (JCAR017), trenutno se procenjuje u kliničkim ispitivanjima. Ostale CAR T ćelije uključuju CD20-CAR-T ćelije.

[0207] Lizati tumorskih ćelija se, takođe, mogu kombinovati sa antigenskim peptidom(ima) prema pronalasku. Tumorske ćelije su zaista sposobne da aktiviraju imuni odgovor, predstavljanjem endogenih peptida-MHC kompleksa, kao i preko dendritskih ćelija (DC) domaćina koje mogu da obrađuju i prezentuju antigen koji isporučuju navedeni lizati. Na taj način se povećava raspon antigena protiv kojih se može indukovati imuni odgovor. Lizati tumorskih ćelija mogu se lako dobiti tretiranjem tumorskih ćelija toplotnim šokom i/ili hemijskim tretmanom, i mogu biti autologni (tj. izolovani od pacijenta), ili alogeni (tj. izolovani od drugog subjekta).

[0208] Standardni hemoterapeutski lekovi i radioterapeutska sredstva ne moraju biti dalje opisani ovde jer su oni opširno opisani u literaturi, posebno od strane Baskar et al. (Baskar et al., Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int J Med Sci.2012;9(3):193-9), Paci et al. (Paci et al., Review of therapeutic drug monitoring of anticancer drugs part 1--cytotoxics. Eur J Cancer. 2014 Aug;50(12):2010-9) and Widmer et al. (Widmer et al., Review of therapeutic drug monitoring of anticancer drugs part twotargeted therapies. Eur J Cancer.

2014 Aug;50(12):2020-36). Spisak takvih lekova i sredstava je, takođe, dostupan na vebsajtu cancer.gov (http://www.can- cer.gov/about-cancer/treatment/drugs).

[0209] Poželjno, modulator imunološke kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom kako je ovde definisan je aktivator ili inhibitor jednog ili više molekula imunske kontrolne tačke izabranih iz CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR i/ili FasR/DcR3; ili aktivator ili inhibitor jednog ili više njihovih liganada.

[0210] Još poželjnije, modulator imunološke kontrolne tačke je aktivator (ko-)stimulativnog molekula kontrolne tačke ili inhibitor molekula inhibitorne kontrolne tačke ili njihova kombinacija. Shodno tome, modulator imunološke kontrolne tačke je poželjnije (i) aktivator CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR i/ili ICOS ili (ii) inhibitor A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR i/ili FasR/DcR3.

[0211] Još poželjnije, modulator imunološke kontrolne tačke je inhibitor molekula inhibitorne kontrolne tačke (ali poželjno nije inhibitor molekula stimulativne kontrolne tačke). Shodno tome, modulator imunološke kontrolne tačke je još poželjnije inhibitor A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR i/ili DcR3 ili njihovog liganda.

[0212] Takođe je poželjno da modulator imunološke kontrolne tačke bude aktivator stimulativnog ili kostimulativnog molekula kontrolne tačke (ali poželjno nije aktivator inhibitornog molekula kontrolne tačke). Shodno tome, modulator imunološke kontrolne tačke je poželjnije aktivator CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR i/ili ICOS ili njihovog liganda.

[0213] Još je poželjnije da modulator imunološke kontrolne tačke bude modulator CD40 puta, IDO puta, LAG3 puta, CTLA-4 puta i/ili PD-1 puta. Posebno, modulator imunološke kontrolne tačke je poželjno modulator CD40, LAG3, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 i/ili IDO, poželjnije je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, LAG3 i/ili IDO ili aktivator CD40, još poželjnije da je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor CTLA-4, PD-L1, PD-1, LAG3 i/ ili IDO, još poželjnije da je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor LAG3, CTLA-4 i/ili PD-1, a najpoželjnije je modulator imunološke kontrolne tačke inhibitor CTLA-4 i/ili PD-1.

[0214] Shodno tome, modulator kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom može biti izabran između poznatih modulatora CTLA-4 puta ili PD-1 puta. Poželjno, modulator kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom kako je ovde definisan može biti izabran iz poznatih modulatora CTLA-4 puta ili PD-1 puta. Posebno poželjno, modulator imunološke kontrolne tačke je PD-1 inhibitor. Poželjni inhibitori CTLA-4 puta i PD-1 puta uključuju monoklonska antitela Yervoy<®>(Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) i Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) kao i Opdivo<®>(Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda<®>(Pembrolizumab; poznat i kao Lambrolizumab ili MK-3475; Merck), Imfinzi<®>(Durvalumab poznat i kao MEDI4736; Medlmmune/Astra- Zeneca), Tecentriq<®>(Atezolizumab poznat i kao MPDL3280A; Roche/Genentech), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), Bavencio<®>(Avelumab; Merck KGaA/Pfizer poznat i kao MSB-0010718C), MIH1 (Affymetrix), LY3300054 (Eli Lilly) i Spartalizumab (poznat i kao PDR001; Novartis). Poželjniji inhibitori kontrolnih tačaka uključuju CTLA-4 inhibitore Yervoy<®>(Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) i Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) kao i PD-1 inhibitore Opdivo<®>(Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda<®>(Pembrolizumab; Merck), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), AMP-224 (PD-L2 Fc fuzionisani protein; Medlmmune).

[0215] Takođe je poželjno da modulator imunološke kontrolne tačke za kombinaciju sa antigenskim peptidom kako je ovde definisan bude izabran iz grupe koju čine Pembrolizumab, Ipilimumab, Nivolumab, Atezolizumab, MEDI4736, Tremelimumab, Avelumab, Spartalizumab, LAG525 (anti-LAG3 monoclonsko antitelo), Epacadostat (ranije INCB24360; IDO inhibitor), Varlilumab (anti-CD27 monoklonsko antitelo), Urelumab (anti-CD137monoklonsko antitelo), AMP-224 i CM-24 (anti-CEACAM1 monoklonsko antitelo).

[0216] U okviru veštine prosečnog stručnjaka u tehnici je da izabere odgovarajuće imunološko terapeutsko sredstvo protiv raka za svrhe pronalaska.

[0217] Terapeutsko sredstvo protiv raka se, takođe, može davati zajedno sa antigenskim peptidom prema predmetnom pronalasku, ćelijom prema predmetnom pronalasku ili farmaceutskom kompozicijom prema predmetnom pronalasku, bilo otprilike u isto vreme ili uzastopno kao što je ovde opisano i u istim ili različitim farmaceutskim oblicima. Otuda, pronalazak predlaže kombinovanu upotrebu kompozicije iz pronalaska i najmanje jednog terapeutskog sredstva protiv raka kao što je gore opisano, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu kao što je ovde opisano.

[0218] Dalje, predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na kombinaciju najmanje dva različita antigenska peptida kao što je ovde opisano uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1, npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelije. Dalje, predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na kombinaciju najmanje dva različita imunogena jedinjenja prema predmetnom pronalasku, npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelije. Dalje, predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na kombinaciju najmanje dve različite nanočestice prema predmetnom pronalasku, npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelije. Dalje, predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na kombinaciju najmanje dve različite nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelije.

[0219] Prema tome, u skladu sa poželjnom realizacijom, najmanje dva antigenska peptida kao što je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 mogu se davati u kombinaciji, na primer, u istoj farmaceutskoj kompoziciji. Na primer, najmanje 3 antigenska peptida, najmanje 4 antigenska peptida, najmanje 5 antigenskih peptida, najmanje 6 antigenskih peptida, najmanje 7 antigenskih peptida, najmanje 8 antigenskih peptida, najmanje 9 antigenskih peptida, najmanje 10 antigenskih peptida, najmanje 11 antigenskih peptida, najmanje 12 antigenskih peptida, najmanje 13 antigenskih peptida, najmanje 14 antigenskih peptida, najmanje 15 antigenskih peptida, najmanje 20 antigenskih peptida, najmanje 25 antigenskih peptida, najmanje 50 antigenskih peptida najmanje 100 antigenskih peptida, se daje u kombinaciji, na primer, u istoj farmaceutskoj kompoziciji. U okviru veštine stručnjaka u tehnici je da odabere kombinaciju antigenskih peptida koja je pogodna za predviđenu svrhu.

[0220] U posebno poželjnoj realizaciji kombinuju se dva različita antigenska peptida uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 (npr. koji se odnose na isti tip maligniteta B ćelije i/ili na isti referentni antigen).

[0221] Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje kombinaciju najmanje dva različita antigenska peptida uključujući antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1, posebno

(i) antigenski peptid prema zahtevu 1, i

(ii) drugi antigenski peptid kao što je ovde opisano (različit od prvog)

poželjno za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelija.

[0222] U kombinacijama prema predmetnom pronalasku, poželjne su takve kombinacije komponenata, poput antigenskih peptida prema predmetnom pronalasku, koje odgovaraju poželjnim kombinacijama komponenata, kao što su antigenski peptidi, prema predmetnom pronalasku uključenih u farmaceutsku kompoziciju kao što je gore opisano.

[0223] Štaviše, antigenski peptid prema zahtevu 1 takođe, može biti kombinovan sa odgovarajućim (humanim) epitopom tumorskog antigena (kao što je gore opisano u vezi sa peptidnim „familijama“). Time se dobija/podržava selekcija klonova T ćelija, koji su veoma efikasni protiv tumora. Posebno, antigenski peptid prema predmetnom pronalasku i odgovarajući epitop (humanog) tumorskog antigena mogu se davati zajedno. Takva ko-administracija može biti otprilike u isto vreme (istovremeno) ili uzastopno, pri čemu je pri uzastopnoj primeni poželjno da se antigenski peptid prema predmetnom pronalasku primeni prvi, a da se nakon toga primeni odgovarajući (humani) epitop tumorskog antigena. Posebno, antigenski peptid prema zahtevu 1 može se davati prvi, a odgovarajući (humani) epitop tumorskog antigena može se koristiti kao (ponovno) pojačavanje.

[0224] Peptidi, koji treba da se kombinuju, kao što su (a) antigenski peptid prema zahtevu 1 i odgovarajući epitop (humanog) tumorskog antigena ili (b) dva različita antigenska peptida uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1, mogu se davati

- (napunjeni) u istoj ćeliji prema predmetnom pronalasku ili u različitim ćelijama prema predmetnom pronalasku, - (da se nalaze) u istoj farmaceutskoj kompoziciji prema predmetnom pronalasku ili u različitoj farmaceutskoj kompoziciji prema predmetnom pronalasku.

[0225] Generalno, izraz „dve različite komponente” u kontekstu kombinacije, npr. za upotrebu prema predmetnom pronalasku (kombinovana terapija), definiše se kao gore (u kontekstu farmaceutske kompozicije). Posebno se odnosi na

(1) prvu komponentu, kao što je antigenski peptid prema zahtevu 1 kako je ovde opisan, nanočesticu prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, ćeliju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisano; i

(2) drugu komponentu (koja se razlikuje od prve komponente), kao što je terapeutsko sredstvo protiv raka kao što je gore opisano, različit antigenski peptid prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisan, različitu ćeliju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, različitu farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku kako je ovde opisana, ili jedan ili više (fragmenata) humanih tumorskih antigena u bilo kom obliku („goli”), kao imunogeno jedinjenje kako je ovde opisano, kao nanočestica kako je ovde opisana, kao ćelija (domaćin) kako je ovde opisana ili kao nukleinska kiselina kako je ovde opisana ili farmaceutska kompozicija kako je ovde opisana).

[0226] Shodno tome, „dve različite komponente”, kako se ovde pominje u kontekstu kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku (kombinovana terapija), su poželjno aktivne komponente u kontekstu bolesti (malignitet B ćelije) koje treba sprečiti i/ ili lečiti. Drugim rečima, svaka od najmanje dve različite komponente, takođe, može biti korisna za prevenciju i/ili lečenje datog raka, ako se primenjuje odvojeno (ne u kombinaciji kako je ovde opisano) - iako kombinacija (tj. kombinovana primena) obično pojačava njihovu prevenciju i /ili terapeutski efekat (kao što je imuni odgovor), posebno na sinergistički način.

[0227] Shodno tome, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje kombinaciju (najmanje) dva različita antigenska peptida kako je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 kako je ovde opisano. U ovom kontekstu, (najmanje) dva različita antigenska peptida mogu biti u bilo kom obliku, npr., „goli”, sadržani u imunogenim jedinjenjima, nanočesticama, (farmaceutskim) kompozicijama ili ćelijama napunjenim njima, ili kodiranim nukleinskim kiselinama (npr. vektorima). Shodno tome, (najmanje) dva različita antigenska peptida mogu biti sadržana u (najmanje) dve različite komponente (koje se kombinuju). U poželjnoj realizaciji, najmanje dve različite komponente kombinacije prema predmetnom pronalasku su najmanje različiti antigenski peptidi kako je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 (u bilo kom obliku, npr. sadržan u nanočesticama, ćelijama ili farmaceutskim kompozicijama, kodiranim nukleinskim kiselinama, itd.).

[0228] Poželjno, najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku odnose se na isti tip raka, na primer, na iste ili različite antigene povezane sa tim rakom i/ili na iste ili različite (referentne) epitope unutar antigena povezanog sa tim rakom. Još poželjnije, najmanje dve različite komponente se odnose na isti tumorski antigen.

[0229] U određenim realizacijama, najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku se nalaze u istim ili različitim kompozicijama. U određenim realizacijama, najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku daju se istim ili različitim putevima primene. U određenim realizacijama, najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku daju se približno u isto vreme (istovremeno) ili uzastopno.

[0230] Poželjno je da se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku daju otprilike u isto vreme. Uopšteno govoreći, poželjno je da se prva komponenta primenjuje u približno isto vreme kada i druga komponenta, pri čemu se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno daju u istom obliku (tj. u istoj vrsti formulacije, npr. kao nanočestice, kao farmaceutske kompozicije, itd.).

[0231] „Otprilike u isto vreme”, kako se ovde koristi, znači posebno istovremenu primenu ili da se neposredno nakon primene prve komponente primenjuje druga komponenta ili direktno nakon primene druge komponente, prva komponenta se primenjuje. Stručnjak u tehnici razume da „direktno posle” uključuje vreme potrebno za pripremu druge primene - posebno vreme potrebno za izlaganje i dezinfekciju lokacije za drugu primenu, kao i odgovarajuću pripremu „uređaja za davanje” (npr. špric, pumpa, itd.). Istovremena primena, takođe, uključuje ako se periodi primene prve komponente i druge komponente preklapaju ili ako se, na primer, jedna komponenta primenjuje tokom dužeg vremenskog perioda, kao što je 30 min, 1 h, 2 h ili čak duže, na primer, putem infuzije, a druga komponenta se primenjuje u nekom trenutku tokom tako dugog perioda. Primena prve komponente i druge komponente u približno isto vreme je posebno poželjna ako se koriste različiti putevi primene i/ili različita mesta primene.

[0232] Takođe je poželjno da se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku daju uzastopno. Uopšteno govoreći, poželjno je da se prva komponenta i druga komponenta daju uzastopno, pri čemu se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno daju u istom obliku (tj. u istom tipu formulacije, npr. kao nanočestice, kao farmaceutske kompozicije, itd.).

[0233] To znači da se prva komponenta primenjuje pre ili posle druge komponente. U uzastopnoj primeni, vreme između primene prve komponente i primene druge komponente poželjno nije više od jedne nedelje, poželjnije ne više od 3 dana, još poželjnije ne više od 2 dana i najpoželjnije ne više od 24 h. Posebno je poželjno da se prva komponenta i druga komponenta daju istog dana sa vremenom između primene prve komponente i primene druge komponente poželjno ne više od 6 sati, poželjnije ne više od 3 sata, čak i poželjnije ne više od 2 sata i najpoželjnije ne više od 1 h.

[0234] Poželjno, prva komponenta i druga komponenta se daju istim načinom primene. Uopšteno govoreći, poželjno je da se prva komponenta i druga komponenta daju istim načinom primene, pri čemu se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno daju u istom obliku (tj. u istoj vrsti formulacije, npr. kao nanočestice, kao farmaceutske kompozicije, itd.).

[0235] Takođe je poželjno da se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku daju različitim načinima primene. Uopšteno govoreći, poželjno je da se prva komponenta i druga komponenta daju različitim načinima primene, pri čemu se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno daju u istom obliku (tj. u istoj vrsti formulacije, npr. kao nanočestice, kao farmaceutske kompozicije, itd.).

[0236] Poželjno, najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku su sadržane u istoj kompoziciji. Uopšteno govoreći, poželjno je da prva komponenta i druga komponenta budu sadržane u istoj kompoziciji, pri čemu se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno daju u istom obliku (tj. isti tip formulacije, npr. kao nanočestice, itd.).

[0237] Takođe je poželjno da se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku nalaze u različitim kompozicijama. Uopšteno govoreći, poželjno je da se prva komponenta i druga komponenta nalaze u različitim kompozicijama, pri čemu se najmanje dve različite komponente kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno daju u istom obliku (tj. isti tip formulacije, npr. kao nanočestice, itd.).

[0238] Konkretno, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži prvi antigenski peptid prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži ili se sastoji od varijante sekvence fragmenta humanog tumorskog antigena, [0239] Još poželjnije, kombinacija prema predmetnom pronalasku (npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelije) sadrži najmanje tri različite komponente kao što je gore opisano, posebno najmanje tri različita antigenska peptida kako je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1. Gornji opis u vezi sa kombinacijom dve različite komponente se shodno tome primenjuje za tri različite komponente.

[0240] Još poželjnije, kombinacija prema predmetnom pronalasku (npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelije) sadrži najmanje četiri različite komponente kao što je gore opisano, posebno najmanje četiri različita antigenska peptida kako je ovde opisano, uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1. Gornji opis u vezi sa kombinacijom dve različite komponente se shodno tome primenjuje za četiri različite komponente.

[0241] Podrazumeva se da kombinacija, npr. za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelija, može takođe da sadrži – umesto gore opisanih poželjnih kombinacija antigenskih peptida – odgovarajuću kombinaciju imunogenih jedinjenja pronalaska, odgovarajuću kombinaciju nanočestica pronalaska ili odgovarajuću kombinaciju nukleinskih kiselina pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0242] U nastavku će biti dat kratak opis priloženih slika. Slike su namenjene da detaljnije prikažu predmetni pronalazak. Međutim, one nemaju za cilj da ograniče predmet pronalaska na bilo koji način.

Slika 1: pokazuje za Primer 1 in vitro afinitet za antigenski peptid CD22-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD22 epitopom CD22-H1.

Slika 2: pokazuje za Primer 1 in vitro afinitet za antigenski peptid CD37-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD37 epitopom CD37-H1.

Slika 3: pokazuje za Primer 1 in vitro afinitet za antigenski peptid CD19-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD19 epitopom CD19-H1.

Slika 4: pokazuje za Primer 1 in vitro afinitet za antigenski peptid CD19-B2 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD19 epitopom CD19-H2.

Slika 5: pokazuje za Primer 1 in vitro afinitet za antigenski peptid TNFRSF13C-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim TNFRSF13C epitopom TNFRSF13C-H1.

Slika 6: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR1 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom CD22-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom CD22-H1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija.

Slika 7: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR1 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom TNFRSF13C-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom TNFRSF13C-H1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija.

Slika 8: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR1 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom CD37-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom CD37-H1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija. Slika 9: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR1 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom CD19-B2 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom CD19-H2. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija. Slika 10: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR1 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom CD19-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom CD19-H1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija. Slika 11: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR3 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom CD22-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom CD22-H1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija. Slika 12: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR3 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom TNFRSF13C-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom TNFRSF13C-B1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija.

Slika 13: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR3 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom CD37-B1 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom CD37-H1. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija. Slika 14: pokazuje za primer 1 in vitro afinitet za antigenski peptid MS4A1-B4 u poređenju sa odgovarajućim humanim MS4A1 epitopom MS4A1-H4.

Slika 15: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR1 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom MS4A1-B4 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom MS4A1-H4. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija.

Slika 16: pokazuje za primer 2 ELISPOT rezultate za HHD DR3 HLA-A2 transgene miševe vakcinisane antigenskim peptidom MS4A1-B4 kao što je prikazano na slici i unakrsnu reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom MS4A1-H4. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.10<6>ukupnih T ćelija.

Slika 17: prikazuje za Primer 3 detekciju CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 CD8<+>T ćelija specifičnih za peptid u perifernoj krvi zdravih donora (pozitivan na HLA-A2).

Slika 18: pokazuje za Primer 3 citotoksični kapacitet klona humanih CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4T ćelija specifičnih za peptide za proširenog in vitro stimulacijom peptidom dobijenim iz mikrobioma. CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 T ćelije specifične za peptide imaju sposobnost da ubijaju T2 ćelije napunjene bakterijskim ili humanim peptidima.

Slika 19: pokazuje za Primer 4 in vitro afinitet za antigenske peptide CD22-B1, CD22-B12 i CD22-B13 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD22 epitopom CD22-H1.

Slika 20: pokazuje za Primer 4 in vitro afinitet za antigenske peptide CD37-B1, CD37-B12, CD37-B13, CD37-B14 i CD37-B15 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD37 epitopom CD37-H1.

Slika 21 pokazuje za Primer 4 in vitro afinitet za antigenske peptide TNFRSF13C-B1, TNFRSF13C-B11,

TNFRSF13C-B12 i TNFRSF13C-B13 u poređenju sa odgovarajućim humanim TNFRSF13C epitopom TNFRSF13C-H1.

Slika 22: pokazuje za Primer 4 in vitro afinitet za antigenski peptid MS4A1-B4, MS4A1-B42 i MS4A1-B43 u poređenju sa odgovarajućim humanim MS4A1 epitopom MS4A1-H4.

PRIMERI

[0243] U nastavku su predstavljeni konkretni primeri koji ilustruju različite realizacije i aspekte pronalaska. PRIMER 1: Antigenski peptidi imaju superioran afinitet prema HLA-A*0201 alelu.

[0244] Zatim, afinitet vezivanja različitih odabranih antigenskih peptida i odgovarajućih fragmenata tumorskih antigena humanih (humani referentni peptidi) za HLA-A*0201 alel je potvrđen in vitro. Naime, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 110 («YIFEHPELL» ovde takođe označen i kao CD22-B1) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidima izvedenim iz CD22 («WVFEHPETL», SEQ ID NO: 270, ovde takođe označen i kao CD22-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 109 («YVFEHPELL» ovde takođe označen i kao CD22-B11) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD22 («WVFEHPETL», SEQ ID NO: 270, ovde takođe označen i kao CD22-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 114 («FLAFVPLQL» ovde takođe označen i kao CD37-B1) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD37 («GLAFVPLQI», SEQ ID NO: 271, ovde takođe označen i kao CD37-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 117 («GMAFVPLLL» ovde takođe označen i kao CD37-B11) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD37 («GLAFVPLQI», SEQ ID NO: 271, ovde takođe označen i kao CD37-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 34 («LLVGILHLV» ovde takođe označen i kao CD19-B1) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD19 («SLVGILHLQ», SEQ ID NO: 260, ovde takođe označen i kao CD19-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 10 («TLLFLTPML» ovde takođe označen i kao CD19-B2) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD19 («FLLFLTPME», SEQ ID NO: 258, ovde takođe označen i kao CD19-H2). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 39 («YLAYLIFEL» ovde takođe označen i kao CD19-B6) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD19 («TLAYLIFCL», SEQ ID NO: 261, ovde takođe označen i kao CD19-H6). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 40 («LQMGGFYLL» ovde takođe označen i kao CD19-B7) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz CD19 («QQMGGFYLC», SEQ ID NO: 262, ovde takođe označen i kao CD19-H7). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 220 («LMFGAPALV» ovde takođe označen i kao TNFRSF13C-B1) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz TNFRSF13C («LLFGAPALL», SEQ ID NO: 279, ovde takođe označen i kao TNFRSF13C-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 231 («ILPGLLFGL» ovde takođe označen i kao TNFRSF13C-B31) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz TNFRSF13C («PLPGLLFGA», SEQ ID NO: 280, ovde takođe označen i kao TNFRSF13C-H3). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 227 («FMPGLLFGA» ovde takođe označen i kao TNFRSF13C-B33) je upoređen sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz TNFRSF13C («PLPGLLFGA», SEQ ID NO: 280, ovde takođe označen i kao TNFRSF13C-H3). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 61 («YILGGLLMV» koja se ovde takođe pominje kao MS4A1-B12) upoređen je sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz MS4A1 (takođe poznatim kao CD20) («IALGGLLMI», SEQ ID NO: 263, koji se ovde takođe pominje kao MS4A1-H1). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 72 («ILIPAGIYL» koja se ovde takođe pominje kao MS4A1-B3) upoređen je sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz MS4A1 (takođe poznatim kao CD20) («LMIPAGIYA», SEQ ID NO: 265, koji se ovde takođe pominje kao MS4A1-H3). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 65 («AMNSLSLYI» koji se ovde takođe pominje kao MS4A1-B4) upoređen je sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz MS4A1 (takođe poznatim kao CD20) («IMNSLSLFA», SEQ ID NO: 264, koji se ovde takođe pominje kao MS4A1-H4). Štaviše, antigenski peptid sekvence SEQ ID NO: 86 («YLFLGILSL» koja se ovde takođe pominje kao MS4A1-B5) upoređen je sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz MS4A1 (takođe poznatim kao CD20) («SLFLGILSV», SEQ ID NO: 266, koji se ovde takođe pominje kao MS4A1-H5).

A. Materijali i postupci

A1. Merenje afiniteta peptida prema T2 ćelijskoj liniji.

[0245] Eksperimentalni protokol je sličan onom koji je potvrđen za peptide predstavljene od strane HLA-A∗0201 (Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(12):3411-21). Merenje afiniteta peptida se postiže pomoću humane tumorske ćelije T2 koja eksprimuje HLA-A∗0201 molekul, ali koja je TAP1/2 negativna i nesposobna da prezentuje endogene peptide.

[0246] T2 ćelije (5.10<4>ćelije po ležištu) se inkubiraju sa opadajućim koncentracijama peptida sa 100 µM na 0,1 µM (4 tačke: 100 µM, 10 µM, 1 µM, 0,1 µM) u medijumu bez seruma (TexMacs) dopunjenom sa 100 ng/µl 2 mikroglobulina na 37°C tokom 16 sati. Ćelije su zatim isprane dva puta i obeležene anti-HLA-A2 antitelom kuplovanim sa PE (klon BB7.2, BD Pharmagen).

[0247] Analiza se vrši pomoću FACS (Macsquant analizator 10- Miltenyi).

[0248] Za svaku koncentraciju peptida, geometrijska sredina označavanja povezanog sa peptidom od interesa se oduzima od pozadinskog šuma i prijavljuje kao procenat geometrijske sredine HLA-A∗0202 obeležavanja dobijenog za referentni peptid HIV pol 589-597 u koncentraciji od 100mM. Relativni afinitet se tada određuje na sledeći način:

Relativni afinitet = koncetracija svakog peptida koji indukuje 20% ekspresije HLA-A*0201 /

koncentraciju referentnog petpida koji indukuje 20% ekspresije HLA-A*0201.

A2. Solubilizacija peptida

[0249] Svaki peptid se rastvori uzimajući u obzir sastav amino-kiselina. Za peptide koji ne sadrže cistein, metionin ili triptofan, dodavanje DMSO je moguće do 10% ukupne zapremine. Ostali peptidi su resuspendovani u vodi ili PBS pH7,4.

B. Rezultati

[0250] Srednje vrednosti relativnog intenziteta fluorescencije (podaci su normalizovani na srednju fluorescenciju HIV peptida, tj. vrednost od 100 je jednaka najboljem vezivanju primećenom sa HIV peptidom) T2 ćelija dobijene za različite koncentracije svakog peptida prikazane su u tabeli 2. ispod:

Tabela 2.

(nastavak)

[0251] Tabela 3 u daljem tekstu rezimira za svaki testirani peptid koncentraciju potrebnu da izazove 20% ekspresije HLA-A2 i in vitro afinitet vezivanja (* normalizovan u odnosu na HIV-pol koncentraciju peptida koji indukuje 20% ekspresije HLA-A2 izvedene tokom istog eksperimenta).

Tabela 3. ND – Neodređeno

(nastavak)

[0252] Pored toga, slike 1 - 5 i 14 prikazuju rezultate za odabrane primere, naime za antigenski peptid CD22-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD22 fragmentom CD22-H1 (slika 1), za antigenski peptid CD37-B1, u poređenju sa odgovarajućim humanim CD37 fragmentom CD37-H1 (Slika 2), za antigenski peptid CD19-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD19 fragmentom CD19-H1 (Slika 3), za antigenski peptid CD19-B2 u poređenju sa odgovarajućim humanim CD19 fragmentom CD19-H2 (Slika 4), za antigenski peptid TNFRSF13C-B1 u poređenju sa odgovarajućim humanim TNFRSF13C fragmentom TNFRSF13C-H1 (Slika 5) i antigenski peptid MS4A1-B4 u poređenju sa odgovarajućim humanim MS4A1 fragmentom MS4A1-B4 (Slika 14).

[0253] Ukratko, rezultati pokazuju da antigenski peptidi kako su ovde opisani ili antigenski peptid prema predmetnom pronalasku pokazuju barem sličan afinitet vezivanja za HLA-A∗0201 kao odgovarajući fragmenti humanog tumorskog antigena. U većini slučajeva, afinitet vezivanja primećen za antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako je ovde opisano bio je jači od onog kod odgovarajućih humanih epitopa. Bez vezivanja ni za jednu teoriju, pretpostavlja se da tako jak afinitet vezivanja antigenskog peptida prema predmetnom pronalasku antigenski peptidi kako su ovde opisani odražavaju njihovu sposobnost da podignu imuni odgovor (tj. njihovu imunogenost).

PRIMER 2: Imunogenost CD22-B1, CD19B1, CD19-B2, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 u HLA-A2 transgenih miševa i unakrsna reaktivnost sa odgovarajućim humanim peptidom.

A. Materijali i postupci

A.1 Mišji model

[0254] Ukratko, HLA-A2 HHD-DR1 humanizovani miševi (C57BL/6JB2mtm1UnclAb-/-Tg(HLA-DRA,HLADRB1* 0101)#GjhTg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe) ili HHD-DR3 humanizovani miševi (C57BL/6JB2mtm1UnclAb-/-Tg(HLADRA, HLA-DRB1*0301)#GjhTg(HLA-A/H2-D/B2M)1 Bpe) su nasumično dodeljeni (na osnovu pola i starosti miša) eksperimentalnim grupama, pri čemu je svaka grupa imunizovana specifičnim peptidom za vakcinaciju (vaccpAg) kombinovanim sa zajedničkim peptidom pomagačem (h-pAg UCP2; sekvenca: KSVWSKLQSIGIRQH; SEQ ID NO: 475; za HHD DR1 miševe ili h-pAg DR3; sekvenca MAKTIAYDEEARRGLERGLN; SEQ ID NO. 473; za HHD DR3 miševe) (kao što je navedeno u Tabeli 4 u daljem tekstu).

Tabela 4. Sastav eksperimentalne grupe. h-pAg: peptid „pomagač”; vacc-pAg: peptid za vakcinaciju. Broj buster injekcija je naveden u zagradama.

(nastavak)

[0255] Peptidi su obezbeđeni na sledeći način:

● vacc-pAg: CD22-B1, CD19-B1, CD19-B2, CD37-B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 svi proizvedeni i obezbeđeni u koncentraciji od 4 mg/ml (4mM);

● h-pAg: DR3 ili UCP2 ponovo suspendovana u čistoj destilovanoj vodi u koncentraciji od 10 mg / mL [0256] Peptidna formulacija za ubrizgavanje (emulzija) pripremljena je sveže svakog dana ubrizgavanja i za svaku grupu. Mešavina za 10 životinja je pripremljena korišćenjem 2 mL luer lock špriceva (4606701V, B BRAUN) i luer konektora (Cole-Parmer, 45502-22): 500 µL mešavine peptida u špricu 1 je emulgovano sa 500 µL IFA u špricu 2, pri velikoj brzini što je brže moguće dok se ne formira gusta (bela pena) emulzija. Svaka emulzija je pripremljena u višku da bi se nadoknadile mrtve zapremine pri ubrizgavanju.

[0257] Životinje su imunizovane na dan 0 (d0) sa udarnom (prvom dozom) injekcijom, a na d14 sa buster injekcijom. Svakom mišu je ubrizgano s.c. na bazi repa 100 mL emulzije na bazi ulja koja je sadržala:

● 60nMol vacc-pAg; 105 nMola UCP2 peptida pomagača (za HHD-DR1 miševe) ili 65 nMol DR3 peptida pomagača (za HHD-DR3 miševe)

● 10 mL da se postigne ukupna zapremina od 50 mL (po mišu);

● Nepotpuni Frojndov adjuvans (IFA) je dodat u odnosu 1:1 (v:v) (50 mL po mišu).

A.2 Analiza

[0258] Sedam dana nakon buster injekcije (tj. na d21), životinje su eutanazirane i slezina je sakupljena. Splenociti su pripremljeni mehaničkim razbijanjem organa nakon čega je usledilo 70 mm-filtriranje i prečišćavanje Ficoll gradijentom gustine.

[0259] Suspenzije ćelija su dalje korišćene u ELISPOT-IFN testu (Tabela 5). Ćelije su kultivisane u 200 µL kompletnog medijuma T ćelija. Eksperimentalni uslovi (duplikati) su bili sledeći: 2x105 ukupnih ćelija po ležištu kada se uzgajaju u prisustvu različitih pAg (10 µM) ili samo u medijumu; i 2x104 ukupnih ćelija kada su kultivisane u prisustvu čestica kuglica napunjenih CD3/CD28 (komplet za aktiviranje/ekspanziju T ćelija, 130-093-627, Miltenyi) (odnos kuglica i ćelija od 1:1). Kulture su procenjene na njihov kapacitet da luče IFN (Diaclone Kit Murine IFN ELISpot, 862.031-005PC), prateći uputstva proizvođača (~16-18č vreme inkubacije pre izvođenja testa). Peptidi koji se koriste za restimulaciju opisani su u tabeli 5.

Tabela 5. Podešavanje ELISPOT-IFNγ testa.

[0260] Tačke su prebrojane na CTL ELISpot čitaču. Crtanje grafikona i statistička analiza vršeni su softverom Prism-5 (GraphPad Software Inc.).

B. Rezultati

[0261] Svi miševi su bili stari od 8 do 13 nedelja na dan početka eksperimenta. U studiji su korišćeni i mužjaci i ženke. Životinje su smeštene u grupama od najviše 6 po kavezu. U vreme žrtvovanja, populacija T ćelija slezine je analizirana protočnom citometrijom, pokazujući da velika većina pripada podskupu CD4+ T ćelija.

[0262] Posle postavljanja na ploče i inkubacije sa odgovarajućim stimulusima, ćelije koje proizvode IFNy su otkrivene i izbrojane. Podaci su dati kao broj tačaka po 1.106 ukupnih T ćelija. Pojedinačne prosečne vrednosti (dobijene iz tri primerka) su zatim korišćene za iscrtavanje prosečnih vrednosti grupe. Statistička analiza za poređenje (sa uslovima srednjeg stanja) izvršena je korišćenjem neuparenog neparametarskog testa (Mann Whitney) (**: p<0.01; *: p<0.05).

[0263] Sve u svemu, vakcinacija sa antigenskim peptidom prema predmetnom pronalasku ili antigenskim peptidima kako je ovde opisano (CD19-B1, CD19-B2, CD22-B1, CD37-B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4) izazvala je značajne T ćelijske odgovore u ELISPOT-IFNγ test kod HHD DR1 miševa (Slike 6-10). Imunogenost CD22-B1, CD37-B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 potvrđena je kod HHD DR1 miševa (Slike 11-13).

[0264] Rezultati (Slika 6) pokazuju da imunizacijaHHD-DR1 miševa sa CD22-B1 omogućava da se indukuju T ćelije koje su u stanju da reaguju snažno nakon izazivanja bilo sa CD22-B1 ili humanim odgovarajućim peptidom CD22-H1. Dakle, CD22-B2 je snažno imunogen i u stanju je da pokrene efikasan imuni odgovor protiv odgovarajućeg humanog peptida.

[0265] Ovi rezultati su potvrđeni kod HHD DR3 miševa koji eksprimuju humani HLA-A2 i HLA-DR3 MHC i nemaju mišje H-2 klase I i klase II MHC (Slika 11).

[0266] Rezultati (Slika 7) pokazuju da imunizacija HHD-DR1 miševa sa TNFRSV13C-B1 omogućava da se indukuju T ćelije koje su u stanju da reaguju snažno nakon izazivanja bilo sa TNFRSF13C-B1 ili humanim odgovarajućim peptidom TNFRSF13-H1. Dakle, TNFRSF13C-B1 je snažno imunogen i u stanju je da pokrene efikasan imuni odgovor protiv odgovarajućeg humanog peptida.

[0267] Ovi rezultati su potvrđeni kod HHD DR3 miševa koji eksprimuju humani HLA-A2 i HLA-DR3 MHC i nemaju mišje H-2 klase I i klase II MHC (Slika 12).

[0268] Rezultati (Slika 8) pokazuju da imunizacija HHD-DR1 miševa sa CD37-B1 omogućava da se indukuju T ćelije koje su u stanju da reaguju snažno nakon izazivanja bilo sa CD37-B1 ili humanim odgovarajućim peptidom CD37-H1. Dakle, CD37-B2 je snažno imunogen i u stanju je da pokrene efikasan imuni odgovor protiv odgovarajućeg humanog peptida.

[0269] Ovi rezultati su potvrđeni kod HHD DR3 miševa koji eksprimuju humani HLA-A2 i HLA-DR3 MHC i nemaju mišje H-2 klase I i klase II MHC (Slika 13).

[0270] Rezultati (Slika 9) pokazuju da imunizacija HHD-DR1 miševa sa CD19-B2 omogućava da se indukuju T ćelije koje su u stanju da reaguju snažno nakon izazivanja bilo sa CD19-B2 ili humanim odgovarajućim peptidom CD19-H2. Otuda, CD19-B2 je snažno imunogen i u stanju je da pokrene efikasan imuni odgovor protiv odgovarajućeg humanog peptida.

[0271] Rezultati (Slika 10) pokazuju da imunizacija HHD-DR1 miševa sa CD19-B1 omogućava da se indukuju T ćelije koje su u stanju da reaguju snažno nakon izazivanja bilo sa CD19-B1 ili humanim odgovarajućim peptidom CD19-H1. Dakle, CD19-B1 je snažno imunogen i u stanju je da pokrene efikasan imuni odgovor protiv odgovarajućeg humanog peptida.

[0272] Rezultati (Slika 15) pokazuju da imunizacija HHD-DR1 miševa sa MS4A1-B4 omogućava da se indukuju T ćelije koje su u stanju da reaguju snažno nakon izazivanja bilo sa MS4A1-B4 ili humanim odgovarajućim peptidom MS4A1-H4. Dakle, MS4A1-B4 je snažno imunogen i u stanju je da pokrene efikasan imuni odgovor protiv odgovarajućeg humanog peptida.

[0273] Ovi rezultati su potvrđeni kod HHD DR3 miševa koji eksprimuju humani HLA-A2 i HLA-DR3 MHC i nemaju mišje H-2 klase I i klase II MHC (Slika 16).

[0274] Sve u svemu, ove studije imunogenosti opisane u Primerima 2 sprovedene na miševima HHD DR3 i HHD DR1 pokazale su da su 6 antigenskih peptida iz pronalaska, CD19-B1, CD19-B2, CD22-B1, CD37-B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 izazvala jake imune odgovore. Unakrsna reaktivnost T ćelija generisanih protiv CD19B1, CD19-B2, CD22-B1, CD37-B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 za odgovarajuće humane peptide prikazana je kod HHD DR3 i HHD DR1 miševa.

[0275] Shodno tome, ovi rezultati pružaju eksperimentalni dokaz da je imunoterapija zasnovana na antigenima u stanju da poboljša odgovor T ćelija in vivoi da su antigenski peptidi prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani su posebno efikasni za tu svrhu.

PRIMER 3: Ex vivo citotoksični efekti CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 specifičnih CD8 humanih T ćelija.

[0276] Višestruka istraživanja podržavaju ideju prisustva repertoara specifičnih T ćelija protiv mikrobnih peptida. Očekuje se da će broj mikrobno specifičnih T ćelija protiv peptida biti nizak, ali dovoljan da se ponovo aktivira kontrolisanim inficiranjem vakcinom.

[0277] Za identifikaciju i funkcionalnu karakterizaciju cirkulišućih CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 specifičnih T ćelija kod ljudi, in vitro je razvijen protokol amplifikacije kako bi se otkrile T ćelije specifične za svaki antigenski peptid i istražio njihov citotoksični kapacitet.

3.1 identifikacija CD8 T ćelija specifičnih za antigenski peptid kod ljudi

[0278] Postupak in vitro amplifikacije i specifični pMHC multimeri su korišćeni za identifikaciju CD22-B1, CD37-B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 specifičnih T ćelija. pMHC multimeri su generisani za sve peptide bakterija i njihove odgovarajuće humane parnjake. PBMC od nekoliko HLA-A*02 zdravih donora (do 19 donora) su sakupljeni, obogaćeni nakon selekcije CD137 i CD8 i podvrgnuti višestrukim krugovima in vitro amplifikacije sa EO2463 peptidima napunjenim T2 ćelijama da bi se povećao broj specifičnih klonova T ćelija. Detekcija CD8 T ćelija specifičnih za OMP peptid korišćenjem citometrijske analize sa fluorescentnim multimerom izvršena je na obogaćenim populacijama CD8 T ćelija.

[0279] Slika 17 prikazuje rezultate dobijene sa jednim HLA-A2 zdravim donorom. Za ovog donora, amplifikacija ćelija omogućava detekciju ćelija specifičnih za MS4A1-B4 (19,7%), ćelija specifičnih za TNFRSF13C-B1 (13%), ćelija specifičnih za CD22-B1 (4,6%) i ćelija specifičnih za CD37-B1 (2,5%).

[0280] U zaključku, ovi rezultati pokazuju prisustvo CD8 T ćelija u krvi zdravih HLA-A2 donora koji mogu prepoznati peptide izvedene iz mikrobioma, i što je još važnije, i humane parnjake peptida.

3.2 Funkcije citotoksičnosti CD8 T specifične za antigenski peptid

[0281] CD8+ T ćelije ekspandovane kako je gore navedeno su korišćene za izvođenje citotoksičnih testova u prisustvu različitih odnosa ciljnih i efektorskih ćelija da bi se procenio njihov citotoksični kapacitet, korišćenjem očitavanja protočne citometrije. Ciljane ćelije su bile T2 ćelijske linije napunjene bakterijskim peptidom ili humanim peptidom. Negativna kontrola je bila neopterećene T2 ćelije i T2 ćelije napunjene irelevantnim peptidom. Kao što je prikazano na slici 18, klon humanih T ćelija specifičnih za antigenski peptid ekspandovan in vitro ima kapacitet da ubija T2 ćelije napunjene svim bakterijskim peptidima, CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4. Što je još važnije, ekspandovani klonovi humanih T ćelija specifičnih za CD22-B1, CD37B1, TNFRSF13C-B1 i MS4A1-B4 in vitro su bili u stanju da ubiju T2 ćelije napunjene humanim TNFR13C (BAFF-R) ili MS4A1 (CD20) peptidom kada jee primećena unakrsna reaktivnost sa bojenjem (Slika 17).

[0282] Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju prisustvo klonova T ćelija kod zdravih dobrovoljaca sposobnih da prepoznaju mikrobni peptid i da ubiju metu mikrobnim peptidima i humanim pandanima. Ovi podaci su posebno ohrabrujući pošto su klonovi T ćelija dobijeni kod zdravih donora, stoga bismo mogli da očekujemo da se specifični klonovi T ćelija mogu efikasno pojačati kod pacijenata koji su bili izloženi imunizaciji antigenskim peptidima pronalaska.

PRIMER 4: Dalji antigenski peptidi imaju superioran afinitet prema HLA-A*0201 alelu.

[0283] Zatim, afinitet vezivanja različitih odabranih antigenskih peptida i odgovarajućih fragmenata tumorskih antigena humanih (humani referentni peptidi) za HLA-A*0201 alel je potvrđen in vitro.

[0284] Naime, antigenski peptidi sekvence SEQ ID NO: 110 («YIFEHPELL» koja se ovde takođe pominje kao CD22-B1), sekvence SEQ ID NO: 107 («LIFEHPERV» koja se ovde takođe pominje kao CD22-B12), i sekvence SEQ ID NO: 108 («RVFEHPELV» ovde takođe označen i kao CD22-B13) upoređeni su sa odgovarajućim referentnim humanim peptidima izvedenim iz CD22 («WVFEHPETL», SEQ ID NO: 270, ovde takođe označen i kao CD22-H1).

[0285] Štaviše, antigenski peptidi sekvence SEQ ID NO: 114 («FLAFVPLQL» koja se ovde takođe pominje kao CD37-B1), sekvence SEQ ID NO: 119 («ILAFVPLYL» koja se ovde takođe pominje kao CD37-B12), sekvence SEQ ID NO: 120 («IMAFVPLAV» koji se ovde takođe pominje kao CD37-B13), sekvence SEQ ID NO: 491 («FLAFVPLDV» koja se ovde takođe pominje kao CD37-B14) i sekvence SEQ ID NO: 493 («VLAFVPLGV» ovde takođe označen i kao CD37-B15) upoređeni su sa odgovarajućim referentnim humanim peptidima izvedenim iz CD37 («GLAFVPLQI», SEQ ID NO: 271, ovde takođe označen i kao CD37-H1).

[0286] Štaviše, antigenski peptidi sekvence SEQ ID NO: 220 («LMFGAPALV» koja se ovde takođe pominje kao TNFRSF13C-B1), sekvence SEQ ID NO: 212 («FLFGAPASA» koja se ovde takođe pominje kao TNFRSF13C-B11), sekvence SEQ ID NO: 217 («LLFGAPAGV» koji se ovde takođe pominje kao TNFRSF13C-B12), i sekvence SEQ ID NO: 224 («VLFGAPAYL» koja se ovde takođe pominje kao TNFRSF13C-B13) upoređeni su sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz TNFRSF13C «LLFGAPALL», SEQ ID NO: 279, koji se ovde takođe naziva TNFRSF13C-H1).

[0287] Naime, antigenski peptidi sekvence SEQ ID NO: 65 («AMNSLSLYI» koja se ovde takođe pominje kao MS4A1-B4), sekvence SEQ ID NO: 70 («YMNSLSLAL» koja se ovde takođe pominje kao MS4A1-B42) i sekvence SEQ ID NO: 477 («AMNSLSLTV» koji se ovde takođe pominje kao MS4A1-B43) upoređeni su sa odgovarajućim referentnim humanim peptidom izvedenim iz MS4A1 (takođe poznatim kao CD20) («IMNSLSLFA», SEQ ID NO: 264, koji se ovde takođe pominje kao MS4A1 -H4).

A. Materijali i postupci

A1. Merenje afiniteta peptida prema T2 ćelijskoj liniji.

[0288] Eksperimentalni protokol je sličan onom koji je potvrđen za peptide predstavljene od strane HLA-A∗0201 (Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(12):3411-21). Merenje afiniteta peptida se postiže pomoću humane tumorske ćelije T2 koja eksprimuje HLA-A∗0201 molekul, ali koja je TAP1/2 negativna i nesposobna da prezentuje endogene peptide.

[0289] T2 ćelije (5.10<4>ćelije po ležištu) se inkubiraju sa opadajućim koncentracijama peptida sa 100 µM na 0,1 µM (4 tačke: 100 µM, 10 µM, 1 µM, 0,1 µM) u medijumu bez seruma (TexMacs) sa dodatkom 100 ng/µl β2 mikroglobulina na 37°C tokom 16 sati. Ćelije su zatim isprane dva puta i obeležene anti-HLA-A2 antitelom kuplovanim sa PE (klon BB7.2, BD Pharmagen).

[0290] Analiza se vrši pomoću FACS (Macsquant analizator 10- Miltenyi).

[0291] Za svaku koncentraciju peptida, geometrijska sredina označavanja povezanog sa peptidom od interesa se oduzima od pozadinskog šuma i prijavljuje kao procenat geometrijske sredine HLA-A∗0202 obeležavanja dobijenog za referentni peptid HIV pol 589-597 u koncentraciji od 100mM.

A2. Solubilizacija peptida

[0292] Svaki peptid se rastvori uzimajući u obzir sastav amino-kiselina. Za peptide koji ne sadrže cistein, metionin ili triptofan, dodavanje DMSO je moguće do 10% ukupne zapremine. Ostali peptidi su resuspendovani u vodi ili PBS pH7,4.

B. Rezultati

[0283] Rezultati su, takođe, prikazani na slikama 19 - 22. Za svaki od testiranih humanih referentnih epitopa CD22-H1 (Slika 19), CD37-H1 (Slika 20), TNFRSF13C-H1 (Slika 21) i MS4A1-H4 (Slika 22), odgovarajući antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani pokazuju jači afinitet vezivanja za HLA-A*0201.

[0294] Ukratko, rezultati pokazuju da antigenski peptid prema predmetnom pronalasku ili antigenski peptidi kako su ovde opisani pokazuju jači afinitet vezivanja za HLA-A*0201 od odgovarajućih fragmenata humanog tumorskog antigena. Kao što je gore naglašeno, bez vezivanja ni za jednu teoriju, pretpostavlja se da tako jak afinitet vezivanja antigenskih peptida prema predmetnom pronalasku kao što je ovde opisano odražava njihovu sposobnost da podignu imuni odgovor (tj. njihovu imunogenost).

Claims

Patentni zahtevi

1. Antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 65.

2. Nanočestica napunjena antigenskim peptidom prema zahtevu 1.

3. Ćelija napunjena antigenskim peptidom prema zahtevu 1.

4. Nukleinska kiselina koja kodira antigenski peptid prema zahtevu 1.

5. Ćelija domaćin sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 4.

6. Citotoksični T limfocit (CTL) specifičan za antigenski peptid prema zahtevu 1.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži

- antigenski peptid prema zahtevu 1,

- nanočesticu prema zahtevu 2, ili

- ćeliju prema zahtevu 3.

8. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, naznačena time što kompozicija sadrži antigenski peptid prema zahtevu 1 i najmanje jedan različit antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 - 64, 66 - 257 i 476-500.

9. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 8 koja sadrži tri ili četiri različita antigenska peptida uključujući antigenski peptid prema zahtevu 1 i dva ili tri različita antigenska peptida izabrana iz grupe koju čine:

- antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 110; - antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:114; i - antigenski peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 220.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 7-9, koja dalje sadrži peptid pomagač.

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time što se pomoćni peptid sastoji od sekvence amino-kiseline prema SEQ ID NO: 475.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 7 do 11, naznačena time što kompozicija sadrži:

- antigenski peptid prema zahtevu 1;

- antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 110;

- antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 114;

- antigenski peptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 220; i

- peptid koji se sastoji od sekvence amino-kiseline prema SEQ ID NO: 475.

13. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 7 do 12, koja dalje sadrži pomoćno sredstvo, naznačena time što je pomoćno sredstvo Montanid.

14. Kombinacija antigenskog peptida prema zahtevu 1 i antigenskog peptida koji se sastoji od sekvence aminokiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs 1 - 64, 66 – 257 i 476 - 500.

15. Antigenski peptid prema zahtevu 1,

nanočestica prema zahtevu 2,

ćelija prema zahtevu 3,

farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 7 do 13, ili

kombinacija prema patentnom zahtevu 14

za upotrebu u medicini.

16. Antigenski peptid, farmaceutska kompozicija ili kombinacija za upotrebu prema zahtevu 15 u prevenciji i/ili lečenju maligniteta B ćelija.

17. Antigenski peptid, farmaceutska kompozicija ili kombinacija za upotrebu prema zahtevu 16, naznačeni time što je malignitet B ćelije B ćelijski limfom izabran iz grupe koju čine ne-Hočkinov limfom (NHL), difuzni B krupnoćelijski limfom (DLBCL), NOS (de novo i transformisan iz indolentnog), primarni medijastinalni B krupnoćelijski limfom (PMBCL), difuzni B krupnoćelijski limfom bogat T ćelijama/histocitima (TCHRBCL), Burkitov limfom, mantel-ćelijski limfom (MCL), limfom marginalne zone (MZL) i folikularni limfom (FL).

18. Multimer peptida-MHC (pMHC) koji sadrži antigenski peptid prema zahtevu 1.