RS65268B1 - Polipeptidni konjugati interleukina-2 i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

PODRUČJE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđije metode za modulisanje bioloških aktivnosti interleukina-2, i, naročito, modulisanje interakcija specifičnih receptora korišćenjem varijante interleukina-2 (IL-2) konjugovane sa polimerom na pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci proteina IL-2 koja interaguje sa interleukin-2 receptorom.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Rak je jedno od najznačajnijih stanja zdravlja. U Sjedinjenim Državama, rak je na drugom mestu nakon srčanih bolesti po smrtnosti i predstavlja jednu od četiri smrti. Generalno se očekuje da će se učestalost karcinoma povećati kako stanovništvo SAD stari, što će dodatno povećati uticaj ovog stanja. Trenutni režimi lečenja raka uspostavljeni 1970-ih i 1980-ih se nisu dramatično promenili. Ovi tretmani, koji uključuju hemoterapiju, zračenje i druge modalitete, uključujući novije ciljane terapije, pokazali su ograničenu ukupnu korist za preživljavanje kada se koriste kod većine uobičajenih karcinoma u uznapredovalom stadijumu pošto, između ostalog, ove terapije prvenstveno ciljaju na tumorsku masu.

[0003] Preciznije, konvencionalna dijagnoza raka i terapije do sada su pokušale da selektivno otkriju i iskorene neoplastične ćelije koje su uglavnom brzo rastuće (tj. ćelije koje čine tumorsku masu). Standardni onkološki režimi često su dizajnirani da uglavnom daju najveću dozu zračenja ili hemoterapeutskog agensa bez nepotrebne toksičnosti, tj. često se nazivaju "maksimalna tolerisana doza" (MTD) ili "doza bez štetnog efekta" (NOAEL). Mnoge konvencionalne hemoterapije protiv raka (npr. agensi za alkilaciju kao što je ciklofosfamid, antimetaboliti kao što je 5-fluorouracil i biljni alkaloidi kao što je vinkristin) i konvencionalne terapije zračenjem ispoljavaju svoje toksične efekte na ć elije raka velikim delom ometajući ćelijske mehanizme koji su uključeni u ćelijski rast i replikaciju DNK. Protokoli hemoterapije takođe često uključuju primenu kombinacije hemoterapeutskih agenasa u pokušaju da se poveća efikasnost lečenja. Uprkos dostupnosti velikog broja hemoterapeutskih sredstava, ove terapije imaju mnoge nedostatke. Na primer, hemoterapeutski agensi su notorno toksični zbog nespecifičnih nuspojava na brzorastuće ćelije, bilo da su normalne ili maligne; npr. hemoterapeutski agensi uzrokuju značajne, i često opasne nuspojave, uključujući depresiju koštane srži, imunosupresiju i gastrointestinalni distres, itd.

Matične ćelije raka

[0004] Matične ćelije raka čine jedinstvenu subpopulaciju (često 0.1-10% ili tako nešto) tumora koji su, u odnosu na preostalih 90% tumora (tj., tumorska masa), tumorogeniji, relativno sporije rastu ili miruju, a često i relativno hemorezistentniji od tumorske mase. S obzirom na to da su konvencionalne terapije i režimi, velikim delom, dizajnirani da napadaju ćelije koje se brzo razmnožavaju (tj. one ćelije raka koje čine tumorsku masu), matične ćelije raka koje često sporo rastu mogu biti relativno otpornije od brže rastuće tumorske mase na konvencionalne terapije i režime. Matične ćelije raka mogu ispoljiti druge karakteristike koje ih čine relativno hemorezistentnim, kao što su rezistencija na više lekova i antiapoptotički putevi. Navedeno bi predstavljalo ključni razlog za neuspeh standardnih režima onkološkog lečenja da osiguraju dugoročnu korist kod većine pacijenata sa uznapredovalim stadijumom karcinoma – tj. neuspeh da se adekvatno ciljaju i iskorene matične ćelije raka. U nekim slučajevima, matična ćelija(e) raka je ćelija začetnik tumora (tj. ona je progenitor ćelija raka koje čine tumorsku masu).

[0005] IL-2 se koristio u lečenju nekoliko karcinoma kao što su karcinom bubrežnih ćelija i metastatski melanom. Komercijalno dostupan IL-2 Aldesleukin® je rekombinantni protein koji je neglikozilovan i uklonjen mu je alanin-1 i rezidua cisteina-125 zamenjena serinom-125 (Whittington et al., 1993). Iako je IL-2 najraniji citokin koji je FDA odobrila u lečenju raka, pokazalo se da IL-2 pokazuje ozbiljne nuspojave kada se koristi u visokim dozama. To je uveliko ograničilo njegovu primenu na potencijalnim pacijentima. Osnovni mehanizam teških nuspojava se pripisuje vezivanju IL-2 za jedan od njegovih receptora, IL-2Rα. Generalno, IL-2 ne samo da može formirati heterotrimerni kompleks sa svojim receptorima uključujući IL-2Rα (ili CD25), IL-2Rβ (ili CD122) i IL-2Rγ (ili CD132) kada su sva tri receptora prisutna u tkivu, već može formirati i heterodimerni kompleks sa IL-2Rβ i IL-2Rγ. U kliničkim uslovima, kada se koristi visoka doza IL-2, IL-2 počinje da vezuje IL-2αβγ, koji je glavni oblik receptora u Tregćelijama. Supresivni uticaj Tregćelija izaziva neželjene efekte primene IL-2 u imunoterapiji raka. Do sada su korišćeni mnogi pristupi da bi se ublažile nuspojave IL-2. Nektar je napravio jedan oblik IL-2 koji koristi 6 PEGilovane lizine da maskira IL2Rα vezujući region na površini IL-2 (Charych et al., 2016). Ovaj oblik PEGilovanog IL-2 ima produžen poluživot, sastoji se od mešavine pojedinačnih i višestrukih PEGilovanih oblika, sadrži vrlo veliku količinu PEG-a, a takođe je pokazao i unapređene sporedne efekte. Međutim, rezultati studija aktivnosti su pokazali da je efikasan oblik PEGilovanog IL-2 u ovoj heterogenoj smesi 6-PEGilovanog IL-2 samo jedan PEGilovani oblik. Prema tome potreban je efikasniji PEGilovani IL-2 sa homogenom dobro definisanom kompozicijom proizvoda koji moduliše nuspojave IL-2.

[0006] Sposobnost da se inkorporiraju ne-genetski kodirane aminokiseline u proteine dozvoljava uvođenje hemijskih funkcionalnih grupa koje bi mogle pružiti vredne alternative funkcionalnim grupama koje se javljaju u prirodi, kao što je epsilon -NH2lizina, sulfhidril -SH cisteina, imino grupa histidina, itd. Poznato je da su određene hemijske funkcionalne grupe inertne prema funkcionalnim grupama koje se nalaze u 20 uobičajenih, genetski kodiranih aminokiselina, ali reaguju čisto i efikasno da formiraju stabilne veze. Azidne i acetilenske grupe, na primer, su poznate u struci da prolaze reakciju cikloadicije Huisgen [3+2] u vodenim uslovima u prisustvu katalitičke količine bakra. Vidi, npr., Tomoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; i, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Uvođenjem azidnog dela molekula u strukturu proteina, na primer, može se inkorporirati funkcionalna grupa koja je hemijski inertna na amine, sulfhidrile, karboksilne kiseline, hidroksilne grupe koje se nalaze u proteinima, ali koja takođe nesmetano i efikasno reaguje sa acetilenskim delom molekula da se formira cikloadicioni proizvod. Važno je da u odsustvu acetilenske rezidue, azid ostaje hemijski inertan i nereaktivan u prisustvu drugih bočnih lanaca proteina i u fiziološkim uslovima.

[0007] Ovaj pronalazak se, između ostalog, bavi problemima povezanim sa aktivnošću i proizvodnjom konjugata IL-2 polipeptida, a takođe se bavi proizvodnjom IL-2 polipeptida sa poboljšanim biološkim ili farmakološkim svojstvima, kao što je pojačana aktivnost protiv tumora i /ili poboljšana konjugacija i/ili poboljšan terapijski poluživot. IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska ciljaju i Tregćelije za koje je poznato da eksprimiraju trimerne IL-2 receptore (alfa, beta i gama) i CD8 ćelije koje primarno eksprimiraju beta i gama dimere IL-2 receptora. IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska smanjuju vezivanje za alfa receptor Treg ćelija i promovišu delimično vezivanje za beta i gama dimere CD8 ćelija, čime se obezbeđuje poboljšana terapeutska primena i poboljšana prognoza za bolesti ili stanja u kojima je IL-2 receptor alfa visoko eksprimiran.

[0008] WO 2012/065086 opisuje konjugate dela molekula IL-2 i polimera. Charych et al., 2016. Clinical Cancer Research, 22(3): 680-690 opisuje inženjerisani IL-2 (NKTR-214) koji ima promenjeno vezivanje za svoj receptor i upotrebu NKTR-21

REZIME PRONALASKA

[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje IL-2 polipeptid sa jednom ne-prirodno kodiranom amino kiselinom, pri čemu IL-2 polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 2, pri čemu je ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u poziciju 45 sekvence SEK ID BR: 2, pri čemu je vodo-rastvorni polimer konjugovan sa IL-2 polipeptidom preko ne-prirodno kodirane aminokiseline preko linkera koji se ne može cepati, pri čemu je ne-prirodno kodirana aminokiselina para acetil fenilalanin, pri čemu je IL- 2 polipeptid glikozilovan, i pri čemu navedeni IL-2 polipeptid ima smanjenu interakciju sa svojom IL-2Ra receptorskom subjedinicom u poređenju sa IL-2 polipeptidom divljeg tipa.

[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metodu za pravljenje IL-2 polipeptida iz pronalaska, metodu koja uključuje kontaktiranje polipeptida IL-2 iz pronalaska sa vodo-rastvornim polimerom, pri čemu vodo-rastvorni polimer sadrži deo molekula koji reaguje sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom.

[0011] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metodu za pravljenje IL-2 polipeptida iz pronalaska, metodu koja se sastoji od kontaktiranja IL-2 polipeptida iz pronalaska sa vodo-rastvornim polimerom, pri čemu vodo-rastvorni polimer sadrži deo molekula koji reaguje sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom, i pri čemu se IL-2 polipeptid dobija ekspresijom u ćelijama sisara ili eukariotskim ćelijama, kao što su CHO ćelije.

[0012] Pronalazak takođe obezbeđuje IL-2 polipeptid koji se može dobiti metodama iz pronalaska.

[0013] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži IL-2 polipeptid iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu su IL-2 polipeptidi u kompoziciji homogeni.

[0014] Pronalazak takođe obezbeđuje IL-2 polipeptid ili kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u lečenju raka.

[0015] U jednoj realizaciji, IL-2 polipeptid je monopegilovan. U jednoj realizaciji, IL-2 polipeptid je dipegilovan. U jednoj realizaciji, IL-2 polipeptid ima više od dva (2) poli(etilen) glikola vezana za njega. Takvi IL-2 polipeptidi se mogu koristiti za modulaciju aktivnosti ćelija imunog sistema.

[0016] U ovoj ili bilo kojoj od realizacija ovog pronalaska, IL-2 polipeptid može sadržati zreli humani interleukin-2 pune dužine (bez signalnog peptida), vezan za PEG polimer. U ovoj ili bilo kojoj od realizacija ovog pronalaska, IL-2 polipeptid može sadržati humani, zreli, pune dužine (bez signalnog peptida) interleukin-2 vezan kovalentnom vezom za PEG polimer ili drugi biološki aktivni molekul. U nekim realizacijama, biološki aktivni molekul je modifikovan, kao neograničavajući primer biološki aktivni molekul može uključivati jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina.

[0017] U PEG-IL2 konjugatima, PEG ili drugi vodo-rastvorni polimer može biti konjugovan sa IL-2 proteinom ili sa biološki aktivnim molekulom direktno ili preko linkera. Pogodni linkeri uključuju, na primer, linkere koji se mogu cepati i koji se ne mogu cepati.

[0018] U jednoj realizaciji pronalaska, IL-2 polipeptid je za upotrebu u lečenju raka kod sisara, npr. sisara uključujući, ali ne ograničavajući se na one sa jednim ili više od sledećih stanja: solidni tumor, hematološki tumor, rak debelog crijeva, rak jajnika, rak dojke, melanom, rak pluća, glioblastom i leukemija, administriranjem efikasne količine IL-2 polipeptida. U nekim realizacijama kancer se karakteriše visokim nivoom Treg ćelija. U nekim realizacijama kancer karakteriše visoka ekspresija IL-2 alfa receptora. Nasledne bolesti se takođe mogu lečiti administriranjem pacijentu efikasne količine IL-2 polipeptida. Stanje ili bolest može karakterisati visoka ekspresije IL-2 alfa receptora. Stanje ili bolest može karakterisati visok nivo Treg ćelija. U nekim realizacijama, kancer se leči smanjenjem, blokiranjem ili utišavanjem ekspresije IL-2 alfa receptora. U nekim realizacijama, kancer se leči smanjenjem vezivanja IL-2 alfa receptora na površini Treg ćelija što dovodi do smanjenja proliferacije Treg ćelija u kanceru koji se leči.

[0019] Kako se ovde koristi, interleukin 2 ili IL-2 je definisan kao protein koji (a) ima aminokiselinsku sekvencu suštinski identičnu poznatoj sekvenci IL-2, uključujući IL-2 muteine, zrelu sekvencu IL-2 (tj. bez sekretorne vodeće sekvence) i IL-2 kako je otkriveno u SEK ID BR: 1, 2, 3, 5 ili 7 ove prijave i (b) ima najmanje jednu biološku aktivnost koja je zajednička za nativni ili divlji tip IL-2. Za potrebe ovog pronalaska, ovde su opisani i glikozilovani (npr. proizvedeni u eukariotskim ćelijama kao što su kvasac ili CHO ćelije) i neglikozilovani (npr. hemijski sintetisan ili proizveden u E. coli) IL-2. Takođe su uključeni i drugi mutanti i drugi analozi, uključujući virusni IL-2, koji zadržavaju biološku aktivnost IL-2.

[0020] U nekim realizacijama, pronalazak takođe obezbeđuje monomere i dimere IL-2 polipeptida. U nekim realizacijama pronalazak takođe obezbeđuje trimere IL-2 polipeptida. U nekim realizacijama pronalazak obezbeđuje multimere IL-2 polipeptida. U nekim realizacijama pronalazak takođe obezbeđuje IL-2 dimere koji sadrže jednu ili više ne-prirodno kodiranih amino kiselina. U nekim realizacijama ovaj pronalazak obezbeđuje multimere IL-2 koji sadrže jednu ili više ne-prirodno kodiranih amino kiselina. U nekim realizacijama pronalazak obezbeđuje homogene IL-2 multimere koji sadrže jednu ili više neprirodno kodiranih aminokiselina, pri čemu svaki IL-2 polipeptid ima istu aminokiselinsku sekvencu. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje heterogene IL-2 multimere, pri čemu najmanje jedan od IL-2 polipeptida sadrži najmanje jednu ne-prirodno kodiranu amino kiselinu, pri čemu bilo koji ili svaki od IL-2 polipeptida u multimeru može imati različite aminokiselinske sekvence.

[0021] U nekim realizacijama, IL-2 polipeptidi sadrže jednu ili više post-translacionih modifikacija. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid je vezan za linker, polimer ili biološki aktivni molekul. U nekim realizacijama monomeri IL-2 su homogeni. U nekim realizacijama IL-2 dimeri su homogeni. U nekim realizacijama IL-2 multimeri su konjugovani sa jednim polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim realizacijama IL-2 multimeri su konjugovani sa dva polimera rastvorljiva u vodi. U nekim realizacijama IL-2 multimeri su konjugovani sa tri polimera rastvorljiva u vodi. U nekim realizacijama IL-2 multimeri su konjugovani sa više od tri polimera rastvorljiva u vodi. U nekim realizacijama, kada je IL-2 polipeptid je vezan za linker dovoljno dug da omogući formiranje dimera. U nekim realizacijama, kada je IL-2 polipeptid vezan za linker dovoljno dug da omogući formiranje trimera. U nekim realizacijama, kada je IL-2 polipeptid vezan za linker dovoljno dug da omogući formiranje multimera. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid je vezan za bifunkcionalni polimer, bifunkcionalni linker ili najmanje jedan dodatni IL-2 polipeptid. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptidi sadrže jednu ili više post-translacionih modifikacija. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid je vezan za linker, polimer ili biološki aktivni molekul.

[0022] U nekim realizacijama, vodo-rastvorni polimer sadrži deo molekula poli(etilen glikola) (PEG). U nekim realizacijama, molekul poli(etilen glikola) je bifunkcionalni polimer. U nekim realizacijama, bifunkcionalni polimer je vezan za drugi polipeptid. U nekim realizacijama, drugi polipeptid je IL-2. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid sadrži najmanje dve aminokiseline vezane za vodo-rastvorni polimer koji sadrži deo molekula poli(etilen glikola).

[0023] U jednoj realizaciji, IL-2 polipeptid iz ovog pronalaska je vezan za terapeutsko sredstvo, kao što je imunomodulatorno sredstvo. Imunomodulatorno sredstvo može biti bilo koji agens koji ima terapeutsko dejstvo na imune ćelije koji se može koristiti kao terapeutsko sredstvo za konjugaciju sa IL-2 polipeptidom.

[0024] Jedna ne-prirodno kodirana aminokiselina može biti inkorporirana u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 5355, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 7880, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 30, 102, 10 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12 , 130, 131, 132, 133, ili dodata na karboksilni terminus proteina, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća amino kiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). U nekim realizacijama, jedan ili više biološki aktivnih molekula je direktno konjugovan sa IL-2 polipeptidom. Jedan ili više biološki aktivnih molekula mogu biti konjugovani sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina u IL-2 polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid iz ovog pronalaska je vezan za linker. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid vezan za linker dalje sadrži biološki aktivan molekul. U nekim realizacijama ovog pronalaska, linker je vezan za ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.

[0025] Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 32, 35, 37, 38, 42, 43, 44, 45 , 48, 49, 61, 62, 64, 65, 68, 72, 76 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pre pozicije 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 35, 37, 42, 45, 49, 61 ili 65, i bilo koja njihova kombinacija (od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuću poziciju amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 45, 61 i 65, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuću poziciju amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 45 i 65, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća aminokiselinska pozicija u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). U pronalasku, ne-prirodno kodirana amino kiselina je inkorporirana na poziciju 45 u IL-2 polipeptidu iz pronalaska.

[0026] Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na bilo kojoj poziciji u jednom ili više od sledećih regiona koji odgovaraju sekundarnim strukturama ili specifičnim aminokiselinama u IL-2 ili njegovoj varijanti kako sledi: na mestima hidrofobnih interakcija; na ili u blizini mesta interakcije sa subjedinicama IL-2 receptora uključujući IL2Rα; u okviru aminokiselinskih pozicija 3 ili 35 do 45; u okviru prvih 107 N-terminalnih aminokiselina; u okviru aminokiselinskih pozicija 61-72; svaku u SEK ID BR: 2, ili odgovarajućoj poziciji aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. U nekim realizacijama, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 34, 39, 39 41, 42, 43 i bilo koja njihova kombinacija sekvence SEK ID BR: 2, ili odgovarajućih aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 8688, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 1, 1, 1, 1, 101113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili dodate na karboksilni terminus proteina, i bilo koja njihova kombinacija sekvence SEK ID BR: 2 ili odgovarajuće aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7.

[0027] Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za lek ili drugi biološki aktivan molekul, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 03 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 56 , 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 08 , 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 11, 11, 11, 11. , 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili dodata na karboksilni terminus proteina, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuće amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0028] Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za lek ili drugi biološki aktivni molekul, uključujući, ali ne ograničavajući se na, na mesta hidrofobnih interakcija; na ili u blizini mesta interakcije sa subjedinicama IL-2 receptora uključujući IL2Rα; u okviru aminokiselinskih pozicija 3 ili 35 do 45; u okviru prvih 107 N-terminalnih aminokiselina; u okviru aminokiselinskih pozicija 61-72; svakoj od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće pozicije amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za lek ili drugi biološki aktivan molekul, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije: pre pozicije 1 (tj. na N- terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 3436, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 i bilo koja njihova kombinacija SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za lek ili drugi biološki aktivan molekul, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije u IL-2 ili njegovoj varijanti: 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 271 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 796 , 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 , 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili dodata na karboksilni kraj proteina, i bilo koja njihova kombinacija SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti i vezane za lek ili drugi biološki aktivan molekul: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0029] Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za linker, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije: pre pozicije 1 (tj. na N- terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 4850, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 7375, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 12, 12, 12, 12, 12, 12 , 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili bilo koja kombinacija SEK ID BR: 2 ili odgovarajuće aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti i vezane za linker: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44 , 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća amino kiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0030] Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za linker koji je dalje vezan za vodo-rastvorni polimer ili biološki aktivan molekul, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije: pre pozicije 1 (tj. na N- terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 2 41 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 76 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 291 , 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 1, 1, 1, 1, 15 , 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili dodata na karboksilni terminus proteina i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID NO: 2 ili odgovarajuće amino kiseline u SEK ID NO: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti i mogu biti vezane za linker koji je dalje vezan za vodo-rastvorni polimer ili biološki aktivni molekul, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije: pre pozicije 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEQ ID BR: 2 ili odgovarajuća aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0031] Ne-prirodna aminokiselina na jednoj ili više ovih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti vezana za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicijae: pre pozicije 1 (tj. na N-terminus), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 8 , 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 372 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 8 , 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 12, 12, 12, 12, 12, 123 , 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili dodata na karboksilni kraj proteina, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 3, 5 ili 7). Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti i mogu biti vezane za linker koji je dalje vezan za vodo-rastvorni polimer, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pozicije: 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0032] IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše afinitet IL-2 za subjedinicu IL-2 receptora ili njegove varijante. IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše afinitet IL-2 ili njegove varijante za IL-2 receptor ili vezujućeg partnera, uključujući, ali ne ograničavajući se na, protein, polipeptid, lipid, masnu kiselinu, mali molekul ili nukleinsku kiselinu. IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše stabilnost IL-2 u poređenju sa stabilnošću odgovarajućeg IL-2 bez supstitucije, adicije ili delecije. Stabilnost i/ili rastvorljivost se mogu meriti korišćenjem brojnih različitih testova poznatih prosečnom stručnjaku. Takvi testovi uključuju, ali nisu ograničeni na SE-HPLC i RP-HPLC. IL-2 može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše imunogenost IL-2 u poređenju sa imunogenošću odgovarajućeg IL-2 bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 može uključivati supstituciju, adiciju, ili deleciju koja moduliše poluživot ili vreme cirkulacije IL-2 u serumu u poređenju sa poluživotom ili vremenom cirkulacije odgovarajućeg IL-2 bez supstitucije, adicije ili delecije.

[0033] IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava rastvorljivost IL-2 u vodi u poređenju sa rastvorljivošću u vodi odgovarajućeg IL-2 ili njegove varijante bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 ili njegova varijanta može uključivati supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava rastvorljivost IL-2 ili njegove varijante proizvedene u ćeliji domaćinu u poređenju sa rastvorljivošću odgovarajućeg IL-2 ili njegove varijante bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 ili njegova varijanta može uključivati supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava ekspresiju IL-2 u ćeliji domaćinu ili povećava sintezu in vitro u poređenju sa ekspresijom ili sintezom odgovarajućeg IL-2 ili njegove varijante bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 ili njegova varijanta koja sadrži ovu supstituciju zadržava agonističku aktivnost i zadržava ili poboljšava nivoe ekspresije u ćeliji domaćinu. IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava otpornost na proteazu IL-2 ili njegove varijante u poređenju sa otpornošću na proteazu odgovarajućeg IL-2 ili njegove varijante bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše aktivnost transdukcije signala IL-2 receptora u poređenju sa aktivnošću receptora nakon interakcije sa odgovarajućim IL-2 ili njegovom varijantom bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše njegovo vezivanje za drugi molekul kao što je receptor u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg IL-2 bez supstitucije, adicije ili delecije.

[0034] Ovde su opisane metode za lečenje proliferativnog stanja, raka, tumora ili prekanceroznog stanja kao što je displazija, sa PEG-IL-2 i najmanje jednim dodatnim terapeutskim ili dijagnostičkim sredstvom. Dodatno terapeutsko sredstvo može biti npr. citokin ili antagonist citokina, kao što je IL-12, interferonalfa ili receptor antiepidermalnog faktora rasta, doksorubicin, epirubicin, anti-folat, npr. metotreksat ili fluoruracil, irinotekan, ciklofosfamid, radioterapija, hormonska ili antihormonska terapija, npr. androgen, estrogen, antiestrogen, flutamid ili dietilstilbestrol, operacija, tamoksifen, ifosfamid, mitolaktol, sredstvo za alkilaciju, npr. melfalan ili cis-platin, etopozid, vinorelbin, vinblastin, vindezin, glukokortikoid, antagonist histaminskog receptora, inhibitor angiogeneze, zračenje, senzitizer zračenja, antraciklin, vinca alkaloid, taksan, npr. paklitaksel i docetaksel, inhibitor ćelijskog ciklusa, npr. inhibitor kinaze zavisan od ciklina, inhibitor kontrolne tačke, imunomodulatorni lek, imunostimulatorni lek, monoklonsko antitelo protiv drugog tumorskog antigena, kompleks monoklonskih antitela i biološki aktivnog molekula, adjuvans T ćelija, transplant koštane srži ili antigen prezentujuće ć elije, npr. terapija dendritičnim ćelijama. Vakcine se mogu obezbediti, na primer, kao rastvorljivi protein ili kao nukleinska kiselina koja kodira protein (videti, npr., Le et al., supra; Greco i Zellefsky (ur.) (2000) Radiotherapy of Prostate Cancer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro i Recht (2001) New Engl. J. Med. 344:1997-2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339:974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med. 331:996-1004; Naylor and Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3:1205-1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350:351-360; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med.

344:783-792; Kudelka, et al. (1998) New Engl. J. Med.338:991-992; van Netten, et al. (1996) New Engl. J. Med.334:920-921).

[0035] Takođe su obezbeđene metode za lečenje ekstramedularne hematopoeze (EMH) raka. EMH je opisan (vidi, npr., Rao, et al. (2003) Leuk. Lymphoma 44:715-718; Lane, et al. (2002) J. Cutan. Pathol.

29:608-612).

[0036] PEG-IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše vezivanje njegovog receptora ili subjedinice receptora u poređenju sa aktivnošću vezivanja receptora ili subjedinice receptora odgovarajućeg IL-2 ili njegove varijante bez supstitucije, adicije ili delecije. IL-2 ili njegova varijanta može uključivati supstituciju, adiciju ili deleciju koja inhibira njegovu aktivnost vezanu za vezivanje receptora ili subjedinice receptora u poređenju sa aktivnošću vezivanja receptora ili subjedinice receptora odgovarajućeg IL-2 ili njegove varijante bez supstitucije, adicije ili delecije.

[0037] IL-2 ili njegova varijanta može sadržati supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava kompatibilnost IL-2 ili njegove varijante sa farmaceutskim konzervansima (npr. m-krezolom, fenolom, benzil alkoholom) u poređenju sa kompatibilnošću odgovarajućeg divljeg tipa IL-2 bez supstitucije, adicije ili delecije. Ova povećana kompatibilnost bi omogućila pripremu konzervisane farmaceutske formulacije koja održava fizičko-hemijska svojstva i biološku aktivnost proteina tokom skladištenja.

[0038] Jedna ili više inženjerisanih veza mogu biti napravljene sa jednom ili više ne-prirodnih amino kiselina. Intramolekulska veza se može stvoriti na mnogo načina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, reakciju između dve aminokiseline u proteinu pod odgovarajućim uslovima (jedna ili obe aminokiseline mogu biti ne-prirodne aminokiseline); reakcija sa dve aminokiseline, od kojih svaka može biti prirodno kodirana ili ne-prirodno kodirana, sa linkerom, polimerom ili drugim molekulom pod odgovarajućim uslovima; itd.

[0039] Jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti sa jednom ili više prirodnih ili ne-prirodnih aminokiselina. Aminokiselindke supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti sa prirodnim ili ne-prirodnim aminokiselinama, pod uslovom da je najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. Jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti sa jednom ili više aminokiselina koje se javljaju u prirodi, a dodatno je najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. Supstitucije aminokiselina u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti sa bilo kojom prirodnom aminokiselinom i najmanje jednom supstitucijom sa neprirodno kodiranom amino kiselinom. Jedna ili više prirodnih aminokiselina mogu biti supstituisane na jednoj ili više od sledećih pozicija IL-2 ili njegove varijante: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 i bilo koja njihova kombinacija (od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće aminokiselinske pozicije u SEK ID BR: 3, 5, ili 7). Jedna ili više prirodnih aminokiselinskih supstitucija mogu biti na jednoj ili više od sledećih pozicija IL-2 ili njegove varijante: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 79 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 1106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12. , 131, 132, 133, ili dodate na karboksilni terminus proteina, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće aminokiselinske pozicije u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti sa najmanje jednom prirodnom amino kiselinom i najmanje jednom supstitucijom sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti sa najmanje dve prirodne aminokiseline i najmanje jednom supstitucijom sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. Jedna ili više aminokiselina koje se prirodno javljaju ili kodiraju može biti bilo koja od 20 uobičajenih aminokiselina uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, glutamin, glutaminsku kiselinu, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin. Najmanje jedna supstitucija prirodne aminokiseline može biti na sledećim pozicijama u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 38, 46 ili 65. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja može biti na poziciji 38 u IL-2 ili njegovoj varijanti. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja na poziciji 38 u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti odabrana između bilo koje od 20 uobičajenih prirodnih aminokiselina uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, glutamin, glutamin kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja na poziciji 38 u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti supstitucija alanina. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja može biti na poziciji 46 u IL-2 ili njegovoj varijanti. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja na poziciji 46 u IL-2 ili njenoj varijanti može biti odabrana između bilo koje od 20 uobičajenih prirodnih aminokiselina uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, glutamin, glutamin kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja na poziciji 46 u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti supstitucija leucinom ili izoleucinom. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja može biti na poziciji 65 u IL-2 ili njegovoj varijanti. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja na poziciji 65 u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti odabrana između bilo koje od 20 uobičajenih prirodnih aminokiselina uključujući, ali ne ograničavajući se na, alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, glutamin, glutaminsku kiselinu, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin. Supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja, na poziciji 65 u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti supstitucija argininom. Supstitucija aminokiseline u IL-2 ili njegovoj varijanti može biti supstitucija aminokiseline koja se prirodno javlja na poziciji 38, 46 ili 65 i najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom inkorporiranom u jednu ili više sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće pozicije aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti prirodne aminokiselinske supstitucije na poziciji 38 i najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom inkorporiranom u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće pozicije aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti supstitucija prirodne aminokiseline na poziciji 46 i najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom inkorporiranom u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće pozicije aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti supstitucija prirodne aminokiseline na poziciji 65 i najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom inkorporiranom u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće pozicije aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti supstitucija prirodne aminokiseline na poziciji 38 i/ili 46 i/ili 65 i najmanje jedna supstitucija sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom ugrađenom u jednu ili više sledećih pozicije u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće pozicije aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti supstitucija prirodne aminokiseline na poziciji 38 i ne-prirodno kodirane amino kiseline inkorporirane u IL-2 ili njegovu varijantu na poziciji 45 (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti supstitucija prirodne aminokiseline na pozicijama 38 i 46 i ne-prirodno kodirane amino kiseline inkorporirane u IL-2 ili njegovu varijantu na poziciji 45 (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti prirodna aminokiselinska supstitucija na pozicijama 38 i 65 i ne-prirodno kodirana amino kiselina inkorporirana u IL-2 ili njegovu varijantu na poziciji 45 (SEQ ID NO : 2, ili odgovarajući pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7). Aminokiselinske supstitucije u IL-2 ili njegovoj varijanti mogu biti supstitucija prirodne aminokiseline na pozicijama 38, 46 i 65, i ne-prirodno kodirane aminokiseline inkorporirane u IL-2 ili njegovu varijantu na poziciji 45 (od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0040] Ne-prirodno kodirana aminokiselina može sadržati karbonilnu grupu, acetilnu grupu, aminooksi grupu, hidrazinsku grupu, hidrazidnu grupu, semikarbazidnu grupu, azidnu grupu ili alkin grupu.

[0041] Ne-prirodno kodirana aminokiselina može sadržati karbonilnu grupu. Ne-prirodno kodirana aminokiselina može imati strukturu:

u kojoj n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil ili supstituisani aril; R2je H, alkil, aril, supstituisani alkil i supstituisani aril; i R3je H, amino kiselina, polipeptid ili grupa za modifikaciju amino terminusa, a R4je H, amino kiselina, polipeptid ili grupa za modifikaciju karboksi terminusa.

[0042] Polipeptid može biti IL-2 agonist, parcijalni agonist, antagonist, parcijalni antagonist ili inverzni agonist. IL-2 agonist, parcijalni agonist, antagonist, parcijalni antagonist ili inverzni agonist može sadržati ne-prirodno kodiranu aminokiselinu vezanu za vodo-rastvorni polimer, vodo-rastvorni polimer može sadržati deo molekula poli(etilen glikola). IL-2 agonist, parcijalni agonist, antagonist, parcijalni antagonist ili inverzni agonist može sadržati ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i jednu ili više posttranslacionih modifikacija, linkera, polimera ili biološki aktivnih molekula.

[0043] Ovde su opisane izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide u SEK ID BR: 1, 2, 3, 5 ili 7 i izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji pod strogim uslovima hibridizuje sa polinukleotidima koji kodiraju polipeptide SEK ID NO: 1, 2, 3, 5 ili 7. Ovde su opisane izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane kao SEK ID BR: 1, 2, 3, 5 ili 7 pri čemu polinukleotid sadrži najmanje jedan selektorski kodon. Ovde su opisane izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane kao SEQ ID NO.: 1, 2, 3, 5 ili 7 sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina. Stručnjacima je očigledno da veliki broj različitih polinukleotida može kodirati bilo koji polipeptid iz ovog pronalaska.

[0044] U nekim realizacijama, selektorski kodon se bira iz grupe koju čine amber kodon, oker kodon, opal kodon, jedinstveni kodon, retki kodon, petobazni kodon i četvorobazni kodon.

[0045] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metode za pravljenje IL-2 polipeptida kako je definisano u zahtevima vezanim za biološki aktivan molekul. U nekim realizacijama, metoda uključuje dovođenje u kontakt IL-2 polipeptida koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu sa biološki aktivnim molekulom koji sadrži deo moolekula koji reaguje sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u IL-2 polipeptidu je reaktivna prema biološki aktivnom molekulu koji je inače nereaktivan prema bilo kojoj od 20 uobičajenih aminokiselina. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u IL-2 polipeptid je reaktivna prema linkeru, polimeru ili biološki aktivnom molekulu koji je inače nereaktivan prema bilo kojoj od 20 uobičajenih aminokiselina, koja je povezana sa biološki aktivnim molekulom.

[0046] U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid vezan za vodorastvorni polimer ili biološki aktivan molekul nastaje reakcijom IL-2 polipeptida koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil sa polimerom rastvornim u vodi ili biološki aktivnim molekulom koji sadrži aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupu. U nekim realizacijama, aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupa je vezana za biološki aktivni molekul preko amidne veze. U nekim realizacijama, aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupa je vezana za vodo-rastvorni polimer ili biološki aktivan molekul preko karbamatne veze.

[0047] U nekim realizacijama, metoda uključuje dovođenje u kontakt izolovanog konjugata IL-2-biološki aktivnog molekula koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu sa vodo-rastvornim polimerom koji sadrži deo molekula koji reaguje sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. U nekim realizacijama, neprirodno kodirana amino kiselina inkorporirana u IL-2 konjugat je reaktivna prema vodo-rastvornom polimeru koji je inače nereaktivan prema bilo kojoj od 20 uobičajenih aminokiselina. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u IL-2 konjugat je reaktivna prema linkeru, polimeru ili biološki aktivnom molekulu koji je inače nereaktivan prema bilo kojoj od 20 uobičajenih aminokiselina.

[0048] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metode za pravljenje IL-2 polipeptida kako je definisano u zahtevima vezanim za vodo-rastvorni polimer, pri čemu metoda uključuje dovođenje u kontakt IL-2 polipeptida koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu sa vodom -rastvorljivi polimer koji sadrži deo koji reaguje sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u IL-2 polipeptid je reaktivna prema vodo-rastvornom polimeru koji je inače nereaktivan prema bilo kojoj od 20 uobičajenih aminokiselina. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u IL-2 polipeptid je reaktivna prema linkeru, polimeru ili biološki aktivnom molekulu koji je inače nereaktivan prema bilo kojoj od 20 uobičajenih aminokiselina.

[0049] U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid vezan za vodo-rastvorni polimer nastaje reakcijom IL-2 polipeptida koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil sa molekulom poli(etilen glikola) koji sadrži aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazidnu grupu. U nekim realizacijama, aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupa je vezana za molekul poli(etilen glikola) preko amidne veze. U nekim realizacijama, aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupa je vezana za molekul poli(etilen glikola) preko karbamatne veze.

[0050] U nekim realizacijama, molekul poli(etilen glikola) ima molekulsku težinu između oko 0.1 kDa i oko 100 kDa. U nekim realizacijama, molekul poli(etilen glikola) ima molekulsku težinu između 0.1 kDa i 50 kDa. U nekim realizacijama, poli(etilen glikol) ima molekulsku težinu između 1 kDa i 25 kDa, ili između 2 i 22 kDa, ili između 5 kDa i 20 kDa. Na primer, molekulska težina poli(etilen glikol) polimera može biti oko 5 kDa, ili oko 10 kDa, ili oko 20 kDa. Na primer, molekulska težina poli(etilen glikol) polimera može biti 5 kDa ili 10 kDa ili 20 kDa. U nekim realizacijama molekul poli(etilen glikola) je 20K 2-granasti PEG. U nekim realizacijama molekul poli(etilen glikola) je linearni 5K PEG. U nekim realizacijama molekul poli(etilen glikola) je linearni 10K PEG. U nekim realizacijama molekul poli(etilen glikola) je linearni 20K PEG. U nekim realizacijama, molekulska težina polimera poli(etilen glikola) je prosečna molekulska težina. U određenim realizacijama, prosečna molekulska težina je prosečna brojčana molekulska težina (Mn). Prosečna molekulska težina se može odrediti ili izmeriti korišćenjem GPC ili SEC, SDS/PAGE analize, RP-HPLC, masene spektrometrije ili kapilarne elektroforeze. Jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 ili 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7), i IL-2 ili njegova varijanta može biti vezana za linearni 20K poli(etilen glikol) molekul. Jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 35, 37, 42, 45, 49, 61 ili 65, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuće aminokiselinske pozicije u SEK ID BR: 3, 5 ili 7), a IL-2 ili njegova varijanta mogu biti vezani za linearni 20K poli(etilen glikol) molekul. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina, para-acetil-fenilalanin je inkorporirana na poziciju 45 u IL-2 polipeptidu, a IL-2 polipeptid je vezan za linearni 20K poli(etilen glikol) molekul.

[0051] U nekim realizacijama, molekul poli(etilen glikola) je granasti polimer. U nekim realizacijama, svaka grana poli(etilen glikol) razgranatog polimera ima molekulsku težinu između 1 kDa i 100 kDa, ili između 1 kDa i 50 kDa. U nekim realizacijama, svaka grana poli(etilen glikol) razgranatog polimera ima molekulsku težinu između 1 kDa i 25 kDa, ili između 2 i 22 kDa, ili između 5 kDa i 20 kDa. Na primer, molekulska težina svake grane poli(etilin glikol) razgranatog polimera može biti oko 5 kDa, ili oko 10 kDa, ili oko 20 kDa. Na primer, molekulska težina svake grane poli(etilen glikol) razgranatog polimera može biti 5 kDa ili 10 kDa ili 20 kDa. U nekim realizacijama molekul poli(etilen glikola) je 20K 2-granasti PEG. U nekim realizacijama molekul poli(etilen glikola) je 20K 4-granasti PEG. U nekim realizacijama, molekulska težina poli(etilen glikol) polimera je prosečna molekulska težina. U određenim realizacijama, prosečna molekulska težina je prosečna brojčana molekulska težina (Mn). Prosečna molekulska težina se može odrediti ili izmeriti korišćenjem GPC ili SEC, SDS/PAGE analize, RP-HPLC, masene spektrometrije ili kapilarne elektroforeze. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 ili 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7), i IL-2 ili njegova varijanta može biti vezana za 20K 2-granasti poli(etilen glikol) molekul. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 35, 37, 42, 45, 49, 61 ili 65, i bilo koja njihova kombinacija (od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija aminokiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7), i IL-2 ili njegova varijanta mogu biti vezani za 20K 2-granasti poli(etilen glikol) molekul. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina para-acetilfenilalanin je inkorporiran na poziciju 45 u IL-2 polipeptidu, a IL-2 polipeptid je vezan za 20K 2-granasti poli(etilen glikol) molekul. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 ili 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7), i IL-2 ili njegova varijanta može biti vezana za 20K 4-granasti poli(etilen glikol) molekul. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pozicija 35, 37, 42, 45, 49, 61 ili 65, i bilo koja njihova kombinacija (od SEK ID BR: 2, ili odgovarajuća pozicija amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7), i IL-2 ili njegova varijanta može biti vezana za 20K 4-granasti poli(etilen glikol) molekul. U nekim realizacijama, ne-prirodno kodirana aminokiselina, para-acetil-fenilalanin, inkorporirana je na poziciju 45 SEK ID BR:2 u IL-2 polipeptidu, a IL-2 polipeptid je vezan za 20K 4-granasti poli(etilen glikol) molekul.

[0052] U nekim realizacijama, vodo-rastvorni polimer vezan za IL-2 polipeptid sadrži deo molekula polialkilen glikola.

[0053] U jednoj realizaciji ovog pronalaska, linker je dovoljno dugačak da omogući fleksibilnost i omogući formiranje dimera. U jednom aspektu pronalaska, linker ima najmanje 3 aminokiseline, ili 18 atoma, u dužini tako da omogućava formiranje dimera.

[0054] Takođe su otkrivene metode lečenja pacijenta kojem je takav tretman potreban efikasnom količinom PEGIL-2 konjugata ili njegove varijante. Otkrivene metode uključuju administriranje pacijentu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži PEG-IL-2 ili njegovu varijantu koja sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i farmaceutski prihvatljiv nosač. Otkrivene metode uključuju administriranje pacijentu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži PEG-IL-2 ili njegovu varijantu koja sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i prirodnu aminokiselinsku supstituciju, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ne-prirodno kodirana aminokiselina može biti vezana za polimer rastvoran u vodi. PEG-IL-2 može biti glikozilovan. PEG-IL-2 ili njegova varijanta ne moraju biti glikozilovani.

[0055] Takođe su otkrivene metode lečenja pacijenta kome je potreban takav tretman sa efikasnom količinom molekula IL-2 ili IL-2 varijante. Otkrivene metode uključuju administriranje pacijentu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži molekul IL-2 ili IL-2 varijante koja sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i farmaceutski prihvatljiv nosač. Otkrivene metode uključuju administriranje pacijentu terapeutski-efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži IL-2 ili njegovu varijantu koja sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih amino kiselina i jednu ili više prirodnih aminokiselinskih supstitucija, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ne-prirodno kodirana aminokiselina može biti vezana za polimer rastvoran u vodi. Prirodna aminokiselina može biti vezana za polimer rastvoran u vodi. IL-2 može biti glikozilovan. U nekim realizacijama, IL-2 možda neće biti glikozilovan. Pacijent kojem je potrebno lečenje može imati rak, stanje ili bolest, ali ne ograničavajući se samo na onu koju karakteriše visoka ekspresija IL-2 alfa receptora. Otkriven je postupak za lečenje raka ili stanja ili bolesti administriranjem subjektu terapeutski efikasne količine IL-2 kompozicije. Takođe je otkrivena metoda lečenja nasleđene bolesti administriranjem pacijentu terapeutski efikasne količine IL-2 kompozicije. IL-2 polipeptidi mogu biti za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja u ćeliji koja ima visoku ekspresiju IL-2 alfa receptora. Rak, stanje ili bolest se mogu lečiti smanjenjem, blokiranjem ili utišavanjem ekspresije alfa IL-2 receptora.

[0056] Takođe je opisan IL-2 koji sadrži sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 1, 2, 3, 5 ili 7, ili bilo koju drugu sekvencu IL-2, osim ako je najmanje jedna aminokiselina supstituisana aminokiselinom koja nije prirodno kodirana aminokiselina.

[0057] U nekim realizacijama ovog pronalaska IL-2 polipeptid sadrži najmanje jedan linker, polimer ili biološki aktivan molekul, pri čemu je navedeni linker, polimer ili biološki aktivan molekul vezan za polipeptid preko funkcionalne grupe ne-prirodno kodirane aminokiseline ribozomski inkorporirane u polipeptid. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid je monoPEGilovan. U nekim realizacijama ovog pronalaska IL-2 polipeptid sadrži linker, polimer ili biološki aktivan molekul koji je vezan za jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina pri čemu je navedena ne-prirodno kodirana amino kiselina ribozomski inkorporirana u polipeptid na unapred odabrana mesta.

[0058] IL-2 polipeptidni lider, ili signalna sekvenca može biti spojena sa IL-2 kodirajućim regionom, kao i heterologna signalna sekvenca povezana sa IL-2 kodirajućim regionom. Izabrani heterologni lider ili signalna sekvenca treba da bude ona koja je prepoznata i procesirana, npr. od strane sistema sekrecije ćelije domaćina, da bi se izlučila i eventualno cepala signalnom peptidazom, od strane ćelije domaćina. Metoda lečenja stanja ili poremećaja sa IL-2 podrazumeva lečenje sa IL-2 ili njegovom varijantom sa ili bez signalnog ili vodećeg peptida.

[0059] U drugoj realizaciji, konjugacija IL-2 polipeptida sa drugim molekulom, uključujući, ali ne ograničavajući se na PEG, daje značajno prečišćeni IL-2 zbog jedinstvene hemijske reakcije koja se koristi za konjugaciju sa ne-prirodnom amino kiselinom. Konjugacija IL-2 polipeptida sa drugim molekulom, kao što je PEG, može se izvesti drugim tehnikama prečišćavanja koje se izvode pre ili nakon koraka konjugacije kako bi se dobio suštinski čist IL-2 polipeptid.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0060]

Slika 1 - Model koji prikazuje IL-2 polipeptid sa potencijalnim mestima interakcije receptora obeleženim strukturom IL-2Rα i njegovim interfejsom sa IL-2.

Slika 2 - Prikazana je plazmidna mapa ekspresionog vektora za ekspresiju IL-2 u E. coli.

Slika 3A - Prikazana je Westarn blot analiza ekspresije IL-2 proteina u E. coli.

Slika 3B - Prikazan je titar varijanti IL-2 u E.coli.

Slika 4A - Prikazan je kinetički senzorgram i linije fitovanja modela i izračunata merenja vezivanja divljeg tipa IL-2 za CD25.

Slika 4B - Prikazana je mapa plazmida ekspresionog vektora za ekspresiju IL-2 u ćelijama sisara.

Slika 5 - Prikazuje sekvencu genomske DNK UPF1 i dizajn CRISPR gRNK mesta.

Slika 6 - Prikazana je verifikacija sekvence UPF1 nokaut ćelijskih linija.

Slika 7A - Prikazana je tranzijentna ekspresija različitih varijanti IL-2 u ćelijama sisara.

Slika 7B – Prikazana je Western blot analiza varijanti IL- 2 divljeg tipa i IL-2 proizvedenih u ćelijama sisara.

Slika 8 - Prikazan je CTLL-2 test ekspanzije IL-2 varijante F42.

Slika 9 – Prikazan je skrining IL-2 varijanti pomoću testa proliferacije CTLL-2.

Slika 10A - Prikazuje kinetički senzorgram vezivanja za divlji tip IL-2 i varijantu F42.

Slika 10B - Prikazuje kinetički senzorgram vezivanja za varijante K35 i Y45.

Slika 10C - Prikazuje kinetički senzorgram vezivanja za varijante T37 i P65.

Slika 11 - Ilustracija testa dimerizacije IL-2 receptora.

Slika 12 - Ilustracija ex-vivo pSTAT5 testa.

Slika 13 - Prikazan je klonalni prekomerni rast i dugoročno razmnožavanje CTLL-2 ćelija u prisustvu glikozilovanog ili neglikozilovanog IL-2.

Slika 14 – Prikazano je poređenje titra pre i nakon stvaranja stabilnih pulova odgovarajućeg divljeg tipa IL-2 ili njegovih odabranih varijanti.

Slika 15A - Prikazuje titar u ćelijama sisara koje eksprimiraju varijantu F42-R38A.

Slika 15B - Prikazuje test vezivanja CTLL-2 varijanti F42-R38A.

Slika 15C - Prikazuje kinetičke senzorgrame vezivanja za varijante F42-R38A.

DEFINICIJE

[0061] Podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole, ćelijske linije, konstrukte i reagense koji su ovde opisani i kao takvi mogu varirati. Takođe treba shvatiti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i nije namenjena da ograniči obim ovog pronalaska, koji će biti ograničen samo priloženim zahtevima. Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

[0062] Kako se koristi ovde i u priloženim zahtevima, oblici jednine "jedan", "neki" i "taj" uključuju referencu u množini osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Tako, na primer, pozivanje na "IL-2", "PEG-IL-2", "PEG-IL-2 konjugat" i različiti oblici napisani velikim slovima, sa i bez crtica je pozivanje na jedan ili više takvih proteina i uključuje njihove ekvivalente poznate stručnjacima iz ove oblasti, i tako dalje.

[0063] Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje koje je obično razumljivo za prosečnog stručnjaka u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se bilo koje metode, uređaji i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju pronalaska, ovde su opisane poželjne metode, uređaji i materijali.

[0064] Publikacije koje se ovde raspravljaju su date isključivo radi njihovog otkrivanja pre datuma podnošenja ove prijave. Ništa od ovde navedenog ne treba tumačiti kao priznanje da pronalazači nemaju pravo da antidatiraju takvo otkriće na osnovu prethodnog pronalaska ili iz bilo kojeg drugog razloga.

[0065] Izraz "suštinski prečišćen" se odnosi na IL-2 ili njegovu varijantu koja može biti suštinski ili uglavnom bez komponenti koje normalno prate ili stupaju u interakciju sa proteinom koji se nalazi u njegovom prirodnom okruženju, tj. nativnoj ćeliji ili ćeliji domaćinu u slučaju rekombinantno proizvedenog IL-2. IL-2 koji suštinski može biti bez ćelijskog materijala uključuje preparate proteina koji imaju manje od oko 30%, manje od oko 25%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5 %, manje od oko 4%, manje od oko 3%, manje od oko 2%, ili manje od oko 1% (prema suvoj težini) kontaminirajućeg proteina. Kada IL-2 ili njegovu varijantu rekombinantno proizvode ćelije domaćini, protein može biti prisutan sa oko 30%, oko 25%, oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, oko 2%, ili oko 1% ili manje od suve težine ć elija. Kada IL-2 ili njegovu varijantu rekombinantno proizvode ćelije domaćini, protein može biti prisutan u medijumu kulture sa oko 5g/L, oko 4g/L, oko 3g/L, oko 2g/L, oko 1g/L , oko 750mg/L, oko 500mg/L, oko 250mg/L, oko 100mg/L, oko 50mg/L, oko 10mg/L, ili oko 1mg/L ili manje od suve težine ćelija. Dakle, " suštinski prečišćeni" IL-2 proizveden metodama iz ovog pronalaska može imati nivo čistoće od najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, konkretno, nivo čistoće od najmanje oko 75%, 80%, 85%, i preciznije, nivo čistoće od najmanje oko 90%, nivo čistoće od najmanje oko 95%, nivo čistoće od najmanje oko 99% ili veći kako je određeno odgovarajućim metodama kao što su SDS/PAGE analiza, RP-HPLC, SEC i kapilarna elektroforeza.

[0066] "Rekombinantna ćelija domaćin" ili "ćelija domaćin" se odnosi na ćeliju koja uključuje egzogeni polinukleotid, bez obzira na metodu koja se koristi za inserciju, na primer, direktno preuzimanje, transdukcija, f-sparivanje ili druge metode poznate u tehnici za kreiranje rekombinantnih ćelija domaćina. Egzogeni polinukleotid može biti održavan kao neintegrisani vektor, na primer, plazmid, ili alternativno, može biti integrisan u genom domaćina.

[0067] Kako se ovde koristi, izraz "medijum" ili "medij" uključuje bilo koji medijum, rastvor, čvrstu, polučvrstu ili tvrdu podlogu koja može podržavati ili sadržati bilo koju ćeliju domaćina, uključujući bakterijske ćelije domaćine, ćelije domaćine kvasca, ćelije domaćine insekata, ćelije domaćine biljaka, eukariotske ćelije domaćine, sisarske ćelije domaćine, CHO ćelije, prokariotske ćelije domaćine, ćelije domaćine E. coli ili Pseudomonas i ćelijske sadržaje. Dakle, pojam može obuhvatiti medijum u kojem je ćelija domaćina gajena, npr. medijum u koji je izlučen IL-2, uključujući medijum pre ili posle koraka proliferacije. Termin takođe može obuhvatiti pufere ili reagense koji sadrže lizate ćelija domaćina, kao u slučaju kada se IL-2 proizvodi intracelularno i se ćelije domaćina liziraju ili razbiju da bi se oslobodio IL-2.

[0068] "Redukciono sredstvo", kako se ovde koristi u pogledu ponovnog savijanja proteina, se definiše kao bilo koje jedinjenje ili materijal koji održava sulfhidrilne grupe u redukovanom stanju i smanjuje intra- ili intermolekularne disulfidne veze. Pogodni redukcioni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, ditiotreitol (DTT), 2-merkaptoetanol, ditioeritritol, cistein, cisteamin (2-aminoetanetiol) i redukovani glutation. Stručnjacima je jasno da je široka lepeza redukcionih agenasa pogodna za upotrebu u metodama i kompozicijama iz ovog pronalaska.

[0069] "Oksidaciono sredstvo", kako se ovde koristi u pogledu ponovnog savijanja proteina, se definiše kao bilo koje jedinjenje ili materijal koji je sposoban da ukloni elektron iz jedinjenja koje se oksiduje. Pogodna oksidaciona sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, oksidovani glutation, cistin, cistamin, oksidovani ditiotreitol, oksidovani eritreitol i kiseonik. Stručnjacima je jasno da je široka lepeza oksidacionih sredstava pogodna za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska.

[0070] "Denaturišuće sredstvo" ili "denaturant", kako se ovde koristi, se definiše kao bilo koje jedinjenje ili materijal koji će uzrokovati reverzibilno odvijanje proteina. Jačina denaturišućeg sredstva ili denaturanta će biti određena kako svojstvima tako i koncentracijom određenog denaturišućeg sredstva ili denaturanta. Pogodna sredstva za denaturaciju ili denaturanti mogu biti haotropi, deterdženti, organski rastvarači, rastvarači mešljivi sa vodom, fosfolipidi ili kombinacija dva ili više takvih sredstaava. Prikladni haotropi uključuju, ali nisu ograničeni na, ureu, gvanidin i natrijum tiocijanat. Korisni deterdženti mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, jake deterdžente kao što su natrijum dodecil sulfat, ili polioksietilen etri (npr. Tween ili Triton deterdženti), Sarkosil, blage nejonske deterdžente (npr. digitonin), blage katjonske deterdžente kao što je N- >2,3-(Dioleioksi)-propil-N,N,N-trimetilamonijum, blagi jonski deterdženti (npr. natrijum holat ili natrijum deoksiholat) ili cviterjonski deterdženti uključujući, ali ne ograničavajući se na, sulfobetain (Zwittergent), 3-(3- hlolamidopropil) dimetilamonio-1-propan sulfat (CHAPS) i 3-(3-hlolamidopropil)dimetilamonio-2-hidroksi-1-propan sulfonat (CHAPSO). Organski rastvarači mešljivi sa vodom kao što je acetonitril, niži alkanoli (posebno C2<-C>4alkanoli kao što su etanol ili izopropanol) ili niži alkandioli (posebno C2-C4alkandioli kao što je etilenglikol) mogu se koristiti kao denaturanti. Fosfolipidi korisni u ovom pronalasku mogu biti fosfolipidi koji se javljaju u prirodi kao š to su fosfatidiletanolamin, fosfatidilholin, fosfatidilserin i fosfatidilinozitol ili sintetički derivati fosfolipida ili varijante kao što je diheksanoilfosfatidilholin ili diheptanoilfosfatidilholin.

[0071] "Ponovno savijanje", kako se ovde koristi, opisuje bilo koji proces, reakciju ili metodu koji transformiše disulfidne veze koje sadrže polipeptide iz nepravilno savijenog ili nesavijenog stanja u nativnu ili pravilno savijenu konformaciju u odnosu na disulfidne veze.

[0072] Kako se ovde koristi "Zajedničko savijanje" se odnosi posebno na procese ponovnog savijanja, reakcije ili metode koje koriste najmanje dva polipeptida koji međusobno interaguju i rezultuju u transformaciji nesavijenih ili nepravilno savijenih polipeptida u nativne, pravilno savijene polipeptide.

[0073] Kako se ovde koristi, "Interleukin-2", "IL-2" i njihovi oblici sa i bez crtica ć e uključivati one polipeptide i proteine koji imaju bar jednu biološku aktivnost IL-2, kao i analoge IL-2 , IL-2 muteine, IL2 varijante, IL-2 izoforme, IL-2 mimetike, IL-2 fragmente, hibridne IL-2 proteine, fuzione proteine, oligomere i multimere, homologe, varijante uzorka glikozilacije, varijante, varijante splajsovanja, i njihove muteine, bez obzira na njihovu biološku aktivnost, a zatim bez obzira na metodu njihove sinteze ili proizvodnje uključujući, ali ne ograničavajući se na, rekombinantne (bez obzira da li se proizvode od cDNK, genomske DNK, sintetičke DNK ili drugog oblika nukleinske kiseline), in vitro, in vivo, mikroinjekcijom molekula nukleinske kiseline, sintetičkim, transgenski i genski aktiviranim metodama. Izraz "IL-2", "IL-2", "IL-2 varijanta" i "IL-2 polipeptid" obuhvataju IL-2 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija.

[0074] Za sekvence IL-2 koje nemaju vodeću sekvencu i nemaju metionin na N-terminusu, pogledajte ovde navedenu SEK ID BR: 2. Za sekvencu IL-2 bez vodeće sekvence i sa metioninom na N-terminusu pogledajte SEK ID BR: 3, 5 ili 7. IL-2 ili njegove varijante mogu biti u osnovi identične sa SEK ID BR: 2, 3, 5 ili 7, ili bilo kojom drugom sekvencom IL-2. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju IL-2 uključujući mutantni IL-2 i druge varijante, kao i metode za ekspresiju i prečišćavanje ovih polipeptida su dobro poznati u struci.

[0075] Termin "IL-2" takođe uključuje farmaceutski prihvatljive soli i prolekove, i soli prolekova, polimorfe, hidrate, solvate, biološki aktivne fragmente, biološki aktivne varijante i stereoizomere IL-2 koji se prirodno javljaju kao kao i agonističke, mimetičke i antagonističke varijante prirodnog IL-2 i njegove polipeptidne fuzije.

[0076] Različite reference otkrivaju modifikaciju polipeptida sa polimerm, konjugacijom ili glikozilacijom. Termin "IL-2" uključuje polipeptide konjugovane sa polimerom kao što je PEG i može se sastojati od jedne ili više dodatnih derivatizacija cisteina, lizina ili drugih rezidua. Dodatno, IL-2 može sadržati linker ili polimer, pri čemu aminokiselina na koju je linker ili polimer konjugovan je ne-prirodna aminokiselina ili može biti konjugovan sa prirodno kodiranom aminokiselinom korišćenjem tehnike poznate u struci kao što su kuplovanje na lizin ili cistein.

[0077] Termin "IL-2 polipeptid" takođe uključuje glikozilovani IL-2, kao što su, bez ograničavanja, polipeptidi glikozilovani na bilo kojoj poziciji amino kiseline, N-vezani ili O-vezani glikozilovani oblici polipeptida. Varijante koje sadrže pojedinačne nukleotidne izmene se takođe smatraju biološki aktivnim varijantama IL-2 polipeptida. Osim toga, uključene su i splajs varijante.

[0078] Termin "IL-2" takođe uključuje IL-2 heterodimere, homodimere, heteromultimere ili homomultimere bilo kojeg ili više IL-2 ili bilo kojeg drugog polipeptida, proteina, ugljenoghidrata, polimera, malog molekula, linkera, liganda ili drugog biološki aktivnog molekula bilo koje vrste, povezane hemijskim putem ili eksprimirane kao fuzioni protein, kao i analoge polipeptida koji sadrže, na primer, specifične delecije ili druge modifikacije, a ipak zadržavaju biološku aktivnost.

[0079] "Interleukin-2" ili "IL-2", kako se ovde koristi, bez obzira da li je konjugovan sa biološki aktivnim molekulom, konjugovan sa polietilen glikolom, ili u nekonjugovanom obliku, je protein koji se sastoji od dve subjedinice koje su nekovalentno vezane da formiraju homodimer. Kako se ovde koristi, "Interleukin-2" i "IL-2" se može odnositi na humani ili mišji IL-2 koji se takođe nazivaju "hIL-2" ili "mIL-2".

[0080] Izraz "pegilovani IL-2", "PEGilovani IL-2" ili "PEG-IL-2" je IL-2 molekul koji ima jedan ili više molekula polietilen glikola kovalentno vezanih za jedan ili više od jedan aminokiselinski ostatak IL-2 proteina preko linkera, tako da je veza stabilna. Izrazi "monopegilovani IL-2" i "mono-PEG-IL-2" znače da je jedan molekul polietilen glikola kovalentno vezan za jedan aminokiselinski ostatak na jednoj subjedinici IL-2 dimera preko linkera. Prosečna molekulska težina PEG dela je poželjno između oko 5.000 i oko 50.000 daltona. Metoda ili mesto vezivanja PEG-a za IL-2 nije kritično, ali poželjno je da pegilacija ne menja, ili samo minimalno menja, aktivnost biološki aktivnog molekula. Poželjno je da povećanje poluživota bude veće od bilo kakvog smanjenja biološke aktivnosti.

[0081] Sve reference na pozicije aminokiselina u IL-2 koje su ovde opisane se zasnivaju na poziciji u SEK ID BR: 2, osim ako nije drugačije naznačeno (tj. kada je navedeno da je poređenje zasnovano na SEK ID BR: 3, 5, ili 7 ili drugom IL-2). Stručnjaci će razumeti da se pozicije aminokiselina koje odgovaraju pozicijama u SEK ID BR: 2 mogu lako identifikovati u bilo kojem drugom IL-2, kao što su SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Oni koji su iskusni u ovoj oblasti će ceniti da se pozicije aminokiselina koje odgovaraju pozicijama u SEK ID BR: 2, 3, 5 ili 7, ili bilo kojoj drugoj sekvenci IL-2 mogu lako identifikovati u bilo kojem drugom IL-2 molekulu kao što su IL-2 fuzije, varijante, fragmenti, itd. Na primer, programi za poravnavanje sekvenci kao što je BLAST se mogu koristiti za poravnavanje i identifikaciju određene pozicije u proteinu koja odgovara poziciji u SEK ID BR: 2, 3, 5 ili 7, ili drugoj IL-2 sekvenci. Supstitucije, delecije ili adicije ovde opisanih aminokiselina u odnosu na SEK ID BR: 2, 3, 5 ili 7, ili druge IL-2 sekvence takođe se odnose na supstitucije, delecije ili dodatke na odgovarajućim pozicijama u IL-2 fuzijama, varijantama, fragmentima, itd. koje su ovde opisane ili poznate u struci.

[0082] IL-2 (IL3): Bilo koji oblik IL-2 poznat u struci se može koristiti u ovde opisanim kompozicijama. Za eksperimentalni rad, posebno je koristan mišji oblik IL-2. Stručnjaci će prepoznati da se neke od aminokiselinskih rezidua u IL2 mogu promeniti bez uticaja na njegovu aktivnost i da se ovi modifikovani oblici IL2 takođe mogu vezati za nosač i koristiti u ovde opisanim metodama.

[0083] Termin "IL-2" ili "IL-2" obuhvata IL-2 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija. IL-2 iz ovog pronalaska se može sastojati od modifikacija sa jednom ili više prirodnih aminokiselina u konjukciji sa jednom ili više ne-prirodnih aminokiselinskih modifikacija. Opisani su primeri supstitucija u širokom spektru pozicija aminokiselina u prirodnim IL-2 polipeptidima, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije koje modulišu farmaceutsku stabilnost, koje modulišu jednu ili više bioloških aktivnosti IL-2 polipeptida, kao što su, ali ne ograničavajući se na, povećanje aktivnosti agonista, povećanje rastvorljivosti polipeptida, smanjenje osetljivosti na proteaze, pretvaranje polipeptida u antagonist, itd. i obuhvaćeni su terminom "IL-2 polipeptid". IL-2 antagonist može sadržati ne-prirodno kodiranu aminokiselinu vezanu za polimer rastvorljiv u vodi koji je prisutan u regionu vezivanja za receptor molekula IL-2.

[0084] U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid dalje sadrži adiciju, supstituciju ili deleciju koja moduliše biološku aktivnost IL-2 polipeptida. U nekim realizacijama, IL-2 polpeptid dalje sadrži adiciju, supstituciju ili deleciju koja moduliše osobine IL-2 poznate i demonstrirane kroz istraživanje kao što je lečenje ili ublažavanje jednog ili više simptoma raka. Adicije, supstitucije ili delecije mogu da modulišu jedno ili više svojstava ili aktivnosti IL-2 polipeptida. Na primer, adicije, supstitucije ili delecije mogu da modulišu afinitet za IL-2 receptor ili jednu ili više subjedinica receptora, da modulišu poluživot u cirkulaciji, da modulišu terapijski poluživot, da modulišu stabilnost polipeptida, da modulišu cepanje proteazama, da modulišu dozu, da modulišu oslobađanje ili bioraspoloživost, da olakšaju prečišćavanje ili poboljšaju ili promene određeni način primene. Slično, IL-2 polipeptidi mogu da sadrže sekvence cepanja proteazom, reaktivne grupe, domene za vezivanje antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na, FLAG ili poli-His) ili druge sekvence bazirane na afinitetu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, FLAG, poli-His, GST, itd.) ili vezane molekule (uključujući ali ne ograničavajući se na biotin) koji poboljšavaju detekciju (uključujući, ali ne ograničavajući se na, GFP), prečišćavanje ili druge osobine polipeptida.

[0085] Pojam "IL-2 polipeptid" takođe obuhvata homodimere, heterodimere, homomultimere i heteromultimere koji su vezani, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koji su direktno vezani preko ne-prirodno kodiranih bočnih lanaca aminokiselina, bilo za iste ili različite ne-prirodno kodirane bočne lance aminokiselina, za prirodno kodirane bočne lance aminokiselina, ili indirektno preko linkera. Primeri linkera uključuju, ali nisu ograničeni na, mala organska jedinjenja, polimere rastvorljive u vodi različitih dužina kao što su poli(etilen glikol) ili polidekstran, ili polipeptide različitih dužina.

[0086] Kako se ovde koristi, izraz "konjugat iz pronalaska", "konjugat IL-2-biološki aktivnog molekula" ili "PEGIL-2" se odnosi na interleukin-2 ili njegov deo molekula, analog ili derivat koji se vezuje za interleukin-2 receptor ili njegovu subjedinicu konjugovanu sa biološki aktivnim molekulom, njegovim delom ili njegovim analogom. Osim ako nije drugačije naznačeno, termini "jedinjenje iz pronalaska" i "kompozicija iz pronalaska" se koriste kao alternative za termin "konjugat iz pronalaska".

[0087] Kako se ovde koristi, izraz "citotoksični agens" može biti bilo koje sredstvo koje ima terapeutsko dejstvo na ćelije raka ili aktivirane imune ćelije koje se mogu koristiti kao terapeutsko sredstvo za upotrebu u kombinaciji sa IL-2, PEG-IL-2 ili IL-2 varijantom (vidi, npr., WO 2004/010957, "Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease"). Klase citotoksičnih ili imunosupresivnih agenasa za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju, na primer, antitubulinske agense, auristatine, molekuli koji se vezuju za mali žleb DNK, inhibitore replikacije DNK, agense za alkilaciju (npr. komplekse platine kao što su cis-platin, mono(platina), bis (platina) i trinuklearni kompleksi platine i karboplatin), antracikline, antibiotike, antifolate, antimetabolite, senzitizere za hemoterapiju, duokarmicine, etopozide, fluorovane pirimidine, jonofore, leksitropsine, nitrozoureadi, platinol, preformirajuća jedinjenja, purinske antimetabolite, puromicine, radijacione senzibilizatore, steroide, taksane, inhibitore topoizomeraze, vinka alkaloide, ili slično.

[0088] Individualni citotoksični ili imunosupresivni agensi uključuju, na primer, androgen, antramicin (AMC), aparaginaze, 5-azacitidin, azatioprin, bleomicin, busulfan, butionin, butionin sulfoksimin, kamptotecin, karboplatin, karmustin (BSNU), CC-1065, hlorambucil, cisplatin, kolhicin, ciklofosfamid, citarabin, citidin arabinozid, citohalazin B, dakarbazin, daktinominomicin (ranije aktinomicin), daunorubicin, dekarbazin, docetaksel, doksorubicin, estrogen, 5-fluordeoksiuridin, 5-fluorouracil, gramicidin D, hidroksiurea, idarubicin, ifosfamid, irinotekan, lomustin (CCNU), mehloretamin, melfalan, 6-merkaptopurin, metotreksat, mitramicin, mitomicin C, mitoksantron, nitroimidazol, paklitaksel, plikamicin, prokarbazin, streptozotocin, tenopozid, 6-tioguanin, tioTEPA, topotekan, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, VP-16 i VM-26.

[0089] U nekim tipičnim realizacijama, terapeutsko sredstvo je citotoksično sredstvo. Pogodna citotoksična sredstva uključuju, na primer, dolastatine (npr. auristatin E, AFP, MMAF, MMAE), molekuli koji se vezuju u mali žleb DNK (npr. enediini i leksitropsini), duokarmicine, taksane (npr. paklitaksel i docetaksel), puromicine, vinca alkaloide CC-1065, SN-38, topotekan, morfolino-doksorubicin, rizoksin, cijanomorfolino-doksorubicin, ehinomicin, kombretastatin, netropsin, epotilon A i B, estramustin, kriptofizine, cemadotin, majtanzinoide, diskodermolid, eleuterobin i mitoksantron.

[0090] "Ne-prirodno kodirana aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu koja nije jedna od 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin ili selenocistein. Drugi izrazi koji se mogu koristiti kao sinonim za izraz "ne-prirodno kodirana aminokiselina" su "ne-prirodna aminokiselina", "ne-prirodna aminokiselina", "aminokiselina koja se ne javlja u prirodi" i njihove različite verzije povezane i ne povezane crticama. Izraz "ne-prirodno kodirana aminokiselina" takođe uključuje, ali nije ograničen na, aminokiseline koje nastaju modifikacijom (npr. post-translacionim modifikacijama) prirodno kodirane aminokiseline (uključujući, ali ne ograničavajući se na, 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin i selenocistein), ali sami po sebi nisu prirodno inkorporirani u rastući polipeptidni lanac putem translacionog kompleksa. Primeri takvih ne-prirodnih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, N-acetilglukozaminil-L-serin, N-acetilglukozaminil-L-treonin i O-fosfotirozin.

[0091] "Grupa za modifikaciju amino terminusa" se odnosi na bilo koji molekul koji se može vezati za amino terminus polipeptida. Slično, "grupa za modifikaciju karboksi terminusa" se odnosi na bilo koji molekul koji se može vezati za karboksi terminus polipeptida. Grupe za modifikaciju terminusa uključuju, ali nisu ograničene na, različite vodorastvorne polimere, peptide ili proteine kao što je serumski albumin, ili druge komponente koje produžavaju poluživot peptida u serumu.

[0092] Izrazi "funkcionalna grupa", "aktivni deo molekula", "aktivirajuća grupa", "odlazeća grupa", "reaktivno mesto", "hemijski reaktivna grupa" i "hemijski reaktivni deo molekula" se koriste u struci i ovde u tekstu za pozivanje na različite, definisane delove ili jedinice molekula. Termini su donekle sinonimi u hemijskoj struci i ovde se koriste da označe delove molekula koji obavljaju neku funkciju ili aktivnost i reaktivni su sa drugim molekulima.

[0093] Termin "veza" ili "linker" se ovde koristi za označavanje grupa ili veza koje se normalno formiraju kao rezultat hemijske reakcije i obično su kovalentne veze. Hidrolitički stabilne veze znače da su veze suštinski stabilne u vodi i da ne reaguju sa vodom pri korisnim pH vrednostima, uključujući ali ne ograničavajući se na, u fiziološkim uslovima tokom dužeg vremenskog perioda, možda čak i neograničeno. Hidrolitički nestabilne ili razgradive veze znače da su veze razgradive u vodi ili u vodenim rastvorima, uključujući, na primer, krv. Enzimski nestabilne ili razgradive veze znače da se veza može razgraditi pomoću jednog ili više enzima. Kao što se razume u struci, PEG i srodni polimeri mogu uključivati razgradive veze u kičmi polimera ili u vezujućoj grupi između kičme polimera i jedne ili više terminalnih funkcionalnih grupa molekula polimera. Na primer, estarske veze nastale reakcijom PEG karboksilnih kiselina ili aktiviranih PEG karboksilnih kiselina sa alkoholnim grupama na biološki aktivnom agensu generalno se hidrolizuju u fiziološkim uslovima kako bi se oslobodio agens. Druge hidrolitički razgradive veze uključuju, ali nisu ograničene na, karbonatne veze; iminske veze su rezultat reakcije amina i aldehida; fosfatne estarske veze nastale reakcijom alkohola sa fosfatnom grupom; hidrazonske veze koje su produkt reakcije hidrazida i aldehida; acetalne veze koje su produkt reakcije aldehida i alkohola; ortoestarske veze koje su produkt reakcije formata i alkohola; peptidne veze formirane aminskom grupom, uključujući, ali bez ograničenja, na kraju polimera kao što je PEG, i karboksilnu grupu peptida; i oligonukleotidne veze formirane od fosforamiditne grupe, uključujući ali ne ograničavajući se na, na kraju polimera, i 5' hidroksilnu grupu oligonukleotida.

[0094] Izraz "biološki aktivan molekul", "biološki aktivan deo molekula" ili "biološki aktivni agens" kada se ovde koristi znači bilo koju supstancu koja može uticati na bilo koje fizičke ili biohemijske osobine biološkog sistema, puta, molekula ili interakcije koja se odnosi na organizam, uključujući, ali ne ograničavajući se na, viruse, bakterije, bakteriofage, transpozon, prion, insekte, gljive, biljke, životinje i ljude. Posebno, kako se ovde koristi, biološki aktivni molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koju supstancu namenjenu dijagnostikovanju, lečenju, ublažavanju, lečenju ili prevenciji bolesti kod ljudi ili drugih životinja, ili da na drugi način poboljšaju fizičko ili mentalno blagostanje ljudi ili životinja. Primeri biološki aktivnih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide, proteine, enzime, lekove sa malim molekulima, vakcine, imunogene, teške lekove, meke lekove, ugljenehidrate, neorganske atome ili molekule, boje, lipide, nukleozide, radionuklide, oligonukleotide, toksoide, biološki aktivne molekule, prokariotske i eukariotske ćelije, viruse, polisaharide, nukleinske kiseline i njihove delove dobijene ili izvedene od virusa, bakterija, insekata, životinja ili bilo koje druge ćelije ili tipa ćelije, lipozoma, mikročestica i micela. Klase biološki aktivnih agenasa koji su prikladni za upotrebu sa pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, lekove, prolekove, radionuklide, agense za snimanje, polimere, antibiotike, fungicide, smole žučne kiseline, niacin i/ili statine, protivupalne agense, agense protiv tumora, kardiovaskularne agense, agense protiv anksioznosti, hormone, faktore rasta, steroidne agense, biološki aktivne molekule dobijene iz mikroba i slično. Biološki aktivni agensi takođe uključuju amidna jedinjenja kao što su ona opisana u Patent Application Publication Number 20080221112, Yamamori et al., koja se mogu administrirati pre, posle i/ili istovremeno sa IL-2 polipeptidima iz ovog pronalaska.

[0095] "Bifunkcionalni polimer" se odnosi na polimer koji sadrži dve diskretne funkcionalne grupe koje su sposobne da reaguju specifično sa drugim delovima molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na, aminokiselinske bočne grupe) da formiraju kovalentne ili nekovalentne veze. Bifunkcionalni linker koji ima jednu funkcionalnu grupu reaktivnu sa grupom na određenoj biološki aktivnoj komponenti, i drugu grupu reaktivnu sa grupom na drugoj biološkoj komponenti, može se koristiti za formiranje konjugata koji uključuje prvu biološki aktivnu komponentu, bifunkcionalni linker i drugu biološki aktivnu komponentu. Poznati su mnogi postupci i molekuli linkera za vezivanje različitih jedinjenja za peptide. Vidi, npr. European Patent Application No. 188,256; U.S. Patent Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; i 4,569,789. "Multi-funkcionalni polimer" se odnosi na polimer koji sadrži dve ili više diskretnih funkcionalnih grupa koje mogu specifično da reaguju sa drugim delovima molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na, bočne grupe aminokiselina) kako bi formirale kovalentne ili nekovalentne veze. Bifunkcionalni polimer ili multifunkcionalni polimer može biti bilo koje željene dužine ili molekulske težine, i može biti odabran tako da obezbedi određeni željeni razmak ili konformaciju između jednog ili više molekula vezanih za IL-2 i njegov receptor ili za IL-2.

[0096] Kada su grupe supstituenata specificirane njihovim konvencionalnim hemijskim formulama, napisanim sa leva na desno, one podjednako obuhvataju hemijski identične supstituente koji bi nastali pisanjem strukture sa desna na levo, na primer, struktura -CH2O- je ekvivalentna struktura -OCH2-.

[0097] Termin "supstituenti" uključuje, ali nije ograničen na "supstituente koji ne ometaju". "Supstituenti koji ne ometaju" su one grupe koje daju stabilna jedinjenja. Prikladni supstituenti ili radikali koji ne ometaju uključuju, ali nisu ograničeni na, halo, C1-C10alkil, C2-C10alkenil, C2-C10alkinil, C1-C10alkoksi, C1-C12aralkil, C1-C12alkaril, C3-C12cikloalkil, C3-C12cikloalkenil, fenil, supstituisani fenil, toluoil, ksilenil, bifenil, C2-C12alkoksialkil, C2-C12alkoksiaril, C7-C12ariloksialkil, C7-C12oksiaril, C1-C6alkilsulfinil, C1-C10alkilsulfonil, -(CH2)m-O-(C1-C10alkil) gde je m od 1 do 8, aril, supstituisani aril, supstituisani alkoksi, fluoroalkil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, nitroalkil, --NOz, --CN, --NRC(O)-(C1-C10alkil), --C(O)-(C1-C10alkil), C2-C10alkil tioalkil, --C(O)O-(C1-C10alkil), --OH, --SO2, =S, --COOH, --NR2, karbonil, --C(O)-- (C1-C10alkil)-CF3, --C(O)-CF3, --C(O)NR2, -(C1C10aril)-S-(C6-C10aril), --C(O )-(C1-C10aril), -(CH2)m--O-(--(CH2)m--O-(C1-C10alkil) pri čemu je svaki m od 1 do 8, -- C(O)NRz, --C(S)NR2, --SO2NR2, --NRC(O)NR2, --NRC(S)NR2, njihove soli i sl. Svaki R kako se ovde koristi je H, alkil ili supstituisani alkil, aril ili supstituisani aril, aralkil ili alkaril.

[0098] Termin "halogen" uključuje fluor, hlor, jod i brom.

[0099] Termin "alkil", sam za sebe ili kao deo drugog supstituenta, označava, osim ako nije drugačije navedeno, ravan ili granasti lanac, ili ciklični ugljovodonični radikal, ili njihovu kombinaciju, koji može biti potpuno zasićen, mono- ili polinezasićen i može uključivati dvo- i multivalentne radikale, koji imaju označeni broj atoma ugljenika (tj. C1-C10znači jedan do deset ugljenika). Primeri zasićenih ugljovodoničnih radikala uključuju, ali nisu ograničeni na, grupe kao što su metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, t-butil, izobutil, sec-butil, cikloheksil, (cikloheksil)metil, ciklopropilmetil, homolozi i izomeri, na primer, n-pentil, n-heksil, n-heptil, n-oktil i slično. Nezasićena alkil grupa je ona koja ima jednu ili više dvostrukih ili trostrukih veza. Primeri nezasićenih alkil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, vinil, 2-propenil, krotil, 2-izopentenil, 2-(butadienil), 2,4-pentadienil, 3-(1,4-pentadienil), etinil, 1- i 3-propinil, 3-butinil i viši homolozi i izomeri. Izraz "alkil", osim ako nije drugačije naznačeno, takođe uključuje one derivate alkila koji su detaljnije definisani u nastavku, kao što je "heteroalkil". Alkil grupe koje su ograničene na ugljovodonične grupe se nazivaju "homoalkil".

[0100] Termin "alkilen" sam za sebe ili kao deo drugog supstituenta označava dvovalentni radikal izveden iz alkana, kao što je prikazano, ali bez ograničavanja, strukturama -CH2CH2- i - CH2CH2CH2CH2-, i dalje uključuje one grupe opisane u nastavku kao "heteroalkilen". Tipično, alkil (ili alkilen) grupa će imati od 1 do 24 atoma ugljenika, pri čemu su grupe koje imaju 10 ili manje atoma ugljenika poseban primer ovde opisanih metoda i kompozicija. "Niži alkil" ili "niži alkilen" je alkil ili alkilen grupa kraćeg lanca, koja obično ima osam ili manje atoma ugljenika.

[0101] Izrazi "alkoksi", "alkilamino" i "alkiltio" (ili tioalkoksi) se koriste u svom konvencionalnom smislu i odnose se na one alkil grupe vezane za ostatak molekula preko atoma kiseonika, amino grupe ili atoma sumpora, respektivno.

[0102] Izraz "heteroalkil", sam za sebe ili u kombinaciji sa drugim terminom, znači, osim ako nije drugačije navedeno, stabilan ravan ili granasti lanac, ili ciklični ugljovodonični radikal, ili njihove kombinacije, koji se sastoji od navedenog broja atoma ugljenika i na najmanje jednog heteroatoma izabranog iz grupe koja se sastoji od O, N, Si i S, i pri čemu atomi azota i sumpora opciono mogu biti oksidovani, a heteroatom može opciono biti kvaternizovan. Heteroatom(i) O, N i S i Si mogu biti postavljeni na bilo koju unutrašnju poziciju heteroalkil grupe ili na poziciju na kojoj je alkil grupa vezana za ostatak molekula. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, -CH2CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CHO-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, and -CH=CH-N(CH3)-CH3. Do dva heteroatoma mogu biti uzastopna, kao što su, na primer, -CH2-NH-OCH3i -CH2-O-Si(CH3)3. Slično, izraz "heteroalkilen" sam po sebi ili kao deo drugog supstituenta označava dvovalentni radikal izveden iz heteroalkila, kao što je prikazano, ali bez ograničavanja sa, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- i -CH2-S-CH2- CH2-NH-CH2-. Za heteroalkilenske grupe, isti ili različiti heteroatomi takođe mogu zauzimati jedan ili oba kraja lanca (uključujući, ali ne ograničavajući se na, alkilenoksi, alkilendioksi, alkilenamino, alkilendiamino, aminooksialkilen i slično). Osim toga, za alkilenske i heteroalkilenske vezne grupe, orijentacija vezujuće grupe nije implicirana smerom u kojem je napisana formula vezujuće grupe. Na primer, formula -C(O)2R'- predstavlja i -C(O)2R'- i -R'C(O)2-.

[0103] Termini "cikloalkil" i "heterocikloalkil", sami ili u kombinaciji sa drugim terminima, predstavljaju, osim ako nije drugačije navedeno, ciklične verzije "alkila" i "heteroalkila", respektivno. Dakle, cikloalkil ili heterocikloalkil uključuje zasićene, delimično nezasićene i potpuno nezasićene prstenaste veze. Dodatno, za heterocikloalkil, heteroatom može zauzeti poziciju na kojoj je heterocikl vezan za ostatak molekula. Primeri cikloalkila uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopentil, cikloheksil, 1-cikloheksenil, 3-cikloheksenil, cikloheptil i slično. Primeri heterocikloalkila uključuju, ali nisu ograničeni na, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridil), 1-piperidinil, 2-piperidinil, 3-piperidinil, 4-morfolinil, 3-morfolinil, tetrahidrofuran-2-il , tetrahidrofuran-3-il, tetrahidrotien-2-il, tetrahidrotien-3-il, 1-piperazinil, 2-piperazinil i slično. Osim toga, pojam obuhvata biciklične i triciklične prstenaste strukture. Slično, izraz "heterocikloalkilen" sam ili kao deo drugog supstituenta označava dvovalentni radikal izveden iz heterocikloalkila, a izraz "cikloalkilen" sam ili kao deo drugog supstituenta označava dvovalentni radikal izveden iz cikloalkila.

[0104] Kako se ovde koristi, izraz "vodorastvorni polimer" se odnosi na bilo koji polimer koji je rastvoran u vodenim rastvaračima. Veza vodorastvornih polimera sa IL-2 može rezultirati promenama uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećan ili modulisan poluživot seruma, ili povećan ili modulisan terapijski poluživot u odnosu na nemodifikovani oblik, modulisanu imunogenost, modulisane karakteristike fizičke povezanosti kao što su agregacija i formiranje multimera, izmenjeno vezivanje receptora, izmenjeno vezivanje za jednog ili više partnera za vezivanje i izmenjena dimerizacija ili multimerizacija receptora. Vodorastvorni polimer može, ali ne mora imati sopstvenu biološku aktivnost i može se koristiti kao linker za vezivanje IL-2 za druge supstance, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više IL-2, ili jedan ili više biološki aktivnih molekula. Pogodni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, polietilen glikol propionaldehid, mono C1-C10alkoksi ili njihove ariloksi derivate (opisani u U.S. Patentu br. 5,252,714), monometoksi-polietilen glikol, polivinil pirolidon, polivinil alkohol, poliamino kiseline, divinil etar maleinski anhidrid, N-(2-hidroksipropil)-metakrilamid, dekstran, derivate dekstrana uključujući dekstran sulfat, polipropilen glikol, polipropilen oksid/etilen oksid kopolimer, polietilovani poliol, heparin, fragmente heparina, polisaharide, oligosaharide, glikane, celulozu i derivate celuloze, uključujući, ali ne ograničavajući se na metilcelulozu i karboksimetil celulozu, skrob i derivate skroba, polipeptide, polialkilen glikole i njihove derivate, polivinil etil etre, i allfa-beta-poli(2-hidroksietil)-DL-aspartamide, i slično, ili njihove smeše. Primeri takvih vodorastvornih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol i serumski albumin.

[0105] Kako se ovde koristi, termin "polialkilen glikol" ili "poli(alken glikol)" se odnosi na polietilen glikol (poli(etilen glikol)), polipropilen glikol, polibutilen glikol i njihove derivate. Pojam "polialkilen glikol" obuhvata i linearne i razgranate polimere i prosečne molekulske težine između 0.1 kDa i 100 kDa. Drugi primeri realizacije su navedeni, na primer, u komercijalnim katalozima dobavljača, kao što je katalog Shearwater Korporacije "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).

[0106] Izraz "aril" znači, ako nije drugačije navedeno, polinezasićeni, aromatični, ugljovodonični supstituent koji može biti sa jednim ili više prstenova (uključujući, ali ne ograničavajući se na, od 1 do 3 prstena) koji su kondenzovani zajedno ili kovalentno vezani. Izraz "heteroaril" se odnosi na aril grupe (ili prstenove) koji sadrže od jedan do četiri heteroatoma odabrana između N, O i S, pri čemu su atomi azota i sumpora opciono oksidovani, a atom(i) azota su opciono kvaternizovani. Heteroaril grupa može biti vezana za ostatak molekula preko heteroatoma. Neograničavajući primeri aril i heteroaril grupa uključuju fenil, 1-naftil, 2-naftil, 4-bifenil, 1-pirolil, 2-pirolil, 3-pirolil, 3-pirazolil, 2-imidazolil, 4-imidazolil, 2-oksazolil, 4-oksazolil, 2-fenil-4-oksazolil, 5-oksazolil, 3-izoksazolil, 4-izoksazolil, 5-izoksazolil, 2-tiazolil, 4-tiazolil, 5-tiazolil, 2-furil, 2-furil furil, 2-tienil, 3-tienil, 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 2-pirimidil, 4-pirimidil, 5-benzotiazolil, purinil, 2-benzimidazolil, 5-indolil, 1-izokinolil, izokinolil, 2-kinoksalinil, 5-kinoksalinil, 3-kinolil i 6-kinolil. Supstituenti za svaki od gore navedenih sistema aril i heteroaril prstena se biraju iz grupe prihvatljivih supstituenata opisanih u nastavku.

[0107] Zbog sažetosti, termin "aril" kada se koristi u kombinaciji sa drugim terminima (uključujući, ali ne ograničavajući se na, ariloksi, ariltioksi, arilalkil) uključuje i aril i heteroaril prstenove kako je gore definisano. Dakle, izraz "arilalkil" podrazumeva one radikale u kojima je aril grupa vezana za alkil grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, benzil, fenetil, piridilmetil i slično), uključujući one alkil grupe u kojima je atom ugljenika (uključujući, ali ne ograničavajući se na, metilensku grupu) zamenjen, na primer, atomom kiseonika (uključujući, ali ne ograničavajući se na, fenoksimetil, 2-piridiloksimetil, 3-(1-naftiloksi)propil i slično).

[0108] Svaki od gornjih pojmova (uključujući, ali ne ograničavajući se na, "alkil", "heteroalkil, "aril" i "heteroaril") podrazumevaju i supstituisane i nesupstituisane oblike naznačenog radikala. Primeri supstituenata za svaki tip radikala su dati u nastavku.

[0109] Supstituenti za alkil i heteroalkil radikale (uključujući one grupe koje se često pominju kao alkilen, alkenil, heteroalkilen, heteroalkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, cikloalkenil i heterocikloalkenil) mogu biti jedna ili više od niza grupa odabranih između, ali ne ograničavajući se na: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogen, -SiR'R"R- , -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R-, -NR"C(O)2R', -NR-C (NR'R"R- )=NR″″, -NR-C(NR'R")=NR-, - S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR' R", -NRSO2R', -CN i -NO2u broju koji je u rasponu od nule do (2m'+1), gde je m' ukupan broj ugljenikovih atoma u takvom radikalu. R', R", R- i R"" svaki nezavisno se odnosi na vodonik, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, uključujući ali ne ograničavajući se na, aril supstituisan sa 1-3 halogena, supstituisane ili nesupstituisane alkil, alkoksi ili tioalkoksi grupe, ili arilalkil grupe. Kada jedinjenje iz ovog pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa je nezavisno odabrana kao i svaka R', R", R'" i R"" grupa kada je prisutno više od jedne od ovih grupa. Kada su R' i R" vezani na isti atom azota, oni se mogu kombinovati sa atomom azota tako da formiraju 5-, 6- ili 7-člani prsten. Na primer, -NR'R" podrazumeva, ali ne ograničavajući se na, 1-pirolidinil i 4-morfolinil. Iz gornje rasprave o supstituentima, stručnjak će razumeti da izraz "alkil" podrazumeva grupe koje uključuju atome ugljenika vezane za grupe koje nisu vodonične grupe, kao što je haloalkil (uključujući, ali ne ograničavajući se na, -CF3i -CH2CF3) i acil (uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3i slično).

[0110] Slično supstituentima opisanim za alkil radikal, supstituenti za aril i heteroaril grupe variraju i biraju se između, ali nisu ograničeni na: halogen, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogen, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR'R-, -NR"C(O)2R', -NRC(NR'R" R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', - CN i -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1-C4)alkoksi i fluoro(C1-C4)alkil, u broju koji je u rasponu od nule do ukupnog broja otvorenih valenci u sistemu aromatičnog prstena; i gde su R', R", R- i R"" nezavisno izabrani između vodonika, alkila, heteroalkila, arila i heteroarila. Kada jedinjenje iz pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa je nezavisno odabrana kao i svaki R', R", R- i R″″ grupe kada je prisutno više od jedne od ovih grupa.

[0111] Kako se ovde koristi, izraz "modulisani poluživot u serumu" označava pozitivnu ili negativnu promenu u poluživotu cirkulacije modifikovanog IL-2 u odnosu na njegov nemodifikovani oblik. Poluživot u serumu se meri uzimanjem uzoraka krvi u različitim vremenskim tačkama nakon primene IL-2 i određivanjem koncentracije tog molekula u svakom uzorku. Korelacija koncentracije u serumu sa vremenom omogućava izračunavanje poluživota u serumu. Poželjno je da se poveća poluživot eliminacije u serumu najmanje dva puta, ali manje povećanje može biti korisno, na primer kada omogućava zadovoljavajući režim doziranja ili izbegava toksični učinak. U nekim realizacijama, povećanje je najmanje oko tri puta, najmanje oko pet puta, ili barem oko deset puta.

[0112] Termin "modulisani terapeutski poluživot" kako se ovde koristi znači pozitivnu ili negativnu promenu u poluživotu terapeutski efikasne količine IL-2, u odnosu na njegov nemodifikovani oblik. Terapeutski poluživot se meri merenjem farmakokinetičkih i/ili farmakodinamičkih svojstava molekula u različitim vremenskim tačkama nakon administracije. Povećan terapeutski poluživot poželjno omogućava određeni povoljan režim doziranja, određenu korisnu ukupnu dozu ili izbegava neželjene efekte. U nekim realizacijama, produžen terapeutski poluživot je rezultat povećane potentnosti, povećanog ili smanjenog vezivanja modifikovanog molekula za njegovu metu, povećane ili smanjene razgradnje molekula pomoću enzima kao što su proteaze, ili povećanja ili smanjenja drugog parametra ili mehanizma delovanja nemodifikovanog molekula ili povećanje ili smanjenje klirensa molekula posredovanog receptorom.

[0113] Izraz "izolovan", kada se primenjuje na nukleinsku kiselinu ili protein, označava da nukleinska kiselina ili protein nema barem neke ćelijske komponente sa kojima je povezan u prirodnom stanju, ili da je nukleinska kiselina ili protein koncentrovan do nivoa većeg od njegove koncentracije u in vivo ili in vitro proizvodnji. On može biti u homogenom stanju. Izdvojene supstance mogu biti u suvom ili polusuvom stanju, ili u rastvoru, uključujući, ali ne ograničavajući se na, vodeni rastvor. On može biti komponenta farmaceutske kompozicije koja sadrži dodatne farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijense. Čistoća i homogenost se obično određuju pomoću tehnika analitičke hemije kao što je elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ili tečna hromatografija visokih performansi. Protein koji je dominantna vrsta prisutna u preparatu je značajno prečišćen. Posebno, izolovani gen je odvojen od otvorenih okvira čitanja koji okružuju gen i kodiraju protein koji nije gen od interesa. Izraz "prečišćeni" označava da nukleinska kiselina ili protein stvaraju uglavnom jednu traku u elektroforetskom gelu. Naročito, to može značiti da je nukleinska kiselina ili protein najmanje 85% čist, najmanje 90% čist, najmanje 95% čist, najmanje 99% ili više čist.

[0114] Termin "nukleinska kiselina" se odnosi na deoksiribonukleotide, deoksiribonukleozide, ribonukleozide ili ribonukleotide i njihove polimere u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Ako nije posebno naznačeno, pojam obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina i metabolišu se na način sličan prirodnim nukleotidima. Osim ako nije drugačije naznačeno, termin se takođe odnosi na analoge oligonukleotida uključujući PNK (peptidonukleinsku kiselinu), analoge DNK koji se koriste u antisens tehnologiji (fosforotioati, fosforoamidati i slično). Osim ako nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (uključujući, ali ne ograničavajući se na degenerativne kodonske supstitucije) i komplementarne sekvence kao i eksplicitno navedene sekvence. Konkretno, degenerisane kodonske supstitucije se mogu postići generisanjem sekvenci u kojima je treća pozicija jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstisuisana sa mešanom bazom i/ili deoksiinozinskim reziduama (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[0115] Izrazi "polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde koriste naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih rezidua. To jest, opis usmeren na polipeptid se primenjuje podjednako na opis peptida i opis proteina, i obrnuto. Izrazi se primenjuju na prirodne aminokiselinske polimere, kao i na polimere aminokiselina u kojima je jedna ili više aminokiselinskih rezidua ne-prirodno kodirana aminokiselina. Kako se ovde koristi, termini obuhvataju lance aminokiselina bilo koje dužine, uključujući proteine pune dužine, pri čemu su aminokiselinske rezidue vezane kovalentnim peptidnim vezama.

[0116] Termin "amino kiselina" se odnosi na prirodne i ne-prirodne aminokiseline, kao i na analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Prirodno kodirane aminokiseline su 20 uobičajenih aminokiselina (alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin) i pirolizin i selenocistein. Analozi aminokiselina se odnosi na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina, tj. α ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, kao što je homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (kao što je norleucin) ili modifikovane peptidne okosnice backbones, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina. Pozivanje na aminokiselinu uključuje, na primer, prirodne proteinogene L-amino kiseline; D-aminokiseline, hemijski modifikovane aminokiseline kao što su varijante i derivati aminokiselina; prirodne neproteinogene aminokiseline kao što su β -alanin, omitin, itd.; i hemijski sintetisana jedinjenja koja u struci imaju svojstva koja su karakteristična za aminokiseline. Primeri ne-prirodnih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničene na, αmetil aminokiseline (npr. α-metil alanin), D-amino kiseline, aminokiseline slične histidinu (npr. 2-aminohistidin, β -hidroksi -histidin, homohistidin, α -fluorometil-histidin i α -metil-histidin), aminokiseline koje imaju dodatni metilen u bočnom lancu ("homo" aminokiseline) i aminokiseline u kojima je funkcionalna grupa karboksilne kiseline u bočnom lancu zamenjena grupom sulfonske kiseline (npr. cisteinska kiselina). Inkorporiranje ne-prirodnih aminokiselina, uključujući sintetičke ne-prirodnne aminokiseline, supstituisane aminokiseline ili jednu ili više D-aminokiselina u proteine može biti korisna na više različitih načina. Peptidi koji sadrže D-aminokiseline, itd., pokazuju povećanu stabilnost in vitro ili in vivo u poređenju sa onima koje sadrže L-aminokiseline. Prema tome, konstrukcija peptida, itd., koji uključuju D-amino kiseline, može biti posebno korisna kada se ž eli ili zahteva veća unutarćelijska stabilnost. Preciznije, D-peptidi, itd., su otporni na endogene peptidaze i proteaze, čime se obezbeđuje poboljšana biodostupnost molekula i produžen životni vek in vivo kada su takva svojstva poželjna. Dodatno, D-peptidi, itd., se ne mogu efikasno procesirati za MHC klase II-restrikcionu prezentaciju T pomoćnim ćelijama, i stoga je manja verovatnoća da će izazvati humoralne imune odgovore u celom organizmu.

[0117] Aminokiseline se ovde mogu označiti ili njihovim uobičajeno poznatim troslovnim simbolima ili simbolima od jednog slova koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za Biohemijsku Nomenklaturu. Nukleotidi, isto tako, se mogu pozivati njihovim opšte-prihvaćenim jednoslovnim oznakama.

[0118] "Konzervativno modifikovane varijante" se odnose i na aminokiselinske sekvence i na nukleinske kiseline. S obzirom na određene sekvence nukleinskih kiselina, "konzervativno modifikovane varijante" se odnose na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične aminokiselinske sekvence, ili kada nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinsku sekvencu, u suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU kodiraju aminokiselinu alanin. Prema tome, na svakoj poziciji gde je alanin specificiran kodonom, kodon se može promeniti u bilo koji od odgovarajućih opisanih kodona bez menjanja kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinskih kiselina su "tihe varijacije", koje su jedna vrsta konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka ovde navedena sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručnjak će prepoznati da se svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može modifikovati kako bi se dobio funkcionalno identičan molekul. Prema tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je implicitna u svakoj opisanoj sekvenci.

[0119] Što se tiče aminokiselinskih sekvenci, prosečan stručnjak će prepoznati da pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteinske sekvence koja menja, dodaje ili briše jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina u kodiranoj sekvenci je "konzervativno modifikovana varijanta" gde promena rezultuje brisanjem aminokiseline, dodavanjem aminokiseline ili zamenom aminokiseline sa hemijski sličnom amino kiselinom. Stručnjacima su poznate tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatak i ne isključuju polimorfne varijante, homologe između vrsta i alele iz pronalaska.

[0120] Konzervativne tabele supstitucije koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline poznate su prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Sledećih osam grupa sadrži aminokiseline koje su konzervativne zamene jedna za drugu: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) arginin (R), lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) Cistein (C), Metionin (M); (vidi, npr., Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993).

[0121] Termini "identičan" ili procenat "identiteta", u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, se odnose na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste. Sekvence su "suštinski identične" ako imaju procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (tj. oko 60% identiteta, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95% identiteta u određenom regionu), kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju u prozoru za poređenje, ili označenom regionu kako je izmereno korišćenjem jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci (ili drugih algoritama dostupnih prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti) ili ručnim poravnavanjem i vizuelnom inspekcijom. Ova definicija se takođe odnosi na komplement test sekvence. Identitet može postojati u regionu koji ima najmanje oko 50 aminokiselina ili nukleotida u dužini, ili u regionu koji je dugačak 75-100 aminokiselina ili nukleotida, ili, kada nije specificirano, u celoj sekvenci polinukleotida ili polipeptida. Polinukleotid koji kodira polipeptid iz ovog pronalaska, uključujući homologe drugih vrsta osim ljudskih, se može dobiti postupkom koji uključuje korake skrininga biblioteke pod strogim uslovima hibridizacije sa obeleženom probom koja ima polinukleotidnu sekvencu iz pronalaska ili njen fragment, i izolojuću cDNK pune dužine i genomske klonove koji sadrže navedenu polinukleotidnu sekvencu. Takve tehnike hibridizacije su dobro poznate stručnjaku.

[0122] Izraz "selektivno (ili specifično) hibridizuje sa" se odnosi na vezivanje, dupleksiranje ili hibridizaciju molekula samo sa određenom nukleotidnom sekvencom pod strogim uslovima hibridizacije kada je ta sekvenca prisutna u složenoj smeši (uključujući, ali ne ograničavajući se na, ukupnu ćelijsku ili DNK ili RNK iz biblioteke).

[0123] Izraz "strogi uslovi hibridizacije" se odnosi na hibridizaciju sekvenci DNK, RNK, PNK ili drugih mimika nukleinske kiseline, ili njihove kombinacije u uslovima niske jonske jačine i visoke temperature kao što je poznato u struci. Tipično, pod strogim uslovima, proba će hibridizovati sa svojom ciljnom podsekvencom u kompleksnoj mešavini nukleinske kiseline (uključujući, ali ne ograničavajući se na, ukupnu ćelijsku ili DNK ili RNK iz biblioteke), ali ne hibridizuje sa drugim sekvencama u kompleksnoj mešavini. Strogi uslovi zavise od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Duže sekvence hibridizuju specifično na višim temperaturama.

[0124] Kako se ovde koristi, izraz "eukarioti" se odnosi na organizme koji pripadaju filogenetskom domenu Eucarya kao što su životinje (uključujući, ali ne ograničavajući se na, sisare, insekte, gmizavce, ptice, itd.), cilijate, biljke (uključujući ali ne ograničavajući se na, monokotile, dikotile, alge, itd.), gljive, kvasce, flagelate, mikrosporidije, protiste, itd.

[0125] Kako se ovde koristi, izraz "neeukarioti" se odnosi na neeukariotske organizme. Na primer, neeukariotski organizam može pripadati Eubakterijama (uključujući, ali ne ograničavajući se na, filogenetski domen Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, itd.), ili Archaea (uključujući ali ne ograničavajući se na, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium kao što je Haloferax volcanii i Halobacterium vrste NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, itd.) filogenetski domen.

[0126] Kako se ovde koristi izraz "subjekt" se odnosi na životinju, u nekim realizacijama na sisara, a u drugim realizacijama na čoveka, koji je predmet tretmana, posmatranja ili eksperimenta. Životinja može biti kućna životinja (npr. psi, mačke i slično), stoka (npr. krave, ovce, svinje, konji i slično) ili laboratorijska životinja (npr. pacovi, miševi, zamorci, i slično).

[0127] Izraz "efikasna količina" kako se ovde koristi se odnosi na onu količinu modifikovanog polipeptida ne-prirodne aminokiseline koja se administrira, a koja će u određenoj meri ublažiti jedan ili više simptoma bolesti, stanja ili poremećaja koji se leči. Kompozicije koje sadrže modifikovani polipeptid ne-prirodne aminokiseline koji je ovde opisan se mogu administrirati za profilaktičke, jačajuće i/ili terapeutske tretmane.

[0128] Izrazi "jačajući" ili "pojačavajući" znače pojačavanje ili produžavanje potentnosti ili trajanja željenog efekta. Dakle, u pogledu efekta pojačavanja terapeutskih agenasa, izraz "pojačavanje" se odnosi na sposobnost da se poveća ili produži, bilo po potentnosti ili trajanju, dejstvo drugih terapeutskih agenasa na sistem. "Količina koja je efikasna za poboljšanje", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu adekvatnu da se pojača učinak drugog terapeutskog agensa u ž eljenom sistemu. Kada se koriste kod pacijenata, količine koje su efikasne za ovu upotrebu će zavisiti od težine i toka bolesti, poremećaja ili stanja, prethodne terapije, zdravstvenog statusa pacijenta i odgovora na lekove, kao i od procene ordinirajućeg lekara.

[0129] Termin "modifikovan", kako se ovde koristi, se odnosi na sve promene napravljene na datom polipeptidu, kao što su promene dužine polipeptida, aminokiselinske sekvence, hemijske strukture, kotranslaciona modifikacija ili post-translaciona modifikacija polipeptida. Termin "(modifikovan)" znači da su polipeptidi o kojima se raspravlja opciono modifikovani, odnosno da polipeptidi o kojima se raspravlja mogu biti modifikovani ili nemodifikovani.

[0130] Izraz "post-translaciono modifikovan" se odnosi na bilo koju modifikaciju prirodne ili ne-prirodne aminokiseline koja se javi na takvoj aminokiselini nakon što je inkorporirana u polipeptidni lanac. Termin obuhvata, samo kao primer, ko-translacione in vivo modifikacije, ko-translacione in vitro modifikacije (kao što je u bezćelijskom translacionom sistemu), post-translacione in vivo modifikacije i posttranslacione in vitro modifikacije.

[0131] U profilaktičkim primenama, preparati koji sadrže IL-2 se administriraju pacijentu koji je podložan određenoj bolesti, poremećaju ili stanju ili na drugi način postoji rizik od određene bolesti. Takva količina je definisana kao "profilaktički efikasna količina". U ovoj upotrebi precizne količine zavise i od zdravstvenog stanja pacijenta, težine, i slično. Smatra se da je u okviru stručne veštine da se takve profilaktički efikasne količine odrede rutinskim eksperimentisanjem (npr. kliničke studije eskalacije doze).

[0132] U terapijskim primenama, kompozicije koje sadrže modifikovani polipeptid ne-prirodne amino kiseline se administriraju pacijentu koji već pati od bolesti, stanja ili poremećaja, u količini dovoljnoj da izleči ili bar delimično zaustavi simptome bolesti, poremećaja ili stanja. Takva količina je definisana kao "terapeutski efikasna količina" i zavisiće od težine i toka bolesti, poremećaja ili stanja, prethodne terapije, zdravstvenog stanja pacijenta i odgovora na lekove, i od procene lekara. Smatra se da je u okviru stručne veštine da se takve terapeutski efikasne količine odrede rutinskim eksperimentisanjem (npr. kliničko ispitivanje eskalacije doze).

[0133] Termin "lečenje" se koristi tako da se odnosi na profilaktičke i/ili terapeutske tretmane.

[0134] Ovde opisani ne-prirodno kodirani polipeptidi aminokiselina mogu uključivati izotopski obeležena jedinjenja sa jednim ili više atoma zamenjenih atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se obično nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji mogu biti inkorporirani u ova jedinjenja uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fluora i hlora, kaošto su<2>H,<3>H,<13>C,<14>C,<15>N,<18>O,<17>O,<35>S,<18>F,<36>Cl, respektivno. Određena izotopski obeležena jedinjenja koja su ovde opisana, na primer ona u koja su inkorporirani radioaktivni izotopi kao što su<3>H i<14>C, mogu biti korisni u testovima distribucije leka i/ili supstrata u tkivu. Dalje, supstitucija sa izotopima kao što je deuterijum, tj. 2H, može da pruži određene terapeutske prednosti koje su rezultat veće metaboličke stabilnosti, na primer produženog poluživota in vivo ili smanjene potrebe za dozom.

[0135] Svi izomeri uključujući, ali ne ograničavajući se na dijastereomere, enantiomere i njihove smeše, smatraju se delom ovde opisanih kompozicija. U dodatnim ili daljim realizacijama, polipeptidi aminokiselina koji nisu prirodno kodirani se nakon administriranja organizmu kome je potrebno metabolišu da se proizvede metabolit koji se zatim koristi za postizanje željenog efekta, uključujući željeni terapeutski efekat. U daljim ili dodatnim realizacijama su aktivni metaboliti ne-prirodno kodiranih polipeptida aminokiselina.

[0136] U nekim situacijama, polipeptidi aminokiselina koji nisu prirodno kodirani mogu postojati kao tautomeri. Osim toga, ovde opisani ne-prirodno kodirani polipeptidi aminokiselina mogu postojati u nesolvatiranim, kao i solvatiranim oblicima sa farmaceutski prihvatljivim rastvaračima kao što su voda, etanol i slično. Takođe se smatra da su i solvatni oblici ovde otkriveni. Stručnjaci će prepoznati da neka od ovde opisanih jedinjenja mogu postojati u nekoliko tautomernih oblika. Svi takvi tautomerni oblici se smatraju delom ovde opisanih kompozicija.

[0137] Osim ako nije drugačije naznačeno, koriste se konvencionalne metode masene spektroskopije, NMR, HPLC, hemije proteina, biohemije, tehnika rekombinantne DNK i farmakologije, u okviru veštine u struci.

DETALJAN OPIS

I. Uvod

[0138] U određenim realizacijama pronalaska, IL-2 polipeptid uključuje najmanje jednu post-translacionu modifikaciju. U jednoj realizaciji, najmanje jedna post-translaciona modifikacija uključuje pričvršćivanje molekula uključujući, ali ne ograničavajući se na, oznaku, boju, polimer, vodorastvorni polimer, derivat polietilen glikola, fotoumreživač, radionuklid, citotoksično jedinjenje, lek, oznaku afiniteta, oznaku fotoafiniteta, reaktivno jedinjenje, smolu, drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida, antitelo ili fragment antitela, kelator metala, kofaktor, masnu kiselinu, ugljeni hidrat, polinukleotid, DNK, RNK, antisens polinukleotid, saharid, vodorastvorni dendrimer, ciklodekstrin, inhibitornu ribonukleinsku kiselinu, biomaterijal, nanočesticu, oznaku spina, fluorofor, deo molekula koji sadrži metal, radioaktivni deo molekula, novu funkcionalnu grupu, grupu koja kovalentno ili nekovalentno interaguje sa drugim molekulima, deo molekula u fotokavezu, deo molekula ekscitabilan aktiničnim zračenjem, deo molekula koji se može fotoizomerizovati, biotin, derivat biotina, analog biotina, teški deo atoma, grupu koja se može hemijski cepati, grupu koja se može fotohemijski cepati, produženi bočni lanac, šećer vezan ugljenikom, redoks-aktivni agens, amino tiokiselinu, toksični deo molekula, izotopski obeležen deo molekula, biofizičku probu, fosforescentnu grupu, hemiluminiscentnu grupu, grupu sa velikom gustinom elektrona, magnetičnu grupu, interkalirajuću grupu, hromoforu, agens za transfer energije, biološki aktivni agens, detektabilnu oznaku, mali molekul, kvantnu tačku, nanotransmiter, radionukleotid, radiotransmiter, agens za hvatanje neutrona, ili bilo koju kombinaciju gore navedenog ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili supstancu, koja sadrži drugu reaktivnu grupu za najmanje jednu ne-prirodnu aminokiselinu koja sadrži prvu reaktivnu grupu koja koristi hemijsku metodologiju koja je prosečnom stručnjaku poznata kao pogodna reaktivna grupa. Na primer, prva reaktivna grupa je alkinil grupa (uključujući, ali ne ograničavajući se samo na nju, u ne-prirodnoj aminokiselinskoj p-propargiloksiloksi grupi, u kojoj je takođe i propargiloksifenil grupa ponekad se naziva acetilenski deo), a druga reaktivna grupa je azido deo, i koriste se hemijske metodologije [3+2] cikloadicije. U drugom primeru, prva reaktivna grupa je azido deo (uključujući, ali ne ograničavajući se na, u ne-prirodnoj aminokiselini pazido-L-fenilalanin ili pAZ kako se ponekad spominje u ovoj specifikaciji), a druga reaktivna grupa je alkinil grupa. U određenim realizacijama IL-2 polipeptida iz ovog pronalaska, koristi se jedna ne-prirodna aminokiselina, para-acetil-fenilalanin, koja sadrži najmanje jednu post-translacionu modifikaciju, gdje najmanje jedna post-translaciona modifikacija sadrži saharidni deo. U određenim realizacijama, posttranslaciona modifikacija se vrši in vivo u eukariotskoj ćeliji ili u neeukariotskoj ćeliji. Linker, polimer, vodorastvorni polimer ili drugi molekul mogu vezati molekul za polipeptid. U dodatnoj realizaciji, linker vezan za IL-2 je dovoljno dugačak da omogući formiranje dimera. Molekul takođe može biti direktno vezan za polipeptid.

[0139] U određenim realizacijama, IL-2 polipeptid uključuje najmanje jednu post-translacionu modifikaciju koju in vivo pravi jedna ćelija domaćina, pri čemu post-translacionu modifikaciju normalno ne pravi drugi tip ćelije domaćina. U određenim realizacijama, IL-2 polipeptid uključuje najmanje jednu post-translacionu modifikaciju koju in vivo pravi eukariotska ćelija, pri čemu post-translacionu modifikaciju normalno ne pravi neeukariotska ćelija. Primeri post-translacionih modifikacija uključuju, ali nisu ograničeni na, glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, modifikaciju lipida, palmitoilaciju, adiciju palmitata, fosforilaciju, modifikaciju glikolipidne veze i slično.

[0140] U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, modifikaciju lipida, palmitoilaciju, adiciju palmitata, fosforilaciju ili modifikaciju glikolipidne veze. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju polipeptida. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid sadrži jednu ili više prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, modifikaciju lipida, palmitoilaciju, adiciju palmitata, fosforilaciju ili modifikaciju glikolipidne veze polipeptida. U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid sadrži jednu ili više prirodno kodiranih amino kiselina za glikozilaciju polipeptida.

[0141] U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jedan ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju polipeptida. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više delecija koje pojačavaju glikozilaciju polipeptida. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju na drugoj amino kiselini u polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više delecija koje pojačavaju glikozilaciju na različitim aminokiselinama u polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju na ne-prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više neprirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju na prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više prirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju na različitim aminokiselinama u polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju na prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim realizacijama, IL-2 sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinskih dodataka i/ili supstitucija koje pojačavaju glikozilaciju na ne-prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu.

[0142] U jednoj realizaciji, post-translaciona modifikacija uključuje vezivanje oligosaharida na asparagin pomoću GlcNAc-asparaginske veze (uključujući, ali ne ograničavajući se na slučaj, kada oligosaharid sadrži (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc-GlcNAc i slično). U drugoj realizaciji, post-translaciona modifikacija uključuje vezivanje oligosaharida (uključujući, ali ne ograničavajući se na, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, itd.) na serin ili treonin pomoću GalNAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina, ili GlcNAc-treonin veze. U određenim realizacijama, protein ili polipeptid iz ovog pronalaska može sadržati sekretornu ili lokalizacionu sekvencu, tag epitopa, FLAG tag, polihistidinski tag, GST fuziju i/ili slično. Primeri sekretornih signalnih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, prokariotsku sekretornu signalnu sekvencu, eukariotsku sekretornu signalnu sekvencu, eukariotsku sekretornu signalnu sekvencu 5'-optimizovanu za bakterijsku ekspresiju, novu sekretornu signalnu sekvencu, sekretornu signalnu sekvencu pektata liaze, Omp A sekretornu signalnu sekvencu i sekretornu signalnu sekvencu faga. Primeri sekretornih signalnih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, STII (prokariotska), Fd GIII i M13 (fag), Bgl2 (kvasac) i bla signalnu sekvencu izvedenu iz transpozona. Bilo koja takva sekvenca može biti modifikovana kako bi se postigao željeni rezultat sa polipeptidom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, supstituciju jedne signalne sekvence drugom signalnom sekvencom, supstituciju vodeće sekvence drugom vodećom sekvencom, itd.

[0143] Protein ili polipeptid mogu sadržati najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet ili deset ili više neprirodnih aminokiselina. Ne-prirodne aminokiseline mogu biti iste ili različite, na primer, može postojati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više različitih mesta u proteinu koja se sastoje od 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više različitih ne-prirodnih aminokiselina. U određenim realizacijama, najmanje jedna, ali manje od ukupnog broja, određenih aminokiseline prisutnih u prirodnoj verziji proteina je supstituisana neprirodnom aminokiselinom.

[0144] Uvođenje najmanje jedne ne-prirodno kodirane aminokiseline u IL-2 može omogućiti primenu hemijskih reakcija konjugacije koje uključuju specifične hemijske reakcije, uključujući, ali ne ograničavajući se na one, sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina dok ne reaguje sa uobičajenih 20 aminokiselina. U nekim realizacijama, IL-2 koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu je vezan za vodo-rastvorni polimer, kao što je polietilen glikol (PEG), preko bočnog lanca ne-prirodno kodirane amino kiseline. Opisana je visoko efikasna metoda za selektivnu modifikaciju proteina sa PEG derivatima, koja uključuje selektivnu inkorporaciju ne-genetski kodiranih aminokiselina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one aminokiseline koje sadrže funkcionalne grupe ili supstituente koji se ne nalaze u 20 prirodno inkorporiranih aminokiselina, uključujući ali ne ograničavajući se na keton, azidni ili acetilenski deo molekula, u proteine kao odgovor na selektorski kodon i naknadnu modifikaciju tih aminokiselina sa pogodno reaktivnim PEG derivatom. Kada su inkorporirani, bočni lanci aminokiselina se mogu modifikovati korišćenjem hemijskih metodologija koje su stručnjacima u ovoj oblasti poznate kao prikladne za određene funkcionalne grupe ili supstituente prisutne u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini. Poznate hemijske metodologije širokog spektra su pogodne za upotrebu u ovom pronalasku za ugradnju polimera rastvorljivog u vodi u protein. Takve metodologije uključuju, ali nisu ograničene na reakciju cikloadicije Huisgen [3+2] (vidi, npr. Padwa, A. u Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, BM, Pergamon, Oxford, str. 1069-1109 i, Huisgen, R. u 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, str. 1-176) sa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, acetilen ili derivate azida, respektivno.

[0145] Pošto Huisgen-ova [3+2] metoda cikloadicije uključuje cikloadiciju, a ne reakciju nukleofilne supstitucije, proteini se mogu modifikovati sa izuzetno visokom selektivnošću. Reakcija se može izvesti na sobnoj temperaturi u vodenim uslovima sa odličnom regioselektivnošću (1.4 > 1.5) dodavanjem katalitičkih količina Cu(I) soli u reakcionu smešu. Vidi, npr., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem.

67:3057-3064; i, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; i WO 03/101972. Molekul koji se može dodati proteinu putem [3+2] cikloadicije uključuje praktično bilo koji molekul sa odgovarajućom funkcionalnom grupom ili supstituentom uključujući ali ne ograničavajući se na azido ili derivat acetilena. Ovi molekuli se mogu dodati ne-prirodnoj aminokiselini sa acetilenskom grupom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, p-propargiloksifenilalanin, ili azido grupu, uključujući ali ne ograničavajući se na p-azido-fenilalanin, respektivno.

[0146] Petočlani prsten koji je rezultat Huisgen [3+2] cikloadicije generalno nije reverzibilan u redukcionim sredinama i stabilan je na hidrolizu tokom dužeg perioda u vodenim sredinama. Shodno tome, fizičke i hemijske karakteristike širokog spektra supstanci se mogu modifikovati u zahtevnim vodenim uslovima sa aktivnim derivatima PEG iz ovog pronalaska. Što je još važnije, budući da su azidni i acetilenski delovi specifični jedni za druge (i ne reaguju, na primer, ni sa jednom od 20 uobičajenih, genetski kodiranih aminokiselina), proteini se mogu modifikovati na jednom ili više specifičnih mesta sa ekstremno visokom selektivnošću.

[0147] Pronalazak takođe obezbeđuje vodorastvorne i hidrolitički stabilne derivate PEG derivata i srodnih hidrofilnih polimera koji imaju jedan ili više acetilenskih ili azidnih delova. Derivati PEG polimera koji sadrže acetilenske delove su visoko selektivni za kuplovanje sa azidnim delovima koji su selektivno uvedeni u proteine kao odgovor na selektorski kodon. Slično, derivati PEG polimera koji sadrže azidne delove su visoko selektivni za kuplovanje sa acetilenskim delovima koji su selektivno uvedeni u proteine kao odgovor na selektorski kodon.

[0148] Preciznije, azidni delovi sadrže, ali nisu ograničeni na, alkil azide, aril azide i derivate ovih azida. Derivati alkil i aril azida mogu uključivati druge supstituente sve dok se održava reaktivnost specifična za acetilen. Acetilenski delovi sadrže alkil i aril acetilene i njihove derivate. Derivati alkil i aril acetilena mogu uključivati druge supstituente sve dok se održava azidna reaktivnost.

[0149] Ovaj pronalazak obezbeđuje konjugate supstanci koje imaju širok spektar funkcionalnih grupa, supstituenata ili grupa, sa drugim supstancama uključujući, ali ne ograničavajući se na oznaku; boju; polimer; vodo-rastvorni polimer; derivat polietilen glikola; fotoumreživač; radionuklid; citotoksično jedinjenje; lek; oznaku afiniteta; oznaku fotoafiniteta; reaktivno jedinjenje; smolu; drugi protein ili polipeptid ili polipeptidni analog; antitelo ili fragment antitela; kelator metala; kofaktor; masnu kiselinu; ugljeni hidrat; polinukleotid; a DNK; a RNA; antisens polinukleotid; saharid; dendrimer rastvoran u vodi; ciklodekstrin; inhibitornu ribonukleinsku kiselinu; biomaterijal; nanočesticu; oznaku spina; fluorofor, deo koji sadrži metal; radioaktivni deo; novu funkcionalnu grupu; grupu koja kovalentno ili nekovalentno reaguje sa drugim molekulima; deo molekula u fotokavezu; deo molekula ekscitabilan aktiničnim zračenjem; deo koji može biti fotoizomerizovan; biotin; derivat biotina; analog biotina; deo koji sadrži teški atom; grupu koja se može hemijski cepati; grupu koja se može cepati fotohemijski; produženi bočni lanac; ugljenikom vezani šećer; redoks-aktivno sredstvo; amino tiokiselinu; toksični deo; izotopski obeleženi deo molekula; biofizičku probu; fosforescentnu grupu; hemiluminiscentnu grupu; grupu sa velikom gustinom elektrona; magnetičnu grupu; interkalirajuću grupu; hromofor; sredstvo za transfer energije; biološki aktivan agens; detektabilnu oznaku; mali molekul; kvantnu tačku; nanotransmiter; radionukleotid; radiotransmiter; agens za hvatanje neutrona; ili bilo koju kombinaciju gore navedenog, ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili supstancu. Ovaj pronalazak takođe uključuje konjugate supstanci koje imaju azidne ili acetilenske delove sa derivatima PEG polimera koji imaju odgovarajuće acetilenske ili azidne delove molekula. Na primer, PEG polimer koji sadrži azidni deo može biti kuplovan sa biološki aktivnim molekulom na poziciji u proteinu koja sadrži ne-genetski kodiranu aminokiselinu koja nosi acetilensku funkciju. Veza kojom su PEG i biološki aktivni molekul kuplovani uključuje, ali nije ograničena na Huisgen [3+2] cikloadicioni proizvod.

[0150] U struci je dobro poznato da se PEG može koristiti za modifikovanje površina biomaterijala (vidi, npr., U.S. Patent 6,610,281; Mehvar, R., J. Pharm Sci., 3(1): 125-136 (2000)). Pronalazak takođe uključuje biomaterijale koji sadrže površinu koja ima jedno ili više reaktivnih azidnih ili acetilenskih mesta i jedan ili više polimera iz pronalaska koji sadrže azid ili acetilen koji su kuplovani na površinu preko Huisgen [3+2] cikloadicione veze. Biomaterijali i druge supstance se takođe mogu kuplovati sa derivatima polimera aktiviranih azidom ili acetilenom preko veze koja nije azidna ili acetilenska veza, kao što je veza koja sadrži karboksilnu kiselinu, amin, alkohol ili tiolnu grupu, kako bi napustili azidni ili acetilenski deo dostupan za sledeće reakcije.

[0151] Pronalazak uključuje metodu sinteze polimera iz pronalaska koji sadrže azid i acetilen. U slučaju derivata PEG koji sadrži azid, azid se može direktno vezati za atom ugljenika polimera. Alternativno, derivat PEG koji sadrži azid može se pripremiti vezivanjem agensa koji ima azidni deo na jednom kraju na uobičajeni aktivirani polimer tako da rezultirajući polimer ima azidni deo na svom terminusu. U slučaju derivata PEG koji sadrži acetilen, acetilen se može direktno vezati za atom ugljenika polimera. Alternativno, derivat PEG koji sadrži acetilen može se pripremiti vezivanjem agensa koji ima acetilenski deo na jednom kraju na uobičajeni aktivirani polimer tako da rezultujući polimer ima acetilenski deo na svom kraju.

[0152] Preciznije, u slučaju derivata PEG koji sadrži azid, polimer rastvorljiv u vodi koji ima najmanje jedan aktivni hidroksilni deo prolazi kroz reakciju da se prizvede supstituisani polimer koji ima reaktivniji deo, kao što je mezilat, tresilat, tozilat ili halogenu odlazeću grupu na sebi. Priprema i upotreba derivata PEG koji sadrže halogenide sulfonil kiseline, atome halogena i druge odlazeće grupe su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Rezultujući supstituisani polimer zatim prolazi kroz reakciju da supstituiše za reaktivniji deo azidni deo na terminusu polimera. Alternativno, vodo-rastvorni polimer koji ima najmanje jedan aktivni nukleofilni ili elektrofilni deo prolazi kroz reakciju sa vezujućim agensom koji ima azid na jednom kraju tako da se formira kovalentna veza između PEG polimera i vezujućeg agensa, a azidni deo je pozicioniran na kraju polimera. Nukleofilni i elektrofilni delovi, uključujući amine, tiole, hidrazide, hidrazine, alkohole, karboksilate, aldehide, ketone, tioestre i slično, su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0153] Preciznije, u slučaju derivata PEG koji sadrži acetilen, vodo-rastvorni polimer koji ima najmanje jednu aktivnu hidroksilnu grupu prolazi kroz reakciju da istisne halogen ili drugu aktiviranu odlazeću grupu iz prekursora koji sadrži acetilenski deo. Alternativno, vodo-rastvorni polimer koji ima najmanje jedan aktivni nukleofilni ili elektrofilni deo prolazi kroz reakciju sa vezujućim agensom koji ima acetilen na jednom terminusu tako da se formira kovalentna veza između PEG polimera i vezujućeg agensa, a acetilenski deo je pozicioniran na terminusu polimera. Upotreba halogenih delova, aktivirane odlazeće grupe, nukleofilnih i elektrofilnih delova u kontekstu organske sinteze i pripreme i upotrebe derivata PEG je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti.

[0154] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za selektivnu modifikaciju proteina za dodavanje drugih supstanci modifikovanom proteinu, uključujući ali ne ograničavajući se na polimere rastvorljive u vodi kao što su PEG i PEG derivati koji sadrže azidni ili acetilenski deo. Derivati PEG koji sadrže azid i acetilen se mogu koristiti za modifikaciju svojstava površina i molekula kod kojih su važni biokompatibilnost, stabilnost, rastvorljivost i nedostatak imunogenosti, dok istovremeno obezbeđuju selektivniji način vezivanja PEG derivata za proteine nego što je ranije bilo poznato u struci.

II. Opšte Rekombinantne Metode Nukleinske Kiseline Za Upotrebu Sa Pronalaskom

[0155] Nukleinske kiseline koje kodiraju IL-2 od interesa se mogu izolovati, klonirati i često menjati pomoću rekombinantnih metoda. Takve metode se koriste, uključujući, ali ne ograničavajući se, za ekspresiju proteina ili tokom stvaranja varijanti, derivata, ekspresionih kaseta ili drugih sekvenci izvedenih iz IL-2. Sekvence koje kodiraju polipeptide mogu biti operativno vezane za heterologni promoter.

[0156] Aminokiselinska sekvenca zrelog humanog IL-2 proteina prikazana je ispod u Tabeli 1.

Tabela 1- IL-2 Protein i DNK sekvence

[0157] Nukleotidna sekvenca koja kodira IL-2 koji sadrži ne-prirodno kodiranu amino kiselinu može biti sintetisana na osnovu aminokiselinske sekvence roditeljskog polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 1, 2, 3, 5 ili 7, a zatim zamenom nukleotidne sekvence kako bi se izvršilo uvođenje (tj. inkorporacija ili supstitucija) ili uklanjanje (tj. delecija ili supstitucija) relevantne(ih) aminokiselinske rezidue(a). Nukleotidna sekvenca se može prikladno modifikovati mutagenezom usmerenom na mesto u skladu sa konvencionalnim metodama. Alternativno, nukleotidna sekvenca se može pripremiti hemijskom sintezom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, korišćenje sintetizera oligonukleotida, pri čemu su oligonukleotidi dizajnirani na osnovu aminokiselinske sekvence željenog polipeptida, i poželjno odabirom onih kodona koji su favorizovani u ćeliji domaćinu u kojoj će se proizvoditi rekombinantni polipeptid. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida se mogu sintetizovati i sastaviti pomoću PCR, ligacijom ili lančanom reakcijom ligacije. Vidi, npr., Barany, et al., Proc. Natl. Akad. Sci. 88: 189-193 (1991); U.S. Patent 6,521,427.

[0158] DNK sekvenca sintetičkog humanog IL-2 gena koja je klonirana u ekspresioni plazmid pKG0269 je prikazana u Tabeli 1, gore, kao SEK ID BR: 4. Ova DNK sekvenca je optimizovana kodonom E. coli.

[0159] Ovaj pronalazak koristi rutinske tehnike u oblasti rekombinantne genetike. Osnovni tekstovi koji otkrivaju opšte metode upotrebe u ovom pronalasku uključuju Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

[0160] Pronalazak se takođe odnosi na eukariotske ć elije domaćine, neeukariotske ć elije domaćine i organizme za in vivo ugradnju ne-prirodne amino kiseline preko ortogonalnih tRNK/RS parova. Ćelije domaćini su genetski inženjerisane (uključujući, ali ne ograničavajući se na, transformisane, transdukovane ili transfektovane) sa polinukleotidima iz pronalaska ili konstruktima koji uključuju polinukleotid iz pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na, vektor iz pronalaska, koji može biti, na primer, vektor za kloniranje ili ekspresioni vektor.

[0161] Dostupno je nekoliko dobro poznatih metoda za uvođenje ciljnih nukleinskih kiselina u ćelije, od kojih se svaka može koristiti u pronalasku. Ovo uključuje: fuziju ćelija primaoca sa bakterijskim protoplastima koji sadrže DNK, elektroporaciju, bombardovanje projektilom i infekciju virusnim vektorima (o čemu se dalje govori u nastavku), itd. Bakterijske ćelije se mogu koristiti za povećanje broja plazmida koji sadrže DNK konstrukte iz ovog pronalaska. Bakterije se uzgajaju do log faze, a plazmidi unutar bakterija se mogu izolovati raznim metodama poznatim u struci (vidi, na primer, Sambrook). Osim toga, komercijalno su dostupni setovi za prečišćavanje plazmida od bakterija (vidi, npr. EasyPrep™, FlexiPrep™, oba od Pharmacia Biotech; StrataClean™ od Stratagene; i QIAprep™ od Qiagena). Izolovani i prečišćeni plazmidi se zatim dalje manipulišu kako bi se proizveli drugi plazmidi, koji se koriste za transfekciju ćelija ili se ugrađuju u srodne vektore za inficiranje organizama. Tipični vektori sadrže terminatore transkripcije i translacije, sekvence inicijacije translacije i promotere korisne za regulaciju ekspresije određene ciljne nukleinske kiseline. Vektori opciono sadrže generičke ekspresione kasete koje sadrže najmanje jednu nezavisnu terminatorsku sekvencu, sekvence koje dozvoljavaju replikaciju kasete kod eukariota, ili prokariota, ili oboje, (uključujući, ali ne ograničavajući se na, šatl vektore) i selekcione markere za prokariotske i eukariotske sisteme. Vektori su pogodni za replikaciju i integraciju u prokariote, eukariote ili oboje. Vidi, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra). Katalog bakterija i bakteriofaga korisnih za kloniranje je obezbeđen, npr. od ATCC, npr. ATCC Katalog bakterija i bakteriofaga (1992) Gherna et al. (eds) objavljen od ATCC. Dodatne osnovne procedure za sekvenciranje, kloniranje i druge aspekte molekularne biologije i temeljna teorijska razmatranja takođe se nalaze u Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Osim toga, u suštini svaka nukleinska kiselina (i gotovo svaka obeležena nukleinska kiselina, standardna ili nestandardna) se može naručiti po specifikaciji ili standardu iz bilo kojeg od niza komercijalnih izvora, kao što je Midland Certified Reagent Company (Midland, TX dostupan na World Wide Web na mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA dostupna na World Wide Webu na genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL dostupno na World Wide Webu na expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) i mnogi drugi.

SELEKTORSKI KODONI

[0162] Selektorski kodoni pronalaska proširuju genetski kodonski okvir biosintetičke mašinerije proteina. Na primer, selektorski kodon uključuje, ali nije ograničen na, jedinstveni trobazni kodon, nonsens kodon, kao što je stop kodon, uključujući, ali ne ograničavajući se na, amber kodon (UAG), oker kodon ili opal kodon (UGA), ne-prirodni kodon, četvoro ili više bazni kodon, retki kodon ili slično. Stručnjacima je lako očito da postoji širok raspon u broju selektorskih kodona koji se mogu uvesti u željeni gen ili polinukleotid, uključujući, ali ne ograničavajući se na, jedan ili više, dva ili više, tri ili više, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više u jednom polinukleotidu koji kodira barem deo IL-2.

[0163] Metode mogu uključivati upotrebu selektorskog kodona koji je stop kodon za ugradnju jedne ili više ne-prirodnih amino kiselina in vivo. Na primer, proizvede se O-tRNK koja prepoznaje stop kodon, uključujući, ali ne ograničavajući se na, UAG, i aminoaciluje se pomoću O-RS sa željenom ne-prirodnom amino kiselinom. Ova O-tRNK nije prepoznata od strane aminoacil-tRNK sintetaza domaćina koje se prirodno javljaju. Konvencionalna mutageneza usmerena na mesto se može koristiti za uvođenje stop kodona, uključujući, ali ne ograničavajući se na, TAG, na mesto od interesa u polipeptidu od interesa. Vidi, npr., Sayers, JR, et al. (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802. Kada se O-RS, O-tRNK i nukleinska kiselina koja kodira polipeptid od interesa kombinuju in vivo, ne-prirodna aminokiselina se inkorporira kao odgovor na UAG kodon kako bi se dobio polipeptid koji sadrži ne-prirodnu aminokiselinu na određenoj poziciji.

[0164] Inkorporacija ne-prirodnih aminokiselina in vivo može se obaviti bez značajne perturbacije eukariotske ćelije domaćina. Na primer, zato što efikasnost supresije za UAG kodon zavisi od kompeticije između O-tRNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na, tRNK amber supresor, i eukariotski faktor oslobađanja (uključujući, ali ne ograničavajući se na, eRF) (koji se vezuje za stop kodon i inicira oslobađanje rastućeg peptida iz ribozoma), efikasnost supresije se može modulisati, uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećanje nivoa ekspresije O-tRNK, i/ili supresorske tRNK.

[0165] Ne-prirodne aminokiseline takođe mogu biti kodirane retkim kodonima. Na primer, kada je koncentracija arginina u in vitro reakciji sinteze proteina smanjena, retki argininski kodon, AGG, se pokazao efikasnim za umetanje Ala pomoću sintetičke tRNK acilovane alaninom. Vidi, npr., Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). U ovom slučaju, sintetička tRNK se takmiči sa prirodnim tRNKArg, koji postoji kao sporedna vrsta u Escherichia coli. Neki organizmi ne koriste sve triplet kodone. Nedodeljeni kodon AGA u Micrococcus luteus je korišćen za inserciju aminokiselina u ekstrakt in vitro transkripcije/translacije. Vidi npr. Kowal i Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Komponente ovog pronalaska se mogu generisati za korišćenje ovih retkih kodona in vivo.

[0166] Selektorski kodoni takođe sadrže proširene kodone, uključujući, ali ne ograničavajući se na, četiri ili više bazne kodone, kao što su č etiri, pet, šest ili više bazni kodoni. Primeri četvorobaznog kodona uključuju, ali nisu ograničeni na, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU i slično. Primeri peto-baznih kodona uključuju, ali nisu ograničeni na, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC i slično. Karakteristika pronalaska uključuje korišćenje proširenih kodona zasnovanih na supresiji pomeranja okvira čitanja. Četvoro ili više bazni kodoni mogu umetnuti, uključujući, ali ne ograničavajući se na jednu ili više ne-prirodnih aminokiselina u isti protein. Na primer, u prisustvu mutiranih O-tRNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specijalne tRNK supresore pomeranja okvira, sa petljama antikodona, na primer, sa najmanje 8-10 nt petlji antikodona, četvoro ili više bazni kodon se čita kao pojedinačna aminokiselina. U drugim realizacijama, petlje antikodona mogu dekodirati, uključujući, ali ne ograničavajući se, najmanje četvorobazni kodon, najmanje petobazni kodon, ili najmanje kodon sa šest ili više baza. Budući da postoji 256 mogućih četvorobaznih kodona, višestruke ne-prirodne aminokiseline mogu biti kodirane u istoj ćeliji korišćenjem čet voro ili više baznih kodona. Vidi, Anderson et al., Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244, (2002); Magliery, Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Fourbase Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769, (2001).

[0167] Na primer, četvorobazni kodoni su korišćeni za inkorporiranje ne-prirodnih aminokiselina u proteine korišćenjem in vitro metoda biosinteze. Vidi, npr., Ma et al., Biochemistry, 32:7939, (1993); i Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121:34, (1999). CGGG i AGGU su korišćeni da istovremeno inkorporiraju 2-naftilalanin i NBD derivat lizina u streptavidin in vitro sa dve hemijski acilovane tRNK supresora pomeranja okvira. Vidi, npr., Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121:12194, (1999). U in vivo studiji, Moore et al. su ispitali sposobnost derivata tRNKLeu sa NCUA antikodonima da potisnu UAGN kodone (N može biti U, A, G ili C) i otkrili da kvadruplet UAGA može biti dekodiran pomoću tRNKLeu sa UCUA antikodonom sa efikasnošću od 13 do 26 % sa malo dekodiranja u okviru 0 ili -1. Vidi, Moore et al., J. Mol. Biol., 298:195, (2000). U jednoj realizaciji, prošireni kodoni zasnovani na retkim kodonima ili nonsens kodonima mogu biti korišćeni u ovom pronalasku, što može smanjiti misens readthrough i supresiju pomeranja okviračitanja na drugim neželjenim mestima.

[0168] Za dati sistem, selektorski kodon takođe može uključivati jedan od prirodnih trobaznih kodona, gde endogeni sistem ne koristi (ili retko koristi) prirodni bazni kodon. Na primer, ovo uključuje sistem kojem nedostaje tRNK koja prepoznaje prirodni trobazni kodon, i/ili sistem gde trobazni kodon je retki kodon.

[0169] Selektorski kodoni opciono uključuju ne-prirodne parove baza. Ovi ne-prirodni parovi baza dodatno proširuju postojeću genetski alfabet. Jedan dodatni bazni par povećava broj triplet kodona sa 64 na 125. Svojstva trećih baznih parova uključuju stabilno i selektivno uparivanje baza, efikasnu enzimsku inkorporaciju u DNK sa visokom tačnošću pomocu polimeraze, i efikasnom kontinuiranom ekstenzijom prajmera nakon sinteze nascentnog ne-prirodnog baznog para. Opisi ne-prirodnih baznih parova koji se mogu adaptirati za metode i kompozicije uključuju, npr., Hirao, et al., An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20: 177-182, (2002). Vidi takođe, Wu, Y., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630, (2002). Ostale relevantne publikacije su navedene u nastavku.

[0170] Za in vivo upotrebu, ne-prirodni nukleozid je membranski permeabilan i fosforilisan je da formira odgovarajući trifosfat. Osim toga, povećane genetske informacije su stabilne i ne uništavaju ih ćelijski enzimi. Prethodni napori Bennera i drugih iskoristili su obrascevezivanja kod vodonične veze koji se razlikuju od onih u kanonskim Watson-Crick parovima, čiji je najistaknutiji primer izo-C:iso-G par. Vidi, npr., Switzer et al., J. Am. Chem. Soc., 111:8322, (1989); i Piccirilli et al., Nature, 343:33, (1990); Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602, (2000). Ove baze se generalno u određenoj meri pogrešno sparuju sa prirodnim bazama i ne mogu se enzimski replicirati. Kool i saradnici su pokazali da hidrofobne interakcije pakovanja između baza mogu zameniti vodoničnu vezu kako bi pokrenule formiranje baznog para. Vidi, Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602, (2000); i Guckian i Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825, (1998). U nastojanju da razviju ne-prirodni bazni par koji zadovoljava sve gore navedene zahteve, Schultz, Romesberg i saradnici su sistematski sintetizovali i proučavali niz ne-prirodnih hidrofobnih baza. Utvrđeno je da je samo-par PICS:PICS stabilniji od prirodnih baznih parova i može se efikasno ugraditi u DNK pomoću Klenow fragmenta Escherichia coli DNK polimeraze I (KF). Vidi, npr. McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-6, (1999); i Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc., 122:3274, (2000). Samo-par 3MN:3MN može biti sintetizovan pomoću KF sa efikasnošću i selektivnošću dovoljnom za biološku funkciju. Vidi, npr., Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc., 122:8803, (2000). Međutim, obe baze deluju kao terminator lanca za dalju replikaciju. Nedavno je razvijena mutantna DNK polimeraza koja se može koristiti za repliciranje PICS self-pair. Osim toga, 7AI self-pair se može replicirati. Vidi, npr., Tae et al., J. Am. Chem. Soc., 123:7439, (2001). Razvijen je i novi par metalobaze, Dipic:Py, koji formira stabilan par nakon vezivanja Cu(II). Vidi, Meggers et al., J. Am. Chem. Soc., 122:10714, (2000). Pošto su prošireni kodoni i ne-prirodni kodoni intrinzično ortogonalni na prirodne kodone, metode iz ovog pronalaska mogu iskoristiti ovo svojstvo za generisanje ortogonalnih tRNK za njih.

[0171] Translacioni bypassing sistem se takođe može koristiti za inkorporiranje ne-prirodne amino kiseline u željeni polipeptid. U translacionom bypassing sistemu, velika sekvenca je inkorporirana u gen, ali nije prevedena u protein. Sekvenca sadrži strukturu koja služi kao signal za izazivanje ribozoma da preskoči sekvencu i nastavi translaciju nizvodno od insercije.

[0172] U određenim realizacijama, protein ili polipeptid od interesa (ili njihov deo) u metodama i/ili kompozicijama iz pronalaska je kodiran nukleinskom kiselinom. Tipično, nukleinska kiselina sadrži najmanje jedan selektorski kodon, najmanje dva selektorska kodona, najmanje tri selektorska kodona, najmanje četiri selektorska kodona, najmanje pet selektorskih kodona, najmanje šest selektorskih kodona, najmanje sedam selektorskih kodona, najmanje osam selektorskih kodona, najmanje devet selektorskih kodona, deset ili više selektorskih kodona.

[0173] Geni koji kodiraju proteine ili polipeptide od interesa mogu biti podvrgnuti mutagenezi korišćenjem metoda poznatih prosečnom stručnjaku i ovde opisanih da uključe, na primer, jedan ili više selektorskih kodona za inkorporaciju ne-prirodne aminokiseline. Na primer, nukleinska kiselina za protein od interesa je podvrgnuta mutagenezi tako da uključuje jedan ili više selektorskih kodona, osiguravajući ugradnju jedne ili više ne-prirodnih aminokiselina.

[0174] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju protein od interesa kao što je IL-2 se mogu lako mutirati da uvedu cistein na bilo koju željenu poziciju polipeptida. Cistein se široko koristi za uvođenje reaktivnih molekula, polimera rastvornih u vodi, proteina ili velikog broja drugih molekula u protein od interesa. Metode prikladne za ugradnju cisteina u željenu poziciju polipeptida su poznate stručnjacima u ovoj oblasti, kao što su one opisane u U.S. Patentu br.6,608,183 i standardne tehnike mutageneze.

III. Ne-prirodno Kodirane Amino Kiseline

[0175] Bilo koji broj ne-prirodno kodiranih aminokiselina se može uvesti u IL-2. Generalno, uvedene neprirodno kodirane aminokiseline su suštinski hemijski inertne prema 20 uobičajenih, genetski kodiranih aminokiselina (tj. alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucidin leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin). Ne-prirodno kodirane aminokiseline mogu uključivati funkcionalne grupe bočnog lanca koje reaguju efikasno i selektivno sa funkcionalnim grupama koje se ne nalaze u 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući, ali ne ograničavajući se na, azido, ketonske, aldehidne i aminooksi grupe) kako bi formirale stabilne konjugate. Na primer, IL-2 koji uključuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži azido funkcionalnu grupu može da reaguje sa polimerom (uključujući, ali ne ograničavajući se na, poli(etilen glikol) ili, alternativno, drugim polipeptidom koji sadrži alkinski deo molekuila) za formiranje stabilnog konjugata koji rezultira selektivnom reakcijom azidnih i alkinskih funkcionalnih grupa kako bi se formirao Huisgen [3+2]cikloadicioni proizvod.

[0176] Generička struktura alfa-amino kiseline je ilustrovana kako sledi (Formula I):

[0177] Ne-prirodno kodirana amino kiselina je tipično svaka struktura koja ima gore navedenu formulu u kojoj je R grupa bilo koji supstituent osim onoga koji se koristi u dvadeset prirodnih aminokiselina. Budući da se ne-prirodno kodirane aminokiseline obično razlikuju od prirodnih aminokiselina samo po strukturi bočnog lanca, ne-prirodno kodirane aminokiseline formiraju amidne veze sa drugim aminokiselinama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, prirodno ili ne-prirodno kodirane, na isti način na koji se formiraju u prirodnim polipeptidima. Međutim, ne-prirodne aminokiseline imaju grupe bočnih lanaca koje ih razlikuju od prirodnih aminokiselina. Na primer, R opciono sadrži alkil-, aril-, acil-, keto-, azido-, hidroksil-, hidrazin, cijano-, halo-, hidrazid, alkenil, alkinl, etar, tiol, seleno-, sulfonil-, borat , boronat, fosfo, fosfono, fosfin, heterociklični, enon, imin, aldehid, estar, tiokiselina, hidroksilamin, amino grupu, ili slično ili bilo koja njihovu kombinaciju. Druge ne-prirodne aminokiseline od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, aminokiseline koje se sastoje od fotoaktivabilnog umreživača, aminokiseline sa oznakom spina, fluorescentnih aminokiselina, aminokiselina koje vezuju metal, aminokiselina koje sadrže metal, radioaktivnih aminokiselina, aminokiselina sa novim funkcionalnim grupama, aminokiselina koje kovalentno ili nekovalentno interaguju sa drugim molekulima, fotokavezne i/ili fotoizomerizujuće aminokiseline, aminokiseline koje sadrže biotin ili analog biotina, glikozilovane aminokiseline kao što je serin zamenjen šećerom, druge aminokiseline modifikovane ugljenim hidratima, aminokiseline koje sadrže keto, aminokiseline koje sadrže polietilen glikol ili polietar, aminokiseline supstituisane teškim atomom, aminokiseline koje se mogu cepati hemijski i/ili fotohemijski, aminokiseline sa produženim bočnim lancima u odnosu na prirodne aminokiseline, uključujući, ali ne ograničavajući se na polietre ili ugljovodonike dugog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, više od oko 5 ili više od oko 10 ugljenika, aminokiseline sa ugljenično vezanim šećerima, redoks aktivne aminokiseline, aminokiseline koje sadrže amino-tiokiseline i aminokiseline koje sadrže jedan ili vise toksičnih delova molekula.

[0178] Primeri ne-prirodno kodiranih aminokiselina koje su korisne za reakcije sa polimerima rastvorljivim u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, one sa karbonil, aminooksi, hidrazin, hidrazid, semikarbazid, azid i alkin reaktivnim grupama. Ne-prirodno kodirane aminokiseline mogu sadržati saharidni deo molekula. Primeri takvih aminokiselina uključuju N-acetil-L-glukozaminil-L-serin, Nacetil-L-galaktozaminil-L-serin, N-acetil-L-glukozaminil-L-treonin, N-acetil-L-glukozaminil-L-asparagin i O-manosaminil-L-serin. Primeri takvih aminokiselina takođe uključuju primere gde je prirodna Nor O-veza između aminokiseline i saharida zamenjena kovalentnom vezom koja se obično ne nalazi u prirodi -uključujući, ali ne ograničavajući se na, alken, oksim, tioetar, amid i slično. Primeri takvih aminokiselina takođe uključuju saharide koji se obično ne nalaze u prirodnim proteinima kao što su 2-deoksi-glukoza, 2-deoksigalaktoza i slično.

[0179] Mnoge ne-prirodno kodirane aminokiseline koje su ovde date su komercijalno dostupne, npr. kod Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD), Novabiochem (odjel EMD Biosciences, Darmstadt, Nemačka) ili Peptech (Burlington, MA, SAD). One koje nisu komercijalno dostupne se opciono sintetišu kako je ovde navedeno ili korišćenjem standardnih metoda poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Za tehnike organske sinteze, vidi npr. Organic Chemistry by Fessendon i Fessendon, drugo izdanje, Willard Grant Press, Boston Mass, (1982); Advanced Organic Chemistry by March Third Edition, Wiley and Sons, New York, (1985); i Advanced Organic Chemistry od Careyja i Sundberga, treće izdanje, delovi A i B, Plenum Press, New York, (1990). Vidi, takođe, U.S. Patents Nos. 7,045,337 i 7,083,970. Osim ne-prirodnih aminokiselina koje sadrže nove bočne lance, ne-prirodne aminokiseline takođe opciono sadrže modifikovane strukture kičme, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kako je ilustrovano strukturama Formule II i III:

gde Z obično sadrži OH, NH2, SH, NH -R', ili S-R'; X i Y, koji mogu biti isti ili različiti, obično sadrži S ili O, i R i R', koji su opciono isti ili različiti, obično se biraju sa iste liste sastojaka za R grupu opisanu gore za ne-prirodne aminokiseline koje imaju formulu I kao i vodonik. Na primer, ne-prirodne aminokiseline opciono sadrže supstitucije u amino ili karboksilnoj grupi kao što je ilustrovano formulama II i III. Ne-prirodne aminokiseline ovoga tipa uključuju, ali nisu ograničene na, α -hidroksi kiseline, α -tiokiseline, α -aminotiokarboksilate, uključujući ali ne ograničavajući se na ine, sa bočnim lancima koje odgovaraju uobičajenim dvadeset prirodnih aminokiselina ili ne-prirodnim bočnim lancima. Osim toga, supstitucije na α -ugljeniku opciono uključuju, ali nisu ograničene na, L, D ili α -α- disupstituisane aminokiseline kao što su D-glutamat, D-alanin, D-metil-O-tirozin, aminobutirna kiselina, i slično. Druge strukturne alternative uključuju ciklične aminokiseline, kao što su analozi prolina, kao i 3, 4, 6, 7, 8, i 9-člani prstenasti analozi prolina, β i γ aminokiseline kao što su supstituisani β-alanin i γ -amino buterna kiselina.

[0180] Mnoge ne-prirodne aminokiseline su bazirane na prirodnim amino kiselinama, kao što su tirozin, glutamin, fenilalanin i slično. Analozi tirozina uključuju, ali nisu ograničeni na, para-supstituisane tirozine, orto-supstituisane tirozine i meta-supstituisane tirozine, gde supstituisani tirozin uključuje, ali ne ograničavajući se na, keto grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, acetil grupu), benzoil grupu, amino grupu, hidrazin, hidroksiamin, tiol grupu, karboksi grupu, izopropil grupu, metil grupu, C6- C20ugljovodonik ravnog ili razgranatog lanca, zasićeni ili nezasićeni ugljovodonik, O-metil grupu, polietersku grupu, nitro grupu, alkinil grupu ili slično. Osim toga, razmatraju se i višestruko supstituisani aril prstenovi. Analozi glutamina uključuju, ali nisu ograničeni na, α -hidroksi derivate, γ -supstituisane derivate, ciklične derivate i derivate glutamina supstituisane amidom. Primeri analoga fenilalanina uključuju, ali nisu ograničeni na, para-supstituisane fenilalanine, orto-supstituisane fenilalanine i metasupstituisane fenilalanine, gde supstituent uključuje, ali ne ograničavajući se na, hidroksi grupu, metoksi grupu, metil grupu, alil grupu, aldehid, azido, jod, bromo, keto grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, acetil grupu), benzoil, alkinil grupu, ili slično. Specifični primeri ne-prirodnih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, p-acetil-L-fenilalanin, O-metil-L-tirozin, L-3-(2-naftil)alanin, 3-metilfenilalanin, O-4-alil-L-tirozin, 4-propil-L-tirozin, tri-O-acetil-GlcNAcβ-serin, L-Dopa, fluorovani fenilalanin, izopropil-L-fenilalanin, p-azido-L-fenilalanin, p-acil-L-fenilalanin, p-benzoil-L-fenilalanin, L-fosfoserin, fosfonoserin, fosfonotirozin, p-jodo-fenilalanin, p-bromofenilanin, p-amino-L-fenilalanin, izopropil-L-fenilalanin, i p-propargiloksi-fenilalanin, i slično. Primeri struktura raznih ne-prirodnih aminokiselina su dati u, na primer, WO 2002/085923 pod naslovom "In vivo incorporation of unnatural amino acids." Videti takođe Kiick et al., Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, (2002) za dodatne analoge metionina. Međunarodna prijava br. PCT/US06/47822 pod naslovom "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Nonnatural Amino Acids and Polypeptides," opisuje reduktivnu alkilaciju aromatičnih aminskih delova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, p-amino-fenilalanin i reduktivnu aminaciju.

[0181] U drugoj realizaciji ovog pronalaska, IL-2 polipeptidi su kovalentno modifikovani. Selektivne hemijske reakcije koje su ortogonalne različitoj funkcionalnosti bioloških sistema su prepoznate kao važni alati u hemijskoj biologiji. Kao relativne novopridošlice u repertoaru hemijske sinteze, ove bioortogonalne reakcije su inspirisale nove strategije za sintezu biblioteke jedinjenja, inženjerisanje proteina, funkcionalnu proteomiku i hemijsko remodelovanje ć elijskih površina. Azid je osigurao istaknutu ulogu kao jedinstvena hemijska alatka za biokonjugaciju. Staudingerova ligacija je korišćena sa fosfinima za obeležavanje azidošećera koji se metabolički unose u ćelijske glikokonjugate. Staudingerova ligacija se može izvesti kod živih životinja bez fizioloških oštećenja; ipak, Staudingerova reakcija nije bez odgovornosti. Neophodni fosfini su podložni oksidaciji vazduhom i njihova optimizacija za poboljšanu rastvorljivost u vodi i povećanu brzinu reakcije se pokazala kao sintetički izazovna.

[0182] Azidna grupa ima alternativni način bioortogonalne reaktivnosti: [3+2] cikloadiciju sa alkinima koju je opisao Huisgen. U svom klasičnom obliku, ova reakcija ima ograničenu primenu u biološkim sistemima zbog zahteva za povišenim temperaturama (ili pritiscima) za razumne brzine reakcije. Sharpless i saradnici su prevazišli ovu prepreku razvojem bakar(I)-katalizovane verzije, nazvane "klik hemija", koja se lako odvija na fiziološkim temperaturama i u bogato funkcionalizovanom biološkom okruženju. Ovo otkriće je omogućilo selektivnu modifikaciju virusnih čestica, nukleinskih kiselina i proteina iz složenih lizata tkiva. Nažalost, obavezni bakarni katalizator je toksičan i za bakterijske i za ćelije sisara, što onemogućuje primenu u kojoj ć elije moraju ostati vijabilne. Prijavljeno je da se Huisgenove cikloadicije alkina aktiviranih supstituentima za povlačenje elektrona bez katalizatora javljaju na sobnoj temperaturi. Međutim, ova jedinjenja prolaze Michaelovu reakciju sa biološkim nukleofilima.

[0183] Opisani su sastavi IL-2 koji uključuju ne-prirodnu amino kiselinu (kao što je p-(propargiloksi)-fenilalanin). Takođe su obezbeđene različite kompozicije koje sadrže p-(propargiloksi)-fenilalanin i, uključujući ali ne ograničavajući se na, proteine i/ili ćelije. Kompozicija koja uključuje ne-prirodnu amino kiselinu p-(propargiloksi)-fenilalanin može dalje uključivati ortogonalnu tRNK. Ne-prirodna aminokiselina može biti vezana (uključujući, ali ne ograničavajući se na, kovalentno) za ortogonalnu tRNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kovalentno vezanu za ortogonalnu tRNK putem aminoacil veze, kovalentno vezanu za 3'OH ili 2'OH terminal šećera riboze ortogonalne tRNK, itd.

[0184] Hemijski delovi preko ne-prirodnih aminokiselina koje se mogu ugraditi u proteine nude razne prednosti i manipulacije proteina. Na primer, jedinstvena reaktivnost keto funkcionalne grupe omogućava selektivnu modifikaciju proteina sa bilo kojim od brojnih reagenasa koji sadrže hidrazin ili hidroksilamin in vitro i in vivo. Teški atom ne-prirodne aminokiseline, na primer, može biti korisan za fazno analiziranje podataka o rendgenskoj strukturi. Lokalno specifično uvođenje teških atoma korišćenjem neprirodnih aminokiselina takođe pruža selektivnost i fleksibilnost u odabiru pozicija za teške atome. Fotoreaktivne ne-prirodne aminokiseline (uključujući, ali ne ograničavajući se na, aminokiseline sa bočnim lancima benzofenona i arilazida (uključujući, ali ne ograničavajući se na, fenilazid), na primer, omogućavaju efikasno in vivo i in vitro foto-umrežavanje proteina. Primeri fotoreaktivnih ne-prirodnih amino kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, p-azidofenilalanin i p-benzoil-fenilalanin. Protein sa fotoreaktivnim ne-prirodnim aminokiselinama može zatim opciono biti umrežen ekscitacijom fotoreaktivne grupe koja obezbeđuje vremensku kontrolu. U jednom primeru, metil grupa ne-prirodne amino kiseline može biti supstituisana izotopski obeleženom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, metil grupu, kao probom lokalne strukture i dinamike, uključujući, ali ne ograničavajući se na, uz korišćenje nuklearne magnetne rezonance i vibracione spektroskopije. Alkinil ili azido funkcionalne grupe, na primer, omogućavaju selektivnu modifikaciju proteina sa molekulima kroz reakciju [3+2] cikloadicije.

[0185] Ne-prirodna aminokiselina inkorporirana u polipeptid na amino terminusu može biti sastavljena od R grupe koja je bilo koji supstituent osim onog koji se koristi u dvadeset prirodnih aminokiselina i druge reaktivne grupe različite od normalno prisutne NH2grupe u α-amino kiselinama (vidi Formulu I). Slična ne-prirodna amino kiselina se može ugraditi na karboksilni kraj sa drugom reaktivnom grupom različitom od COOH grupe koja je normalno prisutna u α-amino kiselinama (vidi Formulu I).

[0186] Ne-prirodne aminokiseline mogu biti odabrane ili dizajnirane da obezbede dodatne karakteristike nedostupne kod dvadeset prirodnih aminokiselina. Na primer, ne-prirodna aminokiselina može biti opciono dizajnirana ili odabrana da modifikuje biološka svojstva proteina, npr. u koji su ugrađene. Na primer, sledeća svojstva se mogu opciono modifikovati uključivanjem ne-prirodne aminokiseline u protein: toksičnost, biodistribucija, rastvorljivost, stabilnost, npr. termička, hidrolitička, oksidativna, otpornost na degradaciju enzimima i slično, mogućnost prečišćavanja i procesiranja, strukturna svojstva, spektroskopska svojstva, hemijska i/ili fotohemijska svojstva, katalitička aktivnost, redoks potencijal, poluživot, sposobnost da reaguju sa drugim molekulima, npr. kovalentno ili nekovalentno, i slično.

[0187] U nekim realizacijama ovaj pronalazak obezbeđuje IL-2 vezan za vodo-rastvorni polimer, npr. PEG, oksimskom vezom. Mnoge vrste aminokiselina koje nisu prirodno kodirane su pogodne za stvaranje oksimskih veza. One uključuju, ali nisu ograničene na, ne-prirodno kodirane aminokiseline koje sadrže karbonilnu, dikarbonilnu ili hidroksilaminsku grupu. Takve aminokiseline su opisane u U.S. Patentnim Publikacijama br. 2006/0194256, 2006/0217532 i 2006/0217289 i WO 2006/069246 pod naslovom "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides,". Ne-prirodno kodirane aminokiseline su takođe opisane u U.S. Patentu br. 7,083,970 i U.S. Patentu br.

7,045,337. Ne-prirodno kodirana aminokiselina IL-2 polipeptida iz pronalaska je para-acetil-fenilalanin.

[0188] Pronalazak obezbeđuje IL-2 polipeptide koji su na jednoj poziciji supstituisani sa paraacetilfenilalanin amino kiselinom. Sinteza p-acetil-(+/-)-fenilalanina i m-acetil-(+/-)-fenilalanina opisana je u Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Druge aminokiseline koje sadrže karbonil ili dikarbonil se mogu pripremiti na sličan način od strane prosečnog stručnjaka. Dalje, neograničavajući primeri sinteze ne-prirodnih aminokiselina koje su ovde otkrivene su predstavljene na SI.4, 24-34 i 36-39 Američkog Patenta br.7,083,970.

A. Karbonil reaktivne grupe

[0189] Aminokiseline sa karbonil reaktivnom grupom omogućavaju različite reakcije za vezivanje molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na, PEG ili druge molekule rastvorljive u vodi) putem nukleofilne adicije ili aldolnih reakcija kondenzacije između ostalog.

[0190] Primeri aminokiselina koje sadrže karbonil mogu biti predstavljene na sledeći način:

gde n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil ili supstituisani aril; R2je H, alkil, aril, supstituisani alkil i supstituisani aril; i R3je H, amino kiselina, polipeptid ili grupa za modifikaciju amino terminusa, a R4je H, amino kiselina, polipeptid ili grupa za modifikaciju karboksi terminusa. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil i R2je jednostavni alkil (tj. metil, etil ili propil), a ketonski deo je pozicioniran u para poziciju u odnosu na bočni lanac alkila. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil i R2je jednostavni alkil (tj. metil, etil ili propil), a ketonski deo je pozicioniran na meta poziciji u odnosu na bočni lanac alkila.

[0191] Sinteza p-acetil-(+/-)-fenilalanina i m-acetil-(+/-)-fenilalanina je opisana u Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Ostale aminokiseline koje sadrže karbonil se mogu pripremiti na sličan način od strane prosečnog stručnjaka.

[0192] Polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu može biti hemijski modifikovan kako bi se stvorila reaktivna karbonilna funkcionalna grupa. Na primer, aldehidna funkcionalnost korisna za reakcije konjugacije se može proizvesti iz funkcionalnosti koja ima susedne amino i hidroksilne grupe. Kada je biološki aktivan molekul polipeptid, na primer, N-terminalni serin ili treonin (koji mogu biti normalno prisutni ili mogu biti izloženi hemijskom ili enzimskom digestijom) se mogu koristiti za stvaranje aldehidne funkcionalnosti pod blagim oksidativnim uslovima cepanja upotrebom perjodata. Vidi, npr., Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Međutim, metode poznate u struci su ograničene na amino kiselinu na N-kraju peptida ili proteina.

[0193] Ne-prirodno kodirana aminokiselina koja nosi susedne hidroksilne i amino grupe se može ugraditi u polipeptid kao "maskirana" aldehidna funkcionalnost. Na primer, 5-hidroksilizin nosi hidroksilnu grupu pored epsilon amina. Reakcioni uslovi za stvaranje aldehida obično uključuju dodavanje molarnog viška natrijum metaperjodata pod blagim uslovima kako bi se izbegla oksidacija na drugim mestima unutar polipeptida. pH reakcije oksidacije je tipično oko 7.0. Tipična reakcija uključuje dodavanje oko 1.5 molarnog viška natrijum metaperjodata u puferovani rastvor polipeptida, nakon čega sledi inkubacija oko 10 minuta u mraku. Vidi, npr. U.S. Patent No.6,423,685.

[0194] Karbonilna funkcionalnost može selektivno reagovati sa reagensom koji sadrži hidrazin, hidrazid, hidroksilamin ili semikarbazid pod blagim uslovima u vodenom rastvoru da bi se formirale odgovarajuće hidrazonske, oksimske ili semikarbazonske veze, respektivno, koje su stabilne u fiziološkim uslovima. Vidi, npr., Jencks, WP, J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. i Tam, JP, J. Am. Chem. Soc.

117:3893-3899 (1995). Osim toga, jedinstvena reaktivnost karbonilne grupe omogućava selektivnu modifikaciju u prisustvu drugih bočnih lanaca aminokiselina. Vidi, npr., Cornish, VW, et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, KF & Stroh, JG, Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, LK, et al., Science 276:1125-1128 (1997).

POLIPEPTIDI SA NEPRIRODNIM AMINOKISELINAMA

[0195] Ugradnja neprirodne aminokiseline se može obaviti u različite svrhe, uključujući, ali ne ograničavajući se na, modulisanje interakcije proteina sa njegovim receptorom ili jednom ili više subjedinica njegovog receptora, prilagođavanje promene u strukturi i/ili funkciji proteina, promenu veličine, kiselosti, nukleofilnosti, vodoničnim vezama, hidrofobnosti, dostupnosti ciljnih mesta proteaze, ciljanje na deo molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na protein array), dodavanje biološki aktivnog molekula, vezivanje za polimer, vezivanje radionuklida, modulisanje poluživota u serumu, modulisanje penetracije u tkivo (npr. tumori), modulisanje aktivnog transporta, modulisanje specifičnosti ili distribucije tkiva, ćelije ili organa, modulisanje imunogenosti, modulisanje rezistencije na proteaze, itd. Proteini koji uključuju ne-prirodnu aminokiselinu mogu imati poboljšana ili čak potpuno nova katalitička ili biofizička svojstva. Na primer, sledeća svojstva se opciono modifikuju uključivanjem ne-prirodne aminokiseline u protein: vezivanje receptora, toksičnost, biodistribucija, strukturna svojstva, spektroskopska svojstva, hemijska i/ili fotohemijska svojstva, katalitička sposobnost, poluživot (uključujući, ali ne ograničavjući se na, poluživot u serumu), sposobnost da reaguje sa drugim molekulima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kovalentno ili nekovalentno, i slično. Kompozicije koje uključuju proteine koji uključuju najmanje jednu ne-prirodnu amino kiselinu su korisne za, ali ne ograničavajući se na, nove terapeutike, dijagnostiku, katalitičke enzime, industrijske enzime, vezujuće proteine (uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitela), uključujući, ali ne ograničavajući se na, proučavanje strukture i funkcije proteina. Vidi, npr., Dougherty, Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652, (2000).

[0196] Proizvodnjom proteina ili polipeptida od interesa sa najmanje jednom ne-prirodnom amino kiselinom u eukariotskim ćelijama, proteini ili polipeptidi će tipično uključivati eukariotske posttranslacione modifikacije. Protein može uključivati najmanje jednu ne-prirodnu aminokiselinu i najmanje jednu post-translacionu modifikaciju koju in vivo vrši eukariotska ćelija, pri č emu post-translacionu modifikaciju ne vrši prokariotska ćelija. Na primer, post-translaciona modifikacija uključuje, ali nije ograničena na, acetilaciju, acilaciju, modifikaciju lipida, palmitoilaciju, adiciju palmitata, fosforilaciju, modifikaciju glikolipidne veze, glikozilaciju i slično.

[0197] Jedna od prednosti ne-prirodne aminokiseline je da ona predstavlja dodatne hemijske delove molekula koji se mogu koristiti za dodavanje dodatnih molekula. Ove modifikacije se mogu napraviti in vivo u eukariotskoj ili neeukariotskoj ćeliji, ili in vitro. Prema tome, u određenim realizacijama, posttranslaciona modifikacija je kroz ne-prirodnu aminokiselinu. Na primer, post-translaciona modifikacija može biti putem nukleofilno-elektrofilne reakcije. Većina reakcija koje se trenutno koriste za selektivnu modifikaciju proteina uključuju formiranje kovalentne veze između nukleofilnih i elektrofilnih partnera u reakciji, uključujući, ali ne ograničavajući se na, reakciju α -haloketona sa histidinskim ili cisteinskim bočnim lancima. Selektivnost je u ovim slučajevima određena brojem i dostupnošću nukleofilnih rezidua u proteinu. Mogu se koristiti i druge još selektivnije reakcije, kao što je reakcija ne-prirodne keto-amino kiseline sa hidrazidima ili aminooksi jedinjenjima, in vitro i in vivo. Vidi, npr., Cornish, et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8150-8151, (1996); Mahal, et al., Science, 276:1125-1128, (1997); Wang, et al., Science 292:498-500, (2001); Chin, et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027, (2002); Chin, et al., Proc. Natl. Akad. Sci., 99:11020-11024, (2002); Wang, et al., Proc. Natl. Akad. Sci., 100:56-61, (2003); Zhang, et al., Biochemistry, 42:6735-6746, (2003); i, Chin, et al., Science, 301:964-7, (2003). Ovo omogućava selektivno obeležavanje praktično bilo kojeg proteina sa mnoštvom reagenasa uključujući fluorofore, umreživače, derivate saharida i citotoksične molekule. Vidi U.S. Patent No. 6,927,042 pod naslovom "Sinteza glikoproteina,". Post-translacione modifikacije, uključujući, ali ne ograničavajući se na one posredstvom azido aminokiseline, takođe se mogu napraviti posredstvom Staudingerove ligacije (uključujući, ali ne ograničavajući se na one, sa triarilfosfinskim reagensima). Vidi, npr. Kiick et al., Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, (2002).

IV. In vivo generiranje IL-2 koji sadrži ne-prirodno-kodirane aminokiseline

[0198] IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska mogu biti generisani in vivo korišćenjem modifikovanih tRNK i tRNK sintetaza za dodavanje ili zamenu aminokiseline koja nije kodirana u sistemima koji se prirodno javljaju.

[0199] Metode za generisanje tRNK i tRNK sintetaza koje koriste aminokiseline koje nisu kodirane u prirodnim sistemima su opisane npr. u U.S. Patentima br. 7,045,337 i 7,083,970. Ove metode uključuju stvaranje translacione mašinerije koja funkcioniše nezavisno od sintetaza i tRNK endogenim za translacioni sistem (i stoga se ponekad nazivaju "ortogonalnim"). Tipično, translacioni sistem se sastoji od ortogonalne tRNK (O-tRNK) i ortogonalne aminoacil tRNK sintetaze (O-RS). Tipično, O-RS preferencijalno aminoaciluje O-tRNK sa najmanje jednom ne-prirodnom amino kiselinom u sistemu translacije i OtRNK prepoznaje najmanje jedan selektorski kodon koji nije prepoznat od strane drugih tRNK u sistemu. Translacioni sistem tako ubacuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u protein proizveden u sistemu, kao odgovor na kodirani selektorski kodon, čime "zamenjuje" aminokiselinu na poziciji u kodiranom polipeptidu.

[0200] U struci je opisan veliki izbor ortogonalnih tRNK i aminoacil tRNK sintetaza za inserciju određenih sintetičkih aminokiselina u polipeptide i one su generalno pogodne za upotrebu u ovom pronalasku. Na primer, keto-specifične O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze su opisane u Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) i Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003).

Primeri O-RS, ili njihovi delovi, su kodirani polinukleotidnim sekvencama i uključuju sekvence aminokiselina otkrivene u U.S. Patentima br. 7,045,337 i 7,083,970. Odgovarajući O-tRNK molekuli za upotrebu sa O-RS su takođe opisani u U.S. Patentima br. 7,045,337 i 7,083,970. Dodatni primeri parova O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza su opisani u WO 2005/007870, WO 2005/007624; i WO 2005/019415.

[0201] Primer sistema O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze specifičnog za azide je opisan u Chin, JW, et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Primeri O-RS sekvenci za p-azido-L-Phe uključuju, ali nisu ograničene na, nukleotidne sekvence SEK ID BR: 14-16 i 29-32 i aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 46-48 i 61-64 kako je otkriveno u U.S. Patentu br. 7,083,970. Primeri sekvenci O-tRNK uključuju, ali nisu ograničeni na nukleotidne sekvence SEK ID BR: 1-3 kao što je otkriveno u U.S. Patentu br.

7,083,970. Drugi primeri parova O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze specifičnih za određene ne-prirodno kodirane aminokiseline su opisani u U.S. Patentu br. 7,045,337. O-RS i O-tRNK koje sadrže aminokiseline koje sadrže i keto- i azide u S. cerevisiae su opisane u Chin, JW, et al., Science 301:964-967 (2003).

[0202] Prijavljeno je nekoliko drugih ortogonalnih parova. Glutaminil (vidi, npr. Liu, DR, i Schultz, PG (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4780-4785), aspartil (vidi, npr., PastRNKk, M., et al., (2000) ) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286) i tirozil (vidi, npr. Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124: 1065-1068; i, Kowal, AK, et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2268-2273) sistemi izvedeni iz S. cerevisiae tRNK i sintetaza su opisani za potencijalno ugrađivanje ne-prirodnih aminokiselina u E. coli . Sistemi izvedeni iz E. coli glutaminila (vidi, npr. Kowal, AK, et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2268-2273) i tirozila (vidi, npr., Edwards, H. i Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641) sintetaza su opisani za upotrebu u S. cerevisiae. E. coli tirozil sistem je korišćen za ugradnju 3-jodo-L-tirozina in vivo, u ćelije sisara. Vidi, Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699.

[0203] Upotreba O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza uključuje odabir specifičnog kodona koji kodira neprirodno kodiranu aminokiselinu (selektorski kodon). Iako se može koristiti bilo koji kodon, generalno je poželjno odabrati kodon koji se retko ili nikada ne koristi u ćeliji u kojoj je eksprimirana O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza. Na primer, primeri kodona uključuju nonsens kodone kao što su stop kodoni (amber, oker i opal), četiri ili više baznih kodona i drugi prirodni trobazni kodoni koji se retko ili uopšte ne koriste.

[0204] Specifični selektorski kodoni mogu biti uvedeni na odgovarajuće pozicije u kodirajućoj sekvenci IL-2 korištenjem metoda mutageneze poznatih u struci (uključujući ali ne ograničavajući se na mutagenezu specifičnu za mesto, kasetnu mutagenezu, restrikciono selekcionu mutagenezu itd.).

V. Lokacija ne-prirodnih aminokiselina u IL-2

[0205] Jedna ili više aminokiselina koje se ne nalaze u prirodi mogu biti inkorporirane na određenoj poziciji koja ne remeti aktivnost polipeptida. U ovom pronalasku, ne-prirodno kodirana amino kiselina je inkorporirana u poziciju 45 SEK ID BR: 2, a ne-prirodno kodirana amino kiselina je para-acetilfenilalanin.

[0206] Različiti biohemijski i strukturni pristupi se mogu koristiti za odabir željenih mesta za supstituciju sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom unutar IL-2. Stručnjacima je očigledno da je bilo koja pozicija polipeptidnog lanca pogodna za selekciju da se inkorporira ne-prirodno kodirana aminokiselina, a odabir se može zasnivati na racionalnom dizajnu ili nasumičnom odabiru za bilo koju ili ni za jednu određenu svrhu. Odabir poželjnih mesta može biti za proizvodnju IL-2 molekula koji ima bilo koje željeno svojstvo ili aktivnost, uključujući, ali ne ograničavajući se na, modulisanje vezivanja receptora ili vezivanje za jednu ili više subjedinica njegovog receptora, agonista, super-agonista, inverznih agonista, antagonista, modulatora vezivanja receptora, modulatora aktivnosti receptora, formiranje dimera ili multimera, bez promene aktivnosti ili svojstva u poređenju sa prirodnim molekulom, ili manipulisanje bilo kojim fizičkim ili hemijskim svojstvom polipeptida kao što je rastvorljivost, agregacija ili stabilnost. Na primer, lokacije u polipeptidu potrebne za biološku aktivnost IL-2 se mogu identifikovati korišćenjem analize tačkastih mutacija, skeniranja alanina, mutageneze zasićenja i skrininga za biološku aktivnost, ili metoda skeniranja homologa poznatih u struci. Druge metode koje se mogu koristiti za identifikaciju rezidua za modifikaciju IL-2 uključuju, ali nisu ograničene na, profilisanje sekvence (Bowie i Eisenberg, Science 253(5016): 164-70, (1991)), odabir biblioteke rotamera (Dahiyat i Mayo, Protein Sci 5(5): 895-903 (1996); Dahiyat i Mayo, Science 278(5335): 82-7 (1997); Desjarlais i Handel, Protein Science 4: 2006-2018 (1995); Harbury et. al, PNAS USA 92(18): 8408-8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244-255 (1994); Hellinga and Richards, PNAS USA 91: 5803-5807 (1994)); i potencijali parova rezidua (Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)), i racionalni dizajn koristeći Protein Design Automation® technology. (Vidi U.S. Patente br. 6,188,965; 6,269,312; 6,403,312; WO98/47089). Rezidue osim onih koje su identifikovane kao kritične za biološku aktivnost skenirajućom mutagenezom alanina ili homologa mogu biti dobri kandidati za supstituciju sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom zavisno od željene aktivnosti za polipeptid. Alternativno, mesta identifikovana kao kritična za biološku aktivnost takođe mogu biti dobri kandidati za supstituciju sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom, opet zavisno od željene aktivnosti za polipeptid. Druga alternativa bi bila jednostavno napraviti serijske supstitucije na svakoj poziciji u polipeptidnom lancu sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom i posmatrati uticaj na aktivnosti polipeptida. Stručnjacima je jasno da je bilo koji način, tehnika ili metoda za odabir pozicije za supstituciju sa ne-prirodnom amino kiselinom u bilo kom polipeptidu pogodna za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom.

[0207] Struktura i aktivnost mutanata IL-2 polipeptida koji sadrže delecije takođe mogu biti ispitane da bi se odredili regioni proteina koji će verovatno biti tolerantni na supstituciju sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. Na sličan način, digestija proteazom i monoklonska antitela se mogu koristiti za identifikaciju regiona IL-2 koji su odgovorni za vezivanje IL-2 receptora. Kada se eliminišu rezidue za koje se veruje da će biti netolerantne na supstituciju sa ne-prirodno kodiranim aminokiselinama, može se ispitati uticaj predloženih supstitucija na svakoj od preostalih pozicija. Prema tome, prosečan stručnjak u ovoj oblasti može lako da identifikuje pozicije aminokiselina koje se mogu zameniti ne-prirodno kodiranim amino kiselinama.

[0208] Stručnjak u ovoj oblasti prepoznaje da takva analiza IL-2 omogućava određivanje koje aminokiselinske rezidue su površinski izložene u poređenju sa aminokiselinskim reziduama koje su zakopane unutar tercijarne strukture proteina. Prema tome, prosečan stručnjak u ovoj oblasti može zameniti aminokiselinu koja nije prirodno kodirana aminokiselinom koja je površinski izložena rezidua.

[0209] Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane u jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 5456, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili dodate na karboksilni terminus proteina, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuće amino kiseline u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0210] Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: pre pozicija 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107, i bilo koja njihova kombinacija (SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća amino kiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7).

[0211] Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na bilo kojoj poziciji u jednoj ili više od sledećih regiona koji odgovaraju sekundarnim strukturama ili specifičnim aminokiselinama u IL-2 ili njegovoj varijanti kako sledi: na mestima hidrofobnih interakcije; na ili u blizini mesta interakcije sa subjedinicama IL-2 receptora uključujući IL2Rα; unutar aminokiselinskih pozicija 3, ili 35 do 45; unutar prvih 107 N-terminalnih aminokiselina; unutar aminokiselinskih pozicija 61-72; svaka od SEK ID BR: 2 ili odgovarajuća aminokiselinska pozicija u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednu ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovu varijantu: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 i bilo koja njihova kombinacija SEK ID BR: 2, ili odgovarajućih aminokiselina u SEK ID BR: 3, 5 ili 7. Jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina mogu biti inkorporirane na jednoj ili više od sledećih pozicija u IL-2 ili njegovoj varijanti: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ili dodate na karboksilni terminus proteina, i bilo koja njihova kombinacija SEK ID NO: 2, ili odgovarajuće amino kiseline u SEK ID NO: 3, 5 ili 7.

[0212] IL-2 polipeptid može biti agonist i ne-prirodna aminokiselina u jednom ili više od ovih regiona može biti vezan za vodo-rastvorni polimer, uključujući, ali ne ograničavajući se na: 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, i 107. IL-2 polipeptid može biti agonist i ne-prirodna aminokiselina u jednom ili više od ovih regiona može biti vezan za vodo-rastvorni polimer, uključujući, ali ne ograničavajući se na: u blizini 3, 35 , 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72 i 107.

[0213] Širok izbor ne-prirodno kodiranih aminokiselina se može supstituisati ili inkorporirati u, datu poziciju u IL-2. Generalno, određena ne-prirodno kodirana aminokiselina za ugradnju se bira na osnovu ispitivanja trodimenzionalne kristalne strukture IL-2 polipeptida ili drugog člana porodice IL-2 sa njegovim receptorom, preferencija za konzervativne substitucije (tj. ne-prirodno kodirane aminokiseline na bazi arila, kao što su p-acetilfenilalanin ili O-propargiltirozin koji supstituišu Phe, Tyr ili Trp), i specifične hemijske konjugacije koju neko želi da uvede u IL-2 (npr. uvođenje 4-azidofenilalana ako se želi postići Huisgen [3+2] cikloadicija sa polimerom rastvorljivim u vodi koji nosi alkinski deo ili formiranje amidne veze sa polimerom rastvorljivim u vodi koji nosi aril estar koji, zauzvrat, uključuje fosfinski deo).

[0214] Metoda dalje može uključivati inkorporiranje ne-prirodne aminokiseline u protein, gde ne-prirodna amino kiselina sadrži prvu reaktivnu grupu; i dovođenje u kontakt proteina sa molekulom (uključujući, ali ne ograničavajući se na, oznaku, boju, polimer, vodo-rastvorni polimer, derivat polietilen glikola, fotoumreživač, radionukleid, citotoksično jedinjenje, lek, oznaku afiniteta, oznaku fotoafiniteta, reaktivno jedinjenje, smolu, drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida, antitelo ili fragment antitela, kelator metala, kofaktor, masnu kiselinu, ugljenihidrat, polinukleotid, DNK, RNK , antisens polinukleotid, saharid, vodorastvorni dendrimer, ciklodekstrin, inhibitornu ribonukleinsku kiselinu, biomaterijal, nanočesticu, spin oznaku, fluorofor, deo koji sadrži metal, radioaktivni deo, novu funkcionalnu grupu, grupu koja kovalentno ili nekovalentno interaguje sa drugim molekulima, deo molekula u fotokavezu, deo molekula ekscitabilan aktiničkim zračenjem, deo koji se može fotoizomerizovati, biotin, derivat biotina, analog biotina, deo koji sadrži teški atom, grupu koja se može hemijski cepati; grupu koja se može cepati fotohemijski, produženi bočni lanac, šećer vezan ugljenikom, redoks-aktivno sredstvo, amino-tiokiselinu, toksični deo, izotopski obeleženi deo, biofizičku probu, fosforescentnu grupu, hemiluminiscentnu grupu, grupu sa velikom gustinom elektrona, magnetičnu grupu, interkalirajuću grupu, hromofor, agens za prenos energije, biološki aktivan agens, detektabilnu oznaku, mali molekul, kvantnu tačku, nanotransmiter, radionukleotid, radiotransmiter, agens za hvatanje neutrona ili bilo koju kombinaciju gore navedenog, ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili supstancu) koja sadrži drugu reaktivnu grupu. Prva reaktivna grupa reaguje sa drugom reaktivnom grupom kako bi spojila molekul sa ne-prirodnom aminokiselinom putem [3+2] cikloadicije.

[0215] U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana supstitucija(e) aminokiselina će se kombinovati sa drugim dodacima, supstitucijama ili delecijama unutar IL-2 da se utiče na druge biološke osobine IL-2 polipeptida. U nekim slučajevima, drugi dodaci, supstitucije ili delecije mogu povećati stabilnost (uključujući, ali ne ograničavajući se na, otpornost na proteolitičku degradaciju) IL-2 ili povećati afinitet IL-2 za njegov receptor. U nekim slučajevima, drugi dodaci, supstitucije ili delecije mogu povećati farmaceutsku stabilnost IL-2. U nekim slučajevima, drugi dodaci, supstitucije ili delecije mogu povećati aktivnost IL-2 za inhibiciju tumora i/ili smanjenje tumora. U nekim slučajevima, drugi dodaci, supstitucije ili delecije mogu povećati rastvorljivost (uključujući, ali ne ograničavajući se na, kada se eksprimiraju u E. coli ili drugim ćelijama domaćinima) IL-2 ili varijanti. U nekim realizacijama dodaci, supstitucije ili delecije mogu povećati rastvorljivost IL-2 nakon ekspresije u E. coli ili drugim rekombinantnim ćelijama domaćinima. U nekim slučajevima se biraju mesta za supstituciju sa prirodno kodiranom ili ne-prirodnom aminokiselinom uz drugo mesto za ugradnju ne-prirodne aminokiseline što rezultira povećanjem rastvorljivosti polipeptida nakon ekspresije u E.coli ili drugim rekombinantnim ćelijama domaćinima. IL-2 polipeptidi mogu sadržati još jedan dodatak, supstituciju ili deleciju koja moduliše afinitet za IL-2 receptor, vezujuće proteine ili povezani ligand, moduliše transdukciju signala nakon vezivanja na IL-2 receptor, moduliše poluživot u cirkulaciji, moduliše oslobađanje ili biodostupnost, olakšava prečišćavanje, ili poboljšava ili menja određeni način primene. IL-2 polipeptidi mogu uključivati dodatak, supstituciju ili deleciju koja povećava afinitet IL-2 varijante za njen receptor. IL-2 može uključivati dodatak, supstituciju ili deleciju koja povećava afinitet IL-2 varijante prema IL-2-R1 i/ili IL-2-R2. Slično, IL-2 polipeptidi mogu sadržati hemijske ili sekvence cepanja enzimima, sekvence cepanja proteazama, reaktivne grupe, domene za vezivanje antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na, FLAG ili poly-His) ili druge sekvence zasnovane na afinitetu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, FLAG, poly-His, GST, itd.) ili vezane molekule (uključujući, ali ne ograničavajući se na biotin) koje poboljšavaju detekciju (uključujući, ali ne ograničavajući se na GFP), prečišćavanje, transport kroz tkiva ili ćelijske membrane, oslobađanje ili aktivaciju proleka, smanjenje veličine IL-2 ili drugih osobina polipeptida.

[0216] Supstitucija ne-prirodno kodirane amino kiseline može stvoriti IL-2 antagonist. Ne-prirodno kodirana aminokiselina može biti zamenjena ili dodata u region uključen u vezivanje receptora. Antagonisti IL-2 mogu sadržati najmanje jednu supstituciju koja uzrokuje da IL-2 deluje kao antagonist. IL-2 antagonist može sadržati ne-prirodno kodiranu aminokiselinu vezanu za polimer rastvoran u vodi koji je prisutan u regionu vezivanja za receptor molekula IL-2.

[0217] U nekim slučajevima, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselina su zamenjene jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina. U nekim slučajevima, IL-2 dalje uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više supstitucija jedne ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina aminokiselinama koje se javljaju u prirodi. Na primer, jedna rezidua u IL-2 je supstituisana sa jednom ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih rezidua su vezane za jedan ili više linearnih ili granastih PEG manje molekulske težine, čime se povećava afinitet vezivanja i uporedivi poluživot u serumu u odnosu na vrste vezane za jedan PEG veće molekulske težine.

VI. Ekspresija kod Ne-eukariota i Eukariota

[0218] Da bi se postigla ekspresija visokog nivoa kloniranog IL-2 polinukleotida, obično se subkloniraju polinukleotidi koji kodiraju IL-2 polipeptid iz ovog pronalaska u ekspresioni vektor koji sadrži jak promoter za direktnu transkripciju, terminator transkripcije/translacije, a ako je za nukleinsku kiselinu koja kodira protein, mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju translacije. Pogodni bakterijski promoteri su poznati stručnjacima iz ove oblasti i opisani su, npr., u Sambrook et al. i Ausubel et al.

[0219] Bakterijski ekspresioni sistemi za ekspresiju IL-2 prema pronalasku su dostupni, uključujući, ali ne ograničavajući se na, E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fZuorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida i Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). Kompleti za takve ekspresione sisteme su komercijalno dostupni. Eukariotski ekspresioni sistemi za ćelije sisara, kvasca i ćelije insekata su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i takođe su komercijalno dostupni. U slučajevima kada se ortogonalne tRNK i aminoacil tRNK sintetaze (gore opisane) koriste za ekspresiju IL-2 polipeptida iz pronalaska, ćelije domaćini za ekspresiju se biraju na osnovu njihove sposobnosti da koriste ortogonalne komponente. Primeri ćelija domaćina uključuju Grampozitivne bakterije (uključujući, ali ne ograničavajući se na B. brevis, B. subtilis, ili Streptomyces) i gramnegativne bakterije (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), kao i kvasce i druge eukariotske ćelije. Ćelije koje sadrže parove O-tRNK/O-RS se mogu koristiti kako je ovde opisano.

[0220] Eukariotska ćelija domaćin ili neeukariotska ćelija domaćin obezbeđuje sposobnost sinteze proteina koji sadrže ne-prirodne aminokiseline u velikim korisnim količinama. U jednom aspektu, kompozicija opciono uključuje, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje 10 mikrograma, najmanje 50 mikrograma, najmanje 75 mikrograma, najmanje 100 mikrograma, najmanje 200 mikrograma, najmanje 250 mikrograma, najmanje 500 mikrograma, najmanje 1 miligram, najmanje 10 miligrama, najmanje 100 miligrama, najmanje jedan gram ili više proteina koji sadrži ne-prirodnu aminokiselinu, ili količinu koja se može postići in vivo metodama proizvodnje proteina (detalji o proizvodnji i prečišćavanju rekombinantnog proteina su dati u tekstu). U drugom aspektu, protein je opciono prisutan u kompoziciji u koncentraciji od, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje 10 mikrograma proteina po litru, najmanje 50 mikrograma proteina po litru, najmanje 75 mikrograma proteina po litru, najmanje 100 mikrograma proteina po litru, najmanje 200 mikrograma proteina po litru, najmanje 250 mikrograma proteina po litru, najmanje 500 mikrograma proteina po litru, najmanje 1 miligram proteina po litru, ili najmanje 10 miligrama proteina po litru ili više, u, uključujući ali ne ograničavajući se na, ćelijski lizat, pufer, farmaceutski pufer ili drugu tečnu suspenziju (uključujući ali ne ograničavajući se na, u zapremini od, uključujući ali ne ograničavajući se na, od oko 1 nl do oko 100 L ili više).

[0221] Eukariotska ćelija domaćin ili neeukariotska ćelija domaćin obezbeđuje sposobnost biosinteze proteina koji sadrže ne-prirodnu aminokiselinu u velikim korisnim količinama. Na primer, proteini koji sadrže ne-prirodnu aminokiselinu se mogu proizvesti u koncentraciji od, ali ne ograničavajući se na, najmanje 10 µg/litar, najmanje 50 µg/litar, najmanje 75 µg/litar, najmanje 100 µg/litar , najmanje 200 µg/litar, najmanje 250 µg/litar, ili najmanje 500 µg/litar, najmanje 1 mg/litar, najmanje 2 mg/litar, najmanje 3 mg/litar, najmanje 4 mg/litar, na najmanje 5 mg/litar, najmanje 6 mg/litar, najmanje 7 mg/litar, najmanje 8 mg/litar, najmanje 9 mg/litar, najmanje 10 mg/litar, najmanje 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litar, 1 g/litar, 5 g/litar, 10 g/litar ili više proteina u ćelijskom ekstraktu, ćelijskom lizatu, medijumu za kulturu, puferu i/ili slično.

[0222] Brojni vektori pogodni za ekspresiju IL-2 su komercijalno dostupni. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore koji sadrže sekvence za kontrolu ekspresije iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Takvi vektori uključuju pCDNA3. 1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) i pCI-neo (Stratagene, La Jolla, Kalifornija, SAD). Mogu se koristiti bakterijski plazmidi, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pBR322, pET3a i pET12a, plazmidi šireg spektra domaćina, kao što su RP4, DNK faga, npr. brojni derivati lambda faga, npr. NM989, i drugi DNK fagi, kao kao što je M13 i filamentozni jednolančani DNK fagi. Plazmid od 2µ i njegovi derivati, vektor POT1 (U.S. Patent No. 4,931,373), vektor pJSO37 opisan u (Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202 207, 1996) i pPICZ A, B ili C (Invitrogen) se može koristiti sa ćelijama domaćina kvasca. Za ćelije insekata, vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, str. 685 98 (1986), pBluebac 4.5 i pMelbac (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0223] Nukleotidna sekvenca koja kodira IL-2 ili njegovu varijantu može, ali ne mora uključivati i sekvencu koja kodira signalni peptid. Signalni peptid je prisutan kada se polipeptid izlučuje iz ćelija u kojima je eksprimiran. Takav signalni peptid može biti bilo koja sekvenca. Signalni peptid može biti prokariotski ili eukariotski. Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89 104) opisuju signalni peptid za upotrebu u ćelijama sisara (mišji Ig kapa signalni peptid lakog lanca). Drugi signalni peptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, signalni peptid α-faktora iz S. cerevisiae (U.S. Patent No. 4,870,008), signalni peptid pljuvačne amilaze miša (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, str. 643-646), modifikovani signalni peptid karboksipeptidaze (LA Valls et al., Cell 48, 1987, str.887-897), signalni peptid kvasca BAR1 (WO 87/02670) i signalni peptid kvasca aspartatna proteaza 3 (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, str.127-137).

[0224] Primeri pogodnih ćelija domaćina sisara su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Takve ćelije domaćini mogu biti ć elije jajnika kineskog hrčka (CHO) (npr. CHO-K1; ATCC CCL-61), ćelije zelenog majmuna (COS) (npr. COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651) ); ćelije miša (npr. NS/O), ćelijske linije bubrega bebe hrčka (BHK) (npr. ATCC CRL-1632 ili ATCC CCL-10), i ljudske ćelije (npr. HEK 293 (ATCC CRL-1573)), kao i biljne ćelije u tkivnoj kulturi. Ove i druge ćelijske linije su dostupne u javnim depozitorijumima kao što je American Type Culture Collection, Rockville, Md. Da bi se obezbedila poboljšana glikozilacija IL-2 polipeptida, ćelija domaćina sisara može biti modifikovana da eksprimira sialiltransferazu, npr. 1,6-sijaliltransferaza, npr. kao š to je opisano u U.S. Pat. br.

5,047,335.

[0225] Metode za uvođenje egzogene DNK u ćelije domaćina sisara uključuju, ali nisu ograničene na, kalcijum-fosfatom posredovanu transfekciju, elektroporaciju, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu lipozomima, virusne vektore i metode transfekcije koje su opisali Life Technologies Ltd, Paisley, UK koristeći Lipofectamin 2000 i Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, SAD koristeći FuGENE 6. Ove metode su dobro poznate u struci i opisali su ih Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, SAD. Gajenje ćelija sisara se može izvoditi prema utvrđenim metodama, npr. kako je otkriveno u (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., USA i Harrison Mass. i Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).

[0226] I. E. Coli, vrste Pseudomonas i drugi Prokarioti Tehnike ekspresije bakterija su poznate prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Dostupan je veliki broj vektora za upotrebu kod bakterijskih domaćina. Vektori mogu biti jednokopijski ili niski ili visoki vektori sa više kopija. Vektori mogu poslužiti za kloniranje i/ili ekspresiju. S obzirom na obilje literature o vektorima, komercijalnoj dostupnosti mnogih vektora, pa čak i priručnicima koji opisuju vektore i njihove restrikcione mape i karakteristike, ovde nije potrebna opsežna diskusija. Kao što je dobro poznato, vektori obično uključuju markere koji omogućavaju selekciju, a koji markeri mogu osigurati otpornost na citotoksične agense, prototrofiju ili imunitet. Često je prisutan veći broj markera koji daju različite karakteristike.

[0227] Bakterijski promoter je bilo koja DNK sekvenca sposobna da veže bakterijsku RNK polimerazu i započne nizvodnu (3') transkripciju kodirajuće sekvence (npr. strukturnog gena) u mRNK. Promoter će imati region inicijacije transkripcije koji se obično nalazi proksimalno od 5' kraja kodirajuće sekvence. Ovaj region inicijacije transkripcije obično uključuje mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto inicijacije transkripcije. Bakterijski promoter može imati i drugi domen koji se zove operator, koji može preklapati susedno mesto vezivanja RNK polimeraze na kojem počinje sinteza RNK. Operator dozvoljava negativno regulisanu (inducibilnu) transkripciju, jer protein represor gena može vezati operator i na taj način inhibirati transkripciju specifičnog gena. Konstitutivna ekspresija se može javiti u odsustvu negativnih regulatornih elemenata, kao što je operator. Pored toga, pozitivna regulacija se može postići vezujućom sekvencom za protein aktivator gena, koja ako je prisutna, obično je proksimalna (5') od sekvence vezivanja RNA polimeraze. Primer proteina aktivatora gena je protein aktivator katabolita (CAP), koji pomaže u pokretanju transkripcije lac operona u Ešerihiji koli (E. coli), (Raibaud et al., ANNU. REV.

GENET. (1984) 18: 173). Regulisana ekspresija prema tome može biti ili pozitivna ili negativna, čime se ili pojačava ili smanjuje transkripcija.

[0228] Sekvence koje kodiraju enzime metaboličkog puta obezbeđuju posebno korisne sekvence promotere. Primeri uključuju promoterske sekvence izvedene iz enzima koji metabolišu šećer, kao što su galaktoza, laktoza (lac), (Chang et al., NATURE (1977) 198:1056) i maltoza. Dodatni primeri uključuju promoterske sekvence izvedene iz biosintetskih enzima kao što je triptofan (trp), (Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731 U.S. Patent No.

4,738,921, EP Pub. br. 036776 i 121775). Sistem promotera β-galaktozidaze (bla) (Weissmann (1981) " The cloning of interferon and other mistakes." U Interferonu 3 (Ed. I. Gresser)), bakteriofag lambda PL (Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128) i T5 (U.S. Patent No.4,689,406) promoterski sistemi takođe obezbeđuju korisne sekvence promotera. Poželjne metode iz ovog pronalaska koriste jake promotere, kao što je T7 promoter da indukuju IL-2 polipeptide na visokim nivoima. Primeri takvih vektora su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju seriju pET29 iz Novagena i pPOP vektore opisane u WO99/05297. Takvi ekspresioni sistemi proizvode visoke nivoe IL-2 polipeptida u domaćinu bez ugrožavanja vijabilnosti ćelije domaćina ili parametara rasta. pET19 (Novagen) je još jedan vektor poznat u struci.

[0229] Osim toga, sintetički promoteri koji se ne javljaju u prirodi takođe funkcionišu kao bakterijski promoteri. Na primer, sekvence aktivacije transkripcije jednog promotera bakterije ili bakteriofaga mogu se spojiti sa sekvencama operona drugog promotera bakterije ili bakteriofaga, stvarajući sintetički hibridni promoter (U.S. Patent No. 4,551,433). Na primer, tac promoter je hibridni trp-lac promoter koji se sastoji od trp promotera i sekvenci lac operona koji je regulisan lac represorom (Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC NATL, ACAD. Sci. (1983) 80:21). Zatim, bakterijski promoter može uključivati prirodne promotere nebakterijskog porekla koji imaju sposobnost da vežu bakterijsku RNK polimerazu i iniciraju transkripciju. Prirodni promoter nebakterijskog porekla takođe može biti spojen sa kompatibilnom RNA polimerazom kako bi se proizveo visoki nivo ekspresije nekih gena u prokariotima. Bakteriofag T7 RNA polimeraza/promoterski sistem je primer spregnutog promoterskog sistema (Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074). Pored toga, hibridni promoter se takođe može sastojati od promotera bakteriofaga i operatorskog regiona E. coli (EP Pub. No.267851).

[0230] Pored funkcionalne promoterske sekvence, efikasno mesto vezivanja ribozoma je takođe korisno za ekspresiju stranih gena u prokariotima. Kod E. coli, mesto vezivanja ribozoma se naziva Shine-Dalgarno (SD) sekvenca i uključuje kodon inicijacije (ATG) i sekvencu dužine 3-9 nukleotida koja se nalazi 3-11 nukleotida uzvodno od kodona inicijacije (Shine et al., NATURE (1975) 254:34). Smatra se da SD sekvenca promoviše vezivanje mRNK za ribozom uparivanjem baza između SD sekvence i 3' i E. coli 16S rRNA (Steitz et al. " Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", u Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. RF Goldberger, 1979)). Za ekspresiju eukariotskih i prokariotskih gena sa slabim mestom vezanja ribozoma (Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

[0231] Termin "bakterijski domaćin" ili "bakterijska ćelija domaćin" se odnosi na bakteriju koja se može, ili je bila, korišćena kao primalac za rekombinantne vektore ili druge transferne DNK. Pojam uključuje potomstvo originalne bakterijske ćelije domaćina koja je transfektovana. Podrazumeva se da potomstvo jedne roditeljske ćelije ne mora nužno biti potpuno identično po morfologiji ili genomskoj ili ukupnoj DNK komplementaciji originalnom roditelju, zbog slučajne ili namerne mutacije. Potomstvo roditeljske ćelije koje je dovoljno slično roditelju da bi se okarakterisalo relevantnim svojstvom, kao što je prisustvo nukleotidne sekvence koja kodira IL-2 polipeptid je uključeno u potomstvo predviđeno ovom definicijom.

[0232] Odabir pogodnih bakterija domaćina za ekspresiju IL-2 polipeptida je poznat stručnjacima u ovoj oblasti. U odabiru bakterijskih domaćina za ekspresiju, pogodni domaćini mogu uključivati one koji imaju, između ostalog, dobar kapacitet formiranja inkluzionih tela, nisku proteolitičku aktivnost i ukupnu robusnost. Bakterijski domaćini su generalno dostupni iz različitih izvora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Univerzitet Kalifornije (Berkeley, CA); i American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). Industrijska/farmaceutska fermentacija uglavnom koristi bakterije koje potiču od K sojeva (npr. W3110) ili od bakterija koje potiču od B sojeva (npr. BL21). Ovi sojevi su posebno korisni jer su njihovi parametri rasta izuzetno dobro poznati i robusni. Osim toga, ovi sojevi su nepatogeni, što je komercijalno važno iz sigurnosnih i ekoloških razloga. Drugi primeri pogodnih domaćina E. coli uključuju, ali nisu ograničeni na, sojeve BL21, DH10B ili njihove derivate. U drugoj realizaciji metoda iz ovog pronalaska, domaćin E. coli je soj proteaza minus uključujući, ali ne ograničavajući se na, OMP- i LON-. Soj ćelije domaćina može biti vrsta Pseudomonas, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens biovar 1, određen soj MB101, poznat je kao koristan za rekombinantnu proizvodnju i dostupan je za procese proizvodnje terapeutskih proteina. Primeri sistema ekspresije Pseudomonas uključuju sistem dostupan kod The Dow Chemical Company kao soj domaćina (Midland, MI dostupan na World Wide Webu na dow.com).

[0233] Kada se uspostavi rekombinantni soj ćelije domaćina (tj. ekspresioni konstrukt je uveden u ćeliju domaćina i ćelije domaćina sa odgovarajućim ekspresionim konstruktom su izolovane), soj rekombinantne ćelije domaćina se uzgaja u uslovima odgovarajućim za proizvodnju IL-2 polipeptida. Kao što će biti očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, metoda kulture rekombinantnog soja ćelije domaćina zavisiće od prirode ekspresionog konstrukta koji se koristi i identiteta ć elije domaćina. Rekombinantni sojevi domaćini se normalno uzgajaju korišćenjem metoda koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Rekombinantne ćelije domaćini se tipično uzgajaju u tečnom medijumu koji sadrži asimilabilne izvore ugljenika, azota i neorganskih soli i, opciono, sadrži vitamine, aminokiseline, faktore rasta i druge proteinske dodatke kulture poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Tečni medijum za kulturu ćelija domaćina može opciono sadržati antibiotike ili anti-fungale za sprečavanje rasta nepoželjnih mikroorganizama i/ili jedinjenja uključujući, ali ne ograničavajući se na, antibiotike za odabir ćelija domaćina koje sadrže ekspresioni vektor.

[0234] Rekombinantne ćelije domaćini se mogu kultivisati u serijama ili kontinuiranim formatima, bilo sa žetvom ćelija (u slučaju kada se IL-2 polipeptid akumulira intracelularno) ili sakupljanjem supernatanta kulture u šaržnom ili kontinuiranom formatu. Za proizvodnju u prokariotskim ćelijama domaćinima su poželjne serije kultura i žetva ćelija.

[0235] IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska se normalno prečišćavaju nakon ekspresije u rekombinantnim sistemima. IL-2 polipeptid se može prečistiti iz ćelija domaćina ili medijuma kulture različitim metodama poznatim u struci. IL-2 polipeptidi proizvedeni u bakterijskim ćelijama domaćinima mogu biti slabo rastvorni ili nerastvorni (u obliku inkluzionih tela). U jednom aspektu ovog pronalaska, aminokiselinske supstitucije se mogu lako napraviti u IL-2 polipeptidu koji se bira u svrhu povećanja rastvorljivosti rekombinantno proizvedenog proteina korišćenjem metoda koje su ovde otkrivene, kao i onih poznatih u struci. U slučaju nerastvornog proteina, protein se može prikupiti iz lizata ćelije domaćina centrifugiranjem koje dalje može biti praćeno homogenizacijom ćelija. U slučaju slabo rastvornih proteina, jedinjenja koja uključuju, ali nisu ograničena na, polietilen imin (PEI) se mogu dodati kako bi se izazvalo taloženje delimično rastvorljivog proteina. Precipitirani protein se zatim može prikladno prikupiti centrifugiranjem. Rekombinantne ćelije domaćini mogu biti razbijene ili homogenizovane da se oslobode inkluziona tela iz ćelija korišćenjem različitih metoda poznatih prosečnom stručnjaku. Razbijanje ili homogenizacija ćelija domaćina se može izvesti korišćenjem dobro poznatih tehnika uključujući, ali ne ograničavajući se na, enzimsko razbijanje ćelija, sonikaciju, homogenizaciju ili razbijanje oslobađanjem visokog pritiska. U jednoj realizaciji metode iz ovog pronalaska, tehnika oslobađanja visokog pritiska se koristi da razbije ćelije domaćina E. coli kako bi se oslobodila inkluziona tela IL-2 polipeptida. Kada se rukuje inkluzionim telima polipeptida IL-2, može biti korisno minimizirati vreme homogenizacije pri ponavljanjima kako bi se maksimizirao prinos inkluzionih tela bez gubitka zbog faktora kao što su solubilizacija, mehaničko smicanje ili proteoliza.

[0236] Nerastvorbi ili precipitirani IL-2 polipeptid se zatim može rastvoriti upotrebom bilo kojeg od brojnih pogodnih sredstava za solubilizaciju poznatih u struci. IL-2 polieptid se može rastvoriti sa ureom ili gvanidin hidrohloridom. Zapremina solubiliziranog IL-2 polipeptida treba da se minimizira tako da se velike serije mogu proizvesti korišćenjem serija veličine kojom se može lako rukovati. Ovaj faktor može biti značajan u komercijalnom okruženju velikih razmera gde se rekombinantni domaćin može gajiti u serijama zapremine od hiljadu litara. Osim toga, kada se proizvodi IL-2 polipeptid u velikim komercijalnim uslovima, posebno za ljudske farmaceutske svrhe, ako je moguće treba izbegavati, jake hemikalije koje mogu oštetiti postrojenja i rezervoar, ili i sam proteinski proizvod. U metodi iz ovog pronalaska je pokazano da se blaži denaturišući agens urea može koristiti za solubilizaciju inkluzionih tela IL-2 polipeptida umesto oštrijeg denaturišućeg agensa gvanidin hidrohlorida. Upotreba uree značajno smanjuje rizik od oštećenja opreme od nerđajućeg čelika koja se koristi u procesu proizvodnje i prečišćavanja IL-2 polipeptida, pri čemu efikasno rastvara inkluziona tela IL-2 polipeptida.

[0237] U slučaju rastvornog IL-2 proteina, IL-2 se može izlučiti u periplazmatski prostor ili u medijum kulture. Pored toga, rastvorni IL-2 može biti prisutan u citoplazmi ćelija domaćina. Možda će biti poželjno koncentrovati rastvorni IL-2 pre izvođenja koraka prečišćavanja. Standardne tehnike poznate stručnjacima u ovoj oblasti se mogu koristiti za koncentrovanje rastvornog IL-2 iz, na primer, ćelijskih lizata ili medijuma za kulturu. Osim toga, standardne tehnike poznate onima koji su uobičajeno verzirani u struku se mogu koristiti za razbijanje ćelija domaćina i oslobađanje rastvornog IL-2 iz citoplazme ili periplazmatskog prostora ćelija domaćina.

[0238] Generalno, povremeno je poželjno denaturisati i redukovati eksprimirane polipeptide, a zatim uzrokovati ponovno savijanje polipeptida u željenu konformaciju. Za prevođenje od interesa proizvodu se mogu dodati na primer, gvanidin, urea, DTT, DTE i/ili šaperonin. Metode redukcije, denaturacije i renaturacije proteina su poznate stručnjacima (vidi gore navedene reference i Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman i Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; i Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., na primer, opisuju denaturaciju i redukciju proteina inkluzionog tela u gvanidinu-DTE. Proteini mogu ponovo biti savijani u redoks puferu koji sadrži, ali ne ograničavajući se na, oksidirani glutation i L-arginin. Reagensi za ponovno savijanje se protokom ili na drugi način mogu dovesti u kontakt sa jednim ili više polipeptida ili drugim ekspresionim produktom, ili obrnuto.

[0239] U slučaju prokariotske proizvodnje IL-2 polipeptida, tako proizvedeni IL-2 polipeptid može biti pogrešno savijen zbog čega nema biološko delovanje ili ima smanjenu bioaktivnost proteina. Bioaktivnost se može obnoviti "ponovnim savijanjem". Generalno, pogrešno savijeni IL-2 polipeptid se ponovo savija solubilizacijom (gde je polipeptid IL-2 takođe nerastvoran), odvijanjem i redukcijom polipeptidnog lanca korištenjem, na primer, jednog ili više haotropnih agenasa (npr. uree i/ili gvanidina) i redukcionog sredstva sposobnog da redukuje disulfidne veze (npr. ditiotreitol, DTT ili 2-merkaptoetanol, 2-ME). Pri umerenoj koncentraciji haotropa, zatim se dodaje oksidacioni agens (npr. kiseonik, cistin ili cistamin), koji omogućava reformu disulfidnih veza. IL-2 polipeptid se može ponovo savijati upotrebom standardnih metoda poznatih u struci, kao što su one opisane u U.S. Pat. br. 4,511,502, 4,511,503 i 4,512,922. IL-2 polipeptid se takođe može spojiti zajedno sa drugim proteinima kako bi se formirali heterodimeri ili heteromultimeri.

[0240] Nakon ponovnog savijanja, IL-2 se može dalje prečistiti. Prečišćavanje IL-2 se može postići korišćenjem različitih tehnika poznatih prosečnom stručnjaku, uključujući hidrofobnu interakcionu hromatografiju, Ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, reverzno-faznu tečnu hromatografiju visokih performansi, afinitetnu hromatografiju i slično ili bilo koju njihovu kombinaciju. Dodatno prečišćavanje može takođe uključiti korak sušenja ili taloženja prečišćenog proteina.

[0241] Nakon prečišćavanja, IL-2 može biti izmenjen u različite pufere i/ili koncentrovan bilo kojom od niza metoda poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, dijafiltraciju i dijalizu. IL-2 koji se dobija kao pojedinačni prečišćeni protein može biti podložan agregaciji i precipitaciji.

[0242] Prečišćeni IL-2 može biti najmanje 90% čist (mereno reverzno-faznom tečnom hromatografijom visokih performansi, RP-HPLC ili elektroforezom natrijum dodecil sulfatpoliakrilamidnog gela, SDS-PAGE) ili najmanje 95% ili najmanje 96% čistoće, ili najmanje 97% čistoće, ili najmanje 98% čistoće, ili najmanje 99% ili veće čistoće. Bez obzira na tačnu numeričku vrednost čistoće IL-2, IL-2 je dovoljno čist za upotrebu kao farmaceutski proizvod ili za dalju obradu, kao što je konjugacija sa polimerom rastvornim u vodi kao što je PEG.

[0243] Određeni IL-2 molekuli se mogu koristiti kao terapeutski agensi u nedostatku drugih aktivnih sastojaka ili proteina (osim ekscipijenasa, nosača i stabilizatora, serumskog albumina i slično), ili mogu biti u kompleksu sa drugim proteinom ili polimerom.

[0244] Ranije je pokazano da se ne-prirodne aminokiseline mogu specifično inkorporirati u proteine in vitro dodavanjem hemijski aminoacilovanih supresorskih tRNK u reakcije sinteze proteina programirane sa genom koji sadrži željenu amber nonsens mutaciju. Koristeći ove pristupe, može se zameniti broj od dvadeset uobičajenih amino kiselina sa bliskim strukturnim homolozima, npr. fluorofenilalanin za fenilalanin, koristeći sojeve auksotropne za određenu aminokiselinu. Vidi, npr., Noren, CJ, Anthony-Cahill, Griffith, MC, Schultz, PG. Opšta metoda za ugradnju ne-prirodnih aminokiselina u proteine specifične za lokaciju, Science, 244: 182-188 (1989); MW Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, JD, Glabe, CG, Dix, TA, Chamberlin, AR, Diala, ES Biosynthetic sitespecific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G.

Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); i, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct.24, 435-62 (1995).

[0245] Na primer, pripremljena je supresorska tRNK koja je prepoznala stop kodon UAG i bila hemijski aminoacilovana ne-prirodnom amino kiselinom. Konvencionalna mutageneza usmerena na mesto je korišćena za uvođenje stop kodona TAG, na mesto od interesa u proteinskom genu. Vidi, npr., Sayers, JR, Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res 16(3):791-802 (1988). Kada su acilovana supresorska tRNK i mutantni gen kombinovani u in vitro sistemu transkripcije/translacije, ne-prirodna amino kiselina je inkorporirana kao odgovor na UAG kodon koji je dao protein koji sadrži tu aminokiselinu na određenoj poziciji. Eksperimenti sa [3H]-Phe i eksperimenti sa α -hidroksi kiselinama su pokazali da je samo željena aminokiselina inkorporirana na poziciju koju je specificirao UAG kodon i da ova aminokiselina nije inkorporirana ni na jednom drugom mestu u proteinu. Vidi, npr., Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; i, Ellman, JA, Mendel, D., Schultz, PG Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992).

[0246] tRNK može biti aminoacilovana sa željenom aminokiselinom bilo kojom metodom ili tehnikom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hemijsku ili enzimsku aminoacilaciju.

[0247] Aminoacilacija se može postići aminoacil tRNK sintetazama ili drugim enzimskim molekulima, uključujući ali ne ograničavajući se na ribozime. Termin "ribozim" je zamenljiv sa "katalitičkom RNK". Cech i saradnici (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem.

64:221-226) su pokazali prisustvo RNK koje se javljaju u prirodi koje mogu delovati kao katalizatori (ribozimi). Međutim, iako se pokazalo da ovi prirodni RNA katalizatori deluju samo na supstrate ribonukleinske kiseline radi cepanja i splajsovanja, nedavni razvoj veštačke evolucije ribozima je proširio repertoar katalize na različite hemijske reakcije. Studije su identifikovale RNK molekule koje mogu da katalizuju aminoacil-RNK veze na sopstvenim (2')3'-terminusima (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647) i molekule RNK koji mogu da prenesu aminokiselinu iz jednog RNK molekula u drugi (Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444).

[0248] U.S. Patent Application Publication 2003/0228593, opisuje metode za konstruisanje ribozima i njihovu upotrebu u aminoacilaciji tRNK sa prirodno kodiranim i ne-prirodno kodiranim aminokiselinama. Supstrat-imobilisani oblici enzimskih molekula koji mogu da aminoaciluju tRNK, uključujući ali ne ograničavajući se na ribozime, mogu omogućiti efikasno afinitetno prečišćavanje aminoacilovanih proizvoda. Primeri pogodnih supstrata uključuju agarozu, sefarozu i magnetne perle. Proizvodnja i upotreba supstrat imobilisanog oblika ribozima za aminoacilaciju je opisana u Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 i Publikaciji U.S. Patentne Prijave 2003/0228593.

[0249] Metode hemijske aminoacilacije uključuju, ali nisu ograničene na, one koje su uveli Hecht i saradnici (Hecht, SM Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, TG; Roesser, JR; Xu, C.; Chang , P.; Hecht, SM Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, SM; Alford, BL; Kuroda, Y.; Kitano, SJ Biol. Chem.

1978, 253, 4517) i Schultz, Chamberlin, Dougherty i drugi ( Cornish, VW; Mendel, D.; Schultz, PG Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, SA; Ellman, JA; Schultz, PGJ Am. Chem. Soc.

1991, 113, 2722 ; Noren, CJ; Anthony-Cahill, SJ; Griffith, MC; Schultz, PG Science 1989, 244, 182; Bain, JD; Glabe, CG; Dix, TA; Chamberlin, ARJ Am. Chem. Soc.1989, 111, 8013; Bain, JD et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, JP; Lestar, HA; Dougherty, DA Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al., J. Biol. Chem., 1996, 27 , 19991; Nowak, MW et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, ME i dr. J. Biol. Chem.

1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), kako bi se izbegla upotreba sintetaza u aminoacilaciji. Takve metode ili druge metode hemijske aminoacilacije se mogu koristiti za aminoacilovanje tRNK molekula.

[0250] Metode za generisanje katalitičke RNK mogu uključivati generisanje odvojenih skupova randomizovanih sekvenci ribozima, izvođenje usmerene evolucije na pulovima, skrining pulova za poželjnu aktivnost aminoacilovanja i biranje sekvenci onih ribozima koji pokazuju željenu aktivnost aminoacilovanja.

[0251] Takođe se mogu koristiti rekonstituisani translacioni sistemi. Mešavine prečišćenih translacionih faktora su takođe uspešno korišćene za translaciju mRNK u protein, kao i kombinacije lizata ili lizata dopunjenih prečišćenim faktorima translacije kao što su faktor inicijacije-1 (IF-1), IF-2, IF-3 (α ili β ), faktor elongacije T (EF-Tu) ili faktori terminacije. Bezćelijski sistemi takođe mogu biti povezani sistemi transkripcije/translacije u kojima se DNK uvodi u sistem, transkribuje u mRNK i mRNK se translira kao što je opisano u Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993). RNA transkribovana u eukariotskom transkripcionom sistemu može biti u obliku heteronuklearne RNK (hnRNA) ili kapa na 5'-kraju (7-metil guanozin) i 3'-kraja zrele mRNA sa poli A repom, što može biti prednost u određenim translacionim sistemima. Na primer, kapirane mRNA se transliraju sa visokom efikasnošću u sistemu lizata retikulocita.

IX. Makromolekularni Polimeri Kuplovani sa IL-2 Polipeptidima

[0252] Različite modifikacije ovde opisanih polipeptida ne-prirodnih aminokiselina se mogu izvršiti korišćenjem ovde opisanih kompozicija, metoda, tehnika i strategija. Ove modifikacije uključuju ugradnju dalje funkcionalnosti u ne-prirodnu aminokiselinsku komponentu polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oznaku; boju; polimer; vodo-rastvorni polimer; derivat polietilen glikola; fotoumreživač; radionuklid; citotoksično jedinjenje; lek; oznaku afiniteta; oznaku fotoafiniteta; reaktivno jedinjenje; smolu; drugi protein ili polipeptid ili polipeptidni analog; antitelo ili fragment antitela; kelator metala; kofaktor; masnu kiselinu; ugljeni hidrat; polinukleotid; DNK; RNA; antisens polinukleotid; saharid; vodorastvorni dendrimer; ciklodekstrin; inhibitornu ribonukleinsku kiselinu; biomaterijal; nanočesticu; oznaku spina; fluorofor, deo molekula koji sadrži metal; radioaktivni deo molekula; novu funkcionalnu grupu; grupu koja kovalentno ili nekovalentno interaguje sa drugim molekulima; deo molekula u fotokavezu; deo molekula ekscitabilan aktiničnim zračenjem; deo molekula koji se može fotoizomerizovati; biotin; derivat biotina; analog biotina; deo koji sadrži teški atom; grupu koja se može hemijski cepati; grupu koja se može fotohemijski cepati; produženi bočni lanac; ugljenikom vezane šećere; redoks-aktivno sredstvo; amino tiokiselinu; toksični deo; izotopski obeleženi deo; biofizičku probu; fosforescentnu grupu; hemiluminiscentnu grupu; grupu sa velikom gustinom elektrona; magnetičnu grupu; interkalirajuću grupu; hromofor; sredstvo za prenos energije; biološki aktivan agens; detektabilnu oznaku; mali molekul; kvantnu tačku; nanotransmiter; radionukleotid; radiotransmiter; agens za hvatanje neutrona; ili bilo koju kombinaciju gore navedenog, ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili supstancu. Kao ilustrativan, neograničavajući primer ovde opisanih kompozicija, metoda, tehnika i strategija, sledeći opis će se fokusirati na dodavanje makromolekulskih polimera polipeptidu ne-prirodne amino kiseline uz razumevanje da su opisane kompozicije, metode, tehnike i strategije takođe primenljive (sa odgovarajućim modifikacijama, ako je potrebno i koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da izvede sa ovde opisanim otkrićima) za dodavanje drugih funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na one gore navedene.

[0253] Veliki broj makromolekularnih polimera i drugih molekula može biti vezan za IL-2 polipeptide iz ovog pronalaska da se modulišu biološka svojstva IL-2 polipeptida, i/ili daju nova biološka svojstva IL-2 molekulu. Ovi makromolekularni polimeri mogu biti povezani sa IL-2 polipeptidom preko prirodno kodirane amino kiseline, preko ne-prirodno kodirane amino kiseline, ili bilo kojeg funkcionalnog supstituenta prirodne ili ne-prirodne amino kiseline, ili bilo kojeg supstituenta ili funkcionalne grupe dodate prirodnoj ili ne-prirodnoj aminokiselini. Molekulska težina polimera može biti u širokom rasponu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, između oko 100 Da i oko 100.000 Da ili više. Molekulska težina polimera može biti između oko 100 Da i oko 100.000 Da, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70,000 Da, 70,600,00055.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 9,000 Da, 0,000,0,0,0 ,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da , 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da i 100 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina polimera je između oko 100 Da i oko 50.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina polimera je između oko 100 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina polimera je između oko 1.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina polimera je između oko 5.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina polimera je između oko 10.000 Da i oko 40.000 Da.

[0254] Ovaj pronalazak obezbeđuje suštinski homogene preparate konjugata polimer:protein. "Uglavnom homogeno" kako se ovde koristi znači da se primećuje da su molekuli konjugata polimer:protein veći od polovine ukupnog proteina. Konjugat polimer:protein ima biološku aktivnost i ovi predstavljeni "suštinski homogeni" PEGilovani IL-2 polipeptidni preparati koji su ovde obezbeđeni su oni koji su dovoljno homogeni da pokažu prednosti homogenog preparata, npr. lakoću kliničke primene u predvidljivosti farmakokinetike od serije do serije.

[0255] Takođe se može izabrati da se pripremi mešavina molekula konjugata polimer:protein, a prednost koja je ovde obezbeđena je da se može izabrati udeo konjugata monopolimer:protein koji će se uključiti u smešu. Stoga, ako se želi, može se pripremiti smeša različitih proteina sa različitim brojem vezanih polimernih delova (tj. di-, tri-, tetra-, itd.) i kombinovati navedene konjugate sa konjugatom monopolimer:protein pripremljenim pomoću metode iz ovog pronalaska, i dobiti smeša sa unapred određenim udelom konjugata mono-polimer:protein.

[0256] Odabrani polimer može biti rastvoran u vodi, tako da protein za koji je vezan ne precipitira u vodenoj sredini, kao što je fiziološka sredina. Polimer može biti razgranat ili nerazgranat. Za terapeutsku upotrebu preparata krajnjeg proizvoda, polimer će biti farmaceutski prihvatljiv.

[0257] Primeri polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polialkil etre i njihove analoge sa alkoksi kapom (npr. polioksietilen glikol, polioksietilen/propilen glikol, i njihovi analozi sa metoksi ili etoksi kapom, posebno polioksietilen glikol, ovaj poslednji je takođe poznat kao polietilenglikol ili PEG); polivinilpirolidone; polivinilalkil etre; polioksazoline, polialkil oksazoline i polihidroksialkil oksazoline; poliakrilamide, polialkil akrilamide i polihidroksialkil akrilamide (npr. polihidroksipropilmetakrilamid i njihovi derivati); polihidroksialkil akrilate; polizijalne kiseline i njihove analoge; hidrofilne peptidne sekvence; polisaharide i njihove derivate, uključujući dekstran i derivate dekstrana, npr. karboksimetildekstran, dekstran sulfate, aminodekstran; celulozu i njene derivate, npr. karboksimetil celulozu, hidroksialkil celuloze; hitin i njegove derivate, npr. hitozan, sukcinil hitozan, karboksimetilhitin, karboksimetilhitozan; hijaluronsku kiselinu i njene derivate; skrobove; alginate; hondroitin sulfate; albumine; pululan i karboksimetil pululan; poliaminokiseline i njihove derivate, npr. poliglutaminske kiseline, polilizine, poliasparaginske kiseline, poliaspartamide; kopolimere anhidrida maleinske kiseline kao što su: kopolimer anhidrida maleinske kiseline stirena, kopolimer maleinskog anhidrida diviniletil etra; polivinil alkohole; njihove kopolimere; njihove terpolimere; njihove mešavine; i njihove derivate.

[0258] Udeo molekula polietilen glikola prema proteinskim molekulima će varirati, kao i njihove koncentracije u reakcionoj smeši. Generalno, optimalni odnos (u smislu efikasnosti reakcije u kojoj postoji minimalni višak neizreagovalog proteina ili polimera) se može odrediti pomoću molekulske težine odabranog polietilen glikola i broja dostupnih reaktivnih grupa. Što se tiče molekulske težine, obično što je veća molekulska težina polimera, to je manji broj molekula polimera koji se mogu vezati za protein. Slično, grananje polimera treba uzeti u obzir prilikom optimizacije ovih parametara. Generalno, što je veća molekulska težina (ili više grana), to je veći odnos polimer:protein.

[0259] Kako se ovde koristi, i kada se razmatraju PEG: IL-2 polipeptidni konjugati, izraz "terapeutski efikasna količina" se odnosi na količinu koja pacijentu daje željenu korist. Količina će se razlikovati od pojedinca do pojedinca i zavisiće od brojnih faktora, uključujući celokupno fizičko stanje pacijenta i osnovni uzrok stanja koje treba lečiti. Količina IL-2 polipeptida koji se koristi za terapiju daje prihvatljivu brzinu promene i održava željeni odgovor na dobrom nivou. Terapeutski efikasna količina ovih kompozicija se može lako utvrditi od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti korišćenjem javno dostupnih materijala i procedura.

[0260] Vodorastvorni polimer može biti bilo koji strukturni oblik uključujući, ali ne ograničavajući se na linearni, račvasti ili granasti. Tipično, vodo-rastvorni polimer je poli(alkilen glikol), kao što je poli(etilen glikol) (PEG), ali se mogu koristiti i drugi vodorastvorni polimeri. Kao primer, PEG se koristi za opisivanje određenih realizacija ovog pronalaska.

[0261] PEG je dobro poznati polimer rastvoran u vodi koji je komercijalno dostupan ili se može dobiti polimerizacijom etilen glikola sa otvaranjem prstena prema metodama poznatim stručnjacima (Sandler i Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, tom 3, stranice 138-161). Termin "PEG" se široko koristi da obuhvati bilo koji molekul polietilen glikola, bez obzira na veličinu ili modifikaciju na kraju PEG-a, i može se predstaviti kao povezan sa IL-2 polipeptidom pomoću formule:

XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y

gdje je n 2 do 10.000 i X je H ili terminalna modifikacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, C1-4alkil, zaštitnu grupu, ili terminalnu funkcionalnu grupu.

[0262] U nekim slučajevima, PEG koji se koristi u pronalasku završava na jednom kraju sa hidroksi ili metoksi, tj. X je H ili CH3("metoksi PEG"). Alternativno, PEG može završiti sa reaktivnom grupom, čime se formira bifunkcionalni polimer. Tipične reaktivne grupe mogu uključivati one reaktivne grupe koje se obično koriste za reakciju sa funkcionalnim grupama koje se nalaze u 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući ali ne ograničavajući se na maleimidne grupe, aktivirane karbonate (uključujući, ali ne ograničavajući se na, p-nitrofenil estar), aktivirane estre (uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-hidroksisukcinimid, p-nitrofenil estar) i aldehide) kao i funkcionalne grupe koje su inertne na 20 uobičajenih aminokiselina, ali koje specifično reaguju sa komplementarnim funkcionalnim grupama prisutnim u ne-prirodno kodiranim aminokiselinama (uključujući, ali ne ograničavajući se na, azidne grupe, alkinske grupe). Napominjemo da će se drugi kraj PEG-a, koji je u gornjoj formuli prikazan sa Y, vezati direktno ili indirektno za IL-2 polipeptid preko aminokiseline koja se javlja u prirodi ili nije prirodno kodirana. Na primer, Y može biti amid, karbamat ili urea veza za aminsku grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, epsilon amin lizina ili N-terminus) polipeptida. Alternativno, Y može biti maleimidna veza sa tiolnom grupom (uključujući ali ne ograničavajući se na tiol grupu cisteina). Alternativno, Y može biti veza sa reziduom koja nije uobičajeno dostupna preko 20 uobičajenih aminokiselina. Na primer, azidna grupa na PEG-u može reagovati sa alkin grupom na IL-2 polipeptidu da bi se formirao Huisgen [3+2] cikloadicioni proizvod. Alternativno, alkinska grupa na PEG može reagovati sa azidnom grupom prisutnom u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini da bi se formirao sličan proizvod. Jak nukleofil (uključujući, ali ne ograničavajući se na, hidrazin, hidrazid, hidroksilamin, semikarbazid) može reagovati sa aldehidnom ili ketonskom grupom prisutnom u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini da se formira hidrazon, oksim ili semikarbazon, kako je primenjivo, koji se u nekim slučajevima može dodatno redukovati tretmanom odgovarajućim redukcionim sedstvom. Alternativno, jak nukleofil se može ugraditi u IL-2 polipeptid preko ne-prirodno kodirane aminokiseline i koristiti za poželjnu reakciju sa ketonskom ili aldehidnom grupom prisutnom u polimeru rastvorljivom u vodi.

[0263] Bilo koja molekulska masa za PEG se može koristiti po želji, uključujući, ali ne ograničavajući se na, od oko 100 Daltona (Da) do 100 000 Da ili više po želji (uključujući, ali ne ograničavajući se na, ponekad 0.1-50 kDa ili 10-40 kDa). Molekulska težina PEG-a može biti u širokom rasponu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, između oko 100 Da i oko 100.000 Da ili više. PEG može biti između oko 100 Da i oko 100.000 Da, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 70.000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da i 100 Da. U nekim realizacijama, PEG je između oko 100 Da i oko 50.000 Da. U nekim realizacijama, PEG je između oko 100 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, PEG je između oko 1.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, PEG je između oko 5.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, PEG je između oko 10.000 Da i oko 40.000 Da. PEG-ovi razgranatog lanca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, PEG molekule sa svakim lancem koji imaju MT u rasponu od 1-100 kDa (uključujući, ali ne ograničavajući se na, 1-50 kDa ili 5-20 kDa) se takođe mogu koristiti. Molekulska težina svakog lanca PEG sa granastim lancem može biti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, između oko 1.000 Da i oko 100.000 Da ili više. Molekulska težina svakog lanca PEG sa granastim lancem može biti između oko 1.000 Da i oko 100.000 Da, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 15.000 Da, 10,000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da i 1.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca PEG sa granastim lancem je između oko 1.000 Da i oko 50.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca PEG sa granastim lancem je između oko 1.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca PEG-a sa granastim lancem je između oko 5.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca PEG-a sa granastim lancem je između oko 5.000 Da i oko 20.000 Da. Širok spektar PEG molekula je opisan u, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog.

[0264] Generalno, najmanje jedan kraj PEG molekula je dostupan za reakciju sa ne-prirodno kodiranom amino kiselinom. Na primer, derivati PEG-a koji nose alkinske i azidne delove za reakciju sa bočnim lancima aminokiselina se mogu koristiti za pričvršćivanje PEG-a na ne-prirodno kodirane aminokiseline kako je ovde opisano. Ako ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži azid, tada će PEG tipično sadržati ili alkinski deo koji utiče na formiranje [3+2] cikloadicionog proizvoda ili aktiviranu PEG vrstu (tj. estar, karbonat) koja sadrži fosfinsku grupu da utiče na formiranje amidne veze. Alternativno, ako ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži alkin, tada će PEG tipično sadržati azidni deo koji utiče na formiranje [3+2] Huisgen cikloadicionog proizvoda. Ako ne prirodno kodirana aminokiselina sadrži karbonilnu grupu, PEG će obično sadržati moćan nukleofil (uključujući, ali ne ograničavajući se na, funkcionalnost hidrazida, hidrazina, hidroksilamina ili semikarbazida) kako bi se uticalo na formiranje odgovarajućih hidrazonskih, oksimskih i semikarbazonskih veza, respektivno. U drugim alternativama, može se koristiti obrnuta orijentacija gore opisanih reaktivnih grupa, tj. azidni deo u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini može reagovati sa PEG derivatom koji sadrži alkin.

[0265] U nekim realizacijama, IL-2 polipeptid sa PEG derivatom sadrži hemijsku funkcionalnost koja je reaktivna sa hemijskom funkcionalnošću prisutnom na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline.

[0266] U nekim realizacijama, derivati polimera koji sadrže azid i acetilen sadrže kičmu polimera rastvornog u vodi sa prosečnom molekulskom težinom od oko 800 Da do oko 100.000 Da. Polimerna kičma polimera rastvornog u vodi može biti poli(etilen glikol). Međutim, treba imati na umu da je veliki broj vodorastvornih polimera uključujući, ali ne ograničavajući se na poli(etilen)glikol i druge srodne polimere, uključujući poli(dekstran) i polipropilen glikol), takođe pogodan za upotrebu u praksi ovog pronalaska i da je upotreba termina PEG ili poli(etilen glikol) namenjena da obuhvati i uključi sve takve molekule. Pojam PEG uključuje, ali nije ograničen na, poli(etilen glikol) u bilo kojem od njegovih oblika, uključujući bifunkcionalni PEG, višestruki PEG, derivatizovani PEG, račvasti PEG, granasti PEG, viseći PEG (tj. PEG ili srodni polimeri koji imaju jednu ili više visećih funkcionalnih grupa na kičmi polimera) ili PEG sa razgradivim vezama u sebi.

[0267] PEG je tipično bistar, bezbojan, bez mirisa, rastvoran u vodi, stabilan na toploti, inertan na mnoge hemijske agense, ne hidrolizuje i ne kvari se, i generalno je netoksičan. Poli(etilen glikol) se smatra biokompatibilnim, što znači da PEG može da koegzistira sa živim tkivima ili organizmima bez nanošenja štete. Preciznije, PEG je u osnovi neimunogen, š to znači da PEG nema tendenciju da proizvede imuni odgovor u telu. Kada je vezan za molekul koji ima neku poželjnu funkciju u telu, kao što je biološki aktivan agens, PEG ima tendenciju da maskira agens i može smanjiti ili eliminisati bilo kakav imunološki odgovor tako da organizam može da toleriše prisustvo agensa. PEG konjugati obično ne proizvode značajan imunološki odgovor i ne uzrokuju zgrušavanje ili druge neželjene efekte. PEG koji ima formulu-- CH2CH2O-(CH2CH2O)n -- CH2CH2--, gde je n od oko 3 do oko 4000, obično od oko 20 do oko 2000, je pogodan za upotrebu u ovom pronalasku. PEG koji ima molekulsku težinu od oko 800 Da do oko 100,000 Da je u nekim realizacijama ovog pronalaska posebno koristan kao kičma polimera. Molekulska težina PEG-a može biti u širokom rasponu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, između oko 100 Da i oko 100.000 Da ili više. Molekulska težina PEG može biti između oko 100 da, uključujući oko 100.000 da, uključujući i ne ograničavajući se na 100.000 DA, 95.000 DA, 90.000 DA, 85.000 DA, 75.000 DA, 65.000 DA, 55.000 DA, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000, 6.000 Da, 5.000Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da i 100 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina PEG-a je između oko 100 Da i oko 50.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina PEG-a je između oko 100 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina PEG-a je između oko 1.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina PEG-a je između oko 5.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina PEG-a je između oko 10.000 Da i oko 40.000 Da.

[0268] Kičma polimera može biti linearna ili razgranata. Razgranate polimerne kičme su generalno poznate u struci. Tipično, granasti polimer ima centralnu granu jezgra i mnoštvo linearnih polimernih lanaca povezanih sa centralnom granom jezgra. PEG se obično koristi u granastim oblicima koji se mogu pripremiti dodavanjem etilen oksida raznim poliolima, kao što su glicerol, glicerol oligomeri, pentaeritritol i sorbitol. Centralna grana takođe može biti izvedena iz nekoliko aminokiselina, kao što je lizin. Granasti poli(etilen glikol) može biti predstavljen u opštem obliku kao R(-PEG-OH)mu kojem je R izveden iz jezgra, kao što je glicerol, glicerol oligomeri ili pentaeritritol, a m predstavlja broj krakova. Višekraki PEG molekuli, kao što su oni opisani u U.S. Pat. br. 5,932,462; 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; U.S. Pat. Appl. 2003/0143596; WO 96/21469; i WO 93/21259 se takođe mogu koristiti kao kičma polimera.

[0269] Granasti PEG takođe može biti u obliku račvastog PEG-a predstavljenog sa PEG(-YCHZ2)n, gde je Y vezna grupa, a Z je aktivirana terminalna grupa vezana za CH pomoću lanca atoma definisane dužine.

[0270] Još jedan granasti oblik, viseći PEG, ima reaktivne grupe, kao što je karboksil, duž kičme PEG, a ne na krajevima PEG lanaca.

[0271] Pored ovih oblika PEG-a, polimer takođe može biti pripremljen sa slabim ili razgradivim vezama u kičmi. Na primer, PEG se može pripremiti sa estarskim vezama u kičmi polimera koje su podložne hidrolizi. Kao što je prikazano u nastavku, ova hidroliza rezultira cepanjem polimera na fragmente niže molekulske težine:

-PEG-CO2-PEG-+H2O → PEG-CO2H+HO-PEG-

Stručnjaci u ovoj oblasti razumeju da izraz poli(etilen glikol) ili PEG predstavlja ili uključuje sve oblike poznate u struci uključujući, ali ne ograničavajući se na one koji su ovde otkriveni.

[0272] Mnogi drugi polimeri rastvorljivi u vodi su takođe pogodni za upotrebu u ovom pronalasku. IL-2 polipeptid iz ovog pronalaska je konjugovan sa polimerom rastvornim u vodi preko ne-prirodno kodirane aminokiseline preko linkera koji se ne može cepati, kako je definisano u zahtevima. U nekim realizacijama, kičme polimera koje su rastvorne u vodi, sa od 2 do oko 300 terminusa, su posebno korisne u ovom pronalasku. Primeri prikladnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, druge poli(alkilen glikole), kao što je polipropilen glikol ("PPG"), njihove kopolimere (uključujući, ali ne ograničavajući se na kopolimere etilen glikola i propilen glikola), njihove terpolimere, njihove mešavine i slično. Iako molekulska težina svakog lanca kičme polimera može varirati, ona je tipično u rasponu od oko 800 Da do oko 100.000 Da, često od oko 6.000 Da do oko 80.000 Da. Molekulska težina svakog lanca kičme polimera može biti između oko 100 Da i oko 100.000 Da, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000, 65,000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9,000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da i 100 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca kičme polimera je između oko 100 Da i oko 50.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca kičme polimera je između oko 100 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca kičme polimera je između oko 1.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca kičme polimera je između oko 5.000 Da i oko 40.000 Da. U nekim realizacijama, molekulska težina svakog lanca kičme polimera je između oko 10.000 Da i oko 40.000 Da.

[0273] Prosečan stručnjak će prepoznati da prethodna lista za kičme koje su uglavnom rastvorljive u vodi nije ni u kom slučaju iscrpna i da je samo ilustrativna, i da se smatra da su svi polimerni materijali koji imaju gore opisane kvalitete pogodni za upotrebu u ovom pronalasku.

[0274] U nekim realizacijama ovog pronalaska, derivati polimera su "multifunkcionalni", što znači da kičma polimera ima najmanje dva terminusa, a moguće čak i oko 300 terminusa, funkcionalizovanih ili aktiviranih funkcionalnom grupom. Multifunkcionalni polimerni derivati uključuju, ali nisu ograničeni na, linearne polimere koji imaju dva terminusa, pri čemu je svaki terminus vezan za funkcionalnu grupu koja može biti ista ili različita.

[0275] U jednom aspektu, derivat polimera ima strukturu:

XA-POLY-BN=N=N

u kojoj:

N=N=N je azidni deo molekula;

B je vezujući deo, koji može biti prisutan ili odsutan;

POLY je neantigenski vodorastvorni polimer;

A je vezni deo, koji može biti prisutan ili odsutan i koji može biti isti kao B ili različit; i

X je druga funkcionalna grupa.

[0276] Primeri vezujućeg dela za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestruko funkcionalizovanu alkil grupu koja sadrži do 18, a može sadržati između 1-10 atoma ugljenika. Heteroatom kao što je azot, kiseonik ili sumpor može biti uključen u alkilni lanac. Alkilni lanac takođe može biti razgranat na heteroatomu. Drugi primeri vezujućeg dela za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestruko funkcionalizovanu aril grupu, koja sadrži do 10, a može sadržati i 5-6 atoma ugljenika. Aril grupa može biti supstituisana sa još jednim atomom ugljenika, azotom, kiseonikom ili atomom sumpora. Drugi primeri pogodnih vezujućih grupa uključuju one vezujuće grupe opisane u U.S. Pat. br. 5,932,462; 5,643,575; i U.S. Pat. Appl. Publication 2003/0143596. Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da prethodna lista za vezujuće delove ni u kom slučaju nije iscrpna i da je samo ilustrativna, i da se smatra da su svi vezujući delovi koji imaju gore opisane kvalitete pogodni za upotrebu u ovom pronalasku.

[0277] Primeri pogodnih funkcionalnih grupa za upotrebu kao X uključuju, ali nisu ograničeni na, hidroksil, zaštićeni hidroksil, alkoksil, aktivni estar, kao što su N-hidroksisukcinimidil estri i 1-benzotriazolil estri, aktivni karbonat, kao što su N-hidroksisukcinimidil karbonati i 1-benzotriazolil karbonati, acetal, aldehid, aldehid hidrati, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, aktivni sulfon, amin, aminooksi, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilna kiselina, zaštićena karboksilna kiselina, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, glioksali, dioni, mezilati, tozilati, trezilat, alken, keton i azid. Kao što je razumljivo prosečnim stručnjacima, odabrani X deo treba da bude kompatibilan sa azidnom grupom tako da ne dođe do reakcije sa azidnom grupom. Derivati polimera koji sadrže azide mogu biti homobifunkcionalni, što znači da je druga funkcionalna grupa (tj. X) takođe azidni deo, ili heterobifunkcionalni, što znači da je druga funkcionalna grupa različita funkcionalna grupa.

[0278] Termin "zaštićen" se odnosi na prisustvo zaštitne grupe ili rezidue koja sprečava reakciju hemijski reaktivne funkcionalne grupe pod određenim reakcionim uslovima. Zaštitna grupa će varirati u zavisnosti od vrste hemijski reaktivne grupe koja se štiti. Na primer, ako je hemijski reaktivna grupa amin ili hidrazid, zaštitna grupa se može odabrati iz grupe terc-butiloksikarbonila (t-Boc) i 9-fluorenilmetoksikarbonila (Fmoc). Ako je hemijski reaktivna grupa tiol, zaštitna grupa može biti ortopiridildisulfid. Ako je hemijski reaktivna grupa karboksilna kiselina, kao što je butanska ili propionska kiselina, ili hidroksilna grupa, zaštitna grupa može biti benzil ili alkil grupa kao što je metil, etil ili tercbutil. U ovom pronalasku se takođe mogu koristiti i druge zaštitne grupe poznate u struci.

[0279] Specifični primeri terminalnih funkcionalnih grupa u literaturi uključuju, ali nisu ograničeni na, N-sukcinimidil karbonat (vidi npr. U.S. Pat. br. 5,281,698, 5,468,478), amino (vidi, npr., Buckmann et al. Makromol. Chem., 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazid (vidi, npr. Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), sukcinimidil propionat i sukcinimidil butanoat (vidi npr. Olson et al. u Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, str. 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997; vidi takođe U.S. Pat. No. 5,672,662), sukcinimidil sukcinat (Vidi npr. Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) i Joppich et al. Makromol. Chem.

180:1381 (1979), sukcinimidil estar, npr. U.S. Pat. 4,670,417), benzotriazol karbonat (vidi, npr., U.S. Pat. br. 5,650,234), glicidil etar (vidi, npr. Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech Appl. Biochem., 13:354 (1991), oksikarbonilimidazol (vidi, npr., Beauchamp, et al., Anal. Biochem.

131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-nitrofenil karbonat (vidi, npr., Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); i Sartore et al., Appl. Biochem Biotech., 27:45 (1991)), aldehid (vidi, npr. Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), U.S. Pat. No. 5,824,784, U.S. Pat. No. 5,252,714), maleimid (vidi npr. Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. u Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)) i Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfid (vidi npr. Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), akrilol (vidi, npr., Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfon (vidi, npr., U.S. Pat. No.5,900,461).

[0280] U određenim realizacijama ovog pronalaska, derivati polimera iz ovog pronalaska sadrže kičmu polimera koja ima strukturu:

X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N

u kojoj:

X je funkcionalna grupa kako je gore opisano; i

n je oko 20 do oko 4000.

[0281] U drugoj realizaciji, derivati polimera iz ovog pronalaska sadrže kičmu polimera koja ima strukturu:

X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)mWN=N =N

u kojoj:

W je alifatični ili aromatični vezujući deo koji sadrži između 1-10 atoma ugljenika;

n je oko 20 do oko 4000; i

X je funkcionalna grupa kako je gore opisano, m je između 1 i 10.

[0282] Derivati PEG-a prema pronalasku koji sadrže azid se mogu pripremiti prema različitim metodama poznatim u struci i/ili ovde otkrivenim. U jednoj metodi, prikazanoj u nastavku, vodorastvorna kičma polimera koja ima prosečnu molekulsku težinu od oko 800 Da do oko 100000 Da, kičmu polimera koja ima prvi terminus vezan za prvu funkcionalnu grupu i drugi terminus vezan za odgovarajuću odlazeću grupu, reaguje sa azidnim anjonom (koji može biti uparen sa bilo kojim od brojnih pogodnih kontra-jona, uključujući natrijum, kalijum, terc-butilamonijum i tako dalje). Odlazeća grupa podleže nukleofilnom premeštanju i zamenjena je azidnim delom molekula, dajući željeni PEG polimer koji sadrži azid.

X-PEG-L N3- → X-PEG-N3

[0283] Kao što je prikazano, pogodna kičma polimera za upotrebu u ovom pronalasku ima formulu X-PEG-L, u kojoj je PEG poli(etilen glikol), a X je funkcionalna grupa koja ne reaguje sa azidnim grupama i L je pogodna odlazeća grupa. Primeri pogodnih funkcionalnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, hidroksil, zaštićeni hidroksil, acetal, alkenil, amin, aminooksi, zaštićeni amin, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilnu kiselinu, zaštićenu karboksilnu kiselinu, maleimid, ditiopiridin i vinilpiridin, i keton. Primeri pogodnih odlazećih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, hlorid, bromid, jodid, mezilat, tresilat i tozilat.

[0284] U drugoj metodi za pripremu derivata polimera koji sadrže azid iz ovog pronalaska, vezujući agens sa azidnom funkcionalnošću se dovodi u kontakt sa vodorastvornom kičmom polimera koji ima prosečnu molekulsku težinu od oko 800 Da do oko 100.000 Da, pri čemu vezujući agens ima hemijsku funkcionalnost koja će selektivno reagovati sa hemijskom funkcionalnošću na PEG polimeru, kako bi se formirao derivat polimera koji sadrži azid u kojem je azid vezujućom grupom odvojen od kičme polimera.

[0285] Primer šeme reakcije je prikazan ispod:

X-PEG-M N-linker-N=N=N → PG-X-PEG-linker-N=N=N

gde:

PEG je poli(etilen glikol) a X je kapa kao što je alkoksi ili funkcionalna grupa kako je gore opisano; i M je funkcionalna grupa koja nije reaktivna sa azidnom funkcionalnošću, ali koja će reagovati efikasno i selektivno sa N funkcionalnom grupom.

[0286] Primeri pogodnih funkcionalnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, M koje je karboksilna kiselina, karbonat ili aktivni estar ako N predstavlja amin; M je keton ako je N hidrazid ili aminooksi deo; M je odlazeća grupa ako je N nukleofil.

[0287] Prečišćavanje sirovog proizvoda se može postići poznatim metodama uključujući, ali ne ograničavajući se na, taloženje proizvoda praćeno hromatografijom, ako je potrebno.

[0288] Specifičniji primer je prikazan u nastavku u slučaju PEG diamina, u kojem je jedan od amina zaštićen zaštitnom grupom kao što je terc-butil-Boc i rezultujući mono-zaštićeni PEG diamin reaguje sa vezujućim delom koji nosi azidnu funkciju:

BocHN-PEG-NH2+ HO2C-(CH2)3-N=N=N

[0289] U ovom slučaju, amino grupa može biti kuplovana sa grupom karboksilne kiseline korišćenjem raznih agenasa za aktivaciju kao što su kao tionil hlorid ili karbodiimidni reagensi i N-hidroksisukcinimid ili N-hidroksibenzotriazol za stvaranje amidne veze između monoaminskog PEG derivata i vezujućeg dela koji nosi azid. Nakon uspešnog formiranja amidne veze, rezultujući derivat koji sadrži N-terc-butil-Boc zaštićen azid se može koristiti direktno za modifikaciju bioaktivnih molekula ili se može dalje razraditi za instaliranje drugih korisnih funkcionalnih grupa. Na primer, Nt-Boc grupa se može hidrolizovati tretmanom sa jakom kiselinom kako bi se dobio omega-amino-PEG-azid. Dobijeni amin se može koristiti kao sintetička alatka za instaliranje drugih korisnih funkcija kao što su maleimidne grupe, aktivirani disulfidi, aktivirani estri i tako dalje za stvaranje vrednih heterobifunkcionalnih reagensa.

[0290] Heterobifunkcionalni derivati su posebno korisni kada treba vezati različite molekule na svaki terminus polimera. Na primer, omega-N-amino-N-azido PEG bi omogućio vezivanje molekula koji ima aktiviranu elektrofilnu grupu, kao što je aldehid, keton, aktivirani estar, aktivirani karbonat i tako dalje, na jedan kraj PEG-a i molekul koji ima acetilensku grupu na drugi kraj PEG-a.

[0291] U drugom aspektu pronalaska, derivat polimera ima strukturu:

XA-POLY-BC≡CR

u kojoj:

R može biti ili H ili alkil, alken, alkiloksi, ili aril ili supstituisana aril grupa;

B je vezujući deo, koji može biti prisutan ili odsutan;

POLY je vodo-rastvorni ne-antigeni polimer;

A je vezujući deo, koji može biti prisutan ili odsutan i koji može biti isti kao B ili različit; i

X je druga funkcionalna grupa.

[0292] Primeri vezujućeg dela molekula za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestruko funkcionalizovanu alkil grupu koja sadrži do 18, a može sadržati između 1-10 atoma ugljenika. Heteroatom kao što je azot, kiseonik ili sumpor može biti uključen u lanac alkila. Alkilni lanac takođe može biti razgranat na heteroatomu. Drugi primeri vezujućeg dela za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestruko funkcionalizovanu aril grupu, koja sadrži do 10 i može sadržati 5-6 atoma ugljenika. Aril grupa može biti supstituisana sa još jednim atomom ugljenika, azota, kiseonika ili atomom sumpora. Drugi primeri pogodnih vezujućih grupa uključuju one vezujuće grupe opisane u U.S. Pat. Nos.5,932,462 i 5,643,575 i U.S. Pat. Appl. Publication 2003/0143596. Prosečni stručnjaci će prepoznati da prethodni spisak vezujućih delova molekula ni u kom slučaju nije iscrpan i treba da bude samo ilustrativan, i da se smatra da će veliki broj vezujućih delova koji imaju gore opisane kvalitete biti korisni u ovom pronalasku.

[0293] Primeri pogodnih funkcionalnih grupa za upotrebu kao X uključuju hidroksil, zaštićeni hidroksil, alkoksil, aktivni estar, kao što su N-hidroksidil-sukcinidi estri, aktivni karbonat, kao š to su N-hidroksisukcinimidil karbonati i 1-benzotriazolil karbonati, acetal, aldehid, aldehid hidrate, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, aktivni sulfon, amin, aminooksi, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilna kiselina, zaštićena karboksilna kiselina, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, glioksali, dioni, mezilati, tozilati i trezilat, alken, ketone, i acetilen. Kao što se može razumeti, odabrani X deo molekula treba da bude kompatibilan sa acetilenskom grupom tako da ne dođe do reakcije sa acetilenskom grupom. Derivati polimera koji sadrže acetilen mogu biti homobifunkcionalni, š to znači da je druga funkcionalna grupa (tj. X) takođe acetilenski dio, ili heterobifunkcionalni, što znači da je druga funkcionalna grupa različita funkcionalna grupa.

[0294] U drugoj realizaciji ovog pronalaska, derivati polimera sadrže kičmu polimera koja ima strukturu:

X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n --CH2CH2- O-(CH2)mC≡CH

u kojoj:

X je funkcionalna grupa kako je gore opisano;

n je oko 20 do oko 4000; i

m je između 1 i 10.

Specifični primeri svakog od heterobifunkcionalnih PEG polimera su prikazani ispod.

[0295] Derivati PEG iz pronalaska koji sadrže acetilen se mogu pripremiti korišćenjem metoda poznatih stručnjacima u ovoj oblasti i/ili ovde otkrivenih. U jednoj metodi, vodorastvorna kičma polimera koji ima prosečnu molekulsku težinu od oko 800 Da do oko 100000 Da, polimernu kičmu koja ima prvi kraj vezan za prvu funkcionalnu grupu i drugi kraj vezan za odgovarajuću nukleofilnu grupu, reaguje sa jedinjenjem koje ima i acetilensku funkcionalnost i odlazeću grupu koja je pogodna za reakciju sa nukleofilnom grupom na PEG. Kada se kombinuju PEG polimer koji nosi nukleofilni deo i molekul koji nosi odlazeću grupu, odlazeća grupa podleže nukleofilnom izmeštanju i zamenjuje se nukleofilnom grupom, dajući željeni polimer koji sadrži acetilen.

X-PEG-Nu LAC → X-PEG-Nu-AC=CR'

[0296] Kao što je prikazano, poželjna kičma polimera za upotrebu u reakciji ima formulu X-PEG-Nu, u kojoj PEG je poli(etilen glikol), Nu je nukleofilni deo, a X je funkcionalna grupa koja ne reaguje sa Nu, L ili acetilenskom funkcijom.

[0297] Primeri Nu uključuju, ali nisu ograničeni na, amin, alkoksi, ariloksi, sulfhidril, imino, karboksilat, hidrazid, aminoksi grupe koje bi reagovale prvenstveno preko mehanizma tipa SN2. Dodatni primeri Nu grupa uključuju one funkcionalne grupe koje bi reagovale prvenstveno putem nukleofilne reakcije adicije. Primeri L grupa uključuju hlorid, bromid, jodid, mezilat, trezilat i tozilat i druge grupe za koje se očekuje da će biti podvrgnute nukleofilnom izmeštanju, kao i ketone, aldehide, tioestre, olefine, alfabeta nezasićene karbonilne grupe, karbonate i druge elektrofilne grupe za koje se očekuje da će biti podvrgnute adiciji pomoću nukleofila.

[0298] U drugoj realizaciji ovog pronalaska, A je alifatični linker koji ima između 1-10 atoma ugljenika ili supstituisani arilni prsten koji ima između 6-14 atoma ugljenika. X je funkcionalna grupa koja ne reaguje sa azidnim grupama i L je pogodna odlazeća grupa

[0299] U drugoj metodi za pripremu derivata polimera koji sadrže acetilen prema ovom pronalasku, PEG polimer koji ima prosečnu molekulsku težinu od oko 800 Da do oko 100.000 Da, koji nosi zaštićenu funkcionalnu grupu ili kapu na jednom terminusu i odgovarajuću odlazeću grupu na drugom terminusu se kontaktira sa acetilenskim anjonom.

[0300] Primer reakcije je prikazan ispod:

X-PEG-L -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'

gde:

PEG je poli(etilen glikol) i X je kapa kao što je alkoksi ili funkcionalna grupa kako je gore opisano; i R' je ili H, alkil, alkoksi, aril ili ariloksi grupa ili supstituisana alkil, alkoksil, aril ili ariloksi grupa.

[0301] U gornjem primeru, odlazeća grupa L bi trebalo da bude dovoljno reaktivna da podleže izmeštanju tipa SN2 kada je u kontaktu sa dovoljnom koncentracijom acetilenskih anjona. Reakcioni uslovi potrebni za postizanje SN2 izmeštanja odlazećih grupa acetilenskim anjonima su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0302] Prečišćavanje sirovog proizvoda se obično može postići metodama poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, taloženje proizvoda praćeno hromatografijom, ako je potrebno.

[0303] Polimeri rastvorni u vodi su vezani za IL-2 polipeptide iz pronalaska. Vodo-rastvorni polimer se konjuguje sa IL-2 polipeptidom iz ovog pronalaska preko ne-prirodno kodirane aminokiseline preko linkera koji se ne može cepati, kao što je definisano u zahtevima. Polimeri rastvorni u vodi mogu biti vezani preko ne-prirodno kodirane aminokiseline inkorporirane u IL-2 polipeptid ili bilo koje funkcionalne grupe ili supstituenta ne-prirodno kodirane ili prirodno kodirane amino kiseline, ili bilo koje funkcionalne grupe ili supstituenta dodatog u ne-prirodno kodiranu ili prirodno kodiranu aminokiselinu. Alternativno, polimeri rastvorni u vodi su vezani za IL-2 polipeptid koji uključuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu preko aminokiseline koja se nalazi u prirodi (uključujući, ali ne ograničavajući se na, cistein, lizin ili amino grupu N-terminalne rezidue). U nekim slučajevima, IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska sadrže 1 ne-prirodnu aminokiselinu, pri čemu je jedna ne-prirodno kodirana aminokiselina vezana za polimer(e) rastvorljiv(e) u vodi (uključujući, ali ne ograničavajući se na, PEG i/ili oligosaharide). U nekim slučajevima, IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska dalje sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više prirodno kodiranih aminokiselina vezanih za polimerz rastvorne u vodi. U nekim slučajevima, IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska sadrže jednu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu povezanu sa polimerima rastvornim u vodi i jednu ili više aminokiselina koje se javljaju u prirodi, koje su vezane za polimere rastvorne u vodi. U nekim realizacijama, polimeri rastvorni u vodi koji se koriste u ovom pronalasku povećavaju poluživot IL-2 polipeptida u serumu u odnosu na nekonjugovani oblik.

[0304] Broj vodorastvornih polimera vezanih za IL-2 polipeptid (tj. stepen PEGilacije ili glikozilacije) iz ovog pronalaska se može podesiti kako bi se obezbedile izmenjene (uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećane ili smanjene) farmakološke, farmakokinetičke ili farmakodinamičke karakteristike kao što je in vivo poluživot. U nekim realizacijama, poluživot IL-2 je povećan najmanje za oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 procenata, 2 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 11 puta, 12 puta, 13 puta, 14 puta, 15 puta, 16 puta, 17 puta, 18 puta, 19 puta, 20 puta, 25 puta, 30 puta, 35 puta, 40 puta, 50 puta ili najmanje oko 100 puta u odnosu na nemodifikovani polipeptid.

Derivati PEG koji sadrže jaku nukleofilnu grupu (tj. hidrazid, hidrazin, hidroksilamin ili semikarbazid)

[0305] U jednoj realizaciji ovog pronalaska, IL-2 polipeptid je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži terminalni hidrazin, hidroksilamin, hidrazid ili semikarbazidni deo koji je direktno vezan za kičmu PEG.

[0306] U nekim realizacijama, derivati hidroksilamin-terminalnog PEG-a će imati strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)mO-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1.000 (tj. prosečna molekulska težina je između 5-40 kDa).

[0307] U nekim realizacijama, PEG derivat koji sadrži hidrazin ili hidrazid će imati strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)mX-NH-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1.000 a X je opciono karbonilna grupa (C=O) koja može biti prisutna ili odsutna.

[0308] U nekim realizacijama, PEG derivat koji sadrži semikarbazid će imati strukturu:

RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, a n je 100-1.000.

[0309] U drugoj realizaciji pronalaska, IL-2 polipeptid je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži terminalni hidroksilamin, hidrazid, hidrazin ili semikarbazidni deo koji je vezan za kičmu PEG pomoću amidne veze.

[0310] U nekim realizacijama, derivati hidroksilamin-terminalnog PEG-a imaju strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)mO-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, a n je 100-1.000 (tj. prosečna molekulska težina je između 5-40 kDa).

[0311] U nekim realizacijama, derivati PEG-a koji sadrže hidrazin ili hidrazid imaju strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)mX-NH-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, n je 100-1,000 a X je opciono karbonilna grupa (C=O) koja može biti prisutna ili odsutna.

[0312] U nekim realizacijama, derivati PEG koji sadrže semikarbazid imaju strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, a n je 100-1.000.

[0313] U drugoj realizaciji pronalaska, IL-2 polipeptid je modifikovan razgranatim PEG derivatom koji sadrži terminalni hidrazin, hidroksilamin, hidrazid ili semikarbazidni deo, pri čemu svaki lanac razgranatog PEG-a ima MT u rasponu od 10-40 kDa i, može biti od 5-20 kDa.

[0314] U drugoj realizaciji pronalaska, IL-2 polipeptid je modifikovan sa PEG derivatom koji ima razgranatu strukturu. Na primer, u nekim realizacijama, hidrazin- ili hidrazid-terminalni PEG derivat će imati sledeću strukturu:

[RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)mX-NH- NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, n je 100-1.000, a X je opciono karbonilna grupa (C=O) koja može biti prisutna ili odsutna.

[0315] U nekim realizacijama, PEG derivati koji sadrže semikarbazidnu grupu će imati strukturu:

[RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), X je opciono NH, O, S, C(O) ili nije prisutan, m je 2- 10 i n je 100-1.000.

[0316] U nekim realizacijama, PEG derivati koji sadrže hidroksilamin grupu će imati strukturu:

[RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)mO-NH2

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), X je opciono NH, O, S, C(O) ili nije prisutan, m je 2-10 a n je 100-1.000.

[0317] Stepen i mesta na kojima su polimer(i) rastvorljivi u vodi vezani za IL-2 polipeptid mogu modulisati vezivanje IL-2 polipeptida za IL-2 receptor. U nekim realizacijama, veze su raspoređene tako da IL-2 polipeptid vezuje IL-2 receptor sa Kdod oko 400 nM ili manje, sa Kdod 150 nM ili manje, a u nekim slučajevima sa Kdod 100 nM ili manje, kao što je izmereno testom ravnotežnog vezivanja, kao što je onaj opisan u Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988).

[0318] Metode i hemija za aktivaciju polimera kao i za konjugaciju peptida su opisani u literaturi i poznati su u struci. Obično korišćene metode za aktivaciju polimera uključuju, ali nisu ograničene na, aktivaciju funkcionalnih grupa sa cijanogen bromidom, perjodatom, glutaraldehidom, biepoksidima, epihlorohidrinom, divinilsulfonom, karbodiimidom, sulfonil halogenidima, trihlorotriazinom, itd. (vidi, RF1991), PROTEIN IMOBILIZATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C.1991).

[0319] Dostupno je nekoliko komentara i monografija o funkcionalizaciji i konjugaciji PEG. Vidi, na primer, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol.14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem.6: 150-165 (1995).

[0320] Metode za aktivaciju polimera se takođe mogu naći u WO 94/17039, U.S. Pat. No.5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, U.S. Pat. No. 5,219,564, U.S. Pat. No. 5,122,614, WO 90/13540, U.S. Pat. No.

5,281,698 i WO 93/15189, i za konjugaciju između aktiviranih polimera i enzima uključujući, ali ne ograničavajući se na faktor koagulacije VIII (WO 94/15625), hemoglobin (WO 94/09027), molekul koji nosi kiseonik (U.S. Pat. No. 4,412,989), ribonukleaza i superoksid dismutaza (Veronese et al., App. Biochem. Biotech.11: 141-52 (1985)).

[0321] PEGilacija (tj. dodavanje bilo kog polimera rastvorljivog u vodi) IL-2 polipeptida koji sadrže neprirodno kodiranu aminokiselinu, kao što je p-azido-L-fenilalanin se izvodi bilo kojom pogodnom metodom. Na primer, IL-2 polipeptid je PEGilovan sa alkilneterminiranim mPEG derivatom. Ukratko, višak čvrstog mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH se dodaje, uz mešanje, u vodeni rastvor p-azido-L-Phe koji sadrži IL-2 polipeptid na sobnoj temperaturi. Tipično, vodeni rastvor je puferovan puferom koji ima pKablizu pH vrednosti na kojoj reakcija treba da se izvede (generalno oko pH 4-10). Primeri pogodnih pufera za PEGilaciju pri pH 7.5, na primer, uključuju, ali nisu ograničeni na, HEPES, fosfat, borat, TRIS-HCl, EPPS i TES. pH se kontinuirano prati i podešava ako je potrebno. Reakcija se obično ostavlja da traje između 1-48 sati.

[0322] Reakcioni proizvodi se zatim podvrgavaju hromatografiji hidrofobnih interakcija da bi se odvojile varijante PEGilovanog IL-2 polipeptida od slobodnog mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH i bilo kojeg kompleksa visoke molekulske težine pegilovanog IL-2 polipeptida koji se može formirati kada se neblokirani PEG aktivira na oba kraja molekula, čime se umrežavaju molekuli varijante IL-2 polipeptida. Uslovi tokom hromatografije hidrofobnih interakcija su takvi da slobodni mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH teče kroz kolonu, dok bilo koji umreženi kompleksi varijante PEGilovanog IL-2 polipeptida eluiraju nakon željenih formi, koje sadrže jedan molekul varijante IL-2 polipeptida konjugovan sa jednom ili više PEG grupa. Pogodni uslovi variraju u zavisnosti od relativnih veličina umreženih kompleksa u odnosu na željene konjugate i lako ih određuju stručnjaci iz ove oblasti. Eluent koji sadrži željene konjugate se koncentruje ultrafiltracijom i odsoljava dijafiltracijom.

[0323] Znatno prečišćen PEG-IL-2 se može proizvesti korišćenjem metoda eluiranja gore navedenih gde proizvedeni PEG-IL-2 ima nivo čistoće od najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, konkretno, nivo čistoće od najmanje oko 75%, 80% , 85%, i preciznije, nivo čistoće od najmanje oko 90%, nivo čistoće od najmanje oko 95%, nivo čistoće od najmanje oko 99% ili veći kako je utvrđeno odgovarajućim metodama kao što je SDS/PAGE analiza, RP-HPLC, SEC i kapilarna elektroforeza. Ako je potrebno, Pegilovani IL-2 polipeptid dobijen hidrofobnom hromatografijom se može dalje prečistiti jednim ili sa više postupaka poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, afinitetnu hromatografiju; hromatografiju sa izmenom anjona ili katjona (koristeći, ali ne ograničavajući se na, DEAE SEPHAROSE); hromatografiju na siliki; HPLC reverzne faze; gel filtraciju (koristeći, ali ne ograničavajući se na, SEPHADEX G-75); hromatografiju hidrofobnih interakcija; ekskluzionu hromatografiju, hromatografiju sa helatima metala; ultrafiltraciju/dijafiltraciju; taloženje etanola; taloženje amonijum sulfata; hromatofokusiranje; displacement hromatografiju; elektroforetske procedure (uključujući ali ne ograničavajući se na preparativno izoelektrično fokusiranje), diferencijalnu rastvorljivost (uključujući, ali ne ograničavajući se na taloženje amonijum sulfata), ili ekstrakciju. Prividna molekulska težina se može proceniti pomoću GPC upoređivanjem sa standardima globularnih proteina (Preneta, AZ u PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). Čistoća IL-2-PEG konjugata se može proceniti proteolitičkom degradacijom (uključujući, ali ne ograničavajući se na, cepanje tripsina) nakon čega sledi analiza masenom spektrometrijom. Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001).

[0324] Vodorastvorni polimer vezan za aminokiselinu IL-2 polipeptida iz pronalaska se može dalje derivatizovati ili supstituisati bez ograničenja.

Derivati PEG koji sadrže azid

[0325] IL-2 polipeptid može biti modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži azidni deo koji će reagovati sa alkinskim delom prisutnim na bočnom lancu aminokiseline koja nije prirodno kodirana. Generalno, PEG derivati će imati prosečnu molekulsku težinu u rasponu od 1-100 kDa i, u nekim realizacijama, od 10-40 kDa.

[0326] Azid-terminalni PEG derivat može imati strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)m-N3

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1.000 (tj. prosečna molekulska težina je između 5-40 kDa).

[0327] U drugoj realizaciji, azid-terminalni PEG derivat će imati strukturu:

RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10, a n je 100-1.000 (tj. prosečna molekulska težina je između 5-40 kDa).

[0328] IL-2 polipeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži alkin se može se modifikovati granastim PEG derivatom koji sadrži terminalni azidni deo, pri čemu svaki lanac razgranatog PEG ima MT u rasponu od 10-40 kDa i može biti od 5-20 kDa. Na primer, azid-terminalni PEG derivat može imati sledeću strukturu:

[RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)mX-(CH2)pN3

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10, n je 100-1.000, a X je opciono O, N, S ili karbonilna grupa (C=O), u svakom slučaju koja može biti prisutna ili odsutna.

Derivati PEG koji sadrže alkin

[0329] IL-2 polipeptid može biti modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži alkinski deo koji će reagovati sa azidnim delom molekula prisutnim na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline.

[0330] Alkin-terminalni PEG derivat može imati sledeću strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)mC≡CH

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1.000 (tj. prosečna molekulska težina je između 5-40 kDa).

[0331] IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži alkin može biti modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži terminalni azidni ili terminalni alkinski deo koji je vezan za kičmu PEG pomoću amidne veze.

[0332] Alkin-terminalni PEG derivat može imati sledeću strukturu:

RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)pC≡CH

u kojoj R je jednostavni alkil (metil , etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10 i n je 100-1.000.

[0333] IL-2 polipeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži azid može biti modifikovan granastim PEG derivatom koji sadrži terminalni alkinski deo, pri čemu svaki lanac granastog PEG ima MT u rasponu od 10-40 kDa i može biti od 5-20 kDa. Na primer, alkin-terminalni PEG derivat može imati sledeću strukturu:

[RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)mX-(CH2)pC≡CH

u kojoj R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10, a n je 100-1.000, a X je opciono O, N, S ili karbonil grupa (C=O ), ili nije prisutno.

Derivati PEG-a koji sadrže fosfin

[0334] IL-2 polipeptid može biti modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži aktiviranu funkcionalnu grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, estar, karbonat) koja dalje sadrži aril fosfin grupu koja će reagovati sa azidnim delom prisutnim na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline. Generalno, derivati PEG će imati prosečnu molekulsku težinu u rasponu od 1-100 kDa i, u nekim realizacijama, od 10-40 kDa.

[0335] Derivat PEG može imati strukturu:

u kojoj n je 1-10; X može biti O, N, S ili nije prisutno, Ph je fenil, a W je vodorastvorni polimer.

[0336] Derivat PEG može imati strukturu:

u kojoj X može biti O, N, S ili nije prisutno, Ph je fenil, W je polimer rastvoran u vodi, a R može biti H, alkil, aril, supstituisana alkil i supstituisana aril grupa. Primeri R grupa uključuju, ali nisu ograničeni na -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -halogen, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN i -NO2. R', R", R- i R″″ se svaki nezavisno odnosi na vodonik, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, uključujući ali ne ograničavajući se na, aril supstituisan sa 1-3 halogena, supstituisane ili nesupstituisane alkil, alkoksi ili tioalkoksi grupe, ili arilalkil grupe. Kada jedinjenje iz pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa je nezavisno odabrana kao i svaka R', R", R- i R″" grupa kada je prisutno više od jedne od ovih grupa. Kada su R' i R" vezani za isti atom azota, oni se mogu kombinovati sa atomom azota tako da formiraju 5-, 6- ili 7-člani prsten. Na primer, -NR'R" podrazumeva, ali ne ograničavajući se na, 1-pirolidinil i 4-morfolinil. Iz gornje diskusije o supstituentima, stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da izraz "alkil" podrazumeva grupe koje uključuju atome ugljenika vezane za grupe koje nisu vodonikove grupe, kao što su haloalkil (uključujući, ali ne ograničavajući se na, -CF3i -CH2CF3) i acil (uključujući, ali ne ograničavajući se na, - C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, i slično).

Ostali PEG Derivati i Opšte Tehnike PEGilacije

[0337] Ostali primeri PEG molekula koji mogu biti vezani za IL-2 polipeptide, kao i metode PEGilacije uključuju, ali nisu ograničene na, one opisane u, npr., U.S. Patent Publication No. 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; U.S. Patent No. 6,646,110; 5,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6,461,603; 6,436,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461; 5,739,208; 5,672,662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247/18247/WO09/200511924 , WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32139, WO 99/32139, WO 99/32139, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921131, WO 98/05363, WO 19/96, EP 6/9607670, EP 605963, EP 510356, EP 400 472, EP 183503 i EP 154316. Bilo koji od ovde opisanih PEG molekula se može koristiti u bilo kojem obliku, uključujući, ali ne ograničavajući se na, jedan lanac, granasti lanac, višekraki lanac, jednofunkcionalni, bi-funkcionalni, multifunkcionalni ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0338] Dodatni polimeri i PEG derivati uključujući, ali ne ograničavajući se na, hidroksilamin (aminooksi) PEG derivate, su opisani u sledećim patentnim prijavama: U.S. Patent Publication No.

2006/0194256, U.S. Patent Publication No. 2006/0217532, U.S. Patent Publication No. 2006/0217289, U.S. Provisional Patent No. 60/755,338; U.S. Provisional Patent No. 60/755,711; U.S. Provisional Patent No. 60/755,018; International Patent Application No. PCT/US06/49397; WO 2006/069246; U.S. Provisional Patent No. 60/743,041; U.S. Provisional Patent No. 60/743,040; International Patent Application No. PCT/US06/47822; U.S. Provisional Patent No. 60/882,819; U.S. Provisional Patent No.

60/882,500; and U.S. Provisional Patent No.60/870,594.

X. Glikozilacija IL-2 Polipeptida

[0339] Pronalazak uključuje IL-2 polipeptide koji sadrže jednu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja nosi saharidne rezidue. Saharidne rezidue mogu biti prirodne (uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-acetilglukozamin) ili ne-prirodne (uključujući, ali ne ograničavajući se na, 3-fluorogalaktozu). Saharidi mogu biti povezani sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom bilo N- ili O-vezanom glikozidnom vezom (uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-acetilgalaktozu-L-serin) ili ne-prirodnom vezom (uključujući, ali ne ograničavajući se na, oksim ili odgovarajući C- ili S-vezani glikozid).

[0340] Saharidni (uključujući, ali ne ograničavajući se na, glikozil) delovi se mogu dodati IL-2 polipeptidima bilo in vivo ili in vitro. U nekim realizacijama ovog pronalaska, IL-2 polipeptid koji sadrži para-acetil-fenilalanin, ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži karbonil, se modifikuje saharidom derivatizovanim aminooksi grupom kako bi se stvorio odgovarajući glikozilovani polipeptid vezan preko oksimske veze. Kad je vezan za ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, saharid može dalje biti elaboriran tretmanom sa glikoziltransferazama i drugim enzimima kako bi se stvorio oligosaharid vezan za IL-2 polipeptid. Vidi, npr., H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc.125: 1702-1703 (2003).

[0341] U nekim realizacijama pronalaska, IL-2 polipeptid koji sadrži para-acetil-fenilalanin, ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži karbonil, se modifikuje direktno glikanom sa definisanom strukturom pripremljenim kao aminooksi derivat. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da se druge funkcionalnosti, uključujući azid, alkin, hidrazid, hidrazin i semikarbazid, mogu koristiti za vezivanje saharida sa neprirodno kodiranom aminokiselinom. IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodirane azidne ili alkinilne aminokiseline zatim može biti modifikovan, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Huisgenovu [3+2] cikloadicionu reakciju sa, ali ne ograničavajući se na, alkinil ili azid derivate, respektivno. Ova metoda omogućava modifikovanje proteina sa izuzetno visokom selektivnošću.

XI. IL-2 Dimeri i Multimeri

[0342] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kombinacije analoga IL-2 i IL-2 kao što su homodimeri, heterodimeri, homomultimeri ili heteromultimeri (tj. trimeri, tetrameri, itd.) u kojima IL-2, koji sadrži jednu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, je vezan za drugu svoju varijantu IL-2 ili bilo koji drugi polipeptid koji nije njegova IL-2 varijanta, bilo direktno za kičmu polipeptida ili preko linkera. Zbog svoje povećane molekulske težine u poređenju sa monomerima, IL-2 dimerni ili multimerni konjugati mogu pokazati nova ili poželjna, uključujući, ali ne ograničavajući se na različita farmakološka, farmakokinetička, farmakodinamička svojstva, modulisane terapeutske poluživote, ili modulisani poluživot u plazmi u odnosu na monomerni IL-2. U nekim realizacijama, IL-2 dimeri iz ovog pronalaska će modulisati transdukciju signala IL-2 receptora. U drugim realizacijama, IL-2 dimeri ili multimeri iz ovog pronalaska će delovati kao antagonist, agonist ili modulator IL-2 receptora.

[0343] Jedan ili više IL-2 molekula prisutnih u dimeru ili multimeru koji sadrži IL-2 može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu povezanu sa polimerom rastvorljivim u vodi. IL-2 polipeptidi mogu biti povezani direktno, uključujući ali ne ograničavajući se na, preko Asn-Lys amidne veze ili Cys-Cys disulfidne veze. IL-2 polipeptidi, i/ili vezani ne-IL-2 molekuli, mogu sadržati različite ne-prirodno kodirane aminokiseline kako bi se olakšala dimerizacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alkin u jednoj ne-prirodno kodiranoj aminokiselini prvog IL-2 polipeptida i azid u drugoj ne-prirodno kodiranoj aminokiselini drugog molekula će biti konjugovani preko Huisgen [3+2] cikloadicije. Alternativno, IL-2 i/ili vezani ne-IL-2 molekul koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži keton može biti konjugovan sa drugim polipeptidom koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži hidroksilamin, a ovi polipeptidi reaguju stvaranjem odgovarajućeg oksima.

[0344] Alternativno, dva IL-2 polipeptida, i/ili vezani ne-IL-2 molekul, su vezani preko linkera. Bilo koji hetero ili homo-bifunkcionalni linker se može koristiti za vezivanje dva molekula, i/ili vezanih ne-IL-2 molekula, koji mogu imati istu ili različitu primarnu sekvencu. U nekim slučajevima, linker koji se koristi za vezivanje IL-2 i/ili vezivanje ne-IL-2 molekula zajedno može biti bifunkcionalni PEG reagens. Linker može imati širok raspon molekulske težine ili molekularne dužine. Linkeri veće ili manje molekulske težine se mogu koristiti da obezbede željeni prostorni odnos ili konformaciju između IL-2 i vezanog entiteta ili između IL-2 i njegovog receptora, ili između vezanog entiteta i njegovog vezujućeg partnera, ako ga ima. Linkeri koji imaju dužu ili kraću molekulsku dužinu se takođe mogu koristiti da obezbede željeni prostor ili fleksibilnost između IL-2 i vezanog entiteta, ili između vezanog entiteta i njegovog vezujućeg partnera, ako ga ima.

[0345] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje bifunkcionalne linkere rastvorne u vodi koji imaju strukturu tegova koja uključuje: a) azid, alkin, hidrazin, hidrazid, hidroksilamin ili deo koji sadrži karbonil najmanje na prvom kraju kičme polimera; i b) najmanje drugu funkcionalnu grupu na drugom kraju kičme polimera. Druga funkcionalna grupa može biti ista kao prva funkcionalna grupa ili drugačija. Druga funkcionalna grupa, u nekim realizacijama, nije reaktivna sa prvom funkcionalnom grupom. Pronalazak obezbeđuje, u nekim realizacijama, jedinjenja rastvorna u vodi koja sadrže najmanje jedan krak razgranate molekulske strukture. Na primer, razgranata molekulska struktura može biti dendritična.

[0346] Multimeri mogu sadržati jedan ili više IL-2 polipeptida, pri čemu se multimeri formiraju reakcijama sa aktiviranim polimerima rastvornim u vodi koji imaju strukturu:

R-(CH2CH2O)nO-(CH2)mX

u kojoj n je od oko 5 do 3,000, m je 2-10, X može biti azid, alkin, hidrazin, hidrazid, aminooksi grupa, hidroksilamin, acetil ili deo koji sadrži karbonil, a R je kapa, funkcionalna grupa, ili odlazeća grupa koja može biti ista ili različita kao X. R može biti, na primer, funkcionalna grupa odabrana iz grupe koju čine hidroksil, zaštićeni hidroksil, alkoksil, N-hidroksisukcinimidil estar, 1-benzotriazolil estar, N-hidroksisukcinimidil karbonat, 1-benzotriazolil karbonat, acetal, aldehid, aldehid hidrati, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, aktivni sulfon, amin, aminooksi, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilna kiselina, zaštićena karboksilna kiselina, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, glioksali, dioni, mezilati, tozilati i trezilat, alken i keton.

XII. Merenje Aktivnosti IL-2 Polipeptida i Afiniteta IL-2 Polipeptida za IL-2 Receptor

[0347] Aktivnost IL-2 polipeptida se može odrediti korišćenjem standardnih ili poznatih in vitro ili in vivo testova. PEG-IL-2 se može analizirati za biološku aktivnost odgovarajućim metodama poznatim u struci. Takvi testovi uključuju, ali nisu ograničeni na, aktivaciju gena koji reaguju na IL-2, testove vezivanja receptora, testove antivirusne aktivnosti, testove inhibicije citopatskog efekta, antiproliferativne testove, imunomodulatorne testove i testove koji prate indukciju MHC molekula.

[0348] PEG-IL-2 polipeptidi se mogu analizirati za njihovu sposobnost da aktiviraju puteve transdukcije signala osetljive na IL-2. Jedan primer je test elementa stimulisanog interferonom (ISRE). Ćelije koje konstitutivno eksprimiraju IL-2 receptor su tranzijentno transfektovane sa vektorom ISRE-luciferaze (pISRE-luc, Clontech). Nakon transfekcije, ć elije su tretirane IL-2 polipeptidom. Brojne koncentracije proteina, na primer od 0.0001-10 ng/mL, se testiraju da bi se napravila kriva doza-odgovor. Ako se IL-2 polipeptid veže i aktivira IL-2 receptor, rezultujuća kaskada transdukcije signala indukuje ekspresiju luciferaze. Luminescencija se može meriti na više načina, na primer korišćenjem TopCount™ ili Fusion™ čitača mikroploča i Steady-GloR Luciferase Assay System (Promega).

[0349] IL-2 polipeptidi se mogu analizirati za njihovu sposobnost da se vežu za IL-2 receptor. Za ne-PEGilovani ili PEGilovani IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodnu aminokiselinu, afinitet IL-2 za njegov receptor se može izmeriti korišćenjem BIAcore™ biosensor (Pharmacia). Pogodni testovi vezivanja uključuju, ali nisu ograničeni na, BIAcore testove (Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)) i AlphaScreen™ testove (PerkinElmer).

[0350] Bez obzira na to koje metode se koriste za stvaranje IL-2 polipeptida, IL-2 polipeptidi su podložni testovima za biološku aktivnost. Generalno, test za biološku aktivnost treba da pruži analizu za željeni rezultat, kao što je povećanje ili smanjenje biološke aktivnosti (u poređenju sa modifikovanim IL-2), različita biološka aktivnost (u poređenju sa modifikovanim IL-2), receptora ili analiza afiniteta vezivanja partnera, konformacione ili strukturne promene samog IL-2 ili njegovog receptora (u poređenju sa modifikovanim IL-2), ili analiza poluživota u serumu.

XIII. Merenje Potentnosti, Funkcionalnog In Vivo Poluživota i Farmakokinetičkih Parametara

[0351] Produženi biološki poluživot se može dobiti konstrukcijom IL-2 polipeptida sa ili bez konjugacije polipeptida sa vodorastvornim polimernim delom molekula. Brzo smanjenje koncentracije IL-2 polipeptida u serumu nakon primene je učinilo važnom procenu bioloških odgovora na lečenje konjugovanim i nekonjugovanim IL-2 polipeptidom i njegovim varijantama. Konjugovani i nekonjugovani IL-2 polipeptid i njegove varijante mogu imati produženi poluživot u serumu i nakon administracije, npr. subkutanom ili iv administracijom, što omogućava merenje npr. ELISA metodom ili primarnim skrining testom. Mogu se koristiti ELISA ili RIA kompleti iz komercijalnih izvora kao što je Invitrogen (Carlsbad, CA). Merenje in vivo biološkog poluživota se izvodi kako je ovde opisano.

[0352] Potentnost i funkcionalni in vivo poluživot polipeptida IL-2 koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu se mogu odrediti prema protokolima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0353] Farmakokinetički parametri za IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu se mogu proceniti kod normalnih mužjaka Sprague-Dawley pacova (N=5 životinja po tretmanskoj grupi). Životinje će primiti ili jednu dozu od 25 ug/pacovu iv ili 50 ug/pacovu sc, i približno 5-7 uzoraka krvi će biti uzeto prema unapred definisanom vremenskom rasporedu, koji generalno pokriva oko 6 sati za IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja nije konjugovana sa vodorastvornim polimerom i oko 4 dana za IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu konjugovanu sa vodo-rastvornim polimerom. Farmakokinetički podaci za IL-2 bez ne-prirodno kodirane aminokiseline se mogu direktno uporediti sa podacima dobijenim za IL-2 polipeptide koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.

XIV. Administracija i Farmaceutske Kompozicije

[0354] Polipeptidi ili proteini (uključujući, ali ne ograničavajući se na, IL-2, sintetaze, proteine koji sadrže jednu ili više ne-prirodnih aminokiselina, itd.) se opciono koriste za terapeutske svrhe, uključujući, ali ne ograničavajući se na kombinacije sa odgovarajućim farmaceutskim nosačem. Takve kompozicije, na primer, sadrže terapeutski efikasnu količinu jedinjenja, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. Takav nosač ili ekscipijens uključuje, ali nije ograničen na, fiziološki rastvor, puferovani fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i/ili njihove kombinacije. Formulacija se pravi tako da odgovara načinu administracije. Generalno, metode administriranja proteina su poznate stručnjacima u ovoj oblasti i mogu se primeniti na administriranje polipeptida iz pronalaska. Kompozicije mogu biti u vodorastvornom obliku, kao što je prisustvo u obliku farmaceutski prihvatljivih soli, što treba da uključuje i kisele i bazne adicione soli.

[0355] Terapeutske kompozicije koje sadrže jedan ili više polipeptida iz ovog pronalaska su opciono testirane u jednom ili više odgovarajućih in vitro i/ili in vivo životinjskih modela bolesti, da bi se potvrdila efikasnost, tkivni metabolizam i procenile doze, prema metodama poznatim prosečnim stručnjacima. Konkretno, doze se mogu inicijalno odrediti prema aktivnosti, stabilnorti ili drugim odgovarajućim merama ovde opisanih ne-prirodnih sa homolozima prirodnih aminokiselina (uključujući, ali ne ograničavajući se na, poređenje IL-2 polipeptida modifikovanog tako da uključuje jednu ili više neprirodnih aminokiselina sa IL-2 polipeptidom sa prirodnim aminokiselinama i poređenje IL-2 polipeptida modifikovanog tako da uključuje jednu ili više ne-prirodnih aminokiselina sa trenutno dostupnim IL-2 tretmanom), tj. u relevantnom testu.

[0356] Administracija se vrši na bilo koji od načina koji se normalno koriste za uvođenje molekula u direktan kontakt sa krvlju ili ćelijama tkiva. Polipeptidi ne-prirodnih aminokiselina iz ovog pronalaska se administriraju na bilo koji pogodan način, opciono sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Dostupne su pogodne metode administriranja takvih polipeptida pacijentu u kontekstu ovog pronalaska, i, iako se za administraciju određene kompozicije može koristiti više od jednog načina, jedan određeni način često može pružiti neposrednije i delotvornije delovanje ili reakciju nego neki drugi način.

[0357] Farmaceutski prihvatljivi nosači se delom određuju posebnom kompozicijom koja se administrira, kao i posebnom metodom koja se koristi za administraciju kompozicije. Shodno tome, postoji širok izbor pogodnih formulacija farmaceutskih kompozicija iz ovog pronalaska.

[0358] IL-2 polipeptidi iz pronalaska se mogu administrirati bilo kojim konvencionalnim putem pogodnim za proteine ili peptide, uključujući, ali ne ograničavajući se na parenteralno, npr. injekcije uključujući, ali ne ograničavajući se na, subkutano ili intravenozno ili bilo koji drugi oblik injekcija ili infuzija. Polipeptidne kompozicije se mogu administrirati na više načina, uključujući, ali ne ograničavajući se na oralna, intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, transdermalna, subkutana, lokalna, sublingvalna ili rektalna sredstva. Kompozicije koje sadrže polipeptide ne-prirodnih aminokiselina, modifikovane ili nemodifikovane, takođe se mogu administrirati putem lipozoma. Takvi putevi administracije i odgovarajuće formulacije generalno su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. IL-2 polipeptid se može koristiti sam ili u kombinaciji sa drugim pogodnim komponentama kao što je farmaceutski nosač. IL-2 polipeptid se može koristiti u kombinaciji sa drugim agensima ili terapeuticima.

[0359] IL-2 polipeptid koji sadrži ne-prirodnu aminokiselinu, sam ili u kombinaciji sa drugim prikladnim komponentama, se takođe može napraviti i u obliku aerosolnih formulacija (tj. može biti "nebulizovan") koje se administriraju inhalacijom. Aerosol formulacije se mogu staviti u prihvatljive potisne gasove pod pritiskom, kao što su dihlorodifluorometan, propan, azot i slično.

[0360] Formulacije pogodne za parenteralnu administraciju, kao što je, na primer, intraartikularnim (u zglobove), intravenskim, intramuskularnim, intradermalnim, intraperitonealnim i subkutanim putevima, uključuju vodene i nevodene, izotonične sterilne rastvore za injekcije, koje mogu sadržati antioksidanse, pufere, bakteriostate i rastvorene materije koje formulaciju čine izotoničnom sa krvlju nameravanog primaoca, kao i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu uključivati agense za suspendovanje, solubilizatore, ugušćivače, stabilizatore i konzervanse. Formulacije IL-2 mogu biti predstavljene u jediničnim ili višedoznim zatvorenim kontejnerima, kao što su ampule i viali.

[0361] Parenteralna administracija i intravenska administracija su poželjne metode administracije. Konkretno, putevi administracije koji se već koriste za prirodne homologne aminokiselinske terapeutike (uključujući, ali ne ograničavajući se na, one koji se obično koriste za EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, npr. IL-2, interleukine, antitela, FGF i/ili bilo koji drugi farmaceutski isporučeni protein), zajedno sa formulacijama u trenutnoj upotrebi, obezbeđuju poželjne puteve administriranja i formulacije za polipeptide iz ovog pronalaska.

[0362] Doza koja se administrira pacijentu, u kontekstu ovog pronalaska, dovoljna je da se dobije blagotvoran terapijski odgovor kod pacijenta tokom vremena, ili druga odgovarajuća aktivnost, zavisno od primene. Doza se određuje prema delotvornosti određenog vektora, ili formulacije, i aktivnosti, stabilnost ili poluživota upotrebljenog polipeptida ne-prirodne aminokiseline u serumu i stanja pacijenta, kao i telesne težine ili površine pacijenta koji se leči. Veličina doze je takođe određena postojanjem, prirodom i opsegom bilo kakvih štetnih nuspojava koje prate primenu određenog vektora, formulacije ili sličnog kod određenog pacijenta.

[0363] U određivanju efikasne količine vektora ili formulacije koja će se administrirati u lečenju ili profilaksi bolesti (uključujući, ali ne ograničavajući se na, neutropeniju, aplastičnu anemiju, cikličnu neutropeniju, idiopatsku neutropeniju, Chdiak-Higashi sindrom, sistemski eritematozni lupus (SLE), leukemiju, mijelodisplastični sindrom i mijelofibrozu, ili slično), lekar procenjuje cirkulišuće nivoe u plazmi, toksičnost formulacije, progresiju bolesti i/ili, kada je relevantno, proizvodnju anti-neprirodnih aminokiselinskih polipeptidnih antitela.

[0364] Doza koja se administrira, na primer, pacijentu od 70 kilograma, obično je u rasponu koji je ekvivalentan dozama trenutno korišćenih terapijskih proteina, prilagođenih promenjenoj aktivnosti ili poluživotu u serumu relevantne kompozicije. Vektori ili farmaceutske formulacije iz ovog pronalaska mogu dopuniti uslove lečenja pomoću bilo koje poznate konvencionalne terapije, uključujući administraciju antitela, administraciju vakcine, administraciju citotoksičnih agenasa, polipeptida prirodnih aminokiselina, nukleinskih kiselina, analoga nukleotida, modifikatora biološkog odgovora i slično.

[0365] Za administraciju, formulacije iz ovog pronalaska se administriraju brzinom određenom pomoću LD-50 ili ED-50 relevantne formulacije, i/ili posmatranjem bilo kojih nuspojava polipeptida ne-prirodnih aminokiselina u različitim koncentracijama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, težinu i ukupno zdravlje pacijenta. Administracija se može izvesti u jednoj ili u podeljenim dozama.

[0366] Ako pacijent koji je podvrgnut infuziji formulacije razvije groznicu, drhtavicu ili bolove u mišićima, on/ona prima odgovarajuću dozu aspirina, ibuprofena, acetaminofena ili drugog leka za kontrolu bola/groznice. Pacijenti koji iskuse reakcije na infuziju kao što su groznica, bolovi u mišićima i drhtavica se 30 minuta pre budućih infuzija tretiraju ili aspirinom, acetaminofenom ili, uključujući, ali ne ograničavajući se na, difenhidraminom. Meperidin se koristi za jače drhtavice i bolove u mišićima koji ne reaguju brzo na antipiretike i antihistaminike. Ćelijska infuzija se usporava ili prekida u zavisnosti od težine reakcije.

[0367] Ljudski IL-2 polipeptidi iz pronalaska se mogu administrirati direktno subjektu sisaru. Administracija se vrši bilo kojim od puteva koji se obično koriste za uvođenje IL-2 polipeptida u subjekta. Kompozicije IL-2 polipeptida prema realizaciji ovog pronalaska uključuju one pogodne za oralnu, rektalnu, topikalnu inhalaciju (uključujući, ali ne ograničavajući se na aerosol), bukalnu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, sublingvalnu), vaginalnu, parenteralnu (uključujući, ali ne ograničavajući se na, subkutanu, intramuskularnu, intradermalnu, intraartikularnu, intrapleuralnu, intraperitonealnu, inracerebralnu, intraarterijsku ili intravenoznu), lokalnu (tj. preko kože i sluzokože, uključujući površine disajnih puteva), pulmonalnu, intraokularnu, intranazalnu i transdermalnu administraciju, iako će najprikladniji put u svakom datom slučaju zavisiti od prirode i ozbiljnosti stanja koje se leči. Administracija može biti lokalna ili sistemska. Formulacije jedinjenja mogu biti predstavljene u jednodoznim ili višedoznim zatvorenim kontejnerima, kao što su ampule i viali. IL-2 polipeptidi iz pronalaska mogu biti pripremljeni u smeši u jediničnoj dozi u obliku injekcije (uključujući, ali ne ograničavajući se na, rastvor, suspenziju ili emulziju) sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska mogu biti administrirani i kontinuiranom infuzijom (koristeći, ali ne ograničavajući se na, minipumpe kao što su osmotske pumpe), pojedinačni bolus ili sporo oslobađajuće depo formulacije.

[0368] Formulacije pogodne za primenu uključuju vodene i nevodene rastvore, izotonične sterilne rastvore, koji mogu sadržati antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvorene materije koje čine formulaciju izotoničnom, kao i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu uključivati sredstva za suspendovanje, solubilizatore, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse. Rastvori i suspenzije mogu biti pripremljeni od sterilnih prahova, granula i tableta prethodno opisane vrste.

[0369] Sušenje zamrzavanjem je uobičajena tehnika za prezentovanje proteina koja služi za uklanjanje vode iz proteinskog preparata od interesa. Sušenje zamrzavanjem ili liofilizacija je proces kojim se materijal koji se suši prvo zamrzava, a zatim se led ili smrznuti rastvarač uklanja sublimacijom u vakuumskom okruženju. Ekscipijens može biti uključen u pre-liofilizirane formulacije kako bi se poboljšala stabilnost tokom procesa sušenja zamrzavanjem i/ili poboljšala stabilnost liofilizovanog proizvoda nakon skladištenja. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) i Arakawa et al. Pharm. Res.

8(3):285-291 (1991).

[0370] Sušenje farmaceutskih proizvoda raspršivanjem je takođe poznato stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, vidi Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals", u Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992). Osim lekova malih molekula, sušeni su i različiti biološki materijali, a to su: enzimi, serumi, plazma, mikroorganizmi i kvasci. Sušenje raspršivanjem je korisna tehnika jer može pretvoriti tečni farmaceutski preparat u fini prah bez prašine ili aglomerat u procesu od jednog koraka. Osnovna tehnika se sastoji od sledeća četiri koraka: a) atomizacija napojnog rastvora u sprej; b) kontakt sprej-vazduh; c) sušenje spreja; i d) odvajanje osušenog proizvoda od vazduha za sušenje. U.S. Patent Nos 6,235,710 i 6,001,800 opisuju pripremu rekombinantnog eritropoetina pomoću sušenja raspršivanjem.

[0371] Farmaceutske kompozicije i formulacije iz pronalaska mogu sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili stabilizator. Farmaceutski prihvatljivi nosači su delimično određeni konkretnom kompozicijom koja se administrira, kao i konkretnom metodom koja se koristi za administraciju kompozicije. Prema tome, postoji širok izbor pogodnih formulacija farmaceutskih kompozicija (uključujući opcione farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore) iz ovog pronalaska (videti, npr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. izdanje 1985.)).

[0372] Pogodni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, pufere koji sadrže sukcinat, fosfat, borat, HEPES, citrat, histidin, imidazol, acetat, bikarbonat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući, ali ne ograničavajući se na, askorbinsku kiselinu; polipeptide male molekulske težine uključujući, ali ne ograničavajući se na one manje od oko 10 rezidua; proteine, uključujući, ali ne ograničavajući se na, serumski albumin, želatin ili imunoglobuline; hidrofilne polimere uključujući ali ne ograničavajući se na polivinilpirolidon; aminokiseline uključujući ali ne ograničavajući se na, glicin, glutamin, asparagin, arginin, histidin ili derivate histidina, metionin, glutamat ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući, ali ne ograničavajući se na, trehalozu, saharozu, glukozu, manozu ili dekstrine; sredstva za keliranje uključujući, ali ne ograničavajući se na, EDTA i dinatrijum edentat; jone dvovalentnih metala uključujući, ali ne ograničavajući se na, cink, kobalt ili bakar; šećerne alkohole uključujući ali ne ograničavajući se na manitol ili sorbitol; kontrajone koji grade soli uključujući, ali ne ograničavajući se na, natrijum i natrijum hlorid; punila kao što su mikrokristalna celuloza, laktoza, kukuruzni i drugi skrobovi; vezivna sredstva; zaslađivače i druge arome; sredstva za bojenje; i/ili nejonogene površinski aktivne materije uključujući, ali ne ograničavajući se na Tween™ (uključujući, ali ne ograničavajući se na, Tween 80 (polisorbat 80) i Tween 20 (polisorbat 20), Pluronics™ i druge pluronske kiseline, uključujući ali ne ograničavajući se na pluronsku kiselinu F68 (poloksamer 188), ili PEG. Pogodni surfaktanti uključuju, na primer, ali nisu ograničeni na polietere na bazi poli(etilen oksida)-poli(propilen oksida)-poli(etilen oksida), tj. (PEO-PPO-PEO) ili polipropilen oksid)-poli(etilen oksid)-poli(propilen oksid), tj. (PPO-PEO-PPO), ili njihovu kombinaciju. PEO-PPO-PEO i PPO-PEO-PPO su komercijalno dostupni pod trgovačkim nazivima Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ i R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) i dalje su opisani u U.S. Pat. No. 4,820,352. Drugi etilen/polipropilen blok polimeri mogu biti pogodni surfaktanti. Surfaktant ili kombinacija surfaktanata se može koristiti za stabilizaciju Pegilovanog IL-2 protiv jednog ili više stresova uključujući ali ne ograničavajući se na stres koji je rezultat agitacije. Neki od gore navedenih se mogu nazvati "agensi za povećanje zapremine". Neki se takođe mogu nazvati "modifikatorima toničnosti". Antimikrobni konzervansi se takođe mogu primeniti za stabilnost proizvoda i antimikrobnu efikasnost; prikladni konzervansi uključuju, ali nisu ograničeni na, benzil alkohol, benzalkonijum hlorid, metakrezol, metil/propil paraben, krezol i fenol, ili njihovu kombinaciju. U.S. Patent No. 7,144,574 opisuje dodatne materijale koji mogu biti prikladni u farmaceutskim kompozicijama i formulacijama iz pronalaska i drugim preparatima koji se isporučuju.

[0373] IL-2 polipeptidi iz pronalaska, se takođe mogu administrirati pomoću ili kao deo sistema sa produženim oslobađanjem. Kompozicije sa produženim oslobađanjem uključuju, ali ne ograničavajući se na, polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, filmove ili mikrokapsule. Matrice sa produženim oslobađanjem uključuju biokompatibilne materijale kao što je poli(2-hidroksietil metakrilat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina (EP 133,988), polilaktidi (polilaktična kiselina) (U.S. Patent No. 3,773,919; EP 58,481), poliglikolid (polimer glikolne kiseline), polilaktikoglikolid (kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline) polianhidride, kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamata (Sidman et al., Biopolimeri, 556, 227, (1983), poli(orto)estre, polipeptide, hijaluronsku kiselinu, kolagen, hondroitin sulfat, karboksilnu kiselinu, masne kiseline, fosfolipide, polisaharide, nukleinske kiseline, poliamino kiseline, aminokiseline kao što su fenilalanin, tirozin, izoleucin, polinukleotidi, polivinil propilen, polivinilpirolidon i silikon. Kompozicije sa produženim oslobađanjem takođe uključuju lipozomski zatvoreno jedinjenje. Lipozomi koji sadrže jedinjenje se pripremaju metodama poznatim per se: DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; U.S. Patent No. 4,619,794; EP 143,949; U.S. Patent No. 5,021,234; Japanese Pat. Appln. 83-118008; U.S. Pat. br. 4,485,045 i 4,544,545; i EP 102,324.

[0374] Lipozomski zatvoreni IL-2 polipeptidi mogu biti pripremljeni metodama opisanim u, npr., DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; U.S. Patent No. 4,619,794; EP 143,949; U.S. Patent No. 5,021,234; Japanese Pat. Appln. 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 i 4,544,545; i EP 102,324. Sastav i veličina lipozoma su dobro poznati ili se mogu lako empirijski odrediti od strane prosečnog stručnjaka. Neki primeri lipozoma su kako je opisano u, npr. Park JW, et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasić D i Papahadjopoulos D (ur.): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res.63: 3154-3161 (2003).

[0375] Doza koja se pacijentu administrira u kontekstu ovog pronalaska bi trebalo da bude dovoljna da izazove povoljan odgovor kod subjekta tokom vremena. Generalno, ukupna farmaceutski efikasna količina IL-2 polipeptida iz ovog pronalaska administriranog parenteralno po dozi je u rasponu od oko 0.01 µg/kg/dan do oko 100 µg/kg, ili oko 0.5 mg/kg do oko 1 mg/kg telesne težine pacijenta, iako je to predmet diskrecije terapeuta. U specifičnim aspektima ove realizacije, konjugat se može administrirati u dozi u rasponu od više od 4 µg/kg dnevno do oko 20 µg/kg dnevno. U nekim drugim aspektima, konjugat se može administrirati u dozi u rasponu od 4 µg/kg dnevno do oko 9 µg/kg dnevno. U nekim drugim aspektima, konjugat se može administrirati u dozi u rasponu od oko 4 µg/kg dnevno do oko 12.5 µg/kg dnevno. U specifičnom aspektu, konjugat se može administrirati pri ili ispod doze koja je maksimalna tolerisana doza bez nepotrebne toksičnosti. Zatim, konjugat se može administrirati najmanje dva puta nedeljno ili se konjugat može administrirati najmanje tri puta nedeljno, najmanje četiri puta nedeljno, najmanje pet puta nedeljno, najmanje šest puta nedeljno ili sedam puta nedeljno. U specifičnom aspektu, kada se konjugat administrira više puta, konjugat se može administrirati u dozi većoj od 4 µg/kg dnevno svaki put. Konkretno, konjugat se može administrirati u periodu od dve nedelje ili duže. U određenim aspektima, rast ć elija koje eksprimiraju interleukin-2 receptor se može inhibirati za najmanje 50%, najmanje 65%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95 % ili za najmanje 99% u poređenju sa referentnim uzorkom, tj. uzorkom ćelija koje nisu bile u kontaktu sa konjugatom iz pronalaska. U specifičnom aspektu ove realizacije, konjugat se može administrirati u dozi od oko 5.3 µg/kg dnevno, ili u dozi od oko 7.1 µg/kg dnevno, ili u dozi od oko 9.4 µg/kg dnevno ili u dozi od oko 12.5 µg/kg dnevno. Učestalost administriranja je takođe podložna diskreciji terapeuta i može biti češća ili ređa nego kod komercijalno dostupnih IL-2 polipeptidnih proizvoda odobrenih za upotrebu kod ljudi. Generalno, IL-2 polipeptid, PEGilovani IL-2 polipeptid, konjugovani IL-2 polipeptid, ili PEGilovani konjugovani IL-2 polipeptid iz pronalaska se može primeniti bilo kojim od gore opisanih puteva administracije.

XV. Terapeutske Upotrebe IL-2 Polipeptida iz Pronalaska

[0376] IL-2 polipeptidi su korisni za lečenje širokog spektra poremećaja. Pronalazak takođe uključuje IL-2 polipeptide za upotrebu u metodi lečenja sisara koji je izložen riziku, ima i/ili je imao rak koji reaguje na IL-2, CD8+ stimulaciju T-ćelija i/ili IL-2 formulacije. Administracija IL-2 polipeptida može rezultirati kratkoročnim efektom, tj. trenutni povoljan uticaj na nekoliko kliničkih parametara, što može biti uočeno 12 ili 24 sata od administracije, a sa druge strane, takođe može rezultirati dugotrajnim delovanjem, blagotvornim usporavanjem progresije rasta tumora, smanjenjem veličine tumora i/ili povećanim nivoima cirkulišućih CD8+ T ćelija i IL-2 polipeptidi iz ovog pronalaska mogu biti administrirani na bilo koji način poznat stručnjacima, i mogu se korisno administrirati putem infuzije, npr. arterijskom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom i/ili infuzijom u dozi koja je dovoljna za postizanje željenog farmakološkog efekta.

[0377] Doza IL-2 polipeptida može biti u rasponu od 10-200 mg, ili 40-80 mg IL-2 polipeptida po kg telesne težine po tretmanu. Na primer, doza IL-2 polipeptida koja se administrira može biti oko 20-100 mg IL-2 polipeptida po kg telesne težine koja se administrira kao bolus injekcija i/ili kao infuzija u klinički potrebnom vremenskom periodu, npr. period u rasponu od nekoliko minuta do nekoliko sati, npr. do 24 sata. Ako je potrebno, administracija IL-2 polipeptida se može ponoviti jednom ili nekoliko puta. Administracija IL-2 polipeptida se može kombinovati sa administracijom drugih farmaceutskih agenasa kao što su hemoterapeutski agensi. Zatim, ovaj pronalazak se odnosi na IL-2 polipeptide iz pronalaska za upotrebu u postupku za profilaksu i/ili lečenje raka koji se sastoji od administracije subjektu kome je to potrebno efikasne količine IL-2 polipeptida.

[0378] Prosečne količine IL-2 mogu varirati i posebno treba da se zasnivaju na preporukama i receptu kvalifikovanog lekara. Tačna količina IL-2 je pitanje prioriteta zavisno od faktora kao š to su tačan tip stanja koje se leči, stanje pacijenta koji se leči, kao i drugi sastojci u kompoziciji. IL-2 polipeptidi iz pronalaska takođe obezbeđuju administriranje terapeutski efikasne količine drugog aktivnog sredstva. Količinu koju treba administrirati lako može odrediti prosečan stručnjak na osnovu terapije IL-2.

PRIMERI

[0379] Sledeći primeri su ponuđeni da ilustruju, ali ne i da ograniče pronalazak za koji se traži zaštita, a koji je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

Primer 1 - Određivanje pozicija rezidua u IL-2 koje će biti mutirane u Amber stop kodonu za inkorporiranje ne-prirodnih aminokiselina.

[0380] IL-2 se koristio u lečenju nekoliko karcinoma kao što su karcinom bubrežnih ćelija i metastatski melanom. Komercijalno dostupan IL-2 Aldesleukin® je rekombinantni protein koji nije glikozilovan i ima uklonjen alanin-1 i reziduu cisteina-125 zamenjenu serinom-125 (Whittington et al., Drugs, 46(3): pp: 446- 514 (1993)). Iako je IL-2 najraniji citokin koji je odobrila FDA u lečenju raka, pokazalo se da IL-2 pokazuje ozbiljne nuspojave kada se koristi u visokim dozama. To je uveliko ograničilo njegovu primenu na potencijalnim pacijentima. Osnovni mehanizam teških nuspojava se pripisuje vezivanju IL-2 za jedan od njegovih receptora, IL-2Rα. Generalno, IL-2 ne samo da može formirati heterotrimerni kompleks sa svojim receptorima uključujući IL-2Rα (ili CD25), IL-2Rβ (ili CD122) i IL-2Rγ (ili CD132) kada su sva tri receptora prisutna u tkivu, već takođe može formirati heterodimerni kompleks sa IL-2Rβ i IL-2Rγ. U kliničkim uslovima, kada se koristi visoka doza IL-2, IL-2 počinje da vezuje IL-2αβγ, koji je glavni oblik receptora u Tregćelijama. Supresivno delovanje Tregćelija izaziva neželjene efekte primene IL-2 u imunoterapiji raka. Da bi se ublažile nuspojave IL-2, ranije su korišćeni mnogi pristupi. Jedno od najvećih otkrića je Nektarov pronalazak koji koristi 6 PEGilovanih lizina za maskiranje regiona vezivanja IL2Rα na površini IL-2 (Charych et al., Clin Cancer Res, 22(3): str: 680-90 (2016)). PEGilovani IL-2 ne samo da ima produženi poluživot, već je pokazao i dramatično smanjene nuspojave. Međutim, rezultati studija aktivnosti su pokazali da je efikasan oblik PEGilovanog IL-2 u ovoj heterogenoj smeši 6-PEGilovanog IL-2 samo jedan PEGilovani oblik. Prema tome, potreban je efikasniji PEGilovani IL-2 sa homogenim proizvodom.

[0381] U trenutnoj aplikaciji, inkorporirane ne-prirodne aminokiseline obezbeđuju jedinstvena mesta konjugacije koja se koriste u IL-2 PEGilaciji. Rezultirajući PEGilovani IL-2 muteini imaju homogeniji proizvod, od prethodno heterogenog 6-PEGilovanog IL-2 iz Nektara.

[0382] Mesta koja ć e se koristiti u stvaranju IL-2 muteina mogu biti odabrana analizom postojeće kristalne strukture IL-2 i njegovih heterotrimernih receptora. Konkretno, detaljno je istražena struktura IL-2Rα i njegova veza sa IL-2 (Slika 1). Ova veza je podeljena na dva regiona koji se sastoje od hidrofobnog centra i polarizovanog regiona. Hidrofobni centar se formira između IL-2Rα rezidua Leu-2<α>, Met-25<α>, Leu-42<α>i Tyr-43<α>i IL-2 rezidua Phe-42<IL-2>, Phe-44<IL-2>, Tyr-45<IL-2>, Pro -65<IL-2>i Leu-72<IL-2>. Polarizovani region se formira između IL-2Rα i IL-2 pet jonskih parova uključujući Lys-38<α>/Glu-61<IL-2>, Arg-36<α>/Glu-62<IL-2>, Glu-1<α>/Lys-35<IL-2>, Asp-6<α>/Arg-38<IL-2>i Glu-29<α>/Lys-43<IL-2>. Osim toga, elektrostatičko mapiranje sugeriše da bi neke druge rezidue mogle igrati ulogu u posredovanju interakcije između IL-2Rα i IL-2. Ovi rezidue su Thr-37<IL-2>, Thre-41<IL-2>, Lys-64<IL-2>, Glu-68<IL-2>i Tyr-107<IL-2>. Prema tome, lokacije koje se mogu koristiti su Phe-42<IL-2>, Phe-44<IL-2>, Tyr-45<IL-2>, Pro-65<IL-2>, Leu-72<IL-2>, Glu-61<IL-2>, Glu-62<IL-2>, Lys-35<IL-2>, Arg-38<IL-2>, Lys-43<IL-2>, Thr-37<IL-2>, Thr-3<IL-2>, Lys-64<IL-2>, Glu-68<IL-2>i Tyr-107<IL-2>. Lista proteinskih sekvenci koje se koriste za proizvodnju muteina sa ne-prirodnom aminokiselinom je navedena u Tabeli 2 ispod:

Primer 2: Sistem ekspresije humanog IL-2

[0383] Ovaj odeljak opisuje metode ekspresije koje se koriste za IL-2 polipeptide koji sadrže ne-prirodnu amino kiselinu. Ćelije domaćini se transformišu konstruktima za ortogonalnu tRNK, ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu i polinukleotidom koji kodira IL-2 polipeptid kao u SEQ ID NOs: 4, 6 ili 8, ili polinukleotidom koji kodira aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO 1, 2, 3, 5, 7 i 9 do 23, koji sadrži selektorski kodon.

[0384] Konstrukcija ekspresionog vektora E.coli i verifikacija sekvence: Ovaj primer detaljno opisuje kloniranje i ekspresiju humanog IL-2 (hIL-2) uključujući ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u E. coli. Svi humani ekspresioni plazmidi IL-2 su konstruirani metodom kloniranja zasnovanom na rekombinaciji korišćenjem Gibson Assembly kit (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) ili korišćenjem QuikChange kompleta za mutagenezu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) u E. coli NEB5α klonirajućem soju (New England Biolabs, MA) kako je opisano u nastavku. Ekspresioni plazmid E. coli je prikazan na Slici 2.

[0385] Gibsonov sklop: Prajmeri za amplifikaciju različitih gena od interesa (GOI) koji sadrže donorske fragmente su imali oko 18-24 baznih parova (bp) preklapajućih sekvenci na svojim 5'-terminusima sa sekvencama akceptorskog vektora za homolognu rekombinaciju i sintetisani su u Integrated DNA Technologies (IDT) (San Diego, CA). PCR fragmenti su amplifikovani korišćenjem mešavine DNK polimeraza visoke tačnosti, Pfu Ultra II Hotstart PCR Master Mix (kat. br.: 600852, Agilent Technologies). PCR proizvodi su digestirani restrikcionim enzimom Dpn1 (NEB# R0176L) 2 sata na 37°C da bi se uklonio pozadinski signal plazmida nakon čega je usledilo prečišćavanje kolone pomoću Qiagen PCR kompleta za prečišćavanje kolone (Qiagen, Valencia, CA; # 28104) i kvantifikovanje pomoću Nanodrop (ThermoFisher, Carlsbad, CA). Acceptorski vektori su linearizovani digestijom sa jedinstvenim restrikcionim enzimima (NEB, MA) unutar vektora u trajanju od 3 do 5 sati na temperaturama koje preporučuje dobavljač, PCR kolona je prečišćena i kvantifikovana. Donorski inserti i odgovarajuće pripremljeni akceptorski vektori su pomešani u molarnom odnosu 3:1, inkubirani 15 minuta na 50°C, korišćenjem Gibson Assembly kompleta (NEB # E2611S), a zatim su korišćeni za transformaciju u E. coli NEB5α soju (NEB # 2987).

[0386] Rekombinanti su dobijeni postavljanjem Gibson Assembly mix na LB agar ploče koje sadrže odgovarajuće antibiotike. Sledećeg dana, 4 do 6 velova izolovanih pojedinačnih kolonija je inokulirano u medijum od 5 mL LB 50 µg/mL kanamicin sulfata (Sigma, St Louis, MO; kat. br. K0254) i gajeno preko noći na 37°C. Rekombinantni plazmidi su izolovani korišćenjem Qiagen plazmidnog DNA miniprep kit-a (Qiagen #27104) i verifikovani sekvenciranjem DNK (Eton Biosciences, San Diego, CA). Kompletan GOI region plus sekvence od 100 bp uzvodno i 100 bp nizvodno su verifikovane korišćenjem gen-specifičnih prajmera za sekvenciranje.

[0387] QuickChange Mutageneza (QCM): Sve Amber varijante koje sadrže TAG stop kodon su kreirane upotrebom QuickChange Lightning site directed mutagenesis kit-a (Agilent Technologies # 201519). Svi QCM oligonukleotidi su dizajnirani pomoću QuickChange Web Portala (Agilent Technologies) i naručeni kod IDT (San Diego, CA). QCM PCR mešavina je sadržala 5 µl 10x pufera, 2.5 µml dNTP Mix, 1 µl (100 ng) plazmidnog templejta, 1 µl oligo mešavine (koncentracije 10 uM svaki), 1 µl QuickChange Lightning enzima, 2.5 µl Quick solution i 37 µl destilovane vode (DW). DNK je amplifikovan korišćenjem PCR programa preporučenog kompletom za samo 18 ciklusa.

[0388] Nakon završetka PCR reakcije, smesa je digestirana sa DpnI enzimom koji je isporučen sa kompletom (Agilent Technologies) 2-3 sata na 37°C, i postavljena na gel da se proveri prisustvo amplifikovanog PCR proizvoda. Nakon toga, 2.5 do 5 µ l PCR proizvoda je transformisano u E.coli NEB5α soju. Rekombinantni plazmidi od 4 do 6 kolonija su zatim izolovani i verifikovana je sekvenca kako je gore opisano u odeljku Gibson Assembly.

[0389] Konstrukcija i verifikacija ekspresionog soja (AXID): Da bi se pripremili AXID proizvodni sojevi, hemijski kompetentne ćelije domaćina E. coli W3110B60 su transformisane plazmidnom DNK (50 ng) sa verifikovanom sekvencom, rekombinantne ćelije su odabrane na 2xYT+1% pločama sa glukoznim agarom koje sadrže 50 µg/mL kanamicin sulfata (Sigma, cat# K0254) i inkubirane preko noći na 37°C. Jedna kolonija sa sveže ploče za transformaciju je zatim razmnožena tri puta na pločama sa glukoznim agarom 2xYT+1% koje sadrže 50 µg/mL kanamicin sulfata sekvencijalnim trostrukim trakama i inkubacijom preko noći na 37°C. Na kraju, jedna kolonija sa ploče sa trećom trakom je inokulirana u 20 mL Super Broth (Fisher-Optigrow™, #BP1432-10B1) medijumu koji sadrži 50 µg/mL kanamicin sulfata (Sigma, cat# K0254) i inkubirana preko noći na 37°C i 250 o/min. Kultura gajena preko noći je zatim razblažena glicerolom do finalne koncentracije glicerola od 20% (w/v) (KIC, Ref# 67790-GL99UK). Ova ćelijska suspenzija je zatim podeljena u alikvote od 1 mL u nekoliko krioviala i zamrznuta na -80°C kao viali AXID proizvodnog soja.

[0390] Nakon generisanja glicerolskih viala AXID produkcionih sojeva kako je gore opisano, oni su dalje validovani DNK sekvenciranjem i fenotipskom karakterizacijom markera resistencije na antibiotike. Da bi se potvrdilo da vial AXID produkcionog soja ima ispravan plazmid u produkcionom domaćinu, plazmid je verifikovan sekvenciranjem. Dvadeset mL LB koji sadrži 50 µg/mL kanamicin sulfata je inokulirano ubodom iz glicerolskog viala sa AXID klonom i gajeno na 37°C, 250 o/min preko noći. DNK plazmida je izolovana korišćenjem Qiagen Miniprep Kit (#27104) i prisustvo intaktnog GOI ORF u izolovanom plazmidu je potvrđeno DNK sekvenciranjem (Eton Biosciences, CA).

[0391] Da bi se dalje potvrdio genotip soja AXID produkcionih sojeva, ćelije iz istog viala su iscrtane na četiri odvojene LB ploče: LB koja sadrži 50 ug/mL Kanamycin sulfata, LB koji sadrži 15 ug/mL tetraciklina, LB koji sadrži 34 ug/mL hloramfenikola i LB koji sadrži 75 ug/mL trimetoprima. Zatim je proveren pozitivan rast na svim ovim pločama, kako je očekivano sa genotipom soja W3110B60 produkcionog soja domaćina.

[0392] Ekspresioni sistem: DNK sekvence optimizovane za aminokiseline i E. coli-kodon koje kodiraju hIL-2 su prikazane u Tabelama 1 i 2. Uvedeni translacioni sistem koji se sastoji od ortogonalne tRNK (O-tRNK) i ortogonalne aminoacil tRNK sintetaze (O-RS) se koristi za ekspresiju hIL-2 koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu (vidi mapu plazmida pKG0269; Slika 2). O-RS prvenstveno aminoaciluje O-tRNK sa aminokiselinom koja nije prirodno kodirana. Zauzvrat, translacioni sistem ubacuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u IL-2 ili IL-2 varijante, kao odgovor na kodirani selektorski kodon. Odgovarajuće O-RS i O-tRNK sekvence su opisane u WO2006/068802 pod naslovom "Kompozicije aminoacil-tRNK Sintetaze i Njihova Upotreba" i WO2007/021297 pod naslovom "Kompozicije tRNK i njihove upotrebe".

[0393] Transformacija E. coli sa plazmidima koji sadrže modifikovanu polinukleotidnu sekvencu IL-2 varijante i ortogonalni par aminoacil tRNK sintetaza/tRNK (specifičan za željenu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu) omogućava specifičnu za mesto inkorporaciju ne-prirodno kodiranih aminokiselina u IL-2 polipeptid. Ekspresija polipeptida varijante IL-2 je pod kontrolom T7 promotera i indukovana je dodatkom arabinoze u medijum (vidi mapu plazmida pKG0269; Slika 2).

[0394] Supresija sa para-acetil-fenilalaninom (pAF): Plazmidi za ekspresiju IL-2 polipeptida se transformišu u W3110B60 ćelijama E. coli. Para-acetil-fenilalanin (pAF) se dodaje ćelijama, a ekspresija proteina se indukuje dodavanjem arabinoze. Izvodi se SDS-PAGE analiza ekspresije IL-2 polipeptida, i posmatraju se IL-2 polipeptidi. Izvedene su trake za poređenje između originalnog divljeg tipa IL-2 polipeptida; i pAF supstituisanih IL-2 polipeptida, IL-2 sa, na primer, supstitucijom paraacetilfenilalanina na određenoj aminokiselinskoj rezidui. Ekspresija T7 polimeraze je pod kontrolom promotera bakteriofaga T7 inducibilnog arabinozom. Ćelijama se dodaje para-acetil-fenilalanin (pAF), a ekspresija proteina se indukuje dodatkom arabinoze (0.2% finalno). Kulture se inkubiraju nekoliko sati (3-5 sati) na 37°C.

[0395] Dodatni konstrukti za povećanje ekspresije hIL-2 u E. coli: Da bi se povećala proizvodnja hIL-2 u E. coli, sledeći parametri ekspresije bi se mogli dodatno optimizovati uz optimizaciju sekvence DNK na bazi upotrebe kodona E. coli koja je ovde opisana: Testiranje različitih promotera osim promotera bakteriofaga T7, kao što su promoteri arabinoze B (araB), pTrc i bakteriofaga T5; Stabilizacija hIL-2 mRNA; Skrining različitih E. coli sojeva domaćina osim standardnog soja W3110B60; Optimizacija parametara proizvodnog procesa kao što su temperatura, medijum za kulturu, koncentracija induktora itd.; Optimizacija elemenata za kontrolu transkripcije i translacije kao što su start i stop kodoni, mesto vezivanja ribozoma (RBS), terminatori transkripcije itd; Broj plazmidnih kopija i optimizacija stabilnosti plazmida; Optimizacija regiona inicijacije translacije (TIR).

Primer 3 - Ovaj primer opisuje ispitivanje ekspresije E. coli u erlenmajeru za mućkanje i fermentaciju ćelija velike gustine.

[0396] Testiranje ekspresije u erlenmajeru: Soj za proizvodnju AXID-a, kako je gore opisano, je korišćen za testiranje ekspresije hIL-2 u eksperimentima sa erlenmajerom. Ukratko, inokulum iz AXID glicerol viala je stavljen u 5 mL Super Broth (Fisher-Optigrow™, #BP1432-10B1) medijum koji sadrži 50 µg/mL kanamicin sulfata (Sigma, MO) i gajen je preko noći na 37° C uz mućkanje. Ova kultura koja je prenoćila je razblažena 1:100 u Super Broth (Fisher-Optigrow™, #BP1432-10B1)medijumu sa 50 µg/mL kanamicin sulfata (Sigma, MO) i gajena je na 37°C uz mućkanje. Kada je gustina kulture dostigla OD600 od 0.6-0.8, ona je indukovana dodatkom 0.2% arabinoze i pAF, nakon čega je usledila žetva nakon nekoliko sati (obično 3 do 5 sati) produkcije. Iz sakupljenih ć elija je uzet alikvot i analiziran pomoću SDS-PAGE. Optimalna ekspresija hIL-2 je standardizovana variranjem temperature, trajanja indukcije i koncentracije induktora. Imunoblot sirovih ekstrakata sa standardnim monoklonskim antitelima protiv hIL-2 je dodatno potvrdio ekspresiju hIL-2, (Slika 3A) prema sledećem Western testu koji je korišćen za analizu ekspresije hIL2: Sakupljene ć elijske pelete su normalizovane na OD600 od 5 i rastvorene u izračunatoj količini B-PER rastvora (ThermoFisher) sa lizozimom (100µg/ml) i DNase 1 (1U/ml). Pelete su mešane vorteksovanjem 2-5 minuta velikom brzinom i inkubiranjem smeše na 37°C, 250 o/min. Uzorci su mešani sa puferom za uzorke (4X) i sredstvom za redukciju uzorka (10x), koje je obezbedio proizvođač, podešavanjem finalne koncentracije na 1x. Ukupno 20 µl uzoraka je stavljeno na gotovi poliakrilamidni gel (ThermoFisher) zajedno sa hIL2 standardom (R&D Systems, Minneapolis, MN) i elektroforetska separacija je izvedena u 1xMES puferu (ThermoFisher). Uzorci proteina su prebačeni na Nitroceluloznu membranu koristeći iBlot aparat i transfer gel stacks. hIL2 je uhvaćen pomoću kozjeg anti-humanog IL-2 antigena (R&D Systems) i detektovan sa HRP konjugovanim anti-kozjim IgG sekundarnim antitelom (R&D Systems) sa opti 4CN kolorimetrijskim supstratom (Bio-Rad, Hercules, CA).

[0397] Fermentacije velike gustine ćelija: Proces fermentacije za proizvodnju hIL-2 se sastoji od dve faze: (i) priprema inokuluma i (ii) proizvodnja fermentora. Inokulum se pokreće iz jednog glycerol viala, odmrzava se, razblažuje 1:1000 (v/v) u 50 mL definisane podloge za zasejavanje u Erlenmajeru od 250 mL sa pregradama, i inkubira na 37°C i 250 o/min. Pre upotrebe, fermentor se č isti i autoklavira. Određena količina bazalnog medijuma se dodaje u fermentor i steriliše parom. Određene količine rastvora kanamicin sulfata, hranljivog medijuma i P2000 antipenušavca se dodaju u bazalni medijum pre inokulacije. Svi rastvori koji se dodaju u fermentor nakon autoklaviranja se filtriraju 0.2 µm ili se autoklaviraju pre aseptične adicije.

[0398] Fermentor je dopunjen sa 4L hemijski definisanog medijuma koji koristi glicerol kao izvor ugljenika. Kultura za zasejavanje se dodaje u fermentor do početnog OD600nm od 0.05. Rastvoreni kiseonik se održava na 30% zasićenja vazduhom pomoću mešanja od 480 do 1200 o/min i obogaćivanja kiseonikom uz pritisak glave od 6 psig i protok vazduha od 5 slpm. Temperatura i pH se podešavaju na 37°C i 7.0, respektivno. Kada kultura dostigne OD600nm od 35 ± 5, započinje hranjenje brzinom od 0.25 mL/L/min. Shodno tome, L-Ala-pAcF, (koji se takođe naziva L-Ala-pAF), dipeptid se dodaje u količini od 0.4 g/L. Petnaest minuta nakon dodavanja dipeptida, kultura se indukuje sa L-arabinozom u finalnoj koncentraciji od 2 g/L. Kultura se sakuplja 6 h posle indukcije.

[0399] Analiza titra reverzno Faznom-HPLC: 1.0 mL uzoraka fermentacije E. coli (ćelijska pasta) je prvo osušeno i izmereno da se odredi masa za pripremu uzorka. Lysonase Bioprocessing Reagent (EMD Millipore #71230) i Benzonase Nuclease Reagent (EMD Millipore # 70664) su svaki razblaženi u odnosu 1:500 u BugBuster Protein Extraction Reagent (EMD Millipore # 70584) i korišćeni za hemijsku lizu hemijske paste. 1.0 mL mešavine Bugbuster-Lysonase-Benzonase je dodato u 1.0 mL osušene ćelijske paste i rezultujuća smeša je snažno mešana. Smeša je zatim stavljena na Eppendorf Thermomixer R šejker 20 minuta na 22°C uz mućkanje na 1000 o/min. Nakon inkubacije, ćelijski lizat je centrifugiran na 16.050 rcf tokom 5 minuta da se peletiraju ćelijski ostaci. Alikvot od 200 µL supernatanta ćelijskog lizata je zatim filtriran kroz 0.22 µm PVDF centrifugalni filter (EMD Millipore #UFC30GVNB) na 16.050 rcf tokom 1 minuta. Filtrirani proizvod je zatim analiziran reverzno faznom hromatografijom da bi se odredila količina hIL2 prisutna u uzorcima fermentacije. 4.6 x 150 mm Zorbax 300SB-C3 (Agilent #863973-909) kolona sa reverznom fazom napunjena česticama od 3.5 µm je korišćena za odvajanje hIL2 od kontaminantnih proteina ćelije domaćina. Mobilna Faza A je korišćena za vezivanje hIL2 koji je sadržao 0.1% trifluoroacetata u vodi. Mobilna faza B koja sadrži 0.1% trifluorosirćetne kiseline u acetonitrilu je korišćena za eluiranje hIL2 iz kolone. Količina hIL2 u uzorku je određena poređenjem broja posmatranih površina iz fiksnog volumena ubrizgavanja sa linijskom jednačinom dobijenom iz standardne krive dobijene korišćenjem prečišćenog hIL2. Nekoliko testiranih amber varijanti IL-2, kao što je prikazano na Slici 3B, je pokazalo visok titar eksperesije u rasponu od oko 65 do 150 mg/L, u fermentaciji E.coli velike ćelijske gustine.

Primer 4 - Ovaj Primer opisuje pripremu inkluzionog tela, ponovno savijanje, prečišćavanje i PEGilaciju.

[0400] Priprema inkluzionog tela i solubilizacija: Ćelijske paste sakupljene fermentacijom velike ćelijske gustine su resuspendovane mešanjem do finalnih 10% čvrste materije u inclusion body (IB) Buffer I na 4°C (50 mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 4°C). Ćelije su lizirane propuštanjem resuspendovanog materijala kroz mikro-fluidizator ukupno dva puta. Uzorci su zatim centrifugirani (14.000 g; 15 minuta; 4°C), i supernatanti su dekantovani. Pelete inkluzionih tela su isprane resuspendovanjem u dodatnoj zapremini IB pufera I (50 mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 4°C) i resuspendovani materijali propušteni kroz mikrofluidizator ukupno dva puta. Uzorci su zatim centrifugirani (14.000 g; 15 minuta; 4°C), a supernatanti su dekantovani. Svaki pelet inkluzionih tela je resuspendovan u jednoj zapremini pufera II (50 mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4°C). Uzorci su centrifugirani (14.000 g; 15 minuta; 4°C), i supernatanti dekantovani. Pelete inkluzionog tela su resuspendovane u jednoj zapremini pufera II (50 mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4°C). Inkluziona tela su zatim alikvotirana u odgovarajuće kontejnere. Uzorci su centrifugirani (14.000 g; 15 minuta; 4°C), a supernatanti dekantovani. Inkluziona tela su solubilizovana ili čuvana na -80°C do dalje upotrebe.

[0401] Inkluziona tela su solubilizovana do finalne koncentracije između 10 - 15 mg/mL u puferu za solubilizaciju (20 mM Tris, pH 8.0; 8 M gvanidin; 10 mM β-ME). Solubilizovana inkluziona tela su zatim inkubirana na sobnoj temperaturi uz stalno mešanje 1 sat ili do potpunog rastvaranja. Uzorci su zatim centrifugirani (10.000 g; 20 minuta; 4°C) kako bi se uklonio sav nerastvoren materijal. Koncentracija proteina u svakom uzorku je zatim podešena razblaživanjem sa dodatnim puferom za solubilizaciju ako je koncentracija proteina visoka.

[0402] Ponovno savijanje i prečišćavanje: Ponovno savijanje se izvodi razblaživanjem uzoraka do konačne koncentracije proteina od 0.5 mg/mL u 20 mM Tris, pH 8.0; 60% Saharoza; 4°C. Ponovno savijanje je omogućeno tokom 5 dana na 4°C. Ponovno savijeni materijal je razblažen 1:1 sa Milli-Q H2O. Materijal je filtriran kroz 0.22 µm PES filter i propušten kroz Blue Sepharose FF kolonu (GE Healthcare) ekvilibrisanu u 20 mM Tris, pH 8.0; 0.15 M NaCl (pufer A). U uzlaznom toku, kolona je isprana sa 5 kolonskih zapremina 30% pufera B (20 mM Tris, pH 8.0; 2 M NaCl; 50% etilen glikol). IL-2 polipeptidi su eluirani ispiranjem kolone sa 10 kolonskih zapremina 100% pufera B.

[0403] PEGilacija i prečišćavanje nakon PEGilacije: IL-2 pul je uzet i razblažen 10X sa Milli-Q water. pH svakog uzorka je podešen na 4.0 sa 50% glacijalne sirćetne kiseline. Uzorci su koncentrovani do ~1.0 mg/mL. Svakom uzorku je dodat 1:12 molarni višak aktiviranog PEG (hidroksilamin PEG). Uzorci su zatim inkubirani na 27°C 48-72 sata. Uzeti su uzorci i razblaženi su 8-10 puta vodom (<8 m/S) i propušteni kroz SP HP kolonu (GE Healthcare) ekvilibrisanu u Puferu A (50 mM NaAc, pH 6.0; 50 mM NaCl; 0.05% Zwittergent 3- 14). IL-2 polipeptidi su eluirani sa 5 kolonskih zapremina Pufera B (50 mM NaAc, pH 6.0; 500 mM NaCl; 0.05% Zwittergent 3-14). Frakcije IL-2 su sakupljene i propuštene kroz Superdex 200 sizing kolonu ekvilibrisanu u puferu za skladištenje IL-2 (20 mM NaAc, pH 5.0; 150 mM NaCl; 0.05% Zwittergent 3-14). Pegilovani materijal je sakupljen i skladišten na 4°C.

Primer 5 - Ovaj primer detaljno opisuje Prečišćavanje IL-2 iz E. coli i ekspresionih sistema sisara. Ovaj primer takođe otkriva PEGilaciju, konjugaciju specifičnu za mesto i PEG-IL-2 Proces Prečišćavanja.

[0404] Priprema iz E. coli Priprema inkluzionog tela: IL-2 inkluziona tela su izolovana kroz niz koraka ispiranja. Pasta smrznutih ćelija je resuspendovana u puferu za ispiranje I (50 mM Tris, pH 8.0; 1% triton X-100; 1M urea, 5mM EDTA, 1mM PMSF) do koncentracije od 10% (W/V) i homogenizovana na 4° C, a zatim centrifugirana (15.000 g, 30 minuta, 4°C). Supernatant je odbačen, a pelet inkluzionih tela je resuspendovan u puferu za ispiranje II (50 mM Tris, pH 8.0; 1% triton X-100; 1 M urea, 5 mM EDTA).

Resuspendovana inkluziona tela su centrifugirana na 15.000 g tokom 30 minuta na 4°C. Supernatant je odbačen, a pelet inkluzionih tela je resuspendovan u puferu za ispiranje III (50 mM Tris, pH 8.0; natrijum deoksiholat, 5 mM EDTA). Resuspendovana inkluziona tela su centrifugirana na 15.000 g tokom 30 minuta na 4°C. Supernatant je odbačen, a pelet inkluzionih tela je resuspendovan u vodi nakon čega je usledilo centrifugiranje na 15.000 g tokom 30 minuta na 4°C. Oprana inkluziona tela su čuvana na -80°C do dalje upotrebe.

[0405] Ponovno savijanje: IL-2 inkluziona tela su solubilizovana resuspendovanjem u vodi i podešavanjem pH smeše na pH 12.2. Nerastvorni materijal je uklonjen centrifugiranjem (12.000 g, 15 minuta). Solubilizovani IL-2 je ponovo savijen podešavanjem pH na pH 8.8±0.2. Pravilno formiranje disulfidne veze je olakšano dodatkom 50 mM cistina u reakciju ponovnog savijanja. Reakcija ponovnog savijanja je ostavljena na sobnoj temperaturi 16-22 sata. Kontaminanti ćelija domaćina su istaloženi podešavanjem reakcije ponovnog savijanja na pH 6.8 sa hlorovodoničnom kiselinom. Precipitat je uklonjen centrifugiranjem (12.000 g, 15 minuta), a prečišćeni supernatant je podešen na pH 7.8 sa natrijum hidroksidom i filtriran na 0.22 µm.

[0406] Prečišćavanje na koloni: Ponovno savijeni IL-2 je propušten kroz kolonu Capto Adhere Impres (GE Healthcare) ekvilibrisanu u puferu A (20 mM natrijum fosfat, pH 7.8). Nakon punjenja, kolona je isprana puferom A (20 mM natrijum fosfat, pH 7.8) i IL-2 je eluiran iz kolone korišćenjem linearnog pH gradijenta do 100% pufera B (20 mM natrijum fosfat, 20 mM limunska kiselina, pH 4.0) sa 20 zapremina kolone. Sakupljene su frakcije koje sadrže IL-2, pH je podešen na 4.0 sa 10% sirćetnom kiselinom, a zatim je pufer zamenjen sa: 20 mM natrijum acetat, 2.5% trehaloza, pH 4.0. IL-2 je koncentrovan na 1-10 mg/mL, filtriran sa 0.22 µm i čuvan na -80°C.

[0407] Prečišćavanje IL-2 iz eukariotskog ekspresionog sistema: Medijum za ćelijsku kulturu koji sadrži His obeleženi IL-2 je podešen na pH 7.8 sa natrijum hidroksidom i napunjen u Ni Excel kolonu (GE Healthcare) ekvilibrisanu u 20 mM natrijum fosfatu, pH 7.8. Nakon punjenja, kolona je isprana puferom A (20 mM natrijum fosfat, pH 7.8), a zatim puferom za ispiranje B (20 mM natrijum fosfat, 1.0 M natrijum hlorid, 30 mM imidazol, pH 7.8) za uklanjanje kontaminanata ćelija domaćina. IL-2 je eluiran iz kolone puferom za eluiranje (10 mM natrijum fosfat, 300 mM imidazol, pH 7.8) i frakcija koja sadrži IL-2 je sakupljena. Sakupljeni IL-2 materijal je propušten kroz Capto Adhere Impres (GE Healthcare) kolonu ekvilibrisanu u puferu A (20 mM natrijum fosfat, pH 7.8). Nakon toga, kolona je isprana puferom A (20 mM natrijum fosfat, pH 7.8) i IL-2 je eluiran iz kolone korišćenjem linearnog pH gradijenta do 100% pufera B (20 mM natrijum fosfat, 20 mM limunska kiselina, pH 4.0) sa 20 zapremina kolone. Sakupljene su frakcije koje sadrže IL-2, pH je podešen na 4.0 sa 10% sirćetnom kiselinom i pufer zamenjen u 20 mM natrijum acetat, 2.5% trehaloza, pH 4.0. IL-2 je koncentrovan na 1-10 mg/mL, filtriran 0.22 µm i čuvan na -80°C do dalje upotrebe.

[0408] Konjugacija Specifična za Mesto i PEG-IL-2 Prečišćavanje: IL-2 varijante koje sadrže ne-prirodnu aminokiselinu (nnAK), para-acetil fenilalanin su zamenjene u pufer za konjugaciju (20 mM natrijum acetat, pH 4.0) i koncentrovane do 1-10 mg/mL. Finalnih 100 mM sirćetnog hidrazida je dodato u reakcije nakon čega je usledio 10 molarni višak PEG sa aminooksi funkcijom. Reakcije konjugacije su inkubirane 18-20 sati na 25-30°C. Nakon konjugacije, PEGilovani IL-2 je razblažen 1:10 sa 20 mM natrijum acetata, pH 5.0 i napunjen u Capto SP Impres kolonu. Nakon punjenja, kolona je isprana puferom A (20 mM natrijum acetat, pH 5.0) i PEGilovani IL-2 je eluiran iz kolone korišćenjem linearnog gradijenta do 100% pufera B (20 mM natrijum acetat, 1.0 M natrijum hlorid, pH 5.0) sa 20 zapremina kolone. Frakcije koje sadrže PEGilovani IL-2 su sakupljene i pufer zamenjen u 10 mM natrijum fosfat, 100 mM natrijum hlorid, 2.5% trehaloza, pH 7.0. IL-2 je koncentrovan na 1-2 mg/mL, filtriran 0.22 µm i čuvan na -80°C do dalje upotrebe.

[0409] Test vezivanja IL-2/CD-25 Interferometrijom Bio-Sloja: Kinetički multikoncentracioni eksperimenti vezivanja IL-2/CD25 su izvedeni na instrumentu Octet RED96 (PALL/ForteBio) na 30°C. Anti-human Fc capture biosenzors (PALL/ForteBio, cat# 18-5063) sa prečišćenim CD25-Fc fuzionim proteinom su ubačeni u 1X HBS-P+ Pufer (GE Healthcare, cat# BR-1008-27). Dostignuti su nivoi imobilizacije između 0.8 nm i 1.0 nm. Biosenzori su isprani sa 1X HBS-P+ puferom kako bi se uklonio bilo koji nevezani protein pre merenja kinetike asocijacije i disocijacije. Za praćenje faze asocijacije, uzorci IL-2 analita su razblaženi sa 1X HBS-P+ puferom i prebačeni na čvrste crne ploče sa 96 velova (Greiner Bio-One, cat# 655209). Uzorci IL-2 su ostavljeni 60 sekundi da se vežu za biosenzore sa CD25-Fc proteinom. Faza disocijacije je snimljena u velovima čvrste crne ploče sa 96 velova koja sadrži 1X HBS-P+ pufer u trajanju od 90 sekundi. Podaci su referencirani korišćenjem paralelnog oduzimanja samog pufera, a bazna linija je poravnata sa y-osom i izglađena pomoću Savitzky-Golay filtera u Octet softveru za analizu podataka verzija 10.0 (PALL/ForteBio). Obrađeni kinetički senzorgrami su globalno fitovani pomoću Langmuirovog modela koji opisuje stehiometriju vezivanja 1:1 (Slika 4A).

Primer 6 - Ovaj primer opisuje kloniranje i ekspresiju IL-2 uključujući ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u sistemu sisara. Ovaj primer takođe opisuje metode za procenu biološke aktivnosti modifikovanog IL-2.

[0410] Priprema varijanti IL-2 u ćelijama sisara. Prirodni humani IL-2 je glikozilovani protein koji ima O-vezanu glikozilaciju na Thr-3 (Conradt et al., Eur J Biochem, 153(2): str: 255-61 (1985)). Iako je pokazano da neglikozilovani IL-2 ima aktivnosti slične kao glikozilovani IL-2, pokazalo se da glikozilovani humani IL-2 ima bolju aktivnost u smislu prekomernog klonalnog rasta i dugoročne propagacije aktiviranih ljudskih T ćelija. Postoje i neki izveštaji koji sugerišu da prirodni IL-2 ima veće specifične aktivnosti. Takođe se sugeriše da ekspresija IL 2 u ćelijama sisara ima prednosti u odnosu na njihovu ekspresiju u E. coli (Kim et al., J Microbiol Biotechnol, 14(4), 810-815 (2004)). U ovom pronalasku, divlji tip IL-2 i njegovi različiti muteini dizajnirani iznad, Tabele 1 i 2, respektivno, se mogu proizvoditi u CHO ćelijama (kao što je opisano ovde u Primerima).

[0411] Za proizvodnju IL-2 muteina koji sadrže ne-prirodne amino kiseline na ž eljenoj poziciji, svaki mutein se proizvodi ili u stabilnom pulu ili u stabilnoj ćelijskoj liniji koja je izvedena iz transfektovanih platformskih ćelijskih linija koje sadrže inženjerisani par ortogonalnih tRNK/tRNK sintetaza (Tian et al., Proc Natl Acad Sci USA, 111(5): str: 1766-71 (2014)) i PCT/2018US/035764). Ukratko, CHOK1 ćelije su inženjerisane tako da budu platformske ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju ortogonalnu tRNK sintetazu (O-RS) i njenu srodnu amber supresorsku tRNK (O-tRNK) za efikasnu inkorporaciju neprirodne aminokiseline, na primer pAF, u terapeutske proteine kao što je IL-2 na primer, u CHO ćelijama. Platformska ćelijska linija je tada prethodno adaptirana za rast suspenzije za brzu progresiju u bioreaktorima. Platformska ćelijska linija je dobro okarakterisana i razvijena sa poboljšanom efikasnošću inkorporacije ne-prirodnih amino kiselina i efikasnošću selekcije klonova. Platformska ćelijska linija se koristi kao roditeljske ćelije za proizvodnju terapeutskih proteina ugrađenih u ne-prirodne aminokiseline brzom i efikasnom tranzijentnom ekspresijom sa titrom većim od 100 mg/L za upotrebu u ranoj fazi istraživanja. Tranzijentna transfekcija i stvaranje stabilnog pula se sprovode kako bi se procenila ekspresija molekula kandidata i obezbedio materijal za funkcionalni test za identifikaciju vodećeg molekula. Proizvodne ćelijske linije se generišu za proizvodnju IL-2 proteina ugrađenih u ne-prirodne aminokiseline transfekcijom amber nonsens kodona koji sadrži gen od interesa u GS sistemu ekspresije u platformskoj ćelijskoj liniji. Strategija razvoja stabilne ćelijske linije se implementira kako bi se dobila proizvodna ćelijska linija sa 5-10 PCD za 3-4 meseca i 20-30 PCD za 6 meseci koristeći platformske ćelijske linije kao roditeljske ćelije.

[0412] Humani IL-2 cDNA (NM_000586.3) sa svojim prirodnim signalnim peptidnim sekvencama je sintetisan i kloniran u ekspresioni vektor sisara koji sadrži GS marker za selekciju (Slika 4B). Kao što je prikazano u Tabeli 1, klonirani divlji tip humanog IL-2 cDNK zadržava svoje originalne DNK sekvence svake aminokiseline bez ikakvih mutacija. Nasuprot tome, tokom stvaranja varijanti IL-2, (Tabela 2), svaki od 15 muteina ima jedinstvenu poziciju koja je mutirana u Amber stop kodonu (TAG), koji se može potisnuti i eksprimirati u inženjerisanim ćelijama za proizvodnju proteina koji sadrže nnAK.

[0413] Formiranje inženjerisanih CHO ćelija koje će se koristiti za ekspresiju IL-2 varijanti. Inženjerisane CHO ćelije su izvedene gen nokautom prethodno formiranih vlasničkih platformskih ćelija (PCT/2018US/035764). Ukratko, web-bazirani alat za pronalaženje ciljeva, CRISPy je korišćen za brzu identifikaciju ciljnih sekvenci gRNK, poželjno u ranim egzonima sa nultim odstupanjem od cilja u CHO-K1 ćelijama. GRNK su klonirane u ekspresioni vektor pGNCV sisara koji se ko-eksprimira sa CHO kodon-optimizovanom verzijom Cas9. Proizvodna ćelijska linija je transfektovana proteinskim ekspresionim vektorom kako bi se stvorio pul ćelija nakon č ega je usledilo kloniranje kako bi se identifikovali pojedinačni ć elijski izolati sa genskim nokautom. Učestalost insercija/delecija iz kompozitnih rezultata višestrukih projekata je bila 30-90% i 50-80% za pul ćelija i izolata pojedinačnih ćelija, respektivno. CRISPR je korišćen za nokautiranje ciljanog gena u CHO ćelijama. Konkretno, da bi se povećala stabilnost mRNA u IL-2, UPF1 gen je nokautiran korišćenjem CRISPR tehnologije. GRNK korišćene u nokautu su prikazane na Slici 5. Nakon skrininga 192 klonova, dve UPF1-KO ćelijske linije su dobijene i sekvenciranjem verifikovane da imaju UPF1 nokaut (Slika 6). Dobijene UPF1-KO ćelijske linije su zatim korišćene za tranzijentnu ekspresiju IL-2 varijanti.

[0414] Tranzijentna ekspresija IL-2 u inženjerisanim CHO ćelijama. IL-2 varijante su tranzijentno eksprimirane u UPF1-KO ćelijskim linijama dobijenim kao što je otkriveno u gornjem primeru. Transfekcija je urađena elektroporacijom pomoću Amaxa kompleta za suspenzione ćelije (Lonza). 6 ug plazmida pripremljenog kao što je opisano u gornjem primeru, transfektovano je u 2 X 10<6>inženjerisanih CHO ćelija. Nakon transfekcije, ćelije su na 37 °C inkubirane 4 dana pre analize titra pomoću ELISA testa, korišćenjem komercijalnog kompleta iz Invitrogena (Carlsbad, CA). Kao što je prikazano na Slikama 7A i 7B, varijanta F42 pokazuje najviši nivo ekspresije između 15 varijanti tokom tranzijentne ekspresije.

[0415] T ćelijski test ekspanzije IL-2 varijanti u CTLL-2 ćelijama. Test ekspanzije CTLL-2 ćelija je izveden korišćenjem supernatanta varijante F42 koji je tranzijentno eksprimiran iz transfektovanih inženjerisanih CHO ć elija. Tokom testa ć elijske proliferacije, divlji tip IL-2 je korićten kao kontrola 100% proliferacije (prikazano na Slici 8). Varijanta F42 je pripremljena u serijskim razblaženjima u testu, 10 ng/mL, 3.33 ng/mL, 1.11 ng/mL, 0.37 ng/mL, 0.12 ng/mL i 0.04 ng/mL. Proliferacija ćelija je izvedena korišćenjem Cell Titer Glo (Promega, WI). Luminescentni signal je očitan na TECAN genios pro. Kao što je prikazano na Slici 8, F42 je pokazao EC50oko 0.24 ng/mL zadržavajući 95% od funkcije u poređenju sa svojom kontrolom divljeg tipa. Opšti postupak za proučavanje varijanti IL-2 iz ovog pronalaska je prikazan u nastavku:

Generalna procedura u studiji efikasnosti PEGilovanih IL2 mutanta sa ne-prirodnim aminokiselinama

Primer 7 - Skrining IL-2 varijanti pomoću ekspanzije ćelija CTLL-2

[0416] Pomoću testa ekspanzije CTLL-2 ćelija kako je otkriveno u Primerima, je izvršen skrining 20 različitih varijanti IL-2 uključujući 16 prvobitno odabranih mesta (uključujući divlji tip) i 4 dodatna mesta (K32, K48, K49, K76) koja su poznata u struci (Charych, D., et al., PLoS One, 12(7): p. e0179431, 2017). Kao što je prikazano na Slici 9 i Tabeli 3, većina varijanti je zadržala svoje aktivnosti nakon mutageneze. Zbog prirode CTLL-2 ćelija koje imaju rezidualnu ekspresiju IL-2Rα, varijante sa mutagenezom koje se najmanje vezuju za CTLL2 ćelije i dalje su pokazivale izvesno inherentno vezivanje za IL-2Rα, iako je bilo minimalno. Na primer, uočeno je da varijanta P65 IL-2, koja je pokazala najmanje vezivanje za IL-2Rα, pokazuje neko inherentno delimično vezivanje za IL-2Rα. Identifikovane varijante su dalje analizirane za njihove sposobnosti vezivanja nakon PEGilacije.

Tabela 3. Aktivnost varijanti IL-2 korišćenjem testa proliferacije CTLL2

Primer 8 - Analiza odabranih varijanti sa testom vezivanja in vitro

[0417] Analiza odabranih varijanti P65, I45, E61, F42, K35, K49 i T37 je izvedena korišćenjem in vitro testova vezivanja, Bio-Layer Interferometery testa, kao što je opisano u gornjim Primerima. Svaka od varijanti je konjugovana sa 20K PEG na svojim specifičnim mestima. PEGilovane varijante su zatim analizirane BLI (Bio-Layer Interferometry) testom opisanim na drugom mestu u Primerima. Kao što je prikazano na Slikama 10A-10C, PEGilovane varijante su testirane na Octet platformi za njihovo vezivanje za IL-2Rα. U testovima je kao pozitivna kontrola korišćen divlji tip IL-2. Nakon PEGilacije, većina varijanti je pokazala dramatično smanjeno vezivanje za IL-2Rα između 92.9% i 99.9%. Među testiranim PEGilovanim varijantama, P65 i I45 su pokazali preko 99% blokirane aktivnosti, Tabela 4.

Tabela 4. In vitro aktivnost vezivanja IL-2 varijanti

Primer 9 - Analiza odabranih varijanti pomoću PathHunter testa Dimerizacije

[0418] Da bi se pronašlo najbolje mesto za konjugaciju PEG, korišćen je PathHunter test dimerizacije koji je razvio DiscoverX (Fremont, CA). Generalno, sistem analize koristi egzogeno eksprimirane IL-2 receptore koji su inženjerisani da imaju komplementarne vezujuće domene enzima tako da izazovu hemiluminiscentni signal nakon što se prethodno razdvojeni receptori nakon dimerizacije aktiviraju dodatkom IL-2 molekula, (Slika 11). Dve ćelijske linije su generisane u U2OS ćelijama. Jedna ćelijska linija je eksprimirala tri receptora, IL-2Rα, IL-2Rβ i IL-2Rγ. Druga ćelijska linija je eksprimirala IL-2Rβ i IL-2Rγ. Odnos vrednosti vezivanja EC50(EC50-βγ/EC50-αβγ) svake varijante se koristi za procenu njihove relativne zadržane sposobnosti vezivanja. Kao što je prikazano u Tabeli 5, najbolja moguća varijanta ima vrednost 1, što znači da je 100% njihove sposobnosti vezivanja za βγ zadržano dok je α vezivanje 100% blokirano. Kao što je navedeno, varijanta Y45-BR4, (varijanta Y45 sa 20K 4-granim PEG konjugovanim), i P65-PEG20K, (varijanta P65 sa 20K-linearnim PEG konjugovanim) su pokazale najniže vrednosti, što ukazuje da bi ove dve PEGilovane varijante bile najbolji kandidati za dalju evaluaciju.

Tabela 5. Aktivnost vezivanja IL-2 varijanti korišćenjem testa dimerizacije - Eksp.1

[0419] Kao što je prikazano u Tabeli 6, u dodatno izvedenom eksperimentu, varijanta P65-BR4, (varijanta P65 konjugovana sa 20K 4-granim PEG), i P65-BR2, (varijanta P65 konjugovana sa 20K 2-granim PEG) su takođe odabrane kao kandidati za dalju evaluaciju pored varijanti Y45-BR4 i P65-PEG20K.

Tabela 6. Poboljšana aktivnost vezivanja varijanti IL-2 korišćenjem testa dimerizacije - Eksp.2

Primer 10 - Ex vivo pSTAT5-test IL-2 varijanti

[0420] Da bi se dalje procenila in vitro funkcija PEGilovanih varijanti, korišćen je ex vivo test korišćenjem PBMC. Kao što je prikazano na Slici 12, vezivanje IL-2 za njegove receptore je izazvalo povećanu fosforilaciju STATS (pSTAT5). Prema tome, određivanje nivoa pSTAT5 bi trebalo da bude indeks za vezivanje IL-2 varijanti za endogene IL-2 receptore. Humane cele PBMC su tretirane odabranim PEGilovanim varijantama kao što su I45-BR2, (varijanta I45 konjugovana sa 20K 2-granim PEG), I45-BR4, (varijanta I45 konjugovana sa 20K 4-granim PEG) i P65-PEG20K, (varijanta P65 sa linearnim 20K PEG), nakon čega je izvedno razdvajanje na dve populacije, CD8+ T ćelije i CD4+ Treg ćelije. Kao što je prikazano u Tabeli 7, sve tri varijante su pokazale znatno bolju aktivnost u pogledu zadržane sposobnosti vezivanja za ßγ i blokiranu aktivnost vezivanja za α. Ovi rezultati su dodatno podržani varijantama testiranim u dodatnom pSTAT5 testu kao što je prikazano u Tabeli 8. Rezultati ovog pSTAT5 testa, (Tabela 8) su pokazali da je više varijanti imalo dramatično bolju aktivnost u smislu njihove smanjene sposobnosti da se vežu za Treg ćelije i relativno zadržano vezivanje za CD8+ ćelije. Izračunati odnos CD8+/Treg se koristi u Tabeli 8 za označavanje rangiranja varijanti tako da se rezultati PathHunter testa mogu direktno uporediti sa rezultatima pSTAT5 testa pomoću sličnog sistema rangiranja.

Tabela 7 - Aktivnost vezivanja varijanti IL-2 korišćenjem ex vivo testa - Eksp.1

Tabela 8 - Poboljšana aktivnost vezivanja varijanti IL-2 korišćenjem ex vivo testa - Eksp.2

Primer 11 - Klonalni prekomerni rast i dugoročna propagacija CTLL-2 ćelija u prisustvu glikozilovanog IL-2 proizvedenog u CHO ćelijama sisara u odnosu na neglikozilovani IL-2 proizveden u E.coli.

[0421] Prijavljeno je da prirodni humani IL-2 je glikozilovani protein koji ima O-vezanu glikozilaciju na Thr-3 (Conradt et al., Eur J Biochem 153(2): 255-261 (1985)). U poređenju sa neglikozilovanim IL-2, funkcija ove glikozilacije je povezana sa većom rastvorljivošću pri fiziološkom pH, sporijim klirensom in vivo i manjom imunogenošću u terapiji raka (Robb et al., Proc Natl Acad Sci U S A 81(20): 6486-6490 (1984); Goodson et al., Biotechnology (NI) 8(4): 343-346 (1990)). Što je još važnije, pokazalo se da je glikozilovani IL-2 superiorniji od neglikozilovanog IL-2 u promovisanju klonalnog rasta i dugoročne propagacije aloaktiviranih humanih T ćelija (Pawelec et al., Immunobiology 174(1): 67-75 (1987)), što sugeriše da je glikozilovani IL-2 bolji izbor u terapeutskim primenama.

[0422] Da bi se dalje analizirala biološka funkcija glikozilovanog IL-2 i ne glikozilovanog IL-2, izveden je eksperiment koji analizira stopu klonalnog rasta i dugoročnu frekvenciju propagacije CTLL-2 ćelija (Slika 13). Pojedinačne CTLL-2 ćelije su deponovane u ploče sa 96 velova sa prethodno obloženim hranljivim slojem γ-ozračenih CF1-MEF (Mouse Embryonic Fibroblast) ćelija (Thermo Fisher, Waltham, MA, CAT#A34180). Tokom 19 dana rasta sa jednim tretmanom različitih koncentracija, (0.005 nM, 0.05 nM, 0.5 nM i 5 nM), IL-2 divljeg tipa proizveden iz CHO ćelija ili E. coli prebrojan je i analiziran procenat izraslih kolonija i procenat preživelih kolonija nakon 19-dnevne inkubacije. Kao što je prikazano na Slici 13, (koristeći 0.5 nM tretman kao primer), glikozilovani IL-2 je pokazao superiornu aktivnost u promociji klonalnog rasta u odnosu na neglikozilovani IL-2. U proseku, sposobnost glikozilovanog IL-2 da promoviše klonalni rast je 2 puta veća od neglikozilovanog IL-2 u prisustvu IL-2 koncentracije od 0.5 nM, što je optimalno stanje ćelijske kulture za rast CTLL-2 ćelija. Nakon dugotrajne inkubacije (~19 dana), stopa preživljavanja kolonija nakon tretmana glikozilovanim IL-2 je bila 4 puta veća od tretmana sa neglikozilovanim IL-2. Podaci jasno pokazuju da glikozilovani IL-2 ima superiornu aktivnost u promociji klonalnog rasta i dugoročne propagacije ćelija koje reaguju na IL-2, i dodatno podržavaju njegove obećavajuće terapeutske primene.

Primer 12 - Poboljšanje titra za ekspresiju IL-2 u novim stabilnim CHO ćelijskim linijama domaćinima

[0423] Mnogi pristupi su pokušani na terenu da se poveća ekspresija divljeg tipa IL-2 i njegovih varijanti u CHO ćelijama, (vidi, na primer, Kim et al., J Microbiol Biotechnol, 14(4), 810-815 (2004)). Međutim, povećanje ekspresije proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline u industriji je osporeno relativno niskim prinosom u ćelijama sisara. Da bi se rešio ovaj problem, vlasnička tehnologija u eukariotskim ćelijskim linijama za poboljšanje proizvodnje titra proteina, kako je otkriveno u PCT/2018US/035764, se koristi za stvaranje stabilnih pulova ćelija IL-2 i njegovih varijanti, i koristi se za stvaranje stabilnih IL-2 ćelijskih linija.

[0424] Ukratko, nađeno je da pet različitih generacija platformskih ćelijskih linija koje eksprimiraju Bax/Bak nokaut dramatično poboljšavaju ekspresiju IL-2 proteina i povećavaju proizvodnju IL-2 proteina na oko 40% u odnosu na roditeljsku ćelijsku liniju. Pored inhibicije apoptoze u ovim ćelijama putem BaxBak nokauta, utvrđeno je da UPF1 nokaut dodatno poboljšava ekspresiju IL-2.

[0425] I divlji tip IL-2 i njegove varijante (F42, Y45 i P65) su testirani stvaranjem njihovih stabilnih pulova. Kao što je prikazano na Slici 13, stabilni pulovi tri varijante IL-2 F42, Y45 i P65, uključujući divlji tip IL-2, imaju izuzetno povećane nivoe ekspresije, u poređenju sa onim koji se koriste u struci (vidi, na primer, Kim et. al. , J Microbiol Biotechnol., 14(4), 810-815, (2004)), do oko 740 mg/L za divlji tip; i do 120 mg/L za varijantu F42, (prikazano na Slici 14), nakon stvaranja stabilnih pulova za svaku. Podaci pokazuju da se proizvodnja ili prinos IL-2 proteina može poboljšati ili povećati generisanjem nove CHO ćelijske linije koja ima efikasno ugrađenu ne-prirodnu aminokiselinu. Oni takođe sugerišu da su nivoi ekspresije i funkcionalnost specifično relevantni za lokaciju.

Primer 13 - IL-2 varijanta F42-R38A je pokazala potpunu blokadu IL-2R alfa vezivanja.

[0426] Kao što je ovde otkriveno, ne-prirodno kodirana supstitucija(e) aminokiselina će biti kombinovana sa drugim adicijama, supstitucijama ili delecijama unutar IL-2 kako bi se uticalo na druga biološka svojstva IL-2 polipeptida uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećanje stabilnosti (uključujući, ali ne ograničavajući se na, otpornost na proteolitičku degradaciju) IL-2 ili povećanje afiniteta IL-2 za njegov receptor; povećanje farmaceutske stabilnosti IL-2; pojačavanje aktivnosti IL-2 za inhibiciju tumora i/ili smanjenje tumora; povećavanje rastvorljivosti (uključujući, ali ne ograničavajući se na to, kada se eksprimiraju u E. coli ili drugim ćelijama domaćinima) IL-2 ili njegovih varijanti; povećanje rastvorljivost IL-2 nakon ekspresije u E. coli ili drugim rekombinantnim ćelijama domaćinima; povećavanje rastvorljivosti polipeptida nakon ekspresije u E.coli ili drugim rekombinantnim ć elijama domaćinima; koje moduliše afinitet za IL-2 receptor, vezujuće proteine ili vezani ligand, moduliše transdukciju signala nakon vezivanja za IL-2 receptor, moduliše poluživot u cirkulaciji, moduliše oslobađanje ili biodostupnost, olakšava prečišćavanje ili poboljšava ili menja određeni način administracije; povećava afinitet IL-2 varijante za njegov receptor; povećava afinitet IL-2 varijante prema IL-2-Rbeta i/ili IL-2-Rgama.

[0427] Prema tome, da bi se poboljšala funkcija varijante F42, pripremljena je nova varijanta sa dodatnom mutacijom, R38A, u CHO ćelijama. Kao što je prikazano na Slici 15A, titar se povećao na 118 mg/L kombinacijom ne-prirodne aminokiselinske i prirodne aminokiselinske supstitucije u IL-2 varijanti F42 u stabilnom pulu tokom stvaranja stabilne ćelijske linije. Nivo ekspresije proteina varijante F42 nije samo održan, već je pokazao i povećanje od 20% u prisustvu mutacije R38A. Da bi se testirala funkcija PEGilovane F42-R38A varijante, izvršen je test vezivanja CTLL-2 ćelija. Kao što je prikazano u Tabeli 9, konjugat F42-R38A 20K 2-grani PEG (varijanta F42-R38-BR2) je pokazao EC50od 15.9 nM za razliku od EC50kod F42, koji je pokazao 3.6 nM, sa efikasnošću blokade vezivanja koja je povećana 4-puta (Slika 15B). Na bazi EC50divljeg tipa IL-2 od 0.025 nM, efikasnost blokiranja vezivanja je preko 99.9%. Ova varijanta je pokazala veliki potencijal za terapeutske primene u pogledu visokog nivoa ekspresije proteina i njegove efikasnosti u blokiranju vezivanja za IL-2Ralfa.

Tabela 9. CTLL-2 Test vezivanja PEGilovane varijante F42-R38A

[0428] Kinetika vezivanja varijante F42pAF, varijante R38A-F42pAF (koja sadrži ne-prirodnu amino kiselinu i tačkastu mutaciju) i F42-R38A-PEG20K-BR2 je procenjena pomoću BLI da bi se odredili efekti mutacije R38A na vezivanje za IL-2Ralfa. Slika 15C prikazuje senzorgrame vezivanja za tri konstrukta a pridružene konstante vezivanja (KD) su prikazane u Tabeli 10. Kao što se vidi u Tabeli 10, IL-2-F42pAF ima KD vezivanja IL-2Ralfa od 20 nM. Uz dodatnu mutaciju R38A, IL-2-F42-R38ApAF ima KD vezivanja IL-2Ralpha od 233nM, što odgovara smanjenju vezivanja IL-2Ralfa od 12 puta. Nakon konjugacije IL-2-R38A-F42pAF sa 20K 2-granim PEG molekulom, sprečeno je vezivanje IL-2Ralfa. Rezultati su jasno pokazali da dodatna mutacija efikasno blokira vezivanje F42-R38A za njegov receptor IL-2Rα.

Tabela 10. Vezivanje IL-2 PEGilovanih varijanti sa prirodnim i neprirodnim aminokiselinskim

supstitucijama

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. IL-2 polipeptid sa jednom neprirodno kodiranom aminokiselinom, pri čemu IL-2 polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 2, pri čemu je neprirodno kodirana amino kiselina inkorporisana u poziciju 45 sekvence SEK ID BR: 2, pri čemu je vodo-rastvorni polimer konjugovan sa IL-2 polipeptidom preko neprirodno kodirane aminokiseline preko linkera koji se ne može cepati, pri čemu je neprirodno kodirana aminokiselina para-acetil-fenilalanin, pri čemu je IL-2 polipeptid glikozilovan, i pri čemu navedeni IL-2 polipeptid ima smanjenu interakciju sa svojom subjedinicom IL-2Rα receptora u poređenju sa divljim tipom IL-2 polipeptida.

2. IL-2 polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je vodorastvorni polimer deo molekula poli(etilen glikola) (PEG).

3. IL-2 polipeptid prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je deo molekula PEG linearan ili razgranat.

4. IL-2 polipeptid prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, pri čemu deo molekula PEG ima molekulsku masu između 0.1 kDa i 100 kDa, poželjno između 0.1 i 50 kDa, još poželjnije između 10 kDa i 50 kDa.

5. IL-2 polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu je linker koji se ne može cepati oksimska veza.

6. IL-2 polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu je IL-2 polipeptid dalje vezan za biološki aktivan molekul, citotoksični agens ili imunostimulatorni agens, opciono pri čemu je biološki aktivan molekul, citotoksični agens ili imunostimulatorni agens vezan za IL-2 polipeptid pomoću linkera, dalje pri čemu opciono linker je linker koji se može ili ne može cepati.

7. IL-2 polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu se IL-2 polipeptid proizvodi u CHO ćelijama.

8. IL-2 polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je vodo-rastvorni polimer deo molekula PEG, pri čemu je deo molekula PEG linearan, pri čemu deo molekula PEG ima molekulsku masu između 10 kDa i 50 kDa, i pri čemu je linker koji se ne može cepati oksimska veza.

9. IL-2 polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu IL-2 polipeptid osigurava produženi poluživot in vivo, pri čemu je in vivo poluživot IL-2 polipeptida povećan najmanje oko 5 puta u odnosu na nemodifikovani polipeptid.

10. Metod proizvodnje IL-2 polipeptida prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9, koji metod uključuje kontaktiranje IL-2 polipeptida kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9 sa vodorastvornim polimerom, pri čemu vodorastvorni polimer sadrži deo molekula koji reaguje sa neprirodno kodiranom amino kiselinom.

11. Metod proizvodnje IL-2 polipeptida prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9, koji metod uključuje kontaktiranje IL-2 polipeptida kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9 sa vodorastvornim polimerom, pri čemu vodorastvorni polimer sadrži deo molekula koji reaguje sa neprirodno kodiranom amino kiselinom, i time što se IL-2 polipeptid dobija ekspresijom u ćelijama sisara ili eukariotskim ćelijama, kao što su CHO ćelije.

12. IL-2 polipeptid koji se može dobiti metodom prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11.

13. Kompozicija koja sadrži IL-2 polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu su IL-2 polipeptidi u kompoziciji homogeni.

14. IL-2 polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9 i 12, ili kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u lečenju raka.