RS65292B1

RS65292B1 - Kompozicija za prevenciju i lečenje oštećenja kože izazvanih izlaganjem sunčevom zračenju

Info

Publication number: RS65292B1
Application number: RS20240311A
Authority: RS
Inventors: Giammaria Giuliani; Fabio Rinaldi; Walter Bertin; Marzia Pellizzato; Barbara Marzani; Daniela Pinto
Original assignee: Giuliani Spa
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2024-04-30
Also published as: US11376211B2; DK3758799T3; EP3758799A1; HUE066213T2; IT201800003232A1; LT3758799T; CA3092281A1; FI3758799T3; SI3758799T1; PT3758799T; US20210000735A1; WO2019167010A1; EP3758799B1; HRP20240377T1; PL3758799T3; ES2974578T3; SMT202400167T1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju za prevenciju i lečenje oštećenja kože izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju.

Ovaj pronalazak pripada farmaceutskoj, nutraceutskoj, dermatološkoj i kozmetičkoj oblasti.

[0002] Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju za prevenciju ili lečenje starenja od izlaganja sunčevoj svetlosti ili određenih afekcija kože izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju, određenije sunčevim zracima.

Stanje tehnike

[0003] Kako ljudsko telo stari, ćelije epidermisa postepeno gube svoju mogućnost proliferacije što dovodi do stanjivanja kože. Istovremeno, keratinske lamele, u koži koja stari, obrazuju kompaktan sloj koji prouzrokuje gubitak mladalačke elastičnosti, dok usporavanje ćelijske reprodukcije dovodi do neravnoteže u fiziološkom procesu isparavanja vode te smanjenja sadržaja kolagena. Ti se fenomeni povezani sa fiziološkim starenjem tela mogu pogoršati kod subjekata koji su se iznova izlagali, i to na duže vremenske periode, sunčevim zracima, naročito bez adekvatne zaštite od sunca. U tim se slučajevima radi o fotostarenju kože, stanju u kom fiziološku pojavu bora i gubitak elastičnosti kože koji su tipični za zrelu dob pojedinca prate atrofija, solarna elastoza, aktinička purpura pa čak i prekancerozne lezije, tumori i melanom (Pandel et al.2013).

[0004] Što se tiče izlaganja sunčevim zracima, otkriveno je da izlaganje UVB zracima uglavnom izaziva oštećenje najpovršnijih slojeva kože. Tipičan primer tog oštećenja, koje je takođe povezano sa zadobijanjem opekotina, javlja se u slučajevima opekotine od sunca. S druge strane, UVA zraci su uspešniji u probijanju slojeva kože a izlaganje njima može voditi prevremenom starenju kože i pojavi aktiničkih ili prekanceroznih lezija.

[0005] Brojna istraživanja su takođe pokazala kako izlaganje kože UV zračenju, bez krema za sunčanje, dovodi do obrazovanja visokotoksičnih produkata, kao što su slobodni radikali, ubrzava starenja kože i izaziva smanjenje funkcionalnosti samih epidermalnih matičnih ćelija.

[0006] Prisustvo prekomernih slobodnih radikala može izazvati i ozbiljno oštećenje DNK jedara i mitohondrija, ćelijskih membrana, lipida i proteina matičnih ćelija kože i njihovog potomstva. U tim je stanjima ugrožena sposobnost samoregeneracije struktura epidermisa uz posledično ubrzanje starenja kože.

[0007] Takođe je pokazano da su mehanizmi fotostarenja i karcinogeneze kože direktna posledica efekta sunčevog zračenja. UV zraci zapravo mogu da stvore reaktivne vrste kiseonika (ROS) a samim tim i da promene ćelijsku homeostazu. Ti efekti, pak, menjaju puteve prenosa signala i zapaljenjsku kaskadu te indukuju remodelovanje vanćelijskog matriksa (ECM) što doprinosi gubitku elastičnosti kože.

[0008] Sada je već naširoko poznato da izlaganje UV zračenju predstavlja glavni uzrok oksidativnog stresa u koži i jedan od glavnih uzroka starenja usled izlaganja suncu.

[0009] Oksidativni stres je zapravo posledica neravnoteže između proizvodnje ROS-ova i njihove neutralizacije ćelijskim antioksidativnim sistemima. ROS-ovi koji nisu neutralisani podstiču različite vrste ćelijskog oštećenja: lipoperoksidaciju na štetu ćelijskih membrana, promenu strukture i funkcionalnosti mnogih enzima i podstiču oksidaciju ugljenih hidrata.

[0010] Kao odgovor na napade ROS-ova, koža ima zaštitni sistem koji se sastoji od endogenih enzimskih i neenzimskih antioksidansa. Međutim, efikasnost antioksidativnog sistema kože opada tokom starenja pa on, svakako, nije u stanju da štiti od kontinuiranih ili prekomernih napada spoljašnjih faktora kojima je izložen, pre svega izlaganja sunčevim zracima.

[0011] U pokušaju da se ti fenomeni reše, formulisani su preparati koji imaju antioksidativna dejstva kako bi se neutralisala šteta koju indukuju ROS-ovi. Neki od tih preparata sadrže antioksidativne supstance biljnog porekla, koje takođe imaju antiinflamatorno i imunomodulatorno dejstvo.

[0012] Na primer, dobro je poznata upotreba epigalokatehin galata i kurkumina u formulaciji preparata za prevenciju ili lečenje UV indukovanog oštećenje kože. Međutim, nedavna istraživanja su pokazala da upotreba tih supstanci biljnog porekla ipak ima neke nuspojave, kao što je pojava kontaktne alergije na kurkumin (Chaudhari et al, J Clin Aesthet Dermatol, 2015) ili abdominalnog bola i mučnine koji su otkriveni uz upotrebu epigalokatehin galata (Chow et al.; Clin Cancer Res.2003).

[0013] Zbog toga trenutno postoji potreba za preparatima koji sprečavaju ili smanjuju kako estetsko oštećenje kože tako i zdravstvene rizike koje prouzrokuje prekomerno ili produženo izlaganje sunčevoj svetlosti.

[0014] Zato je jedan od predmeta ovog pronalaska obezbeđivanje kompozicije na bazi aktivnih supstanci biljnog porekla koje su prikladne za prevenciju ili lečenje oštećenja kože izazvanog prekomernim ili produženim izlaganjem ultraljubičastim zracima, čija upotreba gotovo da nema nuspojava.

[0015] Drugi predmet ovog pronalaska je obezbeđivanje kompozicije za lečenje i smanjivanje rizika od razvoja aktiničkog oštećenja, prekanceroznih lezija ili nemelanomskog kancera kože koji su posledica produženog ili prekomernog izlaganja sunčevim zracima.

Kratak sadržaj pronalaska

[0016] U oblasti tehnike ovog pronalaska, prijavilac je otkrio da se kombinovanjem jedne komponente ekstrakta Lycium barbarum-a ili više njih sa komponentama iz ekstrakta Moringa oleifera-e u razmeri koja je definisana u patentnom zahtevu 1, dobija sinergetski antioksidativni efekat ćelija koji smanjuje oksidativni stres ćelija.

[0017] Pored toga, pronalazači su primetili da kombinacija biološki aktivnih komponenti prisutnih u Lycium barbarum-u i Moringa oleifera-i ili ekstrahovanih iz njih ima dejstvo zaštite i oporavka od oksidativnog stresa indukovanog kod humanih keratinocitnih ćelijskih linija.

[0018] S obzirom na gore izložene predmete, ovaj pronalazak, u skladu sa prvim aspektom, obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a u kombinaciji sa ekstraktom Moringa oleifera-e, za upotrebu u prevenciji ili lečenju kožnih lezija izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju, kao što su aktiničko oštećenje i/ili lezije, prekancerozno oštećenje kože i/ili lezije ili nemelanomski kancer kože (NMSC).

[0019] Gorenavedene kožne lezije i/ili oblici NMSC-a obično potiču od izlaganja kože ultraljubičastim zracima, naročito sunčevim zracima, ili se obrazuju nakon njega.

[0020] Unutar obima primene u oblasti medicine, kompozicija ovog pronalaska je naročito indikovana u lečenju aktiničkog oštećenja, prekanceroznih lezija ili nemelanomskog kancera kože, tj. kancera koji se razlikuje od melanoma, nakon produženog ili prekomernog izlaganja sunčevim zracima.

[0021] Prema drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje neterapijsku upotrebu ekstrakta Lycium barbarum-a ili polisaharida LBP u kombinaciji sa ekstraktom Moringa oleifera-e za prevenciju ili lečenje estetskog oštećenja kože ili starenja kože i/ili prirodnih znakova koje izaziva izlaganje ultraljubičastom zračenju, određenije sunčevim zracima.

[0022] U skladu sa tim aspektom, kompozicija ovog pronalaska nalazi kozmetičku primenu u prevenciji ili lečenju oštećenja kože izazvanog produženim izlaganjem sunčevim zracima koje dovodi do prevremenog starenja kože.

[0023] Kompozicija ovog pronalaska obično je, u neterapijskoj/kozmetičkoj oblasti, indikovana u prevenciji i/ili lečenju prevremenog starenja kože, fotostarenja, naročito usled oksidativnog stresa, koje je posledica izlaganja ultraljubičastim zracima.

Kratak opis nacrta

[0024] Karakteristike i prednosti ovog pronalaska biće jasnije iz pridruženog nacrta, u kom:

Fig.1 prikazuje stubičaste grafikone koji se odnose na procenat vijabilnosti ćelija kod humanih keratinocita NCTC2544, nakon indukovanja oksidativnog stresa pomoću 1mM H2O2, u skladu sa ispitivanjem zaštite od indukovanog oksidativnog stresa u Primeru 6;

Fig.2 prikazuje stubičaste grafikone koji pokazuju oporavak vijabilnosti ćelija nakon indukovanog oksidativnog stresa u skladu sa Primerom 6.

Detaljan opis pronalaska

[0025] Ovaj pronalazak proizilazi iz otkrića da se kombinovanjem fitoekstrakta Lycium barbarum-a ili LBP-a sa fitoekstraktom Moringa oleifera-e, dobija sinergetsko dejstvo zaštite i oporavka od oksidativnog stresa u epidermalnim keratinocitnim linijama. To dejstvo omogućava kako prevenciju/lečenje kozmetičkog oštećenja kože tako i prevenciju/lečenje lezija ili oštećenja kože aktiničke prirode koje su posledica izlaganja ultraljubičastom zračenju.

[0026] Stoga je, u skladu sa prvim aspektom ovog pronalaska, obezbeđena kompozicija za upotrebu, u oblasti medicine, u lečenju kožnih bolesti izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju u skladu sa pridruženim patentnim zahtevom 1.

[0027] Prema određenim aspektima, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu kompozicije koja sadrži sinergetsku kombinaciju Lycium barbarum-a i Moringa oleifera-e za lečenje supkliničih stanja ili bolesti kože izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju, obično izlaganjem sunčevim zracima.

[0028] Načini ostvarivanja upotreba kompozicije ovog pronalaska u oblasti medicine definisani su u pridruženim zavisnim patentnim zahtevima 2-8.

[0029] U skladu sa prvim aspektom ovog pronalaska, kompozicija na bazi fitoekstrakata ima terapijsku indikaciju u prevenciji ili lečenju afekcija kože izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju, koje potiču od njega ili koje su pokrenute njime, određenije dermatološke afekcije izabrane od aktiničkih lezija, prekanceroznih kožnih lezija ili nemelanomskog kancera kože.

[0030] Prema nekim aspektima ovog pronalaska obezbeđena je kompozicija ovog pronalaska prema bilo kom od ovde opisanih načina ostvarivanja za smanjivanje rizika od razvoja aktiničkih keratoznih lezija ili prekanceroznih lezija kože. Prema tim aspektima ovog pronalaska, moguće je lečiti subpopulaciju subjekata/pacijenata koji su već imali te lezije u prošlosti, sa ciljem prevencije njihove rekurencije ili smanjivanja broja relapsa.

[0031] Prema drugim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži fitokomplekse kao što su ovde opisani za smanjivanje rizika od razvoja nemelanomskog kancera kože, stanja koje se u literaturi definiše kao NMSC i/ili njegovu prevenciju.

[0032] U skladu sa drugim aspektima, ovaj pronalazak se odnosi i na neterapijsku/kozmetičku upotrebu kompozicije koja sadrži kombinaciju ovde opisanih fitoekstrakata u lečenju estetskog oštećenja kože ili starenja kože izazvanog izlaganjem ultraljubičastom zračenju.

[0033] Primećeno je da ovde opisana kompozicija ispoljava visokozaštitni i/ili preventivni efekat na estetsko oštećenje kože i/ili starenje kože izazvano izlaganjem UVA, UVB i UVC zračenjima. Stoga je, u jednom aspektu, obezbeđena kozmetička upotreba kompozicije koja obuhvata ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a u kombinaciji sa ekstraktom Moringa oleifera-e i kozmetički/fiziološki prihvatljiv nosač u prevenciji ili lečenju fotostarenja.

[0034] Primećeno je i da je sinergizam dveju komponenti naročito visok u slučaju razmere Moringa oleifera/Lycium barbarum od 1:7 do 5:1, poželjno 1:3 do 3:1.

[0035] Jedan način ostvarivanja kompozicije obezbeđuje prisustvo Moringa oleifera-e i Lycium barbarum-a u količinskoj razmeri od 2:1.

[0036] O sinergiji delovanja svedoče eksperimentalni podaci prikazani u Primeru 7 koji sledi.

[0037] U skladu sa tim aspektima, kompozicija ovog pronalaska nalazi primenu u kozmetičkom lečenju znakova starenja kože koji su posledica izlaganja ultraljubičastom zračenju, obično sunčevim zracima.

[0038] Kompozicija ovog pronalaska obično se koristi za prevenciju ili neterapijsko lečenje starenja kože usled izlaganja sunčevim zracima.

[0039] Pored toga, kompozicija ovog pronalaska se može koristiti za prevenciju ili lečenje tih znakova starenja kože koji se mogu pripisati izlaganju ultraljubičastom zračenju koje se ponavlja tokom vremena, kao što su nabiranje kože, grubost kože, zadebljanje kože, dehidratacija i boranje kože na telu, a naročito na licu.

[0040] Kompozicija ovog pronalaska obično se može koristiti, kako u medicinskim tako i u neterapijskim primenama, za lečenje kože oštećene usled izlaganja UVA, UVB ili UVC zracima.

[0041] UV-A zračenje obično se odnosi na zračenja sa talasnom dužinom od 315 do 400 nm; UV-B zračenje se odnosi na zračenja sa talasnom dužinom od 280 do 314 nm; UV-C zračenje se odnosi na zračenja sa talasnom dužinom od 100 do 279 nm.

[0042] Biološki aktivne komponente prisutne u kompoziciji su iste kako za medicinsku tako i za neterapijsku upotrebu. Te komponente i drugi aspekti kompozicije ovog pronalaska detaljno su opisani u nastavku.

[0043] U kompoziciji ovog pronalaska može se koristiti ekstrakt iz Lycium barbarum-a ili polisaharida Lycium barbarum-a. Taj polisaharid, koji se u literaturi naziva skraćenicom LBP ili kao godži, predstavlja najaktivnije jedinjenje prisutno u biljci, obično u njenom voću ili bobicama (vučjim bobicama), obično godži bobicama.

[0044] Lycium barbarum je biljna vrsta u obliku listopadnog grma koji pripada porodici Solanaceae. Ta biljka daje crveno i/ili ljubičasto voće opštepoznato kao godži bobice.

[0045] Prikladan biljni ekstrakt za upotrebe ovog pronalaska može poticati iz korenja, lišća, voća ili cvetova Lycium barbarum-a ili iz dvaju ili više od tih delova biljke. Ekstrakt poželjno potiče iz voća ili bobica Lycium barbarum-a ili se dobija iz njih.

[0046] Prema nekim načinima ostvarivanja, biljni ekstrakt ovog pronalaska dobija se ekstrakcijom iz delova biljke, određenije voća, primenom fiziološki prihvatljivog ili jestivog rastvarača kao ekstrakcionog sredstva. Unutar obima ovog pronalaska, pojam „jestivˮ označava fiziološki prihvatljivog rastvarača kog ljudsko biće može jesti.

[0047] Rastvarač prikladan za dobijanje biljnog ekstrakta predstavlja fiziološki prihvatljivu i/ili jestivu tečnost, u kojoj su biološki aktivne komponente rastvorljive i pri čemu se ne podvrgavaju značajnoj promeni koja bi ugrozila biološko dejstvo.

[0048] U nekim načinima ostvarivanja, rastvarač je hidrofilnog tipa i izabran je od vode, etanola, etilacetata ili njihovih mešavina.

[0049] Moguće je dobiti biljni ekstrakt iz voća Lycium barbarum-a pomoću konvencionalnih tehnika ekstrakcije, na primer maceracijom ili tehnikama čvrsto-tečno prikladnim za izdvajanje/ekstrakciju jedne biološki aktivne komponente ili više njih iz biljnih tkiva biljaka i njihovog voća. Takođe je moguće izvoditi ekstrakciju primenom superkritičnog CO2.

[0050] U određenim se načinima ostvarivanja ekstrakcija jedne biološki aktivne komponente ili više njih izvodi maceracijom biljnog dela ili matriksa u prikladnom rastvaraču, na primer hidroalkoholnoj mešavini.

[0051] Na primer, prikladna ekstrakcija obezbeđuje uranjanje voća Lycium barbarum-a u prikladan rastvarač, kao što je mešavina voda-etanol, tokom vremena prikladnog za obogaćivanje rastvarača jednom biološki aktivnom komponentom ili sa više njih. U određenim načinima ostvarivanja, vreme maceracije može varirati između 1 i 48 sati. Stoga se ekstrakcija biološki aktivnih komponenti prisutnih u biljnim tkivima biljke pomoću rastvarača može izvoditi difuzijom i osmozom.

[0052] Jedna od najaktivnijih komponenti koja se može ekstrahovati iz Lycium barbarum-a, određenije iz njenog voća, jeste polisaharid Lycium barbarum-a, koji se u literaturi uglavnom navodi kao LBP a koji se, u nastavku, označava i skraćenicom G.

[0053] U formulaciji kompozicije ovog pronalaska moguće je koristiti ekstrakt Lycium barbarum-a i/ili polisaharid LBP.

[0054] Polisaharid LBP može sadržati jedan monosaharid arabinoze, ramnoze, ksiloze, manoze, galaktoze, i glukoze ili više njih, a obično ih sadrži sve. Galakturonska kiselina i aminokiseline mogu biti prisutne u polisaharidnoj LBP kompoziciji.

[0055] Polisaharid LBP je obično prirodnog ili biljnog porekla, ali može biti i sintetičkog porekla, tj. dobijen postupkom za hemijsku sintezu.

[0056] Ekstrakt dobijen iz Lycium barbarum-a obično može biti tečan, mek ili suv. Na primer, u tečnom ekstraktu, 1 mL ekstrakta sadrži biološki aktivne komponente rastvorljive u 1 g biljne droge, u mekom ekstraktu, rastvarač se delimično isparava, konkretno dok ekstrakt ne navlaži filter papir, u suvom ekstraktu, rastvarač se isparava gotovo u potpunosti kako bi se dobio prah.

[0057] U određenim načinima ostvarivanja, ekstrakcija se izvodi uz upotrebu masenog odnosa između rastvarača i biljnog matriksa od između 1:10 i 10:1.

[0058] Lycium barbarum se ovde obično označava i kao godži a ekstrakt potiče od godži bobica ili se može dobiti iz njih.

[0059] Dalji postupci za dobijanje biljnog ekstrakta Lycium barbarum-a za upotrebe ovog pronalaska uključuju ekstrakcione tehnike digestije, infuzije, ceđenja, dekokcije, ispiranja, protivstrujne ekstrakcije, soksleta, ekstrakcije primenom superkritičnih gasova ili ultrazvuka.

[0060] U nekim načinima ostvarivanja, ekstrakt Lycium barbarum-a, dobijen prema bilo kom od ovde opisanih načina ostvarivanja, predstavlja fermentisan ekstrakt.

[0061] Sledeća komponenta kompozicije ovog pronalaska je ekstrakt Moringa oleifera-e, biljke koja pripada porodici Moringaceae.

[0062] Prikladan biljni ekstrakt za upotrebe ovog pronalaska može se dobijati iz korenja, lišća, voća ili cvetova Moringa oleifera-e ili iz dvaju ili više od tih delova biljke.

[0063] Unutar obima ovog opisa, Moringa oleifera se takođe naziva moringom i označava se skraćenicom M.

[0064] Prema nekim načinima ostvarivanja, biljni ekstrakt ovog pronalaska dobija se ekstrakcijom iz lišća Moringa oleifera-e, pomoću fiziološki prihvatljivog ili jestivog rastvarača kao ekstrakcionog sredstva.

[0065] Rastvarač prikladan za dobijanje biljnog ekstrakta je fiziološki prihvatljiva i/ili jestiva tečnost, u kojoj su biološki aktivne komponente rastvorljive i pri čemu se ne podvrgavaju značajnoj promeni koja bi ugrozila biološko dejstvo.

[0066] U nekim načinima ostvarivanja, rastvarač je hidrofilnog tipa i izabran je od vode, etanola, etilacetata ili njihovih mešavina. Poželjan rastvarač je hidroalkoholnog tipa.

[0067] Biljni ekstrakt iz Moringa oleifera-e može se dobiti pomoću konvencionalnih tehnika ekstrakcije, na primer pomoću tehnika čvrsto-tečno prikladnih za izdvajanje/ekstrakciju jedne biološki aktivne komponente ili više njih iz biljnih tkiva biljke ili čak primenom superkritičnog CO2.

[0068] U određenim se načinima ostvarivanja ekstrakcija jedne biološki aktivne komponente ili više njih izvodi maceracijom biljnog dela ili matriksa u prikladnom rastvaraču, na primer hidroalkoholnoj mešavini.

[0069] Na primer, lišće Moringa oleifera-e je uronjeno u prikladan rastvarač, obično mešavinu vodaetanol, tokom vremena prikladnog za obogaćivanje rastvarača jednom biološki aktivnom komponentom prisutnom u tretiranom lišću ili sa više njih. U tim se uslovima ekstrakcija biološki aktivnih komponenti prisutnih u biljnim tkivima biljke pomoću rastvarača izvodi difuzijom i osmozom. Ekstrakcija se može izvoditi i maceracijom lišća Moringa oleifera-e i njihovim držanjem u kontaktu sa rastvaračem tokom vremena prikladnog za dobijanje ekstrakcije efektivne količine jedne biološki aktivne komponente ili više njih. U određenim načinima ostvarivanja, vreme maceracije može varirati između 1 i 48 sati.

[0070] Na primer, biološki aktivne komponente koje se dobijaju ekstrakcijom pomoću hidroalkoholnog rastvarača (50:50) obuhvataju jedan od epigalokatehin galata, kvercetina, genisteina, estara kofeinske kiseline, baikaleina, morina, miricetina, rutina, biohanina a A, hrizina, taksifolina, fizetina, oktil/dodecil galata, antrahinona, kempferola, emodina ili više njih.

[0071] U nekim načinima ostvarivanja, ekstrakt Moringa oleifera-e dobijen prema bilo kom od ovde opisanih načina ostvarivanja predstavlja fermentisani ekstrakt.

[0072] Unutar obima ovog pronalaska, pojam fitoekstrakt označava ekstrakt dobijen ekstrakcijom iz jedne od pomenutih biljaka ili se odnosi na polisaharid LBP. Kompozicija ovog pronalaska obično obuhvata aktivnu količinu jedne biološki aktivne komponente ekstrahovane iz Lycium barbaruma i Moringa oleifera-e ili više njih.

[0073] Prema nekim načinima ostvarivanja, fermentisani su kako ekstrakt Lycium barbarum-a tako i ekstrakt Moringa oleifera-e.

[0074] Kompozicija ovog pronalaska može biti odobrena za trgovinu kao lek, medicinsko sredstvo ili dijetetski ili nutritivni dodatak ishrani.

[0075] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska obuhvata fiziološki i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0076] Fiziološki prihvatljiv nosač kompozicije ovog pronalaska obično predstavlja ekscipijens, nosač ili razblaživač prikladan za topikalnu primenu i/ili oralno davanje.

[0077] Unutar ovog obima, pojam „nosačˮ se odnosi na ekscipijens, nosač, razblaživač ili adjuvans koji može biti prisutan u kompoziciji ovog pronalaska. U upotrebama ovde opisanog biljnog ekstrakta ili aktivnih supstanci prisutnih u njemu uzima se u obzir bilo koji nosač i/ili ekscipijens prikladan za željeni oblik preparata za davanje.

[0078] U određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska sadrži komponente biljnog porekla koje su biološki aktivne i suštinski nemaju nuspojave kada se daju oralno ili lokalno.

[0079] Farmaceutski i/ili fiziološki prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens može se izabrati na osnovu načina davanja za koji je dobijena farmaceutska kompozicija namenjena.

[0080] U drugim načinima ostvarivanja, kompozicija je za topikalnu upotrebu i nanosi se na kožu. U nekim je načinima ostvarivanja način davanja kompozicije ovog pronalaska topikalni.

[0081] U tim slučajevima, kompozicija ovog pronalaska može biti u obliku emulzije, kreme, melema, masti, losiona.

[0082] U kozmetičkim primenama, na primer u prevenciji ili lečenju fotostarenja od izlaganja sunčevim zracima, moguće je nanositi kozmetički aktivnu količinu kompozicije ovog pronalaska na pogođenu oblast kože, jednom ili više puta dnevno, poželjno tokom perioda od najmanje 2-3 meseca.

[0083] Prema drugom aspektu ovog pronalaska, obezbeđen je postupak za kozmetičko lečenje koji obuhvata nanošenje efektivne količine kompozicije gore opisanog tipa na skalp.

[0084] Kompozicija za topikalnu primenu može biti u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku. Prikladne formulacije u čvrstom obliku uključuju kreme, gelove, meleme, paste, masti. U drugim je načinima ostvarivanja formulacija za lokalno davanje u tečnom obliku, na primer u obliku losiona, gelova, šampona, suspenzija, emulzija.

[0085] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije ovog pronalaska mogu obuhvatati ekscipijense koji se obično koriste pri formulisanju kozmetičkih ili farmaceutskih preparata za lokalnu upotrebu, kao što su konzervansi, baktericidna sredstva, stabilizatori, emulgatori, puferi, ovlaživači, sredstva za bojenje i drugi ekscipijensi koji se obično koriste u tehnikama kozmetičkih/farmaceutskih priprema.

[0086] U jednom načinu ostvarivanja, formulacija za lokalno nanošenje je u obliku emulzije koja sadrži ekstrakt kog nosi prikladan ekscipijens. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija za topikalnu primenu obuhvata ekscipijens hidroksimetilceluloznog tipa i/ili sredstva za geliranje sa HLB-om prikladnim za formulaciju i supstance.

[0087] Kompozicija može biti u obliku za oralno davanje.

[0088] Kompozicije za oralno davanje mogu biti u čvrstom ili tečnom obliku. Tipične kompozicije u čvrstom obliku obuhvataju tablete, kapsule, praškove, granule, pilule, želee. Tipične kompozicije u tečnom obliku obuhvataju rastvore, emulzije, suspenzije, sirupe. Sve kompozicije obuhvataju i svoje oblike sa kontrolisanim oslobađanjem.

[0089] Tablete uglavnom obuhvataju prikladan nosač ili ekscipijens u kom je biljni ekstrakt dispergovan, obično u suvom obliku.

[0090] U tom slučaju, prikladni ekscipijensi sadržani u formulaciji predstavljaju derivate celuloze, kao što su hidroksimetilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, metilceluloza, hidroksipropilceluloza, hidroksietilceluloza, karboksietilceluloza, etilhidroksietilceluloza, celuloza-acetatbutirat, celulozaacetatftalat i njihove mešavine.

[0091] Dalji primeri prikladnih ekscipijensa obuhvataju polimere koji pripadaju porodici laktama, kao što su pirolidon i njegovi derivati, kao što su polivinilpirolidon, polivinilpolipirolidon i njihove mešavine, neorganske soli kao što su kalcijum ili dikalcijumfosfat, lubrikante, kao što su magnezijumstearat, triacilgliceroli i njihove mešavine.

[0092] Biološki aktivne komponente ili ekstrakti sadržani u kompoziciji ovog pronalaska mogu biti prisutni u količinama koje variraju, na primer u opsegu od 0,0001mas.% do 50mas.%, od 0,1mas.% do 20mas.%, obično od 0,5 do 5mas.%.

[0093] U skladu sa određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska dalje obuhvata jednu aktivnu supstancu ili više njih, kao što su vitamini, minerali, mikronutrijenti i druge aktivne supstance.

[0094] U skladu sa nekim načinima ostvarivanja, kompozicija za oralno davanje je funkcionalna hrana, nutraceutička kompozicija, dijetetski proizvod, dodatak ishrani ili nutritivni proizvod ili medicinsko sredstvo.

[0095] Funkcionalna hrana označava bilo koji modifikovani prehrambeni proizvod ili prehrambenu

1

komponentu koja, pored tradicionalnih nutrijenata koje sadrži, može da obezbedi korist ili zaštitu od nedostatka ili fiziološkog stanja.

[0096] Nutraceutički proizvod označava proizvod koji je izolovan ili prečišćen iz jestivih supstanci. Nutraceutik je takav kada se pokaže da ima fiziološku korist ili da obezbeđuje zaštitu od nedostatka ili fiziološkog poremećaja.

[0097] Dijetetski ili nutritivni dodatak ishrani označava proizvod koji sadrži vitamin, mineral, biljni ekstrakt, aminokiselinu, metabolit, ekstrakt, koncentrat ili mešavinu tih komponenti.

[0098] Data količina i učestalost davanja kompozicije zavisiće od prirode i ozbiljnosti stanja kog treba lečiti.

[0099] Sada će ovaj pronalazak biti opisan uz pozivanje na sledeće primere koji su obezbeđeni samo u ilustrativne svrhe i koje ne treba tumačiti kao ograničenja ovog pronalaska.

PRIMER 1

Tableta obložena filmom

[0100]

Komponenta Količina (mg) Fermentisani N-acetil-L-cistein 75 - 225

N-acetil-D-glukozamin 75 - 225

Suvi ekstrakt iz semena Moringa oleifera-e 50 - 150

Suvi ekstrakt iz voća Lycium barbarum L.-a 25 - 75

Acetat vitamina E 50% 23-70

Zeaksantin 20 - 60

L-selenometionin 6 - 17

Bakarglukonat 4 - 11

Biotin 0,03 - 0,1 Mikrokristalna celuloza 110 - 330 Hidroksipropilceluloza 15-45

Polimer koji obrazuje beli film 8-25

Umrežena natrijumkarboksimetilceluloza 8-24

Magnezijumstearat (biljnog porekla) 4-12 Silicijumdioksid 2-6 Glicerol (Ph. Eur) 99,5% 1,2 - 3,7 Pigment žutog gvožđe oksida (E172) 2,3 - 6,8 Pigment crvenog gvožđe oksida (E172) 1 - 3

PRIMER 2

Tableta

[0101]

Komponenta Količina (mg) Suvi ekstrakt iz semena Moringa oleifera-e 85,7 - 114,3 Suvi ekstrakt iz voća godžija 42,9 - 57,1 Manitol 90-120 Mikrokristalna celuloza 45 - 60 Pregelirani skrob 14,1 - 18,8 Natrijumskrobglikolat tipa A 13,5 - 18,0 Magnezijumstearat 1,5 - 2,0 Hidroksipropilmetilceluloza 6,3 - 8,4 Titanijumdioksid 1,1 -1,4

PRIMER 3

Krema

[0102]

Komponenta Količina (mg) Polisorbat 60 0,8-2,3 Sorbitanmonostearat - 3

Benzilalkohol 0,5 - 1,5 Oktildodekanol 6,5 - 19,5 Suvi ekstrakt iz semena Moringa oleifera-e 0,5 - 1,5 Ekstrakt iz voća godžija 0,3 - 0,8 Cetilpalmitat 1,5 - 4,5 Cetilstearilalkohol 5-15 Voda q.s. do 100 g

PRIMER 4

Rastvor

[0103]

Komponenta Količina (mg) Etilalkohol 15,1 - 21,7 Dinatrijum EDTA dihidrat 0,03 - 0,09 PEG-40 hidrogenovano ricinusovo ulje 0,8 - 2,3 Ekstrakt iz semena moringe 1 - 3 Ekstrakt iz voća godžija 1 - 3 Etoksidiglikol 0,3 - 0,8 Voda q.s. do 100 g

PRIMER 5

Tečna emulzija

[0104]

Komponenta Količina (mg) Alantoin 0,1 -0,3 EDTA dinatrijumdihidrat 0,1 -0,2

1

Ksantan guma 0,1 -0,2

Ekstrakt iz semena Moringa oleifera-e 0,1 -5,0

Umreženi-polimer-6 poliakrilat 0,3 - 0,8

Emulgator olivoil avenat 2 - 6

Ulje iz semena bele limnante 1,5 - 4,5

Skvalan 1,5 - 4,5

Di-n-butiladipat 3 - 9

Cetiol Ultimat 1 - 3

Glicerilstearat 0,8 - 2,3 Cetilstearilalkohol 0,8 - 2,3

Acticire 0,8 - 2,3

Ekstrakt iz voća Lycium barbarum-a 0,05-5,0

Prirodni vitamin E 0,1 -0,3

Stearilgliciretinat 0,1 -0,2

Dimetikon 0,5 - 1,5

Glicerol 1,5-4,5

Euksil PE9010 0,5 - 1,5

O-cimen-5-ol 0,1 -0,2

Zeastat 0,7 - 2

Parfem 0,3-0,8

90% mlečna kiselina 0,1 -0,3

Voda q.s. do 100 g

PRIMER 6

Uporedni eksperimentalni testovi

Predmet eksperimentalnog rada

[0105] Predmet ovog in vitro ispitivanja jeste proučavanje efekata dvaju biljnih ekstrakata, ekstrakta moringe odnosno ekstrakta godžija, koji su ispitivani sami i u kombinaciji, na proliferaciju, zaštitu i oporavak od oksidativnog stresa indukovanog u ćelijskim linijama.

MATERIJALI

Ispitivani uzorci

[0106]

Korišćeni reagensi i instrumenti

[0107]

1

Korišćeni biološki modeli

Kulture humanih keratinocita

[0108] Korišćena je imortalizovana linija humanih keratinocita NCTC 2544 (Perry VP et al., 1957), držana u sterilnim bocama (25 cm<3>) s podlogom, inkubirana na 37°C, u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2u RPMI podlozi za uzgajanje dopunjenoj 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina.

[0109] Svaka 2 dana je, nakon postizanja monosloja, izvođeno deljenje 1:3 ispiranjem pomoću 1X PBS-a

1

(fosfatni pufer bez Ca<2+>i Mg<2+>) i odvajanja ćelija tripsin-EDTA rastvorom na 37°C tokom 2 minuta. Ćelije su držane u sterilnim bocama od 25 cm<3>s podlogom i inkubirane na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.

Kontrole

MTT TEST

[0110] POZITIVNA KONTROLA: Netretirane ćelije u RPMI-ju koji je dopunjen 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina i držane u pločicama od 25 cm<2>(96 bazenčića) s podlogom na 37°C i 5% CO2.

TEST MTT INDUKOVANOG OKSIDATIVNOG STRESA

[0111] NEGATIVNA KONTROLA: Netretirane ćelije u RPMI-ju koji je dopunjen 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina i držane u pločicama od 25 cm<2>(96 bazenčića) s podlogom na 37°C i 5% CO2(u mraku).

[0112] POZITIVNA KONTROLA: Ćelije tretirane tokom 2h pomoću 1 mM vodonikperoksida u RPMI-ju koji je dopunjen 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina i držane u pločicama od 25 cm<2>(96 bazenčića) s podlogom na 37°C i 5% CO2(u mraku).

Postupci

MTT (proliferacija ćelija) kod humane keratinocitne ćelijske linije NCTC2544

Princip postupka

[0113] MTT test (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijumbromid) predstavlja kolorimetrijski test koji se koristi za procenu proliferacije ćelija in vitro jer omogućava merenje proliferacije i vijabilnosti

1

ćelija procenom aktivnosti mitohondrija [162]. Taj je postupak veoma koristan za merenje rasta ćelija nakon tretiranja mitogenim sredstvima, antigenskim stimulusima, faktorima rasta i za ispitivanja citotoksičnosti.

[0114] Test uključuje upotrebu hromogenog oksidacionog sredstva, MTT, koje se sastoji od policikličnog sistema (C18H16BrN5S) koji uključuje prsten tetrazola koji se može lako redukovati dehidrogenazama mitohondrija ili drugim sistemima transporta elektrona, koji, otvaranjem prstena tetrazola, obrazuje azotno hromogeno jedinjenje zvano formazan. Formazan obrazuje nerastvorljive kristale u unutarćelijskom okruženju, koje membrane suštinski ne propuštaju: stoga je ulazak molekula u ćeliju omogućen, ali izlazak proizvoda nije omogućen, pod uslovom da je pravilno metabolizovan, tj. ako su lanci transporta elektrona i dalje metabolički aktivni.

[0115] Kristali formazana se tada rastvaraju u dimetilsulfoksidu (DMSO) što dovodi do toga da rastvor prelazi iz žute u tamnoplavo-ljubičastu.

Eksperimentalna procedura

[0116] Test je izveden u skladu sa Mosmanovom metodom (1983), uz neke manje izmene. Humani keratinociti NCTC2544 zasejani su u pločici sa 96 bazenčića pri gustini od 5*10<4>ćelije/bazenčić i inkubirani na 37°C, sa 5% CO2, dok nije dostignuta približno 80% konfluencija.

[0117] Zatim su ćelije inkubirane tokom 24-48-72 sata sa aktivnim jedinjenjima koja treba ispitati pri sledećim koncentracijama: 10-25-50-100 i 200 µg/mL za ekstrakt moringe odnosno godžija. Dve aktivne komponente ispitane su i u kombinaciji u razmeri 2:1 pri sledećim koncentracijama: 25 µg/mL moringe i 12,5 µg/mL godžija; 50 µg/mL moringe i 25 µg/mL godžija; 100 µg/mL moringe i 50 µg/mL godžija i 200 µg/mL moringe i 100 µg/mL godžija.

[0118] Razblaživanja su pripremljena počevši od sterilnih filtriranih 1000X štok rastvora u kompletnoj podlozi i uz upotrebu RPMI podloge dopunjene 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina. Netretirane ćelije su korišćene kao pozitivna kontrola.

[0119] Po završetku svih tretiranja, podloga je izvučena i zamenjena sa 100 µL MTT rastvora (Sigma-Aldrich, Sent Luis, MO, SAD) 0,5 mg/mL u kompletnoj podlozi za uzgajanje.

[0120] Nakon 3 sata inkubacije na 37°C, podloga je izvučena a kristali formazana su rastvoreni pomoću 100 µL DMSO-a po bazenčiću (Sigma-Aldrich, Sent Luis, MO, SAD). Pločica, prekrivena aluminijumskom folijom, postavljena je na mehaničku mešalicu (Arhos 160 - PBI International, Milano, Italija) pri 120 o/min tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi.

[0121] Apsorbancija obojenog rastvora izmerena je pomoću spektrofotometrijskog čitača mikropločica (BioTek Instruments Inc., Bad Fridrihshal, Nemačka) na talasnoj dužini od 570 nm (referentna talasna

1

dužina na 630 nm).

[0122] Podaci su izraženi kao procenat vijabilnosti ćelija u odnosu na kontrolne ćelije (kont.), prema sledećoj formuli:

[0123] Sve analize su izvedene najmanje dvaput u duplikatu.

Ispitivanje zaštite od indukovanog oksidativnog stresa kod humane keratinocitne linije NCTC2544

Princip postupka

[0124] Ispitivanja koja su 2005. sproveli Rajapakse i saradnici (2005) istakla su mogućnost iskorišćavanja naširoko primenjivanog i svestranog postupka kao što je MTT test za ispitivanje in vitro antioksidativnog dejstva aktivnih jedinjenja. Tim je postupkom konkretno moguće ispitivati zaštitne efekte tih jedinjenja na ćelije koje su naknadno podvrgnute oksidativnom stresu. Indukovanje oksidativnog stresa izvedeno je inkubacijom sa vodonikperoksidom, sredstvom koje indukuje stvaranje oksidativnih oštećenja u ćelijama putem obrazovanja ROS-ova. Mogući zaštitni efekti mogu se utvrditi procenom vijabilnosti ćelija nakon oksidativnog stresa kod ćelija koje su prethodno tretirane aktivnim jedinjenjima koja treba ispitati/prethodno izložene njima, u poređenju sa ćelijama podvrgnutim istom oksidativnom stresu. Veća vijabilnost ćelija odgovaraće zaštitnom efektu ispitivanih jedinjenja.

Eksperimentalna procedura

[0125] Test je izveden u skladu sa postupkom koji su opisali Coda i saradnici (Coda et al., 2012), uz neke izmene.

[0126] Humani keratinociti NCTC2544 zasejani su u pločici sa 96 bazenčića pri gustini od 5*10<4>ćelije/bazenčić i inkubirani na 37°C, sa 5% CO2, dok nije dostignuta približno 80% konfluencija.

[0127] Zatim su ćelije inkubirane tokom 16 sati sa aktivnim jedinjenjima koja treba ispitati i odgovarajućim kontrolama, pri sledećim koncentracijama: 100 µg/mL za ekstrakt moringe i 50 µg/mL za ekstrakt godžija. Dve aktivne komponente testirane su i u kombinaciji u razmeri 2:1 pri sledećim koncentracijama: 100 µg/mL moringe i 50 µg/mL godžija.

[0128] Razblaživanja su pripremljena počevši od sterilnog filtriranog 1000X štok rastvora u DMSO-u i uz upotrebu PRMI podloge dopunjene 2,5% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina.

1

[0129] Ćelije tretirane pomoću 1mM H2O2korišćene su kao pozitivna kontrola; dok su, kao negativna kontrola, korišćene ćelije koje su držane same u podlozi za uzgajanje (RPMI 2,5% FCS). Alfatokoferol je ispitivan kao referentni antioksidans pri koncentraciji od 250 odnosno 500 µg/mL.

[0130] Po završetku 16-časovnog prethodnog tretiranja, ćelije su isprane pomoću 1X PBS-a i inkubirane 90 minuta pomoću 1mM rastvora H2O2(Sigma-Aldrich, Sent Luis, MO, SAD) u podlozi bez seruma, u mraku, na 37°C, sa 5% CO2.

[0131] Kada je faza indukovanja oksidativnog stresa završena, procenjena je vijabilnost ćelija različitih uzoraka u skladu sa postupkom opisanim u tački 4.1.2 (MTT test).

[0132] Podaci su izraženi kao procenat vijabilnosti ćelija u odnosu na nestresirane kontrolne ćelije (kont.), prema sledećoj formuli:

[0133] Sve analize su izvedene najmanje dvaput u duplikatu.

Ispitivanje dejstva oporavka od oksidativnog stresa indukovanog kod humane keratinocitne linije NCTC2544

Princip postupka

[0134] Ispitivanja koja su 2005. izveli Rajapakse i saradnici (2005) istakla su mogućnost iskorišćavanja naširoko primenjivanog i svestranog postupka kao što je MTT test za ispitivanje in vitro antioksidativnog dejstva aktivnih jedinjenja. Tim je postupkom konkretno moguće ispitivati zaštitne efekte tih jedinjenja na ćelije koje su naknadno podvrgnute oksidativnom stresu. Indukovanje oksidativnog stresa izvedeno je inkubacijom sa vodonikperoksidom, sredstvom koje indukuje stvaranje oksidativnih oštećenja u ćelijama putem obrazovanja ROS-ova. Mogući zaštitni efekti mogu se utvrditi procenom vijabilnosti ćelija nakon oksidativnog stresa kod ćelija koje su prethodno tretirane aktivnim jedinjenjima koja treba ispitati/prethodno izložene njima, u poređenju sa ćelijama podvrgnutim istom oksidativnom stresu. Veća vijabilnost ćelija odgovaraće zaštitnom efektu ispitivanih jedinjenja.

Eksperimentalna procedura

[0135] Test je izveden u skladu sa postupkom koji su opisali Coda i saradnici (Coda et al., 2012), uz neke izmene.

[0136] Humani keratinociti NCTC2544 su zasejani u pločici sa 96 bazenčića pri gustini od 5*10<4>

2

ćelije/bazenčić i inkubirani na 37°C, sa 5% CO2, dok nije dostignuta približno 80% konfluencija.

[0137] Ćelije su inkubirane tokom 90 minuta pomoću 1mM rastvora H2O2(Sigma-Aldrich, Sent Luis, MO, SAD) u podlozi bez seruma, u mraku, na 37°C i 5% CO2.

[0138] Zatim su ćelije isprane pomoću 1X PBS-a i inkubirane tokom 16 sati sa aktivnim jedinjenjima koja treba ispitati i odgovarajućim kontrolama, pri sledećim koncentracijama: 50-100 µg/mL za ekstrakt moringe i 25-50 µg/mL za ekstrakt godžija. Dve aktivne komponente testirane su i u kombinaciji u razmeri 2:1 pri sledećim koncentracijama: 50 µg/mL moringe i 25 µg/mL godžija; 100 µg/mL moringe i 50 µg/mL godžija.

[0139] Razblaživanja su pripremljena počevši od sterilnog filtriranog 1000X štok rastvora u DMSO-u i uz upotrebu PRMI podloge dopunjene 2,5% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina.

[0140] Ćelije tretirane pomoću 1mM H2O2korišćene su kao pozitivna kontrola; dok su, kao negativna kontrola, korišćene ćelije koje su držane same u podlozi za uzgajanje (RPMI 2,5% FCS).

[0141] Alfatokoferol je ispitivan kao referentni antioksidans pri koncentraciji od 250 odnosno 500 µg/mL.

[0142] Po završetku 16-časovnog prethodnog tretiranja, procenjena je vijabilnost ćelija različitih uzoraka u skladu sa postupkom opisanim u tački 4.1.2 (MTT test).

[0143] Podaci su izraženi kao procenat vijabilnosti ćelija u odnosu na nestresirane kontrolne ćelije (kont.), prema sledećoj formuli:

[0144] Sve analize su izvedene najmanje dvaput u duplikatu.

Rezultati

MTT (proliferacija ćelija) kod humane keratinocitne linije NCTC2544

[0145] Nakon 24-časovnog tretiranja (Tabela 1), nijedan od ispitivanih ekstrakata nije proizveo citotoksičnost (vijabilnost ćelija <80%) kod humane keratinocitne NCTC2544 ćelijske linije pa su vrednosti vijabilnosti ćelija do kojih se došlo slične vrednostima netretirane kontrole. Treba zapaziti značajno proliferativno dejstvo (p<0,05) ekstrakta godžija pri koncentraciji od 10 µg/mL.

[0146] Nakon 48-časovnog tretiranja, oba ekstrakta na najvišim koncentracijama tretiranja (200 i 100 µg/mL) pokazuju blagi pad vijabilnosti ćelija, iako vrednosti ostaju iznad ili približno 80% vijabilnosti ćelija (Tabela 1). Do slične situacije se došlo kada je ekstrakt godžija ispitivan na koncentracijama od 50 i 25 µg/mL i kada su dva ekstrakta ispitivana u kombinaciji (Tabela 1).

[0147] Zanimljivo je primetiti da je ekstrakt moringe koji je ispitivan na najnižim koncentracijama (25 i 10 µg/mL) pokazao proliferativno dejstvo kod humanih keratinocita nakon 48 sati tretiranja.

[0148] Situacija ostaje slična nakon tretiranja ekstraktima i njihovim kombinacijama tokom 72h.

Citotoksični efekat (% vijabilnosti niži od 80%) javljao se kada su ćelije tretirane najvišim koncentracijama (200 i 100 µg/mL) dvaju ekstrakata. Određenije, taj efekat je, za ekstrakt godžija, postojan do koncentracije od 25 µg/mL.

Ispitivane koncentracije % vijabilnosti ćelija/kontrola ± SEM

(µg/mL) 24h 48h 72h Kontrola* 100,003,21 ± 100,007,17 ± 100,00 ±

6,65 Ekstrakt moringe 200 µg/mL 102,58 ± 1,13 84,060,37c ± 77,49 ± 1,54f 100 µg/mL 102,82 ± 1,71 80,582,22d ± 66,09 ±

4,97g

50 µg/mL 100,20 ± 0,50 102,091,17 ± 80,24 ±

3,88d

25 µg/mL 95,551,59 ± 111,45 ± 81,11 ±

0,21e 2,60d

10 µg/mL 100,81 ± 2,55 109,826,78 ± 84,58 ±

4,67<c>Ekstrakt godžija 200 µg/mL 101,12 ± 5,94 82,056,76<d>± 39,14 ±

7,35<h>

100 µg/mL 104,63 ± 1,37 85,2616,97<d>± 25,84 ± 0,03<i>50 µg/mL 101,69 ± 5,68 77,557,457<d>± 72,87 ± 3,08<f>25 µg/mL 99,852,54 ± 78,87 ± 72,57 ± 0,51<f>7,657<d>

10 µg/mL 106,13 ± 93,462,777 ± 78,48 ±

3,87<a>8,41<d>Kombinacija 100+50 µg/mL 90,21 ± 80,16 ± 84,31 ± ekstrakt moringe ekstrakt 0,29<b>2,19d 3,50<c>godžija (2:1) 50+25 µg/mL 98,42 ± 81,98 ± 79,92 ±

0,29 5,677<d>1,95<d>200+100 µg/mL 97,12 ± 71,54 ± 83,33 ±

2,79 8,377<d>2,05<c>25+12,5 µg/mL 98,56 ± 89,87 ± 74,09 ±

1,97 6,50 4,90<f>Tabela 1. Vijabilnost ćelija. % Vijabilnosti ćelija kod humanih keratinocita NCTC2544 nakon tretiranja tokom 24, 48 i 72 h sa 10-25-50-100 i 200 µg/mL ekstrakata moringe i godžija te u kombinaciji u razmeri 2:1 pri sledećim koncentracijama: 25 µg/mL moringe i 12, 5 µg/mL godžija; 50 µg/mL moringe i 25 µg/mL godžija; 100 µg/mL moringe i 50 µg/mL godžija; i 200 µg/mL moringe i 100 µg/mL godžija

<a-i>Vrednosti sa različitim slovima u eksponentu razlikuju se značajno (p<0,005).

Ispitivanje zaštite od oksidativnog stresa indukovanog kod humane keratinocitne linije NCTC2544

[0149] Pokazalo se da inkubacija humanih keratinocita tokom 16h sa ekstraktima moringe i godžija, samih ili u kombinaciji, može da zaštiti ćelije od oksidativnog stresa indukovanog primernom vodonikperoksida (1mM H2O2).

[0150] Određenije, ekstrakt moringe bio je značajno efikasniji od ekstrakta godžija (Fig.1) na istoj koncentraciji a taj se efekat može uporediti sa efektom alfatokoferola ispitivanog na 250 odnosno 500µM.

[0151] Štaviše, kada su dva ekstrakta testirana u kombinaciji, zabeležen je značajan (p<0,05) sinergetski efekat na dejstvo zaštite vijabilnosti ćelija nakon oksidativnog stresa, uglavnom na najvišim koncentracijama (moringa 100 µg/mL i godži 50 µg/mL), kao što je prikazano na Tabeli 2.

[0152] Ti su podaci prikazani na Fig.1 koji pokazuje procenat vijabilnosti ćelija kod humanih keratinocita

2

NCTC2544 nakon indukovanja oksidativnog stresa indukovanog pomoću 1mM H2O2. Ćelije su prethodno inkubirane tokom 16h sa 100 i 50 µg/mL ekstrakata moringe i godžija te u kombinaciji u razmeri 2:1: 100 µg/mL moringe i 50 µg/mL godžija.

* (p<0,05)

[0153] Pokazalo se da inkubacija humanih keratinocita tokom 16h sa ekstraktima moringe i godžija, samih ili u kombinaciji, može da olakša oporavak vijabilnosti ćelija nakon indukovanja oksidativnog stresa indukovanog primenom vodonikperoksida (1mM H2O2).

[0154] Određenije, oba ekstrakta su uspela da značajno indukuju (p<0,005) vijabilnost ćelija humanih keratinocita nakon indukovanog oksidativnog stresa (Fig.2) na istoj koncentraciji i taj se efekat može uporediti sa efektom alfatokoferola ispitivanog na 250 odnosno 500µM.

[0155] Štaviše, kada su dva ekstrakta testirana u kombinaciji, postojao je značajan (p<0,05) sinergetski efekat na dejstvo zaštite vijabilnosti ćelija, uglavnom na najvišoj koncentraciji (moringa 100 µg/mL i godži 50 µg/mL). Podaci su prikazani u Tabeli 3.

[0156] Kao što je prikazano na Fig.2, zaštita koju je ispoljavala kombinacija dveju aktivnih komponenti bila je slična zaštiti koju je ispoljavao alfatokoferol, korišćen kao referentni antioksidans.

[0157] Konkretno, Fig.2 prikazuje oporavak vijabilnosti ćelija nakon indukovanog oksidativnog stresa isticanjem procenta vijabilnosti ćelija kod humanih keratinocita NCTC2544 nakon indukovanja oksidativnog stresa indukovanog pomoću 1mM H2O2. Nakon indukovanja oksidativnog stresa, ćelije su inkubirane tokom 16h sa 100 i 50 µg/mL ekstrakata moringe i godžija te u kombinaciji u razmeri 2:1: 50 µg/mL moringe i 25 µg/mL godžija; 100 µg/mL moringe i 50 µg/mL godžija.

*(p<0,05), **(p<0,01)

STATISTIČKA ANALIZA

[0158] Svi podaci su dobijeni najmanje u triplikatima. Na obrađenim podacima izvedena je analiza varijanse (ANOVA), nakon čega je usledila separacija srednjih vrednosti pomoću Studentovog t-testa, primenom GraphPad Prism verzije 7.00 za Vindouz, GraphPad Software (San Dijego Kalifornija SAD, www.graphpad.com).

Bibliografske reference:

[0159]

Mosmann T, 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J Immunol Methods 65(1-2), 55-63.

Coda R, Rizzello CG, Pinto D, Gobbetti M, 2012. Selected Lactic Acid Bacteria Synthesize Antioxidant Peptides during Sourdough Fermentation of Cereal Flours. Appl Environ Microbiol 78(4), 1087-1096.

PRIMER 7

[0160] Za ispitivanje sinergetskog dejstva kombinacije dvaju ekstrakata moringe i godžija, izvedene su dve vrste in vitro procene na ćelijskoj liniji:

1- Antioksidativno dejstvo, vodonikperoksidom kao sredstvom koje može da indukuje visok oksidativni stres koji dovodi do apoptoze ćelija, u kojoj su ekstrakti ispitivani (sami ili u kombinaciji) u pogledu oporavka -saniranja štete- i zaštite od oksidativnog stresa;

2- Dejstvo zaštite od UVA oštećenja, u kojoj su ekstrakti procenjeni, sami ili u kombinaciji, pomoću postupka naznačenog u nastavku.

2

Procena antioksidativnog dejstva

Materijali i postupci

[0161] Materijali i postupci su isti kao oni opisani u Primeru 6 i na njih se ovde poziva.

Rezultati

[0162] Kako bi se bolje izrazili rezultati biološke aktivnosti za ispitivanje oksidativnog stresa pomoću H2O2, podaci su u tabeli iskazani kao % poboljšanja u odnosu na stresirane ćelije, kao što je navedeno u ostalim studijama iz literature (npr. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5122827/).

[0163] Rezultati, dobijeni posle oštećenja pomoću H2O2nakon čega je usledilo tretiranje ekstraktima, pokazuju kako sami ekstrakti imaju dejstvo saniranja štete koja dovodi do apoptoze indukovane oksidativnim stresom i oporavka od nje, sa sinergetskim efektom za razmere prikazane u tabeli koja sledi.

Oporavak

[0164]

2

[0165] Što se tiče zaštite od oksidativnog stresa, pri čemu je tretiranje ekstraktima, samim ili u kombinaciji prema određenim razmerama, izvedeno pre inkubacije sa vodonikperoksidom, rezultati pokazuju sinergetski efekat kombinacija.

Zaštita

[0166]

Procena dejstva zaštite od UVA

Materijali i postupci

- Kulture humanih keratinocita

2

[0167] Korišćena je imortalizovana linija humanih keratinocita NCTC 2544 (Perry VP et al., 1957) držana u sterilnim bocama (25 cm<3>) s podlogom, inkubirana na 37°C, u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2, u RPMI podlozi za uzgajanje dopunjenoj 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina.

[0168] Svaka 2 dana je, nakon postizanja monosloja, izvođeno deljenje 1:3 ispiranjem pomoću 1X PBS-a (fosfatni pufer bez Ca<2+>i Mg<2+>) i odvajanja ćelija tripsin-EDTA rastvorom na 37°C tokom 2 minuta. Ćelije su držane u sterilnim bocama od 25 cm<3>s podlogom i inkubirane na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2.

- Kontrole

[0169] Negativna kontrola: Netretirane ćelije u RPMI-ju koji je dopunjen 2,5% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina i držane u pločicama od 25 cm<2>(96 bazenčića) s podlogom na 37°C i 5% CO2. Pozitivna kontrola: Stresirane ćelije (UVA 10J/cm<2>) u RPMI-ju koji je dopunjen 2,5% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina i održavane u pločicama od 25 cm<2>(96 bazenčića) s podlogom na 37°C i 5% CO2.

- Ispitivanje zaštite od stresa indukovanog UVA zracima

[0170] Test je izveden u skladu sa postupkom koji su opisali Fiori i saradnici (Fiori et al., 2017), uz neke izmene.

[0171] Humani keratinociti NCTC2544 su zasejani u pločici sa 96 bazenčića pri gustini od

5*10<4>ćelije/bazenčić i inkubirani na 37°C, sa 5% CO2, dok nije dostignuta približno 80% konfluencija.

[0172] Zatim su ćelije inkubirane tokom 16 sati sa aktivnim jedinjenjima koja treba ispitati i odgovarajućim kontrolama, pri sledećim koncentracijama: 150 i 250 µg/mL za ekstrakt moringe i 50 µg/mL za ekstrakt godžija. Dve aktivne komponente testirane su i u kombinaciji u sledećim razmerama: 3:1 i 5:1.

2

[0173] Razblaživanja su pripremljena počevši od sterilnog filtriranog 1000X štok rastvora u DMSO-u i uz upotrebu PRMI podloge dopunjene 2,5% fetalnim goveđim serumom (FBS), sa 2mM glutamina, u prisustvu 1% penicilina i streptomicina te 0,1% gentamicina.

[0174] Nestresirane ćelije (bez UV-ova) korišćene su kao negativna kontrola; dok su, kao pozitivna kontrola, korišćene ćelije koje su držane same u podlozi za uzgajanje (RPMI 2,5% FBS) i koje su redom stresirane UVA zracima (10J/cm<2>).

[0175] Po završetku 16-časovnog prethodnog tretiranja, ćelije su isprane pomoću 1X PBS-a i redom podvrgnute UVA zračenju pomoću komore za UVA zračenje (Opsytech, Nemačka), dok nije dostignuta željena doza zračenja. Po završetku zračenja, PBS je eliminisan a ćelije su inkubirane još 24h u RPMI-ju sa 2,5% FBS-om na 37°C i 5% CO2.

[0176] Po isteku 24h, procenjena je vijabilnost ćelija različitih uzoraka u skladu sa (gore opisanim) postupkom za MTT testiranje.

[0177] Podaci su izraženi kao procenat vijabilnosti ćelija u odnosu na nestresirane kontrolne ćelije (kont.), prema sledećoj formuli:

[0178] Sve analize su izvedene najmanje dvaput u duplikatu.

Rezultati

[0179] Drugi skup eksperimenata omogućio je procenu zaštite koju pružaju ekstrakti u slučaju UVA zračenja.

[0180] Što se tiče podataka o zaštiti nakon UVA zračenja, rezultati podvlače sinergetski efekat ekstrakata u razmeri M/G 3:1 i 5:1, uz povećanje vijabilnosti ćelija za 25% odnosno 19%.

2

Claims

Bibliografske reference [0181] Enrica Flori, Arianna Mastrofrancesco, Daniela Kovacs, Barbara Bellei, Stefania Briganti, Vittoria Maresca, Giorgia Cardinali, and Mauro Picardo, "The activation of PPARγ by 2,4,6-Octatrienoic acid protects human keratinocytes from UVR-induced damages," Scientific Reports, vol.7, no.1, 2017. Patentni zahtevi 1. Kompozicija koja obuhvata ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a u kombinaciji sa ekstraktom Moringa oleifera-e i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju oštećenja kože izazvanih izlaganjem ultraljubičastom zračenju, pri čemu je ekstrakt Moringa oleifera-e u razmeri od između 1:7 i 5:1 u odnosu na ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a.
2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu su pomenuta oštećenja kože izabrana od aktiničkog oštećenja, hroničnog aktiničkog oštećenja, prekanceroznih kožnih lezija, nemelanomskog kancera kože.
3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je ekstrakt Moringa oleifera-e u razmeri od između 1:3 i 3:1 u odnosu na ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a.
4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu ultraljubičasto zračenje sadrži UV-A, UV-B, UV-C i potiče od sunčevih zraka.
5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu se ekstrakt Lycium barbarum-a dobija ekstrakcijom iz njegovog voća, dok se ekstrakt Moringa oleifera-e dobija ekstrakcijom iz njenog lišća.
6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, naznačena činjenicom da je u obliku za oralno davanje ili za topikalnu primenu.
7. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena činjenicom da je u obliku za oralno davanje i da dalje obuhvata komponente izabrane od vitamina, minerala, mikronutrijenata i njihovih mešavina.
8. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena činjenicom da je u obliku za topikalnu primenu i da dalje obuhvata pomoćne komponente izabrane od aktivnih supstanci i ekscipijensa korišćenih u oblasti kozmetike ili njihovih mešavina.
9. Kozmetička upotreba kompozicije u prevenciji ili popravljanju estetskog oštećenja kože ili starenja kože izazvanog izlaganjem ultraljubičastom zračenju, pri čemu pomenuta kompozicija obuhvata ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a u kombinaciji sa ekstraktom Moringa oleifera-e i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu je ekstrakt Moringa oleifera-e u razmeri od između 1:7 i 5:1 u odnosu na ekstrakt Lycium barbarum-a ili polisaharid Lycium barbarum-a.
10. Upotreba prema zahtevu 9, pri čemu estetsko oštećenje obuhvata jedno od nabiranja kože, grubosti kože, zadebljanja kože, dehidratacije kože, boranja kože i fotostarenja ili više njih.
11. Upotreba prema zahtevu 9, naznačena činjenicom da je u obliku za oralno davanje, određenije u obliku nutraceutika, dodatka ishrani, ili za topikalnu primenu, određenije u obliku kreme, melema ili masti, emulzije, suspenzije, gela, rastvora ili sredstva za lokalno davanje.
12. Upotreba prema zahtevu 11, pri čemu je pomenuta kompozicija u obliku za oralno davanje i dalje obuhvata komponente izabrane od vitamina, minerala, mikronutrijenata i njihovih mešavina.
13. Upotreba prema zahtevu 11, pri čemu je pomenuta kompozicija u obliku za topikalnu primenu i dalje obuhvata pomoćne komponente izabrane od aktivnih supstanci i ekscipijensa korišćenih u oblasti kozmetike ili njihovih mešavina. 1