RS65322B1 - Terapija mic-om za specifičnu imunosupresiju kod transplantacije - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije sa izolovanim i tretiranim celim krvnim ćelijama ili mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), kao i na farmaceutske kompozicije za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju odbacivanja solidnog organa ili ćelijskog transplantata kod ljudi primaoca grafta. Predmetni pronalazak je izložen u priloženim zahtevima. Reference na metode lečenja u narednim paragrafima ovog opisa treba da se tumače kao reference na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog tela terapijom.

[0002] Usled raznih bolesti ili nesreća ili mnogih drugih razloga, pacijentima i povređenim ljudima je potrebna zamena svojih organa transplantacijom organa. Prema According to the Global Observatory on Donation and Transplantation (http://www.transplantobservatory.org/), u 2016. godini u svetu je presađeno ukupno 135.860 organa. Broj pacijenata kojima je to potrebno i koji su trenutno na listi čekanja, međutim, daleko je više. Pored uporedivo malog broja davalaca organa, donirani organi i primaoci takođe moraju biti podudarni kako bi se smanjio rizik od odbacivanja od strane imunološkog sistema primaoca i time povećala mogućnost i trajanje funkcionalnosti transplantiranog organa.

[0003] Imuni sistem sisara, posebno čoveka, mora da razlikuje između sopstvenog i nespostvenog i prepoznaje, kao i da se bori sa celokupnim tuđim materijalom koji može da bude štetan za organizam. Pored prepoznavanja ćelija ili drugih delova kao što su nukleinske kiseline nesopstvenog organizma kao npr. od bakterija ili virusa, imuni sistem takođe prepoznaje (i mora da prepozna) ćelije ili druge delove nespostvenog organizma koji pripadaju istoj vrsti. Ovaj aspekt je jedan od glavnih nedostataka u medicinskoj transplantaciji organa ili ćelija, jer će obično imuni sistem primaoca prepoznati transplantirani organ ili ćelije kao nespostvene i napada i uništava transplantirani organ ili ćelije. Ovaj prirodni, odbrambeni mehanizam organizma sisara, posebno čovečjeg organizma, jedan je od glavnih razloga za neuspešne transplantacije ili za nestajanje funkcionalnosti transplantiranog organa tokom vremena. Da bi se smanjio rizik za pacijenta posredovan sposobnošću imunog sistema da prepozna i napadne transplantaciju, obično se biraju donor i primalac sa sličnim ćelijskim obrascima koji služe kao posebna karakteristika spostvenog i nespostvenog. Takvo poklapanje donatora i primaoca se često, ali ne nužno, postiže kod bliskih rođaka.

[0004] Međutim, pošto su ove posebne karakteristike i dalje različite čak i kod najbližih rođaka, takvo poklapanje nije dovoljno da spreči imunski odgovor na transplantaciju. Stoga je obavezan i standardni pristup daljem suzbijanju imunog sistema primaoca kako bi se snažno smanjio rizik od imunološkog odgovora na transplantaciju.

[0005] Tipično, endogeni imuni sistem je na taj način široko i nespecifično potisnut tako da transplantacija nije napadnuta imunskim odgovorom i može preživeti i delovati dugo vremena u telu primaoca i da bi se izbegao preterani i opasan inflamatorni odgovor za pacijenta.

[0006] Sadašnje stanje tehnike za takav tretman pacijenata nakon transplantacije je istovremeni tretman sa brojnim lekovima koji slabe imuni sistem pacijenta na nespecifičan način. Na primer, trenutno uspostavljeni tretman za transplantaciju bubrega je višestruka imunosupresija koja se sastoji od terapije indukcije antitela, inhibitora kalcineurina (npr. ciklosporin A, Sandimmun®), inhibitora ćelijske proliferacije (npr. mikofenolna kiselina, derivati MPA) i kortikosteroida (Ekberg H et al., NEJM 2007).

[0007] Primaoci transplanta stoga obično zavise od supresije imuniteta tokom ostatka svog života. Jedan od glavnih nedostataka takvog tretmana je da je imuni sistem kao takav potisnut, kao što je gore opisano. Dakle, imuni sistem primaoca je takođe potisnut za bilo koji drugi organizam, ćeliju ili drugi materijal koji nije njegov sopstven. Primaoci su stoga izloženi velikom riziku od bilo koje zarazne bolesti. Štaviše, neželjeni efekti potisnutog imunog sistema posebno uključuju oštećeno zarastanje rana, povećan rizik od tumorskih bolesti i značajno povećanje rizika od kardiovaskularnih bolesti (Morath C et al., JASN 2004, Opelz G et al., AJT 2013).

[0008] Štaviše, još jedan problem trenutne imunosupresije kod primaoca transplantata je „ograničena“ efikasnost: poznato je da, uprkos dugotrajnoj intenzivnoj imunosupresiji, više od polovine pacijenata pati od hroničnog odbacivanja i dugotrajnog gubitka transplanta (Sellares J et al., AJT 2012).

[0009] Do danas, primaoci transplanta su vezani za imunosupresiju tokom celog života i sa svim njenim nedostacima, uz, ipak, i dalje postoji rizik da se hronično odbacivanje i dalje može desiti.

[0010] Kleist et al., "Generation of suppressive blood cells for control of allograft rejection.", CLINICAL SCIENCE (LONDON, ENGLAND: 1979) MAY 2015, vol. 128, no.

9, May 2015 (2015-05), stranice 593-607 generalno opisuje stvaranje krvnih ćelija za lečenje odbacivanja alografta korišćenjem mitomicina C.

[0011] Metode za pripremu PBMC su generalno opisane u Jiga et al., "Inhibition of heart allograft rejection with mitomycin C-treated donor dendritic cells", TRANSPLANTATION, WILLIAMS AND WILKINS, GB, vol. 83, no.3, 15 February 2007 (2007-02-15), stranice 347-350 i u US 2018/057792 A1.

[0012] WO 2010/000730 A1 uopšteno opisuje postupak za lečenje primaoca transplantata, uključujući primenu tretiranih krvnih ćelija davaoca.

[0013] Ehser et al., "Suppressive dendritic cells as a tool for controlling allograft rejection in organ transplantation: Promises and difficulties", HUMAN IMMUNOLOGY, NEW YORK, NY, US, vol.69, no.3, 1 March 2008 (2008-03-01), stranive 165-173 generalno opisuje da se dendritičke ćelije donora mogu koristiti za kontrolu odbacivanja alografta.

[0014] Yamazaki et al., "Successful treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in allogeneic marrow transplant recipient with the donor leukocyte transfusion, without induction of acute graft-versus-host disease", RINSHO KETSUEKI - JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL HEMATOLOGY, NIHON RINSHO KETSUEKI GAKKAI, JP, vol.

36, no. 7, 30 June 1995 (1995-06-30), stranice 677-681 opisuje transfuzije leukocita donora.

[0015] Primarni cilj sadašnjeg pronalaska je stoga bio da obezbedi poboljšanu prevenciju i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelije kod primaoca humanog transplantata, sa kojim se prevazilaze ili barem smanjuju nedostaci trenutnih opcija.

[0016] Primarni cilj ovog pronalaska se postiže farmaceutskom kompozicijom koja sadrži ili se sastoji od:

a) izolovane ćelije cele krvi i/ili mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) tretirane terapeutski efikasnom količinom aktivne supstance, i

b) opciono farmaceutski prihvatljiv nosač,

za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju odbacivanja transplantata organa (grafta) ili ćelija kod primaoca humanog transplantata, pri čemu se izolovane celije krvi ili PBMC dobijaju ili potiču od donora transplantata,

pri čemu prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje farmaceutske kompozicije primaocu, pri čemu je količina farmaceutske kompozicije odabrana tako da najmanje 0,25 × 10<6>ćelija, poželjno najmanje 1,5 × 10<6>ćelija tretiranog celih krvnih zrnaca ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca se administriraju, poželjno u jednom koraku primene,

pri čemu prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1 × 10<8>ćelija tretiranih celih krvnih zrnaca ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se davanje izvodi najmanje 5 dana pre transplantacije,

pri čemu aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine hemoterapeutici, inhibitori proteazoma, imunosupresivna sredstva i antiproliferativne supstance.

[0017] Razvijanje alternative nespecifičnoj imunosupresiji treba da bude kurativni, a ne simptomatski tretman. Cilj je da se utiče na imuni sistem na način da on i dalje bude u stanju da se brani od bakterija, virusa, tumorskih ćelija itd., ali da se neželjene reakcije imunog sistema, npr. g. protiv karakteristika stranih donatora, mogu posebno isključiti. Tretiranjem krvnih zrnaca, npr. monocita aktivnim supstancama, npr. mitomicinom C (mononuklearne ćelije periferne krvi tretirane mitomicinom C = modifikovane imunske ćelije = MIC), one se ne pretvaraju u stimulativne, već pre u supresivne ćelije slične supresorskim ćelijama dobijenim od mijeloida (MDSC) pacijenata sa rakom.

[0018] U WO 2010/000730 je opisano da farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovane krvne ćelije tretirane terapeutski efikasnom količinom hemoterapeutskog agensa može da se koristi za obezbeđivanje i postizanje prilagođene ili ciljane imunosupresije u okruženju autoimunih bolesti. Kada se aktivna supstanca ispere, gde je primenljivo, MIC se ponovo infundiraju u telo primaoca transplantata. WO 2010/000730 stoga posebno otkriva specifičan tretman za model multiple skleroze kod miševa (eksperimentalni autoimuni encefalitis (EAE) mišji model) za visoko specifično podešavanje u vezi sa režimom doziranja koji se primenjuje na mišjem modelu, tačnije za autoimune EAE modele.

[0019] Standardna procedura kako je prethodno primenjena sastoji se od primene imunosupresivnih lekova koji dovode do opšteg slabljenja imunog sistema i pratećih neželjenih efekata. Ovako oštar tretman hemijski imunosupresivnim agensom više neće biti neophodan kad počnu da se primenjuju saznanja predmetnog pronalaska, pošto se količina imunosupresivnih lekova može da smanji na minimum ili više uopšte nije neophodna kod pacijenata koji se leče farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku.

[0020] Pronalazak nudi posebno pripremljenu imunosupresiju specifičnog za pacijenta koja se bavi uzrocima i bez neželjenih efekata je, čime se značajno razlikuje od trenutno dostupnih metoda lečenja. Ćelijska terapija se može proizvesti centralno u standardnom obliku za pojedinačne indikacije; pojedinačna komponenta se postiže krvnim ćelijama donora i nema potrebe za skupim prilagođavanjem. Metoda je laka za implementaciju u rutinskoj kliničkoj praksi, jer koristi postojeće strukture, a bolnice ne moraju da se obavežu na skupa ulaganja u posebne laboratorije. Konačno, troškovi lečenja su značajno smanjeni, jer doživotno lečenje lekovima više nije potrebno, ili je znatno smanjeno.

[0021] Lečenje ili prevencija odbacivanja primenom MIC ima superiornu ili barem ekvivalentnu efikasnost u poređenju sa zlatnim standardom imunosupresije sa više lekova, dok su u isto vreme smanjeni neželjeni efekti. Stoga je to ogromna korist za pacijente uz velike ekonomske perspektive.

[0022] Poseban tretman, tj. posebno specifičan režim doziranja, ima izuzetan značaj za obezbeđivanje optimizovane terapije. S jedne strane, imuni sistem sisara, posebno ljudi, je strogo regulisan i supresivni efekat imunog sistema će takođe biti izazvan malim dozama administriranih tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC. Međutim, pretpostavlja se da je u ovom slučaju potrebno više vremena da se postigne i reši sveobuhvatna i dugotrajna ciljana supresija imunog sistema.

[0023] Stoga se očekuje da će veća doza obezbediti prilagođenu imunosupresiju za kraće vreme.

[0024] S druge strane, povećanje doze takođe može dostići granicu, jer sa većim dozama se povećava rizik za npr. izazivanjem tromboze ili embolije. Pošto ove nuspojave sigurno treba izbegavati, kritičnu pažnju treba obratiti na određeni režim doziranja. Treba napomenuti, međutim, da se prilagođena supresija imunog sistema takođe postiže tako visokim dozama, ali kada se radi o mogućoj opciji lečenja za primaoce humanog transplantata, ovaj faktor takođe treba uzeti u obzir.

[0025] Nađeno je da režim doziranja tretiranih ćelija, kao što je gore opisano, od najmanje 0,25 × 10<6>ćelija po kg telesne težine, poželjno najmanje 1,5 × 10<6>ćelija po kg telesne težine primaoca humanog transplantata, pokazuje stabilan funkcija grafta, preživljavanje transplantata i pacijenta i bez odbacivanja ili neželjenih efekata u vezi sa lečenjem (uporedi primer 1).

[0026] Izrazi "pacijent", "subjekt", "primalac" ili "primalac grafta/transplantata" kako se ovde koriste mogu da se koriste naizmenično i opisuju pacijenta kome je potrebna ili koji planira transplantaciju organa ili ćelije, kao i pacijenta koji se već podvrgao transplantaciji organa, pri čemu je transplantacija možda izvršena mesecima, godinama ili decenijama unazad.

[0027] Termin "donator" kako se ovde koristi prvenstveno opisuje osobu koja donira cele krvne ćelije. Ova osoba, bilo da je živi ili mrtvi donor, može biti donor transplantiranog organa. U nekim slučajevima, međutim, pacijent može biti i donor.

[0028] Termin "izolovane ćelije cele krvi" prvenstveno opisuje ćelije dobijene iz uzorka krvi ili iz ćelija slezine. Krvne ćelije se mogu dobiti vađenjem krvi od donora, opciono uključujući leukaferezu. Dalje, krvne ćelije se takođe mogu izolovati iz ćelija slezine. Posebno poželjno, izraz "izolovane cele krvne ćelije" opisuje bela krvna zrnca koja su dobijena leukaferezom kao što je gore opisano ili koja su dalje izolovana iz krvnih ćelija dobijenih kao što je gore opisano, metodama koje su dobro poznate stručnjaku.

[0029] Termin "PBMC" ili "Mononuklearne ćelije periferne krvi" opisuju različit tip ćelija perifernih krvnih ćelija sa jednim okruglim jezgrom, kao što su limfociti, monociti ili dendritične ćelije. PBMC se mogu ekstrahovati iz cele krvi pomoću fikola (ficoll), hidrofilnog polisaharida koji odvaja slojeve krvi, sa monocitima i limfocitima koji formiraju mekani omotač ispod sloja plazme. Ovaj mekani omotač sadrži PBMC. Pored toga, PBMC se može ekstrahovati iz cele krvi hipotoničnom lizom koja će prvenstveno lizirati crvena krvna zrnca. Ovaj metod obično dovodi do neutrofila i drugih polimorfonuklearnih (PMN) ćelija. Štaviše, PBMC se takođe mogu dobiti iz pune krvi leukaferezom. Ova metoda obično dovodi do PBMC, PMN, nekih eritrocita i trombocita.

[0030] Poželjno je da se PBMC sadrže ili se sastoje od monocita i limfocita.

[0031] Tipično, izolovane ćelije cele krvi i/ili PBMC se dobijaju od donora prikupljanjem uzorka krvi, opciono uključujući leukaferezu. U nekim slučajevima, proizvod leukafereze se takođe može lečiti fikolom.

[0032] Dodatno ili alternativno, ove ćelije su izvedene od donora, npr. ciljanom diferencijacijom matičnih ćelija dobijenih od donora. Obično se takve ćelije dobijaju ili izvode od jednog donora. Međutim, moguća su i dva ili više donora. U ovom slučaju, izraz "donator" može uključivati jednog, dva, nekoliko ili sve donore.

[0033] Generalno, poželjno je da se ćelije proizvode pod uslovima dobre proizvođačke prakse (Good Manufacturing Practice , GMP).

[0034] Tipično, broj ćelija se meri ručnim ili automatskim brojanjem ćelija. Brojanje ćelija se poželjno izvodi sa bojom za živo/mrtvo bojenje tako da se može odrediti količina živih ćelija. Štaviše, sastav ćelija u proizvodu se analizira protočnom citometrijom. Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži monocite, limfocite i manju količinu granulocita, trombocita i eritrocita.

[0035] Termin "ćelije tretirane sa" kako se ovde koristi prvenstveno opisuje tretman prema sledećoj proceduri: Ćelije su dobijene kao što je gore opisano i isperu. Nakon toga, aktivni agens se dodaje ćelijama (10<6>ćelija/ml) da bi se dobila koncentracija od 10-100 µg/ml i tokom 30 min. Nakon toga, ćelije se intenzivno ispiru da bi se uklonio aktivni agens. Tipično, ćelije se primenjuju, kao što je ovde opisano, posle 4 do 48 sati nakon tretmana kao što je prethodno opisano.

[0036] Poželjno je da se tretman ćelija, kao što je gore opisano, izvodi sledećim postupkom:

Prvo, dobijene ćelije su pažljivo isprane puferom za ispiranje. Zatim je rekonstituisanom aktivnom agensu (agensima) dodat pufer u proporciji od oko 4:1. Nakon toga, smeša pufera i aktivnog agensa (atkivnih agenasa) dodata ćelijama (10<6>- 10<9>ćelija/ml) da bi se dobila koncentracija od 10-105 µg/ml. Posle vremena inkubacije od 30 min na 37°C, ćelije su pažljivo centrifugirane. Nakon toga, ćelije su intenzivno isprane da bi se uklonilo aktivni agens (aktivni agensi). Za kontrolu kvaliteta, finalni proizvod je protočnom citometrijom testiran na broj ćelija, vijabilitet i sastav ćelija, a metodom direktne inokulacije na sterilnost prema Ph. Eur. 2.6.1, testom limulus amoebocitnog lizata prema Pharm Eur 2.6.14 za slobodu endotoksina i tečnom hromatografijom visokih performansi za kvantifikaciju ispranog aktivnog agensa (ispranih aktivnih agenasa). Pored toga, prema odgovarajućim smernicama, iz uzoraka krvi donora testirani su markeri zarazne bolesti.

[0037] Termin "aktivna supstanca" opisuje bilo koju supstancu ili kombinaciju supstanci koja se sastoji od ili najmanje sadrži jednu ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine hemoterapeutici, inhibitori proteazoma, imunosupresivni agensi, antiproliferativne supstance i njihove kombinacije. Dakle, aktivna supstanca (aktivne supstance) može da bude jedna, dve, tri, četiri, pet ili više različitih supstanci.

[0038] Poželjno, jedna, dve, tri ili više ili sve aktivne supstance su (a) hemoterapeutik (terapeutici) izabrani iz grupe koju čine alkilujući agensi (kao što su busulfan, karoplatin, karmustin, hlorambucil, cisplatin , ciklofosfamid (kao što je citoksan), dakarbazin, ifosfamid, lomustin, meholaretamin, melfalan, prokarbazin, streptozocin i tiotepa), antineoplastični antibiotici (kao što su bleomicin, daktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, idarubicin, mitomicin (kao što je mitomicin C), mitoksantron, pentostatin, i plicamicin), antimetaboliti (kao što su fluordeoksiuridin, kladribin, citarabin, floksuridin, fludarabin, flurouracil (kao što je 5-fluorouracil (5FU)), gemcitabin, hidroksiurea, merkaptopurin, metotreksat, i tioguanine, kalcineurin-inhibitori (kao što su ciklosporin, takrolimus), metotreksat, azatioprin, mTOR inibitori (kao što su everolimus, sirolimus), blokada kostimulatora (kao što je abatacept), inhibitori JAK (kao što je ruksolitinib) i derivati prirodnog izvora (kao što je mikofenolat (mofetil), docetaksel , etopozid, irinotekan, taksani (npr. paklitaksel), tenipozid, topotekan, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, steroidi (npr. glukokortikoidi kao što je prednizon) i tamoksifen).

[0039] Poželjno, jedna, dve, tri ili više ili sve aktivne supstance su (a) inhibitor(i) proteazoma izabrani iz grupe koju čine bortezomib (npr. Velcade<®>), karfilzomib (npr. Kyprolis<®>) i iksazomib (npr. Ninlaro<®>).

[0040] Poželjno, jedna, dve, tri ili više ili sve aktivne supstance su (a) imunosupresivni agens(i) izabrani iz grupe koju čine mikofenolna kiselina, inhibitori mTOR, azatioprin, takrolimus i ciklosporin.

[0041] Poželjno, jedna, dve, tri ili više ili sve aktivne supstance su / su (a) antiproliferativne supstance izabrane iz grupe koju čine mikofenolna kiselina, azatioprin, ciklofosfamid, inhibitori mTOR.

[0042] Posebno je poželjno da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine mitomicin C, C2 ceramid, tunikamicin, mikofenolatmofetil, metaboliti triptofana (kao što su kinurenini, npr. Tranilast) i njihovi polusintetički derivati.

[0043] Posebno je poželjno da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od metabolita triptofana (kao što su kinurenini, npr. Tranilast) i/ili mitomicin C.

[0044] Kako se ovde koristi, "terapeutski efikasna količina" označava dovoljnu količinu pomenutog jedinjenja za lečenje određene bolesti, uz razuman odnos koristi i rizika. Generalno, termin "terapeutski efikasna količina" odnosiće se na količinu pomenutog jedinjenja koja je fiziološki značajna i poboljšava zdravlje pojedinca. Sredstvo, tj. navedeno jedinjenje, je fiziološki značajno ako njegovo prisustvo dovodi do promene u fiziologiji čoveka primaoca. Na primer, u lečenju patološkog stanja, primena pomenutog jedinjenja koje ublažava ili zaustavlja dalje napredovanje stanja smatraće se i fiziološki značajnom i terapeutski delotvornom.

[0045] Izrazi "lečenje" ili "tretman" odbacivanja organa ili ćelijskog grafta/transplantata, kako se ovde koriste, poželjno je da se razumeju kao supresija odbacivanja toliko da transplantirani organ(i) i/ili ćelije ostanu funkcionalni.

[0046] Izrazi "sprečavanje" ili "prevencija" odbacivanja organa ili ćelije transplantata, kako se ovde koriste, poželjno je da se razumeju kao inhibiranje ili barem smanjenje intenziteta takvog odbacivanja kako je ovde opisano tokom određenog vremenskog perioda kod subjekta. Podrazumeva se da navedeni vremenski period zavisi od količine kompozicije prema pronalasku koja je primenjena i pojedinačnih faktora subjekta kao što su težina poremećaja, starost, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta, vreme primene, vreme administracije, način administracije, trajanje lečenja kao i lekovi koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa lečenjem. Takva prevencija zahteva samo supresiju relativno malog broja i neaktivnih imunih ćelija. U naivnom nestimulisanom stanju, procenjeno je da učestalost od oko jednog prekursora klona u 100.000 CD8+ T ćelija pokazuje specifičnost za definisani antigen (Blattmann et at., 2002, J. Exp. Med., 195:657-664).

[0047] Kod akutnog odbacivanja transplantata organa, klonovi imunskih ćelija koji prepoznaju tkivo donora su se već proširili. Što se tiče virusnih infekcija, u roku od 7-8 dana dolazi do ogromnog povećanja broja specifičnih klonova T-ćelija, do 50.000 puta, što obuhvata oko 15 do 20 ciklusa proliferacije ((Williams & Bevan, 2007, Ann. Rev. Immunol., 25:171-192). Dakle, aktivnost velikog broja ćelija mora biti uspešno potisnuta. Štaviše, aktivne imune ćelije su u drugačijem fiziološkom stanju u poređenju sa imunskim ćelijama u stanju mirovanja. Da bi pokrenule proliferaciju i različite efektorske funkcije naivne CD4<+>i CD8<+>T ćelije moraju da se susreću sa antigenima u limfoidnim organima predstavljenim ćelijama koje predstavljaju antigen (APC). Nasuprot tome, aktivirane i proširene T ćelije se okupljaju oko perifernih tkiva da bi pronašle i potom eliminisale antigene izvore. Tokom ove izuzetno složene procedure, aktivirane ćelije izražavaju mešavinu različitih signalnih i efektorskih molekula kao što su citokini i hemokini koji pokazuju nebrojene funkcije na imunskim i neimunskim ćelijama. Izlaganje stranim antigenima obično rezultira pojavom dugovečnih takozvanih memorijskih ćelija koje čine 5-10% prvobitnog broja aktiviranih efektorskih ćelija. Kvalitet memorijskih ćelija se ogleda kroz brži i efikasniji odgovor na dalje susrete sa istim antigenima Harty & Badovinac, 2008, Nat. Rev. Immunol., 8:107-119; Williams & Bevan, 2007, Ann. Rev. Immunol., 25:171-192; Sprent & Surh, 2002, Ann. Rev. Immunol., 20:551-579; Rogers et at., 2000, J. Immunol., 164:2338-2346. Stoga, efikasnost farmaceutske kompozicije ovog pronalaska za lečenje odbacivanja transplantata organa je bila iznenađujuća.

[0048] Treba razumeti, međutim, da takav tretman i/ili prevencija možda neće biti efikasan kod svih subjekata koji se leče kompozicijom prema ovom pronalasku. Međutim, termin zahteva da se statistički značajnom delu subjekata iz kohorte ili populacije efikasno spreči ili barem pokaže smanjenje snage odbacivanja transplantata organa ili ćelije ili njegovih pratećih simptoma. Poželjno, u ovom kontekstu je predviđena kohorta ili populacija subjekata koji bi normalno, tj. bez preventivnih mera prema ovom pronalasku, razvili (snažnije) odbacivanje transplantata organa ili ćelije.

[0049] Dodatno ili alternativno, učestanost takvog odbacivanja u kohorti subjekata koji su primili kompoziciju prema pronalasku na način prema pronalasku biće znatno niža od normalne frekventnosti u grupi subjekata koji nisu imali primili kompoziciju prema pronalasku ili ne na način prema pronalasku. Da li je neki deo statistički značajan, može bez daljeg odlaganja odrediti stručnjak u ovoj oblasti koristeći različite dobro poznate alate za statističku procenu, npr. određivanje intervala poverenja, određivanje pvrednosti, Studentov t-test, Mann-Whitney test itd. Preferirani intervali pouzdanosti su najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%. P-vrednosti su, poželjno, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 ili 0,0001. Poželjno je da tretman i/ili prevencija budu efikasni za najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% subjekata date kohorte ili populacije.

[0050] Kao imunosupresivi, prethodno tretirane izolovane ćelije cele krvi ili PBMC prema ovom pronalasku u specifičnom režimu doziranja kako je ovde otkriveno, veoma su korisne kada se primenjuju za prevenciju imunitetom posredovanog odbacivanja transplantata ćelija, tkiva ili organa. Primeri transplantiranih ćelija, tkiva i organa koji su pogođeni ovim efektrima su srce, bubrezi, jetra, koštana srž, koža, rožnjača, pluća, pankreas, udovi, mišići, nervi, dvanaestopalačno crevo, tanko i debelo crevo, Langerhansova ostrvca, alogene hematopoetske matične ćelije, himerne T ćelije receptora antigena, infuzije donorskih limfocita, alogene hematopoetske matične ćelije ili kompoziti (kao što su (delovi) lica ili materice), alogene T ćelije himernog receptora antigena i slično.

[0051] Poželjno, tretman odbacivanja sledećih organa, ćelija i tkiva je obuhvaćen ovim pronalaskom: srce, bubreg, jetra, koštana srž, koža, rožnjača, pluća, pankreas, udovi, mišići, nervi, duodenum, mali i debelo crevo, Langerhansova ostrvca, alogene hematopoetske matične ćelije, himerne T ćelije receptora antigena, infuzije donorskih limfocita, alogene hematopoetske matične ćelije ili kompoziti (kao što su (delovi) lica ili materice), alogene T ćelije himernog receptora antigena i slično.

[0052] Poželjno, farmaceutska kompozicija prema pronalasku može se takođe koristiti u lečenju i/ili prevenciji bolesti transplantata vs. domaćina (graft versus host).

[0053] Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava netoksičan, inertan čvrst, polučvrst ili tečni punilac, razblaživač, materijal za kapsuliranje ili pomoćno sredstvo za formulaciju bilo kog tipa. Neki primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači su šećeri kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobovi kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; celuloza i njeni derivati kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i acetat celuloza; tragakant u prahu; slad; želatin; talk; ekscipijenti kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije; ulja kao što su kikirikijevo ulje, ulje semenki pamuka, ulje šafranike, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikoli, kao što je propilen glikol; estri kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferski agensi kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol, rastvori fosfatnog pufera; netoksični, kompatibilni lubrikansi kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat; kao i sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome i mirisi. U kompoziciji mogu biti prisutni i konzervansi i antioksidansi, prema proceni stručnjaka koji radi na formulacijama.

[0054] Kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom može se administrirati oralno, rektalno, parenteralno, intracisternalno, intravaginalno, intraperitonealno, bukalno ili kao oralni ili nazalni sprej. Izraz "parenteralno" kako se ovde koristi odnosi se na načine administracije koji uključuju intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, intrasternalnu, subkutanu i intraartikularnu injekciju, poželjno kao infuziju. Poželjno, administracija se odvija intravenozno, intramuskularno ili subkutano, poželjno kao infuzija.

[0055] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska za parenteralne injekcije poželjno sadrže farmaceutski prihvatljive sterilne vodene ili nevodene rastvore, disperzije, suspenzije ili emulzije, kao i sterilne prahove za rekonstituciju u sterilne rastvore za injekcije ili disperzije neposredno pre upotrebe. Primeri odgovarajućih vodenih i nevodenih nosača, razblaživača, rastvarača ili vehikuluma uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično), karboksimetilcelulozu i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje ), i organski estri za injekcije kao što je etil oleat. Odgovarajuća tečnost se može održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom površinski aktivnih agenasa (surfaktanata).

[0056] Kao što je gore opisano, očekuje se da će veća doza primenjenih ćelija obezbediti prilagođenu imunosupresiju za kraće vreme. Prema tome, poželjno je da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata davanje primaocu najmanje 1,5 × 10<8>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca.

[0057] Da bi se izbegao ili smanjio rizik za npr. izazivajući trombozu ili emboliju kao što je gore opisano, međutim, poželjno je da se količina farmaceutske kompozicije odabere tako da se administrira maksimalno 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca .

[0058] Poželjno je da se administracija farmaceutske kompozicije vrši u jednom koraku primene, međutim, takođe su moguća dva, tri ili više koraka primene.

[0059] Kao dodatak ili kao alternativa broju ćelija, vremenska tačka (vremenske tačke) koraka administracije je/su važna za omogućavanje imunom sistemu da razvije efikasnu/dovoljno prilagođenu/ciljanu supresiju. Stoga je poželjno da se ćelije daju primaocu najmanje 6 dana, najmanje 7 dana, najmanje 8 dana, najmanje 9 dana, najmanje 10 dana, najmanje 14 dana, najmanje 21 dan ili najmanje 28 dana pre transplantacije.

[0060] Stručnjak će biti sasvim svestan činjenice da specifična kombinacija broja ćelija i vremena primene može zavisiti od nekoliko pojedinačnih faktora subjekta kao što su ozbiljnost poremećaja, starost, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta, način administracije, trajanje lečenja kao i lekovi koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa lečenjem ili može zavisiti od organa koji se transplantira.

[0061] Poznato je da CD19<+>CD24<high>CD38<high>Bregs igraju važnu ulogu u održavanju dugoročne funkcije alografta i promovisanju tolerancije na transplantaciju (Newell KA et al., J Clin Invest 2010; Silva HM et al., Mol Med 2012; Chesneau M et al., Am J Transplant 2014; Shabir S et al., Am J Transplant 2015; Tebbe B et al., PLoS One 2016; Svachova V et al., Transpl Int 2016). Tebbe et al. su pronašli kod pacijenata koji primaju rutinske doze imunosupresije (sa CyA kao inhibitorom kalcineurina) učestalost CD19<+>CD24<high>CD38<high>prelaznih B limfocita u rasponu od 0-5% tokom prve godine nakon transplantacije (Tebbe B, Pls one 2016). Oni pacijenti koji su pokazali učestalost veću od 1% nisu pokazali epizode odbacivanja.

[0062] Neočekivano je otkriveno da tretman sa ovde opisanim specifičnim ćelijama korišćenjem režima doziranja od najmanje 1 × 10<8>ćelija, poželjno najmanje 1,5 × 10<8>ćelija po kg telesne težine primaoca najmanje 5 dana, poželjno najmanje 6 dana, a posebno poželjno najmanje 7 dana pre transplantacije, dovodi do naglog povećanja količine CD19<+>CD24<high>CD38<high>Bregs-a i time tretman čini još delotvornijim. Ta korelacija do danas još nije bila poznata, a posebno da korelacija uopšte postoji. Breg frekvencije transplantiranih kontrola koje nisu bile podvrgnute MIC kondicioniranju bile su uporedive sa stopama koje su opisali Tebbe et al., dok su pacijenti koji su bili podvrgnuti takvom specijalnom tretmanu pokazali učestalost u rasponu od čak 5-40% 180. dana nakon transplantacije, daleko prevazilazeći vrednosti kontrola (medijan 1%) i onih pronađenih kod ovih pacijenata pre transplantacije (videti primer 1 i slike 3 i 4).

[0063] Prema tome, prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelije obuhvata davanje primaocu najmanje 1 × 10<8>ćelija, poželjno najmanje 1,3 × 10<8>ćelija, posebno poželjno najmanje 1,5 × 10<8>ćelija tretiranih ćelija cele krvi ili tretirane PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se primena izvodi najmanje 5 dana, poželjno najmanje 6 dana, posebno poželjno najmanje 7 dana pre transplantacije.

[0064] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu 1 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca. pri čemu se primena vrši najmanje 5 dana pre transplantacije.

[0065] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se primena vrši najmanje 6 dana pre transplantacije.

[0066] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se primena vrši najmanje 7 dana pre transplantacije.

[0067] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se primena vrši najmanje 5 dana pre transplantacije.

[0068] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1,3 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih ćelija cele krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se administracija vrši najmanje 6 dana pre transplantacije.

[0069] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administraciju primaocu najmanje 1,3 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih ćelija krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se administracija vrši najmanje 7 dana pre transplantacije.

[0070] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1,3 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih ćelija krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se administracija vrši najmanje 5 dana pre transplantacije.

[0071] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1,5 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih ćelija krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se administracija vrši najmanje 6 dana pre transplantacije.

[0072] Posebno je poželjno da prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1,5 × 10<8>do 1 × 10<12>ćelija tretiranih celih ćelija krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se administracija vrši najmanje 7 dana pre transplantacije.

[0073] Dalje, posebno je poželjno da u ovom specijalnom tretmanu aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od mitomicina C.

[0074] Ovde je takođe opisana za dalje informacije ex vivo metoda za proizvodnju farmaceutske kompozicije za upotrebu prema pronalasku, koja obuhvata sledeće korake:

a) dobijanje uzorka krvnih ćelija od davaoca i opciono pripremanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od navedenog uzorka krvnih ćelija,

b) tretiranje ćelija dobijenih u koraku a) ex vivo sa terapeutski efikasnom količinom aktivne supstance,

c) opciono: obezbeđivanje farmaceutski prihvatljivog nosača i dodavanje nosača u tretirane ćelije dobijene u koraku b).

[0075] Prvo, dobijene ćelije se pažljivo isperu sa puferom za pranje. Zatim se rekonstituisanom aktivnom agensu (agensima) dodaje pufer u proporciji od oko 4:1. Nakon toga, ćelijama (10<6>- 10<9>ćelija/ml) se dodaje smeša pufera i aktivnog agensa (aktivnih agenasa) da bi se dobila koncentracija od 10-105 µg/ml. Posle vremena inkubacije od 30 min na 37°C, ćelije su pažljivo centrifugirane. Nakon toga, ćelije su intenzivno isprane da bi se uklonilo aktivn agens (aktivni agensi). Za kontrolu kvaliteta, finalni proizvod se testira protočnom citometrijom, na sterilnost metodom direktne inokulacije prema Ph. Eur. 2.6.1, na broj ćelija, vijabilitet i sastav ćelija za oslobađanje endotoksina testom limulus amoebocitnog lizata prema Pharm Eur 2.6.14 i tečnom hromatografijom visokih performansi za kvantifikaciju ispranog aktivnog agensa (aktivnih agenasa). Pored toga, prema odgovarajućim smernicama, markeri zarazne bolesti se testiraju iz uzoraka krvi donatora.

[0076] Sve što je ovde rečeno u vezi sa farmaceutskom kompozicijom za upotrebu, za farmaceutsku kompoziciju nezavisno od njene upotrebe, kao i za komponente takve kompozicije takođe se poželjno odnosi i na farmaceutsku kompoziciju proizvedenu metodom kako je ovde opisano. za dalje informacije.

[0077] Poželjno je da u farmaceutskoj kompoziciji proizvedenoj metodom kao što je ovde opisano za dalje informacije, ukupna količina tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC je u opsegu od 7,5 × 10<6>ćelija do 1,8 × 10<14>ćelija, poželjno od 3,0 × 10<7>do 9,0 × 10<12>ćelija, posebno poželjno od 6,0 × 10<7>do 7,5 × 10<11>ćelija i / ili u opsegu od 10<2>ćelija do 10<10>ćelija / mL, poželjno od 10<6>ćelija do 10<9>ćelija / mL.

[0078] Dalje je poželjno da u farmaceutskoj kompoziciji proizvedenoj metodom kao što je ovde opisano za dalje informacije, koncentracija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC bude u opsegu od 10<2>ćelije do 10<10>ćelija/mL, poželjno od 10<6>ćelija do 10<9>ćelija / mL.

[0079] U poređenju sa onim što je gore opisano, takođe u farmaceutskoj kompoziciji proizvedenoj metodom kako je ovde opisano za dalje informacije, poželjno je da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine hemoterapeutici, inhibitori proteazoma imunosupresivni agensi, antiproliferativne supstance i njihove kombinacije, poželjno da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine mitomicin C, C2 ceramid, tunikamicin, mikofenolat-mofetil, metaboliti triptofana i njihovi polusintetički derivati, a posebno poželjno da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od mitomicina C.

[0080] Dodatno, u farmaceutskoj kompoziciji proizvedenoj metodom kako je ovde opisano za dalje informacije, poželjno je da je farmaceutski prihvatljiv nosač prisutan i da sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine šećeri kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobovi kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; celuloza i njeni derivati kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i acetat celuloza; tragakant u prahu; slad; želatin; talk; ekscipijenti kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije; ulja kao što su kikirikijevo ulje, ulje pamučnog semena, ulje šafranike, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikoli, kao što je propilen glikol; estri kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferski agensi kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol, rastvori fosfatnog pufera; netoksični, kompatibilni lubrinkansi kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat; kao i sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome i mirisi, konzervansi i antioksidansi.

Opis slika

[0081]

Slika 1 ostimupisuje održavanje intakgtnog opšteg imunog sistema, pri čemu je izvedena nespecifična poliklonalna stimulacija (slika 1A) ili treće strane, ili stimulacija specifična za donora (slike 1B i C). Stimulacija treće strane i specifična stimulacija donora je upoređena sa pacijentima pre tretmana (Slika 1B) ili sa netretiranom kontrolom (Slika 1C).

Slika 2 opisuje imunosupresiju, tj. najniži nivo ciklosporina A (A), dnevnu dozu mikofenolnog natrijuma obloženo gastro-rezistentnim premazom (EC-MPS) (B) i dnevnu dozu metilprednizolona (C), kod pacijenata iz grupa A, B, C i kontrole.

Slika 3 opisuje postignutu i održavanu funkciju organa (bubrega), analiziranu nivoima kreatinina u serumu (slika 3A), brzinom glomerularne filtracije (GFR, izračunato prema Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI) formula) (slika 3B) ili odnos proteina i kreatinina u urinu (slika 3C).

Slika 4 opisuje status regulatornih T limfocita pre i posle tretmana, pri čemu su analizirani CD4<+>CD25<+>CD127<->(slika 4A) ili CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>CD127<->(slika 4B) T limfociti.

Slika 5 opisuje status regulatornih B limfocita pre i posle tretmana u okviru studijske grupe C, pri čemu su analizirani CD19<+>CD24<high>CD38<high>regulatorni B limfociti.

Slika 6 opisuje status regulatornih B limfocita pre i posle tretmana studijskih grupa A, B i C, pri čemu su analizirani CD19<+>CD24<high>CD38<high>regulatorni B limfociti.

Slika 7 opisuje status regulatornih B limfocita pre i posle tretmana, u poređenju sa netretiranim kontrolama, gde su analizirani CD19<+>CD24<high>CD38<high>B limfociti.

Slika 8 opisuje nivoe IL-10<+>ćelija među CD19<+>CD24<high>CD38<high>regulatornim B limfocitima pacijenata grupe C.

[0082] Ovde je takođe za dodatne informacije opisana metoda za prevenciju ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili bolesti grafta protiv domaćina kod primaoca humanog transplantata, pri čemu pomenuti metod obuhvata sledeće korake:

a) dobijanje uzorka krvnih ćelija od davaoca, poželjno od davaoca transplantata, i opciono priprema mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz navedenog uzorka krvnih ćelija,

b) tretiranje pomenutog uzorka krvnih ćelija ili PBMC dobijenih iz njih sa terapeutski efikasnom količinom aktivne supstance, i

c) administriranje tretiranog uzorka krvnih zrnaca ili iz njih dobijenih PBMC primaocu transplantata te se na taj način tretira odbacivanje transplantata organa ili ćelije,

pri čemu je količina ćelija datog tretiranog uzorka krvnih ćelija ili iz njih dobijenih PBMC najmanje 0,25 × 10<6>ćelija po kg telesne težine, poželjno najmanje 1,5 × 10<6>ćelija po kg telesne težine primaoca.

[0083] Sve karakteristike opisane u vezi sa farmaceutskom kompozicijom i/ili farmaceutskom kompozicijom za upotrebu takođe važe za metod opisan ovde za dodatne informacije, gde je primenljivo.

[0084] Za ovaj metod je poželjno da tretirane krvne ćelije ili PBMC koje se administriraju primaocu sadrže ili se sastoje od limfocita, monocita i/ili dendritskih ćelija.

[0085] Dalje poželjno u ovoj metodi je da se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine mitomicin C, C2 ceramid, tunikamicin, mikofenolat-mofetil, metaboliti triptofana i njihovi polusintetički derivati i inhibitori proteazoma.

[0086] Takođe je poželjno u postupku da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od metabolita triptofana (kao što su kinurenini, npr. Tranilast) i/ili mitomicin C.

[0087] Poželjno u ovom postupku, količina ćelija u primenjenom uzorku tretiranih krvnih ćelija ili PBMCs izvedenih od njih iznosi najmanje 5 × 10<6>ćelija, najmanje 1 × 10<7>ćelija, najmanje 5 × 10<7>ćelija, najmanje 1 × 10<8>ćelija ili najmanje 1,5 × 10<8>ćelija po kg telesne težine primaoca.

[0088] Dalje poželjno za ovaj postupak je da se tretirani uzorak krvnih ćelija ili PBMC izvedeni iz njih administriraju primaocu najmanje 1 dan pre transplantacije, najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana, u najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, najmanje 7 dana, najmanje 8 dana, najmanje 9 dana, najmanje 10 dana, najmanje 14 dana, najmanje 21 dan ili najmanje 28 dana pre transplantacije.

[0089] Stručnjaku će biti jasna činjenica da specifična kombinacija broja ćelija i vremena primene može zavisiti od nekoliko pojedinačnih faktora subjekta kao što su ozbiljnost poremećaja, starost, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta, način primene, trajanje lečenja kao i lekovi koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa tretrmanom ili mogu zavisiti od organa koji se transplantira.

[0090] Poželjno, u ovom postupku, administracija tretiranog uzorka krvnih ćelija ili iz njih dobijenih PBMC se izvodi kao intravenska injekcija, poželjno kao infuzija.

[0091] Takođe je ovde opisan za dodatne informacije dalji aspekt koji se odnosi na metodu za lečenje ili prevenciju odbacivanja transplantata organa kod primaoca humanog transplantata, pri čemu metoda obuhvata administriranje kompozicije primaocu koja sadrži:

a) izolovane krvne ćelije ili mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) tretirane terapeutski efikasnom količinom aktivne supstance, i

b) opciono farmaceutski prihvatljiv nosač,

pri čemu je količina tretiranih krvnih ćelija ili PBMC u kompoziciji odabrana tako da se administrira najmanje 0,25 × 10<6>ćelija, poželjno najmanje 1,5 × 10<6>ćelija tretiranih krvnih ćelija ili PBMC po kg telesne težine primaoca.

[0092] Poželjno, postupak može takođe biti pogodan za lečenje i/ili prevenciju bolesti transplantata protiv domaćina (graft vs host).

[0093] Sve karakteristike opisane u vezi sa farmaceutskom kompozicijom i/ili farmaceutskom kompozicijom za upotrebu takođe važe za ovde opisan postupak za dodatne informacije, gde je primenljivo.

[0094] U ovom postupku poželjno je da tretirane krvne ćelije ili PBMC koje se administriraju primaocu sadrže limfocite, monocite i/ili dendritske ćelije.

[0095] Posebno je poželjno da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci koje su izabrane iz grupe koju čine mitomicin C, C2 ceramid, tunikamicin, mikofenolat-mofetil, metaboliti triptofana (kao što su kinurenini, npr. Tranilast) i njihovi polusintetički derivati.

[0096] Takođe je poželjno u postupku da aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od metabolita triptofana (kao što su kinurenini, npr. Tranilast) i/ili mitomicin C.

[0097] Poželjno, u ovom postupku, količina ćelija u primenjenom uzorku tretiranih krvnih ćelija ili iz njih izvedenih PBMC iznosi najmanje 5 × 10<6>ćelija, najmanje 1 × 10<7>ćelija, najmanje 5 × 10<7>ćelija, najmanje 1 × 10<8>ćelija ili najmanje 1,5 × 10<8>ćelija po kg telesne težine primaoca.

[0098] Dalje, poželjno za ovaj postupakje da se tretirani uzorak krvnih ćelija ili iz njih izvedenih PBMC administriraju primaocu najmanje 1 dan pre transplantacije, najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana, u najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, najmanje 7 dana, najmanje 8 dana, najmanje 9 dana, najmanje 10 dana, najmanje 14 dana, najmanje 21 dan ili najmanje 28 dana pre transplantacije.

[0099] Stručnjaku u oblasti tehnike će biti jasna činjenica da specifična kombinacija broja ćelija i vremena primene može zavisiti od nekoliko pojedinačnih faktora subjekta kao što su ozbiljnost poremećaja, starost, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta, način administracije, trajanje lečenja kao i lekovi koji se koriste u kombinaciji ili slučajno sa lečenjem ili mogu zavisiti od organa koji se transplantira.

[0100] Poželjno, u ovom postupku, administracija tretiranog uzorka krvnih ćelija ili iz njih dobijenih PBMC se izvodi kao intravenska injekcija, poželjno kao infuzija.

[0101] Poželjne realiyacije i dalji aspekti ovog pronalaska proizilaze iz priloženih zahteva i primera koji slede, pri čemu nije namera primera da ograniče pronalazak. Obim pronalaska je definisan priloženim zahtevima.

Primeri:

Primer 1: TOL-1 studija

[0102] Otvoreno kliničko ispitivanje u jednoj grupi kupini faze I u trajanju od 30 dana za određivanje bezbednosti i izvodljivosti intravenske administracije MIC za individualizovanu imunosupresiju sprovedeno je kod primaoca transplantata bubrega od živih donora ((TOL-1 Study, Ethics number: AFmo-549/2014, EudraCT number: 2014-002086-30, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02560220) nakon čega je usledila faza posmatranja do 360 dana nakon transplantacije (Etički brojevi: 082/2005/20305, S-209 /2011). Studija je sprovedena u skladu sa odredbama Helsinške deklaracije i Smernicama dobre kliničke prakse.

[0103] Primarna mera ishoda bila je bezbednost i izvodljivost intravenske administracije MIC mereno učestalošću neželjenih događaja (AE) kod pacijenata sa hroničnom bubrežnom bolešću stadijuma 4 ili 5 (tj. GFR <30 mL/min) koji su primili bubrežni transplant od živog donora. Neželjeni neželjeni efekti su zabeleženi u skladu sa zajedničkim terminološkim kriterijumima za neželjene događaje (Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE), verzija 4.03.

[0104] Od avgusta 2015. do februara 2017. godine, 14 parova donora i primaoca je pregledano za uključivanje u studiju. Ukupno 12 donora je primilo leukaferezu i na kraju 10 pacijenata je lečeno MIC proizvodom. Faza posmatranja je trajala dodatnih 330 dana do februara 2018.

[0105] 10 pacijenata (grupe A, B, C) je primilo MIC od svog donora pre transplantacije bubrega. Pacijenti su primali ili 1,5×10<6>MIC po kg telesne težine na dan -2 (N=3, grupa A, uporedna) ili 1,5×10<8>MIC po kg telesne težine na dan -2 (N=3, grupa B, uporedna) ili dan -7 (N=4, grupa C, prema pronalasku) pre transplantacije bubrega od živog donora.

[0106] Osnovne karakteristike pacijenata su date u tabeli 1.

Tabela 1: Osnovne karakteristike pacijenata

[0107] Četiri pacijenta (R8, R9, R10, R13) su pregledani, ali nisu primili ćelijsku terapiju.

[0108] Svi ostali pacijenti (N=10: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R11, R12, R14) kao i odgovarajući donori su tretirani prema protokolu (kao što je gore opisano).

[0109] Nestimulisana leukafereza donora je izvedena sa Spectra Optia® uređajem za aferezu (Terumo BCT, Eschborn, Nemačka). MIC su proizvedeni pod uslovima dobre proizvođačk prakse (GMP). MIC proizvod je administriran pacijentima istog dana kad i donorske leukafereze i pripreme proizvoda kao jednokratne administracije. Pacijenti grupe A imali su propisanu dozu od 1,5×10<6>MIC po kg t.t. 2 dana pre transplantacije. Pacijenti grupe B imali su propisanu dozu od 1,5×10<8>MIC po kg t.t. 2 dana pre transplantacije. Kod pacijenata iz grupe C, MIC su administrirani u propisanoj dozi od 1,5×10<8>MIC po kg t.t. već 7 dana pre transplantacije. Pacijenti su raspoređeni u grupe A (R1-R3), B (R4-R6) ili C (R7, R11, R12, R14) i primili su MIC. Stvarne primenjene MIC doze su date u tabeli 2.

[0110] Pacijenti su tretirani postepenim pristupom sa pojačavanjem doze sa grupe A na grupu B da bi se uzele u obzir moguće neželjene reakcije na krajnji proizvod MIC-a kao što su embolija, zapaljenje, alergija ili neželjena reakcija na mitomicin C ili pufer. Budući da suviše mali broj MIC ćelija predstavlja rizik od senzibilizacije primaoca (primaoci grupe A su imali samo 1% broja MIC ćelija pacijenata grupa B i C), MIC su administrirani najmanje 2 dana pre transplantacije tokom faze pojačavanja doze . Iz grupe B u grupu C, vreme administracije je promenjeno sa -2 na dan -7 pre transplantacije.

[0111] Tokom posete primaoca V3 na dan -1 pre operacije transplantacije, senzibilizacija primaoca MIC proizvodom je isključena sa CDC i ELISA unakrsnim podudaranjem i skriningom na HLA antitela Luminex tehnikom.

[0112] Posete primaoca nakon transplantacije bile su 7t1 (V4) i 30±4 dana (V5, kraj studije). Faza posmatranja bila je do 360. dana nakon transplantacije bubrega sa čestim ambulantnim posetama 60±14, 90±14, 135±21, 180±21, 225±28, 270±28, 360±35 dana.

[0113] Imunosupresija se sastojala od ciklosporina A (CyA), mikofenolnog natrijuma obloženog enteričkom bojom (EC-MPS) i metilprednizolona (MPS) datih od dana operacije. Kod pacijenata iz grupe C, imunosupresivna terapija je smanjena na niske doze CyA i niske doze EC-MPS bez steroida tokom faze posmatranja posle 30. dana da bi se izbegle infektivne komplikacije kombinovane ćelijske i imunosupresivne terapije. Pacijenti grupe A i B primali su imunosupresiju prema standardu nege. Ovi standardi su poznati prosečnim stručnjacima. Imunosupresija primenjena na pacijente kontrolne grupe je odabrana tako da je rezultirala imunosupresijom uporedivom sa onom dobijenom kod pacijenata grupe C. Detaljna imunosupresivna terapija kod pacijenata tokom TOL-1 studije i faze posmatranja je data na slici 2A -C.

[0114] Podaci prikupljeni tokom prvih 30 dana nakon transplantacije pokazali su da su MIC infuzije odlično tolerisane. Ukupno 69 neželjenih događaja (AE) uključujući 3 teška neželjena dejstva (SAE) pojavilo se kod 10 lečenih pacijenata. Neželjeni neželjeni efekti su bili ili malo verovatni (N=1) ili nepovezani (N=68) sa MIC terapijom. Tokom faze studije, nije bilo pozitivnih rezultata unakrsnog podudaranja, de novo specifičnih antitela za donore ili epizoda odbacivanja sa odličnom funkcijom transplantata bubrega kod svih pacijenata (videti slike 3A-C i tabelu 2).

Primer 1.1: bez detektabilnog donorskog himerizma nakon MIC infuzije

[0115] Već jedan dan nakon MIC infuzije, kod 10 pacijenata nije detektovan nikakav donorski himerizam. Odsustvo donorskog himerizma je potvrđeno 1. dana pre transplantacije, i 7. i 30. dana posle transplantacije.

Primer 1.2: Odlični klinički ishodi do godinu dana nakon transplantacije

[0116] Tokom faze posmatranja, nije došlo do de novo donor specifičnih antitela ili epizoda odbacivanja i svi pacijenti su imali odličnu funkciju transplantata bubrega (videti Sliku 3A-C i Tabelu 3). Dana 360. nakon operacije, medijana serumskog kreatinina je iznosila 1,4 mg/dL (1,1-2,1), medijana eGFR je iznosila 58 mL/min (37-75) i medijana ekskrecije proteina u urinu je iznosila 10 g/moL kreatinina (3-19). Nisu zabeležene oportunističke infekcije. Ukupno 10 neoportunističkih infektivnih epizoda dogodilo se kod 4 od 10 pacijenata. Ovo je uključivalo 3 epizode infekcije urinarnog trakta kod pacijenta R7 koji je patio od mokraćne bešike malog kapaciteta i 2 epizode infekcije urinarnog trakta kod pacijenta R12. Nisu primećeni novonastali dijabetes (NODAT), leukopenija, epizoda dijareje, limfoproliferativna bolest nakon transplantacije (PTLD) ili drugi maligni tumori. Ukupan rezultat antihipertenzivne terapije bio je niži 360. dana nakon transplantacije u odnosu vredsnot na pre operacije, posebno kod pacijenata grupe C, dok je krvni pritisak bio normalan.

[0117] Svi pacijenti su pokazali odličnu funkciju transplantata bubrega bez proteinurije do 360. dana nakon operacije (vidi sliku 3C).

Tabela 3: Ishodi i komplikacije kod 10 pacijenata (faza studije TOL-1 i faza posmatranja do 360. dana)

*zahteva intervenciju. BKV = BK virus, CMV = citomegalovirus, CV = centralni venski kateter,

DGF = odložena funkcija grafta, DSA = donoro- specifično antitelo, MFI = srednji intenzitet fluorescencije, NODAT = novonastali dijabetes nakon transplantacije, PTLD = limfoproliferativna bolest posle transplantacije , TIS = vrednost terapeutskog intenziteta

[0118] Dodatno, biopsije protokola 7. dana nakon transplantacije nisu pokazale odbacivanje alografta. Indikacione biopsije zbog prolaznog porasta serumskog kreatinina urađene su kod pacijenata R2 i R14, ali nisu pokazale abnormalnosti. Kod oba pacijenta, serumski kreatinin se vratio na početnu vrednost bez dodatnih mera. Pacijent R1 iz grupe A, koji je primio samo 1% MIC broja ćelija administriranih grupama B i C, je imao granične promene u biopsiji 77. dana. Kod ovog pacijenta, biopsija je urađena nakon porasta serumskog kreatinina od 0,2 mg/dL od početne vrednosti. Utvrđeno je da pacijent R11 ima infekciju urinarnog trakta E. coli 128. dana nakon operacije za koju je bio potreban hinolonski antibiotik. Serumski kreatinin je porastao sa 1,31 mg/dL pre tretmana antibioticima na maksimalnih 1,81 mg/dL 157. dana. Procedura biopsije je otkrila ozbiljnu intersticijsku inflamaciju (i3) sa skoro odsutnim tubulitisom (t1) što je indikativno za alergijski intersticijski nefritis. Metilprednizolon je davan u dozi od 125 mg na 3 dana i serumski kreatinin se vratio na početnu vrednost kod oba pacijenta.

[0119] Stoga je praćeno da su biopsije takođe otkrile da nije došlo do odbacivanja alografta.

Primer 1.3: Odgovori anti-donora T limfocita kod pacijenata tretiranih MIC-om

[0120] Pacijenti iz grupe C su pokazali očuvanu proliferaciju limfocita kao odgovor na nespecifične poliklonalne stimulatore 360. dana nakon transplantacije u poređenju sa nalazima pre MIC infuzije, što ukazuje na intaktni opšti imunski odgovor (vidi sliku 1A). Ovo je potvrđeno alogenskom stimulacijom ćelijama trećih lica (vidi sliku 1B). Nasuprot tome, odgovor T-ćelija protiv donora je izostao 360. dana u poređenju sa nalazima pre infuzije MIC (vidi sliku 1B). Dok su pacijenti tretirani MIC-om imali potisnutu reakciju T limfocita, 5 od 6 kontrolnih pacijenata pokazalo je očuvanu reaktivnost na donora (vidi sliku 1C).

Primer 1.4: HLA antitela i titri antitela na bakterijsku i virusnu imunizaciju

[0121] Tokom faze posmatranja nisu otkrivena de novo donorska specifična antitela. Ovaj nalaz je postavio pitanje da li je odgovor memorije B ćelija na antigene koji nisu povezani sa donorima, kao što indukovan prethodnim imunizacijama je takođe bio pogođen. Titar za boginje (medijan 4400 mlU / mL, 200-11 000), zauške (medijan 400, 230-8000), rubeolu (medijan 41 IU / mL, 9-160), varičele (medijan 1350 mlU / mL) 0-350, difteriju (medijan 0,165 IU / mL, 0,04-0,33) i tetanus (medijan 1,45 IU / mL, 0,5-2,1) su bili najniži 30. dana nakon transplantacije bubrega, ali su dostigli nivoe pre transplantacije tokom daljeg toka ispitivanja.

Primer 1.5: Nivoi T limfocita, B limfocita i NK ćelija pre transplantacije godinu dana nakon transplantacije

[0122] Broj CD4<+>i CD8<+>T limfocita kao i broj preostalih aktiviranih CD4<+>i CD8<+>T limfocita je stabilan pre i posle transplantacije. CD19<+>B limfociti su bili najviši 30. dana nakon operacije sa medijanom od 300/µL (149-561), ali su se vratili na nivoe pre transplantacije 180. dana sa medijanom od 35/µL (25-247). CD16<+>CD56<+>NK ćelije su se ponašale obrnuto, jer su bile najniže 30. dana nakon transplantacije sa medijanom od 60/µL (33-73), ali su se povećale 180. dana na medijanu od 104 (93-154).

Primer 1.6: Nepromenjen broj regulatornih T limfocita, ali ubedljivo povećan broj regulatornih B limfocita počevši od 135. dana nakon transplantacije

[0123] Regulatorni broj T limfocita (Treg) bio je nizak 30. dana nakon transplantacije (vidi sliku 4A-B) u vreme najsnažnije imunosupresivne terapije. Srednji procenat CD4+CD25+FokP3+CD127- T limfocita se zatim povećao sa 1% (0-1) na 3% (1-5) 180. dana (vidi sliku 4B). Ova vrednost je bila uporediva sa nivoom pre transplantacije i pre tretmana od 2,5% (2-4).

Primer 1.6: Nepromenjen broj regulatornih T limfocita, ali ubedljivo povećan broj regulatornih B limfocita počevši od 135. dana nakon transplantacije

[0123] Regulatorni broj T limfocita (Treg) bio je nizak 30. dana nakon transplantacije (vidi sliku 4A-B) u vreme najsnažnije imunosupresivne terapije. Srednji procenat CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>CD127<->T limfocita se zatim povećao sa 1% (0-1) na 3% (1-5) 180. dana (vidi sliku 4B). Ova vrednost je bila uporediva sa nivoom pre transplantacije i pre tretmana od 2,5% (2-4).

[0124] Zanimljivo je da je procenat CD19<+>CD24<high>CD38<high>nezrelih B limfocita (regulatorni B limfociti, Bregs) bio nizak do 90. dana nakon transplantacije sa medijanom od 2,0% (0,1-5,5) 30. dana (vidi slike 4 i 5). Nakon toga, Breg vrednosti su prorasle na medijan od 20,4% (5,0-39,6) 180. dana, što je daleko premašilo nivoe pre transplantacije koji su pokazivali medijan od samo 5,7% (0,4-11,2) pre infuzije MIC. Samo pacijent R11 sa potrebom za sistemskom terapijom metilprednizolonom mesec dana unapred pokazao je nižih 5,0% Bregs vrednosti 180. dana. Kod ovog pacijenta, Bregs vrednosti su se ponovo povećale i dostigale 17,0% pri poslednjem praćenju 670. dana. Ne samo relativni udeo već i apsolutni Breg brojevi su porasli sa medijane od 4,5/µL (0,3-14,8) 30. dana na 10/µL (3,8-15,3) 180. dana i 14,2 (4,0-23,9) 270. dana.

[0125] Breg procenti kod pacijenata grupe C u poređenju sa Breg procentima od 40 merenja kod 31 podudarnog primaoca transplantacije bubrega bez MIC infuzije su prikazani na slici 7. Pre MIC infuzije, vrednosti su bile uporedive između pacijenata grupe C i kontrola sa medijanom od 5,7% naspram 11,2%, respektivno. Nasuprot tome, kod pacijenata lečenih MIC-om, Breg vrednosti su dramatično povećane post-transplantacije i iznosile su 19, 26 i 13 puta veći 180, 270 i 360 dana nakon transplantacije, u poređenju sa kontrolama.

[0126] Bilo je od posebnog interesa da li se Breg vrednosti takođe povećaju kod pacijenata grupa A (koji primaju smanjenu ćelijsku dozu na dan -2) i B (koji primaju punu ćelijsku dozu na dan -2). U tu svrhu analizirali smo Bregov vrednosti iz zamrznutih uzoraka. Kao što se i očekivalo, pacijenti iz grupe C su 180. dana nakon transplantacije (sl. 6) pokazali najveće Breg procente koji su premašili vrednosti kod pacijenata grupe A i B za faktor 68, odnosno 20. Što je najvažnije, tokom post-transplantacionog toka većina Breg vrednosti od pacijenata grupe C proizvela je imunosupresivni citokin IL-10 (medijan od 44-100%) (vidi sliku 8).

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži ili se sastoji od

a) izolovane ćelije cele krvi i/ili mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) tretirane terapeutski efikasnom količinom aktivne supstance, i

b) opciono farmaceutski prihvatljiv nosač,

za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju odbacivanja transplantata organa ili ćelija kod humanog primaoca transplantata, pri čemu su izolovane ćelije cele krvi ili PBMC dobijen ili potiču od donora transplantata,

pri čemu prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelije obuhvata davanje farmaceutske kompozicije primaocu, pri čemu je količina farmaceutske kompozicije odabrana tako da najmanje 1,5 × 10<6>ćelija tretiranih ćelija cele krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca su administrirane, poželjno u jednom koraku primene,

pri čemu prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelija obuhvata administriranje primaocu najmanje 1 × 10<8>ćelija tretiranih ćelija cele krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se davanje izvodi najmanje 5 dana pre transplantacije,

pri čemu aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine hemoterapeutici, inhibitori proteazoma, imunosupresivni agensi, antiproliferativne supstance i njihove kombinacije.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time, što aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine mitomicin C, C2 ceramid, tunikamicin, mikofenolat-mofetil, metaboliti triptofana i njihovi polusintetički derivati.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od mitomicina C.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što PBMC sadrže monocite i limfocite.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što farmaceutski prihvatljiv nosač, ako je prisutan, sadrži ili se sastoji od jedne ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine šećeri kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobovi kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; celuloza i njeni derivati kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i acetat celuloza; tragakant u prahu; slad; želatin; talk; ekscipijenti kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije; ulja kao što su kikirikijevo ulje, ulje semenki pamuka, ulje šafranike, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikoli, kao što je propilen glikol; estri kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferski agensi kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol, rastvori fosfatnog pufera; netoksični, kompatibilni lubrikansi kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat; kao i sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome i mirisi, konzervansi i antioksidansi.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelije obuhvata administriranje primaocu najmanje 1,5 × 10<8>ćelija tretiranih celih krvnih ćelija ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca.

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što se ćelije administriraju primaocu najmanje 6 dana ili najmanje 7 dana pre transplantacije.

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što se administracija izvodi kao intravenska, intramuskularna ili subkutana injekcija, poželjno kao infuzija.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što prevencija i/ili lečenje odbacivanja transplantata organa ili ćelije obuhvata administriranje primaocu najmanje 1,3 × 10<8>ćelija, posebno poželjno najmanje 1,5 × 10<8>ćelija tretiranih ćelija cele krvi ili tretiranih PBMC po kg telesne težine primaoca, pri čemu se primena izvodi najmanje 5 dana, poželjno najmanje 6 dana, posebno poželjno najmanje 7 dana pre transplantacije.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu aktivna supstanca sadrži ili se sastoji od mitomicina C.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što se ćelije administriraju primaocu nakon 4 do 48 sati nakon tretmana ćelija aktivnom supstancom.