RS65370B1 - Metode i kompozicije za unapređenje proizvodnje proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline - Google Patents

Metode i kompozicije za unapređenje proizvodnje proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline

Info

Publication number
RS65370B1
RS65370B1 RS20240405A RSP20240405A RS65370B1 RS 65370 B1 RS65370 B1 RS 65370B1 RS 20240405 A RS20240405 A RS 20240405A RS P20240405 A RSP20240405 A RS P20240405A RS 65370 B1 RS65370 B1 RS 65370B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
cell line
gene
bax
bak
Prior art date
Application number
RS20240405A
Other languages
English (en)
Inventor
Sigeng Chen
Yingchun Lu
Feng Tian
Original Assignee
Ambrx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ambrx Inc filed Critical Ambrx Inc
Publication of RS65370B1 publication Critical patent/RS65370B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovo otkriće se odnosi na oblast genomskog inženjeringa i generisanja ćelijskih linija za proizvodnju polipeptida koji ne sadrže prirodne aminokiseline. Sadašnji pronalazak se uopšteno govoreći odnosi na oblast generisanja, razvoja i proizvodnje polipeptida i proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline.
STANJE TEHNIKE
[0002] Publikacije Application of chemically orthogonal directed engineered system in eukaryotic cells (EuCODE), (Feng et al., (2013), A general approach to site-specific antibody drug conjugates, PNAS 111(5): 1766-1771; Schultz et al., USPN 7,083,970), predstavljaju napredak u genetskoj proizvodnji proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline. Poslednjih godina ova tehnologija je brzo napredovala u oblasti konjugacije antitela sa lekovima (vezivanje antitela za lekove) (ADC); (videti na primer, U.S. Patent Publications Nos. 20150018530, 20150141624, 20150152187 i 20150152190). Međutim, širu primenu proteina koji ne sadrže neprirodne aminokiseline u industriji ometa relativno mali prinos u ćelijama sisara.
[0003] Zapažanja ukazuju da glavni faktor koji verovatno doprinosi niskom prinosu proizvodnje proteina može biti indukovana apoptoza uzrokovana prekomernom nenaelektrisanom tRNK u sistemu. Kao što je poznato u tehnici, apoptoza može biti pokrenuta različitim unutrašnjim ili spoljašnjim faktorima u ćelijskim kulturama, uključujući same proizvodne procese. Drugi izazovi koji doprinose niskom prinosu proizvodnje proteina su ćelijski stresori sposobni da aktiviraju unutrašnje apoptotičke puteve nakon povećanja skale proizvodnje u procesima unutar bioreaktora. Stoga, u industriji postoji potreba za poboljšanim metodama i kompozicijama za unapređenje i povećanja skale proizvodnje proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline. Sadašnji pronalazak se bavi ovim i drugim potrebama, što će biti očigledno posle analize otkrića koje sledi.
[0004] WO 2016/066995 opisuje ugradnju neprirodnih aminokiselina u proteine.
[0005] WO 2008/127900 opisuje metode genetskog kodiranja neprirodnih aminokiselina u eukariotskim ćelijama koristeći ortogonalne parove tRNK/sintetaza.
[0006] Zhang et al., Scientific Reports (2015), 6(1), opisuje CRISPRi manipulaciju širenja genetskog koda preko RF1 za preraspodelu amber kodona u bakterijama.
[0007] WO 2009/151591 opisuje metode i kompozicije za generisanje ćelijskih linija bez Bax i Bak.
[0008] Marie Grav et al., Biotechnology JouRNKl (2015), 10(9):1446-1456, opisuje generisanje CHO ćelijskih linija u jednom koraku koristeći CRISPR-Cas9 i fluorescentno obogaćivanje.
[0009] Ilegems et al., Prot. Eng. Design & Selection (2004), 17(12):821-827, opisuje da smanjenje ćelijskog odgovora od strane eRFI RNK interferencijom čime se povećava efikasnost supresije pogrešno acilovane tRNK u ljudskim ćelijama.
[0010] Lajoie et al., Science (2013), 342(6156):357-360, opisuje konstrukciju i karakterizaciju genomski rekodiranog organizma.
[0011] WO 2010/141851 opisuje poboljšanu inkorporaciju neprirodne aminokiseline u eukariotske ćelije.
[0012] Wang i Wang, J. Am. Chem. Soc. (2008), 130(19):6066-6067, opisuje nove metode koje omogućavaju efikasno ugrađivanje neprirodnih aminokiselina u kvasac.
[0013] Wang i Wang, Methods mol. biol. (2011), 794:199-213, opisuje genetsku inkorporaciju neprirodnih aminokiselina u proteine kvasca.
[0014] Cohen et al., Chembiochem (2016), 17(11):1008-1011, opisuje sistem zasnovan na jednom plazmidu za efikasnu nekanonsku mutagenezu aminokiselina u kultivisanim ćelijama sisara.
SUŠTINA PRONALASKA
[0015] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metod za generisanje ćelijske linije koja ima smanjenu apoptozu za inkorporaciju neprirodne aminokiseline u protein, metod koji obuhvata inaktivaciju jednog ili više ciljnih mesta ili regiona u ćeliji, pri čemu jedno ili više ciljnih mesta ili regiona jeste pro-apoptotički gen uključen u apoptotički put, pri čemu je jedno ili više ciljnih mesta ili regiona pro-apoptotički gen odabran od Bax i Bak, gde ćelija ekspresuje gen koji sadrži selektor kodon od interesa i pri čemu ćelija uključuje ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) i ortogonalnu supresornu tRNK (O-tRNK).
[0016] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje metod za snižavanje ili smanjenje apoptoze u ćeliji, gde ćelija ekspresuje gen koji sadrži selektor kodon od interesa, i gde ćelija sadrži ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) i ortogonalnu supresornu tRNK ( O-tRNK), metod koji uključuje inaktivaciju jednog ili više pro-apoptotičkih ciljnih mesta ili regiona u ćeliji, pri čemu je jedno ili više pro-apoptotičkih ciljnih mesta ili regiona odabrano između Bax i Bak.
[0017] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje metod za generisanje ćelije ili ćelijske linije koja ima smanjenu apoptozu za inkorporaciju neprirodne aminokiseline u protein, metod koji se sastoji od: obezbeđivanja ćelije ili ćelijske linije koja ekspresuje gen od interesa koji sadrži selektor kodon, i koji sadrži ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) i ortogonalnu supresornu tRNK (O-tRNK); uvođenje u ćelijsku liniju molekula nukleinske kiseline sposobnog da inaktivira jedno ili više ciljnih mesta ili regiona u ćeliji ili ćelijskoj liniji, pri čemu je jedno ili više ciljnih mesta ili regiona proapoptotski gen uključen u apoptotski put, pri čemu je proapoptotski gen odabran između Bax i Bak; opciono, pri čemu je molekul nukleinske kiseline odabran između SEQ ID NO: 1-6, i dalje opciono obezbeđuje neprirodnu aminokiselinu ćeliji ili ćelijskoj liniji.
[0018] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju ili ćelijsku liniju koja ima smanjenu apoptozu za ugrađivanje neprirodne aminokiseline u protein, pri čemu ćelija ekspresuje gen od interesa koji sadrži selektor kodon, pri čemu ćelija uključuje ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS), i ortogonalnu supresorsku tRNK (O-tRNK); i pri čemu ćelija sadrži jedno ili više inaktiviranih ciljnih mesta ili regiona, pri čemu je jedno ili više inaktiviranih ciljnih mesta ili regiona proapoptotski gen uključen u apoptotski put, pri čemu je proapoptotski gen odabran od Bax i Bak.
[0019] U jednoj realizaciji, ćelija ili ćelijska linija je eukariotska. U drugim realizacijama ćelija ili ćelijska linija se bira između COS, CHO, VERO, MDCK, WI38, W79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa ili HEK293. U jednom drugom aspektu, ćelija ili ćelijska linija je privremena, stabilna ćelijska populacija ili stabilna klonska ćelijska linija. U drugoj realizaciji, ćelija je izolovana ćelija. Izolovana ćelija služi za dobijanje proteina koji sadrži neprirodnu aminokiselinu.
[0020] U drugim realizacima, neprirodna aminokiselina je specifično inkorporirana. U drugoj realizaciji neprirodna aminokiselina je para-acetil fenilalanin, p-nitrofenilalanin, psulfotirozin, p-karboksifenilalanin, o-nitrofenilalanin, m-nitrofenilalanin, p-boronil fenilalanin, o-boronilfenilalanin, m-boronilfenilalanin, p-aminofenilalanin, oaminofenilalanin, m-aminofenilalanin, p-acilfenilalanin, o-acilfenilalanin, m-acilfenilalanin, p-OMe fenilalanin, o-OMe fenilalanin, m-OMe fenilalanin, p-sulfofenilalanin, osulfofenilalanin, m-sulfofenilalanin, 5-nitro His, 3-nitro Tyr, 2-nitro Tyr, nitro supstituisani Leu, nitro supstituisani His, nitro supstituisani De, nitro supstituisani Trp, 2-nitro Trp, 4-nitro Trp, 5-nitro Trp, 6-nitro Trp, 7-nitro Trp, 3-aminotirozin, 2-aminotirozin, O-sulfotirozin, 2-sulfooksifenilalanin, 3-sulfooksifenilalanin, o-karboksifenilalanin, m-karboksifenilalanin, p-acetil-L-fenilalanin, p-propargil-fenilalanin, O-metil-L-tirozin, L-3-(2-naftil)alanin, 3-metil-fenilalanin, O-4-alil-L-tirozin, 4-propil-L-tirozin, tri-O-acetil-GlcNAcβ-serin, L-Dopa, fluorisani fenilalanin, izopropil-L-fenilalanin, p-azido-L-fenilalanin, p-acil-L-fenilalanin, pbenzoil-L-fenilalanin, L-fosfoserin, fosfonoserin, fosfonotirozin, p-jodfenilalanin, pbromfenilalanin, p-amino-L-fenilalanin, izopropil-L-fenilalanin ili p-propargiloksifenilalanin. U nekim realizacijama sadašnjeg pronalaska neprirodna aminokiselina odabira se između O-metil-L-tirozina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O-4-alil-L-tirozina, 4-propil-L-tirozina, p-propargiloksi-L-fenilalanina, tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, L-Dope, fluorisanog fenilalanina, izopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirozina, pjodfenilalanina, p-bromfenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, ili izopropil-L-fenilalanina.
[0021] Ovde je takođe opisan gen od interesa ili gen od interesa koji sadrži kodon selektor. Kodon selektor je besmisleni kodon, retki kodon ili kodon sa četiri baze. U drugoj realizaciji kodon selektor sadrži oker kodon, opal kodon ili amber kodon. U određenim aspektima, selektorski kodon je amber kodon.
[0022] U realizacijama sadašnjeg pronalaska, gen od interesa ili gen koji sadrži selektor kodon od interesa je bioterapeutski gen ili proizvod uključujući vakcinu ili antitelo. Gen od interesa ili gen koji sadrži kodon selektor od interesa je antitelo, scFv, scFv fuzioni proteini, Fc fuzioni proteini, Factor VII, Factor VIII, ili Factor IV. U drugim realizacijama, gen od interesa ili gen koji sadrži selektor kodon od interesa je citokin, interleukin, interferon, hemokin, faktor rasta, hormon i njihovi receptori, analozi, bispecifici ili njihovi fragmenti. U jednom drugom aspektu gen od interesa je HER2, CD-70, PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, IL-2, IL-3, IL-10, IL-15, GPC3, DLL3, ROR1, leptin, FGF-21, FGF-23, HGH, FcR, insulin, TNFR1, TRAIL, EPO, i analozi, bispecifici ili njihovi fragmenti. U drugim realizacijama, gen od interesa ili gen koji sadrži selektor kodon od interesa je izabran iz grupe koju čine: citokin, faktor rasta, receptor faktora rasta, interferon, interleukin, inflamatorni molekul, onkogeni proizvod, peptidni hormon, molekul za transdukciju signala, receptor steroidnih hormona, eritropoetin (EPO), insulin, humani hormon rasta, alfa-1 antitripsin, angiostatin, antihemolitički faktor, antitelo, apolipoprotein, apoprotein, atrijalni natriuretik faktor, atrijalni natriuretski polipeptid, atrijalni peptid, C-Ks-C hemokin, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, kalcitonin, c-kit ligand, citokin, CC hemokin, monocitni hemoatraktantni protein-1, monocitni hemoatraktantni protein-2, monocitni hemoatraktantni protein-3, monocitni inflamatorni protein-1 alfa, monocitni inflamatorni protein-1 beta, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 ligand, C-kit ligand, kolagen, stimulišući faktor kolonija (SCF), komplement faktor 5a, inhibitor komplementa, receptor komplementa 1, citokin, DHFR, epitelni peptid koji aktivira neutrofile-78, GROa/MGSA, GRO β, GRO γ i MIP-1 α, MIP-1 δ, MCP-1, epidermalni faktor rasta (EGF), peptid koji aktivira epitelne neutrofile, eritropoetin (EPO), exfoliating toksin, faktor IX, faktor VII, faktor VIII, faktor X, faktor rasta fibroblasta (FGF), fibrinogen, fibronektin, G-CSF, GM-CSF, glukocerebrozidaza, gonadotropin, faktor rasta, receptor faktora rasta, ježev protein, hemoglobin, faktor rasta hepatocita (HGF), hirudin, ljudski serum albumin, ICAM-1, ICAM-1 receptor, LFA-1, LFA-1 receptor, insulin, faktor rasta sličan insulinu (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon, IFN- α, IFN- β, IFN- γ, interleukin, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL -7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, faktor rasta keratinocita (KGF), laktoferin, faktor inhibitora leukemije, luciferaza, neurturin, faktor inhibitora neutrofila (NIF), onkostatin M, osteogeni protein, onkogeni proizvod, paratiroidni hormon, PD-ECSF, PDGF, peptidni hormon, humani hormon rasta, pleiotropin, protein A, protein G, pirogeni egzotoksini A, B ili C, relaksin, renin, SCF, rastvorljivi receptor komplementa I, rastvorljivi I-CAM 1, rastvorljivi interleukinski receptor, rastvorljivi TNF receptor, somatomedin, somatostatin, somatotropin, streptokinaza, superantigen, stafilokokni enterotoksini, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, receptor steroidnih hormona, superoksid dismutaza (SOD), toksin sindroma toksičnog šoka, timozin alfa 1, aktivator tkivnog plazminogena, faktor rasta tumora (TGF), TGF- α, TGF- β, faktor nekroze tumora, faktor nekroze tumora alfa, faktor nekroze tumora beta, receptor faktora nekroze tumora (TNFR), protein VLA-4, protein VCAM-1, faktor rasta vaskularnog endotela (VEGEF), urokinaza, Mos, Ras, Raf, Met; p53, Tat, Fos, Mic, Jun, Mib, Rel, receptor estrogena, receptor progesterona, receptor testosterona, receptor aldosterona, LDL receptor, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, hijalurin/CD44 i kortikosteron.
[0023] Mesto ili region ciljani za deaktivaciju je Bax ili Bak. U drugim realizacijama ciljno mesto ili region za inaktivaciju je potpuno ili delimično inaktiviran. Delimično inaktivirano, prekinuto, izbačeno ili uklonjeno mesto ili region može uključivati lokaciju ili region koji je 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% , 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, inaktivirano, prekinuto, izbačeno ili uklonjeno.
[0024] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline je izabran od SEQ. ID NO.1-6. U jednom drugom aspektu, jedno ili više mesta ili regiona ciljanih za inaktivaciju, izabranih od Bax i Bak, je isto ili različito.
[0025] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod kao što je gore navedeno za optimizaciju prinosa proteina ili polipeptida koji uključuje neprirodnu aminokiselinu. U nekim realizacijama ćelija ili ćelijska linija pronalaska ili kako se koristi u metodama pronalaska je privremena ćelijska linija, stabilna populacija ćelijske linije ili stabilna klonska ćelijska linija. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod za optimizaciju prinosa proteina ili polipeptida koji imaju mesto za specifično inkorporiranu neprirodnu aminokiselinu.
[0026] U drugim realizacijama, stabilna populacija ćelija ili ćelijske linije je platforma ili proizvodna ćelija ili ćelijska linija.
[0027] U nekim realizacijama metode prema sadašnjem pronalasku, prinos proteina koji sadrži neprirodne aminokiseline je najmanje 0,5 puta ili veći nego bez inaktivacije jednog ili više mesta ili regiona ciljanih za inaktivaciju u ćeliji.
[0028] U jednom aspektu sadašnjeg pronalaska, jedan ili više konstruisanih molekula nukleinske kiseline se uvodi u ćelijsku liniju. Jedan ili više konstruisanih molekula nukleinske kiseline mogu uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konstruisanih molekula nukleinskih kiselina. U drugim realizacijama, jedan ili više konstruisanih molekula nukleinske kiseline je sa istog ili različitog ciljnog mesta ili regiona. U nekim realizacijama, projektovani molekuli nukleinske kiseline mogu uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konstruisanih molekula nukleinskih kiselina sa istog ciljnog mesta ili regiona u ćeliji. U nekim realizacijama, projektovani molekuli nukleinske kiseline mogu uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konstruisanih molekula nukleinskih kiselina sa različitog ciljnog mesta ili regiona.
[0029] U drugim realizacijama, polinukleotid koji prepoznaje jedno ili više mesta ili regiona ciljanih za inaktivaciju, uklanjanje, izbacivanje ili prekid u ćeliji može uključivati polinukleotid koji prepoznaje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više mesta ili regiona.
[0030] U određenim realizacijama, obezbeđena je stabilna proizvodna ćelijska linija. U drugim realizacijama, ćelija ili ćelijska linija je eukariotska ćelija ili ćelijska linija. U drugim realizacijama, eukariotska ćelija ili ćelijska linija mogu uključiti bilo koju od, na primer, ćeliju sisara, ćeliju kvasca, ćeliju gljive, biljnu ćeliju, ćeliju insekata, ali ne ograničavajući se na njih. U nekim realizacijama eukariotska ćelija ili ćelijska linija je ćelija ili ćelijska linija kičmenjaka. U nekim realizacijama eukariotska ćelija ili ćelijska linija je ćelija ili ćelijska linija sisara ili čoveka. U drugim realizacijama, ćelija ili ćelijska linija mogu uključivati COS, CHO (na primer, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa ili HEK293 (na primer, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) ćelije ili ćelijske linije, ali nije ograničena na njih. U drugim realizacijama, ćelija ili ćelijska linija je CHO ćelija ili ćelijska linija uključujući, na primer, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV. U drugim realizacijama, ćelija ili ćelijska linija je CHO-K1, MDCK ili HEK293 ćelija ili ćelijska linija. U određenim realizacijama, ćelija ili ćelijska linija je CHO-K1 ćelija ili ćelijska linija.
[0031] U drugim realizacijama, optimizacija, ili poboljšanje, ili povećanje ili poboljšanje prinosa polipeptida ili proteina koji ne sadrži prirodne aminokiseline može uključivati optimizaciju, ili poboljšanje, ili povećanje, ili poboljšanje prinosa najmanje 0,5 puta, najmanje 1 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, ili najmanje 10 ili više puta nego u odsustvu molekula nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid koji prepoznaje jedno ili više mesta ili regiona ciljanih za inaktivaciju, uklanjanje, izbacivanje ili prekid u ćeliji.
KRATAK OPIS SLIKA
[0032]
SLIKA 1, paneli A i B. Strategija za korišćenje ćelijskih linija u panelu u industriji i farmaceutskim kompanijama za proizvodnju proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline. Slika 1 prikazuje važne uloge korišćenja platforme ćelijske linije u industriji (SLIKA 1A) i u farmaceutskim kompanijama (SLIKA 1B).
SLIKA 2. Opšti postupak korišćenja platforme ćelijske linije u razvoju proizvodnje ćelijske linije na veliko.
SLIKA 3, paneli A-C. Strategije za optimizaciju razvoja proizvodnje ćelijske linije na veliko. SLIKA 3 prikazuje optimizaciju razvoja proizvodnje ćelijske linije na veliko iz nekoliko aspekata kao što su depozicija pojedinačnih ćelija zavisna od FACS (SLIKA 3A), CRISPR nokaut (SLIKA 3B) i optimizacija procesa razvoja ćelijske linije (SLIKA 3C).
SLIKA 4, paneli A i B. Posmatranje apoptoze u ćelijama iz platforme ćelijske linije-4E2. Aneksin V test je korišćen za procenu održivosti (vijabilnosti) CHO-S ćelija (SLIKA 4A) i ćelijske linije platforme 4E2 (SLIKA 4B) koje sadrže genetski ugrađeni ortogonalni par tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze koja posebno uključuje paraacetil-L-fenilalanin. Kao što je prikazano na slici 4, u poređenju sa CHO-S ćelijama (vijabilnost je 96%), 4E2 je pokazao prekomernu apoptozu (vijabilnost je 85%). SLIKA 5. CRISPR gRNK dizajn ciljanog BAX gena u CHO ćelijama. Slika 5 prikazuje sekvencu genomske DNK BAX gena u CHO ćelijama u kojima su označene tri gRNK sekvence. Genomska DNK sekvenca BAX gena, ekson 1 i ekson 2 prikazani su sivom nijansom. Druga sekvenca BAX-a je prikazana u običnom tekstu. Prajmeri koji se koriste u PCR-u i sekvenciranju su prikazani na početku i na kraju sekvence kao prednji prajmer i reversni prajmer, redom.
SLIKA 6. CRISPR gRNK dizajn ciljanog BAK gena u CHO ćelijama. Slika 6 prikazuje sekvencu genomske DNK BAK gena u CHO ćelijama u kojima su označene dve gRNK sekvence. Genomska DNK sekvenca BAK gena, ekson 2 i ekson 3 prikazani su sivom nijansom. Druga sekvenca BAK-a je prikazana u običnom tekstu. Prajmeri koji se koriste u PCR-u i sekvenciranju su prikazani na početku i na kraju sekvence kao prednji prajmer i reversni prajmer, redom.
SLIKA 7. BAX ili BAK CRISPR konstrukti. Slika 7 prikazuje dizajn CRISPR plazmida koji se koriste u BAX ili BAK nokaut eksperimentima. Geneart CRISPR Nuclease Vector (pGCNV) je komercijalno dostupan vektor kompanije Thermo Fisher science, (San Dijego, Kalifornija). Kompletan obrazac pGCNV plazmida se priprema umetanjem oligo-dupleksa u isečeni pGCNV vektor koji sadrži prorez za oligo (oligonukleotidni) dupleks koji je dizajniran sa specifičnim gRNK sekvencama dugim 19 nukleotida za pojedinačno ciljanje genskog mesta (videti Tabelu 1 na drugom mestu u ovom dokumentu).
SLIKA 8. Prikazuje strukture reprezentativnih neprirodnih aminokiselina iz sadašnjeg pronalaska.
SLIKA 9. Ispitivanje populacija ćelija koje ekspresuju anti-HER2 u kojima je BAX ili BAK bio izbačen korišćenjem CRISPR. Slika 9 prikazuje Surveyor analizu efikasnosti izbacivanja (knockout) tokom BAX ili BAK izbacivanja korišćenjem CRISPR. Smanjenje gornje trake i pojava novih donjih traka ukazuju na efikasnost koja se može kvantifikovati denzitometrijskom analizom skenirane slike pomoću softvera Image J. Odnos originalnog opsega pre i posle CRISPR izbacivanja (knockout) (KO) korišćen je za merenje efikasnosti izbacivanja. Efikasnost izbacivanja za BAX i BAK bila je 30% i 70% redom, što je rezultiralo izračunatom efikasnošću dvostrukog izbacivanja od približno 21%.
SLIKA 10. DNK analiza jednoćelijskih klonova koji ekspresuju anti-HER2 sa BAX i BAK genom izbačenim korišćenjem CRISPR. Slika 10 prikazuje rezultate DNK sekvenciranja dvadeset pojedinačnih ćelijskih klonova nakon izbacivanja BAK korišćenjem CRISPR. Gornja DNK sekvenca (Bak-CHO-gDNA1) je DNK sekvenca genomskog regiona originalnog BAK gena. Samo klon 'ZA_112_K32_BakI-II' ima identičnu sekvencu originalnog BAK gena. Ostali geni prikazani na slici imaju ili delecije ili insercije u svojim sekvencama.
SLIKA 11. Western blot analiza potvrde BAX izbacivanja (knockout) u anti-HER2 ekspresujućim BAX nokaut klonovima koristeći CRISPR. BAX je 21-KD protein koji je prikazan kao traka u ćelijama L082 koje nemaju nokaut gena i ekspresuju divlji tip BAX proteina. Ostali klonovi nisu pokazali vidljivu ekspresiju BAX proteina koji se može detektovati osim klona UBB3 koji pokazuje rezidualnu ekspresiju BAX. SLIKA 12, paneli A i B. Analiza apoptoze anti-HER2 gde su ekspresovane BAX/BAK nokaut ćelijske linije. Slika 12 prikazuje analizu apoptoze Aneksinom V roditeljske ćelijske linije L082 (SLIKA 12A) i dvostrukog izbacivanja (knockout) BAX/BAK ćelijske linije BB15 (SLIKA 12B). Kao što je prikazano u tabeli, vijabilnost ćelija je poboljšana sa 40% na 80% nakon BAX i BAK nokauta. Istovremeno, apoptotičke ćelije se smanjuju sa 53% na 17%.
SLIKA 13, paneli A-D. Poboljšanje u proizvodnji anti-HER2 antitela sa BAX/BAK izbačenim (knockout, nokaut) ćelijskim linijama u kulturi jedne šarže. Slika 13 prikazuje promene proizvodnje proteina u ćelijskim linijama gde je došlo do dvostrukog izbacivanja BAX/BAK. Proizvodnja proteina se analizira tokom serijske proizvodnje. Gustina vijabilnih ćelija (Viable Cell Density, VCD, SLIKA 13A). Vijabilnost ćelije (SLIKA 13B). Tokom proizvodnje serije (7. dan), ćelijska linija sa dvostrukim izbacivanjem (knockout) BAX/BAK je pokazala povećanje titra sa 150 mg/L na 270 mg/L (SLIKA 13C). Specifična produktivnost (Qp) (SLIKA 13D). SLIKA 14, paneli A-D. Poboljšanje u proizvodnji anti-HER2 antitela u BAX/BAK izbačenim ćelijskim linijama u hranjenoj kulturi jedne šarže. Slika 14 prikazuje promene proizvodnje proteina u ćelijskim linijama gde je došlo do dvostrukog izbacivanja (knockout) BAX/BAK. Proizvodnja proteina se analizira tokom serijske proizvodnje sa hranjenjem. Gustina vijabilnih ćelija (Viable Cell Density, VCD, SLIKA 14A). Vijabilnost ćelije (SLIKA 14B). Tokom proizvodnje serije sa hranjenjem (14. dan), ćelijska linija sa dvostrukim izbacivanjem (knockout) BAX/BAK je pokazala povećanje titra sa 450 mg/L na 1500 mg/L (SLIKA 14C). Specifična produktivnost (Qp) (SLIKA 14D).
SLIKA 15. Ispitivanje populacija ćelija koje ekspresuju anti-PSMA u kojima je BAX ili BAK izbačen korišćenjem CRISPR. Slika 15 prikazuje Surveyor analizu efikasnosti tokom izbacivanja BAX ili BAK korišćenjem CRISPR. Odnos originalne trake pre i posle CRISPR izbacivanja (knockout) (KO) kvantifikovan je denzitometrijskom analizom skenirane slike pomoću softvera Image J i korišćen je za merenje efikasnosti izbacivanja. Efikasnost izbacivanja za BAX i BAK bila je 42% i 53% redom, što je rezultiralo izračunatom efikasnošću dvostrukog izbacivanja (knockout) od približno 20%.
SLIKA 16, paneli A i B. Western blot analiza potvrde izbacivanja BAX i BAK u anti-PSMA ekspresujućim klonovima. BAX potvrda izbacivanja u anti-PSMA ekspresujućim klonovima koristeći CRISPR (SLIKA 16A). Potvrda izbacivanja BAK u anti-PSMA ekspresujućim klonovima (SLIKA 16B). Kontrole su ćelije L082 koje ekspresuju divlji tip BAX proteina, trake na 21-KD i anti-HER2 koje ekspresuju BB15 ćelije - BAX/BAK dvostruko izbacivanje (knockout).
SLIKA 17. Analiza apoptoze posle izbacivanja (knockout) BAX/BAK u anti-PSMA ćelijskim linijama. Slika 17 prikazuje analizu apoptoze pomoću Aneksina V pri dvostrukom izbacivanju BAX/BAK ćelijskih linija PSMA-192 i PSMA 719 sa vijabilnošću ćelije od oko 85% u poređenju sa približno 35-37% kod pojedinačnih KO klonova (PSMA-882) ili klonova koji nisu podvrgnuti izbacivanju (knockout) (PSMA-484).
SLIKA 18, paneli A-C. Poboljšanje u proizvodnji anti-PSMA antitela u ćelijskim linijama sa izbačenim (knockout) BAX/BAK u kulturi sa hranjenjem. Slika 18 prikazuje promene proizvodnje proteina u dvostruko izbačenim (knockout) BAX/BAK ćelijskim linijama, na primer, prikazana je ćelijska linija PSMA-BBKO-192). Proizvodnja proteina se analizira tokom serijske proizvodnje sa hranjenjem. Gustina vijabilnih ćelija (Viable Cell Density, VCD, SLIKA 18A). Vijabilnost ćelije (SLIKA 18B). Za vreme proizvodnje jedne serije sa hranjenjem (14. dan), ćelijska linija dvostruko izbačenih BAX/BAK pokazala je povećanje titra sa 500 mg/L na 1400 mg/L (SLIKA 18C).
SLIKA 19. Ispitivanje populacija ćelija koje ekspresuju anti-CD70 u kojima je BAX ili BAK izbačen (knockout) korišćenjem CRISPR. Slika 19 prikazuje Surveyor analizu efikasnosti izbacivanja tokom BAX ili BAK izbacivanja korišćenjem CRISPR. Odnos originalne trake pre i posle CRISPR izbacivanja (knockout) (KO) kvantifikovan je denzitometrijskom analizom skenirane slike pomoću softvera Image J i korišćen je za merenje efikasnosti izbacivanja. Efikasnost izbacivanja za BAX i BAK bila je 51% i 23%, redom, što je rezultiralo izračunatom efikasnošću dvostrukog izbacivanja (knockout) od približno 10%.
SLIKA 20, panel A i B. Western blot analiza potvrde izbacivanja BAX i BAK u anti-CD70 ekspresujućim klonovima. BAX potvrda izbacivanja (knockout) u anti-CD70 ekspresujućim klonovima (SLIKA 20A). Potvrda izbacivanja BAK u anti-CD70 ekspresujućim klonovima (SLIKA 20B). Kontrolne ćelije L082 koje ekspresuju divlji tip BAX proteina, traka na 21-KD, i BAK divljeg tipa proteina, traka na 24 KD. SLIKA 21. Analiza apoptoze posle izbacivanja BAX/BAK u anti-CD70 ćelijskim linijama. Slika 21 prikazuje analizu apoptoze pomoću Aneksina V pri dvostrukom izbacivanju (knockout) BAX/BAK ćelijskih linija CD70-BBKO-563, na primer, sa vijabilnošću ćelije od 60% u poređenju sa roditeljskom ćelijskom linijom CD70-MV-108 sa vijabilnošću ćelije od 18%. Apoptične ćelije su smanjene sa 80% na 40%.
SLIKA 22, paneli A-C. Poboljšanje u proizvodnji anti-CD70 antitela u ćelijskim linijama sa izbačenim (knockout) BAX/BAK u kulturi sa fed-batch prihranom. Slika 22 prikazuje profile proizvodnje u dvostruko izbačenim (knockout) BAX/BAK ćelijskim linijama koje ekspresuju anti-CD70 u tikvici za mućkanje i bioreaktoru na radnom stolu. Gustina vijabilnih ćelija (Viable Cell Density, VCD, SLIKA 22A). Vijabilnost ćelije (SLIKA 22B). Na primer, ćelijska linija sa dvostruko izbačenim BAX/BAK, CD70-BBKO-563, pokazala je visok titar od 1000 mg/L (SLIKA 22C).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0033] Kako što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju označavanje množine osim ako sadržaj jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, navod "a cell" uključuje kombinaciju dve ili više ćelija i slično.
Definicije
[0034] Pojam "nukleinska kiselina", kako se ovde koristi, odnosi se na deoksiribonukleotide, deoksiribonukleozide, ribonukleozide ili ribonukleotide i njihove polimere u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Samo Na primer, takve nukleinske kiseline i polimeri nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, (i) analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina i metabolišu se na način sličan nukleotidima koji se javljaju u prirodi; (ii) analozi oligonukleotida uključujući, ali nisu ograničeni na, PNA (peptidonukleinsku kiselinu), analoge DNK koji se koriste u antisens tehnologiji (fosforotioati, fosforoamidati i slično); (iii) njihove konzervativno modifikovane varijante (uključujući, ali ne ograničavajući se na, supstitucije degenerisanog kodona) i komplementarne sekvence i eksplicitno naznačene sekvence. Na primer, supstitucije degenerisanog kodona mogu se postići generisanjem sekvenci u kojima je treća pozicija jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisana mešovitim baznim i/ili deoksiinozinskim ostacima (Batzer et al., Nucleic Acid Res.
19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260: 2605-2608 (1985) i Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0035] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde koriste naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka. To jest, opis usmeren na polipeptid se podjednako primenjuje na opis peptida i opis proteina, i obrnuto. Termini se odnose na polimere aminokiselina koje se javljaju u prirodi, kao i na polimere aminokiselina u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka neprirodna aminokiselina. Dodatno, takvi "polipeptidi", "peptide" i "proteini" uključuju nizove aminokiselina bilo koje dužine, uključujući proteine pune dužine, pri čemu su aminokiselinski ostaci povezani kovalentnim peptidnim vezama.
[0036] Kako se ovde koristi, termin "ortogonalni" se odnosi na molekul (npr., ortogonalna tRNK (O-tRNK) i/ili ortogonalna aminoacil tRNK sintetaza (O-RS)) koji funkcioniše sa endogenim komponentama ćelije sa smanjenom efikasnošću u poređenju sa odgovarajućim molekulom koji je endogen za ćeliju ili sistem translacije, ili koji ne funkcioniše sa endogenim komponentama ćelije. U kontekstu tRNK i aminoacil-tRNK sintetaze, ortogonalno se odnosi na nemogućnost ili smanjenu efikasnost, npr. efikasnost manja od 20 %, efikasnost manja od 10 %, efikasnost manja od 5 % ili efikasnost manja od 1 %, ortogonalne tRNK da funkcioniše (interaguje) sa endogenom tRNK sintetazom u poređenju sa endogenom tRNK koja interaguje sa endogenom tRNK sintetazom, ili da ortogonalna aminoacil-tRNK sintetaza funkcioniše (interaguje) sa endogenom tRNK u poređenju sa endogenom tRNK sintetazom da interaguje sa endogenom tRNK. Ortogonalnom molekulu nedostaje funkcionalni endogeni komplementarni molekul u ćeliji. Na primer, ortogonalna tRNK u ćeliji je aminoacilovana bilo kojim endogenim RS ćelije sa smanjenom ili čak nultom efikasnošću, u poređenju sa aminoacilovanjem endogene tRNK od strane endogenog RS. U drugom primeru, ortogonalni RS aminoaciluje bilo koju endogenu tRNK u ćeliji od interesa sa smanjenom ili čak nultom efikasnošću, u poređenju sa aminoacilovanjem endogene tRNK od strane endogenog RS. Drugi ortogonalni molekul se može uvesti u ćeliju koja interaguje sa prvim ortogonalnim molekulom. Na primer, ortogonalni par tRNK/RS uključuje uvedene komplementarne komponente koje funkcionišu zajedno u ćeliji sa efikasnošću (npr.50% efikasnosti, 60% efikasnosti, 70% efikasnosti, 75% efikasnosti, 80% efikasnosti, 90% efikasnosti, 95 % efikasnosti, ili 99% ili više efikasnosti) u odnosu na odgovarajući endogeni par tRNK/RS.
[0037] Pojam" selektor kodon " odnosi se na kodone koji su prepoznati od O-tRNK u procesu translacije, a nisu prepoznati od endogene tRNK. O-tRNK antikodonska petlja prepoznaje selektor kodon na mRNK i inkorporira njegovu aminokiselinu, na primer, neprirodnu aminokiselinu, na ovom mestu u polipeptidu. Selektor kodoni mogu uključivati, npr., besmisleni kodone, kao što su stop kodoni, npr., amber kodoni, oker i opal kodoni; četiri ili više baznih kodona; retki kodoni; kodoni izvedeni iz prirodnih ili neprirodnih parova baza i/ili slično.
[0038] Pojam "supresorska tRNK" je tRNK koja menja čitanje informacione RNK (mRNK) u datom sistemu translacije, na primer, obezbeđujući mehanizam za ugradnju aminokiseline u polipeptidni lanac kao odgovor na selektor kodon. Na primer, supresorska tRNK može pročitati, na primer, stop kodon, četvorobazni kodon, retki kodon i/ili slično.
[0039] Pojam "translacioni sistem" se odnosi na kolektivni skup komponenti koje inkorporiraju prirodnu aminokiselinu u rastući polipeptidni niz (protein). Komponente translacionog sistema mogu uključivati, na primer, ribozome, tRNK, sintetaze, mRNK, aminokiseline i slično. Komponente sadašnjeg pronalaska (npr. ORS, OtRNK, neprirodne aminokiseline, itd.) mogu se dodati u in vitro ili in vivo sistem translacije, npr., ćeliju eukariota, ćeliju kičmenjaka, npr. ćeliju kvasca, ćeliju sisara, ćeliju biljke, ćeliju alge, ćeliju gljive, ćeliju insekata i/ili slično.
[0040] Pojam "aminokiselina" se odnosi na prirodne i neprirodne aminokiseline, kao i analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Prirodno kodirane aminokiseline su 20 uobičajenih aminokiselina (alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin) i pirolizin i selenocistein. Analozi aminokiselina odnose se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao aminokiselina koja se javlja u prirodi, samo Na primer, α-ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino-grupu i R-grupu. Takvi analozi mogu imati modifikovane R-grupe (na primer, norleucin) ili mogu imati modifikovane osnovni skelet peptida dok i dalje zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao aminokiselina koja se javlja u prirodi. Neograničavajući primeri analoga aminokiselina uključuju homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum.
[0041] Što se tiče sekvenci aminokiselina, pojedinačne supstitucije, brisanja ili dodavanja nukleinskoj kiselini, peptidu, polipeptidu ili proteinskoj sekvenci koja menja, dodaje ili briše jednu prirodnu i neprirodnu aminokiselinu ili mali procenat prirodnih i neprirodnih aminokiselina u kodiranoj sekvenci je "konzervativno modifikovana varijanta" gde promena rezultira brisanjem aminokiseline, dodavanjem aminokiseline ili supstitucijom prirodne i neprirodne aminokiseline sa hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične prirodne aminokiseline su dobro poznate u tehnici. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatak i ne isključuju polimorfne varijante, homologe među vrstama i alele metoda i opisanih ovde kompozicija.
[0042] Onima obučenim u oblasti su poznate tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline. Svaka od sledećih osam grupa sadrži aminokiseline koje su konzervativne zamene jedna za drugu: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (K); 4) arginin (R), lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (I), Triptofan (V); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) cistein (C), metionin (M); (videti, na primer, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (V H Freeman & Co.; 2. izdanje (decembar 1993)).
[0043] Kako se ovde koristi, termin "neprirodna aminokiselina" odnosi se na aminokiselinu koja nije jedna od 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin ili selenocistein. Drugi termini koji se mogu koristiti kao sinonim za termin "neprirodna aminokiselina" su "neprirodno kodirana aminokiselina", "neprirodna aminokiselina", "aminokiselina koja se ne pojavljuje u prirodi" i njihove verzije sa različito stavljenom crticom i bez crtice. Termin "neprirodna aminokiselina" uključuje, ali ne ograničava se na, aminokiseline koje se javljaju u prirodi modifikacijom prirodno kodirane aminokiseline (uključujući, ali ne ograničavajući se na, 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin i selenocistein), ali nisu sami inkorporirani u rastući polipeptidni lanac pomoću kompleksa za translaciju. Primeri aminokiselina koje se javljaju u prirodi koje nisu prirodno kodirane uključuju, ali nisu ograničene na, N-acetilglukozaminil-L-serin, N-acetilglukozaminil-L-treonin i O-fosfotirozin. Dodatno, termin "neprirodna aminokiselina" uključuje, ali nije ograničen na, aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi i mogu se dobiti sintetički ili se mogu dobiti modifikacijom neprirodnih aminokiselina. Primećeno je da reaktivne grupe u neprirodnim aminokiselinama nisu dostupne od funkcionalnih grupa prisutnih u 20 kanonskih aminokiselina. Shodno tome, ove reaktivne grupe se mogu koristiti za specifično i homogeno modifikovanje nekog mesta u polipeptidu.
[0044] Pojam "antitelo", kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na polipeptid koji je suštinski kodiran imunoglobulinskim genom ili imunoglobulinskim genima, ili njihovim fragmentima, koji se specifično vezuju i prepoznaju analit (antigen). Primeri uključuju poliklonska, monoklonska, himerna i jednolančana antitela i slično. Fragmenti imunoglobulina, uključujući Fab fragmente i fragmente proizvedene ekspresionom bibliotekom, uključujući prikaz faga, takođe su uključeni u termin "antitelo" kako se ovde koristi. Videti, npr., Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New York, za strukturu i terminologiju antitela. Fragment antitela se odnosi na bilo koji oblik antitela osim na oblik pune dužine. Fragmenti antitela ovde uključuju antitela koja su manje komponente koje postoje unutar antitela pune dužine i antitela koja su proizvedena. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fc, Fab i (Fab')2, jednolančani Fv (scFv), dijatela, trijatela, tetratela, bifunkcionalna hibridna antitela, CDR1, CDR2, CDR3, kombinacije CDR-a, varijabilne regione, okvirne regione, konstantne regione, duge lance, kratke lance i varijabilne regione, i alternativne vrste koji nisu molekuli antitela, bispecifična antitela i slično (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339- 76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Druga funkcionalna podstruktura je jednolančani Fv (scFv), koji se sastoji od varijabilnih regiona dužeg i kraćeg lanca imunoglobulina, kovalentno povezanih peptidnim linkerom (S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061). Ovi mali (Mr 25.000) proteini generalno zadržavaju specifičnost i afinitet za antigen u jednom polipeptidu i mogu da obezbede pogodan gradivni blok za veće molekule specifične za antigen. Osim ako nije drugačije naznačeno, izjave i tvrdnje koje koriste pojam "antitelo" ili "antitela" posebno uključuju "fragment antitela" i "fragmente antitela".
[0045] Pojam "izolovan", kako se ovde koristi, odnosi se na odvajanje i uklanjanje ćelije ili klona iz homogene ili heterogene ćelijske populacije. U realizacijama sadašnjeg pronalaska, pojam izolovan obuhvata izolovanu ili pojedinačnu ćeliju koja je dobijena iz ćelijske kulture ili populacije ćelija. Ćelija ili klon se može izabrati u odnosu na druge ćelijske ili klonske populacije kultivisanjem u medijumu koji obezbeđuje neku selektivnu prednost željenoj ćeliji ili klonu od interesa. Na primer, u rutinskoj kulturi ćelija, određeni tip ćelije može biti obogaćen dodavanjem specifičnih faktora rasta i citokina. Ovo može uključivati obogaćivanje populacija određene ćelijske linije i faze diferencijacije kako bi se dobila željena ćelija ili klon, korišćenjem selektivnih medija koji omogućavaju specifičnim ćelijama da rastu i inhibiraju druge putem antibiotika ili specifičnih inhibitora rasta ili kombinaciju takvih strategija selekcije što je poznato obrazovanom u ovoj oblasti. Na primer, selektivni mediji se često koriste za izolovanje transfektovanih ćelija. Uobičajeni antibiotici koji se koriste za selekciju ćelija sisara uključuju bleomicin, puromicin i higromicin, ali nisu ograničeni na njih. Pojam "izolovan", kako se ovde koristi, takođe se odnosi na odvajanje i uklanjanje komponente od interesa od komponenti koje nisu od interesa. Izolovane supstance mogu biti u suvom ili polusuvom stanju, ili u rastvoru, uključujući, ali ne ograničavajući se na vodeni rastvor. Izolovana komponenta može biti u homogenom stanju ili izolovana komponenta može biti deo farmaceutske kompozicije koja sadrži dodatne farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijente. Čistoća i homogenost se mogu odrediti korišćenjem tehnika analitičke hemije uključujući, ali bez ograničenja, elektroforezu na poliakrilamidnom gelu ili tečnu hromatografiju visokih performansi. Pored toga, kada je komponenta od interesa izolovana i kada je dominantna vrsta prisutna u preparatu, komponenta je ovde opisana kao suštinski prečišćena. Pojam "prečišćen", kako se ovde koristi, može se odnositi na komponentu od interesa koja je čista najmanje 85%, najmanje 90%, čista najmanje 95%, čista najmanje 99% ili više. Samo Na primer, nukleinske kiseline, polipeptidi ili proteini su „izolovani“ kada su takve nukleinske kiseline, polipeptidi ili proteini oslobođeni barem nekih ćelijskih komponenti sa kojima su povezani u prirodnom stanju, ili da su nukleinska kiselina, polipeptidi, ili proteini koncentrisani do nivoa većeg od koncentracije njegove in vivo ili in vitro proizvodnje. Takođe, Na primer, gen se izoluje kada se odvoji od otvorenih okvira za čitanje koji okružuju gen i kodiraju polipeptid ili protein koji nije gen od interesa.
[0046] Kako se ovde koristi, pojam "eukariot" se odnosi na organizme koji pripadaju filogenetskom domenu Eucaria, uključujući, ali ne ograničavajući se na životinje (uključujući, ali ne ograničavajući se na, sisare, insekte, gmizavce, ptice, itd.), cilijate, biljke (uključujući, ali ne ograničavajući se na, monokote, dvokote i alge), gljive, kvasce, flagelate, mikrosporidije i protiste. Pojmovi "kičmenjak" i "eukariot" mogu se ovde koristiti naizmenično.
[0047] Realizacije sadašnjeg pronalaska obezbeđuju ćelijsku liniju na platformi generisanu iz CHOK1 koja ima smanjenu apoptozu za ugrađivanje neprirodne aminokiseline u protein u CHO ćelijama, pri čemu ćelija ekspresuje gen od interesa koji sadrži selektor kodon, pri čemu ćelija uključuje ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) i ortogonalni supresor tRNK (O-tRNK); i pri čemu ćelija uključuje jedno ili više inaktiviranih ciljnih mesta ili regiona, pri čemu je jedno ili više inaktiviranih ciljnih mesta ili regiona jeste pro-apoptotički gen uključen u apoptotički put, pri čemu pro-apoptotički gen je odabran od Bax Bak (videti na primer, Tian F, et al., 2014). Proizvodne ćelijske linije se mogu generisati za proizvodnju proteina ugrađenih u neprirodne aminokiseline transfekcijom amber besmislenog kodona koji sadrži gen od interesa u sistemu ekspresije GS (glutamin sintetazu) u ćelijsku liniju platforme domaćina. GS ekspresioni sistem koristi glutamin sintetazu kao selektabilni markerski gen za selekciju stabilne integracije gena vezanog proizvoda u genom ćelije domaćina tokom razvoja stabilne ćelijske linije da bi se stvorila proizvedena ćelijska linija. Ćelijska linija platforme je dobro okarakterisana i razvijena sa poboljšanom efikasnošću inkorporacije neprirodnih aminokiselina i efikasnošću selekcije klonova. Ćelijska linija platforme je unapred prilagođena rastu suspenzije za brzu progresiju u bioreaktore.
[0048] Iz perspektive industrije, ćelijska linija na platformi se može koristiti za obezbeđivanje materijala odgovarajuće faze za podršku svakoj fazi razvoja leka, ali i za stvaranje stabilnih, dobro okarakterisanih proizvodnih ćelijskih linija pre uvođenja proizvoda u klinike i komercijalizacije. Zbog toga su u farmaceutskim kompanijama ćelijska linija i grupa za ćelijske kulture blisko uključene u međufunkcionalne aktivnosti. Na primer, tim za otkrivanje identifikuje mete i generiše kandidate za molekule. Privremena transfekcija i stvaranje stabilnog pula (skupa) u platformi domaćina ćelijske linije se sprovodi da bi se procenila ekspresija molekula kandidata i obezbedio materijal za razvojne studije (prečišćavanje, konjugacija i razvoj analitičkih metoda) i funkcionalni test za identifikaciju vodećeg molekula. Kada se odabere vodeći molekul, stabilne ćelijske linije se zatim stvaraju da bi se stvorio proizvod visokog prinosa sa poželjnim atributima kvaliteta. Izbor najkvalitetnijih klonova uključuje ćelijsku liniju, razvoj procesa i analitičke metode za identifikaciju stabilne, dobro okarakterisane proizvodne ćelijske linije skalabilne za industrijsku standardnu proizvodnju kako bi se podržalo kliničko ispitivanje i komercijalizacija. Razvoj procesa ćelijske kulture počinje generisanjem i selekcijom ćelijskih linija, nakon čega sledi optimizacija procesa i medija u sistemima malih razmera, uključujući ploče sa 96 bunarčića, bočice za mućkanje i bioreaktore na radnom stolu, za potrebe skrininga velike propusnosti. Jednom kada su uslovi definisani, proces se često prenosi na pilot skalu da bi se testirala skalabilnost i proizveo materijal za pretkliničke toksikološke studije, zatim sledi proizvodnja velikih razmera za proizvodnju kliničkog materijala prema trenutnoj regulativi dobre proizvodne prakse (cGMP). Kada se razvoj komercijalnog procesa ćelijske kulture za proizvodnju biološkog proizvoda završi u laboratorijskim i pilot skalama, proces komercijalizacije počinje karakterizacijom procesa, povećanjem, transferom tehnologije i validacijom proizvodnog procesa. Većina ovakvih metoda za razvoj ćelijske linije, proces razvoja i proizvodnje ćelijske kulture, ili takve alternativne metode su dobro poznate u tehnici. Videti na primer, Veishou Hu, et al., Cell Culture Process Engineering (2013).
[0049] U sadašnjem pronalasku, implementirana je strategija razvoja stabilne ćelijske linije da bi se dobila proizvodna ćelijska linija sa 5-10 PCD za 3-4 meseca i 20-30 PCD za 6 meseci koristeći ćelijsku liniju platforme kao roditeljske ćelije. Videti takođe, ovde date Primere. Proizvodne ćelijske linije su prošle studiju stabilnosti u trajanju od najmanje 8 nedelja dajući do 12.000L proizvodne skale bioreaktora. Klon koji se koristi za glavnu banku ćelija (MCB) je izabran na osnovu rasta, produktivnosti i kvaliteta proizvoda. Dalji inženjering ćelijskih linija korišćenjem CRISPR/Cas9 tehnologije za editovanje genoma u proizvodnoj ćelijskoj liniji koja daje 0,5 g/L ili 500 mg/L pokazao je da poboljšava rast ćelija i povećava volumetrijski titar do 1,5 g/L ili 1500 mg/L. Fed-batch proces ishrane koji je razvijen za proizvodnu ćelijsku liniju pokazao je skalabilnost na skali bioreaktora za jednokratnu upotrebu (SUB) od 2000L za pripremu kliničkog materijala. Tako, u drugim realizacijama, sadašnji pronalazak obezbeđuje optimizaciju razvoja ćelijske linije za proizvodnju na velikoj skali. Takva optimizacija razvoja ćelijske linije proizvodnje na velikoj skali može se postići metodama i tehnikama dobro poznatim onima obučenim u oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na FACS-zavisnu depoziciju pojedinačnih ćelija, CRISPR nokaut postupak i povećanje proizvodnje.
Metodologija i tehnike
[0050] Sadašnji pronalazak koristi niz konvencionalnih tehnika u molekularnoj biologiji, ćelijskoj kulturi, biohemiji i slično, dobro poznat onima obučenim u oblasti. Metode i tehnike za razvoj ćelijske linije, razvoj procesa ćelijske kulture i proizvodnja, dobro su opisani u, na primer, Veishou Hu, et al., Cell Culture Process Engineering (2013). Opšti tekstovi koji opisuju molekularne biološke tehnike uključuju Berger i Kimmel, Vodič za tehnike molekularnog kloniranja, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Njujork, 1989 („Sambrook“) i Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, zajednički poduhvat Greene Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., (dopunjeno do 1999.) („Ausubel“)). Ovi tekstovi opisuju upotrebu vektora, promotera i mnoge druge relevantne teme vezane za, na primer, generisanje gena koji uključuju selektorske kodone za proizvodnju proteina koji uključuju neprirodne aminokiseline, ortogonalne tRNK, ortogonalne sintetaze i njihove parove.
[0051] Druge procedure se mogu naći u sledećim publikacijama i referencama citiranim u: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem.254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Metode Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro, mutagenesis Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Botstein & Shortle, Strategies i applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. i Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel, Rapid i efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid i efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotidedirected mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient i general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers i a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of fosforothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using fosforothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by fosforothioate groups i its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res.14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in fosforothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res.16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of fosforothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res.16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res.
13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis i cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar i Khorana, Total synthesis i expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed doublestrand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res.23, 3067-8 (1995). Dodatni detalji o mnogim od gore navedenih metoda mogu se naći u Methods in Enzimology Volume 154, koji takođe opisuje korisne kontrole za rešavanje problema sa različitim metodama mutageneze.
[0052] U toj oblasti su poznate različite tehnike i metodologije za prečišćavanje i detekciju polipeptida i proteina. Kao što je ovde navedeno, ove tehnike i metodologije se mogu primeniti na otkrivanje i prečišćavanje proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline. Generalno, antitela su korisni reagensi za ELISA, Western blotting, imunohemiju, metode afinitetne hromatografije, površinsku plazmonsku rezonancu (SPR), Aneksin V, FACS i mnoge druge metode. Reference ovde pružaju detalje o tome kako da se izvedu ELISA testovi, Western blotovi, SPR i slično. Druge tehnike i metodologije pronalaska mogu uključiti intaktnu masenu spektrometriju (MS) i ekskluzionu hromatografiju (SEC). Intaktna masena spektrometrija daje informacije o tačnoj masi proteina i relativnom obilju njegovih izoforma. Ekskluziona hromatografija (SEC), takođe poznata u tehnici kao hromatografija na molekularnom situ, je hromatografska metoda u kojoj su molekuli u rastvoru razdvojeni po svojoj veličini, a u nekim slučajevima i po molekulskoj težini.
Tehnologija editovanja genoma
[0053] Kako se ovde koristi, pojmovi "meta", "meta za", "ciljani" ili "ciljani za" nokaut (knockout), ablacija, inaktivacija ili prekid odnose se na mesto ili region u ćeliji ili genu koji je ablat, inaktiviran, prekinut ili nokautiran. Nekoliko alata za uređivanje gena može se koristiti za preciznu modifikaciju gena izazivanjem ciljanih prekida dvostrukih lanaca DNK (DSB). Takvi alati za uređivanje gena, dobro poznati obučenom u oblasti, mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, nukleaze sa prstom cinka (ZFN), efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) i meganukleaze (MN) takođe poznate obučenom u oblasti kao homing endonukleaze (HEs) (Gaj et al, 2013; Guha et al, 2017), i grupisanih regularno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR). Alati za uređivanje gena mogu se koristiti za dizajniranje konstrukta za prepoznavanje ciljnih mesta ili regiona u ćeliji koja eksprimira gen od interesa ili proizvodnu ćeliju i prave prekide dvostrukih lanaca u ciljnom genu nakon transfekcije.
[0054] ZFN su veštački fuzioni proteini domena koji se vezuje za DNK domen cink-prsta i domena nespecifičnog raskidanja DNK iz FokI restrikcione endonukleaze. Domen cinkprsta se može konstruisati tako da može da prepozna specifične sekvence DNK tako da se može postići uređivanje gena. TALEN su takođe veštački fuzioni proteini koji se sastoje od domena za vezivanje DNK iz TALE proteina i nespecifičnog domena raskidanja DNK iz FokI restrikcione endonukleaze. TALE (Transcription Activator-Like Effectors) su proteini iz bakterije Xanthomonas i njen domen koji se vezuje za DNK se može konstruisati da bi se vezivao za specifične DNK sekvence. Slično ZFN, TALEN mogu indukovati DSB tako da se može postići inaktivacija gena. MN, takođe poznate obučenim u oblasti kao homing endonukleaze, su endonukleaze koje su veoma specifične za mesto u generisanju dvolančanih DNK. MN imaju veliko mesto prepoznavanja specifično za lokaciju koje može prepoznati 18-44 bazna para DNK. Među članovima porodice MN, LAGLIDADG je najopsežnije istražen i projektovan u primenama uređivanja genoma. Tehnologija klasterizovanih ravnomerno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR) je nedavna tehnologija za uređivanje genoma koja koristi nukleazom vođenu RNK (Cas9 je najčešće korišćena nukleaza tipa II) za formiranje ciljanih dvolančanih prekida DNK (DSB). Tokom procesa samopopravljanja ciljanih DSB u ćeliji, često se dešavaju delecije i insercije nukleotida, što dovodi do pomeranja okvira odgovarajućih genomskih sekvenci kodirajućeg regiona ciljanih proteina i na kraju do njihovog gubitka funkcije. Iako je CRISPR prvobitno otkriven kao imuni sistem prokariotskih ćelija u odbrani od invazije virusa, njegova primena u eukariotskim ćelijama kao alat za uređivanje genoma je uspešno razvijena (vidi na primer, Cong, et al, 2013; Hsu, et al, 2014; Jinek, et al., 2012; Ran, et al., 2013). U poređenju sa drugim tehnologijama za uređivanje genoma kao što su nukleaze cink prsta (ZFN) i efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) i meganukleaze (MN) koje koriste specifične domene za vezivanje DNK da bi dovele do formiranja DSB (na primer, USPN 8,597,912), CRISPR tehnologija katalizuje raskidanja DNK uz pomoć́ vođenih RNK (gRNK) koji koriste uparivanje Wotson-Crick baza sa specifičnim sekvencama DNK.
[0055] Iako se bilo koji alat za uređivanje gena opisan ovde može koristiti sa sadašnjim pronalaskom, CRISPR tehnologija je ilustrovana jer obezbeđuje efikasniju, visoko specifičnu tehnologiju koja se može primeniti u različitim ćelijama i organizmima (Hsu, et al, 2014). Kao što je ilustrovano u Primerima datim ovde, gRNK ciljana mesta ili regioni za nokaut, ablaciju, inaktivaciju ili prekid u ćeliji koja eksprimuje gen od interesa mogu biti dizajnirani korišćenjem onlajn alata za dizajn CRISPR gRNK specifičnog za CHO-K1 genom (pogledajte na web@ staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy/). Primeri ciljnih mesta ili regiona koji se mogu izbaciti, ablairati, inaktivirati ili prekinuti u ćeliji dati su u Tabeli 1 ispod.
Tabela 1. RNK sekvence korišćene u CRISPR konstruktima
SEQ. ID. Ime gena gRNK sekvenca Genomski NO. lokus
[0056] Oligonukleotidi se mogu sintetizovati i koristiti za amplifikaciju genomskog DNK lokusa gRNK otkrivenih u gornjoj tabeli kao što je prikazano u Tabeli 2 ispod. Ove tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti na primer, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. i treće izdanje, 2001.; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987. i periodična ažuriranja.
Tabela 2. Oligo sekvence koje se koriste za amplifikaciju lokusa genomske DNK
Mete editovanja gena
[0057] Pojam meta za ciljani nokaut gen, ciljni ili ciljani ablirani gen, ciljni ili ciljani inaktivirani gen, ciljni ili ciljani prekinuti gen, kako se ovde koristi, odnosi se na gen koji je ciljan za nokaut, ablaciju ili inaktivaciju editovanjem gena. U sadašnjem pronalasku, ciljno ili ciljano mesto ili region je uključen u apoptotske puteve. Cilj za nokaut, prekid, ablaciju ili inaktivaciju je BAX i/ili BAK. U drugim realizacijama, ciljani nokaut, poremećeni, ablirani ili inaktivirani gen je potpuno ili delimično nokautiran, abliran ili inaktiviran. Delimično inaktivirani, poremećeni, nokautirani ili ablirani gen može uključivati gen koji je 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% , 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, inaktiviran, poremećen, nokautiran ili ablairan.
Bioterapeutski geni
[0058] Gen od interesa može biti ekspresovan u ćelijskoj liniji platforme. Takvi geni od interesa mogu biti bioterapeutici uključujući, ali ne ograničavajući se na, citokine, faktore rasta, hormone, interferone, interleukine, druge regulatorne peptide i proteine i antitela. Bioterapeutika može uključivati bilo koje biološke proizvode iz genetski modifikovanih bakterija, kvasаca, gljivica ili ćelija. Bioterapeutici uključuju DNK, RNK, rekombinantnu DNK, proteine, polipeptide. U nekim realizacijama bioterapeutik je vakcina, vakcina dobijena bilo kojom metodom ili ćelijom datog pronalaska.
[0059] U određenim realizacijama, ćelije iz platforme ili ćelijske linije ekspresuju gen od interesa uključujući, ali ne ograničavajući se na, na primer, alfa-1 antitripsin, angiostatin, antihelmitički faktor, antitela, apolipoprotein, apoprotein, atrijalni natriuretički faktor, atrijalni natriuretički polipeptid, atrijalne peptide, kalcitonin, CD40 ligand, C-kit ligand, kolagen, faktor stimulacije kolonija (CSF), komplement faktor 5a, inhibitor komplementa, receptor komplementa 1, citokini, (na primer, peptid koji aktivira epitelni neutrofil, GRO α/MGSA, GRO β, GRO γ, MIP-1 α, MIP-1 δ, MCP-1), epidermalni faktor rasta (EGF), eritropoetin ("EPO", ), eksfolijant toksini A i B, faktor IX, faktor VII, faktor VIII, faktor X, Faktor rasta fibroblasta (FGF), fibrinogen, fibronektin, G-CSF, GM-CSF, CD116, M-CSF, CSF-1R, glukocerebrozidaza, gonadotropin, faktori rasta, ježevi proteini (npr. zvučni, indijski, pustinjski), hemoglobin, Faktor rasta hepatocita (HGF), hirudin, humani serumi, albumin, insulin, faktor rasta sličan insulinu (IGF), interferoni (npr. IFN- α, IFN- β, IFN- γ), faktor rasta keratinocita (KGF), laktoferin, faktor inhibitora leukemije, luciferaza, neurturin, faktor inhibicije neutrofila (NIF), onkostatin M, osteogeni protein, paratiroidni hormon, PD-ECSF, PDGF, peptidni hormoni (npr. humani hormon rasta), pleiotropin, protein A, protein G, pirogeni egzotoksini A, B i C, relaksin, renin, SCF, receptor rastvorljivog komplementa I, rastvorljivi I-CAM 1, rastvorljivi interleukinski receptori (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), rastvorljivi TNF receptor, somatomedin, somatostatin, somatotropin, streptokinaza, superantigeni, tj. stafilokokni enterotoksini (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), superoksid dismutaza (SOD), toksin sindroma toksičnog šoka (TSST-1), timozin alfa 1, aktivator tkivnog plazminogena, TGF beta i MIF, faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), urokinaza i slično.
[0060] U drugim realizacijama gen od interesa može uključiti interleukine kao što su, ali ne ograničavajući se na, IL-1 i CD121a, IL-2 i CD25/CD122/CD137, IL-3 i CD123, IL-4 i CD124, IL-5 i CD125, IL-6 i CD126, IL-7 i CD127/CD132, IL-9 i IL-9R, IL-10 i CRF2-4, IL-11 i IL-11R, IL-12 i IL-12Rβ1c/IL-12Rβ2, IL-13 i IL-13R, IL-15 i CD122/CD132, IL-16 i CD4, IL-17 i CD217, IL-18 i IL-1Rrp, IL-19 i IL-20Rα/IL-10Rβc, IL-21 i IL-21R/CD132, IL-22 i IL-22Rαc/IL-10Rβc, IL-23 i IL-23R, IL-24 i IL-22Rαc/IL-10Rβc, IL-25 i IL-17BR, IL-26 i IL-20Rα/IL-10Rβc, IL-27 i WSX-1/CD130c, IL-28 i IL-28Rαc/IL-10Rβc, IL-29 i IL-28Rαc/IL-10Rβc, IL-30 i WSX-1/CD130c, IL-31 i IL31A/OSMR, IL-32, IL-33 i ST2/IL1RAP, IL-34 i CSF-1R, IL-35 i IL-12RB2, IL-36 i IL-1Rrp2, IL-37 i IL-18Rα, TSLP i TSLPR, LIF i LIFR, OSM i OSMR i slično.
[0061] U nekim aspektima pronalaska gen od interesa može uključivati faktor nekroze tumora TNF) uključujući, ali ne ograničavajući se na, faktor nekroze tumora beta (TNF beta), receptor faktora tumora nekroze (TNFR), faktor nekroze tumora-alfa (TNF alfa) i p55/p75, LT-a i p55/p75, LT-b i p55/p75, CD40L i CD40, FasL i CD95, CD27L i CD27, CD30L i CD30, 4-1BBL i 4-1BB, Trail i DR4, RANK -L i RNKK, APRIL i TAC1, LIGHT i HVEM, TWEAK i TWEAKR, BAFF i TAC1, i slično.
[0062] Gen od interesa može uključivati C-X-C hemokine (na primer, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), uključujući CXCL1 i CXCR2, CXCL2 i CXCR2, CXCL3 i CXCR2, CXCL4 i CXCR3B, CXCL5 i CXCR2, CXCL6 i CXCR2, CXCL7 i CXCR1/CXCR2, CXCL8 i CXCR1/CXCL9 i CXCL1/CXCL9 CXCRA/3B, CXCL11 i CXCR3A/3B/CRCR7, CXCL12 i CXCR4/CXCR7, CXCL13 i CXCR5, CXCL14, CXCL15, CXCL16 i CXCR6 i slično. Gen od interesa može takođe uključiti CC hemokine (na primer, monocitni hemoatraktantni protein-1, monocitni hemoatraktantni protein-2, monocitni hemoatraktantni protein-3, monocitni inflamatorni protein-1 alfa, monocitni inflamatorni protein-1 beta, RANTES, RANTES, I391 , R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), uključujući CCL1 i CCR6, CCL2 i CCR2, CCL3 i CCR1/5, CCL4 i CCR5, CCL5 i CCR1/CCR3, CCR5, CCL6 i CCR1/1CR3C i CCR2 /CCR5, CCL8 i CCR1/CCR2/CCR5, CCL9 i CCR1, CCL11 i CCR3, CCL12 i CCR2, CCL13 i CCR2/3, CCL14 i CCR1/3/5, CCL15 i CCR1/3, CCL16 i CCR1/2/5 /8, CCL17 i CCR4, CCL18 i PITPNM3, CCL19 i CCR7, CCL20 i CCR6, CCL21 i CCR7, CCL22 i CCR4, CCL23 i CCR1/FPRL-1, CCL24 i CCR3, CCL25 i CCR9, CCL26, CCRCL i CCR7 , CCL28 i CCR10, i uključujući XCL1 i XCR1, XCL2 i XCR1, CX3CL1 i CX3CR1 i slično.
[0063] Metode, kompozicije, strategije i tehnike opisane ovde nisu ograničene na određeni tip, klasu ili familiju polipeptida ili proteina. Naravno, praktično svaki polipeptid može biti dizajniran ili modifikovan tako da uključuje najmanje jednu "modifikovanu ili nemodifikovanu" neprirodnu aminokiselinu opisanu ovde. Samo Na primer, polipeptid može biti homologan bioterapeutskom ili terapeutskom proteinu koji je ovde opisan. Polipeptidi ili proteini sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom mogu se proizvesti korišćenjem metoda pronalaska. Ekscipijent (npr., farmaceutski prihvatljiv ekscipijent) takođe može biti prisutan sa proteinom.
[0064] Proizvodnjom proteina ili polipeptida od interesa sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom ugrađenom u ćelije kičmenjaka, proteini ili polipeptidi će tipično uključivati posttranslacione modifikacije kičmenjaka. U određenim realizacijama, protein uključuje najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu i najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju koju in vivo pravi ćelija kičmenjaka, pri čemu posttranslacionu modifikaciju ne vrši prokariotska ćelija. Na primer, modifikacija posle translacije uključuje, npr. acetilaciju, acilaciju, modifikaciju lipida, palmitoilaciju, dodavanje palmitata, fosforilaciju, modifikaciju glikolipidne veze, glikozilaciju, i slično.
[0065] Gen od interesa može uključivati terapeutski protein ili polipeptid, geni koji su uključeni u rast ćelija, diferencijaciju, regulaciju, upalu, onkogene i slično, ali ne ograničavajući se na njih. U drugim realizacijama, pronalazak uključuje gen antitela koji sadrži selektor kodon. U drugim realizacijama, antitelo može biti bilo koje antitelo od interesa, uključujući, ali ne ograničavajući se na anti-Her2, anti CD-70, anti-PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, interleukine (uključujući 2, 3, 10 ali ne ograničeno na takve), GPC3, DLL3, ROR1, leptin, FGF familiju uključujući FGF-21 i FGF-23, HGH, FcR, insulin, TNFR1, TRAIL, eritropoetin, i analoge, bispecifične vrste i njihove fragmente i slično, ali ne ograničavajući se na takve. U nekim realizacijama, pronalazak uključuje gen antitela koji sadrži selektor kodon. Antitela mogu biti, na primer, poliklonska, monoklonska, himerna, humanizovana, jednolančana, Fab fragmenti, fragmenti proizvedeni Fab ekspresionom bibliotekom, ili slično. Antitela mogu uključivati, ali nisu ograničena na, na primer, tumor-specifična MAb koja zaustavljaju rast tumora ciljanjem tumorskih ćelija radi uništenja putem citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisnih od antitela (ADCC) ili komplementom posredovane lize (CML) (ovi opšti tipovi Abs se ponekad nazivaju „magični meci“). Jedan primer je Rituxan, anti-CD20 MAb za lečenje ne-Hodgkinsovog limfoma (Scott (1998) Rituximab: a new therapeutic monoclonal
antibody for non-Hodgkin’s lymphoma Cancer Pract 6: 195-7); Antitela koja ometaju kritičnu komponentu rasta tumora. Herceptin je anti-HER-2 monoklonsko antitelo za lečenje metastatskog karcinoma dojke, dat je primer antitela sa ovim mehanizmom delovanja (Baselga et al. (1998) Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel i doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts [objavljena greška nalazi se u Cancer Res (1999) 59(8):2020], Cancer Res 58: 2825-31). Drugi primer se odnosi na antitela za isporuku citotoksičnih jedinjenja (toksini, radionuklidi, itd.) direktno u tumor ili drugo mesto od interesa. Na primer, jedna aplikacija Mab je CIT-356, 90Y-vezano antitelo koje cilja zračenje direktno na ćelije tumora prostate (Deb et al. (1996) Treatment of hormonerefractory prostate cancer with 90Y-CYT-356 monoclonal antibody Clin Cancer Res 2: 1289-97. Drugi primeri mogu uključivati enzimsku terapiju prolekovima usmerenu na antitela, gde enzim ko-lokalizovan na tumoru aktivira sistemski primenjen pro-lek u blizini tumora. Na primer, anti-Ep-CAM1 antitelo povezano na karboksipeptidazu A se razvija za lečenje kolorektalnog karcinoma (Wolfe et al. (1999) Antibody-directed enzyme prodrug therapy with the T268G mutant of human carboxypeptidase A1: in vitro and in vivo studies with prodrugs of methotrexate and the thymidylate synthase inhibitors GW1031 and GW1843 Bioconjug Chem 10: 38-48). Mogu biti uključena i druga antitela (npr. antagonisti) dizajnirana da specifično inhibiraju normalne ćelijske funkcije radi terapeutske koristi. Primer je Orthoclone OKT3, anti-CD3 MAb koji nudi Johnson i Johnson za smanjenje akutnog odbacivanja presađenog organa (Strate et al. (1990) Orthoclone OKT3 as first-line therapy in acute renal allograft rejection Transplant Proc 22: 219-20. Druga klasa antitela može uključivati ona koja su agonisti. Ovi Mab su dizajnirani da posebno poboljšaju normalne ćelijske funkcije radi terapeutske koristi. Na primer, agonisti acetilholinskih receptora za neuroterapiju zasnovani na Mab su u razvoju (Ksie et al. (1997) Direct demonstration of MuSK involvement in acetylcholine receptor clustering through identification of agonist ScFv Nat. Biotechnol. 15: 768-71. Bilo koji od ovih antitela se mogu modifikovati tako da uključuju jednu ili više neprirodnih aminokiselina kako bi se poboljšalo jedno ili više terapeutskih svojstava (specifičnost, avidnost, poluživot u serumu, itd.). Drugi primer može uključivati katalitička antitela kao što su Ig sekvence koje su projektovane da oponašaju katalitičke sposobnosti enzima (Wentworth i Janda (1998) Catalytic antibodies Curr Opin Chem Biol 2: 138-44. Katalitička antitela se takođe mogu modifikovati da uključuju jednu ili više neprirodnih aminokiselina kako bi se poboljšalo jedno ili više svojstava od interesa.
[0066] Selektor kodoni proširuju okvir genetskog kodona biosintetičke mašinerije proteina. Na primer, selektor kodon uključuje, npr., jedinstveni trobazni kodon, besmisleni kodon, kao što je stop kodon, npr. žuti kodon (UAG), opal kodon (UGA), neprirodni kodon, najmanje četvorobazni kodon, retki kodon ili slično. Određeni broj selektor kodona može biti uveden u željeni gen, npr. jedan ili više, dva ili više, više od tri, itd. Gen može uključivati više kopija datog selektor kodona, ili može uključivati više različitih selektor kodona, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Postupci pronalaska uključuju upotrebu gena ili gena od interesa koji sadrže selektor kodon. U jednom aspektu, metode pronalaska uključuju upotrebu antitela koje sadrži selektor kodon pri čemu selektor kodon može biti na teškom (dugom) lancu, lakom (kratkom) lancu ili na oba. Dakle, selektor kodon uključuje stop kodon za inkorporaciju neprirodnih aminokiselina in vivo u ćeliju eukariota.
Proizvodne ćelije
[0067] U nekim realizacijama, sadašnji pronalazak obezbeđuje ćelije za proizvodnju, ćelijske linije i klonove generisane od njih koji ekspresuju gen od interesa. Takve proizvodne ćelije ili ćelijske linije uključuju, ali nisu ograničene na, privremeno transfektovane ćelijske populacije, stabilne masovne ćelijske populacije (na primer, mešovite ili grupe ćelija), stabilne mini populacije ćelija (na primer, mini grupe ili populacije glavnih bunarčića), i stabilne klonska ćelijske linije (na primer izvedene iz jedne ćelije). Privremeno transfektovane populacije ćelija koje se koriste ovde se odnose na grupu ćelija u kojoj je gen od interesa uveden i možda neće biti stabilno integrisan u genom. Stabilna ćelija ili stabilna proizvodna ćelijska linija korišćena ovde se odnosi na ćeliju u kojoj je gen od interesa uveden i stabilno integrisan u genom. Stabilna populacija mini ćelija može imati manju heterogenost od stabilne masovne ćelijske populacije.
[0068] Uz odgovarajući stimulans, Bax i/ili Bak mogu indukovati ili ubrzati apoptozu. Bcl-2 familija proteina deli značajnu sekventnu i strukturnu homologiju. Ovu familiju proteina karakterišu do četiri regiona homologije sekvence, poznate kao domeni homologije Bcl-2. Na primer, Bax protein deli visoko očuvane domene sa Bcl-2. Neki od ovih domena su uključeni u formiranje heterodimera Bax/Bcl-2 za koje se smatra da su važni za preživljavanje ćelije ili ćelijsku smrt kao odgovor na apoptotske signale. Nakon aktivacije, Bax se translocira na spoljašnju mitohondrijalnu membranu gde oligomerizuje, čini membranu propusnom, i oslobađa nekoliko faktora koji podstiču smrt, uključujući citohrom C (Scorrano et al. (2003) Biochem. Biophis. Res. Commun.304:437- 444). Bax se može učiniti neaktivnim u normalnim ćelijama putem interakcije sa proteinom Ku70, koji izdvaja Bax iz mitohondrija (Savada et al. (2003) Nat. Cell Biol. 5:320-329). Kao i Bax, proizvod Bak gena povećava apoptotičku ćelijsku smrt u prisustvu odgovarajućeg stimulusa. Bak takođe promoviše ćelijsku smrt i suprotstavlja se Bcl-2 apoptotičkoj zaštiti. Bak je poznati snažni induktor apoptoze u različitim tipovima ćelija. Dakle, pronalazak obezbeđuje metode za generisanje proizvodnih ćelijskih linija sa delimičnom ili potpunom inaktivacijom jednog ili više gena BAK i/ili BAX gena u ćeliji ili ćelijskoj liniji koja eksprimira gen od interesa sa ugrađenom neprirodnom aminokiselinom. Inaktivacija BAX i/ili BAK u ćeliji koja eksprimira gen od interesa može se koristiti za stvaranje ćelijskih linija koje su otporne na apoptozu i poboljšavaju proizvodnju rekombinantnih proteina uključujući, ali ne ograničavajući se na primer, na antitela, rekombinantne virusne vektore i u proizvodnji vakcina.
[0069] Ćelijske linije sadašnjeg pronalaska mogu se koristiti za proizvodnju rekombinantnog proteina. Rekombinantni protein uključuje, ali nije ograničen na, antitela, antigene, terapeutske proteine kao što je otkriveno na drugom mestu. U nekim realizacijama, pronalazak uključuje ćelije ili ćelijske linije eukariota ili kičmenjaka, uključujući, ali ne ograničavajući se na sisare, insekte, gmizavce, ptice, itd. kvasce, flagelate, mikrosporidije, i protiste. Eukariotske ćelije se mogu koristiti za in vivo ugradnju neprirodne aminokiseline. Ćelije se mogu koristiti za genetski modifikovane (npr. transformisane, transdukovane ili transfektovane) sa polinukleotidima ili konstruktima koji uključuju polinukleotid, npr. vektor, koji može biti, na primer, vektor za kloniranje ili vektor ekspresije. Vektor može biti, na primer, u obliku plazmida, bakterije, virusa, golog polinukleotida ili konjugovanog polinukleotida. Vektori se unose u ćelije i/ili mikroorganizme standardnim metodama uključujući elektroporaciju (From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985), infekcija virusnim vektorima, velika brzina balističkog prodora malih čestica u nukleinsku kiselinu ili unutar matrice malih perli ili čestica, ili na površini (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)).
[0070] Dostupno je nekoliko dobro poznatih metoda za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, od kojih se svaki može koristiti u pronalasku. To uključuje: fuziju ćelija primaoca sa bakterijskim protoplastima koji sadrže DNK, elektroporaciju, bombardovanje projektilima, i infekciju virusnim vektorima (o čemu se dalje govori u nastavku), itd. Bakterijske ćelije se mogu koristiti za povećanje broja plazmida koji sadrže DNK konstrukte koji su ovde otkriveni. Bakterije se uzgajaju do log faze i plazmidi unutar bakterija se mogu izolovati različitim metodama poznatim obučenim u oblasti (videti, na primer, Sambrook). Pored toga, mnoštvo kompleta je komercijalno dostupno za prečišćavanje plazmida od bakterija (vidi, na primer, EasiPrep™, FlexiPrep™, oba od Pharmacia Biotech; StrataClean™, od Stratagene; i QIAprep™ od Qiagena). Izolovani i prečišćeni plazmidi se zatim dalje manipulišu da bi se proizveli drugi plazmidi, koji se koriste za transfekciju ćelija ili se inkorporiraju u srodne vektore za inficiranje organizama. Tipični vektori sadrže terminatore transkripcije i translacije, sekvence inicijacije transkripcije i translacije, i promotere korisne za regulaciju ekspresije određene nukleinske kiseline od interesa. Vektori opciono sadrže generičke ekspresione kasete koje sadrže najmanje jednu nezavisnu terminatorsku sekvencu, sekvence koje dozvoljavaju replikaciju kasete kod eukariota, ili prokariota, ili oboje, (npr. šatl vektore) i selekcione markere za oba prokariotska i kičmenjačka sistema. Vektori su pogodni za replikaciju i integraciju u prokariote, eukariote, ili poželjno oboje. Videti, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif.6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (vide supra). Katalog bakterija i bakteriofaga korisnih za kloniranje je obezbeđen, na primer, od strane ATCC, npr., ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) GheRNK et al. (eds) koje je objavio ATCC. Dodatne osnovne procedure za sekvenciranje, kloniranje i druge aspekte molekularne biologije i temeljna teorijska razmatranja takođe se nalaze u Watson et al. (1992) Recombinant DNA, drugo izdanje Scientific American Books, NI. Pored toga, u suštini svaka nukleinska kiselina (i praktično svaka obeležena nukleinska kiselina, standardna ili nestandardna) može se naručiti po meri ili standardu iz bilo kog od različitih komercijalnih izvora, kao što je Midland Certified Reagent Company (Midland, TKS mcrc. com), The Great American Gene Company (Ramona, Kalifornija dostupna na www@genco.com), EkpressGen Inc. (Čikago, IL dostupno na www@ekpressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) i mnogi drugi.
[0071] Ćelije ili ćelijske linije prema sadašnjem pronalasku mogu se kultivisati u konvencionalnim hranljivim medijima modifikovanim prema potrebi za takve aktivnosti kao što su, na primer, faze skrininga, aktiviranje promotera ili selekcija transformanata. Ove ćelije se opciono mogu kultivisati u transgenim organizmima. Druge korisne reference, npr. za ćelijsku izolaciju i kulturu (npr. za naknadnu izolaciju nukleinske kiseline) uključuju Freshnei (1994) Culture of Animal Cells, Manual of Basic Technique, treće izdanje, Wiley-Liss, New York i tamo citirane reference; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg i Phillips (eds) (1995) Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg, New York) i Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
[0072] Uobičajeni medijum ili medijumi, kako se ovde koriste, odnose se na bilo koji medijum za kulturu koji se koristi za uzgoj i sakupljanje ćelija i/ili proizvoda ekspresovanih i/ili izlučenih od strane takvih ćelija. Takav "medijum" ili "medij" obuhvataju, ali nisu ograničeni na, rastvore, čvrste, polučvrste ili krute nosače koji mogu da podržavaju ili sadrže bilo koju ćeliju domaćina, uključujući, na primer, ćelije domaćina bakterija, ćelije domaćina kvasca, ćelije domaćini insekata, ćelije domaćini biljaka, ćelije domaćini eukariota, ćelije domaćini sisara, CHO ćelije, domaćini prokariotske ćelije, ćelije domaćini E. coli ili Pseudomonas, i sadržaj ćelije. Takav "medijum" ili "medij" uključuje, ali nije ograničen na, medijum ili medijum u kome je izrasla ćelija domaćin u koju je izlučen polipeptid, uključujući medijum pre ili posle koraka proliferacije. Takav "medijum" ili "medij" takođe uključuje, ali nije ograničen na, pufere ili reagense koji sadrže lizate ćelije domaćina, na primer, polipeptid proizveden intracelularno i ćelije domaćina se liziraju ili poremete da bi se polipeptid oslobodio. U drugim realizacijama ovog pronalaska, medijum može biti kompletan medijum za ćelijsku kulturu, tradicionalni medijum za ćelijsku kulturu ili hemijski definisan medijum. Kompletan medijum ćelijske kulture često ima dve glavne kategorije komponenti: bazalni medijum i dodaci za rast. Bazalni medijum je hranljiva mešavina koja se sastoji od komponenata male molekulske težine uključujući šećer, aminokiseline, vitamine, razne soli, itd. Bazalni medijum ne samo da obezbeđuje nutritivni izvor za dobijanje energije i stvaranje nove ćelijske mase i proizvoda, već́ takođe obezbeđuje uravnoteženu koncentraciju soli i osmolarnost da bi se omogućio rast ćelija. Međutim, većina ćelija neće rasti ako se obezbedi samo bazalni medijum, pošto bazalni medijum ne sadrži faktore rasta ili druge faktore neophodne za „optimalne“ uslove rasta. Dodaci za rast koji se mogu dodati bazalnom medijumu uključuju faktore rasta, fosfolipide, hidrolizat soje, serum, itd. Ovi suplementi mogu da pospeše rast ćelija obezbeđujući sastavne komponente za specifične signalne puteve ili mogu zadovoljiti posebne potrebe u ishrani (kao što je isporuka holesterola) i može uticati na direktnu ćelijsku diferencijaciju. Tradicionalni medijum za ćelijsku kulturu sadrži do 15% životinjskog seruma pored bazalnog medijuma. Serum je po svom hemijskom sastavu veoma kompleksna tečnost. Takav medijum, koji sadrži uglavnom nedefinisan hemijski sastav, naziva se složenim medijumom. Mnogi suplementi koji se obično koriste u industrijskim procesima, na primer, biljni hidrolizati, sojini fosfolipidi, takođe spadaju u ovu kategoriju. Njihova upotreba čini hemijski sastav medijuma nedefinisanim. Hemijski definisan medijum sadrži samo komponente čiji je hemijski sastav poznat i okarakterisan i sve njegove hemijske vrste su navedene. Ne sadrži mešavinu komponenti nepoznatog ili nedefinisanog sastava. Na primer, "lipidi" ili "fosfolipidi" nisu dobro definisana jedinjenja, nego su mešavine klase jedinjenja i nisu hemijski specificirane. Hemijski definisan medijum često sadrži faktore rasta, citokine, i proteine nosače. Dakle, hemijski definisan medijum nije nužno bez proteina.
[0073] U realizacijama sadašnjeg pronalaska koristi se prihranjivana proizvodnja dodavanjem u jednoj porciji (batch) i kontinualno u porcijama (fed-batch). Standardne metode za proizvodnju dodavanjem u jednoj porciji (batch) i kontinualno u porcijama (fedbatch) su dobro poznate obučenim u oblasti. U batch procesu, ograničenje osmolarnosti ograničava količinu hranljivih materija koje se mogu dodati na početku. Ovaj nizak nivo hranljivih materija sprečava kulturu da postigne visoke koncentracije proizvoda ćelija. U fed-batch kulturama, medijum se dodaje tokom kultivacije da bi se sprečilo iscrpljivanje hranljivih materija, čime se produžava faza rasta i na kraju povećavaju koncentracije ćelija i proizvoda. U sadašnjim proizvodnim pogonima se koriste različite serije operacija, od veoma jednostavnih do veoma složenih i automatizovanih. Mediji koji se koriste u obe serije prihrane i mogu biti komercijalno dostupni ili vlasnički mediji razvijeni u kompaniji. Tip medijuma može biti složeni medijum koji sadrži uglavnom nedefinisan hemijski sastav, ili hemijski definisan medijum koji sadrži komponente koje imaju hemijski sastav koji je poznat i karakteriše i ima sve njegove hemijske vrste navedene. U nekim realizacijama, hemijski definisan medijum obuhvata samo komponente čiji je hemijski sastav poznat i okarakterisan je i ima navedene sve svoje hemijske vrste. U drugim realizacijama, tip medijuma koji se koristi može biti smeša koja sadrži nedefinisani hemijski sastav i hemijski definisan sastav. U drugom aspektu, nedefinisani hemijski sastav i hemijski definisani sastav mogu biti u bilo kojoj kombinaciji od 99%-90% i 1%-10% redom, ili 89%-80% i 11%-20% redom, ili 79%- 70% i 21%-30% redom, odnosno 69%-60% i 31%-40%, odnosno 59%-50% i 41%-50%; ili u bilo kojoj kombinaciji od 1%-10% i 99%-90% redom, ili 11%-20% i 89%-80% redom, ili 21%-30% i 79%-70% redom, ili 31 %-40% i 69%-60% redom, odnosno 41%-50% i 59%-50%. Većina takvih metoda ili alternativnih metoda je dobro poznata obučenom u oblasti. Videti na primer, Weishou Hu, et al., Cell Culture Process Engineering (2013).
[0074] Metode sadašnjeg pronalaska obezbeđuju visokoproizvodne eukariotske ćelije ili ćelijske linije eukariota za generisanje proteina ili polipeptida koji sadrže ili uključuju neprirodne aminokiseline u velikim korisnim količinama. U jednom aspektu, kompozicija opciono uključuje, npr., najmanje 10 mikrograma, najmanje 50 mikrograma, najmanje 75 mikrograma, najmanje 100 mikrograma, najmanje 200 mikrograma, najmanje 250 mikrograma, najmanje 500 mikrograma, najmanje 1 miligram, najmanje 10 miligrama ili više polipeptida proteina koji sadrži neprirodnu aminokiselinu, ili količinu koja se može postići in vivo metodama proizvodnje proteina. U drugom aspektu, protein je opciono prisutan u kompoziciji u koncentraciji od, na primer, najmanje 10 mikrograma proteina po litru, najmanje 50 mikrograma proteina po litru, najmanje 75 mikrograma proteina po litru, najmanje 100 mikrograma proteina po litru, najmanje 200 mikrograma proteina po litru, najmanje 250 mikrograma proteina po litru, najmanje 500 mikrograma proteina po litru, najmanje 1 miligram proteina po litru, ili najmanje 10 miligrama proteina po litru ili više, u, npr., ćelijskom lizatu, puferu, farmaceutskom puferu ili drugoj tečnoj suspenziji (npr., u zapremini od, npr., bilo gde od oko 1 nl do oko 100 L). Proizvodnja velikih količina (npr. veće od one koje su tipično moguće drugim metodama, npr. in vitro translacijom) proteina u ćeliji eukariota ili kičmenjaka, uključujući najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu, je karakteristika sadašnjeg pronalaska.
[0075] U nekim realizacijama, ćelija sadašnjeg pronalaska je konstruisana ili rekombinantna ćelija domaćin ili ćelija platforme, koja se takođe naziva "ćelija domaćin". Takva platforma, konstruisana ili rekombinantna ćelija domaćin, ili ćelija domaćin, odnosi se na ćeliju koja uključuje egzogeni polinukleotid, pri čemu metode koje se koriste za umetanje egzogenog polinukleotida u ćeliju uključuju, ali nisu ograničene na, direktno preuzimanje, transdukciju, f-sparivanje, ili druge metode poznate obučenom u oblasti za stvaranje rekombinantnih ćelija domaćina. Samo Na primer, takav egzogeni polinukleotid može biti neintegrisani vektor, uključujući ali bez ograničenja na plazmid, ili može biti integrisan u genom domaćina. U drugim aspektima pronalaska, gen od interesa može biti transfektovan u platformu, projektovanu ili rekombinantnu ćeliju domaćina da bi se stvorila proizvodna ćelijska linija za generisanje ili proizvodnju bioterapeutika, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitelo. U drugom aspektu pronalaska proizvodna ćelijska linija je ćelijska linija koja ima gen od interesa. U drugim realizacijama pronalaska proizvodna ćelijska linija koja ima gen od interesa utišan ili nokautiran, abliran, inaktiviran ili poremećen, može postati ćelijska linija platforme. U nekim aspektima pronalaska, ćelija platforme može biti ćelijska linija koja sadrži ortogonalni tRNK/RS sistem bez gena od interesa.
[0076] Kompozicije mogu biti značajno prečišćene. Izraz "suštinski prečišćen", kako se ovde koristi, odnosi se na komponentu od interesa koja može biti suštinski ili fundamentalno bez drugih komponenti koje normalno prate ili deluju sa komponentom od interesa pre prečišćavanja. Samo Na primer, komponenta od interesa može biti "suštinski prečišćena" kada priprema komponente od interesa sadrži manje od oko 30%, manje od oko 25%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 4%, manje od oko 3%, manje od oko 2%, ili manje od oko 1% kontaminirajućih komponenti. Dakle, "suštinski prečišćena" komponenta od interesa može imati nivo čistoće od oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98 %, oko 99% ili više. Samo Na primer, polipeptid prirodne aminokiseline ili polipeptid neprirodne aminokiseline može se prečistiti iz nativne ćelije ili ćelije domaćina u slučaju rekombinantno proizvedenih polipeptida prirodnih aminokiselina ili polipeptida neprirodnih aminokiselina. Na primer, preparat polipeptida prirodne aminokiseline ili polipeptida neprirodne aminokiseline može biti "u suštini prečišćen" kada preparat sadrži manje od oko 30%, manje od oko 25%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 4%, manje od oko 3%, manje od oko 2%, ili manje od oko 1% kontaminirajućeg materijala. Na primer, kada se prirodni polipeptid aminokiseline ili polipeptid neprirodne aminokiseline rekombinantno proizvodi od strane ćelija domaćina, polipeptid prirodne aminokiseline ili polipeptid neprirodne aminokiseline može biti prisutan na oko 30%, oko 25%, oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, oko 2%, ili oko 1% ili manje suve težine ćelija. Na primer, kada se prirodni polipeptid aminokiseline ili polipeptid neprirodne aminokiseline rekombinantno proizvodi od strane ćelija domaćina, polipeptid prirodne aminokiseline ili polipeptid neprirodne aminokiseline može biti prisutan u medijumu kulture na oko 5 g/L, oko 4g/L, oko 3g/L, oko 2g/L, oko 1g/L, oko 750mg/L, oko 500mg/L, oko 250mg/L, oko 100mg/L, oko 50mg/L, oko 10mg/L, ili oko 1 mg/L ili manje, suve težine ćelija. Na primer, „suštinski prečišćeni“ polipeptidi prirodnih aminokiselina ili polipeptidi neprirodnih aminokiselina mogu imati nivo čistoće od oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više, kako je određeno odgovarajućim metodama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, SDS/PAGE analizu, RP-HPLC, SEC, i kapilarnu elektroforezu. Polipeptid ili protein može uključivati ekscipijent (npr. pufer, vodu, farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, ali ne ograničavajući se na to).
[0077] Metode pronalaska mogu uključiti agense, supstance i markere za skrining ili selekciju gena, polipeptida ili proteina. Sredstvo za selekciju ili skrining, kako se ovde koristi, odnosi se na agens koji, kada je prisutan, omogućava selekciju/skrining određenih komponenti iz populacije. Na primer, agens za selekciju ili skrining uključuje, ali nije ograničen na, npr. hranljivu materiju, antibiotik, talasnu dužinu svetlosti, antitelo, ekspresovani polinukleotid (npr. protein modulator transkripcije) ili slično. Selekciono sredstvo može da varira, na primer, po koncentraciji, intenzitetu, itd. U drugim realizacijama, metode pronalaska uključuju supstancu koja se može detektovati. Mogu se koristiti i supstance koje se mogu detektovati. Termin "supstanca koja se može detektovati", kako se ovde koristi, odnosi se na agens koji, kada je aktiviran, izmenjen, ekspresovan ili slično, omogućava selekciju/skrining određenih komponenti iz populacije. Na primer, supstanca koja se može detektovati može biti hemijski agens, na primer, 5-fluororotna kiselina (5-FOA), koja pod određenim uslovima, na primer, ekspresija URA3 reportera, postaje detektabilna, npr. toksični proizvod koji ubija ćelije koje ekspresuju reporter URA3. Pored toga, metode, ćelije ili ćelijske linije pronalaska mogu uključivati pozitivnu i/ili negativnu selekciju ili skrining marker. Kako se ovde koristi, termin "marker pozitivne selekcije ili skrininga" odnosi se na marker koji kada je prisutan, npr. ekspresovan, aktiviran ili slično, rezultira identifikacijom ćelije sa markerom pozitivne selekcije od onih bez markera pozitivne selekcije. Kako se ovde koristi, termin "marker za negativnu selekciju ili skrining" odnosi se na marker koji kada je prisutan, na primer, ekspresovan, aktiviran ili slično, omogućava identifikaciju ćelije koja ne poseduje željeno svojstvo (npr. u poređenju sa ćelijom koji poseduje željeno svojstvo).
Ortogonalna tRNK i Ortogonalna aminoacil-tRNK sintetaza
[0078] U nekim realizacijama, pronalazak se odnosi na stabilnu proizvodnu ćelijsku liniju koja sadrži ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS), ortogonalni supresor tRNK (O-tRNK), i gen od interesa koji sadrži selektorski kodon (na primer bioterapeutike uključujući antitela). Sposobnost da se genetski modifikuju strukture proteina direktno u ćelijama eukariota, izvan hemijskih ograničenja koja nameće genetski kod, pruža moćno molekularno oruđe za ispitivanje i manipulisanje ćelijskim procesima.
[0079] Ortogonalni par se sastoji od O-tRNK, na primer, supresor tRNK, tRNK pomeranja okvira, ili slično, i O-RS. O-tRNK nije acilovan endogenim sintetazama i sposoban je da posreduje u inkorporaciji neprirodne aminokiseline u protein koji je kodiran polinukleotidom što sadrži selektorski kodon koji prepoznaje O-tRNK in vivo. O-RS prepoznaje O-tRNK i prvenstveno aminoaciluje O-tRNK neprirodnom aminokiselinom u ćeliji kičmenjaka. Postupci za proizvodnju ortogonalnih parova zajedno sa ortogonalnim parovima proizvedenim takvim metodama i kompozicije ortogonalnih parova za upotrebu u ćelijama kičmenjaka su otkrivene u Internacionalnim patentnim prijavama WO 2002/086075, pod naslovom „Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetasepairs“. Videti takođe, Forster et al., (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353-6357; i, Feng et al., (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change PNAS 100(10): 5676-5681. Razvoj višestrukih ortogonalnih parova tRNK/sintetaza može omogućiti istovremenu inkorporaciju više neprirodnih aminokiselina korišćenjem različitih kodona u ćeliji kičmenjaka.
[0080] Ortogonalna tRNK i Ortogonalna aminoacil-tRNK su poznate onom obučenom u oblasti. Videti na primer, WO 2008/030612, WO 2008/030614, WO 2008/030613, WO 2006/068802, WO 2007/021297, WO 2007/070659, USPN 8,420,792, USPN 9.133.495; USPN 7.736.872; USPN 7.846.689; USPN 7.883.866; USPN 7.838.265; USPN 7.829.310; USPN 7.858.344; USPN 7.632.823; i USPN 9.586.988. Dodatni detalji za proizvodnju O-RS mogu se naći u WO 2002/086075 pod naslovom " Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs." Videti takođe, Hamano-Takaku et al., (2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine Journal of Biological Chemistry, 275(51):403224-403; Kiga i dr. (2002), An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in vertebrate translation and its application in a wheat germ cellfree system PNAS 99(15): 9715-9723; i, Francklin et al., (2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theater of translation; RNK, 8:1363-1372.
[0081] Ortogonalni par O-tRNK/O-RS u ćeliji kičmenjaka može se proizvesti uvozom para, na primer, besmislenog supresorskog para, iz drugog organizma sa neefikasnom aminoacilovanjem unakrsnih vrsta. O-tRNK i O-RS se efikasno ekspresuju i obrađuju u ćeliji kičmenjaka i O-tRNK se efikasno izvozi iz jezgra u citoplazmu. Na primer, jedan takav par je tirozil-tRNK sintetaza/tRNKCUA par iz E. coli (videti, npr., H. M. Goodman, et al., (1968), Nature 217: 1019-24; i, D. G. Barker, et al. , (1982), FEBS Letters 150:419-23). E. coli tirozil-tRNK sintetaza efikasno aminoaciluje svoj srodni E. coli tRNKCUA kada su oba ekspresovana u citoplazmi S. cerevisiae, ali ne aminoaciluje tRNK S. cerevisiae. Videti, npr., H. Edvards, & P. Schimmel, (1990), Molecular & Cellular Biology 10:1633-41; i npr, H. Edvards, et al., (1991), PNAS Sjedinjene Američke Države 88:1153-6. Pored toga, E. coli tirozil TRNKCUA je loš supstrat za S. cerevisiae aminoacil-tRNK sintetaze (videti, npr., V. Trezeguet, et al., (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51), ali deluje efikasno u translaciji proteina u S. cerevisiae. Videti, npr., H. Edvards, & P. Schimmel, (1990) Molecular & Cellular Biology 10:1633-41; H. Edvards, et al., (1991), PNAS Sjedinjene Američke Države 88:1153-6; i, V. Trezeguet, et al., (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51. Štaviše, E. coli TyrRS nema mehanizam za uređivanje za korekturu neprirodne aminokiseline vezane za tRNK.
Neprirodne aminokiseline
[0082] Inkorporacija neprirodne ili veštačke aminokiseline može da se uradi da bi se prilagodile promene u strukturi i/ili funkciji proteina, uključujući promenu veličine, kiselosti, nukleofilnosti, vodonične veze, hidrofobnosti, dostupnosti ciljnih mesta proteaze, mete za određeni deo (npr. za niz proteina), i slično. Proteini koji uključuju neprirodnu aminokiselinu mogu imati poboljšana ili čak potpuno nova katalitička ili fizička svojstva. Na primer, sledeća svojstva su opciono modifikovana uključivanjem neprirodne aminokiseline u protein: toksičnost, biodistribucija, strukturna svojstva, spektroskopska svojstva, hemijska i/ili fotohemijska svojstva, katalitička sposobnost, poluživot (npr. serumski poluživot), sposobnost da reaguje sa drugim molekulima, na primer, kovalentno ili nekovalentno, i slično. Kompozicije koje uključuju proteine koji uključuju najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu su korisne za, npr. nove terapeutike, dijagnostiku, katalitičke enzime, industrijske enzime, vezujuće proteine (npr. antitela), Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.
[0083] Neprirodne aminokiseline koje se koriste u metodama i kompozicijama opisanim ovde imaju najmanje jedno od sledeća četiri svojstva: (1) najmanje jedna funkcionalna grupa na bočnom lancu neprirodne aminokiseline ima najmanje jednu karakteristiku i/ili aktivnost i/ili reaktivnost ortogonalnu hemijskoj reaktivnost 20 uobičajenih, genetski kodiranih aminokiselina (tj., alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin), ili barem ortogonalno hemijskoj reaktivnosti aminokiselina koje se javljaju u prirodi prisutnih u polipeptidu koji uključuje neprirodnu aminokiselinu; (2) uvedene neprirodne aminokiseline su suštinski hemijski inertne prema 20 uobičajenih, genetski kodiranih aminokiselina; (3) neprirodna aminokiselina može biti stabilno inkorporirana u polipeptid, poželjno sa stabilnošću srazmernom aminokiselinama koje se javljaju u prirodi ili pod tipičnim fiziološkim uslovima, a dalje je poželjno da se takva inkorporacija može desiti preko in vivo sistema; i (4) neprirodna aminokiselina uključuje oksimsku funkcionalnu grupu ili funkcionalnu grupu koja se može transformisati u oksimsku grupu reakcijom sa reagensom, poželjno pod uslovima koji ne uništavaju biološka svojstva polipeptida koji uključuje neprirodna aminokiselina (osim ako takvo uništavanje bioloških svojstava nije svrha modifikacije/transformacije), ili gde se transformacija može desiti u vodenim uslovima pri pH između oko 4 i oko 8, ili gde je reaktivno mesto na neprirodnoj aminokiselini elektrofilno mesto. Bilo koji broj neprirodnih aminokiselina može se uvesti u polipeptid. Neprirodne aminokiseline mogu takođe uključiti zaštićene ili maskirane oksime ili zaštićene ili maskirane grupe koje se mogu transformisati u oksimsku grupu nakon uklanjanja zaštite zaštićene grupe ili demaskiranja maskirane grupe. Neprirodne aminokiseline takođe mogu uključivati zaštićene ili maskirane karbonilne ili dikarbonilne grupe, koje se mogu transformisati u karbonilnu ili dikarbonilnu grupu nakon uklanjanja zaštite sa grupe za zaštitu ili demaskiranja maskirane grupe i tako su dostupne da reaguju sa hidroksilaminima ili oksimima da bi se formirale oksimske grupe.
[0084] Neprirodne aminokiseline koje se mogu koristiti u metodama i kompozicijama opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničene na, aminokiseline koje sadrže aminokiseline sa novim funkcionalnim grupama, aminokiseline koje kovalentno ili nekovalentno reaguju sa drugim molekulima, glikozilovane aminokiseline kao što su šećerom supstituisani serin, druge aminokiseline modifikovane ugljenim hidratima, aminokiseline koje sadrže keto grupu, aminokiseline koje sadrže aldehid, aminokiseline koje sadrže polietilen glikol ili druge polietre, aminokiseline supstituisane teškim atomom, aminokiseline koje se mogu hemijski odvojiti i/ili aminokiseline koje se mogu odvojiti svetlošću, sa izduženim bočnim nizovima u poređenju sa prirodnim aminokiselinama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polietre ili ugljovodonike dugog niza, uključujući, ali ne ograničavajući se na, više od oko 5 ili više od oko 10 ugljenikovih atoma, aminokiseline povezane sa šećerom, redoksaktivne aminokiseline, aminokiseline koje sadrže amino-tiokiseline, i aminokiseline koje sadrže jednu ili više toksičnih grupa.
[0085] U nekim realizacijama, neprirodne aminokiseline sadrže saharidnu grupu. Primeri takvih aminokiselina uključuju N-acetil-L-glukozaminil-L-serin, N-acetil-L-galaktozaminilL-serin, N-acetil-L-glukozaminil-L-treonin, N-acetil-L-glukozaminil- L-asparagin i O-manozaminil-L-serin. Primeri takvih aminokiselina takođe uključuju primere gde je prirodna N- ili O- veza između aminokiseline i saharida zamenjena kovalentnom vezom koja se obično ne nalazi u prirodi - uključujući, ali ne ograničavajući se na, alken, oksim, tioetar, amid i slično. Primeri takvih aminokiselina takođe uključuju saharide koji se obično ne nalaze u prirodnim proteinima kao što su 2-deoksi-glukoza, 2-deoksigalaktoza i slično.
[0086] Specifični primeri neprirodnih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, pacetil-L-fenilalanin, p-propargiloksifenilalanin, O-metil-L-tirozin, L-3-(2-naftil)alanin, 3 -metil-fenilalanin, O-4-alil-L-tirozin, 4-propil-L-tirozin, tri-O-acetil-GlcNAc β-serin, L-Dopa, fluorisani fenilalanin, izopropil-L- fenilalanin, p-azido-L-fenilalanin, p-acil-L-fenilalanin, pbenzoil-L-fenilalanin, L-fosfoserin, fosfonoserin, fosfonotirozin, p-jodfenilalanin, pbromofenilalanin, p-amino-L-fenilalanin, i izopropil-L-fenilalanin, i slično.
[0087] Hemijski delovi ugrađeni u polipeptide putem inkorporacije neprirodnih aminokiselina u takve polipeptide nude niz prednosti i mogućnost manipulacije polipeptidima. Na primer, jedinstvena reaktivnost karbonilne ili dikarbonilne funkcionalne grupe (uključujući keto- ili aldehidnu funkcionalnu grupu) omogućava selektivnu modifikaciju proteina sa bilo kojim od brojnih reagenasa koji sadrže hidrazin ili hidroksilamin in vivo i in vitro. Teški atom neprirodne aminokiseline, na primer, može biti korisna za fazne podatke o rendgenskoj strukturi. Lokalno specifično uvođenje teških atoma korišćenjem neprirodnih aminokiselina takođe obezbeđuje selektivnost i fleksibilnost u izboru mesta za teške atome. Fotoreaktivne neprirodne aminokiseline (uključujući, ali ne ograničavajući se na, aminokiseline sa benzofenonom na bočnim nizovima i arilazida (uključujući, ali ne ograničavajući se na, fenilazid)), na primer, omogućavaju efikasno in vivo i in vitro foto-ukrštanje polipeptida. Primeri fotoreaktivnih neprirodnih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, p-azido-fenilalanin i p-benzoilfenilalanin. Polipeptid sa fotoreaktivnim neprirodnim aminokiselinama može se zatim po želji umrežiti ekscitacijom što je obezbeđeno fotoreaktivnom grupom. U neograničavajućem primeru, metil grupa neprirodne aminokiseline može biti supstituisana izotopski obeleženom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, metil grupu, kao sonda lokalne strukture i dinamike, uključujući, ali ne ograničavajući se na, upotrebu nuklearne magnetne rezonance i vibracione spektroskopije.
[0088] Apsorpcija neprirodnih aminokiselina od strane eukariotske ćelije je jedno pitanje koje se obično razmatra prilikom dizajniranja i odabira neprirodnih aminokiselina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, za ugradnju u polipeptid ili protein. Na primer, visoka gustina naelektrisanja α-aminokiselina sugeriše da je malo verovatno da će ova jedinjenja biti ćelijski permeabilna. Prirodne aminokiseline se unose u eukariotsku ćeliju preko grupe transportnih sistema zasnovanih na proteinima. Može se uraditi brzi pregled kojim se procenjuje koje neprirodne aminokiseline, ako ih ima, apsorbuju ćelije. Videti, na primer, testove toksičnosti u, na primer, Patentnoj publikaciji SAD br.2004/198637 pod naslovom "Protein Arrays", i Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. Proc. Natl. Akad. Sci. USA., 96:4780-4785. Iako se apsorpcija lako analizira različitim testovima, alternativa dizajniranju neprirodnih aminokiselina koje su podložne putevima ćelijske apsorpcije je obezbeđivanje biosintetskih puteva za stvaranje aminokiselina in vivo.
[0089] Tipično, neprirodna aminokiselina proizvedena putem ćelijske apsorpcije, kao što je ovde opisano, proizvodi se u koncentraciji dovoljnoj za efikasnu biosintezu proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, prirodnu ćelijsku količinu, ali ne do tog stepena da utiče na koncentraciju drugih aminokiselina ili da iscrpi ćelijske resurse. Tipične koncentracije proizvedene na ovaj način su oko 10 mM do oko 0,05 mM
[0090] Mnogi biosintetički putevi već postoje u ćelijama za proizvodnju aminokiselina i drugih jedinjenja. Dok biosintetički metod za određenu neprirodnu aminokiselinu možda ne postoji u prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, u ćeliji, metode i kompozicije koje su ovde opisane obezbeđuju takve metode. Na primer, biosintetički putevi za neprirodne aminokiseline mogu se generisati u ćeliji domaćinu dodavanjem novih enzima ili modifikacijom postojećih puteva ćelije domaćina. Dodatni novi enzimi uključuju enzime koji se javljaju u prirodi ili veštački razvijene enzime. Na primer, biosinteza paminofenilalanina (kao što je predstavljeno u primeru u WO 2002/085923 pod naslovom "In vivo incorporation of unnatural amino acids ") se oslanja na dodavanje kombinacije poznatih enzima iz drugih organizama. Geni za ove enzime mogu se uneti u eukariotsku ćeliju transformacijom ćelije plazmidom koji sadrži gene. Geni, kada se ekspresuju u ćeliji, obezbeđuju enzimski put za sintezu željenog jedinjenja. Ovde su dati primeri tipova enzima koji se opciono dodaju. Dodatne sekvence enzima nalaze se, na primer, u Genbank. Veštački razvijeni enzimi se mogu dodati u ćeliju na isti način. Na ovaj način, ćelijska mašinerija i resursi ćelije se manipulišu da bi proizveli neprirodne aminokiseline.
[0091] Dostupne su različite metode za proizvodnju novih enzima za upotrebu u putevima biosinteze ili za evoluciju postojećih puteva. Na primer, rekurzivna rekombinacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, razvijenu od strane kompanije Maxygen, Inc. (dostupna na www@makigen.com), može se koristiti za razvoj novih enzima i puteva do njih. Videti, npr., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNK shuffling, Nature 370(4):389-391; i Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation i reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Akad. Sci. USA., 91:10747-10751. Slično tome, DesignPath™, koji je razvio Genencor (dostupan na www@genencor.com), se opciono koristi za inženjering metaboličkih puteva, uključujući, ali ne ograničavajući se na, projektovanje puta za stvaranje neprirodne aminokiseline u ćeliji. Ova tehnologija rekonstruiše postojeće puteve u organizmima domaćina koristeći kombinaciju novih gena, uključujući, ali ne ograničavajući se na one identifikovane kroz funkcionalnu genomiku, molekularnu evoluciju i dizajn. Diversa Corporation (dostupna na www@diversa.com) takođe obezbeđuje tehnologiju za brzi pregled biblioteka gena i puteva gena, uključujući, ali ne ograničavajući se na, stvaranje novih puteva za biosintetičku proizvodnju neprirodnih aminokiselina.
[0092] Tipično, neprirodna aminokiselina proizvedena pomoću projektovanog puta biosinteze, kako je ovde opisano, proizvodi se u koncentraciji dovoljnoj za efikasnu biosintezu proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, prirodnu ćelijsku količinu, ali ne do tog stepena da utiče na koncentraciju ostalih aminokiselina ili iscrpljenje ćelijskih resursa. Tipične koncentracije proizvedene in vivo na ovaj način su oko 10 mM do oko 0,05 mM. Jednom kada se ćelija transformiše plazmidom koji sadrži gene koji se koriste za proizvodnju enzima željenih za specifični put sinteze i generiše se neprirodna aminokiselina, in vivo selekcije se opciono koriste za dalju optimizaciju proizvodnje neprirodne aminokiseline za sintezu oba ribozomska proteina i rast ćelija. Neprirodne aminokiseline opisane ovde mogu se sintetizovati korišćenjem metodologija onima obučenim u oblasti ili korišćenjem tehnika opisanih ovde ili njihovom kombinacijom.
Karakterizacija proizvoda
[0093] Sveobuhvatna karakterizacija bioterapeutika je neophodna da bi se zadovoljili bezbednosni standardi koje su postavile regulatorne agencije i kako bi se osigurala efikasnost proteinskih lekova. Biofarmaceutska karakterizacija je neophodna u svim fazama razvoja leka i proizvodnje. Zbog toga je najvažnije pratiti kvalitet proizvoda tokom svake faze razvoja ćelijske linije, inženjeringa, i razvoja procesa ćelijske kulture kako bi se osiguralo da je odabran pravi klon jer kvalitet proizvoda i produktivnost često zavise od uslova kulture klonova i ćelija. Tokom procesa selekcije klonova, naglasak se stavlja na parametre kvaliteta proizvoda koji su verovatno specifični za klon. Ovi parametri uključuju, na primer, enzimske procese, kao što su glikozilacija i proteolitički kliping, i genetska pitanja, kao što su mutacije, pomeranja okvira čitanja, i spajanja, ali nisu ograničeni na njih. Naglasak je takođe stavljen na molekularne parametre za koje se zna da doprinose biološkoj aktivnosti. Na primer, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) se oslanja na fukozilaciju, a citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) zavisi od galaktozilacije. Uočene razlike između klonova u obimu hemijskih modifikacija, kao što su oksidacija ili deamidacija, mogu se suziti ili eliminisati kroz optimizaciju procesa prečišćavanja ili podešavanjem parametara procesa ćelijske kulture i biće manje značajne. (Levis et al, 2010).
[0094] Može se ispitati uticaj editovanja genoma pomoću CRISPR-Cas9 i kloniranja jedne ćelije na kvalitet proizvoda ćelije ili ćelijske linije koja eksprimira bioterapeutik. Osobine kvaliteta proizvoda procenjeni tokom selekcije klonova CRISPR-Cas9 proizvedenih ćelija mogu uključiti integritet molekula, agregaciju, glikozilaciju i heterogenost šarže, ali nisu ograničeni na to. Integritet molekula zavisi od klona i može biti uzrokovan genetskim problemima ili proteolitičkom isecanjem. Različite metodologije, tehnike i testovi, svi dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, mogu se koristiti za procenu integriteta molekula sa kriterijumima za izbegavanje mutacije aminokiselinske sekvence ili skraćenih antitela. Takve metodologije, tehnike i testovi mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, sekvenciranje cDNK, mapiranje peptida, CE-SDS ili SDS-PAGE. Agregacija se može meriti korišćenjem, na primer, ekskluzionim hromatografijom (SEC). Kriterijum za ovu analizu je izbegavanje visokog nivoa agregacije koja može biti imunogena. Neki nivoi agregacije se mogu smanjiti optimizacijom procesa kulture ćelija ili ukloniti optimizacijom procesa prečišćavanja. Glikozilacija je još jedan važan molekularni i posttranslacioni atribut koji u velikoj meri zavisi od ćelijske linije. HPLC ili CE testovi glikana, dobro poznati onima obučenim u oblasti, obično se koriste za procenu glikozilacije u fazi selekcije klonova sa ciljem izbegavanja visokih nivoa neobičnih oblika glikozilacije. Heterogenost šarže, koja može nastati usled hemijskih modifikacija, u velikoj meri zavisi od procesa ćelijske kulture i stoga ima manje značajnu ulogu tokom faze selekcije klonova.
[0095] Intaktna masena spektrometrija (MS) daje informacije o tačnoj masi proteina i relativnom obilju njegovih izoformi. Ekskluziona hromatografija (SEC), takođe poznata i kao hromatografija na molekulskom situ, je hromatografska metoda u kojoj su molekuli u rastvoru razdvojeni po svojoj veličini, u nekim slučajevima molekulskoj težini. U ovom pronalasku, MS je korišćen da se pokaže da je za generisane klonove i roditeljske ćelijske linije, primarna aminokiselinska sekvenca ista kao što je izvedena iz cDNK sekvence, u potvrđivanju identifikacije mAb. SEC je takođe modifikovan i korišćen za određivanje čistoće i konzistencije proizvodnje proizvedenih monoklonskih antitela (mAb).
Primeri
Primer 1: Strategija korišćenja platformskog inženjeringa ćelijske linije u industriji razvoja lekova: od otkrića do proizvodnje
[0096] U perspektivi industrije, razvoj platforme ćelijske linije ne samo da podržava svaku fazu razvoja leka obezbeđivanjem odgovarajućeg materijala, već takođe generiše stabilnu, dobro okarakterisanu proizvodnu ćelijsku liniju pre uvođenja proizvoda u klinike i komercijalizaciju (SLIKA 1) . Da bi se efikasno podržala svaka faza razvoja leka, razvijeni su višestruki načini za obezbeđivanje materijala uključujući privremeni, stabilni obilni pul (skup ćelija), stabilnu ćelijsku liniju koja je razvijena kao što je ilustrovano na slici 1. Za selekciju molekula kandidata za antitelo, korišćena je privremena ekspresija da bi se brzo obezbedila mala količina proizvoda. Stabilni obilni skup (skup ćelija) je alternativa za obezbeđivanje velike količine materijala za proučavanje mogućnosti razvoja (prečišćavanje, formulacija, razvoj analitičkih metoda) do IND-omogućavajuće toksikološke studije (100-200g) za 8 nedelja. Kada je vodeći molekul određen, stabilna ćelijska linija je stvorena za 6 meseci sa titrom do 1,5 g/L. Ovo pruža podršku kliničkom ispitivanju i potencijalnoj komercijalizaciji.
Primer 2: Opšti postupak korišćenja platformske ćelijske linije u razvoju ćelijske linije visoke proizvodnje
[0097] Slika 2 prikazuje dijagram toka za stabilan razvoj ćelijske linije. Pronalazači su koristili ovu strategiju da generišu visokoproduktivne, stabilne, dobro okarakterisane proizvodne ćelijske linije skalabilne prema industrijskoj standardnoj proizvodnji, da podrže kliničko ispitivanje i komercijalizaciju uz održavanje željenih profila bezbednosti i efikasnosti terapeutika. Ekspresioni vektor sisara koji nosi gen od interesa (GOI) i selektivni(e) marker(e) je transfektovan u konstruisanu ćelijsku liniju platforme CHO da bi se stvorio mini-skup (MP) u 96 bunarčića. Nakon selekcije i skrininga, gornji MP su postavljeni kao pojedinačna ćelija po bunarčiću korišćenjem FACS, nakon čega je usledilo snimanje visoke rezolucije da bi se dobila klonska ćelijska linija. Ćelijske linije izvedene iz jedne ćelije su pregledane i gornji klonovi su prebačeni u grupu ćelijske kulture radi razvoja procesa. Konačna selekcija klonova za proizvodnju kliničkog materijala bila je zasnovana na rastu, produktivnosti i PK. Ceo CLD proces traje 6 meseci, a produktivnost specifična za ćeliju bila je 20-30 pikograma po ćeliji dnevno. Stabilna duže od 10 nedelja da bi se podržala proizvodnja bioreaktora od 12.000L, fed-batch procesom prehrane ćelijske linije proizvodnja se može povećati do 2000L do sada da bi se podržalo kliničko ispitivanje koje je u toku.
Primer 3: Optimizacija razvoja ćelijske linije visoke proizvodnje
[0098] Optimizacija razvoja ćelijske linije visoke proizvodnje može se postići iz nekoliko aspekata kao što su FACS zavisna depozicija pojedinačnih ćelija (SLIKA 3A), CRISPR nokaut procedura (SLIKA 3B) i optimizacija procesa razvoja ćelijske linije (SLIKA 3C).
[0099] Regulatorno uputstvo (ICH Q5D) upućuje na kloniranje ćelijskoj supstrata „iz jednog ćelijskog progenitora“ tokom razvoja ćelijske linije. Tokom poslednjih nekoliko godina očekivalo se da se uspostavi visoka sigurnost klonalnosti od strane FDA i industrije (Kennett, 2014; Novak, 2017; Velch, 2017). FDA je preporučila da dva kruga kloniranja sa ograničenim razblaženjem (LDC) pri dovoljno niskoj gustini zasejavanja (<0,5 ćelija/bunarčić) obezbede prihvatljivu verovatnoću da je ćelijska linija klonska. Nedavno je jedan krug kloniranja putem FACS ili LDC uz dovoljno opravdanja, kao što je upotreba tehnologije snimanja, pružio prihvatljivu garanciju klonalnosti kada se koriste validirane metode. Pronalazači su tako modifikovali i validirali FACS depoziciju jedne ćelije (FACS SCD) zajedno sa snimanjem visoke rezolucije kao jedan krug kloniranja u procesu razvoja ćelijske linije da bi skratili vremensku liniju, kao i da bi zadovoljili regulatorne zahteve za osiguranje klonalnosti.
[0100] Kao što je prikazano ovde (SLIKA 3A), u poređenju sa tradicionalnim ograničavajućim razblaženim kloniranjem (LDC), FACS SCD je generisao uporedivu stopu taloženja i rasta. Međutim, efikasnost izolovanja monoklonalnog izrastanja (odnos broja bunara koji sadrže kolonije izvedene iz jedne ćelije podeljen sa ukupnim brojem bunara) korišćenjem FACS pristupa je 1,5 puta od one pomoću LDC (49% nasuprot 32%), štedeći značajno vreme i resurse na snimanju i skriningu. Opsežna optimizacija u FACS instrumentaciji i varijaciji g-sile centrifugiranja zajedno sa detaljnom analizom slike za svaki bunarčić je sprovedena da bi se validirao pristup. Uočeno je da je verovatnoća monoklonalnosti kolonije izvedene iz jedne ćelije >99,5%.
[0101] Genetski inženjering proizvodne ćelijske linije korišćenjem CRISRR-cas9 tehnologije za uređivanje genoma je testiran da cilja panel gena za poboljšanje rasta ćelija i produktivnost uz održavanje željenog kvaliteta proizvoda. CRISPR nokaut procedura je ilustrovana, SLIKA, 3B. Alat za pronalaženje ciljeva pomoću web CRISPy, korišćen je za brzu identifikaciju ciljnih sekvenci gRNK, poželjno u ranim eksonima sa nultim promašajem cilja u CHO-K1 ćelijama. gRNK-ovi su klonirani u vektor ekspresije sisara pGNCV koji ko-ekspresuje sa verzijom Cas9 optimizovanom za CHO kodon. Proizvodna ćelijska linija je transfektovana vektorom pGNCV da bi se stvorio skup ćelija, a zatim je usledilo kloniranje da bi se identifikovali pojedinačni ćelijski izolati sa nokautom gena. Učestalost umetanja (umetanja/brisanja) iz kombinovanih rezultata višestrukih projekata bila je 30-90% i 50-80% za grupu ćelija i izolata pojedinačnih ćelija, redom. Western blot je ponovo potvrdio efikasnost nokauta od 50-90% za izolate pojedinačnih ćelija koje su verifikovane sekvenciranjem DNK. Klonovi pojedinačnih ćelija su podvrgnuti daljoj proceni produktivnosti, rasta, testa apoptoze i kvaliteta proizvoda da bi se izabrao proizvodni klon za proizvodnju cGMP. Potvrđene mete korišćene za nokaut su testirane korišćenjem proizvodne ćelijske linije. Ovo se pokazalo korisnim za procenu produktivnosti i rasta i bilo je primenljivo na prekide u domaćinu ćelijske linije platforme koristeći CRISPR za povećanje efikasnosti izolovanja ćelijske linije visoke proizvodnje za budući gen od interesa.
[0102] Proces razvoja ćelijske linije je takođe optimizovan zajedno sa razvojem ćelijske linije platforme. Koristeći prvu ćelijsku liniju platforme kao domaćina, potrebno je tri do četiri koraka (ili 9 meseci do 12 meseci) da se generiše proizvodna ćelijska linija koja proizvodi titar 0,5-1 g/L (SLIKA 3C). Trenutni proces razvoja ćelijske linije je skraćen na dva koraka ili 6 meseci, što se pripisuje poboljšanoj platformi ćelijske linije i kloniranju u jednom koraku kao što je ilustrovano (SLIKA 2).
Primer 4: ćelijska linija platforme pokazuje prekomernu apoptozu u kulturi
[0103] Aneksin V test je korišćen za procenu vijabilnosti CHO-S ćelija u ćelijskoj liniji platforme 4E2 koja sadrži genetski ugrađen ortogonalni par tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze specifične za para-acetil-L-fenilalanin. Kao što je prikazano, SLIKA 4, u poređenju sa CHO-S ćelijama (vijabilnost je 96%), 4E2 je pokazao prekomernu apoptozu (vijabilnost je 85%). Posmatranja pokazuju da ćelije 4E2 koje imaju inkorporiran par tRNK sintetaze i tRNK (specifičan za, na primer, neprirodnu aminokiselinu para-acetilalanin, pAF) iskazuju prekomernu apoptozu u odnosu na njene pandan ćelije, CHO-S ćelije.
Primer 5: Dizajn i priprema BAX i BAK-CRISPR konstrukata
[0104] CRISPR konstrukti su dizajnirani da prepoznaju ciljna mesta u BAX ili BAK genu i prave dvostruke prekide u CHO ćelijama nakon transfekcije. Primeri dizajna su prikazani na slikama 5, 6 i 7.
[0105] Nokaut gena može se izvršiti sekvencijalnom ili simultanom procedurom. BAX i BAK dvostruki nokaut se takođe može postići postupkom sekvencijalnog nokautiranja. Generalno, prvi korak je primena tri BAX ciljana gRNK konstrukta na anti-HER2 ekspresujućoj ćelijskoj liniji. Nakon praćenja sličnih produkata korišćenih u proceduri simultanog nokautiranja, izolovana je ćelijska linija koja ima BAX nokaut. Koristeći ovu ćelijsku liniju, dva BAK ciljana gRNK konstrukta se primenjuju da bi se postiglo izbacivanje BAK. Nakon verifikacije sekvenciranjem gnomske DNK, potvrđeno je da je ćelijska linija dvostrukog nokauta BAX i BAK postignuta takvom sekvencijalnom procedurom.
[0106] CRISPR gRNK dizajn ciljanog BAX gena u CHO ćelijama je ilustrovan, SLIKA 5. Kao što je prikazano, tri gRNK lokacije koje ciljaju BAX gen u CHO ćelijama su dizajnirane korišćenjem onlajn alata za dizajn CRISPR gRNK specifičnog za CHO-K1 genom (pogledajte na www staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy/). Genomska DNK sekvenca BAX gena, ekson 1 i ekson 2 prikazani su sivom nijansom. Druga sekvenca BAX je prikazana u običnom tekstu. Prajmeri koji se koriste u PCR sekvenciranju prikazani su na početku i na kraju sekvence kao prednji prajmer i reversni prajmer redom. Kao što je prikazano u tabeli 1, tri BAX mesta (svako ima sekvencu dugu 19 nukleotida, sekvenca -NGG PAM (protospejcer susedni motiv) sekvenca je izostavljena tokom dizajna zbog prirode plazmida pGCNV koji je otvoren i ima dva „lepljiva“ kraja , kao što je prikazano, SLIKA 7) su sledeće: mesto-I (AGGCACTCGCTCAACTTCG) (SEQ ID NO: 1), mesto-II (TGAGTGTGACCGGCTGTTG) (SEQ ID NO: 2) i mesto-III (TTTCATCCATGTATCGAGCT) (SEQ ID NO: 3).
[0107] Kao što je prikazano, SLIKA 6, CRISPR je korišćen za dizajniranje gRNK ciljanog BAK gena u CHO ćelijama. Slika 6 prikazuje genomsku DNK sekvencu BAK gena u CHO ćelijama u kojima su označene dve gRNK sekvence. Genomska DNK sekvenca BAK gena, ekson 2 i ekson 3 su prikazani sivom nijansom. Druga sekvenca BAK je prikazana u običnom tekstu. Prajmeri koji se koriste u PCR sekvenciranju prikazani su na početku i na kraju sekvence kao prednji prajmer i reversni prajmer redom. Tri BAK mesta prikazana u Tabeli 1 su sledeća: (SEQ ID NO: 4) BAK-IGAACAAATTGTCCATCTCG Ekson 2, (SEQ ID NO: 5) BAK-IIATGCTGTAAGAACGGGAGT Ekson 3, (SEQ ID NO: 6) BAK-IIGAAGCCGGTCAAACCACGT.
[0108] CRISPR plazmidi koji se koriste u BAX ili BAK nokaut eksperimentima su takođe dizajnirani kao što je prikazano, SLIKA 7, korišćenjem komercijalno dostupnog vektora, Geneart CRISPR Nuclease Vector (pGCNV), (Thermo Fisher Scientific). Kompletan oblik pGCNV plazmida je pripremljen umetanjem oligo dupleksa u zasečeni pGCNV vektor koji sadrži prorez za oligo dupleks i koji je dizajniran sa specifičnim gRNK sekvencama dugim 19 nukleotida za pojedinačno ciljanje genskog mesta (videti Tabelu 1 negde drugde ovde ).
[0109] Da bi se formirao oligonukleotidni (oligo) dupleks koji se može umetnuti u pGCNV, pet (5) parova oligo je sintetizovano kao što je prikazano u tabeli 3 ispod.
Tabela 3: Oligo sekvence koje se koriste za pripremu BAX i BAK nokaut CRISPR konstrukata
[0110] Da bi se generisali dvolančani oligonukleotidi, svaki oligo par se inkubira pri konačnoj koncentraciji od 50 uM u puferu za oligonukleotidno temperovanje na 95 °C tokom 4 minuta pre nego što se ohladi na 25 °C tokom 5-10 minuta. Posle 10-strukog razblaženja (5 uM), oligonukleotidni dupleks se može koristiti u postupku ligacije. Ligacija se može obaviti pomoću Roche kompleta za brzu ligaciju (Roche). U reakciji od 21 ul koja sadrži 3 ul pGCNV vektora, 1 ul oligo dupleksa, 2 ul pufera za razblaživanje DNK, 4 ul vode, 10 ul pufera T4 DNK ligaze i 1 ul T4 ligaze. Reakciona smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 5 minuta.3 ul mešavine za ligaciju može se koristiti za transformaciju E. coli za skrining pozitivnih klonova.
Primer 6: Primeri neprirodnih aminokiselina korišćenih u ovom pronalasku [0111] Pronalazak obuhvata inkorporaciju specifičnu za određeno mesto nekanonskih ili neprirodnih aminokiselina u gen od interesa korišćenjem ortogonalnog para aminoaciltRNK sintetaza/transfer RNK o kome se ovde govori na drugom mestu. Slika 8 daje reprezentativan broj neprirodnih aminokiselina koje se mogu koristiti. Na primer, jedna takva neprirodna aminokiselina je para-acetil-L-fenilalanin (pAF) koja je dodata u medijum kulture da bi se pokrenula proizvodnja potpuno sastavljenih gena od interesa, na primer bioterapeutika uključujući monoklonska antitela, sa inkorporacijom pAF na specifičnu lokaciju.
Primer 7: Generisanje i analiza BAX/BAK sa nedostatkom anti-HER2 ekspresujućih ćelijskih linija
[0112] Simultana ablacija BAX i BAK je sprovedena korišćenjem CRISPR tehnologije. Privremena transfekcija je izvedena korišćenjem tri BAX ciljana gRNK konstrukta i dva BAK ciljana gRNK konstrukta na ćelijskoj liniji L082 koja eksprimira anti-HER2. Transfekcija plazmida je urađena elektroporacijom. Tokom elektroporacije, 6 miliona ćelija je pomešano sa 2 ug DNK plazmida u 100 ul rastvora za elektroporaciju. Ćelije su transfektovane u Amaka Nucleofector II (Lonza) korišćenjem programa U-023 i oporavljene u 0,5 ml toplog medijuma. Ispitivanje je obavljeno na transfektovanoj grupi ćelija da bi se izmerila efikasnost nokauta kao što je otkriveno u Primeru 3, SLIKA 3B. Sedam dana nakon što su transfektovane sa tri BAX ciljana gRNK konstrukta zajedno sa dva BAK ciljana gRNK konstrukta istovremeno, ćelije su supklonirane pri gustini zasejavanja od 0,5 ćelija/bunarčiću u ploče sa 96 bunarčića u pojedinačne klonove korišćenjem metode ograničavanja razblaživanja. Svaka pojedinačna ćelija u ploči sa 96 bunarčića je uzgajana oko 2-3 nedelje da bi se stvorio dovoljan broj ćelija koje će se koristiti za dalju genetsku analizu. Klonovi izvedeni iz jedne ćelije su odabrani i pregledani koristeći 96 bunarčića, 24 bunarčića i 24 dubokih bunarčića za produktivnost, rast i genotipizaciju ciljanim sekvenciranjem DNK.
Primer 8: DNK analiza BAX i BAK sа nedostatkom anti-HER2 ekspresujućih klonova
[0113] BAX i BAK inaktivirane CHO ćelije su generisane i analizirane na genetskom nivou. Tri plazmida koji kodiraju tri različite gRNK sekvence koje ciljaju BAK mesta su kotransfektovana u stabilne ćelijske linije izvedene iz CHO ćelija koje su konstruisane da imaju pAF-RS i pAF-tRNK plus anti-HER2 gen ili njegov fragment. 72 sata nakon transfekcije, genomska DNK je izolovana i deo BAK lokusa je PCR amplifikovan korišćenjem oligo K-I-II-F i K-I-II-R (Tabela 2; 5'- CAGACAGCCTTTCTTGCT-3' (SEQ ID NO: 45) i 5'-AGAGCTCCTGAGAGGCATGA-3' (SEQ ID NO: 46)). PCR je izveden korišćenjem Phusion High-Fideliti PCR master mešavine (NeW England Biolabs, Ipswich, MA). Uslovi su bili sledeći: nakon početne denaturacije na 95 °C u trajanju od 2 minuta, izvedeno je 30 ciklusa PCR sa denaturacijom na 95 °C u trajanju od 20 sekundi, nakon čega je usledilo temperovanje od 30 sekundi na koraku od 60 °C, nakon čega je usledio 1 minutno produženje na 72 °C. Posle 30 ciklusa, reakcija je inkubirana na 72 °C tokom 5 minuta, a zatim na 4 °C neograničeno. PCR proizvodi su korišćeni u Surveyor analizi za procenu efikasnosti nokauta. Detekcija testa Surveyor je izvedena korišćenjem kompleta za detekciju mutacija Surveyor iz IDT (Integrated DNK Technology, San Diego, CA). Heterodupleks je formiran korišćenjem termociklera da bi se oponašao postupak prirodnog hlađenja zagrejane oligo smeše. Sledeći postupak je korišćen za formiranje heterodupleksa: 95 °C tokom 10 minuta, nakon čega je usledilo hlađenje sa 95 °C na 85 °C (-2,0 °C/s), 85 °C inkubacija 1 minut; hlađenje sa 85 °C na 75 °C (-0,3 °C/s), inkubacija na 75 °C 1 minut; hlađenje sa 75 °C na 65 °C (-0,3 °C/s), 65 °C inkubacija 1 minut; hlađenje sa 65°C na 55°C (-0,3°C/s), inkubacija na 55°C 1 minut; hlađenje sa 55 °C na 45 °C (-0,3 °C/s), 45 °C inkubacija 1 minut; hlađenje sa 45 °C na 35 °C (-0,3 °C/s), inkubacija na 35 °C 1 minut; hlađenje sa 35 °C na 25 °C (-0,3 °C/s), inkubacija na 25 °C 1 minut; i onda na 4 °C neograničeno. Heterodupleks DNK (20 ul) je inkubiran sa 1 ul Surveyor Enhancer S (2 ul) i Surveyor Nuclease S (1 ul) na 42 °C tokom 60 minuta.10 ul digestiranog uzorka je stavljeno na 1% agarozni gel rame uz rame sa 10 ul nedigestiranog uzorka. Kao što je prikazano, SLIKA 9, Surveyor test je izveden na transfektovanoj grupi ćelija da bi se izmerila efikasnost nokauta kao što je otkriveno u Primeru 3, SLIKA 3B. Analiza efikasnosti nokauta sprovedena je u ćelijskim populacijama koje ekspresuju anti-HER2. Smanjenje gornje trake i pojavljivanja donjih novih traka ukazuje na efikasnost koja se može kvantifikovati denzitometrijskom analizom skenirane slike pomoću softvera Image J. Odnos originalnog opsega pre i posle CRISPR KO korišćen je za merenje efikasnosti nokauta. Efikasnost nokauta za BAX i BAK bila je 30% odnosno 70%, što je rezultiralo izračunatom efikasnošću dvostrukog nokauta od pristojnih 21%.
[0114] Duplirane ploče sa jednoćelijskim pločama sa 96 bunarčića korišćene su za izvođenje izolovanja genomske DNK i sekvenciranja DNK. QuickExtract rastvor je korišćen za izolaciju genomske DNK visoke propusnosti. 150 ul supernatanta ćelijske kulture je uklonjeno iz kulture pre dodavanja 150 ul rastvora QuickExtract. Nakon što su lizirali na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, ćelijski lizati su prebačeni u sveže mikroepruvete da bi se zagrevali na toplotnom bloku na 65 °C tokom 6 minuta, a zatim na 98 °C tokom 2 minuta.
[0115] Ekstrakt genomske DNK je korišćen za PCR amplifikaciju. PCR proizvodi su zatim prečišćeni i sekvencionisani. Rezultati sekvenciranja su analizirani korišćenjem alata za poravnanje u softverskom paketu Vector NTI. Genomska sekvenca gena (u ovom slučaju BAK gen) dobijena na www@CHOgenome.org korišćena je kao sekvenca divljeg tipa tokom analize poravnanja. SLIKA 10 prikazuje rezultate sekvenciranja DNK dvadeset pojedinačnih ćelijskih klonova nakon BAK nokauta pomoću CRISPR. Gornja DNK sekvenca (Bak-CHO-gDNA1) je DNK sekvenca genomskog regiona originalnog BAK gena. Samo klon 'ZA_112_K32_BakI-II' ima identičnu sekvencu originalnog BAK gena. Ostali prikazani geni ili imaju delecije ili insercije u svojim sekvencama. Slična zapažanja su zabeležena sa BAX (podaci nisu prikazani).
Primer 9: Analiza proteina BAX i BAK nokauta u klonovima koji ekspresuju anti-HER2
[0116] BAX i BAK nokaut anti-HER2 ekspresujuće ćelijske linije izvedene iz jedne ćelije su testirane na ekspresiju BAX proteina korišćenjem Western Blot analize (SLIKA 11). Lizati iz 6 miliona BAX/BAK ćelijskih linija dvostrukog nokautiranja su pripremljeni resuspendovanjem u 100 ul RIPA pufera (Abcam) plus inhibitori proteaze (Sigma tablete, Sigma). Lizati su inkubirani na ledu 1 sat pre nego što su centrifugirani na 12.000 rpm tokom 20 minuta. Koncentracija proteina je određena BCA kitom (Pierce).20 ug proteina je korišćeno za Western blot. Ekstrakti proteina iz različitih ćelijskih linija ispitani su anti-BAX antitelom (Abcam). Kao što je prikazano, SLIKA 11, BAX/BAK dvostruke ćelijske linije kao što su BB15, BB12 i BBS19 nisu eksprimovale nikakve detektabilne BAX proteine. Nasuprot tome, kao pozitivna kontrolna ćelijska linija, L082, pokazala je ekspresiju BAX pune dužine, 21-KD proteina. Primećeno je da je ćelijska linija UBB3 eksprimirala rezidualni BAX, iako je sekvenciranjem gena okarakterisana da ima genetski BAX deficit. Slična zapažanja su zabeležena sa BAK-om (podaci nisu prikazani).
Primer 10: Apoptoza je sprečena u BAX/BAK sа nedostatkom anti-HER2 ekspresujućih ćelijskih linija
[0117] Dvostruke ćelijske linije BAX/BAK su testirane na njihovu otpornost na apoptozu. Svojstvo otpornosti na apoptozu je procenjeno tokom primene fed-batch postupka. Izvršena je protočna citometrijska analiza bojenja Annexin-om V 12. dana tokom ishrane ćelija. Standardni protokol koji koristi FITC Annexin V komplet za otkrivanje apoptoze iz BD Biosciences je praćen pod uslovima koje preporučuje proizvođač. Ćelije se mogu podeliti u četiri stadijuma i/ili populacije tokom analize apoptoze: stadijum normalnih održivih ćelija (kvadrant 3, Q3), rani stadijum apoptoze (kvadrant 4, Q4), kasni stadijum apoptoze (kvadrant 2, Q2), i mrtvi stadijum ćelija (kvadrant 1, Q1). Kao što je prikazano, SLIKA 12A, normalne (kontrolne) ćelije L082 koje nemaju nokaute pokazale su značajan obim apoptoze kao što je prikazano u Q4 (11,8%) i Q2 (41,8%). Nasuprot tome, ćelijska linija sa dvostrukim nokautom BAX/BAK (BB15) pokazala je znatno poboljšanu održivost (Q3, 80,9%) i otpornost na apoptozu (Q4, 13,2%; Q2, 3,5%) kao što je prikazano, SLIKA12B. Dakle, primećeno je da se procenat apoptotičkih ćelija smanjuje sa 53% na 17%.
Primer 11: Proizvodnja rekombinantnog proteina je povećana u BAX/BAK sa nedostatkom anti-HER2 ekspresujućih ćelijskih linija
[0118] Proizvodnja antitela je procenjena u obe batch i fed-batch procedure (SLIKE.13 i 14 redom). U uslovima batch kultura, neprirodna aminokiselina pAF je dodata u medijum kulture na dan 3 da bi se pokrenula proizvodnja potpuno sastavljenih anti-HER2 antitela sa ugradnjom pAF specifičnom za mesto ugradnje. Kao što se očekuje za inženjering protiv apoptoze, vršna gustina ćelija merena gustinom vijabilnih ćelija (VCD) nokaut ćelija (SLIKA 13A) je 25% veća od roditeljskih ćelija i vreme proizvodnje (SLIKA 13B) produženo do 10 dana prema 7 dana za roditeljske ćelije. Iznenađujuće, dnevni Qp nokaut ćelija (SLIKA 13D) za dan 7 poboljšan je za 50% u odnosu na roditeljske ćelije, verovatno zbog održane ćelijske aktivnosti koja je rezultat inženjeringa protiv apoptoze. BAX/BAK dvostruke ćelijske linije su pokazale 1,8 puta povećanje titra (270 mg/L naspram 150 mg/L) u poređenju sa roditeljskim ćelijama (SLIKA 13C) 7. dana proizvodnje.
[0119] Sličan trend je primećen u uslovima fed-batch hranjenja (SLIKA 14), kombinacija poboljšanja rasta na osnovu vršne gustine ćelija (VCD) kao što je prikazano, SLIKA 14A, vremena proizvodnje (SLIKA 14B) i ćelijske specifične produktivnosti (SLIKA 14D) dovodi do 3,3 puta povećanja titra za BAX/BAK dvostruke ćelijske linije (SLIKA 14C) koje pokazuju BB15 klon sa titrom od 1500 mg/L u poređenju sa roditeljskom ćelijskom linijom (L082, 450 mg/L).
Primer 12: Kvalitet proizvoda BAX/BAK sa nedostatkom anti-HER2 ekspresujućih ćelijskih linija.
[0120] Kvalitet proizvoda je analiziran intakt masenom spektrometrijom (MS) i ekskluzionom hromatografijom (SEC) korišćenjem uzoraka proizvedenih fed-batch proizvodnjom iz anti-HER2 ekspresujuće roditeljske ćelijske linije i BAX/BAK dvostruko nokaut anti-HER2 ćelijske linije (Tabela 4). Pomoću MS je primećeno da je primarna aminokiselinska sekvenca projektovanog klona i roditeljske ćelijske linije ista kao što je zaključeno iz cDNK sekvence koja je potvrdila identifikaciju mAb (podaci nisu prikazani).
Tabela 4: Analiza kvaliteta proizvoda iz ćelijskih linija koje ekspresuju anti-HER2
[0121] Kao što je prikazano u Tabeli 4, kvalitet proizvoda je analiziran korišćenjem uzoraka proizvedenih fed-batch proizvodnjom iz roditeljskih i BAX/BAK dvostruko nokaut ćelijskih linija koje ekspresuju anti-HER2. Profili glikoforma procenjeni pomoću MS bili su uporedivi pre, (HER2-L082), i posle nokauta, (HER2-BB15), i unutar normalnog opsega distribucije za mAb u fazi selekcije klona. SEC je pokazao da je procenat agregata visoke molekulske težine (HMW) i degradiranih vrsta niske molekulske težine (LMW) bio niži od 5% i uporediv pre i posle inženjeringa, što ukazuje da nokaut i procedura kloniranja jedne ćelije nije negativno uticala na čistoću proizvoda.
Primer 13: Stvaranje BAX/BAK sa nedostatkom anti-PSMA ekspresujućih ćelijskih linija.
[0122] Simultana ablacija BAX i BAK primenom CRISRP tehnologije izvedena je transfekcijom tri BAX ciljana gRNK konstrukta i dva BAK ciljana gRNK konstrukta u anti-PSMA ekspresujuću ćelijsku liniju KO183. BAX i BAK konstrukti korišćeni u ovom eksperimentu su dizajnirani i pripremljeni kao što je opisano u gornjim Primerima i ilustrovani SLIKAMA 5-7 i Tabelama 1-3. CRISPR plazmidi korišćeni u nokaut eksperimentima koji se odnose na anti-PSMA takođe su dizajnirani kao što je prikazano, SLIKA 7, korišćenjem komercijalno dostupnog vektora, Geneart CRISPR Nuclease Vector (pGCNV), (Thermo Fisher Scientific). Oligo dupleks umetnut u pGCNV, sastojao se od pet (5) parova sintetizovanih oligonukleotida od SEQ ID NO: 83 do SEQ ID NO: 92.
[0123] Tri plazmida koji kodiraju tri različite gRNK sekvence koje ciljaju BAX mesta i dva plazmida koja kodiraju dve različite gRNK sekvence koje ciljaju BAK mesta su kotransfektovana u stabilne ćelijske linije izvedene iz CHO ćelija koje su konstruisane da imaju pAF-RS i pAF-tRNK plus anti-PSMA gen ili njegov fragment. 72 sata nakon transfekcije, genomska DNK je izolovana i deo BAK lokusa je PCR amplifikovan korišćenjem oligoa SEQ ID NO: 45 i 46 kao što je opisano u Primeru 8. BAX lokus je PCR amplifikovan korišćenjem oligonikleotida SEQ ID NO: 43 i 44. DNK analiza BAX i BAK klonova sa nedostatkom anti-PSMA ekspresije je sprovedena kao što je opisano u gornjim Primerima. Kao što je prikazano, SLIKA 15, sproveden je Surveyor test da bi se odredila efikasnost nokauta u populacijama ćelija koje ekspresuju anti-PSMA na osnovu CRISPR tehnologije za editovanje. Odnos originalnog opsega pre i posle CRISPR KO korišćen je za merenje efikasnosti nokauta. Efikasnost nokauta za Bax i Bak bila je 42% odnosno 53%, što je rezultiralo izračunatom efikasnošću dvostrukog nokauta od približno 20%.
[0124] Sedam dana kasnije, transficirani skup ćelija je supkloniran sa gustinom zasejavanja od 1 ćelije/bunarčić u 40 ploča korišćenjem FACS. Približno 1000 klonova dobijenih od jedne ćelije, potvrđenih na slici, odabrano je i pregledano kroz 96-bunarčića, 24-bunarčića i 24-dubokih bunarčića na produktivnost, rast i genotipizaciju ciljanim sekvenciranjem DNK.
[0125] Analiza DNK klonova koji ekspresuju anti-PSMA sa BAX i BAK deficitom je sprovedena kao što je opisano u Primeru 8 (podaci nisu prikazani). Najbolji KO183 BAX/BAK dvostruki KO klonovi (KO183 BB KO) odabrani su za dalju procenu rasta i produktivnosti dvomesečnom studijom stabilnosti i radi potvrđivanja nokaut statusa Western blotingom.
[0126] Kao što je prikazano, SLIKA 16, analiza proteina BAX i BAK nokauta u klonovima koji ekspresuju anti-PSMA procenjena je primenom Western Blota. Lizati iz 6 miliona BAX/BAK ćelijskih linija dvostrukog nokautiranja su pripremljeni ponovnim suspendovanjem u 100 ul RIPA pufera (Abcam) sa dodatkom inhibitora proteaze (Sigma tablete; Sigma). Lizati su inkubirani na ledu 1 sat pre nego što su centrifugirani na 12.000 rpm tokom 20 minuta. Koncentracija proteina je određena BCA kitom (Pierce). 20 ug proteina je korišćeno za Western blot. Ekstrakti proteina iz različitih ćelijskih linija ispitani su anti-BAX antitelom (Abcam).
[0127] Na SLICI 16A, prikazan BAX nokaut u klonovima koji ekspresuju anti-PSMA, konstruisanim korišćenjem CRISPR. SLIKA 16B, BAK nokaut u klonovima koji ekspresuju anti-PSMA konstruisanim korišćenjem CRISPR. Od 15 najboljih prikazanih klonova, 5 su bili BAX/BAK dvostruki nokauti. L082 je pozitivna kontrolna ćelijska linija koja eksprimira divlji tip ili BAX pune dužine, protein od 21KD i BAK divljeg tipa, protein od 24KD. BB15 ćelije koje ekspresuju anti-HER2 korišćene su kao kontrola dvostrukog nokauta.
[0128] Analiza apoptoze je dalje sprovedena u klonovima koji ekspresuju anti-PSMA pomoću testa apoptoze vezivanjem Annexin-V. Kao što je prikazano, SLIKA 17, BAX/BAK dvostruki nokaut klonovi, na primer PSMA-192 i PSMA-719, pokazali su vitalnost ćelija od oko 85%, u poređenju sa približno 35-37% uočenim kod pojedinačnih nokaut klonova, na primer PSMA-882, i ne-nokaut klonova na primer PSMA-484.
Primer 14: Proizvodnja rekombinantnog proteina je povećana u klonovima koji ekspresuju anti-PSMA sa nedostatkom BAX/BAK
[0129] Na osnovu analize BAX i BAK klonova koji ekspresuju anti-PSMA metodom Western blotinga i Annexin V analizom, odabran je jedan broj stabilnih klonova za dalju optimizaciju. Tri (3) stabilna klona 192, 719 (oba imaju BAX/BAK nokaut) i 882 (BAK nokaut) su odabrana za optimizaciju procesa da bi se poboljšao titar na osnovu visoke produktivnosti, snažnog rasta i dvomesečne mesečne stabilnosti primećene za svaki klon.
[0130] Proizvodnja antitela je procenjena u fed-batch procesu kao što je prikazano na SLICI 18. U uslovima fed-batch hranjene kulture, BAX/BAK ćelijska linija dvostrukog nokauta (PSMA-BBKO-192) pokazala je trostruko povećanje titra (1400 mg/L u odnosu na 500 mg/L), (SLIKA 18C) desetog dana procesa proizvodnje. Istovremeno, vijabilnost je takođe značajno poboljšana (SLIKA 18B) za više od 90%. Neizmenjana ćelijska linija PSMA-S-164 je korišćena kao kontrola.
[0131] Primer 15: Kvalitet proizvoda BAX/BAK deficitarnih u anti-PSMA ekspresujućim ćelijskim linijama. Kvalitet proizvoda je analiziran intaktnom masenom spektrometrijom (MS) i hromatografijom isključivanja veličine (SEC) korišćenjem uzoraka proizvedenih fed-batch procesom iz kontrolne ćelijske linije koja eksprimira anti-PSMA (PSMA-S-164), i BAX/BAK dvostruke ćelijske linija koja eksprimira anti-PSMA (PSMA-BBKO-192) kao što je prikazano u Tabeli 5. Pomoću MS je primećeno da je primarna aminokiselinska sekvenca konstruisanog klona i roditeljske ćelijske linije ista kao što je zaključeno iz analize cDNK sekvence koja potvrđuje identifikaciju mAb, (podaci nisu prikazani).
Tabela 5: Analiza kvaliteta roizvoda iz anti-PSMA eks resuućih ćeliskih linia
[0132] Kao što je prikazano u tabeli 5, na osnovu procene pomoću MS profili glikoforma bili su uporedivi između nemodifikovanih (PSMA-S-164) i BAX/BAK ćelijske linije sa dvostrukim nokautom (PSMA-BBKO-192) i unutar normalnog opsega distribucije za mAb kod faze selekcije klona. SEC je merio procenat agregata visoke molekulske težine (HMW) i nrCE-SDS je merio procenat degradiranih vrsta niske molekulske težine (LMW). Obe vrste agregata HMW i degradirane vrste LMW bile su niže od 5% i uporedive između anti-PSMA ekspresujućih nekonstruisanih i konstruisanih ćelijskih linija. Ovi profili kvaliteta ukazuju na to da CRISPR-Cas9 inženjering i naknadno kloniranje jedne ćelije nisu negativno uticali na kvalitet proizvoda ćelijskih linija koje ekspresuju anti-PSMA.
Stvaranje BAX/BAK sa nedostatkom anti-CD70 ekspresujućih ćelijskih linija.
[0133] Simultana ablacija BAX i BAK-a korišćenjem CRISRP-Cas9 tehnologije za editovanje je izvedena transfekcijom tri BAX ciljana gRNK konstrukta i dva BAK ciljana gRNK konstrukta u anti-CD70 ekspresujuću ćelijsku populaciju mini-pul (CD70-MV-108). BAX i BAK konstrukti korišćeni u ovom eksperimentu su dizajnirani i pripremljeni kao što je opisano u gornjim Primerima i ilustrovano SLIKAMA 5-7 i Tabelama 1-3. CRISPR plazmidi korišćeni u nokaut eksperimentima koji se odnose na anti-CD70 takođe su dizajnirani kao što je prikazano na SLICI 7 korišćenjem komercijalno dostupnog vektora, Geneart CRISPR Nuclease Vector (pGCNV), (Thermo Fisher Scientific). Oligo dupleks umetnut u pGCNV, sastojao se od pet (5) parova sintetizovanih oligonukleotida od SEQ ID NO: 83 do SEQ ID NO: 92.
[0134] Tri plazmida koji kodiraju tri različite gRNK sekvence a koje ciljaju na BAX mesta i dva plazmida koja kodiraju dve različite gRNK sekvence usmerene na BAK mesta su ko-transfektovana u stabilne ćelijske linije izvedene iz CHO ćelija koje su konstruisane tako da imaju pAF-RS i pAF-tRNK plus anti-PSMA gen ili njegov fragment.72 sata nakon transfekcije, genomska DNK je izolovana i deo BAK lokusa je PCR amplifikovan koristeći oligo SEQ ID NO: 45 i 46 kao što je opisano u Primeru 5. BAX lokus je PCR amplifikovan koristeći oligo SEQ ID NO: 43 i 44 umesto prethodnog. Kao što je prikazano, SLIKA 19, sproveden je Surveyor test da bi se odredila efikasnost nokauta u populacijama ćelija koje ekspresuju anti-CD70 na osnovu CRISPR tehnologije editovanja. Odnos originalne trake pre i posle CRISPR KO kvantifikovan je denzitometrijskom analizom skenirane slike pomoću softvera Image J koji se koristio za merenje efikasnosti nokauta. Efikasnost nokauta za BAX i BAK bila je 51% odnosno 23%, što je rezultiralo izračunatom efikasnošću dvostrukog nokauta od približno 10%. U ovom testu primećena je nespecifična traka. Veruje se da ova traka može biti posledica mini-pula ćelijske populacije.
[0135] Sedam dana kasnije, transfektovani pul ćelija je supkloniran pri gustini zasejavanja od 1 ćelija/bunarčić́ u 40 ploča korišćenjem FACS. Približno 1000 klonova dobijenih od jedne ćelije, utvrđenih na osnovu slike, odabrano je i pregledano kroz 96 bunarčića, 24-bunaričića i 24-duboka bunarčića za produktivnost, rast i genotipizaciju ciljanim sekvenciranjem DNK. Analiza DNK klonova koji ekspresuju anti-CD70 sa nedostatkom BAX i BAK sprovedena je kao što je opisano u Primeru 8 (podaci nisu prikazani). Od broja generisanih klonova koji ekspresuju anti-CD70, BAX/ BAK dvostruki nokaut klonovi su odabrani za dalju procenu rasta i produktivnosti dvomesečnom studijom stabilnosti i za potvrdu nokaut statusa Western blotingom.
[0136] Kao što je prikazano, SLIKA 20, analiza proteina BAX i BAK nokauta u klonovima koji ekspresuju anti-CD70 procenjena je korišćenjem Western Blota. Lizati iz 6 miliona BAX/BAK ćelijskih linija dvostrukog nokautiranja su pripremljeni ponovnim suspendovanjem u 100 ul RIPA pufera (Abcam) sa dodatim inhibitorima proteaze (Sigma tablete; Sigma). Lizati su inkubirani na ledu 1 sat pre nego što su centrifugirani na 12.000 rpm tokom 20 minuta. Koncentracija proteina je određena BCA kitom (Pierce). 20 ug proteina je upotrebljeno za Western blot. Ekstrakti proteina iz različitih ćelijskih linija ispitani su anti-BAX antitelom (Abcam). Na SLICI 20A prikazan je BAX nokaut u klonovima koji ekspresuju anti-CD70, konstruisanim pomoću CRISPR. Kao što je prikazano, SLIKA 20B, BAK nokaut u klonovima koji ekspresuju anti-CD70, projektovanim korišćenjem CRISPR, primećen je kod brojnih klonova. Od 13 najboljih prikazanih klonova, 8 su bili BAX/BAK dvostruki nokauti. Primećeno je da je linija roditeljskih ćelija klona 108 zadržala rezidualnu ekspresiju BAK proteina. L082 je pozitivna kontrolna ćelijska linija koja eksprimira divlji tip ili BAX pune dužine, protein od 21 KD i protein divljeg tipa BAK, traka na 24 KD.
[0137] Analiza apoptoze je dalje sprovedena u klonovima koji ekspresuju anti-CD70 pomoću testa apoptoze Annexin-V vezivanja. Kao što je prikazano, SLIKA 21, BAX/BAK dvostruki nokaut klonovi, na primer CD70-BBKO-563, pokazali su vijabilnost ćelija od oko 60%, u poređenju sa približno 18% uočenim u roditeljskoj ćelijskoj liniji CD70-MV-108.
Istovremeno, apoptotičke ćelije su se smanjile sa 80% na 40% kao što je primećeno iz Q2 i Q4 za svaku ćelijsku liniju.
Primer 17: Proizvodnja rekombinantnog proteina je povećana u BAX/BAK deficitarnim klonovima koji ekspresuju anti-CD70
[0138] Na osnovu analize BAX i BAK klonova koji ekspresuju anti-CD70 metodom Western blotinga i Annexin V analizom, odabran je jedan broj stabilnih klonova za dalju optimizaciju. Kao što je prikazano na Slici 21, devet (9) stabilnih klonova oba sa BAX/BAK nokautom, odabrano je za optimizaciju procesa da bi se poboljšao titar na osnovu visoke produktivnosti, snažnog rasta i dvomesečne stabilnosti primećene za svaki klon.
[0139] Proizvodnja antitela je procenjena u fed-batch procesu kao što je prikazano u SLIKA 22. Pod uslovima fed-batch kulture, anti-CD70 ekspresujuća BAX/BAK ćelijska linija dvostrukog nokauta (CD70-BBKO-563) pokazala je titar od 1000 mg/L u obe posude za mućkanje pod uslovima rada sa bioreaktorom na radnom stolu (SLIKA 22C) četrnaesti dan proizvodnje. Vijabilnost ćelija pod navedenim uslovima, posude za mućkanje i na stonom bioreaktoru (SLIKA 22B) bila je oko 90%. Sve u svemu, proizvodni profil, VCD, održivost i vijabilnost pod uslovima boce za mućkanje i stonog bioreaktora bili su uporedivi i podržavali skalabilnost procesa. Dalja istraživanja su sprovedena u uslovima bioreaktora i procesima na osnovu analiziranog uporedivog profila produktivnosti i rasta (podaci nisu prikazani). Ova studija podržava realizaciju sadašnjeg pronalaska za kontrolu apoptičkih stresora koji utiču na rast ćelija u uslovima rada bioreaktora korišćenjem CRISPR tehnologije za nokautiranje gena koji kontrolišu ili regulišu apoptozu.
[0140] Primer 18: Kvalitet proizvoda anti-CD70 ekspresujućih ćelijskih linija sa nedostatkom BAX/BAK. Kvalitet proizvoda je analiziran intaktnom masenom spektrometrijom (MS) i ekskluzionom hromatografijom (SEC) korišćenjem uzoraka proizvedenih serijskom proizvodnjom iz anti-CD70 ekspresije BAX/BAK ćelijske linije sa dvostrukim nokautiranjem pod uslovima bioreaktora i šejkera kao što je prikazano u Tabeli 6.
Tabela 6: Analiza kvaliteta proizvoda iz ćelijskih linija koje ekspresuju anti-CD70
[0141] Kao što je prikazano u Tabeli 5, profili glikoforma u posudi za mućkanje i bioreaktoru procenjeni pomoću MS bili su uporedivi i bili su unutar normalnog opsega distribucije za mAb u fazi selekcije klona. SEC je merio procenat agregata visoke molekulske težine (HMW) i procenat degradiranih vrsta niske molekulske težine (LMW). Obe vrste HMW agregata i degradirane vrste LMW bile su unutar normalnog opsega u fazi selekcije klonova. Primećeno je da je nešto veći od 5% HMW smanjen na 2-3% nakon prečišćavanja (podaci nisu prikazani). Ovi profili kvaliteta ukazuju na to da CRISPR i naknadno jednoćelijsko kloniranje nije negativno uticalo na kvalitet proizvoda ćelijskih linija koje ekspresuju anti-CD70. Takođe je primećeno da se atributi kvaliteta proizvoda, (agregati, integritet i glikoformi), u uslovima bioreaktora poklapaju sa pandanima u uslovima u posudi za mešanje, što dokazuje da je proces skalabilan.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Metoda za generisanje ćelijske linije koja ima smanjenu apoptozu, za ugrađivanje neprirodne aminokiseline u protein, metoda koja uključuje inaktivaciju jednog ili više ciljnih mesta ili regiona u ćeliji, pri čemu jedno ili više ciljanih mesta ili regiona jeste proapoptotički gen uključen u apoptotički put, pri čemu je pro-apoptotički gen odabran od Bax i Bak, gde ćelija ekspresuje gen od interesa koji sadrži selektorski kodon, i gde ćelija uključuje ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS), i ortogonalni supresor tRNK (O-tRNK).
2. Metoda prema zahtevu 1, koji dalje obuhvata obezbeđivanje molekula nukleinske kiseline sposobnog da inaktivira jedno ili više ciljnih mesta ili regiona u ćeliji, i uvođenje molekula nukleinske kiseline u ćeliju, pri čemu molekul nukleinske kiseline inaktivira jedno ili više ciljnih mesta ili regiona, opciono pri čemu je molekul nukleinske kiseline izabran od SEQ ID NO: 1-6.
3. Metoda prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačena time što:
a) ćelijska linija je
(i) eukariotska ćelijska linija; i/ili
(ii) izabrana od privremene ćelijske linije, populacije stabilne ćelijske linije ili stabilne klonalne ćelijske linije, opciono pri čemu je populacija stabilne ćelijske linije platforma ili proizvodna ćelijska linija; ili
b) ćelijska linija se odbira između COS, CHO, VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, ili HEK293.
4. Metoda prema bilo kom od zahteva 1-3, naznačena time što:
a) neprirodna aminokiselina se odbira između para-acetilfenilalanina, pnitrofenilalanina, p-sulfotirozina, p-karboksifenilalanina, o-nitrofenilalanina, mnitrofenilalanina, p-boronilfenilalanina, o-boronilfenilalanina, m-boronilfenilalanina, p-aminofenilalanina, o-aminofenilalanina, m-aminofenilalanina, p-acilfenilalanina, o-acilfenilalanina, m-acilfenilalanina, p-OMe fenilalanina, o-OMe fenilalanina, m-OMe fenilalanina, p-sulfofenilalanina, o-sulfofenilalanina, m-sulfofenilalanina, 5-nitro His, 3-nitro Tyr, 2-nitro Tyr, nitro supstituisanog Leu, nitro supstituisanog His, nitro supstituisanog De, nitro supstituisanog Trp, 2-nitro Trp, 4-nitro Trp, 5-nitro Trp, 6-nitro Trp, 7-nitro Trp, 3-aminotirozina, 2-aminotirozina, O-sulfotirozina, 2-sulfooksifenilalanina, 3-sulfooksifenilalanina, o-karboksifenilalanina, mkarboksifenilalanina, p-acetil-L-fenilalanina, p-propargil-fenilalanina, O-metil-L-tirozina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O-4-alil-L-tirozina, 4-propil-L-tirozina, tri-O-acetil-GlcNAcb-serina, L-Dopa, fluorisanog fenilalanina, izopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirozina, p-jodfenilalanina, pbromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, izopropil-L-fenilalanina i ppropargiloksi-L-fenilalanina; i/ili
b) neprirodna aminokiselina je inkorporirana za posebno željeno mesto u pomenuti protein.
5. Metoda prema bilo kom od zahteva 1-4, gde je gen od interesa bioterapeutski gen ili proizvod, opciono pri čemu je bioterapeutski gen ili je proizvod vakcina.
6. Metoda prema bilo kom od zahteva 1-5, naznačena time što gen od interesa kodira:
a) antitelo, scFv, scFv fuzioni protein, Fc fuzioni protein, Faktor VII, Faktor VIII, ili Faktor IV;
b) citokin, interleukin, interferon, hemokin, faktor rasta, hormon, ili receptor, analog, bispecifik ili njegov fragment; ili
c) HER2, CD-70, PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, IL-2, IL-3, IL-10, IL-15, GPC3, DLL3, ROR1, leptin, FGF-21, FGF-23, HGH, FcR, insulin, TNFR1, TRAIL, EPO, ili neki analog, bispecifik ili njegov fragment.
7. Metoda prema bilo kom od zahteva 1-6, naznačena time što:
a) jedan ili više ciljnih mesta ili regiona je potpuno ili delimično deaktivirano; b) jedan ili više ciljnih mesta ili regiona su isti ili različiti;
c) selektor kodon je besmisleni kodon, retki kodon, četvorobazni kodon; i/ili d) selektor kodon je oker kodon, opal kodon ili amber kodon.
8. Metoda prema bilo kom od zahteva 1-7, za optimizaciju prinosa proteina koji sadrži neprirodne aminokiseline u ćelijskoj liniji, opciono pri čemu je prinos proteina koji sadrži neprirodne aminokiseline najmanje 0,5 puta ili veći nego u odsustvu inaktivacije jednog ili više ciljnih mesta ili regiona.
9. Metoda za snižavanje ili smanjenje apoptoze u ćeliji, pri čemu ćelija eksprimira gen od interesa koji sadrži selektor kodon, i gde ćelija sadrži ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) i ortogonalni supresor tRNK (O-tRNK), metoda koja obuhvata inaktivaciju jednog ili više pro-apoptotičkih ciljnih mesta ili regiona u ćeliji, pri čemu se jedno ili više pro-apoptotičkih ciljnih mesta ili regiona odbira između Bax i Bak.
10. Metoda za generisanje ćelije ili ćelijske linije koja ima smanjenu apoptozu, za inkorporaciju neprirodne aminokiseline u protein, metoda koja uključuje: obezbeđivanje ćelije ili ćelijske linije koja eksprimira gen od interesa koji sadrži selektor kodon, i koji sadrži ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) i ortogonalni supresor tRNK (O-tRNK); uvođenje u ćelijsku liniju molekula nukleinske kiseline sposobnog da inaktivira jedno ili više ciljnih mesta ili regiona u ćeliji ili ćelijskoj liniji, pri čemu je jedno ili više ciljnih mesta ili regiona pro-apoptotički gen uključen u apoptotički put, pri čemu je proapoptotički gen odabran od Bax i Bak; opciono pri čemu se molekul nukleinske kiseline bira između SEQ ID NO: 1-6, i dalje opciono obezbeđuje neprirodnu aminokiselinu ćeliji ili ćelijskoj liniji.
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-10, koji uključuje inaktivaciju oba, Bax i Bak, i, pri čemu gen od interesa kodira antitelo.
12. Ćelija ili ćelijska linija koja ima smanjenu apoptozu za ugrađivanje neprirodne amino kiseline u protein, pri čemu ćelija eksprimira gen od interesa koji sadrži selektor kodon, pri čemu ćelija uključuje ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS), tj. ortogonalni supresor tRNK (O-tRNK); i pri čemu ćelija uključuje jedno ili više inaktiviranih ciljnih mesta ili regiona, pri čemu je jedno ili više inaktiviranih ciljnih mesta ili regiona pro-apoptotički gen uključen u apoptotički put, pri čemu je pro-apoptotički gen odabran od Bax i Bak.
13. Ćelija ili ćelijska linija prema zahtevu 12, koja sadrži molekul nukleinske kiseline sposoban da inaktivira jedno ili više ciljnih mesta ili regiona u ćeliji, opciono pri čemu je molekul nukleinske kiseline izabran od SEQ ID NO: 1- 6.
14. Ćelija ili ćelijska linija prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, naznačena time što:
a) ćelija ili ćelijska linija je:
(i) eukariotska ćelijska linija; i/ili
(ii) izabrana od privremene ćelijske linije, populacije stabilne ćelijske linije ili stabilne klonalne ćelijske linije, opciono pri čemu je populacija stabilne ćelijske linije platforma ili proizvodna ćelijska linija; ili
b) ćelija ili ćelijska linija se odbira od COS, CHO, VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, ili HEK293; i/ili
c) selektor kodon je:
(i) besmisleni kodon, retki kodon, četvorobazni kodon; ili
(ii) oker kodon, opal kodon ili amber kodon.
15. Ćelija ili ćelijska linija prema bilo kom od zahteva 12-14, gde je gen od interesa bioterapeutski gen ili proizvod, opciono pri čemu je bioterapeutski gen ili je proizvod vakcina.
16. Ćelija ili ćelijska linija prema bilo kom od zahteva 12-15, pri čemu gen od interesa kodira:
a) antitelo, scFv, scFv fuzioni protein, Fc fuzioni protein, Faktor VII, Faktor VIII, ili Faktor IV;
b) citokin, interleukin, interferon, hemokin, faktor rasta, hormon, ili receptor, analog, bispecifik ili njegov fragment; ili
c) HER2, CD-70, PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, IL-2, IL-3, IL-10, IL-15, GPC3, DLL3, ROR1, leptin, FGF-21, FGF-23, HGH, FcR, insulin, TNFR1, TRAIL, EPO, ili analog, bispecifik ili njegov fragment.
17. Ćelija ili ćelijska linija prema bilo kom od zahteva 12-16, gde su oba Bax i Bak inaktivirani, i gde gen od interesa kodira antitelo.
RS20240405A 2017-06-02 2018-06-02 Metode i kompozicije za unapređenje proizvodnje proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline RS65370B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762514754P 2017-06-02 2017-06-02
EP18734359.5A EP3630977B1 (en) 2017-06-02 2018-06-02 Methods and compositions for promoting non-natural amino acid-containing protein production
PCT/US2018/035764 WO2018223108A1 (en) 2017-06-02 2018-06-02 Methods and compositions for promoting non-natural amino acid-containing protein production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65370B1 true RS65370B1 (sr) 2024-04-30

Family

ID=62749186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240405A RS65370B1 (sr) 2017-06-02 2018-06-02 Metode i kompozicije za unapređenje proizvodnje proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline

Country Status (23)

Country Link
US (2) US11851662B2 (sr)
EP (2) EP4382124A3 (sr)
JP (3) JP7245786B2 (sr)
KR (3) KR102662379B1 (sr)
CN (2) CN117286182A (sr)
AU (1) AU2018275152B2 (sr)
BR (1) BR112019025476A2 (sr)
CA (1) CA3065137A1 (sr)
DK (1) DK3630977T5 (sr)
ES (1) ES2978044T3 (sr)
FI (1) FI3630977T3 (sr)
HR (1) HRP20240344T1 (sr)
HU (1) HUE067136T2 (sr)
IL (1) IL270906A (sr)
LT (1) LT3630977T (sr)
MX (2) MX2019014286A (sr)
MY (1) MY202215A (sr)
PL (1) PL3630977T3 (sr)
PT (1) PT3630977T (sr)
RS (1) RS65370B1 (sr)
SI (1) SI3630977T1 (sr)
SM (1) SMT202400125T1 (sr)
WO (1) WO2018223108A1 (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3630977T3 (pl) 2017-06-02 2024-06-24 Ambrx, Inc. Sposoby i kompozycje promujące produkcję białek zawierających nienaturalne aminokwasy
MX2020010104A (es) 2018-03-29 2020-11-06 Ambrx Inc Conjugados de farmaco-anticuerpo anti-antigeno de membrana especifico de prostata (psma) humanizado.
CA3111576A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
KR102910209B1 (ko) 2018-12-21 2026-01-09 제넨테크, 인크. 세포사멸에 내성인 세포주를 사용한 폴리펩티드 생산 방법
CN111117944B (zh) * 2019-11-22 2022-05-24 中农威特生物科技股份有限公司 一种用于规模化悬浮培养的抗凋亡mdck宿主细胞株及其建立方法
CA3184747A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
CN112375774A (zh) * 2020-10-26 2021-02-19 浙江新码生物医药有限公司 一种重组蛋白表达用工程菌株的构建方法
CN112575005A (zh) * 2021-01-04 2021-03-30 昆明理工大学 一种提高烟草重金属镉胁迫抗性和降低镉富集的方法
TW202342106A (zh) 2022-02-09 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 環境應答性遮蔽抗體及其利用
EP4511388A1 (en) * 2022-04-19 2025-02-26 F. Hoffmann-La Roche AG Improved production cells
JP2026504093A (ja) 2023-01-16 2026-02-03 アンブレツクス・インコーポレイテツド 抗ｃｄ７０抗体薬物コンジュゲート
WO2024241086A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 Ambrx, Inc. Pegylated bovine interferon lambda and methods of use thereof
AU2024329469A1 (en) 2023-08-22 2026-04-09 Ambrx, Inc. Anti-psma adc conjugate compositions and methods of use thereof
WO2025147710A1 (en) * 2024-01-05 2025-07-10 Northwestern University Orthogonal translation systems and methods for identifying components thereof
WO2026058210A1 (en) * 2024-09-12 2026-03-19 Janssen Biotech, Inc. Model system and biomarkers to prevent lactate runaway
CN121652263A (zh) * 2026-02-06 2026-03-13 中国医学科学院北京协和医院 非天然氨基酸修饰的蛋白质及相关生物材料、制备方法和应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002085923A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of unnatural amino acids
CA2508939A1 (en) 2002-12-22 2004-07-15 The Scripps Research Institute Protein arrays
CN101160525A (zh) * 2003-06-18 2008-04-09 斯克利普斯研究院 非天然活性氨基酸遗传密码增加
EP2410331B1 (en) 2003-06-18 2015-09-23 The Scripps Research Institute Aminoacyl-tRNA synthetase for aminoacylation tRNA with unnatural amino acids
EP1836298B1 (en) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
DK2339014T3 (en) * 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
WO2007070659A2 (en) 2005-12-14 2007-06-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
JP5399906B2 (ja) 2006-09-08 2014-01-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞用のハイブリッドサプレッサーｔｒｎａ
EP2064333B1 (en) 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
JP2010502221A (ja) 2006-09-08 2010-01-28 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞による非天然アミノ酸の部位特異的組み込み
WO2008073184A2 (en) * 2006-10-18 2008-06-19 The Scripps Research Institute Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells
US8183037B2 (en) * 2007-04-13 2012-05-22 The Salk Institute For Biological Studies Methods of genetically encoding unnatural amino acids in eukaryotic cells using orthogonal tRNA/synthetase pairs
TW200914043A (en) 2007-04-30 2009-04-01 Mj Biolog Inc PRRSV GP5 based compositions and methods
GB0721291D0 (en) * 2007-10-30 2007-12-12 Medical Res Council Methods and compositions
WO2009151591A2 (en) * 2008-06-10 2009-12-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for generation of bax- and bak-deficient cell lines
US20120077224A1 (en) * 2009-06-05 2012-03-29 The Salk Institute For Biological Studies unnatural amino acid incorporation in eukaryotic cells
HK1205686A1 (en) 2012-02-29 2015-12-24 Ambrx, Inc. Novel prodrug containing molecule compostions and their uses
CN108727466B (zh) 2012-06-07 2023-04-28 Ambrx公司 前列腺特异性膜抗原抗体药物结合物
CN104619350A (zh) 2012-06-14 2015-05-13 Ambrx公司 结合到核受体配体多肽的抗psma抗体
KR102190832B1 (ko) 2012-06-19 2020-12-15 암브룩스, 인코포레이티드 항cd70 항체 약물 컨쥬게이트
GB201419109D0 (en) * 2014-10-27 2014-12-10 Medical Res Council Incorporation of unnatural amino acids into proteins
PL3630977T3 (pl) * 2017-06-02 2024-06-24 Ambrx, Inc. Sposoby i kompozycje promujące produkcję białek zawierających nienaturalne aminokwasy

Also Published As

Publication number Publication date
NZ760107A (en) 2024-03-22
SMT202400125T1 (it) 2024-05-14
AU2018275152A1 (en) 2020-01-16
KR102705871B1 (ko) 2024-09-11
SI3630977T1 (sl) 2024-05-31
KR20240063184A (ko) 2024-05-09
MY202215A (en) 2024-04-17
MX2019014286A (es) 2020-01-27
CA3065137A1 (en) 2018-12-06
EP3630977B1 (en) 2024-02-21
AU2018275152B2 (en) 2025-01-23
MX2023004927A (es) 2023-05-17
KR20200011979A (ko) 2020-02-04
KR102662379B1 (ko) 2024-04-29
PT3630977T (pt) 2024-04-24
EP4382124A2 (en) 2024-06-12
US20210017527A1 (en) 2021-01-21
FI3630977T3 (fi) 2024-04-24
CN117286182A (zh) 2023-12-26
JP2020522247A (ja) 2020-07-30
HRP20240344T1 (hr) 2024-05-24
CN110959041B (zh) 2023-09-29
JP2025061014A (ja) 2025-04-10
ES2978044T3 (es) 2024-09-04
LT3630977T (lt) 2024-04-25
US12577575B2 (en) 2026-03-17
WO2018223108A1 (en) 2018-12-06
EP3630977A1 (en) 2020-04-08
US11851662B2 (en) 2023-12-26
US20240167044A1 (en) 2024-05-23
IL270906A (en) 2020-01-30
DK3630977T5 (da) 2024-09-02
CN110959041A (zh) 2020-04-03
PL3630977T3 (pl) 2024-06-24
JP7245786B2 (ja) 2023-03-24
JP7617162B2 (ja) 2025-01-17
DK3630977T3 (da) 2024-04-15
HUE067136T2 (hu) 2024-10-28
BR112019025476A2 (pt) 2020-06-23
JP2023075254A (ja) 2023-05-30
EP4382124A3 (en) 2024-10-16
KR20240140174A (ko) 2024-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12577575B2 (en) Methods and compositions for promoting non-natural amino acid-containing protein production
JP5932117B2 (ja) 脊椎動物細胞内におけるサプレッサーｔｒｎａの転写
AU2010212273B2 (en) Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells
ES2457527T3 (es) ARNt Supresor hibrido en células de vertebrados
JP2010502221A (ja) 脊椎動物細胞による非天然アミノ酸の部位特異的組み込み
EP3212799A1 (en) Incorporation of unnatural amino acids into proteins
JP2021522785A (ja) 抗体発現を最適化するための方法
CN120310832A (zh) 一种非天然氨基酸的表达系统和方法
HK40112802A (en) Methods and compositions for promoting non-natural amino acid-containing protein production
HK40105193A (zh) 促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物
HK40025639A (en) Methods and compositions for promoting non-natural amino acid-containing protein production
HK40025639B (en) Methods and compositions for promoting non-natural amino acid-containing protein production
BR122024018546A2 (pt) Métodos de geração de uma célula ou linhagem celular para incorporar um aminoácido não natural em uma proteína e de diminuição ou redução de apoptose em uma célula, proteína isolada, célula isolada ou linhagem celular e vacina produzida pelos ditos métodos