RS65472B1 - Postupak proizvodnje rekombinantnih proteina - Google Patents

Postupak proizvodnje rekombinantnih proteina

Info

Publication number
RS65472B1
RS65472B1 RS20240475A RSP20240475A RS65472B1 RS 65472 B1 RS65472 B1 RS 65472B1 RS 20240475 A RS20240475 A RS 20240475A RS P20240475 A RSP20240475 A RS P20240475A RS 65472 B1 RS65472 B1 RS 65472B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
culture
medium
enriched
cells
Prior art date
Application number
RS20240475A
Other languages
English (en)
Inventor
Jianlin Xu
Andrew Yongky
Jun Tian
Michael C Borys
Zhengjian Li
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=67470657&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65472(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS65472B1 publication Critical patent/RS65472B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na postupke povećanja gustine vijabilnih ćelija tokom N-1 faze kulture sa neperfuzionom strategijom za inokulaciju N proizvodnih bioreaktora pri velikoj gustini semena za proizvodnju ćelijske kulture.
Stanje tehnike
[0002] Proteini i polipeptidi postaju sve važniji kao terapijska sredstva. U većini slučajeva, terapijski proteini i polipeptidi se proizvode u ćelijskoj kulturi, iz ćelija koje su planirane i/ili odabrane da proizvode neobično visoke nivoe polipeptida od interesa. Kontrola i optimizacija uslova ćelijske kulture su od ključne važnosti za uspešnu komercijalnu proizvodnju proteina i polipeptida.
[0003] Mnogi proteini i polipeptidi proizvedeni u ćelijskoj kulturi se prave u dolivnom (eng. fedbatch) procesu, u kome se ćelije kultivišu tokom određenog vremenskog perioda, i zatim se kultura prekida i proizvedeni protein ili polipeptid se izoluje. Lu i sar. (Biotechnol. Bioeng., 110:191-205 (2013)) opisuju automatizovani dinamički dolivni proces i optimizaciju medijuma visoke produktivnosti za razvoj procesa kulture ćelija.
[0004] Na konačnu količinu i kvalitet proizvedenog proteina ili polipeptida može značajno uticati kultura semena N-1 i gustina semena pri N proizvodnji. Strategiju N-1 šarže semena visoke gustine za proizvodnju CHO ćelijske kulture opisali su Yongky i sar. (ACS National Meeting & Exposition 288: BIOT 487 (2018)). Iako su uloženi napori da se poboljša proizvodnja proteina i polipeptida u dolivnim procesima kulture, ostaje potreba za dodatnim poboljšanjima.
[0005] Perfuziona ćelijska kultura može postići mnogo veću gustinu vijabilnih ćelija nego konvencionalni dolivni sistemi ćelijske kulture. Perfuziona ćelijska kultura obezbeđuje kontinuirano snabdevanje svežim medijumima u sistemu kulture, uz uklanjanje otpadnih produkata, što obezbeđuje bogatu sredinu za rast ćelija. Xu i sar. (Biotechnol. Prog., 33:867-878 (2017)) uporedili su produktivnost bioreaktora iz različitih operativnih režima, uključujući dolivne i perfuzione procese. Pohlscheidt i sar. (Biotechnol. Prog., 29:222-229 (2013)) opisuju opsežnu strategiju perfuzije za bioreaktore N-1 semena. U poređenju sa konvencionalnom dolivnom proizvodnjom kulture sa malom gustinom semena, dolivna proizvodnja kulture sa većom gustine semena inokulisana sa N-1 perfuzionim semenom može postići veći konačni titar u kratkom vremenskom periodu. Međutim, perfuziona ćelijska kultura postaje skupa kada se koristi u sistemima kulture velikog obima (npr. bioreaktor veći od 200 L) zbog velikih količina potrošenih medijuma za ćelijsku kulturu. Takođe, perfuziona ćelijska kultura može imati komplikacije zbog sistema za zadržavanje ćelija, što sprečava uklanjanje ćelija iz sistema ćelijske kulture, posebno za proizvodnju velikog obima.
[0006] Postoji posebna potreba za razvojem poboljšanih sistema za proizvodnju proteina i polipeptida pomoću ćelijske kulture velikog obima sa velikom gustinom semena sa neperfuzionim sistemima.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0007] Predmetni pronalazak je usmeren na postupak za proizvodnju velikog obima rekombinantnog polipeptida od interesa, koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimuju rekombinantni polipeptid od interesa u N-1 fazi neperfuzionog sistema kulture, pri čemu se ćelije domaćina kultivišu u obogaćenom medijumu da bi se dobila gustina vijabilnih ćelija N-1 faze od najmanje 5 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL; i inokulaciju sistema kulture za N proizvodnju sa većom gustinom semena od najmanje 1.5 × 10<6>ćelija po mL sa ćelijama domaćina iz faze N-1 neperfuzionog sistema kulture, pri čemu obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika u odnosu na neobogaćeni medijum i/ili povećanu količinu hranljivih materija koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina u odnosu na neobogaćeni medijum. U nekim tehničkim rešenjima, N-1 faza neprfuzionog sistema kulture je šaržna kultura i ćelija domaćin je kultivisana u obogaćenom medijumu. U drugim tehničkim rešenjima, N-1 faza neperfuzionog sistema kulture je dolivna kultura i ćelija domaćina se kultiviše u medijumu za seme uz dodatak hranljivog medijuma. U nekim tehničkim rešenjima, gustina vijabilnih ćelija u N-1 fazi je najmanje 10 × 10<6>, najmanje 15 × 10<6>, najmanje 20 × 10<6>, najmanje 25 × 10<6>, ili najmanje 30 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL. U nekim tehničkim rešenjima, vijabilnost ćelija je najmanje 80% poslednjeg dana N-1 faze, najmanje 85% poslednjeg dana N-1 faze, ili najmanje 90% poslednjeg dana N-1 faze.
[0008] U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, medijum je obogaćen hranljivim medijumom najmanje 5% u odnosu na neobogaćeni medijum, najmanje 10% u odnosu na neobogaćeni medijum, najmanje 15% u odnosu na neobogaćeni medijum, ili najmanje 20% u odnosu na neobogaćeni medijum. U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum ili hranljivi medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika. U nekim tehničkim rešenjima, izvor ugljenika je glukoza. U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum ili hranljivi medijum sadrži povećanu količinu hranljivih materija. U nekim tehničkim rešenjima, hranljive materije su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina. U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika ili hranljivih materija. U nekim tehničkim rešenjima, izvor ugljenika je glukoza i hranljive materije koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina.
[0009] U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, ćelija domaćin je ćelija sisara. U nekim tehničkim rešenjima, ćelija sisara je izabrana iz grupe koja se sastoji od CHO, VERO, BHK, HEK, HeLa, COS, MDCK i hibridoma ćelija. U nekim tehničkim rešenjima, ćelija domaćin je CHO ćelija.
[0010] U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, polipeptid od interesa je terapijski polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid od interesa je antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen izabran je iz grupe koju čine PD-1, PD-L1, LAG-3, TIGIT, GITR, CXCR4, CD73 HER2, VEGF, CD20, CD40, CD11a, tkivni faktor (TF), PSCA, IL-8, EGFR, HER3, i HER4.
[0011] U nekim tehničkim rešenjima pronalska, bioreaktor je najmanje 50 L, najmanje 500 L, najmanje 1,000 L, najmanje 5,000 L, ili najmanje 10,000 L.
[0012] U nekim tehničkim rešenjima, N proizvodni sistem kulture je dolivni bioreaktor.
[0013] U nekim tehničkim rešenjima pronalska, titar polipeptida od interesa je najmanje 100 mg/L, najmanje 1 g/L, najmanje 3 g/L, najmanje 5 g/L ili najmanje 10 g/L.
[0014] U nekim tehničkim rešenjima pronalska, ćelije domaćina su kultivisane u bazalnom medijumu ili obogaćenom bazalnom medijumu da se dobije gustina vijabilnih ćelija u N fazi proizvodnje od najmanje 1.5 × 10<6>, najmanje 5 × 10<6>, ili najmanje 10 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL.
[0015] U nekim tehničkim rešenjima pronalska, obogaćeni bazalni medijum je obogaćen hranljivi medijum najmanje 5%, majmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20% u odnosu na neobogaćeni medijum. U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika. U nekim tehničkim rešenjima, izvor ugljenika je glukoza. U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu hranljivih materija. U nekim tehničkim rešenjima, hranljive materije su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina. U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika i hranljivih materija. U nekim tehničkim rešenjima, izvor ugljenika je glukoza i hranljive materije koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina.
[0016] U nekim tehničkim rešenjima pronalska, postupak dalje obuhvata korak izolovanja polipeptida od interesa iz N proizvodnog sistema kulture. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid od interesa je terapijski polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid od interesa je antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen.
KRATAK OPIS SLIKA
[0017]
Slike 1A i 1B. Slike 1A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija ("VCD") N-1 ćelijske kulture koja je uzgajana u sledećim sistemima ćelijske kulture za CHO ćelijsku linuju A: perfuzionom, dolivnom, šaržnom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnom sistemu ćelijske kulture sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 1B prikazuje vijabilnost ćelija (%) N-1 ćelijske kulture koja je uzgajana u sledećim sistemima ćelijske kulture za ćelijsku liniju A: perfuzionom, dolivnom, šaržnom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnom sistemu ćelijske kulture sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 2A-2C. Slika 2A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodne kulture za polipeptid-1 pomoću ćelijske linije A primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog, dolivnog, šaržnog, šaržnog sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnog sistema ćelijske kulture sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 2B prikazuje titar polipeptida od interesa koji je uzgajan u proizvodnoj kulturi primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog, dolivnog, šaržnog, šaržnog sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 2C prikazuje snimljeno kapilarno izoelektrično fokusiranje ("iCIEF"), hromatografiju sa isključenjem veličine ("SEC"), i analizu Nglikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u proizvodnoj kulturi za polipeptid-1 pomoću CHO ćelijske linije A primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuz perfuzionog, dolivnog, šaržnog, šaržnog sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 3A i 3B. Slika 3A prikazuje VCD N-1 ćelijske kulture koja je uzgajana u sledećim sistemima ćelijske kulture za CHO ćelijsku liniju B: perfuzionom, dolivnom, šaržnom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnom sistemu ćelijske kulture sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 3B prikazuje vijabilnost ćelija (%) N-1 ćelijske kulture koja je uzgajana u sledećim sistemima ćelijske kulture za CHO ćelijsku liniju B: perfuzionom, dolivnom, šaržnom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnom sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 4A-4C. Slika 4A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodne kulture za polipeptid-2 pomoću CHO ćelijske linije B primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog, dolivnog, šaržnog, šaržnog sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 4B prikazuje titar polipeptida od interesa koji je uzgajan u N proizvodnoj kulturi za polipeptid-2 primenom CHO ćelijske linije B primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog, dolivnog, šaržnog, šaržnog sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 4C prikazuje iCIEF, SEC, i analizu N-glikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u N proizvodnoj kulturi za polipeptid-2 pomoću CHO ćelijske linije B primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog, dolivnog, šaržnog, šaržnog sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 5A i 5B. Slika 5A prikazuje VCD N-1 ćelijske kulture koja je uzgajana u sledećim sistemima ćelijske kulture za CHO ćelijsku liniju C: perfuzionom, dolivnom, šaržnom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnom sistemu ćelijske kulture sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 5B prikazuje vijabilnost ćelija (%) N-1 ćelijskih kultura koje su uzgajane u sledećim sistemima ćelijske kulture: perfuzionom, dolivnom, šaržnom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, i šaržnom sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 6A-6C. Slika 6A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodne kulture za polipeptid-3 primenom CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: dolivnog i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 6B prikazuje titar polipeptida od interesa koji je uzgajan u proizvodnoj kulturi za polipeptid-3 primenom CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: dolivnog i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 6C prikazuje iCIEF, SEC, i analizu N-glikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u N proizvodnoj kulturi za polipeptid-3 primenom CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: dolivnog i šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 7A-7C. Slika 7A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodne kulture za polipeptid-3 pomoću CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sedećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog i dolivnog. Slika 7B prikazuje titar polipeptida od interesa koji je uzgajan u proizvodnoj kulturi za polipeptid-3 pomoću CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog i dolivnog. Slika 7C prikazuje iCIEF, SEC, i analizu N-glikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u N proizvodnoj kulturi za polipeptid-3 primenom CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: perfuzionog i dolivnog.
Slike 8A-8C. Slika 8A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodnih kultura na skali od 1000 L (n=3) i satelita od 5 L (n=2) za polipeptid-1 pomoću CHO ćelijske linije A primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 8B prikazuje titar polipeptida od interesa koji se uzgaja u proizvodnim kulturama na skali od 1000 L (n=3) i satelitima 5 L (n=2) za polipeptid-1 pomoću CHO ćelijske linije A primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 8C prikazuje iCIEF, SEC, i analizu N-glikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u N proizvodnim kulturama na skali od 1000 L (n=3) i satelitima 5 L (n=2) za polipeptid-1 pomoću CHO ćelijske linije A primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 9A-9C. Slika 9A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodnih kultura na skali od 500 L (n=1) i satelita od 5 L (n=2) za polipeptid-2 pomoću CHO ćelijske linije B primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 9B prikazuje titar polipeptida od interesa koji se uzgaja u proizvodnim kulturama na skali od 500 L (n=1) i satelitima od 5 L (n=2) za polipeptid-2 pomoću CHO ćelijske linije B primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Slika 9C prikazuje iCIEF, SEC, i analizu N-glikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u N proizvodnim kulturama na skali od 500 L (n=1) i satelitima 5 L (n=2) za polipeptid-2 pomoću CHO ćelijske linije B primenom semenske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: šaržnog sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama.
Slike 10A-10C. Slika 10A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija N proizvodnih kultura na skali od 500 L (n=1) i satelita od 5 L (n=2) za polipeptid-3 pomoću CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećeg sistema N-1 ćelijske kulture: dolivnog. Slika 10B prikazuje titar polipeptida od interesa koji je uzgajan u proizvodnim kulturama na skali od 500 L (n=1) i satelitima od 5 L (n=2) za polipeptid-3 pomoću CHO ćelijske linije C primenom semenske kulture iz sledećeg sistema N-1 ćelijske kulture: dolivnog. Slika 10C prikazuje iCIEF, SEC, i analizu N-glikana za polipeptid od interesa koji je uzgajan u N proizvodnim kulturama na skali od 500 L (n=1) i satelitima 5 L (n=2) za polipeptid-3 pomoću CHO ćelijske linije C primenom ćelijske kulture iz sledećih sistema N-1 ćelijske kulture: dolivnih.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0018] Predmetni pronalazak je usmeren na postupak proizvodnje velikog obima rekombinantnog polipeptida od interesa, koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimuju rekombinantni polipeptid od interesa u fazi N-1 neperfuzionog sistema kulture, pri čemu se ćelije domaćina kultivišu u obogaćenom medijumu da bi se dobila gustina vijabilnih ćelija N-1 faze od najmanje 5 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL; i inokulaciju sistema N proizvodne kulture velike gustine semena od najmanje 1.5 × 10<6>ćelija po mL sa ćelijama domaćinom iz faze N-1 neperfuzionog sistema kulture, pri čemu obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika u odnosu na neobogaćeni medijum i/ili povećanu količinu hranljivih materija koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina u odnosu na neobogaćemi medijum.
Definicije
[0019] Neodređene članove "a" ili "an" treba razumeti da se odnose na "jednu ili više" od navedenih ili nabrojanih komponenti.
[0020] Termin "oko" kako se ovde koristi za vrednost ili kompoziciju koja je unutar prihvatljivog opsega greške za određenu vrednost ili kompoziciju koju odredi stručnjak iz date oblasti tehnike, što će delimično zavisiti od toga kako se vrednost ili kompozicija meri ili kako je utvrđena, tj. ograničenja mernog sistema. Na primer, "oko" može značiti unutar 1 ili više od 1 standardne devijacije prema praksi u stanju tehnike. Alternativno, "oko" može značiti u opsegu do 20%. Osim toga, posebno u pogledu bioloških sistema ili procesa, termini mogu značiti do reda veličine ili do petostruke vrednosti. Kada su određene vrednosti ili kompozicije dati u prijavi i zahtevima, osim ako nije drugačije navedeno, treba pretpostaviti da je značenje "oko" unutar prihvatljivog opsega greške za tu određenu vrednost ili kompoziciju.
[0021] Termin "i/ili" koji se ovde koristi treba uzeti kao specifično obelodanjivanje svake od dve specifičnne karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Dakle, termin "i/ili" kako se koristi u izrazu kao što je "A i/ili B" ovde treba da uključi "A i B," "A ili B," "A" (sam), i "B" (sam). Slično, termin "i/ili" kako se koristi u izrazu kao što je "A, B, i/ili C" treba da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B, i C; A, B, ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam); i C (sam). Primena alternative (npr. "ili") treba razumeti kao jednu, obe ili bilo koju kombinaciju alternativa.
[0022] Kako se ovde koristi termin "aminokiselina," u svom najširem smislu, odnosi se na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja se može ugraditi u polipeptidni lanac. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina ima opštu strukturu H2N--C(H)(R)--COOH. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina je prirodna aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina je sintetička aminokiselina; u nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina je D-aminokiselina; u nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina je L-aminokiselina. Aminokiseline, uključujući karboksi- i/ili amino-terminalne aminokiseline u peptidima, mogu se modifikovati metilacijom, amidacijom, acetilacijom, zaštitnim grupama i/ili supstitucijom sa drugim hemijskim grupama koje mogu promeniti cirkulišući poluživot peptida bez negativnog uticaja na njihovu aktivnost.
Aminokiseline mogu učestvovati u disulfidnoj vezi. Aminokiseline mogu sadržati jednu ili posttranslacionu modifikaciju, kao što je povezivanje sa jednim ili više hemijskih entiteta (npr. metil grupa, acetatnih grupa, acetilnih grupa, fosfatnih grupa, formil delova, izoprenoidnih grupa, sulfatnih grupa, polietilen glikolnih delova, lipidnih delova, delova ugljenih hidrata, delova biotina, itd. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiseline predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđene u ili da se koriste za dopunu medijuma za ćelijske kulture. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiseline koje se nalaze u medijumu za ćelijsku kulturu ili se koriste za dopunu medijuma za ćelijsku kulturu mogu biti obezbeđene kao soli ili u obliku hidrata.
[0023] Termin "antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično vezuje cilj, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid ili kombinacije prethodnog, preko najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena unutar varijabilni region molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, termin obuhvata intaktna poliklonalna antitela, intaktna monoklonalna antitela, fragmente antitela (kao što su fragmenti Fab, Fab', F(ab')2, i Fv), jednolančana Fv (scFv) antitela, multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela generisana iz najmanje dva intaktna antitela, monospecifična antitela, monovalentna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji sadrže deo antitela za određivanje antigena, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena sve dok antitela pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koja od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, ili njihove podklase (izotipovi) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfigurcije. Antitela mogu biti gola ili konjugovana sa drugim molekulima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, toksine i radioizotope.
[0024] Termin " deo koji se vezuje za antigen" antitela, ili "fragment koji se vezuje za antigen", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Pokazalo se da se funkcija antitela za vezivanje antitela može izvršiti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom "fragment koji se vezuje za antigen", npr. (i) Fab fragment (fragment od cepanja papaina) ili sličan monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, LC i CH1 domena; (ii) F(ab')2 fragment (fragment od cepanja pepsina) ili sličan bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta koja su povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Vard i sar., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena ; (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i (vii) kombinacija dva ili više izolovanih CDR-a koji se opciono mogu spojiti pomoću sintetičkog linkera. Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, primenom rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti, npr. Bird i sar. (1988) Science 242:423-426; i Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85:5879-5883). Ovakva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena terminom "deo koji se vezuje za antigen" antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju primenom konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u stanju tehnike, i fragmenti se pregledaju za primenu na isti način kao i intaktna antitela. Delovi koji se vezuju za antigen mogu se proizvesti tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih imunoglobulina.
[0025] Termin "šaržna kultura" kako se ovde koristi odnosi se na postupak kultivisanja ćelija u kome su sve komponente koje će se na kraju koristiti u kultivisanju ćelija, uključujući medijum (videti definiciju "medijum" u nastavku) kao i same ćelije, obezbeđene na početku procesa kultivisanja. Šaržna kultura se obično zaustavlja u nekom trenutku i ćelije i/ili komponente u medijumu se sakupljaju i opciono prečišćavaju. Termin "dolivna kultura" podrazumeva postepeno ili kontinuirano dodavanje drugog tečnog medijuma za kulturu početnoj ćelijskoj kulturi bez suštinskog ili značajnog uklanjanja prvog tečnog medijuma za kulturu iz ćelijske kulture. U nekim slučajevima, drugi tečni medijum za kulturu je isti kao i prvi tečni medijum za kulturu. U drugim slučajevima, drugi tečni medijum za kulturu je koncentrovani oblik prvog tečnog medijuma za kulturu i/ili se dodaje kao suvi prah.
[0026] Termin "bioreaktor" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koju posudu koja se koristi za uzgajanje ćelijske kulture sisara. Bioreaktor može biti bilo koje veličine sve dok je koristan za kultivisanje ćelija sisara. Tipično, bioreaktor će biti najmanje 1 litar i može biti 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000 litara ili više, ili bilo koje zapremine između. Unutrašnji uslovi bioreaktora, koji uključuju, ali bez ograničavanja na pH i temperaturu, obično se kontrolišu tokom perioda kultivisanja. Bioreaktor može biti sastavljen od bilo kog materijala koji je pogodan za držanje ćelijskih kultura sisara koje su suspendovane u medijumu pod uslovima kulture prema predmetnom pronalasku, uključujući staklo, plastiku ili metal. Termin "proizvodni bioreaktor" kako se ovde koristi odnosi se na konačni bioreaktor koji se koristi u proizvodnji polipeptida ili proteina od interesa. Zapremina bioreaktora za proizvodnju velikog obima ćelijske kulture je obično najmanje 500 litara i može biti 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000 litara ili više, ili bilo koje zapremine između. Stručnjaku iz date oblasti tehnike biće poznato i moći će da izabere pogodne bioreaktore za primenu u praksi predmetnog pronalaska.
[0027] Termin "gustina vijabilnih ćelija" kako se ovde koristi odnosi se na broj vijabilnih (živih) ćelija koje su prisutne u datoj zapremini medijuma. Termin "ciljna gustina ćelija" podrazumeva specifičnu koncentraciju ćelija po zapremini medijuma za kulturu za proizvodnju rekombinantnog proteina u kulturi. Ciljna gustina ćelija može da varira u zavisnosti od specifične ćelije sisara koja se uzgaja.
[0028] Termin "vijabilnost ćelija" kako se ovde koristi odnosi se na sposobnost ćelija u kulturi da prežive pod datim skupom uslova kulture ili eksperimentalnih varijacija. Termin kako se ovde koristi takođe se odnosi na deo ćelija koje su žive u određeno vreme u odnosu na ukupan broj ćelija, živih i mrtvih, u kulturi u to vreme.
[0029] Termini "kultura", "ćelijska kultura" i "ćelijska kultura sisara" kako se ovde koriste odnose se na populaciju ćelija sisara koja je suspendovana u medijumu pod uslovima koji su pogodni za preživljavanje i/ili rast populacije ćelija. Kao što će biti jasno stručnjacima u ovoj oblasti tehnike, ovi termini koji se ovde koriste mogu se odnositi na kombinaciju koja sadrži populaciju ćelija sisara i medijum u kome je populacija suspendovana.
[0030] Termin "kultivisanje" ili "kultivisanje ćelija" podrazumeva održavanje ili uzgajanje ćelije sisara u tečnom medijumu za kulturu pod kontrolisanim skupom fizičkih uslova.
[0031] Termini "medijum", "medijum za ćelijsku kulturu", "medijum za kulturu" kako se ovde koriste odnose se na rastvor koji sadrži hranljive materije koje hrane rastuće ćelije sisara. Tipično, ovaj rastvor obezbeđuje esencijalne i neesencijalne aminokiseline, vitamine, izvore energije, lipide i elemente u tragovima koji su potrebni ćeliji za minimalan rast i/ili preživljavanje. Rastvor takođe može da sadrži komponente koje poboljšavaju rast i/ili preživljavanje iznad minimalne stope, uključujući hormone i faktore rasta. Rastvor je poželjno formulisan na pH i koncentraciju soli koji su optimalni za preživljavanje i proliferaciju ćelija. Medijum takođe može biti "hemijski definisan medijum"- medijum bez seruma koji ne sadrži proteine, hidrolizate ili komponente nepoznate kompozicije. Definisani medijumi ne sadrže komponente životinjskog porekla i sve komponente imaju poznatu hemijsku strukturu. Termin "obogaćeni medijum", "obogaćeni medijumi, ili "obogaćeni hemijski definisani medijum" su medijumi za kulturu koji sadrže dodatne ili povećane količine izvora ugljenika i/ili hranljivih materija u odnosu na standardne medijume za kulturu.
[0032] Termin "N-1 faza" kako se ovde koristi odnosi se na poslednju fazu ekspanzije semena neposredno pre proizvodne inokulacije. N-1 faza je poslednja faza rasta ćelije pre zasejavanja proizvodnog bioreaktora za proizvodnju polipeptida. Termini " N-2 faza " i " N-3 faza " kako se ovde koriste odnose se na vremenski period tokom rasta i ekspanzije ćelije i, tipično, pre inokulacije N proizvodne faze. N-3 faza je faza rasta ćelija koja se koristi za povećanje gustine vijabilnih ćelija koja će se koristiti u fazi N-2. N-2 faza je faza rasta ćelija koja se koristi za povećanje gustine vijabilnih ćelija koja će se koristiti u fazi N-1.
[0033] Termin "perfuzija" ili " proces perfuzije" kako se ovde koristi odnosi se na postupak kultivisanja ćelija u kojoj se ekvivalentne količine medijuma (koji sadrže dodatke ishrani) istovremeno dodaju i uklanjaju iz bioreaktora dok se ćelije zadržavaju u reaktoru. Zapremina ćelija i medijuma koji odgovaraju dodatnim medijumima se obično uklanjaju na kontinuiranoj ili polukontinuiranoj osnovi i opciono se prečišćavaju. Obično, proces ćelijske kulture koji uključuje proces perfuzije se naziva "perfuziona kultura." U nekim tehničkim rešenjima, svež medijum može biti isti ili sličan osnovnom medijumu koji se koristi u procesu ćelijske kulture. U nekim tehničkim rešenjima, svež medijum može da se razlikuje od osnovnog, ali sadrži željene dodatke ishrani. U nekim tehničkim rešenjima, svež medijum je hemijski definisan medijum.
[0034] Termini "polinukleotid" ili "nukleotid" kako se ovde koriste imaju za cilj da obuhvataju jednu nukleinsku kiselinu, kao i više nukleinskih kiselina, i odnose se na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informaciona RNK (iRNK) (eng. messenger RNA (mRNA)), komplementarna DNK (kDNK), ili plazmidna DNK (pDNK). U određenim aspektima, polinukleotid sadrži konvencionalnu fosfodiestarsku vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidna veza, kakva se nalazi u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK)).
[0035] Termin "polipeptid" kako se ovde koristi odnosi se na molekul koji je sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Termin "polipeptid" se odnosi na bilo koji lanac ili lance od dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Kako se ovde koristi termin "protein je namenjen da obuhvati molekul koji se sastoji od jednog ili više polipeptida, koji u nekim slučajevima mogu biti povezani vezama koje nisu amidne. S druge strane, protein takođe može biti jedan polipeptidni lanac. U ovom poslednjem slučaju pojedinačni polipeptidni lanac može u nekim slučajevima da sadrži dve ili više polipeptidnih podjedinica spojenih zajedno da formiraju protein. Termini "polipeptid" i "protein" se takođe odnose na proizvode post-ekspesionih modifikacija, uključujučujući bez ograičenja glikolizaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje ili modifikaciju aminokiselinama koje se ne pojavljuju u prirodi. Polipeptid ili protein može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se proizvesti na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.
[0036] Termin "polipeptid od interesa" kako se ovde koristi se koristi u svom najširem smislu da uključi bilo koji protein (bilo prirodni ili rekombinantni), koji je prisutan u smeši, za koju je prečišćavanje poželjno. Takvi polipeptidi od interesa uključuju, bez ograničenja, enzime, hormone, faktore rasta, citokine, imunoglobuline (npr. antitela), i/ili koje fuzione proteine.
[0037] Termin "faza proizvodnje" ćelijske kulture odnosi se na poslednju fazu ćelijske kulture. Tokom faze proizvodnje, ćelije će prvo rasti, a zatim će uslediti proizvodnja polipeptida. Faza proizvodnje se obično naziva "N" ili poslednja faza proizvodnje ćelijske kulture.
[0038] Termini "prečišćavanje," "razdvajanje," "izolovanje," ili "oporavljanje," kako se ovde koriste nazmenično, odnose se na najmanje delimično prečišćavanje ili izolovanje (npr. najmanje ili oko 5%, npr. najmanje ili oko 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili najmanje ili oko 95% čistoće po težini) rekombinantnog proteina iz jedne ili više drugih komonenti koje su prisutne u medijumu za ćelijsku kulturu (npr. ćelije sisara ili proteini medijuma za kulturu) ili jedne ili više drugih komponenti (npr. DNK, RNK, ili drugi proteini) koje su prisutne u lizatu ćelija sisara. Tipično, stepen čistoće proteina od interesa se povećava uklanjanjem (potpuno ili delimično) najmanje jedne nečistoće iz kompozicije.
[0039] Termini "rekombinantni eksprimovani polipeptid" i "rekombinantni polipeptid" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji je eksprimovan iz ćelije domaćina sisara koja je genetski modifikovana da eksprimuje taj polipeptid. Rekombinantni eksprimovani polipeptid može biti identičan ili sličan polipeptidima koji su normalno eksprimovani u ćeliji domaćina sisara. Rekombinantni eksprimovani polipeptid može takođe biti stran za ćeliju domaćina, tj. heterologni peptidima koji su normalno eksprimovani u ćeliji domaćina sisara. Alternativno, rekombinantni eksprimovani polipeptid može biti himeričan u tome što delovi polipeptida sadrže sekvence aminokiselina koje su identične ili slične polipeptidima koji se normalno eksprimuju u ćeliju domaćina sisara, dok su drugi delovi strani za ćeliju domaćina.
[0040] Termin "zasejavanje" kako se ovde koristi se odnosi na proces obezbeđivanja ćelijske kulture u bioreaktor ili drugu posudu. Ćelije su možda prethodno bile razmnožene u drugom bioreaktoru ili posudi. Alternativno, ćelije su možda bile zamrznute i odmrznute neposredno pre njihovog dostavljanja u bioreaktor ili posudu. Termin se odnosi na bilo koji broj ćelija uključujući jednu ćeliju.
[0041] Termin "boca za mućkanje" označava posudu (npr. sterilnu posudu) koja može da drži zapreminu tečnog medijuma za kulturu koji ima najmanje jednu površinu koja propušta gas. Na primer, boca za mućkanje može biti boca za ćelijsku kulturu, kao što je T-boca, Erlenmajerova boca ili bilo koja modifikovana verzija istih poznata u stanju tehnike.
[0042] 'Termin "titar" kako se ovde koristi odnosi se na ukupnu količinu rekombinantnog eksprimovanog polipeptida ili proteina koji je proizveden razdvajanjem ćelijske kulture sisara sa datom količinom zapremine medijuma. Titar se obično izražava u jedinicama miligrama polipeptida ili proteina po mililitru medijuma.
[0043] Različiti aspekti obelodanjivanja su detaljnije opisani u sledećim pododeljcima.
Postupci
[0044] Ovo obelodanjenje obezbeđuje nove postupke povećanja gustine vijabilnih ćelija N-1 bioreaktorske ćelijske kulture velikog obima, koji obuhvataju kultivisanje ćelije domaćina koja eksprimira rekombinantni polipeptid od interesa u neperfuzionom sistemu kulture, i gde je gustina održivih ćelija povećana na najmanje 5 × 10<6>ćelija/mL.
[0045] Obelodanjivanje dalje obezbeđuje nove postupke za proizvodnju velikog obima rekombinantnog polipeptida od interesa, koji obuhvataju: (1) kultivisanje ćelije domaćina koja eksprimuje rekombinantni polipeptid od interesa u N-1 fazi u neperfuzionom sistemu kulture, pri čemu se gustina vijabilnih ćelija povećava do najmanje 5 × 10<6>ćelija/mL; i (2) kultivisanje ćelija u N proizvodnoj fazi, koje su inokulisane iz N-1 ćelijske kulture u neperfuzionom sistemu kulture, u obogaćenom medijumu sa velikom gustinom semena do najmanje 1.5 × 10<6>ćelija/mL.
[0046] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje velikog obima rekombinantnog polipeptida od interesa, koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimuju rekombinantni polipeptid od interesa u N-1 fazi neperfuzionog sistema kulture, pri čemu se ćelije domaćina kultivišu u obogaćenom medijumu da bi se dobila gustina vijabilnih ćelija N-1 faze od najmanje 5 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL; i inokulaciju N produktivnog sistema kulture sa velikom gustinom semena od najmanje 1.5 × 10<6>ćelija po mL sa ćelijama domaćina iz N-1 faze neperfuzionog sistema kulture, pri čemu obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika u odnosu na neobogaćeni medijum i/ili povećanu količinu hranljivih materija koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina u odnosu na neobogaćeni medijum
Ćelije domaćina
[0047] Bilo koja ćelija ili tip ćelije sisara koji je podložan ćelijskoj kulturi i ekspresiji polipeptida, može se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom. Neograničavajući primeri ćelija sisara koje se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju BALB/c liniju mijeloma miša (NSO/1, ECACC br: 85110503); humani retinoblastom (PER.C6 (CruCell, Leiden, Holandija)); CV1 liniju bubrega majmuna koja je transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humanu embrionalnu liniju bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham i sar., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka ±DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 77:4216 (1980)); mišije sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane ćelije karcinoma grlića materice (HeLa, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); tumor mlečne žlezde miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i sar., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2). U jednom tehničkom rešenjut, predmetni pronalazak se koristi za kultivisanje i ekspresiju polipeptida i proteina iz CHO ćelijskih linija.
[0048] Dodatno, bilo koji broj komercijalno i nekomercijalno dostupnih ćelijskih linija hibridoma koje eksprimuju polipeptide ili proteine može se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom. Stručnjak u ovoj oblasti tehnike će razumeti da ćelijske linije hibridoma mogu imati različite potrebe za hranljivim materijama i/ili mogu zahtevati različite uslove kulture za optimalan rast i ekspresiju polipeptida ili proteina, i biće u stanju da modifikuje uslove po potrebi.
[0049] Kao što je gore navedeno, u mnogim slučajevima ćelije će biti odabrane ili modifikovane da proizvode visoke nivoe proteina ili polipeptida. Često se ćelije genetski modifikuju da bi se proizveo visoki nivo proteina, na primer uvođenjem gena koji kodira protein ili polipeptid od interesa i/ili uvođenjem kontrolnih elemenata koji regulišu ekspresiju gena (bilo endogenog ili uvedenog) koji kodira polipeptid od interesa.
[0050] Određeni polipeptidi mogu imati štetne efekte na rast ćelija, vijabilnost ćelije ili neke druge karakteristike ćelija koje na kraju ograničavaju proizvodnju polipeptida ili proteina od interesa na neki način. Čak i među populacijom ćelija jednog određenog tipa modifikovanih da eksprimuju specifični polipeptid, postoji vijabilnost unutar ćelijske populacije tako da će određene pojedinačne ćelije rasti bolje i/ili proizvoditi više polipeptida od interesa. U određenim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, ćelijska linija je empirijski odabrana od strane praktičara za snažan rast pod određenim uslovima izabranim za kultivisanje ćelija. U drugim tehničkim rešenjima, pojedinačne ćelije modifikovane da eksprimuju određeni polipeptid se biraju za proizvodnju velikog obima na osnovu rasta ćelija, konačne gustine ćelija, procenta vitalnosti ćelija, titra eksprimovanog polipeptida ili bilo koje njihove kombinacije ili bilo kojih drugih uslova koje praktičar smatra važnim.
Dolivna proizvodnja ćelijske kulture
[0051] Tipične procedure za proizvodnju polipeptida od interesa uključuju šaržne kulture za ekspanziju semena i dolivne kulture za proizvodnu fazu. Šaržni procesi kulture semena tradicionalno sadrže inokulaciju proizvodne kulture velikog obima sa kulturom semena određene gustine ćelija, uzgajanje ćelija pod uslovima koji pogoduju rastu ćelija i vijabilnosti, i prenošenje semena kulture u sledeću fazu kada ćelije dostignu određenu gustinu ćelija. Dolivni postupci kulture uključuju dodatnu fazu ili faze dopunjavanja šaržne kulture sa hranljivim materijama i drugim komponentama koje se konzumiraju tokom rasta ćelija. Stručnjak iz date oblasti tehnike će prepoznati da se predmetni pronalazak može primeniti u bilo kom sistemu u kome se ćelije kultivišu uključujući ali bez ograničenja na šaržne, dolivne i perfuzione sisteme. U određenim poželjnim tehničkim rešenjima predmenog pronalaska, ćelije se uzgajaju u šaržnim ili dolivnim sistemima.
Obogaćeni medijumi
[0052] Predmetni pronalazak koristi obogaćene, hemijski definisane formulacije medijuma koje, kada se koriste u skladu sa drugim fazama kultivisanja koje su ovde opisane, povećavaju gustinu vijabilnih ćelija ćelija domaćina u N-1 kulturi i/ili obezbeđuju više hranljivih materija u proizvodnoj kulturi sa velikom gustinom semena, u odnosu na ćelije domaćina koje su kultivisane u neobogaćenim medijumima. Formulacije obogaćenih medijuma predmetnog pronalaska za koje se pokazalo da imaju blagotvorne efekte na rast ćelija ili na proizvodnju polipeptida od interesa uključuju i) povećanu količinu izvora ugljenika i/ili ii) povećane hranljive materije u odnosu na standardne medijume za kulturu. Pored toga, izvor ugljenika može biti: kazein, laktat, dekstroza, fruktoza, fruktan, glukoza, saharoza, laktoza, maltoza, acetat, glicerol, sorbitol, manitol, saharoza, ksiloza, melasa, fukoza, glukozamin, dekstran, masti, ulja, glicerol, natrijum acetat, arabinoza, sojin protein, rastvorljivi protein, rafinoza, amiloza, skrob, tripton, ekstrakt kvasca i njihove kombinacije, i hranljive materije mogu biti aminokiseline. Obogaćeni medijum je obogaćen sa hranljivim medijumom od 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, ili najmanje 20% sa izvorom ugljenika i/ili hranljivim matrijama u odnosu na neobogaćeni medijum. Stručnjak u ovoj oblasti tehnike će razumeti da formulacije medijuma predmetnog pronalska obuhvataju definisane i nedefinisane medijume.
[0053] Neočekivani rezultat primene obogaćenih medijuma, prikazan na Primerima 1-3, je da ćelije domaćina, koje su kultivisane u šaržnim postupcima sa obogaćenim medijumom tokom N-1 faze kulture, pokazuju povećanu gustinu vijabilnih ćelija u odnosu na ćelije domaćina koje su kultivisane u šaržnom postupku sa neobogaćenim medijumom. Takođe, ćelije domaćina koje su kultivisane u šaržnom postupku sa obogaćenim medijumom pokazale su sličnu gustinu vijabilnih ćelija i/ili vijabilnost ćelija kao ćelija domaćina koje su kultivisane u dolivnom postupku bez obogaćenog medijuma. Dakle, ćelije domaćina koje su kultivisane u šaržnom postupku sa obogaćenim medijumom mogu postići slične rezultate kao ćelije domaćina koje su kiltivisane u perfuzionom ili dolivnom sistemu sa neobogaćenim medijumom.
[0054] Još jedan neočekivani rezultat primene obogaćenih medijuma, prikazan u Primerima 1-3, je da su proizvodne kulture koje su zasejane iz ćelija uzgajanih u šaržnoj kulturi sa obogaćenim medijumom imale slične titre za polipeptid od interesa kao i proizvodne kulture koje su zasejane ćelijama iz perfuzionih ili dolivnih postupaka bez obogaćenog medijuma. Gore navedeni uslovi mogu se primeniti pojedinačno ili u različitim njihovim kombinacijama.
[0055] Bilo koja od ovih formulacija medijuma koja je ovde obelodanjena može opciono biti dopunjena po potrebi hormonima i/ili drugim faktorima rasta, određenim jonima (kao što je natrijum, hlorid, kalcijum, magnezijum, i fosfat), puferima, vitaminima, nukleozidima ili nukleotidima, elementima u tragovima (neorganska jedinjenja obično prisutna u veoma niskim konačnim koncentracijama), aminokiselinama, lipidima, proteinskim hidrolizatima ili glukozom ili drugim izvorom energije. U nekim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, može biti korisno da se medijum dopuni sa hemijskim induktivima kao što su heksametilen-bis(acetamid) ("HMBA") i natrijum butirat ("NaB"). Ovi opcioni dodaci mogu biti dodati na početku kulture ili mogu se dodati kasnije da bi se nadoknadili iscrpljeni hranljivi sastojci ili iz nekog drugog razloga. Stručnjak iz date oblasti tehnike biće svestan svih poželjnih ili neophodnih dodataka koji mogu biti uključeni u opisane formulacije medijuma.
Obezbeđivanje ćelijske kulture sisara
[0056] Jednom kada se idenetifikuje ćelija koja eksprimira polipeptid ili protein od interesa, ćelija se razmnožava u kulturi bilo kojim od postupaka koji su dobro poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Ćelija koja eksprimuje polipeptid ili peptid od interesa se tipično razmnožava tako što se uzgaja na temperaturi i u medijumu koji pogoduje preživljvanju, rastu i vijabilnosti ćelija. Početna zapremina kulture može biti bilo koje veličine, ali je često manja od zapremine kulture proizvodnog bioreaktora koji se koristi u finalnoj proizvodnji polipeptida od interesa, i često ćelije prolaze nekoliko puta u bioreaktorima povećanje zapremine pre zasejavanja proizvodnog bioreaktora. Kada ćelije dostignu specifičnu gustinu vijabilnih ćelija, ćelije se uzgajaju u bioreaktoru kako bi se dodatno povećao broj vijabilnih ćelija. Ovi bioreaktori se nazivaju N-1, N-2, N-3, i itd. "N" se odnosi na bioreaktor glavne proizvodne kulture, dok "N-1" podrazumeva bioreaktor pre glavne proizvodne kulture, i tako dalje.
[0057] Ćelijska kultura se može mešati i mućkati da bi se povećala oksigenacija medijuma i disperzija hranljivih materija u ćelije. Alternativno ili dodatno za povećanje i kontrolu oksigenacije kulture mogu se koritsiti uređaji za prskanje koji su dobro poznati u stanju tehnike. U skladu sa predmetnim pronalskom, stručnjak iz date oblasti tehnike će razmeti da može biti korisno kontrolisati ili regulisati određene unutrašnje uslove bioreaktora uključujući ali bez ograničavanja na pH, temperaturu, oksigenaciju, itd.
[0058] Početna gustina ćelija u N-3 bioreaktoru može biti odabrana od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Početna gustina ćelija u proizvodnom bioreaktoru može biti samo 2×10<4>vijabilnih ćelija po mL. U nekim tehničkim rešenjima, početne gustine ćelija u N-3 bioreaktoru su u opsegu od 2×10<4>, 2×10<5>, 2×10<6>, 5×10<6>, 10×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više. Kultivisanje N-3 ćelija domaćina sa obogaćenim medijumom može dovesti do gustina vijabilnih ćelija od najmanje 5×10<6>vijabilnih ćelija po mL do 10×10<6>, 15×10<6>, 20×10<6>, 25×10<6>ili 30×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više.
[0059] Početna gustina ćelija u N-2 bioreaktoru može biti odabrana od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Početna gustina ćelija u proizvodnom bioreaktoru može biti samo 2×10<4>vijabilnih ćelija po mL. U određenim tehničkim rešenjima, početne gustine ćelija u N-2 bioreaktoru mogu biti u opsegu od oko 2×10<4>vijabilnih ćelija po mL do oko 2×10<5>, 2×10<6>, 5×10<6>, 10×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više. Kultivisanje N-2 ćelija domaćina sa obogaćenim medijumom može dovesti do gustina vijabilnih ćelija od najmanje 5×10<6>vijabilnih ćelija po mL do 10×10<6>, 15×10<6>, 20×10<6>, 25×10<6>ili 30×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više.
[0060] Početna gustina ćelija u N-1 bioreaktoru može biti odabrana od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Početna gustina ćelija u proizvodnom bioreaktoru može biti niska kao jedna ćelija po zapremini kulture. U određenim tehničkim rešenjima, početne gustine ćelija u proizvodnom bioreaktoru mogu biti u opsegu od oko 2×10<4>vijabilnih ćelija po mL do oko 2×10<5>, 2×10<6>, 5×10<6>, 10×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više. Kultivisanje N-1 ćelija domaćina sa obogaćenim medijumom može dovesti do gustina vijabilnih ćelija od najmanje 5×10<6>vijabilnih ćelija po mL do oko 10×10<6>, 15×10<6>, 20×10<6>, 25×10<6>ili 30×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više. Prema pronalasku, ćelije domaćina su kultivisane u obogaćenim medijumom da se dobije N-1 faza gustine vijabilnih ćelija od najmanje 5 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL.
[0061] Početna gustina ćelija u N proizvodnom bioreaktoru može biti odabrana od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. Početna gustina ćelija u N proizvodnom bioreaktoru može biti niska kao 1×10<6>ćelija po mL. Početne gustine ćelija u proizvodnom bioreaktru mogu biti u opsegu od oko 1×10<6>vijabilnih ćelija po mL do oko 2×10<6>, 5×10<6>, 10×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više. Prema predmetnom pronalasku, početna gustina ćelija u proizvodnom bioreaktoru je njmanje 1.5×10<6>vijabilnih ćelija po mL. Kultivisanje ćelija domaćina sa obogaćenim medijumom može dovesti do gustina vijabilnih ćelija od najmanje 1×10<6>vijabilnih ćelija po mL do oko 2×10<6>, 5×10<6>, 10×10<6>, 15×10<6>, 20×10<6>, 25×10<6>ili 30×10<6>vijabilnih ćelija po mL i više.
[0062] Generalno, ćelijske kulture N-1 mogu se uzgajati do željene gustine pre zasejavanja u sledećem proizvodnom bioreaktoru. Poželjno je da većina ćelija ostane živa pre zasejavanja, iako nije potrebna potpuna ili skoro potpuna vijabilnost. U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, ćelije se mogu ukloniti iz supernatanta, na primer, centrifugiranjem pri maloj brzini. Takođe može biti poželjno da se uklonjene ćelije isperu medijumom pre zasejavanja u sledećem bioreaktoru da bi se uklonili neželjeni metabolički otpadni proizvodi ili komponente medijuma. Medijum može biti medijum u kome su ćelije prethodno uzgajane ili može biti drugačiji medijum ili rastvor za ispiranje koje je izabrao praktičar predmetnog pronalska.
[0063] Ćelije N-1 se zatim mogu razblažiti do odgovarajuće gustine za zasejavanje proizvodnog bioreaktora. U određenim tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, ćelije se razblažuju u istom medijumu koji se koristiti u proizvodnom bioreaktoru. Alternativno, ćelije se mogu razblažiti u drugom medijumu ili rastvoru, u zavisnosti od potreba i želja praktičara predmetnog pronalaska ili da se prilagode posebnim zahtevima samih ćelija, na primer, ako treba da se čuvaju u kratkom vremenskom periodu pre zasejavanja proizvodnog bioreaktora.
[0064] U skladu sa predmetnim pronalaskom, bioreaktor za proizvodnju može biti bilo koje zapremine koja je prikladna za proizvodnju polipeptida ili proteina velikog obima. U određenim tehničkim rešenjima, zapremina proizvodnog bioreaktora je najmanje 500 litara. U drugim tehničkim rešenjima, zapremina proizvodnog bioreaktora je 1,000, 2,500, 5,000, 8000, 10,000, 15,000, ili 20,000 litara ili više, ili bilo koja zapremina između. Stručnjak iz date oblasti tehnike će biti svestan i moći će da izabere odgovarajući bioreaktor za primenu u izvođenju predmetnog pronalaska. Proizvodni bioreaktor može biti napravljen od bilo kog materijala koji pogoduje ćelijskom rastu i vijabilnosti koji ne ometa eksprimovanje ili stabilnost proizvedenog polipeptida ili proteina.
[0065] U određenim tehničkim rešenjima predmetnog pronalska, faza proizvodnje obuhvata obogaćeni medijum u odnosu na neobogaćeni medijum. Na primer, medijum je obogaćen hranljivim medijumom najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, ili najmanje 20% u odnosu na neobogaćeni medijum. U određenim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika (npr. glukoze). U određenim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu hranljivih materija (npr. aminokiselina). U određenim tehničkim rešenjima, obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika i hranljivih matrija.
[0066] Temperatura ćelijske kulture u fazi N-1 ili fazi proizvodnje se bira prvenstveno na osnovu opsega temperatura na kojima ćelijska kultura ostaje vijabilna. Generalno, većina ćelija sisara dobro raste u opsegu od oko 25°C do 42°C. Poželjno, ćelije sisara dobro rastu u opsegu od oko 35°C do 40°C. Stručnjaci u ovoj oblasti tehnike će moći da izaberu odgovarajuću temperaturu ili temperature na kojima će rasti ćelije, u zavisnosti od potreba ćelija i proizvodnih zahteva praktičara. Opciono, temperatura se održava na jednoj, konstantnoj temperaturi. Opciono, temperatura se održava u opsegu temperatura. Na primer, temperatura se može stalno povećavati ili snižavati. Alternativno, temperatura se može povećati ili smanjiti za diskretne vrednosti u različitim vremenima. Stručnjak iz date oblasti tehnike će moći da odredi da li treba koristiti jednu ili više temperatura i da li temperaturu treba podešavati stalno ili u diskretnim vrednostima.
[0067] Ćelije u fazi N-1 ili fazi proizvodnje mogu se uzgajati duže ili manje vremena, u zavisnosti od potreba praktičara i zahteva samih ćelija. U jednom tehničkom rešenju, ćelije se uzgajaju tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da se postigne gustina vijabilnih ćelija koja je dati procenat od maksimalne gustine vijabilnih ćelija koju bi ćelije na kraju dostigle ako im se dozvoli da rastu neometano. Ćelijama je dozvoljeno da rastu tokom određenog vremenskog perioda. Na primer, u zavisnosti od početne koncentracije ćelijske kulture, temperature na kojoj se ćelije uzgajaju, i unutrašnje brzine rasta ćelija, ćelije se mogu uzgajati za 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više dana. Praktičar predmetnog pronalska će moći da izabere trajanje rasta u zavisnosti od zahteva proizvodnje polipeptida i potreba samih ćelija.
Praćenje uslova kulture
[0068] U određenom tehničkom rešenju, prate se posebni uslovi uzgajanja ćelijske kulture. Praćenje uslova ćelijske kulture omogućava da se utvrdi da li ćelijska kultura proizvodi rekombinantni polipeptid ili protein na suboptimalnim nivoima ili da li će kultura uskoro ući u suboptimalnu proizvodnu fazu.
[0069] Kao neograničavajući primeri, može biti korisno ili neophodno pratiti temperaturu, pH, gustinu ćelija, vijabilnost ćelija, gustina integrisanih vijabilnih ćelija, nivoe laktata, nivoe amonijuma, osmolarnost, ili titar eksprimovanog polipeptida ili proteina. Brojne tehnike su dobro poznate u stanju tehnike da obrzbede stručnjaku u datoj oblasti tehnike da izmeri ove uslove. Na primer, gustina ćelija može se meriti primenom hemacitometra, Coulter brojača (Vi-Cell), ili sistema za ispitivanje gustine ćelija (CEDEX). Gustina vijabilnih ćelija može biti utvrđena bojenjem uzorka kulture sa tripanski plavom. Pošto samo mrtve ćelije zauzimaju tripansko plavo, gustina vijabilnih ćlija može biti određena prebrojavanjem ukupnog broja ćelija, deljenjem broja ćelija koje zauzimaju boju sa ukupnim brojem ćelija i uzimanjem recipročne vrednosti. HPLC se može koristiti za određivanje nivoa laktata, amonijuma ili eksprimovanog polipeptida ili proteina. Alternativno, nivo eksprimovanog polipeptida ili proteina može se odrediti standardnim tehnikama molekularne biologije kao što su coomassie bojenje SDS-PAGE gelovima, Western blot testiranje, Bradford testovi, Lowry testovi, Biuret testovi, i UV apsorbancija. Takođe može biti korisno ili neophodno pratiti post-translacione modifikacije eksprimovanog polipeptida ili proteina, uključujući fosforilaciju i glikozilaciju.
Izolovanje eksprimovanog polipeptida
[0070] Generalno, biće tipično poželjno da se izoluju i/ili prečiste proteini ili polipeptidi koji su eksprimirani prema predmetnom pronalasku. U jednom tehničkom rešenju, eksprimovani polipeptid ili protein se izlučuje u medijum i tako mogu biti uklonjene ćelije i druge čvrste materije, na primer centrifugiranjem ili filtriranjem, kao prvi korak u procesu prečišćavanja. Pošto postupci i kompozicije koji su ovde opisani dovode do povećane vijabilnosti ćelija, ovo tehničko rešenje je posebno korisno kada se koristi u skladu sa predmetnim pronalaskom. Kao rezultat toga, manje ćelija umire tokom procesa kultivisanja, i manje proteolitičkih enzima se oslobađa u medijumu što potencijalno može smanjiti prinos eksprimovanog polipeptida ili proteina.
Rekombinantni polipeptidi
[0071] Postupci predmetnog pronalska mogu se koristiti za proizvodnju velikog obima bilo kog rekombinantnog poilipeptida od interesa, uključujući terapijska antitela. Neograničavajući primeri rekombinantnih polipeptida koji se mogu proizvesti postupcima koji su ovde obezbeđeni uključuju antitela (uključujući intaktne imunoglobuline ili fragmente antitela), enzime (npr. galaktozidazu), proteine (npr. humani eritropoetin, faktor nekroze tumora (TNF), ili interferon alfa ili beta), ćelijske receptore (npr. EGFR) ili imunogene ili antigene proteine ili fragmente proteina (npr. proteine za primenu u vakcinama). Antitela u okviru ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničena na: anti-HER2 antitela uključuju trastuzumab (HERCEPTIN<®>) (Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 89:4285-4289 (1992); anti-HER3 antitela; anti-HER4 antitela; U.S. pat. br.
5,725,856); anti-CD20 antitela kao što su himernna anti-CD20 "C2B8" kao u U.S. pat. br.
5,736,137 (RITUXAN<®>), himerna ili humanizovana varijanta 2H7 antitela kao u U.S. pat. br.
5,721,108B1, ili tositumomab (BEXXAR<®>); anti-IL-8 (St John i sar., Chest, 103:932 (1993), i međunarodna objava br. WO 95/23865); anti-VEGF antitela uključujući humanizovana i/ili afinitetno zrela anti-VEGF antitela, kao što je humanizovano anti-VEGF antitelo huA4.6.1 AVASTIN<®>(Kim i sar., Growth Factors, 7:53-64 (1992), međunarodna objava br. WO 96/30046, i WO 98/45331, objavljena 15 oktobra, 1998); anti-PSCA antitela (WO01/40309); anti-CD40 antitela, uključujući S2C6 i njihove humanizovane varijante (WO00/75348); anti-CD11a (U.S. pat. br. 5,622,700, WO 98/23761, Steppe i sar., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), i Hourmant i sar., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-IgE (Presta i sar., J. Immunol.151:2623-2632 (1993), i međunarodna objava br. WO 95/19181); anti-CD18 (U.S. pat. br.5,622,700, izdat 22 aprila 1997, ili kao u WO 97/26912, objavljenoj 31 jula 1997); anti-IgE (uključujući E25, E26 i E27; U.S. pat. br. 5,714,338, izdat 3 februara 1998 ili U.S. pat. br. 5,091,313, izdat 25 februara 1992, WO 93/04173 objavljena 4 marta 1993, ili međunarodna patentna prijava br. PCT/US98/13410 podneta 30 juna 1998, U.S. pat. br.5,714,338); antitelo anti-Apo-2 receptora (WO 98/51793 objavljena 19 novembar 1998); anti-TNF-α antitela uključujući cA2 (REMICADE<®>), CDP571 i MAK-195 (See, U.S. pat. br. 5,672,347 izdat 30 septembra 1997, Lorenz i sar., J. Immunol. 156(4): 1646-1653 (1996), i Dhainaut i sar., Crit. Care Med.23(9): 1461-1469 (1995)); anti-tkivni faktor (TF) (evropski patent br. 0 420 937 B1 odobren 9 novembra 1994); anti-humani α4β7integrin (WO 98/06248 objavljena 19 februara 1998); anti-EGFR (himerizovano ili humanizovano 225 antitelo kao u WO 96/40210 objavljenoj 19 decembra 1996); anti-CD3 antitela kao što je OKT3 (U.S. pat. br. 4,515,893 izdat 7 maja 1985); anti-CD25 ili anti-tac antitela kao što je CHI-621 (SIMULECT<®>) i (ZENAPAX<®>) (videti U.S. pat. br.5,693,762 izdat 2 decembra 1997); anti-CD4 antitela kao što je cM-7412 antitelo (Choy i sar., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); anti-CD52 antitela kao što je CAMPATH-1H (Riechmann i sar., Nature 332:323-337 (1988)); antitela anti-Fc receptora kao što je M22 antitelo usmereno protiv FcyRI kao u Graziano i sar., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); antitela anti-karcionoembrionog antigena (CEA) kao što je hMN-14 (Sharkey i sar., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995); antitela usmerena protiv epitelnih ćelija dojke uključujući huBrE-3, hu-Mc 3 i CHL6 (Ceriani i sar., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); i Richman i sar., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); antitela koja se vezuju za ćelije karcinoma debelog creva kao što je C242 (Litton i sar., Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)); antiCD38 antitela, npr. AT 13/5 (Ellis i sar., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); anti-CD33 antitela kao što je Hu M195 (Jurcic i sar., Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995) i CMA-676 ili CDP771; anti-CD22 antitela kao što je LL2 ili LymphoCide (Juweid i sar., Cancer Res 55(23 Suppl): 5899s-5907s (1995)); anti-EpCAM antitela kao što je 17-1A (PANOREX<®>); anti-GpIIb/IIIa antitela kao što je abciksimab ili c7E3 Fab (REOPRO<®>); anti-RSV antitela kao što je MEDI-493 (SYNAGIS<®>); anti-CMV antitela kao što je PROTOVIR<®>; anti-HIV antitela kao što je PRO542; anti-hepatitis antitela kao što je anti-Hep B antitelo OSTAVIR<®>; anti-CA 125 antitelo OvaRex; anti-idiotipsko GD3 epitop antitelo BEC2; anti-αvβ3 antitelo VITAXIN<®>; antitelo protiv humanog karcinoma bubrežnih ćelija kao što je ch-G250; ING-1; anti-humano 17-1A antitelo (3622W94); antitelo protiv humanog kolorektalnog tumora (A33); antitelo protiv humanog melanoma R24 usmereno protiv GD3 gangliozida; anti-humani karcinom skvamoznih ćelija (SF-25); antitela protiv humanog leukocitnog antigena (HLA) kao što je Smart ID10; anti-PD-1 antitela; anti-PD-L1 antitela; anti-LAG-3 antitela; anti-GITR antitela; anti-TIGIT antitela; anti-CXCR4 antitela; anti-CD73 antitela; i anti-HLA DR antitelo Oncolym (Lym-1).
PRIMERI
Ćelijske linije i medijumi
[0072] Tri različite CHO ćelijske linije koje proizvode tri različita monoklonalna atitela ili polipeptida su korišćene u ovim eksperimentima. Korišćeni semenski, bazalni i hranljivi medijumi su hemijski definisani.
N-1 kulture semena
[0073] Šaržne i dolivne N-1 ćelijske kulture su uzgajane ili u bocama za mućkanje od 250 ml sa početnom zapreminom od 80-100 ml ili u bocama za mućkanje od 2 L sa početnom zapreminom od 1000 ml. Korišćena je brzina mućkanja od 150 o/min na orbitalnoj mućkalici sa razmakom od 25 mm. Podešavanja inkubatora su bila na konstantnoj temperaturi od 36.5°C i CO2je kontrolisan na 5%. Za šaržnu N-1 kulturu, medijumi za seme su ili bez obogaćivanja, ili sa obogaćivanjem glukozom, ili sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama. Hrana nije dodavana u šaržu N-1 kultura. Za dolivnu N-1 kulturu, medijum za seme je dodavan dnevno od 3. dana nadalje.
[0074] Perfuzione N-1 kulture uključuju uzgajanje ćelija u vrećama od 10 L sa početnom zapreminom od 5 L. Brzina ljuljanja je kontrolisana na 28 o/min i ugao ljuljanja je podešen na 7°. CO2je kontrolisan na 4% između dana 0 i 1 i zatim je isključen. Pomoćni ATF-2 (Repligen) je povezan sa ćelijskom vrećom do perfuzije kulture. Svež medijum za kulturu (1x koncentrovan) se kontinuirano dodaje, dok se stari medijum za kulturu kontinuirano uklanja istom brzinom prema rasporedu: 0.5 VVD D2-4, povećan do 1.0 VVD D4-5, i konačno povećanje do 2.0 VVD D5-6.
Proizvodnja kultura
[0075] Bioreaktori za dolivnu proizvodnju se izvode u bioreaktorima Sartorius od 5 L sa 3.3 L polazne radne zapremine.
Analize
[0076] Gustina vijabilnih ćelija (VCD) i vijabilnost ćelija merene su van mreže primenom Vi-Cell automatizovanog brojača ćelija (Beckman Coulter). Uzorci kulture su takođe analizirani van mreže primenom Cedex Bio HT (Roche) za praćenje glukoze, glutamina, glutamata, laktata i amonijuma. Za bioreaktorske kulture, pH, pCO2, pO2takođe su merene van mreže primenom BioProfile pHOX (Nova Biomedical). Metoda Protein A UPLC je koriščena za merenje titra proteina, koja je prikazana kao normalizovana vrednost.
[0077] Hromatografija isključenja veličine (SEC) za veliku molekulsku težinu (HMW) je izvedena primenom Tosoh TSK G3000SWxlkolone, 7.8 × 30cm, 5um, sa izokratskim gradijentom koji je praćen na 280 nm na Waters Alliance HPLC sistemu (Milford, MA) koji je opremljen sa temperaturno-kontrolisanim autosamplerom i Waters 2996 PDA detektorom.
[0078] Varijante punjenja su analizirane pomoću kapilarnog izoelektričnog fokusiranja slike (iCIEF), koje je izvedeno na Protein Simple iCE3 instrumentu sa Alcott 720NV autosampleru (San Jose, CA). Uzorci su pomešani sa odgovarajućim pI markerima, amfolitima, i ureom i ubrizgani u kapilarni uložak obložen fluorougljenikom. Primenjen je visoki napon i naelektrisane varijante su migrirale na svoje odgovarajuće pI. UV kamera je snimila sliku na 280nM. Idenetifikovan je glavni pik i pikovi koji su migrirali u kiseli i bazni opseg su sabrani, kvantifikovani, i prijavljeni kao relativna procentna površina.
[0079] Analiza N-glikana je izvedena primenom komercijalno dostupnog kompleta od kompanije Prozyme, GlykoPrep<®>Rapid N-glkan koji je pripremljen sa 2-AB (Hayward, CA). Slobodni oligosaharidi su profilisani primenom Acquity UPLC glikan BEH amida, 130 Å, 1.7 µm, 2.1x10 mm kolone (Milford, MA) na Waters Acquity H-Class sistemu (Milford, MA) koji je opremljen sa temperaturno-kontrolisanim autosamplerom i fluorescentnim detektorom.
Primer 1
Ćelijska linija A: N-1 kulture semena
[0080] Za ćelijsku linuju A, N-1 kulture su uzgajane u šaržnom režimu, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom, šaržnom sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim matrijama, dolivnom i perfuzionom režimu. Šaržna kultura N-1 dostigla je pik VCD od samo 15×10<6>ćelija po mL i nije uspela da održi visoku vijabilnost ćelija pri kraju perioda kulture (Slika 1A). Nasuprot tome, šarža N-1 kulture sa obogaćivanjem glukozom dostigla je VCD od 17×10<6>ćelija po mL i održavala je >99% vijabilnost ćelija (Slika 1A). Slično i polušarža N-1 i šarža N-1 sa obogaćivanjem glukozom i hranljivim materijama uzgajana je do >20×10<6>ćelija po mL na 6. dan i vijabilnnosti su održavane na >99% (Slike 1A i 1B). Ćelije u perfuzionoj N-1 kulturi su uzgajane do 44×10<6>ćelija po mL na 6. Dan i vijabilnost je bila >99% (Slike 1A i 1B).
Ćelijska linija A za proizvodnju polipeptida-1: Dolivne proizvodne kulture visoke gustine
[0081] Za ćelijsku liniju A, dolivne proizvodne kulture visoke gustine su inicirane primenom semena koja su uzgajana u šaržim kulturama sa obogaćenjem glukozom, šaržim sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama, dolivnim ili perfuzionim kulturama.
[0082] N proizvodna kultura je inokulisana pri visokoj gustini semena od 5×10<6>ćelija po mL za 14 dana. Dnevno dodavanje je počelo drugog dana sa zapreminom dodavanja od 3.5% zapremine kulture. Rastvoren kiseonik (DO) je održavan na 40% i pH je kontrolisana između 6.8 i 7.6. Temperatura je inicijalno održavana na 36.5°C i 4. dana je pomerena na 34°C.
[0083] Slika 2A pokazuje da su sve proizvodne kulture održavale >90% vijabilnost ćelija tokom čitavog perioda kulture. Perfuziona kultura semena ima maksimalnu gustinu vijabilnih ćelija od 22×10<6>ćelija po mL u poređenju sa 17×10<6>ćelija po mL za dolivnu kulturu semena i šaržne kulture semena sa obogaćenjem glukozom ili obogaćenjem glukozom i hranjivim materijama (Slika 2A). Titar za polipeptid-1 iz perfuzione kulture semena je približno 9.3 g/L, dok dolivna kultura semena ima titar od približno 9 g/L (Slika 2B). Titar polipeptida od interesa iz šaržnog semena obogaćenog sa glukozom ili glukozom i hranljivim materijama je približno 8.5 g/L i 9 g/L, respektivno. Slika 2C prikazuje da su atributi kvaliteta kao što su iCIEF, SEC, i N-glikan bili slični za sve uslove N proizvodnje bez obzira na različita N-1 semena.
Primer 2
Ćelijska linija B: N-1 kulture semena
[0084] Za ćelijsku liniju B, N-1 kulture su uzgajane u šaržnom režimu, šaržnom sa obogaćenjem glukozom, šaržnom sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama, dolivnom ili perfuzionom režimu. Šaržna N-1 kultura dostigla je pik VCD od samo 24.5×10<6>ćelija po mL i nije uspela da održi visoku vijabilnost (Slike 3A i 3B). Nasuprot tome, šaržne N-1 kulture koje su obogaćene samo glukozom ili obogaćene i glukozom i hranljivim materijama su dostigle ≥25.5×10<6>vijabilnih ćelija po mL i održavale ≥99% vijabilnost ćelija (Slike 3A i 3B). Slično, dolivne N-1 kulture su rasle do ≥30×10<6>vijabilnih ćelija po mL 5. dana i vijabilnosti su održavane na ≥99% (Slike 3A i 3B). Ćelije u perfuzionoj N-1 kulturi su rasle do 41×10<6>ćelija po mL 5. dana i vijabilnost je bila ≥99% (Slike 3A i 3B).
Ćelijska linija B za proizvodnju polipeptida-2: Dolivne proizvodne kulture visoke gustine
[0085] Za ćelijsku linuju B, dolivne proizvodne kulture visoke gustine su inicirane primenom semena koja su uzgajana u šaržnim kulturama, šaržnim sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama, dolivnim ili perfuzionim kulturama.
[0086] Proizvodna kultura je inokulisana pri visokoj gustini semena od 3×10<6>ćelija po mL za 14 dana. Dnevno dodavanje je počelo drugog dana sa zapreminom dodavanja od 3.1% zapremine kulture. Rastvoren kiseonik (DO) je održavan na 40% i pH je kontrolisana između 6.7 i 7.6. Temperatura je održavana na 36.5°C.
[0087] Slika 4A pokazuje da su sve proizvodne kulture održavale >90% vijabilnost ćelija tokom čitavog perioda kulture. Perfuziona kultura semena ima maksimalnu gustinu vijabilnih ćelija približno 26×10<6>ćelija po mL u poređenju sa samo približno 24×10<6>ćelija po mL za dolivne i šaržne kulture semena sa obogaćenjem glukozom ili obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama (Slika 4A). Titar polipeptida od interesa iz perfuzione i šaržne kulture semena (sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama) je približno 3.2 g/L, dok su šaržne i dolivne kulture semena imale titar od približno 3 g/L (Slika 4B). Slika 4C prikazuje da su atributi kvaliteta kao što su iCIEF, SEC, i N-glikan bili slični za sve uslove N proizvodnje bez obzira na različita N-1 semena.
Primer 3
Ćelijska linija C: N-1 kulture semena
[0088] Za ćelijsku kulturu C, N-1 kulture su uzgajane u šaržnom režimu, šaržnom sa obogaćenjem glukozom, šaržnom sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama, dolivnom ili perfuzionom režimu. Šaržna N-1 kultura dostigla je pik VCD od samo 26×10<6>ćelija po mL i nije uspela da održi visoku vijabilnost (Slike 5A i 5B). Nasuprot tome, šaržne N-1 kulture obogaćene samo sa glukozom ili obogaćene sa glukozom i hranljivim materijama dostigle su ≥30×10<6>vijabilnih ćelija po mL i održavale ≥99% vijabilnost ćelija (Slike 5A i 5B). Slično, dolivne N-1 kulture su rasle do ≥33×10<6>vijabilnih ćelija po mL 5. dana i vijabilnosti su održavane na ≥99% (Slike 5A i 5B). Ćelije u perfuzionoj N-1 kulturi su rasle do 62×10<6>ćelija po mL 5. dana i vijabilnost je bila ≥99% (Slike 5A i 5B).
Ćelijska linija C za proizvodnju polipeptida-3 (Eksperiment 1): Dolivne proizvodne kulture visoke gustine sa primenom dolivnih ili šaržnih semena sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama
[0089] Za ćelijsku liniju C, dolivne proizvodne kulture visoke gustine su inicirane primenom semena koja su uzgajana u dolivnoj ili šaržnoj kulturi sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama.
[0090] Proizvodna kultura je inokulisana pri visokoj gustini semena od 6×10<6>ćelija po mL za 14 dana. Dnevno dodavanje je počelo drugog dana sa zapreminom dodavanja od 5% zapremine kulture D2-10 i zatim 3.3% od početne zapremine kulture bD 11- 13. Dodavanje je izvršeno dva puta dnevno sa polovinom naznačene količine. Rastvoren kiseonik (DO) je održavan na 40% i pH je kontrolisana između 6.8 i 7.3. Temperatura je inicijalno održavana na 36.5°C i 6. dana je pomerena na 33°C.
[0091] Slika 6A pokazuje da su sve proizvodne kulture održavale >80% vijabilnost ćelija tokom čitavog perioda kulture. Dolivna kultura semena i šaržna kultura semena (sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama) imale su maksimalnu gustinu vijabilnih ćelija približno 27×10<6>ćelija po mL (Slika 6A). Titar polipeptida od interesa iz dolivne i šaržne ćelijske kulture (sa obogaćenjem glukozom i hranljivim materijama) je približno 4.3 g/L (Slika 6B). Slika 6C prikazuje da su atributi kvaliteta kao što su iCIEF, SEC, i N-glikan bili slični za sve uslove N proizvodnje bez obzira na različita N-1 semena.
Ćelijska linija C za proizvodnju polipeptida-3 (Eksperiment 2): Dolivne proizvodne kulture visoke gustine sa primenom dolivnih ili perfuzionih semena
[0092] Za ćelijsku liniju C, dolivne proizvodne kulture visoke gustine su inicirane primenom semena koja su uzgajana u dolivnoj ili perfuzionoj kulturi.
[0093] Proizvodna kultura je inokulisana pri visokoj gustini semena od 6×10<6>ćelija po mL za 14 dana. Dnevno dodavanje je počelo prvog dana sa zapreminom dodavanja od 3.7% zapremine kulture. Rastvoren kiseonik (DO) je održavan na 40% i pH je kontrolisana između 6.8 i 7.3. Temperatura je inicijalno održavana na 36.5°C i 6. dana je pomerena na 33°C.
[0094] Slika 7A pokazuje da su sve proizvodne kulture održavale >80% vijabilnost ćelija tokom čitavog perioda kulture. Perfuziona kultura semena ima maksimalnu gustinu vijabilnih ćelija približno 33×10<6>ćelija po mL, dok dolivna kultura semena ima maksimalnu gustinu vijabilnih ćelija približno 30×10<6>ćelija po mL (Slika 7A). Titar polipeptida od interesa iz perfuzione i dolivne ćelijske kulture je približno 7 g/L (Slika 7B). Slika 7C prikazuje da su atributi kvaliteta kao što su iCIEF, SEC, i N-glikan bili slični za sve uslove N proizvodnje bez obzira na različita N-1 semena.
Primer 4
[0095] Proizvodni postupci velikog obima za tri molekula su izvedena u Bristol-Myers Squibbovoj GMP fabrici bilo na skali od 1000 L (za ćelijsku liniju A) ili scale-up fabrici na skali od 500 L (za ćelijske linije B i C). N-1 kulture semena za ćelijske linije A i B su koristile šaržnu kulturu obogaćenu sa glukozom i hranljivim materijama, dok je N-1 seme za ćelijsku liniju C kultivisano u dolivnom režimu. Pokazalo se da su sva tri postupka robusna i skalabilna do 1000 L ili 500 L.
Gustina ćelija, titar i profili kvaliteta proizvoda su u skladu sa onima u satelitskim kulturama u laboratorijskim bioreaktorima (Slike 8-10). Za ćelijsku liniju A, proizvodne kulture su sakupljene 10. dana zbog izuzetno visokog titra koji premašuje kapacitet za dalje prečišćavanje. Skraćeno trajanje kulture za ćelijsku liniju A omogućilo je da se nova proizvodna kultura inokuliše svake nedelje (sa dve proizvodne posude), značajno povećavajući proizvodnju.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Postupak za proizvodnju velikog obima rekombinantnog polipeptida od interesa, koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimuju rekombinantni polipeptid od interesa u N-1 fazi, neperfuzionom sistemu kulture, pri čemu su ćelije domaćina kultivisane u obogaćenom medijumu da bi se dobila gustina vijabilnih ćelija N-1 faze od najmanje 5 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL; i inokulaciju N proizvodnog sistema kulture sa velikom gustinom semena od najmanje 1.5 × 10<6>ćelija po mL sa ćelijama domaćina iz N-1 faze, neperfuzionog sistema kulture, pri čemu obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika u odnosu na neobogaćeni medijum i/ili povećanu količinu hranljivih materija koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina u odnosu na neobogaćeni medijum.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu N-1 faza, neperfuzioni sistem kulture je šaržna kultura i ćelija domaćina je kultivisana u obogaćenom medijumu, ili pri čemu N-1 faza, neperfuzioni sistem kulture je dolivna kultura i ćelija domaćina je kultivisana u medijumu za seme uz dodatak hranljivog medijuma.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu gustina vijabilnih ćelija N-1 faze je najmanje 10 × 10<6>, najmanje 15 × 10<6>, najmanje 20 × 10<6>, najmanje 25 × 10<6>, ili najmanje 30 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, pri čemu vijabilnost ćelija poslednjeg dana N-1 faze je najmanje 80%, najmanje 85%, ili najmanje 90%.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu medijum je obogaćen hranljivim medijumom najmanje 5% u odnosu na neobogaćeni medijum, najmanje 10% u odnosu na neobogaćeni medijum, najmanje 15% u odnosu na neobogaćeni medijum, ili najmanje 20% u odnosu na neobogaćeni medijum.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu obogaćeni medijum ili hranljivi medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu izvor ugljenika je glukoza.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, pri čemu obogaćeni medijum ili hranljivi medijum sadrži povećanu količinu hranljivih materija, odabranih od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina.
9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, pri čemu obogaćeni medijum sadrži povećanu količinu izvora ugljenika i hranljivih materija koje su odabrane od aminokiselina, lipida, vitamina, minerala, i poliamina.
10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu ćelija domaćina je ćelija sisara.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, pri čemu ćelija domaćina je CHO ćelija.
12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, pri čemu N proizvodni sistem kulture je dolivni bioreaktor.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, pri čemu titar polipeptida od interesa je najmanje 100 mg/L, najmanje 1 g/L, najmanje 3 g/L, najmanje 5 g/L ili najmanje 10 g/L.
14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, pri čemu se ćelije domaćina kultivišu u bazalnom medijumu ili obogaćenom bazalnom medijumu da bi se dobila gustina vijabilnih ćelija u N fazi proizvodnje od najmanje 1.5 × 10<6>, najmanje 5 × 10<6>, ili najmanje 10 × 10<6>vijabilnih ćelija po mL.
15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, koji dalje obuhvata korak izolovanja polipetida od interesa iz N proizvodnog sistema kulture.
RS20240475A 2018-07-03 2019-07-02 Postupak proizvodnje rekombinantnih proteina RS65472B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862693606P 2018-07-03 2018-07-03
PCT/US2019/040298 WO2020010080A1 (en) 2018-07-03 2019-07-02 Methods of producing recombinant proteins
EP19745845.8A EP3818078B1 (en) 2018-07-03 2019-07-02 Methods of producing recombinant proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65472B1 true RS65472B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=67470657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240475A RS65472B1 (sr) 2018-07-03 2019-07-02 Postupak proizvodnje rekombinantnih proteina

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20210253996A1 (sr)
EP (2) EP3818078B1 (sr)
JP (3) JP7419273B2 (sr)
KR (2) KR20250153311A (sr)
CN (1) CN112839954A (sr)
AU (1) AU2019299358B2 (sr)
CA (1) CA3104684A1 (sr)
DK (1) DK3818078T3 (sr)
EA (1) EA202092904A1 (sr)
ES (1) ES2976708T3 (sr)
FI (1) FI3818078T3 (sr)
HR (1) HRP20240584T1 (sr)
HU (1) HUE066560T2 (sr)
IL (2) IL324666A (sr)
LT (1) LT3818078T (sr)
MX (1) MX2020013633A (sr)
PL (1) PL3818078T3 (sr)
PT (1) PT3818078T (sr)
RS (1) RS65472B1 (sr)
SG (1) SG11202012582QA (sr)
SI (1) SI3818078T1 (sr)
SM (1) SMT202400173T1 (sr)
WO (1) WO2020010080A1 (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK181991B1 (en) * 2021-11-11 2025-05-15 Dsm Ip Assets Bv Combined fermentation process for producing one or more human milk oligosaccharide(s) (hmo(s)) in escherichia coli
WO2023242238A1 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 UCB Biopharma SRL Cell culture processes
EP4339274B1 (en) 2022-09-13 2025-03-26 Sartorius Stedim Biotech GmbH Method for operating a bioprocess installation for production of a bioproduct
KR20240172522A (ko) * 2023-06-01 2024-12-10 (주)알테오젠 지속형 호르몬 수용체 길항제의 생산 방법

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515893A (en) 1979-04-26 1985-05-07 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
DE68919361T2 (de) 1988-06-21 1995-05-24 Genentech Inc Therapeutische zusammensetzungen für die behandlung von myocard-infarkten.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ES2193136T3 (es) 1991-08-14 2003-11-01 Genentech Inc Variantes de inmunoglubina para receptores especificos de fc epsilon.
AU687755B2 (en) 1992-08-21 1998-03-05 Genentech Inc. Method for treating an LFA-1-mediated disorder
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ES2108566T3 (es) 1993-12-10 1997-12-16 Genentech Inc Procedimientos para diagnosticar alergias y para seleccionar agentes terapeuticos antialergicos.
WO1995019181A1 (en) 1994-01-18 1995-07-20 Genentech, Inc. A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS
US5707622A (en) 1994-03-03 1998-01-13 Genentech, Inc. Methods for treating ulcerative colitis
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
CA2242414C (en) 1996-01-23 2012-01-03 Genentech, Inc. Anti-cd18 antibodies for use against stroke
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
EP0941344B1 (en) 1996-11-27 2004-05-19 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-CD11a ANTIBODIES
KR100816621B1 (ko) 1997-04-07 2008-03-24 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체
ES2293682T5 (es) 1997-05-15 2011-11-17 Genentech, Inc. Anticuerpo anti-apo2.
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
ES2309012T3 (es) 1999-10-29 2008-12-16 Genentech, Inc. Composiciones del anticuerpo anti-psca y a sus procedimientos contra celulas cancerigenas que expresen psca.
US7335491B2 (en) * 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
AU2007294731B2 (en) * 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
HUE042314T2 (hu) 2011-02-07 2019-06-28 Cerenis Therapeutics Holding Sa Lipoprotein komplexek és azok gyártása és alkalmazásai
PT2837680T (pt) * 2011-07-01 2020-04-17 Amgen Inc Cultura celular de mamífero
WO2015095809A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Biogen Idec Ma Inc. Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality
MA40021A (fr) * 2014-06-03 2015-12-10 Lupin Ltd Processus de culture cellulaire destiné à produire une protéine
AU2015269365A1 (en) * 2014-06-04 2016-12-15 Amgen Inc. Methods for harvesting mammalian cell cultures
US9813410B2 (en) 2014-06-26 2017-11-07 Rakuten, Inc. Information processing apparatus, information processing method, and information processing program

Also Published As

Publication number Publication date
US20210253996A1 (en) 2021-08-19
AU2019299358B2 (en) 2026-04-02
IL324666A (en) 2026-01-01
CA3104684A1 (en) 2020-01-09
IL279782A (en) 2021-03-01
CN112839954A (zh) 2021-05-25
WO2020010080A1 (en) 2020-01-09
PL3818078T3 (pl) 2024-04-29
EP4368699A2 (en) 2024-05-15
BR112020025623A2 (pt) 2021-03-23
IL279782B1 (en) 2026-01-01
SMT202400173T1 (it) 2024-07-09
JP2024050590A (ja) 2024-04-10
PT3818078T (pt) 2024-04-18
JP7419273B2 (ja) 2024-01-22
ES2976708T3 (es) 2024-08-07
EP3818078A1 (en) 2021-05-12
AU2019299358A1 (en) 2021-02-18
EP3818078B1 (en) 2024-02-28
FI3818078T3 (fi) 2024-05-14
DK3818078T3 (da) 2024-05-21
MX2020013633A (es) 2021-03-25
US20250171732A1 (en) 2025-05-29
JP2021529527A (ja) 2021-11-04
EP4368699A3 (en) 2024-09-11
KR20250153311A (ko) 2025-10-24
SI3818078T1 (sl) 2024-05-31
KR20210027427A (ko) 2021-03-10
HRP20240584T1 (hr) 2024-07-19
KR102870511B1 (ko) 2025-10-15
SG11202012582QA (en) 2021-01-28
LT3818078T (lt) 2024-04-25
JP2026048825A (ja) 2026-03-17
HUE066560T2 (hu) 2024-08-28
EA202092904A1 (ru) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250171732A1 (en) Methods of producing recombinant proteins
US20240093143A1 (en) Cell culture compositions and methods for polypeptide production
US20220315887A1 (en) Methods of improving protein productivity in fed-batch cell cultures
JP2018531619A (ja) 灌流様式において組換えたんぱく質の生産プロファイルを調節する方法
US20090142805A1 (en) High expression cell line that eliminates gene amplification
US12486525B2 (en) Methods for increasing productivity of therapeutic proteins
EA048403B1 (ru) Способы получения рекомбинантных белков
BR112020025623B1 (pt) Método para a produção, em grande escala, de um polipeptídeo recombinante de interesse
US20250115666A1 (en) Cell culture methods for producing therapeutic proteins
WO2026006162A2 (en) B vitamin modulation