RS65568B1

RS65568B1 - Postupci za predviđanje korisnosti neoantigena za imunoterapiju

Info

Publication number: RS65568B1
Application number: RS20240614A
Authority: RS
Inventors: Mathias Vormehr; Ugur Sahin; Barbara Schrörs; Martin Löwer; Sebastian Boegel
Original assignee: BioNTech SE; Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2024-06-28
Also published as: KR102358620B1; LT3792628T; ES2826480T3; LT3455625T; IL262680A; RU2018137721A3; US20190178871A1; PT3455625T; AU2017264546A1; IL262680B1; JP2024096712A; MX393653B; MA43794B1; EP3455625A1; SI3792628T1; RU2018137721A; IL262680B2; PT3792628T; ZA201805809B; DK3792628T3

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za predviđanje korisnosti proteina, kao što su epitopi T ćelija, koje eksprimiraju ćelije kancera, za antikancersku imunoterapiju pacijenata. Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na postupke za predviđanje da li su proteini, kao što su neoepitopi povezani sa tumorom, imunogeni i, konkretno, korisni za antikancersku imunoterapiju. Postupci pronalaska mogu da se koriste, konkretno, za obezbeđivanje vakcina koje su specifične za tumor pacijenta i, prema tome, u kontekstu personalizovanih vakcina protiv kancera.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Evolucija imunskog sistema kod vertebrata rezultovala je sistemom visoke efikasnosti baziranim na dva tipa odbrane: urođenom i adaptivnom imunitetu. Nasuprot evoluciono drevnom urođenom imunskom sistemu koji počiva na invarijantnim receptorima koji prepoznaju opšte molekulske obrasce patogena, adaptivna imunost se zasniva na visokospecifičnim antigenskim receptorima na B ćelijama (B limfociti) i T ćelijama (T limfociti), i klonskoj selekciji. Dok B ćelije sekrecijom antitela uspostavljaju humoralni imunski odgovor, T ćelije posreduju u ćelijskom imunskom odgovoru koji dovodi do destrukcije prepoznatih ćelija.

[0003] T ćelije imaju centralnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama, kod ljudi i životinja. Prepoznavanje i vezivanje sa određenim antigenom posredovano je receptorima T ćelija koji se eksprimiraju na površini T ćelija. T-ćelijski receptor (TCR) T ćelije može da interaguje sa imunogenim peptidima (epitopi) vezanim za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i prezentovanim na površini ciljnih ćelija. Specifično vezivanje TCR pokreće signalnu kaskadu unutar T ćelije dovodeći do proliferacije i diferencijacije u zrelu efektorsku T ćeliju. Da bi mogli da ciljaju veliki broj različitih antigena, T-ćelijski receptori treba da imaju veliku raznovrsnost.

[0004] Antigen-specifična imunoterapija ima za cilj da poboljša ili indukuje specifični imunski odgovor kod pacijenata, kako bi se infektivne ili maligne bolesti kontrolisale. Identifikacija rastućeg broja antigena pridruženih patogenima i tumorima dovela je do formiranja široke kolekcije ciljeva pogodnih za imunoterapiju. Ćelije koje prezentuju imunogene peptide (epitope) poreklom iz ovih antigena mogu biti specifični ciljevi u strategijama aktivne ili pasivne imunizacije. Aktivna imunizacija teži da kod pacijenta indukuje i razvije antigen-specifične T ćelije sposobne da specifično prepoznaju i ubiju obolele ćelije. Nasuprot tome, pasivna imunizacija počiva na adoptivnom transferu T ćelija koje su ekspandirane i opciono genetički inženjerisane in vitro (adoptivna T ćelijska terapija; ACT).

[0005] Cilj tumorskih vakcina je indukovanje endogenih tumor-specifičnih imunskih odgovora aktivnom imunizacijom. Za tumorsku vakcinaciju mogu se koristiti različiti formati antigena, uključujući cele obolele ćelije, proteine, peptide ili imunizujuće vektore kao što su RNK, DNK ili virusni vektori, koji mogu da se primene direktno in vivo ili in vitro podsticanjem DC posle transfera u pacijenta.

[0006] Imunoterapija zasnovana na ACT može se široko definisati kao oblik pasivne imunizacije prethodno senzitizovanim T ćelijama prenetim u neimune primaoce ili autologog domaćina posle ex vivo ekspanzije, od prekursora niske učestalosti do klinički relevantnog broja ćelija. Pristup koji prevazilazi ograničenja ACT je adoptivni transfer autolognih T ćelija reprogramiranih da eksprimiraju tumor-reaktivni TCR definisane specifičnosti, tokom kratkotrajnog ex vivo kultivisanja posle kojeg sledi reinfuzija u pacijenta.

[0007] Otkriće više patogen- i tumor-asociranih antigena obezbedilo je osnov za razvijanje antigen-specifičnih imunoterapijskih koncepata. Antigeni pridruženi tumoru (TAA) su neuobičajeni proteini koji se eksprimiraju na tumorskim ćelijama, zbog njihove genetičke nestabilnosti, a ne eksprimiraju se ili se ograničeno eksprimiraju u normalnim ćelijama. Ovi TAA mogu dovesti do toga da imunski sistem specifično prepozna maligne ćelije.

[0008] Kanceri mogu nastati usled akumulacije genomskih mutacija i epigenetičkim promenama, od kojih jedan deo može imati ulogu uzročnika. Pored antigena udruženih sa tumorom, humani kanceri nose prosečno 100-120 nesinonimnih mutacija, od kojih se mnoge mogu ciljati vakcinama. Više od 95% mutacija u tumoru jedinstveno je i specifično za pacijenta. Broj somatskih mutacija koje dovode do promene proteina, koje mogu rezultovati epitopima za T ćelije specifičnim za tumor, u opsegu je od 30 do 400.

[0009] Mutacije se razmatraju kao idealni ciljevi za imunoterapiju kancera. Pošto su u pitanju neoepitopi sa striktnim odsustvom ekspresije u zdravim tkivima, očekuje se da su bezbedni i da bi mogli premostiti centralne mehanizme tolerancije. Nedavno smo predložili pristup personalizovane imunoterapije koja cilja spektar individualnih mutacija (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)).

[0010] Uprkos rastućem broju ciljnih struktura atraktivnih za imunoterapijske pristupe, definicija epitopa pogodnih za imunoterapiju i dalje je izazov. Postoji, prema tome, potreba za modelom koji predviđa da li će epitop, tačnije neoepitop, indukovati efikasan imunitet i tako biti koristan u imunoterapiji.

[0011] Ovde pokazujemo da su imunogeni antigeni i epitopi izrazito prisutni u određenim subćelijskim odeljcima.

[0012] Poznato je da se imunski odgovor protiv tumorskih antigena, tačnije mutiranih tumorskih antigena, ne pokreće samim tumorskim ćelijama već antigen-prezentujućim ćelijama, tačnije dendritskim ćelijama koje prihvataju tumorski antigen oslobođen iz tumorskih ćelija. Isto tako, poznato je da za postizanje efikasnog imunskog odgovora, oslobođeni tumorski antigen koji su preuzele antigen-prezentujuće ćelije treba da se obradi i prezentuje u kontekstu MHC molekula klase II da bi se indukovao CD4 imunski odgovor (egzogena prezentacija) ili MHC molekula klase I da bi se indukovao CD8 imunski odgovor (unakrsna prezentacija). Za ovaj drugi imunski odgovor potrebno je postojanje CD4 imunskog odgovora protiv istog ili različitog tumorskog antigena dostavljenog istoj antigen-prezentujućoj ćeliji (Bennett et al., J. Exp. Med. 186, 65-70 (1997)).

[0013] Wang et al. (Cancer Biology & Therapy 3(9), 806-811, 2004) daje pregled primene metode zvane SEREX (serološka analiza tumorskog antigena pomoću biblioteka ekspresije rekombinantne cDNK), koja se koristi za identifikaciju antigena povezanih sa tumorom, u istraživanju kancera želuca, i saznanja stečenih iz kliničkih studija koje su procenjivale antigene definisane pomoću metode SEREX kao vakcine za imunoterapiju kancera. Türeci et al. (Clinical Cancer Research 22(8), 1885-1896, 2016) daju pregled individualizovanih neoepitopskih vakcina sa posebnim fokusom na klinički razvoj takvih vakcina.

[0014] Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, veruje se da ćelijska lokalizacija antigena u obolelim ćelijama kao što su tumorske ćelije određuje da li će antigen-prezentujuće ćelije preuzeti i prezentovati antigen. Egzozomi oslobođeni iz obolelih ćelija kao što su tumorske ćelije sadrže iRNK, proteine kao i MHC peptidne komplekse, tako da mogu preneti ove komponente antigenprezentujućim ćelijama. Egzozomi nastaju invaginacijom i, prema tome, pored molekula endocitotske membrane, sadrže uglavnom komponente citosola. Prema tome, veruje se da su citosolne komponente kao što su proteini prisutne u egzozomima u povećanoj meri i mogu se preneti u antigen-prezentujuće ćelije. Egzozomi mogu takođe produktivno prenositi iRNK, koja može da se translatira u ćelijama koje preuzimaju RNK. Prema tome, bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, veruje se da su peptidi ili polipeptidi sadržani u egzozomima, tačnije citosolni peptidi ili proteini, ili peptidi ili polipeptidi čija je kodirajuća RNK sadržana u egzozomima prema navodima, posebno korisni za imunoterapiju zbog toga što antigen-prezentujuće ćelije preuzimaju egzozome i prezentuju peptide i proteine (opciono posle translacije kodirajuće RNK). Egzozomi su, dakle, transportni prenosnici peptida, proteina ili RNK u antigen-prezentujuće ćelije i štite peptide, proteine ili RNK od razgradnje proteazama i ribonukleazama. Alternativno, moguće je da antigen-prezentujuće ćelije preuzimaju peptide i proteine u kompleksu sa drugim molekulima kao što su antitela, preko receptor-zavisnog mehanizma.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0015] Predmetni pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

[0016] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za predviđanje korisnosti proteina koji eksprimiraju ćelije kancera za antikancersku imunoterapiju pacijenta, pri čemu navedeni protein sadrži peptid koji se vezuje za molekul MHC klase I, koji sadrži neoepitop povezan sa kancerom, koji sadrži somatsku mutaciju specifičnu za kancer, gde postupak obuhvata utvrđivanje postojanja odgovora antitela na protein, pri čemu se odgovor antitela utvrđuje korišćenjem kompjuterskog analitičkog postupka, gde postojanje odgovora antitela pacijenta na protein ukazuje na to da je protein koristan za imunoterapiju pacijenta sa kancerom.

[0017] U jednom primeru izvođenja, somatska mutacija specifična za kancer se identifikuje korišćenjem sekvenciranja sledeće generacije (NGS). U nekim primerima izvođenja, prezentacija neoepitopa pomoću antigen-prezentujućih ćelija pacijenta aktivira T ćelije usmerene na neoepitop.

[0018] U nekim primerima izvođenja, postupak za predviđanje korisnosti proteina koji eksprimiraju ćelije kancera za antikancersku imunoterapiju pacijenta može da se koristi u kompjuterski implementiranom postupku za dizajniranje vakcine.

KRATAK OPIS NAVODA

[0019] Predmetno otkriće obezbeđuje navode koji u nekim pogledima prevazilaze pronalazak kao takav, koji je definisan isključivo priloženim patentnim zahtevima. Navodi su dati da bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovao mogući povezani tehnički razvoj. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska. Konkretno, termini "primer izvođenja" i "aspekt" ne treba da se tumače kao da se nužno odnose na primer izvođenja pronalaska, osim ako "primer izvođenja" ili "aspekt" o kojima je reč ne spadaju u obim patentnih zahteva.

[0020] U jednom aspektu, navodi se odnose na postupak za predviđanje korisnosti proteina ili njegovog fragmenta, koje eksprimiraju obolele ćelije, za imunoterapiju, postupak uključuje utvrđivanje distribucije ili lokalizacije proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina.

[0021] U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje utvrđivanje da li su protein ili nukleinska kiselina koja ga kodira, ili fragment proteina locirani ili visoko zastupljeni u citosolu i/ili u egzozomima in vivo.

[0022] U jednom primeru izvođenja, lokalizacija ili visoka zastupljenost proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina u citosolu i/ili u egzozomima, ukazuju na to da su protein ili njegov fragment korisni za imunoterapiju.

[0023] U još jednom aspektu, navodi se odnose na postupak za predviđanje korisnosti proteina ili njegovog fragmenta, koje eksprimiraju obolele ćelije, za imunoterapiju, postupak uključuje utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama.

[0024] U jednom primeru izvođenja, unakrsna prezentacija proteina ili njegovog fragmenta antigen-prezentujućim ćelijama ukazuje na to da su protein ili njegov fragment korisni za imunoterapiju.

[0025] U jednom primeru izvođenja, utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama uključuje utvrđivanje da li su protein ili nukleinska kiselina koja ga kodira, ili fragment proteina locirani ili visoko zastupljeni u citosolu i/ili egzozomima in vivo.

[0026] U jednom primeru izvođenja, lokalizacija ili visoka zastupljenost proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina u citosolu i/ili egzozomima ukazuju na to da se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama.

[0027] U jednom primeru izvođenja, utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama uključuje utvrđivanje postojećeg odgovora antitela na protein ili njegov fragment.

[0028] U jednom primeru izvođenja, postojeći odgovor antitela na protein ili njegov fragment ukazuje na to da se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama.

[0029] U jednom primeru izvođenja, utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama uključuje utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za F aktin.

[0030] U jednom primeru izvođenja, vezivanje proteina ili njegovog fragmenta za F aktin ukazuje na to da se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama.

[0031] U jednom primeru izvođenja, utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama uključuje utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za RNK.

[0032] U jednom primeru izvođenja, vezivanje proteina ili njegovog fragmenta za RNK ukazuje na to da se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama.

[0033] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, proteinski fragment je prisutan u egzozomima kao MHC peptidni kompleks, poželjno na površini egzozoma.

[0034] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, lokalizacija ili visoka zastupljenost proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina u citosolu ukazuju na obradu i prezentovanje proteina u MHC I putu, poželjno obolelih ćelija. U jednom primeru izvođenja, obrada i prezentovanje proteina u MHC I putu za rezultat imaju to da CD8+ T ćelije prepoznaju komplekse koje formiraju MHC I i fragmenti proteina.

[0035] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, lokalizacija ili visoka zastupljenost proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina u egzozomima ukazuju na akumulaciju proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina u antigenprezentujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, akumulaciju proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina u antigen-prezentujućim ćelijama ukazuje na obradu i prezentovanje proteina u MHC I i/ili MHC II putu, poželjno antigen-prezentujućih ćelija. U jednom primeru izvođenja, obrada i prezentacija proteina u MHC I putu za rezultat imaju to da CD8+ T ćelije prepoznaju komplekse koje formiraju MHC I i fragmenti proteina.

[0036] U još jednom aspektu, navodi se odnose na postupak za predviđanje korisnosti proteina ili njegovog fragmenta, eksprimiranih od strane obolelih ćelija, u imunoterapiji, postupak uključuje utvrđivanje jednog ili više od sledećeg:

(a) utvrđivanje postojećeg odgovora antitela na protein ili njegov fragment,

(b) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za F aktin, i/ili

(c) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za RNK.

[0037] U jednom primeru izvođenja, postojeći odgovor antitela na protein ili njegov fragment ukazuje na to da su protein ili njegov fragment korisni za imunoterapiju.

[0038] U jednom primeru izvođenja, vezivanje proteina ili njegovog fragmenta za F aktin ukazuje na to da su protein ili njegov fragment korisni za imunoterapiju.

[0039] U jednom primeru izvođenja, vezivanje proteina ili njegovog fragmenta za RNK ukazuje na to da su protein ili njegov fragment korisni za imunoterapiju.

[0040] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, protein ili njegov fragment uključuju aminokiselinsku modifikaciju specifičnu za bolest. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska modifikacija nastala je usled somatske mutacije specifične za bolest.

[0041] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, bolest je kancer i imunoterapija je antikancerska imunoterapija.

[0042] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, proteinski fragment je MHC-vezujući peptid ili potencijalni MHC-vezujući peptid.

[0043] U još jednom aspektu, navodi se odnose na postupak za biranje i/ili rangiranje aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest u pogledu njihove korisnosti u imunoterapiji, postupak uključuje korake:

(i) identifikovanje proteina koje eksprimiraju obolele ćelije, svaki protein uključuje najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju specifičnu za bolest, i

(ii) utvrđivanje distribucije ili lokalizacije proteina identifikovanog pod (i) ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina, i

(iii) ponavljanja koraka (ii) za najmanje još jedan protein identifikovan pod (i).

[0044] U jednom primeru izvođenja, korak (ii) uključuje utvrđivanje da li su protein ili nukleinska kiselina koja ga kodira, ili fragment proteina, locirani ili visoko zastupljeni u citosolu i/ili u egzozomima in vivo.

[0045] U jednom primeru izvođenja, lokalizacija ili visoka zastupljenost proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina, u citosolu i/ili u egzozomima ukazuju na to da je aminokiselinska modifikacija specifična za bolest korisna za imunoterapiju.

[0046] U još jednom aspektu, navodi se odnose na postupak za biranje i/ili rangiranje aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest u pogledu njihove korisnosti u imunoterapiji, postupak uključuje korake:

(ii) utvrđivanje da li se protein identifikovan pod (i) ili fragment proteina unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigenprezentujućim ćelijama, i

(iii) ponavljanje koraka (ii) za najmanje još jedan protein identifikovan pod (i).

[0047] U jednom primeru izvođenja, unakrsna prezentacija proteina ili njegovog fragmenta antigen-prezentujućim ćelijama ukazuje na to da je aminokiselinska modifikacija specifična za bolest korisna za imunoterapiju.

[0048] U još jednom aspektu, navodi se odnose na postupak za biranje i/ili rangiranje aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest u pogledu njihove korisnosti u imunoterapiji, postupak uključuje korake:

(ii) utvrđivanje, za protein identifikovan pod (i) ili fragment proteina, jednog ili više od sledećeg:

(a) utvrđivanje postojećeg odgovora antitela na protein ili njegov fragment, (b) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za F aktin, i/ili

(c) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za RNK, i

[0049] U jednom primeru izvođenja, postojeći odgovor antitela na protein ili njegov fragment ukazuje na to da je aminokiselinska modifikacija specifična za bolest korisna za imunoterapiju.

[0050] U jednom primeru izvođenja, vezivanje proteina ili njegovog fragmenta za F aktin ukazuje na to da je aminokiselinska modifikacija specifična za bolest korisna za imunoterapiju.

[0051] U jednom primeru izvođenja, vezivanje proteina ili njegovog fragmenta za RNK ukazuje na to da je aminokiselinska modifikacija specifična za bolest korisna za imunoterapiju.

[0052] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, aminokiselinska modifikacija specifična za bolest sastoji se od proteinskog fragmenta koji je MHC vezujući peptid ili potencijalni MHC vezujući peptid.

[0053] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, postupak se koristi u izradi vakcine. U jednom primeru izvođenja, vakcina se izvodi iz jednog ili više proteina ili njihovih fragmenata ili jedne ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest, za koje je predviđeno da su korisni za imunoterapiju.

[0054] U dodatnom aspektu, navodi se odnose na postupak za obezbeđivanje vakcine, koji uključuje korak: identifikovanja jednog ili više proteina ili njihovih fragmenata ili jedne ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest, za koje je predviđeno da su korisni za imunoterapiju, postupkom prema bilo kom od aspekata opisanih u ovom tekstu. U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje još i korak: obezbeđivanja vakcine koja sadrži peptid ili polipeptid uključujući jedan ili više proteina ili njihovih fragmenata ili jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest, za koje je predviđeno da su korisni za imunoterapiju, ili nukleinsku kiselinu koja kodira peptid ili polipeptid.

[0055] U još jednom aspektu, navodi se odnose na vakcinu proizvedenu prema postupku iz bilo kojeg od aspekata opisanih u ovom tekstu.

[0056] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, indikacija da su protein ili njegov fragment, eksprimirani od strane obolelih ćelija, korisni za imunoterapiju upućuje na to da će protein ili njegov fragment, posle primene (opciono u formatu kodirajuće nukleinske kiseline), biti imunogeni.

[0057] U jednom primeru izvođenja svih aspekata navoda, proteinski fragment opisan u ovom tekstu je MHC-vezujući peptid ili potencijalno MHC-vezujući peptid (npr. predviđanje vezivanja za MHC ukazuje na to da će se proteinski fragment vezati za MHC). U jednom primeru izvođenja, MHC-vezujući peptid je modifikovani peptid koji je fragment modifikovanog proteina.

[0058] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije proteina ili peptida identifikovane su identifikovanjem nesinonimnih mutacija u jednom ili više protein-kodirajućih regiona.

[0059] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije se identifikuju delimičnim ili potpunim sekvenciranjem genoma ili transkriptoma jedne ili više ćelija kao što su jedna ili više kancerskih ćelija i opciono jedna ili više nekancerskih ćelija i identifikovanjem mutacija u jednom ili više protein-kodirajućih regiona. U jednom primeru izvođenja, pomenute mutacije su somatske mutacije. U jednom primeru izvođenja, pomenute mutacije su kancerske mutacije.

[0060] U jednom primeru izvođenja, posebno u cilju obezbeđivanja personalizovane vakcine za pacijenta kao što je pacijent oboleo od kancera, modifikacija ili modifikacije prisutne su kod pomenutog pacijenta, a postupci prema navodima izvode se za pomenutog pacijenta. U još jednom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju vakcinu koja se može dobiti korišćenjem postupaka prema ovim navodima. Poželjni primeri izvođenja takvih vakcina opisani su u ovom tekstu.

[0061] Vakcina obezbeđena prema navodima može uključivati farmaceutski prihvatljivi nosač i može opciono sadržati jedan ili više adjuvanasa, stabilizera, itd. Vakcina može biti u vidu terapijske ili profilaktičke vakcine.

[0062] Sledeći aspekt odnosi se na postupak indukovanja imunskog odgovora kod pacijenta, uključujući primenu, kod pacijenta, vakcine obezbeđene prema navodima.

[0063] Sledeći aspekt odnosi se na postupak za lečenje pacijenta, koji uključuje korake:

(a) obezbeđivanje imunoterapijskog sredstva opisanog u ovom tekstu, kao što je vakcina, korišćenjem postupaka prema navodima; i

(b) primena pomenutog imunoterapijskog sredstva kod pacijenta.

[0064] Sledeći aspekt odnosi se na postupak za lečenje pacijenta, koji uključuje primenu, kod pacijenta, imunoterapijskog sredstva opisanog u ovom tekstu, na primer vakcine.

[0065] U jednom primeru izvođenja, pacijent je pacijent oboleo od kancera, a vakcina je antikancerska vakcina, na primer vakcina čija primena obezbeđuje neoepitope specifične za kancer.

[0066] U još jednom aspektu, navodi obezbeđuju vakcine opisane u ovom tekstu za upotrebu u postupcima za lečenje opisanim u ovom tekstu, posebno za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera.

[0067] Lečenje kancera opisano u ovom tekstu može se kombinovati sa hirurškom resekcijom i/ili zračenjem i/ili tradicionalnom hemioterapijom.

[0068] Druge odlike i prednosti predmetnih navoda biće jasni iz narednog detaljnog opisa i patentnih zahteva.

DETALJAN OPIS

[0069] Iako su ovi navodi detaljno opisani u nastavku, treba razumeti da ovi navodi nisu ograničeni na posebne metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisa određenih primera izvođenja. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenja koja obično razume prosečno obučen stručnjak u oblasti.

[0070] U nastavku će biti opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da oni mogu da se kombinuju na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se proizveli dodatni primeri izvođenja. Različito opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetne navode samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba shvatiti tako da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem otkrivenih i/ili poželjnih elemenata. Dalje, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim u opisu ove prijave, osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.

[0071] Poželjno, izrazi upotrebljeni u ovom tekstu definisani su kako je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H. G. W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.

[0072] U praktičnom izvođenju predmetnih navoda koristiće se, ukoliko nije drugačije navedeno, konvencionalni metodi biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnika rekombinantne DNK, koje su objašnjene u literaturi iz oblasti (uporediti npr., sa Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0073] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, ukoliko kontekst jasno ne zahteva drugačije, reč "uključiti" i varijacije kao "uključuje" i "uključujući", podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje nekog drugog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, mada u nekim primerima izvođenja takvi drugi članovi, celi brojevi ili koraci, ili grupa članova, celih brojeva ili koraka, mogu biti isključeni, tj. radi se o uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Gramatičke članove i slične reference koji se koriste u kontekstu opisivanja navoda (naročito u kontekstu patentnih zahteva) treba razumeti tako da obuhvataju i jedninu i množinu, ukoliko nije drugačije navedeno u ovom tekstu ili ukoliko nije jasno u suprotnosti sa kontekstom. Navođenje opsega vrednosti u ovom tekstu treba da služi samo kao skraćeni postupak pozivanja na svaku pojedinačnu vrednost unutar opsega. Ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu, svaka pojedinačna vrednost uključena je u specifikaciju kao da je pojedinačno u njoj navedena.

[0074] Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redom, ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu ili ukoliko nije jasno u suprotnosti sa kontekstom. Upotreba bilo kojeg i svih primera ili jezika primera (npr., "kao što je"), data u ovom tekstu namenjena je samo boljem ilustrovanju navoda.

[0075] Predmetni navodi predviđaju imunoterapiju bolesti, posebno kancerskih oboljenja, korišćenjem proteina ili fragmenta proteina prisutnog u obolelim ćelijama kao obeleživača obolelih ćelija i za njihovo ciljanje. Preciznije, obolele ćelije mogu se ciljati usmeravanjem ka fragmentu proteina prisutnog na površini obolelih ćelija u kontekstu MHC. Imunoterapija prema predmetnim navodima treba da se izvede aktivnim i/ili pasivnim imunoterapijskim pristupima.

[0076] Specifično, cilj predmetnih navoda je definisanje proteina ili njihovih fragmenata pogodnih za imunoterapiju. Kada se odgovarajući protein identifikuje, ovaj protein ili njegov fragment (opciono kao deo većeg polipeptida), ili nukleinska kiselina koja kodira protein ili fragment (opciono kao deo većeg polipeptida) mogu se koristiti kao vakcina u cilju poboljšanja imunskog odgovora na protein ili njegov fragment, posebno indukovanjem i/ili aktiviranjem odgovarajućih efektorskih ćelija kao što su T ćelije koje prepoznaju protein ili njegov fragment (posebno kada se prezentuju u kontekstu MHC), posredstvom odgovarajućeg receptora (kao što je T-ćelijski receptor ili veštački T-ćelijski receptor). Alternativno ili dodatno, mogu se primeniti efektorske ćelije kao što su T ćelije koje prepoznaju protein ili njegov fragment (posebno kada se prezentuju u kontekstu MHC) posredstvom odgovarajućeg receptora (kao što je T-ćelijski receptor ili veštački T-ćelijski receptor). Bez želje za ograničavanjem nekom određenom teorijom, veruje se da protein ili njegov fragment za koje se predmetnim navodima predviđa da su korisni u imunoterapiji, imaju veliku verovatnoću da budu preuzeti antigen-prezentujućim ćelijama, i da se prezentuju antigenprezentujućim ćelijama, posebno unakrsnim prezentovanjem, što konačno rezultuje efikasnim imunskim odgovorom protiv obolelih ćelija koje eksprimiraju protein ili njegov fragment.

[0077] Proteini definisani prema navodima kao korisni ili pogodni za imunoterapiju ovde su označeni i kao "antigeni". Proteinski fragmenti definisani prema navodima kao korisni ili pogodni za imunoterapiju ovde su označeni i kao "epitopi".

[0078] Imunoterapijski pristupi prema navodima uključuju imunizaciju:

i) proteinom ili peptidom (nativnim ili modifikovanim), ii) nukleinskom kiselinom koja kodira protein ili peptid, iii) rekombinantnim ćelijama koje kodiraju protein ili peptid, iv) rekombinantnim virusima koji kodiraju protein ili peptid i v) antigen-prezentujućim ćelijama podstaknutim proteinom ili peptidom (nativnim ili modifikovanim) ili transfektovanim nukleinskim kiselinama koje kodiraju protein ili peptid.

[0079] Imunoterapijski pristupi prema navodima uključuju i transfer:

vi) T-ćelijskih receptora koji prepoznaju protein ili peptid, i vii) efektorskih ćelija (kao što su T ćelije) koje kodiraju receptore koji prepoznaju protein ili peptid, posebno kada se prezentuju u kontekstu MHC.

[0080] Poželjni proteini i fragmenti prema navodima eksprimiraju se na način specifičan za bolest, npr. oni su antigeni ili epitopi udruženi sa bolešću (npr. prisustvo proteina ili ćelija koje eksprimiraju protein karakteristično je za bolest) i/ili uključuju jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest, npr. oni su neoantigeni ili neoepitopi udruženi sa bolešću. Poželjno, aminokiselinska modifikacija specifična za bolest nastaje zbog jedne ili više somatskih mutacija specifičnih za bolest. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska modifikacija specifična za bolest je aminokiselinska modifikacija specifična za kancer, a somatska mutacija specifična za bolest je somatska mutacija specifična za kancer. Prema tome, prema navodima vakcina poželjno sadrži aminokiselinske modifikacije specifične za bolest/somatske mutacije specifične za pacijentovu bolest, i poželjno posle primene obezbeđuje jedan ili više neoepitopa zasnovanih na mutaciji. Prema tome, vakcina može uključivati peptid ili polipeptid koji sadrži jedan ili više neoepitopa zasnovanih na mutaciji, ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti peptid ili polipeptid. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije specifične za bolest identifikuju se identifikovanjem somatskih mutacija specifičnih za bolest, npr. sekvenciranjem genomske DNK i/ili RNK obolelog tkiva ili jedne ili više obolelih ćelija.

[0081] Prema navodima, korak identifikovanja aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest i/ili identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za bolest može se obaviti pre ili posle postupaka prema navodima za predviđanje korisnosti proteina ili njegovog fragmenta, eksprimiranih od strane obolelih ćelija, za imunoterapiju. U jednom poželjnom primeru izvođenja navoda, aminokiselinske modifikacije specifične za bolest i/ili somatske mutacije specifične za bolest određuju se prvo u uzorcima pacijentovog bolesnog tkiva, a zatim sledi predviđanje korisnosti proteina koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest ili njegovog fragmenta koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest, za imunoterapiju prema postupcima prema navodima. Kada se identifikuju aminokiselinske modifikacije specifične za bolest (proteini koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest ili njihovi fragmenti koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest), mogu i da se biraju i/ili rangiraju u pogledu svoje korisnosti u imunoterapiji prema postupcima prema navodima.

[0082] Izraz "egzozomi" odnosi se na vezikule poreklom iz ćelije, prisutne u biološkim tečnostima, uključujući krv, urin, i kultivacioni medijum ćelijskih kultura. Egzozomi se oslobađaju iz ćelije kada se multivezikularna tela fuzionišu sa ćelijskom membranom ili se oslobode direktno sa ćelijske membrane. Egzozomi sadrže različite molekulske konstituente iz ćelija iz kojih vode poreklo, uključujući proteine i RNK. Iako sastav egzozomskih proteina varira u zavisnosti od toga iz kojih ćelija i tkiva vode poreklo, većina egzozoma sadrži evoluciono konzervirani opšti set proteinskih molekula. Egzozomi mogu prenositi molekule iz jedne ćelije u drugu transportovanjem membranskih vezikula, utičući time na imunski sistem, na primer na dendritske ćelije i B ćelije i mogu imati funkcionalnu ulogu u medijaciji adaptivnog imunskog odgovora na patogene i tumore.

[0083] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "citosol" odnosi se na deo citoplazme koji nije unutar membranom oivičenih podstruktura ćelije.

[0084] Prema predmetnim navodima, izraz "peptid" odnosi se na supstance koje uključuju dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 aminokiselina kovalentno spojenih peptidnim vezama. Izraz "polipeptid" ili "protein" odnosi se na velike peptide, poželjno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih rezidua, ali uopšteno izrazi "peptid", "polipeptid" i "protein" su sinonimi i koriste se u ovom tekstu naizmenično.

[0085] Prema navodima, izraz "modifikacija", u vezi sa peptidima, polipeptidima ili proteinima, odnosi se na promene u sekvenci peptida, polipeptida ili proteina u poređenju sa roditeljskom sekvencom kao što je sekvenca divljeg tipa peptida, polipeptida ili proteina. Izraz uključuje aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i aminokiselinske supstitucione varijante, poželjno aminokiselinske supstitucione varijante. Sve ove promene sekvence prema navodima mogu potencijalno stvoriti nove epitope.

[0086] Aminokiselinske insercione varijante uključuju insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu.

[0087] Aminokiselinske adicione varijante uključuju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, na primer 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više aminokiselina.

[0088] Aminokiselinske delecione varijante karakterišu se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, na primer uklanjanjem 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više aminokiselina.

[0089] Aminokiselinske supstitucione varijante karakterišu se time što je bar jedna rezidua uklonjena iz sekvence i na njeno mesto insertovana druga rezidua.

[0090] Prema navodima, modifikacija ili modifikovani peptid može biti izveden iz proteina koji sadrži modifikaciju.

[0091] Izraz "izveden" znači, prema navodima, da je određeni entitet, posebno određena peptidna sekvenca, prisutna u objektu iz kojeg je izvedena. U slučaju aminokiselinskih sekvenci, posebno određenih regiona sekvenci, "izveden" posebno znači da je relevantna aminokiselinska sekvenca izvedena iz aminokiselinske sekvence u kojoj je prisutna.

[0092] Prema navodima, proteini opisani u ovom tekstu poželjno sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest. U jednom primeru izvođenja, ta jedna ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest nalaze se u epitopima ili potencijalnim epitopima proteina. Prema tome, poželjni proteini opisani u ovom tekstu su neoantigeni koji poželjno sadrže jedan ili više neoepitopa. Slično tome, poželjan proteinski fragment opisan u ovom tekstu je fragment proteina koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest, pri čemu su poželjno jedna ili više aminokiselinskih modifikacija specifičnih za bolest smeštene unutar fragmenta proteina. Prema tome, poželjan proteinski fragment opisan u ovom tekstu je neoepitop.

[0093] Prema navodima, izraz "neoantigen" odnosi se na peptid ili protein koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa roditeljskim peptidom ili proteinom. Na primer, neoantigen može biti neoantigen pridružen tumoru, pri čemu izraz "neoantigen pridružen tumoru" uključuje peptid ili protein koji sadrži aminokiselinske modifikacije nastale zbog mutacija specifičnih za tumor.

[0094] Prema navodima, izraz "mutacija specifična za bolest" odnosi se na somatsku mutaciju prisutnu u nukleinskoj kiselini obolele ćelije, ali je nema u nukleinskoj kiselini odgovarajuće normalne tj. neobolele ćelije.

[0095] Prema navodima, izraz "mutacija specifična za tumor" ili "mutacija specifična za kancer" odnose se na somatsku mutaciju koja je prisutna u nukleinskoj kiselini tumorske ili kancerske ćelije, ali je nema u nukleinskoj kiselini odgovarajuće normalne tj. netumorske ili nekancerske ćelije. Izrazi "mutacija specifična za tumor" i "tumorska mutacija" i izrazi "mutacija specifična za kancer" i "kancerska mutacija" koriste se naizmenično u ovom tekstu.

[0096] Izraz "imunski odgovor" odnosi se na reakciju imunskog sistema, na primer na imunogene organizme kao što su bakterijske ili virusne ćelije ili supstance. Izraz "imunski odgovor" uključuje urođeni imunski odgovor i adaptivni imunski odgovor. Poželjno, imunski odgovor je povezan sa aktivacijom imunskih ćelija, indukcijom biosinteze citokina, biosintezom i/ili proizvodnjom antitela.

[0097] Poželjno je da imunski odgovor indukovan kompozicijama opisanim u ovom tekstu uključuje korake aktivacije antigen-prezentujućih ćelija kao što su dendritske ćelije i/ili makrofagi, prezentaciju antigena ili njegovog fragmenta pomenutim antigen-prezentujućim ćelijama i aktivaciju citotoksičnih T ćelija ovim prezentovanjem.

[0098] "Indukovanje imunskog odgovora" može značiti da nema imunskog odgovora pre indukcije, ali može značiti i da nema određenog nivoa imunskog odgovora pre indukcije, a posle indukcije pomenuti imunski odgovor se pojačava. Prema tome, "indukovanje imunskog odgovora" uključuje i "pojačavanje imunskog odgovora". Poželjno, posle indukovanja imunskog odgovora kod subjekta, pomenuti subjekt je zaštićen od razvijanja bolesti kao što je kancer, ili je bolesno stanje ublaženo indukovanjem imunskog odgovora. Na primer, imunski odgovor protiv antigena koji se eksprimira u tumoru može se indukovati kod pacijenta koji ima kancersko oboljenje ili kod subjekta koji je pod rizikom da razvije kancersko oboljenje. Indukovanje imunskog odgovora u ovom slučaju može značiti da je bolesno stanje subjekta ublaženo, da subjekt ne razvija metastaze, ili da subjekt koji je pod rizikom da razvije kancersko oboljenje ne razvija kancersko oboljenje.

[0099] Izrazi "ćelijski imunski odgovor" i "ćelijski odgovor" ili slični izrazi, odnose se na imunski odgovor usmeren ka ćelijama koje se karakterišu prezentovanjem antigena u kontekstu MHC molekula klase I ili klase II, uključujući T ćelije ili T-limfocite koji dejstvuju kao "pomagači" ili kao "ubice". Pomažuće T ćelije (označene i kao CD4<+>T ćelije) imaju centralnu ulogu u regulaciji imunskog odgovora, a ćelije-ubice (označene i kao citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8<+>T ćelije ili CTL) ubijaju obolele ćelije kao što su kancerske ćelije, sprečavajući nastanak većeg broja obolelih ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, predmetni navodi obuhvataju stimulaciju CTL odgovora na bolest, usmerenog protiv obolelih ćelija koje jedan ili više antigena udruženih sa bolešću eksprimiraju u kontekstu MHC molekula klase I, posebno antitumorskog CTL odgovora usmerenog protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više antigena koji se eksprimiraju u tumoru i poželjno prezentuju te antigene koji se eksprimiraju u tumoru u kontekstu MHC klase I.

[0100] Prema navodima, izrazi "antigen" ili "imunogen" obuhvataju svaku supstancu, poželjno peptid ili protein, koja je cilj imunskog odgovora i/ili koja će pobuditi imunski odgovor. Tačnije, "antigen" se odnosi na svaku supstancu koja specifično reaguje sa antitelima ili T-limfocitima (T-ćelijama). Prema predmetnim navodima, izraz "antigen" uključuje svaki molekul koji sadrži najmanje jedan epitop kao što je epitop za T ćeliju. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnih navoda je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen ili ćelije koje eksprimiraju antigen. Prema predmetnim navodima, može se koristiti svaki pogodan antigen koji je kandidat za imunsku reakciju, pri čemu je imunska reakcija poželjno ćelijska imunska reakcija. U kontekstu primera izvođenja predmetnih navoda, antigen je poželjno prezentovan ćelijom, poželjno antigen-prezentujućom ćelijom, u kontekstu MHC molekula, što rezultuje imunskom reakcijom protiv antigena. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je izveden iz prirodnog antigena. Takvi prirodni antigeni mogu uključivati ili mogu biti izvedeni iz alergena, virusa, bakterija, gljivica, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena, ili antigen može biti i tumorski antigen. Prema predmetnim navodima, antigen može odgovarati prirodnom proizvodu, na primer, virusnom proteinu, ili njegovom delu. U poželjnim primerima izvođenja, antigen je površinski polipeptid, tj. polipeptid koji se prirodno prikazuje na površini ćelije, patogena, bakterije, virusa, gljivice, parazita, alergena ili tumora. Antigen može pobuditi imunski odgovor protiv ćelije, patogena, bakterije, virusa, gljivice, parazita, alergena ili tumora.

[0101] Izraz "antigen udružen sa bolešću" koristi se u najširem smislu da označi svaki antigen udružen sa bolešću. Antigen udružen sa bolešću je molekul koji sadrži epitope koji će stimulisati domaćinov imunski sistem da pokrene ćelijski imunski odgovor specifičan za antigen i/ili humoralni odgovor antitela protiv bolesti. Antigen udružen sa bolešću može, prema tome, da se koristi u terapijske svrhe. Antigeni udruženi sa bolešću su poželjno udruženi sa infekcijom mikrobima, tipično mikrobnim antigenima, ili su udruženi sa kancerom, tipično sa tumorima.

[0102] Izraz "patogen" odnosi se na patogeni biološki materijal koji može da izazove bolest u organizmu, poželjno organizmu vertebrata. Patogeni uključuju mikroorganizme kao što su bakterije, jednoćelijski eukariotski organizmi (protozoe), gljivice, kao i virusi.

[0103] Izrazi "epitop", "antigeni peptid", "antigenski epitop", "imunogeni peptid" i "MHC-vezujući peptid" koriste se u ovom tekstu naizmenično i označavaju antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj., deo ili fragment imunološki aktivnog jedinjenja, koji se prepoznaje imunskim sistemom, na primer, koji se prepoznaje T ćelijom, posebno kada je prezentovan u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina poželjno uključuje kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i on je poželjno dug između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na primer, epitop poželjno može biti dug 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina. Prema navodima, epitop se može vezivati za MHC molekule kao što su MHC molekuli na površini ćelije i tako može biti "MHC-vezujući peptid" ili "antigeni peptid".

[0104] Izraz "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuje MHC molekule klase I i MHC molekule klase II i odnosi se na kompleks gena prisutnih u ćelijama svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli važni su za signalizaciju između limfocita i antigenprezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu se MHC proteini ili molekuli vezuju za peptide i prezentuju ih da bi bili prepoznati T-ćelijskim receptorima. Proteini kodirani MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i T ćelijama prikazuju svoje antigene (peptidne fragmente iz same ćelije) i strane antigene (npr., fragmente invadirajućih mikroorganizama). Poželjno takvi imunogeni delovi vezuju se za MHC molekule klase I ili klase II. Kako se koristi u ovom tekstu, kaže se da se imunogeni deo "vezuje za" MHC molekul klase I ili klase II ako se takvo vezivanje može detektovati korišćenjem bilo kojeg testa poznatog u struci. Izraz "MHC-vezujući peptid" odnosi se na peptid koji se vezuje za molekul MHC klase I i/ili molekul MHC klase II. U slučaju kompleksa molekul MHC klase I/peptid, vezujući peptidi su tipično dugi 8-10 aminokiselina, mada efikasni mogu biti i duži i kraći peptidi. U slučaju kompleksa molekul MHC klase II/peptid, vezujući peptidi su tipično dugi 10-25 aminokiselina i posebno dugi su 13-18 aminokiselina, iako efikasni mogu biti i duži i kraći peptidi. U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata navoda, MHC molekul je HLA molekul.

[0105] Ako je peptid deo većeg entiteta koji uključuje dodatne sekvence, npr. sekvenca ili polipeptid vakcine, i treba da se prezentuje posle obrade, tačnije posle sečenja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, posebno MHC molekulom klase I i poželjno dug je 7-30 aminokiselina, na primer dug je 7-20 aminokiselina, poželjnije dug je 7-12 aminokiselina, poželjnije dug je 8-11 aminokiselina, posebno dug je 9 ili 10 aminokiselina. Poželjno, sekvenca peptida koji treba da se prezentuje posle obrade izvedena je iz aminokiselinske sekvence antigena ili polipeptida upotrebljenog za vakcinaciju, tj., njegova sekvenca suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu antigena ili polipeptida.

[0106] Prema tome, MHC-vezujući peptid u jednom primeru izvođenja uključuje sekvencu koja suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu antigena.

[0107] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "neoepitop" označava epitop koji nije prisutan u referenci kao što je normalna neobolela ćelija (npr. nekancerska ćelija) ili ćelija germinativne linije, ali se nalazi u obolelim ćelijama (npr. kancerske ćelije). Ovo uključuje, posebno, situacije u kojima se odgovarajući epitop nalazi na normalnim neobolelim ćelijama ili ćelijama germinativne linije, međutim, zbog jedne ili više mutacija u oboleloj ćeliji, sekvenca epitopa je promenjena tako da rezultuje neoepitopom.

[0108] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "T ćelijski epitop" odnosi se na peptid koji se vezuje za MHC molekul u konfiguraciji koju prepoznaje T-ćelijski receptor. Tipično, T ćelijski epitopi se prezentuju na površini antigen-prezentujuće ćelije.

[0109] T ćelijski epitop prema navodima poželjno se odnosi na deo ili fragment antigena koji može da stimuliše imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena ili ćelija koje se karakterišu ekspresijom antigena i poželjno prezentovanjem antigena, kao što su obolele ćelije, posebno kancerske ćelije. Poželjno, T ćelijski epitop sposoban je da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koji se karakteriše prezentovanjem antigena u kontekstu MHC molekula klase I i, poželjno, sposoban je da stimuliše citotoksične T limfocite (CTL) koji odgovaraju na antigen.

[0110] U jednom primeru izvođenja, vakcina prema predmetnim navodima uključuje epitop pogodan za vakcinaciju ciljnog organizma. Stručnjak u oblasti znaće da se jedan od principa imunobiologije i vakcinacije zasniva na činjenici da se imunoprotektivna reakcija na bolest proizvodi imunizacijom organizma vakcinom koja je imunološki relevantna u pogledu oboljenja koje treba lečiti. Prema predmetnim navodima, antigen se bira iz grupe koja sadrži sopstveni antigen i strani antigen. Strani antigen je poželjno bakterijski antigen, virusni antigen, gljivični antigen, alergen ili parazitski antigen. Poželjno je da antigen sadrži epitop koji je sposoban da pobudi imunski odgovor u ciljnom organizmu. Na primer, epitop može pobuditi imunski odgovor protiv bakterije, virusa, gljivice, parazita, alergena ili tumora.

[0111] U nekim primerima izvođenja, strani antigen je bakterijski antigen. U nekim primerima izvođenja, antigen pobuđuje imunski odgovor protiv bakterije koja inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući domestifikovane životinje. Poželjno, bakterija protiv koje će imunski odgovor biti pobuđen je patogena bakterija.

[0112] U nekim primerima izvođenja, strani antigen je virusni antigen. Virusni antigen može na primer biti peptid iz proteina sa površine virusa, npr. polipeptid kapsida ili "šiljak" (spike) polipeptid. U nekim primerima izvođenja, antigen pobuđuje imunski odgovor protiv virusa koji inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući domestifikovane životinje. Poželjno, virus protiv kojeg će imunski odgovor biti pobuđen je patogeni virus.

[0113] U nekim primerima izvođenja, strani antigen je polipeptid ili protein iz gljivice. U nekim primerima izvođenja, antigen pobuđuje imunski odgovor protiv gljivice koja inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući domestifikovane životinje. Poželjno, gljivica protiv koje će imunski odgovor biti pobuđen je patogena gljivica.

[0114] U nekim primerima izvođenja, strani antigen je polipeptid ili protein iz jednoćelijskog eukariotskog parazita. U nekim primerima izvođenja, antigen pobuđuje imunski odgovor protiv jednoćelijskog eukariotskog parazita, poželjno patogenog jednoćelijskog eukariotskog parazita. Patogeni jednoćelijski eukariotski parazit može biti npr. iz roda Plasmodium, npr. P. falciparum, P. vivax, P. malariae ili P. ovale, iz roda Leishmania, ili iz roda Trypanosoma, npr. T. cruzi ili T. brucei.

[0115] U nekim primerima izvođenja, strani antigen je alergeni polipeptid ili alergeni protein. Alergeni protein ili alergeni polipeptid pogodan je za imunoterapiju alergenom, poznatu i kao hiposenzitizacija.

[0116] U nekim primerima izvođenja, antigen je sopstveni antigen, posebno tumorski antigen. Tumorski antigeni i njihova determinacija poznati su stručnjaku u oblasti.

[0117] U kontekstu predmetnih navoda, izrazi "tumorski antigen" ili "antigen udružen sa tumorom" odnose se na proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili na specifičnim stupnjevima razvića, na primer, tumorski antigen može se pod normalnim uslovima specifično eksprimirati u želudačnom tkivu, poželjno u želudačnoj mukozi, u reproduktivnim organima, npr., u testisu, u tkivu trofoblasta, npr., u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i može se eksprimirati ili se aberantno eksprimirati u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U tom kontekstu, "ograničen broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnih navoda uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za tip ćelije, tj., proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenom tipu ćelije na određenom stupnju diferencijacije, kancer/testis antigene, tj., proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u testisu i ponekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu predmetnih navoda, tumorski antigen je poželjno udružen sa površinom kancerske ćelije i poželjno se retko eksprimira ili se ne eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuju kancerske ćelije. U kontekstu predmetnih navoda, tumorski antigen koji eksprimira kancerska ćelija subjekta, npr., pacijenta obolelog od kancerske bolesti, poželjno je sopstveni protein pomenutog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnih navoda se eksprimira pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji nisu esencijalni, tj., u tkivima ili organima koji, kada ih ošteti imunski sistem, ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koji nisu ili su teško pristupačne imunskom sistemu. Poželjno, aminokiselinska sekvenca tumorskog antigena identična je kod tumorskog antigena koji se eksprimira u normalnim tkivima i tumorskog antigena koji se eksprimira u kancerskim tkivima.

[0118] Primeri tumorskih antigena koji mogu biti korisni u predmetnim navodima su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, proteini na površini ćelije iz familije klaudina, kao što su CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 i CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ili hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGEA12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miozin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NYBR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT. Posebno poželjni tumorski antigeni uključuju CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) i CLAUDIN-6 (CLDN6).

[0119] Izraz "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost u indukovanju imunskog odgovora koji je poželjno udružen sa terapijskim tretmanima kao što je tretman protiv kancera. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "imunogeni" odnosi se na osobinu posedovanja imunogenosti. Na primer, izraz "imunogena modifikacija", kada se koristi u kontekstu peptida, polipeptida ili proteina, odnosi se na efikasnost pomenutog peptida, polipeptida ili proteina u indukovanju imunskog odgovora koji je izazvan i/ili usmeren protiv pomenute modifikacije. Poželjno, nemodifikovani peptid, polipeptid ili protein ne indukuju imunski odgovor, indukuju različit imunski odgovor ili indukuju različit nivo, poželjno niži nivo, imunskog odgovora.

[0120] Prema navodima, izraz "imunogenost" ili "imunogeni" se poželjno odnosi na relativnu efikasnost u indukovanju biološki relevantnog imunskog odgovora, tačnije imunskog odgovora korisnog za vakcinaciju. Prema tome, u jednom poželjnom primeru izvođenja, aminokiselinska modifikacija ili modifikovani peptid imunogeni su ako kod subjekta indukuju imunski odgovor protiv ciljne modifikacije, imunski odgovor može biti koristan u terapijske ili profilaktičke svrhe.

[0121] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "predviđanje korisnosti proteina ili njegovog fragmenta za imunoterapiju" odnosi se na predviđanje da li protein ili jedan ili više njegovih fragmenata kao što su epitopi, posebno T-ćelijski epitopi, mogu biti korisni za indukovanje imunskog odgovora ili ciljanje imunskog odgovora. Ako se predviđa da je protein kao što je antigen udružen sa bolešću koristan za imunoterapiju, na primer, epitopi pomenutog proteina mogu da se koriste za vakcinaciju kako je opisano u ovom tekstu ili se može primeniti upućivanje efektorskih ćelija ka epitopu pomenutog proteina. Poželjno, protein čija korisnost za imunoterapiju treba da se predvidi prema navodima, eksprimira se u pacijentovim obolelim ćelijama.

[0122] Prema navodima, T ćelijski epitop može biti prisutan u vakcini kao deo većeg entiteta kao što je sekvenca vakcine i/ili polipeptid koji uključuje više od jednog T ćelijskog epitopa. Predmetni peptid ili T ćelijski epitop proizvodi se odgovarajućim obrađivanjem. Isto tako, T ćelijski epitopi mogu da se modifikuju na jednoj ili više rezidua koje nisu esencijalne za prepoznavanje TCR ili za vezivanje za MHC. Takvi modifikovani T ćelijski epitopi mogu da se smatraju imunološki ekvivalentnim. Poželjno, T ćelijski epitop, kada se prezentuje pomoću MHC i prepoznaje T-ćelijskim receptorom, može u prisustvo pogodnih kostimulatornih signala da indukuje klonsku ekspanziju T ćelije sa T-ćelijskim receptorom koji specifično prepoznaje peptid/MHC-kompleks. Poželjno, T ćelijski epitop uključuje aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno, pomenuti fragment antigena je peptid koji se prezentuje u kontekstu MHC proteina klase I i/ili klase II.

[0123] "Obrada antigena" ili "obrada" odnosi se na degradaciju peptida, polipeptida ili proteina u proizvode obrade, a to su fragmenti pomenutog peptida, polipeptida ili proteina (npr., degradacija polipeptida u peptide) i asocijaciju jednog ili više ovih fragmenata (npr., vezivanjem) sa MHC molekulima da bi se ćelijama, poželjno antigen-prezentujućim ćelijama, prezentovali specifičnim T ćelijama.

[0124] Antigeni ograničeni na klasu II u najvećoj meri su izvedeni iz egzogenih proteina koji ulaze u antigen-prezentujuće ćelije endocitotskim putem i obrađuju se u endozomskom odeljku. Nasuprot tome, antigeni koji se prepoznaju efektorskim CTL, ograničenim na klasu I, obično su poreklom od endogeno sintetisanih proteina. Prema tome, egzogeni proteini ne mogu obezbediti antigene determinante za efektorske CTL ograničene na klasu I osim ako se ne uvedu direktno u citoplazmu ciljnih ćelija.

[0125] Izraz "unakrsna prezentacija" odnosi se na sposobnost antigen-prezentujućih ćelija da preuzmu, obrade i prezentuju vanćelijske antigene sa MHC klasom I molekula, CD8 T ćelijama (citotoksične T ćelije). Unakrsna stimulacija (cross-priming) opisuje stimulaciju naivnih citotoksičnih CD8+ T ćelija ovim procesom. Antigen-prezentujuće ćelije sposobne za ukrštenu prezentaciju primarno su dendritske ćelije, ali pokazano je da i makrofagi, B limfociti i endotelske ćelije sinusoida mogu to da rade.

[0126] Pokazano je da se unakrsna stimulacija dešava za virusne proteine i tumorske antigene. Ovo je dovelo do pretpostavke da unakrsna stimulacija može imunskom sistemu obezbediti mehanizam kojim on može detektovati i odgovoriti na tkivno-tropne viruse koji ne inficiraju profesionalne APC. U odsustvu takvog mehanizma, virusi mogu da izbegnu imunski nadzor izbegavajući profesionalne APC. Ovaj mehanizam imunskom sistemu obezbeđuje sredstvo za pregledanje neoantigena eksprimiranih od strane novonastalih tumorskih ćelija. Kao i egzogeni strani antigeni, egzogeni sopstveni antigeni mogu ući u put prezentovanja posredstvom molekula klase I.

[0127] "Antigen-prezentujuće ćelije" (APC) su ćelije koje na svojoj površini prezentuju peptidne fragmente proteinskih antigena u asocijaciji sa MHC molekulima. Neke APC mogu aktivirati antigen-specifične T ćelije.

[0128] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije su vrlo efikasne u internalizovanju antigena, fagocitozom ili endocitozom posredovanom receptorima, i tada na svojoj membrani prikazuju fragment antigena, vezan za MHC molekul klase II. T ćelija prepoznaje i interaguje sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II na membrani antigen-prezentujuće ćelije. Antigenprezentujuće ćelije tada proizvode dodatni kostimulatorni signal, dovodeći do aktivacije T ćelije. Ekspresija kostimulatornih molekula je definišuća odlika profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija.

[0129] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije koje imaju najširi opseg prezentacije antigena i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, zatim makrofagi, B-ćelije i određene aktivirane epitelne ćelije. Dendritske ćelije (DC) predstavljaju populaciju leukocita koji T ćelijama prezentuju antigene zadržane u perifernim tkivima, posredstvom puteva prezentovanja antigena u kontekstu MHC molekula klase II i I. Dobro je poznato da su dendritske ćelije snažni induktori imunskih odgovora i da je aktivacija ovih ćelija kritičan korak za indukovanje antitumorskog imuniteta. Dendritske ćelije se konvencionalno kategorišu kao "nezrele" i "zrele" ćelije, što se može koristiti kao jednostavan način razlikovanja dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ovu nomenklaturu ne bi trebalo shvatiti kao isključivanje svih mogućih intermedijarnih stupnjeva diferencijacije. Nezrele dendritske ćelije se karakterišu kao antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i manoznog receptora. Zreli fenotip se tipično karakteriše nižom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom ćelijskih površinskih molekula odgovornih za aktivaciju T ćelija, kao što su MHC klase I i klase II, adhezionih molekula (npr. CD54 i CD11) i kostimulatornih molekula (npr., CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB). Maturacija dendritskih ćelija odnosi se na stanje aktivacije dendritske ćelije na kojem takve antigen-prezentujuće dendritske ćelije dovode do stimulacije T ćelija, dok prezentovanje nezrelim dendritskim ćelijama rezultuje tolerancijom. Maturacija dendritske ćelije uglavnom je uzrokovana biomolekulima sa mikrobnim osobinama, detektovanim urođenim receptorima (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), proinflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFN), ligacijom CD40 na površini dendritske ćelije pomoću CD40L, i supstancama oslobođenim iz ćelija koje podležu ćelijskoj smrti usled stresa. Dendritske ćelije mogu biti izvedene kultivisanjem ćelija kostne srži in vitro, u prisustvu citokina, kao što su faktor stimulacije kolonija granulocitamakrofaga (GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.

[0130] Neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno MHC proteine klase II potrebne za interakciju sa naivnim T ćelijama; oni se eksprimiraju samo posle stimulacije neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija određenim citokinima kao što je IFNγ.

[0131] Pod "ćelije koje se karakterišu prezentovanjem antigena" ili "ćelija koja prezentuje antigen" ili sličnim izrazima misli se na ćeliju kao što je obolela ćelija, npr. kancerska ćelija ili antigenprezentujuću ćeliju koja prezentuje antigen ili fragment izveden iz pomenutog antigena, npr. posle obrade antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično tome, izraz "bolest koja se karakteriše prezentovanjem antigena" označava bolest koja uključuje ćelije koje se karakterišu prezentovanjem antigena, posebno sa MHC molekulima klase I. Ćelija može prezentovati antigen ako se ta ćelija transfektuje nukleinskom kiselinom kao što je RNK koja kodira taj antigen.

[0132] Pod "fragment antigena koji se prezentuje" ili sličnim izrazima misli se na to da fragment može da se prezentuje u kontekstu MHC molekula klase I ili klase II, poželjno MHC molekula klase I, npr. kada se doda direktno antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji se prirodno prezentuje ćelijama koje eksprimiraju antigen.

[0133] "Ciljna ćelija" će označavati ćeliju koja predstavlja cilj za imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju ćelije koje prezentuju antigen, tj. peptidni fragment izveden iz antigena, i uključuju svaku neželjenu ćeliju kao što je kancerska ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen kako je opisano u ovom tekstu i poželjno prezentuje pomenuti antigen sa MHC molekulima klase I.

[0134] Izraz "deo" označava frakciju. U vezi sa određenom strukturom kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, izraz njegov "deo" može označavati kontinuiranu ili diskontinuiranu frakciju pomenute strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 90% aminokiselina pomenute aminokiselinske sekvence. Poželjno, ako je deo predstavljen diskontinuiranom frakcijom, pomenuta diskontinuirana frakcija sačinjena je od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, svaki deo je kontinuirani element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija aminokiselinske sekvence može biti sačinjena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela pomenute aminokiselinske sekvence, pri čemu svaki deo poželjno uključuje najmanje 5 kontinuiranih aminokiselina, najmanje 10 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih aminokiselina aminokiselinske sekvence.

[0135] Izrazi "deo" i "fragment" koriste se naizmenično u ovom tekstu i označavaju kontinuirani element. Na primer, deo strukture kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein označava kontinuirani element pomenute strukture. Porcija, deo ili fragment strukture poželjno sadrži jednu ili više funkcionalnih osobina pomenute strukture. Na primer, porcija, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina je poželjno imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu iz kojeg je izveden. U kontekstu predmetnih navoda, "deo" strukture kao što je aminokiselinska sekvenca poželjno uključuje, poželjno se sastoji od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% od cele strukture ili aminokiselinske sekvence.

[0136] Izrazi "efektorska ćelija", "imunska efektorska ćelija" ili "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu predmetnih navoda odnose se na ćeliju koja ispoljava efektorske funkcije tokom imunske reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" je poželjno sposobna za vezivanje sa antigenom ili ćelijom koja se karakteriše prezentovanjem antigena ili njegovog peptidnog fragmenta (npr. T ćelijskog epitopa) i medijacijom imunskog odgovora. Na primer, takve ćelije sekretuju citokine i/ili hemokine, sekretuju antitela, prepoznaju kancerozne ćelije i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije uključuju T ćelije (citotoksične T ćelije, pomažuće T ćelije, tumor-infiltrirajuće T ćelije), B ćelije, ćelije prirodne ubice, neutrofile, makrofage i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnih navoda imunoreaktivne ćelije su T ćelije, poželjno CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije.

[0137] Poželjno, "imunoreaktivne ćelije" prepoznaju antigen ili njegov peptidni fragment sa nekim stepenom specifičnosti, posebno ako je prezentovan u kontekstu MHC molekula na primer na površini antigen-prezentujuće ćelije ili obolelih ćelija kao što su kancerske ćelije. Poželjno, pomenuto prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen ili njegov peptidni fragment da bude reaktivna ili da odgovori na njega. Ako je ćelija pomažuća T ćelija (CD4<+>T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili njegov peptidni fragment u kontekstu MHC molekula klase II, takav odgovor ili reaktivnost mogu uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ako je ćelija CTL, takav odgovor ili reaktivnost mogu uključivati eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, tj., ćelija koje se karakterišu prezentovanjem antigena u kontekstu MHC molekula klase I, na primer, apoptozom ili perforinposredovanom lizom ćelije. Prema navodima, odgovor CTL može uključivati produženi fluks kalcijuma, ćelijsku deobu, proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, pozitivnu regulaciju markera aktivacije kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje antigeneksprimirajućih ciljnih ćelija. Odgovor CTL može se odrediti i korišćenjem veštačkih reportera koji pouzdano ukazuju na odgovor CTL. Takvi CTL mogu prepoznati antigen ili fragment antigena i kada odgovaraju ili su reaktivni označavaju se u ovom tekstu i kao "CTL koji odgovaraju na antigen". Ako je ćelija B ćelija, takav odgovor može uključiti oslobađanje imunoglobulina.

[0138] Izrazi "T ćelija" i "T limfocit" koriste se naizmenično u ovom tekstu i uključuju T pomažuće ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje uključuju citolitičke T ćelije.

[0139] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija poznatih kao limfociti i igraju glavnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama. One se mogu razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i ćelije prirodne ubice, po prisustvu specijalnog receptora na svojoj površini koji se zove T-ćelijski receptor (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za maturaciju T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podgrupa T ćelija, svaka sa različitom funkcijom.

[0140] Pored ostalih funkcija, T pomažuće ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, uključujući, sazrevanje B ćelija u plazma ćelije i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga. Ove ćelije su poznate i kao CD4+ T ćelije zbog toga što na svojoj površini eksprimiraju CD4 protein. Pomažuće T ćelije se aktiviraju kada im se peptidni antigeni prezentuju MHC molekulima klase II koji se eksprimiraju na površini antigen-prezentujućih ćelija (APC). Kada se aktiviraju, ubrzano se dele i sekretuju male proteine koji se nazivaju citokini koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunskom odgovoru.

[0141] Citotoksične T ćelije uništavaju ćelije inficirane virusom i tumorske ćelije, a uključene su i u odbacivanje transplanta. Ove ćelije su poznate i kao CD8+ T ćelije jer na svojoj površini eksprimiraju CD8 glikoprotein. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljeve vezujući se za antigen udružen sa MHC molekulima klase I, koji se prezentuju na površini skoro svake ćelije u telu.

[0142] Većina T ćelija ima T-ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Aktuelni T-ćelijski receptor sačinjen je od dva zasebna peptidna lanca koji se sintetišu na osnovu dva nezavisna gena za T-ćelijski receptor alfa i beta (TCRα i TCRβ) i nazivaju se α- i β-TCR lanci. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju malu podgrupu T ćelija koje poseduju poseban T-ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Međutim, u γδ T ćelijama, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo manje česta (2% od svih T ćelija) nego αβ T ćelije.

[0143] Prema navodima, izraz "antigenski receptor" uključuje prirodne receptore kao što su T-ćelijski receptori, kao i inženjerisane receptore koji daju arbitrarnu specifičnost kao što je specifičnost monoklonskog antitela na efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija. Na taj način, moguće je proizvesti veliki broj antigen-specifičnih T ćelija za adoptivni transfer ćelija. Prema tome, receptor za antigen prema navodima može biti prisutan na T ćelijama, npr. umesto ili u dodatku T ćelijskom receptoru T ćelija. Takve T ćelije ne zahtevaju obavezno obradu i prezentaciju antigena da bi prepoznale ciljne ćelije već mogu prepoznati, poželjno sa specifičnošću, svaki antigen prezentovan na ciljnoj ćeliji. Poželjno, pomenuti antigenski receptor eksprimiran je na površini ćelija. U svrhu predmetnih navoda T ćelije koje uključuju inženjerisani antigenski receptor obuhvaćene su izrazom "T ćelija" kako se koristi u ovom tekstu. Specifično, prema navodima, izraz "antigenski receptor" uključuje veštačke receptore koji podrazumevaju jedan molekul ili kompleks molekula koji prepoznaju, tj. vezuju se za ciljnu strukturu (npr. antigen) na ciljnoj ćeliji kao što je kancerska ćelija (npr. vezivanjem antigen-vezujućeg mesta ili antigen-vezujućeg domena za antigen eksprimiran na površini ciljne ćelije) i mogu dati specifičnost efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija koja eksprimira pomenuti antigenski receptor na površini ćelije. Poželjno, prepoznavanje ciljne strukture antigenskim receptorom rezultuje aktivacijom efektorske ćelije koja eksprimira pomenuti antigenski receptor. Prema navodima, "antigenski receptor" može biti "himerni antigenski receptor (CAR)", "himerni T-ćelijski receptor" ili "veštački T-ćelijski receptor".

[0144] Prema navodima, antigen se može prepoznati antigenskim receptorom preko bilo kojeg od antigen-prepoznavajućih domena (ovde označenih i samo kao "domeni") sposobnih da formiraju antigen-vezujuće mesto, na primer preko antigen-vezujućih delova antitela i T-ćelijskih receptora koji se mogu nalaziti na istom ili različitim peptidnim lancima. U jednom primeru izvođenja, dva domena koja formiraju antigen-vezujuće mesto izvedena su iz imunoglobulina. U drugom primeru izvođenja, dva domena koja formiraju antigen-vezujuće mesto izvedena su iz T-ćelijskog receptora. Posebno su poželjni varijabilni domeni antitela, kao što su jednolančani varijabilni fragmenti (scFv) izvedeni iz monoklonskih antitela i varijabilni domeni T-ćelijskog receptora, posebno pojedinačni lanci TCR alfa i beta. U stvari, gotovo sve što se vezuje za dati cilj sa visokim afinitetom, može se koristiti kao antigen-prepoznavajući domen.

[0145] Prvi signal u aktivaciji T ćelije obezbeđuje se vezivanjem T-ćelijskog receptora za kratki peptid koji se prezentuje posredstvom MHC na drugoj ćeliji. Ovo obezbeđuje da se aktivira samo T ćelija sa TCR specifičnim za taj peptid. Partnerska ćelija je obično antigen-prezentujuća ćelija kao što je profesionalna antigen-prezentujuća ćelija, obično dendritska ćelija u slučaju naivnih odgovora, iako B ćelije i makrofagi mogu biti važne APC.

[0146] Prema predmetnim navodima, molekul je sposoban da se veže za cilj ako ima značajan afinitet za pomenuti prethodno određeni cilj i vezuje se za pomenuti prethodno određeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "afinitet vezivanja" često se meri ravnotežnom konstantom disocijacije (KD). Molekul nije (suštinski) sposoban za vezivanje za cilj ako nema značajan afinitet za pomenuti cilj i ne vezuje se značajno za pomenuti cilj u standardnim testovima.

[0147] Citotoksični T limfociti mogu se generisati in vivo inkorporisanjem antigena ili njegovog peptidnog fragmenta u antigen-prezentujuće ćelije in vivo. Antigen ili njegov peptidni fragment mogu biti predstavljeni u vidu proteina, DNK (npr. u vektoru) ili RNK. Antigen se može obraditi da proizvede peptidni partner za MHC molekul, dok njegov fragment može biti prezentovan bez potrebe za daljom obradom. Ovo drugo je slučaj posebno ako se ovi mogu vezati za MHC molekule. Obično je moguća primena kod pacijenta intradermalnom injekcijom. Međutim injektiranje može da se obavi i intranodalno, u limfni čvor (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). Dobijene ćelije prezentuju kompleks od interesa i bivaju prepoznate autolognim citotoksičnim T limfocitima koji se potom propagiraju.

[0148] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelije može se detektovati na različite načine. Postupci za detektovanje specifične aktivacije T ćelija uključuju detektovanje proliferacije T ćelija, proizvodnje citokina (npr., limfokina), ili generisanja citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjni postupak za detektovanje specifične aktivacije T ćelija je detekcija proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, poželjan postupak za detektovanje specifične aktivacije T ćelija je detekcija generisanja citolitičke aktivnosti.

[0149] Izraz "imunološki ekvivalentan" znači da imunološki ekvivalentan molekul kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca, ispoljava iste ili suštinski iste imunološke osobine i/ili ostvaruje iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr., u vezi sa tipom imunološkog efekta kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, jačina i/ili trajanje indukovane imunske reakcije, ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnih navoda, izraz "imunološki ekvivalentan" se poželjno koristi u vezi sa imunološkim efektima ili osobinama peptida upotrebljenog za imunizaciju. Na primer, aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna sa referentnom aminokiselinskom sekvencom ako pomenuta aminokiselinska sekvenca, kada se izloži imunskom sistemu subjekta, indukuje imunsku reakciju koja specifično reaguje sa referentnom aminokiselinskom sekvencom.

[0150] Izraz "imunske efektorske funkcije" u kontekstu predmetnih navoda uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema, koje rezultuju, na primer, ubijanjem tumorskih ćelija ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i formiranja metastaza. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu predmetnih navoda su efektorske funkcije posredovane T ćelijama. U slučaju pomažućih T ćelija (CD4<+>T ćelija), te funkcije uključuju prepoznavanje, T-ćelijskim receptorima, antigena ili antigenskog fragmenta u kontekstu MHC molekula klase II, oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, a u slučaju CTL, prepoznavanje, T-ćelijskim receptorima, antigena ili antigenskog fragmenta u kontekstu MHC molekula klase I i eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, tj., ćelija koje se karakterišu prezentovanjem antigena sa MHC molekulima klase I, na primer, apoptozom ili perforin-posredovanom ćelijskom lizom, proizvodnjom citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifičnim citolitičkim ubijanjem antigen-eksprimirajućih ciljnih ćelija.

[0151] Uopšteno, prema navodima, proteini koji se eksprimiraju u obolelim ćelijama procenjuju se u pogledu svoje korisnosti u imunoterapiji. Protein koji je predviđen kao koristan za imunoterapiju može se upotrebiti za obezbeđivanje vakcine koja uključuje protein ili jedan ili više njegovih peptidnih fragmenata, tačnije jedan ili više (potencijalnih) MHC-vezujućih peptida proteina.

[0152] Prema navodima, izraz "distribucija" odnosi se na stanje lokalizacije. Izraz "utvrđivanje distribucije ili lokalizacije", posebno, uključuje određivanje ili predviđanje stanja lokalizacije, npr. određivanje ili predviđanje subćelijske lokalizacije ili visoke zastupljenosti peptida, proteina ili nukleinske kiseline kao što je određivanje ili predviđanje da li su peptid, protein ili nukleinska kiselina locirani ili visoko zastupljeni u citosolu i/ili u egzozomima in vivo.

[0153] Izrazi kao što su "predvideti", "predviđa" ili "predviđanje" odnose se na određivanje verovatnoće.

[0154] Prema navodima, predviđanje korisnosti proteina ili njegovog fragmenta koji eksprimiraju obolele ćelije za imunoterapiju može uključivati jedno ili više od sledećeg: (i) utvrđivanje distribucije ili lokalizacije proteina ili nukleinske kiseline koja ga kodira, ili fragmenta proteina, kao što je utvrđivanje da li su protein ili nukleinska kiselina koja ga kodira ili fragment proteina locirani ili visoko zastupljeni u citosolu i/ili u egzozomima in vivo, (ii) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment unakrsno prezentuju antigen-prezentujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama, (iii) utvrđivanje postojanja odgovora antitela na protein ili njegov fragment, (iv) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za F aktin, (v) utvrđivanje da li se protein ili njegov fragment vezuju za RNK. U jednom primeru izvođenja, utvrđivanje da li su protein ili nukleinska kiselina koja ga kodira, ili fragment proteina locirani ili visoko zastupljeni u egzozomima in vivo izvodi se dobijanjem uzorka vanćelijskih tečnosti, izolovanjem egzozoma, na primer diferencijalnim centrifugiranjem, izolovanjem proteina ili nukleinskih kiselina, na primer gel elektroforezom i identifikovanjem pomenutog proteina ili njegovog fragmenta, na primer masenom spektrometrijom, ELISA, protočnom citometrijom, čipom sa antitelima ili vestern blotom ili identifikovanjem nukleinske kiseline koja kodira pomenuti protein npr. mikročipom, sekvenciranjem RNK ili RT-PCR. U drugom primeru izvođenja, utvrđivanje da li su protein ili nukleinska kiselina koja ga kodira, ili fragment proteina locirani ili visoko zastupljeni u egzozomima in vivo izvodi se ekstrahovanjem informacija iz baze podataka sakupljenih iz eksperimenata kako je opisano ranije u ovom odeljku kao na primer ExoCarta (Keerthikumar, S, et al., J. Mol. Biol.428, 688(2016)).

[0155] U jednom primeru izvođenja, utvrđivanje postojanja odgovora antitela može se obaviti korišćenjem SEREX. SEREX označava serološku identifikaciju antigena rekombinantnim ekspresionim kloniranjem i predstavlja postupak za identifikovanje tumorskih antigena skriningom antitela iz pacijentovog seruma u pogledu prepoznavanja iz tumora izvedene cDNK transdukovane fagne biblioteke. Ova tehnika koristi biblioteku prikazivanja na fagima za ekspresiju velikog broja različitih potencijalnih pacijentovih antigena. Antigeni se prenesu na dvodimenzionalnu površinu koja omogućava njihovo mapiranje na određene klonove. Površina se inkubira sa autologim pacijentovim serumima. Imunoreaktivni klonovi se lociraju, kultivišu i sekvenciraju (Sahin, U, et al., PNAS 92, 11810 (1995)).

[0156] Predmetni navodi mogu da uključuju i prekidanje proteinskih sekvenci u fragmente pogodne za vezivanje sa MHC i utvrđivanje skorova za vezivanje fragmenata sa jednim ili više MHC molekula. Rezultati se mogu rangirati i mogu se sastojati od spiska peptida i njihovih predviđenih skorova, što će ukazivati na verovatnoću njihovog vezivanja. Uopšteno, proteini prema navodima su posebno korisni za imunoterapiju ako sadrže jedan ili više (potencijalnih) MHC-vezujućih peptida.

[0157] Postupci prema navodima mogu se izvesti za pacijenta, na primer pacijenta obolelog od kancera, na uzorku tumora dobijenom od pacijenta, na primer pacijenta obolelog od kancera.

[0158] Prema navodima, protein ili proteinski fragment, opisani u ovom tekstu, poželjno sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju. Aminokiselinske modifikacije čiju korisnost u terapiji treba odrediti prema predmetnim navodima ili koje treba birati i/ili rangirati prema njihovoj predviđenoj imunogenosti prema navodima, mogu nastati kao rezultat mutacija u nukleinskoj kiselini ćelije. Takve mutacije mogu se identifikovati poznatim tehnikama sekvenciranja.

[0159] U jednom primeru izvođenja, mutacije su somatske mutacije specifične za kancer u uzorcima tumora pacijenta obolelog od kancera, koje se mogu odrediti identifikovanjem razlika u sekvenci genoma, egzoma i/ili transkriptoma tumorskog uzorka i genoma, egzoma i/ili transkriptoma netumorogenog uzorka.

[0160] Prema navodima, tumorski uzorak odnosi se na svaki uzorak kao što je uzorak iz tela pacijenta, koji sadrži ili se očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Uzorak iz tela pacijenta može biti bilo koji uzorak tkiva, na primer krv, tkivni uzorak dobijen iz primarnog tumora ili iz tumorske metastaze ili bilo koji drugi uzorak koji sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Poželjno, telesni uzorak je krv, a somatske mutacije specifične za kancer ili razlike u sekvenci određuju se u jednoj ili više cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC) koje se nalaze u krvi. U drugom primeru izvođenja, tumorski uzorak odnosi se na jednu ili više tumorskih ili kancerskih ćelija kao što su cirkulišuće tumorske ćelija (CTC) ili uzorak koji sadrži jednu ili više izolovanih tumorskih ili kancerskih ćelija kao što su cirkulišuće tumorske ćelija (CTC).

[0161] Netumorogeni uzorak odnosi se na svaki uzorak kao što je telesni uzorak dobijen od pacijenta ili druge individue koja je poželjno iste vrste kao pacijent, poželjno dobijen od zdrave individue koja ne sadrži ili za koju se ne očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Telesni uzorak može biti bilo koji uzorak tkiva, na primer krv ili uzorak iz netumorogenog tkiva.

[0162] Navodi mogu da uključuju određivanje pacijentove kancerske mutacione signature. Izraz "kancerska mutaciona signatura" može se odnositi na sve kancerske mutacije prisutne u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija, ili se može odnositi samo na deo kancerskih mutacija prisutnih u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija. Prema tome, predmetni navodi mogu da uključuju identifikaciju svih somatskih mutacija specifičnih za kancer prisutnih u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija, ili može uključivati identifikaciju samo dela somatskih mutacija specifičnih za kancer prisutnih u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija. Uopšteno, postupci navoda obezbeđuju identifikaciju određenog broja mutacija koje daju dovoljan broj modifikacija ili modifikovanih proteina koji će biti uključeni u postupke navoda.

[0163] Poželjno, identifikovane mutacije prema predmetnim navodima su nesinonimne mutacije, poželjno nesinonimne mutacije proteina koji se eksprimiraju u tumorskoj ili kancerskoj ćeliji.

[0164] U jednom primeru izvođenja, somatske mutacije specifične za kancer ili razlike u sekvenci određuju se u genomu, poželjno čitavom genomu tumorskog uzorka. Prema tome, navodi mogu da uključuju identifikovanje kancerske mutacione signature genoma, poželjno čitavog genoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za kancer u tumorskom uzorku pacijenta obolelog od kancera uključuje identifikovanje kancerskog mutacionog profila čitavog genoma.

[0165] U jednom primeru izvođenja, somatske mutacije specifične za kancer ili razlike u sekvenci određuju se u egzomu, poželjno čitavom egzomu tumorskog uzorka. Prema tome, navodi mogu da uključuju identifikovanje kancerske mutacione signature egzoma, poželjno čitavog egzoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za kancer u tumorskom uzorku pacijenta obolelog od kancera uključuje identifikovanje kancerskog mutacionog profila čitavog egzoma.

[0166] U jednom primeru izvođenja, somatske mutacije specifične za kancer ili razlike u sekvenci određuju se u transkriptomu, poželjno čitavom transkriptomu tumorskog uzorka. Prema tome, navodi mogu da uključuju identifikovanje kancerske mutacione signature transkriptoma, poželjno čitavog transkriptoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za kancer u tumorskom uzorku pacijenta obolelog od kancera uključuje identifikovanje kancerskog mutacionog profila čitavog transkriptoma.

[0167] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za kancer ili identifikovanja razlika u sekvenci uključuje pojedinačno ćelijsko sekvenciranje jedne ili više, poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili još više kancerskih ćelija. Prema tome, navodi mogu da uključuju identifikovanje kancerske mutacione signature pomenutih jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, kancerske ćelije su cirkulišuće tumorske ćelije. Kancerske ćelije kao što su cirkulišuće tumorske ćelije mogu se izolovati pre sekvenciranja pojedinačnih ćelija.

[0168] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za kancer ili identifikovanja razlika u sekvenci uključuje korišćenje sekvenciranja sledeće generacije (NGS).

[0169] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja somatskih mutacija specifičnih za kancer ili identifikovanja razlika u sekvenci uključuje sekvenciranje genomske DNK i/ili RNK tumorskog uzorka.

[0170] Da bi se otkrile somatske mutacije specifične za kancer ili razlike u sekvenci, informacije o sekvenci dobijene iz uzorka tumora se poželjno upoređuju sa referencom kao što je informacija o sekvenci dobijena sekvenciranjem nukleinske kiseline kao što je DNK ili RNK normalnih nekanceroznih ćelija, na primer ćelija germinativne linije koje se mogu dobiti od pacijenta ili druge individue. U jednom primeru izvođenja, normalna genomska DNK germinativne linije dobija se iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC)

[0171] Izraz "genom" odnosi se na ukupnu količinu genetičke informacije u hromozomima organizma ili ćelije.

[0172] Izraz "egzom" odnosi se na deo genoma organizma koji formiraju egzomi, kodirajući delovi eksprimiranih gena. Egzom obezbeđuje genetičku mapu koja se koristi u sintezi proteina i drugih funkcionalnih genskih proizvoda. To je funkcionalno najrelevantniji deo genoma i stoga je najverovatnije da doprinosi fenotipu organizma. Procenjuje se da egzom humanog genoma sadrži 1.5% ukupnog genoma (Ng, PC et al., PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008).

[0173] Izraz "transkriptom" odnosi se na set svih RNK molekula, uključujući iRNK, rRNK, tRNK i druge nekodirajuće RNK proizvedene u jednoj ćeliji ili populaciji ćelija. U kontekstu predmetnih navoda, transkriptom označava set svih RNK molekula proizvedenih u jednoj ćeliji, populaciji ćelija, poželjno populaciji kancerskih ćelija, ili svim ćelijama date individue u određenoj vremenskoj tački.

[0174] "Nukleinska kiselina" je prema navodima poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetska RNK. Nukleinske kiseline uključuju prema navodima genomsku DNK, cDNK, iRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetisane molekule. Prema navodima, nukleinska kiselina može postojati kao jednolančani ili dvolančani i linearni ili kovalentni cirkularni zatvoreni molekul. Nukleinska kiselina može, prema navodima, da bude izolovana. Izraz "izolovana nukleinska kiselina" označava, prema navodima, da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) proizvedena rekombinantno kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, sečenjem i razdvajanjem gelelektroforezom, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinska kiselina se može upotrebiti za introdukovanje, tj. transfekciju ćelija, posebno u formi RNK koja se može pripremiti in vitro transkripcijom sa DNK templata. Pre primene RNK se može modifikovati stabilisanjem sekvenci, "pokrivanjem" (capping) i poliadenilacijom.

[0175] Izraz "genetički materijal" odnosi se na izolovanu nukleinsku kiselinu, DNK ili RNK, deo dvostrukog heliksa, deo hromozoma, ili ceo genom organizma ili ćelije, posebno njihov egzom ili transkriptom.

[0176] Izraz "mutacija" odnosi se na promenu ili razliku u sekvenci nukleinske kiseline (supstitucija nukleotida, adicija ili delecija) u poređenju sa referencom. "Somatska mutacija" može da se sretne u bilo kojoj telesnoj ćeliji osim germinativnih ćelija (spermatozoid i jajna ćelija) i stoga se ne prenosi na potomstvo. Ove promene mogu (ali ne uvek) izazvati kancer ili druge bolesti. Poželjno, mutacija je nesinonimna mutacija. Izraz "nesinonimna mutacija" odnosi se na mutaciju, poželjno supstituciju nukleotida, koja za rezultat ima zamenu aminokiseline, na primer aminokiselinsku supstituciju, u proizvodu translacije.

[0177] Prema navodima, izraz "mutacija" uključuje tačkaste mutacije, "indele", fuzije, hromotripsis i RNK editovanja.

[0178] Prema navodima, izraz "indel" opisuje specijalnu klasu mutacija definisanih kao mutacije koje rezultuju kolokalizovanom insercijom i delecijom i ukupnim sticanjem ili gubitkom nukleotida. U kodirajućim regionima genoma, osim ako dužina indela ne iznosi umnožak broja 3, one proizvode mutaciju pomaka rama. Indeli mogu da se uporede sa tačkastom mutacijom; dok indel insertuje i deletira nukleotide iz sekvence, tačkasta mutacija je forma supstitucije koja zamenjuje jedan od nukleotida.

[0179] Fuzije mogu stvoriti hibridne gene formirane od dva ranije odvojena gena. Ovo može biti rezultat translokacije, intersticijalne delecije ili hromozomske inverzije. Fuzioni geni su često onkogeni. Onkogeni fuzioni geni mogu dati genski proizvod sa novom ili različitom funkcijom u poređenju sa dva fuziona partnera. Alternativno, protoonkogen se fuzioniše sa snažnim promotorom i na taj način se funkcija onkogena aktivira pozitivnom regulacijom snažnim promotorom ushodnog fuzionog partnera. Onkogeni fuzioni transkripti mogu biti uzrokovani i trans-splajsujućim ili "read-through" događajima.

[0180] Prema navodima, izraz "hromotripsis" odnosi se na genetički fenomen kojim se specifični regioni genoma "razbijaju" i zatim povezuju u okviru jednog oštećujućeg događaja.

[0181] Prema navodima, izraz "editovati RNK" ili "editovanje RNK" odnosi se na molekulske procese u kojima se informacioni sadržaj u molekulu RNK menja hemijskim promenama na nivou baza. Editovanje RNK uključuje modifikacije nukleozida kao što su deaminacije citidina (C) u uridin (U) i adenozina (A) u inozin (I), kao i netemplatne nukleotidne adicije i insercije. Editovanje RNK u iRNK efikasno menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina tako da se on razlikuje od predviđenog na osnovu genomske DNK sekvence.

[0182] Izraz "kancerska mutaciona signatura" odnosi se na set mutacija koje su prisutne u kancerskim ćelijama u odnosu na nekancerozne referentne ćelije.

[0183] Prema navodima, "referenca" može da se koristi za korelisanje i upoređivanje rezultata dobijenih na tumorskim uzorcima. Tipično "referenca" se može dobiti na bazi jednog ili više normalnih uzoraka, posebno uzoraka nezahvaćenih kancerom, dobijenim od pacijenta ili jedne ili više različitih individua, poželjno zdravih individua, posebno individua iste vrste. "Referenca" može da se odredi empirijski, testiranjem dovoljno velikog broja normalnih uzoraka.

[0184] Za određivanje mutacija može se koristiti svaki pogodan postupak sekvenciranja prema navodima, poželjna je tehnologija sekvenciranja sledeće generacije (NGS). Postupci sekvenciranja treće generacije mogu biti zamena za tehnologiju NGS u budućnosti, da bi se ubrzali koraci sekvenciranja u postupku. Radi razjašnjenja: Izrazi "sekvenciranje sledeće generacije" ili "NGS" u kontekstu predmetnih navoda označavaju sve nove visokopropusne tehnologije sekvenciranja koje, nasuprot "konvencionalnoj" metodologiji sekvenciranja, poznatoj kao Sangerova hemija, čitaju template nukleinske kiseline nasumično, uporedo duž čitavog genoma, fragmentisanjem čitavog genoma u male delove. Takve NGS tehnologije (poznate i kao tehnologije masivnog paralelnog sekvenciranja) mogu obezbediti informacije o sekvenci nukleinske kiseline celog genoma, egzoma, transkriptoma (svih transkribovanih sekvenci genoma) ili metiloma (svih metilisanih sekvenci genoma) u veoma kratkim vremenskim periodima, npr. u roku od 1-2 nedelje, poželjno 1-7 dana ili najpoželjnije u roku manjem od 24 sata i dopuštaju, u principu, pristupe sekvenciranja pojedinačnih ćelija. U kontekstu predmetnih navoda moguće je koristiti više NGS platformi koje su komercijalno dostupne ili u pomenute u literaturi, npr. one koje su detaljno opisane u Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; ili u Voelkerding et al.2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Neograničavajući primeri takvih NGS tehnologija/platformi su

1) Tehnologija sekvenciranja sintezom, poznata kao pirosekvenciranje, implementirana npr. u GS-FLX 454 Genome Sequencer ™, kompanije 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), pridružene kompaniji Roche, prvi put opisana u Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. U ovoj tehnologiji koristi se PCR emulzija u kojoj se perlice za vezivanje jednolančane DNK inkapsuliraju snažnim vorteksovanjem u vodene micele koje sadrže PCR reaktante okružene uljem za emulzionu PCR amplifikaciju. Tokom procesa pirosekvenciranja, dok polimeraza sintetiše DNK lanac beleži se svetlost emitovana sa fosfatnih molekula tokom inkorporisanja nukleotida.

2) Pristup sekvenciranja sintezom koji je razvila kompanija Solexa (sada deo Illumina Inc., San Diego, California), zasnovan na reverzibilnim terminatorima obeleženim bojom, imlplementiran je npr. u Illumina/Solexa Genome Analyzer ™ i u Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™. U ovoj tehnologiji, sva četiri nukleotida se dodaju istovremeno oligoprajmovanim klasterskim fragmentima, u kanale protočne ćelije, zajedno sa DNK polimerazom. Bridge-amplifikacijom sintetišu se jednolančani klasteri sa sva četiri fluorescentno obeležena nukleotida za sekvenciranje.

3) Pristup sekvenciranja ligacijom, npr. implementiran je u SOLid™ platformi, Applied Biosystems (sada Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). U ovoj tehnologiji, pul svih mogućih oligonukleotida fiksirane dužine obeleži se prema poziciji u sekvenci. Oligonukleotidi se hibridizuju i izvrši se njihova ligacija; preferencijalna ligacija DNK ligazom za podudarne sekvence rezultuje signalom koji daje informaciju o nukleotidu na toj poziciji. Pre sekvenciranja, DNK se amplifikuje emulzionom PCR. Dobijene perlice, od kojih svaka sadrži samo kopije istog DNK molekula, deponuju se na staklenoj pločici. Kao drugi primer, Polonator™ G.007 platforma, Dover Systems (Salem, New Hampshire) takođe koristi pristup sekvenciranja ligacijom uz upotrebu emulzione PCR zasnovane na čipu sa randomizovanim perlicama, da bi se amplifikovali DNK fragmenti za paralelno sekvenciranje.

4) Tehnologije sekvenciranja pojedinačnih molekula, implementirane npr. u PacBio RS sistemu, Pacific Biosciences (Menlo Park, California) ili u HeliScope™ platformi, Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). Posebna karakteristika ove tehnologije je njena sposobnost da vrši sekvenciranje pojedinačnih DNK ili RNK molekula bez amplifikacije, što je definisano kao sekvenciranje pojedinačnih molekula DNK u realnom vremenu (SMRT). Na primer, HeliScope koristi sistem visoke osetljivosti za detekciju fluorescencije i direktno detektovanje svakog nukleotida, čim se sintetiše. Sličan pristup baziran na fluorescentno rezonantnom energetskom transferu (FRET) razvila je kompanija Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Druge tehnike koje se zasnivaju na fluorescenciji za pojedinačne molekule vlasništvo su U.S. Genomics (GeneEngine™) i Genovoxx (AnyGene™).

5) Nanotehnologije za sekvenciranje pojedinačnih molekula u kojima se koriste različite nanostrukture koje su npr. aranžirane na čipu za praćenje kretanja molekula polimeraze na jednom lancu tokom replikacije. Neograničavajući primeri pristupa koji se zasnivaju na nanotehnologijama su GridON™ platforma, Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), platforme za hibridizacijom asistirano sekvenciranje nanoporama (HANS™) koje je razvio Nabsys (Providence, Rhode Island) i vlasnička platforma bazirana na ligazi za sekvenciranje DNK sa tehnologijom DNK nanoloptica (DNB) pod nazivom kombinatorna ligacija proba-sidro (cPAL™).

6) Tehnologije koje se zasnivaju na elektronskoj mikroskopiji za sekvenciranje pojedinačnih molekula, npr. one koje su razvili LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) i Halcyon Molecular (Redwood City, California).

7) Jonsko semikonduktorsko sekvenciranje koje se zasniva na detektovanju vodonikovih jona koji se oslobađaju tokom polimerizacije DNK. Na primer, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) koristi visokogustinski čip mikromašinskih izrađenih bunarčića za izvođenje ovog biohemijskog procesa na masivno paralelan način. Svaki bunarčić sadrži različit DNK templat. Ispod bunarčića je jonsko-senzitivni sloj, a ispod njega vlasnički jonski senzor.

[0185] Poželjno, DNK i RNK preparati služe kao polazni materijal za NGS. Takve nukleinske kiseline mogu se lako dobiti iz uzoraka kao što je biološki materijal, npr. iz svežeg, brzo smrznutog ili u formalinu fiksiranog i u parafinu ukalupljenog (FFPE) tumorskog tkiva ili iz sveže izolovanih ćelija ili iz CTC prisutnih u perifernoj krvi pacijenata. Normalne nemutirane genomske DNK ili RNK mogu se ekstrahovati iz normalnog, somatskog tkiva, ali u kontekstu predmetnih navoda poželjne su ćelije germinativne linije. Kod pacijenata sa nehematološkim malignitetima, DNK ili RNK germinativne linije mogu se ekstrahovati iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Iako su nukleinske kiseline ekstrahovane iz FFPE tkiva ili sveže izolovanih pojedinačnih ćelija visoko fragmentisane, pogodne su za primenu u NGS.

[0186] Nekoliko ciljanih NGS postupaka za sekvenciranje egzoma opisano je u literaturi (za pregled vidi, npr. Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51), i svi se mogu koristiti zajedno sa predmetnim navodima. U mnogim od ovih postupaka (opisanih npr. kao kaptura genoma, particionisanje genoma, obogaćivanje genoma itd.) koriste se tehnike hibridizacije i oni uključuju pristup hibridizacije na bazi čipa (npr. Hodges et al.2007: Nat. Genet.

39, 1522-1527) i hibridizacije na bazi tečnosti (npr. Choi et al.2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101). Komercijalni kitovi za pripremanje DNK uzoraka i kapturu egzoma takođe su dostupni: na primer, Illumina Inc. (San Diego, California) nudi TruSeq™ DNA Sample Preparation Kit i TruSeq™ Exome Enrichment Kit.

[0187] Da bi se smanjio broj lažno pozitivnih nalaza pri detektovanju somatskih mutacija specifičnih za kancer ili razlika u sekvenci prilikom upoređivanja npr. sekvence tumorskog uzorka sa sekvencom referentnog uzorka, na primer sekvencom uzorka germinativne linije, poželjno je odrediti sekvencu u replikama jednog ili oba tipa uzoraka. Prema tome, poželjno je da se sekvenca referentnog uzorka, na primer sekvenca uzorka germinativne linije, odredi dva puta, tri puta ili više puta. Alternativno ili dodatno, sekvenca tumorskog uzorka određuje se dva puta, tri puta ili više puta. Isto tako, moguće je odrediti sekvencu referentnog uzorka, na primer sekvencu uzorka germinativne linije i/ili sekvencu tumorskog uzorka više od jednom određujući najmanje jednom sekvencu u genomskoj DNK i određujući najmanje jednom sekvencu u RNK pomenutog referentnog uzorka i/ili pomenutog tumorskog uzorka. Na primer, određivanjem varijacija između replika referentnog uzorka, na primer uzorka germinativne linije, može se proceniti očekivana stopa lažno pozitivnih (FDR) somatskih mutacija kao statistička količina. Tehnički ponovci uzorka trebalo bi da daju identične rezultate i svaka detektovana mutacija u ovom "poređenju istog sa istim" je lažno pozitivna. Tačnije, da bi se odredila stopa lažnog otkrivanja za detekciju somatskih mutacija u uzorku tumora u odnosu na referentni uzorak, tehnički ponovak referentnog uzorka može se koristiti kao referenca za procenu broja lažno pozitivnih rezultata. Pored toga, različite metrike povezane sa kvalitetom (npr. pokrivenost ili SNP kvalitet) mogu se kombinovati u jedan kvalitativni skor korišćenjem pristupa mašinskog učenja. Za datu somatsku varijaciju mogu se računati sve druge varijacije sa prevazilazećim skorom kvaliteta, što omogućava rangiranje svih varijacija u setu podataka.

[0188] U kontekstu predmetnih navoda, izraz "RNK" odnosi se na molekul koji sadrži najmanje jednu ribonukleotidnu reziduu i poželjno u celini je ili je suštinski sačinjen od ribonukleotidnih rezidua. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksil grupom na 2’-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Izraz "RNK" uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetsku RNK i rekombinantno generisanu RNK kao što je modifikovana RNK koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili alteraciji jednog ili više nukleotida. Takve alteracije mogu uključivati adiciju nenukleotidnog materijala, na primer na kraju/krajevima RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulu RNK mogu uključivati i nestandardne nukleotide, kao što su neprirodni nukleotidi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu se označiti kao analozi ili analozi prirodnih RNK.

[0189] Prema predmetnim navodima, izraz "RNK" uključuje i poželjno odnosi se na "iRNK". Izraz "iRNK" označava "informacionu RNK" i odnosi se na "transkript" koji se generiše korišćenjem DNK templata i kodira peptid ili polipeptid. Tipično, iRNK uključuje 5’-UTR, protein-kodirajući region, 3’-UTR i opciono poli(A) rep. iRNK ima samo ograničeni poluživot u ćelijama i in vitro. U kontekstu predmetnih navoda, iRNK može da se generiše in vitro transkripcijom sa DNK templata. Metodologija in vitro transkripcije poznata je stručnjaku u oblasti. Na primer, za in vitro transkripciju postoje različiti komercijalno dostupni kitovi.

[0190] Prema navodima, moguće je modifikovati stabilnost i efikasnost translacije RNK. Na primer, RNK se može stabilisati i njena translacija povećati jednom ili većim brojem modifikacija koje imaju efekte stabilisanja i/ili koje povećavaju efikasnost translacije RNK. Takve modifikacije opisane su, na primer, u PCT/EP2006/009448. U cilju povećanja ekspresije upotrebljene RNK prema predmetnim navodima, ona se može modifikovati unutar kodirajućeg regiona, tj. sekvence koja kodira eksprimirani peptid ili protein, poželjno bez menjanja sekvence eksprimiranog peptida ili proteina, tako da se poveća GC-sadržaj, da bi se povećala stabilnost iRNK i obavila optimizacija kodona i tako pojačala translacija u ćelijama.

[0191] Izraz "modifikacija" u kontekstu upotrebljene RNK u predmetnim navodima uključuje svaku modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.

[0192] U jednom primeru izvođenja navoda, RNK upotrebljena prema navodima nema otkrivene 5’-trifosfate. Uklanjanje takvih nepokrivenih 5’-trifosfata može se postići tretiranjem RNK fosfatazom.

[0193] RNK prema navodima može imati modifikovane ribonukleotide da bi joj se povećala stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK upotrebljenoj prema navodima, 5-metilcitidin zamenjuje delimično ili potpuno, poželjno potpuno, citidin. Alternativno ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u RNK upotrebljenoj prema navodima, pseudouridin zamenjuje delimično ili potpuno, poželjno potpuno, uridin.

[0194] U jednom primeru izvođenja, izraz "modifikacija" odnosi se na obezbeđivanje RNK sa 5’-"kapom" ili analogom 5’-"kape". Izraz "5’-kapa" odnosi se na strukturu u vidu kape koja se nalazi na 5’-kraju molekula iRNK i obično se sastoji od guanozinskog nukleotida spojenog sa iRNK preko neobične 5’ ka 5’ trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilisan na poziciji 7. Izraz "konvencionalna 5’-kapa" odnosi se na prirodnu RNK 5’-"kapu", poželjno na 7-metilguanozin "kapu" (m<7>G). U kontekstu predmetnih navoda, izraz "5’-kapa" uključuje 5’-"kapa" analog koji liči na strukturu kape RNK i modifikovan je tako da ima sposobnost da stabiliše RNK i/ili pojača translaciju RNK ako je prikačen za nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.

[0195] Obezbeđivanje RNK sa 5’-"kapa" ili 5’-"kapa" analogom može se postići in vitro transkripcijom DNK templata u prisustvu pomenutog 5’-"kapa" ili 5’-"kapa" analoga, pri čemu se pomenuti 5’-"kapa" kotranskripciono inkorporiše u nastali RNK lanac, ili RNK može da nastane, na primer, in vitro transkripcijom, i 5’-"kapa" može da se prikači za RNK posttranskripciono, korišćenjem "kaping"-enzima, na primer, "kaping"-enzima vakcinija virusa.

[0196] RNK može sadržati i druge modifikacije. Na primer, dodatne modifikacije RNK upotrebljene u predmetnim navodima mogu biti ekstenzija ili trunkacija prirodnog poli(A) repa ili menjanje 5’- ili 3’-netranslatujućih regiona (UTR) na primer, uvođenje UTR koji nije povezan sa kodirajućim regionom pomenute RNK, na primer, zamena postojećeg 3’-UTR ili insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3’-UTR izvedene iz gena za globin, kao što su alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani beta-globin.

[0197] RNK koja ima demaskiranu poli-A sekvencu translatuje se efikasnije od RNK koja ima maskiranu poli-A sekvencu. Izraz "poli(A) rep" ili "poli-A sekvenca" odnosi se na sekvencu adenil (A) rezidua koja je tipično locirana na 3’-kraju RNK molekula i "demaskirana poli-A sekvenca" označava poli-A sekvencu na 3’ kraju RNK molekula koja se završava sa A poli-A sekvence i nije praćena nukleotidima različitim od A lociranim na 3’ kraju, tj. nishodno od poli-A sekvence. Pored toga, duga poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova obezbeđuje optimalnu stabilnost transkripta i efikasnu translaciju RNK.

[0198] Prema tome, u cilju povećanja stabilnosti i/ili ekspresije RNK upotrebljene prema predmetnim navodima, ona se može modifikovati tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, koja je poželjno duga 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i naročito 100 do 150 adenozinskih rezidua. U posebno poželjnom primeru izvođenja poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 adenozinskih rezidua. Da bi se dodatno povećale stabilnost i/ili ekspresija RNK upotrebljene prema predmetnim navodima, poli-A sekvenca može biti demaskirana.

[0199] Pored toga, inkorporacija 3’-netranslatujućeg regiona (UTR) u 3’-netranslatujući region RNK molekula može rezultovati povećanjem efikasnosti translacije. Sinergistički efekat može se postići inkorporisanjem dva ili više takva 3’-netranslatujuća regiona. 3’-netranslatujući regioni mogu biti autologni ili heterologni za RNK u koju se uvode. U jednom posebnom primeru izvođenja, 3’- netranslatujući region izveden je iz humanog gena za β-globin.

[0200] Kombinacija gore opisanih modifikacija, tj. inkorporacija poli-A sekvence, demaskiranje poli-A sekvence i inkorporacija jednog ili više 3’-netranslatujućih regiona, ima sinergistički uticaj na stabilnost RNK i povećanje efikasnosti translacije.

[0201] Izraz "stabilnost" RNK odnosi se na "poluživot" RNK. "Poluživot" odnosi se na period vremena koje je potrebno za eliminisanje polovine aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu predmetnih navoda, poluživot RNK indikacija je stabilnosti pomenute RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da se RNK koja ima dug poluživot eksprimira tokom dužeg vremenskog perioda.

[0202] Naravno, ako je prema predmetnim navodima poželjno smanjiti stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK, moguće je modifikovati RNK tako da interferira sa funkcijom elemenata opisanih gore, koji povećavaju stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK.

[0203] Izraz "ekspresija" koristi se, prema navodima, u svom najopštijem značenju i uključuje proizvodnju RNK i/ili peptida, polipeptida ili proteina, npr. transkripcijom i/ili translacijom. U vezi sa RNK, izraz "ekspresija" ili "translacija" odnosi se posebno na proizvodnju peptida, polipeptida ili proteina. On takođe uključuje parcijalnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može biti prolazna ili stabilna.

[0204] Prema navodima, izraz ekspresija uključuje i "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju". "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" znači, prema navodima, da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana u poređenju sa referencom, npr. stanjem kod subjekta koji nema bolest udruženu sa aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., tumorskog antigena. Porast ekspresije označava porast od najmanje 10%, tačnije najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je prisutna samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom.

[0205] Izraz "specifično eksprimiran" znači da se protein eksprimira samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen koji se specifično eksprimira u želudačnoj mukozi znači da se pomenuti protein prvenstveno eksprimira u želudačnoj mukozi, a ne eksprimira se u drugim tkivima ili se ne eksprimira u značajnoj meri u drugim tipovima tkiva ili organa. Prema tome, protein koji se isključivo eksprimira u ćelijama želudačne mukoze i u značajno manjoj meri u nekom drugom tkivu, na primer testisu, specifično se eksprimira u ćelijama želudačne mukoze. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen može i da se specifično eksprimira pod normalnim uslovima u više nego jednom tipu tkiva ili organa, na primer u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipu tkiva ili organa. U tom slučaju, tumorski antigen se onda specifično eksprimira u tim organima. Na primer, ako se tumorski antigen eksprimira pod normalnim uslovima poželjno u približno jednakoj meri u plućima i želucu, pomenuti tumorski antigen se specifično eksprimira u plućima i želucu.

[0206] U kontekstu predmetnih navoda, izraz "transkripcija" odnosi se na proces u kojem se genetički kod u sekvenci DNK transkribuje u RNK. Potom, RNK može da se translatuje u protein. Prema predmetnim navodima, izraz "transkripcija" uključuje "in vitro transkripciju", pri čemu se izraz "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kojem se RNK, posebno iRNK, sintetiše in vitro u sistemu koji ne sadrži ćelije, poželjno korišćenjem pogodnih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, klonirajući vektori se primenjuju za stvaranje transkripta. Ovi klonirajući vektori su obično označeni kao transkripcioni vektori i prema predmetnim navodima su obuhvaćeni izrazom "vektor". Prema predmetnim navodima, RNK upotrebljena u predmetnim navodima je poželjno in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK templata. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Posebni primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. Poželjno, in vitro transkripcija prema navodima se kontroliše T7 ili SP6 promotorom. DNK templat za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i njenim introdukovanjem u pogodni vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK.

[0207] Izraz "translacija" prema navodima se odnosi na proces na ribozomima ćelije, kojim lanac informacione RNK usmerava asambliranje sekvence aminokiselina da bi se napravio peptid, polipeptid ili protein.

[0208] Kontrolne sekvence ekspresije ili regulatorne sekvence, koje prema navodima mogu biti funkcionalno povezane sa nukleinskom kiselinom, mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca povezane su jedna sa drugom "funkcionalno" ako su povezane kovalentno, tako da su transkripcija ili translacija kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem regulatorne sekvence. Ako kodirajuća sekvenca treba da se translatuje u funkcionalni protein, funkcionalnom vezom regulatorne sekvence sa kodirajućom sekvencom, indukcija regulatorne sekvence dovodi do transkripcije kodirajuće sekvence, ne izazivajući pomak u ramu čitanja u kodirajućoj sekvenci ili nemogućnost da se kodirajuća sekvenca translatuje u željeni protein ili peptid.

[0209] Izraz "kontrolna sekvenca ekspresije" ili "regulatorna sekvenca" obuhvata, prema navodima, promotore, ribozom-vezujuće sekvence i druge kontrolne elemente koji kontrolišu transkripciju nukleinske kiseline ili translaciju izvedene RNK. U određenim primerima izvođenja navoda, regulatorne sekvence mogu biti pod kontrolom. Precizna struktura regulatornih sekvenci može varirati u zavisnosti od vrste ili u zavisnosti od tipa ćelije, ali one obično sadrže 5’-netranskribujuće i 5’- i 3’-netranslatujuće sekvence, koje su uključene u inicijaciju transkripcije ili translacije, kao što su "TATA-boks", "capping"-sekvenca, CAAT-sekvenca i slično. Posebno, 5’-netranskribujuće regulatorne sekvence sadrže promotorski region koji uključuje promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno vezanih gena. Regulatorne sekvence mogu uključivati i enhenserske sekvence ili ushodne aktivatorske sekvence.

[0210] Poželjno, prema navodima, RNK koja će se eksprimirati u ćeliji introdukuje se u pomenutu ćeliju. U jednom primeru izvođenja postupaka prema navodima, RNK koja će se introdukovati u ćeliju dobija se in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK templata.

[0211] Prema navodima, izrazi kao što su "RNK sposobna za ekspresiju" i "RNK kodirajuća" koriste se naizmenično u ovom tekstu i u vezi sa određenim peptidom ili polipeptidom znače da RNK, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno u ćeliji, može da se eksprimira da proizvede pomenuti peptid ili polipeptid. Poželjno, RNK prema navodima je sposobna da interaguje sa ćelijskom translacionom mašinerijom da bi dala peptid ili polipeptid koji je sposobna da eksprimira.

[0212] Izrazi kao što su "transfer", "introdukovanje/uvođenje" ili "transfektovanje" koriste se naizmenično u ovom tekstu i odnose se na uvođenje nukleinskih kiselina, posebno egzogenih ili heterolognih nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju. Prema predmetnim navodima, ćelija može činiti deo organa, tkiva i/ili organizma. Prema predmetnim navodima, nukleinska kiselina se primenjuje ili u vidu gole nukleinske kiseline ili u kombinaciji sa primenom reagensa. Poželjno, nukleinske kiseline se primenjuju u obliku golih nukleinskih kiselina. Poželjno, RNK se primenjuje u kombinaciji sa stabilišućim supstancama kao što su inhibitori RNKaze. Predmetni navodi takođe imaju u vidu ponovljeno introdukovanje nukleinskih kiselina u ćelije da bi se omogućila trajna ekspresija tokom dužih vremenskih perioda.

[0213] Ćelije mogu da se transfektuju bilo kojim nosačem sa kojim se RNK može udružiti, npr. formiranjem kompleksa sa RNK ili formiranjem vezikula u kojima je RNK zatvorena ili inkapsulirana, što rezultuje povećanom stabilnošću RNK u poređenju sa golom RNK. Nosači korisni prema navodima uključuju, na primer, nosače koji sadrže lipide kao što su katjonski lipidi, lipozomi, posebno katjonski lipozomi, i micele i nanočestice. Katjonski lipidi mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Bilo koji katjonski lipid može da se koristi prema navodima.

[0214] Poželjno, introdukovanje RNK koja kodira peptid ili polipeptid u ćeliju, posebno u ćeliju prisutnu in vivo, rezultuje ekspresijom pomenutog peptida ili polipeptida u ćeliji. U određenim primerima izvođenja, poželjno je usmeravanje nukleinskih kiselina u određene ćelije. U takvim primerima izvođenja, nosač koji se koristi za unošenje nukleinske kiseline u ćeliju (na primer, retrovirus ili lipozom), poseduje ciljajući molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo specifično za protein na površini ciljne ćelije ili ligand za receptor na ciljnoj ćeliji mogu se inkorporisati u nosač nukleinske kiseline ili se mogu vezati za nju. U slučaju da se nukleinska kiselina unosi lipozomima, proteini koji se vezuju za protein na površini membrane udružen sa endocitozom mogu se inkorporisati u lipozomsku formulaciju kako bi se omogućilo ciljanje i/ili preuzimanje. Takvi proteini obuhvataju proteine kapsida ili njihove fragmente koji su specifični za određeni tip ćelije, antitela na proteine koji se internalizuju, proteine koji ciljaju unutarćelijsku lokaciju itd.

[0215] Izraz "ćelija" ili "ćelija-domaćin" poželjno označava intaktnu ćeliju, tj. ćeliju sa intaktnom membranom koja ne oslobađa svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno pomenuti izraz se prema navodima odnosi na svaku ćeliju koja može da se transformiše ili transfektuje egzogenom nukleinskom kiselinom. Izraz "ćelija" uključuje prema navodima prokariotske ćelije (npr., E. coli) ili eukariotske ćelije (npr., dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca, i insekatske ćelije). Egzogena nukleinska kiselina može se naći unutar ćelije (i) slobodno dispergovana kao takva, (ii) inkorporisana u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ćelije-domaćina ili DNK mitohondrija. Posebno su poželjne ćelije sisara, na primer ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza i primata. Ćelije se mogu izvesti iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži i embrionalne matične ćelije. U narednim primerima izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0216] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom.

[0217] Izraz "klonska ekspanzija" označava proces u kojem se specifični entitet umnožava. U kontekstu predmetnih navoda, izraz se poželjno koristi u kontekstu imunološkog odgovora u kojem limfociti stimulisani antigenom proliferišu, a specifični limfocit koji prepoznaje pomenuti antigen se amplifikuje. Poželjno, klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.

[0218] Izrazi kao što su "redukovanje" ili "inhibiranje" odnose se na sposobnost izazivanja ukupnog smanjenja nivoa, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije 50% ili više, i najpoželjnije 75% ili više. Izraz "inhibira" ili slične fraze uključuju potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. redukciju na nulu ili suštinski nulu.

[0219] Izrazi kao što su "porast", "pojačanje", "pokretanje" ili "produžavanje" poželjno se odnose na porast, pojačanje, pokretanje ili produžavanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 100%, poželjno najmanje 200% i posebno najmanje 300%. Ovi izrazi mogu se odnositi i na porast, pojačanje, pokretanje ili produžavanje od nule ili nemerljivog ili nedetektabilnog nivoa do nivoa višeg od nule ili merljivog ili detektabilnog nivoa.

[0220] Predmetni navodi obezbeđuju vakcine kao što su kancerske vakcine dizajnirane na bazi poželjno modifikovanih proteina ili proteinskih fragmenata ili aminokiselinskih modifikacija za koje se predviđa da su korisne u imunoterapiji postupcima predmetnih navoda.

[0221] Prema navodima, izraz "vakcina" odnosi se na farmaceutski preparat (farmaceutsku kompoziciju) ili proizvod koji posle primene indukuju imunski odgovor, tačnije ćelijski imunski odgovor koji prepoznaje i napada patogen ili obolelu ćeliju, na primer kancersku ćeliju. Vakcina se može koristiti za prevenciju ili lečenje bolesti. Izraz "personalizovana kancerska vakcina" ili "individualizovana kancerska vakcina" tiče se određenog pacijenta obolelog od kancera i znači da je kancerska vakcina prilagođena potrebama ili posebnim slučajevima pojedinačnog pacijenta obolelog od kancera.

[0222] U jednom primeru izvođenja, vakcina obezbeđena prema navodima može uključivati peptid ili polipeptid koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija ili jedan ili više modifikovanih peptida za koje je predviđeno da bi mogli biti korisni u imunoterapiji postupcima navoda ili nukleinsku kiselinu, poželjno RNK, koja kodira pomenuti peptid ili polipeptid.

[0223] Kancerske vakcine obezbeđene prema navodima, kada se primene kod pacijenta, poželjno obezbeđuju jedan ili više T ćelijskih epitopa pogodnih za stimulisanje, podsticanje i/ili ekspandiranje T ćelija specifičnih za obolele ćelije pacijenta, kao što su ćelije pacijentovog tumora. T ćelije su poželjno usmerene protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni T ćelijski epitopi. Vakcine opisane u ovom tekstu su poželjno sposobne da indukuju ili promovišu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost citotoksičnih T ćelija, protiv kancerskog oboljenja koje se karakteriše prezentovanjem jednog ili više tumor-asociranih neoantigena sa MHC molekulima klase I. Vakcina koja cilja kancer-specifične mutacije biće specifična za pacijentov tumor.

[0224] Vakcina obezbeđena prema navodima odnosi se na vakcinu koja, kada se primeni kod pacijenta, poželjno obezbeđuje jedan ili više T ćelijskih epitopa, na primer 2 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više i poželjno do 60, do 55, do 50, do 45, do 40, do 35 do 30 T ćelijskih epitopa, koji inkorporišu aminokiselinske modifikacije ili modifikovane peptide za koje se postupcima navoda predviđa da su imunogeni. Takvi T ćelijski epitopi označeni su u ovom tekstu i kao "neoepitopi". Prezentovanje ovih epitopa pacijentovim ćelijama, posebno antigen-prezentujućim ćelijama, poželjno rezultuje T ćelijama koje ciljaju epitope kada se vezani za MHC, a time i pacijentov tumor, poželjno primarni tumor kao i tumorske metastaze, koji eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni T ćelijski epitopi i prezentuju iste epitope na površini tumorskih ćelija.

[0225] Postupci navoda mogu uključivati dodatne korake određivanja upotrebljivosti identifikovanih aminokiselinskih modifikacija ili modifikovanih peptida za kancersku vakcinu. Ovi dodatni koraci mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: (i) procenu da li su modifikacije locirane u poznatim ili predviđenim MHC-prezentovanim epitopima, (ii) in vitro i/ili in silico testiranje da li su modifikacije locirane u MHC-prezentovanim epitopima, npr. testiranje da li su modifikacije deo peptidnih sekvenci koje se obrađuju i/ili prezentuju kao MHC-prezentovani epitopi, i (iii) in vitro testiranje da li predviđeni modifikovani epitopi, posebno kada se nalaze u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr. kada su bočno ograničeni aminokiselinskim sekvencama koje bočno ograničavaju pomenute epitope u proteinu koji se sreće prirodno, i kada se eksprimira u antigen-prezentujućim ćelijama, mogu da stimulišu T ćelije kao što su T ćelije pacijenta koje imaju željenu specifičnost. Takve bočne sekvence nogu sadržati 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 aminokiselina i mogu bočno ograničavati sekvencu epitopa N-terminalno i/ili C-terminalno.

[0226] Modifikovani peptidi određeni prema navodima mogu se rangirati u pogledu svoje upotrebljivosti kao epitopa za kancersku vakcinu. Prema tome, u jednom aspektu, navodi uključuju manuelni ili kompjuterizovani analitički proces u kojem se identifikovani modifikovani peptidi analiziraju i selektuju u pogledu svoje upotrebljivosti u respektivnoj vakcini koja će se obezbediti. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti analitički proces je kompjuterizovani proces zasnovan na algoritmu. Poželjno, pomenuti analitički proces uključuje određivanje i/ili rangiranje epitopa prema predviđanju njihovog kapaciteta da budu imunogeni.

[0227] Neoepitopi identifikovani prema navodima i obezbeđeni vakcinom prema navodima su poželjno prisutni u formi polipeptida koji sadrži pomenute neoepitope kao što su poliepitopski polipeptid ili nukleinska kiselina, posebno RNK, kodirajuća za pomenuti polipeptid. Pored toga, neoepitopi mogu biti prisutni u polipeptidu u obliku sekvence za vakcinu, tj. prisutni u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr. bočno ograničeni aminokiselinskim sekvencama koje ograničavaju pomenute epitope i u prirodnom proteinu. Takve bočne sekvence mogu uključivati 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 aminokiselina i mogu bočno ograničavati epitopsku sekvencu N-terminalno i/ili C-terminalno. Prema tome, sekvenca za vakcinu može uključivati 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 35 ili više, 40 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, neoepitopi i/ili sekvence za vakcinu postavljene su u polipeptidu po principu glava-ka-repu.

[0228] U jednom primeru izvođenja, neoepitopi i/ili sekvence za vakcinu razdvojeni su linkerima, tačnije neutralnim linkerima. Izraz "linker" prema navodima odnosi se na peptid dodat između dva peptidna domena kao što su epitopi ili sekvence za vakcinu, da povežu pomenute peptidne domene. Nema posebnog ograničenja u pogledu linkerske sekvence. Međutim, poželjno je da linkerska sekvenca smanjuje sterično ometanje između dva peptidna domena, da se dobro translatuje i podržava ili dopušta obradu epitopa. Pored toga, linker bi trebalo da ne sadrži ili da sadrži samo malo imunogenih sekvencionih elemenata. Linkeri poželjno ne bi trebalo da stvaraju neendogene neoepitope kao što su oni nastali od spojne suture između susednih neoepitopa, koji mogu stvoriti neželjene imunske reakcije. Polipeptidna vakcina bi, dakle, poželjno trebalo da sadrži linkerske sekvence koje mogu da smanje broj neželjenih MHC-vezujućih spojnih epitopa. Hoyt et al. (EMBO J.25(8), 1720-9, 2006) i Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) pokazali su da sekvence bogate glicinom ometaju proteazomsku obradu i tako upotreba linkerskih sekvenci bogatih glicinom deluje smanjujući na najmanju meru broj linker-sadržavajućih peptida koji mogu da se obrade proteazomima. Pored toga, zapaženo je da glicin inhibira jako vezivanje na pozicijama MHC-vezujućeg žleba (Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993). Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005) su otkrili da aminokiseline glicin i serin uključene u aminokiselinsku sekvencu daju fleksibilniji protein koji se efikasnije translatuje i obrađuje proteazomima, omogućavajući bolji pristup kodiranim neoepitopima. Svaki linker može uključivati 3 ili više, 6 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 aminokiselina. Poželjno, linker je obogaćen aminokiselinama glicinom i/ili serinom. Poželjno, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% aminokiselina linkera su glicin i/ili serin. U jednom poželjnom primeru izvođenja, linker je suštinski sačinjen od aminokiselina glicina i serina. U jednom primeru izvođenja, linker uključuje aminokiselinsku sekvencu (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)egde su a, b, c, d i e, nezavisno, broj koji se bira između 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 i gde su a b c d e različiti od 0 i poželjno su 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više ili 5 ili više. U jednom primeru izvođenja, linker uključuje sekvencu koja je opisana u ovom tekstu uključujući linkerske sekvence opisane u primerima kao što je sekvenca GGSGGGGSG.

[0229] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, polipeptid u koji su inkorporisani jedan ili više neoepitopa, na primer poliepitopski polipeptid prema predmetnim navodima, primenjuje se kod pacijenta u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK kao in vitro transkribovana ili sinteska RNK koja se može eksprimirati u pacijentovim ćelijama, na primer antigen-prezentujućim ćelijama, da bi se proizveo polipeptid. Predmetni navodi predviđaju i primenu jednog ili više multiepitopskih polipeptida koji su za potrebe predmetnih navoda obuhvaćeni izrazom "poliepitopski polipeptid", poželjno u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja se može eksprimirati u pacijentovim ćelijama, na primer antigen-prezentujućim ćelijama, da bi se proizveli jedan ili više polipeptida. U slučaju primene više od jednog multiepitopskog polipeptida, neoepitopi obezbeđeni različitim multiepitopskim polipeptidima mogu biti različiti ili se delimično preklapati. Kada se nađe u pacijentovim ćelijama, na primer antigen-prezentujućim ćelijama, polipeptid prema navodima se obrađuje da bi se proizveli neoepitopi identifikovani prema navodima. Primena vakcine date prema navodima poželjno obezbeđuje epitope koji se prezentuju u kontekstu MHC molekula klase I, koji su sposobni da pobude odgovor CD8+ pomažućih T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su MHC-prezentovani epitopi izvedeni. Primena vakcine date prema navodima može obezbediti i epitope koji se prezentuju u kontekstu MHC molekula klase II, koji su sposobni da pobude odgovor CD4+ T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su MHC-prezentovani epitopi izvedeni. Pored toga, primena vakcine date prema navodima može obezbediti jedan ili više neoepitopa (uključujući poznate neoepitope i neoepitope identifikovane prema navodima) kao i jedan ili više epitopa koji ne sadrže somatske mutacije specifične za kancer, ali se eksprimiraju u kancerskim ćelijama i poželjno indukuju imunski odgovor protiv kancerskih ćelija, poželjno imunski odgovor specifičan za kancer.

[0230] Vakcina obezbeđena prema navodima može biti rekombinantna vakcina.

[0231] Izraz "rekombinantna" u kontekstu predmetnih navoda znači "napravljena genetičkim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni entitet" kao što je rekombinantni polipeptid u kontekstu predmetnih navoda ne sreće se prirodno, i poželjno je rezultat kombinacije entiteta kao što su sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina koje se ne kombinuju u prirodi. Na primer, rekombinantni polipeptid u kontekstu predmetnih navoda može sadržati nekoliko aminokiselinskih sekvenci kao što su neoepitopi ili sekvence za vakcinu izvedene iz različitih proteina ili različitih delova istog proteina, fuzionisanih, npr., peptidnim vezama ili odgovarajućim linkerima.

[0232] Izraz "prirodni", kako se koristi u ovom tekstu, označava činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, prirodni su peptid ili nukleinska kiselina koji su prisutni u organizmu (uključujući viruse) i mogu se izolovati iz izvora, a koje čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji.

[0233] Sredstva i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje obolelog subjekta, npr., subjekta sa bolešću koja se karakteriše prisustvom bolesnih ćelija koje eksprimiraju antigen i prezentuju njegov fragment. Posebno poželjne bolesti su kancerske bolesti. Sredstva i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se koristiti i za imunizaciju ili vakcinaciju da bi se prevenirala bolest opisana u ovom tekstu.

[0234] Izraz "bolest" odnosi se na abnormalno stanje koje utiče na telo individue. Bolest se često shvata kao medicinsko stanje udruženo sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti izazvana faktorima originalno iz spoljnog izvora, kao što je infektivna bolest, ili bolest može biti izazvana unutrašnjim disfunkcijama, to su na primer autoimunske bolesti. Kod ljudi, "bolest" se često koristi u širem smislu da označi svako stanje koje izaziva bol, disfunkciju, distres, socijalne probleme, ili smrt obolele osobe, ili slične probleme za one koji su u kontaktu sa osobom. U tom širem smislu, ponekad uključuje povrede, onesposobljenost, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantna ponašanja i atipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i u druge svrhe ovo može smatrati zasebnim kategorijama. Bolesti obično pogađaju osobe ne samo fizički nego i emotivno, jer oboljevanje i življenje sa mnogim bolestima može izmeniti čovekovu ličnost i njegov pogled na život.

[0235] Izraz "normalno" odnosi se na stanje zdravlja ili uslove u zdravom subjektu ili tkivu, tj., nepatološka stanja, pri čemu "zdrav" poželjno znači nekancerozan.

[0236] Izraz "bolest udružena sa antigenom" ili "bolest koja uključuje antigen" odnosi se na svaku bolest koja je povezana sa antigenom, npr. bolest koja se karakteriše prisustvom antigena ili ćelija koje eksprimiraju antigen. Bolest koja uključuje antigen može biti infektivna bolest, autoimunska bolest ili kancerska bolest, ili jednostavno kancer. Kako je pomenuto ranije u ovom tekstu, antigen može biti antigen udružen sa bolešću, kao što je tumor-asocirani antigen, virusni antigen ili bakterijski antigen.

[0237] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen" znači prema navodima da je ekspresija antigena detektovana u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama obolelog tkiva ili organa može biti povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. Porast se odnosi na porast od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak i više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je prisutna samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom.

[0238] Prema navodima, bolest koja uključuje ili je udružena sa ćelijama koje eksprimiraju antigen uključuje kancerske bolesti.

[0239] Izraz "infektivna bolest" odnosi se na svaku bolest koja može da se prenese sa jedne na drugu individuu ili sa jednog na drugi organizam i koja je izazvana mikrobima (npr. obična prehlada). Infektivne bolesti su poznate u struci i uključuju, na primer, virusnu bolest, bakterijsku bolest ili parazitsku bolest, što su bolesti izazvane virusom, bakterijom, odnosno parazitom. U vezi sa tim, infektivna bolest može biti, na primer, hepatitis, polno prenosiva bolest (npr. hlamidija ili gonoreja), tuberkuloza, HIV/sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS), difterija, hepatitis B, hepatitis C, kolera, težak akutni respiratorni sindrom (SARS), ptičji grip i grip.

[0240] Izraz "autoimunska bolest" odnosi se na svaku bolest u kojoj telo proizvodi imunogeni odgovor (tj. odgovor imunskog sistema) na neki konstituent sopstvenog tkiva. Drugim rečima, imunski sistem gubi sposobnost da prepozna neko tkivo ili sistem u telu kao sopstvene i cilja ih i napada kao strane. Autoimunske bolesti mogu se klasifikovati u one u kojima je zahvaćen pretežno jedan organ (npr. hemolitička anemija i antiimunski tiroiditis) i one u kojima je proces autoimunskog oboljenja difuzan u mnogim tkivima (npr. sistemski eritemski lupus). Na primer, veruje se da je multipla skleroza prouzrokovana napadom T ćelija na omotač koji okružuje nervna vlakna mozga i kičmene moždine. Ovo za rezultat ima gubitak koordinacije, slabost i zamućenje vida. Autoimunske bolesti poznate su u struci i uključuju na primer, Hashimotov tiroiditis, Graveovu bolest, lupus, multiplu sklerozu, reumatski artritis, hemolitičku anemiju, antiimunski tiroiditis, sistemski eritemski lupus, celijačnu bolest, Crohnovu bolest, kolitis, dijabetes, sklerodermu, psorijazu i slično.

[0241] Izrazi "kancerska bolest" ili "kancer" označavaju ili opisuju fiziološko stanje osobe koje se tipično karakteriše neregulisanim umnožavanjem ćelija. Primeri kancera uključuju, ali se ne ograničavaju na karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Preciznije, primeri takvih kancera uključuju kancer kosti, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer uterusa, kancer ovarijuma, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer kolona, kancer dojke, kancer prostate, kancer uterusa, karcinom polnih i reproduktivnih organa, Hodgkinovu bolest, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, karcinom bubrega, karcinom bubrežne karlice, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni kancer, tumore kičmene osovine, gliom, meningeom i adenom hipofize. Izraz "kancer" prema navodima uključuje i kancerske metastaze.

[0242] Prema navodima, izraz "tumor" ili "tumorska bolest" odnosi se na abnormalno umnožavanje ćelija (nazvanih neoplastične ćelije, tumorogene ćelije ili tumorske ćelije) koje poželjno formiraju otok ili leziju. Pod "tumorskom ćelijom" misli se na abnormalnu ćeliju koja se umnožava brzom nekontrolisanom proliferacijom koja se nastavlja i posle prestanka stimulusa koji iniciraju ovo umnožavanje. Tumori pokazuju delimično ili potpuno odsustvo strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom i obično formiraju posebnu masu tkiva koja može biti benigna, premaligna ili maligna.

[0243] U svrhu predmetnih navoda, izrazi "kancer" i "kancersko oboljenje" koriste se naizmenično sa izrazima "tumor" i "tumorsko oboljenje".

[0244] Pod "metastazom" misli se na rasprostiranje kancerskih ćelija sa originalnog mesta nastanka ka drugim delovima tela. Formiranje metastaze je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, prodiranja kroz bazalnu membranu endotela da bi se ušlo u telesnu duplju i sudove i zatim, posle transportovanja krvlju, infiltriranja u ciljne organe. Konačno, rast novog tumora, tj. sekundarnog tumora ili metastatskog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Tumorska metastaza se često sreće čak i posle uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu zaostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" prema navodima odnosi se na "udaljenu metastazu" što se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova.

[0245] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su kao one u originalnom tumoru. To znači, na primer, da ako kancer ovarijuma metastazira u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od abnormalnih ovarijalnih ćelija, a ne od abnormalnih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski kancer ovarijuma, a ne kancer jetre.

[0246] Izraz "cirkulišuće tumorske ćelije" ili "CTC" odnosi se na ćelije koje su se odvojile od primarnog tumora i cirkulišu u krvnom toku. CTC mogu predstavljati zametke za kasniji rast dodatnih tumora (metastaze) u različitim tkivima. Kod pacijenata sa metastatskom bolešću, cirkulišuće tumorske ćelije nalaze se sa učestalostima reda veličine 1-10 CTC po mL cele krvi. Razvijeni su istraživački postupci za izolovanje CTC. U struci je opisano nekoliko istraživačkih postupaka za izolovanje CTC, npr. tehnika u kojima se koristi činjenica da epitelne ćelije obično eksprimiraju ćelijski adhezioni protein EpCAM koji je odsutan kod normalnih krvnih ćelija. Imobilisanje zasnovano na imunomagnetnim perlicama uključuje tretiranje uzoraka krvi antitelima na EpCAM koja su konjugovana sa magnetnim česticama, posle čega sledi razdvajanje obeleženih ćelija u magnetnom polju. Izolovane ćelije se zatim boje antitelom na drugi marker epitela, citokeratin, kao i na uobičajeni marker leukocita CD45, tako da se razlikuju retke CTC od kontaminirajućih belih krvnih ćelija. Ovaj robusni i semiautomatizovani pristup identifikuje CTC sa prosečnim prinosom od 1 CTC/mL i čistoćom od 0.1% (Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). U drugom postupku za izolaciju CTC koristi se uređaj za mikrofluidno-baziranu imobilizaciju CTC, koji uključuje proticanje cele krvi kroz komoru sa 80000 mikropostolja koja su funkcionalizovana tako što su obložena antitelima na EpCAM. CTC se zatim boje sekundarnim antitelima na citokeratin ili specifične tkivne markere, kao što su PSA u kanceru prostate ili HER2 u kanceru dojke i vizuelizuju automatizovanim skeniranjem mikropostolja u više ravni duž trodimenzionalnih koordinata. CTC-čipovi mogu da identifikuju citokeratin-pozitivne cirkulišuće tumorske ćelije kod pacijenta, sa srednjim prinosom od 50 ćelija/ml i čistoćom u opsegu 1-80% (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). Sledeća mogućnost za izolovanje CTC je korišćenje CellSearch™ Circulating Tumor Cell (CTC) testa, Veridex, LLC (Raritan, NJ) u kojem se vrše imobilisanje, identifikovanje i brojanje CTC u epruveti krvi. CellSearch™ sistem je metodologija koju je odobrila Uprava za hranu i lekove SAD (FDA) za utvrđivanje broja CTC u celoj krvi, koja se bazira na kombinaciji imunomagnetnog obeležavanja i automatizovane digitalne mikroskopije. U literaturi su opisani i drugi postupci za izolaciju CTC, koji se svi mogu koristiti u vezi sa predmetnim navodima.

[0247] Recidiv ili vraćanje sreću se kada osoba bude ponovo pogođena stanjem kojim je bila pogođena ranije. Na primer, ako je pacijent imao tumorsku bolest, bio uspešno lečen od pomenute bolesti i ponovo razvio pomenutu bolest, pomenuta novorazvijena bolest može se smatrati za recidiv ili vraćanje. Međutim, prema navodima, recidiv ili vraćanje tumorske bolesti može ali se ne mora obavezno desiti na mestu originalne tumorske bolesti. Tako, na primer, ako je pacijent bolovao od tumora ovarijuma i bio uspešno lečen, recidiv ili vraćanje može biti pojava tumora ovarijuma na mestu različitom od ovarijuma. Recidiv ili vraćanje tumora uključuje i situacije u kojima se tumor sreće na mestu različitom od mesta originalnog tumora kao i na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor od kojeg je pacijent bio lečen je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.

[0248] Izraz "imunoterapija" odnosi se na lečenje bolesti ili stanja indukovanjem, pojačavanjem ili supresijom imunskog odgovora. Imunoterapije dizajnirane da pobude ili umnože imunski odgovor klasifikuju se kao aktivacione imunoterapije, dok se imunoterapije koje redukuju ili suprimiraju imunski odgovor klasifikuju kao supresione imunoterapije. Izraz "imunoterapija" uključuje imunizaciju antigenom ili vakcinaciju antigenom, ili tumorsku imunizaciju ili tumorsku vakcinaciju. Izraz "imunoterapija" odnosi se i na manipulaciju imunskog odgovora tako da neodgovarajući imunski odgovori budu modulisani u pogodnije u kontekstu autoimunskih bolesti kao što su reumatski artritis, alergije, dijabetes ili multipla skleroza.

[0249] Izrazi "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuju proces primene antigena kod osobe, sa svrhom indukovanja imunskog odgovora, na primer, iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.

[0250] Izraz "terapijski tretman" ili jednostavno "tretman" odnosi se na svaki tretman koji poboljšava status bolesti i/ili produžava (povećava) životni vek osobe. Pomenuti tretman može eliminisati bolest kod osobe, prekinuti ili usporiti razvoj bolesti kod osobe, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod osobe, smanjiti frekvenciju ili jačinu simptoma kod osobe, i/ili smanjiti ponovno pojavljivanje kod osobe koja trenutno ima ili je ranije imala bolest.

[0251] Izraz "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" odnosi se na svaki tretman koji je namenjen prevenciji pojave bolesti kod osobe. Izrazi "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" u ovom tekstu se koriste naizmenično.

[0252] Izrazi "štiti", "prevenira", "profilaktički", "preventivno", ili "protektivno" odnose se na prevenciju i/ili lečenje pojave i/ili propagacije bolesti, npr. tumora, kod osobe. Na primer, profilaktička primena imunoterapije, npr. davanjem kompozicije opisane u ovom tekstu, može zaštititi osobu koja je prima od razvijanja tumora. Na primer, terapijska primena imunoterapije, npr. davanjem kompozicije opisane u ovom tekstu, može zaustaviti razvoj bolesti, npr. dovesti do inhibicije progresije/rasta tumora. Ovo uključuje usporavanje progresije/rasta tumora, posebno prekid progresije tumora, što poželjno dovodi do eliminacije tumora. Terapijska primena imunoterapije može zaštititi osobu, na primer, od rasejavanja ili metastaziranja postojećih tumora.

[0253] Izraz "osoba" ili "subjekt" odnosi se na vertebrate, posebno sisare. Na primer, sisari su, u kontekstu predmetnih navoda, ljudi, nehumani primati, domestifikovane životinje kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji, itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd. kao i životinje u zarobljeništvu na primer životinje u zoološkim vrtovima. Izraz "subjekt" odnosi se i na nesisarske vertebrate kao što su ptice (posebno domestifikovane ptice kao što su kokoške, patke, guske, ćurke) i na ribe (posebno ribe za uzgoj, npr. losos ili som). Izraz "životinja", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje i ljude. Poželjno, izraz "pacijent" odnosi se na obolelu osobu.

[0254] Sredstva opisana u ovom tekstu mogu se primeniti u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije. Izraz "farmaceutska kompozicije" odnosi se na formulaciju koja uključuje terapijski efikasno sredstvo ili njegovu so, poželjno zajedno sa farmaceutskim ekscipijentima kao što su puferi, prezervansi i modifikatori toničnosti. Pomenuta farmaceutska kompozicija korisna je za lečenje, prevenciju ili smanjenje jačine bolesti ili poremećaja primenom pomenute farmaceutske kompozicije kod individue. Farmaceutska kompozicija poznata je u struci i kao farmaceutska formulacija. Farmaceutska kompozicija može se primeniti lokalno ili sistemski.

[0255] Izraz "sistemska primena" odnosi se na primenu terapijski efikasnog sredstva tako da se sredstvo široko distribuira u telu osobe u značajnim količinama i razvija biološki efekat. Prema predmetnim navodima, poželjno je da se primena vrši parenteralnom primenom.

[0256] Izraz "parenteralna primena" odnosi se na primenu terapijski efikasnog sredstva tako da sredstvo ne prolazi kroz crevo. Izraz "parenteralna primena" uključuje intravensku primenu, supkutanu primenu, intradermalnu primenu ili intraarterijsku primenu, ali ne ograničava se na njih.

[0257] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnim navodima primenjuje se injektiranjem u mišićno tkivo, na primer skeletni mišić. Intramuskularna primena na primer intramuskularna injekcija je dakle poželjan put primene.

[0258] Primena se može postići na različite načine. U jednom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnim navodima primenjuje se injekcijom. U poželjnom primeru izvođenja, injektiranje se izvodi putem igle. Kao alternativa može se koristiti injekcija bez igle.

[0259] Farmaceutske kompozicije predmetnih navoda mogu uključivati najmanje jedan adjuvans. Izraz "adjuvans" odnosi se na jedinjenja koja, kada se osobi daju u kombinaciji sa antigenom ili antigenim peptidom, produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. Pretpostavlja se da adjuvans ispoljava svoju biološku aktivnost jednim ili više mehanizama, uključujući povećanje površine antigena, produžavanje zadržavanja antigena u telu, usporavanje oslobađanja antigena, usmeravanje makrofaga ka antigenu, povećanje preuzimanja antigena, pojačavanje obrade antigena, stimulaciju oslobađanja citokina, stimulaciju i aktivaciju imunskih ćelija kao što su B ćelije, makrofagi, dendritske ćelije, T ćelije i nespecifičnu aktivaciju imunskih ćelija. Adjuvansi obuhvataju heterogenu grupu jedinjenja kao što su uljane emulzije (npr., Freundov adjuvans), mineralna jedinjenja (kao što je alaun), bakterijske proizvode (kao što je toksin Bordetella pertussis), ili imunostimulirajuće komplekse. Primeri adjuvanasa uključuju saponine, nepotpune Freundove adjuvanse, potpune Freundove adjuvanse, tokoferol ili alaun, ali nisu ograničeni na njih.

[0260] Farmaceutska kompozicija prema predmetnim navodima obično se primenjuje u "farmaceutski efikasnoj količini" i u "farmaceutski prihvatljivom preparatu".

[0261] Izraz "farmaceutski efikasna količina" odnosi se na količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat, samu ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti, željena reakcija poželjno se odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo uključuje usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekidanje ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti može biti i odlaganje pojave ili prevencija pojave pomenute bolesti ili pomenutog stanja. Efikasna količina kompozicija opisanih u ovom tekstu zavisiće od stanja koje treba da se leči, jačine bolesti, pacijentovih ličnih parametara, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanja lečenja, tipa pridružene terapije (ako je prisutna), specifičnog puta primene i sličnih faktora. Prema tome, primenjene doze kompozicija opisanih u ovom tekstu mogu zavisiti od takvih različitih parametara. U slučaju da se inicijalnom dozom kod pacijenta ne postigne dovoljna reakcija, mogu se koristiti više doze (ili više efektivne doze koje se postižu drugačijim, lokalizovanijim putem primene).

[0262] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na netoksičnost materijala koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.

[0263] Farmaceutske kompozicije predmetnih navoda mogu sadržati soli, pufere, prezervanse, nosače i opciono druga terapijska sredstva. Poželjno, farmaceutske kompozicije predmetnih navoda uključuju jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenata.

[0264] Izraz "ekscipijent" treba da označi sve supstance u farmaceutskoj kompoziciji koje nisu aktivni sastojci, kao što su povezivači, lubrikansi, zgušnjivači, površinski aktivna sredstva, prezervansi, emulgatori, puferi, sredstva za poboljšanje ukusa, ili sredstva za bojenje.

[0265] Izraz "razblaživač" odnosi se na sredstvo za razblaživanje i/ili razređivanje. Pored toga, izraz "razblaživač" uključuje bilo koji ili više od fluidnih, tečnih ili čvrstih suspenzija i/ili mešovitih medijuma.

[0266] Izraz "nosač" odnosi se na jednu ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih potpornih supstanci ili razblaživača, pogodnih za primenu kod čoveka. Izraz "nosač" odnosi se na prirodnu ili veštačku organsku ili neorgansku komponentu kombinovanu sa aktivnom komponentom u cilju olakšavanja primene aktivne komponente. Poželjno, nosačke komponente su sterilne tečnosti kao što su voda ili ulje, uključujući ona koja su izvedena iz mineralnog ulja, životinja ili biljaka, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, susamovo ulje, suncokretovo ulje itd. Rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerina takođe se mogu upotrebiti kao vodena nosačka jedinjenja.

[0267] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku upotrebu dobro su poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Primeri pogodnih nosača uključuju, na primer, magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktozu, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragant, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, vosak koji se topi na niskoj temperaturi, kakao buter i slično. Primeri pogodnih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu.

[0268] Farmaceutski nosači ili razblaživači mogu se odabrati u odnosu na nameravani put primene i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske kompozicije predmetnih navoda mogu uključivati ili im se mogu dodati kao nosač(i), ekscipijent(i) ili diluent(i), svaki pogodan povezivač(i), lubrikans(i), suspendujuće sredstvo(a), sredstvo(a) za oblaganje, i/ili solubilizujuće sredstvo(a). Primeri pogodnih povezivača uključuju skrob, želatin, prirodne šećere kao što su glukoza, laktoza, slobodno protočna laktoza, beta-laktoza, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetske gume kao što su akacija, tragant ili natrijum alginat, karboksimetil celulozu i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanasa uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. Prezervansi, stabilizeri, boje, čak i sredstva za poboljšanje ukusa mogu se obezbediti u farmaceutskoj kompoziciji. Primeri prezervanasa uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Antioksidatnti i suspendujuća sredstva takođe se mogu upotrebiti.

[0269] U jednom primeru izvođenja, kompozicija je vodena kompozicija. Vodena kompozicija opciono može uključivati rastvorke, npr. soli. U jednom primeru izvođenja, kompozicija je u obliku kompozicije osušene zamrzavanjem. Kompozicija osušena zamrzavanjem dobija se tako što se odgovarajuća vodena kompozicija osuši zamrzavanjem.

[0270] Sredstva i kompozicije dati u ovom tekstu mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim terapijskim režimima kao što su hirurška intervencija, zračenje, hemioterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologa, singena, alogena ili nesrodna).

SLIKE

[0271]

Slika 1. Proteini publikovanih epitopa su u značajno većoj meri prisutni u egzozomima i citosolu u poređenju sa nasumičnim peptidima (proteom).

Slika 2. Geni publikovanih epitopa se znatno češće nalaze u SEREX bazi podataka u poređenju sa nasumičnim peptidima.

PRIMERI

[0272] Ovde upotrebljene tehnike i postupci opisani su u ovom tekstu ili izvedeni na poznat način ili kako je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci koji uključuju upotrebu kitova i reagenasa izvode se u skladu sa uputstvom proizvođača, ukoliko nije specifično napomenuto drugačije.

Primer 1: Lokacija proteina koji sadrže publikovane epitope

[0273] Literatura je pretražena da bi se identifikovali neoepitopi ograničeni na MHC molekule klase I ("Publikovani epitopi", n=129) i njihova lokacija je upoređena sa nasumičnim uzorkom protein-kodirajućih gena ("Proteom", n=500) (Slika 1). Lokacija respektivnih gena određena je na osnovu baze podataka genske ontologije (http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/). Pored toga, prisustvo u egzozomima ispitano je putem baze podataka ExoCarta (http://www.exocarta.org/). Kao što je pokazano na Slici 1, geni koji sadrže neoepitop znatno su zastupljeniji u egzozomima kao i u citosolu, u poređenju sa kontrolnim genima (Fišerov test tačnosti; p<0.0001).

[0274] U drugom koraku, prisustvo gena publikovanih epitopa u bazi podataka SEREX (V. Jongeneel, Cancer Immunity, Vol. 1, p. 3 (30 March 2001)) upoređeno je sa nasumičnim kontrolnim genima (Slika 2). SEREX baza podataka navodi proteine za koje je pokazano da bivaju prepoznati autoantitelima. Geni publikovanih epitopa značajno su češće nađeni u SEREX bazi podataka nego nasumični peptidi (Fišerov test tačnosti; p<0.0001).

[0275] Rezultati prikazani na Slikama 1 i 2 ukazuju na to da prisustvo mutiranih gena u egzozomima, citosolu ili bazi podataka autoantitela predstavlja koristan parametar za predviđanje mutiranih antigena relevantnih za imunoterapiju.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za predviđanje korisnosti proteina koji eksprimiraju ćelije kancera za antikancersku imunoterapiju pacijenta,

naznačen time što navedeni protein sadrži peptid koji se vezuje za molekul MHC klase I, koji sadrži neoepitop povezan sa kancerom, koji sadrži somatsku mutaciju specifičnu za kancer,

gde postupak obuhvata

utvrđivanje postojanja odgovora antitela na protein,

pri čemu se odgovor antitela utvrđuje korišćenjem kompjuterskog analitičkog postupka, gde postojanje odgovora antitela pacijenta na protein ukazuje na to da je protein koristan za imunoterapiju pacijenta sa kancerom.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se somatska mutacija specifična za kancer identifikuje korišćenjem sekvenciranja sledeće generacije (NGS).

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što prezentacija neoepitopa pomoću antigen-prezentujućih ćelija pacijenta aktivira T ćelije usmerene na neoepitop.

4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koji se koristi u kompjuterski implementiranom postupku za dizajniranje vakcine.