RS65631B1 - Novi polisaharid i njegove upotrebe - Google Patents

Novi polisaharid i njegove upotrebe

Info

Publication number
RS65631B1
RS65631B1 RS20240696A RSP20240696A RS65631B1 RS 65631 B1 RS65631 B1 RS 65631B1 RS 20240696 A RS20240696 A RS 20240696A RS P20240696 A RSP20240696 A RS P20240696A RS 65631 B1 RS65631 B1 RS 65631B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
coli
antigen
host cell
carrier protein
seq
Prior art date
Application number
RS20240696A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael T Kowarik
Michael L Wetter
Stefan J Kemmler
Micha A Häuptle
Veronica Gambillara
Manuela Mally
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS65631B1 publication Critical patent/RS65631B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
1. UVOD
[0001] Ovde je otkrivena struktura antigena O25B E. coli, kao i upotreba O25B, postupci za dobijanje O25B i biokonjugati koji sadrže O25B. Prijavioci su identifikovali klaster gena E. coli koji je odgovoran proizvodnju O25B i u potpunosti okarakterisali strukturu antigena O25B. Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže biokonjugat antigena O25 E. coli. Ovde su obezbeđene nukleinske kiseline sposobne da proizvedu O25B u ćelijama domaćinima. Ovde su takođe obezbeđene ćelije domaćini, npr., rekombinantno modifikovane ćelije domaćini, koje sadrže nukleinske kiseline sposobne da proizvedu O25B. Takve ćelije domaćini se mogu koristiti za generisanje biokonjugata koji sadrže O25B vezan za protein nosač, koji se može koristiti u, npr., formulaciji terapeutika (npr. vakcina). Ovde opisani antigen O25B takođe je koristan u stvaranju antitela, koja se mogu koristiti, na primer, u terapijskim metodama kao što je pasivna imunizacija subjekata. Ovde su dalje obezbeđene kompozicije koje sadrže O25B, zasebno ili u kombinaciji sa drugim antigenima E. coli (npr. O1, O2 i O6 i njihovi podserotipovi), za upotrebu u terapijskim postupcima, npr., vakcinacija domaćina protiv infekcije sa E. coli (na primer, ekstra-intestinalni patogen, kao što je uropatogena, E. coli).
2. STАNJE TEHNIKE
[0002] Ekstra-intestinalna patogena E. coli (ExPEC) izaziva širok spektar infekcija koje su odgovorne za značajan morbiditet, smrtnost i troškove na godišnjem nivou. Infekcije urinarnog trakta su među najčešćim stanjima koja ExPEC izaziva kod ljudi. Međutim, životno ugrožavajuća stanja, kao što su meningitis i sepsa, su takođe izazvana ExPEC.
[0003] Bakterijska rezistencija na antibiotike je glavna briga u borbi protiv bakterijske infekcije, a sojevi E. coli otporni na više lekova (MDR) postaju sve zastupljeniji. Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; i Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10):1165-1176. Prema tome, postoji potreba za razvijanjem efikasnih vakcina protiv ExPEC-a. Takođe se priznaju WO 2009/104074 A2, koji se bavi biokonjugatima napravljenim od rekombinantnih N-glikozilovanih proteina iz prokariotskih ćelija, i WO 2013/034664 A1, koji se bavi biokonjugatnim vakcinama napravljenim u prokariotskim ćelijama.
3. SUŠTINA PRONALASKA
[0004] Sve reference u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije, lekove i slično predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja terapijom humanog (ili životinjskog) tela.
[0005] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži biokonjugat E.coli O25B antigena N-vezanog za protein nosač, pri čemu O25B antigen E.coli sadrži strukturu Formule O25B’:
pri čemu je n ceo broj između 1 i 30.
[0006] U jednom aspektu, ovde je obezbeđena prokariotska ćelija domaćina koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju enzime (npr. glikoziltransferaze) sposobne da proizvodu novi polisaharid koji je ovde otkriven, O25B E. coli. Shodno tome, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantno modifikovanu prokariotsku ćeliju domaćina, koja sadrži:
a. nukleotidnu sekvencu koja kodira:
i. dTDP-glukoza 4,6-dehidratazu;
ii. dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimerazu;
iii. Glukoza-1-fosfat timidililtransferazu;
iv. dTDP-4-dehidrohamnoza 3,5-epimerazu;
v. O antigen flipazu;
vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu;
vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukoziltransferazu;
viii. O antigen polimerazu;
ix. O-acetil transferazu;
x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferazu i
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu;
b. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil transferazu; i
c. nukleotidnu sekvencu koja kodira protein nosač, pri čemu protein nosač sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 15).
[0007] Ovde su takođe obezbeđene ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju enzime (npr., glikoziltransferaze) sposobne da proizvodu druge antigene E. coli, npr. O25A, O1, O2 i O6, i njihove podserotipove. Ćelije domaćini koje su ovde obezbeđene mogu prirodno da eksprimuju nukleinske kiseline specifične za proizvodnju antigena O od interesa, ili ćelije domaćina mogu biti napravljene da eksprimuju takve nukleinske kiseline, tj., u određenim izvođenjima pomenute nukleinske kiseline su heterologne za ćelije domaćine.
[0008] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđene ćelije domaćini sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju dodatne enzime koji su aktivni u N-glikozilaciji proteina, npr., ćelija domaćina koja je ovde prikazana može dalje da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira oligosaharil transferazu ili nukleinske kiseline koje kodiraju druge glikoziltransferaze. U određenim izvođenjima, ćelije domaćini koje su ovde prikazane sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira proteinski nosač, npr. protein za koji oligosaharidi i/ili polisaharidi mogu biti vezani da bi se obrazovao biokonjugat. U specifičnom izvođenju, ćelija domaćin je E. coli. Videti Odeljak 5.3.
[0009] Takođe ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćina koja sadrži klaster gena E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO: 12), ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan klasteru gena E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO: 12). U specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0010] Ovde je takođe prikazana prokariotska ćelija domaćina koja sadrži klaster gena E. coli rfb(upec163) ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan ili homologan klasteru gena E. coli rfb(upec163). U specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0011] Takođe ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćina koja sadrži klaster gena E. coli rfb(upec177) ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan klasteru gena E. coli rfb(upec177). U specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0012] Takođe ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćina rekombinantno modifkovana da sadrži (npr. uvođenjem jednog ili više vektora/plazmida u ćeliju domaćina) jedan, dva, tri, četiri ili više sledećih gena (ili nukleinsku kiselinu koja je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ili homologna jednom od sledećih gena): rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2), rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10) i/ili wbbL (SEQ ID NO:11). U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu (npr. heterolognu oligosahariltransferazu). U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0013] Takođe je prikazana prokariotska ćelija domaćina rekombinantno modifikovana da sadrži (npr. uvođenjem jednog ili više vektora/plazmida u ćeliju domaćina) jedan, dva, tri, četiri ili više od sledećih (i) dTDP-glukoza 4, 6-dehidrataza; (ii) dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimeraza; (iii) glukoza-1-fosfat timidililtransferaza; (iv) dTDP-4-dehidrohamnoza 3,5-epimeraza; (v) O antigen flipaza; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnozil-transferaza; (vii) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferaza; (viii) O antigen polimeraza; (ix) O-acetil transferaza; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferaza; i/ili (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-ramnosiltransferaza. U specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu (npr. heterolognu oligosahariltransferazu). U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0014] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđene prokariotske ćelije domaćini sadrže deleciju ili funkcionalnu inaktivaciju jednog ili više gena. Videti Odeljak 5.3.1. U specifičnom izvođenju, jedan ili više waaL gena, gtrA gena, gtrB gena, gtrS gena ili rfb genskog klastera (ili gen ili gena u klasteru rfb klasteru) je izbrisano ili funkcionalno inaktivirano iz genoma prokariotske ćelije domaćina koja je ovde navedena.
[0015] Proteinski nosači eksprimirani u ovde prikazanim prokariotskim ćelijama domaćinima mogu se odabrati od bilo kog proteina nosača poznatog stručnjacima, npr. detoksifikovanog egzotoksina A P. aeruginosa (EPA; videti, npr., Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, proteina koji vezuje maltozu (MBP), toksoida difterije, toksoida tetanusa, detoksifikovanog hemolizina A S. aureus, faktora nakupljanja A, faktora nakupljanja B, E. coli FimH, E. coli FimHC, E. coli toplotno labilnog enterotoksina, detoksikovane varijante toplotno labilnog enterotoksina E. coli, podjedinica toksina kolere B (CTB), toksina kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, E. coli Sat proteina, passenger domena Sat proteina E. coli., Streptococcus pneumoniae Pneumolizin i njegove detoksifikovane varijante, C. jejuni AcrA i C. jejuni prirodnih glikoproteina. U specifičnom izvođenju, proteinski nosač eksprimiran u prokariotskoj ćeliji domaćinu koja je ovde obezbeđena je detoksifikovani egzotoksin Pseudomonas (EPA). U određenim izvođenjima, proteinski nosač ćelije domaćina koji je ovde obezbeđen sadrži signalnu sekvencu za ciljanje proteinskog nosača u periplazmatski prostor ćelije domaćina. U specifičnom izvođenju, signalna sekvenca je od DsbA E. coli, porin A spoljne membrane E. coli (OmpA), E. coli maltoza vezujući protein (MalE), Ervinia carotovorans pektat liaza (PelB), FlgI, NikA ili Bacillus sp. endoksilanaza (KsinA), toplotno labilni enterotoksin E. coli LTIIb, Bacillus endoksilanaza XinA ili flagelin E. coli (FlgI). U određenim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira proteinski nosač koji je eksprimovan u ovde prikazanim ćelijama domaćinima je modifikovan (npr., putem rekombinantnih tehnika) da kodira jednu ili više konsenzusnih sekvenci Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); i/ili konsenzusna sekvenca Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U određenim izvođenjima, proteinski nosači koji su eksprimovani u ovde prikazanim ćelijama domaćinima obuhvataju dve, tri, četiri, pet ili više navedenih konsenzusnih sekvenci. Videti Odeljak 5.3.2.
[0016] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za proizvodnju N-glikozilovanog proteinskog nosača (koji se ovde takođe naziva biokonjugat) koji sadrži protein nosač (npr. EPA) N-vezan za antigen E. coli O (npr., E. coli O25B), pomenuti postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina opisane ovde pod uslovima koji su pogodni za proizvodnju proteina i prečišćavanje N-glikozilovanog proteinskog nosača. Stoga, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za dobijanje N-glikozilovanog proteinskog nosača koji sadrži antigen O25B E.coli, pri čemu navedeni postupak obuhvata:
a. kultivisanje ćelije domaćina ovog pronalaska; i
b. prečišćavanje N-glikozilovanog proteina nosača koji sadrži O25B antigen E.coli.
[0017] Postupci za proizvodnju proteina korišćenjem ćelija domaćina, npr., E. coli, i izolovanja proteina proizvedenih od ćelija domaćina, su dobro poznati u oblasti tehnike. Videti Odeljak 5.3.
[0018] U drugom aspektu, ovde su obezbeđeni biokonjugati proizvedeni od ćelija domaćina koje su ovde prikazane. U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđen biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) A-vezan za O25B E. coli. Videti Odeljak 5.4.
[0019] Takođe je ovde prikazan biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) povezan sa jedinjenjem formule O25B, koje je predstavljeno u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom slučaju, protein nosač je N-vezan za O antigen Formule O25B.
[0020] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđen biokonjugat E.coli O25B antigena N-vezanog za protein nosač (npr. EPA, gde O25B antigen E.coli sadrži strukturu formule O25B’, predstavljenu u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom izvođenju, protein nosač je N-vezan za O antigen Formule O25B’.
[0021] Ovde je takođe prikazan izolovani O antigen iz soja ExPEC E. coli, pri čemu navedeni soj proizvodi O25B. U drugom specifičnom slučaju, ovde je predstavljen izolovani O antigen iz E. coli soja upec138. U konkretnom slučaju, ovde je predstavljen izolovani O antigen iz E. coli soja upec163. U drugom specifičnom slučaju, ovde je predstavljen izolovani O antigen iz E. coli soja upec177. Videti Odeljak 5.2.
[0022] Takođe ovde je prikazana populacija izolovanih makromolekula formule O25B, predstavljena u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom slučaju, n od bar 80% makromolekula u populaciji je između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20.
[0023] U drugom aspektu, ovde je data populacija izolovanih makromolekula Formule O25B’, predstavljena u nastavku
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom izvođenju, n od bar 80% makromolekula u populaciji je između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20.
[0024] U drugom aspektu, ovde su otkriveni postupci za generisanje anti-O25B antitela korišćenjem O25B i/ili biokonjugata koji sadrži O25B. Ovde su dalje otkrivena antitela proizvedena prema takvim postupcima. Videti Odeljak 5.5.
[0025] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije, npr., farmaceutske kompozicije, koje sadrže biokonjugate koji su ovde prikazani i/ili makromolekule (ili njihove populacije) koji su ovde prikazani. Videti Odeljak 5.6.
[0026] Takođe je ovde prikazana kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži makromolekul koji sadrži strukturu Formule O25B:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20.
[0027] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat E.coli O25B antigena N-vezanog za protein nosač pri čemu antigen E.coli O25B sadrži strukturu Formule O25B' :
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20.
[0028] Takođe ovde je prikazana kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji je ovde opisan, pri čemu pomenuti biokonjugat sadrži protein nosač (npr. EPA) povezan sa jedinjenjem Formule O25B, koja je predstavljena u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom slučaju, protein nosač je N-vezan za O antigen Formule O25B’.
[0029] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji je ovde opisan, pri čemu pomenuti biokonjugat sadrži protein nosač (npr. EPA) N-vezan za antigen E. coli O25B Formule O25B ', koja je predstavljena u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom izvođenju, protein nosač je N-vezan za O antigen Formule O25B’.
[0030] U određenim izvođenjima, ovde prikazane farmaceutske kompozicije sadrže jedan ili više dodatnih E. coli O antigena, pri čemu pomenuti antigeni nisu O25B (npr. formula O25B ili formula O25B'), npr. O antigeni iz E. coli (npr., ExPEC) osim onih iz serotipa O25B E. coli, i/ili jedan ili više biokonjugata koji sadrže protein nosač vezan za antigen O E. coli, pri čemu navedeni antigen nije O25B (npr. formula O25B ili formula O25B '). Takve kompozicije mogu da sadrže jedan ili više dodatnih makromolekula koji sadrže ExPEC O antigen i/ili jedan ili više dodatnih biokonjugata, npr. O1A, O2 i/ili O6 makromolekul i/ili O1A, O2 i/ili O6 biokonjugat.
[0031] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedan ili više dodatnih makromolekula koji sadrže ExPEC O antigen i/ili jedan ili više dodatnih biokonjugata, pored biokonjugata O25B (npr. biokonjugata koji sadrži protein nosač vezan za formulu O25B ili formulu O25B'), pri čemu navedeni dodatni makromolekuli sadrže strukturu izabranu iz grupe koju čine:
[0032] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam makromolekula ili biokonjugata koji sadrže pomenute makromolekule, pored biokonjugata O25B (npr., biokonjugata koji sadrži protein nosač vezan za formulu O25B ili formulu O25B'), pri čemu navedeni dodatni makromolekuli sadrže strukturu izabranu iz grupe koju čine:
1
[0033] Takođe je prikazana kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži (i) makromolekul O25 (npr. O25A ili O25B) ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25A ili O25B) i (ii) makromolekul O1 ili biokonjugata koji se sastoji iz O1. U specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O25 je O25B makromolekul. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti O1 makromolekul je O1A. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti O1 makromolekul je O1B. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti makromolekul O1 je O1C.
[0034] Takođe ovde je prikazana kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija, koja sadrži (i) makromolekul O25 (npr. O25A ili O25B) ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25A ili O25B) i (ii) biokonjugat O2 ili makromolekula koji sadrži O2. U specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O25 je O25B makromolekul.
[0035] Takođe ovde je prikazana kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži (i) makromolekul O25 (npr. O25A ili O25B) ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25A ili O25B) i (ii) makromolekul O25 (npr. O25A ili O25B) makromolekul O6 koji sadrži razgranati Glc monosaharid (O6Glc) ili razgranati GlcNAc monosaharid (O6GlcNAc)) ili biokonjugat koji sadrži O6. U specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O25 je O25B makromolekul. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O6 je O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid (O6Glc).
[0036] Ovde je takođe prikazana kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži najmanje dva od sledećeg: (i) makromolekul O25 (npr. O25A ili O25B) ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25A ili O25B); (ii) O1 makromolekula ili biokonjugata koji sadrži O1; (iii) O2 ili biokonjugat koji sadrži O2; i/ili (iv) O6 makromolekul (npr. O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid ili razgranati GlcNAc monosaharid) ili biokonjugat koji sadrži O6. U specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O25 je makromolekul O25B. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti O1 makromolekul je O1A. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O1 makromolekul je O1B. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti makromolekul O1 je O1C. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O6 je O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid (takođe naveden kao O6Glc).
[0037] Ovde je takođe prikazana kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija, koja sadrži makromolekul O25B, makromolekul O1A, makromolekul O2 i makromolekul O6 koji sadrži razgranati Glc monosaharid. U određenim slučajevima, pomenuti makromolekuli su konjugovani sa proteinima nosačima.
[0038] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u postupcima prevencije infekcije kod subjekta, npr., ljudskog subjekta, pomoću ExPEC-a, koji obuhvata davanje subjektu farmaceutski efikasne količine kompozicije (npr. imunogene kompozicije) koja je ovde opisana. Videti Odeljak 5.7.
[0039] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u postupcima lečenja infekcije subjekta, npr., ljudskog subjekta, pri čemu je subjekt inficiran sa ExPEC, koji se sastoji od davanja subjektu farmaceutski efikasne količine kompozicije (npr. imunogene kompozicije) koja je ovde opisana. Videti Odeljak 5.7.
[0040] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u postupcima izazivanja imunog odgovora protiv ExPEC kod subjekta, npr., ljudskog subjekta, koji obuhvata davanje subjektu farmaceutski efikasne količine kompozicije (npr. imunogene kompozicije) koja je ovde opisana. Videti Odeljak 5.7.
[0041] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u postupcima indukovanja proizvodnje opsonofagocitnih antitela protiv ExPEC kod subjekta, npr., čoveka, koji obuhvata davanje subjektu farmaceutski efikasne količine kompozicije (npr. imunogene kompozicije) koja je ovde opisana. Videti Odeljak 5.7.
Termini i skraćenice:
[0042] OPS: O polisaharid; O antigen Gram-negativnih bakterija. OPS je ovde takođe označen kao O antigen.
[0043] rfb klaster: klaster gena (npr. klaster gena E. coli) koji kodira enzimsku mašineriju sposobnu za sintezu strukture okosnice O antigena. Termin klaster rfb se može primeniti na bilo koji biosintetički klaster O antigena, uključujući i one iz bakterija koje ne pripadaju rodu Escherichia.
[0044] waaL: gen O antigen ligaze koji kodira enzim vezan za membranu sa aktivnim mestom koje je locirano u periplazmi. Kodirani enzim prenosi undekaprenilfosfat (UPP) vezani O antigen u jezgro lipida A, obrazujući lipopolisaharid.
[0045] wecA: prvi gen kodiran u klasteru wec. Kodirani protein katalizuje transfer GlcNAc-fosfata sa UDP-GlcNAc na UPP da bi se obrazovao GlcNAc vezan za UPP.
[0046] ECA: enterobakterijski zajednički antigen.
[0047] RU: jedinica ponavljanja. Kao što se ovde koristi, RU je podešena kao biološka jedinica ponavljanja, BRU. BRU opisuje RU antigena O kako se sintetiše in vivo.
[0048] UPP: undekaprenilpirofosfat.
[0049] LLO: lipid vezani oligosaharid.
[0050] 2AB: 2 amino benzamid.
1
[0051] MS: masena spektroskopija.
[0052] O25B: termin O25B se odnosi na antigen O25B iz E. coli koji je ovde identifikovan (podserotip E. coli O25 serotipa). Pozivanje na O25B ovde obuhvata formulu O25B i formulu O25B’, obe gore identifikovane.
[0053] O25A: termin O25A se odnosi na O25A antigen E. coli (podserotip E. coli O25 serotipa). Pozivanje na O25A ovde obuhvata formulu O25A i formulu O25A’, obe gore identifikovane.
[0054] O1A: termin O1A se odnosi na O1A antigen E. coli (podserotip E. coli O1 serotipa). Pozivanje na O1A ovde obuhvata formulu O1A i formulu O1A’, obe gore identifikovane.
[0055] O1B: termin O1B se odnosi na O1B antigen E. coli (podserotip E. coli O1 serotipa). Pozivanje na O1B ovde obuhvata formulu O1B i formulu O1B’, obe gore identifikovane.
[0056] O1C: termin O1C se odnosi na O1C antigen E. coli (podserotip serotipa E. coli O1 serotipa). Pozivanje na O1C ovde obuhvata formulu O1C i formulu O1C’, obe gore identifikovane.
[0057] O2: termin O2 se odnosi na O2 antigen E. coli (E. coli O2 serotip). Pozivanje na O2 ovde obuhvata formulu O2 i formulu O2', obe gore identifikovane.
[0058] O6: termin O6 se odnosi na O6 antigen E. coli (E. coli O6 serotip). Pozivanje na O6 ovde obuhvata formulu O6 i formulu O6', obe gore identifikovane.
[0059] Biokonjugat: izraz biokonjugat se odnosi na konjugat između proteina (npr. proteina nosača) i antigena, npr. O antigena (npr. O25B) pripremljenog u pozadini ćelije domaćina, pri čemu mašinerija ćelije domaćina povezuje antigen sa proteinom (npr. N-vezama). Glikokonjugati uključuju biokonjugate, kao i konjugate antigena šećera (npr. oligo- i polisaharidne)-proteinske konjugate pripremljene na druge načine, na primer, hemijskim povezivanjem proteina i antigena šećera.
[0060] Termin "oko", kada se koristi zajedno sa brojem, odnosi se na bilo koji broj unutar ±1, ±5 ili ±10% referentnog broja.
[0061] Kako se ovde koristi, termin "efikasna količina", u kontekstu primene terapije (npr. ovde opisane kompozicije) subjektu, odnosi se na količinu terapije koja ima profilaktički i/ili terapeutski efek(a)te. U određenim izvođenjima, "efikasna količina" se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna za postizanje jednog, dva, tri, četiri ili više od sledećih efekata: (i) smanjenje ili ublažavanje težine ExPEC infekcije ili simptoma povezanih sa njom; (ii) smanjenje trajanje ExPEC infekcije ili simptoma povezanih sa njom; (iii) sprečavanje napredovanja ExPEC infekcije ili simptoma povezanih sa njom; (iv) izazvati regresiju ExPEC infekcije ili simptoma povezanih sa njom; (v) sprečavanje razvoja ili početak infekcije ExPEC, ili simptoma povezanih sa njom; (vi) sprečavanje ponovne pojave ExPEC infekcije ili simptoma povezanih sa njom; (vii) smanjenje otkazivanja organa koje je povezano sa ExPEC infekcijom; (viii) smanjenje hospitalizacije subjekta koji ima ExPEC infekciju; (ix) smanjenje dužine hospitalizacije subjekta koji ima ExPEC infekciju; (x) povećanje preživljavanja subjekta sa ExPEC infekcijom; (xi) eliminisanje ExPEC infekcije kod subjekta; (xii) inhibicija ili smanjenje replikacije ExPEC kod subjekta; i/ili (xiii) poboljšanje ili unapređenje profilaktičkiog ili terapeutskog efek(a)ta druge terapije.
[0062] Kako se ovde koristi, izraz "u kombinaciji", u kontekstu primene dve ili više terapija subjektu, odnosi se na upotrebu više od jedne terapije. Upotreba termina "u kombinaciji" ne ograničava redosled kojim se terapije primenjuju na subjekta. Na primer, prva terapija (npr. ovde opisana kompozicija) se može primeniti pre (npr.5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 16 sati). sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja ili 12 nedelja ranije), istovremeno sa ili nakon (npr.5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 16 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja ili 12 nedelja posle) primene druge terapije subjektu.
[0063] Kako se ovde koristi, termin "subjekat" se odnosi na životinju (npr. ptice, gmizavce i sisare). U drugom aspektu, subjekt je sisar uključujući ne-primata (npr. kamilu, magarac, zebru, kravu, svinju, konja, kozu, ovcu, mačku, psa, pacova i miša) i primata (npr., majmun, šimpanza i čovek). U određenim izvođenjima, subjekt je životinja koja nije čovek. U nekim izvođenjima, subjekt je životinja sa farme ili kućni ljubimac (npr. pas, mačka, konj, koza, ovca, svinja, magarac ili kokoška). U drugom aspektu, subjekt je čovek. U drugom aspektu, subjekt je ljudsko odojče. U drugom aspektu, subjekt je ljudsko dete. U drugom aspektu, subjekt je odrasla osoba. U drugom aspektu, subjekt je stariji čovek. U drugom aspektu, subjekt je prevremeno rođeno ljudsko dete. Termini "subjekat" i "pacijent" mogu se ovde koristiti naizmenično.
[0064] Kako se ovde koristi, termin "prevremeno rođeno dete" odnosi se na ljudsko dete rođeno u gestacijskom periodu manjem od 37 nedelja.
[0065] Kako se ovde koristi, izraz "ljudsko odojče" odnosi se na novorođenče do humano biće starosti godinu dana.
[0066] Kako se ovde koristi, izraz "ljudsko malo dete" odnosi se na humano biće starosti od 1 godine do 3 godine.
[0067] Kako se ovde koristi, izraz "ljudsko dete" odnosi se na humano biće starosti 1 godinu do 18 godina.
[0068] Kako se ovde koristi, izraz "odrasla osoba" odnosi se na čoveka koji ima 18 godina ili starijeg.
[0069] Kako se ovde koristi, izraz "stariji čovek" odnosi se na čoveka od 65 godina ili starijeg.
4. KRATAK OPIS SLIKA
[0070]
Slika 1: Put za biosintezu O25A. Strelice označavaju pojedinačne enzimske konverzije, nazivi enzima su naznačeni. Šećeri aktivirani nukleotidom se pripremaju u citoplazmi ili enzimima obezbeđenim u klasteru O antigena ili enzimima za održavanje (eng. housekeeping) Gram-negativne ćelije domaćina. Glikozilfosfat transferaza (WecA) dodaje D-GlcNAc fosfat undekaprenil fosfatu (UP), formirajući GlcNAc-UPP. Specifične glikoziltransferaze zatim produžavaju molekul UPP-GlcNAc dodavanjem monosaharida formirajući oligosaharid biološke ponavljajuće jedinice (BRU) (WekABC WbuB). Navedeni redosled enzima se ne odnosi na redosled događaja tokom BRU sinteze (označeno sa < >). BRU se zatim prebacuje u periplazmatski prostor pomoću Wzx. Wzy linearno polimerizuje periplazmatske BRU da bi formirao O antigen polisaharid. Dužina polimera kontroliše Wzz. Mnogi bakterijski oligo- i polisaharidi se sklapaju na UPP, a zatim se prenose na druge molekule, tj. UPP je opšta platforma za izgradnju oligo- i polisaharida u bakterijama. Kod E. coli i
1
većine drugih gram negativnih bakterija, O antigen se prenosi sa UPP na lipidno A jezgro pomoću enzima E. coli WaaL da bi se formirao lipopolisaharid (LPS).
Slika 2: rfb klaster, struktura i put za wzx/wzy-zavisnu sintezu O-antigena, ilustrovan E. coli O25A rfb klasterom i O antigenom. A. Prikazana je struktura rfb klastera soja E. coli E47a, koji se nalazi između galF i gnd gena. Geni su prikazani strelicama, a popunjavanje je naznačeno u skladu sa funkcijom genskih proizvoda: crna su geni za biosintezu monosaharida aktiviranu nukleotidom koji nisu deo kućnog repertoara E. coli (kodirani su na drugom mestu u genomu), crni /bele dijagonalne pruge su glikoziltransferaze odgovorne za dodavanje pojedinačnih monosaharidnih jedinica u BRU, flipaze wzx i polimerazu wzy. B. Hemijska struktura BRU antigena O25A O kako je predstavljena (videti Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4).
Slika 3. A. O25A, O25B i 016 BRU strukture. B. Poređenje klastera biosinteze O antigena (rfb klaster) između O25A, O25B i 016. Geni popunjeni crnom su geni uključeni u biosintezu monosaharida aktivirane nukleotidom, dijagonalne pruge su predviđeni geni glikoziltransferaze, siva vertikalna punjenja označavaju obradu gena i trake za transport BRU pokazuju homologije O-acetiltransferaze. Sive kutije označavaju rezultate homologije iznad 25% između gena; navedene su detaljne vrednosti. Tanke crne i sive strelice pokazuju lokacije topljenja (eng. annealing) tipizacije PCR oligonukleotida za wzy (specifičan za O25A i O25B) i region O25B 3’ (specifičan za O25B).
Slika 4. Distribucija serotipa iz epidemiološke studije. Serotipovi antigena O E. coli identifikovani u uzorcima uzoraka UTI stečenih u zajednici grupisani su prema pojavi
Slika 5. Srebrna i Western analiza bojenja LPS-a iz kliničkih izolata sa O25 pozitivnim fenotipom aglutinacije. Brojevi sojeva su naznačeni iznad gel traka. Pojedinačni klonovi su uzgajani i OD normalizovana biomasa je sakupljena centrifugiranjem. Pelete su rastvorene u SDS PAGE Lämmlijevom puferu i tretirane proteinazom K da bi se hidrolizovali svi proteini u uzorku. Standardno bojenje srebrom je primenjeno na PAGE gel prikazan u A, a sondiranje nitroceluloznih membrana koje sadrže elektrotransferisani materijal iz identično vođenih gelova sa komercijalnim antiserumom za aglutinaciju O25 prikazano je u B.
Slika 6. 2AB HPLC tragovi uzoraka O25A i O25B. 2AB obeleženi LLO uzorci iz sojeva upec138 (isprekidana linija) i upec436 (puna linija). Sakupljeni su pikovi i odgovarajuće BRU strukture izvedene iz MS/MS obrasca fragmentacije detaljno prikazanog na Sl.7 su označene strelicama. Slika 7. MS/MS serija fragmentacije jona dobijena iz pikova prikazanih na Sl. 6 na 50' i 62' vremenima eluiranja matičnih jona m/z=1022 (A; od soja upec138) ili m/z=1021 (B; od upec _436). Jonske serije su prikazane u odnosu na crtež o navodnom BRU.
Slika 8. Deacetilacija 2AB obeleženog LLO uzorka dobijenog iz O25B pozitivnog kliničkog izolata. Specifični pik za O25B u vremenu elucije od 50' dobijen iz 2AB obeleženih LLO kliničkog izolata sa O25B genotipom je sakupljen i analiziran HPLC normalne faze nakon tretmana sa (puna linija) ili bez (isprekidana linija) NaOH za hidrolizu ND Cal-ovim Specijalnim patentnim programom O-acetil grupa.
Slika 9. Analiza sastava monosaharida biokonjugata O25A i O25B. Biokonjugati O25 su proizvedeni, prečišćeni i obrađeni za analizu sastava monosaharida. Prikazani su C18 HPLC tragovi uzoraka. Uzorci dobijeni od O25A (čvrste) i O25B (tačkaste) su upoređeni sa mešavinom monosaharida iz komercijalnih izvora (Glc, GlcNAc, Rha, FucNAc). Vremena eluiranja monosaharida su označena strelicama.
1
Slika 10. Karakterizacija biokonjugata O25A. Prečišćena konačna masa 4S-EPA-O25A biokonjugata je analizirana pomoću SDS PAGE i vizuelizovana direktnim Komasi bojenjem (C) i Western blotom korišćenjem anti-EPA antiseruma ili anti-O25 antiseruma.
Slika 11. Karakterizacija biokonjugata O25B. Prečišćena konačna masa 4S-EPA-O25B biokonjugata je analizirana pomoću SDS PAGE i vizuelizovana direktnim Komasi bojenjem (C) i Western blotom upotrebom ili anti-EPA antiseruma ili anti-O25 antiseruma.
Slika 12. Genetička biosinteza O1 O antigena i hemijska struktura. A. Prikazan je rfb klaster i bočno raspoređeni (eng. flanking) geni soja O1A E. coli G1632 (PRISTUPNI BR. GU299791). Crni, sivi i prugasti kodovi boja su isti kao oni na slici 2, gore opisani. B. Prikazane su hemijske BRU strukture O1 podserotipova.
Slika 13. Analiza LPS iz kliničkih izolata sa O1 pozitivnim fenotipom aglutinacije. A. Bojenje srebrom i B. Western blot korišćenjem anti-O1 antiseruma.
Slika 14. Identifikacija O1A u kliničkim izolatima O1.2AB obeleženi LLO uzorci iz kliničkih izolata O1 analizirani su LLO otiskom prstiju. A. Prikazani su tragovi HPLC normalne faze od 60’ nadalje. Osnovna linija za svaki uzorak je pomerena da bi se vizuelizovali ko-migrirajući vrhovi. Broj upec označava klinički soj. B. MS/MS fragmentacija jonskih serija od m/z=1849,6 (Na+ adukt). Crtež dodeljuje obrazac fragmentacije jona i verovatne prekide glikozidne veze u oligosaharidu od 2 BRU O1A.
Slika 15. O1 biokonjugati. Test ekspresije EPA-O1 glikoproteina u malim razmerama ćelijama E. coli (W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔWaaL) transformisan sa EPA ekspresionim plazmidom (pGWKSN659) i pet različitih ekspresionih plazmida pglB: A, p114: optimizovana ekspresija ne-kodona, HA tag koji sadrži pglB; B, p939: optimizovan kodon, HA tag koji sadrži pglB; C, p970: kodonom optimizovan, HA tag uklonjen pglB; D, optimizovan kodonom, koji sadrži HA tag, prirodno mesto glikozilacije N534Q uklonjeno pglB; i E, kodonom optimizovan, HA tag uklonjen, prirodno mesto glikozilacije N534Q uklonjeno pglB. Ćelije su uzgajane i indukovane arabinozom i IPTG, nakon inkubacije preko noći na 37°C, ćelije su sakupljene i pripremljeni su ekstrakti periplazmatskih proteina. Ekstrakti su zatim razdvojeni pomoću SDS PAGE, preneti na nitrocelulozne membrane elektroblotiranjem i imunodetektovani korišćenjem anti-EPA seruma.
Slika 16. Biokonjugati opisani na slici 15, detektovani sa anti-O1 serumom.
Slika 17. genske i hemijske strukture O6. A. klaster biosinteze O antigena (rfb klaster) i bočno raspoređeni geni E. coli CFT073 (Genbank AE014075.1). Navedene su pretpostavljene funkcije gena prema BLAST-u i geni specifični za biosintezu O6 O antigena. B. Hemijske strukture prijavljenih O6 BRU struktura (Jann et al., Carbohidr. Res.263 (1994) 217-225).
Slika 18. Identifikacija O6 sa grananjem Glc. 2AB označeni LLO uzorci iz kliničkih izolata O6 analizirani su LLO otiskom prstiju. A. Prikazani su tragovi HPLC normalne faze od 60’ nadalje. Ekstrakti su pripremljeni od referentnih sojeva CCUG11309 (tanka puna linija) i 11311 (isprekidana) koji sadrže Glc i GlcNAC grane. Preklapanje pokazuje jasne razlike u vremenima eluiranja naznačenih BRUs. B. Ekstrakti iz kliničkih izolata kako je naznačeno brojem upec upoređeni su sa referentnim sojevima iz A.
Slika 19. Genetička biosinteza O2 O antigena i hemijske strukture. A. klaster biosinteze O antigena (rfb klaster) i bočno raspoređeni geni soja E. coli G1674 (pristupni broj GU299792). Crni, sivi i
1
prugasti kodovi boja su kao što je opisano na prethodnim slikama (npr., Sl. 2). B. Hemijska BRU struktura O2 antigena.
Slika 20. Analiza LPS iz kliničkih izolata sa O2 pozitivnim fenotipom aglutinacije. A. Srebrno bojenje.
B. Western blot korišćenjem anti-O2 antiseruma.
Slika 21. OPS analiza iz soja V3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. Prikazan je hromatogram 2AB obeležene LLO analize pomoću HPLC normalne faze.
Slika 22. Prepoznavanje O25A i O25B LPS anti-O25A i anti-O25B MBP antiseruma u Western blot analizi. Dve nitrocelulozne membrane koje su dobijene nakon elektrotransfera uzoraka LPS pripremljenih od upec436 (O25A) i upec138 (O25B) i razdvojene pomoću SDS-PAGE. Šema punjenja je bila identična za obe membrane, leva traka: O25A LPS od upec438, srednja traka: O25B LPS od upec 138. MBP biokonjugati su korišćeni za imunizaciju zečeva. Levi panel: anti O25B-MBP antiserum; desni panel: anti O25A-MBP antiserum.
Slika 23. MS/MS spektri O2 OPS BRU. MS/MS spektar Na+ adukta sa m/z=989,4 od eluacionog maksimuma na 43.5 min iz 2AB obeleženih LLO ekstrakata iz soja CCUG25. O2 BRU crtež i pridružena serija Y jona je naznačena što potvrđuje očekivanu sekvencu monosaharida.
Slika 24. EPA biokonjugati koji sadrže O1A, O2 i O6 antigene korišćene u pretkliničkoj studiji. OPS glikani su proizvedeni i prečišćeni, i analizirani pomoću SDS PAGE i vizuelizovani Komasi bojenjem.
Slika 25 prikazuje srednje vrednosti ELISA titara dobijenih sa serumima od pacova imunizovanih sa O1A-EPA (G1), samim proteinom nosačem (G10), TBS (G11) ili tetravalentnom kompozicijom sastavljenom od EPA-O1A, O2, O6Glc i O25B (G12), ispitan na ELISA ploči obloženoj O1ALPS prečišćenom od soja upec032.
Slika 26 prikazuje srednje vrednosti ELISA titara dobijenih sa serumima od pacova imunizovanih sa O2 - EPA (G4), samim proteinom nosačem (G10), TBS (G11) ili tetravalentnom kompozicijom sastavljenom od EPA-O1A, O2, O6Glc i O25B (G12), ispitan na ELISA ploči obloženoj O2 LPS prečišćenom od sojeva CCUG25.
Slika 27 prikazuje srednje vrednosti ELISA titara dobijenih sa serumima od pacova imunizovanih sa O6Glc-EPA (G7), samim proteinom nosačem (G10), TBS (G11) ili tetravalentnom kompozicijom sastavljenom od EPA-O1A, O2, O6Glc i O25B (G12), ispitan na ELISA ploči obloženoj OoGlc-LPS prečišćenom od soja CCUG11309.
Slika 28 prikazuje srednje vrednosti ELISA titara dobijenih sa serumima od pacova imunizovanih sa O25B-EPA (G9), samim proteinom nosačem (G10), TBS (G11) ili tetravalentnom kompozicijom sastavljenom od O1A, O2, O6Glc i O25B (G12), ispitan na ELISA ploči obloženoj sa O25B-LPS prečišćenom od soja upec177.
Slika 29: Indeksi opsonizacije seruma dobijenih od pre imunizacije pacova (prazni krugovi) u poređenju sa 42 dana nakon imunizacije (popunjeni kvadrati) sa jednom primarnom dozom i dve doze za pojačavanje naznačenih doza monovalentne vakcine. (A) O2-EPA imunizacija; (B) O6-EPA imunizacija; (C) O25B-EPA imunizacija.
Slika 30: ELISA titri dobijeni sa serumima od ljudskih subjekata vakcinisanih tetravalentnom vakcinom koja sadrži antigene E. coli O1A, O2, O6Glc i O25B. Značajno povećanje titara ELISA
1
između posle (30 dana nakon injekcije) i pre injekcije (1. dan) primećeno je samo u vakcinisanim grupama (*, predstavlja statističku značajnost).
Slika 31: Indeks opsonizacije (OI) dobijen sa serumima ljudskih subjekata vakcinisanih tetravalentnom vakcinom koja sadrži antigene E. coli O1A, O2, O6Glc i O25B. Prikazan je imuni odgovor na koji ukazuje OI na placebo i komponente tetravalentne vakcine (O1A-EPA (31A), O2-EPA (31B), O6Glc-EPA (31C) i O25B-EPA (31D)) pre i posle injekcije. Pre-injekcija, definisana kao dan 1, predstavljena je sa V2 (poseta 2), a nakon injekcije, definisana kao dan 30, predstavljena je sa V4 (poseta 4). Značajno povećanje OI između post-i pre-injekcije (označeno sa *, gde višestruki * predstavljaju povećan stepen značaja) primećeno je samo u vakcinisanim grupama. NS, nema značajne razlike.
Slika 32: ELISA titri (izraženi kao vrednosti EC50) seruma vakcinisanih subjekata prema O25A LPS (crne trake) i O25B LPS (sive trake), na dan 1 (pre vakcinacije) i posle 30 dana (post-vakcinacija). Statistički značajno povećanje titara ELISA između posle injekcije (30 dana nakon injekcije) i pre injekcije (dan 1) primećeno je za oba serotipa: O25A LPS (crni stupci) i O25B LPS (sivi stupci). Slika 33: Reaktivnost seruma vakcinisanih subjekata prema O25A (crne linije) i O25B (sive linije) eksprimirajućih sojeva E. coli. Isprekidana siva linija: serotip 075 soj, negativna kontrola. Slika 33 pokazuje da vakcinom indukovana serumska IgG antitela od vakcinisanih subjekata snažno reaguju na sojeve O25A i O25B.
5. DETALJAN OPIS
[0071] Ovde je otkrivena struktura antigena E. coli O25B, kao i upotreba O25B, postupci za dobijanje O25B i biokonjugati koji se sastoje od O25B. Prijavioci su identifikovali klaster gena E. coli koji je odgovoran za proizvodnju O25B i u potpunosti okarakterisali strukturu antigena O25B. Ovde su otkrivene nukleinske kiseline sposobne da proizvode O25B u ćelijama domaćinima. Ovde su obezbeđene ćelije domaćini, npr., rekombinantno modifikovane ćelije domaćini, koje sadrže nukleinske kiseline sposobne za proizvodnju O25B. Takve ćelije domaćini se mogu koristiti za generisanje biokonjugata koji sadrže O25B vezan za proteinski nosač, koji se može koristiti u, na primer, formulaciji terapeutika (npr. vakcina). O25B antigen koji je ovde opisan je takođe koristan u stvaranju antitela, koja se mogu koristiti, na primer, u terapijskim metodama kao što je pasivna imunizacija subjekata. Ovde su dalje obezbeđene kompozicije koje sadrže O25B, zasebno ili u kombinaciji sa drugim antigenima E. coli (npr. O1, O2 i O6 i njihovi podserotipovi), za upotrebu u terapijskim metodama, npr., vakcinacija domaćina protiv infekcije sa E. coli (na primer, uropatogena E. coli).
5.1 Nukleinske kiseline i proteini
[0072] Ovde su prikazane izolovane nukleinske kiseline povezane sa proizvodnjom O25B, npr. nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više proteina E. coli O25B rfb klastera. Stručnjaci će razumeti da zbog degeneracije genetskog koda, protein koji ima specifičnu sekvencu aminokiselina može biti kodiran sa više različitih nukleinskih kiselina. Stoga će stručnjaci iz ove oblasti razumeti da nukleinska kiselina koja je ovde otkrivena može biti izmenjena na takav način da se njena sekvenca razlikuje od sekvence koja je ovde otkrivena, bez uticaja na aminokiselinsku sekvencu proteina kodiranog nukleinskom kiselinom.
[0073] Ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira E. coli O25B rfb klaster. U specifičnom slučaju, ovde je obezbeđena nukleinska kiselina koja kodira klaster gena E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO: 12). U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira klaster gena koji je
1
oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan sa SEQ ID NO: 12. Upec138 je primer soja E.coli O25B serotipa. Stručnjak iz oblast tehnike će shvatiti da se drugi sojevi ovog serotipa sada mogu lako dobiti iz kliničkih izolata prema ovde opisanim postupcima, a primeri takvih drugih sojeva su upec177 i upec163. Prema tome, gde god se ovde pominje rfb klaster gena ili pojedinačni geni iz takvog klastera takvih sojeva O25B, podrazumeva se da u uključeni odgovarajući klasteri gena ili geni iz drugih sojeva O25B. Takođe, prikazane sekvence se mogu pronaći sekvenciranjem klastera gena rfb ili po želji pojedinačnih gena iz takvih drugih izolata, i obezbediće homologne sekvence koje kodiraju homologne proteine kao klaster gena ili gen. U bilo kom izvođenju gde se homologni klaster gena ili gen pominju upućivanjem na klaster gena ili gen sa određenim procentom, takva homologna sekvenca poželjno kodira protein(e) sa istom funkcijom kao oni iz referentnog soja ili sekvence.
[0074] Takođe ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira E. coli O25B rfb klastera. U specifičnom slučaju, ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira klaster gena E. coli rfb(upec163). U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira klaster gena koji je oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna E. coli rfb(upec163) klasteru gena.
[0075] Takođe ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira klaster gena E. coli O25B rfb U specifičnom slučaju, ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira klaster gena E. coli rfb(upec177). U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana nukleinska kiselina koja kodira klaster gena koja je oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna klasteru gena E. coli rfb(upec177).
[0076] Ovde su takođe prikazane nukleinske kiseline koje kodiraju proteine E. coli O25B rfb klastera.
[0077] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:1, rmlB gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO: 1.
[0078] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:2, rmlD gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:2.
[0079] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:3, rmlA gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:3.
[0080] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:4, rmlC gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:4.
[0081] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:5, wzx gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:5.
2
[0082] U specifičnom slučaju nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:6, wekA gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:6.
[0083] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:7, wekB gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:7.
[0084] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:8, wzy gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:8.
[0085] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:9, wbbJ gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:9.
[0086] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:10, wbbK gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:10.
[0087] U specifičnom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:11, wbbL gena E. coli O25B rfb klastera. U drugom specifičnom slučaju nukleinska kiselina koja kodira protein E. coli O25B rfb klastera koji je ovde prikazan je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO:11.
[0088] U drugom aspektu, ovde su prikazani proteini koji su kodirani ovde prikazanim nukleinskim kiselinama. U specifičnom slučaju, ovde je prikazana dTDP-Glukoza 4,6-dehidrataza, kodirana SEQ ID NO:1. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana dTDP-6-Deoksi-D-glukoza 3,5-epimeraza, kodirana SEQ ID NO:2. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana Glukoza-1-fosfat timidililtransferaza, kodirana SEQ ID NO:3. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana dTDP-4-dehidroramnoza 3,5-epimeraza, kodirana SEQ ID NO:4. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana flipaza O antigena, kodirana SEQ ID NO:5. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnosiltransferaza, kodirana SEQ ID NO:6. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukoziltransferaza, kodirana SEQ ID NO:7. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana O antigen polimeraza, kodirana SEQ ID NO:8. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana O-acetil transferaza, kodirana SEQ ID NO:9. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferaza, kodirana SEQ ID NO:10. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-ramnosiltransferaza, kodirana SEQ ID NO:11.
5.2 O Antigeni E. coli
[0089] U jednom aspektu, ovde su prikazani izolovani antigeni E. coli O25, O1, O2, i O6 serotipova.
[0090] U specifičnom slučaju, ovde je prikazan izolovani O antigen iz E. coli soj upec138. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazan izolovani O antigen iz E. coli soj upec163. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazan izolovani O antigen iz E. coli soj upec177.
[0091] U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazan izolovani O25B antigen E. coli Formule O25B:
[0092] U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazan izolovani O25B antigen E. coli Formule O25B’:
[0093] U drugom slučaju, ovde je prikazana populacija izolovanih makromolekula Formule O25B, koja je prikazana ispod:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom izvođenju, n od najmanje 80% makromolekula u populaciji je između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20.
[0094] U drugom aspektu, ovde je prikazana populacija izolovanih makromolekula Formule O25B’, koja je prikazana ispod:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom slučaju, n od bar 80% makromolekula u populaciji je između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20.
[0095] Drugi antigeni E. coli koji su korisni u ovde opisanim kompozicijama (npr., terapijske kompozicije, npr., vakcine; vidi Odeljak 5.6) uključuju O25A, kao i O1, O2, i O6 antigene, i njihove podserotipove.
[0096] U jednom izvođenju, O25A antigen (npr., u izolovanom obliku ili kao deo biokonjugata) je korišćen u ovde obezbeđenoj kompoziciji (npr., u kombinaciji sa O25B antigenom (ili biokonjugatom koji sadrži O25B antigen)). U specifičnom izvođenju, O25A antigen je Formule O25A:
[0097] U drugom specifičnom izvođenju, O25A antigen je Formule O25A’:
[0098] U jednom izvođenju, O1A antigen (npr., u izolovanom obliku ili kao deo biokonjugata) je korišćen u ovde obezbeđenoj kompoziciji (npr., u kombinaciji sa O25B antigenom (ili biokonjugatom koji sadrži O25B antigen)). U specifičnom izvođenju, O1A antigen je Formule O1A:
2
[0099] U drugom specifičnom izvođenju, O1A antigen je Formule O1A’:
[0100] U jednom izvođenju, O1B antigen (npr., u izolovanom obliku ili kao deo biokonjugata) je korišćen u ovde obezbeđenoj kompoziciji (npr., u kombinaciji sa O25B antigenom (ili biokonjugatom koji sadrži O25B antigen)). U specifičnom izvođenju, O1B antigen je Formule O1B:
[0101] U drugom specifičnom izvođenju, O1B antigen je Formule O1B’:
[0102] U jednom aspektu, O1C antigen (npr., u izolovanom obliku ili kao deo biokonjugata) se koristi u ovde obezbeđenoj kompoziciji (npr., u kombinaciji sa antigenom O25B (ili biokonjugatom koji sadrži antigen O25B)). U specifičnom izvođenju, antigen O1C je Formule O1C:
[0103] U drugom specifičnom izvođenju, antigen O1C je Formule O1C’:
[0104] U jednom izvođenju, antigen O2 (npr., u izolovanom obliku ili kao deo biokonjugata) se koristi u ovde obezbeđenoj kompoziciji (npr., u kombinaciji sa antigenom O25B (ili biokonjugatom koji sadrži antigen O25B)). U specifičnom izvođenju, antigen O2 je Formule O2:
[0105] U drugom specifičnom izvođenju, antigen O2 je Formule O2’:
[0106] U jednom aspektu, antigen O6 (npr., u izolovanom obliku ili kao deo biokonjugata) se koristi u kompoziciji koja je ovde prikazana (npr., u kombinaciji sa O25B antigenom (ili biokonjugatom koji sadrži antigen O25B)). U specifičnom izvođenju, antigen O6 je Formule O6K2 (takođe se ovde pominje kao O6Glc):
[0107] U drugom specifičnom izvođenju, antigen O6 je Formule O6K2’ (takođe se ovde pominje kao O6Glc’):
[0108] U drugom specifičnom izvođenju, antigen O6 antigen je Formule O6K54 (takođe se ovde pominje kao O6GlcNAc):
2
[0109] U drugom specifičnom izvođenju, antigen O6 je Formule O6K54’ (takođe se ovde pominje kao O6GlcNAc’):
5.3 Ćelije domaćina
[0110] Ovde su obezbeđene ćelije domaćini, npr., prokariotske ćelije domaćini, sposobne da proizvode O antigene E. coli i biokonjugate koji sadrže takve O antigene E. coli. U određenim izvođenjima, ćelije domaćini date ovde sadrže (npr., prirodno ili putem genetičkog inženjeringa) jednu ili više ovde opisanih nukleinskih kiselina. Videti Odeljak 5.1. U određenim izvođenjima, ovde obezbeđene ćelije domaćini proizvode jedan ili više ovde opisanih O antigena E. coli, i/ili proizvode biokonjugate koji sadrže jedan ili više ovde opisanih O antigena E. coli. Videti Odeljak 5.2.
[0111] U jednom aspektu, ovde je obezbeđena prokariotska ćelija domaćina koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju enzime (npr. glikoziltransferaze) sposobne da proizvodu novi polisaharid koji je ovde prikazan, O25B E. coli. Konkretno, ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantno modifikovanu prokariotsku ćeliju domaćina, koja sadrži:
a. nukleotidnu sekvencu koja sadrži:
i. dTDP-glukoza 4,6-dehidratazu;
ii. dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimerazu;
iii. Glukoza-1-fosfat timidililtransferazu;
iv. dTDP-4-dehidrohamnoza 3,5-epimerazu;
v. O antigen flipazu;
vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu;
vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukoziltransferazu;
viii. O antigen polimerazu;
ix. O-acetil transferazu;
x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferazu i
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferaza;
b. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil transferazu; i
c. nukleotidnu sekvencu koja kodira protein nosač, pri čemu protein nosač sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO : 15).
2
[0112] Ovde su takođe otkrivene ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju enzime (npr. glikoziltransferaze) sposobne da proizvode druge antigene E. coli, npr. O25A, O1, O2 i O6, i njihove podserotipove (videti Odeljak 5.2). Ćelije domaćini koje su ovde date mogu prirodno da eksprimiraju nukleinske kiseline sposobne da proizvode O antigen od interesa, ili ćelije domaćini mogu biti napravljene da eksprimiraju takve nukleinske kiseline, tj. u određenim izvođenjima navedene nukleinske kiseline su heterologne za ćelije domaćina i uvedene u ćelije domaćina koristeći genetičke pristupe koji su poznati u oblasti tehnike. U određenim slučajevima, ćelije domaćini koje su ovde otkrivene sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju dodatne enzime aktivne u N-glikozilaciji proteina, na primer, ćelija domaćina koja je ovde data može dalje da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira oligosaharil transferazu ili nukleinske kiseline koje kodiraju druge glikoziltransfere. Vidi, na primer, Odeljak 5.3.3. Ćelije domaćini koje su ovde date sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira protein nosač, npr. protein za koji oligo- i polisaharidi mogu biti vezani da formiraju biokonjugat. Videti, na primer, Odeljak 5.3.2 za opis proteina nosača i Odeljak 5.4 za opis biokonjugata. U specifičnom izvođenju, ćelija domaćin je E. coli.
[0113] Upec138 je soj E. coli koji je ovde identifikovan kao soj koji pripada O25B serotipu, a klaster gena rfb soja (i uopšteno, sojevi O25B serotipa) je ovde po prvi put identifikovan tako da sadrži gene koji proizvode novi polisaharid E. coli, O25B. U posebnom slučaju, ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćin koja sadrži klaster gena E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12), ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan sa SEQ ID NO:12. U specifičnom slučaju, klaster gena E. coli rfb(upec138) (SEQ ID NO:12) se uvodi u ćeliju domaćina genetičkom manipulacijom (npr., klaster gena je eksprimiran na plazmidu ili plazmidima ili je integrisan u genom ćelije domaćina (videti, npr., Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/EP2013/068737)). U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14) ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu ili Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U drugom specifičnom izvođenju, neki ili svi geni rfb klastera su heterologni za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, navedena oligosaharil transferaza je heterologna za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti protein nosač je heterologan za ćeliju domaćina. U specifičnom izvođenju, ćelija domaćin je E. coli.
[0114] Upec163 je soj E. coli koji je ovde identifikovan kao pripadajući serotipu O25B, a klaster gena rfb soja (i uopšteno, sojevi O25B serotipa) je ovde po prvi put identifikovan tkao da sadrži gene koji proizvode novi polisaharid E. coli, O25B. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćin koja sadrži klaster gena E. coli rfb(upec163) ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan sa klasterom gena E. coli rfb(upec163). U specifičnom slučaju, klaster gena E. coli rfb(upec163) se uvodi u ćeliju domaćina genetičkom manipulacijom (npr., klaster gena je eksprimiran na plazmidu ili plazmidima ili integrisan u genom ćelije domaćina (vidi, npr., Međunarodna Prijava patenta br. PCT/EP2013/068737)). U drugom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14) ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu ili Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U drugom specifičnom slučaju, neki ili svi geni rfb klastera su heterologni za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, navedena oligosaharil transferaza je heterologna za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju
2
navedeni protein nosač je heterologan za ćeliju domaćina. U specifičnom izvođenju, ćelija domaćin je E. coli.
[0115] Upec177 je soj E. coli koji je ovde identifikovan kao pripadajući serotipu O25B, a klaster gena rfb soja (i uopšteno sojevi O25B serotipa) je ovde po prvi put identifikovan tako da sadrži gene koji proizvode novi polisaharid E. coli, O2B. U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćin koja sadrži klaster gena E. coli rfb(upec177), ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan sa klasterom gena E. coli rfb(upec177). U specifičnom slučaju, klaster gena E. coli rfb(upec177) se uvodi u ćeliju domaćina genetičkom manipulacijom (npr., klaster gena je eksprimiran na plazmidu ili plazmidima ili integrisan u genom ćelije domaćina (vidi, npr., Međunarodna Prijava patenta br. PCT/EP2013/068737)). U drugom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14) ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu ili Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U drugom specifičnom slučaju, neki ili svi geni rfb klastera su heterologni za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, navedena oligosaharil transferaza je heterologna za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, navedeni protein nosač je heterologan za ćeliju domaćina. U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0116] U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O25B, pri čemu navedena ćelija domaćina sadrži rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, i/ili wbbL. Takve ćelije domaćini mogu da se konstruišu korišćenjem rekombinantnih pristupa da sadrže jedan ili više plazmida koji sadrže gene rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, i/ili wbbL. U određenim slučajevima, pomenuti jedan ili više plazmida su integrisani u genom ćelije domaćina. U specifičnom izvođenju, pomenuti rmlB sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:1, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:1. U specifičnom slučaju, navedeni rmlD sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:2, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:2. U specifičnom slučaju, navedeni rmlA sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:3, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:3. U specifičnom slučaju, navedeni rmlC sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 4, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:4. U specifičnom slučaju, navedeni wzx sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 5, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:5. U specifičnom slučaju, navedeni wekA sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 6, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:6. U specifičnom slučaju, navedeni wekB sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:7, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:7. U specifičnom slučaju, navedeni wzy sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 8, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:8. U specifičnom slučaju, navedeni wbbJ sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 9, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:9. U specifičnom slučaju, navedeni wbbK sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:10, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:10. U specifičnom slučaju, navedeni wbbL sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:11, ili je 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična ili homologna sa SEQ ID NO: 11. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14) ili nosač protein koji sadrži konsenzusnu sekvencu ili Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X
2
i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987) . U drugom specifičnom slučaju, neki ili svi geni, rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, i wbbL, su heterologni za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, navedena oligosaharil transferaza je heterologna za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti protein nosač je heterologan za ćeliju domaćina. U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0117] U drugom specifičnom slučaju koji je ovde otkriven je prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O25B, pri čemu navedena ćelija domaćina sadrži jednu, dve, tri, četiri ili više, npr. svi, od sledećih gena (ili nukleinska kiselina koja je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan sa jednom od sledećih gena, a poželjno je da kodiraju protein sa istom funkcijom): rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2), rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10), i/ili wbbL (SEQ ID NO:11). U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzus sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0118] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline rmlB (SEQ ID NO:1). U drugom specifičnom slučaju, ovde je prikazana prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira dTDP-glukoza 4,6-dehidratazu, npr. dTDP-glukoza 4,6-dehidratazu kodiranu sa rmlB. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku kiselinu koja je oko ili najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:1. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0119] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno konstruisana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline rmlD (SEQ ID NO:2). U drugom specifičnom slučaju, ovde je obezbeđena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinska sekvenca koja kodira dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimerazu, npr. dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimerazu kodiranu rmlD. U drugom specifičnom slučaju, ovde je obezbeđena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili
2
biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku kiselinu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:2. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/ 119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0120] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline rmlA (SEQ ID NO:3). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira glukoza-1-fosfat timidililtransferazu, npr. glukoza-1-fosfat timidililtransferazu kodiranu sa rmlA. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku kiselinu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:3. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja amino kiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne amino kiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0121] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline rmlC (SEQ ID NO:4). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira dTDP-4-dehidrohamnozu 3,5-epimerazu, npr. dTDP-4-dehidrohamnozu 3,5-epimerazu kodiranu rmlC. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku kiselinu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:4. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0122] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wzx (SEQ ID NO:5). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira O antigen flipazu, npr. O antigen flipazu kodiranu sa wzx. U drugom specifičnom slučaju, primer ovde je prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku kiselinu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:5. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzus sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0123] U drugom specifičnom slučaju koji je ovde otkriven je prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno projektovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wekA (SEQ ID NO:6). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen O25B E. coli), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira ramnoziltransferazu, npr. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GIcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu koju kodira wekA. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinske kiseline koje su najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO:6. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/ 119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0124] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wekB (SEQ ID NO:7). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira wekB glukoziltransferazu, npr. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukoziltransferazu koju kodira wekB. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinske kiseline koje su najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%,
1
97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO:7. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/ 119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0125] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wzy (SEQ ID NO:8). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira O antigen polimerazu, npr. O antigen polimerazu kodiranu sa wzy. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinske kiseline koje su najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO:8. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0126] U drugom specifičnom slučaju koji je ovde otkriven je prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wbbJ (SEQ ID NO:9). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinska sekvenca koja kodira O-acetil transferazu, npr. O-acetil transferazu koju kodira wbbJ. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identično SEQ ID NO:9. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0127] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokonjugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin
2
prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wbbK (SEQ ID NO:10). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira glukoziltransferazu, npr. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferazu koju kodira wbbK. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:10. U drugom specifičnom izvođenju, prokariotska ćelija domaćina sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzus sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0128] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno konstruisana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili biokojugat O25B (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži sekvencu nukleinske kiseline wbbL (SEQ ID NO:11). U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira ramnozil transferazu, npr. dTDP-Rha:Glc-NAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu koju kodira wbbL. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je modifikovana da sadrži nukleinske kiseline koje su najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO:11. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0129] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi O25B, i/ili O25B biokonjugat (tj., protein nosač vezan za antigen E. coli O25B), pri čemu navedena ćelija domaćin prirodno sadrži ili je projektovana da sadrži najmanje jednu, dve, tri, četiri ili više, npr. sve, od sledećeg: (i) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 1; (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:2; (iii) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:3; (iv) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:4; (v) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:5; (vi) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:6; (vii) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:7; (viii) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:8; (ix) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:9; (x) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:10; i/ili (xi) sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO:11. U specifičnom slučaju, pomenuta ćelija domaćin je konstruisana da sadrži svaku od navedenih sekvenci, tj. navedene sekvence su heterologne za pomenutu ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0130] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr. rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O25B, pri čemu navedena ćelija domaćin sadrži najmanje dva od (i) wbbJ(SEQ ID NO:9) ili nukleinska kiselina koja je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ili homologna sa SEQ ID NO:9; (ii) wbbK (SEQ ID NO:10) ili nukleinska kiselina koja je približno ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa ili homologna SEQ ID NO:10; i/ili (iii) wbbL (SEQ ID NO:11) ili nukleinska kiselina koja je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99 % identična ili homologna sa SEQ ID NO: 11. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćina sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0131] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno projektovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O25B, pri čemu navedena ćelija domaćin sadrži svaki od (i) wbbJ (SEQ ID NO:9) ili nukleinsku kiselinu koja je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ili homologna sa SEQ ID NO:9; (ii) wbbK (SEQ ID NO:10) ili nukleinska kiselina koja je približno ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa ili homologna SEQ ID NO:10; i (iii) wbbL (SEQ ID NO:11) ili nukleinsku kiselinu koja je približno ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ili homologna SEQ ID NO: 11. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
4
[0132] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O25B, pri čemu navedena ćelija domaćin sadrži (i) dTDP-glukoza 4,6-dehidratazu; (ii) dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimerazu; (iii) glukoza-1-fosfat timidililtransferazu; (iv) dTDP-4-dehidrohamnoza 3,5-epimerazu; (v) O antigen flipazu; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukoziltransferazu (viii) O antigen polimerazu; (ix) O-acetil transferazu; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferaza i/ili (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu. U specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćina sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), gde X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 14) ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu ili Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006 /119987). U drugom specifičnom slučaju, neke ili sve (i) dTDP-glukoza 4,6-dehidrataza; (ii) dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimeraza; (iii) glukoza-1-fosfat timidililtransferaza; (iv) dTDP-4-dehidrohamnoza 3,5-epimeraza; (v) O antigen flipaza; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferaza; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukozil-transferaza (viii) O antigen polimeraza; (ix) O-acetil transferaza; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferaza i/ili (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferaza je heterologna za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, navedena oligosaharil transferaza je heterologna za ćeliju domaćina. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti protein nosač je heterologan za ćeliju domaćina. U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0133] U drugom aspektu, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi E. coli O25A, tj. navedena ćelija domaćina sadrži enzime sposobne da sintetišu E. coli O25A (vidi, npr., Sliku 3). U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0134] U drugom aspektu, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr. rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O1 E. coli, tj. navedena ćelija domaćina sadrži enzime sposobne da sintetišu O1 E. coli (vidi, npr., Sliku 12). U specifičnom slučaju, ovde je otkrivena ćelija domaćina koja proizvodi O1A E. coli. U specifičnom slučaju, ovde je otkrivena ćelija domaćina koja proizvodi O1B E. coli. U specifičnom slučaju, ovde je otkrivena ćelija domaćina koja proizvodi O1C E. coli. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0135] U drugom aspektu, ovde je otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O2 E. coli, tj. navedena ćelija domaćina sadrži enzime sposobne da sintetišu O2 E. coli (videti, npr., Sliku 19). U drugom specifičnom izvođenju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEKQ ID NO: 14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0136] U drugom aspektu, ovde je obezbeđena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) koja proizvodi O6 E. coli, tj. navedena ćelija domaćin sadrži enzime sposobne da sintetišu O6 E. coli (vidi, npr., Sliku 17). U specifičnom slučaju, ovde je otkrivena ćelija domaćin koja proizvodi O6 E. coli koji sadrži razgranati Glc monosaharid ili O6 antigen koji sadrži razgranati GlcNAc monosaharid. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzus sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
[0137] Ovde je dalje otkrivena prokariotska ćelija domaćin (npr., rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin) sposobna da proizvodi više od jednog tipa O antigena E. coli. U specifičnom slučaju, ovde je otkrivena ćelija domaćin sposobna da proizvede najmanje dva od sledećeg: O25B, O25A, O1 (npr. O1A, O1B, O1C), O2 i O6. U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkrivena ćelija domaćin sposobna da proizvede O25B i jedan ili više od O25A, O1 (npr. O1A, O1B, O1C), O2 i O6. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oligosaharil transferazu. U drugom specifičnom slučaju, prokariotska ćelija domaćin dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/ 119987). U specifičnom slučaju, ćelija domaćin je E. coli.
5.3.1 Genetička pozadina
[0138] Bilo koja ćelija domaćina poznata stručnjacima može se koristiti za proizvodnju ovde opisanih O antigena E. coli (npr. O25B) i biokonjugata koji sadrže O antigene E. coli opisane ovde (npr. O25B), uključujući arhee, prokariotske ćelije domaćini i eukariotske ćelije domaćini. Primeri prokariotskih ćelija domaćina za upotrebu u proizvodnji O antigena E. coli opisanih ovde i biokonjugata koji sadrže O antigene E. coli opisane ovde uključuju, bez ograničenja, Escherichia vrste, Shigella vrste, Klebsiella vrste, Xhantomonas vrste, Salmonella vrste, Yersinia vrste, Lactococcus vrste, Lactobacillus vrste, Pseudomonas vrste, Corynebacterium vrste, Streptomyces vrste, Streptococcus vrste, Staphylococcus vrste, Bacillus vrste, i Clostridium vrste. U specifičnom izvođenju, ćelija domaćin koja se koristi za proizvodnju ovde opisanih O antigena E. coli i biokonjugata koji sadrže ovde opisane O antigene E. coli je E. coli.
[0139] U određenim izvođenjima, ćelije domaćini koji se koriste za proizvodnju O antigena E. coli i biokonjugata koji su ovde opisani su projektovani da sadrže heterologne nukleinske kiseline, npr. heterologne nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više proteina nosača i/ili heterologne nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više proteina, npr. gena koji kodiraju jedan ili više proteina. U specifičnom izvođenju, heterologne nukleinske kiseline koje kodiraju proteine uključene u puteve glikozilacije (npr., prokariotski i/ili eukariotski putevi glikozilacije) mogu se uvesti u ovde opisane ćelije domaćina. Takve nukleinske kiseline mogu da kodiraju proteine uključujući, bez ograničenja, oligosaharil transferaze i/ili glikoziltransferaze. Heterologne nukleinske kiseline (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju proteine nosače i/ili nukleinske kiseline koje kodiraju druge proteine, npr. proteine uključene u glikozilaciju) mogu se uvesti u ćelije domaćina opisane ovde korišćenjem bilo kojih postupaka koji su poznati stručnjacima, npr., elektroporacija, hemijska transformacija toplotnim šokom, prirodna transformacija, transdukcija faga i konjugacija. U specifičnim izvođenjima, heterologne nukleinske kiseline se unose u ćelije domaćina kao što je ovde opisano korišćenjem plazmida, npr. heterologne nukleinske kiseline se eksprimiraju u ćelijama domaćina pomoću plazmida (npr. ekspresioni vektor). U drugom specifičnom izvođenju, heterologne nukleinske kiseline se uvode u ćelije domaćina kao što je ovde opisano korišćenjem postupka umetanja opisanog u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/EP2013/068737.
[0140] U određenim izvođenjima, dodatne modifikacije mogu biti uvedene (npr. korišćenjem rekombinantnih tehnika) u ćelije domaćina koje se ovde opisuju. Na primer, nukleinske kiseline ćelije domaćina (npr. geni) koje kodiraju proteine koji čine deo mogućeg konkurentskog ili interferirajućeg puta glikozilacije (npr. takmiče se ili ometaju jedan ili više heterolognih gena uključenih u glikozilaciju koji su rekombinantno uvedeni u ćeliju domaćina) mogu biti obrisani ili modifikovani u pozadini ćelije domaćina (genom) na način koji ih čini neaktivnim/disfunkcionalnim (tj. nukleinske kiseline ćelije domaćina koje su izbrisane/modifikovane ne kodiraju funkcionalni protein ili uopšte ne kodiraju protein). U određenim izvođenjima, kada se nukleinske kiseline izbrišu iz genoma ćelija domaćina koje su ovde prikazane, one se zamenjuju poželjnom sekvencom, npr. sekvencom koja je korisna za proizvodnju glikoproteina.
[0141] Primeri gena koji se mogu izbrisati u ćelijama domaćinima (i, u nekim slučajevima, zameniti drugim željenim sekvencama nukleinske kiseline) uključuju gene ćelija domaćina uključenih u biosintezu glikolipida, kao što je waaL (videti, npr., Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), klaster biosinteze jezgra lipida A (waa), klaster galaktoze (gal), klaster arabinoze (ara), klaster kolanske kiseline (wc), klaster kapsularnih polisaharida, gen undekaprenol-p (gena biosinteze-p npr. uppS, uppP), und-P geni za reciklažu, metabolički enzimi uključeni u biosintezu šećera aktiviranog nukleotidom, klaster enterobakterijskih zajedničkih antigena i klaster modifikacije antigena profaga kao što je gtrABS klaster. U specifičnoj varijanti, ćelije domaćini opisane ovde su modifikovane tako da ne proizvode nijedan O antigen osim željenog O antigena iz ExPEC, npr., O25B. U specifičnom izvođenju, jedan ili više waaL gena, gtrA gena, gtrB gena, gtrS gena ili rfb genske grupe je izbrisano ili funkcionalno inaktivirano iz genoma prokariotske ćelije domaćina koja je ovde prikazana. U jednom aspektu, ćelija domaćin koja se ovde koristi je E. coli koja proizvodi O25B antigen, pri čemu su waaL gen, gtrA gen, gtrB gen i gtrS gen izbrisani ili funkcionalno inaktivirani iz genoma ćelije domaćina. U drugom aspektu, ćelija domaćin koja se ovde koristi je E. coli koja proizvodi O25B antigen, pri čemu su waaL gen i gtrS gen izbrisani ili funkcionalno inaktivirani iz genoma ćelije domaćina.
[0142] U određenim izvođenjima, ovde date modifikovane ćelije domaćina mogu se koristiti za glikozilaciju proteina. Glikozilacija proteina može biti dizajnirana za proizvodnju biokonjugata za upotrebu u formulacijama vakcine, npr. vakcine koje sadrže polisaharidni antigen(e) E. coli, npr. O25 (npr. O25B), O1, O2 i O6.
5.3.2 Proteini nosači
[0143] Ovde se može koristiti bilo koji protein nosač pogodan za upotrebu u proizvodnji konjugovanih vakcina (npr. biokonjugati za upotrebu u vakcinama), npr., nukleinske kiseline koje kodiraju protein nosač mogu se uvesti u domaćina koji je ovde dat za proizvodnju biokonjugat koji sadrži protein nosač vezan za ExPEC antigen (npr. O25B). Primeri proteina nosača uključuju, bez ograničenja, detoksifikovani egzotoksin A P. aeruginosa (EPA; videti, npr., Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, protein koji vezuje maltozu (MBP), Toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A od S. aureus, faktor nakupljanja A, faktor nakupljanja B, E. coli FimH, E.
coli FimHC, E. coli toplotno labilni enterotoksin, detoksifikovane varijante E. coli toplotno labilnog enterotoksina podjedinica toksina B (CTB), toksin kolere, detoksifikovane varijante toksina kolere, E. coli Sat protein, passenger domen E. coli Sat proteina, Streptococcus pneumoniae Pneumolisin i njegove detoksifikovane varijante, C. jejuni AcrA i C. jejuni prirodni glikoproteini. Za EPA, u literaturi su opisane različite detoksifikovane varijante proteina i mogu se koristiti kao proteini nosači.
[0144] U određenim izvođenjima, proteini nosači koji se koriste u stvaranju biokonjugata koji su ovde opisani su modifikovani, npr. modifikovani na takav način da je protein manje toksičan i/ili podložniji glikozilaciji. U specifičnom izvođenju, proteini nosači koji se koriste u stvaranju biokonjugata koji su ovde opisani su modifikovani tako da je broj mesta glikozilacije u proteinima nosačima maksimiziran na način koji omogućava primenu nižih koncentracija proteina, npr. u imunogenoj kompoziciji, u njegovom biokonjugovanom obliku.
[0145] U određenim izvođenjima, ovde opisani proteini nosači su modifikovani tako da uključuju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više mesta glikozilacije nego što bi normalno bilo povezano sa proteinom nosačem (npr. na broj mesta glikozilacije povezanih sa proteinom nosačem u njegovom nativnom/prirodnom, npr. "divlji tip" stanju). U specifičnim izvođenjima, uvođenje mesta za glikozilaciju se postiže umetanjem konsenzusnih sekvenci glikozilacije (npr. Asn-X-Ser(Thr), gde X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO:14); ili Asp( Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15) (videti WO 2006/119987)) bilo gde u primarnoj strukturi proteina. Uvođenje takvih mesta glikozilacije može se postići, npr., dodavanjem novih aminokiselina primarnoj strukturi proteina (tj. mesta glikozilacije se dodaju, u potpunosti ili delimično), ili mutacijom postojećih aminokiselina u proteinu po redu da generiše mesta za glikozilaciju (tj. aminokiseline se ne dodaju proteinu, ali su odabrane aminokiseline proteina mutirane tako da formiraju mesta glikozilacije). Stručnjaci će prepoznati da se sekvenca aminokiselina proteina može lako modifikovati korišćenjem pristupa poznatih u tehnici, npr. rekombinantnih pristupa koji uključuju modifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein. U specifičnim izvođenjima, konsenzusne sekvence glikozilacije se uvode u specifične regione proteina nosača, npr., površinske strukture proteina, na N ili C krajevima proteina, i/ili u petlje koje su stabilizovane disulfidnim mostovima na bazi proteina. proteina. U određenim izvođenjima, klasična konsenzusna sekvenca glikozilacije od 5 aminokiselina može biti proširena sa ostacima lizina za efikasniju glikozilaciju, i tako umetnuta konsenzusna sekvenca može da kodira 5, 6 ili 7 aminokiselina koje treba ubaciti ili koje zamenjuju aminokiseline akceptorskog proteina. U jednom posebnom aspektu, protein nosač je detoksifikovan EPA koji sadrži 4 konsenzusne glikozilacione sekvence Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO: 15), i ima sekvencu aminokiselina kao što je dato u SEQ ID NO: 13.
[0146] U određenim izvođenjima, proteini nosači koji se koriste u stvaranju biokonjugata koji su ovde opisani sadrže "tag" (oznaku), tj. sekvencu aminokiselina koja omogućava izolaciju i/ili identifikaciju proteina nosača. Na primer, dodavanje oznake na protein nosač koji je ovde opisan može biti korisno u prečišćavanju tog proteina i, prema tome, prečišćavanju konjugovanih vakcina koje sadrže obeleženi protein nosač. Primeri oznaka koje se ovde mogu koristiti uključuju, bez ograničenja, tag-ovi histidina (HIS) (npr. heksa histidin-tag ili 6XHis-tag), FLAG-TAG i HA tag-ove. U određenim izvođenjima, tagovi koji se ovde koriste se mogu ukloniti, na primer, uklanjanjem hemijskim agensima ili enzimskim sredstvima, kada više nisu potrebne, na primer, nakon što je protein prečišćen.
[0147] U određenim izvođenjima, ovde opisani proteini nosači sadrže signalnu sekvencu koja cilja protein nosač na periplazmatski prostor ćelije domaćina koji eksprimira protein nosač. U specifičnom izvođenju, signalna sekvenca je od E. coli DsbA, E. coli spoljne membrane porina A (OmpA), E. coli maltoza vezujući protein (MalE), Ervinia carotovorans pektat liaza (PelB), FlgI, NikA ili Bacillus sp.
endoksilanaza (XynA), toplotno labilni enterotoksin E. coli LTIIb, Bacillus endoxylanase XynA ili flagelin E. coli (FlgI).
5.3.3 Mašinerija za glikozilaciju
[0148] Ćelije domaćini koje su ovde date sadrže, i/ili mogu biti modifikovane tako da sadrže, nukleinske kiseline koje kodiraju genetičke mašinerije (npr., glikoziltransferaze) sposobne da proizvode O antigene iz ExPEC-a, npr. O25 (npr. O25B), 01, O2 i / ili O6 antigeni. Videti Odeljak 5.1.
Glikoziltransferaze
[0149] Ovde obezbeđene ćelije domaćini sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode antigene ExPEC O, na primer, O antigen iz E. coli O25 serotipa (npr. O25A ili O25B, videti Sliku 3B), O1 (videti Sliku 12), 02 (videti Sliku 19) i O6 (npr. O6 serotip koji proizvodi O6 antigen koji sadrži razgranati Glc monosaharid ili O6 antigen koji sadrži razgranati GlcNAc monosaharid, videti Sliku 17). Primeri nukleinskih kiselina su opisani u odeljku 5.1. U određenim izvođenjima, neke ili sve nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode ExPEC O antigen su prirodno eksprimirane u ćelijama domaćinima koje su ovde date (npr. nukleinske kiseline su prisutne u pozadini ćelije domaćina „divljeg tipa“). U određenim izvođenjima, neke ili sve nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode ExPEC O antigen nisu prirodno eksprimirane u ćelijama domaćinima datim ovde, tj. neke ili sve nukleinske kiseline su heterologne za ćeliju domaćina. Ćelije domaćini se mogu konstruisati tako da sadrže specifične nukleinske kiseline, na primer, nukleinske kiseline opisane u Odeljku 5.1, korišćenjem postupaka koji su poznati u oblasti tehnike, npr. postupaka koji se opisuju u Odeljku 5.3.
[0150] U specifičnoj varijanti, ćelije domaćini koje su ovde obezbeđene sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvedu O antigen E. coli O25B serotipa, tj., antigen O25B koji je opisan ovde. U specifičnom izvođenju, pomenute nukleinske kiseline kodiraju klaster rfb iz upec138 (SEQ ID NO:12), ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan ili homologan SEQ ID NO:12.
[0151] U drugom specifičnom izvođenju, navedene nukleinske kiseline kodiraju rfb klaster iz upec163, ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % ili 99% identičan ili homologan sa rfb klasterom iz upec163. U drugom specifičnom izvođenju, navedene nukleinske kiseline kodiraju rfb klaster iz upec177, ili klaster gena koji je oko ili najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99 % identičan ili homologan sa rfb klasterom iz upec177.
[0152] U drugom specifičnom izvođenju, pomenute nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode O antigen E. coli serotipa O25B su geni O25B serotipa, pri čemu su navedeni geni rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2) rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), WekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10) i wbbL (SEQ ID NO:11). Videti Tabele 3 i 9.
[0153] U specifičnom izvođenju, ćelije domaćini koje su ovde date sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju proteine (npr. glikoziltransferaze) sposobne da proizvode O antigen E. coli O25A serotipa, tj., ovde opisani antigen O25A. U drugom specifičnom izvođenju, navedene nukleinske kiseline koje kodiraju proteine (npr., glikoziltransferaze) sposobne da proizvode O antigen E. coli O25A serotipa su geni O25 serotipa, pri čemu su navedeni geni rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wekC, wzy, fnlA, fnlB, fnlC, wbuB, i/ili wbuC. Videti Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; GenBank GU014554; i Tabelu 2.
[0154] U drugom specifičnom izvođenju, ćelije domaćini koje su ovde date sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode O antigen E. coli O2 serotipa. U drugom specifičnom izvođenju, navedene nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode O antigen E. coli O2 serotipa su geni O2 serotipa, pri čemu su navedeni geni rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, vekP, wekR, wzy, fdtA, fdtB i/ili fdtC. Videti Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77; Fratamico, et al., 2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316; i Tabela 5.
[0155] U drugom specifičnom izvođenju, ćelije domaćini koje su ovde date sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode O antigen E. coli O6 serotipa. Videti Welch et al., 2002, PNAS USA 99(26):17020-17024; Jann et al., Carbohydr. Res.263 (1994) 217-225, i Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283. U specifičnom izvođenju, pomenuti O6 serotip sadrži razgranati Glc monosaharid.
[0156] U drugom specifičnom izvođenju, ćelije domaćini koje su ovde date sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode O antigen E. coli O1 serotipa. U specifičnom izvođenju, navedeni O1 serotip je O1A. U drugom specifičnom izvođenju, navedene nukleinske kiseline koje kodiraju glikoziltransferaze sposobne da proizvode O antigen E. coli O1 serotipa su geni O1 serotipa, pri čemu su navedeni geni rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, mnaA, wekM, wzy, wekN, i/ili wekO.
Oligosaharil transferaze
[0157] Oligosaharil transferaze prenose oligosaharide vezane za lipide na ostatke asparagina u prirodnim polipeptidnim lancima koji sadrže konsenzusni motiv N-glikoksilacije, npr. Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO :14); ili Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 15) (videti WO 2006/119987). Videti, npr., WO 2003/074687 i WO 2006/119987.
[0158] U određenim izvođenjima, ćelije domaćini date ovde sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira oligosaharil transferazu. Nukleinska kiselina koja kodira oligosaharil transferazu može biti nativna za ćeliju domaćina, ili može biti uvedena u ćeliju domaćina korišćenjem genetičkih pristupa, kao što je gore opisano. Oligosaharil transferaza može biti iz bilo kog izvora poznatog u tehnici. U specifičnom izvođenju, oligosaharil transferaza je oligosaharil transferaza iz Campilobacter. U drugom specifičnom izvođenju, oligosaharil transferaza je oligosaharil transferaza iz Campilobacter jejuni (tj. pglB; videti, npr., Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; videti takođe, npr., 32 NCBI3 Gene ID: 7, NCBI3 Gene ID Pristupni broj 086154). U drugom specifičnom izvođenju, oligosaharil transferaza je oligosaharil transferaza iz Campilobacter lari (videti, npr., NCBI gen ID: 7410986).
5.4 Biokonjugati
[0159] U određenim izvođenjima, ovde opisane ćelije domaćini mogu se koristiti za proizvodnju biokonjugata koji sadrže ovde opisani O antigen E. coli (npr. O25B; videti Odeljak 5.2) koji je vezan za protein nosač. Postupci za proizvodnju takvih biokonjugata korišćenjem ćelija domaćina su poznati u tehnici. Videti, npr., WO 2003/074687 i WO 2006/119987.
[0160] Alternativno, glikokonjugati mogu biti pripremljeni hemijskom sintezom, tj. pripremljeni van ćelija domaćina (in vitro). Na primer, ovde opisani O antigeni E. coli, npr., O25B, mogu se konjugovati sa proteinima nosačima korišćenjem postupaka koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike, uključujući i korišćenje aktivacionih reaktivnih grupa u polisaharidima/oligosaharidima kao i proteinom nosačem. Videti, npr., Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18: 1873-1885; and Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978). Takvi pristupi obuhvataju ekstrakciju antigenih polisaharida/oligosaharida iz ćelija domaćina, prečišćavanje polisaharida/oligosaharida, hemijsku
4
aktivaciju polisaharida/oligosaharida i konjugovanj polisaharida/oligosaharida proteina na protein nosač.
[0161] Biokonjugati, kao što je ovde opisano, imaju prednost u odnosu na glikokonjugate, na primer, biokonjugati zahtevaju manje hemikalija u proizvodnji i konzistentniji su u pogledu konačnog proizvoda koji se generiše. Dakle, biokonjugati su poželjniji u odnosu na hemijski proizvedene glikokonjugate.
[0162] U specifičnom izvođenju, ovde su obezbeđeni biokonjugati koji sadrže protein nosač vezan za O antigen ExPEC koji je ovde opisan. Videti Odeljak 5.2.
[0163] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđen biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) N-vezan za E. coli O25B.
[0164] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđen biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) povezan sa jedinjenjem Formule O25B koje je predstavljeno u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20 ili 15 do 20. U specifičnom izvođenju, protein nosač je N vezan za O antigen Formule O25B, tj. O25B je vezan za Asn ostatak proteina nosača koji sadrži sekvencu Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro (SEQ ID NO: 14); ili protein nosač koji sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani od bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO: 15).
[0165] U drugom specifičnom izvpđenju, ovde je obezbeđen biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) N- vezan za antigen E.coli O25B koji sadrži strukturu Formule O25B’, koja je predstavljena u nastavku:
pri čemu je n ceo broj između 1 do 30, 1 do 20, 1 do 15, 1 do 10, 1 do 5, 10 do 30, 15 do 30, 20 do 30, 25 do 30, 5 do 25, 10 do 25, 15 do 25, 20 do 25, 10 do 20, ili 15 do 20. U specifičnom izvođenju, nosač protein je N-vezan sa O antigenom Formule 025B’.
[0166] Ovde je takođe prikazan biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) vezan za antigen O25A. U specifičnom slučaju, navedeni antigen O25A sadrži formulu O25A:
ili O25A’:
[0167] Ovde je takođe prikazan biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) vezan za O1 antigen. U specifičnom izvođenju, navedeni antigen O1 je O1A, npr., navedeni antigen sadrži formulu O1A:
ili O1A’:
[0168] U drugom specifičnom slučaju, navedeni antigen O1 je O1B, na primer, navedeni antigen sadrži formulu 01B:
ili O 1 B’ :
[0169] U drugom specifičnom slučaju, navedeni antigen O1 je O1C, na primer, navedeni antigen sadrži formulu 01C:
ili O1C’:
[0170] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkriven biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) vezan za O2 antigen. U specifičnom slučaju, pomenuti O2 antigen sadrži formulu O2:
ili O2’
4
[0171] U drugom specifičnom slučaju, ovde je otkriven biokonjugat koji sadrži protein nosač (npr. EPA) vezan za O6 antigen. U specifičnom izvođenju, pomenuti O6 antigen sadrži formulu:
06GlcNAc:
O6Glc’:
ili 06GlcNAc’:
[0172] Biokonjugati koji su ovde opisani mogu se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici za prečišćavanje proteina, na primer, hromatografijom (npr. jonska razmena, anjonska razmena, afinitetna i kolonska hromatografija za određivanje veličine), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Videti, npr., Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (str.1-18); videti takođe postupke opisane u WO 2009/104074. Dalje, biokonjugati mogu biti fuzionisani sa heterolognim polipeptidnim sekvencama koje su ovde opisane ili na drugi način poznate u tehnici da bi se olakšalo prečišćavanje. Stvarni uslovi koji se koriste za prečišćavanje određenog biokonjugata zavisiće, delimično, od strategije sinteze (npr. sintetička proizvodnja naspram rekombinantne proizvodnje) i od faktora kao što su neto naelektrisanje, hidrofobnost i/ili hidrofilnost biokonjugata, i biće očigledno onima koji su verzirani u oblast tehnike.
5.5 Antitela na O25B
[0173] Ovde opisani O25B antigen (videti Odeljak 5.2) i/ili biokonjugati koji sadrže antigen O25B koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) mogu se koristiti za izazivanje neutrališućih antitela protiv ExPEC. Ovde opisani antigen O25B i/ili biokonjugati koji sadrže antigen O25B koji je ovde opisan mogu se davati subjektu (npr. čoveku, mišu, zecu, pacu, zamorcu, itd.) da bi se indukovao imuni odgovor koji uključuje proizvodnju antitela. Takva antitela se mogu izolovati korišćenjem tehnika koje su poznate stručnjaku iz oblasti tehnike (npr., imunoafinitetna hromatografija, centrifugiranje, precipitacija, itd.).
[0174] Pored toga, ovde opisani antigen O25B može da se koristi za skrining antitela iz biblioteka antitela. Na primer, izolovani O25B može da se imobiliše na čvrstu podlogu (npr. silika gel, smola, derivatizovana plastična folija, staklena perla, pamuk, plastična čestica, polistirenska čestica, gel aluminijum oksida ili polisaharid, magnetna čestica) i testira na vezivanje antitela. Kao alternativa, antitela koja se testiraju mogu biti imobilizovana na čvrstoj podlozi i testirati na vezivanje za O25B. Bilo koji test skrininga, kao što je “panning” test, ELISA, površinska plazmonska rezonanca, ili drugi test skrininga antitela poznat u tehnici, može se koristiti za skrining antitela koja se vezuju za O25B. Proverena biblioteka antitela može biti komercijalno dostupna biblioteka antitela, biblioteka generisana in vitro ili biblioteka dobijena identifikacijom i kloniranjem ili izolovanjem antitela od osobe inficirane EXPEC-om. Biblioteke antitela se mogu generisati u skladu sa postupcima poznatim u tehnici. U posebnom izvođenju, biblioteka antitela se generiše kloniranjem antitela i njihovim korišćenjem u bibliotekama za prikaz faga ili biblioteci za prikaz fagemida.
[0175] Antitela identifikovana ili izazvana korišćenjem O25B i/ili biokonjugata O25B mogu uključivati molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za O25B. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgI), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase molekula imunoglobulina. Antitela uključuju, ali nisu ograničena na, monoklonalna antitela, multispecifična antitela, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, jednolančana Fvs (scFv), jednolančana antitela, Fab fragmente, F(ab') fragmente, Fvs povezane disulfidom (sdFv), i antiidiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela na antitela izazvana ili identifikovana korišćenjem metode opisane ovde), i fragmente za vezivanje epitopa bilo kog od gore navedenih. U specifičnom aspektu, antitelo izazvano ili identifikovano korišćenjem O25B i/ili biokonjugata O25B je ljudsko ili humanizovano monoklonsko antitelo.
[0176] Antitela izazvana ili identifikovana korišćenjem O25B i/ili biokonjugata O25B mogu se koristiti za praćenje efikasnosti terapije i/ili progresije bolesti. Za ovu svrhu može se koristiti bilo koji sistem za imunotestiranje koji je poznat u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, kompetitivne i nekompetitivne sisteme ispitivanja koji koriste tehnike kao što su radioimunološki testovi, ELISA (enzimski imunoeseji), „sendvič“ imunoeseji, reakcije precipitina, gel difuzione precipitinske reakcije, imunodifuzioni testovi, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunoeseji, imunoeseji proteina A i testovi imunoelektroforeze.
[0177] Antitela izazvana ili identifikovana korišćenjem O25B i/ili biokonjugata O25B mogu se koristiti za detekciju sojeva E. coli O25B, na primer, iz većeg broja sojeva E. coli i/ili za dijagnostikovanje infekcije E. coli. soj O25B.
5.6 Kompozicije
5.6.1 Kompozicije koje se sastoje iz ćelija domaćina
[0178] U jednom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže ćelije domaćina koje se ovde opisuju. Takve kompozicije se mogu koristiti u postupcima za generisanje ovde opisanih biokonjugata (videti Odeljak 5.4), npr., kompozicije se mogu kultivisati pod uslovima pogodnim za proizvodnju
4
proteina. Nakon toga, biokonjugati se mogu izolovati iz navedenih kompozicija korišćenjem postupaka poznatih u oblasti tehnike.
[0179] Kompozicije koje sadrže ćelije domaćina date ovde mogu sadržati dodatne komponente koje su pogodne za održavanje i preživljavanje ćelija domaćina koji se ovde opisuju, i mogu dodatno da sadrže dodatne komponente potrebne ili korisne za proizvodnju proteina od strane ćelija domaćina, npr., inducere za inducibilne promotere, kao što je arabinoza, IPTG.
5.6.2 Kompozicije koje sadrže Antigene i/ili Biokonjugati
[0180] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) koje sadrže jedan ili više O antigena E. coli opisanih ovde (videti Odeljak 5.2) i kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) koje sadrže jedan ili više biokonjugata opisanih ovde (videti Odeljak 5.4). U specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži jedan ili više O antigena E. coli opisanih ovde (videti Odeljak 5.2). U još jednom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži jedan ili više biokonjugata koji se ovde opisuju (videti Odeljak 5.4). U drugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži jedan ili više O antigena E. coli koji se ovde opisuju (videti Odeljak 5.2) i jedan ili više biokonjugata koji se ovde opisuju (videti Odeljak 5.4). Kompozicije koje su ovde opisane su korisne u lečenju i prevenciji infekcije subjekata (npr. ljudskih subjekata) sa ekstraintestinalnom patogenom E. coli (ExPEC). Videti Odeljak 5.7.
[0181] U određenim izvođenjima, pored toga što sadrže O antigen E. coli opisan ovde (videti Odeljak 5.2) i/ili biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4), kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije) opisane ovde sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv" označava odobrenje od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden u Farmakopeji SAD ili drugim opšte priznatim farmakopejama za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi. Termin "nosač", kako se ovde koristi u kontekstu farmaceutski prihvatljivog nosača, odnosi se na razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili nosač sa kojim se primenjuje farmaceutska kompozicija. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola se takođe mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Pogodni ekscipijenti su skrob, glukoza, laktoza, saharoza, želatin, slad, pirinač, brašno, kreda, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, i kao. Primeri odgovarajućih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" E.W. Martina.
[0182] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija koja sadrži protein nosač (npr., protein nosač opisan u Odeljku 5.3.2) vezan za antigen koji je ovde opisan, npr. ExPEC O antigen opisan u odeljku 5.2.
[0183] U drugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži protein nosač (npr. protein nosač opisan u Odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) povezan sa E. coli O25B (videti Odeljak 5.2).
[0184] U dugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži protein nosač (npr., protein nosač opisan u odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) povezan sa E. coli O25A (videti Odeljak 5.2).
[0185] U drugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži protein nosač (npr., protein nosač opisan u odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) povezan sa E. coli O1 (videti Odeljak 5.2). U drugom specifičnom aspektu, pomenuti O1 makromolekul je O1A. U drugoj specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O1 je O1B. U drugom specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O1 je O1C.
4
[0186] U još jednom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži protein nosač (npr., protein nosač opisan u odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) povezan sa E. coli O2 (videti odeljak 5.2).
[0187] U još jednom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži protein nosač (npr., protein nosač opisan u Odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) povezan sa E. coli O6 (videti Odeljak 5.2). U specifičnoj varijanti, navedeni makromolekul O6 je O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid.
[0188] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži (i) O25 (npr. O25A ili O25B) makromolekul, ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25B) ili O25A (ii) O1 makromolekula ili biokonjugata koji sadrži O1. Videti Odeljak 5.2. U specifičnoj varijanti, navedeni makromolekul O25 je makromolekul O25B. U drugom specifičnom aspektu, pomenuti O1 makromolekul je O1A. U drugom specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O1 je O1B. U drugom specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O1 je O1C.
[0189] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži (i) O25 (npr. O25A ili O25B) makromolekul, ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25B) ili O25A (ii) O2 makromolekul ili biokonjugat koji sadrži O2. Videti Odeljke 5.2 i 5.4. U specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O25 je makromolekul O25B.
[0190] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži (i) makromolekul O25 (npr. O25A ili O25B), ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25A ili O25B) i O6ii makromolekul (npr. O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid ili razgranati GlcNAc monosaharid) ili biokonjugat koji sadrži O6. Videti Odeljke 5.2 i 5.4. U specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O25 je makromolekul O25B. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti makromolekul O6 je O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid.
[0191] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži E. coli O25B (videti Odeljak 5.2) ili a ili biokonjugat koji sadrži O25 (videti Odeljak 5.4) i najmanje jedno od sledećeg: (i) E. coli O1 ili biokonjugat koji sadrži O1 (videti Odeljke 5.2 i 5.4); (ii) E. coli O2 ili biokonjugat koji sadrži O2 (videti Odeljke 5.2 i 5.4); i/ili (iii) E. coli O6 ili biokonjugat koji sadrži O6 (videti Odeljke 5.2 i 5.4). U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O1 je O1A. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O1 je O1B. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O1 je O1C. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O6 je O6 koji sadrži razgranati Glc monosaharid.
[0192] Ovde je takođe prikazana kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži najmanje dva od sledećeg: (i) O25 (npr. O25A ili O25B) makromolekul ili biokonjugat koji sadrži O25 (npr. O25A ili O25B); (ii) O1 makromolekul ili biokonjugat koji sadrži O1; (iii) O2 makromolekul ili biokonjugat koji sadrži O2; i/ili (iv) O6 makromolekul (npr. O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid ili razgranati GlcNAc monosaharid) ili biokonjugat koji sadrži O6. U specifičnom slučaju, navedeni makromolekul O25 je O25B makromolekul. U drugom specifičnom slučaju, navedeni makromolekul O1 je O1A. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti makromolekul O1 je O1B. U drugom specifičnom slučaju, navedeni makromolekul O1 je O1C. U drugom specifičnom slučaju, pomenuti O6 makromolekul je O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid.
[0193] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji sadrži E. coli O25B i biokonjugat koji sadrži E. coli O1A. Takvi biokonjugati su opisani u Odeljku 5.4.
4
[0194] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji sadrži E. coli O25B i biokonjugat koji sadrži E. coli O1B. Takvi biokonjugati su opisani u Odeljku 5.4.
[0195] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji sadrži E. coli O25B i biokonjugat koji sadrži E. coli O1C. Takvi biokonjugati su opisani u Odeljku 5.4.
[0196] U drugom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji sadrži E. coli O25B i biokonjugat koji sadrži E. coli O2. Takvi biokonjugati su opisani u Odeljku 5.4.
[0197] U još jednom specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži biokonjugat koji sadrži E. coli O25B i biokonjugat koji sadrži E. coli O6. Takvi biokonjugati su opisani u Odeljku 5.
[0198] U drugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži (i) protein nosač (npr. protein nosač opisan u Odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) N povezan sa E. coli O25B (videti Odeljak 5.2), (ii) protein nosač (npr., protein nosač opisan u Odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) vezan za antigen O E. coli serotipa O1, npr., O1A (videti Odeljak 5.2), (iii) protein nosač (npr., protein nosač opisan u odeljku 5.1.2, npr. EPA ili MBP) vezan za antigen O E. coli serotipa O2 (videti Odeljak 5.2), i (iv) protein nosač (npr., protein nosač opisan u odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) vezan za antigen O E. coli serotipa O6 (videti Odeljak 5.2).
[0199] U određenim izvođenjima, prethodne kompozicije sadrže protein nosač (npr. protein nosač opisan u Odeljku 5.3.2, npr. EPA ili MBP) povezan sa O antigenom E. coli serotipa E. coli koji nije 01, O2, O6 ili O25. Drugi korisni serotipovi E. coli su opisani, npr., u Primeru 1 i Tabeli 1, u nastavku.
[0200] U još jednom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži O25 (npr., O25A ili O25B) makromolekul.
[0201] U drugom specifičnom izvođenju, kompozicija koja je ovde data sadrži O1 makromolekul (npr. O1A, O1B ili O1C).
[0202] U još jednom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži O2 makromolekul.
[0203] U još jednom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena kompozicija sadrži O6 makromolekul (npr. O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid ili GlcNAc monosaharid koji se grana).
[0204] U drugom specifičnom izvođenju, kompozicija koja je ovde data sadrži O25 (npr. O25A ili O25B) makromolekul, O1 makromolekul, O2 makromolekul i O6 makromolekul (npr. monosaharid ili razgranati GlcNAc monosaharid). U specifičnom izvođenju, navedeni makromolekul O25 je makromolekul O25B. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O1 makromolekul je O1A. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti makromolekul 06 je O6 makromolekul koji sadrži razgranati Glc monosaharid.
[0205] Kompozicije koje su ovde date mogu se koristiti za izazivanje imunološkog odgovora kod domaćina kome se daje kompozicija, tj. imunogene su. Prema tome, ovde opisane kompozicije mogu da se koriste kao vakcine protiv infekcije ExPEC, ili se mogu koristiti u lečenju infekcije ExPEC, i prema tome mogu biti formulisane kao farmaceutske kompozicije. Videti Odeljak 5.7.
4
[0206] Kompozicije koje sadrže biokonjugate i/ili makromolekule opisane ovde mogu da sadrže bilo koje dodatne komponente pogodne za upotrebu u farmaceutskoj primeni. U specifičnim izvođenjima, ovde opisane kompozicije su monovalentne formulacije. U drugim izvođenjima, ovde opisane kompozicije su multivalentne formulacije, npr. dvovalentne, trovalentne i tetravalentne formulacije. Na primer, multivalentna formulacija sadrži više od jednog biokonjugata ili O antigena E. coli koji je ovde opisan. Videti Odeljke 5.2 i 5.4 za opis antigena O E. coli i biokonjugata, redom. U specifičnom izvođenju, ovde opisana kompozicija je tetravalentna formulacija koja sadrži makromolekul ili biokonjugat, gde su navedene valence od O antigena E. coli O25B, O1A, O6 i O2 serotipova/podserotipova.
[0207] U određenim izvođenjima, ovde opisane kompozicije dodatno sadrže konzervans, npr., derivat žive timerosal. U specifičnom izvođenju, ovde opisane farmaceutske kompozicije sadrže 0,001% do 0,01% timerosala. U drugim izvođenjima, ovde opisane farmaceutske kompozicije ne sadrže konzervans.
[0208] U određenim izvođenjima, ovde opisane kompozicije (npr. imunogene kompozicije) sadrže, ili se primenjuju u kombinaciji sa adjuvansom. Adjuvans za primenu u kombinaciji sa ovde opisanom kompozicijom može se primeniti pre, istovremeno sa ili posle primene pomenute kompozicije. U nekim izvođenjima, termin "adjuvans" se odnosi na jedinjenje koje kada se daje zajedno sa ili kao deo kompozicije koja je ovde opisana povećava, pojačava i/ili pojačava imuni odgovor na biokonjugat, ali kada se jedinjenje daje samostalno ne generišu imuni odgovor na biokonjugat. U nekim izvođenjima, adjuvans generiše imuni odgovor na poli biokonjugat peptid i ne izaziva alergiju ili drugu neželjenu reakciju. Adjuvansi mogu poboljšati imuni odgovor pomoću nekoliko mehanizama uključujući, na primer, regrutovanje limfocita, stimulaciju B i/ili T ćelija i stimulaciju makrofaga.
[0209] Specifični primeri pomoćnih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, soli aluminijuma (alum) (kao što su aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat i aluminijum sulfat), 3 De-O-acilovani monofosforil lipid A (MPL) (videti Patent Ujedinjenog Kraljevstva GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlakoSmithKline), AS04 (GlakoSmithKline), polisorbat 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), jedinjenja imidazopiridina (videti međunarodnu prijavu br. PCT/US2007/US2007 Međunarodna publikacija br. WO2007/109812), jedinjenja imidazohinoksalina (videti Međunarodnu prijavu br. PCT/US2007/064858, objavljenu kao Međunarodna publikacija br. WO2007/109813) i saponine, kao što je QS21 (videti u Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995.). U nekim izvođenjima, adjuvans je Freundov adjuvans (potpun ili nekompletan). Drugi adjuvansi su emulzije ulja u vodi (kao što je skvalen ili ulje od kikirikija), opciono u kombinaciji sa imunološkim stimulansima, kao što je monofosforil lipid A (videti Stoute et al., N. Engl. J. Med.336, 86-91 (1997).)). Drugi adjuvans je CpG (Bioworld Today, 15. novembar 1998).
[0210] U određenim izvođenjima, ovde opisane kompozicije su formulisane tako da budu pogodne za predviđeni put davanja subjektu. Na primer, ovde opisane kompozicije mogu biti formulisane tako da budu pogodne za subkutanoznu, parenteralnu, oralnu, intradermalnu, transdermalnu, kolorektalnu, intraperitonealnu i rektalnu primenu. U specifičnom izvođenju, farmaceutska kompozicija može biti formulisana za intravensku, oralnu, intraperitonealnu, intranazalnu, intratrahealnu, subkutanu, intramuskularnu, topikalnu, intradermalnu, transdermalnu ili plućnu primenu.
[0211] U određenim izvođenju, ovde opisane kompozicije dodatno sadrže jedan ili više pufera, npr., fosfatni pufer i saharoza fosfat glutamatni pufer. U drugim izvođenjima, ovde opisane kompozicije ne sadrže pufere.
[0212] U određenim izvođenjima, ovde opisane kompozicije dodatno sadrže jednu ili više soli, npr., natrijum hlorid, kalcijum hlorid, natrijum fosfat, mononatrijum glutamat, i soli aluminijuma (npr.,
4
aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat i alumijum-fosfatijum, ili mešavina takvih soli aluminijuma). U drugim izvođenjima, ovde opisane kompozicije ne sadrže soli.
[0213] Kompozicije opisane ovde mogu biti uključene u kontejner, pakovanje ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.
[0214] Kompozicije opisane ovde mogu da se čuvaju pre upotrebe, npr. kompozicije se mogu čuvati zamrznute (npr. na oko -20°C ili na oko -70°C); čuvaju u rashlađenim uslovima (npr. na oko 4°C); ili čuvaju na sobnoj temperaturi.
5.7 Profilaktička i terapeutska upotreba
[0215] Ovde su obezbeđene kompozicije ovog pronalaska za upotrebu u postupcima lečenja i prevencije ekstraintestinalne E. coli (ExPEC) infekcije subjekta koji se sastoje od davanja subjektu O antigena E. coli opisanog ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugata koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4), ili kompozicije koja je ovde opisana (videti Odeljak 5.6.2). U specifičnom izvođenju, ovde opisane kompozicije (videti Odeljak 5.6.2) se koriste u prevenciji infekcije subjekta (npr. ljudskih subjekata) od strane ExPEC-a, tj. ovde opisane kompozicije se koriste za vakcinaciju subjekta protiv infekcije ExPEC. U drugom specifičnom izvođenju, ovde opisane kompozicije (videti odeljak 5.6.2) se koriste u lečenju subjekta koji je inficiran ExPEC. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u vakcinaciji subjekta, poželjno čoveka, protiv van-crevnog patogena Escherichia coli.
[0216] Ovde je takođe obezbeđena kompozicija ovog pronalaska za upotrebu u izazivanju imunog odgovora kod subjekta, poželjno čoveka, protiv ekstra-intestinalne patogene Escherichia coli. Ovde su takođe opisani postupci izazivanja imunog odgovora kod subjekta protiv ExPEC, koji obuhvataju davanje subjektu O antigena E. coli opisanog ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugata opisanog ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6.2). U jednom izvođenju, navedeni subjekt ima ExPEC infekciju u vreme primene. U drugom izvođenju, navedeni subjekt nema infekciju ExPEC u vreme primene.
[0217] Ovde je takođe obezbeđena kompozicija ovog pronalaska za upotrebu u indukovanju proizvodnje opsonofagocitnih antitela kod subjekta, poželjno čoveka, koja su specifična za ekstraintestinalnu patogenu Escherichia coli. Ovde su takođe opisani postupci za izazivanje proizvodnje opsonofagocitnih antitela protiv ExPEC kod subjekta, koji obuhvataju davanje subjektu antigena O E. coli opisanog ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugata opisanog ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6.2). U jednom izvođenju, navedeni subjekt ima ExPEC infekciju u vreme primene. U drugom izvođenju, navedeni subjekat nema ExPEC infekciju u vreme primene.
[0218] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija ovog pronalaska za upotrebu u postupku za prevenciju infekcije E. coli (npr. ExPEC) kod subjekta, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine kompozicije opisane u odeljku 5.6.2. Postupci za prevenciju ExPEC infekcije kod subjekta rezultiraju indukcijom imunog odgovora kod subjekta koji se sastoje od davanja subjektu kompozicije opisane u odeljku 5.6.2. Stručnjak iz oblasti tehnike će razumeti da postupci za izazivanje imunog odgovora kod subjekta koji se ovde opisuju dovode do vakcinacije subjekta protiv infekcije sojevima ExPEC čiji su O antigeni prisutni u kompozicij(i)ama.
[0219] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje infekcije E. coli (npr. ExPEC) kod subjekta, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine kompozicije opisane u Odeljku 5.6.2.
[0220] U određenim izvođenjima, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom opisanim ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan za sprečavanje i/ili lečenje ExPEC infekcije uzrokovane bilo kojim serotipom, podserotipom ili sojem ExPEC-a. U određenim izvođenjima, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan za sprečavanje i/ili lečenje ExPEC infekcije sa više od jednim serotipom ExPEC.
[0221] U specifičnom izvođenju, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan u prevenciji i/ili lečenju infekcije izazvane E. coli serotipa O25. U specifičnom izvođenju, pomenuti O25 serotip je O25B. U specifičnoj izvođenju, pomenuti O25 serotip je O25A.
[0222] U specifičnom izvođenju, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan u prevenciji i/ili lečenju infekcije izazvane E. coli O1 serotipom. U specifičnom izvođenju, navedeni O1 serotip je O1A. U drugom specifičnom izvođenju, pomenuti O1 serotip je O1B. U drugom specifičnom izvođenju, navedeni O1 serotip je O1C.
[0223] U specifičnom izvođenju, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan u prevenciji i/ili lečenju infekcije izazvane E. coli O2 serotipom.
[0224] U specifičnom izvođenju, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan u prevenciji i/ili lečenju infekcije izazvane E. coli serotipom O6.
[0225] U specifičnom izvođenju, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan za sprečavanje i/ili lečenje infekcije izazvane sa dva ili više od sledećih serotipa E. coli: O25 (npr. O25B i O25A), O1 (npr. O1A, O1B i O1C), O2 i/ili O6.
[0226] U specifičnom izvođenju, imuni odgovor izazvan antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom opisanom ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan za sprečavanje i/ili lečenje infekcije izazvane svakim od sledećih serotipa E. coli: O25 (npr. O25B i O25A), O1 (npr. O1A, O1B i O1C), O2 i O6.
[0227] U cilju lečenja subjekta koji ima ExPEC infekciju ili imunizacije subjekta protiv ExPEC infekcije, subjektu se može dati jedna kompozicija koja je ovde opisana, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži jednu, dve, tri, četiri ili više E. coli antigena opisanih ovde. Videti odeljak 5.2. Alternativno, u cilju lečenja subjekta koji ima ExPEC infekciju ili imunizacije subjekta protiv ExPEC infekcije, subjektu se može davati više biokonjugata opisanih ovde, npr., subjektu se mogu davati dva, tri, četiri ili više opisanih biokonjugata u odeljku 5.4. Alternativno, u cilju lečenja subjekta koji ima ExPEC infekciju ili imunizacije subjekta protiv ExPEC infekcije, subjektu se može davati više kompozicija opisanih ovde, npr., subjektu se mogu davati dve, tri, četiri ili više kompozicija opisanih u Odeljku 5.6.2.
[0228] U određenim izvođenjima, imuni odgovor izazvan kod subjekta nakon primene ovde opisanog antigena O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugata koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6 .2) je efikasan u smanjenju simptoma koji su rezultat infekcije ExPEC. Simptomi ExPEC infekcije mogu se razlikovati u zavisnosti od prirode infekcije i mogu
1
uključivati, ali bez ograničenja na: disuriju, povećanu učestalost mokrenja ili urgentnost, piuriju, hematuriju, bol u leđima, bol tokom mokrenja, groznicu, zimicu i/ili mučninu (npr. kod subjekata koji imaju infekciju urinarnog trakta uzrokovanu ExPEC); visoka temperatura, glavobolja, ukočen vrat, mučnina, povraćanje, napade, pospanost i/ili osetljivost na svetlost (npr. kod osoba koje imaju meningitis izazvan ExPEC); groznicu, povećan broj otkucaja srca, povećana brzina disanja, smanjeno izlučivanje urina, smanjen broj trombocita, bol u stomaku, otežano disanje i/ili abnormalnu funkciju srca (npr., kod subjekata koji imaju sepsu uzrokovanu ExPEC).
[0229] U određenim izvođenjima, imuni odgovor izazvan kod subjekta nakon primene ovde opisanog antigena O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugata koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan za smanjenje verovatnoće hospitalizacije subjekta koji pati od ExPEC infekcije. U nekim izvođenjima, imuni odgovor izazvan kod subjekta nakon primene ovde opisanog antigena O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugata koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6.2) je efikasan za smanjenje trajanja hospitalizacije subjekta koji pati od ExPEC infekcije.
[0230] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije ovog pronalaska za upotrebu postupka prevencije i/ili lečenja ExPEC infekcije kod subjekta izazvane E. coli O25B serotipom davanjem ovde opisanog antitela, tj. anti-O25B antitela koje je ovde opisano. U posebnim izvođenjima, neutralizujuće antitelo je monoklonsko antitelo.
5.7.1 Kombinovane terapije
[0231] U određenim izvođenjima, antigen O E. coli opisan ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugat ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde daje se subjektu u kombinaciji sa jednom ili više drugih terapija (npr., antibakterijske ili imunomodulatorne terapije). Jedna ili više drugih terapija mogu biti korisne u lečenju ili prevenciji ExPEC infekcije ili mogu ublažiti simptom ili stanje povezano sa ExPEC infekcijom. U nekim izvođenjuma, jedna ili više drugih terapija su lekovi protiv bolova ili lekovi protiv groznice. U određenim izvođenjima, terapije se daju u razmaku od manje od 5 minuta, manje od 30 minuta, u razmaku od 1 sata, u razmaku od oko 1 sat, u razmaku od oko 1 do oko 2 sata, u razmaku od oko 2 sata do oko 3 sata, u u razmaku od oko 3 sata do oko 4 sata, u razmaku od oko 4 sata do oko 5 sati, u razmaku od oko 5 sati do oko 6 sati, u razmaku od oko 6 sati do oko 7 sati, u razmaku od oko 7 sati do oko 8 sati, u u razmaku od oko 8 sati do oko 9 sati, u razmaku od oko 9 sati do oko 10 sati, u razmaku od oko 10 sati do oko 11 sati, u razmaku od oko 11 sati do oko 12 sati, u razmaku od oko 12 sati do oko 18 sati, 18 sati do 24 sata razmaka, 24 sata do 36 sati, 36 sati do 48 sati, 48 sati do 52 sata, 52 sata do 60 sati, 60 sati do 72 sata, 72 sata do 84 sata, 84 sata do razmaka od 96 sati, ili deo od 96 do 120 sati.
[0232] Bilo koji antibakterijski agensi koji su poznati stručnjacima mogu se koristiti u kombinaciji sa antigenom O E. coli opisanim ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugatom opisanim ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicijom koja je ovde opisana (videti Odeljak 5.6.2). Neograničavajući primeri antibakterijskih agenasa sadrže Amikacin, Amoksicillin, Amoksicillin-klavulanska kiselina, Amfotericin-B, Ampicillin, Ampicllin-sulbactam, Apramicin, Azitromicin, Aztreonam, Bacitracin, Benzilpenicilin, Caspofungin, Cefaklor, Cefadroksil, Cefaleksin, Cefalotin, Cefazolin, Cefdinir, Cefepim, Cefiksim, Cefmenoksim, Cefoperazon, Cefoperazon-sulbaktam, Cefotaksim, Cefoksitin, Cefpirom, Cefpodoksim, Cefpodoksim-klavulanska kiselina, Cefpodoksim-sulbaktam, Cefprozil, Cefhinom, Ceftazidim, Ceftibutin, Ceftiofur, Ceftobiprol, Ceftriakson, Cefuroksim, Hloramfenikol, Florfenikol, Ciprofloksacin, Klaritromicin, Klinafloksacin, Klindamicin, Kloksacilin, Kolistin, Kotrimoksazol (Trimtoprim/sulfametoksazol), Dalbavancin, Dalfopristin/Hinopristin, Daptomicin, Dibekacin, Dikloksacilin, Doripenem, Doksiciklin, Enrofloksacin, Ertapenem, Eritromicin, Flukloksacilin,
2
Flukonazol, Flucitozin, Fosfomicin, Fusidinska kiselina, Garenoksacin, Gatifloksacin, Gemifloksacin, Gentamicin, Imipenem, Itrakonazol, Kanamicin, Ketokonazol, Levofloksacin, Linkomicin, Linezolid, Lorakarbef, Mecilnam (amdinocilin), Meropenem, Metronidazol, Meziocilin, Mezlocilin-sulbaktam, Minociklin, Moksifloksacin, Mupirocin, Nalidiksinska kiselina, Neomicin, Netilmicin, Nitrofurantoin, Norfloksacin, Ofloksacin, Oksacilin, Pefloksacin, Penicilin V, Piperacilin, Piperacilin-sulbaktam, Piperacilin-tazobaktam, Rifampicin, Roksitromicin, Sparfloksacin, Spektinomicin, Spiramicin, Streptomicin, Sulbaktam, Sulfametoksazol, Teikoplanin, Telavancin, Telitromicin, Temocilin, Tetraciklin, Tikarcilin, Tikarcillin-klavulanska kiselina, Tigeciklin, Tobramicin, Trimetoprim, Trovafloksacin, Tilozin, Vankomicin, Virginiamicin, i Vorikonazol.
[0233] U određenim izvođenjima, kombinovana terapija obuhvata davanje dva ili više O antigena E. coli opisanih ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugata opisanih ovde (videti Odeljak 5.4) i/ili kompozicija opisanih ovde (videti Odeljak 5.6.2).
5.7.2 Populacije pacijenata
[0234] U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupcima u kojima se primenjuje naivnom subjektu, tj., subjektu koji nema ExPEC infekciju ili nije ranije imao ExPEC infekciju. U jednom izvođenju, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde se primenjuje naivnom subjektu koji je u opasnosti da dobije ExPEC infekciju.
[0235] U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde daje se subjektu kome je dijagnostikovana ExPEC infekcija. U nekim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde se primenjuje subjektu zaraženom ExPEC-om pre nego što se simptomi ispolje ili simptomi postanu teški (npr. pre potrebe za hospitalizacijom pacijenta).
[0236] U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde daje se subjektu kome je dijagnostikovana UPEC infekcija. U nekim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde se primenjuje subjektu koji pati od ponavljajućih infekcija urinarnog trakta. U nekim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde se primenjuje subjektu koji pati od ponavljajućih infekcija urinarnog trakta, ali je zdrav u trenutku lečenja. U nekim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde se primenjuje subjektu koji ima ili postoji rizik od sticanja bakteremije ili sepse.
[0237] U nekim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili ovde opisana kompozicija (videti Odeljak 5.6.2) je životinja. U određenim izvođenjima, životinja je ptica. U određenim izvođenjima, životinja je pas. U određenim izvođenjima, životinja je mačka. U određenim izvođenjima, životinja je konj. U određenim izvođenjima, životinja je krava. U određenim izvođenjima, životinja je sisar, npr. konj, svinja, miš ili primat. U specifičnom izvođenju, subjekt je čovek.
[0238] U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je odrasla osoba. U određenim izvođenjima, subjektu kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je odrasla osoba više od 50 godina. U određenim izvođenjima, subjekat kome će se dati ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je stariji čovek.
[0239] U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti odeljak 5.6.2) je ljudsko dete. U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili ovde opisana kompozicija (videti Odeljak 5.6.2) je ljudsko odojče. U određenim izvođenjima, subjekt kome će se dati ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je prevremeno rođeno dete. U nekim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je ljudsko dete. U određenim izvođenjima, subjekt kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) nije dete mlađe od 6 meseci.
[0240] U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je osoba koja je trudna. U određenim izvođenjima, subjekt kome će se dati ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je žena koja se prevremeno porodila 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 nedelja.
[0241] U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je pojedinac sa povećanim rizikom od ExPEC-a (npr. imunokompromitovani ili imunodeficijentni pojedinac). U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je osoba u koja se nalazi u bliskom kontaktu sa osobom koja ima ili je u povećanom riziku od infekcije ExPEC.
[0242] U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4), ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je zdravstveni radnik (npr. lekar ili medicinska sestra). U određenim izvođenjima, subjekt kome će se dati ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je imunokompromitovan (npr. boluje od HIV infekcije) ili je imunosuprimiran.
[0243] U određenim izvođenjima, subjektu kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) ima dijabetes. U određenim izvođenjima, subjekat kome se daje ovde opisan antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) ima multiplu sklerozu.
[0244] U određenim izvođenjima, subjekt kome se daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) ima stanje koje zahteva da korišćenje katetera. U određenim izvođenjima, subjekat kome se
4
daje ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) ima povredu kičmene moždine.
5.7.3 Doziranje i učestalost primene
[0245] Količina ovde opisanog antigena O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugata opisanog ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6.2) koja će biti efikasna u lečenju i /ili prevencija ExPEC infekcije zavisiće od prirode bolesti i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Primena O-antigena, biokonjugata i/ili kompozicije može se obaviti na različite načine poznate kliničaru, na primer subkutano, parenteralno, intravenozno, intramuskularno, lokalno, oralno, intradermalno, transdermalno, intranazalno, itd. U jednom aspektu, primena je putem intramuskularne injekcije.
[0246] Precizna doza koja će se koristiti u formulaciji će takođe zavisiti od puta davanja i ozbiljnosti infekcije i trebalo bi da bude odlučena prema proceni lekara i okolnostima svakog subjekta. Na primer, efikasne doze takođe mogu da variraju u zavisnosti od načina primene, ciljnog mesta, fiziološkog stanja pacijenta (uključujući starost, telesnu težinu, zdravlje), da li je pacijent čovek ili životinja, drugih lekova koji se primenjuju i da li je lečenje profilaktičko. ili terapeutski. Doze za lečenje su optimalno titrirane da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost.
[0247] U određenim izvođenjima, in vitro test se koristi da pomogne u identifikaciji optimalnih opsega doziranja. Videti odeljak 5.8. Efikasne doze se mogu ekstrapolirati iz krive odgovora na dozu izvedenih iz in vitro test sistema ili na životinjskim modelima.
[0248] U određenim izvođenjima, primeri doza za vakcine zasnovane na glikokonjugatu (npr. kompozicije koje sadrže biokonjugate) kreću se od oko 0,1 µg do 400 µg ugljenih hidrata po dozi. U drugim izvođenjima, primerne doze za vakcine zasnovane na glikokonjugatu (npr. kompozicije koje sadrže biokonjugate) kreću se od oko 0,1 µg do 4000 µg proteina(a) po dozi. U određenim izvođenjima, primer doze za vakcinu koja je zasnovana na glikokonjugatu (npr. kompozicija koja sadrži biokonjugate) sadrži 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 µg ugljenih hidrata po dozi. U određenim izvođenjima, primer doze za vakcinu koja je zasnovana na glikokonjugatu (npr. kompozicija koja sadrži biokonjugate) sadrži 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 µg protein(a) po dozi. U određenim primerima izvođenja, doza za davanje ljudima odgovara 0,5 ml koja sadrži oko 1-10, npr. oko 2-6, npr. oko 4 µg polisaharida za svaki od uključenih glikokonjugata.
[0249] U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat koji je ovde opisan (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku u kome se daje subjektu jednom kao pojedinačna doza. U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde se primenjuje subjektu kao pojedinačna doza praćena drugom dozom 3 do 6 nedelja kasnije. U skladu sa ovim izvođenjima, dopunske inokulacije se mogu davati subjektu u intervalima od 6 do 12 meseci nakon druge inokulacije. U određenim izvođenjima, dopunske inokulacije mogu da koriste drugačiji E. coli O antigen, biokonjugat ili kompoziciju. U nekim izvođenjima, primena istog E. coli O antigena, biokonjugata ili kompozicije može da se ponovi i primene mogu biti u razmaku najmanje 1 dan, 2 dana, 3 dana, 5 dana, 7 dana, 10 dana, 15 dana. dana, 30 dana, 45 dana, 2 meseca, 75 dana, 3 meseca ili najmanje 6 meseci. U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti Odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) se subjektu daje kao pojedinačna doza jednom godišnje.
[0250] U određenim izvođenjima, ovde opisani antigen O E. coli (videti odeljak 5.2), biokonjugat opisan ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicija opisana ovde (videti Odeljak 5.6.2) je za upotrebu u postupku gde daje se subjektu kao 2, 3, 4, 5 ili više doza u razmaku od 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja ili 6 nedelja. U nekim izvođenjima, 2, 3, 4, 5 ili više doza O antigena E. coli opisanog ovde (videti Odeljak 5.2), biokonjugata opisanog ovde (videti Odeljak 5.4) ili kompozicije opisane ovde (videti Odeljak 5.6.2) se daju subjektu u razmaku od 2, 3, 4, 5 ili 6 nedelja u dozama od 0,1 µg do 0,5 mg, 0,1 µg do 0,4 mg, 0,1 µg do 0,3 mg, 0,1 µg do 0,2 mg ili 0,1 µg do 0,1 mg sadržaj ugljenih hidrata. U određenim izvođenjima, antigen O E. coli, biokonjugat ili kompozicija koja se primenjuje je isti svaki put. U određenim izvođenjima, antigen O E. coli, biokonjugat ili kompozicija koja se primenjuje je različita svaki put.
[0251] Za pasivnu imunizaciju antitelom (npr., anti-O25B antitelom), doza može da se kreće od oko 0,0001 do 100 mg antitela po kg telesne težine, ili od 0,01 do 5 antitela po kg telesne težine. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg ili drugim rečima, 70 mg ili 700 mg ili unutar opsega od 70-700 mg, odnosno za pacijenta od 70 kg. Primer režima lečenja podrazumeva davanje jednom u dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom u 3 do 6 meseci u periodu od jedne godine ili više godina, ili u intervalima od nekoliko godina. Intervali mogu biti nepravilni i promenjeni na osnovu nivoa antitela u krvi kod pacijenta.
5.8 Testovi
Test za procenu sposobnosti biokonjugata da izazovu imuni odgovor
[0252] Sposobnost biokonjugata/kompozicija opisanih ovde da generišu imuni odgovor kod subjekta može se proceniti korišćenjem bilo kog pristupa koji je poznat stručnjacima ili je ovde opisan. U nekim izvođenjima, sposobnost biokonjugata da generiše imuni odgovor kod subjekta može se proceniti imunizacijom subjekta (npr. miša) ili skupa subjekata sa biokonjugatom opisanim ovde i imunizacijom dodatnog subjekta (npr. miša) ili skup subjekata sa kontrolom (PBS). Subjekti ili skup subjekata mogu se naknadno izazvati sa ExPEC-om i može se odrediti sposobnost ExPEC-a da izazove bolest (npr. UTI) kod subjekata ili skupa subjekata. Stručnjaci će prepoznati da ako subjekt ili grupa subjekata imunizovanih kontrolom pati(e) od bolesti nakon izazivanja ExPEC-a, ali subjekt ili grupa subjekata imunizovanih biokonjugatom(ima) ili njegovom kompozicijom opisanim ovde manje pate ili ne pate od bolesti, tada je biokonjugat u stanju da generiše imuni odgovor kod subjekta. Sposobnost biokonjugata(a) ili njihovih kompozicija opisanih ovde da indukuju antiserum koji unakrsno reaguje sa O antigenom iz ExPEC-a može se testirati, npr., imunotestom, kao što je ELISA.
In vitro baktericidni testovi
[0253] Sposobnost biokonjugata koji su ovde opisani da generišu imuni odgovor kod subjekta može se proceniti korišćenjem serumskog baktericidnog testa (SBA) ili opsonofagocitotskog testa ubijanja (OPK), koji predstavlja utvrđenu i prihvaćenu metodu koja je korišćena za dobijanje odobrenje vakcina na bazi glikokonjugata. Takvi testovi su dobro poznati u tehnici i, ukratko, obuhvataju korake generisanja i izolovanja antitela protiv mete od interesa (npr. O antigena, npr. O25B, E. coli) davanjem subjektu (npr. miš) jedinjenje koje izaziva takva antitela. Nakon toga, baktericidni kapacitet antitela se može proceniti, na primer, kultivisanjem bakterija u pitanju (npr. E. coli relevantnog serotipa) u prisustvu navedenih antitela i komplementa i - u zavisnosti od testa - neutrofilnih ćelija i ispitivanjem sposobnosti antitela da ubiju i/ili neutrališu bakterije, na primer, korišćenjem standardnih mikrobioloških pristupa.
5.9 KITOVI
[0254] Ovde je obezbeđeno farmaceutsko pakovanje ili kit koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih jednim ili više sastojaka kompozicija opisanih ovde (videti Odeljak 5.6.2), kao što su jedan ili više antigena E. coli (videti Odeljak 5.2) i/ili biokonjugati (videti Odeljak 5.4) koji su ovde dati. Opciono povezano sa takvim kontejnerom(ima) može biti obaveštenje u formi koju je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za primenu na ljudima. Kompleti koji su ovde obuhvaćeni mogu se koristiti u gornjim postupcima lečenja i imunizacije subjekata.
6. PRIMERI
POSTUPCI
Aglutinacija
[0255] Proces u kome se ćelije ili lizirana ćelijska masa mešaju sa antiserumom koji sadrži antitela specifična za polimernu strukturu, npr. O antigen. Vidljivi, nerastvorljivi agregati se formiraju kada antiserum prepozna ćelijske strukture. Ova metoda se klasično koristi za identifikaciju O, K i H serotipe. Videti, DebRoy, et al., (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185
Priprema uzorka LPS za analizu pomoću SDS PAGE
[0256] LPS Gram-negativnih ćelija se sastoji od baze lipida A, modifikovane oligosaharidom jezgra koji obezbeđuje vezu za O antigen. Za analizu LPS kliničkih izolata, ćelije su uzgajane u standardnom medijumu LB na 37°C tokom 24 h, a biomasa koja odgovara 1 ml kulture sa OD600 od 2 je sakupljena i lizirana u 1x Lämmli puferu za uzorke i inkubirana na 95° C 10 minuta. Ekstrakti su dalje tretirani 1 sat na 65°C da bi se uklonio bilo koji proteinski signal korišćenjem 1 g/l proteinaze K. Tretirani ekstrakti su razdvojeni pomoću SDS PAGE i LPS je vizuelizovan srebrnim bojenjem ili Western blot-om korišćenjem odgovarajućeg antiseruma.
LPS priprema za oblaganje ELISA ploča
[0257] LPS je pripremljen korišćenjem postupka koji je opisao Apicella, (2008) Metode Mol Biol 431, 3-13, i dalje prečišćen kako su opisali Perdomo i Montero, (2006) Biotecnologia Aplicada 23:124-129.
2AB OPS HPLC: „LLO otisak prsta“
[0258] Ovaj postupak se koristi za analizu strukture UPP povezanih OPS.
[0259] Da bi se ekstrahovali UPP-povezani glikani, ćelije E. coli su isprane sa 0,9% NaCl i liofilizovane. Osušene ćelije su ekstrahovane organskim rastvaračem (Metanol:Voda (M:V=17:3 do 19:1, v/v), i/ili mešavine hloroform:metanol:voda optimizovanih odnosa (npr. C:M:V = 10: 10:3; v/v/v)). Ekstrakti su osušeni u struji N2, i resuspendovani u C:M:V=3:48:47. Da bi se prečistili ekstrahovani glikolipidi, resuspenzija 3:48:47 je propuštena kroz tC18Sep-PAK kertridž. Kertridž je kondicioniran sa 10 ml metanola, nakon čega je usledila ekvilibracija sa 10 ml 3:48:47 (C:M:V). Nakon punjenja uzorka, kertridž je ispran sa 10 ml 3:48:47 (C:M:V) i eluiran sa 5 ml metanola i 5 ml 10:10:3 (C:M:V). Kombinovani eluci su osušeni pod N2. Uzorci glikolipida su hidrolizovani rastvaranjem osušenih uzoraka u 2 ml n-propanol:2 M trifluorosirćetne kiseline (1:1), zagrevanjem na 50 °C tokom 15 minuta, a zatim isparavanjem do suvog pod N2(Glover, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). Osušeni uzorci su još jednom resuspendovani u 3:48:47 i prošli kroz tC18 uložak, a protok je osušen pod N2. Obeležavanje sa 2-AB i čišćenje glikanom je izvedeno korišćenjem postupka papirnog diska kao što je opisano (Bigge, et al., Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry, et al., Anal Biochem 304(1): 91-9).
[0260] 2-AB obeleženi glikani su razdvojeni HPLC korišćenjem kolone normalne faze GlicoSep-N prema Royle et al. ali modifikovan u sistem sa tri rastvarača (Royle, et al., Anal Biochem 304(1): 70-90). Rastvarač A je bio 10 mM amonijum formijata pH 4,4 u 80% acetonitrilu. Rastvarač B je bio 30 mM amonijum formijat pH 4,4 u 40% acetonitrilu. Rastvarač C je bio 0,5% mravlja kiselina. Temperatura kolone je bila 30 °C i 2-AB obeleženi glikani su detektovani fluorescencijom (ekscitacija λex = 330 nm, emisija λem = 420 nm). Uslovi gradijenta su bili linearni gradijent od 100 % A do 100 % B tokom 160 min pri brzini protoka od 0,4 ml/min, nakon čega je usledilo 2 min od 100 % B do 100 % C, povećavajući brzinu protoka na 1 ml/min. Kolona je ispirana 5 minuta sa 100% C, vraćajući se na 100% A tokom 2 minuta i radila 15 minuta na 100% A pri brzini protoka od 1 ml/min, a zatim vraćajući brzinu protoka na 0,4 ml/min za 5 min. Uzorci su ubrizgani u vodu.
Test deacetilacije:
[0261] Ekvivalent 2-AB obeleženog glikana se osuši na 30°C, resuspenduje u 50 µl vode sa (uzorak) ili bez (lažni uzorak) 200 mM NaOH (pH ≈ 14), i inkubira 25 sati na 37° C. Rastvor se zatim dovede do sobne temperature i neutrališe dodavanjem 200 mM rastvora HCl (pH ≈ 1). Posle sušenja u brzom vakuumu na 30°C, uzorak se ponovo obeležava sa 2AB i analizira pomoću HPLC.
Hidrazinoliza HPLC
[0262] Ista tehnika normalne faze HPLC opisana je gore za odvajanje OPS oslobođenog iz biokonjugata nakon hidrazinolize. Pre hidrazinolize, biokonjugati koji odgovaraju 1 mg proteina su potpuno osušeni u struji N2. Oslobađanje polisaharida je izvedeno korišćenjem Ludger Liberate Hydrazinolysis kita za oslobađanje glikana (Ludger #LL-HIDRAZ-A2) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, 450 µl hidrazina je dodato u osušene uzorke ispod pokrivača od N2i inkubirano 16 sati na 85°C. Hidrazin je uklonjen uparavanjem pod N2na 45°C. Re-N-acetilacija polisaharida je izvedena inkubacijom u 471 µl 4,5% anhidrida sirćetne kiseline u 1 M natrijum bikarbonatu dva sata na ledu. Zatim je dodato 600 µl 5% rastvora TFA i uzorci su hidrolizovani još jedan sat na ledu. Prečišćavanje je izvedeno na EB20 koloni korišćenjem odgovarajućih pufera EB20 A i B.
[0263] Oslobođeni i prečišćeni polisaharidi su obeleženi sa 2-AB i analizirani pomoću NP-HPLC kao što je opisano za LLO uzorke. MS/MS je prikupio i identifikovao vrhunce interesovanja.
MS i MS/MS HPLC pikovi
[0264] Da bi se analizirala sekvenca monosaharida molekula OPS od interesa, izvršena je masena spektroskopska analiza. Osušene, sakupljene frakcije koje odgovaraju specifičnim HPLC pikovima su resuspendovane u 5 ul 10% acetonitrilu (ACN), 0,1% trifluorosirćetne kiseline (TFA) i pomešane 1:1 sa rastvorom matriksa (40 mg/ml DHB u 50% ACN, 0,1% TFA) na ciljnoj ploči. MS i MS/MS podaci su ručno dobijeni u režimu pozitivnih jona na Ultraflek-II MALDI-ToF/ToF masenom spektrometru (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Nemačka). MS/MS su dobijeni metodom LIFT. Za eksternu kalibraciju korišćena je standardna mešavina peptida (Bruker Daltonik GmbH). Spektri su izvezeni korišćenjem računarskog programa Flek Analisis (Bruker Daltonik GmbH) i manuelno analizirani.
Ćelije domaćina
[0265] Biokonjugati su proizvedeni od strane rekombinantnih ćelija E. coli koje eksprimiraju, preko plazmida(a), protein(e) nosača i oligosaharil transferazu iz C. jejuni (PglB), i OPS iz kozmida ili hromozomskih insercionih mutanata.
[0266] Genetički detoksikovan EPA (egzotoksin A iz Pseudomonas aeruginosa koji sadrži mutacije L552V, ΔE553) je korišćen kao protein nosač, i modifikovan je tako da sadrži 2 ili 4 mesta glikozilacije (ovde se pominju kao 2S-EPA, odnosno 2S-EPA) i C-terminalni HIS tag, a eksprimiran je iz pBR322 izvedenog plazmida inducibilnog arabinozom (videti Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61).
[0267] MBP (protein koji vezuje maltozu), nativni periplazmatski, rastvorljivi protein E. coli, eksprimiran je iz pGVXN579. pGVXN579 je modifikovani plazmid pMAL-p2X (New England Biolabs) koji kodira tri konsenzusne sekvence bakterijske N glikozilacije u nizu, a zatim Myc-Tag C-terminalno fuzionisan sa proteinom za vezivanje maltoze ORF koji je kodiran na plazmidu. Ova postavka je omogućila afinitetno prečišćavanje MBP biokonjugata nezavisno od HIS-tag-a. Indukciju ekspresije kontroliše tac promotor i inducira se korišćenjem IPTG.
[0268] PglB protein je eksprimiran iz plazmida pEXT21 (EcoRI/BamHI fragment iz pMAF10 (Feldman et al., 2005, PNAS USA 102(8):3016-3021)) je kloniran u pEXT21 sa C-terminalno spojenim HA-tagom Varijante ekspresionog plazmida su optimizacija kodona (pGVXN939), optimizacija kodona sa brisanjem mesta glikozilacije (pGVXN948) i uklonjena HA-Ttag (pGVXN970) i optimizacija kodona i izbrisan HA tag (pGVXN971).
[0269] Klinički izolati su analizirani na njihovu sposobnost da sintetišu određeni OPS korišćenjem aglutinacije, Western blot-a, bojenja srebrom, LLO otiska prsta, serotipizacije PCR ili sličnih tehnologija koje omogućavaju identifikaciju strukturnih karakteristika OPS, kao i za njihov fenotip otpornosti na antibiotike. Određeni klinički izolati su dalje hromozomski izbrisani za enzim ligaze, WaaL, da bi se povećala dostupnost OPS za glikozilaciju proteina ili OPS analizu.
[0270] Da bi se dalje analizirali klinički izolati, rfb klaster laboratorijskog soja W3110 je zamenjen rfb klasterom kloniranim iz kliničkih izolata, i analizirana je biosinteza OPS. Gen waaL je obrisan da bi se poboljšala efikasnost proizvodnje biokonjugata.
[0271] Razmena klastera i waaL delecija postignuti su homolognom rekombinacijom korišćenjem optimizovanog postupka (videti Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/EP2013/068737) ili objavljenih procedura (Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645). Za razmenu OPS klastera, rfb klaster kliničkog izolata od interesa je kloniran u plazmid pDOC-C protiv selekcije, zajedno sa kasetom otpornosti na antibiotike, za naknadnu integraciju u rfb lokusu E. coli soja W3110 (Kuhlman and Cox, 2010, Nucleic acids research 38, e92; Lee et al, 2009, BMC Microbiol 9, 252); Homologna rekombinacija velikih rfb klastera od interesa je postignuta korišćenjem DNK koja je bočno raspoređena u odnosu na sekvencu kodiranja rfb klastera W3110 dužine od 0.5 do 1.5 kilobaza i in vivo linearizacijom DNK inserta iz rfb koji nosi plazmid. Dobijeni soj je sadržao zamenjeni rfb klaster (sa i bez kasete za otpornost na antibiotike), tj. rfb klaster W3110 je zamenjen za molekul DNK između gena gale i gnd analognim istegnutim delom (eng. stretch) izolovanim iz kliničkog izolata E. coli.
[0272] U određenim eksperimentima, sojevi W3110 koji sadrže kozmid koji kodira rfb klaster datog serotipa E. coli su korišćeni kao sojevi domaćini.
[0273] Za proizvodnju rekombinantno eksprimiranih biokonjugata u sojevima baziranim na W3110, geni koji nose W3110 koji ometaju proizvodnju rekombinantnog OPS su izbrisani. Na primer, za proizvodnu ćeliju domaćina biokonjugata O25B, gtrABS klaster V3110 je izbrisan. Da bi se ovo postiglo, homologna rekombinacija u skladu sa objavljenim postupkom (Bloor AE, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4):2520-5.) korišćenjem homoloških sekvenci koje se nalaze bočno raspoređeni uzvodno od gtrA gena i nizvodno od gtrS gena.
[0274] Da bi se sklopili proizvodni sojevi, soj domaćin je transformisan sa pglB i ekspresionim plazmidom nosača transformacijom. Videti Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793.
Proizvodnja biokonjugata
[0275] Proizvodnja biokonjugata je izvedena uzgajanjem ćelija domaćina i prečišćavanjem biokonjugata proizvedenih u periplazmatskom prostoru. Uzgoj je vršen ili u posudama za mućkanje ili u procesu serijske fermentacije koji se pohranjuje na industrijskoj skali.
[0276] Kultivacije u posudi su izvedene na 37°C, koristeći medijum sastavljen od odgovarajućih antibiotika u terrific bujonu koji je ponekad dopunjen sa 5 mM MgCl2. Medijum je inokulisan sa OD od 0,05 kulturom preko noći iz sveže transformisanih proizvodnih ćelija, uzgajanih do srednje log faze, indukovane sa 0,2% arabinoze i 1mM IPTG, dalje uzgajane i sakupljene posle 20 h rasta.
Napajane šaržne fermentacije
[0277] Alikvot banke proizvodne ćelijske linije je korišćen za inokulaciju bočice za protresanje koja sadrži sojinu LB medijumu sa odgovarajućim antibioticima. Balon za mućkanje je inkubiran na 180 oum, 37°C približno 12 sati. Serijski medijumi bez komplementa su sterilisani direktno unutar bioreaktora (33 min na ≥ 121°C), ohlađeni i dodati su komplementi.4 M KOH ili 25% fosforne kiseline su pričvršćeni za fermentor za regulaciju pH i pH je podešena na pH7. Inokulacija bioreaktora i šaržne kulture iz predkulture je urađena da bi se dobio početni OD600 od 0,005. pH je stabilno održavan dodatkom 4 M KOH ili 25% fosforne kiseline. Napetost rastvorenog kiseonika (DO) se održava. Nadzemni pritisak je održavan na 600 mbar. Formiranje proizvoda je indukovano sa L-arabinozom (0,1%) i/ili IPTG (1 mM). Odmah nakon indukcije, hranjenje je započeto dodavanjem medijuma za ishranu koji sadrži 2,5% arabinoze i IPTG.24±2 sata nakon indukcije, bioreaktor je ohlađen na 25°C, napajanje je zaustavljeno i sakupljanje je izvedeno filtracijom tangencijalnog protoka ili centrifugiranjem.
[0278] Biomasa je lizirana u 0,5% Triton X-100 razbijanjem tokom 4 ciklusa homogenizacije pod visokim pritiskom na 800 bara.
[0279] Biokonjugati su prečišćeni hromatografijom na koloni. Za pripremu biokonjugata korišćene su različite hromatografske tehnike, uglavnom IMAC, hromatografija na bazi Q-smole anjonske izmene (AEC) i hromatografija za isključivanje po veličini (SEC). Videti, npr., Sarasvat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (str.1-18) i WO 2009/104074 za opis takvih postupaka.
Proizvodnja biokonjugata za pretkliničke eksperimente
[0280] Iz predkulture, definisana količina je prebačena u bioreaktor koji sadrži bogat medijum na 35°C 0,2°C. pH i napetost rastvorenog kiseonika su održavani. Brzina mešanja je dostigla 700 oum.
[0281] Kada je gustina ćelija dostigla OD600= 40 6 5, formiranje proizvoda je indukovano sa L-arabinozom (0,1%) i IPTG (1 mM). Napajanje je započeto 24±2 sata nakon indukcije i bioreaktor je ohlađen. Čim je temperatura dostigla 25°C, hranjenje je prekinuto i ćelije su sakupljene.
Homogenizacija visokim pritiskom
[0282] Biomasa koja odgovara 50 L u vreme sakupljanja je odmrznuta 1 dan na 2 do 8°C. Zatim je u posudu dodato 2.5L pufera za lizu i bistrenje. Triton X-100 je dodat do konačne koncentracije od 0,5% i potpuno odmrznute ćelije su poremećene 4 ciklusa homogenizacije pod visokim pritiskom na 800 bara. Ćelije su sakupljene i isprane standardnim tehnikama.
Analiza sastava monosaharida:
[0283] Biokonjugati koji sadrže približno 8 ug polisaharida su hidrolizovani tokom šest sati u 104 µl 3 M TFA na 99°C. TFA je uklonjena isparavanjem i uzorci su jednom isprani sa 500 µl 2-propanola. Dobijeni monosaharidi su suspendovani u 100 µl smeše za obeležavanje koja sadrži 87,1 mg/ml 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP), 50% MeOH i 150 mM NaOH. Obeležavanje je obavljeno tokom 60 minuta na 70°C. Uzorci su neutralizovani dodavanjem 50 µl 300 mM HCl i 20 µl 100 mM Tris/HCl pH 7,0. PMP-obeleženi monosaharidi su prečišćeni ekstrakcijom, jednom sa 1 ml di-butil etra i tri puta sa 1 ml CHCl3.
[0284] PMP derivatizovani monosaharidi su razdvojeni pomoću RP-HPLC (Merck-Hitachi) na C18 Inertsil ODS-3 koloni (GL Sciences) opremljenoj predkoloni. Dvostepeni gradijent od 100% pufera A (13% acetonitrila, 87% H2O (0,045% KH2PO4, 0,05% trietilamina, pH 7,0) do 50% pufera A / 50% pufera B (21% acetonitrila, 79% H2O (0. % KH2PO4, 0,05% trietilamin, pH 7,0) tokom 4 minuta do 100% pufera B tokom 47 minuta je primenjen na 35°C i brzina protoka od 1 ml/min. Injekciona zapremina je 50 µl i elucija je praćena online UV detekcijom na 250 nm. Pojedinačni pikovi su identifikovani hromatogramima komercijalno dostupnih standarda monosaharida D-glukoze (Sigma-Aldrich #G7528), L-ramnoze (Sigma-Aldrich #R3875), N-acetil-D-glukoze. (Sigma-Aldrich #A8625) i N-acetil-L-fukozamin (Omicron Biochemicals #FUC-006).
Primer 1: Epidemiologija
[0285] Da bi se odredila distribucija serotipova E. coli koja izaziva infekciju urinarnog trakta (UTI), sprovedena je epidemiološka studija. Preko 1800 izolata E. coli iz uzoraka ljudskog urina prikupljeno je od subjekata u Švajcarskoj i serotipovi O antigena (OPS) iz svakog uzorka su analizirani korišćenjem klasičnih tehnika aglutinacije. Vidi Sliku 4
[0286] Izolovani uzorci ljudskog urina su analizirani da bi se utvrdio identitet patogena u njima i njihovi obrasci rezistencije na antibiotike. Izolati E. coli su dobijeni iz uzoraka nakon analize. Izolati E. coli su identifikovani klasičnim mikrobiološkim strategijama isključivanja i uključivanja koje uključuju rast na hromu (CPS3) i MacConkey agaru. Izolati E. coli su dalje analizirani pomoću testa aglutinacije da bi se odredio njihov serotip O antigena. Videti DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185. Izolati iz istih O antigenskih serogrupa su dalje analizirani da bi se odredila hemijska struktura O lanca iz svakog izolata. Videti Tabelu 1A. Utvrđeno je da su određeni izolovani sojevi E. coli otporni na antibiotike, uključujući identifikaciju sojeva otpornih na fluorokinolone i sojeva koji proizvode beta-laktamazu proširenog spektra (ESBL).
1
Tabela 1A: Distribucija najčešćih serotipova E. coli povezanih sa UTI iz kolekcije od 1841 uzorka urina prikupljenih u Švajcarskoj 2012. Prikazana je distribucija serotipova uzoraka iz relevantne subpopulacije od 671 subjekta i distribucija iz svih** uzoraka
(nastavak)
[0287] Serotipovi 01, O2, O4, O6, O7, O8, 016, 018, O25, O73 i O75 su izolovani od subjekata nezavisno od lokacije, vremena izolacije, simptoma i ciljne populacije, što ukazuje na to da su dominantni serotipovi uropatogene E. coli (UPEC).. Prema tome, identifikacija najzastupljenijih serotipova O antigena ukazuje da bi vakcine specifične za O-antigen mogle biti ograničene na podskup serotipova, odnosno onih koji su najviše povezani sa bolešću, kako je identifikovano u studiji opisano u ovom primeru.
[0288] Retrospektivna analiza serotipova UTI u 1323 izolata iz poslednje tri decenije u SAD dobijena od Referentnog centra E. coli (ECRC) omogućila je temeljno poređenje sa literaturom i trenutnim podacima iz Švajcarske. Prevalencija prvih 20 serotipova utvrđena je nezavisno od lokacije, vremena izolacije, simptoma ili ciljne populacije i sugeriše preovlađujuće serotipove povezane sa UPEC (videti Tabelu 1B).
Tabela 1B: Prevalencija najčešćih serotipova povezanih sa UTI iz odabrane literature u rasponu od 1987-2011 i iz retrospektivno analiziranih američkih podataka od 2000-2011 (ECRC).
2
(nastavak)
[0289] Izolati opisanih serotipova su izračunati kao procenat od ukupnog broja izolata (Andreu et al., 1997, J Infect Dis 176:464-469; Blanco et al., 1996, Eur J Epidemiol 12:191-198; Fathollahi et al., 2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnson et al., 2005, J Clin Microbiol 43:6064-6072; Molina-Lopez et al., 2011, Journal of infection in developing countries 5:840-849; Sandberg et al., 1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L.2007, The Journal of infection 55:8-18; Terai et al., 1997, Int J Urol 4:289-294.) U određenim slučajevima konkretni podaci nisu bili dostupni; stoga brojevi u procentima mogu dati samo indikaciju o ukupnoj distribuciji serotipa iz različitih izolata UTI u opisanim studijama i treba ih uzeti u obzir sa oprezom. Ostali opisani serotipovi identifikovani, ali manje zastupljeni (O15, O20, O21, O22, O77 i O82) su takođe uključeni.
[0290] Sve informacije iz epidemiološke analize zajedno, 10 preovlađujućih serotipova bi mogle da pokriju procenjenih 60-80% infekcija E. coli, pod pretpostavkom da su obuhvaćene podporcije sojeva koji nisu tipični. Osim toga, podaci pokazuju neočekivani značaj serotipa O25 u epidemiološkoj studiji iz Švajcarske, u poređenju sa literaturnim podacima i nedavnim podacima iz SAD. Videti Tabele 1A i B.
[0291] O antigenski serotipovi E. coli često se sastoje od podtipova, koji su različiti, ali su strukturno i antigenski slični. Da bi se identifikovali nepoznati/neprijavljeni podtipovi među sakupljenim kliničkim izolatima, i da bi se identifikovali najzastupljeniji podtipovi O antigena, detaljnije su analizirane hemijske strukture O antigena iz najzastupljenijih serotipova.
Primer 2: E. coli O25
[0292] Poslednjih godina primećena je povećana pojava O25-pozitivnih sojeva (videti George i Manges (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690) i o tome svedoči studija opisana u Primeru 1, gde je otkriveno da je O25 serotip jedan od četiri najveća serotipa E. coli u smislu prevalencije.
[0293] Struktura jedinice ponavljanja O antigena serotipa E. coli O25 je ranije objavljena (videti Kenne et al., 1983, Carbohydrate Research 122, 249-256; i Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4) i predstavljen je na Sl.2B. rfb klaster povezan sa O25 O antigenom iz E. coli soja E47a je javno dostupan (GenBank GU014554) i predstavljen je na Sl.2A. E. coli E47a se koristi kao referentni soj za O25 serotipizaciju. Dodatne informacije o sekvenci rfb klastera dostupne su iz sekvence genoma soja koji izaziva asimptomatsku bakteriuriju, E. coli 83972. (videti Zdziarskiet al., 2010, PLoS Pathog 6, e1001078). Iako fenotipska ekspresija O25 nije potvrđena, rfb klaster sekvence E. coli E47a i 83972 su 99,49% identične, što jasno sugeriše da kodiraju isti O antigen.
[0294] O antigen iz E. coli sojeva 83972 i E47a je ovde označen kao "O25A", jer je, kao što je opisano u nastavku, novi O antigen E. coli, označen kao "O25B", identifikovan na osnovu analize kliničkih izolata dobijeno u epidemiološkoj studiji opisanoj u Primeru 1, gore.
[0295] Predložene su funkcionalnosti za predviđene genske proizvode sojeva E. coli 83972 i E47a. Vidi Tabelu 2; GenBank GU014554; i Szijarto, et al. (2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136.
Tabela 2. Predviđanja gena O25A O antigena iz rfb klastera kako su objavili Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; videti takođe GenBank GU014554.
[0296] Poređenja strukture i klastera gena impliciraju da su sve funkcije potrebne za sklapanje O25A OPS-a kodirane unutar rfb klastera koji se nalazi između galE i gnd. Funkcije različitih enzima klastera rfb gena (videti Sliku 2A) su sledeće:
4
RmlBDAC kodira enzime potrebne za biosintezu dTDP-L-ramnoze, koja je supstrat za dodavanje L-Rha grane u jedinicu ponavljanja OPS.
FnlABC kodira enzime potrebne za biosintezu UDP-L-FucNAc, koji je donatorski supstrat za dodavanje L-FucNAc ponavljanju O25 OPS.
WekABC i wbuBC su glikoziltransferaze prema analizi homologije.
[0297] Međutim, wbuC izgleda kratko i skraćeno i malo je verovatno da je funkcionalan. Dakle, najverovatnija funkcionalna napomena ukazuje da postoje četiri glikoziltransferaze koje generišu četiri veze za sklapanje ponavljajuće jedinice.
[0298] Wzx i Wzy su potrebni za okretanje BRU u periplazmatski prostor i njihovu polimerizaciju na Und-PP.
[0299] Sve funkcije potrebne za sintezu objavljene strukture ponavljanja O25A kodirane su klasterima E. coli E47a i 83972 rfb. Stoga je zaključeno da je rfb klaster odgovoran za kodiranje O25A OPS.
O25B
[0300] U 2009. godini, klinički izolati E. coli iz španske bolnice su okarakterisani da bi se odredile klonske grupe. Videti Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141. Urađena je karakterizacija a) tipa ESBL, b) serotipa O, c) gena virulencije, d) tipizacije multilokusne sekvence (MLST) i e) tipizacije gel elektroforezom u pulsnom polju (PFGE). Rezultati su pokazali da se oko 20% svih izolata može pripisati istom klonu: serotip i MLST O25:H4 ST131, ESBL tip CTX-M15, filogrupa B2, koji kodiraju specifičan skup gena virulencije. Analiza komponenti rfb klastera reprezentativnih kliničkih izolata pokazala je nepoznatu 3' sekvencu u poređenju sa sekvencom tipizirajućeg soja iz soja E47a, kao i iz kliničkih izolata identifikovanih postupkom PCR tipizacije specifičnom za alel (videti Clermont et al., 2008, J Antimicrob Chemother.61(5):1024-8.; Clermont et al., Diagn. Microbiol Infect Dis.2007, 57(2):129-36.; i Li, et al., 2010, J Microbiol Methods 82, 71-77. U 2013, Phan i saradnici su objavili sekvencu genoma klona O25b:H4 ST131, potvrđujući da je klon K-12 derivat u skladu sa strukturom njegovog waa klastera kako je ranije objavljeno. Videti Phan et al., 2013, PLOS Genetics 9(10):1-18 (e1003834). Zajedno, podaci sugerišu da se novi klon aglutinacije O25 pojavio u E. coli izolovanoj iz bolničkih okruženja, i da je klon imao specifične ESBL, MLST, i PFGE fenotipove i sadržalo su izmenjeni klaster gena O antigena.
PCR tipizacija
[0301] Da bi se utvrdilo da li je O25B serotip prisutan među izolovanim sojevima E. coli identifikovanim u epidemiološkoj studiji opisanoj u Primeru 1, sojevi pozitivni na aglutinaciju O25 su analizirani tipizacijom PCR-a za O25 i O25B. PCR je izveden korišćenjem kolonija uzetih sa petrijeve posude kao izvora matrice DNK i različitih oligonukleotidnih prajmera. O25-specifični prajmeri, zasnovani na amplifikaciji E47a O25 wzy, i opisani u Li, et al. (2010) Korišćene su J Microbiol Methods 82, 71-77. Takođe su korišćeni prajmeri specifični za O25B opisani u Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141, koji su specifični za nedefinisani 3’ deo O25b rfb klastera (LNB220). Prema Phan et al., 2013, ovaj O25B specifični oligonukleotidni par žari u delu od 3’ O25B rfb klastera.
[0302] Od 24 ispitana klinička izolata sa pozitivnim fenotipom O25 aglutinacije, 20 je dodeljeno O25B serotipu PCR tipizacijom, dok su preostala 4 pozitivno identifikovana kao pripadajuća O25A serotipu PCR tipizacijom. Tako je, iznenađujuće, utvrđeno da su sojevi serotipa O25B češći među analiziranim sojevima nego sojevi O25A serotipa.
Sekvenciranje klastera
[0303] Da bi se genetički analizirao O25B klaster rfb, sekvenciran je klaster O25B PCR-pozitivnog soja, označen kao "upec138". Identifikovani geni i njihovi najbliži relevantni homolozi proteina, zajedno sa predloženom nomenklaturom, navedeni su u Tabeli 3 u nastavku. Geni specifični za O25B i odsutni u O25A označeni su zvezdicom.
Tabela 3. Predviđana ena O25B O anti ena iz r b klastera.
(nastavak)
[0304] Sastav klastera rfb pokazuje jasne razlike u odnosu na sastav klastera O25A. Geni u 5’ delu klastera su bliski homolozi jedan drugom (rmlD do wzy; E. coli E47a i 83972). Ovo nije iznenađujuće za rml gene koji su homologni u mnogim sojevima E. coli koji sintetišu L-ramnozu. Homologija genskih proizvoda O25A i B dopire do wekC (O25A) gena, pre nego što se spusti na nivoe ispod 25% identiteta, što ukazuje na nepovezanost proteinskih sekvenci. Vidi Sl. 3B. Dalje, otkriveno je da geni biosinteze UDP-N-acetilfukozamina O25A odsutni u soju upec138 (O25B), kao i dve glikoziltransferaze nizvodno od fnlABC. Vidi Sl.3B. Uzeti zajedno, ovi podaci sugerišu da sojevi O25B nisu u stanju da sintetišu UDP-L-FucNAc, osim što bi geni biosinteze L-FucNAc mogli biti kodirani izvan rfb klastera. Međutim, nije prijavljen nijedan slučaj za fnlABC lokus izvan rfb klastera kada je L-FucNAc prisutan u BRU antigena O. Prema tome, je malo verovatno da je soj 138 u stanju da sintetiše objavljenu O25A osnovnu ponavljajuću jedinicu (BRU).
[0305] Geni identifikovani u O25B rfb klasteru koji nisu prisutni u rfb klasteru serotipa O25A kodiraju dve glikoziltransferaze i O-acetiltransferazu. Ova tri gena dele istu organizaciju i kodirani proteini imaju visoku homologiju sa genima wbbJKL pronađenim i okarakterisanim u K-12 sojevima E. coli genotipa 016 rfb klastera. Vidi Sl.3B. Prema genetičkoj srodnosti između O25B i 016 serotipova, nomenklatura 016 rfb gena, wbbJKL, primenjena je na homologne gene identifikovane u O25B rfb klasteru.
[0306] Struktura 016 BRU je poznata i određene su funkcije gena wbbJKL. Videti Steveneson et al., (1994) J Bacteriol. 176(13):4144-56. VbbJKL su odgovorni za acetilaciju L-Ramnoze, prenos D-Glc ostatka na L-Rha-D-Glc-UndPP i transfer L-Rha na D-GlcNAc-UPP, koji formira wecA iz ECA klastera. Na osnovu homologije sa 016 WbbJKL, i poznatih funkcija 016 WbbJKL, zaključeno je da O25B rfb klaster sintetiše strukturu koja zajedno sadrži delimično 016 i delimično O25A elemente. Smatralo se da je velika verovatnoća da WbbJKLO25Bsintetiše istu strukturu kao WbbJKLO16, tj. α-D-Glc-1,3- α-L-Rha(2Ac)-1,3-α-D-GlcNAc. Ova trisaharidna struktura je identična nerazgranatom 'jezgru' O25A sa jedinim izuzetkom da L-Rha(2Ac) zamenjuje L-FucNAc. Zamena bi prema tome bila konzervativna, pošto su D-FucNAc i L-RhaOAc monosaharidi sa 6-deoksi i 2-acetil funkcijom. Jedina razlika je konformacija, pošto je fukoza povezana sa galaktozom, a ramnoza sa manozom, što rezultira različitom orijentacijom OH grupe na poziciji 3 i metil grupe na poziciji 5. Veze između monosaharida bi bile identične (svaka α-1,3), što ukazuje da bi strukture bile slične po obliku i hemijskim karakteristikama. Analogno tome, proteini kodirani u uzvodnom delu klastera O25A i B rfb (rmIDCAB i wekAB) granaju BRU O25A ili B vezivanjem D-Glc i L-Rha grananja za bilo koji trisaharid 'jezgra' okosnice. To bi značilo da prihvataju ili okosnicu (sa L-FucNAc ILI L-Rha(2Ac)) kao supstrat.
[0307] Prisustvo L-Rha kao drugog monosaharida sa redukcionog kraja O25B BRU objašnjava zašto biosinteza L-FucNAc može biti odsutna u O25B. UDP-L-FucNAc nije potreban, jer je zamenjen genima biosinteze dTDP-L-Rha koji su prisutni na 5’ kraju klastera (rmlDBAC).
[0308] Phan et al., 2013. sproveli su sličnu genetičku analizu na kliničkom izolatu O25B, ali su zaključili drugačije. Takođe su sekvencirali ceo genom da bi potražili klaster gena za biosintezu UDP-FucNAc; međutim, oni navode da mašinerija za UDP-L-FucNAc u soju O25B:H4 ST131 EC958 nedostaje ne samo u O25B rfb klasteru, već u celom soju. Međutim, Phan je zaključio da se UDP-L-FucNAc mora sintetizovati na drugačiji način, pod pretpostavkom da O25B:H4 ST131 EC958 čini istu O antigen strukturu kao E47a, odnosno O25A. Umesto toga, ovde je otkriveno da je najverovatniji scenario da sojevi O25B ne mogu da proizvode L-FucNAc, već umesto toga zamenjuju drugi ostatak BRU sa O-acetilovanim ostatkom L-ramnoze, a geni potrebni za ovu promenu su isključivo kodirani u rfb klasteru.
[0309] Pored toga, prisustvo homologa O-acetil transferaze u O25B klasteru sugeriše O-acetilaciju u O25B BRU, modifikaciju koja odsutna u O25A. Shodno tome, utvrđeno je da strukture O25 antigena serotipova O25A i O25B moraju biti različite.
O25B Strukturna analiza
[0310] Da bi se potvrdila hipoteza o različitoj strukturi antigena O25, analizirani su hemijski sastav i raspored O antigena kliničkih izolata O25 opisanih u Primeru 1. Da bi se detaljnije okarakterisale O25 OPS strukture, korišćeno je nekoliko postupaka.
[0311] Prvo, struktura O antigena je analizirana pomoću SDS PAGE. Lipopolisaharid (LPS) iz kliničkih izolata je analiziran na razlike u elektroforetskoj pokretljivosti korišćenjem različitih metoda bojenja nakon SDS PAGE. Da bi se vizuelizovala količina LPS-a, izvršeno je bojenje srebrom i anti-O25 specifični Western blotovi. Vidi sliku 5, koja prikazuje rezultate analize 10 izolata. Podaci pokazuju da se slični intenziteti signala dobijaju bojenjem srebrom različitih LPS preparata. Nasuprot tome, sondiranje specifičnim antiserumom pokazalo je jači intenzitet signala u 3 od 10 uzoraka (izolati upec436, upec767, upec827). Spekulisalo se da su različiti intenziteti signala nastali zbog razlika u strukturi OPS-a.
[0312] Da bi se detaljno razjasnila struktura O25B, primenjeni su različiti analitički postupci. Klinički izolat upec138 bio je pozitivan na O25B pomoću PCR-a, i pokazuje slabije prepoznavanje od strane O25 aglutinacionog antiseruma nego sojevi O25A. Videti Sliku 5. Pored toga, soj je ESBL, ali osetljiv na FOS, IPM i TZP, i otporan na AM, CKSM, NOR i CIP. Drugi klinički izolat, soj upec436, bio je negativan na O25B pomoću PCR-a, ali pozitivan na opšti O25 (O25A) pomoću PCR-a. Takođe je utvrđeno da je upec436 snažno reaktivan sa antiserumom za aglutinaciju O25 kada je njegov LPS analiziran Western blotingom. Videti Sl. 5. LLO iz oba soja je ekstrahovan, obeležen sa 2AB i analiziran HPLC normalne faze. Vidi Sl. 6; LLO od upec138 i upec436, 9.079 i 9.081). Obrasci eluiranja pokazali su jasne razlike između dva ekstrakta. MS/MS analiza pikova specifičnih za naprezanje detektovala je signale kompatibilne sa očekivanim strukturama BRU.
[0313] Signali u soju upec436 (9.081): Pik u vremenu eluiranja od 62' je analiziran pomoću MS i utvrđeno je da kao glavnu masu sadrži molekul sa m/z=1021 Da, tj. molekul koji odgovara očekivanoj masi kompletan O25A OPS BRU. MS/MS je proizveo obrazac fragmentacije kompatibilan sa monosaharidnom sekvencom O25A (slika 7A; MS/MS od m/z=1021).
[0314] Signali u soju upec138: Glavna masa u piku u vremenu eluiranja od 50’ bila je m/z 1022 Da, tj. jedan Da više od kompletne jedinice ponavljanja O25A. MS/MS analiza (Slika 7B; O25B MS/MS) je pokazala ponašanje fragmentacije skoro identično ponavljanoj jedinici O25A i lokalizovala je razliku od 1 Da u odnosu na 2. monosaharid sa redukcionog kraja (identifikovana fragmentacijom Y jona od m/z =551 u O25A MS/MS, i m/z=552 u soju upec138). Dodatni pik eluiran na 60' pokazao je sličnu fragmentaciju, ali razliku od 42 Da u masi matičnog jona (m/z=980) koji je lokalizovan na istom monosaharidu (m/z=510), tj. drugom sa redukcionog kraja. Tumačenje ovih rezultata je predstavljeno u nastavku.
[0315] OPS ekstrakcija, hidroliza i postupak obeležavanja 2AB uključuje tretman kiselinom da bi se uklonio Und-PP iz OPS. Pokazalo se da uslovi tretmana delimično otklanjaju O-acetilaciju, ali ne i N-acetilaciju. Dakle, verovatno je da vrh na 60' predstavlja deacetilovanu BRU masu koja je nastala hemijskom hidrolizom materijala u vrhu od 50'. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju da postoji O-acetilacija u O25B na istoj poziciji monosaharida kao što postoji N-acetilacija u L-FucNAc-u O25A.
[0316] Da bi se hemijski potvrdilo da je acetilacija na drugom ostatku sa redukcionog kraja O-vezana, izveden je test deacetilacije. Specifični pik za O25B iz 2AB LLO HPLC u vremenu eluiranja od 50’ je sakupljen iz O25B PCR pozitivnog soja i tretiran alkalijom opisanom u odeljku „Postupci“. Ponovna analiza pomoću HPLC-a je dovela do pika u vremenu elucije od 60' kao što je identifikovano u piku O25B sa slike 6, koji sadrži glavnu masu od m/z=979, sa MS/MS fragmentacijom jona koji je u skladu sa O25B BRU koji izgubio svoju O-acetil grupu. N-acetil grupe su stabilne prema alkalnom tretmanu kao što pokazuje preostala N-acetil grupa u redukcionom kraju D-GlcNAc u istom molekulu.
[0317] U zaključku, utvrđeno je da je reprezentativni soj O25B upec138 strukturno i genetički povezan sa O25A i 016 OPS (Sl. 3A i B) iz E. coli. O25B se razlikuje od O25A po tome što ima strukturu ponavljajuće jedinice koja sadrži O-acetil grupu umesto N-acetil grupe na drugom monosaharidu ponovljene jedinice, koja je L-Rha ostatak a ne D-FucNAc. Ove promene su najverovatnije izazvane zamenom mašine za biosintezu UDP-FucNAc i D-FucNAc transferaze sa DNK istezanjem koje kodira dve glikoziltransferaze i O-acetiltransferazu. Ovi geni su povezani sa klasterom gena 016, na osnovu analize homologije i funkcionalnosti. Konačne strukture su različite, ali slične, što objašnjava unakrsnu reaktivnost uočenu sa O25 aglutinacionim antiserumom.
[0318] Kao što je gore diskutovano, zaključeno je i predloženo na osnovu analize njihovih rfb klastera da O25A OPS sadrži L-FucNAc, dok je struktura odsutna u O25B. Da bi se ispitalo da li je FucNAc odsutan u O25B, izvršena je analiza sastava monosaharida EPA biokonjugata proizvedenih u sojevima O25A i O25B (Sl. 9) korišćenjem metode PMP obeležavanja i metode HPLC analize opisane gore. Za proizvodnju biokonjugata, pripremljeni su klinički izolati E. coli sa fenotipovima O25A i O25B i modifikovani za optimalnu proizvodnju biokonjugata. Kao deo modifikacije, waaL geni iz sojeva upec_436 (O25A) i uepc_138 (O25B) su obrisani kao što je prethodno opisano (videti Datsenko i Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645 po postupku za određivanje tipa jezgra (videti Amor, et al., (2000) Infect Immun 68, 1116-1124). Dobijeni sojevi su transformisani ekspresionim plazmidima za 4S-EPA (pGVKSN659) i oligosaharil transferazu, PglB (pGVXN939), za proizvodnju O25A; i sa pGVXN114 i pGVXN539 (koji proizvode 2S-EPA) za proizvodnju proizvodnje biokonjugata O25B. Biokonjugati O25B su proizvedeni u boci za mućkanje od 2L sa naknadnim afinitetnim prečišćavanjem iz periplazmatskih ekstrakata pomoću IMAC. O25A konjugati su proizvedeni serijskom fermentacijom sa napajanjem i prečišćeni postupkom prečišćavanja u dva koraka počev od pročišćenog homogenata celih ćelija dobijenog homogenizacijom pod visokim pritiskom kao što je opisano u odeljku o postupcima iznad. Analiza sastava monosaharida je izvršena kao što je gore opisano.
[0319] Rezultati su potvrdili odsustvo signala za FucNAc u biokonjugatima dobijenim od O25B, dok su biokonjugati koji sadrže O25A pokazali vrhunac u očekivanom vremenu eluiranja koje je određeno izlaganjem mešavine monosaharida istoj proceduri obrade uzorka kao i kontroli. Tako je potvrđeno da je pretpostavljena struktura O25B, kao što se i očekivalo na osnovu analize rfb klastera, bez L-FucNAc.
[0320] Kompletna struktura ponavljajuće jedinice (RU) polisaharida O-antigena (O-PS) iz Escherichia coli O25B O-antigena određena je nuklearnom magnetnom rezonancom biokonjugata nakon delimične enzimske digestije EPA proteina nosača ostatka. Analiza je potvrdila da se O25B O-PS sastoji od pentasaharida RU.<1>H i<13>C signali su dodeljeni 2D NMR korelacionim tehnikama, što je potvrdilo da se struktura O25B O-PS RU razlikuje od objavljene O25A O-PS RU strukture (Kenne, L., et al. 1983. Carbohydr. Res.122:249-256; Fundin, J., et al.2003. Magn. Reson. Chem.41:202-205) zamenom α-3-Rhap ostatka. od 90% ovog ostatka je O-acetilovano na poziciji C2. Kompletan O25B O-PS RU je prikazan ispod (O25B’):
Proizvodnja i karakterizacija biokonjugata
[0321] Da bi se dalje analizirali O25A i O25B polisaharidni antigeni, proizvedeno je više biokonjugatnog materijala. Za O25A, prečišćena serija O25A-EPA odozgo je korišćena za dalje eksperimente karakterizacije. Za proizvodnju O25B-EPA, konstruisan je soj sa genomski integrisanim O25B klasterom: W3110 ΔwaaL ΔgtrABS ΔrfbO16::rfb(upec138), sa plazmidima pGVXN1076 i pGVXN970. Ovaj soj je konstruisan počev od W3110 postupcima Datsenko i Wanner i tehnikom homologne rekombinacije za integraciju usmerenu na mesto velikih insercija u bakterijske hromozome (videti Međunarodnu prijavu za patent br. PCT/EP2013/071328).
[0322] Dobijeni O25B biokonjugati su okarakterisani korišćenjem standardnih testova oslobađanja i karakterizacije. Biokonjugati su prečišćeni korišćenjem dva uzastopna koraka anjonske izmene i hromatografije isključivanja po veličini, dajući preparate biokonjugata O25A i O25B čistoće od 97,2 i 98,1%. SDS PAGE kvantifikacija je korišćena za analizu čistoće. Videti Sl. 10 (O25A) i Sl. 11 (O25B). Odnosi šećera i proteina su izračunati na osnovu kvantifikacije šećera pomoću antron testa (videti Laurentin and Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143-145) i BCA testa za koncentraciju proteina, što je rezultiralo sa 40,2 i 26,6 % za O25A i O25A. O25B biokonjugati. Analitička ekskluziona hromatografija po veličini pokazala je monomerno stanje čestica u skladu sa očekivanim hidrodinamičkim prečnikom EPA sa vezanim glikanskim lancima.
Primene
[0323] Da bi se rešio imunogeni potencijal strukture O25B, izvedeno je nekoliko pretkliničkih eksperimenata korišćenjem biokonjugata O25B i O25A. Kao što je prikazano na slici 5, svi klinički izolati identifikovani kao O25 pozitivni u Primeru 1 (tj., i izolati O25A i O25B) bili su pozitivni sa O25A antiserumima koji se obično koriste za detekciju O25 serotipova (tipovanje seruma iz O25A soja E47a) u Western blot-ovima. Stoga se čini da je anti-O25A antiserum unakrsno reaktivan na LPS iz sojeva O25B. Da bi se detaljno analizirao odgovor antitela i unakrsna reaktivnost, proizvedeni su O25 biokonjugati. Protein koji vezuje maltozu (MBP) je korišćen kao protein nosač, a protein nosač je vezan za O25A ili O25B. Tabela 4 prikazuje sojeve koji se koriste za proizvodnju proteina. Korišćeni sojevi su identifikovani PCR-om za njihov O25A ili B genotip. Ekspresija je izvedena u TB medijumu i proteinskom proizvodu prečišćenom iz periplazmatskih ekstrakata.
Tabela 4:
[0324] Imunizacije korišćenjem dobijenih biokonjugata su izvedene korišćenjem standardnih protokola imunizacije zečeva (eurogentech 28-day Speedy Protocol). 50 µg polisaharida vezanog za MBP, ubrizgano je 0, 7, 8 i 18 dana sa zaštićenim Freundovim slobodnim imunostimulatornim jedinjenjem. Rezultujući konačni antiserumi krvarenja dobijeni 28. dana nakon prve imunizacije testirani su na njihovu specifičnost prema O25A ili O25B LPS. Slika 22 prikazuje poređenje reaktivnosti antiseruma prema odgovarajućem LPS (O25A ili O25B). LPS je pripremljen od upec436 i upec138 digestijom proteinaze K uzoraka celih ćelija u SDS-PAGE Lämmli puferu. Ista količina LPS je napunjena u dva SDS-PAGE gela, nakon čega je usledio elektrotransfer na nitrocelulozne membrane i detekcija korišćenjem O25A i O25B antiseruma. Rezultati pokazuju da O25A antiserum prepoznaje O25A LPS bolje od O25B LPS, dok O25B antiserum prepoznaje O25B LPS bolje od O25A LPS. Ovaj rezultat ukazuje da autologni antigen čini bolji antigen. Dakle, uključivanje O25B antigena u vakcinu će obezbediti bolju zaštitu od preovlađujućih kliničkih sojeva O25B grupe O25 nego antigena O25A.
Primer 3: E. coli O1
[0325] Strukturne baze podataka navode različite podserotipske strukture za E. coli O1. Konkretno, O1A, O1A1, O1B, O1C. O1A i O1A1 su strukturno identični i veruje se da su povezani sa bolešću, iako nije prijavljeno da su O1B i C patogeni (videti Gupta, et al., (1992) J Bacteriol 174, 7963-7970) i predstavljaju manjinu među O1 izolata. Strukture O1A/O1A1, O1B i O1C su prikazane na Sl.12B. Da bi se analizirala distribucija podserotipa O1 u UPEC epidemiološkoj studiji Primera 1, detaljno su analizirane strukture O antigena nekoliko kliničkih izolata iz studije. Prvo, LPS struktura 12 sojeva za koje je utvrđeno da su pozitivni na O1 testom aglutinacije analizirana je pomoću SDS PAGE. Videti sliku 13: O1 bojenje srebrom i Western blot.
[0326] Bojenje srebrom je pokazalo tipične LPS signale u svim trakama koje sadrže ekstrakte iz kliničkih izolata O1. Snažno bojenje pri elektroforetskoj pokretljivosti od oko 10-15 kDa oslikava jezgro lipida A, a merdevinasti signali sa sporijom pokretljivošću predstavljaju jezgro lipida A modifikovano polimerima ugljenih hidrata sastavljenim od različitog broja O antigen ponavljajućih jedinica. Kada se uporede LPS iz različitih izolata, pojavljuju se razlike u distribuciji modalne dužine, elektroforetskoj pokretljivosti pojedinačnih traka i obrascu merdevina. Na osnovu ovih zapažanja, mogu se identifikovati tri grupe: (i) većina izolata (upec002, upec010, upec032, upec140, upec108, upec143, upec276, upec399 i upec425) ispoljila je nerazlučive elektroforetske opsege pojedinačnih traka, koji se samo razlikuju po intenzitetu signala i prosečnoj dužini lanca (distribucija modalne dužine); (ii) činilo se da dva izolata (upec119 i upec256) imaju nešto bržu pokretljivost u svakom LPS opsegu ponavljajuće jedinice, što ukazuje na drugačiju strukturu, npr. drugačija modifikacija lipidnog A jezgra; i (iii) signali dobijeni iz izolata upec1096 su se pojavili kao razmaz, a ne kao lestvica, što ukazuje na drugačiju OPS strukturu. Videti Sl.13A.
[0327] Analiza Western blot-om i detekcija korišćenjem anti O1 antiseruma pokazala je da se LPS iz svih osim upec1096 detektuje specifičnim O1 antitelima, što ukazuje na unakrsno reaktivne LPS molekule. To znači da je 11 izolata O1 i da upec1096 najverovatnije nije izolat O1 (tj. bio je lažno pozitivan testom aglutinacije).
[0328] Da bi se detaljno analizirala strukturna sličnost O1 antigena, 2AB obeležavanje LLO i HPLC tehnika visoke rezolucije normalne faze su korišćeni kao što je gore opisano. Slika 14A prikazuje preklapanje hromatograma dobijenih od 5 od 11 kliničkih izolata. Oblast za otiske prstiju OPS-a pojavljuje se u vremenu zadržavanja od 110 do 150 minuta. Profili pokazuju da svi uzorci imaju signale koji se pojavljuju u istom vremenu zadržavanja, što ukazuje na identične strukture molekula. Uočene razlike su bile distribucija intenziteta, tj. vreme eluiranja srednjeg maksimalnog signala i opšti intenziteti signala. Preostalih 6 ekstrakata je rezultiralo pikovima u istim vremenima eluacije sa razlikama u intenzitetu. Samo uzorak upec1096 bio je drugačiji u odnosu na obrazac pika, potvrđujući strukturnu razliku koja je gore navedena.
[0329] MS/MS analiza sadržaja pojedinačnih pikova pomoću MALDI-TOF/TOF analize je korišćena da se identifikuje sekvenca monosaharida u uzorcima O1 (videti sliku 14B). MS analiza je izvedena iz uzoraka ekstrahovanih ne iz kliničkih izolata, već iz soja W3110 ΔwaaL koji sadrži kozmid sa rfb klasterom upec032. Pikovi koji su eluirani u vremenu eluiranja od 50, 80, 96 i 108 minuta sadržali su glavne mase m/z=1021,4, 1849,6, 2693,9, 3540,4. Fragmentacione serije jona dobijene nakon MS/MS bile su konzistentne sa 1, 2, 3 i 4 ponavljajuće jedinice HexNAc, tri deoksiheksoze i razgranate HexNAc. Ovi podaci se mogu objasniti samo strukturom podserotipa O1A. Opisana serija pikova predstavlja O1 OPS vezan za UPP u kliničkim izolatima, a svaki uzastopni pik se razlikuje od prethodnog za jednu ponavljajuću jedinicu.
[0330] Ovi podaci potvrđuju izjave iz literature da je reprezentativna struktura za O1O serotip E. coli u kliničkim izolatima UTI iz studije opisane u Primeru 1 podtip O1A.
[0331] Da bi se proizveo biokonjugat koji nosi O1A polisaharid, sojevi W3110 E. coli su konstruisani da eksprimiraju O1A OPS. Dobijeni sojevi su W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL, koji sadrže rfb klaster O1 pozitivnog kliničkog izolata (GU299791*, klaster u rasponu od rmlB-wekO). Sojevi domaćini koji eksprimiraju O1A OPS su konstruisani homolognom rekombinacijom. rfb klaster kliničkog izolata O1A je amplifikovan korišćenjem PCR oligonukleotida koji se tope u DNK koja okružuje rfb klaster. Amplifikovana DNK je zatim korišćena da zameni endogeni klaster O antigena dobro karakterisanog laboratorijskog soja W3110 homolognom rekombinacijom opisanom u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/EP2013/071328. Ekspresioni plazmidi za proteine nosače pGVXN659 i za PglB (pGVXN114, 939, 970, 971) su ubačeni transformacijom i potvrđena je ekspresija O1 (videti Sl.15 i Sl.
16).
[0332] U odvojenom eksperimentu, klinički O1 izolat upec032 je konstruisan da proizvodi biokonjugate. Inženjering je zahtevao da se uzme u obzir fenotip kliničkog izolata osetljivog na antibiotike. upec032 ΔwaaL je konstruisan i transformisan sa pGVXN939 i pGVXN579 za proizvodnju biokonjugata korišćenjem MBP kao proteina nosača. Prednost upotrebe MBP i EPA kao proteina
1
nosača je mogućnost podizanja antiseruma sa oba, što rezultira antiserumima koji su unakrsno reaktivni prema polisaharidnoj komponenti, ali ne i prema nosaču. Takvi antiserumi su korisni alati za procenu pretkliničkih eksperimenata, npr. kao sredstva za oblaganje za razvoj ELISA testova specifičnih za polisaharide.
Primer 4: E. coli O6
[0333] E. coli O6 serotip je najčešći ExPEC prijavljen do sada (George, D. B., and Manges, A. R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690). Ne samo studija opisana u Primeru 1, već i podaci uzeti iz literature potvrđuju da je serotip O6 među prva četiri serotipa u mnogim manifestacijama izazvanim ExPEC (videti Sl.4).
[0334] Dve strukture O6 OPS su prijavljene u literaturi (videti Jann et al., Carbohydr. Res.263 (1994) 217-225, and Jansson et al., Carbohydr. Res.131 (1984) 277-283). Strukture prijavljenih O6 antigena su prikazane na Sl.17B. Oni su identični osim monosaharida koji se grana od svakog, koji je ili Glc ili GlcNAc. Međutim, literatura nije identifikovala dominantnu strukturu O6 u kliničkim izolatima uključenim u UTI.
[0335] Da bi se izabrala najreprezentativnija struktura O6 antigena za potrebe vakcine, OPS strukture O6 aglutinacije pozitivnih kliničkih izolata E. coli iz studije Primera 1 su ispitivane korišćenjem istog pristupa kao što je gore opisano za O1 serotipove. Bojenje srebrom i Western blot-om korišćenjem anti O6 antiseruma identifikovali su jedan od 12 kliničkih izolata koji nisu reagovali na anti O6 serum, iako je LPS bio obojen srebrom u svim uzorcima (nije prikazano), što sugeriše lažno pozitivan rezultat aglutinacije. Međutim, verovatno je da Glc ili GlcNAc razlike neće biti otkrivene pomeranjem elektroforetske pokretljivosti na gelovima.
[0336] Za detaljnu analizu strukture korišćen je LLO otisak prsta. Kao referenca za bilo koju od dve prijavljene strukture, u analizu su uključeni ekstrakti iz sojeva sa prijavljenim grananjem Glc (CCUG11309) i GlcNAc (CCUG11311). Poređenje dva HPLC traga pokazuje seriju pikova koji eluiraju na 70,8, 103,3 i 122,2’ za uzorke izvedene iz CCUG11309, i serije od 68,8, 100,3 i 118,3 za uzorke CCUG11311. Vidi Sl.18A. Pikovi su analizirani pomoću MS za glavne mase prisutne u pikovima i MS/MS za sekvencu monosaharida ovih glavnih masa. Potvrđeni podaci za seriju pikova dobijenih iz ekstrakta CCUG11311 m/z=1094,4, 2027,6 i 2962 (MSO154), što odgovara GlcNAc razgranatim 1, 2 i 3 BRU polimerima kako se očekivalo. m/z=1053,4, 1945,7 i 2836,9 sa razgranatim Glc su prethodno identifikovani u ekstraktima soja W3110 koji eksprimira klonirani rfb klaster kliničkog izolata CFT O6, koji ima identična vremena eluacije 2AB otiska prsta kao CCUGMSO1130 (CCUGMSO1138). Kada su hromatogrami dobijeni od 12 kliničkih izolata upoređeni sa referentnim sojevima, 11 signala je sadržalo seriju pikova koja ukazuje na O6 OPS sa razgranatim Glc ostatkom. Pet od ovih 11 hromatograma je prikazano na slici 18B. Jedan uzorak koji nije generisao signale u specifičnim vremenima eluacije za O6 nije bio O6, tj. najverovatnije je bio lažno pozitivan iz testa aglutinacije. Dakle, O6 OPS sa Glc granom (Sl. 17B, vrh) je najreprezentativnija struktura među O6 serotipovima izolovanim iz epidemiologije opisane u Primeru 1.
[0337] Da bi se proizveo biokonjugat koji nosi polisaharid O6Glc, sojevi W3110 E. coli su projektovani da eksprimiraju O6 OPS zamenom W3110 rfb klastera sa rfb klasterom iz soja CCUG11309. Videti Tabelu s7 i 13. Dobijeni sojevi su W3110 ΔrfbO16::rfbCCUG11309 ΔwaaL, koji sadrže rfb klaster O6 pozitivnog soja E. coli sa prijavljenim Glc granom u BRU (vidi gore). O6Glc OPS koji eksprimira soj domaćina konstruisan je homolognom rekombinacijom. rfb klaster je amplifikovan korišćenjem PCR oligonukleotida koji se tope (eng. annealing) u DNK koja je bočno raspoređena u odnosu na rfb klaster. Amplifikovana DNK je zatim korišćena da zameni endogeni klaster O antigena dobro karakterisanog laboratorijskog soja W3110 homolognom rekombinacijom opisanom u Međunarodnoj patentnoj
2
prijavi br. PCT/EP2013/071328. Ekspresioni plazmidi za proteine nosače i za PglB su umetnuti transformacijom, a ekspresija očekivanog OPS-a na EPA je potvrđena Western blot-om.
Primer 5: E. coli O2
[0338] Struktura ponovljene jedinice O2 polisaharida je poznata od 1987. (Jansson, et al., (1987) Carbohydrate research 161, 273-279). To je prikazano na Sl.19B. Dve sekvence klastera gena antigena O2 O dostupne su iz javnih baza podataka (GenBank EU549863 i GU299792). Urađena je komparativna analiza i predložene su aktivnosti glikoziltransferaze (Tabela 5; Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316; and Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77).
Tabela 5. Predviđanja gena klastera O2O antigena iz rfb klastera kako su objavili Li, et al. i Fratamico, et al. je naznačeno u zagradama.
[0339] Poređenje strukture i homologija gena pokazalo je da su prisutne sve funkcije za biosintezu polimera:
rmIBDAC kodira enzime potrebne za biosintezu dTDP-L-ramnoze, koja je supstrat za dodavanje L-Rha u okosnicu pomoću glikoziltransferaza wekPOR;
fdtABC obezbeđuje dTDP-D-Fuc3NAc za razgranate glikoziltransferaze;
wzy i wzx homolozi odgovorni za okretanje Und-PP-vezane ponovljene jedinice iz citoplazme u periplazmu; i
wekPOR, su predviđene glikoziltransferaze i za koje se predviđa da formiraju glikozidne veze O2 BRU (tri L-Rha i jedan L-FucNAc).
[0340] wekS gen koji se nalazi u objavljenim sekvencama klastera O2 rfb je predviđena sulfataza vezana za membranu, i stoga najverovatnije nije uključen u formiranje BRU. To bi značilo da – ako se pretpostavi pravilo jedan enzim jedna veza – da jedan enzim u grupi wekPOR mora biti bifunkcionalan da bi obezbedio četiri glikozidne veze.
[0341] Da pravilo jedan enzim – jedna veza nije apsolutno pokazano je u više primera u kojima je poznato manje glikoziltransferaza nego veza, npr. kod Shigella flexneri Y, S. flexneri 6, C. jejuni i E. coli O1A. U ovim primerima, multifunkcionalne glikoziltransferaze su odgovorne za formiranje više od jedne glikozidne veze, one su „bi-“ ili „multifunkcionalne“. Uvek je to isti monosaharid koji se dodaje više puta. Ponovljeni ramnoza ostaci - kao što se nalaze u serotipu O2 - često su povezani sa takvim multifunkcionalnim enzimima.
[0342] Zbog prisustva skraćenih transpozonskih elemenata koji prate wekS sekvencu, spekuliše se da je wekS lokus ubačen u rfb klaster događajem rekombinacije DNK (videti Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316). Umetanje wekS lokusa posredovano transpozonom bi sugerisalo da je biosinteza O2 OPS postojala bez prisustva wekS ranije, i shodno tome wekS ne bi bio potreban za sintezu O2 OPS polimera. Da bi se potvrdila ova hipoteza, formiranje O2 OPS je rekonstituisano u rekombinantni ekspresioni sistem 'čista' genomska pozadina, koji sadrži O2 rfb klaster kojem nedostaje wekS gen. Da bi se ovo postiglo, klaster antigena O iz soja W3110 zamenjen je rfb klasterom iz O2 pozitivnog soja upec116 kome nedostaje wekS DNK. Zamena hromozoma je urađena homolognom rekombinacijom kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/EP2013/071328. Dobijeni soj je bio ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. OPS je pripremljen i analiziran pomoću 2AB obeležavanja i normalne faze HPLC i detekcije fluorescencije kao što je urađeno za O1A i O6 OPS (vidi gore) i analiziran pomoću HPLC normalne faze (slika 21) i upoređen sa signalima divljeg tipa soja CCUG25. Analiza je rezultirala nizom preklapajućih pikova između 40 i 140 minuta vremena eluiranja.
[0343] MS analiza serije pikova zavisnih od rfbO2 klastera pokazala je glavne mase sa istim razlikama između uzastopnih pikova (tj. jednog O2 RU).
[0344] MS analiza molekula sakupljenih u odgovarajućim pikovima je izvedena da bi se analizirala struktura OPS. Pikovi dobijeni na 43,5, 73,1, 81,4 i 90’ dobijeni od divljeg tipa soja CCUG25 su sakupljeni i analizirani pomoću MS i MS/MS. Pronađene su mase i Y fragment jonske serije kompatibilne sa očekivanim 1, 2 i 3 ponavljajućim jedinicama O2 OPS molekula (m/z=989,4 (Sl. 23), 1817,8, 2646,1, svi Na<+>adukti).
[0345] Da bi se potvrdio O2 OPS iz kliničkih izolata, analizirano je 12 klonova na njihovu OPS strukturu kao što je gore opisano za O1 serotip. Prvo, LPS je pripremljen za analizu bojenjem srebrom i Western blot-om. Rezultati su prikazani na slici 20. Svi uzorci su pokazivali šemu trake nalik na merdevine sa dve očigledno različite srednje dužine lestvice. Anti-O2 antiserum je detektovao sve uzorke LPS, što ukazuje da je aglutinacija ispravno identifikovala sve izolate kao O2 serotipove.
[0346] Za proizvodnju biokonjugata koji nosi O2 polisaharid, korišćen je W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. Ekspresioni plazmidi za proteine nosače i za PglB su umetnuti transformacijom, a ekspresija očekivanog OPS-a na EPA je potvrđena Western blot-om. Vidi Tabele 7 i 13 i gore.
Primer 6: Imunološka analiza različitih O antigena
[0347] Da bi se procenio imunološki potencijal biokonjugata koji sadrže odabrane antigene polisaharide, sprovedena je pretklinička studija. Biokonjugati O1A-EPA, O2-EPA, O6Glc-EPA i O25B-EPA su proizvedeni, prečišćeni i okarakterisani kao što je gore opisano i u odeljku o postupcima.
4
Tabela 6. Pregled pretkliničke studije na pacovima, uključujući brojeve grupa vakcina, veličinu grupa, korišćene vakcine i indikaciju kvaliteta preparata vakcine.
nastavak
[0348] Prečišćeni biokonjugati su korišćeni za imunizaciju 9 nedelja starih ženki Sprague Dawley pacova.100 µl rastvora iste doze ubrizgano je intramuskularno (i.m.) 1., 22. i 43. dana pacovima koji su na kraju iskrvarili i žrtvovani 56. dana.
[0349] Različite grupe pacova su primile različite vakcine: uvek neformulisane, koje sadrže biokonjugate same ili u kombinaciji kao što je navedeno u tabeli 6. ELISA ploče obložene srodnim LPS proizvedenim u waaL pozitivnom soju korišćene su za merenje imunogenosti u obliku ELISA titra seruma pacova u vremenskoj tački terminalnog krvarenja od 56 dana nakon prve injekcije (Slike 25-28). Uzeto zajedno, primećena je statistički značajna imunogenost za sve vakcinisane grupe merene u odnosu na kontrole (neglikozilovani EPA ili TBS pufer). Stoga, odabrani i proizvedeni biokonjugati predstavljaju korisna jedinjenja kandidata za vakcinu.
[0350] Za sve testirane konjugate O-antigen-EPA, uočena je statistički značajna imunogenost za sve vakcinisane grupe merene u odnosu na kontrole (neglikozilovani EPA ili TBS pufer). Stoga, odabrani i proizvedeni biokonjugati predstavljaju korisna jedinjenja kandidata za vakcinu za indukciju antitela specifičnih za O-antigen.
Primer 7: Fizičko-hemijska karakterizacija biokonjugata
[0351] Četiri biokonjugata opisana u gornjim primerima (O-antigen O25B, O1A, O2 i O6, redom konjugovani sa EPA kao proteinom nosačem) pripremljena su kao monovalentne serije (aktivni farmaceutski sastojci, API) ili kombinovani u jednom preparat kao multivalentna vakcina protiv ExPEC-a. Proizvedene su različite serije: pretkliničke serije, serije studija toksičnosti i kliničke serije. Tabela 7 pokazuje sojeve domaćine koji se koriste za proizvodnju konjugata.
Tabela 7: Soevi domaćini za roizvodnu retkliničkih toksikoloških studia i kliničkih seria
[0352] Četiri monovalentne pre-GMP serije i neglikozilovani EPA referentni standard su stoga analizirani hromatografijom sa isključenjem po veličini sa višeuglovim rasejanjem svetlosti (SEC-MALS), kako bi se kvantifikovao stepen mono- i di- glikozilacija pojedinačnih biokonjugata, i da se odredi molekulska masa (MW) proteinskog nosača i O-PS vezanog za njega. Uzorci su razdvojeni na TSKgel-G3000 SWxl koloni u fosfatnom puferu (pH 7,0; 50 mM NaCl, 150 mM natrijum fosfata) i praćeni UV (214 i 280 nm), indeksom prelamanja (RI) i višeugaonim rasejanjem svetlosti (MALS rasejanje).
[0353] Za neglikozilovani EPA protein nosač, određena je MW od 63-67 kDa (teoretska MW od 70,5 kDa, na osnovu aminokiselinske sekvence). U biokonjugatima je detektovana samo EPA na 280 nm, što je omogućilo da se njena MW ekstrahuje iz ukupne MW merene pomoću RI i MALS: u biokonjugatima, izmerena MW EPA dela je bila 65-71 kDa.
[0354] Analiza standarda proizvoda pre-GMP API prikazana je u Tabeli 8, što ukazuje na prisustvo mono- i di-glikozilovanih konjugata, sa MW u opsegu 75-79 kDa i 87-91 kDa, redom. Delovi O-PS su imali MW od 16-24 kDa za di-glikozilovane vrste, odnosno 8-14 kDa za mono-glikozilovane vrste. Uzimajući u obzir MW RU svakog serotipa, određen je prosečan broj od 10-16 RU po polisaharidnom lancu, u dobroj saglasnosti sa podacima hidrazinolize i MS.
Tabela 8: SEC-MALS analiza monovalentnih re-GMP API standarda roizvoda
[0355] Analiza kružnog dihroizma (CD) serije biokonjugata O25B formulisane u Tris puferovanom fiziološkom rastvoru (TBS), pokazala je da formulacije na pH 6,8 do 7,4 imaju spektre slične spektru neglikozilovanog EPA proteina nosača, sa mešavinom alfa spiralne i beta strukture, kako se očekuje na osnovu objavljene kristalne strukture EPA. Stoga, na osnovu ovih CD analiza, izgleda da glikozilacija sa O25B O-PS lancima nije uticala na sekundarnu strukturu EPA proteina nosača.
[0356] Analiza diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) serijske formulacije O25B biokonjugata u TBS na pH 6,8 do 7,4 i u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) pri pH 7,1 do 7,8, pokazala je krive topljenja uporedive sa krivom topljenja ne-gPA. sa tačkom topljenja od približno 52°C. Ovaj rezultat je pokazao da se biofizička karakteristika proteina nosača EPA nije promenila nakon modifikacije sa O25B O-PS lancima.
Primer 8: Stabilnost monovalentnih serija i četvorovalentnih vakcinskih preparata
[0357] Pre proizvodnje velikih razmera, doslednost proizvodnog procesa je procenjena na maloj skali. Konzistentne serije su procenjene u opsežnim studijama stabilnosti koje su uključivale ubrzane i stresne uslove skladištenja da bi se identifikovali putevi degradacije. Stabilnost četiri monovalentne komponente vakcine (API) je testirana tokom perioda od 3 meseca.
[0358] Analiza podataka o stabilnosti pretkliničkih API-ja pokazala je stabilnost tokom najmanje 3 meseca kada se čuvaju na -75 ±15°C (normalni uslovi skladištenja). Statističkom linearnom regresionom analizom nisu uočeni statistički značajni trendovi u predviđenim uslovima skladištenja. Takođe pri ubrzanom (+5 ±3°C) i uslovima skladištenja pod stresom (+25 ±5°C) proizvod je bio stabilan tokom najmanje 3 meseca, o čemu svedoči niska varijabilnost parametara koji pokazuju stabilnost. Podaci za predklinički API O1A prikazani su u Tabeli 9. Tri druga serotipa (O2, O6, O25B) su pokazala slične podatke o stabilnosti.
Tabela 9: Podaci o stabilnosti O1A retkliničke serie API
[0359] Stabilnost kompozicije tetravalentne vakcine (biokonjugati O25B, O1A, O2 i O6) je testirana tokom perioda od 3 meseca. Studije su uključivale ubrzane i stresne uslove skladištenja da bi se identifikovali putevi degradacije. Dobijeni podaci se smatraju relevantnim za početno opravdanje GMP IMP (istraživačkog medicinskog proizvoda, tetravalentnog ExPEC sastava vakcine) roka trajanja.
[0360] Analiza podataka o stabilnosti pretkliničke serije tetravalentne ExPEC vakcine pokazala je stabilnost tokom najmanje 3 meseca kada se čuva na 5 ±3°C (normalni uslovi skladištenja), kao što je prikazano u Tabeli 10. Nisu primećeni statistički značajni trendovi na predviđeni uslovi skladištenja statističkom linearnom regresionom analizom. Takođe u uslovima ubrzanog skladištenja (+25 ±5°C) proizvod je bio stabilan, o čemu svedoči niska varijabilnost parametara koji pokazuju stabilnost.
Tabela 10: Podaci o stabilnosti retkliničke serie tetravalentne vakcine
[0361] Zajedno, ove studije pokazuju da su API-ji i tetravalentni sastav ExPEC vakcine bili stabilni najmanje tri meseca, i da su stoga pogodne kompozicije vakcine u pogledu stabilnosti.
Primer 9: Studija toksičnosti na preparatu tetravalentne vakcine
[0362] Procenjena je toksičnost i lokalna tolerancija preparata tetravalentne vakcine (O25B, O1A, O2 i O6 biokonjugati) posle dve intramuskularne primene (za lečenje je korišćen quadriceps femoris) kod Sprague Dawley pacova 1. i 14. dana. Reverzibilnost, postojanost ili odloženo pojavljivanje bilo kakvih promena je procenjeno nakon perioda oporavka od 14 dana 28. dana. Nekropsija životinja u glavnim grupama (10 mužjaka i 10 ženki i za vakcinisanu i za kontrolnu grupu) obavljena je 17. dana. i za grupe za oporavak (5 muškaraca i 5 žena i za vakcinisanu i za kontrolnu grupu) 28. dana (nakon 14-dnevnog perioda oporavka). Ovo nije bilo povezano ni sa kakvim efektima koji se smatraju štetnim koji bi se mogli pripisati lečenju. Primenjena doza, tj. puna humana doza ekvivalentna od 4 µg po O-antigenu (16 µg ukupnog O-antigena za tetravalentnu vakcinu), kao što je primenjena 1. i 14. dana, smatrala se kao neželjeni efekat nivo koji nije primećen (NOAEL) za tetravalentnu ExPEC vakcinu pod uslovima ove studije. Pored toga, imunogenost tetravalentne ExPEC vakcine je potvrđena i 17. i 28. dana, nakon procene uzoraka seruma. Veći titri anti-O1A, anti-O2, anti-O6 i anti-O25B IgG antitela indukovani su u vakcinisanoj grupi, u poređenju sa kontrolama koje su primale samo pufer za formulaciju (25 mM Tris, 130 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4).
[0363] Ovi podaci potvrđuju da tetravalentna ExPEC vakcina ima odgovarajući profil toksičnosti za primenu kao vakcina i indukuje antitela na najmanje sva četiri serotipa E. coli iz O-antigena prisutnih u vakcini (tj. O25B, O1A, O2 i O6).
Primer 10: Epidemiologija O-serotipova povezanih sa bakteremijom
[0364] Da bi se odredila distribucija O-serotipa među ekstraintestinalnom E. coli koji izazivaju bakteriemiju kod starijih osoba, sprovedena je epidemiološka studija na panelu izolata krvi E. coli prikupljenih od pacijenata starijih od 60 godina. Ukupno je prikupljeno 860 izolata krvi iz perioda 2011-2013 od subjekata u SAD, Velikoj Britaniji, Nemačkoj, Španiji i Holandiji i analizirano klasičnom O-aglutinacijom. Kao što je prikazano u tabeli 11, distribucija O-serotipa izolata bakteremije ličila je na raspodelu O-serotipa pronađenu kod pacijenata koji pate od infekcije urinarnog trakta (UTI, videti Tabelu 1A). Serotip O25 je bio najzastupljeniji u ispitivanoj populaciji bakteremije; subtipizacija pedeset sedam izolata PCR-om je pokazala da je pedeset šest (98%) O25 serotipova bilo tipično kao O25B. U obe ciljne populacije (UTI i bakteremija), serotipovi O1, O2, O6 i O25 identifikovani su kao četiri najčešća serotipa. Sve u svemu, ovi podaci potvrđuju da je distribucija serotipova između infekcija urinarnog trakta i izolata bakteremije veoma slična i nezavisna od geografske lokacije, vremena izolacije i indikacije.
Tabela 11: Distribucija najčešćih O-serotipova E. coli povezanih sa bakteremijom iz kolekcije od 860 izolata krvi prikupljenih u SAD i EU u periodu 2011-2013. Navedena je relativna distribucija O-serotipa uzoraka.
Primer 11: Indukcija funkcionalnih odgovora antitela
[0365] Funkcionalnost antitela nastalih posle vakcinacije sa monovalentnim i tetravalentnim formulacijama vakcine opisanim gore je ispitana in vitro testom opsonofagocitnog ubijanja (OPK). Ovaj tip testa je prihvaćen kao korelat zaštite za konjugovanu vakcinu protiv Streptococcus pneumoniae (Prevenar®). OPK test meri sposobnost seruma da olakša opsonofagocitozu i ubijanje različitih serotipova E. coli. U pločama sa 96 bunarića, definisana razblaženja uzoraka seruma su inkubirana, u svakom bunariću, sa: bakterijama iz jednog od četiri serotipa E. coli specifična za vakcinu, definisanom količinom HL60 ćelija i komplementom beba zeca. Posle inkubacije, deo smeše je uočen na triptični soja agar (TSA) i izbrojan je broj kolonija bakterija. Sposobnost antitela da vežu bakterijske ćelije i aktiviraju taloženje komplementa i posreduju u preuzimanju i ubijanju bakterija od strane HL60 ćelija izražena je kao opsonični titar. Opsonični titar ili indeks opsonizacije (OI) odgovara razblaženju seruma koji ubija 50% bakterijskih ćelija. Dati su opsonični indeksi za pre i postimune serume. Povećanje OI od pre do postimunog > od 4 puta se smatra značajnim. Ustanovljeni su OPK testovi za tri serotipa O2, O6Glc i O25B.
Funkcionalnost odgovora antitela izazvanih monovalentnim vakcinama
[0366] Da bi se procenila funkcionalna aktivnost vakcinom izazvanih odgovora antitela biokonjugata O25B, O1A, O2 i O6Glc, serumi vakcinisanih pacova su analizirani korišćenjem testova opsonofagocitnog ubijanja (OPK), koji mere in vitro komplement i fagocitozu zavisnu od antitela i ubijanje bakterija, npr. E. coli. E. coli je prethodno opsonizovana sa razblaženjima seruma vakcinisanih pacova, inkubirana sa komplementom i fagocitima (diferencirane HL60 ćelije) i određene su jedinice koje formiraju kolonije (CFU). Nakon toga, izračunati su maksimalni % ubijanja i indeksi opsonizacije (OI: ubijanje razblaženja seruma od 50% E. coli). E. coli odabrani za OPK testiranje su OC 24453 (serotip O2), OC 24781 (serotip O6Glc) i OC 24176 (serotip O25B). Kao što je prikazano na Slici 29, primećen je snažan funkcionalni imuni odgovor na O2-EPA (SL.29A), O6Glc-EPA (SL.29B) i O25B-EPA (SL.29C).
[0367] Podaci pokazuju da ovde opisane komponente vakcine indukuju odgovore antitela protiv serotipova E. coli iz kojih su O-antigeni uključeni u vakcinu, i da su takvi odgovori antitela funkcionalni u ubijanju E. coli iz ovih serotipova.
Funkcionalnost odgovora antitela izazvanih tetravalentnom vakcinom
[0368] Tabela 12 prikazuje ukupne titre OI za O-antigene O2, O6Glc i O25B od životinja imunizovanih tetravalentnom vakcinom sa 0,4 ili 4 mg po O-antigenu. Titri su određeni u dva odvojena eksperimenta. Doza od 0,4 µg je izazvala značajne OI kod svih životinja za serotipove O2 i O6Glc. Za O25B, 3/8 životinja pokazalo je značajno povećanje OI nakon imunizacije sa dozom od 0,4 mg. U poređenju sa dozom od 0,4 mg, doza od 4 mg je izazvala niže povećanje OI za O2 kod svih životinja.
3/8 životinja je pokazalo povećanje OI kada su serumi iz grupe sa dozom od 4 mg testirani na O25B E. coli. Podaci potvrđuju da je tetravalentna vakcina u stanju da izazove opsonizujuća antitela specifična za O-antigen protiv O2, O6Glc i O25B.
[0369] Podaci pokazuju da komponente vakcine koje su ovde opisane indukuju odgovore antitela protiv serotipova E. coli iz kojih su O-antigeni uključeni u vakcinu, i da takvi odgovori antitela deluju na ubijanje E. coli iz ovih serotipova.
.jetin vo žie sv za ni za
prka suta en i er
eksp a en ojv od
dva iz e cij na civak 3 e sli po je aci in kc -va pre eru se e čn na di
poje zaIs .
25 i 6
2,li .co
naIs
12: ela ab T
[0370] Izračunati su maksimalni % ubijanja i indeksi opsonizacije (OI: ubijanje razblaženja seruma od 50% E. coli). E. coli odabrani za OPK testiranje su OC 24453 (serotip O2), OC 24781 (serotip O6Glc) i OC 24176 (serotip O25B). Uočen je snažan funkcionalni imuni odgovor na O2-EPA, O6Glc-EPA i O25B-EPA.
Primer 12: Procena kandidatske vakcine protiv uropatogene Escherichia Coli kod žena sa kliničkom istorijom rekurentne infekcije urinarnog trakta (RUTI)
[0371] Biokonjugatna vakcina E. coli se koristi u kliničkoj studiji faze I. Vakcina sadrži četiri biokonjugata u fiziološkom puferskom rastvoru. Četiri biokonjugata su: (i) E. coli O1A konjugovan sa EPA nosačem proteina, (ii) E. coli O2 konjugovan sa EPA nosačem proteina, (iii) E. coli O6Glc konjugovan sa EPA nosačem proteina, i (iv) E. coli O25B konjugovan sa EPA nosačem proteina.
[0372] Ispitivana populacija uključuje 194 zdrave žene, starosti ≥ 18 do 70 godina, sa istorijom rekurentne infekcije urinarnog trakta (RUTI), definisanom kao ≥ 3 nezavisne epizode u prethodnih 12 meseci ili ≥ 2 epizode u poslednjih 6 meseci. Najmanje jedna od epizoda infekcije urinarnog trakta (UTI) bila je uzrokovana E. coli (kao pojedinačni patogen ili deo polimikrobne infekcije), a uzrok je potvrđen i dokumentovan u kulturi. Za potrebe studije, UTI se definiše prisustvom najmanje jednog specifično određenog simptoma UTI (disurija, hitnost, učestalost, bol u boku, osetljivost bešike, suprapubični bol, groznica, mučnina, povraćanje) zajedno sa brojem bakterija (CFU) od ≥10<3>CFU/ml uropatogena u srednjem protoku urina.
[0373] Studija uključuje dve grupe: (i) kandidat vakcinu i (ii) placebo. Studija je stepenovana, randomizovana, jednostruko slepa, placebom kontrolisana multicentrična studija na zdravim ženama sa istorijom RUTI.
[0374] Procenjeni period upisa za studiju je 4 meseca, sa periodom praćenja od devet meseci za svaki subjekt.
[0375] Cilj studije je da proceni bezbednost, imunogenost i efikasnost biokonjugata vakcine E. coli.
Dizajn studija
[0376] Subjekti se prate 9 meseci nakon injekcije, a samo injektirani subjekti se prate tokom perioda studije. Subjekti prisustvuju ukupno 5 zakazanih poseta: skrining (prva poseta), dan 1 (druga poseta), dan 7, dan 30 i dan 270. Subjekti dobijaju 4 naknadna telefonska poziva, 2. dana, 90. dana, 150. dana i dan 210.
[0377] Sve neplanirane posete zbog pojave UTI uključuju standardnu negu sa usklađenim opcijama lečenja. Urin i krv (ako je moguće) prikupljaju se za dijagnostičke i svrhe serotipizacije. Neželjeni neželjeni događaji (AE) i ozbiljni neželjeni događaji (SAE) se beleže tokom trajanja studije, dok se traženi neželjeni događaji beleže 7 dana nakon injekcije.
[0378] Prilikom svake posete subjektu se daje nova kartica dnevnika i razgovara se o prethodnoj. Doziranje i administracija
[0379] Prilikom prve posete, kvalifikovani subjekti koji su dali informisani pristanak su pregledani i usklađenost sa kriterijumima za uključivanje/isključivanje se potvrđuje. Vadi se krv i sakuplja se urin.
2
[0380] Prilikom posete 2 (dan 1), svaki subjekt će dobiti jednu intramuskularnu injekciju od 0,5 ml rastvora (kandidata za vakcinu ili placebo) u deltoidni mišić. Smanjena doza kandidatske vakcine će sadržati 1 µg svakog polisaharida (ukupno 4 µg polisaharida). Ciljna doza vakcine kandidata će sadržati 4 µg svakog polisaharida (ukupno 16 µg polisaharida).
Ciljevi
[0381] Primarni cilj je da se proceni pojava, intenzitet, odnos i trajanje traženih i neželjenih neželjenih događaja (AE) i ozbiljnih neželjenih događaja (SAE) nakon injekcije kandidatske vakcine u poređenju sa placebo grupom tokom perioda studije.
[0382] Sekundarni ciljevi su (i) da se uporede promene u hematološkim i biohemijskim bezbednosnim krajnjim tačkama pre injekcije (na početnom skriningu i dan 1) i posle injekcije (7 i 30 dana) kandidata vakcine u poređenju sa placebom grupom; (ii) proceniti imuni odgovor vakcine kandidata između početne vrednosti (1. dan) i posle injekcije (30. i 270. dan); (iii) uporediti broj epizoda simptomatske infekcije urinarnog trakta (UTI) uzrokovanih serotipovima vakcine E. coli između dve ruke, ubrizgane sa kandidatom vakcinom ili placebom tokom celog perioda studije kao najrelevantnije krajnje tačke efikasnosti; (iv) proceniti stopu pojavljivanja E. coli UTI specifične za serotip vakcine u grupi koja je primala vakcinu u poređenju sa placebo grupom tokom trajanja studije; i (v) proceni intenzitet i trajanje kliničkih simptoma E. coli specifične E. coli UTI u grupi koja je primala vakcinu u poređenju sa placebo grupom tokom trajanja studije.
[0383] Ciljevi istraživanja su (i) da se uporedi stopa pojavljivanja UTI uzrokovanih bilo kojim serotipom E. coli u grupi koja je primala vakcinu u poređenju sa placebo grupom tokom perioda studije; i (ii) da uporedi stopu pojavljivanja UTI uzrokovanih bilo kojim patogenom u grupi koja je primala vakcinu u poređenju sa placebo grupom tokom perioda studije.
Kriterijumi za uključivanje
[0384] Kriterijumi za uključivanje u studiju su sledeći: (i) žene sa istorijom rekurentnih UTI, što je definisano kao: ≥ 3 nezavisne epizode UTI u prethodnih 12 meseci ili ≥ 2 epizode UTI u poslednjih 6 meseci; najmanje jedan UTI u poslednjih 5 godina bio je izazvan E. coli (kao pojedinačni patogen ili deo polimikrobne infekcije) i bio je kultivisan i dokumentovan; (ii) Starost ≥ 18 i ≤ 70 godina; (iii) subjekti u zdravom stanju bez tekućih ili sumnjivih simptoma UTI tokom posete za skrining i na dan injekcije (poseta 2); (iv) opšte dobro zdravstveno stanje, bez klinički značajne istorije bolesti, nalaza fizičkog pregleda ili abnormalnosti kliničke laboratorije prema kliničkoj proceni istraživača; i (v) spremnost da učestvuje u studiji nakon što su svi aspekti protokola objašnjeni i potpuno shvaćeni, i dobijen pisani obrazac informisanog pristanka.
Kriterijumi za isključenje
[0385] Kriterijumi za isključenje za studiju su sledeći: (i) istorija više od 10 rekurentnih UTI u godini pre posete za skrining; (ii) korišćenje bilo kog kratkotrajnog urinarnog katetera u roku od 7 dana pre skrininga; (iii) korišćenje bilo kog trajnog katetera u roku od 30 dana pre skrininga; (iv) istorija bilo koje nerešene bolesti/abnormalnosti urinarnog trakta; (v) dokaz o oslabljenoj imunološkoj funkciji; (vi) značajne kardiovaskularne bolesti, bolesti jetre, bubrega i/ili insuficijencija; (vii) nekontrolisani dijabetes melitus; (viii) značajne abnormalnosti u rezultatima skrininga za hematologiju, hemiju seruma ili analizu urina; (ix) pozitivan test na HIV, i/ili dokaz o HBV ili HCV; (x) BMI >34; (xi) prethodna imunostimulativna terapija za prevenciju UTI (kao što su Urovaxom®, Strovac® ili Urovac®) u poslednja 3 meseca, ili planirana upotreba tokom perioda studije; (xii) trenutnu upotrebu bilo kog leka za koji se zna da utiče na imunološku funkciju (npr. kortikosteroidi ≥0,5 mg/kg TM/dan-u); (xiii) korišćenje vaginalnog estrogenskog tretmana povezanog sa UTI koji je novo započet manje od 6 meseci pre injekcije i koji se nastavlja tokom studije ili planiranog početka tokom perioda aktivnog ispitivanja; (xiv) upotreba bilo koje antibiotske terapije u roku od 1 nedelje pre injekcije; (xv) planirana upotreba postkoitalnih antibiotika za prevenciju UTI tokom perioda studije; (xvi) svaku vakcinaciju planiranu u roku od 30 dana pre i 30 dana nakon injekcije; (xvii) učešće u drugim kliničkim ispitivanjima tokom 60 dana pre upisa i tokom trajanja studije; (xviii) prethodni tretman imunoglobulinima ili krvnim proizvodima u 3 meseca pre injekcije; (xix) poznata preosetljivost na bilo koju komponentu vakcine; (xx) prisustvo značajnog medicinskog ili psihijatrijskog stanja koje po mišljenju istraživača onemogućava učešće u studiji; (xxi) akutna bolest u vreme ubrizgavanja; (xxii) žene u reproduktivnom periodu koje imaju pozitivan test na trudnoću ili odbijaju da koriste efikasnu kontracepciju; (xxiii) žene koje doje u bilo koje vreme tokom perioda istraživanja; (xxiv) subjekti sa elektivnom hirurškom intervencijom, planiranom tokom perioda studija; i (xxv) bilo koji drugi značajan nalaz koji bi po mišljenju istraživača povećao rizik od štetnog ishoda učešća u studiji.
Statističke metode i analiza
[0386] Opisna statistika (n, srednja vrednost, standardna devijacija, medijana i opsezi za kontinualne varijable, učestalosti i procenti za kategoričke varijable) se obezbeđuju prema grupi tretmana i/ili poseti, gde je primenljivo. Svi podaci su navedeni prema subjektu, grupi tretmana i, gde je primenljivo, poseti. Svi subjekti iz Grupe B koji primaju placebo se kombinuju da bi se formirala grupa za placebo tretman.
Primer 13: Rezultati kliničke studije I faze
[0387] Ovaj primer predstavlja određene rezultate privremene analize kliničke studije faze I opisane u Primeru 12.
12.1: Bezbednost
[0388] Pojava neželjenih događaja i ozbiljnih neželjenih događaja bila je uporediva između placebo i vakcinisanih grupa. Prijavljeno je deset teških neželjenih događaja, a nijedan nije bio povezan sa ispitivanim lekom.
12.2: Imunogenost
[0389] Da bi se procenila imunogenost komponenti vakcine, serumi žena koje su učestvovale u kliničkoj studiji su dobijeni i analizirani ELISA testom da bi se kvantifikovao IgG protiv četiri različita O-antigena uključena u tetravalentnu vakcinu (E. coli O1, E. coli O2, E. coli O6 i E. coli O25B).
[0390] Serumi vakcinisanih žena su inkubirani u pločama obloženim O1A, O2, O6Glc i O25B-LPS i EPA. Nakon toga, ploče su inkubirane sa sekundarnim antitelom obeleženim HRP (anti-humani IgG). Vezana antitela su otkrivena sa TMB supstratom i merena je apsorbancija. Vrednosti EC50 su izračunate 4PL uklapanjem.
[0391] Kao što je prikazano na Slici 30, kod većine vakcinisanih žena javio se snažan imuni odgovor na O1A-EPA, O2-FPA, O6Glc-EPA i O25B-EPA.
[0392] Ovi podaci pokazuju imunogenost svake komponente tetravalentne vakcine.
12.3: Funkcionalni odgovor antitela
4
[0393] OPK testovi, koji mere in vitro fagocitozu zavisnu od komplementa i antitela i ubijanje bakterija E. coli, korišćeni su za procenu funkcionalnog odgovora antitela žena koje su učestvovale u kliničkoj studiji.
[0394] Serumi su prikupljeni od učesnika studije. E. coli je prethodno opsonizovana sa razblaženjima seruma vakcinisanih žena, inkubirana sa komplementom i fagocitima (diferencirane HL60 ćelije), a određene su preostale jedinice koje formiraju kolonije (CFU). Nakon toga, izračunati su maksimalni procenat ubijanja i indeksi opsonizacije (OI: ubijanje razblaženja seruma od 50% E. coli). E. coli odabrane za OPK testiranje su OC 24452 (serotip O1A), OC 24453 (serotip O2), OC 24454 (serotip O6Glc) i OC 24176 (serotip O25B).
[0395] Kao što je prikazano na Slici 31, primećen je snažan funkcionalni imuni odgovor na O1A-EPA (Sl.31A), O2-FPA (Sl.31B), O6Glc-EPA (Sl.31C) i O25B-EPA (Sl.31D).
[0396] Ovi podaci pokazuju da svaka komponenta tetravalentne vakcine indukuje odgovor antitela specifičan za serotip i da su takvi odgovori antitela funkcionalni u ubijanju E. coli iz ovih serotipova. Dakle, ovde opisane kompozicije vakcine su funkcionalne kod ljudi.
12.4: Imunizacija sa tetravalentnim konjugatom O-antigena koji sadrži O25B-EPA izaziva O25A/O25B Unakrsna reaktivna IgG antitela kod ljudi
[0397] Da bi se odredio nivo unakrsne reaktivnosti serumskih IgG antitela indukovanih vakcinom prema dva poznata serosubtipa E. coli O25, O25A i O25B, serijska razblaženja seruma dobijenog od vakcinisanih subjekata su inkubirana sa prečišćenim O25A LPS, O25B LPS bakterijom ili inkubacijom. ćelije, i testirana ELISA-om.
[0398] Kao što je prikazano na Slici 32, slične vrednosti EC50su primećene kada je testirana reaktivnost prema O25A LPS (crne trake) i O25B LPS (sive trake) trideset dana nakon vakcinacije. Sve u svemu, podaci sugerišu da biokonjugat O25B dobro funkcioniše za O25B i O25A, ali u većini slučajeva/testiranih subjekata O25B radi nešto bolje u smislu odgovora antitela za O25B u poređenju sa O25A. Ovaj rezultat pokazuje da sa pojavom neke prirodne varijacije, tetravalentna vakcina indukuje antitela koja prepoznaju i O25A i O25B LPS. Da bi se proverilo da li isto važi i za cele bakterijske ćelije i više sojeva O25A/O25B, takođe je testirana reaktivnost prema skupu kliničkih izolata O25A ili O25B dobijenih iz krvi ili urina. U ovom slučaju soj serotipa O75, serotip koji nije zastupljen u tetravalentnoj vakcini, korišćen je kao negativna kontrola (isprekidana siva linija na Slici 33). Kao što je prikazano na Slici 33, vakcinom indukovana serumska IgG antitela pokazala su snažan odgovor na svaki od pojedinačnih sojeva O25. Iako su varijacije od soja do soja bile očigledne, primećena je reaktivnost prema sojevima O25A (crne linije) i O25B (sive linije). Ovi podaci pokazuju da komponenta O25B vakcine tetravalentne vakcine izaziva antitela koja prepoznaju i O25A i O25B prečišćeni LPS i sojeve E. coli O25A i O25B.
[0399] Tabele 13 i 14, dole, daju detalje o određenim sojevima i plazmidima, korišćenim u prethodnim primerima.
Tabela 13: Sojevi
(nastavak)
Tabela 14: Plazmidi
Tabela 15: Sekvence
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1
(nastavak)
2
(nastavak)
(nastavak)
4
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1 SEQUENCE LISTING
<110> GlycoVaxyn AG
<120> NOVEL POLYSACCHARIDE AND USES THEREOF
<130> 103749PC
<140> TBA
<141> On even date herewith
<150> 61/943,710
<151> 2014-02-24
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1086
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> rmlB (upec138)
<400> 1
gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60 ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120 gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180 gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240 gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300 attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360 gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420 ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480 tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540 tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600 tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660 ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720 cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780 cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840 gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900 gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960 gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020 gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080 cagtaa 1086
<210> 2
<211> 900
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> rmlD (upec138)
<400> 2
atgaatatcc tcctttttgg caaaacaggg caggtaggtt gggaactaca gcgtgctctg 60 gcacctctgg gtaatttgat tgctcttgat gttcactcca ctgattactg tggtgatttt 120 agtaatcctg aaggtgtagc tgaaaccgta agaagcattc ggcctgatat tattgtcaac 180 gcagccgctc acaccgcagt agacaaagca gaatcagaac cgaagtttgc acaattactg 240 aacgcgacga gtgtcgaagc gatcgcgaaa gcagccaatg aagtcggcgc ctgggttatt 300 cactactcta ctgactacgt atttccgggg accggtgaaa taccatggca ggaggaggat 360 gcaaccgcac cgctaaatgt ttacggtgaa accaagttag cgggagaaaa agcattacaa 420 gagcattgtg cgaagcacct tattttccgg accagctggg tctatgcagg taaaggaaat 480 aacttcgcca aaacaatgtt gcgtctggca aaagagcgtg aagaattagc cgttattaat 540 gatcagtttg gtgcgccaac tggcgcagag ttactggctg attgtacggc acatgctatt 600 cgtgtggcac tgaataaacc ggaagtcgca ggcttgtacc atctggtagc tagtggtacc 660 acaacgtggc acgattatgc tgcgctggtt tttgaagagg cgcgcaaagc aggcattccc 720 cttgcactca acaagctcaa cgcagtacca acaacagcct atcctacacc agctcgtcgt 780 ccacataact ctcgccttaa tacagaaaaa tttcagcaga actttgcgct tgtcttgcct 840 gactggcagg ttggcgtgaa acgaatgctt aacgaattat ttacgactac agcaatttaa 900
<210> 3
<211> 879
<212> DNA
<213> E. Coli
<223> rmlA (upec138)
<400> 3
atgaaaacgc gtaaaggtat tattttggcg ggtggttctg gtactcgtct ttatcctgtg 60 acgatggccg tcagtaaaca gctgttaccg atttatgata aaccgatgat ctattacccg 120 ctctctacac tgatgttagc gggtattcgc gatattctga ttatcagtac accacaggat 180 actcctcgtt ttcaacaact gctgggtgac gggagccagt ggggcctgaa tcttcagtac 240 aaagtgcaac cgagtccgga tggtcttgcg caggcgttta ttatcggtga agagtttatt 300 ggtggtgatg attgtgcttt ggtacttggt gataatatct tctacggcca cgacctgccg 360 aagttaatgg acgtagctgt taacaaagaa agtggtgcaa cggtatttgc ctatcacgtt 420 aatgatcctg aacgttatgg tgtcgtggag tttgataata acggtactgc aattagcctg 480 gaagaaaaac cgctggaacc aaaaagtaac tatgcggtta ctgggcttta tttctatgac 540 aatgacgttg tggaaatggc gaaaaacctt aagccttctg cccgaggtga actggaaatt 600 accgatatta accgtattta tatggaacaa ggacgtttgt ctgtcgctat gatggggcgt 660 ggctatgcat ggctggatac agggacgcat caaagtctta ttgaagcaag caacttcatt 720 gccaccattg aagagcgcca gggactaaag gtttcctgtc cggaagaaat tgcttatcgt 780 aaagggttta ttgatgctga gcaggtaaaa gtattagccg aaccgttgaa gaaaaatgct 840 tatggtcagt atctgctcaa aatgattaaa ggttattaa 879
<210> 4
<211> 543
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> rmlC (upec138)
<400> 4
atgaacgtaa ttaaaactga aattcctgat gtgctgattt ttgaaccaaa agtttttggg 60 gatgaacgtg gcttcttttt tgagagtttt aatcagagga tttttgaaga agcagtaggt 120 cgtaaggttg agtttgttca ggataaccat tctaagtcca gtaaaggtgt tttacgtggt 180 cttcattatc agttagaacc ttatgctcaa ggaaaactgg tgcgctgtgt tgttggcgag 240 gtttttgatg ttgcggttga tattcgtaaa tcgtcaccta catttgggaa atgggttggg 300 gtgaatttgt ctgctgagaa taagcgtcag ttgtggattc ctgagggatt tgcacatggt 360 tttttggtgc tgagtgattt agcagaagtt ttatataaaa cgaatcaata ttatgctcca 420 tcacatgaaa aaaatattat atggaatgac ctcttgctta atattaaatg gccgagcaca 480 gcactgatca ctctgtctga taaggatgca aatggggaaa gatttgaact aagtgagttt 540 tga 543
<210> 5
<211> 1260
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wzx (upec138)
<400> 5
atgtctctct taaaacatag tatatggaat gttgcgggct actttatacc aacattaatt 60 gcaattcccg cctttggatt aattgcgagg aaaattggtg tagaactatt tggtttgtat 120 acgttagcaa tgatttttat agggtatgca agtatatttg atgctgggtt aacaagagct 180 gttgtgcgtg aaatagcatt actaaaaaac agagtggacg attgtaatac gataatagta 240 acttctatta tcgctgtgat atttttaggg tttatcggag gcgggggagt gtttctgctt 300 aaaggcgata ttattgaact gttaaatatc tcaccaatat attacgccga ttcgataaag 360 tctctagtat tattatcatc tctgatacct gtattcttag tcacgcaaat actattagca 420 gagcttgagg gtcgggaata ttttgggatt ctaaatatac aaaaaagtgt agggaattct 480 ttaattgcag ggttacctgc attatttgtt ttaattaatc aaacgctttt ttctgcaatt 540 attggtgtag cgattgcaag agttatatgc ttgtggttaa gctacattat gagcagggaa 600 agaataacta tcgatatctc atttttttca ataactgttt taaagcggtt atttagatat 660 ggcgggtggg taactataag taacataata tctcctatat tagcgagtat ggatagattt 720 attctatccc atatccaggg agcatcaaaa atatcattct atacagtccc taatgagctg 780 gtaactaggc ttggaatagt tccaggctct cttgggaaag ctgtttttcc aaaattaagt 840 catgcaagga attttacagc gtcatatgca gagcaaaaaa aagcttatat attaatgact 900 gtcattgtaa tgcctttggt tttatttgta tattattacg caaagtttat tttaacattg 960 tggatggggg ctgagtatgc agggatttcg gtcgaaatat tacggattat gcttataggg 1020 tatattttta actgttattc acaaatctct tttgccaaca tacaggcctt tggaaaagca 1080 aaatacactg catacatcca tatgatggaa tttattcctt atttgataat gttatatata 1140 atttcaaagg aatatggggt tattggtgtt gcgtggttat ggacaattcg agtaataatt 1200 gattttttga tgcttttata tatgagttat cgttgtaata atcttatgaa aaaagggtag 1260
<210> 6
<211> 966
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wekA (upec138)
<400> 6
atgatatata ttgtggtatt aaattggaat ggggctatag ataccattaa ttgtgttaaa 60 agtttaatgg atttaaatgt tagcgattat aaaattatca ttgttgataa ctgttctatg 120 gataactcat atgatactat aaaagaaaat cttaattcat tatatattgc tgataaaagt 180 atcattgagg tgaagtatga ggatagaaat aaatataaaa ccttagaaaa cgataaaatc 240 atattaatac aatctccgca aaataatggg tacgcaagtg gtaataatat tggcatagag 300 ttcgctctta atcaggagaa tatgaaatac gtctgggttc tgaataatga tactgaagtg 360 gataaagagg ctttaactca tttaattagt aaatgtgatt cagataaaag tatagggatt 420 tgcggttctc gtttagtcta ttttgccgac agagagatgc agcaaggact aggtggggtg 480 cataacaaat ggttatgcac tacaaaaaat tatgaaatgg gaagattagt ttccaaaaaa 540 tatgatgatg aagtcattag taatgatata gattatataa ttggcgcatc gatgtttttc 600 tctagagaat gtttggaaac agttggattg atgaatgaag aatatttttt atactatgaa 660 gagttagata tttgcctcag agcaaaagca aagaacttta aattaggtat ttgctcagaa 720 agtttggttt atcataaaat aggtgcaagt actgatgggg gaaagagcat gatggctgat 780 ctttgctcaa taaaaaatag gctggtcatt acagaaaggt tttatcccca atattattgg 840 acggtatggt tgtcactttt tgttgtagca tttaaccgtg ctagaagagg tgagtttaat 900 aagatgaaaa gatgtttgaa tgttatgttt aacttcaaac gaaacaaagg tagcaaatgc 960 cattag 966
<210> 7
<211> 1149
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wekB (upec138)
<400> 7
atgaaagtgg cttttttatc tgcttatgat ccactatcta catccagttg gtctggcaca 60 ccttattata tgctaaaggc attatcgaag agaaatattt ccattgaaat attaggaccg 120 gtaaatagct atatgatata catgttaaaa gtatataaat taatattaag gtgtttcgga 180 aaagaatatg attatagtca ttcgaagttg ctttccaggt attacggtag aatattcggt 240 aggaaattaa aaaaaattga tggtttggat tttattatcg cacctgcagg ttcctcacaa 300 attgcttttt taaaaacaac cataccaata atatatctat cggatacaac atatgatcaa 360 ttaaaaagct attatccgaa tttaaataaa aaaacaatta taaatgatga ggatgcaagt 420 ttaatcgaac gcaaggctat tgaaaaagca acagtagtat ctttcccatc taaatgggca 480 atggattttt gcaggaatta ttacagatta gattttgata aattagttga aataccatgg 540 ggggctaatt tatttgatga tattcacttt gctaataaaa atataattca aaagaatagt 600 tatacttgtc ttttcttggg agttgattgg gaaagaaaag gtgggaaaac agccttgaaa 660 gcaattgaat atgtaaggca gttatatggg atcgatgtta gactaaaaat ttgtggatgt 720 actccgaatc aaaagatttt acctacttgg gttgaattaa ttgataaagt agataaaaat 780 aacgttgacg aatatcagaa attcatcgat gtgttatcta acgctgatat acttctttta 840 ccaaccattg ctgaatgtta tggaatggta ttttgtgaag ctgctgcttt tggattgcct 900 gttgtcgcta cagatacagg tggagtcagt tctatagtta tcaacgaaag gacggggata 960 ttaattaaag acccgttaga ctataagcac tttggaaatg caattcataa aataattagt 1020 tccgtagaga cttatcaaaa ctactcccaa aacgcaagaa ttagatataa taatatattg 1080 cattgggaca attgggctaa aaagataatt gagattatgt atgagcataa gaatagaaga 1140 atcaaatag 1149
<210> 8
<211> 1218
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wzy (upec138)
atgagcataa gaatagaaga atcaaatagc acaaaaagaa ttatatgttt atttatactt 60 tttcttgttt tccctgattt tttgttttat acattagggg ttgataattt tagcatttca 120 acgataatct caattacatt gctttttgtt tttttaagag ctaaaaatat ttgcaaagat 180 aattttctaa taatagtagc gttattcata ttgttgtgtt ttaactgttt gttaagtatg 240 ctatttaata ttgaacaggc tttaacattt aaagttgtac tttcaatata tagcatctta 300 ataatggcat acgtctcctc ttgttatgca cagacgttgt ggttatgttc tgaagaaata 360 cttaagagat ccgtctttta tttgttcgca tttctttgcc ttattggcat tataagtatt 420 cttttacaga agactgagat tatacatgat aaaagtatga ttctttttcc tgaaccatca 480 gcatttgcat tggtttttat acctatcttt tcattttgtt tatactatac aagagggggg 540 gggctactat tgctctatat attatctttg ggtattgcgt taggtatcca gaatttaaca 600 atgttggtag gcattgtgat tagtgttttt gtgatgaaaa aaataactat aaggcaaact 660 attgttatac ttttgggggc atggattttt tccatgatat taagtgattt agacatttct 720 tactatacat cgcggcttga ttttaaaaat actacgaacc tatcagtgct tgtatatctt 780 tcaggaattg aaagagcttt cttgaatttt attacaagtt atggtcttgg tattggtttt 840 caacaaatgg gagtgaatgg ggagatagga atatatcaac aaattttagc tgaacttgat 900 gcccctatgt taaatatata cgatggctca tttatttctt ctaagttaat atctgagttt 960 ggggttattg gtgcattaat gtgtattttc tatttttttt atttttcccg attttatctg 1020 cgtttcaaaa aaagtaagag atattcaccg cagtatattt tagcatatag cttctacatg 1080 tgtttcttca tccctctttt tatacgtggt gctggttata taaaccccta tgtgtttatg 1140 ttattttcat caatattttt gtgcaaatat cacgctaaaa atatcttgat gaaatctaat 1200 gtccagatag ctatataa 1218
<210> 9
<211> 606
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wbbJ (upec138)
<400> 9
atgtgcatta aaaaaaaact taagttaatt aaacgatatg gcctttatgg tggtcttagg 60 cttcttaaag atatattctt aacaaaattt ttattttgtt caaatgttag gattattaga 120 tttccatgtt atattagaaa agatggaagt gttagttttg gaaaaggttt tacatcaggt 180 gtaggattac gagttgatgc atttatggat gccgtagttt ccattggaga aaatgttcaa 240 attaatgact atgttcacat cgcggctatt aataatgtca ttattggtag agatacatta 300 atagcaagta aagtatttat tagtgatcat aatcatggta ttttttctaa atccgatatc 360 catagttcac caactattat tccttcgtct aggccccttg aatctgcacc tgtgtatatt 420 ggagagcgtg tgtggattgg cgaaaatgtg acaatattac caggtgcgtg tataggtaat 480 ggtgtagtta ttggcgcaaa cagtgttgtt cgtggtgaga ttcctaataa tgtgatcatt 540 gctggtgttc cagctaaaat tgttaaaaaa tataactatg agcgtatgca atgggaaaga 600 atatag 606
<210> 10
<211> 1101
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wbbK (upec138)
<400> 10
atgggaaaga atatagttgt aatatcggct gttaatttta caaccggagg cccctttacc 60 gtactaaaaa atgtgcttac agcaactaaa gatagagccg aatgtaaatt tattgcactg 120 gttcatagct ctgctgaact aatggaatta tttccgtggg ttgaatttat agagtatcca 180 gaagtcaagt cttcgtgggt taaaagatta tatttcgaat atataacttg caatagatta 240 tctaaggtga ttaaggcaac tcattgggta tgcttacatg atattacagc aaatgttagt 300 gtaccctata gatttgttta ttgccacaat cctgcaccgt tctataaata tttaagctat 360 cgagatatta taggagaacc taaattttat cttttttatc ttttttatgg gcttttatac 420 aatatcaata taaaaaagaa cacagcagtt tttgttcagc agcagtggct aaaaaaagaa 480 ttcgaaaaaa aatataagtt aaagaatgtt gttgttagtc gccctgaaga tatttgccct 540 tttgaaagtg atggtttggt aagaaataat aataaaaagg atgtgaggat attttaccca 600 gcagtgcccc gtatatttaa aaactttgaa gttatcatac gtgctgcaca aatattacaa 660 gataaaaata ttcattttta tcttactttt gatggtactg aaaataagta tgcaaaaaga 720 atatataaat tagcttccga actgaaaaat gtacatttcc tcggttacct taatgcaacc 780 gagatggtta acttttatca agattcagat attatttgtt tcccatcgaa actagaaacg 840 tggggattac cattatcaga agctaaaaca tacaaaaaat ggatatttgc ggcagactta 900 ccttatgctc atgaagtttt atataactat tcaaaaacta gatattttcc atttgacgat 960 gagaaaatac ttgttcgcta catattagag tacacaagta aaaatatgca tgaagatata 1020 aaaaatagta gggtgaattt taataatgat gcattgactg gttttgaaca gtttattgaa 1080 tatatcctca aggggaactg a 1101
<210> 11
<211> 564
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> wbbL (upec138)
<400> 11
atgattatga ataatgatta ttttctcttt cttaaccccg atgtattcat aaccagtgaa 60 agtttgatta attatgttga ttatataatt agtaatgatt ataagtttag cacattatgt 120 ctttatcgag attttactaa aagcaaacat gattattcaa tacggagttt tccaacttta 180 tatgattttc tttgttcttt tttattgggg gtgaataaaa gtaaaattaa gaaggaaaat 240 atactttctg atactgtagt tgattggtgt gctggctcat ttatgcttat tcatgcttta 300 agtttcttaa atgtgaatgg ttttgatcaa aaatatttta tgtattgtga agatattgac 360 ctttgtatgc gtttaaaatt aagtggagta gatctttact atactcccca ttttgatgct 420 attcattatg cgcagcatga aaatagaaga atatttacta aagcatttcg atggcatata 480 aggagtatta cgcgctacat attacggaaa ccaattcttt cttataaaaa ctatagaaaa 540 attacatccg aactggtaaa gtga 564
<210> 12
<211> 10653
<212> DNA
<213> E. Coli
<220>
<223> E. coli rfb(upec138) gene cluster
<400> 12
gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60 ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120 gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180 gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240 gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300 attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360 gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420 ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480 tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540 tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600 tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660 ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720 cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780 cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840 gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900 gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960 gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020 gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080 cagtaatgaa tatcctcctt tttggcaaaa cagggcaggt aggttgggaa ctacagcgtg 1140 ctctggcacc tctgggtaat ttgattgctc ttgatgttca ctccactgat tactgtggtg 1200 attttagtaa tcctgaaggt gtagctgaaa ccgtaagaag cattcggcct gatattattg 1260 tcaacgcagc cgctcacacc gcagtagaca aagcagaatc agaaccgaag tttgcacaat 1320 tactgaacgc gacgagtgtc gaagcgatcg cgaaagcagc caatgaagtc ggcgcctggg 1380 ttattcacta ctctactgac tacgtatttc cggggaccgg tgaaatacca tggcaggagg 1440 aggatgcaac cgcaccgcta aatgtttacg gtgaaaccaa gttagcggga gaaaaagcat 1500 tacaagagca ttgtgcgaag caccttattt tccggaccag ctgggtctat gcaggtaaag 1560 gaaataactt cgccaaaaca atgttgcgtc tggcaaaaga gcgtgaagaa ttagccgtta 1620 ttaatgatca gtttggtgcg ccaactggcg cagagttact ggctgattgt acggcacatg 1680 ctattcgtgt ggcactgaat aaaccggaag tcgcaggctt gtaccatctg gtagctagtg 1740 gtaccacaac gtggcacgat tatgctgcgc tggtttttga agaggcgcgc aaagcaggca 1800 ttccccttgc actcaacaag ctcaacgcag taccaacaac agcctatcct acaccagctc 1860 gtcgtccaca taactctcgc cttaatacag aaaaatttca gcagaacttt gcgcttgtct 1920 tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa tgcttaacga attatttacg actacagcaa 1980 tttaatagtt tttgcatctt gttcgtaatg gtggagcaag atgtattaaa aggaatgatg 2040 aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttgg cgggtggttc tggtactcgt ctttatcctg 2100 tgacgatggc cgtcagtaaa cagctgttac cgatttatga taaaccgatg atctattacc 2160 cgctctctac actgatgtta gcgggtattc gcgatattct gattatcagt acaccacagg 2220 atactcctcg ttttcaacaa ctgctgggtg acgggagcca gtggggcctg aatcttcagt 2280 acaaagtgca accgagtccg gatggtcttg cgcaggcgtt tattatcggt gaagagttta 2340 ttggtggtga tgattgtgct ttggtacttg gtgataatat cttctacggc cacgacctgc 2400 cgaagttaat ggacgtagct gttaacaaag aaagtggtgc aacggtattt gcctatcacg 2460 ttaatgatcc tgaacgttat ggtgtcgtgg agtttgataa taacggtact gcaattagcc 2520 tggaagaaaa accgctggaa ccaaaaagta actatgcggt tactgggctt tatttctatg 2580 acaatgacgt tgtggaaatg gcgaaaaacc ttaagccttc tgcccgaggt gaactggaaa 2640 ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac aaggacgttt gtctgtcgct atgatggggc 2700 gtggctatgc atggctggat acagggacgc atcaaagtct tattgaagca agcaacttca 2760 ttgccaccat tgaagagcgc cagggactaa aggtttcctg tccggaagaa attgcttatc 2820 gtaaagggtt tattgatgct gagcaggtaa aagtattagc cgaaccgttg aagaaaaatg 2880 cttatggtca gtatctgctc aaaatgatta aaggttatta ataagatgaa cgtaattaaa 2940 actgaaattc ctgatgtgct gatttttgaa ccaaaagttt ttggggatga acgtggcttc 3000 ttttttgaga gttttaatca gaggattttt gaagaagcag taggtcgtaa ggttgagttt 3060 gttcaggata accattctaa gtccagtaaa ggtgttttac gtggtcttca ttatcagtta 3120 gaaccttatg ctcaaggaaa actggtgcgc tgtgttgttg gcgaggtttt tgatgttgcg 3180 gttgatattc gtaaatcgtc acctacattt gggaaatggg ttggggtgaa tttgtctgct 3240 gagaataagc gtcagttgtg gattcctgag ggatttgcac atggtttttt ggtgctgagt 3300 gatttagcag aagttttata taaaacgaat caatattatg ctccatcaca tgaaaaaaat 3360 attatatgga atgacctctt gcttaatatt aaatggccga gcacagcact gatcactctg 3420 tctgataagg atgcaaatgg ggaaagattt gaactaagtg agttttgaaa tgtctctctt 3480 aaaacatagt atatggaatg ttgcgggcta ctttatacca acattaattg caattcccgc 3540 ctttggatta attgcgagga aaattggtgt agaactattt ggtttgtata cgttagcaat 3600 gatttttata gggtatgcaa gtatatttga tgctgggtta acaagagctg ttgtgcgtga 3660 aatagcatta ctaaaaaaca gagtggacga ttgtaatacg ataatagtaa cttctattat 3720 cgctgtgata tttttagggt ttatcggagg cgggggagtg tttctgctta aaggcgatat 3780 tattgaactg ttaaatatct caccaatata ttacgccgat tcgataaagt ctctagtatt 3840 attatcatct ctgatacctg tattcttagt cacgcaaata ctattagcag agcttgaggg 3900 tcgggaatat tttgggattc taaatataca aaaaagtgta gggaattctt taattgcagg 3960 gttacctgca ttatttgttt taattaatca aacgcttttt tctgcaatta ttggtgtagc 4020 gattgcaaga gttatatgct tgtggttaag ctacattatg agcagggaaa gaataactat 4080 cgatatctca tttttttcaa taactgtttt aaagcggtta tttagatatg gcgggtgggt 4140 aactataagt aacataatat ctcctatatt agcgagtatg gatagattta ttctatccca 4200 tatccaggga gcatcaaaaa tatcattcta tacagtccct aatgagctgg taactaggct 4260 tggaatagtt ccaggctctc ttgggaaagc tgtttttcca aaattaagtc atgcaaggaa 4320 ttttacagcg tcatatgcag agcaaaaaaa agcttatata ttaatgactg tcattgtaat 4380 gcctttggtt ttatttgtat attattacgc aaagtttatt ttaacattgt ggatgggggc 4440 tgagtatgca gggatttcgg tcgaaatatt acggattatg cttatagggt atatttttaa 4500 ctgttattca caaatctctt ttgccaacat acaggccttt ggaaaagcaa aatacactgc 4560 atacatccat atgatggaat ttattcctta tttgataatg ttatatataa tttcaaagga 4620 atatggggtt attggtgttg cgtggttatg gacaattcga gtaataattg attttttgat 4680 gcttttatat atgagttatc gttgtaataa tcttatgaaa aaagggtagc ctgatgatat 4740 atattgtggt attaaattgg aatggggcta tagataccat taattgtgtt aaaagtttaa 4800 tggatttaaa tgttagcgat tataaaatta tcattgttga taactgttct atggataact 4860 catatgatac tataaaagaa aatcttaatt cattatatat tgctgataaa agtatcattg 4920 aggtgaagta tgaggataga aataaatata aaaccttaga aaacgataaa atcatattaa 4980 tacaatctcc gcaaaataat gggtacgcaa gtggtaataa tattggcata gagttcgctc 5040 ttaatcagga gaatatgaaa tacgtctggg ttctgaataa tgatactgaa gtggataaag 5100 aggctttaac tcatttaatt agtaaatgtg attcagataa aagtataggg atttgcggtt 5160 ctcgtttagt ctattttgcc gacagagaga tgcagcaagg actaggtggg gtgcataaca 5220 aatggttatg cactacaaaa aattatgaaa tgggaagatt agtttccaaa aaatatgatg 5280 atgaagtcat tagtaatgat atagattata taattggcgc atcgatgttt ttctctagag 5340 aatgtttgga aacagttgga ttgatgaatg aagaatattt tttatactat gaagagttag 5400 atatttgcct cagagcaaaa gcaaagaact ttaaattagg tatttgctca gaaagtttgg 5460 tttatcataa aataggtgca agtactgatg ggggaaagag catgatggct gatctttgct 5520 caataaaaaa taggctggtc attacagaaa ggttttatcc ccaatattat tggacggtat 5580 ggttgtcact ttttgttgta gcatttaacc gtgctagaag aggtgagttt aataagatga 5640 aaagatgttt gaatgttatg tttaacttca aacgaaacaa aggtagcaaa tgccattaga 5700 atatgcactt aatcatggtg ttaataaatc tatagtttga tatgttatta aagggtattt 5760 aatgaaagtg gcttttttat ctgcttatga tccactatct acatccagtt ggtctggcac 5820 accttattat atgctaaagg cattatcgaa gagaaatatt tccattgaaa tattaggacc 5880 ggtaaatagc tatatgatat acatgttaaa agtatataaa ttaatattaa ggtgtttcgg 5940 aaaagaatat gattatagtc attcgaagtt gctttccagg tattacggta gaatattcgg 6000 taggaaatta aaaaaaattg atggtttgga ttttattatc gcacctgcag gttcctcaca 6060 aattgctttt ttaaaaacaa ccataccaat aatatatcta tcggatacaa catatgatca 6120 attaaaaagc tattatccga atttaaataa aaaaacaatt ataaatgatg aggatgcaag 6180 tttaatcgaa cgcaaggcta ttgaaaaagc aacagtagta tctttcccat ctaaatgggc 6240 aatggatttt tgcaggaatt attacagatt agattttgat aaattagttg aaataccatg 6300 gggggctaat ttatttgatg atattcactt tgctaataaa aatataattc aaaagaatag 6360 ttatacttgt cttttcttgg gagttgattg ggaaagaaaa ggtgggaaaa cagccttgaa 6420 agcaattgaa tatgtaaggc agttatatgg gatcgatgtt agactaaaaa tttgtggatg 6480 tactccgaat caaaagattt tacctacttg ggttgaatta attgataaag tagataaaaa 6540 taacgttgac gaatatcaga aattcatcga tgtgttatct aacgctgata tacttctttt 6600 accaaccatt gctgaatgtt atggaatggt attttgtgaa gctgctgctt ttggattgcc 6660 tgttgtcgct acagatacag gtggagtcag ttctatagtt atcaacgaaa ggacggggat 6720 attaattaaa gacccgttag actataagca ctttggaaat gcaattcata aaataattag 6780 ttccgtagag acttatcaaa actactccca aaacgcaaga attagatata ataatatatt 6840 gcattgggac aattgggcta aaaagataat tgagattatg tatgagcata agaatagaag 6900 aatcaaatag cacaaaaaga attatatgtt tatttatact ttttcttgtt ttccctgatt 6960 ttttgtttta tacattaggg gttgataatt ttagcatttc aacgataatc tcaattacat 7020 tgctttttgt ttttttaaga gctaaaaata tttgcaaaga taattttcta ataatagtag 7080 cgttattcat attgttgtgt tttaactgtt tgttaagtat gctatttaat attgaacagg 7140 ctttaacatt taaagttgta ctttcaatat atagcatctt aataatggca tacgtctcct 7200 cttgttatgc acagacgttg tggttatgtt ctgaagaaat acttaagaga tccgtctttt 7260 atttgttcgc atttctttgc cttattggca ttataagtat tcttttacag aagactgaga 7320 ttatacatga taaaagtatg attctttttc ctgaaccatc agcatttgca ttggttttta 7380 tacctatctt ttcattttgt ttatactata caagaggggg ggggctacta ttgctctata 7440 tattatcttt gggtattgcg ttaggtatcc agaatttaac aatgttggta ggcattgtga 7500 ttagtgtttt tgtgatgaaa aaaataacta taaggcaaac tattgttata cttttggggg 7560 catggatttt ttccatgata ttaagtgatt tagacatttc ttactataca tcgcggcttg 7620 attttaaaaa tactacgaac ctatcagtgc ttgtatatct ttcaggaatt gaaagagctt 7680 tcttgaattt tattacaagt tatggtcttg gtattggttt tcaacaaatg ggagtgaatg 7740 gggagatagg aatatatcaa caaattttag ctgaacttga tgcccctatg ttaaatatat 7800 acgatggctc atttatttct tctaagttaa tatctgagtt tggggttatt ggtgcattaa 7860 tgtgtatttt ctattttttt tatttttccc gattttatct gcgtttcaaa aaaagtaaga 7920 gatattcacc gcagtatatt ttagcatata gcttctacat gtgtttcttc atccctcttt 7980 ttatacgtgg tgctggttat ataaacccct atgtgtttat gttattttca tcaatatttt 8040 tgtgcaaata tcacgctaaa aatatcttga tgaaatctaa tgtccagata gctatataat 8100 agtagattat attatcatta tcacgtaaat tacatattaa tagcatatat gataactagg 8160 acataaataa tgtgcattaa aaaaaaactt aagttaatta aacgatatgg cctttatggt 8220 ggtcttaggc ttcttaaaga tatattctta acaaaatttt tattttgttc aaatgttagg 8280 attattagat ttccatgtta tattagaaaa gatggaagtg ttagttttgg aaaaggtttt 8340 acatcaggtg taggattacg agttgatgca tttatggatg ccgtagtttc cattggagaa 8400 aatgttcaaa ttaatgacta tgttcacatc gcggctatta ataatgtcat tattggtaga 8460 gatacattaa tagcaagtaa agtatttatt agtgatcata atcatggtat tttttctaaa 8520 tccgatatcc atagttcacc aactattatt ccttcgtcta ggccccttga atctgcacct 8580 gtgtatattg gagagcgtgt gtggattggc gaaaatgtga caatattacc aggtgcgtgt 8640 ataggtaatg gtgtagttat tggcgcaaac agtgttgttc gtggtgagat tcctaataat 8700 gtgatcattg ctggtgttcc agctaaaatt gttaaaaaat ataactatga gcgtatgcaa 8760 tgggaaagaa tatagttgta atatcggctg ttaattttac aaccggaggc ccctttaccg 8820 tactaaaaaa tgtgcttaca gcaactaaag atagagccga atgtaaattt attgcactgg 8880 ttcatagctc tgctgaacta atggaattat ttccgtgggt tgaatttata gagtatccag 8940 aagtcaagtc ttcgtgggtt aaaagattat atttcgaata tataacttgc aatagattat 9000 ctaaggtgat taaggcaact cattgggtat gcttacatga tattacagca aatgttagtg 9060 taccctatag atttgtttat tgccacaatc ctgcaccgtt ctataaatat ttaagctatc 9120 gagatattat aggagaacct aaattttatc ttttttatct tttttatggg cttttataca 9180 atatcaatat aaaaaagaac acagcagttt ttgttcagca gcagtggcta aaaaaagaat 9240 tcgaaaaaaa atataagtta aagaatgttg ttgttagtcg ccctgaagat atttgccctt 9300 ttgaaagtga tggtttggta agaaataata ataaaaagga tgtgaggata ttttacccag 9360 cagtgccccg tatatttaaa aactttgaag ttatcatacg tgctgcacaa atattacaag 9420 ataaaaatat tcatttttat cttacttttg atggtactga aaataagtat gcaaaaagaa 9480 tatataaatt agcttccgaa ctgaaaaatg tacatttcct cggttacctt aatgcaaccg 9540 agatggttaa cttttatcaa gattcagata ttatttgttt cccatcgaaa ctagaaacgt 9600 ggggattacc attatcagaa gctaaaacat acaaaaaatg gatatttgcg gcagacttac 9660 cttatgctca tgaagtttta tataactatt caaaaactag atattttcca tttgacgatg 9720 agaaaatact tgttcgctac atattagagt acacaagtaa aaatatgcat gaagatataa 9780 aaaatagtag ggtgaatttt aataatgatg cattgactgg ttttgaacag tttattgaat 9840 atatcctcaa ggggaactga cgtggtttat attataatcg tttcacatgg ccatgatgac 9900 tatatagaaa atcttttatt aaatttaaag ttgccctctg gaagatttaa aataatagtt 9960 cgtgataaca aaagttcaat ggttttaaaa aaaacatgcg aaaaaaattg cgtaacctat 10020 ttgcatggag ggcaatatgg atttggacat aataataaca tagcagtgtc atatataatt 10080 aataacttca tgattatgaa taatgattat tttctctttc ttaaccccga tgtattcata 10140 accagtgaaa gtttgattaa ttatgttgat tatataatta gtaatgatta taagtttagc 10200 acattatgtc tttatcgaga ttttactaaa agcaaacatg attattcaat acggagtttt 10260 ccaactttat atgattttct ttgttctttt ttattggggg tgaataaaag taaaattaag 10320 aaggaaaata tactttctga tactgtagtt gattggtgtg ctggctcatt tatgcttatt 10380 catgctttaa gtttcttaaa tgtgaatggt tttgatcaaa aatattttat gtattgtgaa 10440 gatattgacc tttgtatgcg tttaaaatta agtggagtag atctttacta tactccccat 10500 tttgatgcta ttcattatgc gcagcatgaa aatagaagaa tatttactaa agcatttcga 10560 tggcatataa ggagtattac gcgctacata ttacggaaac caattctttc ttataaaaac 10620 tatagaaaaa ttacatccga actggtaaag tga 10653
<210> 13
<211> 652
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Detoxified EPA protein comprising 4 optimized N-glycosylation sequences
<400> 13
Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 20 25 30
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 35 40 45
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
50 55 60
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 65 70 75 80
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 85 90 95
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 100 105 110
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 115 120 125
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 130 135 140
His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 145 150 155 160
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 165 170 175
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 180 185 190
Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 195 200 205
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn 210 215 220
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys 225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile 245 250 255
Lys Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His 260 265 270
Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys 275 280 285
His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp 290 295 300
Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu 305 310 315 320
Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg 325 330 335
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile 340 345 350
Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala 355 360 365
Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly 370 375 380
Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Lys Asp 385 390 395 400
Gln Asn Arg Thr Lys Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp 405 410 415
Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 420 425 430
Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 435 440 445
Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val 450 455 460
Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 465 470 475 480
Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg 485 490 495
Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 500 505 510
Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly 530 535 540
Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 545 550 555 560
Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 565 570 575
Glu Gly Gly Arg Val Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 580 585 590
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly 595 600 605
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala 610 615 620
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu 625 630 635 640
Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr
645 650
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-glycosylation consensus sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Ser or Thr
<400> 14
Asn Xaa Xaa
1
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-glycosylation consensus sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = independently selected from any natural amino acid except Pro
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = independently selected from any natural amino acid except Pro
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Ser or Thr
<400> 15
Xaa Xaa Asn Xaa Xaa
1 5

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Kompozicija koja sadrži biokonjugat antigena O25B E.coli N-vezanog za protein nosač, pri čemu O25B antigen E.coli sadrži strukturu formule O25B’:
    pri čemu je n ceo broj između 1 i 30.
  2. 2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je antigen O25B E.coli kovalentno vezan za Asn ostatak u proteinu nosaču pri čemu je Asn ostatak pozicioniran u konsenzusnoj sekvenci Asn-X-Ser(Thr), pri čemu X može biti bilo koji aminokiselina osim Pro.
  3. 3. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, koja dalje sadrži (i) biokonjugat O1A, koji sadrži antigen O1A E. coli kovalentno vezan za Asn ostatak proteina nosača, (ii) biokonjugat O2, koji sadrži O2 antigen E. coli kovalentno vezan za Asn ostatak proteina nosača, i (iii) biokonjugat O6, koji sadrži antigen O6 E. coli kovalentno vezan za Asn ostatak proteina nosača.
  4. 4. Kompozicija prema patentnom zahtevu 3, gde O1A antigen, O6 antigen i O2 antigen sadrže sledeće formule, redom:
    i
  5. 5. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, što je protein nosač izabran iz grupe koju čine detoksikovani egzotoksin A iz P. aeruginosa (EPA), CRM197, maltoza vezujući protein (MBP), toksoid difterije, toksoid tetanusa, detoksikovani hemolizin A iz S. aureus, faktor nakupljanja A, faktor nakupljanja B, E. coli FimH, E. coli FimHC, toplotno labilni enterotoksin E. coli, detoksifikovane varijante toplotno labilnog enterotoksina E. coli, podjedinica toksina kolere B (CTB), toksin kolere, detoksikovane varijante toksina kolere, protein Sat E. coli, passenger domen Sat proteina E. coli, pneumolizin i njegove detoksifikovane varijante Streptococcus pneumoniae, AcrA C. Jejuni, i prirodni glikoproteini C. jejuni, poželjno detoksifikovani EPA.
  6. 6. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 2-5, što je Asn ostatak proteina nosača pozicioniran u konsenzusnoj sekvenci Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), gde su X i Z nezavisno izabrani iz bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO:15).
  7. 7. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 za upotrebu u vakcinaciji subjekta, poželjno čoveka, protiv ekstra-intestinalnog patogena Escherichia coli.
  8. 8. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 za upotrebu u izazivanju imunog odgovora kod subjekta, poželjno čoveka, protiv ekstra-intestinalnog patogena Escherichia coli.
  9. 9. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 za upotrebu u indukovanju proizvodnje opsonofagocitnih antitela kod subjekta, poželjno čoveka, koja su specifična za ekstraintestinalnog patogena Escherichia coli.
  10. 10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-9, gde je subjekt u riziku od razvijanja infekcije urinarnog trakta, bakteremije ili sepse.
  11. 11. Rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin, koja sadrži: a. nukleotidnu sekvencu koja kodira i. dTDP-glukoza 4,6-dehidratazu; ii. dTDP-6-deoksi-D-glukoza 3,5-epimerazu; iii. Glukoza-1-fosfat timidililtransferazu; iv. dTDP-4-dehidrohamnoza 3,5-epimerazu; v. O antigen flipazu; vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu; vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-glukoziltransferazu; viii. O antigen polimerazu; ix. O-acetil transferazu; x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-glukoziltransferazu i xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-ramnoziltransferazu; b. nukleotidnu sekvencu koja kodira oligosaharil transferazu; i c. nukleotidnu sekvencu koja kodira protein nosač, pri čemu protein nosač sadrži konsenzusnu sekvencu Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), pri čemu su X i Z nezavisno odabrani iz bilo koje prirodne aminokiseline osim Pro (SEQ ID NO :15).
  12. 12. Rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je ćelija domaćin E. coli ćelija domaćina.
  13. 13. Rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 11 ili 12, pri čemu je najmanje jedan od waaL gena, gtrA gena, gtrB gena, gtrS gena ili rfb klastera brisan iz ili funkcionalno inaktiviran u genomu ćelije domaćina.
  14. 14. Rekombinantno modifikovana prokariotska ćelija domaćin prema bilo kom od patentnih zahteva 11-13, gde je protein nosač izabran iz grupe koju čine detoksikovani egzotoksin A P. aeruginosa (EPA), CRM197, maltoza vezujući protein (MBP), toksoid difterije, Toksoid tetanusa, detoksifikovani hemolizin A S. aureus, faktor nakupljanja A, faktor nakupljanja B, E. coli FimH, E. coli FimHC, E. coli toplotno labilni enterotoksin, detoksifikovane varijante toplotno labilnog enterotoksina E. coli, podjedinica B toksina kolere (CTB), toksin kolere, detoksifikovana varijanta toksina kolere, Sat protein E. coli, passenger domen Sat proteina E. coli, Streptococcus pneumoniae Pneumolisin i njegove detoksifikovane varijante, C. jejuni AcrA, i prirodni glikoproteini C. jejuni, poželjno protein nosač je detoksifikovani EPA.
  15. 15. Postupak za dobijanje N-glikozilovanog proteina nosača koji sadrži antigen O25B E.coli prema patentnom zahtevu 1, gde navedeni postupak obuhvata: a. kultivisanje ćelije domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 11-14; i b. prečišćavanje N-glikozilovanog proteina nosača koji sadrži O25B antigen E.coli prema patentnom zahtevu 1. 12
RS20240696A 2014-02-24 2015-02-23 Novi polisaharid i njegove upotrebe RS65631B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461943710P 2014-02-24 2014-02-24
EP15706459.3A EP3110441B1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 Novel polysaccharide and uses thereof
PCT/EP2015/053739 WO2015124769A1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 Novel polysaccharide and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65631B1 true RS65631B1 (sr) 2024-07-31

Family

ID=52589386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240696A RS65631B1 (sr) 2014-02-24 2015-02-23 Novi polisaharid i njegove upotrebe

Country Status (28)

Country Link
US (5) US9700612B2 (sr)
EP (1) EP3110441B1 (sr)
JP (2) JP6276427B2 (sr)
KR (1) KR101855142B1 (sr)
CN (1) CN106535927B (sr)
AR (1) AR100859A1 (sr)
AU (1) AU2015220723C1 (sr)
CA (1) CA2940547C (sr)
CL (1) CL2016002123A1 (sr)
DK (1) DK3110441T5 (sr)
EA (1) EA035991B9 (sr)
ES (1) ES2978870T3 (sr)
FI (1) FI3110441T3 (sr)
HR (1) HRP20240847T1 (sr)
HU (1) HUE066507T2 (sr)
IL (1) IL247344B (sr)
LT (1) LT3110441T (sr)
MX (1) MX380438B (sr)
NZ (1) NZ723328A (sr)
PH (1) PH12016501671A1 (sr)
PL (1) PL3110441T3 (sr)
PT (1) PT3110441T (sr)
RS (1) RS65631B1 (sr)
SG (1) SG11201606889PA (sr)
SI (1) SI3110441T1 (sr)
TW (1) TWI639439B (sr)
WO (1) WO2015124769A1 (sr)
ZA (1) ZA201605858B (sr)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2945651T3 (pl) 2013-01-17 2018-08-31 Arsanis Biosciences Gmbh Przeciwciało swoiste wobec E.coli MDR
WO2015124769A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Glycovaxyn Ag Novel polysaccharide and uses thereof
WO2016183501A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 University Of Washington Compositions and methods for treatment and prevention of uropathogenic e. coli infection
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711637D0 (en) * 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
WO2019175147A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against intra-abdominal infections
CN108531439B (zh) * 2018-04-16 2020-04-07 南京工业大学 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3134216A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
CN110018253A (zh) * 2019-04-15 2019-07-16 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种生物制品中游离蛋白含量的高效液相测定方法
CN111855826B (zh) * 2019-04-24 2022-09-16 岛津企业管理（中国）有限公司 破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法
GB201908528D0 (en) * 2019-06-13 2019-07-31 Univ Dundee Rhamnose-polysaccharides
EP4461744A3 (en) 2020-01-16 2025-01-08 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutant, compositions therewith and use thereof
CN119371566A (zh) * 2020-02-21 2025-01-28 辉瑞公司 糖类的纯化
BR112022014555A2 (pt) * 2020-02-23 2022-09-20 Pfizer Composições de escherichia coli e métodos das mesmas.
WO2021255684A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Shigella-tetravalent (shigella4v) bioconjugate
WO2021259743A2 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
AU2021342797B2 (en) * 2020-09-17 2024-02-08 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Multivalent vaccine compositions and uses thereof
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
JP7495578B2 (ja) * 2020-11-30 2024-06-04 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド キャピラリーベースのイムノアッセイシステムを使用する複合糖質の分析方法
US12357681B2 (en) 2020-12-23 2025-07-15 Pfizer Inc. E. coli FimH mutants and uses thereof
KR20250007029A (ko) 2021-01-12 2025-01-13 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 FimH 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
US12491237B2 (en) 2021-02-16 2025-12-09 Duke University Vaccine compositions and methods for the treatment and prevention of urinary tract infections
IL307247A (en) 2021-04-01 2023-11-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Production of E. Coli O18 bioconjugates
US20240376506A1 (en) 2021-04-08 2024-11-14 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Process for bioconjugate production
WO2023118033A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
US12014256B2 (en) * 2022-01-12 2024-06-18 Dell Products L.P Polysaccharide archival storage
CN114150005B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
EP4630046A1 (en) * 2022-12-05 2025-10-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugate compositions and process for bioconjugate production
GB202302579D0 (en) 2023-02-23 2023-04-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
EP4478050A1 (en) 2023-06-12 2024-12-18 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method for quantifying bound acetate in glycoconjugates

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700612A (en) 1971-06-23 1972-10-24 Tenneco Chem Aqueous surface-coating compositions containing hydroxyalkyl ethers of galactomannan gums as thickeners
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422653D0 (en) 1984-09-07 1984-10-10 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5370872A (en) 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
AUPM399594A0 (en) 1994-02-21 1994-03-17 Csl Limited Antigenic preparation for treatment or prevention of helicobacter infection
FI102976B (fi) 1994-02-28 1999-03-31 Valtion Teknillinen Menetelmä lisäkeittokemikaalien tuottamiseksi sekä käyttämiseksi sulfa attiselluloosaprosessissa
US6858211B1 (en) 1998-07-20 2005-02-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccines against Escherichia coli O157 infection
WO2001078787A2 (en) 2000-04-18 2001-10-25 Endobiologics, Incorporated Lipopolysaccharide-conjugate vaccine for sepsis treatment
RU2189253C1 (ru) 2001-04-09 2002-09-20 Государственный научный центр прикладной микробиологии Диагностикум для идентификации escherichia coli o157 : h7 и способ его получения
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
IL163806A0 (en) 2002-03-07 2005-12-18 Eidgenoess Tech Hochschule System and method for the production of recombinant glycosylated proteins in a prokaryotic host
AU2003901008A0 (en) 2003-03-04 2003-03-20 Anadis Ltd Composition for the treatment and prevention of bacterial infections
CN1324134C (zh) 2003-12-22 2007-07-04 南开大学 对大肠杆菌o81型的o－抗原特异的核苷酸
AU2005229434B2 (en) 2004-03-30 2010-09-30 Nsgene A/S Therapeutic use of a growth factor, NsG33
ES2353814T3 (es) 2005-05-11 2011-03-07 Eth Zuerich Proteinas n-glicosiladas recombinantes de celulas procariotas.
US8063063B2 (en) 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
ES2536426T3 (es) 2006-03-23 2015-05-25 Novartis Ag Compuestos de imidazoquinoxalina como inmunomoduladores
JP4791866B2 (ja) 2006-03-24 2011-10-12 国立大学法人秋田大学 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
EP3124497B1 (en) 2007-09-14 2020-04-15 Adimab, LLC Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CA2711503A1 (en) 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
CN101983070B (zh) * 2008-02-20 2016-03-30 格林考瓦因有限公司 由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物
CA2760096C (en) 2009-04-27 2018-10-30 Immuron Limited Anti-lps enriched immunoglobulin preparation for use in treatment and/or prophylaxis of a pathologic disorder.
NO2501406T3 (sr) 2009-11-19 2018-05-19
KR102318383B1 (ko) 2010-07-16 2021-10-27 아디맵 엘엘씨 항체 라이브러리
CA2819366A1 (en) 2010-12-10 2012-06-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel formulations which mitigate agitation-induced aggregation of immunogenic compositions
US20140336366A1 (en) 2011-09-06 2014-11-13 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
US9932598B2 (en) 2012-08-02 2018-04-03 The Regents Of The University Of California Metabolic engineering of microbial organisms
BR112015004817A2 (pt) 2012-09-10 2017-07-04 Glycovaxyn Ag bioconjugados compreendendo antígenos modificados e seus usos
ES2905107T3 (es) 2012-10-12 2022-04-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de modificación de células hospedadoras
EP3508579B1 (en) 2012-11-07 2021-06-30 GlaxoSmithKline Biologicals SA Production of recombinant vaccine in e. coli by enzymatic conjugation
ES2750525T3 (es) 2012-12-27 2020-03-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos y composiciones relacionados con CRM197
PL2945651T3 (pl) 2013-01-17 2018-08-31 Arsanis Biosciences Gmbh Przeciwciało swoiste wobec E.coli MDR
MX371513B (es) 2013-10-11 2020-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Metodos de modificacion de celulas huespedes.
EP2870974A1 (en) 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
WO2015117711A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 Arsanis Biosciences Gmbh E. coli specific antibody sequences
WO2015124769A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Glycovaxyn Ag Novel polysaccharide and uses thereof
CN107614679B (zh) 2014-12-30 2026-04-07 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于蛋白糖基化的组合物和方法
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
CA3134216A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
FR3098334B1 (fr) 2019-07-05 2021-07-23 Airbus Operations Sas Procédé et système de surveillance d’un état de conscience d’un opérateur dans un poste de pilotage d’un aéronef
IL307247A (en) 2021-04-01 2023-11-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Production of E. Coli O18 bioconjugates

Also Published As

Publication number Publication date
FI3110441T3 (fi) 2024-05-06
TW201615211A (zh) 2016-05-01
JP2017507178A (ja) 2017-03-16
US20150238588A1 (en) 2015-08-27
WO2015124769A1 (en) 2015-08-27
PH12016501671B1 (en) 2016-10-03
CA2940547C (en) 2021-01-05
EA035991B9 (ru) 2020-10-21
IL247344B (en) 2020-06-30
CN106535927A (zh) 2017-03-22
JP6276427B2 (ja) 2018-02-07
PL3110441T3 (pl) 2024-08-05
EA035991B1 (ru) 2020-09-10
AR100859A1 (es) 2016-11-09
ES2978870T3 (es) 2024-09-23
US11738076B2 (en) 2023-08-29
CA2940547A1 (en) 2015-08-27
KR20160125494A (ko) 2016-10-31
AU2015220723B2 (en) 2017-12-14
AU2015220723C1 (en) 2018-04-05
US10940192B2 (en) 2021-03-09
US10441647B2 (en) 2019-10-15
CL2016002123A1 (es) 2018-02-16
AU2015220723A1 (en) 2016-09-22
TWI639439B (zh) 2018-11-01
NZ723328A (en) 2018-01-26
DK3110441T3 (da) 2024-05-06
IL247344A0 (en) 2016-11-30
US12214029B2 (en) 2025-02-04
US20170340718A1 (en) 2017-11-30
KR101855142B1 (ko) 2018-05-08
US9700612B2 (en) 2017-07-11
PH12016501671A1 (en) 2016-10-03
BR112016019341A2 (pt) 2018-01-16
SG11201606889PA (en) 2016-09-29
EP3110441A1 (en) 2017-01-04
US20230364214A1 (en) 2023-11-16
JP6771499B2 (ja) 2020-10-21
MX380438B (es) 2025-03-12
HRP20240847T1 (hr) 2024-09-27
PT3110441T (pt) 2024-05-03
HUE066507T2 (hu) 2024-08-28
DK3110441T5 (da) 2024-10-14
EP3110441B1 (en) 2024-04-03
ZA201605858B (en) 2025-05-28
SI3110441T1 (sl) 2024-07-31
LT3110441T (lt) 2024-04-25
US20200129605A1 (en) 2020-04-30
JP2018087197A (ja) 2018-06-07
CN106535927B (zh) 2019-09-20
US20210154286A1 (en) 2021-05-27
EA201691478A1 (ru) 2017-02-28
MX2016011055A (es) 2017-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12214029B2 (en) Polysaccharide and uses thereof
JP7370391B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲート、その製造方法およびその使用方法
JP7589164B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを製造する方法、その組成物およびその使用方法
JP6682451B2 (ja) 改変型宿主細胞およびその使用
CN115803087B (zh) 多价疫苗组合物及其用途
CN116209753A (zh) 肺炎克雷伯氏菌o-抗原疫苗
JP2014529396A (ja) パスツレラワクチン
Duke et al. Development and immunogenicity of a prototype multivalent group B Streptococcus bioconjugate vaccine
BR112016019341B1 (pt) Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada
EA046206B1 (ru) Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения