ES2978870T3 - Polisacárido novedoso y usos del mismo - Google Patents

Polisacárido novedoso y usos del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2978870T3
ES2978870T3 ES15706459T ES15706459T ES2978870T3 ES 2978870 T3 ES2978870 T3 ES 2978870T3 ES 15706459 T ES15706459 T ES 15706459T ES 15706459 T ES15706459 T ES 15706459T ES 2978870 T3 ES2978870 T3 ES 2978870T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
coli
antigen
host cell
carrier protein
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15706459T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Kowarik
Michael Wetter
Stefan Kemmler
Micha Häuptle
Veronica Gambillara
Manuela Mally
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2978870T3 publication Critical patent/ES2978870T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

En el presente documento se proporciona un nuevo polisacárido O de E. coli, O25B. También se proporcionan en el presente documento células huésped procariotas que comprenden enzimas (por ejemplo, glicosiltransferasas) utilizadas en la producción de O25B. Las células huésped proporcionadas en el presente documento producen bioconjugados de O25B, en donde dichos bioconjugados comprenden O25B unido a una proteína portadora. Además, en el presente documento se proporcionan composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden O25B y/o bioconjugados que comprenden O25B. Dichas composiciones se pueden utilizar como vacunas contra la infección con ExPEC, y pueden comprender además uno o más bioconjugados adicionales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polisacárido novedoso y usos del mismo
1. Introducción
En el presente documento se divulgan la estructura del antígeno deE. coliO25B, así como los usos de O25B, los métodos de preparación de O25B y los bioconjugados que comprenden O25B. Los solicitantes han identificado el complejo génico deE. coliresponsable de la producción de O25B y han caracterizado completamente la estructura del antígeno O25B. Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un bioconjugado de un antígeno O25 deE. coli.En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos capaces de producir O25B en células hospedadoras. También se proporcionan en el presente documento células hospedadoras, por ejemplo, células hospedadoras genomanipuladas de forma recombinante, que comprenden ácidos nucleicos capaces de producir o 25B. Dichas células hospedadoras se pueden usar para generar bioconjugados que comprenden O25B unido a una proteína transportadora, que se puede usar, por ejemplo, en la formulación de agentes terapéuticos (por ejemplo, vacunas). El antígeno O25B descrito en el presente documento también es útil en la generación de anticuerpos, que pueden usarse, por ejemplo, en métodos terapéuticos tales como la inmunización pasiva de sujetos. Además, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden O25B, solo o junto con otros antígenos deE. coli(por ejemplo, O1, O2 y O6 y subserotipos de los mismos), para su uso en métodos terapéuticos, por ejemplo, vacunación de hospedadores contra la infección conE. coli(por ejemplo,E. colipatógena extraintestinal, tal como uropatógena).
2. Antecedentes
LaE. colipatógena extraintestinal (ExPEC) causa una amplia diversidad de infecciones que son responsables de una morbilidad, mortalidad y costes significativos anualmente. Las infecciones del tracto urinario se encuentran entre las afecciones más frecuentes causadas por la ExPEC en los seres humanos. Sin embargo, la ExPEC también causa afecciones potencialmente mortales, tales como meningitis y septicemia.
La resistencia bacteriana a los antibióticos es una preocupación importante en la lucha contra la infección bacteriana, y las cepas deE. coliresistentes a múltiples fármacos (MDR, por sus siglas en inglés) son cada vez más prevalentes. Schitoet al.,2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; y Pitoutet al.,2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther.
10(10):1165-1176. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de vacunas eficaces contra la ExPEC. También se reconocen el documento WO 2009/104074 A2, que trata de bioconjugados elaborados a partir de proteínas N-glucosiladas recombinantes de células procarióticas, y el documento WO 2013/034664 A1, que trata de vacunas bioconjugadas elaboradas en células procarióticas.
3. Sumario
Cualquierreferencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas, medicamentos y similares de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
La presente invención proporciona una composición que comprende un bioconjugado de un antígeno O25B deE. coliunido por N a una proteína transportadora, en donde el antígeno O25B deE. colicomprende la estructura de Fórmula O25B':
en donde n es un número entero entre 1 y 30.
En un aspecto, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaces de producir el polisacárido novedoso divulgado en el presente documento,<o>25B deE. coli.Por consiguiente, la presente invención proporciona además una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante, que comprende:
a. una secuencia de nucleótidos que codifica:
i. dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa;
ii. dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa;
iii. Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa;
iv. dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa;
v. flipasa del antígeno O;
vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa;
vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa;
viii. polimerasa del antígeno O;
ix. O-acetiltransferasa;
x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa y
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacariltransferasa; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora, en donde la proteína transportadora comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO: 15).
También se proporcionan en el presente documento células hospedadoras que comprenden ácidos nucleicos que codifican enzimas (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaces de producir otros antígenos deE. coli,por ejemplo, O25A, O1, O2 y O6, y subserotipos de los mismos. Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento pueden expresar de forma natural ácidos nucleicos específicos para la producción de un antígeno O de interés, o se puede hacer que las células hospedadoras expresen tales ácidos nucleicos, es decir, en determinadas realizaciones dichos ácidos nucleicos son heterólogos de las células hospedadoras.
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican enzimas adicionales activas en la N-glucosilación de proteínas, por ejemplo, la célula hospedadora proporcionada en el presente documento puede comprender además un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa o ácidos nucleicos que codifican otras glucosiltransferasas. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora, por ejemplo, una proteína a la que se pueden unir oligosacáridos y/o polisacáridos para formar un bioconjugado. En una realización específica, la célula hospedadora esE. coli.Véase la Sección 5.3.
También se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende un complejo génico rfb(upec138) deE. coli(SEQ ID NO: 12), o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfb(upec138) deE. coli(SEQ ID NO: 12). En un caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (<s>E<q>ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
También se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende un complejo génico rfb(upec163) deE. coli,o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfib(upec163) deE. coli.En un caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
También se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende un complejo génico rfb(upec177) deE. coli,o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfb(upec177) deE. coli.En un caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
También se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante para comprender (por ejemplo, mediante la introducción de uno o más vectores/plásmidos en la célula hospedadora) uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes genes (o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a uno de los siguientes genes):rmlB(SEQ ID NO:1),rmlD(SEQ ID NO:2),rmlA(SEQ ID NO:3),rmlC(SEQ ID NO:4),wzx(SEQ ID NO:5),wekA(SEQ ID NO:6),wekB(SEQ ID NO:7),wzy(SEQ ID NO:8),wbbJ (SEQID NO:9),wbbK(SEQ ID NO:10) y/owbbL(SEQ ID NO:11). En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, una oligosacariltransferasa heteróloga). En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
También se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante para comprender (por ejemplo, mediante la introducción de uno o más vectores/plásmidos en la célula hospedadora) uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes (i) dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa; (ii) dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa; (iii) Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa; (iv) dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa; (v) flipasa del antígeno O; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa; (vii) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa; (viii) polimerasa del antígeno O; (ix) O-acetiltransferasa; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa; y/o (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa. En un caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, una oligosacariltransferasa heteróloga). En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras procarióticas proporcionadas en el presente documento comprenden una eliminación o inactivación funcional de uno o más genes. Véase la Sección 5.3.1. En una realización específica, uno o más del genwaaL,gengtrA,gengtrB,engtrSo el complejo génicorfb(o un gen o genes en el complejorfb)se eliminan o se inactivan funcionalmente del genoma de una célula hospedadora procariótica proporcionada en el presente documento.
Las proteínas transportadoras expresadas por las células hospedadoras procariotas proporcionadas en el presente documento se pueden seleccionar de cualquier proteína transportadora conocida por los expertos en la técnica, por ejemplo, exotoxina A desintoxicada deP. aeruginosa(EPA; véase, por ejemplo, Ihssen,et al.,(2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A desintoxicada de S.aureus,factor de agregación A, factor de agrupación B, FimH deE. coli,FimHC deE. coli,enterotoxina termolábil deE. coli,variantes desintoxicadas de la enterotoxina termolábil deE. coli,subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes desintoxicadas de la toxina colérica, proteína Sat deE. coli,el dominio pasajero de la proteína Sat deE. coli,neumolisina deStreptococcus pneumoniaey variantes desintoxicadas de la misma, AcrA de C.jejuniy glucoproteínas naturales deC. jejuni.En una realización específica, la proteína transportadora expresada por una célula hospedadora procariota proporcionada en el presente documento es exotoxina dePseudomonas(EPA) desintoxicada. En determinadas realizaciones, la proteína transportadora de una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende una secuencia señal para dirigir la proteína transportadora al espacio periplásmico de la célula hospedadora. En una realización específica, la secuencia señal es de DsbA deE. coli,porina A de la membrana externa deE. coli(OmpA), proteína de unión a maltosa deE. coli(MalE), pectato liasa deErwinia carotovorans(PelB), FlgI, NikA o endoxilanasa deBacillussp. (XynA), enterotoxina termolábil deE. coliLTIIb, endoxilanasa XynA deBacilluso flagelina deE. coli(FlgI). En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína transportadora expresada por las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento se ha genomanipulado (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes) para codificar una o más de las secuencias consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); y/o la secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras expresadas por las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden dos, tres, cuatro, cinco o más de dichas secuencias consenso. Véase la Sección 5.3.2.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para producir una proteína transportadora N-glucosilada (también denominada en el presente documento bioconjugado) que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida por N a un antígeno O deE. coli(por ejemplo, O25B deE. coli),comprendiendo dicho método cultivar una célula hospedadora descrita en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción de proteínas, y purificar la proteína transportadora N-glucosilada. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un método para preparar una proteína transportadora N-glucosilada que comprende un antígeno O25B deE. coli,comprendiendo dicho método:
a. cultivar una célula hospedadora de la presente invención; y
b. purificar una proteína transportadora N-glucosilada que comprende el antígeno O25B deE. coli.
Los métodos para producir proteínas usando células hospedadoras, por ejemplo,E. coli,y aislar proteínas producidas por células hospedadoras, se conocen bien en la técnica. Véase la Sección 5.3.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento bioconjugados producidos por las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento. En una realización específica, se proporciona en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida porNa<o>25B deE. coli.Véase la Sección 5.4.
También se divulga en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un compuesto de Fórmula O25B, presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En un caso específico, la proteína transportadora está unida porNal antígeno O de Fórmula O25B.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un bioconjugado de un antígeno O25B deE. coliunido por N a una proteína transportadora (por ejemplo, EPA, en donde el antígeno O25B deE. colicomprende la estructura de Fórmula O25B', presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En una realización específica, la proteína transportadora está unida por N al antígeno O de Fórmula O25B'.
También se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de una cepa deE. coliExPEC, en donde dicha cepa produce O25B. En otro caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de la cepa deE. coliupec138. En un caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de la cepa deE. coliupec163. En otro caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de la cepa deE. coliupec177. Véase la Sección 5.2.
También se divulga en el presente documento una población de macromoléculas aisladas de Fórmula O25B, presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En un caso específico, n de al menos el 80 % de las macromoléculas en la población está entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una población de macromoléculas aisladas de Fórmula O25B', presentada a continuación
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En una realización específica, n de al menos el 80 % de las macromoléculas en la población está entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20.
En otro aspecto, se divulgan en el presente documento métodos para generar anticuerpos anti O25B usando O25B y/o un bioconjugado que comprende O25B. Además, en el presente documento se divulgan anticuerpos producidos de acuerdo con dichos métodos. Véase la Sección 5.5.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden los bioconjugados proporcionados en el presente documento y/o las macromoléculas (o poblaciones de las mismas) proporcionadas en el presente documento. Véase la Sección 5.6.
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende una macromolécula que comprende una estructura de Fórmula O25B:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado de un antígeno O25B deE. coliunido por N a una proteína transportadora en donde el antígeno O25B deE. colicomprende la estructura de Fórmula O25B':
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20.
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado descrito en el presente documento, en donde dicho bioconjugado comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un compuesto de Fórmula O25B, presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En un caso específico, la proteína transportadora está unida por N al antígeno O de Fórmula O25B'.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado descrito en el presente documento, en donde dicho bioconjugado comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida por N a un antígeno O25B deE. colide Fórmula O25B', presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En una realización específica, la proteína transportadora está unida porNal antígeno O de Fórmula O25B'.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento comprenden uno o más antígenos O deE. coliadicionales, en donde dichos antígenos no son O25B de (por ejemplo, la Fórmula O25B o la Fórmula O25B'), por ejemplo, antígenos O deE. coli(por ejemplo, ExPEC) distintos de aquellos de un serotipo O25B deE. coli,y/o uno o más bioconjugados que comprenden una proteína transportadora unida a un antígeno O deE. coli,en donde dicho antígeno no es O25B (por ejemplo, la Fórmula O25B o la Fórmula O25B'). Dichas composiciones pueden comprender una o más macromoléculas adicionales que comprenden un antígeno O de ExPEC y/o uno o más bioconjugados adicionales, por ejemplo, una macromolécula O1A, O2 y/u O6 y/o un bioconjugado O1A, O2 y/u O6.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende una o más macromoléculas adicionales que comprenden un antígeno O de ExPEC y/o uno o más bioconjugados adicionales, además de un bioconjugado O25B (por ejemplo, un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a la Fórmula O25B o la Fórmula o 25B'), en donde dichas macromoléculas adicionales comprenden una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete macromoléculas o bioconjugados que comprenden dichas macromoléculas, además de un bioconjugado O25B (por ejemplo, un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a la Fórmula O25B o la Fórmula O25B'), en donde dichas macromoléculas adicionales comprenden una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
También se divulga una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B) y (ii) una macromolécula O1 o un bioconjugado que comprende O1. En un caso específico, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otro caso específico, dicha macromolécula O1 es O1A. En otro caso específico, dicha macromolécula O1 es O1B. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1C.
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25<a>u O25B) y (ii) una macromolécula O2 o un bioconjugado que comprende<o>2. En un caso específico, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B.
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B) y (ii) una macromolécula O6 (por ejemplo, una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado (O6Glc) o un monosacárido GlcNAc ramificado (O6GlcNAc)) o un bioconjugado que comprende O6. En un caso específico, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otro caso específico, dicha macromolécula O6 es una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado (O6Glc).
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende al menos dos de los siguientes: (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B) o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B); (ii) una macromolécula O1 o un bioconjugado que comprende O1; (iii) una O2 o un bioconjugado que comprende O2 ; y/o (iv) una macromolécula O6 (por ejemplo, una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado o un monosacárido GlcNAc ramificado) o un bioconjugado que comprende O6. En un caso específico, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otro caso específico, dicha macromolécula O1 es O1A. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1B. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1C. En otro caso específico, dicha macromolécula O6 es una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado (también denominado en el presente documento O6Glc).
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende una macromolécula O25B, una macromolécula O1A, una macromolécula O2, y una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado. En determinados casos, dichas macromoléculas se conjugan con proteínas transportadoras.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones de la presente invención para su uso en métodos para prevenir una infección de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, por ExPEC, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) descrita en el presente documento. Véase la Sección 5.7.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones de la presente invención para su uso en métodos para tratar una infección de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, en donde el sujeto está infectado con ExPEC, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) descrita en el presente documento. Véase la Sección 5.7.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones de la presente invención para su uso en métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra ExPEC en un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) descrita en el presente documento. Véase la Sección 5.7.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones de la presente invención para su uso en métodos para inducir la producción de anticuerpos opsonofagocíticos contra ExPEC en un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) descrita en el presente documento. Véase la Sección 5.7.
Términos y abreviaturas:
OPS: Polisacárido O; el antígeno O de las bacterias gramnegativas. Los OPS también se denominan en el presente documento antígeno O.
Complejo rfb: Un complejo génico (por ejemplo, un complejo génico deE. coli)que codifica la maquinaria enzimática capaz de sintetizar una estructura de cadena principal del antígeno O. La expresión complejorfbpuede aplicarse a cualquier complejo biosintético de antígeno O, incluyendo aquellos de bacterias que no pertenecen al géneroEscherichia.
waaL:El gen de ligasa del antígeno O que codifica una enzima unida a membrana con un sitio activo situado en el periplasma. La enzima codificada transfiere el antígeno O unido al fosfato de undecaprenilo (UPP) al núcleo del lípido A, formando un lipopolisacárido.
wecA:El primer gen codificado en el complejo wec. La proteína codificada cataliza la transferencia de un GlcNAcfosfato de UDP-GlcNAc a UPP para formar GlcNAc unido a UPP.
ECA: Antígeno común enterobacteriano.
UR: Unidad de repetición. Como se usa en el presente documento, la UR se establece igual a la unidad de repetición biológica, URB. La URB describe la UR de un antígeno O tal como se sintetizain vivo.
UPP: Pirofosfato de undecaprenilo.
LLO: Oligosacárido ligado a lípidos.
2AB: 2 Amino benzamida.
MS: Espectroscopía de masas.
O25B: El término O25B se refiere al antígeno O25B deE. coliidentificado en el presente documento (un subserotipo del serotipo deE. coliO25). La referencia a O25B en el presente documento abarca la Fórmula O25B y la Fórmula O25B', ambas identificadas anteriormente.
O25A: el término O25A se refiere al antígeno O25A deE. coli(un subserotipo del serotipo deE. coliO25). La referencia a O25A en el presente documento abarca la Fórmula O25A y la Fórmula O25A', ambas identificadas anteriormente. O1A: el término O1A se refiere al antígeno O1A deE. coli(un subserotipo del serotipo deE. coliO1). La referencia a O1A en el presente documento abarca la Fórmula O1A y la Fórmula O1A', ambas identificadas anteriormente.
O1B: el término O1B se refiere al antígeno O1B deE. coli(un subserotipo del serotipo deE. coliO1). La referencia a O1B en el presente documento abarca la Fórmula O1B y la Fórmula O1B', ambas identificadas anteriormente.
O1C: el término O1C se refiere al antígeno O1C deE. coli(un subserotipo del serotipo deE. coliO1). La referencia a O1C en el presente documento abarca la Fórmula O1C y la Fórmula O1C', ambas identificadas anteriormente.
O2: el término O2 se refiere al antígeno O2 deE. coli(serotipo deE. coli O2).La referencia a O2 en el presente documento abarca la Fórmula O2 y la Fórmula O2', ambas identificadas anteriormente.
O6: el término O6 se refiere al antígeno O6 deE. coli(serotipo deE. coliO6). La referencia a O6 en el presente documento abarca la Fórmula O6 y la Fórmula O6', ambas identificadas anteriormente.
Bioconjugado: El término bioconjugado se refiere a un conjugado entre una proteína (por ejemplo, una proteína transportadora) y un antígeno, por ejemplo, un antígeno O (por ejemplo, O25B) preparado en un entorno de célula hospedadora, en donde la maquinaria de la célula hospedadora une el antígeno a la proteína (por ejemplo, enlaces N). Los glucoconjugados incluyen bioconjugados, así como conjugados de antígeno de azúcar (por ejemplo, oligo y polisacáridos)-proteína preparados por otros medios, por ejemplo, mediante enlace químico de la proteína y el antígeno de azúcar.
El término "aproximadamente", cuando se usa junto con un número, se refiere a cualquier número dentro de ±1, ±5 o ±10 % del número de referencia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz", en el contexto de la administración de una terapia (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento) a un sujeto se refiere a la cantidad de una terapia que tiene uno o más efectos profilácticos y/o terapéuticos). En determinadas realizaciones, una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) reducir o mejorar la gravedad de una infección por ExPEC o síntoma asociado con la misma; (ii) reducir la duración de una infección por ExPEC o síntoma asociado con la misma; (iii) prevenir la progresión de una infección por ExPEC o síntoma asociado con la misma; (iv) causar la regresión de una infección por ExPEC o síntoma asociado con la misma; (v) prevenir el desarrollo o la aparición de una infección por ExPEC, o síntoma asociado con la misma; (vi) prevenir la reaparición de una infección por ExPEC o síntoma asociado con la misma; (vii) reducir la insuficiencia orgánica asociada con una infección por ExPEC; (viii) reducir la hospitalización de un sujeto que tiene una infección por ExPEC; (ix) reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que tiene una infección por ExPEC; (x) aumentar la supervivencia de un sujeto con una infección por ExPEC; (xi) eliminar una infección por ExPEC en un sujeto; (xii) inhibir o reducir la replicación de ExPEC en un sujeto; y/o (xiii) potenciar o mejorar el uno o más efectos profilácticos 0 terapéuticos de otra terapia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "en combinación", en el contexto de la administración de dos o más terapias a un sujeto, se refiere al uso de más de una terapia. El uso de la expresión "en combinación" no restringe el orden en el que se administran las terapias a un sujeto. Por ejemplo, se puede administrar una primera terapia (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento) antes (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente o después (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) de la administración de una segunda terapia a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal (por ejemplo, aves, reptiles y mamíferos). En otra realización, un sujeto es un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, un camello, burro, cebra, vaca, cerdo, caballo, cabra, oveja, gato, perro, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, chimpancé y un ser humano). En determinadas realizaciones, un sujeto es un animal no humano. En algunas realizaciones, un sujeto es un animal de granja o una mascota (por ejemplo, un perro, gato, caballo, cabra, oveja, cerdo, burro o pollo). En otra realización, un sujeto es un ser humano. En otra realización, un sujeto es un bebé humano. En otra realización, un sujeto es un niño humano. En otra realización, un sujeto es un adulto humano. En otra realización, un sujeto es un ser humano anciano. En otra realización, un sujeto es un bebé humano prematuro. Los términos "sujeto" y "paciente" pueden usarse en el presente documento indistintamente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "bebé humano prematuro" se refiere a un bebé humano nacido con menos de 37 semanas de edad gestacional.
Como se usa en el presente documento, la expresión "bebé humano" se refiere a un ser humano de recién nacido a 1 año de edad.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ser humano en edad de empezar a caminar" se refiere a un ser humano de 1 a 3 años.
Como se usa en el presente documento, la expresión "niño humano" se refiere a un ser humano de 1 a 18 años.
Como se usa en el presente documento, la expresión "adulto humano" se refiere a un ser humano de 18 años o más.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ser humano anciano" se refiere a un ser humano de 65 años o más.
. Breve descripción de las figuras
Figura 1:Ruta para la biosíntesis de O25A. Las flechas indican conversiones enzimáticas individuales, se indican los nombres de las enzimas. Los azúcares activados por nucleótidos se preparan en el citoplasma mediante enzimas proporcionadas en el complejo del antígeno O o mediante enzimas constitutivas de la célula hospedadora gramnegativa. Una glucosilfosfatotransferasa (WecA) añade fosfato de D-GlcNAc al fosfato de undecaprenilo (UP), formando GlcNAc-UPP. A continuación, las glucosiltransferasas específicas alargan aún más la molécula de UPP-GlcNAc añadiendo monosacáridos que forman el oligosacárido de unidad de repetición biológica (URB) (WekABC WbuB). El orden indicado de las enzimas no se refiere a la secuencia de eventos durante la síntesis de URB (indicado por < >). A continuación, Wzx invierte la URB en el espacio periplásmico. Wzy polimeriza linealmente las URB periplásmicas para formar el polisacárido del antígeno O. La longitud del polímero está controlada por Wzz. Muchos oligo y polisacáridos bacterianos se ensamblan en UPP y a continuación se transfieren a otras moléculas, es decir, UPP es una plataforma de construcción general para oligo y polisacáridos en las bacterias. EnE. coliy en la mayoría de las demás bacterias gramnegativas, la enzima WaaL deE. colitransfiere el antígeno O de UPP al núcleo del lípido A para formar un lipopolisacárido (LPS).
Figura 2:Complejo rfb, estructura y ruta para la síntesis del antígeno O dependiente de wzx/wzy, ilustrado por el complejorfbde O25A deE. coliy el antígeno O.A.Se muestra la estructura del complejo rfb de la cepa deE. coliE47a, ubicada entre los genesgalFygnd.Los genes se muestran como flechas y el relleno se indica según la función de los productos genéticos: el color negro son genes para la biosíntesis de monosacáridos activados por nucleótidos que no forman parte del repertorio constitutivo deE. coli(están codificados en otras partes del genoma), las rayas diagonales de color negro/blanco son glucosiltransferasas responsables de añadir unidades de monosacáridos individuales a las URB, flipasa wzx y polimerasa wzy.B.Estructura química de la URB del antígeno O O25A como se presenta (véase Fundinet al.,2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4).
Figura 3. A.Estructuras de las URB de O25A, O25B y O16.B.Comparación del complejo de biosíntesis del antígeno O (complejorfb)entre O25A, O25B y O16. Los genes con relleno de color negro son genes implicados en la biosíntesis de monosacáridos activados por nucleótidos, las rayas diagonales son genes de glucosiltransferasa predichos, el relleno de color gris indica genes de procesamiento o transporte de URB, y las rayas verticales muestran homologías de O-acetiltransferasa. Los cuadros de color gris indican puntuaciones de homología superiores al 25 % entre los genes; se indican los valores detallados. Las flechas finas de color negro y gris muestran las ubicaciones de hibridación de los oligonucleótidos de PCR de tipificación para wzy (específicos de O25A y O25B) y la región 3' de O25B (específicos de O25B).
Figura 4.Distribución de serotipos del estudio epidemiológico. Los serotipos del antígeno O deE. coliidentificados en muestras de especímenes de ITU adquiridas extrahospitalarias se agruparon según su aparición
Figura 5.Análisis de tinción con plata y Western de LPS de aislados clínicos con un fenotipo de aglutinación positivo para O25. Los números de cepa se indican encima de los carriles del gel. Se cultivaron clones individuales y se recogió biomasa normalizada con DO mediante centrifugación. Los sedimentos se disolvieron en tampón SDS PAGE Lammli y se trataron con proteinasa K para hidrolizar todas las proteínas de la muestra. Se aplicó tinción con plata estándar al gel PAGE que se muestra en A, y en B se muestra el sondeo de membranas de nitrocelulosa que contienen material electrotransferido de geles analizados de manera idéntica con antisuero de aglutinación de O25 comercial.
Figura 6.T razas de HPLC de 2AB de muestras de O25A y O25B. Se prepararon muestras de LLO marcadas con 2AB de las cepas upecl 38 (línea discontinua) y upec436 (línea continua). Se recopilaron los picos y las estructuras de URB correspondientes deducidas del patrón de fragmentación por MS/MS detallado en la figura 7 se indican con flechas.
Figura 7.Serie de iones de fragmentación por MS/MS obtenida de los picos indicados en la figura 6 en tiempos de elución de 50' y 62' de iones madre m/z = 1022 (A; de la cepa upecl38) o m/z = 1021 (B; de upec_436). Las series de iones se muestran en relación con el dibujo de la supuesta URB.
Figura 8.Desacetilación de una muestra de LLO marcada con 2AB procedente de un aislado clínico positivo para O25B. Se recogió el pico específico de O25B a los 50' de tiempo de elución obtenido de LLO marcados con 2AB de un aislado clínico con el genotipo O25B, y se analizó mediante HPLC en fase normal después del tratamiento con (línea continua) o sin (línea discontinua) NaOH para hidrólisis de los grupos O-acetilo del ND Cal's Special Patent Program.
Figura 9.Análisis de la composición de monosacáridos de los bioconjugados O25A y O25B. Se produjeron, se purificaron y se procesaron bioconjugados O25 para el análisis de la composición de monosacáridos. Se muestran trazas de muestras de HPLC C18. Las muestras derivadas de O25A (continua) y O25B (discontinua) se comparan con una mezcla de monosacáridos de fuentes comerciales (Glc, GlcNAc, Rha, FucNAc). Los tiempos de elución de los monosacáridos se indican mediante flechas.
Figura 10.Caracterización de bioconjugados O25A. El volumen final purificado de bioconjugados 4S-EPA-O25A se analizó mediante SDS PAGE y se visualizó mediante tinción directa de Coomassie (C) y transferencia de Western usando antisuero anti EPA o antisuero anti O25.
Figura 11.Caracterización de bioconjugados O25B. El volumen final purificado de bioconjugados 4S-EPA-O25B se analizó mediante SDS PAGE y se visualizó mediante tinción directa de Coomassie (C) y transferencia de Western usando antisuero anti EPA o antisuero anti O25.
Figura 12.Biosíntesis genética y estructura química del antígeno O O1.A.Se muestra el complejorfby los genes flanqueantes de la cepa O1A deE. coliG1632 (N.° DE REGISTRO GU299791). Los códigos de color negro, gris y a rayas son los mismos que los de la figura 2, descrita anteriormente. B. Se muestran las estructuras químicas de la URB de los subserotipos O1.
Figura 13.Análisis de LPS de aislados clínicos con fenotipo de aglutinación positivo para O1.A.Tinción con plata yB.Transferencia de Western con antisuero anti O1.
Figura 14.Identificación de O1A en aislados clínicos O1. Se analizaron muestras de LLO marcadas con 2AB de aislados clínicos O1 mediante identificación de LLO.A.Se muestran trazas de HPLC en fase normal desde 60' en adelante. El valor inicial de cada muestra se cambió para visualizar picos de comigración. El número upec indica la cepa clínica.B.Serie de iones de fragmentación por MS/MS de m/z = 1849,6 (aducto de Na+). El dibujo asigna el patrón de iones de fragmentación y probables roturas de enlaces glucosídicos en un oligosacárido de 2 URB de O1A.
Figura 15.Bioconjugados O1. Prueba de expresión a pequeña escala de la glucoproteína EPA-O1 mediante células deE. coli(W3110ArfbO16:.rfbO1AwaaL) transformadas con un plásmido de expresión de EPA (pGVXN659) y cinco plásmidos de expresión de pglB diferentes.A,p114. expresión sin codones optimizados, etiqueta HA que contiene pglB;B,p939. de codones optimizados, etiqueta hA que contiene pglB;C,p970. de codones optimizados, etiqueta HA con pglB eliminado;D,de codones optimizados, etiqueta<h>A que contiene un sitio de glucosilación natural N534Q con pglB eliminado; yE,de codones optimizados, etiqueta HA eliminada, un sitio de glucosilación natural N534Q con pglB eliminado. Las células se cultivaron y se indujeron con arabinosa e IPTG, después de la incubación durante una noche a 37 °C, las células se recolectaron y se prepararon extractos de proteínas periplásmicos. A continuación, los extractos se separaron mediante SDS PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron usando un suero anti EPA.Figura 16.Los bioconjugados descritos en la figura 15, detectados con suero anti O1.
Figura 17.Estructuras genéticas y químicas de O6.A.Complejo de biosíntesis de antígeno O (complejorfb)y genes flanqueantes deE. coliCFT073 (Genbank AE014075.1). Se indican las funciones génicas putativas de acuerdo con BLAST y se indican los genes específicos para la biosíntesis del antígeno O O6.B.Estructuras químicas de las estructuras de URB de O6 informadas (Jannet al.,Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225).
Figura 18.Identificación de O6 con Glc ramificada. Se analizaron muestras de LLO marcadas con 2AB de aislados clínicos O6 mediante identificación de LLO.A.Se muestran trazas de HPLC en fase normal desde 60' en adelante. Se prepararon extractos a partir de las cepas de referencia CCUG11309 (línea delgada y continua) y 11311 (discontinua) que contenían ramificaciones de Glc y GlcNAC. La superposición muestra diferencias claras en los tiempos de elución de las URB indicadas.B.Los extractos de aislados clínicos como se indican por el número upec se comparan con las cepas de referencia de A.
Figura 19.Biosíntesis genética y estructuras químicas del antígeno O O2.A.Complejo de biosíntesis de antígeno O (complejorfb)y genes flanqueantes de la cepa deE. coliG1674 (n.° de registro GU299792). Los códigos de color negro, gris y a rayas son los descritos en figuras anteriores (por ejemplo, la figura 2).B.Estructura química de URB del antígeno O2.
Figura 20.Análisis de LPS de aislados clínicos con fenotipo de aglutinación positivo para O2.A.Tinción con plata.
B.Transferencia de Western con antisuero anti O2.
Figura 21.Análisis de OPS de la cepa W3110 AwaaL ArfbW3110..rfbO2 AwekS. Se muestra un cromatograma del análisis de LLO marcado con 2AB mediante HPLC en fase normal.
Figura 22.Reconocimiento de LPS O25A y O25B mediante antisueros de MBP anti O25A y anti O25B en un análisis de transferencia de Western. Dos membranas de nitrocelulosa que se obtuvieron después de electrotransferir muestras de LPS preparadas a partir de upec436 (O25A) y upec138 (O25B) y separadas mediante SDS-PAGE. El patrón de carga fue idéntico para ambas membranas, carril izquierdo. LPS o 25A de upec438, carril central. LPS O25B de upec 138. Se usaron bioconjugados de MBP para la inmunización de conejos.Panel izquierdo:Antisuero de MBP anti O25B;panel derecho:Antisuero de MBP anti O25A.
Figura 23.Espectros de MS/MS de URB de OPS O2. Espectro de MS/MS del aducto de Na+ con m/z = 989,4 del pico de elución a los 43,5 min de extractos LLO marcados con 2AB de la cepa CCUG25. Se indica el dibujo de URB de O2 y la serie de iones Y asociada, lo que confirma la secuencia esperada de monosacáridos.
Figura 24.Bioconjugados de EPA que contienen los antígenos O1A, O2 y O6 usados en el estudio preclínico. Los glucanos de OPS se produjeron y se purificaron, se analizaron mediante SDS PAGE y se visualizaron mediante tinción de Coomassie.
Lafigura 25muestra las valoraciones medias de ELISA obtenidas con sueros de ratas inmunizadas con O1A-EPA (G1), proteína transportadora sola (G10), TBS (G11), o una composición tetravalente compuesta por EPA-O1A, O2, O6Glc y O25B (G12), sondeados contra una placa ELISA recubierta con O1ALPS purificado de la cepa upec032.
Lafigura 26muestra las valoraciones medias de ELISA obtenidas con sueros de ratas inmunizadas con O2-EPA (G4), proteína transportadora sola (G10), TBS (G11), o una composición tetravalente compuesta por EPA-O1A, O2, O6Glc y O25B (G12), sondeados contra una placa ELISA recubierta con O2 LPS purificado de las cepas CCUG25.
Lafigura 27muestra las valoraciones medias de ELISA obtenidas con sueros de ratas inmunizadas con O6Glc-EPA (G7), proteína transportadora sola (G10), TBS (G11), o una composición tetravalente compuesta por EPA-O1A, O2, O6Glc y O25B (G12), sondeados contra una placa ELISA recubierta con O6Glc-LPS purificado de la cepa CCUG11309.
Lafigura 28muestra las valoraciones medias de ELISA obtenidas con sueros de ratas inmunizadas con O25B-EPA (G9), proteína transportadora sola (G10), TBS (G11), o una composición tetravalente compuesta por O1A, O2, O6Glc y O25B (G12), sondeados contra una placa ELISA recubierta con O25B-LPS purificado de la cepa upec177.
Figura 29:Índices de opsonización de sueros derivados de ratas antes de la inmunización (círculos de color blanco) en comparación con 42 días después de la inmunización (cuadrados de color negro) con una dosis inicial y dos dosis de refuerzo de las dosis indicadas de vacuna monovalente. (A) Inmunización O2-EPA; (B) inmunización O6-EPA; (C) inmunización O25B-EPA.
Figura 30:Valores de ELISA obtenidos con sueros de sujetos humanos vacunados con una vacuna tetravalente que comprende los antígenos deE. coliO1A, O2, O6Glc y O25B. Se observó un aumento significativo en los valores de ELISA entre el período posterior (30 días después de la inyección) y el período previo a la inyección (día 1 ) solo en los grupos vacunados (*, representa significación estadística).
Figura 31:Índice opsónico (IO) obtenido con sueros de sujetos humanos vacunados con una vacuna tetravalente que comprende los antígenos deE. coliO1A, O2, O6Glc y O25B. Se representa la respuesta inmunitaria indicada por IO contra placebo y componentes de la vacuna tetravalente (O1A-EPA (31A), O2-e Pa (31B), O6Glc-EPA (31C) y O25B-EPA (31D)) antes y después de la inyección. La preinyección, definida como el día 1, se representa por V2 (visita 2), y la posinyección, definida como el día 30, se representa por V4 (visita 4). Se observó un aumento significativo en el IO entre la posinyección y la preinyección (indicado por *, donde múltiples * representan un mayor grado de significación) solo en los grupos vacunados. NS, sin diferencia significativa.
Figura 32:Valores de ELISA (expresados como valores de CE50) de sueros de sujetos vacunados hacia LPS O25A (barras de color negro) y LPS O25B (barras de color gris), el día 1 (antes de la vacunación) y después de 30 días (después de la vacunación). Se observó un aumento estadísticamente significativo en los valores de ELISA entre la posinyección (30 días después de la inyección) y la preinyección (día 1) para ambos serotipos: LPS O25A (barras de color negro) y LPS O25B (barras de color gris).
Figura 33:Reactividad de sueros de sujetos vacunados hacia O25A (líneas de color negro) y O25B (líneas de color gris) que expresan cepas deE. coli.Línea discontinua de color gris: Cepa serotipo O75, un control negativo. La figura 33 demuestra que los anticuerpos IgG séricos inducidos por la vacuna de sujetos vacunados responden fuertemente a las cepas O25A y O25B.
5. Descripción detallada
En el presente documento se divulgan la estructura del antígeno deE. coliO25B, así como los usos de O25B, los métodos de preparación de O25B y los bioconjugados que comprenden O25B. Los solicitantes han identificado el complejo génico deE. coliresponsable de la producción de O25B y han caracterizado completamente la estructura del antígeno O25B. En el presente documento se divulgan ácidos nucleicos capaces de producir O25B en células hospedadoras. En el presente documento se proporcionan células hospedadoras, por ejemplo, células hospedadoras genomanipuladas de forma recombinante, que comprenden ácidos nucleicos capaces de producir O25B. Dichas células hospedadoras se pueden usar para generar bioconjugados que comprenden O25B unido a una proteína transportadora, que se puede usar en, por ejemplo, la formulación de agentes terapéuticos (por ejemplo, vacunas). El antígeno O25B descrito en el presente documento también es útil en la generación de anticuerpos, que se puede usar, por ejemplo, en métodos terapéuticos tales como la inmunización pasiva de sujetos. Además, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden O25B, solo o junto con otros antígenos deE. coli(por ejemplo, O1 , O2 y O6 y subserotipos de los mismos), para su uso en métodos terapéuticos, por ejemplo, vacunación de hospedadores contra la infección porE. coli(por ejemplo,E. coliuropatógena).
5.1 Ácidos nucleicos y proteínas
En el presente documento se divulgan ácidos nucleicos aislados relacionados con la producción de O25B, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican una o más proteínas de un complejorfbde O25B deE. coli.Los expertos en la técnica apreciarán que, debido a la degeneración del código genético, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos específica se puede codificar por múltiples ácidos nucleicos diferentes. Por lo tanto, los expertos en la técnica entenderán que un ácido nucleico divulgado en el presente documento se puede alterar de tal manera que su secuencia difiera de una secuencia divulgada en el presente documento, sin afectar a la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el ácido nucleico.
En el presente documento se divulga un ácido nucleico que codifica un complejorfbde O25B deE. coli.En un caso específico, se proporciona en el presente documento un ácido nucleico que codifica un complejo génico rfb(upec138) deE. coli(SEQ ID NO: 12). En otro caso específico, se divulga en el presente documento un ácido nucleico que codifica un complejo génico que es aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO: 12. Upec138 es un ejemplo de una cepa deE. colide serotipo O25B. El experto se dará cuenta de que ahora se pueden obtener fácilmente otras cepas de este serotipo a partir de aislados clínicos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, y los ejemplos de dichas otras cepas son upec177 y upec163. Por lo tanto, siempre que en el presente documento se mencione un complejo génicorfbo genes individuales de dicho complejo de tales cepas O25B, se pretende incluir los correspondientes complejos génicos o genes de otras cepas O25B. Además, las secuencias divulgadas se pueden encontrar secuenciando los complejos génicosrfbo, si se desea, de genes individuales de dichos otros aislados, y proporcionarán secuencias homólogas que codifican proteínas homólogas como el complejo génico o el gen. En cualquier realización donde se mencione un complejo génico o gen homólogo haciendo referencia a un complejo génico o gen con un determinado porcentaje, dicha secuencia homóloga codifica preferentemente la una o más proteínas con la misma función que las de la cepa o secuencia de referencia.
En el presente documento también se divulga un ácido nucleico que codifica un complejorfbde O25B deE. coli.En un caso específico, se divulga en el presente documento un ácido nucleico que codifica un complejo génico rfb(upec163) deE. coli.En otro caso específico, se divulga en el presente documento un ácido nucleico que codifica un complejo génico que es aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfb(upec163) deE. coli.
En el presente documento también se divulga un ácido nucleico que codifica un complejorfbde O25B deE. coli.En un caso específico, se divulga en el presente documento un ácido nucleico que codifica un complejo génico rfb(upec177) deE. coli.En otro caso específico, se divulga en el presente documento un ácido nucleico que codifica un complejo génico que es aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfb(upec177) deE. coli.
Además, en el presente documento se divulgan proteínas que codifican ácidos nucleicos de un complejorfbde O25B deE. coli.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:1, el genrmlBdel complejorfbde O25B de E.coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO: 1.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:2, el genrmlDdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:2.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:3, el genrmlAdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:3.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:4, el genrmlCdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:4.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:5, el genwzxdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:5.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado comprende o consiste en la SEQ ID NO:6 , el genwekAdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:6.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:7, el genwekBdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:7.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:8, el genwzydel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:8.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:9, el genwbbJdel complejorfbde O25B deE. coli.
En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99%idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:9.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:10, el genwbbKdel complejorfbde O25B deE. coli.En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:10.
En un caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento comprende o consiste en la SEQ ID NO:11, el genwbbLdel complejorfbde O25B deE. coli. En otro caso específico, un ácido nucleico que codifica una proteína de un complejorfbde O25B deE. colidivulgado en el presente documento es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:11.
En otro aspecto, se divulgan en el presente documento proteínas codificadas por los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento. En un caso específico, se divulga en el presente documento dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa, codificada por la SEQ ID NO:1. En otro caso específico, se divulga en el presente documento dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa, codificada por la SEQ ID NO:2. En otro caso específico, se divulga en el presente documento Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa, codificada por la SEQ ID NO:3. En otro caso específico, se divulga en el presente documento dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa, codificada por la SEQ ID NO:4. En otro caso específico, se divulga en el presente documento la flipasa del antígeno O, codificada por la SEQ ID NO:5. En otro caso específico, se divulga en el presente documento dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa, codificada por la SEQ ID NO:6. En otro caso específico, se divulga en el presente documento UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa, codificada por la SEQ ID NO:7. En otro caso específico, se divulga en el presente documento la polimerasa del antígeno O, codificada por la SEQ ID NO:8. En otro caso específico, se divulga en el presente documento O-acetiltransferasa, codificada por la SEQ ID NO:9. En otro caso específico, se divulga en el presente documento UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa, codificada por la SEQ ID NO:10. En otro caso específico, se divulga en el presente documento dTDP-Rha:GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa, codificada por la SEQ ID NO:11.
5.2 Antígenos O de E. coli
En un aspecto, se divulgan en el presente documento antígenos deE. colide los serotipos O25, O1, O2 y O6. En un caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de la cepa deE. coliupec138. En otro caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de la cepa deE. coliupec163. En otro caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O aislado de la cepa deE. coliupec177. En otro caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O25B deE. coliaislado de Fórmula O25B:
D-Glc
L-Rha
En otro caso específico, se divulga en el presente documento un antígeno O25B deE. coliaislado de Fórmula O25B':
En otro caso, se divulga en el presente documento una población de macromoléculas aisladas de Fórmula O25B, presentada a continuación:
D-Glc
L-Rha?
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En una realización específica, n de al menos el 80 % de las macromoléculas en la población está entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20.
En otro aspecto, se divulga en el presente documento una población de macromoléculas aisladas de Fórmula O25B', presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En un caso específico, n de al menos el 80 % de las macromoléculas en la población está entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20.
Otros antígenos deE. coliútiles en las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, composiciones terapéuticas, por ejemplo, vacunas; véase la Sección 5.6) incluyen antígenos O25A, así como O1, O2 y O6, y subserotipos de los mismos.
En una realización, se usa un antígeno O25A (por ejemplo, en forma aislada o como parte de un bioconjugado) en una composición proporcionada en el presente documento (por ejemplo, en combinación con un antígeno O25B (o bioconjugado que comprende un antígeno O25B)). En una realización específica, el antígeno O25A es la Fórmula O25A:
En otra realización específica, el antígeno O25A es la Fórmula O25A':
En una realización, se usa un antígeno O1A (por ejemplo, en forma aislada o como parte de un bioconjugado) en una composición proporcionada en el presente documento (por ejemplo, en combinación con un antígeno O25B (o bioconjugado que comprende un antígeno O25B)). En una realización específica, el antígeno O1A es la Fórmula O1A:
En otra realización específica, el antígeno O1A es la Fórmula O1A':
En una realización, se usa un antígeno O1B (por ejemplo, en forma aislada o como parte de un bioconjugado) en una composición proporcionada en el presente documento (por ejemplo, en combinación con un antígeno O25B (o bioconjugado que comprende un antígeno O25B)). En una realización específica, el antígeno O1B es la Fórmula O1B:
En otra realización específica, el antígeno O1B es la Fórmula O1B':
En una realización, se usa un antígeno O1C (por ejemplo, en forma aislada o como parte de un bioconjugado) en una composición proporcionada en el presente documento (por ejemplo, en combinación con un antígeno O25B (o bioconjugado que comprende un antígeno O25B)). En una realización específica, el antígeno O1C es la Fórmula O1C:
En otra realización específica, el antígeno O1C es la Fórmula O1C':
En una realización, se usa un antígeno O2 (por ejemplo, en forma aislada o como parte de un bioconjugado) en una composición proporcionada en el presente documento (por ejemplo, en combinación con un antígeno O25B (o bioconjugado que comprende un antígeno O25B)). En una realización específica, el antígeno O2 es la Fórmula O2:
En otra realización específica, el antígeno O2 es la Fórmula O2':
En una realización, se usa un antígeno O6 (por ejemplo, en forma aislada o como parte de un bioconjugado) en una composición proporcionada en el presente documento (por ejemplo, en combinación con un antígeno O25B (o bioconjugado que comprende un antígeno O25B)). En una realización específica, el antígeno O6 es la Fórmula O6K2 (también denominada en el presente documento O6Glc):
En otra realización específica, el antígeno O6 es la Fórmula O6K2' (también denominada en el presente documento O6Glc'):
En otra realización específica, el antígeno O6 es la Fórmula O6K54 (también denominada en el presente documento O6GlcNAc):
En otra realización específica, el antígeno O6 es la Fórmula O6K54' (también denominada en el presente documento O6GlcNAc'):
P 1,2
D-GIcNAc
5.3 Células hospedadoras
En el presente documento se proporcionan células hospedadoras, por ejemplo, células hospedadoras procariotas, capaces de producir antígenos O deE. coliy bioconjugados que comprenden dichos antígenos O deE. coli.En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden (por ejemplo, de forma natural o mediante ingeniería genética) uno o más de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Véase la Sección 5.1. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento producen uno o más de los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento y/o producen bioconjugados que comprenden uno o más de los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento. Véase la Sección 5.2.
En un aspecto, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaces de producir el polisacárido novedoso divulgado en el presente documento, O25B deE. coli.En particular, la presente invención proporciona una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante, que comprende:
a. una secuencia de nucleótidos que comprende:
i. dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa;
ii. dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa;
iii. Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa;
iv. dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa;
v. flipasa del antígeno O;
vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa;
vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa;
viii. polimerasa del antígeno O;
ix. O-acetiltransferasa;
x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa y
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacariltransferasa; y
c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora, en donde la proteína transportadora comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO: 15).
También se divulgan en el presente documento células hospedadoras que comprenden ácidos nucleicos que codifican enzimas (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaces de producir otros antígenos deE. coli, por ejemplo, O25A, O1, O2 y O6, y subserotipos de los mismos (véase la Sección 5.2). Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento pueden expresar de manera natural ácidos nucleicos capaces de producir un antígeno O de interés, o se puede hacer que las células hospedadoras expresen tales ácidos nucleicos, es decir, en determinadas realizaciones, dichos ácidos nucleicos son heterólogos de las células hospedadoras y se introducen en las células hospedadoras usando enfoques genéticos conocidos en la técnica. En determinados casos, las células hospedadoras divulgadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican enzimas adicionales activas en la N-glucosilación de proteínas, por ejemplo, la célula hospedadora proporcionada en el presente documento puede comprender además un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa o ácidos nucleicos que codifican otras glucosiltransferasas. Véase, por ejemplo, la Sección 5.3.3. Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora, por ejemplo, una proteína a la que se pueden unir oligo y polisacáridos para formar un bioconjugado. Véase, por ejemplo, la Sección 5.3.2 para una descripción de las proteínas transportadoras y la Sección 5.4 para una descripción de los bioconjugados. En una realización específica, la célula hospedadora esE. coli.
Upec138 es una cepa deE. coliidentificada en el presente documento como perteneciente al serotipo O25B, y se ha identificado que el complejo génico rfb de la cepa (y las cepas del serotipo O25B en general) en el presente documento por primera vez comprende genes que producen un novedoso polisacárido deE. coli,O25B. En un caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende un complejo génico rfb(upec138) deE. coli(SEQ ID NO: 12), o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:12. En un caso específico, el complejo génico rfb(upec138) deE. coli(SEQ ID NO:12) se introduce en la célula hospedadora mediante manipulación genética (por ejemplo, el complejo génico se expresa en un plásmido o plásmidos o se integra en el genoma de la célula hospedadora (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/068737)). En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14) o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En otra realización específica, algunos o todos los genes del complejo rfb son heterólogos con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha oligosacariltransferasa es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha proteína transportadora es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora esE. coli.
Upec163 es una cepa deE. coliidentificada en el presente documento como perteneciente al serotipo O25B, y se ha identificado que el complejo génico rfb de la cepa (y las cepas del serotipo O25B en general) en el presente documento por primera vez comprende genes que producen un novedoso polisacárido deE. coli,O25B. En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende un complejo génico rfb(upec163) deE. coli,o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfb(upec163) deE. coli.En un caso específico, el complejo génico rfb(upec163) deE. colise introduce en la célula hospedadora mediante manipulación genética (por ejemplo, el complejo génico se expresa en un plásmido o plásmidos o se integra en el genoma de la célula hospedadora (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/068737)). En otro caso, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14) o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En otro caso específico, algunos o todos los genes del complejo rfb son heterólogos con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha oligosacariltransferasa es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha proteína transportadora es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora esE. coli.
Upec177 es una cepa deE. coliidentificada en el presente documento como perteneciente al serotipo O25B, y se ha identificado que el complejo génico rfb de la cepa (y las cepas del serotipo O25B en general) en el presente documento por primera vez comprende genes que producen un novedoso polisacárido deE. coli, O25B. En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota que comprende un complejo génico rfb(upec177) deE. coli,o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a un complejo génico rfb(upec177) deE. coli.En un caso específico, el complejo génico rfb(upec177) deE. colise introduce en la célula hospedadora mediante manipulación genética (por ejemplo, el complejo génico se expresa en un plásmido o plásmidos o se integra en el genoma de la célula hospedadora (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/068737)). En otro caso, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14) o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En otro caso específico, algunos o todos los genes del complejo rfb son heterólogos con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha oligosacariltransferasa es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha proteína transportadora es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce O25B, en donde dicha célula hospedadora comprendermlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbKy/owbbL.Dichas células hospedadoras se pueden genomanipular usando enfoques recombinantes para comprender uno o más plásmidos que comprenden los genesrmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbKy/owbbL.En un determinado caso, dichos uno o más plásmidos se integran en el genoma de la célula hospedadora. En una realización específica, dichormlBcomprende o consiste en la SEQ ID NO:1, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:1. En un caso específico, dichormlDcomprende o consiste en la SEQ ID NO:2, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:2. En un caso específico, dichormlAcomprende o consiste en la SEQ ID NO:3, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%o un 99%idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:3. En un caso específico, dichormlCcomprende o consiste en la SEQ ID NO:4, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:4. En un caso específico, dicho wzx comprende o consiste en la SEQ ID NO:5, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:5. En un caso específico, dichowekAcomprende o consiste en la SEQ ID NO:6, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:6. En un caso específico, dichowekBcomprende o consiste en la SEQ ID NO:7, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:7. En un caso específico, dicho wzy comprende o consiste en la SEQ ID NO:8, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:8. En un caso específico, dichowbbJcomprende o consiste en la SEQ ID NO:9, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:9. En un caso específico, dichowbbKcomprende o consiste en la SEQ ID NO:10, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:10. En un caso específico, dichowbbLcomprende o consiste en la SEQ ID NO:11, o es un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:11. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID n O:14) o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En otro caso específico, algunos o todos los genes,rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbKywbbL,son heterólogos con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha oligosacariltransferasa es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha proteína transportadora es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce O25B, en donde dicha célula hospedadora comprende uno, dos, tres, cuatro o más, por ejemplo, todos, de los siguientes genes (o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a uno de los siguientes genes, y preferentemente que codifica una proteína con la misma función):rmlB(SEQ ID NO:1),rmlD(SEQ ID NO:2),rmlA(SEQ ID NO:3),rmlC(SEQ ID NO:4),wzx(SEQ ID NO:5),wekA(SEQ ID NO:6),wekB(SEQ ID NO:7),wzy(SEQ ID NO:8),wbbJ (SEQID NO:9),wbbK(SEQ ID NO: 10) y/owbbL(SEQ ID NO:11). En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (s Eq ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dermlB(SEQ ID NO:1). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa, por ejemplo, una dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa codificada porrmlB.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:1. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID<n>O:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dermlD(SEQ ID NO:2). En otro caso específico, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa, por ejemplo, una dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa codificada porrmlD.En otro caso específico, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:2. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (s Eq ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dermlA(SEQ ID NO:3). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa, por ejemplo, una Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa codificada porrmlA.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:3. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SE<q>ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dermlC(SEQ ID NO:4). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa, por ejemplo, una dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa codificada porrmlC.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:4. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEq ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewzx(SEQ ID NO:5). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una flipasa del antígeno O, por ejemplo, una flipasa del antígeno O codificada por wzx. En otro caso específico, hay en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:5. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewekA(SEQ ID NO:6). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una ramnosiltransferasa, por ejemplo, una dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa codificada porwekA.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:6. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (s Eq ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewekB(SEQ ID NO:7). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una wekB glucosiltransferasa, por ejemplo, una UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa codificada porwekB.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:7. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewzy(SEQ ID NO:8). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa del antígeno O, por ejemplo, una polimerasa del antígeno O codificada por wzy. En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:8. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewbbJ(SEQ ID NO:9). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una O-acetiltransferasa, por ejemplo, una O-acetiltransferasa codificada porwbbJ.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:9. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewbbK(SEQ ID NO:10). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa, por ejemplo, una UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa codificada porwbbK.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:10. En otra realización específica, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (s Eq ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender la secuencia de ácido nucleico dewbbL(SEQ ID NO:11). En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una ramnosiltransferasa, por ejemplo, una dTDP-Rha:GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa codificada porwbbL.En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender un ácido nucleico que es al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:11. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (s Eq ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir O25B, y/o un bioconjugado O25B (es decir, una proteína transportadora unida al antígeno O25B deE. coli),en donde dicha célula hospedadora comprende de manera natural o está genomanipulada para comprender al menos una, dos, tres, cuatro o más, por ejemplo, todos, de las siguientes: (i) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1; (ii) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:2; (iii) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:3; (iv) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:4; (v) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:5; (vi) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:6 ; (vii) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:7; (viii) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:8; (ix) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:9; (x) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:10; y/o (xi) una secuencia de ácido nucleico que sea al menos un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO:11. En un caso específico, dicha célula hospedadora se ha genomanipulado para comprender cada una de dichas secuencias, es decir, dichas secuencias son heterólogas con respecto a dicha célula hospedadora. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce O25B, en donde dicha célula hospedadora comprende al menos dos de (i)wbbJ (SEQID NO:9) o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:9; (ii)wbbK(SEQ ID NO:10) o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:10; y/o (iii)wbbL(SEQ ID NO:11) o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:11. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID n O:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce O25B, en donde dicha célula hospedadora comprende cada uno de (i)wbbJ(SEQ ID NO:9) o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:9; (ii)wbbK(SEQ ID NO:10) o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:10; y (iii)wbbL(SEQ ID NO:11) o un ácido nucleico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:11. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID N0:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce O25B, en donde dicha célula hospedadora comprende (i) dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa; (ii) dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa; (iii) Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa; (iv) dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa; (v) flipasa del antígeno O; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa (viii) polimerasa del antígeno O; (ix) O-acetiltransferasa; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa y/o (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa. En un caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 14) o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En otro caso específico, algunas o cada una de (i) dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa; (ii) dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa; (iii) Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa; (iv) dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa; (v) flipasa del antígeno O; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa (viii) polimerasa del antígeno O; (ix) O-acetiltransferasa; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa y/o (xi) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa son heterólogas con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha oligosacariltransferasa es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En otro caso específico, dicha proteína transportadora es heteróloga con respecto a la célula hospedadora. En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro aspecto, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce o 25A deE. coli,es decir, dicha célula hospedadora comprende enzimas capaces de sintetizar O25A de E.coli(véase, por ejemplo, la figura 3). En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro aspecto, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce 01 deE. coli,es decir, dicha célula hospedadora comprende enzimas capaces de sintetizar 01 de E.coli(véase, por ejemplo, la figura 12). En un caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora que produce 01A deE. coli.En un caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora que produce 01B deE. coli.En un caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora que produce 01C deE. coli.En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID N0:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO: 15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro aspecto, se divulga en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce 02 deE. coli,es decir, dicha célula hospedadora comprende enzimas capaces de sintetizar 02 de E.coli(véase, por ejemplo, la figura 19). En otra realización específica, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO: 15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) que produce O6 de E.coli, esdecir, dicha célula hospedadora comprende enzimas capaces de sintetizar O6 de E.coli(véase, por ejemplo, la figura 17). En un caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora que produce O6 deE. colique comprende un monosacárido Glc ramificado o un antígeno O6 que comprende un monosacárido GlcNAc ramificado. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
Además, en el presente documento se divulga una célula hospedadora procariota (por ejemplo, una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante) capaz de producir más de un tipo de antígeno O deE. coli.En un caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora capaz de producir al menos dos de los siguientes: O25B, O25A, O1 (por ejemplo, O1A, O1B, O1C), O2 y O6. En otro caso específico, se divulga en el presente documento una célula hospedadora capaz de producir O25B y uno o más de O25<a>, O1 (por ejemplo, O1A, O1B, O1C), O2 y O6. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. En otro caso específico, la célula hospedadora procariota comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). En un caso específico, la célula hospedadora esE. coli.
5.3.1 Antecedentes genéticos
Cualquier célula hospedadora conocida por los expertos en la técnica se puede usar para producir los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento (por ejemplo, O25B) y bioconjugados que comprenden los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento (por ejemplo, O25B), incluyendo arqueas, células hospedadoras procariotas y células hospedadoras eucariotas. Las células hospedadoras procariotas ilustrativas para su uso en la producción de los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento y los bioconjugados que comprenden los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento incluyen, sin limitación, especies deEscherichia,especies deShigella,especies deKlebsiella,especies deXhantomonas,especies deSalmonella,especies deYersinia,especies deLactococcus,especies deLactobacillus,especies dePseudomonas,especies deCorynebacterium,especies deStreptomyces,especies deStreptococcus,especies deStaphylococcus,especies deBacillusy especies deClostridium.En una realización específica, la célula hospedadora usada para producir los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento y los bioconjugados que comprenden los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento esE. coli.
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras usadas para producir los antígenos O deE. coliy los bioconjugados descritos en el presente documento se genomanipulan para comprender ácidos nucleicos heterólogos, por ejemplo, ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más proteínas transportadoras y/o ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más proteínas, por ejemplo, genes que codifican una o más proteínas. En una realización específica, pueden introducirse ácidos nucleicos heterólogos que codifican proteínas implicadas en rutas de glucosilación (por ejemplo, rutas de glucosilación procariotas y/o eucarióticas) en las células hospedadoras descritas en el presente documento. Dichos ácidos nucleicos pueden codificar proteínas que incluyen, sin limitación, oligosacariltransferasas y/o glucosiltransferasas. Los ácidos nucleicos heterólogos (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican proteínas transportadoras y/o ácidos nucleicos que codifican otras proteínas, por ejemplo, proteínas implicadas en la glucosilación) se pueden introducir en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando cualquier método conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, electroporación, transformación química por choque térmico, transformación natural, transducción de fagos y conjugación. En realizaciones específicas, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando un plásmido, por ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos se expresan en las células hospedadoras mediante un plásmido (por ejemplo, un vector de expresión). En otra realización específica, se introducen ácidos nucleicos heterólogos en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando el método de inserción descrito en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/068737.
En determinadas realizaciones, pueden introducirse modificaciones adicionales (por ejemplo, usando técnicas recombinantes) en las células hospedadoras descritas en el presente documento. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de las células hospedadoras (por ejemplo, genes) que codifican proteínas que forman parte de una ruta de glucosilación posiblemente competitiva o de interferencia (por ejemplo, compiten o interfieren con uno o más genes heterólogos implicados en la glucosilación que se introducen de forma recombinante en la célula hospedador) se pueden eliminar o modificar en el fondo (genoma) de las células hospedadoras de una manera que los vuelve inactivos/disfuncionales (es decir, los ácidos nucleicos de la célula hospedadora que se eliminan/modifican no codifican una proteína funcional o no codifican ninguna proteína en absoluto). En determinadas realizaciones, cuando se eliminan ácidos nucleicos del genoma de las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento, se reemplazan por una secuencia deseable, por ejemplo, una secuencia que sea útil para la producción de glucoproteínas.
Los genes ilustrativos que se pueden eliminar en las células hospedadoras (y, en algunos casos, reemplazarse con otras secuencias de ácido nucleico deseadas) incluyen genes de células hospedadoras implicadas en la biosíntesis de glucolípidos, tales comowaaL(véase, por ejemplo, Feldmanet al.,2005, PNAS USA 102:3016-3021), el complejo de biosíntesis del núcleo del lípido A (waa), complejo de galactosa(gal),complejo de arabinosa(ara),complejo de ácido colónico (wc), complejo de polisacárido capsular, genes de biosíntesis de undecaprenol-p (por ejemplo,uppS, uppP),genes de reciclaje und-P, enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de azúcares activados por nucleótidos, complejos de antígenos comunes enterobacterianos y complejos de modificación del antígeno O profago como el complejogtrABS.En una realización específica, las células hospedadoras descritas en el presente documento se modifican de modo que no produzcan ningún antígeno O distinto del antígeno O deseado de una ExPEC, por ejemplo, O25B. En una realización específica, uno o más del genwaaL,gengtrA,gengtrB,gengtrSo el complejo génicorfbse eliminan o se inactivan funcionalmente del genoma de una célula hospedadora procariota proporcionada en el presente documento. En una realización, una célula hospedadora usada en el presente documento esE. colique produce el antígeno O25B, en donde el genwaaL,gengtrA,gengtrBy el gengtrSse eliminan o se inactivan funcionalmente del genoma de la célula hospedadora. En otra realización, una célula hospedadora usada en el presente documento esE. colique produce el antígeno O25B, en donde el genwaaLy el gengtrSse eliminan o se inactivan funcionalmente del genoma de la célula hospedadora.
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento se pueden usar para la glucosilación de proteínas. La glucosilación de proteínas puede diseñarse para producir bioconjugados para su uso en formulaciones de vacunas, por ejemplo, vacunas que contienen uno o más antígenos de polisacáridos deE. coli,por ejemplo, O25 (por ejemplo, O25B), O1, O2 y O6.
5.3.2 Proteínas transportadoras
En el presente documento se puede usar cualquier proteína transportadora adecuada para su uso en la producción de vacunas conjugadas (por ejemplo, bioconjugados para su uso en vacunas), por ejemplo, se pueden introducir ácidos nucleicos que codifican la proteína transportadora en un hospedador proporcionado en el presente documento para la producción de un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno de ExPEC (por ejemplo, O25B). Las proteínas transportadoras ilustrativas incluyen, sin limitación, exotoxina A desintoxicada deP. aeruginosa(EPA; véase, por ejemplo, Ihssen,et al.,(2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A desintoxicadade S. aureus,factor de agregación A, factor de agrupación B, FimH deE. coli,FimHC deE. coli,enterotoxina termolábil deE. coli,variantes desintoxicadas de la enterotoxina termolábil deE. coli,subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes desintoxicadas de la toxina colérica, proteína Sat deE. coli,el dominio pasajero de la proteína Sat deE. coli,neumolisina deStreptococcus pneumoniaey variantes desintoxicadas de la misma, AcrA deC. jejuniy glucoproteínas naturales deC. jejuni.Para la EPA, se han descrito en la bibliografía diversas variantes de proteínas desintoxicadas que podrían usarse como proteínas transportadoras.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras usadas en la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento se modifican, por ejemplo, se modifican de tal manera que la proteína sea menos tóxica y/o más susceptible a la glucosilación. En una realización específica, las proteínas transportadoras usadas en la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento se modifican de manera que el número de sitios de glucosilación en las proteínas transportadoras se maximice de una manera que permita administrar concentraciones inferiores de la proteína, por ejemplo, en una composición inmunogénica, en su forma bioconjugada.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras descritas en el presente documento se modifican para incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de glucosilación de los que normalmente se asociarían con la proteína transportadora (por ejemplo, en relación con el número de sitios de glucosilación asociados con la proteína transportadora en su estado nativo/natural, por ejemplo, el estado de "tipo natural"). En realizaciones específicas, la introducción de sitios de glucosilación se logra mediante la inserción de secuencias consenso de glucosilación (por ejemplo, Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987)) en cualquier parte de la estructura primaria de la proteína. La introducción de tales sitios de glucosilación se puede lograr, por ejemplo, añadiendo nuevos aminoácidos a la estructura primaria de la proteína (es decir, se añaden los sitios de glucosilación, en su totalidad o en parte), o mutando aminoácidos existentes en la proteína para generar los sitios de glucosilación (es decir, no se añaden aminoácidos a la proteína, pero los aminoácidos seleccionados de la proteína se mutan para formar sitios de glucosilación). Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede modificar fácilmente usando enfoques conocidos en la técnica, por ejemplo, enfoques recombinantes que incluyen la modificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína. En realizaciones específicas, las secuencias consenso de glucosilación se introducen en regiones específicas de la proteína transportadora, por ejemplo, estructuras superficiales de la proteína, en los extremos N o C de la proteína, y/o en bucles que están estabilizados mediante puentes disulfuro en la base de la proteína. En determinadas realizaciones, la secuencia consenso de glucosilación de 5 aminoácidos clásica puede ampliarse con residuos de lisina para una glucosilación más eficaz y, por lo tanto, la secuencia consenso insertada puede codificar 5, 6 o 7 aminoácidos que deben insertarse o que reemplazan los aminoácidos de la proteína aceptora. En una realización particular, una proteína transportadora es EPA desintoxicada que comprende 4 secuencias de glucosilación consenso Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO: 15), y tiene una secuencia de aminoácidos como se proporciona en la SEQ ID NO: 13.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras usadas en la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento comprenden una "etiqueta", es decir, una secuencia de aminoácidos que permite el aislamiento y/o la identificación de la proteína transportadora. Por ejemplo, añadir una etiqueta a una proteína transportadora descrita en el presente documento puede ser útil en la purificación de esa proteína y, por lo tanto, en la purificación de vacunas conjugadas que comprenden la proteína transportadora marcada. Las etiquetas ilustrativas que se pueden usar en el presente documento incluyen, sin limitación, etiquetas de histidina (HIS) (por ejemplo, etiqueta de hexahistidina o etiqueta 6XHis), FLAG-TAG y etiquetas HA. En determinadas realizaciones, las etiquetas usadas en el presente documento se pueden quitar, por ejemplo, mediante eliminación por agentes químicos o por medios enzimáticos, una vez que ya no son necesarias, por ejemplo, después de que la proteína se haya purificado.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras descritas en el presente documento comprenden una secuencia señal que dirige la proteína transportadora al espacio periplásmico de la célula hospedadora que expresa la proteína transportadora. En una realización específica, la secuencia señal es de DsbA deE. coli,porina A de la membrana externa deE. coli(OmpA), proteína de unión a maltosa deE. coli(MalE), pectato liasa deErwinia carotovorans(PelB), FlgI, NikA o endoxilanasa deBacillussp. (XynA), enterotoxina termolábil deE. coliLTIIb, endoxilanasa XynA deBacilluso flagelina deE. coli(FlgI).
5.3.3 Maquinaria de glucosilación
Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden, y/o se pueden modificar para que comprendan, ácidos nucleicos que codifican la maquinaria genética (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaz de producir antígenos O a partir de ExPEC, por ejemplo, los antígenos O25 (por ejemplo, O25B), O1, O2 y/u O6. Véase la Sección 5.1.
Glucosiltransferasas
Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir antígenos O de ExPEC, por ejemplo, un antígeno O deE. colide serotipo O25 (por ejemplo, O25A u O25B, véase la figura 3B), O1 (véase la figura 12), O2 (véase la figura 19) y O6 (por ejemplo, un serotipo<o>6 que produce un antígeno O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado o un antígeno O6 que comprende un monosacárido GlcNAc ramificado, véase la figura 17). Los ácidos nucleicos ilustrativos se describen en la Sección 5.1. En determinadas realizaciones, algunos o todos los ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O de ExPEC se expresan de manera natural en las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento (por ejemplo, los ácidos nucleicos están presentes en el fondo "de tipo natural" de la célula hospedadora). En determinadas realizaciones, algunos o todos los ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O de ExPEC no se expresan de manera natural en las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento, es decir, algunos o todos los ácidos nucleicos son heterólogos con respecto a la célula hospedadora. Las células hospedadoras se pueden genomanipular para que comprendan ácidos nucleicos específicos, por ejemplo, los ácidos nucleicos descritos en la Sección 5.1, usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los métodos descritos en la Sección 5.3.
En una realización específica, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O25B, es decir, un antígeno O25B descrito en el presente documento. En una realización específica, dichos ácidos nucleicos codifican el complejorfbde upec138 (SEQ ID NO:12), o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo a la SEQ ID NO:12.
En otra realización específica, dichos ácidos nucleicos codifican el complejorfbde upec163, o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo al complejorfbde upec163. En otra realización específica, dichos ácidos nucleicos codifican el complejorfbde upec177, o un complejo génico que es aproximadamente o al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntico u homólogo al complejorfbde upec177.
En otra realización específica, dichos ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O25B son genes de un serotipo O25B, en donde dichos genes sonrmlB(SEQ ID NO:1),rmlD(SEQ ID NO:2)rmlA(SEQ ID NO:3),rmlC(SEQ ID NO:4),wzx(SEQ ID NO:5),wekA(SEQ ID NO:6),wekB(SEQ ID NO:7),wzy(SEQ ID NO:8),wbbJ(SEQ ID NO:9),wbbK(SEQ ID NO:10) ywbbL(SEQ ID NO:11). Véanse las Tablas 3 y 9.
En una realización específica, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican proteínas (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo o 25A, es decir, un antígeno o 25A descrito en el presente documento. En otra realización específica, dichos ácidos nucleicos que codifican proteínas (por ejemplo, glucosiltransferasas) capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O25A son genes de un serotipo<o>25, en donde dichos genes sonrmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wekC, wzy, fnlA, fnlB, fnlC, wbuB y/o wbuC.Véase Wang,et al.(2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; GenBank GU014554; y la Tabla 2.
En otra realización específica, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O2. En otra realización específica, dichos ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O2 son genes de un serotipo O2, en donde dichos genes sonrmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekP, wekQ, wekR, wzy, fdtA, fdtB y/o fdtC.Véanse Li,et al.,(2010) J Microbiol Methods 82, 71-77; Fratamico,et al.,2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316; y la Tabla 5.
En otra realización específica, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O6. Véanse Welchet al.,2002, PNAS USA 99(26):17020-17024; Jannet al.,Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225, y Janssonet al.,Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283. En una realización específica, dicho serotipo O6 comprende un monosacárido Glc ramificado.
En otra realización específica, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O1. En una realización específica, dicho serotipo O1 es O1A. En otra realización específica, dichos ácidos nucleicos que codifican glucosiltransferasas capaces de producir un antígeno O deE. colidel serotipo O1 son genes de un serotipo O1, en donde dichos genes sonrmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, mnaA, wekM, wzy, wekNy/owekO.
Oligosacariltransferasas
Las oligosacariltransferasas transfieren oligosacáridos unidos a lípidos a residuos de asparagina de cadenas polipeptídicas nacientes que comprenden un motivo consenso de N-glucoxilación, por ejemplo, Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO:14); o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15) (véase el documento WO 2006/119987). Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2003/074687 y WO 2006/119987.
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. El ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa puede ser nativo de la célula hospedadora o se puede introducir en la célula hospedadora usando enfoques genéticos, como se ha descrito anteriormente. La oligosacariltransferasa puede ser de cualquier fuente conocida en la técnica. En una realización específica, la oligosacariltransferasa es una oligosacariltransferasa deCampylobacter.En otra realización específica, la oligosacariltransferasa es una oligosacariltransferasa deCampylobacter jejuni(es decir,pglB;véase, por ejemplo, Wackeret al.,2002, Science 298:1790-1793; véase también, por ejemplo, ID del gen del NCBI: 3231775, n.° de registro de UniProt 086154). En otra realización específica, la oligosacariltransferasa es una oligosacariltransferasa deCampylobacterlari(véase, por ejemplo, ID del gen del NCBI: 7410986).
5.4 Bioconjugados
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras descritas en el presente documento se pueden usar para producir bioconjugados que comprenden un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (por ejemplo, O25B; véase la Sección 5.2) unido a una proteína transportadora. En la técnica se conocen métodos para producir tales bioconjugados usando células hospedadoras. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2003/074687 y WO 2006/119987.
Como alternativa, se pueden preparar glucoconjugados mediante síntesis química, es decir, prepararse fuera de las células hospedadoras(in vitro).Por ejemplo, los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento, por ejemplo, O25B, se pueden conjugar con proteínas transportadoras usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo mediante el uso de grupos reactivos de activación en el polisacárido/oligosacárido, así como el portador de proteínas. Véanse, por ejemplo, Pawlowskiet al.,2000, Vaccine 18: 1873-1885; y Robbins,et al.,2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978). Dichos enfoques comprenden la extracción de polisacáridos/oligosacáridos antigénicos de células hospedadoras, la purificación de los polisacáridos/oligosacáridos, la activación química de los polisacáridos/oligosacáridos y la conjugación de los polisacáridos/oligosacáridos con una proteína transportadora.
Los bioconjugados, como se describe en el presente documento, tienen propiedades ventajosas sobre los glucoconjugados, por ejemplo, los bioconjugados requieren menos agentes químicos en la fabricación y son más consistentes en términos del producto final generado. Por lo tanto, se prefieren los bioconjugados a los glucoconjugados producidos químicamente.
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento bioconjugados que comprenden una proteína transportadora unida a un antígeno O de ExPEC descrito en el presente documento. Véase la Sección 5.2. En una realización específica, se proporciona en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida porNa O25B deE. coli.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un compuesto de Fórmula O25B presentada a continuación:
D-Glc
L-Rha
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En una realización específica, la proteína transportadora está unida por N al antígeno O de Fórmula O25B, es decir, O25B está unido al residuo de Asn de una proteína transportadora que comprende la secuencia Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 14); o una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO: 15).
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida por N a un antígeno O25B deE. colique comprende la estructura de Fórmula O25B', presentada a continuación:
en donde n es un número entero entre 1 y 30, 1 y 20, 1 y 15, 1 y 10, 1 y 5, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 25 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25, 20 y 25, 10 y 20 o 15 y 20. En una realización específica, la proteína transportadora está unida porNal antígeno O de Fórmula O25B'.
También se divulga en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un antígeno O25A. En un caso específico, dicho antígeno O25A comprende la Fórmula O25A:
D-Glc
u O25A':
También se divulga en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un antígeno O1. En una realización específica, dicho antígeno<o>1 es O1A, por ejemplo, dicho antígeno comprende la Fórmula O1A:
u O1A':
En otro caso específico, dicho antígeno O1 es O1B, por ejemplo, dicho antígeno comprende la Fórmula O1B:
u O1B':
En otro caso específico, dicho antígeno O1 es O1C, por ejemplo, dicho antígeno comprende la Fórmula O1C:
u O1C':
En otro caso específico, se divulga en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un antígeno O2. En un caso específico, dicho antígeno O2 comprende la Fórmula O2:
u O2'
En otro caso específico, se divulga en el presente documento un bioconjugado que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, EPA) unida a un antígeno O6. En una realización específica, dicho antígeno O6 comprende la Fórmula O6Glc:
O6GlcNAc:
O6Glc':
D-Gíc
u O6G lcNAc':
Los bioconjugados descritos en el presente documento se pueden purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una proteína, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, intercambio aniónico, afinidad y por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Véase, por ejemplo, Saraswatet al.,2013, Biomed. Res. Int. ID n.° 312709 (pág. 1-18); véanse también los métodos descritos en el documento WO 2009/104074. Además, los bioconjugados pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación. Las condiciones reales usadas para purificar un bioconjugado particular dependerán, en parte, de la estrategia de síntesis (por ejemplo, producción sintética frente a producción recombinante) y de factores tales como carga neta, hidrofobicidad y/o hidrofilicidad del bioconjugado, y resultarán evidentes para los expertos en la técnica.
5.5 Anticuerpos contra O25B
El antígeno O25B descrito en el presente documento (véase la Sección 5.2) y/o los bioconjugados que comprenden el antígeno O25B descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4) se pueden usar para provocar anticuerpos neutralizantes contra ExPEC. El antígeno O25B descrito en el presente documento y/o los bioconjugados que comprenden el antígeno O25B descrito en el presente documento se pueden administrar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano, ratón, conejo, rata, cobaya, etc.) para inducir una respuesta inmunitaria que incluye la producción de anticuerpos. Dichos anticuerpos se pueden aislar usando técnicas conocidas por un experto en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.).
Además, el antígeno O25B descrito en el presente documento se puede usar para cribar anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos. Por ejemplo, el O25B aislado se puede inmovilizar en un soporte sólido (por ejemplo, un gel de sílice, una resina, una película de plástico derivatizada, una perla de vidrio, algodón, una perla de plástico, una perla de poliestireno, un gel de alúmina o un polisacárido, un perla magnética) y se criba su unión a anticuerpos. Como alternativa, los anticuerpos a cribar pueden inmovilizarse en un soporte sólido y cribarse para determinar su unión a O25B. Se puede usar cualquier ensayo de cribado, tal como un ensayo de selección, ELlSA, resonancia de plasmón superficial u otro ensayo de cribado de anticuerpos conocido en la técnica para cribar anticuerpos que se unan a O25B. La biblioteca de anticuerpos cribada puede ser una biblioteca de anticuerpos disponible comercialmente, una biblioteca generadain vitroo una biblioteca obtenida identificando y clonando o aislando anticuerpos de un individuo infectado con EXPEC. Pueden generarse bibliotecas de anticuerpos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En una realización particular, la biblioteca de anticuerpos se genera clonando los anticuerpos y usándolos en bibliotecas de presentación en fagos o una biblioteca de presentación en fagémidos.
Los anticuerpos identificados u obtenidos usando O25B y/o un bioconjugado de O25B pueden incluir moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a O25B. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de la molécula de inmunoglobulina. Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv unidos por disulfuro (sdFv) y anticuerpos antiidiotipo (anti Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti Id contra anticuerpos obtenidos o identificados usando un método descrito en el presente documento), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En una realización específica, un anticuerpo obtenido o identificado usando O25B y/o un bioconjugado de O25B es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.
Los anticuerpos obtenidos o identificados usando O25B y/o un bioconjugado de O25B se pueden usar para controlar la eficacia de una terapia y/o la progresión de la enfermedad. Puede usarse cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica para este propósito, incluyendo, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas), inmunoensayos en "sándwich", reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis.
Los anticuerpos obtenidos o identificados usando O25B y/o un bioconjugado de O25B se pueden usar para detectar cepas O25B deE. coli,por ejemplo, de una pluralidad de cepas deE. co liy/o para diagnosticar una infección por una cepa O25B deE. coli.
5.6 Composiciones
5.6.1 Composiciones que comprenden células hospedadoras
En un aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden las células hospedadoras descritas en el presente documento. Dichas composiciones se pueden usar en métodos para generar los bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4), por ejemplo, las composiciones se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la producción de proteínas. Posteriormente, se pueden aislar bioconjugados de dichas composiciones usando métodos conocidos en la técnica.
Las composiciones que comprenden las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento pueden comprender componentes adicionales adecuados para el mantenimiento y la supervivencia de las células hospedadoras descritas en el presente documento, y pueden comprender adicionalmente componentes adicionales requeridos o beneficiosos para la producción de proteínas por parte de las células hospedadoras, por ejemplo, inductores para promotores inducibles, tales como arabinosa, I<p t>G.
5.6.2 Composiciones que comprenden antígenos y/o bioconjugados
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden uno o más de los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento (véase la Sección 5.2) y composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden uno o más de los bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4). En una realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende uno o más de los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento (véase la Sección 5.2). En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende uno o más de los bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4). En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende uno o más de los antígenos O deE. colidescritos en el presente documento (véase la Sección 5.2) y uno o más de los bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4). Las composiciones descritas en el presente documento son útiles en el tratamiento y prevención de la infección de sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) conE. colipatógena extraintestinal (ExPEC). Véase la Sección 5.7.
En determinadas realizaciones, además de comprender un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2) y/o un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) descritas en el presente documento comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que ha sido aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que figura en la farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "portador", como se usa en el presente documento en el contexto de un portador farmacéuticamente aceptable, se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición que comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2) unida a un antígeno descrito en el presente documento, por ejemplo, un antígeno O de ExPEC descrito en la Sección 5.2.
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a O25B deE. coli(véase la Sección 5.2).
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a O25A deE. coli(véase la Sección 5.2).
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a O1 deE. coli(véase la Sección 5.2). En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1A. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1B. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1C.
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a O2 deE. coli(véase la Sección 5.2).
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a O6 deE. coli(véase la Sección 5.2). En una realización específica, dicha macromolécula O6 es una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B) y (ii) una macromolécula O1 o un bioconjugado que comprende O1. Véase la Sección 5.2. En una realización específica, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1A. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1B. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1C.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B) y (ii) una macromolécula O2 o un bioconjugado que comprende O2. Véanse las Secciones 5.2 y 5.4. En una realización específica, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B) y (ii) una macromolécula O6 (por ejemplo, una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado o un monosacárido GlcNAc ramificado) o un bioconjugado que comprende O6. Véanse las Secciones 5.2 y 5.4. En una realización específica, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otra realización específica, dicha macromolécula O6 es una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende O25B deE. coli(véase la Sección 5.2) o un bioconjugado que comprende O25 (véase la Sección 5.4) y al menos uno de los siguientes: (i) O1 deE. colio un bioconjugado que comprende O1 (véanse las Secciones 5.2 y 5.4); (ii) O2 deE. colio un bioconjugado que comprende O2 (véanse las Secciones 5.2 y 5.4); y/o (iii) O6 deE. colio un bioconjugado que comprende O6 (véanse las Secciones 5.2 y 5.4). En otra realización específica, dicho O1 es O1A. En otra realización específica, dicho O1 es O1B. En otra realización específica, dicho O1 es O1C. En otra realización específica, dicho O6 es O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado.
También se divulga en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende al menos dos de los siguientes: (i) una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B) o un bioconjugado que comprende O25 (por ejemplo, O25A u O25B); (ii) una macromolécula O1 o un bioconjugado que comprende O1; (iii) una macromolécula O2 o un bioconjugado que comprende O2; y/o (iv) una macromolécula o 6 (por ejemplo, una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado o un monosacárido GlcNAc ramificado) o un bioconjugado que comprende O6. En un caso específico, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otro caso específico, dicha macromolécula O1 es O1A. En otro caso específico, dicha macromolécula O1 es O1B. En otro caso específico, dicha macromolécula O1 es O1C. En otro caso específico, dicha macromolécula O6 es una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado que comprende O25B deE. coliy un bioconjugado que comprende O1A deE. coli.Tales bioconjugados se describen en la Sección 5.4.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado que comprende O25B deE. coliy un bioconjugado que comprende O1B deE. coli.Tales bioconjugados se describen en la Sección 5.4.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado que comprende O25B deE. coliy un bioconjugado que comprende O1C deE. coli.Tales bioconjugados se describen en la Sección 5.4.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado que comprende O25B deE. coliy un bioconjugado que comprende O2 deE. coli.Tales bioconjugados se describen en la Sección 5.4.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado que comprende O25B deE. coliy un bioconjugado que comprende O6 deE. coli.Tales bioconjugados se describen en la Sección 5.4.
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende (i) una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida por N a O25B deE. coli(véase la Sección 5.2), (ii) una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a un antígeno O deE. colidel serotipo O1, por ejemplo, O1A (véase la Sección 5.2), (iii) una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.1.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a un antígeno O de E.colidel serotipo O2 (véase la Sección 5.2), y (iv) una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o<m>B<p>) unida a un antígeno O deE. coliO del serotipo O6 (véase la Sección 5.2).
En determinadas realizaciones, las composiciones anteriores comprenden una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la Sección 5.3.2, por ejemplo, EPA o MBP) unida a un antígeno O deE. colide un serotipo deE. colidistinto de O1, O2, O6 u O25. Se describen otros serotipos deE. coliútiles, por ejemplo, en el Ejemplo 1 y la Tabla 1, a continuación.
macromolécula O2.
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una , una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado o un
En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende una macromolécula O25 (por ejemplo, O25A u O25B), una macromolécula O1, una macromolécula O2 y una macromolécula O6 (por ejemplo, una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado o un monosacárido GlcNAc ramificado). En una realización específica, dicha macromolécula O25 es una macromolécula O25B. En otra realización específica, dicha macromolécula O1 es O1A. En otra realización específica, dicha macromolécula O6 es una macromolécula O6 que comprende un monosacárido Glc ramificado.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden usar para provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se administra la composición, es decir, son inmunógenas. Por lo tanto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar como vacunas contra la infección por ExPEC, o se pueden usar en el tratamiento de la infección por ExPEC y, por consiguiente, pueden formularse como composiciones farmacéuticas. Véase la Sección 5.7.
Las composiciones que comprenden los bioconjugados y/o macromoléculas descritas en el presente documento pueden comprender cualquier componente adicional adecuado para su uso en la administración farmacéutica. En realizaciones específicas, las composiciones descritas en el presente documento son formulaciones monovalentes. En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento son formulaciones multivalentes, por ejemplo, formulaciones bivalentes, trivalentes y tetravalentes. Por ejemplo, una formulación multivalente comprende más de un bioconjugado o antígeno O deE. colidescrito en el presente documento. Véanse las Secciones 5.2 y 5.4 para obtener una descripción de los antígenos O deE. coliy los bioconjugados, respectivamente. En una realización específica, una composición descrita en el presente documento es una formulación tetravalente que comprende una macromolécula o bioconjugado, en donde dichas valencias son de antígenos O deE. colide los serotipos/subserotipos O25B, O1A, O6 y O2.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente un conservante, por ejemplo, el derivado de mercurio es timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden del 0,001 % al 0,01 % de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden un conservante.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las composiciones inmunogénicas) comprenden, o se administran junto con, un adyuvante. El adyuvante para administración junto con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, simultáneamente con, o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en el presente documento, aumenta, mejora y/o potencia la respuesta inmunitaria a un bioconjugado, pero cuando el compuesto se administra solo, no genera una respuesta inmunitaria al bioconjugado. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria al péptido polibioconjugado y no produce alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden mejorar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos incluyendo, por ejemplo, reclutamiento de linfocitos, estimulación de linfocitos B y/o T y estimulación de macrófagos.
Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, pero sin limitación, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A (MPL) 3-des-O-acilado (véase la Patente de Reino Unido GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), As 04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional N.° PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional N.° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud Internacional N.° PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional N.° WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véanse Kensilet al.,en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (ed. Powell y Newman, Plenum Press, NY, 1995); Pat. de EE.UU. N.° 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente junto con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil lípido A (véase Stouteet al.,N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998).
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se formulan para que sean adecuadas para la vía de administración prevista a un sujeto. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse para que sean adecuadas para administración subcutánea, parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorrectal, intraperitoneal y rectal. En una realización específica, la composición farmacéutica puede formularse para administración intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica o pulmonar.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente uno o más tampones, por ejemplo, tampón fosfato y tampón fosfato glutamato de sacarosa. En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento no comprenden tampones.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente una o más sales, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, glutamato monosódico y sales de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre (sulfato de aluminio y potasio), o una mezcla de tales sales de aluminio). En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento no comprenden sales.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para la administración.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden almacenar antes de su uso, por ejemplo, las composiciones se pueden almacenar congeladas (por ejemplo, a aproximadamente -20 °C o a aproximadamente -70 °C); almacenar en condiciones refrigeradas (por ejemplo, a aproximadamente 4 °C); o almacenar a temperatura ambiente.
5.7 Usos profilácticos y terapéuticos
En el presente documento se proporcionan composiciones de la presente invención para su uso en métodos para tratar y prevenir una infección porE. coliextraintestinal (ExPEC) de un sujeto que comprende administrar al sujeto un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2). En una realización específica, las composiciones descritas en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) se usan en la prevención de la infección de un sujeto (por ejemplo, sujetos humanos) por ExPEC, es decir, las composiciones descritas en el presente documento se usan para vacunar a un sujeto contra la infección por ExPEC. En otra realización específica, las composiciones descritas en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) se usan en el tratamiento de un sujeto que ha sido infectado por ExPEC. Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición de la presente invención para su uso en la vacunación de un sujeto, preferentemente un ser humano, contraEscherichia colipatógena extraintestinal.
También se proporciona en el presente documento una composición de la presente invención para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto, preferentemente un ser humano, contraEscherichia colipatógena extraintestinal. También se describen en el presente documento métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra ExPEC, que comprenden administrar al sujeto un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2). En una realización, dicho sujeto tiene una infección por ExPEC en el momento de la administración. En otra realización, dicho sujeto no tiene una infección por ExPEC en el momento de la administración.
También se proporciona en el presente documento una composición de la presente invención para su uso en la inducción de la producción de anticuerpos opsonofagocíticos en un sujeto, preferentemente un ser humano, que son específicos deEscherichia colipatógena extraintestinal. También se describen en el presente documento métodos para inducir la producción de anticuerpos opsonofagocíticos contra ExPEC en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2). En una realización, dicho sujeto tiene una infección por ExPEC en el momento de la administración. En otra realización, dicho sujeto no tiene una infección por ExPEC en el momento de la administración.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición de la presente invención para su uso en un método para prevenir una infección porE. coli(por ejemplo, ExPEC) en un sujeto, en donde dicho método comprende administrar a un sujeto que lo necesite un cantidad eficaz de una composición descrita en la Sección 5.6.2. Los métodos para prevenir la infección por ExPEC en un sujeto dan como resultado la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición descrita en la Sección 5.6.2. Un experto en la técnica entenderá que los métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto descritos en el presente documento dan como resultado la vacunación del sujeto contra la infección por las cepas de ExPEC cuyos antígenos O están presentes en la una o más composiciones.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición de la presente invención para su uso en un método para tratar una infección porE. coli(por ejemplo, ExPEC) en un sujeto, en donde dicho método comprende administrar a un sujeto que lo necesite un cantidad eficaz de una composición descrita en la Sección 5.6.2.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por ExPEC causada por cualquier serotipo, subserotipo o cepa de ExPEC. En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por ExPEC de más de un serotipo de ExPEC.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada porE. colidel serotipo O25. En una realización específica, dicho serotipo O25 es O25b . En una realización específica, dicho serotipo O25 es O25A.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada porE. colidel serotipo O1. En una realización específica, dicho serotipo O1 es O1A. En otra realización específica, dicho serotipo O1 es O1B. En otra realización específica, dicho serotipo O1 es O1C.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada porE. colidel serotipo O2.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada porE. colidel serotipo O6.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por dos o más de los siguientes serotipos deE. coli: O25 (por ejemplo, o 25B y O25A), O1 (por ejemplo, O1A, O1B y O1C), O2 y/u O6.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por cada uno de los siguientes serotipos deE. coli:O25 (por ejemplo,<o>25B y O25A), O1 (por ejemplo, O1A, O1B y O1C), O2 y O6.
Para tratar un sujeto que tiene una infección por ExPEC o inmunizar a un sujeto contra una infección por ExPEC, al sujeto se le puede administrar una única composición descrita en el presente documento, en donde dicha composición comprende una, dos, tres, cuatro o más antígenos deE. colidescritos en el presente documento. Véase la Sección 5.2. Como alternativa, para tratar un sujeto que tiene una infección por ExPEC o inmunizar a un sujeto contra una infección por ExPEC, al sujeto se le pueden administrar múltiples bioconjugados descritos en el presente documento, por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar dos, tres, cuatro o más bioconjugados descritos en la Sección 5.4. Como alternativa, para tratar un sujeto que tiene una infección por ExPEC o inmunizar a un sujeto contra una infección por ExPEC, al sujeto se le pueden administrar múltiples composiciones descritas en el presente documento, por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar dos, tres, cuatro o más composiciones descritas en la Sección 5.6.2.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para reducir los síntomas resultantes de una infección por ExPEC. Los síntomas de la infección por ExPEC pueden variar dependiendo de la naturaleza de la infección y pueden incluir, pero sin limitación: disuria, aumento de la frecuencia o urgencia urinaria, piuria, hematuria, dolor de espalda, dolor al orinar, fiebre, escalofríos y/o náuseas (por ejemplo, en sujetos que tienen una infección del tracto urinario causada por ExPEC); fiebre alta, cefalea, rigidez de cuello, náuseas, vómitos, convulsiones, somnolencia y/o sensibilidad a la luz (por ejemplo, en sujetos que tienen meningitis causada por ExPEC); fiebre, aumento de la frecuencia cardíaca, aumento de la frecuencia respiratoria, disminución de la producción de orina, disminución del recuento de plaquetas, dolor abdominal, dificultad para respirar y/o función cardíaca anómala (por ejemplo, en sujetos que tienen septicemia causada por ExPEC).
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para reducir la probabilidad de hospitalización de un sujeto que padece una infección por ExPEC. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es eficaz para reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que padece una infección por ExPEC.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones de la presente invención para su uso en métodos para prevenir y/o tratar una infección por ExPEC en un sujeto causada porE. colidel serotipo O25B mediante la administración de un anticuerpo descrito en el presente documento, es decir, un anticuerpo anti O25B descrito en el presente documento. En realizaciones particulares, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo monoclonal.
5.7.1 Terapias combinadas
En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto junto con una o más terapias diferentes (por ejemplo, terapias antibacterianas o inmunomoduladoras). La una o más terapias diferentes pueden ser beneficiosas en el tratamiento o prevención de una infección por ExPEC o pueden mejorar un síntoma o afección asociada con una infección por ExPEC. En algunas realizaciones, la una o más terapias diferentes son analgésicos o medicamentos contra la fiebre. En determinadas realizaciones, las terapias se administran con una diferencia de menos de 5 minutos, una diferencia de menos de 30 minutos, una diferencia de 1 hora, una diferencia de aproximadamente 1 hora, una diferencia de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, una diferencia de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas, una diferencia de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas, una diferencia de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas, una diferencia de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas, una diferencia de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas, una diferencia de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas, una diferencia de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas, una diferencia de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas, una diferencia de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas, una diferencia de aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas, una diferencia de aproximadamente 12 horas a 18 horas, una diferencia de 18 horas a 24 horas, una diferencia de 24 horas a 36 horas, una diferencia de 36 horas a 48 horas, una diferencia de 48 horas a 52 horas, una diferencia de 52 horas a 60 horas, una diferencia de 60 horas a 72 horas, una diferencia de 72 horas a 84 horas, una diferencia de 84 horas a 96 horas o una diferencia de 96 horas a 120 horas.
Cualquier agente antibacteriano conocido por un experto en la técnica puede usarse junto con un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2). Los ejemplos no limitantes de agentes antibacterianos incluyen amikacina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulánico, anfotericina-B, ampicilina, ampiclina-sulbactam, apramicina, azitromicina, aztreonam, bacitracina, bencilpenicilina, caspofungina, cefaclor, cefadroxilo, cefalexina, cefalotina, cefazolina, cefdinir, cefepima, cefixima, cefmenoxima, cefoperazona, cefoperazona-sulbactam, cefotaxima, cefoxitina, cefpiroma, cefpodoxima, cefpodoxima-ácido clavulánico, cefpodoxima-sulbactam, cefprozilo, cefquinoma, ceftazidima, ceftibutina, ceftiofur, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, florfenicol, ciprofloxacino, claritromicina, clinafloxacina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol (trimtoprim/sulfametoxazol), dalbavancina, dalfopristina/quinopristina, daptomicina, dibekacina, dicloxacilina, doripenem, doxiciclina, enrofloxacina, ertapenem, eritromicina, flucloxacilina, fluconazol, flucitosina, fosfomicina, ácido fusídico, garenoxacina, gatifloxacino, gemifloxacino, gentamicina, imipenem, itraconazol, kanamicina, ketoconazol, levofloxacino, lincomicina, linezolida, loracarbef, mecillnam (amdinocilina), meropenem, metronidazol, meziocilina, mezlocilina-sulbactam, minociclina, moxifloxacino, mupirocina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacino, ofloxacino, oxacilina, pefloxacina, penicilina V, piperacilina, piperacilina-sulbactam, piperacilina/tazobactam, rifampicina, roxitromicina, esparfloxacino, espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, sulbactam, sulfametoxazol, teicoplanina, telavancina, telitromicina, temocilina, tetraciclina, ticarcilina, ticarcilina-ácido clavulánico, tigeciclina, tobramicina, trimetoprima, trovafloxacino, tilosina, vancomicina, virginiamicina y voriconazol.
En determinadas realizaciones, una terapia de combinación comprende la administración de dos o más antígenos O deE. colidescritos en el presente documento (véase la Sección 5.2), bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4) y/o composiciones descritas en el presente documento (véase la Sección 5.6.2).
5.7.2 Población de pacientes
En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto sin tratamiento previo, es decir, un sujeto que no tiene una infección por ExPEC o no ha tenido previamente una infección por ExPEC. En una realización, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto sin tratamiento previo que corre el riesgo de adquirir una infección por ExPEC.
En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto que ha sido diagnosticado con una infección por ExPEC. En algunas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto infectado con ExPEC antes de que los síntomas se manifiesten o los síntomas se vuelvan graves (por ejemplo, antes de que el paciente requiera hospitalización).
En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto que ha sido diagnosticado con una infección por UPEC. En algunas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto que padece infecciones recurrentes del tracto urinario. En algunas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto que padece infecciones recurrentes del tracto urinario, pero que se encuentra sano en el momento del tratamiento. En algunas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto que tiene o está en riesgo de adquirir bacteriemia o septicemia.
En algunas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un ave. En determinadas realizaciones, el animal es un canino. En determinadas realizaciones, el animal es un felino. En determinadas realizaciones, el animal es un caballo. En determinadas realizaciones, el animal es una vaca. En determinadas realizaciones, el animal es un mamífero, por ejemplo, un caballo, cerdo, ratón o primate. En una realización específica, el sujeto es un ser humano.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un ser humano adulto. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un ser humano adulto más de 50 años. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un sujeto humano anciano.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un niño humano. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un bebé humano. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un bebé humano prematuro. En algunas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un ser humano en edad de empezar a caminar. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) no es un bebe menor de 6 meses.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un individuo que está embarazada. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es una mujer que ha dado a luz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas antes.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un individuo con mayor riesgo de ExPEC (por ejemplo, un individuo inmunocomprometido o inmunodeficiente). En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un individuo en contacto estrecho con una persona que tiene o con un mayor riesgo de infección por ExPEC.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es un trabajador de atención médica (por ejemplo, un médico o enfermera). En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) está inmunocomprometido (por ejemplo, padece una infección por VIH) o está inmunodeprimido.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) tiene diabetes. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) tiene esclerosis múltiple.
En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) tiene una afección que le exige el uso de un catéter. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se le va a administrar un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) tiene una lesión de la médula espinal.
5.7.3 Dosificación y frecuencia de administración
La cantidad de un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) que será eficaz en el tratamiento y/o la prevención de una infección por ExPEC dependerá de la naturaleza de la enfermedad y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. La administración del antígeno O, el bioconjugado y/o la composición se puede realizar mediante diversas vías conocidas por el médico, por ejemplo subcutánea, parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, intradérmica, transdérmica, intranasal, etc. En una realización, la administración es a través de una inyección intramuscular.
La dosificación precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la infección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Por ejemplo, las dosificaciones eficaces también pueden variar según la forma de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente (incluyendo edad, peso corporal, salud), si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones de tratamiento se valoran para optimizar la seguridad y la eficacia.
En determinadas realizaciones, se emplea un ensayoin vitropara ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. Véase la Sección 5.8. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosificación derivadas de sistemas de prueba de modelosin vitroo animales.
En determinadas realizaciones, las dosificaciones ilustrativas para vacunas a base de glucoconjugados (por ejemplo, composiciones que comprenden bioconjugados) varían de aproximadamente 0,1 |jg a 400 |jg de carbohidrato por dosis. En otras realizaciones, las dosificaciones ilustrativas para vacunas a base de glucoconjugados (por ejemplo, composiciones que comprenden bioconjugados) varían de aproximadamente 0,1 jg a 4000 jg de una o más proteínas por dosis. En determinadas realizaciones, una dosificación ilustrativa para una vacuna a base de glucoconjugado (por ejemplo, una composición que comprende bioconjugados) comprende 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 jg de uno o más carbohidratos por dosis. En determinadas realizaciones, una dosificación ilustrativa para una vacuna a base de glucoconjugado (por ejemplo, una composición que comprende bioconjugados) comprende 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 jg de una o más proteínas por dosis. En determinadas realizaciones ilustrativas, una dosificación para su administración a un ser humano corresponde a 0,5 ml que contienen aproximadamente 1-10, por ejemplo, aproximadamente 2-6, por ejemplo, aproximadamente 4 jg de polisacárido por cada uno de los glucoconjugados incluidos.
En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto una vez como una dosis única. En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto como una dosis única seguida de una segunda dosis de 3 a 6 semanas después. De acuerdo con estas realizaciones, pueden administrarse al sujeto inoculaciones de refuerzo en intervalos de 6 a 12 meses después de la segunda inoculación. En determinadas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar un antígeno O deE. coli,un bioconjugado o una composición diferente. En algunas realizaciones, la administración del mismo antígeno O deE. coli,bioconjugado o composición puede repetirse y las administraciones pueden separarse al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) se administra a un sujeto como una dosis única una vez al año.
En determinadas realizaciones, un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) es para su uso en un método donde se administra a un sujeto como 2, 3, 4, 5 o más dosis con 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas de diferencia. En algunas realizaciones, 2, 3, 4, 5 o más dosis de un antígeno O deE. colidescrito en el presente documento (véase la Sección 5.2), un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.4), o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.6.2) se administran a un sujeto con una diferencia de 2, 3, 4, 5 o 6 semanas a una dosificación de 0,1 jg a 0,5 mg, de 0,1 jg a 0,4 mg, de 0,1 jg a 0,3 mg, de 0,1 jg a 0,2 mg o de 0,1 jg a 0,1 mg de contenido de carbohidratos. En determinadas realizaciones, el antígeno O deE. coli,el bioconjugado o la composición que se administran son los mismos cada vez. En determinadas realizaciones, el antígeno O deE. coli,el bioconjugado o la composición que se administran son diferentes cada vez.
Para la inmunización pasiva con un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti O25B), la dosificación puede variar de aproximadamente 0,0001 a 100 mg de anticuerpo por kg de peso corporal, o de 0,01 a 5 anticuerpos por kg de peso corporal. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mg o 700 mg, o dentro del intervalo de 70-700 mg, respectivamente, para un paciente de 70 kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses durante un período de un año o durante varios años, o durante varios intervalos de años. Los intervalos pueden ser irregulares y alterarse según los niveles de anticuerpos en sangre del paciente.
5.8 Ensayos
Ensayo para evaluar la capacidad de los bioconjugados para inducir una respuesta inmunitaria
La capacidad de los bioconjugados/composiciones que se describen en el presente documento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar usando cualquier enfoque conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la capacidad de un bioconjugado para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar inmunizando a un sujeto (por ejemplo, un ratón) o un conjunto de sujetos con un bioconjugado descrito en el presente documento e inmunizando a un sujeto adicional (por ejemplo, un ratón) o un conjunto de sujetos con un control (PBS). Posteriormente, los sujetos o el conjunto de sujetos pueden ser expuestos a ExPEC y se puede determinar la capacidad de la ExPEC para causar enfermedad (por ejemplo, ITU) en los sujetos o conjunto de sujetos. Los expertos en la técnica reconocerán que si el sujeto o el conjunto de sujetos inmunizados con el control padecen una enfermedad posterior a la exposición a ExPEC pero el sujeto o el conjunto de sujetos inmunizados con uno o más bioconjugados o una composición de los mismos descritos en el presente documento padece menos o no padece ninguna enfermedad, entonces el bioconjugado es capaz de generar una respuesta inmunitaria en un sujeto. La capacidad de uno o más bioconjugados o una composición de los mismos descritos en el presente documento para inducir un antisuero que reacciona de forma cruzada con un antígeno O de ExPEC se puede ensayar mediante, por ejemplo, un inmunoensayo, tal como un ELISA.
Ensayos bactericidas in vitro
La capacidad de los bioconjugados descritos en el presente documento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar usando un ensayo bactericida en suero (SBA) o un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPK), que representa un método establecido y aceptado que se ha usado para obtener la aprobación de vacunas a base de glucoconjugados. Dichos ensayos se conocen bien en la técnica y, brevemente, comprenden las etapas de generar y aislar anticuerpos contra una diana de interés (por ejemplo, un antígeno O, por ejemplo, O25B, deE. coli)mediante la administración a un sujeto (por ejemplo, un ratón) de un compuesto que provoca tales anticuerpos. Posteriormente, la capacidad bactericida de los anticuerpos se puede evaluar, por ejemplo, cultivando la bacteria en cuestión (por ejemplo,E. colidel serotipo relevante) en presencia de dichos anticuerpos y complemento y, dependiendo del ensayo, células neutrófilas, y ensayando la capacidad de los anticuerpos para destruir y/o neutralizar las bacterias, por ejemplo, usando enfoques microbiológicos estándar.
5.9 KITS
En el presente documento se proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones descritas en el presente documento (véase la Sección 5.6.2), tales como uno o más antígenos deE. coli(véase la Sección 5.2) y/o bioconjugados (véase la Sección 5.4) proporcionados en el presente documento. Opcionalmente, asociado a tal(es) recipiente(s), puede haber un aviso en la forma prescrita por un organismo estatal que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicho aviso la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración a seres humanos. Los kits incluidos en el presente documento se pueden usar en los métodos anteriores de tratamiento e inmunización de sujetos.
6. Ejemplos
MÉTODOS
Aglutinación
Un proceso en el que las células o la masa celular lisada se mezclan con antisuero que contiene anticuerpos específicos para una estructura polimérica, por ejemplo, el antígeno O. Se forman agregados visibles e insolubles cuando el antisuero reconoce las estructuras celulares. Este método se usa convencionalmente para identificar los serotipos O, K y H. Véase DebRoy,et al.,(2011) Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185
Preparación de muestras de LPS para análisis mediante SDS PAGE
El LPS de células gramnegativas está compuesto por una base de lípido A, modificada con un oligosacárido central que proporciona la unión para el antígeno O. Para analizar el LPS de los aislados clínicos, las células se cultivaron en medio Lb estándar a 37 °C durante 24 h, y la biomasa correspondiente a 1 ml de cultivo con una DO600 de 2 se recogió y se lisó en tampón de muestra Lammli 1x y se incubó a 95 °C durante 10 minutos. Los extractos se trataron adicionalmente durante 1 hora a 65 °C para eliminar cualquier señal proteica usando 1 g/l de proteinasa K. Los extractos tratados se separaron mediante SDS PAGE y el LPS se visualizó mediante tinción con plata o transferencia de Western usando el antisuero apropiado.
Preparación de LPS para el recubrimiento de placas ELISA
Se preparó LPS usando un método descrito por Apicella, (2008) Methods Mol Biol 431, 3-13, y se purificó adicionalmente como se describe por Perdomo y Montero, (2006) Biotecnologia Aplicada 23:124-129.
HPLC de OPS 2AB: "Identificación de LLO"
Este método se usa para analizar la estructura del OPS ligado a UPP.
Para extraer glucanos ligados a UPP, se lavaron células deE. colicon NaCl al 0,9 % y se liofilizaron. Las células secas se extrajeron con disolvente orgánico (mezclas de metanol:agua (M:Ag. = 17:3 a 19:1, v/v) y/o cloroformo:metanol:agua de relaciones optimizadas (por ejemplo, C:M:Ag. = 10:10:3; v/v/v)). Los extractos se secaron en una corriente de N2 y se resuspendieron en C:M:Ag. = 3:48:47. Para purificar los glucolípidos extraídos, la resuspensión 3:48:47 se pasó a través de un cartucho tC18 Sep-PAK. El cartucho se acondicionó con 10 ml de metanol, seguido de equilibrio con 10 ml de 3:48:47 (C:M:Ag.). Después de cargar la muestra, el cartucho se lavó con 10 ml de 3:48:47 (C:M:Ag.) y se eluyó con 5 ml de metanol y 5 ml de 10:10:3 (C:M:Ag.). Las eluciones combinadas se secaron en una atmósfera de N2. Las muestras de glucolípidos se hidrolizaron disolviendo las muestras secas en 2 ml de npropanol:ácido trifluoroacético 2 M (1:1), con calentamiento a 50 °C durante 15 min y a continuación evaporación a sequedad en una atmósfera de N2 (Glover,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). Las muestras secas se resuspendieron una vez más en 3:48:47 y se pasaron a través de un cartucho tC18, y el flujo se secó en una atmósfera de N2. El etiquetado con 2-AB y la limpieza de glucanos se realizaron usando el método del disco de papel como se describe (Bigge,et al.,Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry,et al.,Anal Biochem 304(1): 91-9).
Se separaron glucanos marcados con 2-AB mediante HPLC usando una columna de fase normal GlycoSep-N según Royleet al.pero modificados con respecto a un sistema de tres disolventes (Royle,et al.,Anal Biochem 304(1): 70 90). El disolvente A era formiato de amonio 10 mM, pH 4,4, en acetonitrilo al 80 %. El disolvente B era formiato de amonio 30 mM, pH 4,4, en acetonitrilo al 40 %. El disolvente C era ácido fórmico al 0,5 %. La temperatura de la columna fue de 30 °C y los glucanos marcados con 2-AB se detectaron mediante fluorescencia (Aex de excitación = 330 nm, Aem de emisión = 420 nm). Las condiciones del gradiente fueron un gradiente lineal del 100 % de A al 100 % de B durante 160 min a un caudal de 0,4 ml/min, seguido de 2 min del 100 % de B al 100 % de C, aumentando el caudal a 1 ml/min. La columna se lavó durante 5 min con el 100 % de C, volviendo al 100 % de A durante 2 min y funcionando durante 15 min al 100 % de A a un caudal de 1 ml/min, devolviendo a continuación el caudal a 0,4 ml/min durante 5 min. Las muestras se inyectaron en agua.
Ensayo de desacetilación:
Un equivalente de glucano marcado con 2-AB se seca a 30 °C, se resuspende en 50 pl de agua con (muestra) o sin (simulado) NaOH 200 mM (pH = 14) y se incuba durante 25 horas a 37 °C. A continuación, la solución se lleva a temperatura ambiente y se neutraliza mediante la adición de una solución de HCl 200 mM (pH = 1). Después del secado en vacío rápido a 30 °C, la muestra se vuelve a marcar con 2AB y se analiza mediante HPLC.
HPLC de hidrazinolisis
Se usó la misma técnica de HPLC en fase normal descrita anteriormente para separar los OPS liberados de los bioconjugados después de la hidrazinolisis. Antes de la hidrazinolisis, los bioconjugados correspondientes a 1 mg de proteína se secaron completamente en una corriente de N2. La liberación de polisacáridos se realizó usando el kit de liberación de glucanos por hidrazinolisis Ludger Liberate (Ludger n.° LL-HYDRAZ-A2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 450 pl de hidrazina a las muestras secas en una manta de N2 y se incubaron durante 16 horas a 85 °C. La hidrazina se eliminó por evaporación en atmósfera de N2 a 45 °C. La re-N-acetilación de los polisacáridos se realizó mediante incubación en 471 pl de anhídrido acético al 4,5 % en bicarbonato de sodio 1 M durante dos horas en hielo. Posteriormente, se añadieron 600 pl de una solución al 5 % de TFA y las muestras se hidrolizaron durante otra hora en hielo. La purificación se realizó en una columna EB20 usando los correspondientes tampones EB20 A y B.
Los polisacáridos liberados y purificados se marcaron con 2-AB y se analizaron mediante NP-HPLC como se describe para las muestras de LLO. Los picos de interés se recogieron y se identificaron mediante MS/MS.
MS y MS/MS de picos de HPLC
Para analizar la secuencia de monosacáridos de una molécula de OPS de interés, se realizó un análisis espectroscópico de masas. Las fracciones recogidas secas correspondientes a picos de HPLC específicos se resuspendieron en 5 ul de acetonitrilo (ACN) al 10 %, ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % y se mezclaron 1:1 con una solución de matriz (40 mg/ml de DHB en ACN al 50 %, TFA al 0,1 %) en la placa objetivo. Los datos de MS y MS/MS se adquirieron manualmente en el modo de iones positivos en un espectrómetro de masas Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Se obtuvieron MS/MS usando el método LIFT. Se usó una mezcla de péptidos estándar (Bruker Daltonik GmbH) para la calibración externa. Los espectros se exportaron usando el software Flex Analysis (Bruker Daltonik GmbH) y se analizaron manualmente.
Células hospedadoras
Se produjeron bioconjugados mediante células deE. colirecombinantes que expresaban, a través de uno o más plásmidos, una o más proteínas portadoras y la oligosacariltransferasa deC. jejuni(PglB), y OPS de cósmidos o mutantes de inserción cromosómica.
Se usó EPA genéticamente desintoxicada (exotoxina A dePseudomonas aeruginosaque contenía las mutaciones L552V, AE553) como proteína transportadora y se modificó para comprender 2 o 4 sitios de glucosilación (denominados en el presente documento 2S-EPA y 4S-EPA, respectivamente) y una etiqueta HIS del extremo C, y se expresó a partir de un plásmido inducible por arabinosa procedente de pBR322 (véase ihssen,et al.,(2010) Microbial cell factories 9, 61).
Se expresó MBP (proteína de unión a maltosa), una proteína deE. colisoluble y periplásmica nativa, a partir de un pGVXN579. pGVXN579 es un plásmido pMAL-p2X (New England Biolabs) modificado que codifica tres secuencias consenso de N glucosilación bacteriana seguidas de una etiqueta Myc fusionada en el extremo C a la proteína de unión a maltosa ORF codificada en el plásmido. Esta configuración permitió la purificación por afinidad del bioconjugado de MBP independientemente de una etiqueta HIS. La inducción de la expresión está controlada por el promotor tac y es inducible mediante IPTG.
La proteína PglB se expresó a partir del plásmido pEXT21 (un fragmentoEcoRI/BamHIde pMAF10 (Feldmanet al.,2005, PNAS USA 102(8):3016-3021) se clonó en pEXT21 con una etiqueta HA fusionada en el extremo C. Las variantes del plásmido de expresión son optimización de codones (pGVXN939), optimización de codones con eliminación del sitio de glucosilación (pGVXN948) y etiqueta HA-T eliminada (pGVXN970) y optimización de codones y etiqueta HA eliminada (pGVXN971).
Se analizaron los aislados clínicos para determinar su capacidad para sintetizar un determinado OPS usando aglutinación, transferencia de Western, tinción con plata, transferencia de Western, tinción con plata, identificación de LLO, serotipado por PCR o tecnologías similares que permiten la identificación de las características estructurales de OPS, y también para determinar su fenotipo de resistencia a antibióticos. Determinados aislados clínicos se eliminaron eliminados cromosómicamente para la enzima ligasa, WaaL, para mejorar la disponibilidad de OPS para la glucosilación de proteínas o el análisis de OPS.
Para analizar adicionalmente los aislados clínicos, el complejorfbde la cepa de laboratorio W3110 se reemplazó por el complejorfbclonado a partir de aislados clínicos, y se analizó la biosíntesis de OPS. Se eliminó el gen waaL para mejorar la eficiencia de la producción de bioconjugados.
Los intercambios de complejos y las eliminaciones de waaL se lograron mediante recombinación homóloga usando un método optimizado (véase la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/068737) o procedimientos publicados (Datsenko y Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645). Para el intercambio de complejos de OPS, el complejorfbde interés de un aislado clínico se clonó en el plásmido de contraselección pDOC-C, junto con un casete de resistencia a antibióticos, para su posterior integración en el locusrfbde la cepa W 3l10 deE. coli(Kuhlman y Cox, 2010, Nucleic acids research 38, e92; Lee et al, 2009, BMC Microbiol 9, 252). La recombinación homóloga de grandes complejosrfbde interés se logró usando ADN que flanqueaba la secuencia codificante del complejorfbde W3110 de 0,5 a 1,5 kilobases de longitud y la linealizaciónin vivodel ADN insertado derfbtransmitido por plásmidos. La cepa resultante contenía un complejorfbreemplazado (con y sin casete de resistencia a antibióticos), es decir, el complejorfbde W3110 se reemplazó por una molécula de ADN entre los genes gale ygndpor el tramo análogo aislado de un aislado clínico deE. coli.
En determinados experimentos, se usaron como cepas hospedadoras cepas W3110 que contenían un cósmido que codificaba el complejorfbde un serotipo deE. colideterminado.
Para la producción de bioconjugados expresados de forma recombinante en cepas a base de W3110, se eliminaron genes transmitidos por W3110 que interfieren con la producción de OPS recombinante. Por ejemplo, para la producción de células hospedadoras de bioconjugados O25B, se eliminó el complejo gtrABS de W3110. Para conseguir esto, se realiza una recombinación homóloga de acuerdo con un método publicado (Bloor AE, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol. abril de 2006;72(4):2520-5) usando secuencias de homología que flanquean cadena arriba del gen gtrA y cadena abajo del gen gtrS.
Para ensamblar las cepas de producción, la cepa hospedadora se transformó con unpglBy un plásmido de expresión portador mediante transformación. Véase Wackeret al.,2002, Science 298:1790-1793.
Producción de bioconjugados
La producción de bioconjugados se realizó mediante el crecimiento de células hospedadoras y la purificación de bioconjugados producidos en el espacio periplásmico. El crecimiento se realizó en matraces agitados o en un proceso de fermentación discontinua alimentada a escala industrial.
Los cultivos en matraces agitados se realizaron a 37 °C, usando un medio compuesto por los antibióticos apropiados en un excelente caldo complementado a veces con MgCl25 mM. Se inoculó medio a una DO de 0,05 con un cultivo nocturno a partir de células de producción recién transformadas, se cultivó hasta la fase logarítmica media, se indujo con arabinosa al 0,2%e IPTG 1 mM, se cultivó adicionalmente y se cosechó después de 20 h de crecimiento.
Fermentaciones discontinuas alimentadas
Se usó una alícuota de un banco de líneas celulares de producción para inocular un matraz agitado que contenía medio Soy LB con los antibióticos apropiados. El matraz agitado se incubó a 180 rpm, 37 °C durante aproximadamente 12 horas. Los medios discontinuos sin complementos se esterilizaron directamente dentro del biorreactor (33 min a >121 °C), se enfriaron y se añadieron los complementos. Se unió KOH 4 M o ácido fosfórico al 25 % al fermentador para regular el pH y el pH se ajustó a pH 7. La inoculación del biorreactor y el cultivo discontinuo a partir del precultivo se realizaron para producir una DO600 inicial de 0,005. El pH se mantuvo estable mediante la adición de KOH 4 M o ácido fosfórico al 25 %. Se mantiene la tensión de oxígeno disuelto (DO). La presión superior se mantuvo a 600 mbar. La formación de producto se indujo con L-arabinosa (0,1 %) y/o IPTG (1 mM). Inmediatamente después de la inducción, la alimentación se inició añadiendo un medio de alimentación que contenía arabinosa al 2,5 % e IPTG. 24 ± 2 horas después de la inducción, el biorreactor se enfrió a 25 °C, la alimentación se detuvo y se realizó la recolección mediante filtración de flujo tangencial o centrifugación.
La biomasa se lisó en Triton X-100 al 0,5 % mediante disrupción durante 4 ciclos de homogeneización a alta presión a 800 bar.
Los bioconjugados se purificaron mediante cromatografía en columna. Se usaron diversas técnicas cromatográficas para preparar bioconjugados, principalmente IMAC, cromatografía de intercambio aniónico (AEC) basada en resina Q y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Véanse, por ejemplo, Saraswatet al.,2013, Biomed. Res. Int. ID n.° 312709 (pág. 1-18) y el documento WO 2009/104074 para una descripción de dichos métodos.
Producción de bioconjugados para experimentos preclínicos
A partir del precultivo, se transfirió una cantidad definida a un biorreactor que contenía un medio rico a 35 ± 0,2 °C. Se mantuvieron el pH y la tensión de oxígeno disuelto. La velocidad de agitación alcanzó 700 rpm.
Cuando la densidad celular alcanzó la DO600 = 40 ± 5, se indujo la formación de producto con L-arabinosa (0,1 %) e IPTG (1 mM). La alimentación se inició 24 ± 2 horas después de la inducción y se enfrió el biorreactor. Tan pronto como la temperatura alcanzó 25 °C, la alimentación se detuvo y las células se recogieron.
Homogeneización a alta presión
Se descongeló una biomasa correspondiente a 50 l en el momento de la recolección durante 1 día a entre 2 y 8 °C. A continuación, en el recipiente se añadieron 2,5 l de tampón de lisis y clarificación. Se añadió Triton X-100 hasta una concentración final del 0,5 % y las células completamente descongeladas se rompieron mediante 4 ciclos de homogeneización a alta presión a 800 bar. Las células se recolectaron y se lavaron usando técnicas estándar.
Análisis de la composición de monosacáridos:
Se hidrolizaron bioconjugados que contenían aproximadamente 8 ug de polisacárido durante seis horas en 104 pl de TFA 3 M a 99 °C. El t Fa se eliminó por evaporación y las muestras se lavaron una vez con 500 pl de 2-propanol. Los monosacáridos resultantes se suspendieron en 100 pl de una mezcla de etiquetado que contenía 87,1 mg/ml de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP), MeOH al 50 % y NaOH 150 mM. El etiquetado se realizó durante 60 minutos a 70 °C. Las muestras se neutralizaron mediante la adición de 50 pl de HCl 300 mM y 20 pl de Tris/HCl 100 mM a pH 7,0. Los monosacáridos marcados con PMP se purificaron mediante extracción, una vez con 1 ml de di-butiléter y tres veces con 1 ml de CHCl3.
Los monosacáridos derivatizados con PMP se separaron mediante RP-HPLC (Merck-Hitachi) en una columna C18 Inertsil ODS-3 (GL Sciences) equipada con una precolumna. Se aplicó un gradiente de dos etapas del 100 % de tampón A (acetonitrilo al 13 %, H2O al 87 % (KH2PO4 al 0,045 %, trietilamina al 0,05 %, pH 7,0) al 50 % de tampón A/50 % de tampón B (acetonitrilo al 21 %, H2O al 79 % (KH2PO4 al 0,045 %, trietilamina al 0,05 %, pH 7,0) durante 4 minutos al 100 % de tampón B durante 47 minutos a 35 °C y un caudal de 1 ml/min. El volumen de inyección fue de 50 pl y la elución se controló mediante detección UV en línea a 250 nm. Los picos individuales se identificaron mediante superposición con cromatogramas de los estándares de monosacáridos disponibles comercialmente D-glucosa (Sigma-Aldrich n.° G7528), L-ramnosa (Sigma-Aldrich n.° R3875), N-acetil-D-glucosamina (Sigma-Aldrich n.° A8625) y N-acetil-L-fucosamina (Omicron Biochemicals n.° FUC-006).
Ejemplo 1: Epidemiología
Para determinar la distribución de serotipos deE. colicausante de infección del tracto urinario (ITU), se realizó un estudio epidemiológico. Se recogieron más de 1800 aislados deE. colide muestras de orina humana de sujetos en Suiza y se analizaron los serotipos del antígeno O (OPS) de cada muestra usando técnicas de aglutinación convencionales. Véase la figura 4
Se analizaron muestras de orina humana aisladas para determinar la identidad de los patógenos en las mismas y sus patrones de resistencia a antibióticos. Se obtuvieron aislados deE. colide las muestras posteriores al análisis. Los aislados deE. colise identificaron mediante estrategias de exclusión e inclusión microbiológicas convencionales que implicaban el crecimiento en cromo (CPS3) y agar MacConkey. Los aislados deE. colise analizaron adicionalmente mediante un ensayo de aglutinación para determinar su serotipo de antígeno O. Véase DebRoyet al.(2011) Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185. Se analizaron más a fondo los aislados de los mismos serogrupos del antígeno O para determinar la estructura química de la cadena O de cada aislado. Véase la Tabla 1A. Se determinó que determinadas cepas aisladas deE. colieran resistentes a los antibióticos, incluida la identificación de cepas resistentes a fluoroquinolonas y cepas productoras de beta-lactamasas de espectro extendido (ESBL, por sus siglas en inglés).
Tabla 1A:Distribución de los serotipos deE. coliasociados con ITU más comunes de una recopilación de 1841 muestras de orina recogidas en Suiza en 2012. Se muestra la distribución de serotipos de muestras de una l i n r l v n 71 l i ri i n ** m r .
Los serotipos O1, O2, O4, O6, O7, O8, O16, O18, O25, O73 y O75 se aislaron de sujetos independientemente de la ubicación, el tiempo de aislamiento, los síntomas y la población objetivo, lo que sugiere que estos son los serotipos predominantes deE. coliuropatógena (UPEC). Por consiguiente, la identificación de los serotipos del antígeno O más prevalentes indica que las vacunas específicas del antígeno O podrían limitarse a un subconjunto de serotipos, es decir, los más asociados con la enfermedad, como se identificó en el estudio descrito en este ejemplo.
Un análisis retrospectivo de serotipos de ITU en 1323 aislados de las últimas tres décadas en EE.UU. obtenidos del Centro de referencia deE. coli(ECRC) permitió una comparación exhaustiva con la bibliografía y los datos actuales de Suiza. La prevalencia de los 20 serotipos principales se encontró independientemente de la ubicación, el tiempo de aislamiento, los síntomas o la población objetivo y sugiere serotipos predominantes asociados a la UPEC (véase la Tabla 1B).
Tabla 1B:Prevalencia de los serotipos más comunes asociados a ITU de bibliografía seleccionada de 1987 a 2011 de datos de e E.UU. analizados retros ectivamente de 2000-2011 ECRC .
continuación
Los aislados de los serotipos descritos se calcularon como porcentaje sobre el número total de aislados (Andreuet al.,1997, J Infect Dis 176:464-469; Blancoet al.,1996, Eur J Epidemiol 12:191-198; Fathollahiet al.,2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnsonet al.,2005, J Clin Microbiol 43:6064-6072; Molina-Lopezet al.,2011, Journal of infection in developing countries 5:840-849; Sandberget al.,1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L. 2007, The Journal of infection 55:8-18; Teraiet al.,1997, Int J Urol 4:289-294). En determinados casos no se disponía de datos específicos; por lo tanto, los números porcentuales sólo pueden dar una indicación sobre la distribución general de serotipos de diferentes aislados de ITU en los estudios descritos y deben considerarse con precaución. También se incluyen los demás serotipos descritos identificados aunque menos prevalentes (O15, O20, O21, O22, O77 y O82).
Toda la información del análisis epidemiológico tomada en conjunto, los 10 serotipos predominantes podrían cubrir aproximadamente el 60-80 % de las infecciones porE. coli,suponiendo la cobertura de subporciones de las cepas no tipificables. Además, los datos muestran la importancia inesperada del serotipo O25 en el estudio epidemiológico de Suiza, en comparación con los datos de la bibliografía y los datos recientes de EE.UU. Véanse las Tablas 1A y B.
Los serotipos del antígeno O deE. colia menudo están compuestos por subtipos, que son distintos, pero estructural y antigénicamente similares. Para identificar subtipos desconocidos/no informados entre los aislados clínicos recolectados y para identificar los subtipos de antígeno O más prevalentes, se analizaron con más detalle las estructuras químicas de los antígenos O de los serotipos más prevalentes.
Ejemplo 2: O25 de E. coli
En los últimos años, se ha observado una mayor aparición de cepas positivas para O25 (véase George y Manges (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690) y se evidencia en el estudio descrito en el Ejemplo 1, donde se encontró que el serotipo O25 era uno de los cuatro serotipos principales deE. colien términos de prevalencia.
O25A
Se ha publicado previamente una estructura de unidades repetidas del antígeno O del serotipo O25 deE. coli(véase Kenneet al.,1983, Carbohydrate Research 122, 249-256; y Fundinet al.,2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4) y se presenta en la figura 2B. Un complejorfbrelacionado con el antígeno O O25 de la cepa E47a deE. coliestá disponible públicamente (GenBank GU014554) y se presenta en la figura 2A. E47a deE. colise usa como cepa de referencia para el serotipo O25. Se encuentra disponible más información sobre la secuencia del complejorfba partir de la secuencia genómica de una cepa que causa bacteriuria asintomática, 83972 deE. coli.(Véase Zdziarskietal.,2010, PLoS Pathog 6, e1001078). Aunque no se ha confirmado la expresión fenotípica de O25, las secuencias del complejorfbde E47a y 83972 deE. colison idénticas en un 99,49 %, lo que sugiere fuertemente que codifican el mismo antígeno O.
El antígeno O de las cepas deE. coli83972 yE47ase designa en el presente documento como "O25A", porque, como se describe a continuación, se identificó un antígeno O deE. colinovedoso, denominado "O25B", basándose en el análisis de los aislados clínicos obtenido en el estudio epidemiológico descrito en el Ejemplo 1, anteriormente.
Se han propuesto las funcionalidades para los productos génicos predichos de las cepas deE. coli83972 y E47a. Véase la Tabla 2; GenBank GU014554; y Szijarto,et al.(2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136.
Tabla 2.Predicciones del gen del antígeno O O25A del complejorfbsegún lo publicado por Wang,et al.(2010) J
Clin Microbiol 48 2066-2074 véase también GenBank GU014554.
Las comparaciones de estructura y complejo génico implican que todas las funciones necesarias para el ensamblaje del OPS O25A están codificadas dentro del complejorfbubicado entregalEygnd.Las funciones de las diversas enzimas del complejo génicorfb(véase la figura 2A) son las siguientes:
RmlBDAC codifica las enzimas necesarias para la biosíntesis de dTDP-L-ramnosa, que es el sustrato para la adición de la ramificación L-Rha a la unidad de repetición de OPS.
FnlABC codifica las enzimas necesarias para la biosíntesis de UDP-L-FucNAc, que es el sustrato donante para la adición de L-FucNAc a la repetición de OPS O25.
WekABC y wbuBC son glucosiltransferasas de acuerdo con el análisis de homología.
Sin embargo, wbuC parece corto y truncado y es poco probable que sea funcional. Por lo tanto, la anotación funcional más probable indica que hay cuatro glucosiltransferasas que generan los cuatro enlaces para el ensamblaje de la unidad de repetición.
Se requieren Wzx y Wzy para invertir la URB en el espacio periplásmico y su polimerización en Und-PP.
Todas las funciones requeridas para sintetizar la estructura de unidad de repetición de O25A publicada están codificadas por los complejosrfbdeE. coliE47a y 83972. Por lo tanto, se concluyó que el complejorfbes responsable de codificar el OPS O25A.
O25B
En 2009, se caracterizaron aislados clínicos deE. coliprocedentes de un entorno hospitalario español para determinar grupos clonales. Véase Blanco,et al.(2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141. Se realizó la caracterización de a) el tipo de ESBL, b) el serotipo O, c) los genes de virulencia, d) la tipificación de secuencias multilocus (MLST, por sus siglas en inglés) y e) la tipificación por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE, por sus siglas en inglés). Los resultados indicaron que aproximadamente el 20 % de todos los aislados podrían atribuirse al mismo clon: Serotipo y MLST O25:H4 ST131, tipo de ESBL CTX-M15, Filogrupo B2, que codifica un conjunto específico de genes de virulencia. El análisis de los componentes del complejorfbde aislados clínicos representativos mostró una secuencia 3' desconocida en comparación con la secuencia de la cepa de tipificación de la cepa E47a, y también de aislados clínicos identificados mediante un método de tipificación por PCR específico de alelo (véase Clermontet al.,2008, J Antimicrob Chemother. 61(5):1024-8; Clermontet al.,Diagn. Microbiol Infect Dis. 2007, 57(2):129-36; y Li,et al.,2010, J Microbiol Methods 82, 71-77. En 2013, Phanet al.publicaron la secuencia genómica del clon O25b:H4 ST131, confirmando que el clon es un derivado de K-12 de acuerdo con la estructura de su complejo génicowaacomo se ha informado anteriormente. Véase Phanet al.,2013, PLOS Genetics 9(10):1-18 (e1003834). En conjunto, los datos sugieren que había surgido un clon aglutinante de O25 novedoso enE. coliaislado de entornos hospitalarios, y que el clon tenía fenotipos ESBL, MLST y PFGE específicos y contenían un complejo génico del antígeno O alterado.
Tipificación por PCR
Para determinar si el serotipo O25B estaba presente entre las cepas aisladas deE. coliidentificadas en el estudio epidemiológico descrito en el Ejemplo 1, se analizaron cepas positivas para aglutinación de O25 tipificando por PCR para determinar O25 y O25B. La<p>C<r>se realizó usando colonias extraídas de una placa de Petri como fuente de ADN molde y diferentes cebadores oligonucleotídicos. Se usaron cebadores específicos de O25, basados en la amplificación de E47a O25wzy,y descritos en Li,et al.(2010) J Microbiol Methods 82, 71-77. También se usaron los cebadores específicos de O25B descritos en Blanco,et al.(2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141, que son específicos para una porción 3' indefinida del complejorfbde O25b (LNB220). De acuerdo con Phanet al.,2013, este par de oligonucleótidos específico de O25B se hibrida en una porción 3' del complejorfbde O25B.
De 24 aislados clínicos analizados con un fenotipo positivo para aglutinación de O25, 20 se asignaron al serotipo O25B mediante tipificación por PCR, mientras que los 4 restantes se identificaron positivamente como pertenecientes al serotipo O25A mediante tipificación por PCR. Por lo tanto, sorprendentemente, se determinó que las cepas del serotipo O25B eran más frecuentes entre las cepas analizadas que las cepas del serotipo O25A.
Secuenciación de complejos
Para analizar genéticamente el complejorfbde O25B, se secuenció el complejo de una cepa O25B positiva para PCR, denominada "upec138". Los genes identificados y sus homólogos de proteínas relevantes más cercanos junto con la nomenclatura sugerida se enumeran en la Tabla 3, a continuación. Los genes específicos de O25B y ausentes en O25A se indican con un asterisco.
T l .Pr i i n l n l ní n 2 B l m lrf .
La composición del complejorfbmuestra diferencias claras con la composición del complejo O25A. Los genes en la porción 5' del complejo son homólogos cercanos entre sí(rmlDa wzy; E47a y 83972 deE. coli).Esto no es sorprendente para los genesrmlque son homólogos en muchas cepas deE. colique sintetizan L-ramnosa. La homología de los productos génicos de O25A y B llega al genwekC(O25A), antes de descender a niveles inferiores al 25 % de identidad, lo que indica que las secuencias de proteínas no están relacionadas. Véase la figura 3B. Además, se encontró que los genes de biosíntesis de UDP-N-acetilfucosamina de O25A están ausentes en la cepa upec138 (O25B), al igual que dos glucosiltransferasas cadena abajo defnlABC.Véase la figura 3B. En conjunto, estos datos sugieren que las cepas O25B no pueden sintetizar UDP-L-FucNAc, excepto que los genes de biosíntesis de L-FucNAc podrían codificarse fuera del complejorfb.Sin embargo, no se ha informado de un solo caso de un locusfnlABCfuera del complejorfbcuando L-FucNAc está presente en la URB del antígeno O. Por lo tanto, es poco probable que la cepa 138 sea capaz de sintetizar la unidad de repetición básica (URB) de O25A publicada.
Los genes identificados en el complejorfbde O25B que no están presentes en el complejorfbdel serotipo O25A codifican dos glucosiltransferasas y una O-acetiltransferasa. Estos tres genes comparten la misma organización y las proteínas codificadas tienen una alta homología con los geneswbbJKLencontrados y caracterizados en las cepas K-12 deE. colidel genotipo del complejorfbde O16. Véase la figura 3B. De acuerdo con la relación genética entre los serotipos O25B y O16, la nomenclatura de los genesrfbO16, wbbJKL, se aplicó a los genes homólogos identificados en el complejorfbde O25B.
Se conoce la estructura de la URB de O16 y se han determinado las funciones génicas dewbbJKL.Véase Stevenesonet al.,(1994) J Bacteriol. 176(13):4144-56. WbbJKL son responsables de la acetilación de L-ramnosa, la transferencia de un residuo de D-Glc a L-Rha-D-Glc-UndPP y la transferencia de L-Rha a D-GlcNAc-UPP, que está formado por wecA del complejo ECA. Basándose en la homología con WbbJKL de O16 y las funciones conocidas de WbbJKL de O16, se dedujo que el complejorfbde O25B sintetiza una estructura que contiene parcialmente elementos O16 y parcialmente O25A juntos. Se consideró muy probable que WbbJKLü<25>B sintetizara la misma estructura que WbbJKLo i<6>, es decir, a-D-Glc-1,3-a-L-Rha(2Ac)-1,3-a-D-GlcNAc. Esta estructura de trisacárido es idéntica a la cadena principal "central" no ramificada de O25A con la única excepción de que L-Rha(2Ac) reemplaza L-FucNAc. Por consiguiente, el reemplazo sería conservador, ya que D-FucNAc y L-RhaOAc son ambos monosacáridos con una función 6-desoxi y 2-acetilo. La única diferencia es la conformación, ya que la fucosa está relacionada con la galactosa y la ramnosa con la manosa, lo que da como resultado una orientación diferente del grupo OH en la posición 3 y del grupo metilo en la posición 5. Los enlaces entre los monosacáridos serían idénticos (todos a-1,3), lo que indica que las estructuras serían similares en forma y características químicas. Por analogía, las proteínas codificadas en la parte cadena arriba de los gruposrfbde O25A y B(rmlDCABywekAB)ramifican la URB de O25A o B mediante la unión de las ramificaciones D-Glc y L-Rha a cualquiera de los trisacáridos de la cadena principal "central". Esto significaría que aceptan cualquiera de las cadenas principales (con L-FucNAc O L-Rha(2Ac)) como sustrato.
La presencia de L-Rha como segundo monosacárido del extremo reductor de la URB de O25B explica por qué la biosíntesis de L-FucNAc puede estar ausente en O25B. UDP-L-FucNAc no es necesario porque se reemplaza por los genes de biosíntesis de dTDP-L-Rha que están presentes en el extremo 5' del complejo (rmlDBAC).
Phanet al.,2013 realizaron un análisis genético similar en un aislado clínico O25B, pero concluyeron de manera diferente. También secuenciaron el genoma completo para buscar el complejo génico de biosíntesis de UDP-FucNAc; sin embargo, afirman que falta la maquinaria para UDP-L-FucNAc en la cepa O25B:H4 ST131 EC958 no solo en el complejorfbde O25B, sino en toda la cepa. Sin embargo, Phan concluyó que UDP-L-FucNAc debe sintetizarse de una manera diferente, suponiendo que O25B:H4 ST131 EC958 produce la misma estructura del antígeno O que E47a, es decir, O25A. En cambio, se divulga en el presente documento que el escenario más probable es que las cepas O25B no puedan producir L-FucNAc, sino que reemplacen el segundo residuo de la URB con un residuo de L-ramnosa O-acetilada, y que los genes necesarios para este cambio estén codificados exclusivamente en el complejorfb.
Además, la presencia de un homólogo de O-acetiltransferasa en el complejo de O25B sugiere la O-acetilación en la URB de O25b , una modificación ausente en O25A. Por consiguiente, se determinó que las estructuras del antígeno O25 de los serotipos O25A y O25B deben ser diferentes.
Análisis estructural de O25B
Para confirmar la hipótesis de una estructura del antígeno O25 diferente, se analizaron la composición química y la disposición de los antígenos O de los aislados clínicos O25 descritos en el Ejemplo 1. Para caracterizar las estructuras del OPS O25 con más detalle, se usaron varios métodos.
En primer lugar, se analizó la estructura del antígeno O mediante SDS PAGE. Se analizó el lipopolisacárido (LPS) de aislados clínicos para determinar diferencias en la movilidad electroforética usando diferentes métodos de tinción después del análisis por SDS PAGE. Para visualizar las cantidades de LPS, se realizaron tinciones con plata y transferencias de Western específicas anti O25. Véase la figura 5, que muestra los resultados del análisis de 10 aislados. Los datos muestran que se obtienen intensidades de señal similares mediante tinción con plata de las diferentes preparaciones de LPS. En cambio, el sondeo con el antisuero específico mostró intensidades de señal más fuertes en 3 de 10 muestras (aislados upec436, upec767, upec827). Se especuló que las diferentes intensidades de señal surgieron debido a diferencias en la estructura del OPS.
Para dilucidar la estructura de O25B en detalle, se aplicaron diferentes métodos analíticos. El aislado clínico upec138 fue positivo para O25B mediante PCR y muestra un reconocimiento más débil por el antisuero de aglutinación de O25 que las cepas O25A. Véase la figura 5. Además, la cepa es ESBL, pero sensible a FOS, IPM y TZP, y resistente a Am , CXM, NOR u CIP. Otro aislado clínico, la cepa upec436, fue negativo para O25B por PCR, pero positivo para O25 general (O25A) por PCR. También se encontró que upec436 era fuertemente reactivo con el antisuero de aglutinación de O25 cuando se analizó su LPS mediante transferencia de Western. Véase la figura 5. Se extrajo LLO de ambas cepas, se marcó con 2AB y se analizó mediante HPLC en fase normal. Véase la figura 6; LLO de upec138 y upec436, 9,079 y 9,081). Los patrones de elución mostraron claras diferencias entre los dos extractos. El análisis MS/MS de picos específicos de cepa detectó señales compatibles con las estructuras de URB esperadas.
Señales en la cepa upec436 (9,081): El pico en el tiempo de elución 62' se analizó mediante MS y se encontró que contenía como masa principal una molécula con m/z = 1021 Da, es decir, una molécula correspondiente a la masa esperada de la URB de OPS O25A completa. El análisis por MS/MS produjo un patrón de fragmentación compatible con la secuencia de monosacáridos de O25A (figura 7A; Ms /MS de m/z = 1021).
Señales en la cepa upec138: La masa principal en el pico en el tiempo de elución 50' fue m/z 1022 Da, es decir, un Da más que la unidad de repetición de O25A completa. El análisis por MS/MS (figura 7B; MS/MS de O25B) mostró un comportamiento de fragmentación casi idéntico al de la unidad de repetición de O25A, y localizó una diferencia de 1 Da en el segundo monosacárido del extremo reductor (identificado por un ion Y de fragmentación de m/z = 551 en MS/MS de O25A, y m/z = 552 en la cepa upec138). Un pico adicional que eluyó en 60' mostró una fragmentación similar, pero una diferencia de 42 Da en la masa del ion madre (m/z = 980) que se localizó en el mismo monosacárido (m/z = 510), es decir, el segundo desde el extremo reductor. La interpretación de estos resultados se da a continuación.
El procedimiento de extracción de OPS, hidrólisis y etiquetado con 2AB implica un tratamiento con ácido para eliminar el Und-PP del OPS. Se demostró que las condiciones de tratamiento eliminan parcialmente la O-acetilación, pero no la N-acetilación. Por lo tanto, es probable que el pico en 60' represente una masa de URB desacetilada que surgió de la hidrólisis química del material en el pico de 50'. En conjunto, estos datos indican que hay una O-acetilación en O25B en la misma posición del monosacárido en la que hay N-acetilación en L-FucNAc de O25A.
Para confirmar químicamente que la acetilación en el segundo residuo del extremo reductor está unida por O, se realizó un ensayo de desacetilación. El pico específico de O25B de HPLC de 2AB LLO con un tiempo de elución de 50' se recogió de una cepa positiva para PCR O25B y se trató con el álcali descrito en "Métodos". El nuevo análisis por HPLC dio como resultado un pico con un tiempo de elución de 60' como se identifica en un pico de O25B de la figura 6, que contiene una masa principal de m/z = 979, con un patrón iónico de fragmentación por MS/MS consistente con una URB de O25B que había perdido su grupo O-acetilo. Los grupos N-acetilo son estables frente al tratamiento con álcali, como lo muestra el grupo N-acetilo restante en el extremo reductor D-GlcNAc en la misma molécula.
En conclusión, se determinó que la cepa upec138 representativa de O25B está relacionada estructural y genéticamente con los OPS O25A y O16 (figura 3A y B) deE. coli.O25B se diferencia de O25A en que tiene una estructura de unidad de repetición que contiene un grupoO-acetilo en lugar de un grupo N-acetilo en el segundo monosacárido de la unidad de repetición, que es un residuo L-Rha y no un D-FucNAc. Estos cambios probablemente fueron causados por un reemplazo de la maquinaria de biosíntesis de UDP-FucNAc y la D-FucNAc transferasa por un tramo de ADN que codifica dos glucosiltransferasas y una O-acetiltransferasa. Estos genes están relacionados con el complejo génico de O16, basándose en el análisis de homología y funcionalidad. Las estructuras finales son diferentes, pero similares, lo que explica la reactividad cruzada observada con el antisuero de aglutinación de O25.
Como se ha analizado anteriormente, se concluyó y se propuso basándose en el análisis de sus complejosrfbque OPS O25A contiene L-FucNAc, mientras que la estructura está ausente en O25B. Para investigar si FucNAc está ausente en O25B, se realizó un análisis de la composición de monosacáridos de los bioconjugados de EPA producidos en las cepas O25A y O25B (figura 9) usando el método de etiquetado PMP y el método de análisis por HPLC descritos anteriormente. Para producir bioconjugados, se prepararon y se modificaron aislados clínicos deE. colicon los fenotipos O25A y O25B para una producción óptima de bioconjugados. Como parte de la modificación, los geneswaaLde las cepas upec_436 (O25A) y upec_138 (O25B) se eliminaron como se ha descrito previamente (véase Datsenko y Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645) informado por el método para determinación del tipo de núcleo (véase Amor,et al.,(2000) Infect Immun 68, 1116-1124). Las cepas resultantes se transformaron con plásmidos de expresión para 4S-EPA (pGVXN659) y una oligosacariltransferasa, PglB (pGVXN939), para la producción de O25A; y con pGVXN114 y pGVXN539 (que producen 2S-EPA) para la producción de bioconjugados O25B. Los bioconjugados O25B se produjeron en un matraz agitado de 2 l con posterior purificación por afinidad a partir de extractos periplásmicos mediante IMAC. Los conjugados O25A se produjeron mediante fermentación discontinua alimentada y se purificaron mediante un procedimiento de purificación de dos etapas a partir de un homogeneizado de células completas clarificado generado mediante homogeneización a alta presión como se ha descrito en la sección de métodos anterior. El análisis de la composición de monosacáridos se realizó como se ha descrito anteriormente.
Los resultados confirmaron la ausencia de una señal para FucNAc en los bioconjugados derivados de O25B, mientras que los bioconjugados que contienen O25A mostraron un pico en el tiempo de elución esperado como se determinó sometiendo una mezcla de monosacáridos al mismo procedimiento de procesamiento de muestras que un control. Por lo tanto, se confirmó que la supuesta estructura de O25B, como se esperaba según el análisis del complejorfb,no tiene L-FucNAc.
La estructura completa de la unidad de repetición (UR) del polisacárido del antígeno O (O-PS) del antígeno O deEscherichia colio 25B se determinó mediante resonancia magnética nuclear del bioconjugado después de la digestión enzimática parcial del resto de proteína transportadora EPA. El análisis confirmó que el O-PS O25B está compuesto por una UR de pentasacárido. Las señales de 1H y 13C se asignaron mediante técnicas de correlación de r Mn 2D, que confirmaron que la estructura de la UR de O-PS O25B difiere de la estructura de la UR de O-PS O25A publicada (Kenne, L.,et al.1983. Carbohydr. Res. 122:249-256; Fundin, J.,et al.2003. Magn. Reson. Chem. 41:202-205) mediante la sustitución de un residuo de a-3-FucpNAc por un residuo de a-3-Rhap, estando más del 90 % de este residuo O-acetilado en la posición C2. La UR de O-PS O25B completa se muestra a continuación (O25B'):
Producción y caracterización de bioconjugados
Para analizar más a fondo los antígenos de polisacáridos O25A y O25B, se produjo más material bioconjugado. Para O25A, el lote purificado de O25A-EPA anterior se usó para experimentos de caracterización adicionales. Para la producción de O25B-EPA, se construyó una cepa con un complejo O25B genómicamente integrado: W3110 AwaaL AgtrABS A/f6O16::/f6(upec138), con los plásmidos pGVXN1076 y pGVXN970. Esta cepa se construyó a partir de W3110 mediante los métodos de Datsenko y Wanner y una técnica de recombinación homóloga para la integración de sitio dirigido de inserciones grandes en cromosomas bacterianos (véase la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/071328).
Los bioconjugados O25B resultantes se caracterizaron usando ensayos de caracterización y liberación estándar. Los bioconjugados se purificaron usando dos etapas consecutivas de cromatografía de intercambio aniónico y de exclusión por tamaño, produciendo preparaciones de bioconjugados O25A y O25B con una pureza del 97,2 y el 98,1 %, respectivamente. Se usó cuantificación SDS PAGE para el análisis de pureza. Véanse la figura 10 (O25A) y la figura 11 (O25B). Las relaciones de azúcar-proteína se calcularon basándose en la cuantificación de azúcar mediante el ensayo de antrona (véase Laurentin y Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143-145) y el ensayo BCA para la concentración de proteínas, lo que dio como resultado el 40,2 y el 26,6 % para los bioconjugados O25A y o 25B. La cromatografía analítica de exclusión por tamaño mostró un estado monomérico de las partículas de acuerdo con el radio hidrodinámico esperado de E<p>A con cadenas de glucano unidas.
Aplicaciones
Para abordar el potencial inmunogénico de la estructura de O25B, se realizaron varios experimentos preclínicos usando bioconjugados O25B y O25A. Como se muestra en la figura 5, todos los aislados clínicos identificados como positivos para O25 en el Ejemplo 1 (es decir, los aislados tanto O25A como O25B) fueron positivos con los antisueros O25A comúnmente usados para detectar serotipos O25 (tipificación de sueros de la cepa O25A E47a) en transferencias de Western. Por lo tanto, el antisuero anti O25A parece tener reactividad cruzada con el LPS de las cepas O25B. Para analizar en detalle la respuesta de los anticuerpos y la reactividad cruzada, se produjeron bioconjugados O25. Se usó proteína de unión a maltosa (MBP) como proteína transportadora y la proteína transportadora se unió a O25A u O25B. La Tabla 4 muestra las cepas usadas para la producción de proteínas. Las cepas usadas se identificaron mediante PCR por su genotipo O25A o B. La expresión se realizó en medio TB y el producto proteico se purificó a partir de extractos periplásmicos.
Tabla 4:
Las inmunizaciones usando los bioconjugados obtenidos se realizaron usando protocolos estándar de inmunización de conejos (el protocolo rápido de 28 días de eurogentech). Se inyectaron 50 ^g de polisacárido unido a MBP los días 0, 7, 8 y 18 con un compuesto inmunoestimulante libre de Freund patentado. Los antisueros de sangrado final resultantes obtenidos el día 28 después de la primera inmunización se ensayaron para determinar su especificidad hacia el LPS O25A u O25B. La figura 22 muestra una comparación de las reactividades de los antisueros frente al LPS respectivo (O25A u O25B). Se preparó LPS a partir de upec436 y upec138 mediante digestión con proteinasa K de muestras de células completas en tampón SDS-PAGE Lammli. Se cargó la misma cantidad de LPS en dos geles SDS-PAGE seguido de electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa y detección usando antisueros O25A y O25B. Los resultados muestran que el antisuero O25A reconoce el LPS O25A mejor que el LPS O25B, mientras que el antisuero O25B reconoce el LPS O25B mejor que el LPS O25A. Este resultado indica que el antígeno autólogo produce un antígeno mejor. Por lo tanto, la inclusión del antígeno O25B en una vacuna proporcionará una mejor protección contra las cepas clínicas O25B predominantes del grupo O25 que el antígeno O25A.
Ejemplo 3: O1 de E. coli
Las bases de datos estructurales enumeran diferentes estructuras de subserotipos para O1 deE. coli.En particular, O1A, O1A1, O1B, O1C. O1A y O1A1 son estructuralmente idénticos y se cree que están asociados con enfermedades, aunque no se ha informado que O1B y C sean patógenos (véase Gupta,et al.,(1992) J Bacteriol 174, 7963-7970), y representan una minoría entre los aislados O1. Las estructuras de O1A/O1A1, O1B y O1C se muestran en la figura 12B. Para analizar la distribución del subserotipo O1 en el estudio epidemiológico de la UPEC del Ejemplo 1, se analizaron en detalle las estructuras del antígeno O de varios aislados clínicos del estudio. En primer lugar, se analizó mediante SDS PAGE la estructura de LPS de 12 cepas determinadas como positivas para O1 mediante un ensayo de aglutinación. Véase la figura 13: Tinción con plata de O1 y transferencia de Western.
La tinción con plata mostró señales típicas de LPS en todos los carriles que contenían extractos de los aislados clínicos O1. La tinción fuerte con una movilidad electroforética de aproximadamente 10-15 kDa representa el núcleo del lípido A, y las señales en forma de escalera con movilidades más lentas representan el núcleo del lípido A modificado con polímeros de carbohidratos compuestos por diferentes números de unidades de repetición del antígeno O. Cuando se comparan los LPS de diferentes aislados, aparecen diferencias en la distribución de longitud modal, la movilidad electroforética de las bandas individuales y el patrón de escalera. Basándose en estas observaciones, se pueden identificar tres grupos: (i) la mayoría de los aislados (upec002, upec010, upec032, upec140, upec108, upec143, upec276, upec399 y upec425) exhibieron una movilidad electroforética indistinguible de las bandas individuales, difiriendo solo en la intensidad de la señal y longitud promedio de las cadenas (distribución de longitud modal); (ii) dos aislados (upec119 y upec256) parecían tener una movilidad ligeramente más rápida en cada banda de LPS de la unidad de repetición, lo que sugiere una estructura diferente, por ejemplo, una modificación diferente del núcleo del lípido A; y (iii) las señales obtenidas del aislado upec1096 parecían una mancha en lugar de una escalera, lo que indica una estructura de OPS diferente. Véase la figura 13A.
El análisis mediante transferencia de Western y detección usando el antisuero anti O1 mostró que el LPS de todos menos upec1096 se detecta mediante anticuerpos O1 específicos, indicativo de moléculas de LPS con reactividad cruzada. Esto significa que 11 de los aislados son O1, y que lo más probable es que upec1096 no sea un aislado O1 (es decir, fue un falso positivo por el ensayo de aglutinación).
Para analizar la similitud estructural de los antígenos O1 en detalle, se usó el marcaje con 2AB de LLO y una técnica de HPLC de fase normal de alta resolución como se ha descrito anteriormente. La figura 14A muestra una superposición de los cromatogramas obtenidos de 5 de los 11 aislados clínicos. El área de identificación del OPS aparece en tiempos de retención de 110 a 150 minutos. Los perfiles indican que todas las muestras tienen señales que aparecen en los mismos tiempos de retención, lo que indica estructuras moleculares idénticas. Las diferencias observadas fueron la distribución de intensidad, es decir, el tiempo de elución de la señal máxima media, y las intensidades de señal generales. Los 6 extractos restantes dieron como resultado picos en los mismos tiempos de elución con diferencias en las intensidades. Sólo la muestra upec1096 fue diferente con respecto al patrón de picos, lo que confirma la diferencia estructural señalada anteriormente.
Se usó el análisis por MS/MS del contenido de picos individuales mediante análisis MALDI-TOF/TOF para identificar la secuencia de monosacáridos en las muestras de O1 (véase la figura 14B). El análisis por MS se realizó a partir de muestras extraídas no de aislados clínicos sino de una cepa W3110 AwaaL que contenía un cósmido con el complejorfbde upec032. Los picos que eluyeron en 50, 80, 96 y 108 minutos de tiempo de elución contenían masas principales de m/z = 1021,4, 1849,6, 2693,9, 3540,4. Las series de iones de fragmentación obtenidas después del análisis por MS/MS fueron consistentes con 1, 2, 3 y 4 unidades de repetición de una HexNAc, tres desoxihexosas y una HexNAc ramificada. Estos datos sólo pueden explicarse por la estructura del subserotipo O1A. La serie de picos descrita representa el OPS O1 adjunto a UPP en aislados clínicos, y cada pico consecutivo difiere del anterior en una unidad de repetición.
Estos datos confirman las afirmaciones de la bibliografía de que la estructura representativa para el serotipo O O1 deE. colien los aislados clínicos de ITU del estudio descrito en el Ejemplo 1 es el subtipo O1A.
Para producir un bioconjugado que porta el polisacárido O1A, se genomanipularon cepas deE. coliW3110 para expresar OPS O1A. Las cepas resultantes fueron W3110 ArfbO16::rfbO1AwaaL,contenía el complejorfbde un aislado clínico positivo para O1 (GU299791*, complejo que va dermlB-wekO).Las cepas hospedadoras que expresan OPS O1A se construyeron mediante recombinación homóloga. El complejorfbde un aislado clínico O1A se amplificó usando oligonucleótidos de PCR que se hibridan en el ADN que flanquea el complejorfb.A continuación, el ADN amplificado se usó para reemplazar el complejo de antígeno O endógeno de la cepa de laboratorio ya caracterizada W3110 mediante la recombinación homóloga descrita en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/071328. Se insertaron plásmidos de expresión para las proteínas transportadoras pGVXN659 y para PglB (pGVXN114, 939, 970, 971) mediante transformación y se confirmó la expresión de O1 (véanse la figura 15 y la figura 16).
En un experimento distinto, el aislado clínico O1 upec032 se genomanipuló para producir bioconjugados. La genomanipulación requirió que se considerara el fenotipo sensible a los antibióticos del aislado clínico. upec032AwaaLse construyó y se transformó con pGVXN939 y pGVXN579 para la producción de bioconjugados usando MBP como proteína transportadora. La ventaja de usar MBP y EPA como proteínas transportadoras es la posibilidad de generar antisueros, lo que da como resultado antisueros que tienen reactividad cruzada con el componente polisacárido pero no con el portador. Dichos antisueros son herramientas útiles para la evaluación de experimentos preclínicos, por ejemplo, como agentes de recubrimiento para desarrollar ensayos ELISA específicos de polisacáridos.
Ejemplo 4: O6 de E. coli
El serotipo O6 deE. colies la ExPEC más frecuente informada hasta la fecha (George, D. B. y Manges, A. R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690). No solo el estudio descrito en el Ejemplo 1, sino también los datos tomados de la bibliografía confirman que el serotipo O6 se encuentra entre los cuatro serotipos principales en muchas manifestaciones causadas por la ExPEC (véase la figura 4).
Se han informado dos estructuras de OPS O6 en la bibliografía (véanse Jannet al.,Carbohydr. Res. 263 (1994) 217 225, y Janssonet al.,Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283). Las estructuras de los antígenos O6 informados se muestran en la figura 17B. Son idénticas excepto por el monosacárido ramificado de cada uno, que es Glc o GlcNAc. Sin embargo, la bibliografía no ha identificado la estructura O6 predominante en aislados clínicos implicados en una ITU.
Para elegir la estructura más representativa del antígeno O6 con fines de vacuna, se investigaron las estructuras OPS de aislados clínicos deE. colipositivos para aglutinación de O6 del estudio del Ejemplo 1 usando el mismo enfoque descrito anteriormente para los serotipos O1. La tinción con plata y la transferencia de Western usando antisuero anti 06 identificaron uno de los 12 aislados clínicos que no reaccionaban al suero anti O6, aunque el LPS se tiñó con plata en todas las muestras (no mostrado), lo que sugiere un resultado de aglutinación de falso positivo. Sin embargo, es probable que las diferencias de Glc o GlcNAc no se detecten mediante el cambio de movilidad electroforética en los geles.
Para el análisis detallado de la estructura, se usó la identificación de LLO. Como referencia para cualquiera de las dos estructuras informadas, se incluyeron en el análisis extractos de cepas con Glc (CCUG11309) y GlcNAc (CCUG11311) ramificadas informadas. La comparación de las dos trazas de HPLC muestra series de picos que eluyen en 70,8, 103,3 y 122,2' para las muestras derivadas de CCUG11309, y series de 68,8, 100,3 y 118,3 para las muestras de CCUG11311. Véase la figura 18A. Los picos se analizaron mediante MS para determinar las masas principales presentes en los picos y MS/MS para determinar la secuencia de monosacáridos de estas masas principales. Los datos confirmaron para la serie de picos derivados del extracto CCUG11311 m/z = 1094,4, 2027,6 y 2962 (MSO154), correspondientes a polímeros de URB 1, 2 y 3 ramificados de GlcNAc como se esperaba. m/z = 1053,4, 1945,7 y 2836,9 con Glc ramificada se identificaron previamente en extractos de una cepa W3110 que expresaba el complejorfbclonado del aislado clínico O6 CFT, que tiene tiempos de elución máxima de identificación de 2AB idénticos a los de CCUG11309 (MSO138). Cuando los cromatogramas obtenidos de los 12 aislados clínicos se compararon con las cepas de referencia, 11 señales contenían la serie de picos indicativa de OPS O6 con un residuo de Glc ramificado. Cinco de estos 11 cromatogramas se muestran en la figura 18B. La única muestra que no generó señales en tiempos de elución específicos de O6 no era O6, es decir, lo más probable es que fuera un falso positivo de la prueba de aglutinación. Por lo tanto, el OPS O6 con una ramificación de Glc (figura 17B, arriba) es la estructura más representativa entre los serotipos O6 aislados de la epidemiología descrita en el Ejemplo 1.
Para producir un bioconjugado que porta el polisacárido O6Glc, se genomanipularon cepas deE. coliW3110 para expresar OPS O6 reemplazando el complejorfbW3110 con el complejorfbde la cepa CCUG11309. Véanse las Tablas 7 y 13. Las cepas resultantes fueron W3110 ArfbO16::rfbCCUG11309AwaaL,que contenían el complejorfbde una cepa deE. colipositiva para O6 con la ramificación de Glc informada en la URB (véase anteriormente). Las cepas hospedadoras que expresan OPS O6Glc se construyeron mediante recombinación homóloga. El complejorfbse amplificó usando oligonucleótidos de PCR que se hibridan en el ADN que flanquea el complejorfb.A continuación, el ADN amplificado se usó para reemplazar el complejo de antígeno O endógeno de la cepa de laboratorio ya caracterizada W3110 mediante la recombinación homóloga descrita en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/071328. Se insertaron plásmidos de expresión para las proteínas transportadoras y para PglB mediante transformación y la expresión de la OPS esperada en EPA se confirmó mediante transferencia de Western.
Ejemplo 5: O2 de E. coli
La estructura de unidades de repetición del polisacárido O2 se conoce desde 1987 (Jansson,et al.,(1987) Carbohydrate research 161,273-279). Se muestra en la figura 19B. Dos secuencias de conjuntos génicos del antígeno O O2 están disponibles en bases de datos públicas (GenBank EU549863 y GU299792). Se han realizado análisis comparativos y se han sugerido actividades de glucosiltransferasa (Tabla 5; Fratamicoet al.,2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316; y Li,et al.,(2010) J Microbiol Methods 82, 71-77).
Tabla 5.Las predicciones génicas del complejo del antígeno O O2 del complejorfbsegún lo publicado por Li,et al.y Fr mil.in i n nr r n i .
La comparación de la estructura y las homologías génicas indicó que todas las funciones para la biosíntesis del polímero están presentes:
rmIBDACcodifica las enzimas necesarias para la biosíntesis de dTDP-L-ramnosa, que es el sustrato para la adición de L-Rha a la cadena principal por las glucosiltransferasas wekPOR;
fdtABCproporciona dTDP-D-Fuc3NAc para las glucosiltransferasas ramificadas;
homólogos dewzyywzxresponsables de invertir la unidad de repetición unida a Und-PP del citoplasma al periplasma; y
wekPOR,son glucosiltransferasas previstas y se prevé que formen enlaces glucosídicos de la URB de O2 (tres L-Rha y una L-FucNAc).
El genwekSencontrado en las secuencias del complejorfbde O2 publicadas es una sulfatasa unida a membrana prevista y, por lo tanto, lo más probable es que no esté implicada en la formación de URB. Esto significaría que, si se asume la regla de una enzima-un enlace, una enzima del grupo de wekPOR debe ser bifuncional para proporcionar los cuatro enlaces glucosídicos.
Se demostró que la regla de una enzima-un enlace no es absoluta en múltiples ejemplos en los que se conocen menos glucosiltransferasas que enlaces, por ejemplo, enShigella flexneriY, S.flexneri6,C. jejuniy<o>1<a>deE. coli.En estos ejemplos, las glucosiltransferasas multifuncionales son responsables de la formación de más de un enlace glucosídico, son "bifuncionales" o "multifuncionales". Siempre es el mismo monosacárido el que se añade varias veces. Los residuos repetidos de ramnosa, como los que se encuentran en el serotipo O2, suelen estar asociados a este tipo de enzimas multifuncionales.
Debido a la presencia de elementos transposón truncados que flanquean la secuencia wekS, se ha especulado que el locuswekSse insertó en el complejorfbmediante un evento de recombinación de ADN (véase Fratamicoet al.,2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316). Una inserción mediada por transposones del locus wekS sugeriría que la biosíntesis de OPS O2 existió sin la presencia de wekS antes y, por consiguiente, no se requeriría wekS para la síntesis del polímero de OPS O2. Para confirmar esta hipótesis, la formación de OPS O2 se reconstituyó en un sistema de expresión recombinante con un fondo genómico "limpio", que contiene un complejorfbde O2 que carece del gen wekS. Para conseguir esto, el complejo de antígeno O de la cepa W3110 se reemplazó por el complejorfbde la cepa positiva para O2 upec116 que carecía del ADN de wekS. El reemplazo cromosómico se realizó mediante recombinación homóloga como se describe en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP2013/071328. La cepa resultante fue W3110 AwaaL ArfbW3110::rfbO2 AwekS. OPS se preparó y se analizó mediante marcaje con 2AB y HPLC de fase normal y detección de fluorescencia como se hizo para OPS O1A y O6 (véase anteriormente) y se analizó mediante HPLC de fase normal (figura 21) y se comparó con las señales de la cepa de tipo natural CCUG25. El análisis dio como resultado una serie de picos superpuestos de entre 40 y 140 minutos de tiempo de elución.
El análisis por MS de la serie de picos dependientes del complejorfbde O2 mostró masas principales con las mismas diferencias entre picos consecutivos (es decir, de una única UR de O2).
Se realizó un análisis por MS de las moléculas recogidas en los picos respectivos para analizar la estructura del OPS. Los picos obtenidos en 43,5, 73,1, 81,4 y 90' obtenidos de la cepa de tipo natural CCUG25 se recogieron y se analizaron mediante MS y MS/MS. Se encontraron masas y series de iones de fragmentos Y compatibles con las moléculas de OPS O2 de 1, 2 y 3 unidades de repetición esperadas (m/z = 989,4 (figura 23), 1817,8, 2646,1, todos aductos de Na+).
Para confirmar el OPS O2 de aislados clínicos, se analizaron 12 clones para determinar su estructura de OPS como se ha descrito anteriormente para el serotipo O1. En primer lugar, se preparó LPS para ser analizado mediante tinción con plata y transferencia de Western. Los resultados se representan en la figura 20. Todas las muestras mostraron un patrón de bandas en forma de escalera con dos longitudes medias de escalera aparentemente diferentes. El antisuero anti O2 detectó todas las muestras de LPS, lo que indica que la aglutinación identificó correctamente todos los aislados como serotipos O2.
Para producir un bioconjugado que porta el polisacárido O2, se usó W3110 AwaaL ArfbW3110::rfbO2 AwekS. Se insertaron plásmidos de expresión para las proteínas transportadoras y para PglB mediante transformación y la expresión de la OPS esperada en EPA se confirmó mediante transferencia de Western. Véanse las Tablas 7 y 13 y anteriormente.
Ejemplo 6; Análisis inmunológico de los diferentes antígenos O
Para evaluar el potencial inmunológico de los bioconjugados que contienen los polisacáridos antigénicos seleccionados, se realizó un estudio preclínico. Los bioconjugados O1A-EPA, O2-EPA, O6Glc-EPA y O25B-EPA se produjeron, se purificaron y se caracterizaron como se ha descrito anteriormente y en la sección de métodos.
Tabla 6.Descripción general del estudio preclínico en ratas, incluido el número de grupos de vacunas, el tamaño de los ru os las vacunas usadas la indicación de calidad de la re aración de la vacuna.
Se usaron bioconjugados purificados para inmunizar ratas Sprague Dawley hembra de 9 semanas de edad. Se inyectaron 100 pl de soluciones de la misma dosis por vía intramuscular (i.m.) los días 1, 22 y 43 en las ratas que se desangraron terminalmente y se sacrificaron el día 56.
Diferentes grupos de ratas recibieron diferentes vacunas: siempre sin formular, que comprenden bioconjugados solos o en combinación como se indica en la Tabla 6. Se usaron placas de ELISA recubiertas con el LPS afín producido en una cepa positiva parawaaLpara medir la inmunogenicidad en forma de valor de ELISA de los sueros de rata en el momento del sangrado terminal de 56 días después de la primera inyección (figuras 25-28). En conjunto, se observó una inmunogenicidad estadísticamente significativa para todos los grupos de vacunación medidos frente a los controles (EPA no glucosilada o tampón TBS). Por lo tanto, los bioconjugados seleccionados y producidos representan compuestos candidatos a vacunas útiles.
Para todos los conjugados de antígeno O-EPA ensayados, se observó una inmunogenicidad estadísticamente significativa para todos los grupos de vacunación medidos frente a los controles (EPA no glucosilada o tampón TBS). Por lo tanto, los bioconjugados seleccionados y producidos representan compuestos candidatos a vacunas útiles para la inducción de anticuerpos específicos del antígeno O.
Ejemplo 7: Caracterización físico-química de los bioconjugados
Los cuatro biococonjugados descritos en los ejemplos anteriores (antígeno O de O25B, O1A, O2 y O6, respectivamente conjugados con EPA como proteína transportadora) se prepararon como lotes monovalentes (principios farmacéuticos activos, API) o se combinaron en una única preparación como vacuna multivalente contra ExPEC. Se produjeron varios lotes: lotes preclínicos, lotes de estudios de toxicidad y lotes clínicos. La Tabla 7 indica las cepas hospedadoras usadas para la producción de conjugados.
Por lo tanto, los cuatro lotes monovalentes pre-GMP y un estándar de referencia de EPA no glucosilada se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz de ángulo múltiple (SEC-MALS), para cuantificar el grado de monoglucosilación y diglucosilación de los bioconjugados individuales y determinar la masa molecular (PM) de la proteína transportadora y del O-PS unido a ella. Las muestras se separaron en una columna TSKgel-G3000 SWxl en tampón fosfato (pH 7,0; NaCl 50 mM, fosfato de sodio 150 mM) y se controlaron mediante UV (214 y 280 nm), índice de refracción (IR) y dispersión de luz de ángulo múltiple (MALS).
Para la proteína transportadora EPA no glucosilada, se determinó un PM de 63-67 kDa (PM teórico de 70,5 kDa, basado en la secuencia de aminoácidos). En los bioconjugados, solo se detectó EPA a 280 nm, lo que permitió extraer su PM del PM total medido por IR y M<a>L<s>: en los bioconjugados, el PM medido del resto de EPA fue de 65-71 kDa.
El análisis de los estándares de productos API pre-GMP se muestra en la Tabla 8, que indica la presencia de conjugados monoglucosilados y diglucosilados, con un PM en el intervalo de 75-79 kDa y 87-91 kDa, respectivamente. Las partes de O-PS presentaban un PM de 16-24 kDa para las especies diglucosiladas y de 8-14 kDa para las especies monoglucosiladas, respectivamente. Considerando el PM de las UR de cada serotipo, se determinó un número promedio de 10-16 UR por cadena de polisacárido, en buena concordancia con los datos de hidrazinolisis y MS.
Ta l : An li i E -MAL l n r r API m n v l n r - MP
El análisis de dicroísmo circular (DC) de un lote de biooconjugado O25B formulado en solución salina tamponada con Tris (TBS), mostró que las formulaciones a pH de 6,8 a 7,4 tenían espectros similares al de la proteína transportadora EPA no glucosilada, con una mezcla de estructuras alfa helicoidales y de láminas beta, como se esperaba según la estructura cristalina publicada de la EPA. Por lo tanto, basándose en estos análisis de DC, la glucosilación con cadenas O-PS O25B no pareció afectar a la estructura secundaria de la proteína transportadora EPA.
El análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de una formulación por lotes de bioconjugado O25B en TBS a pH de 6,8 a 7,4, y en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH de 7,1 a 7,8, mostró curvas de fusión comparables a las de EPA no glucosilada, con un punto de fusión de aproximadamente 52 °C. Este resultado indicó que la característica biofísica de la proteína transportadora EPA no cambió tras la modificación con cadenas O-PS O25B.
Ejemplo 8: Estabilidad de preparaciones de vacunas monovalentes a granel y tetravalentes
Antes de la producción a gran escala, la consistencia del proceso de fabricación se evaluó a pequeña escala. Los lotes de consistencia se evaluaron en extensos estudios de estabilidad que incluyeron condiciones de almacenamiento acelerado y bajo estrés para identificar vías de degradación. La estabilidad de los cuatro componentes de la vacuna monovalente (API) se ensayó durante un período de 3 meses.
El análisis de los datos de estabilidad de los API preclínicos indicó estabilidad durante al menos 3 meses cuando se almacenan a -75 ± 15 °C (condiciones de almacenamiento normales). No se observaron tendencias estadísticamente significativas en las condiciones de almacenamiento previstas mediante análisis de regresión lineal estadística. También en las condiciones de almacenamiento acelerado (+5 ± 3 °C) y bajo estrés (+25 ± 5 °C), el producto se mantuvo estable durante al menos 3 meses, como lo demuestra la baja variabilidad de los parámetros indicadores de estabilidad. Los datos del API preclínico de O1A se muestran en la Tabla 9. Los otros tres serotipos (O2, O6, O25B) demostraron datos de estabilidad similares.
T l : D ili l l API r líni 1A
La estabilidad de la composición de vacuna tetravalente (bioconjugados O25B, O1A, O2 y O6) se ensayó durante un período de 3 meses. Los estudios incluyeron condiciones de almacenamiento acelerado y bajo estrés para identificar vías de degradación. Los datos resultantes se consideran relevantes para la justificación inicial de la vida útil de GMP IMP (medicamento en investigación, composición de vacuna tetravalente contra ExPEC).
El análisis de los datos de estabilidad del lote preclínico de la vacuna tetravalente contra ExPEC indicó estabilidad durante al menos 3 meses cuando se almacenó a 5 ± 3 °C (condiciones de almacenamiento normales), como se muestra en la Tabla 10. No se observaron tendencias estadísticamente significativas en las condiciones de almacenamiento previstas mediante análisis de regresión lineal estadística. También en las condiciones de almacenamiento acelerado (+25 ± 5 °C) el producto era estable, como lo demuestra la baja variabilidad de los parámetros indicadores de estabilidad.
T l 1 : D ili l l v n r v l n r líni
En conjunto, estos estudios demuestran que los API y la composición de vacuna tetravalente contra ExPEC fueron estables durante al menos tres meses y, por lo tanto, son composiciones de vacuna adecuadas con respecto a la estabilidad.
Ejemplo 9: Estudio de toxicidad en la preparación de vacuna tetravalente
Se evaluó la toxicidad y la tolerancia local de una preparación de vacuna tetravalente (bioconjugados O25B, O1A, O2 y O6) después de dos administraciones intramusculares (se usó el cuádriceps femoral para el tratamiento) en ratas Sprague Dawley los días 1 y 14. La reversibilidad, la persistencia o el retraso en la aparición de cualquier cambio se evaluaron después de un período de recuperación de 14 días el día 28. La necropsia de los animales en los grupos principales (10 machos y 10 hembras tanto para el grupo vacunado como para el grupo de control) se realizó el día 17, y para los grupos de recuperación (5 machos y 5 hembras tanto para el grupo vacunado como para el grupo de control) el día 28 (después de un período de recuperación de 14 días). Esto no se asoció con ningún efecto considerado adverso que pudiera atribuirse al tratamiento. La dosis administrada, es decir, una dosis humana equivalente completa de 4 |jg por antígeno O (16 |jg de antígeno O total para la vacuna tetravalente), como se administró los días 1 y 14, se consideró el nivel sin efecto adverso observado (NOAEL, por sus siglas en inglés) para la vacuna tetravalente contra ExPEC en las condiciones de este estudio. Además, se confirmó la inmunogenicidad de la vacuna tetravalente contra ExPEC tanto el día 17 como el día 28, tras la evaluación de las muestras séricas. Se indujeron valores más altos de anticuerpos IgG anti O1A, anti O2, anti O6 y anti O25B en el grupo vacunado, en comparación con los controles que recibieron solo el tampón de formulación (Tris 25 mM, NaCl 130 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4).
Estos datos confirman que la vacuna tetravalente contra ExPEC tiene un perfil de toxicidad adecuado para la administración como vacuna e induce anticuerpos contra al menos los cuatro serotipos deE. colia partir de los antígenos O presentes en la vacuna (es decir, O25B, O1A, O2 y O6).
Ejemplo 10: Epidemiología de serotipos O asociados a bacteriemia
Para determinar la distribución del serotipo O entre laE. coliextraintestinal que causa bacteriemia en ancianos, se realizó un estudio epidemiológico en un panel de aislados de sangre deE. coliextraídos de pacientes mayores de 60 años. En total, se extrajeron 860 aislados de sangre en el período 2011-2013 de sujetos de EE.UU., Reino Unido, Alemania, España y los Países Bajos, y se analizaron mediante O-aglutinación convencional. Como se muestra en la Tabla 11, la distribución del serotipo O de los aislados de bacteriemia se parecía a la distribución del serotipo O encontrada en pacientes que padecían infección del tracto urinario (ITU, véase la Tabla 1A). El serotipo O25 fue el más prevalente en la población con bacteriemia estudiada; la subtipificación de cincuenta y siete aislados mediante PCR mostró que cincuenta y seis (98 %) de los serotipos O25 eran tipificables como O25B. En ambas poblaciones objetivo (ITU y bacteriemia), se identificaron los serotipos O1, O2, O6 y O25 como los cuatro serotipos más prevalentes. En general, estos datos confirman que la distribución de serotipos entre los aislados de infección del tracto urinario y de bacteriemia es muy similar e independiente de la ubicación geográfica, el momento de aislamiento y la indicación.
Tabla 11: Distribución de los serotipos O de E. coli asociados a bacteriemia más comunes de una colección de 860 aislados de sangre extraídos en EE.UU. y la UE en el período 2011-2013. Se indica la distribución relativa del seroti o O de las muestras.
Ejemplo 11: Inducción de respuestas de anticuerpos funcionales
La funcionalidad de los anticuerpos generados después de la vacunación con formulaciones de vacunas monovalentes y tetravalentes descritas anteriormente se investigó con un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPK)in vitro.Este tipo de ensayo ha sido aceptado como vinculado a la protección de la vacuna conjugada contraStreptococcus pneumoniae(Prevenar®). El ensayo OPK mide la capacidad del suero para facilitar la opsonofagocitosis y la destrucción de diferentes serotipos deE. coli.En placas de 96 pocillos, se incubaron diluciones definidas de los sueros de muestra, en cada pocillo, con: bacterias de uno de los cuatro serotipos deE. coliespecíficos de la vacuna, una cantidad definida de células HL60 y complemento de bebés conejo. Después de la incubación, se aplicó una proporción de la mezcla sobre agar tríptico de soja (TSA) y se contó el número de colonias bacterianas. La capacidad de los anticuerpos para unirse a las células bacterianas y activar la deposición del complemento y mediar en la absorción y destrucción de las bacterias por las células HL60 se expresó como valor opsónico. El valor o índice de opsonización (IO) corresponde a la dilución de los sueros que destruyen el 50 % de las células bacterianas. Se proporcionan índices opsónicos para sueros pre y posinmunes. Un aumento > de 4 veces del IO de preinmune a posinmune se considera significativo. Se establecieron ensayos OPK para tres serotipos O2, O6Glc y o 25B.
Funcionalidad de las respuestas de anticuerpos inducidas por vacunas monovalentes
Para evaluar la actividad funcional de las respuestas de anticuerpos inducidas por la vacuna de los bioconjugados O25B, O1A, O2 y O6Glc, se analizaron sueros de ratas vacunadas usando ensayos de destrucción opsonofagocítica (OPK), que miden la fagocitosisin vitrodependiente del complemento y de los anticuerpos y la destrucción de bacterias, por ejemplo,E. coli.Se preopsonizóE. colicon diluciones de suero de ratas vacunadas, se incubó con complemento y fagocitos (células HL60 diferenciadas) y se determinaron las unidades formadoras de colonias (UFC). Posteriormente, se calcularon el % máximo de destrucción y los índices de opsonización (IO: destrucción por dilución sérica del 50 % deE. coli).LasE. coliseleccionadas para las pruebas OPK fueron OC 24453 (serotipo O2), OC 24781 (serotipo O6Glc) y OC 24176 (serotipo O25B). Como se muestra en la figura 29, se observó una sólida respuesta inmunitaria funcional a O2-EPA (figura 29A), O6Glc-EPA (figura 29B) y O25B-EPA (figura 29C).
Los datos demuestran que los componentes de la vacuna descritos en el presente documento inducen respuestas de anticuerpos contra serotipos deE. colide los cuales se incluyen antígenos O en la vacuna, y que tales respuestas de anticuerpos son funcionales para destruirE. colide estos serotipos.
Funcionalidad de las respuestas de anticuerpos inducidas por una vacuna tetravalente
La Tabla 12 muestra los valores de IO totales para los antígenos O O2, O6Glc y O25B de animales inmunizados con la vacuna tetravalente con 0,4 o 4 |jg por antígeno O. Los valores se determinaron en dos experimentos separados. La dosis de 0,4 jg indujo IO significativos en todos los animales para los serotipos O2 y O6Glc. Para O25B, 3/8 animales mostraron un aumento significativo en el IO después de la inmunización con la dosis de 0,4 jg . En comparación con la dosis de 0,4 jg , la dosis de 4 jg indujo menores aumentos del IO para O2 en todos los animales.
3/8 animales mostraron aumentos del IO cuando los sueros del grupo de dosis de 4 jg se ensayaron en O25B deE. coli.Los datos confirman que una vacuna tetravalente es capaz de provocar anticuerpos opsónicos específicos del antígeno O contra O2, O6Glc y O25B.
Los datos demuestran que los componentes de la vacuna descritos en el presente documento inducen respuestas de anticuerpos contra serotipos deE. colide los cuales se incluyen antígenos O en la vacuna, y que tales respuestas de anticuerpos son funcionales para destruirE. colide estos serotipos.
Se calcularon el%máximo de destrucción y los índices de opsonización (IO: destrucción por dilución sérica del 50%deE. coli).LasE. coliseleccionadas para las pruebas OPK fueron OC 24453 (serotipo O2), OC 24781 (serotipo O6Glc) y OC 24176 (serotipo O25B). Se observó una sólida respuesta inmunitaria funcional a O2-EPA, O6Glc-EPA y O25B-EPA.
Ejemplo 12: Evaluación de una vacuna candidata contra Escherichia coli uropatógena en mujeres con antecedentes clínicos de infección del tracto urinario recurrente (ITU-R)
Se usa una vacuna bioconjugada deE. colien un estudio clínico de fase I. La vacuna consta de cuatro bioconjugados en una solución de tampón salina. Los cuatro bioconjugados son: (i) O1A deE. coliconjugado con la proteína transportadora EPA, (ii) O2 deE. coliconjugado con la proteína transportadora EPA, (iii) O6Glc deE. coliconjugado con la proteína transportadora EPA, y (iv) O25B deE. coliconjugado con la proteína transportadora EPA.
La población de estudio incluye 194 mujeres sanas, con edades >18 a 70 años, con antecedentes de infección del tracto urinario recurrente (ITU-R), definida como >3 episodios independientes en los 12 meses anteriores o >2 episodios en los últimos 6 meses. Al menos uno de los episodios de infección del tracto urinario (ITU) fue causado porE. coli(como patógeno único o parte de una infección polimicrobiana) y la causa fue confirmada y documentada mediante cultivo. Para los fines del estudio, la ITU se define por la presencia de al menos un síntoma de ITU específico (disuria, urgencia, frecuencia, dolor en el costado, sensibilidad en la vejiga, dolor suprapúbico, fiebre, náuseas, vómitos) junto con un recuento bacteriano (UFC) de >103 UFC/ml de uropatógeno en la orina media.
El estudio incluye dos grupos: (i) vacuna candidata y (ii) placebo. El estudio es un estudio multicéntrico escalonado, aleatorizado, con ocultación única y controlado con placebo en mujeres sanas con antecedentes de ITU-R.
El período de inclusión estimado para el estudio es de 4 meses, con un período de duración de seguimiento de nueve meses para cada sujeto.
El objetivo del estudio es evaluar la seguridad, inmunogenicidad y eficacia de la vacuna bioconjugada deE. coli.Diseño del estudio
Los sujetos tienen un seguimiento durante 9 meses después de la inyección, y sólo los sujetos inyectados tienen seguimiento durante todo el período de estudio. Los sujetos asisten a un total de 5 visitas programadas: selección (primera visita), día 1 (segunda visita), día 7, día 30 y día 270. Los sujetos reciben 4 llamadas telefónicas de seguimiento, el día 2, día 90, día 150 y el día 210.
Cualquier visita no programada debido a la aparición de una ITU incluye atención estándar con opciones de tratamiento armonizadas. Se recogen orina y sangre (si es posible) con fines de diagnóstico y serotipificación. Los acontecimientos adversos (AA) no solicitados y los acontecimientos adversos graves (AAG) se registran a lo largo de la duración del estudio, mientras que los AA solicitados se registran durante 7 días después de la inyección.
En cada visita se entrega una nueva ficha de diario al sujeto y se comenta la anterior.
Dosificación y administración
En la primera visita, se seleccionan los sujetos aptos que han proporcionado su consentimiento informado y se confirma el cumplimiento de los criterios de inclusión/exclusión. Se extrae sangre y se recoge orina.
En la visita 2 (día 1), cada sujeto recibirá una inyección intramuscular de 0,5 ml de solución (vacuna candidata o placebo) en el músculo deltoides. La dosis reducida de la vacuna candidata contendrá 1 |jg de cada polisacárido (un total de 4 jg de polisacárido). La dosis objetivo de la vacuna candidata contendrá 4 jg de cada polisacárido (un total de 16 jg de polisacárido).
Objetivos
El objetivo principal es evaluar la aparición, intensidad, relación y duración de los acontecimientos adversos (AA) solicitados y no solicitados y los acontecimientos adversos graves (AAG) posteriores a la inyección de la vacuna candidata en comparación con el grupo de placebo durante todo el período de estudio.
Los objetivos secundarios son (i) comparar el cambio en los criterios de valoración de seguridad hematológica y bioquímica antes de la inyección (en la selección inicial y el día 1) y después de la inyección (el día 7 y el día 30) de la vacuna candidata en comparación con el grupo de placebo; (ii) evaluar la respuesta inmunitaria de la vacuna candidata entre el inicio (día 1) y la posinyección (día 30 y día 270); (iii) comparar el número de episodios de infección del tracto urinario (ITU) sintomáticos causados por los serotipos de la vacuna deE. colientre los dos grupos, inyectados con la vacuna candidata o placebo durante todo el período de estudio como criterio de valoración de eficacia más relevante; (iv) evaluar la tasa de aparición de ITU porE. coliespecífica del serotipo de la vacuna en el grupo de vacuna en comparación con el grupo de placebo a lo largo de la duración del estudio; y (v) evaluar la intensidad y duración de los síntomas clínicos de la<i>T<u>porE. coliespecífica del serotipo de la vacuna en el grupo de vacuna en comparación con el grupo de placebo a lo largo de la duración del estudio.
Los objetivos exploratorios son (i) comparar la tasa de aparición de ITU causada por cualquier serotipo deE. colien el grupo de vacuna en comparación con el grupo de placebo durante todo el período de estudio; y (ii) comparar la tasa de aparición de ITU causada por cualquier patógeno en el grupo de vacuna en comparación con el grupo de placebo durante todo el período de estudio.
Criterios de inclusión
Los criterios de inclusión para el estudio son los siguientes: (i) mujeres con antecedentes de ITU recurrente, que se define como: >3 episodios independientes de ITU en los 12 meses anteriores o >2 episodios de ITU en los últimos 6 meses; al menos una ITU durante los últimos 5 años fue causada porE. coli(como patógeno único o parte de una infección polimicrobiana) y fue confirmada y documentada mediante cultivo; (ii) edad >18 y <70 años; (iii) sujetos en un estado de salud sin ITU sintomática en curso o sospechada en la visita de selección y el día de la inyección (visita 2); (iv) buen estado de salud general, sin antecedentes médicos clínicamente significativos, hallazgos en el examen físico o anomalías de laboratorio clínico según el criterio clínico del investigador; y (v) voluntad de participar en el estudio después de que se hayan explicado y comprendido completamente todos los aspectos del protocolo y se haya obtenido un formulario de consentimiento informado por escrito.
Criterios de exclusión
Los criterios de exclusión para el estudio son los siguientes: (i) antecedentes de más de 10 ITU recurrentes en el año anterior a la visita de selección; (ii) uso de cualquier catéter urinario de corta duración en los 7 días anteriores a la selección; (iii) uso de cualquier catéter permanente en los 30 días anteriores a la selección; (iv) antecedentes de cualquier enfermedad/anomalía del tracto urinario no resuelta; (v) evidencia de deterioro de la función inmunitaria; (vi) enfermedades y/o insuficiencia cardiovascular, hepática, renal significativa; (vii) diabetes mellitus no controlada; (viii) anomalías significativas en los resultados de las pruebas de selección de hematología, química sérica o análisis de orina; (ix) prueba positiva para VIH y/o evidencia de VHB o VHC; (x) IMC >34; (xi) terapia inmunoestimulante previa para la prevención de ITU (tal como Urovaxom®, Strovac® o Urovac®) en los últimos 3 meses, o uso planificado durante el período de estudio; (xii) uso actual de cualquier medicamento que se sepa que afecta a la función inmunitaria (por ejemplo, corticosteroides >0,5 mg/kg de PC/día); (xiii) uso de tratamiento con estrógeno vaginal relacionado con la ITU recién iniciado menos de 6 meses antes de la inyección y que continúa durante el estudio o inicio planificado durante el período de estudio activo; (xiv) uso de cualquier terapia con antibióticos en la semana anterior a la inyección; (xv) uso planificado de antibióticos poscoitales para la prevención de ITU durante el período de estudio; (xvi) cualquier vacunación planificada en los 30 días anteriores y 30 días posteriores a la inyección; (xvii) participación en otros ensayos clínicos en los 60 días anteriores a la inclusión y durante la duración del estudio; (xviii) tratamiento previo con inmunoglobulinas o hemoderivados en los 3 meses anteriores a la inyección; (xix) hipersensibilidad conocida a cualquier componente de la vacuna; (xx) presencia de una afección médica o psiquiátrica significativa que, en opinión del investigador, impide la participación en el estudio; (xxi) enfermedad aguda en el momento de la inyección; (xxii) mujeres en edad fértil que tengan una prueba de embarazo positiva o se nieguen a usar un método anticonceptivo eficaz; (xxiii) mujeres que estén amamantando en cualquier momento durante el período de estudio; (xxiv) sujetos con una intervención quirúrgica electiva, planificada durante el período de estudio; y (xxv) cualquier otro hallazgo significativo que en opinión del investigador aumentaría el riesgo de tener un resultado adverso por participar en el estudio.
Métodos y análisis estadísticos
Se proporcionan estadísticas descriptivas (n, media, desviación estándar, mediana e intervalos para variables continuas, frecuencias y porcentajes para variables categóricas) por grupo de tratamiento y/o visita, cuando sea aplicable. Todos los datos se enumeran por sujeto, grupo de tratamiento y, cuando sea aplicable, visita. Todos los sujetos del Grupo B que reciben placebo se combinan para formar el grupo de tratamiento con placebo.
Ejemplo 13: Resultados del estudio clínico de fase I
Este Ejemplo presenta determinados resultados del Análisis Intermedio del estudio clínico de fase I descrito en el Ejemplo 12.
12.1: Seguridad
La aparición de acontecimientos adversos y acontecimientos adversos graves fue comparable entre los grupos de placebo y vacunados. Se informaron diez acontecimientos adversos graves y ninguno estuvo relacionado con el fármaco del estudio.
12.2: Inmunogenicidad
Para evaluar la inmunogenicidad de los componentes de la vacuna, se obtuvieron y se analizaron mediante ELISA sueros de mujeres que participaron en el estudio clínico para cuantificar IgG contra los cuatro antígenos O diferentes incluidos en la vacuna tetravalente (O1 deE. coli,O2 deE. coli,O6 deE. coliy O25B deE. coli).
Se incubaron sueros de mujeres vacunadas en placas recubiertas con O1A, O2, O6Glc y O25B-LPS y EPA. Posteriormente, las placas se incubaron con anticuerpo secundario marcado con HRP (anti IgG humana). Los anticuerpos unidos se detectaron con sustrato TMB y se midió la absorbancia. Los valores de CE50 se calcularon mediante ajuste 4PL.
Como se muestra en la figura 30, se produjo una sólida respuesta inmunitaria a O1A-EPA, O2-FPA, O6Glc-EPA y O25B-EPA en la mayoría de las mujeres vacunadas.
Estos datos demuestran la inmunogenicidad de cada componente de la vacuna tetravalente.
12.3: Respuesta de anticuerpos funcionales
Se usaron ensayos OPK, que miden la fagocitosis dependiente del complemento y anticuerposin vitroy la destrucción de bacteriasE. coli,para evaluar la respuesta funcional de anticuerpos de las mujeres que participaron en el estudio clínico.
Se recogieron sueros de las participantes del estudio. Se preopsonizóE. colicon diluciones de suero de las mujeres vacunadas, se incubó con complemento y fagocitos (células HL60 diferenciadas) y se determinaron las unidades formadoras de colonias (UFC) restantes. Posteriormente, se calcularon el porcentaje máximo de destrucción y los índices de opsonización (IO: destrucción por dilución sérica del 50 % deE. coli).LasE. coliseleccionadas para las pruebas OPK fueron OC 24452 (serotipo O1A), OC 24453 (serotipo O2), OC 24454 (serotipo O6Glc) y OC 24176 (serotipo O25B).
Como se muestra en la figura 31, se observó una sólida respuesta inmunitaria funcional a O1A-EPA (figura 31A), O2-FPA (figura 31B), O6Glc-EPA (figura 31C) y O25B-EPA (figura 31D).
Estos datos demuestran que cada componente de la vacuna tetravalente induce una respuesta de anticuerpos específica de serotipo, y que dichas respuestas de anticuerpos son funcionales para destruirE. colide estos serotipos. Por lo tanto, las composiciones de vacuna descritas en el presente documento son funcionales en los seres humanos.
12.4: La inmunización con un conjugado de antígeno O tetravalente que comprende O25B-EPA provoca anticuerpos IgG de reactividad cruzada O25A/O25B en los seres humanos
Para determinar el nivel de reactividad cruzada de los anticuerpos IgG séricos inducidos por la vacuna hacia los dos serosubtipos O25 deE. coliconocidos, O25A y O25B, se incubaron diluciones en serie de suero procedentes de sujetos vacunados con LPS O25A purificado, LPS O25B, o células bacterianas intactas, y ensayaron mediante ELISA.
Como se muestra en la figura 32, se observaron valores de CE50 similares cuando se ensayó la reactividad hacia LPS O25A (barras de color negro) y LPS O25B (barras de color gris) treinta días después de la vacunación. En general, los datos sugieren que el bioconjugado O25B funciona bien para O25B y O25A, pero en la mayoría de los casos/sujetos ensayados, O25B funciona ligeramente mejor en términos de respuesta de anticuerpos para O25B en comparación con O25A. Este resultado demuestra que, ante la aparición de alguna variación natural, la vacuna tetravalente induce anticuerpos que reconocen tanto el LPS O25A como O25B. Para probar si lo mismo ocurría con células bacterianas completas y múltiples cepas O25A/O25B, también se analizó la reactividad hacia un conjunto de aislados clínicos de O25A u O25B procedentes de sangre u orina. En este caso se usó como control negativo una cepa de serotipo O75, un serotipo no representado en la vacuna tetravalente (línea de color gris discontinua en la figura 33). Como se demuestra en la figura 33, los anticuerpos IgG séricos inducidos por la vacuna mostraron una fuerte respuesta hacia cada una de las cepas O25 individuales. Aunque la variación entre cepas fue evidente, se observó reactividad hacia las cepas O25A (líneas de color negro) y O25B (líneas de color gris). Estos datos demuestran que el componente de la vacuna O25B de la vacuna tetravalente provoca anticuerpos que reconocen tanto el LPS purificado de O25A como de O25B y las cepas O25A y O25B deE. coli.
Las Tablas 13 y 14, a continuación, proporcionan detalles de determinadas cepas y plásmidos, respectivamente, usados en los ejemplos anteriores.
Tabla 13: Ce as
continuación
Tabla 14: Plásmidos
Tabla 15: Secuencias
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende un bioconjugado de un antígeno O25B deE. coliunido porN auna proteína transportadora, en donde el antígeno O25B deE. colicomprende la estructura de Fórmula O25B':
    en donde n es un número entero entre 1 y 30.
  2. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde el antígeno O25B deE. coliestá unido covalentemente a un residuo de Asn en la proteína transportadora, en donde el residuo de Asn está posicionado en una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro.
  3. 3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además (i) un bioconjugado O1A, que comprende un antígeno O1A deE. coliunido covalentemente a un residuo de Asn de una proteína transportadora, (ii) un bioconjugado O2, que comprende un antígeno O2 deE. coliunido covalentemente a un residuo de Asn de una proteína transportadora, y (iii) un bioconjugado O6, que comprende un antígeno O6 deE. coliunido covalentemente a un residuo de Asn de una proteína transportadora.
  4. 4. La composición de la reivindicación 3, en donde el antígeno O1A, el antígeno O6 y el antígeno O2 comprenden las siguientes fórmulas, respectivamente:
    y c. Fórmula O2'
  5. 5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en exotoxina A desintoxicada deP. aeruginosa(EPA), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A desintoxicada de S.aureus,factor de agregación A, factor de agrupación B, FimH deE. coli,FimHC deE. coli,enterotoxina termolábil deE. coli,variantes desintoxicadas de la enterotoxina termolábil deE. coli,subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes desintoxicadas de la toxina colérica, proteína Sat deE. coli,el dominio pasajero de la proteína Sat deE. coli,neumolisina deStreptococcus pneumoniaey variantes desintoxicadas de la misma, AcrA deC. jejuniy glucoproteínas naturales deC. jejuni,preferentemente EPA desintoxicada.
  6. 6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde el residuo de Asn de la proteína transportadora está posicionado en la secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15).
  7. 7. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la vacunación de un sujeto, preferentemente un ser humano, contraEscherichia colipatógena extraintestinal.
  8. 8. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto, preferentemente un ser humano, contraEscherichia colipatógena extraintestinal.
  9. 9. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la inducción de la producción de anticuerpos opsonofagocíticos en un sujeto, preferentemente un ser humano, que son específicos deEscherichia colipatógena extraintestinal.
  10. 10. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el sujeto tiene riesgo de desarrollar una infección del tracto urinario, bacteriemia o septicemia.
  11. 11. Una célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante, que comprende: a. una secuencia de nucleótidos que codifica: i. dTDP-Glucosa 4,6-deshidratasa; ii. dTDP-6-Desoxi-D-glucosa 3,5-epimerasa; iii. Glucosa-1-fosfato timidililtransferasa; iv. dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa; v. flipasa del antígeno O; vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa; vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP p-1,6-glucosiltransferasa; viii. polimerasa del antígeno O; ix. O-acetiltransferasa; x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP a-1,3-glucosiltransferasa y xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP a-1,3-ramnosiltransferasa; b. una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacariltransferasa; y c. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora, en donde la proteína transportadora comprende una secuencia consenso Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO:15).
  12. 12. La célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante de la reivindicación 11, en donde la célula hospedadora es una célula hospedadora deE. coli.
  13. 13. La célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante de la reivindicación 11 o 12, en donde al menos uno del genwaaL,gengtrA,gengtrB,gengtrSo complejorfbse elimina o se inactiva funcionalmente en el genoma de la célula hospedadora.
  14. 14. La célula hospedadora procariota genomanipulada de forma recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde la proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en exotoxina A desintoxicada deP. aeruginosa(EPA), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A desintoxicada de S.aureus,factor de agregación A, factor de agrupación B, FimH deE. coli,FimHC deE. coli,enterotoxina termolábil deE. coli,variantes desintoxicadas de la enterotoxina termolábil deE. coli,subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes desintoxicadas de la toxina colérica, proteína Sat deE. coli,el dominio pasajero de la proteína Sat deE. coli,neumolisina deStreptococcus pneumoniaey variantes desintoxicadas de la misma, AcrA deC. jejuniy glucoproteínas naturales deC. jejuni,preferentemente la proteína transportadora es EPA desintoxicada.
  15. 15. Un método para preparar una proteína transportadora N-glucosilada que comprende un antígeno O25B deE. colide la reivindicación 1, comprendiendo dicho método: a. cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 11-14; y b. purificar una proteína transportadora N-glucosilada que comprende el antígeno O25B deE. colide la reivindicación 1.
ES15706459T 2014-02-24 2015-02-23 Polisacárido novedoso y usos del mismo Active ES2978870T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461943710P 2014-02-24 2014-02-24
PCT/EP2015/053739 WO2015124769A1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 Novel polysaccharide and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2978870T3 true ES2978870T3 (es) 2024-09-23

Family

ID=52589386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15706459T Active ES2978870T3 (es) 2014-02-24 2015-02-23 Polisacárido novedoso y usos del mismo

Country Status (28)

Country Link
US (5) US9700612B2 (es)
EP (1) EP3110441B1 (es)
JP (2) JP6276427B2 (es)
KR (1) KR101855142B1 (es)
CN (1) CN106535927B (es)
AR (1) AR100859A1 (es)
AU (1) AU2015220723C1 (es)
CA (1) CA2940547C (es)
CL (1) CL2016002123A1 (es)
DK (1) DK3110441T5 (es)
EA (1) EA035991B9 (es)
ES (1) ES2978870T3 (es)
FI (1) FI3110441T3 (es)
HR (1) HRP20240847T1 (es)
HU (1) HUE066507T2 (es)
IL (1) IL247344B (es)
LT (1) LT3110441T (es)
MX (1) MX380438B (es)
NZ (1) NZ723328A (es)
PH (1) PH12016501671A1 (es)
PL (1) PL3110441T3 (es)
PT (1) PT3110441T (es)
RS (1) RS65631B1 (es)
SG (1) SG11201606889PA (es)
SI (1) SI3110441T1 (es)
TW (1) TWI639439B (es)
WO (1) WO2015124769A1 (es)
ZA (1) ZA201605858B (es)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR201807924T4 (tr) 2013-01-17 2018-06-21 Arsanis Biosciences Gmbh MDR e. koli spesifik antikor.
CN106535927B (zh) 2014-02-24 2019-09-20 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新颖多糖及其用途
EP3294761A4 (en) * 2015-05-13 2019-04-03 University of Washington COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF UROPATHOGEN E. COLI
TWI715617B (zh) * 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711637D0 (en) * 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
US20190275134A1 (en) 2018-03-12 2019-09-12 Janssen Pharmaceuticals, Inc Vaccines against urinary tract infections
CN108531439B (zh) * 2018-04-16 2020-04-07 南京工业大学 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
CR20210522A (es) 2019-03-18 2021-12-17 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de antígenos–polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos
CN110018253A (zh) * 2019-04-15 2019-07-16 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种生物制品中游离蛋白含量的高效液相测定方法
CN111855826B (zh) * 2019-04-24 2022-09-16 岛津企业管理（中国）有限公司 破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法
GB201908528D0 (en) * 2019-06-13 2019-07-31 Univ Dundee Rhamnose-polysaccharides
LT4090363T (lt) 2020-01-16 2024-09-25 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutantas, kompozicijos su juo ir jų panaudojimas
CA3171864A1 (en) * 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
NZ790372A (en) * 2020-02-23 2026-01-30 Pfizer Escherichia coli compositions and methods thereof
MX2022016587A (es) 2020-06-18 2023-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bioconjugado tetravalente de shigella (shigella4v).
EP4171625A2 (en) 2020-06-25 2023-05-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Klebsiella pneumoniae o-antigen vaccine
IL308201A (en) 2020-09-17 2024-01-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Multivalent vaccine compositions and uses thereof
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
JP7495578B2 (ja) * 2020-11-30 2024-06-04 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド キャピラリーベースのイムノアッセイシステムを使用する複合糖質の分析方法
US12357681B2 (en) 2020-12-23 2025-07-15 Pfizer Inc. E. coli FimH mutants and uses thereof
US11725028B2 (en) 2021-01-12 2023-08-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. FimH mutants, compositions therewith and use thereof
US12491237B2 (en) 2021-02-16 2025-12-09 Duke University Vaccine compositions and methods for the treatment and prevention of urinary tract infections
KR20230164108A (ko) 2021-04-01 2023-12-01 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 E. coli O18 생물접합체의 생산
WO2022214620A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Process for bioconjugate production
WO2023118033A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
US12014256B2 (en) 2022-01-12 2024-06-18 Dell Products L.P Polysaccharide archival storage
CN114150005B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
EP4630046A1 (en) * 2022-12-05 2025-10-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugate compositions and process for bioconjugate production
GB202302579D0 (en) 2023-02-23 2023-04-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
EP4478050A1 (en) 2023-06-12 2024-12-18 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method for quantifying bound acetate in glycoconjugates

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700612A (en) 1971-06-23 1972-10-24 Tenneco Chem Aqueous surface-coating compositions containing hydroxyalkyl ethers of galactomannan gums as thickeners
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422653D0 (en) 1984-09-07 1984-10-10 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5370872A (en) 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
AUPM399594A0 (en) 1994-02-21 1994-03-17 Csl Limited Antigenic preparation for treatment or prevention of helicobacter infection
FI102976B1 (fi) 1994-02-28 1999-03-31 Valtion Teknillinen Menetelmä lisäkeittokemikaalien tuottamiseen ja käyttämiseen sulfaattiprosessissa
US6858211B1 (en) 1998-07-20 2005-02-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccines against Escherichia coli O157 infection
WO2001078787A2 (en) 2000-04-18 2001-10-25 Endobiologics, Incorporated Lipopolysaccharide-conjugate vaccine for sepsis treatment
RU2189253C1 (ru) 2001-04-09 2002-09-20 Государственный научный центр прикладной микробиологии Диагностикум для идентификации escherichia coli o157 : h7 и способ его получения
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
KR20090110951A (ko) 2002-03-07 2009-10-23 아이드게노쉬쉐 테흐니쉐 호흐슐레 쥬리히 원핵 숙주에서의 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법 및 생산계
AU2003901008A0 (en) 2003-03-04 2003-03-20 Anadis Ltd Composition for the treatment and prevention of bacterial infections
CN1324134C (zh) 2003-12-22 2007-07-04 南开大学 对大肠杆菌o81型的o－抗原特异的核苷酸
PL1745069T3 (pl) 2004-03-30 2009-10-30 Nsgene As Zastosowanie terapeutyczne czynnika wzrostu NSG33
CA2607595C (en) 2005-05-11 2018-11-27 Eth Zuerich Recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
CA2646539A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
JP4791866B2 (ja) 2006-03-24 2011-10-12 国立大学法人秋田大学 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等
US8691730B2 (en) 2007-09-14 2014-04-08 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CA2711503A1 (en) 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
HRP20181259T1 (hr) * 2008-02-20 2018-10-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Biokonjugati načinjeni iz rekombinantnih n-glikoziliranih proteina iz prokariotskih stanica
EA024697B1 (ru) 2009-04-27 2016-10-31 Иммурон Лимитед Применение композиции, содержащей обогащенный анти-lps-антителами иммуноглобулиновый препарат, для лечения заболеваний печени
EP2501406B8 (en) 2009-11-19 2018-01-24 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Biosynthetic system that produces immunogenic polysaccharides in prokaryotic cells
DK2593594T3 (en) 2010-07-16 2017-12-11 Adimab Llc ANTIBODY LIBRARIES
AR084158A1 (es) 2010-12-10 2013-04-24 Merck Sharp & Dohme Formulaciones que mitigan la agregacion inducida por agitacion de composiciones inmunogenicas
WO2013034664A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
US9932598B2 (en) 2012-08-02 2018-04-03 The Regents Of The University Of California Metabolic engineering of microbial organisms
CA2883000A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
CN110423716A (zh) 2012-10-12 2019-11-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 宿主细胞修饰方法
CA2889767C (en) 2012-11-07 2021-09-21 Glycovaxyn Ag Production of recombinant vaccine in e. coli by enzymatic conjugation
WO2014102265A1 (en) 2012-12-27 2014-07-03 Glycovaxyn Ag Methods and compositions relating to crm197
TR201807924T4 (tr) 2013-01-17 2018-06-21 Arsanis Biosciences Gmbh MDR e. koli spesifik antikor.
SG11201602546RA (en) 2013-10-11 2016-04-28 Glycovaxyn Ag Methods of host cell modification
EP2870974A1 (en) 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
JP6590413B2 (ja) 2014-02-06 2019-10-16 エックスフォー・ファーマシューティカルズ（オーストリア）ゲーエムべーハー 大腸菌特異的抗体配列
CN106535927B (zh) 2014-02-24 2019-09-20 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新颖多糖及其用途
LT3240895T (lt) 2014-12-30 2022-04-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Kompozicijos ir būdai, skirti baltymų glikozilinimui
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
CR20210522A (es) 2019-03-18 2021-12-17 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de antígenos–polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos
FR3098334B1 (fr) 2019-07-05 2021-07-23 Airbus Operations Sas Procédé et système de surveillance d’un état de conscience d’un opérateur dans un poste de pilotage d’un aéronef
KR20230164108A (ko) 2021-04-01 2023-12-01 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 E. coli O18 생물접합체의 생산

Also Published As

Publication number Publication date
IL247344B (en) 2020-06-30
WO2015124769A1 (en) 2015-08-27
LT3110441T (lt) 2024-04-25
JP6771499B2 (ja) 2020-10-21
NZ723328A (en) 2018-01-26
RS65631B1 (sr) 2024-07-31
MX380438B (es) 2025-03-12
PH12016501671B1 (en) 2016-10-03
JP2018087197A (ja) 2018-06-07
PH12016501671A1 (en) 2016-10-03
EP3110441A1 (en) 2017-01-04
US20150238588A1 (en) 2015-08-27
EP3110441B1 (en) 2024-04-03
US20230364214A1 (en) 2023-11-16
CA2940547A1 (en) 2015-08-27
AU2015220723A1 (en) 2016-09-22
AU2015220723C1 (en) 2018-04-05
PL3110441T3 (pl) 2024-08-05
FI3110441T3 (fi) 2024-05-06
US20200129605A1 (en) 2020-04-30
CL2016002123A1 (es) 2018-02-16
CN106535927A (zh) 2017-03-22
EA201691478A1 (ru) 2017-02-28
AR100859A1 (es) 2016-11-09
SG11201606889PA (en) 2016-09-29
US12214029B2 (en) 2025-02-04
AU2015220723B2 (en) 2017-12-14
KR20160125494A (ko) 2016-10-31
SI3110441T1 (sl) 2024-07-31
US9700612B2 (en) 2017-07-11
CN106535927B (zh) 2019-09-20
HUE066507T2 (hu) 2024-08-28
PT3110441T (pt) 2024-05-03
IL247344A0 (en) 2016-11-30
TWI639439B (zh) 2018-11-01
JP6276427B2 (ja) 2018-02-07
US10940192B2 (en) 2021-03-09
KR101855142B1 (ko) 2018-05-08
DK3110441T5 (da) 2024-10-14
TW201615211A (zh) 2016-05-01
BR112016019341A2 (pt) 2018-01-16
JP2017507178A (ja) 2017-03-16
US20170340718A1 (en) 2017-11-30
ZA201605858B (en) 2025-05-28
DK3110441T3 (da) 2024-05-06
HRP20240847T1 (hr) 2024-09-27
US10441647B2 (en) 2019-10-15
US11738076B2 (en) 2023-08-29
US20210154286A1 (en) 2021-05-27
CA2940547C (en) 2021-01-05
MX2016011055A (es) 2017-10-24
EA035991B1 (ru) 2020-09-10
EA035991B9 (ru) 2020-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2978870T3 (es) Polisacárido novedoso y usos del mismo
TWI751513B (zh) E. coli O-抗原多醣生物結合物、其製備方法及其使用方法
JP7589164B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを製造する方法、その組成物およびその使用方法
US11612647B2 (en) Immunogenic compositions
BR112016019341B1 (pt) Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada
RU2791256C2 (ru) Иммуногенные композиции