RS65714B1 - Tečni sastav, način pripreme sastava i upotreba - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ova patentna prijava se odnosi na tečne sastave, u specijalnim aktivnim tečnim sastavima koji se mogu koristiti u sistemima senzora za glukozu, na primer senzor glukoze koji se oslanja na osmotski pritisak kao princip senzora.

POZADINA

[0002] Obično se merenje glukoze zasniva na instrumentaciji senzora ručnog uzorka (ubadanje prstiju). Međutim, uređaji koji mogu da sprovedu kontinuirano merenje glukoze u krvi bi pružili najpotpuniju sliku varijacija glukoze u toku dana i sprečili nastanak opasnih događaja, na primer, aktiviranjem funkcije alarma kada se nivo glukoze u krvi kreće iznad onoga što se smatra bezbednim nivoima. Ovo je posebno važno kada osobe spavaju ili ne mogu da se brinu o sebi. Iako se instrumentacija za kontinuirano merenje glukoze u krvi smatra najefikasnijim postupkom praćenja glukoze, transkutana priroda senzorskih flastera, u kombinaciji sa ograničenim životnim vekom senzora i dugim periodima pokretanja, znači da senzor za jednokratnu upotrebu za ručno tačkasto uzorkovanje ostaje najčešći.

[0003] Postoje neki nedostaci postupka ručnog tačkastog uzorkovanja. Osobe često doživljavaju bol i nelagodnost sa ručnim uređajima za tačkasto uzorkovanje, što bi zauzvrat moglo ugroziti takve režime samotestiranja. Nepotpuni broj merenja u toku dana može dovesti do toga da prosečna osoba sa dijabetesom provede periode tokom dana u hiperglikemijskom ili hipoglikemijskom stanju. Oba ova stanja su potencijalno opasna i mogu doprineti vaskularnom oštećenju, mentalnoj konfuziji, pa čak i smrti.

[0004] Prednosti postojećih kontinuiranih senzorskih tehnologija dolaze sa velikim nedostacima, pa stoga trenutno ne postoje prave komercijalne alternative postupku ručnog uzorkovanja tačke. Postojeći sistemi tehnologije kontinuiranog merenja glukoze su nezgodni, komplikovani i skupi. Ne postoje funkcije alarma ili digitalna memorija za čuvanje podataka. Postojeći sistemi takođe imaju ograničen radni vek i zahtevaju česte kalibracije korišćenjem eksternih merača uzoraka.

[0005] Detekcija glukoze po principu osmotskog pritiska obećava senzorsku tehnologiju glukoze koja je pogodna i za minijaturizaciju i za dugoročno kontinuirano praćenje in vivo bez izazivanja nelagodnosti kod pacijenata ili smanjenja kvaliteta života. Osmotski senzor za merenje glukoze u krvi opisan je u doktorskoj tezi "Osmotic sensor for blood glucose monitoring applications ", od strane Olga Krushinitskaya, Department of Micro- and Nanosystems Technology, Vestfold University College, avgust 2012. Projekat u ovom doktorskom radu bavio se tehnološkim aspektom razvoja novog senzora glukoze koji je bio sposoban da kontinuirano prati glukozu kroz snimanje osmotskog pritiska, na osnovu principa korišćenja difuzije vode niz sopstveni gradijent koncentracije, što omogućava inherentno jednostavan dizajn senzora u kome je generisani pritisak funkcija koncentracije glukoze.

[0006] Osmotski senzor razvijen u pomenutom projektu zasnivao se na osmotskom pritisku nastalom kompetetivnim vezivanjem između lektina koji vezuje šećer Konkanavalin A (ConA) i dugolančanog polisaharidnog dekstrana, koji formira veliki makromolekularni kompleks. Lektini su grupa proteina koji imaju posebna mesta vezivanja za ugljene hidrate, a ConA se snažno vezuje za glukozu. Studije u gornjoj tezi su eksploatisale osmotski efekat nastao kompetetivnim vezivanjem ConA i dekstrana u prisustvu glukoze. Kako se koncentracija glukoze povećava, više većih makromolekularnih kompleksa ConA-dekstrana se deli na manje „podjedinice“ ConA-glukoze i slobodnog dekstrana. Na ovaj način se povećava broj slobodnih čestica unutar senzora kao funkcija glukoze, što dovodi do odgovarajućeg porasta osmotskog pritiska, videti Sliku.1A-B.

[0007] Ovaj proces je reverzibilan i kako koncentracije glukoze opadaju, ConA se ponovo vezuje za dekstran formirajući veliki makromolekularni kompleks od ConA i "podjedinica" dekstrana. Odgovarajuće smanjenje broja slobodnih čestica izaziva pad osmotskog pritiska.

[0008] Odobreni evropski patent EP 1631187 B1 otkriva senzor za in vivo merenje osmotskih promena. Senzor je invazivni senzor koji se može implantirati subkutano, a posebno invazivni senzor koji se sastoji od najmanje jednog diferencijalnog pretvarača pritiska koji meri razliku pritiska između dve zapremine tečnosti ograničene, na jednom kraju, najmanje jednim pretvaračem diferencijalnog pritiska, i na drugom kraju osmotske membrane.

[0009] Senzor opisan u EP 1631187 B1 može da se koristi za praćenje bilo kakvih promena u hemiji in vivo. Vrsta rastvorenih materija i njihova koncentracija primećena in vivo daje ogromnu količinu informacija u vezi sa fiziologijom tela i njegovim stanjem. Merenje sastava, na primer, u intersticijskoj tečnosti (ISF), može se dobiti mnogo informacija o dehidraciji tela i različitim bolestima: dijabetes, funkcije bubrega, itd. Takođe se mogu pratiti normalne varijacije, na primer u koncentraciji laktata izazvane fizičkom aktivnošću.

[0010] Pored iznad navedenih supstanci koje mogu da promene osmolalnosti u organizmu, mogu se naći i supstance koje lekovima daju osmotski doprinos u telesnoj tečnosti.

[0011] Merenje glukoze u ISF postaje prepoznato kao alternativa merenju glukoze direktno u krvi. Merenje glukoze u krvi povezano je sa nekoliko nedostataka. Potreban je uzorak krvi, uzet iz tela. Iako je oprema postala osetljivija i stoga zahteva manje krvi, proces je povezan sa bolom i broj testova je obično ograničen na manje od 10 dnevno. Takođe je poznato da velike varijacije u izmerenim vrednostima mogu biti uzrokovane postupkom merenja.

[0012] Otelotvorenja i detalji senzora su prikazani na slikama EP 1631187 B1 i u paragrafima opisa [0022] do [0054].

[0013] Dalji dokumenti koji obelodanjuju sastav za upotrebu kao aktivne tečnosti u kontinualnom senzoru glukoze; EP 2055226; WO 2006/061207; WO 20047056311; OLGA KRUSHINITSKAYA ET AL: "The assessment of potentially interfering metabolites and dietary components in blood using an osmotic glucose sensor based on the concanavalin Adextran affinity assay", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, ELSEVIER BV, NL, vol.28, br.1, 9 jul 2011, str.195-203; ADAMS GARY GET AL: "Rheological and diffusion properties of a dextran-con A polymer in the presence of Insulin and Magnesium", RHEOLOGICA ACTA, DIETRICH STEINKOPFF VERLAG, DARMSTADT, DE, vol.45, br.5, 8 novembar 2005, str. 611-620, XP036030668,ISSN: 0035-4511, DOI: 10.1007 S00397-005-0013-Y i Ramljak S ET AL: "& Moderated Poster Discussion ADA-Supported Research CLINICAL THERAPEUTICS/NEW TECHNOLOGY- GLUCOSE MONITORING AND SENSING: In vitro proof of principle experiment with the osmotic pressurebased sencell implantable glucose sensor technology", 10. jun 2016, XP055473961.

[0014] Sadašnji pronalazak, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima, odnosi se na sastav koji se može koristiti kao aktivna tečnost u kontinuiranoj senzorskoj tehnologiji glukoze bez iznad opisanih nedostataka. Utvrđeno je da optimalni sastav aktivne tečnosti treba da ima nizak viskozitet i da viskozitet treba da bude suštinski nezavisan od koncentracije glukoze. Sadašnji sastavi aktivnih tečnosti obezbeđuju brže vreme odziva u poređenju sa prethodnim poznatim sastavima zbog nižeg viskoziteta tečnosti i optimalnog sastava. Rukovanje aktivnim tečnostima je takođe lakše zbog nižeg viskoziteta. Dalje, optimalni sastavi rezultiraju merljivim promenama osmotskog pritiska pomoću senzora pritiska koji se koristi, tj. osetljivost sistema je veoma poboljšana. Hemijski sastav aktivnih tečnosti pokazuje ponovljive koncentracije, pokazuje dugotrajne stabilne reakcije na sobnoj temperaturi (>3 meseca), a koncentracije su stabilne na 37 °C.

[0015] Prema tome, aktivni tečni sastav prema pronalasku ima povoljan efekat na

• životni vek senzora; zbog visoke stabilnosti tečnosti, bez taloženja aktivnih jedinjenja i bez curenja aktivnih jedinjenja kroz membranu;

• vreme odziva merenja; zbog niske viskoznosti tečnosti;

• asimetriju odziva merenja; zbog viskoznosti je suštinski nezavisna od koncentracije glukoze,

• osetljivost merenja; zbog optimalne koncentracije i izbora jedinjenja.

REZIME PRONALASKA

[0016] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje sastav aktivne tečnosti koja se koristi kao aktivna tečnost u kontinualnom senzoru glukoze koji sadrži lektin, pri čemu je lektin Konkanavalin A (ConA); molekul koji vezuje lektin i ima molekulsku masu od 10-100 kDa, molekul koji vezuje lektin je dekstran; najmanje jednu hloridnu so jona dvovalentnog metala izabranu između MgCl2, CaCl2i MnCh ili njihove kombinacije, pri čemu koncentracija ConA meri promene u koncentracijama glukoze u tečnostima in vitro ili in vivo otkrivanjem razlika u osmotskom pritisku, i koncentracija glukoze se kontinuirano prati putem snimanja osmotskog pritiska, za merenje koncentracije glukoze in vitro ili in vivo

[0017] U prvom otelotvorenju molarni odnos ConA prema dekstranu je 1:1.

[0018] U drugom aspektu, obezbeđeni sastav sadrži dekstran 40 kDa ili dekstran 70 kDa i vodeni puferski rastvor sa pH 7,4-7,5 koji sadrži Tris pufer 100 mM, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl2i 150 mM NaCl.

[0019] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu sastava pogodnih za upotrebu kao aktivna tečnost u kontinualnom senzoru glukoze, u skladu sa bilo kojim od gornjih otelotvorenja, koji obuhvata sledeće korake

(i) priprema vodenog puferskog rastvora koji ima pH od 7,0 do 7,8, koji sadrži najmanje jednu hloridnu so dvovalentnog metala izabranu između MgCl2, CaCl2i MnCh ili njihove kombinacije, i opciono glukoze,

(ii) bilo

(a) obezbeđivanje željene količine molekula koji vezuje lektin, pri čemu je molekul koji vezuje lektin polisaharid, u koji se dodaje vodeni puferski rastvor pripremljen u koraku (i) i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori, a zatim se dobije željeni rastvor količinu molekula koji vezuje ugljene hidrate, gde je molekul koji vezuje ugljene hidrate lektin u koji se dodaje pomenuti puferski rastvor koji sadrži pomenuti molekul koji vezuje lektin i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori, ili

(b) obezbeđivanje željene količine molekula koji vezuje ugljene hidrate, pri čemu je molekul koji vezuje ugljene hidrate lektin, u koji se dodaje vodeni puferski rastvor pripremljen u koraku (i) i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori, a zatim se obezbeđuje željeni rastvor količinu molekula koji vezuje lektin, gde je molekul koji vezuje lektin polisaharid, kome se dodaje pomenuti puferski rastvor koji sadrži navedeni lektin i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori.

[0020] U prvoj varijanti postupka, rastvori u koraku (ii) se mešaju 2-48 sati, na primer 6-36 sati, ili 12-24 sata za rastvaranje i homogenizaciju pomenutog lektina i navedenog polisaharida u vodenom puferskom rastvoru.

[0021] U bilo kojem od iznad navedenih otelotvorenja postupka, aktivna tečnost se može degasirati da bi se minimiziralo stvaranje mehurića.

[0022] U specifičnom otelotvorenju postupka, tečni sastav se priprema sledećim koracima

• priprema vodenog puferskog rastvora koji sadrži 100 mM Trizma pufera, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl i 30 mM glukoze,

• provera pH 7,4-7,5,

• izmeri se željena količina dekstrana i doda se puferski rastvor i ostavi preko noći uz mešanje, dajući rastvoren i homogenizovan rastvor dekstrana,

• željena količina ConA se odmeri i dodaje se rastvor dekstrana i ostavi uz mešanje 24 sata pre upotrebe.

[0023] Vodeni puferski rastvor se može degasirati da bi se minimiziralo stvaranje mehurića. Nakon degasiranja, zapreminu treba proveriti i po potrebi dopuniti.

[0024] Sastav prema sadašnjem pronalasku može se koristiti kao aktivna tečnost u senzoru za merenje promena u koncentracijama ugljenih hidrata u tečnostima in vitro ili in vivo detekcijom razlika osmotskog pritiska. U jednom otelotvorenju, sastav aktivne tečnosti prema predmetnom pronalasku može da se koristi za merenje koncentracije glukoze u krvi in vitro ili in vivo. Navedeni sastav može se koristiti kao aktivna tečnost u osmotskom senzoru glukoze koji je sposoban da kontinuirano prati koncentracije glukoze putem snimanja osmotskog pritiska, za merenje koncentracije glukoze in vitro ili in vivo.

[0025] U kontekstu predmetnog pronalaska, termini "sastav", "aktivna tečnost", "tečni sastav", "referentna tečnost" su sve termini koji se odnose na sastav prema predmetnom pronalasku.

KRATAK OPIS SLIKA:

[0026]

Slika 1: Ilustracija senzorskog principa; Sl.1A. Niska glukoza, niska razlika pritiska; Sl.1B. Visoka glukoza, velika razlika u pritisku. Sl.1C. Makro ćelija in-vitro; Sl.1D. Linearna korelacija između osmotskog pritiska i nivoa glukoze.

Slika 2: Viskozitet kao funkcija koncentracije glukoze za dekstran 10kDa, 40kDa i 70kDa. ConA koncentracija je jednaka 3 mM, koncentracija dekstrana je 0,5 mM. Obratite pažnju na ylogaritamsku skalu.

Slika 3: Viskozitet kao funkcija koncentracije glukoze za dekstran 10kDa, 40kDa i 70kDa. ConA koncentracija je jednaka 1,5 mM, koncentracija dekstrana je 0,5 mM. Obratite pažnju na ylogaritamsku skalu.

Slika 4: Viskozitet kao funkcija koncentracije glukoze za dekstran 10kDa, 40kDa i 70kDa. ConA koncentracija je jednaka 1 mM, koncentracija dekstrana je 1 mM. Obratite pažnju na ylogaritamsku skalu.

Slika 5: Viskozitet kao funkcija koncentracije glukoze za dva dekstrana, 40kDa i 70k. ConA i koncentracije dekstrana su jednake 1,5 mM.

Slika 6: Viskozitet kao funkcija koncentracije glukoze za dekstran 40kDa, sa dve različite koncentracije ConA i dekstrana (1 i 1,5 mM).

Slika 7: Viskozitet kao funkcija koncentracije glukoze za dekstran 70kDa, sa dve različite koncentracije ConA i dekstrana (1 i 1,5 mM).

Slika 8: Primer krive koja pokazuje promene između 2 mM rastvora glukoze i 30 mM rastvora glukoze.

Obratite pažnju na snažan brzi skok praćen sporim pomakom u suprotnom smeru da biste postigli stabilnu ravnotežu.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0027] Predmet sadašnjeg pronalaska je da obezbedi sastav koji se može koristiti kao aktivna tečnost u kontinuiranoj senzorskoj tehnologiji glukoze. Ovaj cilj je postignut sastavom koji sadrži

lektin, lektin je Konkanavalin A (ConA);

molekul koji vezuje lektin i ima molekulsku masu od 10-100 kDa, molekul koji vezuje lektin je dekstran;

najmanje jednu hloridnu so jona dvovalentnog metala izabranu između MgCl2, CaCl2i MnCh ili njihove kombinacije, pri čemu koncentracija ConA meri promene u koncentracijama glukoze u tečnostima in vitro ili in vivo otkrivanjem razlika u osmotskom pritisku, i koncentracija glukoze se kontinuirano prati putem snimanja osmotskog pritiska, za merenje koncentracije glukoze in vitro ili in vivo.

[0028] Gornji sastav sadrži molekul koji vezuje ugljene hidrate koji je lektin. Lektini su proteini koji vezuju ugljene hidrate, makromolekuli koji su veoma specifični za delove šećera. Konkanavalin A (ConA) je lektin prvobitno ekstrahovan iz pasulja, Canavalia ensiformis. Član je porodice lektina mahunarki. On se specifično vezuje za određene strukture koje se nalaze u različitim šećerima, glikoproteinima i glikolipidima, uglavnom unutrašnje i neredukcione terminalne α-D-manozilne i α-D-glukozilne grupe. Poznato je da pokazuje dugoročnu hemijsku stabilnost na fiziološkim temperaturama tela. Konfiguracija ConA zavisi od pH vrednosti. Monomerne podjedinice se formiraju pri pH 4-6 u prisustvu 2-propanola, dimerne pri pH 4,5-6,5, dok se tetramerna struktura formira pri pH većem od 7. Veličina ConA monomera je približno 42x40x39 A. Molekularna masa jedne takve podjedinice kreće se od 25500 Da do 27000 Da, u zavisnosti od literature koja se konsultuje. Jedna podjedinica sadrži jedno vezivno mesto za određene strukture koje se nalaze u šećerima, npr. glukoza ili manoza, a s obzirom na tetramernu strukturu, takav molekul bi imao ukupno 4 mesta vezivanja. Afinitet prema ugljenim hidratima je regulisan mestom za vezivanje metalnih jona koje istovremeno aktivira ConA za vezivanje saharida i modulira njegovu stabilnost. Za aktiviranje ConA mogu se koristiti Ca<2+>, Mg<2+>i Mn<2+>, jon Mn<2+>može biti zamenjen sa Co<2+>, Ni<2+>, Zn<2+>i Cd<2+>.

[0029] Dalje, gornji sastav sadrži molekul koji vezuje lektin. U ovom radu dekstran je korišćen kao molekul koji vezuje lekciju. Dekstran je složen razgranati glukan (polisaharid sačinjen od mnogih molekula glukoze) sastavljen od lanaca različite dužine (od 3 do 2000 kDa). Pravi lanac se sastoji od α-1,6 glikozidnih veza između molekula glukoze, dok grane počinju od α-1,3 veza. Grananje dekstrana može biti od 0,5-60%, pri čemu se rastvorljivost smanjuje kako se grananje povećava. Dekstran se sintetiše iz saharoze od strane određenih bakterija mlečne kiseline, a najpoznatije su Leuconostoc mesenteroides i Streptococcus mutans. Hemijska formula za dekstran je (od Mehvar i dr. Dekstran za tragično i kontinuirano isporuku terapeutskih sredstava i sredstava za snimanje. Časopis kontrolisanog izdanja, 2000.69: str.1-25.)

[0030] Gornji sastav dalje uključuje najmanje jednu hloridnu so dvovalentnog metalnog jona. Najmanje jedna hloridna so jona dvovalentnog metala se bira između MgCl2, CaCl2i MnCl2. Najmanje jedna hloridna so ili njihova kombinacija se rastvori u vodenom puferskom rastvoru dajući koncentracije 1-10 mM MgCl2, 1-10 mM CaCl2i 1-10 mM MnCh. Vodeni rastvor može takođe da sadrži NaCl koji daje izotonični rastvor.

[0031] U sastavu prema sadašnjem pronalasku pufer koji se koristi za pripremu vodenog puferskog rastvora može biti izabran između

[0032] Tris pufer, drugi nazivi tris(hidroksimetil)aminometan ili THAM, je organsko jedinjenje sa formulom (HOCH2)3CNH2. Tris pufer je takođe poznat kao Trizma®, što je zaštitni znak koji pripada Sigma-Aldrich®. Tris se koristi kao komponenta puferskih rastvora, kao što su TAE (Tris-acetat-EDTA) i TBE (Tris-barat-EDTA) pufer. TAE pufer je puferski rastvor koji sadrži mešavinu Tris baze, sirćetne kiseline i EDTA. TBE pufer je puferski rastvor koji sadrži mešavinu Tris baze, borne kiseline i EDTA. Tris-puferisani slani rastvor (TBS) je pufer koji se koristi u nekim biohemijskim tehnikama i izotoničan je i netoksičan. TBS sadrži Tris i NaCl. pKaTris pufera zavisi od temperature, pKaopada za približno 0,03 jedinice po stepenu Celzijusa porasta temperature.

ili

HEPES pufer (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina; IUPAC naziv: 2-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il]etansulfonska kiselina) koja je cviterjonski organski hemijski puferski agens. Puferski rastvor može biti kombinacija HEPES kiseline/Na HEPES soli i NaCl

[0033] U sastavu prema predmetnom pronalasku glukoza se može dalje dodati u svrhu smanjenja viskoziteta ako je aktivni tečni sastav. Pri niskim koncentracijama glukoze, molekuli dekstrana su umreženi ConA vezama, formirajući izuzetno viskozan rastvor. Kada se koncentracija glukoze poveća, molekuli dekstrana se delimično zamenjuju glukozom na mestima vezivanja ConA. Kao rezultat, mreža ConA-dekstran je oslabljena i viskozitet aktivne tečnosti se smanjuje.

[0034] NaCl se može dodati sastavu aktivne tečnosti da bi se dobio izotonični rastvor.

[0035] Voda koja se koristi za pripremu aktivnog fluida, odnosno puferskog rastvora je prečišćena voda kao što je voda reverzne osmoze, dejonizovana ili destilovana voda.

[0036] Senzorski princip implantabilnog senzora glukoze oslanja se na varijacije osmotskog pritiska između komore za reagens i rastvora, videti slike 1A-D. Detekcija glukoze se zasniva na nadmetanju između glukoze i polisaharida (dekstrana) da se vežu za receptor, lektin Konkanavalin A (ConA). ConA i dekstran su prisutni u komori za reagens u "aktivnoj tečnosti" i ne izlaze kroz nanoporoznu membranu. Pri niskoj koncentraciji glukoze, razlika pritiska u komori za reagens je mala. Molekuli glukoze i mali joni će proći kroz pore membrane. Molekuli glukoze koji ulaze u komoru za reagens takmiče se sa dekstranom da se vežu za ConA proteine. Kako se koncentracija glukoze povećava, oslobađanje dekstrana iz ConA dovodi do povećanja osmotskog pritiska koji se može koristiti za kvantifikaciju koncentracije glukoze. Ovaj proces je reverzibilan i kako koncentracije glukoze opadaju, ConA se ponovo vezuje za dekstran formirajući veliki makromolekularni kompleks od ConA i "podjedinica" dekstrana. Odgovarajuće smanjenje broja slobodnih čestica izaziva pad osmotskog pritiska.

[0037] Osmotski pritisak P idealnog rastvora niske koncentracije može se aproksimirati pomoću Morzeove jednačine:

gde je i bezdimenzionalni Van't Hof faktor, M je molarnost, R gasna konstanta i T temperatura komore.

[0038] Slika 1D prikazuje linearnu korelaciju između osmotskog pritiska i nivoa glukoze, tačnu i na hipo i hiperglikemijskim nivoima.

[0039] Pronalazači su otkrili da bi smanjenje viskoziteta kompozicije posledično smanjilo asimetriju i vreme odziva senzora. Da bi se smanjio viskozitet aktivne tečnosti, tokom variranja koncentracije glukoze u rastvorima ispitivani su sledeći parametri:

• Molekularna masa dekstrana (10kDa, 40kDa ili 70kDa)

• Odnos ConA prema dekstranu

• Početna koncentracija ConA.

[0040] Slika 2 prikazuje viskozitet kao funkciju koncentracije glukoze za dekstran 10kDa, 40kDa i 70kDa, molarni odnos između ConA i dekstrana je bio 6:1, koristeći početne koncentracije 3 mM i 0,5 mM. Ovaj aktivni tečni sastav smatran je „osnovnom linijom“ za merenja viskoziteta.

[0041] Očekivalo se da će smanjenje koncentracije ConA i tačnije, odnosa koncentracija ConA prema dekstrana, smanjiti broj intermolekularnih veza između dekstrana i ConA, čime se smanjuje viskozitet sistema. Da bi se istražio ovaj efekat, ConA u dekstran je smanjen sa 6:1 na 3:1, koristeći sledeće koncentracije ConA 1,5 mM, dekstran 0,5 mM i opseg glukoze od 2 do 30 mM.

[0042] Slika 3 jasno pokazuje da se viskoznost svakog sistema smanjuje za jedan do dva reda veličine kada se koncentracija ConA podeli sa dva (svi ostali parametri ostaju konstantni). Očekuje se da će ovo imati izuzetno značajan uticaj na vreme odgovora i asimetriju odgovora sa povećanjem ili smanjenjem koncentracije glukoze.

[0043] Pokazalo se da smanjenje molarnog odnosa ConA prema dekstranu na 1:1 poboljšava amplitudu odziva senzora. Smanjenje broja intermolekularnih veza između ConA i dekstrana takođe je smanjilo viskozitet. Pronalazači su odlučili da testiraju nešto veću koncentraciju dekstrana (1 mM umesto 0,5 mM) jer se takođe pokazalo da poboljšava amplitudu odgovora i osetljivost senzora. Aktivna tečnost sa koncentracijama ConA i dekstrana od 1 mM pokazala je amplitudu odgovora približno tri puta veću od amplitude odgovora "osnovne" aktivne tečnosti koja je iznad opisana.

[0044] Održavanjem molarnih koncentracija dekstrana i ConA jednakim (na 1 mM), viskoznost je dodatno smanjena za red veličine u poređenju sa molarnim odnosom ConA prema dekstranu od 3:1, videti sliku 4. Štaviše, smanjuje se uticaj koncentracije glukoze na viskozitet. Ovo je smanjilo asimetriju vremena odgovora na rastuće i opadajuće koncentracije glukoze.

[0045] Za karakterizaciju, svaki rastvor je mešan tokom 24 sata pre merenja viskoziteta. Za sva merenja je korišćen Brookfield DV-II+Pro viskozimetar. Viskozimetar pokreće vreteno kroz kalibrisanu oprugu koja je uronjena u aktivnu tečnost. Viskozni otpor tečnosti prema vretenu se meri otklonom opruge, koji se meri rotacionim transduktorom. Opseg merenja je određen brzinom rotacije vretena, veličinom i oblikom vretena, ambalažom u kojoj se vreteno okreće i obrtnim momentom pune skale kalibrisane opruge. Viskozitet se pojavljuje u jedinicama centipoaza (prikazano "cP"). Jedan centipoaz je jednak 1 mPa.s u USI.

[0046] Za kontrolu temperature (T) na kojoj su vršena merenja, viskozimetar je opremljen vodenim kupatilom koje se može podesiti na izabranu T. Sva merenja viskoziteta su vršena na 37 °C, sa 5 min. period čekanja da se obezbedi stabilizacija temperature u aktivnoj tečnosti.

[0047] Na osnovu merenja viskoziteta i rezultata simulacije, pronalazači su otkrili da se mogu utvrditi jasni trendovi u pogledu osetljivosti i kinetike senzora:

• Odnos molarne koncentracije ConA prema dekstranu od 1 prema 1 bio je povoljan u pogledu osetljivosti u smislu osmotskog pritiska u opsegu koncentracije glukoze [0;30] mM.

• Odnos molarne koncentracije ConA prema dekstranu od 1 prema 1 bio je povoljan u pogledu brze kinetike i najmanje asimetričnog odgovora na varijacije glukoze pošto je viskozitet aktivne tečnosti veoma malo varirao sa koncentracijom glukoze.

• Pri odnosu molarne koncentracije ConA prema dekstranu od 1 do 1, visoka koncentracija ConA (= koncentracija dekstrana) dala je bolju osetljivost. Međutim, takođe je verovatno da će povećati viskozitet sistema, zauzvrat povećati vremenski odziv senzora.

• Izvršena su eksperimentalna ispitivanja viskoziteta različitih aktivnih tečnosti. Oni su pokazali brz pad (od 3 reda veličine) pošto je koncentracija ConA smanjena sa 3 mM (na osnovu koncentracije monomera) na 1 mM. Promene u koncentraciji dekstrana su takođe uticale na viskozitet, ali u manjoj meri. Nasuprot tome, molekulska masa dekstrana (10kDa, 40kDa, 70kDa) može promeniti viskozitet po redosledu veličine, videti slike 6 i 7.

• Što je niža MV dekstrana, to je bio niži viskozitet. To znači da će aktivna tečnost koja sadrži dekstran 10kDa dati brži odgovor od one koja sadrži dekstran 40kDa, za koju se očekuje da će dati brži odgovor od one koja sadrži dekstran 70kDa.

• Veća MV dekstrana je obezbedila veći diferencijalni osmotski pritisak sistema. Upotreba dekstrana veće veličine (npr.70 kDa) u aktivnoj tečnosti će stoga poboljšati osetljivost sistema.

• Simulacije vremena odziva zasnovane na ovim merenjima su pokazale da se očekuje da broj aktivnih tečnosti ima vreme odziva (u oba slučaja povećavajući opadajuću koncentraciju glukoze) manje od 5 minuta.

[0048] Pronalazači su izveli niz eksperimenata kako bi testirali odgovor različitih aktivnih tečnosti, npr.: 1,0 mM ConA, 1,0 mM dekstrana 40 kDa i 1,0 mM ConA, 1,0 mM dekstrana 70 kDa.1,5 mM ConA, 1,5 mM dekstrana 40 kDa i 1,5 mM ConA, 1,5 mM dekstrana 70 kDa.

Test aktivnih tečnosti na bazi 1,5 mM ConA, 1,5 mM dekstrana 40 kDa

[0049] Eksperimenti su izvedeni smenjivanjem sadržaja komore za uzorke u makroćeliji između 2 mM glukoze (u rastvoru koji sadrži 100 mM Trizma B pufera, 150 mM NaCl, 10 mM MgCh i 10 mM CaCl2) i 30 mM glukoze u istom rastvoru. Pri svakoj promeni koncentracije glukoze, rastvor je uklonjen ručno pomoću pipete, vodeći računa da se ne dodirne nanoporozna (NP) membrana, ali je vrh pipete što je moguće bliže dnu komore za uzorke. Rastvor je zatim zamenjen novim izabranim rastvorom, koji je mešan "pumpanjem" pipete. Rastvor je uklonjen i zamenjen svežim rastvorom još dva puta. Temperatura je bila 21 °C.

[0050] Nakon ove procedure, dobijen je ponovljiv signal. Promena sa 2 mM glukoze na 30 mM glukoze dovela je do velikog skoka izmerenog pritiska, praćenog sporim porastom do novog pritiska koji je bio približno 10 mbar veći od prvobitne vrednosti. Promena sa 30 mM glukoze na 2 mM glukoze dovela je do velikog porasta izmerenog pritiska praćenog polaganim pomakom naniže (videti sliku 8). Svaki put su se desili i brzi skok u jednom pravcu i sporo skretanje u suprotnom smeru.

[0051] Ove dve karakteristike se mogu razumeti kada uzmemo u obzir vremenski tok događaja koji se dešavaju u komori za uzorke i komori za aktivnu tečnost, kao što je opisano u nastavku.

1) Počevši od niske koncentracije glukoze, za početak, sve male rastvorene supstance su prisutne u jednakim koncentracijama na obe strane NP membrane. Većina ConA i dekstrana unutar komore za aktivnu tečnost je povezana zajedno, stvarajući mali nadpritisak unutar komore.

2) Glukoza se dodaje izvan NP membrane. Koncentracija rastvorenih materija je nakratko veća izvan membrane nego unutra. Unutar komore postoji kratak potpritisak.

3) Glukoza difunduje kroz membranu. Male rastvorene materije su prisutne u jednakim koncentracijama na obe strane NP membrane. ConA i dekstran se disociraju i izmereni pritisak se povećava da bi se konačno dobio nadpritisak unutar komore.

[0052] Dakle, primećeni skok nije artefakt, već pokazuje proces ekvilibracije koncentracije glukoze na dve strane membrane.

[0053] Rezultati ispitivanja o aktivnim tečnostima takođe pokazuju da se sadašnji sastavi aktivne tečnosti mogu proučavati tokom 3 meseca bez vidljivog gubitka osetljivosti, odnosno dugoročne stabilnosti.

[0054] Opisavši poželjna otelotvorenja prema pronalasku, stručnjacima u ovoj oblasti biće jasno da se mogu koristiti druga otelotvorenja koja uključuju koncepte. Ovi i drugi primeri pronalaska koji su iznad ilustrovani su namenjeni samo kao primer i stvarni obim pronalaska treba da se odredi iz sledećih patentnih zahteva.

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Sastav za upotrebu kao aktivna tečnost u senzorima za kontinuirano merenje glukoze koji sadrži:

lektin, lektin je konkanavalin A (ConA);

molekul koji vezuje lektin i ima molekulsku masu od 10-100 kDa, molekul koji vezuje lektin je dekstran;

najmanje jednu hloridnu so jona dvovalentnog metala izabrana između MgCl2, CaCl2i MnCl2ili njihove kombinacije,

sastav naznačen time da:

koncentracija ConA je 1-1,5 mM na osnovu koncentracije monomera i koncentracija dekstrana je 1-1,5 mM pri čemu je senzor za kontinuirano merenje glukoze:

- merenje promena u koncentraciji glukoze u tečnostima in vitro ili in vivo otkrivanjem razlika u osmotskom pritisku, i

- kontinuirano praćenje koncentracije glukoze putem snimanja osmotskog pritiska, za merenje koncentracije glukoze in vitro ili in vivo.

2. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde je molarni odnos ConA prema dekstranu 1:1.

3. Sastav prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je sastav naznačen time da:

je dekstran, dekstran 40 kDa ili dekstran 70 kDa;

vodeni puferski rastvor sa pH 7,4-7,5 koji sadrži Tris pufer 100 mM, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl i 30 mM glukoze.

4. Postupak za pripremu sastava pogodnog za upotrebu kao aktivna tečnost u senzoru za kontinuirano merenje glukoze prema patentnim zahtevima 1-3, koji obuhvata sledeće korake

(i) pripremu vodenog puferskog rastvora koji ima pH od 7,0 do 7,8, koji sadrži najmanje jednu hloridnu so dvovalentnog metala izabranu između MgCl2, CaCl2 i MnCh ili njihove kombinacije, i opciono glukoze,

(ii) bilo:

- (a) obezbeđivanje željene količine molekula koji vezuje lektin, pri čemu je molekul koji vezuje lektin dekstran koji ima molekulsku masu od 10-100 kDa, u koji se dodaje vodeni puferski rastvor pripremljen u koraku (i) i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori, a nakon toga obezbedi željenu količinu lektina, lektin je ConA u koji se dodaje pomenuti puferski rastvor koji sadrži navedeni dekstran i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori, ili

- (b) obezbeđivanje željene količine lektina, lektin je ConA, u koji se dodaje vodeni puferski rastvor pripremljen u koraku (i) i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori, a nakon toga se obezbeđuje željena količina molekula koji vezuje lektin, gde je molekul koji vezuje lektin dekstran koji ima molekulsku masu od 10-100 kDa, kome se dodaje pomenuti puferski rastvor koji sadrži navedeni ConA i ostavi da se meša dok se ne homogenizuje i rastvori.