RS65726B1 - Postupak za sintezu monozaštićenih bifunkcionalnih prolekova i konjugata antitela i lekova zasnovanih na njima kao i postupak za pripremu konjugata antitela i lekova - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sintezu jedinjenja koja se koriste u pripremi konjugata antitela i lekova (ADC), zapravo, monozaštićenih dimernih bifuncionalnih prolekova zasnovanih na analozima duokarmicina. U daljem aspektu, obezbeđena su jedinjenja dobijena postupkom prema predmetnom pronalasku. Monozaštićeni bifunkcionlni prolek se koristi za pripremu konjugata antitela i lekova koji se sastoje od dela antitela i monozaštićenog bifunkcionalnog proleka. Obezbeđeni su tako dobijeni konjugati antitela i jedinjenja. Dalje, obezbeđen je postupak za pripremu konjugata antitela i leka i koji se sastoji od dva identična ili dva različita dela antitela, kao i konjugata antitela i jedinjenja koji sadrži dva različita dela antitela u skladu sa tim. Ovi konjugati mogu se koristiti u farmaceutskim kompozicijama, posebno za primenu u lečenju tumora, npr. za primenu u ADC terapiji.

Stanje tehnike

[0002] Različiti oblici bolesti kancera zahtevaju individualne koncepte lečenja. Kao odgovor na složenost neoplastičnih bolesti, većina postupaka lečenja koji se trenutno primenjuju u kliničkoj praksi su kombinacije različitih terapijskih modaliteta. Za hirurški podložne tumore sa dobro definisanim granicama, hirurško uklanjanje može biti postupak izbora. Međutim, ako je tumor teže dostupan ili zahvata vitalne strukture, lečenje zračenjem i hemoterapijom su postupci izbora. U naprednijim stadijumima, kada su se metastaze već formirale ili postoji bar rizik od metastaza, hemoterapija se obično daje odmah. Pored toga, u lečenju tumora primenjuju se postupci hormonske terapije, imunoterapije i terapije inhibitorima angiogeneze i inhibitorima kinaze.

[0003] U stvari, u slučajevima metastaza ili čak sistemskih tumora, hemoterapija je trenutno najvažniji postupak lečenja, iako je često povezana sa ozbiljnim neželjenim dejstvima, kao što su poremećaj krvne slike, imunodeficijencija, mukozitis, groznica, mučnina, povraćanje. Tako da, većina hemoterapijskih sredstava se distribuira po celom telu putem cirkulacije krvi tako da mogu da stignu do svih ćelija. Međutim, hemoterapijski lekovi deluju na ljudske ćelije uopšteno sistemski, odnosno sprečavaju ćelijsku proliferaciju, ili deluju citotoksično, odnosno mogu izazvati ćelijsku smrt. Hemoterapijska sredstva obično ne prave razliku između ćelija kancera i normalnih ćelija. Razlika je u tome što su tumorske ćelije vrsta ćelija koje se brzo razmnožavaju, dok su normalne ćelije ćelije koje se sporo razmnožavaju. Međutim, pošto su brzo rastuće netumorske ćelije lečene osobe takođe pogođene, posebno ćelije koštane srži, korena kose i epitelnih ćelija creva, javljaju se ozbiljna neželjena dejstva. Jedan primer citotoksičnih sredstava koja se koriste u hemoterapiji uključuju sredstva za alkilovanje. Sredstva za alkilovanje su brojčano značajna strukturno veoma raznolika klasa izuzetno reaktivnih supstanci. U nekim slučajevima posle prethodne aktivacije leka ili proleka u karbokatjon, aktivno jedinjenje reaguje kao elektrofil, posebno sa nukleinskim kiselinama, formirajući kovalentne veze. Dakle, dolazi do unakrsnog povezivanja DNK, abnormalnog uparivanja baza ili prekida lanaca koji sprečavaju replikaciju i na kraju dovode do smrti ćelije. Tipični primeri lekova za alkilovanje su ciklofosfamid, ali i cisplatin. Grupa posebno efikasnih sredstava za alkilovanje uključuje prirodni antibiotik CC1065, derivat ciklopropilpiroloindola (CPI), derivate duokarmicina i ciklopropilbenzoindola (CBI), jatekemicin kao i derivate i analoge ove klase prirodnih prolekova. Zbog neophodnosti hemoterapijskog lečenja, jaka neželjena dejstva velikog dela klinički primenjenih lekova i pojave rezistencije na mnoga poznata hemoterapijska sredstva, neophodan je kontinuiran razvoj u oblasti hemoterapijskih sredstava.

[0004] Da bi se smanjila neželjena dejstva u hemoterapiji, razvijeni su novi koncepti koji koriste genotipske i fenotipske karakteristike tumorskih ćelija i omogućavaju ciljanu aktivaciju reverzibilnih prolekova direktno na mestu delovanja. Takva ciljana aktivacija postoji u takozvanom ADEPT konceptu (terapija prolekovima enzima usmerena na antitela). U ovom slučaju se koriste kongregacije enzima i antitela, koje direktno pretvaraju tumor u transformaciju netoksičnog proleka u lek i postiže se veća selektivnost. Ovaj pristup binarne terapije sastoji se od dva koraka. Prvo se primenjuje određena količina konjugata antitela i enzima koji se zatim cirkulacijom krvi distribuira po celom organizmu.

[0005] Konjugat se vezuje za specifične antigene na površini tumorskih ćelija ili ga telo razgrađuje ili izlučuje. Ako se kongregat enzima i nevezanog antitela više ne može detektovati, primena proleka se odvija u drugom koraku. Netoksični prolek se takođe obično distribuira po celom organizmu i selektivno je toksičan u tumorskom tkivu zahvaljujući enzimu koji je obično prisutan samo na površini tumora u obliku kongregata enzima i antitela. Oslobođeni lek tada razvija svoj toksični efekat nakon prodiranja kroz ćelijsku membranu, dok enzim ostaje aktivan na spoljašnjoj strani tumorske ćelije i može aktivirati dalje molekule proleka. Cepanje prolekova pomoću enzimskog sistema specifičnog za telo ne bi trebalo da se dešava koliko god je to moguće tokom ovog pristupa, jer bi u suprotnom aktivnost terapije bila smanjena ili ukinuta. Međutim, ove prednosti prethodno poznatih prolekova imaju premalu razliku u citotoksičnosti između proleka i leka koji je iz njega nastao, kao i prenisku citotoksičnost za sam lek koji se formira.

[0006] Kao smernica: Vrednosti QIC50 proleka u prisustvu enzima treba da budu veće od 1000 i citotoksičnost osnovnog leka ima vrednost QIC50 manju od 10 nM.

[0007] Kliničke studije su već sprovedene za ADEPT koncept. Iako se pokazalo da je ADEPT koncept pogodan za selektivnu terapiju tumora, potrebna su dalja poboljšanja u različitim aspektima kako bi se omogućila selektivna i efikasna terapija.

[0008] Drugi pristup u kontektsu ciljanog lečenja malignih tumora je monoterapija prolekovima. U tom slučaju, poželjno je prisustvo enzima koji su prekomerno eksprimirani u tumorima koji su u stanju da cepaju odgovarajući prolek uz oslobađanje odgovarajućeg leka. Primer ovog mogućeg enzima je β-D-glukuronidaza koja se može detektovati u povećanim koncentracijama u nekrotičnim delovima tumorskog tkiva. Alternativno, konjugati lekova i tumor-specifičnh liganada se takođe mogu koristiti za selektivno ciljanje u terapiji kancera. Jedan od problema koje bi bilo poželjno poboljšati je obezbeđivanje novih i efikasnih prolekova koji imaju veliku razliku u citotoksičnosti između proleka i odgovarajućeg leka, visoku citotoksičnost leka i kratko srednje vreme u plazmi u leku. Pored toga, postoji potreba za novim tipovima bifunkcionalnih prolekova na bazi analoga duokarmicina za ADC terapiju (konjugat antitela i leka).

[0009] ADC je važna klasa visoko potentnih biofarmaceutskih lekova dizajniranih kao ciljana terapija za lečenje subjekata koji pate npr. od kancera. U ADC, antitela su povezana sa biološki aktivnim principom koji se takođe naziva korisnim opterećenjem ili prolekom/lekom. Lek može biti u obliku proleka pretvorenog u aktivni princip u ciljanoj ćeliji ili može biti prisutan kao lek koji je efikasan posle vezivanja za cilj.

[0010] Sa ADC, sposobnost ciljanja monoklonskih antitela je kombinovana sa citotoksičnom aktivnošću aktivnih sredstava ili preoblikovanjima navedenih aktivnih sredstava. Zbog specifičnosti monoklonskih antitela, moguće je usmereno ciljanje na ćelije kancera. Tako je moguće efikasnije lečenje ćelija kancera uz manje ozbiljna neželjena dejstva, odnosno na zdrave ćelije.

[0011] Iako je nekoliko ADC proizvoda već komercijalno dostupno, očekuje se da će ADC farmaceutski proizvodi imati veliki potencijal. Postoje linkeri koji se mogu cepati i koji se ne mogu cepati i koji povezuju deo antitela sa sredstvom protiv kancera ili aktivnim principom ili njegovim prekursorom. Međutim, vezivanje može uticati na toksičnost aktivnog principa.

[0012] U stanju tehnike su opisana različita tehnička rešenja za vezivanje dela antitela ili drugih partnera za vezivanje za korisna opterećenja, posebno za CBI komponente.

[0013] Na primer, WO 2009/017394 opisuje supstituisane analoge CC-1065 i njihove konjugate. Ostala bifunkcionalna jedinjenja su opisana npr. u DE 10 2015 118 490 identifikujući nove bifunkcionalne prolekove i lekove zasnovane na analozima CC-1065.

[0014] Međutim, bifunkcionalna jedinjenja koja su opisana u stanju tehnike su vezana za vezujuće entitete, kao što su antitela, simetrično, to jest, na obe CBI podjedinice bifunkcionalnog jedinjenja. Međutim, poželjno je obezbediti bifunkcionalne prolekove koji imaju različite funkcionalne grupe na obe strane konjugacije dve podjedinice.

Kratak opis predmetnog pronalaska

[0015] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi nove bifunkcionalne prolekove zasnovane na analozima duokarmicina za ADC terapiju koji omogućavaju heterogenu derivatizaciju koja je pogodna za ADC terapiju.

[0016] Predmetni pronalazak opisuje sintezu navedenih analoga za ADC terapiju u skladu sa tim. Utvrđeno je da je moguće konjugovati antitelo sa jednom podjedinicom bifunkcionalnog proleka, čime se postiže veza sa najmanje jednom od dve OH grupe dok je druga OH grupa neophodna za potrebnu Winstein-ovu ciklizaciju koja je neophodna za konverziju proleka u aktivni lek. Prema tome, moguće je obezbediti bifunkcionalni prolek koji sadrži neophodan deo koji omogućava kasniju Winstein-ovu ciklizaciju, dok je kod druge OH grupe druge podjedinice, antitelo ili bilo koji vezujući deo vezan za bifunkcionalni prolek. Dalje, može se predvideti obezbeđivanje heterogenih bifunkcionalnih prolekova koji su različito konjugovani sa funkcionalnim grupama, čime se omogućava Winstein-ova ciklizacija dve CBI podjedinice u različitim vremenskim tačkama.

[0017] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku ne zahtevaju uvođenje bilo koje dodatne funkcionalne grupe kao korisnog opterećenja ili leka za vezivanje npr. antitela. Suprotno učenju DE 102015 118 490, vezivanje vezujućeg dela, kao i antitela, nije u vezivnom delu, već na najmanje jednoj od dve podjedinice proleka.

[0018] Sva jedinjenja koja su opisana u stanju tehnike imaju istu funkcionalnu grupu sa obe strane konjugacije i prema tome bi imala iste molekularne mehanizme cepanja i regrutacije ćelija kancera.

[0019] Predmetni pronalazak sada omogućava nezavisnu i različitu modifikaciju dve OH grupe dve podjedinice, čije cepanje je neophodno za aktivaciju i transformaciju proleka u aktivni lek.

[0020] Prema tome, u prvom aspektu, obezbeđen je postupak za sintezu jedinjenja opšte formule I

pri čemu Hal je F, Cl, Br, ili I;

R je H ili opciono supstituisana C1-C4alkil grupa, opciono supstituisana C1-C4alkoksi grupa, opciono supstituisana aril grupa, opciono supstituisana heteroaril grupa, opciono supstituisana C1-C4alkil karboksi C1-C4alkil grupa, Hal, CN, opciono supstituisana C1-C4alkilsulfonil grupa, opciono supstituisana arilsulfonil grupa, ili NRzgrupa kao što je definisano u nastavku;

R1je H ili C1-C4alkil grupa ili C1-C4alkoksi grupa;

X1je zaštitna grupa;

L je vezna grupa za kovalentnu vezu pri čemu L ima opštu strukturu Z-Y-Z';

Z i Z' su nezavisno jedan od drugog izabrani od C = O, OC = O, SO2, NRz, NR2C = O, C = O NRz, pri čemu svaki Rzje nezavisno jedan od drugog izabran od H, opciono supstituisane C1-C4alkil grupe ili opciono supstituisanog C1-C4acila;

pri čemu Y je opciono supstituisana C1-C10alkil grupa, grupa strukture (VIII)

pri čemu o i p su nezavisno jedan od drugog izabrani od celog broja od 1 do 20, pri čemu o i p mogu biti isti ceo broj ili različit ceo broj, X3je i) N, S ili O, ili ii) aril grupa ili heteroaril grupa, pri čemu [C(Ra)2]Oi [C(Ra)2]psu prisutni u metapoziciji navedene aril grupe ili navedene heteroaril grupe,

svaki RAje nezavisno jedan od drugog izabran od H opciono supstituisane C1-C4alkil grupe ili opciono supstituisane C1-C4acil grupe; koji obuhvata korak reagovanja jedinjenja formule II

pri čemu R, R1, i Hal su definisani kao gore i X2je zaštitna grupa koja može biti identična ili različita od X1gore,

sa sredstvom za uklanjanje zaštite za uklanjanje zaštitne X2grupe iz jedinjenja formule II; nakon čega sledi reagovanje jedinjenja formule II uklonjenom zaštitom sa jedinjenjem formule III

pri čemu supstituenti Hal, R1, X1i R su definisani kao gore i L je vezna grupa kao što je gore definisano, R3je izabran od Hal, posebno, Cl i Br, i OH u prisustvu sredstva za kuplovanje i baze da se dobije jedinjenje formule I;

pri čemu jedinjenje formule III se dobija reagovanjem jedinjenja formule IV

pri čemu X1, X4, R, R1i Hal su definisani kao gore, X4je zaštitna grupa kao što je definisano gore za X1i X1i X4se razlikuju jedan od drugog, sa jedinjenjem opšte formule VII

VII R5 - L - R6

gde L je Z - Y - Z' i pri čemu Z, Y i Z' su definisani kao gore i R5i R6su nezavisno jedan od drugog izabrani od halogena ili OH grupe.

pri čemu se u prvom koraku jedinjenju formule IV uklanja zaštitna X4grupa reagovanjem istog sa sredstvom za uklanjanje zaštite, i zatim jedinjenje formule IV sa uklonjenom zaštitom reaguje sa jedinjenjem formule VII u prisustvu baze da se dobije jedinjenje formule III.

[0021] U dalje aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja omogućavaju kuplovanje vezujućeg dela, kao što je deo antitela preko slobodne OH grupe na jednoj podjedinici bifunkcionlnog jedinjenja, dok je druga OH grupa drugih podgrupa zaštićena.

[0022] U drugom aspektu, opisan je postupak pripreme ADC primenom jedinjenja formule I prema predmetnom pronalasku. Pored toga, opisan je navedeni konjugat antetitela i jedinjenja koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku.

[0023] Pored toga, opisan je obezbeđeni postupak za pripremu ADC konjugata sasatavljenog od dva identična ili dva različita dela antitela i jedinjenja prema formuli I, kao i navedeni ADC koji se može dobiti ovim postupkom koji sadrži dva različita dela antitela.

[0024] Na kraju, opisane su farmaceutske kompozicije koje sadrže ADC prema predmetnom pronalasku, kao i primena ADC prema predmetnom pronalasku za lečenje tumora npr. za primenu u ADEPT terapiji ili u ADC terapiji.

Kratak opis crteža

[0025] Šema 1: Šema 1 prikazuje rakcije postupka prema predmetnom pronalasku da bi se došlo do jedinjenja opšte formule I.

Detaljan opis predmetnog pronalaska

[0026] Predmetni pronalazači imaju za cilj da obezbede postupak za sintezu novih intermedijera i prolekova za jedinjenja pogodna u terapiji kancera.

[0027] U prvom aspektu, obezbeđen je postupak za sintezu jedinjenja opšte formule I

pri čemu Hal je F, Cl, Br, ili I;

R je H ili opciono supstituisana C1-C4alkil grupa, opciono supstituisana C1-C4alkoksi grupa, opciono supstituisana aril grupa, opciono supstituisana heteroaril grupa, opciono supstituisana C1-C4alkil karboksi C1-C4alkil grupa, Hal, CN, opciono supstituisana C1-C4alkilsulfonil grupa, opciono supstituisana arilsulfonil grupa, ili NRzgrupa kao što je definisano u nastavku;

R1je H ili C1-C4alkil grupa ili C1-C4alkoksi grupa;

X1je zaštitna grupa;

L je vezna grupa za kovalentnu vezu pri čemu L ima opštu strukturu Z-Y-Z';

Z i Z' su nezavisno jedan od drugog izabrani od C = O, OC = O, SO2, NRz, NR2C = O, C = O NRz, pri čemu svaki Rzje nezavisno jedan od drugog izabran od H, opciono supstituisane C1-C4alkil grupe ili opciono supstituisanog C1-C4acila;

pri čemu Y je opciono supstituisana C1-C10alkil grupa, grupa strukture (VIII)

pri čemu o i p su nezavisno jedan od drugog izabrani od celog broja od 1 do 20, pri čemu o i p mogu biti isti ceo broj ili različit ceo broj, X3je i) N, S ili O, ili ii) aril grupa ili heteroaril grupa, pri čemu [C(Ra)2]Oi [C(Ra)2]psu prisutni u metapoziciji navedene aril grupe ili navedene heteroaril grupe,

svaki RAje nezavisno jedan od drugog izabran od H opciono supstituisane C1-C4alkil grupe ili opciono supstituisane C1-C4acil grupe;

koji obuhvata korak reagovanja jedinjenja formule II

pri čemu R, R1, i Hal su definisani kao gore i X2je zaštitna grupa koja može biti identična ili različita od X1gore,

sa sredstvom za uklanjanje zaštite za uklanjanje zaštitne X2grupe iz jedinjenja formule II; nakon čega sledi reagovanje jedinjenja formule II sa uklonjenom zaštitom sa jedinjenjem formule III

pri čemu supstituenti Hal, R1, X1i R su definisani kao gore i L je vezna grupa kao što je gore definisano, R3je izabran od Hal, posebno, Cl i Br, i OH u prisustvu sredstva za kuplovanje i baze da se dobije jedinjenje formule I; pri čemu jedinjenje formule III se dobija reagovanjem jedinjenja formule IV

pri čemu X1, X4, R, R1i Hal su definisani kao gore, X4je zaštitna grupa kao što je definisano gore za X1i X1i X4se razlikuju jedan od drugog, sa jedinjenjem opšte formule VII

VII R5-L-R6

gde L ima opštu strukturu Z - Y - Z'

pri čemu Z, Y i Z' su definisani kao gore i R5i R6su nezavisno jedan od drugog izabrani od halogena ili OH grupe.

pri čemu se u prvom koraku jedinjenju formule IV uklanja zaštitna X4grupa reagovanjem istog sa sredstvom za uklanjanje zaštite i zatim,

jedinjenje formule IV sa uklonjenom zaštitom reaguje sa jedinjenjem formule VII u prisustvu baze da se dobije jedinjenje formule III.

[0028] Predmetni pronalazak sada omogućava nezavisnu i različitu modifikaciju dve OH grupe na 5' poziciji benzoindola dve podjedinice bifunkcionalnih prolekova zasnovanih na CBI. Potrebno je cepanje najmanje jedne od pomenute dve OH grupe za aktivaciju i transformaciju pomenute jedne podjedinice u aktivni lek.

[0029] ADC koji se može pripremiti primenom predmetnog pronalaska, npr. je sastavljen od dela antitela i jedinjenja formule I prema predmetnom pronalasku ili jedinjenja iz kojeg je uklonjena zaštita bilo gde je X1je H ili gde je X1ostatak uklonjen, npr. kada X1je tetraacetil-beta-D-galaktozid, deprotektovani X1je beta-D-galaktozid.

[0030] Zakačeno antitelo se prvo može odcepiti preko pH-labilnih grupa pri niskom pH unutar lizozoma, i zatim se dešava prvo preuređenje u toksičnu CBI jedinicu. U drugom koraku, preuređenje druge toksične CBI jedinice može biti pokrenuto enzimskim cepanjem X1jedinice, npr. jedinice galaktoze zasnovane na aktivnosti β-galaktozidaze u lizozomima, ali i u drugim ćelijskim komponentama, kao što je endoplazmatski retikulum, čime se izaziva citotoksičnost. Aktivacija u dva koraka, zapravo prva toksična faza praćena drugom toksičnom fazom, mogla bi da bude od prednosti obezbeđivanjem bolje ili duže efikasnosti ili sa malo ili manje neželjenih dejstava.

[0031] Jedinjenje prema formuli I omogućava vezivanje antitela samo za jednu fenolnu OH grupu ili za obe grupe. Na primer, ako su obe OH grupe konjugovane sa antitelom, predmetni pronalazak dozvoljava konjugaciju različitih antitela na svakoj strani. Ovo bi omogućilo da se primenjuju dva različita epitopa specifična za tumor, što bi imalo prednost daljeg povećanja specifičnosti ADC terapije.

[0032] Shodno tome, postupak prema predmetnom pronalasku je prikazan na šemi 1 u kojoj su navedeni koraci. Zapravo, jedinjenje (13) prema formuli IV u kojoj X1je zaštićeni galaktozid, zapravo zaštićen acetil grupom, X4je Boc, R je H i R1je H dok Hal je Cl, se dobija reagovanjem jedinjenja 11 sa jedinjenjem 12, što dovodi do jedinjenja 13 strukture III sa dve zaštitne grupe X1i X4. Jedinjenje 13 reaguje sa jedinjenjem 14 koje je ilustrovano strukturom VII gde R5i R6su Cl, Z i Z' su C=O i Y je propil grupa.

[0033] Dobijeno jedinjenje 15 je primer formule III gde R i R1su H, Hal je Cl, i L sa Z i Z' je C=O i Y je (CH2)3, R3je OH i X1je tetra-acetil-beta-D-galaktozid.

[0034] Jedinjenje 15 odgovarajuće strukture formule III zatim reaguje sa jedinjenjem 11 odgovarajuće strukture II sa R i R1= H, X2= Boc i Hal = Cl, prvo uklanjanjem zaštite 11 sa BF3OEt2u CH2Cl2i, nakon toga, reagovanje jedinjenja 11 sa uklonjenom zaštitom sa jedinjenjem 15 u prisustvu baze i sredstva za kuplovanje, ovde DIPEA i PyBroP, da bi se došlo do jedinjenja opšte formule I gde X1je tetra-acetil-beta-D-galaktozid, R i R1su H, Hal je Cl i L je Z i Z' je C = O i Y je (CH2)3.

[0035] Konkretno, predmetni pronalazači su prepoznali da je moguće selektivno reagovanje jedinjenja 15 sa jedinjenjem 11 da bi se dobilo jedinjenje 16 u visokim prinosima.

[0036] U tehničkom rešenju predmetnog pronalaska zaštitna grupa X1i X2je nezavisno jedna od druge izabrana od terc-butoksikarbonila, benziloksikarbonila, tozila, nozila, trimetilsilila, dimetiltercbutilsilila, ugljenohidratne jedinice, kao što je furanoza, piranoza, zaštićenog mono-, di- ili trisaharida koji uključuje galaktozid, kao što je beta-D-galaktozid, beta-D-glukuronska kiselina, beta-D-glukozid, alfa-D-manozid, fukoza, deo koji sadrži karbamat, deo koji sadrži acetal ili etar koji sadrži deo koji se može cepati oksidacijom.

[0037] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" se odnosi na prirodna ili rekombinantna antitela, kao i na fragmente antitela. U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, antitela su humanizovana antitela ili fragmenti antitela. Stručnjak iz date oblasti tehnike je upoznat sa odgovarajućim antitelima i fragmentima antitela i njihovom proizvodnjom. Ako je potrebno, antitelo ili fragmenti antitela se modifikuju omogućavajući vezivanje, ali i cepanje istih preko/na benzolindol OH grupi. Štaviše, antitelo ili fragmenti antitela mogu sadržati pogodan linker region koji omogućava vezivanje, ali i cepanje istog preko/na benzoindol grupi. Njihovi primeri su poznati u stanju tehnike, npr. WO 2017/072295 A1.

[0038] Pod terminom "konjugat antitela i jedinjenja", podrazumeva se konjugat antitela sa jedinjenjem prema predmetnom pronalasku. Jedinjenje može biti prolek ili lek. U skladu sa tim, tehničko rešenje konjugata antitela i leka prema predmetnom pronalasku je konjugat antitela i leka (ADC).

[0039] Termin "supstituisan" posebno u odnosu na alkil, heteroalkil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, alilsulfonil, arilsulfonil, alkoksi i acil kako se ovde koristi, se odnosi na navedene grupe koje su supstituisane sa jednim ili više supstituenata izabranih od OH, = O, = S, = NR<h>, = N-OR<h>, S<h>, NH2, NO2, NO, N3, CF3, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, halogena, R<h>, SR<h>, S(O)R<h>, S(O)OR<h>, S(O)2R<h>, S(O)2OR<h>, OS(O)R<h>, OS(O)OR<h>, OS(O)2R<h>, OS(O)2OR<h>, OP(O)(OR<h>)(OR<i>), P(O)(OR<h>)(OR<i>), OR<h>, NHR<i>, N(R<h>)R<i>,<+>N(R<h>)(R<i>)R<j>, Si(R<h>)(R<i>)R<j>, Si(R<h>)(R<i>)(R<j>), C(O)R<h>, C(O)OR<h>, C(O)N(R<i>)R<h>, OC(O)R<h>, OC(O)OR<h>, OC(O)N(R<h>)R<i>, N(R<i>)C(O)R<h>, N(R<i>)C(O)OR<h>, N(R<i>)C(O)N(R<j>)R<h>i tioderivata ovih supstituenata ili protonovanog ili deprotonovanog oblika ovih supstituenata pri čemu R<h>, R<i>, i R<j>su izabrani nezavisno jedan od drugog od H i opciono supstituisanih C1-15alkila, C1-15heteroalkila, C3-

15cikloalkila, C3-15hheterocikloalkila, C4-15arila, ili C4-15heteroarila ili njihova kombinacija pri čemu dva ili više od R<h>, R<i>i R<j>su opciono povezani jedan sa drugim tako da formiraju cikloakil alil ili heterocil.

[0040] Termin "alkil" kako se ovde koristi osim ako nije drugačije identifikovan, se odnosi na ravan ili razgranat, zasićen ili nezasićen ugljovodonik, poželjno, alkil grupu koja sadrži od 1 do 12, kao što je 1 do 10 atoma ugljenika, tj. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 atoma ugljenika, poželjno 1 do 8 atoma ugljenika, kao što je 1 do 6 ili 1 do 4 atoma ugljenika. Primeri alkil grupa su metil, etil, propil, butil, pentil, heksil, oktil, decil, izopropil, sek-butil, izobutil, terc-butil, izopentil, venil, alil, 1-butenil, 2-butenil, izobutenil, pentinil itd.

[0041] Termin "aril" ili "aromatični prsten" se odnosi na monoradikal aromatičnog cikličnog ugljovodonika. Poželjno, aril grupa sadrži 3 do 14 (npr. 5 do 10, kao što je 5, 6 ili 10) atoma ugljenika, poželjnije 6 do 10 atoma ugljenika. Oni mogu biti raspoređeni u jednom prstenu, npr. fenilu, ili u dva ili više kondenzovanih prstena (npr. naftil). Poželjno, aril se odnosi na monociklični prsten koji sadrži 6 atoma ugljenika ili aromatični biciklični sistem prstena koji sadrži 10 atoma ugljenika. U nekim tehničkim rešenjima aril je nesupstituisan u nekim tehničkim rešenjima aril je supstituisan.

[0042] Termin "cikloalkil" kako se ovde koristi se odnosi na zasićeni ili nezasićeni, nearomatični cikloalkil koji sadrži 1, 2 ili više prstenova. Primeri uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, ciklopentadienil, cikloheksonil itd.

[0043] Termin "heteroalkil" kako se ovde koristi se odnosi na ravne ili razgranate, zasićene ili nezasićene ugljovodonike gde je najmanje jedan ugljenik supstituisan sa heteroatomom. Heteroatomi su poželjno izabrano od S, N, O, i P.

[0044] Termin "heteroaril" se odnosi na aromatične monoradikale sastavljene od jednog ili više fuzionisanih aromatičnih prstenstih sistema. Tu je najmanje jedan od atoma ugljenika supstituisan sa heteroatomom. Pogodni heteroatomi uključuju O, N, S ili P.

[0045] Termin "acil" kako se ovde koristi se odnosi na funkcionalnu grupu sa opštom fomulom Rac- CH = O – pri čemu Racse odnosi na opciono supstituisani ugljovodonični radikal, posebno ugljovodonični lanac koji ima C1- C8atoma ugljenika.

[0046] Termin "alkilsulfonil" ili "arilsulfonil" se odnosi na alkil ili aril grupe koje sadrže SO2ostatak.

[0047] Kako se ovde koristi i u celom opisu, termin "halogen" ili "halo" ili "Hal" podrazumeva fluoro, hluoro, bromo, ili jodo.

[0048] Zaštitna grupa može imati funkcionalnu grupu ili biti funkcionalna grupa. Funkcionalna grupa X1može biti supstrat koji se može cepati, gde supstrat koji se može cepati, kako se ovde koristi, se odnosi na strukturu koja se može cepati pod odgovarajućim uslovima, zapravo kao što je dole identifikovano putem enzimske digestije ili drugog fizičkog ili hemijskog cepanja. Tako da, u slučaju da je supstituent X1funkcionalna grupa u obliku supstrata, cepanje navedenog supstrata može biti u ćeliji u specifičnim odeljcima, kao što su lizozomi ili drugi ćelijski odeljci koji konvertuju prolek u aktivni lek u skladu sa tim. Funkcionalna grupa uključuje jedinice ugljenih hidrata, kao što su furanoza i piranoza ili fukoza. Dalje, funkcionalna grupa je disaharid ili trisaharid. U tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, funkcionalna grupa je galaktozid koji se može cepati galaktozidazom.

[0049] U aspektu predmetnog pronalaska, supstituent Hal je Cl(chloro) i/ili R1je H i/ili pri čemu svaki R je H.

[0050] U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, zaštitna grupa X2je tercbutiloksikarbonil i X1je tetra-acetil-beta-D-galaktozid. Pored toga, u tehničkom rešenju predmetnog pronalska, zaštitna grupa X2je terc-butiloksikarbonil.

[0051] Zaštitna grupa X1, X2i X4kao što je ovde definisano može biti izabrana nezavisno od jedne ili više zaštitinih funkcionalnih grupa mono-, di- ili trisaharida ili oligosaharida, posebno heksoze, pentoze ili heptoze koje opciono predstavljaju njihove dezoksiderivate ili aminoderivate. Ovi supstituenti mogu dalje biti supstituisani sa supstituentima halogenom, C1-8alkilom, C1-8acilom, C1-8heteroalkilom, C3-7cikloalkilom, C3-7heterocikloalkilom, C4-12arilom ili C4-12heteroarilom, amino ili amido grupama. Naravno, mogu biti mogući i drugi pogodni supstituenti poput labilnih supstituenata izabranih od semiacetala i acetala, benzil grupa i supstituisanih benzil grupa.

[0052] U sledećem tehničkom rešenju, postupak je postupak u kome baza prisutna za reagovanje jedinjenja formule II sa jedinjenjem formule III je izabrana od diizopropiletilamina (DIPEA), trietilamina ili piridina.

[0053] Naravno druge pogodne baze mogu se primeniti prema predmetnom pronalasku, stručnjak iz date oblasti tehnike je upoznat sa pogodnim bazama.

[0054] Dalje, sredstvo za kuplovanje može biti izabrano od poznatih sredstava za kuplovanje uključujući fosfonijumska sredstava. Pogodna fosfonijumska sredstva uključuju jedinjenja poznata kao PyCloP, PyBroP, PyBoP, PyAoP.

[0055] U drugom tehničkom rešenju, postupak predmetnog pronalska grupa L ima opštu strukturu VI pri čemu n je ceo broj od 1 do 10. U jednom tehničkom rešenju, n je ceo broj od 1 do 5, kao 1, 2, 3, 4 i 5, posebno 3.

[0056] Kao što je diskutovano u vezi sa šemom 1 gore, jedinjenju prema opštoj formuli IV koje sadrži zaštitnu grupu X4, npr. u obliku Boc, je uklonjena zaštita poznatim postupcima, npr. primenom Luisove kiseline.

[0057] Tako da, uklanjanje zaštite iz jedinjenja koje sadrži zaštitnu grupu može biti postignuto primenom Luisove kiseline ili Broenstedove kiseline. Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznate pogodne kiseline. Alternativno, zaštitna grupa, kao što je karboksibenzil grupa (kbz-grupa) može biti uklonjena primenom H2u prisustvu katalizatora, kao što je katalizator koji sadrži Pd.

[0058] Zaštitna struktura IV je zatim ostavljena da reaguje sa jedinjenjem opšte formule VII.

[0059] U opštoj formuli VII definicije Z i Z' kao i Y su kao što je gore identifikovano, npr. struktura Z - Y - Z' je L kako je definisano za opštu strukturu VI.

[0060] R5i R6su odlazeće grupe, npr. halogen uključujući Cl i Br ili hidroksilna grupa kao deo karboksilne grupe.

[0061] Baza može biti baza kao što je definisano gore, kao diizopropilamin (DIPEA), trietilamin ili piridin. Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznate pogodne baze korisne za ovu reakciju.

[0062] U sledećem aspektu, opisano je jedinjenje formule I dobijeno postupkom prema predmetnom pronalasku.

[0063] Jedinjenja se karakterišu time što imaju slobodnu hidroksilnu grupu u jednoj benzoindolnoj grupi bifunkcionalnog jedinjenja opšte formule I, dok je odgovarajući supstituent u drugom delu benzoindolne grupe zaštićen preko zaštitne grupe.

[0064] Jedinjenje formule I obuhvata jedinjenja u kojima je sam X1u zaštićenom ili nezaštićenom obliku, npr. u slučaju mono- ili di- ili trisaharida ili oligosaharida, saharidi su zaštićeni ili nezaštićeni. Na primer, u slučaju zaštitne grupe tetra-acetil-beta-D-galaktozida, tetra-acetil supstituenti mogu biti odsutni, tako da u skladu sa tim X1je slobodni beta-D-galaktozid.

[0065] Jedinjenja formule I kao što je gore opisano su pogodna za pripremu npr. konjugata antitela i jedinjenja u kojima je prisutna najmanje jedna funkcionalna grupa uključujući antitela ili vezujući deo uopšte. Vezujući deo kako je ovde definisano uključuje antitelo ili fragmente antitela koji omogućavaju specifično vezivanje za vezujućeg partnera. Uopšteno, vezujući deo može da uključi bilo koji ligand koji omogućava vezivanje za vezujućeg partnera što rezultuje vezujućim parom koji uključuje vezujuće parove kao što je receptor liganda, vezivanje za epitop koji je specifičan za kancer, i vezivanje za epitop koji je specifičan za stare ćelije.

[0066] Pored toga, zaštitna grupa može biti funkcionalna grupa u obliku supstrata koji se može osloboditi enzimskom digestijom, npr. proteolitičko, oksidativno ili reduktivno cepanje enzimima uključujući plazmin, katepsin, katepsin B, beta-glukuronidazu, galaktozidazu, manozidazu, glukozidazu, neuramidazu, saharozidazu, maltazu, fruktozidazu, glikozilazu, antigen specifičan za prostate, aktivator plazminogena tipa urokinaze (u-PA), metaloproteinazu, citohrom P450 ili druge enzime koji se primenjuju u terapiji enzimskim proizvodima kao što je ADEPT.

[0067] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za pripremu konjugata antitela i leka koji se sastoji od dela antitela i jedinjenja prema formuli I kako je ovde pripremljeno, koji obuhvata korak kuplovanja dela antitela sa jedinjenjem prema formuli I preko slobodne OH grupe na poziciji 5 benzoindolne grupe formule I.

[0068] Postupak uključuje pripremanje jedinjenja formule I prema predmetnom pronalasku kao polaznim materijalom gde je u jednom od dva dela prisutna slobodna OH grupa na poziciji 5 benzoindolne grupe formule I, dok je druga OH grupa na poziciji 5 druge benzoindolne grupe drugog dela zaštićena sa zaštitnom grupom npr. funkcionalnom grupom, dok sama pomenuta zaštitna grupa može biti zaštićena ili nezaštićena.

[0069] Pored toga, opisan je konjugat antitela i jedinjenja koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku. U jednom aspektu, ovaj konjugat antitela i jedinjenja je konjugat antitela i leka (ADC).

[0070] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za pripremu ADC sastavljenog od dva identična ili dva različita dela antitela i jedinjenja prema formuli I gde je X1ili odsutan ili prisutan koji obuhvata korak obezbeđivanja konjugata antitela i jedinjenja prema predmetnom pronalasku, opciono uklanjanje zaštitne X1grupe sa sredstvom za uklanjanje zaštite kao što je ovde opisano i kuplovanje drugog dela antitela sa konjugatom antitela i leka u skladu sa predmetnim pronalaskom preko deprotektovane OH grupe na poziciji 5 benzoindolne grupe formule I ili ako je X1prisutan preko deprotektovane X1zaštitne grupe. Na primer, u slučaju da je X1galaktozid, drugi deo antitela je vezan preko deprotektovanog galaktozida.

[0071] Konjugat antitela i jedinjenja koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku sadrži dva različita dela antitela.

[0072] U daljem aspektu, takođe je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugate sastavljene od antitela prema predmetnom pronalasku.

[0073] Farmaceutska kompozicija za primenu kako je ovde obelodanjeno, dalje sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim tehničkim rešenjima, jedinjenja prema predmetnom pronalasku ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili hidrat, mogu biti uključena u farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0074] Kako se ovde koristi i kroz ceo opis, termini "nosač" i "ekscipijens" se ovde koriste naizmenično. Farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi uključuju razblaživače (punioce, sredstva za povećanje zapremine, npr. laktozu, mikrokristalnu celulozu), sredstva za dezintegraciju (npr. natrijum skrob glikolat, kroskarmelozu natrijum), veziva (npr. PVP, HPMC), lubrikanse (npr. magnezijum stearat), sredstva za klizanje (npr. kolidini SiO2), rastvarače/ko-rastvarače (npr. vodeni vehikulum, propilen glikol, glicerol), puferska sredstva (npr. citrat, glukonate, laktate), konzervanse (npr. Na benzoat, parabene (Me, Pr i Bu), BKC), anti- oksidanse (npr. BHT, BHA, askorbinsku kiselinu), sredstva za vlaženje (npr. polisorbate, sorbitan estre), sredstva protiv pene (npr. simetikon), sredstva za zgušnjavanje (npr. metilcelulozu ili hidroksietilcelulozu), zaslađivače (npr. sorbitol, saharin, aspartam, acesulfam), arome (npr. pepermint, limunova ulja, butterscotch, itd.), humektante (npr. propilen, glikol, glicerol, sorbitol). Stručnjak iz date oblasti tehnike lako će moći da izabere pogodne farmaceutski prihvatljive nosače ili ekscipijense, u zavisnosti, npr., od formulacije i načina administracije farmaceutske kompozicije.

[0075] Neiscrpna lista primera farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa uključuje (biorazgradive) lipozome; mikrosfere napravljene od biorazgradivog polimera poli(D,L)-mlečnakoglikolna kiselina (PLGA), albuminskih mikrosfera; sintetičke polimere (rastvorljive); nanovlakna, komplekse protein-DNK; proteinske konjugate; eritrocite; ili virozome. Različiti oblici doziranja zasnovani na nosaču sadrže čvrste lipidne nanočestice (SLN), polimerne nanočestice, keramičke nanočestice, nanočestice hidrogela, kopolimerizovane peptidne nanočestice, nanokristale i nanosuspenzije, nanokristale, nanocevčice i nanožice, funkcionalizovane nanonosače, nanosfere, nanokapsule, lipozome, lipidne emulzije, lipidne mikrotubule/mikrocilindre, lipidne mikromehuriće, liposfere, lipopoliplekse, inverzne lipidne micele, dendrimere, etozome, multikompozitne ultratanke kapsule, akvazome, farmakozome, koloidozome, niozome, diskozome, proniozome, mikrosfere, mikroemulzije i polimerne micele. Drugi pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su, između ostalog, opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991) i Bauer i sar., Pharmazeutische Technologie, 5th Ed., Govi-Verlag Frankfurt (1997).

[0076] Farmaceutska kompozicija pronalaska će generalno biti dizajnirana za specifične rute i načine administracije, između ostalog za specifične doze i učestalost administracije, za specifično lečenje specifičnih bolesti, sa rasponima biodostupnosti i postojanosti. Materijali kompozicije su poželjno formulisani u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto administracije.

[0077] Formulacije i kompozicije zato mogu biti dizajnirane u skladu sa pronalaskom za isporuku bilo kojom pogodnom rutom administriranja. U kontekstu predmetnog pronalaska, rute administracije uključuju:

• topikalne rute (kao što su epikutana, inhalaciona, nazalna, oftalmološka, aurikularna/auralna, vaginalna, mukozna) i aerosole;

• enteralne rute (kao što su oralna, gastrointestinalna, sublingvalna, sublabijalna, bukalna, rektalna); i

• parenteralne rute (kao što su intravenska, intraarterijska, intraosealna, intramuskularna, intracerebralna, intracerebroventrikularna, epiduralna, intratekalna, potkožna, intraperitonealna, ekstra-amnionska, intraartikularna, intrakardijalna, intradermalna, intralezijska, intrauterina, intravezikalna, intravitrealna, transdermalna, intranazalna, transmukozna, intrasinovijalna, intraluminalna).

U nekim tehničkim rešenjima administracija može biti parenteramna ruta, posebno intravenozna ili intramuskularna.

[0078] U nekim tehničkim rešenjima, farmaceutska kompozicija kako je ovde obelodanjeno, se administrira subjektu kome je to potrebno u količini efikasnoj za lečenje kancera. Poželjno je da je subjekt sisar.

[0079] Kako se ovde koristi i kroz ceo opis, termin "subjekt" podrazumeva eukariote, poput životinja, uključujući toplokrvne sisare kao što su ljudi i primati; ptice; domaće životinje ili životinje na farmi kao što su mačke, psi, ovce, koze, goveda, konji i svinje; laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi i zamorci; riba; reptili; životinje iz zoološkog vrta i divlje životinje; i slično. Poželjno je da je subjekt sisar, poželjnije da je čovek.

[0080] Kako se ovde koristi i u celom opisu, termin "efikasna količina" u kontekstu kompozicije ili doznog oblika za administriranje subjektu odnosi se na količinu kompozicije ili doznog oblika dovoljnu da obezbedi korist u lečenju kancera, da odloži ili umanji simptome povezane sa kancerom, ili da izleči ili ublaži kancer. Posebno, terapijski efikasna količina podrazumeva količinu dovoljnu da obezbedi terapijsku korist in vivo. Termin korišćen u vezi sa količinom jedinjenja pronalaska, poželjno obuhvata netoksičnu količinu koja poboljšava ukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava simptome ili uzroke bolesti, ili poboljšava terapijsku efikasnost ili sinergiju sa drugim terapijskim sredstvom.

[0081] Efikasne količine će zavisiti, naravno, od određenog subjekta koji se leči; ozbiljnosti stanja, bolesti ili poremećaja; individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fizičko stanje, veličinu i težinu; trajanje lečenja; priroda istovremene terapije (ako postoji); specifičnu rutu administracije i slične faktore u okviru znanja i stručnosti zdravstvenog radnika. Ovi faktori su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike i mogu se rešiti samo rutinskim eksperimentisanjem. Uopšteno je poželjno da se koristi maksimalna doza, to jest, najveća bezbedna doza prema zdravstvenoj medicinskoj proceni. Međutim, stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti, da pacijent može insistirati na nižoj dozi ili podnošljivoj dozi iz medicinskih, psiholoških razloga ili iz bilo kog drugog razloga.

[0082] U daljem aspektu, opisana je primena jedinjenja prema predmetnom pronalasku za lečenje poremećaja ili bolesti povezanih sa starenjem.

[0083] Kako se ovde koristi, poremećaji ili bolesti povezani sa starenjem obuhvataju poremećaje ili bolesti povezane ili uzrokovane sa ćelijskim starenjem, uključujući bolesti i poremećaje povezane sa starenjem. Bolest ili poremećaj povezan sa starenjem se takođe može nazvati bolest ili poremećaj povezan sa starenjem ćelija. Istaknuta karakteristika starenja je postepeni gubitak funkcije ili degeneracija koja se javlja na molekularnom, ćelijskom, tkivnom i nivou organizma. Starostna degeneracija dovodi do dobro poznatih patologija kao što su sarkopenija, ateroskleroza i srčana insuficijencija, osteoporoza, plućna insuficijencija, bubrežna insuficijencija, neurodegeneracija (uključujući makularnu degeneraciju, Alchajmerovu bolest i Parkinsonovu bolest) i mnoge druge.

[0084] Bolesti i poremećaji povezani sa starenjem uključuju, ali nisu ograničeni na, kardiovaskularne bolesti i poremećaje, inflamatorne bolesti i poremećaje, autoimune bolesti i poremećaje, plućne bolesti i poremećaje, očne bolesti i poremećaje, metaboličke bolesti i poremećaje, neurološke bolesti i poremećaje (npr. neurodegenerativne bolesti i poremećaje); bolesti i poremećaje povezane sa uzrastom izazvani starenjem; stanja kože; bolesti povezane sa uzrastom; dermatološke bolesti i poremećaje; i bolesti i poremećaje u vezi sa transplantacijom.

[0085] Poželjno je da je subjekt sisar, poželjno da je čovek.

[0086] U jednom poželjnom tehničkom rešenju pronalaska, bolest ili poremećaj povezan sa starenjem je proliferativni poremećaj, kao što je kancer ili leukemija uključujući limfom. U drugom poželjnom tehničkom rešenju, bolest ili poremećaj koji je povezan sa starenjem je kardiovaskularna bolest. Sledeće tehničko rešenje pronalaska bolesti ili poremećaja koji je povezan sa starenjem je inflamatorna ili autoimuna bolest ili poremećaj.

[0087] Drugo tehničko rešenje se odnosi na neurološke bolesti ili poremećaje kao bolest ili poremećaj povezan sa starenjem. Dalje bolest ili poremećaj povezan sa starenjem uključuje oftalmološke bolesti i poremećaje, kao i metaboličku bolest i plućnu bolest ili poremećaj.

[0088] Dalje bolesti ili poremećaji povezani sa starenjem se odnose na poremećaje vezane za uzrast, kao i na dermatološke bolesti ili poremećaje i bolesti ili stanja povezana sa uzrastom i životnim vekom. Pored toga, predmetna prijava, zapravo primena jedinjenja prema predmetnom pronalasku gde je X1npr. galaktozid se odnosi na bolesti ili poremećaje koji su u korelaciji ili povezani sa povišenom aktivnošću β-galaktozidaze.

[0089] Pored toga, opisana je primena jedinjenja prema predmetnom pronalasku za lečenje tumora, posebno kod sisara, gde je primena posebno moguća u ADEPT terapiji.

[0090] Osim toga, predmetni pronalazak se odnosi na primenu jedinjenja prema formuli I za pripremu konjugata antitela i leka.

[0091] Predmetni pronalazak biće dalje opisan putem primera i neće biti ograničen na njih.

Primeri

Eksperimentalne procedure

Opšti postupci

[0092] Osim ako nije drugačije navedeno, eksperimenti su izvedeni na vazduhu. Reagensi su dobijeni iz komercijalnih izvora i korišćeni bez prečišćavanja. Anhidrovani CH2Cl2(analitičke čistoće, Fischer Scientific) i THF (AnalR NORMAPUR, VWR) su dobijeni dodavanjem 3 Å molekulskih sita koja su osušena u peći u vakuumu (Vacutherm 6025 od kompanije Heraeus Instruments) u bocu ispranu argonom. DMF (kvaliteta za peptidnu sintezu, Fischer Scientific) je korišćen u celosti. NMR spektri su snimljeni na spektrometrima Mercury-300, Unity-300, Inova-500 i Inova-600 kompanije Varian i na spektrometru AMX-300 kompanije Bruker. Hemijski pomaci su prikazani u delovima na milion (ppm) od visoke do niske frekvencije koristeći rezidualni pik rastvarača kao internu referencu (DMSO = 2.50 ppm).

[0093] Prikazano je da je ukupna<1>H rezonanca najbliža 0.01 ppm. Mnoštvo<1>H signala se izražava kao: s = singlet; d = dublet; t = triplet; q = kvartet; sept = septet; m = multiplet; br = širok; app = jasno; ili njihova kombinacija. Konstanta kuplovanja (J) je izražena u Hz i prikazane na najbližih 0.1 Hz. Tamo gde je bilo potrebno, prosečni signali sa pikova koji pokazuju višestrukost su korišćeni za izračunavanje vrednosti konstante kuplovanja.<13>C NMR spektri su snimljeni na istom spektrometru sa centralnom rezonancom pika rastvarača, pošto je prijavljeno da je interna referentna (DMSO = 39.52 ppm)<13>C rezonanca najbliža 0.01 ppm. Eksperimenti DEPT, COSY, HSQC i HMBC su korišćeni da pomognu u određivanju strukture i spektralnom dodeljivanju. Potpuno okarakterisana jedinjenja su bila hromatografski homogena. Fleš hromatografija na koloni je izvedena na automatizovanom sistemu (Isolera One od Biotage) primenom Biotage SNAP fleš kertridža KP-Sil (silicijum dioksid 55 Å, 53 µm, 96.95% između 30-90 µm) ili Interchim PF-15SIHP (sferni silicijum dioksid visokih performansi, 15 µm) kao stacionarna faza. Preparativna TLC je izvedena primenom ploča od silika gela GF UV25420×20 cm 2000 mikrona (Analtech) ili RP-18W/UV2545×20 cm 250 mikrona (Macherey-Nagel) i prečišćene su manje količine (< 10 mg sirovog materijala) na analitičkoj TLC silika gel 60 F254pločama (Merck, Germany). TLC je vizuelizovan korišćenjem ultraljubičastog svetla sa kratkim i dugim talasima u kombinaciji sa standardnim laboratorijskim bojama (kiseli kalijum permanganat, kiseli amonijum molibdat i ninhidrin). ESI-MS i ESI-HRMS spektri su snimljeni na spektrometru Apex IV kompanije Bruker Daltronik. EI-MS i EI-HRMS spektri su snimljeni na MAT 95 spektrometru kompanije Finnigan. Tačke topljenja (Mp) su određene korišćenjem EZ-Melt automatizovanog aparata za tačku topljenja kompanije Standford Research Sistems i nisu korigovane.

IR spektri su snimljeni na spektrometru FT/IR-4100 kompanije Jasco. Sve supstance su uredno nanete na ATR jedinicu. UV spektri su snimljeni na spektrometru V-630 kompanije Jasco. Optičke rotacije su merene na polarimetru JASCO P-2000. Merenja su sprovedena primenom natrijumove

lampe (λ 589 nm, D-linija); vrednosti su prikazane u 10 deg cm<2>g<-1>, koncentracije (c) u g na 100 ml. Preparativna HPLC je izvedena primenom Kromasil 100 C18 (7.5 µm veličina čestica, 250×200 mm, Dr. Maisch GmbH) kolone na Jasco HPLC sistemu sa binarnom pumpom i UV-detektorom. Analitička HPLC je izvedena na Kromasil 100 C18 (5.0 µm veličina čestica, 250×4 mm, Dr. Maisch GmbH) ili Chiralpak IA (5 µm veličina čestica, 250×4.6 mm, Daicel Corporation) koloni na Jasco HPLC sistemu sa UV- i DAD-detektorom.

[0094] Osim ako nije drugačije navedeno, hidrogenovanja su izvedene na sobnoj temperaturi na sistemu ThalesNano Nanotechnology H-Cube (Pd/C 10 tež.% ćelija za punjenje) u režimu ukupnog vodonika sa brzinom protoka od 1.0 mL/min.

terc-butil (S)-1-(hlorometil)-5-hidroksi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-karboksdilat (11)

[0095]

[0096] U balon napunjen argonom koji sadrži benzil etar CBI 11 (200 mg, 0.472 mmol) i Pd/C (10 tež.% punjenja, 100 mg, 0.940 mmol) je dodat suvi THF (20 mL). Argon je pažljivo zamenjen vodonikom sa balonom i reakciona smeša je zagrevana na 40 °C tokom 10 h. Smeša je filtrirana preko celita i ostatak je opran sa EtOAc (3 × 50 mL). Kombinovani filtrat je koncentrovan pri sniženom pritisku i prečišćen fleš hromatografijom na koloni (CH2Cl2/EtOAc, 94:6) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (113 mg, 0.340 mmol) kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 72%.

Rf0.45 (CH2Cl2/EtOAc, 92:8) 0.39 za dehlorisani proizvod

(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(acetoksimetil)-6-(((S)-3-(terc-butoksikarbonil)-1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il)oksi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetat (13)

[0097]

[0098] U balon napunjen naftolom 11 (138 mg, 0.413 mmol), tetraacetil-β-D-galaktoziltrihloracetimidatom 12 (265 mg, 0.537 mmol) i 3 Å molekularnim sitom dodat je suvi CH2Cl2(21 mL) pod atmosferom argona. Smeša je mešana tokom 30 min i dodat je rastvor bor trifluorid dietil eterata (26 µL, 0.21 mmol) u suvom CH2Cl2(2.0 mL) na -10 °C. Reakciona smeša je mešana tokom 3 h na -10 °C i koncentrovana pri smanjenom pritisku. Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (PET/EtOAc, 1:0 do 1:1) dalo je željeno jedinjenje (223 mg, 0.336 mmol) kao belu čvrstu supstancu u prinosu od 81 %.

5-((S)-1-(hlorometil)-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-triacetoksi-6-(acetoksimetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-5-okso-pentanska kiselina (15)

[0099]

[0100] CBI tetraacetil-β-D-galaktozid 13 (50 mg, 0.075 mmol) je rastvoren u CH2Cl2(3.0 mL) i dve kapi bor trifluorid dietil eterata su dodate na 0 °C. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana još 2 h. Po završetku, smeša je koncentrovana pri sniženom pritisku i rastvorena u DMF peptidnog kvaliteta (1 mL). Dobijeni rastvor je ohlađen na 0 °C i polako dodat u sveže pripremljen rastvor glutaril dihlorida 5 (0.19 g, 1.1 mmol) u DMF peptidnog kvaliteta (1 mL) na 0 °C. Posle dodavanja DIPEA u kapima (0.20 mL), reakciona smeša je mešana 30 min i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografijom na koloni (CH2Cl2/MeOH, 100:0 do 96:4) dobijeno je naslovno jedinjenje (41 mg, 0.061 mmol) kao svetlo braon čvrsta supstanca u prinosu od 80%.

Rf0.74 (EtOAc)

Mp 155 °C

<1>H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.29 (s, 1H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (app t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.41 (app t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 5.45-5.38 (m, 3H), 4.55 (dd, J = 7.5, 4.5 Hz, 1H), 4.34 (app t, J = 9.8 Hz, 1H), 4.26-4.14 (m, 3H), 4.07 (dd, J = 11.5, 7.8 Hz, 1H), 4.01 (dd, J = 10.9, 3.0 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 11.0, 7.4 Hz, 1H), 2.66-2.46 (m, 2H), 2.34 (app t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.83 (m, 2H)

<13>C-NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ 174.39, 170.69, 170.38, 170.12, 169.76, 169.56, 153.04, 141.77, 129.61, 127.74, 124.11, 122.99, 122.03, 121.97, 117.92, 101.43, 98.83, 70.92, 69.83, 68.53, 67.54, 61.84, 52.62, 47.73, 40.66, 34.24, 32.97, 20.59, 20.47, 20.43, 20.43, 19.57

HRMS (ESI) m/z izračunato za C32H35ClNO13[M-H]-: 676.1797, nađeno 676.1797

(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(acetoksimetil)-6-(((S)-1-(hlorometil)-3-(5-((S)-1-(hlorometil)-5-hidroksi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-5-oksopentanoil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il)oksi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetat (16)

[0101]

[0102] CBI-tetraacetil-β-D-galaktozid-pentadioat monoamid 15 (12 mg, 0.035 mmol) je rastvoren u CH2Cl2(2 mL) i 3 kapi bor trifluorid dietil eterata su dodate na 0 °C. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i uklanjanje zaštite je praćeno sa TLC. Posle 2 h reakciona smeša je koncentrovana pri smanjenom pritisku i sirova čvrsta supstanca je držana pod visokim-vakuumom još 1 sat. Kiselina 5 (20 mg, 0.030 mmol), molekulska sita (3 Å) i DMF (0.30 mL) su dodati u rastvor pod atmosferom argona. Dobijena smeša je ohlađena na -20 °C i PyBroP (16 mg, 0.035 mmol) i DIPEA (15 µL, 0.089 mmol) su dodavani uzastopno. Reakciona smeša je držana na -20 °C preko noći i ostavljena da se zagreje do 0 °C sledećeg dana. Reakcija je mešana još 8 h na toj temperaturi i zatim koncentrovana pri sniženom pritisku. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (PET/EtOAc, 1:0 do 3:7) da se dobije 16 kao svetlo braon čvrsta supstanca (14 mg, 0.016 mmol) u prinosu od 44%.

Rf0.51 (EtOAc/PET, 2:1)

Mp 155 °C

Optička rotacija (c 0.27, CHCl3)

<1>H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ 10.31 (s, 1H), 8.33 (br s, 1H), 8.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.02 (br s, 1H), 7.94 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.49 (m, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.32 (m, 1H), 5.56 (m, 1H), 5.43-5.41 (m, 2H), 5.40 (m, 1H), 4.54 (dd, J = 7.1, 4.8Hz, 1H), 4.38 (app t, J = 10.2 Hz, 1H), 4.33 (app t, J = 10.0 Hz, 1H), 4.27-4.21 (m, 2H), 4.20-4.13 (m, 3H), 4.10 (dd, J = 11.4, 7.7 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 11.1, 3.1 Hz, 1H), 3.99 (dd, J = 11.1, 3.0 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 11.1, 7.4 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 10.8, 8.3 Hz, 1H), 2.77-2.67 (m, 2H), 2.66-2.57 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.08 (br s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01-1.95 (m, 2H), 1.97 (s, 3H)

<13>C-NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ 170.62, 170.37, 169.94, 169.72, 169.35, 169.16, 154.03, 152.79, 141.81, 141.53, 129.77, 129.41, 127.44, 126.98, 123.82, 122.90, 122.71, 122.42, 122.30, 121.90, 121.78, 121.46, 117.75, 113.56, 101.50, 99.70, 98.78, 70.75, 69.75, 68.48, 67.38, 61.57, 52.58, 52.5847.53, 47.53 40.74, 40.74, 34.39, 25.03, 20.48, 20.34, 20.34, 20.30, 19.15

LRMS (ESI) m/z izračunato za C45H45Cl2N2NaO13[M+Na]<+>: 915.3, nađeno 915.3 (100), C45H47Cl2N2O13[M+H]<+>: 893.3, nađeno 893.2 (24)

HRMS (ESI) m/z izračunato za C45H45Cl2N2NaO13[M+Na]<+>: 915.2269, nađeno 915.2263

Claims (12)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak za sintezu jedinjenja opšte formule I

   pri čemu Hal je F, Cl, Br, ili I; R je H ili opciono supstituisana C1-C4alkil grupa, opciono supstituisana C1-C4alkoksi grupa, opciono supstituisana aril grupa, opciono supstituisana heteroaril grupa, opciono supstituisana C1-C4alkil karboksi C1-C4alkil grupa, Hal, CN, opciono supstituisana C1-C4alkilsulfonil grupa, opciono supstituisana arilsulfonil grupa, ili NRzgrupa kao što je definisano u nastavku; R1je H ili C1-C4alkil grupa ili C1-C4alkoksi grupa; X1je zaštitna grupa; L je vezna grupa za kovalentnu vezu pri čemu L ima opštu strukturu Z-Y-Z'; Z i Z' su nezavisno jedan od drugog izabrani od C = O, OC = O, SO2, NRz, NR2C = O, C = O NRz, pri čemu svaki Rzje nezavisno jedan od drugog izabran od H, opciono supstituisane C1-C4alkil grupe ili opciono supstituisanog C1-C4acila; pri čemu Y je opciono supstituisana C1-C10alkil grupa, grupa strukture VIII:

   pri čemu o i p su nezavisno jedan od drugog izabrani od celog broja od 1 do 20, pri čemu o i p mogu biti isti ceo broj ili različit ceo broj, X3je i) N, S ili O, ili ii) aril grupa ili heteroaril grupa, pri čemu [C(Ra)2]Oi [C(Ra)2]psu prisutni u metapoziciji navedene aril grupe ili navedene heteroaril grupe, svaki RAje nezavisno jedan od drugog izabran od H opciono supstituisane C1-C4alkil grupe ili opciono supstituisane C1-C4acil grupe; koji obuhvata korak reagovanja jedinjenja formule II

   pri čemu R, R1, i Hal su definisani kao gore i X2je zaštitna grupa koja može biti identična ili različita od X1gore, sa sredstvom za uklanjanje zaštite za uklanjanje zaštitne X2grupe iz jedinjenja formule II; nakon čega sledi reagovanje jedinjenja formule II sa uklonjenom zaštitom sa jedinjenjem formule III

   pri čemu supstituenti Hal, R1, X1i R su definisani kao gore i L je vezna grupa kao što je gore definisano, R3je izabran od Hal, posebno, Cl i Br, i OH u prisustvu sredstva za kuplovanje i baze da se dobije jedinjenje formule I; pri čemu se jedinjenje formule III dobija reagovanjem jedinjenja formule IV

   pri čemu X1, X4, R, R1i Hal su definisani kao gore, X4je zaštitna grupa kao što je definisano gore za X1i X1i X4se razlikuju jedan od drugog, sa jedinjenjem opšte formule VII VII R5-L-R6 gde L je Z - Y - Z' i pri čemu Z, Y i Z' su definisani kao gore i R5i R6su nezavisno jedan od drugog izabrani od halogena ili OH grupe. pri čemu se u prvom koraku jedinjenju formule IV uklanja zaštitna X4grupa reagovanjem istog sa sredstvom za uklanjanje zaštite, i zatim jedinjenje formule IV sa uklonjenom zaštitom reaguje sa jedinjenjem formule VII u prisustvu baze da se dobije jedinjenje formule III.
2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu R3je izabran od Cl ili Br.
3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2 pri čemu R5i R6su nezavisno jedan od drugog izabrani od Cl ili Br.
4. 4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 pri čemu zaštitna grupa X1i X2je nezavisno jedna od druge izabrana iz funkcionalne grupe uključujući terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, tozil, nozil, trimetilsilil, dimetiltercbutilsilil, zaštićeni mono-, di- ili trisaharid uključujući beta-D-galaktozid, beta-D-glukuronsku kiselinu, beta-D-glukozid, alfa-D-manozid, fukozu, deo koji sadrži karbamat, deo koji sadrži acetal ili deo koji sadrži etar koji se može cepati oksidacijom.
5. 5. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva pri čemu Hal je Cl i/ili R1je H, i/ili pri čemu R je H.
6. 6. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva pri čemu X2je terc-butiloksikarbonil i X1je tetraacetil-beta-D-galaktozid.
7. 7. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva pri čemu baza je izabrana od diizopropiletilamina, trietilamina, piridina.
8. 8. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva pri čemu sredstvo za kuplovanje je fosfonijumsko sredstvo.
9. 9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva pri čemu L ima opštu strukturu VI

   pri čemu n je ceo broj od 1 do 10.
10. 10. Postupak pripreme konjukata antitela i leka sastavljenog od dela antitela i jedinjenja fomule I, obuhvata postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za sintezu jedinjenja opšte formule I i korak kuplovanja dela antitela sa jedinjenjem prema formuli I preko slobodne OH grupe na poziciji 5 benzoindolne grupe formule I, opciono, uklanjanje zaštitne X1 grupe ili zaštitne grupe(a) prisutne na X1.
11. 11. Postupak za pripremu konjugata antitela I leka sastavljenog od dva identična ili dva različita dela antitela i jedinjenja prema formuli I kao što je gore definisano koji obuhvata korake postupka prema patentnom zahtevu 10 opciono, uklanjanje zaštitne X1grupe sa sredstvom za uklanjanje zaštite ili zaštitne grupe(a) prisutne na X1, kuplovanje drugog dela antitela sa navedenim konjugatom antitela i leka preko deprotektovane OH grupe na poziciji 5 benzoindolne grupe formule I, ili ako je X1prisutna preko deprotektovane X1zaštitne grupe.
12. 12. Postupak prema patentnom zahtevu 11 pri čemu su prisutna dva različita dela antitela. Ċ