RS65745B1 - T ćelijski receptori - Google Patents

T ćelijski receptori

Info

Publication number
RS65745B1
RS65745B1 RS20240811A RSP20240811A RS65745B1 RS 65745 B1 RS65745 B1 RS 65745B1 RS 20240811 A RS20240811 A RS 20240811A RS P20240811 A RSP20240811 A RS P20240811A RS 65745 B1 RS65745 B1 RS 65745B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tcr
seq
fusion molecule
alpha
sequences
Prior art date
Application number
RS20240811A
Other languages
English (en)
Inventor
Philip William Addis
Nicole Joy Bedke
Lucie Bouard
Stephen Harper
Nathaniel Liddy
Tara Mahon
Ronan Pádraic O'dwyer
Original Assignee
Immunocore Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunocore Ltd filed Critical Immunocore Ltd
Publication of RS65745B1 publication Critical patent/RS65745B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001189—PRAME
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K40/427—PRAME
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4271—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/86—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na fuzione molekule TCR-anti-CD3 koji sadrže T ćelijske receptore (TCR) koji vezuju HLA-A*02 ograničeni peptid SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) poreklom od antigena kancera klicine linije PRAME. Navedeni TCR mogu sadržati neprirodne mutacije unutar alfa i/ili beta varijabilnih domena u odnosu na nativni PRAME TCR. Fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 su posebno pogodni za upotrebu kao novi imunoterapeutski reagensi za lečenje malignih bolesti.
Osnova pronalaska
[0002] T ćelijski receptori (TCR) su prirodno eksprimirani od strane CD4<+>i CD8<+>T ćelija. TCR su dizajnirani da prepoznaju kratke peptidne antigene koji su prikazani na površini ćelija koje predstavljaju antigen u kompleksu sa molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) (kod ljudi, MHC molekuli su takođe poznati kao humani leukocitni antigeni ili HLA) (Davis et al., Annu Rev Immunol. 1998;16:523-44). CD8<+>T ćelije, koje se takođe nazivaju citotoksične T ćelije, imaju TCR koji specifično prepoznaju peptide vezane za molekule MHC klase I. CD8<+>T ćelije su generalno odgovorne za pronalaženje i posredovanje u uništavanju obolelih ćelija, uključujući kancerogene i virusom inficirane ćelije. Afinitet TCR-ova specifičnih za kancer u prirodnom repertoaru za odgovarajući antigen je obično nizak kao rezultat selekcije timusa, što znači da ćelije kancera često izbegavaju otkrivanje i uništenje. Novi imunoterapijski pristupi koji imaju za cilj stimulisanje prepoznavanja kancera od strane T ćelija nude veoma obećavajuću strategiju za razvoj efikasnih tretmana protiv kancera.
[0003] PRAME ili preferencijalno eksprimiran antigen u melanomu je prvi put identifikovan kao antigen koji je prekomerno eksprimiran u melanomu (Ikeda et al Immunity. 1997 Feb;6(2):199-208); poznat je i kao CT130, MAPE, OIP-4 i ima Uniprot pristupni broj P78395. Protein funkcioniše kao represor prenosa signala receptora retinoične kiseline (Epping et al., Cell. 2005 Sep 23;122(6):835-47). PRAME pripada porodici antigena kodiranih klicinih linijama poznatih kao antigeni kancera testisa. Antigeni kancera testisa su privlačne mete za imunoterapeutsku intervenciju jer obično imaju ograničenu ili nikakvu ekspresiju u normalnim tkivima odraslih. PRAME se eksprimira u velikom broju solidnih tumora, kao i u leukemijama i limfomima (Doolan et al Breast Cancer Res Treat. 2008 May;109(2):359-65; Epping et al Cancer Res. 2006 Nov 15;66(22):10639-42; Ercolak et al Breast Cancer Res Treat.2008 May;109(2):359-65; Matsushita et al Leuk Lymphoma. 2003 Mar;44(3):439-44; Mitsuhashi et al Int. J Hematol.2014;100(1):88-95; Proto-Sequeire et al Leuk Res.2006 Nov;30(11):1333-9; Szczepanski et al Oral Oncol.2013 Feb;49(2):144-51; Van Baren et al Br J Haematol.1998 Sep;102(5):1376-9). Terapije koje ciljno deluju na PRAME prema pronalasku mogu biti posebno pogodne za lečenje kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na, kancer pluća (NSCLC i SCLC), dojke (uključujući trostruko negativne), jajnika, endometrijuma, jednjaka, bešike i glave i vrata.
[0004] Peptid SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) odgovara aminokiselinama 425-433 pune dužine PRAME proteina i predstavljen je na površini ćelije u kompleksu sa HLA-A*02 (Kessler et al., J Exp Med.2001 Jan 1;193(1):73-88). Ovaj kompleks peptid-HLA predstavlja korisno ciljno mesto za imunoterapeutsku intervenciju zasnovanu na TCR-u.
[0005] Identifikacija određenih TCR sekvenci koje se vezuju za kompleks SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 sa visokim afinitetom i visokom specifičnošću ima prednost za razvoj novih imunoterapija. Terapeutski TCR se mogu koristiti, na primer, kao rastvorljiva sredstva za ciljno delovanje u svrhu isporuke citotoksičnih sredstava na mesto tumora ili aktiviranja imunih efektorskih funkcija protiv tumorskih ćelija (Lissin, et al., "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions" in Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges. 2013. S. R. Schmidt, Wiley; Boulter et al., Protein Eng. 2003 Sep;16(9):707-11; Liddy, et al., Nat Med.2012 Jun;18(6):980-7), ili alternativno mogu se koristiti za konstrukciju T ćelija za adaptivnu terapiju (Fesnak et al., Nat Rev Cancer.2016. Aug 23;16(9):566-81).
[0006] TCR koji se vezuju za SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) u kompleksu sa HLA-A*02 su ranije objavljeni (Amir et al., Clin Cancer Res. 2011 Sep 1;17(17):5615-25; Griffioen et al., Clin Cancer Res. 2006 May 15;12(10):3130-6; WO2016142783). Međutim, ovi TCR nisu konstruisani tako da se vezuju za ciljni antigen sa povećanim afinitetom, u odnosu na prirodni TCR. Kao što je dalje objašnjeno u nastavku, suprafiziološki afinitet antigena je poželjna karakteristika za terapeutski TCR, čija proizvodnja nije jednostavna, posebno kada je u ravnoteži sa drugim poželjnim karakteristikama, kao što je specifičnost.
[0007] Ovde definisane TCR sekvence su opisane u vezi sa IMGT nomenklaturom koja je široko poznata i dostupna onima koji rade u oblasti TCR. Na primer, pogledati: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10O; and Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. Ukratko, αβ TCR se sastoje od dva disulfidno povezana lanca. Svaki lanac (alfa i beta) se generalno smatra da ima dva domena, naime varijabilni i konstantni domen. Kratki spojni region povezuje varijabilne i konstantne domene i obično se smatra delom alfa varijabilnog regiona. Pored toga, beta lanac obično sadrži region kratke raznolikosti pored spojnog regiona, koji se takođe tipično smatra delom beta varijabilnog regiona.
[0008] Varijabilni domen svakog lanca nalazi se na N-terminalnom nivou i obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) ugrađena u okvirnu sekvencu (FR). CDR regioni sadrže mesto prepoznavanja za vezivanje peptida-MHC. Postoji nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione alfa lanca (Vα) i nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione beta lanca (Vβ), koji se razlikuju po svom okviru, CDR1 i CDR2 sekvencama i delimično definisanom CDR3 sekvencom. Geni Vα i Vβ se u IMGT nomenklaturi označavaju prefiksom TRAV i TRBV (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Slično, postoji nekoliko spajajućih ili J gena, nazvanih TRAJ ili TRBJ, za alfa i beta lanac respektivno, a za beta lanac, gen za raznolikost ili D koji se naziva TRBD (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Ogromna raznolikost lanaca receptora T ćelija rezultat je kombinatornih preuređivanja između različitih V, J i D gena, koji uključuju alelne varijante, i različitost spojeva ((Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107). Konstantni, ili C, regioni TCR alfa i beta lanaca se nazivaju TRAC i TRBC respektivno (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).
[0009] Pronalazači ove prijave su iznenađujuće pronašli nove TCR koji su u stanju da se vežu za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 sa visokim afinitetom i specifičnošću. Navedeni TCR su konstruisani iz odgovarajuće sekvence skele u koju je uveden veliki broj mutacija. TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3prema pronalasku imaju posebno pogodan profil za terapeutsku upotrebu. Generalno, identifikacija takvih TCR nije jednostavna i obično ima visoku stopu iscrpljivanja.
[0010] U prvom slučaju, stručnjak treba da identifikuje odgovarajuću početnu sekvencu ili sekvencu skele. Obično se takve sekvence dobijaju iz prirodnih izvora, npr. iz T ćelija koje reaguju na antigen ekstrahovane iz krvi donora. Imajući u vidu retkost T ćelija specifičnih za kancer u prirodnom repertoaru, često je potrebno pregledati mnoge donatore, na primer 20 ili više, pre nego što se pronađe T ćelija koja reaguje. Postupak skrininga može potrajati nekoliko nedelja ili meseci, pa čak i kada se pronađe T ćelija koja reaguje, ona može biti neprikladna za imunoterapeutsku upotrebu. Na primer, odgovor može biti preslab i/ili možda nije specifičan za ciljni antigen. Alternativno, možda neće biti moguće stvoriti klonsku populaciju T ćelija, niti proširiti ili održavati datu T ćelijsku liniju da bi se proizvelo dovoljno materijala za identifikaciju tačnih sekvenci TCR lanca. TCR sekvence koje su pogodne kao početne sekvence ili sekvence skele treba da imaju jedno ili više od sledećih svojstava: dobar afinitet za ciljni peptid-HLA kompleks, na primer 200 µM ili jači; visok nivo specifičnosti cilja, npr. relativno slabo ili nikakvo vezivanje za alternativne komplekse peptid-HLA; biti pogodan za upotrebu u bibliotekama prikaza, kao što je prikaz faga; i mogu da se ponovo presavijaju i prečiste uz visok prinos. S obzirom na degenerisanu prirodu prepoznavanja TCR-a, izuzetno je teško čak i za kvalifikovane praktičare da odrede da li određena TCR sekvenca skele ima profil specifičnosti koji bi je učinio podobnim za inženjering za terapeutsku upotrebu (Wooldridge, et al., J Biol Chem.2012 Jan 6;287(2):1168-77).
[0011] Sledeći izazov je da se konstruiše TCR tako da ima veći afinitet prema ciljnom antigenu uz zadržavanje poželjnih karakteristika kao što su specifičnost i prinos. TCR, kako postoje u prirodi, imaju slab afinitet za ciljni antigen (nizak mikromolarni opseg) u poređenju sa antitelima, a TCR protiv antigena kancera obično imaju slabije prepoznavanje antigena od virusno specifičnih TCR (Aleksic, et al. Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9). Ovaj slab afinitet u kombinaciji sa smanjenjem HLA na ćelijama kancera znači da terapeutski TCR za imunoterapiju kancera obično zahtevaju inženjering da povećaju njihov afinitet prema ciljnom antigenu i tako generišu snažniji odgovor. Takva povećanja afiniteta su neophodna za rastvorljive reagense zasnovane na TCR. U takvim slučajevima, poželjni su afiniteti vezivanja antigena u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu, sa poluživotom vezivanja od nekoliko sati. Poboljšana potencija generisana prepoznavanjem antigena visokog afiniteta pri malom broju epitopa je prikazana na slikama 1e i 1f Liddy et al. (Liddy, et al., Nat Med.2012 Jun;18(6):980-7). Proces sazrevanja afiniteta obično uključuje kvalifikovanu osobu koja mora da konstruiše specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije, insercije i/ili delecije, na početnoj TCR sekvenci kako bi se povećala snaga prepoznavanja antigena. Postupci za konstrukciju mutacija koje povećavaju afinitet na datom TCR su poznate u tehnici, na primer korišćenje biblioteka prikaza (Li et al., Nat Biotechnol.2005 Mar;23(3):349-54; Holler et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 May 9;97(10):5387-92). Međutim, da bi proizvela značajno povećanje afiniteta datog TCR-a prema datom ciljnom mestu, stručnjak će možda morati da konstruiše kombinacije mutacija iz velikog broja mogućih alternativa. Specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija koje dovode do značajnog povećanja afiniteta nisu predvidljive i postoji visoka stopa trošenja. U mnogim slučajevima, možda neće biti moguće postići značajno povećanje afiniteta sa datom TCR početnom sekvencom.
[0012] Proces sazrevanja afiniteta takođe mora da uzme u obzir neophodnost održavanja specifičnosti TCR antigena. Povećanje afiniteta TCR-a za njegov ciljni antigen donosi značajan rizik od otkrivanja unakrsne reaktivnosti sa drugim neželjenim ciljnim mestima kao rezultat inherentne degeneracije prepoznavanja TCR antigena (Wooldridge, et al., J Biol Chem.2012 Jan 6;287(2):1168-77; Wilson, et al., Mol Immunol.2004 Feb;40(14-15):1047-55; Zhao et al., J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5845-54). Na prirodnom nivou afiniteta, prepoznavanje unakrsno reaktivnog antigena može biti prenisko da bi proizvelo odgovor. Ako se unakrsno reaktivni antigen prikaže na normalnim zdravim ćelijama, postoji velika mogućnost vezivanja van cilja in vivo što se može manifestovati u kliničkoj toksičnosti. Stoga, pored povećanja snage vezivanja antigena, stručnjak mora takođe da napravi mutacije i/ili kombinacije mutacija koje omogućavaju TCR-u da zadrži visoku specifičnost za ciljni antigen i pokaže dobar bezbednosni profil u pretkliničkom testiranju. Opet, pogodne mutacije i/ili kombinacije mutacija nisu predvidljive. Stopa trošenja u ovoj fazi je još veća i u mnogim slučajevima možda uopšte nije moguća iz date TCR početne sekvence.
[0013] Uprkos gore opisanim poteškoćama, pronalazači su identifikovali mutirane TCR sa posebno visokim afinitetom (pikomolarni opseg) i visokim stepenom specifičnosti antigena. Navedeni TCR pokazuju snažno ubijanje PRAME pozitivnih ćelija kancera kada su pripremljeni kao rastvorljivi reagensi fuzionisani sa ostatkom koji preusmerava T ćelije.
Opis pronalaska
[0014] Pronalazak je definisan u priloženom skupu zahteva.
[0015] U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzioni molekul TCR-anti-CD3 koji sadrži rastvorljivi TCR i anti-CD3 antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, koje je kovalentno vezano za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR, pri čemu TCR ima svojstvo vezivanja za kompleks SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 i sadrži varijabilni domen alfa lanca TCR i varijabilni domen beta lanca TCR od kojih svaki sadrži FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 gde je FR okvirni region, a CDR region koji određuje komplementarnost, pri čemu
(a) CDR regioni alfa lanca imaju sledeće sekvence:
CDR1 - TISGTDY (SEQ ID NO: 39)
CDR2 - GLTSN (SEQ ID NO: 40)
CDR3 - CILILGHSRLGNYIATF (SEQ ID NO: 46)
i
(b) CDR regioni beta lanca imaju sledeće sekvence:
CDR1 - LNHDA (SEQ ID NO: 42)
CDR2 - SQIMGDE (SEQ ID NO: 48)
CDR3 - CASSWWTGGASPIRF (SEQ ID NO: 58).
[0016] Takođe je otkriven, ali nije obuhvaćen zahtevima, T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) u kompleksu sa HLA-A*02 i koji sadrži TCR alfa lanac varijabilnog domena i/ili TCR beta lanac varijabilnog domena, od kojih svaki sadrži FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 gde je FR okvirni region, a CDR je region koji određuje komplementarnost, pri čemu
(a) CDR regioni alfa lanca imaju sledeće sekvence:
CDR1 - TISGTDY (SEQ ID NO: 39)
CDR2 - GLTSN (SEQ ID NO: 40)
CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 41)
izborno sa jednom ili više mutacija u njemu,
i/ili
(b) CDR regioni beta lanca imaju sledeće sekvence:
CDR1 - LNHDA (SEQ ID NO: 42)
CDR2 - SQIVNDF (SEQ ID NO: 43)
CDR3 - CASSPWTSGSREQYF (SEQ ID NO: 44)
izborno sa jednom ili više mutacija.
[0017] U TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 prvog aspekta, okvirni regioni varijabilnog domena alfa lanca mogu sadržati sledeće okvirne sekvence:
FR1 - aminokiseline 1-25 SEQ ID NO: 2
FR2 - aminokiseline 33-49 SEQ ID NO: 2
FR3 - aminokiseline 55-87 SEQ ID NO: 2
FR4 - aminokiseline 105-114 SEQ ID NO: 2
ili odgovarajuće sekvence koje imaju najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičnosti sa navedenim sekvencama, i/ili
regioni okvira varijabilnog domena beta lanca mogu sadržati sledeće sekvence:
FR1 - aminokiseline 1-26 SEQ ID NO: 3
FR2 - aminokiseline 32-48 SEQ ID NO: 3
FR3 - aminokiseline 56-90 SEQ ID NO: 3
FR4 - aminokiseline 106-114 SEQ ID NO: 3
ili odgovarajuće sekvence koje imaju najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičnosti sa navedenim sekvencama.
[0018] Termin „mutacije“ obuhvata supstitucije, insercije i delecije. Mutacije u roditeljski (ili divlji tip, ili skelu) TCR mogu uključivati one koje povećavaju afinitet vezivanja (kDi/ili poluživot vezivanja) TCR-a za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02.
[0019] Konvencionalno, ostatak beta lanca F55 se smatra delom okvirnog regiona 3. Međutim, za potrebe ovog pronalaska, ostatak beta lanca F55 se smatra delom CDR2.
[0020] Okvirni regioni alfa lanca FR1, FR2 i FR3 mogu sadržati aminokiselinske sekvence koje odgovaraju TRAV 26-2 lancu i/ili okvirnim regionima beta lanca FR1, FR2 i FR3, mogu sadržati aminokiselinske sekvence koje odgovaraju onima iz TRBV19 lanca.
[0021] FR4 region može da sadrži spojni region alfa i beta varijabilnih lanaca (TRAJ i TRBJ, respektivno).
[0022] U varijabilnom regionu alfa lanca TCR ovde opisanog TCR, može postojati najmanje jedna mutacija u CDR regionima. Može da postoji jedna, dve, tri, četiri ili pet, ili više, mutacija u CDR regionima alfa lanca. Može da postoji jedna, dve, tri, četiri ili pet mutacija u CDR3 alfa lanca. Jedna ili više od navedenih mutacija može da bude izabrana od sledećih mutacija, u odnosu na numerisanje SEQ ID NO: 2:
[0023] Dakle, može postojati bilo koja ili sve mutacije u gornjoj tabeli, izborno u kombinaciji sa drugim mutacijama.
[0024] CDR3 alfa lanca može sadržati jednu od sledećih grupa mutacija (u odnosu na numerisanje SEQ ID NO: 2):
[0025] Poželjna grupa mutacija je grupa 1. Druga poželjna grupa mutacija je grupa 2.
[0026] CDR3 alfa lanca može imati sekvencu koja je izabrana od:
[0027] Poželjni CDR3 alfa lanca je CILILGHSRAGNYIATF (SEQ ID NO: 45). Poželjni CDR3 alfa lanca je CILILGHSRLGNYIATF (SEQ ID NO: 46).
[0028] U varijabilnom regionu beta lanca TCR ovde opisanog TCR može da postoji najmanje jedna mutacija u CDR regionima. Može da postoji jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, ili više mutacija u CDR regionima beta lanca. Može da postoji jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset mutacija u CDR3 beta lanca. Jedna ili više od navedenih mutacija može da bude izabrana od sledećih mutacija u odnosu na numerisanje SEQ ID NO: 3:
[0029] Dakle, može postojati bilo koja ili sve mutacije u gornjoj tabeli, izborno u kombinaciji sa drugim mutacijama.
[0030] CDR2 i CDR3 beta lanca mogu sadržati jednu od sledećih grupa mutacija (u odnosu na numerisanje SEQ ID NO: 3):
[0031] Poželjna grupa mutacija je grupa 1. Poželjna grupa mutacija je grupa 9.
[0032] Beta lanac CDR2 može imati sekvencu koja je izabrana od:
1
[0033] Poželjni CDR2 beta lanca je SQIMGDE (SEQ ID NO: 48).
[0034] CDR3 beta lanca može imati sekvencu izabranu od:
[0035] Poželjni CDR3 beta lanca je CASSWWTGGASPISF (SEQ ID NO: 51). Poželjni CDR3 beta lanca je CASSWWTGGASPIRF (SEQ ID NO: 58).
[0036] Poželjne kombinacije CDR2 i CDR3 beta lanca su sledeće:
[0037] Poželjna kombinacija je kombinacija 1. Druga poželjna kombinacija je kombinacija 9.
[0038] CDR sekvence TCR alfa i beta lanca mogu da budu izabrane od:
1
[0039] Poželjna kombinacija je kombinacija 1. Poželjna kombinacija je kombinacija 17. TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska obuhvata CDR sekvence u kombinaciji 17.
[0040] Mutacija(e) unutar CDR regiona poželjno poboljšavaju afinitet vezivanja TCR-a za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02, ali mogu dodatno ili alternativno dati druge prednosti kao što su poboljšana stabilnost u izolovanom obliku i poboljšana specifičnost. Mutacije na jednoj ili više pozicija mogu dodatno ili alternativno uticati na interakciju susedne pozicije sa srodnim pMHC kompleksom, na primer obezbeđivanjem povoljnijeg ugla za interakciju. Mutacije mogu uključivati one koje su u stanju da smanje količinu nespecifičnog vezivanja, tj. smanje vezivanje za alternativne antigene u odnosu na SLLQHLIGL-HLA-A*02. Mutacije mogu uključivati one koje povećavaju efikasnost savijanja i/ili proizvodnje. Neke mutacije mogu doprineti svakoj od ovih karakteristika; drugi mogu doprineti afinitetu, ali ne specifičnosti, na primer, ili specifičnosti, ali ne afinitetu itd.
[0041] Obično je potrebno najmanje 5, najmanje 10, najmanje 15 ili više CDR mutacija da bi se dobili TCR sa pM afinitetom za ciljni antigen. Najmanje 5, najmanje 10 ili najmanje 15 CDR mutacija ukupno može biti potrebno da bi se dobili TCR sa pM afinitetom za ciljni antigen. TCR sa pM afinitetom za ciljni antigen su posebno pogodni kao rastvorljivi terapeutici. TCR-ovi za upotrebu u primenama adoptivne terapije mogu imati niži afinitet za ciljni antigen, a samim tim i manje CDR mutacija, na primer, do 1, do 2, do 5 ili više CDR mutacija ukupno. TCR-ovi za upotrebu u primenama adoptivne terapije mogu imati niži afinitet za ciljni antigen, a samim tim i manje CDR mutacija, na primer, do 1, do 2 ili do 5 CDR mutacija ukupno.
[0042] Mutacije se mogu dodatno, ili alternativno, napraviti van CDR regiona, unutar okvirnih regiona; takve mutacije mogu poboljšati vezivanje, i/ili specifičnost, i/ili stabilnost, i/ili prinos prečišćenog rastvorljivog oblika TCR. Na primer, TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska može da sadrži varijabilni domen alfa lanca, pri čemu varijabilni region alfa lanca FR1 ima G ostatak na poziciji-1 koristeći numeraciju SEQ ID NO: 2, tj. umetnut je pre pozicije 1. Utvrđeno je da G na poziciji-1 poboljšava efikasnost cepanja N-terminalnog metionina tokom proizvodnje u E. coli. Neefikasno cepanje može biti štetno za terapeutika, jer može rezultirati
1
heterogenim proteinskim proizvodom, a ili prisustvo inicijacionog metionina može biti imunogeno kod ljudi.
[0043] Poželjno, varijabilni domen α lanca TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska može da sadrži odgovarajuće okvirne aminokiselinske sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95 %, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa okvirnim aminokiselinskim ostacima 1-25, 33-49, 55-87, 105-114 SEQ ID NO: 2. Varijabilni domen beta lanca TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska može da sadrži odgovarajuće okvirne aminokiselinske sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa okvirnim aminokiselinskim ostacima 1-26, 32-48, 56-90, 106-114 SEQ ID NO: 3. Alternativno, navedeni procenat identičnosti može biti iznad okvirnih sekvenci kada se posmatra kao celina.
[0044] TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska može da sadrži varijabilni domen alfa lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i varijabilni domen beta lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17. Ostali ovde opisani TCR mogu da sadrže varijabilni domen alfa lanca koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 6-8, i varijabilni domen beta lanca koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 9-24.
[0045] Na primer, ovde opisani TCR može da sadrži sledeće parove alfa i beta lanaca.
1
[0046] Poželjno sparivanje TCR lanca je SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 9.
[0047] Unutar obima ovog pronalaska su fenotipski tihe varijante bilo kog TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska koji su ovde otkriveni. Kako se ovde koristi, termin "fenotipski tihe varijante" podrazumeva se da se odnosi na TCR varijabilni domen koji uključuje jednu ili više daljih promena aminokiselina, uključujući supstitucije, insercije i delecije, pored onih koje su gore navedene, a TCR ima sličan fenotip odgovarajućem TCR bez pomenute promene(a). Za potrebe ove prijave, TCR fenotip obuhvata afinitet vezivanja (KDi/ili poluživot vezivanja) i specifičnost. Poželjno, fenotip za rastvorljivi TCR povezan sa imunim efektorom uključuje potenciju imunološke aktivacije i prinos prečišćavanja, pored afiniteta i specifičnosti vezivanja. Fenotipski tiha varijanta može imati KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 unutar 50%, ili još poželjnije unutar 30%, 25% ili 20% izmerenog KDi/ili poluživot vezivanja odgovarajućeg TCR-a bez pomenute promene(a), kada se meri pod identičnim uslovima (na primer na 25°C i/ili na istom SPR čipu). Pogodni uslovi su dalje dati u Primeru 3. Kao što je stručnjacima poznato, moguće je proizvesti TCR-ove koji uključuju promene u svojim varijabilnim domenima u poređenju sa onima koji su detaljno opisani iznad bez promene afiniteta interakcije sa SLLQHLIGL-HLA-A*02 kompleksom i druge funkcionalne karakteristike. Posebno, takve tihe mutacije mogu biti ugrađene u delove sekvence za koje je poznato da nisu direktno uključene u vezivanje antigena (npr. okvirni regioni). Takve varijante su uključene u obim ovog pronalaska.
1
[0048] Fenotipski tihe varijante mogu sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija i/ili jednu ili više tolerisanih supstitucija. Pod tolerisanim supstitucijama podrazumevaju se one supstitucije koje ne potpadaju pod definiciju konzervativnih kao što je dato u nastavku, ali su ipak fenotipski tihe. Stručnjak je svestan da različite aminokiseline imaju slična svojstva i stoga su „konzervativne“. Jedna ili više takvih aminokiselina proteina, polipeptida ili peptida često mogu biti supstituisane sa jednom ili više drugih takvih aminokiselina bez eliminisanja željene aktivnosti tog proteina, polipeptida ili peptida.
[0049] Tako se aminokiseline glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin često mogu zameniti jedna drugom (aminokiseline koje imaju alifatične bočne lance). Od ovih mogućih supstitucija, poželjno je da se glicin i alanin koriste da se međusobno supstituišu (pošto imaju relativno kratke bočne lance) i da se valin, leucin i izoleucin koriste da se međusobno supstituišu (pošto imaju veće alifatične bočne lance koji su hidrofobni). Druge aminokiseline koje se često mogu međusobno supstituisati uključuju: fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance); lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju bazne bočne lance); aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance); asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju bočne lance amida); i cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor). Treba imati na umu da se aminokiselinske supstitucije u okviru ovog pronalaska mogu napraviti korišćenjem aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili koje se ne nalaze u prirodi. Na primer, ovde se razmatra da metil grupa na alaninu može biti zamenjena etil grupom, i/ili da se manje promene mogu izvršiti na peptidnom osnovnom lancu. Bez obzira da li se koriste prirodne ili sintetičke aminokiseline ili ne, poželjno je da su prisutne samo L-aminokiseline.
[0050] Supstitucije ove prirode se često nazivaju "konzervativnim" ili "polukonzervativnim" supstitucijama aminokiselina. Ovaj pronalazak se stoga proširuje na upotrebu TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska koji sadrži bilo koju od gore opisanih aminokiselinskih sekvenci, ali sa jednom ili više konzervativnih supstitucija i ili jednom ili više tolerisanih supstitucija u sekvenci, tako da sekvenca aminokiselina TCR ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, prema TCR koji sadrži aminokiseline 1-114 sekvence SEQ ID NO.: 7 i/ili aminokiseline 1-114 sekvence SEQ ID NO: 17.
[0051] Ovo otkriće uključuje upotrebu TCR koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci opisanih gore, ali sa jednom ili više konzervativnih supstitucija i ili jednom ili više tolerisanih supstitucija u sekvenci, tako da aminokiselinska sekvenca TCR ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, prema TCR koji sadrži aminokiseline 1-114 sekvenci SEQ ID NO: 2, 6, ili 8, i/ili aminokiseline 1-114
1
sekvenci SEQ ID NO: 3, 9-16 ili 18-24.
[0052] "Identičnost" kao što je poznato u tehnici je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identičnost takođe označava stepen srodnosti sekvenci između polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, kao što je određeno podudarnošću između nizova takvih sekvenci. Iako postoji veliki broj postupaka za merenje identičnosti između dve polipeptidne ili dve polinukleotidne sekvence, postupci koji se obično koriste za određivanje identičnosti su kodifikovane u kompjuterskim programima. Poželjni kompjuterski programi za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, i FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol.215, 403 (1990)).
[0053] Može se koristiti program kao što je CLUSTAL program za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci. Ovaj program upoređuje aminokiselinske sekvence i pronalazi optimalno poravnanje umetanjem razmaka u bilo koju sekvencu prema potrebi. Moguće je izračunati identičnost ili sličnost aminokiselina (identičnost plus očuvanje tipa aminokiseline) za optimalno poravnanje. Program kao što je BLASTx će poravnati najduži deo sličnih sekvenci i dodeliti vrednost uklapanju. Stoga je moguće dobiti poređenje gde se nalazi nekoliko regiona sličnosti, od kojih svaki ima drugačiji rezultat. Oba tipa analize identičnosti su razmatrana u ovom pronalasku.
[0054] Procenat identičnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinskih kiselina se određuje poravnavanjem sekvenci radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u prvu sekvencu radi najboljeg usklađivanja sa sekvencom) i poređenjem aminokiselinskih ostataka ili nukleotida na odgovarajućim pozicijama. „Najbolje poravnanje“ je poravnanje dve sekvence koje rezultira najvećim procentom identičnosti. Procenat identičnosti je određen brojem identičnih aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvencama koje se porede (tj. % identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija × 100).
[0055] Određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma poznatog stručnjacima u ovoj oblasti. Primer matematičkog algoritma za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modifikovano kao u Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Programi BLASTn i BLASTp Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 su ugradili takav algoritam. Određivanje procenta identičnosti između dve nukleotidne sekvence može se izvršiti pomoću programa BLASTn. Određivanje procenta identičnosti između dve proteinske sekvence može se izvršiti pomoću programa BLASTp. Da biste dobili razmaknuta poravnanja u svrhu poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et
1
al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast se može koristiti za obavljanje iterirane pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (Id.). Kada koristite programe BLAST, Gapped BLAST i PSI-Blast, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. BLASTp i BLASTp). Pogledati http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Podrazumevani opšti parametri mogu uključivati, na primer, veličinu reči = 3, očekivani prag = 10. Parametri se mogu izabrati da se automatski prilagođavaju za kratke sekvence unosa. Drugi primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam prema Myers and Miller, CABIOS (1989). Program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje sekvenci CGC ugradio je takav algoritam. Drugi algoritmi za analizu sekvenci poznati u tehnici uključuju ADVANCE i ADAM kao što je opisano u Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5; i FASTA opisana u Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
85:2444-8. U okviru FASTA, ktup je kontrolna opcija koja postavlja osetljivost i brzinu pretrage. Za potrebe procene procenta identičnosti u ovom otkriću, BLASTp sa podrazumevanim parametrima se koristi kao metodologija poređenja. Pored toga, kada navedeni procenat identičnosti daje vrednost koja nije cela za aminokiseline (tj., sekvenca od 25 aminokiselina sa 90% identičnosti sekvence daje vrednost od "22.5", dobijena vrednost se zaokružuje na sledeći ceo broj, dakle "22"). Shodno tome, u datom primeru, sekvenca koja ima 22 podudaranja od 25 aminokiselina je unutar 90% identičnosti sekvence.
[0056] Kao što će biti očigledno stručnjacima u ovoj oblasti, može biti moguće skratiti ili proširiti sekvence obezbeđene na C-terminusu i/ili N-terminusu za 1, 2, 3, 4, 5 ili više ostataka, bez suštinskog uticaja na funkcionalne karakteristike TCR-a. Sekvence obezbeđene na njegovom C-terminusu i/ili N-terminusu mogu biti skraćene ili produžene za 1, 2, 3, 4 ili 5 ostataka. Sve takve varijante su obuhvaćene ovim pronalaskom.
[0057] Mutacije, uključujući konzervativne i tolerisane supstitucije, insercije i delecije, mogu se uvesti u sekvence koje su obezbeđene korišćenjem bilo kog odgovarajućeg postupka uključujući, ali ne ograničavajući se na, one zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze (PCR), kloniranje zasnovano na restrikcionim enzimima ili postupke kloniranja nezavisne od ligacije (LIC). Ovi postupci su detaljno opisani u mnogim standardnim tekstovima o molekularnoj biologiji. Za više detalja u vezi sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i kloniranjem zasnovanim na restrikcionim enzimima, pogledajte Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press. Dodatne informacije o postupcima nezavisnog kloniranja od ligacije (LIC) mogu se naći u Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6. TCR sekvence TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska mogu se dobiti sintezom u čvrstom stanju, ili bilo kojim drugim odgovarajućim postupkom poznatim u tehnici.
2
[0058] TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska imaju svojstvo vezivanja kompleksa SLLQHLIGL-HLA-A*02. TCR pokazuju visok stepen specifičnosti za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 i stoga su posebno pogodni za terapeutsku upotrebu. Specifičnost u kontekstu TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska se odnosi na njihovu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su pozitivne na antigen, dok imaju minimalnu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su antigen negativne.
[0059] Specifičnost se može meriti in vitro, na primer, u ćelijskim testovima kao što su oni opisani u Primerima 6, 7 i 8. Specifičnost se može odrediti merenjem nivoa aktivacije T ćelija u prisustvu antigen pozitivnih i antigen negativnih ciljnih ćelija. Minimalno prepoznavanje ciljnih ćelija negativnih na antigen je definisano kao nivo aktivacije T ćelija manji od 20%, poželjno manji od 10%, poželjno manji od 5%, a poželjnije manji od 1% nivoa proizvedenog u prisustvu antigen pozitivne ciljne ćelije, kada se mere pod istim uslovima i pri terapijski relevantnoj koncentraciji TCR. Za rastvorljive TCR povezane sa imunološkim efektorom, terapeutski relevantna koncentracija se može definisati kao koncentracija TCR od 10<-9>M ili ispod, i/ili koncentracija do 100, poželjno do 1000, puta veća od odgovarajuće vrednosti EC50. Poželjno, za rastvorljive TCR povezane sa imunim efektorom postoji najmanje 100 puta razlika u koncentraciji koja je potrebna za aktivaciju T ćelija protiv antigen pozitivnih ćelija u odnosu na antigen negativne ćelije. Antigen pozitivne ćelije se mogu dobiti pulsiranjem peptida korišćenjem odgovarajuće koncentracije peptida da bi se dobio nivo prezentacije antigena uporediv sa ćelijama kancera (npr.10<-9>M peptid, kao što je opisano u Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840) ili mogu prirodno predstavljati navedeni peptid. Poželjno, i antigen pozitivne i antigen negativne ćelije su ljudske ćelije. Poželjno antigen pozitivne ćelije su humane ćelije kancera. Antigen negativne ćelije poželjno uključuju one izvedene iz zdravih humanih tkiva.
[0060] Specifičnost se može dodatno, ili alternativno, odnositi na sposobnost TCR-a da se veže za SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks, a ne za panel alternativnih kompleksa peptid-HLA. Ovo se, na primer, može odrediti Biacore metodom iz Primera 3. Navedena ploča može da sadrži najmanje 5, a poželjno najmanje 10 alternativnih kompleksa peptid-HLA-A*02. Alternativni peptidi mogu deliti nizak nivo identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1 i mogu biti prirodno predstavljeni. Alternativni peptidi su poželjno poreklom iz proteina eksprimiranih u zdravim ljudskim tkivima. Vezivanje TCR-a za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 može biti najmanje 2 puta veće nego za druge prirodno prisutne peptidne HLA komplekse, poželjnije najmanje 10 puta, ili najmanje 50 puta ili najmanje 100 puta veće, još poželjnije najmanje 400 puta veće.
[0061] Alternativni ili dodatni pristup za određivanje TCR specifičnosti može biti da se identifikuje motiv prepoznavanja peptida TCR korišćenjem sekvencijalne mutageneze, npr. skeniranje alaninom. Ostaci koji čine deo vezujućeg motiva su oni koji nisu dozvoljeni za supstituciju. Nedozvoljene supstitucije se mogu definisati kao one peptidne pozicije u kojima je afinitet vezivanja TCR smanjen za najmanje 50%, ili poželjno najmanje 80% u odnosu na afinitet vezivanja za ne-mutirani peptid. Takav pristup je dalje opisan u Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5 (197): 197ra103 i WO2014096803. Specifičnost TCR-a u ovom slučaju može se odrediti identifikacijom peptida koji sadrže alternativni motiv, posebno peptida koji sadrže alternativni motiv u humanom proteomu, i testiranjem ovih peptida na vezivanje za TCR. Vezivanje TCR-a za jedan ili više alternativnih peptida može ukazivati na nedostatak specifičnosti. U ovom slučaju može biti potrebno dalje testiranje specifičnosti TCR putem ćelijskih testova.
[0062] Fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 prema pronalasku mogu imati idealan bezbednosni profil za upotrebu kao terapeutski reagensi. U ovom slučaju TCR su u rastvorljivom obliku i anti-CD3 antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, je kovalentno vezano za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR. Ovde otkriveni TCR mogu da budu fuzionisani sa drugim pogodnim imunim efektorima uključujući, ali bez ograničenja, citokine, kao što su IL-2 i IFN-γ; superantigeni i njihovi mutanti; hemokini kao što je IL-8, trombocitni faktor 4, protein koji stimuliše rast melanoma; antitela, uključujući njihove fragmente, derivate i varijante, koja se vezuju za antigene na imunim ćelijama kao što su T ćelije ili NK ćelije (npr. anti-CD28 ili anti-CD16); i aktivatori komplementa. Idealan bezbednosni profil znači da su, pored demonstracije dobre specifičnosti, TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku možda prošli dalje pretkliničke testove bezbednosti. Primeri takvih testova uključuju testove pune krvi da bi se potvrdilo minimalno oslobađanje citokina u prisustvu pune krvi i samim tim mali rizik od izazivanja sindroma potencijalnog oslobađanja citokina in vivo, i testovi aloreaktivnosti da bi se potvrdio nizak potencijal za prepoznavanje alternativnih HLA tipova.
[0063] Fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 pronalaska mogu biti podložni prečišćavanju visokog prinosa. Prinos se može odrediti na osnovu količine materijala zadržanog tokom postupka prečišćavanja (tj. količine pravilno presavijenog materijala dobijenog na kraju postupka prečišćavanja u odnosu na količinu rastvorenog materijala dobijenog pre ponovnog presavijanja), ili se prinos može zasnivati na količini pravilno presavijenog materijala dobijenog na kraju postupka prečišćavanja, u odnosu na prvobitnu zapreminu kulture. Visok prinos znači veći od 1%, ili poželjnije veći od 5%, ili veći prinos. Visok prinos znači veći od 1 mg/ml, ili poželjnije veći od 3 mg/ml, ili veći od 5 mg/ml, ili veći prinos.
[0064] TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku poželjno imaju KDza kompleks SLLQHLIGL -HLA-A*02 veći od (tj. jačeg od) ne-mutiranog, ili skele TCR, na primer u opsegu od 1 pM do 100 µM. U jednom aspektu, TCR imaju KDza kompleks od oko (tj. /- 10%) 1 pM do oko 400 nM, od oko 1 pM do oko 1000 pM, od oko 1 pM do oko 500 pM. Navedeni TCR mogu dodatno, ili alternativno, imati poluvreme vezivanja (T1⁄2) za kompleks u rasponu od oko 1 min do oko 60 h, od oko 20 min do oko 50 h, ili od oko 2 h do oko 35 h. U posebno poželjnom primeru izvođenja, TCR imaju KDza kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 od oko 1 pM do oko 500 pM i/ili poluživot vezivanja od oko 2 h do oko 35 h. Takav visoki afinitet je poželjniji za TCR u rastvorljivom formatu kada je povezan sa terapeutskim sredstvima i/ili detektabilnim obeleživačima.
[0065] Ostali ovde opisani TCR mogu imati KDza kompleks od oko 50 nM do oko 200 uM), ili od oko 100 nM do oko 1 µM i/ili poluživot vezivanja za kompleks od oko 3 sek do oko 12 min. Takvi TCR mogu biti poželjniji za primene adoptivne terapije.
[0066] Postupci za određivanje afiniteta vezivanja (obrnuto proporcionalno konstanti ravnoteže KD) i poluživota vezivanja (izražen kao T1⁄2) su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. U poželjnom primeru izvođenja, afinitet vezivanja i poluživot vezivanja se određuju korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR) ili interferometrije biosloja (BLI), na primer korišćenjem BIAcore instrumenta ili instrumenta Octet, respektivno. Poželjan postupak je dat u Primeru 3. Biće jasno da udvostručavanje afiniteta TCR dovodi do prepolovljenja KD. T1⁄2 se izračunava kao In2 podeljen sa koeficijentom disocijacije (koff). Prema tome, udvostručavanje T1⁄2 rezultira prepolovljenjem koff. KDi koffvrednosti za TCR se obično mere za rastvorljive oblike TCR, tj. one oblike koji su skraćeni da bi se uklonili ostaci citoplazmatskog i transmembranskog domena. Da bi se uzele u obzir varijacije između nezavisnih merenja, a posebno za interakcije sa vremenima disocijacije većim od 20 sati, afinitet vezivanja i/ili poluvreme vezivanja datog TCR se može meriti nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, koristeći isti protokol analize, i prosek uzetih rezultata. Da bi se uporedili podaci o vezivanju između dva uzorka (tj. dva različita TCR-a i ili dva preparata istog TCR-a) poželjno je da se merenja vrše korišćenjem istih uslova analize (npr. temperature), kao što su oni opisani u Primeru 3.
[0067] Određeni poželjni TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku imaju afinitet vezivanja i/ili poluvreme vezivanja za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 koji je znatno veći od onog kod prirodnog TCR. Povećanje afiniteta vezivanja prirodnog TCR-a često smanjuje specifičnost TCR-a za njegov peptid-MHC ligand, a to je demonstrirano u Zhao et al., (2007) J. Immunol, 179:9, 5845-5854. Međutim, takvi TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku ostaju specifični za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02, uprkos tome što imaju znatno veći afinitet vezivanja od prirodnog TCR.
[0068] Određeni poželjni fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 su u stanju da generišu veoma moćan
2
odgovor T ćelija in vitro protiv ćelija pozitivnih na antigen, posebno onih ćelija koje predstavljaju niske nivoe antigena tipične za ćelije kancera (tj. reda veličine 5-100, na primer 50 antigena po ćeliji (Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840; Purbhoo et al., (2006). J Immunol 176(12): 7308-7316.)). Takvi fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 sadrže TCR u rastvorljivom obliku vezan za anti-CD3 antitelo. Odgovor T ćelija koji se meri može biti oslobađanje markera aktivacije T ćelija kao što je Interferon γ ili Granzim B, ili ubijanje ciljnih ćelija, ili druga mera aktivacije T ćelija, kao što je proliferacija T ćelija. Poželjno je da je visoko potentan odgovor onaj sa EC50vrednošću u pM opsegu, najpoželjnije, 100 pM ili niže.
[0069] TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku mogu biti αβ heterodimeri. Alfa-beta heterodimerni TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 pronalaska obično sadrže sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i/ili sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2. Konstantni domeni u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 pronalaska, ako su prisutni, nalaze se u rastvorljivom formatu (tj. nemaju transmembranske ili citoplazmatske domene). Drugi TCR ovde otkriveni mogu da sadrže konstantne domene koji su pune dužine, čime se podrazumeva da su prisutni ekstracelularni, transmembranski i citoplazmatski domeni. Jedan ili oba konstantna domena mogu sadržati mutacije, supstitucije ili delecije u odnosu na nativnu TRAC i/ili TRBC1/2 sekvencu. Termin TRAC i TRBC1/2 takođe obuhvata prirodne polimorfne varijante, na primer od N do K na poziciji 4 TRAC (Bragado et al International immunology.1994 Feb;6(2):223-30).
[0070] Rastvorljivi TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku mogu da imaju sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca koje su modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2. Sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca može imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano, na primer, u WO 03/020763. U poželjnom primeru izvođenja alfa i beta konstantni domeni mogu biti modifikovani supstitucijom cisteinskih ostataka na poziciji Thr 48 TRAC i poziciji Ser 57 na TRBC1 ili TRBC2, pomenuti cisteini formiraju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR. TRBC1 ili TRBC2 mogu dodatno uključiti mutaciju cisteina u alanin na poziciji 75 konstantnog domena i mutaciju asparagina u asparaginsku kiselinu na poziciji 89 konstantnog domena. Jedan ili oba ekstracelularna konstantna domena prisutna u αβ heterodimeru TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska mogu biti skraćena na C-terminusu ili C-terminusima, na primer za do 15, ili do 10, ili do 8 ili manje aminokiselina. Jedan ili oba ekstracelularna konstantna domena prisutna u αβ heterodimeru TCR u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska mogu biti skraćena na C-terminusu ili C-terminusima za, na primer, do 15, ili do 10 ili do 8 aminokiselina. C-terminus ekstracelularnog konstantnog domena alfa lanca može biti skraćen za 8 aminokiselina.
[0071] Konstantni domeni αβ heterodimernog TCR koji je ovde opisan mogu biti pune dužine, sa transmembranskim i citoplazmatskim domenima. Takvi TCR mogu sadržati disulfidnu vezu koja odgovara onoj koja se nalazi u prirodi između odgovarajućih alfa i beta konstantnih domena. Dodatno, ili alternativno, ne-nativna disulfidna veza može biti prisutna između ekstracelularnih konstantnih domena. Navedene ne-prirodne disulfidne veze su dalje opisane u WO03020763 i WO06000830. Ne-nativna disulfidna veza može biti između položaja Thr 48 TRAC-a i položaja Ser 57 TRBC1 ili TRBC2. Jedan ili oba konstantna domena mogu da sadrže jednu ili više supstitucija ili delecija mutacija u odnosu na nativnu TRAC i/ili TRBC1/2 sekvencu. TCR sa konstantnim domenima pune dužine su poželjniji za upotrebu u adoptivnoj terapiji.
[0072] TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 pronalaska mogu biti u jednolančanom formatu. Jednolančani formati uključuju, ali nisu ograničeni na, αβ TCR polipeptide Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ ili Vα-Cα-L-Vβ-Cβ tipovi, pri čemu su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno, a L je sekvenca linkera (Veidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). Tamo gde su prisutni, jedan ili oba konstantna domena mogu biti pune dužine, ili mogu biti skraćeni i/ili sadrže mutacije kao što je gore opisano. U određenim primerima izvođenja, jednolančani TCR u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 prema pronalasku mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano u WO 2004/033685. Jednolančani TCR su dalje opisani u WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).
[0073] Ovde su opisane i čestice koje prikazuju ovde opisane TCR i uključivanje navedenih čestica u biblioteku čestica. Takve čestice uključuju ali nisu ograničene na fage, ćelije kvasca, ribozome ili ćelije sisara. Postupci za proizvodnju takvih čestica i biblioteka su poznati u tehnici (na primer, videti WO2004/044004; WO01/48145, Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184).
[0074] Rastvorljivi TCR su korisni za isporuku detektabilnih obeleživača ili terapeutskih sredstava u ćelije koje prezentuju antigen i tkiva koja sadrže ćelije koje prezentuju antigen. Oni stoga mogu biti povezani (kovalentno ili drugačije) sa detektabilnim obeleživačem (u dijagnostičke svrhe gde se TCR koristi za otkrivanje prisustva ćelija koje prezentuju srodni antigen); i ili terapeutsko sredstvo; i ili ostatak koji modifikuje PK.
2
[0075] Primeri ostataka koji modifikuju PK uključuju, ali nisu ograničeni na, PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 and Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28), PASilaciju (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501), albumin, i albumin vezujuće domene, (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43), i/ili nestrukturirane polipeptide (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90). Dodatni ostaci koji modifikuju PK uključuju Fc fragmente antitela.
[0076] Obeleživači koje se mogu detektovati u dijagnostičke svrhe uključuju, na primer, fluorescentne obeleživače, radioaktivne obeleživače, enzime, sonde nukleinske kiseline i kontrastne reagense.
[0077] Za neke svrhe, fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 pronalaska mogu biti agregirani u kompleks koji sadrži nekoliko TCR-a da bi se formirao multivalentni TCR kompleks. Postoji veliki broj humanih proteina koji sadrže multimerizacioni domen koji se može koristiti u proizvodnji multivalentnih TCR kompleksa. Na primer, domen tetramerizacije p53 koji je korišćen za proizvodnju tetramera fragmenata scFv antitela koji su pokazali povećanu postojanost seruma i značajno smanjenu brzinu u poređenju sa monomernim scFv fragmentom (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). Hemoglobin takođe ima domen tetramerizacije koji bi se mogao koristiti za ovu vrstu primene. Multivalentni TCR kompleks može imati poboljšanu sposobnost vezivanja za kompleks u poređenju sa nemultimernim heterodimerom divljeg tipa ili T ćelijskog receptora. Prema tome, multivalentni kompleksi fuzionih molekula TCR-anti-CD3 prema pronalasku su takođe uključeni u pronalazak. Takvi multivalentni TCR kompleksi su posebno korisni za praćenje ili ciljno delovanje na ćelije koje prezentuju određene antigene in vitro ili in vivo, i takođe su korisni kao intermedijeri za proizvodnju dodatnih multivalentnih TCR kompleksa koji imaju takvu upotrebu.
[0078] Terapeutska sredstva koja mogu biti povezana sa ovde opisanim TCR uključuju imunomodulatore i efektore, radioaktivna jedinjenja, enzime (na primer perforin) ili hemoterapeutska sredstva (na primer, cis-platina). Da bi se osiguralo da se toksični efekti vrše na željenoj lokaciji, toksin bi mogao biti unutar lipozoma koji je povezan sa TCR-om tako da se jedinjenje polako oslobađa. Ovo će sprečiti štetne efekte tokom transporta u telu i obezbediti da toksin ima maksimalan efekat nakon vezivanja TCR-a za relevantne ćelije koje predstavljaju antigen.
[0079] Primeri pogodnih terapeutskih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na:
• citotoksična sredstva male molekule, odnosno jedinjenja sa sposobnošću da ubijaju ćelije
2
sisara čija je molekulska težina manja od 700 daltona. Takva jedinjenja mogu takođe da sadrže toksične metale sposobne da imaju citotoksični efekat. Dalje, treba razumeti da ova citotoksična sredstva sa malim molekulima takođe uključuju pro-lekove, tj. jedinjenja koja se raspadaju ili se konvertuju u fiziološkim uslovima da bi oslobodila citotoksična sredstva. Primeri takvih sredstava uključuju cis-platin, derivate majtanzina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etopozid, gemcitabin, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, sorfimer natrijumfotofrin II, temoteteburestatin, topotekan, trimetreat 22arbour22at, auristatin E vinkristin i i doksorubicin; • peptidne citotoksine, tj. proteine ili njihove fragmente sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara. Na primer, ricin, toksin difterije, egzotoksin A bakterije pseudomonas, Dnazu i Rnazu; • radionuklide, tj. nestabilne izotope elemenata koji se raspadaju uz istovremenu emisiju jedne ili više α, ili β čestica, ili γ zraka. Na primer, jod 131, renijum 186, indijum 111, itrijum 90, bizmut 210 i 213, aktinijum 225 i astatin 213; helatirajuća sredstva se mogu koristiti za olakšavanje povezivanja ovih radionuklida sa TCR-ovima visokog afiniteta ili njihovim multimerima;
• Imunostimulanse, odnosno imunološke efektorske molekule koji stimulišu imuni odgovor. Na primer, citokine kao što su IL-2 i IFN-γ,
• Superantigene i njihove mutante;
• TCR-HLA fuzije, npr. fuziju sa kompleksom peptid-HLA, pri čemu je navedeni peptid poreklom iz uobičajenog humanog patogena, kao što je Epstein Barr virus (EBV);
• hemokine kao što su IL-8, trombocitni faktor 4, protein koji stimuliše rast melanoma, itd; • antitela ili njihove fragmente, uključujući antitela determinanta anti-T ćelija ili NK ćelija (npr. anti-CD3, anti-CD28 ili anti-CD16);
• alternativne proteinske skele sa karakteristikama vezivanja poput antitela
• aktivatore komplementa;
• ksenogene proteinske domene, alogene proteinske domene, virusne/bakterijske proteinske domene, virusne/bakterijske peptide.
[0080] Fuzioni molekuli TCR-anti-CD3 pronalaska sadrže rastvorljivi TCR i anti-CD3 antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, koje je kovalentno vezano za N- ili C-terminus alfa ili beta lanca TCR. U predmetnom pronalasku imuni efektor je anti-CD3 antitelo, ili funkcionalni fragment ili varijanta pomenutog anti-CD3 antitela (takve TCR-anti-CD3 fuzije mogu se nazvati ImmTAC<™>molekulima). Kako se ovde koristi, termin "antitelo" obuhvata takve fragmente i varijante. Primeri anti-CD3 antitela uključuju, ali nisu ograničeni na OKT3, UCHT-1, BMA-031 i 12F6. Fragmenti antitela i varijante/analozi koji su pogodni za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisanim ovde uključuju minitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, dsFv i scFv fragmente, Nanobodies<™>
2
(ovi konstrukti, koje prodaje Ablynx (Belgija), sadrže sintetički pojedinačni imunoglobulinski varijabilni teški domen dobijen iz antitela kamile (npr. kamile ili lame)) i antitela domena (Domantis (Belgija), koji sadrže afinitetno zreo pojedinačni imunoglobulinski varijabilni teški domen ili imunoglobulinski varijabilni laki domen) ili alternativne proteinske skele koje pokazuju karakteristike vezivanja poput antitela, kao što su Affibodies (Affibody (Švedska), koja sadrže konstruisani protein A skelu) ili Antiticalins (Pieris (Nemačka)), koji sadrže konstruisane antitikaline), da spomenemo samo neke.
[0081] Veza TCR i anti-CD3 antitela u fuzionim molekulima TCR-anti-CD3 pronalaska je ostvarena putem kovalentnog vezivanja. Kovalentno vezivanje može biti direktno ili indirektno preko linker sekvence. Linker sekvence su obično fleksibilne, jer se sastoje prvenstveno od aminokiselina kao što su glicin, alanin i serin, koji nemaju glomazne bočne lance koji bi verovatno ograničavali fleksibilnost. Alternativno, linkeri sa većom krutošću mogu biti poželjni. Upotrebljive ili optimalne dužine linker sekvenci mogu se lako odrediti. Često će sekvenca linkera biti manja od oko 12, kao što je manja od 10, ili od 2-10 aminokiselina u dužini. Primeri pogodnih linkera koji se mogu koristiti u fuzionom molekulu TCR-anti-CD3 pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na: GGGGS (SEQ ID NO: 31), GGGSG (SEQ ID NO: 32), GGSGG (SEQ ID NO: 33), GSGGG (SEQ ID NO: 34), GSGGGP (SEQ ID NO: 35), GGEPS (SEQ ID NO: 36), GGEGGGP (SEQ ID NO: 37) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 38) (kao što je opisano u WO2010/133828).
[0082] Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 pronalaska može da sadrži varijabilni domen alfa lanca TCR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i varijabilni domen beta lanca TCR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17. Ostali fuzioni konstrukti anti-CD3-TCR koji su ovde opisani uključuju one parove alfa i beta lanaca u kojima se alfa lanac sastoji od TCR varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6-8 i/ili beta lanac se sastoji od TCR varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9-24. Pomenuti alfa i beta lanci mogu dalje da sadrže konstantni region koji sadrži ne-nativnu disulfidnu vezu. Konstantni domen alfa lanca može biti skraćen za osam aminokiselina. N ili C terminus alfa i/ili beta lanca može biti fuzionisan sa fragmentom anti-CD3 scFv antitela preko linkera izabranog od SEQ ID NO: 31-38.
[0083] Fuzioni molekul TCR-anti CD3 pronalaska može da sadrži aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara sekvenci SEQ ID NO: 27 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara sekvenci SEQ ID NO: 28. Određeni drugi ovde opisani fuzioni konstrukti anti-CD3-TCR su dati u nastavku:
2
[0084] Unutar obima pronalaska su takođe uključene funkcionalne varijante pomenutih anti-CD3-TCR fuzionih konstrukata. Navedene funkcionalne varijante poželjno imaju najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa referentnom sekvencom, ali su ipak funkcionalno ekvivalentni.
[0085] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni molekul TCR-anti CD3 pronalaska. Nukleinska kiselina može da bude cDNK. Nukleinska kiselina može da bude iRNK. Nukleinska kiselina može da sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen α lanca TCR u fuzionom molekulu TCR-anti CD3 pronalaska. Nukleinska kiselina može da sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen β lanca TCR u fuzionom molekulu TCR-anti CD3 pronalaska. Nukleinska kiselina može biti neprirodna i/ili prečišćena i/ili konstruisana. Sekvenca nukleinske kiseline može biti optimizovana kodonom, u skladu sa korišćenim ekspresionim sistemom. Kao što je stručnjacima poznato, ekspresioni sistemi mogu uključivati bakterijske ćelije kao što su E. coli, ili ćelije kvasca, ili ćelije sisara, ili ćelije insekata, ili mogu biti sistemi ekspresije slobodnih ćelija.
[0086] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska. Pogodni TCR ekspresioni vektori uključuju, na primer, gama-retrovirusne vektore ili, poželjnije, lentivirusne vektore. Dodatni detalji se mogu naći u Zhang 2012 i reference u njemu (Zhang et al,. Adv Drug Deliv Rev.2012 Jun 1; 64(8): 756-762).
[0087] Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju koja sadrži ekspresioni vektor pronalaska. Pogodne ćelije uključuju ćelije sisara, poželjno imune ćelije, još poželjnije T ćelije. Ekspresioni vektor može da sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska koja kodira u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja, koji kodiraju alfa lanac i beta lanac fuzionog molekula TCR-anti-CD3 pronalaska, respektivno. Sledeći aspekt obezbeđuje ćeliju koja sadrži prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac fuzionog molekula TCR-anti CD3 pronalaska, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac fuzionog molekula TCR-anti CD3 pronalaska. Takve ćelije su posebno korisne u adoptivnoj terapiji. Ćelije pronalaska mogu biti izolovane i/ili rekombinantne i/ili ne-prirodne i/ili konstruisane.
[0088] Budući da su ovde opisani TCR korisni u adoptivnoj terapiji, predmetno otkriće uključuje
2
ne-prirodnu i/ili prečišćenu i/ili konstruisanu ćeliju, posebno T-ćeliju, koja predstavlja ovde opisani TCR. Otkriće takođe obezbeđuje proširenu populaciju T ćelija koje predstavljaju ovde opisani TCR. Postoji veliki broj postupaka pogodnih za transfekciju T ćelija nukleinskom kiselinom (kao što su DNK, cDNK ili RNK) koje kodiraju ovde opisane TCR (videti npr. Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). T ćelije koje eksprimiraju ovde opisane TCR biće pogodne za upotrebu u lečenju kancera zasnovanom na adoptivnoj terapiji. Kao što će biti poznato stručnjacima u ovoj oblasti, postoji niz pogodnih postupaka pomoću kojih se može sprovesti adoptivna terapija (videti npr. Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
[0089] Kao što je dobro poznato u tehnici, TCR-ovi mogu biti podložni posttranslacionim modifikacijama. Glikozilacija je jedna takva modifikacija, koja obuhvata kovalentno vezivanje oligosaharidnih delova za definisane aminokiseline u TCR lancu. Na primer, ostaci asparagina, ili ostaci serina/treonina su dobro poznate lokacije za vezivanje oligosaharida. Status glikozilacije određenog proteina zavisi od brojnih faktora, uključujući sekvencu proteina, konformaciju proteina i dostupnost određenih enzima. Štaviše, status glikozilacije (tj. tip oligosaharida, kovalentna veza i ukupan broj veza) može uticati na funkciju proteina. Stoga, kada se proizvode rekombinantni proteini, kontrola glikozilacije je često poželjna. Kontrolisana glikozilacija je korišćena za poboljšanje terapije na bazi antitela. (Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.). Za rastvorljive TCR, glikozilacija se može kontrolisati korišćenjem određenih ćelijskih linija, na primer (uključujući, ali ne ograničavajući se na ćelijske linije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK)) ili hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije mogu biti poželjne, pošto glikozilacija može poboljšati farmakokinetiku, smanjiti imunogenost i bolje imitirati prirodni humani protein (Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35).
[0090] Za primenu na pacijente, fuzioni molekuli TCR-anti CD3, nukleinske kiseline, ekspresioni vektori ili ćelije pronalaska mogu biti obezbeđeni kao deo sterilne farmaceutske kompozicije zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka primene na pacijenta). Može se obezbediti u obliku jedinične doze, generalno će biti obezbeđena u zapečaćenom kontejneru i može se obezbediti kao deo kompleta. Takav komplet bi obično (iako ne nužno) uključivao uputstva za upotrebu. Može uključivati veći broj navedenih jediničnih oblika doze.
[0091] Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za primenu na bilo koji odgovarajući način, kao što su parenteralni (uključujući subkutani, intramuskularni, intratekalni ili intravenski), enteralni (uključujući oralni ili rektalni), inhalacioni ili intranazalni putevi. Takve kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u farmaciji, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem(ima) ili ekscipijensom(ima) u sterilnim uslovima.
[0092] Doze supstanci ovog pronalaska mogu da variraju u širokim granicama, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se leči, starosti i stanja individue koja se leči, itd. odgovarajući opseg doza za TCR-anti-CD3 fuzione molekule može biti u opsegu od 25 ng/kg do 50 µg/kg ili 1 µg do 1 g. Lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti.
[0093] Fuzioni molekuli TCR-anti-CD3, farmaceutske kompozicije, ekspresioni vektori, nukleinske kiseline i ćelije pronalaska mogu se obezbediti u suštinski čistom obliku, na primer, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% čisti.
[0094] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fuzioni molekul TCR-anti-CD3, nukleinsku kiselinu, farmaceutsku kompoziciju ili ćeliju pronalaska za upotrebu u medicini, poželjno kod humanih subjekata. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje fuzioni molekul TCR-anti-CD3, nukleinsku kiselinu, farmaceutsku kompoziciju ili ćeliju pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje kancera ili tumora kod humanih subjekata. U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje injektabilnu formulaciju za primenu kod humanih subjekata koja sadrži fuzioni molekul TCR-anti-CD3 pronalaska.
[0095] Ovde su otkriveni i:
• ovde opisani TCR za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u postupku za lečenje kancera ili tumora;
• upotreba ovde opisanog TCR, fuzionog molekula TCR-anti-CD3, nukleinske kiseline, farmaceutske kompozicije ili ćelije u proizvodnji leka za lečenje kancera ili tumora;
• injektabilna formulacija za primenu na humanog subjekta koja sadrži ovde opisani TCR, nukleinsku kiselinu, farmaceutsku kompoziciju ili ćeliju.
[0096] Kancer može biti solidni ili tečni tumor. Poželjno je da tumor eksprimira PRAME. Kancer može biti dojke (uključujući trostruko negativan), jajnika, endometrijuma, jednjaka, pluća (NSCLC i SCLC), mokraćne bešike ili glave i vrata. Alternativno ili dodatno kancer može biti leukemija ili limfom. Od ovih kancera, prednost imaju kancer dojke (uključujući trostruko negativne), jajnika i endometrijuma. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija ili ćelija pronalaska mogu se primenjivati injekcijom, kao što je intravenska ili direktna intratumorska injekcija. Humani subjekat može biti podtipa HLA-A*02.
[0097] Postupak lečenja može dalje uključivati primenu odvojeno, u kombinaciji ili uzastopno, dodatnog antineoplastičnog sredstva. Primeri takvih sredstava su poznati u tehnici i mogu
1
uključivati sredstva za aktivaciju imuniteta i/ili sredstva za modulaciju T ćelija.
[0098] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju fuzionog molekula TCR-anti-CD3 pronalaska, koji obuhvata a) održavanje ćelije prema pronalasku pod optimalnim uslovima za ekspresiju lanaca TCR i b) izolovanje lanaca TCR.
[0099] Poželjne karakteristike svakog aspekta pronalaska su kao i za svaki drugi aspekt mutatis mutandis.
Opis crteža
[0100]
Slika 1 - prikazuje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnih regiona skele PRAME TCR alfa i beta lanca.
Slika 2 - prikazuje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnih regiona rastvorljive verzije skele PRAME TCR alfa i beta lanca.
Slika 3 - daje primere aminokiselinskih sekvenci mutiranih varijabilnih regiona alfa lanca PRAME TCR.
Slika 4 - daje primere aminokiselinskih sekvenci mutiranih varijabilnih regiona PRAME TCR beta lanca.
Slika 5 - daje aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula (TCR-anti-CD3 fuzije) koje sadrže određene mutirane varijabilne domene PRAME TCR kao što je prikazano na slikama 3 i 4.
Slika 6 - pruža ćelijske podatke koji demonstriraju potenciju i specifičnost ImmTAC molekula sa slike 5 koji sadrže mutirane varijabilne domene PRAME TCR kao što je prikazano na slikama 3 i 4.
Slika 7 (paneli a i b) - pružaju ćelijske podatke koji demonstriraju specifičnost ImmTAC molekula sa slike 5, koji sadrže mutirane varijabilne domene PRAME TCR kao što je prikazano na slikama 3 i 4.
Slika 8 - pruža ćelijske podatke koji pokazuju ubijanje PRAME pozitivnih ćelija kancera melanoma od strane ImmTAC molekula sa slike 5, koji sadrže mutirane varijabilne domene PRAME TCR kao što je prikazano na slikama 3 i 4.
Slika 9 - pruža ćelijske podatke koji pokazuju ubijanje PRAME pozitivnih ćelija kancera pluća od strane ImmTAC molekula sa slike 5, koji sadrže mutirane varijabilne domene PRAME TCR kao što je prikazano na slikama 3 i 4.
[0101] Pronalazak je dalje opisan u sledećim neograničavajućim primerima.
2
Primeri
Primer 1 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje rastvorljivih TCR
Postupak
[0102] DNK sekvence koje kodiraju alfa i beta ekstracelularne regione rastvorljivih TCR kao što je ovde opisano su klonirane odvojeno u ekspresione plazmide zasnovane na pGMT7 korišćenjem standardnih postupaka (kao što je opisano u Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbour laboratory press). Ekspresioni plazmidi su transformisani odvojeno u E. coli soj Rosetta (BL21pLysS), ili T7 Express, i pojedinačne kolonije otporne na ampicilin su uzgajane na 37°C u TYP (+ ampicilin 100 µg/ml) medijumu do OD600od ~0.6-0.8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0.5 mM IPTG. Ćelije su sakupljene tri sata nakon indukcije centrifugiranjem. Ćelijski peleti su lizirani reagensom za ekstrakciju proteina BugBuster (Merck Millipore) prema uputstvima proizvođača. Peleti inkluzijskog tela su dobijeni centrifugiranjem. Peleti su dva puta isprani u Triton puferu (50 mM Tris-HCl pH 8.1, 0.5% Triton-X100, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) i na kraju resuspendovani u puferu bez deterdženta (50 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA). Prinos proteina inkluzijskog tela je kvantitativno određen rastvaranjem sa 6 M guanidin-HCl i merenjem OD280. Koncentracija proteina je zatim izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije. Čistoća inkluzijskog tela je merena rastvaranjem sa 8M uree i spanjem ~2 µg na 4-20% SDS-PAGE u redukcionim uslovima. Čistoća je zatim procenjena ili izračunata korišćenjem softvera za denzitometriju (Chemidoc, Biorad). Inkluziona tela su čuvana na 4°C za kratkotrajno skladištenje i na -20°C ili -70°C za dugotrajno skladištenje.
[0103] Za ponovno savijanje rastvorljivog TCR-a, inkluziona tela koja sadrže α i β lanac su prvo pomešana i razblažena u 10 ml pufera za solubilizaciju/denaturaciju (6 M guanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM NaCl, 10 mM 20 mM EDTA) nakon čega sledi inkubacija od 30 min na 37°C. Ponovno savijanje je zatim započeto daljim razblaživanjem u 1 L refold pufera (100 mM Tris pH 8.1, 800 ili 1000 mM L-arginin HCL, 2 mM EDTA, 4 M uree, 10 mM cisteamin hidrohlorida i 2.5 mM cisteamin dihidrohlorida) i rastvor je dobro izmešan. Ponovo savijena smeša je dijalizovana protiv 10 L H2O tokom 18-20 sati na 5 °C ± 3 °C. Posle ovog vremena, pufer za dijalizu je dva puta zamenjen sa 10 mM Tris pH 8.1 (10 L) i dijaliza je nastavljena još 15 sati. Smeša za ponovno savijanje je zatim filtrirana kroz celulozne filtere od 0.45 µm.
[0104] Prečišćavanje rastvorljivih TCR je započeto nanošenjem dijalizovanog refolda na POROS<®>50HQ kolonu za anjonsku izmenu i eluiranje vezanog proteina sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM Tris pH 8.1 preko 6 zapremina kolone korišćenjem Akta<®>Pure (GE Healthcare). Maksimalne TCR frakcije su identifikovane pomoću SDS PAGE pre nego što su objedinjene i koncentrovane. Koncentrovani uzorak je zatim primenjen na Superdex<®>200 Increase 10/300 GL kolonu za gel filtraciju (GE Healthcare) prethodno ekvilibrisanu u Dulbecco-ovom PBS puferu. Maksimalne TCR frakcije su sakupljene i koncentrovane i izračunat je konačni prinos prečišćenog materijala.
Primer 2 – Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje ImmTAC molekula (rastvorljivi TCR-anti CD3 fuzioni molekuli)
Postupak
[0105] Priprema ImmTAC-a je izvedena kao što je opisano u Primeru 1, osim što je TCR beta lanac fuzionisan preko linkera sa anti-CD3 jednolančanim antitelom. Pored toga, izveden je korak izmene katjona tokom prečišćavanja nakon izmene anjona. U ovom slučaju frakcije pikova iz anjonske razmene su razblažene 20 puta u 20mM MES (pH6.5) i primenjene na POROS<®>50HS kolonu za izmenu katjona. Vezani protein je eluiran sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM MES. Maksimalne frakcije ImmTAC su sakupljene i podešene na 50 mM Tris pH 8.1, pre nego što su koncentrovane i nanete direktno na matricu za gel filtraciju kao što je opisano u Primeru 1.
Primer 3 - Karakterizacija vezivanja
[0106] Analiza vezivanja prečišćenih rastvorljivih TCR-a i ImmTAC molekula za relevantni kompleks peptid-HLA sprovedena je površinskom plazmonskom rezonancom, korišćenjem BIAcore 3000 ili BIAcore T200 instrumenta, ili bioslojnom interferometrijom, koristeći ForteBio Octet instrument). Biotinilovani molekuli HLA-A*02 klase I ponovo su presavijeni sa peptidom od interesa i prečišćeni korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). Sva merenja su izvedena na 25°C u Dulbecco-vom PBS puferu, dopunjenom sa 0.005% P20.
BIAcore postupak
4
[0107] Biotinilovani peptid-HLA monomeri su imobilisani na CM-5 senzorskim čipovima spojenim sa streptavidinom. Konstante ravnoteže vezivanja su određene korišćenjem serijskih razblaženja rastvorljivog TCR/ImmTAC injektiranih pri konstantnoj brzini protoka od 30 µl min<-1>preko protočne ćelije obložene sa ~200 jedinica odgovora (RU) kompleksa peptid-HLA-A*02. Ravnotežni odgovori su normalizovani za svaku TCR koncentraciju oduzimanjem puferskog odgovora na kontrolnoj protočnoj ćeliji koja sadrži irelevantan peptid-HLA. KDvrednost je dobijena aproksimacijom nelinearne krive korišćenjem softvera Prism i Langmuirove izoterme vezivanja, vezan = C*Max/(C KD), gde je „vezan“ ravnotežno vezivanje u RU pri ubrizganoj TCR koncentraciji C, a Max je maksimalno vezivanje.
[0108] Za interakcije visokog afiniteta, parametri vezivanja su određeni analizom kinetike jednog ciklusa. Pet različitih koncentracija rastvorljivog TCR/ImmTAC je ubrizgano preko protočne ćelije obložene sa ~100 - 200 RU kompleksa peptid-HLA korišćenjem brzine protoka od 50-60 µl min<-1>. Tipično, 60-120 µl rastvorljivog TCR/ImmTAC je ubrizgano u najvišoj koncentraciji između 50-100 nM, uz uzastopna 2 puta razblaženja koja su korišćena za ostale četiri injekcije. Prvo je ubrizgana najniža koncentracija. Da bi se izmerila faza disocijacije, pufer je zatim ubrizgavan dok se ne dogodi ≥ 10% disocijacije, obično posle 1 - 3 sata. Kinetički parametri su izračunati korišćenjem BIAevaluation<®>softvera. Faza disocijacije je prilagođena jednoj eksponencijalnoj jednačini raspada koja omogućava izračunavanje vremena poluraspada. Konstanta ravnoteže KDizračunata je iz koff/kon.
Postupak okteta
[0109] Biotinilovani peptid-HLA monomeri su uhvaćeni do 1 nm na (SA) streptavidin biosenzore (Pall ForteBio) prethodno imobilizovane sa streptavidinom. Senzori su blokirani slobodnim biotinom (2 µM) tokom 2 minuta. Konstante ravnoteže vezivanja su određene uranjanjem napunjenih biosenzora u rastvorljiv TCR/ImmTAC serijski razblažen u ploči za uzorke sa 96 ili 384 bunarića. Mućkanje ploče je podešeno na 1000 obrtaja u minuti. Za interakcije niskog afiniteta (opseg µM) korišćeno je kratko vreme asocijacije (~2 minuta) i kratko vreme disocijacije (~2 minuta). Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem referentnih biosenzora napunjenih irelevantnim pHLA koristeći Octet Data Analysis Software (Pall ForteBio). Odgovori (nm) u ravnoteži su korišćeni za procenu KDvrednost iz dijagrama stacionarnog stanja prilagođenih jednačini Odgovor = Rmax*konc/(KD konc), gde je "odgovor" ravnotežno vezivanje u nm pri svakoj koncentraciji TCR (konc) i Rmax je maksimalni odgovor vezivanja pri pHLA zasićenju.
[0110] Za interakcije visokog afiniteta (opseg nM - pM), kinetički parametri su određeni iz krivih vezivanja pri ≥ 3 TCR/ImmTAC koncentracijama tipično 10 nM, 5 nM i 2.5 nM. Vreme asocijacije je bilo 30 minuta, a vreme disocijacije 1-2 sata. Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem referentnih biosenzora napunjenih irelevantnim pHLA i blokiranih biotinom. Kinetički parametri koni koffizračunati su globalnim uklapanjem direktno na krive vezivanja korišćenjem Octet Data Analysis Software (Pall ForteBio). KDizračunato je od koff/kon, a polu-vreme disocijacije je izračunato iz t1/2= 0.693/koff.
Primer 4 - Karakterizacija vezivanja nativnog TCR-a
[0111] Rastvorljivi prirodni TCR je pripremljen prema postupcima opisanim u Primeru 1, a vezivanje za pHLA analizirano prema Primeru 3. Aminokiselinske sekvence alfa i beta lanaca su odgovarale onima prikazanim na Slici 2. Rastvorljivi biotinilovani HLA-A*02 je pripremljen sa PRAME peptidom SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) i imobilisan na BIAcore senzorski čip.
Rezultati
[0112] Vezivanje je određeno pri različitim koncentracijama i KDvrednost za interakciju je određena na 141 µM. Unakrsna reaktivnost (specifičnost) je procenjena prema panelu od 14 irelevantnih peptidnih HLA-A*02 kompleksa korišćenjem ravnotežnog BIAcore postupka iz Primera 3.14 irelevantnih pHLA je podeljeno u tri grupe i stavljeno u jednu od tri protočne ćelije, da bi se dobilo približno 1000 RU svake pHLA po protočnoj ćeliji. 30 µL rastvorljivog divljeg tipa TCR je ubrizgano u koncentracijama od 130 i 488 µM preko svih protočnih ćelija brzinom od 20 µL/min. Ni u jednoj koncentraciji nije otkriveno značajno vezivanje, što ukazuje da je nativni TCR specifičan za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02.
[0113] Ovi podaci ukazuju da ovaj prirodni TCR ima karakteristike koje su pogodne za upotrebu kao početna sekvenca za inženjering terapijskih TCR-a visokog afiniteta.
Primer 5 - Karakterizacija vezivanja određenih mutiranih TCR
[0114] Mutirane TCR alfa i beta aminokiselinske sekvence varijabilnog domena, date na slikama 3 i 4 (SEQ ID NO: 6-24), korišćene su za pripremu ImmTAC molekula. Imajte na umu da je nađeno da uključivanje ostatka glicina na početku alfa lanca (-1 pozicija u odnosu na numerisanje SEQ ID NO: 2) poboljšava efikasnost cepanja N terminalnog metionina tokom proizvodnje u E.coli. Neefikasno cepanje može biti štetno za terapeutik, jer može dovesti do heterogenog proteinskog proizvoda i ili prisustvo inicijacionog metionina može biti imunogeno kod ljudi. Pune aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže sledeće alfa i beta lance date su na slici 5
• a28b50 - ImmTAC1
• a79b74 - ImmTAC2
• a79b46 - ImmTAC3
[0115] Molekuli su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 2 i vezivanje za kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 je određeno prema Primeru 3.
Rezultati
[0116] Podaci predstavljeni u tabeli ispod pokazuju da ImmTAC molekuli koji sadrže naznačene sekvence TCR varijabilnog domena prepoznaju kompleks SLLQHLIGL-HLA-A*02 sa posebno pogodnim afinitetom i/ili poluživotom.
Primer 6 - Karakterizacija potencije i specifičnosti određenih mutiranih TCR
[0117] ImmTAC molekuli koji sadrže iste sekvence TCR varijabilnog domena kao što je navedeno u Primeru 5 su procenjene na njihovu sposobnost da posreduju u snažnom i specifičnom preusmeravanju CD3+ T ćelija protiv PRAME pozitivnih ćelija kancera. Oslobađanje interferonaγ (IFN-γ) je korišćeno kao očitavanje za aktivaciju T ćelija. Pune aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje se sastoje od sledećih alfa i beta lanaca date su na slici 5
• a28b50 - ImmTAC1
• a79b74 - ImmTAC2
• a79b46 - ImmTAC3
[0118] Testovi su izvedeni korišćenjem humanog IFN-γ ELISPOT kompleta (BD Biosciences) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ciljne ćelije su pripremljene u gustini od 1 × 10<6>/ml u medijumu za ispitivanje (RPMI 1640 koji sadrži 10% toplotno inaktiviranog FBS-a i 1% penicilinstreptomicin-L-glutamina) i nanete na 50000 ćelija po bunarčiću u zapremini od 50 µl. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), izolovane iz sveže donorske krvi, korišćene su kao efektorske ćelije i postavljene na 50000 ćelija po bunarčiću u zapremini od 50 µl (tačan broj ćelija korišćenih za svaki eksperiment zavisi od donora i može se podesiti da proizvede odgovor u okviru odgovarajućeg opsega za test). ImmTAC molekuli su titrirani da bi se dobile konačne koncentracije od 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM i 0.001 nM, koje obuhvataju očekivani klinički relevantan opseg, i dodati u bunarčić u zapremini od 50 µl.
[0119] Ploče su pripremljene prema uputstvima proizvođača. Ciljne ćelije, efektorske ćelije i ImmTAC molekuli su dodati u relevantne bunarčiće i dopunjeni do konačne zapremine od 200 µl sa medijumom za ispitivanje. Sve reakcije su izvedene u tri primerka. Kontrolni bunarčići su takođe pripremljeni bez ImmTAC-a, efektorskih ćelija ili ciljnih ćelija. Ploče su zatim inkubirane preko noći (37°C/5% CO2). Sledećeg dana ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje (1xPBS kesica, koja sadrži 0.05% Tween-20, pripremljena u dejonizovanoj vodi). Primarno detekciono antitelo je zatim dodato u svaki bunarčić u zapremini od 50 µl. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 2 sata pre nego što su ponovo tri puta isprane. Sekundarna detekcija je izvedena dodavanjem 50 µl razblaženog streptavidina-HRP u svaki bunarčić i inkubacijom na sobnoj temperaturi 1 sat i korak ispiranja je ponovljen. Ne više od 15 minuta pre upotrebe, jedna kap (20 µl) AEC hromogena je dodata u svaki 1 ml AEC supstrata i izmešana i dodato je 50 µl u svaki bunarčić. Razvoj mrlja je redovno praćen i ploče su isprane u vodi iz slavine da bi se prekinula reakcija razvoja. Ploče su zatim ostavljene da se osuše na sobnoj temperaturi najmanje 2 sata pre brojanja mrlja korišćenjem CTL analizatora sa softverom Immunospot (Cellular Technology Limited).
[0120] U ovom primeru, sledeće linije ćelija kancera su korišćene kao ciljne ćelije:
Rezultati
[0121] Svaki od ImmTAC molekula, koji sadrži alfa i beta varijabilne domene navedene u tabeli ispod, pokazao je snažnu aktivaciju preusmerenih T ćelija u prisustvu Mel624 ćelija pozitivnih na antigen. U svakom slučaju, vrednosti EC50 su izračunate iz podataka i prikazane su u tabeli ispod. Pored toga, svaki ImmTAC molekul je pokazao minimalno ili nikakvo prepoznavanje dve antigen negativne, HLA-A*02 pozitivne ćelije, u koncentraciji do 1 nM. ImmTAC molekuli takođe nisu pokazali prepoznavanje PRAME pozitivnih ćelija koje su HLA-A*02 negativne (podaci nisu prikazani). Slika 6 prikazuje reprezentativne podatke za četiri ImmTAC molekula navedena u tabeli ispod.
[0122] Ovi podaci pokazuju da ImmTAC molekuli koji sadrže mutirane TCR sekvence varijabilnog domena kako je ovde opisano mogu posredovati u snažnom i specifičnom preusmeravanju T ćelija protiv PRAME pozitivnih, HLA-A*02 pozitivnih ćelija kancera, u opsegu koncentracija pogodnim za terapeutsku upotrebu.
Primer 7 - Dalja karakterizacija specifičnosti određenih mutiranih TCR
4
[0123] Da bi se dalje demonstrirala specifičnost ImmTAC molekula koji sadrže mutirane TCR sekvence, izvršeno je dalje testiranje korišćenjem iste ELISPOT metodologije kao što je opisano u Primeru 6, sa panelom normalnih ćelija izvedenih iz zdravih ljudskih tkiva kao ciljnih ćelija. • Normalna tkiva su uključivala kardiovaskularna, bubrežna, skeletnih mišića, plućna, vaskularna, jetre i mozga. U svakom slučaju kao pozitivna kontrola korišćene su ćelije kancera Mel624 pozitivne na antigen.
[0124] Podaci predstavljeni u ovom primeru uključuju ImmTAC molekule koji sadrže sledeće TCR alfa i beta lance
• a28b50
• a79b74
• a79b46
• a79b77
[0125] Pune aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže a28b50, a79b74 i a79b46 date su na slici 5 (ImmTAC 1-3 respektivno)
Rezultati
[0126] Podaci predstavljeni na slici 7 (panel a) pokazuju da ImmTAC molekuli koji sadrže mutirane alfa i beta lance a28b50 i a79b46 pokazuju minimalnu reaktivnost prema panelu od 8 normalnih ćelija u odnosu na ćelije kancera pozitivne na antigen u koncentraciji do 1 nM. Slično, podaci na slici 7 (panel b) pokazuju da ImmTAC molekuli koji sadrže a28b57 i a79b46 pokazuju minimalnu reaktivnost prema panelu od 4 normalne ćelije u odnosu na antigen pozitivne ćelije kancera u koncentraciji do 1 nM.
Primer 8 - Ubijanje ćelija kancera posredovano određenim mutiranim TCR
[0127] Sposobnost ImmTAC molekula koji sadrže mutirane TCR sekvence da posreduju u snažnom preusmerenom ubijanju tumorskih ćelija pozitivnih na antigen od strane T ćelija ispitana je korišćenjem IncuCite platforme (Essen BioScience). Ovaj test omogućava detekciju u realnom vremenu mikroskopijom oslobađanja kaspaze-3/7, markera za apoptozu.
Postupak
[0128] Testovi su izvedeni korišćenjem kompleta za analizu apoptoze Caspase-3/7 sa 96 bunarčića CellPlayer (Essen BioScience, Kat. br.4440) i sprovedeni prema protokolu proizvođača. Ukratko, ciljne ćelije (Mel624 (PRAME+ve HLA-A*02+ve) ili NCI-H1755) su postavljene na 10000 ćelija po bunarčiću i inkubirane preko noći da bi im se omogućilo da prianjaju. ImmTAC molekuli su pripremljeni u različitim koncentracijama i po 25 µl svakog je dodato u odgovarajući bunarčić tako da su konačne koncentracije bile između 1 pM i 100 pM. Efektorske ćelije su korišćene u odnosu efektorskih ciljnih ćelija od 10:1 (100000 ćelija po bunarčiću). Kontrolni uzorak bez ImmTAC-a je takođe pripremljen zajedno sa uzorcima koji sadrže ili same efektorske ćelije ili same ciljne ćelije. NucView reagens za analizu je napravljen na 30 µM i 25 µl je dodato u svaki bunarčić i konačna zapremina je dovedena do 150 µl (dajući 5 µM konačnog konc.). Ploča je stavljena u instrument IncuCite i slike su snimane svaka 2 sata (1 slika po otvoru) tokom 3 dana. Broj apoptotičkih ćelija na svakoj slici je određen i zabeležen kao apoptotičke ćelije po mm<2>. Testovi su izvedeni u tri primerka.
[0129] Podaci predstavljeni u ovom primeru uključuju ImmTAC molekule koji sadrže sledeće TCR alfa i beta lance
• a28b50
• a79b74
• a79b46
[0130] Pune aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže a28b50, a79b74 i a79b46 date su na slici 5 (ImmTAC 1, 2 i 3 respektivno).
Rezultati
[0131] Podaci predstavljeni na slikama 8 i 9 pokazuju ubijanje ćelija kancera pozitivnih na antigen u realnom vremenu (ćelijske linije melanoma Mel624 na slici 8 i ćelijska linija kancera pluća NCI-H1755 na slici 9) u prisustvu ImmTAC molekula koji sadrže mutirane TCR sekvence, u koncentraciji od 100 pM ili niže. Nije primećeno ubijanje u odsustvu ImmTAC molekula.

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 koji sadrži rastvorljivi TCR i anti-CD3 antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, koje je kovalentno vezano za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR, gde TCR ima svojstvo vezivanja za kompleks SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 i sadrži varijabilni domen alfa lanca TCR i varijabilni domen beta lanca TCR, od kojih svaki sadrži FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, gde je FR okvirni region, a CDR region koji određuje komplementarnost, pri čemu
(a) CDR regioni alfa lanca imaju sledeće sekvence:
CDR1 - TISGTDY (SEQ ID NO: 39)
CDR2 - GLTSN (SEQ ID NO: 40)
CDR3 - CILILGHSRLGNYIATF (SEQ ID NO: 46)
i
(b) CDR regioni beta lanca imaju sledeće sekvence:
CDR1 - LNHDA (SEQ ID NO: 42)
CDR2 - SQIMGDE (SEQ ID NO: 48)
CDR3 - CASSWWTGGASPIRF (SEQ ID NO: 58).
2. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema zahtevu 1, gde okvirni regioni varijabilnog domena alfa lanca TCR sadrže sledeće sekvence:
FR1 - aminokiseline 1-25 SEQ ID NO: 2
FR2 - aminokiseline 33-49 SEQ ID NO: 2
FR3 - aminokiseline 55-87 SEQ ID NO: 2
FR4 - aminokiseline 105-114 SEQ ID NO: 2
ili odgovarajuće sekvence koje imaju najmanje 90% identičnosti sa navedenim sekvencama, i
okvirni regioni varijabilnog domena beta lanca TCR sadrže sledeće sekvence:
FR1 - aminokiseline 1-26 SEQ ID NO: 3
FR2 - aminokiseline 32-48 SEQ ID NO: 3
FR3 - aminokiseline 56-90 SEQ ID NO: 3
FR4 - aminokiseline 106-114 SEQ ID NO: 3
ili odgovarajuće sekvence koje imaju najmanje 90% identičnosti sa navedenim sekvencama.
4
3. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde FR1 varijabilnog regiona alfa lanca TCR ima G ostatak na poziciji -1, kada se koristi numeracija sekvence SEQ ID NO: 2.
4. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde varijabilni domen alfa lanca TCR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, a varijabilni domen beta lanca TCR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17.
5. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je TCR alfa-beta heterodimer, koji ima sekvencu konstantnog domena TRAC alfa lanca i sekvencu konstantnog domena TRBC1 ili TRBC2 beta lanca, izborno pri čemu su sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom za deleciju nativne disulfidne veze između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2, dalje izborno gde su sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca modifikovane supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu pomenuti cisteini formiraju ne-nativnu disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.
6. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je TCR u jednolančanom formatu tipa Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, ili Vα-L-Vβ-Cβ, pri čemu Vα i Vβ su TCR α i β varijabilni regioni respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno i L je sekvenca linkera.
7. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde je anti-CD3 antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, kovalentno vezano za N-terminus ili C-terminus beta lanca TCR preko sekvence linkera izabrane iz grupe koja se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO: 31), GGGSG (SEQ ID NO: 32), GGSGG (SEQ ID NO: 33), GSGGG (SEQ ID NO: 34), GSGGGP (SEQ ID NO: 35), GGEPS (SEQ ID NO: 36), GGEGGGP (SEQ ID NO: 37) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 38).
8. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde je anti-CD3 antitelo, ili njegov funkcionalni fragment, kovalentno vezano za N-terminus beta lanca TCR i/ili gde je anti-CD3 antitelo scFv.
9. Nukleinska kiselina koja kodira fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od prethodnih zahteva.
10. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 9.
11. Ćelija koja sadrži
(a) ekspresioni vektor prema zahtevu 10 koji kodira alfa i beta lance fuzionog molekula TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8, u jednom otvorenom okviru čitanja, ili u dva različita otvorena okvira čitanja; ili
(b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac fuzionog molekula TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac fuzionog molekula TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fuzioni molekul TCR-anti CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili ćeliju prema zahtevu 11, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.
13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12, gde je farmaceutska kompozicija prilagođena za parenteralnu primenu, opciono za subkutanu ili intravensku primenu.
14. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili nukleinska kiselina prema zahtevu 9, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, ili ćelija prema zahtevu 11, za upotrebu u medicini, poželjno kod humanog subjekta.
15. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili nukleinska kiselina prema zahtevu 9, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, ili ćelija prema zahtevu 11, za upotrebu u postupku za lečenje kancera ili tumora kod humanog subjekta.
16. Fuzioni molekul TCR-anti-CD3, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija, ili ćelija za upotrebu prema zahtevu 15, gde
humani subjekat ima tumor koji eksprimira PRAME, i/ili
tumor je solidni tumor, i/ili
humani subjekat je podtipa HLA-A*02, i/ili
fuzioni molekul TCR-anti-CD3, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija ili ćelija se primenjuju injekcijom, kao što je intravenska ili direktna intratumorska injekcija.
17. Injektabilna formulacija za primenu kod humanog subjekta koja sadrži fuzioni molekul TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8.
18. Postupak za proizvodnju fuzionog molekula TCR-anti-CD3 prema bilo kom od zahteva 1 do 8, koji sadrži a) održavanje ćelije prema zahtevu 11 pod optimalnim uslovima za ekspresiju lanaca TCR i b) izolovanje lanaca TCR.
4
RS20240811A 2017-06-20 2018-06-19 T ćelijski receptori RS65745B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1709866.6A GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-06-20 T cell receptors
EP22216199.4A EP4219542B1 (en) 2017-06-20 2018-06-19 T cell receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65745B1 true RS65745B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=59462408

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240811A RS65745B1 (sr) 2017-06-20 2018-06-19 T ćelijski receptori
RS20230427A RS64244B1 (sr) 2017-06-20 2018-06-19 T ćelijski receptori

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230427A RS64244B1 (sr) 2017-06-20 2018-06-19 T ćelijski receptori

Country Status (25)

Country Link
US (4) US11718657B2 (sr)
EP (3) EP4219542B1 (sr)
JP (2) JP7720685B2 (sr)
KR (2) KR102804045B1 (sr)
CN (1) CN111148756B (sr)
AU (2) AU2018286984B2 (sr)
BR (1) BR112019027291A2 (sr)
CA (1) CA3067163A1 (sr)
DK (2) DK4219542T3 (sr)
ES (2) ES2942765T3 (sr)
FI (2) FI4219542T3 (sr)
GB (1) GB201709866D0 (sr)
HR (2) HRP20240998T1 (sr)
HU (2) HUE062008T2 (sr)
IL (1) IL271435A (sr)
LT (2) LT4219542T (sr)
MX (2) MX2019015532A (sr)
PL (2) PL3642224T3 (sr)
PT (2) PT4219542T (sr)
RS (2) RS65745B1 (sr)
RU (1) RU2762255C2 (sr)
SI (2) SI3642224T1 (sr)
SM (2) SMT202300171T1 (sr)
WO (1) WO2018234319A1 (sr)
ZA (1) ZA202306640B (sr)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Immunocore Ltd T cell receptors
RS65139B1 (sr) 2019-01-17 2024-02-29 Immunocore Ltd Formulacije
GB201901305D0 (en) * 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
NZ783169A (en) 2019-06-25 2024-12-20 Gilead Sciences Inc Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
WO2021046072A1 (en) * 2019-09-06 2021-03-11 Eli Lilly And Company Proteins comprising t-cell receptor constant domains
JP2023503416A (ja) * 2019-11-18 2023-01-30 バイオエヌテック エスエー Ｐｒａｍｅ ｔｃｒ受容体及びその使用
PH12022551857A1 (en) * 2020-01-24 2024-01-03 Regeneron Pharma Preferentially expressed antigen in melanoma (prame) t cell receptors and methods of use thereof
WO2021163064A2 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to ccr8 and uses thereof
JP7644421B2 (ja) * 2020-10-07 2025-03-12 ダアン バイオセラピュティクス カンパニー、リミテッド Ｔ細胞受容体、ｔ細胞受容体を含む免疫細胞およびそれを用いる方法｛ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ｝
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
BR112023022765A2 (pt) 2021-05-05 2024-01-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Proteínas de ligação ao antígeno que ligam especificamente o prame
EP4334331A1 (en) * 2021-05-07 2024-03-13 Medigene Immunotherapies GmbH Combination of prame specific t cell receptors and chimeric co-stimulatory receptors
WO2022245671A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Gilead Sciences, Inc. Methods of using flt3l-fc fusion proteins
CA3234909A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
JP7787991B2 (ja) 2021-10-29 2025-12-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｃｄ７３化合物
JP2024542682A (ja) 2021-12-01 2024-11-15 イムノコア リミテッド 治療
WO2023122615A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
JP2024546851A (ja) 2021-12-22 2024-12-26 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｉｋａｒｏｓジンクフィンガーファミリー分解剤及びその使用
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
TW202346277A (zh) 2022-03-17 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 Ｉｋａｒｏｓ鋅指家族降解劑及其用途
JP2025513258A (ja) 2022-04-21 2025-04-24 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｋｒａ ｇ１２ｄ調節化合物
AU2023298558A1 (en) 2022-07-01 2024-12-19 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024013401A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Gadeta B.V. Novel method for identifying gamma t-cell (or delta t-cell) receptor chains (or gammadelta t-cell receptors) or fragments thereof that mediate an anti-tumour or an anti-infective response
JP2025526817A (ja) * 2022-08-12 2025-08-15 アバタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 多発性硬化症のための細胞療法
CN120112556A (zh) 2022-08-18 2025-06-06 英美偌科有限公司 多结构域结合分子
TW202413409A (zh) 2022-08-18 2024-04-01 英商英美偌科有限公司 多域結合分子
CA3264964A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited MULTI-DOMAIN BONDING MOLECULES
IL319653A (en) * 2022-10-05 2025-05-01 Tscan Therapeutics Inc Immunogenic PRAME peptides, binding proteins that recognize immunogenic PRAME peptides and uses thereof
WO2024100136A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Gadeta B.V. Novel method for obtaining gamma t-cell (or delta t-cell) receptor chains (or gamma delta t-cell receptors) or fragments thereof that mediate an anti-tumour or an anti-infective response
GB202218754D0 (en) * 2022-12-13 2023-01-25 Adaptimmune Ltd T cell receptor
AU2023409398A1 (en) 2022-12-22 2025-06-05 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024148397A1 (en) * 2023-01-09 2024-07-18 Myrio Therapeutics Pty Ltd Binding agents for prame peptide-mhc complex
CN118754968A (zh) * 2023-03-14 2024-10-11 新景智源生物科技(苏州)有限公司 特异性识别prame抗原的tcr及其与cd8共表达来重定向cd4 t细胞
EP4695260A1 (en) 2023-04-11 2026-02-18 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
WO2024220917A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
CN118047853B (zh) * 2023-06-28 2024-11-15 立凌生物制药(苏州)有限公司 识别肿瘤相关抗原的tcr分子及其用途
US20250042922A1 (en) 2023-06-30 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
TW202519517A (zh) 2023-07-26 2025-05-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
CN121568935A (zh) 2023-07-26 2026-02-24 吉利德科学公司 Parp7抑制剂
TW202519257A (zh) 2023-08-01 2025-05-16 英商英美偌科有限公司 治療皮膚黑色素瘤之方法
WO2025054530A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine-containing polycyclic derivatives as kras g12d modulating compounds
WO2025054347A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
GB202315181D0 (en) 2023-10-03 2023-11-15 Immunocore Ltd Peptide-HLA binding molecules
WO2025094054A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Immunocore Limited Method for purifying small multi-domain proteins
WO2025096589A1 (en) 2023-11-03 2025-05-08 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US20250230168A1 (en) 2023-12-22 2025-07-17 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
GB202320012D0 (en) 2023-12-22 2024-02-07 Immunocore Ltd Bispecific molecules
CN117624340B (zh) * 2024-01-23 2024-04-30 北京臻知医学科技有限责任公司 识别人乙型肝炎病毒（hbv）抗原的t细胞受体（tcr）及其用途
TW202544042A (zh) 2024-03-13 2025-11-16 英商英美偌科有限公司 治療prame陽性癌症之方法
WO2025224692A1 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Immunocore Limited Method of treating cancer using a gene expression signature
WO2025245003A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
GB2641580A (en) 2024-06-07 2025-12-10 T Therapeutics Ltd Tumour-transforming multispecific proteins
WO2026039365A1 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039482A1 (en) 1997-03-07 1998-09-11 Sunol Molecular Corporation Fusion proteins comprising bacteriophage coat protein and a single-chain t cell receptor
KR100712256B1 (ko) 1997-10-02 2007-04-27 알토 바이오사이언스 코포레이션 가용성 단일쇄 ｔ-세포 수용체 단백질
AU5076301A (en) 1999-12-06 2001-07-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The High affinity tcr proteins and methods
EP1259601A2 (en) 2000-02-22 2002-11-27 Ahuva Nissim Chimeric and tcr phage display libraries, chimeric and tcr reagents and methods of use thereof
CA2457652C (en) 2001-08-31 2012-08-07 Avidex Limited Soluble t cell receptor
EP1549748B1 (en) 2002-10-09 2014-10-01 Immunocore Ltd. Single chain recombinant t cell receptors
ES2327229T3 (es) 2002-11-09 2009-10-27 Immunocore Ltd. Presentacion del receptor de linfocitos t.
DE602005022595D1 (de) 2004-06-29 2010-09-09 Immunocore Ltd Einen modifizierten t-zellen-rezeptor exprimierende zellen
AU2008230240B2 (en) * 2007-03-26 2012-09-13 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc PRAME derived peptides and immunogenic compositions comprising these
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
GB0911566D0 (en) * 2009-07-03 2009-08-12 Immunocore Ltd T cell receptors
CN102869682B (zh) * 2009-11-18 2016-10-19 曼康公司 单克隆抗体及其诊断用途
US9228007B1 (en) * 2010-03-11 2016-01-05 The Regents Of The University Of California Recombinant human progenitor cells, engineered human thymocytes, and engineered human T cells
RU2020108070A (ru) 2012-07-27 2020-03-16 Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Иллинойс Конструирование t-клеточных рецепторов
GB201223172D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Immunocore Ltd Method
RU2590701C2 (ru) * 2013-04-29 2016-07-10 Общество с ограниченной ответственностью "ГеноТехнология" Антигенная композиция и ее терапевтическое применение для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, а также способ получения белка
GB201314404D0 (en) 2013-08-12 2013-09-25 Immunocore Ltd T Cell Receptors
ES2740930T3 (es) 2014-03-14 2020-02-07 Immunocore Ltd Bibliotecas de TCR
EP4219544A1 (en) * 2015-03-10 2023-08-02 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Leids Universitair Medisch Centrum T-cell receptors directed against the preferentially expressed antigen of melanoma and uses thereof
WO2016170348A2 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Mina Therapeutics Limited Sarna compositions and methods of use
HK1252998A1 (zh) * 2015-05-22 2019-06-06 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Prame肽专一性类t细胞受体抗体
GB201521894D0 (en) * 2015-12-11 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
CN106699874B (zh) * 2016-03-29 2018-06-05 广东香雪精准医疗技术有限公司 识别prame抗原短肽的t细胞受体
CN110139873A (zh) * 2016-10-03 2019-08-16 朱诺治疗学股份有限公司 Hpv特异性结合分子
GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Immunocore Ltd T cell receptors

Also Published As

Publication number Publication date
CN111148756B (zh) 2024-06-14
KR102804045B1 (ko) 2025-05-12
FI3642224T3 (fi) 2023-06-19
US20230416335A1 (en) 2023-12-28
US20210355188A1 (en) 2021-11-18
EP4219541A2 (en) 2023-08-02
CA3067163A1 (en) 2018-12-27
IL271435A (en) 2020-01-30
DK3642224T3 (da) 2023-06-06
MX2024001522A (es) 2024-02-23
US20240368243A1 (en) 2024-11-07
SMT202300171T1 (it) 2023-07-20
WO2018234319A1 (en) 2018-12-27
PL3642224T3 (pl) 2023-07-17
RU2762255C2 (ru) 2021-12-17
EP4219542B1 (en) 2024-05-01
KR20200019211A (ko) 2020-02-21
EP4219541A3 (en) 2023-08-09
EP4219542A3 (en) 2023-08-30
ZA202306640B (en) 2023-11-29
JP7720685B2 (ja) 2025-08-08
PL4219542T3 (pl) 2024-09-16
DK4219542T3 (da) 2024-07-22
HRP20240998T1 (hr) 2024-10-25
US11718657B2 (en) 2023-08-08
KR20250065724A (ko) 2025-05-13
LT3642224T (lt) 2023-04-25
RU2019142600A3 (sr) 2021-07-20
US20220177541A1 (en) 2022-06-09
BR112019027291A2 (pt) 2020-07-14
SI4219542T1 (sl) 2024-08-30
FI4219542T3 (fi) 2024-08-01
GB201709866D0 (en) 2017-08-02
MX2019015532A (es) 2020-08-17
HUE062008T2 (hu) 2023-09-28
EP3642224A1 (en) 2020-04-29
AU2024203359A1 (en) 2024-06-13
PT4219542T (pt) 2024-07-26
JP2023145483A (ja) 2023-10-11
RS64244B1 (sr) 2023-06-30
CN111148756A (zh) 2020-05-12
SMT202400296T1 (it) 2024-09-16
RU2019142600A (ru) 2021-07-20
LT4219542T (lt) 2024-06-10
PT3642224T (pt) 2023-04-26
EP4219542A2 (en) 2023-08-02
HRP20230542T1 (hr) 2023-08-04
JP2020529191A (ja) 2020-10-08
SI3642224T1 (sl) 2023-05-31
US12018062B2 (en) 2024-06-25
US11427624B2 (en) 2022-08-30
ES2942765T3 (es) 2023-06-06
EP3642224B1 (en) 2023-03-22
HUE068149T2 (hu) 2024-12-28
AU2018286984A1 (en) 2020-02-06
AU2018286984B2 (en) 2024-02-22
ES2985686T3 (es) 2024-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12018062B2 (en) T cell receptors
JP7254519B2 (ja) Ｔ細胞レセプター
RS63501B1 (sr) T ćelijski receptori specifični za kompleks tumorskog antigena ny-eso-1 sa hla-a*02
CA3181362A1 (en) Soluble tors and fusions to anti-cd3 recognising kras g12d for the treatment of cancer
US20240190969A1 (en) Specific binding molecules
RS64952B1 (sr) T ćelijski receptori
EP3947444B1 (en) Binding molecules specfic for hbv envelope protein
RU2825837C2 (ru) Специфичные связывающие молекулы
HK40091169B (en) T cell receptors
HK40091169A (en) T cell receptors
HK40091863A (en) T cell receptors