RS64952B1 - T ćelijski receptori - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na T ćelijske receptore (TCR) koji vezuju HLA-A*02 ograničeni peptid SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) poreklom iz HIV Gag genskog proizvoda, p17. Navedeni TCR sadrže neprirodne mutacije unutar alfa i/ili beta varijabilnih domena u odnosu na nativni HIV TCR. TCR prema pronalasku poseduju neočekivano visok afinitet, specifičnost i osetljivost za kompleks SEQ ID NO: 1 i HLA-A*02, i pokreću posebno snažan odgovor T ćelija. Takvi TCR su posebno korisni u razvoju rastvorljivih imunoterapijskih reagenasa za lečenje osoba inficiranih HIV-om.

Osnova pronalaska

[0002] Virus humane imunodeficijencije (HIV) je uzročnik sindroma stečene imunodeficijencije (SIDA). Virus je retrovirus sa omotačem koji pripada grupi lentivirusa. Trenutni tretmani se oslanjaju na upotrebu kombinovane antiretrovirusne terapije (ART) za kontrolu virusne infekcije. Međutim, ovi tretmani ne mogu u potpunosti da iskorene infekciju zbog stabilne integracije virusnih gena u hromozome ćelije domaćina, što dovodi do brzog uspostavljanja rezervoara dugovečnih, latentno inficiranih CD4+ T ćelija (Siliciano et al.2003 Nat Med, 9, 727). Zbog toga su potrebni novi tretmani koji imaju potencijal da iskorene virusne rezervoare i da postignu funkcionalno izlečenje. Imunoterapeutske strategije, a posebno one koje rezultiraju aktivacijom CD8+ T ćelija, predstavljaju obećavajući pristup (Vanham et al.

2012, Retroviral 9, 72; Shan et al.2012, Immmunity 36, 491; Sloan et al. 2015, PLoS Pathog.

5;11 (11); Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5). Takvi pristupi se mogu kombinovati sa sredstvima za poništavanje kašnjenja.

[0003] Vakcine dizajnirane da stimulišu odgovor T ćelija su razvijene i korišćene u kombinaciji sa reagensima za reaktivaciju virusa; međutim, do danas su se one pokazale uglavnom neefikasnim, verovatno zato što su aktivirani klonovi T ćelija oni koji uopšte nisu uspeli da kontrolišu virus (Autran et al. 2008, AIDS 22, 1313; Schooley et al. 2012, J Infect Dis 202, 705; Casazza et al. 2013, J. Infect Dis 207, 1829). Alternativni imunoterapeutski pristup uključuje korišćenje konstruisanih T ćelijskih receptora (TCR) za stvaranje snažnog imunološkog odgovora protiv ćelija inficiranih HIV-om. U prirodi, T ćelije i TCR obično imaju slab afinitet za antigen, u niskom mikromolarnom do nanomolarnom opsegu. Inženjering TCR mutiranjem mesta za prepoznavanje antigena može dovesti do povećanja afiniteta antigena što može dovesti do pojačanog imunološkog odgovora in vivo. U kontekstu HIV-a, pojačani odgovor bi trebao biti dovoljan da se virus iskoreni iz ćelija koje imaju nizak nivo antigena. Takvi konstruisani TCR se mogu koristiti u primenama za ćelijsku terapiju genom modifikovanim T ćelijama (videti Vonderheide and June, 2014, Immunol Rev, 257, 7-13). Alternativno, konstruisani TCR se mogu proizvesti kao rastvorljivi reagensi u svrhu isporuke citotoksičnih ili imunostimulativnih sredstava u inficirane ćelije (Lissin, et al., (2013). "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707-711; Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987; WO03/020763). Da bi se rastvorljivi TCR koristili kao terapeutici, poželjno je da je afinitet (KD) i/ili poluživot vezivanja za antigen posebno visok, na primer KDu pikomolarnom opsegu i/ili poluživotu vezivanja od nekoliko sati. Tako visoki afiniteti su potrebni da bi se pokrenuo snažan odgovor protiv ciljnih ćelija koje prikazuju nizak nivo antigena. U svim primenama koje uključuju afinitetno konstruisane TCR, od suštinskog je značaja da TCR ne samo da imaju veći afinitet za antigen nego odgovarajući divlji tip TCR, već i da zadrže visok nivo specifičnosti antigena. Gubitak specifičnosti u ovom kontekstu može dovesti do efekata van ciljnog mesta kada se takvi TCR primenjuju na pacijente.

[0004] Sazrevanje afiniteta obično uključuje kvalifikovanu osobu koja mora da identifikuje specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije, insercije i/ili delecije, koje se mogu izvršiti na WT TCR sekvenci kako bi se povećala snaga prepoznavanja antigena. Postupci za identifikaciju mutacija datog TCR koje daju poboljšanje afiniteta su poznate u tehnici, na primer korišćenje biblioteka prikaza (Li et al., (2005) Nat Biotechnol. 23(3):349-354; Holler et al., (2000). Proc Natl Acad Sci USA; 97(10):5387-5392). Međutim, da bi se proizvelo značajno povećanje afiniteta datog TCR prema datom ciljnom mestu, potrebno je da stručnjak izabere specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija iz velikog skupa mogućih alternativa. U mnogim slučajevima možda neće biti moguće postići željeni afinitet i specifičnost. Mutacije potrebne za visok afinitet i visoku specifičnost takođe bi trebalo da proizvedu TCR koji može da se eksprimira, ponovo savija i prečisti sa razumnim prinosom i koji je visoko stabilan u prečišćenom obliku.

[0005] Peptidna sekvenca SLYNTVATL (SEQ ID NO 1) je izvedena iz p17 genskog proizvoda Gag gena, jednog od devet gena koji čine HIV virus i za koje se pokazalo da su odgovori T ćelija posebno efikasni u kontroli virusnog opterećenja (Rolland et al. 2008, PLoS One, 3:e1424). Peptid (ovde nazvan Gag) predstavlja HLA-A*02 na površini ćelija inficiranih HIV-om. Stoga, kompleks Gag-HLA-A*02 predstavlja idealno ciljno mesto za prepoznavanje ćelija inficiranih HIV-om zasnovano na TCR-u.

[0006] Izolovan je WT TCR koji prepoznaje kompleks Gag-HLA-A*02 i identifikovane su različite mutacije unutar WT TCR sekvence koje rezultiraju većim prepoznavanjem afiniteta (WO06103429 i Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5). CD8+ citotoksične T ćelije transdukovane pomenutim TCR-ovima sa povećanim afinitetom su bile u stanju da kontrolišu HIV infekciju in vitro pri pogodnim ciljnim odnosima efektora za terapiju T ćelijama. Ovi TCR su bili u stanju da prepoznaju sve najčešće virusne peptide (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5). Dok su takvi TCR korisni u adoptivnoj T ćelijskoj terapiji, rastvorljivi TCR za terapijsku upotrebu obično zahtevaju prepoznavanje antigena većeg afiniteta da bi mogli da prepoznaju inficirane ćelije koje prikazuju niske nivoe epitopa.

[0007] Pronalazači su neočekivano pronašli dodatne mutante istog WT TCR koji se mogu kombinovati sa jednom ili više prethodno identifikovanih mutacija da bi se proizveli TCR sa posebno pogodnim svojstvima za upotrebu u rastvorljivim terapeuticima zasnovanim na TCR.

Detaljan opis pronalaska

[0008] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za SLYNTVATL (SEQ ID No: 1) u kompleksu sa HLA-A*02 i koji sadrži varijabilni domen TCR alfa lanca i TCR beta lanac promenljivog domena, pri čemu

(i) varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili 7 i varijabilni domen beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8; ili (ii) TCR ima najmanje 90% identičnosti sa TCR (i) i ima KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 unutar 50% izmerenog KDi/ili poluživot vezivanja TCR iz (i), kada se meri korišćenjem površinske plazmonske rezonance pod identičnim uslovima, na 25°C i na istom SPR čipu.

[0009] Poželjne karakteristike pronalaska su navedene u zavisnim patentnim zahtevima ovde. TCR iz (ii) može imati KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 unutar 20% izmerenog KDi/ili poluživot vezivanja TCR iz (i), kada se meri pod identičnim uslovima, na 25°C i na istom SPR čipu.

[0010] Ovaj pronalazak otkriva TCR koji poseduju neočekivano dobra svojstva vezivanja antigena, uključujući afinitet pikomolarnog antigena, dugi poluživot vezivanja i sposobnost da posreduju u moćnoj imunološkoj aktivaciji, kada su spojeni sa aktivirajućim delom, protiv ćelija inficiranih HIV-om koje prikazuju izuzetno niske nivoe antigena, uz održavanje visokog nivoa specifičnosti. TCR prema pronalasku su posebno pogodni za upotrebu kao rastvorljivi ciljajući reagensi u lečenju HIV inficiranih pojedinaca. Posebno, TCR u skladu sa pronalaskom neočekivano imaju visok afinitet prema antigenu u odnosu na divlji tip Gag TCR i visoku antigensku specifičnost. Percepcija u tehnici je da će konstrukcija TCR tako da poseduju visok afinitet za antigen takođe rezultirati TCR sa smanjenom specifičnošću antigena. Na primer, dramatično povećanje afiniteta povezano je sa gubitkom specifičnosti antigena u CD8 T ćelijama modifikovanim TCR genom, što bi moglo dovesti do nespecifične aktivacije ovih TCR-transficiranih CD8 ćelija (videti Zhao et al., (2007) J Immunol.179: 5845-54; Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-31; i WO2008/038002). Pored toga, pokazalo se da rastvorljivi TCR visokog afiniteta spojeni sa anti-CD3 mogu izgubiti specifičnost za antigen kada se koriste u visokim koncentracijama (videti Liddy et al., (2012), Nat Med, 8: 180-187). Zabrinutost u vezi sa specifičnostima je posebna pažnja za TCR visokog afiniteta izvedene iz ovog WT Gag TCR, pošto WT TCR ima širok profil prepoznavanja epitopa, sposoban da toleriše pojedinačne supstitucije alanina na bilo kojoj poziciji bočnog lanca Gag peptida, pa čak i da prepoznaje višestruki peptid supstituisan alaninom (Varela-Rohena et al.2008, Nat Med, 14(12):1390-5 i reference u njima). Suprotno percepciji u tehnici, pronalazači su pronašli mutantne TCR koji imaju i visok afinitet i visoku specifičnost, i stoga su posebno pogodni za kliničku primenu.

[0011] Ovde definisane TCR sekvence su opisane u vezi sa IMGT nomenklaturom koja je široko poznata i dostupna onima koji rade u oblasti TCR. Na primer, videti: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10O; and Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. Ukratko, αβ TCR se sastoje od dva disulfidno povezana lanca. Svaki lanac (alfa i beta) se generalno smatra da ima dva domena, naime varijabilni i konstantni domen. Kratki spojni region povezuje varijabilne i konstantne domene i obično se smatra delom alfa varijabilnog regiona. Pored toga, beta lanac obično sadrži kratak region raznolikosti pored spojnog regiona, koji se takođe tipično smatra delom beta varijabilnog regiona.

[0012] Varijabilni domen svakog lanca je lociran N-terminalno i obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) ugrađena u okvirnu sekvencu. CDR regioni sadrže mesto prepoznavanja za vezivanje peptida-MHC. Postoji nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione alfa lanca (Vα) i nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione beta lanca (Vβ), koji se razlikuju po svom okviru, CDR1 i CDR2 sekvencama i delimično definisanom CDR3 sekvencom. Geni Vα i Vβ se u IMGT nomenklaturi pominju prefiksom TRAV i TRBV (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Slično, postoji nekoliko spajajućih ili J gena, nazvanih TRAJ ili TRBJ, za alfa i beta lanac respektivno, za beta lanac, gen za raznolikost ili D koji se naziva TRBD (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Ogromna raznolikost lanaca receptora T ćelija rezultat je kombinatornih preuređivanja između različitih V, J i D gena, koji uključuju alelne varijante, i različitost spojeva (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.) Konstantni, ili C, regioni TCR alfa i beta lanaca se nazivaju TRAC i TRBC respektivno (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).

[0013] Termin 'nativni TCR' se u ovoj prijavi koristi kao sinonim sa terminima 'divlji tip TCR' ili 'WT TCR' ili 'nemutirani TCR' da znači TCR koji ima varijabilni domen alfa lanca koji sadrži TRAV12-2*01 sa sledećim mutacijama u odnosu na kanonsku TRAV12-2 sekvencu: V73I, Q81K i P82L na osnovu numeracije SEQ ID NO 2 i CDR3 aminokiselinske sekvence AVRTNSGYALN (SEQ ID NO: 22), i varijabilni domen beta lanca koji sadrži TRBV5-6 *01 i CDR3 aminokiselinsku sekvencu ASSDTVSYEQY (SEQ ID NO: 25). Aminokiselinske sekvence nativnih alfa i beta varijabilnih domena obezbeđene su ostacima 1-112 SEQ ID NO: 2 i ostacima 1-113 SEQ ID NO: 3, kao što je prikazano na Slici 1 [imajte na umu da u poređenju sa prethodno objavljenim sekvencama (videti WO06103429 i Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5), ostatak nakon inicijacije metionina TRBV je označen kao asparaginska kiselina (D), a ne kao glutaminska kiselina (E). Asparaginska kiselina je kanonski ostatak na ovoj poziciji za TRBV5-6*01 i ponovo je uveden tokom inženjeringa. Iz sličnog razloga, ostatak nakon inicijacije metionina u TRAV je Q pre nego A kao što je navedeno u prethodno objavljenoj sekvenci]. U TCR-ovima ovog pronalaska, inicijacijski ostatak metionina na N-kraju odgovarajućih alfa i beta lanca varijabilnih domena je izborni. Dodatno ili alternativno, ostatak nakon inicijacije metionina varijabilnog domena alfa lanca može biti alanin (A) ili glutamin (Q).

[0014] Konstantni domen WT TCR može biti pune dužine, ili može biti skraćen i/ili mutiran da bi se proizveo rastvorljivi TCR. U oba slučaja cisteinske supstitucije se mogu uvesti u TRAC i TRBC regione tako da se može formirati ne-nativna međulančana disulfidna veza. Pogodne pozicije za lokaciju navedenih cisteinskih supstitucija su opisane u WO03020763. Slika 2 prikazuje ekstracelularne sekvence divljeg tipa TCR alfa i beta lanaca, u rastvorljivom formatu. SEQ ID NO: 4 je identična ekstracelularnoj sekvenci prirodnog alfa lanca SEQ ID NO: 2 osim što je cistein na poziciji 48 konstantnog domena zamenjen treoninom. Konstantni domen alfa lanca može biti skraćen za 8 aminokiselina na svom C kraju (FFPSPESS). Slično tome SEQ ID NO: 5 je identična ekstracelularnoj sekvenci prirodnog beta lanca SEQ ID NO: 3 osim što je cistein na poziciji 57 konstantnog domena zamenjen serinom, cistein na poziciji 75 konstantnog domena je zamenjen alaninom i asparagin na poziciji 89 konstantnog domena je zamenjen asparaginskom kiselinom. Rastvorljivi TCR divljeg tipa može da se koristi da obezbedi referencu sa kojom se može uporediti profil vezivanja mutiranih TCR prema pronalasku. Takve sekvence su posebno pogodne za upotrebu kao terapeutski TCR za ciljanu imunoterapiju kancera koji predstavljaju SLYNTVATL HLA-A*02 kompleks.

[0015] U određenim poželjnim primerima izvođenja, sekvenca CDR1, CDR2 i CDR3 alfa i/ili beta lanca može biti izabrana iz sledećih tabela, u odnosu na numeraciju SEQ ID NOs: 2 i 3 respektivno.

CDR regioni alfa lanca

[0017] Ovde je otkriven TCR koji se vezuje za SLYNTVATL (SEQ ID No: 1) u kompleksu sa HLA-A*02, pri čemu: CDR regioni alfa lanca 1, 2 i 3 sadrže SEQ ID NO: 26, 27 i 22 respektivno ili SEQ ID NO: 26, 21 i 22 respektivno, i/ili CDR regioni beta lanca 1, 2 i 3 sadrže SEQ ID NO: 23, 28 i 25 respektivno; i/ili najmanje jedan od CDR regiona sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija u odnosu na SEQ ID NO: 21-23 i 25-28; i/ili najmanje jedan od CDR regiona sadrži do tri tolerisane supstitucije u odnosu na SEQ ID NO: 21-23 i 25-28. Poželjno je da pomenute supstitucije ne menjaju afinitet vezivanja i/ili poluživot vezivanja (T1⁄2) za više od /- 50%, ili poželjnije za ne više od /- 20%, u odnosu na nesupstituisani TCR.

[0018] Aminokiselinska sekvenca CDR3 varijabilnog domena alfa lanca može biti identična sekvenci CDR3 alfa lanca TCR divljeg tipa. Dodatno ili alternativno, aminokiselinska sekvenca CDR3 varijabilnog domena beta lanca može biti identična sekvenci CDR3 beta lanca TCR divljeg tipa.

[0019] Kao što je primećeno, u TCR receptorima ovog pronalaska, inicijacijski ostatak metionina na N-kraju odgovarajućih alfa i beta lanca varijabilnih domena je izborni. Dodatno ili alternativno, ostatak nakon inicijacije metionina varijabilnog domena alfa lanca (pozicija 1 u SEQ ID NO: 6 i 7) može biti alanin (A) ili glutamin (Q).

[0020] U okviru ovog pronalaska su fenotipski tihe varijante bilo kog TCR pronalaska koji su ovde otkriveni. Kako se ovde koristi, termin "fenotipski tihe varijante" podrazumeva se da se odnosi na TCR koji uključuje jednu ili više dodatnih promena aminokiselina, uključujući supstitucije, insercije i delecije, pored onih navedenih gore, koji TCR ima sličan fenotip kao odgovarajući TCR bez pomenute promene(a). Za potrebe ove prijave, TCR fenotip sadrži afinitet vezivanja antigena (KDi/ili poluživot vezivanja) i specifičnost antigena. Fenotipski tiha varijanta može imati KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks SLINTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 unutar 50%, ili još poželjnije unutar 20%, od izmerenog KDi/ili poluživot vezivanja odgovarajućeg TCR bez pomenute promene(a), kada se meri pod identičnim uslovima (na 25°C i na istom SPR čipu). Pogodni uslovi su dalje dati u Primeru 3. Specifičnost antigena je dalje definisana u nastavku. Kao što je stručnjacima poznato, može biti moguće proizvesti TCR koji uključuju promene u svojim varijabilnim domenima u poređenju sa onima koji su detaljno opisani iznad bez promene afiniteta interakcije sa SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A *02 kompleksom. Posebno, takve tihe mutacije mogu biti ugrađene u delove sekvence za koje je poznato da nisu direktno uključene u vezivanje antigena (npr. okvirni regioni ili delovi CDR regiona koji ne dolaze u kontakt sa peptidnim antigenom). Takve trivijalne varijante su uključene u obim ovog pronalaska. Kao što je poznato u tehnici, dodatne aminokiselinske promene mogu biti uključene iz razloga kao što su poboljšanje stabilnosti i/ili proizvodnosti.

[0021] Dodatne ili alternativno dodatne aminokiselinske promene mogu se izvršiti da bi se smanjio potencijal imunogenosti in vivo. Takve mutacije su uključene u obim pronalaska pod uslovom da su fenotipski tihe.

[0022] Fenotipski tihe varijante se mogu proizvesti ugradnjom jedne ili više konzervativnih supstitucija i/ili jedne ili više tolerisanih supstitucija. Pod tolerisanim supstitucijama podrazumevaju se one supstitucije koje ne potpadaju pod definiciju konzervativnih kao što je dato u nastavku, ali su ipak fenotipski tihe. Pod konzervativnim supstitucijama podrazumevaju se supstitucije jedne ili više aminokiselina sa alternativnim aminokiselinama koje dele slična svojstva. Stručnjak je svestan da različite aminokiseline imaju slična svojstva i stoga su 'konzervativne'. Jedna ili više takvih aminokiselina proteina, polipeptida ili peptida često mogu biti supstituisane sa jednom ili više drugih takvih aminokiselina bez eliminisanja željene aktivnosti tog proteina, polipeptida ili peptida. Tako se aminokiseline glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin često mogu zameniti jedna drugom (aminokiseline koje imaju alifatične bočne lance). Od ovih mogućih supstitucija, poželjno je da se glicin i alanin koriste da zamenjuju jedni druge (pošto imaju relativno kratke bočne lance) i da se valin, leucin i izoleucin koriste da zamene jedni druge (pošto imaju veće alifatične bočne lance koji su hidrofobni). Druge aminokiseline koje se često mogu zameniti jedna drugom uključuju: fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance); lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju osnovne bočne lance); aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance); asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju bočne lance amida); i cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor). Treba imati na umu da se supstitucije aminokiselina u okviru ovog pronalaska mogu napraviti korišćenjem aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili koje se ne nalaze u prirodi. Na primer, ovde se razmatra da metil grupa na alaninu može biti zamenjena etil grupom, i/ili da se manje promene mogu izvršiti na peptidnoj osnovi. Bez obzira da li se koriste prirodne ili sintetičke aminokiseline ili ne, poželjno je da su prisutne samo L-aminokiseline.

[0023] Ovaj pronalazak se stoga proširuje na TCR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ili 100% identičnosti, sa TCR pri čemu alfa varijabilni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 i 7 i beta varijabilni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.

[0024] "Identičnost" kao što je poznato u tehnici je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identičnost takođe označava stepen srodnosti sekvenci između polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, kao što je određeno podudaranjem između nizova takvih sekvenci. Iako postoji veliki broj postupaka za merenje identičnosti između dve polipeptidne ili dve polinukleotidne sekvence, postupvi koji se obično koriste za određivanje identičnosti su kodifikovani u kompjuterskim programima. Poželjni kompjuterski programi za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN i FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol.215, 403 (1990)).

[0025] Može se koristiti program kao što je CLUSTAL program za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci. Ovaj program upoređuje aminokiselinske sekvence i pronalazi optimalno poravnanje umetanjem razmaka u bilo koju sekvencu prema potrebi. Moguće je izračunati identičnost ili sličnost aminokiselina (identičnost plus očuvanje tipa aminokiseline) za optimalno poravnanje. Program kao što je BLASTx će poravnati najduži deo sličnih sekvenci i dodeliti vrednost uklapanju. Stoga je moguće dobiti poređenje gde se nalazi nekoliko regiona sličnosti, od kojih svaki ima drugačiji rezultat. Oba tipa analize identičnosti su razmatrana u ovom pronalasku.

[0026] Procenat identičnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinskih kiselina se određuje poravnavanjem sekvenci radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u prvu sekvencu radi najboljeg usklađivanja sa sekvencom) i poređenjem aminokiselinskih ostataka ili nukleotida na odgovarajućim pozicijama. „Najbolje poravnanje“ je poravnanje dve sekvence koje rezultira najvećim procentom identičnosti. Procenat identičnosti je određen brojem identičnih aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvencama koje se porede (tj. % identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija × 100).

[0027] Određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma poznatog stručnjacima u ovoj oblasti. Primer matematičkog algoritma za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modifikovan kao u Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. NBLAST i XBLAST programi Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 su ugradili takav algoritam. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti pomoću NBLAST programa, rezultat = 100, dužina reči = 12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti pomoću programa XBLAST, rezultat = 50, dužina reči = 3 da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinskim molekulima za upotrebu u pronalasku. Da bi se dobila razmaknuta poravnanja u svrhu poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al. (1997)

1

Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast se može koristiti za obavljanje iterirane pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (Id.). Kada se koriste programi BLAST, Gapped BLAST i PSI-Blast, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. XBLAST i NBLAST). Pogledati http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Drugi primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam Myers and Miller, CABIOS (1989). Program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje sekvenci CGC ugradio je takav algoritam. Drugi algoritmi za analizu sekvenci poznati u tehnici uključuju ADVANCE i ADAM kao što je opisano u Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5; i FASTA opisan u Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.85:2444-8. U okviru FASTA, ktup je kontrolna opcija koja postavlja osetljivost i brzinu pretrage.

[0028] Mutacije, uključujući konzervativne i tolerisane supstitucije, insercije i delecije, mogu se uvesti u sekvence koje su obezbeđene korišćenjem bilo kog odgovarajućeg postupka uključujući, ali ne ograničavajući se na, one postupke zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze (PCR), kloniranje zasnovano na restrikcionim enzimima ili kloniranje nezavisno od ligacije (LIC). Ovi postupci su detaljno opisani u mnogim standardnim tekstovima o molekularnoj biologiji. Za više detalja u vezi sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i kloniranjem zasnovanim na restrikcionim enzimima, videti Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press. Dodatne informacije o postupcima nezavisnog kloniranja od ligacije (LIC) mogu se naći u Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6. TCR sekvence obezbeđene pronalaskom mogu se dobiti sintezom u čvrstom stanju, ili bilo kojim drugim odgovarajućim postupkom poznatim u tehnici.

[0029] TCR pronalaska imaju svojstvo vezivanja SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleksa. Utvrđeno je da su TCR prema pronalasku visoko specifični za ovaj epitop u odnosu na druge, irelevantne epitope i stoga su posebno pogodni kao ciljani vektori za isporuku terapeutskih sredstava ili detektabilnih obeleživača u ćelije i tkiva koja pokazuju te epitope. Specifičnost u kontekstu TCR pronalaska se odnosi na njihovu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su pozitivne na antigen, dok imaju minimalnu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su antigen negativne.

[0030] Specifičnost se može meriti in vitro, na primer, u ćelijskim testovima kao što su oni opisani u Primeru 5. Da bi se testirala specifičnost, TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i/ili mogu biti eksprimirani na površini T ćelija. Prepoznavanje se može odrediti merenjem nivoa aktivacije T ćelija u prisustvu TCR pronalaska i ciljnih ćelija. Minimalno prepoznavanje ciljnih ćelija negativnih na antigen je definisano kao nivo aktivacije T ćelija manji od 20%, poželjno manji od 10%, poželjno manji od 5% i poželjnije manji od 1% nivoa proizvedenog u prisustvu antigen pozitivne ciljne ćelije, kada se mere pod istim uslovima i pri terapijski relevantnoj koncentraciji TCR. Za rastvorljive TCR prema pronalasku, terapeutski relevantna koncentracija može se definisati kao koncentracija TCR od 10<-9>M ili ispod, i/ili koncentracija do 100, poželjno do 1000, puta veća od odgovarajuće EC50vrednosti. Antigen pozitivne ćelije se mogu dobiti pulsiranjem peptida korišćenjem odgovarajuće koncentracije peptida da bi se dobio nizak nivo prikaza antigena (npr., 10<-9>M peptida, kao što je opisano u Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840) ili, mogu prirodno da predstavljaju pomenuti peptid. Poželjno, antigen negativne ćelije su ljudske ćelije.

[0031] Specifičnost se može dodatno, ili alternativno, odnositi na sposobnost TCR da se veže za SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks, a ne za panel alternativnih kompleksa peptid-HLA. Poželjno, alternativni kompleksi peptid-HLA sadrže HLA-A*02. Ovo se, na primer, može odrediti Biacore postupkom iz Primera 3. Alternativni peptidi mogu deliti nizak nivo identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1 i mogu biti prirodno prikazani. Poželjno, alternativni peptidi su prikazani na površini ćelija izvedenih iz normalnih ljudskih tkiva (tj. ćelije koje nisu inficirane HIV-om). Vezivanje za SLYNTVATL-HLA-A*02 kompleks može biti najmanje 2 puta veće nego za druge prirodno prisutne peptidne HLA komplekse, poželjnije najmanje 10 puta, ili najmanje 50 puta ili najmanje 100 puta veće, još poželjnije na najmanje 400 puta veći.

[0032] Alternativni ili dodatni pristup za određivanje TCR specifičnosti može biti da se identifikuje motiv prepoznavanja peptida TCR korišćenjem sekvencijalne mutageneze, npr. skeniranje alaninom. Takav pristup je dalje opisan u Cameron et al., (2013), Sci Transl Med.

2013 Aug 7; 5 (197): 197ra103 i WO2014096803.

[0033] TCR prema pronalasku mogu dodatno da se vežu za komplekse koji sadrže prirodne varijante SEQ ID NO: 1 predstavljene sa HLA-A*02. Varijante peptida SLYNTVATL izolovane su od pacijenata sa SIDA-om i uključuju sledeće (Sewell et al., (1997) Eur J Immunol. 27: 2323-2329):

SLFNTVATL (SEQ ID NO: 20)

SLFNTVAVL (SEQ ID NO: 21)

SLSNTVATL (SEQ ID NO: 22)

SSFNTVATL (SEQ ID NO: 23)

SLLNTVATL (SEQ ID NO: 24)

SLYNTIATL (SEQ ID NO: 25)

SLYNTIAVL (SEQ ID NO: 26)

SLFNTIATL (SEQ ID NO: 27)

SLFNTIAVL (SEQ ID NO: 28)

SLFNFVATL (SEQ ID NO: 29)

[0034] Određeni TCR prema pronalasku mogu imati idealan bezbednosni profil za upotrebu kao terapeutski reagensi. U ovom slučaju TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i poželjno je da budu fuzionisani sa imunim efektorom. Idealan bezbednosni profil znači da pored demonstracije dobre specifičnosti, TCR prema pronalasku možda su prošli dalje pretkliničke testove bezbednosti. Primeri takvih testova uključuju testove pune krvi da bi se potvrdilo minimalno oslobađanje citokina u prisustvu pune krvi i samim tim mali rizik od izazivanja sindroma potencijalnog oslobađanja citokina in vivo, i testovi aloreaktivnosti da bi se potvrdio nizak potencijal za prepoznavanje alternativnih HLA tipova.

[0035] Određeni rastvorljivi TCR prema pronalasku mogu biti podložni prečišćavanju visokog prinosa. Visok prinos znači veći od 1%, ili poželjnije veći od 10%, ili veći prinos.

[0036] TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks manji od 100 nM, na primer od oko 50 nM do oko 1 pM i/ili imaju poluvreme vezivanja (T1⁄2) za kompleks u opsegu od oko 1 min do oko 50 h ili više. Određeni TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks od oko 1 pM do oko 1 nM, od oko 1 pM do oko 500 pM, od oko 1 pM do oko 300 pM. Određeni TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks od oko 50 pM do oko 200 pM. TCR prema pronalasku mogu imati poluvreme vezivanja (T1⁄2) za kompleks u opsegu od oko 1 min do oko 50 h ili više (kao što je 100 h), od oko 30 min do oko 50 h ili više (npr. kao 100 h), ili od oko 6 h do oko 50 h ili više (kao što je 100 h). Svi takvi TCR su veoma pogodni za upotrebu kao terapeutici i/ili dijagnostici kada su spojeni sa detektabilnim obeleživačem ili terapeutskim sredstvom. Određeni TCR prema pronalasku mogu biti pogodni za primenu u usvajanju terapije, takvi TCR mogu imati KDza kompleks od oko 50 nM do oko 100 nM, i/ili polu-život vezivanja za kompleks od oko 30 s sec do oko 12 min.

[0037] Određeni poželjni TCR su u stanju da generišu veoma moćan odgovor T ćelija in vitro protiv antigen pozitivnih ćelija, posebno onih ćelija koje prikazuju niske nivoe antigena tipične za CD4 ćelije inficirane HIV-om. Takvi TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i vezani za imuni efektor kao što je anti-CD3 antitelo. Odgovor T ćelija koji se meri može biti oslobađanje markera aktivacije T ćelija kao što je Interferon γ ili Granzim B, ili ubijanje ćelija, ili druge mere aktivacije T ćelija koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Poželjno je da je veoma moćan odgovor onaj sa EC50vrednosti u pM opsegu, na primer 100 pM ili niže, poželjno 50 pM ili niže, na primer između 50 pM i 1 pM.

1

[0038] Određeni poželjni TCR prema pronalasku imaju afinitet vezivanja i/ili poluvreme vezivanja za kompleks SLYNTVATL-HLA-A*02 znatno veći od onog kod prirodnog TCR. Povećanje afiniteta vezivanja prirodnog TCR često smanjuje specifičnost TCR za njegov peptid-MHC ligand, a to je demonstrirano u Zhao et al., (2007) J.Immunol, 179:9, 5845-5854. Međutim, takvi TCR prema pronalasku ostaju specifični za kompleks SLYNTVATL-HLA-A*02, uprkos tome što imaju znatno veći afinitet vezivanja od prirodnog TCR.

[0039] Afinitet vezivanja (obrnuto proporcionalan konstanti ravnoteže KD) i poluživot vezivanja (izražen kao T1⁄2) mogu se odrediti korišćenjem površinske plazmonske rezonance (BIAcore) i/ili oktet postupka iz Primera 3 ovde. Biće jasno da udvostručavanje afiniteta TCR rezultira prepolovljenjem KD. T1⁄2 se izračunava kao In2 podeljen sa stopom disocijacije (koff). Prema tome, udvostručavanje T1⁄2 rezultira prepolovljenjem koff. KDi koffvrednosti za TCR se obično mere za rastvorljive oblike TCR, tj. one oblike koji su skraćeni da bi se uklonili ostaci citoplazmatskog i transmembranskog domena. Poželjno, afinitet vezivanja ili poluvreme vezivanja datog TCR se meri nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, koristeći isti protokol analize i uzima se prosek rezultata.

[0040] Za upotrebu kao ciljano sredstvo za isporuku terapeutskih sredstava u ćeliju koja prikazuje antigen, TCR može biti u rastvorljivom obliku (tj. bez transmembranskih ili citoplazmatskih domena). Radi stabilnosti, TCR prema pronalasku, i poželjno rastvorljivi αβ heterodimerni TCR, mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano, na primer, u WO 03/020763. Jedan ili oba ekstracelularna konstantna domena prisutna u αβ heterodimeru pronalaska mogu biti skraćena na C kraju ili C terminusu, na primer za do 15, ili do 10 ili do 8 ili manje aminokiselina. Za upotrebu u terapiji usvajanja, αβ heterodimerni TCR može, na primer, biti transfektovan kao lanci pune dužine koji imaju i citoplazmatski i transmembranski domen. TCR za upotrebu u terapiji usvajanja mogu da sadrže disulfidnu vezu koja odgovara onoj koja se nalazi u prirodi između odgovarajućih alfa i beta konstantnih domena, dodatno ili alternativno može biti prisutna ne-nativna disulfidna veza.

[0041] TCR prema pronalasku mogu biti αβ heterodimeri. TCR pronalaska mogu biti u jednolančanom formatu. Jednolančani formati uključuju, ali nisu ograničeni na, αβ TCR polipeptide Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, Vα-Cα-L-Vβ-Cβ ili Vβ-Cβ-L-Vα-Cα tipovi, pri čemu su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno i L je sekvenca linkera (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. 51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). Jedan ili oba konstantna domena mogu biti pune dužine, ili mogu biti skraćeni, i/ili sadrže mutacije. U određenim primerima izvođenja, jednolančani TCR prema pronalasku mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano u WO 2004/033685. Jednolančani TCR su dalje opisani u WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).

[0042] Kao što će biti očigledno stručnjacima u ovoj oblasti, može biti moguće skratiti sekvence obezbeđene na C-terminusu i/ili njegovom N-terminusu, za 1, 2, 3, 4, 5 ili više ostataka, bez suštinskog uticaja karakteristike vezivanja TCR. Sve takve trivijalne varijante su obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0043] Alfa-beta heterodimerni TCR pronalaska obično sadrže sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i/ili sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2. Sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca mogu biti modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 od TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2. Sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca takođe može biti modifikovana supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu navedeni cisteini formiraju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena od TCR.

[0044] TRBC1 ili TRBC2 mogu dodatno uključiti mutaciju cisteina u alanin na poziciji 75 konstantnog domena i mutaciju asparagina u asparaginsku kiselinu na poziciji 89 konstantnog domena. Konstantni domen može dodatno ili alternativno da sadrži dalje mutacije, supstitucije ili delecije u odnosu na nativnu TRAC i/ili TRBC1/2 sekvencu. Termin TRAC i TRBC1/2 obuhvata prirodne polimofne varijante, na primer od N do K na poziciji 4 TRAC (Bragado et al Int Immunol. 1994 Feb;6(2):223-30).

[0045] TCR pronalaska mogu biti prikazani na česticama i navedene čestice mogu biti uključene u biblioteku čestica. Takve čestice uključuju ali nisu ograničene na fage, ribozome kvasca ili ćelije sisara. Postupci proizvodnje takvih čestica i biblioteka su poznati u tehnici (na primer, videti WO2004/044004; WO01/48145, Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184).

[0046] U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira TCR pronalaska i/ili TCR-anti-CD3 fuzioni molekul pronalaska. Nukleinska kiselina može biti cDNK. Pronalazak može da obezbedi nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen α lanca TCR pronalaska. Pronalazak može da obezbedi nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen β lanca TCR pronalaska. Nukleinska

1

kiselina može biti neprirodna i/ili prečišćena i/ili konstruisana. Na primer, nukleinska kiselina može biti optimizovana kodonom za određene ekspresione sisteme.

[0047] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska. Poželjno, vektor je vektor ekspresije TCR.

[0048] Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju koja sadrži (a) vektor ekspresije TCR koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja koja kodiraju alfa lanac i beta lanac; ili (b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR pronalaska, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR pronalaska. Takve ćelije su posebno korisne u adoptivnoj terapiji. Ćelije pronalaska mogu biti izolovane i/ili rekombinantne i/ili neprirodne i/ili konstruisane.

[0049] Pošto TCR pronalaska imaju koristi u adoptivnoj terapiji, pronalazak uključuje izolovanu, ne-prirodnu i/ili prečišćenu i/ili konstruisanu ćeliju, posebno T-ćeliju, koja predstavlja TCR pronalaska. Može se obezbediti proširena populacija T ćelija koje predstavljaju TCR pronalaska. Postoji veliki broj postupaka pogodnih za transfekciju T ćelija nukleinskom kiselinom (kao što su DNK, cDNK ili RNK) koje kodiraju TCR prema pronalasku (videti npr. Robbins et al., (2008) J Immunol.180: 6116-6131). T ćelije koje eksprimiraju TCR prema pronalasku biće pogodne za upotrebu u lečenju HIV infekcije zasnovanom na adoptivnoj terapiji. Kao što će biti poznato stručnjacima u ovoj oblasti, postoji niz pogodnih postupaka pomoću kojih se može sprovesti adoptivna terapija (videti npr. Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).

[0050] Rastvorljivi TCR prema pronalasku su korisni za isporuku detektabilnih oznaka ili terapeutskih sredstava u ćelije koje prikazuju antigen i tkiva koja sadrže ćelije koje predstavljaju antigen. Oni stoga mogu biti povezani (kovalentno ili na drugi način) sa detektabilnim obeleživačem (u dijagnostičke svrhe gde se TCR koristi za detekciju prisustva ćelija koje predstavljaju SLYNTVATL-HLA-A2 kompleks); terapeutsko sredstvo; ili grupa koja modifikuje PK.

[0051] Primeri grupa koje modifikuju PK uključuju, ali nisu ograničeni na, PEG Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 and Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28), PAS (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501), albumin (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43) i/ili nestrukturirane polipeptide (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90).

1

[0052] Detektabilni obeleživači koji se mogu detektovati u dijagnostičke svrhe uključuju, na primer, fluorescentne obeleživače, radioaktivne obeleživače, enzime, probe nukleinske kiseline i kontrastne reagense.

[0053] Terapeutska sredstva koja mogu biti povezana sa TCR pronalaska uključuju imunomodulatore, radioaktivna jedinjenja, enzime (na primer perforin) ili hemoterapeutska sredstva (na primer, cis-platina). Da bi se osiguralo da se toksični efekti vrše na željenoj lokaciji, toksin bi mogao biti unutar lipozoma koji je povezan sa TCR tako da se jedinjenje sporo oslobađa. Ovo će sprečiti štetne efekte tokom transporta u telu i obezbediti da toksin ima maksimalan efekat nakon vezivanja TCR za relevantne ćelije koje prikazuju antigen.

[0054] Druga pogodna terapeutska sredstva uključuju:

• mali molekuli citotoksičnih sredstava, odnosno jedinjenja sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara čija je molekulska težina manja od 700 daltona. Takva jedinjenja mogu takođe da sadrže toksične metale sposobne da imaju citotoksični efekat. Dalje, treba razumeti da ova citotoksična sredstva sa malim molekulima takođe uključuju prolekove, tj. jedinjenja koja se raspadaju ili se konvertuju u fiziološkim uslovima da bi oslobodila citotoksična sredstva. Primeri ovakvih sredstava uključuju cis-platin, derivate majtanzina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etopozid, gemcitabin, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, sorfimer natrijumfotofrin II, temzolomid, topotekan, trimetrat glukuronat, auristatin E vinkristin i doksorubicin;

• peptidni citotoksini, tj. proteini ili njihovi fragmenti sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara. Na primer, ricin, toksin difterije, bakterijski egzotoksin A pseudomonasa, DNaza i RNKaza;

• radionuklidi, tj. nestabilni izotopi elemenata koji se raspadaju uz istovremenu emisiju jedne ili više α, ili β čestica, ili γ zraka. Na primer, jod 131, renijum 186, indijum 111, itrijum 90, bizmut 210 i 213, aktinijum 225 i astatin 213; helatirajuća sredstva se mogu koristiti za olakšavanje povezivanja ovih radionuklida sa TCR visokog afiniteta ili njihovim multimerima;

• imunostimulansi, odnosno imuni efektorski molekuli koji stimulišu imuni odgovor. Na primer, citokini kao što su IL-2 i IFN-γ,

• Superantigeni i njihovi mutanti;

• TCR-HLA fuzije, npr. fuzija sa kompleksom peptid-HLA, pri čemu je navedeni peptid izveden iz uobičajenog humanog patogena, kao što je Epstein Barr virus (EBV);

1

• hemokini kao što su IL-8, trombocitni faktor 4, protein koji stimuliše rast melanoma, itd;

• antitela ili njihove fragmente, uključujući antitela determinanta anti-T ćelija ili NK ćelija (npr. anti-CD3, anti-CD28 ili anti-CD16);

• alternativne proteinske osnove sa karakteristikama vezivanja poput antitela

• aktivatori komplementa;

• ksenogeni proteinski domeni, alogeni proteinski domeni, virusni/bakterijski proteinski domeni, virusni/bakterijski peptidi.

[0055] Jedna poželjna varijanta je TCR pronalaska povezan (obično fuzijom na N- ili C-terminus alfa ili beta lanca) sa anti-CD3 antitelom, ili funkcionalnim fragmentom ili varijantom pomenutog anti-CD3 antitela . Kako se ovde koristi, termin "antitelo" obuhvata takve fragmente i varijante, uključujući humanizovane varijante. Primeri anti-CD3 antitela uključuju, ali nisu ograničeni na OKT3, UCHT-1, BMA-031 i 12F6. Fragmenti antitela i varijante/analozi koji su pogodni za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisanim ovde uključuju minitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, dsFv i scFv fragmente, Nanobodies<™>(ovi konstrukti, koje prodaje Ablynx (Belgija), sadrže sintetički pojedinačni imunoglobulinski varijabilni teški domen dobijen iz antitela kamile (npr. kamile ili lame)) i antitela domena (Domantis (Belgija), koja se sastoje od afiniteta zrelog pojedinačnog imunoglobulinsko varijabilnog teškog domena ili imunoglobulina varijabilni svetlosni domen) ili alternativne proteinske osnove koje pokazuju karakteristike vezivanja poput antitela, kao što su Affibodies (Affibody (Švedska), koji sadrži osnovu konstruisanog proteina A) ili Antitikalini (Pieris (Nemačka)), koji sadrži konstruisane antitikaline), da spomenemo samo neke.

[0056] Veza TCR i anti-CD3 antitela može biti direktna ili indirektna preko linker sekvence. Linker sekvence su obično fleksibilne, jer su sastavljene prvenstveno od aminokiselina kao što su glicin, alanin i serin koji nemaju glomazne bočne lance koji bi verovatno ograničavali fleksibilnost. Upotrebljive ili optimalne dužine linker sekvenci se lako određuju. Često će sekvenca linkera biti manja od oko 12, kao što je manja od 10, ili od 2-10 aminokiselina u dužini. Pogodni linkeri koji se mogu koristiti u TCR pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na: GGGGS (SEQ ID No: 12), GGGSG (SEQ ID No: 13), GGSGG (SEQ ID No: 14), GSGGG (SEQ ID No: 15), GSGGGP (SEQ ID No: 16), GGEPS (SEQ ID No: 17), GGEGGGP (SEQ ID No: 18) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID No: 19) (kao što je opisano u WO2010/133828).

[0057] Pronalazak takođe obezbeđuje TCR-anti-CD3 fuzioni molekul gde varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7 i TCR

1

beta lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No: 8, i gde je anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za N-terminus ili C-terminus TCR beta lanca preko linker sekvence izabrane od SEQ ID NOs: 12-19. Navedeni alfa i beta lanci mogu dalje da sadrže skraćeni konstantni region koji ima ne-nativnu disulfidnu vezu. Određeni poželjni primeri izvođenja takvih TCR-anti-CD3-fuzionih molekula su dati u nastavku:

[0058] Za neke svrhe, TCR pronalaska mogu biti agregirani u kompleks koji sadrži nekoliko TCR da bi se formirao multivalentni TCR kompleks. Postoji veliki broj humanih proteina koji sadrže multimerizacioni domen koji se može koristiti u proizvodnji multivalentnih TCR kompleksa. Na primer, domen tetramerizacije p53 koji je korišćen za proizvodnju tetramera fragmenata scFv antitela koji su pokazali povećanu postojanost seruma i značajno smanjenu brzinu u poređenju sa monomernim scFv fragmentom (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem.276 (17) 14385-14392). Hemoglobin takođe ima domen tetramerizacije koji bi se mogao koristiti za ovu vrstu primene. Multivalentni TCR kompleks može imati poboljšanu sposobnost vezivanja za kompleks SLYNTVATL-HLA-A2 u poređenju sa nemultimernim heterodimerom divljeg tipa ili T ćelijskog receptora prema pronalasku. Takvi multivalentni TCR kompleksi su posebno korisni za praćenje ili ciljno delovanje na ćelije koje prikazuju određene antigene in vitro ili in vivo, i takođe su korisni kao intermedijeri za proizvodnju dodatnih multivalentnih TCR kompleksa koji imaju takvu upotrebu.

[0059] Kao što je dobro poznato u tehnici, TCR mogu biti podložni post-translacionim modifikacijama. Glikozilacija je jedna takva modifikacija, koja sadrži kovalentno vezivanje oligosaharidnih delova za definisane aminokiseline u TCR lancu. Na primer, ostaci asparagina, ili ostaci serina/treonina su dobro poznate lokacije za vezivanje oligosaharida. Status glikozilacije određenog proteina zavisi od brojnih faktora, uključujući sekvencu proteina, konformaciju proteina i dostupnost određenih enzima. Pored toga, status glikozilacije (tj. tip oligosaharida, kovalentna veza i ukupan broj veza) može uticati na funkciju proteina. Stoga, kada se proizvode rekombinantni proteini, kontrola glikozilacije je često poželjna. Kontrolisana glikozilacija je korišćena za poboljšanje terapije na bazi antitela. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34.). Za rastvorljive TCR prema pronalasku, glikozilacija se može

1

kontrolisati in vivo, korišćenjem određenih ćelijskih linija, na primer, ili in vitro, hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije su poželjne, pošto glikozilacija može poboljšati famakokinetiku, smanjiti imunogenost i bolje imitirati prirodni humani protein (Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci.2005 Aug; 94(8):1626-35).

[0060] Za primenu na pacijente, TCR pronalaska (poželjno povezani sa detektabilnim obeleživačem ili terapeutskim sredstvom ili eksprimirani na transfektovanoj T ćeliji), TCR-anti-CD3 fuzioni molekuli ili ćelije pronalaska mogu biti obezbeđeni u farmaceutskoj kompoziciji zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Terapeutski ili TCR za snimanje ili ćelije, u skladu sa pronalaskom, obično će biti isporučeni kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja će normalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka primene na pacijenta). Može se obezbediti u obliku jedinične doze, generalno će biti obezbeđena u zapečaćenom kontejneru i može se obezbediti kao deo kompleta. Takav komplet bi obično (iako ne nužno) uključivao uputstva za upotrebu. Može uključivati veći broj navedenih jediničnih doznih oblika.

[0061] Farmaceutska kompozicija se može prilagoditi za primenu bilo kojim odgovarajućim putem, kao što je parenteralni (uključujući subkutani, intramuskularni ili intravenski), enteralni (uključujući oralni ili rektalni), inhalacioni ili intranazalni putevi. Takve kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u farmaciji, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem(ima) ili ekscipijensom(ima) u sterilnim uslovima.

[0062] Doze supstanci iz ovog pronalaska mogu da variraju između širokih granica, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se leči, starosti i stanja pojedinca koji se leči, itd. odgovarajući opseg doza za rastvorljiv TCR pronalaska povezan sa anti-CD3 antitelom može biti između 25 ng/kg i 50 µg/kg. Lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti.

[0063] TCR, farmaceutske kompozicije, vektori, nukleinske kiseline i ćelije pronalaska mogu se obezbediti u suštinski čistom obliku, na primer najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, na najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% čisti.

[0064] Pronalaskom su takođe obezbeđeni:

• TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina ili ćelija pronalaska za upotrebu u medicini,

• TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina ili ćelija pronalaska za upotrebu u postupku lečenja HIV infekcije ili SIDA-e kod ljudi.

2

[0065] Poželjne karakteristike svakog aspekta pronalaska su kao i za svaki drugi aspekt mutatis mutandis. Dokumenti prethodnog stanja tehnike koji su ovde pomenuti su uključeni u najvećoj meri dozvoljenoj zakonom.

Opis slika

[0066]

Slika 1 – obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnog dela alfa i beta lanca Gag TCR divljeg tipa.

Slika 2 - obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu rastvorljive verzije divljeg tipa Gag TCR alfa i beta lanca.

Slika 3 - obezbeđuje aminokiselinske sekvence mutiranih varijabilnih domena TCR alfa lanca Slika 4 - obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu mutiranih varijabilnih domena TCR beta lanca Slika 5 - obezbeđuje aminokiselinske sekvence alfa lanca TCR anti-CD3 fuzionih molekula. Slika 6 - obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu beta lanca TCR anti-CD3 fuzionih molekula. Slika 7 - obezbeđuje ćelijske podatke koji demonstriraju potenciju TCR anti-CD3 fuzionih molekula

Slika 8 - obezbeđuje ćelijske podatke koji pokazuju specifičnost TCR anti-CD3 fuzionih molekula

Slika 9 - obezbeđuje ćelijske podatke koji pokazuju osetljivost TCR anti-CD3 fuzionih molekula

[0067] Pronalazak je dalje opisan u sledećim neograničavajućim primerima.

Primeri

Primer 1 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje rastvorljivih TCR

Postupak

[0068] DNK sekvence koje kodiraju alfa i beta ekstracelularne regione rastvorljivih TCR prema pronalasku su klonirane odvojeno u ekspresione plazmide zasnovane na pGMT7 korišćenjem standardnih postupaka (kao što je opisano u Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol.2. (1989) New York: Cold spring harbour laboratory press). Ekspresioni plazmidi su odvojeno transformisani u E. coli soju Rosetta (BL21 pLysS) i pojedinačne kolonije otporne na ampicilin su uzgajane na 37°C u TYP (+ ampicilin 100 µg/ml) medijumu do OD600od -0.6-0.8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0.5 mM IPTG. Ćelije su sakupljene tri sata nakon indukcije centrifugiranjem. Ćelijski talozi su lizirani reagensom za ekstrakciju proteina BugBuster (Merck Millipore) prema uputstvima proizvođača. Talozi inkluzijskog tela su dobijeni centrifugiranjem. Talozi su dva puta isprani u Triton puferu (50 mM Tris-HCl pH 8.1, 0.5% Triton-X100, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) i na kraju resuspendovane u puferu bez deterdženta (50 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA). Prinos proteina inkluzijskog tela je kvantifikovan rastvaranjem sa 6 M guanidin-HCl i merenjem OD280. Koncentracija proteina je zatim izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije. Čistoća inkluzijskog tela je merena rastvaranjem sa 8M uree i stavljanjem ~2 µg na 4-20% SDS-PAGE u redukcionim uslovima. Čistoća je zatim procenjena ili izračunata korišćenjem softvera za denzitometriju (Chemidoc, Biorad). Inkluziona tela su čuvana na 4°C za kratkotrajno skladištenje i na -20°C ili -70°C za dugotrajno skladištenje.

[0069] Za ponovno savijanje rastvorljivog TCR, inkluziona tela koja sadrže α i β lanac su prvo pomešana i razblažena u 10 ml pufera za solubilizaciju/denaturaciju (6 M guanidin hidrohlorid, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM DTT) nakon čega sledi inkubacija od 30 min na 37°C. Ponovno savijanje je zatim započeto daljim razblaživanjem u 1 L pufera za ponovno savijanje (100 mM Tris pH 8.1, 400 mM L-arginin HCL, 2 mM EDTA, 4 M uree, 10 mM cisteamin hidrohlorida i 2.5 mM cistamin dihidrohlorida) i rastvor je dobro mešan. Ponovo savijena smeša je dijalizovana protiv 10 L H2O tokom 18-20 sati na 5°C ± 3°C. Posle ovog vremena, pufer za dijalizu je dva puta zamenjen sa 10 mM Tris pH 8.1 (10 L) i dijaliza je nastavljena još 15 sati. Mešavina za ponovno savijanje je zatim filtrirana kroz celulozne filtere od 0.45 µm.

[0070] Prečišćavanje rastvorljivih TCR je započeto nanošenjem dijalizovanog ponovo savijeg proizvoda na POROS<®>50HQ kolonu za anjonsku izmjenu i eluiranje vezanog proteina sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM Tris pH 8.1 preko 50 zapremina kolone koristeći Akta<®>prečišćivač (GE Healthcare). Maksimalne TCR frakcije su identifikovane pomoću SDS PAGE pre nego što su objedinjene i koncentrovane. Koncentrovani uzorak je zatim nanet na Superdex<®>75HR kolonu za gel filtraciju (GE Healthcare) prethodno ekvilibrisanu u Dulbeccoovom PBS puferu. Maksimalne TCR frakcije su sakupljene i koncentrovane i izračunat je konačni prinos prečišćenog materijala.

Primer 2 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje rastvorljivih TCR anti-CD3 fuzionih molekula

[0071] Priprema rastvorljivih TCR anti-CD3 fuzija je izvedena kao što je opisano u Primeru 1, osim što je TCR beta lanac fuzionisan preko linkera sa anti-CD3 jednolančanim antitelom. Pored toga, izveden je korak izmene katjona tokom prečišćavanja nakon izmene anjona. U ovom slučaju frakcije pikova iz anjonske razmene su razblažene 20 puta u 20mM MES (pH6.5) i nanete na POROS<®>50HS kolonu za izmenu katjona. Vezani protein je eluiran sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM MES. Maksimalne frakcije su sakupljene i podešene na 50 mM Tris pH 8.1, pre nego što su koncentrovane i primenjene direktno na matricu za gel filtraciju kao što je opisano u Primeru 1.

Primer 3 - Karakterizacija vezivanja antigena rastvorljivih TCR anti-CD3 fuzionih molekula

[0072] Analiza vezivanja je sprovedena površinskom plazmonskom rezonancom, korišćenjem BIAcore 3000 ili BIAcore T200 instrumenta. Biotinilovani molekuli HLA-A*02 klase I ponovo su presavijeni sa peptidom od interesa i prečišćeni korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). Biotinilovani peptid-HLA monomeri su imobilisani na CM-5 senzorskim čipovima spojenim sa streptavidinom. Sva merenja su izvedena na 25°C u Dulbecco-vom PBS puferu, dopunjenom sa 0.005% P20.

[0073] Konstante ravnoteže vezivanja su određene korišćenjem serijskih razblaženja rastvorljivih TCR/TCR anti-CD3 fuzija ubrizganih pri konstantnoj brzini protoka od 30 ul min-1 preko protočne ćelije obložene sa ~200 jedinica odgovora (RU) peptid-HLA-A*02 kompleksa. Ravnotežni odgovori su normalizovani za svaku koncentraciju oduzimanjem puferskog odgovora na kontrolnoj protočnoj ćeliji koja sadrži irelevantan peptid-HLA. Vrednost Kd je dobijena prilagođavanjem nelinearne krive korišćenjem Prism softvera i Langmuirove izoterme vezivanja, vezana = C*Max/(C KD), gde je „vezano“ ravnotežno vezivanje u RU kod injektiranog TCR/TCR anti-CD3 koncentracija C i Max je maksimalno vezivanje.

[0074] Za interakcije visokog afiniteta, parametri vezivanja su određeni analizom kinetike jednog ciklusa. Pet različitih koncentracija TCR anti-CD3 fuzije je injektirano preko protočne ćelije obložene sa ~100 - 200 RU kompleksa peptid-HLA korišćenjem brzine protoka od 50-60

2

µl min-1. Tipično, 60-200 µl TCR anti-CD3 fuzije je ubrizgano u najvišoj koncentraciji od 100-300 nM, uz uzastopna 2 puta razblaženja koja su korišćena za ostale četiri injekcije. Prvo je ubrizgana najniža koncentracija. Da bi se izmerila faza disocijacije, pufer je zatim injektiran dok se ne javi ≥ 10% disocijacije, obično posle 1 - 3 sata. Kinetički parametri su izračunati korišćenjem BIAevaluation<®>softvera. Faza disocijacije je prilagođena jednoj eksponencijalnoj jednačini raspada koja omogućava izračunavanje vremena poluraspada. Konstanta ravnoteže Kd je izračunata iz koff/kon.

Rezultati

[0075] Parametri vezivanja (konstanta disocijacije (Kd) i polu-život (T1/2)) dva mutantna TCR pronalaska spojena sa anti-CD3 prikazani su u tabeli ispod. Vrednost Kd rastvorljivog oblika nemutiranog TCR, bez anti-CD3, prethodno je određena kao 85 nM (WO2006103429 i Varela-Rohena et al.2008, Nat Med, 14(12):1390-5).

Uporedni primer

[0076] Prethodno poznati mutant najvećeg afiniteta WT TCR (nazvan a11b6, (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5)) je pripremljen kao anti-CD3 fuzija i procenjen na vezivanje pod istim uslovima kao m121 i m134 gore. U ovom slučaju, afinitet vezivanja (Kd) je izračunat kao 360 pM, a poluživot je bio 3.5 h.

[0077] Ovi rezultati pokazuju da mutantni TCR prema pronalasku imaju neočekivano visok afinitet i dug poluživot vezivanja za kompleks SLYNTVATL-HLA-A*02, u poređenju sa WT TCR, i drugim prethodno otkrivenim varijantama visokog afiniteta, što ih čini posebno pogodnim za upotrebu kao rastvorljiva terapeutska sredstva za preusmeravanje odgovora T ćelija na ćelije inficirane HIV-om koje predstavljaju niske nivoe kompleksa SLYNTVATL-HLA-A*02.

Primer 4 – Potentno preusmeravanje T ćelija protiv ćelija koje prikazuju kompleks SLYNTVATL-HLA-A*02 pomoću TCR anti-CD3 fuzionih molekula

[0078] Sposobnost TCR anti-CD3 fuzije pronalaska da izazovu snažan odgovor T ćelija u prisustvu ćelija koje prikazuju SLYNTVATL-HLA-A*02 kompleks je ispitivana korišćenjem ELISPOT testa, sa sekrecijom IFNy kao što je očitano za aktivaciju T ćelija.

[0079] Testovi su sprovedeni korišćenjem IFNy ELISPOT test kompleta (BD Biosciences, kat. br. 551849), prema uputstvima proizvođača. T2 ćelije (American Type Culture Collection) pulsirane sa 1nM SLYNTVATL peptidom su korišćene kao ciljne ćelije i postavljene na 5×10<4>ćelija/bunariću u 50 µl. Titrirane koncentracije TCR-anti CD3 fuzije su zatim dodate u konačnim koncentracijama od of 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 nM u 50 µl. Efektorske ćelije (CD8+ T ćelije) iz donorskih PBMC su izolovane Ficoll-Hypaque odvajanjem gradijenta gustine (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS), koristeći Lymphoprep (Axis-Shields, kat. br. NYC-1114547) i Leucosep epruvete (Greiner, kat. br.227290). CD8+ T ćelije su obogaćene iz PBMC negativnim selekcijama korišćenjem imunodeplecije magnetnih kuglica, u skladu sa uputstvima proizvođača (MACS, Miltenyi Biotec). Efektorske ćelije su postavljene na 8 × 10<4>ćelija/bunariću u 50 µl. Konačna zapremina svakog bunarčića je dopunjena do 200 µl sa puferom za ispitivanje (10% FCS, 88% RPMI, 1% glutamin, 1% penicilin/streptomicin).

[0080] Ploče su inkubirane 18-20 h na 37°C i 5% CO2i kvantitativno određene nakon razvoja korišćenjem automatizovanog ELISpot čitača (Immunospot Series 5 Analyzer, Cellular Technology Ltd).

[0081] Ciljne ćelije koje predstavljaju irelevantan peptid su dodate kao negativna kontrola u prisustvu efektora i 1 nM TCR-anti CD3 fuzije. Dodatni kontrolni uzorci su pripremljeni sa efektorskim ćelijama plus ciljnim ćelijama i samim efektorima. Podaci su analizirani korišćenjem Prism 5.0 softvera (GraphPad, softver) da bi se izračunale vrednosti EC50.

Rezultati

2

[0082] Slika 7 prikazuje krive odgovora koje proizvode m121 i m134. EC50vrednosti poreklom iz krivih su u tabeli ispod.

Uporedni primer

[0083] Ranije poznati mutant najvećeg afiniteta WT TCR (nazvan a11b6, (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5)) je pripremljen kao anti-CD3 fuzija i EC50vrednost utvrđena u isto vreme i pod identičnim uslovima kao za m121 i m134 gore. EC50vrednost za a11b6 je izračunata na 135 pM.

[0084] Ovi podaci pokazuju da su TCR-anti CD3 fuzije pronalaska, neočekivano, veoma moćne u preusmeravanju T ćelija protiv ćelija koje prikazuju SLYNTVATL-HLA-A*02 kompleks, i stoga su idealne kao terapeutski reagensi za ciljno delovanje na HIV inficirane ćelije sa niskim nivoom kompleksa SLYNTVATL-HLA-A*02.

Primer 5 - Specifično preusmeravanje T ćelija pomoću TCR anti-CD3 fuzije

[0085] Specifičnost TCR-anti CD3 fuzije je procenjena IFNy ELISPOT testom korišćenjem antigen-negativnih, HLA-A*02-pozitivnih, humanih ćelijskih linija kancera kao ciljnih ćelija (ćelije melanoma Mel526 (Thymed) i ćelija kancera bešike J82 (American Type Culture Collection)). Testovi su izvedeni korišćenjem istog postupka kao što je opisan u Primeru 4. Korišćene su različite koncentracije TCR anti-CD3 fuzije kao što je prikazano na Slici 8.

Rezultati

2

[0086] Podaci predstavljeni na slici 8 pokazuju da se niski nivoi nespecifične aktivacije T ćelija mogu otkriti samo pri visokim koncentracijama TCR-anti CD3 fuzije, odnosno najmanje 1000 puta većim od vrednosti EC50, i izvan očekivanog terapeutskog opsega (više od 10<-9>M). Zbog toga TCR prema pronalasku imaju neočekivano visok nivo ciljne specifičnosti.

Primer 6 - Preusmeravanje T ćelija pomoću TCR anti-CD3 fuzije se dešava čak i pri niskim koncentracijama peptida

[0087] Da bi se odredila osetljivost TCR anti-CD3 fuzije pronalaska na peptidni HLA-kompleks, izvedeni su eksperimenti titracije peptida korišćenjem T2 ćelija pulsiranih sa različitim koncentracijama peptida. Aktivacija T ćelija je određena korišćenjem istog IFNy ELISPOT postupka kao što je opisan u Primeru 4. TCR anti-CD3 fuzije su korišćene u koncentraciji od 1 nM. Koncentracije peptida su prikazane na slici 9.

Rezultati

[0088] Podaci predstavljeni na slici 9 pokazuju da su TCR anti-CD3 fuzije osetljive na niske nanomolarne koncentracije egzogeno napunjenog peptida. U struci je pokazano da pulsirajuće T2 ćelije pri koncentracijama peptida od 10-9 M rezultiraju malim brojem epitopa po ćeliji (>50) i odgovaraju broju epitopa prisutnih na površini ćelija kancer (Bossi et al. Oncoimmunology, 2013, 2(11): e26840); prema tome, TCR prema pronalasku su neočekivano visoko osetljivi na ćelije koje prikazuju veoma mali broj epitopa. Ovako visok nivo osetljivosti može olakšati čišćenje rezervoara ćelija inificiranih virusom in vivo.

2

Claims (18)

1. Patentni zahtevi 1. T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) u kompleksu sa HLA-A*02 i koji sadrži varijabilni domen alfa lanca TCR i varijabilni domen beta lanca TCR, pri čemu (i) varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili 7 i varijabilni domen beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8; ili (ii) TCR ima najmanje 90% identičnosti sa TCR (i) i ima KDi/ili polu-život vezivanja za kompleks SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 unutar 50% izmerenog KDi/ili poluživot vezivanja TCR iz (i), kada se meri korišćenjem površinske plazmonske rezonance pod identičnim uslovima, na 25°C i na istom SPR čipu.
2. 2. TCR prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što TCR iz (ii) ima KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 unutar 20% izmerenog KDi/ili poluživot vezivanja TCR iz (i), kada se meri pod identičnim uslovima, na 25°C i na istom SPR čipu.
3. 3. TCR prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time što je, u varijabilnom domenu alfa lanca, sekvenca aminokiselinskih ostataka 28-33, 51-56 i 91-101 izabrana od sledećih u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 2:
4. 4. TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je, u varijabilnom domenu beta lanca, sekvenca aminokiselinskih ostataka 28-32, 50-55 i 93-103 izabrana od sledećih u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 3: 2
5. 5. TCR prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačen time što varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa SEQ ID NOs: 6 ili 7 i varijabilni domen beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa SEQ ID NO: 8.
6. 6. TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je alfa-beta heterodimer, koji ima sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2, izborno pri čemu su sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom za deleciju prirodne disulfidne veze između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2, dalje izborno pri čemu su sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca modifikovane supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pomenuti cisteini formiraju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.
7. 7. TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je u jednolančanom formatu tipa Va-L-Vb, Vb-L-Va, Va-Ca-L-Vb, Va-L-Vb-Cb, Va-Ca- L-Vb-Cb ili Vb-Cb-L-Va-Ca pri čemu su Va i Vb TCR alfa i beta varijabilni regioni, Ca i Cb su TCR alfa i beta konstantni regioni, respektivno i L je sekvenca linkera.
8. 8. TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je povezan sa obeleživačem koji se može detektovati, terapeutskim sredstvom ili grupom koja modifikuje PK.
9. 9. TCR prema patentnom zahtevu 8, koji je povezan sa anti-CD3 antitelom kovalentno vezanim za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR, izborno preko linker sekvence, izborno pri čemu je sekvenca linkera izabrana iz grupe koja se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGSG (SEQ ID NO: 13), GGSGG (SEQ ID NO: 14), GSGGG (SEQ ID NO: 15), GSGGGP (SEQ ID NO: 16), GGEPS (SEQ ID NO: 17), GGEGGGP (SEQ ID NO: 18) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 19).
10. 10. TCR-anti-CD3 fuzioni molekul u kome varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 6 ili 7 i varijabilni domen beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, i pri čemu anti-CD3 antitelo je kovalentno vezano za N-terminus ili C-terminus TCR beta lanca preko linker sekvence izabrane od SEQ ID NOs: 12-19.
11. 11. TCR-anti-CD3 fuzioni molekul koji sadrži aminokiselinsku sekvencu alfa lanca SEQ ID NO: 9 ili 10, i aminokiselinsku sekvencu beta lanca SEQ ID NO: 11.
12. 12. Nukleinska kiselina koja kodira TCR alfa lanac i/ili TCR beta lanac prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 i/ili TCR-anti-CD3 fuzioni molekul prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11.
13. 13. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12.
14. 14. Ćelija koja sadrži (a) TCR ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12 u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja koja kodira alfa lanac i beta lanac; ili (b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR prema bilo kom patentnih zahteva 1-9.
15. 15. Izolovana ili ćelija koja se ne javlja u prirodi, posebno T-ćelija, koja prikazuje TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.
16. 16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili TCR-anti-CD3 fuzioni molekul prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, ili ćelija prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.
17. 17. TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili TCR-anti-CD3 fuzioni molekul prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, ili nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 12, ili ćelija prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15 za upotrebu u medicini, kod humanog subjekta.
18. 18. TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili TCR-anti-CD3 fuzioni molekul prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, ili nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 12, ili ćelija prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15 za upotrebu u postupku lečenja HIV infekcije ili SIDA-e kod humanog subjekta. 1