RS65779B1

RS65779B1 - Biljke koje proizvode besemeni plod

Info

Publication number: RS65779B1
Application number: RS20240861A
Authority: RS
Inventors: Alberto Sirizzotti; Richard Bernard Berentsen; Hendrik Willem Vriezen
Original assignee: Nunhems Bv
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2024-08-30
Also published as: IL262975B2; JP6995783B2; AU2017269647B2; US20190194672A1; PL3464333T3; US11761018B2; CN109476715A; EP3464333B1; ZA201808577B; US20240018539A1; MA44031B1; UA126901C2; KR102538812B1; BR112018074101A2; HRP20241072T1; CN109476715B; EP3464333C0; KR20190008958A; ES2985965T3; EA201892624A1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je usmeren na biljke koje proizvode besemeni plod. Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupke za proizvodnju navedenih biljaka i upotrebu nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine slične ciklinu SDS za proizvodnju besemenih plodova.

[0002] Većina komercijalnih besemenih plodova je razvijena iz biljaka čiji plodovi normalno sadrže brojno, relativno krupno, tvrdo seme raspoređeno u mesu ploda. Besemeni plodovi su poznati npr. kod lubenice, paradajza, krastavca, patlidžana, grožđa, banane, citrusnog voća, kao što je narandža, limun i limeta. Besemeni plodovi su cenjeni, s obzirom da je njihovo konzumiranje uglavnom lakše i prijatnije.

[0003] Razvoj ploda normalno počinje kada jedna ili više jajnih ćelija u jajnom aparatu cveta bude oplođena jedrima spermatične ćelije iz polena.

[0004] Besemeni plodovi mogu biti rezultat dva različita fenomena. U nekim slučajevima plod se razvija bez oplodnje semenog zametka polenom, što je fenomen poznat kao partenokarpija. U drugim slučajevima, besemeni plodovi nastaju nakon oprašivanja kada je rast semena (embriona i/ili endosperma) inhibiran ili seme rano ugine, dok ostatak ploda nastavlja da raste (stenospermokarpija). Za razliku od partenokarpije, stenospermokarpija zahteva oprašivanje za početak rasta ploda.

[0005] Plodovi narandže bez semena su primer partenokarpije. Neke sorte narandže (npr. Navel) ne proizvode vijabilni polen. Međutim, mogu se unakrsno oprašiti polenom drugih sorti. U slučaju da se u voćnjaku gaji samo muški sterilna sorta, neće biti oprašivanja i proizvodiće se partenokarpni besemeni plodovi. Razmnožavanje odgovarajućih stabala pomorandže se obično vrši reznicama nakon čega sledi kalemljenje na drugu podlogu.

[0006] Banane bez semena su triploidne. Iako oprašivanje u nekim slučajevima može biti normalno, velika većina plodova je bez semena. Ovo se objašnjava neujednačenim setovima hromozoma (3x) što dovodi do nepravilne podele hromozoma tokom mejoze i kao posledica, do proizvodnje nevijabilnog polena. Bez oplodnje, triploidne banane su takođe u stanju da zametnu i razviju besemene plodove. Čak i kada dođe do oprašivanja, najviše jedan od tri stotine plodova sadrži nekoliko semena. Ovo može biti zbog toga što triploidni polen nije vijabilan, iz objašnjenih razloga. Zbog toga se generalno može videti da su biljke banana partenokarpne. Biljke banana se obično razmnožavaju aseksualno iz bočnih izdanaka ili izbojaka na dnu glavne stabljike, koji se mogu ukloniti i ponovo posaditi da bi se nastavio kultivar. Uzgajivači banane razmnožavaju i pomoću kulture tkiva, posebno za proizvodnju materijala koji ne nosi bolesti.

[0007] Besemeni krastavac, besemena bundeva i besemeni patlidžan su primeri kultura koje mogu da daju besemene plodove bez oprašivanja (partenokarpija), npr. u uslovima u kojima je oprašivanje narušeno (npr. niske temperature). Međutim, i u ovim uslovima mogu da se proizvedu plodovi komercijalnog kvaliteta.

[0008] Međutim, nakon oprašivanja sve ove kulture mogu da daju plodove sa semenom. Stoga su ove kulture fakultativno partenokarpne. Razmnožavanje kultura može da se ostvari samo- ili unakrsnim oprašivanjem, in vitro razmnožavanjem i kalemljenjem.

[0009] Takođe je poznato da mutanti paradajza mogu da proizvedu besemene plodove u uslovima kada je normalno oprašivanje/oplodnja otežana (npr. u uslovima niske temperature). Stoga su i ovi mutanti fakultativno partenokarpni. Mutanti za koje se zna da ispoljavaju ovaj fenotip su pat, pat-2 i sistem pat-3/pat-4. Genetička osnova ovih mutacija nije poznata i izgleda da sistem pat-3/pat-4 zavisi od većeg broja lokusa.

[0010] Parenokarpija je takođe uvedena u nekoliko biljnih vrsta genetskom modifikacijom. Ekspresija bakterijske triptofan monooksigenaze (iaaM) koja omogućava sintezu auksina pod kontrolom promotora DefH9 specifičnog za semeni zametak i placentu indukovala je partenokarpiju kod krastavaca (Yin et al., 2006, Clular & molecular Biotech. Letters 11, 279-290), patlidžana (Acciarri et al., 2002, BMC Biotech. 2(4)), paradajza (Rotino et al., 2005, BMC Biotech. 5(32)) i duvana.

[0011] Ove transgene biljke pokazuju značaj biljnih hormona u razvoju semena i plodova. U tehnici je dobro poznato da su razvoj semena i ploda, pored drugih faktora, pod snažnom kontrolom nekoliko biljnih hormona. Partenokarpija, uključujući logičnu posledicu gubitka semena ploda, takođe može biti izazvana npr. egzogenom primenom biljnih hormona, posebno auksina ili giberelina (Ruan et al., Trends in Plant Sci.17(11), 1360-1385).

[0012] Besemene lubenice koje proizvode uzgajivači su primeri stenospermokarpnih kultura. Normalne biljke lubenice su diploidne (2n). Lubenice koje proizvode plod bez semena su hibridi proizvedeni ukrštanjem muške diploidne (2n) biljke lubenice sa ženskom tetraploidnom (4n) biljkom lubenice. Dobijeno F1 hibridno seme je triploidno (3n). Indukcija zametanja plodova kod F1 hibridnih biljaka zahteva oprašivanje. Kako triploidne (3n) F1 hibridne biljke ne proizvode plodni polen, takozvani oprašivači, ili biljke oprašivači, moraju da budu posađeni na istom polju. Biljke oprašivači su diploidne (2n). Generalno, odnos oprašivača i hibridnih biljaka od oko 1 do 3 mora biti zasađen u datoj šemi da bi se obezbedilo dovoljno polena za oprašivanje svih F1 hibridnih biljaka. Unakrsno oprašivanje između diploidnog (2n) oprašivača i cvetova ženske triploidne (3n) hibridne biljke izaziva zametanje plodova i dovodi do proizvodnje triploidnih plodova bez semena na triploidnoj hibridnoj biljci. Diploidni (2n) i tetraploidni (4n) roditelji F1 hibrida proizvode plodove sa semenom i oba se mogu razmnožavati nezavisno jedan od drugog samooprašivanjem.

[0013] Besemeno grožđe može da se proizvede od biljaka koje su partenokarpne ili stenospermokarpne. Sorta Crni Korint je partenokarp, dok je Sultanina stenospermokarp. Biljke vinove loze se uglavnom razmnožavaju reznicama i uzastopnim kalemljenjem na drugu podlogu.

[0014] Nepravilnosti u mejozi mogu biti faktor koji dovodi do toga da biljke proizvode plodove bez semena. Primer biljaka koje proizvode plodove bez semena dat je u Zhang et al. (2012, Scientia Horticulture 140, 107-114), koji otkriva besemene lubenice. Muški i ženski sterilni (MFS) mutant je dobijen iz potomstva F1-hibrida nakon ozračivanja njegovog semena gama zracima. Polen sa MFS mutanta uopšte nije bio vijabilan. Besemene plodove proizvode MFS biljke, kada se opraše polenom muških plodnih biljaka. Stoga MFS biljka lubenice može da se klasifikuje kao stenospermokarpna. Semeni zameci su takođe bili skoro u potpunosti nevijabilni, pošto skoro da nije bilo semena nakon unakrsnog oprašivanja MFS mutanata polenom različitih muški plodnih biljaka. Kod MFS mutanta je primećena nepotpuna sinapsa i abnormalno razdvajanje hromatida tokom mejoze, što se smatra uzrokom muškog i ženskog steriliteta. Geni odgovorni za efekte prisutne u MFS mutantu nisu identifikovani, ali se čini verovatnim da je fenotip MFS mutanta posledica jednog recesivnog gena.

[0015] Pradillo et al. (2014, Frontiers in Plant Sci. 5, Article 23, do: 10.3389/fpls.2014.00023) daje pregled znanja u struci o genima koji su uključeni u homolognu rekombinaciju tokom mejoze kod biljke Arabidospsis.

[0016] Azumi et al. (2002, EMBO J. 21(12), 3081-3095) opisuju izolaciju mutanta Arabidopsis koji ima defekte u sinapsi i bivalentnu formaciju u muškoj mejozi, i slične defekte, mada u manjoj meri, u ženskoj mejozi. Mutacija je označena kao „Solo Dancers“ (sds) i pokazalo se da potiče od jednog recesivnog gena. SDS mutanti su muški sterilni i sa jako narušenom ženskom plodnošću. Biljke homozigotne za sds mutaciju su muški sterilne, ali barem u manjoj meri ženski plodne, što je pokazano unakrsnim oprašivanjem sds mutantne biljke polenom muški plodnih biljaka. SDS mutanti su stoga muški sterilni i sa jako narušenom ženskom plodnošću. Utvrđeno je da gen sds pripada genima koji kodiraju protein tipa ciklina i pokazalo se da interaguje sa proteinima CDKs, Cdc2a i Ccdc2b Arabidopsisa. Međutim, utvrđeno je da je SDS novi, prethodno nepoznati protein tipa ciklina. De Muyt et al. (2009, PLOS genet. 5(9) e1000654, doi: 10.1371/journal.pgen.

1000654) potvrđuje da mutant sds Arabidopsisa ima defekt rekombinacije u mejozi i sugeriše da je defekt uzrokovan pogrešnom raspodelom drugog proteina (AtDMC1) u ćelijama tokom mejoze.

[0017] Iz gornje diskusije je očigledno da su faktori koji određuju da li biljke proizvode besemene plodove višestruki po prirodi i mogu da imaju nekoliko, npr. morfoloških, fizioloških i/ili genetskih uzroka.

[0018] Za dobijanje besemenih plodova kod stenospermokarpnih kultura, ženski deo cveta biljke mora da se opraši. Stenospermokarpne kulture koje se danas uzgajaju su muški sterilne. Kao posledica toga, pored ženske biljke, na istom polju mora da se uzgaja i druga muški plodna biljka (oprašivač ili biljka oprašivač). Kako je površina koja se koristi za biljke oprašivače na štetu površine koja je dostupna za ženske biljke koje daju plod bez semena, prinos po površini pod uzgojem je smanjen. Uopšteno, biljke oprašivači su normalne biljke koje takođe mogu da se samooprašuju. Međutim, plodovi koje daju biljke oprašivači proizvode seme. Kod lubenice, biljke oprašivači su obično diploidne (2n), koje nakon samooprašivanja daju plodove sa semenom, koji se u nekim slučajevima takođe mogu ubrati i prodati odvojeno (videti WO2012069539). Iz komercijalnih razloga ovi plodovi sa semenom biljaka oprašivača ne smeju se mešati sa besemenim plodovima. Zbog toga mora da se obezbedi odvajanje besemenih plodova i plodova sa semenom tokom ili posle berbe, što može da oteža ili onemogući mašinsku berbu, ili da zahteva dalju obradu nakon berbe. Ove dodatne mere predostrožnosti koje treba preduzeti povećavaju ulazne troškove u proizvodnji besemenog voća. Pored toga, biljke oprašivači su razvijene tako da cvetaju i proizvode dovoljno vijabilnog polena u isto vreme kada ženske biljke cvetaju i žig tučka može da prihvati polen, kako bi se indukovalo zametanje plodova. Dakle, biljka oprašivač mora da se uklopi sa ženskom biljkom koja proizvodi besemeni plod u pogledu vremena cvetanja i oplodnje. Ako vreme cvetanja biljke oprašivača i odgovarajuće ženske biljke nije dovoljno sinhronizovano, do oprašivanja neće doći ili će se odvijati samo u nedovoljnom broju slučajeva. Kao rezultat toga, stenospermokarpna ženska biljka proizvodi manje plodova. Štaviše, dobro je poznato u tehnici da klimatski uslovi, kao što su kiša, toplota itd., mogu da utiču na proizvodnju polena biljke oprašivača drugačije nego na vreme plodnosti žiga kod genotipski drugačije ženske biljke. Zbog toga klimatski uslovi mogu dovesti i do asinhronosti vremena plodnosti oprašivača i ženske biljke što dovodi do smanjenja prinosa.

[0019] Odgovarajući nedostaci nisu primenljivi na biljke pronalaska koje su opisane u nastavku ovog dokumenta.

[0020] Prema tome, cilj pronalaska je da se prevaziđu nedostaci biljaka koje proizvode besemeno voće koje se trenutno uzgajaju.

[0021] U populaciji mutagenizovanih M2 diploidnih biljaka lubenice posmatrana je biljka koja daje plodove bez semena. Mutantna biljka je označena kao EMB1. Iznenađujuće, polen pomenute biljke može da bude upotrebljen za povratno ukrštanje. Dakle, za razliku od biljaka koje daju besemene plodove poznatih u tehnici, biljke koje su ovde otkrivene su muški plodne. Sprovedeno je samooprašivanje potomstva dobijenog kao rezultat povratnog ukrštanja i 25% dobijenih biljaka dalo je plodove bez semena. Identifikovan je mutantni alel (emb1) koji dovodi do fenotipa besemenog ploda, odnosno kada su diploidne biljke homozigotne za emb1 (emb1/emb1) bile ili samooprašene ili oprašene polenom druge biljke, proizvele su diploidne besemene plodove. Dakle, fenotip besemenog ploda javlja se kod biljaka koje su homozigotne za recesivnu mutaciju u alelu emb1. Protein divljeg tipa, kodiran alelom divljeg tipa, koji odgovara mutantnom alelu emb1 prema pronalasku, ima neke sličnosti, ali i značajne razlike sa proteinima ciklin SDS i stoga je označen kao „protein sličan ciklinu SDS“. Identičnost sekvence između proteina ciklin SDS i sekvenci nukleinske kiseline koje ga kodiraju, poznatih u tehnici, i odgovarajućih sekvenci proteina sličnih ciklinu SDS, koji su ovde otkriveni, je niska. Što se tiče fenotipskog efekta na biljke, biljke poznate u tehnici, koje imaju mutaciju u proteinu ciklin SDS, imaju muški sterilni fenotip, dok se biljke koje su ovde otkrivene, koje imaju mutaciju u proteinu sličnom ciklinu SDS, odlikuju muškom plodnošću.

[0022] Prvi primer izvođenja ovog pronalaska odnosi se na biljne ćelije, delove biljaka i biljke, koje se odlikuju time što biljne ćelije ili biljke imaju smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u poređenju sa biljnim ćelijama i biljkama koje sadrže funkcionalni divlji tip proteina sličnog ciklinu SDS, kao što je navedeno u priloženim zahtevima.

[0023] U kontekstu ovog pronalaska, „protein sličan ciklinu SDS“ treba razumeti tako da označava protein koji, kada je njegova aktivnost smanjena ili njegova ekspresija u biljci potpuno eliminisana, dovodi do toga da se u biljci (npr. u biljci homozigotnoj za mutantnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein sličan ciklinu SDS) proizvodi polen sa muškom plodnošću, ali u isto vreme dovodi do proizvodnje besemenih plodova ove biljke, pri njenom samooprašivanju.

[0024] U kontekstu ovog pronalaska, „smanjena aktivnost“ proteina će značiti smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u poređenju sa odgovarajućom ćelijom divljeg tipa ili odgovarajućom biljkom divljeg tipa. Smanjenje će u jednom aspektu obuhvatati potpunu inaktivaciju ekspresije gena, ili proizvodnju proteina sličnog ciklinu SDS koji je neaktivan ili ima smanjenu funkciju, npr. skraćeni protein sličan SDS može da bude neaktivan ili da ima smanjenu funkciju. Smanjenje aktivnosti može da bude smanjenje ekspresije gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS (takođe označeno kao „knock-down“), ili inaktivacija ekspresije gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS i/ili smanjenje količine proteina sličnog ciklinu SDS u ćelijama, ili smanjenje funkcije ili gubitak funkcije enzimske aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u ćelijama.

[0025] „Inaktivacija“ (knock-out) ili „potpuna inaktivacija“ podrazumeva da se ekspresija dotičnog gena više ne može detektovati.

[0026] „Gubitak funkcije (u enzimskoj aktivnosti)“ znači u kontekstu ovog pronalaska da protein, iako je prisutan u količinama jednakim ili sličnim odgovarajućem proteinu divljeg tipa, više ne izaziva njegov efekat, tj. kada su mutantni aleli prisutni u diploidnoj biljci u homozigotnom obliku, biljka je muški plodna, ali nakon oprašivanja daje samo besemene plodove. Izrazi „nefunkcionalni“ i „izgubljena aktivnost“ imaju isto značenje kao i „gubitak funkcije“. Sva tri termina se ovde koriste kao sinonimi. Dakle, kada je reč o genu za protein sličan ciklinu SDS koji kodira nefunkcionalni protein, to znači da gen može da bude eksprimiran, ali kodirani protein nije funkcionalan, npr. zbog toga što je protein skraćen ili sadrži jednu ili više aminokiselinskih zamena, insercija ili delecija u poređenju sa proteinom sličnim SDS divljeg tipa.

[0027] „Smanjenje funkcije (u enzimskoj aktivnosti)“ ili „snižena funkcija“ znači u kontekstu ovog pronalaska da protein, iako je prisutan u količinama jednakim ili sličnim odgovarajućem proteinu divljeg tipa, više ne izaziva svoj efekat, tj. kada je prisutan u homozigotnom obliku u diploidnoj biljci, biljka je muški plodna, ali nakon oprašivanja daje samo besemene plodove.

[0028] „Konzervisani domen“ se odnosi na konzervisane proteinske domene, kao što su domeni Cyclin_N (pfam00134) i Cyclin_C (pfam02984). Ovi domeni mogu da se nađu npr. u bazi podataka konzervisanih domena NCBI (internet adresa ncbi.nlm.nih.gov/cdd).

[0029] „M1 generacija“ ili „M1 biljke“ u kontekstu ovog pronalaska odnosiće se na prvu generaciju koja je proizvedena direktno mutagenim tretmanom. Biljka uzgojena iz semena tretiranog mutagenom npr. je predstavnik M1 generacije.

[0030] „M2 generacija“ ili „M2 biljka“ se ovde odnosi na generaciju dobijenu samooprašivanjem M1 generacije. Biljka uzgojena iz semena dobijenog od M1 biljke podvrgnute samooprašivanju predstavlja M2 biljku.

[0031] Smanjenje ekspresije može se, na primer, odrediti merenjem količine RNK transkripata koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS, npr. korišćenjem Northern blot analize ili RT-PCR. Ovde, smanjenje poželjno znači smanjenje količine transkripata za najmanje 50%, posebno za najmanje 70%, poželjno za najmanje 85%, a posebno poželjno za najmanje 95%.

[0032] Smanjenje količine proteina sličnog ciklinu SDS, koje rezultuje smanjenom aktivnošću ovih proteina u razmatranim biljnim ćelijama ili biljkama, može se, na primer, utvrditi imunološkim metodama kao što je Western blot analiza, ELISA (enzimski vezani imunosorbentni test) ili RIA (radioimunološki test). Ovde, smanjenje poželjno znači smanjenje količine proteina sličnih ciklinu SDS za najmanje 50%, posebno za najmanje 70%, poželjno za najmanje 85%, a posebno poželjno za najmanje 95%.

[0033] Postupci za proizvodnju antitela koja reaguju specifično sa određenim proteinom, tj. koja se specifično vezuju za navedeni protein, poznati su stručnjacima (videti, npr. Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). Nekoliko firmi nudi proizvodnju takvih antitela kao ugovornu uslugu.

[0034] Što se tiče ovog pronalaska, smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljci prema pronalasku takođe može da se odredi na osnovu fenotipa biljke. Biljke koje su homozigotne za mutantni alel koji kodira protein sličan ciklinu SDS ili imaju smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS, proizvode besemene plodove i odlikuju se muškom plodnošću (proizvode vijabilni polen).

[0035] U jednom primeru izvođenja smanjena aktivnost proteina koji ima funkciju sličnu ciklinu SDS je smanjena u biljnim ćelijama ili biljkama prema pronalasku u poređenju sa odgovarajućim biljnim ćelijama divljeg tipa ili biljkama divljeg tipa.

[0036] U kontekstu ovog pronalaska, izraz „biljna ćelija divljeg tipa“ ili „biljka divljeg tipa“ znači da su dotične biljne ćelije ili biljke korišćene kao početni materijal za proizvodnju biljnih ćelija ili biljaka prema pronalasku, tj. njihova genetska informacija, osim introdukovane jedne ili više (genetskih) modifikacija ili mutacija, odgovara onoj kod biljne ćelije ili biljke prema pronalasku. U jednom aspektu, biljka divljeg tipa ili biljna ćelija divljeg tipa je biljka koja sadrži potpuno funkcionalni protein sličan ciklinu SDS, npr. kada je u pitanju biljaka ili biljne ćelije lubenice, diploidna biljka lubenice proizvodi protein sekvence SEQ ID NO 2 i proizvodi plodove sa semenom nakon samooprašivanja. Ili, u pogledu biljaka dinje, krastavca, paradajza ili paprike, koje su ovde opisane, ali nisu u skladu sa pronalaskom, kada su u pitanju biljke ili ćelije dinje, diploidna biljka dinje proizvodi protein sekvence SEQ ID NO 6, ili kada su u pitanju biljke ili ćelije krastavca, diploidna biljka krastavca proizvodi protein sekvence SEQ ID NO 12, ili kada su u pitanju biljke ili ćelije paradajza, diploidna biljka paradajza proizvodi protein sekvence SEQ ID NO 19, ili kada su u pitanju biljke ili ćelije paprike, diploidna biljka proizvodi protein sekvence SEQ ID NO: 20.

[0037] U vezi sa ovim pronalaskom, izraz „odgovarajući“ znači da su, u poređenju nekoliko objekata, objekti koji se upoređuju jedan sa drugim održavani pod istim uslovima. U vezi sa ovim pronalaskom, izraz „odgovarajući“ u sprezi sa biljnom ćelijom divljeg tipa ili biljkom divljeg tipa znači da su biljne ćelije ili biljke, koje se međusobno upoređuju, uzgajane pod istim uslovima kultivacije, da imaju istu (kultivacionu) starost i da njihova genetska informacija, osim introdukovane jedne ili više (genetskih) modifikacija ili mutacija, odgovara onoj kod biljne ćelije ili biljke prema pronalasku. U slučaju kada se međusobno porede sekvence molekula nukleinskih kiselina RNK i DNK, ili se kaže da one odgovaraju jedna drugoj, u struci je dobro poznato da je timin (T) u molekulu DNK ekvivalentan uridinu (U) u molekulu RNK. Dakle, treba razumeti da se T u DNK sekvenci zamenjuje sa U u RNK sekvenci i obrnuto, kada se takvi molekuli međusobno porede.

[0038] Poželjno, u primerima izvođenja prema pronalasku, protein sličan ciklinu SDS biljne ćelije divljeg tipa, dela biljke ili biljke divljeg tipa je kodiran molekulima nukleinske kiseline izabranim iz grupe koja se sastoji od:

a) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2 (protein sličan ciklinu SDS lubenice) ili sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 6 (protein sličan ciklinu SDS dinje) ili SEQ ID NO 12 (protein sličan ciklinu SDS krastavca) ili SEQ ID NO: 19 (protein sličan ciklinu SDS Solanum lycopersicum) ili SEQ ID NO: 20 (protein sličan ciklinu SDS Capsicum annuum), koje nisu u skladu sa pronalaskom;

b) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein, čija je sekvenca najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak još poželjnije najmanje 90%, ili posebno poželjno najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2 ili sa sekvencom datom pod SEQ ID NO 6 ili SEQ ID NO 12 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 20, koje nisu u skladu sa pronalaskom;

c) molekula nukleinske kiseline, koji sadrže nukleotidnu sekvencu prikazanu pod SEQ ID NO 1 ili njenu komplementarnu sekvencu;

d) molekula nukleinske kiseline, koje su najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak još poželjnije najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identične sa nukleotidnim sekvencama opisanim pod c);

e) molekula nukleinske kiseline, koji hibridizuju sa najmanje jednim lancem molekula nukleinske kiseline opisanih pod a) ili c) pod strogim uslovima;

f) molekula nukleinske kiseline, čija nukleotidna sekvenca odstupa od sekvence molekula nukleinske kiseline identifikovanih pod a) ili b) zbog degeneracije genetskog koda; i g) molekula nukleinske kiseline, koji predstavljaju fragmente, alelne varijante i/ili derivate molekula nukleinske kiseline identifikovanih pod a), b), c) ili d).

[0039] Genomska nukleotidna sekvenca prikazana pod SEQ ID NO 1, i kodirajuća sekvenca kao što je naznačeno u SEQ ID NO 1, kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa Citrullus lanatus (lubenica) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazanu pod SEQ ID NO 2. SEQ ID NO 5, koja je ovde opisana, ali nije prema pronalasku, prikazuje kodirajuću sekvencu koja kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa iz Cucumis melo (dinja) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano pod SEQ ID NO 6. SEQ ID NO 12, koja je ovde opisana, ali nije prema pronalasku, prikazuje protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa iz Cucumis sativus (krastavac). SEQ ID NO: 19, koja je ovde opisana, ali nije prema pronalasku, prikazuje protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa Solanum lycopsersicum (paradajz). SEQ ID NO: 20, koja je ovde opisana, ali nije prema pronalasku, prikazuje protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa Capsicum annuum (paprika).

[0040] Biljne ćelije, delovi biljke ili biljke opisane ovde mogu biti biljne ćelije bilo koje vrste ili biljke bilo koje vrste. Biljne ćelije koje su ovde opisane mogu biti monokotiledone i dikotiledone biljne ćelije, biljke opisane ovde mogu biti monokotiledone i dikotiledone biljke. Poželjno, biljne ćelije koje su ovde opisane su biljne ćelije povrća (ćelije povrća) ili su biljke povrće, posebno povrće kao paradajz, crni luk, praziluk, beli luk, šargarepa, paprika, špargla, artičoka, celer, krastavac, dinja, tikva, bundeva, zelena salata, lubenica, spanać, kupus (Brassica oleracea), matovilac, patlidžan i bamija. Poželjnije su ovde opisane biljne ćelije povrća (ćelije povrća) ili biljke povrća iz familije Cucurbitaceae ili familije Solanaceae. Najpoželjnije ovde opisane biljne ćelije i biljke obuhvataju biljne ćelije ili biljke bundeve (Cucurbita pepo, Cucurbtita maxima, Cucurbita moschata, Lagenaria siceraria), dinje (Cucumis melo), krastavca (Cucumis sativus), lubenice (Citrullus lanatus), paradajza (Solanum lycopersicum) ili paprike (Capsicum annuum), posebno poželjne su biljne ćelije lubenice (Citrullus lanatus) ili biljke lubenice (Citrullus lanatus), kao što je dato u priloženim patentnim zahtevima. U jednom primeru izvođenja, biljke i biljne ćelije su kultivisane biljke ovih vrsta, kao što su inbred linije ili sorte koje imaju dobre agronomske karakteristike, posebno koje proizvode tržišne proizvode (npr. plodove) dobrog kvaliteta i uniformnosti.

[0041] Drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska se odnosi na biljke i delove biljaka koji sadrže biljne ćelije prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

[0042] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska je biljna ćelija ili biljka, kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima, koje se odlikuju time što biljna ćelija ili biljka imaju smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u poređenju sa odgovarajućom biljnom ćelijom divljeg tipa ili biljkom divljeg tipa, pri čemu je protein sličan ciklinu SDS odgovarajuće biljne ćelije divljeg tipa ili biljke divljeg tipa kodiran molekulima nukleinske kiseline izabranim iz grupe koja se sastoji od

a) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2 (protein sličan ciklinu SDS lubenice) ili protein sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 6 (protein sličan ciklinu SDS dinje) ili SEQ ID NO 12 (protein sličan ciklinu SDS krastavca) ili SEQ ID NO: 19 (protein sličan ciklinu SDS Solanum lycopersicum) ili SEQ ID NO: 20 (protein sličan ciklinu SDS Capsicum annuum), koje nisu prema pronalasku;

b) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein, čija je sekvenca najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak još poželjnije najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2 ili sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 6 ili SEQ ID NO 12 ili SEQ ID NO 19 ili SEQ ID NO 20, koje nisu prema pronalasku;

d) molekula nukleinske kiseline, koji su najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak još poželjnije najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identični sa nukleotidnim sekvencama opisanim pod c);

e) molekula nukleinske kiseline, koji hibridizuju sa najmanje jednim lancem molekula nukleinske kiseline opisanih pod a), b), c), ili d) pod strogim uslovima od najmanje jednog pranja u 0.2X SSC na temperaturi od najmanje 50°C tokom 20 min;

f) molekula nukleinske kiseline, čija nukleotidna sekvenca odstupa od sekvence molekula nukleinske kiseline identifikovanih pod a) ili b) zbog degeneracije genetskog koda.

[0043] „Identičnost sekvence“ i „sličnost sekvence“ se mogu odrediti poravnanjem dve peptidne ili dve nukleotidne sekvence korišćenjem globalnih ili lokalnih algoritama poravnanja. Sekvence se tada mogu označiti „suštinski identičnim“ ili „sa suštinskom identičnošću“ kada optimalno poravnate, na primer, programima GAP ili BESTFIT ili Emboss programom „Needle“ (korišćenjem podrazumevanih parametara, pogledajte ispod) dele barem određeni minimalni procenat identičnosti sekvence (kao što je definisano dalje u nastavku). Ovi programi koriste Needleman i Wunsch globalni algoritam poravnanja za poravnavanje dve sekvence, po celoj njihovoj dužini, maksimizirajući broj podudaranja i minimizirajući broj praznina. Generalno, koriste se podrazumevani parametri, sa kaznom za stvaranje praznine = 10 i kaznom za dužinu praznine = 0.5 (za poravnanje nukleotida, kao i proteina). Za nukleotide korišćena podrazumevana matrica za bodovanje je DNAFULL a za proteine podrazumevana matrica za bodovanje je Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Poravnanja sekvenci i rezultati za procentualnu identičnost sekvenci mogu se, na primer, odrediti korišćenjem kompjuterskih programa, kao što je EMBOSS, koji su dostupni na internet adresi ebi.ac.uk/Tools/emboss/. Alternativno, sličnost ili identičnost sekvenci se može utvrditi pretraživanjem prema bazama podataka (npr. EMBL, GenBank) korišćenjem opšte poznatih algoritama i izlaznih formata kao što su FASTA, BLAST, itd., ali pogotke treba preuzeti i poravnati u parovima da bi se uporedila identičnost sekvence. Dva proteina ili dva proteinska domena, ili dve sekvence nukleinske kiseline imaju „suštinsku identičnost sekvenci“ ako je procenat identičnosti sekvence najmanje 58%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ili više (određeno pomoću programa Emboss „needle“ korišćenjem podrazumevanih parametara, tj. kazne za stvaranje praznine = 10, kazne za dužinu praznine = 0.5, korišćenjem matrice bodovanja DNAFULL za nukleinske kiseline i Blosum62 za proteine). Takve sekvence se ovde takođe nazivaju „varijante“ ili „alelne varijante“ ili „derivati“. Mogu se identifikovati druge alelne varijante gena/alela koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS i proteina sličnih ciklinu SDS u odnosu na specifične sekvence nukleinske kiseline i proteina koje su ovde otkrivene. Tako su, na primer proteini slični ciklinu SDS koji imaju suštinsku identičnost sekvence sa proteinom sekvence SEQ ID NO: 2, ili sa proteinom sekvence SEQ ID NO: 6, ili sa proteinom sekvence SEQ ID NO: 12, ili sa proteinom sekvence SEQ ID NO: 18, ili sa proteinom sekvence SEQ ID NO: 19 varijante datog proteina.

[0044] Alelne varijante mogu da postoje u drugim kultivisanim biljnim ćelijama ili biljkama, posebno u povrću kao što je paradajz, crni luk, praziluk, beli luk, šargarepa, paprika, špargla, artičoka, tikva, bundeva, celer, krastavac, dinja, zelena salata, lubenica, spanać, vrste kupusa (Brassica), matovilac i bamija. Mutacije u takvim alelnim varijantama gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS imaju isti efekat na mušku i žensku plodnost i proizvodnju besemenog ploda u biljkama drugog povrća. Posebno alelne varijante gena za protein sličan ciklinu SDS mogu da postoje u biljnim ćelijama ili biljkama familije Cucurbitaceae, kao dinja (Cucumis melo), krastavac (Cucumis sativus), lubenica (Citrullus lanatus), bundeva (Cucurbita pepo, Cucurbtita maxima, Cucurbita moschata, Lagenaria siceraria), posebno poželjne alelne varijante gena za protein sličan ciklinu SDS mogu da postoje u biljnim ćelijama lubenice (Citrullus lanatus), dinje (Cucumis melo) ili krastavca (Cucumis sativus) ili biljkama lubenice (Citrullus lanatus) ili dinje (Cucumis melo) ili krastavca (Cucumis sativus). Dodatno, alelne varijante gena za protein sličan ciklinu SDS mogu da postoje u biljnim ćelijama ili biljkama familije Solanaceae, kao paradajz (Solanum lycopersicum) ili divlji srodnici paradajza (S. pimpinelli, S. cheesmaniae, S. galapagense, S. pimpinellifolium, S. chmielewskii, S. habrochaites, S. neorickii, i S. pennelli, S. arcanum, S. chilense, S. corneliomulleri, S. huaylasense i S. peruvianum), paprika (Capsicum annuum), Solanum melongena (patlidžan), Solanum tuberosum (krompir), itd.

[0045] Alelne varijante mogu takođe da postoje u drugim kultivisanim kulturama, kao što su biljne kulture (npr. vrste Brassica, kukuruz, pirinač, soja, pšenica, ječam, pamuk, duvan, kafa, itd.) ili kulturama voća (npr. grožđe, jabuka, šljiva, citrusi, jagoda, itd.).

[0046] Treba napomenuti da proteini slični ciklinu SDS Cucurbitaceae imaju visok stepen međusobne identičnosti sekvence (najmanje 70% za date sekvence) i proteini slični ciklinu SDS Solanaceae takođe imaju visok stepen međusobne identičnosti sekvence. Sa druge strane, identičnost sekvence između sekvenci Cucurbitaceae i Solanaceae nije visoka (40% ili manje), videti tabelu A ispod.

Tabela A - identičnost sekvence proteina sličnih ciklinu SDS (poravnanje u parovima korišćenjem Needleman i Wunsch)

[0047] „Strogi uslovi hibridizacije“ se mogu koristiti za identifikaciju nukleotidnih sekvenci, koje su suštinski identične datoj nukleotidnoj sekvenci. Strogi uslovi zavise od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Generalno, strogi uslovi se biraju tako da budu oko 5 °C niži od termičke tačke topljenja (Tm) za specifične sekvence pri definisanoj jonskoj jačini i pH. Tm je temperatura (pod definisanom jonskom jačinom i pH) na kojoj se 50% ciljne sekvence hibridizuje sa savršeno podudarnom probom. Biće izabrani tipično strogi uslovi u kojima je koncentracija soli oko 0.02 mola pri pH 7 i temperatura najmanje 60 °C. Smanjenje koncentracije soli i/ili povećanje temperature povećava strogost. Strogi uslovi za RNK-DNK hibridizacije (Nothern blot pomoću probe od npr.100nt) su na primer oni koji uključuju najmanje jedno pranje u 0.2X SSC na 63 °C tokom 20 minuta, ili u ekvivalentnim uslovima. Strogi uslovi za DNK-DNK hibridizaciju (Southern blot pomoću probe od npr.100nt) su na primer oni koji uključuju najmanje jedno pranje (obično dva) u 0.2X SSC na temperaturi od najmanje 50 °C, obično oko 55 °C, tokom 20 minuta, ili u ekvivalentnim uslovima. Videti takođe Sambrook et al. (1989) i Sambruk and Russell (2001).

[0048] Smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama ili biljkama prema pronalasku se takođe može postići efektom utišavanja gena.

[0049] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, smanjena aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama ili biljkama prema pronalasku je uzrokovana efektom utišavanja gena.

[0050] Biljne ćelije prema pronalasku i biljke prema pronalasku koje imaju smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS mogu se proizvesti različitim postupcima koje izazivaju efekat utišavanja gena poznat stručnjaku. To uključuje, na primer, ekspresiju odgovarajuće antisens RNK ili dvolančanog RNK konstrukta (tehnologija RNK-interferencije), obezbeđivanje molekula ili vektora nukleinske kiseline, koji daju efekat kosupresije, ekspresiju odgovarajuće konstruisanog ribozima koji cepa specifične transkripte, koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS.

[0051] Smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama prema pronalasku može biti izazvano ekspresijom antisens sekvence u odgovarajućim biljnim ćelijama ili biljkama.

[0052] Smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama prema pronalasku može biti izazvano istovremenom ekspresijom sens i antisens molekula RNK (tehnologija RNK-interferencije) odgovarajućeg ciljnog gena čija represija treba da se postigne, poželjno gena ili alela koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0053] Pored ovoga, poznato je da in planta formiranje dvolančanih RNK molekula promotorskih sekvenci može dovesti do in trans metilacije i transkripcione inaktivacije homolognih kopija ovog promotora (Mette et al., EMBO J.19, (2000), 5194-5201). Smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama prema pronalasku može biti izazvano istovremenom ekspresijom sens i antisens molekula RNK (tehnologija RNK-interferencije) promotorskih sekvenci koje iniciraju transkripciju odgovarajućeg ciljnog gena čija represija treba da se postigne, poželjno gena ili alela koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0054] U tehnici je takođe opisano da ribozimi smanjuju ekspresiju proteina cepanjem RNK molekula koji kodiraju ciljni gen.

[0055] Dodatna diskusija o odgovarajućim tehnologijama za utišavanje gena koje su poznate stručnjaku u ovoj oblasti biće dodatno data u nastavku teksta i one su primenljive na biljne ćelije ili biljke prema pronalasku.

[0056] „Efekat utišavanja gena“ se odnosi na nishodnu regulaciju ili potpunu inhibiciju genske ekspresije ciljnog gena ili porodice gena. Utišane biljne ćelije ili biljke proizvode manje količine transkripata pogodnih za translaciju (uključujući iRNK) za odgovarajući ciljni gen ili alel, u poređenju sa odgovarajućim biljnim ćelijama divljeg tipa ili odgovarajućim biljkama divljeg tipa.

Manje količine transkripata pogodnih za translaciju (uključujući iRNK) mogu da budu posledica ciljane degradacije odgovarajućih transkripata.

[0057] Pod „ciljnim genom ili alelom“ podrazumeva se gen ili alel ili porodica gena (ili jedan ili više specifičnih alela gena) koji moraju da se moduliraju da bi organizam (npr. biljna ćelija ili biljka) proizveo željeni fenotip. Kada su u pitanju muški sterilne biljke koje daju besemene plodove, npr. ciljni gen(i) ili ciljni alel(i) je/su gen(i) koji kodira(ju) protein linije ciklina SDS.

[0058] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, smanjena aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama ili biljkama prema pronalasku je uzrokovana imunomodulacionim postupcima.

[0059] Dalji mogući način na koji se može smanjiti enzimska aktivnost proteina u biljnim ćelijama ili biljkama je takozvani imunomodulacioni postupak. Poznato je da je in planta ekspresija antitela, koja specifično prepoznaju biljni protein, dovodi do smanjenja aktivnosti dotičnih proteina. Dodatna diskusija o odgovarajućoj tehnologiji poznatoj stručnjaku u ovoj oblasti će biti dodatno data u nastavku teksta.

[0060] Sledeći primer izvođenja pronalaska su biljne ćelije ili biljke, kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima, koje se odlikuju time što sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS može biti prisutan u homozigotnom ili heterozigotnom stanju. U jednom aspektu, mutantni alel kodira protein sličan ciklinu SDS koji ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije kodiranog mutantnog proteina. Mutantni alel može da kodira protein sa jednom ili više aminokiselina koje su zamenjene, inserirane ili deletirane, što dovodi do toga da protein ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije u poređenju sa (funkcionalnim) proteinom divljeg tipa. U jednom aspektu mutantni alel dovodi do toga da se proizvodi skraćeni protein sličan ciklinu SDS, pri čemu skraćeni protein ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije. U drugom aspektu, mutantni alel kodira protein sa jednom ili više aminokiselina koje su zamenjene, inserirane ili deletirane u konzervisanom domenu proteina sličnog ciklinu SDS, kao što je domen Cyclin_N (pfam00134) ili domen Cyclin C (pfam02984). Stručnjak može identifikovati domen Cyclin_N i domen Cyclin_C proteina, npr. poravnanja proteinskih sekvenci pomoću programa BLAST na veb-sajtu NCBI (internet adresa blast.ncbi.nlm.nih.gov) ili pretraživanjem u bazi podataka konzervisanih domena NCBI (internet adresa ncbi.nlm.nih.gov/cdd).

[0061] U SEQ ID NO: 2 domen Cyclin_N se nalazi u rasponu od aminokiseline 388 do amino kiseline 463, a domen Cyclin_C se nalazi u rasponu od aminokiseline 466 do 531.

[0062] Poravnanjem proteinskih sekvenci pomoću programa BLAST mogu se identifikovati domeni Cyclin N i Cyclin_C korišćenog upita za pretragu, uključujući poravnanje traženih sekvenci sa domenom. Treba napomenuti da „od“ određenog broja „do“ drugog broja uključuje krajnje tačke, odnosno uključuje prvi i poslednji navedeni broj. Dakle, za bilo koju od ovde navedenih proteinskih sekvenci, ili za druge varijante sekvenci (npr. proteine čija je sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identična sa bilo kojom od sekvenci ovde datih proteina, npr. SEQ ID NO: 2, 6, 12, 19 ili 20) mogu da se odrede domeni Cyclin_N i Cyclin_C.

[0063] U SEQ ID NO 6, domen Cyclin_N se nalazi u rasponu od aminokiseline 351 do aminokiseline 481, a domen Cyclin_C se nalazi u rasponu od aminokiseline 486 do aminokiseline 577.

[0064] U SEQ ID NO: 12, domen Cyclin_N se nalazi u rasponu od aminokiseline 343 do aminokiseline 473, a domen Cyclin_C se nalazi u rasponu od aminokiseline 478 do aminokiseline 569.

[0065] U SEQ ID NO: 19, domen Cyclin_N se nalazi u rasponu od aminokiseline 362 do aminokiseline 494, a domen Cyclin_C se nalazi u rasponu od aminokiseline 499 do 584.

[0066] U SEQ ID NO: 20, domen Cyclin_N se nalazi u rasponu od aminokiseline 332 do aminokiseline 464, a domen Cyclin_C se nalazi u rasponu od aminokiseline 469 do 554.

[0067] Biljke u kojima je mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prisutan u heterozigotnom stanju, proizvešće seme i odlikuju se muškom plodnošću. Dakle, ove biljke mogu da se koriste za introdukovanje mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS u druge biljke ili mogu da se koriste za introdukovanje drugih osobina u biljku u kojoj je prisutan mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Ove biljke se takođe mogu koristiti za razmnožavanje biljaka koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.50% potomstva dobijenog kao rezultat samooprašivanja u svakom slučaju će i dalje nositi mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS u heterozigotnom stanju. Prema tome, biljke u kojima je prisutan mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS su korisne npr. u uzgoju.

[0068] Prema tome, jedan primer izvođenja pronalaska se odnosi na biljne ćelije ili biljke prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, koje su heterozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0069] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, smanjena aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama ili biljkama prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, je posledica, ili je uzrokovana, ili je efekat, mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koji je prisutan u biljnim ćelijama, odnosno biljkama.

[0070] U jednom aspektu, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, su homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koji kodira smanjenje funkcije proteina sličnog ciklinu SDS ili gubitak funkcije proteina sličnog ciklinu SDS. Biljke prema pronalasku koje su homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS proizvode plodove bez semena nakon oprašivanja sopstvenim polenom ili polenom koji potiče od druge biljke (npr. biljke divljeg tipa).

[0071] Sledeći primer izvođenja pronalaska se stoga odnosi na biljne ćelije ili biljke prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, koje su homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0072] Mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS uzrokuje da biljka bude muški plodna, ali proizvodi plodove bez semena, kada je biljka homozigotna za mutantni alel. Kada su u pitanju primeri izvođenja pronalaska, mutacija u mutantnom alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS može biti bilo koja mutacija, uključujući delecije, skraćenja, insercije, tačkaste mutacije, besmislene mutacije, mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije, mutacije na mestu spajanja egzona, mutacije pomeranja okvira čitanja i/ili mutacije u regulatornim sekvencama. Poželjno je da je mutacija u mutantnom alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS tačkasta mutacija i/ili mutacija na mestu spajanja egzona. Mutacija može da se javi u DNK sekvenci koja sadrži kodirajuću sekvencu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ili u RNK sekvenci koja kodira protein sličan ciklinu SDS ili može da se javiti u aminokiselini proteina sličnog ciklinu SDS. Što se tiče DNK sekvence gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, mutacija može da se javi u kodirajućoj sekvenci (cds, koja se sastoji od egzona) ili može da se javi u nekodirajućim sekvencama kao što su 5'- i 3'-netranslirani regioni, introni, promotori, pojačivači itd. gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Kada je u pitanju RNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, mutacija može da se javi u pre-iRNK ili iRNK. U jednom aspektu, mutantni alel rezultuje gubitkom funkcije ili smanjenjem funkcije proteina zbog zamene, insercije i/ili delecije jedne ili više aminokiselina, što na primer dovodi do zamene, insercije ili delecije jedne ili više aminokiselina u konzervisanom domenu Cyclin_N i/ili Cyclin_C. Na primer, skraćivanje proteina da bi se izazvala delecija domena Cyclin_C domena, ili njegovog dela, ili domena Cyclin_N i domena Cyclin_C ili dela domena Cyclin N i domena Cyclin_C će dovesti do gubitka funkcije ili smanjenja funkcije proteina.

[0073] Sledeći primer izvođenja pronalaska se stoga odnosi na biljne ćelije ili biljke prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koje se odlikuju time što mutantni alel sadrži ili ima za posledicu jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od

a) delecije, skraćenja, insercije, tačkaste mutacije, besmislene mutacije, mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije, mutacije na mestu spajanja egzona, mutacije pomeranja okvira čitanja u genomskoj sekvenci;

b) mutacija u jednoj ili više regulatornih sekvenci;

c) delecije, skraćenja, insercije, tačkaste mutacije, besmislene mutacije, mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije, mutacije na mestu spajanja egzona, mutacije pomeranja okvira čitanja u kodirajućoj sekvenci;

d) delecije, skraćenja, insercije, tačkaste mutacije, besmislene mutacije, mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije, mutacije na mestu spajanja egzona, mutacije pomeranja okvira čitanja u pre-iRNK ili iRNK; i/ili

e) delecije, skraćenja, insercije ili zamene jedne ili više aminokiselina u proteinu sličnom ciklinu SDS.

[0074] U poređenju sa SEQ ID NO 1, jedan od mutantnih alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, koji je ovde otkriven kao jedan primer izvođenja (prisutan u EMB1 mutantnoj biljci lubenice), ima tačkastu mutaciju (zamena G sa A) na nukleotidnoj poziciji 2185 u SEQ ID NO 1. iRNK transkribovana sa otkrivenog mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prikazana je pod SEQ ID NO 3. Odgovarajući nukleotidi na pozicijama 2186 do 2201 divljeg tipa alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prikazani pod SEQ ID NO 1 nisu prisutni u iRNK prikazanoj pod SEQ ID NO 3. Dakle, tačkasta mutacija pronađena u mutantnom alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS dovodi do delecije 16 nukleotida u iRNK transkribovanoj sa mutantnog alela u poređenju sa iRNK transkribovanom sa odgovarajućeg alela divljeg tipa. Delecija u iRNK transkribovanoj sa mutantnog alela se objašnjava mutacijom na mestu spajanja egzona koja rezultuje alternativnim spajanjem odgovarajuće iRNK. Pored toga, delecija 16 nukleotida u iRNK transkribovanoj sa otkrivenog mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS uzrokuje pomeranje okvira u okviru čitanja iRNK transkribovane sa mutantnog alela u poređenju sa iRNK transkribovanom iz odgovarajućeg divljeg tipa alela. Protein translatiran sa divljeg tipa alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prikazan je pod SEQ ID NO 2. Protein translatiran sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS je prikazan pod SEQ ID NO 4. Odgovarajuća nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiseline 358 do 363 (Ile-Leu-Arg-Phe-Glu-Glu) u SEQ ID NO 2 nije prisutna u SEQ ID NO 4 i zbog pomeranja okvira u okviru čitanja ostatak aminokiselinske sekvence je različit i aminokiseline 364 do 562 u SEQ ID NO 2 su zamenjene sa 8 aberantnih aminokiselina Asn-Trp-Thr-Met-Lys-Lys-Pro-Ile u SEQ ID NO 4 (tj. aminokiseline 358 do 365 SEQ ID NO. 4). Mutantni protein sličan ciklinu SDS je mnogo kraći, ima samo 365 aminokiselina, u poređenju sa proteinom divljeg tipa od 562 aminokiseline. Dakle, aminokiselinska sekvenca mutantnog proteina sličnog ciklinu SDS, kao što je prikazano pod SEQ ID NO 4, sadrži delecije aminokiselina i zamene aminokiselina u poređenju sa divljim tipom proteina sličnog ciklinu SDS prikazanim pod SEQ ID NO 2. Dalje, pomeranje okvira u okviru čitanja iRNK transkribovane sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan SDS izaziva besmislenu mutaciju koja stvara prevremeni stop kodon (nukleotidi 1096 do 1098 u SEQ ID NO 3), što dovodi do toga da je aminokiselinska sekvenca koju kodira mutantni alel skraćena za 197 aminokiselina na C-terminusu u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinskom sekvencom kodiranom alelom divljeg tipa prikazanom pod SEQ ID NO 2. Dakle, u poređenju sa proteinom divljeg tipa, 205 aminokiselina na C-terminusu divljeg tipa zamenjeno je sa 8 drugačijih (aberantnih) aminokiselina na C-terminalnom kraju zbog pomeranja okvira čitanja, što rezultuje mutantnim proteinom koji je 197 aminokiselina kraći od proteina divljeg tipa. Mutantni protein je, dakle, skraćen u poređenju sa proteinom divljeg tipa, pošto 205 aminokiselina C-terminusa divljeg tipa nedostaje u mutantnom proteinu. Od proteina divljeg tipa samo su aminokiseline egzona 1 (aminokiseline 1 do 357 sekvence SEQ ID NO: 2) još uvek prisutne u mutantnom proteinu. To znači da nisu prisutni ni konzervisani proteinski domeni Cyclin_N i Cyclin_C, što znači da mutantni protein nema funkciju (tj. mutantni alel predstavlja alel koji je izgubio funkciju) ili ima smanjenu funkciju.

[0075] Ukratko, ovde je u jednom aspektu za ilustraciju primene specifično otkrivena sekvenca nukleinske kiseline mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koji ima tačkastu mutaciju (zamena nukleotida) u poređenju sa sekvencom nukleinske kiseline odgovarajućeg divljeg tipa gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Tačkasta mutacija u mutantnom alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS izaziva mutaciju na mestu spajanja egzona koja dovodi do alternativnog spajanja odgovarajuće pre-iRNK. Alternativno spajanje izaziva pomeranje okvira u otvorenom okviru čitanja iRNK transkribovane sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Pomeranje okvira u otvorenom okviru čitanja iRNK transkribovane sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS izaziva deleciju nukleotida, zamenu nukleotida (mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije) i stvaranje besmislene mutacije koja stvara prevremeni stop kodon u iRNK transkribovanoj sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS u poređenju sa iRNK transkribovanom sa odgovarajućeg gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca proteina translatiranog sa iRNK transkribovane sa mutantnog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS pokazuje deleciju aminokiselina, zamenu aminokiselina i skraćenje aminokiselinske sekvence na C-terminusu u poređenju sa sekvencom aminokiselina translatiranom sa iRNK transkribovane sa odgovarajućeg gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa. Pošto je tačkasta mutacija u prvom intronu, aminokiseline kodirane egzonom 2, egzonom 3 i egzonom 4 proteina sličnog ciklinu SDS divljeg tipa nedostaju u mutantu, tj. samo aminokiseline kodirane egzonom 1 proteina sličnog ciklinu SDS divljeg tipa su prisutne u mutantnom proteinu.

[0076] Kod lubenice egzon 1 proteina sličnog ciklinu SDS kodira aminokiseline 1 do 357 sekvence SEQ ID NO 2; kod dinje egzon 1 proteina sličnog ciklinu SDS kodira aminokiseline 1 do 338 sekvence SEQ ID NO: 6; kod krastavca egzon 1 proteina sličnog ciklinu SDS kodira aminokiseline 1 do 330 sekvence SEQ ID NO: 12; kod paradajza egzon 1 proteina sličnog ciklinu SDS kodira aminokiseline 1 do 350 sekvence SEQ ID NO 19; kod paprike egzon 1 proteina sličnog ciklinu SDS kodira aminokiseline 1 do 320 sekvence SEQ ID NO 20.

[0077] Pored mutantne biljke lubenice EMB 1 opisane gore (i u primerima), mutagenezom je stvorena još jedna biljka lubenice, koja sadrži drugačiju mutaciju u genu koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Mutant sadrži nukleotidnu supstituciju C (citozin) u T (timin) na nukleotidu 1687 sekvence SEQ ID NO: 1, što dovodi do promene kodona 'cag' (koji kodira aminokiselinu glutamin, aminokiselinu 224 divljeg tipa proteina) u 'tag', što je stop kodon. Mutantna cDNK je prikazana u SEQ ID NO 17, a skraćeni protein, koji sadrži samo deo aminokiselina kodiranih egzonom 1 (tj. samo aminokiseline 1 do 223 umesto aminokiselina 1 do 357), prikazan je u SEQ ID NO 18. Kao i u mutantnoj biljci EMB1, dva konzervisana domena, domeni Cyclin N i Cyclin C, nedostaju u mutantnom proteinu. Takođe, ovaj mutant dovodi do gubitka funkcije proteina sličnog ciklinu SDS (ili barem do smanjenja funkcije).

[0078] U jednom aspektu pronalaska, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima mutaciju koja dovodi do toga da jedna ili više ili sve aminokiseline domena Cyclin_N i/ili Cyclin_C budu deletirane ili zamenjene drugačijim aminokiselinama u odnosu na divlji tip. U jednom aspektu, mutantni alel dovodi do skraćenog proteina kojem nedostaje ceo ili deo domena Cyclin_N i/ili ceo ili deo domena Cyclin_C. Na primer, mutantni alel sadrži mutaciju koja dovodi do prevremenog stop kodona, pri čemu ceo ili deo domena Cyclin_N i/ili ceo ili deo domena Cyclin_C više nisu prisutni u rezultujućem proteinu.

[0079] U jednom aspektu, mutantni alel je mutantni alel gena sličnog ciklinu SDS lubenice sekvence SEQ ID NO: 1 koji daje protein SEQ ID NO: 4 ili protein SEQ ID NO: 18.

[0080] U jednom aspektu pronalaska, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima mutaciju koja dovodi do odsustva egzona 2, 3 i/ili 4 koji kodiraju aminokiseline divljeg tipa proteina. Tako u jednom aspektu mutantni alel kodira skraćeni protein sličan ciklinu SDS / ili protein koji sadrži deleciju, kojem nedostaju aminokiseline kodirane egzonima 2, 3 i/ili 4 proteina divljeg tipa, tj. nedostaju mu aminokiseline 358 do 413 SEQ ID NO 2 (egzon 2) ili aminokiseline 339 do 394 SEQ ID NO: 6 (egzon 2) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 331 do 386 SEQ ID NO 12 (egzon 2) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 351 do 407 SEQ ID NO 19 (egzon 2) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 321 do 377 SEQ ID NO: 20 (egzon 2) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, i/ili aminokiseline 414 do 469 SEQ ID NO 2 (egzon 3) ili aminokiseline 395 do 493 SEQ ID NO 6 (egzon 3) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom ili aminokiseline 387 do 485 SEQ ID NO 12 koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 408 do 506 SEQ ID NO 19 (egzon 3) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 378 do 476 SEQ ID NO 20 (egzon 3) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, i/ili aminokiseline 470 do 562 SEQ ID NO 2 (egzon 4) ili aminokiseline 494 do 577 SEQ ID NO: 6 (egzon 4) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom ili aminokiseline 486 do 569 SEQ ID NO 12 (egzon 4) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 507 do 590 SEQ ID NO 19 (egzon 4) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, aminokiseline 477 do 560 SEQ ID NO 20 (egzon 4) koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom. Opciono, mutantni alel kodira skraćeni protein sličan ciklinu SDS / ili protein koji sadrži deleciju, kome dalje nedostaju sve, ili deo aminokiselina koje kodira egzon 1, tj. aminokiseline 1 do 357 SEQ ID NO 2 ili aminokiseline 1 do 338 u SEQ ID NO: 6 koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom ili aminokiseline 1 do 330 u SEQ ID NO 12 koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom ili aminokiseline 1 do 350 SEQ ID NO 19 koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, ili aminokiseline 1 do 320 SEQ ID NO 20 koja je ovde opisana, ali koja nije u skladu sa pronalaskom. Odgovarajući aminokiselinski regioni kodirani egzonima 1, 2, 3 i 4 drugih proteina sličnih ciklinu SDS, npr. ortologa drugih vrsta, mogu se identifikovati poravnavanjem po parovima sekvenci genomske DNK ili aminokiselinskih sekvenci. Napominje se da su samo za SEQ ID NO 2 egzoni utvrđeni kao pravi egzoni (odvojeni intronima na genomskoj DNK), dok su za ostale sekvence egzoni određeni poravnanjem i možda nisu pravi egzoni, već su aminokiseline koje odgovaraju egzonima SEQ ID NO 2 i stoga se mogu jednostavno nazvati aminokiselinskim regionima proteina.

[0081] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima, ili rezultuje mutacijom na 5'-kraju svoje kodirajuće sekvence (koja kodira N-terminus proteina). Poželjniji mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima, ili rezultuje, tačkastom mutacijom i/ili skraćenjem na 5'-kraju svoje kodirajuće sekvence. U struci je dobro poznato da će mutacija u start kodonu (ATG) gena imati takav efekat, da se odgovarajući gen ne translatira u odgovarajući protein pune dužine. Za translaciju se može koristiti sledeći mogući start kodon (ATG), ali to će dovesti do skraćenja aminokiselinske sekvence proteina na N-terminusu, u slučaju da se sledeći ATG pojavi u istom okviru čitanja ili do proizvodnje proteina koji ima drugačiju aminokiselinsku sekvencu.

[0082] U oba slučaja, odgovarajuća mutacija na 5'-kraju će dovesti do proizvodnje proteina koji ima smanjenu ili izgubljenu enzimsku aktivnost. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima mutaciju u start kodonu. Mutacija u start kodonu može da bude tačkasta mutacija u bilo kom od njegova tri nukleotida ili delecija/skraćenje najmanje prvog, najmanje prvog i drugog ili najmanje sva tri nukleotida start kodona.

[0083] Dalji poželjni primeri izvođenja pronalaska su mutantni aleli gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koji rezultuju delecijom na 3'-kraju njegove kodirajuće sekvence (koja kodira C-terminus proteina). Pošto je konzervisani domen Cyclin_C prisutan na C-terminusu proteina, skraćenje koje rezultuje odsustvom dela domena Cyclin_C (npr.1, 2, 3, 4, 5 ili više aminokiselina domena Cyclin_C ili čak celog domena Cyclin_C) će dovesti do toga da protein ima smanjenu funkciju ili nema funkciju. Duže skraćivanje na C-terminusu će čak dovesti do delecije dela ili celog domena Cyclin_N, što će takođe dovesti do toga da protein ima smanjenu funkciju ili je uopšte nema. Postoji samo pet aminokiselina između domena Cyclin_C i Cyclin_N. Skraćivanje od oko 90 ili više aminokiselina na C-terminusu dovodi do toga da većini proteina sličnih ciklinu nedostaje domen Cyclin_C, a duža skraćivanja od 95, 100, 110 ili više aminokiselina će rezultovati barem delimičnom delecijom domena Cyclin_N. Kao što je ranije pomenuto, ova skraćivanja su ovde obuhvaćena, jer dovode do proteina sa smanjenom funkcijom ili bez funkcije. Kao što je ranije pomenuto, da bi se testiralo da li protein ima smanjenu funkciju ili nema funkciju, mutantna biljka koja je homozigotna za mutantni alel može da se ispita fenotipski, kako bi se videlo da li se očekivani fenotip javlja.

[0084] Poželjno je da mutantni aleli gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS rezultuju skraćenjem od najmanje 10, 20, 30, 40 ili 50 nukleotida, poželjno najmanje 100 nukleotida, poželjnije od najmanje 200 nukleotida, još poželjnije od najmanje 300 nukleotida, dalje poželjno od najmanje 400 nukleotida i najpoželjnije od najmanje 500 nukleotida, posebno poželjno od najmanje 615 nukleotida na 3' kraju sekvence koja kodira protein. Skraćivanje za 591 nukleotid iz kodirajuće sekvence translatira se u skraćenje za 197 aminokiselina odgovarajuće proteinske sekvence. Poželjan primer proteina sličnog ciklinu SDS koji je skraćen za 197 aminokiselina u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom odgovarajućeg proteina sličnog ciklinu SDS divljeg tipa (SEQ ID NO 2) prikazan je pod SEQ ID NO 4. Drugi primer skraćenja od 339 aminokiselina (tj. 1017 nukleotida kodirajućeg regiona) u poređenju sa odgovarajućim proteinom sličnim SDS divljeg tipa (SEQ ID NO 2) prikazan je u SEQ ID NO 18.

[0085] U jednom aspektu, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima bilo koju od gore navedenih mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein SEQ ID NO: 2 (što rezultuje kodiranim proteinom koji sadrži deleciju ili skraćenje u poređenju sa divljim tipom), ili u bilo kojoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identična sa SEQ ID NO 2, kao što je na primer SEQ ID NO 6 koja je opisana ovde, ali koja nije u skladu sa pronalaskom, koja ima 71% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 2.

[0086] U drugom aspektu koji je opisan, ali za koji se ne traži zaštita, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima bilo koju od gore navedenih mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein SEQ ID NO: 6 (što rezultuje kodiranim proteinom koji sadrži deleciju ili skraćenje u poređenju sa divljim tipom), ili u bilo kojoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identična sa SEQ ID NO 6.

[0087] U još jednom aspektu koji je opisan, ali za koji se ne traži zaštita, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima bilo koju od gore navedenih mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein SEQ ID NO: 12 (što rezultuje kodiranim proteinom koji sadrži deleciju ili skraćenje u poređenju sa divljim tipom), ili u bilo kojoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identična sa SEQ ID NO: 12.

[0088] U još jednom aspektu koji je opisan, ali za koji se ne traži zaštita, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima bilo koju od gore navedenih mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein SEQ ID NO: 19 (što rezultuje kodiranim proteinom koji sadrži deleciju ili skraćenje u poređenju sa divljim tipom), ili u bilo kojoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identična sa SEQ ID NO: 19.

[0089] U još jednom aspektu koji je opisan, ali za koji se ne traži zaštita, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima bilo koju od gore navedenih mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein SEQ ID NO: 20 (što rezultuje kodiranim proteinom koji sadrži deleciju ili skraćenje u poređenju sa divljim tipom), ili u bilo kojoj sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identična sa SEQ ID NO: 20.

[0090] U daljem poželjnom primeru izvođenja, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima bilo koju od gore navedenih mutacija u sekvenci nukleinske kiseline prikazanoj pod SEQ ID NO 1 ili u sekvenci koja je najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identična sa sekvencom nukleinske kiseline prikazanom pod SEQ ID NO 1. U jednom aspektu, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS sadrži mutaciju u sekvenci nukleinske kiseline prikazanoj pod SEQ ID NO 1 ili u varijanti sekvence koja je najmanje 70%, poželjnije 80%, još poželjnije 90% ili posebno poželjnije 95% identična sa sekvencom nukleinske kiseline prikazanom pod SEQ ID NO 1 u kojoj je nukleotid guanin (G) na nukleotidnoj poziciji broj 2185 u SEQ ID NO 1 zamenjen adeninom (A), citozinom (C) ili timinom (T), najpoželjnije nukleotid guanin (G) na nukleotidnoj poziciji broj 2185 u SEQ ID NO 1, ili ekvivalentni nukleotid u varijantnoj sekvenci, zamenjen je adeninom (A). Najpoželjnije je da mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ima sekvencu nukleotidne kiseline prikazanu pod SEQ NO 1, osim što je nukleotid guanin (G) na nukleotidnoj poziciji broj 2185 u SEQ ID NO 1 zamenjen adeninom (A), citozinom (C) ili timinom (T), najpoželjnije nukleotid guanin (G) na nukleotidnoj poziciji broj 2185 u SEQ ID NO 1 je zamenjen adeninom (A). U drugom aspektu, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS sadrži mutaciju u sekvenci nukleinske kiseline prikazanoj pod SEQ ID NO 1 ili u varijantnoj sekvenci koja je najmanje 70%, poželjnije 80%, čak još poželjnije 90% ili posebno poželjno 95% identična sa sekvencom nukleinske kiseline prikazanom pod SEQ ID NO 1 pri čemu je u mutantnom alelu gena koji kodira protein sličan SDS nukleotid citozin (C) na nukleotidu 1687, ili ekvivalentni nukleotid u varijantnoj sekvenci, zamenjen drugim nukleotidom, poželjno timinom (T).

[0091] Drugačiji primer izvođenja pronalaska odnosi se na biljne ćelije, biljne delove ili biljke koje sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od

a) mutacije delecije

b) mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije;

c) mutacije pomeranja okvira čitanja; i/ili

d) besmislene mutacije.

[0092] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, biljne ćelije, delovi biljke ili biljke prema pronalasku sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od

a) mutacije delecije

b) mutacije pogrešnog smisla ili nesinonimne mutacije;

c) mutacije pomeranja okvira čitanja; i/ili

d) besmislene mutacije

[0093] Što se tiče delecija i zamena jednog ili više nukleotida, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku poželjno sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu iRNK sadrži deleciju od najmanje 1, najmanje 2, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 13, najmanje 14 ili poželjno najmanje 16 nukleotida u poređenju sa iRNK koja kodira divlji tip proteina sličnog ciklinu SDS. U jednom aspektu, nukleotid(i) deletirani u iRNK su jedan ili više nukleotida egzona 1, egzona 2, egzona 3 i/ili egzona 4 proteina sličnog ciklinu SDS i/ili nukleotida deletiranih u iRNK su jedan ili više nukleotida domena Cyclin_N ili Cyclin_C proteina sličnog ciklinu SDS. U jednom aspektu, nukleotidi su nukleotidi egzona 2, npr. jedan ili više ili svi nukleotidi koji počinju na nukleotidu 2186 i završavaju na nukleotidu 2201 sekvence SEQ ID NO 1.

[0094] Poželjno, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, okarakterisane time što iRNK sadrži mutaciju pomeranja okvira čitanja i/ili besmislenu mutaciju. Besmislena mutacija stvara prevremeni stop kodon i time dovodi do skraćenja kodirajuće sekvence iRNK. Poželjni primer izvođenja pronalaska se odnosi na biljne ćelije ili biljke prema pronalasku koje sadrže iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, okarakterisanu time što iRNK sadrži skraćenje kodirajuće sekvence. Skraćivanje iRNK kodirajuće sekvence proteina sličnog ciklinu SDS je poželjno skraćenje od najmanje 100 nukleotida, poželjno od najmanje 200 nukleotida, poželjnije od najmanje 300 nukleotida, još poželjnije od najmanje 400 nukleotida i dalje poželjnije od najmanje 500 nukleotida, posebno poželjno od najmanje 591 nukleotida u poređenju sa iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa. U jednom aspektu skraćivanje iRNK kodirajuće sekvence dovodi do toga da egzon 2, 3 i 4 budu odsutni; ili da egzon 3 i 4 budu odsutni; ili da egzon 4 bude odsutan. U drugom aspektu, skraćenje iRNK kodirajuće sekvence dovodi do toga da ceo ili deo egzona 1, ceo egzon 2, ceo egzon 3 i ceo egzon 4 budu odsutni. U drugom aspektu, mutacija pomeranja okvira čitanja dovodi do toga da ceo ili deo egzona 2 bude u drugom okviru čitanja. U drugom aspektu, mutacija pomeranja okvira čitanja dovodi do toga da ceo ili deo egzona 3 i/ili egzona 4 budu u drugom okviru čitanja. Pomeranje okvira čitanja može biti uzrokovano delecijom jednog ili više nukleotida (bilo koji broj koji nije umnožak od tri, kao što je 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, itd.), čime se okvir čitanja menja.

[0095] U poželjnom primeru izvođenja, biljne ćelije, delovi biljke ili biljke prema pronalasku sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS čija iRNK ima najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak i još poželjnije najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identičnosti sekvence sa odgovarajućom kodirajućom sekvencom naznačenom u SEQ ID NO 1 sa preduslovom da iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS sadrži besmislenu mutaciju ili prevremeni stop kodon. U jednom aspektu, stop kodon je u egzonu 1 SEQ ID NO: 1, npr. na nukleotidima 1687 do 1689. U daljem poželjnom primeru izvođenja, biljne ćelije, delovi biljke ili biljke prema pronalasku sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS čija iRNK ima najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, čak još poželjno najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identičnosti sekvence sa kodirajućom sekvencom naznačenom u SEQ ID NO 3, uz preduslov da nukleotidi 1096 do 1098 u SEQ ID NO 3 predstavljaju stop kodon. U najpoželjnijem primeru izvođenja pronalaska, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku sadrže ili sintetišu iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS čija iRNK ima sekvencu prikazanu pod SEQ ID NO 3.

[0096] U drugom primeru izvođenja pronalaska, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, sadrže ili sintetizuju iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS koji ima jednu ili više mutacija, pri čemu je iRNK transkribovana sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Ovim primerima izvođenja pronalaska obuhvaćene su biljne ćelije, delovi biljke ili biljke prema pronalasku koje sadrže ili sintetizuju iRNK transkribovanu sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, okarakterisane time što iRNK sadrži delecionu mutaciju i/ili mutaciju pogrešnog smisla ili nesinonimnu mutacija i/ili mutacija pomeranja okvira čitanja i/ili besmislenu mutaciju, u poređenju sa odgovarajućom (DNK) kodirajućom sekvencom mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS sa kojeg je transkribovana iRNK. Dakle, u jednom aspektu je obuhvaćena svaka mutacija koja utiče na spajanje egzona pre-iRNK, tj. koja modifikuje normalan proces spajanja egzona pre-iRNK, što dovodi do drugačijeg molekula iRNK.

[0097] Što se tiče delecionih mutacija, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku u jednom aspektu sadrže ili sintetizuju iRNK transkribovanu sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu iRNK sadrži deleciju od najmanje 1, najmanje 2, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 13, najmanje 14 ili najmanje 16 nukleotida u poređenju sa odgovarajućom (DNK) kodirajućom sekvencom mutantnog alela gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS sa kojeg se transkribuje iRNK. U jednom aspektu, nukleotid(i) koji su deletirani u iRNK su jedan ili više nukleotida egzona 1, egzona 2, egzona 3 i/ili egzona 4 proteina sličnog ciklinu SDS. U jednom aspektu, nukleotidi su nukleotidi egzona 2, npr. jedan ili više ili svi nukleotidi koji počinju na nukleotidu 2186 i završavaju na nukleotidu 2201 sekvence SEQ ID NO 1.

[0098] Poželjno, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku sadrže ili sintetizuju iRNK transkribovanu sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, okarakterisanu time što iRNK sadrži mutaciju pomeranja okvira čitanja i/ili besmislenu mutaciju u poređenju sa (DNK) kodirajućom sekvencom mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koji kodira protein sa kojeg je transkribovana iRNK. Besmislena mutacija stvara prevremeni stop kodon u iRNK koji uzrokuje skraćenje 3'-kraja iRNK kodirajuće sekvence i skraćivanje proteina sličnog ciklinu SDS na C-terminusu. Poželjan primer izvođenja pronalaska se stoga odnosi na biljne ćelije ili biljke prema pronalasku koje sadrže ili sintetizuju iRNK transkribovanu sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, okarakterisane time što iRNK sadrži skraćenje kodirajuće sekvence u poređenju sa (DNK) kodirajućom sekvencom mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS sa kojeg je transkribovana iRNK. Skraćivanje iRNK kodirajuće sekvence gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS je poželjno skraćenje od najmanje 100 nukleotida, poželjnije od najmanje 200 nukleotida, još poželjnije od najmanje 300 nukleotida, poželjnije od najmanje 400 nukleotida i još poželjnije od najmanje 500 nukleotida, posebno poželjno od najmanje 591 u poređenju sa (DNK) kodirajućom sekvencom mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS sa kojeg je iRNK transkribovana. U jednom aspektu skraćivanje iRNK kodirajuće sekvence dovodi do toga da egzon 2, 3 i 4 budu odsutni; ili da egzon 3 i 4 budu odsutni; ili da egzon 4 bude odsutan. U drugom aspektu, skraćenje iRNK kodirajuće sekvence dovodi do toga da ceo ili deo egzona 1, ceo egzon 2, ceo egzon 3 i ceo egzon 4 budu odsutni. U drugom aspektu, mutacija pomeranja okvira čitanja dovodi do toga da ceo ili deo egzona 2 bude u drugom okviru čitanja. U drugom aspektu, mutacija pomeranja okvira čitanja dovodi do toga da ceo ili deo egzona 3 i/ili egzona 4 budu u drugom okviru čitanja. Pomeranje okvira čitanja može biti uzrokovano delecijom jednog ili više nukleotida (bilo koji broj koji nije umnožak od tri, kao što je 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, itd.), čime se okvir čitanja menja.

[0099] U daljem poželjnom primeru izvođenja, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, sadrže ili sintetizuju iRNK koja ima najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% ili posebno poželjno najmanje 95% identičnosti sa odgovarajućom (DNK) kodirajućom sekvencom naznačenom u SEQ ID NO 1 uz preduslov da sekvenca iRNK sadrži najmanje besmislenu mutaciju ili prevremeni stop kodon u poređenju sa odgovarajućom (DNK) kodirajućom sekvencom naznačenom u SEQ ID NO 1, poželjno je da se besmislena mutacija javlja na pozicijama nukleotida 1096 do 1098 u SEQ ID NO: 3. U jednom aspektu, prevremeni stop kodon je na nukleotidima 1687 do 1689 sekvence SEQ ID NO: 1. U posebno poželjnom primeru izvođenja pronalaska, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku sadrže iRNK koja ima nukleotidnu sekvencu prikazanu pod SEQ ID NO 3.

[0100] „iRNK kodirajuća sekvenca“ ovde ima uobičajeno značenje. iRNK kodirajuća sekvenca odgovara odgovarajućoj DNK kodirajućoj sekvenci gena/alela osim što je timin (T) zamenjen uracilom (U).

[0101] Za bilo koju od gore opisanih mutacija ili kombinacija mutacija (npr. delecija nukleotida koja dovodi do pomeranja okvira čitanja), podrazumeva se da one dovode do smanjenja funkcije ili gubitka funkcije aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama, delovima biljke ili biljkama prema pronalasku.

[0102] Još jedan primer izvođenja pronalaska se odnosi na biljne ćelije, delove biljaka ili biljke, koje sadrže ili sintetizuju protein sličan ciklinu SDS, okarakterisan time što aminokiselinska sekvenca proteina sličnog ciklinu SDS sadrži mutaciju u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom proteina sličnog ciklinu SDS. Mutacija u proteinu sličnom ciklinu SDS uzrokuje smanjenje ili gubitak funkcije u aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS u biljnim ćelijama, delovima biljke ili biljkama prema pronalasku.

[0103] Naročito poželjne su biljne ćelije, delovi biljke ili biljke prema pronalasku koje sadrže ili sintetizuju protein sličan ciklinu SDS, okarakterisan time što aminokiselinska sekvenca proteina sličnog ciklinu SDS sadrži mutaciju u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom proteina sličnog ciklinu SDS.

[0104] Mutacija u proteinu sličnom ciklinu SDS može da bude zamena aminokiselina, insercija, delecija i/ili skraćenje u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa proteina sličnog ciklinu SDS. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, aminokiselinska sekvenca proteina sličnog ciklinu SDS sadrži deleciju ili skraćenje, poželjnije skraćenje na N-terminusu i/ili C-terminusu, još poželjnije skraćenje na C-terminusu. Poželjno najmanje 10, najmanje 25, poželjno najmanje 50, 60, 70, 80, 90 ili 100, poželjnije najmanje 150 i još poželjnije najmanje 197 ili najmanje 200, 250, 300 ili 339 aminokiselina nedostaje sa N-terminalnog kraja ili C-terminalnog kraja aminokiselinske sekvence u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom proteina sličnog ciklinu SDS. Kada je u pitanju C-terminus, mutacija u proteinu sličnom ciklinu SDS je skraćenje od najmanje 25, poželjno najmanje 50, 60, 70, 80, 90, poželjno najmanje 100, poželjnije najmanje 150 i još poželjnije od najmanje 197 ili najmanje 200, 250, 300 ili 339 aminokiselina u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom proteina sličnog ciklinu SDS. U drugom aspektu, mutacija u proteinu sličnom ciklinu SDS dovodi do toga da aminokiseline kodirane egzonom 2, 3 i 4 budu odsutne; ili da aminokiseline kodirane egzonom 3 i 4 budu odsutne; ili da aminokiseline kodirane egzonom 4 budu odsutne. U drugom aspektu, mutacija dovodi do toga da sve ili deo aminokiselina kodiranih egzonom 1, sve aminokiseline kodirane egzonom 2, sve aminokiseline kodirane egzonom 3 i sve amino kiseline kodirane egzonom 4 budu odsutne. U drugom aspektu, mutacija dovodi do toga da sve ili deo aminokiselina kodiranih egzonom 2 budu zamenjene drugačijim aminokiselinama (npr. usled pomeranja okvira čitanja). U drugačijem aspektu, mutacija dovodi do toga da aminokiseline kodirane celim ili delom egzona 3 i/ili egzona 4 budu zamenjene različitim aminokiselinama (npr. usled pomeranja okvira čitanja). U drugom aspektu, mutacija rezultuje odsustvom celog ili dela domena Cyclin_C i/ili Cyclin_N. U još jednom drugačijem aspektu, mutacija rezultuje u domenu Cyclin_C i/ili Cyclin_N koji sadrži jednu ili više aminokiselina koja je zamenjena, insertovana ili deletirana.

[0105] Dalje su obezbeđene biljne ćelije, delovi biljke ili biljke prema pronalasku i kao što je navedeno u priloženim zahtevima koji sadrže ili sintetizuju protein sličan ciklinu SDS koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu pod SEQ ID NO 4 ili pod SEQ ID NO: 18.

[0106] Sledeći primer izvođenja pronalaska stoga se odnosi na biljne ćelije ili biljke odabrane od vrste lubenice, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, i opisano za vrstu lubenice, krastavca, paradajza i paprike (što su vrste koje nisu u skladu sa pronalaskom) koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS okarakterisane time što mutantni alel sadrži ili dovodi do jedne ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od

b) mutacije u jednoj ili više regulatornih sekvenci;

[0107] Gornji mutantni alel dovodi do smanjene aktivnosti mutantnog proteina sličnog ciklinu SDS u poređenju sa divljim tipom proteina sličnog ciklinu SDS. Smanjena aktivnost je posledica inaktivacije ekspresije gena sličnog ciklinu SDS, utišavanja ekspresije gena, gubitka funkcije kodiranog mutantnog proteina sličnog ciklinu SDS ili smanjenja funkcije mutantnog proteina sličnog ciklinu SDS.

[0108] U jednom aspektu, gde je biljna ćelija ili biljka lubenica, mutantni alel proteina sličnog ciklinu SDS je mutantni alel alela koji kodira protein SEQ ID NO: 2 ili protein čija je sekvenca suštinski identična sa sekvencom SEQ ID NO: 2, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% identična, kada su dve sekvence pune dužine funkcionalnog proteina sličnog SDS poravnate u paru.

[0109] U drugom aspektu koji je ovde opisan, ali ne u skladu sa pronalaskom, biljna ćelija ili biljka je dinja, mutantni alel proteina sličnog ciklinu SDS je mutantni alel alela koji kodira protein SEQ ID NO: 6 ili protein čija je sekvenca suštinski identična sa sekvencom SEQ ID NO: 6, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% identična, kada su dve sekvence pune dužine funkcionalnog proteina sličnog SDS poravnate u paru.

[0110] U sledećem aspektu koji je ovde opisan, ali ne prema pronalasku, biljna ćelija ili biljka je krastavac, mutantni alel proteina sličnog ciklinu SDS je mutantni alel alela koji kodira protein SEQ ID NO: 12 ili protein čija je sekvenca suštinski identična sa sekvencom SEQ ID NO: 12, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% identična, kada su dve sekvence pune dužine funkcionalnog proteina sličnog SDS poravnate u paru.

[0111] U sledećem aspektu koji je ovde opisan, ali ne u skladu sa pronalaskom, biljna ćelija ili biljka je paradajz, mutantni alel proteina sličnog ciklinu SDS je mutantni alel alela koji kodira protein SEQ ID NO: 19 ili protein čija je sekvenca suštinski identična sa sekvencom SEQ ID NO: 19, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% identična, kada su dve sekvence pune dužine funkcionalnog proteina sličnog SDS poravnate u paru.

[0112] U sledećem aspektu koji je ovde opisan, ali ne u skladu sa pronalaskom, biljna ćelija ili biljka je paprika, mutantni alel proteina sličnog ciklinu SDS je mutantni alel alela koji kodira protein SEQ ID NO: 20 ili protein čija je sekvenca suštinski identična sa sekvencom SEQ ID NO: 20, poželjno najmanje 60%, 70%, 80%, 90% identična, kada su dve sekvence pune dužine funkcionalnog proteina sličnog SDS poravnate u paru.

[0113] U jednom aspektu biljka lubenice prema pronalasku, ili biljka dinje, krastavca, paradajza ili paprike, koje su opisane, ali nisu prema pronalasku, sadrži mutantni alel sličan ciklinu SDS u heterozigotnom obliku. U drugom aspektu, biljka lubenice prema pronalasku, ili biljka dinje, krastavca, paradajza ili paprike, koje su opisane, ali nisu prema pronalasku, sadrži mutantni alel sličan ciklinu SDS u homozigotnom obliku, pri čemu biljka proizvodi plodove bez semena nakon oprašivanja sopstvenim ili drugim polenom. U poželjnom aspektu mutantni alel sličan ciklinu SDS je inaktivisan (tj. gen se ne eksprimira) ili alel kodira nefunkcionalni protein sličan ciklinu SDS.

[0114] Seme iz kojeg se takve biljke mogu uzgajati, kao što je navedeno u priloženim zahtevima, je ovde obuhvaćeno, kao i plodovi bez semena koje proizvode navedene biljke kada je alel u homozigotnom obliku ili plodovi sa semenom koje proizvode navedene biljke kada je alel u heterozigotnom obliku. Takođe su dati bilo koji delovi biljke, kao što je navedeno u priloženim zahtevima“, kao što su reznice, materijal za vegetativno razmnožavanje, ćelije, itd. koji sadrže najmanje jedan mutantni alel sličan ciklinu SDS u svom genomu.

[0115] Ovde su date i ćelije koje se razmnožavaju i koje se ne razmnožavaju koje sadrže najmanje jednu kopiju mutantnog alela sličnog ciklinu SDS. Podrazumeva se da takve ćelije koje se razmnožavaju ili koje se ne razmnožavaju mogu da budu deo biljnog organa ili cele biljke, ili mogu da budu izolovane, npr. u kulturi ćelija ili tkiva.

[0116] Seme, biljke i delovi biljke koji su ovde dati, koji sadrže najmanje jedan mutantni alel sličan ciklinu SDS u svom genomu, poželjno su agronomski korisne biljke, npr. inbred linije, oplemenjivačke linije, sorte ili kultivari ili F1 hibridi. Poželjno je da imaju dobre agronomske karakteristike, posebno da proizvode tržišne plodove dobrog kvaliteta i ujednačenosti ploda.

[0117] Kako se ovde koristi, termin „sorta“ ili „kultivar“ označava grupu biljaka unutar jednog botaničkog taksona najnižeg poznatog ranga, koja se može definisati ekspresijom karakteristika koje su rezultat datog genotipa ili kombinacije genotipova.

[0118] „F1 hibridna“ biljka (ili F1 hibridno seme) je generacija dobijena ukrštanjem dve inbred roditeljske linije. Dakle, F1 hibridno seme je seme iz koga rastu F1 hibridne biljke. F1 hibridi su snažniji i daju veći prinos, zbog heterozisa. Inbred linije su u suštini homozigotne na većini lokusa u genomu.

[0119] „Biljna linija“ ili „oplemenjivačka linija“ odnosi se na biljku i njeno potomstvo. Kako se ovde koristi, izraz „inbred linija“ odnosi se na biljnu liniju koja je dobijena povratnim samooprašivanjem i praktično je homozigotna. Prema tome, „inbred linija“ ili „roditeljska linija“ se odnosi na biljku koja je prošla kroz nekoliko generacija (npr. najmanje 5, 6, 7 ili više) inbridinga, što rezultuje biljnom linijom visoke uniformnosti.

[0120] Alel sličan ciklinu SDS lubenice nalazi se na hromozomu 7 (između nukleotida 7450185 i 7445051) genoma. Hromozomska lokacija može da se odredi izvođenjem analize celog genoma pomoću programa BLAST, npr. na internet adresi icugi.org/pub/genome/watermelon/97103). Izgleda da se alel sličan ciklinu SDS krastavca takođe nalazi na hromozomu 5 (između nukleotida 848447 i 852718) genoma krastavca (na internet adresi icugi.org/pub/genome/cucumber/Chinese_long/).

[0121] Kod lubenice, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS može da se dobije iz semena lubenica koje su heterozigotne ili homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, deponovan pod NCIMB 42532. Alel divljeg tipa gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS može da se dobije iz semena lubenica koje su heterozigotne ili homozigotne za gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa, deponovan pod NCIMB 42532. Kod deponovanog semena odgovarajući alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS je označen kao emb1. Mogu se generisati i drugi mutantni aleli gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS de novo, na primer. mutagenezom ili drugim postupcima poznatim stručnjaku. Ovo važi za bilo koju biljnu vrstu.

[0122] Jedan primer generisanja još jednog mutantnog alela sličnog SDS de novo u lubenici je dat u Primerima. Ovde su pronalazači generisali mutantnu populaciju mutagenezom semena lubenice, a zatim koristili TILLING da identifikuju biljku koja sadrži mutantni alel sličan SDS. Identifikovani alel sadrži jednu zamenu nukleotida na nukleotidu 1687 sekvence SEQ ID NO: 1, što dovodi do nastanka stop kodona. Mutantni alel tako kodira skraćeni protein sličan ciklinu SDS koji sadrži samo aminokiseline od 1 do 223 divljeg tipa proteina (videti SEQ ID NO: 18).

[0123] Biljne ćelije, delovi biljke ili biljke ili njihovo potomstvo koji se mogu dobiti/dobijeni iz semena koje je heterozigotno ili homozigotno za alel gena koji kodira protein sličan SDS, deponovanog pod NCIMB 42532, takođe predstavljaju primer izvođenja pronalaska. U poželjnom primeru izvođenja, biljne ćelije, delovi biljke ili biljke ili njihovo potomstvo dobijeno iz semena deponovanog pod NCIMB 42532 su homozigotni za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Sledeći obuhvaćeni primer izvođenja pronalaska se odnosi na biljne ćelije, delove biljke ili biljke, homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, koje su dobijene/mogu da se dobiju nakon ukrštanja biljke lubenice dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 sa drugom biljkom. Poželjno je da se biljne ćelije ili biljke koje su dobijene/mogu da se dobiju nakon ukrštanja biljke dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 sa drugom biljkom naknadno samooprašuju i opciono se u sledećem koraku biraju biljke koje daju plodove bez semena i/ili se biraju biljke koje su homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0124] Termin „alel(i)“ označava bilo koji od jednog ili više alternativnih oblika gena na određenom lokusu, od kojih se svi aleli odnose na jednu osobinu ili karakteristiku na određenom lokusu. U diploidnoj ćeliji organizma, aleli datog gena se nalaze na određenoj lokaciji, ili lokusu (lokusima u množini) na hromozomu. Jedan alel je prisutan na svakom hromozomu para homolognih hromozoma. Diploidna biljna vrsta može da sadrži veliki broj različitih alela na određenom lokusu. To mogu biti identični aleli gena (homozigotni) ili dva različita alela (heterozigotni).

[0125] „Alel divljeg tipa“ se ovde odnosi na verziju gena koji kodira potpuno funkcionalni protein (protein divljeg tipa). Sekvenca gena koji kodira potpuno funkcionalan protein sličan ciklinu SDS je na primer kodirajuća sekvenca sekvenci proteina sličnog ciklinu SDS divljeg tipa prikazana pod SEQ ID NO 1 (iz kultivisane lubenice) i SEQ ID NO 5 (iz kultivisane dinje). Aminokiselinska sekvenca koju kodira ovaj gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa je prikazana u SEQ ID NO 2, odnosno SEQ ID NO 6. Drugi proteini slični ciklinu SDS divljeg tipa su prikazani pod SEQ ID NO: 12 (krastavac), SEQ ID NO: 19 (paradajz) i SEQ ID NO: 20 (paprika). Druge sekvence nukleinske kiseline, koje kodiraju protein sličan ciklinu SDS, koje kodiraju alele potpuno funkcionalnog proteina sličnog ciklinu SDS (tj. varijantni aleli ili alelne varijante) postoje u drugim biljkama i mogu da sadrže suštinski identične sekvence sa najmanje kodirajućom sekvencom sekvenci nukleinske kiseline prikazanih pod SEQ ID NO 1 ili SEQ ID NO: 5 ili sa aminokiselinskim sekvencama prikazanim pod SEQ ID NO 2 ili SEQ ID NO 6 ili SEQ ID NO: 12, ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 20. Na primer, protein sličan ciklinu SDS kultivisanog krastavca sekvence SEQ ID NO 12 ima 86% identičnosti aminokiselinske sekvence sa proteinom sličnim ciklinu SDS divljeg tipa dinje (SEQ ID NO 6) i 70% identičnosti aminokiselinske sekvence sa proteinom sličnim ciklinu SDS divljeg tipa lubenice (SEQ ID NO 2).

[0126] „Mutantni alel“ treba razumeti u vezi sa ovim pronalaskom kao alel koji ima mutaciju u poređenju sa odgovarajućim alelom divljeg tipa. Primer iRNK transkribovane sa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prikazan je pod SEQ ID NO 3. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca kodirana iRNK prikazanom pod SEQ ID NO 3 je prikazana pod SEQ ID NO 4.

[0127] Termin „lokus“ (lokusi u množini) označava određeno mesto ili mesta ili položaj na hromozomu gde se, na primer, nalazi gen ili genetski marker.

[0128] „Mutacija“ u molekulu nukleinske kiseline (DNK ili RNK) je promena jednog ili više nukleotida u poređenju sa odgovarajućom sekvencom divljeg tipa, npr. zamenom, delecijom ili insercijom jednog ili više nukleotida. Primeri takve mutacije su tačkasta mutacija, besmislena mutacija, mutacija pogrešnog smisla, mutacija na mestu spajanja egzona, mutacija pomeranja okvira čitanja ili mutacija u regulatornoj sekvenci.

[0129] „Molekul nukleinske kiseline“ će imati opšte razumevanje u tehnici. Sastoji se od nukleotida koji sadrže jedan od šećera dezoksiriboze (DNK) ili riboze (RNK).

[0130] „Tačkasta mutacija“ je zamena jednog nukleotida, ili insercija ili delecija jednog nukleotida.

[0131] „Besmislena mutacija“ je (tačkasta) mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein, kod koje je kodon u molekulu nukleinske kiseline izmenjen u stop kodon. Ovo dovodi do toga da se u iRNK javlja prevremeni stop kodon i rezultuje translacijom skraćenog proteina. Skraćeni protein može da ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije.

[0132] „Mutacija pogrešnog smisla ili nesinonimna mutacija“ je (tačkasta) mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein, kod koje je kodon izmenjen tako da kodira drugu aminokiselinu. Dobijeni protein može da ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije.

[0133] „Mutacija na mestu spajanja egzona“ je mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein, kod koje je spajanje egzona RNK u pre-iRNK izmenjeno, što dovodi do toga da iRNK ima drugačiju nukleotidnu sekvencu i da protein koji ima drugačiju aminokiselinsku sekvencu od divljeg tipa. Dobijeni protein može da ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije.

[0134] „Mutacija pomeranja okvira čitanja“ je mutacija u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira protein kojom se menja okvir čitanja iRNK, što rezultuje različitom aminokiselinskom sekvencom. Dobijeni protein može da ima smanjenu funkciju ili gubitak funkcije.

[0135] „Delecija“ u kontekstu pronalaska će značiti da bilo gde u datoj sekvenci nukleinske kiseline nedostaje najmanje jedan nukleotid u poređenju sa nukleinskom sekvencom odgovarajuće sekvence divljeg tipa, ili bilo gde u datoj aminokiselinskoj sekvenci nedostaje najmanje jedna aminokiselina u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom odgovarajuće sekvence (divljeg tipa).

[0136] Pod „skraćivanjem“ se podrazumeva da najmanje jedan nukleotid na 3'-kraju ili 5'-kraju nukleotidne sekvence nedostaje u poređenju sa nukleinskom sekvencom odgovarajuće sekvence divljeg tipa ili da najmanje jedna aminokiselina nedostaje na N-terminusu ili C-terminusu proteina u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom odgovarajućeg proteina divljeg tipa, pri čemu je kod skraćenja na 3'-kraju ili C-terminalnog skraćenja najmanje prvi nukleotid na 5 '-kraju, odnosno prva aminokiselina na N-terminusu još uvek prisutna, a kod skraćenja na 5'-kraju ili N-terminalnog skraćenja, najmanje poslednji nukleotid na 3'-kraju, odnosno poslednja aminokiselina na C-terminusu je i dalje prisutna. 5 '-kraj je određen ATG kodonom koji se koristi kao start kodon u translaciji odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline divljeg tipa.

[0137] „Zamena“ znači da je najmanje jedan nukleotid u sekvenci nukleinske kiseline ili jedna aminokiselina u sekvenci proteina drugačija u poređenju sa odgovarajućom sekvencom nukleinske kiseline divljeg tipa, odnosno odgovarajućom aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa zbog izmene nukleotida u sekvenci koja kodira odgovarajući protein.

[0138] „Insercija“ znači da sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca proteina sadrži najmanje jedan dodatni nukleotid ili aminokiselinu u poređenju sa odgovarajućom sekvencom nukleinske kiseline divljeg tipa, odnosno odgovarajućom aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa.

[0139] „Prevremeni stop kodon“ u kontekstu ovog pronalaska znači da je u kodirajućoj sekvenci (cds) prisutan stop kodon koji je bliži start kodonu na 5'-kraju u poređenju sa stop kodonom odgovarajuće kodirajuće sekvence divljeg tipa.

[0140] „Mutacija u regulatornoj sekvenci“, npr. u promotoru ili pojačivaču gena, je promena jednog ili više nukleotida u poređenju sa sekvencom divljeg tipa, npr. zamenom, delecijom ili insercijom jednog ili više nukleotida, što dovodi na primer do smanjenja ili izostanka proizvodnje iRNK transkripta gena.

[0141] „Homozigot“ ovde znači da su sve kopije datog gena ili alela na odgovarajućem hromozomskom lokusu u ćeliji ili organizmu identične. „Homozigot za mutantni alel“ znači da su sve kopije odgovarajućeg mutantnog alela na odgovarajućem hromozomskom lokusu u ćeliji ili organizmu identične.

[0142] „Heterozigot“ ovde znači da se najmanje jedna kopija datog gena ili alela na specifičnom hromozomskom lokusu u ćeliji ili organizmu razlikuje od ostalih kopija jednog ili više gena ili alela na odgovarajućem lokus/lokusima na drugom hromozomu(ima). „Heterozigot za mutantni alel“ znači da najmanje jedan alel na specifičnom hromozomskom lokusu u ćeliji ili organizmu ima drugačiju sekvencu od jednog ili više alela na odgovarajućem lokusu/lokusima na drugom hromozomu(ima).

[0143] „Mutacija u proteinu“ je promena jednog ili više aminokiselinskih ostataka u poređenju sa sekvencom divljeg tipa, npr. zamenom, delecijom, skraćenjem ili insercijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka.

[0144] Biotehnološki postupci za uvođenje mutacija u željeni gen/alel biljne ćelije ili biljke su poznati u tehnici. Prema tome, mutantni aleli gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS mogu, korišćenjem ovih postupaka, da se proizvedu u biljnim ćelijama ili biljkama. Primeri takvih tehnologija su konkretno tehnike mutageneze ili enzimi koji indukuju dvolančane prekide DNK (enzim koji indukuje dvolančane prekide DNK (DSBI)) u genomu biljaka. Poznate i često korišćene tehnologije podrazumevaju endonukleaze za isecanje na retkim mestima (engl. - rarecleaving endonucleases) i individualno prilagođene endonukleaze za isecanje na retkim mestima, uključujući, ali ne ograničavajući se na „homing“ endonukleaze, koje se nazivaju i meganukleaze, efektore slične aktivatoru transkripcije spojene sa katalitičkim domenom nukleaze (TALEN) i tzv. CRISPR/Cas sisteme.

[0145] Sve ove tehnologije su pogodne za uvođenje mutacije u gene u biljnim ćelijama ili biljkama. Prema tome, biljne ćelije i biljke prema pronalasku koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličnog ciklinu SDS, pri čemu je mutacija u mutantni alel uvedena pomoću endonukleaza za isecanje na retkim mestima ili individualno prilagođenih endonukleaza za isecanje na retkim mestima, takođe predstavljaju primer izvođenja pronalaska. Što se tiče individualno prilagođenih endonukleaza za isecanje na retkim mestima, mutacija u mutantnom alelu za protein sličan ciklinu SDS je poželjno uvedena pomoću meganukleaze, tehnologije TALEN ili CRISPR/Cas sistema.

[0146] Kako se ovde koristi, „enzim koji indukuje dvolančane prekide DNK (DSBI)“ je enzim sposoban da indukuje dvolančani prekid DNK na određenoj nukleotidnoj sekvenci, nazvanoj „mesto prepoznavanja“. Endonukleaze za isecanje na retkim mestima su DSBI enzimi koji imaju mesto prepoznavanja od oko 14 do 70 uzastopnih nukleotida, i stoga imaju veoma nisku učestalost isecanja, čak i u većim genomima, kao što je većina genoma biljaka.

[0147] „Homing endonukleaze, koje se nazivaju i meganukleaze“, čine porodicu takvih endonukleaza za isecanje na retkim mestima. One mogu da budu kodirane intronima, nezavisnim genima ili umetnutim sekvencama, i imaju upečatljiva strukturna i funkcionalna svojstva koja ih razlikuju od klasičnijih restrikcionih enzima, obično od bakterijskih restrikciono-modifikovanih sistema tipa II. Njihova mesta prepoznavanja imaju opštu asimetriju koja je u suprotnosti sa karakterističnom dijadnom simetrijom mesta prepoznavanja većine restrikcionih enzima. Pokazalo se da nekoliko „homing“ endonukleaza kodiranih intronima ili inteinima podstiče navođenje njihovih odgovarajućih genetskih elemenata na alelna mesta bez introna ili bez inteina. Pravljenjem mesto-specifičnog dvolančanog prekida u alelima bez introna ili bez inteina, ove nukleaze stvaraju rekombinogene krajeve, koji se uključuju u proces konverzije gena koji duplira kodirajuću sekvencu i dovodi do umetanja introna ili umetnute sekvence na nivou DNK.

[0148] Spisak ostalih meganukleaza za isecanje na retkim mestima i njihovih odgovarajućih mesta prepoznavanja dat je u tabeli I u WO 03/004659 (stranice 17 do 20) Ovo uključuje I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I ili PI-Tsp I.

[0149] Dalje, dostupni su postupci za dizajniranje „individualno prilagođenih endonukleaza za isecanje na retkim mestima“ koje prepoznaju u osnovi bilo koju ciljnu nukleotidnu sekvencu po izboru. Ukratko, mogu da se pripreme himerni restrikcioni enzimi korišćenjem hibrida između domena sa cinkanim prstićima dizajniranog da prepozna specifičnu nukleotidnu sekvencu i domena za nespecifično isecanje DNK iz prirodnog restrikcionog enzima, kao što je FokI. Takvi postupci su opisani npr. u WO 03/080809, WO94/18313 ili WO95/09233 i u Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656- 660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Prilagođene meganukleaze mogu da se dobiju selekcijom iz biblioteke varijanti, kao što je opisano u WO2004/067736. Prilagođene meganukleaze sa izmenjenom specifičnošću za sekvencu i afinitetom za vezivanje za DNK takođe mogu da se dobiju putem racionalnog dizajna, kao što je opisano u WO2007/047859.

[0150] Još jedan primer individualno prilagođenih endonukleaza uključuje takozvane „nukleaze TALE (TALEN)“, koje su zasnovane na efektorima sličnim aktivatoru transkripcije (TALE) iz roda bakterija Xanthomonas fuzionisanim sa katalitičkim domenom nukleaze (npr. FOKI).

Specifičnost vezivanja za DNK kod ovih TALE je definisana sa dva aminokiselinska ostatka unutar svakog ponavljanja (engl. – repeat variable diresidues, RVD) niza tandemskih ponovljenih jedinica dužine 34/35 aminokiselina, tako da jedan RVD specifično prepoznaje jedan nukleotid u ciljnoj DNK. Ponovljene jedinice mogu da se sastave tako da prepoznaju praktično bilo koje ciljne sekvence i spoje sa katalitičkim domenom nukleaze, stvarajući endonukleaze specifične za sekvencu (videti npr. Boch et al., 2009, Science 326:p1509-1512; Moscou and Bogdanove, 2009, Science 326:p1501; Christian et al., 2010, Genetics 186:p757-761; i WO10/079430, WO11/072246, WO2011/154393, WO11/146121, WO2012/001527, WO2012/093833, WO2012/104729, WO2012/138927, WO2012/138939). WO2012/138927 dalje opisuje monomerne (kompaktne) TALEN i TALEN sa različitim katalitičkim domenima i njihove kombinacije.

[0151] Nedavno je opisan novi tip sistema individualno prilagodljivih endonukleaza; takozvani „CRISPR/Cas sistem“, koji koristi poseban RNK molekul (crRNK) koji obezbeđuje specifičnost za sekvencu za usmeravanje isecanja povezanom nukleazom Cas9 (Jinek et al, 2012, Science 337: p816-821). Takve individualno dizajnirane endonukleaze za isecanje na retkim mestima su označene i kao endonukleaze za isecanje na retkim mestima koje se ne javljaju u prirodi.

[0152] Sledeći postupak poznat u tehnici za uvođenje mutacija u gen/alel biljne ćelije ili biljke je tzv. „in vivo mutageneza“. Dalja diskusija o odgovarajućoj tehnologiji je data u nastavku.

[0153] Biljne ćelije ili biljke prema pronalasku koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, kod kojih je mutacija uvedena u mutantni alel pomoću in vivo mutageneze su takođe primer izvođenja pronalaska.

[0154] Različite tehnologije opšte poznate u tehnici su pogodne za stvaranje insercionih mutacija u biljnim ćelijama ili biljkama.

[0155] Sledeći primeri izvođenja pronalaska su biljne ćelije i biljke prema pronalasku koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, kod kojih je mutacija uvedena u mutantni alel insercionom mutagenezom.

[0156] Biljne ćelije prema pronalasku i biljke prema pronalasku koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS mogu se proizvesti takozvanom insercionom mutagenezom. Konkretno, umetanje transpozona i sekvenci transfer DNK (T-DNK) u gene/alele koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS su pogodni za smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti odgovarajućih gena/alela u koje su integrisani (Thorneycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601).

[0157] Dodatna diskusija o odgovarajućim tehnologijama poznatim stručnjaku u ovoj oblasti će biti data u nastavku teksta.

[0158] Pod „insercionom mutagenezom“ se posebno podrazumeva insercija transpozona ili takozvane transfer DNK (T-DNK) u gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu je, kao rezultat toga, aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u ćeliji koja je u pitanju smanjena, ili se proizvodi nefunkcionalni protein sličan ciklinu SDS.

[0159] U daljem poželjnom primeru izvođenja, biljke prema pronalasku su muški plodne biljke.

[0160] Biljke prema pronalasku su muški plodne i proizvode besemene plodove kada je mutantni alel sličan ciklinu SDS prisutan u homozigotnom obliku. Prednost muški plodnih biljaka u odnosu na muški sterilne biljke je u tome što će proizvesti vijabilan polen i stoga nema potrebe da se na istom polju sadi druga biljka, tzv. biljka oprašivač za podsticanje zametanja i razvoja plodova na ženskoj biljci koja daje besemeni plod. Cela površina pod kultivacijom može stoga da bude zasađena biljkama koje proizvode besemene plodove, što dovodi do povećanja prinosa besemenih plodova po obrađenoj površini. Takođe, obezbeđena je sinhronizacija vremena cvetanja i oplodnje za muške i ženske delove biljke, jer semene zametke i polen proizvodi ista biljka. Ovo osigurava da će doći do dovoljno oprašivanja za proizvodnju najveće moguće količine plodova.

[0161] U kontekstu ovog pronalaska, izraz „muški plodna biljka“ treba razumeti kao biljku koja proizvodi vijabilan polen. Proizvodnja vijabilnog ili plodnog polena može da se pokaže npr. korišćenjem polena iz odgovarajuće biljke za unakrsno oprašivanje druge, različite biljke i dobijanjem vijabilnog semena iz ovog ukrštanja.

[0162] Fenotip biljaka koji dovodi do proizvodnje besemenih plodova prema pronalasku u jednom aspektu se ne stvara samo u diploidnim biljkama, već i u poliploidnim biljkama. U jednom aspektu biljke prema pronalasku daju plodove bez semena i kada imaju različit stepen ploidije. Stoga treba razumeti da biljne ćelije ili biljke prema pronalasku obuhvataju biljke bilo kog stepena ploidije koje obuhvataju biljke sa parnim stepenom ploidije (2n, 4n, 6n, 8n itd.) i biljke sa neparnim stepenom ploidije (3n, 5n itd.). U jednom aspektu, mutantni gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS je homozigotan u diploidnim biljkama, ali u drugom aspektu mutantni protein sličan SDS je homozigotan u poliploidnim biljkama, kao što su tetraploidne lubenice. „Homozigot u poliploidnim biljkama“ znači da lokus na svakom hromozomu sadrži mutantni alel, a ne alel gena divljeg tipa.

[0163] Poliploidizacija je široko rasprostranjena u biljkama. Odgovorna je za povećanje genetskog diverziteta i proizvodnju vrsta koje pokazuju povećanu robusnost, veličinu, snagu i otpornost na bolesti. Očigledne prednosti poliploidnih biljaka su heteroza i redundantnost gena.

[0164] Određeni broj kultura koje se danas gaje na velikim površinama i plantažama pretrpeo je jednu ili više duplikacija genoma. Primeri su pamuk (faktor množenja x6), krompir (x2, x3), hlebna pšenica (x3), seme uljarica (x3), kukuruz (x2), soja (x2), suncokret (x2), banana (x2), jabuka (x2) i kafa (x2) (Renny-Byfield 7 Wendel, 2014, American J. Botany, 101(10), 1711-1725).

[0165] Posebno u uzgoju povrća, poliploidija u različitim biljkama je izazvana upotrebom hemikalija uključujući kolhicin, kolhamin, orizalin, kolcemid, trifluralin ili amiprofosmetil. Primeri duplikacija genoma u povrću proizvedenom upotrebom hemikalija su diploidni prokelj iz haploidnih biljaka (2x), tetraploidni grašak (2x), tetraploidne lubenice (2x), tetraploidne muskatne dinje (2x), tetraploidni luk (2x), oktaploidni cocoyam (4x), tetraploidna zmijska tikva (2x), triploidna i tetraploidna rebrasta bundeva (1.5x, 2x), tetraploidni krastavac (2x) i tetraploidna boranija (2x) (Kazi, 2015, J. Global Biosciences 4(3), 1774-1779).

[0166] Biljke koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS mogu se proizvesti različitim postupcima koji su uobičajeno poznati stručnjaku. Ovi postupci obuhvataju upotrebu semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532. Posebna prednost ovog deponovanog semena je u tome što će biljke uzgojene iz semena koje sadrži mutantni alel biti muški plodne. Dakle, mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prisutan u tim biljkama može da se introdukuje u druge biljke korišćenjem polena biljaka koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS za oplođenje drugih biljaka, posebno drugih biljaka lubenice, posebno kultivisane lubenice. Pošto je mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS recesivan, proizvodnja ploda bez semena se javlja samo ako u odgovarajućoj biljci nije prisutan dominantan alel divljeg tipa gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Dakle, u slučaju da je alel divljeg tipa gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS prisutan u biljkama, ove biljke proizvode plodove sa semenom. Prilikom prenosa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS iz diploidnog semena, homozigotnog za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS (npr. deponovanog pod brojem NCIMB 42532 ili njegovog potomstva) na drugu biljku koja ne sadrži recesivni mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, F1 generacija će biti heterozigotna i neće ispoljavati fenotip ploda bez semena. F1 prvo treba da se podvrgne samooprašivanju da bi se dobile biljke koje sadrže fenotip ploda bez semena zbog prisustva dve kopije (homozigotne) recesivnog mutantnog alela.

[0167] Diploidna biljka koja sadrži dve kopije mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS može da se koristi za dobijanje tetraploidne biljke koja sadrži četiri kopije mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Takav tetraploid će imati isti fenotip kao diploid, tj. proizvodiće plodove bez semena (koji su tetraploidni) i vijabilni polen.

[0168] Prilikom prenosa mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS iz tetraploidne biljke u drugu tetraploidnu biljku koja ne sadrži recesivni mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, F1 generacija će biti heterozigotna i neće pokazivati fenotip ploda bez semena. Fenotip ploda bez semena će se ponovo javiti samo u generaciji dobijenoj od F1 generacije podvrgnute samooprašivanju.

[0169] Kao što je pomenuto, tetraploidne biljke koje ispoljavaju fenotip ploda bez semena mogu se generisati dupliranjem hromozoma diploidne biljke homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS (npr. iz semena, homozigotnog za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 ili iz biljaka, homozigotnih za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, dobijen nakon ukrštanja biljke dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 sa drugom biljkom i opciono naknadnim samooprašivanjem biljaka dobijenih navedenim ukrštanjem). Tako dobijene tetraploidne biljke sadrže četiri kopije mutantnog alela gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0170] U struci je poznato da biljne ćelije za seksualno razmnožavanje (polen i semeni zametak) sadrže skup hromozoma koji je polovina seta preostalih ćelija navedene biljke. Polen i semeni zameci biljaka mogu se regenerisati u cele biljke. U slučaju da biljke imaju paran stepen ploidije, generalno je moguće smanjiti stepen ploidije za polovinu nakon regeneracije polena ili semenih zametaka. Od biljaka prema pronalasku koje imaju paran stepen ploidije (npr.2n, 4n, 6n, 8n itd.) mogu da se proizvedu biljke koje imaju prepolovljeni set hromozoma (npr. 1n, 2n, 3n, 4n, itd., redom) putem regeneracije polena ili semenog zametka.

[0171] Diploidne biljke prema pronalasku mogu npr. da budu regenerisane iz ćelija polena ili semenog zametka koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu se ćelije polena ili semenog zametka dobijaju iz tetraploidne biljke koja sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Poželjno, ćelije polena ili semenog zametka koje se dobijaju iz tetraploidne biljke sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS u homozigotnom stanju. Izvedene diploidne biljke mogu se zatim koristiti u daljem uzgajanju i generisanju biljaka koje ispoljavaju fenotip besemenog ploda.

[0172] Triploidne biljke se mogu dobiti ukrštanjem diploidne (2n) biljke prema pronalasku sa tetraploidnom (4n) biljkom prema pronalasku. Seme hibridnih biljaka koje potiče od pomenutog ukrštanja biće triploidno (3n). Poželjno je da su diploidne (2n) i tetraploidne (4n) biljke prema pronalasku koje su međusobno ukrštene obe homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Dobijeno triploidno seme (i triploidne biljke uzgojene iz semena) imaće tri kopije mutantnog alela. Diploidna biljka koja se koristi za proizvodnju triploidnog hibrida može npr. da bude biljka dobijena/koja može da se dobije iz semena koje je homozigotno za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koji je dobijen iz semena deponovanog pod brojem NCIMB 42532.

[0173] Biljke (npr. diploidne, triploidne ili tetraploidne, ili druge ploidije) i delovi biljaka (kao što su plodovi) koji sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS koje mogu da se dobiju/koje su dobijene jednim od upravo opisanih postupaka takođe su primer izvođenja pronalaska. Takođe, seme iz kojeg takve biljke mogu da se uzgajaju je primer izvođenja pronalaska.

[0174] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, biljne ćelije ili biljke prema pronalasku imaju paran stepen ploidije, poželjno su diploidne (2n) ili tetraploidne (4n).

[0175] Biljke sa neparnim stepenom ploidije, npr. triploidne (3n) biljke su obično muški i ženski sterilne, jer tokom mejoze hromozomi ne mogu podjednako da se podele na ćerke ćelije. Prednost biljaka sa parnim stepenom ploidije, npr. diploidnih (2n) ili tetraploidnih (4n) biljaka u odnosu na biljke sa neparnim stepenom ploidije, npr. triploidne (3n) biljke je u tome što biljke sa parnim stepenom ploidije mogu da proizvedu vijabilan polen i/ili vijabilne semene zametke. Kao posledica toga, biljke sa parnim stepenom ploidije mogu da se gaje bez potrebe za drugom, drugačijem, tzv. biljkom oprašivačem koja je potrebna za podsticanje zametanja i razvoja plodova kod biljaka sa neparnim stepenom ploidije. Biljke oprašivači će takođe proizvoditi plodove koji će obično biti semenski (odnosno imati seme). Ove plodove sa semenom treba odvojiti od plodova bez semena tokom ili posle berbe. Prema tome, prednost biljaka koje imaju parni stepen ploidije u odnosu na biljke sa neparnim stepenom ploidije je u tome što nema potrebe za odvajanjem neželjenih plodova koji imaju seme koje proizvode biljke oprašivači od željenih plodova bez semena.

[0176] „Parni stepen ploidije“ u kontekstu ovog pronalaska znači da broj homolognih hromozomskih skupova prisutnih u ćeliji ili organizmu kada se podeli sa dva daje ceo broj. Tako su ćelije ili organizmi diploidne (2n), tetraploidne (4n), heksaploidne (6n), oktaploidne (8n) itd.

[0177] „Neparni stepen ploidije“ u kontekstu ovog pronalaska znači da broj homolognih hromozomskih skupova prisutnih u ćeliji ili organizmu kada se podeli sa dva ne daje ceo broj. Tako su ćelije ili organizmi haploidne (1n), triploidne (3n) itd.

[0178] „Diploidna biljna ćelija ili biljka“ u kontekstu ovog pronalaska označava biljku, vegetativni deo(delove) biljke, plod ili seme ili biljnu ćeliju, koja ima dva seta odgovarajućih hromozoma, ovde označenih kao 2n.

[0179] „Tetraploidna ćelija ili biljka“ u kontekstu ovog pronalaska označava biljku, vegetativni deo(delove) biljke, plod ili seme ili biljnu ćeliju, koja ima četiri seta odgovarajućih hromozoma, ovde označenih kao 4n.

[0180] Biljne ćelije prema pronalasku mogu biti one biljne ćelije koje se mogu regenerisati u celu biljku ili one koje se ne mogu regenerisati u cele biljke. Prema tome, biljne ćelije prema pronalasku mogu biti one biljne ćelije koje nisu sposobne da regenerišu celu biljku.

[0181] U poželjnom primeru izvođenja, biljke prema pronalasku su muški plodne i imaju paran stepen ploidije. Poželjno, biljke prema pronalasku su muški plodne i diploidne (2n) ili tetraploidne (4n).

[0182] U drugom poželjnom primeru izvođenja, biljke prema pronalasku su stenospermokarpne biljke. Poželjnije, biljke prema pronalasku su muški plodne stenospermokarpne biljke. Još dalje poželjnije, biljke prema pronalasku su muški plodne, stenospermokarpne i imaju paran stepen ploidije. Posebno su poželjne biljke prema pronalasku koje su muški plodne, stenospermokarpne, diploidne (2n) ili tetraploidne (4).

[0183] Stenospermokarpne biljke daju plodove bez semena. Muški plodne stenospermokarpne biljke imaju prednost u odnosu na poznate stenospermokarpne biljke u tome što im nije potrebna druga biljka oprašivač koja se uzgaja na istom području, ali ipak daju plodove bez semena. Biljke oprašivači će proizvesti neželjene plodove sa semenom, koji će morati da se odvoje od plodova bez semena. Dakle, stenospermokarpne muški plodne biljke imaju prednost u tome što nema kompeticije za prostor za rast i hranljive materije između biljke koja proizvodi željene plodove bez semena i biljaka oprašivača, što povećava prinos željenih plodova bez semena po raspoloživoj površini za sadnju.

[0184] „Stenospermokarpija“ je uopšteno poznata u tehnici i u vezi sa ovim pronalaskom treba je razumeti tako da znači da indukcija zametanja i razvoja plodova zahteva oprašivanje, pri čemu biljke ne daju plodove koji proizvode zrelo ili vijabilno seme. Zrelo ili vijabilno seme se ne razvija u stenospermokarpnim biljkama zbog zaustavljenog razvoja semena ili degradacije semenih zametaka i/ili embriona i/ili endosperma ili abortusa semenih zametaka i/ili embriona i/ili endosperma pre nego što dostignu zrelost.

[0185] Od stenospermokarpije treba razlikovati partenokarpiju. „Partenokarpija“ je uopšteno poznata u tehnici i u kontekstu ovog pronalaska on označava razvoj plodova bez oplodnje ženskog semenog zametka. Proces oprašivanja nije potreban za proizvodnju plodova koji, međutim, kao posledica nedostatka oprašivanja, nemaju seme.

[0186] U daljem poželjnom primeru izvođenja pronalaska, biljke prema pronalasku proizvode plodove bez semena.

[0187] Plodovi biljaka prema pronalasku mogu da sadrže strukture koje imaju izgled sličan semenu. Ove strukture koje izgledaju kao seme su obično bele i meke u poređenju sa semenom biljaka divljeg tipa koje je tamno smeđe ili crno i tvrdo. Strukture koje imaju izgled semena u plodovima biljke prema pronalasku se ponekad označavaju kao prazna semena. Međutim, to nije pravo seme, jer ne sadrži vijabilni embrion, već su to strukture koje potiču iz integumenta semenog zametka.

[0188] U poželjnijem primeru izvođenja pronalaska, biljke prema pronalasku daju plodove bez semena i/ili su muški plodne i/ili imaju paran stepen ploidije i/ili su stenospermokarpne. Još poželjnije, biljke prema pronalasku daju plodove bez semena, muški su plodne, diploidne (2n) ili tetraploidne (4n) i stenospermokarpne.

[0189] Izraz „plod“ u njegovom botaničkom značenju se obično shvata kao struktura koja nosi seme razvijena iz plodnika cvetova skrivenosemenica.

[0190] „Besemeni plod“, kako se obično koristi u struci, a posebno u oplemenjivanju, iako je na neki način u suprotnosti sa botaničkim značenjem „ploda“, treba shvatiti u kontekstu ovog pronalaska kao plod bez zrelog ili vijabilnog semena. Zrelo ili vijabilno seme može da klija u zemljištu pod uslovima odgovarajućim za dotičnu biljku i da izraste u biljke. Ovaj test može da se koristi da bi se utvrdilo da li biljka proizvodi plodove bez semena. Plodovi bez semena neće proizvesti seme koje će klijati i izrasti u biljku pod uslovima odgovarajućim za dotičnu biljku.

[0191] Poznajući uzročni gen za proizvodnju plodova bez semena koji je ovde otkriven, sada je moguće proizvesti biljke za proizvodnju besemenih plodova različitim poznatim postupcima. Ovi postupci mogu da se zasnivaju na proizvodnji i selekciji biljaka koje imaju mutantne alele koji kodiraju nefunkcionalne proteine slične ciklinu SDS ili mutantne alele koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS sa smanjenom funkcijom ili gubitkom funkcije ili korišćenjem konvencionalnih agenasa za indukciju mutacija, kao što su hemikalije, visoko energetsko zračenje (npr. rendgensko zračenje, neutronsko zračenje, gama zračenje ili UV zračenje). Takođe je moguće pomoću genske tehnologije proizvesti biljke koje imaju nefunkcionalne proteine slične ciklinu SDS ili imaju smanjenu aktivnost proteina sličnih ciklinu SDS.

[0192] Biljke prema pronalasku se mogu proizvesti uvođenjem jedne ili više mutacija u alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0193] Jedan aspekt je postupak za proizvodnju biljke lubenice, kao što je dato u priloženom patentnom zahtevu 6, koji obuhvata sledeće korake

a) uvođenje mutacija u populaciju biljaka lubenice,

b) selektovanje muški plodne biljke koja proizvodi besemeni plod,

c) proveru da li biljka selektovana pod b) ima mutacija u alelu, koji kodira gen, koji kodira protein sličan ciklinu SDS i selektovanje biljke koja sadrži takvu mutaciju, i opciono d) uzgajanje/kultivisanje biljaka dobijenih pod c),

pri čemu alel divljeg tipa gena kodira protein sličan ciklinu SDS čija je sekvenca najmanje 60% identična sa sekvencom bilo kog od proteina izabranih iz grupe: SEQ ID NO 2.

[0194] Međutim, u jednom aspektu, redosled koraka može da bude drugačiji.

[0195] Prema tome, u jednom aspektu postupak za proizvodnju biljke lubenice, kao što je dato u priloženom patentnom zahtevu 5, obuhvata sledeće korake

a) uvođenje mutacija u populaciju biljaka lubenice,

b) identifikovanje biljke koja ima mutaciju u alelu, koji kodira gen, koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu alel divljeg tipa gena kodira protein sličan ciklinu SDS čija je sekvenca najmanje 60% identična sa sekvencom bilo kog od proteina odabranih iz grupe: SEQ ID NO 2, i

c) određivanje da li je biljka muški plodna i da li biljka proizvodi besemene plodove i d) selektovanje biljke koja sadrži najmanje jednu kopiju mutantnog alela iz koraka b).

[0196] Mutantni alel, kada je u homozigotnom obliku, rezultuje proizvodnjom plodova bez semena. Biljka koja sadrži alel je muški plodna.

[0197] U jednom aspektu alel divljeg tipa gena kodira protein sličan ciklinu SDS čija je sekvenca najmanje 60% identična sa sekvencom bilo kog od proteina izabranih iz grupe: SEQ ID NO 2.

[0198] „Populacija biljaka“ znači u kontekstu ovog pronalaska više od jedne cele biljke i obuhvataće i delove biljke, plodove, seme ili biljne ćelije. Delovi biljke, plodovi, seme ili biljne ćelije u svakom slučaju potiču od više od jedne biljke, što znači da u pogledu „populacije delova biljke, plodova, semena ili biljnih ćelija“, delovi biljke, plodovi, seme, odnosno biljne ćelije, nisu dobijeni iz jedne biljke, već iz više biljaka.

[0199] Hemijske supstance, koje mogu da se koriste za proizvodnju hemijski indukovanih mutacija, i mutacije koje nastaju usled dejstva odgovarajućih mutagena su, na primer, opisane u Ehrenberg and Husain, 1981, (Mutation Research 86, 1-113), Müller, 1972 (Biologisches Zentralblatt 91 (1), 31-48). Proizvodnja mutanata pirinča korišćenjem gama zračenja, etil metan sulfonata (EMS), N-metil-N-nitrozuree ili natrijum azida (NaN3) opisana je, na primer, u Jauhar and Siddiq (1999, Indian Journal of Genetics, 59 (1), 23-28), u Rao (1977, Cytologica 42, 443-450), Gupta and Sharma (1990, Oryza 27, 217-219) i Satoh and Omura (1981, Japanese Journal of Breeding 31 (3), 316-326). Proizvodnja mutanata pšenice korišćenjem NaN3ili maleičnog hidrazida opisana je u Arora et al. (1992, Annals of Biology 8 (1), 65-69). Pregled proizvodnje mutanata pšenice korišćenjem različitih vrsta visokoenergetski zračenja i hemijskih supstanci dat je u Scarascia-Mugnozza et al. (1993, Mutation Breeding Review 10, 1-28). Svec et al. (1998, Cereal Research Communications 26 (4), 391-396) opisuje upotrebu N-etil-N-nitrozuree za proizvodnju mutacija u biljci tritikale. Upotreba MMS (metil metan sulfonske kiseline) i gama zračenja za proizvodnju mutanata prosa opisana je u Shashidhara et al. (1990, Journal of Maharashtra Agricultural Universities 15 (1), 20-23).

[0200] Proizvodnja mutanata u biljnim vrstama, koje se uglavnom razmnožavaju vegetativno, opisana je, na primer, za krompir, koji proizvodi modifikovan skrob (Hovenkamp-Hermelink et al. (1987, Theoretical and Applied Genetics 75, 217-221) i za nanu sa povećanim prinosom ulja ili izmenjenim kvalitetom ulja (Dwivedi et al., 2000, Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 22, 460-463).

[0201] Svi ovi postupci su u osnovi pogodni u postupku za proizvodnju biljke prema pronalasku za proizvodnju mutantnih alela u genima koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS. U postupku za proizvodnju biljke prema pronalasku poželjno je da se mutantna populacija proizvodi primenom etil metan sulfonata (EMS) na biljke ili seme biljaka za introdukciju mutacija.

[0202] Selekcija biljaka koje proizvode plodove bez semena može se obaviti jednostavnim vizuelnim pregledom/fenotipizacijom plodova. Kako se fenotip besemenosti vidi samo u homozigotnom stanju, pre fenotipizacije poželjno se obavlja samooprašivanje populacije mutagenizovanih biljaka. To, da biljka proizvodi plodni polen može npr. da se pokaže korišćenjem polena dotične biljke za unakrsno oprašivanje druge, različite, ženski plodne biljke. U slučaju da je seme dobijeno ovim ukrštanjem vijabilno, polen korišćen u unakrsnom oprašivanju bio je plodan. Mutacije u odgovarajućim alelima, posebno u alelima gena koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS, mogu se otkriti pomoću postupaka poznatih stručnjaku. U tu svrhu mogu se posebno koristiti analize zasnovane na hibridizaciji sa probama (Southern blot), amplifikaciji pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR), sekvenciranju srodnih genomskih sekvenci i traženju pojedinačnih zamena nukleotida. Postupak identifikacije mutacija zasnovan na obrascima hibridizacije je, na primer, traženje razlika u dužini restrikcionih fragmenata (polimorfizam dužine restrikcionih fragmenata, RFLP) (Nam et al., 1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750). Postupak zasnovana na PCR metodi je, na primer, analiza razlika u dužini amplifikovanih fragmenata (polimorfizam dužine amplifikovanih fragmenata, AFLP) (Castiglioni et al., 1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksem et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Meyer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160). Upotreba amplifikovanih fragmenata isečenih restrikcionim endonukleazama (isečene amplifikovane polimorfne sekvence, CAPS) takođe može da se koristi za identifikaciju mutacija (Konieczny and Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis et al., 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachem et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753). Postupci za određivanje SNP su opisani kod Qi et al. (2001, Nucleic Acids Research 29 (22), e116) Drenkard et al. (2000, Plant Physiology 124, 1483-1492) i Cho et al. (1999, Nature Genetics 23, 203-207) između ostalog.

[0203] Posebno su prikladni postupci koji omogućavaju da se nekoliko biljaka ispita na mutacije u određenim genima za kratko vreme. Takav postupak, takozvani TILLING (pretraga indukovanih lokalnih lezija u genomima), opisao je McCallum et al. (2000, Plant Physiology 123, 439-442).

[0204] U struci je dobro poznato da su danas i drugi postupci korisni za identifikaciju biljnih ćelija prema pronalasku i biljaka prema pronalasku koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Ovi postupci obuhvataju npr. takozvane pristupe direktnog skrininga. U pristupima direktnog skrininga proizvodi se mutantna populacija. Biljke mutantne populacije, npr. M2 biljke podvrgavaju se skriningu za biljke koje proizvode besemene plodove, koje se zatim ukrštaju sa različitim inbred linijama za proizvodnju populacije za mapiranje. Populacija za mapiranje se zatim analizira postupcima dobro poznatim u tehnici da bi se identifikovao alel koji uzrokuje fenotip ploda bez semena. Drugi postupci za identifikaciju da li biljna ćelija ili biljka sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS obuhvataju sekvenciranje odgovarajućih alela i analize SNP markera postupcima koji su uobičajeni u tehnici i npr. diskutovani u Thomson (2014, Plant Breeding and Biotechnology 2, 195-212).

[0205] Ovi postupci su u osnovi pogodni za identifikaciju biljnih ćelija prema pronalasku i biljaka prema pronalasku koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0206] Uzgajanje muški plodnih biljaka koje proizvode besemeni plod koje imaju mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS identifikovan u postupku za proizvodnju biljke prema pronalasku, može se obaviti konvencionalnim postupcima u stakleniku ili na terenu. Kultivacija i/ili razmnožavanje ovih biljaka može da se obavi pomoću postupaka koji su uobičajeni u tehnici npr. upotrebom reznica, in vitro kulture tkiva, ćelija, protoplasta, embriona ili kalusa ili mikropropagacijom ili kalemljenjem reznica na drugu podlogu.

[0207] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, postupci za proizvodnju biljke prema pronalasku se koriste za proizvodnju biljaka prema pronalasku. Poželjni primeri izvođenja koji su gore opisani za biljke prema pronalasku su shodno tome primenljive na postupke za proizvodnju biljke prema pronalasku.

[0208] Biljke koje mogu da se dobiju/dobijene postupkom za proizvodnju biljke prema pronalasku su takođe primer izvođenja pronalaska.

[0209] Različiti postupci dostupni u genskoj tehnologiji nude dalje mogućnosti za proizvodnju biljaka koje imaju mutantne alele gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ili imaju nefunkcionalne proteine slične ciklinu SDS, ili imaju smanjenu aktivnost proteina sličnih ciklinu SDS, ili pokazuju smanjenu ekspresiju proteina sličnih ciklinu SDS.

[0210] Svi ovi postupci se zasnivaju na introdukovanju stranog ili više stranih molekula nukleinske kiseline u genom biljnih ćelija ili biljaka i stoga su u osnovi pogodni za proizvodnju biljnih ćelija prema pronalasku i biljaka prema pronalasku.

[0211] Sledeći aspekt koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, stoga se odnosi na postupak za proizvodnju biljke koji obuhvata sledeće korake

a) introdukovanje stranog molekula nukleinske kiseline u biljku, pri čemu je strani molekul nukleinske kiseline izabran iz grupe koja se sastoji od:

i) molekula DNK, koji kodiraju najmanje jednu antisens RNK, koja dovodi do smanjenja ekspresije endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS; ii) molekula DNK, koja putem efekta kosupresije dovodi do smanjenja ekspresije endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS;

iii) molekula DNK, koji kodiraju najmanje jedan ribozim, koji cepa specifične transkripte endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS;

iv) molekula DNK, koji istovremeno kodiraju najmanje jednu antisens RNK i najmanje jednu sens RNK, pri čemu navedena antisens RNK i navedena sens RNK obrazuju dvolančani molekul RNK, koji dovodi do smanjenja ekspresije endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS (tehnologija RNKi);

v) molekula nukleinske kiseline introdukovanog pomoću in vivo mutageneze, koja dovodi do mutacije ili insercije heterologe sekvence u endogeni gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu mutacija ili insercija dovode do smanjenja ekspresije gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ili rezultuju sintezom neaktivnog proteina sličnog ciklinu SDS;

vi) molekula nukleinske kiseline, koji kodira antitelo, pri čemu antitelo rezultuje smanjenjem aktivnosti endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS zbog vezivanja antitela za endogeni protein sličan ciklinu SDS,

vii) molekula DNK, koji sadrži transpozone, pri čemu integracija ovih transpozona dovodi do mutacije ili insercije u endogeni gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS, što dovodi do smanjenja ekspresije endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ili rezultuje sintezom neaktivnog proteina sličnog ciklinu SDS; viii) molekula T-DNK, koji, zbog insercije u endogeni gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS, dovode do smanjenja ekspresije endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ili rezultuju sintezom neaktivnog proteina sličnog ciklinu SDS, i/ili

ix) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju endonukleaze za isecanje na retkim mestima ili individualno prilagođene endonukleaze za isecanje na retkim mestima, poželjno meganukleazu, TALEN ili CRISPR/Cas sistem

b) selektovanje biljke koja proizvodi besemene plodove, opciono

c) proveru da li biljka selektovana pod b) ima smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS u poređenju sa biljkama divljeg tipa u čiji genom nisu introdukovani molekuli strane nukleinske kiseline, i opciono

d) uzgajanje/kultivisanje biljaka dobijenih pod c).

[0212] U jednom aspektu koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, postupak koji obuhvata introdukovanje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju se odnosi na postupak za proizvodnju muški plodne biljke, što znači da da se odvija selekcija biljke koja je muški plodna i proizvodi plod bez semena (u koraku b i/ili c).

[0213] Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama ili biljkama koje su ovde opisane, ali koje nije u skladu sa pronalaskom, ili u ovde opisanom postupku, ali koji nije prema pronalasku, koje obuhvata introdukovanje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju može da se ostvari ekspresijom antisens ili kosupresivnih konstrukata.

[0214] Za inhibiciju ekspresije gena pomoću antisens ili kosupresivne tehnologije može da se koristi molekul DNK, na primer, koji uključuje celu kodirajuću sekvencu za protein sličan ciklinu SDS, uključujući sve postojeće bočne sekvence, kao i DNK molekule, koji obuhvataju samo delove kodirajuće sekvence, pri čemu ovi delovi moraju biti dovoljno dugi da proizvedu antisens efekat, odnosno efekat kosupresije u ćelijama. Generalno, pogodne su sekvence do minimalne dužine od 20 bp ili 21 bp (ili nukleotida), poželjno minimalne dužine od najmanje 100 bp (ili nukleotida), posebno poželjno od najmanje 500 bp (ili nukleotida). Na primer, molekuli DNK imaju dužinu od 21-100 bp (ili nukleotida), poželjno 100-500 bp (ili nukleotida), posebno poželjno preko 500 bp (ili nukleotida).

[0215] Upotreba DNK sekvenci, koje imaju visok stepen identičnosti sa endogenim sekvencama koje se javljaju u biljnoj ćeliji i koje kodiraju proteine slične ciklinu SDS, takođe je pogodna za antisens ili kosupresivne preparate. Minimalna identičnost treba da bude veća od približno 65%, poželjno više od 80%. Poželjna je upotreba sekvenci sa identitčnošću od najmanje 90%, posebno između 95% i 100%. Značenje izraza „identičnost sekvence“ je definisano na drugom mestu.

[0216] Dalje, za postizanje antisens ili kosupresivnog efekta mogu takođe da se upotrebe introni, tj. nekodirajuće oblasti gena koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS. Upotreba intronskih sekvenci za inhibiciju ekspresije gena koji kodiraju proteine biosinteze skroba, opisana je npr. u međunarodnim patentnim prijavama WO97/04112, WO97/04113, WO98/37213, WO98/37214.

[0217] Stručnjak u ovoj oblasti zna kako da postigne antisens i kosupresivni efekat. Na primer, postupak kosupresivne inhibicije je opisan u Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol.197 (1995), 43-46), Palaqui and Vaucheret (Plant. Mol. Biol.29 (1995), 149-159), Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet.248 (1995), 311-317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet.

243 (1994), 613-621).

[0218] Ekspresija ribozima za smanjenje aktivnosti određenih enzima u ćelijama je takođe poznata stručnjaku u ovoj oblasti i opisana je, na primer, u EP-B10321201. Ekspresija ribozima u biljnim ćelijama opisana je, na primer, u Feyter et al. (Mol. Gen. Genet.250, (1996), 329-338).

[0219] Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama ili biljkama koje su ovde opisane, ali koje nije u skladu sa pronalaskom, ili u ovde opisanom postupku, ali koji nije prema pronalasku, koje obuhvata introdukovanje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju se takođe može sprovesti istovremenom ekspresijom sens i antisens RNK molekula (tehnologija RNKi) odgovarajućeg ciljnog gena koji treba da bude podvrgnut represiji, poželjno gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0220] Ovo se može postići, na primer, upotrebom himernih konstrukata, koji sadrže „invertovane ponovke“ odgovarajućeg ciljnog gena ili delova ciljnog gena. U ovom slučaju, generički konstrukti kodiraju sens i antisens molekule RNK odgovarajućeg ciljnog gena. Sens i antisens RNK se sintetišu istovremeno in planta kao molekul RNK, pri čemu se sens i antisens RNK međusobno odvajaju pomoću spejsera i mogu da formiraju dvolančani RNK molekul.

[0221] Pokazalo se da je introdukovanje konstrukata invertovanih DNK ponovaka u genom biljnih ćelija ili biljaka veoma efikasan postupak za represiju gena koji odgovaraju konstruktima invertovanih DNK ponovaka (Waterhouse et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, (1998), 13959-13964; Wang and Woterhouse, Plant Mol. Biol. 43, (2000), 67-82; Singh et al., Biochemical Society Transactions Vol.28 part 6 (2000), 925-927; Liu et al., Biochemical Society Transactions Vol. 28 part 6 (2000), 927-929); Smith et al., (Nature 407, (2000), 319-320; međunarodna patentna prijava WO99/53050 A1). Sens i antisens sekvence ciljnog gena ili ciljnih gena takođe mogu biti eksprimirane odvojeno jedna od druge pomoću sličnih ili različitih promotora (Nap, J-P et al, 6th International Congress of Plant Molecular Biology, Quebec, 18th-24th June, 2000; Poster S7-27, Presentation Session S7). Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama koje je ovde opisano, ali koje nije u skladu sa pronalaskom, ili biljke koje su ovde opisane, ali koje nisu prema pronalasku, se stoga takođe mogu dobiti proizvodnjom dvolančanih RNK molekula. S tim u vezi, „invertovani ponovci“ molekula DNK gena koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS ili cDNK se poželjno introdukuju u genom biljaka, pri čemu su molekuli DNK (gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS ili cDNK ili fragmenti ovih gena ili cDNK) koji treba da se transkribuju pod kontrolom promotora koji kontroliše ekspresiju navedenih DNK molekula.

[0222] Fragmenti bilo kog od molekula nukleinske kiseline koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS su stoga takođe opisani ovde. Takvi fragmenti imaju različite namene, npr. kao prajmeri ili probe, ili se mogu ugraditi u vektore transformacije i koristiti za stvaranje biljaka koje proizvode plodove bez semena.

[0223] Takvi fragmenti molekula nukleinske kiseline koji kodiraju proteine slične ciklinu SDS mogu biti različitih veličina, npr. najmanje 10 nukleotida, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90, najmanje 100, najmanje 200, najmanje 300, na najmanje 400, najmanje 500 nukleotida ili više.

[0224] Pored ovoga, poznato je da formiranje dvolančanih RNK molekula sa promotorskih molekula DNK u biljkama in trans može dovesti do metilacije i transkripcione inaktivacije homolognih kopija ovih promotora, koji će se u daljem tekstu nazivati ciljnim promotorima (Mette et al., EMBO J.19, (2000), 5194-5201). Zbog toga je moguće smanjiti ekspresiju gena određenog ciljnog gena (npr. gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS), koji je prirodno pod kontrolom ovog ciljnog promotora, deaktivacijom ciljnog promotora. To znači da se, u ovom slučaju, molekuli DNK, koji uključuju ciljne promotore gena koje treba reprimirati (ciljne gene), za razliku od prvobitne funkcije promotora u biljkama, ne koriste kao kontrolni elementi za ekspresiju gena ili cDNK, ali se i sami koriste kao molekuli DNK koji se mogu transkribovati.

[0225] Za proizvodnju dvolančanih molekula RNK ciljnog promotora in planta, koji se mogu javiti u vidu RNK molekula sa strukturom ukosnice, poželjno se koriste konstrukti koji sadrže „invertovane ponovke“ molekula DNK ciljnog promotora, pri čemu su molekuli DNK ciljnog promotora pod kontrolom promotora koji kontroliše ekspresiju gena pomenutih molekula DNK ciljnog promotora. Ovi konstrukti se zatim uvode u genom biljaka. Ekspresija „invertovanih ponovaka“ navedenih molekula DNK ciljnog promotora in planta dovodi do formiranja dvolančanih molekula RNK ciljnog promotora (Mette et al., EMBO J. 19, (2000), 5194-5201). Ciljni promotor na ovaj način može da bude inaktiviran. Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama se stoga takođe može postići introdukovanjem dvolančanih RNK molekula promotorskih sekvenci gena koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS u biljne ćelije ili biljke. S tim u vezi, „invertovani ponovci“ promotorskih DNK molekula gena koji kodiraju protein sličan ciklinu, SDS, poželjno se introdukuju u genom biljaka, pri čemu su molekuli DNK ciljnog promotora (promotor gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS) koji treba da se transkribuju pod kontrolom promotora, koji kontroliše ekspresiju pomenutih molekula DNK ciljnog promotora.

[0226] Za inhibiciju ekspresije gena putem istovremene ekspresije sens i antisens molekula RNK (tehnologija RNKi), može se koristiti molekul DNK, na primer, koji uključuje celu kodirajuću sekvencu za protein sličan ciklinu SDS, uključujući bilo koje postojeće bočne sekvence, kao i molekule DNK, koji uključuju samo delove kodirajuće sekvence, pri čemu ovi delovi moraju biti dovoljno dugački da proizvedu takozvani RNKi efekat u ćelijama. Delovi gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS mogu da budu izabrani između kodirajućih sekvenci, netranslatiranih nishodnih ili ushodnih sekvenci, introna, promotora i/ili pojačivača. Generalno, pogodne su sekvence sa minimalnom dužinom od 20 bp (ili nukleotida), poželjno minimalnom dužinom od najmanje 25 bp (ili nukleotida), posebno poželjno od najmanje 50 bp (ili nukleotida). Na primer, molekuli DNK imaju dužinu od 20 do 25 bp (ili nukleotida), poželjno od 26 do 50 bp (ili nukleotida), posebno poželjno više od 50 bp (ili nukleotida).

[0227] Upotreba DNK sekvenci, koje imaju visok stepen identičnosti sa endogenim sekvencama koje se javljaju u biljnim ćelijama i koje kodiraju protein sličan ciklinu SDS, takođe je pogodna za istovremenu ekspresiju sens i antisens RNK molekula (tehnologija RNKi). Minimalna identičnost treba da bude veća od približno 65%, poželjno više od 80%. Posebno je poželjna upotreba sekvenci sa identičnošću od najmanje 90%, posebno između 95% i 100%. Sekvence, koje sadrže uzastopne fragmente sekvenci nukleinske kiseline sačinjene od sekvence nukleinske kiseline prikazane pod SEQ ID NO 1, su posebno pogodne za inhibiciju gena koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS pomoću tehnologije RNKi.

[0228] Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama ili u postupku koji je ovde opisan, ali koji nije prema pronalasku, koja obuhvata introdukovanje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju može se postići tzv. „in vivo mutagenezom“, u kojoj se hibridni RNK-DNK oligonukleotid („Himeroplast“) introdukuje u biljne ćelije (Kipp, P.B. et al., Poster Session at the „5th International Congress of Plant Molecular Biology, 21st-27th September 1997, Singapore; R. A. Dixon and C.J. Arntzen, meeting report on „Metabolic Engineering in Transgenic Plants“, Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15, (1997), 441-447; međunarodna patentna prijava WO 9515972; Kren et al., Hepatology 25, (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273, (1996), 1386-1389; Beetham et al., 1999, PNAS 96, 8774-8778).

[0229] Deo DNK komponenti RNK-DNK oligonukleotida je homologan sekvenci nukleinske kiseline endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ali, u poređenju sa sekvencom nukleinske kiseline endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ima mutacija ili sadrži heterologni region, koji je okružen homolognim regionima. Uparivanjem baza homolognih regiona RNK-DNK oligonukleotida i molekula endogene nukleinske kiseline praćenim homolognom rekombinacijom, mutacija ili heterologni region sadržan u DNK komponentama RNK-DNK oligonukleotida može se preneti u genom biljne ćelije.. Ovo dovodi do smanjenja aktivnosti jednog ili više proteina sličnih ciklinu SDS.

[0230] Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama ili u postupku koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata uvođenje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju može se postići introdukovanjem molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antagoniste/inhibitore proteina sličnih ciklinu SDS u biljnu ćeliju. Stručnjak u ovoj oblasti zna da može postići smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS ekspresijom nefunkcionalnih derivata, posebno trans-dominantnih mutacija, takvih proteina, i/ili ekspresijom antagonista/inhibitora takvih proteina. Antagonisti/inhibitori takvih proteina uključuju, na primer, antitela, fragmente antitela ili molekule sa sličnim karakteristikama vezivanja. Na primer, citoplazmatsko scFv antitelo je korišćeno za modulaciju aktivnosti proteina fitohroma A u genetski modifikovanim biljkama duvana (Owen, Bio/Technology 10 (1992), 790-4; Review: Franken, E, Teuschel, U. and Hain, R., Current Opinion in Biotechnology 8, (1997), 411-416; Whitelam, Trends Plant Sci. 1 (1996), 268-272; Conrad and Manteufel, Trends in Plant Science 6, (2001), 399-402; De Jaeger et al., Plant Molecular Biology 43, (2000), 419-428). Smanjenje aktivnosti razgranatog enzima u biljkama krompira ekspresijom specifičnog antitela opisano je Jobling et al. (Nature Biotechnology 21, (2003), 77-80). Ovde antitelo ima ciljnu sekvencu plastida, tako da je inhibicija proteina lokalizovanih u plastidima zagarantovana.

[0231] Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama ili u postupku koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata uvođenje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju može se postići introdukovanjem molekula nukleinske kiseline koji sadrže transpozonske sekvence u biljnu ćeliju. Insercija sekvenci transpozona u sekvencu endogenog gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, utiče na smanjenje ekspresije endogenog proteina sličnog ciklinu SDS.

[0232] Transpozoni mogu da budu endogeni transpozoni (homologni za biljku), kao i oni koji se prirodno ne pojavljuju u navedenoj ćeliji (heterologni za biljku), ali u svakom slučaju moraju da budu introdukovani u biljnu ćeliju ili biljku postupcima genetskog inženjeringa, kao što je transformacija ćelije, na primer. Menjanje ekspresije gena pomoću transpozona je poznato stručnjaku u ovoj oblasti. Pregled upotrebe endogenih i heterolognih transpozona kao alata u biljnoj biotehnologiji predstavljen je u Ramachandran and Sundaresan (2001, Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252). Mogućnost identifikacije mutacija u kojima su specifični geni inaktivirani insercionom mutagenezom transpozona predstavljena je u pregledu autora Maes et al. (1999, Trends in Plant Science 4 (3), 90-96). Proizvodnja mutanata pirinča uz pomoć endogenih transpozona opisana je kod Hirochika (2001, Current Opinion in Plant Biology 4, 118-122). Identifikacija gena kukuruza uz pomoć endogenih retrotranspozona predstavljena je npr. kod Hanley et al. (2000, The Plant Journal 22 (4), 557-566). Mogućnost proizvodnje mutanata uz pomoć retrotranspozona i postupci za identifikaciju mutanata su opisani kod Kumar and Hirochika (2001, Trends in Plant Science 6 (3), 127-134). Opisana je aktivnost tehnoloških (veštačkih) transpozona u različitim vrstama i za dikotiledone i za monokotiledone biljke: npr. za pirinač (Greco et al., 2001, Plant Phisiology 125, 1175-1177; Liu et al., 1999, Molecular and General Genetics 262, 413-420; Hiroyuki et al., 1999, The Plant Journal 19 (5), 605-613; Jeon und Gynheung, 2001, Plant Science 161, 211-219), ječam (2000, Koprek et al., The Plant Journal 24 (2), 253-263) Arabidopsis thaliana (Aarts et al., 1993, Nature 363, 715-717, Schmidt und Willmitzer, 1989, Molecular and General Genetics 220, 17-24; Altmann et al., 1992, Theoretical and Applied Genetics 84, 371-383; Tissier et al., 1999, The Plant Cell 11, 1841-1852), paradajz (Belzile und Yoder, 1992, The Plant Journal 2 (2), 173-179) i krompir (Frey et al., 1989, Molecular and General Genetics 217, 172-177; Knapp et al., 1988, Molecular and General Genetics 213, 285-290).

[0233] U osnovi, biljne ćelije i biljke mogu se proizvesti i uz pomoć homolognih i heterolognih transpozona.

[0234] U vezi sa ovim pronalaskom, biljne ćelije i biljke koje su ovde opisane, ali koje nisu u skladu sa pronalaskom, takođe mogu da budu proizvedene upotrebom takozvane insercione mutageneze (pregledni članak: Thomeycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601). Smanjenje aktivnosti proteina sličnih ciklinu SDS u biljnim ćelijama i biljkama ili u postupku koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata uvođenje stranog molekula nukleinske kiseline u biljnu ćeliju može se postići introdukovanjem molekula nukleinske kiseline koji sadrže T-DNK sekvence u biljnu ćeliju.

[0235] Inserciona mutageneza T-DNK zasniva se na činjenici da određeni delovi (T-DNK) Ti plazmida iz Agrobacterium mogu da se integrišu u genom biljnih ćelija. Mesto integracije u biljnom hromozomu nije definisano, ali se može desiti na bilo kojoj tački. Ako se T-DNK integriše u deo hromozoma, koji obavlja funkciju gena, onda to može dovesti do promene u ekspresiji gena, a samim tim i do promene aktivnosti proteina kodiranog tim genom. Konkretno, integracija T-DNK u kodirajuću oblast proteina često dovodi do toga da odgovarajući protein više uopšte ne može da se sintetiše, ili da se više ne sintetiše u aktivnom obliku, od strane dotične ćelije. Upotreba insercija T-DNK u proizvodnji mutanata je opisana, na primer, za Arabidopsis thaliana (Krysan et al., 1999, The Plant Cell 11, 2283-2290; Atipiroz-Leehan and Feldmann, 1997, Trends in genetics 13 (4), 152-156; Parinov and Sundaresan, 2000, Current Opinion in Biotechnology 11, 157-161) i pirinač (Jeon and An, 2001, Plant Science 161, 211-219; Jeon et al., 2000, The Plant Journal 22 (6), 561-570). Postupci za identifikaciju mutanata, koji su proizvedeni uz pomoć insercione mutageneze T-DNK, opisani su, između ostalog, u Young et al., (2001, Plant Physiology 125, 513-518), Parinov et al. (1999, The Plant cell 11, 2263-2270), Thorneycroft et al. (2001, Journal of Experimental Botany 52, 1593-1601) i McKinney et al. (1995, The Plant Journal 8 (4), 613-622).

[0236] Insercioni mutanti T-DNK su proizvedeni u velikom broju za Arabidopsis thaliana, na primer, i dostupni su u raznim kolekcijama kultura („Stock centre“, npr. Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, http://signal.salk.edu/).

[0237] T-DNK mutageneza je u osnovi pogodna za proizvodnju biljnih ćelija i biljaka, koje imaju smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS.

[0238] U vezi sa ovim pronalaskom, termin „molekul strane nukleinske kiseline“ podrazumeva takav molekul nukleinske kiseline koji se ili ne pojavljuje prirodno u odgovarajućim biljnim ćelijama ili biljkama divljeg tipa, ili koji se ne pojavljuje prirodno u konkretnom prostornom rasporedu u biljnim ćelijama ili biljkama divljeg tipa, ili koji je lokalizovan na mestu u genomu biljne ćelije ili biljke na kome se ne javlja prirodno. Poželjno, molekul strane nukleinske kiseline je rekombinantni molekul, koji se sastoji od različitih elemenata, čija se kombinacija ili specifičan prostorni raspored ne javlja prirodno u biljnim ćelijama ili biljkama.

[0239] U principu, molekul strane nukleinske kiseline može da bude bilo koji molekul nukleinske kiseline koji utiče na smanjenje aktivnosti proteina sličnog ciklinu SDS. Takve vrste molekula nukleinske kiseline su gore opisane.

[0240] U vezi sa ovim pronalaskom, termin „genom“ treba shvatiti kao ukupnost genetskog materijala prisutnog u biljnoj ćeliji. Stručnjaku je poznato da, kao i jedro ćelije, drugi delovi (npr. plastidi, mitohondrije) takođe sadrže genetski materijal.

[0241] Dostupan je veliki broj tehnika za uvođenje DNK u biljnu ćeliju domaćina. Ove tehnike uključuju transformaciju biljnih ćelija pomoću T-DNK korišćenjem Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes kao medijuma za transformaciju, fuziju protoplasta, ubrizgavanje nukleinskih kiselina, elektroporaciju nukleinskih kiselina, introdukovanje nukleinskih kiselina putem biolističkog pristupa, kao i druge mogućnosti.

[0242] Upotreba transformacije biljnih ćelija posredovana agrobakterijama je intenzivno istražena i adekvatno opisana u EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci.4, 1-46 i kod An et al. EMBO J.4, (1985), 277-287. Za transformaciju krompira, videti Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33, na primer.

[0243] Transformacija monokotiledonih biljaka pomoću vektora na bazi Agrobacterium transformacije je takođe opisana (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J.6, (1994) 271-282; Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci.153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res.2, (1993), 252-265). Alternativni sistem transformacije monokotiledonih biljaka je transformacija pomoću biolističkog pristupa (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil etal., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol.24, (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), transformacije protoplasta, elektroporacije delimično permeabilizovanih ćelija i uvođenja DNK pomoću staklenih vlakana. Konkretno, transformacija kukuruza je opisana u literaturi mnogo puta (upor. npr. WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726). Uspešna transformacija drugih vrsta žitarica je takođe već opisana, na primer za ječam (Wan and Lemaux, videti gore; Ritala et al., videti gore; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) i za pšenicu (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307). Svi gore navedeni postupci su pogodni u okvirima ovog pronalaska. Transformacija povrtarskih kultura je takođe opšte poznata u tehnici. In Curtis (2012, Springer Science & Business Media, ISBN: 1402023332, 9781402023330) pored ostalih, otkriveni su postupci za transformaciju kafe, ananasa, kruške, rotkvice, šargarepe, graška, kupusa, karfiola i lubenice. Transformacija povrća kao što su banana, citrusi, mango, papaja, lubenica, avokado, grožđe, (slatka) dinja, kivi, kafa, kakao, opisani su u Pua and Davey (2007, Springer Science & Business Media, ISBN: 3540491619, 9783540491613).

[0244] Za ekspresiju molekula nukleinske kiseline, poput onih koji daju efekat utišavanja gena ili se koriste za introdukovanje mutacija u alel u biljnim ćelijama ili biljkama, ove nukleinske kiseline su poželjno povezane sa regulatornim DNK sekvencama, uključujući one koje iniciraju transkripciju u biljnim ćelijama (promotori). Istovremeno, promotor može da se izabere tako da se ekspresija odvija konstitutivno ili samo u određenom tkivu, u određenom stadijumu razvoja biljke ili u vremenu određenom spoljnim uticajima. Promotor može da bude homologan ili heterologan, kako u odnosu na biljku, tako i u odnosu na molekul nukleinske kiseline. Molekuli nukleinske kiseline se stoga obično ne javljaju prirodno u biljkama, već su rekombinantni molekuli nukleinske kiseline, što znači da kombinacija različitih genetskih elemenata (npr. kodirajuće sekvence, RNKi komplementarna sekvenca, promotori) koju sadrži molekul nukleinske kiseline nije prisutna u ovoj kombinaciji u prirodi.

[0245] Pogodni promotori su opšte poznati u tehnici, na primer, promotor 35S RNK virusa mozaika karfiola i ubikvitinski promotor iz kukuruza za konstitutivnu ekspresiju, promotor patatina B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) za ekspresiju specifičnu za krtole u krompiru ili promotor, koji obezbeđuje ekspresiju samo u fotosintetički aktivnim tkivima, npr. promotor ST-LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J.8 (1989), 2445-2451) ili, za endosperm-specifičnu ekspresiju promotor HMG iz pšenice, USP promotor, promotor fazeolina, promotor gena zeina iz kukuruza (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), promotor glutelina (Leisy et al., Plant Mol. Biol.14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J.4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett.383 (1996), 213-218) ili shrunken-1 promotor (Werr et al., EMBO J.4 (1985), 1373-1380). Međutim, mogu se koristiti i promotori koji se aktiviraju samo u vremenu određenom spoljnim uticajima (videti npr. WO 9307279). Promotori proteina toplotnog šoka, koji omogućavaju jednostavnu indukciju, mogu biti od posebnog interesa ovde. Dalje, mogu da se koriste promotori specifični za seme, kao što je USP promotor iz Vicia faba, što garantuje ekspresiju specifičnu za seme u Vicia faba i drugim biljkama (Fiedler et al., Plant Mol. Biol.22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet.225 (1991), 459-467).

[0246] Molekul rekombinantne nukleinske kiseline može takođe da sadrži terminacionu sekvencu (poliadenilacioni signal), koja se koristi za dodavanje poli-A repa na transkript. Funkcija u stabilizaciji transkripata se pripisuje poli-A repu. Elementi ovog tipa su opisani u literaturi (upor. Gielen et al., EMBO J.8 (1989), 23-29) i mogu da se zamene po želji.

[0247] Intronske sekvence takođe mogu da budu prisutne, npr. između promotora i kodirajućeg regiona. Takve intronske sekvence mogu dovesti do stabilnosti ekspresije i povećane ekspresije u biljkama (Callis et al., 1987, Genes Devel.1, 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, et al., 1997; Plant Journal. 12(4): 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol.122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol.91, 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569). Pogodne intronske sekvence su, na primer, prvi intron gena shl iz kukuruza, prvi intron gena 1 poliubikvitina iz kukuruza, prvi intron gena epsps iz pirinča ili jedan od dva prva introna gena PAT1 iz Arabidopsis.

[0248] Ono što je ovde opisano u vezi sa potvrđivanjem da li biljka ima mutaciju u sekvenci nukleinske kiseline ili u genu ili alelu koji kodira protein sličan ciklinu SDS i za uzgoj/kultivaciju biljaka za postupak za proizvodnju biljke prema pronalasku je takođe ovde primenljivo ovde za postupak koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata introdukovanje molekula strane nukleinske kiseline u biljnu ćeliju prema pronalasku.

[0249] U sledećem aspektu, postupci za proizvodnju biljke i postupak koji je ovde opisan, ali koji nije u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata introdukovanje molekula strane nukleinske kiseline u biljnu ćeliju, obuhvata dodatni korak koji se sastoji od proizvodnje dodatnih biljaka iz biljaka dobijenih iz koraka d) u svakom od postupaka. Dodatne proizvedene biljke se karakterišu time što sadrže najmanje jedan mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ili time što imaju smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS zbog introdukovanje molekula strane nukleinske kiseline kao što je gore opisano. Ove dodatne biljke mogu da se proizvedu vegetativnim (bespolnim) ili generativnim (polnim) razmnožavanjem. Za vegetativno razmnožavanje su pogodne, na primer, reznice, in vitro kulture tkiva, ćelija, protoplasta, embriona ili kalusa, materijal za mikropropagaciju, rizomi ili krtole. Drugi materijal za razmnožavanje uključuje, na primer, plodove, seme, sadnice, koji su heterozigotni ili homozigotni za mutantni alel gena koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS, itd.

[0250] Tehnike za vegetativno (bespolno) razmnožavanje, uključujući mikropropagaciju biljaka, dobro su poznate u tehnici i opisane npr. za banane, citruse, mango, papaju, avokado, (slatku) dinju, u radu Pua and Davey (2007, Springer Science & Business Media, ISBN: 3540491619, 9783540491613). Sultana and Rhaman (2012, LAP Lambert Academic Publishing, ISBN-13: 978-3-8484-3937-9) npr. otkrivaju različite kulture tkiva i postupke mikropropagacije kod lubenice.

[0251] Biljke koje mogu da se dobiju/dobijene ovde opisanim postupkom koji obuhvata introdukovanje molekula strane nukleinske kiseline u biljnu ćeliju, takođe su ovde opisane, ali nisu primer izvođenja pronalaska.

[0252] Sledeći aspekt koji je ovde opisan odnosi se na postupak za razmnožavanje biljaka koje daju besemeni plod, koji obuhvata sledeće korake:

a) dobijanje semena iz koga biljka prema pronalasku raste ili dobijanje semena deponovanog pod pristupnim br. NCIMB 42532 ili njihovog potomstva,

b) uzgajanje biljaka iz semena dobijenog u koraku a),

c) selektovanje biljaka koje daju besemeni plod od biljaka uzgojenih u koraku b), d) razmnožavanje biljaka selektovanih u koraku c) postupkom izabranim iz grupe koja se sastoji od

i) kalemljenja delova biljaka izabranih u koraku c) na drugu podlogu, ii) kultivisanja delova biljaka izabranih u koraku c) u in vitro kulturi tkiva i opciono regenerisanja novih biljaka iz kulture tkiva,

iii) opcione proizvodnje kultura embriona ili kalusa od delova biljaka izabranih u koraku c) i opcionog regenerisanja novih biljaka iz kulture tkiva,

iv) opcione proizvodnje dodatnih biljaka tehnikama mikropropagacije.

[0253] Razmnožavanje delova biljaka kalemljenjem i razmnožavanje i opciono regeneracija biljaka postupcima kulture tkiva su dobro poznati u tehnici. Ovakvi postupci su opisani u raznim naučnim publikacijama i pregledi i sažeci su dati u brojnim naučnim knjigama, kao npr. Smith (2012, Academic Press, ISBN-13: 978-0124159204), Gayatri & Kavyashree (2015, Alpha Science International Ltd, ISBN-13: 978-1842659618) itd. Odgovarajući postupci kod lubenice su opisani, npr. kod Sultana and Rhaman (2012, LAP Lambert Academic Publishing, ISBN-13: 978-3848439379).

[0254] Biljke ili delovi biljaka koji mogu da se dobiju/dobijeni postupcima za razmnožavanje biljaka koje proizvode besemene plodove prema pronalasku takođe su primer izvođenja pronalaska.

[0255] Sledeći primer izvođenja pronalaska se odnosi na materijal za razmnožavanje biljaka prema pronalasku, i/ili materijal za razmnožavanje biljaka koji sadrži biljne ćelije prema pronalasku kako je navedeno u priloženom patentnom zahtevu 10. Specifični obuhvaćeni primer izvođenja pronalaska je materijal za razmnožavanje biljaka koje mogu da se dobiju/koje su dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532, poželjno, materijal za razmnožavanje biljaka koje mogu da se dobiju/koje su dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532, koje su heterozigotne ili homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Pronalazak takođe obuhvata materijal za razmnožavanje biljaka koje su heterozigotne ili homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu se materijal za razmnožavanje dobija/može da se dobije od biljaka koje potiču iz ukrštanja biljke dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 sa drugom biljkom.

[0256] Ovde, termin „materijal za razmnožavanje“ obuhvata one komponente biljke koje su pogodne za generisanje potomstva vegetativnim (bespolnim) ili generativnim (polnim, seksualnim) putem. Za vegetativno razmnožavanje su pogodne, na primer, reznice, in vitro kulture tkiva, ćelija, protoplasta, embriona ili kalusa, postupci mikropropagacije, rizomi ili krtole. Drugi materijal za razmnožavanje obuhvata, na primer, plodove, seme, sadnice, koji su heterozigotni za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS itd. Materijal za razmnožavanje u jednom aspektu ima oblik reznica koje se razmnožavaju, npr. kalemljenjem na drugu podlogu, ili materijala in vitro kulture tkiva, posebno kulture embriona. Posebno poželjan je materijal za razmnožavanje u obliku materijala in vitro kulture tkiva, posebno in vitro kulture embriona. Biljka proizvedena vegetativnim razmnožavanjem se ovde takođe naziva vegetativno razmnoženom biljkom. Naročito, biljke u kojima je mutantni alel sličan ciklinu SDS prisutan u homozigotnom obliku poželjno se razmnožavaju vegetativno (pošto su njihovi plodovi bez semena).

[0257] Sledeći primer izvođenja pronalaska se odnosi na delove biljaka prema pronalasku, i/ili delove biljaka koji sadrže biljne ćelije prema pronalasku, kao što je navedeno u priloženom patentnom zahtevu 9. Sledeći obuhvaćeni primer izvođenja pronalaska odnosi se na delove biljaka koje mogu da se dobiju/koje su dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 (ili iz njegovog potomstva), poželjno, delove biljaka koje mogu da se dobiju/koje su dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 (ili iz njegovog potomstva) koje su heterozigotne ili homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Pronalazak takođe obuhvata delove biljaka koje su heterozigotne ili homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu su delovi biljke dobijeni/mogu da se dobiju od biljaka koje potiču iz ukrštanja biljke dobijene iz semena deponovanog pod brojem NCIMB 42532 sa drugom biljkom.

[0258] Sledeći primer izvođenja pronalaska se odnosi na postupak za proizvodnju besemenog ploda koji obuhvata uzgoj biljke prema pronalasku i/ili uzgoj biljke koja sadrži biljne ćelije prema pronalasku kako je navedeno u priloženom patentnom zahtevu 13, omogućavanjem biljci da bude oprašena i branjem besemenog ploda. Biljka uzgajana u postupku za proizvodnju besemneih plodova prema pronalasku je homozigotna za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0259] Iznenađujuće je otkriveno da će oprašivanje biljaka koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS u homozigotnom stanju sa polenom druge biljke rezultovati biljkom koja proizvedi plodove bez semena. Nije odlučujuće da li se žig biljke koja je homozigotna za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS oprašuje polenom koji sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS ili polenom koji sadrži alel divljeg tipa gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. U svakom slučaju, nezavisno od genotipa polena, ženska biljka koja je homozigotna za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS će proizvesti besemene plodove. Čak i kada se unakrsno oprašuju polenom biljaka divljeg tipa, biljke prema pronalasku koje su homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS će proizvesti besemene plodove. Na taj način, pri gajenju biljaka prema pronalasku u svakom slučaju se dobijaju besemeni plodovi.

[0260] U vezi sa ovim pronalaskom „staklenik“ podrazumeva zgradu ili odeljak koji se koristi za gajenje biljaka koji ima krov i zidove od providnog materijala koji se sastoji od stakla, plastike, polietilena, gaze, mreže ili slično. Staklenici mogu, ali ne moraju da imaju dodatnu tehničku opremu za grejanje, hlađenje, zasenjivanje, automatsko zalivanje, đubrenje, podešavanje koncentracije ugljen-dioksida itd. Staklenici sa bilo kojom vrstom tehničke opreme biće obuhvaćeni terminom „staklenik“ kako se ovde koristi.

[0261] Sledeći primer izvođenja pronalaska se odnosi na plodove biljaka, ili plodove koji mogu da se dobiju/koji su dobijeni od biljaka prema pronalasku, i/ili plodove koji sadrže biljne ćelije prema pronalasku ili plodove biljaka koji mogu da se dobiju/koji su dobijeni od biljke koja je dobijena/može da se dobije postupkom prema pronalasku za razmnožavanje biljaka koje proizvode besemene plodove ili plod koji može da se dobije/koji je dobijen postupkom prema pronalasku za proizvodnju besemenog ploda, kao što je navedeno u priloženom patentnom zahtevu 11. Sledeći obuhvaćeni primer izvođenja pronalaska se odnosi na plodove biljaka koje mogu da se dobiju/koje su dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 (ili njegovog potomstva), poželjno plodove biljaka koje mogu da se dobiju/koje su dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 (ili njegovog potomstva) koje su heterozigotne ili homozigotne za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Pronalazak obuhvata i plodove koji su heterozigotni ili homozigotni za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu se plodovi dobijaju/mogu da se dobiju od biljaka koje potiču iz ukrštanja biljke dobijene iz semena deponovanog pod pristupnim brojem NCIMB 42532 sa drugom biljkom. Plodovi mogu biti heterozigotni za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS i proizvoditi plodove sa semenom ili mogu biti homozigotni za alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS i proizvoditi plodove bez semena. Plodovi koji su heterozigotni za alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS mogu se koristiti za razmnožavanje biljaka koje sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS. Poželjno, plodovi prema pronalasku su homozigotni za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS i/ili proizvode plodove bez semena. Besemeni plodovi iz logičnih razloga nisu pogodni za uzgajaju dodatnih biljaka iz ovih plodova. Prema tome, jedan primer izvođenja pronalaska se odnosi na plod prema pronalasku koji predstavlja besemeni plod koji nije pogodan za razmnožavanje ili koje se ne može razmnožavati ili koje se ne razmnožava.

[0262] Kao što je dato u priloženom patentnom zahtevu 8 sledeći primer izvođenja pronalaska se odnosi na upotrebu molekula nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS izabranog iz grupe koja se sastoji od:

a) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2;

b) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein, čija je sekvenca najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90%, ili posebno poželjno najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2;

c) molekula nukleinske kiseline, koji sadrže nukleotidnu sekvencu prikazanu pod SEQ ID NO 1 ili SEQ ID NO 3 ili SEQ ID NO 17 ili komplementarnu sekvencu;

d) molekula nukleinske kiseline, koji su najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90%, ili posebno poželjno najmanje 95% identični sa sekvencama nukleinske kiseline opisanim pod c);

e) molekula nukleinske kiseline, koji hibridizuju sa najmanje jednim lancem molekula nukleinske kiseline opisanim pod a) ili c) pod strogim uslovima od najmanje jednog pranja u 0.2X SSC na temperaturi od najmanje 50°C tokom 20 min;

f) molekula nukleinske kiseline, čija nukleotidna sekvenca odstupa od sekvence molekula nukleinske kiseline identifikovanih pod c) ili d) zbog degeneracije genetskog koda; i g) molekula nukleinske kiseline, koji predstavljaju fragmente od najmanje 20 nukleotida molekula nukleinske kiseline identifikovanih pod a) ili pod c),

za proizvodnju biljke koja proizvodi besemene plodove.

[0263] U poželjnom primeru izvođenja upotrebe molekula nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS, molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS se koristi za proizvodnju biljaka prema pronalasku, u posebno poželjnom primeru izvođenja, upotreba molekula nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS je upotreba za proizvodnju biljaka koje proizvode plodove bez semena prema pronalasku.

[0264] U drugim poželjnim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS se koristi za proizvodnju dela biljke prema pronalasku ili ploda prema pronalasku.

[0265] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS, koristi se u bilo kom od postupaka pronalaska koji su ovde otkriveni. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS mogu npr. da se koriste u postupku prema pronalasku za proizvodnju biljke ili u postupku prema pronalasku za razmnožavanje biljaka koje proizvode besemene plodove prema pronalasku ili u postupku prema pronalasku za proizvodnju besemenog ploda.

[0266] U drugom aspektu koji je ovde opisan, molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS se koristi za identifikaciju da li biljna ćelija ili biljka sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ili da li biljna ćelija ili biljka sintetizuju mutantnu iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, ili da li biljna ćelija ili biljka ima smanjenu aktivnost proteina sličnog ciklinu SDS. Poželjno je da se molekul nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS koristi za identifikaciju da li biljka koja proizvodi besemeni plod sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, ili da li biljka sintetiše mutantnu iRNK koja kodira protein sličan ciklinu SDS, ili da li biljka ima smanjenu aktivnost protein sličan ciklinu SDS. Ranije u ovom dokumentu je opisano kako takve biljke mogu da se identifikuju i takođe je ovde primenljivo.

[0267] Poželjni primeri izvođenja koji se odnose na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju protein sličan ciklinu SDS su opisani gore u tekstu i shodno tome su primenljivi na upotrebe prema pronalasku.

[0268] U jednom aspektu koji je ovde opisan, otkriven je postupak skrininga za identifikaciju i/ili selekciju semena, biljaka ili delova biljaka ili DNK iz takvog semena, biljaka ili delova biljaka koji u svom genomu sadrže mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

[0269] Postupak obuhvata skrining na nivou DNK, RNK (ili cDNK) ili proteina korišćenjem poznatih postupaka, za detektovanje prisustva mutantnog alela. Postoji mnogo postupaka za detektovanje prisustva mutantnog alela gena.

[0270] Na primer, ako postoji razlika u jednom nukleotidu (polimorfizam jednog nukleotida, SNP) između divljeg tipa i mutantnog alela, može se koristiti test genotipizacije SNP da bi se otkrilo da li biljka ili deo biljke ili ćelija sadrži nukleotid divljeg tipa ili mutantni nukleotid u svom genomu. Na primer, SNP može lako da se detektuje korišćenjem KASP testa (videti na internet adresi kpbioscience.co.uk) ili drugih testova genotipizacije SNP. Za razvoj KASP testa, može da se izabere na primer, 70 baznih parova ushodno i 70 baznih parova nishodno od SNP i mogu da se dizajniraju dva direktna alel-specifična prajmera i jedan reverzni alel-specifični prajmer. Videti npr. Allen et al.2011, Plant Biotechnology J.9, 1086-1099, posebno postupak KASP testa na str.

097-1098.

[0271] Isto tako, mogu se koristiti i drugi testovi genotipizacije. Na primer, mogu da se koriste i TaqMan SNP test genotipizacije, test topljenja visoke rezolucije (HRM), SNP-genotipizacija na čipu (npr. Fluidigm, Illumina, itd.) ili sekvenciranje DNK.

[0272] Genotipizacija diploidnih biljaka ili delova biljaka (ćelije, listovi, DNK, itd.) može da omogući razlikovanje SNP genotipova, npr. omogućava razlikovanje biljaka ili delova biljaka koji sadrže CC kao nukleotid 1687 u SEQ ID NO: 1 (homozigot za nukleotid divljeg tipa) od biljaka ili delova biljaka koji sadrže CT kao nukleotid 1687 u SEQ ID NO: 1 (heterozigot za mutantni nukleotid) u svojim genomima. Genotipizacija tetraploidnih biljaka ili delova biljaka (ćelije, listovi, DNK, itd.) se može uraditi na isti način kao i za diploide, korišćenjem na primer KASP testa za razlikovanje SNP genotipova, npr. moguće je razlikovati biljke ili delove biljaka koji sadrže CCCC kao nukleotid u 1687 SEQ ID NO: 1 (homozigot za divlji tip nukleotida) od biljaka ili delova biljaka koji sadrže druge genotipove za SNP, npr. CCCA, CCAA itd. u svom genomu. Isto važi i za triploide. Isto važi i za druge poliploide.

[0273] U gornjim postupcima, biljke, biljne ćelije i delovi biljaka koji sadrže najmanje jednu kopiju mutantnog alela gen koji kodira protein sličan ciklinu SDS, su biljke lubenice, posebno uzgajana lubenica, npr. diploidna, tetraploidna ili triploidna uzgajana lubenica.

[0274] Biljke lubenice mogu da budu oplemenjivačke linije ili sorte. Mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS može da bude generisan u, ili introdukovan u (npr. iz semena deponovanog pod NCIMB42532 ili njegovog potomstva), bilo koju uzgajanu lubenicu da bi se dobile linije ili sorte koje sadrže mutantni alel proteina sličnog SDS, poželjno u homozigotnom obliku. Kultivisane lubenice daju plodove različite veličine (npr. veoma male, kao što je opisano u WO2012069539, npr. manje od 0.9 kg ili čak 0.65 kg ili manje; sa individualnom veličinom od oko 3-7 funti, odnosno oko 1.4 do 3.2 kg; sa veličinom za čuvanje u rashladnoj komori od oko 6-12 funti, odnosno oko 2.7 do 5.5 kg; i veće veličine do 35 funti, odnosno oko 15.9 kg), boje mesa ploda i oblicima ploda i sa različitim bojama kore. Mutantni alel, stoga, može da se introdukuje u kultivisanu lubenicu dajući po uzgoju bilo koji oblik ploda (npr. izdužen, ovalan, ovalno izdužen, kockast, kockasto izdužen, sferičan ili okrugao), površinu ploda (npr. izbrazdana, glatka), boju mesa (npr. crvena, tamno crvena, grimizno crvena, koralno crvena, narandžasta, losos ili roze, žuta, kanarinsko žuta ili bela), boja kore (npr. svetlo zelena; tamno zelena; prugasto-zeleno sa uskim, srednjim ili širokim prugama; sivih tipova; sa mrljama ili bez; zlatno-žuta; kora tipa Crimson, kora tipa Jubilee; kora tipa Allsweet; crna/tamno zelena), debljinu kore, žilavost kore, uzorak kore (npr. prugasta, bez pruga, mrežasta), strukturu mesa/čvrstoću mesa; sadržaj likopena i/ili vitamina, različite odnose šećera i kiselina, veoma dobar ukus voća, itd. Videti Guner and Wehner 2004, Hort Science 39(6): 1175-1182, posebno na stranicama 1180-1181 koje opisuju gene za karakteristike ploda. Generalno važni ciljevi oplemenjivanja su rana zrelost, visok prinos ploda, visok unutrašnji kvalitet ploda (dobra ujednačena boja, visok sadržaj šećera, odgovarajući odnos šećer : kiselina, dobar ukus, visok sadržaj vitamina i likopena, čvrsta tekstura mesa, nevlaknasta tekstura mesa, odsustvo nedostataka, kao što su šuplje srce, nekroza kore, vršna trulež ili krstasta oštećenja, i dobre karakteristike kore i otpornost na pucanje). Plodovi koje daje linija ili sorta su poželjno tržišni plodovi. U jednom aspektu, prosečna vrednost briksa je najmanje 6.0, 7.0, 8.0 ili najmanje 9.0, poželjno najmanje 10.0, poželjnije najmanje 11.0 ili više.

[0275] Boja ploda može da bude bilo koja, kao što su crvena, tamno crvena, grimizno crvena, koralno crvena, narandžasta, losos, roze, ružičasto crvena, žuta, kanarinsko žuta ili bela. Poželjno je da je boja mesa ploda ujednačena.

Informacije o deponovanom materijalu

[0276] Seme diploidnih biljaka Citrullus lanatus izdvojenih prema mutantnom alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS deponovala je kompanija Nunhems B.V. u skladu sa Budimpeštanskim ugovorom pod pristupnim brojem NCIMB 42532 u NCIMB Ltd., Bucksburn Aberdeen AB21 9YA, Škotska, 27. januara 2016. Za deponovanje semena alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS je označen kao emb1. Primenjuje se ekspertsko rešenje.

[0277] Deponovano seme je dobijeno kao rezultat samooprašivanja i povratnog ukrštanja biljke homozigotne za mutantni alel emb1 sa biljkama homozigotnim za alel emb1 divljeg tipa. Stoga je 25% deponovanog semena homozigotno za mutantni alel emb1 i proizvode plodove bez semena, 50% je heterozigotno za mutantni alel i 25% je homozigotno za alel divljeg tipa, koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa.

[0278] Tokom perioda razmatranja ove prijave, pristup depozitima biće omogućen na zahtev osobama za koje Poverenik za patente i žigove utvrdi da imaju pravo na to.

[0279] U skladu sa odredbama 37 C.F.R. § 1.808(b), sva ograničenja koja deponent nametne u pogledu dostupnosti javnosti jednog ili više depozita biće neopozivo uklonjena nakon priznavanja patenta omogućavanjem pristupa depozitima. Depoziti će se čuvati u periodu od 30 godina, ili 5 godina nakon poslednjeg zahteva, ili tokom važenja patenta, šta god da je duže, i biće zamenjeni ako ikada postanu nevijabilni tokom tog perioda. Podnosilac prijave se ne odriče nijednog prava dodeljenog ovim patentom po ovoj prijavi ili prema Zakonu o zaštiti biljnih sorti (7 USC 2321 i dalje).

Opis sekvenci

[0280]

SEQ ID NO 1: Genomska sekvenca gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa iz Citrullus lanatus.

SEQ ID NO 2: Aminokiselinska sekvenca proteina sličnog SDS iz Citrullus lanatus.

Aminokiselinska sekvenca može da se izvede iz kodirajuće sekvence SEQ ID NO 1.

SEQ ID NO 3: Sekvenca iRNK mutantnog alela proteina sličnog ciklinu SDS iz Citrullus lanatus.

SEQ ID NO 4: Aminokiselinska sekvenca mutantnog alela proteina sličnog SDS.

Aminokiselinska sekvenca može da se izvede iz SEQ ID NO 3.

SEQ ID NO 5: Sekvenca nukleinske kiseline gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS divljeg tipa iz Cucumis melo.

SEQ ID NO 6: Aminokiselinska sekvenca proteina sličnog SDS iz Cucumis melo.

Aminokiselinska sekvenca može da se izvede iz kodirajuće sekvence SEQ ID NO 5.

SEQ ID NO 7: Veštačka sekvenca korišćena kao prajmer (A4532) za PCR i\ili reakcije sekvenciranja.

SEQ ID NO 8: Veštačka sekvenca korišćena kao prajmer (A4533) za PCR i\ili reakcije sekvenciranja.

SEQ ID NO 9: Veštačka sekvenca korišćena kao prajmer (A4534) za PCR i\ili reakcije sekvenciranja.

SEQ ID NO 10: Veštačka sekvenca korišćena kao prajmer (A4535) za PCR i\ili reakcije sekvenciranja.

SEQ ID NO 11: Veštačka sekvenca korišćena kao prajmer (A4538) za PCR i\ili reakcije sekvenciranja.

SEQ ID NO 12: Aminokiselinska sekvenca proteina sličnog SDS iz Cucumis sativus.

SEQ ID NO 13: Sekvenca uzorka 114 i 115 sa slike 2

SEQ ID NO 14: Sekvenca uzorka 114 i 115 sa slike 2

SEQ ID NO 15: Sekvenca uzorka 116 i 117 sa slike 2

SEQ ID NO 16: Sekvenca uzorka 116 i 117 sa slike 2

SEQ ID NO 17: Sekvenca cDNK mutantnog gena sličnog ciklinu SDS lubenice koji sadrži mutaciju C u T na nukleotidu 670 koja rezultuje stop kodonom na nukleotidu 670 do 671

SEQ ID NO 18: Mutantni protein sličan ciklinu SDS lubenice kodiran sa cDNK sekvence SEQ ID NO 17

SEQ ID NO 19: Aminokiselinska sekvenca proteina sličnog SDS divljeg tipa iz Solanum lycopersicum

SEQ ID NO 20: Aminokiselinska sekvenca proteina sličnog SDS divljeg tipa iz Capsicum annuum

Opis slika

[0281]

Sl. 1 Plodovi lubenice biljaka divljeg tipa (1A), biljke divljeg tipa u poređenju sa plodovima mutantnih biljaka EMB1 (1B), kriška besemenog ploda mutantne biljke EMB1 (1C) i otvoreno seme bez embriona mutantne biljke EMB1 (1D).

Sl. 2 Poravnanje sekvenci za poređenje sekvenci dobijenih iz uzoraka broj 114, 115, 116 i 117.

Brojevi gore desno označavaju poziciju nukleotida u odgovarajućoj sekvenci prikazanoj pod SEQ NO 1. Uzorci broj 116 i 117 su dobijeni iz mutantnih biljaka EMB1. Uzorci broj 114 i 115 su dobijeni iz biljaka divljeg tipa.

Sl. 3 Elektroforetska analiza proizvoda PCR reakcije dobijenih iz cDNK uzoraka broj 114, 115, 116 i 117 na poliakrilamidnom gelu. Uzorci broj 114 i 115 su dobijeni iz biljaka divljeg tipa. Uzorci broj 116 i 117 su dobijeni iz mutantnih biljaka EMB1.

Opšti postupci

1. Izolovanje RNK

[0282] Mlado tkivo plodnika je isečeno na male komade, zamrznuto u tečnom azotu i čuvano na -80 °C do dalje upotrebe. Zamrznuti komadi tkiva su zdrobljeni u avanu u tečnom azotu da bi prah ostao zamrznut. 100 mg praha je korišćeno za izolovanje ukupne RNK korišćenjem kompleta za izolaciju RNK biljaka prema protokolu proizvođača (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen).

2. Priprema cDNK

[0283] RNK je tretirana DNazom (TURBODNA-free, Ambion) i 0.9 µg RNK je korišćeno za reverznu transkripciju u skladu sa protokolima proizvođača (iScript cDNA Synthesiskit, BioRad).

3. PCR na cDNK

[0284] PCR je obavljen u ukupnoj zapremini od 20 µl pufera (Phire reakcioni pufer, Thermo Fisher Scientific) koji sadrži 0.2 mM dNTP, 0.4 µl enzima Phire Hot Start II DNK Polymerase (Thermo Fisher Scientific), 0.25 µM svakog prajmera i 0.4 µl mešavine cDNK. Posle početnog koraka denaturacije od 30 minuta na 90 °C, izvedeno je 40 ciklusa od 10 sekundi na 98 °C, 15 sekundi na 60 °C i 30 sekundi na 72 °C i reakcija je završena sa 3 minuta na 72 °C.

4. Sekvenciranje

[0285] Veličina proizvoda PCR reakcije je analizirana korišćenjem sistema QIAxcel Advanced System (Qiagen) i PCR reakciona smeša je poslata dobavljaču usluge za sekvenciranje (BaseClear, NL).

Primeri

1. Izolovanje mutanta sa besemenim plodom

[0286] Mutantna populacija je uspostavljena tretiranjem približno 10 000 semenki lubenice iz inbred linije (WMZD0048TYY, skraćeno TYY u nastavku) sa EMS nekoliko sati i zatim ispiranjem semena u tekućoj česmenskoj vodi tokom 30 minuta. Nakon toga, seme je održavano vlažnim do setve u zemlju. Biljke M1 su gajene iz mutagenizovanog semena, sprovedeno je njihovo samooprašivanje i sakupljeno je seme (generacija M2). Posejano je osam semena iz svake od 3000 porodica M2 i izolovane su mutantne biljke koje su dale plodove bez semena. Jedna od ovih mutantnih biljaka je označena kao EMB1. Razmnožavanje mutantne biljke EMB1 izvedeno je kalemljenjem reznica mutantne biljke EMB1 na podlogu od nemutagenizovanih biljaka lubenice.

2. Potvrda fenotipa besemenog ploda

[0287] Mutant EMB1 je povratno ukršten sa originalnom nemutagenizovanom inbred linijom TYY lubenice, korišćenjem polena iz mutanta EMB1 (generacija BC1). 25% biljaka uzgojenih kao rezultat samooprašivanja generacije BC1 dalo je besemene plodove.

[0288] Polen iz mutanta EMB1 je takođe korišćen za ukrštanje sa različitim inbred linijama lubenice za uspostavljanje populacije za mapiranje. Posle samooprašivanja, 25% biljaka populacije za mapiranje dalo je besemene plodove.

[0289] Rezultati odgovarajućih povratnih ukrštanja i ukrštanja u kojima je polen iz mutanta EMB1 korišćen za oplodnju drugih inbred linija jasno pokazuju da je polen mutanta EMB1 plodan.

[0290] U daljim ukrštanjima mutantnih biljaka EMB 1, homozigoti za mutantni alel emb1 su korišćeni kao ženski roditelj i oprašeni polenom iz različitih drugih linija.100% biljaka iz svakog od ovih ukrštanja dalo je besemene plodove.

[0291] Rezultati dobijeni sa različitih ukrštanja pokazuju da je mutacija emb1 posledica jednog recesivnog alela. Rezultati takođe pokazuju da se fenotip ploda bez semena održava kada se polen biljaka koje proizvode seme koristi za oprašivanje mutantnih biljaka EMB1. Fenotip besemenog ploda stoga nije posledica aberantnog polena mutanta EMB1, već se može pripisati defektima u razvoju embriona.

3. Identifikacija gena koji uzrokuje fenotip besemenog ploda

[0292] Populacija za mapiranje uspostavljena oprašivanjem različitih inbred linija lubenice polenom iz mutantne biljke EMB 1 je analizirana i otkriven je polimorfizam jednog nukleotida (SNP) u genomskoj sekvenci prikazanoj pod SEQ ID NO 1. SEQ ID NO 1 prikazuje sekvencu alela divljeg tipa. U odgovarajućem alelu mutantne biljke EMB1, nukleotid guanin (G) na poziciji broj 2185 u SEQ ID NO 1 zamenjen je adeninom (A).

4. Analiza iRNK transkribovane sa alela emb1

[0293] Cvetni pupoljci različite veličine ubirani su sa biljaka gajenih u polju. Uzorci broj 114 i 115 su cvetni pupoljci biljaka originalne inbred linije, označene TYY, koja je korišćena za mutagenezu. TYY tako predstavljaju biljke divljeg tipa koje sadrže alele emb1 divljeg tipa. Uzorci broj 115 i 116 su cvetni pupoljci mutantnih biljaka EMB1 koje proizvode besemeni plod koje sadrže mutantne alele emb1. Pregled fenotipova, materijala sakupljenog i analiziranog za odgovarajuće brojeve uzoraka dat je u tabeli 1.

Tabela 1

[0294] RNK je izolovana iz cvetnih pupoljaka različitih brojeva uzoraka. Za sintezu cDNK je korišćeno 700 ng RNK za svaki od brojeva uzoraka. PCR reakcija korišćenjem prajmera A4532 (SEQ ID NO 7) i A4533 (SEQ ID NO 8) izvedena je na svakom od dobijenih uzoraka cDNK. Prajmeri su dizajnirani tako da amplifikuju deo alela emb1 kodirajuće sekvence naznačene u SEQ ID NO 1. PCR proizvodi su analizirani na poliakrilamidnom gelu koji je prikazan na slici 3. Sa slike 3 jasno može da se vidi da su uzorci broj 116 i 117 rezultovali kraćim PCR fragmentom od svih drugi brojeva uzoraka. Ovo je jasno ukazalo da iRNK mutantnog alela emb1 sadrži deleciju nukleotida u poređenju sa odgovarajućim alelom divljeg tipa u uzorcima broj 114 i 115.

5. Analiza sekvence cDNK alela emb1

[0295] cDNK uzoraka broj 114, 115, 116 i 117 je sekvencirana korišćenjem prajmera A4532 prikazanog pod SEQ ID NO 7, prajmera A4538 prikazanog pod SEQ ID NO 11, prajmera A4534 SEQ ID NO 9 i prajmera A4535 SEQ ID NO 10. Sekvence dobijene iz svakog od uzoraka broj 116 i 117 su prikazane pod SEQ ID NO 3 kao molekul iRNK. Sekvence dobijene iz svakog od uzoraka broj 114 i 115 su identične kodirajućoj sekvenci naznačenoj u SEQ ID NO 1. Poređenje sekvenci dobijenih iz uzoraka broj 114, 115, 116 i 117 pokazalo je da sekvence svakog od uzoraka broj 116 i 117 imaju deleciju od 16 uzastopnih nukleotida u poređenju sa sekvencama svakog od uzoraka broj 114 i 115. Pored toga, sekvence svakog od uzoraka broj 116 i 117 imaju pomeranje okvira čitanja koje izaziva prevremeni stop kodon u kodirajućoj sekvenci, u poređenju sa sekvencama svakog od uzoraka broj 114 i 115. Poravnanje dotičnih delova sekvence je prikazano na slici 2.

[0296] Može se zaključiti da se mutantni alel emb1 uzoraka broj 116 i 117 transkribuje u iRNK koja ima deleciju, pomeranje okvira u okviru čitanja i prevremeni stop kodon u poređenju sa iRNK transkribovanom sa alela divljeg tipa uzoraka broj 114 i 115. Pored toga, sa slike 2 može da se vidi da iRNK transkribovana sa mutantnog alela emb1 uzoraka broj 116 i 117 kodira protein u kome je 8 aminokiselina zamenjeno u poređenju sa proteinom koji je kodiran iRNK transkribovanom sa alela divljeg tipa uzoraka broj 114 i 115.

6. Generisanje druge mutantne biljke lubenice

[0297] Poznavanje sekvence gena sličnog ciklinu SDS omogućilo je stvaranje drugih mutantnih alela u genu sličnom SDS. TILLING populacija, mutagenizovana pomoću EMS, podvrgnuta je skriningu sa prajmerima dizajniranim na bazi domena u kojem EMS mutacije mogu da konvertuju kodon koji kodira aminokiseline u stop kodon.

Direktni prajmer: CGAAGAGAAAGGATTAGACGTTG (SEQ ID NO: 21)

Reverzni prajmer: TCTGAGCAGTCAGTATCAGACG (SEQ ID NO: 22)

[0298] Identifikovana je biljka koja sadrži mutantni alel sličan ciklinu SDS. Identifikovani alel sadrži zamenu jednog nukleotida na nukleotidu 1687 u SEQ ID NO: 1, koja dovodi do nastanka stop kodona. Mutantni alel na taj način kodira skraćeni protein sličan ciklinu SDS koji sadrži samo aminokiseline 1 do 223 proteina divljeg tipa sekvence SEQ ID NO: 2. cDNK mutantnog alela je data u SEQ ID NO: 17, a skraćeni protein kodiran mutantnim alelom je dat u SEQ ID NO: 18.

Claims

Patentni zahtevi

1. Biljna ćelija lubenice, naznačena time, što biljna ćelija sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu mutantni alel sadrži mutaciju u jednoj ili više regulatornih sekvenci koja rezultuje sniženom ekspresijom gena ili izostankom ekspresije gena u poređenju sa odgovarajućim alelom divljeg tipa, ili pri čemu mutantni alel kodira protein koji sadrži deleciju, skraćenje, inserciju ili zamenu jedne ili većeg broja aminokiselina, u poređenju sa proteinom kodiranim alelom divljeg tipa, što rezultuje smanjenom funkcijom ili gubitkom funkcije proteina sličnog ciklinu SDS, gde ta smanjena funkcija ili gubitak funkcije dovodi do proizvodnje besemenih plodova biljke lubenice, pri čemu je protein sličan ciklinu SDS alela divljeg tipa kodiran molekulima nukleinske kiseline izabranim iz grupe koja se sastoji od:

b) molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju protein, čija je sekvenca najmanje 60% identična sa aminokiselinskom sekvencom datom pod SEQ ID NO 2;

d) molekula nukleinske kiseline, koji su najmanje 70% identični sa sekvencama nukleinske kiseline opisanim pod c);

e) molekula nukleinske kiseline, koji hibridizuju sa najmanje jednim lancem molekula nukleinske kiseline opisanih pod a) ili c) pod strogim uslovima od najmanje jednog pranja u 0.2X SSC na temperaturi od najmanje 50°C tokom 20 min; i

2. Biljna ćelija lubenice prema patentnom zahtevu 1, gde mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS kodira protein u kome je jedna ili više aminokiselina insertovano, zamenjeno ili deletirano u konzervisanom domenu ciklin C i/ili domenu ciklin N proteina ili gde je domen Cyclin_C i/ili domen Cyclin_N potpuno ili delimično odsutan.

3. Biljka lubenice koja sadrži biljnu ćeliju prema patentnom zahtevu 1 ili 2.

4. Seme iz kojeg može da se uzgoji biljka lubenice prema patentnom zahtevu 3.

5. Postupak za proizvodnju biljke lubenice koji sadrži sledeće korake:

a) uvođenje mutacija u populaciju biljaka lubenice,

b) identifikovanje biljke koja ima mutaciju u alelu, koji kodira gen, koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu alel divljeg tipa gena kodira protein sličan ciklinu SDS koji ima najmanje 60% identičnosti sekvence sa proteinom sekvence SEQ ID NO 2, i c) određivanje da li je biljka muški plodna i da li biljka proizvodi besemene plodove i d) selektovanje biljke koja sadrži najmanje jednu kopiju mutantnog alela iz koraka b).

6. Postupak za proizvodnju biljke lubenice koji sadrži sledeće korake:

a) uvođenje mutacija u populaciju biljaka lubenice,

b) selektovanje muški plodne biljke koja proizvodi besemeni plod,

pri čemu alel divljeg tipa gena kodira protein sličan ciklinu SDS koji ima najmanje 60% identičnosti sekvence sa proteinom sekvence SEQ ID NO 2.

7. Biljka lubenice dobijena postupkom prema patentnom zahtevu 5 ili 6.

8. Upotreba molekula nukleinske kiseline koji kodira protein sličan ciklinu SDS izabranog iz grupe koja se sastoji od:

c) molekula nukleinske kiseline, koji sadrže nukleotidnu sekvencu prikazanu pod SEQ ID NO 1 ili SEQ ID NO 3 ili SEQ ID NO 17, ili sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom SEQ ID NO 1 ili SEQ ID NO 3 ili SEQ ID NO 17;

za proizvodnju biljke koja proizvodi besemeni plod.

9. Delovi biljaka koji sadrže biljne ćelije prema patentnim zahtevima 1 ili 2, ili delovi biljaka prema patentnom zahtevu 7, gde navedeni delovi sadrže ćelije koje imaju mutaciju u alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

10. Materijal za razmnožavanje koji sadrži biljne ćelije prema patentnim zahtevima 1 ili 2, ili materijal za razmnožavanje koji može da se dobije iz biljke prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 7, pri čemu navedeni materijal za razmnožavanje sadrži ćelije koje imaju mutaciju u alelu gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

11. Plod koji sadrži biljnu ćeliju prema patentnim zahtevima 1 ili 2, ili plod koji može da se dobije od biljke prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 7, ili plod koji može da se dobije od materijala za razmnožavanje prema patentnom zahtevu 10.

12. Biljka lubenice prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je navedena biljka homozigotna za mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS.

13. Postupak za proizvodnju besemenog ploda koji sadrži uzgajanje biljke prema patentnom zahtevu 12 i omogućavanje oprašivanja navedene biljke, i branje besemenog ploda.

14. Biljka prema patentnom zahtevu 3, ili seme prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je biljka ili seme diploidna, triploidna ili tetraploidna kultivisana biljka lubenice.

15. Biljna ćelija lubenice prema patentnom zahtevu 1, gde mutantni alel kodira protein, u kome najmanje 25, poželjno najmanje 50, 60, 70, 80, 90 ili 100, poželjnije najmanje 150 aminokiselina nedostaje na N-terminalnom kraju ili C-terminalnom kraju aminokiselinske sekvence u poređenju sa odgovarajućim proteinom sličnim ciklinu SDS divljeg tipa.

16. Biljka, deo biljke ili seme lubenice, koji sadrže biljnu ćeliju prema patentnom zahtevu 1, koja sadrži mutantni alel gena koji kodira protein sličan ciklinu SDS, pri čemu mutantni alel kodira skraćeni protein kome nedostaju aminokiseline 358 do 562 proteina divljeg tipa sekvence SEQ ID NO: 2, ili kome nedostaju aminokiseline 224 do 562 proteina divljeg tipa sekvence SEQ ID NO: 2.

17. Biljka, deo biljke ili seme lubenice prema patentnom zahtevu 16, gde mutantni alel kodira protein sekvence SEQ ID NO: 4 ili sekvence SEQ ID NO: 18.

18. Biljka, deo biljke ili seme lubenice prema patentnom zahtevu 16 ili 17, gde je mutantni alel u homozigotnom obliku.

19. Postupak za proizvodnju besemenog ploda koji sadrži uzgajanje biljke lubenice prema patentnom zahtevu 18 i omogućavanje oprašivanja navedene biljke, i branje besemenog ploda.